گام های بزرگ در تعیین توالی DNA (مقاله ترجمه شده)

در سال های اخیر پیشرفت های فوق العاده ای در توانایی ما برای تعیین سریع و کم هزینه توالی DNA توالی به وجود آمده است. این مساله تحولات بنیادین در زمینه های ژنتیک و زیست شناسی ایجاد کرده که منجر به درک عمیق تر از رویدادهای مولکولی در فرایندهای زیستی شده است. پیشرفت های سریع تکنولوژیکی، فرصت ها و کاربردهای تعیین توالی را به سرعت گسترش داده است و در عین حال چالش هایی در مراحل پیشین تعیین توالی و در فرآیندهای پایین دستی بررسی و تجزیه و تحلیل این حجم انبوه از داده های توالی تحمیل کرده است. به طور سنتی، تعیین توالی، به قطعات کوچک DNA برای حدود یک هزار پایه(مشتق شده از ژنوم ارگانیسم) بمنظور حفظ کیفیت توالی و دقت بالا برای خواندن طول های بالاتر محدود شده است. اگر چه پیشرفت های تکنولوژیکی بسیاری بوجود آمده است، روش های تعیین توالی موازی که بطور تجاری در حال حاضر در دسترس هستند قادر به حل این مساله نیستند. روش تعیین توالی قادر به حل این مسئله نبوده است. با این حال، اعلان اخیر در تعیین توالی نانوحفره وعده از بین بردن این محدودیت خواندن طول را داده است، که امکان تعیین توالی قطعات سالم بزرگ تر DNA را می دهد. توانایی تعیین توالی DNA سالم با دقت بالا گامی بزرگ به سوی تسهیل تجزیه و تحلیل پایین دستی و افزایش قدرت تعیین توالی نسبت به امروز است. این بررسی برخی از پیشرفت های فنی در تعیین توالی که مرزهای جدیدی را در ژنتیک باز کرده-اند پوشش می دهد. مقدمهدرک کامل زبان DNA نیاز به تعیین کامل ترتیب پایه های ژنوم انسان (و یا دیگر موجودات مورد نظر) دارد. دستیابی به آن دانش، وعده بینش کامل تر نسبت به تغییرات بیولوژیکی و علل بیماری ها را می دهد. در سپیده دم تعیین توالی، خواندن ترتیب چهار پایه DNA یک فرایند دست و پا گیر بود. تعیین توالی اگرچه هنوز به سختی، با معرفی روش تجزیه شیمیایی صنعتی توسط Maxam و Gilbert [1] و روش تعیین توالی زنجیره پایانی که توسط sanger ساخته شده بود[2] در پایان دهه 1970 ممکن شد. ثابت شد روش دوم مفید تر است و روش غالب تعیین توالی DNA برای تقریبا سه دهه بود و پروژه ژنوم انسان (HGP) را به پیش برد، و هنوز هم توسط بسیاری به عنوان "استاندارد طلایی" در نظر گرفته می شود. راه اندازی تجاری ابزارهای تعیین توالی موازی فشرده DNA در سال 2005 آغاز تغییر پارادایم طراحی شده توسط تکنیک-های جدید تعیین توالی DNA بود که به محققان برای پاسخ به سوالات جسورانه در آزمایشات وسیع ژنوم الهام بخشید. در سال های اخیر رقبای جدید بسیاری در زمینه تعیین توالی موازی فشرده دیده می شود. قابل ذکر است، روش های تعیین توالی نوآورانه با استفاده از تک مولکول های DNA و تشخیص بی درنگ ظهور کرده اند. در حال حاضر، این رویکردهای نواورانه در حال تکمیل پلتفرم های تعیین توالی موجود است، اما پیش از آن، آنها مسیری طولانی برای جایگزین شدن با روش تعیین توالی موازی فشرده دارند.فن آوری های معمول تعیین توالی DNA و چالش های خود و محدودیت هایشان، در زیر توضیح داده می-شود. خلاصه ای از ویژگی های هر یک از تکنولوژی ها در جدول 1 ارائه شده است حالی که تعدادی از خوانش توالی ها و خوانش طول در شکل 1 نشان داده شده است. توالی sanger – توالی خاتمه دهی زنجیرهمهارت روش خاتمه دهی زنجیره در استفاده از نوکلئوتیدهای خاتمه زنجیره، دیدئوکسی- نوکلئوتید است که فاقد یک گروه 3پریم هیدروکسیل است و بسط و گسترش بیشتر زنجیره DNA کپی شده را محدود می-کند. برای تعیین توالی اولیه sanger نیاز است فرآیند توالی به چهار واکنش جداگانه تقسیم شود. هر واکنش شامل یک الگوی تک رشته ای ،DNA یک آغازگر DNA و یک پلیمراز DNA در حضور مخلوطی از چهار نوکلئوتید اصلاح نشده، که یکی از آنها نشانه گذاری شده، و یک نوع نوکلئوتید خاتمه زنجیره اصلاح شده است. قطعاتی با طول متفاوت پس از هیبریداسیون پرایمر و اکتنشن پلیمراز سنتز می شوند و همه همان 5 پریمپایانی را دارند اما توسط یک نوکلئوتید خاتمه زنجیره به 3ختم می شوند. اضافه کردن تنها بخشی از نوکلئوتید پایان دار ترکیب تصادفی دیدئوکسی نوکلئوتیدها را تنها در بخش کوچکی از مولکول ها تضمین می-کند. از آنجا که نوکلئوتیدهای خاتمه زنجیره مختلف در چهار واکنش توالی یابی استفاده می شود، تمام ترکیبات خاتمه می تواند تولید شود. الگوهای DNA محدود به 3 تولید شده پس از تغییر ماهیت بوسیله حرارت و تجزیه و تفکیک شدن توسط ژل الکتروفورز، فراورده های هر چهار واکنش تعیین توالی موازی را ادامه می دهد[2]. با استفاده از رادیواکتیو یا، اخیرا، بوسیله برچسب زنی با فلورسنت برای تجسم باندها دنباله -ای از الگوهای DNA اصلی را قادر می سازد تا با پیروی از ترتیب مهاجرت قطعات بزرگتر متوالی در ژل تعیین شود. توالی موازی فشرده - توالی اجماعپلتفرم های تعیین توالی که امروزه به طور گسترده ای در تحقیقات ژنتیکی مورد استفاده قرار می گیرند، پلتفرم-های تعیین توالی فشرده هستند. که ویژگی های بسیاری از توالی sanger به ارث برده اند مانند استفاده از پلیمرازها برای سنتز، نوکلئوتیدهای اصلاح شده و تشخیص فلورسنت. ویژگی دیگر این است که آنها نیاز به DNA دارند تا بطور کلونال تقویت شوند تا تشکیل یک الگوی اجماعی قبل از تعیین توالی را بدهند. تعیین توالی به روش پیروMelamede در ابتدا مفهوم تعیین توالی با سنتز (SBS) را در سال 1985 در یک گزارش از تلاش ها برای تشخیص رویداد ترکیب نوکلئوتید با اندازه گیری جذب نوکلئوتید [8] را مطرح کرد. بی خبر از یافته های Melamede ، Nyrén رویکرد SBS دیگری را با استفاده از زیست تابی به جای جذب در سال 1986 تصور کرد[9]، که منجر ( 12 سال پس از آزمایش دیگری) به معرفی pyro-sequencing شد[10]. فن-آوری pyrosequencing قادر به تکمیل توالی sanger بود و بیشتر توسط علوم زندگی 454، که توسط جاناتان روتبرگ پایه گذاری شد، توسعه داده شد. در سال 2005، روتبرگ و همکارانش [11] اولین مقاله اثبات مفهومی را منتشر کردند که نشان داد رویکرد pyrosequencing در تعیین توالی موازی فشرده، بازده فوق العاده ای در افزایش ظرفیت توالی، و در نتیجه دگرگونی روش تعیین توالی دارد. تعیین توالی موازی فشرده – تعیین توالی تک مولکولیتغیین توالی اجماع موازی فشرده به تکنولوژی غالب در تعیین توالی تبدیل شده است، اما روش های دیگر که از تقویت الگوهای پیشین DNA برای تعیین توالی پرهیز می کنند ظهور کرده اند. هدف از این فنآوری ها تعیین توالی با تک مولکول DNA و ترجیحا در بصورت بلادرنگ است. مزایای بالقوه استفاده از تعیین توالی تک مولکولی عبارتند از: مقادیر حداقل DNA ورودی مورد نیاز؛ حذف بایاس تقویت؛ سنتز اسنکرون؛ زمان چرخش سریع؛ و ظرفیت بررسی ویژگی های تک مولکول های DNA است. یک مقایسه از تعیین توالی اجماعی و تعیین توالی تک مولکولی، و همچنین رایج ترین اشتباهات برای هر یک از تکنولوژی های تعیین توالی در شکل 2 نشان داده شده است.SBS ترمیناتور تک رنگ برگشت پذیرHelicos Biosciences اولین تعیین توالی تک مولکولی DNA را در سال 2008 به نام سیستم Helicos معرفی کرد[37]. این سیستم از نوکلئوتیدهای پایان دهی زنجیره برگشت پذیر لیبل گذاری شده در یک رویکرد SBS باDNA بیحرکت بر روی یک سطح مسطح استفاده می کند[38، 39]. از این رو، بسیاری از ویژگی ها را با توالی اجماعی موازی فشرده در برپایی، بیوشیمی، توالی زمان اجرا و توان به اشتراک می گذارد. آن در اولین توالی تک مولکولی ژنوم انسان در سال 2009 استفاده شد[40] و می تواند برای تقویت توالی RNA استفاده شود[41]. با این حال، پلتفرم از سال 2008 است در بازار بوده است و به نظر می رسد در حال مبارزه در رقابتی شدید است. دلایلش احتمالا در نرخ خطای خواندن خام بالای آن (> 5٪) و طول کوتاه خواندن (~ 32 پایه) است[42]. چشم انداز آیندهتکنولوژی های تعیین توالی پیشرفت های سریعی در سال های اخیر داشته اند و هیچ نشانه ای از کاهش پیشرفت وجود ندارد. این مساله عدم تعادلی بین تعیین توالی برای هرse و دیگر روش های درگیر، در هر دو مراحل بالادستی و پایین دستی، به عنوان مثال آماده سازی نمونه و تجزیه و تحلیل داده ها و ذخیره سازی ایجاد کرده است. بارکدگذاری نمونه ها به همراه اتوماسیون مراحل پیش از تعیین توالی پتانسیل این را دارد که در بسیاری از مسائل مربوط به فرآیند بالادستی استفاده شود. چالش واقعی در مراحل پایین دستی تجزیه و تحلیل داده های توالی،حمل و ذخیره سازی است. ذخیره سازی طولانی مدت داده های توالی و تجزیه و تحلیل-های بعدی دست و پا گیر و گران است، بنابراین، در آینده، ممکن است تجدید تعیین توالی نمونه ها ارزان تر و آسان تر باشد چنانچه اطلاعاتی مورد نیاز باشد. البته، چالش های متعددی وجود دارد که در واکنش های تعیین توالی واقعی باقی می ماند. دو تا از ضروری ترین موارد، طول خواندن و کیفیت خواندن دنباله است که وضوح تکرارهای مرسوم و نواحی تکثیر شده را ممکن می سازد. در حال حاضر، پلتفرم های تعیین توالی موازی فشرده و تک مولکولی مکمل هستند، و هیچ تکنولوژی بتنهایی برای تمام کاربردها بهترین گزینه نیست. بنابراین باید دید کدام تکنولوژی منجر به تغییر اتی در پارادایم تعیین توالی خواهد شد.توالی به طور سنتی برای مراکز تحقیقاتی بزرگ با بودجه بسیار خوب محفوظ است، اما هزینه برای هر پایه توالی در طول پایان HGP شروع به کاهش کرده است. سرعت کاهش هزینه ها حتی با راه اندازی و متعاقب آن تکامل ابزارهای تعیین توالی موازی فشرده بنظر می رسد در سال های اخیر بیشتر شتاب گرفته است.دموکراتیزه کردن تعیین توالی از افزایش مداوم و قابل ملاحظه تعداد کاربردها و تحلیل هایی که شامل داده های توالی است مشهود است. امروزه تعیین توالی در عرصه های گوناگون، مانند پزشکی قانونی، کشاورزی، تولید سوخت های زیستی، دیرین شناسی، اهلی، و داروسازی کاربرد دارد. این انقلاب در حال وقوع وعده آوردن تعیین توالی به تقریبا هر جنبه ای از زندگی را می دهد.این مقاله ISI در سال 2012 در نشریه وایلی و در مجله بیوتکنولوژی، توسط گروه پزشکی مولکولی و جراحی منتشر شده و در سایت ای ترجمه جهت دانلود ارائه شده است. در صورت نیاز به دانلود رایگان اصل مقاله انگلیسی و ترجمه آن می توانید به پست دانلود ترجمه مقاله گام های بزرگ در تعیین توالی DNA در سایت ای ترجمه مراجعه نمایید.