聚合酶鏈式反應

聚合酶連鎖反應，而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。DNA 體外擴增的實現首先基於DNA半保留複製原理，還有鹼基互補配對原則，即複製的過程中雙鏈DNA會解鏈，由雙鏈變成單鏈，溫度一般為95℃；之後溫度降下來，引物會結合到DNA單鏈上，在DNA聚合酶的作用下，把遊離的dNTP按照鹼基互補配對原則結合到單鏈上，形成一條由舊鏈和新鏈雜合成的新的雙鏈DNA。這個過程可概括為‘變性-黏合-延伸’三個基本步驟。凱利·穆利斯於1983年開發此技術，當時他是Cetus公司的僱員，也是1993年諾貝爾化學獎的獲得者，它是一種簡單，廉價和可靠的方法複製DNA片段，這個概念適用於現代生物學和相關科學的許多領域。 PCR可能是分子生物學中使用最廣泛的技術。這種技術被用於生物醫學研究，犯罪取證和分子考古學。微生物複製是一個費時耗力的流程，首先要將DNA經限制酶剪裁，再利用連線酶中，將此菌於培養皿大量繁殖培養，再經過繁複的分離、純化過程，時間通常需要近一週，才能大量複製片段。所以僅需一小時的PCR能節省大量時間和繁複的操作，聚合酶鏈式反應技術被廣泛地運用在醫學和生物學的實驗室，例如用於判斷檢體中是否會表現某遺傳疾病的圖譜、傳染病的診斷、基因複製，以及親子鑑定。歷史.聚合酶鏈式反應技術是由凱利·穆利斯發明，因此在7年之後的1993年10月，獲得了諾貝爾化學獎。穆利斯的想法是，利用一種人工方法，和反覆相同程式的方法，並利用一種特殊的酶——即DNA聚合酶來擴增特定的DNA片段。DNA聚合酶天然存在於生物體內，在細胞分裂前進行DNA的複製。當DNA開始複製時，解旋酶將雙股的DNA分開成兩個單股。DNA聚合酶便結合在兩DNA單股鏈上，生成互補鏈。在穆利斯最初的聚合酶鏈式反應中，將DNA聚合酶用於體外試驗。但是，沒有採用正常細胞常溫解旋的方法，而是把雙鏈DNA加熱到96℃，使得雙鏈分離成為兩條單鏈。但是在這個溫度下，DNA聚合酶被破壞，因此在每個迴圈的加熱步驟後必須補充新的聚合酶。穆利斯的原始聚合酶鏈式反應效率極低，需要大量時間和DNA聚合酶，並且在整個聚合酶鏈式反應中都需要人來照看。後來，由嗜熱細菌水生棲熱菌的間歇泉中，它的DNA聚合酶具有耐熱性。在用於聚合酶鏈式反應時，高溫並不能破壞這種DNA聚合酶，因此不需要不斷加入新的聚合酶，聚合酶鏈式反應由此變得簡單並且可以由機器操作。最初的具有耐熱性的DNA聚合酶來自於水生棲熱菌。但是又是從古菌中獲得的"Pwo"酶及"Pfu"酶，發現均有校正機制，能夠大大降低聚合酶鏈式反應中的突變。將"Taq"與"Pfu"結合使用可以保證真實準確的能夠擴增DNA。不但如此，現在一些廠商利用蛋白質的模擬分析，將DNA聚合酶的結構進行人工修改，還可以合成出效能遠超原本自然提取而來的酶。專利之爭.聚合酶鏈式反應技術的專利由Cetus公司持有，穆利斯發明聚合酶鏈式反應技術的時候在那個公司工作。Taq聚合酶也受專利保護。關於這個技術有幾個訴訟案，包括著名的杜邦訴訟案。製藥公司Hoffmann-La Roche於1992年買下了專利並持有至今。在世界各地的多個司法管轄區，羅氏與Promega公司與Taq聚合酶相關的專利爭鬥仍然在繼續。法律上的爭論已經超出了聚合酶鏈式反應和Taq聚合酶專利的期限，這些專利已於2005年3月28日到期。操作過程.聚合酶鏈式反應用於擴增一小段已知的DNA片段，可能是單個基因，或者僅僅是某個基因的一部分。與活體生物不同的是，PCR只能複製很短的DNA片段，通常不超過10kbp。DNA是雙鏈分子，因此用互補DNA雙鏈的構造單位。某些特定的方法可以擴增40kbp左右的片段，但是這種大小與真核細胞的染色體DNA相比仍然是很少的。例如，人的體細胞DNA含有大約30億個鹼基對。目前應用的聚合酶鏈式反應需要幾個基本組成：聚合酶鏈式反應在熱迴圈裝置中進行。PCR儀可以將反應管加熱或冷卻到每步反應所需的精確的溫度。為防止反應體系中液體產生蒸氣，通常在反應管上加蓋加熱的蓋子，或者在反應體系表面加入一層石蠟油。引物.特定的專一性引物決定了所擴增的DNA片段。而引物，它們與所要擴增的DNA片段的起始和終止區域完全互補。在“黏合”時引物結合於DNA模板的起始和終止點，DNA聚合酶結合到這兩個位置，開始合成新的DNA鏈。選擇引物的長度和熔點要考慮許多條件。引物的熔點與聚合酶鏈式反應第一步中DNA的熔點不同，是指50％的引物與模板結合的溫度，高於這個溫度的引物與模板就不能有效結合。這個溫度隨著引物長度的增加而升高。如果引物長度太短，就有可能與DNA模板的幾個位置結合，造成非特異性複製。另一方面，引物長度也受限於Tm。如果Tm太高，即高於80℃，也會導致問題，因為DNA聚合酶在此溫度下活性較低。引物最優長度通常為20到40個鹼基，熔點從60℃到75℃。有時也用到簡併引物，是一些相似但不相同的引物的混合物。通常用於從不同的生物DNA中擴增相同的基因，因為這些基因通常都是近似但不相同的。應用兼併引物的另一種情況是根據蛋白質序列設計引物時，由於幾個不同的密碼子都能編碼一個氨基酸，通常難以判斷在DNA中究竟是哪個密碼子編碼的這個氨基酸。例如編碼異亮氨酸的引物可能使用"ATH"，A是腺嘌呤，T是胸腺嘧啶，H可能是腺嘌呤，胸腺嘧啶或者胞嘧啶部分地解決。基於上述考慮，設計引物可以採取以下原則：現有一些幫助設計引物的程式。步驟.一般的聚合酶鏈式反應由20到35個迴圈組成，每個迴圈包括以下3個步驟：最佳化聚合酶鏈式反應.在實踐中，聚合酶鏈式反應可以因各種原因而失敗，部分原因是由於其對於汙染的敏感性，導致擴增錯誤的DNA產物。正因為如此，人們已經開發了一些技術和步驟來最佳化聚合酶鏈式反應條件。將聚合酶鏈式反應前的混合物與潛在DNA汙染物分開的實驗室方案和流程解決了外源DNA的汙染問題。這通常包括從用於分析的區域分理出聚合酶鏈式反應的設定區域或者說聚合酶鏈式反應產物的純化，一次性塑膠製品的使用，及對反應裝置之間的工作臺面徹底清潔。引物的設計技術在改善聚合酶鏈式反應產物產率和避免雜產物的形成是很重要的。替代緩衝成分和聚合酶的使用有助於較長或存在其他問題的DNA區域的擴增。在緩衝體系中加入試劑，如甲醯胺，或會增加聚合酶鏈式反應的特異性和產量。可以利用計算機模擬理論聚合酶鏈式反應結果，以協助在引物設計。PCR及其延伸技術.一般 PCR 的原理是，靠著探針偵測設定的遺傳目標序列，接著經歷升溫、降溫的迴圈，將目標不斷複製放大，直到能夠判斷訊號。判斷陽性的標準，英文稱作「cycle threshold  value」，即是 CT值。例如，若迴圈 35 次後能識別目標存在，CT值便是 35。通常樣本內的病毒含量愈高，複製愈少次，便足以判斷陽性。舉例來說，原始量多隻需 20 次，便能放大到超過足夠的量；原始量低需要到 35 次，才能放大到有存在感。應用.鑑定基因.人體內的細胞共有約為30億個鹼基對的DNA，每個人的DNA會有差異，具有差異的鹼基對數目達幾百萬之多，因此透過分子生物學方法顯示的DNA圖譜也因人而異，由此可以識別不同的人。所謂“DNA指紋”，就是把DNA作為像指紋那樣的獨特特徵來識別不同的人。由於DNA是遺傳物質，因此透過對DNA鑑定還可以判斷兩個人之間的親緣關係。診斷遺傳病.聚合酶鏈式反應允許白血病、淋巴瘤等惡性疾病的早早期診斷。此法是當今癌症研究中最發達的，並已被常規使用。聚合酶鏈式反應分析能以高於其他細胞10,000倍的敏感度在核酸DNA樣本中直接探測具特定轉錄的惡性細胞。聚合酶鏈式反應同樣可以對不可培養的或生長緩慢的微生物進行定位。在微生物學中，聚合酶鏈式反應診斷性應用的基礎是傳染媒介的探測和從病原種系中藉助特定基因的分離出非致病的種系。