TITLE: Covid sekventering - SSI
AUTHORS: Theis Hass THTR Thorsen, Sekventeringsenheden SB

[DESCRIPTION]
Method used at Statens Serum Institut for detection and sequencing of SARS-CoV-2 from saliva tests. 
This protocol is specified for high-throughput sequencing of 384 samples - 376 positive SARS-CoV-2 samples + 8 control samples divided into four 96-well PCR plates. Furthermore, the samples are sequenced on the Illumina sequencing platform using a NextSeq 550.
Note, this protocol is in Danish.

[BEFORE_START]
Husk at der til at start med arbejdes med levende vira. Brug derfor passende beskyttelse som kittel, handsker og mundbind.

[GUIDELINES]
Arbejdsmængden i denne protokol kan med fordel deles over to dage.
Dag 1
RNA oprensning 
RT-qPCR 
Præ-PCR delen af biblioteksklargøringen 
Dag 2 
Post-PCR delen af biblioteksklargøringen
Sekventering 

[STEPS]
SECTION: Tagmentering af PCR Amplicons
62. Start med at navngive en ny 96-brønds PCR plade med "TAG1" + et unik ID.
SECTION: Tagmentering af PCR Amplicons
64. Klargør "Tagmentation" MM. 
Benyt nedenstående tabel og gang voluminerne med antallet af prøver (+1-2 prøver for at have nok MM). 
Vortex   grundigt før brug. 
 
 
            4   plader        TB1   HT      4608   µL        EBLTS   HT      1536   µL        Nuclease-frit   vand      7640   µL   

Vend forsigtigt den endelige MM nogle gange.
SECTION: Tagmentering af PCR Amplicons
65. Tilsæt 30 µL MM til alle brønde med prøver og kontroller i TAG1-pladen.
Gør det forsigtigt og husk at skifte spids mellem hver brønd for at undgå kontaminering mellem prøverne.
SECTION: Tagmentering af PCR Amplicons
66. "Seal" og ryst prøverne ved  .
SECTION: Tagmentering af PCR Amplicons
67. Kør PCR på prøverne med "COVIDSeq TAG"-programmet (Tager ca. 7 min).

 

SECTION: Post Tagmenterings &quot;Clean Up&quot;
68. Centrifugér TAG1-pladen ved 1000 rpm. 
SECTION: Covid sekventering - post-PCR
61. Find følgende reagenser frem.

Reagenser opbevaret ved stuetemperatur:
  
  

Reagenser opbevaret på køl:
  
  
  
  - Hold røret på is indtil en halv time før det skal bruges.

Regenser opbevaret på frost:
  - Hold røret på is.
  - Sæt på is når det er tøet op.
  - Sæt på is når det er tøet op.
 

 

 

 

SECTION: &quot;Pool&quot; og oprensning af biblioteker
87. Centrifugér TAG1-pladen ved 1000 rpm, 10 s.
SECTION: &quot;Pool&quot; og oprensning af biblioteker
88. 
 

Fjern "seal" og sæt TAG1-pladen på en magnet.
Vent til væsken er klar (~3 min).

SECTION: &quot;Pool&quot; og oprensning af biblioteker
90. Vortex "Pooled ITB"-røret for at blande og centrifugér kortvarigt.
SECTION: &quot;Pool&quot; og oprensning af biblioteker
91. Vortex   for at re-suspendere.

SECTION: &quot;Pool&quot; og oprensning af biblioteker
92. Tilsæt   svarende til den resulterende volumen i "Pooled ITB"-røret ganget med 0,9.
For eksempel, for 96 prøver, tilsæt 396 µL   til "Pooled ITB"-røret.
SECTION: &quot;Pool&quot; og oprensning af biblioteker
93. Vortex for at blande.
SECTION: &quot;Pool&quot; og oprensning af biblioteker
94. Inkubér ved stuetemperatur i 5 min

SECTION: &quot;Pool&quot; og oprensning af biblioteker
95. Centrifugér kort.

SECTION: &quot;Pool&quot; og oprensning af biblioteker
96. Sæt "Pooled ITB"-røret på en magnet og vent til væsken er klar (~5 min).
SECTION: &quot;Pool&quot; og oprensning af biblioteker
97. Fjern og kassér supernatanten. 
SECTION: &quot;Pool&quot; og oprensning af biblioteker
98. Vask "beads" 2 gange på følgende måde:
SECTION: &quot;Pool&quot; og oprensning af biblioteker
99. Brug en 10 µL pipette til at fjerne rester af EtOH.

 

SECTION: &quot;Pool&quot; og oprensning af biblioteker
100. Tilsæt 55 µL   


SECTION: &quot;Pool&quot; og oprensning af biblioteker
101. Vortex "Pooled ITB"-røret for at blande og centrifugér kort.

SECTION: &quot;Pool&quot; og oprensning af biblioteker
102. Inkubér ved stuetemperatur i 2 min.


SECTION: &quot;Pool&quot; og oprensning af biblioteker
103. Sæt "Pooled ITB"-røret på magneten og vent til væsken er klar (~2 min).


SECTION: &quot;Pool&quot; og oprensning af biblioteker
104. Overfør 50 µL supernatant fra "Pooled ITB"-røret til et nyt rør mærket ”PP” (står for "Plate Pool") + et unikt ID.

SECTION: Kvantificering og Normalisering
105. Fortynd biblioteket fra PP-røret 1:10 i et nyt rør ved at blande 4 µL bibliotek i 36 µL  .

SECTION: Kvantificering og Normalisering
106. Vortex og spin ned.
SECTION: Kvantificering og Normalisering
107. Bestem koncentrationen af 1:10-fortyndingen på en
 
med et   (mål på 10µL).
Hvis biblioteket er uden for standardområdet, så mål i stedet på det ufortyndede bibliotek (PP-røret).

 

SECTION: Kvantificering og Normalisering
109. Fortynd biblioteket i et nyt rør med en minimum volumen på 30 µL og en koncentration på 4 nanomolar (nM). Fortynd med  .
Vortex og spin ned.
SECTION: Kvantificering og Normalisering
110. Overfør 25 µL fra 1-4 rør med 4 nM-fortyndinger til et nyt rør mærket “FP” (Står for "Final Pool") + et unikt ID.

 

SECTION: Kvantificering og Normalisering
111. Vortex FP-røret.

Sæt FP-røret på is indtil det skal bruges. 
Hvis det ikke skal bruges med det samme, så opbevar det på -20°C frys.
SECTION: Denaturering og fortynding af biblioteker
113. Lav en frisk 0.2 Molarity (M) fortynding af NaOH. 
I et eppendorfrør blandes 400 µL   med 100 µL  . 
Vortex kort.
SECTION: Modtagelse af prøver
1. Modtag og registrér prøverne.
SECTION: Modtagelse af prøver
2. Opbevar prøverne på køl/frys (alt efter hvor lang tid der går, før prøverne skal bruges), eller fortsæt med det samme. 
SECTION: RNA-oprensning
3. 
 

 

Centrifugér prøverørene for at samle prøvematerialet/-mediet (podepinde) i bunden af røret. 
SECTION: RNA-oprensning
4. "Decap" prøverne i en LAF-bænk. 
"Decap" derefter en negativ og positiv ( 5 Kopier pr. uL) kontrol.

 

SECTION: RNA-oprensning
5. Tilsæt 700 µL   til alle prøverne og kontrollerne.

SECTION: RNA-oprensning
6. Ryst prøverne ved  .
SECTION: RNA-oprensning
8. Når prøverne er blevet vortexet, overfør da 200 µL fra hver prøve/kontrol til en "deep well" plade (94 prøver + 2 kontroller pr. plade). 
Registrér i hvilken brønd hver prøve/kontrol bliver overført til.

SECTION: RNA-oprensning
7. Imens klargøres følgende tre reagenser:
SECTION: RNA-oprensning
7.1. Klargøring af Proteinase K.
 

Tilsæt 10 mL   til røret/flasken med   (Den endelige koncentration er 50 mg/mL).

For at undgå skum, mix ved at vende røret/flasken nogle gange og lad det stå i 5 minutters tid, inden det bruges. Opbevar Proteinase K opløsningen på -20 °C når det ikke bruges.

(Spring dette trin over hvis reagenset allerede er klar).
SECTION: RNA-oprensning
7.2. Klargøring af vaske buffer.
 

Tilsæt 225 mL   til flasken med  .

Notér på flasken hvornår der er blevet tilsat Isopropanol, og opbevar "Wash WBE" ved stuetemperatur.

(Spring dette trin over hvis reagenset allerede er klar).
SECTION: RNA-oprensning
7.3. Klargøring af "beads".
 

Vortex røret med   i mindst 30 sek. for at få resuspenderet "beads" ordentligt.

Per prøve: 
Mix 5 µL   med 200 µL  .
Mix grundigt.
SECTION: RNA-oprensning
9. Tilsæt 10 µL   (50 mg/mL) til hver brønd med en prøve/kontrol.

SECTION: RNA-oprensning
10. 
 

Tilsæt 150 µL   til hver brønd.
Mix grundigt ved at pipettere op og ned 10 gange.
SECTION: RNA-oprensning
11. "Seal" pladen og lad den inkubere i 20 min.

 

SECTION: RNA-oprensning
12. Tilsæt 205 µL   (med isopropanol) til hver brønd, og mix 10 gange ved pipettering eller indtil de er mixet grundigt nok. 
Husk at mix "beads" inden de overføres til prøverne.

Inkubér prøverne i 5 min.
SECTION: RNA-oprensning
13. Placér prøvepladen på en magnet og vent i 5 min.
SECTION: RNA-oprensning
14. Imens prøvepladen er på magneten. 
Fjern supernatanten og smid det ud.
SECTION: RNA-oprensning
15. Fjern prøvepladen fra magneten. 
Tilsæt 400 µL   (med isopropanol) til hver brønd for at vaske "beads". 
Mix 10 gange ved pipettering for at resuspendere de magnetiske "beads".
SECTION: RNA-oprensning
16. Placér prøvepladen på en magnet og vent i 5 min.
Prøverne (væsken) skal være 'klar', før der fortsættes.
SECTION: RNA-oprensning
17. Imens prøvepladen er på magneten. Undgå at forstyrre pellet med magnetiske "beads".
Fjern supernatanten og smid det ud.

SECTION: RNA-oprensning
18. Imens prøvepladen er på magneten. Prøverne skal ikke mixes.
Vask prøverne ved at tilsætte 400 µL 70 % (v/v)  , og lad prøverne stå i ~2 min.
Fjern ethanolen.
SECTION: RNA-oprensning
19. Gentag trin 18.
SECTION: RNA-oprensning
20. Lad de magnetiske "beads" tørre i 1 min for at få de sidste dråber af ethanol til at fordampe. Undgå dog at "beads" tørrer helt ud.
SECTION: RNA-oprensning
21. Fjern prøvepladen fra magneten. 
Eluér RNA ved at tilføje 40 µL   til hver brønd.
Mix 10 gange ved pipettering og inkubér prøverne i 5 min (RNA'et er nu i væsken).

SECTION: RNA-oprensning
22. Stil prøvepladen tilbage på en magnet og vent i 2 min.
SECTION: RT-qPCR
25. Start med at klargøre RT-qPCR "Master Mix" (MM) i et "rent-rum" væk fra prøverne for at undgå kontaminering.

Følgende komponenter skal bruges:
  
  
  
  
  
  
 

Tø alle komponenterne ved stuetemperatur og stil dem på is.
Når alle komponenterne er tøet op, mix kortvarigt hver komponent ved at vende røret, pipettering eller forsigtig vortexing.

Benyt nedenstående tabel og gang voluminerne med antallet af prøver der skal analyseres (+1-2 prøver for at have nok MM).
 

Mix MM grundigt men forsigtigt ved pipettering eller vortexing efterfulgt af en kort centrifugering.
SECTION: RNA-oprensning
23. Overfør eluatet med RNA fra hver brønd til de tilsvarende brønde i en ny 96-brønds PCR plade (uden at medtage "beads"). 
Stil straks prøverne med RNA på is (hvis de skal bruges med det samme) eller gem dem i længere tid på -20 til -80 °C.
SECTION: RT-qPCR
26. Pipettér 20 µL MM til hver brønd (svarende til antal prøver + kontroller) i en ny 96-brønds PCR plade. Undgå bobler.
SECTION: RT-qPCR
27. Overfør 5 µL RNA prøve materiale fra alle brønde i eluat-pladen til den nye plade med MM. 
Gør det forsigtigt for at undgå kontaminering mellem prøverne.
SECTION: RT-qPCR
28. Luk pladen med optisk transparent "seal". 
Det er vigtigt at prøverne er helt lukket til for at undgå fordampning under RT-qPCR.
SECTION: RT-qPCR
29. Spin pladen ved 2500-3000 rpm, 1 min for at fjerne bobler og samle dråber.
SECTION: RT-qPCR
30. Programmér "real-time" PCR instrumentet.

 

SECTION: Analyse af RT-qPCR resultater
32. Åben datafilen i det valgte data analyse program. 

 

SECTION: RT-qPCR
31. Sæt prøvepladen i "real-time" PCR instrumentet og igangsæt kørslen.
SECTION: Analyse af RT-qPCR resultater
33. Sæt 'baseline'.
(i CFX Maestro) Vælg “Apply Fluorescense Drift Correction” fra menuen “Settings” → “Baseline Settings”.
SECTION: Analyse af RT-qPCR resultater
34. Sortér Ct-værdier (høj til lav).
Dobbelt-klik på trekanten i kolonnen (Cq) med Ct-værdier.
SECTION: Analyse af RT-qPCR resultater
35. Hvis der er signal-støj i de første 10 cykler, som forstyrrer analysen af PCR-kurverne, skær da de første 10 cykler væk. 
Tryk på ”Settings”→”Cycle to analyze” og ændre fra 1 til 10.
SECTION: Analyse af RT-qPCR resultater
36. Vurdér om den positive kontrol har en sigmoid (S-formet) PCR-kurve.
Hvis der ikke er tale om en S-kurve, skal prøverne køres om.
SECTION: Analyse af RT-qPCR resultater
37. Vurdér om prøverne er positive, inkonklusive eller negative baseret på de tre parametre:
"End relative fluorescence units" (End RFU)
Ct-værdi
Er PCR-kurven sigmoid eller ej (subjektiv bedømmelse)

Positiv prøve
 

Inkonklusiv prøve
 

Negativ prøve
 


SECTION: Analyse af RT-qPCR resultater
38.   og lav en frisk RNA-oprensning af de positive prøver.

SECTION: RNA-oprensning
24. Hvis denne RNA-oprensning kun har været af positive prøver, spring da til 'Covid sekventering - pre-PCR'.
Ellers fortsæt med 'RT-qPCR' nedenfor.
SECTION: Covid sekventering - pre-PCR
39. 
 

Start med at finde følgende reagenser frem fra -20°C-fryseren:

  
  
  
 
  

Lad dem tø ved stuetemperatur, og hold dem derefter på is indtil de skal bruges.
SECTION: &quot;Anneal RNA&quot;
40. Navngiv en 96-brønds PCR plade med 'CDNA' + et unikt ID.
SECTION: &quot;Anneal RNA&quot;
41. Vend røret med   nogle gange og tilsæt 9 µL til det nødvendige antal brønde i CDNA-pladen.

SECTION: &quot;Anneal RNA&quot;
42. Overfør herefter 9 µL fra hver brønd i eluat-pladen (positive prøver + kontroller) til CDNA-pladen.

SECTION: &quot;Anneal RNA&quot;
43. "Seal" og ryst prøverne ved  .

SECTION: &quot;Anneal RNA&quot;
44. Centrifugér prøverne ved 1000 rpm.

SECTION: &quot;Anneal RNA&quot;
45. Kør PCR på prøverne med "Anneal"-programmet.

 

SECTION: Syntetisering af &quot;first strand cDNA&quot;
46. Hent   fra -20°C-fryseren og stil det direkte på is (skal hele tiden holdes kold).

SECTION: Syntetisering af &quot;first strand cDNA&quot;
47. Klargør "first strand cDNA" MM.
Benyt nedenstående tabel og gang voluminerne med antallet af prøver (+1-2 prøver for at have nok MM. Hvis der er mange prøver så tilsæt lidt ekstra). 
Vend begge komponenter nogle gange før de bruges.
 

Vend forsigtigt den endelige MM nogle gange.
SECTION: Syntetisering af &quot;first strand cDNA&quot;
48. Tilsæt 8.5 µL MM til hver brønd med prøver og kontroller.
Gør det forsigtigt og husk at skifte spids mellem hver brønd for at undgå  kontaminering mellem prøverne.
SECTION: Syntetisering af &quot;first strand cDNA&quot;
49. "Seal" og ryst prøverne ved  .
SECTION: Syntetisering af &quot;first strand cDNA&quot;
50. Centrifugér prøverne ved 1000 rpm.
SECTION: Syntetisering af &quot;first strand cDNA&quot;
51. Kør PCR på prøverne med "FSS"-programmet.

 

SECTION: Amplificering af cDNA
52. For hver CDNA-plade, navngiv to nye med hhv. "COVA" og "COVB" + et unik ID så det er tydeligt, at de hører sammen.
COVA- og COVB-pladerne er to separate PCR reaktioner til hver prøve + kontrol i den tilhørende CDNA-plade.
SECTION: Amplificering af cDNA
53. Klargør "COVIDseq PCR A" MM og "COVIDseq PCR B" MM.
Benyt nedenstående tabel og gang voluminerne med antallet af prøver (+1-2 prøver for at have nok MM. Hvis der er mange prøver så tilsæt nogle ekstra). 
Vend   nogle gange før det bruges.

 

Vend forsigtigt de endelige MM nogle gange for at blande dem.
SECTION: Amplificering af cDNA
54. Tilsæt 20 µL "COVIDSeq PCR A" MM til hver nødvendig brønd i COVA-pladen. 

SECTION: Amplificering af cDNA
55. Tilsæt 20 µL "COVIDSeq PCR B" MM til hver nødvendig brønd i COVB-pladen.
SECTION: Amplificering af cDNA
56. Overfør 5 µL fra hver brønd i CDNA-pladen til de tilsvarende COVA- og COVB-plader. 
Gør det forsigtigt og husk at skifte spids mellem hver brønd for at undgå  kontaminering mellem prøverne.
SECTION: Amplificering af cDNA
57. "Seal" og ryst prøverne ved  .
SECTION: Amplificering af cDNA
58. Centrifugér prøverne ved 1000 rpm.
SECTION: Amplificering af cDNA
59. Kør PCR på prøverne med "COVIDSeq PCR"-programmet.

 

Prøverne kan blive i PCR-instrumentet natten over.
SECTION: Covid sekventering - post-PCR
60. 
 

SECTION: Tagmentering af PCR Amplicons
63. Kombinér COVA- og COVB-pladen på følgnde måde:
SECTION: Tagmentering af PCR Amplicons
63.1. Overfør 10 µL fra hver brønd i COVA-pladen til den tilhørende brønd i TAG1-pladen.
SECTION: Tagmentering af PCR Amplicons
63.2. Overfør 10 µL fra hver brønd i COVB-pladen til den tilhørende brønd i TAG1-pladen, der indeholder materiale fra COVA-pladen.
SECTION: Amplificering af Tagmenterede Amplicons
78. Imens TAG1-pladen står på magneten. Gør det forsigtigt og husk at skifte spids mellem hver brønd for at undgå kontaminering mellem prøverne. Undgå at forstyrre pellet.
Fjern og kassér supernatanten.
Brug derefter en 20 uL pipette til at fjerne de sidste rester af vaske buffer.
SECTION: Post Tagmenterings &quot;Clean Up&quot;
69. 
 

Tilsæt 10 µL   til alle brønde med prøver og kontroller i TAG1-pladen.
Gør det forsigtigt og husk at skifte spids mellem hver brønd for at undgå kontaminering mellem prøverne samt skum og bobler i prøverne.
SECTION: Post Tagmenterings &quot;Clean Up&quot;
70. "Seal" og ryst prøverne ved  .
SECTION: Post Tagmenterings &quot;Clean Up&quot;
71. Inkubér prøverne i 5 min 
SECTION: Post Tagmenterings &quot;Clean Up&quot;
72. Centrifugér TAG1-pladen ved 1000 rpm. 
Inspicér for bobler på sealet. Hvis der er nogen, så gentag centrifugeringen. 
SECTION: Post Tagmenterings &quot;Clean Up&quot;
73. Fjern "seal" og sæt TAG1-pladen på en magnet. 
Vent til væsken er klar (~3 min). 

SECTION: Post Tagmenterings &quot;Clean Up&quot;
74. Fjern og kassér supernatanten.
Gør det forsigtigt og husk at skifte spids mellem hver brønd for at undgå kontaminering mellem prøverne.
Undgå at forstyrre pellet.
SECTION: Post Tagmenterings &quot;Clean Up&quot;
75. Vask "beads" 2 gange på følgende måde:
SECTION: Post Tagmenterings &quot;Clean Up&quot;
75.1. Tag TAG1-pladen af magneten.
SECTION: Post Tagmenterings &quot;Clean Up&quot;
75.2. Tilsæt 100 µL   til alle brønde med prøver og kontroller.
Undgå at komme i kontakt med væsken i brøndene, og skift spidser efter hver plade.
SECTION: Post Tagmenterings &quot;Clean Up&quot;
75.3. "Seal" og ryst prøverne ved  .
SECTION: Post Tagmenterings &quot;Clean Up&quot;
75.4. Centrifugér TAG1-pladen ved 1000 rpm. 
SECTION: Post Tagmenterings &quot;Clean Up&quot;
75.5. Fjern "seal" og sæt TAG1-pladen på en magnet.
Vent til væsken er klar (~3 min).
SECTION: Post Tagmenterings &quot;Clean Up&quot;
75.6. Første vask: 
Fjern og kassér supernatanten.
Gør det forsigtigt og husk at skifte spids mellem hver brønd for at undgå kontaminering mellem prøverne. Undgå at forstyrre pellet.

Anden vask: 
Gå videre til næste trin.
SECTION: Amplificering af Tagmenterede Amplicons
76. Start med at tø en plade med    op.
Vortex derefter pladen med index' ved   og spin den ned ved 1000 rpm, 1 min.
SECTION: Amplificering af Tagmenterede Amplicons
79. Tag TAG1-pladen af magneten.
SECTION: Amplificering af Tagmenterede Amplicons
81. Åbn index-adaptor pladen ved at trykke en ny PCR-plade igennem foliesealet - kassér derefter PCR-pladen. Brug en ny PCR-plade til hver ny index-adapter plade. 
  
SECTION: Amplificering af Tagmenterede Amplicons
77. Klargør PCR MM. 
Benyt nedenstående tabel og gang voluminerne med antallet af prøver (+1-2 prøver for at have nok MM). 
Vend   nogle gange før brug. 
 
  
            4   plader        TB1   HT      4608   µL        EBLTS   HT      1536   µL        Nuclease-frit   vand      7640   µL   

Vend den endelige MM nogle gange.

SECTION: Amplificering af Tagmenterede Amplicons
80. Tilsæt 40 µL MM til alle brønde med prøver og kontroller i TAG1-pladen.
Gør det forsigtigt for at undgå  kontaminering mellem prøverne.
SECTION: Amplificering af Tagmenterede Amplicons
82. Overfør 10 µL fra hver brønd i index-adaptor pladen til den tilhørende brønd i TAG1-pladen.
Gør det forsigtigt og husk at skifte spids mellem hver brønd for at undgå  kontaminering mellem prøverne.
SECTION: Amplificering af Tagmenterede Amplicons
83. "Seal" og ryst prøverne ved  .
SECTION: Amplificering af Tagmenterede Amplicons
84. Hvis der er væske på sealet centrifugeres TAG1-pladen ved 1000 rpm. 
For at resuspendere "beads", ryst pladen ved  .
SECTION: Amplificering af Tagmenterede Amplicons
85. Kør PCR på prøverne med "COVIDSeq TAG PCR"-programmet.

 

SECTION: &quot;Pool&quot; og oprensning af biblioteker
89. Samle ("Pool") prøverne og kontrollerne fra TAG1-pladen i et 1,5 mL rør på følgende måde:
SECTION: &quot;Pool&quot; og oprensning af biblioteker
89.1. Brug en 10 μl otte-kanals pipette til at overføre 5.5 µL prøvemateriale fra hver brønd i TAG1-pladen til en 8 rør PCR-strimmel. Skift spidser efter hver kolonne.
Re-suspendér ved forsigtigt at pipettere op og ned nogle gange.

Dette resulterer i 66 µL "poolet" bibliotek pr. række fra TAG1-pladen (hvis pladen er fyldt).

SECTION: &quot;Pool&quot; og oprensning af biblioteker
89.2. Navngiv et nyt 1,5 mL rør "Pooled ITB" + et unikt ID.
SECTION: &quot;Pool&quot; og oprensning af biblioteker
89.3. Overfør 55 µL "poolet" bibliotek fra hver brønd i 8 rør PCR-strimlen til "Pooled ITB"-røret.

For hver prøveplade bliver resultatet et "Pooled ITB"-rør med 440 µL "pooled" bibliotek (hvis prøvepladen er fyldt).

SECTION: &quot;Pool&quot; og oprensning af biblioteker
86. Stil   ved stuetemperatur så det kan temperere (~30 min).

SECTION: &quot;Pool&quot; og oprensning af biblioteker
98.1. Lad "Pooled ITB"-røret blive på magneten og tilsæt 1000 µL frisk 80 % (v/v)   til røret.
SECTION: &quot;Pool&quot; og oprensning af biblioteker
98.2. Vent 30 s.
SECTION: &quot;Pool&quot; og oprensning af biblioteker
98.3. Fjern og kassér supernatanten.
SECTION: Kvantificering og Normalisering
108. Beregn molariteten (i nM) ved hjælp af følgende formel:
Brug 400 bp som den gennemsnitlige biblioteksstørrelse.

 
SECTION: Sekventering
112. Find følgende reagenser frem

Opbevares ved stuetemperatur:
 
  

Opbevares på køl:
  
  

Opbevares på frost:
  
- Kan sættes på køl dagen før for at tø.
  
- Stil på is når det er tøet op.
SECTION: Denaturering og fortynding af biblioteker
114. Overfør 5 µL bibliotek fra FP-røret til et nyt 1,5 mL-rør.

SECTION: Denaturering og fortynding af biblioteker
115. Tilsæt 5 µL 0.2 M NaOH.

SECTION: Denaturering og fortynding af biblioteker
116. Vortex og centrifugér kortvarigt.
SECTION: Denaturering og fortynding af biblioteker
117. Inkubér ved stuetemperatur i 5 min.
SECTION: Denaturering og fortynding af biblioteker
118. Tilsæt 5 µL   til røret.
SECTION: Denaturering og fortynding af biblioteker
119. Vortex og centrifugér kortvarigt.
SECTION: Denaturering og fortynding af biblioteker
120. Tilsæt 985 µL afkølet   til røret (koncentrationen er nu 20 picomolar (pM)).

SECTION: Denaturering og fortynding af biblioteker
121. Vortex og centrifugér kortvarigt.
SECTION: Denaturering og fortynding af biblioteker
122. Sæt røret på is.
SECTION: Denaturering og fortynding af biblioteker
123. Fortynd til 1.3 picomolar (pM) i et nyt 1,5 mL rør ved at blande 85 µL 20 picomolar (pM) denatureret bibliotek med 1215 µL afkølet  .
SECTION: Denaturering og fortynding af biblioteker
124. Vend røret et par gange og centrifugér kortvarigt.
SECTION: Denaturering og fortynding af biblioteker
125. Hold røret på is indtil sekventeringen skal klargøres.
SECTION: NextSeq 550 kørsel
126. Vend   og   fem gange for at blande reagenserne. 
SECTION: NextSeq 550 kørsel
127. Overfør hele 1.3 picomolar (pM) biblioteket til   i den markerede position på kassetten. 
SECTION: NextSeq 550 kørsel
128. Tryk på Experiment på skærmen af 
 

SECTION: NextSeq 550 kørsel
131. Pak   ud af indpakningen, og hold på siderne af flow cellen uden at røre ved glasset.

SECTION: NextSeq 550 kørsel
132. Placér flow cellen i instrumentet som ansvist på skærmen.

Tryk på Load.
SECTION: NextSeq 550 kørsel
130. Vælg én af to "setup" muligheder:
SECTION: NextSeq 550 kørsel
129. Tryk på Sequence.
SECTION: NextSeq 550 kørsel
130.1. Manual

 

Indtast et "Run Name" (og et "Library ID" hvis det ønskes).

Vælg paired end .

Indtast følgende informationer:
Index 1 og Index 2 sættes til 10,
Read 1 og Read 2 sættes til 74.

Vælg den ønskede "output folder".

"Browse" og vælg det klargjorte "sample sheet".

Vælg "Purge consumables for this run" til.

Tryk på Next.
SECTION: NextSeq 550 kørsel
130.2. Local Run Manager

 

Vælg det ønskede "run" fra listen med klargjorte kørsler.

Vælg den ønskede "output folder".

Tryk på Next.
SECTION: NextSeq 550 kørsel
133. Når lågen er lukket til, og sensorerne har registreret flow cellen, tryk på Next.
SECTION: NextSeq 550 kørsel
134. Åben lågen til højre på fronten af instrumentet.
SECTION: NextSeq 550 kørsel
135. Fjern affaldsbeholderen (den nederste beholder) med brugte reagenser, fragt affaldsbeholderen sikkert til et stinkskab (f.eks. i en lukket, tyk plastik pose) og kassér indholdet i overensstemmelse med gældende regionale, nationale og lokale love og regler.

 

SECTION: NextSeq 550 kørsel
138. Når sensorerne har registreret beholderen, luk lågen og tryk på Next.
SECTION: NextSeq 550 kørsel
137. Skub   ind på pladsen oven over affaldsbeholderen, som vist på skærmen. 
Når der høres/føles et klik, er den på plads.
SECTION: NextSeq 550 kørsel
136. Skub affaldsbeholderen tilbage ind på sin plads i instrumentet. 
Når der høres/føles et klik, er den på plads.
SECTION: NextSeq 550 kørsel
139. Åben lågen til venstre på fronten af instrumentet.
SECTION: NextSeq 550 kørsel
140. Skub   ind i reagensrummet indtil kassetten ikke kan komme længere ind.

SECTION: NextSeq 550 kørsel
141. Luk lågen til reagensrummet og tryk på Load.
SECTION: NextSeq 550 kørsel
142. Når kassetten er kørt i position og sensorerne har registreret den, tryk på Next.
SECTION: NextSeq 550 kørsel
144. Når instrumentet er færdig med at lave et automatisk tjek, tryk på Start.

Herefter begynder NextSeq'en at sekventere.
SECTION: Hvor lang tid tager kørslen?
145. En kørsel med en    tager ~16 timer.

SECTION: NextSeq 550 kørsel
143. Tjek at "run parameters" er korrekte og tryk på Next.