TITLE: DOT BLOT - DENGUE VIRUS
AUTHORS: Delia Piedad Recalde-Reyes, Juliana Lopez Calderon

[DESCRIPTION]
Es un inmunoensayo simple y rápido. Requiere la aplicación de una pequeña cantidad de muestra directamente sobre una membrana polivinilo PVDF, en la que se deposita antigeno total de DENV y posteriormente se expone a suero humano diluido en TBS-T 1:200, para posteriormente, ser detectado con anticuerpo IgG anti human marcado con fosfatasa alcalina diluido en TBS-T (1:5000).

La reacción se visualiza a simple vista al visualizar la presencia de un punto de color violeta (reactivo o positivo) o la ausencia de este (no reactivo o negativo). 

Este protocolo fue desarrollado gracias al apoyo administrativo de la CUE Alexander von Humboldt de Armenia y desarrollado dentro de la convocatoria de Minciencia 917 de estancia en investigación: Desarrollo de una prueba tipo Western blot, Dot blot e Inmunofluorescencia para detección de antígenos virales de dengue serotipos 1 – 4.



[BEFORE_START]
Preparar todos los medios y reactivos necesarios para usar en el inmunoensayo. Asegúrese de contar con la candad suficientes para cada uno de los pasos.



[GUIDELINES]
El siguiente protocolo describe el paso a paso para la realización de una prueba tipo Dot Blot para detección de dengue virus.

Tiempo de duración 24 horas a partir de la activación de las membranas de polivinilo.

[STEPS]
2. Activación membrana de polivinilo 

Para realizar este paso es necesario sumergir la membrana de polivinilo poro 0,45μm en metanol absoluto durante  5 min.

Posteriormente se retira y se deja secar a temperatura ambiente.


 

3. Adición del antígeno total sobre la membrana (transferencia directa)

En la membrana de polivinilo se aplica 1 µL de metanol absoluto, empleando una micropipeta de 10μm.

Sobre este punto se añaden 3 µL de antígeno total (DENV).

Esta muestra se deja secar a temperatura ambiente durante 10 min .

6. Lavados 

Se realiza lavado de la membrana con 5 mL de TBS-Tween-0,05% (TBS-T) por 5 min, este proceso se repite tres veces.

7. Anticuerpo secundario 

El anticuerpo secundario (Anti human Sigma Cat. A8542)  fue diluido 1:5000 en TBS-T con azida de sodio (NaN3) al 0,03%.

 

1. Preparación del antígeno 

En este ensayo se trabajó con antígeno total de DENV2; el virus esta previamente titulado a 17.000.000 UFP/mL y almacenado a -80 °C.

Previo al uso del antígeno total, este se llevó a temperatura ambiente de manera espontánea.

Estos virus fueron empleados como antígeno total para los ensayos de Dot Blot. 

Después de su descongelación, estas alicuotas fueron almacenadas a -20 °C.

 

4. Bloqueo de la membrana 

Cada membrana sensibilizada fue bloqueada   empleando leche descremada al 5%, disuelta en TBS-T. 

 

5. Adición de Anticuerpo Primario

Se emplearon sueros de origen humano previamente determinados por kit comerciales como 
Positivos para DENV y Negativos para DENV.

Estos anticuerpos fueron diluidos 1:200 empleando solución de bloqueo.

La reacción fue incubada durante 120 min a temperatura ambiente 20 °C en agitación constante  120rpm. 

8. Lavados 

Se realiza lavado de la membrana con 5 mL de TBS-Tween-0,05% (TBS-T) por 5 min, este proceso se repite tres veces.
9. Revalado.

Para revelar la reacción se empleó sustrato (BCIP/NBT) Thermo Scientific Ref: 34042, la reacción se incubó a 37 °C durante 5 min.

La reacción se detuvo empleando agua destilada.

Las membranas se secaron a temperatura ambiente por 5 min.

10.     
  

      
11. Determinación punto de corte

La interpretación de los datos debe realizarse tomando de la siguiente manera.

Obtener el promedio y desviación estandar de la intensidad de señal de los controles negativos (PBS, o sueros/plasmas) negativos.

Cut off =   

X̅: Promedio
DS: Desviación estandar

Interpretación

Los valores iguales e inferiores al promedio se consideran NEGATIVOS, valores iguales al promedio + 3 desviaciones estandar se consideran resultados INDETERMINADOS (zona gris de la prueba). 

Valores por encima del punto de corte se consideran POSITIVOS.