BILAGA I

Testmetoder för påvisande och identifiering av den angivna skadegöraren enligt artikel 3.2

1. Testning med hjälp av sporer

För påvisande och identifiering används sommarsporangier och vilsporer, vilka erhålls från jord efter siktning eller direkt från växtmaterialet.

2. Metoder för påvisande

För att extrahera sporer av den angivna skadegöraren från jord ska en av följande metoder användas:

a) Den metod för siktning av jord som beskrivs av Pratt (1976) (1).

b) Den metod för siktning av jord som beskrivs av van Leeuwen et al. (2005) (2).

c) Den centrifugeringsteknik för provberedning med hög kapacitet som beskrivs av Wander et al. (2007) (3).

3. Metoder för identifiering

Efter extraktionen ska sporer av den angivna skadegöraren identifieras med en av följande metoder:

a) Morfologisk identifiering i ljusmikroskop med 100–400 gångers förstoring.

b) Konventionell PCR med primrar baserade på Lévesque et al. (2001) (4) och van den Boogert et al. (2005) (5).

c) Realtids-PCR med de primrar och prober som beskrivs av Gent-Pelzer et al. (2010) (6).

d) Realtids-PCR med de primrar och prober som beskrivs av Smith et al. (2014) (7).

4. Vilsporers livsduglighet

Vilsporers livsduglighet får bestämmas genom mikroskopisk undersökning eller bioassay. Sporangiers livsduglighet får bestämmas genom mikroskopisk undersökning av sporangier monterade i laktofenol eller i vatten (Przetakiewicz 2015) (8). Sporangier med granulärt innehåll eller med lätt rundad protoplasma får anses vara livsdugliga. De som permanent har dragit sig samman genom plasmolys eller som inte verkar ha något innehåll ska anses vara döda.

Som ett alternativ, eller om det råder tvivel, får bioassay enligt beskrivningen i punkt 3 i bilaga IV utföras.

5. Bestämning av patotyper

Bestämning av patotyper ska kräva nya svulster.

Inokulatet för testet ska framställas med en av följande metoder:

a) Den metod som beskrivs av SASA (Science and Advice for Scottish Agriculture), som består av följande två steg: i) Framställning av inokulat. Gammal (brun) svulstvävnad ska delas upp i mindre bitar och lufttorkas i rumstemperatur tills den blir hård. Den hårda vävnaden ska malas, antingen för hand eller mekaniskt. Det malda materialet ska torrsiktas, för att samla in fraktionen 25–75 μm, och därefter extraheras med den kloroformmetod som beskrivs av Pratt (1976)1. ii) Framställning av nya svulster. Cirka 10 mg extraherade vilsporer ska strös över ytan av 10 ml sterilt destillerat vatten i en liten petriskål av plast och inkuberas i mörker vid 20 °C tills de börjar gro. Potatisknölar med små groddar som är cirka 1–2 mm långa ska placeras i genomskinliga plastlådor som är fodrade med fuktigt mjukpapper, med de synliga groddarna vända uppåt. Groddarna ska omringas med smält vaselin med hjälp av en spruta. Ringen ska vara obruten och tillräckligt hög för att kunna hålla sporsuspensionen utan läckage. De 10 ml groende vilsporerna ska spädas ut ytterligare till 20 ml med sterilt vatten och placeras i ringarna med hjälp av en pipett eller en klämflaska tills grodden är helt täckt av sporsuspensionen. Plastlådorna ska vara täckta med lock och inkuberas i fyra dagar vid 10 °C, sedan ska de öppnas, inokulatet och vaselinringarna ska avlägsnas och lådorna ska flyttas till ett växthus med luftfuktning och en temperatur på 15–18 °C (och 16 timmars belysning).

b) Den metod som beskrivs av Spieckermann & Kothoff (1924) (9).

c) Den metod som beskrivs av Potoček et al. (1991) (10).

d) Den metod som beskrivs av Glynne-Lemmerzahl (Glynne 1925 (11), Lemmerzahl 1930 (12), Noble och Glynne 1970 (13)).

För bestämning av alla patotyper som har konstaterats vara relevanta för unionen – 1(D1), 2(G1), 6(O1), 18(T1) och 38(Nevşehir) – ska ett infektionstest (differentialtest) med olika sorter av den angivna växten användas i enlighet med tabellen. Infektionstestet ska utföras enligt det protokoll som avses i led d (metoden enligt Glynne-Lemmerzahl).

Selektiv känslighet hos potatissorter för bestämning av patotyper av S. endobioticum

Sort Patotyper av S. endobioticum 1(D1) 2(G1) 6(O1) 18(T1) 38(Nevşehir) Tomensa/Evora/Deodara S S S S S Irga/Producent R S S S S Talent R R (*) R (*) S S Saphir R S R R S Ikar/Gawin/Karolin/Belita R R R R R S: mottaglig. R: resistent. (*) Anger att sorten är svagt mottaglig för S. endobioticum (förekomst av icke-nekrotiska sorusområden utan svulstbildning).

(1) Pratt, M.A., 1976, ”A wet-sieving and flotation technique for the detection of resting sporangia of Synchytrium endobioticum in soil”, Annals of Applied Biology, 82: s. 21–29.

(2) van Leeuwen, G.C.M., Wander, J.G.N., Lamers, J., Meffert, J.P., van den Boogert, P.H.J.F., Baayen, R.P., 2005, ”Direct examination of soil for sporangia of Synchytrium endobioticum using chloroform, calcium chloride and zinc sulphate as extraction reagents”, EPPO Bulletin, 35: s. 25–31.

(3) Wander, J.G.N., van den Berg, W., van den Boogert, P.H.J.F., Lamers, J.G., van Leeuwen, G.C.M., Hendrickx, G., Bonants, P., 2007, ”A novel technique using the Hendrickx centrifuge for extracting winter sporangia of Synchytrium endobioticum from soil”, European Journal of Plant Pathology, 119: s. 165–174.

(4) Lévesque, C.A., de Jong, S.N., Ward, L.J. & de Boer, S.H., 2001, ”Molecular phylogeny and detection of Synchytrium endobioticum, the causal agent of potato wart”, Canadian Journal of Plant Pathology, 23: s. 200–201.

(5) van den Boogert, P.H.J.F., van Gent-Pelzer, M.P.E., Bonants, P.J.M., de Boer, S.H., Wander, J.G.N., Lévesque, C.A., van Leeuwen, G.C.M., Baayen, R.P., 2005, ”Development of PCR-based detection methods for the quarantine phytopathogen Synchytrium endobioticum, causal agent of potato wart disease”, European Journal of Plant Pathology, 113: s. 47–57.

(6) van Gent-Pelzer, M.P.E., Krijger, M., Bonants, P.J.M., 2010, ”Improved real-time PCR assay for detection of the quarantine potato pathogen, Synchytrium endobioticum, in zonal centrifuge extracts from soil and in plants”, European Journal of Plant Pathology, 126: s. 129–133.

(7) Smith, D.S., Rocheleau, H., Chapados, J.T., Abbott, C., Ribero, S., Redhead, S.A., Lévesque, C.A., De Boer, S.H., 2014, ”Phylogeny of the genus Synchytrium and the development of TaqMan PCR assay for sensitive detection of Synchytrium endobioticum in soil”, Phytopathology, 104: s. 422–432.

(8) Przetakiewicz, J., 2015, ”The Viability of Winter Sporangia of Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. From Poland”, American Journal of Potato Research, 92: s. 704–708.

(9) Spieckermann, A., Kothoff, P., 1924, ”Testing potatoes for wart resistance”, Deutsche Landwirtschaftliche Presse, 51: s. 114–115.

(10) Potoček, J., Krajíčková, K., Klabzubová, S., Krejcar, Z., Hnízdil, M., Novák, F., Perlová, V., 1991, ”Identification of new Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. pathotypes in Czech Republic”, Ochrana Rostlin, 27: s. 191–205.

(11) Glynne, M.D., 1925, ”Infection experiments with wart disease of potatoes. Synchytrium endobioticum”, Annals of Applied Biology, 12: s. 34–60.

(12) Lemmerzahl, J., 1930, ”A new simplified method for inoculation of potato cultivars to test for wart resistance”, Züchter, 2: s. 288–297.

(13) Noble, M., Glynne, M.D., 1970, ”Wart disease of potatoes”, FAO Plant Protection Bulletin, 18: s. 125–135.