BILAGA I

KAPITEL 1

PRESTANDAKRITERIER OCH ÖVRIGA KRAV FÖR ANALYSMETODER

1.1 Krav för screeningmetoder

1.1.1 Kategorier av lämpliga screeningmetoder

Kvalitativa, semikvantitativa eller kvantitativa metoder ska användas som lämpliga screeningmetoder.

1.1.2 Krav för biologiska, biokemiska eller fysikalisk-kemiska screeningmetoder

För förbjudna eller otillåtna substanser ska CCß vara så lågt som rimligen är möjligt och i alla händelser lägre än referensvärdet för åtgärder (RPA) för substanser när det har fastställts referensvärden för åtgärder i enlighet med förordning (EU) 2019/1871.

För godkända farmakologiskt aktiva substanser ska CCß vara lägre än MRL-värdet eller den högsta tillåtna halten (ML).

Endast sådana analysmetoder som bevisats vara validerade på ett dokumenterat, spårbart sätt och som har en andel resultat som felaktigt bedömts överensstämma (falskt negativa resultat) som är lägre än eller lika med 5 % (β-fel) ska användas för screening. Vid ett misstänkt icke-överensstämmande (positivt) resultat ska resultatet bekräftas med en konfirmeringsmetod.

Kvantitativa screeningmetoder som används för både screening och konfirmering ska uppfylla de krav på noggrannhet, intervall och precision som anges i 1.2.2.1 och 1.2.2.2.

1.2 Krav för konfirmeringsmetoder

1.2.1 Allmänna krav för konfirmeringsmetoder

För förbjudna eller otillåtna substanser ska CCα vara så lågt som rimligen är möjligt. För förbjudna eller otillåtna substanser för vilka ett referensvärde för åtgärder har fastställts i enlighet med förordning (EU) 2019/1871 ska CCα vara lägre än eller lika med referensvärdet för åtgärder.

För godkända substanser ska CCα vara högre än men ligga så nära MRL-värdet eller den högsta tillåtna halten (ML) som möjligt.

För konfirmering ska man endast använda analysmetoder som bevisats vara validerade på ett dokumenterat och spårbart sätt och som har en frekvens av resultat som felaktigt bedömts vara icke-överensstämmande (falskt positiva resultat) (α-fel) på högst 1 % för förbjudna eller otillåtna substanser eller högst 5 % för godkända substanser.

Konfirmeringsmetoderna ska ge information om analytens strukturella kemiska sammansättning. Konfirmeringsmetoder som endast grundar sig på kromatografisk analys utan användning av masspektrometrisk detektion är således olämpliga att användas som enda konfirmeringsmetod för förbjudna eller otillåtna farmakologiskt aktiva substanser. Om masspektrometri inte är lämpligt för godkända substanser kan andra metoder användas, t.ex. HPLC-DAD och HPLC-FLD eller en kombination av dem.

När det krävs enligt konfirmeringsmetoden ska en lämplig intern standard tillsättas provportionen i början av extraktionsförfarandet. Beroende på vad som finns tillgängligt ska antingen stabila isotopmärkta former av analyten, som är särskilt lämpade för masspektrometrisk detektion, eller analoga föreningar, vars struktur liknar analyten, användas. Om ingen lämplig intern standard kan användas ska identifieringen av analyten helst bekräftas med co-kromatografi (1). I detta fall ska bara en topp erhållas, och toppens ökade höjd (eller area) motsvarar mängden tillsatt analyt. Om detta inte är praktiskt genomförbart ska matrismatchade eller matrisspetsade standarder användas.

1.2.2 Allmänna prestandakriterier för konfirmeringsmetoder

1.2.2.1 Riktighet genom utbyte

Vid upprepade analyser av ett certifierat referensmaterial ska avvikelsen från det certifierade värdet för den genomsnittliga massfraktionen, som har bestämts genom experiment och korrigerats för utbytet, överensstämma med intervallen för minsta riktighet i tabell 1.

Tabell 1

Minsta riktighet hos kvantitativa metoder

Massfraktion Intervall ≤ 1 μg/kg – 50 % till +20 % > 1 μg/kg till 10 μg/kg –30 % till +20 % ≥ 10 μg/kg –20 % till +20 %

När det inte finns något certifierat referensmaterial tillgängligt får riktigheten hos mätningarna fastställas på andra sätt, t.ex. genom användning av material med tilldelade värden från interlaborativa avprövningar eller genom tillsatser av kända mängder av analyten eller analyterna till en blankmatris.

1.2.2.2 Precision

Variationskoefficienten (CV) för upprepad analys av ett referensmaterial eller spetsat material under reproducerbarhetsbetingelser inom laboratoriet får inte överskrida det värde som beräknats enligt Horwitz ekvation. Ekvationen är

CV = 2(1 – 0,5 log C)

där C är massfraktionen uttryckt som tiopotens (t.ex. 1 mg/g = 10–3). Vid massfraktioner under 120 μg/kg fås oacceptabelt höga värden då Horwitz ekvation används. Den högsta tillåtna variationskoefficienten får därför inte överstiga värdena i tabell 2.

Tabell 2

Godtagbar variationskoefficient

Massfraktion CV för reproducerbarhet (%) > 1 000 μg/kg 16 (anpassat efter Horwitz ekvation) > 120 μg/kg – 1 000 μg/kg 22 (anpassat efter Horwitz ekvation) 10–120 μg/kg 25 (*) < 10 μg/kg 30 (*)

Vid analyser som utförs under repeterbarhetsbetingelser får variationskoefficienten under repeterbarhetsbetingelser inte överstiga två tredjedelar av värdena i tabell 2.

1.2.3 Krav för kromatografisk separation

Vid vätskekromatografi (LC) eller gaskromatografi (GC) ska den minsta godtagbara retentionstiden för den eller de analyter som undersöks vara två gånger den retentionstid som motsvarar kolonnens hålrumsvolym. Analytens retentionstid i extraktet ska motsvara kalibreringsstandardens, en matrismatchad standards eller en matrisspetsad standards med en tolerans på ± 0,1 minut. Vid snabb kromatografi, där retentionstiden är under två minuter, är en avvikelse på mindre än 5 % av retentionstiden godtagbar. Om en intern standard används ska analytens relativa retentionstid, dvs. förhållandet mellan analytens och den interna standardens kromatografiska retentionstid, motsvara kalibreringsstandardens, den matrismatchade standardens eller den matrisspetsade standardens med en maximal avvikelse på 0,5 % för gaskromatografi och 1 % för vätskekromatografi i fråga om metoder som valideras efter att denna förordning har trätt i kraft.

1.2.4 Särskilda prestandakriterier för masspektrometri

1.2.4.1 Masspektrometrisk detektion

Masspektrometrisk detektion ska utföras genom användning av några av följande alternativ:

1. Registrering av hela masspektrum (fullscan).

2. Selektiv jonanalys (SIM).

3. Sekventiella masspektrometri-tekniker (MSn), t.ex. Selected Reaction Monitoring (SRM).

4. En kombination av masspektrometri-tekniker (MS) eller sekventiella masspektrometri-tekniker (MSn) och lämpliga joniseringsmetoder.

Både lågupplösande masspektrometri (LRMS, med upplösning på en massenhet) och högupplösande masspektrometri (HRMS), inklusive dubbelfokuserande sektorer, Time of Flight (TOF) och Orbitrap-instrument, är lämpliga.

Vid konfirmering av en analyts identitet vid högupplösande masspektrometri (HRMS) ska massavvikelsen för alla diagnostiska joner understiga 5 ppm (eller vid m/z < 200 understiga 1 mDa). På grundval av detta bör en ändamålsenligt effektiv upplösningen väljas, och upplösningen ska normalt vara större än 10 000 för hela massområdet vid 10 % valley eller 20 000 vid halvvärdesbredd (FWHM).

Om den masspektrometriska bestämningen utförs genom registrering av fullscan-spektrum (både LRMS och HRMS) är endast diagnostiska joner med en relativ intensitet som är högre än 10 % i referensspektrumet för kalibreringsstandarden, den matrismatchade standarden eller den matrisspetsade standarden lämpliga. Diagnostiska joner ska innehålla molekyljonen (om den förekommer med en intensitet på ≥ 10 % av bastoppen) och karakteristiska fragment eller dotterjoner.

Val av moderjon: Om den masspektrometriska bestämningen utförs genom fragmentering efter val av moderjon görs valet av moderjon vid en upplösning som minst motsvarar upplösningen för en massenhet. Den valda moderjonen ska vara molekyljonen, karakteristiska addukter av molekyljonen, karakteristiska dotterjoner eller en av deras isotopjoner. Om valet av moderjon har ett massurvalsfönster på mer än en dalton (t.ex. vid dataoberoende framtagning) anses tekniken vara en fullscan-konfirmeringsanalys.

Fragment och dotterjoner: De valda fragmenten eller dotterjonerna ska vara specifika fragment för den uppmätta analyten/produkten. Icke-selektiva transitioner (t.ex. tropyliumkatjonen eller förlust av vatten) ska om möjligt utelämnas. Förekomsten av diagnostiska joner ska bestämmas utifrån topparean eller topphöjden i integrerade kromatogram av de valda jonerna. Detta gäller också när fullscan-mätningar används för identifiering. Signal-brusförhållandet (S/N-förhållandet) för alla diagnostiska joner ska vara större än eller lika med 3:1.

Relativa intensiteter: De relativa intensiteterna för de diagnostiska jonerna (jonförhållandet) uttrycks som procent av intensiteten för den vanligast förekommande jonen eller transitionen. Jonförhållandet ska bestämmas genom jämförelse av spektrumen eller genom integrering av signalerna för spåren av den extraherade jonmassan. Jonförhållandet för den analyt som ska bekräftas ska motsvara de matrismatchade standardernas, de matrisspetsade standardernas eller standardlösningarnas vid jämförbara koncentrationer, inom ± 40 % relativ avvikelse.

För alla masspektrometriska analyser ska minst ett jonförhållande bestämmas. De ska helst vara joner som erhållits inom en enda skanning, men jonerna kan också komma från olika skanningar i samma injektion (dvs. fullscan och fragmenteringsskanning).

1.2.4.2 Identifiering

Ett system med identifieringspunkter ska användas för att välja lämpliga framtagningsmetoder och utvärderingskriterier. Vid konfirmering av substansers identitet i en matris för vilken det har fastställts ett MRL-värde (godkänd användning) krävs minst fyra identifieringspunkter. För otillåtna eller förbjudna substanser krävs fem identifieringspunkter. En punkt kan komma från den kromatografiska separationen. I tabell 3 visas antalet identifieringspunkter som kan fås vid var och en av teknikerna. För att uppfylla kraven för identifieringspunkterna som krävs för konfirmering kan identifieringspunkter som kommer från olika tekniker läggas till.

1. Alla masspektrometriska analyser ska kombineras med en separationsteknik som har tillräcklig separationsförmåga och selektivitet för den specifika tillämpningen. Lämpliga separationstekniker är bl.a. vätske- och gaskromatografi, kapillärelektrofores (CE) och superkritisk kromatografi (SFC). För en analyt som uppvisar en isobar- eller isomerförening måste retentionstiden vara godtagbar, dvs. ± 0,5 % vid gaskromatografi (GC) och ± 1 % vid vätskekromatografi (LC) och superkritisk kromatografi (SFC), för att bekräfta dess identitet.

2. Högst tre separata tekniker får kombineras för att uppnå det minsta antalet identifieringspunkter.

3. Olika joniseringsmetoder (t.ex. elektronjonisering och kemisk jonisering) betraktas som olika tekniker. Tabell 3 Identifieringspunkter per teknik Teknik Identifieringspunkt Separation (GC, LC, SFC, CE) 1 LR-MS-jon 1 Val av moderjon i massområdet < ± 0,5 Da 1 (indirekt) LR-MSn-dotterjon 1,5 HR-MS-jon 1,5 HR-MSn-dotterjon 2,5 Tabell 4 Exempel på antalet identifieringspunkter för specifika tekniker och kombinationer av tekniker (n = ett heltal) Teknik(er) Separation Antal joner Identifieringspunkter GC-MS (EI eller CI) GC n 1 + n GC-MS (EI och CI) GC 2 (EI) + 2 (CI) 1 + 4 = 5 GC-MS (EI eller CI) 2 derivat GC 2 (derivat A) + 2 (derivat B) 1 + 4 = 5 LC-MS LC n (MS) 1 + n GC- eller LC-MS/MS GC eller LC 1 moderjon + 2 dotterjoner 1 + 1 + 2 × 1,5 = 5 GC- eller LC-MS/MS GC eller LC 2 moderjoner + 2 dotterjoner 1 + 2 + 2 × 1,5 = 6 GC- eller LC-MS3 GC eller LC 1 moderjon + 1 MS2-dotterjon + 1 MS3-dotterjon 1 + 1 + 1,5 × 1,5 = 5 GC- eller LC-HRMS GC eller LC n 1 + n × 1,5 GC- eller LC-HRMS/MS GC eller LC 1 moderjon (massområde < ± 0,5 Da) + 1 dotterjon 1 + 1 + 2,5 = 4,5 GC- eller LC-HRMS och HRMS/MS GC eller LC 1 fullscan-jon + 1 HRMS-dotterjon (a) 1 + 1,5 + 2,5 = 5 GC- och LC-MS GC och LC 2 joner (GCMS) + 1 jon (LCMS) 1 + 1 + 2 + 1 + 1 = 6

1.2.5 Särskilda prestandakriterier för bestämning av en analyt genom vätskekromatografi med andra detektionstekniker än masspektrometri

Endast för godkända substanser kan följande tekniker användas som alternativ till masspektrometribaserade metoder, förutsatt att de tillämpliga kriterierna för dessa tekniker är uppfyllda:

1. Fullscan-spektrofotometri med diod array-detektion (DAD) vid användning tillsammans med HPLC.

2. Spektrofotometrisk mätning med fluorescensdetektion (FLD) vid användning tillsammans med HPLC.

Vätskekromatografi med UV/VIS-detektion (en våglängd) är olämplig att användas som enda konfirmeringsmetod.

1.2.5.1 Prestandakriterier för fullscan-spektrofotometri med diod array-detektion

Prestandakriterierna för kromatografisk separation i kapitel 1.2.3 ska vara uppfyllda.

Absorptionsmaxima i analytens UV-spektrum ska vara vid samma våglängder som för kalibreringsstandarden i matris inom en maximal marginal som bestäms av detektionssystemets upplösning. Vid diod array-detektion ligger den maximala marginalen normalt sett inom ± 2 nm. Analytens spektrum över 220 nm får inte skilja sig utseendemässigt från kalibreringsstandardens spektrum vad gäller de delar av dessa två spektrum där den relativa absorbansen är minst 10 %. Detta kriterium är uppfyllt om samma maxima föreligger och skillnaden mellan de båda spektrumen inte vid någon punkt överstiger 10 % av kalibreringsstandardens absorbans. Om datorstödd bibliotekssökning och matchning i databaser används ska spektraldata för de officiella proverna jämföras med data för kalibreringslösningen och överstiga en kritisk matchningsfaktor. Denna faktor ska under valideringen bestämmas för varje enskild analyt på grundval av spektrum som uppfyller de kriterier som beskrivs ovan. Variation i spektrumen som orsakas av provmatrisen och detektorns prestanda ska kontrolleras.

1.2.5.2 Prestandakriterier för spektrofotometrisk mätning med fluorescensdetektion

Prestandakriterierna för kromatografisk separation i kapitel 1.2.3 ska vara uppfyllda.

Valet av excitations- och emissionsvåglängderna i kombination med de kromatografiska betingelserna ska göras så att effekterna av interfererande komponenter i blankprovsextrakten minimeras. Det bör vara minst 50 nanometer mellan excitations- och emissionsvåglängderna.

I ett kromatogram ska den närmaste toppens maximihöjd vara separerad från målanalytens topp med minst en hel toppbredd vid 10 % av maximihöjden för målanalytens topp.

Detta gäller för molekyler med naturlig fluorescens och för molekyler som fluorescerar efter att de omvandlats eller bildat derivat.

KAPITEL 2

VALIDERING

2.1 Prestandaegenskaper som ska bestämmas för analysmetoder

Genom validering av metoden ska det påvisas att analysmetoden överensstämmer med de kriterier som är tillämpliga på de aktuella prestandaegenskaperna. Olika kontrollsyften kräver olika metodkategorier. I tabell 5 anges vilka prestandaegenskaper som ska verifieras för respektive metod, och varje parameter förklaras närmare i detta kapitel.

Tabell 5

Klassificering av analysmetoder genom de prestandaegenskaper som ska bestämmas

Metod Konfirmering Screening Kvalitativ Kvantitativ Kvalitativ Semikvantitativ Kvantitativ Substanser A A, B A, B A, B A, B Identifiering i enlighet med 1.2 x x CCα x x CCβ – x x x Riktighet x x Precision x (x) x Relativ matriseffekt/absolut utbyte (*) x x Selektivitet/specificitet x x x x Stabilitet (#) x x x x Robusthet x x x x x: Det ska bevisas genom valideringen att kraven för prestandaegenskaperna är uppfyllda. x) Precisionskraven i kapitel 1.2.2.2 behöver inte uppfyllas för semikvantitativa screeningmetoder. Precisionen ska dock bestämmas för att bevisa att metoden är lämplig för att undvika analysresultat som felaktigt bedömts överensstämma (falskt negativa analysresultat). A: Förbjudna eller otillåtna substanser B: Godkända substanser

2.2 Riktighet, repeterbarhet och reproducerbarhet inom ett laboratorium

Detta kapitel ger exempel på och referenser till förfaranden vid validering. Andra sätt att visa att metoden överensstämmer med prestandakriterierna kan användas, förutsatt att de ger information på samma nivå och av samma kvalitet.

2.2.1 Konventionell validering

Beräkningen av parametrarna enligt konventionella metoder kräver att flera enskilda experiment utförs. Varje prestandaegenskap ska bestämmas för varje större ändring (se avsnitt 2.4). Vid metoder som använder flera analyter kan många analyter analyseras samtidigt under förutsättning att eventuella relevanta interferenser har uteslutits. Många prestandaegenskaper kan bestämmas på liknande sätt. För att minimera arbetsbördan är det därför lämpligt att kombinera experimenten i så stor utsträckning som möjligt (t.ex. repeterbarhet och reproducerbarhet inom ett laboratorium med specificitet, analys av blankprover för att bestämma beslutsgränsen vid konfirmering och för att testa specificiteten).

2.2.1.1 Riktighet baserat på ett certifierat referensmaterial

En analysmetods riktighet bör bedömas genom ett certifierat referensmaterial (CRM). Metoden beskrivs i ISO 5725–4:1994 (2).

Ett exempel:

1. Analysera sex replikat av det certifierade referensmaterialet i enlighet med testinstruktionerna för metoden.

2. Bestäm koncentrationen för analyten som finns i varje replikatprov.

3. Beräkna medelvärdet, standardavvikelsen och variationskoefficienten (%) för dessa sex replikat.

4. Beräkna riktigheten genom att dividera den påvisade medelkoncentrationen med det certifierade värdet (mätt som koncentration) och multiplicera med 100 för att uttrycka resultatet i procent.

Riktighet (%) = påvisad utbyteskorrigerad medelkoncentration) × 100/certifierat värde.

2.2.1.2 Riktighet baserat på spetsade prover

Om det inte finns något certifierat referensmaterial att tillgå ska metodens riktighet bestämmas genom försök med spetsad blankmatris, som minst i enlighet med följande:

1. För metoder som valideras efter att denna förordning har trätt i kraft: välj blankmaterial och spetsa vid en koncentration på a) 0,5 (3), 1,0 och 1,5 gånger referensvärdet för åtgärder (RPA), eller b) 0,1 (4), 1,0 och 1,5 gånger MRL-värdet eller den högsta tillåtna halten (ML) för godkända substanser, eller c) 1,0, 2,0 och 3,0 gånger den lägsta kalibrerade nivån (LCL) för otillåtna substanser (för vilka det inte har fastställts något referensvärde för åtgärder).

2. Analysen ska utföras med sex replikat på varje nivå.

3. Analysera proverna.

4. Beräkna koncentrationen som påvisats i varje prov.

5. Beräkna riktigheten för varje prov med hjälp av ekvationen nedan, och beräkna därefter den genomsnittliga riktigheten och variationskoefficienten för de sex resultaten på varje koncentrationsnivå.

Riktighet (%) = (påvisad utbyteskorrigerad medelkoncentration) × 100/spetsningsnivå.

När det gäller metoder för godkända substanser som validerats före denna förordnings tillämpningsdag räcker det att bestämma metodens riktighet med hjälp av 6 spetsade alikvoter vid 0,5, 1,0 och 1,5 gånger MRL-värdet eller den högsta tillåtna halten (ML).

2.2.1.3 Repeterbarhet

1. För metoder som valideras efter att denna förordning har trätt i kraft ska en uppsättning prover med identiska blankmatriser av samma djurslag beredas. De ska spetsas med analyten till koncentrationer som motsvarar a) 0,5 (5), 1,0 och 1,5 gånger referensvärdet för åtgärder (RPA), eller b) 0,1 (6), 1,0 och 1,5 gånger MRL-värdet eller den högsta tillåtna halten (ML) för godkända substanser, eller c) 1,0, 2,0 och 3,0 gånger den lägsta kalibrerade nivån (LCL) för otillåtna eller förbjudna substanser om inte något referensvärde för åtgärder (RPA) är tillämpligt.

2. Analysen ska utföras med minst sex replikat på varje nivå.

3. Analysera proverna.

4. Beräkna koncentrationen som påvisats i varje prov.

5. Beräkna medelkoncentrationen, standardavvikelsen och variationskoefficienten (%) för de spetsade proverna.

6. Upprepa dessa steg vid minst två andra tillfällen.

7. Beräkna de totala medelkoncentrationerna, standardavvikelserna (genom att beräkna genomsnittet för standardavvikelsen i kvadrat för de enskilda tillfällena och ta kvadratroten därav) och variationskoefficienterna för de spetsade proverna. När det gäller metoder för godkända substanser som validerats före denna förordnings ikraftträdande räcker det att bestämma repeterbarheten med spetsade matriser vid koncentrationer på 0,5, 1,0 och 1,5 gånger MRL-värdet eller den högsta tillåtna halten (ML). Beräkningen av repeterbarhet kan också göras i enlighet med ISO 5725–2:2019 (7).

2.2.1.4 Reproducerbarhet inom ett laboratorium

1. För valideringar som utförs efter denna förordnings ikraftträdande bereds en uppsättning prover av specificerat provmaterial (identiska eller olika matriser), spetsade med analyten eller analyterna till koncentrationer som motsvarar a) 0,55, 1,0 och 1,5 gånger referensvärdet för åtgärder (RPA), eller b) 0,16, 1,0 och 1,5 gånger MRL-värdet eller den högsta tillåtna halten (ML) för godkända substanser, eller c) 1,0, 2,0 och 3,0 gånger den lägsta kalibrerade nivån (LCL) för otillåtna eller förbjudna substanser om inte något referensvärde för åtgärder (RPA) är tillämpligt.

2. Utför analysen på varje koncentrationsnivå med minst sex replikat av blankmaterial.

3. Analysera proverna.

4. Beräkna koncentrationen som påvisats i varje prov.

5. Upprepa dessa steg vid minst två olika tillfällen med olika satser blankmaterial, olika laboranter och så många olika miljöbetingelser som möjligt, t.ex. olika reagenssatser, lösningsmedel, olika rumstemperaturer, olika instrument eller en variation av andra parametrar.

6. Bestäm medelkoncentrationen, standardavvikelsen och variationskoefficienten (%) för de spetsade proverna. När det gäller metoder för godkända substanser som validerats före denna förordnings ikraftträdande räcker det att bestämma reproducerbarheten inom ett laboratorium med spetsade matriser vid koncentrationer på 0,5, 1,0 och 1,5 gånger MRL-värdet eller den högsta tillåtna halten (ML). Beräkningen av reproducerbarhet inom ett laboratorium/intermediär precision kan också göras i enlighet med ISO 5725–2:2019, ISO 11843–1:1997 (8), Codex CAC/GL 59–2006 (9).

2.2.2 Validering enligt alternativa modeller

Beräkningen av parametrarna enligt alternativa modeller förutsätter att en försöksplan används. Försöksplanen ska utformas med hänsyn till antalet olika djurslag och olika faktorer som ska undersökas. För att de viktigaste djurslagen och de faktorer som kan inverka på mätresultaten ska kunna bestämmas, ska därför det första steget i hela valideringen gälla de provpopulationer som ska analyseras i laboratoriet i framtiden. Den faktoriella metoden gör det möjligt att bedöma mätosäkerheten för testresultaten, som erhållits under en rad betingelser i ett visst laboratorium, t.ex. olika laboranter, olika instrument, olika partier av reagenser, olika matriser, olika analystider och olika analystemperaturer. Därefter ska koncentrationsintervallet väljas ut på ett ändamålsenligt sätt med hänsyn till MRL-värdet eller den högsta tillåtna halten (ML) för godkända substanser eller till referensvärdet för åtgärder (RPA) eller den lägsta kalibrerade nivån (LCL) för förbjudna eller otillåtna substanser.

Den faktoriella metoden syftar till att fastställa tillförlitliga precisionsdata och mätdata genom samtidig kontrollerad variation av de utvalda faktorerna. Den möjliggör en utvärdering av den kombinerade inverkan av faktoriella effekter och slumpvisa effekter. Försöksutformningen möjliggör också undersökning av analysmetodens robusthet (10) och bestämning av standardavvikelsen för intern reproducerbarhet i olika matriser.

Nedan ges ett exempel på ett alternativt tillvägagångssätt med användning av en ortogonal plan för försöksutformning.

Upp till sju faktorer (brusfaktorer) kan undersökas. Studien är utformad så att precision, riktighet (baserat på spetsade prover), känslighet, mätosäkerhet och kritiska koncentrationer kan bestämmas samtidigt med hjälp av försöksplanen.

Tabell 6

Exempel på en ortogonal plan för försöksutformning med sju faktorer (I–VII) som varieras på två nivåer (A/B) i en valideringsstudie med åtta omgångar (kombination av faktornivåer)

Faktor I II III IV V VI VII Omgång 01 A A A A A A A Omgång 02 A A B A B B B Omgång 03 A B A B A B B Omgång 04 A B B B B A A Omgång 05 B A A B B A B Omgång 06 B A B B A B A Omgång 07 B B A A B B A Omgång 08 B B B A A A B

Beräkningen av metodegenskaperna ska utföras i enlighet med Jülicher et al (11).

2.2.3 Andra valideringssätt

Andra sätt att visa att analysmetoden överensstämmer med prestandakriterierna för prestandaegenskaper kan användas, förutsatt att de ger information på samma nivå och av samma kvalitet. Validering kan också utföras genom en interlaborativ avprövning enligt Codex Alimentarius, ISO eller IUPAC (12), eller enligt alternativa metoder, såsom singellaboratoriestudier eller intern validering (13). Om alternativa valideringar tillämpas ska den underliggande modellen och strategin med respektive förutsättningar, antaganden och formler fastställas i valideringsprotokollet eller åtminstone hänvisningar ges till var de finns tillgängliga.

2.3 Selektivitet/specificitet

Förmågan att skilja på analyten och närbesläktade substanser ska bestämmas i största möjliga utsträckning. Interferens från homologer, isomerer, nedbrytningsprodukter, endogena substanser, analoger och metaboliter av den restsubstans som undersöks, av matrisföreningar eller av andra eventuellt interfererande substanser ska bestämmas, och vid behov ska metoden ändras så att de identifierade interferenserna undviks. För bestämning av metodens specificitet ska följande tillvägagångssätt användas:

1. Välj ett antal kemiskt besläktade föreningar eller andra substanser som ofta förekommer tillsammans med föreningen i fråga och som kan finnas i proverna, och verifiera om de skulle kunna interferera med analysen av målanalyten eller målanalyterna.

2. Analysera ett lämpligt antal representativa blankprover, t.ex. olika partier eller partier från olika djurslag (n ≥ 20) och kontrollera om det finns interferenser från signaler, toppar eller jonspår i området i fråga där målanalyten förväntas eluera.

3. Spetsa representativa blankprover vid relevant koncentration med substanser som möjligen skulle kunna interferera med identifieringen och/eller kvantifieringen av analyten, och undersök om den tillsatta substansen a) kan leda till falsk identifiering, b) hindrar identifiering av målanalyten, c) påverkar kvantifieringen märkbart.

2.4 Robusthet

Det ska testas att analysmetodens prestanda upprätthålls vid olika försöksbetingelser, t.ex. olika provtagningsbetingelser och mindre ändringar som kan ske vid rutintestning. För testning av metodens robusthet bör de ändringar som införs i försöksbetingelserna vara mindre ändringar. Dessa ändringars betydelse ska utvärderas. Varje prestandaegenskap ska bestämmas för alla mindre ändringar som har visat sig ha en signifikant effekt på undersökningens prestanda.

2.5 Stabilitet

Stabiliteten hos kalibreringsstandarden, den matrismatchade standarden och/eller de matrisspetsade standarderna och stabiliteten hos analyten eller matrisens beståndsdelar i provet under lagring eller analys ska bestämmas, eftersom instabilitet skulle kunna påverka testresultatet.

Vanligtvis är analytens stabilitet väl beskriven under olika lagringsförhållanden. Den information som krävs kan fås från de försök som genomförs för övervakning av standarders och provers lagringsförhållanden, vilken genomförs som ett led i det normala systemet för ackreditering och kvalitetskontroll av laboratorier. Om stabilitetsdata för analyter i en matris finns tillgängliga (t.ex. baserat på information från EU-referenslaboratorierna eller offentliggjorda data) behöver dessa data inte bestämmas av varje laboratorium. En hänvisning till tillgängliga stabilitetsdata för analyter i lösningar och i matris är dock endast godtagbar om betingelserna är identiska.

Om erforderliga stabilitetsdata inte finns tillgängliga bör följande tillvägagångssätt användas.

2.5.1 Bestämning av analytens stabilitet i lösning

1. Bered nya stamlösningar av analyten eller analyterna och späd enligt testinstruktionerna för att få tillräckligt många alikvoter (t.ex. 40) av varje vald koncentration. Proverna ska beredas av a) de analytlösningar som används för spetsning, b) de analytlösningar som används för den slutliga analysen, c) alla andra lösningar som är av intresse (t.ex. derivatiserade standarder).

2. Mät analytkoncentrationen i den nyberedda lösningen enligt testinstruktionerna.

3. Portionera lämpliga mängder i passande behållare, märk och lagra enligt ljus- och temperaturförhållandena i tabell 7. Lagringstiden ska väljas med beaktande av den analyspraxis som tillämpas, helst tills de första nedbrytningsfenomenen kan observeras under identifieringen och/eller kvantifieringen. Om ingen nedbrytning iakttas under stabilitetsstudien ska lagringstiden för stabilitetsstudien vara lika med den maximala lagringstiden för lösningen.

4. Beräkna analytens eller analyternas koncentration i varje alikvot jämfört med analytens koncentration i den nyberedda lösningen med hjälp av följande formel: Resterande analyt (%) = Ci × 100/Cfresh Ci = koncentration vid tidpunkt i Cfresh = koncentration för nyberedd lösning Medelvärdet för fem replikatlösningar som varit lagrade får inte avvika mer än 15 % från medelvärdet för fem nyberedda replikatlösningar. Medelvärdet för de fem nyberedda lösningarna ska användas som grund för beräkningen av skillnaden i procent. Tabell 7 Plan för bestämning av analytstabilitet i lösning – 20 °C + 4 °C + 20 °C Mörkt 10 alikvoter 10 alikvoter 10 alikvoter Ljust 10 alikvoter

2.5.2 Bestämning av stabiliteten hos analyt(er) i matris

1. Använd om möjligt prover från behandlade djur. Om det inte finns någon matris från behandlat djur (incurred matrix) att tillgå ska en blankmatris som spetsats med analyten användas.

2. Om det finns en matris från behandlat djur att tillgå ska koncentrationen i materialet bestämmas medan matrisen fortfarande är ny. Lagra ytterligare alikvoter av den homogeniserade matrisen från behandlat djur vid –20 °C eller lägre temperatur om så krävs, och bestäm koncentrationen för analyten så länge som provet sparas i laboratoriet.

3. Om det inte finns någon matris från behandlat djur att tillgå används en liten mängd blankmatris som homogeniseras. Dela upp matrisen i fem alikvoter. Spetsa varje alikvot med analyten, som helst ska beredas i en liten mängd vattenlösning. Analysera en alikvot direkt. Lagra resterande alikvoter vid –20 °C eller lägre temperatur om så krävs, och analysera dem efter kortvarig, medellång och långvarig lagring med beaktande av de tillämpade analysmetoderna.

4. Registrera den längsta godtagbara lagringstiden och de optimala lagringsförhållandena. Medelvärdet för fem replikatlösningar som varit lagrade får inte avvika från medelvärdet för fem nyberedda replikatlösningar med mer än värdet för metodens reproducerbarhet inom ett laboratorium. Medelvärdet för de fem nyberedda lösningarna ska användas som grund för beräkningen av skillnaden i procent.

2.6 Beslutsgräns vid konfirmering (CCα)

CCα ska bestämmas för konfirmeringsmetoder CCα ska fastställas under betingelser som uppfyller kraven för identifiering eller för identifiering och kvantifiering enligt kapitel 1, ”Prestandakriterier och övriga krav för analysmetoder”.

För kontroll av provernas överensstämmelse har det redan tagits hänsyn till den kombinerade standardmätosäkerheten i CCα-värdet (beslutsgräns vid konfirmering).

1. För otillåtna eller förbjudna farmakologiskt aktiva substanser ska CCα beräknas på följande sätt: a) Metod 1: Genom förfarandet med kalibreringskurvor i enlighet med ISO 11843–1:1997 (14) (där benämnt ”critical value of the net state variable”). I detta fall ska representativt blankmaterial användas som spetsats vid och över referensvärdet för åtgärder (RPA) eller den lägsta kalibrerade nivån (LCL) i ekvidistanta steg. Analysera proverna. Efter identifiering plottas signalen, om möjligt, eller den omräknade koncentrationen mot den tillsatta koncentrationen. Motsvarande koncentration vid skärningen med y-axeln plus 2,33 gånger standardavvikelsen för reproducerbarheten inom ett laboratorium för skärningen är lika med beslutsgränsen. Denna metod är endast tillämplig på kvantitativa undersökningar. Beslutsgränser som erhålls med detta tillvägagångssätt ska verifieras genom analys av blankmatris som spetsats vid den beräknade beslutsgränsen. b) Metod 2: Genom analys av minst 20 representativa blankmaterial per matris för att beräkna signal-brusförhållandet i det tidsfönster där analyten förväntas. Som beslutsgräns kan tre gånger signal-brusförhållandet användas. Detta är tillämpligt på kvantitativa och kvalitativa undersökningar. Beslutsgränser som erhålls med detta tillvägagångssätt ska verifieras genom analys av blankmatris som spetsats vid den beräknade beslutsgränsen. c) Metod 3: CCα = LCL + k (ensidig, 99 %) × (kombinerad) standardmätosäkerhet vid LCL. För otillåtna eller förbjudna farmakologiskt aktiva substanser kan det, beroende på valideringsförsöket (och dess respektive frihetsgrader), vara rimligt att tillämpa t-fördelningen, eller så ska en k-faktor på 2,33 användas om normalfördelningen (ensidig, n=∞) används som grund. Reproducerbarheten inom ett laboratorium och riktigheten är lämpliga för att ange (den kombinerade) standardmätosäkerheten, om den bestäms med hänsyn till alla relevanta påverkande faktorer. Metod 2 för beräkningen av CCα kan endast användas till den 1 januari 2026 om det rör sig om metoder som validerats före denna förordnings ikraftträdande. För metoder som validerats efter denna förordnings ikraftträdande ska endast metod 1 eller 3 användas.

2. För godkända farmakologiskt aktiva substanser ska CCα beräknas på följande sätt: a) För godkända substanser där ett MRL-värde eller en högsta tillåtna halt (ML) fastställts för kombinationer av matriser/djurslag: i) Metod 1: Genom förfarandet med kalibreringskurvor i enlighet med ISO 11843–1:1997 (där benämnt ”critical value of the net state variable”). I detta fall ska det användas blankmaterial som spetsats vid och över MRL-värdet eller den högsta tillåtna halten (ML) i ekvidistanta steg. Analysera proverna. Efter identifiering plottas signalen, om möjligt, eller den omräknade koncentrationen mot den tillsatta koncentrationen. Motsvarande koncentration vid MRL-värdet eller den högsta tillåtna halten (ML) plus 1,64 gånger standardavvikelsen för reproducerbarheten inom ett laboratorium vid det tillåtna gränsvärdet är lika med beslutsgränsen (α = 5 %). ii) Metod 2: CCα = MRL-värdet (eller den högsta tillåtna halten) + k (ensidig, 95 %) × (kombinerad) standardmätosäkerhet vid MRL-värdet eller den högsta tillåtna halten (ML). För godkända substanser kan det, beroende på valideringsförsöket (och dess respektive frihetsgrader), vara rimligt att tillämpa t-fördelningen, eller så ska en k-faktor på 1,64 användas om normalfördelningen (ensidig, n=∞) används som grund. Reproducerbarheten inom ett laboratorium och riktigheten är lämpliga för att ange (den kombinerade) standardmätosäkerheten, om den bestäms med hänsyn till alla relevanta påverkande faktorer. För farmakologiskt aktiva substanser med fastställt MRL-värde för summan av olika substanser ska CCα för substansen med högst koncentration i provet användas som CCα för att bedöma summan av substanser i det uppmätta provet. b) För godkända substanser där det inte har fastställts något MRL-värde för kombinationer av matriser/djurslag får inga resthalter förekomma, såvida inte en godkänd behandling i enlighet med artikel 11 i direktiv 2001/82/EG har ägt rum. För godkända substanser för vilka det inte har fastställts något MRL-värde ska ett kaskad-MRL-värde i enlighet med kommissionens genomförandeförordning (EU) 2018/470 (15) användas för beräkningen av CCα. Metod 1 eller 2 i stycket ovan ska tillämpas, men med MRL-värdet avses ’0,5 gånger MRL-värdet enligt kaskadprincipen, med målet 0,1 gång kaskad-MRL-värdet, om det rimligen kan uppnås.

2.7 Detektionsförmåga vid screening (CCβ)

CCβ ska bestämmas för screeningmetoder. CCβ ska fastställas i enlighet med kapitel 1,”Prestandakriterier och övriga krav för analysmetoder”, i denna bilaga och i enlighet med kraven i tabell 5. De fullständiga kraven för identifiering (se 1.2.3, 1.2.4 och 1.2.5) behöver inte tillämpas för screeningmetoder.

1. För otillåtna eller förbjudna farmakologiskt aktiva substanser ska ett β-fel på högst 5 % säkerställas. CCβ ska beräknas enligt följande: a) Metod 1: Genom förfarandet med kalibreringskurvor i enlighet med ISO 11843–1:1997 (där benämnt ”minimum detectable value of the net state variable”). I detta fall ska det användas ett representativt blankmaterial som spetsats vid och under referensvärdet för åtgärder (RPA) eller, om det inte har fastställts något RPA, omkring målkoncentrationen för screening (STC) i ekvidistanta steg. Analysera proverna. Plotta signalen mot den tillsatta koncentrationen. Motsvarande koncentration vid STC plus 1,64 gånger standardavvikelsen för reproducerbarheten inom ett laboratorium för det genomsnittligt uppmätta innehållet vid STC är lika med detektionsförmågan. Extrapolering långt under den lägsta spetsningsnivån (< 50 % av den lägsta spetsningsnivån) ska bekräftas genom försöksdata i valideringssteget. b) Metod 2: Undersökning av spetsade blankmaterial på koncentrationsnivåer vid och över STC. För varje koncentrationsnivå ska 20 spetsade blankprover analyseras för att garantera ett tillförlitligt underlag för denna bestämning. Koncentrationsnivån, då endast ≤ 5 % resultat som felaktigt bedömts överensstämma (falskt negativa resultat) kvarstår, är lika med detektionsförmågan för metoden. c) Metod 3: CCβ = STC + k (ensidig, 95 %) × (kombinerad) standardmätosäkerhet vid eller över STC. För otillåtna eller förbjudna farmakologiskt aktiva substanser kan det, beroende på valideringsförsöket (och dess respektive frihetsgrader), vara rimligt att tillämpa t-fördelningen, eller så ska en k-faktor på 1,64 användas om normalfördelningen (ensidig, n=∞) används som grund. Reproducerbarheten inom ett laboratorium och riktigheten är lämpliga för att ange (den kombinerade) standardmätosäkerheten, om den bestäms med hänsyn till alla relevanta påverkande faktorer.

2. För godkända substanser ska ett β-fel på högst 5 % säkerställas. CCβ ska beräknas enligt följande: a) Metod 1: Genom förfarandet med kalibreringskurvor i enlighet med ISO 11843–1:1997 (där benämnt ”minimum detectable value of the net state variable”). I detta fall ska det användas ett representativt blankmaterial som spetsats vid och under det tillåtna gränsvärdet, med utgångspunkt i STC i ekvidistanta steg. Analysera proverna och identifiera analyten eller analyterna. Beräkna standardavvikelsen för det genomsnittligt uppmätta innehållet vid STC. Motsvarande koncentration vid STC plus 1,64 gånger standardavvikelsen för reproducerbarheten inom ett laboratorium för det genomsnittligt uppmätta innehållet vid STC är lika med detektionsförmågan. b) Metod 2: Genom undersökning av spetsade blankmaterial på koncentrationsnivåer under det tillåtna gränsvärdet. För varje koncentrationsnivå ska 20 spetsade blankprover analyseras för att garantera ett tillförlitligt underlag för denna bestämning. Koncentrationsnivån, då endast ≤ 5 % resultat som felaktigt bedömts överensstämma (falskt negativa resultat) kvarstår, är lika med detektionsförmågan för metoden. c) Metod 3: CCβ = STC + k (ensidig, 95 %) × (kombinerad) standardmätosäkerhet vid eller över STC. För godkända substanser kan det, beroende på valideringsförsöket (och dess respektive frihetsgrader), vara rimligt att tillämpa t-fördelningen, eller så ska en k-faktor på 1,64 användas (antingen vid kaskadanvändning eller normal användning av MRL-värden) om normalfördelningen (ensidig, n=∞) används som grund. Reproducerbarheten inom ett laboratorium och riktigheten är lämpliga för att ange (den kombinerade) standardmätosäkerheten, om den bestäms med hänsyn till alla relevanta påverkande faktorer. För farmakologiskt aktiva substanser med fastställt MRL-värde för summan av olika substanser ska CCβ för substansen med högst koncentration i provet användas som CCβ för att bedöma summan av substanser i det uppmätta provet.

2.8 Kalibreringskurvor

Då kalibreringskurvor används för kvantifiering ska

1. minst fem helst ekvidistanta nivåer (inklusive nollnivå) användas för att konstruera kurvan,

2. kurvans mätområde beskrivas,

3. kurvans matematiska formel och anpassningsgraden för data (determinationskoefficient R2) till kurvan beskrivas,

4. godtagbara intervall för kurvans parametrar beskrivas.

För kalibreringskurvor baserade på en standardlösning, matrismatchade standarder eller matrisspetsade standarder ska godtagbara intervall anges för de parametrar för kalibreringskurvan som kan variera från serie till serie.

2.9 Absolut utbyte

Metodens absoluta utbyte ska bestämmas när inte någon intern standard eller matrisspetsad kalibrering används.

När kraven för riktighet i tabell 1 är uppfyllda kan en fast korrigeringsfaktor användas. I annat fall ska den utbytesfaktor som erhållits för den specifika satsen användas. Alternativt ska förfarandet för standardaddition (16) eller en intern standard användas i stället för en korrigeringsfaktor för utbyte.

Det absoluta utbytet ska beräknas för minst sex representativa partier av matrisen.

En alikvot av blankmatris ska spetsas med analyten före extraktion, och en andra alikvot av blankmatris ska spetsas efter provberedning på en relevant koncentrationsnivå, och analytens koncentration ska bestämmas.

Utbytet ska beräknas enligt följande:

Utbyte (analyt) = (area matrisspetsad standard) / (area matrismatchad standard) × 100

2.10 Relativa matriseffekter

Den relativa matriseffekten ska bestämmas i samtliga fall. Detta kan göras antingen som ett led i valideringen eller i separata försök. Beräkningen av den relativa matriseffekten ska göras för minst 20 olika blankpartier (matris/djurslag), enligt tillämpningsområdet för metoden, t.ex. olika djurslag som ska omfattas.

Blankmatrisen bör spetsas efter extraktion med analyten vid referensvärde för åtgärder (RPA), MRL-värdet eller den högsta tillåtna halten (ML) och bör analyseras tillsammans med en ren analytlösning.

Den relativa matriseffekten eller matrisfaktorn (MF) beräknas enligt följande:

IS: intern standard

MMS: matrismatchad standard

Variationskoefficienten får inte vara större än 20 % för MF (standard som är normaliserad mot IS).

KAPITEL 3

KVALITETSKONTROLL VID RUTINANALYS – LÖPANDE VERIFIERING AV METODENS PRESTANDA

Kraven för kvalitetssäkring av analysresultat i kapitel 7.7 i ISO/IEC 17025:2017 (17) ska uppfyllas.

Vid rutinanalys är analys av de certifierade referensmaterialen (CRM) det bästa alternativet för att bevisa metodens prestanda. Eftersom certifierade referensmaterial som innehåller den relevanta analyten på de erforderliga koncentrationsnivåerna sällan är tillgängliga, får också referensmaterial som tagits fram och karakteriserats av EU-referenslaboratorierna eller de laboratorier som har en ackreditering enligt ISO/IEC 17043:2010 (18) användas. Interna referensmaterial som kontrolleras regelbundet får också användas.

Den löpande verifieringen av metodens prestanda vid rutinanalys bör utföras i screeningsteget och konfirmeringssteget.

1. Screeningsteget: För varje serie (sats) utförda analyser ska en uppsättning av följande prover för kvalitetskontroll samtidigt analyseras: a) Kontrollprov för instrumentets systemlämplighet, helst metodspecifikt. b) Prover för kvalitetskontroll som är spetsade vid en koncentration nära målkoncentrationen för screening (STC) och helst vid CCβ vid screening både för godkända farmakologiskt aktiva substanser och för förbjudna eller otillåtna substanser. c) Överensstämmande (negativt) kontrollprov (blankprover) och i förekommande fall reagensblankar.

2. Konfirmeringssteget: För varje serie (sats) utförda analyser ska en uppsättning av följande prover för kvalitetskontroll samtidigt analyseras: a) Kontrollprov för instrumentets systemlämplighet, helst metodspecifikt. b) Prover för kvalitetskontroll som är spetsade vid en koncentration nära MRL-värdet och den högsta tillåtna halten (ML) för godkända farmakologiskt aktiva substanser eller nära referensvärdet för åtgärder (RPA) eller den lägsta kalibrerade nivån (LCL) för förbjudna eller otillåtna substanser (icke-överensstämmande (positiva) kontrollprover). c) Överensstämmande (negativt) kontrollprov (blankprover) och i förekommande fall reagensblankar.

Följande ordning rekommenderas för prover för kvalitetskontroll: kontrollprov för instrumentets systemlämplighet, överensstämmande (negativt) kontrollprov, prov(er) som ska konfirmeras, överensstämmande (negativt) kontrollprov på nytt och spetsade prover för kvalitetskontroll (icke-överensstämmande (positiva) kontrollprover).

För kvantitativa metoder ska med varje sats officiella prover en kalibreringskurva analyseras och mätas före eller efter de ovan angivna proverna.

Om det är praktiskt möjligt ska riktigheten (baserat på spetsade prover) av alla målanalyter i de icke-överensstämmande (positiva) kontrollproverna utvärderas med hjälp av kontrollkort i enlighet med kapitel 7.7 i ISO/IEC 17025:2017. Om detta ställer krav på ett oproportionerligt stort antal bestämningar av riktighet kan antalet analyter minskas till ett antal representativa analyter.

KAPITEL 4

UTVIDGNING AV DET VALIDERADE TILLÄMPNINGSOMRÅDET FÖR EN TIDIGARE VALIDERAD METOD

Ibland är det nödvändigt att utvidga tillämpningsområdet för en metod som tidigare genomgått en omfattande validering. I sådana fall bör tillämpningsområdet utvidgas på ett effektivt och analytiskt korrekt sätt. Detta kan uppnås genom en validering av ett reducerat antal prover (t.ex. hälften av proverna) jämfört med en fullständig validering.

Typen av och antalet ändringar som ska valideras genom en reducerad valideringsordning ska dock alltid baseras på expertkunskap och tidigare erfarenheter, t.ex. skulle en ändring av detektionsteknik i vilket fall som helst kräva en fullständig validering.

I allmänhet ska metodens prestanda övervakas kontinuerligt och jämföras med de ursprungliga valideringsparametrarna så att det försäkras att metoden alltjämt är giltig. Denna löpande kontroll av metodens prestanda ska utformas på ett sådant sätt att de data som saknas för en fullständig validering kan samlas in över tid (t.ex. med några få datapunkter från prover för kvalitetskontroll i varje analysserie).

4.1 Utvidgning av metoder med avseende på koncentrationsintervall

Efter ändringar av MRL-värden, högsta tillåtna halter (ML) och referensvärden för åtgärder (RPA) kan det bli nödvändigt att justera det koncentrationsintervall som en metod har validerats för. I sådant fall är en reducerad valideringsordning godtagbar.

Kalibreringskurvor för det ändrade intervallet bör tas fram enligt det validerade förfarandet. Olika satser som har spetsats på olika koncentrationsnivåer (se 2.2.1 och 2.2.2) bör analyseras. Riktighet, repeterbarhet och reproducerbarhet inom ett laboratorium/intermediär precision bör ligga inom ett godtagbart intervall jämfört med de ursprungligen validerade metoderna. En omräkning av CCβ (screeningmetoder) och CCα (konfirmeringsmetoder) bör göras i förekommande fall.

4.2 Utvidgning av metoder med avseende på ytterligare substanser

I allmänhet går det bara att utvidga metoder med ytterligare föreningar när det gäller analyter som har samma struktur och egenskaper som de analyter som redan ingår i analysmetoden. I sådant fall är en reducerad valideringsordning godtagbar. Det är inte heller tillåtet att avvika från metodbeskrivningen.

Kalibreringskurvor för de ytterligare substanserna bör tas fram enligt det validerade förfarandet. Olika satser matrismaterial som har spetsats på olika koncentrationsnivåer (se 2.2.1 och 2.2.2) bör analyseras. Riktighet, repeterbarhet och reproducerbarhet inom ett laboratorium/intermediär precision bör ligga inom ett intervall som är jämförbart med intervallet för de andra analyterna i den ursprungligen validerade metoden och överensstämma med kraven i 1.2.2. En beräkning av CCβ (screeningmetoder) och CCα (konfirmeringsmetoder) ska göras för de nya analyterna.

4.3 Utvidgning av metoder med avseende på matriser/djurslag

Beslutet att införa nya matriser eller djurslag i en redan validerad analysmetod ska alltid fattas från fall till fall baserat på den kunskap och erfarenhet man har av metoden och på de förberedande försöken för utvärdering av potentiella matriseffekter och interferenser. I allmänhet kommer det att vara möjligt endast för matriser som uppvisar liknade egenskaper och för analyter som inte är kritiska (stabilitet, detekterbarhet).

Kalibreringskurvor (standard eller matris) bör tas fram enligt det validerade förfarandet. Olika satser matrismaterial som har spetsats på olika koncentrationsnivåer (se 2.2.1 och 2.2.2) bör analyseras. Riktighet, repeterbarhet och reproducerbarhet inom ett laboratorium/intermediär precision bör ligga inom ett godtagbart intervall jämfört med intervallen för den ursprungligen validerade metoden och överensstämma med kraven i 1.2.2. Beroende på valideringssättet kan det bli nödvändigt med en omräkning av CCβ (screeningmetoder) eller CCα (konfirmeringsmetoder).

Om resultatet inte ligger inom ett godtagbart intervall jämfört med värdena för den ursprungliga matrisen blir det nödvändigt att göra en ytterligare fullständig validering för att bestämma de matris-/djurslagsspecifika prestandaparametrarna.

När MRL-värdet för en specifik substans är olika i vissa matriser är det sannolikt svårt att anpassa metodens tillämpningsområde till den ytterligare matrisen/djurslaget och koncentrationen, eftersom två ändringar måste beaktas i detta fall. I sådana fall rekommenderas en fullständig validering.

(1) Co-kromatografi är ett förfarande där provextraktet delas upp i två delar före kromatografisteget eller kromatografistegen. Den första delen kromatograferas i befintligt skick. Den andra delen blandas med den standard som ska mätas. Därefter kromatograferas även blandningen. Mängden tillsatt standard ska motsvara den förväntade mängden analyt i extraktet. Co-kromatografi används för att förbättra identifieringen av en analyt vid användning av kromatografimetoder, särskilt när ingen lämplig intern standard kan användas.

(*) * CV (%) är ett riktvärde och bör vara så lågt som rimligen är möjligt.

(a) Ingen ytterligare identifieringspunkt erhålls för valet av moderjon, om denna moderjon är samma jon (eller en addukt eller isotop) som den HRMS-jon som övervakas i fullscan.

(#) Om stabilitetsdata för analyter i en matris finns tillgängliga i vetenskaplig litteratur eller hos ett annat laboratorium behöver dessa data inte bestämmas igen av det berörda laboratoriet. En hänvisning till tillgängliga stabilitetsdata för analyter i lösningar är dock endast godtagbar om betingelserna är identiska.

(*) Det är relevant för MS-metoder att valideringen visar att kraven för prestandaegenskaperna är uppfyllda. Metodens relativa matriseffekt ska bestämmas när denna effekt inte har bedömts under valideringen. Metodens absoluta utbyte ska bestämmas när inte någon intern standard eller matrisspetsad kalibrering används.

(2) ISO 5725–4:2020 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results – Part 4: Basic methods for the determination of the trueness of a standard measurement method (punkt 3).

(3) Om det för otillåtna farmakologiskt aktiva substanser inte rimligen kan göras en validering av en koncentration på 0,5 gånger RPA, kan koncentrationen på 0,5 gånger RPA ersättas med den lägsta koncentration mellan 0,5 gånger och 1,0 gång RPA som rimligen kan uppnås.

(4) Om det för en specifik farmakologiskt aktiv substans inte rimligen kan göras en validering av en koncentration på 0,1 gång MRL-värdet, kan koncentrationen på 0,1 gång MRL-värdet ersättas med den lägsta koncentration mellan 0,1 gång och 0,5 gånger MRL-värdet som rimligen kan uppnås.

(5) Om det för en otillåten farmakologiskt aktiv substans inte rimligen kan göras en validering av en koncentration på 0,5 gånger RPA, kan koncentrationen på 0,5 gånger RPA ersättas med den lägsta koncentration mellan 0,5 gånger och 1,0 gång RPA som rimligen kan uppnås.

(6) Om det för en specifik farmakologiskt aktiv substans inte rimligen kan göras en validering av en koncentration på 0,1 gång MRL-värdet, kan koncentrationen på 0,1 gång MRL-värdet ersättas med den lägsta koncentration mellan 0,1 gång och 0,5 gånger MRL-värdet som rimligen kan uppnås.

(7) ISO 5725–2:2019 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results – Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method (punkt 3).

(8) ISO 11843–1:1997 Detektionskapabilitet – Del 1: Termer och definitioner.

(9) Codex Alimentarius-kommissionen, FAO/WHO, Guidelines on estimation of uncertainty of results (CAC/GL 59–2006).

(10) De ändringar av försöksbetingelserna som avses där kan gälla provmaterial, analyter, lagringsförhållanden, miljö- och/eller provberedningsförhållanden. För alla de försöksbetingelser som i praktiken kan variera (t.ex. reagensernas stabilitet, provsammansättning, pH, temperatur) ska alla avvikelser som kan påverka analysresultatet anges.

(11) Jülicher, B., Gowik, P. och Uhlig, S. (1998), Assessment of detection methods in trace analysis by means of a statistically based in-house validation concept. Analyst, 120, 173

(12) IUPAC (1995), Protocol for the design, conduct and interpretation of method-performance studies, Pure & Applied Chem, 67, 331.

(13) Gowik, P., Jülicher, B. och Uhlig, S. (1998), Multi-residue method for non-steroidal anti-inflammatory drugs in plasma using high performance liquid chromatography-photodiode-array detection. Method description and comprehensive in-house validation. Chromatogr., 716, 221.

(14) ISO 11843–1:1997 Detektionskapabilitet – Del 1: Termer och definitioner.

(15) Kommissionens genomförandeförordning (EU) 2018/470 av den 21 mars 2018 om detaljerade bestämmelser om det MRL-värde som ska beaktas för kontrollsyfte när det gäller livsmedel som härrör från djur som har behandlats i EU i enlighet med artikel 11 i direktiv 2001/82/EG (EUT L 79, 22.3.2018, s. 16).

(16) Mängden standard som tillsätts kan t.ex. vara mellan två och fem gånger den förväntade mängden analyt i provet. Detta förfarande är utformat för att bestämma halten av en analyt i ett prov med beaktande av utbytet för analysmetoden.

(17) ISO/IEC 17025:2017 Allmänna kompetenskrav för provnings- och kalibreringslaboratorier (kapitel 7.7).

(18) ISO/IEC 17043:2010 Conformity assessment – General requirements for proficiency testing.