TITLE: Выделение, пробоподготовка и секвенирование тотальной ДНК грибов на Nanopore MinION
AUTHORS: Elena Zvyagina, Nina Filippova

[DESCRIPTION]
[EN] Protocols for sampling, sample preparation, and sequencing on the Nanopore MinION platform. The target material is total fungal DNA (amplicons) from soil and other substrates. This protocol includes the sampling conditions and DNA extraction methods for metabarcoding tasks, as well as a more or less literal translation of the protocol for the Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24) and the instructions provided on the Nanopore website to Russian. The text has been supplemented with the experience of the laboratory "Molecular Genetic Methods in Biodiversity Studies" in the context of our research objectives.

[RU] Протоколы отбора, подготовки проб и секвенирования на платформе Nanopore MinION. В качестве объекта используется тотальная ДНК (ампликоны) грибов из почвы и других субстратов. Данный протокол содержит условия отбора проб и выделения ДНК для задач метабаркодинга, а также более или менее дословный перевод протокола для Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24) и инструкций, размещенных на сайте Nanopore. Текст был дополнен опытом работы лаборатории "Молекулярно-генетических методов в изучении биоразнообразия" в рамках наших исследовательских задач.

[STEPS]
SECTION: Подготовка проб почвы для выделения тотальной ДНК
3. Выделение тотальной ДНК ведется из небольших объемов субстрата (в стандартных наборах для выделения 500 mg), что может препятствовать полноценному отбору всего сообщества и гомогенности его распределения. Альтернативным способом является вымывание внеклеточной тотальной ДНК с помощью фосфатного буфера (Taberlet et al., 2018) или использование специальных наборов для увеличенного объема субстрата. Если используется стандартная навеска 500 mg , важно на этапе подготовки пробы к выделению обеспечить гомогенизацию и измельчение отобранного субстрата, чтобы обеспечить максимально равномерный охват сообщества.
 


Оборудование:
Гомогенизатор со сменными стаканами объемом 250 мл
Увлажнитель воздуха или гепа-фильтр
Пинцет большой
Спиртовка или инфракрасный стерилизатор

Материалы: 
Фольга в рулоне
Спирт
Перекись водорода
Перчатки
Карандаш
Пробирки 1,5 мл
Ершик для промывания стакана

 

SECTION: Лигирование баркодов
15. ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАКТИВЫ:

Реактивы:
  
  
  

Набор для флуориметра:
  
 Набор для очистки продукта:
  

А также:
DNA Control Sample (DCS)
Концентрированный этанол (для приготовления раствора 80%)
Безнуклеазная вода

Оборудование: 
Флуориметр Qubit 4.0
Амплификатор
Центрифуга
Микроцентрифуга
Вортекс
Ротатор
Магнитный штатив на 1.5 или 0.2 мл в зависимости от объема
Дозаторы объемов 2, 10, 20, 100, 1000 μl
Холодный штатив

Расходные материалы:
Микропробирки 1.5 мл или 0.2 мл
Тонкостенные пробирки на 0.5 мл без делений для измерений концентрации на флуориметре
Наконечники для дозаторов 2, 10, 20, 100, 1000 μl

 

SECTION: Выделение тотальной ДНК
4. Выделению тотальной ДНК должна предшествовать гомогенизация субстрата на микро-уровне (разрушение тканей и клеточных стенок) физическим и химическим путем. В зависимости от плотности структур, могут использоваться следующие параметры:
Предварительное замачивание в лизис-буфере на несколько часов (с нагревом на термостате при 60 °C)
Гомогенизация микро-пестиком в микро-пробирке вручную или с использованием ручного гомогенизатора. К субстрату могут быть добавлены измельчающие частицы (шарики), согласно инструкциям в наборе для выделения.
Гомогенизация с использованием шариков в гомогенизаторе.

Оборудование и реактивы:
Гомогенизатор ручной для микро-пробирок
Гомогенизатор для микропробирок на 24 пробирки
Микро-пестики для микропробирок
Термостат

  
  

SECTION: Репарация ДНК и подготовка липких концов
13.1. Разморозьте AMPure XP Beads (AXP) и DNA Control Sample (DCS) до комнатной температуре и перемешайте на вортексе

 

SECTION: Репарация ДНК и подготовка липких концов
13. ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАКТИВЫ:

Реактивы NEB:
 
  
  
  
Набор для флуориметра:
  
 Набор для очистки продукта:
  
А также:
DNA Control Sample (DCS)
Концентрированный этанол (для приготовления раствора 80%)
Безнуклеазная вода

Оборудование: 
Флуориметр Qubit 4.0
Амплификатор
Центрифуга
Микроцентрифуга
Вортекс
Магнитный штатив на 1.5 или 0.2 мл в зависимости от объема
Дозаторы объемов 2, 10, 20, 100, 1000 μl
Холодный штатив

Расходные материалы:
Микропробирки 1.5 мл или 0.2 мл
Тонкостенные пробирки на 0.5 мл без делений для измерений концентрации на флуориметре
Наконечники для дозаторов 2, 10, 20, 100, 1000 μl

 

SECTION: Репарация ДНК и подготовка липких концов
13.2. Подготовьте NEBNext FFPE DNA Repair Mix и NEBNext Ultra II End Repair / dA-tailing Module в соответствии с рекомендациями производителя

 

SECTION: Очистка продуктов репарации
14. Очистка продукта с помощью AMPure XP beads (AXP)
SECTION: Репарация ДНК и подготовка липких концов
13.3. Растворите контрольный образец ДНК (DCS) добавив 105 µLElution Buffer (EB) прямо в пробирку DCS

 

SECTION: Репарация ДНК и подготовка липких концов
13.4. Подготовьте образцы ДНК в чистых тонкостенных пробирках на 0.2 mL или 96-луночной плашке

 

SECTION: Репарация ДНК и подготовка липких концов
13.5. Доведите каждый образец до 11 µL безнуклеазной водой, аккуратно перемешайте пипетированием и коротко прокрутите на центрифуге
Если не используете DCS, увеличьте объем ДНК до 12,5 мкл

SECTION: Репарация ДНК и подготовка липких концов
13.6. Для приготовления мастер-микса, рассчитайте необходимое количество реагентов и приготовьте смесь:

 


 

SECTION: Репарация ДНК и подготовка липких концов
13.7. Разлейте по 3 µL мастер-смеси в каждую пробирку с подготовленной ДНК

 

SECTION: Репарация ДНК и подготовка липких концов
13.9. Инкубируйте при 20 °C в течение  15 мин и 65 °C  в течение 15 мин в термоциклере.
! Производитель рекомендует 5 мин каждого шага, но время необходимо увеличить для более эффективного лигирования

 


SECTION: Репарация ДНК и подготовка липких концов
13.8. Сбросьте капли при помощи микро-центрифуги
SECTION: Очистка продуктов репарации
14.1. Ресуспендируйте AXP beads на вортексе
SECTION: Очистка продуктов репарации
14.6. Не снимая пробирки с магнитного штатива, промойте пробирки 200 µLсвежеприготовленного этанола не задевая магнитные частицы. Удалите спирт пипеткой. Если задели магнитные частицы, подождите, пока они осядут на магнит и удалите спирт.

SECTION: Очистка продуктов репарации
14.5. Прокрутите пробирки с образцами на центрифуге и поставьте на магнитный штатив. Удалите супернатант.
SECTION: Очистка продуктов репарации
14.4. Приготовьте свежий 80% этанол в безнуклеазной воде исходя из 400 µL на образец с небольшим запасом

SECTION: Очистка продуктов репарации
14.3. Инкубируйте при комнатной температуре в течении 5 min, периодически перемешивая встряхиванием пробирки

SECTION: Очистка продуктов репарации
14.2. Добавьте 15 µL AXP в каждую пробирку с ДНК и перемешайте встряхиванием пробирки

SECTION: Очистка продуктов репарации
14.11. Поставьте пробирки на магнитный штатив и дайте частицам осесть на магнит.
SECTION: Очистка продуктов репарации
14.10. Снимите пробирки с магнитного штатива и ресуспендируйте магниты в 8 µLбезнуклеазной воды. Если дозатор не точный, рекомендуется смывать10 µL воды. Инкубируйте 5 min для растворения ДНК.
SECTION: Очистка продуктов репарации
14.9. Просушите 30 s, но не пересушивайте до растрескивания.

SECTION: Очистка продуктов репарации
14.8. Коротко прокрутите на микроцентрифуге и поставьте обратно на магнитный штатив. Дайте осесть частицам на магнит и удалите остатки этанола. 
SECTION: Очистка продуктов репарации
14.7. Повторите промывку.
SECTION: Очистка продуктов репарации
14.12. Отберите 7.5 µL элюата в чистую пробирку на  1.5 mL.
При приготовлении более чем 1 образца перенести в пробирки на 0.2 mL.


 


SECTION: Лигирование баркодов
15.1. Подготовьте NEB Blunt/TA Ligase Master Mix
 

SECTION: Лигирование баркодов
15.8. Пулирование (сливание баркодированных образцов вместе). Перенесите все баркодированные образцы в одну пробирку на 1.5 мл. Объем каждого образца и результирующий объем показаны в таблице:

 


SECTION: Лигирование баркодов
15.7. Добавьте соответствующий Вашему набору объем EDTA в каждую пробирку, тщательно перемешайте и сбросьте капли на центрифуге. Избегайте избытка ЭДТА и следите за тем, чтобы в пробирке с ЭДТА не образовывались кристаллы

 

SECTION: Лигирование баркодов
15.6. Инкубируйте при комнатной температуре 20 минут. Или оставьте на +4 °C на ночь. 
Есть рекомендации по продлению лигирования до одного часа.

SECTION: Лигирование баркодов
15.5. В пробирки на 0.2 mL добавьте реактивы в следующем порядке и тщательно перемешайте подготовленную смесь пипетированием:

 

SECTION: Лигирование баркодов
15.4. Запишите уникальные баркоды для каждого образца, которые будут запущены вместе в одной проточной ячейке. В одном запуске можно закодировать до 24 образцов.
 

SECTION: Лигирование баркодов
15.3. Разморозьте баркоды (NB01-24) по числу образцов, перемешайте, сбросьте капли на центрифуге и поместите на холодный штатив.

SECTION: Лигирование баркодов
15.2. Разморозьте и перемешайте на вортексе EDTA. Сбросьте капли на центрфуге и поставьте на холодный штатив.
SECTION: Лигирование баркодов
16. Очистка продукта с помощью AMPure XP beads (AXP)
SECTION: Лигирование баркодов
16.1. Ресуспендируйте AMPure XP Beads (AXP) на вортексе
SECTION: Лигирование баркодов
16.2. Добавьте 0.4X AMPure XP Beads (AXP) в пулированную библиотеку и перемешайте пипетированием
SECTION: Лигирование баркодов
16.3. Инкубируйте с перемешиванием на ротаторе 10 мин при комнатной температуре
SECTION: Лигирование баркодов
16.4. Сделайте 2 мл раствора свежего 80% спирта на безнуклеазной воде

SECTION: Лигирование баркодов
16.5. Сбросьте капли в пробирке с библиотекой на центрифуге и поместите на ее магнитный штатив

SECTION: Лигирование баркодов
16.6. Подержите на магнитном штативе до достижения прозрачного раствора и удалите супернатант
SECTION: Лигирование баркодов
16.11. Инкубируйте 10 min при 37°C, каждые 2 min встряхивайте щелчками для улучшения растворения ДНК

SECTION: Лигирование баркодов
16.10. Снимите пробирку со штатива и добавьте 35 µL безнуклеазной воды. Перемешайте легкими щелчками

SECTION: Лигирование баркодов
16.9. Прокрутите на центрифуге для сброса капель и магнитов, поместите обратно на магнитный штатив, удалите остатки спирта и дайте просохнуть около 30 s не давая пересохнуть до трещин.
Если за 30 сек не перестало блестеть, дождаться того, чтобы осадок перестал блестеть, но не растрескался.
SECTION: Лигирование баркодов
16.8. Повторите предыдущий шаг.
SECTION: Лигирование баркодов
16.7. Не снимая с магнитного штатива, добавьте 700 µL свежеприготовленного 80% спирта. Удалите спирт.
 

SECTION: Лигирование баркодов
16.13. Отберите и перенесите 30 µL элюата в новую 0.2 мл пробирку (в протоколе пробирка 1.5 мл, однако мы уменьшили объем пробирки для улучшения качества промывки на следующем этапе)

SECTION: Лигирование баркодов
16.12. Поставьте пробирку на магнитный штатив до достижения раствором прозрачности

SECTION: Лигирование адаптеров
17. Реактивы:
  
  
  

Набор для флуориметра:
  
 Набор для очистки продукта:
  

А также:
DNA Control Sample (DCS)
Концентрированный этанол (для приготовления раствора 80%)
Безнуклеазная вода

Оборудование: 
Флуориметр Qubit 4.0
Амплификатор
Центрифуга
Микроцентрифуга
Вортекс
Ротатор
Магнитный штатив на 1.5 или 0.2 мл в зависимости от объема
Дозаторы объемов 2, 10, 20, 100, 1000 μl
Холодный штатив

Расходные материалы:
Микропробирки 1.5 мл или 0.2 мл
Тонкостенные пробирки на 0.5 мл без делений для измерений концентрации на флуориметре
Наконечники для дозаторов 2, 10, 20, 100, 1000 μl
SECTION: Лигирование адаптеров
17.1. 
 

SECTION: Лигирование адаптеров
17.5. Инкубируйте при комнатной температуре от 20 min до 60 min

SECTION: Лигирование адаптеров
17.4. Хорошо перемешайте реакционную смесь аккуратным пипетированием и сбросьте капли коротким центрифугированием
SECTION: Лигирование адаптеров
17.3. В пробирке на 1.5 мл подготовьте реакционную смесь в следующем порядке:
 

SECTION: Лигирование адаптеров
17.2. Подготовьте реактивы NEBNext Quick Ligation Reaction Module согласно инструкции производителя и поставьте на холодный штатив:
Long Fragment Buffer (LFB)
Short Fragment Buffer (SFB)
Elution Buffer (EB)
Native Adapter (NA)
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5x)
 

SECTION: Отбор проб, консервация и хранение
1. Для изучения состава и структуры сообщества грибов лесных и болотных почв, отбор проб проводится на репрезентативных участках в основных типах местообитаний. Оптимально, если на тех же участках проводилась ревизия видового состава классическим методом (наблюдение плодовых тел или выделение в культуру). В нашем случае, отбор проб ведется на площадках многолетнего мониторинга в окр. пос. Шапша и на стационаре Мухрино ЮГУ. Схема организации постоянных учетных площадей опубликована нами ранее в протоколе Sampling macrofungi using fixed-sized plots.

 

В зависимости от выбранного биотопа, определяется тип субстрата для отбора проб, глубина и  другие параметры среды, значимые для сообщества. Например, для изучения сообществ грибов лесов, мы отбираем пробы в двух горизонтах почвы: подстилка и лежащий под ней гумусовый горизонт. На сфагновых болотах отбор проб торфа происходит с разных глубин: от поверхности до глубоких слоев торфяной залежи, в зависимости от задачи. Отдельной задачей может являться отбор микоризных окончаний растений; отбор опада листьев разных растений, и др.
SECTION: Прайминг ячейки и загрузка библиотек
19. Основное оборудование:
 

 
Реактивы:
  
А именно из этого набора:
Flow Cell Flush (FCF)
Flow Cell Tether (FCT)
Library Solution (LIS)
Library Beads (LIB)
Sequencing Buffer (SB)
Bovine Serum Albumin (BSA)

 

А также:
Безнуклеазная вода
Дозаторы объемов 2, 10, 20, 100, 1000 μl
Вортекс
Микроцентрифуга
Холодный штатив

Расходные материалы:
Микропробирки 1.5 мл или 0.2 мл
Наконечники для дозаторов 2, 10, 20, 100, 1000 μl
SECTION: Прайминг ячейки и загрузка библиотек
19.1. Рекомендуется посмотреть видео демонстрации прайминга и загрузки ячейки перед первым использованием прибора на сайте Nanopore

 

 
SECTION: Прайминг ячейки и загрузка библиотек
20.4. Сдвиньте крышку праймингового порта по часовой стрелке. После открытия порта проверьте наличие мелких пузырьков воздуха под крышкой. Вытяните пипеткой небольшое количество буфера, чтобы удалить пузырьки из праймингового порта следующим образом:
Установите пипетку объемом 1000 μl на 200 μl
Поставьте пипетку на прайминговый порт
Вращайте счетчик объема пипетки на увеличение пока счетчик не покажет 220-230 μl, чтобы отобрать 20-30 μl буфера, или пока не появится небольшое количество желтого буфера в кончике пипетки
Проверьте визуально наличие буфера на протяжении от праймингового порта до сенсорной панели пор

 

SECTION: Прайминг ячейки и загрузка библиотек
20.3. Откройте крышку секвенатора MinION или GridION и задвиньте проточную ячейку до щелчка. Прижмите ячейку, чтобы убедиться в хорошем электрическом контакте.

SECTION: Прайминг ячейки и загрузка библиотек
20.2. Для приготовления прайминговой смеси с BSA, смешайте Flow Cell Flush (FCF) и Flow Cell Tether (FCT) как указано ниже:

 

Пробирочный формат прайминговой смеси. Добавьте 5 µL Bovine Serum Albumin (BSA) концентрации 50 mg/ml и 30 µL Flow Cell Tether (FCT) непосредственно в пробирку с Flow Cell Flush (FCF).
Флаконный формат. В соответствующей пробирке смешайте реактивы по схеме:
 

SECTION: Прайминг ячейки и загрузка библиотек
20.1. Разморозьте Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB) или Library Solution (LIS) (см. примечание в начале раздела), Flow Cell Tether (FCT) и одну пробирку Flow Cell Flush (FCF) при комнатной температуре, размешайте на вортексе, сбросьте на центрифуге и поставьте на холодный штатив

SECTION: Отбор проб, консервация и хранение
2. Отбор проб почвы, подстилки или торфа

Для работы в поле потребуются следующие инструменты:
 


SECTION: Отбор проб, консервация и хранение
2.1. На площадке выбирается от 3 до 5 точек, расположенных равноудаленно друг от друга. 
В каждой точке ножом или большой ложкой отбирается равный объем (вес или объем может определяться условиями эксперимента) субстрата. Вынутый из трех-пяти точек субстрат складывается в общий конверт (таким образом обеспечивается охват разнообразных микро-условий в пределах одной площадки).  Если отбор ведется с разных глубин, то отбор повторяется несколько раз на разных глубинах. Конверт подписывают номером площадки, микро-площадки и типом субстрата. Во время полевой работы образцы в конвертах хранят в сумке с хладагентом. 
SECTION: Отбор проб, консервация и хранение
2.2. В лаборатории образцы помещают на длительное хранение в морозильную камеру. Перед отправкой в морозильную камеру, нужно убедиться в надежности этикеток на конвертах и общих пакетах. Перед началом выделения тотальной ДНК пробы размораживают и сушат, подвергают лиофильной сушке, или выделяют из мокрого состояния, в зависимости выбранной стратегии.
SECTION: Отбор проб, консервация и хранение
2.3. Альтернативным способом заморозке является лиофильная сушка. Пробы упаковывают в бумажные (пергаментные) пакеты и помещают в камеру лиофильной сушилки, где происходит сначала их заморозка до -40 °C, а затем возгонка воды в вакууме. Процесс сушки может занять до нескольких суток, в зависимости от объема. 


 


SECTION: Отбор проб, консервация и хранение
2.4. Еще один альтернативный способ - консервация сушкой в термошкафу. Образцы помещают в стерильные бумажные конверты (или собирают пробы сразу в них) и сушат при температуре до 40 °C в течении двух суток. 

SECTION: Подготовка проб почвы для выделения тотальной ДНК
3.1. Подготавливаются поверхность для работы: стол стерилизуют, рядом включают фильтр или увлажнитель, ставят корзину для мусора и лоток с образцами, подготавливают раковину для мытья стаканов; на соседнем столе располагают штатив с пробирками, пинцет и стерилизатор
SECTION: Подготовка проб почвы для выделения тотальной ДНК
3.2. Сухой  образец почвы, подстилки или торфа помещают в стакан гомогенизатора, накрывают стерильным куском фольги (чтобы избежать сильного пыления), закрывают крышкой и измельчают до образования пыли. После остановки ждут несколько секунд для оседания пыли. Пробу пересыпают в тот же конверт или заворачивают в кусок фольги, подписывают номером образца и складывают в лоток.
SECTION: Подготовка проб почвы для выделения тотальной ДНК
3.3. Стакан гомогенизатора промывают под проточной водой с использованием ершика, стерилизуют перекисью водорода, и высушивают с помощью чистой бумажной салфетки и спирта. Процедуру повторяют со следующим образцом. При наличии нескольких стаканов удобно работать в паре (один человек занимается измельчением, другой чисткой и стерилизацией стаканов).
SECTION: Подготовка проб почвы для выделения тотальной ДНК
3.5. Альтернативными вариантами измельчения и гомогенизации разных субстратов может быть использование ступок и пестиков, а для древесных субстратов использование дрели (приготовление опилок). На рисунках показаны этапы измельчения, гомогенизации и отбора проб разных субстратов для метабаркодинга подстилки, торфа и древесины соответственно.


 

 

 


SECTION: Подготовка проб почвы для выделения тотальной ДНК
3.4. Образцы с измельченной до пылеватого состояния пробой переносят в микропробирки. Для этого на чистой поверхности стерильным узким шпателем из нескольких мест пробы отбирается объем (около 500 мг). Шпатель стерилизуется между образцами. Можно использовать стерильные носики, отбирая гомогенизат обратной стороной 5-10 раз. Пробирки подписывают номерами проб и хранят в замороженном виде до выделения.

 

SECTION: Выделение тотальной ДНК
4.1. Образцы замачивают в лизис-буфере и оставляют на несколько часов на термостате при  60 °C
SECTION: Выделение тотальной ДНК
4.2. В зависимости от субстрата выбирают ручной способ гомогенизации (микро-пестик) или гомогенизатор для микро-пробирок; также выбирают измельчающие частицы или шарики для растирания в пробирке


 

SECTION: Выделение тотальной ДНК
4.3. Далее выделение ДНК проводят по протоколу производителя набора для выделения. Выделенная ДНК хранится в морозильной камере -40 °C в микро-пробирках в штативах с маркировкой от нескольких дней до нескольких месяцев.

SECTION: Прайминг ячейки и загрузка библиотек
20.9. Загрузите через каплю 200 µL прайминговой смеси в прайминговый порт (! не в SpotON sample port), избегая попадания пузырьков

При правильной загрузке наблюдается выделение и обратное всасывание жидкости через SpotON sample port
SECTION: Прайминг ячейки и загрузка библиотек
20.8. Аккуратно отогните крышку SpotON sample port
SECTION: Прайминг ячейки и загрузка библиотек
20.7.  В новой пробирке объемом 1.5 mL подготовить библиотеку следующим образом:
 


SECTION: Прайминг ячейки и загрузка библиотек
20.6. Тщательно размешать пипетированием содержимое Library Beads (LIB)
 

SECTION: Прайминг ячейки и загрузка библиотек
20.5. Загрузите 800 µL прайминговой смеси через прайминговый порт, стараясь не допустить попадания воздуха. Подождите 5 минут. В это время подготовьте библиотеку к загрузке, следуя инструкции:

SECTION: Прайминг ячейки и загрузка библиотек
20.10. Перемешайте библиотеку пипетированием прямо перед загрузкой

SECTION: Прайминг ячейки и загрузка библиотек
20.11. Добавьте 75 µL подготовленной библиотеки в ячейку через каплю в SpotON sample port

SECTION: Подготовка ампликонов
6. Измерение концентраций выделенной ДНК
1. В тонкостенные пробирки на 0.5 mL разлить про 198 µL рабочего раствора Qbit dS DNA HS Kit одним наконечником
2. В каждую пробирку добавить 2 µL выделенной ДНК разными наконечниками
3. Интенсивно перемешать на вортексе
4. Измерить концентрацию на флуориметре Qubit
5. Внести результаты измерения в базу данных, для последующего расчета нормирования

SECTION: Нормализация концентраций ампликонов для подготовки библиотек
12. Оборудование:
Флуориметр Qubit

Реактивы:
Набор для флуориметра:
  

 

 


SECTION: Подготовка ампликонов
7. Нормализация концентраций ДНК
Для нормализации концентрации ДНК во всех пробирках, требуется рассчитать необходимый объем раствора исходной ДНК и воды как показано в таблице:

 



 

SECTION: Подготовка ампликонов
5. ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАКТИВЫ:

Набор для флуориметра:
  

Оборудование: 
Флуориметр Qubit 4.0
Амплификатор
Центрифуга
Микроцентрифуга
Вортекс
Дозаторы объемов 2, 10, 20, 100, 1000 μl

Расходные материалы:
Микропробирки 1.5 мл и 0.2 мл
Тонкостенные пробирки на 0.5 мл без делений для измерений концентрации на флуориметре
Рабочий раствора для флуориметра Qbit dS DNA HS Kit 
Наконечники для дозаторов 2, 10, 20, 100, 1000 μl
Праймеры
Готовая смесь с полимеразой
Безнуклеазная вода

 

SECTION: Подготовка ампликонов
8. Постановка ПЦР

 


Для приготовления ПЦР смешать компоненты смеси из расчета на число пробирок:
 
     
SECTION: Очистка ампликонов
11. Оборудование:
Центрифуга
Магнитный штатив на пробирки 1.5 mL
Вортекс
Дозаторы объемов 2, 10, 20, 100, 1000 μl

Реактивы:
  
Безнуклеазная вода
Cвежеприготовленный 80% спирт в безнуклеазной воде


 


 

SECTION: Прайминг ячейки и загрузка библиотек
20. Подготовьте концентрацию библиотеки 35-50 fmol для симплексных данных или 10-20 fmol для дуплексных данных в объеме 12 µL

 

SECTION: Запуск секвенирования
22. Установите ячейку в секвенатор до упора, убедитесь в примыкании вертикальных контактов
SECTION: Подготовка ампликонов
7.1. Подготовьте серию свежих пробирок 0.2 мл по числу проб для нормализованной ДНК. Подпишите маркером номера как на исходных пробирках с ДНК
SECTION: Подготовка ампликонов
7.2. Переносите последовательно необходимые объемы ДНК и воды в каждую пробирку, пользуясь таблицей с рассчитанными значениями. Для каждой новой пробы ДНК и воды используйте новые носики!

 

SECTION: Подготовка ампликонов
8.1. Подготовьте серию свежих пробирок 0.2 mL по числу проб (плюс К+ и К-) и подпишите маркером номера проб

SECTION: Подготовка ампликонов
8.2. Перенесите по 22.5 µL смеси в каждую пробирку одним носиком

SECTION: Подготовка ампликонов
8.3. Добавьте по 2.5 µL нормализованной ДНК в каждую пробирку

SECTION: Подготовка ампликонов
8.4. Сбросьте капли на центрифуге и установите пробирки в ПЦР машину с параметрами амплификации как в таблице:
SECTION: Подготовка ампликонов
8.5. Программа амплификации региона ITS1-5.8S-ITS2 грибов
для праймеров ITS1F (Gardes and Bruns, 1993) и ITS4 (White et al., 1990)

 

 

SECTION: Очистка ампликонов
11.3. Для очистки ампликонов ITS добавьте 0,8 объема AmPure, тщательно пипетируйте и инкубируйте 5 min


SECTION: Очистка ампликонов
11.4. Установите на магнитный штатив и дождитесь, пока частицы полностью осядут на магнит и раствор станет прозрачным
SECTION: Очистка ампликонов
11.5. Отберите супернатант
SECTION: Очистка ампликонов
11.6. Добавьте соответствующий объем свежеприготовленного 80% спирта до краев пробирки, отберите и слейте спирт
SECTION: Очистка ампликонов
11.7. Повторите предыдущий шаг
SECTION: Очистка ампликонов
11.8. Тщательно отберите спирт, сбросьте капли со стенок пробирки на центрифуге
SECTION: Очистка ампликонов
11.9. Снова поместите пробирки на магнитный штатив, тонким носиком отберите остатки жидкости
SECTION: Очистка ампликонов
11.10. Просушите до 1 min, не давайте осадку растрескиваться. Просушенный осадок перестает блестеть

SECTION: Очистка ампликонов
11.12. Установите пробирки на штатив, дождитесь оседания частиц на магнит 
SECTION: Очистка ампликонов
11.11. Добавьте 20 µL безнуклеазной воды, инкубируйте до 5 min для растворения ДНК

SECTION: Очистка ампликонов
11.13. Подготовьте серию чистых пробирок и отберите ДНК в чистую пробирку
SECTION: Очистка ампликонов
11.1. Установите на обычный штатив серию пробирок по числу проб и подпишите маркером
SECTION: Очистка ампликонов
11.2. В соответствующие пробирки слейте ПЦР продукт из двух или более пробирок с одинаковым номерами (серии ампликонов) 
(примечание к след редакции протокола ФНВ: какой должен быть общий общем ПЦР продукта? если взяли несколько серий ампликонов, то затем отбираем только часть общего объема?)
SECTION: Нормализация концентраций ампликонов для подготовки библиотек
12.1. Установите на штатив серию пробирок по числу проб и подпишите маркером
SECTION: Нормализация концентраций ампликонов для подготовки библиотек
12.2. Измерьте концентрацию ампликонов на флуориметре Qbit (размерность в ng/μl)
SECTION: Нормализация концентраций ампликонов для подготовки библиотек
12.3. Рассчитайте молярную массу ДНК, воспользовавшись NEBCalculator

 

 

SECTION: Нормализация концентраций ампликонов для подготовки библиотек
12.4. Рассчитайте необходимый объем ДНК ампликонов и воды для подготовки библиотек по таблице:
 



 

SECTION: Подготовка ампликонов
9. Поставьте гель-электрофорез для визуальной оценки результатов ПЦР, в базе данных отметьте положительный и отрицательный результат, а также чистоту контролей
SECTION: Подготовка ампликонов
10. Объедините пцр-продукт из одной пробы ДНК
Для этого в соответствующие пробирки слейте ПЦР продукт из двух или более пробирок с одинаковым номерами (серии ампликонов)
SECTION: Очистка продукта с помощью AMPure XP beads (AXP) с буферами фрагментов вместо спирта
18. 
 

SECTION: Очистка продукта с помощью AMPure XP beads (AXP) с буферами фрагментов вместо спирта
18.1. Ресуспендируйте AMPure XP Beads (AXP) на вортексе
SECTION: Очистка продукта с помощью AMPure XP beads (AXP) с буферами фрагментов вместо спирта
18.2. Добавьте 20 µL AMPure XP Beads (AXP) и перемешайте пипетированием
SECTION: Очистка продукта с помощью AMPure XP beads (AXP) с буферами фрагментов вместо спирта
18.3.  Инкубируйте 10 min с периодическим перемешиванием пощелкиванием
SECTION: Очистка продукта с помощью AMPure XP beads (AXP) с буферами фрагментов вместо спирта
18.4. Сбросьте капли коротким центрифугированием и поставьте пробирку на магнитный штатив. Не снимая пробирку со штатива удалите супернатант
SECTION: Очистка продукта с помощью AMPure XP beads (AXP) с буферами фрагментов вместо спирта
18.5. Промойте магнитные частицы в 125 µL Long Fragment Buffer (LFB) или Short Fragment Buffer (SFB). Снимите пробирку с магнитного штатива и встряхните, сбросьте капли на центрифуге, верните пробирку на магнитный штатив и дайте частицам осесть на магнит
SECTION: Очистка продукта с помощью AMPure XP beads (AXP) с буферами фрагментов вместо спирта
18.6. Повторите предыдущий шаг
SECTION: Очистка продукта с помощью AMPure XP beads (AXP) с буферами фрагментов вместо спирта
18.9. Оставьте  на магнитном штативе пока элюат не станет прозрачным
SECTION: Очистка продукта с помощью AMPure XP beads (AXP) с буферами фрагментов вместо спирта
18.8. Сбросьте центрифугированием и инкубируйте 10 min при 37°C. Каждые 2 min встряхивайте содержимое пробирки легким щелчком для облегчения смыва ДНК с частиц
SECTION: Очистка продукта с помощью AMPure XP beads (AXP) с буферами фрагментов вместо спирта
18.7. Снимите пробирку с магнитного штатива и добавьте 15 µL Elution Buffer (EB), после чего встряхните
SECTION: Очистка продукта с помощью AMPure XP beads (AXP) с буферами фрагментов вместо спирта
18.11. Подготовленная библиотека используется для загрузки в проточную ячейку. Библиотеку до загрузки храните на холодном штативе или в холодильнике.

 



SECTION: Очистка продукта с помощью AMPure XP beads (AXP) с буферами фрагментов вместо спирта
18.10. Отберите и перенести 15 µL элюата, содержащего ДНК библиотеки, в 1.5 ml пробирку. Пробирку с микрочастицами можно выкинуть.
SECTION: Очистка продукта с помощью AMPure XP beads (AXP) с буферами фрагментов вместо спирта
18.12. Измерьте концентрацию на флуориметре
 

SECTION: Запуск секвенирования
22.1. Запустите MinKnow, ячейка определится автоматически
SECTION: Запуск секвенирования
22.2. В меню Start  выбрать кнопку Sequencing
SECTION: Запуск секвенирования
22.3. Выбрать на последующих вкладках название и место записи результатов секвенирования, соответствующий кит для подготовки библиотек, быстрый базеколлинг Fast basecalling и запустить секвенирование
SECTION: Запуск секвенирования
22.4. После запуска проверить состояние ячейки
! хорошо работающая ячейка в программе залита ярко-зеленым полем
! увеличение площади темно-зеленого поля говорит об увеличении числа не секвенирующих доступных пор
! увеличение площади голубого поля говорит об увеличении числа недоступных ячеек
SECTION: Запуск секвенирования
22.5. При возникновении указанных проблем нужно
1. Остановить секвенирование
2. Вынуть и вставить заново ячейку
3. Проверить температуру прибора: двойным щелчком по строке с обзором секвенирования вызвать обзорный экран, справа в середине будет отображена температура, она не должна превышать 36 °C 

SECTION: Прайминг ячейки и загрузка библиотек
21. плотно закройте прайминговый порт и SpotON порт, отберите примерно 1000 мкл жидкости из порта для отходов
SECTION: Использованные ресурсы
23. Данный протокол содержит более или менее дословный перевод протоколов и инструкций, размещенных на сайте Nanopore. Текст был также дополнен опытом нашей работы в рамках наших исследовательских задач.