一氧化碳脫氫酶

一氧化碳脫氫酶的反應或其逆反應，在這些微生物的代謝途徑中扮演著關鍵的角色。CO + H2O ⇌ CO2 + 2 H+ + 2 e−不同一氧化碳脫氫酶具有不同的結構和催化機理。需氧細菌中的一氧化碳脫氫酶是一類含鉬結合形成雙功能酶，共同發揮作用，將一氧化碳和二氧化碳轉化為重要的代謝中間物乙醯輔酶A。由於一氧化碳脫氫酶能夠高效地催化對動物和人體有很高毒性的一氧化碳氧化為二氧化碳，因此對於其催化機理的研究有助於治理環境中的一氧化碳汙染。分類.一氧化碳脫氫酶可以被分為兩大類：存在於需氧微生物中的Mo-Fe-黃素，因此分別稱這兩類酶為Mo-CODH和Ni-CODH。Mo-CODH對CO有很高的親和力， 適合於除去環境中痕量的一氧化碳氣體；而就催化活性而言，Ni-CODH則是Mo-CODH的近1000倍。Mo-CODH.Mo-CODH存在於一類被稱為一氧化碳自養菌和相同的亞基組成。在一氧化碳自養菌中，除少量定位於細胞質外，大多數的Mo-CODH連線在細胞質膜的內表面上， 從而有利於其與同樣連在內膜上的其生理條件下的電子受體——細胞色素b561之間進行電子傳遞。 在Mo-CODH中，Mo結合在molybdopterin胞嘧啶二核苷酸家族。 以下以研究較多的"O. carboxidovorans"中的Mo-CODH為例進行詳述。亞基組成.Mo-CODH由L；S亞基屬於鐵硫蛋白，結合了兩個[2Fe-2S]簇。含有兩個[2Fe-2S]簇的S亞基從結構上可以被分為N端和C端兩個結構域，這兩個結構域各結合了一個[2Fe-2S]簇。兩個鐵硫簇之間的距離約為12Å，在可以進行電子傳遞的最長距離大約9 Å，因此其功能被認為是在鐵硫簇I和FAD分子之間傳遞電子。 這兩個結構域的摺疊型別和結合鐵硫簇II的氨基酸序列普遍存在於其他含Mo的羥化酶家族成員中。M亞基由N端、中間和C端三個結構域組成。其FAD分子的結合位點為兩段特徵性的“雙甘氨酸”序列，在含Mo的羥化酶家族中非常保守。 其中一個雙甘氨酸序列位於N端結構域的一段loop上，與FAD分子上的焦磷酸根相互作用。另一個雙甘氨酸序列則位於中間結構域的一個小段α螺旋上與FAD分子相互作用。FAD分子結合在N端和中間結構域之間的縫隙中，且FAD的結合需要透過M亞基與L和S亞基作用所產生的構象變化來實現，遊離的M亞基沒有FAD的結合活性。 M亞基作為鐵硫簇II與細胞色素b561之間電子傳遞的中間體，一方面接受來自鐵硫簇II的電子，另一方面向細胞色素b561提供電子。分子量最大的L亞基不僅包含有活性位點，也在LMS複合物形成及Mo-CODH二體化中起主要作用。L亞基含有N端結構域和C端結構域，而Mo原子就定位在這兩個結構域的結合面上。MCD輔因子的一端連線Mo的部分與活性中心的[CuSMoO2]簇一起結合在N端結構域的凹槽中；而輔因子的另一端則插入C端結構域的裂縫中。L亞基的N端結構域與M和S亞基相互作用以形成LMS複合物；而C端結構域則主要參與形成Mo-CODH二體結構。活性位點.Mo-CODH的活性位點位於L亞基，並被包埋於蛋白質內部，但從外部可以透過一個約17Å長的通道到達活性位點。這一通道由疏水殘基構成，從而允許CO分子進入而防止極性溶劑分子來連線，結合在Cys388的Sγ原子上將此金屬簇[CuSMoO2]與L亞基共價連線的是Cu而不是Se。 而MCD是透過其上的兩個S原子與Mo離子形成配位連線。這種由Mo和Cu兩種金屬組成的雙核金屬簇非常獨特，因為所有已知的含molybdopterin或MCD的Mo金屬蛋白中都是單核的。無論Mo-CODH處在還原態還是氧化態，活性位點的Cu離子總是保持+I價，而連線Mo離子的MCD分子的構象也沒有發生明顯的變化。在空氣中，Mo-CODH處於氧化態，此時Mo離子為+VI價，位於Mo離子與MCD的兩個配位硫原子所形成平面垂直方向上的氧配基Oa與Mo離子之間形成雙鍵連線；而與Mo離子配位的另一個氧配基Ob則有可能與之形成單鍵或雙鍵。 與氧化態的結構相比，還原態中Cu-Mo距離和Mo-Ob距離都有所延長。結合CO時，活性位點很可能是處於非常短暫的中間態，難以捕捉，因此研究者利用異腈基團與活性位點結合的結構來模擬中間態。由研究結果推測CO應該連線在Cu離子上而不直接與Mo連線。在Mo-CODH二聚體中，由於兩個活性位點的間距超過了可以直接進行電子傳遞的距離，而且沒有輔因子位於它們之間，兩者之間不可能進行電子傳遞；因此Mo-CODH二聚體中的兩個單體很可能可以獨立進行催化活動，即每個單體都是一個完整的催化單位。催化機理.透過對不同狀態下活性位點的結構變化，可以推測整個催化過程：處於氧化態的Mo離子與MCD上的兩個硫原子以及Oa和Ob形成扭曲的金字塔形的四配位結構；當CO結合上後，CO與硫橋、Ob以及Cu離子連線並處於同一平面上，Mo離子被還原為+IV價，Mo與Oa之間距離縮短，可能形成了三鍵連線；在H2O分子的攻擊下，CO2和H+被釋放出來，Mo與Oa之間回到雙鍵連線，而Ob變為OH基團與Mo離子之間形成單鍵連線，整個活性中心處於還原態；將兩個電子傳遞給鐵硫簇II後，活性中心又重新回到氧化態，從而完成一輪催化過程。抑制作用.Mo-CODH很容易被氰化物所抑制，這種抑制主要是透過氰化物與[CuSMoO2]簇的硫橋和Cu離子反應生成遊離的硫氰離子來使活性位點失活。Ni-CODH.Ni-CODH廣泛存在於以一氧化碳為碳源和能源的厭氧微生物中，如乙酸生成細菌。與Mo-CODH相比，Ni-CODH在活性位點處的關鍵金屬為Ni，負責電子傳遞的鐵硫簇為[4Fe-4S]而非[2Fe-2S]，且沒有發現有像Mo-CODH中的FAD和MCD輔因子，整體結構上也沒有相似性。除此之外，不同Ni-CODH差別很大：既有單功能的一氧化碳脫氫酶只負責催化CO的氧化；又有雙功能酶，即同時具有一氧化碳脫氫酶和乙醯輔酶A合成酶的活性，生理狀態下需要Ni-CODH與ACS結合共同發揮功能。因此，又常常以CODH/ACS複合物的名稱來代替Ni-CODH。與Mo-CODH相似的是，CODH/ACS也需要形成二聚體來發揮催化作用。分類.基於催化活性、代謝功能和蛋白性質及組成，可將不同的CODH/ACS分為四類：雖然把CODH/ACS家族分為這樣四類與利用生物資訊學進行的序列分析的結果相符合； 但對來自"M. thermophila"的CODH/ACS進行研究發現，乙醯輔酶A的合成和分解都是由相同的CODH/ACS來完成， 這說明這一分類的依據和方法還需進一步改進。亞基組成.這四類酶的亞基組成也有較大差別。 第一/二類CODH/ACS都由五個不同的亞基組成。第三類CODH/ACS則由α和β兩個亞基組成，其中α亞基與第一/二類中的β亞基同源，但α亞基多了N端30 kDa的一段序列；而其β亞基與第一/二類中的α亞基同源，但同源性較差，且相比之下，β亞基的分子量要小一些。雖然第三類的中也存在與第一/二類CODH/ACS對應的γ和δ亞基，但不存在ε亞基的同源蛋白，且γ和δ亞基不參與CODH/ACS的組成，而是形成異二聚體發揮甲基傳遞作用。第四類CODH/ACS中只含有與第三類中β亞基具有很高同源性的單個蛋白。活性位點.由於除了第四類CODH/ACS外，其他類酶都是雙功能，甚至多功能酶，從而具有兩個或多個活性位點。其中，兩個核心反應，即CO的氧化和乙醯輔酶A的合成，對應的活性位點金屬簇分別為C簇 和A簇。其中，C簇位於α亞基二聚體中還含有5-7個鐵硫簇[4Fe-4S]，負責電子傳遞。催化機理.負責CO的氧化的活性位點C簇的催化機制主要由兩步反應組成。 第一步，CO被氧化，而C簇被還原；第二步，電子從C簇傳遞到蛋白外的電子受體，如ferredoxin蛋白，C簇回到初始狀態。在這一過程，C簇中存在四種氧化還原態：Cox，Cred1，Cint和Cred2。其中，處於氧化狀態，使結合在Fe1上的水分子的pKa值顯著降低，從而使水分子轉變為活性的OH基團，對CO進行攻擊。此外，在C簇附近還有一個保守的天冬氨酸，可以與組氨酸形成氫鍵連線，促進此酸鹼反應的發生。反應生成的H+離子透過組氨酸形成的質子通道傳遞到外部溶劑中。CO被氧化為CO2後，C簇接受兩個電子從Cred1轉變為Cred2，隨後兩個電子一個接一個地被傳遞到B簇。傳走第一個電子後，C簇轉化為中間態Cint；兩個電子都傳到B簇後，C簇又重新轉化為Cred1，從而完成一次催化迴圈。