TITLE: Anotação de genomas de fungos
AUTHORS: Thiago Mafra Batista

[DESCRIPTION]
Este tutorial guiará estudantes e pesquisadores a realizarem a anotação (estrutural e funcional) de genomas de fungos com o software Maker2. Iniciamos com a identificação e mascaramento das regiões repetitivas com o RepeatModeler e RepeatMasker, respectivamente. Treinamos os preditores SNAP e Augustus para aprimorarmos a predição gênica que é realizada em duas etapas. Então, conduzimos a anotação funcional dos genes codificadores de proteínas a partir da similaridade encontrada com sequências depositadas nos bancos de dados Swissprot e Trembl e com o Interproscan.

[STEPS]
SECTION: Identificação e mascaramento das regiões repetitivas
1. Antes de realizar a predição gênica, vamos identificar as famílias de repetições com o RepeatModeler e depois mascará-las no genoma com o RepeatMasker. No exemplo abaixo estou utilizando um arquivo fasta com nome contigs_Y6065_v1.fasta, os softwares instalados em /opt/apps e seus executáveis disponíveis na variável de ambiente.

Criar o banco indexado a partir do genoma montado

 

Rodar o RepeatModeler com 32 processadores

 

Famílias de repetições identificadas. Hora de mascará-las no genoma

 

SECTION: Predição gênica
2. A predição gênica será realizada com o software Maker2. O maker possui um preditor interno e também faz o uso de preditores externos como o SNAP, Augustus e GeneMark. Neste tutorial, vamos utilizar o SNAP e Augustus. Ambos precisam ser treinados. Para treinarmos o SNAP utilizaremos o arquivo gff gerado como output do CEGMA.
SECTION: Predição gênica
2.1. CEGMA (Core Eukaryotic Genes Mapping Approach) 

O CEGMA utiliza um grupo de 458 proteinas altamente conservadas em diferentes espécies. Os softwares de alinhamento identificam as junções exon-intron nos genomas avaliados e seus resultados são uteis para treinar preditores e para avaliar a completude de genomas.

 
Agora vamos treinar o SNAP a partir do gff gerado pelo CEGMA. Abaixo todos os comandos necessários para isso.

 

SECTION: Predição gênica
2.2. Maker (passo 1)

Vamos rodar o maker em duas etapas. Na primeira, habilitamos o SNAP com o arquivo cegmasnap.hmm e utilizamos um conjunto de proteínas de sete leveduras diferentes (Clavispora lusitaniae, Kluyveromyces lactis, Lodderomyces elongisporus, Metchnikowia bicuspidata, Saccharomyces cerevisiae S288C, Spathaspora passalidarium e Schefferomyces stipitis) em um único arquivo nomeado seven_yeasts_proteins.faa. Essas proteínas servirão de evidências para a predição gênica. O ideal seria utilizar também dados de transcriptoma, quando disponíveis.

 
Vamos modificar apenas o arquivo maker_opts.ctl. Abaixo estão as linhas modificadas:

 
Agora vamos rodar a primeira etapa do maker. Tempo estimado: 50 minutos.

 
Após concluída a primeira etapa, vamos gerar os arquivos fasta contendo as sequências codificadoras de proteínas (nucleotídeos e aminoácidos) e o arquivo gff com as coordenadas das predições.

 

SECTION: Predição gênica
2.3. Treinamento do SNAP

Vamos treinar o SNAP novamente, mas agora, a partir do arquivo gff gerado pelo maker no passo 1.

 

SECTION: Predição gênica
2.4. Treinamento do Augustus

O treinamento do Augustus será realizado em duas etapas. Vamos usar de exemplo neste tutorial o código y6065 que deverá ser alterado de acordo com o projeto.

Primeira etapa do treinamento:
 
Segunda etapa do treinamento:
 
Agora vamos avaliar as duas etapas de treinamento. O comando grep irá imprimir as informações na tela. Observe os valores de sensibilidade (sensitivity) de especificidade (specificity).
 

SECTION: Predição gênica
2.5. Maker passo 2

Vamos realizar uma nova predição modificando alterando apenas as informações para o SNAP e para o Augustus no arquivo maker_opts.ctl

 
Rodando o maker no passo 2. Tempo estimado: 50 minutos.
 
 Após concluída a segunda etapa, vamos novamente gerar os arquivos fasta contendo as sequências codificadoras de proteínas (nucleotídeos e aminoácidos) e o arquivo gff com as coordenadas das predições.

 

Vamos agora processar os cabeçalhos das sequências, inserindo um código único de cada genoma:

 

Agora as sequências codificadoras de proteínas preditas no genoma estão prontas para serem anotadas funcionalmente.
SECTION: Anotação funcional
3. Vamos anotar as sequências a partir da similaridade encontrada com proteínas depositadas no Swissprot. As sequências que não tiverem correspondência, serão alinhadas no Trembl. Além disso, vamos anotar também com o Interproscan. Por fim, as sequencias que não tiverem correspondência com o Trembl, serão alinhadas no banco Non-redundants (NR), mas não para anotá-las, e sim para verificarmos se há alguma correspondência e verificarmos quantas sequências são desconhecidas, ou seja, sem homologia com qualquer outra já depositada no Genbank.

Vamos utilizar o Diamond/BlastX para as buscas por similaridade entre sequencias nos bancos Swissprot, Trembl e NR. Com o Interproscan utilizaremos todos as análises disponíveis no software. Abaixo segue um script para automatizar todo o processo:

 
 Agora é hora de atribuirmos as anotações aos arquivos fasta e ao arquivo gff. É neste momento que utilizamos o arquivo uniprot_sprot_trembl.fasta.

Observação: o maker_funciontal_fasta consome muita memória RAM. Serão necessários mais de 100GB. Atentem-se a isso e acompanhem o consumo durante essa fase.

 

E por fim, vamos adicionar a anotação obtida com o Interproscan ao arquivo gff

 

Anotação funcional concluída!