TITLE: Fluorescent gelatin degradation protocol in 96-well plates
AUTHORS: Bianca Cruz Pachane

[DESCRIPTION]
Protocolo do ensaio de degradação de gelatina fluorescente, método de estudo da invasão celular que permite a avaliação da atividade gelatinase in vitro por análise de microscopia epifluorescente. Adaptado de Pachane et al (2022) para placas de 96 poços.

Fluorescent gelatin degradation protocol, a method for studying cell invasion by detecting gelatinase activity in vitro upon epifluorescence microscopy analysis. Adapted from Pachane et al (2022) (PMID: 36293503)

[BEFORE_START]
Sob condições estéreis, solubilizar a gelatina fluorescente a 37 °C com PBS morno, conforme o datasheet, para uma solução estoque de 5 mg/mL . Aliquotar e manter os estoques congelados a -20 °C. Descongelar o estoque a 37 °C por 30 min antes do uso. Para solução de uso, diluir a solução estoque para 0.2 mg/mL com PBS morno, misturar bem e manter a 37 °C até o uso.


[GUIDELINES]
Descongelar a gelatina a 37 ºC, protegida da luz. Todo o trabalho no fluxo deve ser realizado com a luz da capela apagada (luz ambiente pode estar acesa). Uma vez que o ensaio for finalizado, selar a placa com Parafilm M e deixa-la na geladeira (4 ºC) embalada em papel alumínio até a análise.

[STEPS]
SECTION: Preparação da Placa Recoberta com Gelatina Fluorescente
1. Descongelar estoque de Gelatina Fluorescente a 5 mg/mL ou solução de uso a 0.2 mg/mL por 30 min a 37 °C  (estufa ou banho-maria).
   
SECTION: Preparação da Placa Recoberta com Gelatina Fluorescente
1.1. Preparar a solução de uso com PBS morno e mante-la a 37 °C até o uso.
SECTION: Preparação da Placa Recoberta com Gelatina Fluorescente
2. Dentro do fluxo, sob condições estéreis, abrir uma nova placa preta de 96 poços e nomear os grupos conforme o mapa experimental, que deverá conter pelo menos:

Controle negativo - células em meio sem soro, sem tratamento
Controle positivo - células em meio com soro, sem tratamento
Tratamento
          
OBS: planejar ensaio para conter três replicatas técnicas pelo menos.

  
SECTION: Preparação da Placa Recoberta com Gelatina Fluorescente
3. Aplicar 70 µL da solução de uso de gelatina fluorescente (0.2 mg/mL ) diretamente no fundo de cada poço, com as pipetas a 90º em relação ao fundo da placa. Evitar a formação de bolhas ao dispensar o líquido. 
SECTION: Preparação da Placa Recoberta com Gelatina Fluorescente
4. Incubar a placa por 30 min em estufa a 37 °C , protegido da luz, para polimerização da gelatina.

SECTION: Preparação da Placa Recoberta com Gelatina Fluorescente
5. Remover o excesso de coating da placa por pipetagem ou aspiração (evitar tocar no fundo do poço).
SECTION: Preparação da Placa Recoberta com Gelatina Fluorescente
6. Pré-condicionar a placa com 200 µL do meio de plaqueamento adequado por 30 min em estufa a 37 °C :
Controle negativo: meio sem soro
Controle positivo: meio com soro
Tratamento: meio sem soro


SECTION: Preparação e Plaqueamento do Ensaio
7. Repicar as células como de costume. Ressuspender células em meio sem soro para contagem automatizada com trypan blue.
  
 


SECTION: Preparação e Plaqueamento do Ensaio
8. Remover o meio de pré-condicionamento da placa por pipetagem ou aspiração (evitar tocar no fundo do poço).
SECTION: Preparação e Plaqueamento do Ensaio
9. Adicionar meio de plaqueamento + suspensão de células + tratamento para um volume total de 200 µL . Efetuar o plaqueamento individualizado por poço.
SECTION: Preparação e Plaqueamento do Ensaio
10. Incubar a placa em estufa a 37 °C , 5% CO2, por 960 min a 2880 min .
SECTION: Preparação e Plaqueamento do Ensaio
9.1. Densidades sugeridas:
MDA-MB-231:  5x103 células/poço (= 1x105 células/ml)
HUVEC: 5x103 células/poço (= 1x105 células/ml)
HDFa: 2x103 células/poço (= 1x104 células/ml)
THP-1: 5x103 células/poço (= 1x105 células/ml)
MCF7: 5x103 células/poço (= 1x105 células/ml)
SECTION: Fixação e Marcação das Células
11. Ao final da incubação, remover o meio condicionado da placa. O meio pode ser descartado ou coletado para avaliação de gelatinases por zimografia.
SECTION: Fixação e Marcação das Células
12. Fixação: Adicionar gentilmente 100 µL em cada poço e incubar em Room temperature por 10 min .
SECTION: Fixação e Marcação das Células
13. Lavar os poços gentilmente com 100 µL . Descartar o sobrenadante. Repetir a lavagem.

SECTION: Fixação e Marcação das Células
14. Permeabilização: Adicionar gentilmente 100 µL por poço e incubar em Room temperature por exatamente 5 min .

SECTION: Fixação e Marcação das Células
15. Lavar os poços gentilmente com 100 µL . Descartar o sobrenadante. Repetir a lavagem.
SECTION: Fixação e Marcação das Células
16. Marcação: adicionar 70 µL por 20 min em Room temperature , protegido da luz.
  
  

SECTION: Fixação e Marcação das Células
17. Lavar os poços gentilmente com 100 µL . Descartar o sobrenadante. Repetir a lavagem.
SECTION: Fixação e Marcação das Células
18. Manter as amostras em 200 µL . Selar a placa com Parafilm M e embalar com papel alumínio.
  

SECTION: Imageamento por microscopia de epifluorescência
19. 
 

SECTION: Imageamento por microscopia de epifluorescência
20. No software MetaXpress, utilizar o template para placa Corning 3603. Serão utilizados os filtros DAPI (núcleo), FITC (gelatina) e Cy5 (faloidina 647).
SECTION: Imageamento por microscopia de epifluorescência
21. Ajustar a intensidade do laser, iniciando a partir de 10 ms e aumentando gradativamente 

Lembrete: intensidades muito altas podem queimar a amostra e a fluorescência é perdida mais facilmente.
SECTION: Imageamento por microscopia de epifluorescência
22. Verificar a dispersão das células no poço com a lente de 4X. Não é necessário adquirir essa etapa.
SECTION: Imageamento por microscopia de epifluorescência
23. Ajustar o foco para aquisição das imagens em lentes de 20X e 40X. Selecionar pelo menos 9 sítios por poço.
SECTION: Imageamento por microscopia de epifluorescência
24. Após a aquisição, exportar os dados brutos para um HD ou pen drive formatado:

1. Anotar o mapa e nome da placa, junto de seu código no MetaXpress.
2. Screening > Plate Data Utilities > Export Images > selecionar a placa desejada > Select
3. Selecionar o drive externo > OK
SECTION: Imageamento por microscopia de epifluorescência
25. Desligar o sistema e guardar a placa pós-análise embalada em papel alumínio a 4 °C .

SECTION: Processamento de imagens - Degradação da Gelatina
26. Abrir o software FIJI
 

SECTION: Processamento de imagens - Degradação da Gelatina
28.  A escala das imagens já deverá estar ajustada. Caso contrário, efetuar o ajuste da escala das imagens:

Menu Analyze > Set scale >

Para 4x:  500 px = 800 µm
Para 10x: 600 px = 400 µm
Para 20x: 600 px = 200 µm
Para 40x: 600 px = 100 µm
Para 60x: 480 px = 50 µm

>   √ Global > OK

SECTION: Processamento de imagens - Degradação da Gelatina
27. Arrastar o arquivo bruto em formato .HTD para o FIJI. Elas devem ser importadas através do BioFormats conforme a imagem abaixo: 
SECTION: Processamento de imagens - Degradação da Gelatina
27.1. 
 

SECTION: Processamento de imagens - Degradação da Gelatina
30. As imagens virão agrupadas em stacks contendo todos os filtros de um sítio, em formato 16-bit (escala de cinza).

Para agrupar todos os sítios em um único arquivo:
Menu Image > Stacks > Tools > Concatenate >
Na aba Concatenator > √ All open windows > Renomear > OK
SECTION: Processamento de imagens - Degradação da Gelatina
31. Para selecionar o filtro FITC:
Menu Image > Colors > Split channels
Minimizar os stacks referentes ao DAPI (C1) e ao Cy5 (C3). Manter apenas o stack do FITC (C2).
SECTION: Processamento de imagens - Degradação da Gelatina
32. Para transformar a imagem 16-bit em binária:
Menu Image > Adjust > Threshold >
Na aba Threshold > √ Don't reset range > Ajustar a máscara para conter apenas os pontos de degradação > Apply
Na aba Convert Stack to Binary > √ Black background (of binary masks) > √ Create new stack > OK
SECTION: Processamento de imagens - Degradação da Gelatina
33. Para medir a área de degradação:
Menu Analyze > Analyze Particles
Na aba Analyze Particles > Size (micron^2) = 5-Infinity > √ Summarize > OK
Na aba Process stack? > Process all images? > Yes

A tabela contendo o resumo de cada imagem do stack será criada pelo sistema e pode ser salva como arquivo de texto .csv.

Menu File > Save as > Selecionar a pasta > Save

A área total será mostrada em µm2. Os arquivos de texto podem ser compilados no Excel para organização dos dados e análise estatística.
SECTION: Processamento de imagens - Degradação da Gelatina
29. Ajustar as medidas do sistema:
Menu Analyze > Set Measurements > √ Area > √ Standard Deviation > √ Shape Descriptor > √ Mean grey value > √ Perimeter > √ Display label > OK
SECTION: Processamento de Imagens: Contagem de Células
34. Abrir o software FIJI
 

SECTION: Processamento de Imagens: Contagem de Células
35. Arrastar o arquivo bruto em formato .HTD para o FIJI. Elas devem ser importadas através do BioFormats conforme a imagem abaixo: 
SECTION: Processamento de Imagens: Contagem de Células
35.1. 
 

SECTION: Processamento de Imagens: Contagem de Células
36. As imagens virão agrupadas em stacks contendo todos os filtros de um sítio, em formato 16-bit (escala de cinza).

Para agrupar todos os sítios em um único arquivo:
Menu Image > Stacks > Tools > Concatenate >
Na aba Concatenator > √ All open windows > Renomear > OK
SECTION: Processamento de Imagens: Contagem de Células
37. Para selecionar o filtro DAPI:
Menu Image > Colors > Split channels
Minimizar os stacks referentes ao FITC (C2) e ao Cy5 (C3). Manter apenas o stack do DAPI (C1).
SECTION: Processamento de Imagens: Contagem de Células
38. Para transformar a imagem 16-bit em binária:
Menu Image > Adjust > Threshold >
Na aba Threshold > √ Don't reset range > Ajustar a máscara para conter os núcleos > Apply
Na aba Convert Stack to Binary > √ Black background (of binary masks) > √ Create new stack > OK
SECTION: Processamento de Imagens: Contagem de Células
39. Para contagem das células:
Menu Analyze > Analyze Particles
Na aba Analyze Particles > Size (micron^2) = 10-Infinity > √ Summarize > OK
Na aba Process stack? > Process all images? > Yes

A tabela contendo o resumo de cada imagem do stack será criada pelo sistema e pode ser salva como arquivo de texto .csv.

Menu File > Save as > Selecionar a pasta > Save

O número de núcleos estará na coluna Count. Os arquivos de texto podem ser compilados no Excel para organização dos dados e análise estatística.
SECTION: Processamento de Imagens: Morfologia Celular
40. Abrir o software FIJI

 

SECTION: Processamento de Imagens: Morfologia Celular
41. Arrastar o arquivo bruto em formato .HTD para o FIJI. Elas devem ser importadas através do BioFormats conforme a imagem abaixo: 
SECTION: Processamento de Imagens: Morfologia Celular
41.1. 
 

SECTION: Processamento de Imagens: Morfologia Celular
42. A escala das imagens já deverá estar ajustada. Caso contrário, efetuar o ajuste da escala das imagens:

Menu Analyze > Set scale >

Para 4x:  500 px = 800 µm
Para 10x: 600 px = 400 µm
Para 20x: 600 px = 200 µm
Para 40x: 600 px = 100 µm
Para 60x: 480 px = 50 µm

>   √ Global > OK

SECTION: Processamento de Imagens: Morfologia Celular
43. Ajustar as medidas do sistema:
Menu Analyze > Set Measurements > √ Area > √ Standard Deviation > √ Shape Descriptor > √ Mean grey value > √ Perimeter > √ Display label > OK
SECTION: Processamento de Imagens: Morfologia Celular
44. As imagens virão agrupadas em stacks contendo todos os filtros de um sítio, em formato 16-bit (escala de cinza).

Para agrupar todos os sítios em um único arquivo:
Menu Image > Stacks > Tools > Concatenate >
Na aba Concatenator > √ All open windows > Renomear > OK
SECTION: Processamento de Imagens: Morfologia Celular
45. Para selecionar o filtro Cy5:
Menu Image > Colors > Split channels
Minimizar os stacks referentes ao DAPI (C1) e ao FITC (C2). Manter apenas o stack do Cy5 (C1).

Para duplicar o filtro Cy5:
Menu Image > Duplicate
Na aba Duplicate > √ Duplicate Stack > OK
SECTION: Processamento de Imagens: Morfologia Celular
46. Para transformar a imagem 16-bit em binária:
Menu Image > Adjust > Threshold >
Na aba Threshold > √ Don't reset range > Ajustar a máscara para conter apenas o citoplasma das células > Apply
Na aba Convert Stack to Binary > √ Black background (of binary masks) > √ Create new stack > OK
SECTION: Processamento de Imagens: Morfologia Celular
47. Para separar células manualmente:
Selecionar a ferramenta conta-gotas
Clicar com o botão direito do mouse > selecionar White/black

Selecionar a ferramenta lápis
Clicar duas vezes no ícone para abrir o editor de espessura > 
Na aba Pencil tool > Pencil width (pixels) = 3 > OK

Utilizando a imagem duplicada como guia, separar as células da imagem binária manualmente com a ferramenta lápis.
SECTION: Processamento de Imagens: Morfologia Celular
48. Para medir as células:
Menu Analyze > Analyze Particles
Na aba Analyze Particles > Size (micron^2) = 10-Infinity > √ Summarize > √ Display results > OK
Na aba Process stack? > Process all images? > Yes

Duas tabelas contendo o resumo de cada imagem do stack e os resultados de cada célula serão criados pelo sistema e podem ser salvos como arquivo de texto .csv.

Menu File > Save as > Selecionar a pasta > Save

A área das células estará disposta em µm2 e a circularidade celular estará disposto em índice (0 mais alongado > 1 mais circular). Os arquivos de texto podem ser compilados no Excel para organização dos dados e análise estatística.
SECTION: Processamento de Imagens: Imagens Representativas
49. Abrir o software FIJI

 

SECTION: Processamento de Imagens: Imagens Representativas
50. Arrastar o arquivo bruto em formato .HTD para o FIJI. Elas devem ser importadas através do BioFormats conforme a imagem abaixo: 
SECTION: Processamento de Imagens: Imagens Representativas
50.1. 
 

SECTION: Processamento de Imagens: Imagens Representativas
51. A escala das imagens já deverá estar ajustada. Caso contrário, efetuar o ajuste da escala das imagens:

Menu Analyze > Set scale >

Para 4x:  500 px = 800 µm
Para 10x: 600 px = 400 µm
Para 20x: 600 px = 200 µm
Para 40x: 600 px = 100 µm
Para 60x: 480 px = 50 µm

>   √ Global > OK
SECTION: Processamento de Imagens: Imagens Representativas
52. Para separar os filtros:
Menu Image > Colors > Split channels
Teremos DAPI = C1, FITC = C2 e Cy5 = C3

Para colorir as imagens:
Selecionar o filtro desejado
Menu Image > Lookup tables > Selecionar a cor desejada

Para selecionar uma região na imagem:
Com a ferramenta retângulo, selecionar um quadrado (dica: verificar o valor das arestas na barra do FIJI).
Menu Image > Duplicate
Na aba Duplicate > √ Duplicate Stack > OK

Para levar essa seleção à outra imagem, mantendo seu tamanho e coordenada: 
Menu Edit > Selection > Restore Selection
Menu Image > Duplicate
Na aba Duplicate > √ Duplicate Stack > OK

Para criar uma imagem multicolorida (OBS: Imagens precisam ter mesmo tamanho e profundidade):
Menu Image > Colors > Merge channels
Na aba Merge channels > Incluir as imagens nos filtros > √ Create composite > √ Keep source images > OK

Para adicionar uma barra de escala:
Menu Analyze > Tools > Scale Bar
Aba Scale Bar > Selecionar tamanho da barra (Width) e espessura (Thickness in pixels) > Ajustar tamanho do texto e/ou retirar o texto da barra > OK

Para salvar as imagens:
Menu File > Save as > PNG... > Selecionar a pasta de destino > OK