蛋白酶體

蛋白酶體是一種巨型筒狀蛋白質複合體，主要作用是透過打斷肽鍵來實現降解細胞不需要的或受到損傷的蛋白質。能夠發揮這一作用的酶被稱為蛋白酶。蛋白酶體是細胞用來調控特定蛋白質的濃度和除去錯誤摺疊蛋白質的主要機制。需要被降解的蛋白質會先被一個稱為泛素的小型蛋白質所標記。這一標記反應是被泛素連線酶所催化。一旦一個蛋白質被標記上一個泛素分子，就會引發其它連線酶加上更多的泛素分子；這就形成了可以與蛋白酶體結合的“多泛素鏈”，從而將蛋白酶體帶到這一標記的蛋白質上，開始其降解過程。經過蛋白酶體的降解，蛋白質被切割為約7-8個氨基酸長的肽段；這些肽段可以被進一步降解為單個氨基酸分子，然後被用於合成新的蛋白質。目前所有已知的真核生物和古菌皆有蛋白酶體，在一些原核生物中也存在。在真核生物中，它位於細胞核和細胞質中。從蛋白質結構看，蛋白酶體是一桶狀複合體，包括一個由四個堆積在一起的環所組成的“核心”進行控制；調節顆粒可以識別連線在蛋白質上的多泛素鏈標籤，並啟動降解過程。包括泛素化和蛋白酶體降解的整個系統被稱為“泛素-蛋白酶體系統”。蛋白酶體降解途徑對於許多細胞過程是必不可少的，包括細胞週期，基因表現的調節，與氧化應激反應等。細胞內的蛋白酶體降解和泛素蛋白水解途徑的作用的重要性在2004年的諾貝爾化學獎得到承認，阿龍·切哈諾沃、阿夫拉姆·赫什科和歐文·羅斯三人分享該獎。發現.在發現泛素-蛋白酶體系統之前，細胞中的蛋白質降解被認為主要依賴於溶酶體，一種膜包裹的囊狀細胞器，內部為酸性環境且充滿了蛋白酶，可以降解並回收外源蛋白質以及衰老或損傷的細胞器。然而，在對網織紅血球的研究中發現，在缺少溶酶體的情況下，ATP依賴的蛋白質降解依然能夠發生；這一結果提示，細胞中存在另一種蛋白質降解機制。1978年，一些研究者發現這一新的降解機制有多種不同的蛋白質參與，在當時被認為是新的蛋白酶。隨後在對組蛋白修飾的研究工作中發現，組蛋白髮生了意外的共價修飾：組蛋白上的一個賴氨酸殘基與泛素蛋白C-端的甘氨酸殘基之間形成了共價連線，但其對應的功能未知。而後又發現先前鑑定的一個參與新的降解機制的蛋白質，ATP依賴的蛋白質水解因子1，實際上就是泛素。這些早期的工作導致了1970年代末和1980年代初，泛素-蛋白酶體系統在以色列技術工程學院歐文·羅斯的實驗室做訪問研究期間，赫什科提出了關鍵的概念性想法，而羅斯後來並沒有對自己在其中的貢獻加以強調。由於他們在發現泛素-蛋白酶體系統上的貢獻，這三人一起分享了2004年度的諾貝爾化學獎。雖然1980年代中期，已經有電子顯微學資料顯示蛋白酶體的堆積環結構，但直到1994年，第一個蛋白酶體核心顆粒的原子解析度結構才透過X射線晶體學獲得解析。至2000年，研究者用酵母中的20S核心顆粒與錐蟲的11S調節顆粒構造了異源蛋白酶體複合物，並解析了這一複合物的結構。但截至2007年，還沒有獲得核心顆粒與真核生物中更為常見的19S調節顆粒的蛋白酶體複合物結構。結構和組成.蛋白酶體的組分通常根據它們的斯維德伯格沉降係數蛋白也可以單獨作為啟用蛋白來調控20S顆粒的開啟。20S核心顆粒.不同的生物體中，20S核心顆粒中亞基的數量和差異性都有所不同；就亞基數量而言，多細胞生物比單細胞生物要多，真核生物比原核生物多。所有的20S顆粒都由四個堆積的七元環所組成，這些環結構則是由兩種不同的亞基構成：α亞基為結構性蛋白，而β亞基則發揮主要的催化作用。外部的兩個環，每個環都含有七個α亞基，一方面作為調節顆粒的結合部，另一方面發揮“門”的作用，阻止蛋白質不受調控地進入核心顆粒的內部。內部的兩個環，每個環都含有七個β亞基，且包含蛋白酶活性位點，用於蛋白質水解反應。蛋白酶體的大小在不同物種之間相當保守，其長和寬分別為約150 Å和115 Å。其內部孔道寬為近53 Å，而入口處則只有13 Å的寬度，這就提示蛋白質要進入其中，需要先被至少部分去摺疊。在古菌，相對於正常形式的蛋白酶體，其底物特異性發生了變化。19S調節顆粒.真核生物中的19S顆粒是由19個蛋白質組成的，並可以被分成兩個部分：一個由10個蛋白質組成的可以與20S核心顆粒上的α環直接結合的基底，和一個由9個蛋白質組成的結合多泛素鏈的蓋子。其中，10個基底蛋白質中的6個具有ATP酶活性。19S和20S顆粒的結合需要ATP先結合到19S顆粒上的ATP結合位點。ATP的水解對於蛋白酶體降解一個連線泛素的緊密摺疊的蛋白質是必不可少的，而ATP水解所產生的能量主要是用於蛋白質的去摺疊、核心顆粒的孔道開放還是兩者皆有，則還不清楚。截止到2006年，26S蛋白酶體的結構還沒有獲得解析。19S顆粒的每個組分都有它們自己的調控作用。一個近期鑑定出的癌蛋白是19S顆粒的組分之一，可以與細胞週期蛋白依賴性激酶CDK4緊密結合，並且透過與泛素連線酶的結合，在識別泛素化的P53蛋白中發揮作用。Gankyrin具有抗凋亡作用，其被發現在一些型別的腫瘤細胞中過表達。11S調節顆粒.20S核心顆粒也可以與第二種調節顆粒，即11S顆粒相結合。11S調節顆粒又被稱為PA28或REG。它是七聚體結構，不包含任何ATP酶，能夠促進短肽而不是完整的蛋白質的降解。這可能是因為由11S顆粒與核心顆粒所組成的複合物無法將大的底物去摺疊。11S顆粒的調控機制與19S顆粒的機制類似，是透過其亞基的C末端結合核心顆粒，並誘發α環發生構象變化，從而開啟20S核心顆粒的“門”，使得底物蛋白質可以進入核心顆粒。11S顆粒的表達受γ干擾素的誘導，並且負責與免疫蛋白酶體的β亞基一起生成結合到主要組織相容性複合體上的肽段。PA200/Blm10.11S和19S調節顆粒都是多亞基的複合物，而實際上真核生物中還存在著以單個蛋白結合20S顆粒的調節蛋白──PA200或Blm10。PA200的分子量高達200kDa，其主要定位於細胞核中，可以直接結合並激活20S顆粒。PA200可能參與了DNA雙鏈斷裂的修復。組裝機制.蛋白酶體的組裝是一個十分複雜的過程，這是因為必須將所有的數量眾多的亞基正確地結合到一起才能形成一個有活性的核心顆粒複合物。β亞基被合成後，其N末端帶有“前肽”；在組裝20S顆粒的過程中，“前肽”透過翻譯後修飾作用以暴露出活性位點。整個組裝過程雖然複雜，卻也十分有序。首先，將α亞基組裝為七元環，為對應的前β環提供模板，然後完成前β環的組裝，這樣一個七亞基的前β環和一個七亞基的α環就形成了半個核心顆粒。對於α環的組裝機制，目前還沒有定論。接著，兩個半個核心顆粒之間的兩個β環相結合，並觸發蘇氨酸依賴的“前肽”的自降解，從而暴露出活性位點，這就組裝成了一個有活性的20S核心顆粒。β環之間的這種相互作用主要是由保守的α螺旋殘基之間的鹽橋和疏水相互作用來介導的；而透過突變這些保守殘基，可以破壞蛋白酶體的組裝，從而從另一方面證實了這些殘基對於組裝的重要性。對於19S調節顆粒的組裝和成熟過程的瞭解較少。目前的看法認為19S調節顆粒是由兩個不同的部分，即含ATP酶的基底部分和泛素識別的蓋子部分組裝而成。其中，基底部分中的六個ATP酶可以透過捲曲螺旋的相互作用以配對的方式結合在一起。調節顆粒中19個亞基的這樣的組裝順序很可能是一種調控機制，用於阻止在組裝完成之前將活性位點暴露出來。蛋白質降解過程.步驟1：泛素化和定靶.需要被蛋白酶體降解的蛋白質會先被連線上泛素作為標記，即蛋白質上的一個賴氨酸與泛素之間形成共價連線。這一過程是一個三酶級聯反應，即需要有由三個酶催化的一系列反應的發生，整個過程被稱為泛素化訊號通路。在第一步反應中，泛素活化酶。因此，是E3使得這一系統具有了底物特異性。E1、E2和E3蛋白的數量依賴於生物體和細胞型別，人體中就存在大量不同的E3蛋白，這說明泛素-蛋白酶體系統可以作用於數量巨大的靶蛋白。多泛素化後的蛋白質是如何被蛋白酶體所識別的，還沒有完全弄清。泛素受體蛋白的N末端具有一個類泛素結構域，以及一至多個泛素結合結構域。類泛素結構域可以被19S調節顆粒所識別，而泛素結合結構域可以透過形成三螺旋束來結合泛素。這些受體蛋白可能能夠結合多泛素化的蛋白質並將其攜帶到蛋白酶體，而關於這種結合的特異性和調控機制還不清楚。但最近有研究者發現，調節顆粒上的亞基Rpn13可以發揮泛素受體的功能。泛素蛋白自身由76個殘基所組成，以“泛素”為名是因為它在生物體中廣泛存在：具有高度保守的序列並且存在於所有已知的真核生物體中。真核生物中編碼泛素的基因以串聯重複的方式排列，這可能是因為大量轉錄的需要，為細胞生產足夠多的泛素。有人提出泛素是目前發現的進化速度最慢的蛋白質。步驟2：去摺疊和移位.泛素化後的蛋白質，而移位必須發生在去泛素化之後。但目前對於底物蛋白的去泛素化和去摺疊機制還不瞭解。在整個降解反應過程中，那一步是限速步取決於底物蛋白的類別；對於一些蛋白質，去摺疊過程是限速步，而對於另一些蛋白質，可能是去泛素化為限速因子。至於哪些底物蛋白在移位之前必須去摺疊，還未有結論，而牢固的三級結構和一些特殊的非區域性相互作用，如二硫鍵，能夠抑制降解。由α亞基所形成的“門”可以阻止長於四個殘基的多肽進入20S顆粒的內部。在識別步驟開始前結合上的ATP分子在移位發生前被水解，而對於水解產生的能量是用於蛋白質去摺疊還是“門”的開啟還有爭議。26S蛋白酶體在存在無法水解的ATP類似物的情況下，依然可以降解去摺疊的蛋白質，但卻無法降解摺疊的蛋白質；這一結果說明ATP水解所產生的能量至少部分被用於蛋白質去摺疊。在19S帽子處於ATP結合狀態時，去摺疊的底物蛋白可以由促進擴散作用，傳遞透過開啟的“門”。球蛋白去摺疊的機制是基本類似的，但在一定程度上也取決於蛋白質的氨基酸序列。研究者發現含有較長的甘氨酸或丙氨酸序列可以抑制去摺疊，從而降低蛋白酶體的降解效率；其結果是生成含有部分去摺疊蛋白質的混合物，這可能是由於ATP水解和去摺疊步驟之間的脫節所導致的。自然界中的一些蛋白質也有這樣的甘氨酸-丙氨酸重複序列存在，如蠶絲中的；值得一提的是，特定的人類皰疹病毒基因的表達產物也含有這樣的序列，透過抑制蛋白酶體的作用，阻止了抗原呈遞到主要組織相容性複合體上，從而有助於病毒的繁殖。步驟3：蛋白質的降解.蛋白質的降解由20S核心顆粒中的β亞基進行，其機制被認為是蘇氨酸依賴的親核攻擊。這一機制可能需要有一個結合的水分子參與活性的蘇氨酸上羥基的去質子化。降解發生在核心顆粒中間的兩個β環內的孔道裡，一般不生成部分降解的產物，而是將底物蛋白完全降解為長度一定的肽段；肽段的長度一般為7-9個殘基，但根據生物體和底物蛋白的不同，長度範圍可以從4-25個殘基不等。決定分解產物中肽段長度的機制，目前還沒有完全弄清。雖然具有催化活性的三個β亞基具有共同的降解機制，但它們對於底物的特異性卻略有不同，分別為類胰凝乳蛋白酶型、類胰蛋白酶型和肽谷氨醯基肽水解型。這種對於底物特異性的差異是來自於靠近活性位點的區域性殘基與底物之間的相互作用的不同。每一個具有催化活性的β亞基也都含有一個降解所必需的保守的賴氨酸。雖然蛋白酶體通常生成非常短的降解片斷，但在一些情況下，這些降解產物自身是具有生物學活性的功能分子。特定的轉錄因子，包括哺乳動物的NF-κB複合物中的一個組分，合成後是以無活性的前體分子存在，在經過泛素化和蛋白酶降解後，才轉變為活性分子。這種降解需要蛋白酶體剪下蛋白質的中間部分，而不是通常情況下的從蛋白質的一端開始的剪下。有人提出，需要被剪下的中間部分為一個長的，位於蛋白表面，從而可以作為蛋白酶體的底物進入其內部孔道，而蛋白質的其他部分依然在孔道外，並不會被降解。在酵母蛋白中也發現了類似的現象；這種選擇性降解被稱為“受調控的泛素-蛋白酶體依賴的剪下”。補充：非泛素依賴的降解.雖然大多數的蛋白酶體的底物必須在降解之前被泛素化，但仍然有一些例外的情況，尤其是在蛋白酶體參與蛋白質的翻譯後處理過程中。一個主要的例子是蛋白酶體透過將蛋白剪下為蛋白來啟用NF-κB。一些由於存在而被推測具有不穩定性的蛋白質也可以透過非泛素依賴的途徑被降解。鳥氨酸脫羧酶是最著名的非泛素依賴途徑中蛋白酶體的底物。對於關鍵的細胞週期調控因子，如P53蛋白的非泛素依賴的降解機制已經有報道，雖然p53蛋白也可以透過泛素依賴的途徑被降解。此外，在一定的細胞應激條件下，結構不正常、錯誤摺疊或者過度氧化的蛋白質也都會進入非泛素依賴的和非19S顆粒依賴的降解途徑。蛋白酶體的進化.20S蛋白酶體在真核生物中廣泛存在且必不可少。一些原核生物，包括許多古菌和細菌中的放線菌也含有20S蛋白酶體的同源體，即大多數細菌都含有的熱休克基因'和'，這兩個基因所編碼的蛋白質可以形成雙層環狀多聚體和ATP酶。一些研究者認為HslV蛋白很可能類似於20S蛋白酶體的祖先。一般來說，HslV蛋白對於細菌不是必要的，且並非所有的細菌都含有這一蛋白，而原生生物同時含有20S蛋白酶體和HslV蛋白系統。序列分析顯示，催化性的β亞基在進化過程中分化得比結構性的α亞基要早。表達20S蛋白酶體的細菌中，其β亞基與古菌以及真核生物的β亞基具有高度的序列相似性，而α亞基的序列相似程度則低得多。細菌中存在20S蛋白酶體可能是基因水平轉移的結果，而真核生物中各亞基的分化則應是多次基因重複的結果。作用.細胞週期控制.細胞週期程序是由一系列細胞週期蛋白依賴性激酶來啟用。有絲分裂的細胞週期蛋白，在細胞中只有幾分鐘壽命，是所有已知的細胞內蛋白中壽命最短的。在CDK-cyclin複合物行使了它的功能之後，複合物中的cyclin就會被多泛素化並由蛋白酶體降解，從而保證了細胞週期的正常運轉。尤其是在細胞退出有絲分裂期時，作為調控組分的需要從有絲分裂促進因子上脫落下來，而這一解離過程依賴於蛋白酶體的參與。細胞週期檢控點，如G1期和S期之間的後限制點檢查，也需要蛋白酶體降解，而cyclin A的泛素化由一個名為後期促進複合物可以在G1期到S期的過渡期中抑制SCF複合物的活性，因此透過泛素化Skp2蛋白，APC蛋白就可以啟用SCF複合物。調控植物生長.在植物中，生長素或植物激素的作用是調控植物生長的方向和向性，它們透過細胞訊號通路來誘導一系列轉錄因子抑制蛋白家族的轉錄因子的抑制就被解除，從而誘導ARF基因的表達。ARF被啟用所導致的結果因植物型別和發育水平的不同而有所差異，但都參與了對根和葉脈生長的指導。ARF蛋白和Aux/IAA蛋白之間配對的特異性被認為是ARF的去抑制作用具有反應特異性的原因。細胞凋亡.細胞內外的訊號都能夠誘導細胞凋亡或程式設計性細胞死亡。其結果是細胞內部的組分發生解構，這主要是由特定的蛋白酶半胱天冬酶來完成，但同時蛋白酶體也可能在細胞凋亡過程中扮演了多種重要角色。蛋白酶體參與細胞凋亡程序的推測是基於凋亡發生前，細胞中泛素化蛋白質以及E1、E2、E3在數量上的增加這一現象；並且，在細胞凋亡過程中，原本定位於細胞核的蛋白酶體被發現能夠移位到調亡小泡的外膜。蛋白酶體的抑制作用可以影響不同型別細胞的凋亡誘導，在大多數已被研究的細胞型別中，抑制蛋白酶體可以促進細胞凋亡。但一般而言，蛋白酶體並非是細胞凋亡所必需的因子。而且，對於一些細胞系，特別是原代培養的靜止和分化的細胞，如胸腺細胞和神經元細胞，暴露於蛋白酶體抑制劑反而阻止了細胞的凋亡。這一作用機制目前還不清楚，但有人推測這種現象只特異性地發生於靜止狀態的細胞或者這是由於促細胞凋亡激酶的活性差異所導致的。由於蛋白酶抑制劑可以誘發處於快速分裂中的細胞的凋亡，因此一些蛋白酶抑制劑已經被開發並作為化療藥品被用於治療癌症。細胞應激反應.當細胞應激，其自身可以透過抑制與其對應的E2之間的相互作用而被調控。對於氧化損傷的蛋白質，也有相似的機制可以促使它們被蛋白酶體系統降解。例如，定位於細胞核中的蛋白酶體是由PARP蛋白所調控，可以降解被不正確氧化的組蛋白。被氧化的蛋白質往往會在細胞中形成巨大的兩性聚合物，而這種聚合物可以被20S核心顆粒直接降解，而不需要19S調節顆粒的參與，也不需要ATP水解和泛素標籤。但高水平的氧化損傷增加了蛋白片斷之間互相連線的程度，所形成的聚集物就能夠抵抗蛋白酶體的降解。這種高氧化度的聚集物的數量和大小與衰老程度相關。一些晚髮型神經退行性疾病的毒性變得更加敏感。在免疫系統中的作用.蛋白酶體直接參與了適應性免疫系統的運作，並在其中扮演著關鍵角色。肽類抗原是由主要組織相容性複合體，參與T細胞的發育調控。MHC型別I蛋白的配基結合強度取決於配基C末端的組成，因為肽段配基是透過氫鍵和與MHC表面的"B pocket"近接觸來結合的。許多MHC型別I蛋白趨向於結合疏水性殘基，而免疫蛋白酶體複合物就可以更多地生成具有疏水性C末端的肽段。由於蛋白酶體參與生成活性形勢的NF-κB，因此，蛋白酶體被認為與炎症反應和自體免疫性疾病相關。蛋白酶體活性水平的提高與包括紅斑性狼瘡和類風溼性關節炎在內的自體免疫性疾病相關。蛋白酶體抑制劑.蛋白酶體抑制劑對於人工培養的細胞具有有效的抗腫瘤活性，透過降解受調控的促生長細胞週期蛋白來誘導腫瘤細胞的凋亡。這種可以選擇性地誘導腫瘤細胞凋亡的方法被證明在動物模型以及人體試驗中都非常有效。硼替佐米是第一種用作化學治療藥物的蛋白酶體抑制劑，由開發，市場名稱為Velcade。硼替佐米主要被用於多發性骨髓瘤的治療值得一提的是，多發性骨髓瘤會導致血清中蛋白酶體水平的提高，而成功的化療可以將蛋白酶體的水平恢復到正常範圍。動物研究顯示硼替佐米可能對死亡率極高的胰腺癌也有顯著的臨床效果。對於硼替佐米在治療B細胞相關癌症的臨床前和早期臨床研究已經開始，特別是一些型別的非霍奇金氏淋巴瘤。利托那韋，市場名稱為Norvir，是用於治療艾滋病的一種蛋白酶抑制劑。近期的研究發現，利托那韋不僅可以抑制蛋白酶，對蛋白酶體也有抑制作用，特別是對類胰凝乳蛋白酶型的蛋白酶體，但對類胰蛋白酶的蛋白酶體則有部分的促進作用。對於動物模型的研究表明利托那韋可能對神經膠質瘤細胞的生長有抑制作用。將蛋白酶體抑制劑應用於自體免疫性疾病也大有前景。目前這一方面的研究主要是利用動物模型來進行。例如，在對植有人類皮膚的小鼠的研究中發現，用蛋白酶體抑制劑處理過後，原本因患牛皮癬而受損的皮膚所有減少；在一些齧齒動物模型中發現，蛋白酶體抑制劑對於哮喘也有一定的治療作用。蛋白酶體的標記和抑制作用也被用於在實驗室中針對細胞中蛋白酶體活性所進行的“體外”研究。實驗室中最常用的抑制劑為，一種由鏈黴菌合成的天然產物。帶有熒光基團的抑制劑也已經被開發應用於特異性標記組裝好的蛋白酶體上的活性位點。擴充套件閱讀.