青蒿素

青蒿素及其衍生物是現今所有藥物中起效最快的抗惡性瘧原蟲瘧疾藥。 使用包含青蒿素衍生物在內的青蒿素聯合療法是現今全球範圍內治療惡性瘧原蟲瘧疾的標準方法。青蒿素提取自黃花蒿，1969年－1972年間，中國科學家屠呦呦參與的523課題組發現並從黃花蒿中提取了青蒿素，屠呦呦也因此獲得2011年拉斯克臨床醫學獎和2015年諾貝爾醫學獎。化學上，青蒿素是少見的一種含有過氧橋的類化合物。普遍認為這種過氧化結構與青蒿素的抗瘧活性有關。已知其他多種天然含有過氧橋的化合物。世界衛生組織明確指出不要單獨使用青蒿素進行治療，因為有研究指出這會增加瘧原蟲的耐藥性。已證明使用包括青蒿素在內的多藥聯合療法治療瘧疾同時具有很好的效果和耐受性。使用青蒿素來治療間日瘧原蟲瘧疾也越來越普遍，並且使用其來治療癌症也是近來研究的課題之一。醫療用途.單純性瘧疾.單獨青蒿素治療瘧疾使用會導致瘧原蟲復發，需要與其他藥物配合使用清除寄生蟲。 世界衛生組織正向製藥商施壓，使其停止向市場供應純青蒿素，以免瘧原蟲對青蒿素產生抗藥性。作用機制.青蒿素無論在體內和體外的實驗中均對瘧疾有很好的殺滅效果。青蒿素的作用機制尚不十分清楚，主要是干擾瘧原蟲的表膜-線粒體功能。青蒿素透過影響瘧原蟲紅內期的超微結構，使其膜繫結構發生變化。由於對食物泡膜的作用，阻斷了瘧原蟲的營養攝取，當瘧原蟲損失大量胞漿和營養物質，而又得不到補充，因而很快死亡。其作用方式是透過其內過氧化物(雙氧)橋，經血紅蛋白分解後產生的遊離鐵所介導，產生不穩定的有機自由基及/或其他親電子的中介物，然後與瘧原蟲的蛋白質形成共價加合物，而使瘧原蟲死亡。 2015年，Wang等人利用化學蛋白質組學的技術手段合成了基於青蒿素結構的化學探針，準確的鑑定出了青蒿素在瘧原蟲中的100多個蛋白靶點，並且確定了青蒿素的啟用依賴於瘧原蟲中生成的大量血紅素。自由基的抗瘧作用.青蒿素及其衍生物化學結構中的過氧橋這一基團是抗瘧作用中最重要的結構。改變過氧基團，青蒿素的抗瘧作用消失。青蒿素在體內活化後產生自由基，繼而氧化性自由基與瘧原蟲蛋白質中的活性殘基形成共價鍵，使蛋白失去功能導致瘧原蟲死亡。另一種觀點認為青蒿素轉化為碳自由基發揮烷化作用使瘧原蟲的蛋白烷基化。目前這一觀點被廣泛認可。對紅內期瘧原蟲的直接殺滅作用.青蒿素選擇性殺滅紅內期瘧原蟲是透過影響表膜-線粒體的功能，阻斷宿主紅細胞為其提供營養，從而達到抗瘧的目的。同時青蒿素對瘧原蟲配子體具有殺滅作用。抑制 PfATP6 酶的抗瘧作用.有研究推測青蒿素及其衍生物對 。青蒿素抑制 PfATP6，使瘧原蟲胞漿內鈣離子濃度升高，引起細胞凋亡，從而發揮抗瘧作用。耐藥性.有報道稱早在2003年和2004年，首例以青蒿素為基礎的綜合療法的耐藥性案例就在泰國柬埔寨邊界出現。2005年以來，治療瘧疾最有效的藥物青蒿素已在柬埔寨、緬甸、越南、寮國以及泰國邊境地區的越來越多患者中失效。不良反應.少數部分病人可能會出現輕度噁心、嘔吐、腹瀉，存在胚胎毒性，孕婦慎用。性質.物理性質.青蒿素在常溫下是一種無色針狀晶體，密度1.3g/cm3，比旋光度+68°；其質譜具有質荷比為250的峰，對應的物種為分子脫去過氧橋後形成的分子離子。化學性質.青蒿素是一種內酯，因而可以與鹽酸羥胺發生反應，產物遇鐵離子顯色。雖然青蒿素含有過氧鍵，但相較於其他的過氧化物，青蒿素化學性質較為穩定，加熱到熔點仍不分解。青蒿素可被三苯膦或碘離子定量地還原，這一反應可用於定量分析。在常壓和鈀-碳酸鈣催化下，青蒿素的過氧鍵可被氫氣還原，生成氫化青蒿素。室溫下以碳酸鉀甲醇溶液處理青蒿素一小時，酸化後可以得到一種含有環氧基團的五元環內酯。製法.青蒿素在黃花蒿中的生物合成.黃花蒿分佈地域狹窄，青蒿素含量偏低，中國以外地區野生黃花蒿因青蒿素含量太低而沒有商業開發價值。全合成.1982年，羅氏公司的研究員G.Schmid和W.Hofheinz以薄荷醇為原料首次完成了青蒿素全合成。稍後，上海有機所的周維善等人以香草醛為原料完成了這一全合成。至2003年已有十餘種青蒿素全合成路線。這些路線的起始物包括薄荷酮、3-蒈烯和環己烯酮。從逆合成分析的角度看，青蒿素的一個特點是它的結構中含有一個1,2,4-三噁唑環。該環實際上是一個縮酮-縮醛-內酯體系的一部分，可以由上圖中α-過氧羥基醛的烯醇醚或類似化合物經過氧化反應獲得。過氧化是青蒿素合成中的關鍵步驟，儘管不同的路線採用不同的方法引入過氧基團，這步反應產率總是比較低。Schmid等人、Ravindranathan等人、Lansbury等人、周維善等人利用烯醇醚在低溫、光照和光敏劑存在下與單線態的氧分子發生的[2+2]環加成反應產生四員環中間體，然後開環形成過氧化物；Avery等人則利用烯基矽烷的反常臭氧化反應引入過氧基團。用酸處理過氧化產物就可以得到青蒿素。;zh-hans:1989年，Nancy Acton等人發現，在低溫和光照下，二氫青蒿酸可以被兩當量的氧氣直接氧化成青蒿素，產率17%-32%。後續研究表明在反應中，二氫青蒿酸先與一分子單線態氧發生烯反應，生成過氧化物。再與另一分子三線態氧反應，開環生成α-過氧羥基醛，最後脫水產生青蒿素。不久這一反應就被用於改進青蒿素的全合成路線。化學合成青蒿素工藝繁雜，步驟多，成本高，易汙染，尤其引入過氧基團的光氧化或化學氧化的產率不理想，導致化學全合成工藝一直無法用於青蒿素的商業化生產。微生物工程菌全合成青蒿酸.黃花蒿與酵母合成萜類前體法呢基焦磷酸的酶促反應完全相同，只要在酵母中增加一個代謝支路就能讓酵母菌合成青蒿素。2006年，美國加州大學的Keasling小組將ADS 基因連同新克隆的細胞色素P450 單氧化酶基因，並將該基因連同ADS、CYP71AV1、CPR 基因一起匯入釀酒酵母，率先培育出能合成雙氫青蒿酸的酵母工程菌。酵母工程菌中未檢測到青蒿素的原因可能有兩個：一是釀酒酵母中單線態氧缺乏，雙氫青蒿酸合成後不能轉變成青蒿素；二是青蒿素未被油相環境隔離而與細胞成分發生烷基化反應，無法檢測到青蒿素。黃花蒿是如何避免青蒿素對本身的傷害呢？ Covello小組的研究顯示，青蒿素合成酶基因在黃花蒿葉片表面具有特殊腺體結構並充滿揮發油的腺狀毛囊細胞中高效表達，說明具有毒性的青蒿素隔離在油相腺毛中應該是一種進化的選擇。黃花蒿採取細胞分割槽和分相隔離的方式，合成並貯存具有細胞毒性的青蒿素，可用來殺滅獵食性害蟲；同時青蒿素前體在油相環境中更易發生化學催化反應。據測定，青蒿植株中的青蒿素含量比雙氫青蒿酸含量低5-10倍，最大可相差15倍。2013年4月25日出版的Nature雜誌發表了美國Keasling小組和加拿大Covello小組的兩國科學家撰寫的研究通訊《強效抗瘧劑青蒿素的高水平半合成生產》一文，報道了將酵母工程菌中青蒿素前體青蒿酸的發酵產量從1.6克/升提高到25克/升，並利用單線態氧成功地將青蒿酸轉化成青蒿素。發現歷史.20世紀60年代，越南戰爭時期，越南民主共和國軍隊受到瘧疾困擾。為此，北越向中國求援。於是，時任中國共產黨中央委員會主席的毛澤東和國務院總理的周恩來向中國大陸的頂級科學家下令，要求他們幫助研發相關藥物。當時，中國的形勢因為文化大革命的開展正開始逐漸失控，但是，由於命令來自毛澤東本人，該專案得以進行。1967年5月23日，「瘧疾防治藥物研究工作協作會議」召開，代號為523專案的抗瘧藥物研究正式工作開展。在接下來14年中，來自60所軍民機構的500位科學家參與了此專案。1969年1月21日，全國523辦公室白冰秋、張劍方二位正、副主任及辦公室田辛到衛生部中醫研究院中藥研究所從東晉葛洪《肘後備急方之治寒熱諸瘧方》中“青蒿一握，以水二升漬，絞取汁，盡服之”的記載中受到了啟發，認為溫度高有可能對青蒿有效成分造成破壞而影響療效，便由用乙醇提取改為用沸點比乙醇低的乙醚提取。1971年10月4日研究組取得青蒿中性提取物對鼠瘧、猴瘧100%瘧原蟲抑制率的突破：後來採用沸點更低的汽油提取法成功提取高質量青蒿素，印證了青蒿提取物的抗瘧效果與溫度有著非常重要的關係。1971年下半年北京中藥所對青蒿乙醚提取物對鼠瘧原蟲近期抑制率達100%。1972年3月的全國523會議上中醫研究院屠呦呦做了青蒿提取物的報告後，山東省寄生蟲病防治研究所採用本省黃花蒿的提取物進行鼠瘧試驗，於1972年10月21日在向全國523辦公室作了書面報告一切和屠呦呦的結果一致。1972年，在全國523辦公室的支援和協調下，北京中藥所經進一步實驗，屠呦呦科研組的倪慕雲設計了色譜柱分離的前處理，將青蒿乙醚提取物中性部分和聚醯胺混勻後，用47％乙醇滲濾，滲濾液濃縮後用乙醚提取濃縮後，編為91號，抗鼠瘧作用大幅度提高。在經過動物毒性試驗和少數健康志願者試服，未發現明顯毒副作用後，經全國523辦公室協調安排，於1972年8～10月到海南島昌江地區進行臨床試驗；又與解放軍302醫院合作，在北京也進行臨床療效觀察。經過共30例臨床試用，取得了比較滿意的結果：“1972年8-10月採用乙醚提取中性部分在昌江地區療效更明顯。對間日瘧平均退熱時間19小時6分，對外來人口惡性瘧平均退熱時間35小時59分，但短期內有原蟲復現。由於藥物體積較大，無法再加大劑量進行觀察，但發現大劑量組原蟲復現較小劑量組有所減少。臨床觀察藥物對胃腸道、肝、腎功能等未見明顯副作用，個別病人出現嘔吐、腹瀉現象，302醫院2例轉氨酶偏高病人服藥後轉氨酶繼續增高，但1-2周左右恢復正常。”在粗提物臨床觀察的同時，根據523辦公室要求，北京中藥所開展了青蒿素抗瘧有效單體的分離研究。1972年11月8日，屠呦呦領導的研究組從乙醚提取物中用色譜法分離提取出了多個單體成分，其中1個有抗瘧效果的無色晶體提取物定名為“青蒿素II”，並測定了熔點和分子量。1972年11月17日屠呦呦在北京召開的“523”全體大會上，報告了首次青蒿抗瘧30例全部有效的療效總結，引起523專案參與單位的極大關注。北京中藥所按照全國523辦公室指定的1973年研究計劃的要求，為了將分離的到的“青蒿素II”，儘快拿到現場進行臨床試用觀察，開展了臨床前動物毒性試驗，發現“青蒿素II”對實驗動物的心臟有明顯的毒性。因此，圍繞著“青蒿素Ⅱ”能否進行臨床試用產生了分歧。為此，北京中藥所領導和專家多次研究，全國523辦公室的領導聽取了該所的彙報後，經該所的3名科技人員試服，每天口服1次，連服3天，3人的總劑量分別是3.5g、5g、5g。經心電圖、腦電圖、肝功能、腎功能、胸透和血常規、尿常規檢查，均無明顯變化。其中1人出現四肢發麻感，12h後消失；1人心跳加速，30min後恢復正常。北京中藥所領導同意“青蒿素Ⅱ”進行臨床試驗。1972年，在印度新德里召開的第八屆國際天然產物化學會議上，南斯拉夫植物化學家宣讀了一份研究報告，稱他們從蒿屬植物中分離出一種新型倍半萜內酯，分子式為C15H22O5，分子量是282，與青蒿素結果相同。南斯拉夫科學家雖然搞對了分子式和分子量，但卻排錯了化學結構，誤以為是雙氫青蒿素的臭氧化物。該：1973年3月，北京中醫研究院中藥研究所的科技人員找到上海有機所，以測定青蒿素結晶的分子結構。經全國523辦公室協調，由山東省中醫藥研究所提供了10多克黃花蒿素。上海有機所避孕藥組的吳照華專職帶著北京中醫研究院中藥研究所的倪慕雲和後來的劉靜明、樊菊芬在實驗室進行工作。青蒿素結構測定中的一個主要困難是無法在15個碳骨架中安排5個氧原子，當時參加的人員都曾經考慮過這可能是一個過氧化合物，但是過氧化合物不穩定的傳統概念又否定了這一想法。當時全國本來沒有質譜儀，唯一一套還是北京某機關1974年剛剛引進的。赴京申請到高分辨質譜儀做實驗確定了分子量，再結合碳氫分析資料把分子式確定下來，這是一個有15個碳原子、22個氫原子和5個氧原子組成的化合物，證明它是一個倍半萜類化合物。 在質譜的分析中，他們發現一個特殊的碎片峰M-32，這明顯說明分子中存在兩個氧原子連在一起的情況。1975年4月下旬，在成都召開的全國“五二三專案”座談會上，北京醫學科學院藥物研究所於德泉報告了另一種抗瘧藥鷹爪素是一個過氧化合物。吳毓林獲悉這一訊息後，立即在吳照華的實驗室用青蒿素做了一個碘化鈉的定性試驗，明確了過氧基團的存在。在此基礎上，又用三苯膦的方法作了過氧基團的定量分析，進一步確證了青蒿素是一過氧化合物。根據青蒿素的波譜資料得出了青蒿素的片段結構，如內酯、3個甲基、4個次甲基等；根據南斯拉夫Stefanovic從同一植物中分得的青蒿素B的結構，提出其與青蒿素結構可能有相似性；從當時已收集了青蒿素單晶X－衍射的資料，正要進行計算的中科院生物物理所，提出了一個青蒿素初步結構作為他們計算時參考。最終1975年的12月生物物理所由單晶X－衍射得到了青蒿素的相對構型，根據青蒿素B的結構則可推測得絕對構型；1979年還是由生物物理所透過反常的X－衍射分析最終肯定了青蒿素的絕對構型。1973年4月，雲南省藥物研究所用乙醚提取分離直接得到有效單體，在1973年10月完成鼠瘧與猴瘧動物實驗，定名為“苦蒿結晶III”。1974年初，雲南藥物研究所用重結晶法得到純結晶。1973年11月，山東省中醫藥研究所從山東省當地的黃花蒿提取出有效單體，命名為“黃花蒿素”。1973年9-10月，由中醫研究院李傳傑為組長的臨床試驗組，再次到海南島昌江地區石碌進行“青蒿素Ⅱ”臨床試驗。全國523辦公室施凜榮和上海523辦公室副主任王連柱到海南現場工作，也到昌江瞭解的試用情況。該組在海南島昌江縣收治外來人口間日瘧和惡性瘧病人8例：間日瘧3例有效，惡性瘧5例未顯示明顯療效，其中1例雖即時有效，但6天內復發，2例無效，另2例因出現心臟毒性反應而終止了臨床試驗。1974年2月28號-3月1號，正在進行青蒿/黃花蒿抗瘧研究的北京、山東、雲南三地四家單位研究進展。北京中藥所的景厚德提出三地的提取到的晶體之間的不同之處：景厚德根據以上四點不一樣提出三家提取到的結晶可能不用完全一樣。1975年6月，北京中藥所重新開展青蒿素的臨床研究，與湖北健民製藥廠合作，用四川酉陽黃花蒿、雲南溶劑汽油法提取青蒿素，分別在海南或與湖北醫科院、武鋼和河南等單位合作進行的。1975年，上海有機化學所在化學結構的測定研究中，為證明青蒿素是一個過氧化物，進行氫化—還原等實驗，確定了青蒿素的內酯可被鈉硼氫還原，並保留其過氧基團。該還原物稱為“還原青蒿素”或“二氫青蒿素”，後命名為“雙氫青蒿素”。它是製備青蒿素衍生物的重要中間體。1978年，上海藥物所在青蒿素衍生物的研究中，發現其抗瘧效果比青蒿素更好。由於化學穩定性較差、溶解度低、抗瘧效果不及其他衍生物，當時尚未被列為進一步開發的物件。1976年523辦公室獲悉南斯拉夫科學家正在分離蒿屬植物的類似物質，估計就是正在研究的青蒿素。為了搶先發表論文，表明青蒿素是中國的原創發明，衛生部直屬的北京中醫研究院中藥研究所請示，經國家衛生部批准，在1977年《科學通報》第22卷第3期以“青蒿素結構研究協作組”的名義，首次發表了青蒿素化學結構及相對構型的論文，題目是《一種新型的倍半萜內酯——青蒿素》。青蒿素的結構完全公諸於世。1978年11月23-29日，全國523領導小組在江蘇省揚州市中僅列出6個主要研究單位——衛生部中醫研究院中藥研究所、山東省中醫藥研究所、雲南省藥物研究所、中國科學院生物物理所、中國科學院上海有機化學所、廣州中醫學院。1978年，蒿甲醚與青蒿琥酯分別研製成功。由於涉密，1979年這些研究成果才陸續發表，以“青蒿素結構研究協作組”和中國科學院生物物理研究所名義在《中國科學》1979年第11期發表的《青蒿素的晶體結構及其絕對構型》的論文以劉靜明、倪慕雲、樊菊芬、屠呦呦論文，更是公開了實驗研究和臨床研究的化學及藥理學資料。1980年12月5日，時任WHO總幹事的致函中國衛生部稱，鑑於氯喹抗性瘧的蔓延己達到不可遏制的地步，WHO迫切希望儘快在中國召開一次青蒿素及其衍生物的學術研討會。由WHO的瘧疾化療學術工作組製劑的質控標準、臨床前藥理毒性實驗資料和臨床I、II 、III期等6項課題的研究工作，WHO則向中方提供人員培訓、儀器裝置和必要的純種實驗動物等。。青蒿素的第一個新藥證書於1986年由衛生部頒發給中國中醫研究院中藥研究所，編號為衛藥證字X-01號。1987年，由桂林製藥廠、上海醫藥工業研究院、軍事醫學科學院微生物流行病研究所、中國中醫研究院中藥研究所、中國醫學科學院藥物研究所、中國科學院上海藥物研究所、廣西醫學院、廣西中醫學院研製的青蒿琥酯獲得新藥證書，編號為列入第12版“基本藥物目錄”。1987年，中國科學院上海藥物研究所和昆明製藥廠研製的蒿甲醚及其注射液獲得新藥證書，編號分別為衛藥證字X-14號。1997年，蒿甲醚油針劑被WHO列入第9版“基本藥物目錄”。1989年12月，“抗瘧新藥——青蒿琥酯”獲得國家發明三等獎。軍事醫學科學院以本芴醇與蒿甲醚研製的複方蒿甲醚於1992年獲得新藥證書，編號是衛藥證字X-23號。複方蒿甲醚於2002年被WHO列入第12版“基本藥物目錄”。從1985年中國開始實行新藥評審規定到1995年，總共批准一類新藥14個，其中青蒿素及其衍生物類抗瘧新藥就佔了7個。1996年12月，中國科學院上海藥物研究所的“抗瘧新藥——蒿甲醚”發明獲得國家發明三等獎。