Contribution of epigenetic and epitranscriptomic factors in gene regulation of embryonic stem cells : I. Generation of Ythdf1-3 knock-outs and characterization of their phenotypes. II. Investigating the role of a chromatin modifier, MMSET in R-loop biology

Epigenetikk og epitranskriptomikk er vist å påvirke genregulering, og er koblet til mange ulike sykdommer og utvikling av kreft. Reversible endringer i genuttrykk som ikke påvirker nukleinsyresekvensen, er definert som epigenetisk regulering, mens modifikasjoner på RNA er kjent som epitranskriptomisk regulering. Målet med denne studien var å undersøke hvordan epigenetiske og epitranskriptomiske modifikasjoner påvirker genregulering i embryonale stamceller fra mus, ved å se på to ulike aspekter: hvordan «leserproteinene» YTHDF1-3 (DF1-3) påvirker cellulære prosesser, og rollen til et kromatinmodifiserende protein, MMSET, i biologien til R-loops. YTHDF1-3-proteinene er cytoplasmiske lesere, som gjenkjenner og binder N6-metyladenosin (m6A) modifikasjoner. DF1-3-proteinene har blitt vist å både promotere translasjon og påvirke mRNA-stabiliteten. Enkelte studier rapporterer at DF1-3 har like funksjoner på grunn av høy sekvenslikhet, likevel påpeker de fleste andre studier ulike funksjoner. Derfor gjenstår det fortsatt å finne ut hvordan DF1-3-proteinene utfører deres potensielt ulike oppgaver, og om de binder de samme eller ulike m6A seter. Vi ønsket å slå ut Df1-3 genene hver for seg og i ulike kombinasjoner i embryonale stamceller fra mus, og endelig undersøke hvordan DF1-3 proteinene påvirker proliferasjon og differensiering, samt samspillet mellom dem. Vi brukte creERT2 rekombinase og CRISPR/Cas9 teknologi for å slå ut Df1, Df3, Df1/2, og Df1/3 genene. Vi observerte ubetydelige forandringer med tanke på vekst i embryonale stamceller fra mus som manglet en eller to ulike Df1-3 gener. Deretter testet vi muligheten for differensiering i de genererte cellelinjene, og vi observerte da en forandring for differensiering, spesielt mot den neuroektoderme cellelinjen. De funnene som ble gjort samsvarer med teorien om at endringer i epigenetikk og epitranskriptomikk ikke påvirker celledeling, men heller differensiering av embryonale stamceller. Den andre delene av denne oppgaven handler om rollen til et histonmodifiserende protein, Multiple-Myeloma SET domain, MMSET, som er viktig for R-loop-biologi. MMSET-proteinet metylerer histoner, og har vist seg å være viktig i overgangen fra pluripotent til differensiert tilstand, samt i dannelse av det mesendoderme kimlaget. I tillegg har MMSET blitt koblet til R-loop-biologi som en interaksjonspartner med R-loops. R-loop består av tre nukleinsyre tråder: ett dobbelttrådet DNA-RNA hybrid og et enkelttrådet DNA. R-loops har en fysiologisk rolle i cellulære prosesser, men spiller også ofte en patologisk rolle med negativ påvirkning på transkripsjon og replikasjon, i tillegg til å være forbundet med DNA skade. I tillegg er R-loops rapporter å være beriket i polycomb nedregulerte gener. Derfor ville vi validere MMSET som en interaksjonspartner med R-loops i embryonale stamceller fra mus, og videre se på effektene i R-loop biologien ved å slå ut MMSET genet. Ved å utføre immunpresipitering kombinert med western blotting ønsket vi å validere MMSET og R-loops som interaksjonspartnere med RNA helikasene DHX9, DDX5, og DDX3, i tillegg til med hverandre. Differensieringsforsøk ble utført på MMSET+/- og MMSET-/- celler. Resultatene viste at det ikke var noen forsinket utgang fra en pluripotent tilstand ved å slå ut MMSET. På den andre siden, var evnen for differensiering til de tre ulike kimlagene endret. Ved å bruke immunfluorescence forsøk oppdaget vi endringer i akkumulering av R-loops, samt økt foci-dannelse av H2AX og 53BP1 ved å indusere oksidativt stress i MMSET-/- celler. Vi validerte at R-loops er beriket i det polycomb nedregulerte genet Gata4 uavhengig av MMSET. Med unntak av den reduserte evnen for å nå en differensiert tilstand, observerte vi generelt små endringer med tanke på R-loop-biologien ved å fjerne MMSET. Fremtidige studier vil forhåpentligvis gi en dypere forståelse av hvordan MMSET påvirker akkumulering og distribusjon av R-loop i genomet.