TITLE: Montagem de genomas de fungos (short reads)
AUTHORS: Thiago Mafra Batista

[DESCRIPTION]
This protocol provides step-by-step instructions for students and researchers to assemble fungal nuclear genomes using Illumina short reads with SPAdes software. Before assembling the genome, we will align the short reads against a bacterial genome database to eliminate possible contaminations. Finally, we will evaluate the completeness of the assemblies using the BUSCO software.

[STEPS]
SECTION: Avaliação da qualidade do sequenciamento
1. Para avaliarmos os parâmetros de qualidade, sobretudo o phred score, utilizaremos dois softwares: FastQC e MultiQC.

 
O fastqc gera um arquivo .html e um arquivo .zip para cada read. Os arquivos .html podem ser abertos em qualquer navegador de internet. Já o multiqc utiliza as informações geradas pelo fastqc para gerar um relatório mais completo. Ele deve ser executado no mesmo diretório onde foram salvos os arquivos de saída do fastqc.

 

Será gerado um arquivo chamado multiqc_report.html que também deve ser visualizado em qualquer navegador de internet.
SECTION: Filtragem de possíveis contaminantes bacterianos
2. Com o intuito de eliminar possíveis contaminantes bacterianos, vamos filtrar as reads alinhando-as contra um banco de sequências de genomas bacterianos depositadas no RefSeq.

Configure os caminhos das reads e do diretório de trabalho de acordo com o projeto. A seguir, um script em bash que filtra as raw reads contra o banco de dados RefSeq bacteriano. Ao fim, é gerado a contagem de reads pareadas e singletons alinhadas e não alinhadas no RefSeq bacteriano.
 

SECTION: Montagem do genoma com SPAdes
3. Instruções:
- Realizar, pelo menos, três diferentes montagens com os dados testando parâmetros como o --cov-cutoff; por padrão, ele está off; testar --cov-cutoff auto e um valor abaixo de 100, por exemplo --cov-cutoff 80
- Sempre habilitar o parâmetro --isolate quando houver uma alta cobertura de dados (acima de 100x)
- Utilizar as reads não alinhadas no RefSeq bacteriano
- Tempo estimado para cada montagem: 90 minutos

SECTION: Montagem do genoma com SPAdes
4. Para montar o genoma com o SPAdes, lembre-se de utilizar as reads que não alinharam no RefSeq bacteriano.

 

Avaliação das montagens com scaffold_stats.pl e BUSCO

O spades gera dois principais arquivos de output, o contigs.fasta e o scaffolds.fasta. Avalie os parâmetros de avaliação da qualidade da montagem em ambos arquivos e decida qual utilizar a partir das melhores métricas.

O Genbank só aceita contigs que tenham pelo menos 200 pb. Para eliminar os contigs menores que 200 pb utilize o comando abaixo: 

 

- rodar o script scaffold_stats.pl com todos os arquivos contigs_200bp.fasta, assim:

 
 
Avalie os seguintes parâmetros:

Tamanho do genoma montado
Quantidade de contigs/scaffolds
N50
L50
Maior contig/scaffold

Rodar o BUSCO para avaliar a presença de ortólogos conservados no grupo taxonômico de interesse. Neste caso, saccharomycetes

 

Observação: especifique um local para download do orthodb de saccharomycetes para que nas próximas vezes que rodar o busco não seja necessário um novo download. No caso acima, especifiquei /data/busco_downloads/. Isso economiza um bom tempo ao rodá-lo.