BILAGA

Bilagan till förordning (EG) nr 440/2008 ska ändras på följande sätt:

Kapitlen B.53, B.54, B.55, B.56, B.57 och B.58 ska införas:

”B.53 STUDIE AV UTVECKLINGSNEUROTOXICITET

INLEDNING

1. Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 426 (2007). En OECD-arbetsgrupp för reproduktions- och utvecklingstoxicitet diskuterade i Köpenhamn i juni 1995 behovet av att uppdatera befintliga OECD-testriktlinjer för reproduktions- och utvecklingstoxicitet samt utarbeta nya riktlinjer för endpoints som ännu inte omfattas (se hänvisning 1). Arbetsgruppen rekommenderade att en testriktlinje för utvecklingsneurotoxicitet bör skrivas på grundval av en riktlinje från den amerikanska miljöskyddsmyndigheten, som sedan dess har reviderats (se hänvisning 2). I juni 1996 hölls ett andra samrådsmöte i Köpenhamn för att förse sekretariatet med vägledning om utkast till en ny testriktlinje för utvecklingsneurotoxicitet, inklusive de viktigaste delarna som t.ex. uppgifter om val av djurart, doseringsperiod, testperiod, endpoints som ska bedömas och kriterier för utvärdering av resultaten. En amerikansk riktlinje för riskbedömning av neurotoxicitet publicerades 1998 (se hänvisning 3). Ett OECD-expertmöte och en ILSI Risk Science Institute-workshop hölls direkt efter varandra i oktober 2000 och ett expertmöte hölls i Tokyo 2005. Dessa möten hölls för att diskutera vetenskapliga och tekniska frågor i samband med den aktuella testriktlinjen, och rekommendationerna från mötena (se hänvisning 4, 5, 6, 7) övervägdes vid utarbetandet av denna testmetod. Ytterligare information om genomförandet, tolkningen och terminologin som används för denna testmetod finns i OECD:s vägledning nr 43 om testning och utvärdering av reproduktionstoxicitet (se hänvisning 8) och nr 20 om testning av neurotoxicitet (se hänvisning 9).

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN

2. Ett antal kemikalier är kända för att ge utvecklingsneurotoxiska effekter hos människor och andra arter (se hänvisning 10, 11, 12, 13). Bestämning av risken för utvecklingsneurotoxicitet kan behövas för att bedöma och utvärdera de toxiska egenskaperna hos en kemikalie. Utvecklingsneurotoxiska studier är utformade för att tillhandahålla uppgifter, bland annat dos-responskarakterisering av de potentiella funktionella och morfologiska effekterna på utvecklingen av nervsystemet hos avkomman som kan uppstå vid exponering i livmodern och tidigt i livet.

3. En studie om utvecklingsneurotoxicitet kan genomföras som en separat studie som ingår i en studie om reproduktionstoxicitet och/eller vuxenneurotoxicitet (t.ex. testmetoderna B.34 [se hänvisning 14], B.35 [se hänvisning 15], B.43 [se hänvisning 16]), eller läggas till i en studie om prenatal utvecklingstoxicitet (t.ex.testmetod B.31 [se hänvisning 17]). När studien om utvecklingsneurotoxicitet införlivas i, eller ansluts till, en annan studie är det viktigt att bevara integriteten för båda studietyperna. Alla tester ska följa gällande lagstiftning eller statliga och institutionella riktlinjer för användning av försöksdjur inom forskningen (se t.ex.hänvisning 18).

4. Testlaboratoriet bör analysera all tillgänglig information om testkemikalien innan studien genomförs. Sådan information innehåller kemikaliens identitet och struktur, dess fysikalisk-kemiska egenskaper, resultaten från andra in vitro- eller in vivo-toxicitetsstudier av kemikalien, toxikologiska data om strukturellt närbesläktade kemikalier samt den förväntade användningen av kemikalien. Denna information är nödvändig för att förvissa alla berörda parter om att testet är relevant för skyddet av människors hälsa, och att det är behjälpligt vid valet av en lämplig startdos.

PRINCIP FÖR TESTMETODEN

5. Testkemikalien administreras till djuren under dräktighet och laktation. Moderdjur testas för att bedöma effekter hos dräktiga och lakterande honor och kan också ge jämförande information (moderdjur kontra avkomma). Avkomman är slumpmässigt utvald inom kullarna för utvärdering av neurotoxicitet. Utvärderingen består av observationer för att upptäcka grova neurologiska och beteendemässiga avvikelser, inklusive en bedömning av fysisk utveckling, beteendemässig ontogeni, motorik, motoriska och sensoriska funktioner och inlärning och minne, samt utvärderingen av hjärnvikter och neuropatologi under postnatal utveckling och vuxenliv.

6. När testmetoden genomförs som en separat studie kan ytterligare tillgängliga djur i varje grupp användas för specifika neurobeteendemässiga, neuropatologiska, neurokemiska eller elektrofysiologiska förfaranden som kan komplettera uppgifterna från de undersökningar som rekommenderas i denna testmetod (se hänvisning 16, 19, 20, 21). De kompletterande förfarandena kan vara särskilt användbara när empirisk observation, förväntade effekter eller mekanism/tillvägagångssätt indikerar en viss typ av neurotoxicitet. Dessa kompletterande förfaranden kan användas för moderdjuren såväl som för avkomman. Dessutom kan ex vivo- eller in vitro-förfaranden också användas, förutsatt att dessa förfaranden inte förändrar integriteten för in vivo-förfarandena.

FÖRBEREDELSER FÖR TESTET

Val av djurart

7. Rekommenderad testart är råtta. Andra arter kan användas vid behov. Observera dock att dräktighetsdagar (GD) och postnatala dagar (PND) som anges i denna testmetod är specifika för de råttstammar som vanligen används, och jämförbara dagar bör väljas om en annan art eller ovanlig stam används. Användningen av annan art bör motiveras utifrån toxikologiska, farmakokinetiska och/eller andra data. Motiveringen bör omfatta tillgängligheten av artspecifika postnatala neurobeteendemässiga och neuropatologiska bedömningar. Om ett tidigare test föranlett problem, bör arten/stammen som varit problematisk beaktas. På grund av de skilda prestandaattributen hos olika råttstammar, bör det finnas evidens för att den stam som ska användas har adekvat fruktsamhet och mottaglighet. Andra arters tillförlitlighet och känslighet när det gäller att upptäcka utvecklingsneurotoxicitet bör dokumenteras.

Inhysnings- och utfodringsförhållanden

8. Temperaturen i djurutrymmet bör vara 22 ± 3 °C. Den relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och helst inte överstiga 70 %, utom när rummet rengörs då målet bör vara 50–60 %. Artificiell belysning bör användas, med en dygnsrytm på 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. Det är också möjligt att vända ljuscykeln före parningen och under hela studien, för att utföra bedömningar av funktionella och beteendemässiga endpoints under mörkerperioden (vid rött ljus), dvs. under den tid som djuren normalt är aktiva (se hänvisning 22). Eventuella förändringar i ljus-mörkercykeln bör innefatta tillräcklig acklimatiseringstid för att låta djuren anpassa sig till den nya cykeln. För utfodringen kan konventionellt laboratoriefoder användas med fri tillgång till dricksvatten. Den typ av foder och vatten som används bör redovisas och båda bör analyseras beträffande föroreningar.

9. Djuren kan inhysas individuellt eller i burar i små grupper av samma kön. Parningsförfarandena bör utföras i burar som är lämpliga för ändamålet. Efter tecken på parning, eller senast dag 15 av dräktigheten, bör parade djur inhysas separat i förlossnings- eller moderskapsburar. Burarna bör placeras så att eventuell påverkan beroende på deras placering blir så liten som möjligt. Parade honor bör förses med lämpliga och definierade material i redet när nedkomsten är nära. Det är allmänt känt att olämplig hantering eller stress under dräktigheten kan leda till motsatt resultat, inberäknat prenatal förlust samt förändrad fosterutveckling och postnatal utveckling. Som skydd mot förlust av foster genom faktorer som inte är behandlingsrelaterade, bör djuren hanteras varsamt under dräktigheten och stress från yttre faktorer såsom högt buller bör undvikas.

Förberedelse av djuren

10. Friska djur ska användas vilka har acklimatiserats till laboratoriemiljön och inte använts i tidigare försöksförfaranden, såvida inte studien ingår i en annan studie (se punkt 3). Försöksdjuren bör karakteriseras efter art, stam, ursprung, kön, vikt och ålder. Varje djur tilldelas och märks med ett unikt identifieringsnummer. Djuren i alla testgrupper bör, så vitt det är praktiskt möjligt, ha enhetlig vikt och ålder och ligga inom det normala intervallet för den art och stam som studeras. Unga vuxna honor utan avkomma bör användas vid varje dosnivå. Syskon ska inte paras och försiktighet bör iakttas för att säkerställa detta. Dräktighetsdagen (GD) 0 är den dag då en vaginalplugg och/eller sperma observeras. Adekvat acklimatiseringstid (t.ex.2–3 dagar) bör tillåtas vid köp av tidsdräktiga djur från en leverantör. Parade honor bör anvisas på ett opartiskt sätt till kontroll- och behandlingsgrupperna och så vitt det är möjligt bör de fördelas jämnt mellan grupperna (t.ex.ett stratifierat slumpmässigt förfarande rekommenderas för att ge en jämn fördelning i alla grupper, exempelvis baserat på kroppsvikt). Honor som har befruktats av samma hane bör fördelas jämnt i grupperna.

FÖRFARANDE

Djurens antal och kön

11. Varje test- och kontrollgrupp bör innehålla ett tillräckligt antal dräktiga honor som ska exponeras för testkemikalien, för att säkerställa att ett tillräckligt antal avkommor produceras för utvärderingen av neurotoxicitet. Sammanlagt 20 kullar rekommenderas vid varje dosnivå. Doseringsutformningar med replikat och förskjutna grupper är tillåtna om det totala antalet kullar per grupp uppnås och om lämpliga statistiska modeller används för att redovisa replikat.

12. Senast postnatal dag (PND) 4 (nedkomstdag är PND 0), bör storleken på varje kull justeras genom att extra ungar utesluts genom ett slumpmässigt urval för att ge en enhetlig kullstorlek för alla kullar (se hänvisning 23). Kullens storlek ska inte överstiga den genomsnittliga kullstorleken för den stam av gnagare som används (8–12). Kullen bör i möjligaste mån ha lika många han- och honungar. Selektiv uteslutning av ungar,t.ex.baserat på kroppsvikt, är inte lämpligt. Efter standardisering av kullarna (gallring) och före vidare testning av funktionella endpoints, bör enskilda ungar som är schemalagda för testning före eller efter avvänjningen identifieras unikt med hjälp av en lämplig human metod för identifiering (se t.ex. hänvisning24).

Anvisning av djur till funktions- och beteendetester, hjärnvikter och neuropatologiska utvärderingar

13. Testmetoden medger olika tillvägagångssätt när det gäller anvisning av djur som exponerats in utero och genom laktation till funktions- och beteendetester, könsmognad, fastställande av hjärnvikt och neuropatologisk utvärdering (se hänvisning 25). Andra tester av kognitiva funktioner (t.ex. socialt beteende), neurokemi eller neuropatologi kan läggas till i en bedömning från fall till fall, så länge integriteten hos de ursprungliga nödvändiga testerna inte äventyras.

14. Ungar väljs ut från varje dosgrupp och anvisas till endpointbedömning på PND 4 eller senare. Urvalet av ungar bör utföras så att, i möjligaste mån, båda könen från varje kull i varje dosgrupp är lika representerade i alla test. För testning av motorisk aktivitet bör samma par av han- och honungar testas vid alla åldrar före avvänjningen (se punkt 35). För alla andra tester kan samma eller separata par av han- och hondjur anvisas till olika beteendetester. Olika ungar kan behöva anvisas till tester av kognitiv funktion för avvanda djur kontra vuxna för att undvika störning av effekter från ålder och tidigare träning på dessa mätningar (se hänvisning 26, 27). Vid avvänjning (PND 21) kan ungar som inte valts ut för testning avlivas på ett humant sätt. Eventuella förändringar i anvisning av ungar ska redovisas. Den statistiska enheten bör vara kullen (eller moderdjuret), och inte ungen.

15. Det finns olika sätt att anvisa avkommor till undersökningar före och efter avvänjning, kognitiva tester, patologiska undersökningar etc., (se figur 1 för allmän utformning, och tillägg 1 för exempel på anvisning). Rekommenderat minsta antal djur i varje dosgrupp för undersökningar före och efter avvänjning är följande:

Kliniska observationer och kroppsvikt Alla djur Detaljerade kliniska observationer 20/kön (1/kön/kull) Hjärnvikt (efter fixering) PND 11–22 10/kön (1/kull) Hjärnvikt (ej fixerad) ~ PND 70 10/kön (1/kull) Neuropatologi (immersions- eller perfusionsfixering) PND 11–22 10/kön (1/kull) Neuropatologi (perfusionsfixering) PND ~ 70 10/kön (1/kull) Könsmognad 20/kön (1/kön/kull) Andra utvecklingsmarkörer (valfria) Alla djur Beteendeontogeni 20/kön (1/kön/kull) Motorisk aktivitet 20/kön (1/kön/kull) Motoriska och sensoriska funktioner 20/kön (1/kön/kull) Inlärning och minne 10/kön (1) (1/kull)

Dosering

16. Minst tre dosnivåer och en jämsides behandlad kontroll ska användas. Dosnivåerna bör spridas ut för att ge en gradering av de toxiska effekterna. Den högsta dosnivån ska väljas, om kemikalien inte har några begränsningar på grund av sina fysikalisk-kemiska eller biologiska egenskaper, i syfte att framkalla en viss maternell toxicitet (t.ex. kliniska tecken, minskad viktuppgång (högst 10 %) och/eller tecken på dosbegränsande toxicitet i ett målorgan). Den höga dosen kan begränsas till 1 000 mg/kg/dag kroppsvikt, med några undantag. Exempelvis kan förväntad exponering av människor indikera ett behov av att använda en högre dosnivå. Alternativt bör pilotstudier eller preliminära dosfinnande studier utföras för att fastställa den högsta dos som ska användas för att producera en minimal grad av maternell toxicitet. Om testkemikalien har visat sig vara utvecklingsmässigt toxisk, antingen i en vanlig undersökning av fosterskadande effekter eller i en pilotstudie, bör den högsta dosnivån vara den högsta dos som inte framkallar alltför stor toxicitet i avkomman, eller in utero eller neonatal död eller missbildning, tillräckligt för att utesluta en meningsfull utvärdering av neurotoxicitet. Den lägsta dosen bör syfta till att inte ge några tecken på vare sig maternell eller utvecklingsmässig toxicitet, inklusive neurotoxicitet. En fallande dosnivå bör väljas i syfte att påvisa en eventuell dosrelaterad respons och en nivå där ingen skadlig effekt observeras (Noael) eller doser nära detektionsgränsen vilka gör det möjligt att fastställa en referensdos. Två- till fyrfaldiga dosintervall är ofta optimala för de fallande dosnivåerna, och att lägga till en fjärde dosgrupp är att föredra framför att använda mycket stora intervall (t.ex. mer än en faktor på 10) mellan doseringarna.

17. Dosnivåerna bör väljas med hänsyn till alla befintliga toxicitetsdata samt ytterligare information om metabolism och toxikokinetik hos testkemikalien eller närbesläktade ämnen. Denna information kan också hjälpa till att visa doseringsschemats lämplighet. Direktdosering av ungar bör övervägas baserat på exponeringsinformation och farmakokinetisk information (se hänvisning 28, 29). Fördelar och nackdelar bör övervägas noga innan direktdoseringsstudier utförs (se hänvisning 30).

18. Den jämsides behandlade kontrollgruppen bör vara en kontrollgrupp som får en overksam behandling (placebo) eller en vehikelkontrollgrupp om en vehikel används för tillförsel av testkemikalien. Samtliga djur bör normalt ges samma volym av antingen testkemikalien eller vehikeln baserat på kroppsvikten. Om en vehikel eller annan tillsats används för att underlätta doseringen ska hänsyn tas till följande egenskaper: påverkan på absorption, distribution, metabolism eller lagring av testkemikalien; effekter på testkemikaliens kemiska egenskaper som kan ändra dess toxiska egenskaper, samt påverkan på foder- eller vattenkonsumtionen eller djurens näringsstatus. Vehikeln ska inte leda till effekter som kan störa tolkningen av studien, inte heller ska den vara neurobeteendetoxisk eller ha effekter på fortplantning eller utveckling. När det gäller nya vehiklar bör en placebobehandlad kontrollgrupp ingå förutom en vehikelkontrollgrupp. Djur i kontrollgrupper ska hanteras på samma sätt som djur i testgrupper.

Administration av doser

19. Testkemikalien eller vehikeln bör ges på det sätt som är mest relevant för potentiell exponering av människor och baserat på tillgänglig information om metabolism och spridning i försöksdjuren. Administrationsvägen är i allmänhet oral (t.ex.sondmatning, via föda, via dricksvatten) men andra vägar (t.ex.hud eller inandning) kan användas beroende på egenskaper och förväntade eller kända vägar för mänsklig exponering (ytterligare vägledning finns i vägledningsdokument 43 [se hänvisning 8]). Motivering bör ges för valet av administrationsväg. Testkemikalien bör ges vid ungefär samma tid varje dag.

20. Den dos som ges till varje djur ska normalt baseras på den senaste bestämningen av individuell kroppsvikt. Dock bör försiktighet iakttas vid justering av doser under sista tredjedelen av dräktigheten. Om överskottstoxicitet noteras i de behandlade moderdjuren bör dessa avlivas på ett humant sätt.

21. Testkemikalien eller vehikeln bör, som ett minimum, administreras dagligen till parade honor från tiden för implanteringen (GD 6) och under laktationen (PND 21), så att avkomman är exponerad för testkemikalien under den pre- och postnatala neurologiska utvecklingen. Den ålder då doseringen startar, och doseringens varaktighet och frekvens, kan justeras om evidens stöder en experimentell utformning som är mer relevant för mänsklig exponering. Doseringsvaraktigheter bör justeras för andra arter för att säkerställa exponering under alla tidiga perioder av hjärnans utveckling (dvs., motsvarande prenatal och tidig postnatal tillväxt av den mänskliga hjärnan). Doseringen kan börja när dräktigheten inleds (GD 0), även om man bör överväga risken för att testkemikalien kan orsaka preimplantatorisk förlust. Administration som börjar på GD 6 skulle kunna undvika denna risk, men utvecklingsstadierna mellan GD 0 och GD 6 skulle då inte behandlas. När ett laboratorium köper tidsparade djur är det opraktiskt att börja dosera på GD 0, och därmed vore GD 6 en bra startdag. Testlaboratoriet bör ställa in doseringsschemat i enlighet med relevant information om testkemikaliens effekter, tidigare erfarenhet och logistiska faktorer; detta kan omfatta en förlängning av doseringen förbi avvänjningen. Doseringen bör inte ske på nedkomstdagen hos de djur som inte har fött fram hela sin avkomma. I allmänhet antas det att exponering av ungarna sker via modersmjölken, dock ska direktdosering av ungar övervägas i de fall då det saknas evidens på fortsatt exponering av avkomman. Belägg för kontinuerlig exponering kan t.ex.hämtas från farmakokinetisk information, toxicitet hos avkomma eller förändringar av biologiska markörer (se hänvisning 28).

OBSERVATIONER

Observation av moderdjur

22. Alla moderdjur bör observeras noga minst en gång dagligen avseende deras hälsotillstånd, inbegripet sjuklighet och dödlighet.

23. Under behandlings- och observationsperioderna bör mer detaljerade kliniska observationer utföras regelbundet (minst två gånger under dräktighetsdoseringsperioden och två gånger under laktationsdoseringsperioden) med minst tio moderdjur per dosnivå. Djuren ska observeras utanför buren av utbildade tekniker som är omedvetna om djurens behandling, med hjälp av standardiserade procedurer som minimerar djurens stress och observatörernas partiskhet och maximerar tillförlitligheten mellan observatörer. Om det är möjligt bör observationerna i en given studie göras av samma tekniker.

24. Förekomst av observerade tecken ska registreras. När det är möjligt bör också de observerade tecknens omfattning registreras. Kliniska observationer bör omfatta, men inte begränsas till, förändringar av hud, päls, ögon och slemhinnor, förekomst av sekret och autonom aktivitet (t.ex.tårflöde, piloerektion, pupillstorlek, ovanligt andningsmönster och/eller munandning, och eventuella ovanliga tecken på urinering eller avföring).

25. Eventuella ovanliga reaktioner med avseende på kroppsställning, aktivitetsnivå (t.ex.minskad eller ökad utforskning av standardområdet) och samordning av rörelser bör också noteras. Förändringar i gång, (t.ex.vaggande, ataxi), kroppsställning (t.ex.krökt rygg) och reaktivitet mot hantering, placering eller andra miljömässiga stimuli, liksom förekomst av kloniska eller toniska rörelser, konvulsioner, darrningar, stereotypier (t.ex.överdrivet putsande, ovanliga huvudrörelser, repetitivt cirklande), bisarrt beteende (t.ex.bitande eller överdrivet slickande, självstympning, baklängesgång, vokalisering) eller aggressioner bör registreras.

26. Tecken på toxicitet bör registreras, inklusive dag för första tecken, tid på dygnet, grad och varaktighet.

27. Djuren bör vägas vid doseringstidpunkten minst en gång i veckan under hela studien, på eller nära nedkomstdagen, och på PND 21 (avvänjning). Vid sondmatningsstudier bör moderdjuren vägas minst två gånger per vecka. Doserna ska vid behov justeras i samband med varje bestämning av kroppsvikt. Foderkonsumtionen bör mätas minst en gång i veckan under dräktighet och laktation. Vattenförbrukningen bör mätas minst en gång i veckan om exponeringen sker via vattenförsörjningen.

Observationer av avkomma

28. All avkomma bör observeras noggrant minst en gång per dag för att upptäcka eventuella tecken på toxicitet, sjuklighet och dödlighet.

29. Under behandlings- och observationsperioderna bör mer detaljerade kliniska observationer av avkomman genomföras. Avkomman (minst en unge per kön/kull) bör observeras av utbildade tekniker som är omedvetna om djurens behandling, med hjälp av standardiserade procedurer som minimerar partiskheten och maximerar tillförlitligheten mellan observatörer. Om möjligt bör observationerna göras av samma tekniker. Som ett minimum, bör de endpoints som beskrivs i punkterna 24 och 25 övervakas på lämpligt sätt för det utvecklingsstadium som observeras.

30. Alla tecken på toxicitet hos avkomman bör registreras, inklusive dag för första tecken, tid på dygnet, grad och varaktighet.

Fysiska och utvecklingsmässiga markörer

31. Förändringar i utvecklingsmarkörer före avvänjningen (t.ex.ytterörats utvikning, ögonöppning, tandsprickning) är starkt korrelerade med kroppsvikten (se hänvisning 30, 31). Kroppsvikten kan vara den bästa indikatorn på fysisk utveckling. Mätning av utvecklingsmarkörer rekommenderas därför endast när det finns tidigare belägg på att dessa endpoints kan ge ytterligare information. Tidpunkten för bedömningen av dessa parametrar anges i tabell 1. Beroende på de förväntade effekterna och resultaten av de inledande mätningarna, kan det vara lämpligt att lägga till ytterligare tidpunkter eller att utföra mätningarna under andra utvecklingsstadier.

32. Det är lämpligt att använda postkoital ålder i stället för postnatal ålder vid bedömning av fysisk utveckling (se hänvisning 33). Om avkomman testas på dagen för avvänjningen, rekommenderas att detta test genomförs före själva avvänjningen för att undvika feltolkning på grund av stress i samband med avvänjningen. Dessutom bör inte något test av avkomman ske under två dagar efter avvänjningen.

Tabell 1

Tidpunkt för bedömningen av fysiska och utvecklingsmässiga markörer och av funktionella/beteendemässiga endpoints (2)

Åldersperioder Endpoints Före avvänjning (3) Ungdjur (3) Unga vuxna (3) Fysiska och utvecklingsmässiga markörer Kroppsvikt samt kliniska observationer en gång i veckan (4) minst varannan vecka minst varannan vecka Hjärnvikt PND 22 (5) vid avslutningen Neuropatologi PND 22 (5) vid avslutningen Könsmognad — i förekommande fall — Andra utvecklingsmarkörer (6) i förekommande fall — — Funktionella och beteendemässiga endpoints Beteendeontogeni Minst två mätningar Motorisk aktivitet (inklusive tillvänjning) 1–3 gånger (7) — en gång Motoriska och sensoriska funktioner — en gång en gång Inlärning och minne — en gång en gång

33. Levande avkomma ska räknas och könsbestämmas, t.ex.genom visuell inspektion eller mätning av anogenitalt avstånd (se hänvisning 34, 35), och var och en av ungarna i en kull bör vägas individuellt vid födseln eller strax därefter, minst en gång i veckan under diandet, och minst en gång varannan vecka därefter. När könsmognad utvärderas bör djurets ålder och kroppsvikt bestämmas när vaginal öppning (se hänvisning 36) eller preputial separation (se hänvisning 37) förekommer, hos minst en hane och en hona per kull.

Beteendeontogeni

34. Ontogeni för utvalda beteenden bör mätas på minst en unge/kön/kull under lämplig åldersperiod med samma ungar som ska användas på alla testdagar för de beteenden som ska bedömas. Mätningsdagarna ska fördelas jämnt över denna period för att definiera antingen normal eller behandlingsrelaterad förändring i ontogenesen för detta beteende (se hänvisning 38). Följande är några exempel på beteenden för vilka ontogenesen kunde bedömas: upprätningsreflex, negativ geotaxis och motorisk aktivitet (se hänvisning 38, 39, 40).

Motorisk aktivitet

35. Motorisk aktivitet bör övervakas (se hänvisning 41, 42, 43, 44, 45) under perioden före avvänjningen och i vuxen ålder. För testning vid tidpunkten för avvänjningen, se punkt 32. Testperioden bör vara tillräckligt lång för att visa tillvänjning inom perioden för icke-behandlade kontroller. Att använda motorisk aktivitet för att bedöma beteendeontogeni rekommenderas bestämt. Om detta används som ett beteendeontogenitest, bör testningen nyttja samma djur för alla testsessioner före avvänjningen. Testning bör ske tillräckligt ofta för att man ska kunna bedöma ontogenin för tillvänjning inom sessionen (se hänvisning 44). Detta kan kräva tre eller flera tidsperioder före, och inklusive, dagen för avvänjningen (t.ex.PND 13, 17, 21). Test av samma djur eller kullsyskon bör även bör ske i vuxen ålder nära studiens avslutning (t.ex.PND 60–70). Tester på ytterligare dagar kan utföras vid behov. Motorisk aktivitet bör övervakas av en automatisk apparat för aktivitetsregistrering som bör kunna upptäcka både ökad och minskad aktivitet, (dvs. aktivitetsgrundvärdet som mäts av apparaten bör inte vara så låg att upptäckten av minskningar hindras och inte heller så hög att upptäckten av aktivitetsökningar hindras). Varje enhet bör testas genom standardförfaranden, för att så långt som möjligt säkerställa tillförlitlighet i driften mellan olika apparater och mellan olika dagar. I den mån det är möjligt, bör behandlingsgrupperna balanseras mellan enheterna. Varje djur bör testas individuellt. Behandlingsgrupperna bör fördelas jämnt över testtiderna för att undvika aktivitetsmönster kopplade till dygnsrytm stör resultaten. Ansträngningar bör göras för att säkerställa att variationerna i testbetingelserna är minimala och inte systematiskt relaterade till behandlingen. Bland de variabler som kan påverka många beteendemätningar inklusive motorisk aktivitet, är ljudnivån, storlek och form på testburen, temperatur, relativ luftfuktighet, ljusförhållanden, lukter, användning av buren eller en ny provbur, samt miljömässiga störningar.

Motoriska och sensoriska funktioner

36. Motoriska och sensoriska funktioner bör undersökas i detalj minst en gång under adolescensen och en gång under den tidiga vuxenperioden (t.ex.PND 60–70). För testning vid tidpunkten för avvänjningen, se punkt 32. Tillräcklig testning bör utföras för att säkerställa en lämplig kvantitativ provtagning av sensoriska modaliteter (t.ex. somato-sensoriska, vestibulära) och motoriska funktioner (t.ex. styrka, koordination). Några exempel på tester avseende motorisk och sensorisk funktion är extensorreflex (se hänvisning 46), upprätningsreflex (se hänvisning 47, 48), tillvänjning till plötsliga ljud (se hänvisning 40, 49, 50, 51, 52, 53, 54) och framkallade potentialer (se hänvisning 55).

Tester av inlärning och minne

37. Ett test av associativ inlärning och minne bör utföras efter avvänjningen (t.ex. 25 ± 2 dagar) och för unga vuxna (PND 60 och äldre). För testning vid tidpunkten för avvänjningen, se punkt 32. Samma eller separata tester kan användas för dessa två utvecklingsstadier. En viss flexibilitet är tillåten vid val av tester för inlärning och minne hos avvanda och vuxna råttor. Emellertid bör testerna vara utformade så att de uppfyller två kriterier. För det första bör inlärningen antingen bedömas som en förändring över flera upprepade inlärningsförsök eller sessioner, eller, i tester som involverar ett enda försök, med hänvisning till ett villkor som kontrollerar icke-associativa effekter av utbildningserfarenheten. För det andra bör testerna omfatta någon mätning av minnet (korttids- eller långtidsminne), utöver den ursprungliga inlärningen (tillägnandet), dock kan denna mätning av minnet inte rapporteras i avsaknad av måttet på tillägnande som erhållits från samma test. Om tester av inlärning och minne avslöjar en påverkan av testkemikalien, kan att ytterligare tester övervägas för att utesluta alternativa tolkningar som baseras på förändringar i sensorisk, motiverande och/eller motorisk kapacitet. Förutom ovanstående två kriterier rekommenderas det att testet av inlärning och minne väljs utifrån dess visade känslighet för den klass av kemikalier som utreds, om sådan information finns tillgänglig i litteraturen. I avsaknad av sådan information, inkluderar följande exempel tester som kan göras för att uppfylla ovanstående kriterier: passivt undvikande (se hänvisning 43, 56, 57), fördröjd-matchning-till-position för vuxen råtta (se hänvisning 58) och för råttungar (se hänvisning 59), olfaktorisk betingning (se hänvisning 43, 60), Morris vattenlabyrint (se hänvisning 61, 62, 63), Biel- eller Cincinnati-labyrint (se hänvisning 64, 65), ’radial arm maze’ (se hänvisning 66), T-labyrint (se hänvisning 43), samt förvärv och upprätthållande av schemastyrt beteende (se hänvisning 26, 67, 68). Ytterligare tester beskrivs i litteraturen för avvanda (se hänvisning 26, 27) och för vuxna råttor (se hänvisning 19, 20).

Obduktion

38. Honor kan avlivas efter avvänjning av avkomman.

39. Neuropatologisk utvärdering av avkomman kan genomföras med hjälp av vävnad från djur som avlivats humant på PND 22 eller vid en tidigare tidpunkt mellan PND 11 och PND 22, samt vid studiens avslutning. För avkomma som avlivats från PND 22 bör hjärnvävnaden utvärderas, för djur som avlivats vid avslutningen, bör både centrala nervsystemets (CNS) och perifera nervsystemets (PNS) vävnader utvärderas. Djur som avlivas på PND 22 eller tidigare kan antingen fixeras genom immersion eller perfusion. Djur som avlivas vid studiens avslutning bör fixeras genom perfusion. Under alla moment i prepareringen av vävnadsprover, från perfusion av djuren till dissektion av vävnadsprover, vävnadsbehandling och färgning av utstryksglas bör man använda sig av en balanserad utformning, så att varje sats innehåller representativa prover från varje dosgrupp. Ytterligare vägledning om neuropatologi finns i OECD:s vägledning nr 20 (se hänvisning 9), se även (se hänvisning 103).

Beredning av vävnadsprover

40. Alla större avvikelser som är uppenbara vid obduktionstidpunkten bör noteras. De vävnadsprover som tas bör representera alla stora regioner i nervsystemet. Vävnadsproverna bör bevaras i ett lämpligt fixativ och beredas enligt publicerade histologiska standardprotokoll (se hänvisning 69, 70, 71, 103). Paraffininingjutning är acceptabelt för vävnader från CNS och PNS men användning av osmium i efterfixeringen tillsammans med epoxiinbäddning kan vara lämplig när högre upplösning krävs (t.ex.för perifera nerver, när en perifer neuropati misstänks och/eller för morfometrisk analys av perifera nerver). Hjärnvävnad som samlas in för morfometrisk analys bör ingjutas i lämpligt medium för alla dosnivåer vid samma tidpunkt för att undvika krympning av artefakter, vilket kan förknippas med långvarig lagring i fixativ (se hänvisning 6).

Neuropatologiska undersökningar

41. Syftet med den kvalitativa undersökningen är

i) att identifiera regioner inom nervsystemet som uppvisar tecken på neuropatologiska förändringar,

ii) identifiera olika typer av neuropatologiska förändringar till följd av exponering för testkemikalien och

iii) fastställa allvarlighetsgraden för de neuropatologiska förändringarna.

Representativa histologiska snitt från vävnadsproverna bör undersökas mikroskopiskt av en lämpligt utbildad patolog avseende belägg på neuropatologiska förändringar. Alla neuropatologiska förändringar bör tilldelas en subjektiv klass som anger allvarlighetsgraden. Ett hematoxylin- och eosinfärgämne kan vara tillräckligt för att utvärdera hjärnsnitt från djur som avlivats humant på PND 22, eller tidigare. Emellertid kan ett myelinfärgämne (t.ex.Luxol snabb blå/kresylviolett) och en silverfärg (t.ex.Bielschowskys eller Bodians färgämnen) rekommenderas för snitt av CNS- och PNS-vävnader från djur som avlivas vid studiens avslutning. Med förbehåll för patologens yrkesmässiga bedömning och typen av förändringar som har observerats, kan andra färgämnen anses lämpliga för att identifiera och karakterisera vissa typer av förändringar (t.ex.surt gliafibrillärt protein [GFAP], eller lektin histokemi för att bedöma glia- och mikrogliaförändringar [se hänvisning 72], fluoro-jade för att detektera nekros [se hänvisning 73, 74], eller silverfärgämnen specifika för neural degenerering [se hänvisning 75]).

42. Morfometrisk (kvantitativ) utvärdering bör utföras eftersom dessa uppgifter kan bidra till att upptäcka en behandlingsrelaterad effekt och är värdefulla vid tolkningen av behandlingsrelaterade skillnader i hjärnans vikt eller morfologi (se hänvisning 76, 77). Nervvävnad bör provtas och prepareras för en morfometrisk utvärdering. Morfometriska utvärderingar kan t.ex. omfatta linjära mätningar eller arealmätningar av specifika delar av hjärnan (se hänvisning 78). Linjära mätningar eller arealmätningar kräver att man använder noggrant utvalda homologa snitt baserat på tillförlitliga mikroskopiska markörer (se hänvisning 6). Stereologi kan användas för att identifiera behandlingsrelaterade verkningar på parametrar såsom volym eller cellantal för specifika neuroanatomiska områden (se hänvisning 79, 80, 81, 82, 83, 84).

43. Hjärnan bör undersökas avseende belägg på behandlingsrelaterade neuropatologiska förändringar och lämpliga prover bör tas från alla stora regioner av hjärnan (t.ex. luktbulben, hjärnbarken, hippocampus, basala ganglier, thalamus, hypothalamus, mitthjärnan (tectum, tegmentum och cerebrala pedunklar), pons, medulla oblongata, cerebellum) för att säkerställa en grundlig undersökning. Det är viktigt att snitten tas i samma plan för alla djur. På vuxna djur, som avlivas humant vid studiens avslutning, bör prover tas från representativa delar av ryggmärgen och PNS. De undersökta områdena bör innehålla ögat med synnerv och näthinna, ryggmärgen vid cervikal och lumbal svullnad, dorsala och ventrala rotfibrer, proximala ischiasnerven, proximala tibialnerven (vid knät) och tibialnervens vadmuskelgrenar. Ryggmärgen och perifera nervsnitt bör omfatta diagonala, tvärgående och längsgående snitt.

44. Neuropatologiska utvärderingar bör innehålla en undersökning av tecken på utvecklingsskador på nervsystemet (se hänvisning 6, 85, 86, 87, 88, 89) utöver de cellulära förändringarna (t.ex.neuronal vakuolisering, degeneration, nekros), och vävnadsförändringar (t.ex.gliosis, leukocytisk inlagring, cystisk bildning). I detta avseende är det viktigt att behandlingsrelaterade effekter kan särskiljas från normala utvecklingshändelser kända för att inträffa vid ett utvecklingsstadium som motsvarar tidpunkten för avlivningen (se hänvisning 90). Exempel på viktiga förändringar som indikerar utvecklingsmässig skada inkluderar, men är inte begränsad till, följande:

— Förändring av storlek eller form på luktbulberna, storhjärnan eller lillhjärnan.

— Förändringar av relativ storlek på olika hjärnregioner, inklusive minskning eller ökning av storlek på regioner till följd av förlust eller uthållighet hos vanligtvis tillfälliga cellpopulationer eller axonala projektioner (t.ex.externt germinalt lager hos lillhjärnan, hjärnbalken).

— Förändringar i proliferation, migration och differentiering, vilket indikeras av områden med överdriven apoptos eller nekros, grupper eller spridda populationer av ektopiska, desorienterade eller missbildade nervceller, eller förändringar i relativ storlek hos olika lager av kortikala strukturer.

— Förändringar i myelinationsmönster, inklusive en generell minskning av storlek eller förändrad färgning av myeliniserade strukturer.

— Tecken på hydrocefalus, särskilt utvidgning av kamrarna, cerebral akveduktstenos och förtunning av hjärnhalvorna.

Analys av sambandet mellan dos och respons hos neuropatologiska förändringar

45. Följande stegvisa förfarande rekommenderas för de kvalitativa och kvantitativa analyserna av neuropatologi. Först jämförs snitten från högdosgruppen med dem i kontrollgruppen. Om inga tecken på neuropatologiska förändringar påträffas hos djuren i högdosgruppen så krävs inga fler analyser. Om tecken på neuropatologiska förändringar påträffas i högdosgruppen så undersöks djuren i mellan- och lågdosgruppen. Om högdosgruppen faller bort på grund av dödsfall eller annan störande toxicitet, bör hög- och mellandosgruppen analyseras avseende neuropatologiska förändringar. Om det finns eventuella tecken på neurotoxicitet i lägre dosgrupper, bör neuropatologisk analys utföras för dessa grupper. Om eventuella behandlingsrelaterade neuropatologiska förändringar påträffas i den kvalitativa eller kvantitativa undersökningen, bör den dosberoende förekomsten, frekvensen och allvarlighetsgraden av skadorna eller de morfometriska ändringarna fastställas på grundval av en bedömning av samtliga djur i alla dosgrupper. Samtliga regioner i hjärnan som uppvisar tecken på neuropatologiska förändringar bör ingå i denna utvärdering. För varje typ av skada bör de egenskaper som används för att definiera varje allvarlighetsgrad beskrivas och de egenskaper som används för att åtskilja varje klass anges. Frekvensen för varje typ av skada och dess allvarlighetsgrad bör registreras, och en statistisk analys bör utföras för att bedöma hur dos-responssambandet ser ut. Användning av kodade utstryksglas rekommenderas (se hänvisning 91).

DATA OCH RAPPORTERING

Data

46. Data bör rapporteras individuellt och sammanställas i tabellform, och för varje testgrupp visa förändringstyper och antalet moderdjur, avkomma efter kön och kullar för varje typ av förändring. Om direkt postnatal exponering av avkomman har utförts, bör sättet, varaktigheten och exponeringsperioden rapporteras.

Utvärdering och tolkning av resultaten

47. En studie av utvecklingsneurotoxicitet ger information om effekterna av upprepad exponering för en kemikalie under in utero och tidig postnatal utveckling. Eftersom vikten läggs på endpoints för både allmän toxicitet och utvecklingsneurotoxicitet, kommer resultaten från studien att möjliggöra en åtskillnad mellan neuroutvecklingseffekter som förekommer i frånvaron av allmän maternell toxicitet, och de som bara uttrycks på nivåer som också är giftiga för moderdjuret. På grund av de komplexa sambanden mellan studieutformning, statistisk analys och biologisk signifikans för data, inbegriper en adekvat tolkning av data om utvecklingsneurotoxicitet en expertbedömning (se hänvisning 107, 109). Vid tolkningen av testresultaten bör man använda en metod som bygger på evidensvärde (se hänvisning 20, 92, 93, 94). Mönster av beteendemässiga eller morfologiska fynd bör, om det finns, diskuteras, liksom belägg för dos-respons. Data från alla studier som är relevanta för bedömningen av utvecklingsneurotoxicitet, inklusive mänskliga epidemiologiska studier och fallrapporter, samt experimentella djurstudier (t.ex.toxikokinetiska data, struktur-aktivitetsinformation, data från andra toxicitetsstudier), bör ingå i denna karakterisering. Detta inkluderar relationen mellan doser av testkemikalien och närvaron eller frånvaron, förekomsten och omfattningen av eventuell neurotoxisk effekt för varje kön (se hänvisning 20, 95).

48. Utvärderingen av data bör omfatta en diskussion om både den biologiska och statistiska signifikansen. Statistisk analys bör ses som ett verktyg som vägleder, snarare än bestämmer, tolkningen av data. Avsaknad av statistisk signifikans bör inte vara den enda grunden för att fastslå en avsaknad av behandlingsrelaterad effekt, precis som statistisk signifikans inte bör vara den enda motiveringen för att fastslå en behandlingsrelaterad effekt. För att skydda sig mot eventuella falska negativa fynd och svårigheterna i att ’bevisa ett negativt resultat’ bör tillgängliga positiva resultat och historiska kontrolldata diskuteras, särskilt när det saknas behandlingsrelaterade effekter (se hänvisning 102, 106). Sannolikheten för falska positiva resultat bör diskuteras i ljuset av den totala statistiska utvärderingen av data (se hänvisning 96). Utvärderingen bör omfatta det eventuella sambandet mellan observerade neuropatologiska och beteendemässiga förändringar.

49. Samtliga resultat bör analyseras med hjälp av statistiska modeller som är lämpliga för försökets utformning (se hänvisning 108). Valet av en parametrisk eller icke-parametrisk analys bör motiveras med tanke på faktorer såsom typen av data (transformerad eller ej) och fördelning, samt den relativa robustheten i den valda statistiska analysen. Syftet och utformningen av studien bör styra valet av statistiska analyser för att minimera fel av typ I (falskt positiva) och typ II (falskt negativa) (se hänvisning 96, 97, 104, 105). Utvecklingsstudier med hjälp av multipara arter där flera ungar per kull testas, bör inkludera kullen i den statistiska modellen som skydd mot överdrivna felfrekvenser av typ I (se hänvisning 98, 99, 100, 101). Den statistiska enheten bör vara kullen, och inte ungen. Försök bör utformas så att kullsyskon inte behandlas som oberoende observationer. Varje endpoint som mäts upprepade gånger hos samma försöksdjur bör analyseras med hjälp av statistiska modeller som står för icke-oberoendet hos dessa mätningar.

Testrapport

50. Testrapporten ska innehålla följande information:

Testkemikalie:

— Fysikalisk form och, när så är tillämpligt, fysikalisk-kemiska egenskaper.

— Identifieringsdata, inklusive källa.

— Beredningens renhet, samt kända och/eller förväntade föroreningar.

Vehikel (i förekommande fall):

— Motivering för val av vehikel, om annan än vatten eller fysiologisk koksaltlösning.

Försöksdjur:

— Art och stam som används, samt en motivering om annat än råtta används.

— Leverantör av försöksdjur.

— Djurens antal, ålder vid start och kön.

— Ursprung, inhysning, foder, vatten etc.

— Djurens individuella vikt vid testets början.

Testbetingelser:

— Grund för val av dosnivå.

— Grund för doseringssätt och tidsperiod.

— Specifikation av tillförda doser, inbegripet uppgifter om vehikel, volym och det tillförda ämnets fysikaliska form.

— Uppgifter om testkemikaliens sammansättning/foderberedning, uppnådd koncentration, beredningens stabilitet och homogenitet.

— Metod som används för att unikt identifiera moderdjur och avkomma.

— En detaljerad beskrivning av de statistiska stickprovsmetoder som används för att anvisa moderdjur till behandlingsgrupperna, välja ungar för avlivning, samt anvisa ungar till testgrupper.

— Uppgifter om administreringen av testkemikalien.

— Omräkning av testkemikaliens koncentration (ppm) från foder/dricksvatten eller genom inhalation till faktisk dos (mg/kg kroppsvikt/dag), i förekommande fall.

— Miljöförhållanden.

— Uppgifter om kvalitet på foder och vatten (t.ex.kran, destillerat).

— Datum för studiens start och slut.

Observationer och testförfaranden:

— En detaljerad beskrivning av de förfaranden som används för att standardisera observationer och förfaranden, samt operationella definitioner för att värdera observationer.

— En förteckning över samtliga testförfaranden, samt motivering av deras användning.

— Uppgifter om de beteendemässiga/funktionella, patologiska, neurokemiska eller elektrofysiologiska metoder som används, inklusive information och detaljer om automatiserade enheter.

— Rutiner för kalibrering och säkerställande av likvärdiga enheter, och balansen mellan behandlingsgrupper i testförfaranden.

— En kort motivering som förklarar eventuella beslut som inbegriper en yrkesmässig bedömning.

Resultat (enskilda och sammanfattande, inklusive medelvärde och varians i förekommande fall):

— Antalet djur vid studiens början och i slutet av studien.

— Antalet djur och kullar som används för varje testmetod.

— Identifikationsnummer för varje djur och kullen som den kommer från.

— Kullstorlek och medelvikt vid födseln för respektive kön.

— Kroppsvikt och kroppsviktsförändringsdata, inklusive terminal kroppsvikt för moderdjur och avkomma.

— Uppgifter om foderintag, och i tillämpliga fall uppgifter om vattenintag (t.ex.om testkemikalien tillförs via vatten).

— Uppgifter om toxiska reaktioner för respektive kön och dosnivå, inklusive tecken på toxicitet eller dödlighet, inklusive tidpunkt för, och orsak till dödsfall, om detta är tillämpligt.

— Natur, allvarlighetsgrad, varaktighet, dag för första tecken, tid på dygnet, och efterföljande förlopp för de detaljerade kliniska observationerna.

— Värde för varje utvecklingsmarkör (vikt, könsmognad och beteendeontogeni) vid varje observationstidpunkt.

— En detaljerad beskrivning av alla beteendemässiga, funktionella, neuropatologiska, neurokemiska, elektrofysiologiska fynd för respektive kön, som omfattar både ökningar och minskningar från kontroller.

— Obduktionsfynd.

— Hjärnvikter.

— Eventuella diagnoser som härrör från neurologiska symtom och skador, inklusive naturligt förekommande sjukdomar eller tillstånd.

— Bilder på typiska exempel på fynd.

— Lågupplösta bilder för att bedöma homologi i snitt som används för morfometri.

— Absorptions- och metabolismdata, inklusive kompletterande uppgifter från en separat toxikokinetisk studie, om sådan finns.

— Statistisk bearbetning av resultaten, inklusive statistiska modeller som används för att analysera data, och resultaten, oavsett om de var signifikanta eller ej.

— Förteckning över personal som utför studien, inklusive deras yrkesutbildning.

Diskussion av resultaten:

— Dos-respons-information, för respektive kön och grupp.

— Eventuella toxiska effekters samband med en slutsats om testkemikaliens neurotoxiska potential, för respektive kön och grupp.

— Hur påverkas slutsatserna av eventuell toxikokinetisk information.

— Likheter med effekter från alla kända neurotoxiska ämnen.

— Data som stöder testmetodens tillförlitlighet och känslighet (dvs. positiva och historiska kontrolldata).

— Eventuella samband mellan neuropatologiska och funktionella effekter.

— Noael- eller referensdos för moderdjur och avkomma, för respektive kön och grupp.

Slutsatser:

— En diskussion om den övergripande tolkningen av data baserad på resultaten, inklusive en slutsats om huruvida testkemikalien orsakat utvecklingsneurotoxicitet och Noael.

HÄNVISNINGAR

1. OECD (1995). Utkast till rapport från OECD:s ad hoc-arbetsgrupp för reproduktion och utvecklingstoxicitet. Köpenhamn, Danmark, 13–14 juni 1995.

2. US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98-239. Finns på: http://www.epa.gov/opptsfrs/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/

3. US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 630/R-95/001F. Finns på: http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordisplay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479

4. Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79–91.

5. Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101–111.

6. Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Claudio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropathology. Environ. Health Perspect., 109:93–100.

7. OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., US, 23–25 October 2000.

8. OECD (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, OECD, Paris. Juli 2008 finns på: http://search.oecd.org/officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage = en

9. OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OECD, Paris, september 2003. Finns på: http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html

10. Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantitative comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173–292.

11. Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000) Experimental and Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition, ISBN 0195084772, Oxford University Press, New York.

12. Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188–197.

13. Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998) Handbook of Developmental Neurotoxicology, 1:a utgåvan, ISBN 0126488606, Academic Press, New York.

14. Kapitel B.34 i denna bilaga, reproduktionstoxicitetstest på en generation.

15. Kapitel B.35 i denna bilaga, test avseende reproduktionstoxicitet på två generationer.

16. Kapitel B.43 i denna bilaga, test avseende neurotoxicitet på gnagare.

17. Kapitel B.31 i denna bilaga, test avseende prenatal utvecklingstoxicitet.

18. Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU av den 22 september 2010 om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål (EUT L 276, 20.10.2010, s. 33).

19. WHO (1986) Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals, (Environmental Health Criteria 60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, Förenta staterna. Finns på: http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060.htm

20. WHO (2001) Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles and Approaches, (Environmental Health Criteria 223), World Health Organization Publications, Geneva. Finns på: http://www.intox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm

21. Chang, L.W., Slikker, W. (1995) Neurotoxicology: Approaches and Methods, 1:a utgåvan, ISBN 012168055X, Academic Press, New York.

22. De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxicol. Teratol., 19:499–509.

23. Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2–6.

24. Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. Animal Sci., 27:110–112.

25. Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118–136.

26. Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979) Ontogeny of Learning and Memory. ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.

27. Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987) Perinatal Development: A Psychobiological Perspective. Academic Press, Orlando.

28. Zoetis, T., Walls, I. (2003) Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research. ILSI Press, Washington, DC.

29. Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87–94.

30. Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1–4.

31. ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceuticals for Human Use.

32. Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical considerations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433–439.

33. Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449–457.

34. Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. (1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383–390.

35. Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350–365.

36. Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579–586.

37. Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298–303.

38. Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489–95.

39. Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896–920.

40. Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. I: Handbook of Behavioral Teratology. Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, New York, s. 67–100.

41. Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53–66.

42. Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measurement of spontaneous motor activity, Handbook of Psychopharmacology, Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, New York, s. 37–82.

43. Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neurotoxicity following neonatal exposure to 3,3′-iminodipropionitrile in the rat. Neurotoxicol. Teratol., 15:117–129.

44. Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247–260.

45. Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599–609.

46. Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 19:1997. 405–411.

47. Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals.Physiol. Behav., 64:661–669.

48. Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol., 40:589–591.

49. Davis, M. (1984) The mammalian startle response. I: Neural Mechanisms of Startle Behavior, Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, pp. 287–351

50. Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107–128.

51. Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory dysfunction. In Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology, Tilson, H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, pp. 181–211.

52. Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 8:199–211.

53. Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototoxicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res.,80:25–30.

54. Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 6:437–445.

55. Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked potentials into neurotoxicity test schemes. I: Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicity, Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New York. pp. 125–145.

56. Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory deficits in rats following exposure to 3,3′-iminopropionitrile. Toxicol. Appl. Pharmacol., 105:321–332.

57. Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247–296.

58. Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 10:237–244.

59. Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98–105.

60. Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 17:465–479.

61. Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47–60.

62. Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29–69.

63. D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60–90.

64. Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235–241.

65. Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387–399.

66. Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced microcephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327–332.

67. Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 71:342–352.

68. Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338–341.

69. Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 28: 122–131.

70. Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994) Laboratory Methods in Histotechnology, American Registry of Pathology, Washington, DC, s. 84–107.

71. Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002) Theory and Practice of Histological Techniques, 5th edition, Churchill Livingstone, London.

72. Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evaluation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291–304.

73. Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123–130.

74. Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 53:365–372.

75. De Olmos, I.S., Beltramino, C.A. och de Olmos de Lorenzo, S. (1994) Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545–561.

76. De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Environ. Toxicol. Pharmacol., 19:745–755.

77. De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for developmental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417–432.

78. Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 1:129–135.

79. Howard, C.V., Reed, M.G. (1998) Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy, Springer-Verlag, New York.

80. Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A practical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305–310.

81. Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262–268.

82. Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in disector stereology. J. Neurocytol., 26:707–710.

83. West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22:51–61.

84. Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience, 130: 813–831.

85. Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of growth deficiency in rats exposed in utero to undernutrition, ethanol, or the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113–121.

86. Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 84:294–298.

87. Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental neurotoxicology. I: Handbook of Developmental Neurotoxicology, Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, s. 3–41.

88. Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science, 283:70–74.

89. Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056–1060.

90. Friede, R. L. (1989) Developmental Neuropathology. Second edition. Springer-Verlag, Berlin.

91. House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127–133.

92. Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401–405.

93. US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA NCEA-F-0644A.

94. US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, Federal Register 61(212): 56274–56322.

95. Danish Environmental Protection Agency (1995) Neurotoxicology. Review of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefoged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.

96. Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxicology, 5:113–126.

97. Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 08:21–27.

98. Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329–335.

99. Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in teratology studies. Teratology, 12:165–172.

100. Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 14: 221–228.

101. Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. (1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587–90.

102. Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. (2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345–352.

103. Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an ad hoc working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006) A ’best practices’ approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing – for today. Toxicol. Pathol. 34:296–313.

104. Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205–210.

105. Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295–301.

106. Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):266–287.

107. Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. (2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):288–325.

108. Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):326–348.

109. Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):349–381.

Figur 1

Allmänt testschema för funktions- och beteendetester, neuropatologisk utvärdering samt hjärnvikter. Detta diagram baseras på beskrivningen i punkterna 13–15 (PND = postnatal dag). Exempel på anvisning av djur finns i tillägg 1

Tillägg 1 1. Exempel på möjliga anvisningar av försöksdjur beskrivs och visas i tabellform nedan. Dessa exempel ges för att visa att anvisning av djur till olika testparadigm kan åstadkommas på flera olika sätt. Exempel 1 2. En uppsättning av 20 ungar/kön/dosnivå (dvs. 1 hane och 1 hona per kull) används för testning av beetendeontogeni före avvänjningen. Av dessa djur avlivas 10 ungar/kön/dosnivå (dvs. 1 hane eller 1 hona per kull) humant på PND 22. Hjärnorna avlägsnas, vägs och bereds för histopatologisk utvärdering. Dessutom samlas hjärnviktsdata in från de ej fixerade hjärnorna från de återstående 10 hanarna och 10 honorna per dosnivå. 3. Ytterligare en uppsättning av 20 djur/kön/dosnivå (dvs. 1 hane och 1 hona per kull) används för funktions-/beteendetester efter avvänjningen (detaljerade kliniska observationer, motorisk aktivitet, plötsliga ljud och kognitiv funktionstestning av unga djur) samt bedömning av ålder för könsmognad. Av dessa djur sövs och fixeras 10 djur/kön/dosnivå (dvs. 1 hane och 1 hona per kull) genom perfusion vid studiens avslutning (cirka PND 70). Efter ytterligare fixering in situ, tas hjärnan ut och bereds för en neuropatologisk utvärdering. 4. För kognitiva funktionstester av unga vuxna (t.ex. PND 60–70) används en tredje uppsättning av 20 ungar/kön/dosnivå (dvs. 1 hane och 1 hona per kull). Av dessa djur avlivas 10 djur/kön/grupp (1 hane och 1 hona per kull) vid studiens avslutning och hjärnan avlägsnas och vägs. 5. Återstående 20 djur/kön/grupp reserveras för eventuella ytterligare test. Tabell 1 Unge nr (8) Antal ungar anvisade till test Undersökning/test m f 1 5 20 m + 20 f Beteendeontogeni 10 m + 10 f PND 22 hjärnvikt/neuropatologi/morfometri 10 m + 10 f PND 22 hjärnvikt 2 6 20 m + 20 f Detaljerade kliniska observationer 20 m + 20 f Motorisk aktivitet 20 m + 20 f Könsmognad 20 m + 20 f Motoriska och sensoriska funktioner 20 m + 20 f Inlärning och minne (PND 25) 10 m + 10 f Unga vuxna hjärnvikt/neuropatologi/morfometri ~ PND 70 3 7 20 m + 20 f Inlärning och minne (unga vuxna) 10 m + 10 f Unga vuxna hjärnvikt ~ PND 70 4 8 — Reservdjur till utbyten eller ytterligare tester Exempel 2 6. En uppsättning av 20 ungar/kön/dosnivå (dvs. 1 hane och 1 hona per kull) används för testning av beetendeontogeni före avvänjningen. Av dessa djur avlivas 10 ungar/kön/dosnivå (1 hane eller 1 hona per kull) humant på PND 11. Hjärnorna avlägsnas, vägs och bereds för en histopatologisk utvärdering. 7. Ytterligare en uppsättning av 20 djur/kön/dosnivå (1 hane och 1 hona per kull) används för undersökningar efter avvänjningen (detaljerade kliniska observationer, motorisk aktivitet, åldersbedömning av könsmognad samt motoriska och sensoriska funktioner). Av dessa djur sövs och fixeras 10 djur/kön/dosnivå (dvs. 1 hane och 1 hona per kull) genom perfusion vid studiens avslutning (cirka PND 70). Efter ytterligare fixering in situ, tas hjärnan ut, vägs och bereds för en neuropatologisk utvärdering. 8. För kognitiv funktionstestning av ungdjur och unga vuxna används 10 ungar/kön/dosnivå (dvs. 1 hane och 1 hona per kull). Olika djur används för kognitiva funktionstester på PND 23 och unga vuxna. Vid avslutningen avlivas de 10 djur/kön/ grupp som testades som vuxna, och hjärnan avlägsnas och vägs. 9. De återstående 20 djur/kön/grupp som inte valts ut för testning avlivas och kasseras vid avvänjningen. Tabell 2 Unge nr (9) Antal ungar anvisade till test Undersökning/test m f 1 5 20 m + 20 f Beteendeontogeni 10 m + 10 f PND 11 hjärnvikt/neuropatologi/morfometri 2 6 20 m + 20 f Detaljerade kliniska observationer 20 m + 20 f Motorisk aktivitet 20 m + 20 f Könsmognad 20 m + 20 f Motoriska och sensoriska funktioner 10 m + 10 f Unga vuxna hjärnvikt/neuropatologi/morfometri ~ PND 70 3 7 10 m + 10 f (10) Inlärning och minne (PND 23) 3 7 10 m + 10 f (10) Inlärning och minne (unga vuxna) Unga vuxna hjärnvikt 4 8 — Djur som avlivas och kasseras PND 21 Exempel 3 10. En uppsättning av 20 ungar/kön/dosnivå (dvs. 1 hane och 1 hona per kull) används för bedömning av hjärnvikt och neuropatologi på PND 11. Av dessa djur avlivas 10 ungar/kön/dosnivå (dvs.1 hane och 1 hona per kull) humant på PND 11 och hjärnorna avlägsnas, vägs och bereds för en histopatologisk utvärdering. Dessutom samlas hjärnviktsdata in från de ej fixerade hjärnorna från de återstående 10 hanarna och 10 honorna per dosnivå. 11. Ytterligare en uppsättning av 20 djur/kön/dosnivå (dvs. 1 hane och 1 hona per kull) används för undersökningar av beteendeontogeni (motorisk aktivitet) efter avvänjningen (motorisk aktivitet och bedömning av ålder för könsmognad) samt testning av kognitiv funktion hos ungdjur. 12. Ytterligare en uppsättning av 20 djur/kön/dosnivå (dvs. 1 hane och 1 hona per kull) används för motoriska och sensoriska funktionstester (plötsliga ljud) och detaljerade kliniska observationer. Av dessa djur sövs och fixeras 10 djur/kön/dosnivå (dvs. 1 hane och 1 hona per kull) genom perfusion vid studiens avslutning (cirka PND 70). Efter ytterligare fixering in situ, tas hjärnan bort, vägs och bereds för en neuropatologisk utvärdering. 13. Ytterligare en uppsättning av 20 ungar/kön/dosnivå används för testning av kognitiv funktion hos unga vuxna (dvs. 1 hane och 1 hona per kull). Av dessa avlivas 10 djur/kön/grupp (dvs. 1 hane och 1 hona per kull) vid avslutningen, och hjärnan avlägsnas och vägs. Tabell 3 Unge nr (11) Antal ungar anvisade till test Undersökning/test m f 1 5 10 m + 10 f PND 11 hjärnvikt/neuropatologi/morfometri 10 m + 10 f PND 11 hjärnvikt 2 6 20 m + 20 f Beteendeontogeni (motorisk aktivitet) 20 m + 20 f Motorisk aktivitet 20 m + 20 f Könsmognad 20 m + 20 f Inlärning och minne (PND 27) 3 7 20 m + 20 f Plötsliga ljud (ungdjur och unga vuxna) 20 m + 20 f Detaljerade kliniska observationer 10 m + 10 f Unga vuxna hjärnvikt/neuropatologi/morfometri ~ PND 70 4 8 20 m + 20 f Inlärning och minne (unga vuxna) 10 m + 10 f Unga vuxna hjärnvikt

Tillägg 2 Definitioner kemikalie: Ett ämne eller en blandning. testkemikalie: Alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.

B.54 UTEROTROF BIOASSAY PÅ GNAGARE: ETT KORTTIDSSCREENINGTEST FÖR ÖSTROGENA EGENSKAPER

INLEDNING

1. Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 440 (2007). OECD inledde en högprioriterad verksamhet under 1998 för att se över befintliga riktlinjer och ta fram nya riktlinjer för screening och testning av potentiellt hormonstörande ämnen (se hänvisning 1). En del av verksamheten var att ta fram en riktlinje för den uterotrofa bioassayen på gnagare. Den uterotrofa bioassayen på gnagare undergick då ett omfattande valideringsprogram, inklusive sammanställandet av ett detaljerat bakgrundsdokument (se hänvisning 2, 3) och genomförandet av omfattande studier inom och mellan laboratorier för att visa testets relevans och reproducerbarhet med en potent referensöstrogen, svaga östrogenreceptoragonister, en stark östrogenreceptorantagonist och en negativ referenskemikalie (se hänvisning 4, 5, 6, 7, 8, 9). Denna testmetod B.54 är resultatet av de erfarenheter som vunnits under valideringen av testprogrammet och de resultat som erhållits därigenom med östrogena agonister.

2. Den uterotrofa bioassayen är ett korttidsscreeningtest som har sitt ursprung på 1930-talet (se hänvisning 27, 28) och som först standardiserades för screening av en expertkommitté 1962 (se hänvisning 32, 35). Den baseras på ökningen av livmodervikt eller uterotrof respons (för översikt, se hänvisning 29). Den utvärderar en testkemikalies möjlighet att framkalla biologiska aktiviteter som är förenliga med agonister eller antagonister för naturliga östrogener (t.ex. 17-ß-östradiol), dock används den inte lika ofta för att upptäcka antagonister som för agonister. Livmodern svarar på östrogen på två sätt. En första reaktion är viktökning på grund av vattenupptag. Detta följs av viktökning på grund av vävnadstillväxt (se hänvisning 30). Livmoderns reaktion hos råttor och möss är kvalitativt jämförbara.

3. Denna bioassay tjänar som ett in vivo-screeningtest och dess tillämpning bör ses mot bakgrund av ’OECD:s konceptuella ram för testning och bedömning av endokrinstörande kemikalier’ (tillägg 2). I denna konceptuella ram ingår den uterotrofa bioassayen i nivå 3 som ett in vivo-test som ger data om en enda endokrin mekanism, dvs. östrogenicitet.

4. Den uterotrofa bioassayen är avsedd att ingå i en serie in vitro- och in vivo-tester för att identifiera kemikalier med potential att interagera med det endokrina systemet, vilket slutligen leder till riskbedömningar för människors hälsa eller miljön. OECD:s valideringsprogram använder både starka och svaga östrogenagonister för att utvärdera metodens prestanda att identifiera östrogena kemikalier (se hänvisning 4, 5, 6, 7, 8). Därigenom visades att metodens känslighet när det gäller östrogenagonister var god, vid sidan av en god reproducerbarhet inom och mellan laboratorier.

5. När det gäller negativa kemikalier, så ingick bara en enda ’negativ’ referenskemikalie som redan rapporterats negativ genom uterotrof bioassay samt in vitro-receptorbindning och receptortest i valideringsprogrammet, men ytterligare testdata, som inte är relaterade till OECD:s valideringsprogram, har utvärderats, vilket ger ytterligare stöd till den särskilda karaktären hos den uterotrofa bioassayen för screening av östrogenagonister (se hänvisning 16).

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR

6. Östrogenagonister och -antagonister verkar som ligander för östrogenreceptorerna a och b och kan aktivera respektive inhibera receptorernas transkriptionella verkan. Detta har potentialen att leda till negativa hälsorisker, inklusive reproduktions- och utvecklingseffekter. Därför föreligger behovet av att snabbt bedöma och utvärdera en kemikalie som en möjlig östrogenagonist eller -antagonist. Affiniteten hos en ligand för en östrogenreceptor eller en transkriptionell aktivering av rapportörgener in vitro är informativ men den är bara en av flera faktorer som är avgörande för eventuella risker. Andra bestämningsfaktorer kan omfatta metabolisk aktivering och avaktivering vid införandet i kroppen, fördelning till målgruppsvävnader samt utträde ur kroppen, beroende, åtminstone delvis, på administreringsväg och kemikalien som testas. Detta medför att det är nödvändigt att granska en kemikalies möjliga aktivitet in vivo enligt tillämpliga villkor, såvida inte kemikaliens egenskaper vad gäller absorption, distribution, metabolism och eliminering (Adme) redan ger lämplig information. Livmodervävnader svarar med snabb och kraftig tillväxt vid östrogenstimulering, särskilt hos laboratoriegnagare då brunstcykeln varar cirka 4 dagar. Gnagare, framför allt råtta, är också vanliga i toxicitetsstudier för riskbedömning. Därför är gnagares livmoder ett lämpligt målorgan för in vivo-screeningen av östrogenagonister och -antagonister.

7. Denna testmetod baseras på de protokoll som används i OECD:s valideringsstudie som har visat sig vara tillförlitlig och repeterbar i studier inom och mellan laboratorier (se hänvisning 5, 7). För närvarande finns det två metoder tillgängliga, en metod med ovariektomerade vuxna honor (OVX-adultmetod) och en metod med ej ovariektomerade omogna honor (immaturmetod). Det visades i OECD:s valideringstestprogram att båda metoderna har jämförbar känslighet och reproducerbarhet. Immaturmetoden är dock något mindre specifik eftersom den har en intakt hypotalamus-hypofys-gonad-axel (HPG-axeln), men den täcker ett större undersökningsområde än ovariektomerade djur eftersom den kan reagera på kemikalier som interagerar med HPG-axeln och inte bara med östrogenreceptorn. Råttans HGP-axel är funktionell när djuret är ca 15 dygn gammalt. Dessförinnan kan puberteten inte påskyndas med behandlingar som GnRH. Allteftersom honorna börjar nå puberteten, före vaginal öppning, har honan flera tysta cykler som inte resulterar i vaginal öppning eller ägglossning men där det finns vissa hormonella svängningar. Om en kemikalie stimulerar HPG-axeln direkt eller indirekt leder det till tidig pubertet, tidig ägglossning och påskyndad vaginal öppning. Det är inte bara kemikalier som verkar på HPG-axeln som leder till detta, utan vissa typer av föda med högre metaboliserbara energinivåer än andra stimulerar tillväxten och påskyndar vaginal öppning utan att vara östrogena. Sådana kemikalier framkallar inte en uterotrof respons hos ovariektomerade vuxna djur eftersom deras HPG-axel inte fungerar.

8. Av djurskyddsskäl bör företräde ges till den metod som använder omogna råttor, undviker kirurgisk förbehandling av djuren samt även undviker en eventuell icke-användning av de djur som visar eventuella tecken på brunst (se hänvisning 30).

9. Den uterotrofa responsen är inte helt och hållet av östrogent ursprung, dvs. andra kemikalier än agonister eller antagonister av östrogener kan också ge en respons. Exempelvis kan relativt höga doser av progesteron, testosteron eller olika syntetiska progestiner alla leda till en stimulerande respons (se hänvisning 30). Eventuell respons kan analyseras histologiskt för keratinisering och förhorning av vaginan (se hänvisning 30). Oavsett det möjliga ursprunget till responsen, bör ett positivt utfall av en uterotrof bioassay normalt initiera åtgärder för vidare utredning. Ytterligare bevis på östrogenicitet kan komma från in vitro-metoder, såsom ER-bindnings- och transkriptionsaktiveringstesterna, eller från andra in vivo-metoder såsom honligt pubertetstest.

10. Med beaktande av att den uterotrofa bioassayen tjänar som ett in vivo-screeningtest, tog valideringsstrategin både hänsyn till djurens välbefinnande och fungerade som en strategi för stegvis testning. För detta ändamål riktades ansträngningarna mot att noggrant validera reproducerbarheten och känsligheten hos östrogenicitet – det största problemet för många kemikalier, medan liten ansträngning riktades mot antiöstrogenicitetskomponenten i testet. Endast ett antiöstrogen med kraftig aktivitet testades, eftersom antalet kemikalier med en tydlig antiöstrogen profil (som inte skyms av någon östrogen aktivitet) är mycket begränsad. Denna testmetod är således avsedd för det östrogena protokollet, medan protokollet som beskriver testets antagonistläge ingår i ett vägledningsdokument (se hänvisning 37). Testets reproducerbarhet och känslighet för kemikalier med uteslutande antiöstrogen aktivitet kommer att definieras tydligare längre fram, efter det att testförfarandet har använts rutinmässigt under en tid och fler kemikalier med detta verkningssätt har identifierats.

11. Alla djurbaserade förfaranden ska uppfylla lokala normer för djurskötsel. De beskrivningar av vård och behandling som anges nedan är minimala prestandakrav som kommer att ersättas av lokala föreskrifter som t.ex. Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU av den 22 september 2010 om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål (se hänvisning 38). Ytterligare vägledning om human behandling av djur finns i OECD (se hänvisning 25).

12. Som med alla tester som använder sig av levande djur är det viktigt att se till att uppgifterna verkligen är nödvändiga innan testet påbörjas. Två förhållanden där data kan krävas är:

— Hög exponeringspotential (nivå 1 i den konceptuella ramen, tillägg 2) eller indikationer på östrogenicitet (nivå 2) för att undersöka om sådana effekter kan uppstå in vivo.

— Effekter som indikerar östrogenicitet i in vivo-tester på nivå 4 eller 5, för att styrka att effekterna var relaterade till en östrogen mekanism som inte kan belysas med hjälp av ett in vitro-test.

13. Definitioner som används i denna testmetod finns i tillägg 1.

PRINCIP FÖR TESTMETODEN

14. Den uterotrofa bioassayen förlitar sig på känsligheten hos ett djurtestsystem där hypotalamus-hypofys-ovarie-axeln inte är funktionell, vilket leder till låga endogena nivåer av cirkulerande östrogen. Detta säkerställer en låg livmoderreferensvikt och ett maximalt responsområde för administrerade östrogener. Två östrogenkänsliga tillstånd hos hongnagare uppfyller detta krav:

i) Omogna honor efter avvänjning och före puberteten och

ii) unga vuxna honor efter ovariektomi med tillräcklig tid för livmodervävnaden att gå i regress.

15. Testkemikalien tillförs dagligen via sondmatning eller subkutan injektion. Stegvisa testkemikaliedoser ges till minst två behandlingsgrupper av försöksdjur (se punkt 33 för vägledning), med en dosnivå per grupp, och för immaturmetoden en administreringsperiod av tre på dagar i följd och för OVX-adultmetoden en administreringsperiod av minst tre dagar i följd. Djuren obduceras cirka 24 timmar efter sista dosen. För östrogenagonister utvärderas medelvärdet för livmodervikten hos de behandlade djurgrupperna i förhållande till vehikelgruppen avseende en statistiskt signifikant ökning. En statistiskt signifikant ökning av den genomsnittliga livmodervikten hos en testgrupp visar en positiv respons i denna bioassay.

BESKRIVNING AV METODEN

Val av djurart

16. Vanligen använda stammar av laboratoriegnagare kan användas. Till exempel användes Sprague-Dawley- och Wistar-råttstammar vid valideringen. Stammar med en livmoder som är eller misstänks vara mindre känslig bör inte användas. Laboratoriet bör påvisa känslighet hos den stam som används, enligt beskrivningen i punkt 26 och 27.

17. Råtta och mus har rutinmässigt använts för den uterotrofa bioassayen sedan 1930-talet. OECD:s valideringsstudier har endast utförts med råttor, grundat på en förståelse för att båda arterna bedöms vara likvärdiga och att det därmed bör räcka med en art för den världsomfattande valideringen för att spara resurser och djur. Råttan är den art som används i de flesta studier om reproduktions- och utvecklingstoxicitet. Med hänsyn till att det finns en stor historisk databas för möss och därmed möjlighet att bredda testmetoden för uterotrof bioassay på gnagare och använda möss som testart, har en begränsad uppföljande valideringsstudie genomförts på möss (se hänvisning 16). En överbryggande studie, med ett begränsat antal testkemikalier och deltagande laboratorier och utan kodad provtestning, har valts i enlighet med den ursprungliga avsikten att spara resurser och djur. Denna överbryggande valideringsstudie visar för den uterotrofa bioassayen på unga vuxna ovariektomerade möss att data som erhålls från råttor och möss överensstämmer väl, både kvalitativt och kvantitativt. Resultatet från den uterotrofa bioassayen kan bli inledningen till en långsiktig studie, vilket gör att djur från samma stam och ursprung kan användas i båda försöken. Den överbryggande studien begränsades till OVX-möss och rapporten ger inte en robust datauppsättning för att validera immaturmodellen, och därför beaktas inte immaturmodellen för möss i denna testmetod.

18. Således kan, i vissa fall, möss användas i stället för råttor. En motivering bör ges för denna art baserat på toxikologiska, farmakokinetiska och/eller andra kriterier. Ändringar i protokollet kan bli nödvändigt för möss. Till exempel är foderkonsumtionen hos möss i förhållande till kroppsvikt högre än den hos råttor och därför bör innehållet av fytoöstrogen i fodret vara lägre för möss än för råttor (se hänvisning 9, 20, 22).

Inhysnings- och utfodringsförhållanden

19. Alla förfaranden bör överensstämma med lokala normer för laboratoriedjurvård. Dessa beskrivningar av vård och behandling är minimikrav och ersätts av lokala föreskrifter som t.ex. Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU av den 22 september 2010 om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål (se hänvisning 38). Temperaturen i djurutrymmet bör vara 22 °C (med ett ungefärligt intervall på ± 3 °C). Den relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och bör helst inte överstiga 70 %, utom när rummet rengörs. Målet bör vara relativ luftfuktighet på 50–60 %. Artificiell belysning bör användas. Den dagliga belysningssekvensen bör vara 12 timmar ljus, 12 timmar mörker.

20. Djuren ska ha fri tillgång till laboratoriefoder och dricksvatten. Unga vuxna djur kan inhysas individuellt eller i burar om grupper på upp till tre djur. På grund av de omogna djurens låga ålder rekommenderas social gruppinhysning.

21. Höga nivåer av fytoöstrogener i laboratoriefoder har varit kända för att öka livmodervikterna tillräckligt mycket hos gnagare för att störa den uterotrofa bioassayen (se hänvisning 13, 14, 15). Höga nivåer av fytoöstrogener och omsättbar energi i laboratoriefoder kan också leda till tidig pubertet om omogna djur används. Förekomsten av fytoöstrogener kommer främst från soja och alfalfaprodukter som tillförts laboratoriefodret, och koncentrationer av fytoöstrogener har visat sig variera mellan olika partier av standardlaboratoriefoder (se hänvisning 23). Kroppsvikt är en viktig variabel, eftersom den mängd livsmedel som konsumeras är relaterad till kroppsvikten. Därför kan den faktiska fytoöstrogendosen som konsumeras genom samma foder variera mellan arter och åldrar (se hänvisning 9). För omogna honråttor kan foderkonsumtionen på grundval av kroppsvikten vara ungefär dubbelt så stor som hos ovariektomerade unga vuxna honor. För unga vuxna möss kan foderkonsumtionen på grundval av kroppsvikten vara ungefär fyrdubblad som den för ovariektomerade unga vuxna honråttor.

22. Resultat från den uterotrofa bioassayen (se hänvisning 9, 17, 18, 19) visar dock att begränsade mängder fytoöstrogener i fodret är acceptabla och minskar inte bioassayens känslighet. Som en vägledning bör nivåerna av fytoöstrogener i fodret inte överstiga 350 μg genisteinekvivalenter/gram laboratoriefoder för omogna Sprague Dawley- och Wistar-honråttor (se hänvisning 6, 9). Sådant foder bör också vara lämplig vid testning av unga vuxna ovariektomerade råttor, eftersom foderkonsumtionen på basis av kroppsvikten är mindre hos unga vuxna jämfört med omogna djur. Om vuxna ovariektomerade möss eller mer fytoöstrogenkänsliga råttor används, måste en proportionell minskning av fytoöstrogennivåerna i fodret övervägas (se hänvisning 20). Dessutom kan skillnader i tillgänglig metabolisk energi för olika typer av föda leda till tidsförskjutning av pubertetsdebuten (se hänvisning 21, 22).

23. Ett noggrant val av foder utan förhöjda nivåer av fytoöstrogener (för vägledning, se hänvisning 6, 9) eller omsättbar energi, som kan påverka resultaten (se hänvisning 15, 17, 19, 22, 36), krävs före studien. Att säkerställa ett korrekt utförande av det testsystem som används på laboratoriet enligt punkterna 26 och 27 är en viktig kontroll av båda dessa faktorer. Som en säkerhetsåtgärd enligt god laboratoriesed (GLP) bör representativ provtagning av varje parti av foder som tillförs under studien utföras för eventuell analys av fytoöstrogeninnehållet (t.ex. vid hög livmoderkontrollvikt i förhållande till historiska kontroller, eller en otillräcklig respons på referensöstrogen, 17-alfa-etinylestradiol). Alikvoter ska analyseras som en del av studien eller frysas vid – 20 °C eller på sådant sätt att provet inte bryts ned i väntan på analys.

24. Vissa strömaterial kan innehålla naturligt förekommande östrogena eller antiöstrogena kemikalier (t.ex. är majskolvar kända för att påverka cykliciteten hos råttor och förefaller vara antiöstrogena). Det valda ströet bör ha en minimal halt av fytoöstrogener.

Förberedelse av djuren

25. Försöksdjur utan tecken på sjukdom eller fysiska abnormiteter väljs slumpmässigt ut för placering i kontroll- och behandlingsgrupperna. Burarna bör placeras så att eventuella effekter beroende på placering blir så små som möjligt. Djuren bör identifieras unikt. Helst bör omogna djur placeras i bur tillsammans med moderdjur eller fostermoderdjur fram till avvänjningen under acklimatiseringen. Acklimatiseringsperioden före studiens start bör vara ca 5 dagar för unga vuxna djur och omogna djur som levererats tillsammans med moderdjur eller fostermoderdjur. Om omogna djur erhålls som avvanda utan moderdjur kan det vara nödvändigt att förkorta acklimatiseringsperioden eftersom doseringen bör inledas omedelbart efter avvänjningen (se punkt 29).

FÖRFARANDE

Kvalifikationsprövning av laboratorium

26. Två olika alternativ kan användas för att kvalitetspröva laboratorier:

— Återkommande kontroller eller förlita sig på en inledande positiv grundkontrollstudie (se punkt 27). Minst var 6:e månad och varje gång det sker en förändring som kan påverka utförandet av testet (t.ex. en ny beredning av foder, byte av personal som utför dissektioner, förändringar av djurstam eller leverantör, etc.), bör känsligheten hos testsystemet (djurmodell) verifieras med en lämplig dos (baserat på den inledande positiva grundkontrollstudien beskriven i punkt 27) av ett referensöstrogen: 17a-etinylestradiol (CAS-nr 57-63-6) (EE).

— Användning av jämsides behandlade kontroller genom att inkludera en grupp som tillförs en lämplig dos av referensöstrogen i varje test.

Om systemet inte svarar som förväntat bör försöksbetingelserna granskas och ändras i enlighet därmed. Det rekommenderas att dosen av referensöstrogen som används i båda fallen bör vara ungefär ED 70 till 80.

27. Positiv grundkontrollstudie – Innan ett laboratorium genomför en undersökning enligt denna testmetod för första gången bör laboratoriets kompetens visas i ett test av djurmodellens respons genom fastställande av dosresponsen för ett referensöstrogen: 17a-etinylestradiol (CAS-nr 57-63-6) (EE) med minst fyra doser. Livmoderviktsresponsen kommer att jämföras med etablerade historiska data (se hänvisning 5). Om denna positiva grundkontrollstudie inte ger förväntade resultat bör försöksbetingelserna granskas och ändras.

Djurens antal och skick

28. Varje behandlad grupp och kontrollgrupp bör innehålla minst 6 djur (protokoll för både immatur- och OVX-adultmetod).

Ålder på omogna djur

29. För den uterotrofa bioassayen med omogna djur måste födelsedatum anges. Doseringen bör starta tillräckligt tidigt för att säkerställa, i slutet av tillförseln av testkemikalien, att den fysiologiska ökningen av endogena östrogener som sammanhänger med puberteten ännu inte har ägt rum. Å andra sidan finns det belägg för att mycket unga djur kan vara mindre känsliga. För att definiera optimal ålder bör varje laboratorium ta sina egna bakgrundsdata om mognad i beaktande.

Som en allmän vägledning kan doseringen av råttor påbörjas omedelbart efter tidig avvänjning på postnatal dag 18 (postnatal dag 0 är födelsedatum). Doseringen av råttor bör helst vara avslutad på postnatal dag 21 men i alla händelser före postnatal dag 25, eftersom hypotalamus-hypofys-ovarie-axeln blir funktionell efter den åldern och endogena östrogennivåer kan börja stiga vilket leder till en ökning av referensmedelvärden för livmodervikt och gruppens standardavvikelser (se hänvisning 2, 3, 10, 11, 12).

Förfarande för ovariektomi

30. För ovariektomerad honråtta och honmus (behandlings- och kontrollgrupper) bör ovariektomin ske mellan 6 och 8 veckors ålder. För råttor bör minst 14 dagar förflyta mellan ovariektomin och den första dagen för tillförseln så att livmodern går i regress till en minimal, stabil referensnivå. För möss bör åtminstone 7 dagar förflyta mellan ovariektomin och tillförselns första dag. Eftersom små mängder av äggstocksvävnad är tillräckliga för att ge betydande cirkulerande nivåer av östrogen (se hänvisning 3), bör djuren testas före användningen genom att prov av epitelceller från vagina observeras minst fem dagar i följd (t.ex. dag 10–14 efter ovariektomin för råttor). Om djuren visar tecken på brunst bör de inte användas. Vid obduktionen bör äggstocksresterna undersökas avseende eventuella tecken på äggstocksvävnad. Om så är fallet bör djuret inte tas med i beräkningarna (se hänvisning 3).

31. Ovariektomiproceduren inleds med djuret placerat i ventral halvliggande ställning, efter att djuret har blivit ordentligt bedövat. Snittet som öppnar den dorsolaterala bukväggen bör vara ca 1 cm på längden vid mittpunkten mellan revbensbroskets undre kant och höftbenskammen, och några millimeter i sidled fram till den laterala kanten på ryggmuskeln. Äggstockarna bör tas ut ur bukhålan till ett aseptiskt underlag. Äggstockarna bör lossas vid förbindelsen mellan äggledaren och livmodern. Efter att ha bekräftat att ingen massiv blödning sker, bör bukväggen tillslutas med en sutur och huden tillslutas med autoclips eller lämplig sutur. Ligaturpunkterna visas schematiskt i figur 1. Lämplig postoperativ smärtlindring bör användas i enlighet med rekommendationer från en veterinär med erfarenhet av gnagarvård.

Kroppsvikt

32. För OVX-adultmetoden är kroppsvikt och livmodervikt inte korrelerade eftersom livmodervikten påverkas av hormoner som östrogen, men inte av tillväxtfaktorer som reglerar kroppsstorleken. Däremot är kroppsvikten relaterad till livmoderns vikt i immaturmodellen, samtidigt som den mognar (se hänvisning 34). Således bör, vid början av studien, viktskillnaden mellan djuren som används i immaturmodellen vara minimal och inte överstiga ± 20 % av medelvikten. Detta innebär att uppfödaren bör standardisera kullstorleken, för att säkerställa att avkomman från olika moderdjur kommer att matas ungefär likadant. Djuren bör anvisas till grupper (både kontroll- och behandlingsgrupper) genom slumpmässig viktfördelning, så att medelvärdet för kroppsvikten i varje grupp inte statistiskt skiljer sig åt från andra grupper. Man bör överväga att undvika anvisning av kullsyskon till samma behandlingsgrupp, så vitt det är möjligt, utan att öka antalet kullar som ska användas för undersökningen.

Dosering

33. För att fastställa huruvida en testkemikalie kan ha östrogen aktivitet in vivo är normalt två dosgrupper och en kontrollgrupp tillräckliga, och denna utformning är därför att föredra av djurskyddsskäl. Om syftet är att antingen erhålla en dos-responskurva eller att extrapolera till lägre doser, behövs minst 3 dosgrupper. Om information utöver identifiering av östrogen aktivitet (t.ex. en uppskattning av potens) krävs, bör ett annat doseringsschema övervägas. Med undantag av behandlingen med testkemikalien bör djuren i kontrollgruppen hanteras på exakt samma sätt som i testgruppen. Om en vehikel används för tillförsel av testkemikalien bör kontrollgruppen tillföras samma mängd vehikel som används i de behandlade grupperna (eller den största volym som används i testgrupperna om detta skiljer sig åt mellan grupperna).

34. Målet för den uterotrofa bioassayen är att välja doser som garanterar djurens överlevnad och som inte orsakar signifikant toxicitet eller lidande hos djuren, efter tre dagar i följd med tillförsel av kemikalien upp till en maximal dos på 1 000 mg/kg/dag. Alla dosnivåer bör väljas med hänsyn till eventuella toxicitetsdata och (toxiko-)kinetiska data som finns tillgängliga om testkemikalien eller närbesläktade ämnen. Den högsta dosen bör ta hänsyn till LD 50 och/eller information om akut toxicitet för att undvika dödsfall, svår smärta och lidande hos djuren (se hänvisning 24, 25, 26). Den högsta dosen bör motsvara maximal tolererbar dos (MTD). En studie som genomförs vid en dosnivå som framkallar en positiv uterotrof respons accepteras också. Som en screening är breda intervall (t.ex. halva logenheter som motsvarar en dosprogression på 3,2 eller till och med upp till en logenhet) mellan doseringarna i allmänhet godtagbara. Om det inte finns några lämpliga data tillgängliga kan en dosfinnande studie genomföras som hjälp för att bestämma vilka doser som ska användas.

35. Alternativt, om den östrogena potensen hos en agonist kan uppskattas genom in vitro-data (eller datormodeller) kan dessa beaktas vid valet av dos. Exempelvis kan mängden testkemikalie som skulle framkalla en uterotrof respons som är likvärdig med referensagonisten (etinylestradiol) uppskattas genom dess relativa in vitro-potens jämfört med etinylestradiol. Den högsta testdosen ges genom att multiplicera denna ekvivalentdos med en lämplig faktor, t.ex. 10 eller 100.

Överväganden för dosfinnande studie

36. Vid behov kan en preliminär dosfinnande studie genomföras med några få djur. För detta ändamål kan man använda OECD:s vägledning nr 19 (se hänvisning 25) som definierar kliniska tecken som tyder på toxicitet eller lidande för djuren. Om det är möjligt inom denna dosfinnande studie kan, efter tre dagars tillförsel, livmodern skäras ut och vägas ca 24 timmar efter att sista dosen getts. Dessa data kan sedan användas vid utformning av huvu