KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EEG) nr 2568/91 av den 11 juli 1991 om egenskaper hos olivolja och olivolja av pressrester och om lämpliga analysmetoder

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DENNA FÖRORDNING

med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekonomiska gemenskapen,

med beaktande av rådets förordning nr 136/66/EEG av den 22 september 1966 om den gemensamma organisationen av marknaden för oljor och fetter(1), senast ändrad genom förordning (EEG) nr 3577/90(2), särskilt artikel 35a i denna, och

med beaktande av följande:

Bilagan till förordning nr 136/66/EEG innehåller beskrivningar och definitioner av olivolja och olivolja av pressrester som saluförs inom varje medlemsstat, inom gemenskapen och i handeln med tredje länder.

För att kunna skilja mellan de olika typerna av olja bör de fysiska och kemiska egenskaperna hos var och en av dem och de organoleptiska egenskaperna hos jungfruolja definieras så att renheten och kvaliteten för de berörda varorna kan säkerställas med beaktande av andra befintliga bestämmelser.

Egenskaperna hos de olika typerna av olja bör bestämmas enhetligt inom hela gemenskapen. För detta ändamål bör gemenskapsmetoder för kemisk analys och organoleptisk värdering upprättas. Under en övergångsperiod bör användningen av andra analysmetoder som tillämpas i medlemsstaterna tillåtas, under förutsättning att de resultat som erhålls med gemenskapsmetoden skall vara avgörande vid en skillnad i resultaten.

Definitionen av de fysiska och kemiska egenskaperna hos olivolja och av analysmetoderna medför ändringar av tilläggsanmärkningarna i kapitel 15 i Kombinerade nomenklaturen.

Metoden för utvärdering av de organoleptiska egenskaperna hos jungfruolja innefattar upprättandet av paneler med utvalda och utbildade provsmakare. Den tid som krävs för att upprätta en sådan struktur bör därför fastställas. Med hänsyn till de svårigheter som några medlemsstater kommer att möta när det gäller att upprätta paneler med provsmakare, bör användning av paneler i andra medlemsstater tillåtas.

För att säkerställa att det system med avgifter som tillämpas på import av olivpressrester fungerar på avsett sätt bör en gemensam metod för bestämning av oljehalten i dessa varor fastställas.

För att inte skapa handelshinder bör åtgärder vidtas för att olja som är förpackad innan denna förordning träder i kraft skall kunna avyttras under en begränsad tid.

Det är nödvändigt att upphäva kommissionens förordning (EEG) nr 1058/77(3), senast ändrad genom förordning (EEG) nr 1858/88(4).

Förvaltningskommittén för oljor och fetter har inte yttrat sig inom den tid som dess ordförande har bestämt.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE

Artikel 1

1. Oljor vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkterna 1, 2 och 3 i bilaga 1 till denna förordning skall anses vara jungfruolja enligt innebörden i punkterna 1 a, b och c i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

2. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkt 4 i bilaga 1 till denna förordning skall anses vara bomolja i den mening som avses i punkt 1 d i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

3. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkt 5 i bilaga 1 till denna förordning skall anses vara raffinerad olivolja i den mening som avses i punkt 2 i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

4. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkt 6 i bilaga 1 till denna förordning skall anses vara ren olivolja i den mening som avses i punkt 3 i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

5. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkt 7 i bilaga 1 till denna förordning skall anses vara olivolja av pressrester i den mening som avses i punkt 4 i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

6. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkt 8 i bilaga 1 till denna förordning skall anses vara raffinerad olivolja av pressrester i den mening som avses i punkt 5 i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

7. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkt 9 i bilaga 1 till denna förordning skall anses vara olivolja av pressrester i den mening som avses i punkt 6 i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

Artikel 2

1. Egenskaperna hos de oljor som fastställts i bilaga 1 skall bestämmas i enlighet med de analysmetoder som anges nedan.

- För bestämning av de fria fettsyrorna uttryckta som procent oljesyra, den metod som anges i bilaga 2.

- För bestämning av peroxidindex, den metod som anges i bilaga 3.

- För bestämning av alifatiska alkoholer, den metod som anges i bilaga 4.

- För bestämning av sterolhalten, den metod som anges i bilaga 5.

- För bestämning av erytrodiol och uvaol, den metod som anges i bilaga 6.

- För bestämning av mättade fettsyror i ställning 2 hos triglycerider, den metod som anges i bilaga 7.

- För bestämning av trilinolenhalten, den metod som anges i bilaga 8.

- För spektrofotometri, den metod som anges i bilaga 9.

- För bestämning av fettsyresammansättningen, den metod som anges i bilaga 10 A och 10 B.

- För bestämning av de flyktiga, halogenerade lösningsmedlen, den metod som anges i bilaga 11.

- För utvärdering av de organoleptiska egenskaperna för jungfruolja, den metod som anges i bilaga 12, tillämpad enligt punkt 2.

- För bevis på att raffinering har genomförts, den metod som anges i bilaga 13.

2. Utvärdering av de organoleptiska egenskaperna skall genomföras av en analytiker och om så är tillämpligt med hjälp av en specialist enligt det förfarande som beskrivs i de smakanmärkningar som anges i bilaga 12. Om analysen visar andra egenskaper än dem som erhållits genom beskrivning av produkten skall provet undersökas av en provsmakarpanel enligt bestämmelserna i bilaga 12.

Varje ytterligare analys skall genomföras av panelen enligt dessa bestämmelser.

För att säkerställa de organoleptiska egenskaperna i samband med åtgärder avseende interventionssystemet, skall panelen av provsmakare genomföra denna utvärdering enligt bestämmelserna i bilaga 12.

Artikel 3

Fram till den 31 oktober 1992 skall införandet av de analysmetoder som anges i artikel 2 inte förhindra att medlemsstaterna använder andra beprövade och vetenskapligt giltiga metoder, under förutsättning att produkter som anses uppfylla gällande regler för gemenskapsmetoder skall tillåtas fri rörlighet. Innan andra metoder används skall de berörda medlemsstaterna meddela dessa till kommissionen.

Om någon av de andra metoderna ger ett resultat som skiljer sig från dem som erhålls genom gemenskapsmetoden, skall det resultat som erhålls genom den senare metoden vara avgörande.

Artikel 4

1. För att utvärdera de organoleptiska egenskaperna skall medlemsstaterna upprätta paneler av utbildade och utvalda provsmakare i enlighet med de bestämmelser som fastställs genom den metod som anges i bilaga 12.

2. Om en medlemsstat möter svårigheter i att sätta upp en panel på sitt territorium, får den använda tjänster från en panel som arbetar i en annan medlemsstat.

Artikel 5

Tilläggsanmärkningarna 2, 3 och 4 i kapitel 15 i Kombinerade nomenklaturen ersätts av tilläggsanmärkningarna 2, 3 och 4 som återfinns i bilaga 14.

Artikel 6

1. Oljehalten i oljekakor och andra rester som erhållits vid extraktion av olivolja (KN-nr 2306 90 11 och 2306 90 19) skall bestämmas med användning av den metod som anges i bilaga 15.

2. Den oljehalt som anges i punkt 1 skall uttryckas som viktprocent olja i förhållande till torrsubstans.

Artikel 7

De gemenskapsbestämmelser som rör närvaron av andra oönskade ämnen än de som anges i bilaga 11 skall tillämpas.

Artikel 8

1. Medlemsstaterna skall meddela kommissionen vilka åtgärder de har vidtagit för att genomföra denna förordning.

2. Medlemsstaterna skall till kommissionen i början av varje halvår överlämna en redogörelse av de analysdata som hänför sig till prover som genomförts under det gångna halvåret.

Resultaten skall prövas av Förvaltningskommittén för oljor och fetter i enlighet med förfarandet i artikel 39 i förordning nr 136/66/EEG.

Artikel 9

Förordning (EEG) nr 1058/77 skall upphöra att gälla.

Artikel 10

1. Denna förordning träder i kraft den tredje dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska gemenskapernas officiella tidning. Den metod som anges i bilaga 12 skall emellertid tillämpas från den 1 januari 1992, utom då det gäller åtgärder i samband med interventionssystemet.

2. Denna förordning skall inte tillämpas på olivolja och olivolja av pressrester som är förpackad före denna förordnings ikraftträdande och saluförs fram till och med den 31 oktober 1992.

Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla medlemsstater.

Utfärdad i Bryssel den 11 juli 1991.

På kommissionens vägnar

RAY MAC SHARRY

Ledamot av kommissionen

(1) EGT nr 172, 30.9.1966, s. 3025/66.

(2) EGT nr L 353, 17.12.1990, s. 23.

(3) EGT nr L 128, 24.5.1977, s. 6.

(4) EGT nr L 166, 1.7.1988, s. 10.

BILAGOR

Sammanfattning

Sida

Bilaga 1 Egenskaper hos olivolja 177

Bilaga 2 Bestämning av fria fettsyror 179

Bilaga 3 Bestämning av peroxidvärdet 181

Bilaga 4 Bestämning av halten alifatiska alkoholer med kapillärgaskromatografi 183

Bilaga 5 Bestämning av sammansättningen och halten av steroler genom gaskromatografi med kapillärkolonn 188

Bilaga 6 Bestämning av erytrodiol och uvaol 195

Bilaga 7 Bestämning av fettsyror i 2-ställning i triglycerider 197

Bilaga 8 Bestämning av sammansättningen av trilinolein 201

Bilaga 9 Spektrofotometrisk undersökning 205

Bilaga 10 A Analys av metylestrar av fettsyror med gaskromatografi 208

Bilaga 10 B Preparering av metylestrar av fettsyror i enlighet med rubrikerna 1 och 2 i bilaga 6 till förordning (EEG) nr 72/77 eller till den metod som beskrivs nedan 215

Bilaga 11 Bestämning av halten flyktiga halogenerade lösningsmedel i olivolja 219

Bilaga 12 Organoleptisk värdering av jungfruolja 220

Bilaga 13 Bevis på att raffinering har utförts 245

Bilaga 14 Tilläggsanmärkningar 2, 3 och 4 till kapitel 15 i kombinerade nomenklaturen 247

Bilaga 15 Oljehalt i pressrester av oliver 249

Bilaga 16 Bestämning av jodtal 251

BILAGA 1

EGENSKAPER HOS OLIVOLJA

>Plats för tabell>

>Plats för tabell>

BILAGA 2

BESTÄMNING AV FRIA FETTSYROR

1. BESTÄMNING AV SYRAHALT

Bestämning av fria fettsyror i olivoljor. Halten fria fettsyror uttrycks som syrahalt beräknad på konventionellt sätt.

1.1 Princip

Ett prov löses i en blandning av lösningsmedel och de närvarande fria fettsyrorna titreras med en etanollösning av kaliumhydroxid.

1.2 Reagenser

Alla reagenser bör vara av analyskvalitet och det vatten som används skall vara destillerat eller ha motsvarande renhet.

1.2.1 Dietyleter. 95 % etanol (v/v), blandning av lika volymdelar.

Anm: Dietyleter är en mycket lättantändlig vätska och kan bilda explosiva peroxider. Speciell försiktighet bör iakttas vid användning.

Neutralisera exakt vid användningstillfället med kaliumhydroxidlösningen (1.2.2) med tillsats av 0,3 ml av fenolftaleinlösningen (1.2.3) per 100 ml blandning.

Anm: Om det inte är möjligt att använda dietyleter kan en blandning av lösningsmedel som innehåller etanol och toluen användas. Om så erfordras kan etanolen ersättas av propanol-2.

1.2.2 Kaliumhydroxid, filtrerad etanollösning, c(KOH) ca 0,1 mol/l eller, om nödvändigt c(KOH), ca 0,5 mol/l.

Den exakta koncentrationen hos etanollösningen av kaliumhydroxid måste vara känd och kontrollerad omedelbart före användning. Använd en lösning som gjorts minst fem dagar före användning och dekanterats i en brun glasflaska med gummipropp. Lösningen bör vara färglös eller halmfärgad.

Anm: En stabil färglös lösning av kaliumhydroxid kan framställas på följande sätt: Koka upp 1 000 ml etanol med 8 g kaliumhydroxid och 0,5 g aluminiumspån och fortsätt att koka under återflöde under 1 timme. Destillera lösningen omedelbart. Lös den behövliga mängden kaliumhydroxid i destillatet. Låt lösningen stå i flera dagar och dekantera den klara vätskan från fällningen av kaliumkarbonat.

Lösningen kan också framställas utan destillation på följande sätt: Tillsätt 4 ml aluminiumbutylat till 1 000 ml etanol och låt blandningen stå i flera dagar. Dekantera den klara vätskan och lös den behövliga mängden kaliumhydroxid i den. Lösningen är klar för användning.

1.2.3 Fenolftalein, 10 g/l lösning i 95 till 96 %-ig etanol (v/v) eller alkaliskt blått (då det gäller starkt färgade fetter) 20 g/l lösning i 95 till 96 %-ig etanol (v/v).

1.3 Utrustning

Vanlig laboratorieutrustning som innefattar:

1.3.1 Analysvåg

1.3.2 250 ml E-kolv

1.3.3 10 ml byrett graderad i 0,05 ml

1.4 Utförande

1.4.1 Preparering av provet för analys

Genomför analysen på ett filtrerat prov. Om fukt och föroreningar tillsammans är mindre än 1 % använd provet utan vidare behandling.

1.4.2 Provtagning

Ta ut ett prov beroende på det antagna syratalet i enlighet med följande tabell:

>Plats för tabell>

Väg in provet i E-kolven (1.3.2).

1.4.3 Bestämning

Lös provet (1.4.2) i 50 till 150 ml av den neutraliserade blandningen av dietyleter och etanol (1.2.1).

Titrera under omrörning med 0,1 mol/l lösning av kaliumhydroxid (1.2.2) (se anmärkning 2) tills indikatorn ändrar färg (den röda fenolftaleinfärgen skall bestå under minst 10 sekunder).

Anm 1: Den ställda etanollösningen av kaliumhydroxid (1.2.2) kan ersättas av en vattenlösning av kalium- eller natriumhydroxid under förutsättning att vattenvolymen inte medför fasseparation.

Anm 2: Om den nödvändiga mängden 0,1 molar kaliumhydroxidlösning överstiger 10 ml, använd 0,5-molar lösning.

Anm 3: Om lösningen blir ogenomskinlig under titreringen, tillsätt tillräckligt med lösningsmedel (1.2.1) för att det skall bli en klar lösning.

1.5 Syramängd uttryckt som procent oleinsyra

Syramängden som massprocent motsvaras av:

V × c × >NUM>M/ >DEN>1 000 × >NUM>100/ >DEN>m = >NUM>V × c × M/ >DEN>10 × m

där:

>Plats för tabell>

Det aritmetiska medelvärdet av de två beräkningarna bör bedömas som resultatet.

BILAGA 3

BESTÄMNING AV PEROXIDVÄRDET

1. SYFTE

Denna standard beskriver en metod för bestämning av peroxidvärdet i oljor och fetter.

2. TILLÄMPNINGSOMRÅDE

Denna standard är tillämplig på animaliska och vegetabiliska oljor och fetter.

3. DEFINITION

Peroxidvärdet är den kvantitet av de substanser i provet uttryckta i milliekvivalenter aktivt O2/kg som oxiderar kaliumjodid under de förhållanden som beskrivs.

4. PRINCIP

Behandling av provet i lösning i ättiksyra och kloroform med en lösning av kaliumjodid. Titrering av den frigjorda joden med ställd natriumtiosulfatlösning.

5. UTRUSTNING

All utrustning som skall användas skall vara fri från reducerande eller oxiderande ämnen.

Anm: Smörj inte slipade ytor.

5.1 3 ml glassked.

5.2 Kolvar med slipade halsar och proppar på ca 250 ml, torkade i förväg och fyllda med en torr, ren, inert gas (kväve eller företrädesvis koldioxid).

5.3 25 eller 50 ml byrett graderad i 0,1 ml.

6. REAGENSER

6.1 Kloroform, P. A. som befriats från syre genom att en ström av ren, torr inert gas bubblats igenom den.

6.2 Ättiksyra, P. A. befriad från syre genom att en ström av torr, ren gas bubblats igenom den.

6.3 Kaliumjodid, mättad vattenlösning, nyligen framställd, fri från jod och jodater.

6.4 Natriumtiosulfat 0,01 eller 0,002 N exakt ställd vattenlösning, ställd omedelbart före användning.

6.5 Stärkelselösning, 10 g per liter vattenlösning nyligen framställd av naturlig löslig stärkelse.

7. PROV

Se till att provet tas och bevaras kallt och mörkt i glasbehållare som skall vara helt fyllda, hermetiskt tillslutna med slipade glasproppar eller kork.

8. UTFÖRANDE

Analysen skall genomföras i diffust dagsljus eller artificiellt ljus. Väg in i ett vägglas (5.1) eller om inte detta går i en kolv (5.2) på 0,001 g när, en mängd av provet som överensstämmer med följande tabell enligt det förväntade peroxidvärdet:

>Plats för tabell>

Ta bort proppen från en kolv (5.2) och för in vägglaset som innehåller provet. Tillsätt 10 ml kloroform (6.1). Lös provet snabbt under omrörning. Tillsätt 15 ml ättiksyra (6.2) och sedan 1 ml kaliumjodidlösning (6.3). Sätt snabbt i proppen, skaka om under en minut och låt stå i mörker exakt 5 minuter vid en temperatur mellan 15 och 25 °C.

Tillsätt ca 75 ml destillerat vatten. Titrera den frigjorda joden med natriumtiosulfatlösning (6.4) (0,002 N lösning för förväntade värden som är mindre 12 och 0,01 N lösning för förväntade värden över 12) under omskakning och använd stärkelselösning (6.5) som indikator.

Genomför två bestämningar på samma prov.

Genomför samtidigt ett blindprov. Om resultatet av blindprovet överstiger 0,05 ml av 0,01 N natriumtiosulfatlösning (6.4) ersätt de orena reagenserna.

9. RESULTATANGIVELSE

Peroxidvärdet (PV), uttryckt som milliekvivalenter av aktivt O2/kg erhålls genom följande formel:

PV = >NUM>V × T × 1 000/ >DEN>m

där:

>Plats för tabell>

Som resultat tas det aritmetiska medelvärdet av de två bestämningarna som genomförts.

BILAGA 4

BESTÄMNING AV HALTEN ALIFATISKA ALKOHOLER MED KAPILLÄRGASKROMATOGRAFI

1. SYFTE

Förfarandet beskriver en metod för bestämning av halten alifatiska alkoholer i oljor och fetter.

2. METODENS PRINCIP

Fettämnet med 1-eicosanol tillsatt som standard, förtvålas med kaliumhydroxid i metanol varefter de oförtvålbara ämnena extraheras med etyleter. Alkoholfraktionen separeras från de oförtvålbara ämnena genom kromatografi på ett lager kiselgel impregnerat med kaliumhydroxid. Alkoholerna som återvunnits från kiselgelen överförs till trimetylsilyletrar och analyseras genom kapillär gaskromatografi.

3. UTRUSTNING

3.1 250 ml rundkolv med återflödeskylare och slipningar.

3.2 Separertratt 500 ml.

3.3 Kolvar 250 ml.

3.4 Kromatografitank för tunnskiktskromatografi, för glasplattor med måtten 20 × 20 cm.

3.5 Ultraviolett ljus med en våglängd 366 eller 254 nm.

3.6 Mikrosprutor som kan ge 100 ìl och 500 ìl.

3.7 Glasfiltertratt med porositeten G 3 (porositeten 15-40 ì) är med ca 2 cm diameter och ca 5 cm höjd lämplig för vakuumfiltrering och med >NUM>12/ >DEN>21 hanslipning.

3.8 Vakuumkolv 50 ml med >NUM>12/ >DEN>21 honslipning för användning med filtrertratt (3.7).

3.9 Provrör 10 ml med konisk botten och propp.

3.10 Gaskromatograf för användning med kapillärkolonn och försedd med spaltningssystem som består av:

3.10.1 Termostatstyrd kammare för kolonner (kolonnugn) som kan hålla önskad temperatur med en noggrannhet av ± 1°C.

3.10.2 Termostatförsedd injektordel med silaniserat septum.

3.10.3 Flamjoniseringsdetektor och omformarförstärkare.

3.10.4 Integrerad registreringsenhet för användning med omformarförstärkaren med svarstider som inte överstiger 1 sekund och med variabel pappershastighet.

3.11 Kapillärkolonn av glas eller kvarts, längd 20 till 30 meter, innerdiameter 0,25 till 0,32 mm, med SE-52 eller SE-54 vätskefas eller motsvarande och med en filmtjocklek mellan 0,10 och 0,30 ìm.

3.12 Mikrosprutor för gaskromatografi, 10 ìl med härdad nål.

4. REAGENSER

4.1 Kaliumhydroxid, ca 2 N etanollösning: 130 g kaliumhydroxid (med en lägsta koncentration av 85 %) löses under kylning i 200 ml destillerat vatten som sedan späds till en liter med etanol. Lösningen bör förvaras i en väl tillsluten mörk glasflaska.

4.2 Etyleter, P. A.

4.3 Vattenfritt natriumsulfat, P. A.

4.4 TLC-glasplattor med silikagel, utan fluorescensindikator, med en tjocklek på 0,25 mm (kan köpas färdigställda).

4.5 Kaliumhydroxid, ca 0,2 N etanollösning. 13 g kaliumhydroxid löses i 20 ml destillerat vatten och spädes till en liter med etanol.

4.6 Bensen, för kromatografi (se 5.2.2).

4.7 Aceton, för kromatografi (se 5.2.2).

4.8 Hexan, för kromatografi (se 5.2.2).

4.9 Etyleter, för kromatografi (se 5.2.2).

4.10 Kloroform, för kromatografi.

4.11 Referenslösning för tunnskiktskromatografi: blandning av 5 % C20 till C28 alkoholer i kloroform.

4.12 0,2 % lösning av 2,7-dikloroflourescein i etanol. Denna görs lätt alkalisk genom att tillsätta några droppar 2 N kaliumhydroxidlösning.

4.13 Vattenfri pyridin för kromatografi.

4.14 Hexametyldisilasan.

4.15 Trimetylklorosilan.

4.16 Ställda lösningar av trimetylsilyletrar av alifatiska alkoholer från C20 till C28. De kan framställas av blandningar av rena alkoholer omedelbart innan de skall användas.

4.17 En 0,1 % (m/v) lösning av 1-eicosanol i CHCl3 (inre standard).

4.18 Bärargaser: Väte eller helium, ren för gaskromatografi.

4.19 Supplementerande gaser: väte eller helium, ren för gaskromatografi.

5. UTFÖRANDE

5.1 Preparering av oförtvålbara ämnen

5.1.1 Inför med hjälp av en 500 ìl spruta i en 250 ml rundkolv en volym av 0,1 % 1-eicosanollösning (4.17) som innehåller en kvantitet av 1-eicosanol som ungefärligen motsvarar 10 % av halten alifatiska alkohol i den del av provet som tagits ut för analys. Tillsätt t.ex. 5 gram av provet 250 ìl av den 0,1 % 1-eicosanollösningen om det gäller olivolja eller fröolja och 1 500 ìl om det gäller olivolja av pressrester.

Indunsta till torrhet under en ström av kväve och väg upp exakt 5 g torrt filtrerat prov i kolven.

5.1.2 50 ml 2 N kaliumhydroxidlösning i etanol tillsätts, sätt på återflödeskylare och värm upp apparaten till sakta kokning på ångbad under kontinuerlig omrörning under hela uppvärmningsprocessen tills förtvålning har inträtt (lösningen blir klar). Fortsätt uppvärmningen i ytterligare 20 minuter och tillsätt sedan 50 ml destillerat vatten genom kylaren. Ta sedan bort kylaren och kyl kolven till ca 30 °C.

5.1.3 Innehållet i kolven överförs kvantitativt till en separertratt på 500 ml och sköljs upprepade gånger med destillerat vatten av en mängd som totalt får uppgå till 50 ml. Ca 80 ml etyleter tillsätts, innehållet omskakas kraftigt i 30 sekunder och lämnas sedan att separera (anm 1).

Den undre vattenfasen överförs sedan till en ny separertratt. Ytterligare två extraktioner görs på vattenfasen på samma sätt, varje gång med användning av 60 till 70 ml etyleter.

Anm 1: Emulsioner kan undvikas genom att små kvantiteter etanol eller metanol tillsätts i sprayform.

5.1.4 Etyleterextrakten samlas i en separertratt och tvättas med destillerat vatten (50 ml åt gången) tills tvättvattnet ger neutral reaktion.

Kasta bort vattenfasen, torka med vattenfritt natriumsulfat och filtrera i en kolv på 250 ml som har vägts innan. Tratten och filtret tvättas med små kvantiteter etyleter som läggs till etyleterfasen.

5.1.5 Etern indunstas under försiktig uppvärmning till några ml och torkas under lätt undertryck eller under ström av kväve. Torkningen avslutas i torkskåp vid 100 °C i ca 15 minuter och återstoden vägs sedan den svalnat i exsickator.

5.2 Separering av alkoholfraktionerna

5.2.1 Preparering av TLC-plattor (4.4) sker genom att de nedsänks helt i en 0,2 N kaliumhydroxidetanollösning (4.5) i 10 sekunder och sedan får torka i dragskåp i två timmar, varefter de placeras i ett torkskåp vid 100 °C i en timme.

Plattorna tas ut från torkskåpet och förvaras i exsickatorn med kalciumklorid tills de skall användas. Plattor som behandlas på detta sätt måste användas inom två veckor.

Anm 2: När silicagelplattor används för separation av alkoholfraktionen behöver inte oförtvålbara ämnen behandlas med aluminium. Därav följer att alla syraföreningar (fettsyror och andra) bibehålls i ursprungligt skick, varvid man får både alifatiska alkoholer och terpenalkoholers band som ändå är klart åtskilda från sterolbandet.

5.2.2 En lösning av 95:5 räknat i volym av bensen och aceton införs i utvecklingskammaren till ett djup av ca 1 cm. Alternativt kan en blandning av 65:35 räknat per volym av hexan och etyleter användas. Tanken stängs och får stå minst en halvtimme för att tillåta att jämvikt inträder mellan gas och vätska. Remsor av filtrerpapper som doppas ner i eluanten kan placeras på insidan av tankens ytor för att minska framkallningstiden med ungefär en tredjedel och få en jämnare eluering av komponenterna.

Anm 3: Framkallningslösningen måste ersättas för varje analys för att få reproducerbara framkallningsförhållanden.

5.2.3 En ca 5 % lösning av oförtvålbara ämnen (5.1.5) i kloroform iordningsställs och 0,3 ml av lösningen stryks ut jämnt till minsta möjliga tjocklek med hjälp av en mikrospruta på 100 ìl på en TLC-platta ca 2 cm från dess nederkant. I jämnhöjd med ursprungsprovet placeras 2-3 ìl av referenslösningen med alifatiska alkoholer (4.11) för att man skall kunna känna igen de alifatiska alkoholernas band efter det att framkallningen har genomförts.

5.2.4 Plattan placeras i framkallningstanken som anges i 5.2.2. Temperaturen skall hållas mellan 15 och 20 °C. Tanken stängs omedelbart och provet får eluera tills lösningen har nått ett avstånd av 1 cm från plattans överkant. Plattan tas sedan bort från framkallningstanken och lösningsmedlet får avdunsta i varmluftström eller också placeras plattan en stund i dragskåp.

5.2.5 Plattan sprayas lätt och jämnt med en lösning av 2,7-diklorflourescein. Medan plattan belyses med ultraviolett ljus kan de alifatiska alkoholernas band identifieras genom att de läggs i linje med den fläck som uppstår vid referensupplösningen, och alla de alifatiska alkoholernas band, liksom bandet omedelbart ovanför, som svarar mot triterpenalalkoholerna, markeras med blyerts.

Anm 4: Kravet för grupperingen av de alifatiska alkholernas band och triterpenalkoholernas band tillsammans bestäms av den möjliga övergången av en del alifatiska alkoholer i triterpenalkoholbandet.

5.2.6 Silicagelen i området som är definierat skrapas av med en metallspatel. Det borttagna materialet finfördelas och överförs till en filtrertratt (3.7), 10 ml varm kloroform tillsätts och innehållet blandas väl med hjälp av metallspateln och vakuumfiltreras. Filtratet samlas upp i kolven (3.8) som är ansluten till filtrertratten.

Återstoden i filtrertratten tvättas med 3 x 10 ml etyleter så att filtratet uppsamlas i samma kolv som finns finns på filtrertratten. Filtratet indunstas till en volym på ungefär 4 till 5 ml och den återstående lösningen överförs till ett provrör på 10 ml (3.9) som har vägts i förväg. Provröret torkas genom lätt uppvärmning under en försiktig kvävgasström. Återstoden löses igen med ett par droppar aceton, torkas igen och placeras sedan i torkskåp vid 105 °C i 10 minuter, tas ut och får svalna i exsickator varefter den vägs.

Återstoden i provröret består av alkoholfraktionen.

5.3 Framställning av trimetylsilyletrar

5.3.1 Reagensen för silyleringen, som består av en blandning av 9:3:1 räknat per volym (anm 5) av pyridinhexametyldisalazen-trimetylklorosilan i förhållandet 50 ìl för varje mg alkoholer tillsätts till provröret som innehåller alkoholfraktionen, varvid ingen fukt får absorberas (anm 6).

Anm 5: Lösningar som är klara för användning kan köpas färdiga. Silyneringsreagenser som t.ex. bis-trimetylsilyltriflour-acetamid + 1 % trimetylklorosilan som blandas med samma volym av vattenfri pyridin.

5.3.2 Provröret förses med propp och skakas om försiktigt utan att det vänds, tills alkoholerna har blivit lösliga. De får sedan stå minst 15 minuter vid rumstemperatur och centrifugeras sedan i några minuter. Den klara lösningen är därmed färdig för analys med gaskromatografi.

Anm 6: Eventuell bildning av en svag opalescens är normalt och inverkar inte. Bildandet av en vit flockig fyllning eller rosafärgning är tecken på närvaro av fukt och sönderfall hos reagensen. Om detta inträffar skall provet upprepas.

5.4 Analys med gaskromatografi

5.4.1 Förberedelser och preparering av kapillärkolonnen.

5.4.1.1 Kapillärkolonnen placeras inuti gaskromatografen genom att kolonnens inlopp ansluts till injektorblocket som är ansluten till spaltningssystemet och andra änden av kolonnen till detektorn.

En allmän kontroll av gaskromatografen genomförs (gasanslutningarna skall vara täta, detektorn i fullgott skick, fungerarande spaltningssystem och registreringssystem etc).

5.4.1.2 Kapillärkolonner som används för första gången skall prepareras. En liten mängd bärargas får flyta igenom kapillärkolonnen och sedan kopplas gaskromatografen på och en gradvis upphettning genomförs tills temperaturen är minst 20 °C över drifttemperaturen (se anm 7). Temperaturen bibehålls i minst två timmar och sedan ställs kromatografen iordning för driftförhållanden (inställning av gasflöde, tändning av delningsflamma, anslutning till den elektroniska registreringen, inställning av temperaturen i kapillärkolonnens ugn, detektorn och injektorn) signalen ställs in på en känslighet som är minst två gånger den högsta nivån som beräknas för genomförande av analysen. Baslinjens streck skall vara linjärt, inte ha några spikar oavsett ursprung och inte visa tecken på att driva.

Negativ drift av linjen är tecken på otäta kolonnanslutningar medan en positivt drift tyder på otillräcklig preparering av kolonnen.

Anm 7: Temperaturen vid prepareringen skall vara minst 20 °C lägre än maximitemperaturen som beräknas för den vätskefas som används.

5.4.2 Val av driftförhållanden.

5.4.2.1 Allmänna driftförhållanden är följande:

- kolonntemperatur: startisotermen ställs in vid 180 °C i 8 minuter och programmeras sedan med 5 °C per minut till 260 °C och ytterligare 15 minuter vid 260 °C,

- injektorblockets temperatur: 280 °C,

- detektorns temperatur: 290 °C,

- linjär hastighet för bärargasen: helium 20 till 35 cm/s, väte 30 till 50 cm/s,

- delningsförhållande 1:50 vid 1:100,

- instrumentets känslighet: 4 till 16 gånger högre än minimikänsligheten,

- registreringskänslighet: 1 till 2 mV,

- pappershastighet: 30 till 60 cm/timme,

- kvantitet av det injicerade ämnet: 0,5 till 1 ìl av TMSE-lösning.

Ovanstående förhållanden kan ändras med hänsyn till kolonnkaraktäristiken och gaskromatografen för att kromatogrammen som erhålls skall uppfylla följande:

- alkoholretentionstiden C26 skall vara 18 ± 5 minuter,

- toppen för alkoholen C22 skall vara 80 ± 20 % av hela skalvärdet för olivolja och 40 ± 20 % av hela skalvärdet för fröolja.

5.4.2.2 Att de tidigare nämnda kraven är uppfyllda kontrolleras genom en upprepad injicering av den ställda TMSE-blandningen av alkoholer, och driftförhållandena justeras för att ge bästa resultat.

5.4.2.3 Parametrarna för integrering av topparna skall ställas in så att en korrekt uppskattning av topparnas ytor erhålls.

5.4.3 Utförande av analysen

5.4.3.1 Sug med hjälp av en mikrospruta på 10 ìl upp 1 ìl hexan följt av 0,5 ìl luft och därefter 0,5 till 1 ìl av provlösningen varefter sprutans kolv dras upp för att suga in det som finns i nålen. Nålen förs in genom membranet i insprutningsdelen och efter en till två sekunder sprutas lösningen in snabbt varefter nålen sakta dras ut efter ca 5 sekunder.

5.4.3.2 Registreringen genomförs tills de närvarande alkoholernas TMSE har eluerats totalt. Baslinjen skall alltid motsvara kraven i 5.4.1.2.

5.4.4 Identifiering av toppar

Identifieringen av enstaka toppar genomförs med ledning av retentionstiderna och genom jämförelse med den ställda TMSE-lösningen som analyseras under samma förhållanden.

Ett kromatogram av alkoholifraktionen av en jungfruolja visas i figur 1.

5.4.5 Kvantitativ uppskattning.

5.4.5.1 Toppområdena för 1-eicosanol och de alifatiska alkoholerna C22 till C28 beräknas genom elektronisk integrering.

5.4.5.2 Halten av varje alkohol uttryckt i mg/100 g fettämne beräknas på följande sätt:

alkohol x = >NUM>Ax 7 ms 7 100/ >DEN>As 7 m

där:

>Plats för tabell>

6. RESULTATANGIVELSE

Innehållet av de enskilda alifatiska alkoholerna i mg/100 g fettämne och summan av de totala alifatiska alkoholerna antecknas.

TILLÄGG

Bestämning av den linjära hastigheten hos gasen

1 till 3 ìl metan (eller propan) sprutas in i gaskromatografen under vanliga driftförhållanden, och den tid det tar för metanet eller propanet att passera kolonnen från insprutningsögonblicket till det ögonblick toppen eluerar (tM) mäts med stoppur.

Den linjära hastigheten i cm/s erhålls genom L/tM där L är kolonnens längd i cm och tM är tiden i sekunder som uppmäts med stoppur.

>Hänvisning till >

BILAGA 5

BESTÄMNING AV SAMMANSÄTTNINGEN OCH HALTEN AV STEROLER GENOM GASKROMATOGRAFI MED KAPILLÄRKOLONN

1. SYFTE

Förfarandet beskriver en metod för att bestämma de enskilda och totala sterolhalterna hos fettämen.

2. METODENS PRINCIP

Fettämnet med tillsats av a-kolestanol som en inre standard, förtvålas med kaliumhydroxid i etanollösning och de oförtvålbara ämnena extraheras sedan med etyleter. Sterolfraktionen separeras från det oförtvålbara extraktet genom kromatografi på en basisk kiselgelplatta. Sterolerna som återvunnits från kiselgelen överförs till trimetylsilyletrar och analyseras genom gaskromatografi med kapillärkolonn.

3. UTRUSTNING

3.1 250 ml kolv försedd med återflödeskylare med slipningar.

3.2 500 ml separertrattar.

3.3 250 ml kolvar.

3.4 Komplett apparatur för analys med tunnskiktskromatografi som använder glasplattor 20 × 20 cm.

3.5 Ultraviolett lampa med en våglängd av 366 eller 254 nm.

3.6 Mikrosprutor 100 ìl och 500 ìl.

3.7 En cylindrisk filtrertratt med porositeten G 3 (porositet 15 till 40 ìm) och med en diameter på ca 2 cm, ett djup på 5 cm och försedd med en hanslipning >NUM>12/ >DEN>21 som passar på en vakuumkolv.

3.8 50 ml vakuum-E-kolv med honslipning >NUM>12/ >DEN>21 som kan användas för filtrertratten (3.7).

3.9 10 ml provrör med konisk botten och propp.

3.10 Gaskromatograf lämpad för användning med kapillärkolonn försedd med splitsystem bestående av:

3.10.1 En termostatkammare för kolonner som kan bibehålla önskad temperatur med en noggrannhet av ± 1°C.

3.10.2 En förångningsenhet med inställbar temperatur och försedd med ett förångningselement av glas med försiliniserad yta.

3.10.3 En flamjoniseringsdetektor och omformarförstärkare.

3.10.4 En integrerad skrivare som är lämplig för användning med omformarförstärkare (3.10.3).

3.11 En kapillärkolonn av glas eller kvarts med en längd på 20 till 30 meter, innerdiameter 0,25 till 0,32 mm och helt täckt med SE-52 eller SE-54-vätska eller motsvarande i ett jämnt lager med en tjocklek av mellan 0,10 och 0,30 ìm.

3.12 En 10 ìl mikrospruta för gaskromatografi med härdad kanyl.

4. REAGENSER

4.1 Kaliumhydroxid ungefär 2 N i etanollösning. Lös 130 g kaliumhydroxid (minimihalt 85 %) under kylning i 200 ml destillerat vatten och späd sedan till 1 liter med etanol. Förvara lösningen i väl tillslutna, mörka flaskor (etanol 95 % v/v).

4.2 Etyleter, P. A.

4.3 Vattenfritt natriumsulfat, P. A.

4.4 Glasplattor täckta med kiselgel utan flouresceinsindikator, tjocklek 0,25 mm (finns i handeln färdiga för användning).

4.5 Kaliumhydroxid, 0,2 N i etanollösning. Lös 13 g kaliumhydroxid i 20 ml destillerat vatten och späd till 1 liter med etanol.

4.6 Bensen, för kromatografi (se 5.2.2).

4.7 Aceton, för kromatografi (se 5.2.2).

4.8 Hexan, för kromatografi (se 5.2.2).

4.9 Etyleter, för kromatografi (se 5.2.2).

4.10 Kloroform, P. A. (se 5.2.2).

4.11 Referenslösning för tunnskiktskromatografi: kolesterol eller fytosterol, 5 % lösning i kloroform.

4.12 2.7-diklorflourecein, 0,2 % etanollösning. Denna görs lätt alkalisk genom att tillsätta ett par droppar 2 N alkoholisk kaliumhydroxidlösning.

4.13 Vattenfri pyridin, för kromatografi.

4.14 Hexametyldisilasan.

4.15 Trimetylklorosilan.

4.16 Referenslösning av steroltrimetylsilyletrar. Framställs omedelbart före användning av rena steroler eller blandningar av steroler som erhållits från oljor som innehåller dem.

4.17 á-kolestanol, 0,2 % lösning (m/v) i kloroform (inre standard).

4.18 Bärargas: väte eller helium, ren för gaskromatografi.

4.19 Supplementerande gaser: väte eller helium, ren för gaskromatografi.

5. UTFÖRANDE

5.1 Preparering av oförtvålbara ämnen

5.1.1 Med hjälp av en 500 ìl mikrospruta införs en volym av 0,2 % á-kolestanollösning i kloroform (4.17) som innehåller en mängd á-kolestanol motsvarande ca 10 % sterolhalten i provet som tagits ut för analysen i 250 ml kolv. Exempelvis tillsätts 500 ìl av den 0,2 % á-kolestanollösningen per 5 g prov när det gäller olivolja och 1 500 ìl för fröoljor eller olivoljor av pressrester.

Indunsta till torrhet under en ström av kväve och väg noggrannt upp 5 g av det torra filtrerade provet i samma kolv.

Animaliska eller vegetabiliska oljor och fetter som innehåller uppskattningsbara kvantiteter av kolesterol kan visa en topp med en retentionstid som är samma för kolestanol. Om detta inträffar måste sterolfraktionen analyseras dubbelt med och utan inre standard.

5.1.2 Tillsätt 50 ml 2 N kaliumhydroxid i etanollösning, sätt på återflödeskylaren och värm till svag kokning på vattenbad under kontinuerlig omrörning tills förtvålning inträder (lösningen blir klar). Fortsätt upphettningen under ytterligare 20 minuter, och tillsätt sedan 50 ml destillerat vatten genom återflödeskylaren, ta bort kylaren och kyl kolven till ca 30 °C.

5.1.3 Överför kvantitativt innehållet i kolven till en 500 ml separertratt och skölj upprepade gånger med destillerat vatten av en mängd som totalt får uppgå till 50 ml. Tillsätt ca 80 ml etyleter, skaka omsorgsfullt i ungefär 30 sekunder och låt sedan innehållet separera (anm 1).

Separera av den lägre vattenfasen i en ny separertratt. Genomför ytterligare två extraheringar på vattenfasen på samma sätt med användande av 60-70 ml etyleter vid varje tillfälle.

Anm 1: Eventuell emulsion kan tas bort genom tillsats av små kvantiteter etanol eller metanol i sprayform.

5.1.4 Samla eterextrakten i en separertratt och tvätta med destillerat vatten (50 ml åt gången) tills tvättvattnet ger neutral reaktion.

När tvättvattnet har avlägsnats, torka med vattenfritt natriumsulfat och filtrera på vattenfritt natriumsulfat ner i en i förväg vägd 250 ml kolv, och tvätta därefter tratten och filtret med små mängder etyleter.

5.1.5 Destillera av etern tills endast ett par ml återstår, torka sedan under lätt vakuum eller i en ström av kvävegas och torka sedan helt i ett torkskåp vid 100 °C i ungefär en kvart och väg därefter provet som fått svalna i exsickator.

5.2 Separering av sterolfraktionen

5.2.1 Preparering av plattorna. Sänk ner kiselgelplattorna (4.4) helt i 0,2 N kaliumhydroxidetanollösning (4.5) i 10 sekunder och låt sedan torka i dragskåp i två timmar varefter den placeras i torkskåp vid 100 °C i en timme.

Ta ut plattorna från torkskåpet och förvara dem i en exsickator med kalciumklorid tills de skall användas (plattor som behandlas på detta sätt måste användas inom 15 dagar).

Anm 2: Om kiselelplatta används för att separera serolfraktionen behöver inte de oförtvålbara ämnena behandlas med aluminumoxid. På det här sättet kan alla sura föreningar (fettsyror och andra) behållas på identifieringslinjen och sterolbanden separeras klart från de alifatiska och triterpena alkoholernas band.

5.2.2 Fyll på en 95:5 (v/v) benzen/acetonblandning i framkallningskammaren till ett djup av ca 1 cm. En blandning av 65:35 (v/v) av hexan/etyleter kan också användas. Stäng kammaren med tillhörande lock och låt stå ca en halvtimme för att jämnvikten vätska/gas inställer sig. Remsor av filtrerpapper som doppas ner i eluenten kan placeras på insidorna av kammaren. Detta minskar framkallningstiden med ca en tredjedel och åstadkommer en jämnare eluering av komponenterna.

Anm 3: Framkallningsblandningen skall bytas för varje prov för att få exakt reproducerbara elueringsförhållanden.

5.2.3 Preparera en ca 5 % lösning av oförtvålbara ämnen (5.1.5) i kloroform och stryk ut med hjälp av en 100 ìl spruta på en kromatografiplatta (5.2.1) 0,3 ml ca 2 cm från ena änden i en strykning som är så tunn och jämn som möjligt. Placera i linje med strykningen 2 till 3 ìl av sterolreferenslösningen (4.11) i enda änden av plattan så att sterolbandet kan identifieras efter framkallning.

5.2.4 Placera plattan i framkallningskammaren som preparerats enligt 5.2.2. Genomsnittstemperaturen skall hållas mellan 15 och 20 °C. Stäng kammaren omedelbart med locket och påbörja elueringen tills lösningsmedlets främre kant når till ca 1 cm från övre änden av plattan. Ta bort plattan från framkallningskammaren och låt lösningsmedlet avdunsta i en ström av varmluft eller genom att plattan ligger en kort stund i dragskåp.

5.2.5 Spraya plattan lätt och jämnt med 2,7-diklorofluorosceinlösning. När plattan betraktas i ultraviolett ljus kan sterolbandet identifieras genom att det ligger i höjd med fläcken som har erhållits från referenslösningen. Markera änden av bandet längs kanterna av flouroscensen med svart blyerts.

5.2.6 Skrapa med hjälp av en metallspatel bort silikagelen på det markerade området. Placera det finfördelade materialet som tagits bort i filtrertratten (3.7). Tillsätt 10 ml het kloroform, rör försiktigt med metallspateln och filtrera i vakuum-E-kolven (3.8) som är ansluten till filtrertratten.

Tvätta återstoden i kolven tre gånger med etyleter (ca 10 ml varje gång) och samla filtratet i samma kolv som är ansluten till filtrertratten. Indunsta filtratet till en volym på 4 till 5 ml, överför lösningen till ett vägt 10 ml provrör (3.9), indunsta till torrhet genom lätt uppvärmning i ett försiktigt flöde av kvävgas, lös igen med hjälp av ett par droppar aceton, indunsta igen till torrhet, placera i ett värmeskåp vid 105 °C i ca 10 minuter och låt sedan provet svalna i exsickator och väg det.

Återstoden som finns i provröret består av sterolfraktionen.

5.3 Preparering av trimetylsilyletrar

5.3.1 Tillsätt silyleringsreagensen, som består av 9:3:1 (v/v/v) blandning av pyridin/hexametyldisdilasan/trimetylklorosilan (anm 4) i mängden 50 ìl för varje milligram steroler som finns i provröret som innehåller sterolfraktionen, varvid fukt ska undvikas (anm 5).

Anm 4: Lösningar klara för användning finns att köpa i handeln. Andra silaniseringsreagenser som t ex bis-trimetylsilyl, triflouracetamid + 1 % trimetylklorosilan, som måste spädas med lika stor mängd vattenfri pyridin finns också tillgängliga.

5.3.2 Sätt proppen i provröret, skaka försiktigt (utan att vända på det) tills sterolerna är helt lösta. Låt stå i minst 15 minuter i rumstemperatur och centrifugera sedan i ett par minuter. Den klara lösningen är nu färdig för analys med gaskromatografi.

Anm 5: Eventuell bildning av en svag opalescens är normal och inverkar inte. Bildandet av en vit flockig fyllning eller rosafärgning är tecken på närvaro av fukt och sönderfall hos reagensen. Om detta inträffar skall provet upprepas.

5.4 Analys med gaskromatografi

5.4.1 Förberedelser och iordningsställande av kapillärkolonnen.

5.4.1.1 Kapillärkolonnen placeras inuti gaskromatografen genom att kolonnens inlopp ansluts till injektorblocket som är ansluten till splitsystemet och andra änden av kolonnen till detektorn.

En allmän kontroll av gaskromatografen genomförs (gasanslutningarna skall vara täta, detektorn i fullgott skick, fungerarande splitsystem och registreringssystem etc).

5.4.1.2 Kapillärkolonner som används för första gången skall prepareras. En liten mängd bärargas får flyta igenom kapillärkolonnen och sedan kopplas gaskromatografen på och en gradvis upphettning genomförs tills temperaturen är minst 20 °C över drifttemperaturen (se anm 6). Temperaturen bibehålls i minst två timmar och sedan ställs kromatografen iordning för driftförhållanden (inställning av gasflöde, tändning av delningsflamma, anslutning till den elektroniska registreringen, inställning av temperaturen i kapillärkolonnens ugn, detektorn och injektorn) signalen ställs in på en känslighet som är minst två gånger den högsta nivån som beräknas för genomförande av analysen. Baslinjens streck skall vara linjärt, inte ha några spikar oavsett ursprung och inte visa tecken på att driva.

Negativ drift av linjen är tecken på otäta kolonnanslutningar medan en positivt drift tyder på otillräcklig preparering av kolonnen.

Anm 6: Temperaturen vid prepareringen skall vara minst 20 °C lägre än maximitemperaturen som specificeras för den använda fasen.

5.4.2 Val av driftförhållanden

5.4.2.1 Allmänna driftförhållanden är följande:

- kolonntemperatur: 260 ± 5°C

- injektorblockets temperatur: 280 °C,

- detektorns temperatur: 290 °C,

- linjär hastighet för bärargasen: helium 20 till 35 cm/s, väte 30 till 50 cm/s,

- delningsförhållande 1:50 vid 1:100,

- instrumentets känslighet: 4 till 16 gånger högre än minimikänsligheten,

- registreringskänslighet: 1 till 2 mV,

- pappershastighet: 30 till 60 cm/timme,

- kvantitet av det injicerade ämnet: 0,5 till 1 ìl av TMSE-lösning.

Dessa förhållanden kan varieras beroende på egenskaper hos kolonn och gaskromatograf för att få kromatogram som uppfyller följande krav:

- retentionstiden för ß-sitosterol bör vara 20 ± 5 minuter,

- kampesteroltoppen bör vara: olivolja (medelinnehåll 3 %) 15 ± 5 % av fullt utslag, för sojaolja (medelinnehåll 20 %) 80 ± 10 % av fullt utslag,

- alla närvarande steroler måste separeras. Förutom att topparna måste separeras måste de också återgå helt, dvs varje toppkurva skall återvända till baslinjen innan nästa topp ritas. Ofullständig upplösning kan emellertid tolereras under förutsättning att toppen vid TRR 1,02 kan kvantifieras med hjälp av topphöjden.

5.4.3 Analysförfarande

5.4.3.1 Sug med hjälp av en 10 ìl spruta upp 1 ìl hexan, sug in 0,5 ìl luft och sedan 0,5 till 1 ìl av provlösningen. Drag ut kolven ur sprutan ytterligare så att kanylen töms. Kör in kanylen genom membranet i insprutningsenheten och spruta snabbt efter en till två sekunder in innehållet och drag sedan sakta ut kanylen efter ca fem sekunder.

5.4.3.2 Fortsätt registreringen tills TMSE för de närvarande sterolerna är helt eluerade.

Baslinjen måste fortsätta att uppfylla kraven i 5.4.1.2.

5.4.4 Identifiering av toppar.

Identifiera individuella toppar på grundval av retentionstiderna och genom jämförelse med blandningar av sterol-TMSE som är analyserade under samma förhållanden.

Sterolerna elueras i följande följd: kolesterol, brassikasterol, 24-metylenkolesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Ä 7-kampesterol, Ä 5,23-stigmastadienol, klerosterol, ß-sistosterol, sitostanol, Ä 5-avenasterol, 5,24-stigmastadienol, Ä 7-sigmastenol, Ä 7-avenasterol.

Retentionstiderna för sitosterol för SE-52 och SE-54 kolonner framgår av tabell 1.

Figurerna 1 och 2 visar typiska kromatogram för en del oljor.

5.4.5 Kvantitativ utvärdering

5.4.5.1 Beräkna områdena för á-kolestanol och steroltopparna med hjälp av integratorn. Bortse från toppar för föreningar som inte finns med bland de som är upptagna i tabell 1. Svarskoefficienten för á-kolestanol skall vara lika med 1.

5.4.5.2 Beräkna koncentrationen för varje sterol i mg/100 g fettämne som följer:

sterol x = >NUM>Ax 7 ms 7 100/ >DEN>As 7 m

där:

>Plats för tabell>

6. RESULTATANGIVELSE

6.1 Registrera enstaka sterolkoncentrationer som milligram per 100 g av fettämne och deras summa som totala steroler.

6.2 Beräkna procenttalet för varje enskild sterol ur förhållandet mellan arean av den aktuella toppen till summan av areorna av topparna för steroler.

% av sterol x = >NUM>Ax/ >DEN>ÓA 7 100där:

>Plats för tabell>

TILLÄGG

Bestämning av den linjära hastigheten för gasen

1 till 3 ìl metan (eller propan) sprutas in i gaskromatografen under vanliga driftförhållanden och den tid det tar för metanet (eller propanet) att passera kolonnen från insprutningsögonblicket till det ögonblick toppen eluerar (tM) mäts med stoppur.

Den linjära hastigheten i cm/s erhålls genom L/tM där L är kolonnens längd i cm och tM är tiden i sekunder som uppmäts med stoppur.

>Plats för tabell>

Figur 1 Gaskromatogram för sterolfraktionen hos en oraffinerad olivolja

>Hänvisning till >

>Start Grafik>

>Slut Grafik>

Figur 2 Gaskromatogram för sterolfraktionen hos en raffinerad olivolja

>Hänvisning till >

>Start Grafik>

>Slut Grafik>

BILAGA 6

BESTÄMNING AV ERYTRODIOL OCH UVAOL

INLEDNING

Erytrodiol (som vanligen förstås som glykolerna i erytrodiol och uvaol tillsammans) är en del av den oförtvålbara reaktionen, som tillhör en del typer av fettämnens karaktäristiska. Den kan påvisas i påtagligt högre koncentration i olivolja som extraherats med lösningsmedel än i andra oljor t. ex. pressad olivolja och druvolja som också innehåller den och närvaron av den kan visa närvaron av olivolja som extraherats med lösningsmedel.

1. SYFTE

Förfarandet beskriver en metod för att påvisa erytrodiol i fettämnen.

2. METODENS PRINCIP

Fettämnet förtvålas med en kaliumhydroxid i metanol-etanol-lösning. Den oförtvålbara fraktionen extraheras sedan med etyleter och renas genom passage över en kolonn med aluminumoxid. De oförtvålbara ämnen får sedan genomgå tunnskiktskromatografi på kiselgelplattor till banden som motsvarar sterol- och erytrodiolfraktionerna är separerade.

Sterolerna och erytrodiolerna återvinns från plattan och överförs till trimetylsilyletrar och blandningarna analyseras senare med gaskromatografi.

Resultatet uttrycks som procent erytrodiol i blandningen av erytrodiol och steroler.

3. UTRUSTNING

3.1 Utrustningen som beskrivs i bilaga 5 (bestämning av halten av sterol).

4. REAGENSER

4.1 De reagenser som beskrivs i bilaga 5 (bestämning av halten sterol).

4.2 Referenslösning av erytrodiol, 0,5 % lösning i kloroform.

5. UTFÖRANDE

5.1 Preparering av oförtvålbara ämnen

Som beskrivits i punkt 5.1.2 i bilaga 5.

5.2 Separering av erytrodiol och sterolerna.

5.2.1 Se punkt 5.2.1 i bilaga 5.

5.2.2 Se punkt 5.2.2 i bilaga 5.

5.2.3 Gör iordning en 5 % lösning av de oförtvålbara ämnena i kloroform.

Med hjälp av en 0,1 ml mikrospruta stryks 0,3 ml av lösningen ut på en kromatografiplatta ca 1,5 cm från nedre änden i en strykning som är så tunn och jämn som möjligt. I ena änden av plattan placeras ett par mikroliter av lösningarna av kolesterol och erytrodiol som tjänar som referens.

5.2.4 Placera plattan i framkallningskammaren som iordningsställts enligt 5.2.1. Omgivningstemperaturen bör vara omkring 20 °C. Stäng kammaren omedelbart med locket och låt elueringen fortgå tills lösningsmedlets front når ca 1 cm från övre kanten av plattan. Ta bort plattan från framkallningskammaren och låt lösningsmedlet avdunsta i ett varmt luftflöde.

5.2.5 Spraya plattan lätt och jämnt med den alkoholiska 2,7-dikloroflourosceinlösningen. När plattan betraktas under ultraviolett ljus kan sterol- och erytrodiolbanden identifieras genom att de ligger mitt för sina referenspunkter. Markera med en punkt utanför gränserna för flouroscensen.

5.2.6 Skrapa med hjälp av en metallspatel bort silikagelen på de markerade områdena. Placera materialet från plattan i en 50 ml kolv. Tillsätt 15 ml varm kloroform. Skaka om väl och filtrera genom en glasfiltertratt så att silikagelen överförs till filtret. Tvätta tre gånger med varm kloroform (10 ml varje gång) och samla upp filtratet i en 100 ml kolv. Indunsta filtratet till en volym av 4-5 ml, överför till en kalibrerat 10 ml centrifugrör med konisk botten, torka i en försiktig uppvärmning i kväveström och väg.

5.3 Framställning av trimetylsilylestrar

Som beskrivits i punkt 5.3 i bilaga 5.

5.4 Gaskromatografianalys

Som beskrivits i punkt 5.4 om ovanstående metod.

Driftförhållandena för gaskromatografen i analys måste vara sådana att de går att genomföra sterolanalyser och separera TMSE från erytrodiol och uvaol.

När provets sprutats in, fortsätt registreringen tills de närvarande sterolerna, erytrodiolen och uvaolen har eluerats. Identifiera sedan topparna (retentionstiderna för ertytrodiol och uvaol relativt till ß-sitosterol är ca 1,45 respektive 1,55) och beräkna områdena på samma sätt som för steroler.

6. RESULTATANGIVELSE

erytrodiol i % = >NUM>A1 + A2/ >DEN>A1 + A2 + ÓAsteroler × 100

där:

>Plats för tabell>

Resultatet uttrycks med en decimal.

BILAGA 7

BESTÄMNING AV FETTSYROR I 2-STÄLLNING I TRIGLYCERIDER

1. SYFTE

Den här standarden beskriver en metod för sammansättningen av den fraktion av fettsyror hos en olja eller ett fettämen som förestras i 2-ställning (eller inre ställning) hos glycerolen.

2. TILLÄMPNINGSOMRÅDE

Denna standard kan tillämpas på oljor och fetter som har en smältpunkt under 45 °C beroende på de särskilda omständigheterna som följer av inverkan av pankreatiskt lipas.

Den kan inte tillämpas oreserverat på oljor och fetter som innehåller påtagliga mängder av: fettsyror med 12 eller färre kolatomer (kokosnöt- och palmkärneoljor, smörfett) eller mycket omättade fettsyror (med mer än fyra dubbelbindningar) som innehåller 20 eller flera kolatomer (fiskoljor och andra marina animaliska oljor) eller fettsyror som innehåller andra oxygenerade grupper än syragruppen.

3. PRINCIP

Möjlig neutralisering av sura oljor och fetter i ett lösningsmedel. Rening genom passage över en aluminumoxidkolonn. Delvis hydrolys av triglycerider med pankreatiskt lipas under en bestämd tid. Separation av de bildade monoglyceriderna med tunnskiktskromatografi och metanolys av dessa monoglycerider. Analys av dessa metylestrar genom gas-vätskekromatografi.

4. UTRUSTNING

4.1 100 ml rundkolv.

4.2 25 ml rundkolv med slipning.

4.3 1 m lång luftkylare, som passar i kolven 4.2.

4.4 250 ml E-kolv.

4.5 50 ml bägare.

4.6 500 ml separertratt.

4.7 Glaskolonn för kromatografi, 13 mm innerdiameter, 400 mm lång, försedd med porös glasskiva och kran.

4.8 10 ml centrifugrör med slipad glaspropp.

4.9 5 ml byrett graderad i 0,05 ml.

4.10 1 ml injektionsspruta försedd med en tunn kanyl.

4.11 Mikrospruta som kan ge droppar på 3 till 4 ìl.

4.12 Utstrykare för tunnskiktskromatografi.

4.13 Glasplattor för tunnskiktskromatografi, 20 × 20 cm.

4.14 Framkallningstank av glas för tunnskiktskromatografi, med slipat glaslock, lämplig för plattor, med måtten 20 × 20 cm.

4.15 Spray för tunnskiktskromatografi.

4.16 Torkskåp för 103 ± 2°C.

4.17 Termostat som kan ställas in mellan 30 och 45 °C med en noggrannhet på 0,5 °C.

4.18 Rotationsförgängare.

4.19 Elektrisk skakapparat som tillåter kraftig omskakning av centrifugröret.

4.20 Ultraviolett lampa för undersökning av tunnskiktsplattorna.

För kontroll av lipasaktiviteten:

4.21 pH-meter.

4.22 Spiralomrörare.

4.23 5 ml byrett.

4.24 Stoppur.

För eventuell framställning av lipas:

4.25 Laboratorieomrörare, lämplig för dispergering och blandning av heterogena material.

5. REAGENSER

5.1 N-hexan, eller om detta inte finns, lättbensin (kokpunkt 30 till 50 °C) kromatografikvalitet.

5.2 2-propanol, eller etanol, 95 % (v/v) P. A.

5.3 2-propanol, eller etanol, 1/1 vattenlösning.

5.4 Dietyleter fri från peroxider.

5.5 Aceton.

5.6 Myrsyra, minst 98 % (m/m).

5.7 Lösningsmedel för framkallning: blandning av n-hexan (5.1), dietyleter (5.4) och myrsyra (5.6) i proportionerna 70/30/1 (v/v/v).

5.8 Aktiverad aluminumoxid för kromatografi, neutral, enligt Brockmann 1.

5.9 Kiselpulver, med bindemedel, av lämplig kvalitet för tunnskiktskromatografi.

5.10 Pankreatiskt lipas av lämplig kvalitet (anm 1 och 2).

5.11 Natriumhydroxid, 120 g/l vattenlösning.

5.12 Saltsyra, vattenlösning 6 N.

5.13 Kalciumklorid (CaCl2), 220 g/l vattenlösning.

5.14 Natriumkolat (enzymkvalitet) 1 g/l vattenlösning.

5.15 Buffertlösning: 1 M vattenlösning av tri-hydroxymetylaminometan som ställs till pH 8 genom tillsats av saltsyra (5.12) (kontrolleras med potentiometer).

5.16 Fenolftalin, 10 g/l lösning i 95 % (v/v) etanol.

5.17 2,7-dikloroflourescein, 2 g/l lösning i 95 % (v/v) etanol, som gjorts lätt alkalisk genom tillsats av en droppe 1 N natriumhydroxidlösning per 100 ml.

För kontroll av lipasaktiviteten:

5.18 Neutraliserad olja.

5.19 Natriumhydroxid, 0,1 N vattenlösning.

5.20 Natriumkolat (enzymkvalitet), 200 g/l vattenlösning.

5.21 Gummi arabicum, 100 g/l vattenlösning.

6. PREPARERING AV PROVET

Om provet har en syrahalt under 3 %, bestämd enligt bilaga 2, kan det renas direkt över aluminumoxid enligt 6.2.

Om provet har en syrahalt över 3 %, bestämd enligt bilaga 2, neutraliseras med alkali vid närvaro av lösningsmedel enligt 6.1 för passagen över aluminumoxid enligt 6.2.

6.1 Neutralisering med alkali vid närvaro av lösningsmedel

Häll 10 g av den råa oljan i en separertratt (4.6) och tillsätt 100 ml hexan (5.1), 50 ml av 2-propanol (5.2), ett par droppar fenolftalinlösning (5.16) och en mängd av natriumhydroxidlösningen (5.11) som motsvarar de fria syrorna i oljan plus 0,3 % i överskott.

Skaka ordentligt i en minut, tillsätt 50 ml destillerat vatten, skaka igen och låt stå.

Efter separering, tappa av såplagret i botten. Ta också bort andra mellanlager (t ex olösliga ämnen). Tvätta hexanlösningen som innehåller den neutraliserade oljan med 25 till 30 ml portioner av 2-propanollösningen (5.3) tills den rosa färgen från fenolftalin försvinner.

Ta bort det mesta av hexanen genom destillation under vakuum i den roterande injektorblocket (4.18). Torka oljan vid 30 till 40 °C under vakuum med hjälp av en ström av rent kväve tills hexanet avlägsnats helt och hållet.

6.2 Rening genom aluminumoxid

Gör iordning en suspension av 15 g aktiverat aluminumoxid (5.8) i 50 ml hexan (5.1) och häll den under omrörning i kromatografikolonnen (4.7).

Låt aluminumoxidet sätta sig jämnt och låt lösningsmedelsnivån falla till mellan 1 och 2 mm ovanför absorbentlagret. Häll försiktigt lösningen av 5 g olja i 25 ml hexan (5.1) i kolonnen och samla sedan ihop allt från kolonnen i rundkolv (4.1).

7. PREPARERING AV KROMATOGRAFIPLATTOR

Rengör omsorgsfullt glasplattorna (4.13) med etanol, lättbensin och aceton för att ta bort varje spår av fettämnen.

Häll upp 30 g kiselpulver (5.9) i en E-kolv (4.4). Tillsätt 60 ml destillerat vatten. Sätt i proppen och skaka omsorgsfullt i en minut. Överför omedelbart suspensionen till utstrykaren (4.12) och täck de rena plattorna med ett lager som är 0,25 mm tjockt.

Lufttorka plattorna i 15 minuter och sedan i en timme i torkskåpet (4.16) vid 103 ± 2°C.

Låt plattorna svalna i exsickator till rumstemperatur för användning.

Färdigställda plattor finns tillgängliga i handeln.

8. UTFÖRANDE

8.1 Hydrolys med pankreatiskt lipas

Väg upp ca 0,1 g av det färdigställda provet i ett centrifugrör (4.8). Om provet är fett i fast form lös upp i 0,2 ml hexan, under lätt uppvärmning om så behövs.

Tillsätt 20 ml lipas (5.10) och 2 ml av buffertlösningen (5.15). Skaka om ordentligt men försiktigt och tillsätt 0,5 ml av natriumkolatlösningen (5.14) och 0,2 ml av kalciumkloridlösningen (5.13). Förslut provröret med den slipade proppen, skaka försiktigt (se till att proppen inte blöts) och placera sedan röret omedelbart i termostaten (4.17) som hålls vid 40 ± 0,5 °C och skaka för hand under exakt en minut. Ta bort röret från termostaten och blanda omsorgsfullt med hjälp av en elektrisk skakapparat (4.19) i exakt två minuter. Kyl omedelbart i rinnande vatten. Tillsätt 1 ml saltsyra (5.12) och 1 ml dietyleter (5.4). Sätt i proppen och blanda omsorgsfullt med hjälp av en elektrisk skakapparat. Låt stå och ta bort det organiska lagret med hjälp av en spruta (4.10) om så behövs efter centrifugering.

8.2 Separering av monoglyceriderna genom tunnskiktskromatografi

Placera extraktet på kromatografiplattan med hjälp av mikrosprutan (4.11) ca 1,5 cm från nedre kanten i en tunn jämn sträng, så smal som möjligt. Placera plattan i den väl mättade framkallningstanken (4.14) och framkalla med framkallningslösningsmedel (5.7) vid 20 °C upp till ca 1 cm från övre änden av plattan.

Lufttorka plattan i samma temperatur som tanken har och spraya den 2,7-dikloroflourosceinlösning (5.17). Identifiera monoglyceridernas band (Rf ca 0,035) under ultraviolett ljus (4.20).

8.3 Analys av monoglyceriderna genom gas- vätskekromatografi

Ta bort bandet som erhållits i 8.2 med hjälp av en spatel (undvik att ta bort komponenter som stannat på baslinjen) och överför till metyleringskolven (4.2).

Behandla den uppsamlade kiseln direkt med de metoder som beskrivits i punkt 4.2 i bilaga 10 B för att överföra monoglyceriderna till metylestrar, och undersök sedan estrarna med gaskromatografi som beskrivits i bilaga 10 A.

9. RESULTATANGIVELSE

Beräkna fettsyresammansättningen i 2-ställning med en decimal (anm 3).

10. ANMÄRKNINGAR

Anm 1: Kontroll av lipasets aktivitet.

Preparera en oljeemulsion genom att skaka en blandning av 165 ml av lösningen av gummi arabicum (5.21), 15 g krossad is och 20 ml av en neutraliserad olja (5.18) i en lämplig skakapparat.

Placera 10 ml av denna emulsion i en bägare (4.5) följt av 0,3 ml av natriumkolatlösningen (5.20) och sedan 20 ml destillerat vatten. Sätt bägaren på en termostat vid 37 ± 0,5 °C (anm 4). Sänk ner elektroderna till en pH-meter (4.21) och en spiralomrörare (4.22). Tillsätt med hjälp av en byrett (4.23) droppvis natriumhydroxidlösning (5.19) tills pH går upp till 8,5.

Tillsätt en tillräcklig mängd av vattensuspensionen med lipas (se nedan). Så snart pH-metern visar ett pH på 8,3 startas stoppuret (4.24) och droppa i natriumhydroxidlösningen (5.19) i en sådan takt att pH bibehålls vid 8,3. Läs av volymen förbrukad alkali varje minut.

Rita upp avläsningarna i form av en kurva med användande av tiden som abskissa och antal ml alkalilösning som gått åt för att bibehålla konstant pH som ordinata.

En rät linje bör erhållas.

Lipassuspensionen som angivits ovan är en 1:1 000 (m/m) suspension i vatten. För varje prov bör tillräckligt med denna suspension användas så att ca 1 ml av alkalilösningen förbrukas på fyra till fem minuter.

Vanligen behövs 1 till 5 mg av pulvret.

Lipasenheten definieras som mängden enzym som kommer att frigöra 10 mikroekvivalenter syra per minut. Då erhålls aktiviteten A av det pulver som använts, mätt i lipasenheter per mg genom formeln:

A = >NUM>V × 10/ >DEN>m

där:

>Plats för tabell>

Anm 2: Preparering av lipasen

Lipaser som har tillräcklig lipasaktivitet finns tillgängliga i handeln. Det är också möjligt att framställa dem i laboratoriet på följande sätt:

Kyl 5 kg färsk svinpankreas till 0 °C. Ta bort det omgivande fettet och anslutande vävnad och kör det i en mixer så att en pasta erhålles. Rör pastan med omröraren (4.25) i 4 till 6 timmar med 2,5 l av vattenfri aceton och centrifugera sedan. Extrahera återstoden tre gånger till med samma mängd aceton, och sedan två gånger med 1:1 (v/v) blandning av aceton och dietyleter och därefter två gånger med dietyleter.

Torka återstoden i vakuum i 48 timmar så att ett stabilt pulver erhålls. Detta skall lagras i kylskåp.

Anm 3: I samtliga fall är det tillrådligt att bestämma sammansättningen av de totala fettsyrorna i samma prov, eftersom jämförelse med dessa i syror i 2-ställning kommer att vara till hjälp vid tolkningen av de kurvor som erhålls.

Anm 4: Temperaturen för hydrolysen ställs in vid 37 °C om en olja i vätskeform används. Den ställs emellertid på 40 °C för provet för att tillåta undersökning av fetter med smältpunkter upp till 45 °C.

BILAGA 8

BESTÄMNING AV SAMMANSÄTTNINGEN AV TRILINOLEIN

1. SYFTE

Bestämning av sammansättning av triglycerider i olivoljor i förhållande till deras motsvarande antal kolatomer genom högeffektiv vätskekromatografi (HPLC).

I denna standard beskrivs en metod för separering och kvantitativ bestämning av triglyceridsammansättningen i vegetabiliska oljor i förhållande till deras molekylvikter och hur omättade de är, som en funktion av deras motsvarande antal kolatomer (se anm 1).

2. TILLÄMPNINGSOMRÅDE

Denna standard är tillämplig på alla vegetabiliska oljor som innehåller triglycerider av fettsyror med långa kedjor. Metoden är speciellt lämpad för bestämning av närvaron av små kvantiteter av halvtorkande oljor (med hög halt av linolsyra) i vegetabiliska oljor som innehåller oljesyra som den övervägande omättade fettsyran, t. ex. olivolja.

3. PRINCIP

Separation av triglycerider enligt deras antal kolatomer genom HPLC (omvänd faspolaritet) och tolkning av kromatogrammen.

4. UTRUSTNING

4.1 HPLC-kromatograf, med möjlighet till termostatkontroll av kolonntemperaturen.

4.2 Insprutningsenhet för 10 ìl.

4.3 Detektor: Differentialrefraktometer. Känslighet vid fullt skalutslag bör vara minst 10 4 enheter av refraktionsindex.

4.4 Kolonn: Rostfritt rör 250 mm långt och med innerdiametern 4,5 mm, fyllt med kiselkorn med 5 ìm diameter med 22 till 23 % kol i form av oktadekylsilan (anm 2).

4.5 Registreringsenhet och/eller integreringsenhet.

5. REAGENSER

Reagenserna bör vara av analysren kvalitet. Elueringslösningsmedlen bör vara avgasade, och kan återvinnas flera gånger utan inverkan på separeringarna.

5.1 Kloroform.

5.2 Aceton.

5.3 Acetonitril.

5.4 Elueringslösningsmedel: Acetontitril + aceton (proportionerna mellan dessa kan justeras för att få önskad separering, börja med blandningen 50:50).

5.5 Lösningsgörande lösningsmedel: Aceton eller en blandning av 1:1 aceton-kloroform.

5.6 Referenstriglycerider: Antingen kan triglycerider som finns i handeln användas (tripalmitin, triolein, osv) och retentionstiderna plottas i enlighet med motsvarande antal kolatomer, eller alternativt ett referenskromatogram som erhållits ur sojaolja (se anm 3 och 4 och fig 1 och 2).

6. PREPARERING AV PROVEN

En 5 % lösning av proven som skall analyseras iordningställs genom att väga in 0,5 ± 0,001 g av provet i en 10 ml mätkolv och späda till 10 ml med det lösningsgörande lösningsmedlet (5.5).

7. UTFÖRANDE

7.1 Sätt upp kromatografisystemet. Pumpa elueringslösningsmedel (5.4) med en hastighet av 1,5 ml/min så att hela systemet rengörs. Vänta tills en stabil baslinje erhålls.

Injicera 10 ìl av provet som preparerats enligt punkt 6.

8. RESULTATANGIVELSE

Använd den interna standardiseringsmetoden, dvs antag att summan av areorna av topparna som motsvarar de olika triglyceriderna är lika med 100 %.

Beräkna den relativa procenten av varje glycerid enligt formeln:

% triglycerid = >NUM>toppens area/ >DEN>summan av areorna av topparna × 100

Resultatet anges med en decimal.

Anm 1: Elueringsordningen kan bestämmas genom att beräkna motsvarande antal kolatomer som ofta definieras av förhållandet ECN = CN 2n, där CN är antalet kolatomer och n är antalet dubbelbindningar.

Den kan beräknas mera exakt genom att hänsyn tas till dubbelbindningarnas ursprung.

Om n0, n1 och n1n är antalet dubbelbindningar som överförs till olinsyra, linolsyra och linolensyra kan motsvarande antal kolatomer beräknas som ett förhållanden genom formeln:

ECN = CN d0n0 d1n1 d1an1a

där koefficienterna d0,d1 och d1n kan beräknas med hjälp av referenstriglycerider. Under de förhållanden som anges i denna metod kommer det förhållandet som erhålls att vara nära:

ECN = CN [2,60n0] [2,35n1] [2,17n1n]

Anm 2: Exempel: Lichrosorb (Merck) RP 18, artikel 50333.

Lichrosphere (Merck) 100 CH18, artikel 50377, eller liknande.

Anm 3: Med flera referenstriglycerider är det också möjligt att beräkna upplösningen i fråga om triolein,

á = RT'/RT'olein.

Genom användning av den reducerade retentionstiden RT' = RT - RT lösningsmedel.

Kurvan av log á mot f (antal dubbelbindningar) gör det möjligt att bestämma återgångsvärdena för alla triglycerider i fettsyror som innehåller referenstriglyceriderna - se figur 2.

Anm 4: Effektiviteten hos kolonnen bör tillåta klar separering av trilinolentoppen (LLL) från topparna hos de triglycerider som har en näraliggande RT.

Figur 1 Kromatogram av ett prov på sojaolja

>Hänvisning till >

>Start Grafik>

>Slut Grafik>

Figure 2 Kurva för log a mot f (antal dubbelbindningar)

>Hänvisning till >

>Start Grafik>

>Slut Grafik>

BILAGA 9

SPEKTROFOTOMETRISK UNDERSÖKNING

INLEDNING

Spektrofotometrisk undersökning i ultraviolett ljus kan ge information om kvalitet på fett, dess grad av konservering och förändringar som inträffar i dem beroende på tekniska processer.

Absorptionen vid våglängderna som anges i metoden beror på närvaron av konjugerade dien- och triensystem. Dessa absorptioner uttrycks som specifika extinktioner E 1 % 1 cm (extinktionen av 1 % lösning av fettet i ett givet lösningsmedel med en tjocklek av 1 cm som konventionellt anges genom K (även kallad extinktionskoefficienten).

1. SYFTE

Förfarandet beskriver en metod för genomförande av spektrofotometrisk undersökning av fetter i ultraviolett ljus.

2. PRINCIP

Fettet i fråga löses i den behövliga mängden lösningsmedel och extinktionen hos lösningen bestäms sedan vid de angivna våglängderna med rent lösningsmedel som referens. Specifika extinktioner beräknas ur spektrofotometervärdena.

3. UTRUSTNING

3.1 En spektrofotometer för mätning av extinktion vid ultraviolettområdet mellan 220 och 360 nm med möjlighet till att avläsa enstaka nanometriska enheter.

3.2 Rektangulära quartzkuvetter med lock och med en optisk längd av 1 cm. När de är fyllda med vatten eller annat lämpligt lösningsmedel bör kuvetterna inte skiljas åt mer än 0,01 extinktionsenheter.

3.3 25 ml mätkolvar.

3.4 Kromatografikolonn med en längd av 450 mm och en diameter av 35 mm med ett utloppsrör som har en diameter av ca 10 mm.

4. REAGENSER

4.1 Spektrografren iso-oktan (2,2,4-trimetylpentan). Med destillerat vatten som referens skall denna ha en genomsläpplighet av minst 60 % vid 220 nm och minst 95 % vid 250 nm, eller

- spektrografren cyklohexan. Med destillerat vatten som referens bör denna ha en genomsläpplighet av minst 40 % vid 220 nm och minst 95 % vid 250 nm, eller

- något annat lämpligt lösningsmedel som helt kan lösa fettet (t.ex. etanol för ricinolja).

4.2 Aluminumoxid för kolonnkromatografi som är iordningsställd och kontrollerad som beskrivits i bilaga 1.

4.3 N-hexan för kromatografi.

5. UTFÖRANDE

5.1 Provet i fråga måste vara helt homogent och utan misstänkta föroreningar. Oljor som är flytande vid den omgivande temperaturen skall filtreras genom papper vid en temperatur av ca 30 °C, hårdare fetter skall homogeniseras och filtreras vid en temperatur på högst 10 °C över smältpunkten.

5.2 Väg exakt in ungefär 0,25 g av provet som iordningsställts på detta sätt i en 25 ml mätkolv, späd till märket med det angivna lösningsmedlet och homogenisera. Den resulterande lösningen måste vara helt klar. Vid opalesens filtreras lösningen genom papper.

5.3 Fyll en kuvett med den erhållna lösningen och mät extinktionen vid en lämplig våglängd mellan 232 och 276 nm, med användande av lösningsmedlet som referens.

Extinktionsvärdena som antecknas måste ligga inom området 0,1 till 0,8. Om de inte gör detta måste mätningarna göras om och mera koncentrerad eller mera utspädd lösning måste användas.

5.4 När en bestämning av den specifika extinktionen krävs efter passage över aluminiumoxid, görs det på följande sätt. Placera 30 g aluminumoxid i suspension i hexan i kromatografikolonnen. Sedan adsorbenten har satt sig, ta bort överskottet av hexan ned till ca 1 cm ovanför aluminumoxidets övre yta.

Lös 10 g av fettet, homogeniserat och filtrerat som beskrivits i 5.1, i 100 ml hexan och häll lösningen i kolonnen. Samla upp eluatet och indunsta allt lösningsmedel i vakuum vid en temperatur under 25 °C.

Fortsätt därefter omdelbart som angivits i 5.2 med användande av det fett som erhållits.

6. RESULTATANGIVELSE

6.1 Anteckna de specifika extinktionerna (extinktionskoefficienterna) vid de olika våglängderna och beräkna på följande sätt:

Kë = >NUM>Eë/ >DEN>c 7 s

där:

>Plats för tabell>

Resultaten uttrycks med två decimaler.

6.2 Spektrofotometrisk analys av olivolja enligt den officiella metoden i EEG:s förordningar anges bestämning av den specifika extinktionen i iso-oktanlösning vid våglängderna 232 och 270 nm och bestämning av Ä K som ges genom:

ÄK = Km - >NUM>Km - 4 + Km + 4/ >DEN>2

där Km är den specifika extinktionen vid våglängden m, våglängden för maximal absorbtion runt 270 mm.

TILLÄGG I

Preparering av aluminumoxid och provning av dess aktivitet

A.1.1 Preparering av aluminumoxid

Placera aluminumoxidet som har torkats i en ugn vid 380 till 400 °C i tre timmar i en hermetiskt sluten behållare, sätt till destillerat vatten i förhållandet 5 ml per 100 g aluminumoxid, stäng behållaren omedelbart, skaka flera gånger och låt stå i minst 12 timmar före användning.

A.1.2 Kontroll av aluminumoxidets aktivitet

Gör i ordning en kromatografikolonn med 30 g aluminumoxid. Gör på samma sätt som beskrivits i punkt 5.4 och låt en blandning som består av

- 95 % jungfruolja med en specifik extinktion på mindre än 0,18 vid 268 nm

- 5 % jordnötsolja som behandlats med jord i raffineringsprocessen och som har en specifik extinktion av minst 4 vid 268 nm

passera genom kolonnen.

Om blandningen sedan den passerat kolonnen har en specifik extinktion av mer än 0,11 vid 268 nm kan aluminumoxidet accepteras, om inte måste dehydreringsnivån ökas.

TILLÄGG II

Kalibrering av fotospektrometer

A.2 Utrustningen måste kontrolleras med jämna mellanrum (minst var sjätte månad) både beträffande våglängderna och noggrannheten hos svaret.

A.2.1 Våglängden kan kontrolleras med användning av kvicksilvergaslampa eller med hjälp av lämpliga filter.

A.2.2 För att kontrollera svaret från fotocellen och fotomultiplikatorn gör på följande sätt: Väg in 0,2 g ren kaliumkromat för spektrofotometri och lös detta i 0,05 N kaliumhydroxidlösning i en 1 000 ml mätkolv och späd till märket. Ta ut exakt 25 ml av lösningen, överför det till en 500 ml mätkolv och späd upp till märket med samma kaliumhydroxidlösning.

Mät extinktionen hos lösningen vid 275 nm med användning av kaliumhydroxidlösningen som referens. Den uppmätta extinktionen med användande av 1 cm kuvett bör vara 0,200 ± 0,005.

BILAGA 10 A

ANALYS AV METYLESTRAR AV FETTSYROR MED GASKROMATOGRAFI

1. SYFTE

Denna metod ger allmänna riktlinjer för tillämpning av gaskromatografi med användning av packade kolonner eller kapillärkolonner för att bestämma den kvalitativa och kvantitativa sammansättning av en blandning av fettsyremetylestrar som erhållits i enlighet med den metod som anges i bilaga 10 B.

Metoden är inte tillämplig på polymeriserade fettsyror.

2. REAGENSER

2.1 Bärargas

Inert gas (kväve, helium, argon, väte osv) som är omsorgsfullt torkad och med en syrehalt som är mindre än 10 mg/kg.

Anm 1: Väte, som endast används som bärargas i kapillärkolonner, kan fördubbla analyshastigheten men är farlig. Säkerhetsanordningar finns att tillgå.

2.2 Supplementerande gaser

2.2.1 Väte (renhet ≥ 99,9 %) fri från organiska föroreningar.

2.2.2 Luft eller syre fri från organiska föroreningar.

2.3 Standard för referens

En blandning av metylestrar av rena fettsyror eller metylestrar av ett fett av känd sammansättning, företrädesvis liknande det fett som skall analyseras.

Försiktighet skall iakttas för att förhindra oxidation av fleromättade fettsyror.

3. UTRUSTNING

De anvisningar som ges här avser vanlig utrustning som används för gaskromatografi, som använder packade kolonner eller kapillärkolonner och en flamjoniseringsdetektor. Vilken apparatur som helst som ger effektiviteten och upplösningen som anges i 4.1.2 är lämplig.

3.1 Gaskromatograf

Gaskromatografen skall bestå av följande enheter.

3.1.1 Insprutningssystem

Använd ett insprutningssystem

a) med packade kolonner med minsta möjliga dödutrymme (i det här fallet skall insprutningssystemet kunna upphettas till en temperatur som är 20 till 50 °C högre än kolonnens, eller

b) med kapillärkolonner, varvid insprutningssystemet skall vara speciellt konstruerat för användning med sådana kolonner. Injektorn kan vara med eller utan split.

Anm 2: Vid frånvaro av fettsyror med minst 16 kolatomer kan ett insprutningssystem med rörlig nål användas.

3.1.2 Ugn

Ugnen skall kunna värma kolonnen till en temperatur av minst 260 °C och upprätthålla den önskade temperaturen inom 1 °C med packad kolonn och inom 0,1 °C med kapillärkolonn. Det senaste kravet är särskilt viktigt när kvartsrör används.

Användning av temperaturprogrammerad uppvärmning rekommenderas i alla fall och särskilt för fettsyror med mindre än 16 kolatomer.

3.1.3 Packad kolonn

3.1.3.1 En kolonn som är tillverkad av ett material som är inert mot de ämnen som skall analyseras (dvs glas eller rostfritt stål och som har följande dimensioner:

a) längd: 1 till 3 m. En relativt kort kolonn bör användas om fettsyror med långa kedjor (längre än C20) finns närvarande. I analys av fettsyror med 4 eller 6 kolatomer rekommenderas att en kolonn på 2 m i längd används.

b) innerdiameter: 2 till 4 mm.

Anm 3: Om fleromättade komponenter med fler än 3 dubbelbindningar finns närvarande kan de sönderdelas i en kolonn av rostfritt stål.

Anm 4: Ett system med dubbla packade kolonner kan användas.

3.1.3.2 Fyllning, sammansatt av följande element

a) bärare: syratvättad och silaniserad kiselgur, eller annan lämplig inert bärare med en kornstorlek med liten avvikelse (25 ìm inom gränserna 125 till 200 ìm) varvid genomsnittskornstorleken skall avpassas efter innerdiametern och längden på kolonnen.

b) stationär fas: polyestertyp av polar vätska (t.ex. dietylenglykolpolysuccinat, butandiolpolysuccinat, etylenglykolpolyadipat, osv) cyanosilikoner eller någon annan vätska som tillåter den behövliga kromatografiska separationen (se punkt 4). Den stationära fasen bör uppgå till 5 till 20 % (m/m) av fyllningen. En ickepolar stationär fas kan användas för vissa separationer.

3.1.3.3 Preparering av kolonnen

Om möjligt tas kolonnen bort från detektorn, ugnen upphettas stegvis till 185 °C och en ström av inert gas blåses igenom den nybehandlade kolonnen med en hastighet av 20 till 60 ml per minut i åtminstone 16 timmar vid denna temperatur och under ytterligare två timmar vid 195 °C.

3.1.4 Kapillärkolonn

3.1.4.1 Rör som är tillverkade av ett material som är inert för ämnen som skall analyseras (vanligen glas eller kvarts). Innerdiametern skall vara mellan 0,2 och 0,8 mm. Den inre ytan skall genomgå en lämplig behandling (t ex ytpreparering, inaktivering) innan den får täckning av den stationära fasen. En längd på 25 mm är tillräcklig i de flesta fall.

3.1.4.2 Stationär fas, vanligen av typen polyglykol [poly(etylenglykol) 20 000], polyester (butandiol polysuccinat) eller polärpolysiloxan (cyanosilikoner). Tvärbundna kolonnfyllningar är lämpliga.

Anm 5: Det finns en risk att polära polysiloxaner ger upphov till svårighet att identifiera och separera linolensyra och C20-syror.

Beläggningen skall vara tunn, dvs 0,1 till 0,2 ìm.

3.1.4.3 Sammansättning och konditionering av kolonnen

Följ de normala försiktighetsåtgärderna för att sätta ihop kapillärkolonnerna, dvs placeringen av kolonnen i ugnen (bärare) val och sammansättning av skarvar (läckaget) placering av kolonnens in- och utlopp i injektorn och detektorn (minskning av dödutrymmen). Placera kolonnen i en ström av bärargas [t.ex. 0,3 bar (30 kPa) för en kolonn med längden 25 mm och en innerdiameter på 0,3 mm].

Behandla kolonnen genom temperaturprogrammering av ugnen till 3 °C/minut från omgivningstemperaturen till en temperatur som är 10 °C under sönderfallsgränsen för den stationära fasen. Håll ugnen vid denna temperatur i en timme, tills baslinjen har stabiliserats. Gå tillbaka till 180 °C för att arbeta under isoterma förhållanden.

Anm 6: Lämpliga förbehandlade kolonner finns tillgängliga i handeln.

3.1.5 Detektor som lämpligen skall kunna värmas upp till en temperatur som ligger ovanför kolonntemperaturen.

3.2 Sprutor

Sprutorna skall ha en maximivolym av 10 ìl och vara graderade i 0,1 ìl delning.

3.3 Registering

Om registreringskurvan skall användas för att beräkna sammansättningen av den blandning som analyseras, krävs en elektronisk registreringsapparat med hög precision och som är kompatibel med apparaturen som används. Registreringsenheten skall ha följande karaktäristika:

a) svarstid, under 1,5 sekunder, företrädesvis 1 sekund (svarshastigheten är tiden det tar för pennan att gå från 0 till 90 % vid en plötslig ingångssignal på 100 %),

b) pappersbredd minimum 20 cm,

c) pappershastighet inställbar på värden mellan 0,4 och 2,5 cm/minut.

3.4 Integreringsenhet

Snabb och exakt beräkning kan genomföras med hjälp av en elektronisk integreringsenhet. Den skall ge ett linjärt svar med tillräcklig känslighet och korrektionen för avvikelser från baslinjen skall vara tillfredsställande.

4. UTFÖRANDE

De arbeten som beskrivs i 4.1 till 4.3 är relaterade till användning av en flamjoniseringsdetektor.

Som alternativ kan en gaskromatograf som använder sig av en katarometerdetektor användas (som arbetar enligt principen om förändringar i värmeledning). Driftförhållandena modifieras som beskrivs i punkt 6.

4.1 Provningsförhållanden

4.1.1 Val av optimala provningsförhållanden.

4.1.1.1 Packad kolonn

Vid val av provningsförhållanden skall hänsyn tas till följande variabler:

a) längden och diametern hos kolonnen,

b) sorten och mängden av den stationära fasen,

c) temperaturen hos kolonnen,

d) bärargasen flöde,

e) den upplösning som krävs,

f) storleken på det uttagna provet som har valts på ett sådant sätt att detektorn och elektrometer ger ett linjärt utslag,

g) analysens tidslängd.

I allmänhet ger de värden som anges i tabell 1 och tabell 2 de önskade resultatet, dvs minst 2 000 teoretiska bottnar per meter kolonnlängd för metylstearat och en elueringstid på ca 15 minuter.

Om utrustningen tillåter skall injektorn hållas vid en temperatur av ca 200 °C och detektorn vid en temperatur som är lika med eller högre än den i kolonnen.

Som regel gäller att förhållandet mellan flödet hos vätet som tillförs till flamjoniseringsdetektorn och bärargasen varierar från 1:2 till 1:1 beroende på diametern på kolonnen. Syreflödet är ca 5 till 10 gånger vätets flöde.

>Plats för tabell>

>Plats för tabell>

4.1.1.2 Kapillärkolonn

Effektivitets- och permeabilitetsegenskaperna hos kapillärkolonnen medför att separationen mellan komponenterna och tiden för analysen i hög grad är beroende av flödeshastigheten på bärargasen i kolonnen. Det är därför nödvändigt att optimera driftförhållandena genom att påverka denna parameter (eller enklare tryckfall i kolonnen) beroende på om man önskar förbättra separationen eller göra en snabb analys.

4.1.2 Bestämning av antalet teoretiska bottnar (effektivt) och upplösning (se figur 1).

Genomför analys av en blandning av metylstearat och metyloleat i ungefär lika proportioner (t.ex. metylestrar av kakaosmör).

Välj temperaturen för kolonnen och bärargasens flöde så att maximum på metylstearattoppen registreras ca 15 minuter efter lösningsmedelstoppen. Använd en tillräcklig mängd av blandningen av metylestrar så att metylstearattoppen upptar ungefär >NUM>3/ >DEN>4 av hela skalan.

Beräkna antalet teoretiska bottnar, n, med hjälp av formeln

n = 16 [ >NUM>dr1/ >DEN>W1]² och upplösningen R, med hjälp av formeln

R = >NUM>2Ä/ >DEN>W1 + W2

där:

>Plats för tabell>

Figur 1 Kromatogram för bestämning av antalet teoretiska bottnar (effektivitet) och upplösning

>

Hänvisning till >

>Start Grafik>

>Slut Grafik>

Driftförhållandena som skall väljas är sådana som kan ge åtminstone 2 000 teoretiska bottnar per meter av kolonnlängden för metylstearat och en upplösning som är minst 1,25.

4.2 Prov

Använd sprutan (3.2) och sug upp 0,1 till 2 ìl av lösningen av metylestrar som preparerats enligt bilaga 10 B och spruta in dem i kolonnen.

När det gäller estrar som inte är i lösning, preparera en lösning av ca 100 mg/ml av kromatografiskt ren heptan och spruta in 0,1 till 1 ìl av denna lösning.

Om analysen gäller ämnen i spårmängder, kan mängden av provet ökas (upp till 10 gånger).

4.3 Analys

I allmänhet skall driftförhållandena vara de som angetts i 4.1.1.

Det går emellertid att arbeta med en lägre kolonntemperatur när det krävs bestämning av fettsyror med mindre än 12 kolatomer eller vid högre temperaturer vid bestämning av fettsyror med mera än 20 kolatomer.

Ibland kan det vara möjligt att använda temperaturprogrammering i båda dessa fall. Om provet t ex innehåller metylestrar av fettsyror med mindre än 12 kolatomer, sprutas provet in vid 100 °C (eller vid 50 till 60 °C om smörsyra finns närvarande) och sedan höjs temperaturen omedelbart med en hastighet av 4 till 8 °C per minut till optimal temperatur. I vissa fall kan de två förfarandena kombineras.

Efter den programmerade uppvärmningen fortsätts elueringen vid en konstant temperatur tills alla komponenterna eluerats. Om inte instrumentet har programmerad uppvärmning, använd det vid två bestämda temperaturer mellan 100 och 195 °C.

Om så är nödvändigt rekommenderas att analysen genomförs på två fasta faser med olika polaritet för att påvisa frånvaron av maskerade toppar t ex när det gäller samtidig närvaro av C18:3 och C20:0, eller C18:3 och C18:2.

4.4 Beredning av referenskromatogrammet och referensgraferna

Analysera referensstandardblandningen (2.3) med användande av samma driftförhållande som de som använts för provet och mät retentionstiderna eller retentionsavstånden för de närvarande fettsyrorna. Rita på halvlogaritmiskt papper för varje grad av omättnad de kurvor som visar den logaritmiska retentionstiden eller avståndet som en funktion av antalet kolatomer. Under isoterma förhållanden skall kurvorna för syror med raka kolkedjor med samma grad av omättnad vara räta linjer. Dessa linjer skall vara ungefär parallella.

Det är nödvändigt att undvika förhållanden som gör att "maskerade toppar" existerar, dvs där upplösningen är otillräcklig för att separera två av de ingående ämnena.

5. RESULTATANGIVELSER

5.1 Kvalitativ analys

Identifiera topparna för metylestrarna från provet från de kurvor som iordningställts enligt 4.4 om så behövs genom interpolering.

5.2 Kvantitativ analys

5.2.1 Bestämning av sammansättningen

Bortsett från extrema fall användes den inre normaliseringsmetoden, dvs antag att alla ingående komponenter i provet finns representerade på kromatogrammet så att den totala ytan under topparna representerar 100 % av de ingående ämnena (total eluering).

Om utrustningen innefattar en integreringsenhet, använd de kurvor som erhållits från denna. Om inte, bestäm arean under varje topp genom att multiplicera höjden på toppen med dess bredd på mitten och där så behövs med hänsyn till de olika avvikelserna som används under registreringen.

5.2.2 Beräkningssätt

5.2.2.1 Allmänt fall

Beräkna halten av en given komponent i, uttryckt som massprocent av metylestrar, genom att bestämma den procent som representeras av området hos motsvarande toppar relativt summan av områdena för alla toppar med användning av formeln:

>NUM>Ai/ >DEN>ÓA × 100

där:

Ai är arean under toppen som motsvarar komponent i,

ÓA är summan av areorna under alla toppar,

Ange resultatet med en decimal.

Anm 7: I det här allmänna fallet anses resultatet av beräkningen som baseras på relativa områden representera massprocent. För de fall där inte detta antagande är tillåtet, se 5.2.2.2.

5.2.2.2 Användning av korrektionsfaktorer

I vissa fall, t.ex. i närvaro av fettsyror med färre än 8 kolatomer eller fettsyror med sekundära grupper, när termiska ledningsdetektorer används eller där högsta graden av noggrannhet särskilt krävs, skall korrektionsfaktorer användas för att omvandla procenten för toppareorna till massprocent hos komponenterna.

Bestäm korrektionsfaktorerna med hjälp av ett kromatogram som erhållits genom analys av en referensblandning med metylestrar av känd sammansättning genomförda under identiskt samma förhållanden som de som används vid analys av provet.

För denna referensblandning erhålls massprocenten av komponenten i genom formeln

>NUM>mi/ >DEN>Óm × 100

där:

mi är massan hos komponenten i i referensblandningen.

Óm är den totala massan av de olika komponenterna i referensblandningen.

Beräkna ur kromatogrammet för referensblandningen (4.4) procenten (area/area) för komponent i på följande sätt:

>NUM>AI/ >DEN>ÓA × 100

där:

Ai är arean under toppen som motsvarar komponenten i,

ÓA är summan av areorna under alla topparna,

Korrektionsfaktorn beräknas sedan som:

Ki = >NUM>mi × ÓA/

>DEN>Ai × Óm

Vanligen är korrektionsfaktorerna uttryckta relativt till KC16 så att de relativa faktorerna blir:

K'i = >NUM>Ki/>DEN>KC16

För provet är innehållet av varje komponent i uttryckt som massprocent av metylestrar:

>NUM>K'i × Ai/>DEN>Ó (K'i × Ai) × 100

Ange resultatet med en decimal.

5.2.2.3 Användning av inre standard

I vissa analyser (t ex där inte alla fettsyrorna är kvantifierade, såsom när syror med fyra och sex kolatomer är närvarande tillsammans med syror med 16 och 18 kolatomer, eller när det är nödvändigt att bestämma den absoluta mängden fettsyror i ett prov) är det nödvändigt att använda en inre standard. Fettsyror med 5, 15 eller 17 kolatomer används ofta. Korrektionsfaktorn (om sådan finns) för den inre standarden bör bestämmas.

Massprocenten av komponenten i, uttryckt som metylestrar, erhålls genom formeln:

>NUM>ms × K'i × Ai/>DEN>m × K's × As × 100

där:

>Plats för tabell>

Ange resultatet med en decimal.

6. SPECIALFALL ANVÄNDNING AV KATAROMETERDETEKTOR (SOM REGISTRERAR FÖRÄNDRINGAR AV VÄRMELEDNINGSFÖRMÅGAN)

En gaskromatograf med en detektor som registrerar förändringar av värmeledningsförmågan (en katorometer) kan också användas för bestämning av den kvalitativa och kvantitativa sammansättningen av en blandning av fettsyror metylestrar. Om en sådan används bör det förhållande som anges i punkt 3 och punkt 4 modifieras enligt tabell 3.

För kvantitativ analys används korrektionsfaktorerna som definieras i 5.2.2.2.

>Plats för tabell>

7. PROVRAPPORT

Provrapporten skall ange de metoder som används för framställning av metylestrarna och för gaskromatografanalysen och vilka resultat som erhållits. Den skall också ange alla driftsdetaljer som inte anges i denna internationella standard eller som betraktas som tillägg tillsammans med enskildheter om varje incident som kan ha påverkat resultaten.

Provrapporten skall innehålla all information som behövs för en komplett identifiering av provet.

BILAGA 10 B

PREPARERING AV METYLESTRAR AV FETTSYROR I ENLIGHET MED RUBRIKERNA 1 OCH 2 I BILAGA 6 TILL FÖRORDNING (EEG) NR 72/77 ELLER TILL DEN METOD SOM BESKRIVS NEDAN

INLEDNING

Valet av förfarande bestäms av fettsyresammansättningen och surhetsgraden för fettet som skall undersökas och den gaskromatografianalys som skall genomföras.

Mer specificerat:

- endast processer med slutna ampuller eller processer som använder dimetylsulfat kan användas för fettämnen som innehåller fettsyror med mindre än 12 kolatomer,

- endast metanol-saltsyre eller metanol-sulfatprocesser kan användas för fettämnen med en surhetsgrad över 3 %,

- endast processer som använder natriummetylat eller dimetylsulfat kan användas för gaskromatografimätningar av transisomerer,

- metanol-hexan-svavelsyraprocessen skall användas för iordningställande av metylestrarna i små kvantiteter av fettämnen från separationen genom tunnskiktskromatografi.

Närvaron av oförtvålbara ämnen kan försummas under förutsättning att de inte överskrider 3 %, i annat fall måste metylestrarna framställas från fettsyrorna.

1. SYFTE OCH TILLÄMPNINGSOMRÅDE

Här ges en beskrivning för fem metoder för framställning av metylestrar ur fettämnen:

a) med natriummetylat,

b) med natriummetylat i en sluten ampull,

c) med metanol-saltsyra i en sluten ampull,

d) med dimetylsulfat,

e) med metanol-hexan-svavelsyra.

Metod A

2. PRINCIP

Fettämnet som skall underkastas analys uppvärms under återflöde med metanol och natriummetylat. De metylestrar som erhålles extraheras med etyleter.

3. UTRUSTNING

3.1 100 ml kolv med återflödeskylare som är försedd med natriumkalciumhydroxidfyllt rör i toppen och normalslipningar.

3.2 50 ml mätglas.

3.3 5 ml mätpipett som är graderad i 0,1 ml.

3.4 250 ml separertrattar.

3.5 200 ml kolv.

4. REAGENSER

4.1 Vattenfri metanol.

4.2 Lösning av ca 1 % natriummetylat i metanol. Denna iordningställs genom att 0,34 g av metalliskt natrium löses i 100 ml vattenfri metanol.

4.3 Dietyleter.

4.4 10 % natriumkloridlösning.

4.5 40 till 60 °C petroleumeter.

5. UTFÖRANDE

5.1 2 g av fettämnet som tidigare har torkats över natriumsulftat och filtrerats, överförs till 100 ml kolven. Tillsätt 35 ml metanol, sätt på återflödeskylaren och koka under återflöde några minuter.

5.2 Stoppa uppvärmningsprocessen, ta bort kylaren och tillsätt snabbt 3,5 ml natriummetylatlösning. Sätt tillbaka kylaren och koka under återflöde i minst tre timmar. Metyliseringen är färdig när alla fettämnena har övergått till vätskeform och blandningen är helt klar vid rumstemperatur.

5.3 Kyl och häll reagensblandningen i 250 ml separertratt, tillsätt 35 till 40 ml etyleter, 100 ml vatten och 5 till 6 ml av 10 % natriumkloridlösning. Skaka och låt sedan faserna separera. Överför vattenfasen till en ny separertratt och extrahera ytterligare en gång med 25 ml dietyleter.

Tillsätt 50 ml 40 till 60 °C petroleumeter till de sammanslagna eterextrakten. Vatten kommer att avskiljas och kan tas bort.

Tvätta eterfasen tre gånger med 10 till 15 ml vatten, låt torka över natriumsulfat och filtrera genom papper varvid filtratet samlas upp i en 200 ml kolv.

Indunsta lösningsmedlet till 20 ml och fullfölj indunstningen på vattenbad i en ström av ren kväve.

Metod B

2. PRINCIP

Fettämnet som skall underkastas analys behandlas med natriummetylat i en metanollösning i en sluten ampull vid 85 till 90 °C.

3. UTRUSTNING

3.1 Kraftig glasampull med en kapacitet på ca 5 ml (höjd 40 till 45 mm, diameter 14 till 16 mm).

3.2 1 ml mätpipett som är graderad i 0,1 ml.

4. REAGENSER

4.1 Lösning av ca 1,5 % natriummetylat i metanol. Denna framställs genom att 0,50 g metalliskt natrium löses i 100 ml vattenfri metanol.

5. UTFÖRANDE

5.1 2 g av fettämnet som tidigare har torkats över natriumsulfat och filtrerats förs in i glasampullen. Tillsätt 0,3 g (ca 0,4 ml) natriummetylatlösning och smält sedan igen ampullen.

5.2 Sänk ner ampullen i 2 timmar i ett bad vid 85 till 90 °C och skaka om då och då. Förestringen är färdig när innehållet i ampullen är klart efter sedimentering av glycerin och återstoden av reagenserna.

5.3 Kyl till rumstemperatur. Öppna ampullen när metylestrarna skall användas. Dessa behöver inte någon vidare behandling innan de placeras i glaskromatografen.

Metod C

2. PRINCIP

Fettämnet som skall underkastas analys behandlas med metanol-saltsyra i en sluten ampull vid 100 °C.

3. UTRUSTNING

3.1 Kraftig glasampull med en rymd av ca 5 ml (höjd 40 till 45 mm, diameter 14 till 16 mm).

3.2 1 ml och 2 ml kalibrerade pipetter.

4. REAGENSER

4.1 Lösning av saltsyra i 2 % metanol. Denna framställs ur klorväte och vattenfri metanol (anm 1).

4.2 Hexan för gaskromatografi.

5. UTFÖRANDE

5.1 2 g av fettämnet som tidigare har torkats över natriumsulfat och filtrerats förs in i glasampullen och 2 ml av saltsyra-metanollösningen tillsätts. Smält igen glasampullen.

5.2 Sänk ner glasampullen i 40 minuter i ett bad vid 100 °C.

5.3 Kyl ampullen under rinnande vatten, öppna den, tillsätt 2 ml destillerat vatten och 1 ml hexan. Centrifugera och ta bort hexanfasen som är klar för användning.

Metod D

2. PRINCIP

Fettämnet som skall underkastas analys förtvålas med en metanollösning av kaliumhydroxid och behandlas sedan med dimetylsulfat. När saltsyra tillsätts separeras automatiskt de bildade metylestrarna. Mycket rena metylestrar framställs genom efterföljande behandling med aluminumoxid.

3. UTRUSTNING

3.1 Kraftigt provrör med en rymd av ca 20 ml, med >NUM>10/>DEN>19 slipad propp och säkerhetsfjädrar.

3.2 Återflödeskylare med normalslipningar >NUM>10/>DEN>19.

3.3 Glasfilter med sintrad skiva, G 2 storlek, 20 mm diameter.

3.4 Provrör i glas med en rymd av ca 10 ml och konisk botten.

3.5 1 ml och 5 ml sprutor.

4. REAGENSER

4.1 Kaliumhydroxid 10 % lösning i metanol för gaskromatografi.

4.2 Grön bromkresolindikator: 0,05 % lösning i metanol.

4.3 Dimetylsulfat (d = 1,335 vid 15 °C).

4.4 Koncentrerad saltsyra (d = 1,19) spädd till lika delar med metanol för gaskromatografi.

4.5 Brockmanns aluminiumoxid för adsorptionskromatografi.

5. UTFÖRANDE

5.1 2,2 ml av fettämnet som i förväg har torkats över natriumsulfat och filtrerats förs över till ett 20 ml provrör. Tillsätt 5 ml av kaliumhydroxidlösningen och några kvartsbitar som kokstenar. Anslut återflödeskylaren och värm röret över en låg flamma i 5 minuter, skaka om. Förtvålningen är helt genomförd när lösningen blir klar. Kyl slutligen med rinnande vatten och ta bort återflödeskylaren.

5.2 Tillsätt 2 droppar av indikatorn och 1 ml dimetylsulfat med hjälp av en spruta så att det sakta kan sprutas in. Förslut provröret hermetiskt och skaka i 2 till 3 minuter och doppa ner botten av provröret i kokande vattenbad med jämna mellanrum. Reaktionen är färdig när indikatorn ändrar färg från blått till gult. Kyl slutligen provröret i rinnande vatten, öppna det och sätt till 5 ml av saltsyra-metanollösningen.

5.3 Skaka om några sekunder, luta provröret åt sidan och knacka lätt på det. Detta underlättar för metylestrarna att stiga till ytan i form av en oljig massa (anm A).

Ta bort metylestrarna med hjälp av en spruta, överför dem till ett provrör med konisk botten, tillsätt en mängd aluminumoxid som motsvarar ca >NUM>1/>DEN>4 av volymen av metylestrarna, skaka och filtrera med filtrerpapper.

Anm A: Om inte metylestrarna separeras spontant, tillsätt 5 ml vatten till provröret och skaka om.

Metod E

2. PRINCIP

Fettämnena som skall underkastas analys upphettas under återflöde med metanol-hexan-svavelsyra. Metylestrarna som erhålles extraheras med petroleumeter.

3. UTRUSTNING

3.1 Provrör med en rymd av ca 20 ml försedd med en luftåterflödeskylare ca 1 meter lång, med slipningar.

3.2 5 ml kalibrerad pipett.

3.3 50 ml separertratt.

3.4 10 ml och 25 ml mätglas.

3.5 15 ml provrör med konisk botten.

4. REAGENSER

4.1 Metyleringsreagens: vattenfri metanol-hexan-koncentrerad svavelsyra (d = 1,84) i förhållandet 75:25:1 (v/v/v).

4.2 Petroleumeter 40 till 60 °C.

4.3 Vattenfritt natriumsulfat.

5. UTFÖRANDE

5.1 För över ämnet som tagits från plattan i ett 20 ml provrör och tillsätt 5 ml metyleringsreagens.

5.2 Sätt på återflödeskylaren och värm i 30 minuter i ett kokande vattenbad (anm 2).

5.3 Överför kvantitativt blandningen i en 50 ml separertratt med tillsats av 10 ml destillerat vatten och 10 ml petroleumeter. Skaka kraftigt och låt sedan faserna separera, ta bort vattenfasen och tvätta eterfasen 2 gånger med 20 ml destillerat vatten. Tillsätt en liten mängd vattenfritt natriumsulfat i separertratten, skaka om och låt det sätta sig under några minuter och filtrera. Samla upp filtratet i ett 15 ml provrör med konisk botten.

Indunsta lösningsmedlet på ett vattenbad i en ström av kväve.

Anm 1: Små mängder klorväte i gasform kan lätt framställas i laboratoriet ur den lösning som finns i handeln (d = 1,18) genom att koncentrerad svavelsyra (d = 1,84) doppas i den. Den frigjorda gasen torkas lätt genom att den får bubbla genom koncentrerad svavelsyra. Eftersom klorväte mycket snabbt absorberas av metanol är det tillrådligt att vidta de vanliga försiktighetsåtgärderna när man löser det, t.ex. införa gasen genom en liten upp- och nervänd tratt så att kanten på tratten precis når ytan på vätskan. Stora kvantiteter metanol-klorvätelösning kan iordningställas i förväg eftersom det håller sig utmärkt i ett provrör med glaspropp som förvaras mörkt.

Anm 2: För att styra kokpunkten sätt in en glasstav i provröret och ställ in temperaturen på vattenbadet på 90 °C.

BILAGA 11

BESTÄMNING AV HALTEN FLYKTIGA HALOGENERADE LÖSNINGSMEDEL I OLIVOLJA

1. METOD

Analys med gaskromatografi med användning av joniseringsteknik (head space).

2. UTRUSTNING

2.1 Gaskromatografiapparatur utrustad med elektronabsorbtionsdetektor (ECD).

2.2 Huvudutrymmesapparat (head space).

2.3 Gaskromatografikolonn, av glas, 2 meter lång och 2 mm i diameter, stationär fas.

OV101 10 % eller motsvarande uppsugen i kalcinerad diatomijord, syramättad och silaniserad med en partikelstorlek på 80 till 100 mesh.

2.4 Bärar- och supplementerande gaser: Kväve för gaskromatografi, lämplig för elektrondetektor.

2.5 Glaskolvar, 10 till 15 ml, med teflonskikt och aluminiumpropp med membran för sprutor (septum).

2.6 Förslutningsklämmor.

2.7 Gassprutor 0,5 till 2 ml.

3. REAGENSER

Standard: halogenerat lösningsmedel med en renhet som är lämplig för gaskromatografi.

4. UTFÖRANDE

4.1 Väg exakt in ca 3 g olja i en glaskolv (som inte skall återanvändas) och förslut den hermetiskt. Placera med en termostat vid 70 °C i en timme. Med hjälp av en