ゲノム編集
ゲノム編集（ゲノムへんしゅう、英: genome editing）とは、部位特異的ヌクレアーゼを利用して、思い通りに標的遺伝子を改変する技術である。部位特異的ヌクレアーゼとしては、2005年以降に開発・発見された、ZFN（ズィーエフエヌ、または、ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、TALEN（タレン）、CRISPR/Cas9（クリスパー・キャスナイン）を中心としている。従来の遺伝子工学、遺伝子治療と比較して、非常に応用範囲が広い。
概要
ゲノム編集のための部位特異的ヌクレアーゼとして、ZFN (Zinc-Finger Nuclease)、TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease)、CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 (Crispr ASsociated protein 9)が挙げられる。
これらの部位特異的ヌクレアーゼに共通する特徴は、特定の配列を狙ってDNAの切断を行い、これにより意図的なDNAの改変を可能とすることにある。DNA切断の後は、細胞の本来の機能によりDNA修復も起こる。この際、特定の配列を断片として与えると、切断部に挿入するノックインが可能となる。ノックインをさせずに修復を行ったとしても、配列が変わらない限り、DNA切断が何度でも繰り返されるため、変異が発生する。これを利用して、特定の遺伝子の機能を止めるノックアウトにも活用される。
部位特異的ヌクレアーゼの中で、特に高効率とされるのはCRISPR/Cas9であり、2015年時点でゲノム編集に関する研究の主流である。しかし一方、高効率であることの代償として、CRISPR/Cas9では標的部位ではない場所をも改変してしまうオフターゲットと呼ばれる現象が発生しやすい。このオフターゲットが生じると、がん等の疾患を発症する恐れがあるため、オフターゲットを改善する研究も進む。
ゲノム編集は『ネイチャー・メソッズ』誌において2011年のメソッズ・オブ・ザ・イヤーに輝いた。2015年にはCRISPR/Cas9の研究がノーベル賞候補と言われていた。
歴史
遺伝子工学は、1972年にポール・バーグらが細菌に感染するウイルスのDNAを、サルに感染するウイルスのDNAに挿入することに成功したことに始まる。翌1973年には、ハーバート・ボイヤーとスタンリー・ノルマン・コーエンがこの技術を生物種にも適用する。1970年代後半には、遺伝子工学によるインスリンの量産が成される。しかし、これら従来の遺伝子工学には大きな課題が2つあった。特定の遺伝子を操作する正確性の欠如と、遺伝子の配列や生物種に依らない適用という応用性の欠如である。
1990年代になり、DNAを特定の位置で切断できるタンパク質である制限酵素が発展するに至い、正確性の問題は解決された。応用性の欠如の方も、2005年以降の各種のゲノム編集技術の登場により解決される。
2012年8月、既知の真核生物の獲得免疫に関わるCRISPRが、ゲノム編集にも活用しうることをエマニュエル・シャルパンティエとジェニファー・ダウドナらが見出す。彼らは、レンサ球菌のRNAを、CRIPRのガイドRNAとして活用することにも成功する。これにより、CRISPR/Cas9による高効率のゲノム編集が可能となる。
2014年、中華人民共和国においてCRISPR/Cas9による世界初の遺伝子改変サルが誕生する。翌2015年、同じく中国でCRISPR/Cas9を用いた世界初のヒト受精卵の遺伝子操作が行われ、国際的に物議を醸す。この実験を主導したJunjiu Huang（黄軍就）らが使ったのは、不妊治療目的の体外受精において、2つの精子が受精した異常な受精卵で、元々廃棄されるものであった。Huangらの報告では、狙った遺伝子を思い通りに書きかえられたのは86個中4個のみであり、オフターゲットが起きた受精卵もあった。そのため、技術的な改善の必要性も記している。HuangはNature誌により2015年の10人に選ばれる。この研究を契機に、ヒト受精卵に対するゲノム編集の倫理が新たな課題となる。
2016年、中国政府は第13次5カ年計画でゲノム編集を国家戦略と位置付け、同年2例目のヒト受精卵のゲノム編集も中国で行われる。また10月には、世界初のゲノム編集の臨床試験、翌2017年3月には、世界初の“正常な”ヒト受精卵へのゲノム編集も中国で行われる。2018年時点で中国では86人の遺伝子がCRISPR/Cas9によって改変される。同年11月26日には南方科技大学の賀建奎副教授が、ゲノム編集した双子の女児「かんかんとかんかん」の誕生を発表する。ゲノム編集は後天性免疫不全症候群（AIDS）に耐性を持たせるためだと主張されたが、世界的な波紋を呼んだ。
CRISPR/Cas9
原核生物において発見された獲得免疫機構をCRISPR/Casシステムという。このシステムのうち、Cas9と呼ばれるヌクレアーゼと、標的となるDNA配列へ導くガイドRNAとを複合化し、これをDNAの改変に応用した技術をCRISPR/Cas9という。
ZNF、TALENが各々一つのタンパク質であるのに対して、CRISPR/Cas9では、ガイドRNAとCas9という2つの別々の分子で構成されるのが特徴的である。DNAの標的部位と相補的な配列をガイドRNAに用意するので、ガイドRNAは標的部位に特異的に結合できる。そうするとガイドRNAとDNAを覆うようにCas9タンパク質が結合して、DNAを切断する。Cas9自体は使い回しができて、狙いに応じてガイドRNAだけを作成すれば済む。
CRISPR/Cas9は、他のヌクレアーゼの中で部位特異性の低さと、それによるオフターゲットが課題である。オフターゲットの多寡は、DNA修復の機構が非相同末端結合 (NHEJ) か、相同組換え修復 (Homology Directed Repair: HDR) であるかによっても異なる。HDRの方がNHEJよりもオフターゲットとして安全だが、手間がかかるうえ、互いに使用条件が限られる。それを克服するために、ニッカーゼ改変型Casを用いて、標的ごとに2種類のガイドRNAを与えるという手法が開発された。また、NHEJとHDRの競合改善の手段として、NHEJの抑制剤となるSCR7が、HDRの促進剤としてL755,507があり、逆のNHEJの促進剤としてはAzidothymidine (AZT) が挙げられる。
ゲノム編集の対象とする核内のDNAにアクセスするために、Cas9とガイドRNAを細胞内、更に核内へと導入しなければならない。そのための導入媒体、つまりベクターとしてプラスミドやウイルスが使用される。プラスミドや、ベクターを介さず直接的にタンパク質の形で導入する方法としては、エレクトロポレーション法がある。2015年現在の技術水準では、どの導入手段が効率が高いかは一概には言えないことが多く、実験的に確認することが多い。また、プラスミドについては、非営利のリポジトリが存在する。
ガイドRNAの設計ツール、またライブラリーと呼ばれる製品が各社から販売されている。国内では、ライフサイエンス統合データベースセンター (DBCLS) がCRISPRdirectというガイドRNAの設計ツールを提供している。
正しく配列が導入され、余分な挿入や欠失がないことを確認するためのプロトコルが提案され、また、検証用の製品が販売されている。
TALEN
TALENは日本語で転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼとも呼ばれる。制限酵素であるFokIをDNA切断ドメインとして、植物病原細菌キサントモナス属 (Xanthomonas) から分泌されるTALEタンパク質のDNA結合ドメインを融合させた人工酵素である。
TALEタンパク質から成るDNA結合ドメインは34個程度のアミノ酸の繰返し構造をとっている。この繰返しの単位をモジュールとよぶ。その中で、アミノ酸第12位と13位が可変となっており、標的配列と結合する部分で「反復可変二残基」(RVD) と呼ばれる。TALENは原理の説明図の中に示したように、L TALENとR TALENのペアとして、標的DNAの反対鎖にそれぞれ結合する必要がある。つまり、FokIが切断活性を示すためには、TALENが適切な距離を維持して二量体を形成する必要がある。TALENにおけるミスマッチ寛容やオフターゲット活性はほとんど報告されておらず、高い特異性が特徴である。
Golden Gate法では、10モジュールのアセンブリを用いてTALENプラスミドを構築する。これに改良を加えて、高速かつ簡便に高活性なTALENを作成する手法が開発され、Platinum TALENと名付けられた。主な改良点は、作成したプラスミドの活性評価が哺乳動物の培養細胞で行えること、モジュールのアセンブリにおける失敗を減じるため6または4モジュールのアセンブリを用いること、切断活性を向上させたこと、活性が向上したにも関わらず細胞毒性を出さない工夫がなされたことである。
広島大学では、TALENやCRISPR/Cas9により外来遺伝子を挿入する手法として相同組換えを用いる際に、相同組換え活性の低い細胞種や生物種では、挿入効率が低いという問題点があったところを、相同組換えに依存しない遺伝子挿入法（マイクロホモロジー媒介性末端結合：MMEJ）を用いる手法を開発し、PITChシステムと名付け、プロトコルとして発表した。
なお、TALENはCellectis Groupによる登録商標とのこと。
ZFN
ZFNはジンクフィンガードメインとDNA切断ドメインから成る人工制限酵素である。ジンクフィンガードメインは任意のDNA塩基配列を認識するように改変可能で、これによってジンクフィンガーヌクレアーゼが複雑なゲノム中の単一の配列を標的とすることが可能となる。