TITLE: Quantification de la callose dans les filaments de P. patens par microscopie confocale
AUTHORS: Yoan Coudert, Arthur  Muller

[DESCRIPTION]
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[STEPS]
?. [Culture]
Faire une culture de colonie sur milieu BCD (AT) pendant 15 jours en boîte carrée (10 x 10 cm)
?. [Aniline blue staining]
Préparer la solution de travail en diluant la solution stock d’aniline bleu 1:3 (v :v) dans du tampon phosphate pH 8,5
?. [Aniline blue staining]
Remplir les puits d’une plaque 48 puits avec 200µL de la solution de travail d’aniline bleu
?. [Aniline blue staining]
Prélever une petite quantité de protonema à la périphérie des colonies et la placer dans les puits de la plaque 48-puits
?. [Aniline blue staining]
Laisser les tissues dans la solution d’aniline bleu 30 minutes à 23°C et à l’obscurité
?. [Aniline blue staining]
Rincer les échantillons à l’eau
?. [Aniline blue staining]
Placer les échantillons sur lame dans une d’iodure de propidium puis déposer une lamelle
?. [Confocal imaging]
Vérifier l’échantillon à la binoculaire
?. [Confocal imaging]
Régler les paramètres du microscope cf Paramétrage du microscope Leica TCS SP8
?. [Confocal imaging]
Localiser l’échantillon sur la lame au grossissement x 5 (air)
?. [Confocal imaging]
Observer l’ensemble de l’échantillon au grossissement x 25 puis x 40 (eau)
?. [Confocal imaging]
Définir le nombre de tiles et leurs espacements pour l’acquisition d’images cf Paramétrage du microscope Leica TCS SP8
?. [Confocal imaging]
Faire acquisition de la paroi entre la cellule apicale et la cellule sub-apicale (50 réplicats biologiques)
?. [Confocal imaging]
A partir des z-stack utiliser la fonction projection maximale pour obtenir l'image finale
?. [Confocal imaging]
Sauvegarder fréquemment le projet
?. [Traitement des images avec Fiji software]
Dupliquer les images (raccourci commande + maj + D)
?. [Traitement des images avec Fiji software]
Changer le contraste pour toutes les images Image>Adjust>Contrast>Set
?. [Traitement des images avec Fiji software]
Mettre Minimum displayed value : 0 et maximum displayed value : 4095 en 12 bit
?. [Traitement des images avec Fiji software]
Appliquer les fausses couleurs : Image>Lookup tables>Fire
?. [Traitement des images avec Fiji software]
Ouvrir le ROI T1 (modèle 360 µm2) dans le gestionnaire de ROI : analyze>tools>ROI manager
?. [Traitement des images avec Fiji software]
Déplacer la ROI dans un coin où il n’y a pas de signal et mesurer la somme de l’intensité des pixels de la ROI = signal bruit de fond :analyze>set measurments>cocher integrated densityanalyze>measure (cntrl + m)RawIntDens
?. [Traitement des images avec Fiji software]
Positionner la ROI au niveau de la paroi entre la cellule apical et sub-apical et mesurer la somme de l’intensité des pixels de la ROI = signal callose brut
?. [Traitement des images avec Fiji software]
Signal callose brut – signal bruit de fond = signal callose
?. [Traitement des images avec Fiji software]
Procéder de la même façon pour tous les échantillons
?. [Traitement des images avec Fiji software]
Enregistrer les données dans un tableur excel
?. [Analyses statistiques]
Dans un premier temps pour visualiser les données faire un box plot avec les différentes conditions traités
?. [Paramétrage du microscope LEICA TCS SP8]
Lasers  AB1  Type laser
    %
  2Laser diode UV 405 nm (callose)  10%
  3  Laser visible 488 nm (PI)
    9% à 15%
   Détecteurs  ABCDE1  Détecteur
    Observation
    Gain
    Offset
    Intervalle nm
  2  PMT 2 
    callose
    670
    0,1%
    440-520 nm
  3  PMT4
    autofluo chloroplaste
    550
    0,1%
    600-720 nm
  4  PI
     
     
    560-615 nm
  StackNombre de tiles : 30Espacement entre les tiles : 0,70 AutresGrossissement : x 40Zoom : 1,5Pinhole airy : 1Frame average : 8Scan speed : 8 000 hzDéfinition de l’image : 1024x1024Bit : 12AutresGrossissement : x 40Zoom : 1,5Pinhole airy : 1Frame average : 8Scan speed : 8 000 hzDéfinition de l’image : 1024x1024Bit : 12Aniline blueλex 390 nmλem 480 nmPIλex 493 nmλem 636 nm
AB1  Type laser
    %
  2Laser diode UV 405 nm (callose)  10%
  3  Laser visible 488 nm (PI)
    9% à 15%
ABCDE1  Détecteur
    Observation
    Gain
    Offset
    Intervalle nm
  2  PMT 2 
    callose
    670
    0,1%
    440-520 nm
  3  PMT4
    autofluo chloroplaste
    550
    0,1%
    600-720 nm
  4  PI
     
     
    560-615 nm