text:
 IZVEDBENA UREDBA KOMISIJE (EU) .../...
 z dne 30.1.2018
 o spremembi Izvedbene uredbe Komisije (EU) 2016/1240 glede analitskih metod in ocenjevanja kakovosti mleka in mlečnih proizvodov, ki so upravičeni do javne intervencije in pomoči za zasebno skladiščenje
 EVROPSKA KOMISIJA JE –
 ob upoštevanju Pogodbe o delovanju Evropske unije,
 ob upoštevanju Uredbe (EU) št. 1306/2013 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 17. decembra 2013 o financiranju, upravljanju in spremljanju skupne kmetijske politike in razveljavitvi uredb Sveta (EGS) št. 352/78, (ES) št. 165/94, (ES) št. 2799/98, (ES) št. 814/2000, (ES) št. 1290/2005 in (ES) št. 485/2008
 1
 ter zlasti člena 62(2)(i) Uredbe,
 ob upoštevanju naslednjega:
 (1)Delegirana uredba Komisije (EU) 2016/1238
 2
 in Izvedbena uredba Komisije (EU) 2016/1240
 3
 določata pravila o javni intervenciji in pomoči za zasebno skladiščenje. Uredba Komisije (ES) št. 273/2008
 4
 določa metode, ki naj se uporabljajo pri oceni, ali so mleko in mlečni proizvodi v skladu z zahtevami glede upravičenosti do javne intervencije in pomoči za zasebno skladiščenje, določenimi v navedenih uredbah.
 (2)Zaradi tehničnega razvoja na področju metodologije, uporabljene pri analizi in ocenjevanju kakovosti mleka in mlečnih proizvodov, bi bile potrebne spremembe, da se poenostavijo in posodobijo sklicevanja na standarde ISO. Za večjo jasnost in učinkovitost ter ob upoštevanju obsega in tehnične narave sprememb določb Uredbe (ES) št. 273/2008 bi bilo treba ustrezne določbe navedene uredbe vključiti v Izvedbeno uredbo (EU) 2016/1240.
 (3)Da bi zagotovili poenoteno izpolnjevanje novih standardov in metod v državah članicah, bi morali imeti laboratoriji na voljo dovolj časa za pregled postopkov in uporabo posodobljenih metod.
 (4)Izvedbeno uredbo (EU) 2016/1240 bi bilo zato treba ustrezno spremeniti.
 (5)Zaradi pravne jasnosti bi bilo treba Uredbo (ES) št. 273/2008 razveljaviti.
 (6)Ukrepi iz te uredbe so v skladu z mnenjem Odbora za skupno ureditev kmetijskih trgov –
 SPREJELA NASLEDNJO UREDBO:
 Člen 1
 Izvedbena uredba (EU) 2016/1240 se spremeni:
 (1)člen 4 se spremeni:
 (a)odstavek 1 se spremeni:
 (i) točka (d) se nadomesti z naslednjim:
 „za maslo: v delih I in Ia Priloge IV k tej uredbi“;
 (ii) točka (e) se nadomesti z naslednjim:
 „za posneto mleko v prahu: v delih I in Ia Priloge V k tej uredbi“;
 (b)odstavek 2 se nadomesti z naslednjim:
 „2. Metode, ki se uporabljajo za določitev kakovosti žita, masla in posnetega mleka v prahu, ki so upravičeni do javne intervencije iz prilog I, IV oziroma V, so določene v najnovejših različicah ustreznih evropskih ali mednarodnih standardov, kakor je ustrezno, v veljavi vsaj 6 mesecev pred prvim dnem obdobja javne intervencije, kakor je opredeljeno v členu 12 Uredbe (EU) št. 1308/2013.“;
 (2)vstavi se naslednji člen 60a:
 „Člen 60a
 Posebne določbe o pregledih v zvezi z javno intervencijo in pomočjo za zasebno skladiščenje za mleko in mlečne proizvode
 1. Upravičenost masla, posnetega mleka v prahu in sira do pomoči za zasebno skladiščenje se določi v skladu z metodami iz prilog VI, VII oziroma VIII.
 Navedene metode se določijo s sklicevanjem na najnovejše različice ustreznih evropskih ali mednarodnih standardov, kakor je ustrezno, v veljavi vsaj 6 mesecev pred prvim dnem obdobja javne intervencije, kakor je opredeljeno v členu 12 Uredbe (EU) št. 1308/2013.
 2. Rezultati pregledov, opravljenih z uporabo metod iz te uredbe, se ocenijo v skladu s Prilogo IX.“
 (3)Priloge se spremenijo v skladu s Prilogo k tej uredbi.
 Člen 2
 Uredba Komisije (ES) št. 273/2008 se razveljavi.
 Člen 3
 Ta uredba začne veljati sedmi dan po objavi v Uradnem listu Evropske unije.
 Ta uredba je v celoti zavezujoča in se neposredno uporablja v vseh državah članicah.
 V Bruslju, 30.1.2018
 Za Komisijo
 Predsednik
 Jean-Claude JUNCKER
 (1)
 UL L 347, 20.12.2013, str. 549.
 (2)
 Delegirana uredba Komisije (EU) 2016/1238 z dne 18. maja 2016 o dopolnitvi Uredbe (EU) št. 1308/2013 Evropskega parlamenta in Sveta glede javne intervencije in pomoči za zasebno skladiščenje (UL L 206, 30.7.2016, str. 15).
 (3)
 Izvedbena uredba Komisije (EU) 2016/1240 z dne 18. maja 2016 o pravilih za uporabo Uredbe (EU) št. 1308/2013 Evropskega parlamenta in Sveta glede javne intervencije in pomoči za zasebno skladiščenje (UL L 206, 30.7.2016, str. 71).
 (4)
 Uredba Komisije (ES) št. 273/2008 z dne 5. marca 2008 o določitvi podrobnih pravil za izvajanje Uredbe Sveta (ES) št. 1255/1999 o analitskih metodah in ocenjevanju kakovosti mleka in mlečnih proizvodov (UL L 88, 29.3.2008, str. 1).
 ---documentbreak---
 SL
 PRILOGA
 Priloge k Izvedbeni uredbi (EU) 2016/1240 se spremenijo:
 (1) Priloga IV se spremeni:
 (a) v delu I se drugi pododstavek točke 2 nadomesti z naslednjim:
 „Vsak vzorec je treba oceniti posebej. Ponovno vzorčenje ali ponovno ocenjevanje ni dovoljeno.“;
 (b) vstavi se naslednji del Ia:
 „Del Ia
 Metode za analizo nesoljenega masla za javno intervencijo
 Parameter
 Metoda
 Maščoba
 1
 ISO 17189 ali ISO 3727, del 3
 Voda
 ISO 3727, del 1
 Nemastna trdna snov
 ISO 3727, del 2
 Kislost maščobe
 ISO 1740
 Peroksidno število
 ISO 3976
 Nemlečna maščoba
 ISO 17678
 Senzorične lastnosti
 ISO 22935, del 2 in 3 ter tabela za ocenjevanje v nadaljevanju
 Tabela za ocenjevanje
 Videz
 Konsistentnost
 Vonj in okus
 Točke
 Opombe
 Točke
 Opombe
 Točke
 Opombe
 5
 Zelo dober
 Odličen vzorec
 Najvišja kakovost
 (enakomerno suho)
 5
 Zelo dobra
 Odličen vzorec
 Najvišja kakovost
 (enakomerno mazavo)
 5
 Zelo dobra
 Odličen vzorec
 Najvišja kakovost
 (popolnoma čist fin vonj)
 4
 Dober
 (brez očitnih pomanjkljivosti)
 4
 Dobra
 (brez očitnih pomanjkljivosti)
 4
 Dobra
 (brez očitnih pomanjkljivosti)
 1, 2 ali 3
 Kakršna koli pomanjkljivost
 1, 2 ali 3
 Kakršna koli pomanjkljivost
 1, 2 ali 3
 Kakršna koli pomanjkljivost
 “
 (2) v Prilogi V se vstavi naslednji del Ia:
 „Del Ia
 Metode za analizo posnetega mleka v prahu za javno intervencijo
 Parameter
 Metoda
 Beljakovine
 ISO 8968, del 1
 Maščoba
 ISO 1736
 Voda
 ISO 5537
 Kislost
 ISO 6091
 Laktati
 ISO 8069
 Preskus na fosfatazo
 ISO 11816, del 1
 Indeks netopnosti
 ISO 8156
 Sežgani delci
 2
 ADPI
 Mikroorganizmi
 ISO 4833, del 1
 Pinjenec
 Dodatek I
 Sladka sirotka
 3
 Dodatka II in III
 Kisla sirotka
 4
 ISO 8069 ali pregledi na kraju samem
 Senzorični pregledi
 5
 ISO 22935, del 2 in 3
 Dodatek I
 POSNETO MLEKO V PRAHU: KOLIČINSKO DOLOČANJE FOSFATIDILSERINA IN FOSFATIDILETANOLAMINA
 Metoda: HPLC na reverzni fazi
 1.NAMEN IN PODROČJE UPORABE
 Metoda navaja postopek za količinsko določanje fosfatidilserina (PS) in fosfatidiletanolamina (PE) v posnetem mleku v prahu in je primerna za zaznavanje trdnih snovi pinjenca v posnetem mleku v prahu.
 2.OPREDELITEV
 Vsebnost PS + PE: masni delež snovi, določen s tukaj opisanim postopkom. Rezultat se izrazi v miligramih fosfatidiletanolamina dipalmitola (PEDP) na 100 g prahu.
 3.PRINCIP METODE
 Ekstrakcija aminofosfolipidov iz rekonstruiranega mleka v prahu z uporabo metanola. Določitev PS in PE kot derivatov o-ftaldialdehida (OPA) s HPLC na reverzni fazi (RP) in fluorescenčno detekcijo. Količinska opredelitev vsebnosti PS in PE v preskusnem vzorcu glede na standardni vzorec, ki vsebuje znano količino PEDP.
 4.REAGENTI
 Vsi reagenti dosegajo priznano analitsko čistost. Uporabljena voda je destilirana voda ali voda vsaj enakovredne čistosti, če ni navedeno drugače.
 4.1
 Standardni material: PEDP s čistostjo najmanj 99 %
 Opomba: Standardni material se hrani pri –18 °C.
 4.2
 Reagenti za pripravo standardnega in preskusnega vzorca
 4.2.1
 Metanol, HPLC-čistost
 4.2.2
 Kloroform, HPLC-čistost
 4.2.3
 Triptamin-monohidroklorid
 4.3
 Reagenti za o-ftalaldehidno derivatizacijo
 4.3.1
 Natrijev hidroksid, 12 M vodna raztopina
 4.3.2
 Borova kislina, 0,4 M vodna raztopina, uravnana na pH 10,0 z natrijevim hidroksidom (4.3.1)
 4.3.3
 2-merkaptoetanol
 4.3.4
 o-ftalaldehid (OPA)
 4.4
 Reagenti za HPLC (eluenti)
 4.4.1
 Eluente je treba pripraviti z uporabo reagentov HPLC-čistost.
 4.4.2
 Voda, HPLC-čistost
 4.4.3
 Metanol, čistost za fluorimetrijo
 4.4.4
 Tetrahidrofuran
 4.4.5
 Natrijev dihidrogen fosfat
 4.4.6
 Natrijev acetat
 4.4.7
 Ocetna kislina
 5.OPREMA
 5.1
 Analitska tehtnica, ki lahko tehta na 1 mg natančno, s čitljivostjo 0,1 mg
 5.2
 Čaše s prostornino 25 in 100 ml
 5.3
 Pipete, ki lahko prepuščajo 1 ml in 10 ml
 5.4
 Magnetni mešalnik
 5.5
 Polnilne pipete, ki lahko prepuščajo 0,2, 0,5 in 5 ml
 5.6
 Merilne bučke s prostornino 10, 50 in 100 ml
 5.7
 Brizgalke s prostornino 20 in 100 μl
 5.8
 Ultrazvočna kopel
 5.9
 Centrifuga, delujoča pri 27 000 × g
 5.10
 Reakcijske stekleničke s prostornino približno 5 ml
 5.11
 Merilni valj s prostornino 25 ml
 5.12
 pH-meter z natančnostjo do 0,1 pH-enot
 5.13
 HPLC-oprema
 5.13.1
 Gradientni sistem črpalk z možnostjo delovanja pri pretoku 1,0 ml/min pri 200 barih
 5.13.2
 Avtomatski vzorčevalnik z možnostjo izvajanja derivatizacije
 5.13.3
 Grelnik kolone, ki lahko temperaturo ohranja na 30 °C ± 1 °C
 5.13.4
 Fluorescenčni detektor z valovno dolžino vzbujanja 330 nm in valovno dolžino emisije 440 nm
 5.13.5
 Integrator ali programska oprema za obdelavo podatkov, ki lahko meri površino vrha
 5.13.6
 Kolona LiChrospher ® – 100 (250 × 4,6 mm) ali enakovredna kolona, polnjena z oktadecilsilanom (C 18), velikost delcev 5 μm
 6.VZORČENJE
 Vzorčenje mora biti izvedeno v skladu s standardom ISO 707.
 7.POSTOPEK
 7.1
 Priprava raztopine internega standarda
 7.1.1
 Natehtajte 30,0 ± 0,1 mg triptamin-monohidroklorida (4.2.3) v 100-mililitrsko merilno bučko (5.6) in dopolnite do oznake z metanolom (4.2.1).
 7.1.2
 Odpipetirajte 1 ml (5.3) te raztopine v 10-mililitrsko merilno bučko (5.6) in dopolnite do oznake z metanolom (4.2.1), da dobite raztopino s koncentracijo 0,15 mM triptamina.
 7.2
 Priprava raztopine preskusnega vzorca
 7.2.1
 Odtehtajte 1,000 ± 0,001 g vzorca posnetega mleka v prahu v 25-mililitrsko čašo (5.2). S pipeto (5.3) dodajte 10 ml destilirane vode pri 40 °C ± 1 °C in mešajte 30 minut z magnetnim mešalnikom (5.4), da raztopite morebitne grudice.
 7.2.2
 Odpipetirajte 0,2 ml (5.5) rekonstruiranega vzorca mleka v 10-mililitrsko merilno bučko (5.6), dodajte 100 μl 0,15 mM raztopine triptamina (7.1) z brizgalko (5.7) in dopolnite do oznake z metanolom (4.2.1). Previdno zmešajte z obračanjem bučke in postavite v ultrazvočno kopel (5.8) za 15 min.
 7.2.3
 Centrifugirajte (5.9) 10 minut pri 27 000 × g in zberite bistro tekočino v stekleno vialo (5.10).
 Opomba: Raztopino preskusnega vzorca je treba do HPLC-analize hraniti pri 4 °C.
 7.3
 Priprava raztopine eksternega standarda
 7.3.1
 Odtehtajte 55,4 mg PEDP (4.1) v 50-mililitrsko merilno bučko (5.6) in dodajte z merilnim valjem (5.11) približno 25 ml kloroforma (4.2.2). Zaprto bučko segrejte do 50 °C ± 1 °C in previdno premešajte, da se PEDP raztopi. Ohladite bučko na 20 °C in dopolnite do oznake z metanolom (4.2.1) ter zmešajte z obračanjem.
 7.3.2
 Odpipetirajte 1 ml (5.3) te raztopine v 100-mililitrsko merilno bučko (5.6) in dopolnite do oznake z metanolom (4.2.1). Odpipetirajte 1 ml (5.3) te raztopine v 10-mililitrsko merilno bučko (5.6), dodajte 100 μl (5.7) 0,15 mM raztopine triptamina (7.1) in dopolnite do oznake z metanolom (4.2.1). Zmešajte z obračanjem bučke.
 Opomba: Raztopino referenčnega vzorca je treba do HPLC-analize hraniti pri 4 °C.
 7.4
 Priprava reagenta za derivatizacijo
 Odtehtajte 25,0 ± 0,1 mg OPA (4.3.4) v 10-mililitrsko merilno bučko (5.6), dodajte 0,5 ml (5.5) metanola (4.2.1) in previdno premešajte, da se OPA raztopi. Dopolnite do oznake z raztopino borove kisline (4.3.2) in dodajte z brizgalko (5.7) 20 μl 2-merkaptoetanola (4.3.3).
 Opomba: Reagent za derivatizacijo je treba hraniti v temni viali pri 4 °C in je stabilen en teden.
 7.5
 HPLC-določitev
 7.5.1
 Topila (eluenti) (4.4)
 Topilo A: 0,3 mM raztopina natrijevega dihidrogen fosfata in 3 mM natrijevega acetata (pH uravnan na 6,5 ± 0,1 z ocetno kislino): metanol: tetrahidrofuran = 558:440:2 (v/v/v)
 Topilo B: metanol
 7.5.2
 Predlagani elucijski gradient
 Čas (min)
 Topilo A (%)
 Topilo B (%)
 Pretok (ml/min)
 Začetek
 40
 60
 0
 0,1
 40
 60
 0,1
 5,0
 40
 60
 0,1
 6,0
 40
 60
 1,0
 6,5
 40
 60
 1,0
 9,0
 36
 64
 1,0
 10,0
 20
 80
 1,0
 11,5
 16
 84
 1,0
 12,0
 16
 84
 1,0
 16,0
 10
 90
 1,0
 19,0
 0
 100
 1,0
 20,0
 0
 100
 1,0
 21,0
 40
 60
 1,0
 29,0
 40
 60
 1,0
 30,0
 40
 60
 0
 Opomba: Elucijski gradient je morda treba rahlo spremeniti, da bi dobili ločljivost, kakor je prikazana na sliki 1.
 Temperatura kolone: 30 °C.
 7.5.3
 Prostornina vbrizganja: 50 μl reagenta za derivatizacijo in 50 μl raztopine vzorca
 7.5.4
 Vzpostavitev ravnotežja v koloni
 Če se sistem začne dnevno, se kolona spira 15 minut s 100-odstotnim topilom B, potem nastavi A:B = 40:60 in 15 minut vzpostavlja ravnotežje pri pretoku 1 ml/min. Slepa določitev se izvede z vbrizganjem metanola (4.2.1).
 Opomba: Pred daljšim hranjenjem je treba kolono spirati 30 minut z mešanico metanol: kloroform = 80:20 (v/v).
 7.5.5
 Določitev vsebnosti PS + PE v preskusnem vzorcu
 7.5.6
 Izvedite zaporedje kromatografskih analiz s konstantnim časom med dvema analizama, da s tem zagotovite konstanten retenzijski čas. Vsakih 5–10 preskusnih vzorcev vbrizgajte raztopino eksternega standarda (7.3) za ovrednotenje odzivnega faktorja
 Opomba: Na vsakih 20–25 analiz se kolona očisti, tako da se najmanj 30 minut spira s 100-odstotnim topilom B (7.5.1).
 7.6
 Način integracije
 7.6.1
 Vrh PEDP
 Vrh PEDP se pojavi samostojno. Njegova površina se določi z integracijo dolina–dolina.
 7.6.2
 Vrh triptamina
 Vrh triptamina se pojavi samostojno (slika 1). Njegova površina se določi z integracijo dolina–dolina.
 7.6.3
 Skupine vrhov PS in PE
 Pri opisanih pogojih (slika 1) se PS eluira v obliki dveh delno neločenih vrhov, pred katerima je še en manjši vrh. PE se eluira v obliki treh glavnih delno neločenih vrhov. Površina vsake skupine vrhov se določi z nastavitvijo bazne linije, kakor je prikazano na sliki 1.
 8.IZRAČUN IN IRAŽANJE REZULTATOV
 Vsebnost PS in PE v preskusnem vzorcu se izračuna, kakor sledi: C = 55,36 × ((A2)/(A1)) × ((T1)/(T2))
 kjer je:
 C = vsebnost PS ali PE (v mg/100 g prahu) v preskusnem vzorcu
 A 1 = površina vrha PEDP raztopine standardnega vzorca (7.3)
 A 2 = površina vrha PS ali PE raztopine preskusnega vzorca (7.2)
 T 1 = površina vrha triptamina v raztopini standardnega vzorca (7.3)
 T 2 = površina vrha triptamina v raztopini preskusnega vzorca (7.2)
 9.TOČNOST METODE
 Opomba: Vrednosti za ponovljivost so bile izračunane v skladu z mednarodnim standardom IDF
 6
 .
 9.1
 Ponovljivost
 Relativni standardni odmik ponovljivosti, izražajoč variabilnost neodvisnih analitskih rezultatov, ki jih dobi isti analitik z isto opremo pri enakih pogojih na istem preskusnem vzorcu v kratkem časovnem intervalu, ne sme presegati vrednosti 2 % relativno. Če sta dve določitvi pridobljeni pri teh pogojih, relativna razlika med dvema rezultatoma ne sme biti večja od 6 % aritmetične sredine teh rezultatov.
 9.2
 Obnovljivost
 Če sta dve določitvi pridobljeni v različnih laboratorijih z različno opremo pri različnih pogojih analize na enakem preskusnem vzorcu, relativna razlika med dvema rezultatoma ne sme biti večja od 11 % aritmetične sredine teh rezultatov.
 10.VIRI
 10.1
 Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M., „Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids.“ Sci. Tech. Latt.-Cas., 39, 395(1988).
 Slika 1
 HPLC vzorec derivatov o-ftaldialdehida (OPA), fosfatidilserina (PS) in fosfatidiletanolamina (PE) v ekstraktu metanola rekonstruiranega posnetega mleka v prahu. Prikazan je način integracije vrhov PS, PE in triptamina (interni standard)
 Fluorescenca (poljubne enote)
 Dodatek II
 ZAZNAVANJE SLADKE SIROTKE V POSNETEM MLEKU V PRAHU ZA JAVNO SKLADIŠČENJE Z DOLOČITVIJO MAKROPEPTIDOV KAZEINA S TEKOČINSKO KROMATOGRAFIJO VISOKE ZMOGLJIVOSTI (HPLC)
 1.NAMEN IN PODROČJE UPORABE
 Ta metoda omogoča zaznavanje sladke sirotke v posnetem mleku v prahu, ki je namenjeno javnemu skladiščenju, z ugotavljanjem makropeptidov kazeina.
 2.SKLIC
 Mednarodni standard ISO 707 – Mleko in mlečni proizvodi – Smernice o vzorčenju
 3.OPREDELITEV
 Vsebnost trdnih snovi sladke sirotke je opredeljena kot masni odstotek, ki se določi z vsebnostjo makropeptidov kazeina v skladu z opisanim postopkom.
 4.PRINCIP
 –Rekonstitucija posnetega mleka v prahu, odstranitev maščob in beljakovin s trikloroocetno kislino, ki ji sledi centrifugacija ali filtracija.
 –Določitev količine makropeptidov kazeina (CMP) v supernatantu se izvede s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC).
 –Ocenjevanje rezultatov, dobljenih za vzorce, glede na standardne vzorce posnetega mleka v prahu z dodatkom znanega odstotka sirotke v prahu ali brez njega.
 5.REAGENTI
 Vsi reagenti dosegajo priznano analitsko čistost. Uporabljena voda je destilirana voda ali voda vsaj enakovredne čistosti.
 5.1
 Raztopina trikloroocetne kisline
 Raztopite 240 g trikloroocetne kisline (CCl3COOH) v vodi in dopolnite do prostornine 1 000 ml. Raztopina mora biti bistra in brezbarvna.
 5.2
 Raztopina eluenta, pH 6,0
 Raztopite 1,74 g dikalijevega hidrogen fosfata (K2HPO4), 12,37g kalijevega dihidrogen fosfata (KH2PO4) in 21,41 g natrijevega sulfata (Na2SO4) v približno 700 ml vode. Če je potrebno, uravnajte pH na vrednost 6,0 z uporabo raztopin fosforjeve kisline ali kalijevega hidroksida.
 Dopolnite z vodo do 1 000 ml in homogenizirajte.
 Opomba:
 Sestava eluenta se lahko posodobi tako, da ustreza spričevalu v skladu s standardi ali priporočili proizvajalca materiala za polnitev kolone.
 Raztopino eluenta pred uporabo filtrirajte skozi membranski filter s premerom por 0,45 μm.
 5.3
 Raztopina za izpiranje
 Zmešajte eno volumsko enoto acetonitrila (CH3CN) z devetimi volumskimi enotami vode. Pred uporabo filtrirajte zmes z membranskimi filtrom s premerom por 0,45 μm.
 Opomba:
 Uporabi se lahko katera koli druga raztopina za izpiranje z baktericidnim učinkom, ki ne poslabša ločljivosti kolone.
 5.4
 Standardni vzorci
 5.4.1
 Posneto mleko v prahu, ki ustreza zahtevam te uredbe (npr. [0])
 5.4.2
 Enako posneto mleko v prahu z dodatkom 5 % (m/m) sladke sirotke v prahu s standardno sestavo (tj. [5]).
 6.OPREMA
 6.1
 Analitska tehtnica
 6.2
 Neobvezna centrifuga, ki lahko razvije centrifugalno silo 2 200 g, z epruvetami za centrifugiranje z zamaški ali pokrovčki s prostornino približno 50 ml
 6.3
 Mehanični stresalnik
 6.4
 Magnetni mešalnik
 6.5
 Stekleni lijaki s premerom približno 7 cm
 6.6
 Filtrirni papir, srednje porozen, s premerom približno 12,5 cm
 6.7
 Oprema za filtriranje iz stekla s premerom por membranskega filtra 0,45 μm
 6.8
 Graduirana pipeta, ki prepušča 10 ml (ISO 648, razred A, ali ISO/R 835) ali razdelilni sistem, ki lahko prepušča 10,0 ml v dveh minutah
 6.9
 Razdelilni sistem, ki lahko prepušča 20,0 ml vode pri pribl. 50 °C
 6.10
 Termostatska vodna kopel, nastavljena na 25 ± 0,5 °C
 6.11
 HPLC-oprema, ki jo sestavljajo:
 6.11.1
 Črpalka
 6.11.2
 Ročni ali avtomatski injektor s prostornino 15 do 30 μl
 6.11.3
 Dve serijski koloni TSK 2 000-SW (dolžina 30 cm, notranji premer 0,75 cm) ali istovrstni koloni (tj. enojna TSK 2 000-SWxl, enojna Agilent Technologies Zorbax GF 250) in predkolona (3 cm × 0,3 cm), polnjena z I 125 ali enako učinkovitim materialom
 6.11.4
 Termostatski grelnik kolone, nastavljen na 35 ± 1 °C
 6.11.5
 UV-detektor z nastavljivo valovno dolžino z možnostjo merjenja pri 205 nm z občutljivostjo 0,008 Å.
 6.11.6
 Integrator z integracijo dolina–dolina
 Opomba:Mogoče je delo s kolonami pri sobni temperaturi, vendar je njihova moč ločljivosti nekoliko manjša. V tem primeru mora biti obseg temperature manjši od ± 5 °C v kateri koli stopnji analize.
 7.VZORČENJE
 7.1
 Vzorci se vzamejo v skladu s postopkom, določenim v mednarodnem standardu ISO 707. Vendar lahko države članice uporabijo drugo metodo vzorčenja, če je skladna z navedenim standardom.
 7.2
 Vzorec hranite pri pogojih, ki izključujejo kakršno koli kvarjenje ali spremembo sestave.
 8.POSTOPEK
 8.1
 Priprava preskusnega vzorca
 Prenesite mlečni prah v posodo z nepredušnim pokrovom s približno dvakrat večjo prostornino, kakor je prostornina prahu. Posodo takoj zaprite. Zmešajte mlečni prah s ponavljajočim obračanjem posode.
 8.2
 Preskusni delež
 Odtehtajte 2,000 ± 0,001 g preskusnega vzorca v centrifugalno epruveto (6.2) ali ustrezno zaprto bučko (50 ml).
 8.3
 Odstranitev maščob in beljakovin
 8.3.1
 Preskusnemu deležu dodajte 20,0 ml tople vode (50 °C). Raztopite prah s petminutnim stresanjem na mehaničnem stresalniku (6.3). Postavite epruveto v vodno kopel (6.10) in pustite, da se temperatura uravna na 25 °C.
 8.3.2
 V dveh minutah dodajte 10,0 ml raztopine trikloroocetne kisline (5.1) s temperaturo približno 25 °C in pri tem intenzivno mešajte z magnetnim mešalnikom (6.4). Postavite epruveto v vodno kopel (6.10) in pustite 60 minut.
 8.3.3
 Centrifugirajte (6.2) 10 minut pri 2 200 g ali filtrirajte skozi filter (6.6) in zavrzite prvih 5 ml filtrata.
 8.4
 Kromatografsko določanje
 8.4.1
 Vbrizgajte 15 do 30 μl natančno odmerjenega supernatanta ali filtrata (8.3.3) v HPLC-opremo (6.11), ki deluje s pretokom 1,0 ml raztopine eluenta (5.2) na minuto.
 Opomba 1: Uporabiti je mogoče tudi drugačen pretok, odvisno od notranjega premera kolon, ki so uporabljene, ali navodil proizvajalca kolon.
 Opomba 2: Med vsako prekinitvijo sperite kolone z vodo. Nikoli ne pustite v njih raztopine eluenta (5.2).
 Pred kakršno koli prekinitvijo, ki traja več kot 24 ur, spirajte kolone z vodo in nato z raztopino (5.3) pri pretoku 0,2 ml na minuto najmanj tri ure.
 8.4.2
 Rezultati kromatografske analize preskusnega vzorca [E] so dobljeni v obliki kromatogramov, pri katerih je vsak vrh opredeljen z retenzijskim časom RT, kakor sledi:
 Vrh II:
 Drugi vrh kromatograma z retenzijskim časom približno 12,5 minute.
 Vrh III:
 Tretji vrh kromatograma, ki ustreza CMP z retenzijskim časom približno 15,5 minute.
 Izbira kolon(-e) lahko bistveno vpliva na retenzijski čas posameznih vrhov.
 Integrator (6.11.6) samodejno izračuna površino A vsakega vrha:
 AII:
 površina vrha II
 AIII:
 površina vrha III
 Pred kvantitativno interpretacijo je treba pregledati videz vsakega kromatograma, da bi tako lahko izsledili kakršne koli nepravilnosti kot posledice slabega delovanja bodisi kromatografa ali kolon ali pa kot posledico izvora in narave analiziranega vzorca.
 V primeru dvoma analizo ponovite.
 8.5
 Kalibracija
 8.5.1
 Za standardne vzorce (5.4) uporabite postopek, opisan od točke 8.2 do točke 8.4.2.
 Uporabite sveže pripravljene raztopine, ker se CMP razgradi v 8-odstotnem trikloroocetnem okolju. Izguba je ocenjena na 0,2 % na uro pri 30 °C.
 8.5.2
 Pred kromatografskim določanjem vzorcev pripravite kolone s ponavljajočim vbrizgavanjem standardnega vzorca (5.4.2) v raztopino (8.5.1), dokler nista površina in retenzijski čas vrha, ki ustreza CMP, stalna.
 8.5.3
 Z vbrizganjem enake prostornine filtrata (8.5.1), kakor je uporabljen pri vzorcih, določite odzivne faktorje R.
 9.IZRAŽANJE REZULTATOV
 9.1
 Metoda za izračun in enačbe
 9.1.1
 Izračun odzivnih faktorjev R:
 Vrh II:
 RII = 100/(AII[0])
 kjer je:
 RII
 =
 odzivni faktorji vrhov II,
 AII [0]
 =
 površine vrhov II standardnega vzorca [0], pridobljene v 8.5.3.
 Vrh III:
 RIII = W/(AIII[5] - AIII[0])
 kjer je:
 RIII
 =
 odzivni faktor vrha III,
 AIII [0] in AIII [5]
 =
 površine vrha III standardnega vzorca [0] in [5], pridobljene v 8.5.3,
 W
 =
 količina sirotke v standardnem vzorcu [5], tj. 5.
 9.1.2
 Izračun relativnih površin vrhov vzorca [E]
 SII[E] = RII × AII[E]
 SIII[E] = RIII × AIII[E]
 SIV[E] = RIV × AIV[E]
 kjer je:
 SII [E], SIII [E], SIV [E]
 =
 relativne površine vrhov II, III in IV v vzorcu [E],
 AII [E], AIII [E]
 =
 površine vrhov II in III v vzorcu [E], pridobljene v 8.4.2,
 RII, RIII
 =
 odzivni faktorji, izračunani v 9.1.1.
 9.1.3
 Izračun relativnega retenzijskega časa vrha III v vzorcu [E]: RRTIII[E] = (RTIII[E])/(RTIII[5])
 kjer je:
 RRTIII [E]
 =
 relativni retenzijski čas vrha III v vzorcu [E],
 RTIII [E]
 =
 retenzijski čas vrha III v vzorcu [E], pridobljen v 8.4.2,
 RTIII [5]
 =
 retenzijski čas vrha III v kontrolnem vzorcu [5], pridobljen v 8.5.3.
 9.1.4
 Preskusi so pokazali, da obstaja linearna povezava med relativnim retenzijskim časom vrha III, npr. RRTIII [E], in odstotkom dodane sirotke v prahu do 10 %
 –RRTIII [E] je < 1,000, ko je vsebnost sirotke > 5 %,
 –RRTIII [E] je ≥ 1,000, ko je vsebnost sirotke ≤ 5 %.
 Dovoljena negotovost za vrednosti RRTIII je ±0,002.
 Običajno se vrednost RRTIII [0] giblje malo okoli 1,034. Odvisno od stanja kolon se vrednost lahko približa 1,000, ampak mora biti vedno večja od 1,000.
 9.2 Izračun deleža sladke sirotke v prahu v vzorcu:
 W = SIII[E] – [1, 3 + (SIII[0] – 0, 9)]
 kjer je:
 W
 =
 odstotek m/m sladke sirotke v vzorcu [E];
 SIII [E]
 =
 relativna površina vrha III preskusnega vzorca [E], pridobljena v 9.1.2;
 1,3
 =
 predstavlja relativno povprečno površino vrha III, izraženo v gramih sladke sirotke na 100 g določene v posnetem mleku v prahu brez primesi različnega izvora. Ta podatek je bil pridobljen eksperimentalno;
 SIII [0]
 =
 predstavlja relativno površino vrha III, ki je enaka RIII × AIII [0]. Te vrednosti so pridobljene v 9.1.1 in 8.5.3;
 (SIII [0] – 0,9)
 =
 predstavlja popravek za relativno povprečno površino 1,3, ko SIII [0] ni enako 0,9. Eksperimentalno je relativna povprečna površina vrha III kontrolnega vzorca [0] 0,9.
 9.3
 Zanesljivost postopka
 9.3.1
 Ponovljivost
 Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju izvede simultano ali po kratkem času isti analitik z isto opremo in na enakem preskusnem materialu, ne sme presegati 0,2 % m/m.
 9.3.2
 Obnovljivost
 Razlika med dvema posamičnima in neodvisnima rezultatoma, dobljenima v dveh različnih laboratorijih na enakem preskusnem materialu, ne sme presegati 0,4 % m/m.
 9.4
 Interpretacija
 9.4.1
 Če je relativna površina vrha III, SIII [E], izražena v gramih sladke sirotke na 100 g proizvoda ≤ 2,0 + (SIII[0] – 0,9), je treba zanikati obstoj sirotke,
 kjer je:
 2,0
 največja dovoljena vrednost relativne površine vrha III ob upoštevanju relativne povprečne površine vrha III, npr. 1,3, negotovosti zaradi sprememb v sestavi posnetega mleka v prahu in obnovljivosti metode (9.3.2);
 (SIII [0] — 0,9)
 popravek, ki ga je treba upoštevati, ko se površina SIII [0] razlikuje od 0,9 (glej točko 9.2).
 9.4.2
 Če je relativna površina vrha III, SIII [E] > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) in relativna površina vrha II, SII [E] ≤ 160, določite vsebnost sladke sirotke, kot je navedeno v točki 9.2.
 9.4.3
 Če je relativna površina vrha III, SIII [E] > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) in relativna površina vrha II, SII [E] ≤ 160, določite vsebnost skupnih beljakovin (P %); nato preučite grafa 1 in 2.
 9.4.4
 Podatki, dobljeni po analizi nepotvorjenih vzorcev posnetega mleka v prahu z visoko vsebnostjo skupnih beljakovin, so zbrani v grafih 1 in 2.
 Neprekinjena črta predstavlja linearno regresijo, katere koeficienti so izračunani z metodo najmanjših kvadratov.
 Prekinjena ravna črta označuje zgornjo mejo relativne površine vrha III z verjetnostjo, da v 90 % primerov ni presežena.
 Enačbi prekinjenih ravnih črt v grafih 1 in 2 sta:
 SIII = 0,376 P % – 10,7
 (graf 1),
 SIII = 0,0123 SII [E] + 0,93
 (graf 2),
 kjer je:
 SIII
 relativna površina vrha III, izračunana bodisi v skladu z vsebnostjo skupnih beljakovin bodisi v skladu z relativno površino vrha SII [E],
 P %
 vsebnost skupnih beljakovin, izražena v masnih odstotkih,
 SII [E]
 relativna površina vzorca, izračunana v točki 9.1.2.
 Te enačbe so enakovredne vrednosti 1,3, navedeni v točki 9.2.
 Odstopanje (T1 in T2) med relativno površino SIII [E] in relativno površino SIII je prikazano z naslednjimi vrednostmi: T1 = SIII[E] - [(0,376 P% - 10,7) + (SIII[0] - 0,9)]T2 = SIII[E] - [(0,0123 SII[E] + 0,93) + (SIII[0] - 0,9)]
 9.4.3.2
 Če je T1 in/ali T2
 nič ali manj, prisotnosti sladke sirotke ni mogoče določiti.
 Če sta T1 in T2
 večji kot nič, je sladka sirotka prisotna.
 Vsebnost sladke sirotke se izračuna v skladu z naslednjo enačbo: W = T2 + 0,91
 kjer je:
 0,91 razdalja navpičnih osi med neprekinjenimi in pikčastimi ravnimi črtami.
 “
 Dodatek III
 DOLOČANJE TRDNIH SNOVI SLADKE SIROTKE V POSNETEM MLEKU V PRAHU
 1.NAMEN: ZAZNAVANJE DODATKA TRDNIH SNOVI SLADKE SIROTKE K POSNETEMU MLEKU V PRAHU
 2.SKLICI: MEDNARODNI STANDARD ISO 707
 3.OPREDELITEV
 Vsebnost trdnih snovi sladke sirotke je opredeljena kot masni odstotek, ki se določi z vsebnostjo makropeptidov kazeina v skladu z opisanim postopkom.
 4.PRINCIP
 Pri vzorcih se analizira vsebnost makropeptida kazeina A s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti z reverzno fazo (HPLC-postopek). Rezultati se ocenijo glede na standardne vzorce posnetega mleka v prahu z znanim deležem in brez znanega deleža sirotke v prahu. Rezultati, ki presegajo 1 % masnega deleža, kažejo na prisotnost trdnih snovi sladke sirotke.
 5.REAGENTI
 Vsi reagenti dosegajo priznano analitsko čistost. Uporabljena voda je destilirana voda ali voda vsaj enakovredne čistosti. Kakovost acetonitrila mora biti primerna za spektroskop ali HPLC.
 5.1
 Raztopina trikloroocetne kisline
 Raztopite 240 g trikloroocetne kisline (CCl3COOH) v vodi in dopolnite do prostornine 1 000 ml. Raztopina mora biti bistra in brezbarvna.
 5.2
 Eluenta A in B
 Eluent A: V 1 000-mililitrsko merilno bučko dodajte 150 ml acetonitrila (CH3CN), 20 ml izopropanola (CH3CHOHCH3) in 1,00 ml trifluoroocetne kisline (TFA, CF3COOH). Dopolnite z vodo do 1 000 ml.
 Eluent B: V 1 000-mililitrsko merilno bučko dodajte 550 ml acetonitrila, 20 ml izopropanola in 1,00 ml TFA. Dopolnite z vodo do 1 000 ml. Raztopino eluenta pred uporabo filtrirajte skozi membranski filter s premerom por 0,45 μm.
 5.3
 Shranitev kolone
 Po analizi kolono sperete z eluentom B (gradientno) in potem še z acetonitrilom (gradientno v 30 minutah.). Kolona se shrani v acetonitrilu.
 5.4
 Standardni vzorci
 5.4.1
 Posneto mleko v prahu, ki ustreza zahtevam za javno skladiščenje (npr. [0]).
 5.4.2
 Enako posneto mleko v prahu z dodatkom 5 % (m/m) sladke sirotke v prahu s standardno sestavo (tj. [5]).
 5.4.3
 Enako posneto mleko v prahu z dodatkom 50 % (m/m) sladke sirotke v prahu s standardno sestavo (tj. [50]).
 6.OPREMA
 6.1
 Analitska tehtnica
 6.2
 Neobvezna centrifuga, ki lahko razvije centrifugalno silo 2 200 g, z epruvetami za centrifugiranje z zamaški ali pokrovčki s prostornino približno 50 ml
 6.3
 Mehanični stresalnik
 6.4
 Magnetni mešalnik
 6.5
 Stekleni lijaki s premerom približno 7 cm
 6.6
 Filtrirni papir, srednje porozen, s premerom približno 12,5 cm
 6.7
 Oprema za filtriranje iz stekla s premerom por membranskega filtra 0,45 μm
 6.8
 Graduirana pipeta, ki prepušča 10 ml (ISO 648, razred A, ali ISO/R 835) ali razdelilni sistem, ki lahko prepušča 10,0 ml v dveh minutah
 6.9
 Razdelilni sistem, ki lahko prepušča 20,0 ml vode pri pribl. 50 °C
 6.10
 Termostatska vodna kopel, nastavljena na 25 ± 0,5 °C
 6.11
 HPLC-oprema, ki jo sestavljajo:
 6.11.1
 Binarni gradientni sistem črpalk
 6.11.2
 Ročni ali avtomatski injektor s prostornino 100 μl
 6.11.3
 Kolona Agilent Technologies Zorbax 300 SB-C3 (dolžina 25 cm, notranji premer 0,46 cm) ali enakovredna silicijeva kolona s širokimi porami za reverzno kromatografijo
 6.11.4
 Termostatiran grelnik kolone, nastavljen na 35 ± 1 °C
 6.11.5
 UV-detektor z nastavljivo valovno dolžino in z možnostjo merjenja pri 210 nm (če je potrebno, se lahko uporabi višja valovna dolžina do 220 nm) z občutljivostjo 0,02 Å
 6.11.6
 Integrator, ki lahko določi integracijo na splošni bazni liniji ali dolina–dolina
 Opomba: Delo s kolonami je mogoče tudi pri sobni temperaturi, če temperatura niha manj kot ± 1 °C, sicer nastane preveliko nihanje retenzijskega časa CMPA.
 7.VZORČENJE
 7.1
 Vzorci se vzamejo v skladu s postopkom, določenim v mednarodnem standardu ISO 707. Vendar lahko države članice uporabijo drugo metodo vzorčenja, če je skladna z navedenim standardom.
 7.2
 Vzorec hranite pri pogojih, ki izključujejo kakršno koli kvarjenje ali spremembo sestave.
 8.POSTOPEK
 8.1
 Priprava preskusnega vzorca
 Prenesite mlečni prah v posodo z nepredušnim pokrovom s približno dvakrat večjo prostornino, kakor je prostornina prahu. Posodo takoj zaprite. Zmešajte mlečni prah s ponavljajočim obračanjem posode.
 8.2
 Preskusni delež
 Odtehtajte 2,00 ± 0,001 g preskusnega vzorca v epruveto za centrifugiranje (6.2) ali ustrezno zaprto bučko (50 ml).
 Opomba: V primeru mešanic odtehtajte takšno količino preskusnega vzorca, da razmaščeni vzorec deleža ustreza 2,00 g.
 8.3
 Odstranitev maščob in beljakovin
 8.3.1
 Preskusnemu deležu dodajte 20,0 ml tople vode (50 °C). Raztopite prah s petminutnim stresanjem na mehaničnem stresalniku (6.3). Postavite epruveto v vodno kopel (6.10) in pustite, da se temperatura uravna na 25 °C.
 8.3.2
 V dveh minutah dodajte 10,0 ml raztopine triklorocetne kisline s temperaturo približno 25 °C (5.1) in pri tem intenzivno mešajte z magnetnim mešalnikom (6.4). Postavite epruveto v vodno kopel (6.10) in pustite 60 minut.
 8.3.3
 Centrifugirajte (6.2) 10 minut pri 2 200 g ali filtrirajte skozi filter (6.6) in zavrzite prvih 5 ml filtrata.
 8.4
 Kromatografsko določanje
 8.4.1
 Metoda HPLC na reverzni fazi izključuje možnost lažno pozitivnih rezultatov zaradi prisotnosti kislega pinjenca v prahu.
 8.4.2
 Pred izvedbo HPLC-analize na reverzni fazi je treba optimizirati gradientne pogoje. Retenzijski čas CMPA 26 ± 2 minuti je optimalen za gradientne sisteme z mrtvo prostornino približno 6 ml (prostornina od točke, na kateri pridejo skupaj topila, do vključno s prostornino injekcijske zanke). Gradientni sistemi z manjšo mrtvo prostornino (npr. 2 ml) naj uporabijo 22 minut kot optimalen retenzijski čas.
 Odvzem raztopine standardnih vzorcev (5.4) brez sladke sirotke in s 50 % sladke sirotke.
 Vbrizgajte 100 μl supernatanta ali filtrata (8.3.3) v instrument HPLC, ki deluje pri predlaganih gradientnih pogojih, danih v tabeli 1.
 Tabela 1
 Predlagani gradientni pogoji za optimizacijo kromatografije
 Čas
 (minute)
 Pretok
 (ml/min)
 % A
 % B
 Krivulja
 Začetek
 1,0
 90
 10
 *
 27
 1,0
 60
 40
 linearna
 32
 1,0
 10
 90
 linearna
 37
 1,0
 10
 90
 linearna
 42
 1,0
 90
 10
 linearna
 Iz primerjave dveh kromatogramov se razbere lokacija vrha CMPΑ.
 Po navedeni enačbi se lahko izračuna sestava začetnega topila, ki se uporabi za normalni gradient (glej 8.4.3): % B = 10 – 2,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6)*30 / 27 % B = 7,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6)*1,11,
 kjer je:
 RTcmpA
 :
 retenzijski čas CMPΑ v predlaganem gradientu
 10
 :
 začetni % B v predlaganem gradientu
 2,5
 :
 % B na sredini minus % B na začetku normalnega gradienta
 13,5
 :
 srednji čas predlaganega gradienta
 26
 :
 zahtevani retenzijski čas CMPΑ
 6
 :
 razmerje naklonov predlaganega in normalnega gradienta
 30
 :
 % B na začetku minus % B pri 27 minutah predlaganega gradienta
 27
 :
 celotni čas predlaganega gradienta.
 8.4.3
 Odvzem raztopin preskusnih vzorcev
 Vbrizgajte 100 μl natančno odmerjenega supernatanta ali filtrata (8.3.3) v instrument HPLC, ki deluje pri pretoku 1,0 ml raztopine eluenta (5.2) na minuto.
 Sestavo eluenta na začetku analize dobite iz 8.4.2. Ponavadi je blizu A:B = 76:24 (5.2). Takoj po vbrizgavanju se vklopi linearni gradient, ki ima po 27 minutah za 5 % višji delež B. Nato se vklopi linearni gradient, ki v petih minutah spremeni sestavo eluenta na 90 % B. Ta sestava se ohrani pet minut, potem pa se prek linearnega gradienta v petih minutah spremeni v začetno sestavo. Odvisno od notranje prostornine sistema črpalk lahko naslednje vbrizgavanje sledi 15 minut zatem, ko dosežete začetno sestavo.
 Opomba 1: Retenzijski čas CMPA je 26 ± 2 minuti. To je mogoče doseči s spreminjanjem začetnih in končnih pogojev prvega gradienta. Vendar mora razlika % B pri začetnih in končnih pogojih prvega gradienta ostati 5 % B.
 Opomba 2: Eluente je treba primerno razpliniti in morajo ostati razplinjeni. To je nujno za pravilno delovanje gradientnega sistema črpalk. Standardni odmik retenzijskega časa CMPA vrha naj bo manjši od 0,1 minute (n = 10).
 Opomba 3: Vsakih pet vzorcev je treba vbrizgati referenčni vzorec [5] in ga uporabiti za izračun novega odzivnega faktorja R (9.1.1).
 8.4.4
 Rezultati kromatografske analize preskusnega vzorca (E) so dobljeni v obliki kromatograma, v katerem je vrh CMPA prepoznan z retenzijskim časom približno 26 minut.
 Integrator (6.11.6) samodejno izračuna višino vrha H vrha CMPA. Na vsakem kromatogramu je treba preveriti položaj bazne linije. Analizo ali integracijo je treba ponoviti, če je bazna linija nepravilno določena.
 Opomba: Če je vrh CMPA dovolj ločen od drugih vrhov, je treba uporabiti bazno linijo dolina–dolina, v nasprotnem primeru uporabite padajoče navpičnice za splošno bazno linijo, ki mora imeti izhodišče blizu vrha CMPA (torej ne pri t = 0 min!).Za standard in vzorec uporabite enako vrsto integracije in v primeru splošne bazne linije preverite skladnost vrste za vzorce in standard.
 Pred kvantitativno interpretacijo je treba pregledati videz vsakega kromatograma, da bi tako lahko izsledili kakršne koli nepravilnosti kot posledice slabega delovanja bodisi kromatografa ali kolone ali pa kot posledico izvora in narave analiziranega vzorca. V primeru dvoma analizo ponovite.
 8.5
 Kalibracija
 8.5.1
 Za standardne vzorce uporabite postopek, opisan od točke 8.2 do točke 8.4.4 (od 5.4.1 do 5.4.2). Uporabite sveže pripravljene raztopine, ker se CMP razgradi v 8-odstotni triklorocetni kislini pri sobni temperaturi. Pri 4 °C ostane raztopina stabilna 24 ur. Pri veliki seriji analiz je zaželena uporaba hlajenega pladnja za vzorce v avtomatskem injektorju.
 Opomba: Točko 8.4.2 je mogoče izpustiti, če je % B pri začetnih pogojih znan iz prejšnjih analiz.
 Kromatogram referenčnega vzorca [5] mora biti analogen sliki 1. Na tej sliki sta pred vrhom CMPA dva majhna vrhova. Nujno je, da dobite podobno ločevanje.
 8.5.2
 Pred kromatografskim določanjem vzorcev vbrizgajte 100 μl standardnega vzorca brez sladke sirotke [0] (5.4.1).
 Kromatogram ne sme imeti vrha pri retenzijskem času vrha CMPA.
 8.5.3
 Z vbrizganjem enake prostornine filtrata (8.5.1), kakor je uporabljen pri vzorcih, določite odzivne faktorje R.
 9.IZRAŽANJE REZULTATOV
 9.1
 Metoda za izračun in enačbe
 9.1.1
 Izračun odzivnega faktorja R:
 vrh CMPA: R = W/H,
 kjer je:
 R
 =
 R odzivni faktor vrha CMPA,
 H
 =
 višina vrha CMPA,
 W
 =
 količina sirotke v standardnem vzorcu [5].
 9.2
 Izračun deleža sladke sirotke v prahu v vzorcu
 W(E) = R × H(E)
 kjer je:
 W(E)
 =
 odstotek (m/m) sladke sirotke v vzorcu (E);
 R
 =
 odzivni faktor vrha CMPA (9.1.1)
 H(E)
 =
 višina vrha CMPA iz vzorca (E)
 Če je W(E) večji od 1 % in razlika med retenzijskim časom pri vzorcu in standardnem vzorcu [5] manjša od 0,2 minute, potem je trdna snov sladke sirotke prisotna.
 9.3
 Zanesljivost postopka
 9.3.1
 Ponovljivost
 Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju izvede simultano ali po kratkem času isti analitik z isto opremo in na enakem preskusnem materialu, ne sme presegati 0,2 % m/m.
 9.3.2
 Obnovljivost
 Ni določena.
 9.3.3
 Linearnost
 Linearno zvezo s korelacijskim koeficientom > 0,99 je treba dobiti v območju od 0 do 16 % sladke sirotke.
 9.4
 Interpretacija
 Meja 1 % vključuje negotovost zaradi obnovljivosti.
 Slika 1
 Ni – standard 4.6
 CMP A
 “
 (3) Dodajo se naslednje priloge:
 „PRILOGA VI
 Metode za analizo masla za zasebno skladiščenje
 Parameter
 Metoda
 Maščoba
 7
 ISO 17189 ali ISO 3727, del 3
 Voda
 ISO 3727, del 1
 Nemastna trdna snov (razen soli)
 ISO 3727, del 2
 Sol
 ISO 15648
 PRILOGA VII
 Metode za analizo posnetega mleka v prahu za zasebno skladiščenje
 Parameter
 Metoda
 Maščoba
 ISO 1736
 Beljakovine
 ISO 8968, del 1
 Voda
 ISO 5537
 PRILOGA VIII
 Metode za analizo sira za zasebno skladiščenje
 1. Za zagotovitev, da sir, izdelan izključno iz ovčjega, kozjega ali bivoličjega mleka ali iz mešanice ovčjega, kozjega in bivoličjega mleka, dejansko ne vsebuje kazeina kravjega mleka, se uporablja analitska metoda iz dodatka.
 Če je vsebnost kazeina kravjega mleka v analiziranem vzorcu enaka ali višja od vsebnosti v referenčnem vzorcu, ki vsebuje 1 % kravjega mleka, kakor je opisano v dodatku, se šteje, da je kazein kravjega mleka prisoten.
 2. Metode za zaznavanje kazeina kravjega mleka v siru, kakor je navedeno v odstavku 1, se lahko uporabijo, če:
 (a) je meja zaznavnosti največ 0,5 % in
 (b) ni napačnih pozitivnih rezultatov ter
 (c) se kazein kravjega mleka lahko zazna z zahtevano občutljivostjo tudi po daljših obdobjih zorenja, do česar lahko pride v običajnih trgovinskih pogojih.
 Če katera od navedenih zahtev ni izpolnjena, se uporabijo referenčne metode iz dodatka.
 Dodatek
 METODA ZA ZAZNAVANJE KRAVJEGA MLEKA IN KAZEINATA V SIRIH IZ OVČJEGA, KOZJEGA ALI BIVOLIČJEGA MLEKA ALI MEŠANIC OVČJEGA, KOZJEGA IN BIVOLIČJEGA MLEKA
 1.NAMEN
 Zaznavanje kravjega mleka in kazeinata v sirih iz ovčjega, kozjega in bivoličjega mleka ali mešanic ovčjega, kozjega in bivoličjega mleka z izoelektričnim fokusiranjem γ-kazeinov po plazminolizi.
 2.PODROČJE UPORABE
 Ta metoda je primerna za občutljivo, specifično zaznavanje surovega in toplotno obdelanega kravjega mleka in kazeinata v svežih in zorenih sirih iz ovčjega, kozjega in bivoličjega mleka ter iz mešanic ovčjega, kozjega in bivoličjega mleka. Ni pa primerna za zaznavanje mlečnih ali sirnih ponaredkov s toplotno obdelanimi proteinskimi koncentrati govejega sirila.
 3.PRINCIP METODE
 3.1
 Izolacija kazeinov iz sira in referenčni standardi
 3.2
 Raztopitev izoliranih kazeinov in izpostavitev v plazminsko cepitev (EC.3.4.21.7)
 3.3
 Izoelektrično fokusiranje plazminsko obdelanih kazeinov v prisotnosti sečnine in obarvanje proteinov
 3.4
 Ocenjevanje obarvanih γ3 in γ2-kazeinskih profilov (dokaz kravjega mleka) s primerjavo primerka, pridobljenega iz vzorca, s primerki, pridobljenimi v istem gelu iz referenčnih standardov, ki vsebujejo 0 % in 1 % kravjega mleka.
 4.REAGENTI
 Razen če ni določeno drugače, se uporabijo analitsko čiste kemikalije. Voda je dvakrat destilirana ali enakovredne čistosti.
 Opomba: Naslednje podrobnosti veljajo za laboratorijsko pripravljene poliakrilamidne gele v velikosti 265 × 125 × 0,25 mm, ki vsebujejo sečnino. Če so uporabljene druge velikosti in vrste gelov, se lahko pogoji ločitve prilagodijo.
 Izoelektrično fokusiranje
 4.1
 Reagenti za izdelavo poliakrilamidnih gelov z vsebnostjo sečnine
 4.1.1
 Osnovna gelska raztopina
 V vodi raztopite:
 4,85 g akrilamida,
 0,15 g N, N'-metilen-bis-akrilamida (BIS),
 48,05 g sečnine,
 15,00 g glicerola (87 % w/w)
 in dopolnite do 100 ml ter raztopino shranite v rjavi steklenici v hladilniku.
 Opomba: Namesto navedenih določenih količin nevrotoksičnih akrilamidov se lahko uporabi tudi komercialo dostopna mešanica akrilamidne/BIS raztopine. Če taka raztopina vsebuje 30 % w/v akrilamida in 0,8 % w/v BIS, se namesto navedenih količin za pripravek vzame 16,2 ml. Rok uporabnosti raztopine je največ 10 dni. Če je njena prevodnost več kot 5 μS, raztopino deionizirajte z mešanjem 2 g amberlita MB-3 30 minut, nato filtrirajte skozi membrano 0,45 μm.
 4.1.2
 Gelska raztopina
 Gelsko raztopino pripravite z mešanjem dodatkov, amfolitov
 8
 in gelske raztopine iz zaloge (glej 4.1.1).
 9,0 ml osnovne gelske raztopine,
 24 mg β-alanina,
 500 μl amfolita pH 3,5–9,5,
 250 μl amfolita pH 5-7,
 250 μl amfolita pH 6-8.
 Zmešajte gelsko raztopino in jo dve do tri minute razplinjajte v ultrazvočni kopeli ali vakuumu.
 Opomba: Gelsko raztopino pripravite, tik preden jo nalijete (glej 6.2).
 4.1.3
 Katalizatorske raztopine
 4.1.3.1
 N, N, N' N' – tetrametiletilendiamin (Temed)
 4.1.3.2
 40 % w/v amonijev persulfat (PER):
 Raztopite 800 mg PER v vodi in dopolnite do 2 ml.
 Opomba: Vedno uporabite sveže pripravljeno raztopino PER.
 4.2
 Kontaktna tekočina
 Kerozen ali tekoči parafin.
 4.3
 Anodna raztopina
 Raztopite 5,77 g fosforjeve kisline (85 % w/w) v vodi in dopolnite do 100 ml.
 4.4
 Katodna raztopina
 Raztopite 2,00 g natrijevega hidroksida v vodi in dopolnite do 100 ml.
 Priprava vzorca
 4.5
 Reagent za izolacijo proteinov
 4.5.1
 Razredčena ocetna kislina (25,0 ml ledocetne kisline dopolnite z vodo do 100 ml).
 4.5.2
 Diklorometan
 4.5.3
 Aceton
 4.6
 Pufer za raztapljanje proteinov
 V vodi raztopite
 5,75 g glicerola (87 % w/w),
 24,03 g sečnine,
 250 mg ditiotreitola
 in dopolnite do 50 ml.
 Opomba: Hranite v hladilniku; najdaljši rok uporabnosti je en teden.
 4.7
 Reagenti za plazminsko cepitev kazeinov
 4.7.1
 Pufer amonijevega hidrogenkarbonata
 Titrirajte 0,2 mol/l raztopine amonijevega hidrogenkarbonata (1,58 g/100 ml vode), ki vsebuje 0,05 mol/l etilendiamintetraocetne kisline (EDTA, 1,46 g/100 ml) z 0,2 mol/l raztopine amonijevega karbonata (1,92 g/100 ml vode), ki vsebuje 0,05 mol/l EDTA do pH 8.
 4.7.2
 Goveji plazmin (EC. 3.4.21.7) z aktivnostjo najmanj 5 U/ml.
 4.7.3
 Raztopina ε-aminokapronske kisline za inhibiranje encimov.
 Raztopite 2,624 g ε-aminokapronske kisline (6-amino-n-heksanojske kisline) v 100 ml 40 % (v/v) etanola.
 4.8
 Standardi
 4.8.1
 Certificirani referenčni standardi mešanice sesirjenega posnetega ovčjega in kozjega mleka, ki vsebuje 0 % in 1 % kravjega mleka, so na voljo na Inštitutu za referenčne materiale in meritve Komisije, 2440 Geel, Belgija.
 4.8.2
 Priprava laboratorijskih delovnih standardov sesirjenega bivoličjega mleka, ki vsebuje 0 % in 1 % kravjega mleka.
 Posneto mleko se pripravi z 20-minutnim centrifugiranjem vzorca surovega bivoličjega mleka ali mleka goveda pri 37 °C in 2 500 g. Po hitri ohladitvi epruvete in vsebine na 6 do 8 °C se popolnoma odstrani zgornja plast maščobe. Za pripravo 1 % standarda v litrski čaši k 495 ml posnetega bivoličjega mleka dodajte 5,00 ml posnetega mleka goveda, uravnajte pH na 6,4 z dodajanjem razredčene mlečne kisline (10 % w/v). Nastavite temperaturo na 35 °C in dodajte 100 μl telečjega sirila (aktivnost sirila je 1 : 10 000, pribl. 3 000 U/ml), mešajte eno minuto in nato čašo pustite eno uro pokrito z aluminijasto folijo pri 35 °C, da se naredi sirna gruda. Ko se je naredila sirna gruda, se celotno sesirjeno mleko posuši z zmrzovanjem (freeze-dry) brez predhodne homogenizacije ali odcejanja sirotke. Po tem postopku sirno grudo fino zmeljite, da dobite homogen prah. Za pripravo 0 % standarda uporabite isti postopek z naravnim posnetim bivoličjim mlekom. Standard se shrani pri –20 °C.
 Opomba: Pred pripravo standardov je priporočljivo, da se preveri čistost bivoličjega mleka z izoelektričnim fokusiranjem plazminsko obdelanih kazeinov.
 Reagenti za obarvanje proteinov
 4.9
 Fiksir
 Raztopite 150 g trikloroocetne kisline v vodi in dopolnite do 1 000 ml.
 4.10
 Raztopina za razbarvanje
 500 ml metanola in 200 ml ledocetne kisline razredčite z destilirano vodo do 2 000 ml.
 Opomba: Vsak dan pripravite svežo raztopino za razbarvanje. Lahko jo pripravite z mešanjem enakih prostornin osnovnih raztopin 50 % (v/v) metanola in 20 % (v/v) ocetne kisline.
 4.11
 Raztopine za obarvanje
 4.11.1
 Raztopina za obarvanje (osnovna raztopina 1)
 Raztopite 3,0 g Coomassie Brillant Blue G-250 (C.I. 42655) v 1 000 ml 90 % (v/v) metanola z magnetnim mešalom (približno 45 minut), filtrirajte skozi dva srednje hitra nagubana filtra.
 4.11.2
 Raztopina za obarvanje (osnovna raztopina 2)
 Raztopite 5,0 g bakrovega sulfata pentahidrata v 1 000 ml 20 % (v/v) ocetne kisline.
 4.11.3
 Raztopina za obarvanje (delovna raztopina)
 Tik pred obarvanjem zmešajte skupaj 125 ml vsake osnovne raztopine (4.11.1, 4.11.2).
 Opomba: Raztopino za obarvanje je treba pripraviti na dan uporabe.
 5.OPREMA
 5.1
 Steklene ploščice (265 × 125 × 4 mm); valjček iz gume (širine 15 cm); nivelirna miza
 5.2
 Nosilna folija za gel (265 × 125 mm)
 5.3
 Pokrivna folija (280 × 125 mm). Na vsak dolgi rob zalepite trak lepilnega traku (280 × 6 × 0,25 mm) (glej sliko 1)
 5.4
 Elektrofokusirna komora s hladilno ploščo (npr. 265 × 125 mm) in ustrezen vir energije (≥ 2,5 kV) ali avtomatska elektroforezna naprava
 5.5
 Cirkulacijski kriostat, termostatsko nadzorovan na 12 ± 0,5 °C
 5.6
 Centrifuga, nastavljiva do 3 000 g
 5.7
 Elektrodni trakovi (≥ 265 mm dolgi)
 5.8
 Plastične kapalke za anodne in katodne raztopine
 5.9
 Trakovi za nanos vzorca (10 × 5 mm, iz viskoze ali nizkoadsorpcijski filtrirni papir)
 5.10
 Posode iz nerjavnega jekla ali steklene posode za obarvanje in razbarvanje (npr. pladnji za instrumente 280 × 150 mm)
 5.12
 Prilagodljiv palični homogenizator (premer osi 10 mm), v razponu od 8 000 do 20 000 vrtljajev/minuto
 5.13
 Magnetni mešalnik
 5.14
 Ultrazvočna kopel
 5.15
 Varilnik folije
 5.16
 Mikropipete s prostornino 25 μl
 5.17
 Vakuumski koncentrator ali – zamrzovalni sušilnik
 5.18
 Termostatsko nadzorovana vodna kopel, prilagodljiva na 35 in 40 ± 1 °C, z mešalnikom
 5.19
 Denzitometer za odčitavanje pri λ = 634 nm
 6.POSTOPEK
 6.1
 Priprava vzorca
 6.1.1
 Izolacija kazeinov
 Stehtajte količino, enakovredno 5 g suhe mase sira ali referenčnih standardov v 100-mililitrski epruveti za centrifugiranje, dodajte 60 ml destilirane vode in homogenizirajte s paličnim homogenizatorjem (8 000 do 10 000 vrt./min). Uravnajte na pH 4,6 z razredčeno ocetno kislino (4.5.1) in centrifugirajte (5 minut, 3 000 g). Odlijte maščobo in sirotko, homogenizirajte ostanek pri 20 000 vrt./min v 40 ml destilirane vode s pH 4,5, dobljenim z razredčeno ocetno kislino (4.5.1); dodajte 20 ml diklorometana (4.5.2), znova homogenizirajte in centrifugirajte (5 minut, 3 000 g). Z lopatico odstranite kazeinsko plast, ki leži med vodno in organsko fazo (glej sliko 2), in odlijte obe fazi. Znova homogenizirajte kazein v 40 ml destilirane vode (glej zgoraj) in 20 ml diklorometana (4.5.2) in centrifugirajte. Nadaljujte postopek (dva- do trikrat), dokler obe ekstrakcijski fazi ne postaneta brezbarvni. Homogenizirajte proteinski preostanek s 50 ml acetona (4.5.3) in filtrirajte prek srednje hitrega nagubanega filtrirnega papirja. Ostanek na filtru vsakič sperite z dvema ločenima 25-mililitrskima odmerkoma acetona in pustite, da se posuši na zraku ali v toku dušika, nato ga v terilnici zdrobite v fin prah.
 Opomba: Izoliran suh kazein je treba hraniti pri –20 °C.
 6.1.2
 Plazminsko cepljenje β-kazeinov za okrepitev γ-kazeinov
 Disperzirajte 25 mg izoliranih kazeinov (6.1.1) v 0,5 ml pufra amonijevega karbonata (4.7.1) in 20 minut homogenizirajte, npr. z uporabo ultrazvočnega postopka. Ogrejte na 40 °C in dodajte 10 μl plazmina (4.7.2), zmešajte in eno uro inkubirajte pri 40 °C z neprestanim tresenjem. Za inhibicijo encima dodajte 20 μl raztopine ε-aminokapronske kisline (4.7.3), nato dodajte 200 mg sečnine v trdi obliki in 2 ml ditiotreitola.
 Opomba: Da bi dobili več simetrije v fokusiranih kazeinskih trakovih, je priporočljivo, da raztopino sušite z zmrzovanjem, potem ko ste dodali ε-aminokapronsko kislino, in nato raztopite preostanek v 0,5 ml pufra za raztapljanje proteinov (4.6).
 6.2
 Priprava sečnine, ki vsebuje poliakrilamidne gele
 Z nekaj kapljicami vode povaljajte nosilno folijo za gel (5.2) po stekleni plošči (5.1), odstranite vso odvečno vodo s papirnato brisačo ali tkanino. Na enak način povaljajte pokrivno folijo (5.3) z distančniki (0,25 mm) po drugi stekleni plošči. Položite ploščo vodoravno na nivelirno mizo.
 Dodajte 10 μl Temeda (4.1.3.1) v pripravljeno in razplinjeno gelsko raztopino (4.1.2), pomešajte in dodajte 10 μl raztopine PER (4.1.3.2), dobro premešajte in takoj enakomerno nalijte na sredino pokrivne folije. En rob nosilne plošče gela (folija naj bo obrnjena navzdol) položite na pokrivno folijo in jo počasi spuščajte, tako da se med folijami naredi film gela in se enakomerno ter brez mehurčkov razširi (slika 3). Pazljivo do konca spustite nosilno ploščo gela s tanko lopatico in nanjo položite še tri steklene plošče, ki bodo namenjene za uteži. Potem ko je polimerizacija končana (po približno 60 minutah), premestite polimerizirani gel na nosilno folijo skupaj s pokrivno folijo, tako da rahlo udarite po steklenih ploščah. Skrbno očistite hrbtno stran nosilne folije ostankov gela in sečnine. Zavarite gelov sendvič v filmski tulec in shranite v hladilnik (največ šest tednov).
 Opomba: Pokrivna folija z distančniki se lahko uporabi znova. Poliakrilamidni gel se lahko razreže v manjše kose, kar je priporočljivo zlasti, kadar je vzorcev malo ali če uporabljate avtomatsko elektroforezno napravo (dva gela, velikost 4,5 × 5 cm).
 6.3
 Izoelektrično fokusiranje
 Nastavite termostat za hlajenje na 12 °C. S kerozinom zbrišite hrbtno stran nosilne folije in kapnite nekaj kapljic kerozina (4.2) na sredo hladilnega bloka. Nato po njem povaljajte gelov sendvič z nosilno stranjo navzdol in pazite, da ne nastanejo mehurčki. Obrišite ves odvečni kerozin in odstranite pokrivno folijo. Prepojite elektrodna trakova z elektrodnima raztopinama (4.3, 4.4), odrežite ju v dolžini gela in postavite v pripravljene položaje (razdalja elektrod 9,5 cm).
 Pogoji za izoelektrično fokusiranje:
 6.3.1
 Velikost gela 265 × 125 × 0,25 mm
 Korak
 Čas
 (min)
 Napetost
 (V)
 Tok
 (mA)
 Moč
 (W)
 Volt ure
 (Vh)
 1. Predhodno fokusiranje
 30
 največ
 2 500
 največ
 15
 konstan. 4
 pribl. 300
 2. Vzorčno fokusiranje
 9
 60
 največ
 2 500
 največ
 15
 konstan. 4
 pribl. 1 000
 3. Končno fokusiranje
 60
 največ
 2 500
 največ
 5
 največ
 20
 pribl. 3 000
 40
 največ
 2 500
 največ
 6
 največ
 20
 pribl. 3 000
 30
 največ
 2 500
 največ
 7
 največ
 25
 pribl. 3 000
 Opomba:
 Če sta debelina ali širina gela spremenjeni, se morata ustrezno prilagoditi vrednosti za tok in moč (npr. podvojite vrednosti za električni tok in moč, če se uporabi gel 265 × 125 × 0,5 mm).
 6.3.2
 Primer programa napetosti za avtomatsko elektroforezno napravo (2 gela 5,0 × 4,5 cm), elektrodi brez trakov, ki se neposredno naneseta na gel
 Korak
 Napetost
 Tok
 Moč
 Začasna
 Volt ure
 1. Predhodno fokusiranje
 1 000 V
 10,0 mA
 3,5 W
 8 °C
 85 Vh
 2. Vzorčno fokusiranje
 250 V
 5,0 mA
 2,5 W
 8 °C
 30 Vh
 3. Fokusiranje
 1 200 V
 10,0 mA
 3,5 W
 8 °C
 80 Vh
 4. Fokusiranje
 1 500 V
 5,0 mA
 7,0 W
 8 °C
 570 Vh
 V koraku 2 postavite trak za nanos vzorca na 0 Vh.
 V koraku 2 odstranite trak za nanos vzorca pri 30 Vh.
 6.4
 Proteinsko obarvanje
 6.4.1
 Proteinsko fiksiranje
 Po izključitvi elektrike takoj odstranite elektrodna trakova in dajte gel v posodo za obarvanje/razbarvanje, napolnjeno z 200 ml fiksirja (4.9); pustite 15 minut in neprestano stresajte.
 6.4.2
 Umivanje in obarvanje gelske plošče
 Temeljito odtočite fiksir in dvakrat vsakič po 30 sekund spirajte gelsko ploščo s 100 ml raztopine za razbarvanje (4.10). Odlijte raztopino za razbarvanje in dopolnite posodo z 250 ml raztopine za obarvanje (4.11.3); počakajte 45 minut in z rahlim tresenjem omogočite, da se obarva.
 6.4.3
 Razbarvanje gelske plošče
 Odlijte raztopino za obarvanje, dvakrat sperite gelsko ploščo, pri čemer vsakič uporabite 100 ml raztopine za razbarvanje (4.10), nato 15 minut tresite z 200 ml raztopine za razbarvanje in najmanj dvakrat ali trikrat ponovite korak razbarvanja, dokler ozadje ne postane čisto in brezbarvno. Nato splaknite gelsko ploščo z destilirano vodo (2 × 2 minuti) in sušite na zraku (2 do 3 ure) ali s sušilnikom za lase (10–15 minut).
 Opomba 1:
 Fiksiranje, pomivanje, obarvanje in razbarvanje opravite pri temperaturi 20 °C. Ne uporabljajte visokih temperatur.
 Opomba 2:
 Če raje uporabljate bolj občutljivo obarvanje s srebrom (npr. oprema za obarvanje s srebrom, protein, Pharmacia Biotech, št. kode 17–1150–01), morate plazminsko obdelane kazeinske vzorce razredčiti do 5 mg/ml.
 7.OCENJEVANJE
 Ocenjevanje se izvaja s primerjavo proteinskih profilov neznanega vzorca z referenčnimi standardi na istem gelu. Zaznavanje kravjega mleka v sirih iz ovčjega, kozjega in bivoličjega mleka in mešanic ovčjega, kozjega in bivoličjega mleka se izvaja prek y3- in y2-kazeinov, katerih izoelektrične točke so v razponu med pH 6,5 in pH 7,5 (slike 4a, b in 5). Meja zaznavnosti je manj kot 0,5 %.
 7.1
 Vizualna ocena
 Za vizualno ocenitev količine mleka goveda je priporočljivo, da se koncentracije vzorcev in standardov prilagodijo za pridobitev iste stopnje intenzitete ovčjih, kozjih in/ali bivoličjih γ2- in γ3-kazeinov (glej „γ2 E,G,B“ in „γ3 E,G,B“ na slikah 4a, b in 5). Po tem se lahko neposredno presodi količina mleka goveda (manj kot, enako ali več kot 1 %) v neznanem vzorcu s primerjavo intenzitete kravjih γ3- in γ2-kazeinov (glej „γ3 C“ in „γ2 C“ na slikah 4a, b in 5) s tistimi od 0 % in 1 % referenčnih standardov (ovca, koza) ali laboratorijskimi vmesnimi standardi (bivolica).
 7.2
 Denzitometrijska ocena
 Za določitev razmerja površin pod vrhovi za goveja, ovčja, kozja in/ali bivoličja kazeina γ2 in γ3 (glej sliko 5) uporabite denzitometrijo (5.19), če je na voljo. Primerjajte to vrednost z razmerjem površin pod vrhovi γ2- in γ3-kazeinov 1-odstotnega referenčnega standarda (ovca, koza) ali laboratorijskega vmesnega standarda (bivolica), analiziranega na istem gelu.
 Opomba:
 Metoda deluje zadovoljivo, če se pokaže jasen pozitiven znak za goveja kazeina γ2 in γ3 v 1-odstotnem referenčnem standardu, vendar ne v 0-odstotnem referenčnem standardu. V nasprotnem primeru optimizirajte postopek tako, da natančno sledite podrobnostim metode.
 Vzorec se šteje za pozitivnega, če sta oba goveja kazeina γ2 in γ3 ali ustrezajoče razmerje površin pod vrhovi enako ali večje, kot je stopnja 1-odstotnega referenčnega standarda.
 8.VIRI
 Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A. in Bocca A., „Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins“, Milchwissenschaft 45, 1990, str. 708–711.
 Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A. in Del Giovine L., „A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting“, Milchwissenschaft 50, 1995, str. 83–85.
 Krause I., Berner I. in Klostermeyer H., „Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte – and carrier ampholyte/immobilized pH gradient – isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier“, v: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ur.), Bode-Verlag, München, 1989, str. 389–393.
 Krause Ι., Belitz H.–D. in Kaiser K.–P., „Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen“, Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 1982, str. 195–199.
 Radola, B. J., „Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50–100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films“, Electrophoresis 1, 1980, str. 43–56.
 Slika 1
 Shematska risba pokrivne folije
 Slika 2
 Kazeinska plast, ki po centrifugiranju plava med vodno in organsko fazo
 Slika 3
 Poklopna tehnika za ulivanje zelo tankih poliakrilamidnih gelov
 a = lepilni trak na distančniku (0,25 mm); b = pokrivna folija (5.3); c, e = stekleni plošči (5.1); d = gelska raztopina (4.1.2); f = nosilna folija gela (5.2)
 Slika 4a
 Izoelektrično fokusiranje plazminsko obdelanih kazeinov iz ovčjega in kozjega sira, ki vsebuje različne količine kravjega mleka
 % CM = odstotek kravjega mleka, C = krava, E = ovca, G = koza
 Prikazan je zgornji del gela izoelektričnega fokusiranja (IEF)
 Slika 4b
 Izoelektrično fokusiranje plazminsko obdelanih kazeinov iz sira, narejenega iz mešanic ovčjega, kozjega in bivoličjega mleka z vsebnostjo različnih količin kravjega mleka
 % CM = odstotek kravjega mleka; 1+ = vzorec vsebuje 1 % kravjega mleka, v sredini sledi pa ima dodatek čistega govejega kazeina. C = krava, E = ovca, G = koza, B = bivol
 Prikazana je skupna razdalja separacije za gel IEF.
 Slika 5
 Superpozicija denzitogramov standardnih vzorcev (SDT) in vzorcev sira, narejenega iz mešanice ovčjega, kozjega in bivoljega mleka po izometričnem fokusiranju
 a, b = standardi, ki vsebujejo 0 in 1 % kravjega mleka; c–g = vzorci sirov, ki vsebujejo 0, 1, 2, 3 in 7 % kravjega mleka. C = krava, E = ovca, G = koza.
 Zgornja polovica gela IEF je bila obdelana pri λ = 634 nm.
 PRILOGA IX
 Ocenjevanje analiz
 1. Zagotavljanje kakovosti
 Analize se opravijo v laboratorijih, ki so določeni v skladu s členom 12 Uredbe (ES) št. 882/2004
 10
 , ali jih določijo pristojni organi države članice.
 2. Vzorčenje in nesoglasja glede rezultatov analiz
 1. Vzorčenje se izvaja v skladu z ustrezno uredbo za zadevne proizvode. Če ni določb o vzorčenju, se uporabljajo določbe iz standarda ISO 707, mleko in mlečni proizvodi – smernice o vzorčenju.
 2. Laboratorijska poročila o rezultatih analiz vsebujejo zadostne podatke za oceno rezultatov, ki se opravi v skladu z dodatkom.
 3. Za analize, ki jih določajo pravila Unije, se vzamejo dvojni vzorci.
 4. Če pride do spora glede rezultatov, plačilna agencija poskrbi za ponovno izvedbo potrebne analize na zadevnem proizvodu, stroške pa krije stranka, ki spor izgubi.
 Zgoraj navedena analiza se opravi, če so na voljo zapečatene kopije vzorcev proizvoda, ki jih ustrezno hranijo pristojni organi. Proizvajalec plačilni agenciji pošlje zahtevek za izvedbo analize v 7 delovnih dneh po objavi rezultatov prve analize. Plačila agencija analizo izvede v 21 delovnih dneh po prejemu zahtevka.
 5. Rezultat pritožbe je dokončen.
 6. Če lahko proizvajalec v petih dneh po vzorčenju dokaže, da postopek vzorčenja ni potekal pravilno, se vzorčenje ponovi, kadar je mogoče. Če vzorčenja ni mogoče ponoviti, se analizirana pošiljka sprejme.
 Dodatek
 Ocena skladnosti pošiljke s pravno omejitvijo
 1. Princip
 Če zakonodaja o javni intervenciji in zasebnem skladiščenju podrobno določa postopke vzorčenja, se upoštevajo navedeni postopki. V vseh drugih primerih se uporabi vzorec vsaj treh vzorčnih enot, naključno izbranih iz pošiljke, ki se predloži v pregled. Pripravi se lahko sestavljen vzorec. Pridobljeni rezultat se primerja s pravnimi omejitvami z izračunom 95-odstotne stopnje natančnosti kot dvakratnega standardnega odmika, pri čemer je ustrezni standardni odmik odvisen od tega, (1) ali se metoda potrdi z mednarodnim sodelovanjem z vrednostmi za σr in σR ali (2) se v primeru znotrajlaboratorijske validacije izračuna interna obnovljivost. Ta stopnja natančnosti bo nato enaka merilni negotovosti rezultata.
 2. Metoda je validirana z mednarodnim sodelovanjem
 V tem primeru se določita standardni odmik ponovljivosti σr in standardni odmik obnovljivosti σR, medtem ko lahko laboratorij dokaže skladnost z učinkovitostjo validirane metode.
 Izračunajte aritmetično sredino
 za n ponovljenih meritev.
 Izračunajte razširjeno negotovost (k = 2)
 kot
 Če se končni rezultat x merjenja izračuna s formulo v obliki
 ,
 ,
 ali
 , je treba uporabiti običajne postopke za združevanje standardnih odmikov v takšnih primerih.
 Šteje se, da pošiljka ni v skladu z zgornjo pravno omejitvijo UL, če je
 ;
 sicer se šteje, da je v skladu z UL.
 Šteje se, da pošiljka ni v skladu s spodnjo pravno omejitvijo LL, če je
 ;
 sicer se šteje, da je v skladu z LL.
 3. ZNOTRAJLABORATORIJSKA VALIDACIJA Z IZRAČUNOM STANDARDNEGA ODMIKA INTERNE OBNOVLJIVOSTI
 Če se uporabljajo metode, ki niso določene v tej uredbi, in niso določene meritve za natančnost, se izvede znotrajlaboratorijska validacija. V formulah za izračun razširjene negotovosti U je treba ustrezno uporabiti standardni odmik interne ponovljivosti sir in standardni odmik interne obnovljivosti siR namesto σr in σR.
 Pravila, ki jih je treba upoštevati za določitev skladnosti s pravno omejitvijo, so navedena v točki 1. Če se pošiljka šteje kot neskladna s pravno omejitvijo, je treba meritve ponoviti na podlagi metode iz te uredbe ter rezultat oceniti v skladu s točko 1.“
 (1)
 Metodo, ki jo je treba uporabiti, odobri plačilna agencija.
 (2)
 Analize sežganih delcev se lahko opravljajo sistematično. Vendar pa je take analize treba opraviti vedno, če se ne izvajajo senzorični pregledi.
 (3)
 Metodo, ki jo je treba uporabiti, odobri plačilna agencija (eno ali obe metodi).
 (4)
 Metodo, ki jo je treba uporabiti, odobri plačilna agencija.
 (5)
 Senzorični pregledi se opravijo po potrebi na podlagi analize tveganja, ki jo odobri plačilna agencija.
 (6)
 Mednarodni standard IDF 135B/1991. Mleko in mlečni proizvodi. Značilnosti natančnosti analitskih metod. Prikaz postopka medlaboratorijske študije.
 (7)
 Metodo, ki jo je treba uporabiti, odobri plačilna agencija.
 (8)
 Izdelka Ampholine® pH 3,5–9,5 (Pharmacia) in Resolyte® pH 5–7 in pH 6–8 (BDH, Merck) sta se pokazala kot posebno primerna za pridobitev potrebnih ločitev γ–kazeinov.
 (9)
 Nanašanje vzorca: po predhodnem fokusiranju (korak 1) s pipeto nakapajte 18 μl vzorca in standardne raztopine na trakove za nanos vzorca (10 × 5 mm), jih položite na gel v razmiku 1 mm drug od drugega in 5 mm podolžno od anode ter rahlo pritisnite. Fokusiranje opravite pod navedenimi pogoji, po 60-minutnem fokusiranju vzorca previdno odstranite trakove za nanos vzorca.
 (10)


type: wikipedia

text:
(3864) Søren – planetoida z pasa głównego asteroid okrążająca Słońce w ciągu 4 lat i 74 dni w średniej odległości 2,6 j.a. Została odkryta 6 grudnia 1986 roku w obserwatorium astronomicznym w Brorfelde przez Poula Jensena. Nazwa planetoidy pochodzi od Sørena Augustesena, syna Karla Augustesena, kolegi odkrywcy. Przed jej nadaniem planetoida nosiła oznaczenie tymczasowe (3864) 1986 XF.
 Zobacz też
 lista planetoid 3001–4000
 lista ponumerowanych planetoid
 Bibliografia
 Linki zewnętrzne
 Nazwane planetoidy
 Planetoidy pasa głównego
 Obiekty astronomiczne odkryte w 1986


type: caselaw

jurisdiction: EU

text:
20150731059617102015/C 270/402812015TC27020150817BG01BGINFO_JUDICIAL20150526323322Дело T-281/15: Жалба, подадена на 26 май 2015 г. — Pirelli Tyre/СХВП (Пневматични покрития за колела на автомобили)
 ---documentbreak--- C2702015BG3220120150526BG0040322332Жалба, подадена на 26 май 2015 г. — Pirelli Tyre/СХВП (Пневматични покрития за колела на автомобили)
 (Дело T-281/15)2015/C 270/40Език на производството: италиански
 Страни
 Жалбоподател: Pirelli Tyre SpA (Милано, Италия) (представители: D. Caneva и G. Fucci, адвокати)
 Ответник: Служба за хармонизация във вътрешния пазар (марки, дизайни и модели) (СХВП)
 Данни за производството пред СХВП
 Спорен промишлен дизайн: промишлен дизайн на Общността (пневматични покрития за колела на автомобили) — заявка за регистрация No 4 700-0001
 Обжалвано решение: решение на трети апелативен състав на СХВП от 11 февруари 2015 г. по преписка R 1287/2014-3
 Искания
 Жалбоподателят моли Общия съд:
 —
 да отмени обжалваното решение,
 —
 да уважи искането за restitutio in integrum, направено от Pirelli Tyre SpA по смисъла на член 67 от Регламент (ЕО) No 6/2002 на Съвета относно промишления дизайн на Общността, като обяви за редовно плащането на таксата за запазване за втория 5-годишен период с удържане от текуща сметка No 000069, открита на името на Bugnion SpA, както и че въпросната регистрация понастоящем следователно поражда действие,
 —
 да осъди ответника да заплати съдебните разноски на Pirelli Tyre SpA, направени в хода на настоящото производство.
 Изложено основание
 —
 Нарушение на член 67 от Регламент (ЕО) No 6/2002 относно промишления дизайн на Общността.


text:
 9.10.2017
 HU
 Az Európai Unió Hivatalos Lapja
 C 338/7
 A Tribunale Amministrativo Regionale per il Lazio (Olaszország) által 2017. február 1-jén benyújtott előzetes döntéshozatal iránti kérelem – Enel Energia SpA kontra Autorità Garante della Concorrenza e del Mercato és társai
 (C-408/17. sz. ügy)
 (2017/C 338/07)
 Az eljárás nyelve: olasz
 A kérdést előterjesztő bíróság
 Tribunale Amministrativo Regionale per il Lazio
 Az alapeljárás felei
 Felperes: Enel Energia SpA
 Alperesek: Autorità Garante della Concorrenza e del Mercato, Autorità per l’Energia Elettrica il Gas e il Sistema Idrico, Autorità per le Garanzie nelle Comunicazioni
 Az előzetes döntéshozatalra előterjesztett kérdések
 1)
 Ellentétes-e a fogyasztók védelmére szolgáló „biztonsági hálóval” mint a 2005/29/EK „általános” irányelv (1) céljával, valamint konkrétan ezen irányelv (10) preambulumbekezdésével, 3. cikkének (4) bekezdésével és 5. cikkének (3) bekezdésével az a nemzeti szabály, amely a 2009/72/EK ágazati irányelvben (2) és a 2009/73/EK ágazati irányelvben (3) a fogyasztók védelme érdekében előírt különös kötelezettségek tiszteletben tartásának értékelését a tisztességtelen kereskedelmi gyakorlatokról szóló 2005/29/EK általános irányelv alkalmazása körébe utalja, és ebből következően kizárja az ágazati irányelv megsértésének megakadályozására hatáskörrel rendelkező ágazati hatóság, a jelen esetben az AEEGSI beavatkozását minden olyan esetben, amikor egyúttal teljesülhetnek a tisztességtelen kereskedelmi gyakorlat feltételei is?
 2)
 Úgy kell-e értelmezni a 2005/29/EK irányelv 3. cikkének (4) bekezdésében foglalt specialitás elvét, hogy az a szabályozások (általános és ágazati szabályozások), a rendelkezések (általános vagy különös rendelkezések) vagy még inkább a vonatkozó ágazatokat szabályozó és felügyelő hatóságok közötti kapcsolatokat szabályozza?
 3)
 A 2005/29/EK irányelv 3. cikkének (4) bekezdésében foglalt „összeütközés” fogalma csak a tisztességtelen kereskedelmi gyakorlatokra vonatkozó szabályozás rendelkezései és az uniós jogból eredő, a kereskedelmi gyakorlatok különös ágazati kérdéseit szabályozó egyéb szabályok közötti alapvető ellentét esetén áll-e fenn, vagy elegendő-e az, hogy a szóban forgó szabályok a tisztességtelen kereskedelmi gyakorlatokra vonatkozó szabályozástól eltérő olyan szabályozást írjanak elő, amely normák közötti összeütközéshez vezet a konkrét esettel összefüggésben?
 4)
 A 2005/29/EK irányelv 3. cikkének (4) bekezdésében foglalt közösségi szabályok fogalom kizárólag az európai rendeletekben és irányelvekben foglalt rendelkezésekre, és az azokat közvetlenül átültető rendelkezésekre utal-e, vagy az magában foglalja az uniós jogelveket átültető törvényi és rendeleti szintű rendelkezéseket is?
 5)
 Ellentétes-e a 2005/29/EK irányelv (10) preambulumbekezdésében és 3. cikkének (4) bekezdésében foglalt specialitás elvével, a 2009/72/EK irányelv 37. cikkével, valamint a 2009/73/EK irányelv 41. cikkével a vonatkozó nemzeti átültető rendelkezések olyan értelmezése, amely szerint, amennyiben egy ágazati „fogyasztói” szabályozást tartalmazó szabályozott ágazatban, amely az ágazati hatóságra ruházza a szabályozó és szankcionáló hatáskört, a 2005/29/EK irányelv 8. és 9. cikkében foglalt „agresszív gyakorlat” vagy a 2005/29/EK irányelv I. mellékletében foglalt „minden körülmény között agresszív gyakorlat” fogalmára visszavezethető magatartás valósul meg, mindig a tisztességtelen gyakorlatokra vonatkozó általános szabályozást kell alkalmazni, abban az esetben is, ha létezik a fogyasztók érdekében és az uniós jogi rendelkezések alapján elfogadott olyan ágazati szabályozás, amely részletesen szabályozza az „agresszív gyakorlatokat” és a „minden körülmény között agresszív gyakorlatokat”, vagy magukat az egyébként „tisztességtelen gyakorlatokat”?
 (1) A belső piacon az üzleti vállalkozások fogyasztókkal szemben folytatott tisztességtelen kereskedelmi gyakorlatairól, valamint a 84/450/EGK tanácsi irányelv, a 97/7/EK, a 98/27/EK és a 2002/65/EK európai parlamenti és tanácsi irányelvek, valamint a 2006/2004/EK európai parlamenti és tanácsi rendelet módosításáról szóló (a tisztességtelen kereskedelmi gyakorlatokról szóló irányelv) (HL 2005. L 149., 22. o.).
 (2) A villamos energia belső piacára vonatkozó közös szabályokról és a 2003/54/EK irányelv hatályon kívül helyezéséről szóló, 2009. július 13-i 2009/72/EK európai parlamenti és tanácsi irányelv (HL L 211., 55. o.).
 (3) A földgáz belső piacára vonatkozó közös szabályokról és a 2003/55/EK irányelv hatályon kívül helyezéséről szóló, 2009. július 13-i 2009/73/EK európai parlamenti és tanácsi irányelv (HL L 211., 94. o.).


type: legislation

text:
 5.1.2022
 IT
 Gazzetta ufficiale dell’Unione europea
 L 1/1
 REGOLAMENTO DI ESECUZIONE (UE) 2022/2 DELLA COMMISSIONE
 del 4 gennaio 2022
 che rettifica la versione in lingua francese del regolamento di esecuzione (UE) n. 1207/2011 della Commissione che stabilisce requisiti di prestazione e interoperabilità per la sorveglianza del cielo unico europeo
 (Testo rilevante ai fini del SEE)
 LA COMMISSIONE EUROPEA,
 visto il trattato sul funzionamento dell’Unione europea,
 visto il regolamento (UE) 2018/1139 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 4 luglio 2018, recante norme comuni nel settore dell’aviazione civile, che istituisce un’Agenzia dell’Unione europea per la sicurezza aerea e che modifica i regolamenti (CE) n. 2111/2005, (CE) n. 1008/2008, (UE) n. 996/2010, (UE) n. 376/2014 e le direttive 2014/30/UE e 2014/53/UE del Parlamento europeo e del Consiglio, e abroga i regolamenti (CE) n. 552/2004 e (CE) n. 216/2008 del Parlamento europeo e del Consiglio e il regolamento (CEE) n. 3922/91 del Consiglio (1), in particolare l’articolo 44, paragrafo 1, lettera a),
 considerando quanto segue:
 (1)
 La versione in lingua francese del regolamento di esecuzione (UE) n. 1207/2011 della Commissione (2) contiene errori nell’articolo 5, paragrafo 5, secondo comma, punto iii), e nell’articolo 8, paragrafo 8, che modificano il significato del testo.
 (2)
 È pertanto opportuno rettificare di conseguenza la versione in lingua francese del regolamento di esecuzione (UE) n. 1207/2011. La rettifica non riguarda le altre versioni linguistiche.
 (3)
 Le misure di cui al presente regolamento sono conformi al parere del comitato di cui all’articolo 127, paragrafo 1, del regolamento (UE) 2018/1139,
 HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO:
 Articolo 1
 (non riguarda la versione italiana)
 Articolo 2
 Il presente regolamento entra in vigore il ventesimo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale dell’Unione europea.
 Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri.
 Fatto a Bruxelles, il 4 gennaio 2022
 Per la Commissione
 La presidente
 Ursula VON DER LEYEN
 (1) GU L 212 del 22.8.2018, pag. 1.
 (2) Regolamento di esecuzione (UE) n. 1207/2011 della Commissione, del 22 novembre 2011, che stabilisce requisiti di prestazione e interoperabilità per la sorveglianza del cielo unico europeo (GU L 305 del 23.11.2011, pag. 35).


text:
 VYKONÁVACIE NARIADENIE KOMISIE (EÚ) .../...
 z 25. 1. 2022
 ktorým sa mení vykonávacie nariadenie (EÚ) 2019/1859, ktorým sa stanovujú pravidlá uplatňovania článku 10 nariadenia Európskeho parlamentu a Rady (EÚ) 2019/1242, pokiaľ ide o zber určitých údajov
 (Text s významom pre EHP)
 EURÓPSKA KOMISIA,
 so zreteľom na Zmluvu o fungovaní Európskej únie,
 so zreteľom na nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (EÚ) 2019/1242 z 20. júna 2019, ktorým sa stanovujú emisné normy CO2 pre nové ťažké úžitkové vozidlá a menia nariadenia Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 595/2009 a (EÚ) 2018/956 a smernica Rady 96/53/ES
 1
 , a najmä na jeho článok 10,
 keďže:
 (1)V článku 1 vykonávacieho nariadenia Komisie (EÚ) 2019/1859
 2
 sa výrobcom ukladá povinnosť, pokiaľ ide o určité nové ťažké úžitkové vozidlá, monitorovať a nahlasovať súbor vo formáte CSV („comma separated values“); tento súbor s príponou .vsum musí mať rovnaký názov ako príslušný pracovný súbor a musí obsahovať súhrnné výsledky za každý simulovaný účel použitia a stav užitočného zaťaženia, ktorý vygeneruje simulačný nástroj uvedený v článku 5 ods. 1 písm. a) nariadenia (EÚ) 2017/2400
 3
 vo verzii jeho grafického používateľského rozhrania (ďalej len súbor „sum exec data file“).
 (2)Táto povinnosť bola rozložená v čase podľa dátumu simulácie vozidiel; výsledky prvých simulácií (od 1. januára 2019 do 30. septembra 2019) majú byť nahlásené v neskoršom z dvoch dátumov nahlasovania stanovených vo vykonávacom nariadení (EÚ) 2019/1859, aby sa zohľadnila skutočnosť, že výrobcovia môžu byť nútení zopakovať simuláciu vozidiel patriacich do danej série z dôvodov, za ktoré nezodpovedajú.
 (3)Hodnotením údajov získaných za prvé vykazované obdobie s konečným termínom 30. septembra 2020 sa medzitým potvrdilo, že analýza založená na uvedenej prvej skupine súborov „sum exec data file“ poskytnutých podľa článku 1 ods. 2 písm. a) vykonávacieho nariadenia (EÚ) 2019/1859 priniesla stabilné výsledky. Preto už nie je potrebné vyžadovať od výrobcov povinnosť nahlasovať údaje uvedené v článku 1 ods. 2 písm. b) vykonávacieho nariadenia (EÚ) 2019/1859 a uvedený bod by sa mal vypustiť.
 (4)Vykonávacie nariadenie (EÚ) 2019/1859 by sa preto malo zodpovedajúcim spôsobom zmeniť.
 (5)Opatrenia stanovené v tomto nariadení sú v súlade so stanoviskom Výboru pre zmenu klímy,
 PRIJALA TOTO NARIADENIE:
 Článok 1
 Zmena vykonávacieho nariadenia (EÚ) 2019/1859
 V článku 1 ods. 2 vykonávacieho nariadenia (EÚ) 2019/1859 sa vypúšťa písmeno b).
 Článok 2
 Toto nariadenie nadobúda účinnosť tretím dňom po jeho uverejnení v Úradnom vestníku Európskej únie.
 Toto nariadenie je záväzné v celom rozsahu a priamo uplatniteľné vo všetkých členských štátoch.
 V Bruseli 25. 1. 2022
 Za Komisiu
 predsedníčka
 Ursula VON DER LEYEN
 (1)
 Ú. v. EÚ L 198, 25.7.2019, s. 202.
 (2)
 Vykonávacie nariadenie Komisie (EÚ) 2019/1859 zo 6. novembra 2019, ktorým sa stanovujú pravidlá uplatňovania článku 10 nariadenia Európskeho parlamentu a Rady (EÚ) 2019/1242, pokiaľ ide o zber určitých údajov (Ú. v. EÚ L 286, 7.11.2019, s. 10).
 (3)
 Nariadenie Komisie (EÚ) 2017/2400 z 12. decembra 2017, ktorým sa vykonáva nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 595/2009, pokiaľ ide o určovanie emisií CO2 a spotreby paliva ťažkých úžitkových vozidiel a ktorým sa mení smernica Európskeho parlamentu a Rady 2007/46/ES a nariadenie Komisie (EÚ) č. 582/2011 (Ú. v. EÚ L 349, 29.12.2017, s. 1).


text:
5.1.2002 DA De Europæiske Fællesskabers Tidende C 3/1
 I
 (Meddelelser)
 DOMSTOLEN
 DOMSTOLEN
 DOMSTOLENS DOM und Lohnausgleichskasse der Bauwirtschaft mod Tecnamb-
 Tecnologia do Ambiente Lda (sag C-53/98), Urlaubs- und
 Lohnausgleichskasse der Bauwirtschaft mod Turiprata Con-
 (Femte Afdeling)
 struções Civil Lda (sag C-54/98), Urlaubs- und Lohnausgleichs-
 kasse der Bauwirtschaft mod Duarte dos Santos Sousa (sag
 af 25. oktober 2001 C-68/98), Urlaubs- und Lohnausgleichskasse der Bauwirtschaft
 mod Santos & Kewitz Construções Lda (sag C-69/98), Portugaia
 i de forenede sager C-49/98, C-50/98, C-52/98, C-53/98, Construções Lda mod Urlaubs- und Lohnausgleichskasse der
 C-54/98 og C-68/98 — C-71/98, Finalarte Sociedade de Bauwirtschaft (sag C-70/98) og Engil Sociedade de Construção
 Construção Civil Lda mod Urlaubs- und Lohnausgleichs- Civil SA mod Urlaubs- und Lohnausgleichskasse der Bauwirt-
 kasse der Bauwirtschaft, Urlaubs- und Lohnausgleichs- schaft (sag C-71/98), at opnå en præjudiciel afgørelse vedrøren-
 kasse der Bauwirtschaft mod Amilcar Oliveira Rocha de fortolkningen af EF-traktatens artikel 48 og 59 (efter
 m.fl., Portugaia Construções Lda mod Urlaubs- und Loh- ændring nu artikel 39 EF og 49 EF), af EF-traktatens artikel 60
 nausgleichskasse der Bauwirtschaft, og Engil Sociedade (nu artikel 50 EF) samt af artikel 3, stk. 1, første afsnit, andet
 de Construção Civil SA mod Urlaubs- und Lohnaus- led, litra b), i Europa-Parlamentets og Rådets direktiv 96/71/EF
 gleichskasse der Bauwirtschaft (anmodning om præjudici- af 16. december 1996 om udstationering af arbejdstagere som
 el afgørelse fra Arbeitsgericht Wiesbaden) (1) led i udveksling af tjenesteydelser (EFT 1997 L 18, s. 1), har
 Domstolen (Femte Afdeling), sammensat af afdelingsforman-
 den, P. Jann, og dommerne D.A.O. Edward (refererende
 (»Fri udveksling af tjenesteydelser — midlertidig udstatione- dommer) og L. Sevón; generaladvokat: J. Mischo; justitssekre-
 ring med henblik på opfyldelse af kontrakt — betalt ferie og tær: ekspeditionssekretær H.A. Rühl, den 25. oktober 2001
 feriegodtgørelse«) afsagt dom, hvis konklusion lyder således:
 (2002/C 3/01)
 (Processprog: tysk)
 (Foreløbig oversættelse. Den endelige oversættelse vil blive offentlig-
 gjort i Samling af Afgørelser) 1) EF-traktatens artikel 59 (efter ændring nu artikel 49 EF) og
 artikel 60 (nu artikel 50 EF) er ikke til hinder for, at en
 medlemsstat pålægger en virksomhed med hjemsted i en
 anden medlemsstat, som leverer en tjenesteydelse på den første
 I de forenede sager C-49/98, C-50/98, C-52/98, C-53/98, medlemsstats område, at overholde nationale bestemmelser
 C-54/98 og C-68/98 — C-71/98, angående en anmodning, som dem, der er omhandlet i § 1, stk. 3, 1. pkt., i
 som Arbeitsgericht Wiesbaden (Tyskland) i medfør af EF- Arbeitnehmerentsendegesetz (den tyske lov om udstationering
 traktatens artikel 177 (nu artikel 234 EF) har indgivet til af arbejdstagere), hvorefter arbejdstagere, som virksomheden
 Domstolen for i de for nævnte ret verserende sager, Finalarte har udstationeret med henblik på denne tjenesteydelse, sikres et
 Sociedade de Construção Civil Lda mod Urlaubs- und Lohnaus- krav på betalt ferie, forudsat dels, at arbejdstagerne ikke har en
 gleichskasse der Bauwirtschaft (sag C-49/98), Urlaubs- und i det væsentlige tilsvarende beskyttelse i henhold til bestemmel-
 Lohnausgleichskasse der Bauwirtschaft mod Amilcar Oliveira serne i den medlemsstat, hvor deres arbejdsgiver har hjemsted,
 Rocha (sag C-50/98), Urlaubs- und Lohnausgleichskasse der således at anvendelsen af de nationale bestemmelser i den første
 Bauwirtschaft mod Tudor Stone Ltd (sag C-52/98), Urlaubs- medlemsstat dermed yder dem en reel fordel, som på væsentlig
 ---pagebreak--- C 3/2 DA De Europæiske Fællesskabers Tidende 5.1.2002
 måde bidrager til deres sociale beskyttelse, dels at anvendelsen DOMSTOLENS DOM
 af den første medlemsstats bestemmelser er forholdsmæssig i
 relation til det forfulgte formål af almen interesse.
 (Sjette Afdeling)
 2) a) Traktatens artikel 59 og 60 er ikke til hinder for, at en
 medlemsstats bestemmelser, hvorefter der gælder en læn- af 20. september 2001
 gere betalt ferie end den, der følger af Rådets direktiv
 93/104/EF af 23. november 1993 om visse aspekter i
 forbindelse med tilrettelæggelse af arbejdstiden, i udstatio- I sag C-263/98, Kongeriget Belgien mod Kommissionen
 neringsperioden udstrækkes til at omfatte arbejdstagere, for De Europæiske Fællesskaber (1)
 som er udstationeret til denne medlemsstat af tjenesteydere
 med hjemsted i andre medlemsstater.
 (»EUGFL — afslutning af regnskaber — regnskabsåret
 1994 — korn og oksekød«)
 b) I det omfang det er begrundet som følge af objektive
 forskelle mellem på den ene side virksomheder med
 hjemsted i Forbundsrepublikken Tyskland og på den anden (2002/C 3/02)
 side virksomheder med hjemsted i andre medlemsstater, er
 traktatens artikel 59 og 60 ikke er til hinder for nationale
 bestemmelser, som tildeler de førstnævnte virksomheder en
 ret til refusion fra feriekassen af de beløb, som de har (Processprog: nederlandsk)
 udbetalt i feriegodtgørelse og ferietillæg, mens bestemmel-
 serne ikke giver de sidstnævnte virksomheder denne ret,
 men i stedet giver de udstationerede arbejdstagere et (Foreløbig oversættelse. Den endelige oversættelse vil blive offentlig-
 direkte krav over for denne kasse. gjort i Samling af Afgørelser)
 c) Det tilkommer den forelæggende ret under hensyn til
 proportionalitetsprincippet at fastlægge de typer oplys-
 ninger, som de tyske myndigheder lovligt kan kræve fra I sag C-263/98, Kongeriget Belgien (befuldmægtigede: J. De-
 tjenesteydere med hjemsted uden for Tyskland. Til brug vadder, derefter A. Snoecx, bistået af H. Gilliams) mod
 herfor bør den forelæggende ret foretage en vurdering af, Kommissionen for De Europæiske Fællesskaber (befuldmægti-
 om objektive forskelle mellem situationen for virksomheder get: H. van Vliet), hvori der er nedlagt påstand om delvis
 med hjemsted i Tyskland og situationen for virksomheder annullation af Kommissionens beslutning 98/358/EF af 6. maj
 med hjemsted uden for Tyskland sagligt nødvendiggør de 1998 om afslutning af medlemsstaternes regnskaber over de
 yderligere oplysninger, som de sidstnævnte virksomheder udgifter, som de har afholdt for Den Europæiske Udviklings-
 afkræves. og Garantifond for Landbruget, Garantisektionen, i 1994 (EFT
 L 163 s. 28), for så vidt angår udelukkelse af udgifter på
 382 208 436 BEF, som den sagsøgende medlemsstat har
 afholdt inden for rammerne af den forskudsvis udbetaling af
 3) Traktatens artikel 59 og 60 er til hinder for, at en medlemsstats eksportrestitutioner, har Domstolen (Sjette Afdeling), sammen-
 ordning vedrørende betalt ferie finder anvendelse på alle sat af afdelingsformanden, C. Gulmann, dommerne J.-P. Puisso-
 virksomheder med hjemsted i andre medlemsstater, som leverer chet, R. Schintgen, F. Macken (refererende dommer) og
 tjenesteydelser inden for byggesektoren på den første medlems- J.N. Cunha Rodrigues; generaladvokat: S. Alber; justitssekretær:
 stats område, når virksomheder med hjemsted i den første ekspeditionssekretær H.A. Rühl, den 20. september 2001
 medlemsstat, som kun udøver en del af deres virksomhed inden afsagt dom, hvis konklusion lyder således:
 for denne sektor, ikke alle er omfattet af ordninger for deres
 arbejdstagere, der er beskæftiget inden for denne sektor.
 1) Kommissionen for De Europæiske Fællesskaber frifindes.
 2) Kongeriget Belgien betaler sagens omkostninger.
 ( 1) EFT C 137 af 2.5.1998; EFT C 166 af 30.5.1998.
 (1) EFT C 278 af 5.9.1998.


type: other

text:
BFH, Urteil v. 14.09.1994 - I R 136/93 - NWB Urteile
 Dokument BFH, Urteil v. 14.09.1994 - I R 136/93
 BFH Urteil v. 14.09.1994 - I R 136/93 BStBl 1995 II S. 382
 Gesetze: AO 1977 §§ 118, 163EStG § 57 Abs. 4EStG DDR §§ 2 Abs. 1, 25 Abs. 1DMBilG § 53VWWSU Art. 1 Abs. 1Anlage VWWSU Art. 2 Satz 1StÄndG DDR § 1 Abs. 1GewStG § 36 Abs. 5aHGB § 244AO über den Abschluß der Buchführung in Mark der DDR § 2 Abs.1
 1. Die im Beitrittsgebiet ergangenen Bescheide über die Steuerrate 1990 können mehrere selbständig anfechtbare Verwaltungsakte enthalten - 2. Die in diesen Bescheiden vorgenommene Halbierung der auf das 1. Halbjahr 1990 entfallenden Steuer ist eine Billigkeitsmaßnahme - 3. Die in den Bescheiden enthaltene Aufteilung der auf das 1. und 2. Halbjahr entfallenden Steuern dient nur der Ermittlung dieser abweichenden Steuerfestsetzung und enthält keine gesonderten Steuerfestsetzungen für das 1. und 2. Halbjahr
 1. Die im Beitrittsgebiet ergangenen Bescheide über die Steuerrate 1990 können mehrere selbständig anfechtbare Verwaltungsakte enthalten.
 2. Die in diesen Bescheiden vorgenommene Halbierung der auf das 1. Halbjahr 1990 entfallenden Steuer ist eine Billigkeitsmaßnahme.
 3. Die in den Bescheiden enthaltene Aufteilung der auf das 1. und 2. Halbjahr entfallenden Steuern dient nur der Ermittlung dieser abweichenden Steuerfestsetzung und enthält keine gesonderten Steuerfestsetzungen für das 1. und 2. Halbjahr.
 FG Baden-Württemberg 24.3.2015 - 14 K 1835/14
 BFH 24.4.2003 - VII R 3/02
 FG Sachsen 5.6.2001 - 2 K 1999/00
 BFH 17.12.1997 - III R 194/94
 BFH 21.10.1997 - IX R 29/95
 BFH 1.8.1996 - VIII R 6/95
 BFH 26.9.1995 - VIII R 70/94
 BFH 8.8.1995 - III R 263/94
 BFH 25.7.1995 - VIII R 25/94
 BStBl 1995 II Seite 382
 WAAAA-95206
 BFH, Urteil v. 14.09.1994 - I R 136/93 ablegen in?


text:
Vyhláška č. 1/2003 | www.pasovice.cz
 Úvodní stránka > Vyhláška č. 1/2003
 Obecně závazná vyhláška obce Pašovice o místním poplatku za provoz systému shromažďování, sběru, přepravy, třídění, využívání a odstraňování komunálních odpadů.
 Zastupitelstvo obce Pašovice vydává dne 12. 12. 2002 podle ustanovení § 15 zákona č. 565/1990 Sb., o místních poplatcích, ve znění pozdějších předpisů, a v souladu s ustanoveními § 10 písm. a) a § 84 odst. 2 písm. i) zákona č. 128/2000 Sb., o obcích (obecní zřízení) ve znění pozdějších předpisů, tuto obecně závaznou vyhlášku.
 Správu poplatku vykonává obecní úřad v Pašovicích (dále jen „správce poplatku“) a v řízení ve věcech poplatku se postupuje podle zákona č. 337/1992 Sb., o správě daní a poplatků, ve znění pozdějších předpisů, pokud zákon č. 565/1990 Sb., o místních poplatcích, ve znění pozdějších předpisů, nestanoví jinak.
 Sazba poplatku pro poplatníka podle Čl. 2 písm. a) a b) této vyhlášky činí 310,- Kč a je tvořena
 a) z částky 64,- Kč za kalendářní rok – jedná se o poplatek za provoz systému shromažďování, sběru, přepravy, třídění, využívání a odstraňování komunálních odpadů,
 b) z částky 246,- Kč za kalendářní rok.
 Skutečné náklady v roce 2002 činily 252.640,10 Kč a byly rozúčtovány takto:
 poplatek za uložení odpadu 37.736,00
 manipulační poplatek 89.434,70
 uložení směsného komunálního odpadu 62.219,10
 rekultivační rezerva 13.826,40
 odvoz odpadu ramenovým nakladačem – km 10.857,00
 výkon RN na místě 6.184,50
 uložení odpadu z van (31 svozů) 26.933,10
 rekultivační rezerva 5.449,30
 Počet obyvatel k 1.1.2002: 714.
 Od poplatku jsou osvobozeni občané, kteří se prokazatelně celoročně zdržují mimo území obce nebo státu.
 Vznik nároku na osvobození je poplatník povinen oznámit správci poplatku písemně nebo ústně do protokolu ve lhůtě do 15 dnů ode dne, kdy nastala skutečnost zakládající nárok na osvobození. Ve stejné lhůtě a stejným způsobem je poplatník povinen správci poplatku oznámit zánik nároku na osvobození.
 Poplatek je splatný nejpozději do 28. 2. 2004.
 Poplatník podle Čl. 2 písm. a) této vyhlášky je povinen ohlásit správci poplatku zánik jeho poplatkové povinnosti v důsledku změny trvalého pobytu v obci, a to nejpozději do 10 dnů ode dne, kdy tato změna nastala.
 Poplatník podle Čl. 2 písm. b) této vyhlášky je povinen ohlásit správci poplatku zánik jeho poplatkové povinnosti v důsledku změny vlastnictví ke stavbě určené nebo sloužící individuální rekreaci, a to nejpozději do 10 dnů ode dne, kdy tato změna nastala.
 Nebude-li poplatek zaplacen včas nebo ve správné výši, vyměří správce poplatku tento poplatek platebním výměrem a může zvýšit včas nezaplacený poplatek až o 50 %. Vyměřený poplatek se zaokrouhluje na celé koruny nahoru.
 Obecně závazná vyhláška č. 1/2002 o místním poplatku za provoz systému shromažďování, sběru, přepravy, třídění, využívání a odstraňování komunálních odpadů ze dne 13.12.2002 se zrušuje.
 Jaromír Čáp v. r.
 Josef Gajdůšek v. r.


text:
Wanderers F.C. Rugby Club est un club de rugby irlandais basé dans la ville de Dublin, en Irlande qui évolue dans le championnat irlandais de Deuxième Division. Le club est affilié à la fédération du Leinster et ses joueurs peuvent être sélectionnés pour l’équipe représentative de la région, Leinster Rugby.
 Histoire
 Fondé en 1870 par des membres du Dublin University FC, le premier club irlandais parfois considéré comme le plus ancien club de rugby du monde, le club des Wanderers est le second plus vieux club d'Irlande. Ainsi Dublin University a pu affronter un adversaire. Le club est un des clubs fondateurs de l'Irish Rugby Football Union (IRFU). Le club a eu dans ses rans 87 joueurs internationaux irlandais, 5 capitaines de l'Irlande et un capitaine de l'Angleterre et de l'Australie en plus d'un capitaine des Lions.
 Palmarès
 Leinster Club Senior Cup (14) : 1885, 1888, 1894, 1906, 1911, 1947, 1954, 1959, 1973, 1978, 1982, 1984, 1990
 Metropolitan Cup (5) : 1924, 1954, 1986, 1987, 1992
 Joueurs célèbres
 ALLEN W.S. 1875(1)
 BARLOW, M. 1875 (1)
 BLANEY, J. 1950 (1)
 BORNEMANN W. 1960 (4)
 BRADSHAM R.M. 1885 (2)
 BRADY J. 1976 (2)
 BROWNING, D.R. 1881 (2)
 BURNS, I. 1980 (1)
 CADDELL, E.D. 1904 (13)
 Coo Clinch 1892-1897 (10 sélections en équipe nationale)
 Jammie Clinch 1923-1931 (30 sélections en équipe nationale)
 COLLIS, W.R.F. 1924 (7)
 COLLIS, W.S. 1884 (1)
 CORLEY, H.H. 1902 (8)
 COTTON, J. 1889 (1)
 Tom Crean 1894-1896 (9 sélections en équipe nationale)
 CULLITON, G. 1959 (19)
 Ronnie Dawson 1958-1964 (27 sélections en équipe nationale)
 DOYLE, T. 1967 (3)
 ENNIS, F. 1979 (1)
 ENSOR, A.H. 1973 (21)
 FAGAN, C. 1956 (3)
 FITZGERALD, J. 1884 (10)
 FITZPATRICK, M. 1978 (10)
 FLYNN, K. 1959 (22)
 FORREST, A.J. 1880 (7)
 Edmund Forrest 1888-1897 (13 sélections en équipe nationale et capitaine)
 FORREST, H. 1893 (2)
 Mike Gibson 1964-1979 (45 sélections en équipe nationale)
 GIFFORD, C.N.H. 1890 (1)
 GRAVES, C.R.A. 1934 (15)
 GRIFFIN, J.L. 1949 (2)
 HALPIN, G. 1990 (4)
 HAMILTON,R.W. 1893 (1)
 HARVEY, F.M.W. 1907 (2)
 HARVEY, G.A.D. 1903 (5)
 HEWSON, F.T. 1875 (10)
 HOLLAND, J. 1981 (3)
 JACKSON, A.R.V. 1911 (10)
 JEFFARES, E.W. 1913 (2)
 JOHNSON, R. 1893 (2)
 James Kavanagh 1953-1962 (37 sélections en équipe nationale)
 Patrick Kavanagh 1952 (2)
 KEARNEY, R. 1982 (4)
 KELLY, W. 1884 (1)
 KENNY, P. 1992 (1)
 KENNEDY, F. 1880 (3)
 KENNEDY, P.A. 1904 (2)
 KENNEDY, J.M. 1882 (2)
 LEAHY, K. 1992 (1)
 LEVIS,F.H. 1884 (1)
 McCORMAC, F.P. 1909 (3)
 McCORMICK, W.J. 1930 (1)
 Robbie McGrath 1977-1984 (16 sélections en équipe nationale)
 Freddie McLennan 1977-1981 (18 sélections en équipe nationale)
 Phillip Matthews 1984-1992 (38 sélections en équipe nationale)
 MATTSON, J. 1948 (1)
 MILLER, F.H. 1886 (1)
 MOORE, D.F. 1883 (4)
 MOORE, F.W. 1884 (4)
 Andy Mulligan 1956-1961 (19 sélections en équipe nationale)
 MURRAY, P.F. 1927 (19)
 NOTLEY,J.R. 1952 (2)
 O'NEILL, W. 1952 (2)
 PARR, J.S. 1914 (4)
 PATTERSON, R.D.A. 1912 (8)
 POTTERTON, H.N. 1920 (1)
 RIDGEWAY, E.C. 1932 (5)
 ROCHE, J. 1890 (7)
 SCHUTE, F. 1878 (2)
 SEXTON, W. 1995 (3)
 SOLOMONS, B. 1908 (10)
 SPUNNER, H. F. 1881 (3)
 STOKER, E.W. 1882 (2)
 STOKER, F.O. 1886 (5)
 Mark Sugden 1925-1931 (28 sélections en équipe nationale)
 TECTOR, W. 1955 (3)
 THORNHILL, T.E. 1892 (4)
 THRIFT, H. 1904 (18)
 WALLACE, JAMES 1904 (2)
 WALLACE, JOSEPH 1903 (9)
 WALLIS, A.K. 1892 (5)
 WALLIS, C.O.N. 1936 (1)
 WALLIS, T.G. 1921 (5)
 WALLIS, W.A. 1880 (5)
 WATSON, R. 1913 (1)
 WILKINSON, R.W. 1948 (1)
 GREGORY, J. 1948 (1)
 MIDDLETON, J.A. 1922 (1)
 NEWBOLD, C.J. 1904 (3)
 YOUNG, P.D. 1954 (9)
 FRAWLEY, D. 1986 (12)
 HOWARD, P. 1993 (10)
 SLACK, A. 1978 (38)
 WALKER, L. 1988 (7)
 Liens externes
 Site officiel
 Club de rugby à XV à Dublin
 Club de rugby à XV fondé en 1870