KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EG) nr 440/2008

av den 30 maj 2008

om testmetoder enligt Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach)

(Text av betydelse för EES)

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DENNA FÖRORDNING

med beaktande av fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen,

med beaktande av Europaparlamentets och rådets förordning nr 1907/2006 av den 18 december 2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach), inrättande av en europeisk kemikaliemyndighet, ändring av direktiv 1999/45/EG och upphävande av rådets förordning (EEG) nr 793/93 och kommissionens förordning (EG) nr 1488/94 samt rådets direktiv 76/769/EEG och kommissionens direktiv 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG och 2000/21/EG (1), särskilt artikel 13.3, och

av följande skäl:

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

De testmetoder som ska tillämpas för de syften som avses i förordning (EG) nr 1907/2006 fastställs i bilagan till denna förordning.

Artikel 2

Kommissionen ska där så är lämpligt se över de testmetoder som ingår i denna förordning i syfte att ersätta, minska eller förfina testning på ryggradsdjur.

Artikel 3

Hänvisningar till bilaga V till direktiv 67/548/EEG ska läsas som hänvisningar till denna förordning.

Artikel 4

Denna förordning träder i kraft dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning.

(1) EUT L 396, 30.12.2006, s. 1. Rättad i EUT L 136, 29.5.2007, s. 3.

(2) EGT 196, 16.8.1967, s. 1. Direktivet senast ändrat genom Europaparlamentets och rådets direktiv 2006/121/EG (EUT L 396, 30.12.2006, s. 850. Rättat i EUT L 136, 29.5.2007, s. 281) – uppdateras med lämpliga referenser så snart den 30:e anpassningen offentliggjorts.

Apparaten, helt monterad med tryckgivare och uppvärmningssystem men utan sprängblecket på plats, stöds med tändstiftsänden nedåt. 2,5 g av den vätska som ska provas blandas med 2,5 g torkad cellulosa i dekanteringsglas med hjälp av en omrörningsstav av glas (16) . För säkerhets skull ska blandningen utföras med en skyddsskärm mellan operatören och blandningen. Om vid blandning eller fyllning självantändning uppstår krävs ingen ytterligare provning. Blandningen tillsätts tryckkärlet i små portioner under knackning, så att blandningen säkert packas runt tändspiralen och är i god kontakt med den. Det är viktigt att spiralen inte förvrids under packningsprocessen då detta kan leda till oriktiga resultat (17) . Sprängblecket sätts på plats och fästpluggen skruvas åt ordentligt. Det fyllda kärlet placeras, med sprängblecket överst, i stödställningen vilken ska stå i ett lämpligt, förstärkt dragskåp eller eldningsutrymme. Kraftförsörjningen ansluts till tändstiftets yttre anslutningar och 10 A läggs på. Tiden mellan det att blandningen påbörjas och inkopplingen av strömmen får inte överstiga 10 minuter.

Torkad fibercellulosa med en fiberlängd mellan 50 och 250 μm och en medeldiameter av 25 μm (12) , används som brännbart material. Den torkas tills vikten inte ändras, i ett lager som är högst 25 mm tjockt vid 105 oC under fyra timmar, och förvaras i en exikator med torkmedel tills den svalnat och ska användas. Vattenhalten i den torkade cellulosan ska vara mindre än 0,5 % av torrsubstansen (13) . Om det behövs ska torktiden förlängas för att uppnå detta (14) . Samma parti cellulosa ska användas under hela provningen.

De enskilda värdena för total mängd organiskt kol i vätskeextrakten för de två trippelexperimenten och medelvärdet för varje experiment ska anges, uttryckt som massa per volym lösning (normalt mg C/l), samt som massa per vikt för det ursprungliga provet (normalt mg C/g).

ASTM D 5296-92, (1992), Standardmetod för analys av medelmolekylvikter och molekylviktfördelning i polystyren med storleksseparationskromatografi. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

ASTM D 3536-91, (1991), Standardmetod för analys av medelmolekylvikter och molekylviktfördelning med vätskeuteslutningskromatografi (gelégenomträngningskromatografi – GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Information om all extrapolering, alla antaganden och approximeringar gjorda under experimentproceduren samt om bedömning och bearbetning av data.

Efter fastställande av retentionsvolymerna eller retentionstiderna (eventuellt korrigerade med en intern standard), plottas log Mp-värdena (Mp är maximalt toppvärde för kalibreringsämnet) mot en av nämnda mängder. Minst två kalibreringspunkter krävs per tiotal molekylvikter och minst fem mätpunkter för den totala kurvan, som ska täcka provets uppskattade molekylvikt. Kalibreringskurvans ändpunkt för den låga molekylvikten definieras av n-hexylbenzen eller annan lämplig icke-polär lösning. Den del av kurvan som svarar mot molekylvikter under 1 000 bestäms och korrigeras för föroreningar och tillsatser efter behov. Elutionskurvorna bedöms i allmänhet med hjälp av elektronisk databehandling. Om manuell digitalisering används kan råd hämtas från ASTM D 3536-91 (3).

Amiya, S., et al. (1990), Pure and Applied Chemistry (ung. Ren och tillämpad kemi), 62, 2139–2146.

Garmon, R.G., (1975), End-Group Determinations (ung. Bestämning av ändgrupper) kapitel 3 In: Polymer Molecular Weights (Polymerers molekylvikt), Del 1, P.E. Siade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.

Morris, C.E.M., (1989), Vapour Pressure osmometry (Ångtrycksosmometri). In: Determination of Molecular Weight (Bestämning av molekylvikt), A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons.

ASTM 3592-77, (1977), Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure (ung. Rekommenderad standardmetod för bestämning av molekylvikt med hjälp av ångtryck), American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Coll, H. (1989), Membrane Osmometry (Membranosmometri). In: Determination of Molecular Weight (Bestämning av molekylvikt), A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, s. 25–52.

ASTM D 3750-79, (1979), Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry (ung. Standardmetod för bestämning av numerisk medelmolekylvikt med membranosmometri i polymerer). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Glover, C.A., (1975), Absolute Colligative Property Methods (ung. Absoluta metoder för bestämning av kolligativa egenskaper), kapitel 4, In: Polymer Molecular Weights (ung. Polymerers molekylvikt), Part I P.E. Siade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.

Billmeyer, F.W. Jr., (1984), Textbook of Polymer Science (ung. Textbok om polymerforskning), tredje utg., John Wiley, New York.

ASTM D 5296-92, (1992), Standardmetod för analys av medelmolekylvikter och molekylviktfördelning i polystyren med storleksseparationskromatografi. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

ASTM D 3536-91, (1991), Standardmetod för analys av medelmolekylvikter och molekylviktfördelning med vätskeuteslutningskromatografi (gelégenomträngningskromatografi – GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Information om all extrapolering, alla antaganden och approximeringar gjorda under experimentproceduren samt om bedömning och bearbetning av data.

NF T 20-035 (september 85), Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.

Det högsta värdet för brännhastighet som erhålls vid en testomgång med sex test av en given blandning är relevant for utvärderingen.

NF T 20-036 (September 1985). Chemical products for industrial use. Determination of the relative tempe-rature of the spontaneous flammability of solids.

NF T 20-038 (Sept. 85), Chemical products for industrial use – Determination of explosion risk.

Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Test and criteria., 1990, Förenta nationerna, New York.

Sex försök med en belastning av 360 N utförs. Om en explosion förekommer i ett av dessa sex försök utförs en ny serie med sex försök med en belastning av 120 N. I andra apparater jämförs proven med det valda referensämnet med hjälp av ett fastställt förfarande (t.ex. up- and down-teknik).

Porslinspinnen anbringas på testprovet och vikten hängs på. När testet utförs ska slipmärkena på porslinsplattan ligga tvärs emot rörelseriktningen. Kontrollera noggrant att pinnen vilar på provet, att tillräckligt med testämne ligger under pinnen och att plattan rör sig korrekt under pinnen. För pastaaktiga ämnen används en 0,5 mm tjock form med en hål av 2 × 10 för att anbringa ämnet på plattan. Porslinsplattan ska flytta sig 10 mm fram och tillbaka under porslinspinnen under 0,44 sekunder. Varje del av porslinsplattan och porslinspinnen får endast användas en gång. Varje pinnes två ändar räcker till två försök och de två ytorna på en platta räcker vardera för tre försök.

Friktionsapparaturen består av en bottenplatta av gjuten stål på vilken själva friktionsanordningen är monterad. Denna består av en fast porslinspinne och rörliga porslinsplåtar. Porslinsplåten är fäst i en glidbar vagga som rör sig mellan två skenor. Vaggan drivs via en drivstång, en excentrisk trissa och en överföringsväxel av en elektrisk motor på sådant sätt att porslinsplåten rörs under porslinspinnen med en bakåt- och framåtgående rörelse på 10 mm. Porslinspinnen ska belastas med t.ex. 120 eller 360 newton.

Vätskor och geléaktiga ämnen fylls i röret till en höjd av 60 mm varvid försiktighet iakttas med geléaktiga ämnen för att undvika luftbubblor under påfyllning. Den gängade kragen förs upp på röret underifrån, den valda strypflänsen sätts in och muttern åtstramas efter smörjning med ett molybdensulfidbaserat smörjmedel. Det är viktigt att kontrollera att inget ämne har fastnat mellan flänsen och plattan eller i gängorna.

Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and Criteria, 1990, United Nations, New York.

NF T 20-039 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.

Ämnet, fast eller flytande, blandas med en inaktiv bärare och får under fem minuter vara i kontakt med luften vid rumstemperatur. Flytande ämnen som inte fattar eld absorberas sedan de på filterpapper och utsätts under fem minuter för luftens påverkan vid rumstemperatur (cirka 20 oC). Fasta och flytande ämnen som fattar eld och vätskor som fattar eld eller får filterpappret att förkolna anses vara självantändliga.

NF T 20-040 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.

Recommendations on the transport of dangerous goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York.

10 till 20 ml vatten tillsätts i apparatens dropptratt, och 10 g av ämnet placeras i den koniska kolven. Den gasvolym som utvecklas kan mätas med lämplig metod. Kranen på dropptratten öppnas för att släppa in vattnet i den koniska kolven och ett stoppur startas. Gasutvecklingen mäts varje timme under en sjutimmarsperiod. Om gasutvecklingen är oregelbunden under denna period, eller om hastigheten för gasutvecklingen ökar vid slutet av denna period, fortsätter mätningarna i upp till fem dagar. Om gasutvecklingen vid någon tidpunkt överstiger 1 liter/timme kan testet avbrytas. Detta test ska utföras tre gånger.

Testämnet blandas med destillerat vatten vid 20 oC och gasutvecklingshastigheten mäts varje timme under sju timmar. Om utvecklingshastigheten efter sju timmar är oregelbunden eller ökande ska mättiden förlängas till högst fem dagar. Testet kan avbrytas om hastigheten vid något tillfälle överstiger 1 liter/kg per timme.

NF T 20-041 (Sept. 85), Chemical products for industrial use. Determination of flammability of gases.

NF T 20-042 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.

Luftdraget ska vara tillräckligt för att förhindra rök från att ta sig in i laboratoriet och ska inte ändras under testet. Ett dragskydd bör ställas upp runt apparaten.

Ämnet formas till ett obrutet band som är omkring 250 mm långt, 20 mm brett och 10 mm högt på en ickebrännbar, icke-porös dåligt värmeledande plats. En gaslåga (minsta diameter 5 mm) hålls vid den ena änden av pulverbandet tills pulvret fattar eld, dock högst 2 minuter (5 minuter för metallpulver och metallegeringar). Man noterar om förbränningen breder ut sig 200 mm över bandet under testperiodens 4 minuter (40 minuter för metallpulver). Om ämnet inte fattar eld eller förbränning med öppen låga eller genom glödning inte breder ut sig 200 mm över bandet under testperiodens 4 minuter (40 minuter) anses ämnet inte vara lättantändligt och ytterligare försök är inte nödvändiga. Om förbränningen i ämnet breder ut sig 200 mm över bandet på mindre än 4 minuter eller mindre än 40 minuter för metallpulver utförs nedanstående test (1.6.2).

R. F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.

C. Hansch och A. J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

W. J. Lyman, W. F. Reehl och D. H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

där fi representerar de olika molekylfragmentkonstanterna, Fi är korrektionsuttrycken och ai och bj är de motsvarande uppträdandefrekvenserna. På grundval av experimentellt bestämda värden av Pow har man genom att prova sig fram kunnat ställa upp en lista över atom- och gruppfragmentvärden och en lista över korrektionsuttryck Fj (s.k. faktorer). Korrektionsuttrycken har delats in i olika klasser (se hänvisningar a och c). Det är relativt komplicerat och tidsödande att ta hänsyn till alla regler och korrektionsuttryck. Programvarupaket har utvecklats för detta (se hänvisning b).

Y. C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Basel, 1978.

NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use – Determination of partition coefficient – Flask shake method.

A. Leo, C. Hansch och D. Elkins, artition coefficients and their uses. Chem. Rev. 1971, vol. 71, s. 525.

Log P and Parameter Database, A took for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hasch, chairman, A. J. Leo, dir.) – Tillgänglig från Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pornona College, Claremont, California 91711.

C. Hansch och A. j. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

Delarna n-oktansyra ska mätas per volym. Testkärlen ska antingen placeras i en lämplig skakapparat eller skakas för hand. Nar ett centrifugeringsglas används rekommenderas att snabbt vrida centrifugglaset 180o kring dess tväraxel så att all instängd luft stiger upp genom de två faserna. Erfarenheten visar att 50 sådana vridningar normalt är tillräckligt för att erhålla fördelningsjämvikt. För att vara säker på detta rekommenderas 100 vridningar under fem minuter.

Metodens mätområde bestäms av analysförfarandets detektionsgräns. Denna bör vara tillräcklig för att medge bestämning av värden för log Pow i området - 2 till 4 (under vissa omständigheter kan detta område ökas till log Pow upp till 5) när koncentrationen av det lösta ämnet i endera fasen inte är större än 0,01 mol per liter.

För att kunna korrelera uppmätta HPLC-data för ett ämne med dess P-värde måste en kalibreringskurva för log P mot kromatografiska data fastställas med användning av minst 6 referenspunkter. Det är upp till användaren att välja lämpliga referensämnen. När så är möjligt ska minst ett referensämne ha en Pow-värde som ligger över testämnets, och minst ett med ett Pow-värde under testämnets. För värden av log P under 4 kan kalibreringen baseras på data som erhållits genom skakkolvmetoden. För värden av log P över 4 kan kalibreringen baseras på validerade hänvisningsvärden om dessa motsvarar beräknade värden. För bättre noggrannhet är det att föredra att välja referensämnen som strukturmässigt liknar testämnet.

NF T 20-045 AFNOR (Sept., 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubilityof solids and liquids with high solubility – Flask method.

NF T 20-045 AFNOR (Sept., 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubilityof solids and liquids with low solubility – Column elution method.

De enskilda resultaten ska anges för var och en av de tre kolvarna, och för de resultat som bedöms vara konstanta (repeterbarhet mindre än 15 %), ska medelvärdet beräknas och anges i viktenheter per volymenhet lösning. Om lösligheten ar mycket hög (> 100 gram per liter) kan det vara nödvändigt att omvandla viktenhet till volymenhet med hjälp av densiteten.

Medelvärdet och standardavvikelsen ska beräknas for minst fem på varandra följande prov, tagna vid mättnadsplatån. Resultaten ska anges i viktenheter per volymenhet lösning.

Testet ska helst utföras vid 20 ±0,5 oC. Om man misstänker att lösligheten är temperaturberoende (> 3 % per oC), ska man även utföra tester vid två andra temperaturer, som ligger minst 10 oC över respektive under den först valda temperaturen. I detta fall ska temperaturen regleras till ±0,1 oC. Den valda temperaturen ska hållas konstant i alla relevanta delar av utrustningen.

Ett ämnes löslighet i vatten anges av mättnadskoncentrationen av ämnet i vatten vid en viss temperatur. Lösligheten i vatten anges i viktenhet per volym lösning. SI-enheten är kg/m3 (gram per liter kan också användas).

R. Weissberg ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Inter-science Publ., New York, 1959, vol. I, del I, kapitel XIV.

Se ISO 304 och NF T 73-060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).

Se ISO 304 och NF T 73-060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).

Se ISO-304 och NF T 73-060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).

ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope.

NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressureof solids and liquids within range from 10-3 to 1 Pa – Vapour pressure balance method.

NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressureof solids and liquids within range from 10-1 tu 105 Pa – Static method.

R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed.,kapitel IX, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, del 1.

När det gäller fasta ämnen används, beroende på tryck och temperaturområde, de manometervätskor som anges i 1.6.2. Den avgasade manometervätskan fylls in i utbuktningen på isoteniskopets långa arm. Därefter placeras det fasta testämnet i klotet och avgasas vid förhöjd temperatur. Sedan lutas isoteniskopet så att manometer-vätskan kan flyta in i U-röret. Mätningen av ångtrycket som en funktion av temperaturen utförs enligt 1.6.2.

När provet värms upp ökar ångtrycket. Detta ändrar jämvikten hos vätskan i U-röret. För att kompensera detta leds kväve eller luft in i apparaten via en ventil tills tryckindikatorvärskan åter är på noll. Det tryck som krävs för detta avläses på en precisionsmanometer vid rumstemperatur. Detta tryck motsvarar ämnets ångtryck vid den särskilda mättemperatur.

I manometern kan man använda kvicksilver i området från normalt lufttryck till 102 Pa, medan silikonvätskor och ftalater är lämpliga från 102 Pa ned till 10 Pa. Värmebeständiga membrankondensatormanometrar kan till och med användas under 10-1 Pa. Det finns även andra tryckmätare som kan användas under 102 Pa.

Kokkärlet värms upp med ett värmeelement (t.ex. värmepatron) som sätts in i glasapparaturen nedifrån. Önskad strömstyrka ställs in och mäts med ett termoelement.

Denna metod ar baserad på bestämning av den mängd testämne som under ultravakuum strömmar ut från en Knudsen-cell (se hänvisning 4) genom en mikroöppning per tidsenhet i gasform. Volymen av den utströmmade ångan kan konstateras antingen genom att bestämma cellens viktförlust eller genom att kondensera ångan vid låg temperatur och bestämma den förångade mängden ämne genom kromatografisk analys. Ångtrycket beräknas med användning av Hertz-Knudsen-relationen.

Den mängd ämne som avgår ur en cell per tidsenhet genom en öppning av känd storlek, bestäms under vakuum så att den mängd ämne som återvänder till cellen är försumbar (t.ex. genom mätning av den puls som en ångstråle framkallar på en känslig våg eller genom att mäta viktförlusten).

Determination of the density of soils

Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pycnometric method

Metod B i Method for Determining the Density and Relative Density of Plastics excluding Cellular Plastics

Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pykonometric method

Method for determination of relative density of petroleum products by the capillary-stoppered pycnometer method

Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method)

Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of density

Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer

Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tubes (för väts-kor som inte är för tjockflytande)

Liquid chemical products; determination of density at 20 oC

Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; lmmersed body method

Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petro-leum products by hydrometer method

Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method

Testing of mineral oils and related materials; determination of density

Testing of plastics and elastometers; determination of density

Specific gravity and density of plastics by displacement

Chemical products for industrial use – Determination of the density of solids other than powders and cellular products – Hydrostatic balance method

Method A: Methods för determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics

Chemical products for industrial use – Determination of density of liquids Aerometric method

Part III: Use and test

Part I: Density hydrometers; construction, admjustment and use;

IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, s. 508.

R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., kapitel IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, del 1.

Fasta ämnens och vätskors relativa densitet (D4 20) är förhållandet mellan det undersökta ämnets vikt per volymenhet, bestämd vid 20 oC och vikten per samma volymenhet vatten, bestämd vid 4 oC. Den relativa densiteten har ingen dimension.

Standard definitions of terms relating to thermal analysis

Standard method for assessine the thermal stability of chemicals by methods or differential thermal analysis

Method for the determination of distillation characteristics

Method for determination of distillation of petroleum products

Test Method for Distillation (Distillation Field and Distillation Range)

Standard test method for boiling point of engine anti-freezes

R. Weissberg ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Inter-science Publ., New York, 1959, vol. I, del I, kapitel VII.

Badvätskan väljs med hänsyn till kokpunkten. Vid temperaturer upp till 573 K kan silikonolja användas. Paraf-finolja kan endast användas upp till 473 K. Uppvärmningen av badvätskan ska i början regleras till en temperaturstegring av 3 K/min, under omrörning. Vid ungefär 10 K under den förväntade kokpunkten sänks värmetillförseln så att temperaturstegringen blir mindre än 1 K/min. När temperaturen närmar sig kokpunkten börjar bubblor strömma ut från kapillärröret.

Ebulliometern utvecklades ursprungligen för molekylviktsbestämning via kokpunktshöjningar, men de lämpar sig även för exakt bestämning av kokpunkter. En mycket enkel apparat beskrivs i ASTM D 1120-72 (se tillägg). I denna apparat uppvärms vätskan under jämviktsbetingelser i atmosfäriskt tryck tills den kokar.

Den ”dynamiska metoden” har den fördelen att den också kan användas för bestämning av ångtryck, och det är inte nödvändigt att korrigera kokpunkten till standardtryck (101,325 kPa) eftersom standardtrycket kan ställas in med en manostat under mätningen.

Standard test method for pour point of petroleum oils

Echantillonnage et analyse des produits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite – Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt

Standard definitions of terms relating to thermal analysis

Standard method for asseying the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis

Standard definitions of terms relating to thermal analysis

Standard method for asseying the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis

Method for the determination of the freezing point

Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve)

Method for the determination of crystallizing point

Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials

Testing methods for melting point of chemical products

Method for determination of melting point and/or melting range

Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals

IUPAC, ”Physiochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry”, vol. 48, 1976, 505–515.

R. Weissberg ed., ”Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry”, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959,, vol. I del I kapitel VII.

Badvätskan uppvärms med en temperaturstegring av ungefar 3 K/min under omrörning av vätskan. När temperaturen är ungefär 10 K under den förväntade smältpunkten ställs temperaturstegringen in till högst 1 K/min.

Ett kapillärrör fylls med en liten, tätt packad mängd av det finmalda ämnet. Röret uppvärms tillsammans med en termometer och temperaturstegringen ställs in till mindre än ca 1 K/min under själva smältningen. Temperaturen vid begynnande och slutlig smältning bestäms.

DEL B: METODER FÖR BESTÄMNING AV TOXICITET OCH ANDRA HÄLSOEFFEKTER

INNEHÅLLSFÖRTECKNING

ALLMÄN INLEDNING

B.1a AKUT TOXICITET (ORALT) – METOD MED FASTA SÄRSKILJANDE DOSER

B.1b AKUT TOXICITET ORALT – METOD FÖR BESTÄMNING AV AKUT TOXICITETSKLASS

B.2 AKUT TOXICITET (INANDNING)

B.3 AKUT TOXICITET (DERMALT)

B.4 AKUT TOXICITET: HUDIRRITATION/HUDKORROSION

B.5 AKUT TOXICITET: ÖGONIRRITATION/ÖGONKORROSION

B.6 HUDSENSIBILISERING

B.7 28 DAGARS STUDIE AV TOXICITET MED UPPREPAD ORAL DOSERING

B.8 TOXICITET VID UPPREPAD DOSERING (28 DAGAR, INANDNING)

B.9 TOXICITET VID UPPREPAD DOSERING (28 DAGAR, DERMALT)

B.10 MUTAGENICITET – TEST IN VITRO AV KROMOSOMAVVIKELSER HOS DÄGGDJUR

B.11 MUTAGENICITET – TEST IN VIVO AV KROMOSOMAVVIKELSER I BENMÄRG HOS DÄGGDJUR

B.12 MUTAGENICITET – TEST AV MIKROKÄRNOR IN VIVO I ERYTROCYTER HOS DÄGGDJUR

B.13/14 MUTAGENICITET – TEST AV ÅTERMUTATION HOS BAKTERIER

B.15 MUTAGENICITETSTEST OCH SVREENING FÖR CANCERGENICITET

B.16 MITOTISK REKOMBINATION – SACCHAROMYCES CEREVISIAE

B.17 MUTAGENICITET – TEST AV GENMUTATIONER HOS DÄGGDJURSCELLER IN VITRO

B.18 DNA-SKADA OCH DNS-REPARATION – FELAKTIG DNA-SYNTES – DÄGGDJURSCELLER IN VITRO

B.19 TEST AVSEENDE SYSTERKROMATIDSBYTEN IN VITRO

B.20 KÖNSBUNDEN RECESSIV LETAL TEST PÅ DROSOPHILA MELANOGASTER

B.21 CELLTRANSFORMATIONSTEST PÅ DÄGGDJURSCELLER IN VITRO

B.22 DOMINANT LETAL TEST PÅ GNAGARE

B.23 SPERMATOGENIAL TEST AV KROMOSOMAVVIKELSER HOS DÄGGDJUR

B.24 FLÄCKTEST PÅ MUS

B.25 TEST AVSEENDE ÄRFTLIG TRANSLOKATION PÅ MUS

B.26 TEST AVSEENDE SUBKRONISK ORAL TOXICITET (90-DAGARS UPPREPAT ORALTEST PÅ GNAGARE)

B.27 TEST AVSEENDE SUBKRONISK ORAL TOXICITET (90-DAGARS UPPREPAT ORALTEST PÅ ICKE-GNAGARE)

B.28 TEST AVSEENDE SUBKRONISK DERMAL TOXICITET (90-DAGARS REPETERAD DERMALTEST PÅ GNAGARE)

B.29 TEST AVSEENDE SUBKRONISK INHALATIONSTOXICITET (90-DAGARS REPETERAD INHALATIONSTEST PÅ GNAGARE)

B.30 TEST AVSEENDE KRONISK TOXICITET

B.31 TEST AVSEENDE PRENATAL UTVECKLINGSTOXICITET

B.32 TEST AVSEENDE CANCERGENICITET

B.33 KOMBINERAT TEST AVSEENDE KRONISK TOXICITET OCH CANCERGENICITET

B.34 REPRODUKTIONSTOXICITETSTEST PÅ EN GENERATION

B.35 TEST AVSEENDE REPRODUKTIONSTOXICITET PÅ TVÅ GENERATIONER

B.36 TOXIKOKINETIK

B.37 FÖRDRÖJD NEUROTOXICITET ORSAKAD AV ORGANISKA FOSFORFÖRENINGAR TILL FÖLJD AV AKUT EXPONERING

B.38 FÖRDRÖJD NEUROTOXICITET ORSAKAD AV ORGANISKA FOSFORFÖRENINGAR (28 DAGARS UPPREPAD DOSUNDERSÖKNING)

B.39 TEST AV REPARATIONSSYNTES (uds) HOS LEVERCELLER FRÅN DÄGGDJUR IN VIVO

B.40 IN VITRO -TEST AV HUDKORROSIVITET: BESTÄMNING AV TRANSKUTANT ELEKTRISKT MOTSTÅND (TER)

B.40a IN VITRO -TEST AV HUDKORROSIVITET: TEST MED MODELL AV HUMAN HUD

B.41 3T3 NRU-FOTOTOXICITETSTEST IN VITRO

B.42 HUDSENSIBILISERING: LLNA-METODEN (LOCAL LYMPH NODE ASSAY)

B.43 TEST AVSEENDE NEUROTOXICITET PÅ GNAGARE

B.44 HUDABSORPTION: IN VIVO -METOD

B.45 HUDABSORPTION: IN VITRO -METOD

ALLMÄN INLEDNING

A. BESKRIVNING AV TESTSUBSTANSEN

Testsubstansens sammansättning, inbegripet de viktigaste orenheterna, och dess relevanta fysikaliskt-kemiska egenskaper, inbegripet ämnets stabilitet, ska vara kända innan en toxicitetsundersökning inleds.

Testsubstansens fysikaliskt-kemiska egenskaper ger viktig vägledning vid val av tillförselväg, utformning av varje enskild undersökning samt hantering och lagring av testsubstansen.

En analysmetod för kvalitativ och kvantitativ bestämning av testsubstansen (om möjligt inbegripet viktiga orenheter) i doseringsmediet och i biologiska material bör utvecklas innan en undersökning inleds.

Alla uppgifter om identifiering av testsubstansen, dess fysikaliskt-kemiska egenskaper, renhet och beteende bör omfattas av testrapporten.

B. DJURVÅRD

En strikt kontroll av miljöförhållandena samt tillämpliga djurvårdsmetoder är grundläggande i fråga om toxicitetstester.

i) Förvaltningsförhållanden

Miljön i försöksdjurens rum eller burar ska vara avpassade efter djurarten. Lämpliga betingelser för råttor, möss och marsvin är en rumstemperatur på 22 ±3 oC med en relativ luftfuktighet på 30 – 70 %. För kaniner och marsvin bör temperaturen hållas vid 20 ±3 oC med en relativ luftfuktighet på 30 – 70 %.

Vissa testmetoder är särskilt känsliga för temperatureffekter och i dessa fall ingår detaljuppgifter om lämpliga betingelser i metodbeskrivningen. I alla undersökningar av toxiska effekter ska temperaturen och luftfuktigheten kontrolleras, registreras och anges i den slutliga testrapporten.

Artificiell belysning bör användas, med en dygnsrytm på 12 timmar ljus, 12 timmar mörker. Detaljuppgifter om belysningsrytmen ska registreras och anges i den slutliga testrapporten.

Om inte annat anges för metoden får djuren inhysas individuellt eller i små grupper av samma kön; i fråga om grupper bör högst fem djur inhysas i varje bur.

I rapporter om djurförsök är det viktigt att ange vilken typ av bur som används och antalet djur i varje bur, både under exponering för det kemiska ämnet och under en påföljande observationstid.

ii) Utfodring

Fodret ska uppfylla alla näringsmässiga krav som kan ställas för den djurart som används i försöket. Om testsubstansen tillförs djuren via fodret kan näringsvärdet sjunka till följd av en samverkan mellan ämnet och någon beståndsdel i fodret. Möjligheten av en sådan reaktion ska övervägas vid tolkningen av testresultaten. Konventionellt laboratoriefoder får användas tillsammans med obegränsade mängder vatten. Valet av foder kan påverkas av behovet av att säkerställa en lämplig blandning med testsubstansen när denna tillförs enligt denna metod.

I fodret får inte finnas störande koncentrationer av föroreningar som man vet påverkar toxiciteten.

C. ALTERNATIVA TESTER

För Europeiska unionen är det ett åtagande att främja utvecklandet och valideringen av alternativa metoder som kan ge samma informationsnivå som nuvarande djurförsök, men som använder färre djur, orsakar mindre lidande eller undviker användning av djur fullständigt.

När sådana metoder blir tillgängliga ska de om möjligt beaktas för riskbedömning och efterföljande klassificering och märkning av eventuella risker.

D. UTVÄRDERING OCH TOLKNING

När tester utvärderas och tolkas ska begränsningarna för i vilken utsträckning resultaten av djurförsök och in vitro-undersökningar går att tillämpa på människor beaktas och därför får bevis för negativa effekter på människor i förekommande fall användas som bekräftelse av testresultaten.

E. LITTERATURHÄNVISNINGAR

De flesta av dessa metoder har utvecklats inom ramen för OECD:s program för riktlinjer för tester och bör utföras i enlighet med principerna för god laboratoriepraxis, i syfte att så långt möjligt säkerställa ”ömsesidigt godtagande av uppgifter”.

Ytterligare information finns i de hänvisningar som görs i OECD:s riktlinjer och relevant litteratur som publicerats på annat håll.

B.1a AKUT TOXICITET (ORALT) – METOD MED FASTA SÄRSKILJANDE DOSER

1. METOD

Denna testmetod motsvarar OECD TG 420 (2001).

1.1 INLEDNING

Vid traditionella metoder för bedömning av akut toxicitet används djurens död som slutpunkt. 1984 föreslog British Toxicology Society en ny metod för test avseende akut toxicitet. Den nya metoden bygger på att djuren ges en serie doser på definierade nivåer (se hänvisning 1). Då behöver djurens död inte användas som slutpunkt, eftersom metoden bygger på observationer av klara tecken på toxicitet vid någon av de definierade dosnivåerna. Efter brittiska och internationella (se hänvisning 2 respektive 3) valideringsstudier in vivo 1992 detta förfarande som en testmetod. Därefter har metodens statistiska egenskaper utvärderats med hjälp av matematiska modeller i en serie studier (se hänvisning 4, 5, och 6). Med hjälp av dessa in vivo- och modelleringsstudier har man kunnat demonstrera att metoden är reproducerbar, kräver ett mindre antal djur och orsakar mindre lidande än de traditionella metoderna, och att metoden även gör det möjligt att klassificera ämnen på ett liknande sätt som med de övriga testmetoderna för akut toxicitet.

Riktlinjer för valet av den lämpligaste testmetoden för ett visst ändamål finns i vägledningen om testning av akut toxicitet oralt (se hänvisning 7). I vägledningen finns även tilläggsinformation rörande utförandet av testmetod B.1b och tolkningen av resultaten.

Metoden bygger på principen om att endast skäligen toxiska doser används i huvudtestet, och att doser som förväntas vara dödliga ska undvikas. Doser som, på grund av frätande eller allvarligt irriterande verkningar, är kända att orsaka klar smärta och svårt lidande behöver inte användas. Döende djur eller djur som uppvisar klara tecken på smärta eller allvarligt och ihållande lidande ska avlivas skonsamt, och vid tolkningen av testresultaten ska dessa djur beaktas på samma sätt som djur som har dött under testets gång. Kriterierna för beslut rörande avlivning av döende eller svårt lidande djur, liksom även riktlinjer för tecknen på förutsägbar eller annalkande död, behandlas i en separat vägledning (se hänvisning 8).

Metoden ger information om ett ämnes farliga egenskaper och möjliggör klassificering av ämnet enligt det globala harmoniserade systemet (GHS) för klassificering av kemikalier som orsakar akut toxicitet (se hänvisning 9).

Testningslaboratoriet bör analysera all tillgänglig information om testämnet innan själva testningen genomförs. Sådan information inbegriper ämnets identitet och kemiska struktur, fysikalkemiska egenskaper, resultaten från andra eventuella in vitro- eller in vivo-test avseende toxicitet, toxikologiska data om strukturellt närbesläktade ämnen och ämnets tilltänkta användningsändamål. Denna information behövs för att avgöra huruvida testet är relevant för skyddet av människors hälsa, och hjälper vid valet av en optimal startdos.

1.2 DEFINITIONER

Akut toxicitet (oralt): De skadliga verkningar som uppträder efter oral tillförsel av en engångsdos av ett ämne eller upprepade doser som ges inom 24 timmar.

Fördröjd död: Det att ett djur inte dör eller är döende inom 48 timmar, men dör senare under den 14 dagar långa observationsperioden.

Dos: Den mängd testämne som tillförs. Dosen uttrycks som vikten testämne per viktenhet försöksdjur (exempelvis mg/kg).

Uppenbar toxicitet: En allmän term för att beskriva klara tecken på toxicitet efter tillförsel av testämnet (exempel finns i hänvisning 3). Verkningarna är då så allvarliga att närmaste högre dos troligen leder till att största delen av djuren utsätts för svår smärta eller uppvisar ihållande tecken på allvarligt lidande, är döende (kriterierna anges i vägledningen om konsekvenser för människor, se hänvisning 8) eller sannolikt dör.

GHS: Globala harmoniserade systemet för klassificering och märkning av kemikalier och blandningar. Systemet utarbetas gemensamt inom OECD (människors hälsa och miljö), FN:s expertkommitté om transport av farligt gods (fysikalkemiska egenskaper) och ILO (varningar). Samordningen sker genom det gemensamma programmet för sund kemikaliehantering (IOMC).

Annalkande död: När ett djur troligen är döende eller har dött före den nästa planenliga observationstidpunkten. Hos gnagare kan tecknen på annalkande död inbegripa konvulsioner, lateral kroppsställning, halvliggande ställning och tremor (närmare uppgifter finns i vägledning om konsekvenserna för människor, se hänvisning 8).

LD50 (median letal dos): En statistiskt fastställd engångsdos som kan förväntas leda till döden för 50 % av de djur som har tillförts dosen oralt. LD 50 -värdet uttrycks som vikten testämne per viktenhet försöksdjur (mg/kg).

Gränsdos: En dos på den övre gränsnivån (2 000 eller 5 000 mg/kg).

Döende djur: Ett djur som håller på att dö eller som har små chanser att överleva, även om det får behandling (närmare uppgifter finns i vägledningen om konsekvenserna för människors hälsa, se hänvisning 8).

Förutsägbar död: Förekomsten av kliniska tecken som tyder på död vid en känd framtida tidpunkt som infaller före försökets planerade avslutningstidpunkt, exempelvis oförmåga att nå vatten eller föda (närmare uppgifter finns i vägledningen om konsekvenserna för människors hälsa, se hänvisning 8).

man når den dos som orsakar uppenbar toxicitet eller ett dödsfall, eller tills inga verkningar kan iakttas på den högsta dosnivån eller dödsfall inträffar på den lägsta dosnivån.

1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN

1.4.1 Val av djurart

Rekommenderad gnagare är råtta, även om testet kan utföras med andra gnagare. I regel används hondjur (se hänvisning 7). Detta beror på att litteraturstudier av konventionella LD50-test indikerar att känslighetsskillnaderna mellan könen är små, men att honorna i förekommande fall ofta är en aning mer känsliga (se hänvisning 10). Om däremot kunskaperna om strukturellt närbesläktade ämnens toxikologiska eller toxiko-kinetiska egenskaper tyder på att hanarna sannolikt är känsligare än honorna bör hanar användas. Om testet görs på hanar bör tillbörlig motivering ges.

Djuren bör vara unga och friska vuxna exemplar som härrör från normala laboratoriestammar. Hondjuren får inte ha fött ungar och får inte vara dräktiga. När dostillförseln inleds ska djuret vara mellan 8 och 12 veckor gammalt, och variationerna i vikt får vara högst ± 20 % av medelvikten för alla tidigare djur som har doserats.

1.4.2 Förvarings- och utfodringsbetingelser

Temperaturen i testdjurens utrymmen bör vara 22 oC (± 3 oC). Den relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och ska helst inte överstiga 70 %, utom när rummet rengörs. Målvärdet bör dock vara 50–60 %. Belysningen bör vara artificiell med omväxlande 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. För utfodringen kan konventionellt laboratoriefoder användas, och djuren bör ha obegränsad tillgång till dricksvatten. Djur som tillförs doser på samma nivå kan inhysas i samma bur, men antalet djur per bur får inte vara högre än att klara observationer kan göras av varje djur.

1.4.3 Förberedelse av djuren

Djuren väljs ut slumpmässigt och förses med märkning så att de kan identifieras individuellt Därefter får djuren acklimatisera sig till laboratoriets betingelser i sina burar i minst 5 dagar före doseringsstart.

1.4.4 Förberedelse av doserna

I regel ska de olika doserna av testämnet tillföras i en konstant volym, vilket innebär att doserna har varierande koncentration. När en slutprodukt i vätskeform eller en blandning testas, kan det med tanke på riskbedömningen vara mer relevant att använda testämnet i outspädd form (konstant koncentration), vilket även förutsätts av vissa tillsynsmyndigheter. Den maximala dosvolymen för tillförsel får aldrig överskridas. Den största mängd vätska som kan tillföras vid ett och samma tillfälle beror på testdjurets storlek. För gnagare bör denna volym i regel inte överskrida 1 ml per 100 g kroppsvikt. I fråga om vattenlösningar får dock 2 ml per 100 g kroppsvikt användas. För tillförsel av dosen rekommenderas alltid i första hand lösning, suspension eller emulsion i vatten, sedan lösning, suspension eller emulsion i olja (exempelvis majsolja) och därefter eventuella andra vehiklar. I fråga om andra vehiklar än vatten måste de toxikologiska egenskaperna vara kända. Doserna måste beredas strax före tillförseln, utom i fall där preparatets stabilitet är känd och har påvisats vara godtagbar över hela användningsperioden.

1.5 FÖRFARANDE

1.5.1 Tillförsel av doser

Testämnet tillförs som en engångsdos genom sondmatning med hjälp av magsond eller lämplig intubationskanyl. I det sällsynta fallet att det inte är möjligt med en engångsdos, kan dosen tillföras i mindre delar över en period som inte överskrider 24 timmar.

Före dostillförseln hålls djuren fastande (utan föda och med tillgång till vatten, för råttor över natten och för möss i 3–4 timmar). Efter fasteperioden vägs djuren och testämnet tillförs. Efter tillförsel av ämnet kan djuren hållas utan föda i ytterligare 3–4 timmar (råttor) respektive 1–2 timmar (möss). Om dosen tillförs i delar över en tidsperiod kan det vara nödvändigt att ge djuren föda och vatten, beroende på periodens längd.

1.5.2 Inledande test

Avsikten med ett inledande test är att få en grund för valet av optimal startdos för huvudtestet. Testämnet tillförs enskilda djur enligt den sekvens som anges i flödesschemat i bilaga 1. Det inledande testet kan avslutas när sekvensen når fram till ett utfall om en startdos för huvudtestet (eller om ett djur dör på den lägsta angivna dosnivån).

Som startdos för det inledande testet väljs en av de angivna dosnivåerna 5, 50, 300 och 2 000 mg/kg. Startdosen väljs så att den troligen ger tecken på uppenbar toxicitet, och den ska i mån av möjlighet grunda sig på resultat från in vivo- och in vitro-test av samma kemikalie och strukturellt närbesläktade kemikalier. Om sådan information inte finns att tillgå, används startdosen 300 mg/kg.

Det bör gå minst 24 timmar från doseringen av att djur till doseringen av följande djur. Alla djur bör observeras i minst 14 dagar.

Undantagsvis, och endast när det kan motiveras med specifika tillsynskrav, får en ytterligare högre dosnivå på 5 000 mg/kg användas (se bilaga 3). Med hänsyn till djurens välbefinnande avråds testning på djur när det gäller GHS-kategori 5 (2 000–5 000 mg/kg). Sådan testning får endast göras när det finns en stark sannolikhet för att resultaten har en direkt relevans för skyddet av djurs eller människors hälsa eller av miljön.

I ett inledande test där ett djur dör vid den lägsta dosnivån (5 mg/kg), bör förfarandet i regel avslutas och ämnet klassificeras som tillhörande GHS-kategori 1 (se bilaga 1). Om det ändå behövs ytterligare bekräftelse av klassificeringen kan ett valfritt tilläggsförfarande genomföras. Detta går ut på att ett andra djur doseras vid nivån 5 mg/kg. Om detta andra djur dör, anses GHS-kategorin 1 vara bekräftad och testet avslutas omedelbart. Om det andra djuret överlever doseras högst tre tilläggsdjur vid nivån 5 mg/kg. Eftersom mortalitetsrisken är hög bör dessa djur av hänsyn till djurens välbefinnande doseras sekventiellt. Efter doseringen av ett djur får följande djur inte doseras förrän det är klart att det tidigare djuret sannolikt överlever. Om något av dessa djur dör ska doseringssekvensen omedelbart avslutas, och inga ytterligare djur ska doseras. Eftersom förekomsten av ett dödsfall till (oavsett hur många djur som har testats vid testets slut) leder till utfall A (två eller flera dödsfall), ska klassificeringen enligt bilaga 2 göras för dosen 5 mg/kg (kategori 1 om det förekommit två eller flera dödsfall eller kategori 2 om det inte förekommit fler än ett dödsfall). Dessutom innehåller bilaga 4 vägledning om klassificeringen enligt EU-systemet, som gäller tills det att det nya GHS-systemet har genomförts.

1.5.3 Huvudtest

1.5.3.1 Antalet djur och dosnivåer

I flödesschemat i bilaga 2 anges de steg som bör följas efter testning vid startdosnivå. Ett av tre steg måste tas – avsluta testet och riskklassificera ämnet på grundval av utfallet, testa vid en högre dosnivå eller testa vid en lägre dosnivå. Med hänsyn till djurens välbefinnande bör dosnivåer som har orsakat dödsfall i det inledande testet inte användas i huvudtestet (se bilaga 2). Erfarenheterna tyder på att det mest sannolika utfallet vid startdosnivån är att ämnet kan klassificeras och att ingen ytterligare testning behövs.

I regel används totalt fem djur av samma kön vid varje dosnivå. Dessa fem djur inbegriper det djur som i det inledande testet doserades vid den valda nivån och därutöver fyra djur (utom, i undantagsfall, om en dosnivå som används i huvudtestet inte har ingått i det inledande testet).

Tidsintervallet mellan doseringen vid varje nivå bestäms av start, varaktighet och allvarlighetsgrad för de toxiska tecknen. Doseringen av djuren på följande dosnivå bör inte inledas förrän det råder säkerhet om de tidigare doserade djurens överlevnad. I förekommande fall rekommenderas ett intervall på 3–4 dagar mellan doseringen vid de olika nivåerna, så att eventuella tecken på fördröjd toxicitet kan observeras. Tidsintervallet kan anpassas på tillbörligt sätt, exempelvis i fall där responsen är tvetydig.

I fall där man överväger att använda en övre dos på 5 000 mg/kg bör förfarandet enligt bilaga 3 följas (se även avsnitt 1.6.2).

1.5.3.2 Gränstest (limit test)

Gränstest används primärt i situationer där laboratoriet har information som tyder på att testämnet sannolikt inte är toxiskt (toxiskt endast ovanför de gränsdoser som anges i bestämmelser). Information om testämnets toxicitet kan härledas från kunskaperna om liknande testade ämnen eller liknande testade blandningar eller produkter, med hänsyn tagen till identiteten och halten av de komponenter som har känd toxikologisk signifikans. Om informationen om ämnets toxicitet är bristfällig eller saknas, eller om ämnet troligen är toxiskt, bör huvudtestet genomföras.

Som gränstest för den metod som beskrivs här kan man använda ett inledande test med en startdos på 2 000 mg/kg (eller undantagsvis 5 000 mg/kg) som åtföljs av dosering av ytterligare fyra djur vid denna nivå.

1.6 OBSERVATIONER

Efter doseringen observeras djuren individuellt minst en gång under de första 30 minuterna, periodiskt under de första 24 timmarna (med särskild uppmärksamhet under de första 4 timmarna) och därefter dagligen under totalt 14 dagar. Detta gäller inte för djur som av hänsyn till djurens välbefinnande måste avlivas skonsamt eller för djur som hittas döda. Observationsperiodens längd bör dock ha en anpassningsmån. Längden bör bestämmas enligt de toxiska reaktionerna, tidpunkten för när de sätter in och återhämtningsperiodens längd. Observationsperioden kan således förlängas om det anses vara nödvändigt. Tidpunkten då tecken på toxicitet uppträder och försvinner är viktig, särskilt om de toxiska tecknen tenderar att vara fördröjda (se hänvisning 11). Alla observationer registreras systematiskt, med individuella registreringar för varje djur.

Tilläggsobservationer behövs om djuren fortsätter att uppvisa tecken på toxicitet. Observationerna bör omfatta ändringar i hud och päls, ögon och slemhinnor samt även andningsorganen, cirkulationsorganen och det autonoma och centrala nervsystemet. Likaså bör den somatomotoriska aktiviteten och beteendemönstret observeras. Uppmärksamhet bör fästas vid observationer av tremor, konvulsioner, salivutsöndring, diarré, letargi, sömn och koma. Hänsyn bör tas till de principer och kriterier som anges i vägledningen om konsekvenserna för människor (se hänvisning 8). Djur som befinns vara döende och djur som visar tecken på svår smärta eller ihållande lidande bör avlivas skonsamt. I fall där djur avlivas av hänsyn till djurens välbefinnande eller hittas döda, bör tidpunkten för dödsfallet registreras så exakt som möjligt.

1.6.1 Kroppsvikt

Djurens individuella vikter bör registreras strax innan testämnet tillförs och därefter minst en gång per vecka. Alla viktändringar bör bestämmas och registreras. Vid testets slut vägs alla överlevande djur och därefter avlivas de skonsamt.

1.6.2 Patologi

Alla försöksdjur (inbegripet de som dött under testet eller som har avlivats av hänsyn till djurens välbefinnande) bör obduceras. Alla betydande patologiska förändringar bör registreras för varje djur. Användbar information kan även fås genom mikroskopundersökning av organ som uppvisar betydande skador och som härrör från djur som överlevt minst 24 timmar efter tillförsel av startdosen.

2. DATA

Data bör rapporteras individuellt per djur. Dessutom bör alla data sammanställas i tabellform. Tabellen ska för varje testgrupp visa antalet djur som använts, antalet djur som uppvisat tecken på toxicitet, antalet djur som under testets gång har dött eller avlivats av hänsyn till djurens välbefinnande, tidpunkterna för alla individuella dödsfall, en beskrivning av och förloppet för de toxiska verkningarna och deras reversibilitet samt obduktionsfynd.

3. RAPPORTERING

3.1 TESTRAPPORT

Testrapporten ska innehålla nedan angivna uppgifter, enligt det som är relevant:

Testämne: — Fysikalisk natur, renhet och, där det är relevant, fysikalkemiska egenskaper (inbegripet isomerisering). — Identifieringsdata, inbegripet CAS-nummer.

Vehikel (i förekommande fall). — Motivering för val av vehikel, om annan än vatten.

Försöksdjur: — Art och stam som använts. — Mikrobiologiska data för djuren, om dessa data är kända. — Antalet djur, deras ålder och kön (och i förekommande fall en motivering för användning av hanar i stället för honor). — Ursprung, förvaringsförhållanden, foder och dylikt.

Testbetingelser: — Detaljerade uppgifter om testämnets sammansättning, inbegripet uppgifter om den tillförda dosens fysikaliska form. — Uppgifter om hur testämnet har tillförts, inbegripet dosens volym och doseringstidpunkt. — Detaljerade uppgifter om foder- och vattenkvalitet (inbegripet diettyp/källa, vattenkälla). — Motivering för valet av startdos.

Resultat: — En tabell med responsdata och dosnivå för varje djur (djur som uppvisat tecken på toxicitet samt mortalitet, verkningarnas art, allvarlighetsgrad och varaktighet). — Tabell med kroppsvikt och förändringar av kroppsvikt. — Djurens individuella vikt på doseringsdagen och därefter med en veckas intervall, samt tidpunkten för dödsfall eller avlivning. — Datum och tidpunkt för dödsfall som inträffat före den planenliga avlivningen. — Tidsförloppet för när tecken på toxicitet sätter in och huruvida tecknen är reversibla, för varje djur. — Obduktionsfynd och histopatologiska fynd för varje djur, i förekommande fall.

Diskussion och tolkning av resultaten.

Slutsatser.

4. HÄNVISNINGAR

1. British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984), ”Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity”, Human Toxicol., 3, 85–92.

2. M. J. Van den Heuvel, A.D. Dayan och R.O. Shillaker (1987), ”Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity”, Human Toxicol., 6, 279–291.

3. M. J. Van den Heuvel, D.G. Clark, R.J. Fielder, P.P. Koundakjian, G.J.A. Oliver, D. Pelling, N.J. Tomlinson och A.P. Walker (1990), ”The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test”, Fd. Chem. Toxicol., 28, 469–482.

4. A. Whitehead och R.N. Curnow (1992), ”Statistical evaluation of the fixed-dose procedure”, Fd. Chem. Toxicol., 30, 313–324.

5. N. Stallard och A. Whitehead (1995), ”Reducing numbers in the fixed-dose procedure”, Human Exptl. Toxicol., 14, 315–323.

6. Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002), Statistical evaluation of the revised fixed dose pro cedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183–196.

7. OECD (2001), ”Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing”, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment, 24, Paris.

8. OECD (2000), ”Guidance Document on the Recognition”, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment, 19.

9. OECD (1998), ”Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2”, s. 11 (http://webnet1.oecd.org/oecd/ pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html).

10. R.L. Lipnick, J.A. Cotruvo, R.N. Hill, R.D. Bruce, K.A. Stitzel, A.P. Walker, I. Chu, M. Goddard, L. Segal, J.A. Springer och R.C. Myers (1995), ”Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures”, Fd. Chem. Toxicol., 33, 223–231.

11. P.K Chan och A.W. Hayes (1994), ”Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation, Principles and Methods of Toxicology”, 3rd Edition, red. A.W. Hayes, Raven Press, Ltd. New York, USA.

BILAGA 1 FLÖDESSCHEMA FÖR INLEDANDE TEST

BILAGA 2 FLÖDESSCHEMA FÖR HUVUDTEST

Bilaga 3 KRITERIER FÖR HUR TESTÄMNEN MED FÖRVÄNTADE LD50-VÄRDEN ÖVER 2 000 MG/KG KAN KLASSIFICERAS UTAN TESTNING Med hjälp av kriterierna för riskkategori 5 kan man identifiera testämnen som har en relativt låg risk för akut toxicitet men som under vissa omständigheter kan utgöra en risk för sårbara populationer. Dessa ämnen förväntas ha ett LD50-värde (oralt eller via huden) inom området 2 000–5 000 mg/kg eller motsvarande doser i fråga om andra tillförselvägar. Ett testämne kan klassificeras enligt riskkategorin 2 000 mg/kg < LD50 < 5 000 mg/kg (GHS-kategori 5) i följande fall: a) Om ämnet hänförs till denna kategori enligt utfallet i något av de testningsscheman som finns i bilaga 2, på grundval av mortalitet. b) Om det redan finns tillförlitliga bevis för att LD50-värdet ligger inom det intervall som motsvarar kategori 5 eller om tidigare djurförsök eller toxiska verkningar hos människor tyder på akut fara för människors hälsa. c) På grundval av extrapolering, uppskattning eller mätning av data, om det inte är motiverat att placera ämnet i en högre riskklass. — Om det finns tillförlitlig information som tyder på betydande toxiska verkningar hos människor, eller något av följande: — Mortalitet kan observeras vid testning med värden upp till kategori 4. — En bedömning av sakkunniga bekräftar betydande kliniska tecken på toxicitet vid testning upp till värden för kategori 4, med undantag av diarré, upprest päls eller ovårdat utseende. — En bedömning av sakkunniga bekräftar tillförlitlig information från andra djurförsök som tyder på förmågan till betydande akuta verkningar. TESTNING PÅ DOSNIVÅER ÖVER 2 000 MG/KG Undantagsvis, och endast när det kan motiveras med specifika tillsynskrav, får en ytterligare övre dosnivå på 5 000 mg/kg användas. Med hänsyn till djurens välbefinnande avråds testning på djur vid dosnivån 5 000 mg/kg. Sådan testning bör endast övervägas när det finns en stark sannolikhet för att resultaten har en direkt relevans för skyddet av djurs eller människors hälsa (9). Inledande test De beslutsregler som styr det sekventiella förfarandet enligt bilaga 1 utökas till att innefatta en dosnivå på 5 000 mg/kg. När en startdos på 5 000 mg/kg används vid ett inledande test och utfallet blir A (död) måste således ytterligare ett djur testas vid nivån 2 000 mg/kg, medan utfallen B och C (uppenbar toxicitet eller ingen toxicitet) gör det möjligt att använda 5 000 mg/kg som startdos i huvudtestet. På samma sätt gäller att om en startdos annan än 5 000 mg/kg används i ett test där man går vidare till 5 000 mg/kg efter att ha fått utfall B eller C vid nivån 2 000 mg/kg, leder ett utfall A på nivån 5 000 mg/kg till att huvudtestets startnivå blir 2 000 mg/kg medan utfallen B och C leder till 5 000 mg/kg som startnivå. Huvudtest De beslutsregler som styr det sekventiella förfarandet enligt bilaga 2 utökas till att innefatta en dosnivå på 5 000 mg/kg. Detta innebär att utfallet A (≥ 2 dödsfall) i ett huvudtest med startdosen 5 000 mg/kg leder till att en ytterligare grupp måste testas vid nivån 2 000 mg/kg, medan utfallet B (uppenbar toxicitet och/eller ≤ 1 dödsfall) eller C (ingen toxicitet) leder till att ämnet inte får någon klassificering enligt GHS. På liknande sätt gäller att om en startdos annan än 5 000 mg/kg används i ett test och man har gått vidare till dosnivån 5 000 mg/kg efter att ha fått utfall C vid dosnivån 2 000 mg/kg, leder utfallet A vid dosnivån 5 000 mg/kg till att ämnet anses tillhöra GHS-kategorin 5 medan utfall B eller C leder till att ämnet inte får någon klassificering.

Bilaga 4 TESTMETOD B.l b – Vägledning för klassificering enligt EU-Systemet, som gäller under övergängsperioden tills det globala harmoniserade systemet (GHS) för kassificering har genomförts helt (ur hänvisning 8)

B.1b AKUT TOXICITET ORALT – METOD FÖR BESTÄMNING AV AKUT TOXICITETSKLASS

1. METOD

Denna testmetod motsvarar OECD TG 423 (2001).

1.1 INLEDNING

Denna metod för bestämning av akut toxicitetsklass (se hänvisning 1) är ett stegvis förfarande där tre djur av samma kön används per steg. Beroende på mortaliteten och/eller förekomsten av döende djur behövs det i genomsnitt 2–4 steg för bedömningen av testämnets akuta toxicitet. Förfarandet är reproducerbart, kräver mycket få djur och ger en möjlighet att klassificera ämnen på ett liknande sätt som med de övriga metoderna för testning av akut toxicitet. Metoden för bestämning av akut toxicitetsklass baserar sig på biometriska bedömningar (se hänvisningarna 2, 3, 4 och 5) och fast definierade doser på tillräckligt separerade nivåer för att testämnet ska kunna kategoriseras för klassificering och riskbedömning. Metoden antogs 1996 och har validerats omfattande in vivo mot LD50-data som erhållits vid litteraturstudier, både nationellt (se hänvisning 6) och internationellt (se hänvisning 7).

Riktlinjer för valet av den lämpligaste testmetoden för ett bestämt ändamål finns i vägledningen för testning av akut oral toxicitet (se hänvisning 8). I vägledningsdokumentet finns även tilläggsinformation rörande utförandet av testmetod B.1b och tolkningen av resultaten.

Testämnesdoser som, på grund av frätande eller allvarligt irriterande verkningar, är kända att orsaka klar smärta och svårt lidande behöver inte ges. Döende djur eller djur som uppvisar klara tecken på smärta eller allvarligt och ihållande lidande ska avlivas skonsamt, och vid tolkningen av testresultaten ska dessa djur beaktas på samma sätt som djur som har dött under testets gång. Kriterierna för beslut rörande avlivning av döende eller svårt lidande djur, liksom även vägledning om igenkänning av förutsägbar eller annalkande död, behandlas i en separat vägledning (se hänvisning 9).

Metoden bygger på användning av fast definierade doser, och resultatet ger en möjlighet att kategorisera och klassificera ett ämne enligt det globala harmoniserade systemet (GHS) för klassificering och märkning av kemikalier som orsakar akut toxicitet (se hänvisning 10).

Även om metoden i princip inte är avsedd att användas för beräkning av exakta LD50-värden ger den ändå en möjlighet att bestämma exponeringsområden där ämnets verkan sannolikt är dödlig, eftersom den viktigaste ändpunkten för detta test fortfarande är andelen djur som dör. Bestämning av ett LD50-värde med denna metod kan endast göras när minst två doser leder till en mortalitet som är högre än 0 % och lägre än 100 %. Eftersom testningen alltid utförs med fast definierade doser, oavsett vilket ämne som testas, och klassificeringen uttryckligen är bunden till antalet djur som reagerar på ett visst sätt, ökas möjligheterna till enhetliga testrapporter och repeterbarhet mellan olika laboratorier.

Testningslaboratoriet bör analysera all tillgänglig information om testämnet innan själva testningen genomförs. Sådan information inbegriper ämnets identitet och kemiska struktur, fysikalkemiska egenskaper, resultaten från andra eventuella in vivo- eller in vitro-test avseende toxicitet, toxikologiska data om strukturellt närbesläktade ämnen och ämnets förutsedda användningsändamål. Denna information behövs för att avgöra huruvida testet är relevant för skyddet av människors hälsa, och utgör en hjälp vid valet av en optimal startdos.

1.2 DEFINITIONER

Akut toxicitet (oralt): De skadliga verkningar som uppträder efter oral tillförsel av en engångsdos av ett ämne eller upprepade doser som ges inom 24 timmar.

Fördröjd död: Det att ett djur inte dör eller är döende inom 48 timmar, men dör senare under den 14 dagar långa observationsperioden.

Dos: Den mängd testämne som tillförs. Dosen uttrycks som vikten testämne per viktenhet försöksdjur (exempelvis mg/kg).

GHS: Globala harmoniserade systemet för klassificering och märkning av kemikalier och blandningar. Systemet utarbetas gemensamt inom OECD (människors hälsa och miljö), FN:s expertkommitté om transport av farligt gods (fysikalkemiska egenskaper) och ILO (varningar). Samordningen sker genom det gemensamma programmet för sund kemikaliehantering (IOMC).

Annalkande död: När ett djur troligen är döende eller har dött före den nästa planenliga observationstidpunkten. Tecken som tyder på detta tillstånd kan hos gnagare inbegripa konvulsioner, kroppsställning på sidan, bakåtlutad kroppsställning och tremor (närmare uppgifter finns i vägledningen om konsekvenser för människor, se hänvisning 9).

LD50 (median letal dos, oralt): En statistiskt fastställd engångsdos som troligen leder till döden för 50 % av de djur som har tillförts dosen oralt. LD50-värdet uttrycks som vikten testämne per viktenhet försöksdjur (mg/kg).

Gränsdos: En testdos vid den övre gränsnivån (2 000 eller 5 000 mg/kg).

Döende djur: Ett djur som håller på att dö eller som har små chanser att överleva, även om det får behandling (närmare uppgifter finns i vägledningen om konsekvenser för människor, se hänvisning 9).

Förutsägbar död: Förekomsten av kliniska tecken som tyder på död vid en känd framtida tidpunkt som infaller före försökets planerade avslutningstidpunkt, exempelvis oförmåga att nå vatten eller föda (närmare uppgifter finns i vägledningen om konsekvenser för människor, se hänvisning 9).

1.3 PRINCIP FÖR TESTMETODEN

Testmetoden bygger på principen om att man genom ett stegvis förfarande med ett minimalt antal djur per steg kan få tillräcklig information om testämnets akuta toxicitet för att det ska vara möjligt att klassificera ämnet. Ämnet tillförs oralt till en grupp försöksdjur vid en av de definierade dosnivåerna. Ämnet testas genom ett stegvis förfarande med tre djur av samma kön (i regel honor) per steg. Avsaknaden eller förekomsten av ämnesrelaterad mortalitet hos de djur som doserats på ett visst steg avgör vilket av följande som blir nästa steg:

— Ingen ytterligare testning behövs.

— Ytterligare tre djur tillförs en lika stor dos.

— Ytterligare tre djur tillförs en dos på nästa högre eller lägre dosnivå.

Testningsförfarandet beskrivs närmare i bilaga 1. När denna metod används kan testämnet genom de olika utfallen placeras i en av de toxicitetsklasser som definieras genom fasta LD50-gränsvärden.

1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN

1.4.1 Val av djurart

Rekommenderad gnagare är råtta, även om testet kan utföras med andra gnagare. I regel används hondjur (se hänvisning 9). Skälet till detta är att litteraturundersökningar av konventionella LD50-test tyder på att känslighetsskillnaderna mellan könen är små, men att honorna i förekommande fall ofta är en aning mer känsliga (se hänvisning 11). Om däremot kunskaperna om strukturellt närbesläktade ämnens toxikologiska eller toxikokinetiska egenskaper tyder på att hanarna sannolikt är känsligare än honorna bör hanar användas. Om testet görs på hanar bör tillbörlig motivering ges.

Djuren bör vara unga och friska vuxna exemplar som härrör från normala laboratoriestammar. Hondjuren får inte ha fött ungar och får inte vara dräktiga. När dostillförseln inleds ska djuret vara mellan 8 och 12 veckor gammalt, och variationerna i vikt får vara högst ± 20 % av medelvikten för alla tidigare djur som har doserats.

1.4.2 Förvarings- och utfodringsbetingelser

Temperaturen i testdjurens utrymmen bör vara 22 oC (± 3 oC). Den relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och ska helst inte överstiga 70 %, utom när rummet rengörs. Målvärdet bör dock vara 50–60 %. Belysningen bör vara artificiell med omväxlande 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. För utfodringen kan konventionellt laboratoriefoder användas, och djuren bör ha obegränsad tillgång till dricksvatten. Djur som tillförs doser på samma nivå kan inhysas i samma bur, men antalet djur per bur får inte vara högre än att klara observationer kan göras av varje djur.

1.4.3 Förberedelse av djuren

Djuren väljs ut slumpmässigt och förses med märkning så att de kan identifieras individuellt Därefter får djuren acklimatisera sig till laboratoriets betingelser i sina burar i minst 5 dagar före doseringsstart.

1.4.4 Förberedelse av doserna

I regel ska de olika doserna av testämnet tillföras i en konstant volym, vilket innebär att doserna har varierande koncentration. När slutprodukter i vätskeform eller blandningar testas, kan det med tanke på riskbedömningen vara mer relevant att använda testämnet i outspädd form (konstant koncentration), vilket även förutsätts av vissa tillsynsmyndigheter. Den maximala dosvolymen för tillförsel får aldrig överskridas. Den största mängd vätska som kan tillföras vid ett och samma tillfälle beror på testdjurets storlek. För gnagare bör denna volym i regel inte överskrida 1 ml per 100 g kroppsvikt. I fråga om vattenlösningar får dock 2 ml per 100 g kroppsvikt användas. För tillförsel av dosen rekommenderas alltid i första hand lösning, suspension eller emulsion i vatten, sedan lösning, suspension eller emulsion i olja (exempelvis majsolja) och därefter eventuella andra vehiklar. I fråga om andra vehiklar än vatten måste de toxikologiska egenskaperna vara kända. Doserna måste beredas strax före tillförseln, om inte preparatets stabilitet är känd och har påvisats vara godtagbar över hela användningsperioden.

1.5 FÖRFARANDE

1.5.1 Tillförsel av doser

Testämnet tillförs som en engångsdos genom sondmatning med hjälp av magsond eller lämplig intubationskanyl. I det sällsynta fall det inte är möjligt med en engångsdos, kan dosen tillföras i mindre delar över en period som inte överskrider 24 timmar.

Före dostillförseln hålls djuren fastande (utan föda och med tillgång till vatten, för råttor över natten och för möss i 3–4 timmar). Efter fasteperioden vägs djuren och testämnet tillförs. Efter tillförsel av ämnet kan djuren hållas utan föda i ytterligare 3–4 timmar (råttor) respektive 1–2 timmar (möss). Om dosen tillförs i delar över en tidsperiod kan det vara nödvändigt att ge djuren föda och vatten, beroende på tidsperiodens längd.

1.5.2 Antalet djur och dosnivåer

Tre djur används per steg. För startdosen väljs en av fyra fast definierade nivåer (5, 50, 300 eller 2 000 mg per kg kroppsvikt). För startdosen väljs den nivå som högst sannolikt leder till att ett antal av de doserade djuren dör. I flödesschemat i bilaga 1 beskrivs de förfaranden som gäller för de olika startdoserna. Dessutom innehåller bilaga 4 vägledning om klassificeringen enligt EU-systemet, som gäller tills det att det nya GHS-systemet har genomförts.

Om den tillgängliga informationen tyder på att inga djur dör vid den högsta startdosnivån (2 000 mg per kg kroppsvikt) bör ett gränstest utföras. Om det inte finns någon information tillgänglig om testämnet, rekommenderas med hänsyn till djurens välbefinnande att startdosen 300 mg per kg kroppsvikt används.

Tidsintervallet mellan dostillförseln till de olika grupperna bestäms av start, varaktighet och allvarlighets-grad för de toxiska tecknen. Doseringen av djuren på nästa dosnivå bör inte inledas förrän det råder säkerhet om de tidigare doserade djurens överlevnad.

Undantagsvis, och endast när det kan motiveras med specifika tillsynskrav, får en ytterligare övre dosnivå på 5 000 mg per kg kroppsvikt användas (se bilaga 2). Med hänsyn till djurens välbefinnande avråds testning på djur när det gäller GHS-kategori 5 (2 000–5 000 mg per kg kroppsvikt). Sådan testning bör endast övervägas när det finns en stark sannolikhet för att resultaten har direkt relevans för skyddet av människors eller djurs hälsa eller av miljön.

1.5.3 Gränstest

Gränstest används primärt i situationer där laboratoriet har information som tyder på att testämnet sannolikt inte är toxiskt (toxiskt endast ovanför de gränsdoser som anges i gällande föreskrifter). Information om testämnets toxicitet kan härledas från kunskaperna om liknande testade ämnen eller liknande testade blandningar eller produkter, med hänsyn tagen till identiteten och halten av de komponenter som har känd toxikologisk signifikans. Om informationen om ämnets toxicitet är bristfällig eller saknas, eller om ämnet troligen är toxiskt, bör huvudtestet genomföras.

Ett gränstest vid en dosnivå 2 000 mg per kg kroppsvikt kan utföras med sex djur (tre djur per steg). Undantagsvis kan ett gränstest på dosnivån 5 000 mg per kg kroppsvikt utföras med tre djur (se bilaga 2). Om testämnet orsakar dödsfall måste eventuellt ytterligare testning utföras på närmaste lägre nivå.

1.6 OBSERVATIONER

Efter doseringen observeras djuren individuellt minst en gång under de första 30 minuterna, periodiskt under de första 24 timmarna (med särskild uppmärksamhet under de första 4 timmarna) och därefter dagligen under totalt 14 dagar. Detta gäller inte för djur som av hänsyn till djurens välbefinnande måste avlivas skonsamt eller för djur som hittas döda. Observationsperiodens längd bör dock ha en anpassningsmån. Längden bör bestämmas enligt de toxiska reaktionerna, tidpunkten för när de sätter in och återhämtningsperiodens längd. Observationsperioden kan således förlängas om det anses vara nödvändigt. Tidpunkten då tecken på toxicitet uppträder och försvinner är viktig, särskilt om de toxiska tecknen tenderar att vara fördröjda (se hänvisning 12). Alla observationer registreras systematiskt, med individuella registreringar för varje djur.

Tilläggsobservationer behövs om djuren fortsätter att uppvisa tecken på toxicitet. Observationerna bör omfatta förändringar i hud och päls, ögon och slemhinnor samt även andningsorganen, cirkulationsorganen och det autonoma och centrala nervsystemet. Likaså bör den somatomotoriska aktiviteten och beteendemönstret observeras. Uppmärksamhet bör fästas vid observationer av tremor, konvulsioner, salivutsöndring, diarré, letargi, sömn och koma. Hänsyn bör tas till de principer och kriterier som anges i vägledningen om konsekvenser för människor (se hänvisning 8). Djur som befinns vara döende och djur som visar tecken på svår smärta eller ihållande lidande bör avlivas skonsamt. I fall där djur avlivas av hänsyn till djurens välbefinnande eller hittas döda, bör tidpunkten för dödsfallet registreras så exakt som möjligt.

1.6.1 Kroppsvikt

Djurens vikt bör registreras individuellt strax före testämnet tillförs och därefter minst en gång per vecka. Alla viktändringar bör bestämmas och registreras. Vid testets slut vägs alla överlevande djur och avlivas därefter skonsamt.

1.6.2 Patologi

Alla försöksdjur (inbegripet de som dött under testet eller som har avlivats av hänsyn till djurens välbefinnande) bör obduceras. Alla betydande patologiska förändringar bör registreras för varje djur. Användbar information kan även fås genom mikroskopundersökning av organ som uppvisar betydande skador och som härrör från djur som överlevt minst 24 timmar efter tillförsel av startdosen.

2. DATA

Data bör rapporteras individuellt per djur. Dessutom bör alla data sammanställas i tabellform. Tabellen ska för varje testgrupp visa antalet djur som använts, antalet djur som uppvisat tecken på toxicitet, antalet djur som under testets gång har dött eller avlivats av hänsyn till djurens välbefinnande, tidpunkterna för alla individuella dödsfall, en beskrivning av och förloppet för de toxiska verkningarna och deras reversibili-tet samt obduktionsfynd.

3. RAPPORTERING

3.1 Testrapport

Testrapporten ska innehålla nedan angivna uppgifter, enligt det som är relevant:

Testämne: — Fysikalisk natur, renhet och, där det är relevant, fysikalkemiska egenskaper (inbegripet isomerisering). — Identifieringsdata, inbegripet CAS-nummer.

Vehikel (i förekommande fall). — Motivering för val av vehikel, om annan än vatten.

Försöksdjur: — Art och stam som använts. — Mikrobiologiska data för djuren, om dessa data är kända. — Antalet djur, deras ålder och kön (och i förekommande fall en motivering för användning av hanar i stället för honor). — Ursprung, förvaringsförhållanden, foder och dylikt.

Testbetingelser: — Detaljerade uppgifter om testämnets sammansättning, inbegripet uppgifter om den tillförda dosens fysikaliska form. — Uppgifter om hur testämnet har tillförts, inbegripet dosens volym och doseringstidpunkten. — Detaljerade uppgifter om foder- och vattenkvalitet (inbegripet diettyp/källa, vattenkälla). — Motivering för valet av startdos.

Resultat: — En tabell med responsdata och dosnivå för varje djur (djur som uppvisat tecken på toxicitet samt mortalitet, verkningarnas natur, allvarlighetsgrad och varaktighet). — Tabell med kroppsvikt och förändringar av kroppsvikt. — Djurens individuella vikt på doseringsdagen och därefter med en veckas intervall, samt tidpunkten för dödsfall eller avlivning. — Datum och tidpunkt för dödsfall som inträffat före den planenliga avlivningen. — Tidsförloppet för när tecken på toxicitet sätter in och huruvida dessa är reversibla, för varje djur. — Obduktionsfynd och histopatologiska fynd för varje djur, i förekommande fall.

Diskussion och tolkning av resultaten.

Slutsatser.

4. HÄNVISNINGAR

1. Roll R., Höfer-Bosse T. and Kayser D. (1986), New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86.

2. Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989), Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336–341.

3. Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994), The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral), Arch. Toxicol. 68, 559–610.

4. Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995), The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729–734.

5. Diener W. and Schlede E. (1999), Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129–134.

6. Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992), A National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455–470.

7. Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994), The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659–670.

8. OECD (2001), Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.

9. OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 19.

10. OECD (1998), Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environ mental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1. oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380, EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].

11. Lipnick R.L., Cotruvo J.A., Hill R.N., Bruce R.D., Stitzel K.A., Walker A.P., Chu I., Goddard M., Segal L., Springer J.A. and Myers R.C. (1995), Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223–231.

12. Chan P.K. and Hayes A.W. (1994), Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.

Bilaga 1 FÖRFARANDEN SOM BÖR FÖLJAS BEROENDE PÅ STARTDOS ALLMÄNNA ANMÄRKNINGAR För de olika startdoserna finns det olika testningsscheman som bör följas, enligt beskrivningen i denna bilaga. — Bilaga 1 a: Startdosen är 5 mg per kg kroppsvikt. — Bilaga 1 b: Startdosen är 50 mg per kg kroppsvikt. — Bilaga 1 c: Startdosen är 300 mg per kg kroppsvikt. — Bilaga 1 d: Startdosen är 2 000 mg per kg kroppsvikt. Testningens förlopp anges av pilarna och beror på antalet avlivade djur eller djur som dött. Bilaga 1 A TESTFÖRFARANDE MED STARTDOSEN 5 MG PER KG KROPPSVIKT Bilaga 1 B TESTFÖRFARANDE MED STARTDOSEN 50 MG PER KG KROPPSVIKT Bilaga 1 C TESTFÖRFARANDE MED STARTDOSEN 300 MG PER KG KROPPSVIKT Bilaga 1 D TESTFÖRFARANDE MED STARTDOSEN 2 000 MG PER KG KROPPSVIKT

Bilaga 2 KRITERIER FÖR HUR TESTÄMNEN MED FÖRVÄNTADE LD50-VÄRDEN ÖVER 2 000 MG/KG KAN KLASSIFICERAS UTAN TESTNING Med hjälp av kriterierna för riskkategori 5 kan man identifiera testämnen som har en relativt låg risk för akut toxicitet men som under vissa omständigheter kan utgöra en risk för sårbara populationer. Dessa ämnen förväntas ha ett LD50-värde (oralt eller via huden) inom området 2 000–5 000 mg/kg eller motsvarande doser i fråga om andra tillförselvägar. Ett testämne kan klassificeras enligt riskkategorin 2 000 mg/kg < LD50 < 5 000 mg/kg (GHS-kategori 5) i följande fall: a) Om ämnet hänförs till denna kategori enligt utfallet i något av de testningsscheman som finns i bilaga 1A–1 D, på grundval av mortalitet. b) Om det redan finns tillförlitliga bevis för att LD50-värdet ligger inom det intervall som motsvarar kategori 5 eller om tidigare djurförsök eller toxiska verkningar hos människor tyder på akut fara för människors hälsa. c) På grundval av extrapolering, uppskattning eller mätning av data, om det inte är motiverat att placera ämnet i en högre riskklass. — Om det finns tillförlitlig information som tyder på betydande toxiska verkningar hos människor, eller något av följande: — Mortalitet kan observeras vid testning med värden upp till kategori 4 via oral tillförsel. — Om en bedömning av sakkunniga bekräftar signifikanta kliniska tecken på toxicitet vid testning med värden upp till kategori 4, med undantag av diarré, upprest päls eller ett ovårdat utseende. — Om en bedömning av sakkunniga bekräftar tillförlitlig information från andra djurförsök som tyder på förmåga till signifikanta akuta verkningar. TESTNING PÅ DOSNIVÅER ÖVER 2 000 MG/KG Med hänsyn till djurens välbefinnande avråds testning på djur när det gäller kategori 5 (5 000 mg/kg). Sådan testning bör endast övervägas när det finns en hög sannolikhet för att resultaten har direkt relevans för skyddet av djurens eller människors hälsa (se hänvisning 10). Ingen ytterligare testning bör utföras vid högre dosnivåer. I nödvändiga fall används en dos på 5 000 mg/kg i ett enda steg (tre djur). Om det först doserade djuret dör, fortsätts doseringen till 2 000 mg/kg i enlighet med flödesschemat i bilaga 1. Om det första djuret överlever, doseras ytterligare två djur. Om endast ett av de tre djuren dör antas LD50-värdet överskrida 5 000 mg/kg. Om de två djuren dör fortsätts doseringen med 2 000 mg/kg.

Bilaga 3 TESTMETOD B.1b: Vägledning för klassificering enligt EU-systemet, som gäller tills det globala harmoniserade systemet för klassificering och märkning av kemikalier (GHS) har genomförts helt (ur hänvisning 8)

B.2 AKUT TOXICITET (INANDNING)

1. METOD

1.1 INLEDNING

Det är användbart att ha förhandsupplysningar om ämnets partikelstorleksfördelning, ångtryck, smältpunkt, kokpunkt, flampunkt och eventuellt explosiva egenskaper.

Se allmän inledning till del B (A).

1.2 DEFINITIONER

Se allmän inledning till del B (B).

1.3 REFERENSÄMNEN

Inga.

1.4 TESTMETODSPRINCIP

Flera grupper av försöksdjur exponeras under en angiven period för testämnet i graderade koncentrationer, en bestämd koncentration per grupp. Därefter observeras effekter och dödsfall. Djur som dör under försöket ska obduceras och i slutet av försöket obduceras överlevande djur.

Det kan vara nödvändigt att på ett humant sätt avliva djur som uppvisar ihållande tecken på stark smärta och lidande. Undersökningar av ämnen på ett sätt som på grund av deras frätande eller irriterade egenskaper vållar avsevärd smärta och lidande behöver inte utföras.

1.5 KVALITETSKRITERIER

Inga.

1.6 METODBESKRIVNING

1.6.1 Förberedelser

I minst fem dagar före försöket ska djuren hållas under testbetingelser vad beträffar miljö och utfodring. Före försöket fördelas friska könsmogna djur slumpmässigt i erforderligt antal behandlingsgrupper. De behöver inte utsättas för simulerad exponering om detta inte indiceras av den typ av exponeringsapparatur som används.

Det kan vara nödvändigt att mikronisera fasta testämnen för att erhålla lämplig partikelstorlek.

Vid behov kan lämplig vehikel tillsättas till testämnet för att göra det lättare att uppnå en lämplig koncentration av testämnet i atmosfären. I sådana fall ska försöket omfatta en kontrollgrupp som exponeras för vehikeln. Om den vehikel eller annan additiv substans används för att underlätta dosering ska det vara påvisat att dessa inte framkallar toxiska effekter. Här kan tidigare insamlade data användas, om så bedöms vara lämpligt.

1.6.2 Testbetingelser

1.6.2.1 Försöksdjur

Om det inte finns kontraindikationer är råttan förstahandsvalet. De vanligen nyttjade laboratoriestammarna ska användas. För både han- och honkön gäller att vikten hos djur som används i ett försök inte får avvika mer än ± 20 % från en rimlig genomsnittsvikt.

1.6.2.2 Antal och kön

Minst 10 gnagare (fem honor och fem hanar) används på varje koncentrationsnivå. Honorna får inte ha fött ungar och får inte vara dräktiga.

Anmärkning: Vid användning av djur som är högre upp i näringskedjan än gnagare vid tester av akut toxicitet ska man överväga användning av ett mindre antal djur. Doserna ska fastställas med omsorg och man ska anstränga sig för att inte utnyttja högre doser än moderat toxiska doser. Vid sådana undersökningar bör tillförsel av dödliga doser av testämnet undvikas.

1.6.2.3 Exponeringskoncentrationer

Till försöket ska användas ett tillräckligt antal exponeringskoncentrationer, minst tre, som ska vara så valda att man får en gradering av de toxiska effekterna och av dödligheten i behandlingsgrupperna. Datauppgifterna ska vara tillräckliga för framställning av en koncentrations-/dödlighetskurva och, om möjligt, för att medge en rimlig bestämning av LC50.

1.6.2.4 Gränstest

Om en exponering av fem han- och fem hondjur med 20 mg/l av en gas eller 5 mg/l av en aerosol eller ett stoft under fyra timmar (eller om detta inte är möjligt på grund av det testade ämnets fysikaliska eller kemiska, inbegripet explosiva, egenskaper, den högsta koncentration som kan uppnås) inte har produktrelaterad dödlig verkan inom 14 dagar, kan ytterligare försök anses som överflödiga.

1.6.2.5 Exponeringstid

Exponeringstiden är fyra timmar.

1.6.2.6 Utrustning

Djuren ska testas med inhalationsutrustning som utformats så att den upprätthåller en dynamisk luftcirkulation med minst 12 luftväxlingar per timme, för att säkerställa en tillräcklig syrehalt och en jämnt fördelad exponeringsatmosfär. Om exponeringskammare används ska den vara så utformad att trängseln bland försöksdjuren minimeras och exponeringen för testämnet genom inandning maximeras. Som en allmän regel för att säkerställa en stabi] atmosfär i en kammare, ska försöksdjurens totala ’volym’ inte överstiga 5 % av exponeringskammarens volym. Exponeringen kan göras genom kammare för mun-näsa, enbart huvudet eller hela försöksdjurets kropp; vid användning av de två första metoderna kan man minska möjligheten att testämnet upptas via andra vägar.

1.6.2.7 Observationstid

Observationstiden ska vara minst 14 dagar. Observationstiden ska emellertid inte vara strikt fastställd utan ska bestämmas utifrån de toxiska reaktionerna, tidpunkten för deras uppträdande och återhämtningsperiodens längd. Den kan följaktligen förlängas när detta anses nödvändigt. Tidpunkten vid vilken tecken på toxicitet uppträder respektive försvinner och tidpunkten för dödsfall är viktiga, särskilt om det finns en tendens till att sena dödsfall inträffar.

1.6.3 Förfarande

Omedelbart före exponering ska djuren vägas varefter de exponeras för testkoncentrationen i den aktuella apparaturen i minst fyra timmar, efter det att jämvikt har uppnåtts för koncentrationen i kammaren. Jämvikt ska uppnås på kort tid. Temperaturen under försöket ska hållas vid 22 ± 3 oC. Under ideala betingelser ska den relativa luftfuktigheten hållas mellan 30 % och 70 %, men i vissa fall (t.ex. test med aerosoler) kan detta vara praktiskt ogenomförbart. Ett svagt undertryck i kammaren (5 mm vatten) förhindrar att testämnet läcker ut i det omgivande rummet. Under exponeringen ska djuren undanhållas foder och vatten. Ett dynamiskt respirationssystem med ett lämpligt analytiskt kontrollsystem ska användas. Ett försökstest rekommenderas för att fastställa lämpliga exponeringskoncentrationer. Systemet ska vara sådant att det så snabbt som möjligt går att säkerställa stabila exponeringsbetingelser. Lufthastigheten ska justeras för att säkerställa att betingelserna är homogena i hela exponeringskammaren.

Mätning eller kontroll ska göras av:

a) Lufthastighet (fortlöpande).

b) Den faktiska koncentrationen av testämnet mätt i respirationszonen minst tre gånger under exponeringen (vissa atmosfärer, t.ex. aerosoler med höga koncentrationer, kan behöva kontrolleras oftare). Under exponeringsperioden ska koncentrationen inte avvika mer än ± 15 % från den genomsnittliga koncentrationen. En sådan kontrollnivå kan emellertid var omöjlig att uppnå vid test med stoft och vissa aerosoler, och i sådana fall kan större avvikelser accepteras. För aerosoler ska analys av partikelstorleken göras så ofta som möjligt (minst en gång per försöksgrupp).

c) Temperatur och luftfuktighet, fortlöpande om möjligt.

Under och efter exponering ska observationer göras och registreras systematiskt för varje enskilt djur. Den första dagen ska täta observationer göras. En grundlig klinisk undersökning ska göras minst en gång varje arbetsdag, andra observationer ska göras dagligen och lämpliga åtgärder ska vidtas för att minimera förlust av djur som ingår i studien, t.ex. ska djur som hittas döda obduceras eller nedfrysas och svaga eller döende djur ska isoleras eller avlivas.

Observation ska omfatta hud- och pälsförändringar, ögon, slemhinnor, respirations- och cirkulationssystem, autonoma och centrala nervsystemet samt kroppsmotorik och beteendemönster. Särskilt uppmärksamhet ska ägnas åt observation av andningsbeteende, skälvningar, kramper, salivavsöndring, diarré, letargi, sömn och koma. Tidpunkten för dödsfall ska registreras så noggrant som möjligt. De enskilda djurens vikt ska bestämmas varje vecka efter exponeringen och vid dödsfall.

Djur som dör under försöket ska obduceras och i slutet av försöket ska överlevande djur obduceras, särskilt med avseende på eventuella förändringar av övre och nedre andningsvägarna. Alla makroskopiska patologiska förändringar ska registreras. Vid sådana indikationer ska vävnadsprover tas för histopatologisk undersökning.

2. DATA

Data ska ställas upp i tabellform och för varje behandlingsgrupp ska anges antal djur i början av försöket, tidpunkten för enskilda djurs dödsfall, antal djur som visar andra tecken på toxicitet, beskrivning av toxiska effekter och obduktionsfynd. De enskilda försöksdjurens vikt ska bestämmas och registreras om överlevnaden överstiger en dag efter exponeringen. Avlivning av djur på grund av ämnesrelaterat lidande och smärta ska registreras som ämnesrelaterade dödsfall. LC50 ska bestämmas enligt en vedertagen metod. Utvärderingen av data ska omfatta eventuellt samband mellan djurens exponering för testämnet och omfattningen och svårighetsgrad av alla abnormiteter, inklusive beteendemässiga och kliniska abnormiteter, makroskopiska lesioner, ändringar av kroppsvikt, dödlighet och eventuella andra toxikologiska effekter.

3. RAPPORTERING

3.1 TESTRAPPORT

Testrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter:

— Djurart, stam, härkomst, miljöbetingelser, foder osv.

— Testbetingelser; beskrivning av exponeringsapparaturen inklusive utformning, typ, dimensioner, luftkälla, system för framställning av finfördelade ämnen och aerosoler, metod att konditionera luften och sätt att hålla djuren i en försökskammare när sådan används. Utrustning för mätning av temperatur, luftfuktighet och finfördelade aerosolers koncentration och storlek ska beskrivas.

Exponeringsdata

Dessa ska ställas upp i tabellform och presenteras med medelvärden och ett spridningsmått (t.ex. standardavvikelse) och ska, om möjligt, omfatta

a) lufthastighet genom inhalationsutrustningen,

b) luftens temperatur och fuktighet,

c) nominella koncentrationer (total mängd testämne som tillförts inhalationsutrustningen, dividerat med luft volymen),

d) typ av vehikel, om sådan används,

e) faktiska koncentrationer i försökets respirationszon,

f) massmedianen av den aerodynamiska diametern (MMAD) och den geometriska standardavvikelsen (GSD),

g) jämviktsperiod,

h) exponeringstid — Tabelluppställning av responsdata efter kön och exponeringsnivå (dvs. antal döda djur, antal djur som upp visar tecken på toxicitet, antal exponerade djur). — Dödstidpunkt under eller efter exponering, motivering och använda kriterier för human avlivning av djur. — Alla observationer. — LC50-värde för varje kön bestämt i slutet av observationsperioden (med angivande av bestämningsmetod). — 95 % tillförlitlighetsintervall för LC50 (om detta är möjligt). — Dos-/dödlighetskurva och lutning (om bestämningsmetoden medger detta). — Obduktionsfynd. — Eventuella histopatologiska fynd. — Diskussion av resultaten (med särskild uppmärksamhet på om human avlivning av djur under försöket kan ha inverkat på det beräknade LD50-värdet). — Tolkning av resultaten.

3.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING

Se allmän inledning till del B (D).

4. HÄNVISNINGAR

Se allmän inledning till del B (E).

B.3 AKUT TOXICITET (DERMALT)

1. METOD

1.1 INLEDNING

Se allmän inledning till del B (A).

1.2 DEFINITIONER

Se allmän inledning till del B (B).

1.3 REFERENSÄMNEN

Inga.

1.4 TESTMETODSPRINCIP

Testämnet appliceras i graderade doser på huden till flera grupper av försöksdjur, en bestämd dos per grupp. Därefter observeras effekter och dödsfall. Djur som dör under försöket ska obduceras och i slutet av försöket obduceras överlevande djur.

Det kan vara nödvändigt att på ett humant sätt avliva djur som uppvisar ihållande tecken på stark smärta och lidande. Undersökningar av ämnen på ett sätt som på grund av deras frätande eller irriterade egenskaper vållar avsevärd smärta och lidande behöver inte utföras.

1.5 KVALITETSKRITERIER

Inga.

1.6 METODBESKRIVNING

1.6.1 Förberedelser

I minst fem dagar före försöket ska djuren hållas under testbetingelserna vad beträffar miljö och utfodring. Före försöket fördelas friska könsmogna djur slumpmässigt i behandlingsgrupper. Ungefär 24 timmar före testet ska päls avlägsnas från djurens rygg genom klippning eller rakning. Vid klippning eller rakning ska försiktighet iakttas så att huden inte skadas, eftersom det kan ändra dess genomtränglighet. Minst 10 % av kroppsytan ska göras klar för applicering av testämnet. Vid test av fasta ämnen, som får pulvriseras om det är lämpligt, ska testämnet fuktas tillräckligt med vatten eller, vid behov med lämplig vehikel, för att säkerställa god kontakt med huden. När vehikel används ska hänsyn tas till vehikelns inverkan på testämnets penetrering av huden. Flytande testämnen används vanligen outspädda.

1.6.2 Testbetingelser

1.6.2.1 Försöksdjur

Könsmogna råttor eller kaniner får användas. Andra arter kan användas men i så fall ska detta motiveras. De vanligen nyttjade laboratoriestammarna ska användas. För både han- och honkön gäller att vikten hos djur som används i ett försök inte får avvika mer än ± 20 % från en rimlig genomsnittsvikt.

1.6.2.2 Antal och kön

Minst 5 djur ska användas på varje dosnivå. De ska alla vara av samma kön. Om hondjur används får de inte ha fött ungar och får inte vara dräktiga. Om det finns information som visar att ett kön är väsentligt mer känsligt ska djur av detta kön användas.

Anmärkning: Vid användning av djur som är högre upp i näringskedjan än gnagare vid tester av akut toxicitet ska man överväga användning av ett mindre antal djur. Doserna ska fastställas med omsorg och man ska anstränga sig för att inte utnyttja högre doser än moderat toxiska doser. Vid sådana undersökningar bör tillförsel av dödliga doser av testämnet undvikas.

1.6.2.3 Dosnivåer

Till försöket ska användas ett tillräckligt antal dosnivåer, minst tre, som ska vara så valda att man får en gra-dering av de toxiska verkningarna och av dödligheten i behandlingsgrupperna. När dosnivåerna bestäms ska hänsyn tas till eventuellt irriterande eller trätande effekter. Datauppgifterna ska vara tillräckliga för framställning av en dos-/responskurva och, om möjligt, för att medge en rimlig bestämning av LD50.

1.6.2.4 Gränstest

Ett gränstest med en dosnivå av minst 2 000 mg/kg kroppsvikt kan utföras med en grupp av fem djur av varje kön enligt ovan beskrivna förfarande. Om ämnesrelaterade dödsfall inträffar bör en fullständig undersökning övervägas.

1.6.2.5 Observationsperiod

Observationstiden ska vara minst 14 dagar. Observationstiden ska emellertid inte vara strikt fastställd utan ska bestämmas utifrån de toxiska reaktionerna, tidpunkten för deras uppträdande och återhämtningsperiodens längd. Den kan följaktligen förlängas när detta anses nödvändigt. Tidpunkten vid vilken tecken på toxicitet uppträder respektive försvinner och tidpunkten för dödsfall är viktiga, särskilt om det finns en tendens till att sena dödsfall inträffar.

1.6.3 Förfarande

Djuren ska hållas i var sin bur. Testämnet ska appliceras jämnt över ett område som motsvarar ungefär 10 % av den totala kroppsytan. Vid användning av kraftigt toxiska ämnen kan en mindre yta täckas, men ämnet ska appliceras på ytan i ett så tunt och jämnt lager som möjligt.

Testämnen ska hållas i kontakt med huden med en porös gaskompress och icke hudirriterande tejp under en 24 timmar lång exponeringstid. Testytan ska vidare täckas på lämpligt sätt för att säkerställa att gaskompressen och testämnet hålls på plats så att djuren inte kan svälja testämnet. För att förhindra att djuren intar testämnet kan

rörelsehindrande anordningar användas, men total immobilisering rekommenderas inte.

I slutet av exponeringsperioden ska resterande testämne avlägsnas, i lämpliga fall med vatten eller med annan lämplig metod för rengöring av huden. Observationer ska registreras systematiskt när de görs. Varje enskilt djur ska registreras separat. Den första dagen ska täta observationer göras. En grundlig klinisk undersökning ska göras minst en gång varje arbetsdag, andra observationer ska göras dagligen och lämpliga åtgärder ska vidtas för att minimera förlust av djur som ingår i studien, t.ex. ska djur som hittas döda obduceras eller nedfrysas och svaga eller döende djur ska isoleras eller avlivas.

Observation av djuren i burarna ska omfatta pälsförändringar, behandlad hud, ögon och slemhinnor, respirations- och cirkulationssystem, autonoma och centrala nervsystemet samt kroppsmotorik och beteendemönster. Särskilt uppmärksamhet ska ägnas åt observation av skälvningar, kramper, salivavsöndring, diarré, letargi, sömn och koma. Tidpunkten för dödsfall ska registreras så noggrant som möjligt. Djur som dör under försöket ska obduceras och i slutet av försöket ska överlevande djur obduceras. Alla makroskopiska patologiska förändringar ska registreras. När det är indicerat ska vävnadsprov tas för histopatologisk undersökning.

Bedömning av toxicitet bos det motsatta könet

Sedan en undersökning av det ena könet avslutats ska minst en grupp med fem djur av det motsatta könet testas för att fastställa om djur av detta kön är avsevärt mer känsliga för testämnet. I vissa fall kan användning av färre djur vara motiverat. Om det finns tillräckligt med information om att djur av det kön som har testats är avsevärt mer känsliga, behöver djur av det motsatta könet inte testas.

2. DATA

Data ska ställas upp i tabellform och för varje behandlingsgrupp ska anges antal djur i början av försöket, tidpunkten för enskilda djurs dödsfall, antal djur som visar andra tecken på toxicitet, beskrivning av toxiska effekter och obduktionsfynd. De enskilda försöksdjurens vikt ska bestämmas och registreras omedelbart innan testämnet appliceras, därefter varje vecka och vid dödsfall. Viktförändringar ska beräknas och registreras om överlevnaden överstiger en dag efter applicering av testämnet. Avlivning av djur på ett humant sätt till följd av ämnesrelaterat lidande och smärta ska registreras som ämnesrelaterade dödsfall. LD50 ska bestämmas enligt en erkänd metod.

Utvärderingen av data ska omfatta eventuellt samband mellan djurens exponering för testämnet och omfattningen och svårighetsgraden av alla abnormiteter, inklusive beteendemässiga och kliniska abnormiteter, makro-skopiska lesioner, ändringar av kroppsvikt, dödlighet och eventuella andra toxikologiska effekter.

3. RAPPORTERING

3.1 TESTRAPPORT

Testrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter:

— Djurart, stam, härkomst, miljöbetingelser, foder osv.

— Testbetingelser (inklusive metod för hudrengöring och slag av bandage: med eller utan ocklusion).

— Dosnivåer (med angivande av vehikel, om sådan används, och koncentrationer).

— Försöksdjurens kön.

— Tabelluppställning av responsdata efter kön och dosnivå (dvs. antal döda djur, antal djur som uppvisar tecken på toxicitet, antal exponerade djur).

— Dödstidpunkt efter dosering, motivering och kriterier för human avlivning av djur.

— Alla observationer.

— LD50-värde för det kön som har varit föremål för en fullständig undersökning bestämt efter 14 dagar med angivande av bestämningsmetod.

— 95 % tillförlitlighetsintervall för LD50 (där detta är möjligt).

— Dos-dödlighetskurva och lutning (om bestämningsmetoden medger detta).

— Obduktionsfynd.

— Eventuella histopatologiska fynd.

— Resultat av försök med motsatt kön.

— Diskussion av resultaten (med särskild