Development of multidrug resistance to beta-lactam antibiotics Utveckling av multidrogresistens för beta-lactam-antibiotika Enzymes play prominent roles in the resistance phenotype of cells treated with ß-lactam antibiotics or with alkylating cytostatic drugs. Drug resistance is a growing problem in medicine world-wide and understanding of the molecular evolution of enzymes that inactivate drugs is important to the design of more effective drugs and to improved therapeutic regimes. Our ongoing project is primarily focused on multidrug resistance in bacteria and evolution of ß-lactamase activity inactivating antibiotics. In one mode Salmonella bacteria are subjected to alternative ß-lactam antibiotics for selection of clones expressing enzyme mutants that provide resistance. In a second and parallel mode computational studies will predict the optimal enzyme structure for inactivation of a given antibiotic. The predicted structure will be expressed from a synthetic gene. In both cases the starting point is the same designed recombinant metallo-ß-lactamase mimic. Comparison of the outcome of experimental resistance evolution in bacteria with the predicted optimal enzyme structure will reveal if alternative potent enzymes can evolve, and if the phenotype resulting from bacterial selection is only a mild version in comparison with the calculated optimal solution. GSTs offer a second system for studies relevant to anti-cancer drug resistance. In this paradigm gain of activity against alkylators and loss of sensitivity to enzyme inhibitors will be studied based on the Resistens mot läkemedel är ett stort och växande problem inom den globala sjukvården. Resistens som uppkommer vid behandling av patienter kan göra läkemedel verkningslösa. Vissa sjukdomar kan redan initialt vara svårbehandlade på grund av en ursprunglig läkemedelsresistens, medan behandling av andra ger upphov till resistens genom en kombination av mutationsframkallande processer och urval av mutanter av celler eller molekyler som bär resistensegenskaperna. I detta forskningsprojekt studeras resistens som orsakas av att läkemedel bryts ned av enzymer. Detta är fallet vid behandling av infektionssjukdomar med antibiotika. Vi studerar ett enzym som ursprungligen saknar förmågan att bryta ned aktuella läkemedel, men som genom strukturella förändringar förvärvat denna egenskap. Vi kommer nu att undersöka hur genen för det inaktiva proteinet kan muteras och ge upphov till resistens hos bakterier. Ett rekombinantenzym från människa med viss strukturell likhet till bakteriella ß-laktamaser som bryter ned penicillin och liknande läkemedelsmolekyler muteras med biokemisk metodik så att nya enzymer med förändrade egenskaper bildas. Enzymvarianterna testas i salmonellabakterier som odlas i närvaro av olika ß-laktamantibiotika. Bakterier som växer i närvaro av höga koncentrationer av antibiotika isoleras och sambandet med ökad enzymaktivitet valideras. Liknande försök har tidigare utförts av andra forskare. Det nya konceptet är att parallellt utsätta enzymvarianterna i bakterier för ett tiotal olika kliniskt relevanta antibiotika. Arbetshypotesen är att det bildas en eller flera typer av nya muterade enzymer, som ger bakterierna överlevnadsvärde i närvaro av alternativa antibiotika. De identifierade enzymerna kommer att renframställas för strukturell och funktionell karakterisering på molekylär nivå. Vi kan på så vis finna betingelser för uppkomst av korsresistens mot olika läkemedel orsakad av mutationer i ett enzym. Resultaten från vårt modellsystem kommer att ge kunskap om grundläggande principer för uppkomst av enzymbaserad resistens mot alternativa läkemedel. Resistens kan uppstå samtidigt mot vissa antibiotika men inte mot alla. Denna information är värdefull för design av nya läkemedel som inte ger upphov till korsresistens. Resultaten kan vidare generaliseras för utveckling av individbaserad behandling, baserad på val av läkemedel efter analys av målenzymet i den aktuella patienten.