TITLE: Cyanobacteria growth 
AUTHORS: Ricardo M. Borges, Gabriela de Assis Ferreira, pauloihc

[DESCRIPTION]
Este documento apresenta o protocolo para cultivar cianobactérias em água salgada, incluindo informações detalhadas sobre as soluções, cálculos e volumes necessários para o processo. É importante observar que as taxas de crescimento de diferentes espécies de cianobactérias podem variar significativamente.



This document outlines the protocol for cultivating cyanobacteria in saltwater, including detailed information on the solutions, calculations, and volumes required for the process. It is essential to note that the growth rates of different cyanobacteria species may vary significantly.



[STEPS]
SECTION: Material
7. Preparo do meio de cultivo F/2:
 Para 1 litro de água destilada:
41,5 gramas de sal marinho para aquario (Reef Salt)
1 mL de solução de NaNO3
1 mL de solução de NaH2PO4•H2O
1 mL de solução de metais traço
Autoclave: 15 minutos 1.5 ATM
Espera esfriar
Adiciona a solução de vitaminas antes do uso.
SECTION: Preparo Anterior ao Cultivo
10. Separar todos (# ) os frascos erlenmeyer de 500 ml
 Lavá-los com Extran 5% 
Rinsa-los em excesso com água destilada
> Atenção ao número de cepas e réplicas a serem cultivadas
SECTION: Preparo Anterior ao Cultivo
11. Preparar as rolhas com algodão para vedar o cultivo
SECTION: Preparo Anterior ao Cultivo
12. Autoclavar os frascos previamente lavados com as rolhas de algodão
 Depois secar em estufa (frasco com rolhas): 24 horas a 70oC
SECTION: Preparo Anterior ao Cultivo
1. #   frascos erlenmeyer de 500 ml
O número de frascos erlenmeyer vai variar de acordo com o número de amostras que serão produzidas: 
X amostras em quintuplicatas (x5) + 
Controle (CCMR0280) em quintuplicatas (x5) + 
Branco de meio (1 frasco erlenmeyer tratado da mesma forma com meio e adição de nutrientes, mas apenas sem a etapa de inoculação)
> por exemplo: Vamos comparar 3 espécies diferentes, então usaremos (3*5) + 5 + 1 (=21) frascos 

   

SECTION: Preparo Anterior ao Cultivo
13. Autoclavar os frascos tipo Schott com 1 L do meio de cultivo F/2
 por exemplo para 21 frascos: 21 x 200 ml = 4.2 litros (5 litros)
Fazer em frasco becher de 5 litros
Dividir em frascos Schott de 1 litro
Autoclave: 15 minutos 1.5 ATM
SECTION: Preparo Anterior ao Cultivo
14. Após o meio resfriar, adicionar 0,5 mL de solução de vitaminas (previamente filtrada em filtro de seringa: 0.22 um )
 não vale o filtro de seringa 0.45 um
SECTION: Material
6. Preparo da solução de vitaminas:
Em um frasco previamente lavado (com extran 5% e rinsado a exaustão com água destilada), adicionar:
200 mg de Thiamina 
10 ml (0.1 g) de Biotina
1 ml (1g/l) de Cyanocobalamine
E completar o volume com água destilada até 1 litro
 Uso: 0.5 ml para cada 1 litro de meio (após autoclave)
 

SECTION: Material
3. Preparo de soluções Estoque:
Solução estoque de NaNO3 :
 Em um frasco previamente lavado (com extran 5% e rinsado a exaustão com água destilada), adicionar 7.5 g de NaNO3 (MARCA e PartNumber) a 100 ml de água destilada
Uso: 1 ml para cada 1 litro de meio.
SECTION: Inoculação
16. Com o auxílio de alças estéreis coletar a biomassa de um cultivo já preparado.
 Quantidade: "tufo" do tamanho de uma moeda de 50 centavos
Importante: Tudo deve ser feito utilizando luvas descartáveis e evitando o fluxo de ar
Vedar bem os frascos erlenmeyer com as rolhas de algodão previamente preparadas



SECTION: Manutenção do cultivo
17. Para manter as cianos em fase log deve-se alimentá-las com frequência adicionando a solução de nutrientes preparada previamente (ítem #  ).
Para cada cultivo o recomendado é de 200  μL da solução de nutrientes
É possível observar que as cianos precisam de nutrientes pela cor verde delas

Rotina de adição da solução de nutrientes:
A cada semana
Anotar na folha de controle de adição da solução de nutrientes



SECTION: Coleta da biomassa e tratamento
18. O tempo de cultivo será estabelecido como sendo:
 4 semanas ou 28 dias
Com adição da solução de nutrientes a cada 7 dias
SECTION: Coleta da biomassa e tratamento
19. Ao final dos 28 dias, de cada frasco erlenmeyer, será retirada uma quantidade visualmente equivalente a 80-90% da biomassa.
 Vamos permitir que cada espécime se mantenha crescendo até que seja necessário interromper
a princípio, podemos estabelecer um limite de 4 meses para cada espécime
21. Liofilizar cada amostra devidamente identificada em separado
 Adicionar detalhes e comentários ao Metadata
SECTION: Coleta da biomassa e tratamento
20. Procedimento para retirada do meio:
 Centrifugação: 
Filtração: 
SECTION: Preparo Anterior ao Cultivo
15. Identificar cada frasco erlenmeyer com etiquetas contendo código (rastreável a lista de amostras do projeto) e data de produção
 as datas de produção de cada espécime, de adição da solução de nutrientes, de coletas das biomassas, etc deverão ser documentadas na lista de amostras do projeto.
SECTION: Material
5. Solução de Metais-traço:
 Em um frasco previamente lavado (com extran 5% e rinsado a exaustão com água destilada), adicionar:
23 mg de ZnSO4•7H2O 
152 mg de MnSO4•H2O
7.3 mg de Na2mOO4•2H2O
14 mg de CoSO4•7H2O
6.8 mg de CuCl2•2H2O
4.6 g de Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O
4.4 g de Na2EDTA•2H2O
E completar o volume com água destilada até 1 litro
 Uso: 1 ml para cada 1 litro de meio.
 

SECTION: Material
4. Solução estoque de NaH2PO4•H2O :
  Em um frasco previamente lavado (com extran 5% e rinsado a exaustão com água destilada), adicionar 0.5 g de NaH2PO4•H2O a 100 ml de água destilada
Uso: 1 ml para cada 1 litro de meio.
SECTION: Material
9. Preparo das rolhas de algodão:
Material a ser utilizado: algodão hidrófobo, gaze, tesoura, barbante 
Corte um pedaço de gaze do tamanho da palma da sua mão;
Abra a gaze e insira parte dela dentro do frasco;
Coloque, dentro da gaze que estão dentro da boca do frasco, o algodão hidrofóbico;
Continue inserindo algodão até que, quando tirar a gaze com o algodão do frasco, seja feito um barulho semelhante a: “puf” (barulho ocasionado pelo vácuo causado pela rolha);
Corte um pedaço de barbante;
Amarre a gaze com o barbante (faça isso bem em cima do algodão colocado, ou seja, não deixe espaço);
Corte o excesso de barbante e de gaze; 
Verifique se a rolha está um pouco acima da boca do vidro;
Caso a resposta do item anterior seja negativa, suba um pouco ela;
Autoclave: 15 minutos 1.5 ATM
Seque na estufa o frasco tampado com as rolhas de algodão por entre 8-12 horas a 70°C; 


SECTION: Material
8. Preparo de solução de nutrientes:
20 ml
20 ml
1 ml de vitaminas
1 ml de metais
filtra em 0.22 um
SECTION: Preparo Anterior ao Cultivo
2. Iniciar a criação e preenchimento do arquivo Metadata:
código das amostras;
código das cepas;
espécie;
meios de cultivo;
data de início;
data de coleta da biomassa;
método de extração 1;
método de extração 2;
comentários