Studies on the role of pRB-CYCLIN/CDK pathway in tissue regeneration and its response to viral infection in Ambystoma salamander species Studier av pRB-CYCLIN/CDK-mekanismens roll i vävnadsregeneration och dess funktion vid virusinfektion hos Ambystoma salamanderarter Enligt de senaste internationella studierna hotas mellan en tredjedel till hälften av världens cirka 6000 amfibiska arter av utrotning inom de kommande årtionden. Orsaken ligger i en kombination av faktorer såsom klimatförändringar, förlust av livsmiljö, miljöförstörelse samt biotiska hot i form av svamp- och virusinfektioner, exempelvis orsakade av Ambystoma tigrinum (ATV). Experter inom bevarandebiologi jämställer det aktuella kritiska tillståndet för amfibiska arters överlevnad med utrotningen av dinosaurierna. Mexiko utgör en av de fem länder i världen med högst biodiversitet. Fler än 300 amfibiska arter lever här, varav 128 är inhemska för Mexiko. Majoriteten av dessa arter skyddas genom nationella lagar men trots det är fyra arter (Ambystoma dumerilii, A. lermaense, A. mexicanum and Bufo retiformis) allvarligt utrotningshotade. Tre av dessa allvarligt hotade arter tillhör genus Ambystoma (vanliga salamandrar) som till fullo består av 32 arter varav 16 är inhemska för Mexiko och vid olika risknivå för utrotning. För att bidra till bevarandet av dessa värdefulla arter har vi som målsättning att utröna hur den genetiska och molekylära responsen hos Ambystoma mexicanum och Ambystoma velasci ter sig när dem utsätts för ATV-infektion. Tidigare experimentellt data tyder på att viruset triggar igång en ackumulering av Polo-like kinase (Plk) som aktiverar reglerande proteinkinaskomplex inom CYCLIN/CDK-cellcykeln. Dessa komplex kan fosforylera och därigenom modulera retinoblastoma tumörrepressorproteinet pRB som är en avgörande regulator av cellprolifiering. pRB spelar även en viktig roll i att bibehålla balansen mellan celldelning och differentiering hos flercelliga organismer. Vi avser undersöka hur pRB-CYCLIN/CDK-mekanismen fungerar hos salamandrar med ATV-infektion. Vårt forskningsprogram inkluderar även funktionella analyser av pRB-CYCLIN/CDK-mekanismen inom kontexten av vävnadsregeneration hos Ambystomatider eftersom dessa visar en unik kapacitet för att regenerera olika extremiteter till följd av skador eller amputationer. Eftersom salamandergenomet ännu ej sekvenserats initierade Cruz-Ramirez forskargrupp i Irapuato i Mexiko en RNA-sekvenseringsmetodik för att identifiera gener kopplade till pRB-CYCLIN/CDK-mekanismen. Proteinerna som dessa gener kodar för kommer uttryckas av Bakos forskargrupp i Umeå i Sverige för att studera den Plk-medierade aktiveringen av CYCKLIN/CDK-komplexen, testa fosforyleringsaktiviteten hos dessa komplex gentemot pRB samt kartlägga fosforyleringssajterna. Det huvudsakliga fokuset i den här fasen av samarbetet är att färdigutveckla molekylära verktyg liksom att fastställa de funktionella samband som finns mellan olika komponenter av pRB-CYCLIN/CDK-meaknismen. För att bygga vidare på förvärvade insikter kommer expressionsmönster av Plk-, pRB- och CYKLIN/CDK-gener undersökas in-vivo genom in-situ hybridiserings- och immunkolokaliseringstekniker i transgena Ambystomalinjer både vid ATV-infektion och vid vävnadsregeneration. Slutligen, kommer fenotyperna i gain-of-function- och loss-of-function-försök för samtliga nyckelgener att studeras. Våra resultat kommer bidra till en bättre förståelse för responsmekanismerna hos värdceller vid ATV-virusinfektion och kommer möjliggöra utvecklandet av nya strategier för att bevara amfibiska arter som är mottagliga för viruset. Vidare kommer våra resultat kring pRB-CYCLIN/CDK-mekanismens funktion hos salamandrar under vävnadsregenereration bidra till vår förståelse för de rundläggande molekylära mekanismer som utgör cellulär omprogrammering och kommer således att vara ett värdefullt bidrag inom områdena regenerativ biologi och biomedicinen. Overall purpose of the research program is to explore the molecular mechanism underlying the unique regeneration capacity of salamanders and to investigate the response of this mechanism to viral infection. Laboratory in Mexico initiated an RNA sequencing approach to identify genes of the pRB-CYCLIN/CDK pathway. Proteins encoded by pathway genes will be expressed by the group in Sweden to study the Plk-mediated activation of CYCLIN/CDK complexes, test their phosphorylation activity against pRB and map phosphorylation sites by mass spectrometry. Initial phase of the collaboration aims to establish molecular tools and to determine functional relationships between pathway members. Following up on this knowledge the in vivo expression patterns of Plk, pRB and CYCLIN/CDK genes will be investigated by in situ hybridization and immunolocalization techniques in transgenic Ambystoma lines in response to ATV infection and during regeneration. Finally, the phenotypes of gain-of-function and loss-of-function approaches for all the key genes will be studied. Our results will lead to a better understanding of the host response mechanism to ATV virus infection and will enable novel strategies for the conservation of amphibian species. Furthermore, our results of how the pRB-CYCLIN/CDK pathway acts in salamanders during regeneration will facilitate understanding of the molecular mechanisms underlying cellular reprogramming and will be valuable in tissue regenerative biology and biomedicine.