آزمایش کاریوتایپ؛ روشی برای بررسی ناهنجاری های کروموزومی

کاریوتایپ فرآیند جفت شدن و مرتب کردن تمام کروموزوم‌های یک ارگانیسم است، بنابراین یک تصویر ژنومی از کروموزوم‌های یک فرد ارائه می‌کند. کاریوتایپ‌ها با استفاده از روش‌های رنگ‌آمیزی استاندارد شده تهیه می‌شوند که ویژگی‌های ساختاری مشخصه را برای هر کروموزوم نشان می‌دهد. سیتوژنتیک بالینی، کاریوتایپ های انسانی را برای تشخیص تغییرات ژنتیکی فاحش و ناهنجاری هایی که چندین مگاباز یا بیشتر از DNA را شامل می شود، تجزیه و تحلیل می کنند. کاریوتایپ ها می توانند تغییرات در تعداد کروموزوم های مرتبط با اختلالات آنیوپلوئیدی مانند تریزومی 21 ( سندرم داون) را نشان دهند. تجزیه و تحلیل دقیق کاریوتیپ‌ها همچنین می‌تواند تغییرات ساختاری ظریف‌تری مانند حذف‌های کروموزومی، تکرارها ،جابجایی ها یا وارونگی ها را مشخص کند. در واقع، همانطور که ژنتیک پزشکی به طور فزاینده ای با پزشکی بالینی ادغام می شود، کاریوتایپ ها به منبع اطلاعات برای تشخیص نقایص خاص مادرزادی، اختلالات ژنتیکی و حتی سرطان تبدیل می شوند.تهیه کاریوتیپ از سلول های میتوزیکاریوتایپ‌ها از سلول‌های میتوزی تهیه می‌شوند که در بخش متافاز یا پرومتافاز چرخه سلولی متوقف شده‌اند (زمانی که کروموزوم‌ها متراکم‌ترین ترکیبات خود را به خود می‌گیرند.) انواع بافت ها را می توان به عنوان منبع این سلول ها استفاده کرد. برای تشخیص سرطان، نمونه‌های معمولی شامل بیوپسی تومور یا نمونه‌های مغز استخوان استفاده می شود. برای سایر تشخیص‌ها، اغلب از نمونه‌های خون محیطی یا بیوپسی پوست استفاده می شود. برای تشخیص پیش از تولد، از مایع آمنیوتیک یا نمونه های پرز کوریونی (cvs) به عنوان منبع سلول استفاده می شود.فرآیند تولید کاریوتایپ با کشت کوتاه مدت سلول های مشتق شده از یک نمونه آغاز می شود. پس از یک دوره رشد و تکثیر سلولی، تقسیم سلول ها در متافاز با افزودن کلشی سین متوقف می شود. میکند.کلشی سین تقسیم میتوز را در مرحله متافازی متوقف میکند زیرا بهترین مرحله برای مشاهده کاریوتایپ مرحله متافازی است. سلول‌ها در مرحله بعدی با محلول هیپوتونیک تیمار می‌شوند که باعث می‌شود هسته‌هایشان متورم شود، سلول‌ها ترکیده و کروموزم ها از هم جدا شوند. سپس هسته‌ها با یک تثبیت‌کننده شیمیایی تیمار می‌شوند، روی یک لام شیشه‌ای قرار می گیرند و با لکه‌های مختلفی که ویژگی‌های ساختاری کروموزوم‌ها را نشان می‌دهند، مشخص می‌شوند.الگوهای نواری جزئیات ساختاری کروموزوم ها را آشکار می کندبدون هیچ پردازشی، جزئیات ساختاری کروموزوم ها در زیر میکروسکوپ نوری به سختی قابل تشخیص است. بنابراین، برای موثرتر و کارآمدتر کردن آنالیز، سیتولوژیست‌ها لکه‌ رنگ هایی را ایجاد کرده‌اند که به DNA متصل می‌شوند و الگوهای نواری مشخصی را برای کروموزوم‌های مختلف ایجاد می‌کنند. قبل از توسعه این تکنیک‌های نواربندی، تشخیص کروموزوم‌ها از یکدیگر بسیار مشکل بود و کروموزوم‌ها بر اساس اندازه و محل قرارگیری سانترومرشان گروه‌بندی می‌شدند. این روش در سال 1970 تغییر کرد، زمانی که Torbjorn Caspersson و همکارانش اولین تکنیک باندینگ را که به نام Q-banding شناخته می شود، توصیف کردند. Q-banding شامل استفاده از رنگ فلورسنت کویناکرین است که DNA را alkylate می کند و به مرور زمان خاموش می شود. Caspersson و همکاراننشان دادند که کویناکرین الگوهای نواری مشخص و قابل تکرار را برای کروموزوم های فردی تولید می کند. از آن زمان، محققان انواع دیگری از تکنیک‌های باندینگ کروموزوم را توسعه داده‌اند که تا حد زیادی جایگزین Q-banding در سیتوژنتیک بالینی شده‌اند. امروزه اکثر کاریوتایپ ها با رنگ گیمسا رنگ آمیزی می شوند که وضوح بهتری از نوارهای جداگانه را ارائه می دهد، آماده سازی پایدارتری ایجاد می کند و می تواند با میکروسکوپ نوری (زمینه روشن) تجزیه و تحلیل شود. در ادامه با انواع روش های باندینگ آشنا می شویم.Q باندینگ (Quinacrine- banding)Q باندینگ از رنگ آمیزی کویناکرین (کویناکرین دی هیدروکلراید) استفاده می کند و ساده ترین و اولین روش باندبندی کروموزومی است. کروموزوم‌های رنگ‌آمیزی کویناکرین الگوی مشخصی از نوارهای روشن را در زمینه تیره‌تر نشان می‌دهند. از آنجایی که کویناکرین ترکیب فلورسنت است، نوارها تنها زمانی ظاهر می‌شوند که کروموزوم‌ها در معرض نور فرابنفش (UV) قرار گیرند.نور فرابنفش باعث درخشش مولکول‌های کویناکرین می‌شود، بنابراین نواحی هتروکروماتین فلورسانس دار شده و در زیر میکروسکوپ فلورسنت به صورت درخشان ظاهر می شود در حالی که قسمت‌های دیگر تاریک باقی می‌مانند.این الگوی نواری روشن و تاریک بسیار قابل تکرار است و همچنین برای هر کروموزوم اختصاصی است. بنابراین با استفاده از باند کویناکرین برای شناسایی کروموزوم های خاص در یک سلول و همچنین برای تعیین اینکه آیا کروموزوم از نظر ساختاری طبیعی است یا غیر طبیعی استفاده می شود.کویناکرین یک عامل بینابینی است و بین جفت های باز مارپیچ DNA قرار می گیرد. کویناکرین تمایل بیشتری به توالی حاویAT دارد. بنابراین فلورسانس کویناکرین در طول توالی غنی از AT افزایش می یابد و نسبت به توالی غنی از GC روشن به نظر می رسد. (کویناکرین سرطان زا است.)G باندینگ (Giemsa-banding)G-banding رایج ترین تکنیک مورد استفاده برای رنگ آمیزی کروموزوم در سیتوژنتیک است. در این روش رنگ آمیزی کروموزوم ها، ابتدا آن ها با تریپسین تیمار می شوند. تریپسین تا حدی برخی از پروتئین های کروموزومی را هضم می کند، در نتیجه ساختار کروماتین را ضعیف می کند و به رنگ گیمسا اجازه می دهد به DNA دسترسی پیدا کند تا الگوی مشخص و قابل تکراری از نوارهای تیره و روشن رانمایان کند. به طور کلی، مناطق هتروکروماتیک DNA که غنی از AT هستند، در G-banding تیره تر می شوند و در مقابل مناطق غنی از GC که از نظر رونویسی فعالترند، روشن تر دیده می شوند. نمونه ای از کروموزوم های انسانی رنگ آمیزی شده با گیمسا، همانطور که در زیر میکروسکوپ ظاهر می شوند، در شکل 1 نشان داده شده است. به طور معمول، نوار بندی G بین 400 تا 800 نوار با کیفیت بالا را در بین 23 جفت کروموزوم انسانی ایجاد می کند. هرکدام از این نوارها به طور متوسط معادل ۶۰۰۰ تا ۸۰۰۰ kb از DNA می باشند. دراین روش ابتدا تقسیم سلولی با معرفی مثل متوتروکسات یا تیمیدین مهار می شود. سپس با اضافه کردن اسیدفولیک یا دئوکسی سیتیدین به محیط کشت، سلول ها وارد تقسیم میتوز می شوند. در ادامه کلشی سین در زمانی که تعداد بیشتری از سلول ها درمرحله پرومتافاز می باشند و کروموزوم ها به طور کامل متراکم نشدند، اضافه می شود بنابراین یک الگوی نواربندی دقیق تری به دست می آید.شکل1. نمونه رنگ آمیزی شده با گیمساC باندینگ (Centromeric- heterochromatin)در این روش، قبل از استفاده از رنگ آمیزی گیمسا، سلول با هیدروکسید باریم پیش تیمار می شود. بنابراین این تکنیک به رنگ آمیزی (CBG (C-banding by base with Giemsa نیز معروف است. DNAبه طور انتخابی با هیدروکسید باریم دپورینه شده و دورشته ازهم باز می شوند، سپس با انکوبه کردن در محلول نمکی گرم قطعات حاصل شسته می شوند. هترو کروماتین در برابر تجزیه مقاوم باقی مانده و بنابراین تنها بخشی است که به رنگ گیمسا متصل می شود. درنتیجه کروموزوم ها به صورت محو و شبح مانند دیده می شوند که اطراف سانترومر در نواحی پلی مورفیک پری سانترومری کروموزوم های ۱،۹،۱۶ ودر انتهای بازوی بلند Y به شدت رنگ گرفته و تیره هستند نواربندی C برای تعیین کروموزم های دی سانتریک، دی سانتریک کاذب و نیز مطالعه کروموزوم های مارکر و انواع پلی مورفیسم مفید است.R باندینگ (Reverse-banding)در این تکنیک الگوی نوار تولید شده در کروموزوم، مخالف نوار بندی G و Q است. یعنی نوار تاریک (منطقه غنی ازAT ) مشاهده شده در روش G-banding، در R-banding روشن و یوکرماتینی به نظر می رسد و بالعکس. این تکنیک به دو روش فلورسنت و غیر فلورسنت انجام می شود. روش R-banding نیز از رنگ‌آمیزی گیمسا استفاده می‌کند، اما قبل از رنگ‌آمیزی با گیمسا، لام در دمای 88 درجه سانتی‌گراد در محلول بافر حرارت داده می‌شود. گرما باعث دناتوره شدن DNA می شود. G-banding معمولاً به R-banding ترجیح داده می شود. با این حال در برخی موارد،R-banding یک مکمل مفید برای G-banding است، زیرا برخی از G باند های کوچک توسط R-banding تشخیص داده می شوند.T باندینگ (Telomeric-banding)نواربندی T نوعی نواربندی R است که دران فقط نواحی انتهایی کروموزوم ها یا تلومرها رنگ می گیرند. تیمار شدیدتر کروموزوم ها، رنگ پذیری را به جز در نواحی تلومر که مقاوم به حرارت هستند کاهش می دهد. تکنیک های نواربندی T به صورت فلورسنت وغیرفلورسنت هستند.NOR باندینگ (Nucleolar organizing regions)نواربندی NOR تنها مناطقی را رنگ می‌کند که به عنوان سازمان‌دهنده هسته ای (NORs) در ساقه ماهواره ای کروموزوم های آکروسانتریک فعالبت دارند. این نواحی حاوی ژن های RNA ریبوزومی هستند و با نیترات نقره رنگ می گیرند.شکل2.انواع الگوهای باندینگسازماندهی کروموزوم ها در کاریوگرامبه منظور به حداکثر رساندن اطلاعات تشخیصی به دست آمده از کروموزوم، تصاویر کروموزوم های منفرد در قالب استاندارد شده ای به نام کاریوتایپ یا به طور دقیق تر، کاریوگرام مرتب می شوند. طبق کنوانسیون‌های بین‌المللی، اتوزوم‌های انسان یا کروموزوم‌های غیرجنسی به ترتیب نزولی بر حسب اندازه از 1 تا 22 شماره‌گذاری می‌شوند، به استثنای کروموزوم‌های 21 و 22 که اولی در واقع کوچک‌ترین اتوزوم است. کروموزوم های جنسی معمولاً در انتهای کاریوگرام قرار می گیرند.در کاریوگرام، کروموزوم ها در امتداد یک محور افقی که با سانترومرهای آنها مشترک است، همسو می شوند. از محل قرار گیری سانترومر همچنین می توان برای شناسایی مورفولوژی یا شکل ناخالص کروموزوم ها استفاده کرد. به عنوان مثال، کروموزوم های متاسانتریک، مانند کروموزوم های 1، 3 و 16، دارای بازوهای p و q با طول تقریبا مساوی هستند. کروموزوم های ساب متاسانتریک، مانند کروموزوم های 2، 6 و 10، دارای سانترومرهایی هستند که کمی از مرکز جابجا شده اند. کروموزوم های آکروسانتریک مانند کروموزوم های 14، 15 و 21 دارای سانترومرهایی هستند که در نزدیکی انتهای خود قرار دارند.مرتب کردن کروموزوم ها در کاریوگرام می تواند شناسایی هر گونه ناهنجاری را ساده کند. توجه داشته باشید که الگوهای نواری بین دو نسخه کروموزوم یا همولوگ هر اتوزوم تقریباً یکسان است. برخی از تفاوت های ظریف بین همولوگ های یک کروموزوم معین را می توان به تنوع ساختاری طبیعی در بین افراد نسبت داد.استفاده از کاریوگرام برای تشخیص ناهنجاری های کروموزومیامروزه کاریوگرام باند G به طور معمول برای تشخیص طیف گسترده ای از ناهنجاری های کروموزومی در افراد استفاده می شود. اگرچه وضوح تغییرات کروموزومی قابل تشخیص با کاریوتایپ معمولاً چند مگاباس است، این مقدار می تواند برای تشخیص دسته های خاصی از ناهنجاری ها کافی باشد. به عنوان مثال، آنیوپلوئیدی، که اغلب به دلیل عدم وجود یا اضافه شدن یک کروموزوم ایجاد می شود، با تجزیه و تحلیل کاریوتیپ به راحتی قابل تشخیص است. سیتوژنتیک ها همچنین اغلب می توانند حذف ها یا درج های بسیار ظریف تر را به عنوان انحراف از الگوهای نواری طبیعی تشخیص دهند. به همین ترتیب، جابه‌جایی ‌ها اغلب بر روی کاریوتیپ‌ها به راحتی آشکار می‌شوند.هنگامی که تغییرات منطقه ای در کروموزوم ها روی کاریوتیپ ها مشاهده می شود، محققان اغلب علاقه مند به شناسایی ژن های کاندید در بازه بحرانی هستند که بیان نادرست آنها ممکن است باعث ایجاد علائم در بیماران شود. این فرآیند جستجو با تکمیل پروژه ژنوم انسانی، که نوارهای سیتوژنتیکی را با اطلاعات توالی DNA مرتبط می کند، بسیار تسهیل شده است. در نتیجه، محققان اکنون قادرند طیف وسیعی از تکنیک‌های سیتوژنتیک مولکولی را برای دستیابی به وضوح بالاتر تغییرات ژنومی به کار ببرند. هیبریداسیون درجا فلورسانس ( FISH ) و هیبریداسیون ژنومی مقایسه ای(CGH) نمونه هایی از دو رویکرد هستند که به طور بالقوه می توانند ناهنجاری ها را در سطح ژن های فردی شناسایی کنند.با توجه به اینکه کاریوتایپ بسیاری از بیماری های ژنتیکی را شناسایی می کند اما ممکن است به تنهایی مفید واقع نشود، مراجعه به متخصص ژنتیک امری واجب و ضروری است.https://erythrogen.com/blog/karyotype-test-a-method-for-examining-chromosomal-abnormalities/