TITLE: FISH and antibody staining
AUTHORS: 张 雪

[DESCRIPTION]
<div class = "text-blocks"><div class = "text-block">荧光原位杂交方法与一般原位杂交方法类似，只是为了不影响后续抗体显色，第一天所用的杂交温度较低，可选择55-65°C，还有第二天加入的是anti-dig-POD（4°C冰箱自取）而不是anti-dig-AP（领抗体），最后显色方法也有不同。</div></div>

[STEPS]
?. [Day1]
复水：75%MetOH+25%PBT 1ml shake for 5min
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50%MetOH+50%PBT 5min
?. [Day1]
25%MetOH+75%PBT 5min
?. [Day1]
100%PBT 5min 1/4
融化PK
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100%PBT 5min 2/4
?. [Day1]
100%PBT 5min 3/4
?. [Day1]
100%PBT 5min 4/4
?. [Day1]
透化：Proteinase K: PBT = 1 : 2000 (终浓度5µg/ml），5min
?. [Day1]
再固定：4%PFA 20min
加PFA时，加完一管应立即放在摇床上，否则容易在底部凝结成团
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1×PT 20min 1/3
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1×PT 20min 2/3
?. [Day1]
1×PT 20min 3/3
?. [Day1]
1×PBT 5min 1/4
?. [Day1]
1×PBT 5min 2/4
?. [Day1]
1×PBT 5min 3/4
?. [Day1]
1×PBT 5min 4/4
?. [Day1]
预杂交：500µl Hybe buffer（需提前预热），65°C水浴锅中预热2−5h，其中温度较为灵活(63-68.5°C), 温度低有利于探针的结合，温度高可使背景更干净
?. [Day1]
杂交：6µl probe+200µl Hybe buffer，65°Covernight
65 °C
?. [Day2]
Hybe buffer 10min
?. [Day2]
75% Hybe buffer+25% 2×SSCT 10min
?. [Day2]
50%Hybe buffer+50% 2×SSCT 10min
?. [Day2]
25%Hybe buffer+75% 2×SSCT 10min
?. [Day2]
2×SSCT 10min
?. [Day2]
0.2×SSCT 15min 1/4
?. [Day2]
0.2×SSCT 15min 2/4
?. [Day2]
0.2×SSCT 15min 3/4
?. [Day2]
0.2×SSCT 15min 4/4
?. [Day2]
以下步骤在室温水平摇床上进行 75% 0.2× SSCT+25% MABt 5min
0 Room temperature
1 mL
?. [Day2]
50% 0.2× SSCT+50%MABt 5min
?. [Day2]
25%0.2× SSCT+75%MABt 5min
?. [Day2]
MABt 5min
?. [Day2]
1×blocking 500µl（每管配700µl）2h，RT
0 Room temperature
?. [Day3]
吸去抗体不回收
?. [Day3]
1×MABt 15min 1/8
?. [Day3]
1×MABt 15min 2/8
?. [Day3]
1×MABt 15min 3/8
?. [Day3]
1×MABt 15min 4/8
?. [Day3]
1×MABt 15min 5/8
?. [Day3]
1×MABt 15min 6/8
?. [Day3]
1×MABt 15min 7/8
?. [Day3]
1×MABt 15min 8/8
?. [Day3]
PT 20min 1/3
?. [Day3]
PT 20min 2/3
?. [Day3]
PT 20min 3/3
?. [Day3]
PBS 5min 1/2
?. [Day3]
PBS 5min 2/2
?. [Day3]
加入〔1µl Cys TSA+49µl magnification buffer〕Green/Red，注意避光，室温摇床避光过夜（此后所有操作均应避光！！！）
0 Room temperature
50 µl
避光
?. [Day4]
吸去染液
?. [Day4]
PT 20min 1/8
?. [Day4]
PT 20min 2/8
?. [Day4]
PT 20min 3/8
?. [Day4]
PT 20min 4/8
?. [Day4]
PT 20min 5/8
?. [Day4]
PT 20min 6/8
?. [Day4]
PT 20min 7/8
?. [Day4]
PT 20min 8/8
?. [Day4]
+blocking PBTN 500µl，4°C摇床，2h
4 °C
500 µl
?. [Day4]
+一抗（抗体:PBTN=1:1000，100µl，4°C摇床过夜） Dendra2：Rabbit-anti-Dendra2／ Kaeda：Rabbit-anti-kaeda ／ Mcherry：Mouse-anti-mcherry ／ CFP/GFP：Ab6658（goat），A1122（rabbit），Sc9996（mouse ）／ DsRed：Mouse-anti-DsRed 若实验对象带有两种及以上荧光，注意两种抗体应选择不同的来源
100 µl
4 °C
?. [Day5]
回收一抗，保存在4°C冰箱
?. [Day5]
＋二抗（in PBTN，1:2000，200µl，4°C过夜）： 例donkey−goat 633，donkey-rabbit 488，donkey-rabbit 633 二抗与对应的所有一抗的来源都不能相同
200 µl
4 °C
?. [Day6]
吸去二抗，不回收
?. [Day6]
直接拍照或1×PT在4°C摇床洗过夜，后者可以去除很多杂背景
?. [Day2]
回收探针，保存在-20°C，可重复使用（以下步骤仍在水浴锅中进行，且不用盖盖子，根据热胀冷缩原理，所吸液体量减至700-800µl）
750 µl
65 °C
提前配制以下液体，并放在65°C水浴锅中预热，29）之前的操作均在水浴锅中进行
?. [Day2]
Anti-Dig-POD 1:1000，200µl，4°C摇床缓慢摇动过夜
4 °C
注意与in situ不同，为Anti-Dig-POD
?. [Day5]
PT 20min 1/8
?. [Day5]
PT 20min 2/8
?. [Day5]
PT 20min 3/8
?. [Day5]
PT 20min 4/8
?. [Day5]
PT 20min 5/8
?. [Day5]
PT 20min 6/8
?. [Day5]
PT 20min 7/8
?. [Day5]
PT 20min 8/8（此后直接孵育二抗，不用加PBTN blocking）
?. [Day6]
PT 20min 1/8
?. [Day6]
PT 20min 2/8
?. [Day6]
PT 20min 3/8
?. [Day6]
PT 20min 4/8
?. [Day6]
PT 20min 5/8
?. [Day6]
PT 20min 6/8
?. [Day6]
PT 20min 7/8
?. [Day6]
PT 20min 8/8