同位素標記

同位素標記是一項用於追蹤同位素在某個化學反應、代謝通路、或細胞定位中的路徑和去向的技術。在使用時，透過把特定的反應物分子中的某個原子替換為其同位素來進行“標記”，再讓標記過後的反應物發生反應，產物分子中同位素標記的位置就反映了反應過程中被標記原子的變化。在同位素標記中使用的核素可以是穩定核素，也可以是放射性核素，在後面這種情況中，特稱放射性示蹤技術。在同位素標記技術中，檢測同位素標記的方法有很多種。質譜可以用於檢測不同同位素的質量差異，而紅外光譜可以檢測同位素原子的振動模式，核磁共振技術則可以分辨原子的磁旋比，放射性衰變一般透過電離室或者放射性顯影檢測。同位素標記的一個應用例項是對苯酚在水中溶解性的研究。透過把苯酚加入氘代水，在苯酚的羥基上可以檢測到氘原子，說明苯酚在不斷與水發生質子交換。而只有酚羥基受到了影響，說明苯酚的其他5個氫原子並不參與質子交換。同位素示蹤劑.同位素示蹤劑也不會干擾正在研究的反應。但是，中子數的差異又使我們可以把同位素標記與同一元素的原子區分開來。核磁共振被用來研究化學反應的機理。核磁共振和質譜儀可以檢測到同位素之間的差異，從而可以確定產物結構中標記原子的位置資訊。利用同位素標記在產物分子中的定位，我們就可以確定反應物轉化為產物的反應途徑。放射性同位素可以用凝膠電泳的自顯影圖進行檢測，含有放射性同位素的化合物所發出的輻射會使一塊膠片變色，從而顯現出標記原子在凝膠中的相對位置。同位素示蹤劑通常以同位素比率的形式使用。透過研究同一元素的兩種同位素之間的自然比例，我們就可以避免同位素的整體丰度的影響，因為這通常會掩蓋同位素丰度中較小的變化。同位素是地質學中很重要的工具，因為它們可以用來理解地殼系統中複雜的混合過程。同位素示蹤通常由同位素種類的不同，分為穩定同位素示蹤劑和放射性同位素示蹤劑。穩定同位素示蹤劑只涉及非放射性同位素，通常依賴於質量的差異進行分辨。理論上，任何具有兩個穩定同位素的元素都可以用作同位素示蹤劑。然而，最常用的穩定同位素示蹤劑只涉及相對輕的同位素，因為這些同位素很容易分離開來。放射性同位素示蹤劑則使用可發生放射性衰變的同位素。穩定同位素標記.最常見的穩定同位素是2H、13C和15N，這些同位素可以進一步用於合成核磁共振溶劑、氨基酸、核酸、脂類、代謝物和細胞生長介質。 使用穩定同位素產生的化合物，要麼是由同位素標記的百分比來確定。利用穩定同位素標記進行代謝通量分析.利用穩定同位素標記的代謝通量分析。一旦確定了產出代謝物的同位素比率，我們就可以用它來確定反應途徑中代謝通量，即反應物對產物的轉化速率的大小。如圖所示，假設一種三碳化合物，既可以裂解成一個二碳代謝物和一個一碳代謝物並重組，也可以保持不變。如果在反應中提供兩種同等比例的反應物，一種完全標記。圖左側的代謝路徑沒有代謝物的任何變化，而右側則顯示出分裂和重組。如果代謝物只是沿著左側的路徑，它仍然是一個50：50的比率，一半是完全標記的，一半完全未標記。如果代謝物只從右側的一路徑反應，就會出現新的標記模式——4種相同比例的不同標記產物。其他比例的情況也可能發生，取決於多少原始反應物選擇左側的路徑與右側的路徑。圖片中間顯示的情況下，則是一半的代謝物採取左側，和一半採取右側路徑的情況 。這些標記和未標記的原子在同一種化合物中的不同分佈代表了不同的同位素異構體。透過測定不同代謝物的同位素異構體比例，可以最終確定透過每個反應的通量。將從同位素標記中獲取的資料與每個反應、邊界條件和最最佳化過程結合起來，就可以繪成通量圖。不可逆反應提供了確定通量所需的熱力學約束，反應的化學計量用於構造矩陣，細胞內的代謝通量則是透過迭代法來估計的。模擬的通量顯示在一個通量圖中，它顯示每個反應的反應物轉換成產品的速率。 在大多數通量圖中，箭頭越粗，說明反應的通量值就越大。同位素標記測量技術.理論上，任何可以測量同位素異構體之間差異的技術都可以使用。不過，為了測定穩定同位素標記中的質量同位素，現已經開發出了兩種主要方法——核磁共振。質子核磁共振是第一種用於13-碳標記實驗的技術。 使用這種方法，可以分別觀察在特定代謝物池中的每一個有氫原子連線的碳原子。這樣就可以知道在這一特定位置上標記的同位素的百分比。質子核磁共振的缺陷在於，如果一種代謝物中存在n個碳原子，那麼最多隻能存在n個不同的位置富集值，這只是同位素資訊總量的一小部分。雖然如此，但純質子核磁共振實驗也要比用更多的同位素資訊進行實驗容易得多。除了質子核磁共振技術外，13C核磁共振技術可以使人們能夠更詳細地瞭解同位素的分佈情況。 一個標記的碳原子會產生不同的超細分裂訊號，這取決於它在分子中直接相鄰的原子的標記狀態。 如果相鄰的碳原子沒有被標記，一個單線峰就會出現。 如果只有一個鄰近的碳原子被標記，那麼雙峰就會出現。雙重分裂的大小取決於鄰近碳原子的官能團。如果兩個相鄰且化學等價的碳原子被標記，一個雙重峰就可能退化為一個三重峰。使用NMR技術進行代謝通量分析的缺點是，不同於其他核磁共振應用，這是一個相當專業的領域。一般的研究團隊可能無法直接使用NMR光譜儀，因為NMR測量引數的最佳化和峰值結構的正確分析往往需要一個熟練的核磁共振專家。某些代謝物也可能需要專門的測量程式來獲得額外的同位素資料。此外，還需要特別的軟體工具來確定峰值區的精確數量，以及識別糾纏單重峰、雙重峰和三重峰的分解。與核磁共振相反，質譜法是另一種更適用於代謝通量分析實驗的方法。依據使用場合的不同，質譜法的工具可以有不同的變體。與二維核磁共振不同的是，質譜儀能夠直接對水解產物進行分析。在氣相色譜-質譜法中，質譜儀與氣相色譜儀配合，對水解產物進行分離。從氣相色譜柱中洗脫出來的化合物被同時電離和分散。使用氣相色譜-質譜儀的好處是，不僅測量了同位素離子的質量，而且還有數個同位素碎片的質量光譜，大大增加了測量所得到的資訊。在液相色譜-質譜法中，用液相色譜儀代替氣相色譜。 然而，LC-MS在代謝通量分析中的應用並不常見。使用質譜技術的缺點是，對於氣相色譜法來說，樣品必須透過化學衍化製備以獲得帶電分子。有許多化合物用來衍生樣品。DMFDMA和MTBSTFA是兩個用於衍生氨基酸的化合物的例子。放射性同位素標記.放射同位素標記是一種用於跟蹤一個物質樣本透過一個系統的技術，這種物質是透過在其化學組成中加入放射性核素來標記的。當這些放射性同位素衰變時，它們的存在可以透過探測發出的輻射來確定。 放射性同位素標記是一種特殊的同位素標記。為此目的，一種特別有用的放射性衰變是正電子發射。 當正電子與一個電子發生碰撞時，它會釋放出兩個高能量光子向相反的方向運動。 如果正電子是在固體內產生的，那麼它很可能在移動一毫米以上之前就這樣湮滅了。如果這兩個光子都能被探測到，那麼衰變事件的位置就可以非常精確地確定。嚴格地說，放射性同位素標記只包括實驗人員人為引入放射性的情況，但是對一些自然現象也可以進行類似的分析，例如放射性定年法。蛋白質組學的應用.在蛋白質組學中，研究由基因組表達的一整套蛋白質，識別疾病的生物標記可能涉及到穩定同位素標記的細胞培養，其中同位素標記形式的氨基酸可以用來估計蛋白質代謝水平。在蛋白質重組中，重組蛋白質需要被大量產生，而同位素標記就是測試相關蛋白質產量的有效工具。為了提高標記蛋白質的產量，降低同位素標記介質的成本，一種替代的方法主要是先使用未標記的介質來增加細胞的質量，然後再用少量的同位素介質來進行標記。同位素標記的另一個應用是針對體外細胞增殖，測定細胞DNA的合成，一般使用H3-胸腺嘧啶標記來比較細胞中的DNA合成模式或序列特徵。生態系統過程分析中的應用.同位素示蹤劑可用來檢測自然系統中的過程，特別是陸地和水生生態系統。在土壤科學中，使用15N示蹤劑研究氮迴圈十分普遍；而13C和14C，分別作為穩定性和放射性同位素，一般用於研究有機化合物的轉換和自養生物對二氧化碳的固定。例如，Marsh等人於2005年使用雙標記。海洋學的應用.在海洋學中，同位素示蹤劑也被廣泛用來研究一系列的過程。這裡所使用的同位素通常是自然形成的，其形成和衰變速率都很明確。然而，人工同位素也可能很有利用價值。研究人員測量不同地點和不同時間的同位素比率，以推斷海洋物理過程的資訊。顆粒傳輸.海洋是一個巨大的粒子運輸網路，而釷同位素可以幫助研究人員破譯物質的垂直和水平運動。釷234在海洋中有一個固定的、明確的產生速度，半衰期為24天，其含量隨深度呈線性變化。因此，這個線性模式的任何變化都可以體現為釷234粒子的傳輸。例如，在表面水層中同位素比值很低，但幾米以下就達到一個較高的值，就表明向下方向有一個垂直通量。此外，釷同位素可以追溯到一個特定的深度，以研究粒子的橫向運輸。迴圈.區域性系統內的迴圈，如海灣、河口和地下水，可以用鐳同位素進行檢測。 鐳223的半衰期為11天，可自然產生在河流和地下水源的特定地點。隨著河水進入一個海灣或河口，鐳的同位素比例將隨之降低。透過在許多不同的地點測量鐳223的數量，就可以發現一個迴圈模式。同樣的過程也可以用來研究地下水的運動和排放情況。各種鉛的同位素可以用來研究全球範圍內的迴圈。 不同的海洋有不同的同位素特徵。這是由於不同海洋中沉積物和岩石的同位素比例的差異。由於不同的鉛同位素的半衰期為50-200年，因此沒有足夠的時間使同位素比率在整個海洋均勻化。因此，可以利用鉛同位素比的精確分析來研究不同海洋的環流。