روش ایمونو پرسی پتاسیون (Immunoprecipitation) جهت جداسازی  پروتئین و سایر مولکول های زیستی از سلول ها

محبثی که در این مطلب به آن پرداخته می شود راجع به یک روش رایج در جداسازی پروتئین و سایر مولکول های زیستی از باقی مانده تجزیه سلولی یا بافتی است. اما این روش چه نام دارد و روش های انجام آن چه می باشد؟دایا اکسیر به عنوان نمایندگی فروش مواد شیمیایی آزمایشگاهی در پاسخ به سوال اول می گوید نام این روش، Immunoprecipitation(ایمونو پرسی پتاسیون) نام دارد که در ادامه به تعریف و بیان روش های انجام آن خواهیم پرداخت.Immunoprecipitation چیست؟Immunoprecipitation چیست؟IP، تکنیکی است که بر اساس تعامل آنتی بادی و آنتی ژن برای غنی سازی یا جداسازی پروتئین از نمونه های بیولوژیکی در مطالعه هویت، ساختار، بیان و تغییرات پس از ترجمه استفاده می شود. همچنین از تغییرات IP برای مطالعه تعامل بین پروتئین هدف با سایر پروتئین ها مثلا کروماتین از طریق IP یا RNA-IP یا اسیدهای نوکلئیک از طریق Co-IP استفاده می شود.پس هرگاه یک آنتی ژن محلول را در حضور آنتی بادی اختصاصی آن در محیط مایع یا نیمه جامد مانند آگار قرار دهیم مولکول ها این دو پس از رسیدن به هم و تشکیل کمپلکس، واکنش رسوبی ایمنی یا ایمونو پرسی پتاسیون (Immunoprecipitation) ایجاد می کنند.به بیانی ساده تر میتوان گفت در ايمونوديفوزيون، مولكول های آنتی ژن يا آنتی بادی طی روند انتشار ساده در داخل يک بستر انتخابی مثل محيط آبكی يا داخل ژل آگارز به حركت در می آيند و اگر مواردی که بیان کردیم به صورت اختصاصی باشند در محل برخورد، كمپلكسی تشكيل می شود كه غير محلول است؛ بنابراین به واكنش ایجاد شده ايمونوپرسی پيتاسيون و به كمپلكس های تشكيل شده آن خطوط يا باند های رسوبی گفته می شود. در نهایت اين باند های رسوبی معمولا در داخل بستر انتخابی و در محل بروز این اتفاق، بدون حركت باقی می مانند.روش های انجام Immunoprecipitation:براساس اینکه در ژل فقط یکی از مولکول ها (آنتی ژن یا آنتی بادی) یا هردو مولکول به طرف یکدیگر انتشار پیدا کنند دو روش وجود دارد:v انتشار یک طرفه شعاعی (SRID) یا روش ManciniSingle Radial Immuno Diffusion، یک آزمایش کمی می باشد که در آن یکی از دو مولکول آنتی ژن یا آنتی بادی را در آگار مخلوط و ثابت می گیرند. از طرفی مولکول دیگری را که در حفره آگارایجاد کرده اند، می ریزند. مولکول داخل حفره با انتشار و نفوذ شعاعی در آگار، به ناحیه تعادل رسیده و با مولکول دیگر واکنش می کند. بنابراین فقط یکی از مولکول ها به صورت شعاعی در آگار نفوذ می کند.در این روش یک خط رسوبی به صورت حلقه ای در حفره ایجاد شده که با ماده مجهول یعنی آنتی ژن یا آنتی بادی، متناسب است . حال با استفاده از اندازه گیری و مقایسه آن با منحنی، مقدار ماده مجهول (آنتی ژن یا آنتی بادی) به دست می آید.این هم لازم است بدانید که معمولا از این روش در اندازه گیری ایمونوگلوبولین های سرم و اجزا کمپلمان مانند اندازه گیری غلظت پروتئین هايی نظيرIgG، IgA و IgG و پروتئین هايی مثل C4، C3و فاكتورB بهره می برند.v انتشار دو طرفه(DID) یا روش OchtroloniDouble Immuno Diffusion ، یک تست کیفی است که بر اساس نفوذ هر دو مولکول آنتی ژن و آنتی بادی در آگار استوار است. هنگامی که این دو مولکول را جداگانه در دو حفره مقابل هم در آگار بریزیم، دو مولکول با انتشار شعاعی در همه جهات در آگار نفوذ و سه حالت ایجاد می کند.ü Identity: مشابه بودن دو آنتی ژن باهمü Partial Identity: مشترک بودن یک یا چند اپی دو آنتی ژن باهمü Non-Identity: متفاوت بودن دو آنتی ژن باهمدر این روش نيمه كمی كه در محيط نيمه جامد انجام می شود مبنا، حركت آنتی ژن و آنتی بادی اختصاصی به طرف هم و ايجاد رسوبی ثابت و بدون حركت ناشی از تشكيل كمپلكس آنتی ژن و آنتی بادی در بستر ژلی است.این روش برای مقایسه اپی توپ آنتی ژن های نامعلوم با يكديگر است؛ یعنی اگر دو آنتی ژن مصرفی از نظر اپی توپ ها با هم مشابه يا نيمه مشابه و يا غير مشابه باشند شكل خطوط رسوبی آن ها با هم متفاوت خواهد بود.از این روش نیز در تعيين حضور آنتی ژن ، بررسی تشابه يا عدم تشابه آنتی ژن استفاده می گردد مثل بررسی زير كلاس های ايمونوگلوبولينی.نحوه انجام کار در Single Radial Immuno Diffusion:در این روش مقدار معينی از نمونه سرم فرد بيمار را به همراه پروتئین استاندارد در داخل حفره های معين در داخل ژل، می ريزند. همچنین از قبل در داخل ژل، آنتی سرم اختصاصی مونواسپسيفيک ريخته شده است. مثلا اگر قرار باشد IgG فرد يا بيمار اندازه گيری شود، ژل حاوی anti IgG و یا اگر قرار باشد C3 اندازه گيری شود ژل، حاوی antiC3 خواهد بود. حالا در زمان انكوباسيون با نفوذ نمونه بيمار و نمونه های كنترل از حفره ها به داخل ژل، در محل برخورد با آنتی سرم اختصاصی كمپلكس ها در منطقهEquivalent ، به شكل حلقه سفيد رنگ ديده می شوند. حال قطر حلقه های رسوبی مربوط به نمونه بیمار و نمونه استاندارد را می توان با خط كش و بر حسب ميلی متر اندازه گيری كرد.با داشتن قطر حلقه های مربوط به نمونه استاندارد و با داشتن غلظت هر يک از آن ها میتوان منحنی استاندارد را رسم و سپس از روی آن ها، غلظت آنتی ژن مورد نظر را اندازه گيری کرد.نحوه انجام کار در Double Immuno Diffusion:نحوه انجام کار در این روش به این صورت است که در حفره های تعبيه شده ژل، مقدار معينی آنتی سرم و آنتی ژن نامعلوم ريخته و در طول مدت انكوباسيون بین 24 تا 48 ، آنتی ژن ها و آنتی بادی ها در داخل ژل نفوذ كرده و در محل برخورد آن ها رسوب سفيد رنگ ديده می شود. این هم بهتر است بدانید که در این روش آنتی ژن در حفرات كناری و آنتی سرم در حفره مركزی ريخته می شود.مزایا و محدودیت هایIP چیست؟در ادامه صحبت ها به مزایا و محدودیت های Immunoprecipitation می رسیم.IP برای غنی سازی کوچک پروتئین ها، ایده آل است و در مقایسه با کروماتوگرافی ترکیبی که زمان بر است، سریع و نسبتاً آسان است.همچنین co-IPدر مقایسه با تکنیک های دیگر که تعامل پروتئین-پروتئین را تشخیص می دهند نیز نسبتاً آسان و با اکثر روش های تجزیه و تحلیل مانند طیف سنجی جرمی سازگار است.در واقع Co-IP یک تکنیک قدرتمند برای شناسایی فعل و انفعالات پروتئینی با اهمیت فیزیولوژیکی است؛ بنابراین co-IP به عنوان روش استاندارد طلایی برای برهم کنش پروتئینی در نظر گرفته می شود.اما co-IP علیرغم اینکه یک تکنیک قدرتمند برای تجزیه و تحلیل فعل و انفعالات پروتئینی است، ممکن است نتواند تمایلات کم و فعل و انفعالات پروتئینی گذرا را ثبت کند. علاوه بر این ، تعامل پروتئین- پروتئین که توسطco-IP تشخیص داده می شود ممکن است غیر مستقیم باشد، در نتیجه نتایج حاصل ازco-IP باید توسط سنجش های دیگر تأیید شود.سخن پایانی(IP) Immunoprecipitation خالص سازی آنتی ژن ها در مقیاس کوچک و تمایلی است که با استفاده از یک آنتی بادی خاص و یک تکیه گاه جامد مانند ذرات مغناطیسی یا رزین آگارز بی حرکت انجام می شود. این روش یکی از رایج ترین روش ها برای جداسازی پروتئین ها و سایر مولکول های زیستی از باقی مانده تجزیه سلولی یا بافتی است.دایا اکسیر، مرکز فروش انواع مواد شیمیایی آزمایشگاهی در ایران از برندهای معتبر دنیا مانند مرک و سیگما آلدریچ.برای مطالب بیشتر به وب سایت دایا اکسیر مراجعه کنید.راه ها ارتباطی با ما ؛شماره تماس دفتر : ۰۲۱۲۲۳۲۷۰۴۳واتس اپ: ۰۹۰۱۷۷۷۷۰۲۳ایمیل : info@dayaexir.com