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índole, y lo mismo ocurre a los de Almería y Utielar, en muchos de cuyos parajes existen endémicamente las fiebres palúdicas, vulgo síziones.

Los trabajos de saneamiento, realizados en algunos pueblos, y los esfuerzos de los médicos han limitado mucho los estragos que antes causaba el hematozoario de Laveran; pero, por desgracia, no todos los focos se han agotado y son muchas las localidades que pagan crecido tributo a la quinina.

La fiebre de Malta es otra afeción que reina con caracteres endémicos en la región que estudiamos. Endémica en el país, como la fiebre en Astrakán, puede decirse que ninguna localidad se ve libre de ella, y su frecuencia y rebeldía constituye a diario la preocupación de los médicos.

Añádanse los casos frecuentes de fiebres gastrointestinales, desde las más leves formas de las infecciones comunes hasta las manifestaciones gravísimas del tifus abdominal, y se tendrá una idea general de la endemiología propia del país, cuyos protozoos parásitos, recientemente descubiertos por nosotros, nos proponemos estudiar en estas páginas.

Y terminaremos este ligero bosquejo de geografía médica ocupándonos de las relaciones que con otros países guardan sus habitantes.

La índole especial de las labores a que la mayor parte se dedican — faenas agrícolas — y la escasez y deficiencias de las vías de comunicación, hacen que, en general, viajen poco los labriegos alpujarreños. Hay, sin embargo, aparte la emigración a la Argentina, verdadera sangría que a grandes pasos despuebla tales parajes, dos movimientos colectivos que a nuestro objeto interesan.

Es uno, el de los habitantes del partido judicial de Berja y pueblos inmediatos, que constituyen el principal núcleo de obreros de que disponen las cuencas mineras de Linares, La Carolina y Posadas. Y nos importa tanto más este incansante ir y venir, cuanto que ello nos explica la rebeldía que a su desaparición ofrecen los focos palúdicos de nuestras comarcas. Son sus mismos hijos los que al regresar de esa zona minera — intensamente palúdica, como se sabe, — contribuyen a nutrir y extender la referida endemia.

Otra periódica emigración es la que muchos labriegos alpujarreños y almerienses, del término de Albuñol, en especial, hacen todos los años a las provincias de la Argelia, donde se dedican a las faenas del cultivo de la vid, en las que son peritísimos obreros. En esos anuales viajes son acompañados de sus familias respectivas, que buscan ocupaciones compatibles con su sexo o con su edad, y los niños, aun recién nacidos, forman parte de la caravana.

Una enfermedad que, cual sucede al kala-azar, se propaga por animales tan abundantes como los perros, que acompañan al labriego alpujarreño como al árabe el caballo, y que tan extendida está por todas las comarcas de Túnez y de Argelia, debía forzosamente haber pasado el Mediterráneo y arraigado en las costas y en las poblaciones andaluzas.

Tal era la base científica de nuestras primeras investigaciones.
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Los hemáties se colorean en rosa-pálido, los núcleos de los leucocitos en rojo, los parásitos en azul y su cromatina en rojo rubí.

PROCEDIMIENTO DE NOCARD Y MOTAS. — Fijación en alcohol ab soluto. Coloración en

    Eosina Höchst al 0'5 por 100
    1 cm.³

    Thionina fenicada de Nicolle
    1

    Azul Borrel
    II gotas

    (M.)

El líquido se prepara con algunas horas de anticipación y los frotes permanecerán en él de 12 a 24. Lavado abundante. Sumersión durante medio minuto en anaranjado Grubler. Lavado en agua.

El protoplasma de los leishmanias aparece azul. El núcleo, rojo carmín.

PROCEDIMIENTO DE MARINO. — Desecación al aire. Fijación y coloración simultánea en

    Azul de Marino
    0'10 gramos

    Alcohol metílico absoluto
    50 cm.³

durante diez minutos. Solución acuosa de eosina al 0'05 por litro durante dos minutos. Lavado.

PROCEDIMIENTO DE LEISHMANN. — Se prepara una solución acuosa al 1 por 100 de azul de metileno medicinal Grubler; se le adiciona 0'50 por 100 de carbonato sódico; se calienta durante doce horas a 85°, y se la conserva diez días a la temperatura del laboratorio.

Se prepara, de otra parte, una solución al 1 por 1,000 de eosina B. A. Grubler. Se mezcla volúmenes iguales de las dos soluciones, y se les agita de cuando en cuando durante diez horas. Se lava el precipitado en agua destilada, hasta que el líquido de loción no presente más que un tenue color azulado. Se recoge el residuo en un filtro, se seca y se pulveriza. Con el polvo así obtenido se prepara una solución al 0'15 por 100 en alcohol metílico absoluto.

Sobre los frotes simplemente secos al aire, se vierten III a IV gotas de la solución metílica y a los treinta segundos de contacto se agregan VIII a X gotas de agua y se la deja actuar de cinco a diez minutos. Se lava con agua abundante.

Resultados como en el método Jenner.

PROCEDIMIENTO DE ROMANOWSKY. — Fijación durante una hora en estufa seca a 105-110°. Coloración durante dos horas en

    Solución acuosa de eosina Höchst A. G. al 1 por 1,000
    5 cm.³

    Solución acuosa saturada de azul de metileno Höchst
    2

lavado en agua. Los núcleos parasitarios, en rojo. Los citoplasmas, en azul.

PROCEDIMIENTO DE GIEMSA. — El fundamento del método anterior, tan empleado en el estudio de los protozoarios, estriba en la aplicación de soluciones de azul de metileno y de eosina, que colorean en
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azul al protoplasma celular y en rojo a los elementos nucleares. De las diferentes modificaciones que tienden a facilitar y perfeccionar dicho método, sobresale, por su sencillez y buenos resultados, la efectuada por Giemsa y modificada por Schuberg, que a continuación exponemos.

Se emplea como colorante una solución formada de

    Azur II eosina
    3 gramos

    Azur II
    0'80 gramos

    Glicerina purísima
    125 gramos

    Alcohol metílico puro
    375 gramos

Se colorean las preparaciones por este método sumergiéndolas durante quince minutos a tres horas (y en algunas ocasiones hasta veinticuatro horas) en un líquido formado por la mezcla de una gota de la solución anterior por centímetro cúbico de agua destilada, que no contenga ni vestigios de acidez.

La técnica de esta coloración es sumamente difícil. Nosotros la hemos empleado muchísimo, y debemos confesar que muchas veces, sin saber por qué, hemos obtenido resultados desastrosos. En cambio, sus preparaciones, cuando salen bien, son incomparablemente superiores a las obtenidas con otros procedimientos.

Al líquido anterior puede agregarse una gota de solución de carbonato sódico al 1 por 100 por cada 2 cm.³ del agua destilada.

El procedimiento de teñido más recomendado es el llamado de tinte progresivo, vigilando la marcha de la operación para elegir el momento en que los parásitos tengan el tinte apetecido; pero nosotros preferimos sobrecolorar intensamente la preparación, y después, por diferenciación, rebajar el color hasta el punto deseado.

Schuber recomienda para esta diferenciación una mezcla de dos partes de agua común y una de acetona pura (libre de alcohol y ácido), después de la cual se deshidrata rápidamente en acetona absoluta y se deja secar.

Nuestra experiencia nos enseña que sólo de este modo se conservan las preparaciones bien teñidas durante mucho tiempo.

MÉTODO DE HEIDENHEIM.—Se preparan las soluciones siguientes:

    Sulfato férrico amónico.
    3 gramos

    Agua destilada.
    100 gramos

    (D.)

    B
    Hematoxilina cristalizada
    1 gramo

    Alcohol de 70°
    10 gramos

    Agua destilada
    90 gramos

    (D.)

Tratar la preparación durante una a tres horas con la solución A. Lavar rápidamente en agua. Colorear con la solución B de dos a doce horas o hasta que tome color negro. Lavado rápido en agua. Diferenciación al microscopio con la solución A. Lavado durante una hora en agua corriente. Xilol. Toda la sustancia cromática toma color negro. Puede obtenerse doble coloración asociando un colorante plástico, como la solución acuosa de eosina al 1, 0'5 ó 0'2 por 100, de fuchina ácida o de rojo Magenta al 1 por 100, etc.
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PROCEDIMIENTO DE DELAFIELD. — Se prepara por una parte

Hematoxilina cristalizada ................. 4 gramos
Alcohol absoluto ......................... 100 cm.³

y por otra, y al calor

Alumbre amónico .......................... 52 gramos
Agua destilada ............................ 100 cm.³

Se mezclan. A los tres o cuatro días se filtra y se añade

Glicerina pura y alcohol metílico (ana).. 100 cm.³

se filtra y se deja envejecer durante dos meses hasta que adquiera color violeta obscuro.

Se toma 1 cm.³ de esta solución y se agrega a 20 cm.³ de agua destilada. Se colorea durante media a veinticuatro horas. Lavado rápido en agua. Diferenciación al microscópico con

Acido clorhídrico ........................ X gotas
Alcohol de 70º ............................. 100 cm.³

o con

Acido clorhídrico ........................ X gotas
Glicerina pura ............................ 30 cm.³
Alcohol de 70º ............................. 70 "

se lava largamente con agua. Se deshidrata en alcohol y se clarifica en xilol.

PROCEDIMIENTO DE GIEmsA Y LAVERAN :

Solución acuosa de eosina al 1 por 1,000. 2 cm.³
Solución acuosa de azur II al 1 por 1,000. 1 "
Agua destilada ............................. 8 "

El citoplasma se tiñe en azul, el núcleo en rosa, el blefaroplasto en violeta, el flagelo — si lo hay — en rosa pálido.

Pudieramos hacer interminable la lista de los procedimientos aplicables al teñido de los leishmanias. La mayoría tiene el mismo fundamento: establecer contraste entre los parásitos teñidos de azul por el cloruro de tetrametiltinona y los elementos de la sangre teñidos en rosa por la eosina. Remitimos al que desee conocer el asunto, a cualquiera de los clásicos tratados de bacteriología, donde podrá aprender, además de los dichos, los métodos de Borrel y Bournet, Hecht y Wilenko, Ravaut, Reiman, Herxheimer y Huber, Proca y Vasileso, Oppenheim y Sachs, Davidson, Simonelli y Bandi, Hoffmann y Halle, Michaelis, Unna, panóptico, pancrómico de Pappenheim, etc., etc.

Nosotros, fruto de nuestra larga labor, hemos concedido la preferencia absoluta al Giemsa, que practicamos siempre, utilizando alguna vez el Leishmann a título rápido y expeditivo. Nunca nos cansaremos de repetir las excelencias del primero.

Si queremos estudiar la distribución del leishmania en el interior de los órganos, cortaremos pequeños bloques que, fijos y endurecidos
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por los procedimientos clásicos (formol, alcohol, etc.), serán sometidos a la encastración parafínica y cortados en tenues laminillas de cinco micras de grosor. El teñido se hará por los métodos anteriores o por el violeta de genciana (Weigert), azul alcalino (Loeffler), azul fenicado (Kuhne) o la doble coloración (Gram y eosina) o por la triple (Gram, ácido pícrico y picrocarmín de Orth), etc., etc.

V. — El leishmania infantum es difícilmente cultivable y requiere siempre medios especiales. El agar común, el glicerinado, agar-ascitis, agar preparado con caldo de bazo de perro, agar de Nicolle, caldo común, caldo glicerinado, caldo de bazo, etc., han sido utilizados sin obtener resultados favorables.

Rogers, de Calcuta, consiguió por primera vez el cultivo utilizando la sangre esplénica citrada. Longo, de Catania, reprodujo en seguida el experimento, y lo mismo Leishmann, Mackensie, Christophers y Stathan, y, recientemente, Di Cristina y Cannata sembraron en sangre de conejo adicionada con citrato de sosa y colocada en matraces de anaerobios.

Ponselle, en 1913, recomienda una mezcla a partes iguales de sangre desfibrinada de conejo y el agar siguiente:

Agar no lavado ......................... 20 gramos
Agua ........................................ 1,000 cm.³

Mathis mezcla una parte de agar nutritivo a una o dos de sangre desfibrinada de caballo o buey, calentando el conjunto varias veces a 75° o media hora a 120°.

Novy y Mac-Neal resolvieron el problema del cultivo de los tripanosomas utilizando un medio nutritivo compuesto de

Extracto de 125 gramos de carne de vaca en 1,000 gramos de agua.
Agar ........................................... 25 gramos
Peptona ........................................ 20 "
Cloruro sódico ............................... 5 "
Solución normal de carbonato sódico (al 5'30 por 100) ..................... 10 cm.³

De otra parte se desfibrina, por el procedimiento de las bolas u otro análogo, dos partes de sangre de conejo y se las añade a una de la preparación anterior, bien esterilizada. El todo se distribuye en tubos (3 ó 4 cm.³), se solidifica en plano inclinado, y se mantiene durante veinticuatro horas a 37°, rechazando los tubos que resulten infectados.

Nicolle modificó ventajosamente el procedimiento anterior, combinando el método que, por las iniciales de sus tres autores (Novy, Neal y Nicolle), se conoce en parasitología con el abreviado de NNN o N3.

Con él, y siguiendo la técnica recomendada por Jemma, Di Cristina y Cannata, del Laboratorio de Clínica pediátrica de Palermo, hemos conseguido nosotros cultivos inmejorables de leishmanias.
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He aquí nuestro manual operatorio. Se prepara una fórmula de agar formada de

Cloruro sódico ......................... 8 gramos
Agar .................................. 14
Agua ................................... 900

Se esteriliza al autoclave, se distribuye en tubos de cultivo vertiendo en cada uno 4 cm.³ del líquido fundido.

De otra parte se recoge la sangre del conejo, no siendo ésta una de las menores dificultades del procedimiento.

Véase cómo procedemos nosotros.

Utilizamos el cuerpo de una jeringa de vidrio de 10 cm.³ de cabida, a cuyo extremo adaptamos una aguja relativamente gruesa y resistente. Al otro extremo del cuerpo de la jeringa adaptamos un tubo de goma que termina en una pieza de marfil, tomada de las que vienen con las pipetas mezcladoras de los estuches para numeraciones globulares.

Mientras todo ello se esteriliza por ebullición, fijamos cuidadosamente el conejo que ha de suministrar la sangre, sujetándole en la bandeja rectangular de cobre que sirve para inmovilizar esta clase de animales. Afeitamos cuidadosamente la piel de su tórax, y delimitamos por tacto la zona esternal en que el corazón late con su máximo de violencia, desinfectándola en seguida con la aplicación de tintura de iodo.

Tomamos entonces el aparato ya esterilizado y enchufamos sus piezas, con lo que resultará el cuerpo de la jeringa unido por un extremo a la aguja y por el otro al tubo de goma terminado por la boquilla de marfil.

Cogida la boquilla con los dientes y la jeringa con la mano derecha, colocamos la punta de la aguja sobre la parte media de la zona de proyección del corazón, y penetraremos, por movimientos de tornillo, a través de las paredes del tórax.

Comenzando a aspirar por el tubo de goma, y penetrando lentamente con la aguja, llegará un momento en que la punta de ésta penetre en el interior del corazón, en cuyo caso la sangre empezará a llenar el cuerpo de la jeringa.

Cuando hemos extraído 10 ó 12 cm.³ retiramos rápidamente la aguja, y dejamos que un ayudante obture con colodión la picadura hecha al conejo, el cual, contra lo que pudiera creerse, no muere a consecuencia de la operación.

Los tubos de agar que antes preparamos, habrán estado mantenidos en baño de maría, con lo que su contenido permanecerá líquido. Rápidamente, y con todas las precauciones de rigor, vamos destapando cada uno de ellos y echándoles 2 cm.³ de la sangre que recogimos al conejo, operando con todas las reglas capaces de impedir la infección del terreno y con la rapidez suficiente a evitar la coagulación.

Inmediatamente se agita cada tubo para conseguir la mezcla de la sangre con el agar fundido, pero cuidando mucho de no formar espuma, y en seguida se les tapa con algodón aséptico, se les coloca
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un capuchón de goma y se ponen a solidificar en un plano inclinado, para que la masa del cultivo resulte extendida a lo largo de la pared del tubo en pico de flauta.

El cierre ha de ser lo más perfecto posible para evitar la evaporación y facilitar la formación del agua de condensación.

Los tubos se colocan en estufa a 37° y se observan a las veinticuatro horas, para rechazar los infectados y guardar los que no lo estén. En éstos se practican las siembras del parásito.

Sirve para ello el producto recogido por la punción del bazo, o el jugo de la víscera autopsiada, o el material de un cultivo anterior, o la pequeña partícula que con el hilo de platino recogemos del hueso trepanado de un animal infectado.

Con el mismo hilo o anillo de platino (öse) o con una pipeta capilar, se recoge el material parasitífero —que puede o no diluirse en un poco de suero salino— y se siembra en el agua de condensación de los tubos anteriormente preparados, colocándolos en seguida en estufa con termorregulador y manteniéndolos a 22°, que es la temperatura más favorable. Los leishmanias mueren generalmente a los 40° y a los 0°.

Es práctica muy prudente la de sembrar gran número de tubos, ya que la experiencia nos ha enseñado la facilidad con que el cultivo no prende, quedando estériles nuestros esfuerzos.

Al cabo de cuatro a ocho días de estufa a 22°, si la siembra ha sido fértil, aparecen los leishmanias multiplicados en el agua de condensación y dotados de los caracteres que luego describiremos. Alguna vez pueden apreciarse sobre la superficie del agar-sangre pequeñas colonias macroscópicas con ligero relieve y aspecto redondeado, pero el hecho es muy raro.

Por medio de repicajes sucesivos, es decir, tomando una gotita del agua de condensación de un tubo fértil y depositándola en la de otro recientemente preparado, puede obtenerse una nueva generación de leishmanias, que en estos casos germinan a los tres o cuatro días, y repitiendo los pases, siempre con exageradas precauciones, pueden conseguirse cultivos en serie, llegando a repetir, con éxito, numerosas generaciones.

Conviene hacer constar que hemos observado una estricta relación entre el desarrollo de los leishmanias y la presencia de hematies bien conservados y numerosos en el agua de condensación. La persistencia de glóbulos rojos integros, o por lo menos la abundancia de hematies en buen estado de conservación, sin hemólisis muy acentuada, y sin deformaciones graves del estroma, es, en nuestra opinión, indispensable para el crecimiento del protozoo.

Esta observación inclina el ánimo a pensar que los leishmanias atraviesan un período de desarrollo endoglobular o cuando menos estrictamente ligado con el glóbulo rojo (Pittaluga).

El desarrollo de los flagelados de los cultivos es tardío cuando los tubos se conservan a la temperatura inconstante del ambiente exterior.

No hemos logrado poner de relieve la menor diferencia, ni en el tiempo de crecimiento, ni en el aspecto y movilidad de los flagelados,
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entre los sembrados en N3 hecho con sangre venosa (corazón derecho) y los sembrados en el NNN, preparado con sangre arterial (corazón izquierdo), ni hemos apreciado en el conejo granadino la presencia del trypanosoma cuniculi (T. lewisi var.), como ocurre en la mayor parte de los utilizados en el Instituto de Alfonso XIII de Madrid.

VI. — La clasificación general de los protozoos, tan debatida en estos últimos años, permite agruparlos actualmente en dos grandes divisiones : Plasmodríomata (Doflein, 1901), caracterizados por la identidad substancial de los órganos locomotores y del protoplasma celular, con flagelos y pseudopodos, o sin ningún órgano locomotor, y reproducción sexuada iso o anisogámica, alternando generalmente con la sexual, y Heterokariota (Hickson, 1903), con cirros vibrítiles, por lo menos en las formas jóvenes, y cuyos apéndices están diferenciados, desde el punto de vista bioquímico, del resto del protoplasmia.

En los primeros, que comprenden las antiguas agrupaciones de los sarcodinos, de los mastigophora y de los esporozoos, pueden los apéndices locomotores ser persistentes, como los flagelos de los mastigophora, o transitorios y variables como los pseudopodos de las amebas. Entre los segundos, que reúnen a los antiguos ciliata, acineta, infusoria y ciliophora, pueden, igualmente, ser persistentes los órganos de la locomoición (ciliata) o faltar en algún período del ciclo evolutivo (acineta) ofreciendo, en ambos casos, una neta diferenciación de los materiales nucleares en dos masas (micro y macronúcleo) destinadas, la primera a las funciones propias de la reproducción, y la segunda a las tróficas y de relación.

Hácese del grupo plasmodríomata cuatro subdivisiones : sarcodina (Butchill), mastigophora (Doflein), telosporidia (Schaudinn), y neosporidia (Schaudinn).

Los mastigóforos o flagelados se caracterizan por la existencia constante, al menos en el estado adulto, de los flagelos como órganos de locomoción.

Constuyen los flagelados un grupo taxonómico tan mal definido como los gusanos en los metazoos. Como éste, reúnen especies muy distintas y mal estudiadas muchas de ellas. La clase que nos ocupa se relaciona por medio de los dinoflagelados y fitomonadinos con genuinas algas ; los protomonadinos (Trypanosomas), indican, por un lado, sus afinidades con spirochaetas y típicas bacteriáceas (vibrio, spirillum), y, por otra parte, sus afinidades con los hemospórididos son tales, que Hartmann reúne ambos grupos formando el orden Binucleata. Muchas especies, por último, denotan marcada afinidad con los rizóspodos e infusorios. (Rodríguez López-Neyra) (1).

Como hemos dicho, es carácter esencialmente distinto del grupo mastigophora la existencia de flagelos en escaso número, que pueden faltar en el estado joven de alguna especie; pero nunca dejan de observarse en la fase adulta. Determinados flagelados sencillos pueden presentar pseudopodos en toda o parte de su vida ; pero en

(1) Rodríguez López Neyra : Estudio elemental de los protozoarios y en especial de las especies parásitas, Madrid, Rojas, editor, 1914.