KOMMISSIONENS GENOMFÖRANDEBESLUT (EU) 2015/1554

av den 11 september 2015

om tillämpningsföreskrifter för direktiv 2006/88/EG vad gäller krav för övervakning och diagnostiska metoder

[delgivet med nr C(2015) 6188]

(Text av betydelse för EES)

EUROPEISKA KOMMISSIONEN HAR ANTAGIT DETTA BESLUT

med beaktande av fördraget om Europeiska unionens funktionssätt,

med beaktande av rådets direktiv 2006/88/EG av den 24 oktober 2006 om djurhälsokrav för djur och produkter från vattenbruk och om förebyggande och bekämpning av vissa sjukdomar hos vattenlevande djur (1), särskilt artiklarna 49.3, 50.4, 57 b och 61.3, och

av följande skäl:

Världsorganisationen för djurhälsa (OIE) har antagit Aquatic Animal Health Code (nedan kallad OIE:s Aquatic Code) där det fastställs standarder för att förbättra hälsan hos vattenlevande djur och välbefinnandet hos odlad fisk i hela världen, inklusive standarder för säker internationell handel med vattenlevande djur och produkter av dessa. Några kapitel i OIE:s Aquatic Code innehåller rekommendationer vad gäller användningen av vissa diagnostiska tester. Dessa tester fastställs i OIE:s Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals (nedan kallad OIE:s manual). För att säkerställa att unionens krav när det gäller diagnostik av sjukdom hos vattenlevande djur överensstämmer med internationella standarder bör de regler som fastställs i detta beslut beakta standarderna och rekommendationerna i OIE:s Aquatic Code.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Syfte

I detta beslut fastställs bestämmelser vad gäller följande:

Artikel 2

Definitioner

I detta beslut avses med

a) viral hemorragisk septikemi (VHS) : en sjukdom som orsakas av viruset för viral hemorragisk septikemi (VHS-virus) som är ett virus av släktet Novirhabdovirus i familjen Rhabdoviridae,

b) infektiös hematopoietisk nekros (IHN) : en sjukdom som orsakas av viruset för infektiös hematopoietisk nekros (IHN-virus) som är ett virus av släktet Novirhabdovirus i familjen Rhabdoviridae,

c) koiherpesvirus (KHV) : en sjukdom som orsakas av koiherpesvirus (KHV) som tillhör familjen Alloherpesviridae; det vetenskapliga namnet är cyprinidherpesvirus 3 (CyHV-3),

d) infektiös laxanemi (ILA/ISA) : en sjukdom som orsakas av en infektion med HPR-deleted (highly polymorphic region-deleted) laxanemivirus (ISA-virus) som är ett virus av släktet Isavirus i familjen Orthomyxoviridae,

e) infektion orsakad av Marteilia refringens: en sjukdom som orsakas av en infektion med Marteilia refringens, en protozo tillhörande stammen Paramyxea,

f) infektion orsakad av Bonamia ostreae: en sjukdom som orsakas av en infektion med Bonamia ostreae, en protozo tillhörande stammen haplosporidier,

g) vitprickig kräftdjurssjuka (WSD) : en sjukdom som orsakas av White Spot Syndrome Virus (WSSV) som är ett dubbelsträngat DNA-virus av släktet Whispovirus i familjen Nimaviridae.

Artikel 3

Minimikrav för utrotnings- och övervakningsprogram

Medlemsstaterna ska se till att de bestämmelser vad gäller övervaknings- och utrotningsprogram, buffertzoner, provtagningsmetoder och diagnostiska metoder som fastställs i bilaga I samt de särskilda metoder och detaljerade förfaranden som fastställs i bilaga II följs när en sjukdomsfri status ska beviljas, återkallas eller återutfärdas för en medlemsstat eller för en zon eller ett delområde i en medlemsstat med avseende på en eller flera av de förtecknade sjukdomarna.

Artikel 4

Minimikrav för diagnostiska metoder och särskilda förfaranden

Medlemsstaterna ska se till att de bekämpningsmetoder som fastställs i bilaga I och de särskilda diagnostiska metoder och detaljerade förfaranden som fastställs i bilaga II följs när laboratorieanalyser genomförs för att bekräfta eller utesluta förekomst av en förtecknad sjukdom.

Artikel 5

Minimibekämpningsåtgärder för att motverka spridning av förtecknade sjukdomar och minimikrav för att upphäva dessa åtgärder i medlemsstater, zoner eller delområden som inte förklarats fria från de förtecknade sjukdomarna

Medlemsstaterna ska se till att de minimibekämpningsåtgärder och de minimikrav för att upphäva dessa åtgärder som fastställs i bilaga I följs när bekämpningsåtgärder vidtas och dessa åtgärder för att motverka spridning av en eller flera av de förtecknade sjukdomarna upphävs i en medlemsstat eller i en zon eller ett delområde i en medlemsstat som inte förklarats fri/fritt från de förtecknade sjukdomarna.

Artikel 6

Upphävande

Besluten 2001/183/EG, 2002/878/EG och 2003/466/EG ska upphöra att gälla.

Artikel 7

Tillämpningsdatum

Detta beslut ska tillämpas från och med den 1 april 2016.

Artikel 8

Adressater

Detta beslut riktar sig till medlemsstaterna.

(1) EUT L 328, 24.11.2006, s. 14.

(2) Kommissionens beslut 2001/183/EG av den 22 februari 2001 om fastställande av provtagningsplaner och diagnostiska metoder för påvisande och bekräftelse av vissa fisksjukdomar och om upphävande av beslut 92/532/EEG (EGT L 67, 9.3.2001, s. 65).

(3) Kommissionens beslut 2003/466/EG av den 13 juni 2003 om kriterier för zonindelning och officiell övervakning vid misstanke om eller bekräftelse av förekomst av infektiös laxanemi (ISA) (EUT L 156, 25.6.2003, s. 61).

(4) Kommissionens beslut 2002/878/EG av den 6 november 2002 om provtagningsplaner och de diagnostiseringsmetoder som skall tillämpas för påvisande och konstaterande av musselsjukdomarna Bonamiosis (Bonamia ostreae) och Marteiliosis (Marteilia refringens) (EGT L 305, 7.11.2002, s. 57).

(14) Proverna ska varje år samlas in och undersökas under två testperioder på en månad (på våren och hösten) eller när så är lämpligt efter praktiska överväganden.

(12) Proverna ska varje år samlas in, förvaras och undersökas under två testperioder på en månad (på våren och hösten) eller när så är lämpligt efter praktiska överväganden.

Förekomsten av WSD har inte bekräftats under den tvåårsperiod som följer på slutförandet av de åtgärder som avses i leden a och b, och under denna period har misstankar om förekomst uteslutits i enlighet med förfarandena i punkt II.3.

En hälsoinspektion: I de anläggningar där de tester som avses i led i har gett negativa resultat ska hälsoinspektionerna fortsätta en gång per månad under den årstid då vattentemperaturen sannolikt är som högst, fram till dess att skyddszonen har återkallats i enlighet med punkt I.2.2.1 c.

Infektion orsakad av Bonamia ostreae har inte bekräftats under den tvåårsperiod som följer på slutförandet av de åtgärder som avses i leden a, b och c, och under denna period har misstankar om förekomst uteslutits i enlighet med förfarandena i punkt II.3.

När Ostrea edulis som kommer från en medlemsstat, en zon eller ett delområde med hälsostatus av kategori I ska ingå i provet, ska de ha förts in på anläggningen eller området för blötdjursodling senast under den höst som föregår den period då övervakningsprogrammet genomförs.

Infektion orsakad av Marteilia refringens har inte bekräftats under den tvåårsperiod som följer på slutförandet av de åtgärder som avses i leden a, b och c, och under denna period har misstankar om förekomst uteslutits i enlighet med förfarandena i punkt II.3.

När Ostrea edulis, Mytilus edulis eller Mytilus galloprovincialis som kommer från en medlemsstat, en zon eller ett delområde med hälsostatus av kategori I ska ingå i provet, ska de ha förts in på anläggningen eller området för blötdjursodling senast under den vår som föregår den period då övervakningsprogrammet genomförs.

Förekomst av HPR-deleted ISA-virus har inte bekräftats under den tvåårsperiod som följer på slutförandet av de åtgärder som avses i leden a, b och c, och under denna period har misstankar om förekomst uteslutits i enlighet med förfarandena i punkt II.3.

En hälsoinspektion: I de anläggningar där de tester som avses i led i har gett negativa resultat ska hälsoinspektionerna fortsätta en gång per månad fram till dess att skyddszonen har återkallats i enlighet med punkt I.2.2.1 c.

En hälsoinspektion i de anläggningar där de tester som avses i punkt III.2 har gett negativa resultat. Hälsoinspektionerna ska fortsätta en gång per månad under den årstid då vattentemperaturen sannolikt överstiger 15 °C fram till dess att skyddszonen har återkallats i enlighet med punkt I.2.2.1 c.

När anläggningar eller vilda populationer ska genomgå hälsoinspektioner eller provtas mer än en gång per år ska intervallerna mellan hälsoinspektionerna eller mellan provinsamlingarna vara så långa som möjligt under den årstid då vattentemperaturen sannolikt är som högst utan att överskrida gränsen på 28 °C.

Vid upptagning och annan hantering av fisken samlas prover in som en del av normal hantering. Proverna ska om möjligt samlas in 24–72 timmar efter denna hantering för att förbättra chanserna för att påvisa KHV.

En hälsoinspektion i de anläggningar där de tester som avses i led i har gett negativa resultat. Hälsoinspektionerna ska fortsätta en gång per månad under den period då vattentemperaturen understiger 14 °C, utom när dammar eller nätkassar är täckta av is, fram till dess att skyddszonen har återkallats i enlighet med punkt I.2.2.1 c.

Hälsoinspektioner och, i förekommande fall, provtagning ska genomföras under den tid på året då vattentemperaturen understiger 14 °C eller närhelst under året då vattentemperaturen sannolikt är som lägst.

BILAGA II

DETALJERADE DIAGNOSTISKA METODER OCH FÖRFARANDEN

I. Inledning

I denna bilaga fastställs de detaljerade förfarandena för de diagnostiska metoder som ska användas vid laboratorieanalyserna i de utrotnings- och övervakningsprogram som fastställs i bilaga I till detta beslut för att i enlighet med artikel 57 b i det direktivet utesluta misstanke om eller bekräfta förekomst av följande sjukdomar som inte är exotiska och som förtecknas i del II i bilaga IV till direktiv 2006/88/EG (nedan kallade de förtecknade sjukdomarna):

1. Viral hemorragisk septikemi (VHS) Del 1 2. Infektiös hematopoietisk nekros (IHN) Del 1 3. Koiherpesvirus (KHV) Del 2 4. Infektiös laxanemi (ILA/ISA) Del 3 5. Infektion orsakad av Marteilia refringens Del 4 6. Infektion orsakad av Bonamia ostreae Del 5 7. Vitprickig kräftdjurssjuka (WSD) Del 6

II. Definitioner

I denna bilaga avses med transportmedium ett cellodlingsmedium med 10 % kalvserum samt med 200 IE penicillin, 200 μg streptomycin och 200 μg kanamycin per milliliter eller med annan antibiotika med dokumenterad effektivitet.

DEL 1

DETALJERADE DIAGNOSTISKA METODER OCH FÖRFARANDEN FÖR ÖVERVAKNING OCH BEKRÄFTELSE AV FÖREKOMST AV VHS OCH IHN

I. Diagnostiska metoder och förfaranden för övervakning av VHS och IHN

Vid genomförandet av provtagning och laboratorieanalys för att erhålla eller få behålla sjukdomsfri hälsostatus med avseende på VHS eller IHN i enlighet med del 1 avsnitt I i bilaga I med de diagnostiska metoderna i del 1 punkterna II.1 och II.2 i den bilagan ska de detaljerade diagnostiska metoderna och förfarandena i de följande punkterna I.1–I.6 tillämpas.

I.1 Beredning och transport av fiskprover

I.1.1 Vävnader för virologisk undersökning i cellkultur

Före transport eller överföring till laboratoriet ska delar av de organ som ska undersökas avlägsnas från fisken med sterila dissektionsinstrument och överföras till sterila plaströr med transportmedium.

Vilken mängd fiskmaterial som lämpar sig för virologisk undersökning i cellkultur och RT-qPCR beror på fiskens storlek. De vävnader som ska provtas ska därför vara hela gulesäcksyngel (längd < 4 cm), inälvor inklusive njure (längd 4–6 cm) eller, för större fiskar, njure, mjälte, hjärta och/eller encephalon samt ovarievätska från stamfisk vid lektiden.

Ovarievätska, sädesvätska eller organdelar från högst 10 fiskar får samlas in i ett sterilt rör med minst 4 ml transportmedium och ska utgöra ett samlingsprov. Vävnaderna i varje prov ska väga minst 0,5 g.

Den virologiska undersökningen i cellkultur ska påbörjas så snart som möjligt och senast 48 timmar efter provinsamlingen. I undantagsfall får den virologiska undersökningen påbörjas senast 72 timmar efter materialinsamlingen, förutsatt att det material som ska undersökas skyddas av ett transportmedium och att temperaturkraven under transport kan uppfyllas.

I.1.2 Prover för analys med PCR med omvänd transkription (RT-PCR eller RT-qPCR)

Prover ska tas från fisken med ett sterilt instrument och överföras till sterila plaströr med transportmedium i enlighet med förfarandet i punkt I.1.1. Vävnad från 10 fiskar får samlas in i ett rör och ska utgöra ett samlingsprov. Om mängden inokulat är liten får dock vävnad från upp till 5 fiskar användas. Alternativt får prover slås samman i RNA-stabiliserande lösning, t.ex. 0,2 g vävnad/ml reagens enligt tillverkarnas rekommendationer, även om varje fisk ska bearbetas separat och inte får slås samman i prov på grund av att mängden material för extraktion är liten.

Även hel fisk får skickas till laboratoriet.

I.2 Transport av fiskprover

Rör med fiskvävnader i transportmedium för cellodling eller analys med RT-PCR/RT-qPCR ska placeras i isolerade behållare (t.ex. tjockväggiga polystyrenlådor) tillsammans med så mycket is eller ett alternativt kylmedel med liknande avkylande effekt så att proverna hålls kylda under transporten till laboratoriet. Frysning av proverna ska dock förhindras. Provernas temperatur under transporten får aldrig överstiga 10 °C och när proverna tas emot ska det finnas is kvar i transportlådan eller också ska ett eller flera av frysblocken fortfarande vara helt eller delvis frysta.

Hel fisk får skickas till laboratoriet om de temperaturkrav som anges i första stycket kan uppfyllas under transporten. Hel fisk ska slås in i absorberande papper och transporteras i plastpåse. Även levande fisk får transporteras.

I.3 Insamling av kompletterande diagnostiskt material

När diagnostiklaboratoriet godkänt det får även andra fiskvävnader samlas in och beredas för kompletterande undersökningar.

I.4 Provberedning för undersökning i cellkultur och RT-qPCR

I.4.1 Frysning i undantagsfall

Om det uppstår praktiska svårigheter som gör det omöjligt att bearbeta proverna inom 48 timmar efter insamlingen av fiskvävnaderna får man frysa vävnaderna i transportmedium vid högst – 20 °C och genomföra den virologiska undersökningen inom 14 dagar. Fiskvävnaden får dock endast frysas och tinas upp en gång före undersökningen. Skälen till infrysning av fiskvävnadsprover ska registreras varje gång.

I.4.2 Homogenisering av organ

På laboratoriet ska fiskvävnaden i rören homogeniseras fullständigt (antingen med stomacher homogenisator, mixer eller med mortel och stöt med steril sand) och därefter blandas med det ursprungliga transportmediet.

Om ett prov består av en hel fisk som är mindre än 4 cm ska denna sönderdelas med steril sax eller skalpell efter det att kroppen bakom analöppningen har avlägsnats. Om ett prov består av en hel fisk som är 4–6 cm ska inälvorna inklusive njure samlas in. Om ett prov består av en hel fisk som är längre än 6 cm ska vävnadsprover samlas in enligt punkt I.1. Vävnadsproverna ska sönderdelas med steril sax eller skalpell, homogeniseras enligt första stycket och blandas med transportmedium.

Det slutliga förhållandet mellan vävnadsmaterial och transportmedium ska på laboratoriet justeras till 1:10.

I.4.3 Centrifugering av homogenat

Homogenatet ska centrifugeras i en kylcentrifug vid 2 000–4 000 × g vid 2–5 °C i 15 minuter, varefter supernatanten ska samlas in och får behandlas med antibiotika antingen vid 15 °C i 4 timmar eller vid 4–8 °C över natten. Om provet har transporterats i ett transportmedium får man utelämna behandlingen av supernatanten med antibiotika.

Om det uppstår praktiska svårigheter (t.ex. om inkubatorn inte fungerar eller om man får problem med cellkulturerna) som gör det omöjligt att inokulera cellerna inom 48 timmar efter insamlingen av fiskvävnadsproverna får man frysa supernatanten vid – 80 °C och genomföra den virologiska undersökningen inom 14 dagar.

Om den insamlade supernatanten förvaras vid – 80 °C inom 48 timmar efter provtagningen får den återanvändas endast en gång för virologisk undersökning.

Före inokuleringen av cellerna ska supernatanten blandas med lika delar av lämpligt utspätt, sammanslaget antiserum mot de inhemska serotyperna av virus för infektiös pankreasnekros (IPN-virus) och inkuberas vid 15 °C i minst en timme eller vid 4 °C i högst 18 timmar. Antiserumets titer ska vara minst 1:2 000 i ett 50 % plackneutralisationstest.

Alla inokulat behandlas med antiserum mot IPN-virus för att förhindra att en cytopatisk effekt (CPE) orsakad av IPN-virus utvecklas i inokulerade cellkulturer. Detta gör de virologiska undersökningarna snabbare och ger färre fall där förekomsten av CPE skulle uppfattas som en potentiell indikation på VHS-virus eller IHN-virus.

När prover kommer från produktionsenheter som anses fria från IPN behöver inokulat inte behandlas med antiserum mot IPN-virus.

I.4.4 Provberedning för RT-PCR- och RT-qPCR-baserade övervakningsprogram

Om prover har samlats in i transportmedium ska förfarandet i punkterna I.4.2 och I.4.3 genomföras. Efter centrifugering ska supernatanten samlas in och RNA extraheras. Om ingen ytterligare undersökning ska genomföras direkt efter centrifugeringen ska proverna omedelbart frysas vid högst – 20 °C.

Vid analys av fiskvävnader som bevarats i RNA-stabiliserande lösning ska efterföljande steg utföras inom följande tidsramar beroende på den temperatur som proverna förvarats vid:

Prover förvarade vid 37 °C: en dag.

Prover förvarade vid 25 °C: en vecka.

Prover förvarade vid 4 °C: en månad.

Prover förvarade vid – 20 °C: på obestämd tid.

Samlingsprover i RNA-stabiliserande lösning ska behandlas som enskilda prover i RNA-stabiliserande lösning. För prover som slås samman i RNA-stabiliserande lösning får provmängden inte överstiga den som rekommenderas av tillverkaren vid extraktion med RNA-kit, såsom RNeasy Mini kits (Qiagen) eller liknande. Om större prover slås samman ska extraktionskiten eller extraktionsmetoderna återspegla denna sammanslagning.

Prover som samlas in i RNA-stabiliserande lösning får inte användas för cellodling.

I.4.5 Sammanslagning av prover för RT-qPCR

Eftersom protokollen för RT-qPCR har liknande eller högre sensitivitet än cellodlingsmetoderna, får man vid PCR använda supernatanten från homogeniserat fiskvävnadsmaterial bestående av organ från upp till 10 fiskar som slagits samman i cellodlingsmedium. På grund av den lilla mängd inokulat som används vid PCR jämfört med vid cellodling ska alla fiskvävnader noggrant homogeniserade innan materialet slås samman för extraktion.

Samma princip ska också tillämpas om prover samlas in i RNA-stabiliserande lösning. I dessa fall är det emellertid ofta svårt att samla in representativt material från upp till 10 fiskar i ett rör och antalet fiskar per sammanslaget prov ska därför minskas till 2–5 stycken.

I.5 Virologisk undersökning i cellkultur

I.5.1 Cellkulturer och medier

Antingen cellinjen Bluegill fry (BF-2) eller Rainbow trout gonad (RTG-2) och antingen cellinjen Epithelioma papulosum cyprini (EPC) eller Fathead minnow (FHM) ska odlas vid 20–30 °C i lämpligt medium, dvs. Eagle's Minimum Essential Medium (MEM) eller modifieringar därav, med tillsats av 10 % fetalt bovinserum och antibiotika i standardkoncentrationer.

När cellerna odlas i stängda flaskor ska mediet buffras med bikarbonat. Vid odling i öppna kärl kan cellodlingsmediet buffras med Tris-HCl (tris(hydroximetyl)aminometan-HCl) (23 mM) och natriumbikarbonat (6 mM). pH-värdet ska vara 7,6 ± 0,2.

De cellkulturer som ska användas för inokulering med fiskvävnadsmaterial ska vara unga, om möjligt ska vanligtvis en dag gamla cellkulturer i monolager användas. Emellertid kan cellkulturer som är 4–48 timmar godtas. Cellerna ska vara aktivt växande vid inokuleringen.

I.5.2 Inokulering av cellkulturer

Antibiotikabehandlade organsuspensioner ska inokuleras i cellkulturer i två spädningar för att förhindra homolog interferens, dvs. primärspädningen plus en spädning på 1:10 av denna, vilket resulterar i slutliga spädningar av vävnadsmaterial i cellodlingsmedium på 1:100 respektive 1:1 000. Minst två cellinjer ska inokuleras enligt punkt I.5.1. Förhållandet mellan inokulatets storlek och cellodlingsmediets volym ska vara cirka 1:10.

För varje spädning och varje cellinje ska minst cirka 2 cm2 cellyta användas, motsvarande en brunn i en cellodlingsplatta med 24 brunnar. Cellodlingsplattor ska användas när så är möjligt.

I.5.3 Inkubering av cellkulturer

De inokulerade cellkulturerna ska inkuberas vid 15 °C i 7–10 dagar. Om färgen på cellodlingsmediet ändras från rött till gult, vilket är ett tecken på att mediet blivit surt, ska pH-värdet justeras med steril bikarbonatlösning eller likvärdiga ämnen för att säkerställa cellernas mottaglighet för virusinfektion.

Minst var sjätte månad eller så snart man misstänker att cellernas mottaglighet för infektion har minskat ska frusna lager av VHS-virus och IHN-virus titreras för att kontrollera cellkulturernas mottaglighet för infektion. Förfarandet i avsnitt III ska användas när så är möjligt.

I.5.4 Mikroskopi

Inokulerade cellkulturer ska regelbundet (minst tre gånger per vecka) undersökas vid 40–150 × förstoring för förekomst av CPE. Om tydlig CPE iakttas ska förfaranden för identifiering av virus enligt punkt I.6 påbörjas omedelbart.

I.5.5 Subkultivering

Om CPE inte har utvecklats efter 7–10 dagars primärinkubering ska subkultivering till friska cellkulturer göras och en ungefär lika stor cellyta som i primärkulturen ska användas.

Från samtliga kulturer eller brunnar i primärkulturen ska alikvoter av medium (supernatant) slås samman enligt cellinje 7–10 dagar efter inokuleringen. Det sammanslagna mediet ska sedan inokuleras i homologa cellkulturer både outspätt och i spädning 1:10 (vilket resulterar i slutliga spädningar av supernatanten på 1:10 respektive 1:100) enligt punkt I.5.2. Alternativt inokuleras alikvoter om 10 % av primärkulturens medium direkt i brunnar med frisk cellkultur (dvs. subkultivering från brunn till brunn). Inokuleringen får föregås av preinkubering av de utspädda lösningarna med antiserum mot IPN-virus i lämplig spädning enligt punkt I.4.3.

De inokulerade kulturerna ska därefter inkuberas vid 15 °C i 7–10 dagar och undersökas i enlighet med punkt I.5.4.

Om toxisk CPE förekommer under inkuberingens 3 första dagar ska subkultivering göras i detta skede och cellerna ska inkuberas i 7 dagar och därefter återigen subkultiveras med ytterligare 7 dagars inkubering. Om toxisk CPE utvecklas efter 3 dagar ska cellerna subkultiveras en gång och inkuberas så att det totalt fortlöper 14 dagar från primärinokuleringen. Det får inte finnas några tecken på toxicitet under de sista 7 dagarna av inkuberingen.

Om bakteriell kontaminering förekommer trots antibiotikabehandling ska subkultiveringen föregås av centrifugering vid 2 000–4 000 × g vid 2–5 °C i 15–30 minuter eller av filtrering av supernatanten genom ett 0,45 μm filter, eller av båda (membran med låg proteinbindningsgrad). Subkultiveringen ska dessutom följa samma förfaranden som det som gäller vid toxisk CPE i fjärde stycket i denna punkt.

Om ingen CPE förekommer kan testet förklaras vara negativt.

I.6 Identifiering av virus

Om tecken på CPE har iakttagits i en cellkultur ska mediet (supernatanten) samlas in och undersökas med en eller flera av följande metoder: ELISA (enzymkopplad immunadsorberande analys), immunofluorescens (IF), neutralisationstest, RT-PCR eller RT-qPCR. Om dessa tester inte leder till en säker identifiering av viruset inom en vecka ska supernatanten skickas för omedelbar identifiering till det nationella referenslaboratoriet eller till EU:s referenslaboratorium för fisksjukdomar som avses i bilaga VI till direktiv 2006/88/EG.

I.6.1 ELISA

En antigen-ELISA med dubbla antikroppar ska utföras för att identifiera virusisolatet. Mikrotiterplattorna ska vara belagda med 50 μl/brunn (0,9 pg) av protein-A renade immunoglobuliner (Ig) av dokumenterad kvalitet från kaninantiserum mot VSH-virus eller IHN-virus vilka spätts i karbonatbuffert (pH 9,6) innehållande 15 mM natriumazid och plattorna ska inkuberas vid 4 °C i 18 timmar–2 veckor.

I en spädningsplatta ska varje prov innehållande 1 % Triton X-100 och de positiva kontrollerna spädas med buffertlösning (dvs. fosfatbuffrad koksaltlösning med 1 % BSA (PBS-T-BSA)) i en fyrfaldig spädning: outspätt, 1:4, 1:16 och 1:64. ELISA-plattorna ska tvättas med PBS innehållande 0,05 % Tween-20 (PBS-T) och 50 μl av varje spädning ska överföras från spädningsplattan till den tvättade och belagda ELISA-plattan.

I nästa steg ska ELISA-plattorna inkuberas vid 37 °C i 30 minuter. Därefter ska plattorna tvättas och inkuberas vid 37 °C i 30 minuter med specifika monoklonala antikroppar (dvs. MAb IP5B11 för identifiering av VHS-virus respektive Hyb 136–3 för IHN-virus). 50 μl HRP-konjugerade (HRP = pepparrotperoxidas) kanin-antikroppar mot mus utspädda i PBS-T-BSA (1:1 000) ska överföras till ELISA-plattan.

Efter ytterligare en tvättning ska reaktionerna startas genom tillsats av 50 μl orto-fenylendiamin (OPD)/brunn. ELISA-plattorna ska inkuberas mörkt vid rumstemperatur i 20 minuter och reaktionen ska stoppas genom tillsats av 100 μl 0,5 M H2SO4/brunn.

Absorbansen ska mätas vid 492 och 620 nm i en ELISA-spektrofotometer. Genom att jämföra testresultaten med absorbansvärdena för de positiva och negativa kontrollerna ska proverna bedömas som positiva eller negativa. I allmänhet ska prover med kombinerade absorbansvärden (A-värden) under 0,5 för outspätt material anses vara negativa, prover med A-värden på 0,5–1,0 ska anses vara misstänkta och prover med A-värden över 1,0 ska anses vara positiva.

Även andra varianter av ELISA med liknande dokumenterad effektivitet får användas i stället för den som anges i denna punkt.

I.6.2 Immunofluorescens (IF)

De förtecknade patogenerna VHS-virus och IHN-virus ska identifieras genom att celler i svarta 96-hålsplattor, i konventionella 24-hålsplattor eller på täckglas i 24-hålsplattor smittas. När VHS-virus eller IHN-virus, eller båda, identifieras genom att celler på täckglas smittas ska följande protokoll tillämpas:

a) Cellerna ska sås ut på täckglas med en densitet som ger 60–90 % konfluens efter 24 timmars odling. Om möjligt ska EPC-celler användas för detta ändamål eftersom de fäster bra på glasytor, men även andra cellinjer får användas, t.ex. BF-2, RTG-2 eller FHM. 150 μl av cellkulturens supernatant i två olika spädningar (1:10 och 1:1 000) ska inokuleras i duplikat på endagsgamla monolager och inkuberas vid 15 °C i 24 timmar.

b) Därefter ska cellodlingsmediet avlägsnas och de smittade monolagren fixeras med 0,5 ml iskall, vattenlösning av aceton (80 % v/v). Fixeringen ska göras i dragskåp vid rumstemperatur i 15 minuter, sedan ska acetonlösningen avlägsnas och täckglasen ska lufttorka i minst 30 minuter. I detta skede ska plattorna antingen bearbetas omedelbart eller förvaras vid – 20 °C för vidare användning.

c) Specifika monoklonala antikroppar (dvs. MAb IP5B11 för identifiering av VHS-virus respektive Hyb 136–3 för IHN-virus) ska spädas i 0,01 M PBS-T (pH 7,2) vid den spädning som leverantören av MAb rekommenderar. 50–100 μl/brunn ska tillsättas till det fixerade monolagret och plattorna ska inkuberas vid 37 °C i 1 timme i en fuktkammare.

d) Täckglasen ska tvättas försiktigt tre gånger med PBS innehållande 0,05 % Tween-20 (PBS-T) och bufferten ska avlägsnas helt efter den sista sköljningen. Cellerna ska därefter inkuberas vid 37 °C i 1 timme med fluoresceinisotiocyanat (FITC)- eller tetrametylrodamin-5-(och -6-)isotiocyanat (TRITC)-konjugerade antikroppar mot musimmunglobulin (dvs. den primära antikroppen) utspädda enligt leverantörens anvisningar, och återigen tvättas med PBS-T samt torkas. Färgade kulturer ska monteras på objektglas med glycerolsaltlösning och undersökas under infallande UV-ljus. Använd okular med förstoringsgrad 10 × eller 12 × och objektiv × 25 eller × 40 med bländare > 0,7 respektive > 1,3.

Även andra IF-metoder (med cellkulturer, fixering och antikroppar av referenskvalitet) med liknande dokumenterad effektivitet får användas.

I.6.3 Neutralisationstest

Cellerna ska avlägsnas från den insamlade supernatanten genom centrifugering (2 000–4 000 × g) eller membranfiltrering (0,45 μm) med ett membran med låg proteinbindningsgrad och supernatanten ska spädas 1:100 och 1:10 000 i cellodlingsmedium.

Alikvoter av minst två supernatantspädningar ska blandas separat med lika delar av vart och ett av följande reagens och inkuberas vid 15 °C i 60 minuter:

a) Serum innehållande gruppspecifika antikroppar mot VHS-virus i spädning 1:50 (v/v).

b) Serum innehållande gruppspecifika antikroppar mot IHN-virus i spädning 1:50 (v/v).

c) Sammanslagna antiserum mot inhemska serotyper av IPN-virus i spädning 1:50 (v/v).

d) Endast medium (positiv kontroll).

Minst två cellkulturer ska inokuleras med 50 μl av varje supernatant-serumblandning och sedan inkuberas vid 15 °C. Utveckling av CPE ska kontrolleras enligt punkt I.5.4.

VHS-virusstammar och -virusisolat som inte reagerar i neutralisationstestet ska identifieras med IF eller ELISA.

Även andra neutralisationstest med liknande dokumenterad effektivitet får användas.

I.6.4 RT-PCR/RT-qPCR

I.6.4.1 Beredning av virus-RNA

Allt arbete med RNA ska utföras på is och handskar ska användas.

RNA ska extraheras med fenol/kloroform-metoden eller med spinnkolonner med affinitet för RNA enligt tillverkarens anvisningar. Kommersiellt tillgängliga RNA-extraktionskit som ger högkvalitativt RNA som lämpar sig för användning med de protokoll för RT-PCR som beskrivs nedan får användas.

RNA ska återsuspenderas i destillerat, RNase-fritt vatten (dvs. vatten som behandlats med 0,1 % dietylpyrokarbonat) eller en lämplig elueringsbuffert.

I.6.4.2 RT-PCR

Följande primrar ska användas för påvisande av IHN-virus:

Framåtriktad primer: 5′-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3′.

Bakåtriktad primer: 5′-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3′.

Följande cykler ska användas (ettstegs-RT-PCR): 1 cykel: 50 °C i 30 minuter, 1 cykel: 95 °C i 2 minuter, 30 cykler: 95 °C i 30 sekunder, 50 °C i 30 sekunder och 72 °C i 60 sekunder, 1 cykel: 72 °C i 7 minuter och blötläggning vid 4 °C.

Följande primrar ska användas för påvisande av VHS-virus:

VN For 5′-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3′.

VN Rev 5′-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3′.

Följande cykler ska användas (ettstegs-RT-PCR): 50 °C i 30 minuter, 95 °C i 15 minuter, 35 cykler vid 94 °C i 30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder och 68 °C i 60 sekunder. Reaktionen ska därefter hållas vid 68 °C i 7 minuter.

RT-PCR-reaktionernas kvantitet och specificitet ska utvärderas med elektrofores i 1,5 % agarosgel med etidiumbromid och observeras med UV-genomlysning. Ett PCR-amplikon på 693 baspar kan iakttas för IHN-virus. För VHS-virus ska storleken vara 505 baspar.

Resultaten från PCR kan variera beroende på under vilka förhållanden den genomförs, dvs. temperaturprotokollen kan behöva optimeras beroende på den termocykler som används. Falskt positiva resultat kan dessutom uppkomma på grund av felaktig hybridisering av primrar eller kontaminering i laboratoriet. Lämpliga positiva och negativa kontroller samt sekvenserade amplikon ska därför användas för att undvika eventuella oklarheter. När det gäller primrar för VHS-virus ska man vara särskilt försiktig vid användning av BF-2-celler, eftersom primrarna kan reagera med cellinjens DNA/RNA och ge falskt positiva resultat av liknande storlek. När supernatanten från BF-2-celler testas ska alla amplifierade PCR-fragment sekvenseras.

I.6.4.3 RT-qPCR för VHS-virus

När det gäller VHS-virus ska amplifieringen utföras med följande primrar och prob:

Framåtriktad primer: 5′-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3′.

Bakåtriktad primer: 5′-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3′.

Prob: 5′-FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTG-ATC-TTC-TG-BHQ1.

Ettstegs-RT-qPCR:

Negativa reagenskontroller utan templat och positiva reagenskontroller ska ingå i varje PCR-körning. Cykelförhållanden: 50 °C i 30 minuter, 95 °C i 15 minuter, 40 cykler vid 94 °C i 15 sekunder, 60 °C i 40 sekunder och 72 °C i 20 sekunder (justera vid behov). Även andra varianter av RT-PCR eller RT-qPCR med liknande dokumenterad effektivitet får användas.

I.6.4.4 RT-qPCR för IHN-virus

När det gäller IHN-virus ska amplifieringen utföras med följande primrar och prob:

Framåtriktad primer: 5′-AGA-GCC-AAG-GCA-CTG-TGC-G-3′.

Bakåtriktad primer: 5′-TTCTTTGCGGCTTGGTTGA-3′.

Prob: 5′-6FAM-TGAGACTGAGCGGGACA-NFQ/MGB.

Tvåstegs-RT-qPCR:

Eftersom följande test bygger på en tvåstegsamplifiering ska man vara extra försiktig vid hanteringen av rören mellan det första och andra steget för att förhindra kontaminering.

Cykelförhållanden (efter RT-steget): 50 °C i 2 minuter, 95 °C i 10 minuter, följt av 40 cykler vid 95 °C i 15 sekunder och 60 °C i 1 minut (justera vid behov).

Även andra varianter av RT-PCR eller RT-qPCR med liknande dokumenterad effektivitet får användas.

II. Detaljerade diagnostiska metoder och förfaranden för att utesluta misstanke om eller bekräfta förekomst av VHS eller IHN, eller båda, vid misstänkta sjukdomsutbrott

När det i enlighet med artikel 57 b i direktiv 2006/88/EG krävs en laboratorieanalys för att bekräfta eller utesluta förekomst av VHS eller IHN, eller båda, med de diagnostiska metoderna i del 1 punkt II.3 i bilaga I ska följande detaljerade diagnostiska metoder och förfaranden tillämpas:

a) Konventionell virusisolering med efterföljande serumneutralisationstest, immunokemisk eller molekylär identifiering av virus.

b) Påvisande av virus med RT-PCR eller RT-qPCR.

c) Andra diagnostiska metoder, t.ex. IFAT, ELISA, RT-PCR eller IHK.

II.1 Konventionell virusisolering med efterföljande identifiering av virus

II.1.1 Urval av prover

Minst tio fiskar med typiska tecken på VHS eller IHN ska väljas ut för undersökning.

II.1.2 Beredning och transport av fiskprover

Beredningen och transporten för konventionell virusisolering ska följa metoderna och förfarandena i punkt I.2.

II.1.3 Insamling av kompletterande diagnostiskt material

Insamlingen av kompletterande material för konventionell virusisolering ska följa metoderna och förfarandena i punkt I.3.

II.1.4 Provberedning för undersökning med cellkultur

Provberedningen för undersökning med cellkultur för konventionell virusisolering ska följa metoderna och förfarandena i punkt I.4.

II.1.5 Virologisk undersökning i cellkultur

Den virologiska undersökningen för konventionell virusisolering ska följa metoderna och förfarandena i punkt I.5.

II.1.6 Identifiering av virus

Identifieringen av virus för konventionell virusisolering ska följa metoderna och förfarandena i punkt I.6.

II.2 Påvisande av virus med RT-qPCR

II.2.1 Urval av prover

Urvalet av prover för påvisande av virus med RT-qPCR ska följa metoderna och förfarandena i punkt I.1.2.

II.2.2 Beredning och transport av fiskprover

Beredningen och transporten för påvisande av virus med RT-qPCR ska följa metoderna och förfarandena i punkt I.2.

II.2.3 Insamling av kompletterande diagnostiskt material

Insamlingen av kompletterande diagnostiskt material för påvisande av virus med RT-qPCR ska följa metoderna och förfarandena i punkt I.3.

II.2.4 Provberedning för RT-qPCR

Provberedningen för påvisande av virus med RT-qPCR ska följa metoderna och förfarandena i punkt I.6.4.1.

II.2.5 RT-qPCR

Påvisandet av virus med RT-qPCR ska följa metoderna och förfarandena i punkterna I.6.4.1, I.6.4.3 och I.6.4.4.

II.3 Andra diagnostiska metoder

Supernatant som beretts enligt punkt I.4.3 får analyseras med ELISA, indirekt fluorescerande antikroppstest (IFAT) eller RT-PCR i enlighet med punkt I.6.1, I.6.2 respektive I.6.4. Vävnadsmaterial får undersökas med andra diagnostiska metoder, t.ex. IFAT för fryssnitt eller immunhistokemi för formalinfixerat vävnadsmaterial. Dessa snabba metoder ska senast 48 timmar efter provtagningen kompletteras med en virologisk undersökning i enlighet med antingen punkt II a eller II b

a) om resultatet är negativt, eller

b) om resultatet är positivt med material som utgör första fallet av VHS eller IHN.

III. Förfarande för titrering för att kontrollera cellkulturernas mottaglighet för infektion

När den titrering för att kontrollera cellkulturernas mottaglighet för infektion som avses i punkt I.5.3 utförs ska förfarandena i följande stycken följas:

Minst två VHS-virusisolat och ett IHN-virusisolat ska användas. Isolaten ska representera huvudgruppen av virus inom Europeiska unionen, dvs. ett patogent isolat från regnbåge i sötvatten och ett marint isolat som är patogent hos piggvar för VHS-virus och en EU-stam som är patogen hos regnbåge för IHN-virus. Väldefinierade isolat från medlemsstaterna ska användas. Batcher av virus i cellkulturer med lågt passagenummer ska odlas i cellodlingsflaskor på BF-2- eller RTG-2-celler för VHS-virus och på EPC- eller FHM-celler för IHN-virus. Cellodlingsmedium med minst 10 % serum ska användas. Vid inokulering ska en låg MOI (< 1) användas.

Vid full CPE ska viruset skördas genom centrifugering av cellkulturens supernatant vid 2 000 × g i 15 minuter, sterilfiltreras genom 0,45 μm membranfilter och fördelas i märkta kryorör. Viruset ska förvaras vid – 80 °C.

En vecka efter infrysningen ska tre replikat för varje virus tinas upp i kallt vatten och titreras på respektive cellinje. Minst var sjätte månad eller så snart man misstänker att en cellinjes mottaglighet har minskat ska varje virusisolat tinas upp och titreras.

Titreringsförfarandet ska beskrivas i detalj och utföras på samma sätt varje gång.

Slutpunktstitrering ska inbegripa minst 6 replikat för varje spädningssteg. Titervärdena ska jämföras med tidigare titervärden. Om titern för något av de tre virusisolaten har sjunkit med en faktor av minst 2 logaritmer jämfört med den ursprungliga titern, ska cellinjen inte längre användas för övervakningsändamål.

Om olika cellinjer förvaras på laboratoriet ska varje linje undersökas för sig.

Dokumentationen ska sparas i minst tio år.

DEL 2

DETALJERADE DIAGNOSTISKA METODER OCH FÖRFARANDEN FÖR ÖVERVAKNING OCH BEKRÄFTELSE AV FÖREKOMST AV KHV

I. Detaljerade diagnostiska metoder och förfaranden för att utesluta misstanke om eller bekräfta förekomst av KHV

När det i enlighet med artikel 57 b i direktiv 2006/88/EG krävs en laboratorieanalys för att utesluta misstanke om eller bekräfta förekomst av KHV med de diagnostiska metoderna i del 2 avsnitt III i bilaga I ska de detaljerade diagnostiska metoderna och förfarandena i punkterna I.1–I.2 tillämpas.

I.1 Beredning av fiskprover

För diagnostiska ändamål får fisk (skickad levande eller död och förpackad separat i förseglade aseptiska behållare) eller alternativt frysta organ eller organdelar bevarade i 80–100 % alkohol eller i transportmedium för virus (för bearbetning inom 48 timmar efter insamling) användas vid testning med konventionell PCR eller qPCR-baserade metoder.

För påvisande av KHV ska gäle och njure samlas in. Dessutom får mjälte, encephalon och tarm ingå i ett ytterligare separat prov. I akuta fall får vävnadsmaterial från upp till fem fiskar slås samman.

Vid misstanke om förekomst av KHV hos mycket värdefull fisk får dessutom icke-letal provtagning användas, t.ex. blodprover, svabbprover från gälar, biopsi från gälar och skrapprover från slemskikt.

I.1.1 DNA-extraktion

DNA ska extraheras i enlighet med standardförfaranden.

Kommersiellt tillgängliga DNA-extraktionskit som ger högkvalitativt DNA som lämpar sig för användning med de protokoll för PCR som anges i punkt I.2 får användas.

I.2 Påvisande och identifiering av agens med PCR-baserade metoder

I.2.1 qPCR för påvisande av KHV

För påvisande av KHV med qPCR ska följande metod användas:

Framåtriktad primer (KHV-86f): 5′-GACGCCGGAGACCTTGTG-3′.

Bakåtriktad primer (KHV-163r): 5′-CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT-3′.

Prob (KHV-109p): 5′-FAM-CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG-3′.

Cykelförhållanden: 1 cykel vid 95 °C i 15 minuter, följt av 40 cykler vid 94 °C i 15 sekunder och 60 °C i 60 sekunder. Negativa reagenskontroller utan templat och positiva reagenskontroller ska ingå i varje PCR-körning. Även andra varianter av qPCR med liknande dokumenterad effektivitet får användas.

I.2.2 Konventionell PCR för påvisande av KHV

Den metod som beskrivs i denna punkt och som riktar in sig på genen för tymidinkinas (TK) hos KHV ska användas. Även andra PCR-metoder som visat liknande sensitivitet och specificitet som den beskrivna metoden får användas.

Framåtriktad primer (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTAC GAG-3′.

Bakåtriktad primer (KHV-TKr): 5′-CACCCAGTAGATTA TGC-3′.

Cykelförhållanden: 1 cykel vid 95 °C i 5 minuter, följt av 35 cykler vid 95 °C i 30 sekunder, 52 °C i 30 sekunder och 72 °C i 1 minut samt 1 cykel vid 72 °C i 10 minuter. Produktstorleken bör vara 409 baspar.

Resultaten från PCR kan variera beroende på under vilka förhållanden den genomförs, dvs. temperaturprotokollen kan behöva optimeras beroende på den termocykler som används. Falskt positiva resultat kan dessutom uppkomma på grund av felaktig hybridisering av primrar eller kontaminering. Negativa reagenskontroller utan templat och positiva reagenskontroller ska ingå i varje PCR-körning. Även andra varianter av PCR med liknande dokumenterad effektivitet får användas.

Det första påvisandet i ett område ska bekräftas genom sekvensering eller skickas för omedelbar identifiering till ett nationellt referenslaboratorium eller till EU:s referenslaboratorium för fisksjukdomar som avses i bilaga VI till direktiv 2006/88/EG.

II. Detaljerade diagnostiska metoder och förfaranden för övervakning av KHV

När provtagning och laboratorieanalys för att erhålla eller få behålla en viss hälsostatus med avseende på KHV i enlighet med del 2 avsnitt I i bilaga I genomförs med de diagnostiska metoderna i del 2 avsnitt II eller III i den bilagan, ska de detaljerade diagnostiska metoderna och förfarandena i de följande punkterna II.1 och II.2 tillämpas.

II.1 Beredning av fiskprover

Om möjligt ska fisk som har hållits under en längre period i temperaturer där viruset förökar sig (dvs. vid 15–26 °C i 2–3 veckor) provtas. Prover ska om möjligt samlas in 24 timmar, men senast 72 timmar, efter hantering som kan reaktivera virus hos fisk med bärarstatus, t.ex. håvning eller transport, för att förbättra chanserna att påvisa KHV.

För övervakning av KHV får fisk (skickad levande eller död och förpackad separat i förseglade aseptiska behållare) eller alternativt frysta organ eller organdelar bevarade i 80–100 % alkohol eller i transportmedium för virus (för bearbetning inom 48 timmar efter insamling) användas vid testning med PCR-baserade metoder. För övervakning av KHV ska gäle och njurvävnad samlas in.

För övervakning av KHV ska sammanslagning av material om möjligt förhindras. Om det är nödvändigt att slå samman material får vävnadsmaterial från högst två fiskar slås samman. Större prover ska homogeniseras med mortel och stöt eller med stomacher homogenisator och delprover ska tas för DNA-extraktion före klarifiering. Alternativt får delprover samlas in från varje vävnad som ingår i provet och läggas i lyseringsrör.

II.1.1 DNA-extraktion

DNA ska extraheras i enlighet med standardförfaranden. Kommersiellt tillgängliga DNA-extraktionskit som ger högkvalitativt DNA som lämpar sig för användning med de protokoll för PCR som anges i punkt II.2 får användas.

Det godtagbara förhållandet mellan vävnad och medium ska vara 1:9 (w/v). Testen ska omfatta 20–25 mg vävnadsmaterial.

II.2 Övervakning av KHV med PCR-baserade metoder

Vid övervakning av KHV ska qPCR användas. Om positiva prover påvisas i ett område som inte tidigare bekräftats vara positivt ska testresultaten antingen

a) bekräftas med sekvensering av en PCR- eller nästad PCR-produkt från proverna; den erhållna rena konsensus-sekvensen ska överensstämma med referenssekvenserna till minst 98 %,

b) eller alternativt får prover skickas till ett nationellt referenslaboratorium för bekräftelse.

II.2.1 qPCR för påvisande av KHV

Följande qPCR-metod ska användas:

Framåtriktad primer (KHV-86f): 5′-GACGCCGGAGACCTTGTG-3′.

Bakåtriktad primer (KHV-163r): 5′-CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT-3′.

Prob (KHV-109p): 5′-FAM-CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG-3′.

Cykelförhållanden: 1 cykel vid 95 °C i 15 minuter, följt av 50 cykler vid 94 °C i 15 sekunder och 60 °C i 60 sekunder.

Resultaten från qPCR kan variera beroende på under vilka förhållanden den genomförs, dvs. temperaturprotokollen kan behöva optimeras beroende på den termocykler som används. Falskt positiva resultat kan dessutom uppkomma på grund av felaktig hybridisering av primrar eller kontaminering i laboratoriet. Negativa reagenskontroller utan templat och positiva reagenskontroller ska ingå i varje PCR-körning. Även andra varianter av qPCR med liknande dokumenterad effektivitet får användas.

II.2.2 Konventionell PCR för bekräftelse av påvisande av KHV

För att bekräfta förekomsten av infektion orsakad av KHV ska den generiska nästade PCR-metod som beskrivs i tabell 2.1 användas, följt av sekvensering av den amplifierade produkten.

Tabell 2.1

Primrar och förhållanden för den nästade PCR-metod som riktar in sig på alla cyprinidherpesvirus (CyHV-1, CyHV-2 och CyHV-3)

Primer Sekvens Cykelförhållanden Produktstorlek CyHVpol-forward 5′-CCAGCAACATGTGCGACGG-3′ Första omgången PCR 1 cykel: 95 °C i 2 minuter 40 cykler: 95 °C i 30 sekunder 55 °C i 30 sekunder 72 °C i 45 sekunder 1 cykel: 72 °C i 10 minuter 362 baspar CyHVpol-reverse 5′-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3′ CyHVpol-internal forward 5′-CGACGGVGGYATCAGCCC-3′ Andra omgången PCR 1 cykel: 95 °C i 2 minuter 40 cykler: 95 °C i 30 sekunder 55 °C i 30 sekunder 72 °C i 45 sekunder 1 cykel: 72 °C i 10 minuter 339 baspar CyHVpol-internal reverse 5′-GAGTTGGCGCAYACYTTCATC-3′

Resultaten från PCR kan variera beroende på under vilka förhållanden den genomförs, dvs. temperaturprotokollen kan behöva optimeras beroende på den termocykler som används. Falskt positiva resultat kan dessutom uppkomma på grund av felaktig hybridisering av primrar eller kontaminering i laboratoriet. Negativa reagenskontroller utan templat och positiva reagenskontroller ska ingå i varje PCR-körning. Även andra varianter av PCR med liknande dokumenterad effektivitet får användas.

Sekvensering får utföras av laboratoriet eller vid externa specialiserade sekvenseringsföretag. Sekvenseringsresultat ska analyseras genom att jämföra sekvenserna med kända referenssekvenser för KHV (GenBank nummer AP008984, DQ657948 och DQ177346). Den erhållna rena konsensus-sekvensen ska överensstämma med referenssekvenserna till minst 98 %.

DEL 3

DETALJERADE DIAGNOSTISKA METODER OCH FÖRFARANDEN FÖR ÖVERVAKNING OCH BEKRÄFTELSE AV FÖREKOMST AV INFEKTIÖS LAXANEMI (ILA/ISA)

I. Provtagningsförfaranden för övervakning och kontroll av ILA/ISA

När provtagning och laboratorieanalys genomförs för övervaknings- eller utrotningsprogram enligt del 3 i bilaga I eller för att bekräfta eller utesluta förekomst av ILA/ISA i enlighet med artikel 57 b i direktiv 2006/88/EG, ska de detaljerade metoderna och förfarandena i punkterna I.1, I.2 och I.3 tillämpas.

I.1 Beredning av fiskprover

Vid laboratorieanalys för att undersöka förekomst av ILA/ISA ska fiskprover om möjligt inte slås samman. Vid övervakning av ILA/ISA får dock 2–5 fiskar slås samman.

Prover för PCR med omvänd transkription (RT-PCR) ska tas från alla fiskar som provtas. En bit av njurens mellersta del ska avlägsnas från fisken med ett sterilt instrument och överföras till ett mikrofugrör med 1 ml RNA-stabiliserande lösning med dokumenterad effektivitet. Vävnad från upp till 5 fiskar får samlas in i ett rör med transportlösning och ska utgöra ett samlingsprov. Vikten på vävnaden i ett prov ska vara 0,5 g. När fisken är för liten för att man ska kunna ta ett prov som väger så mycket får även delar av njure, hjärta, mjälte, lever eller pylorusbihang, i den ordningen, användas så att provet kommer upp i 0,5 g.

Vävnad för histologisk undersökning ska endast tas från nyligen dödad fisk med normal konstitution som visar kliniska tecken eller tecken vid inspektion efter slakt som överensstämmer med förekomst av ILA/ISA. Eventuella yttre eller inre skador ska provtas och under alla omständigheter ska prover tas från njurens mellersta del, hjärta, lever, bukspottskörtel, tarm, gäle och mjälte från enskilda fiskar med skalpell och överföras till 8–10 % (v/v) buffrad formalinlösning. Förhållandet mellan fixativ och vävnad ska vara minst 20:1 för att säkerställa att vävnaderna bevaras på ett tillfredsställande sätt. För immunhistokemi (IHK) ska prover tas från njurens mellersta del och hjärta.

Vävnader för virologisk undersökning i cellkultur ska tas från alla fiskar som provtas. Delar av lever, njurens främre eller mellersta del, hjärta och mjälte ska avlägsnas från fisken med ett sterilt instrument och överföras till plaströr med 9 ml transportlösning. Vävnad från upp till 5 fiskar får samlas in i ett rör med transportlösning och ska utgöra ett samlingsprov. Vikten på vävnaden i ett prov ska vara 1,0 ± 0,5 g.

I.2 Transport av fiskprover

Hel fisk får transporteras till laboratoriet om de temperaturkrav som anges i tredje stycket kan uppfyllas under transporten. Hel fisk ska slås in i absorberande papper, transporteras i plastpåse och kylas enligt tredje stycket.

Även levande fisk får transporteras, men endast under överinseende av det nationella referenslaboratoriet för fisksjukdomar och med beaktande av de ytterligare desinficerings- och biosäkerhetfrågor som gäller vid transport av levande fisk.

Blodprover och rör med fiskvävnad för virologisk undersökning eller analys med RT-PCR ska placeras i isolerade behållare (t.ex. tjockväggiga polystyrenlådor) tillsammans med så mycket is eller frysblock så att proverna hålls kylda under transporten till laboratoriet. Frysning av proverna ska förhindras och när de tas emot ska det finnas is kvar i transportlådan eller också ska ett eller flera av frysblocken fortfarande vara helt eller delvis frysta. I undantagsfall får RT-PCR-prover och prover för virologisk undersökning snabbfrysas och transporteras till laboratoriet vid minst – 20 °C.

Vid RT-PCR-analys av vävnader som bevarats i RNAlater ska RNA-extraktion utföras inom följande tidsramar beroende på den temperatur som proverna förvarats vid:

Prover förvarade vid 37 °C: en dag.

Prover förvarade vid 25 °C: en vecka.

Prover förvarade vid 4 °C: en månad.

Prover förvarade vid – 20 °C: på obestämd tid.

Om fiskvävnader transporteras i fixativ för histologisk undersökning ska de transporteras i läckagesäkra rör i stöttåliga behållare. Frysning av proverna ska förhindras.

Den virologiska undersökningen i cellkultur ska påbörjas så snart som möjligt och senast 48 timmar efter provinsamlingen. I undantagsfall får den virologiska undersökningen påbörjas senast 72 timmar efter materialinsamlingen, förutsatt att det material som ska undersökas skyddas av ett transportmedium och att temperaturkraven under transport kan uppfyllas.

I.3 Insamling av kompletterande diagnostiskt material

När diagnostiklaboratoriet godkänt det får även andra fiskvävnader än de som avses i punkt I.2 samlas in och beredas för kompletterande undersökningar.

II. Detaljerade diagnostiska metoder och förfaranden för övervakning av och för att utesluta misstanke om eller bekräfta förekomst av ISA

När laboratorieanalys för att erhålla eller få behålla en viss hälsostatus med avseende på ILA/ISA i enlighet med del 3 avsnitt I i bilaga I eller för att utesluta misstanke om eller bekräfta förekomst av ILA/ISA i enlighet med artikel 57 b i direktiv 2006/88/EG genomförs med de diagnostiska metoderna i del 3 avsnitt II i bilaga I, ska de detaljerade diagnostiska metoderna och förfarandena i de följande punkterna II.1–II.5 tillämpas.

II.1 Undersökning av prover med RT-PCR

Den diagnostiska metod som ska användas för screening med avseende på ISA-virus ska vara RT-qPCR. Eftersom resultaten från RT-qPCR kan variera beroende på under vilka förhållanden den genomförs ska lämpliga positiva och negativa kontroller samt amplikon användas för att undvika eventuella oklarheter.

II.1.1 Total RNA-extraktion

Allt arbete med RNA ska utföras på is och handskar ska användas.

Totalt RNA ska extraheras med fenol/kloroform-metoden eller med spinnkolonner med affinitet för RNA enligt tillverkarens anvisningar.

Renat RNA ska återsuspenderas i destillerat, RNase-fritt vatten (dvs. vatten som behandlats med 0,1 % dietylpyrokarbonat).

Koncentrationen och renheten hos extraherat RNA ska uppskattas genom att mäta den optiska densiteten vid 260 och 280 nm. Ett annat tillvägagångssätt kan vara att inkludera interna kontroller som riktar in sig på det virusgenom som avses i punkt II.1.3.

II.1.2 RT-PCR för påvisande av ISA-virus

Flera RT-PCR-metoder får användas för amplifiering av ISA-virusets genom. En tvåstegs-RT-PCR får utföras där RT-steget och PCR-reaktionssteget genomförs i två separata rör. Emellertid får även en enstegs-RT-PCR utföras där de två reaktionerna genomförs i ett rör. Om möjligt ska enstegsmetoden användas eftersom risken för korskontaminering minimeras när innehållet inte behöver överföras och den metoden anses ha samma sensitivitet som tvåstegsmetoden.

De primrar och metoder som beskrivs i denna punkt, dvs. primerparet ILA1 eller ILA2 som riktar in sig på segmentet 8 och som har funnits lämpligt för påvisande av ISA-virus vid utbrott och i fisk med bärarstatus, ska användas. Eftersom den bakåtriktade ILA2-primern inte överensstämmer med isolat från Nordamerika ska ett alternativt primerpar användas i dessa fall.

Framåtriktad primer (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′.

Bakåtriktad primer (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.

Cykelförhållanden: 1 cykel vid 50 °C i 30 minuter, 1 cykel vid 94 °C i 15 minuter, 40 cykler vid 94 °C i 30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder och 72 °C i 60 sekunder samt 1 cykel vid 72 °C i 5 minuter. Produktstorlek 155 baspar.

Resultaten från PCR kan variera beroende på under vilka förhållanden den genomförs, dvs. temperaturprotokollen kan behöva optimeras beroende på den termocykler som används. Falskt positiva resultat kan dessutom uppkomma på grund av felaktig hybridisering av primrar eller kontaminering i laboratoriet. Negativa reagenskontroller utan templat och positiva reagenskontroller ska ingå i varje PCR-körning. Även andra varianter av RT-PCR med liknande dokumenterad effektivitet får användas.

II.1.3 RT-qPCR för påvisande av ISA-virus

Användningen av RT-qPCR kan öka specificiteten och förmodligen även sensitiviteten. Metoden kan utföras snabbare eftersom det inte krävs någon gelelektrofores och risken för korskontaminering minskar eftersom det är möjligt att uppskatta mängden genomiska virus-RNA i provröret. En nackdel med RT-qPCR-metoden är att det ofta inte är möjligt att sekvensera amplifierade produkter. Om den amplifierade produktens specificitet är oklar ska dock en annan metod som är specifik för ISA-virus användas för att bekräfta resultatet.

Den metod som beskrivs i denna punkt (dvs. en metod som riktar in sig på segmentet 8) ska användas. Metoden ska omfatta isolat från Europeiska unionen, Europeiska frihandelssammanslutningen (Efta) och Nordamerika. Om möjligt ska enstegsmetoden användas eftersom den metoden minimerar risken för korskontaminering.

Framåtriktad primer: 5′-CTACACAGCAGGATGCAGATGT-3′.

Bakåtriktad primer: 5′-CAGGATGCCGGAAGTCGAT-3′.

Prob: 5′-FAM-CATCGTCGCTGCAGTTC – MGBNFQ-3′.

Negativa reagenskontroller utan templat och positiva reagenskontroller ska ingå i varje PCR-körning. Cykelförhållanden: 1 cykel vid 50 °C i 30 minuter, 1 cykel vid 95 °C i 15 minuter samt 40 cykler vid 94 °C i 15 sekunder och 60 °C i 60 sekunder (justera vid behov). Även andra varianter av RT-PCR eller RT-qPCR med liknande dokumenterad effektivitet får användas.

II.1.4 Sekvensering av amplifierade PCR-produkter

Framåtriktad primer (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA-3′.

Bakåtriktad primer (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA-3′.

Negativa reagenskontroller utan templat och positiva reagenskontroller ska ingå i varje PCR-körning. Cykelförhållanden (ettstegs-RT-PCR): 1 cykel vid 50 °C i 30 minuter, 1 cykel vid 94 °C i 15 minuter, 40 cykler vid 94 °C i 30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder och 72 °C i 60 sekunder samt 1 cykel vid 72 °C i 5 minuter (justera vid behov). Även andra varianter av RT-PCR eller RT-qPCR med liknande dokumenterad effektivitet får användas.

Alternativt får följande metod för sekvensering av HPR i segment 6 användas:

Framåtriktad primer: 5′-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′.

Bakåtriktad primer: 5′-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3′.

Produktstorlek: 304 nukleotider om HPR0.

Även andra RT-PCR-metoder som visat liknande sensitivitet och specificitet som den metod som beskrivs i denna punkt får användas.

Den amplifierade RT-PCR-produktens renhet ska kontrolleras med gelelektrofores före sekvensering. Om endast ett rent fragment förekommer ska det renas direkt från PCR-reaktionen. Om flera amplifierade fragment förekommer ska det relevanta fragmentet renas med gelelektrofores. PCR-fragment ska renas från lösningar eller agarosgel med spinnkolonner med affinitet för PCR-fragment enligt tillverkarens anvisningar.

Sekvensering ska utföras med primrar för amplifiering vid externa specialiserade sekvenseringsföretag. Resultaten ska analyseras med sökverktyget BLAST och sekvenserna ska jämföras med andra kända sekvenser i NCBI:s databas över nukleotider (NCBI = National Centre for Biotechnical Information i Förenta staterna).

Sekvenseringen ska undanröja eventuella oklarheter om en amplifierad RT-PCR-produkts specificitet.

II.2 Isolering av ISA-virus i cellkulturer

II.2.1 Beredning av prover

Vävnaden får förvaras vid – 80 °C. Vävnaden får endast frysas och tinas upp en gång före undersökningen. För övervakning och kontroll ska undersökningen genomföras så snabbt som möjligt.

Varje prov (sammanslaget vävnadsprov i transportlösning) ska vara fullständigt homogeniserat med en validerad homogenisator och centrifugeras vid 2 000–4 000 × g vid 0–6 °C i 15 minuter; därefter ska supernatanten filtreras (0,45 μm) och inkuberas med en lika stor volym av ett på lämpligt sätt utspätt sammanslaget antiserum mot inhemska serotyper av IPN-virus. Antiserumets titer ska vara minst 1:2 000 i ett 50 % plackneutralisationstest. Blandningen ska inkuberas vid 15 °C i 1 timme. Detta utgör inokulatet.

Alla inokulat behandlas med antiserum mot IPN-virus (ett virus som i vissa delar av Europa finns i 50 % av alla fiskprover) för att förhindra att en cytopatisk effekt (CPE) orsakad av IPN-virus utvecklas i inokulerade cellkulturer. Sådan behandling får utföras för att göra de virologiska undersökningarna snabbare och ge färre fall där förekomsten av CPE skulle uppfattas som en potentiell indikation på ISA-virus. När prover kommer från produktionsenheter som anses fria från IPN behöver inokulat inte behandlas med antiserum mot IPN-virus.

II.2.2 Inokulering i cellkulturer

Celler från atlantlaxens njure (ASK-celler) ska användas för primär isolering av ISA-virus. Även andra cellinjer med dokumenterad effektivitet och sensitivitet vad gäller isolering av ISA-virus får användas, med beaktande av stamvariationer och olika stammars förmåga att replikera sig i olika cellinjer. ASK-celler verkar stödja isolering och odling av de hittills kända virusisolaten, så länge som celler med ett lågt passagenummer används. En tydligare cytopatisk effekt (CPE) kan uppträda i ASK-celler än i andra mottagliga cellinjer såsom SHK-1 (Salmon head kidney-1).

ASK-celler (passage 65 eller lägre) ska odlas i L-15-medium med 10 % fetalt bovinserum, 2 % (v/v) 200 mM L-glutamin och 0,08 % (v/v) 50 mM 2-merkaptoetanol i mikrotiterplattor. Organsuspension som behandlats med antiserum ska inokuleras i unga, aktivt växande cellkulturer så att den slutliga spädningen av vävnadsmaterial i odlingsmedium blir 1:1 000. För varje organ ska en suspension av 40 μl inokulat tillsättas en brunn med 2 ml odlingsmedium. För att minimera risken för korskontaminering ska separata 12- eller 24-hålsplattor används för prover från olika platser på fiskodlingsanläggningen.

En platta ska användas som negativ kontroll och lämnas oinokulerad. En separat platta ska användas som positiv kontroll och inokuleras med ett referensisolat av ISA-virus enligt följande. Den första brunnen ska inokuleras med 100 μl av en stamberedning av ISA-virus (minst titer 107 TCID50/ml (50 % Tissue Culture Infective Dose) och blandas. En volym av detta material ska överföras från den första brunnen till den andra för en utspädning på 1:10 och blandas. Detta ska upprepas över hela plattan för att göra sex tiofaldiga spädningar. Stamberedningar av ISA-virus kan förvaras vid – 80 °C i minst två år, men om de tinas upp måste de användas inom tre dagar. Korskontaminering av testplattorna med positivt kontrollmaterial ska förhindras. För att förhindra detta ska positiva kontroller beredas och hanteras separat från testplattorna. Om ASK-cellerna genomgår ett sensitivitetstest mot ISA-virusisolat var sjätte månad kan detta ersätta användningen av en positiv kontroll vid varje inokulering.

Prover ska inkuberas vid 15 ± 2 °C i upp till 15 dagar. Cellkulturerna ska undersökas med mikroskop avseende CPE dag 5–7 och 12–14 efter inokulering. Om ett sammanslaget prov uppvisar CPE ska förfaranden för identifiering av virus enligt punkt II.2.4 påbörjas omedelbart. Om ingen CPE iakttas senast dag 14 ska ett indirekt fluorescerande antikroppstest (IFAT), ett hemadsorptionstest eller en RT-PCR utföras.

II.2.3 Subkultivering

Subkultivering ska göras dag 13–15. Cellkulturernas supernatant ska tillsättas brunnar med färska aktivt växande celler i lämplig spädning (1:10) i mikrotiterplattor och inkuberas vid 14 ± 2 °C i upp till 18 dagar. Cellkulturerna ska undersökas med mikroskop avseende CPE dag 5–7 och 14–18 efter inokulering. Om ett sammanslaget prov uppvisar CPE ska förfaranden för identifiering av virus enligt punkt II.2.4 påbörjas omedelbart. Om ingen CPE iakttas senast dag 14–18 ska ett hemadsorptionstest eller en RT-PCR utföras.

Om cytotoxicitet förekommer under inkuberingens 7 första dagar ska subkultivering göras i detta skede och cellerna ska inkuberas i 14–18 dagar och därefter återigen subkultiveras med ytterligare 14–18 dagars inkubering. Om cytotoxicitet förekommer efter 7 dagar ska cellerna subkultiveras en gång och inkuberas så att de inkuberas i totalt 28–36 dagar från primärinokuleringen.

Om bakteriell kontaminering förekommer i primärkulturen ska testet genomföras på nytt med det vävnadshomogenat som förvarats vid – 80 °C. Före inokulering ska vävnadshomogenatet centrifugeras vid 4 000 × g vid 0–6 °C i 15–30 minuter och supernatanten ska filtreras genom 0,22 μm. Om bakteriell kontaminering förekommer vid subkultiveringen ska supernatanten filtreras genom 0,22 μm, inokuleras i färska celler och inkuberas i ytterligare 14–18 dagar.

II.2.4 Tester för identifiering av virus

Om tecken på CPE iakttas i något skede eller om ett hemadsorptionstest är positivt ska identifiering av virus genomföras. Den rekommenderade metoden för identifiering av ISA-virus ska vara RT-PCR enligt punkt II.1 eller immunofluorescens (IF) enligt punkt II.2.6. Om det bedöms att andra virus kan förekomma ska kompletterande tester för identifiering av virus genomföras. Om dessa tester inte leder till en säker identifiering av viruset inom en vecka ska supernatanten skickas för omedelbar identifiering till

a) OIE:s (Världsorganisationen för djurhälsa) referenslaboratorium för ILA/ISA, eller

b) ett nationellt referenslaboratorium eller EU:s referenslaboratorium för fisksjukdomar som avses i bilaga VI till direktiv 2006/88/EG.

II.2.5 Hemadsorptionstest

Eftersom replikation av ISA-virus i cellkulturer inte alltid resulterar i CPE ska varje brunn genomgå en RT-PCR, ett hemadsorptionstest enligt denna punkt eller ett IF-test enligt punkt II.2.6.

Cellodlingsmediet ska avlägsnas från varje brunn, även från brunnarna för de positiva och negativa kontrollerna, och placeras i märkta sterila rör. 500 μl av en 0,2 % (v/v) suspension av tvättade röda blodkroppar från kanin eller häst eller en 0,05 % (v/v) suspension av tvättade röda blodkroppar från regnbåge eller atlantlax ska tillsättas varje brunn och inkuberas i rumstemperatur i 45 minuter. De röda blodkropparna ska avlägsnas och varje brunn ska tvättas två gånger med L-15-medium. Varje brunn ska undersökas med mikroskop.

Förekomsten av kluster med röda blodkroppar som är fästa vid ASK-cellernas yta visar på trolig infektion orsakad av ortomyxovirus. Om ett hemadsorptionstest är positivt ska ett test för identifiering av virus enligt punkt II.2.4 genomföras omedelbart.

II.2.6 Immunofluorescens (IF)

ASK-celler (passage 65 eller lägre) ska odlas i L-15-medium med 10 % fetalt bovinserum, 2 % (v/v) 200 mM L-glutamin och 0,08 % (v/v) 50 mM 2-merkaptoetanol i mikrotiterplattor och användas vid konfluens över 50 %. Även andra cellinjer eller odlingsmedier med dokumenterad effektivitet får användas. 225 μl supernatant från odling som är smittad med det förmodade viruset ska tillsättas två brunnar, blandas och därefter ska 225 μl överföras till två ytterligare brunnar, dvs. en spädning på 1:5. Två ytterligare brunnar ska används som kontroller och lämnas oinokulerade. Prover från varje plats på fiskodlingsanläggningen ska hanteras på separata plattor, liksom viruskontrollen. Som viruskontroll ska ett referensisolat av ISA-virus användas.

Plattorna ska inkuberas vid 14 ± 2 °C och undersökas med mikroskop i upp till 7 dagar. När en tidig CPE iakttas, eller om ingen CPE iakttas inom 7 dagar, ska plattorna fixeras. Brunnarna ska tvättas med PBS och fixeras genom inkubering med 80 % aceton vid rumstemperatur i 20 minuter. Plattorna ska lufttorkas och färgas omedelbart eller förvaras vid 0–6 °C i högst 24 timmar före färgning.

Replikatbrunnar ska färgas med en blandning av de monoklonala antikropparna (MAb) 3H6F8 och 1OC9F5 mot ISA-virus, eller med andra MAb med dokumenterad effektivitet och specificitet, utspädda i PBS och inkuberas vid 37 ± 4 °C i 30 minuter. MAb ska avlägsnas och plattorna ska tvättas tre gånger med PBS med 0,05 % Tween 20. FITC-konjugerade antikroppar mot mus IgG utspädda i PBS ska tillsättas varje brunn och inkuberas vid 37 ± 4 °C i 30 minuter. Varje laboratorium ska optimera spädningen av olika batcher av MAb och FITC-konjugat. Antikropparna ska avlägsnas och plattorna ska tvättas tre gånger med PBS med 0,05 % Tween 20.

Brunnarna ska omedelbart undersökas med ett inverterat fluorescensmikroskop med lämpligt filter för excitation av FITC. Ett test ska anses positivt om fluorescerande celler kan iakttas. För att ett test ska vara giltigt ska de positiva kontrollerna ge positiva resultat och de negativa kontrollerna ge negativa resultat.

II.3 Undersökning av andra vävnader

Den metod som avses i punkt II.2.6 får användas på andra fiskvävnader, t.ex. lever, mjälte och hjärta, förutsatt att en rimlig mängd endotelceller, leukocyter eller lymfocyter kan placeras på objektglaset. Färgningsförfarandet ska vara detsamma för varje vävnad, även om det för vissa vävnader kan vara lämpligare att utelämna färgningen med propidiumjodid och i stället använda faskontrastbelysning för att identifiera de celltyper som förekommer i imprintet.

II.4 Histologi

Paraffininbäddade preparat ska snittas i 5 μm tunna skivor och färgas med hematoxylin och eosin.

De histologiska förändringarna i kliniskt sjuk atlantlax varierar men de kan omfatta följande:

a) Ansamling av erytrocyter i primärlamellens centralvenösa sinus och sekundärlamellernas kapillärer i gälarna, där erytrocyttromber också kan bildas.

b) Multifokala till sammanflytande petekier eller nekros av hepatocyter, eller båda, en bit från de större kärlen i levern. Multifokal ackumulering av erytrocyter i dilaterade sinusoider i levern.

c) Ackumulering av erytrocyter i blodkärlen i tarmens lamina propria och så småningom blödningar i lamina propria.

d) Mjältens stroma utspänt på grund av ackumulering av erytrocyter.

e) Lindrig multifokal till utbredd interstitiell blödning med tubulär nekros i de blödande områden samt ackumulering av erytrocyter i glomeruli i njuren.

f) Erytrofagocytos i mjälten och sekundära blödningar i lever och njure.

II.5 Immunhistokemi (IHK)

Polyklonala antikroppar mot ISA-virusets nukleoprotein ska användas på paraffinpreparat av formalinfixerad vävnad. De organ som ska undersökas ska vara njurens mellersta del, hjärta (övergångsområden inklusive alla tre kamrarna och klaffar). Misstänkta fall baserade på patologiska tecken ska bekräftas med en positiv IHK. Histologiska preparat ska beredas i enlighet med standardmetoder.

1. Beredning av vävnadspreparat Vävnaderna ska fixeras i neutral fosfatbuffrad 10 % formalinlösning i minst 1 dag och dehydreras med etanol i stigande koncentration, därefter ska etanolen avlägsnas i xylen och vävnaderna ska inbäddas i paraffin enligt standardprotokoll. Cirka 5 μm tunna preparat (för IHK placerade på poly-L-lysinbelagda objektglas) ska upphettas vid 56–58 °C (högst 60 °C) i 20 minuter och paraffinet ska avlägsnas med xylen, därefter rehydreras preparaten med etanol i sjunkande koncentration och färgas med hematoxylin och eosin för patomorfologi och IHK i enlighet med punkt 2.

2. Färgningsförfarande för IHK Alla inkuberingar ska utföras vid rumstemperatur på vippbord, såvida inte annat föreskrivs i detta beslut. a) Antigen retrieval ska utföras genom att preparaten kokas i 0,1 M citratbuffert (pH 6,0) i 2 × 6 minuter, följt av blockering med 5 % fettfri torrmjölk och 2 % getserum i 50 mM TBS (Tris Buffered Saline: 50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6) i 20 minuter. b) Preparaten ska sedan inkuberas över natten med primära antikroppar (monoklonala kanin-antikroppar mot ISA-virusets nukleoprotein) utspädda i TBS med 1 % fettfri torrmjölk, följt av tre tvättar med TBS med 0,1 % Tween 20. c) För påvisande av bundna antikroppar ska preparaten inkuberas med alkaliska fosfatas-konjugerade antikroppar mot kanin IgG i 60 minuter. Efter en slutlig tvätt ska Fast Red (1 mg/ml) och naftol-AS-MX fosfat (0,2 mg/ml) med 1 mM levamisol i 0,1 M TBS (pH 8,2) tillsättas för infärgning i 20 minuter. Preparaten ska därefter tvättas i kranvatten före motfärgning med Harris hematoxylin och monteras med vattenbaserat monteringsmedel. Vävnadspreparat som är positiva och negativa för ISA-virus ska ingå som kontroller i varje provomgång.

3. Tolkning av resultatet av IHK Resultatet av IHK-testet ska tolkas enligt de följande leden a och b: a) Kontrollpreparat ska anses vara positiva när det konstateras att i kontrollpreparaten har blodkärlens endotelceller i endokardium en klart synlig röd/rödaktig cytoplasmatisk och intranukleär infärgning. Ett provpreparat ska endast anses som positivt om endotelcellerna har en sådan tydlig intranukleär röd infärgning. b) Kontrollpreparaten ska anses vara negativa om de inte har någon betydande infärgning. Eftersom den intranukleära placeringen av ortomyxovirusets nukleoprotein är specifik för ett visst skede av virusreplikationen och den samtidiga cytoplasmatiska infärgningen oftast är dominerande, ska cytoplasmatisk infärgning och andra infärgningsmönster som inte är intranukleära anses vara icke-specifika eller ofullständiga. De starkaste positiva infärgningarna observeras oftast i endotelceller från hjärta och njure. Infärgningen av endotelceller med mycket omfattande hemorragiska lesioner kan vara liten eller obefintlig, eventuellt på grund av att smittade endotelceller har lyserat.

DEL 4

DETALJERADE DIAGNOSTISKA METODER OCH FÖRFARANDEN FÖR ÖVERVAKNING OCH BEKRÄFTELSE AV FÖREKOMST AV INFEKTION ORSAKAD AV MARTEILIA REFRINGENS

I. Detaljerade diagnostiska metoder och förfaranden för diagnos av infektion orsakad av Marteilia refringens

När provtagning och laboratorieanalys för att erhålla eller få behålla en hälsostatus med avseende på infektion orsakad av Marteilia refringens i enlighet med del 4 avsnitt I i bilaga I eller för att bekräfta eller utesluta förekomst av den förtecknade sjukdomen i enlighet med artikel 57 b i direktiv 2006/88/EG med de diagnostiska metoderna i del 4 avsnitt II i bilaga I, ska de detaljerade diagnostiska metoderna och förfarandena i punkterna I.1, I.2 och I.3 tillämpas.

I.1 Provtagningsförfarande

Provtagning av enskilda blötdjur med öppna skal eller nydöda blötdjur ska prioriteras för att förbättra chanserna att hitta smittade djur.

Provtagna ostron eller musslor ska förvaras vid 4 °C eller på kyld is i högst 24 timmar om proverna innehåller blötdjur med öppna skal och i högst 72 timmar om de inte innehåller sådana; de ska förvaras i en plastpåse med en etikett med uppgifter om ostronens eller musslornas typ och ursprung. Blötdjur med öppna skal eller nydöda blötdjur ska förvaras separat från andra blötdjur.

Ett 3–5 mm tunt vävnadspreparat, inklusive gälar och hjärtvävnad, ska användas för diagnos av Marteilia refringens genom histologi. En bit av digestionskörteln ska användas för vissa tester, bl.a. imprint och PCR.

I.2 Mikroskopiska metoder

I.2.1 Cytologi (imprintcytologi)

Efter det att digestionskörtelvävnader torkats med absorberande papper ska flera imprint göras på ett objektglas. Objektglasen ska lufttorkas, fixeras i metanol eller absolut etanol och färgas med ett kommersiellt tillgängligt kit för infärgning av blod (t.ex. Diff-Quick® eller Hemacolor®) enligt tillverkarens anvisningar. Efter sköljning med kranvatten och torkning ska objektglasen monteras med täckglas och med ett lämpligt syntetiskt monteringsmedel. Objektglasen ska först undersökas vid 200 × förstoring och därefter med immersionsolja vid 1 000 × förstoring.

Ett positivt resultat ska vara observation av celler i storlekar upp till 30–40 μm. Cytoplasman färgas basofilt, medan cellkärnan färgas eosinofilt. Ljusa halor runt stora, starkt färgade (refraktila) granula och i större celler kan primär-, sekundär- och tertiärstadier observeras.

Metoden är inte artspecifik för parasiter.

I.2.2 Histologi

Vävnadspreparat som omfattar gälar, digestionskörtel, mantel och gonad ska fixeras i minst 24 timmar i Davidsons fixeringsmedel, följt av normal bearbetning för histologi med paraffininbäddning och färgning, t.ex. med hematoxylin och eosin. Undersökningar ska göras i allt större förstoring upp till 1 000 ×.

Ett positivt resultat ska vara observation av celler i storlekarna 4–40 μm. De tidiga stadierna består av multinukleära celler som är sfäriska till avlånga. Dessa återfinns främst i matstrupens och magsäckens epitel och ibland i labiala palperna. Sporbildning omfattar celldelning inom celler och äger rum i digestionskörtels tubuli och kanaler. Refraktila granula syns vid sporbildningen men inte i de tidiga stadierna. I de sena infektionsstadierna observeras fria sporangier i lumen i mag-tarmkanalen. Cytoplasman färgas basofilt, medan cellkärnan färgas eosinofilt. Granula kan variera från intensivt orange till intensivt röd.

Metoden är inte artspecifik för parasiter.

I.3 Molekylära metoder

I.3.1 DNA-extraktion

DNA ska extraheras i enlighet med standardförfaranden.

Kommersiellt tillgängliga DNA-extraktionskit som ger högkvalitativt DNA som lämpar sig för användning med de protokoll för PCR som anges i punkt I.3.2 får användas.

I.3.2 PCR

Flera PCR-protokoll har utarbetats och publicerats.

PCR-primrar som riktar in sig på ITS1-regionen (internal transcribed spacer) ska användas eftersom de kan amplifiera endast Marteilia refringens.

PCR ska utföras i volymen 50 μl. PCR-blandningar ska innehålla buffert (500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl [pH 9,0 vid 25 °C] och 1 % Triton® X-100), 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP-mix, 1 μM framåtriktade och bakåtriktade primrar, 0,02 enheter/μl Taq DNA-polymeras och 10–100 ng extraherat DNA. Efter att DNA har denaturerats vid 94 °C i 5 minuter ska 30 cykler köras enligt följande: denaturering vid 94 °C i 1 minut, hybridisering vid 55 °C i 1 minut och elongering vid 72 °C i 1 minut per kilobaspar. En slutlig elongering vid 72 °C i 10 minuter ska utföras. För påvisande av Marteilia refringens ska PCR genomföras med primrar som riktar in sig på ITS1-regionen (5′-CCG-CAC-ACG-TTC-TTC-ACT-CC-3′ och 5′-CTC-GCG-AGT-TTC-GAC-AGA-CG-3′).

Positiva kontroller ska bestå av genomiskt DNA från ett ytterst smittat värd-DNA eller plasmid-DNA, inklusive målregionen.

Negativa kontroller ska bestå av genomiskt DNA från icke-smittade värdar och PCR-reagens utan mål-DNA.

Ett positivt resultat ska vara positiv PCR-amplifiering vid den förväntade storleken (412 baspar) och alla negativa kontroller ska vara negativa och alla positiva kontroller positiva.

I.3.3 In situ-hybridisering (ISH)

Flera ISH-protokoll har utarbetats och publicerats.

Den prob som riktar in sig på SSU rRNA ska användas eftersom den har validerats mot histologi.

Vävnadspreparat som omfattar gälar och digestionskörtel ska fixeras i minst 24 timmar i Davidsons fixeringsmedel, följt av normal bearbetning för histologi med paraffininbäddning. Preparatet ska snittas i 5 μm tunna skivor som placeras på aminoalkylsilanbelagda objektglas som sedan ska värmas vid 40 °C över natten. Paraffinet ska avlägsnas ur preparaten genom nedsänkning i xylen i 10 minuter. Detta steg ska upprepas en gång och sedan ska lösningsmedlet avlägsnas genom nedsänkning i två successiva bad med absolut etanol på 10 minuter vardera. Preparaten ska därefter dehydreras genom nedsänkning i etanol i stigande koncentration. Preparaten ska behandlas med proteinas K (100 μg/ml) i TE-buffert (50 mM Tris, 10 mM EDTA) vid 37 °C i 30 minuter. Objektglasen ska dehydreras genom nedsänkning i etanol i stigande koncentration och sedan lufttorkas. Preparaten ska inkuberas med 100 μl hybridiseringsbuffert (4 × SSC [Standard Saline Citrate], 50 % formamid, 1 × Denhardts lösning, 250 μg/ml jäst tRNA, 10 % dextransulfat) innehållande 10 ng (1 μl av de PCR-reaktanter som bereds enligt punkt I.3.2 med primrarna CCG-GTG-CCA-GGT-ATA-TCT-CG och TTC-GGG-TGG-TCT-TGA-AAG-GC) av den digoxigeninmärkta proben. Preparaten ska täckas med in situ-täckglas i plast och placeras på ett värmeblock vid 95 °C i 5 minuter. Objektglasen ska därefter kylas på is i 1 minut innan de hybridiseras vid 42 °C över natten i en fuktkammare. Preparaten ska tvättas 2 × 5 minuter med 2 × SSC vid rumstemperatur och 1 × 10 minuter med 0,4 × SSC vid 42 °C. Påvisandet ska utföras enligt tillverkarens anvisningar. Objektglasen ska sedan sköljas med sterilt destillerat vatten (dH2O). Preparaten ska motfärgas med Bismarck Brown Yellow, sköljas i dH2O och monteras med täckglas och med ett vattenbaserat monteringsmedel.

Positiva och negativa kontroller ska vara preparat från kända smittade respektive icke-smittade värdar.

Ett positivt resultat ska visas genom lila-svart märkning av Marteilia refringens-celler i kända målvävnader och alla negativa kontroller ska vara negativa och alla positiva kontroller positiva.

I.3.4 Sekvensering

Sekvensering ska genomföras som ett av de sista stegen för bekräftande diagnos. Målregioner är SSU rDNA och ITS1.

II. Detaljerade diagnostiska metoder och förfaranden för övervakning och bekräftelse av förekomst av infektion orsakad av Marteilia refringens

För övervakningsprogram och för att bekräfta förekomst av infektion orsakad av Marteilia refringens eller för att utesluta misstanke om förekomst av den förtecknade sjukdomen i enlighet med kraven i del 4 avsnitt II i bilaga I, ska de diagnostiska metoder och motsvarande förfaranden som används följa riktlinjerna i tabell 4.1.

Tabell 4.1

Riktlinjer för användning av diagnostiska metoder för övervakningsprogram och för att bekräfta eller utesluta förekomst av infektion orsakad av Marteilia refringens

Metod Riktad övervakning Presumtiv diagnos Bekräftande diagnos Imprint av digestionskörtel X X X, eller Histopatologi X X, eller In situ-hybridisering X, och PCR X X X, och Sekvensering X

DEL 5

DETALJERADE DIAGNOSTISKA METODER OCH FÖRFARANDEN FÖR ÖVERVAKNING OCH BEKRÄFTELSE AV FÖREKOMST AV INFEKTION ORSAKAD AV BONAMIA OSTREAE

I. Förfaranden för diagnos av infektion orsakad av Bonamia ostreae

När provtagning och laboratorieanalys för att erhålla eller få behålla en viss hälsostatus med avseende på Bonamia ostreae i enlighet med del 5 avsnitt I i bilaga I eller för att bekräfta eller utesluta förekomst av den förtecknade sjukdomen i enlighet med artikel 57 b i direktiv 2006/88/EG med de diagnostiska metoderna i del 5 avsnitt II i bilaga I, ska de detaljerade diagnostiska metoderna och förfarandena i de följande punkterna I.1, I.2 och I.3 tillämpas.

I.1 Provbearbetning

Provtagning av enskilda blötdjur med öppna skal eller nydöda blötdjur ska prioriteras för att förbättra chanserna att hitta smittade djur.

Provtagna ostron ska förvaras vid 4 °C eller på kyld is i högst 24 timmar om proverna innehåller blötdjur med öppna skal och i högst 72 timmar om de inte innehåller sådana; de ska förvaras i en plastpåse med en etikett med uppgifter om ostronens typ och ursprung. Blötdjur med öppna skal eller nydöda blötdjur ska förvaras separat från andra blötdjur.

Ett 3–5 mm tunt vävnadspreparat, inklusive gälar och hjärtvävnad, ska användas för diagnostik av Bonamia ostreae genom histologi. En bit av digestionskörteln ska användas för vissa tester, bl.a. imprint och PCR.

I.2 Mikroskopiska metoder

I.2.1 Cytologi (imprintcytologi)

Efter det att gälarna eller hjärtvävnaden torkats med absorberande papper ska flera imprint göras på ett objektglas. Objektglasen ska lufttorkas, fixeras i metanol eller absolut etanol och färgas med ett kommersiellt tillgängligt kit för infärgning av blod (dvs. Diff-Quick® eller Hemacolor®) enligt tillverkarens anvisningar. Efter sköljning med kranvatten och torkning ska objektglasen monteras med täckglas och med ett lämpligt syntetiskt monteringsmedel. Objektglasen ska först undersökas vid 200 × förstoring och därefter med immersionsolja vid 1 000 × förstoring.

Ett positivt resultat ska vara förekomst av små sfäriska eller äggformade organismer (diameter 2–5 μm) i hemocyter. Parasiten kan dock även förekomma extracellulärt. Dessa organismer har en basofil cytoplasma och en eosinofil cellkärna (färgerna kan variera beroende på vilken färg som används) och eftersom de sprids på objektglas kan de verka bredare på imprint än vid histologisk undersökning. Multinukleära celler kan observeras. Metoden är inte artspecifik för parasiter.

I.2.2 Histologi

Vävnadspreparat som omfattar gälar, digestionskörtel, mantel och gonad ska fixeras i minst 24 timmar i Davidsons fixeringsmedel, följt av normal bearbetning för histologi med paraffininbäddning och färgning, t.ex. med hematoxylin och eosin. Undersökningar ska göras i allt större förstoring upp till 1 000 ×.

Ett positivt resultat ska vara förekomst av parasiter, som mycket små celler med en diameter på 2–5 μm, i hemocyterna eller fria i bindväv eller sinus i gäle, tarm och mantelepitel, vilket ofta är förbunden med en intensiv inflammatorisk reaktion. För att undvika eventuella oklarheter ska parasiten observeras inne i hemocyten för en positiv diagnos. Metoden är inte artspecifik för parasiter.

I.3 Molekylära metoder

I.3.1 DNA-extraktion

DNA ska extraheras i enlighet med standardförfaranden.

Kommersiellt tillgängliga DNA-extraktionskit som ger högkvalitativt DNA som lämpar sig för användning med de protokoll för PCR som anges nedan får användas.

I.3.2 PCR

Flera PCR-protokoll har utarbetats och publicerats.

Två PCR-protokoll som riktar in sig på SSU rDNA får användas:

a) Det första protokollet är en konventionell PCR som amplifierar flera medlemmar av Haplosporidia, inklusive Bonamia spp. Primrarna som betecknas Bo och Boas är 5′-CAT-TTA-ATT-GGT-CGG-GCC-GC-3′ respektive 5′-CTG-ATC-GTC-TTC-GAT-CCC-CC-3′ och amplifierar en produkt på 300 baspar. PCR-blandningar innehåller buffert (500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl [pH 9,0 vid 25 °C] och 1 % Triton® X-100), 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP-mix, 1 μM framåtriktade och bakåtriktade primrar, 0,02 enheter/μl Taq DNA-polymeras och 0,2 ng/μl av DNA-templatet och har en total volym på 50 μl. Proverna ska denatureras i en termocykler vid 94 °C i 5 minuter, följt av 35 cykler (94 °C i 1 minut, 55 °C i 1 minut och 72 °C i 1 minut) och en slutlig elongering vid 72 °C i 10 minuter. Positiva kontroller ska bestå av genomiskt DNA från ett ytterst smittat värd-DNA eller plasmid-DNA, inklusive målregionen. Negativa kontroller ska bestå av genomiskt DNA från icke-smittade värdar och PCR-reagens utan mål-DNA. Ett positivt resultat ska vara positiv PCR-amplifiering vid den förväntade storleken (300 baspar) och alla negativa kontroller ska vara negativa och alla positiva kontroller positiva.

b) Det andra PCR-protokollet är en SYBR® Green realtids-PCR-metod. Protokollet gör det möjligt att specifikt påvisa B. ostreae och kan kombineras med en SYBR® Green realtids-PCR-metod som möjliggör att specifikt påvisa B. exitiosa (Ramilo et al., 2013). Primrarna BOSTRE-F (5′-TTACGTCCCTGCCCTTTGTA-3′) och BOSTRE-R (5′-TCGCGGTTGAATTTTATCGT-3′) amplifierar en produkt på 208 baspar. PCR-blandningar innehåller SYBR® Green Master Mix (1 ×), 0,3 μM framåtriktade och bakåtriktade primrar och 200 ng extraherat DNA. Proverna ska denatureras i ett PCR-instrument med realtidsdetektion vid 95 °C i 10 minuter, följt av 35 cykler (95 °C i 30 sekunder, 55 °C i 45 sekunder och 72 °C i 1 minut). Smältkurvan ska analyseras med temperaturökningar på 0,5 °C/s från 55 °C till 95 °C och fluorescens ska registreras vid varje temperaturändring. Positiva kontroller ska bestå av genomiskt DNA från ett ytterst smittat värd-DNA eller plasmid-DNA, inklusive målregionen. Negativa kontroller ska bestå av genomiskt DNA från icke-smittade värdar och PCR-reagens utan mål-DNA. Ett positivt resultat ska vara positiv PCR-amplifiering med en unik smälttemperaturtopp (78,25 ± 0,25 °C vid de förhållanden som publicerats av Ramilo et al., 2013) och alla negativa kontroller ska vara negativa och alla positiva kontroller positiva.

I.3.3 In situ-hybridisering (ISH)

Flera ISH-protokoll har utarbetats och publicerats.

En prob som riktar in sig på SSU rDNA ska användas, även om det har visats att den korsreagerar med vissa andra medlemmar i familjen Haplosporidia.

Vävnadspreparat som omfattar gälar och digestionskörtel ska fixeras i minst 24 timmar i Davidsons fixeringsmedel, följt av normal bearbetning för histologi med paraffininbäddning. Preparatet ska snittas i 5 μm tunna skivor som placeras på aminoalkylsilanbelagda objektglas som sedan ska värmas vid 40 °C över natten. Paraffinet ska avlägsnas ur preparaten genom nedsänkning i xylen i 10 minuter. Detta steg ska upprepas en gång och sedan ska lösningsmedlet avlägsnas genom nedsänkning i två successiva bad med absolut etanol på 10 minuter vardera. Preparaten ska därefter dehydreras genom nedsänkning i etanol i stigande koncentration. Preparaten ska behandlas med proteinas K (100 μg/ml) i TE-buffert (50 mM Tris, 10 mM EDTA) vid 37 °C i 30 minuter. Objektglasen ska dehydreras genom nedsänkning i etanol i stigande koncentration och sedan lufttorkas. Preparaten ska inkuberas med 100 μl hybridiseringsbuffert (4 × SSC [Standard Saline Citrate], 50 % formamid, 1 × Denhardts lösning, 250 μg/ml jäst tRNA, 10 % dextransulfat) innehållande 20 ng (2 μl av den PCR-reaktion som bereds enligt punkt I.3.2 med primrarna Bo och Boas) av den digoxigeninmärkta proben. Preparaten ska täckas med in situ-täckglas i plast och placeras på ett värmeblock vid 95 °C i 5 minuter. Objektglasen ska därefter kylas på is i 1 minut innan de hybridiseras vid 42 °C över natten i en fuktkammare. Preparaten ska tvättas 2 × 5 minuter med 2 × SSC vid rumstemperatur och 1 × 10 minuter med 0,4 × SSC vid 42 °C. Påvisandet ska utföras enligt tillverkarens anvisningar. Objektglasen ska sedan sköljas med sterilt destillerat vatten (dH2O). Preparaten ska motfärgas med Bismarck Brown Yellow, sköljas i dH2O och monteras med täckglas och med ett vattenbaserat monteringsmedel.

Positiva och negativa kontroller ska vara preparat från kända smittade respektive icke-smittade värdar.

Ett positivt resultat ska motsvara de märkta parasiterna inne i hemocyterna och alla negativa kontroller ska vara negativa och alla positiva kontroller positiva.

I.3.4 Sekvensering

Sekvensering ska genomföras som ett av de sista stegen för bekräftande diagnos. Målregioner ska vara SSU rDNA och ITS1.

II. Förfaranden för övervakning och bekräftelse av förekomst av infektion orsakad av Bonamia ostreae

För övervakning och för att utesluta misstanke om eller bekräfta förekomst av infektion orsakad av Bonamia ostreae i enlighet med kraven i i del 5 avsnitt II i bilaga I, ska de diagnostiska metoder och motsvarande förfaranden som används följa riktlinjerna i tabell 5.1.

Tabell 5.1.

Riktlinjer för användning av diagnostiska metoder för övervakningsprogram och för att utesluta eller bekräfta förekomst av infektion orsakad av Bonamia ostreae

Metod Riktad övervakning Presumtiv diagnos Bekräftande diagnos Imprint av hjärta eller gäl X X X, eller Histopatologi X X, eller In situ-hybridisering X, och PCR X X X, och Sekvensering X

DEL 6

DETALJERADE DIAGNOSTISKA METODER OCH FÖRFARANDEN FÖR ÖVERVAKNING OCH BEKRÄFTELSE AV FÖREKOMST AV VITPRICKIG KRÄFTDJURSSJUKA (WSD)

1. Diagnostiska förfaranden för påvisande av White spot syndrome virus (WSSV)

När provtagning och laboratorieanalys genomförs för de övervaknings- och utrotningsprogram som anges i del 6 avsnitt I i bilaga I och för att utesluta misstanke om eller bekräfta förekomst av infektion orsakad av WSSV i enlighet med artikel 57 b i direktiv 2006/88/EG med de diagnostiska metoderna i del 6 avsnitt II i bilaga I, ska de detaljerade diagnostiska metoderna och förfarandena i punkterna 2–7 tillämpas.

De metoder och förfaranden som beskrivs i denna del av bilaga II har anpassats efter det ISO 17025-ackrediterade test som tillämpas vid EU:s referenslaboratorium för kräftdjurssjukdomar. Även alternativa tillvägagångssätt, metoder med likvärdiga förhållanden eller kit framställda av olika tillverkare, som ger likvärdig sensitivitet och specificitet som de metoder som beskrivs i denna del får tillämpas. PCR-amplifierade produkter ska under alla omständigheter sekvenseras för att bekräfta WSSV.

2. Provbearbetning

Kräftdjursvävnad (bakkroppsben och gälar) innehållande WSSV får förvaras i etanol eller RNAlater, eller snabbfrysas vid – 80 °C. De steg som krävs för att identifiera WSSV från vävnadsprover är följande: homogenisering av vävnad, DNA-extraktion, specifik amplifiering av DNA från WSSV med PCR, visualisering av den amplifierade produkten på en gel, DNA-rening och sekvensering för att bekräfta patogenens identitet.

3. Homogenisering av vävnad

Sönderdelningen av vävnad och beredningen av ett homogenat i en lämplig buffert ska utföras med FastPrep homogenisator och Lysing Matrix A-rör (MP Biomedicals). Vävnaden ska vägas, placeras i Lysing Matrix A-rör, spädas 1:10 (w/v) eller enligt tillverkarens anvisningar med en lämplig buffert (G2 och 10 μl proteinas K för DNA Tissue kit (Qiagen)) och homogeniseras med FastPrep-24 homogenisator i 2 minuter. Homogeniserade prover ska inkuberas vid 56 °C i minst 4 timmar eller över natten. Proverna ska vortexas, centrifugeras vid 9 000 rpm i 2 minuter och 50 μl supernatant eller en volym som motsvarar 5 mg vävnad (dvs. den vävnadsvikt som är optimal för extraktionskit) ska tillsättas ett provrör för DNA-extraktion och fyllas upp till 200 μl med G2 buffert.

4. DNA-extraktion

Totalt DNA ska extraheras med ett DNA-extraktionskit för vävnader och EZ1 Advanced XL Biorobot (Qiagen) enligt tillverkarens anvisningar. En extraktionskontroll (DNA från kalvthymus) och en negativ kontroll (G2 buffert) ska köras med varje batch prover. DNA ska elueras i volymen 50 μl. För att säkerställa att extraktionen har lyckats ska DNA-koncentrationen i alla prover och kontroller bestämmas med en NanoDrop-maskin. Extraherat DNA ska frysas vid – 20 °C om det inte ska användas omedelbart.

5. PCR för påvisande av WSSV

Det protokoll som ska användas för påvisande av WSSV och som beskrivs i följande stycken använder nästad PCR och amplifierar två av 18s rRNA-genens amplikon på 1 447 baspar och 848 baspar i den första respektive andra PCR-omgången.

Den första PCR-reaktionen ska utföras i volymen 50 μl som innehåller en slutlig koncentration på 1 × GoTaq buffert (Promega), 5 mM MgCl2, 1 pmol/μl WSSV 146 F1 primer, 1 pmol/μl WSSV 146 R1 primer (tabell 1), 0,25 mM dNTPs, 1,25 enheter Taq polymeras och 2,5 μl DNA. Varje prov ska köras som duplikat tillsammans med en negativ extraktionskontroll, en negativ PCR-kontroll (2,5 μl H2O tillsätts i stället för DNA) och en positiv kontroll. Den positiva kontrollen ska vara utspädd WSSV-plasmid som framställts och validerats internt (tillgänglig från EU:s referenslaboratorium).

Den andra PCR-reaktionen ska utföras på samma sätt som den första men med primerparet WSSV 146 F2/R2 och med en andra positiv kontroll för att kontrollera att detta PCR-steg har fungerat.

Primer Sekvens WSSV 146 F1 ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG WSSV 146 R1 TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA WSSV 146 F2 GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA WSSV 146 R2 TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT

Både den första och andra PCR-omgången ska köras vid följande cykelförhållanden på en DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler (eller motsvarande): En första denaturering vid 94 °C i 2 minuter, följt av 30 cykler vid 94 °C i 30 sekunder, 62 °C i 30 sekunder och 72 °C i 30 sekunder, elongering vid 72 °C i 2 minuter och därefter hålls reaktionen vid 4 °C.

6. Gelelektrofores

Amplifierade PCR-produkter från både den första och den andra PCR-omgången ska visualiseras på 2 % agarosgel med TAE buffert. 15 μl av varje prov ska köras vid 120 volt i cirka 20 minuter och studeras under UV-ljus. Positiva prover ska ge ett band på 1 447 baspar i den första PCR-omgången och på 848 baspar i den andra PCR-omgången. Prover av den storleken ska skäras ut och placeras i ett 1,5 ml mikrofugrör. Det DNA som finns i gelbitarna ska renas med Promega Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System enligt tillverkarens anvisningar. DNA-koncentrationen ska uppskattas med en NanoDrop-maskin. Renat DNA ska frysas vid – 20 °C om det inte ska användas omedelbart.

7. Sekvensering av PCR-produkter

DNA ska sekvenseras med BigDye Terminator v3.1 Kit (Applied Biosystems). Den totala volymen i varje reaktion är 20 μl med de slutliga koncentrationerna 1 × BigDye Terminator, 1 × sekvenseringsbuffert, 10 pmol/μl framåtriktad eller bakåtriktad primer och 10 μl renat DNA (utspätt till cirka 10 ng/μl); följande cykelförhållanden ska användas på en DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler (eller motsvarande): 94 °C i 30 sekunder, följt av 30 cykler vid 96 °C i 10 sekunder, 50 °C i 10 sekunder och 60 °C i 4 minuter.

PCR-produkterna ska fällas ut med en natriumacetatmetod enligt följande: 20 μl DNA tillsätts till 10 μl NaAc, 70 μl H2O och 250 μl etanol, allt vortexas och centrifugeras vid 13 000 rpm i 20 minuter, supernatanten avlägsnas och pelleten tvättas med 200 μl absolut etanol och centrifugeras vid 13 000 rpm i 5 minuter. Pelleten ska torkas vid 37 °C i 5 minuter. 25 μl Hi-Di formamid ska tillsättas pelleterna och allt ska värmas vid 95 °C i 2 minuter och vortexas ordentligt. Proverna ska sekvenseras med 3130xl Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) enligt tillverkarens anvisningar. Sekvenseringsresultaten ska analyseras med programvaran Sequencher och sökverktyget BLAST och sekvenserna ska överensstämma med sekvenser i NCBI:s databas.