TITLE: Code-barres natif des amplicons (plaques 96 puits)
AUTHORS: Alex Shaw, Catherine Troman, Joyce Akello, Erika Bujaki, Javier Martin, Nick Grassly

[DESCRIPTION]
Le protocole suivant concerne la préparation des amplicons pour le séquençage à l'aide du kit de codage à barres Oxford Nanopore Native version 14 avec 96 codes à barres (SQK-NBD114.96). Lorsque vous utilisez ce kit, vous devez vous assurer d'utiliser la Flow Cell appropriée (FLO-MIN114, R10.4.1), sinon vous rencontrerez des difficultés lors du démarrage de l'analyse et les résultats de séquençage ne seront pas précis. 

Nous fournissons des estimations de ng de matériel requis pour ce protocole lors de l'amplification de la région VP1 de la poliomyélite, de la région de la capside (PanEV) ou de l'ensemble du génome (PanPV). Si vous avez des amplicons d'une taille différente de ceux-ci, vous pouvez calculer le ng requis à l'aide d'un calculateur en ligne tel que celui-ci : Poids en quantité molaire (pour les acides nucléiques) (bioline.com). 


AVANT DE COMMENCER 
Préparez environ 40 ml d'éthanol frais à 80 % avant de commencer. Cela devrait être suffisant pour l'ensemble du protocole.


[GUIDELINES]
Si vous avez de longs fragments, réduisez le pipetage (et le cisaillement potentiel) en feuilletant ou en inversant soigneusement les tubes ou les plaques pour mélanger les réactions et en les faisant tourner dans une centrifugeuse.

[STEPS]
SECTION: Preparation de l&#x27;ADN d&#x27;entree
2. Quantifier l'ADN amplifié avec un kit “Qubit Broad Range dsDNA”.
SECTION: Preparation de l&#x27;ADN d&#x27;entree
2.1. En bref, créer un master mix de 200 μl (199 μl de tampon, 1 μl de réactif Qubit) pour chaque échantillon + 2 standards + 10 %. Pour les deux standards, ajouter 190 μl du “master mix” à 10 μl de standard, et pour les échantillons, ajouter 198 μl du “master mix” à 2 μl d'échantillon. Vortexer tous les tubes standards et échantillons et incuber à température ambiante pendant 2 minutes avant de quantifier. 
SECTION: Preparation de l&#x27;ADN d&#x27;entree
2.2. *Important - assurez-vous de choisir le kit vaste gamme sur le Qubit* Enregistrer la concentration d'ADN pour chaque échantillon. 
SECTION: Preparation de l&#x27;ADN d&#x27;entree
3. Transférer 200 fmol d'ADN par échantillon dans une plaque à 96 puits propre et ajuster le volume à 12,5 ul avec de l'eau sans nucléase. Mélange doucement en pipetant. 200 fmol = ~155ng VP1, ~584ng PanEV, ~974ng PanPV
SECTION: Preparation de l&#x27;ADN d&#x27;entree
4. Centrifuger brièvement dans une centrifugeuse à plaques.
None. 
SECTION: Preparation de l&#x27;ADN d&#x27;entree
1.6. Peler les billes sur l'aimant, puis retirer et conserver 20 µl d'éluat (ou autant que possible) dans une nouvelle plaque PCR à 96 puits. 
SECTION: Preparation de l&#x27;ADN d&#x27;entree
1.5. Retirer le tube de l’étagère magnétique et remettre le granule en suspension dans 20 µl d'eau sans nucléase. Incuber pendant 2 minutes à température ambiante. 
SECTION: Preparation de l&#x27;ADN d&#x27;entree
1.4. Centrifugez et replacez le tube sur l'aimant. Pipeter tout éthanol résiduel. Laisser sécher pendant 30 secondes. 
SECTION: Preparation de l&#x27;ADN d&#x27;entree
1.3. Maintenez l'aimant, lavez les billes avec 100 µl d'éthanol à 80 % sans perturber le granule. Retirer l'éthanol à l'aide d'une pipette et jeter. Répéter. 
SECTION: Preparation de l&#x27;ADN d&#x27;entree
1.2. Faites tourner l'échantillon et placer sur un aimant lorsqu’il soit claire et incolore. Gardez le tube sur l'aimant et pipettez le surnageant.
SECTION: Preparation de l&#x27;ADN d&#x27;entree
1.1.      Incuber sur un rotateur pendant 5 minutes à température ambiente. 
SECTION: Preparation de l&#x27;ADN d&#x27;entree
1. Laisser les billes AMPure se réchauffer à température ambiante, puis ajouter 0,8x le volume du mélange de réaction PCR à la réaction et pipeter doucement pour mélanger.

Par exemple, pour une réaction PCR de 25 µl, ajouter 15 µl de billes AMPure XP

SECTION: End-prep &amp; dA-tailing
5. Préparez les réactifs suivants comme master mix pour le nombre d'échantillons + 10% supplémentaire :

 

SECTION: End-prep &amp; dA-tailing
6. Ajouter 2,5 µl du mélange réactionnel à chaque échantillon.
SECTION: End-prep &amp; dA-tailing
7. Bien mélanger par pipetage et centrifuger dans une centrifugeuse à plaques.
SECTION: End-prep &amp; dA-tailing
8. Incuber 5 minutes à 20 °C et 5 minutes à 65 °C à l'aide du thermocycleur.
SECTION: Ligation des codes-barres et mutualisation
9. Sélectionnez un code-barres natif unique pour chaque échantillon de l'analyse et décongelez à température ambiante, puis gardez-les sur de la glace.
SECTION: Ligation des codes-barres et mutualisation
10. Décongeler les billes AMPure à température ambiante. Mélanger les billes AMPure au vortex avant d’utiliser. 
SECTION: Ligation des codes-barres et mutualisation
11. Dans chaque puits requis d'une plaque 96 puits, ajouter :

 

SECTION: Ligation des codes-barres et mutualisation
12. Mélanger doucement en pipetant. Sceller la plaque et centrifuger. 
SECTION: Ligation des codes-barres et mutualisation
13. Incuber la plaque pendant 20 minutes à température ambiante. 

SECTION: Ligation des codes-barres et mutualisation
14. Ajouter 1µl d'EDTA dans chaque puit, mélanger par pipetage puis centrifuger brièvement.

SECTION: Ligation des codes-barres et mutualisation
15. Regroupez tous les échantillons dans un tube de 1,5 ml. 
SECTION: Ligation des codes-barres et mutualisation
16. Préparez les billes AMPure XP pour utilisation; remettre en suspension au vortex. 
SECTION: Ligation des codes-barres et mutualisation
17. Nettoyer et concentrer les échantillons regroupés en utilisant un volume de billes AMPure XP remises en suspension égale à 0,4x le volume de vos échantillons regroupés. 
SECTION: Ligation des codes-barres et mutualisation
17.1. Ajouter les billes AMPureXP, pipeter pour mélanger. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante. 
SECTION: Ligation des codes-barres et mutualisation
17.2. Faites tourner l'échantillon et le granule sur une étagère magnétique lorsqu’il soit claire et incolore, puis pipettez le surnageant.
SECTION: Ligation des codes-barres et mutualisation
17.3. Gardez sur l'aimant et lavez les billes avec 700 µl d'éthanol à 80 %, puis retirer l'éthanol et jeter. Répéter. 
SECTION: Ligation des codes-barres et mutualisation
17.4. Centrifugez et replacez le tube sur l’étagère magnétique. Pipeter tout éthanol résiduel. Laisser sécher pendant 30 secondes. 
SECTION: Ligation des codes-barres et mutualisation
17.5. Remettre le granule en suspension dans 35 µl d'eau sans nuclease en effleurant le tube. 
SECTION: Ligation des codes-barres et mutualisation
17.6. Incuber pendant 10 minutes à 37°C, en agitant le tube toutes les 2-3 minutes pour favoriser l'élution. 
SECTION: Ligation des codes-barres et mutualisation
17.7. Pelletez les perles sur l’ étagère magnétique jusqu'à ce qu'elles soient claires, puis conservez 35 uL dans un tube propre Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml.
SECTION: Ligature de l&#x27;adaptateur
18. Décongelez les réactifs comme suit: Décongele le tampon de réaction de ligature rapide NEBNext (5X) (NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer 5X), tampon d'élution (Elution Buffer - EB) et soit un tube de Long Fragment Buffer (LFB) pour les amplicons plus longues (<3kb) ou un tube de Short Fragment Buffer (SFB) pour maintenir toutes les différents tailles d’amplicons à température ambiante, mélanger au vortex, centrifuger et placer sur de la glace. Faites tourner l'adaptateur natif (Native Adaptor - NA) et la ligase T4 rapide (Quick T4 Ligase), mélangez par pipetage et placez sur de la glace. 
SECTION: Ligature de l&#x27;adaptateur
19. Aux 30 uL d'échantillon à code-barres regroupé, ajoutez les réactifs suivants :

 

SECTION: Ligature de l&#x27;adaptateur
20. Mélanger en tapotant le tube et centrifuger. 
SECTION: Ligature de l&#x27;adaptateur
21. Incuber la réaction pendant 20 minutes à température ambiante. 
SECTION: Ligature de l&#x27;adaptateur
22. Remettre les billes AMPure XP en suspension au vortex, puis ajouter 20 µl de billes AMPure XP à la réaction de ligature de l'adaptateur. 
SECTION: Ligature de l&#x27;adaptateur
23. Quantifiez 1 µl de votre bibliothèque adaptée à l'aide d'un Qubit ou tapestation. 
SECTION: Ligature de l&#x27;adaptateur
24. Ajoutez 20 fmol de votre bibliothèque dans un tube PCR de 0,2 ml et augmentez le volume jusqu'à 12 µl à l'aide du tampon d'élution.
Si vous avez besoin de diluer la bibliothèque pour faciliter le pipetage, vous pouvez la diluer dans un tampon d'élution. 20 fmol = ~16ng VP1, ~59ng PanEV, ~98ng PanPV  
SECTION: Ligature de l&#x27;adaptateur
22.1. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante sur un rotateur. 
SECTION: Ligature de l&#x27;adaptateur
22.2. Faites tourner l'endroit sur une étagère magnétique, laissez les billes se sédimenter et pipetez le surnageant. 
SECTION: Ligature de l&#x27;adaptateur
22.3. Laver les billes en ajoutant 125 uL de LFB ou SFB, effleurer le tube pour remettre les billes en suspension, centrifuger puis remettre sur l'aimant pour granuler les billes. Pipeter le surnageant, puis répéter cette étape.
SECTION: Ligature de l&#x27;adaptateur
22.4. Faites tourner le tube et remettez-le sur l’étagère magnétique. Pipeter
le surnageant résiduel. 
SECTION: Ligature de l&#x27;adaptateur
22.5. Retirer le tube de l’étagère magnétique et remettre en suspension le granule dans 15 µl de tampon d'élution. Effleurez doucement le tube pour remettre le culot en suspension. 
SECTION: Ligature de l&#x27;adaptateur
22.6. Incuber à 37 degrés pendant 10 minutes, en effleurant doucement le tube toutes les 2-3 minutes pour favoriser l'élution de l'ADN.
SECTION: Ligature de l&#x27;adaptateur
22.7. Centrifugez puis culottez les billes sur l’étagère magnétique, et retirez et conservez 15 ul d’éluat dans un tube propre de 1,5 ml. Jetez les billes granulées.
SECTION: Amorcage et chargement de la Flow Cell MinION
25. Décongelez le tampon de séquençage (Sequencing Buffer - SB), les perles de bibliothèque (Library Beads - LIB), l’attache de cellule d’écoulement (Flow Cell Tether - FCT) et un tube de flux de cellule d’écoulement (Flow Cell Flush - FCF) à température ambiante et remettez-les dans la glace une fois décongelés.  Mélanger les tubes de tampon de séquençage (Sequencing Buffer - SB), flux de cellule d’écoulement (Flow Cell Flush - FCF) et attache de cellule d’écoulement (Flow Cell Tether - FCT) au vortex, centrifuger et remettre dans la glace.  Faites tourner le LIB une fois décongelé, puis remettez-le dans la glace.
SECTION: Amorcage et chargement de la Flow Cell MinION
26. Pour créer le mélange d'amorçage, ajoutez 30 μL de FCT et 5 uL de BSA (50 mg/ml) au tube de FCF, puis mélangez par pipetage.
SECTION: Amorcage et chargement de la Flow Cell MinION
27. Ouvrez le couvercle du dispositif de séquençage nanopore et faites glisser le couvercle du port d'amorçage de la Flow Cell dans le sens des aiguilles d'une montre afin que le port d'amorçage soit visible. Après avoir ouvert le couvercle d'amorçage, vérifiez s'il y a de l'air sous l'orifice. Retirez un petit volume en faisant tourner le piston de la pipette pour augmenter lentement le volume afin d'éliminer les bulles d'air (quelques µL). Vérifiez visuellement qu'il y a un tampon continu du port d'amorçage à travers le réseau de capteurs. 
SECTION: Amorcage et chargement de la Flow Cell MinION
28. Utilisez une pipette P1000 pour chargez 800 µl du mélange d'amorçage dans la cellule à écoulement via le port d'amorçage, en évitant l'introduction de bulles d'air.  Laissez une petite quantité de liquide à l'extrémité de la pointe de la pipette pour vous assurer de ne pas introduire d'air dans la cuve à circulation. Attendez 5 minutes. 
SECTION: Amorcage et chargement de la Flow Cell MinION
29. Mélanger le contenu du tube LIB en pipetant juste avant de l'ajouter au mélange de bibliothèque suivant dans un tube de 1,5 ml:

 


SECTION: Amorcage et chargement de la Flow Cell MinION
30. Terminez l'amorçage de la flowcell en ouvrant le couvercle du port SpotOn et en chargeant soigneusement 200 μl du mélange d'amorçage dans le port d'amorçage. Comme avant, laissez une petite quantité de liquide au fond de l'embout pour éviter l'introduction de bulles d'air. 
 
Lors de l'ajout du mélange d'amorçage, vous pouvez voir une petite quantité de liquide monter par le port SpotOn. Si vous le faites, faites une pause et laissez le liquide refluer dans la flowcell avant de continuer à passer le mélange d'amorçage.
SECTION: Amorcage et chargement de la Flow Cell MinION
31. Mélangez délicatement la librairie préparée en la pipetant. 
Ajouter goutte à goutte 75 μl d'échantillon à la Flow Cell via le port d'échantillon SpotON. Assurez-vous que chaque goutte coule dans le port avant d'ajouter la suivante. 
SECTION: Amorcage et chargement de la Flow Cell MinION
32. Replacez délicatement le couvercle du port d'échantillonnage SpotON, en vous assurant que le bouchon pénètre dans le port SpotON, fermez le port d'amorçage et replacez le couvercle MinION.
SECTION: Amorcage et chargement de la Flow Cell MinION
33. Ouvrez le logiciel ONT MinKNOW et suivez les étapes pour configurer et démarrer votre cycle de séquençage.
Dans la section Démarrer, sélectionnez démarrer l'exécution et suivez les invites pour sélectionner le kit utilisé, définir la durée d'exécution et définir l'appel de base et le démultiplexage.