KOMMISSIONENS DIREKTIV av den 25 juli 1980 om gemenskapens analysmetod för bestämning av halten erukasyra i oljor och fetter avsedda som människoföda och i livsmedel tillsatta med oljor och fetter (80/891/EEG)

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIV

med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekonomiska gemenskapen,

med beaktande av rådets direktiv 76/621/EEG den 20 juli 1976 om högsta tillåtna halt av erukasyra i oljor och fetter avsedda som människoföda och i livsmedel med tillsatta oljor och fetter(1), särskilt artikel 3 i detta, och

med beaktande av följande:

Artikel 2 i direktiv 76/621/EEG föreskriver att från och med den 1 juli 1979 får mängden erukasyra i de produkter som avses i artikel 1 i det direktivet inte överstiga 5 %, beräknat på den totala mängden fettsyror i fettkomponenten.

Artikel 3 i direktiv 76/621/EEG föreskriver att mängden erukasyra skall bestämmas genom en analysmetod som gäller inom gemenskapen.

Förordning (EEG) nr 1470/68 av den 23 september 1968 om provtagning och reduktion av prover och om bestämning av oljehalt, föroreningar och fukt i oljefröer(2) fastställer i bilaga 6 en i förordning (EEG) nr 72/77(3) framlagd analysmetod för bestämning av halten erukasyra i raps- och rybsfrö. Den metoden bör användas som en screeningmetod.

När de viktigaste fettsyrorna i oljor och fetter analyseras genom gasvätskekromatografi under normala förhållanden är det inte möjligt att skilja mellan erukasyror och andra isomerer av dokosensyra som till exempel cetoljesyra.

Det är nödvändigt att bestämma halten av erukasyra såväl i oljor och fetter som i livsmedel som har tillförts oljor eller fetter som kan innehålla cetoljesyra och andra isomerer av dokosensyra.

Halten erukasyra behöver inte bestämmas i oljor och fetter eller i livsmedel som tillförts oljor eller fetter, när de efter analys genom screeningmetoder visat sig inte innehålla mer än 5 % dokosensyror eller cisdokosensyror.

I avvaktan på att det ska komma fram bättre analysmetoder för att bestämma erukasyra anses denna analysmetod för närvarande som den mest lämpliga.

Åtgärderna enligt detta direktiv har tillstyrkts av Ständiga livsmedelskommittén.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Medlemsstaterna skall föreskriva att den analys som krävs för att bestämma halten av erukasyra i de produkter som avses i artikel 1 i direktiv 76/621/EEG skall utföras i enlighet med artikel 2.

Artikel 2

1. Som screening skall endera av följande bestämmas:

a) Den totala halten dokosensyra i de produkter som avses i artikel 1 genom den metod som anges i bilaga 6 till förordning (EEG) nr 1470/68.

b) Den totala halten cisdokosensyra i de produkter som avses i artikel 1 genom den metod som anges i bilaga 6 till förordning (EEG) nr 1470/68 genom gasvätskekromatografi under förhållanden då cis- och transisomerer av dokosensyra separeras; stationära faser lämpliga för detta ändamål är till exempel cyanpropylpolysiloxaner eller flytande kristaller.

2. Om den totala mängden av endera

a) dokosensyra bestämd i enlighet med punkt 1 a eller

b) cisdokosensyror bestämda i enlighet med punkt 1 b

i de produkter som avses i artikel 1, beräknad på deras totala fettsyrahalt i fettkomponenten, inte överskrider 5 % behövs ingen ytterligare bestämning. Annars skall halten erukasyra bestämmas enligt den metod som anges i bilagan.

Artikel 3

Medlemsstaterna skall sätta i kraft de lagar och andra författningar som är nödvändiga för att följa detta direktiv senast den 1 februari 1982. De skall genast underrätta kommissionen om detta.

Artikel 4

Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.

Utfärdat i Bryssel den 25 juli 1980.

På kommissionens vägnar

Étienne DAVIGNON

Ledamot av kommissionen

(1) EGT nr L 202, 28.7.1976, s. 35.

(2) EGT nr L 239, 28.9.1968, s. 2.

(3) EGT nr L 12, 15.1.1977, s. 11.

BILAGA

BESTÄMNING AV ERUKASYRAHALTEN I OLJOR OCH FETTER AVSEDDA SOM MÄNNISKOFÖDA OCH I FETT- ELLER OLJEKOMPONENTEN I LIVSMEDEL MED TILLSATS AV OLJOR ELLER FETTER

I. INLEDNING

1. BEREDNING AV PROVER

1.1 Allmänt

Det prov som lämnas till laboratoriet för analys skall normalt ha en vikt av 50 g om inte större kvantitet har begärts.

1.2 Beredning av prov för analys i laboratorium

Provet måste vara homogeniserat före analysen.

1.3 Behållare

Det beredda provet skall förvaras i en luft- och fukttät behållare.

2. REAGENS

2.1 Vatten

2.1.1 Där vatten behövs som lösningsmedel, för spädning eller för tvättning, skall destillerat vatten eller avjoniserat vatten som har minst motsvarande renhet användas.

2.1.2 Där det talas om "lösning" eller "spädning" utan att något annat reagens specificeras avses vattenlösning eller spädning med vatten.

2.2 Kemikalier

Alla kemikalier som används skall om inte annat anges vara av allmänt vedertagen analyskvalitet.

3. APPARATUR

3.1 Apparaturlista

Listan omfattar enbart utrustning för speciella ändamål och som har en specifikation.

3.2 Analysvåg

"Analysvåg" betecknar en våg som kan väga med en noggrannhet av 0,1 mg eller bättre.

4. RESULTATANGIVELSER

4.1 Resultat

De resultat som avses i den offentliga analysrapporten skall utgöra medelvärdet av minst två bestämningar med tillfredsställande repeterbarhet.

4.2 Procentuell beräkning

Om inte annat anges skall resultaten uttryckas i procent (m/m) av den totala mängden fettsyror i det prov som lämnats till laboratoriet.

4.3 Antal signifikanta siffror

Metodens noggrannhet avgör hur många signifikanta siffror det ska finnas i de resultat som uttrycks på detta sätt.

II BESTÄMNING AV ERUKASYRA

1. OMFATTNING OCH ANVÄNDNINGSOMRÅDE

Metoden kan användas för att bestämma halten av erukasyra i

i) oljor och fetter som innehåller cetoljesyra (en speciell cis-isomer av dokosensyra som uppträder i fiskoljor) och

ii) hydrerade oljor och fetter som innehåller trans- och cis-isomerer av dokosensyra.

2. DEFINITION

Halt av erukasyra: den mängd erukasyra som bestäms med angiven metod.

3. PRINCIP

Metylestrar av de fettsyror som ingår i oljan eller fettet separeras genom silverjons-tunnskiktskromatografi vid låg temperatur och bestäms kvantitativt genom gasvätskekromatografi.

4. REAGENSER

4.1 Nydestillerad peroxidfri dietyleter.

4.2 n-hexan.

4.3 Kiselgel G för tunnskiktskromatografi.

4.4 Kiselgel för kolonnkromatografi.

4.5 Silvernitratlösning, 200 g/l. Lös 24 g silvernitrat i vatten och tillsätt vatten till 120 ml.

4.6 Metylerukatlösning 5 mg/ml. Lös 50 mg metylerukat i ett par ml n-hexan och späd med n-hexan till 10 ml.

4.7 Metyltetrakosanoat, intern standardlösning, 0,25 mg/ml. Lös 25 mg metyltetrakosanoat i ett några ml n-hexan (som i 4.6) och späd till 100 ml med n-hexan.

4.8 Elueringsvätska. Toluen: n-hexan 90: 10 (v/v).

4.9 2,7-diklorfluoresceinlösning 0,5 g/l. Lös genom att värma och röra om 50 mg 2,7-diklorfluorescein i 100 ml 50 %-ig vattenspädd metanol.

5. APPARATUR

5.1 Apparatur för tunnskiktskromatografi med i första hand:

5.1.1 Djupfrysningsenhet som kan hålla framkallningstank med innehåll vid en temperatur av minus 20 till minus 25 °C.

5.1.2 Glasplattor, 200 × 200 mm.

5.1.3 Ultraviolett lampa.

5.1.4 Glaskolonner, ca 200 mm långa och med ca 10 mm invändig diameter samt filter av glasull eller sintrat glas. Alternativt små trattar med filter av sintrat glas.

5.1.5 Applikator för påsättning av lösningar som smala band eller strängar på tunnskiktsplattor.

5.2 Gasvätskekromatograf med elektronisk integrator enligt avsnitt III i bilaga 6 till kommissionens förordning (EEG) nr 72/77.

6. UTFÖRANDE

6.1 Beredning av fettsyrametylestrar

Ta ca 400 mg av provets olje- eller fettkomponent för analys och bered en lösning som innehåller omkring 20 till 50 mg/ml av fettsyrametylestrarna i n-hexan enligt den metod som beskrivs i avsnitt II.3 i bilaga 6 av kommissionens förordning (EEG) nr 72/77.

6.2 Tunnskiktskromatografi

6.2.1 Beredning av plattorna

Placera 60 g kiselgel (4.3) i en 500 ml rundbottnad flaska. Tillsätt 120 ml silvernitratlösning (4.5) och skaka om i en minut så att uppslamningen blir fullständigt homogen. Sprid ut uppslamningen på vanligt sätt över plattorna, så att skiktets tjocklek blir ca 0,5 mm. Denna mängd slam räcker till beredning av fem plattor om 200 × 200 mm.

Låt plattorna lufttorka något (lämpligen genom att lämna dem i mörker i ca 30 minuter). Torka plattorna helt i ugn vid en jämn temperatur av 100 °C i två timmar och 30 minuter, varvid de samtidigt aktiveras. Använd plattorna så snart som möjligt efter aktiveringen eller förvara dem omsorgsfullt i mörkt skåp och aktivera dem på nytt innan de används. (Anmärkning: Det kan räcka med att aktivera dem vid 110 °C i en timme under förutsättning att plattorna inte mörknar under tiden.) Minska kanteffekterna under framkallningen genom att ritsa linjer genom beläggningen 10 mm från sidorna och ovankanten på varje platta innan de används.

6.2.2 Applicering av metylestrar

Använd applikatorn (5.1.5) och avsätt 50 ìl av lösningen av metylestrarna (6.1) från provet i en smal och ca 50 mm lång remsa minst 40 mm från plattans sida och 10 mm från nedre kanten. Applicera på samma sätt 100 ìl lösning som till lika delar består av metylesterlösningen (6.1) och metylerukatlösningen (4.6). Applicera lösningarna med stor försiktighet, eftersom beläggningen är mycket ömtålig. (Anmärkning: Om så önskas får 50 ìl av metylerukatlösningen (4.6) appliceras på plattan för att strängen av metylerukat skall bli lättare att urskilja efter framkallningen, se figur). När metylestrarna har applicerats placeras tunnskiktsplattan med den nedre kanten i dietyletern. Låt etern eluera ca 5 mm förbi det område där proverna applicerats. Detta gör att metylestrarna koncentreras till ett smalt band.

6.2.3 Framkallning av plattorna

Häll elueringsvätskan (4.8) i tanken till ca 5 mm djup och placera tanken med locket på i ett frysskåp (5.1.1) som håller en temperatur av minus 25 °C eller så nära denna temperatur som möjligt. (I vissa fall kan det vara en fördel om tanken är fodrad). Placera plattan försiktigt i tanken efter två timmar och låt lösningen stiga till omkring hälften eller två tredjedelar av plattans höjd. Avlägsna plattan och ånga försiktigt bort vätskan i en ström av kvävgas. Sätt tillbaka plattan i tanken och låt vätskan stiga till plattans övre kant. Avlägsna plattan, torka den som förut i kvävgas och spreja därefter försiktigt med en lösning av 2,7-diklorfluorescein (4.9).

Betrakta plattan under ultraviolett ljus och lokalisera det band i provet som innehåller metylerukat och därför är kraftigare markerat (se figur).

6.2.4 Separering av metylesterfraktioner

Skrapa av metylerukatbandet från provet i en 50 ml bägare och se till att ingenting går förlorat. Överför på samma sätt det kiselgel som sitter över och under metylerukatbandet till en annan 50 ml bägare. Detta band innehåller alla övriga fraktioner av fettsyrametylestrar. Tillsätt 1,0 ml av standardlösningen av metyltetrakosanoat (4.7) och 10 ml dietyleter (4.1) i varje bägare. Rör om och häll över innehållet i bägarna till olika kolonner eller trattar (5.1.4) som var och en innehåller ca 1 g kiselgel (4.4) samt eluera metylestrarna med hjälp av tre eller fyra portioner om 10 ml dietyleter. Samla upp filtraten i små flaskor. Indunsta varje filtrat till liten volym med hjälp av en lätt kvävgasström och för över metylestrarna till små spetsbottnade glasrör. Avlägsna hela vätskan genom indunstning med kvävgas på sådant sätt att metylestrarna koncentreras i botten på rören. Lös upp metylestrarna i 25 till 50 ìl n-hexan (4.2).

6.3 Gasvätskekromatografi

6.3.1 Följ den metodik som beskrivs i avsnitt III i bilaga 6 till kommissionens förordning 72/77/EEG och analysera 1 till 2 ìl av metylesterlösningarna från i den fraktion som innehåller metylerukat och ii de fraktioner som innehåller resten av de metylerade fettsyrorna.

6.3.2 Ta fram följande toppytor från den elektroniska integratorn:

i) Från kromatogrammet av den fraktion som innehåller metylerukat

a) metylerukat [E]

b) intern standard [L1]

c) totala toppytor med metylester utom intern standard [EF].

ii) Från kromatogrammet av de fraktioner som innehåller återstoden av fettsyrametylestrarna

a) totala toppytor för metylester utom intern standard [RF]

b) intern standard [L2].

7. REDOVISNING AV RESULTAT

7.1 Beräkningsmetod och formel

7.1.1 Mängden erukasyra i provet uttryckt som metylester i procent av totala mängden fettsyrametylestrar från provet erhålls genom

>Hänvisning till >

där

E, EF, RF, L1 och L2 är de toppytor som nämns i 6.3.2 och som korrigerats i behövlig grad med hjälp av kalibreringsfaktorer.

Av praktiska skäl är värdet för metylerukat i ovannämnda formel lika med mängden erukasyra uttryckt i procent av totala mängden fettsyror i provet.

7.1.2 Om toppytorna erhålls i procent kan värdena för EF och RF beräknas så här:

EF = 100 - L1

RF = 100 - L2

7.1.3 Beräkningsmetoden (7.1.1) utgår från att mängden tetrakosansyra i provet är försumbar. Om det visar sig att det finns betydande mängder av denna syra, måste värdet för den tetrakosansyra (L2) som erhållits ur kromatogrammet från fraktionerna som innehåller resten av fettsyrametylestrarna, reduceras till

L2 - T2

där

T2 = >NUM>T0P2

>DEN>P°

och

T2 = toppytan för metyltetrakosanoat som härrör från provet och som utgör en del av den toppyta som hänförs till den interna standarden i kromatogrammet för den återstående fraktionen av fettsyrametylestrar.

P2 = toppytan för metylpalmitat som erhållits från kromatogrammet för den återstående fraktionen.

T0 = toppytan för metyltetrakosanoat som erhållits från kromatogrammet för metylestrarna av de sammanlagda fettsyrorna som bestäms genom den analys som nämns i artikel 2 i detta direktiv.

P0 = toppytan för metylpalmitat som erhållits från kromatogrammet för metylestrar av de sammanlagda fettsyrorna som bestäms genom den analys som nämns i artikel 2 i detta direktiv.

7.1.4 Härledning av formel

Proportionen fettsyror i den fraktion som innehåller metylerukat uttryckt i procent av de sammanlagda fettsyrorna i provet fås genom

>Hänvisning till >

Proportionen erukasyra i fraktionen som innehåller metylerukat fås genom

>NUM>E

>DEN>EF

Mängden erukasyra i provet uttryckt i procent av totala fettsyrahalten fås genom

>Hänvisning till >

7.1.5 Repeterbarhet

Skillnaden mellan värdena av två bestämningar som utförs samtidigt eller i snabb följd på samma prov, av samma person och under samma förhållanden får inte överstiga 10 % av resultatet eller 0,5 g per 100 g prov, varvid det högre värdet skall gälla.

>Hänvisning till >

>Hänvisning till >

>Hänvisning till >

>Hänvisning till >

>Hänvisning till >