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de clorhidrato ó de sulfato de amoníaco y de glucosa, han formado materias albuminoideas. Al contrario el lemna no forma estas sustancias en las mezclas siguientes: esparraguina y azúcar de caña, glicocola y glucosa. ¿Es preciso ver en estas discordancias el resultado de la influencia individual? Nuevas investigaciones demostrarán lo que hay en esta cuestión.

Entre tanto la concordancia de los resultados obtenidos por experimentadores tan hábiles como los Sres. Godlewski y Laurent nos autoriza á considerar las radiaciones como la fuente principal de la energía necesaria para la formación de las materias albuminoideas.

Los materiales necesarios para esta síntesis son, junto con el nitrato, las sales amoniacales. Estos resultados son una nueva confirmación del hecho ya conocido: la utilización directa de las sales amoniacales por las plantas.

§ 2.—Fijación del ázoe en el suelo de los bosques

La nutrición azoada de las plantas que cubren la superficie de los bosques es aun poco conocida; las investigaciones de Frank sobre la importancia de los mycorhizas han presentado la cuestión bajo un nuevo aspecto, pero son incompletas y merecen repetirse y ser proseguidas.

Cualquiera sea el mecanismo que preside á la fijación y á la nutrición del ázoe, se presenta una cuestión primordial, que acaba de recibir un comienzo de solución por un trabajo del Sr. Henry sobre el ázoe y la vegetación forestal.

El suelo de los bosques se empobrece por la sustracción de los productos. ¿Cómo puede explicarse la fertilidad indefinida de estas regiones?

Henry pasa revista á las pérdidas y á las ganancias de ázoe de un suelo forestal.

Por lo que respecta á las ganancias, distingue desde luego el transporte de ázoe realizado por la atmósfera y las aguas meteóricas, después el transporte debido á los materiales azoados encerrados en los despojos que se acumulan en el suelo, y concluye que estas ganancias son insuficientes para llenar el déficit anual producido por la recolección de las cosechas y causado por los fenómenos reductores que dependen, al estado gaseoso, una parte del ázoe del humus.

Es necesario pues encontrar un manantial de ázoe mas considerable.

Henry se ha propuesto investigar las transformaciones que las materias minerales ó orgánicas sufren en las hojas hasta el momento que se convierten en humus.
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Es interesante seguir las migraciones de los materiales azoados ante la cantidad y la variedad de organismos que vejetan en los tejidos muertos.

Con este objeto han sido expuestas al aire libre hojas de encina y de ojaranzo en cajas de zinc cuyo fondo estaba formado por una capa de tierra calcárea para la encina, y de gres por el ojaranzo. Al cabo de un año la cantidad de ázoe de estas hojas ha aumentado: para la encina ha pasado de 1 gr. 108 á 1 gr. 923; para el ojaranzo de 0 gr. 947 á 2 gr. 216 por 100. Siguiendo entonces las variaciones de la cantidad de ázoe durante su vida, y luego después de su muerte, se encuentran las cifras siguientes:

    Materias azoadas

    Hojas vivas
    Mayo
    25,9

    Junio
    14,6

    Julio
    14,0

    Agosto
    9,9

    Septiembre
    7,0

    Octubre
    6,6

    Hojas muertas.
    Diciembre 1894.
    6,9

    1895.
    12,0

    1896.
    10,8

Se ve que la cantidad de ázoe disminuye regularmente durante la vida de las hojas hasta su caída, época en que presenta el mínimo; después, á partir de este momento la cantidad de ázoe aumenta poco á poco, traduciéndose al cabo de un año por un aumento de ázoe igual á la cantidad que existía en el momento de la caída.

El mecanismo de esta fijación de ázoe no está aún dilucidado, pero se puede pensar que las hojas constituyen un medio favorable al desarrollo de ciertas bacterias capaces de fijar el ázoe atmosféric.

Sin embargo, no es dudoso que la fijación de este gas se efectúa, además de la bacteria radicícola, por otros organismos microscópicos; pero pueden caber dudas sobre la naturaleza de los seres que realizan este fenómeno, y admitir que ciertas algas verdes sean capaces de realizar la síntesis de las materias azoadas.

Las experiencias de Kossowitch demuestran que la fijación del ázoe no se efectúa en los cultivos puros de algas; si se ha notado esta fijación en un cierto número de observaciones, esto es debido á la impureza de los cultivos, y principalmente á la presencia de bacterias.

Además, las observaciones de Vinogradsky tenderían á demostrar
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que el número de bacterias capaces de vejetar en un medio pobre en ázoe y de nutrirse del ázoe atmosférico, es relativamente restringido. Entre las especies estudiadas el Clostridium pasteurianum es la sola que posee esta propiedad de una manera bien demostrada.

§ 3. – Las bacterias de las leguminosas

Después del descubrimiento de la fijación del ázoe por las bacterias que evolucionan en los tubérculos radicales de las leguminosas, se ha tratado de elucidar el mecanismo de esta fijación y la manera como la planta hospitalaria utiliza las materias azoadas fabricadas por su huesped.

Las investigaciones emprendidas por Beyerinck y Laurent han demostrado que si es bastante fácil cultivar en estado de libertad las bacterias de las leguminosas, no se obtiene en estos cultivos la fijación de ázoe; si se manifiesta, es insignificante. El muy interesante trabajo que P. Mazé acaba de publicar bajo la dirección del Sr. Duclaux, explica los fracasos sufridos por sus antecesores y nos hace seguir paso á paso todas las fases de la nutrición azoada de las leguminosas (1).

Si las bacterias asimilan el ázoe en los tubérculos y lo fijan en el estado de libertad, esto se debe sin duda alguna, á que en este último caso no tienen á su disposición los materiales necesarios.

En efecto, ¿qué necesitan para manifestar su actividad? Desde luego una materia azoada, no al estado de ázoe ó de sales amoniacales, como sucede en las investigaciones negativas anteriores, sino bajo la forma con que las bacterias la consumen en los tubérculos, esto es, la legúmina. Por otra parte, la fijación del ázoe exige al mismo tiempo la destrucción de la materia hidrocarbonada; según Winogradsky y Duclaux esta materia suministrará el manantial de energía necesaria para la síntesis de los compuestos azoados: Mazé se inclina á la sacarosa. En fin, el oxígeno es indispensable para terminar la combustión del hidrato de carbono.

De conformidad con estas consideraciones, el autor compone un caldo de cultura obtenido con una infusión de guisantes blancos adicionado con un 2 por 100 de sacarosa, 1 por 100 de NaCl. y vestigios de carbonato de sosa. Este caldo, solidificado con la gelosa se coloca en vasos de fondo plano, provistos de tubos laterales que permiten el paso de una corriente de aire despojado de ázoe combinado.

Los cultivos, sembrados con las precauciones usuales, se mantienen

(1) P. Mazé: Les microbes des nodosités de Légumineuses: These de Doctorat, Sceaux, 1898.
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á una temperatura de 20° ó 25°. Al cabo de diez días la vejetación de las bacterias es espléndida y los bastoncillos están anegados en una mucosidad abundante y muy viscosa. El análisis ha manifestado un aumento de ázoe igual á los dos tercios del ázoe inicial.

Habiéndose llevado el cultivo hasta el momento en que toda vejetación parece haber desaparecido, puede suponerse que todo el azúcar ha sido consumido, y la relación del ázoe formado con el azúcar destruido, es igual á 0'013.

Los cultivos en el agua, en capas delgadas, con el caldo precedente han dado los mismos resultados, y la relación del azúcar destruido y del ázoe formado es de 100 por 1.

De esta manera se ven confirmadas las ideas emitidas por Duclaux, que la bacteria de las leguminosas es el sólo instrumento de la fijación del ázoe; el estado de simbiosis no le confiere propiedades nuevas, como se enseña en los tratados clásicos; la planta que la hospeda se limita á asegurar, por medio de una nutrición apropiada, las condiciones necesarias á su actividad.

Sin embargo se presenta una dificultad: ¿el abundante consumo de materias hidrocarbonadas, 100 gramos por cada gramo de ázoe fijado, no es un obstáculo para que el trabajo de síntesis, tal como se realiza en los cultivos, pueda cumplirse en la planta? Cuando las plantas fijan 100 gramos de ázoe, por ejemplo, es necesario que sea destruido al mismo tiempo un peso 100 veces mayor de materias hidrocarbonadas, unos 10 kilogramos.

Luego, Mazé sienta que para la remolacha, la relación que existe entre la cantidad de sacarosa y la cantidad de materias azoadas es la mitad de la que él ha encontrado; por consiguiente, en las leguminosas que tienen una superficie foliar mayor y una vejetación mas prolongada que la de la remolacha, el trabajo de la función clorofílica puede bastar suficientemente para alimentar, en hidratos de carbono, los tubérculos en donde se efectúa la síntesis de las materias azoadas.

Como lo hemos visto, las condiciones necesarias á la vejetación á las bacterias radicícolas en cultivo libre, con fijación de ázoe, son triples: se necesitan ázoe combinado, hidrato de carbono y oxígeno. ¿En qué proporciones estas sustancias favorecen más ó menos la actividad específica de las bacterias? Los cultivos comparados, realizados con soluciones á dosis variables de legumina y de sacarosa, muestran que para la sacarosa los límites están comprendidos entre 2 por 100 y 4 por 100, por el ázoe 7 y 15 miligramos por 50 centímetros cúbicos de líquido; además, el mejor rendimiento en ázoe fijado corresponde á la relación 1 por 200 entre el ázoe combinado y la sacarosa.
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Además, las bacterias radicícolas son esencialmente aerobias, consumen una cantidad considerable de oxígeno, y no se desarrollan en una atmósfera de ázoe puro. Si Laurent ha obtenido colonias en una corriente de ázoe, se debe á que el gas que empleó contenía vestigios de oxígeno.

El examen de los cultivos mas activos bajo el punto de vista de la fijación del ázoe, revela la presencia de una sustancia mucilaginosa muy viscosa que se difunde rápidamente y se disuelve por completo en una gran cantidad de agua. Cuando falta esta mucosidad no hay aumento de ázoe, y la proporción de este gas fijado será tanto mayor cuanto mas abundante sea dicha viscosidad. P. Mazé demuestra que no puede ser debida á una modificación alotrópica del azúcar; piensa que constituye un compuesto azoad, resultado de la combinación del ázoe libre con los productos de la despomposición de la sacarosa.

¿Qué papel representa esta sustancia viscosa? Notemos desde luego que existe también en los tubérculos, pero solamente cuando son muy jóvenes. En efecto, sus células contienen tubos refrigerentes irregulares abiertos, flexuosos, pasando de una célula á la otra, y formando un pseudo-micelio cuya naturaleza ha sido largo tiempo discutida. Beyerinck los consideraba como filamentos nucleares alterados; Prazmonski, habiendo visto salir cocobacilos de estos tubos, piensa que constituyen una forma transitoria del bacilo de las leguminosas; Prillieux vió en ellos estrías de mucosidad. Los cultivos realizados por Mazé en soluciones demasiado ricas en sacarosa, hacen aparecer tubos análogos que contienen cocobacilos; estos tubos, tratados por el agua pierden sus contornos, desaparecen y los bacilos quedan en libertad. El mismo hecho se observa en los tubérculos jóvenes, cuyos cortes, sumergidos en el agua no muestran nunca filamentos porque la sustancia que los forma está disuelta.

La comparación de lo que sucede en los tubérculos jóvenes y en los cultivos ricos en sacarosa, autoriza para pensar que el pseudo-micelio de los tubérculos está formado por mucosidad, cuya aparición marcha á la par con la fijación del ázoe.

Cuando las bacterias evolucionan en un tubérculo joven, secretan la sustancia viscosa característica de las vejetaciones vigorosas, y de este modo edifican estos tubos varicosos que llenan las células; pero tan pronto como los vasos están formados, el agua circula en mayor ó menor cantidad, la viscosidad se disuelve y es arrastrada. Esta alimentación azoad, que, inútil al bacilo, es utilizada por la planta hospitalaria, y explica de aumento rápido de la vejetación en las plantas que Hellriegel y Wilsarth han descrito al estado de inanición azoad. La
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materia viscosa azoada representaría entonces un producto de secreción inútil, ó mejor aun, nocivo á las bacterias, que, quitado á cada momento de su lugar de origen, se emplea en nutrir las plantas, mientras que las bacterias desembarazadas de su producto de secreción, vejetan con mayor actividad.

Falta explicar un hecho bien conocido de los agrónomos y de los botánicos. ¿Porque las nudosidades son mas numerosas y mas grandes en las raíces de las leguminosas que vejetan en las tierras pobres, y y raras en las tierras ricas en alimentos azoados, es decir en nitratos?

Mazé dilucida esta aparente contradicción de una manera muy ingeniosa, y explica al mismo tiempo la aparición de bacterias sobre las raíces.

Cuando se examina el sistema radical de las plantas que vejetan en soluciones fluidas á las cuales se añaden bacterias, se ve que los tubérculos radicales se desarrollan exclusivamente sobre las raíces formadas después de la introducción de los bacilos.

Además, estos últimos son extremadamente movibles á la temperatura de 25°; el movimiento de traslación rápida que poseen cesa por debajo de 15° y por encima de 30°. Según esto, Mazé ha pensado que las raíces jóvenes ejercen sobre las bacterias una atracción debida á un fenómeno quimiotáxico: dejarían exudar en la región de crecimiento, principalmente en aquella que está cubierta de pelos absorbentes, una sustancia que atraería á las bacterias; esta sustancia estaría constituida por hidratos de carbono. En efecto, si se hacen germinar granos en un medio esterilizado, y se examina el líquido de germinación en el cual las raíces están sumergidas, se encuentra que dicho líquido reduce las sales de cobre. De otra parte, las experiencias directas de quimiotactismo han demostrado que los hidratos de carbono atraen los microbios de las nudosidades.

Según estos hechos comparemos las leguminosas que crecen en los suelos ricos y en los suelos pobres.

En los suelos ricos, las leguminosas absorben los nitratos; éstos, distribuidos en los órganos verdes, en los que la asimilación de carbono es activa, se combinan á los hidratos de carbono que produce, y suministran compuestos cuaternarios; no se necesita mas para que las migraciones nutritivas las conduzcan á las raicillas de manera a atraer á las bacterias, y éstas no se fijan: entonces los tubérculos faltan.

Al contrario, en los suelos pobres, la ausencia de nitratos deja sin empleo inmediato los hidratos de carbono resultantes de la asimilación; pueden entonces difundirse por todo el cuerpo de la planta, sobre todo en las raíces, en donde son excretadas; ejercen entonces una atracción sobre las bacterias que se fijan en gran número.
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Estas consideraciones—muy ingeniosas sin duda—suscitan sin embargo alguna objeciones. No insistiremos sobre la dificultad de admitir, sin experiencia previa, que la movilidad de las bacterias sea comparable en el suelo á la que se observa en las bacterias en suspensión en una gota de agua, pues estas últimas están en plena vejetación, mientras que las bacterias del suelo, situadas en un medio falto de todos los elementos nutritivos necesarios á la vejetación, están en el estado de vida retardada, y por consiguiente inmóviles. Llamamos la atención sobre la excreción de los hidratos de carbono, que Mazé ha creído poner en evidencia. La expresión hidratos de carbono ha ido evidentemente mas lejos que su pensamiento, pues el experimento que hemos realizado sobre la arveja de Narbona no prueba mas que una cosa: que el agua de germinación contiene materias capaces de reducir las sales de cobre.

Luego, estas materias se componen de los productos de desorganización de las células de la cefia y de las gomas que impregnan la superficie pilifera. A menudo he observado en el trigo que los pelos están revestidos, aquí y allá, de una substancia que se colora con el rojo de ruthenio y que forma, á la superficie de la serie pilifera, exudaciones en forma de gotas; estas exudaciones se hinchan poco á poco y se disuelven en el agua. Si añadimos á estos productos las membranas desagregadas, tendremos allí un conjunto de materiales capaces de reducir, como se sabe, las sales de cobre. Luego, estos materiales existen sobre las raíces, cualquiera sea la naturaleza de los alimentos. Admitiendo, pues, que los hidratos de carbono son excretados por las raíces de los suelos privados de nitratos, y no lo son en los suelos que contienen estas sales, Mazé ha formulado una hipótesis insuficientemente justificada.

Por otra parte, el autor ha señalado un hecho que reduce á la nada su ingeniosa hipótesis sobre el quimiotaxismo de la región pilifera de las raicillas, puesto que anuncia que el agua de germinación, aquella en la cual se encuentran las sustancias que reducen las sales de cobre, parece repeler las bacterias de las nudosidades, á causa, sin duda, de su ligera acidez. Por consiguiente el quimiotactismo no puede ejercerse sino después de la completa neutralización de los materiales ácidos que la raíz segregá de una manera constante.

Después del estudio fisiológico que acabamos de resumir, y cuyo interés es tan considerable, Mazé ha creído deber tratar de la morfología de las bacterias radicícolas:

Sentimos no poder exponer en detalle esta parte del trabajo del autor, pues es necesario volver á tratarla y precisarla.
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II.—EL PIGMENTO DE LA CLOROFILA AISLADO ESACTIVO

¿LA CLOROFILA INERTE ES ACTIVA?

Esta cuestión, planteadas desde la publicación de las experiencias de Regnard, ha dado lugar á numerosas controversias, á las cuales el reciente trabajo de L. Kny acaba de dar carácter de actualidad, resolviéndola negativamente (1).

El autor investiga desde luego si—como lo han afirmado Boussingaud antes y mas recientemente Jochin—la clorofila extraída por los disolventes de la planta viva, es incapaz de descomponer el gas carbónico. Regnard ha comprobado este hecho.

Kny ha empleado el carmín de índigo, la nigrosina soluble al agua, probablemente semejante al azul bleu occupier de Regnard, y también el thioacarmín, habiéndose asegurado antes que estos reactivos eran incapaces de tomar un tinte azulado bajo la influencia de la luz sola. Los ensayos se verificaron con la solución de clorofila, y los resultados fueron negativos. El autor ha verificado sus experiencias comparativas con órganos verdes vivos y con órganos matados por la desecación, por el calor ó por los anestésicos; las especies estudiadas fueron la Elodea canadensis y la Selaginella martensii. En todas sus experiencias las yemas vivas han dado un resultado positivo, los órganos matados no han provocado el mas ligero tinte azulado. Por último ha comprobado los resultados de esta primera serie de experimentos empleando el método de las bacterias.

Podemos, pues, deducir que la clorofila no tiene la propiedad de descomponer el anhídrido carbónico.

La diferenciación muy precoz y la evolución de los cuerpos clorofilianos en las células de los tejidos verdes, autorizaría para pensar que cada uno de ellos tiene una individualidad distinta de la del protoplasma de la célula en la cual están sumergidos.

En efecto, Engelmann afirma que los cuerpos clorofilianos aislados de los Mesocarpus, Spirogyra, Navicula, Elosterium, pueden vivir largo tiempo á la luz y asimilar el gas ácido carbónico; Kaberland confirma el hecho con los cloroplastos de Tunaria, y saca la consecuencia de que en los Musgos la asimilación del carbono es independiente de la influencia del núcleo. En fin, Pfeffer, admite como demostrada la individualidad fisiológica de los cuerpos clorofilianos, como también su individualidad anatómica.

Kny ha repetido estos experimentos empleando el método de

(1) L. KNY: Die Abhängigkeit der Chlorophyllfunction von den Chromatophoren und von Cytoplasma. Bericht d. D. Bot. Gesellsch. 24 janvier 1897.
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las bacterias. Se proporciona las bacterias dejando macerar la carne de buey en el agua, y el líquido de cultura se emplea al cabo de tres á seis días, ya solo, ya asociado de 10 á 25 por 100 de sacarosa.

Ha experimentado con un gran número de especies de Musgos, de Helechos y de Fanerogamas, y en todos sus experimentos el resultado fué negativo, es decir, que los cuerpos clorofílianios aislados, desprovistos de cytoplasma no han manifestado la asimilación.

Si en los primeros ensayos ha obtenido resultado positivos, esto era debido á la presencia de gonidias de algas ó de cuerpos clorofílianios provistos todavía de cytoplasma, como lo han comprobado observaciones mas precisas con ayuda de reactivos colorantes.

Por último, en una tercera serie de experimentos, Kny ha estudiado comparativamente la influencia deprimente de un cierto número de agentes exteriores sobre la función clorofíliana y sobre las propiedades del núcleo y del protoplasma. Comprobó que no existe ningún paralelismo entre estas influencias: el protoplasma puede perder su movilidad y puede ser separado de la membrana sin que la asimilación del carbono esté disminuida; esta última no está modificada aun cuando el núcleo presente indicios de desorganización.

Los resultados de Kny han sido puestos en duda y criticados por Ewart, que ha publicado (1) una serie de observaciones sobre el mismo asunto, y confirmado, en oposición con Kny, las observaciones de Engelmaren y de Haberlandt. Señala en una nota, cuya exposición deja mucho que desechar, las causas de error que presenta el trabajo de Kny; se refiere al empleo de cultivos impuros alcalinos y conteniendo venenos. Según Ewart, las soluciones alcalinas son nocivas á los granos de clorofila incluidos en las células.

Por otra parte, Ewart censura el empleo del mechero Auier para la iluminacion de los objetos sometidos á estudio, porque la intensidad luminosa demasiado considerable altera los granos de clorofila y ocasiona una disminución de la asimilación; esta actividad provoca una disminución de la sensibilidad y de la movilidad de las bacterias. Habría sido necesario colocarse en las mejores condiciones de iluminación para el estudio de estos fenómenos tan delicados.

Por último, el autor prefería al método de trituramiento destinado á aislar los cuerpos clorofílianios, el método de disección, empleado ya por Heberland.

(1) ALFR.—J. EWART: The Relations of chloroplastid and cytoplasma. Bot. Centr. Blatt., 1897, Bd. LXXII.