核酸医薬
核酸医薬（英: oligonucleotide therapeutics）とは天然型ヌクレオチドまたは化学修飾型ヌクレオチドを基本骨格とする薬物であり、遺伝子発現を介さずに直接生体に作用し、化学合成により製造されることを特徴とする。代表的な核酸医薬にはアンチセンスオリゴヌクレオチド、RNAi、アプタマー、デコイなどがあげられる。核酸医薬は化学合成により製造された核酸が遺伝子発現を介さずに直接生体に作用するのに対して、遺伝子治療薬は特定のDNA遺伝子から遺伝子発現させ、何らかの機能をもつ蛋白質を産出させる点が異なる。核酸医薬は高い特異性に加えてmRNAやnon-coding RNAなど従来の医薬品では狙えない細胞内の標的分子を創薬ターゲットにすることが可能であり、一度プラットフォームが完成すれば比較的短時間で規格化しやすいという特徴がある。そのため核酸医薬は低分子医薬、抗体医薬に次ぐ次世代医薬であり癌や遺伝性疾患に対する革新的医薬品としての発展が期待されている。
RNAの化学構造
リボヌクレオシドとは核酸塩基と糖の一種であるD-リボースとかβ-N-グリコシド結合で結合した化合物である。天然のリボヌクレオシドにはアデノシン（A）、グアノシン（G）、シチジン（C）、ウリジン（U）の4種類がある。このうちAとGを合わせてプリンヌクレオシドとよび、CとUを合わせてピリミジンヌクレオシドとよぶ。これらの名称は、各々のヌクレオシドの塩基成分の名称がアデニン、グアニン、ウラシル、シトシンであることによる。リボヌクレオシドのリボース環の殻炭素原子は「ダッシュ（プライム）」をつけた番号で示し、塩基部分の各原子は番号で示す。リボヌクレオシドの水酸基とリン酸基が結合した物質がリボヌクレオチドであり、RNAを構成する最小単位である。4種のリボヌクレオシドとリン酸化される水酸基の位置の組み合わせや個数によって色々なリボヌクレオチドができる。リボヌクレオチドが互いにリン酸ジエステルを介して1本の鎖状につながった物質がオリゴリボヌクレオチドであり、RNAという。RNA中でのリン酸の結合位置はヌクレオシドの5'位酸素と3'位の酸素原子である。相補的な塩基配列をもった一本鎖RNA同士はワトソン-クリック塩基対で、逆平行に会合し二本鎖RNAを形成する。二本鎖RNAは11塩基対で1回転するA型二重らせん構造をとる。一本鎖RNAにそれと相補的な配列をもったDNAを加えたRNA-DNAハイブリッド二重らせんは固体状態ではA型二重らせん構造である。しかし溶液中では異なる構造をとっており、その特異的な構造がRNaseHに認識されRNA鎖が切断されると考えられている。
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）
ASOは核酸医薬の中で最も適応範囲が広いと考えられている。具体的にはRNAのウイルスに対して使用したり、がん細胞のアポトーシス抑制遺伝子を抑制したりするといった臨床応用が考えられる。ASOは細胞質内、核内のどちらでも効果を発揮することから蛋白質に翻訳される遺伝子だけではなくmiRNAや長鎖非コードRNAの機能を抑制することも可能である。
歴史
アンチセンスオリゴヌクレオチド（antisense oligonucleotide、ASO）は標的とするmRNAに相補的なDNAやRNAを塩基配列特異的にハイブリダイゼーションさせ蛋白質合成の発現を制御する。ASOの概念は1967年のBilikovaらの報告から始まったと考えられている。彼らは反応性基を持った核酸2量体の対象核酸への結合を報告している。一方Ts’oらは核酸オリゴマーを用いてRNAを選択的にマスクすることでRNAの機能阻害を試みた研究成果を1974年に報告している。彼らの試みは、核酸オリゴマーを設計する際に、細胞内への導入を視野に入れてリン酸ジエステル結合の負電荷をなくす試み、すなわちトリエステル型核酸オリゴマーを開発した点で高く評価されている。彼らはさらに1977年にメチルホスホネート型核酸オリゴマーの開発をしている。これらに対してザメクニック（Zamecnic）とステファンソン（Stephenson）らは1978年、天然型核酸オリゴマー（D-オリゴ）を用いて、培養細胞系でウイルス増殖制御を成功させている ことからASOの最初の報告として引用されることが多い。彼らはトリ線維芽細胞由来の培養細胞においてRNAウイルスであるラウス肉腫ウイルスの3’末端に相補的なASOによりウイルス複製を抑制することに成功した。そして、1989年にNIHグループがホスホロチオエート型核酸オリゴマー（PS-オリゴまたはS-オリゴともいう）を開発しアンチセンスオリゴヌクレオチドが大きく展開し始めた。2012年現在、ASOの標的となるのはmRNA、pre-mRNA、miRNA、lcRNAウイルスゲノムなどがあげられこれらの標的RNAに対して種々の作用メカニズムを介して関連疾患蛋白質の制御を行う。
デリバリー
ASOはその化学修飾、特に核酸間リン酸結合のホスホロチオエート化によりアルブミンをはじめとした生体内分子に結合して様々な臓器にデリバリーされる。細胞内への取り込みはいくつか報告されているがエンドサイトーシスが中心である。修飾されたASOを薬物動態学は核酸医薬のリーディングカンパニーであるIONIS社のGene Hungらによって報告されている。彼らはノンコーディングRNAであるMALAT1を標的とするASOをデザインした。MALAT1は様々な組織で発現しているが、ノックアウトマウスが明瞭な表現型を示さないことが知られている。そのためASOの薬物動態学の解析に適切と考えた。ASOをマウスに50mg/kgで週に2回投与を4週間行い、最終投与の24時間後に臓器採取しリアルタイムPCR法でノックダウン効果を評価したところ多くの臓器で高いノックダウン効果が得られた。肝臓、腎臓、脾臓などの腹部臓器のほか坐骨神経でも高いノックダウン効果が得られた。脳では25～35％程度、脊髄では20％程度のノックダウン効果が得られた。in site ハイブリダイゼーションでノックダウン効果が低い細胞も認められたがこれらは細胞への取り込みの差と考えられた。
ASOは血液脳関門を通過しないことが知られている。Gene Hungらの報告では脳や脊髄でもわずかなノックダウン効果が得られたが、抗ASO抗体で脳を免疫染色すると神経細胞やグリア細胞にASOを示す蛍光は認められなかった。彼らはASOが作用したのは神経細胞ではなく、脈絡叢や第三脳室や第四脳室や脳室周囲器官など血液脳関門をもたない部位でのノックダウン効果と考察した。
ASOの設計
ASOの分子設計はASOの分子構造、ASOの配列、ASOの機能化の観点から行われる。
分子構造
ASOを医薬品として用いるための最低限の要件は厳密な塩基配列認識能、ヌクレアーゼ耐性、細胞内移行性、代謝性である。Ts’oらは研究当初から細胞内移行性に着目し、リン酸ジエステル結合の負電荷をリン酸トリエステル型にすることで消し去り、細胞内移行性を高めようとした。それ以後、実に多くの修飾核酸がASO分子として開発された。それらは核酸塩基部位の修飾（新規人工核酸塩基）、リボースの修飾、リボース環自体の改変、リン原子関連修飾（メチルホスホネート型やホスホロチオエート型）、リンケージの修飾（非リン酸型）に分類される。
第一世代のASOは主にリン原子関連修飾によって設計されたものであり、とりわけPS-オリゴは最も優れたアンチセンス効果を示してきている。1990年代には第二世代ASOが開発された。Ionis社が開発した2’-O-アルキル型は第一世代よりも高い効果を示している。さらにBNAやLNA など改変されたリボース環をもつ第2.5世代の核酸医薬も開発されている。その他、ASOの新規構造体設計時に求められるポイントしてはRNAとの結合安定性（Tm値など）、ミスマッチ配列認識能、ヌクレアーゼ耐性、RNaseH活性、科学的な安定性、脂溶性または水溶性、蛋白質との結合性があげられる。
配列
ASOが機能を発揮するためには対象RNAと二重鎖を形成することが必須である。しかし細胞内でどのように二重鎖を形成するのかは不明な点が多い、RNAの高次構造中に一本鎖領域が存在し、その部位にASOが結合する場合と、ASOがRNA鎖の二重鎖領域の一方の鎖と競合的に作用して結合する場合が考えられる。極めて安定なステム領域にASOが結合することは不可能であるので、配列決定の際には対象RNAの高次構造の情報が必要である。しかしRNAの立体構造の多様性はDNAの立体構造よりもはるかに多く、その決定法や評価法は確立していない。大阪大学の小比賀聡らは2016年現在のこの状況を踏まえてASOの配列のデザインでは標的RNAの二次構造、他の動物種とのホモロジー、ASOの二次構造、化学修飾、毒性発現に関わるモチーフ、オフターゲット効果、配列長に注目するべきと述べている。標的RNAの二次構造がステムかループかあるいは蛋白結合部位かによってASOのアクセス効率は大きく異なる。またASO自体、ヘアピン構造やダイマー形成をすることでアクセス効率が低下することがある。ヘアピン構造やダイマー形成には回文構造の配列の場合に起こる。
高機能化
核酸構造の修飾だけでは理想的なアンチセンス効果は期待できない。そのためASOの分子設計のひとつの方向性としてASOの高機能化があげられる。高機能化では高分子医薬品で利用される様々なDDSの技術が用いられる。脂溶性物質やPEG、膜透過性ペプチド、抗体などをコンジェゲートすることで経口投与可能なASOや血液脳関門を通過するASOなどをデザインするのが目的である。代表的なコンジュゲート物質として脂溶性分子やビタミン、ポリアミン・カチオン性基、膜透過性ペプチド、糖鎖などは細胞内への移行性を改善させるために用いる。切断活性を有する基などを用いてプロドラック化なども検討される。
歴史
RNAi（RNA interference、RNA干渉）とは外から細胞内に導入された二本鎖RNA（double-stranded RNA、ds-RNA）によって配列特異的に標的RNAが分解され、結果として標的遺伝子の発現が抑制される現象である。RNAiが最初に報告されたのは1998年にFireとMelloらによる線虫を用いた研究である。線虫ではそれ以前から一本鎖RNA（single-stranded RNA、ssRNA）を体内に注入することで、配列特異的に遺伝子発現を抑制できることが知られていた。彼らはこの現象が、実は調整したssRNAにごく微量に含まれているdsRNAによるものであり、dsRNAを用いることで効率的に遺伝子発現を抑制できることを発見した。精製してdsRNAを除いたssRNAではほとんど抑制効果を示さなかったのに対してdsRNAを用いた場合は殆どの遺伝子で95％以上もの抑制効果がみられた。その後、植物におけるcosuppression現象やウイルス感染から誘導される遺伝子発現抑制現象（virus-induced gene silencing）などが同様なしくみで起こる現象であると判明した。
機序
RNAiは細胞内に導入されたdsRNAまたはsiRNAが引き金となって起こされる。細胞内に導入されたdsRNAはRNaseⅢファミリーに属する蛋白質であるDicerによって21～25塩基程度の低分子RNA（small interfering RNA、siRNA）へ切断される,。Dicerはヒトや線虫において1種類、ショウジョウバエでは2種類、植物では4種類報告されている。siRNAはATP依存的な巻き戻しを受けて一本鎖となり、他の因子とともにRISC（RNA-induced silencing complex）を形成する。RISCはsiRNAをガイド分子として相補的な配列をもつ標的RNAを認識し、siRNAの中央部分で切断して分解へ導く。標的RNAを切断する活性をもつ因子はSlicerとよばれている。
Dicerによって作り出されたsiRNAは次のような特徴をもつ。siRNAは長さ21～25塩基程度のdsRNA（siRNA duplexとよぶ）であり、3’末端に2塩基の突出（オーバーハング）をもつ。またRNAi活性には5’末端のリン酸基が必要である。リン酸基をもたないsiRNAであっても、生体内でリン酸化を受けるためRNAi活性を示すが、5’末端を修飾してリン酸化を抑制すると活性は消失する。RISCの構成因子としてArgonaute蛋白質が知られている。代表例はAGO2である。
RISCの機能
RISCは自身がもつガイドRNAと相補的な標的配列をもつRNAに結合し、標的を切断したり、翻訳の抑制やポリA鎖の短縮などを引き起こす。一般に小分子RNAがどのように働くかはsmall RNAの生合成過程よりもむしろ、取り込まれるArgonaute蛋白質の性質に依存する。いいかえれば、small RNAはArgonauteを標的RNAへ導くガイドとしての働きをしているだけであり、実際の機能を発揮しているのはArgonaute蛋白質である。スライサー活性をもつArgonauteがガイド鎖と相補性の高い標的配列に結合した場合にはパッセンジャー鎖の切断と全く同じメカニズムにより標的mRNAを切断する。これに対してスライサー活性を持たないArgonauteの場合、あるいはガイド鎖と標的配列の中央付近にミスマッチが存在する場合には切断は起こらないが、標的配列上に結合し、下流のサイレンシング因子をよびこむ足場として機能する。
一般にsiRNAは相補的な長い二本鎖RNAから作られるため、siRNAの配列は自身が由来するRNAと完全に相補的であり、その切断を行うことができる。一方でmiRNAは標的mRNAとの相補性がseed領域（あるいはseed領域に加えて3’supplementary領域）に限定される場合が多く、一般に切断は行わずに翻訳抑制などのサイレンシングを誘導する。例外として哺乳類のmiR-196はHOXB8 mRNAに対してほぼ完全に相補的であり、その切断を行うことが知られている。またsiRNAなどの小分子RNAは1つの細胞の中で働くわけではなく、細胞間、あるいは組織間あるいは世代間のシグナルとして働くことが知られている。シグナルとして働く場合もRISCあるいは何らかのRNA-蛋白質複合体としてシグナル伝達していると考えられている。
デリバリー
siRNAのみでは生体内で標的臓器および細胞にデリバリーされないため、何らかの形でDDSを付加する必要がある。siRNAにコレステロールを直接結合させることでsiRNAの肝臓へのデリバリーを格段に向上させたという報告がある。
siRNAの設計
哺乳類においては約30塩基以上の長いdsRNAを細胞内に導入すると抗ウイルス応答であるインターフェロン応答が生じ、アポトーシスの引き金となるPKRなどが活性化され細胞が死滅してします。化学的に合成されたsiRNAをヒトの培養細胞に導入することでインターフェロン応答を引き起こすことなく効果的に標的遺伝子の抑制が可能である。
配列
Tuschlらのグループが提唱した初期のガイドラインでは以下のようなものである。まず、5’、3’の非翻訳領域（UTR）を避けて、開始コドンから50～100塩基下流の翻訳領域からターゲットとなる領域を選択し、さらにGC含量が50％程度のAA(N19)TTという配列を選ぶ。もしターゲット領域内でそのような配列が見つからない場合にはAA(N21)もしくはCA(N21)で代用し、対応するsiRNAを作成するのがよいとされた。またオーバーハングに関しては、標的配列との相同性は必須ではなく、UUまたはTTが推奨された。しかしこのようなガイドラインには根拠がないという意見もある。
アプタマー
核酸アプタマーとは標的分子に特異的に結合する一本鎖のRNAまたはDNA分子である。その塩基配列に依存して種々の三次元立体構造をとることで標的分子に結合する。このアプタマーは米国のGilead Sciences社がRNAライブラリーから効率よくアプタマーを識別する技術であるSELEX法（試験管内人工進化法）を開発している。その権利がArchemix社（治療）とSomaLogic社（診断）のほぼ独占状態である。抗体よりも高い特異性をもち、化学的に合成できる核酸医薬である。権利の問題でアプタマーの実用化が遅れているという意見もある。加齢性黄斑変性症の治療薬であるペガプタニブが唯一の実用化したアプタマーである。
デコイ
デコイ核酸とは転写因子結合配列と同じ配列を持つ二本鎖 DNAで、転写因子と結合することで目的遺伝子の発現を抑制する核酸医薬である。NF-κBのデコイが知られている。NF-κBのデコイはNF-κBによる転写活性化を抑制するがステロイドの抗炎症作用と重複しており、またステロイドのような多様な作用は示さず、より安全なアトピー性皮膚炎の治療薬として期待されている。
体内分布
薬の動態は脂溶性や分子量や電荷などに代表される薬物の物理化学的性質と血流や臓器サイズなどの生体側の特徴で決まる。薬物の分子量が大きくなるにつれて薬物が移行可能な臓器や組織は制限される。特に脳や筋肉では毛細血管の内皮細胞が連続内皮であるために毛細血管の透過は制限される。核酸医薬の基本単位であるヌクレオチドの分子量は310～330程度であり、修飾核酸でもその値は大きく変わらないことが多い。核酸医薬では最小のもので分子量4,000程度であり、2本鎖RNAであるsiRNAの場合は分子量13,000程度になる。分子量4000程度の最小の核酸医薬であっても連続内皮の毛細血管を自由に通過することはできない。分布可能な臓器は肝臓、脾臓、腎臓、骨髄など有窓内皮、不連続内皮から構成される毛細血管のある臓器である。例外として固形がん組織では正常組織と比べて新生血管の増生と血管壁の著しい透過性の亢進があることから数十nmサイズのキャリアが固形がん組織に集積しやすいことが知られEPR効果（enhanced permeation and retention effect）といわれる。EPR効果によって高分子が蓄積しやすい固形腫瘍には核酸医薬も到達可能である。実際に静脈内や腹腔内に投与された核酸は、これらの臓器に集積する傾向がある。もうひとつの例外が筋ジストロフィーにおける筋組織である。通常は筋組織は連続型毛細血管をもつため核酸医薬は通過できない。しかし筋ジストロフィーのように筋細胞の壊死・再生が活発な病態では筋組織に効率よくオリゴヌクレオチドが取り込まれる。
分子量が約40,000以下の高分子の場合、あるいは5nm未満のサイズの場合は腎臓の糸球体濾過も体内動態を決定する過程として重要である。タンパク結合率が低い場合には、循環血液中の核酸医薬は速やかに糸球体濾過によって血中濃度が減少する。またマクロファージなどの細胞に発現するスカベンジャーレセプターなどは、ポリアニオンを認識し、これをエンドサイトーシスにより取り込み、分解することが知られている。天然型の核酸はリン酸ジエステル結合を有するポリアニオンであることから、ポリアニオンを認識する機構により除去されることが報告されている。特に100nm以上のサイズになると肝臓や肺などに存在する貪食細胞によって認識されやすく排除されてしまう。
天然型のリン酸ジエステル結合からなる核酸はヌクレアーゼにより速やかに分解される。核酸医薬の作用は量反応関係があるため分解や消失による濃度減少を抑制することは非常に重要である。核酸が体内で速やかに分解される現象の対策としてホスホチオエート化に代表される安定化誘導体が開発されてきた。また多くの核酸医薬は腎糸球体の濾過の閾値よりもサイズが小さい。したがって、血液中で血漿タンパク質と結合しない場合は速やかに腎排泄される。この過程は分子サイズに依存することからポリエチレングリコール（PEG）などの高分子修飾や高分子修飾やタンパク結合性を増大することで速やかな腎排泄の制御が可能と考えられている。
細胞膜透過
核酸医薬のようなオリゴヌクレオチドは細胞にとって不要であるため細胞内への移行は大きく制限されると考えられている。一般的にオリゴヌクレオチドを含める高分子は主にエンドサイトーシスによって取り込まれる。この場合、細胞内移行後も細胞膜を通過していないため、オリゴヌクレオチドが細胞質や核に移行する可能性は非常に低い。一般的にエンドサイトーシスによって取り込まれた分子はエンドソームへ輸送され、その後、加水分解酵素を含むリソソームへ輸送され、分解される。
　膜透過性の乏しい活性分子の透過性改善を目的としてDDSの分野では様々な方法が提唱されている。その多くは核酸医薬に対しても適応されている。その一例としてはコレステロールなどの脂溶性化合物を利用した修飾があげられる。これは、水溶性高分子である核酸医薬の疎水性を増大することで、細胞膜との相互作用を高め、結果的に細胞膜を介する輸送効率を高めることを目的としたものである。コレステロールの他には膜透過ペプチドや正電荷を有するアルギニン誘導体などを結合させる方法やリポソームなどの脂質微粒子やポリカチオンなども開発されている。核酸と細胞膜との相互作用の増大と膜構造不安定化により、核酸医薬の膜透過性改善は実現可能と考えられている。
細胞膜の透過に関しては一本鎖のアンチセンス核酸と二本鎖のsiRNAでは異なる点がある。アンチセンス核酸の場合は培養細胞の実験の場合は数100nMまで濃度を挙げると細胞内に取り込まれるが、二本鎖のsiRNAは取り込まれない。またアンチセンス核酸はGapmer型アンチセンスでもスプライシング制御型アンチセンスであっても核内で機能するため核膜を通過する必要がある。siRNAは細胞質で作用するため核膜を通過する必要はない。
リポプレックス
リン酸基に由来する負電荷を豊富にもつ核酸分子をカチオン性リポソームと混合すると静電的相互作用によって自発的に複合体を形成する。この複合体をリポプレックスという。基本的に正電荷を帯びるリポプレックスは負電荷を帯びる細胞表面に吸着後、細胞内へ効率的に取り込まれ、エンドソームから細胞質内に移行した核酸は機能を発揮することができる。In vitroで培養細胞に遺伝子を導入するためのトランスフェクション試薬として開発された種々のカチオン性脂質とエンドソームからの放出を高める膜融合性の中性脂質を混合したリポソームなどがin vivoでも応用されている。ガラクトース、マンノースといった糖鎖や葉酸などで表面を就職してレセプターを介して細胞特異的に送達されるリポプレックスも開発されている。
Tekmira社がリポソームの脂質成分を徹底的にスクリーニングして開発したSNALPがよく知られている。膜融合活性に優れた独自のpH応答性カチオン性脂質を含み、エンドソーム内の酸性環境下で中性からカチオン性に変化して効率的に膜融合を誘起する特徴をもつ。パチシランはSNALPを用いて静脈内投与にて肝臓にsiRNAを送達してトランスサイレチン型アミロイドーシスを治療する核酸医薬である。
ポリプレックス
カチオン性ポリマーと核酸分子との複合体がポリプレックスである。高分子ミセルがその代表であり、主に悪性腫瘍を対象として開発されている。高分子ミセルではPICミセルがよく知られている。東京大学大学院工学系研究科の片岡一則教授らはDNAを内核に保持し、外殻を生体適合性物質で覆うナノ粒子キャリアに注目している。PICミセル（ポリイオンコンプレックスミセル）は親水性で生体適合性の高いポリエチレングリコール（PEG）鎖とカチオン性高分子鎖をブロック状に連結したブロック共重合体が、水中でポリアニオンであるDNAやRNAと静電相互作用を駆動力として自律的に多分子会合した構造物を形成したものである。PICミセルは効率的にプラスミドDNAやアンチセンスDNAやsiRNAを内包することができる。しかし鎖長の短い核酸を内包したPICミセルは安定性が十分ではなく、一定の濃度以下ではミセルの解離が起こってしまう。
リポポリプレックス
カチオン性リポソームとカチオン性ポリマーの両キャリアを併用して調整した核酸分子との複合体がリポポリプレックスである。リポポリプレックスにPEG修飾や膜透過性ペプチドの導入をはじめ様々な機能を組み込んだものが北海道大学の原島秀吉らが開発したMEND（multifunctional envelope nano device）である。
局所投与
組織内に局所投与する場合は、核酸医薬は分子量が大きいため周囲への拡散性が小さく、注入局所に留まる傾向がある。また注入溶液による組織内圧の上昇、針の刺入による細胞膜への障害などにより投与された核酸医薬が直接細胞質に到達する。これは核酸医薬よりも巨大なサイズのプラスミドDNAを用いた場合でも認められる現象である。
静脈内投与
静脈内投与は投与した薬物が直ちに循環に入り、急速に血漿濃度を高めることができる投与法である。バイオアベイラビリティは1.0となる。筋肉内注射や皮下注射と比べると大量の薬物投与が可能である。短所としては急速に血漿濃度が高まるため望ましくない作用も急激に起こりうること、塞栓、出血、感染などの危険を伴うことがあげられる。静脈内投与により血液脳関門を通過させて神経細胞に核酸医薬をデリバリーさせる方法は少ないがいくつか報告されている。特定物質のコンジュゲートによってASOを中枢神経へ送達する方法が知られている。膜透過ペプチドを用いる方法、抗体を用いる方法、脂質を用いる方法などがある。また中枢神経系には送達されないがN-アセチルガラクトサミン（GalNac）は肝細胞内へ送達し家族性アミロイドポリニューロパチーの治療へ応用可能という点は注目に値する。抗体のコンジェゲートの例としてはトランスフェリン受容体に対するモノクローナル抗体をASOにコンジュゲートし受容体介在性エンドサイトーシスの機序で中枢神経系へASOを送達したという報告がある。膜透過ペプチドをASOにコンジェゲートする方法も知られている。アルギニンを多く含む膜透過ペプチドを用いると大脳および小脳へASOを送達することができる。しかしアルギニンを多く含む膜透過ペプチドを用いた方法は血液脳関門への選択性が乏しく様々な臓器への核酸医薬の移行性を高める。副作用としては行動異常、体重減少、腎障害といった副作用が報告されている。脂質ナノ粒子（lipid nanoparticle、LNP）にトランスフェリン受容体に対するモノクローナル抗体を結合させ受容体介在性エンドサイトーシスの機序でASOを中枢神経に送達するという報告もある。
siRNAではペプチドを用いて神経細胞に送達させたという報告がある。またインスリン受容体やトランスフェリン受容体など、脳血管内皮細胞に発現している受容体に対するモノクローナル抗体をリポソームに結合させ、siRNAを内包してデリバリーさせる方法が報告されている。またsiRNAに狂犬病ウイルス外殻の一部の糖蛋白配列（rabies virus glycopretein、RVG）を結合させる方法が報告されている。RVGはアセチルコリン受容体に対するリガンド配列となっており、アセチルコリン受容体は脳血管内皮細胞および神経細胞に発現していることから、静脈内投与により神経細胞に特異的にデリバリーさせることが可能とされる。RVGをsiRNAに静電的に直接結合させる方法やエクソソームにRVGを発現させ、siRNAを内包させる方法などが報告されている。最大の問題はRVGの合成が容易でなく、医薬品化する際の精製は困難であると考えられている点である。グルコース修飾高分子ミセルといったナノマシンもASOやsiRNAのデリバリー方法となる可能性もある。
核酸自体を修飾するのではなく血液脳関門のタイトジャンクションを制御することでASOをはじめとした高分子医薬品を送達する方法も考案されている。代表例が収束超音波法（high-intensity focused ultrasound、HIFUまたはFocused ultrasound、FUS）である。収束超音波法は外科的処理を必要とせず一過性にタイトジャンクションに作用して送達される。しかし収束超音波法は無菌性の炎症を誘発すると報告されている。トリセルラータイトジャンクションに存在するangulin-1に結合するウェルシュ菌のイオタ毒素由来のリコンビナント蛋白質angubindin-1を利用してASOを中枢神経系へ送達したという報告もある。
また脳血管内皮細胞自体を標的としたデリバリーも選択肢の一つとなる。脳梗塞や多発性硬化症といった脳血管内皮細胞が病変の場となる疾患だけでなく、アルツハイマー病などの神経変性疾患においても脳血管内皮細胞が病変の一端を担っているという報告がなされている。脳血管内皮細胞に対する標的遺伝子の発現抑制の方法としては、siRNAを大量の輸液とともに静脈内投与することで圧力をかけて投与する方法（ハイドロダイナミクス法）やHDLをベクターとしてコレステロール結合siRNAを静脈内投与する方法が報告されている。血液脳関門と同様に血液脳脊髄液関門（blood-cerebrospinal fulid barrier、BCSFB）を構成する脳脈絡叢についても中枢神経疾患の病態への関与が指摘されており、ASOを静脈内投与することによって脳脈絡叢における有効な標的遺伝子発現抑制が報告されている。
皮下投与
皮下投与は血漿濃度の上昇は筋肉注射よりも遅い。緩徐な効果発現を特徴とする投与方法である。油性や懸濁性の薬物が投与可能である。短所としては少量の薬物投与しかできない点があげられる。核酸医薬を皮下投与する方法も報告されている。肝細胞表面上のアシアロ糖蛋白のリガンドとしてN-アセチルガラクトサミンが知られている。N-アセチルガラクトサミンを化学修飾siRNAもしくはASOリンカーを介して結合させたものが開発されている。最大の利点は皮下投与が可能と成る点であり、静脈内投与による方法と比較して単回投与での有効性は劣るものの、複数回投与が容易であることから、家族性アミロイドポリニューロパチーのように核酸医薬を長期間投与する必要がある疾患に対しては有利と考えられている。家族性アミロイドポリニューロパチーは神経疾患であるが核酸医薬が作用しているのが肝臓であり中枢神経ではないことに注意が必要である。
脳室内投与
脳室内投与は血液脳関門を考慮する必要のない投与法であり、高い有効性を保って核酸医薬を神経細胞へデリバリーできる有力な方法であるが、最大の問題点は侵襲性が高いことである。siRNAとASOのいずれも数種の報告がなされている。ASOは静脈内投与と同様に核酸間リン酸結合のホスホロチオエート化された核酸を用いることが一般的であるため、ドラッグデリバリーシステムを考慮せず、そのまま投与されることがほとんどである。一方siRNAについては、そのまま脳室内投与した報告もあるが、より高い効果を得るために各種化学修飾を加えることやDDS素子を結合させる方法が報告されている。また通常二本鎖であるsiRNAを一本鎖にしたsiRNA(single-stranded siRNA、ss-siRNA)も報告されており、その脳室内投与でハンチントン病のモデルマウスを治療した報告がなされている。
髄腔内投与
髄腔内投与も血液脳関門を考慮する必要のない方法である。脳室内投与よりも侵襲性が低いが処置が簡便ではない。ASOは一般的に単独投与では血液脳関門を通過しにくいことから髄腔内投与で臨床試験が行われている。化学修飾をしたアンチセンスオリゴヌクレオチドを髄腔内投与すると脊髄の神経細胞とグリア細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドは取り込まれた。髄腔内投与の代表例が脊髄性筋萎縮症の治療薬であるヌシネルセンである。脳室内投与でsiRNAとASOのいずれも神経細胞に送達されるため髄腔内投与でも同様に分布すると考えられる。
経鼻投与
経鼻投与は最も侵襲性の低い方法で、脳室内投与同様に血液脳関門を無視することのできる方法である。簡便であることも利点であるが、鼻粘膜からの吸収率がとても悪いため、それを向上させる各種工夫が必要な点と、局所濃度が上がっても脳内全般に行き渡らない点が問題となる。化学修飾したsiRNA自体を投与する方法やデンドリマーをキャリアとする方法が報告されている。いずれも上記の問題点を解決する必要があるが、頻回投与などで解決できる部分もあると考えられ、今後の進展が期待される。
核酸医薬と免疫系
核酸医薬は脂質のコンジェゲートや微粒子キャリアを用いることが多いためウイルスに対する免疫系が関与することが多い。ウイルスに関与する免疫系は自然免疫系と適応免疫系の両者がある。自然免疫系の活性化によって適応免疫系が発動できる状況が準備され、適応免疫系の機能発現の一部は感染細胞や生体に不都合な分子を自然免疫系である貪食細胞に取り込ませることによってなされる。
DNA/RNAヘテロ2本鎖核酸
東京医科歯科大学の仁科、横田らは核酸医薬のデリバリーとしてビタミンE（α-tocopherol、Toc）に注目した。彼らはTocをアミダイト化しsiRNAの5’末端に結合させたToc-siRNAを合成して、肝臓をターゲットとした生体内でのTocの生理学的輸送動態を用いたsiRNAのデリバリーを試みた。マウスに静脈注射し肝臓での標的mRNAの発現量を検討した。従来のコレステロール結合siRNAと比較して投与量を1/10に減らすことに成功した。次に彼らはTocをギャップマー型ASO（一本鎖DNAの両端をLNAで置換したASO）へ応用することを考えた。しかし脂質をはじめとした各種分子をASOに直接結合するとASOの有効性が減弱することが知られていた。そのためASOに対して相補となる両端を2'-OMeで化学修飾したRNA（complementary RNA、cRNA）を合成し、ASOとアニーリングすることで日本発の新規核酸医薬となるDNA/RNAヘテロ2本鎖核酸(DNA/RNA heteroduplex oligonucleotide、HDO)を開発した。ASOではなくcRNAの5’末端にTocを結合させるToc-HDOを合成することでASOに間接的にTocが結合しASOの有効性に対して干渉が少ないと考えられた。実際にToc-HDOはASOと比較して20倍以上の有効性を示した。LNAを用いたASOは肝障害を示すことが報告されていたがToc-HDOではASOよりも少ない投与量で同等の効果を生じることから投与量削減に伴う肝障害の改善が示唆された。またToc-HDO投与後のインターフェロン値の上昇は認められなかった。HDOはcRNAが核内でRNase Hによって切断され、DNA鎖がASOとなってmRNAと結合し同様にRNase HによってmRNAが切断されることが想定されたが、cRNAが細胞質でDNA鎖と分離されること、最終的にRNaseで切断されるが詳細なメカニズムは不明である。
経口投与可能な核酸医薬
消化管から吸収されないのが高分子医薬品の特徴のひとつである。大阪大谷大学の村上正裕は東京医科歯科大学の横田隆徳との共同研究でビタミンE結合siRNAを脂肪酸などから構成される脂質ナノ粒子に組み入れることで世界初の腸管投与可能な核酸医薬を開発した。いわゆる坐薬である。この方法は既存の大腸デリバリー技術と組み合わせることで経口投与可能な核酸医薬を開発可能にする可能性がある。脂肪酸は吸収促進薬としても知られているリノール酸を用いた。