表達載體

表達載體，指在可在細胞中進行基因表達的遺傳工具，一般是質粒或病毒的形式。這類載體一般用於將特定基因匯入靶細胞內，並利用靶細胞內的蛋白生產系統來表達載體上基因編碼的蛋白質。這是生物技術中蛋白質生產的基本工具。表達載體通常包含一些調控序列，例如增強子和啟動子，來提高其上攜帶基因的表達效率。一個好的表達載體應當能夠高效地生產其編碼的蛋白質，而這一般是透過轉錄大量且穩定的信使RNA，並使其翻譯為目標蛋白質來實現的。目標蛋白的生產也可以進行嚴格的調控，使其僅在有特定的誘導條件存在時才大量生產。大腸桿菌是蛋白質生產最常用的宿主細胞，但是也有很多其他的選擇。這些技術的一個代表性應用例項是生產可用於治療糖尿病的胰島素。元件.表達載體具有許多和其他載體相同的元件，例如複製起點、篩選標記和適合插入基因的多克隆位點。這和只負責儲存基因文庫的克隆載體相同。一般的表達載體只會在一種生物系統中使用都能自我複製，則會需要額外的元件，如多個不同的複製起點，而這樣的載體稱為穿梭載體。表達元件.表達載體必須包括基因表達所需要的表達元件，這包括啟動子、正確的翻譯起始序列、終止子。原核生物和真核生物的蛋白質合成機理有所不同，所以特定的表達載體必須具有和其宿主細胞相容的表達元件。例如，原核表達載體在其翻譯起始位點會有可以結合核糖體的Shine-Dalgarno序列，而真核表達載體則會在對應的位置包含Kozak同源序列。啟動子負責起始基因的轉錄，也是基因表達的主要調控位點。表達載體中的啟動子大多是可誘導的，即需要特定的誘導訊號存在才會起始基因表達。也有組成型的啟動子，可以持續穩定地表達基因。不過，即使是較嚴緊的可誘導啟動子，在沒有誘導訊號的情況下也會有低水平的背景表達。蛋白質標籤.在細胞內合成目標蛋白質之後，往往需要將其純化出來，然而，要把目標蛋白和細胞中大量其他的蛋白質分離並不容易。所以插入基因的閱讀框內一般會包含一個蛋白質標籤以便於後續純化。常用的標籤包括組氨酸標籤、谷胱甘肽硫轉移酶等。有的蛋白質標籤還具有增加融合蛋白水溶性的作用。其他常用的融合蛋白元件還有綠色熒光蛋白這樣的報告基因，可用於檢驗克隆是否成功，也可以在顯微鏡下進一步研究融合蛋白在細胞中的表達情況。其他.表達載體通常是透過轉化或轉染的方式進入宿主細胞的。有的表達載體可能會需要一些元件來幫助它整合進宿主的基因組中，例如轉化植物細胞需要的vir基因、染色體重組需要的整合酶位點等。其他表達載體可能會需要特殊的定位序列，以把表達的蛋白定位到宿主細胞的特定區域，比如細菌的周質空間內。表達/生產系統.我們可能需要在各種不同的生物中合成我們需要的蛋白質，而在不同的生物細胞內需要針對其蛋白質合成系統設計不同的元件。最常用於合成蛋白質的宿主生物是細菌中的大腸桿菌，但是，不是所有的蛋白質都能在大腸桿菌中成功合成，或完成正確的翻譯後修飾，例如糖基化。這時，我們或許就要考慮在其他生物中合成我們的蛋白質。細菌.大腸桿菌成為最常用的外源蛋白質生產工具的原因，在於其操作相對簡單方便，而且成本低廉，速度較快。如今已有大量可用於大腸桿菌的表達載體質粒可供選擇。其他表達載體常用的宿主細菌還包括枯草芽孢桿菌。通常，大腸桿菌中表達的外源蛋白會存在於其細胞質中，不過一些蛋白質在細胞質中的溶解性可能不好，會和一些錯誤摺疊的蛋白質一起在細胞質中形成包涵體。如果發生這樣的情況，就需要進行復雜的重摺疊操作，還會降低產量。需要形成二硫鍵的蛋白質往往也不能正確摺疊，因為細菌細胞質中的還原性環境不利於二硫鍵的形成。解決這個問題的辦法之一是在蛋白質N端加一個訊號肽，將其定位到更容易形成二硫鍵的周質空間中；或者透過一些方法改變細胞質中的氧化還原環境。現在已經有一些複雜的操作來幫助我們在細菌細胞中表達本來不可能在細菌中合成的蛋白質，例如糖基化蛋白。這裡使用的啟動子一般都乳糖操縱子的啟動子和T7啟動子，一般由乳糖操縱子進行調控。也有雜交啟動子，例如Tac啟動子就是由色氨酸葡萄糖抑制的。有時，在一些抑制特性尚存的系統中，葡萄糖也可以被利用來抑制背景表達。大腸桿菌表達載體的例子有pGEX系列載體，使用谷胱甘肽巰基轉移酶組成融合蛋白，由Tac啟動子調控表達。還有使用T7啟動子的pET系列載體。在大腸桿菌中同時表達兩個不同的載體是可以實現的，但是兩個載體需要有不同的複製起點和抗性標記，否則兩者無法穩定共存。很多常用的大腸桿菌載體使用的是ColE1複製原點，這些載體彼此之間就是不相容的。如果想要在同一個細胞內再表達一個載體，就需要選擇一個具有不同複製原點的載體，例如基因p15A複製原點的pACYC系列載體。或者，也可以透過表達一個串聯了多順反子的載體來表達一個以上的蛋白。酵母.具有二硫鍵和糖基化修飾的蛋白質在酵母中相對比較容易表達。一種常用於表達蛋白的酵母是畢赤氏酵母，一般使用LAC4啟動子。釀酒酵母則常用於實驗室中的研究用途，例如酵母雙雜交系統，可以檢測蛋白質之間的相互作用。桿狀病毒.桿狀病毒是一類可以感染昆蟲細胞，並在其中表達蛋白的表達載體。 來自鱗翅目昆蟲的細胞系是常用的宿主細胞，其優勢在於生長迅速，而且不需要像哺乳動物細胞一樣使用昂貴的血清來培養。細菌和昆蟲細胞中的穿梭載體被稱為杆粒，一般使用pPolh啟動子。 桿狀病毒也可以在某些系統中用於哺乳動物細胞。桿狀病毒載體一般用於表達糖蛋白，雖然其糖基化形式可能和脊椎動物中有所不同。相比於可以感染哺乳動物細胞的其他病毒載體，一般情況不會把哺乳動物細胞作為宿主的桿狀病毒被認為更加安全。植物.很多植物載體是基於土壤農桿菌的Ti質粒設計的。透過農桿菌的感染，我們可以把外來基因引入植物細胞的基因組中。也有基於植物自身基因重組功能設計的基因內載體，用來避免把病毒或細菌的遺傳資訊引入植物基因組內。用於農桿菌的宿主範圍有限，植物病毒也被用於載體，例如菸草花葉病毒(TMV)，豇豆花葉病毒、土豆病毒X。目標蛋白既可以和病毒的衣殼蛋白融合表達，也可以單獨表達，從而在植物體內積累。植物載體中的蛋白往往是組成型表達，常用的啟動子之一是花椰菜花葉病毒35S啟動子。哺乳動物細胞.在表達來自哺乳動物的蛋白質時，哺乳動物細胞載體相比細菌載體的優勢在於更好的蛋白質摺疊和翻譯後修飾，活性資料也更有參考價值。相比其他的真核表達系統，也可以避免不正確的糖基化修飾。尤其是在表達膜結合蛋白時，優勢更為明顯。它的缺點也很明顯：蛋白質產量低、成本較高、操作繁瑣、汙染風險大等等。常用的哺乳動物細胞系包括中國倉鼠卵巢細胞(CHO)以及人類細胞系，例如HEK和海拉細胞。載體透過轉染的方式進入細胞，既可以透過同源重組的方式把外來DNA整合進宿主基因組來達到穩定轉染，也可以不整合基因組來達到短時高表達的瞬時轉染。哺乳動物細胞載體的例子包括腺病毒載體，pSV和pCMV系列質粒載體，牛痘病毒和逆轉錄病毒載體。CMV和SV40啟動子則是常用的啟動子。也有非病毒啟動子，例如EF-1啟動子。無細胞系統.大腸桿菌細胞裂解液在包含了轉錄和翻譯機器的情況下，可以用於體外的蛋白質生產。這種系統的優勢在於速度更快，但是成本也更高。用於大腸桿菌細胞的載體這裡也可以使用，但是也有針對無細胞系統特殊設計的載體。真核的無細胞系統也可以用於生產蛋白質，例如小麥胚芽裂解液，哺乳動物細胞裂解液。應用.科學研究.利用表達載體在細胞中生產特定的蛋白質，現在已經是實驗室中常用的研究手段。根據實際需要，各種型別的系統都有可能使用。生物製藥.大部分的生物藥物現在都是利用重組DNA和表達載體技術生產的，包括各類激素、疫苗、抗生素、酶等。第一種用於醫療的人類重組蛋白，胰島素，在1982年開始投入使用。現代生物技術使得許多以前難以獲取的此類藥物能夠進行大批次的生產，並且避免了病原體的汙染。例如，用於治療侏儒症的垂體激素，之前需要從屍體的垂體中分離，有被朊病毒汙染的風險，會使患者感染克雅氏病。之前從人血清中分離獲得的凝血因子VIII則有傳播肝炎和艾滋病病毒的風險。從非人類宿主透過表達載體技術生產的藥物則大大降低了此類危險因素。轉基因生物.近年來，表達載體技術開始被用於製造轉基因動物和植物，並應用於農業和畜牧業。例如把維生素A前體，β-胡蘿蔔素引入大米，生產出“黃金大米”。以及把來自細菌的抗蟲蛋白引入經濟作物，以減少殺蟲劑的使用量。還有改變番茄的乙烯生產量以延長其成熟期，使之不易腐爛。有反對者認為培育轉基因作物的做法可能帶來未知的健康風險，倫理問題和專利爭議。儘管如此，這些技術現在已在成規模地使用，並且也是科學研究的熱點。轉基因動物則常被用於研究生物機理和人類疾病，也可用於生物製藥用途。現在已有將綠色熒光蛋白引入觀賞魚體內產生的商品用熒光魚。基因療法.透過把正常的基因代替病人體內異常的基因，或者補充特定基因的表達量，表達載體也可以用於治療某些疾病。一般使用的治療用載體都是病毒，但是利用非病毒載體的療法也在研究中。這種療法依然是有風險的，因為病毒載體可能會給患者的基因組引入插入突變，從而誘發癌變。不過，現有的臨床試驗已經一些有值得期待的結果。