TITLE: extraccion de ARN en TRIzol 
AUTHORS: Marco  Cacciabue, María Ines Gismondi

[DESCRIPTION]
<div class = "text-blocks"><div class = "text-block">Protocolo para extraccion de ARN a partir de TRIzol para virus de la fiebre aftosa</div></div>

[STEPS]
?. [Preparación]
Controlar cada uno de los siguiente puntos (cada volumen es para 1 muestra a procesar)
?. [Preparación]
Enfriar la centrifuga refrigerada.
?. [Preparación]
Limpiar mesada de trabajo.
?. [Preparación]
200 μL de cloroformo.
?. [Preparación]
1 μL de glucógeno.
?. [Preparación]
700 μL de isopropanol.
?. [Preparación]
1 mL de Etanol 70% Agua DEPC 30%
?. [Preparación]
12 μL de Agua Libre de Nucleasas
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
src="file:///C:\Users\Marco\AppData\Local\Temp\msohtmlclip1\01\clip_image001.gif"
?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Asegurarse
?. [Método]
que las muestras congeladas con TRIZOL estén totalmente descongeladas o agregar
?. [Método]
200 μL de muestra a 1 mL de TRIZOL .
?. [Método]
1.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Incubar
?. [Método]
a T. Amb. Por 5 min.
?. [Método]
2.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Agregar
?. [Método]
200 μL de Cloroformo al tubo.
?. [Método]
3.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
src="file:///C:\Users\Marco\AppData\Local\Temp\msohtmlclip1\01\clip_image001.gif"
?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Mezclar
?. [Método]
con vortex o por inversión por 10- 15 seg, dejar a 22° C por 3 min
?. [Método]
4.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Centrifugar
?. [Método]
por 15 min. A 13000 rpm a 2-8° C.
?. [Método]
5.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Rotular
?. [Método]
'mso-spacerun:yes'>  un eppendorf de 1,5 mL y agregar 1 μL de
?. [Método]
glycogen.
?. [Método]
6.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Tomar
?. [Método]
la mayor cantidad posible de la fase líquida superior (650- 700 μL) de los
?. [Método]
tubos centrifugados y agregar al tubo correspondiente con glycogen.
?. [Método]
7.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Agregar
?. [Método]
un volumen equivalente de Isopropanol (650-700 μL) a cada tubo.
?. [Método]
8.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Mezclar
?. [Método]
con vortex unos segundos.
?. [Método]
9.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Incubar
?. [Método]
(alternativamente) a 22° C por 10 min, 1 hora a -70° C u ON a -20° C.
?. [Método]
10.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Centrifugar
?. [Método]
por 15 min a 13000 rpm a 2-8 ° C.
?. [Método]
11.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Descartar
?. [Método]
sobrenadante y agregar 1 mL de etanol 70% Agua DEPC 30% a cada tubo. Mezclar
?. [Método]
suavemente con los dedos.
?. [Método]
12.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Centrifugar
?. [Método]
por 15 min. A 13000 rpma 2-8° C (sacar
?. [Método]
fuera del freezer todos los reactivos ARN y prender el baño de agua a 70 ° C).
?. [Método]
13.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Remover
?. [Método]
todo el sobrenadante posible y dejar secar al aire.
?. [Método]
14.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Resuspender
?. [Método]
el pellet de ARN agregando 15 μL de Agua DEPC.
?. [Método]
15.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Conservar
?. [Método]
en hielo para proseguir con la RT o congelar a -70° C.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Asegurarse
?. [Método]
que las muestras congeladas con TRIZOL estén totalmente descongeladas o agregar
?. [Método]
200 μL de muestra a 1 mL de TRIZOL .
?. [Método]
1.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Incubar
?. [Método]
a T. Amb. Por 5 min.
?. [Método]
2.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Agregar
?. [Método]
200 μL de Cloroformo al tubo.
?. [Método]
3.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Mezclar
?. [Método]
con vortex o por inversión por 10- 15 seg, dejar a 22° C por 3 min
?. [Método]
4.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Centrifugar
?. [Método]
por 15 min. A 13000 rpm a 2-8° C.
?. [Método]
5.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Rotular
?. [Método]
'mso-spacerun:yes'>  un eppendorf de 1,5 mL y agregar 1 μL de
?. [Método]
glycogen.
?. [Método]
6.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Tomar
?. [Método]
la mayor cantidad posible de la fase líquida superior (650- 700 μL) de los
?. [Método]
tubos centrifugados y agregar al tubo correspondiente con glycogen.
?. [Método]
7.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Agregar
?. [Método]
un volumen equivalente de Isopropanol (650-700 μL) a cada tubo.
?. [Método]
8.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Mezclar
?. [Método]
con vortex unos segundos.
?. [Método]
9.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Incubar
?. [Método]
(alternativamente) a 22° C por 10 min, 1 hora a -70° C u ON a -20° C.
?. [Método]
10.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Centrifugar
?. [Método]
por 15 min a 13000 rpm a 2-8 ° C.
?. [Método]
11.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
src="file:///C:\Users\Marco\AppData\Local\Temp\msohtmlclip1\01\clip_image001.gif"
?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Descartar
?. [Método]
sobrenadante y agregar 1 mL de etanol 70% Agua DEPC 30% a cada tubo. Mezclar
?. [Método]
suavemente con los dedos.
?. [Método]
12.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Centrifugar
?. [Método]
por 15 min. A 13000 rpma 2-8° C (sacar
?. [Método]
fuera del freezer todos los reactivos ARN y prender el baño de agua a 70 ° C).
?. [Método]
13.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Remover
?. [Método]
todo el sobrenadante posible y dejar secar al aire.
?. [Método]
14.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Resuspender
?. [Método]
el pellet de ARN agregando 15 μL de Agua DEPC.
?. [Método]
15.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Conservar
?. [Método]
en hielo para proseguir con la RT o congelar a -70° C.
?. [Método]
suavemente con los dedos.
?. [Método]
12.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Centrifugar
?. [Método]
por 15 min. A 13000 rpma 2-8° C (sacar
?. [Método]
fuera del freezer todos los reactivos ARN y prender el baño de agua a 70 ° C).
?. [Método]
13.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Remover
?. [Método]
todo el sobrenadante posible y dejar secar al aire.
?. [Método]
14.
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Resuspender
?. [Método]
el pellet de ARN agregando 15 μL de Agua DEPC.
?. [Método]
15.
?. [Método]
text-indent:-18.0pt;mso-list:l0 level1 lfo1'>
?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
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?. [Método]
alt="*">
?. [Método]
Conservar
?. [Método]
en hielo para proseguir con la RT o congelar a -70° C.
?. [Metodo]
Asegurarse que las muestras congeladas con TRIZOL estén totalmente descongeladas o agregar 200 μL de muestra a 1 mL de TRIZOL. Incubar a T. Amb  . Por 5 min.
20 Room temperature
?. [Metodo]
Agregar   de Cloroformo al tubo.
200 µl
?. [Metodo]
Mezclar con vortex o por inversión por  Dejar a  por
20 Room temperature
?. [Metodo]
por .
Centrifuge: 13000 33, 2-8 10
?. [Metodo]
Rotular  un eppendorf de 1,5 mL y agregar  de glycogen.
1 µl
?. [Metodo]
Tomar la mayor cantidad posible de la fase líquida superior () de los tubos centrifugados y agregar al tubo correspondiente con glycogen.
600 µl
?. [Metodo]
Agregar un volumen equivalente de Isopropanol  a cada tubo.
-700 µl
?. [Metodo]
Mezclar con vortex unos segundos.
?. [Metodo]
Incubar a por ,
20 Room temperature
?. [Metodo]
Centrifugar por  a  a.
Centrifuge: 13000 33
2 °C
?. [Metodo]
Descartar sobrenadante y agregar  de etanol 70% Agua DEPC 30% a cada tubo. Mezclar suavemente con los dedos.
1 mL
?. [Metodo]
Centrifugar por  A   a  (sacar fuera del freezer todos los reactivos ARN y prender el baño de agua a ).
Centrifuge: 13000 33
2 °C
70 °C
?. [Metodo]
Remover todo el sobrenadante posible y dejar secar al aire.
?. [Metodo]
Resuspender el pellet de ARN agregando  de Agua DEPC.
15 µl
?. [Metodo]
Conservar en hielo () para proseguir con la RT o congelar a.
on ice
-70 °C
?. [Metodo]
Incubar (alternativamente)  a u  a .
-70 °C
-20 °C