Följande bilagor ska läggas till:

”

Tillägg

METOD FÖR ATT PÅVISA KOMJÖLK OCH KASEINAT I OST SOM ÄR TILLVERKAD AV MJÖLK FRÅN TACKOR, GETTER ELLER BUFFLAR ELLER BLANDNINGAR AV MJÖLK FRÅN TACKOR, GETTER OCH BUFFLAR

1. SYFTE

Påvisande av komjölk och kaseinat i ost som är tillverkad av mjölk från tackor, getter eller bufflar eller av blandningar av mjölk från tackor, getter och bufflar, genom isoelektrisk fokusering av γ-kaseiner efter plasminolys.

2. TILLÄMPNINGSOMRÅDE

Metoden är lämplig för känsligt och specifikt påvisande av rå och värmebehandlad komjölk och kaseinat i färsk och mogen ost som tillverkats av mjölk från tackor, getter och bufflar eller blandningar av mjölk från tackor, getter och bufflar. Den är inte lämplig för att påvisa tillsatser av värmebehandlat koncentrat av protein från kolöpe i mjölk och ost.

3. PRINCIP

3.1 Isolering av kaseiner från ost och standardlösning

3.2 Upplösning av isolerade kaseiner som därefter underkastas plasminspjälkning (E.C.3.4.21.7)

3.3 Isoelektrisk fokusering av de plasminbehandlade kaseinerna i närvaro av urea och färgning av proteinerna

3.4 Bedömning av de färgade γ3- och γ2-kaseinmönstren (tecken på komjölk) genom jämförelse av provets mönster med mönster i samma gel från standardlösningar som innehåller 0 % och 1 % komjölk

4. REAGENSER

Om inte annat anges ska kemikalier av analyskvalitet användas. Vattnet ska vara dubbeldestillerat eller av motsvarande renhetsgrad.

Anm.: Följande uppgifter gäller för laboratorietillverkade polyakrylamidgeler med måtten 265 × 125 × 0,25 mm som innehåller urea. Om gel av annan storlek eller typ används kan separationsbetingelserna behöva anpassas.

Isoelektrisk fokusering

4.1 Reagenser för framställning av polyakrylamidgeler som innehåller urea

4.1.1 Stamgellösning

Lös

4,85 g akrylamid

0,15 g N, N′-metylen-bis-akrylamid (BIS)

48,05 g urea

15,00 g glycerol (87 viktprocent)

i vatten och späd till 100 ml. Förvara lösningen i en brun glasflaska i kylskåp.

Anm.: Använd gärna en färdigblandad akrylamid/BIS-lösning, som kan fås i handeln, i stället för de angivna bestämda vikterna av de neurotoxiska akrylamiderna. Om en sådan lösning innehåller 30 % w/v akrylamid och 0,8 % w/v BIS ska en volym på 16,2 ml användas i sammansättningen i stället för de angivna vikterna. Stamlösningen är hållbar i högst 10 dagar. Om dess ledningsförmåga överstiger 5 μS, avjoniseras den genom omrörning med 2 g Amberlite MB-3 i 30 minuter och filtreras därefter genom ett 0,45 μm membranfilter.

4.1.2 Gellösning

Bered en gellösning genom att blanda tillsatser och amfolyter (*) med stamlösningen (se 4.1.1).

9,0 ml stamlösning

24 mg β-alanin

500 μl amfolyt pH 3,5–9,5

250 μl amfolyt pH 5–7

250 μl amfolyt pH 6–8

Blanda gellösningen och avgasa den i 2–3 minuter i ett ultraljudsbad eller i vakuum.

Anm.: Bered gellösningen omedelbart före upphällningen (se 6.2).

4.1.3 Katalysatorlösningar

4.1.3.1 N, N, N′ N′ – tetrametyletylen-diamin (Temed)

4.1.3.2 40 % w/v ammoniumpersulfat (PER):

Lös 800 mg PER i vatten och späd med vatten till 2 ml.

Anm.: Använd alltid nyblandad PER-lösning.

4.2 Kontaktvätska

Fotogen eller flytande paraffin.

4.3 Anodlösning

Lös 5,77 g fosforsyra (85 viktprocent) i vatten och späd med vatten till 100 ml.

4.4 Katodlösning

Lös 2,00 g natriumhydroxid i vatten och späd med vatten till 100 ml.

Provberedning

4.5 Reagenser för proteinisolering

4.5.1 Späd ättiksyra (25,0 ml isättika späds med vatten till 100 ml).

4.5.2 Diklormetan

4.5.3 Aceton

4.6 Proteinupplösande buffert

Lös

5,75 g glycerol (87 viktprocent),

24,03 g urea,

250 mg ditiotreitol

i vatten och späd till 50 ml.

Anm.: Förvaras i kylskåp, hållbar i högst en vecka.

4.7 Reagenser till plasminspjälkning av kaseiner

4.7.1 Ammoniumkarbonatbuffert

Titrera en 0,2 mol/l ammoniumvätekarbonatlösning (1,58 g/100 ml vatten) som innehåller 0,05 mol/l etylendiamintetraättiksyra (EDTA, 1,46 g/100 ml) med en 0,2 mol/l ammoniumkarbonatlösning (1,92 g/100 ml vatten) som innehåller 0,05 mol/l EDTA till pH 8.

4.7.2 Bovin plasmin (EC. 3.4.21.7), aktivitet minst 5 IE/ml

4.7.3 ε-Aminokapronsyralösning för enzyminhibition

Lös 2,624 g ε-aminokapronsyra (6-amino-n-hexanonsyra) i 100 ml 40 % (v/v) etanol.

4.8 Standarder

4.8.1 Certifierade referensstandarder av en blandning av skummjölk från tackor och getter vilken behandlats med löpe och som innehåller 0 % och 1 % komjölk är tillgängliga från kommissionens institut för referensmaterial och mätningar, B-2440 Geel, Belgien.

4.8.2 Beredning av interimstandarder för laboratoriebruk av buffelmjölk som behandlats med löpe och som innehåller 0 % och 1 % komjölk

Skummjölken bereds genom att obehandlad och opaketerad mjölk från antingen bufflar eller kor centrifugeras vid 37 °C, 2 500 g i 20 minuter. Röret med innehåll kyls snabbt till 6–8 °C och det översta fettlagret avlägsnas fullständigt. 1 %-standardlösning bereds genom att 5,00 ml skummjölk från ko tillsätts till 495 ml skummjölk från buffel i 1-litersbägare och pH-värdet justeras till 6,4 genom tillsats av utspädd mjölksyra (10 % w/v). Ställ in temperaturen på 35 °C och tillsätt 100 μl kalvlöpe (löpeaktivitet 1: 10 000, ca 3 000 U/ml). och rör om i 1 minut. Täck sedan bägaren med aluminiumfolie och låt den stå i 35 °C under 1 timme, så att ostmassan bildas. När ostmassan har bildats, frystorkas all den löpebehandlade mjölken utan föregående homogenisering eller avrinning av vasslen. Efter frystorkningen mals produkten fint till ett homogent pulver. Använd samma förfarande för att bereda 0 %-standardlösningen av ren skummad buffelmjölk. Standardlösningarna ska förvaras vid – 20 °C.

Anm.: Kontrollera buffelmjölkens renhet genom isoelektrisk fokusering av plasminbehandlade kaseiner innan standardlösningarna bereds.

Reagenser för proteinfärgning

4.9 Fixeringsvätska

Lös 150 g triklorättiksyra i vatten och späd till 1 000 ml.

4.10 Avfärgningslösning

Späd 500 ml metanol och 200 ml isättika med destillerat vatten till 2 000 ml.

Anm.: Blanda till ny avfärgningslösning varje dag. Utgå gärna från stamlösningar av 50 % (v/v) metanol och 20 % (v/v) isättika som blandas i lika stora mängder.

4.11 Färgningslösningar

4.11.1 Färgningslösning (stamlösning 1)

Lös 3,0 g Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) i 1 000 ml 90 % (v/v) metanol med hjälp av en magnetisk omrörare (ca 45 minuter) och filtrera därefter lösningen genom två vikta filter för medelsnabb filtrering.

4.11.2 Färgningslösning (stamlösning 2)

Lös 5,0 g kopparsulfatpentahydrat i 1 000 ml 20 % (v/v) ättiksyra.

4.11.3 Färgningslösning (arbetslösning)

Blanda 125 ml av vardera stamlösningen (4.11.1, 4.11.2) med varandra omedelbart före färgningen.

Anm.: Färgningslösningen bör beredas samma dag som den ska användas.

5. UTRUSTNING

5.1 Glasplattor (265 × 125 × 4 mm) gummirulle (15 cm bred) vågrätt underlag

5.2 Gelbärarfolie (265 × 125 mm)

5.3 Täckfolie (280 × 125 mm) Fäst en tejpremsa (280 × 6 × 0,25 mm) längs vardera långsidan (se figur 1)

5.4 Elektrofokuseringskammare med kylplatta (t.ex. 265 × 125 mm) med lämplig spänningskälla (≥ 2,5 kV) eller automatisk elektroforesapparat

5.5 Cirkulationskryostat, termostatstyrd vid 12 ± 0,5 °C

5.6 Centrifug, justerbar till 3 000 g

5.7 Elektrodremsor (≥ 265 mm långa)

5.8 Droppflaskor av plast till anod- och katodlösningarna

5.9 Provapplikatorer (10 × 5 mm, viskosfilterpapper eller filterpapper för låg proteinabsorption)

5.10 Färgningsskålar och avfärgningsskålar av rostfritt stål eller glas (t.ex. 280 × 150 mm instrumentbrickor)

5.12 Justerbar homogenisator med stång (10 mm diameter), varvtalsintervall 8 000–20 000.

5.13 Magnetomrörare

5.14 Ultraljudsbad

5.15 Foliesvets

5.16 25 μl mikropipetter

5.17 Vakuumindunstare eller frystork

5.18 Termostatstyrt vattenbad inställt på 35 och 40 ± 1 °C med skakare

5.19 Densitometerutrustning med avläsning vid λ = 634 nm

6. FÖRFARANDE

6.1 Provberedning

6.1.1 Isolering av kaseiner

Väg upp en mängd som motsvarar 5 g torr ost eller referensstandarderna i ett 100 ml centrifugrör, tillsätt 60 ml destillerat vatten och homogenisera med en homogenisator med stång (8 000–10 000 varv/minut). Justera pH-värdet till 4,6 med utspädd ättiksyra (4.5.1) och centrifugera (5 minuter, 3 000 g). Avlägsna fettet och vasslen och homogenisera återstoden vid 20 000 varv/min i 40 ml destillerat vatten som justerats till pH 4,5 med utspädd ättiksyra (4.5.1), tillsätt 20 ml diklormetan (4.5.2) och homogenisera och centrifugera igen (5 minuter, 3 000 g). Avlägsna det kaseinlager som finns mellan vattenfasen och den organiska fasen (se figur 2) med en spatel och dekantera av båda faserna. Homogenisera kaseinet igen i 40 ml destillerat vatten (se ovan) och 20 ml diklormetan (4.5.2) och centrifugera. Upprepa detta förfarande tills båda extraktionsfaserna är färglösa (två eller tre gånger). Homogenisera proteinresterna med 50 ml aceton (4.5.3) och filtrera dem genom ett vikt filter för medelsnabb filtrering. Tvätta resterna på filtret med två olika omgångar av 25 ml aceton, låt torka i luft eller i en kväveström och pulverisera dem sedan fint i mortel.

Anm.: Torra kaseinisolat ska förvaras vid – 20 °C.

6.1.2 Plasminspjälkning av β-kaseiner för att intensifiera γ-kaseiner

Slamma upp 25 mg isolerade kaseiner (6.1.1) i 0,5 ml ammoniumkarbonatbuffert (4.7.1) och homogenisera under 20 minuter, exempelvis genom ultraljudsbehandling. Värm till 40 °C och tillsätt 10 μl plasmin (4.7.2), blanda och inkubera under en timme vid 40 °C under ständig skakning. Inhibera enzymet genom att tillsätta 20 μl ε-aminokapronsyra (4.7.3), och tillsätt sedan 200 mg fast urea och 2 mg ditiotreitol.

Anm.: För att få de fokuserade kaseinbanden mer symmetriska rekommenderas att lösningen frystorkas efter tillsättning av ε-aminokapronsyran och att resterna löses i 0,5 ml proteinupplösande buffert (4.6).

6.2 Beredning av akrylamidgeler som innehåller urea

Rulla ut gelbärarfolien (5.2) med hjälp av ett par droppar vatten på en glasplatta (5.1) och avlägsna eventuellt överflödigt vatten med pappershandduk eller hushållspapper. Rulla på samma sätt ut täckfolien (5.3) med avståndsmärken med 0,25 mm mellanrum på en annan glasplatta. Placera plattan plant på ett vågrätt underlag.

Tillsätt 10 μl Temed (4.1.3.1) till den förbehandlade och avgasade gellösningen (4.1.2), rör om och tillsätt 10 μl Per-lösning (4.1.3.2), blanda noggrant och häll omedelbart ut ett jämnt lager på mitten av täckfolien. Placera ena sidan av gelbärarplattan (med folien nedåt) på täckfolieplattan och sänk ned den långsamt så att en gelfilm bildas mellan folierna och sprids ut jämnt utan bubblor (figur 3). Sänk försiktigt ned hela gelbärarplattan med hjälp av en tunn spatel och placera ytterligare tre glasplattor ovanpå den som vikter. När polymeriseringen är avslutad (efter ca 60 minuter) överför den polymeriserade gelen till gelbärarfolien tillsammans med täckfolien genom att vicka på glasplattorna. Rengör baksidan av gelbärarfolien försiktigt från gelrester och urea. Svetsa ”gelsandwichen” till ett folierör, som förvaras i kylskåp (högst 6 veckor).

Anm.: Täckfolien med avståndsmärken kan återanvändas. Polyakrylamidgelen kan skäras i mindre bitar, vilket är lämpligt då antalet prover är få eller då en automatisk elektroforesapparat används (2 geler, storlek 4,5 × 5 cm).

6.3 Isoelektrisk fokusering

Ställ in kyltermostaten på 12 °C. Torka av baksidan på gelbärarfolien med fotogen och droppa sedan några droppar fotogen (4.2) på mitten av kylblocket. Rulla därefter ut gelsandwichen på den (med bärarsidan nedåt) och se till att det inte bildas några bubblor. Torka av eventuellt överflödigt fotogen och ta bort täckfolien. Dränk in elektrodremsorna med elektrodlösningarna (4.3 och 4.4), skär till dem till samma längd som gelen och placera dem på de givna platserna (elektrodavstånd 9,5 cm).

Fokuseringen sker under följande betingelser:

6.3.1 Gelstorlek 265 × 125 × 0,25 mm

Steg Tid (minuter) Spänning (V) Strömstyrka (mA) Effekt (W) Volttimmar (Vh) 1. Förfokusering 30 högst 2 500 högst 15 konstant 4 cirka 300 2. Provfokusering (7) 60 högst 2 500 högst 15 konstant 4 cirka 1 000 3. Slutfokusering 60 högst 2 500 högst 5 högst 20 cirka 3 000 40 högst 2 500 högst 6 högst 20 cirka 3 000 30 högst 2 500 högst 7 högst 25 cirka 3 000

Anm.: Om gelernas tjocklek eller bredd ändras måste strömstyrkan och effekten justeras därefter (dubblera t.ex. strömstyrkan och effekten om en gel med måtten 265 × 125 × 0,5 mm används).

6.3.2 Exempel på spänningsprogram för en automatisk elektroforesapparat (2 geler på 5,0 × 4,5 cm); elektroderna placeras utan remsor direkt på gelen

Steg Spänning Strömstyrka Effekt Temp. Volttimmar 1. Förfokusering 1 000 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 85 Vh 2. Provfokusering 250 V 5,0 mA 2,5 W 8 °C 30 Vh 3. Fokusering 1 200 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 80 Vh 4. Fokusering 1 500 V 5,0 mA 7,0 W 8 °C 570 Vh

Placera provapplikatorn i steg 2 vid 0 Vh.

Ta bort provapplikatorn i steg 2 vid 30 Vh.

6.4 Proteinfärgning

6.4.1 Proteinfixering

Ta bort elektrodremsorna omedelbart efter det att strömmen slagits av och placera gelen i en färgningsskål eller avfärgningsskål fylld med 200 ml fixeringsvätska (4.9). Låt den stå i 15 minuter och skaka om då och då.

6.4.2 Tvättning och färgning av gelplattan

Låt fixeringsvätskan rinna av ordentligt och tvätta gelplattan två gånger under 30 sekunder med 100 ml avfärgningslösning (4.10) per gång. Häll av avfärgningslösningen och fyll skålen med 250 ml färgningslösning (4.11.3). Låt färgen verka under 45 minuter under försiktig skakning.

6.4.3 Avfärgning av gelplattan

Häll bort färgningslösningen och tvätta gelplattan två gånger med 100 ml avfärgningslösning (4.10) per gång, skaka sedan under 15 minuter med 200 ml avfärgningslösning. Upprepa avfärgningen två eller tre gånger tills bakgrunden är klar och färglös. Tvätta sedan gelplattan med destillerat vatten (2 × 2 minuter) och låt lufttorka (2–3 timmar) eller torka med en hårtork (10–15 minuter).

Anm. 1: Utför fixering, tvättning, färgning och avfärgning vid 20 °C. Högre temperatur får inte användas.

Anm. 2: Om en mer känslig silverfärgning önskas (t.ex. Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, Code No 17–1150–01) måste plasminbehandlade kaseinprov spädas till 5 mg/ml.

7. BEDÖMNING

Bedömningen görs genom att proteinmönstret för det okända provet jämförs med referensstandarder på samma gel. Påvisande av komjölk i ost som tillverkats av mjölk från tackor, getter och bufflar och blandningar av mjölk från dessa djur sker via de γ3- och γ2-kaseiner, vars isoelektriska punkter ligger mellan pH 6,5 och pH 7,5 (figurerna 4 a, 4 b och 5). Detektionsgränsen ligger under 0,5 %.

7.1 Visuell bedömning

För visuell bedömning av mängden komjölk rekommenderas att provernas och standardernas koncentration justeras till samma intensitetsnivå för γ2- och γ3-kaseinerna från mjölk från får, getter och bufflar (jfr ”γ2 E, G, B” och ”γ3 E, G, B” i figurerna 4 a, 4 b och 5). Därefter kan innehållet av komjölk (lägre, lika med eller högre än 1 %) i det okända provet bedömas direkt genom jämförelse med intensiteten hos γ3- och γ2-kaseinerna från komjölk (jfr ”γ3 C” och ”γ2 C” i figurerna 4 a, 4 b och 5) med referensstandarder på 0 % och 1 % (tacka, get) eller med laboratoriets interimstandarder (buffel).

7.2 Densitometrisk bedömning

Om möjligt används densitometri (5.19) för att bestämma förhållandet mellan toppareorna för γ2- och γ3-kasein för kor och får, getter och/eller bufflar (jfr figur 5). Jämför detta värde med förhållandet mellan toppareorna för γ2- och γ3-kaseiner i 1 %-referensstandarden (tacka, get) eller i laboratoriets interimstandard (buffel) som analyseras på samma gel.

Anm.: Metoden fungerar tillfredsställande om det finns en tydlig positiv signal för både γ2- och γ3-kasein från komjölk i 1 %-referensstandarden, men inte i 0 %-referensstandarden. Om så inte är fallet, bör förfarandet förbättras genom att metoden följs noga i alla detaljer.

Ett prov betraktas som positivt om både γ2- och γ3-kaseiner eller motsvarande förhållanden mellan toppareorna är lika med eller större än nivån för 1 %-referensstandarden.

8. REFERENSER

Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708–711 (1990).

Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83–85 (1995).

Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte – and carrier ampholyte/immobilized pH gradient – isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier. in: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.) s. 389–393, Bode-Verlag, München (1989).

Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195–199 (1982).

Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43–56 (1980).

Figur 1

Schematisk bild av täckfolien

Figur 2

Kaseinlager som flyter mellan vattenfasen och den organiska fasen efter centrifugeringen

Figur 3

Vickningsteknik vid gjutning av ultratunna polyakrylamidgeler

a = avståndsband (0,25 mm) b = täckfolie (5.3) c, e = glasplattor (5.1) d = gellösning (4.1.2) f = gelbärarfolie (5.2)

Figur 4 a

Isoelektrisk fokusering av plasminbehandlade kaseiner från ost som tillverkats av mjölk från tackor och getter och som innehåller olika mängder komjölk

% CM = procent komjölk, C = ko, E = tacka, G = get

Den övre halvan av IEF-gelen visas.

Figur 4 b

Isoelektrisk fokusering av plasminbehandlade kaseiner från ost som tillverkats av blandningar av mjölk från tackor, getter och bufflar och som innehåller olika mängder komjölk

% CM = procent komjölk 1 + = prov som innehåller 1 % komjölk och där rent kasein från komjölk tillsatts i mitten av figuren. C = ko, E = tacka, G = get, B = buffel

Det totala separationsavståndet för IEF-gelen visas.

Figur 5

Överlagring av densitogram av standarder (STD) och ostprover som tillverkas av en blandning av mjölk från tackor och getter efter isoelektrisk fokusering

a,b = standarder som innehåller 0 och 1 % komjölk, c-g = ostprover som innehåller 0, 1, 2, 3 och 7 % komjölk. C = ko, E = tacka, G = get

Den övre halvan av IEF-gelen analyserades vid λ = 634 nm.