TITLE: Electroforesis de proteínas y Western blot DENV
AUTHORS: Delia Piedad Recalde-Reyes, Juliana Lopez Calderon

[DESCRIPTION]
Una prueba tipo Western Blot (también conocida como inmunotransferencia) es una técnica utilizada para detectar proteínas específicas en una muestra. El procedimiento consiste en separar las proteínas de la muestra en función de su tamaño mediante la técnica de electroforesis para luego ser transferida a una membrana de polivinilo. 

La membrana se somete a una serie de pasos de bloqueo y lavado para eliminar las proteínas no específicas y prevenir la unión no específica de anticuerpos en la muestra. Se añade un primer anticuerpo específico que se unen a la proteína de interés y un anticuerpo secundario que se une al anticuerpo primario.

Finalmente, se utiliza un sustrato químico que reacciona con el anticuerpo secundario para producir una señal visual que indica la presencia de la proteína de interés. La intensidad de la señal visual está relacionada con la cantidad de proteína presente en la muestra.

Este protocolo fue desarrollado gracias al apoyo administrativo de la CUE Alexander von Humboldt de Armenia y desarrollado dentro de la convocatoria de Minciencia 917 de estancia en investigación: Desarrollo de una prueba tipo Western blot, Dot blot e Inmunofluorescencia para detección de antígenos virales de dengue serotipos 1 – 4.

[BEFORE_START]
Preparar todos los medios y reactivos necesarios para usar en el inmunoensayo. Asegúrese de contar con la candad suficientes para cada uno de los pasos.

[GUIDELINES]
El siguiente protocolo describe el paso a paso para la realización de una prueba tipo Wester Blot para detección de dengue virus.

Tiempo de duración horas a partir de la realización del gel de electroforesis.

[STEPS]
1. Gel de electroforesis de proteínas (Denaturante) al 10%  (Volumenes suficientes para 2 geles)

Preparar gel de resolución empleando 

Acrilamida bis acrilamida 40%   2.5 mL
1.5M Tris HCl pH 8.8                   2.5 mL
SDS 10%                                      100 µL
Agua destilada                            4.845 mL
TEMED                                         5 µL
PSA 10%                                       50 µL

VOLUMEN TOTAL                        10 mL

Después de adicionar los reactivos en la cámara de proteínas puede adicionarse 300 µL de metanol absoluto para favorecer la polimerización del gel.

 

Gel de empaquetamiento (staking) al 4% (Volumenes suficientes para 2 geles)

Acrilamida bis acrilamida 40%   0.5 mL
1.5M Tris HCl pH 6.8                   1.25 mL
SDS 10%                                      50 µL
Agua destilada                            3.160 mL
TEMED                                         5 µL
PSA 10%                                       25 µL


VOLUMEN TOTAL                        5 mL


 

Correr el gel a 80 voltios( 8 voltios por cada cm de gel ) hasta que termine la corrida en el gel de empaquetamiento.

Posteriormente correr entre 12 a 15 voltios por cm de gel (entre 120 a 150 voltios) durante 60 minutos.

Si esta corriendo un gel a 30mAmp y para 2 geles 60mAmp.
2. Preparación de la muestra 

Preparación buffer carga  2X

SDS al 10%                             6 mL 
Glicerol al 50%                       15 mL
Azul de bromofenol al 1%      0.3 mL
0.5 M Tris HCl pH 6.8             3.75 mL
Agua destilada ajustar a        30mL

Adicionar B mercaptoetanol a 950 µL de muestra antes de usar.

Protocolo tomado y adaptado de BioRad.


Adicion buffer carga a la muestra 

Para 10 µLde muestra añadir: 

5 µL de muestra (entre 5 µg  a 10 µg de proteína total para un minigel o determinar concentración de proteínas por BCA.  

4.75 µL de buffer carga 
0.25 µL de betamercaptoetanol

Total muestra 10 µL

Calentar muestra 90 °C-100 °C durante 5 min ó  a 70 °C durante 10 min 

Cargar muestra a cada pozo 10 µL


 


3. Transferencia semi seca de proteínas 

Buffer de transferencia  1L

3.029 gde Tris Base
14.263 gde glicina

Diluir empleando agua destilada, ajustar volumen hasta    700 mL
Verificar pH a 8.3 o ajustar hasta alcanzar un volumen de 800 mL


Llevar a 1000 mLempleando 200 mL de metanol absoluto.

Para realizar la transferencia del gel de proteinas a la membrana se debe hidratar previamente la membrana sumergiendola durante 5 min en metanol absoluto, posterior a esto poner en contacto la membrana de polivinilo con el gel de electroforesis.

Eliminar las burbujas restantes entre gel membrana 

Tanto gel como membrana deben ponerse sobre papel filtro BioRad Cat. 1703960

El papel filtro debe sumergirse previamente en buffer de transferencia a 4 °Cdurante 5 min

El orden de los elementos debe ser el siguiente desde la parte superior hasta la inferior 

Papel filtro
Gel
Membrana de polivinilo 0.45um
Papel filtro 

La trasferencia se realiza en equipo trans tubo blot de BioRad empleando el protocolo éstandar  preestablecido para 2 mini geles  

25 voltios - 1.0A - 30 min


 

4. Bloqueo membrana de PVDF 

Cada membrana sensibilizada fue bloqueada   empleando leche descremada al 5%, disuelta en TBS-T. 

 

5. Adición anticuerpo primario 

Se emplearon sueros de origen humano previamente determinados por kit comerciales como 
Positivos para DENV y Negativos para DENV.

Estos anticuerpos fueron diluidos 1:200 empleando solución de bloqueo.

La reacción fue incubada durante 120 min a temperatura ambiente 20 °C en agitación constante  120rpm. 
7. Anticuerpo secundario

El anticuerpo secundario (Anti human Sigma Cat. A8542)  fue diluido 1:5000 en TBS-T con azida de sodio (NaN3) al 0,03%.

 

10. Lectura de los resultados 
6. Lavados

Se realiza lavado de la membrana con 5 mL de TBS-Tween-0,05% (TBS-T) por 5 min, este proceso se repite tres veces.
8. Lavados 

Se realiza lavado de la membrana con 5 mL de TBS-Tween-0,05% (TBS-T) por 5 min, este proceso se repite tres veces.
9. Para revelar la reacción se empleó sustrato (BCIP/NBT) Thermo Scientific Ref: 34042, la reacción se incubó a 37 °C durante 5 min.

La reacción se detuvo empleando agua destilada.

Las membranas se secaron a temperatura ambiente por 5 min.