القاء آپوپتوز در سلول های سرطانی HeLa (مقاله ترجمه شده)

چکیدهترکیبات گیاهی طبیعی به عنوان راهکار درمان جایگزین در درمان سرطان به طور گسترده ای معرفی شده اند. علیرغم فعالیت ضد سرطانی کورکومین، کاربرد بالینی آن به دلیل حلالیت آب کم و کمبود بیوپسی بودن محدود شده است. در این مطالعه، یک روش جدید برای کمک به اولتراسونیک برای سنتز نانو ذرات تراتلیوفسفات کیتوزان-آلژینات سدیم تربلی پلی فسفات NP-CS-ALG-STPP) ) از کورکومین طراحی شده است. علاوه بر این، اثرات ضد تومور نیکل کورکومین بارگذاری شده در محیط آزمایشگاهی مورد بررسی قرار گرفت. برای مشخص کردن خصوصیات NP ها از میکروسکوپ الکترونی (FE-SEM) و میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM) استفاده شد. فعالیت ضد تومور NP های پرشده با کورکومین با استفاده از MTT و واکنش زنجیره ای پلی مراز در زمان واقعی (qRT-PCR) مورد بررسی قرار گرفت. داده های FE-SEM و AFM مورفولوژی کروی را نشان دادند و اندازه متوسط NP ها 50 نانومتر بود. آزمایش سیتوتوکسی سیتی درون آزمایشگاهی نشان داد که کورکومین CS-ALG-STPP NP دارای فعالیت ضد توموری قابل توجهی در مقایسه با کورکومین آزاد بود. تجزیه و تحلیل سطح حالت ژن نشان داد که NP های کورکومین به طور قابل توجهی حالت ژن آپوپتوزی را افزایش داد. به طور خلاصه، نتایج ما نشان می دهد که پروتئین های کرکومین به طور قابل توجهی تکثیر را سرکوب کرده و القاء آپوپتوز را در سلول های سرطانی اپیتلیویید سرویکس انسانی ایجاد می کند که ممکن است به عنوان یک راهکار جایگزین برای درمان سرطان در نظر گرفته شود.مقدمهکورکومین یک پلی فنول زرد مشتق از ریزوم زردچوبه (Curcuma longa) است. 1 تعداد بیشتری از مطالعات نشان داده اند که کورکومین دارای خواص مفید مانند آنتی باکتریال، آنتی اکسیدان 2،3، 4 ضد آمیلوئید، 5 ضد التهابی، 6 ضد میکروبی 7 و اثرات بهبود زخم می باشد.8 مطالعات قبلی نشان داد که کورکومین به تنهایی یا در ترکیب با سایر داروهای ضد سرطان دارای فعالیت ضد تومور قوی در سلول های مختلف تومور شامل کبد، 9 پروستات، 10 تخمدان، 11 پستان، 12 پانکراس، 13 و سرطان معده است. 14 علاوه بر این، گزارش شده است که کورکومین اثرات قابل ملاحظه ای بر مسیر های سیگنالینگ (علامت دهی) سرطان زایی از طریق مهار آنژیوژنز، فعال سازی مرگ سلولی 13 ، 15 و تحریک متوقف شدن چرخه سلولی دارد. [16] علی رغم فعالیت امیدوار کننده ضد تومور کورکومین، کاربرد بالینی آن به علت حذف سیستمیک سریع و حلالیت آب پایین است که قابلیت زیستی این ترکیب زیست فعال را محدود می سازد. برای غلبه بر این محدودیت ها روش های مختلفی برای بهبود حلالیت کورکومین از جمله کپسوله کردن کورکومین در لیپوزوم، 19 دندریمر، 20 نانوذرات پلیمری (NP ها)21، نانوژل 22 سیکلوکودکسترین، 23 و میکروسفور زیست تخریب پذیر مورد استفاده قرار گرفته اند. به دلیل ماهیت هیدروفوب کورکومین، بسته شدن آن با پلیمرهای زیست سازگارو زیست تخریب پذیر به عنوان یک استراتژی امیدوار کننده برای درمان سرطان معرفی شده است. آلژینات (ALG) و کیتوزان (CS) دو پلیمر طبیعی هستند که دارای کاربرد فراوان داروئی و زیست پزشکی می باشند. 25 ALG یک پلی ساکارید خطی محلول در آب است که از جلبک دریایی قهوه ای استخراج شده و NPG های ALG را می توان با افزودن تراتو پلی فسفات سدیم (STPP) و محلول پلی کاتیوتیک بدست آورد، که باعث تشکیل ترکیب پلی الکترولیتی می گردد.26. به علت کمبود ایمنی و خواص غیر سمی CS، آن به عنوان یک پلیمتیک کاتیونی انتخاب شده است. 27 شواهد فراوانی نشان داده است که NPهای کورکومین را می توان با استفاده از CS28،29 یا ALG.30،31 تهیه کرد. علاوه بر این، یک مطالعه قبلی نشان داد که کورکومین را می توان با ALG، CS و کامپوزیت پلورونیک کپسوله کرد که می تواند فعالیت ضد سرطانی کورکومین را به طور قابل توجهی افزایش دهد .32 علاوه بر این، کورکومین به عنوان یک اسفنج CS-ALG برای بهبود خواص زخم ترکیب شده است .34،34 اخیرا، NPهای کورکومین با استفاده از CS، ALG، TPP و کلرید کلسیم تولید شده است .35 با توجه به ضرورت یافتن سیستم جایگزینی دارو برای درمان سرطان، مطالعه حاضر روش جدیدی را برای بارگذاری و ترکیب کورکومین بر روی CS، ALG و STPP NP توسط یک روش اولتراسونیک کمکی شرح می دهد. سپس، تأثیر نانوذرات کورکومین بر تکثیر و آپوپتوز در سلولهای سرطانی سرطان اپیتلیویید گردن انسان (HeLa) مورد بررسی قرار گرفت.مواد و روش هامواد شیمیاییپودر کورکومین ازشرکت مرک در Darmstadtآلمان خریداری شد. CS و ALG از شرکت سیگما آلدریچ در سنت لوییز امریکا بدست آمد. STPP از شرکت Daejung، Sasang-gu، در بوسان کره جنوبی تهیه شد. مواد محیط کشت و MTT به ترتیب از ATOCEL در گراز اتریش و آلفا آئسار (Ward Hill، MA، USA ) خریداری شده است.آماده سازی NPهای CS -ALG –STPP ترکیب شده با کرکومینطبق گزارش Caetano وهمکاران، NPهای CS -ALG –STPP با برخی از اصلاحات تهیه شده است. 36 میلی گرم CS در 1٪ اسید استیک به دست می آید تا با غلظت مغناطیسی به غلظت نهایی 1 میلی گرم بر میلی لیتر برسد و pH آن در 4.9تنظیم می شود . محلول CS با استفاده از اشعه ماوراء بنفش (Bandelin، Berlin، (Germany به مدت 1 ساعت هم زده شد. سپس پودر کرکومین در مقدار کمی اتانول حل شد و 1 میلی لیتر از محلول آن (1 میلی گرم در میلی لیتر در اتانول) در محلول CS با تکان دادن اضافه شد. 5 میلی گرم ALG در آب مقطر حل شد، و pH سوسپانسیون تا 4.6توسط (HCl (0.5 M تنظیم شد. ALG به این محلول به صورت قطره ای اضافه شد و سپس با استفاده از یک سرنگ انسولین (سرعت جریان: 1 میلی لیتر در دقیقه) ، STPP (0.13٪ w / v) در آب دیئونیزه فوق خالص به مدت 120 دقیقه هم زده شد. مخلوط حاصل جمع آوری شد و با 10 درصد اتانول و آب بوسیله سانتریفوژ با 14000 دور در دقیقه برای مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد شسته شد.ویژگی های NP (نانو ذرات)مورفولوژی سطح و توزیع اندازه ذرات آلکالین - هیدروکسید کربن با استفاده از میکروسکوپ الکترونیک با اسکن انتشار میدانی(FE-SEM، Mira 3 XMU، TESCAN، Brno، جمهوری چک)، میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM، Easyscan 2 Flex، Liestal ، سوئیس) و طیف سنجی مادون قرمز فوریه (FT-IR) تعیین گردید. طیف سنجی FT-IR ازNPهای ALG-CS-STPP ترکیبی با کورکومین، با استفاده از اسپکتروفتومتر FT-IR (Vector 22 FT-IR، Bruker Optik GmbH، Ettlingen، آلمان) به دست آمد.بازده کپسوله سازیبرای تعیین میزان جذب کورکومین، تجزیه و تحلیل کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC) (Knauer؛ Smartline، Berlin، Germany) انجام شد. همانطور که قبلا ذکر شد، در مرحله نهایی آماده سازی NP، محلول کورکومین-CS-ALG-STPP سانتریفیوژ شد و محلول فریز شده جمع آوری گردید. پس از شستن مخلوط با اتانول، سطح سوپرمنات جمع آوری شد و مقدار کورکومین باقی مانده مورد بررسی قرار گرفت. علاوه بر این، 1 میلیگرم نانوذرات خشک شده در هوا در 1 میلی لیتر آب حل شده و کورکومین بر روی نانوذرات با استفاده از استونیترول استخراج شده است. ستون HPLC (C18 Eurospher، Knauer، Smartline، Berlin، Germany ) و فاز متحرک مخلوطی از استونیتریل و آب در نسبت 90:10 (V / V ) بود. سرعت جریان فاز متحرک 1 میلی لیتر در دقیقه بود و این حلال با استفاده از آشکارگر ماوراء بنفش (UV) در طول موج 425 نانومتر تشخیص داده شد.مطالعات آزاد سازی در شرایط آزمایشگاهیرها سازی آزمايشگاهی کورکومين از نانوذرات بر اساس یک گزارش قبلی انجام شد. به طور خلاصه، 5 میلی گرم از نانوذرات ترکیبی با کورکومین خشک شده در هوا در 32 میلی لیتر PBS pH 7.4) ) پراکنده و توزیع شد و محلول حاصل تقسیم و در 16 لوله میکرو فیف (هر 2 میلی لیتر) نگهداری شد. در فواصل زمانی 0، 1، 2، 3، 4، 5 و 24 ساعت، محلول در 10000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شد. کورکومین آزاد شده در 2 میلی لیتر اتانول آزاد حل شد و جذب با استفاده از اشعه ماوراء بنفش (SQ4802؛ UNICO، Dayton، NJ، USA ) با طول موج 425 نانومتر اندازه گیری شد.مطالعه ایزوترم جذبآزمایشات ایزوترم با توجه به گزارش قبلی چنگ و همکاران 38 انجام شد. به طور خلاصه، غلظت های مختلف کورکومین (0.1، 0.15، 0.2، 0.25 و 0.3 میلی گرم / میلی لیتر) با NP-CS-ALG-STPP مخلوط شدند و نتیجه مخلوط به مدت 24 ساعت در دمای 25 درجه سانتی گراد به طور مداوم تکان داده شد.رنگ آمیزی هسته ایهمانند آزمایش MTT، سلول از خط سلولی HeLa کشت شدند و به مدت 48 ساعت با NP خالص، کورکومین یا NPC های کورکومین انکوباتور شدند. سپس، سلول ها با PBS شسته شدند و با پروما فرمالدئید 4٪ ثابت به مدت 20 دقیقه ثابت می شدند. پس از شستشو با PBS، برای افزایش نفوذ پذیری، 0.2٪ Triton X-100 به مدت 20 دقیقه اضافه شد؛ در مرحله نهایی، رنگ آمیزی هسته ای به مدت 25 دقیقه با استفاده از DAPI (1 میکروگرم در میلی لیتر سانتا کروز بیوتکنولوژی، سانتا کروز، CA، USA) انجام شد و سلول ها تحت یک میکروسکوپ فلورسنت (نیکون) مشاهده شدند.واکنش زنجیره ای پلیمراز در زمان واقعی کمی (qRT-PCR)سلول های HeLa به مدت 48 ساعت با NP های خالی، کورکومین و CF-ALG-STPP NPC (50 میکروگرم بر میلی لیتر) کورکومین انکوباتور شدند. سپس آنها با PBS شسته شدند و RNA با استفاده از کل کیت استخراج RNAیکتا تاجیز، تهران، ایران) بر اساس پروتکل تولید کننده استخراج شد. سنتز cDNA با استفاده از کیت رونویسی شده معکوس تجاری (یکتا تاجیز) انجام شد. در مجموع 20 میکرولیتر مخلوط واکنش حاوی 4/0 میکروگرم پرایمر جلو، 0.4 میکروگرم مبدل برگشتی، 2 میلی لیتر cDNA، 10 میکرو لیتر SYBR سبز PCR ترکیبی اصلی(یکتا تاجیز)، 0.4 میکرولیتر کربوکسی-ادرادامین (یکتا تاجیز) و 6.8 میلی لیتر RNase آب آزاد GAPDH به عنوان یک کنترل داخلی مورد استفاده قرار گرفت. سطح ویژگی ژن با روش Ct تجزیه و تحلیل شد. جدول S1 توالی پرایمر و دمای آنیلینگ را نشان می دهد.تحلیل آماریداده های آزمون MTT با استفاده از آزمون آماری t مستقل تجزیه و تحلیل شد. نتایج qRT-PCR با استفاده از تجزیه واریانس یک طرفه و سپس پس آزمون توکی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. نتايج به صورت ميانگين ± خطاي استاندارد ميانگين و p-value 0.05 به صورت آماري معني دار در نظر گرفته شدند.نتایجخواص نانوذرات CS -ALG -STPP NPC حاوی کورکومیننتایج FE-SEM نشان داد که NP-CFC-ALG-STPP دارای کورکومین کروی و اندازه متوسط ~ 50 نانومتر است که با یکدیگر جمع و متراکم می شوند (شکل 1A. ). شکل 1B یک تصویر AFM و نمای سه بعدی آن را نمایش می دهد. مطابق با داده های FE-SEM، اندازه گیری نتایج AFM نیز نشان می دهد که ذرات دارای توزیع اندازه یکنواخت هستند و اندازه های متوسط نانوذرات کورکومین بارگذاری شده 50 نانومتر است (شکل 1C.)تجزیه و تحلیل طیف سنجی FT-IRشکل 2 طیف های FT-IR از کورکومین، CS-ALG-STPP و NC-ALG-STPP ترکیب شده کورکومین را نشان می دهد. در طیف نانوذرات CS-ALG-STPP، گروه وسیعی در 3،432 cm-1 به گروه هیدروکسیل و آمین مربوط می شود.آزمایشات درون آزمایشگاهیبر اساس فعالیت فلورسانس ذاتی کورکومین، جذب آن در سلول های HeLa، 48 ساعت پس از انکوباسیون NPC-ALG-STPP NPC کورکومین مورد بررسی قرار گرفت. تصاویر میکروسکوپی فلورسنس نشان داد که سلول های کنترل و آنهایی که با NP-CS-ALG-STPP انکوباتور به عنوان گروه آزمایشی خالی نانوذرات هیچ فعالیت فلورسانس نشان نمی دهد. در مقایسه با گروه های آزمایشی کنترل و خالی ناقل NP ، سلول های HeLa که با آزاد کورکومین یا NPC کروکومین (50 میکروگرم بر میلی لیتر) تحت درمان با فلورسانس سبز قرار گرفته اند (شکل 6A). در مرحله بعد، اثر سیتوتوکسی NPs کرکومین بارگذاری شده با استفاده از آزمون MTT ارزیابی شد. فیبروبلاست های پیش پوست انسان و سلول های HeLa به مدت 48 ساعت با دوزهای مختلف کربوکامین آزاد یا کورکومین بارگذاری نشده CS-ALG-STPP NP (6.25، 12.5، 25، 50 و 100 میکروگرم در میلی لیتر) انکوباتور شدند. برای ارزیابی سمیت نارسایی های کورکومین بر روی سلول های طبیعی، فیبروبلاست های فورنچه پوست انسان کشت شدند و با غلظت های مختلف کورکومین نانوذرات ترکیبی با کورکومین به مدت 48 ساعت انکوباتور شدند. نتایج حاصل از MTT نشان داد که اثر سیتوتوکسیک قابل توجه در درمان سلول های کروموزوم طبیعی تحت درمان با نانوذرات کورکومین یا نانوذرات ترکیبی با کورکومین (شکل 6B) مشخص نشد. علاوه بر این، اثر سیتوتوکسی NP در بیماران مبتلا به سرطان HeLa مورد بررسی قرار گرفت. نتایج آزمون زنده ماندن سلول نشان می دهد که NPs کرکومین بارگذاری شده، به ویژه دوز بالای آن ، اثر بازدارنده وابسته به دوز ، به تکثیر سلولی نسبت به گروه کوروکوم آزاد داشت (شکل 6B).اثر نانوذرات کرکومین بر حالت ژن مربوط به آپوپتوزبرای ارزیابی اثر متقابل کروکومین CS-ALG-STPP NP در آپوپتوز، سلول های HeLa به مدت 48 ساعت با NP خالص، آزاد کورکومین یا کورکومین بارگذاری NP-CS-ALG-STPP (50 میکروگرم بر میلی لیتر) انکوباتور شدند. رنگ آمیزی هسته ای با استفاده از DAPI انجام شد و تغییرات هسته ای در زیر میکروسکوپ فلورسنت مشاهده شد. داده های ما نشان می دهد که NP های بدون درمان و خالی که سلول های دریافت شده را رنگ آمیزی به همان اندازه فلورسانس آبی رنگ. در سلول هایی که تحت درمان با NC-ALG-STPP با کورکومین قرار گرفتند، تکه تکه شدن DNA، پیکنوز هسته ای و انتشار فلوئورسانس روشن به عنوان ویژگی های آپوپتوزی مشاهده شد. در مقایسه با NP های کورکومین بار، درمان کورکومین نمی تواند تغییرات قابل توجهی در مورفولوژی هسته ای ایجاد کند .شکل 7A).)بحثشواهد گسترده نشان داده است که کورکومین یک فعالیت ضد سرطانی قوی در سلول های سرطانی مختلف دارد.31 با این حال، به علت حلالیت ضعیف آبی و قابلیت کم دسترسی بیولوژیک ، کاربرد بالینی آن محدود شده است. 40 توسعه فرمول جدید برای کپسوله کردن کورکومین، میدان نانومواد NP باید در دراز مدت پایدار باشد و برای گردش در کوچکترین مویرگ باید اندازه آن 100 نانومتر باشد. علاوه بر این، تمام مواد برای سنتز NP باید بیو سازگار باشند .38 یکی دیگر از عوامل مهم در تولید NP است توانایی ذرات برای عبور از مانع خون مغزی است.38 همانطور که قبلا ذکر شد، اندازه NP ها یک پارامتر مهم در موفقیت درونی سازی ذرات به سلول های سرطانی است .38 مطالعات متعددی نشان داد که اندازه ذرات در محدوده 10-100 نانومتر برای سرطان مناسب است در مطالعه ما FE-SEM و AFM داده ها نشان داد که اندازه نانوذرات CS-ALG-STPP دارای کورکومین 50 نانومتر است. مطالعات قبلی Das و همکاران نشان داد که NPC های کورکومین بار را می توان با استفاده از ALG به عنوان متقابل لینکر در محلول CS سنتز کرده و اندازه ذره های آماده شده 100 نانومتر بود. مطالعه دیگری نشان داد که اندازه نانوذرات CS دارای کورکومین دارای 200 نانومتر می باشد. علاوه بر این Mirnejad و همکاران از CS و TPP برای بارگیری کورکومین استفاده کردند و اندازه ذرات 160 نانومتر بود. در مقایسه با مطالعات ذکر شده، ما قادر به تولید نانوذرات کورکومین با ابعاد کوچکتر هستیم. احتمالا با استفاده از غلظت های مختلف CS، ALG و STPP و امواج فراصوت بعدی از محلول نهایی می تواند منجر به سنتز NP ها با اندازه مطلوب در راهکار درمان سرطان شود. در توافق با گزارش های قبلی، نتایج 29.32 رهاسازی آزمایشگاهی دارو 53٪ رهاسازی از کورکومین NP در ظرف 24 ساعت را نشان می دهد. به علت ماهیت CS و حلالیت بهتر آن در pH اسیدی، آزاد شدن آهسته تر کورکومین با pH 7.4.29 اتفاق می افتد. انتشار اولیه اولیه احتمالا به دلیل وابستگی کورکومین به سطح NP است. پس از شروع اولیه انفجار، آزادی پایدار برای نیکل های کورکومین بارگذاری شده مشاهده شد. انتشار کنترل شده دارو از NP به عنوان یک عامل ضروری در رویکرد تحویل دارو محسوب می شود.نتیجه گیریدر نهایت، NPs کرکومین بارگذاری شده با استفاده از امواج فراصوت از پلیمرهای زیست تخریب پذیر شامل CS و ALG با موفقیت انجام شد. NPC CS-ALG-STPP در معرض کورکومین به صورت همگن در محلول آبی پراکنده شدند و اندازه ایده آل آنها برای درمان سرطان به دست آمد. این NP ها می توانند به سلول های سرطانی HeLa تبدیل شوند و انکوباسیون سلول های HeLa با NPC CS-ALG-STPP با کورکومین منجر به سرکوب تکثیر می شود. علاوه بر این، بیان ژن آپوپتوز در سلول های درمان شده توسط NPC های کورکومین افزایش یافته است. این یافته ها ممکن است یک رویکرد درمانی در درمان سرطان ارائه دهد.این مقاله ISI در سال 2017 در نشریه Dovepress و در مجله بین المللی نانوپزشکی، توسط مرکز تحقیقات علوم اعصاب منتشر شده و در سایت ای ترجمه جهت دانلود ارائه شده است. در صورت نیاز به دانلود رایگان اصل مقاله انگلیسی و ترجمه آن می توانید به پست دانلود ترجمه مقاله القاء آپوپتوز در سلول های سرطانی HeLa در سایت ای ترجمه مراجعه نمایید.