TITLE: Cyanobacteria growth 
AUTHORS: Ricardo M. Borges, Gabriela de Assis Ferreira, Fernanda Chagas, pauloihc

[DESCRIPTION]
Este documento tem como objetivo apresentar um protocolo abrangente para o cultivo de cianobactérias em meio aquático salino. O protocolo incorpora informações detalhadas sobre a composição das soluções, cálculos fundamentais e volumes requeridos para a execução bem-sucedida de todo o procedimento. É pertinente ressaltar que as taxas de crescimento podem manifestar consideráveis variações interspecíficas entre as diferentes estirpes de cianobactérias.


[STEPS]
SECTION: Material
10. Preparo do Meio de Cultivo F/2:
 Para 1 litro de água destilada, adicione:
41,5 gramas de sal marinho para aquario (Reef Salt)
1 mL de Solução Estoque de NaNO3 
1 mL de Solução Estoque de NaH2PO4•H2O
1 mL de Solução Estoque de Metais-Traço
Autoclave: 15 minutos a 15 min a 121oC
Aguarde o resfriamento.

Adicione 0,5 mL da Solução Estoque de vitaminas antes de usar.
SECTION: Preparo Anterior ao Cultivo
11. Separe todos os frascos Erlenmeyer de 500 mL
Lave-os com Extran a 5%.
Enxágue-os abundantemente com água destilada.

Importante considerar o número de cepas e réplicas a serem cultivadas.
SECTION: Preparo Anterior ao Cultivo
12. Prepare os Tampões de algodão para vedar os cultivos
SECTION: Preparo Anterior ao Cultivo
13. Autoclave os frascos previamente lavados com os Tampões de algodão
Autoclave: 15 minutos a 15 min a 121oC.
Seque o frasco tampado com os Tampões de algodão na estufa por 8-12 horas a 70°C.
SECTION: Preparo Anterior ao Cultivo
1. A quantidade de frascos Erlenmeyer de 500 mL necessária variará conforme o número de amostras a serem produzidas. Siga o seguinte esquema:
X amostras em quintuplicatas (x5)
Cepa Controle de Qualidade Externo (CCRM0280) em quintuplicatas (x5)
Amostras Branco de Meio de Cultivo(2 frasco Erlenmeyer tratado da mesma forma com meio e nutrientes, mas sem a etapa de inoculação)

Por exemplo: se estivermos comparando 3 espécies diferentes, serão necessários (3*5) + 5 + 2 (=22) frascos no total.

 
SECTION: Preparo Anterior ao Cultivo
14. Autoclave os frascos contendo o meio de cultivo F/2
Para 22 frascos: 22 x 200 ml = 4.4 litros (arredondado para 5 litros).
Prepare a solução em um frasco de 5 litros e divida em frascos Schott de 1 litro.
Autoclave: 15 minutos a 15 min a 121oC.
SECTION: Preparo Anterior ao Cultivo
15. Após o meio de cultivo resfriar, adicione 0,5 mL de solução de vitaminas (previamente filtrada em filtro de seringa: 0.22 um )
Nota: Não utilize o filtro de seringa de 0.45 um
SECTION: Material
7. Solução Estoque de Vitaminas:
Utilize um frasco que tenha sido previamente lavado (lavado previamente com extran 5% e rinsado com água destilada até exaustão).
Adicione os seguintes componentes:
200 mg de Tiamina
10 mL (0,1 g) de Biotina
1 ml (1 g/l) de Cianocobalamina
Complete o volume com água destilada até 1 litro.
Armazene a solução sob resfriamento em geladeira

Uso: Após a autoclavagem do meio, adicione 1 mL para cada 1 litro de meio.
SECTION: Material
4. Preparo das Soluções Estoque:
Solução Estoque de NaNO3 :
Utilize um frasco devidamente lavado (lavado previamente com extran 5% e rinsado com água destilada até exaustão)
Acrescente 7,5 g de NaNO3 (NEON, p# 01813) a 100 mL de água destilada
Armazene a solução sob resfriamento em geladeira

Uso: 1 mL para cada 1 litro de meio.
SECTION: Inoculação
17. Utilizando alças estéreis, proceder à coleta da biomassa de um cultivo previamente preparado
Quantidade: "tufo" com dimensões semelhantes a uma moeda de 50 centavos.
É imperativo realizar todas as operações utilizando luvas descartáveis e minimizar a exposição ao fluxo de ar.
Vede adequadamente os frascos Erlenmeyer com os Tampões de algodão preparados anteriormente.
SECTION: Manutenção do Cultivo
18. Para manter as cianobactérias em fase logarítmica, é essencial fornecer alimentação frequente por meio da adição da Solução Estoque de Nutrientes, preparada previamente 
Em cada cultivo, é recomendado adicionar 200 μL da Solução Estoque de Nutrientes.

A necessidade de nutrientes nas cianobactérias pode ser visualizada pela sua coloração verde característica.
SECTION: Coleta da biomassa e tratamento
19. O período de cultivo está estipulado em:
28 dias.
Com a adição da Solução Estoque de Nutrientes a cada intervalo de 7 dias.
SECTION: Coleta da biomassa e tratamento
20. Ao término dos 28 dias, de cada frasco Erlenmeyer, será coletada uma quantidade que corresponda visualmente a 80-90% da biomassa
Permitiremos que cada espécime continue seu crescimento até que seja necessário interrompê-lo.
Inicialmente, podemos fixar um limite de 4 meses para cada espécime.
SECTION: Coleta da biomassa e tratamento
21. Transfira o meio de cultivo de cada frasco Erlenmeyer com a biomassa para um tubo cônico de centrífuga de 50 mL (tipo Falcon), devidamente identificado com etiqueta (correspondente ao código de referência na lista de amostras)

Centrifugue: 3011 xg (4500 rpm) por 15 minutos a 4°C
Descarte o sobrenadante 
Continue transferindo o conteúdo de cada frasco Erlenmeyer, centrifugando e descartando o sobrenadante até completa eliminação de todo o conteúdo aquoso 
Registre o volume de biomassa obtido (foto para arquivo)
SECTION: Preparo Anterior ao Cultivo
16. Identifique cada frasco Erlenmeyer com etiquetas contendo código (rastreável na lista de amostras do projeto) e data de produção
As datas de produção de cada espécime, adição de solução de nutrientes e coletas de biomassa devem ser documentadas na lista de amostras do projeto.
Garanta que cada etapa seja realizada de forma meticulosa para assegurar um início
apropriado para o cultivo e um rastreamento confiável dos processos subsequentes.



SECTION: Material
6. Solução Estoque de Metais-Traço:
Utilize um frasco lavado (lavado previamente com extran 5% e rinsado com água destilada até exaustão).
Adicione os seguintes componentes:
23 mg de ZnSO4•7H2O
152 mg de MnSO4•H2O
7,3 mg de Na2MoO4•2H2O
14 mg de CoSO4•7H2O
6,8 mg de CuCl2•2H2O
4,6 g de Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O
4,4 g de Na2EDTA•2H2O
Complete o volume com água destilada até 1 litro.
Armazene a solução sob resfriamento em geladeira
 
Uso: 1 mL para cada 1 litro de meio.
SECTION: Material
5. Solução Estoque de NaH2PO4•H2O :
Utilize um frasco previamente lavado (lavado previamente com extran 5% e rinsado com água destilada até exaustão)
Adicione 0,5 g de NaH2PO4•H2O (NEON, p# 01415) a 100 mL de água destilada
Armazene a solução sob resfriamento em geladeira

Uso: 1 mL para cada 1 litro de meio.
SECTION: Material
9. Preparo dos Tampões de Algodão:
Materiais necessários: algodão hidrofóbico, gaze, tesoura, barbante.
Corte um pedaço de gaze do tamanho da palma da mão.
Abra a gaze e insira parte dela dentro do frasco.
Coloque o algodão hidrofóbico dentro da gaze que está dentro da boca do frasco.
Continue inserindo algodão até que, ao retirar a gaze com o algodão do frasco, um som semelhante a "puf" seja ouvido (indicando o vácuo causado pelo Tampão).
Corte um pedaço de barbante.
Amarre a gaze com o barbante, assegurando que fique bem acima do algodão (sem deixar espaço).
Corte o excesso de barbante e gaze.
Verifique se o Tampão está um pouco acima da boca do vidro.
Se necessário, ajuste sua posição.
Autoclave: 15 minutos a 15 min a 121oC.
Seque o frasco tampado com os Tampões de algodão na estufa por 8-12 horas a 70°C.

Garanta que cada etapa seja seguida de maneira precisa para assegurar a qualidade do meio de cultivo e dos procedimentos subsequentes.
   
Os Tampões de algodão são reutilizadas de um cultivo para o próximo. Ao final do cultivo, é suficiente secá-las em uma estufa para evitar a proliferação de fungos.
SECTION: Material
8. Preparo de Solução Estoque de Nutrientes:
Misture:
20 ml da Solução Estoque de NaNO3
20 ml da Solução Estoque de NaH2PO4.H2O
1 ml da Solução Estoque de Vitaminas
1 ml da Solução Estoque de Metais-Traço
Filtração em filtro em 0.22 um
Armazene a solução sob resfriamento
SECTION: Preparo Anterior ao Cultivo
2. Preenchimento do Arquivo Metadata:
Código das amostras
Código das cepas
Espécie
Meios de cultivo
Data de início
Datas de adição dos nutrientes
Data de coleta da biomassa
Método de extração (média polaridade: Diclorometano-Metanol)
Método de extração 2 (alta-polaridade: Metanol-Água)
Comentários

Lembre-se de seguir essas etapas para um registro completo e preciso das informações relacionadas ao experimento.
SECTION: Material
3. Frascos Erlenmeyer de 500 mL
Frascos tipo Scotch de 250 mL e de 1 litro
Tubos de centrifuga de 50 mL do tipo Falcon
Alças estéreis
Reagentes para preparo das soluções estoque (ver abaixo)
Centrífuga de Bancada Refrigerada (Hettich Modelo 320R, Tuttlingen, Alemanha)
SpeedVac (Christ modelo RVC 2-25, Osterode am Harz, Alemanha) no LabMeta - Instituto de Química - UFRJ
Liofilizador (modelo L120, Liotop, Brazil)

  
SECTION: Coleta da biomassa e tratamento
22. Submeta cada amostra devidamente identificada a processo de liofilização à secura
Cada amostra deve ser identificada separadamente em tubos Falcon limpos e semi-rosqueados (para nao haver contaminação cruzada das amostras)
Inserir detalhes e observações pertinentes no Metadata.
Sempre armazene em freezer a -20 oC