داربست طبیعی برای تمایز کلیوی مهندسی بافت کلیه (مقاله ترجمه شده)

چکیدهبا وجود شور و شوق برای مهندسی زیستی پیوند زدن بافت های عملکردی کلیه، موانع بسیاری قبل از تحقق پتانسیل این فن آوری در یک محیط بالینی باقی مانده است. استراتژی های مهندسی بافت زنده برای کلیه به شناسایی جمعیت های سلولی لازم، داربست های کارآمد و شرایط کشت سه بعدی برای توسعه و حمایت از معماری منحصر به فرد و عملکرد فیزیولوژیکی این عضو حیاتی نیاز دارد. مطالعات ما قبلا نشان داده اند که بخش سلول زدایی شده کلیه های میمون رزوس در همه گروه های سنی, یک ماتریکس خارج سلولی طبیعی (ECM) را با خواص ساختاری کافی با تاثیرات فضایی و سازمانی روی مهاجرت و تمایز سلول های بنیادی جنینی انسان (hESC) را ارائه می دهند. برای بررسی بیشتر استفاده از داربست های کلیه طبیعی غیرسلولی شده برای مهندسی بافت کلیوی، hESC پرتوان به طور کلی یا روی بخش های ECM کلیه و مهاجرت سلولی و فنوتیپ در مقایسه با روش های تمایز تعیین شده برای hESC کشت داده شدند. نتایج qPCR و تجزیه و تحلیل های ایمونوهیستوشیمی, تنظیم مثبت نشانگرهای سویه کلیوی را نشان داد, زمانی که hESC بدون سیتوکین یا تحریک فاکتور رشد در داربست های غیرسلولی شده کشت داده شدند، که نقش ECM در جهت دهی به تمایز سویهکلیوی را نشان می دهد. hESC نیز با فاکتورهای رشد متمایز شد و در هنگام کاشت روی ECM کلیوی یا یک داربست پلی ساکارید جدید بیولوژیکی بی اثر برای بلوغ بیشتر مقایسه شد. نشانگرهای سویه کلیوی به تدریج در طول زمان روی هر دوی داربست ها تنظیم مثبت شدند و نشان داده شد که hESC, ژن های امضای ساز کلیوی، توبول پروگزیمال، اندوتلیال، و جمعیت های مجرای جمع آوری را بیان می کند. این یافته ها نشان می دهند که داربست های طبیعی, بیان نشانگرهای سویه کلیوی را به خصوص در مقایسه با کشت جنینی بدن ارتقا می دهند. نتایج این مطالعات نشاندهنده قابلیت های یک داربست پلی ساکارید جدید برای کمک به تعریف یک پروتکل برای تمایز جد کلیه از hESC، و پیشرفت وعده مهندسی بافت به عنوان یک منبع از بافت عملکردی کلیه است.مقدمهزمینه در حال گسترش مهندسی بافت, نویدبخش خلق بافت و اندام با خواص کاربردی و پتانسیل درمانی تقریباً برای هر بافت از بدن انسان است. استراتژی های مهندسی اولیه به طور خاص برای ساختارهای لوله ای مانند رگ های خونی [1، 2]، مثانه ادراری [3] ، حنجره [4]، و نای موفق بوده اند [5]. نیاز بالینی برای تعویض بافت های عملکردی برای فهرست در حال انتظار بیماران پیوند عضو, فوریتی است و به ویژه برای بیماران در حال انتظار برای دریافت کلیه حیاتی است؛ افراد نیازمند یک کلیه > 80٪ تمام بیماران در فهرست در حال انتظار را تشکیل می دهند (http://optn.transplant.hrsa.gov). قابل ذکر است که کلیه که بیشترین تقاضا را دارد, با توجه به معماری پیچیده، یک طیف از فنوتیپ های سلول، توابع چندگانه، و فقدان یک جمعیت سلول های بنیادی / پیش ساز ایجاد شده در بزرگسالان که از آن کلیه را می توان بازسازی نمود, یکی از چالش برانگیز ترین بافت های تحت مهندسی است. استراتژی های مهندسی بافت زنده برای کلیه به شناسایی جمعیت های سلولی لازم، داربست های مناسب برای ارائه پشتیبانی از خواص ساختاری و سازمانی فضایی و زمانی، و همچنین ترکیبات محیط/ رشد عامل / کشت برای حفظ رشد و عملکرد فیزیولوژیکی بافت مهندسی شده نیاز دارد.یک روش امیدوار کننده برای مهندسی بافت کلیوی شامل استفاده از داربست های طبیعی تولید شده توسط غیرسلولی نمودن کلیه های اهدا کننده می شود. فرآیند غیرسلولی نمودن معمولاً یک داربست بیولوژیکی سه بعدی (سه بعدی) با مولکول های ماتریکس خارج سلولی مادری (ECM) در مکان های هندسی مناسب و مجراهای عروقی سالم تولید می کند. از زمان مطالعات اثبات مفهوم اولیه [6]، داربست های کلیه غیرسلولی شده در موش ها [07/11]، پستانداران غیر انسانی [12-13]، خوک ها [14-18] و کلیه های جسد انسان تولید شده اند که در تحقق معیارهای پیوند زدن [8، 19-21] ناموفق بوده اند. همچنین مطالعات, حضور دیگر عوامل بیولوژیک [22] از جمله عوامل رشد، سیتوکین [10-11، 20]، و پپتیدهای زیست فعال را نشان داده اند که می توانند به نفع رشد و بلوغ عملکردی سلول های درون ساختار باشند. با وجود وعده این رویکرد, بسیاری از چالش ها از جمله تعیین یک منبع مناسب از سلول ها برای سلولی نمودن دوباره، بهینه سازی سیستم های کشت بافت برای ساختاری مهندسی بافت در حال توسعه، روشن نمودن نقش و مطلوبیت ECM بومی در هدایت سرنوشت سلول، و تعریف یک نقطه پایانی بلوغ مناسب قبل از پیوند زدن در داخل بدن [23] باقی می ماند. با توجه به کمبود کلیه های دهنده دردسترس, استراتژی های مهندسی بافت با مواد داربست طبیعی که برای این نیاز تنظیم شده اند می توانند انتقال بالینی را تسهیل نمایند.مواد و روشهاجمع آوری بافتهیچ حیوانی در این مطالعه گنجانده نشد. یک مخزن زیستی در بخش های میمون رزوس کلیه قبلا به دست آمده و یا کل کلیه ها برای این مطالعات مورد استفاده قرار گرفت. نمونه ها از طریق برنامه تدارک بافت (www.cnprc.ucdavis.edu/our-services) به دست آمدند (N=12 گنجانده شده در این مطالعه).تمایز دادن جهتیتمایز دادن hESC به سمت اجداد کلیوی تحت دو رژیم مکمل فاکتور رشد مقایسه شد، که توسط پروتکل A [25] و یا پروتکل B مشخص شده است (شکل S1) [26]. سلول های پرتوان به عنوان اجسام شبه جنینی در محیط پایه متشکل از DMEM با سرم جنین گاوی (10٪)، پنی سیلین (0.1 کو / میلی لیتر)، استرپتومایسین (0.1 میلی گرم / میلی لیتر) و L گلوتامین (2 میلی متر) در صفحات اتصال فوق العاده کم برای 24 ساعت قبل از اضافه نمودن عوامل رشد مکمل متمایز شدند. تحت پروتکل A، کشت ها با 30 میلی لیتر/ نانوگرم پروتئین مورفوژنتیک استخوان (BMP4) و 10 نانوگرم / میلی لیتر Activin A به مدت 2 روز تکمیل شد؛ پس از آن 200 نانوگرم / میلی لیتر و FGF9 1 میکروگرم / میلی لیتر هپارین به مدت 5 روز؛ پس از آن به مدت 5 روز, 200 نانوگرم عامل / میلی لیتر رشد فیبروبلاست 9 (FGF9)، 1 میکروگرم / میلی لیتر هپارین، 50 نانوگرم / میلی لیتر BMP7، و 1 میکرومتر اسید رتیونیک (EMD Millipore) تکمیل شدند. تحت پروتکل B، کشت ها با 30 ng/ml BMP4 و 50 ng/ml FGF2 به مدت 2 روز تکمیل شد. پس از آن 10 نانوگرم / میلی لیتر Activin A، 100 نانوگرم / میلی لیتر BMP7، و 1 میکرومتر اسید رتیونیک برای 3 روز تکمیل شدند. در تکمیل این پروتکل تمایز فاکتور رشد، سلول ها در بخش های کلیه و یا PSS اندود شدند که در بالا توضیح داده دشه است و در محیط پایه در واسط هوا-متوسط ​​کشت شدند. محیط ​​هر 48 ساعت برای مدت زمان دوره کشت (20 روز کلاً) تغییر یافت.تحلیل داربستداربست های غیرسلولی شده و ساختار های سلول / داربست در فرمالین 10 درصد برای 3-6 ساعت ثابت شدند و در پارافین جاسازی شدند. مورفولوژی و وجود سلول ها در داربست های غیرسلولی شده در مقاطع 5 میکرومتری توسط هماتوکسیلین و رنگ آمیزی ائوزین (H & E) ارزیابی شد. ساختار های Recellularized به طور جامع در ضخامت 5 میکرون با مجموعه ای از مقاطع 10 میکرومتر برای تجزیه و تحلیل مولکولی در فواصل 10-بخش برش داده شدند. هر بخش 10ام توسط H & E برای ارزیابی محل سلول و مورفولوژی ساختار، با ایمونوهیستوشیمی و تجزیه و تحلیل مولکولی در بخش مجاور انجام آغشته شدند.ایمونوهیستوشیمیتجزیه و تحلیل نشانگرهای ایمونوهیستوشیمی با توجه به پروتکل های تعیین شده برای نشانگرهای گلومرولی، لوله ای، و رشدی کلیوی [27، 28] انجام شد. آنتی بادی های اولیه مورد استفاده در مطالعه در جدول 1. نشان داده شده اند. به طور خلاصه, نقاطع deparaffinized شدند و آنتی ژن ها در معرض بازیابی اپی القایی- حرارتی در بافر سیترات داغ (Life Technologies) قرار گرفتند. سپس مقاطع به مدت 1 ساعت با یک حلال حاوی 2٪ سرم از میزبان آنتی بادی ثانویه مسدود شدند. آنتی بادی های اولیه اعمال شدند و یک شبه در 4 درجه سانتی گراد نگهداری شدند. پس از شستشوهای واسطه در PBS، مقاطع به مدت 1 ساعت در تاریکی با آنتی بادی های ثانویه مناسب (Alexa Fluor 488 or 594, Life Technologies) انکوبه شدند. هسته ها با کاربرد ProLong Gold با DAPI (Life Technologies) مشاهده گردیدند. اسلایدها با یک میکروسکوپ فلورسنت Olympus BX61 ، مجهز به دوربین رنگی Olympus DP72 تصویربرداری شدند.تجزیه و تحلیل بیان ژنDNA و RNA از بخش های فرمالین-تثبیت شده پارافین-جاسازی شده فرمالین (FFPE) با AllPrep1 DNA/RNA FFPE Kit (Qiagen) با توجه به دستورالعمل های سازنده استخراج شد. RNA الگو برای آماده سازی cDNA با آغازگرهای تصادفی (Ambion) و Sensiscript Reverse Transcriptase (Qiagen) مورد استفاده قرار گرفت. PCR زمان واقعی در 96 صفحات-چاه با توجه به پروتکل های سازنده با استفاده از 79001 ABI سیستم توالی کشف (بیوسیستم های کاربردی) و کیت QuantiTectTM SYBR1 Green PCR Kit (Qiagen) انجام شد. آغازگرها از قبل شناسایی شده برای ارزیابی میزان تمایز hESC به سمت دودمان های کلیوی مشخص [24] به عنوان نشانگرها برای پرتوانی (اکتامر پیوندیافته به پروتئین 4، OCT4)، خط ابتدایی خلفی (brachyury، BRY)، مزودرم متوسط ​​( فاکتور رونویسی ، OSR1 ؛ LIM پروتئین homeobox 1، LIM1؛ PAX2)، و مزانشیم متانفریک (SIX2، PAX2، WT1) استفاده شد.نتایجتولید و مشخصه داربست غیرسلولی شدهرویه ها برای decellularize کل کلیه های میمون رزوس توسط پرفیوژن ملایم حلال ها در دنباله زیر به اجرا در آمدند: هپارینه PBS، 1٪ SDS در آب برای غیرسلولی نمودن و PBS به علاوه حلال آنتی بیوتیک ضد قارچ برای شستن SDS باقی مانده. کلیه ها مات و شفاف بودند, زیرا فرآیند غیرسلولی نمودن با استفاده از پروتکل های استاندارد (شکل 1A و 1B) تکمیل شد. مقاطع کلیه از یک دهنده پس از غیرسلولی نمودن پرفیوژن کل کلیه (شکل 1C) و یا غیرسلولی نمودن مقاطع در 4 درجه سانتی گراد به مدت 7 روز (شکل 1D) مقایسه شد. کلیه های پرفیوژن شده شفاف بودند در حالی که کلیه های غیرسلولی شده به صورت مقاطع, رنگ و کدورت را حفظ نمودند که نشاندهنده غیرسلولی نمودن ناقص بود مگر اینکه آنها با آشفتگی غیرسلولی شده شده باند. تجزیه و تحلیل بافت شناسایی مقاطع FFPE از کل کلیه های غیرسلولی شده (شکل 1E) و مقایسه توسط رنگ آمیزی H & E برای کلیه مادری (شکل 1F), حذف هسته و دیگر اجزای سلولی با نگهداری معماری کلیوی را نشان داد. مقاطع کلیه های غیرسلولی شده با پروتکل های استاندارد در 4 درجه سانتی گراد یا در دمای اتاق با تحریک در یک تکان دهنده, مقاطع آماده شده با تحریکی را نشان دادند که به طور کامل با غیرسلولی نمودن کامل آشکار شد (به ترتیب شکل 1G و 1H،)، که توسط تجزیه و تحلیل H & E تایید شد. این پروتکل برای همه آزمایش های بعدی مورد استفاده قرار گرفت.بحثبسیاری از موانع قبل از تحقق مهندسی زیستی بافت کلیوی های کاربردی برای پیوند باقی مانده. موانع اولیه شامل انتخاب داربست های مناسب برای حمایت از رشد و نگهداری از بسیاری از انواع سلول در کلیه، و شناسایی جمعیت های بنیادی و / یا سلول اجدادی مناسب برای سلولی سازی مجدد و اطمینان از هر دو ظرفیت ساختاری و عملکردی مورد نیاز می شوند. این مطالعات برای کاوش استفاده از داربست های بیولوژیک بدن مانند ECM کلیوی و مقایسه با PSS فیزیولوژیکی بی اثر انجام شدند که نشانه های بیوشیمیایی و ویژگی های ساختاری قالب ECM بومی را فراهم نمی کنند. نتایج نیز, شرایط غیرسلولی نمودن تصفیه شده برای کلیه های میمون رزوس را پالایش نموده اند و نشان داده اند که داربست ها, در مقایسه با پروتکل های تمایز بدن جنینی, موجب بهبود تنظیم مثبت نشانگرهای سویه کلیوی اولیه می شوند.این مقاله ISI در سال 2015 در نشریه پلاس و در مجله Plos One، توسط مرکز تحقیقات ملی پستانداران کالیفرنیا منتشر شده و در سایت ای ترجمه جهت دانلود ارائه شده است. در صورت نیاز به دانلود رایگان اصل مقاله انگلیسی و ترجمه آن می توانید به پست دانلود ترجمه مقاله داربست طبیعی برای تمایز کلیوی مهندسی بافت کلیه در سایت ای ترجمه مراجعه نمایید.