Clinical trial NCT04431960
Conditions: Postmenopausal Osteoporosis Gut Microbiota Cardiovascular Diseases
Keywords: blackcurrant gut microbiome osteoporosis menopause bone aging women cardiovascular disease
Sponsor: University of Connecticut
Start date: 2021-07-20; Completion date: 2022-10-03
Enrollment: 51 participants; Allocation: RANDOMIZED; Intervention model: PARALLEL

Brief summary:
Aim to evaluate the effects of blackcurrant supplementation on changes in gut microbiome, bone mass, and CVD risk factors in adult women.

Detailed description:
Postmenopausal bone loss is a primary contributor to osteoporosis and osteoporotic fractures in adult women in menopause transition. By following women over this period, studies have documented distinct patterns of a decrease in estrogen, a natural antioxidant, simultaneously with adverse alterations in body fat distribution, lipids and lipoproteins, and measures of vascular health, which can increase a woman's risk of developing CVD. Overall goal of this project is to evaluate the effects of blackcurrant (BC) supplementation on changes in gut microbiome, bone mass, and CVD risk factors in adult women. For this purpose, the investigators will conduct a pilot randomized placebo-controlled clinical trial with BC supplementation for 6 months in peri- and early postmenopausal women aged 45-60 years.

The primary endpoint will be whole-body bone mineral density (BMD); secondary endpoints will be gut microbiota composition. To delineate the underlying mechanisms of the action, changes in biomarkers for bone metabolism, bone-related immune and endocrine systemic biomarkers, and CVD risk factors by BC supplementation will be measured in plasma and peripheral blood derived mononuclear cells.

The specific objectives of the study are to investigate the effects of BC extract on: 1) bone mass and bone remodeling markers; 2) changes in the gut microbiota abundance and composition, immune and endocrine biomarkers, and CVD risk factors and their relationships with changes in bone mass.

The proposed study will provide novel insight into whether and how BC consumption reduces the risk of postmenopausal bone loss and CVD in adult women and will improve understanding of the clinical roles of gut microbiome in postmenopausal bone loss. Findings from this study will help increase awareness of the bone and heart health promoting effect of BC and motivate increased production of BC and other berry products in response to the increasing consumer demand.

Arms: arm 1: consume: 1) one tablet containing 392 mg blackcurrant (BC) extract per capsule and 2) one calcium citrate caplet containing 400 mg calcium and 500 IU vitamin D arm 2: consume: 1) two capsules containing 392 mg BC extract per tablet (total 784 mg/day) and 2) one calcium citrate caplet containing 400 mg calcium and 500 IU vitamin D arm 3: consume: 1) one placebo capsule and 2) one calcium citrate caplet containing 400 mg calcium and 500 IU vitamin D
Interventions: intervention 1: blackcurrant (BC) extract
Intervention descriptions: intervention 1: A calcium citrate caplet (Bayer AG, Germany) will be taken by all 3 groups to avoid bone deterioration related to calcium and vitamin D deficiency

Protocol documents:
Prot_SAP_000.pdf: 
 
 
Study Protocol Title:  
Blackcurrant Modifies Gut Microbiota and Reduces the 
Risk of Postmenopausal Osteoporosis and Cardiovascular 
Disease: A Pilot Randomized Clinical Trial 
 
 
 
NCT number: NCT04431960 
 
Document data: September 29, 2023 
 


Study Protocol and Statistical Analysis Plan 
 
1. Purpose/Introduction:   
This study aimed to evaluate the dose‐dependent effects of blackcurrant supplemen‐tation 
on bone density in adult women and its relationship to bone metabolism. The fea‐sibility of 
the pilot clinical study was also assessed. For this purpose, we conducted a pilot double‐
blind, randomized, placebo‐controlled clinical study with blackcurrant supple‐mentation 
for six months in peri‐ and early postmenopausal women aged 45–60. The primary endpoint 
was whole‐body BMD. In addition, to delineate the underlying mecha‐nisms of the action, 
changes  in  serum  markers  of  bone  metabolism  following  blackcurrant  supplementation 
were also assessed. 
 
2. Materials and Methods 
2.1. Study Participants 
Forty  peri‐  and  postmenopausal women aged 45–60 were initially recruited from 
northeastern  Connecticut  through  newspaper  advertisements,  flyers,  and  email.  The 
inclusion criteria for this study were: (1) women aged 45–60 years old; (2) not on HRT for 
at least one year before the initiation of the study; (3) maintaining normal exercise level 
(<7 h/week) and willing to avoid exercise 24‐h prior to blood and stool sampling and 12‐
h prior to bone measurements; (4) willing to ingest a dietary blackcurrant supplement or 
placebo as well as 400 mg calcium and 500 IU vitamin D daily; (5) willing to avoid other 
dietary supplements for the duration of the study, (6) willing to avoid intake of foods 
extremely rich in anthocyanins and fermented dairy products, (7) willing to have 3 blood 
draws and 2 bone scans and (8) willing to take a urine pregnancy test before each bone 
scan. Exclusion criteria included: (1) those with metabolic bone disease, renal disease, 
cancer,  cardiovascular  disease,  diabetes  mellitus,  respiratory  disease,  gastrointestinal 
disease, liver disease, or other chronic diseases, (2) heavy smokers (>20 cigarettes/day), 
(3) perimenopausal women with any chance or plan of pregnancy, (4) taking prescription 
medications  known  to  alter  bone  and  Ca  metabolism;  (5)  taking  anabolic  agents;  (6) 
alcohol consumption exceeding 2 drinks/day. Subjects who met the recruitment criteria 
upon initial phone screening were immediately invited to the study laboratory at the 
University of Connecticut in Storrs, Storrs, CT, USA. 
2.2. Study Design 
Upon signing the consent form, an initial physical examination (body weight, height, 
waist  circumference,  and  blood  pressure)  was  conducted.  The  participants  were  also 
interviewed  about  their  medical  history  and  dietary  behaviors  by  study  personnel. 
Participants had a urine pregnancy test to confirm that they were not pregnant and thus 
eligible  for  the  bone  density  measurement  using  dual‐energy  X‐ray  absorptiometry 
(DXA).  All  eligible  participants  completed  an  additional  consent  form  for  the  DXA 


assessment and scheduled their bone mass measures on or within ± 3 days of study visit 
1 (month 0) and 3 (months 6) at the University of Connecticut Korey Stringer Institute 
Human  Performance  Laboratory.  Participants  were  asked  to  refrain  from  taking  the 
provided  calcium  supplements  the  day  before  the  exam  (24  h)  to  limit  potential 
interference with the DXA measurements.  
 
The participants were taught how to complete 3‐day food records (FR) and physical 
activity records and asked to complete them one week prior to each study visit at months 
0, 3, and 6. Subjects who were taking any dietary supplements that are known to affect 
bone metabolism were asked to stop taking them. After the initial screening visit, subjects 
underwent a 2‐week equilibration period, followed by a 6‐month clinical trial period. To 
avoid  potential  bone  deterioration  related  to  calcium  and  vitamin  D  deficiency,  all 
participants took a calcium citrate caplet daily that includes 400 mg calcium and 500 IU 
vitamin D (Bayer AG, Leverkusen, Germany) beginning 2 weeks before the study and 
lasting  for  the  duration  of  the  study.  After  the  2‐week  equilibration  period,  study 
participants  were  randomly  assigned  to  three  groups  and  asked  to  consume:  (1)  one 
capsule  containing  392  mg  of  blackcurrant  powder  (low  BC  group);  (2)  two  capsules 
containing 392 mg blackcurrant powder per capsule, total 784 mg of blackcurrant powder 
(high BC group); or (3) one placebo capsule (control group) daily for 6 months. Each 392 
mg  blackcurrant  extract  contained  176  mg  anthocyanins  (min.  40%  delphinidin‐3‐
rutinoside, 35% cyanidin‐3‐rutinoside, 10% delphinidin‐3‐glucoside and 7% cyanidin‐3‐
glucoside).  One  capsule  was  equivalent  to  about  142  fresh  blackcurrants.  The 
blackcurrant  powder  and  composition  information  was  provided  by  Just  the  Berries, 
New Zealand (Just the Berries PD Corporation, Los Angeles, CA, USA). The placebo was 


an identical‐looking capsule that contained rice powder (supplied by Beehive Botanicals 
Hayward, WI, USA). The extract and placebo were encapsulated in vegetarian capsules 
and packaged into coded containers for daily dosing to participants (Beehive Botanicals 
Hayward,  WI).  Distribution  of  the  supplements  was  performed  blindly  at  the  study 
center at month 0 (study visit 1: after the 2‐week equilibration period) and month 3 (study 
visit 2).  
Aside  from  the  exclusion  of  dietary  supplements,  foods  extremely  rich  in 
anthocyanins  (all  berries,  grapes,  red  wine,  and  berry  juices),  and  fermented  dairy 
products containing viable Bifidobacteria or Lactobacilli, all participants were instructed to 
keep their usual dietary habits for the duration of the study. Subjects provided a 12‐h 
fasting blood sample and stool specimen at each study visit at months 0, 3, and 6 for 
biochemical and metagenome sequencing analysis, and a physical examination (height, 
weight, waist circumference, blood pressure) was conducted at the initial visit (month 0), 
month 3, and the end of the treatment period (month 6). This clinical trial was registered 
at  ClinicalTrials.gov  (NCT04431960).  The  proposed  project  and  its  procedures  were 
reviewed  and  approved  by  the  University  of  Connecticut  Institutional  Review  Board 
(HR20‐0035) prior to the initiation of the project. 
2.3. Dietary Intake and Physical Activity Assessment 
During the trial, participants were asked to complete 3‐day FR and physical activity 
records at months 0, 3, and 6. The FR data were analyzed using the Nutrition Data System 
for  Research  (NDSR,  University  of  Minnesota  Nutrition  Coordinating  Center, 
Minneapolis, MN, USA). The 3‐d FR data included all foods and beverages consumed 
during two non‐consecutive weekdays plus a weekend day of the week following the test 
visits. The physical activity records were used to estimate the metabolic equivalent of task 
(MET)  scores  to  confirm  participants  maintained  normal  exercise  levels  (<7  h/week) 
during the entire intervention period and avoided exercise 24‐h prior to study visits. 
2.4. Bone Density Assessments 
BMD  analyses  were  conducted  at  the  University  of  Connecticut  Korey  Stringer 
Institute by a licensed radiologic technician at baseline and 6 months using DXA (GE 
Healthcare Lunar) equipped with appropriate software for whole‐body, head, arms, legs, 
trunk, ribs, spine, and pelvis BMD. Specific positioning and analysis guidelines were 
followed  according  to  the  operator’s  manual.  Calibration,  maintenance,  and  quality 
control  of  the  equipment  were  routinely  conducted  following  the  maintenance 
instructions in the manual.  
2.5. Blood Collection and Pretreatments 
Fasted blood samples were collected at months 0, 3, and 6. The blood samples (80 
mL)  from  subjects  who  fasted  for  12  h  were  used  to  determine  biomarkers  for  bone 
metabolism.  Whole  blood  samples  were  collected  in  serum  tubes  (BD  Vacutainer, 


Mississauga ON, Canada), centrifuged at 3500× g for 15 min at 4 °C, divided into aliquots, 
and stored at −80°C until analyzed.  
2.6. Measurements of Serum Biomarkers of Bone Metabolism 
Changes  in  the  amino‐terminal  propeptide  of  type  1  procollagen  (P1NP),  bone‐
specific  alkaline  phosphatase  (BALP),  osteocalcin  (OC),  carboxy‐terminal  crosslinked 
telopeptide of type 1 collagen (CTX1), and sclerostin at baseline, 3 months, and 6 months 
were measured in serum using commercially available ELISA kits.  
3. Statistical Analysis 
Data  are  reported  as  mean  ±  standard  deviation  (SD)  unless  specified  otherwise. 
Differences  with  two‐sided  p  <  0.05  were  considered  significant.  Data  were  analyzed 
using analysis of variance methods with PROC MIXED in SAS (Version 9.4, SAS Institute, 
Cary,  NC,  USA)  to  determine  the  main  and  interaction  effects  of  the  two  factors, 
treatment  (0,  392,  or  784  mg/day  blackcurrants),  and  time  (baseline,  3  months,  and  6 
months). The significance of differences in baseline characteristics was tested by ANOVA 
or Chi‐square/Fisher’s Exact test. The significance of changes in all outcome variables was 
tested  by  repeated‐measures  ANOVA  with  treatment  as  levels  of  between‐subjects 
factors and time as levels of within‐subjects factors. Percent changes in BMD and bone 
biomarkers between control and low BC groups and between control and high BC groups 
were evaluated using t‐tests.