iGEM 2021 — Team GO_Paris-Saclay

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# Team:GO Paris-Saclay/Notebook

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* Project
  Projet
  Проект

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* Laboratory
  Laboratoire
  Лаборатория

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  [Contribution](https://2021.igem.org/Team%3AGO_Paris-Saclay/Contribution)
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  Ouverture sur la société
  Работа с обществом

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# Notebook

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  Université Paris-Saclay

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Table of contents

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[Hardware](#2)
[Laboratory](#3)
[Science education: Video Game](#4)
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## Engineering success

## Engineering success

## Инженерный успех

### Machine Learning

**Machine Learning**

**Machine Learning**

**Машинное обучение**

We have found in the literature different types of markers, which we can test using synthetic biology. We have stopped on microRNA, but how should we choose one of them? For this, we have created a Machine Learning script in the Python programming language, using feature selection with three different methods: filter method: Pearson correlation, wrapper method: recursive feature elimination, and embedded method: Lasso regularization.

We can conclude that between the selected miRNAs using these feature selection methods,the miRNA hsa-miR-200c-3p appears to be our best candidate for a good biomarker. It's worthy to mention, that this miRNA appeared all the other times we have run the code with different training and test sets.

In order to test our model on different data, we have tried to connect different companies (EndoDiag, Dotlab) to train our machine learning models on data of unnamed samples. Unfortunately, we have not received a positive answer.

Nous avons trouvé dans la littérature différents types de marqueurs, que nous pouvons tester par biologie synthétique. On s'est arrêté sur le microARN, mais comment le choisir ? Pour cela, nous créons un script Machine Learning en langage de programmation Python, avec méthode de filtrage : corrélation de Pearson, méthode wrapper : élimination de fonctionnalité récursive, et méthode embarquée : régularisation Lasso.

Nous pouvons conclure qu'entre les miARN sélectionnés pour cette méthode de sélection de caractéristiques apparaît également le miARN hsa-miR-200c-3p, qui semble être notre meilleur candidat pour un bon biomarqueur. Il convient de mentionner que ce miARN est apparu toutes les autres fois où nous avons exécuté le code avec différents ensembles d'entraînement et de test.

Pour nous améliorer, nous avons essayé de nous connecter à différentes sociétés (EndoDiag, Dotlab) pour former notre ML sur des données d'échantillons non nommés. Malheureusement, nous n'avons pas reçu de réponse positive.

Мы нашли в литературе различные типы маркеров, которые можно протестировать с помощью синтетической биологии. Мы остановились на микроРНК, но как ее выбрать? Для этого мы создаем сценарий машинного обучения на языке программирования Python с методом фильтрации: корреляция Пирсона, методом оболочки: устранение рекурсивных функций и встроенным методом: регуляризация лассо.

Мы можем сделать вывод, вспомнив, что между отобранными miRNA для этого метода отбора признаков также появляется miRNA hsa-miR-200c-3p, которая, по-видимому, является нашим лучшим кандидатом на роль хорошего биомаркера. Стоит отметить, что эта miRNA появлялась все время, когда мы запускали код с разными наборами для обучения и тестирования.

Для улучшения мы пытались подключиться к разным компаниям (EndoDiag, Dotlab), чтобы обучить наш ML на данных неназванных образцов. К сожалению, положительного ответа мы не получили.

**Matériel**

**Hardware**

**Флуориметр**

Our inspiration was the women of Afghanistan and other countries in which there are conflicts. We wanted to create a device that could be used especially in difficult life situations.

We built our first prototype and were expecting a laser pointer. Also, we initially abandoned the plastic model due to environmental friendliness and inaccessibility.
For a cheap fluorometer, the significant design involved a laser and mirrors, but after that, we decided to stick with a laser pointer.
Unfortunately, it didn't arrive on time, so we had to adapt the system for the first test using a linear laser pointer (we solved this problem with an additional cardboard “filter” that limited the transmission width to the size of the lens.

After the first test, we adapted the program on the phone for a more convenient interface, because initially, it was not very convenient. Further, we realized that it was necessary to reduce the height of our device since the cuvette in the photo turned out to be very far away and took up less than 50% of the photo. (from 13 cm to 7 cm)

Later we tried our new system again, and although we had few tests, we got a good result for a made-to-measure fluorometer.

Notre inspiration était les femmes d'Afghanistan et d'autres pays où il y a des conflits. Nous voulions créer un appareil qui pourrait être utilisé en particulier dans des situations de vie difficiles.

Nous avons construit notre premier prototype et nous attendions un pointeur laser. De plus, nous avons initialement abandonné le modèle en plastique en raison du respect de l'environnement et de l'inaccessibilité.
Pour un fluorimètre bon marché, la conception importante impliquait un laser et des miroirs, mais après cela, nous avons décidé de nous en tenir à un pointeur laser.

Malheureusement, il n'est pas arrivé à temps, nous avons donc dû adapter le système pour le premier test à l'aide d'un pointeur laser linéaire (nous avons résolu ce problème avec un "filtre" en carton supplémentaire qui limitait la largeur de transmission à la taille de l'objectif.

Après le premier test, nous avons adapté le programme sur le téléphone pour une interface plus pratique, car au départ, ce n'était pas très pratique. De plus, nous nous sommes rendu compte qu'il fallait réduire la hauteur de notre appareil puisque la cuvette sur la photo s'est avérée très éloignée et occupait moins de 50 % de la photo. (de 13 cm à 7 cm)

Plus tard, nous avons réessayé notre nouveau système, et bien que nous ayons eu peu de tests, nous avons obtenu un bon résultat pour un fluorimètre sur mesure.

Нашем вдохновлением являлись женщины Афганистана и других стран, в которых сейчас происходят конфликты. Мы хотели создать прибор, который можно было бы использовать особенно в тяжелых жизненных ситуациях.

Мы создали наш первый прототип и ожидали лазерную указку. Также мы изначально отказались от пластиковой модели по причине экологичности и недоступности.

Для дешевого флуориметра значальный дизайн предполагал лазер и зеркала, но после мы решили остановиться на лазерной указке.
К сожалению, она не пришла вовремя, поэтому нам пришлось адаптировать систему для первого теста при помощи линейной лазерной указки (мы решили эту проблему при помощи дополнительного “фильтра” из картона, который ограничивал ширину пропускания до размера линзы.
После первого теста, мы адаптировали программу на телефоне, для более удобного интерфейса, ведь изначально было не совсем удобно. Дальше, мы поняли что необходимо уменьшить высоту нашего устройства, так как кювета на фотографии оказывалась очень далеко и занимала меньше 50% фотографии. (с 13 см до 7)

Позже мы снова попробовали нашу новую систему, и хоть у нас было мало тестов, мы получили неплохой результат для флуориметра, сделанного из подручных средств.

### Laboratoire

**Laboratory**

**Laboratoire**

**Лаборатория**

During the first attempt to purify the Cas13a protein, we stored our purified proteins on a nickel affinity column at -20°C overnight, this temperature of conservation being that generally advised. The next day we were surprised to discover that our protein had aggregated overnight. So, after reproducing Cas13a in our bacteria, we, this time, kept the protein at -4°C throughout the purification process. After purification on a heparin affinity column, the protein was resolubilized in a 10% ethanol solution and we tried to store it at -20°C. Fortunately, it did not reaggregated.

Durant la première tentative de purification de la protéine Cas13a, nous avons conservé nos protéines purifiées sur colonne d’affinité au nickel à -20°C pour la nuit, cette température de conservation étant celle généralement conseillée. Le lendemain nous avons eu la surprise de découvrir que notre protéine avait aggrégé pendant la nuit. Ainsi, après avoir fait reproduire Cas13a à nos bactéries, nous avons cette fois-ci conservé la protéine à -4°C tout au long du processus de purification. Après la purification sur colonne d’affinité à l’héparine, la protéine ayant été resolubilisée dans une solution contenant 10% d’éthanol, nous avons retenté de la conservé à -20°C. Par chance, elle n’a pas réaggrégé.

Во время первой попытки очистить белок Cas13a мы хранили наши очищенные белки на никелевой аффинной колонке при -20 ° C в течение ночи, эта температура хранения была обычно рекомендуемой. На следующий день мы с удивлением обнаружили, что наш белок агрегировал за ночь. Таким образом, после того, как наши бактерии воспроизвели Cas13a, на этот раз мы держали белок при -4 ° C на протяжении всего процесса очистки. После очистки на аффинной колонке с гепарином, после ресолюбилизации белка в растворе, содержащем 10% этанол, мы снова попытались сохранить его при -20 ° C. К счастью, он не реагригировал заново.

**Éducation scientifique: Jeu vidéo**

**Science education: Video Game**

**Научное образование: Видео игра**

During the development of the game, we had two tasks: to create the code with the plot and to create the illustrations. We settled on the idea of reworking a small world with a detective story - finding those who are missing due to a strange illness.

Following the publication of our game on smartphones, we received several feedbacks indicating that the text was displayed too small, making it difficult to read the dialogues. Following this feedback, the text size has been increased.

Moreover, at the beginning, we wanted to make a version only on PC. However, while exchanging with the scientific mediator of the Cité des Sciences et de l'Industrie to prepare our intervention in this museum, she advised us to make a version for smartphone because it allowed several things: to respect the Covid barrier gestures, to increase the number of people who could play it, and finally to bring a solution to play while being mobile. This thing was done and integrated as a mobile game version on Play Store was developed in addition. To this we must add all the feedback we had from children as well as adults (parents or researchers) in order to find the right level of language, the right level of technical details to make this game accessible to the largest number of people.

On October 21, 2021, we counted more than 75 people who had downloaded The Adventures of Detective Coli in French and in English. In addition, we received an audience of about 300 players during our exhibition at the Cité des Sciences. We have used all this feedback, as well as the reactions of parents and young people, to adapt the story and the form of the game, in order to present it to you today. In the future, we will always look at the feedback on the Play Store and will not hesitate to evolve the mobile game in the future if requests are made. We hope that this flexibility and form of communication will reach more people in the future.

При разработке игры перед нами стояли две задачи: создать код с сюжетом и создать иллюстрации. Мы остановились на идее переработать маленький мир детективным сюжетом - найти пропавших без вести из-за странной болезни.

После публикации нашей игры на смартфонах мы получили несколько отзывов о том, что текст отображался слишком мелким шрифтом, что затрудняло чтение диалогов. После этого отзыва размер текста был увеличен.
Более того, изначально мы хотели сделать версию только на ПК. Однако, обмениваясь с научным посредником Cité des Sciences et de l'Industrie, чтобы подготовить наше выступление в этом музее, она посоветовала нам сделать версию для смартфона, потому что это позволяло несколько вещей: уважать жесты барьера Covid, увеличивать количество людей, которые могли играть в нее, и, наконец, предложить решение для игры, оставаясь мобильным. Эта штука была сделана и интегрирована, поскольку дополнительно была разработана мобильная версия игры в Play Store. К этому мы должны добавить все отзывы, полученные от детей и взрослых (родителей или исследователей), чтобы найти нужный уровень языка, нужный уровень технических деталей, чтобы сделать эту игру доступной для наибольшего числа людей.

Pendant le développement du jeu, nous avions deux tâches : créer le code avec l'intrigue et créer les illustrations. Nous avons finalement décidé de travailler sur l'idée d'un petit monde avec un roman policier - retrouver des personnes qui sont portées disparues à cause d'une étrange maladie (= l'endométriose).

Suite à la publication de notre jeu sur smartphones, nous avons reçu plusieurs retours indiquant que le texte était affiché trop petit, rendant la lecture des dialogues difficile. Suite à ces retours, la taille du texte a été augmentée.

D'ailleurs, au départ, nous voulions faire une version uniquement sur PC. Cependant, en échangeant avec la médiatrice scientifique de la Cité des Sciences et de l'Industrie pour préparer notre intervention dans ce musée, elle nous a conseillé de faire une version pour smartphone car elle permettait plusieurs choses : respecter les gestes barrière Covid, augmenter le nombre de personnes pouvant y jouer, et enfin d'apporter une solution pour jouer tout en étant mobile. Cette chose a été faite et intégrée car une version mobile sur Play Store a été développée. A celà il faut ajouter tous les retours que nous avons eus aussi bien des enfants que des adultes (parents ou chercheurs) afin de trouver le bon niveau de langage, le bon niveau de détails techniques pour rendre ce jeu accessible au plus grand nombre.
Nous comptons au jour du 21 octobre 2021 plus de 75 personnes ayant téléchargé Les aventures du détectives Coli en français et en anglais. De plus, nous avons reçu un publique d'environ 300 joueurs lors de notre exposition à la cité des sciences. Nous nous sommes servis de tous ces retours ainsi que des réactions des parents et des plus jeunes pour adapter l'histoire et la forme du jeu, afin de vous la présenter aujourd'hui. A l'avenir, nous regarderons toujours les commentaires sur le Play Store et n'hésiterons pas a faire évoluer le jeu mobile à l'avenir si des demandes se forment. Nous espérons que cette flexibilité et cette forme de communication touchera encore des gens à l'avenir.

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Click on the detective Coli to start the experiments.

Table of contents

[Sequences of miRNAs and ST-HP](#1)
[RNAs and DNAs synthesis](#2)
[Cas13a and Cas14a1 purification](#3)
[Cas13a and Cas14a1 detection assays](#4)
![bannière sommaire](https://static.igem.org/mediawiki/2021/0/03/T--GO_Paris-Saclay--sumarryimage.png)

## Materials and Methods

## Matériels et Méthodes

## Материалы и методы

**Sequences of miRNAs and ST-HP**
Two miRNAs were chosen for the significance of the difference in their expression in the serum of women with endometriosis compared to healthy women : concentration of the miRNA miR-125b (UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA) was greatly increased in the serum of women suffering from endometriosis compared to unaffected women, while that of miR-3613 (UGUUGUACUUUUUUUUUUGUUC) was reduced (Cosar et al., 2016) (Moustafa et al., 2020). The dual DNA-RNA molecule called ST-HP (GGCGTAGTTACATTCTCCCAGTTGA**UU**CTGGGAGAATGTAACTACGCC) was synthesized by Eurofins.

**Séquences des miRNAs et de la ST-HP**
Deux ARNs ont été choisis pour l'importance de la différence de leur expression dans le sérum des femmes atteintes d'endométriose par rapport à des femmes saines : la concentration du miRNA miR-125b (UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA) était fortement augmentée dans le sérum des femmes souffrant d'endométriose par rapport aux femmes non atteintes, tandis que celle du miR-3613 (UGUUGUACUUUUUUUUUUUC) était réduite (Cosar et al, 2016) (Moustafa et al., 2020). La molécule ADN-ARN appelée ST-HP (GGCGTAGTTACATTCTCCCAGTTGA**UU**CTGGGAGAATGTAACTACGCC) a été synthétisée par Eurofins.

**Последовательности микроРНК и шпилька ST-HP**
Две микроРНК были выбраны из-за значимости разницы в их экспрессии в сыворотке крови женщин с эндометриозом по сравнению со здоровыми женщинами: концентрация miRNA miR-125b (UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA) была значительно увеличена в сыворотке крови женщин, страдающих эндометриозом, по сравнению с здоровыми женщинами. , тогда как miR-3613 (UGUUGUACUUUUUUUUUUGUUC) была снижена (Cosar et al., 2016) (Moustafa et al., 2020). Двойная молекула ДНК-РНК под названием шпилька ST-HP (GGCGTAGTTACATTCTCCCAGTTGA**UU**CTGGGAGAATGTAACTACGCC) была синтезирована компанией Eurofins.

**RNAs and DNAs synthesis**
Sequences of crRNAs of Cas13a or sgRNA of Cas14a1 allow the formation of a stem-loop structure. This is recognizable by the protein followed by a sequence complementary to the target miRNAs or to that of the segment released following ST-HP cleavage, respectively. Geneblock or complementary primers synthetized by IDT (Table 1) were used to generate dsDNA fragments that served as template for RNA synthesis using the T7 Ribomax express kit from Promega. RNAs were further purified with Promega ReliaPrep columns and checked by electrophoresis on urea-acrylamide gels. Reporter probes for Cas protein activity with fluorophore (FAM) and quencher (BHQ1) were ordered at Eurofins (Table 1).

![tab1 experiences](https://static.igem.org/mediawiki/2021/1/12/T--GO_Paris-Saclay--experiments2.jpg)

![tab1 experiences](https://static.igem.org/mediawiki/2021/f/f7/T--GO_Paris-Saclay--experiments1.jpg)

**TABLE 1: Primers and geneblocks used in this project (T7 promoter sequence is indicated in italics).**

**Synthèse des ARNs et ADNs**
Les séquences des crRNAs de Cas13a ou du sgRNA de Cas14a1 permettent la formation d'une structure tige-boucle. Celle-ci est reconnaissable par la protéine et est suivie d'une séquence complémentaire aux miRNAs cibles ou à celle du segment libéré suite au clivage de la ST-HP. Des Geneblock ou amorces complémentaires synthétisées par IDT (tableau 1) ont été utilisées pour générer des fragments d'ADNdb qui ont servi de matrice pour la synthèse d'ARN à l'aide du kit T7 Ribomax express de Promega. Les ARN ont ensuite été purifiés avec les colonnes ReliaPrep de Promega et vérifiés par électrophorèse sur des gels d'urée-acrylamide. Des sondes rapporteuses de l'activité des protéine Cas avec fluorophore (FAM) et quencher (BHQ1) ont été commandées chez Eurofins (Tableau 1).

![tab1 experiences](https://static.igem.org/mediawiki/2021/1/12/T--GO_Paris-Saclay--experiments2.jpg)
![tab1 experiences](https://static.igem.org/mediawiki/2021/f/f7/T--GO_Paris-Saclay--experiments1.jpg)

**TABLEAU 1: Amorces et geneblocks utilisés durant ce projet (la séquence du promoteur T7 est indiquée en italique).**

**Синтез РНК и ДНК**
Последовательности crRNA Cas13a или sgRNA Cas14a1 позволяют формировать структуру петля-стержень. Это распознается белком, за которым следует последовательность, комплементарная миРНК-мишени или последовательности сегмента, высвобождаемого после расщепления ST-HP, соответственно. Геноблок или комплементарные праймеры, синтезированные с помощью IDT (таблица 1), использовали для создания фрагментов дцДНК, которые служили в качестве матрицы для синтеза РНК с использованием экспресс-набора T7 Ribomax от Promega. РНК дополнительно очищали на колонках Promega ReliaPrep и проверяли электрофорезом на мочевинно-акриламидных гелях. Репортерные зонды активности белка Cas с флуорофором (FAM) и гасителем (BHQ1) были заказаны в Eurofins (Таблица 1).

![tab1 experiences](https://static.igem.org/mediawiki/2021/1/12/T--GO_Paris-Saclay--experiments2.jpg)
![tab1 experiences](https://static.igem.org/mediawiki/2021/f/f7/T--GO_Paris-Saclay--experiments1.jpg)

**ТАБЛИЦА 1: Праймеры и генные блоки, использованные в этом проекте (последовательность промотора Т7 указана курсивом).**

**Cas13a and Cas14a1 purification**

![fig 2 experiences](https://static.igem.org/mediawiki/2021/f/f1/T--GO_Paris-Saclay--experiments3.jpg)

**FIGURE 1 : Schema representing the purification process of the Cas13a and Cas14a1 proteins used.**

For the production of Cas13a and Cas14a1, E.coli Rosetta strain was transformed with plasmids pC0072 LbuCas13a His6-TwinStrep-SUMO-BsaI or pLBH531\_His10-MBP-Cas14a1, respectively (Gootenberg et al., 2018; Harrington et al., 2018). The plasmids, which were ordered from Addgene, carry an ampicillin resistance gene and allow the constitutive production of the transcription inhibitor LacI. Expression of the gene of interest is under the control of the T7 polymerase (already expressed by Rosetta strain) promoter and the lacO operator. Transformed bacteria were grown overnight in LB supplemented with ampicillin (200 mg/mL), chloramphenicol (30 mg/mL) and glucose (0.2%). Cells were diluted in 1 L Terrific Broth (rich medium) supplemented with antibiotics to OD600=0.1 and grown at 37°C until the OD reached 0.5. Then, IPTG (0.5 mM) was added and the culture was shaken at 18°C for 16 h for protein production. The bacteria were harvested by centrifugation at 5000xg for 15 min and resuspended in 40 mL LEW buffer (50mM NaH2PO4 300 mM NaCl pH 8.0) containing Complete protease inhibitor cocktail (Roche). Following lysis by sonication, the proteins carrying His-tags were purified using nickel columns (Protino Ni-IDA 1000, Machery-Nagel) and digested with SenP2 (Cas13a) or TEV protease (Cas14a1) in order to remove the histidine tags and solubilization domains they carried. Cas13a was then purified by FPLC on heparin column (1 mL, GE Healthcare) using a gradient using solution A (50 mM NaH2PO4 pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM beta-mercaptoethanol (BME)) and solution B (50 mM NaH2PO4 pH 7.5, 1 M NaCl, 10% glycerol, 1 mM BME). For heparin purification of Cas14a1, solution B was 50 mM NaH2PO4 pH 7.5, 1.5 M NaCl, 10% glycerol, 1 mM BME. Proteins were then diluted 3-fold in 50 mM NaH2PO4 pH 7.5, 20 m M NaCl, 10% glycerol, 1 mM BME. Finally, a Millipore centrifugal device was used to concentrate the protein. Proteins were stored at -20°C after adding glycerol up to 50%. Proteins were analyzed by SDS-PAGE and Coomassie staining.

**Purification de Cas13a et Cas14a1**

![fig 2 experiences](https://static.igem.org/mediawiki/2021/f/f1/T--GO_Paris-Saclay--experiments3.jpg)

**FIGURE 1 : Schéma représentant le processus utilisé pour la purification des protéines Cas13a et Cas14a1.**

Pour la production de Cas13a et Cas14a1, la souche E.coli Rosetta a été transformée avec les plasmides pC0072 LbuCas13a His6-TwinStrep-SUMO-BsaI ou pLBH531\_His10-MBP-Cas14a1, respectivement (Gootenberg et al., 2018 ; Harrington et al., 2018). Ces plasmides, commandés chez Addgene, portent un gène de résistance à l'ampicilline et permettent la production constitutive de l'inhibiteur de transcription LacI. L'expression du gène d'intérêt est sous le contrôle du promoteur de la polymérase T7 (déjà exprimée par la souche Rosetta) et de l'opérateur lacO. Les bactéries transformées ont été cultivées pendant une nuit dans du milieu LB complété par de l'ampicilline (200 mg/mL), du chloramphénicol (30 mg/mL) et du glucose (0,2%). Les cellules ont été diluées dans 1 L de Terrific Broth (milieu riche) complété par des antibiotiques jusqu'à une DO600=0,1 et cultivées à 37°C jusqu'à ce que la DO atteigne 0,5. Ensuite, de l'IPTG (0,5 mM) a été ajouté et la culture a été agitée à 18°C pendant 16 h pour la production de protéines. Les bactéries ont été récoltées par centrifugation à 5000xg pendant 15 min et remises en suspension dans 40 mL de tampon LEW (50mM NaH2PO4 300 mM NaCl pH 8.0) contenant un cocktail complet d'inhibiteurs de protéase (Roche). Après lyse par sonication, les protéines portant des étiquettes His ont été purifiées à l'aide de colonnes de nickel (Protino Ni-IDA 1000, Machery-Nagel) et digérées avec la protéase SenP2 (Cas13a) ou TEV (Cas14a1) afin d'éliminer les étiquettes histidine et les domaines de solubilisation qu'elles portaient. Cas13a a ensuite été purifié par FPLC sur une colonne d'héparine (1 mL, GE Healthcare) en utilisant un gradient comprenant la solution A (50 mM NaH2PO4 pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM beta-mercaptoethanol (BME)) et la solution B (50 mM NaH2PO4 pH 7,5, 1 M NaCl, 10% de glycérol, 1 mM BME). Pour la purification de Cas14a1 à l'héparine, la solution B était constituée de 50 mM NaH2PO4 pH 7,5, 1,5 M NaCl, 10% de glycérol, 1 mM BME. Les protéines ont ensuite été diluées 3 fois dans 50 mM NaH2PO4 pH 7,5, 20 m M NaCl, 10% de glycérol, 1 mM BME. Enfin, un dispositif de centrifugation Millipore a été utilisé pour concentrer les protéines. Les protéines ont été conservées à -20°C après ajout de glycérol jusqu'à 50%. Les protéines ont été analysées par SDS-PAGE et coloration de Coomassie.

**Очистка Cas13a и Cas14a1**

![fig 2 experiences](https://static.igem.org/mediawiki/2021/f/f1/T--GO_Paris-Saclay--experiments3.jpg)

**РИСУНОК 1: Схема, представляющая процесс очистки используемых белков Cas13a и Cas14a1.**

Для продукции Cas13a и Cas14a1 штамм E.coli Rosetta трансформировали плазмидами pC0072 LbuCas13a His6-TwinStrep-SUMO-BsaI или pLBH531\_His10-MBP-Cas14a1 соответственно (Gootenberg et al., 2018; Harrington et al., 2018). Плазмиды, которые были заказаны у Addgene, несут ген устойчивости к ампициллину и позволяют конститутивно продуцировать ингибитор транскрипции LacI. Экспрессия интересующего гена находится под контролем промотора полимеразы Т7 (уже экспрессируемого штаммом Rosetta) и оператора lacO. Трансформированные бактерии выращивали в течение ночи в LB с добавлением ампициллина (200 мг / мл), хлорамфеникола (30 мг / мл) и глюкозы (0,2%). Клетки разводили в 1 л Terrific Broth (богатая среда) с добавлением антибиотиков до OD600 = 0,1 и выращивали при 37 ° C до достижения OD 0,5. Затем добавляли IPTG (0,5 мМ) и культуру встряхивали при 18 ° C в течение 16 часов для продукции белка. Бактерии собирали центрифугированием при 5000g в течение 15 мин и ресуспендировали в 40 мл буфера LEW (50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, pH 8,0), содержащего коктейль полного ингибитора протеазы (Roche). После лизиса ультразвуком белки, несущие His-метки, очищали с использованием никелевых колонок (Protino Ni-IDA 1000, Machery-Nagel) и расщепляли с помощью SenP2 (Cas13a) или протеазы TEV (Cas14a1) для удаления гистидиновых меток и доменов солюбилизации. они несли. Затем Cas13a очищали с помощью FPLC на колонке с гепарином (1 мл, GE Healthcare), используя градиент с использованием раствора A (50 мМ NaH2PO4, pH 7,5, 100 мМ NaCl, 1 мМ бета-меркаптоэтанол (BME)) и раствора B (50 мМ NaH2PO4, pH 7,5, 1 M NaCl, 10% глицерин, 1 мМ BME). Для очистки Cas14a1 гепарином раствор B представлял собой 50 мМ NaH2PO4 pH 7,5, 1,5 М NaCl, 10% глицерин, 1 мМ BME. Затем белки разбавляли в 3 раза 50 мМ NaH2PO4 pH 7,5, 20 мМ NaCl, 10% глицерином, 1 мМ BME. Наконец, для концентрирования белка использовали центробежное устройство Millipore. Белки хранили при -20 ° C после добавления глицерина до 50%. Белки анализировали с помощью SDS-PAGE и окрашивания Кумасси.

**Cas13a and Cas14a1 detection assays**
All the measurements were made on 96 wells fluorescent assay plates.
We first denatured our oligos at 65°C (cooling down at -2°C/min until reaching room temperature), and then incubated at 37°C, Cas13 and Cas14 with their corresponding cr/sgRNA, respectively : crRNA 125, 3613 or 7863 for Cas13 and sgRNA for Cas14. Each Cas complex was then incubated with its activator (miRNA for a Cas13 only assay or ssDNA activator for a Cas14 only assay, and activated Cas13 complex + cleaved ST-HP for a full cascade test). Incubation times of 10 minutes, 30 minutes, 1 hour and 2 hours were tested for each step to optimize the reactions.

![fig 3 experiences](https://static.igem.org/mediawiki/2021/d/d9/T--GO_Paris-Saclay--experiments4.jpg)

**FIGURE 2 : Cas13a-only reaction
Detailed process of the reaction used to test Cas13a independently from the rest of the system.**

We first denatured both the crRNA (from 5 to 100 nM) and the miRNA (from 0.2 to 200 nM) of our chosen couple, we then incubated the denatured crRNA with the Cas13 (20 nM) protein and incubated the now bound Cas13a/crRNA complex with the miRNA for annealing. Once this step is over we mixed the solution with a buffer and the RNA probe (200 nM) on a fluorescence assay plate.
This reaction was used first to assess whether or not Cas13a alone was efficient for miRNA detection. And once the enzymatic activity was confirmed we used it with both crRNA (Fig 5-8) and miRNA (Fig 9-10) concentration gradients to find their optimal concentration for the cascade reaction. All three mi/crRNA couples were tested with the crRNA concentration gradient while only the mi/crRNA-125b couple was tested with the miRNA gradient. We also tested the Cas13 only reaction in a heterogeneous medium composed of Hela cell total RNA acquired from I2BC lab (50 to 600 nM) , we did the same with bacterial total RNA extracted from a Rosetta strain culture done previously (50 to 600 nM), using it as specificity control.

![fig 4 experiences](https://static.igem.org/mediawiki/2021/7/7d/T--GO_Paris-Saclay--exp31.png)

**FIGURE 3 : Cas14a1-only reaction

Detailed process of the reaction used to test Cas14a1 independently from the rest of the system.**

We first denatured the sgRNA and once denatured we incubated it with Cas14 (30 nM). Once bound we incubated the Cas14a1/sgRNA complex with an ssDNA activator (6 to 120 nM) for annealing. After both these steps were completed we mixed the complexe with the ssDNA probe (500 nM) on the fluorescence assay plate.
This reaction was used to assess whether or not Cas14a1 alone was efficient. We tested it with varying concentrations of sgRNA but constant concentrations of other elements (Fig 11).

![fig 5 experiences](https://static.igem.org/mediawiki/2021/e/eb/T--GO_Paris-Saclay--exp3.2.png)

**FIGURE 4 : Cascade reaction
Detailed process of the final cascade reaction.**

We first denatured all three previously used elements, sgRNA and our crRNA/miRNA couple of choice. We then incubated Cas14a1 (30 nM) with the sgRNA (12 or 30 nM) and Cas13 (20 nM) with the crRNA (20 nM), afterward we incubated the Cas13/crRNA complex with the miRNA. We incubated once again now activated Cas13 (Cas13 + crRNA + miRNA) with ST-HP (200 nM).
 Afterward we incubated the activated Cas13 and the cleaved ST-HP with the inactive Cas14/sgRNA complex, ST-HP’s now exposed single strand would now anneal with the Cas14/sgRNA complex which would result in an active Cas14. Once all those steps are completed we mixed everything with the ssDNA probe (100, 200 or 500 nM) on a fluorescence assay plate.

**FIGURE 5 : All used reactions recap.**

![fig 6 experiences](https://static.igem.org/mediawiki/2021/6/69/T--GO_Paris-Saclay--exp3.3.png)

**Tests de détection par Cas13a et Cas14a1**
Toutes les mesures ont été effectuées en plaques d’essais fluorescents 96 puits.
Nous avons d'abord dénaturé nos oligos à 65°C (refroidissement à -2°C/min jusqu'à atteindre la température ambiante), puis nous avons incubé à 37°C, Cas13 et Cas14 avec leurs cr/sgRNA correspondants, respectivement : crRNA 125, 3613 ou 7863 pour Cas1a3 et sgRNA pour Cas14a1. Chaque complexe Cas a ensuite été incubé avec son activateur (miRNA pour un test Cas13 seule, activateur ssDNA pour un test Cas14 seule, et complexe Cas13 activé + ST-HP clivé pour un test en cascade complet). Des temps d'incubation de 10 minutes, 30 minutes, 1 heure et 2 heures ont été testés pour chaque étape afin d'optimiser les réactions.

![fig 3 experiences](https://static.igem.org/mediawiki/2021/d/d9/T--GO_Paris-Saclay--experiments4.jpg)

**FIGURE 2 : Réaction avec Cas13a seule
Processus détaillé de la réaction utilisée pour tester Cas13a indépendamment du reste du système.**

Nous avons d'abord dénaturé le crRNA (5 à 100 nM) et le miRNA (0,2 à 200 nM) de notre couple choisi, puis nous avons incubé le crRNA dénaturé avec la protéine Cas13a (20 nM). Nous avons ensuite incubé le complexe Cas13/crRNA nouvellement formé avec le miRNA pour l'hybridation. Une fois cette étape terminée, nous avons mélangé la solution avec un tampon et la sonde ARN (200 nM) sur une plaque d'essai de fluorescence.
Cette réaction a d'abord été utilisée pour évaluer si Cas13a était efficace pour la détection des miRNAs, et une fois l'activité enzymatique confirmée, nous l'avons utilisée avec des gradients de concentration de crRNA (Fig 5-8) et de miRNA (Fig 9-10) pour trouver leurs concentration optimale pour la réaction en cascade. Les trois couples mi/crRNA ont été testés avec le gradient de concentration crRNA tandis que seul le couple mi/crRNA-125b a été testé avec le gradient miRNA. Nous avons également testé la réaction de Cas13a seule dans un milieu hétérogène composé d'ARN total de cellules Hela acquis auprès du laboratoire I2BC (50 à 600 nM), nous avons fait de même avec de l'ARN total bactérien extrait d'une culture de la souche Rosetta réalisée précédemment (50 à 600 nM), utilisant ainsi ces deux tests comme contrôles de spécificité.

![fig 4 experiences](https://static.igem.org/mediawiki/2021/7/7d/T--GO_Paris-Saclay--exp31.png)

**FIGURE 3 : Réaction avec Cas14a1 seule

Processus détaillé de la réaction utilisée pour tester Cas14a1 indépendamment du reste du système.**

Nous avons d'abord dénaturé le sgRNA et une fois dénaturé nous l'avons incubé avec Cas14a1 (30 nM). Une fois lié nous avons incubé le complexe Cas14/sgRNA avec un activateur ssDNA (6 à 120 nM) pour hybridation. Après que ces deux étapes aient été terminées, nous avons mélangé le complexe avec la sonde d'ADNsb (500 nM) sur la plaque d'essai de fluorescence.
Cette réaction a été utilisée pour évaluer si Cas14a1 seule était efficace ou non. Nous l'avons testée avec des concentrations variables de sgRNA mais des concentrations constantes des autres éléments (Fig 11).

![fig 5 experiences](https://static.igem.org/mediawiki/2021/e/eb/T--GO_Paris-Saclay--exp3.2.png)

**FIGURE 4 : Réaction en Cascade
Processus détaillé de la réaction utilisée pour tester la réaction en cascade.**
Nous avons d'abord dénaturé les trois éléments précédemment utilisés, le sgRNA et le couple crRNA/miRNA de notre choix. Nous avons ensuite incubé Cas14a1 (30 nM) avec le sgRNA (12 ou 30 nM) et Cas13a (20 nM) avec le sgRNA (20 nM), puis nous avons incubé le complexe Cas13a/crRNA avec le miRNA. Nous avons incubé une fois de plus Cas13a maintenant activée (Cas13a + crRNA + miRNA) avec la ST-HP (200 nM).
 Ensuite, nous avons incubé la Cas13a activée et la ST-HP clivée avec le complexe Cas14a1/sgRNA inactif. Le simple brin exposé de la ST-HP va maintenant s'hybrider avec le complexe Cas14a1/sgRNA, ce qui donnera une Cas14 active. Une fois toutes ces étapes terminées, nous avons mélangé le tout avec la sonde ADNsb (100, 200 ou 500 nM) sur une plaque d'essai de fluorescence.

**FIGURE 5 : Récapitulation de toutes les réactions utilisées.**

![fig 6 experiences](https://static.igem.org/mediawiki/2021/6/69/T--GO_Paris-Saclay--exp3.3.png)

**Анализы для обнаружения Cas13a и Cas14a1**
Все измерения проводились на 96-луночных планшетах для флуоресцентного анализа.
Сначала мы денатурировали наши олигонуклеотиды при 65 ° C (охлаждение со скоростью -2 ° C / мин до достижения комнатной температуры), а затем инкубировали при 37 ° C, Cas13 и Cas14 с их соответствующими cr / sgRNA, соответственно: crRNA 125, 3613 или 7863 для Cas13 и sgRNA для Cas14. Затем каждый комплекс Cas инкубировали с его активатором (miRNA для анализа только Cas13 или активатор ssDNA для анализа только Cas14 и активированный комплекс Cas13 + расщепленный ST-HP для полного каскадного теста). Время инкубации составляло 10 минут, 30 минут, 1 час и 2 часа для каждого шага, чтобы оптимизировать реакции.

![fig 3 experiences](https://static.igem.org/mediawiki/2021/d/d9/T--GO_Paris-Saclay--experiments4.jpg)

**РИСУНОК 2: Реакция только Cas13a**

Подробный процесс реакции использовался для тестирования Cas13a независимо от остальной системы.
Сначала мы денатурировали как crRNA (от 5 до 100 нМ), так и miRNA (от 0,2 до 200 нМ) выбранной нами пары, затем мы инкубировали денатурированную crRNA с белком Cas13 (20 нМ) и инкубировали теперь связанный комплекс Cas13a / crRNA с miRNA для отжига. По завершении этого этапа мы смешали раствор с буфером и зондом РНК (200 нМ) на планшете для флуоресцентного анализа.
Эта реакция была использована сначала, чтобы оценить, эффективен ли только Cas13a для обнаружения miRNA.
 И как только ферментативная активность была подтверждена, мы использовали ее с градиентами концентрации как crRNA (рис. 5-8), так и miRNA (рис. 9-10), чтобы найти их оптимальную концентрацию для каскадной реакции. Все три пары mi / crRNA тестировали с градиентом концентрации crRNA, тогда как только пару mi / crRNA-125b тестировали с градиентом miRNA. Мы также протестировали реакцию только Cas13 в гетерогенной среде, состоящей из общей РНК клеток Hela, полученной из лаборатории I2BC (от 50 до 600 нМ), мы сделали то же самое с общей РНК бактерий, экстрагированной из культуры штамма Rosetta, сделанной ранее (от 50 до 600 нМ). , используя его как контроль специфичности.

![fig 4 experiences](https://static.igem.org/mediawiki/2021/7/7d/T--GO_Paris-Saclay--exp31.png)

**РИСУНОК 3: Реакция только Cas14a1

Подробный процесс реакции, используемый для тестирования Cas14a1, независимо от остальной системы.**

Сначала мы денатурировали sgRNA, а после денатурирования инкубировали ее с Cas14a1 (30 нМ). После связывания мы инкубировали комплекс Cas14 / sgRNA с активатором ssDNA (от 6 до 120 нМ) для гибридизации. После завершения этих двух этапов мы смешали комплекс с зондом оцДНК (500 нМ) на планшете для флуоресцентного анализа.
Эту реакцию использовали для оценки эффективности только Cas14a1. Мы протестировали его с различными концентрациями sgRNA, но постоянными концентрациями других элементов (рис. 11).

![fig 5 experiences](https://static.igem.org/mediawiki/2021/e/eb/T--GO_Paris-Saclay--exp3.2.png)

**РИСУНОК 4: Каскадная реакция
Подробный процесс финальной каскадной реакции.**

Сначала мы денатурировали три использованных ранее элемента, sgRNA и пару crRNA / miRNA по нашему выбору. Затем мы инкубировали Cas14a1 (30 нМ) с sgRNA (12 или 30 нМ) и Cas13a (20 нМ) с sgRNA (20 нМ). Затем мы инкубировали комплекс Cas13a / crRNA с miRNA.
 Мы снова инкубировали активированный Cas13a (Cas13a + crRNA + miRNA) с ST-HP (200 нМ), после инкубировали активированный Cas13a и расщепленный ST-HP с неактивным комплексом Cas14a1 / sgRNA. Обнаруженная одиночная цепь шпильки ST-HP теперь будет гибридизоваться с комплексом Cas14a1 / sgRNA, в результате чего образуется активный Cas14. После того, как все эти шаги были выполнены, мы смешали все с зондом оцДНК (100, 200 или 500 нМ) на планшете для флуоресцентного анализа.

**РИСУНОК 5: Сводка всех использованных реакций.**

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Table of contents

[Cas13a and Cas14a1 purification](#1)
[Cas13a and Cas14a1 detection assays](#2)
![bannière sommaire](https://static.igem.org/mediawiki/2021/0/03/T--GO_Paris-Saclay--sumarryimage.png)

## Results

## Résultats

## Результаты

**Cas13a and Cas14a1 purification**

![image cascade](https://static.igem.org/mediawiki/2021/7/75/T--GO_Paris-Saclay--results1.jpg)
**FIGURE 1 : Coomassie staining results after nickel purification of Cas13a and Cas14a1 proteins.
The bluer a sample is, the more important the protein concentration is. El : elution**

Following the purification of our protein samples on nickel columns, it seems that our two proteins were efficiently purified (following a single elution for Cas13a1 and two for Cas14a1). An SDS-Page was however necessary to confirm that the eluted proteins were indeed our proteins of interest.

![image results 2](https://static.igem.org/mediawiki/2021/6/6c/T--GO_Paris-Saclay--results2.jpg)
**FIGURE 2 : Coomassie blue-stained SDS-PAGE gel with nickel-column purified SUMO-Cas13a digested with the SenP2 protease (NG13) and MBP-Cas14a1 digested with the TEV protease (NG14). Following digest, the samples were subjected to a second affinity purification on nickel column
LA : ladder (sizes in kDa), NG : Non-digested, FT : Flowthrough, E : Elution (1 or 2), 13 : Cas13a , 14 : Cas14a1. Expected sizes for: SUMO-Cas13, 155 kDa; Cas13 after cleavage, 140 kDa; MBP-Cas14a1, 107 kDa; Cas14a1 after cleavage, 62 kDa.**

Non-digested Cas13a measuring 155 Kda and digested Cas13a measuring 138 Kda we can conclude that Cas13a has been efficiently digested and its tags and solubilization domains removed. Concerning Cas14a1, the expected sizes before and after digestion are respectively 108 Kda and 65.5 Kda, then Cas14a1 was only partially digested. The observed fragment of about 40 Kda corresponding to the tags and solubilization domains removed. Note however that even if the tags have been removed, a part of our proteins still seems to cling to the columns.

![image results 3](https://static.igem.org/mediawiki/2021/3/3e/T--GO_Paris-Saclay--results3.jpg)
**FIGURE 3 : Heparin purification by FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) results**

Following the purification on heparin column we could observe 2 absorbance peaks at 280 nm at 50 minutes for Cas13a and at 35 minutes for Cas14a1 corresponding to our two proteins of interest.

![image results 4](https://static.igem.org/mediawiki/2021/7/79/T--GO_Paris-Saclay--results4.jpg)
**FIGURE 4 : SDS-PAGE gel corresponding to Cas14a1 after heparin purification
BH : Cas14a1 before heparin purification, LA : ladder, HP : Cas14a1 after heparin purification. The 45-kDa MBP domain was eliminated thanks to the chromatography with a heparin column. We recovered the uncleaved MBP-Cas14a1 protein and the Cas14a1 protein.**

The purification of cleaved Cas14a1 was controlled by SDS-Page, unfortunately, it seems that this third purification was not sufficient to purify only the cleaved protein. However, it allowed us to remove the fragments corresponding to the tags and solubilization domains.

**Conclusions/Discussions :**

In conclusion, we succeeded in producing and purifying Cas13a and Cas14a1 proteins, but only Cas13a could be completely cleared of its tags. For the activity tests of the proteins we finally decided to use non-digested Cas14a1.

Moreover, even if we did not detail it in the previous results, the production of Cas13a and its first purification on nickel column had to be restarted due to the unexpected tendency of the protein to aggregate at -20°C. Throughout the different purification steps, it was then kept at -4°C until heparin purification for which it had been resolubilized in a solution containing 10% of ethanol, preventing aggregation at -20°C.

**Purification de Cas13a et Cas14a1**

![image cascade](https://static.igem.org/mediawiki/2021/7/75/T--GO_Paris-Saclay--results1.jpg)
**FIGURE 1 : Résultats de la coloration au bleu de Coomassie après purification des Cas13a et Cas14a1 sur colonne d’affinité au nickel
Plus un échantillon est bleu plus la concentration en protéines y est importante. El : élution**

Suite à la purification de nos échantillons de protéines sur colonnes de nickel, il semble que nos deux protéines aient été efficacement purifiées (suite à une seule élution pour Cas13a1 et deux pour Cas14a1). Un SDS-Page a cependant été nécessaire pour confirmer que les protéines éluées étaient bien nos protéines d'intérêt.

![image results 2](https://static.igem.org/mediawiki/2021/6/6c/T--GO_Paris-Saclay--results2.jpg)
**FIGURE 2 : Coloration de Coomassie (A) et gel de SDS-PAGE (B) correspondant à Cas13a et Cas14a1 après digestion avec la protéase SenP2 (Cas13a) ou TEV (Cas14a1) et une seconde purification sur colonne de nickel.
LA : échelle, NG : Non-digérée, FT : Flowthrough, E : Elution (1 ou 2), 13 : Cas13a, 14 : Cas14a1**

Cas13a non digérée mesurant 155 Kda et Cas13a digérée mesurant 138 Kda nous pouvons conclure que Cas13a a été efficacement digérée et que ses tags et domaines de solubilisation ont été enlevés. Concernant Cas14a1, les tailles attendues avant et après digestion sont respectivement de 108 Kda et 65,5 Kda, alors Cas14a1 n'a été que partiellement digéré. Le fragment observé d'environ 40 Kda correspondant aux tags et domaines de solubilisation retirés. Notons cependant que même si les tags ont été enlevés, une partie de nos protéines semble encore s'accrocher aux colonnes.

![image results 3](https://static.igem.org/mediawiki/2021/3/3e/T--GO_Paris-Saclay--results3.jpg)
**FIGURE 3 : Résultats de la purification sur héparine par FPLC**

Après la purification sur colonne d'héparine, nous avons pu observer 2 pics d'absorbance à 280 nm à 50 minutes pour Cas13a et à 35 minutes pour Cas14a1 correspondant à nos deux protéines d'intérêt.

![image results 4](https://static.igem.org/mediawiki/2021/7/79/T--GO_Paris-Saclay--results4.jpg)
**FIGURE 4 : Gel de SDS-PAGE correspondant à Cas14a1 après purification sur héparine
BH : Cas14a1 avant purification sur héparine, LA : échelle, HP : Cas14a1 après purification sur héparine**

La purification de Cas14a1 clivée a été contrôlée par SDS-Page, malheureusement, il semble que cette troisième purification n'ait pas été suffisante pour purifier uniquement la protéine clivée. Cependant, elle a permis d'éliminer les fragments correspondant aux tags et aux domaines de solubilisation.

**Conclusions/Discussions :**

En conclusion, nous avons réussi à produire et purifier les protéines Cas13a et Cas14a1, mais seule Cas13a a pu être complètement débarrassée de ses tags. Pour les tests d'activité des protéines, nous avons finalement décidé d'utiliser Cas14a1 non digérée.

Par ailleurs, même si nous ne l'avons pas détaillé dans les résultats précédents, la production de Cas13a et sa première purification sur colonne de nickel ont dû être reprises en raison de la tendance inattendue de la protéine à s'agréger à -20°C. Tout au long des différentes étapes de purification, elle a ensuite été maintenue à -4°C jusqu'à la purification à l'héparine pour laquelle elle avait été resolubilisée dans une solution contenant 10% d'éthanol, empêchant l'agrégation à -20°C.

**Очистка Cas13a и Сas14a1**

![image cascade](https://static.igem.org/mediawiki/2021/7/75/T--GO_Paris-Saclay--results1.jpg)
**РИСУНОК 1: Результаты окрашивания Кумасси после очистки белков Cas13a и Cas14a1 на колонке с никелем
Чем синее образец, тем важнее концентрация белка. El: элюирование**

После очистки наших образцов белка на никелевых колонках оказалось, что два наших белка были эффективно очищены (после одной элюции для Cas13a1 и двух для Cas14a1). Однако SDS-Page был необходим для подтверждения того, что элюированные белки действительно были интересующими нас белками.

![image results 2](https://static.igem.org/mediawiki/2021/6/6c/T--GO_Paris-Saclay--results2.jpg)
**Рисунок 2: Окрашенный Кумасси гель SDS-PAGE с очищенным на никелевой колонке SUMO-Cas13a, расщепленным протеазой SenP2 (NG13), и MBP-Cas14a1, расщепленным протеазой TEV (NG14). После гидролиза образцы подвергали второй аффинной очистке на никелевой колонке.
LA: ладдер (размеры в кДа), NG: непереваренный, FT: проточный, E: элюция (1 или 2), 13: Cas13a, 14: Cas14a1. Ожидаемые размеры для: SUMO-Cas13, 155 кДа; Cas13 после расщепления 140 кДа; MBP-Cas14a1, 107 кДа; Cas14a1 после расщепления, 62 кДа.**

Мы получили нерасщепленный Cas13a размером 155 кДа и расщепленный Cas13a размером 138 кДа, мы можем сделать вывод, что Cas13a был эффективно расщеплен и что его метки и домены солюбилизации были удалены. Что касается Cas14a1, ожидаемые размеры до и после расщепления составляют соответственно 108 кДа и 65,5 кДа, поэтому Cas14a1 расщепляется только частично. Наблюдаемый фрагмент около 40 кДа соответствует удаленным меткам и доменам солюбилизации. Обратите внимание, однако, что даже если теги были удалены, некоторые из наших белков, кажется, все еще цепляются за столбцы.

![image results 3](https://static.igem.org/mediawiki/2021/3/3e/T--GO_Paris-Saclay--results3.jpg)
**РИСУНОК 3: Очистка гепарина по результатам FPLC (быстрая белковая жидкостная хроматография)**

После очистки на колонке с гепарином мы смогли наблюдать 2 пика поглощения при 280 нм через 50 минут для Cas13a и через 35 минут для Cas14a1, соответствующих двум интересующим нас белкам.

![image results 4](https://static.igem.org/mediawiki/2021/7/79/T--GO_Paris-Saclay--results4.jpg)
**Фигура 4: SDS-PAGE гель, соответствующий Cas14a1 после очистки гепарина
BH: Cas14a1 до очистки гепарина, LA: ладдер, HP: Cas14a1 после очистки гепарина. Домен MBP 45 кДа был удален благодаря хроматографии на колонке с гепарином. Мы восстановили нерасщепленный белок MBP-Cas14a1 и белок Cas14a1.**

Очистку расщепленного Cas14a1 контролировали с помощью SDS-Page, к сожалению, кажется, что этой третьей очистки было недостаточно для очистки только расщепленного белка. Однако это позволило удалить фрагменты, соответствующие меткам и доменам солюбилизации.

**Выводы/Рассуждения :**

В заключение, нам удалось получить и очистить белки Cas13a и Cas14a1, но только Cas13a удалось полностью очистить от его меток. В конце концов, для тестирования активности белков мы решили использовать нерасщепленный Cas14a1.

Более того, даже если мы не подробно описали это в предыдущих результатах, производство Cas13a и его первую очистку на никелевой колонке пришлось перезапустить из-за неожиданной тенденции белка к агрегации при -20 ° C. На протяжении различных стадий очистки его затем выдерживали при -4 ° C до очистки гепарина, для чего его повторно растворяли в растворе, содержащем 10% этанола, предотвращая агрегацию при -20 ° C.

**Cas13a and Cas14a1 detection assays**

![image results 5](https://static.igem.org/mediawiki/2021/thumb/4/44/T--GO_Paris-Saclay--results5.jpg/800px-T--GO_Paris-Saclay--results5.jpg)
**FIGURE 5 : Cas13a (cr/miR-125) activity with different concentrations of crRNAs and times of pre-incubation but constant miRNA concentrations.
10 min of incubation (A), 30 min (B), 60 min (C), 120 min (D)**

![image results 6](https://static.igem.org/mediawiki/2021/thumb/3/39/T--GO_Paris-Saclay--results6.jpg/800px-T--GO_Paris-Saclay--results6.jpg)
**FIGURE 6 : Initial velocities corresponding to the results presented on the Figure 5C.
Initial velocities (x = a.u./min).**

Referring to the results presented in Figures 5 and 6, the optimal conditions for miR-125 detection with Cas13a appear to be a crRNA concentration of 5nM and a 60-minute pre-incubation (Fig 5C and 6). Indeed, although the highest fluorescent signal is observed with a 30-minutes pre-incubation (Fig 5B), the corresponding profile at the other concentrations suggests that this is a result due to measurement or handling error. On the other hand, we can see that a pre-incubation of 10 minutes or 120 minutes seems to result in a low level of fluorescence, even for the most optimal crRNA concentrations (Fig 5A and D).

![image results 7](https://static.igem.org/mediawiki/2021/thumb/4/42/T--GO_Paris-Saclay--results7.jpg/800px-T--GO_Paris-Saclay--results7.jpg)
**FIGURE 7 : Cas13a (cr/miR-7863) only activity with different concentrations of crRNAs and times of pre-incubation but constant miRNA concentrations.
10 min of incubation (A), 30 min (B), 60 min (C), 120 min (D).**

![image results 8](https://static.igem.org/mediawiki/2021/thumb/8/8f/T--GO_Paris-Saclay--results8.jpg/800px-T--GO_Paris-Saclay--results8.jpg)
**FIGURE 8 : Initiale velocities corresponding to the results presented on the Figure 7C.
Initial velocities (x = a.u./min).**

The results presented in Figures 7 and 8 seem to correlate with those presented in Figures 5 and 6. As with miR-125 detection, the conditions for obtaining an optimal signal when detecting miR-7863 by Cas13a appear to be 5nM of crRNA and 60 minutes of pre-incubation (Fig 7C and 8).

![image results 8](https://static.igem.org/mediawiki/2021/thumb/f/f9/T--GO_Paris-Saclay--results9.jpg/799px-T--GO_Paris-Saclay--results9.jpg)
**FIGURE 9 : Cas13a (cr/miR-125) only reactions with different miRNA concentrations, constant crRNA concentrations (A) and associated initial velocities (B).
Initial velocities (x = a.u./min).**

The results presented in Figure 9 suggest that the optimal concentration of miRNA for detection of miR-125 by Cas13a is 50 nM. The limit of detection appears to be 20nM.

![image results 10](https://static.igem.org/mediawiki/2021/thumb/2/27/T--GO_Paris-Saclay--results10.jpg/800px-T--GO_Paris-Saclay--results10.jpg)
**FIGURE 10: Cas13a (cr/miR-125) only reactions with different bacterial RNA (A) or human RNA (B) concentrations.**

By observing the results in figure 10 we can conclude that the activation of Cas13a is well specific. Indeed, Cas13 coupled to crRNA-125 does not seem to cleave the fluorophore when incubated with non-specific RNA (bacterial or human) or miR3613.

![image results 11](https://static.igem.org/mediawiki/2021/thumb/2/23/T--GO_Paris-Saclay--results11.jpg/800px-T--GO_Paris-Saclay--results11.jpg)
**FIGURE 11 : Cas14a1 (sgRNA and ssDNA activator) only activity with different concentrations of ssDNA activator and times of pre-incubation but constant sgRNA concentrations.
10 min of incubation (A), 30 min (B), 60 min (C), 120 min (D).**

Figure 11 seems to show that Cas14a1 exhibits activity even in the absence of the activator. If this activity seems to be increased a bit by its presence, it does not seem to depend on its concentration or on the pre-incubation time.

![image results 12](https://static.igem.org/mediawiki/2021/4/4b/T--GO_Paris-Saclay--results12.jpg)
**FIGURE 12 : Cascade CRISPR/Cas with different conditions and 100 nM of fluorescent ssDNA reporter (A) or 200 nM (B) for the detection of miR-125b miRNA.**

Unfortunately, the cascade experiment did not seem to permit the detection of miR-125. Indeed, the fluorescence observed is probably due to the basal activity of Cas14a1 described in figure 11.

**Conclusions/Discussions :**

The tests shows that while the specificity of the Cas13a1 only reaction is high as we were able to detect miRNA 125 (Fig 5-7) and 7863 (Fig 8-9) without detecting non-specific RNAs (Fig 10), the sensibility needs to be improved and incubation times need to be tested over a wider range of durations to further improve the cleaving response.
Unfortunately we were unable to obtain a clear detection profile of miR3613, probably due to a defect in the design of the associated crRNA.

Cas14a1 appears to have basal activity even without activation. However, this activity does not seem to increase much in the presence of an activator.

We weren't able to detect any fluorescence increase using Cas14a1 with Cas13a and ST-HP, the issue could be with the produced Cas14a1 protein itself, with its sgRNA, both ST-HP and the ssDNA activator or a combination of several of these factors.

One other hypothesis for the low activity of Cas14a1 could be a hindrance of its ability to dimerize caused by the tags that were not removed, as its dimerization seems to be an indispensable condition for its activation.

However, if the Cas14a1 protein used is really inactive due to its inability to dimerize caused by the presence of tags that we failed to remove with TEV. One possibility would be to repeat the experiments using another plasmid encoding a Cas14a1 whose tag digestion site would be recognized by another enzyme.

**Tests de détection par Cas13a et Cas14a1**

![image results 5](https://static.igem.org/mediawiki/2021/thumb/4/44/T--GO_Paris-Saclay--results5.jpg/800px-T--GO_Paris-Saclay--results5.jpg)
**FIGURE 5 : Activité de Cas13a (cr/miR-125) avec différentes concentrations de crRNAs et temps de pré-incubation mais concentrations de miRNAs constantes.
10 min d'incubation (A), 30 min (B), 60 min (C), 120 min (D)**

![image results 6](https://static.igem.org/mediawiki/2021/thumb/3/39/T--GO_Paris-Saclay--results6.jpg/800px-T--GO_Paris-Saclay--results6.jpg)
**FIGURE 6 : Vitesses initiales correspondant aux résultats présentés sur la Figure 5C.
Vitesses initiales (x = a.u./min).**

En se référant aux résultats présentés dans les Figures 5 et 6, les conditions optimales pour la détection du miR-125 avec Cas13a semblent être une concentration de 5nM de crRNA et une pré-incubation de 60 minutes (Fig 5C et 6). En effet, bien que le signal fluorescent le plus élevé soit observé avec une pré-incubation de 30 minutes (Fig 5B), le profil correspondant aux autres concentrations suggère qu'il s'agit d'un résultat dû à une erreur de mesure ou de manipulation. D'autre part, on constate qu'une pré-incubation de 10 minutes ou 120 minutes semble entraîner un faible niveau de fluorescence, même pour les concentrations les plus optimales de crRNA (Fig 5A et D).

![image results 7](https://static.igem.org/mediawiki/2021/thumb/4/42/T--GO_Paris-Saclay--results7.jpg/800px-T--GO_Paris-Saclay--results7.jpg)
**FIGURE 7 : Activité de Cas13a (cr/miR-7863) seule avec différentes concentrations de crRNAs et temps de pré-incubation mais concentrations de miRNAs constantes.
10 min d'incubation (A), 30 min (B), 60 min (C), 120 min (D).**

![image results 8](https://static.igem.org/mediawiki/2021/thumb/8/8f/T--GO_Paris-Saclay--results8.jpg/800px-T--GO_Paris-Saclay--results8.jpg)
**FIGURE 8 : Vitesses initiales correspondant aux résultats présentés sur la Figure 7C.
Vitesses initiales (x = a.u./min).**

Les résultats présentés dans les figures 7 et 8 semblent être en corrélation avec ceux présentés dans les figures 5 et 6. Comme pour la détection du miR-125, les conditions pour obtenir un signal optimal lors de la détection du miR-7863 par Cas13a semblent être 5nM de crRNA et 60 minutes de pré-incubation (Fig 7C et 8).

![image results 8](https://static.igem.org/mediawiki/2021/thumb/f/f9/T--GO_Paris-Saclay--results9.jpg/799px-T--GO_Paris-Saclay--results9.jpg)
**FIGURE 9 : Réactions de Cas13a (cr/miR-125) seule avec différentes concentrations de miRNA, concentrations constantes de crRNA (A) et vitesses initiales associées (B).
Vitesses initiales (x = a.u./min).**

Les résultats présentés dans la figure 9 suggèrent que la concentration optimale de miRNA pour la détection du miR-125 par Cas13a est de 50 nM. La limite de détection semble être de 20 nM.

![image results 8](https://static.igem.org/mediawiki/2021/thumb/2/27/T--GO_Paris-Saclay--results10.jpg/800px-T--GO_Paris-Saclay--results10.jpg)
**FIGURE 10 : Réactions de Cas13a (cr/miR-125) seule avec différentes concentrations d'ARN bactérien (A) ou d'ARN humain (B).**

En observant les résultats de la figure 10, nous pouvons conclure que l'activation de Cas13a est bien spécifique. En effet, Cas13 couplé au crRNA-125 ne semble pas cliver le fluorophore lorsqu'il est incubé avec un ARN non spécifique (bactérien ou humain) ou miR-3613.

![image results 11](https://static.igem.org/mediawiki/2021/thumb/2/23/T--GO_Paris-Saclay--results11.jpg/800px-T--GO_Paris-Saclay--results11.jpg)
**FIGURE 11 : Activité de Cas14a1 (sgRNA et activateur ssDNA) seule avec différentes concentrations d'activateur ssDNA et temps de pré-incubation mais concentrations constantes de sgRNA.
10 min d'incubation (A), 30 min (B), 60 min (C), 120 min (D).**

La figure 11 semble montrer que Cas14a1 présente une activité même en l'absence de l'activateur. Si cette activité semble être un peu augmentée par sa présence, elle ne semble pas dépendre de sa concentration ou du temps de pré-incubation.

![image results 12](https://static.igem.org/mediawiki/2021/4/4b/T--GO_Paris-Saclay--results12.jpg)
**FIGURE 12 : Cascade CRISPR/Cas avec différentes conditions et 100 nM de rapporteur ssDNA fluorescent (A) ou 200 nM (B) pour la détection du miR-125b miRNA.**

Malheureusement, l'expérience en cascade n'a pas semblé permettre la détection de miR-125. En effet, la fluorescence observée est probablement due à l'activité basale de Cas14a1 décrite en figure 11.

**Conclusions/Discussions :**

Les tests montrent que si la spécificité de la réaction Cas13a1 seule est élevée puisque nous avons pu détecter les miRNA 125 (Fig 5-7) et 7863 (Fig 8-9) sans détecter d'ARN non spécifiques (Fig 10), la sensibilité doit être améliorée et les temps d'incubation doivent être testés sur une plus large gamme de durées pour améliorer encore la réaction de clivage.
Malheureusement, nous n'avons pas été en mesure d'obtenir un profil de détection clair du miR3613, probablement en raison d'un défaut dans la conception du crRNA associé.

Cas14a1 semble avoir une activité basale même sans activation. Cependant, cette activité ne semble pas augmenter beaucoup en présence d'un activateur.

Nous n'avons pas pu détecter d'augmentation de la fluorescence en utilisant Cas14a1 avec Cas13a et la ST-HP, le problème pourrait être lié à la protéine Cas14a1 produite elle-même, à son sgRNA, à ST-HP et à l'activateur ssDNA ou à une combinaison de plusieurs de ces facteurs.

Une autre hypothèse pour la faible activité de Cas14a1 pourrait être une entrave à sa capacité à se dimériser causée par les étiquettes qui n'ont pas été retirées, car sa dimérisation semble être une condition indispensable à son activation.

Cependant, si la protéine Cas14a1 utilisée est réellement inactive en raison de son incapacité à se dimériser causée par la présence de tags que nous n'avons pas réussi à enlever avec la TEV. Une possibilité serait de répéter les expériences en utilisant un autre plasmide codant pour une Cas14a1 dont le site de digestion des tags serait reconnu par une autre enzyme.

**Тесты по детектированию Cas13a и Cas14a1**

![image results 5](https://static.igem.org/mediawiki/2021/thumb/4/44/T--GO_Paris-Saclay--results5.jpg/800px-T--GO_Paris-Saclay--results5.jpg)
**РИСУНОК 5: Активность Cas13a (cr / miR-125) при различных концентрациях crRNA и времени преинкубации, но постоянных концентрациях miRNA.
10 мин инкубации (A), 30 мин (B), 60 мин (C), 120 мин (D)**

![image results 6](https://static.igem.org/mediawiki/2021/thumb/3/39/T--GO_Paris-Saclay--results6.jpg/800px-T--GO_Paris-Saclay--results6.jpg)
**FIGURE 6 : Vitesses initiales correspondant aux résultats présentés sur la Figure 5C.
Vitesses initiales (x = a.u./min).**

**РИСУНОК 6: Начальные скорости, соответствующие результатам, представленным на Рисунке 5C.
Начальные скорости (x = а.е. / мин).**

Ссылаясь на результаты, представленные на рисунках 5 и 6, оптимальными условиями для обнаружения miR-125 с помощью Cas13a, по-видимому, являются концентрация crРНК 5 нМ и 60-минутная преинкубация (рис. 5C и 6). Действительно, хотя самый высокий флуоресцентный сигнал наблюдается при 30-минутной предварительной инкубации (рис. 5B), соответствующий профиль при других концентрациях предполагает, что это результат может быть таким из-за ошибки измерения или обработки. С другой стороны, мы можем видеть, что предварительная инкубация в течение 10 или 120 минут, по-видимому, приводит к низкому уровню флуоресценции даже для самых оптимальных концентраций crRNA - а значит, наиболее оптимальное время инкубации будет находится в окне этих значений (рис. 5A и D).

![image results 7](https://static.igem.org/mediawiki/2021/thumb/4/42/T--GO_Paris-Saclay--results7.jpg/800px-T--GO_Paris-Saclay--results7.jpg)
**РИСУНОК 7: Активность только Cas13a (cr / miR-7863) с разными концентрациями crRNA и временами преинкубации, но с постоянными концентрациями miRNA.
10 мин инкубации (A), 30 мин (B), 60 мин (C), 120 мин (D).**

![image results 8](https://static.igem.org/mediawiki/2021/thumb/8/8f/T--GO_Paris-Saclay--results8.jpg/800px-T--GO_Paris-Saclay--results8.jpg)
**РИСУНОК 8: Начальные скорости, соответствующие результатам, представленным на Рисунке 7C.
Начальные скорости (x = а.е. / мин).**

Результаты, представленные на рисунках 7 и 8, похоже, коррелируют с результатами, представленными на рисунках 5 и 6. Как и в случае обнаружения miR-125, условия для получения оптимального сигнала при обнаружении miR-7863 с помощью Cas13a, по-видимому, составляют 5 нМ crРНК и 60 минут. предварительной инкубации (рис. 7C и 8).

![image results 8](https://static.igem.org/mediawiki/2021/thumb/f/f9/T--GO_Paris-Saclay--results9.jpg/799px-T--GO_Paris-Saclay--results9.jpg)
**РИСУНОК 9: реакции только Cas13a (cr / miR-125) с разными концентрациями miRNA, постоянными концентрациями crRNA (A) и соответствующими начальными скоростями (B).
Начальные скорости (x = а.е. / мин).**

Результаты, представленные на рис. 9, предполагают, что оптимальная концентрация miRNA для обнаружения miR-125 с помощью Cas13a составляет 50 нМ. Предел обнаружения составляет 20 нм.

![image results 8](https://static.igem.org/mediawiki/2021/thumb/2/27/T--GO_Paris-Saclay--results10.jpg/800px-T--GO_Paris-Saclay--results10.jpg)
**РИСУНОК 10: Реакции только Cas13a (cr / miR-125) с различными концентрациями бактериальной РНК (A) или человеческой РНК (B).**

Наблюдая за результатами на рисунке 10, мы можем сделать вывод, что активация Cas13a хорошо специфична. Действительно, Cas13, связанный с crRNA-125, по-видимому, не расщепляет флуорофор при инкубации с неспецифической РНК (бактериальной или человеческой) или miR3613.

![image results 11](https://static.igem.org/mediawiki/2021/thumb/2/23/T--GO_Paris-Saclay--results11.jpg/800px-T--GO_Paris-Saclay--results11.jpg)
**РИСУНОК 11: Активность только Cas14a1 (активатора sgRNA и ssDNA) при различных концентрациях активатора ssDNA и времени предварительной инкубации, но постоянных концентрациях sgRNA.
10 мин инкубации (A), 30 мин (B), 60 мин (C), 120 мин (D).**

Рисунок 11, по-видимому, показывает, что Cas14a1 проявляет активность даже в отсутствие активатора. Даже если эта активность немного увеличивается из-за его присутствия, это не зависит от концентрации или время предварительной инкубации.

![image results 12](https://static.igem.org/mediawiki/2021/4/4b/T--GO_Paris-Saclay--results12.jpg)
**РИСУНОК 12: Каскад CRISPR / Cas в различных условиях и 100 нМ флуоресцентного репортера оцДНК (A) или 200 нМ (B) для обнаружения miR-125b miRNA.**

К сожалению, каскадный эксперимент, похоже, не позволил обнаружить miR-125. Действительно, наблюдаемая флуоресценция, вероятно, связана с базовой активностью Cas14a1, описанной на рисунке 11.

**Выводы/Обсуждение :**

Тесты показывают, что, хотя специфичность реакции только с Cas13a1 высока, поскольку мы смогли обнаружить miRNA 125 (Рис. 5-7) и 7863 (Рис. 8-9), не обнаруживая неспецифических РНК (Рис. 10), чувствительность необходима. необходимо улучшить, а время инкубации необходимо протестировать в более широком диапазоне продолжительности, чтобы еще больше улучшить реакцию расщепления.

К сожалению, нам не удалось получить четкий профиль обнаружения miR3613, вероятно, из-за дефекта в конструкции связанной crRNA.

Cas14a1, по-видимому, обладает базовой активностью даже без активации. Однако эта активность не сильно увеличивается в присутствии активатора.

Нам не удалось обнаружить какое-либо увеличение флуоресценции с использованием Cas14a1 с Cas13a и ST-HP, проблема могла быть в самом продуцированном белке Cas14a1 с его sgRNA, как ST-HP, так и активатором ssDNA, или в комбинации нескольких из этих факторов.

Еще одна гипотеза о низкой активности Cas14a1 может быть препятствием для его способности димеризоваться, вызванной метками, которые не были удалены, поскольку его димеризация, по-видимому, является важным условием для его активации.

Однако, если используемый белок Cas14a1 действительно неактивен из-за его неспособности димеризоваться из-за наличия меток, которые нам не удалось удалить с помощью TEV. Одна из возможностей состояла бы в том, чтобы повторить эксперименты с использованием другой плазмиды, кодирующей Cas14a1, сайт расщепления метки которого будет распознаваться другим ферментом.