分类：教育/科学-理工学科-生物学
问题：请提供稳定转染的protocol转染了几次，都没成功 
转染了几次，都没成功
回答：1. 转染前一天，将细胞用胰酶消化、计数并铺板，使转染日细胞融合度为70-90％。在铺板和转染期间避免使用抗生素。2. 对每孔细胞，在100μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ或D-MEM）中稀释1-2μg DNA。如有多孔细胞，可以批量制备。3. 在每孔中，用100μl无血清的培养基稀释2-25μl阳离子脂质体试剂。阳离子脂质体试剂的每次稀释都使用单独的管。对于LFECTIN，必须使用OPTI-MEMⅠ稀释并将稀释液在室温保温30分钟。4. 将稀释的DNA（步骤2）同稀释的脂质体试剂（步骤3）混合。在室温保温15分钟。5. 使用0.8ml/孔的转染培养基在转染开始前清洗细胞。转染培养基中可以含有血清。6. 使用转染培养基稀释复合物至总体积1ml/管。将稀释的复合物加入细胞。5% CO2，37℃保温5小时。7. 5小时后，增加培养基的体积至正常体积。如果转染培养基不含血清，加入血清，使其终浓度达到正常生长培养基的浓度。如欲使细胞生长最佳，使用新鲜的完全培养基替换含有复合物的培养基。8. 转染24-48小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周