二次構造
実験的決定
生体高分子の大まかな二次構造含量（例えば、「このタンパク質は40%のαヘリックスと20%のβシートを含む」）は分光法により推定することができる。タンパク質に対しては、遠紫外（170–250 nm）円偏光二色性スペクトル測定が一般的な手法である。208および222 nmにおける目立った二重極小はαヘリックス構造を示すのに対して、204 nmまたは217 nmにおける単一極小はランダムコイルまたはβシート構造をそれぞれ反映している。水素結合によるアミド基の結合振動における違いを検出する手法である赤外分光法も用いられるがあまり一般的ではない。二次構造含量はNMRスペクトルの化学シフトを使って正確に推定することができる。
予測
アミノ酸配列のみからタンパク質三次構造を予測することは非常に困難な問題であるが、より単純な二次構造の定義を用いることはより扱いやすい。
初期の二次構造予測の手法では3つの主要な状態、ヘリックス、シート、またはランダムコイルを予測することしかできなかった。これらの手法は個々のアミノ酸のヘリックスまたはシートを形成する傾向に基づいており、二次構造要素形成の自由エネルギーを推定するための規則を組み合わせられることもあった。このような手法が残基が3つの状態（ヘリックス/シート/コイル）のどれを取るかの予測精度は概して~60%であった。アミノ酸配列から二次構造を予測するために最初に広く用いられた手法はシュー–ファスマン法であった。
精度の著しい上昇（~80%近くまで）は多重配列アラインメントを利用することによって成された。進化を通じてある位置（とその周辺、典型的には前後に~7残基）に存在するアミノ酸の完全な分布を知ることにより、その位置周辺の構造的傾向についてはるかに良い予想を立てることが可能になった。
例えば、あるタンパク質がある位置にグリシンを持つとすると、それ自体はその位置にランダムコイルが存在することを示唆する。しかし、多重配列アラインメントにより、数十億年近くの進化を経ている相同タンパク質の95%においてヘリックスに多く含まれるアミノ酸がその位置（と近傍）に存在することを明らかにするかもしれない。さらに、その位置と近傍における平均疎水性を調べることによって、同じアラインメントがαヘリックスと一致した残基の溶媒接触可能表面積のパターンをも示唆するかもしれない。これらの事実は元のタンパク質のグリシンがランダムコイルではなくαヘリックス構造に含まれることを示唆する。ニューラルネットワーク、隠れマルコフモデル、サポートベクターマシンを含む数種類の手法が、利用可能な全データを組み合わせ上記の3種の二次構造を予測するために用いられている。現代的な予測手法は、全ての位置における予測に対する信頼性スコアも提供する。
二次構造予測手法は継続的に基準に従って評価された（例: EVA）。これらの試験に基づいた最も正確な手法は、PSIPRED、SAM、PORTER、PROF、SABLEであった。改善のための根本的な領域はβ鎖の予測と考えられている。β鎖と確信を持って予測される残基についての精度は高いが、これらの手法は一部のβ鎖領域を見落としがちである（偽陰性）。PDB構造に対して二次構造クラス（ヘリックス/ストランド/コイル）を割り当てる標準手法（DSSPで割り当てられ、この二次構造に対する予測精度が評価される）の特異性のため、全体の予測精度には~90%の上限がありそうである。
最も単純なホモロジーモデリングの場合を除いて、正確な二次構造予測は三次構造の予測において鍵となる要素である。例えば、明確に予測された6つの二次構造要素のパターンβαββαβはフェレドキシン折り畳み構造の特徴である。
応用
タンパク質および核酸二次構造のどちらも多重配列アラインメントに利用でき、単純な配列情報に加えて二次構造の情報を含めることでより正確にアラインすることできる。RNAでは、塩基対が配列よりもかなり高度に保存されているためあまり役に立たない。一次構造がアラインできないほどに異なるタンパク質間の関係が二次構造の比較によって見出されることがある。
天然タンパク質において、αヘリックスはβストランドよりも安定で、変異に対して頑強で、設計可能であることが示されてきたことから、全てがα-ヘリックスによって構成されている機能性タンパク質の設計はヘリックスとストランドの両方を持つタンパク質の設計よりも容易であると思われており、最近実験的に確かめられている。
ペプチド結合の構造
1930-40年代、ライナス・ポーリングとロバート・コリーはポリペプチド鎖内においてアミノ酸やペプチド結合がどのような形状をしているのかを調べるためX線構造解析を行い、右図のような平面構造を取っていることを突き止めた。ペプチドのC-N結合はCα-N結合より0.13 Å短く、C=O結合がアルデヒドやケトンのC=Oよりも0.02 Å短い事から次のように共鳴していると考えられている。
ペプチド結合の共鳴エネルギーは平面のとき最大値（約85 kJ/mol）をとり、平面から90° ねじれると共鳴エネルギーはゼロとなることからも平面構造が非常に強いことが分かる。ペプチド結合は普通トランス型をとり、隣接するCα同士は点対称の関係になる。シス型をとった場合、立体障害のためトランス型より約8 kJ/molだけ不安定になる。しかし、プロリンの手前のペプチドでは少しだけ安定化する。このためプロリンの手前のペプチドの約10%はシス型をとっている。
ポリペプチド主鎖の二面角
ポリペプチド鎖は平面構造のペプチド結合が繋がっている。したがって、ポリペプチドの構造はそのペプチド結合面同士の二面角（ねじれ角）で表すことができ、Cα-N結合角はφ、Cα-C結合角はψで、それぞれの角度はCαから見て時計回りに回ると値が大きくなると決めている。二面角とφ、そしてψは立体障害のために様々な制約を受ける。
ヘリックス構造
ポリペプチド鎖の各Cα炭素が同じようにねじれるとヘリックス（螺旋）構造をとる。ヘリックス構造はφ、ψではなく、1回転あたりの残基数（n：右巻きは正、左巻きは負）、1回転で軸方向に進む距離（ピッチ、p）で表される。p=0のとき閉環となり、p=2のときは平面リボン構造をとる。
αヘリックス
ポリペプチドのヘリックス構造の中で二面角と水素結合形成の双方を満足する構造はαヘリックスだけで、L-アミノ酸で作られるαヘリックスはφ=−57°、ψ=−47°、n=3.6、p=5.4 Åである。αヘリックスではすべてのN-H基が4残基離れたアミノ酸のC=O基へ水素結合をしている。このときのN…O間の距離は2.8 Åで、水素結合には適当であり、会合エネルギーも最大となる。右巻き構造では側鎖は外側を向いており主鎖にとっても相互にも障害にならない。しかし左巻き構造では側鎖が主鎖に近すぎるため作られることは少ない。
その他のヘリックス構造
2.2₇リボン、3₁₀ヘリックスのようなnₘという表示のnはヘリックス1回転あたりのアミノ酸残基数、mは水素結合で閉環した構造の水素原子を含む構成原子数を表している。αヘリックスをこの表記で書くと3.6₁₃ヘリックスとなる。
右巻き3₁₀ヘリックスは、p=6.0 Åで、二面角はラマチャンドランダイアグラムでは禁制領域に入り、側鎖にも立体障害がある。このため、3₁₀ヘリックスはあまり見られることはなく、普通はαヘリックスの終端に1回転だけできる。また、2.2₇リボンは二面角が完全に禁制領域にあるためタンパク質中には存在しない。πヘリックス（4.4₁₆ヘリックス）も二面角が禁制領域にあるため、ヘリックスの途中にたまに見られる程度である。
βシート構造
βシートは、φとψが同じ角度で繰り返し、水素結合が2本のポリペプチド鎖の間にある構造である。βシートには平行βシートと逆平行βシートがある。水素結合が適切にできるためには完全な平面構造（φ=180°=ψ）ではなく襞（プリーツ）状をとる。襞の周期は7.0Åである。
非繰り返し構造
球状のタンパク質においてヘリックスやシート構造は全体の半分ほどで、それ以外の部分はループと呼ばれるひも状の状態をとる。球状タンパクでは二次構造の間にペプチド鎖が急にターンする場所があり、この部分はβターン（逆ターン）と呼ばれる。βターンにはI型とII型が存在し、両方ともアミノ酸4残基で構成されている。βターンは3残基離れたアミノ酸と水素結合して安定化するが、構造がずれて水素結合できないこともある。また、II型βターンでは2番目のアミノ酸残基の酸素原子が3番目のアミノ酸残基のCβと衝突するため、ほとんどの3番目のアミノ酸はグリシンである。