ردیابی چندگانه‌ بهینه جهش 7 KRAS با روش PCR (مقاله ترجمه شده)

چکیدهتعیین وضعیت جهش‌یافته بودن یا نبودن KRAS در نمونه‌های توموری اهمیت بنیادینی در مدیریت بیماران مبتلا به سرطان ریه یا سرطان روده‌ی بزرگ دارد؛ چرا که این جهش‌ها مانع درمان با آنتی‌بادی‌های مونوکلونال گیرنده‌های فاکتورهای رشد اپیدرمی (EGFR) می‌شوند. در این پژوهش، روش PCR کمّی مخصوص برای الل چندگانه، سریع و ارزان‌قیمتی را گزارش می‌دهیم که می‌تواند هفت جهش اصلی و مرتبط با مسائل بالینی در KRAS را شناسایی و همزمان، ژن‌های KRAS جهش‌نیافته را در سلول‌های توموری و بافت‌های بیماران سرطان روده‌ی بزرگ تکثیر کند. نمونه‌های مثبت در تست‌های چندگانه تحت تحلیل‌های مخصوص برای الل قرار گرفتند تا جهش هر کدام به طور خاص بررسی شود. DNA مرجع سرطان‌های انسانی اعم از G12A، G12C، G12D، G12R، G12S، G12V و G13D اختصاصی بودن تست را با =<۱٪ حساسیت الل‌های جهش‌یافته تأیید کردند. همچنین، کاربردی بودن تحلیل چندگانه‌ی جهش‌های KRAS با انجام آزمایش‌های جاسازی پارافین فیکس‌شده توسط فرمالین (FFPE) بر روی بیوپسی‌های سرطان روده‌ی بزرگ نشان داده شد. در نتیجه، تکثیر همزمان DNA جهش‌نیافته منجر به حذف داده‌های منفی کاذب از نمونه‌های تخریب‌شده می‌شود. همچنین، نتایج این روش مقرون‌به‌صرفه با نتایج حاصل از توالی‌یابی DNA در بافت‌های FFPE هم‌خوانی دارد، اما در حالتی که غلظت‌های DNA محدود هستند، حساسیت بالاتری دارد.مقدمهسرطان روده‌ی بزرگ سومین سرطان شایع در مردان و دومین سرطان شایع در زنانِ سراسر جهان است [۱]. کتاکسیمب و پانیتومامب آنتی‌بادی‌های مونوکلونالی هستند که در روش‌های بالینی برای درمان کارسینومای روده‌ی بزرگ، علیه گیرنده‌ی EGFR به کار می‌روند [۲]. جهش‌های سرطان‌زای KRAS مدت‌هاست که به عنوان مانع روش‌ درمانی مذکور شناخته شده‌اند، چرا که منجر به تولید پروتئینی می‌شوند که همواره فعال است و به شکل مستقل از محرک، عملگردهای پایین‌دست EGFR، مانند آبشارهای RAF، MEK و ERK را فعال می‌کند [۳، ۴، ۵]. فعال‌سازی به وسیله‌ی فسفریلاسیون پروتئینی در چند تشکیل‌دهنده‌ی مسیرهای MAPK در نمونه‌های جهش‌یافته برای KRAS، ماندگارتر از دیگر گروه‌های توموری است. این فعال‌سازی‌های سرطان‌زا در نمونه‌های جهش‌یافته برای KRAS، در ۳۵ تا ۴۰ درصد از کارسینوماهای روده‌ی بزرگ دیده می‌شود و در بیشتر موارد، جهش در کدون ۱۲ (۸۰٪) و ۱۳ (۱۵٪) از اگزون ۲ رخ داده است [۶، ۷، ۸]. جهش‌ در موقعیت‌های دیگر، برای مثال کدون ۶۱، ۱۱۷، ۱۴۶ و ۱۵۴ نیز دیده شده اما فراوانی بسیار کم‌تری (تنها حدود ۱٪) به خود اختصاص می‌دهد [۹، ۴]. آژانس پزشکی اروپا (EMA)، شبکه‌ی جامع ملی سرطان (NCCN)، انجمن سرطان‌شناسی بالینی آمریکا (ASCO) و اداره‌ی مواد غذایی و دارویی ایالات متحده‌ی آمریکا (FDA) توصیه می‌کنند که هدف قرار دادن EGFR به وسیله‌ی کتاکسیمب و پانیتومامب نیازمند این است که بیمار نسخه‌ی سالم و جهش‌نیافته‌ی KRAS را دارا باشد. بنابراین، غربال‌گری ساده و دقیق جهش‌های KRAS پیش از تیمار کردن با آنتی‌بادی علیه EGFR ضروری است [۲، ۱۰]. در موارد کمبود فراوانی DNA جهش‌یافته در مقایسه با طبیعی، تشخیص زودهنگام در بافت‌های دردسترس و موجود در کلینیک‌ها مشکل است. این امر نیاز به انجام تکنیک‌های مشکل، زمان‌بر و گران‌قیمتی برای ایزوله کردن سلول‌های توموری پیش از آنالیز مولکولی ایجاد می‌کند که برای آزمایش‌های پاتولوژیک رایج نامناسب است [۱۱]. از این رو، تشخیص و شناسایی الل‌های در اقلیت چالشی‌ست که به صحت و حساسیت تکنیک‌های مولکولی بستگی دارد و قادر است توانایی تشخیص جهش‌های کم‌یاب را پایین بیاورد.تکنیک‌های مولکولی زیادی برای تشخیص جهش‌های KRAS ایجاد شده‌اند که هر کدام مزایا و مضرات متفاوت، هزینه‌های گوناگون و تفاوت‌های قابل توجهی در زمینه‌ی مدت آزمایش، اختصاصی بودن، حساسیت، توانایی تشخیص جهش‌های جدید، توانایی کوانتیده کردن الل‌های جهش‌یافته و تکرارپذیری نتایج دارند [۱۲، ۱۳، ۱۴]. در بین این روش‌ها، توالی‌یابی به روش سنگر کماکان استاندارد طلایی به شمار می‌رود؛ با این حال این روش حساسیت پایینی دارد و نیازمند بین ۱۰ تا ۳۰ درصد الل‌های KRAS جهش‌یافته از بین نمونه‌های طبیعی است [۱۲، ۱۵]. با توجه به این که PCR همه‌ی الل‌ها را با بازده برابر نسبت به غلظت‌های اولیه تکثیر می‌کند [۱۶]، روشی مطلوب برای کاش تکثیر الل‌های طبیعی است [۲، ۱۷]. PCR اختصاصی برای الل، که به عنوان سیستم تکثیری مقاوم در برابر جهش یا ARMS نیز شناخته می‌شود، بر این اصل استوار است که تکثیر در حالتی که باز آلی انتهای ۳’ در پرایمر با توالی الگو اتصال برقرار می‌کند، بازده بالایی دارد؛ در حالی که چنانچه این اتصال برقرار نشود و یا اتصال اشتباه برقرار شود، بازده پایین‌تر است [۱۸، ۱۹]. اختلاط روش‌های PCR اختصاصی برای الل و PCR زمان واقعی بر اساس کاوشگر‌های Taq-Man ابزار مناسبی برای ردیابی جهش‌ها با حساسیت و مقدار بالا به دست می‌دهد. تست‌هایی بر این اساس جهت استفاده در محیط بالینی ایجاد شده‌اند (۲۰-۲۵) و چند کیت آزمایشگاهی برای کاربردهای بالینی در بازار موجود هستند؛ برای مثال، کیت KRAS RGQ PCR ار تِراسکرین (کیاژن ) و کیت Cobas KRAS (TaqMelt PCR). [۲۱، ۲۲، ۲۵، ۲۶، ۲۷، ۲۸، ۲۹، ۳۰]مواد و روش‌ هاDNA مرجع و نمونه‌های بالینیما از DNAژنومی مرجع استاندارد و دارای ژن طبیعی KRAS و همچنین DNA دارای هفت جهش نقطه‌ای در کدون ۱۲ و ۱۳ KRAS (G12D، G12A، G12R، G12C، G12S، G12V و G13D) استفاده کردیم. مرجع استانداردهای DNA ژن KRAS، هورایزن ، واقع در کمبریج، CB26 9PL، بریتانیا بود.استخراج DNA ژنومی از نمونه‌های FFPEDNA از سلول‌های کشت‌داده‌شده به وسیله‌ی کیت کلروفرم-DNAzol و طبق توصیه‌ی شرکت تولیدکننده (اینویتروژن ) استخراج شد. DNA ژنومی از بافت‌های FFPE با استفاده از کیت QIAamp مخصوصی FFPE DNA تولید شرکت کیاژن طبق توصیه‌ی شرکت تولید‌کننده استخراج شد. به طور خلاصه، تومورها از بلوک‌های پارافینی جدا، به قطعات ۱۰ میکرومتری تقسیم و در لوله‌های ۱.۵ میلی‌لیتری ذخیره شدند. پارافین به وسیله‌ی زایلن ز بلوک‌ها جدا شد و نمونه‌ها در دمای محیطی خشک شدند. مقادیر دقیق DNA به روش مقدارسنجی فلوئورومتریک توسط دستگاه فلوئوریمتری کوبیت ورژن ۲.۰ (Q32866، اینویتروژن) سنجیده شد. نمونه‌های DNA در ۲۰- درجه ذخیره شدند.ردیابی جهش به وسیله‌ی تست PCR کمّیجهش‌های موجود در کدون‌های ۱۲ و ۱۳ ژن KRAS (به شماره‌ی NG_007524) به وسیله‌ی PCR کمّی با استفاده از پرایمرهای مخصوص برای الل (AsP) که برای هر یک از هفت جهش و همچنین ناحیه‌ی جهش‌نیافته طراحی شده بودند، مشخص شدند [۲۲] (به جدول ۱ موجود در بخش تکمیلی مقاله مراجعه شود). باز آلی انتهای ۳’ برای هر پرایمر با توجه به جهشی که می‌بایست شناسایی می‌کرد طراحی شد. همچنین، یک ناجوری مصنوعی در باز یکی‌مانده‌به‌آخر و یا باز پیش از آن القا شد تا اختصاصی بودن اتصال را افزایش دهد [۲۲]. واکنش‌های PCR در پلیت‌های ۴۸-چاهکی در سیستم PCR زمان واقعیِ اکو متعلق به شرکت ایلومینا انجام شدند.شرایط واکنش برای هر چاهک برابر بود با: ۰.۳۵ میکرومولاز پرایمر Forward، ۰.۳۵ میکرومولار پرایمر Reverse، ۰.۵ میکرومولار کاوشگر و ۳ میکرومولار DNA الگو با غلظت‌های مختلف. واکنش‌ها با استفاده از مخلوط آماده‌ی ژنوتایپینگ 1XTaqMan (به شماره‌ی کاتالوگ ۴۳۷۱۳۵۵، شرکت اپلاید بیوسیستمز ، فاستر سیتی ، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) در حجم نهایی برابر با ۱۰ میکرولیتر انجام شد. بر خلاف یک پروتکل قدیمی Taqman که از دمای اولیه‌ی ۹۵ درجه برای واسرشتی DNA به مدت ۱۰ دقیقه، ۵۰ چرخه در ۹۰ درجه سانتیگراد به مدت ۱۵ ثانیه و ۶۰ درجه‌ی سانتیگراد برای ۶۰ ثانیه استفاده کرده بود، واکنش PCR کمّی ما از یک مرحله‌ی ده‌دقیقه‌ای در ۹۰ درجه‌‌ی سانتیگراد پیش از شروع واکنش‌های اصلی استفاده می‌کرد، ۵۰ چرخه در ۹۵ درجه‌ی سانتیگراد به مدت ۳۰ ثانیه و ۶۰ درجه‌ی سانتیگراد برای ۳۰ ثانیه داشت. همه‌ی نمونه‌ها در قالب سه‌تایی تکرار می‌شدند. در هر چرخه، حداقل یک کنترل منفی ( بدون DNA) مورد استفاده قرار گرفت.تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل (Mult-AsP)تست‌های چندگانه‌‌ی مخصوص برای الل بر اساس همین پروتکل اما با استفاده از همه‌ی هفت پرایمر مخصوص برای الل جهت شناسایی جهش KRAS، همان پرایمر Reverse و کاوشگر Taqman در یک لوله‌ی آزمایش انجام شدند. این واکنش‌های چندگانه حاوی ۰.۴ میکرومولار از هر پرایمر Forward، ۰.۵۵ میکرومولار از هر پرایمر Reverse، ۰.۵ میکرومولار کاوشگر و ۳۵ نانوگرم بر میکرولیتر DNA الگو با شرایط PCR که در بالا ذکر شد بودند. برای هر الگو، مقدار Cq در PCR مرجع ثبت و برای هر واکنش چندگانه، ΔCqمحاسبه شد (تفاوت‌ها در چرخه‌ها بین دو روش تست مخصوص برای الل و تست PCR مرجع، و همچنین تفاوت‌ها در چرخه‌ها بین دو روش تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل و تست PCR مرجع).ژنوتایپینگ KRAS در نمونه‌های بالینیژنوتایپینگ KRAS در بافت‌های FFPE شامل امپلیکون های غیرجهش‌یافته‌ی مرجع (NM) و پرایمرهای چندگانه‌ی مخصوص برای الل در تست PCR کمّی می‌شد. پروتکل سنجش نمونه‌های بالینی شامل یک تکثیر در مرحله‌ی اول برای امپلیکون‌های جهش‌نیافته‌ی مرجع و تست‌ چندگانه‌ی مخصوص برای الل می‌شد. هنگامی که نتیجه‌ی PCR کمّی برای DNA جهش‌نیافته‌ی مرجع منفی می‌شد، نمونه دیگر مورد آنالیزهای بعدی قرار نمی‌گرفت. با این حال، اگر تکثیر چندگانه منفی و امپلیکون جهش‌نیافته مثبت می‌شد، نمونه منفی در نظر گرفته می‌شد. در مواردی که نمونه‌های بالینی برای تست چندگانه نتیجه‌ی مثبت به دست می‌دادند، بر روی آن‌ها هفت واکنش جداگانه PCR با پرایمرهای مربوط به KRAS جهش‌یافته انجام می‌شد تا جهش‌ها شناسایی شوند. همه‌ی نمونه‌ها در قالب‌های سه‌تایی آزمایش شدند.حساسیت تست‌ چندگانه‌ی مخصوص برای اللبرای تعیین پایین‌ترین دقت محدوده‌ی تشخیص در تست‌ چندگانه‌ی مخصوص برای الل، DNAجهش‌یافته‌ی KRAS با DNAطبیعی مخلوط شد. میزان DNA جهش‌یافته به مرور کم‌تر و کم‌تر شد تا به کسرهای ۵٪، ۲.۵٪، ۱.۲۵٪، ۰.۶۲٪، ۰.۳۲٪ و ۰.۱۵٪ برسد. واکنش‌ها در قالب سه‌تایی و به همراه یک کنترل منفی انجام شدند.نتایجژنوتایپینگ چندگانه‌ی مخصوص برای الل برای ژن KRASما یک تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل طراحی کردیم که هدف آن غربالگری هفت جهش شایع برای KRASدر کدون‌های ۱۲ و ۱۳ در سرطان کارسینومای روده‌ی بزرگ است و در این راستا از تست PCR کمّی مخصوص برای الل استفاده کردیم (شکل ۱). مرحله‌ی اول شامل یک امپلیکون مرجع بدون جهش بود (واکنش کنترل) که همزمان با تست‌های چندگانه‌ی مخصوص برای الل انجام شد. پس از آن، یک تست تأییدی انجام دادیم که نتایجی تکرارپذیر و بدون اختلاط پرایمرهای مخصوص برای الل‌ها به دست می‌داد. شکل ۲ واکنش‌های تکثیری برای تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل و DNA هر یک از هفت جهش شایع در KRAS را نشان می‌دهد. مقادیر ΔCq در جدول ۱ نشان‌ داده‌ شده‌اند. همچنین، پرایمرهای مخصوص برای الل تنها الگوهای دارای توالی خاص را تکثیر کردند، چرا که PCRکمّی با استفاده از پرایمر مخصوص برای G12S، DNA مربوط به G12Vرا تکثیر نکرد (شکل ۳).بررسی جهش ژنتیکی در KRAS با استفاده از نمونه‌های کارسینومای روده‌ی بزرگتست چندگانه‌ی مخصوص برای الل که بر روی ۳۲ نمونه‌ی FFPE سرطان روده‌ی بزرگ انجام شد، در ۲۱ نمونه جهش شناسایی کرد. نمودارهای تکثیر در شکل ۴ نشان داده شده‌اند. واکنش‌ها در قالب سه‌گانه انجام شدند و انحراف‌های معیار منفی و مثبت برای مقادیر ΔCtدر جدول ۲ نشان داده‌ شده‌اند. مقایسه‌ی تست‌های چندگانه‌ی مخصوص برای الل و توالی‌یابی سنگر در جدول ۲ ارائه شده است. در این مطالعه به وسیله‌ی PCRکمّی، ما به این نتیجه رسیدیم که ۲۲ از ۳۰ مورد که برای ژن KRASبررسی شدند، محصولات قابل تکثیر PCR به دست دادند. ۶ مورد با استفاده از روش سنگر هیچ محصول قابل تکثیری به دست نداد، اما با استفاده از تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل،در KRASجهش نشان داد. این ناهماهنگی بین تست چندگانه و روش سنگر، احتمالاً به دلیل بالا بودن کسر سلول‌های غیرتوموری و حساسیت بالاتر تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل است. در ۸ نمونه، هیچ محصول قابل تکثیری در پی روش سنگر و یا تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل به دست نیامد. ۷ نمونه از این نمونه‌ها، از درمان‌گاه‌های عمومی محلی گرفته شده و احتمالاً به دلیل پردازش نامناسب، متحمل تخریب و واسرشتی DNAشده بودند [۱۷]. این باور به این دلیل است که هیچ تکثیری در مورد این نمونه‌ها دیده نشد. در هر ۸ نمونه، نمونه‌های منفی سه بار با هر دو روش توالی‌یابی سنگر و تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل آزمایش شدند. نمونه‌های دیگر به دلیل عدم توانایی تکثیر امپلیکون جهش‌نیافته، تخریب‌شده انگاشته شدند.حساسیت تست چندگانه‌ی PCR کمّی برای KRASبرای اندازه‌گیری حساسیت و اختصاصی بودن تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل، DNAهای استاندارد مرجع که دارای ‌KRAS جهش‌یافته بودند رقیق شدند و با DNA مرجع مخلوط شدند. غلظت DNA جهش‌یافته به مرور کم‌تر و کم‌تر شد تا نسبت DNA جهش یافته به DNA سالم کم‌تر شود. ما می‌توانیم در تست چندگانه‌ تا ۰.۱۵٪(برابر با ۳۵ پیکوگرم) از ‌DNA جهش‌یافته را تشخیص دهیم. مثال‌های نماینده‌ی تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل با استفاده از جهش G12S در DNA ژن KRASدر شکل ۱ بخش تکمیلی مقاله نشان داده شده‌اند. برای سنجش حساسیت تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل، جهش‌های KRAS در مخلوط DNAشامل DNA جهش‌یافته و طبیعی با کسرهای گوناگون (۵٪، ۲.۵٪، ۱.۲۵٪، ۰.۶۲٪، ۰.۳۲٪ و ۰.۱۵٪) مقدارسنجی شدند. نتایج به گونه‌ای تکرارپذیر، خبر از وجود مقادیر مقایسه‌پذیر الل‌های جهش‌یافته‌ی KRASدر همه‌ی دفعات آزمایش دادند. میانگین انحراف معیار مثبت و منفی برای ΔCqکه در جدول ۳ نشان داده شده‌اند به وضوح ردیابی جهش‌های شایع KRASرا ممکن ساختند. با این حال، در غلظت‌های پایین‌تری DNAجهش‌یافته، تست چندگانه‌ی ما بیشتر G12S، G13Dو G12C را ردیابی کرد.بحثبا توجه به این که جهش‌های KRAS با مقاومت به روش‌های علیه EGFR (به وسیله‌ی کتاکسیمب و پانیتومامب) هم‌راستایی نشان می‌دهد، نیاز به تست‌های سریع، ارزان‌قیمت و پُرداده[1]حس می‌شود که جهش‌های KRAS را در نمونه‌های بالینی تشخیص دهند. روش‌های توالی‌یابی نسل بعد[2](NGS) به شدت توصیه می‌شوند، اما استفاده از آن‌ها فراتر از توانایی مالی و تخصصی آزمایشگاه‌های بالینی معمولی است. با این که توالی‌یابی به روش سنگر استاندارد طلایی برای شناسایی جهش‌های DNA محسوب می‌شود، حساسیت پایین آن نیاز به درصدهای بالاتری از سلول‌های توموری (برای مثال، ۱۰ تا ۳۰٪) به دلیل اتصالات ضربدری DNA و یا تخریب DNAبه وسیله‌ی فرمالین و یا میزان کم توالی هدف، ایجاد می‌کند [۲۷، ۲۸].این مقاله ISI در سال 2016 در نشریه Plos و در مجله Plos One، توسط آزمایشگاه بیولوژی سلول تومور منتشر شده و در سایت ای ترجمه جهت دانلود ارائه شده است. در صورت نیاز به دانلود رایگان اصل مقاله انگلیسی و ترجمه آن می توانید به پست دانلود ترجمه مقاله ردیابی چندگانه‌ بهینه جهش 7 KRAS با روش PCR در سایت ای ترجمه مراجعه نمایید.