Epigenetic modulation of antibiotic resistance gene transfer in bacteria Epigenetisk metylering i plasmider och värdbakterier påverkar spridning av antibiotikaresistensgener Antibiotic resistance is increasing in bacteria. The problem has escalated by recent overuse of antibiotics in humans and animals and by contaminated environments. Today we face a real risk that emergence of multi-resistance in bacterial pathogens might render some infections untreatable and throw humanity back to the pre-antibiotic era. We have performed transconjugation experiments using bacteria derived direclty from natural contaminated water sources in Bolivia to study tranfer of antibiotic resistance genes. Recipient bacteria with obtained resistance were whole genome sequenced and the tranferred genetic material was analyzed. We found that genes encoding epigenetic methyltransferases and restriction endonucleases were part of the mobile DNA. We will now address the impact of epigenetic modifications in donor and recipient bacteria by taking advantage of Long-Read sequencing techniques (PacBio) that allows assemly of entire chromosomes and plasmids and also detect methylation profiles. Our preliminary data indicate that strain specific methylation profiles are present in E coli. We have found isolats that seemingly are unable to take up mobile genetic material while other isolates seems hypereffective in acquisition of foreign DNA. We hypotheze that this is due to epigenetic modifications of donor and recipient strains. The results will improve our understanding on how superbugs with antibiotic multiresistance can emerge and spread globally. Antibiotikaresistenta bakterier ökar över hela världen och nu är ett reellt hot mot hälsa hos människor. Tidigare forskning har visat att selektion och/eller evolution av resistens hos bakterier kan påskyndas av antibiotikarester, biocider och föroreningar i vattendrag orsakade av utsläpp och ofullständig rening av avlopp. Orsaken till detta är att gener som kodar för antibiotikaresistens och metal/biocid resistens ofta finns på samma DNA fragment och kan överföras genom horisontell överföring mellan bakterier.   Men bakterier har också starka skyddsmekanismer mot främmande DNA vilket lika väl kan ge en evolutionär nackdel för den mottagande bakterien. Bakteriers skydd innebär att de har specifika metylasenzym som sätter en metylgrupp på adenosin(A)- och cytosin(C)-nukleotider i det egna DNAt och att de också bär på ett motsvarande restriktionsenzym som klipper upp DNA som inte har rätt metyleringsmönster. Likaså är CRISPR/cas systemet från början ett sätt för bakterier att idenifiera virus eller plasmider som tidigare infekterat stammen och riktat klippa sönder dessa fragment vid ny infektion. På så sätt har bakterier ett slags primitivt immunsystem som förstör ovälkommet inkommande DNA. Detta innebär att eftersom horisontell spridning av antibiotikaresistens ändå sker måste plasmider kunna motverka dessa skyddsmekanismer för att etablera sig i sin nya bakterievärdVi har resultat från experiment där vi blandat förorenat naturligt flodvatten innehållande miljö- och fekala bakterier från en flod i Bolivia, med en mottagande labstam. Genom att analysera mottagarstammarför erhållen antibiotikaresistens kunde vi se att överföring av resistens hade skett. För att karakterisera mottagarbakterierna extraherade vi DNA och utförde helgenomsekvensering. Genom att jämföra sekvenser mellan de resistenta mottagarcellerna med den ursprungliga bakteriecellen identifieras gener som kodade för antibiotikaresistens och intressant nog även metylaser och antirestriktionsgener. Detta innebär att de överförda genetiska fragmenten förmodligen reglerar sin egen metyleringsprofil och eventuellt ändrar metyleringen i mottagarcellen. Detta visar att överföring av antibiotikaresistens är komplex och beroende både av givarcellens och mottagarcellens genetiska profil. Dessutom kan metylering medföra epigenetiska förändingar i genexpression hos bakterier. Upptag av antibiotiakresistensplasmider kan alltså eventuellt påverka uttryck av virulensfaktorer eller andra gener hos bakterier.Vi avser att anända Long-Read sequencing (PacBio) som kan sekvensera mycket långa DNA fragment och samtidigt upptäcka metylerade nukleotider eftersom det uppstår en tidsförskjutning i insättandet av nästa nukleotid. PacBio tekninken också kan sätta ihop hela bakteriella kromosomer och stora plasmider så vi kan bestämma exakt vilka plasmider som överförs. Metyleringsprofilen i givar och mottagarceller före och efter överföring kommer att jämföras med PacBio sekvensering i samarbete med SciLife Uppsala, Preliminära resultat indikerar att naturliga isolat av E. coli har en klonspecifik metyleringsprofil.Vår hypotes är att vissa enterobakterier kan vara obenägna eller hyperbenägna att ta upp och/eller överföra antibiotikaresistens p.g.a av sin metyleringsprofil.  Detta stöds av fynd av multiresistenta kloner av E. coli som rapporteras sprida sig närmast explosionsartat över världen under de senaste 10-20 åren. Ett sådant exempel är den anmälningspliktiga multiresistenta E. coli klonen ST131 som ger svår urinvägsinfektion vilken kan resultera i obotliga urinvägsinfektioner. Vi har i försök sett att ST131 kan ta upp resistensgener från andra mutiresistenta kloner vilket stöder vår hypotes.Detta projekt kombinerar unika miljöer bakterier i Bolivia med avancerade genetiska och epigenetiska analyser i Sverige. Det bolivianska teamet är experter på transkonjugeringsexperiment och odlingsanalys medan den svenska gruppen bidrar med molekylärbiologi och sekvensering. Vi använder naturligt förekommande bakterier från förorenat vatten i Bolivia samt en E. coli stamkollektion för analyser av upptag av antibiotikaresistensplasmider, epigenetik och genexpression före och efter transkonjugering. Vi kommer slå ut metylaser och antirestriktionsfaktorer med mutagenes och studera om detta påverkar överföring av plasmider och genuttryck hos givar och mottagarceller. Resultaten kommer ge en bättre förståelse för de molekylära mekanismerna bakom spridning och uppkomst av antbiotikaresistens.