تکنیک FISH (هیبریداسیون درجا فلوروسنت)

سیتوژنتیک با معرفی هیبریداسیون درجا وارد دوران مولکولی شد، روشی که به محققان اجازه می دهد موقعیت های توالی DNA خاص را بر روی کروموزوم ها پیدا کنند. از اولین آزمایش‌های هیبریداسیون درجا در سال 1969، انواع مختلفی از این روش ایجاد شده است و حساسیت آن به شدت افزایش یافته است. امروزه، اکثر روش‌های هیبریداسیون درجا از پروب‌های فلورسنت برای تشخیص توالی‌های DNA استفاده می‌کنند و این فرآیند معمولاً به عنوان FISH(هیبریداسیون درجا فلورسنت) نامیده می‌شود. انواع روش های FISH در دسترس متخصصان سیتوژنتیک است که از آنها برای تشخیص بسیاری از انواع ناهنجاری های کروموزومی در بیماران استفاده می کنند. موفقیت FISH و سایر روش های هیبریداسیون درجا به پایداری قابل توجه مارپیچ دوگانه DNA بستگی دارد.استفاده از هیبریداسیون درجا برای بومی سازی توالی های DNA روی کروموزوم هادر سال 1953، جیمز واتسون و فرانسیس کریک شبکه گسترده پیوندهای هیدروژنی را توصیف کردند که دو رشته موازی ناهمسو در مارپیچ دوگانه DNA را در کنار هم نگه می دارد. به دلیل پیوندهای هیدروژنی فراوانی که بین این پایه ها تشکیل شده است، مارپیچ دوگانه به صورت قابل توجهی ساختاری پایدار دارد. علاوه بر این، اگر پیوندهای هیدروژنی که مارپیچ را در کنار هم نگه می دارند با گرما یا مواد شیمیایی شکسته شوند، مارپیچ می تواند زمانی که شرایط مساعدتر شود دوباره تشکیل شود. این توانایی مارپیچ DNA برای شکل گیری مجدد یا تغییر شکل، پایه ای را برای هیبریداسیون مولکولی فراهم می کند.در هیبریداسیون مولکولی، از یک توالی DNA یا RNA نشاندار شده به عنوان یک پروب برای شناسایی یا تعیین مقدار همتای طبیعی توالی در یک نمونه بیولوژیکی استفاده می شود. در دهه 1960، محققان (Joseph Gall ,Mary Lou) متوجه شدند که هیبریداسیون مولکولی می تواند برای شناسایی موقعیت توالی های DNA درجا (یعنی در موقعیت های طبیعی آنها در یک کروموزوم) استفاده شود. در واقع، در سال 1969، این دو دانشمند مقاله مهمی را منتشر کردند که نشان می‌داد کپی‌های رادیواکتیو از یک توالی DNA ریبوزومی می‌توانند برای شناسایی توالی‌های DNA مکمل در هسته تخم قورباغه استفاده شوند. از آن زمان مشاهدات اولیه، بسیاری از اصلاحات، تطبیق پذیری و حساسیت این روش را افزایش داده اند تا جایی که FISH اکنون به عنوان یک ابزار ضروری در سیتوژنتیک در نظر گرفته می شود.اصول تکنیک FISHبلافاصله پس از کار Gall و Pardue، برچسب های فلورسنت به دلیل ایمنی، پایداری و سهولت تشخیص بیشتر، به سرعت جایگزین برچسب های رادیواکتیو در پروب های هیبریداسیون شدند. در واقع، بیشتر هیبریداسیون درجا با استفاده از روش های FISH انجام می شود. تشخیص یک توالی DNA را می توان با جستجوی سوزن در انبار کاه مقایسه کرد، به طوری که سوزن دنباله DNA مورد نظر و انبار کاه مجموعه ای از کروموزوم ها است. اگر محقق یک “آهنربای” قدرتمند داشته باشد (در این مورد، یک کپی فلورسنت از توالی DNA مورد نظر)، این جستجو بسیار آسان تر می شود. هیبریداسیون زمانی اتفاق می افتد که “آهنربا” با “سوزن” برخورد کند. همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است، در این روش، هم به یک پروب و هم به یک هدف نیاز است. در شکل، توالی پروب که اغلب قطعه ای از DNA شبیه سازی شده است به رنگ قرمز نشان داده شده است. همچنین DNA هدف (کروموزوم های روی یک اسلاید شیشه ای) نیز به رنگ آبی (در ستون سمت راست) نشان داده شده است. پیوندهای هیدروژنی که به دو رشته مارپیچ DNA می پیوندند نیز با خطوط سیاه نشان داده می شوند.اولین گام در این فرآیند، ایجاد یک کپی فلورسنت از دنباله پروب (شکل b1، ستون میانی) یا یک کپی اصلاح شده از دنباله پروب است که می تواند در مراحل بعدی فلورسنت شود (شکل b1، ستون سمت چپ). در مرحله بعد، قبل از هر گونه هیبریداسیون، هر دو دنباله هدف و پروب باید با حرارت یا مواد شیمیایی دناتوره شوند (شکل c1). دناتوره شدن در این مرحله به منظور تشکیل پیوندهای هیدروژنی جدید بین هدف و پروب در طول مرحله هیبریداسیون بعدی ضروری است. سپس توالی‌های پروب و هدف با هم مخلوط می‌شوند (شکل d1) و پروب به‌طور خاصی با توالی مکمل خود روی کروموزوم هیبرید می‌شود. اگر پروب قبلاً فلورسنت باشد (ستون میانی)، تشخیص مستقیم محل هیبریداسیون امکان پذیر خواهد بود. در موارد دیگر (ستون سمت چپ)، ممکن است یک مرحله اضافی برای تجسم پروب هیبرید شده مورد نیاز باشد. هیبریدهای تشکیل شده بین پروب ها و اهداف کروموزومی آنها را می توان با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت تشخیص داد. هنگامی که محققین یک آزمایش FISH را طراحی می کنند، باید در نظر بگیرند که آیا حساسیت و وضوح مورد نیاز برای آزمایش در محدوده فنی میکروسکوپ فلورسانس قرار دارد یا خیر. حساسیت، به توانایی جمع‌آوری نور میکروسکوپ خاص بستگی دارد، که تعیین می‌کند آیا توالی‌های هدف کوچک، که دیدن آن‌ها دشوارتر از توالی‌های هدف بزرگ هستند، قابل تشخیص هستند یا خیر. وضوح به توانایی تمایز بین دو نقطه در طول یک کروموزوم اشاره دارد. در نهایت، میکروسکوپ نوری نمی‌تواند اجسامی را که با فاصله کمتر از 200 تا 250 نانومتر، یعنی حد پایین‌تر طیف نور مرئی از هم فاصله دارند، تشخیص دهد. با در نظر گرفتن این محدودیت های فنی، محققان همچنین باید ترکیب DNA را در کروموزوم در نظر بگیرند. کروموزوم های متافاز هزاران بار فشرده تر از کروموزوم های اینترفاز هستند، که به نوبه خود حداقل ده برابر فشرده تر از DNA برهنه هستند. (به یاد داشته باشید که یک چرخش 3.4 نانومتری از مارپیچ DNA مربوط به 10 جفت باز DNA است.)شکل 1. اصول تکنیک FISH – عناصر اساسی FISH یک پروب DNA و یک توالی هدف هستند.استفاده از FISH برای شناسایی موقعیت ژن هاFISH ابزار قدرتمندی برای شناسایی محل توالی DNA کلون شده بر روی کروموزوم های متافاز فراهم می کند. شکل a2 نتایج یک آزمایش معمولی FISH را نشان می دهد که در آن یک توالی DNA کلون شده با کروموزوم های متافاز طبیعی هیبرید شده است. نوارهای قرمز در محل های هیبریداسیون روی دو کروموزوم همولوگ شناسایی می شوند که می توان آنها را با الگوهای نواری مشخصه آنها شناسایی کرد. بررسی دقیق تر نشان می دهد که هر نوار قرمز در واقع شامل دو نقطه است که مربوط به دو کروماتید خواهری در یک کروموزوم میتوزی است. یک متخصص سیتوژنتیک ماهر می تواند از این داده های هیبریداسیون همراه با الگوی نواری استفاده کند تا توالی پروب را در چند مگاباز از ژن های شناخته شده دیگر روی کروموزوم قرار دهد.از نظر تاریخی، FISH نقش اصلی را در نقشه‌برداری ژن‌ها بر روی کروموزوم‌های انسانی بازی می‌کنند. نتایج حاصل از این آزمایش‌ها جمع‌آوری و در پایگاه‌های اطلاعاتی گردآوری شد و این اطلاعات در مرحله حاشیه‌نویسی پروژه ژنوم انسانی (HGP) مفید بود. اکنون که HGP کامل شده است، محققین به ندرت از هیبریداسیون درجا صرفاً برای شناسایی مکان کروموزومی یک ژن انسانی استفاده می کنند.شکل 2تشخیص ناهنجاری های کروموزومی با استفاده از کاریوتیپ و FISHFISH و سایر روش‌های هیبریداسیون درجا در تشخیص بالینی ناهنجاری‌های کروموزومی مختلف، از جمله حذف، تکرار، و جابه‌جایی مهم هستند. شکل b2 نمونه ای را نشان می دهد که در آن محققین از FISH همراه با کاریوتایپینگ استاندارد برای تجزیه و تحلیل جابجایی کروموزومی بیمار استفاده کردند. پروب هیبریداسیون مربوط به قسمتی از کروموزوم 19 بود که مشکوک به وجود translocation breakpoint است. سه ناحیه هیبریداسیون در تصویر فلورسنت آشکار است. یک نقطه مربوط به نسخه طبیعی بیمار از کروموزوم 19(nl19) است و دو نقطه دیگر مربوط به نسخه های تغییر یافته یا مشتق شده (der) کروموزوم های 11 و 19 است که در حین جابجایی تولید شده اند. بنابراین، محققان توانستند از داده‌ها برای محدود کردن breakpoint region در کروموزوم 19 و شناسایی کروموزوم دوم درگیر در جابجایی استفاده کنند.پروب هیبریداسیون مورد استفاده در شکل b2 یکی از هزاران کلون کروموزوم مصنوعی باکتریایی (BAC) از HGP بود که در دسترس جامعه علمی قرار گرفته است. امروزه متخصصین سیتوژنتیک می توانند از منابع کلون HGP برای شناسایی دقیق مکان های بازآرایی کروموزومی که در کاریوتیپ ها ظاهر می شوند استفاده کنند. در واقع، انجمنی از دانشمندان بیش از 7000 کلون DNA را از HGP به نوارهای خاصی روی کروموزوم های انسانی ترسیم کرده اند (حداقل یک کلون برای هر بخش مگاباز DNA کروموزومی در دسترس است.) تنها استثنا کروموزوم Y است، زیرا از نظر ژن نسبتاً فقیر است.استفاده از مجموعه ای از پروب های FISH برای “رنگ آمیزی” کل کروموزوم هاتشخیص بازآرایی‌های کروموزومی با پروب‌های مخصوص مکان می‌تواند یک تلاش طولانی باشد، به‌ویژه اگر بازآرایی‌های پیچیده رخ داده باشد یا اگر مناطق بازآرایی شده با الگوهای نواری در کاریوتایپ به سختی شناسایی شوند. خوشبختانه، متخصصین سیتوژنتیک اکنون این گزینه را دارند که از Multifluor FISH یا کاریوتایپینگ طیفی برای اسکن سریع مجموعه ای از کروموزوم های متافاز برای بازآرایی احتمالی استفاده کنند. Multifluor FISH کاریوتایپی را تولید می کند که در آن هر کروموزوم با رنگ متفاوتی رنگ آمیزی شده است. هر “رنگ” در واقع مجموعه ای از پروب های هیبریداسیون برای توالی هایی است که طول یک کروموزوم خاص را در بر می گیرند.با Multifluor FISH، محققان ابتدا مجموعه‌ای از توالی‌های DNA را برای استفاده به عنوان پروب برای هر کروموزوم آماده می‌کنند. در شکل a3، کروموزوم های پروب به صورت فیزیکی از یکدیگر توسط فلوسایتومتری جدا شده اند. در مرحله بعد، نمونه‌های DNA با ترکیبی از فلوروکروم‌ها که رنگ منحصر به فردی را برای هر کروموزوم ایجاد می‌کنند، برچسب‌گذاری می‌شوند. (مرحله DNA Cot-1 در شکل، توالی های DNA تکراری را [به عنوان مثال، DNA سانترومریک] که به همه کروموزوم‌ها متصل می‌شوند حذف می کند.) پروب‌های هیبریداسیون فلورسنت سپس با کروموزوم‌های متافاز ترکیب شده و هیبرید می‌شوند. شکلb3 تصاویر کروموزوم های اینترفاز و متافاز را نشان می دهد که پس از هیبریداسیون از طریق میکروسکوپ ظاهر می شوند. برای چشم انسان، به نظر می رسد که چندین کروموزوم متافاز رنگ یکسانی دارند، اما پردازش دیجیتالی تصویر، تفاوت های طیفی بین کروموزوم ها را تشخیص می دهد. یک کروموزوم طبیعی انسان (شکل b3) در طول خود رنگی یکنواخت خواهد داشت، اما کروموزوم بازآرایی شده ظاهری راه راه خواهد داشت.اگرچه رنگ های کروموزومی امکان ارزیابی سریع تغییرات کروموزومی بزرگ در گسترش متافاز را فراهم می کند، وضوح روش محدود است. بنابراین، در حالی که رنگ آمیزی کروموزوم به محققان اجازه می دهد تا به سرعت کروموزوم های دخیل در جابجایی ها و یا حذف ها و/یا تکرارهای بزرگ را شناسایی کنند، حذف ها و تکرارهای کوچک قابل تشخیص نیستند. اگر محققین به اطلاعات دقیق‌تری در مورد توالی‌های واقعی دخیل در بازآرایی‌های کروموزومی نیاز داشته باشند، باید با پروب های مخصوص، همانطور که قبلاً توضیح داده شد، پیگیری کنند (شکل 2).شکل 3استفاده از FISH برای تجزیه و تحلیل کروموزوم های اینترفازاز زمان معرفی FISH، متخصصین سیتوژنتیک قادر به تجزیه و تحلیل کروموزوم های اینتر فاز و همچنین کروموزوم های متافاز مورد استفاده در کاریوتیپ ها بوده اند. این یک مزیت عالی است، زیرا سلول ها نیازی به کشت از چند روز یا هفته قبل از آماده شدن کروموزوم ها برای تجزیه و تحلیل ندارند. علاوه بر این، FISH می تواند برای تجزیه و تحلیل کروموزوم های نمونه هایی مانند تومورهای جامد، که دارای اهمیت بالینی زیادی هستند، اما به طور مکرر تقسیم نمی شوند، استفاده شود. یکی دیگر از ویژگی های مفید FISH این است که اگر پروب های هیبریداسیون با فلوروفورهای مختلف برچسب گذاری شده باشند، محققان می توانند به طور همزمان چندین مکان را نظارت کنند.شکل 4 دو نمونه از نحوه استفاده interphase FISH برای تشخیص ناهنجاری های کروموزومی را نشان می دهد. شکل a4 یک هسته اینترفاز از یک بیمار مبتلا به بیماری Charcot-Marie-Tooth) CMT) نوع A1 را نشان می دهد. CMT نوع A1 یک بیماری عصبی نسبتاً رایج است که به دلیل تکرار در ژنی در کروموزوم 17 ایجاد می شود که یکی از پروتئین های غلاف میلین را که آکسون های عصبی را احاطه کرده است کد می کند. در شکل a4، سلول بیمار با یک پروب با برچسب قرمز مربوط به دنباله ای در ناحیه تکراری، همراه با یک پروب سبز رنگ مربوط به دنباله ای در کروموزوم 17 که در خارج از ناحیه تکراری قرار دارد، هیبرید شده است. از دو سیگنال سبز رنگ، می توان دو نسخه از کروموزوم 17 را در هسته پیدا کرد. یک کروموزوم دارای پیکربندی نرمال است، در حالی که کروموزوم دوم (der17)، حاوی ناحیه تکراری است که از دو سیگنال قرمز مجاور مشخص است. این شکل همچنین برای نشان دادن یکی دیگر از ویژگی های مهم interphase FISH است. چون کروماتین اینترفازتقریباً 10000 برابر کمتر از کروماتین میتوزی فشرده شده است، می توان مناطق تکراری در (der17) را به عنوان نقاط مجزا تشخیص داد.شکل b4 تجزیه و تحلیل FISH را نشان می دهد که برای تشخیص وجود جابجایی کروموزومی در یک بیمار مبتلا به لوسمی میلوژن مزمن استفاده شد. در بیشتر موارد این بیماری، بخشی از کروموزوم 9 که حاوی پروتوآنکوژن ABL است، در طی یک جابجایی متقابل با منطقه (BCR (breakpoint cluster region در کروموزوم 22 ترکیب می شود. کروموزوم 22 مشتق شده یا (der22)، که به عنوان کروموزوم فیلادلفیا شناخته می شود، حاوی یک ژن همجوشی BCR-ABL است که در آن پروموتر قدرتمند BCR سنتز رونوشت انکوژن ABL را هدایت می کند و منجر به سرطان می شود. شکل b4 نشان می دهد که همجوشی های BCR-ABL را می توان به آسانی توسط FISH زمانی که یک پروب هیبریداسیون با برچسب سبز در کنار BCR همراه با یک پروب با برچسب قرمز در کنار ABL اعمال شود، شناسایی کرد. در این تصویر، نسخه های طبیعی کروموزوم های 9 و 22 به ترتیب به صورت لکه های قرمز و سبز مشخص شده اند. از سوی دیگر، کروموزوم فیلادلفیا به صورت یک لکه ترکیبی پیچیده قابل مشاهده است که به نظر می رسد یک ناحیه زرد مرکزی با زیر ناحیه های قرمز و سبز در دو طرف دارد. (در میکروسکوپ فلورسنت، رنگ زرد نشان دهنده مجاورت بسیار نزدیک پروب های قرمز و سبز است، به طوری که به نظر می رسد همپوشانی دارند.) زیرساخت پیچیده نقطه ادغام شده در کروموزوم های اینترفازی قابل تشخیص است، اما در تجزیه و تحلیل مشابه برای کرومزوم های متافاز قابل تشخیص نیست. بنابراین، interphase FISH دو رنگ، روشی حساس برای تجزیه و تحلیل رویدادهای همجوشی کروموزوم بدون نیاز به کشت سلولی قبلی ارائه می‌کند .یکی دیگر از کاربردهای تحقیقاتی interphase FISH این است که از رنگ های کروموزوم خاص برای به دست آوردن اطلاعات در مورد سازماندهی کروموزوم ها در هسته استفاده می کند. (شکل a2بالا سمت چپ) یک هسته اینتر فازی را نشان می دهد که با رنگ های مخصوص کروموزوم رنگ آمیزی شده است. از شکل می توان دریافت که کروموزوم ها مناطق مجزایی در هسته را اشغال می کنند. با ترکیب خلاقانه پروب های کروموزوم خاص با پروب ها و آنتی بادی های اختصاصی ژن، محققان می توانند از FISH برای ارائه بینش های هیجان انگیز جدید در مورد معماری هسته ای استفاده کنند.شکل 4کاربردهای اضافی FISH در کلینیک و آزمایشگاه تحقیقاتیبرنامه های جدید هیجان انگیز FISH که دامنه آن را گسترش می دهد همچنان در حال توسعه هستند. به عنوان مثال، سیتوژنتیک ها اکنون از هیبریداسیون ژنومی مقایسه ای برای تشخیص تفاوت های کمی، مانند تغییرات تعداد کپی، در کروموزوم های بیماران خود استفاده می کنند. اخیراً، محققان همچنین توانسته‌اند وضوح FISH را با استفاده از الیاف کروماتین کشیده یا microarrays به عنوان هدف افزایش دهند. با ابزارهایی مانند این، سیتوژنتیک توانسته است از مطالعه کل کروموزوم ها در مقیاس ماکروسکوپی به مطالعه DNA که این کروموزوم ها از آن تشکیل شده است، حرکت کند.https://erythrogen.com/blog/fish-technique/