KOMMISSIONENS FJÄRDE DIREKTIV av den 5 december 1972 om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen (73/46/EEG)

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIV

med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekonomiska gemenskapen,

med beaktande av rådets direktiv av den 20 juli 1970(1) om införande av gemenskapsmetoder för provtagning och analys vid den officiella foderkontrollen, senast ändrad genom direktiv 72/275/EEG av den 20 juli 1972(2), särskilt artikel 2 i detta, och

med beaktande av följande:

I det nämnda direktivet krävs att den officiella foderkontrollen skall utföras med gemenskapsmetoder för provtagning och analys i syfte att kontrollera att produkterna uppfyller de krav som framgår av bestämmelser i lagar och andra författningar som gäller kvalitet och sammansättning på foder.

I direktiv 71/250/EEG av den 15 juni 1971(3), 71/393/EEG av den 18 november 1971(4) och 72/199/EEG av den 27 april 1972(5) har redan ett antal gemenskapsmetoder för analys fastställts. Mot bakgrund av den utveckling som därefter skett på området är det lämpligt att nu anta en fjärde metodsamling.

De åtgärder som beslutas i detta direktiv är förenliga med Ständiga foderkommitténs yttrande.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Medlemsstaterna skall kräva att analyser vid den officiella foderkontrollen då det gäller animaliska och vegetabiliska oljors och fetters vattenhalt samt halten av magnesium och råfibrer i foder skall utföras med de metoder som föreskrivs i bilaga 1 till detta direktiv.

De allmänna bestämmelser som anges i del 1 (Inledning) av bilagan till kommissionens första direktiv 71/250/EEG av den 15 juni 1971 skall tillämpas på de metoder som föreskrivs i bilaga 1 till detta direktiv.

Artikel 2

Medlemsstaterna skall kräva att analyser vid den officiella foderkontrollen då det gäller halter av retinol (vitamin A), tiamin (aneurin, vitamin B1), askorbinsyra och dehydroaskorbinsyra (vitamin C) skall utföras med de metoder som föreskrivs i bilaga 2 till detta direktiv.

De allmänna bestämmelser som anges i del 1 (Inledning) av bilagan till kommissionens första direktiv 71/250/EEG av den 15 juni 1971, med undantag av det avsnitt som behandlar prepareringen av analysprovet, skall tillämpas på de metoder som föreskrivs i bilaga 2 till detta direktiv.

Artikel 3

Medlemsstaterna skall senast den 1 januari 1974 sätta i kraft de lagar och andra författningar som är nödvändiga för att följa detta direktiv. De skall genast underrätta kommissionen om detta.

Artikel 4

Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.

Utfärdat i Bryssel den 5 december 1972.

På kommissionens vägnar

S. L. MANSHOLT

Ordförande

(1) EGT nr L 170, 3.8.1970,

(2) EGT nr L 171, 29.7.1972, s. 39.

(3) EGT nr L 155, 12.7.1971, s. 13.

(4) EGT nr L 279, 20.12.1971, s. 7.

(5) EGT nr L 123, 29.5.1972, s. 6.

BILAGA 1

1. BESTÄMNING AV ANIMALISKA OCH VEGETABILISKA OLJORS OCH FETTERS VATTENHALT

1. Syfte och räckvidd

Med denna metod är det möjligt att bestämma halter av vatten och flyktiga ämnen i animaliska och vegetabiliska oljor och fetter.

2. Princip

Provet torkas till konstant vikt vid 103 °C. Massaförlusten bestäms genom vägning.

3. Utrustning

3.1 Flatbottnad skål av korrosionsresistent material, 8 9 cm i diameter och cirka 3 cm hög

3.2 Kvicksilvertermometer med förstärkt kula och expansionsrör i överdelen, graderad från cirka 80 °C till minst 110 °C och cirka 10 cm lång

3.3 Sandbad eller elektrisk värmeplatta

3.4 Exsickator med ett effektivt torkmedel

3.5 Analysvåg

4. Utförande

Väg med 1 mg noggrannhet upp cirka 20 g av det homogeniserade provet på den torra, vägda skålen (3.1) där termometern (3.2) placerats. Upphetta på sandbadet eller värmeplattan (3.3) under ständig omrörning med termometern så att temperaturen stiger till 90 °C på cirka sju minuter.

Sänk värmen och iaktta med vilken frekvens bubblor stiger från skålens botten. Temperaturen får inte överstiga 105 °C. Fortsätt att röra om så att skålens botten berörs tills det inte längre bildas några bubblor.

För att försäkra sig om att vattnet helt har avlägsnats upphettar man upprepade gånger till 103 °C ± 2 °C och kyler till 93 °C mellan upphettningarna. Därefter får provet svalna till rumstemperatur i exsickatorn (3.4) varefter det vägs. Detta upprepas tills massaförlusten mellan två på varandra följande vägningar inte längre överstiger 2 mg.

>Plats för tabell>

5. Resultatberäkning

Vattenhalten i procent av provet erhålls med följande formel:

(M1 M2) 7 >NUM>100 >DEN>M0 där

M0 = provets massa i gram

M1 = skålens massa inklusive innehåll före upphettning

M2 = skålens massa inklusive innehåll efter upphettning

Om resultatet är lägre än 0,05 % skall detta redovisas som "lägre än 0,05 %".

Repeterbarhet

Skillnaden i vattenhalt mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga 0,05 %, absolutvärde.

2. BESTÄMNING AV MAGNESIUM - genom atomabsorptionsspektrometri -

1. Syfte och räckvidd

Med denna metod kan mängden magnesium i foder bestämmas. Den lämpar sig särskilt för bestämning av magnesiumhalter under 5 %.

2. Princip

Provet föraskas och löses upp i utspädd saltsyra. Om det inte innehåller någon organisk substans löses det upp direkt i utspädd saltsyra. Lösningen späds ut och magnesiumhalten bestäms med atomabsorptionsspektrometri vid 285,2 nm genom jämförelse med standardlösningar.

3. Reagens

3.1 Saltsyra pa, d: 1,16

3.2 Koncentrerad saltsyra pa, d: 1,19

3.3 Magnesiumband eller -tråd eller magnesiumsulfatheptahydrat som torkats vid rumstemperatur

3.4 Strontiumsaltlösning (klorid eller nitrat) med 2,5 % strontium (vikt/volym) (= 76,08 g SrCl2 7 6H2O pa eller 60,38 g Sr (NO3)2 pa)

3.5 Standardmagnesiumlösning: väg med 1 mg noggrannhet upp 1 g magnesium (3.3), vars oxidskikt först noggrant avlägsnats, eller motsvarande kvantitet (10,143 g) magnesiumsulfatheptahydrat (3.3). Överför detta till en 1000 ml mätkolv, tillsätt 80 ml saltsyra (3.1), låt magnesiumet lösas upp och fyll på vatten till 1000 ml. 1 ml av denna lösning innehåller 1,000 mg magnesium.

4. Utrustning

4.1 Föraskningsdeglar av platina, kisel eller porslin

4.2 Elektrisk muffelugn med termostat

4.3 Atomabsorptionsspektrometer.

5. Utförande

5.1 Beredning av provlösningen

5.1.1 Foder som uteslutande består av mineralämnen

Väg med 1 mg noggrannhet upp 5 g av provet i en 500 ml mätkolv med 250 300 ml vatten. Tillsätt 40 ml saltsyra (3.1), koka upp och låt koka sakta under 30 minuter. Låt svalna, fyll på vatten till full volym, blanda och filtrera över till en torr bägare genom ett torrt veckat filter. Avlägsna de första 30 millilitrarna av filtratet. Om kisel förekommer behandlas 5 g av provet med en tillräcklig kvantitet (15 30 ml) saltsyra (3.2), varefter det indunstas i vattenbad tills det torkat varefter det överförs för en timmes torkning till en ugn som är inställd på 105 °C. Fortsätt därefter enligt anvisningarna i 5.1.2 (från och med tredje meningen).

5.1.2 Foder som till övervägande del består av mineralämnen

Väg med 1 mg noggrannhet upp 5 g av provet i en degel och föraska vid 550 °C i muffelugnen tills den aska som erhålls är fri från kolpartiklar och låt därefter svalna. För att avlägsna kisel tillsätts en tillräcklig kvantitet (15 30 ml) saltsyra (3.2) till askan, varpå provet får indunsta i vattenbad tills det torkat och därefter placeras i ugn vid 105 °C under en timme. Behandla återstoden med 10 ml saltsyra (3.1) och överför detta med varmvatten till en 500 ml mätkolv. Låt svalna och fyll på vatten till full volym. Blanda och filtrera över till en torr bägare genom ett torrt veckat filter. Avlägsna de första 30 millilitrarna av filtratet.

5.1.3 Foder som till övervägande del består av organiska ämnen

Väg med 1 mg noggrannhet upp 5 g av provet i en degel och föraska vid 550 °C i muffelugnen tills den aska som erhålls är fri från kolpartiklar. Behandla askan med 5 ml saltsyra (3.2), indunsta i vattenbad tills provet har torkat och torka därefter under en timme i ugnen vid 105 °C så att kiseln blir olöslig. Behandla askan med 5 ml saltsyra (3.1), flytta den med varmvatten till en 250 ml mätkolv, koka upp, låt svalna och fyll på vatten till full volym. Blanda och filtrera över till en torr bägare genom ett torrt veckat filter. Avlägsna de första 30 millilitrarna av filtratet.

5.2 Mätning genom atomabsorption

Späd ut standardlösningen (3.5) med vatten så att åtminstone fem referenslösningar erhålls med stigande koncentrationer som motsvarar spektrometerns optimala mätintervall. Tillsätt 10 ml strontiumsaltlösning (3.4) till varje lösning och fyll därefter på vatten till 100 ml. Späd ut en uppmätt del av det filtrat som erhållits enligt 5.1.1, 5.1.2 eller 5.1.3 med vatten så att en magnesiumkoncentration erhålls som ligger inom intervallet för referenslösningarnas koncentrationer. Koncentrationen av saltsyra i denna lösning får inte överstiga 0,4 N. Tillsätt 10 ml strontiumsaltlösning (3.4) och fyll sedan på vatten till 100 ml. Mät absorptionen hos den lösning som skall bestämmas samt hos referenslösningarna vid 285,2 nm.

6. Resultatberäkning

Beräkna kvantiteten magnesium i provet genom jämförelse med referenslösningarna. Uttryck resultatet i procent av provet.

Repeterbarhet

Skillnaden mellan två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga 5 %, relativvärde.

3. BESTÄMNING AV RÅFIBRER

1. Syfte och räckvidd

Med denna metod är det möjligt att bestämma foders halt av sådana fettfria organiska ämnen som är olösliga i sur och basisk miljö och som konventionellt betecknas som råfibrer.

2. Princip

Provet, som om så är nödvändigt först har avfettats, behandlas successivt med kokande lösningar av svavelsyra och kaliumhydroxid i angivna koncentrationer. Återstoden separeras genom filtrering med asbest, sköljs, torkas, vägs och föraskas vid 900 °C. Viktförlusten efter föraskning motsvarar mängden råfibrer i analysprovet.

3. Reagens

3.1 Svavelsyra 0,26 N

3.2 Behandlad asbest: till asbest av den typ som används i Goochdeglar tillsätts cirka fem gånger asbestens vikt utspädd saltsyra (en del saltsyra, d: 1,19 + tre delar vatten). Koka blandningen under cirka 45 minuter, låt svalna och filtrera genom Buchnertratt. Skölj återstoden först med vatten tills sköljvattnet är fritt från saltsyra och därefter med aceton (3.6). Torka asbesten i torkugnen och föraska därefter under två timmar vid 900 °C. Låt den behandlade asbesten svalna och förvara den i tillsluten kolv. Asbest som behandlats på detta sätt kan användas flera gånger. Den måste motsvara de krav som anges i punkt 5 beträffande blankprovet.

3.3 Skumdämpande emulsion (t.ex. silikon)

3.4 Kaliumhydroxidlösning 0,23 N

3.5 Saltsyra 0,5 N

3.6 Aceton

3.7 Dietyleter

4. Utrustning

4.1 Bägare med minst 600 ml rymd och markering för 200 ml

4.2 Porslinsskivor, cirka 80 mm i diameter och cirka 4 mm tjocka, perforerade med cirka 32 hål, vart och ett cirka 4 mm i diameter

4.3 Termosflaskor med gummiförslutning som rymmer cirka 2 liter med markering för 800 ml och som är försedda med glastrattar, 120 mm i diameter

4.4 Filterplattor cirka 40 mm i diameter och cirka 4 mm tjocka med sned kant för att passa trattkonen (4.3), perforerade med cirka 16 hål, vart och ett cirka 4 mm i diameter, och täckta med metalltrådsnät med cirka 1 mm maskor. Såväl plattor som trådnät måste vara resistenta mot syror och baser.

4.5 Föraskningsdeglar av platina eller kisel

4.6 Elektrisk muffelugn med termostat

4.7 Exsickator

4.8 Asbestfilter: slamma upp 2,0 g asbest (3.2) i 100 ml vatten. Filter under vacuum över en filterplatta som är täckt med ett metalltrådsnät (4.4) och placerad i tratten till en termosflaska (4.3). Samla in filtratet och filtrera på nytt genom samma filter. Avlägsna filtratet.

5. Utförande

Väg med 1 mg noggrannhet upp 3 g av provet och 2 g behandlad asbest (3.2) i en bägare (4.1), tillsätt 200 ml svavelsyra (3.1) och några droppar skumdämpande emulsion (3.3). Koka upp hastigt och låt koka under exakt 30 minuter. För att hålla volymen konstant täcks bägaren med en kylanordning som t.ex. en 500 ml rundbottnad kolv i vilken det cirkulerar kallvatten. Avbryt kokningen genom att tillsätta 50 ml kallt vatten och filtrera omedelbart under vakuum genom ett asbestfilter som gjorts i ordning i förväg enligt punkt 4.8.

Skölj återstoden fem gånger, varje gång med cirka 100 ml mycket hett vatten, så att den slutliga volymen på filtratet blir 800 ml. Flytta hela filtratmängden till bägaren (4.1) efter att denna försetts med en porslinsskiva (4.2) för att reglera kokningen. Tillsätt 200 ml kaliumhydroxidlösning (3.4). Koka upp hastigt och låt koka under exakt 30 minuter. Tillsätt cirka 50 ml kallt vatten och filtrera omedelbart under vakuum genom ett nytt asbestfilter som gjorts i ordning i förväg enligt punkt 4.8. Skölj återstoden med mycket hett vatten tills sköljvattnet är neutralt (kontrollera med lackmuspapper) och därefter tre gånger med aceton (3.6) (sammanlagt cirka 100 ml aceton).

Flytta hela återstoden till en föraskningsdegel (4.5), lös upp om så är nödvändigt och torka tills vikten är konstant i torkugn vid 130 °C.

Låt svalna i exsickatorn (4.7) och väg snabbt.

Placera degeln i muffelugnen (4.6) och låt föraska under 30 minuter vid 900 °C. Låt svalna i exsickatorn (4.7) och väg snabbt.

Utför ett blankprov med samma utförande med den behandlade asbesten (3.2) men utan provet. Viktförlusten efter föraskning av 6 g asbest får inte överstiga 10 mg.

6. Resultatberäkning

Råfiberhalten i procent av provet erhålls med formeln:

>NUM>(a - b) 7 100 >DEN>3 där

a = viktförlust efter föraskning vid bestämningen

b = viktförlust efter föraskning vid blankprovet

Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga

0,3, absolutvärde, för råfiberhalter under 10 %,

3 %, relativvärde, för råfiberhalter på 10 % eller mer.

7. Anmärkningar

7.1 Foder som innehåller mer än 10 % oljor och fetter måste före analysen avfettas med dietyleter (3.7). Detta sker genom att analysprovet (3 g, uppvägt med 1 mg noggrannhet) placeras på ett asbestfilter (4.8). Täck tre gånger med 50 ml dietyleter (3.7) och filtrera varje gång noggrant under vakuum. Flytta hela mängden avfettat analysprov och asbest till en bägare (4.1) och fortsätt analysen enligt punkt 5.

7.2 Foder som innehåller oljor och fetter som inte kan extraheras direkt måste avfettas enligt punkt 7.1 och sedan avfettas ytterligare en gång efter att syraangreppet har sköljts bort från återstoden.

Detta sker genom att angreppet sköljs bort från återstoden tre gånger med aceton (3.6) (sammanlagt 100 ml) och därefter tre gånger med 50 ml dietyleter (3.7). Flytta därefter hela återstoden till en bägare (4.1) och fortsätt analysen enligt punkt 5, andra stycket (behandling med kaliumhydroxidlösning).

7.3 Om fodret är kalciumrikt (mer än 2 % kalcium) placeras analysprovet (3 g, uppvägt med 1 mg noggrannhet) i en bägare (4.1) tillsammans med 100 ml saltsyra 0,5 N (3.5) och får stå svalt under fem minuter. Filtrera omedelbart och skölj med kallt vatten. Som filtrermedel används de 2,0 g asbest som upptagits ovan för kokning med svavelsyra. Om filtreringen visar sig svår att genomföra späds suspensionen med aceton (3.6). Fortsätt därefter enligt anvisningarna i punkt 5.

BILAGA 2

1. BESTÄMNING AV RETINOL (VITAMIN A)

1. Syfte och räckvidd

Med denna metod är det möjligt att bestämma mängden retinol (vitamin A) i foder, koncentrat och premixer. Den lägsta gränsen för bestämningen är 10 000 IE/kg för starkt pigmenterade foder och 4 000 IE/kg för övriga foder(1). Produkterna indelas i två grupper efter sin antagna retinolhalt:

Grupp A: halter under 200 000 IE/kg,

Grupp B: halter på 200 000 IE/kg eller mer.

2. Princip

Det varma provet hydrolyseras med en kaliumhydroxidlösning i etanolmedium och i närvaro av ett antioxidationsmedel eller i kväveatmosfär. Blandningen extraheras med 1,2-dikloretan. Extraktet indunstas tills det är torrt och behandlas med petroleumeter. Lösningen kromatograferas på en aluminiumoxidkolonn (för produkter i grupp B krävs kromatografi endast i vissa fall). För produkter i grupp A bestäms retinolet genom spektralfotometri vid 610 nm efter att ett färgat komplex utvecklats enligt Carr-Pricereaktionen; för produkter i grupp B används spektralfotometri i UV-området vid 325 nm.

3. Reagens

a) används vid analys av produkter i grupperna A och B

3.1 96-procentig etanol (volymprocent)

3.2 10-procentig natriumaskorbatlösning (vikt/volym) pa, eller

3.3 renat kväve

3.4 50-procentig kaliumhydroxidlösning (vikt/volym) pa

3.5 Kaliumhydroxidlösning 1 N pa

3.6 Kaliumhydroxidlösning 0,5 N pa

3.7 1,2-dikloretan pa

3.8 Petroleumeter, kokintervall 30 50 °C. Rena, om så är nödvändigt, på följande sätt: rör om 1000 ml petroleumeter med satser om 20 ml koncentrerad svavelsyra tills syran förblir färglös. Avlägsna syran och skölj petroleumetern i tur och ordning med 500 ml vatten, två gånger med 10-procentig natriumhydroxidlösning (vikt/volym) och tre gånger med 500 ml vatten. Avlägsna vattenskiktet, torka petroleumetern under en timme över aktivt kol och vattenfritt natriumsulfat, filtrera och destillera.

3.9 Aluminiumoxid, standardiserad enligt Brockmann: föraska under åtta timmar vid 750 °C, kyl i exsickator och förvara i brun glasflaska med propp av matterat glas. Fukta på följande sätt innan aluminiumoxiden används för kromatografi: placera 10 g aluminiumoxid och 0,7 ml vatten i en brun glasflaska, tillslut med propp och upphetta under fem minuter i kokande vattenbad samtidigt som flaskan skakas om. Låt svalna. Kontrollera aktiviteten hos det på detta sätt preparerade aluminiumet genom att låta en känd kvantitet retinol (3.17) (cirka 500 IE) behandlas enligt 5.3 och 5.4 varefter återhämtningen kontrolleras.

3.10 Basisk aluminiumoxid, aktivitetsgrad 1 (Woelm, Merck eller motsvarande)

3.11 Ren dietyleter. Avlägsna peroxider och spår av vatten genom kromatografi mot en kolonn basisk aluminiumoxid (3.10). (25 g aluminiumoxid till 250 ml dietyleter)

3.12 Petroleumeterlösningar (3.8) med 4, 8, 12, 16 och 20 % (volymprocent) dietyleter (3.11)

3.13 Natriumsulfidlösning 0,5 molar i 70-procentig glycerin (volymprocent), beredd av natriumsulfid pa

b) används uteslutande vid analys av produkter i grupp A

3.14 Kristalliserbar bensen pa

3.15 Kloroform pa. Avlägsna etanol, fosgen och spår av vatten genom kromatografi mot en kolonn basisk aluminiumoxid (3.10) (50 g aluminiumoxid till 200 ml kloroform; de första 50 ml eluat bör kromatograferas en andra gång).

3.16 Carr-Pricereagens: rör om cirka 25 g antimontriklorid pa (förvarad i exsickator) med 100 ml kloroform (3.15) tills lösningen är mättad. En viss antimontrikloridfällning utgör inget problem. Tillsätt 2 ml ättiksyraanhydrid pa. Förvara i kylskåp i brun glasflaska med propp av matterat glas. Lösningen är hållbar i flera veckor.

3.17 Retinol, spektralfotometriskt standardiserad

c) används uteslutande vid analys av produkter i grupp B

3.18 Isopropanol till kromatografi

4. Utrustning

4.1 Vattenbad

4.2 Vakuumindunstningsutrustning med runda kolvar med olika rymd

4.3 Glasrör för kromatografi (längd: 300 mm; inre diameter: cirka 13 mm)

4.4 Spektralfotometer med 10 mm celler. Vid mätningar inom UV-området krävs kiselceller.

4.5 UV-lampor som är lämpliga för 365 nm

5. Utförande

>Plats för tabell>

5.1 Analysprov

Av det fint sönderdelade provet tas en del för analys i proportion till den antagna retinolhalten enligt följande:

0,1 1,0 g av koncentrat (halter över 20 000 IE/g),

3,0 5,0 g av premixer (halter mellan 400 och 20 000 IE/g),

10 20 g av mineralblandningar,

30 g av produkter i grupp A.

Placera analysprovet omedelbart i en 500 ml kolv med propp av matterat glas.

5.2 Hydrolys och extraktion(2)

Tillsätt i tur och ordning till analysprovet 40 ml etanol (3.1), 2 ml natriumaskorbatlösning (3.2)(3), 10 ml kaliumhydroxidlösning (3.4) och 2 ml natriumsulfidlösning (3.13).

Upphetta under 30 minuter vid 70 80 °C under återloppskylare och låt sedan svalna under rinnande vatten. Tillsätt 50 ml etanol (3.1) och 100 ml 1,2-dikloretan (3.7) (använd pipett). Skaka om kraftigt och dekantera därefter supernatanten i en dekanteringsbehållare. Tillsätt till denna 150 ml kaliumhydroxidlösning (3.5), skaka om under 10 sekunder och låt stå tills skikten är separerade. Samla in dikloretanskiktet (det lägsta skiktet) i en dekanteringsbehållare, tillsätt 40 ml kaliumhydroxidlösning (3.6), skaka om under 10 sekunder och låt stå tills skikten är separerade. Samla in dikloretanskiktet i en dekanteringsbehållare och skölj 6 8 gånger med 40 ml vatten per gång tills det är alkalifritt (fenolftaleintest). Samla in dikloretanskiktet och avlägsna de sista spåren av vatten med remsor av filterpapper.

Indunsta en uppmätt del av lösningen under vakuum i vattenbad vid 40 °C tills den är torr. Behandla skyndsamt återstoden med 5 ml petroleumeter (3.8).

Produkter i grupp A: kromatografera enligt anvisningarna i 5.3.1.

Produkter i grupp B: flytta lösningen till en 50 ml mätkolv, fyll på petroleumeter (3.8) till full volym, blanda och mät den optiska densiteten enligt anvisningarna i 5.4.2.

5.3 Kromatografi

5.3.1 Produkter i grupp A

Fyll ett kromatografirör (4.3) till 200 mm höjd med 10 g aluminiumoxid (3.9) som dessförinnan uppslammats i petroleumeter (3.8). Placera den lösning som erhållits enligt 5.2 i röret och tillsätt omedelbart 20 ml petroleumeter (3.8). Eluera i tur och ordning med 10 ml-satser av lösningarna av petroleumeter i 4, 8, 12, 16 och 20 % dietyleter (3.12) under tryck eller partiellt vakuum med en flödestakt på 2 3 droppar per sekund.

Karotinet elueras först(4) Retinolen elueras vanligen med lösningen av petroleumeter i 20 % dietyleter (3.12). Elueringen iakttas i UV-ljus (kort belysning av kolonnen med kvicksilverlampan). Den fluorescerande retinolzonen är klart skild från de gula xantofyllzoner som följer efter den. Samla in den del av eluatet som innehåller retinolen i en Erlenmayerkolv.

5.3.2 Produkter i grupp B

Kromatografi är endast nödvändig om de mätvärden av den optiska densiteten som erhålls enligt 5.4.2 inte motsvarar de krav som anges där.

Om det visar sig nödvändigt att använda kromatografi placeras en uppmätt del av den lösning i petroleumeter som erhållits enligt 5.2 med en retinolhalt av cirka 500 IE i kromatografiröret varefter kromatografin utförs enligt 5.3.1.

5.4 Mätning av den optiska densiteten

5.4.1 Produkter i grupp A

Indunsta under vakuum det eluat med retinolen som erhållits enligt 5.3.1 tills det är torrt. Behandla återstoden med 2 ml bensen (3.14). Ta 0,3 ml av denna lösning och tillsätt 3 ml Carr-Pricereagens (3.16). En blå färgton utvecklas. Mät den optiska densiteten med spektralfotometern vid 610 nm exakt 30 sekunder efter att reaktionen har börjat. Bestäm retinolhalten genom jämförelse med en standardkurva som erhållits med bensenlösningar med ökande koncentrationer av standardretinol som behandlats med Carr-Pricereagens (2 16 IE standardretinol (3.17) till 0,3 ml bensen (3.14) + 3 ml Carr-Pricereagens (3.16)). Standardkurvan måste kontrolleras ofta och regelbundet med hjälp av standardretinol och en nyberedd Carr-Pricereagenslösning.

5.4.2 Produkter i grupp B

Ta en uppmätt del av den lösning i petroleumeter som erhållits enligt 5.2 med en retinolhalt av cirka 200 IE. Indunsta under vakuum tills lösningen blivit torr och behandla återstoden med 25 ml isopropanol (3.18). Mät den optiska densiteten i spektralfotometern vid 325, 310 och 334 nm. Absorptionsmaximum ligger vid 325 nm. Lösningens retinolhalt beräknas på följande sätt:

E325 7 18,30 = IE retinol/ml

Kvoten av de optiska densiteterna

E310 : E325 och E334 : E325

måste dock vara 6 : 7 = 0,857.

Om någon av dessa kvoter skiljer sig väsentligt från detta värde ( 0,880) måste mätningen av de optiska densiteterna föregås av kromatografi med den metod som anges i 5.3.2. Om den mätning av de optiska densiteterna som utförs efter kromatografin visar att de ovannämnda kvoterna fortfarande skiljer sig väsentligt från värdet 0,857 ( 0,880) måste bestämningen utföras med den metod som angetts för produkter i grupp A.

6. Resultatberäkning

Beräkna provets retinolhalt med beaktande av analysprovets vikt och de utspädningar som utförts under analysen. Uttryck resultaten i IE retinol per kg foder, koncentrat eller premix.

Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga:

- 20 %, relativvärde, för retinolhalter under 75 000 IE/kg,

- 15 000 IE för halter mellan 75 000 och 150 000 IE/kg,

- 10 %, relativvärde, för halter mellan 150 000 och 250 000 IE/kg,

- 25 000 IE för halter mellan 250 000 och 500 000 IE/kg,

- 5 %, relativvärde, för halter över 500 000 IE/kg.

2. BESTÄMNING AV TIAMIN (VITAMIN B1, ANEURIN)

1. Syfte och räckvidd

Med denna metod är det möjligt att bestämma mängden tiamin (aneurin, vitamin B1) i foder, koncentrat och premixer. Lägsta gräns för bestämningen är 5 ppm.

2. Princip

Det varma provet behandlas med utspädd svavelsyra varefter det enzymhydrolyseras. Den lösning som erhålls får genomgå basisk oxidation. Det tiokrom som bildas extraheras med isobutanol och bestäms genom fluorometri.

3. Reagens

3.1 100 µg/ml standardtiaminlösning: lös upp 112,3 mg tiaminhydroklorid, som vakuumtorkats till konstant vikt, i 1 000 ml svavelsyra 0,2 N (3.2). Om denna lösning förvaras svalt och i skydd för ljus är den hållbar i en månad.

3.2 Svavelsyra 0,2 N

3.3 Ren natriumbisulfit

3.4 20-procentig kaliumferrocyanidlösning pa (vikt/volym)

3.5 25-procentig kaliumhydroxidlösning pa (vikt/volym)

3.6 Oxiderande blandning: blanda 2 ml kaliumferrocyanidlösning (3.4) med 48 ml kaliumhydroxidlösning (3.5). Denna lösning är endast hållbar i fyra timmar.

3.7 Isobutanol pa

3.8 Natriumacetatlösning 2,5 N

3.9 Flerenzymsberedning som innehåller proteas, fosfatas och amylas (t.ex. Clarase)

3.10 96-procentig etanol (volymprocent)

4. Utrustning

4.1 Vattenbad

4.2 Centrifug (3 500 varv per minut) med 30 50 ml rör som är försedda med proppar av matterat glas

4.3 Fluorometer

5. Utförande

5.1 Enzymhydrolys

I två 250 ml mätkolvar, A och B, placeras identiska mängder av det fint sönderdelade provet med ett innehåll av cirka 100 µg tiamin och 125 ml svavelsyra (3.2). Tillsätt även, men endast till kolv A, 1,0 ml standardlösning (3.1) (intern standard).

Skaka om kolvarna kraftigt, placera dem i kokande vattenbad under 15 minuter och skaka om några gånger under denna tid. Låt svalna till cirka 45 °C. Tillsätt 20 ml natriumacetatlösning (3.8) och 0,5 g flerenzymsberedning (3.9) till var och en av kolvarna och låt dem därefter stå 20 minuter i rumstemperatur. Tillsätt 20 ml natriumacetatlösning (3.8), fyll på vatten till full volym, homogenisera och filtrera. Ta vara på filtraten A och B efter att de första 15 millilitrarna avlägsnats. Bered följande lösningar:

5.1.1 Referenslösning T

Placera 5 ml filtrat A och cirka 10 mg natriumbisulfit (3.3) i ett centrifugrör (4.2). Sänk ned röret i kokande vattenbad under 15 minuter och låt därefter svalna till rumstemperatur.

5.1.2 Lösning A (intern standard) och B (prov)

Placera 5 ml filtrat A i ett centrifugrör (4.2) och 5 ml filtrat B i ett centrifugrör (4.2).

5.2 Oxidation

Tillsätt till lösningarna T, A och B 5 ml oxiderande blandning (3.6) och en minut senare 10 ml isobutanol (3.7). Tillslut rören och skaka om kraftigt under fem sekunder. Låt stå under en minut och centrifugera så att skikten separeras. Överför från varje rör 5 ml av dekanteringsskiktet isobutanol till var och en av 25 ml mätkolvarna, fyll på etanol (3.10) till full volym och homogenisera (=extrakt T, A och B).

5.3 Fluorescensmätning

Utför mätningarna vid den våglängd där fluorometern ger optimalt utslag för tiokromets fluorescens. Bestråla vid cirka 365 nm.

Nollställ instrumentet för extrakt T. Mät fluorescensintensiteten hos extrakten A och B.

6. Resultatberäkning

Provets tiaminhalt i mg/kg erhålls med formeln:

>NUM>a 7 b >DEN>(a b) c där

a = fluorescensintensiteten hos extrakt A (intern standard),

b = fluorescensintensiteten hos extrakt B (prov),

c = analysprovets vikt i gram,

d = mängd tiamin i µg som tillsatts till analysprovet (intern standard).

Repeterbarhet

Skillnaden mellan två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga

10 %, relativvärde, för halter under 500 mg/kg, och

5 %, relativvärde, för halter på 500 mg/kg eller mer.

3. BESTÄMNING AV ASKORBINSYRA OCH DEHYDROASKORBINSYRA (VITAMIN C)

1. Syfte och räckvidd

Med denna metod är det möjligt att bestämma den totala mängden askorbinsyra och dehydroaskorbinsyra (vitamin C) i foder, koncentrat och premixer. Den lägsta gränsen för bestämningen är 5 ppm. Produkterna indelas i två grupper efter sin antagna C-vitaminhalt:

Grupp A: halter under 10 g/kg,

Grupp B: halter på 10 g/kg eller mer.

2. Princip

Provet slammas i utspädd metafosforsyralösning och extraheras med kloroform. Vattenfasen behandlas med 2,6-diklorfenol-indofenollösning för att omvandla askorbinsyran till dehydroaskorbinsyra och därefter med 2,4-dinitrofenylhydrazinlösning. Det hydrazon som bildas extraheras med en blandning av etylacetat, isättiksyra och aceton. Lösningen kromatograferas mot en kiselgelkolonn, eluatet indunstas tills det är torrt och återstoden löses upp i utspädd svavelsyra. Lösningens optiska densitet mäts med spektralfotometer vid 509 nm.

Då det gäller produkter i grupp A genomgår det eluat som bildas vid kromatografi på kolonnen dessutom tunnskiktskromatografi för att isolera hydrazonet.

3. Reagens

3.1 Standardlösning L-askorbinsyra, 0,05 %: lös upp 50 mg L-askorbinsyra pa i cirka 20 ml metafosforsyralösning (3.2) och fyll på vatten till 100 ml. Bered lösningen omedelbart före användning.

3.2 10-procentig metafosforsyralösning (vikt/volym): mal 200 g metafosforsyra pa i mortel och lös därefter upp detta i vatten samt fyll på vatten till 2 000 ml. Förvara vid 4 °C. Lösningen är stabil i en vecka.

3.3 Kloroform pa.

3.4 0,5-procentig lösning av 2,6-diklorfenol-indofenol pa (vikt/volym). Bereds omedelbart före användning.

3.5 Filtrermedel (S. och S. nr 121 eller motsvarande).

3.6 2-procentig syralösning av 2,4-dinitrofenylhydrazin (vikt/volym): lös upp 2 g 2,4- dinitrofenylhydrazin i 100 ml utspädd svavelsyra (25 ml svavelsyra pa, d: 1,84, utspädd genom att vatten fyllts på till 100 ml). Om denna lösning förvaras svalt är den hållbar i en vecka.

3.7 Kväve, eller

3.8 koldioxid.

3.9 Blandning etylacetat pa/isättiksyra/aceton pa i volymproportionerna 96/2/2.

3.10 Blandning diklormetan pa/isättiksyra i volymproportionerna 97/3.

3.11 Kiselgel, partikelstorlek: 0,05 0,2 mm.

3.12 Kiselgel H, Stahlkvalitet, för tunnskiktskromatografi.

3.13 Utspädd svavelsyra: fyll 105 ml vatten i en 200 ml mätkolv och fyll på svavelsyra pa, d: 1,84, till full volym.

3.14 Eluerande lösningsmedel för tunnskiktskromatografi: blanda 75 ml dietyleter pa, 25 ml etylacetat pa och 4,0 ml 96-procentig isättiksyra pa (vikt/volym). Efter 2 3 kromatografier skall ny lösning användas.

4. Utrustning

4.1 Vattenbad med termostat inställd på 20 °C.

4.2 Centrifug (3 500 varv per minut) med 40 50 millilitersrör med proppar av matterat glas.

4.3 Vakuumrotationsindunstare med 250 ml kolvar.

4.4 Glasrör för kromatografi (längd: 100 mm, inre diameter: 20 mm) med sintrad skiva (t.ex. Allihnrör).

4.5 Spektralfotometer eller kolorimeter med filter med 10 mm celler.

4.6 Apparatur för tunnskiktskromatografi med kiselgelplattor (3.12) täckta med ett 0,5 0,6 mm tjockt lager. (Det är lämpligast att använda färdigtillverkade plattor.) Torka plattorna under 2½ 3 timmar i torkugnen vid 120 130 °C. Låt svalna och förvara dem därefter i exsickatorn under minst 24 timmar före användning.

4.7 Torkugn inställd på 120 130 °C.

5. Utförande

5.1 Extraktion

I två 250 ml mätkolvar (med proppar av matterat glas), A och B, placeras identiska mängder av det fint sönderdelade provet med ett C-vitamininnehåll av cirka 200 µg. Tillsätt endast till kolv A 0,4 ml standardlösning (3.1) och blanda under försiktig omskakning (intern standard).

Tillsätt till vardera kolven 30 ml kloroform (3.3) och 25 ml metafosforsyralösning (3.2) med en temperatur av 4 °C. Skaka om hastigt och låt därefter stå under 10 15 minuter. Tillsätt 25 ml vatten, tillslut kolvarna, skaka om kraftigt under 10 sekunder och placera dem i vattenbadet (4.1) under 10 15 minuter. Centrifugera, så att vattenfasen skiljs från kloroformfasen. Utför de operationer som beskrivs nedan samtidigt på de vattenhaltiga extrakten A (intern standard) och B.

5.2 Oxidation

Flytta med pipett 40 ml av den lätt grumliga vattenlösning som erhålls som dekanteringsvätska (5.1) till ett reaktionsrör med propp av matterat glas, tillsätt 0,5 1 ml 2,6-diklorfenol- indofenollösning (3.4) och blanda. En röd färgton utvecklas som bör kvarstå i minst 15 minuter. Tillsätt därefter cirka 300 mg filtrermedel (3.5), skaka om och filtrera genom ett torrt veckat filter. Filtratet behöver inte nödvändigtvis vara klart.

5.3 Reaktion med 2,4-dinitrofenylhydrazin och hydrazonextraktion

Flytta med pipett 10 ml av det filtrat som erhålls enligt 5.2 till ett centrifugrör (4.2), tillsätt 2 ml 2,4-dinitrofenylhydrazinlösning (3.6) och blanda. Sänd snabbt en ström kväve (3.7) eller koldioxid (3.8) in i röret, tillslut det och sänk ned det under cirka 15 timmar (över natten) i vattenbadet (4.1).

Tillsätt därefter 3 ml vatten, 20 ml etylacetat/isättiksyra/acetonblandning (3.9) och cirka 800 mg filtrermedel (3.5). Tillslut röret, skaka om kraftigt under 30 sekunder och centrifugera. Placera 15 ml av supernatantfasen i en indunstningskolv och indunsta under reducerat tryck i rotationsindunstaren (4.3) tills en oljig återstod erhålls. Lös upp återstoden i 2 ml etylacetat/isättiksyra/acetonblandning (3.9) genom att på nytt värma till 50 °C, låt svalna, tillsätt 10 ml diklormetan/isättiksyrablandning (3.10) och blanda.

5.4 Kromatografi mot kolonn

Fyll ett kromatografirör (4.4) till 30 mm-markeringen med diklormetan/isättiksyrablandningen (3.10). Slamma (genom kraftig omskakning) 5 g kiselgel (3.11) i 30 ml diklormetan/isättiksyrablandning (3.10) och häll suspensionen i röret. Låt stå och komprimera därefter med kväve (3.7) vid lågt tryck. Dekantera den lösning som erhållits enligt 5.3 i röret, skölj kolven med en liten kvantitet diklormetan/isättiksyrablandning (3.10) och dekantera i röret och fyll därefter detta med blandningen (3.10) varefter kolonnen sköljs med samma blandning (3 4 satser om cirka 5 ml) tills ett färglöst eluat erhålls. Avlägsna den del av eluatet som är gulfärgad.

Eluera den rödaktiga zonen högst upp på kolonnen med etylacetat/isättiksyra/acetonblandningen (3.9), samla in eluatet och indunsta tills det är torrt.

5.4.1 Produkter i grupp A (C-vitaminhalter under 10 g/kg): lös upp återstoden i 2,0 ml etylacetat/isättiksyra/acetonblandning (3.9) och kromatografera omedelbart mot ett tunt skikt enligt 5.5.

5.4.2 Produkter i grupp B (C-vitaminhalter på 10 g/kg eller mer): behandla den oljiga återstoden med 4,0 ml utspädd svavelsyra (3.13), skaka om kraftigt så att återstoden helt löses upp och mät den optiska densiteten enligt 5.6.

5.5 Tunnskiktskromatografi

De operationer som beskrivs i det följande skall utföras parallellt vid två samtidiga försök. Placera 0,5 ml av den lösning som erhållits enligt 5.4.1 i en tunn linje på plattan (4.6). Använd det eluerande lösningsmedlet (3.14) för att framkalla under minst 20 minuter i en vanna som är mättad med ånga från lösningsmedlet tills den rosafärgade hydrazonzonen separerats tydligt. Låt lufttorka. Markera gränsen för den rosafärgade zonen, skrapa av den med spatel och flytta allt pulver utan spill till ett kromatografirör (4.4).

Eluera i tur och ordning först en gång med 2 ml och därefter två gånger med 1,5 ml etylacetat/isättiksyra/acetonblandning (3.9). Samla in eluatet i en liten kolv (den sista delen måste vara färglös). Indunsta tills det är torrt, behandla den oljiga återstoden med 4,0 ml utspädd svavelsyra (3.13), skaka om kraftigt så att återstoden löses upp fullständigt och mät den optiska densiteten.

5.6 Mätning av den optiska densiteten

Mät den optiska densiteten med spektralfotometer vid 509 nm 20 30 minuter efter att återstoden lösts upp i svavelsyra. Utför mätningarna genom jämförelse med utspädd svavelsyra (3.13).

5.7 Blankprov

Utför ett blankprov med samma metod men med uteslutande av provet.

6. Resultatberäkning

Provets C-vitaminhalt i g per kg erhålls med formeln:

>NUM>(c a) 7 2 >DEN>(b c) 7 10d där

a = blankprovets optiska densitet

b = den interna standardlösningens optiska densitet

c = provlösningens optiska densitet

d = analysprovets vikt i gram.

Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga:

10 %, relativvärde, för C-vitaminhalter under 10 g/kg, och

5 %, relativvärde, för halter på 10 g/kg eller mer.

(1) IE = 0,3 ìg retinol.

(2) För mjölkfoder och produkter med tendens att agglomerera eller svälla, skall mängden av de reagens som upptas i 5.2, första och andra stycket, dubbleras.

(3) Natriumaskorbat behöver inte tillsättas när hydrolysen utförs i kväveatmosfär.

(4) Karotinhalten kan beräknas genom mätning av den optiska densiteten vid 450 nm; E >NUM>1 % >DEN>1 cm = 2600.