TITLE: Bakteriel WGS - SSI
AUTHORS: Theis Hass THTR Thorsen, Sekventeringsenheden SB

[DESCRIPTION]
Method used at Sequencing Core Facility - Statens Serum Institut for sequencing of bacterial isolates. 
This protocol is specified for high-throughput sequencing of 96 isolates (sometimes less depending on the number of  isolates with large genomes). Furthermore, the genomes are sequenced on the Illumina sequencing platform using a MiSeq and the MiSeq 500-cycle v2 kit.
Note, this protocol is in Danish.
Note, it is also possible to use a 300-cycle Mid Output Kit v2.5 on a NextSeq for the sequencing, but this will not be covered in this protocol.

[BEFORE_START]
Fortynding af DNA-oprensninger
Inputkoncentrationen for de forskellige DNA-oprensninger kan være organismespecifik. Det vil sige at der kan være forskel på, hvor meget DNA der skal bruges til analysen ved sekventering af f.eks. en Salmonella vs Clostridium.
En ting der skal overvejes, inden der startes en WGS-kørsel, er hvor mange isolater det er muligt at samle i én kørsel, og dermed hvor mange Mbp der bruges til den endelige sekventering. I denne protokol benyttes en "500 cycles" kassette (MiSeq), der max. kan "loades" med 90 Mbp. 
Til denne protokol fortyndes inputkoncentrationerne for DNA-oprensningerne normalt til 0,3 til 0,5 ng/µL. DNA-oprensningerne kan med fordel fortyndes i en 96-brønds PCR-plade, hvor koncentrationerne kan bestemmes med en Fluostar Omega Platereader.

[GUIDELINES]
For at begrænse krydskontaminering, skift spidser stort set efter hver brug. 

[STEPS]
SECTION: Tagmentering af input-DNA
1. Find følgende komponenter frem.

Komponenter opbevaret på frost:
 
  
- Tø op på is. Vend de optøede rør 3-5 gange og centrifugér derefter kortvarigt.

 


Komponent opbevaret ved stuetemperatur: 
  
- Tjek for bundfald. Hvis der er bundfald til stede, vortex indtil alle partikler er resuspenderet.
SECTION: Tagmentering af input-DNA
2. 
 

Navngiv en standard 96-brønds PCR-plade med "NTA" + et unik ID. 
Tilføj 5 µL   til brøndene ved hjælp af en multikanalpipette. 
SECTION: Tagmentering af input-DNA
3. Overfør prøverne - 2.5 µL DNA pr. prøve fra fortyndingspladen (justeret til 0.3-0.5 ng/µL).

SECTION: Tagmentering af input-DNA
4. Tilføj 2.5 µL   til hver brønd.

SECTION: Tagmentering af input-DNA
5. Brug en multikanalpipette indstillet på 10 µl til at blande hver prøve forsigtigt 5 gange.
SECTION: Tagmentering af input-DNA
6. "Seal" pladen og centrifugér den ved 280 x g, 1 min, 20 °C.

SECTION: Tagmentering af input-DNA
7. Placér pladen i en PCR-maskine og kør følgende opvarmningsprogram:

"Tagmentation" program
 

SECTION: Tagmentering af input-DNA
8. Så snart temperaturen når 10 °C, centrifugér pladen kortvarigt og fjern forseglingen, tilsæt herefter 2.5 µL   til hver brønd.

SECTION: Tagmentering af input-DNA
9. Brug en multikanalpipette indstillet på 10 µl til at blande hver prøve mindst 5 gange.
SECTION: Tagmentering af input-DNA
10. "Seal" pladen og centrifugér den ved 280 x g, 1 min, 20 °C.
SECTION: Tagmentering af input-DNA
11. Inkubér pladen i 5 min. 
Fortsæt herefter med næste trin.
SECTION: PCR amplificering af biblioteker
12. Find følgende komponenter frem.

Komponenter opbevaret på frost:
  
- Optø ved stuetemperatur. (Rør) Vortex for at blande og centrifugér derefter ved 12000 rpm, 15 s. [Plader] Spin 30 s før brug.
  
- Optø på is i 20 minutter.
SECTION: PCR amplificering af biblioteker
13. Tilsæt 7.5 µL   til hver brønd i NTA-pladen. 
"Seal" og centrifugér pladen i ~4 s.

SECTION: PCR amplificering af biblioteker
14. Tilsæt 2.5 µL fra den første Nxxx-indeks primer (orange propper) til hver brønd i den første kolonne på NTA-pladen. Gør derefter det samme med den anden indeks primer i den anden kolonne, og fortsæt til alle brønde har fået indeks (se Figur 1).
Smid den gamle prop ud og sæt en ny på (dette gøres for at forhindre kontaminering af primerrøret).

 
SECTION: PCR amplificering af biblioteker
15. Tilsæt 2.5 µL fra den første Sxxx-indeks primer (hvide propper) til hver brønd i den første række på NTA-pladen. Gør derefter det samme med den anden indeks primer i den anden række, og fortsæt til alle brønde har fået indeks (se Figur 1).
Smid den gamle prop ud og sæt en ny på (dette gøres for at forhindre kontaminering af primerrøret).
SECTION: PCR amplificering af biblioteker
16. Bland indholdet i brøndene 3-5 gange med en multikanalpipette indstillet til 10 µL. 
"Seal" pladen. Spin ned ved 280 x g, 1 min.
SECTION: PCR amplificering af biblioteker
17. Kør NTA-pladen på følgende PCR-program:

 

SECTION: PCR amplificering af biblioteker
18. Sikkert stoppested
Hvis det ikke er planlagt at fortsætte direkte efter denne PCR, skal pladen enten blive i termocykleren ved 10 grader natten over eller opbevares i køleskabet i op til to dage.
SECTION: Rengøring af PCR-produkter
19. Find følgende komponenter frem.

Komponenter opbevaret på frost/køl:
  
- Tø op og bring til stuetemperatur. Vortex for at blande. "Resuspension Buffer" kan opbevares ved 2°C til 8°C efter den indledende optøning.

Komponenter opbevaret på køl:
  
- Lad stå ved stuetemperatur i 30 minutter. Vortex og vend for at blande.
SECTION: Rengøring af PCR-produkter
20. Lav op til 50 mL 80 % (v/v)   fra absolut ethanol - nok til 96 prøver.

SECTION: Rengøring af PCR-produkter
21. Centrifugér NTA-pladen ved 280 x g, 1 min for at samle indholdet i bunden af brøndende.
SECTION: Rengøring af PCR-produkter
22. Vortex  . 
"Beads" skal have stuetemperatur, før der fortsættes.

SECTION: Rengøring af PCR-produkter
23. Tilsæt 11.25 µL   til hver brønd i NTA-pladen.

SECTION: Rengøring af PCR-produkter
24. Bland forsigtigt hver brønd 10 gange (brug en multikanalpipette sat til 50 µL).
SECTION: Rengøring af PCR-produkter
25. Inkubér NTA-pladen i 5 min.
SECTION: Rengøring af PCR-produkter
26. Placér pladen på en magnetisk holder i ~2 min - eller indtil supernatanten er helt klar.

SECTION: Rengøring af PCR-produkter
27. Lad NTA-pladen blive på den magnetiske holder. 
Indstil en 200 µL multikanalpipette til 40 µL, fjern forsigtigt supernatanten og kassér den. 
VIGTIGT: Undgå at forstyrre pellet. Hvis pellet forstyrres skal supernatanten pipetteres tilbage i brøndene og stå i yderligere 2 minutter.
SECTION: Rengøring af PCR-produkter
28. Vask prøverne to gange på følgende måde:
SECTION: Rengøring af PCR-produkter
28.1. Imens NTA-pladen bliver på den magnetiske holder tilsættes 200 µL friskblandet 80 % (v/v)   - bland ikke prøverne.

SECTION: Rengøring af PCR-produkter
28.2. Inkubér prøverne i 30 s.

SECTION: Rengøring af PCR-produkter
28.3. Fjern og kassér supernatanten uden at forstyrre pellet.
(Efter 1. vask  )
SECTION: Rengøring af PCR-produkter
29. Brug en 10 µL multikanalpipette til at fjerne de sidste rester af EtOH fra brøndene - vær stadig forsigtig med ikke at forstyrre pelleten.
SECTION: Rengøring af PCR-produkter
30. Lad NTA-pladen stå på den magnetiske holder i 15 min for at lufttørre pelleten.

SECTION: Rengøring af PCR-produkter
31. Fjern NTA-pladen fra den magnetiske holder og tilsæt 22 µL   til hver brønd.

SECTION: Rengøring af PCR-produkter
32. Bland forsigtigt 10 gange med en multikanalpipette.
SECTION: Rengøring af PCR-produkter
33. Inkubér pladen i 5 min.
Anbring derefter pladen på den magnetiske holder i 5 min indtil supernatanten er helt klar.

SECTION: Rengøring af PCR-produkter
34. Navngiv en ny plade "CAN" (Clean Amplified Plate) + et unik ID.
SECTION: Rengøring af PCR-produkter
35. Overfør 20 µL supernatant fra NTA-pladen til den nye CAN-plade. 


 

SECTION: Rengøring af PCR-produkter
36. Sikkert stoppested
Hvis det ikke er planlagt at fortsætte direkte, kan CAN-pladen opbevares ved -15 til -25˚C i op til 1 uge, ellers fortsæt til trin 37.
SECTION: Rengøring af PCR-produkter
37. Bestem DNA-koncentrationen i CAN-pladen med et 
 
med et   (mål på 2 µL).

 

SECTION: Normalisering og &quot;final pool&quot;
38. Under normaliseringen beregnes der, hvor meget der skal overføres fra hver enkelte prøve til en "final pool", således at hver prøve sekventeres med tilstrækkelig dybde.
Det gøres ved hjælp af et excel-ark hvor beregningerne er "automatiseret" og tager forhold til bakteriernes gns. genom størrelse og prøve koncentrationerne samt den ønskede slutkoncentration og slutvolumen på "final pool".

Download og benyt følgende excel-ark: 
 

SECTION: Normalisering og &quot;final pool&quot;
38.1. Under Trin 1 indtastes:
- Batch navn
- Navn på eksperiment
- Dato for det udførte arbejde
- Laboranten der udfører arbejdet
SECTION: Normalisering og &quot;final pool&quot;
38.2. Under Trin 2 indtastes for hver prøve, ud for den rette brøndposition: 
- Prøve ID
- Organismens latinske navn

Den tilhørende genom størrelse tilføjes automatisk baseret på organismens navn.
SECTION: Normalisering og &quot;final pool&quot;
38.4. Under Trin 4 indtastes:
- De målte koncentrationer for prøverne i ng/uL (blå kolonne)

Værdierne i de efterfølgende kolonner udregnes automatisk.
SECTION: Normalisering og &quot;final pool&quot;
38.5. Hvis en prøve har en koncentration < 1 ng/uL, er koncentrationen for lav. 
I det/de tilfælde skal den tilhørende værdi i kolonne x grr (rød kolonne) ændres til '0'. Hvilket fjerner prøven fra de videre beregninger, og der bliver ikke overført noget fra prøven til den endelige "final pool".
SECTION: Normalisering og &quot;final pool&quot;
38.3. Under Trin 3 indtastes:
- Den ønskede slutkoncentration (i nM) for "final pool" 
(i denne protokol er den sat til 4 nanomolar (nM)).
- Den ønskede "pooling" volumen (i uL) for "final pool" 
(i denne protokol er den sat til 300 µL).

SECTION: Normalisering og &quot;final pool&quot;
38.6. Overfør for hver prøve den tilhørende beregnede volumen angivet i kolonnen uL fra prøve til "final pool" (grøn kolonne) til et nyt 1,5 mL rør. 
Dette er "final pool".

 

 

SECTION: Normalisering og &quot;final pool&quot;
39.1. Bestem DNA-koncentrationen i "final pool" med et Qubit fluorometer (se trin 37).
SECTION: Normalisering og &quot;final pool&quot;
39.2. Bestem den gns. fragmentstørrelse i "final pool" - f.eks. på en 
 
med følgende komponenter: 
   

 

SECTION: Normalisering og &quot;final pool&quot;
39. For at være sikker på at "final pool" har den ønskede molær slutkoncentration, lav endnu en koncentrationsbestemmelse på følgende måde:
SECTION: Sekventering
40. Find følgende reagenser frem.

Opbevares ved stuetemperatur:
  

Opbevares på køl:
  
  
  

Opbevares på frost:
  
  
- Stil på is når det er tøet op.
  
- Kan sættes på køl dagen før for at tø.


 

SECTION: Denaturering og fortynding af bibliotek
41. Lav en frisk 0.2 Molarity (M) fortynding af NaOH. 
I et eppendorfrør blandes 400 µL   med 100 µL  . 
Vortex kort.
SECTION: MiSeq kørsel
61. 
 

Vend   ti gange og   fem gange for at blande reagenserne. 

Sikre at alle reagenser er tøet op, er blandet og at der ikke er luftbobler i bunden af de forskellige reservoir. 
SECTION: MiSeq kørsel
62. På  , prik hul i folieforseglingen ved det markerede reservoir "Load Samples" med en ren 1 mL pipettespids.
SECTION: Denaturering og fortynding af bibliotek
42. Overfør 5 µL fra "final pool" til et nyt 1,5 mL rør.
SECTION: Denaturering og fortynding af bibliotek
43. Tilsæt 5 µL 0.2 M NaOH.
SECTION: Denaturering og fortynding af bibliotek
44. Vortex og centrifugér ved 280 x g, 1 min.
SECTION: Denaturering og fortynding af bibliotek
45. Inkubér i 5 min.
SECTION: Denaturering og fortynding af bibliotek
46. Tilsæt 990 µL afkølet   til røret (koncentrationen er nu 20 picomolar (pM)).
SECTION: Denaturering og fortynding af bibliotek
47. Vortex og centrifugér kortvarigt.
SECTION: Denaturering og fortynding af bibliotek
48. Sæt røret på is.
SECTION: Denaturering og fortynding af bibliotek
49. Fortynd til 10 picomolar (pM) i et nyt 1,5 mL rør ved at blande 300 µL 20 picomolar (pM) denatureret bibliotek med 300 µL afkølet   .
SECTION: Denaturering og fortynding af bibliotek
50. Vend røret et par gange og centrifugér kortvarigt.
Sæt røret på is.
SECTION: Denaturering og fortynding af bibliotek
51. Hvis det ønskes at tilsætte en PhiX kontrol til det denatureret bibliotek inden sekventeringen - fortsæt til trin 52. 

Hvis det ikke ønskes at tilsætte en PhiX kontrol - gå til trin 61.
SECTION: Denaturering og fortynding af bibliotek
52. I et 1,5 mL rør, miks 2 µL 10 nanomolar (nM)    med 3 µL   
SECTION: Denaturering og fortynding af bibliotek
53. Tilsæt 5 µL 0.2 Molarity (M) NaOH til røret. 
SECTION: Denaturering og fortynding af bibliotek
54. Vortex og centrifugér ved 280 x g, 1 min.
SECTION: Denaturering og fortynding af bibliotek
55. Inkubér i 5 min.
SECTION: Denaturering og fortynding af bibliotek
56. Tilsæt 990 µL afkølet   til røret (koncentrationen er nu 20 picomolar (pM)).

 

SECTION: Denaturering og fortynding af bibliotek
57. Overfør 375 µL 20 picomolar (pM) PhiX kontrol til et nyt 1,5 mL rør.
Tilsæt 225 µL afkølet   til røret (koncentrationen er nu 12.5 picomolar (pM)).
SECTION: Denaturering og fortynding af bibliotek
58. Fjern 6 µL fra det 10 picomolar (pM) denatureret bibliotek (prøverne).

SECTION: Denaturering og fortynding af bibliotek
59. Tilsæt 6 µL 12.5 picomolar (pM) PhiX kontrol til det denatureret bibliotek (prøverne).

SECTION: Denaturering og fortynding af bibliotek
60. Vend røret et par gange og centrifugér kortvarigt.
Sæt røret på is.
SECTION: MiSeq kørsel
63. Overfør hele 10 picomolar (pM) prøve biblioteket til reservoiret. 
Undgå at røre ved folieforseglingen.
SECTION: MiSeq kørsel
64. Tryk på Sequence på skærmen af 
 

SECTION: MiSeq kørsel
65. Vælg én af tre "setup" muligheder:
SECTION: MiSeq kørsel
65.1. Local Run Manager

 

Vælg det ønskede "run" fra listen med klargjorte kørsler.

Tryk på Next.
SECTION: MiSeq kørsel
65.3. Manual 

Vælg paired end .

Indtast følgende informationer:
Index 1 og Index 2 sættes til 8,
Read 1 og Read 2 sættes til 251.

Vælg den ønskede "output folder".

"Browse" og vælg det klargjorte "sample sheet" (skal indeholde prøve ID og index' på alle prøverne).
Se trin 65.2 for en skabelon til et "sample sheet".

Tryk på Next.
SECTION: MiSeq kørsel
65.2. Sample Sheet

 

"Browse" og vælg det klargjorte "sample sheet".

Tryk på Next.
SECTION: Normalisering og &quot;final pool&quot;
39.3. Åben excel-arket: Normalisering og final pool - SSI.

Under Trin 5 indtastes: 
- DNA-koncentrationen i "final pool" (i ng/µL)
- Den gns. fragmentstørrelse i "final pool" (i bp)

Den reelle molær slutkoncentration udregnes automatisk, samt om det er nødvendigt at fortynde "final pool" yderligere.  
SECTION: Normalisering og &quot;final pool&quot;
39.4. Hvis det er nødvendigt, fortynd "final pool" med   som nævnt under Trin 5.
SECTION: MiSeq kørsel
66. Inden   sættes i instrumentet.

Skyl flow cellen grundigt men forsigtigt med   for at skylle buffer og eventuelle saltrester af flow cellen.
SECTION: MiSeq kørsel
67. Tør forsigtigt men grundigt flow cellen med fnugfri linse renseservietter.
Vær meget forsigtig omkring de sorte flow celle porte samt glasset på flow cellen.
SECTION: MiSeq kørsel
68. Skyl glasset på flow cellen med 70 % (v/v)   (undgå at ramme de sorte porte), og tør det forsigtigt af igen med fnugfri linse renseservietter (der kan gemme sig meget i revnerne på flow cellen). 

Vær sikker på at glasset er fri for striber, fingeraftryk, fnug og fibre.
SECTION: MiSeq kørsel
69. Hold på kanterne af flow cellen uden at røre ved glasset.

Placér flow cellen i instrumentet som ansvist på skærmen.

Tryk på Next.
SECTION: MiSeq kørsel
70. Åben lågen under skærmen.
SECTION: MiSeq kørsel
72. Fjern den gamle flaske med buffer (står i midten) og tøm affaldsbeholderen (står til højre).
SECTION: MiSeq kørsel
74. Indsæt   og den tomme affaldsbeholder på deres rette position som anvist på skærmen.

SECTION: MiSeq kørsel
71. Løft håndtaget til de to "sipper", som anvist på skærmen, indtil det låser på plads. 
(Håndtaget er placeret imellem de to flasker)
SECTION: MiSeq kørsel
73. Fjern låget fra  .

SECTION: MiSeq kørsel
75. Sænk langsomt håndtaget til de to "sipper". 
Sørg for at de to "sipper" sænkes ned i   og affaldsbeholderen.

SECTION: MiSeq kørsel
76. Tryk på Next.
SECTION: MiSeq kørsel
77. Åben lågen til kølerummet (til venstre).
SECTION: MiSeq kørsel
78. Fjern den gamle vaskekassette.
SECTION: MiSeq kørsel
79. Hold   i håndtaget i  bagenden af kassetten ved Illumina mærket og skub den ind i kølerummet indtil den stopper.

SECTION: MiSeq kørsel
80. Luk lågen til kølerummet.
SECTION: MiSeq kørsel
81. Tryk på Next.
SECTION: MiSeq kørsel
82. Tjek at "run parameters" passer og tryk på Next.
SECTION: MiSeq kørsel
83. Når instrumentet er færdig med sit "pre-run check", tryk på Start Run. 

Hvis "Start run after pre-run check" er valgt til under kørselsindstillingerne, begynder kørslen automatisk, når instrumentet er færdig med sit "pre-run check".
SECTION: Hvor lang tid tager kørslen?
84. En kørsel med en   tager ~39 timer.