TITLE: Protocolo de coleta de amostras para eDNA metabarcoding usando filtros Sterivex - LGC PUC Minas
AUTHORS: Gabriel Antônio Mendes, Guilherme Costa Berger, Heron O Hilário, Daniel Cardoso de Carvalho

[DESCRIPTION]
O objetivo deste protocolo é orientar sobre a coleta de amostras de água para empregar a técnica de DNA ambiental (eDNA) metabarcoding. Nesta metodologia empregamos os filtros Sterivex, que permitem uma filtragem no local de coleta, com fácil manuseio, menor risco de contaminação e uma melhor preservação de DNA ambiental nas amostras. 
Este protocolo foi desenvolvido pelo Laboratório de Genética da Conservação - PUC Minas, e está em constante aprimoramento.
Conheça nosso grupo e linhas de pesquisa: https://sites.google.com/view/lgcpucminas



[BEFORE_START]
Preparação
Primeiramente, certifique-se de realizar a coleta e a filtragem em um ambiente aberto e plano. Se possível, utilize uma superfície esterilizada para apoiar o kit de coleta e seus componentes durante os procedimentos. Após a filtragem e armazenamento das amostras, lembre-se de recolher os descartáveis para efetuar seu descarte adequado. Se possível, realizar os procedimentos em dupla.

[STEPS]
SECTION: Preparação
1. Primeiramente, certifique-se de realizar a filtragem em um ambiente aberto
e plano. Se possível, utilize uma superfície esterilizada para apoiar o kit de coleta e
seus componentes durante os procedimentos. Após a filtragem e armazenamento das
amostras, lembre-se de recolher os descartáveis para efetuar seu descarte adequado. Se
possível, realizar os procedimentos em dupla.
SECTION: Preparação
2. O kit de coleta é composto pelos seguintes materiais:

 
Dois pares de luvas
Três filtros Sterivex
Três pedaçosde filme plástico Parafilm
Seis tampas Luer Lock
Tubo falcon contendo solução tampão ATL
Uma seringa descartável de 60ml
Um saco Stand up pequeno
Um saco Stand up grande
Uma seringa descartável de 10ml
SECTION: Coleta
3. Abra o kit com cuidado e colque um par de luvas para começar a coleta. Evite tocar na superfície externa das luvas.
SECTION: Coleta
5. Com a seringa de 60ml, colete a água do saco Stand Up ou diretamente do ponto amostral (2A).
 

SECTION: Coleta
6. Encaixe o Sterivex na Seringa (2B) utilizando o encaixe de rosca luer lock (2C).
SECTION: Coleta
7. Passe a água pelo Sterivex pressionando o êmbolo da seringa (2D). Esse processo deve ser repetido quantas vezes for necessário. 1 passagem = 60ml de água. Se a seringa ficar obstruída e o êmbolo travar, puxe levemente o êmbolo para remover particulado do filtro, e retome o processo. Evite passar ar pelo filtro, apenas água.
 

SECTION: Coleta
8. Após filtrar a quantidade total planejada, desencaixe a seringa do filtro e puxe o êmbolo para a posição inicial, preenchendo a seringa de ar (3A). Encaixe a seringa novamente no Sterivex e aperte o êmbolo, passando o ar pelo filtro Sterivex (3B). Repita esse passo até retirar toda a água do filtro. Este passo é muito importante para garantir a conservação da amostra.
 

SECTION: Conservação das amostras
9. Após a filtragem, é necessário colocar o tampão ATL para conservar o material genético contido no filtro. Primeiro abra a seringa de 10ml, remova o êmbolo e encaixe uma das tampas Luer Lock de cor vermelha na saída da seringa.
SECTION: Conservação das amostras
10. Abra o tubo falcon contendo ATL Buffer, e despeje seu conteúdo na seringa. A tampa Luer Lock irá impedir que o tampão saia (4B).
 

SECTION: Coleta
4. A coleta da água pode ser feita diretamente através da seringa (1A), caso seja um local seguro para o coletor e sem o risco de contaminar a água a ser filtrada. Também é possível realizar a coleta utilizando o saco Stand Up grande (1B e 1C). Se houver muito sedimento em suspensão na água, aguarde alguns momentos para que estes decantem e proceda com a filtragem.
 

SECTION: Conservação das amostras
11. Cuidadosamente, recoloque o êmbolo na seringa. Com a seringa voltada para cima, retire a tampa Luer Lock. Em seguida, encaixe o filtro Sterivex que já foi utilizado na filtragem.
SECTION: Conservação das amostras
12. Se o kit contém o Sterivex com apenas uma saída Luer Lock (5A), utilize um pedaço de Parafilm ou de papel-filme para obstruir a saída enquanto coloca o tampão. Esse mesmo papel pode ser utilizado na vedação final da amostra. 
Caso seja o Sterivex com duas saídas Luer Lock (5B), feche a saída com uma tampa Luer Lock.
 

SECTION: Conservação das amostras
13. Encaixe a seringa preenchida com o tampão ATL na entrada Luer Lock do filtro Sterivex. Com seringa para baixo, coloque 2,5ml de tampão ATL em cada Sterivex filtrado. Pressione repetidamente a seringa para facilitar o processo de entrada do tampão (6A).
 

SECTION: Conservação das amostras
14. Com o Parafilm (6A) ou papel-filme (6B), embale o filtro. Durante o processo de embalo, adicione uma etiqueta de identificação única a cada um dos filtros, possibilitando seu armazenamento e identificação adequados (6C).
 

SECTION: Conservação das amostras
15. Repita os processos descritos acima para cada uma das replicatas biológicas coletadas em campo.
SECTION: Conservação das amostras
16. Após realizar os procedimentos para cada uma das replicatas, guarde os filtros no saco Stand Up pequeno (6C e 7). Certifique-se que o lacre está bem vedado e coloque o saco dentro de um isopor ou caixa térmica com gelo (7). Garanta que as amostras estarão protegidas da luz do sol e do calor. 
 

SECTION: Observações
17. Uso de amostras de controle de contaminação da filtração: estas amostras têm como objetivo garantir que não há contaminação intrínseca ao sistema de coleta. A filtragem destas devem ser feitas em um ambiente limpo, utilizando água ultrapura (em experimentos com microorganismos), ou mineral (no caso de experimentos com vertebrados). Estas amostras devem ser extraídas, sequenciadas, analisadas e, caso apresentem ASVs/OTUs, as mesmas podem/devem ser excluídas das demais amostras.
Volume de água: O volume a ser filtrado em cada filtro (replicata) deve ser padronizado em todos os pontos amostrais. Recomendamos no mínimo 3 passagens de 60ml, mas pode variar devido a qualidade da água, podendo ser decidido pelo pesquisador no momento da coleta se o volume filtrado será maior.