TITLE: Prozedere Bacterial stabs in Kultur nehmen bis Übernachtkultur ernten
AUTHORS: Bettina Ergün

[DESCRIPTION]
Das Protokoll beschreibt die In-Kulturnahme von Bacterial stabs zur Anreicherung einzelner Klone und zur Produktion von ausreichend Bakterien zur Gewinnung der gewünschten Plasmide mittels Maxi Prep.

[GUIDELINES]
Addgene ships plasmids as transformed bacteria in stab culture format. A stab culture is a type of Luria Broth (LB) Agar media, similar to a standard LB Agar plate. Unlike an LB Agar plate, a stab culture is created by piercing the LB agar with the bacteria instead of spreading it on the surface. The bacteria in a stab culture grow from the puncture site to spread across the surface of the stab culture.


Short Term Storage ofBacterial Stab


Stab cultures should be stored at 4°C upon receipt. The bacteria in the stab is guaranteed to live for at least 2 weeks when stored at 4°C.


Long Term Storage - Isolating and Verifying the Plasmid and Creating a Glycerol Stock


Within 2 weeks of receiving your new Addgene plasmid you should verify that the plasmid is correct and create a glycerol stock. Please follow Addgene’s recommended protocols below.


1.       Streak Bacteria for Single Colonies - use your bacterial stab to streak bacteria onto a plate, grow overnight, and isolate single colonies.


2.       Select an isolated, single colony to inoculate an overnight culture. Using a liquid culture will allow you to grow enough
bacteria for plasmid DNA purification and for creating glycerol stocks.


1.       Addgene recommends selecting and inoculating 2-4 separate colonies for plasmid screening and verification.


3.       Isolate your Plasmid DNA - many companies sell miniprep or maxiprep kits for easy plasmid isolation. Addgene also provides a protocol for plasmid purification without a kit.


4.       After isolating plasmid DNA, Addgene recommends verifying the plasmid by diagnostic digest or sequencing before beginning any experiments.


1.       Perform a Diagnostic Digest - verify backbone and insert sizes


2.       Sequence your Plasmid - verify key regions of the plasmid using DNA sequencing and compare these to sequences Addgene obtained from the plasmid, found on the plasmid page under “Sequences”


3.       After screening 2-4 colonies, if you find that your plasmid DNA is not correct, please view the instructions on how to report a problem with a plasmid.


5.       Once you have verified that the plasmid DNA is correct, keep the glycerol stocks corresponding to the colony that was
verified- most plasmids are stable for years when stored as bacterial glycerol stocks.

[STEPS]
SECTION: Before Start
1. Ampicillin:
100 mg/ml in sterilem H2O lösen; sterilfiltrieren, aliq.; - 20 °C
1:1000 zu dem Platten bzw. Medium => 100 µg/ml
SECTION: Before Start
2. Agarplatten gießen:
10 cm Greiner-Schalen
1,5 g Agar auf 100 ml LB-Broth-Medium o. 3,5 g LB Agar auf 100 ml ddH2O
aufkochen, abkühlen auf 50 °C im Wasserbad
unter der Bench + AB; gießen (3-4 mm hoch)
reicht für ca. 4-5 Platten 
gegossene Platten im Kühlschrank in Plastiktüte über Kopf lagern
SECTION: Before Start
3. LB-Medium ansetzen:
20 g in 1 L ddH2O lösen
121 °C 15 min autoklavieren

SECTION: Bacterial stabs ausstreichen
4. Bacterial stab mit steriler Pipettespitze auf den Agarplatten ausstreichen; trocknen lassen
SECTION: Bacterial stabs ausstreichen
5.   im Inkubator bei 37 °C über Kopf inkubieren
SECTION: Vorkultur und Übernachtkultur
6. mit einer sterilen Pipettenspitze Klone picken und im 15 ml Falcontube in ca. 2 mL Medium/ mit AB einbringen
SECTION: Vorkultur und Übernachtkultur
7. bei37 °C im Schüttelinkubator für einige Stunden anziehen (Deckel leicht geöffnet)
SECTION: Vorkultur und Übernachtkultur
8. restliche Platte mit Parafilm abdichten; als Backup im Kühlschrank in Plastiktüte über Kopf lagern
SECTION: Vorkultur und Übernachtkultur
9. 250 µL auf 100 mLMedium/ mit AB in 250 ml Erlenmeyerkolben mit leicht geöffneter Alufolie als Deckel;   bei 37 °C im Wasserbad schütteln

SECTION: Glycerolstocks
11. 700 µL Übernacht-Kultur + 300 µL 50 % Glycerol
SECTION: Glycerolstocks
12. 
für 5 min in Trockeneis/EtOH-Bad einfrieren
SECTION: Glycerolstocks
13. aufbewahren bei -70 °C
SECTION: Vorkultur und Übernachtkultur
10. Zellen abzentrifugieren 4000 x g 10 min und zur Plasmidisolierung weiter mit Protokoll:


 

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