iGEM 2012 — Team SEU_A

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# Team:SEU A/Notebook

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iGEM 2012 SEU\_A Safety

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# Notebook

This is our experiment diary.

|  |
| --- |
| Index   * [1 Learning Period](#.A0)   + [1.1 Key words](#.A1)   + [1.2 Research Safety](#.A2)   + [1.3 Public Safety](#.A3)   + [1.4 Environment Safety](#.A4) * [2Period 2](#.B0) * [3Period 3](#.C0) * [4Period 4](#.D0) * [5Period 5](#.E0) * [6Period 6](#.F0) |

## Period 1 Biosafety

2012/04/05-2012/06/23
学习阶段：实验技能学习、实验理论学习，掌握从已有工程菌得到希望构建的工程菌的过程
设计从污水中分离培养蛭弧菌方案
Learning stage : Learn about the skill and theory of Molecular Biology Experiment.
Set up the method of isolation and culture BD from sewage.
2012/04/05
LB培养基的制备、高压蒸汽灭菌锅的使用
LB medium preparation . Learn the usage of autoclaves.
细菌的培养
2012/04/06
利用BIOMIGA质粒小量提取试剂盒进行大肠杆菌质粒提取
2012/04/12
购买农业用蛭弧菌混合液，从中分离培养蛭弧菌
2012/04/14
蛭弧菌长出噬菌斑，分离纯化培养
2012/04/21
关于酶切、酶接相关实验技术学习
2012/05/18
2012年kit寄到，取kit进行转化，第一个转化I13521，命名“小红菌”
线性化质粒骨架酶切
2012/05/19
转化涂板技能练习
2012/05/20
挑单克隆，液体培养基振荡过夜培养
2012/05/22
PCR体系配置和技能练习
2012/05/23
优化酶接是骨架和片段的比例
2012/05/25
蛭弧菌菌液PCR，条带很弱，显示其生长不好或已变种
2012/06/13
所构建的工程菌保种

## Period 2 Biosafety

Jun 26-Jul 12
整体方案敲定，如下所示：
Death gene验证通路确定，如下：
蛭弧菌培养如火如荼
Sweet gene的钓取
2012/06/26
用小红菌作为营养物质培养异养型蛭弧菌
2012/06/28
K117010、I14032kit转化，构建工程菌，并设置对照实验验证其功能
2012/06/29
设置对照组，用活的&死的大肠杆菌培养蛭弧菌
2012/06/30
K117010功能验证实验
I14032质粒小提，凝胶回收
2012/07/01
0630阳性、阴性均未长菌，0628所转菌为假阳性
0630摇R0010质粒小提
2012/07/02
基因组分别钓取groES、groEL基因通过PCR
2012/07/03
转化K117010、B0034、K117000涂板技术及使用菌液量改进
复苏小红菌
2012/07/04
K117010、B0034、K117000、R0010、B0015摇菌
2012/07/05
蛭弧菌双层琼脂培养基分开涂板，计算E.coli菌落扩散速率及蛭弧菌游动并捕食E.coli的速率
2012/07/06
蛭弧菌半定量PCR引物重新设计购买
2012/07/07
跟进蛭弧菌、小红菌菌斑扩增速率
2012/07/09
K117000、B0015双酶切
复苏K117000、K117010、B0034、R0010、B0015
2012/07/10
质粒小提K117000、K117010、B0034、R0010、B0015
K117000使用通用引物PCR，20ul体系
2012/07/11
质粒小提K117000、B0015
小红菌摇菌，用作蛭弧菌的食物
转化K117000，B0015
摇菌K117010、R0010、B0034、B0015.
2012/07/12
蛭弧菌菌液PCR验证
K117010、R0010、B0015菌液PCR
保种B0034、R0010、K117010、B0015，传代培养R0010、B0034、B0015
K117000挑单菌落，BL21摇菌
B0034、B0015酶切

## Period 3 Biosafety

Jul 13--Jul 21
Conjugation支路的构建：
趋化性支路的构建：
成功钓取groE并含标准组件所需的酶切位点
2012/07/13
0712酶切体系跑胶回收
质粒小提B0034、B0015
R0010、B0034通用引物PCR
酶接体系配制R0010+B0034
转化酶接产物R0010+B0034，转化J01003、K117000
groES、groEL基因钓取
2012/07/14
J01003、R0010+B0034、K117000挑单菌落
2012/07/15
质粒小提K117000、J01003、R0010+B0034
K117000、J01003、R0010+B0034使用通用引物PCR
2012/07/16
R0010、K117010复苏
R0010+B0034菌液PCR
转化J01003
2012/07/17
R0010、K117010质粒小提
K117010、J01003、R0010+B0034质粒、R0010+B0034菌液、K117000 PCR
2012/07/18
J01003、K537001转化
自制感受态DH5α
2012/07/19
K117010、B0015、groEL、K117010（自主设计引物）
2012/07/20
groE基因钓取PCR
J01003质粒小提R0010、K117010转化
图3.从基因组钓取的groE基因电泳图
（中间为D15000 Marker）
2012/07/21
R0010、K117010挑单菌落
R0010、K117010质粒小提
K537001转化
接合转移实验验证

## Period 4 Biosafety

Jul 22-Aug 17
Death gene 验证通路构建成功
Conjugation通路构建成功，并将其连接至标准载体
Sweet gene表达载体的构建
2012/07/22
PCR退火最适温度实验探究
2012/07/23
转化J01001、R0084
0721接合转移菌株质粒检测
2012/07/24
K537001复苏摇菌
R0084、B0015挑单菌落
2012/07/25
半固体培养基配制
质粒小提J01001、R0084
K537001、R0084、J01001、groE菌液PCR
2012/07/26
K537001、K098011转化
2012/07/27
蛭弧菌涂板
2012/07/28
质粒小提R0010、K117010
菌液PCR R0010
2012/07/29
K537001、K098011挑单菌落
2012/07/30
菌液PCR groE/cheZ
复苏 R0084+B0034，送测序
2012/07/31
转化I13521、K117000、K098011
菌液PCR K117010、R0084+B0034、groE
质粒PCR K117010、R0084+B0034
质粒小提K098011、K117010、R0010、R0084+B0034
质粒小提电泳图
复苏R0010、 R0084、B0034 、K117010、K117000
双酶切R0010、K117010
2012/08/01
保种groES、B0034
双酶切R0084+B0034 、B0034 、K117000
双酶切电泳图
转化J04500
菌液PCR K117000、R0084、groE、R0010
2012/08/02
酶切回收R0084+B0034、B0034
菌液PCR K117000、R0084、K117010
质粒小提groES、B0034
保种K117000
双酶切R0084、B0034
J04500挑单菌落
酶接（R0084+B0034）+ K117000 、R0084+B0034、R0010+B0034
2012/08/03
质粒小提B0015、R0084、B0034、K117000、J04500
保种J04500
J04500、K117000质粒送测序
酶切回收R0084、B0034
双酶切R0084、B0034、J04500
酶接R0084+B0034
2012/08/04
酶切回收R0084、B0034、J04500
酶接R0084+B0034、J04500+ K117000
摇菌R0084、B0034、K117000
2012/08/05
质粒小提R0084、B0034、K117000
双酶切R0084、B0034、K117000
小红菌I13521 挑单菌落
复苏J01003、groES、PET
转化J01001
2012/08/06
菌液PCR groE
保种PET、I13521
酶接R0084+B0034、J04500+ K117000
质粒小提groES、J01003、PET32a、I13521
双酶切groE、J01003、pET32a、I13521
J01001挑单菌落
2012/08/07
质粒小提J01001、J04500、B0034
菌液PCR K117000、R0084、J01001
质粒PCR K117000、J01003
PCR产物回收K117000
双酶切J04500（S.P）、B0034（E.X）、K117000（X.P）、R0084（E.S）、 J01003（E.S）
转化R0084+B0034
2012/08/08
J01003+I13521、groE+pET32a酶接纯化
转化J01003+I13521、groE+pET32a
PCR J01003+I13521
复苏J04500、groES、pET32a、I13521、 R0084、B0034
保种R0084+B0034
2012/08/09
J01003+I13521 回收送测序
J01003+I13521、groE+pET32a挑单菌落
J04500、groES、pET32a、B0034质粒小提，凝胶回收
菌液PCR J01003+I13521、R0084、J01001、J01003
PCR产物回收J01003+I13521、R0084、J01001、J01003
双酶切J04500、groES、pET32a、B0034、K117000
双酶切电泳图
2012/08/10
0809的PCR产物点样
J01003+I13521、groE+pET32a菌液PCR验证，保种
pET32a保种
酶接J04500 +K117000、groES + pET32a
转化pSB1C3、J04500 +K117000、groES + pET32a
2012/08/11
pSB1C3、J04500 +K117000、groES + pET32a挑单菌落
J04500 +K117000、groES + pET32a酶接纯化
转化J04500 +K117000、groES + pET32a
菌液PCR J04500 +K117000
PCR产物回收J04500 +K117000
复苏B0015
2012/08/12
B0015质粒小提，凝胶回收
菌液PCR验证pSB1C3、J04500 +K117000、groES + pET32a
保种pSB1C3、J04500 +K117000、groES + pET32a
J04500 +K117000、groES + pET32a挑单菌落
2012/08/13
复苏B0034
重新转化pSB1C3
质粒小提（J04500+K117000）、菌液PCR用于酶切（J04500+K117000）
双酶切B0015、（J04500+K117000）
2012/08/14
挑单菌落pSB1C3
重新转化R0084
复苏（J01003+I13521）
0813双酶切回收
酶接体系（J04500+K117000）+B0015
2012/08/15
挑单菌落R0084
保种pSB1C3
质粒小提pSB1C3
菌液PCR用于酶切（J01003+I13521）
酶接回收，转化（J04500+K117000）+B0015
双酶切pSB1C3、（J01003+I13521）
2012/08/16
菌液PCR验证R0084
挑单菌落（J04500+K117000）+B0015
0815双酶切回收
酶接pSB1C3+（J01003+I13521）
复苏pSB1C3
2012/08/17
保种（J04500+K117000）+B0015
0816酶接回收，转化pSB1C3+（J01003+I13521）
质粒小提pSB1C3
菌液PCR用于酶切（J04500+K117000）+B0015
双酶切pSB1C3、（J04500+K117000）+B0015

## Period 5 Biosafety

Aug 18-Sep 02
趋化性通路构建ＯＫ
Sweet gene 验证开幕
Death gene验证开幕
Conjugation验证开幕
HSP promoter验证开幕
2012/08/18
复苏groE+pET32a、pET32a各一瓶
接着重新转化R0084
复苏pSB1C3、（J01003+I13521）
2012/08/19
挑单菌落R0084
Sweet gene验证实验Version 1.0（第一天）
质粒小提pSB1C3
菌液PCR用于酶切 （J01003+I13521）
双酶切pSB1C3、（J01003+I13521）
2012/08/20
菌液PCR验证R0084，送测序
Sweet gene验证实验Version 1.0（第二天）
含RP4质粒的HB101菌株寄到，复苏
0820酶切回收
酶接pSB1C3+（J01003+I13521）
复苏（J04500+K117000+B0015）
2012/08/21
保种HB101、R0084
Death gene验证实验version 1.0（第一天）
转化pSB1C3+（J01003+I13521）
复苏B0034、R0084
2012/08/22
菌液PCR用于酶切R0084
质粒小提B0034
挑单菌落pSB1C3+（J01003+I13521）
Death gene验证实验version 1.0（第二天）
双酶切R0084、B0034
转化E0240
2012/08/23
0822酶切回收
菌液PCR验证pSB1C3+（J01003+I13521）
保种pSB1C3+（J01003+I13521）
质粒小提pSB1C3+（J01003+I13521）
酶接R0084+B0034
挑单菌落E0240
Promoter合成完成，复苏菌种
2012/08/24
酶接纯化，转化R0084+B0034
菌液PCR验证E0240
保种E0240
质粒小提E0240、HSP Promoter
双酶切E0240、HSP Promoter
复苏pSB1C3+（J01003+I13521）（BL21）、HB101、DH5α菌株
2012/08/25
0824酶切回收
挑单菌落R0084+B0034
Conjugation验证实验version 1.0（第一天）
酶接HSP promoter+E0240
复苏pSB1C3
2012/08/26
菌液PCR验证R0084+B0034
菌液PCR验证构建质粒是否成功
（所挑五个单克隆中，只有中间一个加上了目的片段）
保种R0084+B0034
菌液PCR用于酶切R0084+B0034（E& P）、cheZ（E&P）、cheZ（X&P）
从基因组钓取的cheZ基因
（第一泳道为D15000 Marker，第三至第八泳道为cheZ基因）
质粒小提pSB1C3（E&P）、R0084+B0034（S&P）
Conjugation验证实验version 1.0（第二天）
酶接回收
转化HSP promoter+E0240
双酶切R0084+B0034（E& P）、cheZ（E&P）、cheZ（X&P）、pSB1C3（E&P）、R0084+B0034（S&P）
2012/08/27
0826酶切回收
酶接pSB1C3+（R0084+B0034）、pSB1C3+cheZ、（R0084+B0034）+ cheZ
挑单菌落HSP promoter+E0240
复苏pSB1C3、HSP promoter
2012/08/28
0827酶接回收
酶接转化pSB1C3+（R0084+B0034）、pSB1C3+cheZ、（R0084+B0034）+ cheZ
转化cheZ
菌液PCR验证HSP promoter+E0240
菌液PCR验证
（从Marker左数第二个为构建好的目的载体，左数第一个可能没有加上目的片段HSP promoter）
保种HSP promoter+E0240
质粒小提pSB1C3、HSP promoter
双酶切pSB1C3（E&P）、HSP promoter（E&P）
复苏pSB1C3+（J01003+I13521）（BL21）、HB101、DH5α菌株
2012/08/29
0828酶切回收pSB1C3（E&P）、HSP promoter（E&P）
挑单菌落pSB1C3+（R0084+B0034）、pSB1C3+cheZ、（R0084+B0034）+ cheZ
酶接pSB1C3+HSP promoter
Conjugation验证实验version 2.0（第一天）
复苏B0015
2012/08/29
0828酶接回收
转化pSB1C3+HSP promoter
菌液PCR验证pSB1C3+（R0084+B0034）、pSB1C3+cheZ、（R0084+B0034）+ cheZ
保种pSB1C3+（R0084+B0034）、pSB1C3+cheZ、（R0084+B0034）+ cheZ
菌液PCR用于酶切（R0084+B0034）+ cheZ
质粒小提B0015、pSB1C3+（R0084+B0034）、pSB1C3+cheZ
双酶切（R0084+B0034）+ cheZ（E&S）、B0015(E&X)
Conjugation验证实验version 2.0（第二天）
2012/08/30
挑单菌落pSB1C3+HSP promoter
酶切回收（R0084+B0034）+ cheZ（E&S）、B0015(E&X)
酶接（R0084+B0034+ cheZ）+B0015
2012/08/31
菌液PCR验证pSB1C3+HSP promoter
保种pSB1C3+HSP promoter
质粒小提pSB1C3+HSP promoter
酶接纯化（R0084+B0034+ cheZ）+B0015
转化（R0084+B0034+ cheZ）+B0015
复苏HSP promoter+E0240
2012/09/01
HSP promoter验证实验version 1.0（第一天）
挑单菌落（R0084+B0034+ cheZ）+B0015
复苏（J04500+K117000+B0015）
2012/09/02
菌液PCR验证（R0084+B0034+ cheZ）+B0015
保种（R0084+B0034+ cheZ+B0015）
HSP promoter验证实验version 1.0（第二天）
复苏pSB1C3+（J01003+I13521）、K117010、（HSP promoter+E0240）、pSB1C3
转化R0040

## Period 6 Biosafety

Sep 03-Sep 22
验证实验升级中~~
尝试构建终极通路：
准备标准组件
2012/09/03
Death gene验证实验version 2.0（第一天）
质粒小提pSB1C3+（J01003+I13521）、pSB1C3
菌液PCR用于酶切K117010、（HSP promoter+E0240）
双酶切pSB1C3+（J01003+I13521）（S&P）、K117010（X&P）、pSB1C3（E&P）、（HSP promoter+E0240）（E&P）
挑单菌落R0040
2012/09/04
0903酶切回收
酶接pSB1C3+（J01003+I13521）+K117010、pSB1C3+（HSP promoter+E0240）
Death gene验证实验version 2.0（第二天）
复苏B0015
菌液PCR验证R0040
保种R0040
2012/09/05
酶接纯化
转化pSB1C3+（J01003+I13521）+K117010、pSB1C3+（HSP promoter+E0240）
菌液PCR用于酶切groE
质粒小提B0015
双酶切groE（E&S）、B0015（E&X）
2012/09/06
挑单菌落pSB1C3+（J01003+I13521）+K117010、pSB1C3+（HSP promoter+E0240）
酶切回收groE（E&S）、B0015（E&X）
酶接groE+B0015
复苏B0034、R0040
2012/09/07
酶接纯化groE+B0015
转化groE+B0015
菌液PCR验证pSB1C3+（J01003+I13521）+K117010、pSB1C3+（HSP promoter+E0240）
保种pSB1C3+（J01003+I13521）+K117010、pSB1C3+（HSP promoter+E0240）
质粒小提B0034、pSB1C3+（J01003+I13521）+K117010、pSB1C3+（HSP promoter+E0240）
菌液PCR用于酶切R0040
双酶切R0040（E&S）、B0034（E&X）
复苏pSB1C3+（R0084+B0034）
2012/09/08
挑单菌落groE+B0015
酶切回收R0040（E&S）、B0034（E&X）
酶接R0040+B0034
质粒小提pSB1C3+（HSP promoter+E0240）
菌液PCR用于酶切pSB1C3+（R0084+B0034）
双酶切pSB1C3+（HSP promoter+E0240）（S&P）、pSB1C3+（R0084+B0034）（X&P）
2012/09/09
酶接纯化
转化R0040+B0034
酶切回收pSB1C3+（HSP promoter+E0240）（S&P）、pSB1C3+（R0084+B0034）（X&P）
酶接pSB1C3+（HSP promoter+E0240）+（R0084+B0034）
菌液PCR验证groE+B0015
保种（groE+B0015）
复苏J04500
2012/09/10
挑单菌落R0040+B0034
酶接纯化pSB1C3+（HSP promoter+E0240）+（R0084+B0034）
转化pSB1C3+（HSP promoter+E0240）+（R0084+B0034）
质粒小提（groE+B0015）
双酶切（groE+B0015）（E&X）
复苏B0015、pSB1C3
2012/09/11
菌液PCR验证R0040+B0034
保种（R0040+B0034）
酶切回收（groE+B0015）（E&X）
菌液PCR用于酶切(R0040+B0034)、groES
质粒小提B0015、pSB1C3
双酶切（R0040+B0034）（E&P）、groES（E&P）、pSB1C3（E&P）、groES（E&S）、B0015（E&X）
挑单菌落pSB1C3+（HSP promoter+E0240）+（R0084+B0034）
2012/09/12
菌液PCR验证pSB1C3+（HSP promoter+E0240）+（R0084+B0034）
保种pSB1C3+（HSP promoter+E0240）+（R0084+B0034）
质粒小提pSB1C3+（HSP promoter+E0240）+（R0084+B0034）
酶切回收（R0040+B0034）（E&S）、（R0040+B0034）（E&S）、groES（E&P）、pSB1C3（E&P）、groES（E&S）、B0015（E&X）
酶接pSB1C3+（R0040+B0034）、groES+pSB1C3、groES+B0015、（R0040+B0034）+（groE+B0015）
复苏pSB1C3
2012/09/13
酶接纯化pSB1C3+（R0040+B0034）、groES+pSB1C3、groES+B0015、（R0040+B0034）+（groE+B0015）
转化pSB1C3+（R0040+B0034）、groES+pSB1C3、groES+B0015、（R0040+B0034）+（groE+B0015）
质粒小提pSB1C3
质粒PCR用于酶切groES+B0015
双酶切pSB1C3（E&P）、groES+B0015（E&P）
2012/09/14
挑单菌落pSB1C3+（R0040+B0034）、groES+pSB1C3、groES+B0015、（R0040+B0034）+（groE+B0015）
酶切回收pSB1C3（E&P）、groES+B0015（E&P）
酶接pSB1C3+（groES+B0015）
2012/09/15
酶接纯化pSB1C3+（groES+B0015）
转化pSB1C3+（groES+B0015）
菌液PCR验证pSB1C3+（R0040+B0034）、groES+pSB1C3、groES+B0015、（R0040+B0034）+（groE+B0015）
保种（pSB1C3+R0040+B0034）、（groES+pSB1C3）、（groES+B0015）、（R0040+B0034+groE+B0015）
质粒小提（pSB1C3+R0040+B0034）、（groES+pSB1C3）
2012/09/16
挑单菌落pSB1C3+（groES+B0015）
菌液PCR验证pSB1C3+（groES+B0015）
保种pSB1C3+（groES+B0015）
质粒小提pSB1C3+（groES+B0015）
寄出所构建的标准组件
2012/09/17
休息
2012/09/18
休息
2012/09/19
复苏验证实验所需菌种
2012/09/20
Death gene 验证实验 version 3.0 （第一天）
HSP promoter验证实验 version 2.0 （第一天）
Conjugation 验证实验 version 3.0 （第一天）
Sweet gene 验证实验 version 1.0 （第一天）
2012/09/21
Death gene 验证实验 version 3.0 （第二天）
HSP promoter验证实验 version 2.0 （第二天）
Conjugation 验证实验 version 3.0 （第二天）
Sweet gene 验证实验 version 1.0 （第二天）
2012/09/22
Death gene 验证实验 version 3.0 （第三天）
Conjugation 验证实验 version 3.0 （第三天）

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