KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EEG) nr 2426/90 av den 21 augusti 1990 om ändring av förordning (EEG) nr 1725/79 om bestämmelserna om beviljande av stöd för skummjölk bearbetad till foderblandningar och för skummjölkspulver särskilt avsett som kalvfoder

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DENNA FÖRORDNING

med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekonomiska gemenskapen,

med beaktande av rådets förordning (EEG) nr 804/68 av den 27 juni 1968 om den gemensamma organisationen av marknaden för mjölk och mjölkprodukter(1), senast ändrad genom förordning (EEG) nr 3879/89(2), särskilt artikel 10.3 i denna, och

med beaktande av följande:

I artikel 1.2 a i kommissionens förordning (EEG) nr 1725/79(3), senast ändrad genom förordning (EEG) nr 3368/88(4), fastställs att det skummjölkspulver som avses i artikel 1 måste motsvara de definitioner som ges i artikel 1 i rådets förordning (EEG) 986/68(5), senast ändrad genom förordning (EEG) nr 1115/89(6), och framställas utan tillsatser.

Olovlig tillsättning av vasslepulver i skummjölk som används för framställning av skummjölkspulver eller i själva skummjölkspulvret strider mot de ovannämnda bestämmelserna. I brist på en officiell gemenskapsmetod för att påvisa vasslepulver i skummjölkspulver som kan innehålla kärnmjölkspulver innehåller inte förordning (EEG) nr 1725/79 särskilda regler för påvisande av vasslepulver. Nyligen har en analysmetod utvecklats för påvisande av löpevassle. Det är lämpligt att införa denna metod i ovannämnda förordning.

De åtgärder som föreskrivs i denna förordning är förenliga med yttrandet från Förvaltningskommittén för mjölk och mjölkprodukter.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Förordning (EEG) nr 1725/79 ändras på följande sätt:

1. Följande skall läggas till första stycket i artikel 10.3:

"När dessa kontroller avser skummjölkspulver som skall användas obearbetat eller i form av en blandning, skall frånvaro av löpevasslepulver påvisas med hjälp av förfarandet i bilaga 4."

2. Bilaga 1 A.2 j skall ersättas med följande:

"j) annat och särskilt sur vassle i den utsträckning de nationella myndigheterna kräver att den påvisas."

3. Bilagan till den här förordningen skall läggas till som bilaga 4.

Artikel 2

Denna förordning träder i kraft samma dag som den offentliggörs i Europeiska gemenskapernas officiella tidning.

Den skall tillämpas från och med den 1 mars 1991.

Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla medlemsstater.

Utfärdad i Bryssel den 21 augusti 1990.

På kommissionens vägnar

Ray MAC SHARRY

Ledamot av kommissionen

(1) EGT nr L 148, 28.6.1968, s. 13.

(2) EGT nr L 378, 27.12.1989, s. 1.

(3) EGT nr L 199, 7.8.1979, s. 1.

(4) EGT nr L 296, 29.10.1988, s. 50.

(5) EGT nr L 169, 18.7.1968, s. 4.

(6) EGT nr L 118, 29.4.1989, s. 7.

BILAGA

"BILAGA 4

FASTSTÄLLANDE AV FÖREKOMST AV LÖPEVASSLEPULVER I SKUMMJÖLKSPULVER OCH BLANDNINGAR ENLIGT FÖRORDNING (EEG) nr 1725/79

1. Syfte: Påvisande av tillsatt löpevasslepulver i

a) skummjölkspulver som avses i artikel 1 i förordning (EEG) nr 986/68, och

b) blandningar som definieras i artikel 1.3 i förordning (EEG) nr 1725/79.

2. Hänvisning: Internationell standard ISO 707

Mjölk och mjölkprodukter: - provtagningsmetoder i överensstämmelse med riktlinjerna i punkt 2 c i bilaga 1 till förordning (EEG) nr 625/78.

3. Definition

Halten löpevasslepulver fastställs med den nedan beskrivna metoden, uttryckt i viktprocent.

4. Princip

Fastställande av kvantiteten glykomakropeptid A enligt bilaga 5 till förordning (EEG) nr 625/78. Prov som ger positiva resultat analyseras för glykomakropeptid A genom högtrycksvätskekromatografi med omvänd fas (HPLC-metod). Bedömning av det erhållna resultatet med hänvisning till standardprover som består av skummjölkspulver med eller utan tillsats av en känd procentsats vasslepulver. Resultatet över 1 % (m/m) visar på förekomst av löpevasslepulver.

5. Reagenser

Alla reagenser skall vara av p. a. kvalitet. Det använda vattnet skall vara destillerat vatten eller vatten med minst motsvarande renhetsgrad. Acetonitril skall vara av spektroskopisk kvalitet eller HPLC-kvalitet.

De reagenser som är nödvändiga för metoden i förordning (EEG) nr 625/78 beskrivs i bilaga 5 till den förordningen.

Reagenser till HPLC med omvänd fas.

5.1 Triklorättiksyralösning

Lös 240 g triklorättiksyra (CCl3CCOOH) i vatten och späd till 1 000 ml.

5.2 Elueringslösning A och B

Elueringslösning A: Blanda 150 ml acetonitril (CH3CN), 20 ml isopropanol (CH3CHOHCH3) och 1,00 ml trifluorättiksyra (TFA, CF3COOH) med vatten till 1 000 ml.

Elueringslösning B: Blanda 550 ml acetonitril, 20 ml isopropanol och 1,00 ml TFA med vatten till 1 000 ml.

Före användning skall elueringslösningen filtreras genom filtermembran med pordiameter 0,45 ìm.

5.3 Regenerering av kolonnen

Skölj kolonnen med elueringslösning B (med användning av en gradient) efter analyserna och därefter med acetonitril (med användning av en gradient i 30 minuter). Förvara kolonnen i acetonitril.

5.4 Standardprov

5.4.1 Skummjölkspulver som uppfyller kraven i förordning (EEG) nr 625/78 (dvs. [0]).

5.4.2 Samma skummjölkspulver uppblandat med 5 % (m/m) vasslepulver (löpetyp) med en standardsammansättning (dvs. [5]).

5.4.3 Samma skummjölkspulver uppblandat med 50 % (m/m)vasslepulver (löpetyp) med en standardsammansättning (dvs. [50])(*).

6. Utrustning

Den utrustning som behövs för metoden i förordning (EEG) nr 625/78 beskrivs i bilaga 5 till den förordningen.

6.1 Analysvåg.

6.2 Centrifug med kapacitet för en centrifugalkraft på 2 200 g, utrustad med proppförsedda centrifugrör som rymmer ca 50 ml.

6.3 Mekanisk skakapparat med kapacitet att skaka vid 50 °C.

6.4 Magnetomrörare.

6.5 Glastrattar, diameter ca 7 cm.

6.6 Filtrerpapper, medelfint, diameter ca 12,5 cm.

6.7 Glasfilterutrustning, filtermembran med pordiameter 0,45 ìm.

6.8 Graderade pipetter som medger tillförsel av 10 ml (ISO 648, klass A, eller ISO/R 835), eller ett system som kan tillföra 10,0 ml på två minuter.

6.9 Termostatstyrt vattenbad, inställt på 25 ± 0,5 °C.

6.10 Utrustning för högtrycksvätskekromatografi (HPLC) bestående av:

6.10.1 Binärt gradientpumpsystem.

6.10.2 Injektor, manuell eller automatisk, med kapaciteten 100 ìl.

6.10.3 En Dupont Protein Plus-kolonn (25 x 0,46 cm invändig diameter) eller en motsvarande grovporig kiselbaserad kolonn med omvänd fas.

6.10.4 Termostatstyrd kolonnugn, inställd på 35 ± 1 °C.

6.10.5 UV-detektor, variabel våglängd, som medger mätningar vid 210 nm med känsligheten 0,02 Å (vid behov kan en högre våglängd upp till 220 nm användas).

6.10.6 Integrator som medger integrering av enskilda toppar.

Anmärkning

Man kan använda kolonner vid rumstemperatur förutsatt att rumstemperaturen inte varierar mer än 1 °C. I annat fall uppstår för stor variation i retentionstiden för GMPÅ.

7. Provtagning

7.1 Internationell standard ISO 707 - Provtagningsmetoder för mjölk- och mjölkprodukter enligt riktlinjerna i punkt 2 c i bilaga 1 till förordning (EEG) nr 625/78.

7.2 Proven skall förvaras under förhållanden som förhindrar nedbrytning eller förändring i sammansättningen.

8. Förfarande

8.1 Beredning av proverna

Överför mjölkpulvret till ett kärl som rymmer ungefär dubbelt så stor volym som pulvrets och som är försett med lufttätt lock. Förslut behållaren omedelbart. Blanda mjölkpulvret väl genom att upprepade gånger vända behållaren.

8.2 Provmängd

Väg upp 2,000 ± 0,001 g av testmaterialet i ett centrifugrör (6.2) eller till en lämpligt tillförsluten kolv (50 ml).

8.3 Borttagande av fett och proteiner

8.3.1 Tillsätt 20,0 g varmt vatten (50 °C) till det uppvägda provet. Lös pulvret genom att skaka det i mekanisk skakapparat (6.3) i 5 minuter eller i 30 minuter om det gäller sur kärnmjölk. Ställ röret i vattenbad (6.9) och temperera vid 25 °C.

8.3.2 Tillsätt under två minuter 10,0 ml av den till 25 °C tempererade triklorättiksyralösningen (5.1) under kraftig omröring med magnetomröraren (6.4). Placera röret i vattenbad (6.9) och lämna det i 60 minuter.

(*) Vasslepulver (löpetyp) med standardsammansättning samt uppblandat skummjölkspulver kan fås från NIZO, Kernhemseweg 2, PO Box 20, NL 6710 BA.

Pulver som ger resultat motsvarande NIZO-pulver får också användas.8.3.3 Centrifugera (6.2) i 10 minuter vid 2 200 g eller filtrera genom pappersfilter (6.6) och kasta de första 5 ml av filtratet.

8.4. Kromatografisk analys

8.4.1 Utför HPLC-analysen som beskrivs i förordning (EEG) nr 625/78, bilaga 5. Vid negativt resultat innehåller provet inget löpevasslepulver i påvisbara mängder. Vid positivt resultat skall den HPLC-metod med omvänd fas som beskrivs nedan tillämpas. Förekomsten av pulver från sur kärnmjölk kan ge felaktigt positiva resultat. Genom att använda HPLC-metoden med omvänd fas utesluts denna risk.

8.4.2 Innan HPLC-analysen med omvänd fas utförs bör gradientförhållandena optimeras. En retentionstid på 26 ± 2 minuter för GMPÅ är optimal för gradientsystem med en dödvolym på ca 6 ml (volym från den punkt där lösningarna blandas till och med den punkt där insprutningsslingan slutar). I gradientsystem med lägre dödvolym (t.ex. 2 ml) bör en optimal retentionstid på 22 minuter användas.

Bered lösningar av standardproven (5.4) med och utan 50 % löpevassle.

Injicera 100 ìl av supernatanten eller filtratet (8.3.3) i en HPLC-apparat som arbetar under de kontrollgradientvillkor som anges i tabell 1.

>Plats för tabell>

En jämförelse mellan båda kromatogrammen bör visa GMPA-toppens läge.

Vid användning av nedanstående formel kan den ursprungliga sammansättningen av den lösning som kommer att användas för den normala gradienten (se 8.4.3) beräknas:

% B = 10 - 2,5 + (13,5 + (RTgmpA - 26)/6) 730/27

% B = 7,5 + (13,5 + (RTgmpA 26)/6) 71,11

där:

>Plats för tabell>

8.4.3 Bered lösningar av testproven.

Injicera 100 ìl noggrant uppmätt supernatant eller filtrat (8.3.3) i HPLC-apparaten med en flödeshastighet av 1,0 ml elueringslösning (5.2) per minut.

Elueringslösningens sammansättning i början av analysen fås fram från 8.4.2. Normalt är den nära A:B = 76:24 (5.2). Omedelbart efter insprutningen påbörjas en linjär gradient så att B höjs med 5 % efter 27 minuter. Därefter påbörjas en linjär gradient som höjer eluentsammansättningens andel B till 90 % inom 5 minuter. Sammansättningen bibehålls i 5 minuter varefter den inom 5 minuter ändras tillbaka till den ursprungliga sammansättningen via en linjär gradient. Beroende på pumpsystemets inre volym kan nästa insprutning ske 15 minuter efter det att de ursprungliga förhållandena har uppnåtts.

Anmärkningar

1. Retentionstiden för glykomakropeptid bör vara 26 ± 2 minuter. Detta kan uppnås genom att variera initial- och slutförhållandena för den första gradienten. Skillnaden i % B för initial- och slutförhållandena för den första gradienten måste dock fortfarande vara 5 % B.

2. Elueringslösningarna bör avgasas tillräckligt och bör också förbli avgasade. Detta är viktigt för att gradientpumpsystemet skall kunna arbeta på ett korrekt sätt. Standardavvikelsen för retentionstiden för GMP-toppen bör vara mindre än 0,1 minuter (n=10).

3. Efter vart femte prov bör referensprovet [5] injiceras och användas för att beräkna en ny kalibreringsfaktor R (9.1.1).

8.4.4 Resultaten av den kromatografiska analysen av provet [E] erhålls i form av kromatogram där GMP-toppen identifieras genom sin retentionstid på 26 minuter.

Integratorn (6.10.6) beräknar automatiskt GMP-toppens höjd H. Baslinjens läge bör kontrolleras i varje kromatogram. Analysen eller integrationen bör upprepas om baslinjens läge inte var korrekt.

Det är av största vikt att varje kromatograms utseende undersöks före kvantitativ bestämning för att upptäcka eventuella avvikelser som beror antingen på felfunktion hos apparaten eller kolonnerna, eller på ursprunget och beskaffenheten hos det analyserade provet. Upprepa analysen i händelse av tveksamhet.

8.5 Kalibrering

8.5.1 Tillämpa exakt det förfarande som beskrivs i punkt 8.2 - 8.4.4 på standardproven (5.4.1 - 5.4.2). Använd nyberedda lösningar, eftersom GMP bryts ner i 8 procentig triklorättiksyralösning vid rumstemperatur. Vid 4 °C förblir lösningen stabil i 24 timmar. Vid långa serier av analyser är det önskvärt att en nedkyld provbricka används i autoinjektorn.

Anmärkning

8.4.2 kan utelämnas om % B vid initialförhållandena är känd från tidigare analyser.

Kromatogrammet till referensprovet [5] bör motsvara fig. 1. I denna figur föregås GMPÅ-toppen av två mindre toppar. Det är viktigt att uppnå en liknande separation.

8.5.2 Injicera 100 ìl av standardprovet utan löpevassle [0] (5.4.1) före den kromatografiska analysen av proven. Kromatogrammet bör inte uppvisa någon topp vid GMPÅ-toppens retentionstid.

8.5.3 Fastställ kalibreringsfaktorerna R genom att injicera filtrat (8.5.1) i samma mängd som för proven.

9. Resultatangivelse

9.1 Beräkningsmetod och formler

9.1.1 Beräkning av kalibreringsfaktorn R:

GMP-topp = W/H

där

>Plats för tabell>

9.2 Beräkning av procentsatsen löpevasslepulver i provet

W[E] = R x H[E]

där

>Plats för tabell>

Om W[E] är större än 1 % och skillnaden mellan retentionstiden och standardprovets [5] retentionstid är mindre än 0,2 minuter, innehåller provet löpevasslepulver.

9.3 Metodens noggrannhet9.3.1 Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten av två analyser som samtidigt eller med kort tidsintervall utförts av samma person med användning av samma utrustning på identiskt lika prover får inte överstiga 0,2 % m/m.

9.3.2 Reproducerbarhet

Ännu inte fastlagd.

9.3.3 Linjäritet

För mellan 0 och 16 % löpevasslehalt bör ett linjärt förhållande uppnås med en korrelationskoefficient som är > 0,99.

9.4 Tolkning

9.4.1 Vassle anses förekomma om resultatet enligt 9.2 är större än 1 % m/m och retentionstiden för GMP-toppen avviker mindre än 0,2 minuter från standardprovets [5] retentionstid. Gränsen på 1 % är fastlagd i enlighet med bestämmelserna i bilaga 5 till förordning (EEG) nr 625/78, punkterna 9.2 och 9.4.1."

>Start Grafik>

Absorbans (220 nm)

>Slut Grafik>

>Hänvisning till >