TITLE: Détection Directe du poliovirus par Séquencage Nanopore (DDNS) - Selle 
AUTHORS: Alex Shaw, Catherine Troman, Joyce Akello, Erika Bujaki, Manasi Majumdar, Shannon Fitz, Ben Bellekom, Aine OToole, c.ansley, rachel.colquhoun, arshady, khurshida, alammu, Andrew Rambaut, Javier Martin, Nick Grassly

[DESCRIPTION]
Ce protocole est une mise à jour du protocole décrit dans l'article "Rapid and sensitive direct detection and identification of poliovirus from stool and environmental surveillance samples using nanopore sequencing" par Shaw et al dans le Journal of Clinical Microbiology (2020), DOI : 10.1128/JCM.00920-20 et est généralement connu sous le nom de Direct Detection of Poliovirus by Nanopore Sequencing (DDNS).

Le protocole vise à amplifier la région VP1 du poliovirus par une PCR semi-nichée utilisant une amorce pan-Enterovirus et des amorces spécifiques à la polio, suivie par l'amplification de la région VP1 à l'aide d'un ensemble d'amorces spécifiques pour le polio. Nous utilisons des amorces à code-barres, ce qui simplifie beaucoup le processus ultérieur de préparation de la bibliothèque.

Ce protocole est destiné à être utilisé avec les réactifs de séquençage par ligature chimique du kit 14 d'Oxford Nanopore et peut être utilisé avec le séquenceur MinION Mk1B ou GridION.

Dans les étapes du protocole, des contrôles de qualité sont inclus et suivent le flux de travail défini dans le document "Quality Control and Data Recording for DDNS" (Contrôle de qualité et enregistrement des données pour le DDNS).

English
Title: Direct Detection of poliovirus and Nanopore Sequencing (DDNS) - Stool V.4
Abstract: This protocol is an update from the protocol described in the paper "Rapid and sensitive direct detection and identification of poliovirus from stool and environmental surveillance samples using nanopore sequencing" by Shaw et al  in the Journal of Clinical Microbiology (2020), DOI: 10.1128/JCM.00920-20 and is commonly known as Direct Detection of Poliovirus by Nanopore Sequencing (DDNS).

The protocol aims to amplify the VP1 region of poliovirus through a semi-nested PCR using a pan-Enterovirus primer and polio specific primers followed by amplification of the VP1 region using a polio specific primer set. We use barcoded primers as this greatly simplifies the subsequent library preparation process. 

This protocol is for use with Oxford Nanopore kit14 chemistry ligation sequencing reagents and can be used with the MinION Mk1B or GridION sequencer. 

Within the protocol steps, quality control checks are included and follow the workflow set out in the document "Quality Control and Data Recording for DDNS".

[BEFORE_START]
Ce protocole décrit l'amplification de la région VP1, le codage à barres de l'échantillon et la préparation de la bibliothèque. Nous pensons que les utilisateurs auront effectué une extraction d'ARN avant ce protocole pour extraire l'ARN du poliovirus. Nous recommandons le kit d'isolement de l'ARN viral MagMAX pour ce processus.

Amorces VP1 à code-barres :

Pour simplifier le protocole, nous utilisons une plaque d'amorce à 96 puits avec 5µM d'amorce Y7 à code-barres et 5µM d'amorce Cre à code-barres dans chaque puits, ce qui donne une concentration totale d'amorce de 10µM.
Chaque puits contient des amorces Cre et Y7 avec le même code-barres unique, par exemple A1 = Y7 avec le code-barres 1 et Cre avec le code-barres 1, A2 = Y7 avec le code-barres 2 et Cre avec le code-barres 2, etc.

L'ensemble complet des 96 séquences d'amorces à code-barres figure dans le Dataset_S1 de Shaw et al, 2020 et dans la feuille de calcul ci-jointe.   


[GUIDELINES]
Les étapes 13 et suivantes sont basées sur le protocole Ligation Sequencing of Amplicons d'Oxford Nanopore Technologies.

Si vous disposez d'un Tapestation ou d'un appareil similaire dans votre laboratoire, vous pouvez l'utiliser à la place des gels pour les étapes de contrôle de la qualité.

[STEPS]
SECTION: Premier tour PCR (semi-nest)
2. Préparer un mélange maître en utilisant les volumes de réaction détaillés dans le tableau ci-dessous pour le nombre d'échantillons que vous avez plus les contrôles négatifs. Le mélange réactionnel et l'enzyme SSIII sont fournis dans l'emballage suivant:  

Amorce avant: Y7 [GGGTTTGTGTCAGCCTGTAATGA] 

Amorces inverses: Cre [TCAATACGGTGTTTGCTCTTGAACTG] (Arita et al. 2015)
                                nOPV-MM-R [TCGATACGGTGCTTGGATTTAAATTG]

 

 



SECTION: Premier tour PCR (semi-nest)
3. Vortexer le mastermix pendant 3 secondes et centrifuger pendant 5 secondes pour rassembler le contenu au fond du tube. Aliquoter 19μL dans chaque tube PCR et ajouter 5μL d'ARN du échantillon ou d'eau sans nucléase pour les contrôles négatifs.
SECTION: Premier tour PCR (semi-nest)
4. Incuber dans un thermocycleur pendant 30 minutes à 50°C.
SECTION: Premier tour PCR (semi-nest)
5. Ajouter 1μL de l'amorce avant à chaque réaction.
SECTION: Premier tour PCR (semi-nest)
6. Amplifier en utilisant ses conditions de cycle suivant
 

 

SECTION: Seconde tour PCR (VP1 amplification)
7. L'amplification du VP1 est réalisée à l'aide d'amorces à code-barres comme décrit dans Dataset_S1 dans Shaw et al 2020. Ceux-ci doivent être commandés dans une disposition de plaque à 96 puits et les amorces avant et arrière prémélangées pour obtenir un stock finale de 10μM.

Préparer un mastermix comme décrit ci-dessous en utilisant  et en multipliant par le nombre de réactions nécessaires :

 

SECTION: Seconde tour PCR (VP1 amplification)
8. Vortexer le mastermix pendant 3 secondes et centrifuger pendant 5 secondes pour rassembler le contenu au fond du tube.  
SECTION: Seconde tour PCR (VP1 amplification)
10. Amplifier en utilisant les conditions de cycle suivantes :

 

SECTION: Seconde tour PCR (VP1 amplification)
11. Vérifier tous les contrôles positifs et négatifs de la réaction VP1 sur un gel d'agarose à 1 %. La bande attendue pour le contrôle positif est d'environ 1,2 kb.

Tous les échantillons peuvent être marqués comme "Pass" pour le PositiveControlCheck si tous les contrôles positifs extraits le même jour présentent une bande VP1 sur le gel.

Tous les échantillons peuvent être marqués comme "Pass" pour le NegativeControlCheck si tous les contrôles négatifs extraits le même jour ne présentent pas de bande VP1 sur le gel.

Si l'un des contrôles positifs échoue ou si l'un des contrôles négatifs présente une bande, tous les échantillons doivent être marqués comme échoués.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
12. Rassembler 2μL de chaque produit PCR VP1 dans un tube de 1,5mL et concentrer avec des billes AMPure.
  
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
13. Préparation End-prep :
Ajouter les réactifs suivants de dans le tube de 0,2 mL contenant le pool d'ADN nettoyé.

 

SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
14. Mélanger doucement en retournant le tube et centrifuger pendant 3 secondes.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
15. Dans le thermocycleur, incuber pendant 5 minutes à 20°C puis 5 minutes à 65°C.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
17. Du   :
Centrifuger la NEB Quick T4 Ligase et la placer sur de la glace.

En utilisant le   :
Centrifuger et décongeler l'adaptateur de ligature (LA) sur de la glace.
Décongeler le tampon de ligature (LNB) à température ambiante, centrifuger , le mélanger par pipetage, puis le placer sur de la glace.
Décongeler le tampon d'élution (EB) et le tampon pour fragments courts (SFB) à température ambiante, mélanger par vortex et placer sur de la glace.

Si vous prévoyez d'utiliser le MinION le même jour, retirez le tampon de rinçage, le flush tether (FLT) et la BSA du congélateur et décongelez-les à température ambiante. Une fois décongelés, placer-les sur de la glace.

Sortez votre FlowCell (FLO-MIN114, R10.4.1) du réfrigérateur pour qu'elle atteigne la température ambiante.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
18. Préparer le mélange suivant en ajoutant les réactifs au tube de 1,5 ml contenant l'ADN préparé :

 

SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
19. Mélanger doucement en faisant basculer le tube, puis centrifuger le.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
20. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes.
SECTION: Amorçage et chargement de la Flowcell MinION
22. Décongeler le tampon de séquençage (SB), les billes de librairie (LIB), le Flow Cell Tether (FCT) et un tube de Flow Cell Flush (FCF) à température ambiante, puis les placer sur de la glace.

Vortexer le SQB, le FCF et le FCT, centrifuger et remettre sur la glace. Centrifuger la LIB et la remettre sur la glace.
SECTION: Amorçage et chargement de la Flowcell MinION
24. Ouvrez le couvercle du dispositif de séquençage par nanopores et faites glisser le couvercle du port d'amorçage du FlowCell dans le sens des aiguilles d'une montre pour que le port d'amorçage soit visible. Après avoir ouvert le port d'amorçage, vérifier qu'il n'y a pas de bulles sous le couvercle. Aspirer un petit volume pour éliminer les bulles (quelques µl). Vérifier visuellement qu'il y a un tampon continu à partir de l'orifice d'amorçage à travers le réseau de capteurs.
SECTION: Amorçage et chargement de la Flowcell MinION
23. Pour créer l'amorçage, mélanger les réactifs suivants dans un tube propre de 1,5 ml :


 

Mélanger par pipetage et centrifuger . Placer sur de la glace jusqu'au moment de l'utilisation.
SECTION: Amorçage et chargement de la Flowcell MinION
25. À l'aide d'une pipette P1000, chargez lentement 800μL du mélange d'amorçage dans le FlowCell via le port d'amorçage.

Laisser une petite quantité de liquide à l'extrémité de l'embout de la pipette pour éviter d'introduire de l'air dans la FlowCell.

Laisser reposer pendant 5 minutes.
SECTION: Amorçage et chargement de la Flowcell MinION
26. Mélanger le contenu du tube LIB à l'aide d'une pipette juste avant de l'ajouter au mélange de librairies suivant dans un tube de 1,5 ml :

 

SECTION: Amorçage et chargement de la Flowcell MinION
27. Compléter l'amorçage de le FlowCell en ouvrant le couvercle du port SpotOn et en chargeant soigneusement 200μL du mélange d'amorçage dans le port d'amorçage. Comme précédemment, laissez une petite quantité de liquide au fond de l'embout pour éviter l'introduction de bulles d'air.

Lors de l'ajout du mélange d'amorçage, il se peut qu'une petite quantité de liquide remonte par l'orifice SpotOn. Si c'est le cas, faites une pause et laissez le liquide retourner dans le FlowCell avant de continuer à ajouter le mélange d'amorçage.
SECTION: Amorçage et chargement de la Flowcell MinION
28. Mélanger doucement le mélange de librairies préparé en pipettant.

Ajouter le mélange de librairies aux FlowCell via le port SpotOn, goutte à goutte, en laissant chaque goutte s'écouler avant d'ajouter la suivante.
SECTION: Amorçage et chargement de la Flowcell MinION
29. Replacez le couvercle du port SpotOn et fermez le port d'amorçage, puis replacez le couvercle de votre appareil de séquençage.
SECTION: Amorçage et chargement de la Flowcell MinION
30. Ouvrez le logiciel ONT MinKNOW et suivez les étapes ci-dessous pour configurer et démarrer votre cycle de séquençage.
SECTION: Seconde tour PCR (VP1 amplification)
9. Aliquotez 21μL pour chaque puits d'une plaque PCR à 96 puits et ajoutez 2μL d'amorces à code-barres de 10μM (en veillant à utiliser un code-barres différent pour chaque échantillon) et 2μL de produit de PCR de premier tour ou d'eau sans nucléase pour les contrôles négatifs de PCR.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
21. Effectuer une purification des billes AMPure en utilisant 40μL de billes AMPure XP remises en suspension.

 

SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
21.1. Mélanger les billes AMPure à l'aide d'un vortex jusqu'à ce que toutes les billes soient bien mélangées.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
21.2. Ajouter 40μL de billes remises en suspension dans le tube de 1,5mL et mélanger en faisant basculer le tube.

Incuber à température ambiante pendant 5 minutes. Pousser doucement après 2 minutes pour faciliter la fixation.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
21.3. Centrifuger le tube pendant 3 secondes puis placer-le sur un support magnétique jusqu'à ce que toutes les billes ont formé une boulette et que la solution soit claire.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
21.4. Prélever la solution à l'aide d'une pipette, en évitant de perturber la boulette de billes.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
21.5. Ajouter 250μL de tampon pour fragments courts (SFB). Retirer le tube de l'aimant et remettre les billes en suspension dans le SFB en faisant basculer le tube.
Centrifuger le tube pendant 3 secondes, puis le replacer dans l'aimant.
Laisser les billes se regrouper, puis les retirer et les jeter.

Répéter cette étape.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
21.6. Centrifuger le tube pendant 2 secondes, le replacer sur l'aimant, puis retirer toute trace de SFB.

Laisser la boulette sécher à l'air libre pendant 1 minute ou jusqu'à ce qu'elle soit sèche mais non fissurée.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
21.7. Retirer le tube de l'aimant et ajouter 15μL de tampon d'élution (EB). Pousser doucement pour remettre en suspension les billes et incuber à température ambiante pendant 10 minutes.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
21.8. Centrifuger le tube pendant 3 secondes, puis le replacer sur l'aimant, pour permettre aux billes de se regrouper complètement.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
21.9. Prélever 12µl de l'ADN élué et le transférer dans un tube propre de 1,5ml.
 

SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
16. Transférer dans un tube de 1,5 ml et effectuer un nettoyage des billes par AMPure.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
16.1. Mélanger les billes AMPure à l'aide d'un vortex jusqu'à ce que toutes les billes soient bien mélangées.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
16.2. Ajouter 60μl de billes remises en suspension dans le tube et agiter le tube pour mélanger.

Incuber à température ambiante pendant 5 minutes. Pousser doucement après 2 minutes pour faciliter la fixation.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
16.3. Centrifuger le tube pendant 3 secondes puis le placer sur un support magnétique jusqu'à ce que toutes les billes aient formé une boulette et que la solution soit claire.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
16.4. Prélever la solution à l'aide d'une pipette, en évitant de perturber la boulette de billes.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
16.5. Ajouter 200μL d'éthanol à 80% dans le tube, laisser reposer pendant 30 secondes, puis retirer et jeter.

Répéter cette étape.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
16.6. Centrifuger le tube pendant 2 secondes, le replacer sur l'aimant, puis retirer l'éthanol restant.

Laisser la pastille sécher à l'air libre pendant 1 minute ou jusqu'à ce qu'elle soit sèche mais ne se fissure pas.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
16.7. Retirer le tube de l'aimant et ajouter 61μL d'eau sans nucléase. Pousser le tube pour remettre les billes en suspension et incuber à température ambiante pendant 2 minutes.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
16.8. Centrifuger le tube pendant 3 secondes, puis le replacer sur l'aimant, pour permettre aux billes de se regrouper complètement.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
16.9. Prélever 60μL de l'ADN élué et l'ajouter dans un tube propre de 1,5mL.
 

SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
12.1. Ajouter un volume de billes AMPure égal au volume des produits VP1 regroupés et incuber à température ambiante pendant 5 minutes. Secouer doucement les billes après 2 minutes pour faciliter la liaison.

Par exemple, 50 échantillons, 2µl de chaque pool = 100µl du pool, donc ajouter 100ul de billes AMPure.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
12.2. Centrifuger le tube pendant 3 secondes puis le placer sur un support magnétique jusqu'à ce que toutes les billes ont formé une boulette et que la solution soit claire.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
12.3. Prélever la solution à l'aide d'une pipette, en évitant de perturber la boulette de billes.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
12.4. Ajouter 200μL d'éthanol à 80 % dans le tube, laisser reposer pendant 30 secondes, puis retirer et jeter.

Répéter cette étape.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
12.5. Centrifuger le tube pendant 2 secondes, replacer-le sur l'aimant, puis retirer l'éthanol restant.

Laisser la pastille sécher à l'air libre pendant 30 secondes ou jusqu'à ce qu'elle soit sèche mais ne se fissure pas.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
12.6. Retirer le tube de l'aimant et ajouter 51μL d'eau sans nucléase. Agiter le tube pour remettre les billes en suspension et incuber à température ambiante pendant 2 minutes.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
12.7. Centrifuger le tube pendant 3 secondes, puis replacer-le sur l'aimant, pour permettre aux billes de se regrouper complètement.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
12.8. Prélever 50μL de l'ADN élué et l'ajouter à un tube PCR propre de 0,2mL.
SECTION: Préparation de librairies pour ONT MinION : Pooling, End-prep, et ligature d&#x27;adaptateurs
20.1. Pendant ce temps, vous pouvez effectuer le contrôle du FlowCell

Branchez votre appareil de séquençage (MinION), ouvrez le couvercle et insérez votre FlowCell. Dans le logiciel MinKNOW, naviguez jusqu'au panneau de démarrage et sélectionnez FlowCell check, puis start. Vous saurez alors combien de pores sont disponibles pour le séquençage.
Si votre FlowCell a déjà été utilisée, au lieu d'effectuer un contrôle du FlowCell, lancez un séquençage fictif en sélectionnant Start Sequencing, nommez le séquençage "flowcell_check", sélectionnez n'importe quel kit, puis réglez la durée pour 10 minutes, passez à l'examen final et lancez le séquençage. Au début de l'exécution, une courte vérification du FlowCell sera effectuée et un nombre plus précis de pores disponibles sera donné (calculé en additionnant les pores disponibles et indisponibles dans le graphique d'état des pores (voir l'image d'exemple ci-dessous)).

 

Si un FlowCell a moins de 700 pores, ne l'utilisez pas pour une analyse DDNS de 96 échantillons. Prenez une autre et effectuez une autre vérification. Le nombre de pores disponibles dans le FlowCell utilisée doit être noté dans l'échantillon CSV dans la colonne "PoresAvilableAtFlowCellCheck" et l'ID du FlowCell doit être enregistré dans la colonne "FlowCellID". Notez également le nombre de fois où le FlowCell a été utilisée dans la colonne "FlowCellUses".
SECTION: Amorçage et chargement de la Flowcell MinION
30.1. Cliquez sur start, puis sur start sequencing.
Créez un nom pour votre série de séquençage. Il est conseillé de rendre ce nom unique et identifiable si vous avez besoin de revoir les données. Il est recommandé d'indiquer la date et le nom de l'expérience. Dans le nom de l'échantillon, vous pouvez mettre un numéro ou répéter le nom de l'expérience - ce n'est pas aussi important que le nom de la série. Cliquez ensuite sur continuer.
SECTION: Amorçage et chargement de la Flowcell MinION
30.2. Sélectionnez le kit utilisé - il s'agit de SQK-LSK114. Une fois que vous avez cliqué sur ce bouton, les options de codage à barres apparaissent. Sélectionnez EXP-PBC096, puis cliquez sur continuer.
SECTION: Amorçage et chargement de la Flowcell MinION
30.3. Dans les options de durée d'exécution, réglez la durée d'exécution sur 4 heures pour une exécution DDNS prospective. Cliquez sur continuer.
SECTION: Amorçage et chargement de la Flowcell MinION
30.4. Dans les options d'appel de base, sélectionnez l'appel de base de haute précision. Dans les options de codage à barres, assurez-vous que le codage à barres est activé et basculez pour utiliser le code à barres aux deux extrémités. Cliquez sur continuer jusqu'à ce que vous atteigniez l'aperçu de l'exécution, où vous pouvez vérifier les options sélectionnées, puis cliquez sur démarrer l'exécution.
SECTION: Amorçage et chargement de la Flowcell MinION
30.5. Dans votre échantillon csv, enregistrez le numéro d'exécution dans la colonne "RunNumber", la date dans "DateSeqRunLoaded" et la durée de l'exécution dans "RunHoursDuration".
SECTION: Premier tour PCR (semi-nest)
6.1. Une fois la PCR terminée, vérifiez si des réactions se sont évaporées. Si c'est le cas, notez-le dans l'échantillon CSV.
SECTION: Seconde tour PCR (VP1 amplification)
11.1. Si la vérification du contrôle positif échoue, exécuter le(s) produit(s) PCR du premier tour du contrôle positif sur un gel à 1 %.

S'il n'y a pas de bande, répéter la réaction VP1 imbriquée pour le contrôle. Si une bande est visible, éliminer les amplicons VP1 et répéter les réactions VP1 pour tous les échantillons.  

Si aucune bande n'est visible après avoir répété la réaction VP1 imbriquée, répéter les extractions d'ARN après avoir vérifié que le kit d'extraction d'ARN est utilisé correctement et qu'il n'est pas périmé.
SECTION: Seconde tour PCR (VP1 amplification)
11.2. Si la vérification du contrôle négatif échoue, répéter les deux tours PCR.

Si le contrôle négatif présente toujours une bande sur un gel ou une TapeStation :
Nettoyer soigneusement les stations de travail de PCR et d'extraction d'ARN.
Remplacer tour à tour les réactifs tout en effectuant des réactions à blanc pour déterminer si un réactif a été contaminé.
Effectuer une extraction supplémentaire d'ARN négatif pour confirmer que le kit d'extraction d'ARN n'est pas contaminé.

 

SECTION: Sample Organisation
1. Les paires d'échantillons (avec le même EPID) peuvent avoir des codes-barres consécutifs, mais essayez de ne pas regrouper des échantillons provenant de la même zone géographique. Cela permet de détecter toute contamination croisée potentielle, car il est alors peu probable que des séquences identiques soient détectées dans des échantillons dont les codes-barres sont consécutifs et qui sont adjacents sur la plaque à 96 puits.
SECTION: Sample Organisation
1.1. Enregistrez les données de l'échantillon et l'ordre des échantillons dans votre fichier CSV. À ce stade, vous pouvez également ajouter toutes les autres métadonnées dont vous disposez pour les échantillons.

Voici un exemple de fichier CSV de code-barres :
  
Il est conseillé de modifier le nom du fichier afin qu'il soit unique pour chaque analyse.

Vous devez également inclure les contrôles positifs et négatifs dans votre liste d'échantillons. Un contrôle positif (Coxsackievirus A20 remis en suspension par le NIBSC) et un contrôle négatif (eau) doivent être inclus dans le premier et le dernier lot d'extraction d'ARN de la journée au minimum.

Si des échantillons sont des répétitions d'une série précédente, notez-le dans la colonne "IfRetestOriginalRun".

Si le traitement de l'échantillon a été retardé, par exemple en raison d'un manque de kits d'extraction ou de mises à jour logicielles empêchant l'exécution, notez "Oui" dans la colonne "DelaysInProcessingForDDNS" et indiquez le type de retard dans la colonne "DetailsOfDelays" (détails des retards).

 

SECTION: Lavage du FlowCell
31. Une fois le séquençage terminé, vous pouvez laver votre FlowCell pour éliminer la librairie restante et préparer un autre séquençage ou pour stocker à 4 °C . Le lavage utilise les réactifs fournis dans le kit de lavage ONT :  

SECTION: Lavage du FlowCell
31.1. Décongeler le diluant de lavage à température ambiante et mélanger brièvement au vortex.

Centrifuger le tube de mélange de lavage (WMX) et le placer sur de la glace.
SECTION: Lavage du FlowCell
31.2. Préparer la solution de lavage suivante dans un tube propre de 1,5 ml

 

SECTION: Lavage du FlowCell
32. Ouvrez l'orifice d'amorçage et, à l'aide d'une pipette P1000, prélevez avec précaution une petite quantité de liquide pour éliminer toute bulle d'air sous l'orifice.
SECTION: Lavage du FlowCell
33. Ajouter avec précaution 200μL de la solution de lavage par l'orifice d'amorçage, en laissant une petite quantité de liquide dans l'embout vers la fin pour éviter d'introduire une bulle d'air. Fermer le port d'amorçage et incuber pendant 5 minutes à température ambiante.
SECTION: Lavage du FlowCell
33.1. Ajouter les 200μL restants de solution de lavage par l'orifice d'amorçage. Fermer l'orifice d'amorçage et incuber à température ambiante pendant une heure.

À ce stade, vous pouvez retirer tous les déchets du canal d'évacuation, en veillant à ce que l'orifice d'amorçage soit fermé avant de le faire.

Vous pouvez également coller une étiquette sur l'emballage pour indiquer la date à laquelle elle a été utilisée, ce qu'elle a subi et pendant combien de temps, par exemple : 13/03/2024 DDNS-run30 4 heures.

Si vous souhaitez conserver la Flow Cell pour une réutilisation ultérieure, retirez le flacon de tampon de stockage du kit de lavage pour le décongeler à température ambiante.
SECTION: Lavage du FlowCell
33.2. Après l'incubation, vous pouvez soit suivre les étapes d'amorçage et de chargement de la Flow Cell à partir de l'étape 22 pour charger une nouvelle série, soit les étapes suivantes pour stocker la Flow Cell en vue d'une utilisation ultérieure.

Vortexer brièvement le tampon de stockage décongelé pour le mélanger, puis ajouter 500μL lentement par le port d'amorçage.

Fermer l'orifice d'amorçage avant de retirer tous les déchets du canal d'évacuation. Replacer la FlowCell  dans sa boîte en plastique et son enveloppe, puis la conserver à 4 °C.