TITLE: Técnica de inmunofluorescencia indirecta para detección de dengue virus
AUTHORS: Delia Piedad Recalde-Reyes, Juliana Lopez Calderon

[DESCRIPTION]
La inmunofluorescencia indirecta (IFI) es una técnica para detectar la presencia de anticuerpos en una muestra. Esta se debe a la unión de anticuerpos fluorescentes a los anticuerpos presentes en la muestra, lo que permite la detección visual de estos.

Para la visualización, se aplican anticuerpos fluorescentes a un portaobjetos de vidrio que contiene una muestra fijada y se observa con un microscopio de fluorescencia. 

Si hay anticuerpos en la muestra que se unen a los anticuerpos fluorescentes, se produce una fluorescencia indicando la presencia de anticuerpos.

Este protocolo fue desarrollado gracias al apoyo administrativo de la CUE Alexander von Humboldt de Armenia y desarrollado dentro de la convocatoria de Minciencia 917 de estancia en investigación: Desarrollo de una prueba tipo Western blot, Dot blot e Inmunofluorescencia para detección de antígenos virales de dengue serotipos 1 – 4.

[BEFORE_START]
Cumplir con todas las medidas de bioseguridad. Preparar todos los medios y reactivos necesarios para usar en el inmunoensayo. Asegúrese de contar con la candad suficientes para cada uno de los pasos.


[GUIDELINES]
El siguiente protocolo describe el paso a paso para la realización de una prueba tipo inmunofluorescencia indirecta para detección de dengue virus.

Tiempo de duración 24 horas a partir de la adición de las células eucariotas en las cajas de 24 pozos.  

[STEPS]
1. Mantenimiento línea celular BHK

Para obtener celulas BHK, se requiere 


2. Se emplea una caja de 24 pozos para trabajar con células BHK (RPMI), se usará vidrio para cada uno de los pozos.
3. Se adiciona 100.000 células por cada uno de los pozos.
4. Infección viral de células eucariotas 

Se realiza la infección con virus dengue 2 (DENV 2) con un Moi=1, y se deja la interacción virus-célula durante 120 min a 37 °C.

5. Lavado

Al día siguiente, se realizan 2 a 3 lavados con 200 µL de solución salina 0.9%.

7. NH4Cl 50 milimolar disuelto en PBS o solución salina 1X 200 µL durante 10 min (se elimina la fluorescencia inespecífica a temperatura ambiente.)

8. Permeabilización

La permeabilización se realizará con tritón X100 al 0,5% disuelto en PBS o solución salina 1X, 200 µL por pozo.

Se incuba durante 5 min a 37 °C. Posteriormente se realizan 2 lavados con solución salina y se deja 10 min. 

 


9. Seguido se realizará bloqueo PBS O SSN  1X o leche descremada al 5% durante 45 min a 37 °C. 


 

10. Anticuerpo primario

Se adicionan los anticuerpos (ANTICUERPO PRIMARIO) 
●        Anti NS1 1:10.000 disuelto en PBS 1X  
Se dejarán en interacción durante 40 min   a 37 °C. Después lavado 3 veces con PBS 1X se dejan 3 minutos cada lavado.

4.1. Pasado el tiempo, se retira el inóculo y se adiciona medio de mantenimiento 200 µL.

Se deja 1440 min en cámara húmeda a 37 °C . 

6. Fijación

Se hará fijación con 200 µL paraformaldehido al 4%, se incuba a 4 °C durante 10 min, después se realizan 2 lavados con solución salina 0.9%.
11. Finalmente se adicionaron los anticuerpos (ANTICUERPO PRIMARIO) 
●        Anti NS1 1:10.000 disuelto en PBS 1X  
●        Anti ENV 1:5.000 disuelto en PBS 1X  
Anticuerpos de rato los cuales se dejarán en interacción durante 40 minutos   a 37 grados. Después lavado 3 veces con PBS 1X se dejan 3 minutos cada lavado.
12. ANTICUERPO SECUNDARIO 
1.Anticuerpo secundario anti-mouse, Fitc 1:200, se deja incubando media hora a 37 grados 
2.Prepara ssn de Hoesht 1 uL en 1000 mL 1X PBS5 minutos a 37 grados. 2 lavados con PBS 1 X 
3.50 um sobre láminaportaobjetos cada vidrio sobre la lámina. Se deja reposar 24 h.