横浜高速鉄道みなとみらい線
東急東横線との直通運転
元町・中華街行きの始発列車が横浜発である以外は全列車が東急東横線と相互直通運転を実施しており、本路線と東横線は列車運行面では事実上一つの路線として運行されている。また、運転業務は東急電鉄（東急）に委託しており、横浜駅で乗務員交代は行わず東急の乗務員が本路線内も引き続き乗務する。また、駅業務に関しても東急の子会社である東急レールウェイサービスが担当していたが、2012年4月より東急との共同使用駅であり、東急が管轄している横浜駅を除き、自社社員による業務に切り替えている。
混雑対策として、本路線沿線で花火大会などのイベント開催により一時的な多客時輸送を行う場合、混雑のピークが予想される時間帯に限り本路線内では全列車各駅停車とする臨時ダイヤを組む。その場合は事前に駅構内ポスターや電光掲示板、東急および横浜高速の公式ウェブサイト上で告知されるほか、臨時列車も運転されることもある。
東京メトロ副都心線との直通運転
2013年（平成25年）3月16日に乗り入れ先である東急東横線が東京メトロ副都心線との相互直通運転を開始し、本路線も東横線を経由して副都心線と相互直通運転を実施している。既に、副都心線は2008年6月14日の開業時から東武東上線、西武有楽町線・西武池袋線・西武狭山線（臨時列車のみ）と相互直通運転を行っており、東横線と副都心線の相互直通運転や2017年3月25日からは西武秩父線との直通運転も開始された。これにより、副都心線・東横線を介して本路線までが一本で結ばれ、本路線を含めた鉄道5事業者（横浜高速・東急・東京メトロ・東武・西武）による相互直通運転が行われるようになった。
これに合わせ、東横線および本路線の速達列車（特急・通勤特急・急行）は急行の一部列車をのぞいて8両編成から10両編成に増強し、本路線の速達列車停車駅においても東横線と同様に10両編成の列車が停車できるようにホーム延長工事が実施された（速達列車が停車しない新高島駅についても非常時に備えて延伸工事を施工しているが、通常時は柵で封鎖される）。なお、このホーム延伸を考慮した形でトンネルは建設されている。
一方、各駅停車については副都心線直通運転開始後も全列車が8両編成での運転となる。東京メトロ側では副都心線開業までに東京メトロ7000系の一部編成を10両編成から8両編成にした上で、主に副都心線や乗り入れ先の東上線や西武線内の各駅停車（西武線では急行系列車としても使用）として使用されている。これは、東急東横線・みなとみらい線内においても各駅停車として運用することに備えたものである。
みなとみらい号
クリスマスやゴールデンウィークなどにおいて、臨時列車として埼玉高速鉄道線浦和美園駅（東京メトロ南北線経由）・都営三田線高島平駅・東京メトロ日比谷線北千住駅から東急線を経由して元町・中華街駅まで「みなとみらい号」が運行されていた。みなとみらい線内では運転開始当初は急行として運転していたが、2007年（平成19年）4月運転分より各駅に停車するようになった。
2004年（平成16年）の設定当初は「横浜みらい号」の名称で、東急1000系を使用し、北千住駅 - 元町・中華街駅間を1往復運転した。この際、日比谷線内は急行運転・東横線内は通勤特急と同じ停車駅で運転した。2回目以降の運転時から現在の名称である「みなとみらい号」に変更し、全区間急行として運転された。その後、2004年（平成16年）の年末からは埼玉高速鉄道線（南北線経由）および都営三田線から東急目黒線・東横線を経由したみなとみらい号も運行されるようになった。2006年（平成18年）秋から目黒線内でも急行が設定されたため、同線内も急行運転を行うようになった。
女性専用車
乗り入れ先である東急東横線・東京メトロ副都心線・西武池袋線・東武東上線と合わせ、平日始発から9時30分まで上下線とも全列車の1号車（池袋方先頭車）が女性専用車となる。午前9時30分になった時点で、女性専用車の運用を一斉に終了する。
人身事故などの輸送障害発生によりダイヤが乱れた際は、女性専用車の運用を中止することがある。
なお、小学6年生までの児童や身体が不自由な客、およびその介助者については、男女問わず女性専用車への乗車が認められている。
女性専用車の変遷
みなとみらい線の女性専用車は、2005年（平成17年）7月25日に東横線と同時に初めて導入された。
対象列車は平日の特急・通勤特急・急行であり、首都圏では初となる終日運用であった。この当時は、現在とは反対側の元町・中華街方先頭車である8号車に導入されたが、元町・中華街駅の元町口の最寄り車両が8号車であり、さらに東横線菊名駅では元町・中華街寄りの一箇所しか階段がなく、ここに最も近い8号車が女性専用となったことで危険な駆け込み乗車や乗り遅れなどの問題が多発。列車遅延の原因にもなった上、男性客を中心に東急に対する抗議が殺到した（いわゆる菊名問題）。
これを受け、翌2006年（平成18年）7月18日からは横浜方から数えて5両目である5号車に変更したほか、昼間や夕方以降の渋谷方面行において女性専用車の利用率が低いとして終日設定を取り止め、平日の特急・通勤特急・急行のうち、始発から10時までの上下線と17時以降に東横線渋谷駅を発車する元町・中華街方面行のみの実施となった経緯がある。2013年（平成25年）3月15日までは夕方にも女性専用車の運用を実施する列車が存在していたため、年末や毎年8月1日に行われる神奈川新聞花火大会をはじめとする大規模イベント開催に伴う一時的な多客輸送を行う場合は、女性専用車としての運用を解除していた。
そして、2013年3月16日に新たに相互直通運転を開始した副都心線・西武線・東武東上線と実施内容の統一を図るため、相互直通運転開始後初めての平日となった3月18日からは、直通先に合わせて各駅停車を含めた全列車に対象列車を拡大し、横浜方先頭車である1号車に変更した。ただし、設定時間帯については平日始発から9時30分までに縮小し、それまでの夕方以降の設定は廃止となり現在に至る。
当初の計画
建設当時の仮称駅名は、横浜側から順に「横浜駅」（横浜地下駅とも呼ばれた）・「高島駅」・「みなとみらい中央駅」・「北仲駅」・「県庁前駅」・「元町駅」だった。また、元々高島駅（現新高島駅）は計画されていなかったが、東横線高島町駅廃止の代償なども考え、後に都市計画が決定したことにより追加された駅である。
1985年（昭和60年）の運輸政策審議会答申第7号では、東神奈川駅で国鉄横浜線と直通する計画で、元町・本牧経由で国鉄根岸駅に至る予定であった。横浜駅は横浜駅東口に設ける予定であったが、国鉄分割民営化や国鉄の財政問題もあって中止となった。その後、横浜市は東急電鉄・京浜急行電鉄・相模鉄道・横浜市交通局などと交渉を重ね、横浜駅ホームの拡幅が困難であったり、横浜駅以南の輸送効率の改善などの課題を抱えていた東急電鉄が1987年（昭和62年）に申し入れを受けた。同年6月11日に神奈川新聞の一面でスクープとして報道され、東急東横線との直通へと計画が変更された。この計画変更によって必然となる東横線の横浜駅以南の廃止は、終着駅として栄えてきた東横線桜木町駅廃止に直結するため、桜木町・野毛町地区住民からの猛反発を招き、最初の地元説明会は横浜市当局への「糾弾の場」と化してしまったという。東急桜木町駅廃止に加え、JR桜木町駅駅舎の改修に伴う移設・道路整備によるものも含め、野毛町地区への補償として桜木町駅と野毛地区を結ぶ地下道「野毛ちかみち」・桜木町駅前歩道橋が整備された。また地域振興策としては、野毛大道芸の実施、野毛本通りのモール化、横浜にぎわい座の開設などが行われた。
前述した神奈川新聞のスクープ記事は1995年（平成7年）の開業を目指すとされ、工事着手当初は1999年（平成11年）に開業すると工事中の看板に書かれていた。しかし横浜駅の地上部を通るJRとの調整や、線路が過密であるため工事用地が狭小であること、終電から始発のわずかな間でしか施工できない箇所があること、横浜市による横浜駅きた通路・南通路の建設計画もあいまって、横浜駅の地下化工事が難航したため、開業が大幅に遅れることとなる。2002年（平成14年）ごろに一度、横浜地下駅の完成を待たずに、先に工事が進んでいたみなとみらい中央 - 元町（駅名はいずれも仮称）間での暫定部分開業が検討されたほか、新高島駅付近に車両搬入専用の施設（同様の例として都営大江戸線がある）や電車区を設けるとの話が浮上した。しかし試算では年間で数億円の赤字が発生し、10億円以上の追加費用がかかることがわかり、また車両の搬入方法や検査設備の確保、独自車両か東急からの借用かなどの問題もあり立ち消えになった。
延伸構想
元町・中華街駅から横浜環状鉄道として本牧・根岸駅方面への延長構想があるが、現時点では計画が凍結状態にある。