text:
 28.4.2016
 BG
 Официален вестник на Европейския съюз
 L 114/12
 РЕГЛАМЕНТ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ (ЕС) 2016/660 НА КОМИСИЯТА
 от 27 април 2016 година
 за установяване на стандартни стойности при внос с цел определяне на входната цена на някои плодове и зеленчуци
 ЕВРОПЕЙСКАТА КОМИСИЯ,
 като взе предвид Договора за функционирането на Европейския съюз,
 като взе предвид Регламент (ЕC) No 1308/2013 на Европейския парламент и на Съвета от 17 декември 2013 г. за установяване на обща организация на селскостопанските пазари и за отмяна на регламенти (ЕИО) No 922/72, (ЕИО) No 234/79, (ЕО) No 1037/2001 и (ЕО) No 1234/2007 (1),
 като взе предвид Регламент за изпълнение (ЕС) No 543/2011 на Комисията от 7 юни 2011 г. за определяне на подробни правила за прилагането на Регламент (ЕО) No 1234/2007 на Съвета по отношение на секторите на плодовете и зеленчуците и на преработените плодове и зеленчуци (2), и по-специално член 136, параграф 1 от него,
 като има предвид, че:
 (1)
 В изпълнение на резултатите от Уругвайския кръг на многостранните търговски преговори в Регламент за изпълнение (ЕС) No 543/2011 са посочени критериите, по които Комисията определя стандартните стойности при внос от трети държави за продуктите и периодите, посочени в приложение XVI, част A от същия регламент.
 (2)
 Стандартната стойност при внос се изчислява за всеки работен ден съгласно член 136, параграф 1 от Регламент за изпълнение (ЕС) No 543/2011, като се вземат под внимание променливите данни за всеки ден. В резултат на това настоящият регламент следва да влезе в сила в деня на публикуването му в Официален вестник на Европейския съюз,
 ПРИЕ НАСТОЯЩИЯ РЕГЛАМЕНТ:
 Член 1
 Стандартните стойности при внос, посочени в член 136 от Регламент за изпълнение (ЕС) No 543/2011, са определени в приложението към настоящия регламент.
 Член 2
 Настоящият регламент влиза в сила в деня на публикуването му в Официален вестник на Европейския съюз.
 Настоящият регламент е задължителен в своята цялост и се прилага пряко във всички държави членки.
 Съставено в Брюксел на 27 април 2016 година.
 За Комисията,
 от името на председателя,
 Jerzy PLEWA
 Генерален директор на генерална дирекция „Земеделие и развитие на селските райони“
 (1) ОВ L 347, 20.12.2013 г., стр. 671.
 (2) ОВ L 157, 15.6.2011 г., стр. 1.
 ПРИЛОЖЕНИЕ
 Стандартни стойности при внос за определяне на входната цена на някои плодове и зеленчуци
 (EUR/100 kg)
 Код по КН
 Код на третa държавa (1)
 Стандартна стойност при внос
 0702 00 00
 IL
 268,0
 MA
 85,8
 ZZ
 176,9
 0707 00 05
 MA
 83,0
 TR
 118,9
 ZZ
 101,0
 0709 93 10
 MA
 95,4
 TR
 127,5
 ZZ
 111,5
 0805 10 20
 AR
 115,8
 EG
 47,1
 IL
 85,1
 MA
 58,1
 TR
 39,9
 ZZ
 69,2
 0808 10 80
 AR
 123,2
 BR
 100,4
 CL
 112,7
 CN
 73,3
 NZ
 147,2
 US
 199,1
 ZA
 94,3
 ZZ
 121,5
 0808 30 90
 AR
 122,3
 CL
 93,3
 CN
 62,0
 ZA
 111,8
 ZZ
 97,4
 (1) Номенклатура на държавите, определена с Регламент (ЕC) No 1106/2012 на Комисията от 27 ноември 2012 година за прилагане на Регламент (ЕО) No 471/2009 на Европейския парламент и на Съвета относно статистиката на Общността за външната търговия с трети страни по отношение на актуализиране на номенклатурата на държавите и териториите (ОВ L 328, 28.11.2012 г., стр. 7). Код „ZZ“ означава „с друг произход“.


type: wikipedia

text:
Narsarsuaq är en by i området Södra Grönland ca 44 km väster om Narsaq, grundad 1941. Byn har 145 invånare 2015 och ligger nära Narsarsuaq flygplats.
 Narsarsuaq betyder bokstavligen Den Stora Planen. En äldre stavning av bynamnet är Narssarssuaq.
 Narsarsuaq är en av få platser på Grönland där månadsmedeltemperaturen överstiger +10 grader Celsius (i juli). Detta innebär att Narsarsuaq inte har arktiskt klimat. Det är ändå bara 10 km uppåt dalen till en tunga av inlandsisen. Det växer buskar här, bland annat av vide och björk. Det finns en botanisk trädgård kallad Arboretum Groenlandicum, med en stor samling planterade träd, bland annat gran, tall och lärk.
 Historia
 Nära Narsarsuaq låg den främsta bebyggda platsen på Grönland under Erik Rödes tid, vars gård Brattahlíð tros ha varit placerad väster om bosättningen, tvärs över fjorden.
 1941 byggde USA en flygbas vid Narsarsuaq kallad Bluie West One. Tusentals plan tankade här på väg från flygplansfabriker i Nordamerika till krigszonen i Europa. Flygbasen användes efter kriget för civila plan och blev senare helt civil.
 Referenser
 Noter
 Orter på Grönland


type: legislation

jurisdiction: EU

text:
 29.4.2020
 PL
 Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej
 L 137/1
 ROZPORZĄDZENIE WYKONAWCZE RADY (UE) 2020/582
 z dnia 28 kwietnia 2020 r.
 dotyczące wykonania art. 17 ust. 1 rozporządzenia (UE) nr 224/2014 w sprawie środków ograniczających w związku z sytuacją w Republice Środkowoafrykańskiej
 RADA UNII EUROPEJSKIEJ,
 uwzględniając Traktat o funkcjonowaniu Unii Europejskiej,
 uwzględniając rozporządzenie Rady (UE) nr 224/2014 z dnia 10 marca 2014 r. w sprawie środków ograniczających w związku z sytuacją w Republice Środkowoafrykańskiej (1), w szczególności jego art. 17 ust. 1,
 uwzględniając wniosek Wysokiego Przedstawiciela Unii do Spraw Zagranicznych i Polityki Bezpieczeństwa,
 a także mając na uwadze, co następuje:
 (1)
 W dniu 10 marca 2014 r. Rada przyjęła rozporządzenie (UE) nr 224/2014.
 (2)
 W dniu 20 kwietnia 2020 r. Komitet Rady Bezpieczeństwa Organizacji Narodów Zjednoczonych (RB ONZ), powołany na podstawie rezolucji RB ONZ nr 2127 (2013), dodał jedną osobę do wykazu osób i podmiotów objętych środkami ograniczającymi.
 (3)
 Należy zatem odpowiednio zmienić załącznik I do rozporządzenia (UE) nr 224/2014,
 PRZYJMUJE NINIEJSZE ROZPORZĄDZENIE:
 Artykuł 1
 W załączniku I do rozporządzenia (UE) nr 224/2014 wprowadza się zmiany zgodnie z załącznikiem do niniejszego rozporządzenia.
 Artykuł 2
 Niniejsze rozporządzenie wchodzi w życie z dniem jego opublikowania w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej.
 Niniejsze rozporządzenie wiąże w całości i jest bezpośrednio stosowane we wszystkich państwach członkowskich.
 Sporządzono w Brukseli dnia 28 kwietnia 2020 r.
 W imieniu Rady
 G. GRLIĆ RADMAN
 Przewodniczący
 (1) Dz.U. L 70 z 11.3.2014, s. 1.
 ZAŁĄCZNIK
 Do wykazu zawartego w części A (Osoby) załącznika I do rozporządzenia (UE) nr 224/2014 dodaje się następującą osobę:
 A. Osoby
 „13. Martin KOUMTAMADJI (alias: a) Abdoulaye Miskine b) Abdoullaye Miskine c) Martin Nadingar Koumtamadji d) Martin Nkoumtamadji e) Martin Koumta Madji f) Omar Mahamat)
 Funkcja: Przewodniczący i głównodowodzący Demokratycznego Frontu Ludu Środkowoafrykańskiego (FDPC)
 Data urodzenia: a) 5 października 1965 r., b) 3 marca 1965 r.
 Miejsce urodzenia: a) Ndïnaba, Czad, b) Kobo, Republika Środkowoafrykańska, c) Kabo, Republika Środkowoafrykańska
 Obywatelstwo: a) Czad, b) Republika Środkowoafrykańska
 Nr paszportu: 06FBO2262 (paszport dyplomatyczny Republiki Środkowoafrykańskiej) wydany 22 lutego 2007 r., ważny do 21 lutego 2012 r.
 Adres: Sama Dafock, prefektura Vakaga, Republika Środkowoafrykańska (ostatni znany adres)
 Data wskazania przez ONZ:20 kwietnia 2020 r.
 Inne informacje: Martin Koumtamadji założył FDPC w 2005 r. W grudniu 2012 r. przyłączył się do koalicji Séléka, a następnie opuścił ją w kwietniu 2013 r. po przejęciu władzy przez rebeliantów w Bangi. Po aresztowaniu w Kamerunie został następnie przeniesiony do Brazzaville w Republice Konga. Zawsze stał na czele swoich oddziałów na miejscu w Republice Środkowoafrykańskiej, nawet gdy znajdował się w Brazzaville przed powrotem do Republiki Środkowoafrykańskiej (w okresie od listopada 2014 r. do 2019 r.). 6 lutego 2019 r. FDPC podpisał porozumienie polityczne na rzecz pokoju i pojednania w Republice Środkowoafrykańskiej, jednak Martin Koumtamadji pozostaje zagrożeniem dla pokoju, stabilności i bezpieczeństwa Republiki Środkowoafrykańskiej.
 Informacje pochodzące z opisowego streszczenia powodów umieszczenia w wykazie dostarczonego przez Komitet Sankcji:
 Przewodniczący i głównodowodzący Demokratycznego Frontu Ludu Środkowoafrykańskiego (FDPC, grupa zbrojna prowadząca działalność z użyciem przemocy) Martin Koumatamadji brał udział w działaniach zagrażających pokojowi, stabilności i bezpieczeństwu Republiki Środkowoafrykańskiej, a w szczególności zagrażających realizacji porozumienia politycznego na rzecz pokoju i pojednania w Republice Środkowoafrykańskiej, podpisanego 6 lutego 2019 r. w Bangi.
 Odmówił rozbrojenia bojowników FDPC, zgodnie z jego zobowiązaniami jako sygnatariusza porozumienia politycznego na rzecz pokoju i pojednania w Republice Środkowoafrykańskiej, i w lipcu 2019 r. zagroził obaleniem prezydenta Touadéry.
 W czerwcu 2019 r. rozpoczął współpracę z obłożonym sankcjami Nourredine’em Adamem (CFi.002) i zaangażował się – z bliskim współpracownikiem Nourredine’a Adama – w nielegalny handel bronią, by zwiększyć zdolności wojskowe FDPC.
 Złożył również Ludowemu Ruchowi na rzecz Odrodzenia Afryki Środkowej (FPRC) ofertę dotyczącą przeprowadzenia operacji wojskowej ze swoją grupą zbrojną podczas walk w prefekturze Vakaga w 2019 r.
 Wciąż utrudniał odbudowę władzy państwowej w obszarach działalności FPDC poprzez utrzymywanie nielegalnych blokad dróg służących zastraszaniu hodowców bydła, podmiotów gospodarczych (w tym firm prowadzących wydobycie złota działających w prefekturze Nana-Mambéré) i podróżnych.
 Pod jego przywództwem FDPC naruszał lub łamał prawa człowieka w prefekturze Nana-Mambéré, m.in. w kwietniu 2019 r. przeprowadził ataki skierowane przeciwko ludności cywilnej, w marcu 2019 r. uprowadził cywilów (w pobliżu Zoukombo) oraz w maju 2019 r. dokonał aktów przemocy seksualnej i przemocy ze względu na płeć (w Bagary). W czasie konfliktu w 2017 r. FDPC dopuścił się również czternastu aktów przemocy seksualnej.
 W latach 2016–2019 FDPC rekrutował dzieci-żołnierzy i wykorzystywał je w konfliktach zbrojnych. Zmusił jedenaście dziewcząt do zawarcia małżeństw z członkami FDPC.
 W marcu 2019 r. Abdoulaye Miskine brał udział w utrudnianiu dostarczania pomocy humanitarnej, gdy FDPC, pod jego przywództwem, przeprowadził serię ataków na główną drogę w Bangi z Kamerunu.
 W kwietniu 2019 r. niedaleko Zoukombo (prefektura Nana-Mambéré) oraz na osi Bouar-Beleko doszło do potyczek niedobitków z FDPC z siłami MINUSCA.”


type: other

text:
 Kummissjoni Ewropea - Network gudizzjarju ewropew - Jurisdizzjoni tal-qrati - Danimarka
 Kummissjoni Ewropea > NGE > Jurisdizzjoni tal-qrati > Danimarka
 Jurisdizzjoni tal-qrati - Danimarka
 A. Ghandi niftaħ kawża f’qorti ordinarja jew f’waħda speċjalizzata?
 B. F’liema qorti ordinarja għandi niftaħ il-kawża?
 I. Hemm distinzjoni bejn il-qorti inferjuri u dik ordinarja superjuri u jekk inhu hekk liema minnhom hija kompetenti fil-każ tiegħi?
 II. Il-qorti kompetenti
 1. Ir-regola bażika inkwantu liema hi l-qorti kompetenti
 2. Eċċezzjonijiet għar-regola bażika
 a) Meta nista’ nagħżel bejn il-qorti kompetenti tal-konvenut u qorti oħra?
 b) Meta għandi nagħżel qorti li mhix dik il-qorti kompetenti tal-konvenut?
 c) Jistgħu il-partijiet stess jagħżlu qorti li ma tkunx altrimenti kompetenti?
 C. Kif nista’ nsir naf liema qorti hija kompetenti?
 Tilwim ċivili normalment jinstema' quddiem qorti ordinarja. Il-każ għandu jinġieb quddiem dik il-qorti li hija kompetenti biex tisimgħu, ara B hawn taħt.
 Il-Qrati Ordinarji jinkludu l-qrati distrettwali, l-Qrati Superjuri u l-Qorti Suprema. Jeżistu wkoll tliet qrati speċjalizzati li jittrattaw każijiet ċivili: il-Qorti Marittima u Kummerċjali, it-Tribunal Industrijali u t-Tribunal tal-Kera. Dawn il-ġuriżdizzjonijiet tal-qrati huma deskritti f'iktar dettal taħt l-punt Ċ.
 Il-qrati ordinarji huma organizzati fi tliett livelli. Il-livell t’isfel jikkonsisti fi qrati distrettwali, warajħ il-Qrati Superjuri, bil-Qorti Suprema fl-ogħla livell.
 Il-każijiet kollha ċivili għandhom jitressqu quddiem qrati distrettwali. Madankollu, ċerti każi li jirrelataw ma’ negozju jistgħu jitressqu quddiem il-qorti Marittima u Kummerċjali.
 Ir-regola bażika hi li l-każ għandu jitressaq quddiem il-qorti kompetenti tal-konvenut. Il-qorti kompetenti għall-persuni naturali hija l-qorti distrettwali li il-ġuriżdizzjoni tagħha tkopri l-lokal tar-residenza tagħhom. Il-qorti kompetenti għall-persuni legali bħalma huma kumpaniji u assoċjazzjonijiet hija l-qorti distrettwali li l-ġuriżdizzjoni tagħha tkopri l-lokal fejn jinsab l-uffiċċju prinċipali.
 Hemm numru ta’ sitwazzjonijiet li fihom każ jista’ jinġieb quddiem qorti Daniża anke jekk il-konvenut mhux residenti fid-Danimarka. Ċerti każi ċivili jistgħu jittellgħu quddiem qorti Daniża anke jekk il-qorti kompetetni tal-konvenut tinsab f’art barranija. Eżempji ta’ dan jinkludu każijiet marbuta ma’ proprjetà immobbli fid-Danimarka jew każijiet li jikkonċernaw kuntratti li jridu jiġu esegwiti f’dan il-pajjiż. Jekk il-konvenut mhux residenti hawnhekk, il-każ jista’ jitressaq fil-lokal fejn il-parti kkonċernata tinsab fil-mument jew, fejn ikun xieraq, fejn il-parti kienet l-aħħar domiċiljata jew tinsab.
 Safejn jikkonċerna każijiet internazzjonali, id-Danimarka laqgħet il-Konvenzjonijiet ta’ Brussell u Lugano. Barra minn hekk, il-Komunità Ewropea u d-Danimarka daħlu f’arranġament parallel li taħtu r-regoli mniżżlin fl-I Regolament ta’ Brussell b’effett mill-1 ta’ Lulju 2007 huma applikabbli bejn id-Danimarka u l-Istati Membri l-oħra.
 Jeżistu numru ta' regoli dwar il-ġudizzjoni li taħthom ukoll jistgħu jitressqu każijiet quddiem qorti differenti minn dik il-qorti kompetenti tal-konvenut. Barra hekk, hemm regoli fuq lokalitajiet ġudizzjarji alternattivi f'numru ta' konvenzjonijiet u arranġamenti internazzjonali li d-Danimarka tifforma parti minnhom, u dawn huma il-Konvenzjoni ta' Brussell, il-Konvenzjoni ta' Lugano u l-I Regolament ta' Brussell (cf. l-arranġament paralel fuq is-suġġett).
 Ir-regoli prinċipali dwar il-lokalitajiet legali alternattivi li huma applikabbli fid-Danimarka huma mniżżlin hawn taħt:
 Każijiet kontra persuni li qiegħdin jagħmlu attività kummerċjali li jirrelataw ma' din l-attività jistgħu jinġibu quddiem il-qorti fil-post fejn l-attività qed tinżamm.
 Każijiet li għandhom x'jaqsmu ma' drittijiet fuq propjetà immobbli jistgħu jitressqu quddiem il-qorti fil-post fejn tinsab il-propjetà.
 Każijiet li jikkonċernaw kuntratti jistgħu jitressqu quddiem il-qorti fil-lokal fejn l-obbligazzjoni li fuqha il-każ huwa bbażat hija sodisfatta jew trid tiġi ssodisfata.
 Każijiet li jirrelataw ma' obbligu mhux kuntrattwali jistgħu jitressqu quddiem il-qorti fil-lokal fejn saret l-azzjoni li kkawżat id-dannu.
 F'każijiet li jikkonċernaw arranġamenti tal-konsumatur, il-konsumatur jista' jqajjem azzjoni kontra l-operatur quddiem il-qorti kompetenti tiegħu, sakemm il-partijiet ma laqgħux il-ftehim tal-konsumatur għat-talba tal-konsumatur stess u fl-indirizz permanenti tan-negozju tal-operatur.
 Il-liġi Daniża fiha numru ta' regoli dwar ġuriżdizzjoni esklussiva li tistipula li ċerti każi ċivili għandhom jitressqu quddiem qorti partikolari. Hemm ukoll regoli fuq ġuriżdizzjoni esklussiva f'numru ta' konvenzjonijiet u arranġamenti internazzjonali li d-Danimarka laqgħat, u dawn huma il-Konvenzjoni ta' Brussell, il-Konvenzjoni ta' Lugano u l-I Regolament ta' Brussell (cf. l-arranġament parallel fuq is-suġġett). Jekk il-każ jinġieb quddiem qorti li mhix dik li għandha ġuriżdizzjoni esklussiva taħt ir-regoli msemmija hawn fuq, dik il-qorti ma tistax tittratta l-każ. Il-qorti trid jew tirreferi l-każ lill-qorti adegwata inkella tirrifjutah, dan jekk mhux possibbli li ssir referenza.
 Ir-regoli prinċipali fuq ġuriżdizzjoni esklussiva fid-Danimarka huma mniżżlin hawn taħt:
 Il-kustodja tal-ġenituri għandha tinġieb quddiem il-qorti fil-post fejn joqqgħod it-tifel ikkonċernat.
 Il-proċeduri legali għall-paternità għandhom jinġiebu quddiem il-qorti tal-post fejn tinsab l-qorti kompetenti tal-omm.
 Każijiet ta' divorzju għandhom jitressqu quddiem il-qorti fil-post tar-residenza tal-miżżewġin. Jekk dawn ma jabitawx fl-istess ġuriżdizzjoni, id-divorzju għandu jiġi ppronunzjat mill-qorti tal-post fejn l-aħħar kellhom residenza komuni, sakemm wieħed minnhom ikun għadu joqgħod f'dik il-ġuriżdizzjoni.
 Il-partijiet jistgħu jilħqu ftehim (ftehim fuq lokal ġudizzjarju) li jgħid li l-każ jista’ jew għandu jitressaq quddiem qorti (qorti distrettwali) li mhix dik li jiddettaw ir-regoli ordinarji fuq il-ġuriżdizzjoni. M’hemmx rekwiżiti formali f’dak li għandu x’jaqsam ma’ arranġamenti dwar lokalitajiet ġudizzjarji, bħal per eżempju li għandhom ikunu bil-miktub. Madankollu, arranġamenti li jkunu saru qabel dwar lokali ġudizzjarji – jiġifieri, arranġamenti milħuqa qabel ma nbdiet it-tilwima – m’humiex obbligatorji għall-konsumaturi f’każijiet li jikkonċernaw arranġamenti tal-konsumatur. Huwa possibbli li jintlaħaq qbil taċitu dwar il-lokal ġudizzjarju, jekk, per eżempju, il-konvenut ma jikkontestax il-ġuriżdizzjoni tal-qorti fid-dikjarazzjoni tad-difiża tiegħu.
 Il-qorti tiżgura, bl-inizjattiva tagħha stess, li l-każ ma ġiex imtella’ fuq kontravenzjoni ta’ regoli nazzjonali jew internazzjonali fuq ġuriżdizzjoni esklussiva.
 Jeżistu tliet qrati speċjalizzati biex jittrattaw każi ċivili:
 Il-Qorti Marittima u Kummerċjali tittratta ċerti każi (dawk li jikkonċernaw każijiet internazzjonali kummerċjali), numru ta' każijiet fuq materji inkorporjali u każijiet ta' kompetizzjoni ċivili, kif ukoll każijiet kummerċjali li jinvolvu materji bbażati fuq prinċipju irreferuti mill-qorti distrettwali.
 it-Tribunal Industrijali jittratta ċerti tip ta' każijiet li jikkonċernaw il-ksur u l-interpretazzjoni ta' arranġamenti kollettivi.
 It-Tribunali tal-kera jittrattaw każi li jikkonċernaw djar jew alloġġi kopruti mil-liġijiet fuq akkomodazzjoni mikrija.
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jurisdiction: US

text: b' NATIONAL SCIENCE FOUNDATION\n OFFICE OF INSPECTOR GENERAL\n OFFICE OF INVESTIGATIONS\n\n CLOSEOUT MEMORANDUM\n\n Case Number: 109060031 Page 1 of 1\n\n\n\n We received an allegation that an NSF program officer, 1 who was working at NSF in a\n temporary position under the Intergovernmental Personnel Act, reviewed and approved an\n annual report submitted by a Principal Investigator (PI) from his home institution and\n department. While this was a technical violation of 18 U.S.C. \xc2\xa7 208, the following facts\n mitigate this violation: at the time, P was temporarily handling PO responsibilities for a\n colleague who was on travel, in addition to his own PO duties; his violation was inadvertent;\n approving the report merely provided more time for the PI to finish spending the funds for a\n small international collaboration award; he does not collaborate with the PI and CQuid not\n have rationally anticipated receiving any direct financial benefit from his action; he was a\n temporary federal employee who is unlikely to return to federal government service; and he\n has no record of previous such offenses.\n\n Accordingly, this case is closed.\n\n\n\n\nNSF OIG Fonn 2 (11102)\n\x0c'


text:
 Avis juridique important
 |
 31972L0199
 Troisième directive 72/199/CEE de la Commission, du 27 avril 1972, portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux
 Journal officiel n° L 123 du 29/05/1972 p. 0006 - 0034 édition spéciale finnoise: chapitre 3 tome 4 p. 0184 édition spéciale danoise: série III chapitre 1966-1972 p. 0071 édition spéciale suédoise: chapitre 3 tome 4 p. 0184 édition spéciale anglaise: série III chapitre 1966-1972 p. 0074 édition spéciale grecque: chapitre 03 tome 8 p. 0007 édition spéciale espagnole: chapitre 03 tome 6 p. 0008 édition spéciale portugaise: chapitre 03 tome 6 p. 0008
 TROISIÈME DIRECTIVE DE LA COMMISSION du 27 avril 1972 portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux (72/199/CEE) LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES, vu le traité instituant la Communauté économique européenne, vu la directive du Conseil, du 20 juillet 1970, concernant l'introduction de modes de prélèvement d'échantillons et de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux (1), et notamment son article 2, considérant que la directive susvisée prévoit que les contrôles officiels des aliments des animaux pour constater si les conditions prescrites en vertu des dispositions législatives, réglementaires ou administratives concernant la qualité et la composition des aliments des animaux sont respectées, sont effectués selon des modes de prélèvement d'échantillons et des méthodes d'analyse communautaires; considérant que les directives no 71/250/CEE et no 71/393/CEE de la Commission, du 15 juin 1971 (2) et du 18 novembre 1971 (3), ont déjà fixé un certain nombre de méthodes d'analyse communautaires ; que, compte tenu de l'état d'avancement des travaux effectués depuis lors, il convient d'arrêter une troisième série de méthodes; considérant que les mesures prévues dans la présente directive sont conformes à l'avis du Comité permanent des aliments des animaux, A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DIRECTIVE: Article premier Les États membres prescrivent que les analyses pour les contrôles officiels des aliments des animaux en ce qui concerne leurs teneurs en amidon, protéines brutes, protéines brutes solubilisables par la pepsine et l'acide chlorhydrique et en gossypol libre et total ainsi que l'activité de la pepsine, sont effectuées selon les méthodes décrites à l'annexe I de la présente directive. Les dispositions générales figurant à la partie 1 (introduction) de l'annexe de la première directive no 71/250/CEE de la Commission, du 15 juin 1971, portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux sont applicables aux méthodes décrites à l'annexe I de la présente directive. Article 2 Les États membres prescrivent que les analyses pour les contrôles officiels des aliments des animaux en vue de la détection et de l'identification des antibiotiques du groupe des tétracyclines ainsi qu'en ce qui concerne les teneurs des aliments en chlortétracycline, oxytétracycline, tétracycline, oléandomycine, tylosine, virginiamycine sont effectuées selon les méthodes décrites à l'annexe II de la présente directive. Les dispositions générales figurant à la partie 1 (introduction) de l'annexe de la première directive no 71/250/CEE de la Commission du 15 juin 1971, à l'exception de la partie concernant la préparation de l'échantillon à analyser, sont applicables aux méthodes décrites à l'annexe II de la présente directive. Article 3 Les États membres mettent en vigueur, le 1er juillet 1973 au plus tard, les dispositions législatives, réglementaires ou administratives nécessaires pour se conformer aux dispositions de la présente directive. Ils en informent immédiatement la Commission. Article 4 Les États membres sont destinataires de la présente directive. Fait à Bruxelles, le 27 avril 1972. Par la Commission Le président S.L. MANSHOLT (1)JO no L 170 du 3.8.1970, p. 2. (2)JO no L 155 du 12.7.1971, p. 13. (3)JO no L 279 du 20.12.1971, p. 7. ANNEXE I 1. DOSAGE DE L'AMIDON - Méthode polarimétrique - 1. Objet et domaine d'application La méthode permet de déterminer la teneur en amidon et en produits de dégradation à haut poids moléculaire de l'amidon des aliments des animaux, à l'exception de ceux qui contiennent des cossettes, des pulpes, des feuilles ou des collets séchés de betteraves, des pulpes de pommes de terre, des levures déshydratées, des produits riches en inuline (par exemple, cossettes et farine de topinambours) ou des cretons. 2. Principe La méthode comprend une double détermination. Dans la première, l'échantillon est traité à chaud par l'acide chlorhydrique dilué. Après défécation et filtration, on mesure par polarimétrie le pouvoir rotatoire de la solution. Dans la seconde, l'échantillon est extrait par l'éthanol à 40 %. Après acidification du filtrat par l'acide chlorhydrique, défécation et filtration, on mesure le pouvoir rotatoire dans les mêmes conditions que lors de la première détermination. La différence entre les deux multipliée par un facteur connu donne la teneur en amidon de l'échantillon. 3. Réactifs 3.1 Acide chlorhydrique à 25 % (p/p), d : 1,126. 3.2 Acide chlorhydrique à 1,128 % (p/v). La concentration doit être vérifiée par titration à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium 0,1 N en présence de rouge de méthyle à 0,1 % (p/v) dans l'éthanol à 94 % (v/v). 10 ml = 30,94 ml de NaOH 0,1 N. 3.3 Solution de Carrez I : Dissoudre dans l'eau 21,9 g d'acétate de zinc Zn (CH3COO)2 7 2H2O et 3 g d'acide acétique glacial. Compléter à 100 ml avec de l'eau. 3.4 Solution de Carrez II : Dissoudre dans l'eau 10,6 g de ferrocyanure de potassium K4[Fe(CN)6] 7 3H20. Compléter à 100 ml avec de l'eau. 3.5 Éthanol à 40 % (v/v), d : 0,948 à 20 oC. 4 Appareillage 4.1 Erlenmeyer de 250 ml à rodage normalisé, avec réfrigérant à reflux. 4.2 Polarimètre ou saccharimètre. 5. Mode opératoire 5.1 Préparation de l'échantillon Broyer l'échantillon de façon qu'il passe en totalité au travers d'un tamis à mailles rondes de 0,5 mm de diamètre. 5.2 Détermination du pouvoir rotatoire total (P ou S) (v. observation 7.1) Peser, à 1 mg près, 2,5 g de l'échantillon broyé et les introduire dans un ballon jaugé de 100 ml. Ajouter 25 ml d'acide chlorhydrique (3.2), agiter pour obtenir une bonne répartition de la prise d'essai et ajouter à nouveau 25 ml d'acide chlorhydrique (3.2). Plonger le ballon dans un bain d'eau bouillante et, durant les 3 premières minutes qui suivent, agiter énergiquement et régulièrement pour éviter la formation d'agglomérats. La quantité d'eau du bain doit être suffisante pour permettre de maintenir le bain en ébullition lorsque le ballon y est plongé. Celui-ci ne peut être retiré du bain au cours de l'agitation. Après 15 minutes exactement, retirer le ballon du bain, y ajouter 30 ml d'eau froide et refroidir immédiatement jusqu'à 20 oC. Ajouter 5 ml de solution de Carrez I (3.3) et agiter pendant une minute. Ajouter ensuite 5 ml de solution de Carrez II (3.4) et agiter à nouveau pendant une minute. Compléter au volume avec de l'eau, homogénéiser et filtrer. Si le filtrat n'est pas parfaitement limpide (ce qui est peu fréquent), recommencer l'analyse en utilisant une plus grande quantité des solutions de Carrez I et II, par exemple 10 ml. Mesurer ensuite le pouvoir rotatoire de la solution dans un tube de 200 mm au polarimètre ou au saccharimètre 5.3 Détermination du pouvoir rotatoire (P' ou S') des substances solubles dans l'éthanol à 40 % Peser, à 1 mg près, 5 g de l'échantillon, les introduire dans un ballon jaugé de 100 ml et ajouter 80 ml environ d'éthanol (3.5) (v. observation 7.2). Laisser le ballon en attente durant 1 h à la température ambiante ; au cours de ce laps de temps, procéder 6 fois à une agitation énergique de façon que la prise d'essai soit bien mélangée à l'éthanol. Porter ensuite au volume avec de l'éthanol (3.5), homogénéiser et filtrer. Introduire à la pipette 50 ml du filtrat (= 2,5 g de l'échantillon) dans un erlenmeyer de 250 ml, ajouter 2,1 ml d'acide chlorhydrique (3.1) et agiter énergiquement. Ajuster un réfrigérant à reflux à l'erlenmeyer et plonger celui-ci dans un bain d'eau bouillante. Après 15 minutes exactement, retirer l'erlenmeyer du bain, transvaser son contenu dans un ballon jaugé de 100 ml, en rinçant avec un peu d'eau froide, et refroidir jusqu'à 20 oC. Déféquer ensuite à l'aide des solutions de Carrez I (3.3) et II (3.4), compléter au volume avec de l'eau, homogénéiser, filtrer et mesurer le pouvoir rotatoire comme indiqué en 5.2, deuxième et troisième alinéas. 6. Calcul des résultats La teneur en amidon pour cent d'échantillon est calculée comme suit: 6.1 Mesures effectuées au polarimètre >PIC FILE= "T0004345"> + 185,9o: amidon de riz + 195,4o: amidon de pommes de terre + 184,6o: amidon de maïs + 182,7o: amidon de froment + 181,5o: amidon d'orge + 181,3o: amidon d'avoine + 184,0o: autres types d'amidons, ainsi que mélanges d'amidons des aliments composés 6.2 Mesures effectuées au saccharimètre >PIC FILE= "T0004346"> 6.3 Répétabilité La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur un même échantillon ne doit pas dépasser 0,4 en valeur absolue pour les teneurs en amidon inférieures à 40 % 1,1 % en valeur relative pour les teneurs en amidon égales ou supérieures à 40 %. 7. Observations 7.1 Lorsque l'échantillon contient plus de 6 % de carbonates, calculés en carbonate de calcium, ceux-ci doivent être détruits par un traitement à l'aide d'une quantité exactement appropriée d'acide sulfurique dilué, avant la détermination du pouvoir rotatoire total. 7.2 Dans le cas des produits à forte teneur en lactose, tels que les poudres de lactosérum ou de lait écrémé, procéder comme suit après l'addition des 80 ml d'éthanol (3.5). Ajuster au ballon un réfrigérant à reflux, plonger le ballon durant 30 minutes dans un bain d'eau à 50 oC. Laisser ensuite refroidir et poursuivre l'analyse comme indiqué en 5.3. 2. DOSAGE DES PROTÉINES BRUTES 1. Objet et domaine d'application La méthode permet de déterminer conventionnellement la teneur en protéines brutes des aliments des animaux à partir de la teneur en azote, dosée selon Kjeldahl. 2. Principe L'échantillon est minéralisé par voie humide. La solution acide est alcalinisée par une solution d'hydroxyde de sodium. L'ammoniac libéré est entraîné par distillation et recueilli dans une quantité déterminée d'acide sulfurique dont l'excès est titré par une solution d'hydroxyde de sodium. 3. Réactifs 3.1 Sulfate de potassium p.a. 3.2 Catalyseur : oxyde cuivrique CuO p.a., ou sulfate cuivrique cristallisé CuSO4 7 5H2O p.a., ou mercure, ou oxyde mercurique HgO p.a. 3.3 Zinc p.a., en granulés. 3.4 Acide sulfurique p.a., d : 1,84 3.5 Acide sulfurique 0,1 N. 3.6 Acide sulfurique 0,5 N. 3.7 Indicateur au rouge de méthyle : dissoudre 300 mg de rouge de méthyle dans 100 ml d'éthanol à 95-96 % (v/v). 3.8 Solution à 40 % (p/v) d'hydroxyde de sodium. 3.9 Solution d'hydroxyde de sodium 0,1 N. 3.10 Solution d'hydroxyde de sodium 0,25 N. 3.11. Solution saturée de sulfure de sodium p.a. 3.12 Solution à 8 % (p/v) de thiosulfate de sodium, Na2S2O3 7 5H2O p.a. 3.13 Pierre ponce en grains, lavée à l'acide chlorhydrique et calcinée. 4. Appareillage Appareils à minéraliser et distiller selon Kjedahl (v. observation 7.1). 5. Mode opératoire 5.1 Minéralisation Peser, à 1 mg près, 1 g de l'échantillon et introduire la prise d'essai dans le ballon de l'appareil à minéraliser. Ajouter 10 g de sulfate de potassium (3.1), une quantité appropriée de catalyseur (3.2) (0,3 à 0,4 g d'oxyde cuivrique ou 0,9 à 1,2 g de sulfate cuivrique ou une goutte de mercure ou 0,6 à 0,7 g d'oxyde mercurique), 25 ml d'acide sulfurique (3.4) et quelques granulés de pierre ponce (3.13). Homogénéiser. Chauffer le ballon d'abord avec modération et en agitant de temps en temps jusqu'à carbonisation de la masse et disparition de l'écume ; ensuite plus intensément jusqu'à ébullition régulière du liquide. Éviter la surchauffe des parois et l'adhérence de particules organiques. Lorsque la solution apparaît limpide et incolore (vert clair en présence de catalyseur à base de cuivre), maintenir l'ébullition durant 1 h encore. Laisser ensuite refroidir. 5.2 Distillation Ajouter 250 à 350 ml d'eau, avec précaution et tout en agitant pour dissoudre complètement les sulfates ; laisser refroidir. Ajouter ensuite quelques granulés de zinc (3.3). Introduire dans le flacon collecteur de l'appareil à distiller 25 ml exactement mesurés d'acide sulfurique 0,1 N (3.5) ou 0,5 N (3.6), selon la teneur présumée en azote (v. observation 7.2) et quelques gouttes d'indicateur au rouge de méthyle (3.7). Connecter le ballon au réfrigérant de l'appareil à distiller et plonger l'extrémité de ce dernier sur une hauteur de 1 cm au moins dans le liquide du flacon collecteur (v. observation 7.3). Introduire lentement dans le ballon par l'entonnoir à robinet 100 ml de solution à 40 % d'hydroxyde de sodium (3.8). Si l'on a utilisé un catalyseur à base de mercure, introduire en outre dans le ballon soit 10 ml de solution de sulfure de sodium (3.11), soit 25 ml de solution de thiosulfate de sodium (3.12). Chauffer le ballon de façon à distiller 150 ml environ de liquide en 30 minutes. Après ce laps de temps, vérifier la neutralité du distillat qui s'écoule au moyen de papier de tournesol. Si la réaction est alcaline, poursuivre la distillation. Arrêter celle-ci lorsque le distillat apparaît neutre au papier de tournesol. Au cours de la distillation, remuer de temps en temps le contenu du flacon collecteur et surveiller sa coloration. Si celle-ci vire au jaune, ajouter immédiatement un volume exactement mesuré d'acide sulfurique 0,1 N (3.5) ou 0,5 N (3.6). 5.3 Titration Titrer dans le flacon collecteur l'excès d'acide sulfurique par la solution d'hydroxyde de sodium 0,1 N (3.9) ou 0,25 N (3.10), selon la normalité de l'acide sulfurique utilisé, jusqu'à virage de la coloration au jaune clair. 5.4 Contrôle de la méthode Pour contrôler que les réactifs sont exempts d'azote, effectuer un essai à blanc (distillation et titration), en l'absence d'échantillon à analyser. Pour contrôler l'exactitude de la méthode, effectuer l'analyse (minéralisation, distillation et titration) sur 1,5 à 2,0 g d'acétanilide p.a. (P.F. 114 oC ; % N : 10,36) en présence de 1 g de saccharose, exempt d'azote ; 1 g d'acétanilide consomme 14,80 ml d'acide sulfurique 0,5 N. 6. Calcul des résultats Déterminer le volume d'acide sulfurique consommé, 1 ml d'acide sulfurique 0,1 N correspond à 1,4 mg d'azote. Multiplier la quantité d'azote par le facteur 6,25. Exprimer le résultat en pour cent de l'échantillon. Répétabilité La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur un même échantillon ne doit pas dépasser: - 0,2 en valeur absolue pour les teneurs en protéines brutes inférieures à 20 %; - 1,0 % en valeur relative pour les teneurs comprises entre 20 et 40 %; - 0,4 en valeur absolue pour les teneurs supérieures à 40 %. 7. Observations 7.1 Certains appareils, qui exigent un transvasement entre minéralisation et distillation, peuvent être utilisés. Dans ce cas, le transvasement doit être effectué sans perte. 7.2 Pour les produits pauvres en matières azotées, le volume d'acide sulfurique 0,1 N à introduire dans le flacon collecteur peut être réduit, si nécessaire, à 10 ou 15 ml et complété à 25 ml par de l'eau. 7.3 Si le ballon de l'appareil à distiller n'est pas muni d'un entonnoir à robinet, ajouter la solution d'hydroxyde de sodium immédiatement avant de connecter le ballon au réfrigérant et en laissant couler le liquide lentement le long des parois de façon à éviter qu'il se mélange à la solution acide. 3. DOSAGE DES PROTÉINES BRUTES SOLUBILISÉES PAR LA PEPSINE ET L'ACIDE CHLORHYDRIQUE 1. Objet et domaine d'application La méthode permet de déterminer la fraction des protéines brutes solubilisées par la pepsine et l'acide chlorhydrique dans des conditions déterminées. Elle est applicable à tous les aliments. 2. Principe L'échantillon est soumis à un traitement de 48 h à 40 oC par une solution chlorhydrique de pepsine. La suspension est filtrée et la teneur en azote du filtrat est déterminée selon la méthode décrite pour le dosage des protéines brutes. 3. Réactifs 3.1 Acide chlorhydrique, d : 1,125 3.2 Acide chlorhydrique 0,075 N. 3.3 Pepsine à 2,0 U/mg ; cette activité est définie et doit être contrôlée selon la méthode faisant l'objet de la partie 4 de la présente annexe. 3.4 Solution fraîchement préparée à environ 0,02 % (p/v) de pepsine dans l'acide chlorhydrique (3.2) ; activité : 400 U/l. 3.5 Émulsion d'antimousse (silicone par exemple). 3.6 Tous les réactifs indiqués sous le point 3 de la méthode de dosage des protéines brutes. 4. Appareillage 4.1 Bain d'eau ou étuve à incubation, réglé à 40 oC ± 1 oC. 4.2 Appareils à minéraliser et à distiller selon Kjeldahl. 5. Mode opératoire 5.1 Mise en solution (v. observation 7.2) Peser, à 1 mg près, 2 g de l'échantillon. Introduire la prise d'essai dans un ballon jaugé de 500 ml et ajouter 450 ml de solution chlorhydrique de pepsine (3.4) préalablement portée à 40 oC. Agiter de façon à éviter la formation d'agglomérats. Vérifier que le pH de la suspension est inférieur à 1,7. Porter le ballon dans le bain d'eau ou l'étuve à incubation (4.1) et l'y maintenir durant 48 h. Agiter après 8, 24 et 32 h. Après 48 h, ajouter 15 ml d'acide chlorhydrique (3.1), refroidir jusqu'à 20 oC, compléter au volume avec de l'eau et filtrer. 5.2 Minéralisation Prélever 250 ml du filtrat et les introduire dans le ballon de l'appareil à distiller (4.2). Ajouter les réactifs nécessaires à la minéralisation comme indiqué dans la méthode de dosage des protéines brutes, au point 5.1, deuxième phrase. Homogénéiser et chauffer à ébullition. S'il y a formation de mousse, ajouter quelques gouttes d'émulsion d'antimousse (3.5). Maintenir une ébullition vive jusqu'à évaporation presque complète de l'eau. Éliminer les dernières traces d'eau avec précaution, en réduisant l'intensité du chauffage. Lorsque la solution apparaît limpide et incolore (vert clair en présence de catalyseur à base de cuivre), poursuivre l'ébullition durant 1 h encore. Laisser ensuite refroidir. 5.3 Distillation et titration Procéder comme indiqué dans la méthode de dosage des protéines brutes, points 5.2 et 5.3. 5.4 Essai à blanc Effectuer un essai à blanc en appliquant le mode opératoire en l'absence d'échantillon à analyser. 6. Calcul des résultats Déduire le volume d'acide sulfurique consommé par l'essai à blanc de celui consommé par la prise d'essai. 1 ml d'acide sulfurique 0,1 N correspond à 1,4 mg d'azote. Multiplier la quantité d'azote par le facteur 6,25. Exprimer le résultat en pour cent de l'échantillon. Répétabilité La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur un même échantillon ne doit pas dépasser: - 0,4 en valeur absolue, pour les teneurs inférieures à 20 %; - 2,0 %, en valeur relative, pour les teneurs comprises entre 20 et 40 %; - 0,8, en valeur absolue, pour les teneurs supérieures à 40 %. 7. Observations 7.1 Les valeurs obtenues par la présente méthode n'ont pas de lien direct avec la digestibilité in vivo. 7.2 Les produits dont la teneur en matières grasses dépasse 10 % doivent être préalablement dégraissés par extraction à l'éther de pétrole (éb. 40-60 oC). 4. DÉTERMINATION DE L'ACTIVITÉ DE LA PEPSINE 1. Objet et domaine d'application La méthode permet de contrôler l'activité de la pepsine utilisée pour le dosage des protéines brutes solubilisées par la pepsine et l'acide chlorhydrique. 2. Principe L'hémoglobine est traitée dans des conditions définies par la pepsine en milieu chlorhydrique. La fraction non hydrolysée des protéines est précipitée par l'acide trichloracétique. Le filtrat est additionné d'hydroxyde de sodium et du réactif selon Folin-Ciocalteu. La densité optique de cette solution est mesurée à 750 nm et la quantité de tyrosine qui y correspond est lue sur une courbe d'étalonnage. Définition : L'unité de pepsine est définie comme étant la quantité de cette enzyme qui libère, par minute, dans les conditions de la méthode, une quantité de groupements hydroxyaryl dont la coloration par le réactif selon Folin-Ciocalteu a une densité optique correspondant à celle d'une ¶mole de tyrosine, dans les mêmes conditions. 3. Réactifs 3.1 Acide chlorhydrique 0,2 N. 3.2 Acide chlorhydrique 0,06 N. 3.3 Acide chlorhydrique 0,025 N. 3.4 Solution à 5 % (p/v) d'acide trichloracétique. 3.5 Solution d'hydroxyde de sodium 0,5 N. 3.6 Réactif selon Folin-Ciocalteu. Introduire 100 g de tungstate de sodium (Na2WO4 7 2H2O), 25 g de molybdate de sodium (Na2MoO4 7 2H2O) et 700 ml d'eau dans un ballon à fond rond de 2 l à rodage normalisé. Ajouter 50 ml d'acide phosphorique (d : 1,71) et 100 ml d'acide chlorhydrique concentré (d : 1,19), ajuster au ballon un réfrigérant à reflux, chauffer à ébullition et maintenir la solution en ébullition douce durant 10 h. Laisser refroidir, détacher le réfrigérant à reflux, ajouter 175 g de sulfate de lithium (Li2SO4 7 2H2O), 50 ml d'eau et 1 ml de brome. Faire bouillir durant 15 minutes pour éliminer l'excès de brome. Laisser refroidir, transvaser la solution dans un ballon jauge de 1 l, compléter au volume avec de l'eau, homogénéiser et filtrer. Il ne peut subsister de coloration verdâtre. Avant l'emploi, diluer 1 volume du réactif par 2 volumes d'eau. 3.7 Solution d'hémoglobine : Peser une quantité d'hémoglobine, substrat protéique d'après Anson, (2 g environ) correspondant à 354 mg d'azote (1) et l'introduire dans un ballon de 200 ml à rodage normalisé. Ajouter quelques ml d'acide chlorhydrique (3.2), relier le ballon à la pompe à vide et agiter jusqu'à dissolution complète de l'hémoglobine. Couper le vide et ajouter tout en agitant de l'acide chlorhydrique (3.2) pour compléter à 100 ml. Préparer immédiatement avant l'emploi. 3.8 Solution étalon de tyrosine : Dissoudre 181,2 mg de tyrosine dans l'acide chlorhydrique (3.1) et compléter à 1 l avec le même acide (solution mère). Prélever 20,0 ml et diluer à 100 ml par l'acide chlorhydrique (3.1). 1 ml de cette solution contient 0,2 ¶mole de tyrosine. 4. Appareillage 4.1 Bain d'eau, réglé à 25 oC ± 0,1 oC par l'ultrathermostat. 4.2 Spectrophotomètre. 4.3 Chronomètre, précision : 1 seconde. 4.4 pH-mètre. 5. Mode opératoire 5.1 Préparation de la solution (v. observation 7.1) Dissoudre 150 mg de pepsine dans 100 ml d'acide chlorhydrique (3.2). Prélever à la pipette 2 ml de la solution, les introduire dans un ballon jaugé de 50 ml et compléter au volume par de l'acide chlorhydrique (3.3). Le pH, contrôlé au pH-mètre, doit être de 1,6 ± 0,1 Plonger le ballon dans le bain d'eau (4.1). 5.2 Hydrolyse Introduire à la pipette dans un tube à essai 5,0 ml de solution d'hémoglobine (3.7), porter à 25 oC dans le bain d'eau (4.1), ajouter 1,0 ml de la solution de pepsine obtenue en 5.1 et mélanger à l'aide d'une tige de verre, épaissie à une extrémité, par environ 10 mouvements de va-et-vient. Maintenir le tube à essai dans le bain d'eau à 25 oC durant 10 minutes exactement, comptées à partir de l'addition de la solution de pepsine (la durée et la température doivent être parfaitement respectées). Ajouter ensuite 10,0 ml de solution d'acide trichloracétique (3.4), préalablement portée à 25 oC, homogénéiser et filtrer sur un filtre sec. 5.3 Développement de la coloration et mesure de la densité optique Prélever à la pipette 5,0 ml du filtrat, les introduire dans un erlenmeyer de 50 ml, ajouter 10,0 ml de solution d'hydroxyde de sodium (3.5) et, en agitant constamment, 3,0 ml du réactif dilué de Folin-Ciocalteu (3.6). Après 5 à 10 minutes, déterminer la densité optique de la solution au spectrophotomètre à 750 nm dans des cuvettes de 1 cm d'épaisseur, par comparaison avec de l'eau. (1)Déterminer la teneur en azote par un semi-microkjeldahl (teneur théorique : 17,7 % d'azote). 5.4 Essai à blanc Pour chaque détermination, procéder à un essai à blanc comme indiqué ci-après. Introduire à la pipette dans un tube à essai 5,0 ml de solution d'hémoglobine (3.7), porter à 25 oC dans le bain d'eau (4.1), ajouter 10,0 ml de solution d'acide trichloracétique (3.4) préalablement portée à 25 oC, homogénéiser et ajouter ensuite 1,0 ml de la solution de pepsine obtenue en 5.1. Mélanger à l'aide d'une tige de verre et maintenir le tube à essai 10 minutes exactement dans le bain d'eau (4.1) à 25 oC. Homogénéiser et filtrer sur un filtre sec. Poursuivre le mode opératoire comme indiqué en 5.3. 5.5 Courbe d'étalonnage Introduire dans des erlenmeyers de 50 ml des volumes de 1,0 ; 2,0 ; 3,0 ; 4,0 et 5,0 ml de solution étalon de tyrosine (3.8), correspondant respectivement à des quantités de tyrosine de 0,2 ; 0,4 ; 0,6 ; 0,8 et 1,0 ¶moles. Compléter la série par un témoin exempt de tyrosine. Porter les volumes à 5,0 ml à l'aide d'acide chlorhydrique (3.1). Ajouter 10,0 ml de solution d'hydroxyde de sodium (3.5) et, en agitant constamment, 3,0 ml du réactif dilué de Folin-Ciocalteu (3.6). Mesurer la densité optique comme indiqué en 5.3, dernière phrase. Tracer la courbe d'étalonnage en portant les densités optiques en regard des quantités de tyrosine. 6. Calcul des résultats Lire sur la courbe d'étalonnage la quantité de tyrosine, en ¶mole, correspondant à la densité optique de la solution colorée, corrigée de l'essai à blanc. L'activité de la pepsine, en ¶mole de tyrosine, par mg et par minute, à 25 oC, est donnée par la formule: >PIC FILE= "T0004348"> dans laquelle: a = quantité de tyrosine, en ¶mole, lue sur la courbe d'étalonnage; p = poids en mg de la quantité de pepsine ajoutée en 5.2. 7. Observations 7.1 La quantité de pepsine à mettre en solution doit être choisie de façon à obtenir, lors de la mesure photométrique finale, une densité optique de 0,35 ± 0,035. 7.2 Deux unités par mg obtenues par la présente méthode correspondent à : 3,64 milliunités Anson/mg (¶mole de tyrosine/mg min à 35,5 oC) ou 36 400 unités commerciales/g (¶mole de tyrosine/g en 10 min à 35,5 oC). 5. DOSAGE DU GOSSYPOL LIBRE ET TOTAL 1. Objet et domaine d'application La méthode permet de doser le gossypol libre, le gossypol total et les substances chimiquement apparentées dans les graines, les farines et les tourteaux de coton ainsi que dans les aliments composés qui en contiennent. La limite inférieure du dosage est de 20 ppm. 2. Principe Le gossypol est extrait en présence de 3-amino-l-propanol, soit par un mélange d'isopropanol et d'hexane pour le dosage du gossypol libre, soit par la diméthylformamide pour le dosage du gossypol total. Le gossypol est transformé au moyen d'aniline en gossypol-dianiline, dont la densité optique est mesurée à 440 nm. 3. Réactifs 3.1 Mélange isopropanol-hexane : mélanger 60 parts en volume d'isopropanol p.a. à 40 parts en volume d'hexane normal. 3.2 Solvant A : porter dans un ballon jaugé de 1 l, 500 ml environ du mélange isopropanolhexane (3.1), 2 ml de 3-amino-l-propanol, 8 ml d'acide acétique glacial et 50 ml d'eau. Compléter au volume par le mélange isopropanol-hexane (3.1). Ce réactif est stable durant une semaine. 3.3 Solvant B : porter à la pipette dans un ballon jaugé de 100 ml, 2 ml de 3-amino-l-propanol et 10 ml d'acide acétique glacial. Refroidir à la température ambiante et compléter au volume par la N,N-diméthylformamide. Ce réactif est stable durant une semaine. 3.4 Aniline p.a. : si la densité optique de l'essai à blanc excède 0,022, distiller l'aniline sur poudre de zinc en éliminant les première et dernière fractions de 10 % du distillat. En flacon bouché de verre brun et au réfrigérateur, ce réactif se conserve plusieurs mois. 3.5 Solution étalon A de gossypol : Porter dans un ballon jaugé de 250 ml, 27,9 mg d'acétate de gossypol. Dissoudre et compléter au volume par le solvant A (3.2). Introduire à la pipette 50 ml de cette solution dans un ballon jaugé de 250 ml et compléter au volume par le solvant A. La concentration en gossypol de cette solution est de 0,02 mg/ml. Laisser reposer durant 1 h à la température ambiante, avant l'emploi. 3.6 Solution étalon B de gossypol : Porter dans un ballon jaugé de 50 ml, 27,9 mg d'acétate de gossypol. Dissoudre et compléter au volume par le solvant B (3.3). La concentration en gossypol de cette solution est de 0,5 mg/ml. Conservées à l'abri de la lumière, les solutions étalon A et B de gossypol sont stables durant 24 h. 4. Appareillage 4.1 Mélangeur (culbuteur) : environ 35 retournements par minute. 4.2 Spectrophotomètre. 5. Mode opératoire 5.1 Prise d'essai La prise d'essai est en rapport avec la teneur présumée en gossypol de l'échantillon. Il est préférable d'opérer sur une petite prise d'essai et sur une partie aliquote du filtrat relativement importante, de façon à obtenir une quantité de gossypol suffisante pour effectuer une mesure photométrique précise. Pour le dosage du gossypol libre dans les graines, les farines et les tourteaux de coton, la prise d'essai ne doit pas excéder 1 g ; pour les aliments composés elle pourra atteindre 5 g. Une partie aliquote de 10 ml de filtrat convient dans la plupart des cas ; elle devra contenir de 50 à 100 ¶g de gossypol. Pour le dosage du gossypol total, la prise d'essai pourra varier de 0,5 à 5 g afin qu'une partie aliquote de 2 ml de filtrat contienne de 40 à 200 ¶g de gossypol. L'analyse doit être effectuée à une température ambiante proche de 20 oC. 5.2 Dosage du gossypol libre Introduire la prise d'essai dans un ballon à col rodé de 250 ml, dont le fond est recouvert de verre pilé. Ajouter à la pipette 50 ml de solvant A (3.2), boucher le ballon et mélanger durant 1 h dans le culbuteur. Filtrer sur filtre sec et recueillir le filtrat dans un petit ballon à col rodé. Au cours de la filtration, recouvrir l'entonnoir d'un verre de montre. Introduire à la pipette respectivement dans deux ballons jaugés de 25 ml (A et B) des parties aliquotes identiques de filtrat contenant de 50 à 100 ¶g de gossypol. Compléter éventuellement le volume à 10 ml à l'aide du solvant A (3.2). Compléter ensuite au volume le contenu du ballon (A) par le mélange isopropanol-hexane (3.1). Cette solution sera utilisée comme solution de référence pour la mesure de la solution de l'échantillon. Introduire à la pipette 10 ml du solvant A (3.2) respectivement dans deux autres ballons jaugés de 25 ml (C et D). Compléter au volume le contenu du ballon (C) par le mélange isopropanol-hexane (3.1). Cette solution sera utilisée comme solution de référence pour la mesure de la solution de l'essai à blanc. Ajouter 2 ml d'aniline (3.4) respectivement dans les ballons (D) et (B). Chauffer durant 30 minutes sur un bain d'eau bouillante pour développer la coloration. Refroidir à la température ambiante, compléter au volume par le mélange isopropanol-hexane (3.1), homogénéiser et laisser reposer durant 1 h. Déterminer au spectrophotomètre à 440 nm, dans des cuvettes en verre de 1 cm, la densité optique de la solution de l'essai à blanc (D) par comparaison avec la solution de référence (C) et la densité optique de la solution de l'échantillon (B) par comparaison avec la solution de référence (A). Soustraire la densité optique de la solution de l'essai à blanc de celle de la solution de l'échantillon (= densité optique corrigée). Calculer à partir de cette valeur la teneur en gossypol libre comme indiqué en 6. 5.3 Dosage du gossypol total Introduire une prise d'essai contenant de 1 à 5 mg de gossypol dans un ballon jaugé de 50 ml et ajouter 10 ml de solvant B (3.3). Préparer simultanément un essai à blanc, en introduisant 10 ml de solvant B (3.3), dans un autre ballon jaugé de 50 ml. Chauffer les 2 ballons durant 30 minutes sur un bain d'eau bouillante. Refroidir à la température ambiante et compléter le contenu de chaque ballon au volume par le mélange isopropanol-hexane (3.1). Homogénéiser et laisser déposer pendant 10 à 15 minutes, filtrer ensuite et recueillir les filtrats dans des ballons à col rodé. Porter à la pipette 2 ml du filtrat de l'échantillon respectivement dans deux ballons jaugés de 25 ml et 2 ml du filtrat de l'essai à blanc respectivement dans deux autres ballons de 25 ml. Prélever un ballon de chaque série et compléter les contenus respectifs à 25 ml par le mélange isopropanol-hexane (3.1). Ces solutions seront utilisées comme solutions de référence. Ajouter 2 ml d'aniline (3.4) respectivement dans les deux autres ballons. Chauffer durant 30 minutes sur bain d'eau bouillante pour développer la coloration. Refroidir à la température ambiante, compléter à 25 ml par le mélange isopropanol-hexane (3.1), homogénéiser et laisser reposer durant 1 h. Déterminer la densité optique comme indiqué en 5.2 pour le gossypol libre. Calculer à partir de cette valeur la teneur en gossypol total comme indiqué en 6. 6. Calcul des résultats Le calcul des résultats peut se faire soit à partir de la densité optique spécifique (6.1), soit en se référant à une courbe d'étalonnage (6.2). 6.1 A partir de la densité optique spécifique >PIC FILE= "T0004349"> dans laquelle: E = densité optique corrigée, déterminée comme indiqué en 5.2, p = prise d'essai en g, a = partie aliquote du filtrat en ml. 6.2 A partir d'une courbe d'étalonnage 6.2.1 Gossypol libre Préparer 2 séries de 5 ballons jaugés de 25 ml. Dans chaque série, introduire à la pipette dans les ballons des volumes respectifs de 2,0 - 4,0 - 6,0 - 8,0 et 10,0 ml de la solution étalon A de gossypol (3.5). Compléter les volumes à 10 ml à l'aide du solvant A (3.2). Compléter chaque série par un témoin constitué d'un ballon jaugé de 25 ml contenant uniquement 10 ml de solvant A (3.2). Compléter à 25 ml le volume des ballons de la première série (y compris le témoin) par le mélange isopropanol-hexane (3.1) (série de référence). Ajouter 2 ml d'aniline (3.4) dans chaque ballon de la seconde série (y compris le témoin). Chauffer durant 30 minutes sur un bain d'eau bouillante pour développer la coloration. Refroidir à la température ambiante, compléter au volume par le mélange isopropanol-hexane (3.1), homogénéiser et laisser reposer durant 1 h (série étalon). Déterminer dans les conditions indiquées en 5.2 la densité optique des solutions de la série étalon par comparaison avec les solutions correspondantes de la série de référence. Tracer graphiquement la courbe d'étalonnage en portant les densités optiques en regard des quantités de gossypol (en ¶g). 6.2.2 Gossypol total Préparer 6 ballons jaugés de 50 ml. Introduire dans le premier ballon 10 ml de solvant B (3.3) et dans les autres respectivement 2,0 - 4,0 - 6,0 - 8,0 et 10,0 ml de la solution étalon B de gossypol (3.6). Compléter le contenu de chaque ballon à 10 ml à l'aide du solvant B (3.3). Chauffer durant 30 minutes sur un bain d'eau bouillante. Refroidir à la température ambiante, compléter au volume par le mélange isopropanol-hexane (3.1) et homogénéiser. Introduire 2,0 ml de ces solutions respectivement dans deux séries de 6 ballons jaugés de 25 ml. Compléter à 25 ml le contenu des ballons de la première série par le mélange isopropanol-hexane (3.1) (série de référence). Ajouter 2 ml d'aniline (3.4) dans chaque ballon de la seconde série. Chauffer durant 30 minutes sur un bain d'eau bouillante. Refroidir à la température ambiante, compléter au volume par le mélange isopropanol-hexane (3.1), homogénéiser et laisser reposer durant 1 h (série étalon). Déterminer dans les conditions indiquées en 5.2 la densité optique des solutions de la série étalon par comparaison avec les solutions correspondantes de la série de référence. Tracer graphiquement la courbe d'étalonnage en portant les densités optiques en regard des quantités de gossypol (en ¶g). 6.3 Répétabilité La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur un même échantillon ne doit pas dépasser: - 15 %, en valeur relative, pour les teneurs en gossypol inférieures à 500 ppm, - 75 ppm, en valeur absolue, pour les teneurs comprises entre 500 et 750 ppm, - 10 %, en valeur relative, pour les teneurs supérieures à 750 ppm. ANNEXE II 1. DÉTECTION ET IDENTIFICATION DES ANTIBIOTIQUES DU GROUPE DES TÉTRACYCLINES 1. Objet et domaine d'application La méthode permet de déceler et d'identifier les antibiotiques du groupe des tétracyclines dans les aliments qui en contiennent au moins 0,1 ppm, les concentrats et les prémélanges. 2. Principe L'échantillon est soumis à l'extraction par un mélange de méthanol et d'acide chlorhydrique. L'extrait est chromatographié sur papier par voie ascendante comparativement à des solutions de référence. Les antibiotiques sont décelés et identifiés par comparaison de leurs valeurs Rf avec celles des substances étalon, soit par fluorescence en lumière UV (fortes teneurs en antibiotiques), soit par bioautographie sur milieu gélosé inoculé avec B. cereus. 3. Réactifs et milieu de culture >PIC FILE= "T9000556"> 3.5 Mélange méthanol pur/acide chlorhydrique (d : 1,19) : 98/2 en volume. 3.6 Acide chlorhydrique 0,1 N. 3.7 Ammoniaque, d : 0,91. 3.8 Substances étalon : chlortétracycline, oxytétracycline, tétracycline dont l'activité est exprimée en chlorhydrate. 3.9 Microorganisme : B. cereus ATCC no 11.778 Entretien de la souche, préparation de la suspension de spores et inoculation du milieu de culture : appliquer les prescriptions 3.1 et 3.2 de la méthode de dosage de la chlortétracycline, de l'oxytétracycline et de la tétracycline, par diffusion sur gélose, faisant l'objet de la partie 2 de la présente annexe. 3.10 Milieu de culture (1) >PIC FILE= "T9000558"> 3.11 Solution à 0,1 % (p/v) de chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium et 5 % (p/v) de glucose. 4. Appareillage 4.1 Appareillage pour chromatographie ascendante sur papier (hauteur du papier : 25 cm). Papiers Schleicher et Schüll 2040 b ou 2043 b, ou équivalents. 4.2 Centrifugeuse. 4.3 Étuve à incubation, réglée à 30 oC. 4.4 Lampe UV pour détection de la fluorescence. 4.5 Plaques de verre de 20 × 30 cm environ, permettant le montage d'une boîte plate pour la bioautographie. 5. Solutions étalon 5.1 Solutions-mère Préparer, à partir des substances étalon (3.8) et à l'aide d'acide chlorhydrique (3.6), des solutions dont la concentration correspond respectivement à 500 ¶g de chlortétracycline-HCl, d'oxytétracycline-HCl et de tétracycline-HCl par ml. 5.2 Solutions de référence pour la détection en lumière UV Diluer les solutions (5.1) par le tampon phosphate (3.2) pour obtenir des solutions dont la concentration correspond à 100 ¶g de chlortétracycline-HCl, d'oxytétracycline-HCl et de tétracycline-HCl par ml. 5.3 Solutions de référence pour la détection par bioautographie Diluer les solutions (5.1) par le tampon phosphate (3.2) pour obtenir des solutions dont la concentration correspond à 5 ¶g de chlortétracycline-HCl, d'oxytétracycline-HCl et de tétracycline-HCl par ml. 6. Extraction Lorsque la teneur présumée en antibiotique est inférieure à 10 ppm, on peut utiliser soit l'échantillon homogénéisé, soit la fraction la plus fine séparée par tamisage, étant donné que les antibiotiques se trouvent de préférence dans cette fraction. Mettre l'échantillon en suspension dans le mélange (3.5) et centrifuger. Recueillir le liquide surnageant pour l'utiliser tel quel ou le diluer, si nécessaire, par le mélange (3.5) pour obtenir des concentrations en antibiotique de 100 ¶g (6.1) et 5 ¶g (6.2) environ par ml. 7. Détection et identification 7.1 Chromatographie Plonger le papier dans la solution tampon, pH 3,5 (3.1). Éliminer l'excès de liquide en comprimant le papier entre des feuilles de papier filtre sec. Déposer ensuite sur le papier des (1)Tout milieu de culture commercial de composition analogue et donnant les mêmes résultats peut être utilisé volumes de 0,01 ml des solutions de référence (5.2 et 5.3) et de l'extrait (6.1 et 6.2). Pour obtenir une bonne séparation, la teneur appropriée en humidité du papier est déterminante ; le cas échéant, laisser sécher légèrement. Développer par chromatographie ascendante. Utiliser l'éluant I (3.3) pour la détection par bioautographie, l'éluant II (3.4) pour la détection en lumière UV. Lorsque le front de solvant atteint 15 à 20 cm de haut (environ 1 h 30), interrompre la chromatographie et sécher le papier. 7.2 Détection en lumière UV Lorsque la teneur en antibiotique est supérieure à 1 ¶g/cm2, on perçoit des taches fluorescentes jaune or par irradiation sous la lampe UV (4.4) après traitement du chromatogramme par des vapeurs ammoniacales (3.7). 7.3 Détection par bioautographie Verser le milieu de culture (3.10), préalablement inoculé par B. cereus (3.9), sur des plaques de verre (4.5) et poser le papier sur le milieu de culture. Après 5 minutes de contact, détacher le papier et poser celui-ci sur un autre endroit du milieu de culture, où il sera maintenu durant la période d'incubation. Incuber ensuite durant une nuit à l'étuve à 30 oC. La présence d'un antibiotique du groupe des tétracyclines se marque par des zones d'inhibition claires dans le milieu de culture trouble. Pour fixer le chromatogramme, on vaporise la solution (3.11) sur le papier, après incubation. 7.4 Identification Les valeurs Rf relatives des antibiotiques du groupe des tétracyclines sont données ci-après. Ces valeurs peuvent varier légèrement selon la qualité du papier et sa teneur en humidité. >PIC FILE= "T9000559"> Les composés «épi» ont une activité antibiotique inférieure à celle des composés normaux. 2. DOSAGE DE LA CHLORTÉTRACYCLINE, DE L'OXYTÉTRACYCLINE ET DE LA TÉTRACYCLINE A. PAR DIFFUSION SUR GÉLOSE 1. Objet et domaine d'application La méthode permet de doser la chlortétracycline (CTC), l'oxytétracycline (OTC) et la tétracycline (TC) dans les aliments, les concentrats et les prélémanges. La limite inférieure du dosage est de 5 ppm. Les teneurs inférieures à 5 ppm peuvent être estimées par interpolation graphique. 2. Principe Pour les teneurs égales ou inférieures à 50 ppm, l'échantillon est soumis à l'extraction par la formamide diluée. Pour les teneurs supérieures à 50 ppm, il est soumis à l'extraction par un mélange d'acétone, d'eau et d'acide chlorhydrique pour le dosage de la CTC et par un mélange de méthanol et d'acide chlorhydrique pour le dosage de l'OTC et de la TC. Les extraits sont ensuite dilués et leur activité antibiotique est déterminée par la mesure de la diffusion de la CTC, de l'OTC ou de la TC dans un milieu gélosé ensemencé avec B. cereus. La diffusion est indiquée par la formation de zones d'inhibition en présence du microorganisme. Le diamètre de ces zones est directement proportionnel au logarithme de la concentration de l'antibiotique. 3. Microorganisme : B. cereus ATCC no 11.778 3.1 Entretien de la souche Inoculer B. cereus sur gélose inclinée en tube constituée par le milieu de culture (4.1), exempt de bleu de méthylène et d'acide borique. Incuber durant une nuit à 30 oC environ. Conserver la culture en réfrigérateur et repiquer tous les 14 jours sur gélose inclinée. 3.2 Préparation de la suspension de spores Récolter les germes d'un tube de gélose inclinée (3.1) à l'aide de 2 à 3 ml de sérum physiologique (4.5). Ensemencer avec cette suspension un flacon de Roux contenant 300 ml du milieu de culture (4.1), exempt de bleu de méthylène et d'acide borique, dont la concentration en gélose est de 3 à 4 %. Incuber 3 à 5 jours à 28-30 oC, récolter ensuite les spores dans 15 ml d'éthanol (4.6), après avoir vérifié la sporulation sous le microscope, et homogénéiser. Cette suspension peut être conservée en réfrigérateur durant 5 mois au moins. Par des essais préliminaires sur plaques avec le milieu de base du dosage (4.1), déterminer la quantité d'inoculum permettant d'obtenir pour les différentes concentrations d'antibiotique utilisées, des zones d'inhibition aussi étendues que possible et qui soient encore nettes. Cette quantité est généralement de 0,2 à 0,3 ml/1000 ml. L'inoculation du milieu de culture se fait entre 50 et 60 oC. 4. Milieux de culture et réactifs 4.1 Milieu de base du dosage (1) >PIC FILE= "T9000560"> 4.5 Sérum physiologique stérile 4.6 Éthanol à 20 % (v/v) 4.7 Acide chlorhydrique 0,1 N (1)Tout milieu de culture commercial de composition analogue et donnant les mêmes résultats peut être utilisé. 4.8 Formamide à 70 % (v/v) : préparer fraîchement avant l'emploi et ajuster le pH 4,5 à l'aide d'acide sulfurique 2 N environ. 4.9 Mélange acétone pur/eau/acide chlorhydrique (d : 1,19) : 65/33/2 en volume. 4.10 Mélange méthanol pur/acide chlorhydrique (d : 1,19) : 98/2 en volume. 4.11 Substances étalon : CTC, OTC, TC dont l'activité est exprimée en chlorhydrate. 5. Solutions étalon 5.1 Chlortétracycline Préparer, à partir de la substance étalon (4.11) et à l'aide d'acide chlorhydrique (4.7), une solution-mère dont la concentration correspond à 500 ¶g de chlortétracycline-HCl par ml Cette solution se conserve une semaine en réfrigérateur. A partir de cette solution-mère, préparer une solution étalon de travail S8 dont la concentration correspond à 0,2 ¶g de chlortétracycline-HCl par ml. La dilution est faite à l'aide du tampon phosphate, pH 5,5 dilué à 1/10 (4.3), additionné de 0,01 % de noir amido (1). Préparer ensuite par dilutions successives (1 + 1) à l'aide du tampon (4.3), les concentrations suivantes: S4 0,1 ¶g/ml S2 0,05 ¶g/ml S1 0,025 ¶g/ml 5.2 Oxytétracycline En procédant comme indiqué en 5.1, préparer, à partir d'une solution-mère dont la concentration correspond à 400 ¶g d'oxytétracycline-HCl par ml, une solution étalon de travail S8 à 1,6 ¶g d'oxytétracycline-HCl par ml et les concentrations suivantes: S4 0,8 ¶g/ml S2 0,4 ¶g/ml S1 0,2 ¶g/ml 5.2 Tétracycline En procédant comme indiqué en 5.1, préparer, à partir d'une solution-mère dont la concentration correspond à 500 ¶g de tétracycline-HCl par ml, une solution étalon de travail S8 à 1,0 ¶g de tétracycline-HCl par ml et les concentrations suivantes: S4 0,5 ¶g/ml S2 0,25 ¶g/ml S1 0,125 ¶g/ml 6. Extraction 6.1 Teneurs égales ou inférieures à 50 ppm Traiter la prise d'essai par la formamide (4.8), selon les indications données dans le tableau ci-dessous. Agiter durant 30 minutes sur table à secousses. Diluer immédiatement après à l'aide du tampon phosphate (4.3), selon les indications données dans le tableau ci-dessous, pour obtenir la concentration U8. La concentration en formamide de cette solution ne doit pas dépasser 40 %. Centrifuger ou laisser décanter de manière à obtenir une solution limpide. Préparer ensuite les concentrations U4, U2 et U1 par dilutions successives (1 + 1) à l'aide du tampon phosphate (4.3). (1)Le noir amido sert à caractériser les zones d'inhibition des solutions étalon (anneaux bleus). >PIC FILE= "T0004350"> 6.2 Teneurs supérieures à 50 ppm 6.2.1 Chlortétracycline Traiter, selon la teneur présumée en antibiotique de l'échantillon ou sa garantie de fabrication, une prise d'essai de 2 à 10 g par 20 fois son volume de mélange (4.9). Agiter durant 30 minutes sur table à secousses. Vérifier que le pH reste inférieur à 3 au cours de l'extraction ; si nécessaire, ajuster à pH 3 (pour les composés minéraux, à l'aide d'acide acétique à 10 %). Prélever une partie aliquote de l'extrait et ajuster le pH à 5,5 à l'aide du tampon phosphate, pH 8 (4.4) en présence de vert de bromocrésol (virage du jaune au bleu). Diluer à l'aide du tampon phosphate, pH 5,5 dilué à 1/10 (4.3) pour obtenir la concentration U8 (v.6.1). Préparer ensuite les concentrations U4, U2 et U1 par dilutions successives (1 + 1) à l'aide du tampon phosphate (4.3). 6.2.2 Oxytétracycline et tétracycline Procéder comme indiqué en 6.2.1 en remplaçant le mélange (4.9) par le mélange (4.10). 7. Modalités du dosage 7.1 Inoculation du milieu de culture Inoculer à 50-60 oC le milieu de base du dosage (4.1) par la suspension de spores (3.2). 7.2 Préparation des boîtes La diffusion sur gélose s'effectue dans des boîtes avec les 4 concentrations de la solution étalon (S8, S4, S2, S1) et les 4 concentrations de l'extrait (U8, U4, U2, U1). Chaque boîte doit recevoir nécessairement les 4 concentrations de l'étalon et de l'extrait. A cet effet, choisir les dimensions des boîtes de telle sorte qu'on puisse pratiquer dans le milieu gélosé au moins 8 cavités de 10 à 13 mm de diamètre. Calculer la quantité de milieu de culture inoculé (7.1) à utiliser de façon à obtenir un recouvrement uniforme de 2 mm environ d'épaisseur. Il est préférable d'utiliser comme boîtes des plaques de verre planes munies d'un anneau d'aluminium ou de matière plastique parfaitement plan de 200 mm de diamètre et 20 mm de hauteur. Introduire à la pipette dans les cavités des quantités exactement mesurées de solution d'antibiotique comprises entre 0,10 et 0,15 ml, selon le diamètre. Pour chaque échantillon, faire au moins 4 répétitions de diffusion avec chaque concentration, de sorte que chaque dosage fasse l'objet d'une évaluation de 32 zones d'inhibition. 7.3 Incubation Incuber les boîtes durant 18 h environ à 28-30 oC. 6. Évaluation Mesurer le diamètre des zones d'inhibition, de préférence par projection. Inscrire les mesures sur papier semi-logarithmique, en portant le logarithme des concentrations en regard des diamètres des zones d'inhibition. Tracer les droites de la solution étalon et de l'extrait. En l'absence d'interférences, les deux droites doivent être parallèles. Le logarithme de l'activité relative est calculé par la formule suivante: >PIC FILE= "T0004351"> Activité réelle = activité présumée × activité relative. 9. Répétabilité La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon ne doit pas dépasser 10 %, en valeur relative. B. PAR TURBIDIMÉTRIE 1. Objet et domaine d'application La méthode permet de doser la chlortétracycline (CTC), l'oxytétracycline (OTC) et la tétracycline (TC) aux concentrations supérieures à 1 g/kg, dans la mesure où aucune autre substance n'interfère en donnant lieu à des extraits troubles. Cette méthode est plus rapide que la méthode par diffusion sur gélose. 2. Principe L'échantillon est soumis à l'extraction par un mélange d'acétone, d'eau et d'acide chlorhydrique pour le dosage de la CTC et par un mélange de méthanol et d'acide chlorhydrique pour le dosage de l'OTC et de la TC. Les extraits sont ensuite dilués et leur effet antibiotique est déterminé par la mesure de la transmission lumineuse d'un milieu de culture ensemencé avec Staphylococcus aureus et additionné de l'antibiotique. La transmission lumineuse est fonction de la concentration de l'antibiotique. 3. Microorganisme : Staphylococcus aureus K 141 (1) 3.1 Entretien de la souche Inoculer S. aureus sur gélose inclinée en tube constituée par le milieu de culture (4.1), additionné de 1,5 à 3 % de gélose (selon la qualité). Incuber durant une nuit à 37 oC. Conserver la culture en réfrigérateur et repiquer toutes les 4 semaines sur gélose inclinée. Préparer simultanément des sous-cultures pour l'usage de laboratoire. 3.2 Préparation de l'inoculum 24 h avant son utilisation, repiquer une sous-culture sur gélose inclinée et incuber durant une nuit à 37 oC. Mettre en suspension la totalité de la culture d'un tube de gélose dans 2 ml environ du milieu de base (4.1) et transvaser ensuite la suspension dans des conditions stériles dans 100 ml environ du même milieu de base (4.1). Incuber au bain d'eau à 37 oC, jusqu'à ce que la croissance de la souche entre dans sa phase logarithmique (1 h 30 à 2 h). (1)Cette souche, isolée par la LUFA à Kiel, accuse une croissance plus rapide que S. aureus ATCC 6538 P. 4. Milieux de culture et réactifs 4.1 Milieu de base du dosage (1) >PIC FILE= "T9000561"> 4.3 Acide chlorhydrique 0,1 N 4.4 Mélange acétone pur/eau/acide chlorhydrique (d : 1,19) : 65/33/2 en volume. 4.5 Mélange méthanol pur/acide chlorhydrique (d : 1,19) : 98/2 en volume. 4.6 Solution à 10 % environ (p/v) de formaldéhyde. 4.7 Substances étalon : OTC, OTC, TC dont l'activité est exprimée en chlorhydrate. 5. Solution étalon Préparer, à partir de la substance étalon (4.7) et à l'aide d'acide chlorhydrique (4.3) une solution-mère dont la concentration correspond à 400 à 500 ¶g de CTC-HCl, OTC-HCl ou TC-HCl par ml. Cette solution se conserve une semaine en réfrigérateur. 6. Extraction 6.1 Chlortétracycline Introduire dans un ballon jaugé de 200 ou 250 ml une prise d'essai de 1 à 2 g. Ajouter 100 ml environ du mélange (4.4) et agiter durant 30 minutes sur table à secousses. Compléter au volume par le tampon phosphate, pH 4,5 (4.2). Homogénéiser et laisser déposer. 6.2 Oxytétracycline et tétracycline Introduire dans un ballon jaugé de 200 ou 250 ml une prise d'essai de 1 à 2 g. Ajouter 100 ml environ du mélange (4.5) et agiter durant 30 minutes sur table à secousses. Compléter au volume par le tampon phosphate, pH 4,5 (4.2). Homogénéiser et laisser déposer. 7. Modalités du dosage 7.1 Préparation de séries étalon et de l'extrait Diluer de façon appropriée à l'aide du tampon phosphate, pH 4,5 (4.2) la solution étalon (5) et l'extrait (6) de manière à obtenir une série de concentrations qui permette d'établir, pour chaque dosage, une courbe d'étalonnage et l'interpolation sur cette courbe d'au moins deux valeurs relatives à l'extrait. Les dilutions doivent être choisies en fonction des conditions de croissance de la souche, qui peuvent varier d'un laboratoire à l'autre. On procède généralement comme suit: (1)Tout milieu de culture commercial de composition analogue et donnant les mêmes résultats peut être utilisé. 7.1.1 Chlortétracycline Diluer la solution étalon (5) à l'aide du tampon phosphate (4.2) pour obtenir une solution étalon de travail dont la concentration corresponde à 0,2 ¶g de CTC-HCl par ml. Préparer ensuite à l'aide du tampon phosphate (4.2), comme indiqué ci-après et dans des tubes destinés au dosage, 6 dilutions avec une répétition de chaque dilution. >PIC FILE= "T0004352"> Diluer l'extrait (6.1) à l'aide du tampon phosphate (4.2) pour obtenir une concentration présumée en CTC-HCl de 0,12 ¶g/ml. Introduire 1 ml de cette solution dans 2 tubes et 0,75 ml (= 0,09 ¶g) dans 2 autres tubes. Compléter le volume des 2 derniers tubes à 1 ml par le tampon phosphate (4.2). 7.1.2 Oxytétracycline et tétracycline Diluer la solution étalon (5) à l'aide du tampon phosphate (4.2) pour obtenir une solution étalon de travail dont la concentration corresponde à 0,6 ¶g d'OTC-HCl ou de TC-HCl par ml. Préparer ensuite à l'aide du tampon phosphate (4.2) comme indiqué ci-après et dans des tubes destinés au dosage, 7 dilutions avec une répétition de chaque dilution. >PIC FILE= "T0004353"> Diluer l'extrait (6.2) par le tampon phosphate (4.2) pour obtenir une concentration présumée en OTC-HCl ou TC-HCL de 0,48 ¶g/ml. Introduire 1 ml de cette solution dans 2 tubes et 0,5 ml (= 0,24 ¶g) dans 2 autres tubes. Compléter le volume des 2 derniers tubes à 1 ml par le tampon phosphate (4.2). 7.2 Inoculation du milieu de culture Inoculer le milieu de base du dosage (4.1) par l'inoculum (3.2) de manière à obtenir au photomètre à 590 nm une transmission lumineuse de 85 % dans une cuvette de 5 cm ou de 92 % dans une cuvette de 2 cm, l'appareil étant réglé à 100 % de transmission sur le milieu de base (4.1) non inoculé. 7.3 Ensemencement Introduire dans chaque tube (7.1.1 ou 7.1.2) 9 ml du milieu de culture inoculé (7.2). Le remplissage des tubes doit se faire proprement, mais pas nécessairement dans des conditions stériles. 7.4 Incubation L'incubation doit se faire obligatoirement dans un bain d'eau dont la température est maintenue homogène à 37 oC ± 0,1 oC par agitation. Le temps d'incubation doit être choisi de manière à pouvoir tracer des courbes de transmission dont la pente est appropriée à des mesures précises (généralement 2 h 30 à 3 h). Bloquer ensuite la croissance en injectant rapidement 1 ml de solution de formaldéhyde (4.6) dans chaque tube. 7.5 Mesure de la croissance Mesurer les transmissions au photomètre à 590 nm, en réglant l'appareil à 100 % de transmission sur la solution étalon la plus limpide (correspondant à la teneur la plus élevée en antibiotique). En raison des faibles différences de turbidité présentées par les différents tubes, il est recommandé d'utiliser des cuvettes de 2 cm au moins et, de préférence, de 5 cm. 8. Calcul des résultats Tracer graphiquement la courbe d'étalonnage sur papier millimétré en portant les transmissions photométriques en regard des concentrations en antibiotique. Interpoler sur la courbe les transmissions relatives à l'extrait. Calculer la teneur en antibiotique de l'échantillon. 9. Répétabilité La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon ne doit pas dépasser 10 %, en valeur relative. 3. DOSAGE DE L'OLÉANDOMYCINE - par diffusion sur gélose - 1. Objet et domaine d'application La méthode permet de doser l'oléandomycine dans les aliments, les concentrats et les prémélanges, même en présence de tétracyclines. La limite inférieure du dosage est de 0,5 ppm. 2. Principe L'échantillon est soumis à l'extraction par une solution méthanolique diluée de tris (hydroxyméthyl) aminométhane. Après centrifugation, l'extrait est dilué et son activité antibiotique est déterminée par la mesure de la diffusion de l'oléandomycine dans un milieu gélosé ensemencé avec B. cereus. La diffusion est indiquée par la formation de zones d'inhibition en présence du microorganisme. Le diamètre de ces zones est directement proportionnel au logarithme de la concentration de l'antibiotique. 3. Microorganisme : B. cereus K 250 TR (1) (résistant aux tétracyclines) 3.1 Entretien de la souche Inoculer B. cereus sur gélose inclinée en tube constituée par le milieu de culture (4.1) et additionnée de 100 ¶g d'oxytétracycline par 5 ml. Incuber durant une nuit à 30 oC environ. Conserver la culture en réfrigérateur et repiquer toutes les 4 semaines sur gélose inclinée. 3.2 Préparation de la suspension de spores Récolter les germes d'un tube de gélose inclinée (3.1) à l'aide de 3 ml environ du sérum physiologique (4.3). Ensemencer avec cette suspension un flacon de Roux contenant 300 ml du milieu de culture (4.1) dont la concentration en gélose est de 3 à 4 %. Incuber 3 à 5 jours à 28-30 oC, récolter ensuite les spores dans 15 ml d'éthanol (4.4), après avoir vérifié la sporulation sous le microscope, et homogénéiser. Cette suspension peut être conservée en réfrigérateur durant 5 mois au moins. Par des essais préliminaires sur plaques avec le milieu de base du dosage (4.2), déterminer la quantité d'inoculum permettant d'obtenir pour les différentes concentrations d'oléandomycine utilisées, des zones d'inhibition aussi étendues que possible et qui soient encore nettes. Cette quantité est généralement de 0,1 à 0,2 ml/1000 ml. L'inoculation du milieu de culture se fait à 60 oC. (1)Souche isolée par la LUFA à Kiel. 4. Milieux de culture et réactifs 4.1 Milieu d'entretien de la souche (1) >PIC FILE= "T9000562"> 4.2 Milieu de base du dosage (1) Milieu (4.1) ajusté à pH 8,8 4.3 Sérum physiologique stérile 4.4 Éthanol à 20 % (v/v) 4.5 Méthanol, pur 4.6 Solution à 0,5 % (p/v) de tris (hydroxyméthyl) amino-méthane p.a. 4.7 Solution d'extraction >PIC FILE= "T9000563"> 4.8 Substance étalon : oléandomycine d'activité connue. 5. Solution étalon Dissoudre de la substance étalon (4.8) dans 5 ml de méthanol (4.5) et diluer par la solution (4.6) pour obtenir une concentration en oléandomycine de 100 ¶g/ml. A partir de cette solution-mère, préparer en diluant par la solution (4.6) une solution étalon de travail S8 contenant 0,1 ¶g d'oléandomycine par ml. Préparer ensuite par dilutions successives (1 + 1) à l'aide de la solution (4.6) les concentrations suivantes: S4 0,05 ¶g/ml S2 0,025 ¶g/ml S1 0,0125 ¶g/ml 6. Extraction Prélever, selon la teneur présumée en oléandomycine de l'échantillon, une prise d'essai de 2 à 10 g, ajouter 100 ml de la solution (4.7) et agiter durant 30 minutes sur table à secousses. Centrifuger, prélever une partie aliquote de l'extrait et diluer par la solution (4.6) pour obtenir une concentration présumée en oléandomycine de 0,1 ¶g/ml (= U8). Préparer ensuite les concentrations U4, U2 et U1 par dilutions successives (1 + 1) à l'aide de la solution (4.6). (1)Tout milieu de culture commercial de composition analogue et donnant les mêmes résultats peut être utilisé. 7. Modalités du dosage 7.1 Inoculation du milieu de culture Inoculer à 60 oC le milieu de base du dosage (4.2) par la suspension de spores (3.2). 7.2 Préparation des boîtes La diffusion sur gélose s'effectue dans des boîtes avec les 4 concentrations de la solution étalon (S8, S4, S2, S1) et les 4 concentrations de l'extrait (U8, U4, U2, U1. Chaque boîte doit recevoir nécessairement les 4 concentrations de l'étalon et de l'extrait. A cet effet, choisir les dimensions des boîtes de telle sorte qu'on puisse pratiquer dans le milieu gélosé au moins 8 cavités de 10 à 13 mm de diamètre. Calculer la quantité du milieu de culture inoculé (7.1) à utiliser de façon à obtenir un recouvrement uniforme de 2 mm environ d'épaisseur. Il est préférable d'utiliser comme boîtes des plaques de verre planes munies d'un anneau d'aluminium ou de matière plastique parfaitement plan de 200 mm de diamètre et 20 mm de hauteur. Introduire à la pipette dans les cavités des quantités exactement mesurées de solution d'antibiotique comprises entre 0,10 et 0,15 ml, selon le diamètre. Pour chaque échantillon, faire au moins 4 répétitions de diffusion avec chaque concentration, de sorte que chaque dosage fasse l'objet d'une évaluation de 32 zones d'inhibition. 7.3 Incubation Incuber les boîtes durant 18 h environ à 28-30 oC. 8. Évaluation Mesurer le diamètre des zones d'inhibition, de préférence, par projection. Inscrire les mesures sur papier semi-logarithmique, en portant le logarithme des concentrations en regard des diamètres des zones d'inhibition. Tracer les droites de la solution étalon et de l'extrait. En l'absence d'interférences, les deux droites doivent être parallèles. Le logarithme de l'activité relative est calculé par la formule suivante: >PIC FILE= "T0004354"> Activité réelle = activité présumée × activité relative. 9. Répétabilité La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon ne doit pas dépasser 10 % m, en valeur relative. 4. DOSAGE DE LA TYLOSINE - par diffusion sur gélose - 1. Objet et domaine d'application La méthode permet de doser la tylosine dans les aliments, les concentrats et les prémélanges. La limite inférieure du dosage est de 2 ppm. 2. Principe L'échantillon est traité par une solution tampon phosphate à pH 8, préalablement portée à 80 oC, et soumis ensuite à l'extraction par le méthanol. Après centrifugation, l'extrait est dilué et son activité antibiotique est déterminée par la mesure de la diffusion de la tylosine dans un milieu gélosé ensemencé avec Sarcina lutea. La diffusion est indiquée par la formation de zones d'inhibition en présence du microorganisme. Le diamètre de ces zones est directement proportionnel au logarithme de la concentration de l'antibiotique. 3. Microorganisme : Sarcina lutea ATCC no 9341 3.1 Entretien de la souche Inoculer Sarcina lutea sur gélose inclinée en tube constituée par le milieu de culture (4.1), ajusté à pH 7,0. Incuber durant une nuit à 35 oC environ. Conserver la culture en réfrigérateur et repiquer tous les mois sur gélose inclinée. 3.2 Préparation de la suspension de germes Récolter les germes d'un tube de gélose inclinée (3.1) de préparation récente, par 2 à 3 ml de sérum physiologique (4.4). Ensemencer avec cette suspension un flacon de Roux contenant 250 ml du milieu de culture (4.1), ajusté à pH 7,0. Incuber durant 24 h à 35 oC, récolter les germes à l'aide de 25 ml de sérum physiologique (4.4). Homogénéiser et diluer cette suspension pour obtenir une transmission lumineuse de 75 % environ à 650 nm. Conservée en réfrigérateur, cette suspension est utilisable durant une semaine. Par des essais préliminaires sur plaques avec le milieu de base du dosage (4.1), déterminer la quantité d'inocolum permettant d'obtenir pour les différentes concentrations de tylosine utilisée des zones d'inhibition aussi étendues que possible et qui soient encore nettes. L'inoculation du milieu de culture se fait à 48-50 oC. 4. Milieux de culture et réactifs 4.1 Milieu de base du dosage (1) >PIC FILE= "T9000564"> 4.4 Sérum physiologique stérile 4.5 Méthanol, pur 4.6 Méthanol à 10 % (v/v) 4.7 Mélange tampon phosphate (4.2)/méthanol pur : 60/40 en volume. 4.8 Substance étalon : tylosine connue. (1)Tout milieu de culture commercial de composition analogue et donnant les mêmes résultats pour être utilisé. 5. Solutions étalon Sécher la substance étalon (4.8) durant 3 h à 60 oC dans une étuve à vide (5 mm de mercure). Peser 10 à 50 mg dans un ballon jaugé, les dissoudre dans 5 ml de méthanol (4.5) et diluer la solution par le tampon phosphate, pH 7 (4.3) pour obtenir une concentration en tylosine-base de 1000 ¶g/ml. A partir de cette solution-mère, préparer en diluant par le mélange (4.7) une solution étalon de travail S8 contenant 2 ¶g de tylosine-base par ml. Préparer ensuite par dilutions successives (1 + 1) à l'aide du mélange (4.7), les concentrations suivantes: S4 1 ¶g/ml S2 0,5 ¶g/ml S1 0,25 ¶g/ml 6. Extraction Prélever pour les concentrats une prise d'essai de 10 g ; pour les prémélanges et les aliments une prise d'essai de 20 g. Ajouter 60 ml de tampon phosphate, pH 8 (4.2), préalablement portés à 80 oC, et homogénéiser durant 2 minutes (appareil ménager, Ultra-turrax, etc.). Laisser ensuite reposer 10 minutes, ajouter 40 ml de méthanol (4.5) et homogénéiser durant 5 minutes. Centrifuger, prélever une partie aliquote de l'extrait et diluer par le mélange (4.7) pour obtenir une concentration présumée en tylosine de 2 ¶g/ml (= U8). Préparer ensuite les concentrations U4, U2 et U1 par dilutions successives (1 + 1) à l'aide du mélange (4.7). Pour les teneurs inférieures à 10 ppm, évaporer l'extrait à sec dans un évaporateur rotatif à 35 oC et reprendre le résidu par du méthanol à 40 % (4.6). 7. Modalités du dosage 7.1 Inoculation du milieu de culture Inoculer à 48-50 oC le milieu de base du dosage (4.1), ajusté à pH 8,0, par la suspension de germes (3.2). 7.2 Préparation des boîtes La diffusion sur gélose s'effectue dans des boîtes avec les 4 concentrations de la solution étalon (S8, S4, S2, S1) et les 4 concentrations de l'extrait (U8, U4, U2, U1). Chaque boîte doit recevoir nécessairement les 4 concentrations de l'étalon et de l'extrait. A cet effet, choisir les dimensions des boîtes de telle sorte qu'on puisse pratiquer dans le milieu gélosé au moins 8 cavités de 10 à 13 mm de diamètre. Calculer la quantité du milieu de culture inoculé (7.1) à utiliser de façon à obtenir un recouvrement uniforme de 2 mm environ d'épaisseur. Il est préférable d'utiliser comme boîtes des plaques de verre planes munies d'un anneau d'aluminium ou de matière plastique parfaitement plan de 200 mm de diamètre et 20 mm de hauteur. Introduire à la pipette dans les cavités des quantités exactement mesurées de solution d'antibiotique comprise entre 0,10 et 0,15 ml, selon le diamètre. Pour chaque échantillon, faire au moins 4 répétitions de diffusion avec chaque concentration, de sorte que chaque dosage fasse l'objet d'une évaluation de 32 zones d'inhibition. 7.3 Incubation Incuber les boîtes durant une nuit à 35-37 oC. 8. Évaluation Mesurer le diamètre des zones d'inhibition, de préférence, par projection. Inscrire les mesures sur papier semi-logarithmique, en portant le logarithme des concentrations en regard des diamètres de zones d'inhibition. Tracer les droites de la solution étalon et de l'extrait. En l'absence d'interférences, les deux droites doivent être parallèles. Le logarithme de l'activité relative est calculé par la formule suivante: >PIC FILE= "T0004355"> Activité réelle = activité présumée × activité relative. 9. Répétabilité La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon ne doit pas dépasser 10 %, en valeur relative. 5. DOSAGE DE LA VIRGINIAMYCINE - par diffusion sur gélose - 1. Objet et domaine d'application La méthode permet de doser la virginiamycine dans les aliments, les concentrats et les prémélanges. La limite inférieure du dosage est de 2 ppm. 2. Principe L'échantillon est soumis à l'extraction par une solution méthanolique de Tween 80. Après centrifugation ou filtration, l'extrait est dilué et son activité antibiotique est déterminée par la mesure de la diffusion de la virginiamycine dans un milieu gélosé ensemencé avec Sarcina lutea La diffusion est indiquée par la formation de zones d'inhibition en présence du microorganisme. Le diamètre de ces zones est directement proportionnel au logarithme de la contration de l'antibiotique. 3. Microorganisme : Sarcina lutea ATCC no 9341 3.1 Entreprise de la souche Inoculer S. lutea sur gélose inclinée en tube constituée par le milieu de culture (4.1). Incuber durant une nuit à 35 oC environ. Conserver la culture en réfrigérateur et repiquer tous les 14 jours sur gélose inclinée. 3.2 Préparation de la suspension de germes Récolter les germes d'un tube de gélose inclinée (3.1), de préparation récente, par 2 à 3 ml de sérum physiologique (4.3). Ensemencer avec cette suspension un flacon de Roux contenant 250 ml du milieu de culture (4.1). Incuber durant 24 h à 35 oC, récolter les germes à l'aide de 25 ml de sérum physiologique (4.3). Homogénéiser et diluer cette suspension pour obtenir une transmission lumineuse de 75 % environ à 650 nm. Conservée en réfrigérateur, cette suspension est utilisable durant une semaine. Par des essais préliminaires sur plaques avec le milieu de base du dosage (4.1), déterminer la quantité d'inoculum permettant d'obtenir pour les différentes concentrations de virginiamycine utilisées des zones d'inhibition aussi étendues que possible et qui soient encore nettes. L'inoculation du milieu de culture se fait à 48-50 oC. 4. Milieux de culture et réactifs 4.1 Milieu de base du dosage (1) >PIC FILE= "T9000565"> (1)Tout milieu de culture commercial de composition analogue et donnant les mêmes résultats peut être utilisé. >PIC FILE= "T9000566"> 4.3 Sérum physiologique stérile 4.4 Méthanol, pur 4.5 Mélange tampon phosphate (4.2)/méthanol pur : 80/20 en volume. 4.6 Solution méthanolique à 0,5 % (p/v) de Tween 80. 4.7 Substance étalon : virginiamycine d'activité connue. 5. Solution étalon Préparer une solution méthanolique de substance étalon (4.7) à 800 ¶g de virginiamycine par ml. A partir de cette solution-mère, préparer en diluant par le mélange (4.5) une solution étalon de travail S8 contenant 1 ¶g de virginiamycine par ml. Préparer ensuite par dilutions successives (1 + 1) à l'aide du mélange (4.5), les concentrations suivantes: S4 0,5 ¶g/ml S2 0,25 ¶g/ml S1 0,125 ¶g/ml 6. Extraction 6.1 Produits dont la teneur en virginiamycine est égale ou inférieure à 50 ppm Prélever une prise d'essai de 10 à 20 g, ajouter 100 ml de la solution (4.6) et agiter durant 30 minutes sur table à secousses. Centrifuger ou filtrer, prélever 20 ml de la solution limpide et les évaporer à sec dans un évaporateur rotatif. Reprendre le résidu par 20 ml ou plus du mélange (4.5) pour obtenir une concentration présumée en virginiamycine de 1 ¶g/ml (= U8). Préparer ensuite les concentrations U4, U2 et U1 par dilutions successives (1 + 1) à l'aide du mélange (4.5). 6.2 Produits dont la teneur en virginiamycine est supérieure à 50 ppm Prélever une prise d'essai de 1 à 10 g, ajouter 100 ml de la solution (4.6) et agiter durant 30 minutes sur table à secousses. Centrifuger ou filtrer et diluer ensuite par le mélange (4.5) pour obtenir une concentration présumée en virginiamycine de 1 ¶g/ml (= U8). Préparer ensuite les concentrations U4, U2 et U1 comme indiqué en 6.1. 7. Modalités de dosage 7.1 Inoculation du milieu de culture Inoculer à 48-50 oC le milieu de base du dosage (4.1) par la suspension de germes (3.2). 7.2 Préparation des boîtes La diffusion sur gélose s'effectue dans des boîtes avec les 4 concentrations de la solution étalon (S8, S4, S2, S1) et les 4 concentrations de l'extrait (U8, U4, U2, U1). Chaque boîte doit recevoir nécessairement les 4 concentrations de l'étalon et de l'extrait. A cet effet, choisir les dimensions des boîtes de telle sorte qu'on puisse pratiquer dans le milieu gélosé au moins 8 cavités de 10 à 13 mm de diamètre. Calculer la quantité du milieu de culture inoculé (7.1) à utiliser, de façon à obtenir un recouvrement uniforme de 2 mm environ d'épaisseur. Il est préférable d'utiliser comme boîtes des plaques de verre planes munies d'un anneau d'aluminium ou de matière plastique parfaitement plan de 200 mm de diamètre et 20 mm de hauteur. Introduire à la pipette dans les cavités des quantités exactement mesurées de solution d'antibiotique comprises entre 0,10 et 0,15 ml, selon le diamètre. Pour chaque échantillon, faire au moins 4 répétitions de diffusion avec chaque concentration, de sorte que chaque dosage fasse l'objet d'une évaluation de 32 zones d'inhibition. 7.3 Incubation Incuber les boîtes durant 18 h environ à 28-30 oC. 8. Évaluation Mesurer le diamètre des zones d'inhibition, de préférence, par projection. Inscrire les mesures sur papier semi-logarithmique, en portant le logarithme des concentrations en regard des diamètres des zones d'inhibition. Tracer les droites de la solution étalon et de l'extrait. En l'absence d'interférences, les deux droites doivent être parallèles. Le logarithme de l'activité relative est calculé par la formule suivante: >PIC FILE= "T0004356"> Activité réelle = activité présumée × activité relative. 9. Répétabilité La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon ne doit pas dépasser 10 %, en valeur relative.


text:
PRP steht als Abkürzung für:
 Parallel Redundancy Protocol, Redundanzprotokoll für Ethernet-Netzwerke
 Parti de la Révolution Populaire, Partei im Kongo, gegründet 1967 von Laurent-Désiré Kabila
 Partido Republicano Português, ehemalige portugiesische Partei
 Partido Republicano Progressista (1945), ehemalige brasilianische Partei, 1965 aufgelöst
 Partido Republicano Progressista (1989), brasilianische Partei, 1989 gegründet
 Partija Reformy i Porjadok, ukrainische Partei, siehe Partei Reformen und Ordnung
 Pathology – Research and Practice, Fachzeitschrift (Elsevier)
 Petroleum Remediation Product, Material zur Absorption von Erdöl
 Platelet-rich plasma, siehe Thrombozytenreiches Plasma
 Probable Prime, siehe PRP-Zahl
 PrP steht als Abkürzung für:
 Prion Protein, siehe Prion
 Abkürzung