TITLE: MICRO-DILUCIÓN EN PLACA PARA LA EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA EN 50 uL 
AUTHORS: Germán Alberto Téllez Ramírez, Lily Johanna Toro, Juliana Franco Castrillon, Diana Carolina Henao, Jhon Carlos  Castaño Osorio, Grupo de Inmunología Molecular GYMOL. Universidad del Quindio

[DESCRIPTION]
<div class = "text-blocks"><div class = "text-block">Este método es basado en el método clásico de micro-dilución en placa de NCLSS (National Committee of Laboratory Safety and Standards (NCLSS) como fue publicado en Amsterdam, D. 1996. Susceptibility testing of Antimicrobials in liquid media. In 'Antibiotics in Laboratory Medicine', Lorian, V., ed. Fourth Edition, pp.52-111. Williams and Wilkins, Baltimore.  </div><div class = "text-block">Modificado con respecto a la lectura de la placa utilizando un indicador metabólico para incrementar la sensibilidad de la prueba respecto al crecimiento de las bacterias.</div><div class = "text-block">La realizacion de este protocolo fue posible gracias al apoyo del departamento administrativo de ciencia tecnología e innovacion, Colciencias a traves del proyecto 111356933173 convocatoria569-2012. </div><div class = "text-block">Este protocolo fue estandarizado con el desarrollo del proyecto de grado "OPTIMIZACIÓN DE UN MÉTODO PARA EVALUAR LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA IN VITRO EN MICROVOLÚMENES" de la estudiante Juliana Franco para optar por el titulo de Biologa. </div></div>

[STEPS]
?. [Preparación de las bacterias ]
Tome las bacterias a evaluar del banco de células y siga el protocolo de descongelación (siembre en placas de medio selectivo e incube a 37°C por 12-24 horas)Inocule una de las colonias de las bacterias a evaluar en tubos conicos de 15ml con de 2-5ml de caldo de cultivo Muller Hinton y lleve a 37°C en agitación a 180 rpm deje crecer por 5-8 horas aprox.
[incuba bacterias]
[crecimiento inóculo]
?. [Preparación de la muestra]
Diluya el péptido a una concentración 10 veces más alta con respecto a la concentración máxima a evaluar (solución stock del péptido). Realice diluciones seriadas de la solución stock del péptido en agua estéril o medio de cultivo, según corresponda a las diluciones del péptido que se quieren evaluar.Adicione 5 µL de cada una de las diluciones del péptido en cada uno de los pozos correspondientes (columnas 1-10).Adicione 50 µL de medio Mueller Hinton a la columan 11 como control de medio y 45 µL a las filas D y G como control de esterilidad del compuesto.
[por placa]
?. [Dilución de las bacterias]
Tome las bacterias crecidas en el paso 1 y diluya o deje crecer hasta alcanzar una concentración aproximada de 3-6 por 10 a la 8 UFC, lo cual corresponde a una densidad óptica (O.D) de 0,2 a 0,4 a una longitud de onda de 600 nm en celda de 1 cm ó a una O.D de 0,1 a 570 nm en 100 µL en placa de ELISA de 96 pozos. Tome las bacterias del paso anterior y diluya 1:1000 en medio líquido Muller Hinton para llevar a una concentración de 3-5 por 10 a la 5 UFC (solución de trabajo de bacterias)Adicione 45 µL de la solución de trabajo de bacterias a todos los pozos de la placa de microtitulación menos fila D, H y columna 11 como se indica en la Tabla 1.Tabla 1  ABCDEFGHIJKLMN1µg/ml
&nbsp;250
125
62,5
31,25
15,62
7,81
3,91
1,95
0,98
0,49
C-
C+
2Replicas
&nbsp;1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
3Replica 1 de cada tratamiento
A
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;4Replica 2 de cada tratamiento
B
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;5Replica 3 de cada tratamiento
C
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;6Ctrl esterilidad péptidos
D
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;7Replica 1 de cada tratamiento
E
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;8Replica 2 de cada tratamiento
F
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;9Replica 3 de cada tratamiento
G
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;10Ctrl esterilidad péptidos
&nbsp;
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;Deje incubar por 12-16 horas (crítico: no más de 16 horas) a 37ºC sin agitación.
ABCDEFGHIJKLMN1µg/ml
&nbsp;250
125
62,5
31,25
15,62
7,81
3,91
1,95
0,98
0,49
C-
C+
2Replicas
&nbsp;1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
3Replica 1 de cada tratamiento
A
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;4Replica 2 de cada tratamiento
B
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;5Replica 3 de cada tratamiento
C
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;6Ctrl esterilidad péptidos
D
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;7Replica 1 de cada tratamiento
E
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;8Replica 2 de cada tratamiento
F
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;9Replica 3 de cada tratamiento
G
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;10Ctrl esterilidad péptidos
&nbsp;
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
[adicionar bacterias]
[incubación placa]
?. [Análisis]
Para leer por turbidimetria lea la absorbancia a 570nm
?. [Análisis]
Para leer por Absorbancia con resazurina: adicione 5 µL  de solución de rezasurina a 440µM para una concentración final de 44 µM en cada pozo Incube por 2 horas a 37°CLea las placas en espectrofotómetro a 570 y 603nmRealizar delta: por cada pozo reste la absorbancia de 570nm menos 603 nmDelta = A570nm-A603nmA partir del grupo de datos del delta calcula: Blancos: calcula la mediana del grupo de blancos C- (medio de cultivo).Blanco = Mediana (11A:11C)Reste el blanco a los valores del delta de cada pozoA partir del grupo de datos del delta menos el blanco calcula: Creminiento de bacterias: calcula la mediana del grupo de crecimiento de bacterias C+. ControlBacterias= Mediana(12A:12C)A partir de estos valores calcula el porcentaje de crecimiento de cada pozo haciendo una relacion directa. %Crecimiento= (X/Control de bacterias)*100 X= Valor de delta menos el blanco de cada pozo.
?. [Análisis]
Para leer por FluorescenciaAdicione resazurina a concentración final de 44  µM. Deje incubar por 90 minutosLea la placa  ext/emisión  579/584 (filtros ext 565/10; em 600/40)Tome los valores de fluorescencia y calcula:Blancos: calcula la mediana del grupo de blancos C- (medio de cultivo).Blanco = Mediana (11A:11C)Resta el valor del blanco a todos lo pozos. Crecimiento de bacterias: calcula la mediana del grupo de crecimiento de bacterias C+. ControlBacterias= Mediana(12A:12C) A partir de estos valores calcula el porcentaje de crecimiento de cada pozo haciendo una relacion directa. %Crecimiento= (X/Control de bacterias)*100 X= Valor fluorescencia menos el blanco
?. [CBM]
Para calcular la concentración bactericida mínima (C.B.M)Tome 10 µL de hasta 3 concentraciones por triplicado sin crecimiento viable y siembre en platos de agar mueller Hinton.Incube por 18 a 24 h a 37°C y cuente las coloniasLa C.B.M es considerada como la concentración más baja que previene la formación de colonias residuales (fig 2)
?.