KOMMISSIONENS TREDJE DIREKTIV av den 27 april 1972 om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen (72/199/EEG)

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIV

med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekonomiska gemenskapen,

med beaktande av rådets direktiv av den 20 juli 1970(1) om införande av gemenskapsmetoder för provtagning och analys vid den officiella foderkontrollen, särskilt artikel 2 i detta, och

med beaktande av följande:

I det nämnda direktivet krävs att den officiella foderkontrollen skall utföras med gemenskapsmetoder för provtagning och analys i syfte att kontrollera att produkterna uppfyller de krav som framgår av bestämmelser i lagar och andra författningar som gäller foders kvalitet och sammansättning.

I kommissionens direktiv 71/250/EEG(2) av den 15 juni 1971 och 71/393/EEG(3) av den 18 november 1971 har redan ett antal gemenskapsmetoder för analys fastställts. Mot bakgrund av den utveckling som därefter skett bör en tredje metodsamling antas.

De åtgärder som beslutas om i detta direktiv är förenliga med Ständiga foderkommitténs yttrande.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Medlemsstaterna skall kräva att analyser vid den officiella foderkontrollen skall utföras med de metoder som beskrivs i bilaga 1 till detta direktiv då det gäller halter av stärkelse, råprotein, råprotein som är lösligt i pepsin och saltsyra, fri och total gossypol samt pepsinaktivitet.

De allmänna bestämmelser som anges i del 1 (Inledning) av bilagan till kommissionens första direktiv 71/250/EEG av den 15 juni 1971 om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen skall tillämpas på de metoder som beskrivs i bilaga 1 till det här direktivet.

Artikel 2

Medlemsstaterna skall kräva att analyser vid den officiella foderkontrollen skall utföras med de metoder som beskrivs i bilaga 2 till detta direktiv då det gäller att upptäcka och identifiera antibiotika av tetracyklingruppen samt även vid bestämning av halter av klortetracyklin, oxytetracyklin, tetracyklin, oleandomycin, tylosin och virginiamycin i foder.

De allmänna bestämmelser som anges i del 1 (Inledning) av bilagan till kommissionens första direktiv 71/250/EEG av den 15 juni 1971, med undantag av sådana som gäller beredning av provet för analys, skall tillämpas på de metoder som beskrivs i bilaga 2 till det här direktivet.

Artikel 3

Medlemsstaterna skall senast den 1 juli 1973 sätta i kraft de lagar och andra författningar som är nödvändiga för att följa detta direktiv. De skall genast underrätta kommissionen om detta.

Artikel 4

Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.

Utfärdat i Bryssel den 27 april 1972.

På kommissionens vägnar

S. L. MANSHOLT

Ordförande

(1) EGT nr L 170, 3.8.1970, s. 2.

(2) EGT nr L 155, 12.7.1971, s. 13.

(3) EGT nr L 279, 20.12.1971, s. 7.

BILAGA 1

1. BESTÄMNING AV STÄRKELSE

Polarimetrisk metod

1. Syfte och räckvidd

Med denna metod kan halten av stärkelse samt av nedbrytningsprodukter av stärkelse med hög molekylvikt bestämmas i foder med undantag av sådana foder som innehåller betsnitsel, betmassa, torkad betblast eller torkade betblad, potatismos, vattenfri jäst, inulinrika produkter (t.ex. snitsel och mjöl av jordärtskockor) eller fettgrevar.

2. Princip

Metoden omfattar två bestämningar. I den första behandlas det varma provet med utspädd saltsyra. Efter klarning och filtrering mäts lösningens optiska rotation polarimetriskt.

I den andra extraheras provet med 40-procentig etanol. Efter att filtratet surgjorts med saltsyra, klarats och filtrerats mäts den optiska rotationen på samma sätt som vid den första bestämningen.

Genom att multiplicera skillnaden mellan de båda mätningarna med en känd faktor erhålls provets stärkelsehalt.

3. Reagens

3.1 25-procentig (vikt/vikt) saltsyra, d: 1,126

3.2 1,128-procentig (vikt/volym) saltsyra

Koncentrationen måste kontrolleras genom titrering med natriumhydroxidlösning 0,1 M och 0,1-procentigt metylrött (vikt/volym) i 94-procentig etanol (volym/volym). 10 ml = 30,94 ml NaOH 0,1 M.

3.3 Carrez-lösning I: lös upp 21,9 g zinkacetat Zn(CH3COO)2 7 2H2O och 3 g isättika i vatten. Fyll på vatten till 100 ml.

3.4 Carrez-lösning II: lös upp 10,6 g kaliumferrocyanid K4 [Fe (CN)6] 7 3H2O i vatten. Fyll på vatten till 100 ml.

3.5 40-procentig etanol (volym/volym), d: 0,948 vid 20°C.

4. Utrustning

4.1 250 ml Erlenmayerkolv med standardkoppling av matterat glas och återloppskylare

4.2 Polarimeter eller sackarimeter

5. Utförande

5.1 Beredning av provet

Krossa provet tills det är tillräckligt finfördelat för att helt kunna passera genom ett såll med 0,5 mm runda maskor.

5.2 Bestämning av den totala optiska rotationen (P eller S) (se anmärkning 7.1)

Väg upp 2,5 g av det krossade provet med 1 mg noggrannhet och placera det i en 100 ml mätkolv. Tillsätt 25 ml saltsyra (3.2), skaka om så att provet fördelas jämnt och tillsätt ytterligare 25 ml saltsyra (3.2). Sänk ned kolven i kokande vattenbad under kraftig och jämn omskakning under de tre första minuterna för att förhindra agglomeratbildning. Vattenbadet måste innehålla så mycket vatten att det förblir vid kokpunkten då kolven sänks ned i det. Kolven får inte tas upp ur vattenbadet vid omskakningen. Ta upp kolven ur vattenbadet efter exakt 15 minuter, tillsätt 30 ml kallt vatten och kyl omedelbart till 20°C.

Tillsätt 5 ml Carrez-lösning I (3.3) och skaka om under en minut. Tillsätt därefter 5 ml Carrez-lösning II (3.4) och skaka på nytt om under en minut. Fyll på vatten till full volym, homogenisera och filtrera. Om filtratet inte är fullständigt klart (vilket är sällsynt) upprepas bestämningen med en större kvantitet Carrez-lösning I och II, till exempel 10 ml.

Mät lösningens optiska rotation i ett 200 mm rör med polarimetern eller sackarimetern.

5.3 Bestämning av den optiska rotationen (P'm eller S'm) hos ämnen som är lösliga i 40-procentig etanol

Väg upp 5 g av provet med 1 mg noggrannhet, placera det i en 100 ml mätkolv och tillsätt cirka 80 ml etanol (3.5) (se anmärkning 7.2). Låt kolven stå en timme i rumstemperatur och skaka under denna tid om kraftigt vid sex tillfällen så att provet blandas väl med etanolen. Fyll på etanol (3.5) till full volym, homogenisera och filtrera.

Flytta med pipett 50 ml av filtratet (= 2,5 g av provet) till en 250 ml Erlenmayerkolv, tillsätt 2,1 ml saltsyra (3.1) och skaka om kraftigt. Anslut en återloppskylare till Erlenmayerkolven som därefter sänks ned i kokande vattenbad. Ta efter exakt 15 minuter upp Erlenmayerkolven ur vattenbadet, flytta innehållet till en 100 ml mätkolv (skölj med litet kallt vatten) och kyl ned till 20°C.

Klargör med Carrez-lösning I (3.3) och II (3.4), fyll på vatten till full volym, homogenisera, filtrera och mät den optiska rotationen på det sätt som anges i 5.2 andra och tredje styckena.

6. Resultatberäkning

Stärkelsehalten uttryckt i procent av provet beräknas på följande sätt:

6.1 Polarimetrisk mätning

Procent stärkelse = >NUM>2000 (P-P')>DEN>[á]D20°

där:

P = den totala optiska rotationen i grader

P' = optisk rotation i grader för ämnen som är lösliga i 40-procentig etanol

[á]D20° = ren stärkelses specifika optiska rotation. De konventionellt accepterade värdena för denna faktor är:

+ 185,9°: risstärkelse

+ 195,4°: potatisstärkelse

+ 184,6°: majsstärkelse

+ 182,7°: vetestärkelse

+ 181,5°: kornstärkelse

+ 181,3°: havrestärkelse

+ 184,0°: andra typer av stärkelse och stärkelsemixer i foderblandningar.

6.2 Sackarimetrisk mätning

Procent stärkelse = >NUM>2000>DEN>[á]D20°7 >NUM>(2N 7 0,665) (S-S')>DEN>100 = >NUM>26,6 N (S-S')>DEN>[á]D20°

där:

S = total optisk rotation i sackarimetriska grader

S' = optisk rotation i sackarimetriska grader för ämnen som är lösliga i 40-procentig etanol

N = sackarosvikt i gram i 100 ml vatten som ger en optisk rotation på 100 sackarimetriska grader i ett 200 mm rör. Vikten varierar på följande sätt beroende på vilken typ av sackarimeter som används:

16,29 g för franska sackarimetrar,

26,00 g för tyska sackarimetrar,

20,00 g för övriga sackarimetrar.

[á]D20° = ren stärkelses specifika optiska rotation (se 6.1)

6.3 Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga 0,4, absolutvärde, om stärkelsehalten är under 40 % och 1 %, relativvärde, om stärkelsehalten är 40 % eller högre.

7. Anmärkningar

7.1 Om provet innehåller mer än 6 % karbonater, beräknat som kalciumkarbonat, måste dessa avlägsnas genom behandling med den exakt beräknade mängd utspädd svavelsyra som krävs, innan den totala optiska rotationen bestäms.

7.2 Då det gäller produkter med hög laktoshalt, som mjölkserum i pulverform och skummjölkspulver, förfar man på följande sätt efter att 80 ml etanol (3.5) har tillsatts: Anslut en återloppskylare till kolven som nedsänks i 50° C vattenbad under 30 minuter. Låt svalna och fortsätt analysen enligt anvisningarna i 5.3.

2. BESTÄMNING AV RÅPROTEIN

1. Syfte och räckvidd

Med denna metod kan råproteinhalten i foder bestämmas på konventionellt sätt på grundval av kvävehalten som bestäms enligt Kjeldahlmetoden.

2. Princip

Provet bryts ned genom våtförbränning. Den sura lösningen alkaliseras med natriumhydroxidlösning. Den ammoniak som frigörs destilleras av och insamlas i en uppmätt mängd svavelsyra varefter överskottet svavelsyra titreras med natriumhydroxidlösning.

3. Reagens

3.1 Kaliumsulfat pa

3.2 Katalysator: kopparoxid CuO pa eller kristalliserat kopparsulfat CuSO4 7 5H2O pa eller kvicksilver eller kvicksilveroxid HgO pa

3.3 Zinkgranulat pa

3.4 Svavelsyra pa, d: 1,84

3.5 Svavelsyra 0,1 M

3.6 Svavelsyra 0,5 M

3.7 Metylröttindikator: lös upp 300 mg metylrött i 100 ml 95 96-procentig etanol (volym/volym)

3.8 40-procentig natriumhydroxidlösning (vikt/volym)

3.9 Natriumhydroxidlösning 0,1 M

3.10 Natriumhydroxidlösning 0,25 M

3.11 Mättad natriumsulfidlösning pa

3.12 8-procentig natriumtiosulfatlösning (vikt/volym), Na2S2O3 7 5H2O pa

3.13 Pimpstensgranulat som saltsyresköljts och föraskats

4. Utrustning

Apparatur för nedbrytning genom förbränning samt destillering enligt Kjeldahlmetoden (se anmärkning 7.1)

5. Utförande

5.1 Nedbrytning

Väg upp 1 g av provet med 1 mg noggrannhet och placera detta i nedbrytningsapparatens kolv. Tillsätt 10 g kaliumsulfat (3.1), en lämplig mängd katalysator (3.2) (0,3 0,4 g kopparoxid eller 0,9 1,2 g kopparsulfat eller en droppe kvicksilver eller 0,6 0,7 g kvicksilveroxid), 25 ml svavelsyra (3.4) och något pimpstensgranulat (3.13). Homogenisera. Upphetta kolven - först måttligt och under omskakning då och då tills massan har karboniserats och skummet försvunnit, därefter intensivare tills vätskan kommit i konstant kokning. Se till att kolvens väggar inte blir överhettade och att organiska partiklar inte fastnar på dem. När lösningen har blivit klar och färglös (eller ljusgrön om en kopparbaserad katalysator används) fortsätts kokningen under en timme, varefter lösningen får svalna.

5.2 Destillering

Tillsätt försiktigt 250 350 ml vatten under ständig omrörning så att sulfaterna löses upp fullständigt. Låt svalna. Tillsätt något zinkgranulat (3.3).

Tillför, efter att mängden mätts upp exakt, 25 ml svavelsyra 0,1 M (3.5) eller 0,5 M (3.6), beroende på den antagna kvävehalten (se anmärkning 7.2), till destilleringsapparatens uppsamlingskolv samt tillsätt några droppar metylröttindikator (3.7).

Förbind kolven med destilleringsapparatens kylare och sänk ned kylarens slutstycke minst 1 cm (se anmärkning 7.3) i vätskan i uppsamlingskolven. Häll långsamt 100 ml 40-procentig natriumhydroxidlösning (3.8) i kolven genom dropptratten. Om en kvicksilverbaserad katalysator används, tillsätts också antingen 10 ml natriumsulfidlösning (3.11) eller 25 ml natriumtiosulfatlösning (3.12).

Upphetta kolven så att cirka 150 ml vätska destilleras på 30 minuter. Kontrollera mot slutet av denna tid det erhållna destillatets pH med lackmuspapper. Om reaktionen är basisk fortsätts destilleringen. Avbryt när destillatet är neutralt på lackmuspapper. Under destilleringen skall färgreaktionen iakttas och innehållet i kolven skakas om då och då. Om vätskan blir gul tillsätts omedelbart en exakt uppmätt volym svavelsyra 0,1 M (3.5) eller 0,5 M (3.6).

5.3 Titrering

Överskottet svavelsyra titreras i uppsamlingskolven med natriumhydroxidlösning 0,1 M (3.9) eller 0,25 M (3.10), beroende på vilken koncentration av svavelsyra som använts, tills färgen blir blekgul.

5.4 Verifiering av metoden

För att fastställa om reagensen är fria från kväve utförs ett blankprov (destillering och titrering) med uteslutande av analysprovet. För kontroll av metodens tillförlitlighet utförs analysen (nedbrytning, destillering och titrering) på 1,5 2,0 g acetanilid pa (smältpunkt 114°C; % N: 10,36) med tillsats av 1 g kvävefri sackaros. 1 g acetanilid förbrukar 14,80 ml svavelsyra 0,5 M.

6. Resultatberäkning

Fastställ hur stor volym svavelsyra som förbrukats. 1 ml svavelsyra 0,1 M motsvarar 1,4 mg kväve. Multiplicera kvävemängden med faktorn 6,25. Uttryck resultatet i procent av provet.

Repeterbarhet

Skillnaden mellan två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga:

- 0,2, absolutvärde, för råproteinhalter under 20 %,

- 1,0 %, relativvärde, för halter på lägst 20 % och högst 40 %,

- 0,4, absolutvärde, för halter över 40 %.

7. Anmärkningar

7.1 Apparattyper som kräver att materialet flyttas mellan nedbrytning och destillering får användas. Om sådana apparater används måste flyttningen ske utan förlust av material.

7.2 Då det gäller produkter med låg kvävehalt kan volymen svavelsyra 0,1 M som skall placeras i uppsamlingskolven minskas till 10 15 ml, om så är nödvändigt, varefter vatten fylls på till 25 ml.

7.3 Om destilleringsapparatens kolv inte är försedd med dropptratt, tillsätts natriumhydroxiden omedelbart innan kolven ansluts till kylaren, varvid vätskan skall hällas långsamt längs med kylarens väggar så att den inte blandas med syralösningen.

3. BESTÄMNING AV RÅPROTEIN SOM LÖSES AV PEPSIN OCH SALTSYRA

1. Syfte och räckvidd

Med denna metod kan man fastställa hur stor del råprotein som under vissa definierade förhållanden löses av pepsin och saltsyra. Metoden kan tillämpas på alla foder.

2. Princip

Provet upphettas under 48 timmar vid 40°C i en lösning av pepsin och saltsyra. Suspensionen filtreras och filtratets kvävehalt fastställs enligt metoden för bestämning av råprotein.

3. Reagens

3.1 Saltsyra, d: 1,125

3.2 Saltsyra 0,075 M

3.3 2,0 E/mg pepsin. Pepsinaktiviteten definieras i metodbeskrivningen i del 4 av denna bilaga och måste fastställas enligt denna metod.

3.4 Cirka 0,02-procentig (vikt/volym) nyberedd lösning av pepsin i saltsyra (3.2); aktivitet: 400 E/l

3.5 Skumhämmande emulsion (t.ex. silikon)

3.6 Samtliga reagens som upptas i förteckningen i punkt 3 av metoden för bestämning av råprotein

4. Utrustning

4.1 Vattenbad eller inkubator inställd på 40°C ± 1°C

4.2 Kjeldahlapparatur för nedbrytning och destillering

5. Utförande

5.1 Beredning av lösningen (se anmärkning 7.2)

Väg upp 2 g av provet med 1 mg noggrannhet och placera det i en 500 ml mätkolv. Tillsätt 450 ml lösning av pepsin i saltsyra (3.4) som i förväg upphettats till 40°C och skaka om för att förhindra agglomeratbildning. Kontrollera att suspensionens pH är lägre än 1,7. Placera kolven i vattenbadet eller inkubatorn (4.1) och behåll den där under 48 timmar. Skaka om efter 8, 24 och 32 timmar. Tillsätt efter 48 timmar 15 ml saltsyra (3.1), kyl till 20°C, fyll på vatten till full volym och filtrera.

5.2 Nedbrytning

Ta 250 ml av filtratet och placera det i destilleringsapparatens (4.2) kolv. Tillsätt de reagens som är nödvändiga för nedbrytningen enligt anvisningarna i metoden för bestämning av råprotein (andra meningen i punkt 5.1). Homogenisera och koka upp. Om det bildas skum tillsätts några droppar skumhämmande emulsion (3.5). Låt fortsätta att koka kraftigt tills vattnet har förångats nästan fullständigt. Sänk värmen och avlägsna noggrant de sista resterna av vatten.

När lösningen blivit klar och färglös (eller ljusgrön om en kopparbaserad katalysator används) fortsätts kokningen under ytterligare en timme. Låt svalna.

5.3 Destillering och titrering

Utförs enligt anvisningarna i metoden för bestämning av råprotein (punkt 5.2 och 5.3).

5.4 Blankprov

Utför ett blankprov enligt samma metod men med uteslutande av analysprovet.

6. Resultatberäkning

Subtrahera den volym svavelsyra som förbrukats i blankprovet från den som förbrukats av analysprovet. 1 ml svavelsyra 0,1 M motsvarar 1,4 mg kväve.

Multiplicera kvävemängden med faktorn 6,25. Uttryck resultatet i procent av provet.

Repeterbarhet

Skillnaden mellan två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga:

- 0,4, absolutvärde, för halter under 20 %,

- 2,0 %, relativvärde, för halter på lägst 20 % och högst 40 %,

- 0,8, absolutvärde, för halter över 40 %.

7. Anmärkningar

7.1 De värden som erhålls med denna metod har inget direkt samband med nedbrytbarhet in vivo.

7.2 Produkter med en olje- eller fetthalt över 10 % måste först avfettas genom extraktion med petroleumeter (kokpunkt 40 60°C).

4. BERÄKNING AV PEPSINAKTIVITET

1. Syfte och räckvidd

Med denna metod är det möjligt att fastställa aktiviteten hos det pepsin som används vid bestämning av råprotein som löses av pepsin och saltsyra.

2. Princip

Hemoglobin behandlas med pepsin under definierade förhållanden i ett saltsyremedium. Den del av proteinet som inte hydrolyseras fälls ut i triklorättiksyra. Natriumhydroxid och Folin-Ciocalteureagens tillsätts till filtratet. Den optiska densiteten hos denna lösning mäts vid 750 nm och den motsvarande kvantiteten tyrosin avläses från en kalibreringskurva.

Definition: Definitionen av pepsinenheten är den kvantitet av detta enzym som, under de förutsättningar som gäller för denna metod, per minut frigör en kvantitet hydroxiarylgrupper som, efter att ha färgats av Folin-Ciocalteureagensen, har en optisk densitet som motsvarar den optiska densiteten hos en mikromol tyrosin som färgats på samma sätt.

3. Reagens

3.1 Saltsyra 0,2 M

3.2 Saltsyra 0,06 M

3.3 Saltsyra 0,025 M

3.4 5-procentig triklorättiksyrelösning (vikt/volym)

3.5 Natriumhydroxidlösning 0,5 M

3.6 Folin-Ciocalteureagens. Placera 100 g natriumvolframit (Na2WO4 7 2H2O), 25 g natriummolybdat (Na2MoO4 7 2H2O) och 700 ml vatten i en tvåliters rundbottnad kolv som är försedd med standardanslutning av matterat glas. Tillsätt 50 ml fosforsyra (d: 1,71) och 100 ml koncentrerad saltsyra (d: 1,19), anslut en återloppskylare till kolven, koka upp och låt koka sakta under 10 timmar. Låt svalna, avlägsna återloppskylaren, tillsätt 175 g litiumsulfat (Li2SO4 7 2H2O), 50 ml vatten och 1 ml brom. Koka under 15 minuter för att avlägsna överskottet brom.

Låt svalna, flytta lösningen till en enliters mätkolv, fyll på vatten till full volym, homogenisera och filtrera. Ingen grönaktig färgton får finnas kvar. Späd före användning ut en del reagens med två delar vatten.

3.7 Hemoglobinlösning: Väg upp en mängd hemoglobin (cirka 2 g proteinsubstrat, bestämt enligt Anson) som motsvarar 354 mg kväve(1) och placera detta i en 200 ml kolv som är försedd med standardanslutning av matterat glas. Tillsätt några ml saltsyra (3.2), anslut kolven till vakuumpumpen och skaka om tills hemoglobinet har lösts fullständigt. Frigör vakuumet och tillsätt under omskakning saltsyra (3.2) till 100 ml. Bered denna lösning omedelbart före användandet.

3.8 Standardtyrosinlösning: lös upp 181,2 mg tyrosin i saltsyra (3.1) och fyll på med samma syra till 1 liter (lagerhållen lösning). Ta 20,0 ml av denna lösning och späd med saltsyra (3.1) till 100 ml. 1 ml av denna lösning innehåller 0,2 mikromol tyrosin.

4. Utrustning

4.1 Vattenbad inställt på 25°C ± 0,1°C med ultratermostat

4.2 Spektrofotometer

4.3 Kronometer, högsta avvikelse: 1 sekund

4.4 pH-mätare

5. Utförande

5.1 Beredning av lösningen (se anmärkning 7.1)

Lös upp 150 mg pepsin i 100 ml saltsyra (3.2). Överför med pipett 2 ml av lösningen till en 50 ml mätkolv och fyll på saltsyra (3.3) till full volym. pH-mätaren måste visa ett värde på 1,6 ± 0,1. Sänk ned kolven i vattenbadet (4.1).

5.2 Hydrolys

Överför med pipett 5,0 ml hemoglobinlösning (3.7) till ett provrör, upphetta till 25°C i vattenbadet (4.1), tillsätt 1,0 ml av den pepsinlösning som erhållits enligt punkt 5.1 och blanda med hjälp av en glasstav som är tjockare i ena ändan med cirka 10 pendelrörelser. Lämna provröret i vattenbadet vid 25°C under exakt 10 minuter, räknat från den tid då pepsinlösningen tillsattes (tidslängd och temperatur måste iakttas noggrant). Tillsätt därefter 10,0 ml triklorättiksyrelösning (3.4) som i förväg upphettats till 25°C, homogenisera och filtrera genom ett torrt filter.

5.3 Färgutveckling och mätning av optisk densitet

Överför med pipett 5,0 ml av filtratet till en 50 ml Erlenmayerkolv, tillsätt 10,0 ml natriumhydroxidlösning (3.5) samt, under ständig omskakning, 3,0 ml utspätt Folin-Ciocalteureagens (3.6). Bestäm efter 5 10 minuter lösningens optiska densitet mot vatten med spektrofotometer vid 750 nm i celler som är 1 cm tjocka.

5.4 Blankprov

Utför vid varje bestämning ett blankprov enligt följande:

Överför med pipett 5,0 ml hemoglobinlösning (3.7) till ett provrör, upphetta till 25°C i vattenbadet (4.1), tillsätt 10,0 ml triklorättiksyrelösning (3.4) som i förväg upphettats till 25°C, homogenisera och tillsätt därefter 1,0 ml av den pepsinlösning som erhållits enligt punkt 5.1. Blanda med en glasstav och lämna provröret i vattenbadet (4.1) vid 25°C under exakt 10 minuter. Homogenisera och filtrera genom ett torrt filter. Fortsätt enligt punkt 5.3.

5.5 Kalibreringskurva

I 50 ml Erlenmayerkolvar placeras provmängder på 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 och 5,0 ml standardtyrosinlösning (3.8), motsvarande 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 respektive 1,0 mikromol tyrosin. Komplettera serien med en tyrosinfri referenslösning. Fyll på saltsyra (3.1) till 5,0 ml. Tillsätt 10,0 ml natriumhydroxidlösning (3.5) samt, under ständig omskakning, 3,0 ml utspätt Folin-Ciocalteureagens (3.6). Mät den optiska densiteten på det sätt som anges i punkt 5.3 sista meningen. Rita kalibreringskurvan genom att föra in värdena för optisk densitet vid respektive kvantitet tyrosin.

6. Resultatberäkning

Avläs från kalibreringskurvan den kvantitet tyrosin i mikromol som motsvarar den färgade lösningens optiska densitet efter korrigering med blankvärdet.

Pepsinaktiviteten i mikromol hos tyrosin vid 25°C, per mg och minut, beräknas med följande formel:

Enheter per mg (E/mg) = >NUM>0,32 a>DEN>p

där:

a = kvantitet tyrosin i mikromol avläst från kalibreringskurvan

p = vikt i mg av det pepsin som tillsatts enligt punkt 5.2

7. Anmärkningar

7.1 Den kvantitet pepsin som skall lösas upp måste vara sådan att en optisk densitet av 0,35 ± 0,035 erhålls vid den slutliga fotometriska mätningen.

7.2 Två enheter per mg enligt denna metod motsvarar:

3,64 Anson-millienheter/mg (mikromol tyrosin/mg/min vid 35,5°C), eller36 400 handelsenheter/g (mikromol tyrosin/g/10 min vid 35,5°C).

5. BESTÄMNING AV FRI OCH TOTAL GOSSYPOL

1. Syfte och räckvidd

Med denna metod kan halter av fri gossypol, total gossypol och kemiskt besläktade ämnen bestämmas i bomullsfrö, bomullsfrömjöl och bomullsfrökakor samt i foderblandningar som innehåller sådana ämnen, om halterna överstiger 20 ppm.

2. Princip

Gossypolen extraheras under närvaro av 3-aminopropan-1-ol, antingen med en blandning av propan2-ol och hexan (vid bestämning av fri gossypol) eller med dimetylformamid (vid bestämning av total gossypol). Gossypolen omvandlas med anilin till gossypol-dianilin och detta ämnes optiska densitet mäts vid 440 nm.

3. Reagens

3.1 Propan-2-ol/hexanblandning: blanda 60 (volym)delar propan-2-ol pa med 40 delar n-hexan.

3.2 Lösningsmedel A: placera i en enliters mätkolv cirka 500 ml propan-2-ol/hexanblandning (3.1), 2 ml 3-aminopropan-1-ol, 8 ml isättika och 50 ml vatten. Fyll på med propan-2-ol/hexanblandningen (3.1) till full volym. Detta reagens är hållbart i en vecka.

3.3 Lösningsmedel B: Överför med pipett 2 ml 3-aminopropan-1-ol och 10 ml isättiksyra till en 100 ml mätkolv. Kyl till rumstemperatur och fyll på N,N-dimetylformamid till full volym. Detta reagens är hållbart i en vecka.

3.4 Anilin pa: Om den optiska densiteten vid blankprovet överstiger 0,022, destilleras anilinet över zinkpulver och de första och sista tio procenten av destillatet avlägsnas. Om detta reagens kylförvaras i en brun, proppförsluten glaskolv är det hållbart i flera månader.

3.5 Standardgossypollösning A: placera 27,9 mg gossypolacetat i en 250 ml mätkolv. Lös upp och fyll på till full volym med lösningsmedel A (3.2). Överför med pipett 50 ml av denna lösning till en 250 ml mätkolv och fyll på lösningsmedel A till full volym. Gossypolhalten i denna lösning är 0,02 mg per ml. Låt lösningen stå en timme i rumstemperatur innan den används.

3.6 Standardgossypollösning B: placera 27,9 mg gossypolacetat i en 50 ml mätkolv. Lös upp och fyll på till full volym med lösningsmedel B (3.3). Gossypolhalten i denna lösning är 0,5 mg per ml.

Standardgossypollösningarna A och B förblir stabila under 24 timmar om de skyddas från ljus.

4. Utrustning

4.1 Blandare (tumlare): cirka 35 varv per minut

4.2 Spektrofotometer

5. Utförande

5.1 Testprov

Hur stor mängd som skall användas för testprovet beror på den antagna gossypolhalten hos provet. Det är fördelaktigt att arbeta med ett litet testprov och en relativt stor analysmängd av filtratet så att en så stor mängd gossypol erhålls att en exakt fotometrisk mätning blir möjlig. Vid bestämning av fri gossypol i bomullsfrö, bomullsfrömjöl och bomullsfrökakor bör testprovet inte väga mer än 1 g; då det gäller foderblandningar kan det gå upp till 5 g. I de flesta fall är det lämpligt att analysmängden uppgår till 10 ml; den bör innehålla 50 100 µg gossypol. Vid bestämning av total gossypol bör testprovet väga mella 0,5 och 5 g så att 2 ml av filtratet innehåller 40 200 µg gossypol.

Analysen skall utföras vid rumstemperatur, d.v.s. cirka 20°C.

5.2 Bestämning av fri gossypol

Placera testprovet i en 250 ml kolv med hals av matterat glas efter att kolvens botten täckts med krossat glas. Tillsätt med pipett 50 ml lösningsmedel A (3.2), tillslut kolven och blanda under en timme i blandaren. Filtrera genom torrt filter och samla upp filtratet i en liten kolv med hals av matterat glas. Täck under filtreringen tratten med klockglas. Överför med pipett identiska analysmängder av filtratet med en gossypolhalt av 50 100 µg till två 25 ml mätkolvar (A och B). Fyll, om så är nödvändigt, på lösningsmedel A (3.2) upp till 10 ml. Fyll därefter på innehållet i kolv A upp till full volym med propan-2-ol/hexanblandningen (3.1). Denna lösning skall användas som referenslösning för mätvärdena av provlösningen.

Överför med pipett 10 ml lösningsmedel A (3.2) till två andra 25 ml mätkolvar (C och D). Fyll på innehållet i kolv C till full volym med propan-2-ol/hexanblandningen (3.1). Denna lösning skall användas som referenslösning för mätvärdena av blankprovslösningen.

Tillsätt 2 ml anilin (3.4) till kolvarna D och B. Upphetta under 30 minuter över kokande vattenbad så att färgen framträder. Kyl till rumstemperatur, fyll på propan-2-ol/hexanblandning (3.1) till full volym, homogenisera och låt stå under en timme.

Fastställ blankprovlösningens (D) optiska densitet genom jämförelse med referenslösningen (C) samt provlösningens (B) optiska densitet genom jämförelse med referenslösningen (A) i spektrofotometern vid 440 nm med 1 cm glasceller.

Subtrahera blankprovlösningens optiska densitet från provlösningens (korrigerad optisk densitet). Beräkna utifrån det erhållna värdet halten fri gossypol enligt anvisningarna i punkt 6.

5.3 Bestämning av total gossypol

Placera ett testprov som innehåller 1 5 mg gossypol i en 50 ml mätkolv och tillsätt 10 ml lösningsmedel B (3.3). Förbered samtidigt ett blankprov genom att fylla 10 ml lösningsmedel B (3.3) i en annan 50 ml mätkolv. Upphetta de två kolvarna under 30 minuter över kokande vattenbad. Kyl till rumstemperatur och fyll på innehållet i de båda kolvarna till full volym med propan-2-ol/hexanlösningen (3.1). Homogenisera och låt sedimentera under 10 15 minuter; filtrera därefter och samla upp filtraten i kolvar med halsar av matterat glas.

Överför med pipett 2 ml av provfiltratet till var och en av två 25 ml mätkolvar samt 2 ml av blankprovsfiltratet till var och en av två andra 25 ml kolvar. Fyll på innehållet i den ena kolven i varje par till 25 ml med propan-2-ol/hexanblandningen (3.1). Dessa lösningar skall användas som referenslösningar.

Tillsätt 2 ml anilin (3.4) till var och en av de båda andra kolvarna. Upphetta under 30 minuter över kokande vattenbad så att färgen framträder. Kyl till rumstemperatur, fyll på propan2-ol/hexanblandning (3.1) till 25 ml, homogenisera och låt stå under en timme.

Bestäm den optiska densiteten enligt anvisningarna i punkt 5.2 för fri gossypol. Beräkna utifrån det erhållna värdet halten total gossypol enligt anvisningarna i punkt 6.

6. Resultatberäkning

Resultaten kan beräknas antingen utifrån den specifika optiska densiteten (6.1) eller med utnyttjande av en kalibreringskurva (6.2).

6.1 Utifrån specifik optisk densitet

De specifika optiska densiteterna är under de angivna förutsättningarna:

fri gossypol: E >NUM>1 %>DEN>1 cm = 625

total gossypol: E >NUM>1 % >DEN>1 cm = 600

Provets halt fri eller total gossypol beräknas med följande formel:

% gossypol = >NUM>E 7 1250 >DEN>E >NUM>1 % >DEN>1 cm 7 p 7 a

där:

E = korrigerad optisk densitet, bestämd enligt anvisningarna i punkt 5.2,

p = testprovets vikt i g,

a = analysmängd filtrat i ml.

6.2 Utifrån kalibreringskurva

6.2.1 Fri gossypol

Förbered två serier om vardera fem 25 ml mätkolvar. Överför med pipett mängder på 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 och 10,0 ml standardgossypollösning A (3.5) till vardera av de båda serierna. Fyll på lösningsmedel A (3.2) till 10 ml. Komplettera varje serie med en 25 ml mätkolv som endast innehåller 10 ml lösningsmedel A (3.2) (blankprov).

Fyll på propan-2-ol/hexanblandning (3.1) till 25 ml i kolvarna i den första serien (även i den kolv som är avsedd för blankprovet) (referensserie).

Tillsätt 2 ml anilin (3.4) till varje kolv i den andra serien (även den kolv som är avsedd för blankprovet). Upphetta under 30 minuter över kokande vattenbad så att färgen framträder. Kyl till rumstemperatur, fyll på propan-2-ol/hexanblandning (3.1) till full volym, homogenisera och låt stå under en timme (standardserie).

Bestäm, enligt anvisningarna i punkt 5.2, den optiska densiteten hos lösningarna i standardserien genom jämförelse med motsvarande lösningar i referensserien. Rita kalibreringskurvan genom att föra in de optiska densiteterna vid motsvarande kvantitet gossypol (i µg).

6.2.2 Total gossypol

Förbered sex 50 ml mätkolvar. I den första kolven placeras 10 ml lösningsmedel B (3.3) och i de övriga 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 respektive 10,0 ml standardgossypollösning B (3.6). Fyll på lösningsmedel B (3.3) upp till 10 ml i varje kolv. Upphetta under 30 minuter över kokande vattenbad. Kyl till rumstemperatur, fyll på propan-2-ol/hexanblandning (3.1) till full volym och homogenisera.

Placera 2,0 ml av dessa lösningar vardera i två serier om sex 25 ml mätkolvar. Fyll kolvarna i den första serien med propan-2-ol/hexanblandning (3.1) till 25 ml (referensserie).

Tillsätt 2 ml anilin (3.4) till var och en av kolvarna i den andra serien. Upphetta under 30 minuter över kokande vattenbad. Kyl till rumstemperatur, fyll på propan-2-ol/hexanblandning (3.1) till full volym, homogenisera och låt stå under en timme (standardserie).

Bestäm, enligt anvisningarna i punkt 5.2, den optiska densiteten hos lösningarna i standardserien genom jämförelse med motsvarande lösningar i referensserien. Rita kalibreringskurvan genom att föra in de optiska densiteterna vid motsvarande kvantitet gossypol (i µg).

6.3 Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga:

- 15 %, relativvärde, för gossypolhalter under 500 ppm,

- 75 ppm, absolutvärde, för halter på minst 500 ppm och högst 750 ppm,

- 10 %, relativvärde, för halter över 750 ppm.

(1) Bestäm kvävehalten med halvmikro-Kjeldahlmetod (teoretisk halt: 17,7 % kväve).

BILAGA 2

1. PÅVISANDE OCH IDENTIFIERING AV ANTIBIOTIKA AV TETRACYKLINGRUPPEN

1. Syfte och räckvidd

Med denna metod är det möjligt att påvisa och identifiera antibiotika av tetracyklingruppen i foder som innehåller lägst 0,1 ppm antibiotika samt i koncentrat och premixer.

2. Princip

Provet extraheras med en blandning av metanol och saltsyra. Extraktet och referenslösningarna undergår stigande papperskromatografi. Antibiotikan påvisas och identifieras genom att dess Rf-värden jämförs med standardsubstansernas, antingen genom fluorescens i UV-ljus (hög halt antibiotika) eller genom bioautografi på ett agarsubstrat som inokulerats med B. cereus.

3. Reagens och odlingssubstrat

3.1 Buffertlösning, pH 3,5

Citronsyremonohydrat pa 10,256 g

Dinatriumvätefosfat Na2HPO4 7 2H2O pa 7,45 g

Aceton pa 300 ml

Destillerat vatten till 1000 ml

3.2 Fosfatbuffertlösning, pH 5,5

Kaliumdivätefosfat KH2PO4 pa 130,86 g

Dinatriumvätefosfat Na2HPO4 7 2H2O pa 6,947 g

Destillerat vatten till 1000 ml

3.3 Eluant I: blandning av ren nitrometan/ren kloroform/1,3-diklorpropan-2-ol; volymproportion: 20/10/1,5; bereds omedelbart före användning

3.4 Eluant II: blandning av ren nitrometan/ren kloroform/2-pikolin; volymproportion: 20/10/3; bereds omedelbart före användning

3.5 Blandning ren metanol/saltsyra (d: 1,19): volymproportion 98/2

3.6 Saltsyra 0,1 M

3.7 Ammoniak, d: 0,91

3.8 Standardsubstanser: klortetracyklin, oxytetracyklin, tetracyklin, vilkas aktivitet uttrycks som väteklorid

3.9 Mikroorganism: B. cereus ATCC nr 11 778

Underhåll av parentalstammen, beredning av sporsuspensionen och inokulering av odlingssubstratet: följ instruktionerna i punkt 3.1 och 3.2 i den metod för bestämning av klortetracyklin-, oxytetracyklin- och tetracyklinhalt genom diffusion på agar som beskrivs i del 2 av denna bilaga.

3.10 Odlingssubstrat(1)

Glukos 1 g

Tryptisk pepton 10 g

Köttextrakt 1,5 g

Jästextrakt 3 g

Agar 20 g

Destillerat vatten till 1000 ml

Justera pH-värdet till 5,8 omedelbart före användning.

3.11 0,1-procentig (vikt/volym) 2,3,5-trifenyltetrazoliumkloridlösning och 5-procentig (vikt/volym) glukoslösning.

4. Utrustning

4.1 Apparatur för stigande papperskromatografi (pappershöjd: 25 cm); Schleicher och Schüllpapper (2040b eller 2043b) eller motsvarande

4.2 Centrifug

4.3 Inkubator inställd på 30°C

4.4 UV-lampa för påvisande av fluorescens

4.5 Glasplattor, cirka 20 x 30 cm, för bioautografi

5. Standardlösningar

5.1 Lagerhållna lösningar

Bered med saltsyra (3.6) lösningar av standardsubstanserna (3.8) med koncentrationer motsvarande 500 µg per ml av klortetracyklin-HCl, oxytetracyklin-HCl respektive tetracyklin-HCl.

5.2 Referenslösningar för påvisande genom UV-ljus

Späd ut lösningarna (5.1) med fosfatbuffertlösning (3.2) för att erhålla lösningar med koncentrationer motsvarande 100 µg per ml av klortetracyklin-HCl, oxytetracyklin-HCl och tetracyklinHCl.

5.3 Referenslösningar för påvisande genom bioautografi

Späd ut lösningarna (5.1) med fosfatbuffertlösning (3.2) för att erhålla lösningar med koncentrationer motsvarande 5 µg per ml av klortetracyklin-HCl, oxytetracyklin-HCl och tetracyklinHCl.

6. Extraktion

Om den antagna antibiotikahalten är lägre än 10 ppm kan antingen det homogeniserade provet eller den finaste delen som avskilts vid siktningen användas, eftersom antibiotikan huvudsakligen påträffas i denna del.

Slamma provet i blandningen (3.5) och centrifugera. Samla upp dekanteringsvätskan (supernatanten) och använd den antingen i ursprungligt skick eller, om så är nödvändigt, utspädd med blandningen (3.5) så att antibiotikahalterna blir cirka 100 µg per ml (6.1) och 5 µg per ml (6.2).

7. Påvisande och identifiering

7.1 Kromatografi

Dränk in papperet med buffertlösningen, pH 3,5 (3.1). Avlägsna överskottsvätskan genom att pressa papperet mellan torra ark filtrerpapper. Placera därefter volymer på 0,01 ml av referens lösningarna (5.2 och 5.3) och extraktet (6.1 och 6.2) på papperet. För att uppnå en god separering är det nödvändigt att papperet har korrekt vätskehalt; därför bör man låta det torka en tid om så är nödvändigt.

Framkalla genom stigande kromatografi. Använd eluant I (3.3) för påvisande genom bioautografi och eluant II (3.4) för påvisande genom UV-ljus. När lösningsmedlets kant har stigit 15 20 cm (cirka 1 timme och 30 minuter) avbryts kromatografin och papperet torkas.

7.2 Påvisande genom UV-ljus

Om antibiotikahalten överstiger 1 µg per cm² kommer, efter att kromatogrammet har behandlats med ammoniakångor, guldgula fläckar att framträda vid bestrålning under UV-lampan (4.4).

7.3 Påvisande genom bioautografi

Häll odlingssubstratet (3.10), som i förväg inokulerats med B. cereus (3.9), på glasplattor (4.5) och placera papperet i odlingssubstratet. Efter fem minuters kontakt med substratet avlägsnas papperet och placeras på en annan plats i odlingssubstratet där det sedan förblir under inkubationsperioden. Inkubera därefter över natten vid 30°C. Om något antibiotikum av tetracyklingruppen finns i provet framträder ljushämningszoner i det grumliga odlingssubstratet.

För att fixera kromatogrammet förångas lösningen (3.11) på papperet efter inkubering.

7.4 Identifiering

De relativa Rf-värdena för antibiotika av tetracyklingruppen anges nedan. Dessa värden kan variera något beroende på papperets kvalitet och vätskehalt.

Klortetracyklin (CTC) 0,60

Tetracyklin (TC) 0,40

Oxytetracyklin (OTC) 0,20

4-epi-CTC 0,15

4-epi-TC 0,13

4-epi-OTC 0,10

Den antibiotiska aktiviteten är lägre hos "epi"-föreningar än hos normala föreningar.

2. BESTÄMNING AV KLORTETRACYKLIN, OXYTETRACYKLIN OCH TETRACYKLIN

A. GENOM AGARDIFFUSION

1. Syfte och omfattning

Med denna metod kan halter av klortetracyklin (CTC), oxytetracyklin (OTC) och tetracyklin (TC) bestämmas i foder, koncentrat och premixer, om de överstiger 5 ppm. Halter under 5 ppm kan bestämmas med grafisk interpolation.

2. Princip

Då det gäller halter på 50 ppm eller lägre extraheras provet med utspädd formamid. Om halterna överstiger 50 ppm extraheras provet med en blandning av aceton, vatten och saltsyra vid bestämning av CTC och med en blandning av metanol och saltsyra vid bestämning av OTC och TC.

Därefter späds extrakten ut och deras antibiotiska aktivitet bestäms genom att man mäter CTC:s, OTC:s eller TC:s diffusion på ett agarsubstrat som tillförts B. cereus. Diffusionen påvisas genom att hämningszoner bildas vid förekomst av mikroorganismen. Dessa zoners diameter är direkt proportionell till logaritmen på den antibiotiska koncentrationen.

3. Mikroorganism: B. cereus, ATCC nr 11 778

3.1 Underhåll av parentalstammen

Inokulera B. cereus i ett rör med snedagar som tagits från ett odlingssubstrat (4.1), som är fritt från metylenblått och borsyra. Inkubera över natten vid cirka 30°C. Förvara odlingen i kylskåp och inokulera snedagar på nytt med den var fjortonde dag.

3.2 Beredning av sporsuspensionen

Samla in bakterierna från ett rör snedagar (3.1) med 2 3 ml fysiologisk koksaltlösning (4.5). Tillför denna suspension till en Rouxkolv som innehåller 300 ml odlingssubstrat (4.1) fritt från metylenblått och borsyra och med en agarkoncentration av 3 4 %. Inkubera under 3 5 dagar vid 28 30°C och samla därefter in sporerna i 15 ml etanol (4.6), efter att sporbildning kontrollerats i mikroskop, samt homogenisera. Denna suspension är hållbar minst 5 månader i kylskåp.

Fastställ genom förberedande prov på plattor med bassubstratet för bestämningen (4.1) vilken kvantitet av inokulatet som, vid de olika antibiotikakoncentrationer som används, ger största möjliga hämningszoner som fortfarande är tydliga. Vanligtvis ligger denna kvantitet mellan 0,2 och 0,3 ml per 1 000 ml. Odlingssubstratet inokuleras vid en temperatur av mellan 50 och 60°C.

4. Odlingssubstrat och reagens

4.1 Bassubstrat för bestämningen(2)

Glukos 1 g

Tryptisk pepton 10 g

Köttextrakt 1,5 g

Jästextrakt 3 g

Agar (beroende på kvalitet) 10 20 g

"Tween 80" 1ml

Fosfatbuffertlösning, pH 5,5 (4.2) 10 ml

5-procentig borsyrelösning (vikt/volym) 15 ml

0.5-procentig lösning av metylenblått

i etanol 4 ml

Destillerat vatten till 1000 ml

Justera pH-värdet till 5,8 omedelbart före användning.4.2 Fosfatbuffertlösning, pH 5,5

Kaliumdivätefosfat KH2PO4 pa 130,86 g

Dinatriumvätefosfat Na2HPO4 7 2H2O pa 6,947 g

Destillerat vatten till 1000 ml

4.3 Fosfatbuffertlösning, pH 5,5, utspädd 1/10

4.4 Fosfatbuffertlösning, pH 8

Kaliumdivätefosfat KH2PO4 pa 1,407 g

Dinatriumvätefosfat Na2HPO4 7 2H2O pa 57,539 g

Destillerat vatten till 1000 ml

4.5 Steril fysiologisk koksaltlösning.

4.6 20-procentig etanol (volym/volym).

4.7 Saltsyra 0,1 M

4.8 70-procentig formamid (volym/volym): nybereds före användning; pH-värdet justeras till 4,5 med svavelsyra, cirka 2 M.

4.9 Blandning av ren aceton/vatten/saltsyra (d: 1,19) i volymsproportionerna 65/33/2.

4.10 Blandning av ren metanol/saltsyra (d: 1,19) i volymsproportionerna 98/2.

4.11 Standardsubstanser: CTC, OTC, TC. Dessas aktivitet uttrycks som väteklorid.

5. Standardlösningar

5.1 Klortetracyklin

Bered en lösning som skall hållas i lager med en koncentration motsvarande 500 µg per ml klortetracyklin-HCl genom att tillsätta saltsyra (4.7) till standardlösningen (4.11). Denna lösning är hållbar en vecka i kylskåp.

Av denna utgångslösning bereds en standardarbetslösning S8 med en koncentration motsvarande 0,2 µg per ml klortetracyklin-HCl. Utspädning sker med fosfatbuffertlösningen, pH 5,5, utspädd 1/10 (4.3), med tillsats av 0,01 % amidsvart(3).

Bered därefter genom successiv utspädning (1+1) med buffertlösningen (4.3) följande koncentrationer:

S4 0,1 µg/ml

S2 0,05 µg/ml

S1 0,025 µg/ml

5.2 Oxytetracyklin

Bered, enligt anvisningarna i 5.1, av en utgångslösning med en koncentration motsvarande 400 µg per ml oxytetracyklin-HCl en standardarbetslösning S8 som innehåller 1,6 µg oxytetracyklinHCl per ml samt följande koncentrationer:

S4 0,8 µg/ml

S2 0,4 µg/ml

S1 0,2 µg/ml

5.3 Tetracyklin

Bered, enligt anvisningarna i 5.1, av en utgångslösning med en koncentration motsvarande 500 µg per ml tetracyklin-HCl en standardarbetslösning S8 som innehåller 1,0 µg tetracyklin-HCl per ml samt följande koncentrationer:

S4 0,5 µg/ml

S2 0,25 µg/ml

S1 0,125 µg/ml

6. Extraktion

6.1 Halter på högst 50 ppm

Tillsätt formamid (4.8) till analysprovet i de kvantiteter som anges i nedanstående tabell. Skaka om på platta under 30 minuter. Späd därefter omedelbart ut med fosfatbuffertlösning (4.3) enligt nedanstående tabell så att koncentrationen U8 erhålls. Denna lösnings formamidkoncentration får inte överstiga 40 %.

Centrifugera eller dekantera så att lösningen blir klar. Bered därefter koncentrationerna U4, U2 och U1 genom successiv utspädning (1+1) med fosfatbuffertlösningen (4.3).

>Plats för tabell>

6.2 Halter över 50 ppm

6.2.1 Klortetracyklin

Tillsätt till ett analysprov på 2 10 g (beroende på provets antagna halt av antibiotika eller tillverkarens garanti) blandning (4.9) i proportionen 20 gånger provets volym. Skaka om på platta under 30 minuter. Under extraktionen måste pH-värdet konstant ligga under 3; justera, om så är nödvändigt, till pH 3 med 10-procentig ättiksyra för mineralblandningar. Ta en del av extraktet för analys och justera pH-värdet till 5,5 med fosfatbuffertlösning, pH 8 (4.4) och tillsätt samtidigt bromkresolgrönt (som växlar färg från gult till blått). Späd ut med fosfatbuffertlösning, pH 5,5, utspädd 1/10 (4.3) så att koncentrationen U8 uppnås (se 6.1).

Förbered sedan koncentrationerna U4, U2 och U1 genom successiva utspädningar (1 : 1) med fosfatbuffertlösning (4.3).

6.2.2 Oxytetracyklin och tetracyklin

Följ anvisningarna i punkt 6.2.1, men använd blandning (4.10) i stället för blandning (4.9).

7. Bestämningsmetod

7.1 Inokulering av odlingssubstratet

Inokulera bassubstratet för bestämningen (4.1) i sporsuspensionen (3.2) vid 50 60°C.

7.2 Preparering av brickorna

Diffusion på agar utförs på brickor med fyra koncentrationer av standardlösningen (S8, S4, S2, S1) och fyra koncentrationer av extraktet (U8, U4, U2, U1). Samtliga fyra koncentrationer extrakt och standardlösning måste placeras på varje bricka.

Välj därför brickor med en yta som tillåter att minst åtta hål, 10 13 mm i diameter, görs i agarsubstratet. Beräkna vilken kvantitet inokulerat odlingssubstrat (7.1) som krävs för att täcka brickorna med ett jämnt, cirka 2 mm tjockt lager. Försöket bör helst utföras på brickor av planglas som är försedda med en helt jämn aluminium- eller plastring, 200 mm i diameter och 20 mm hög.

Fyll med pipett noggrant uppmätta kvantiteter antibiotikalösning, mellan 0,10 och 0,15 ml beroende på hålens diameter.

Upprepa för varje prov diffusionen minst fyra gånger med varje koncentration så att en utvärdering av 32 hämningszoner ingår i varje bestämning.

7.3 Inkubation

Inkubera brickorna under cirka 18 timmar vid 28 30°C.

8. Utvärdering

Mät hämningszonernas diameter, helst genom projektion. För in mätvärdena på semilogaritmiskt papper så att logaritmen på koncentrationerna förs in vid hämningszonernas diameter. Rita linjerna för standardlösningen respektive extraktet. Förutsatt att ingen interferens förekommer skall de båda linjerna vara parallella.

Logaritmen på den relativa aktiviteten beräknas med följande formel:

>NUM>(U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8) 7 0,602 >DEN>U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2

Reell aktivitet = antagen aktivitet × relativ aktivitet

9. Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga 10 % relativvärde.

B. GENOM TURBIDIMETRI

1. Syfte och räckvidd

Denna metod gör det möjligt att bestämma halter av klortetracyklin (CTC), oxytetracyklin (OTC) och tetracyklin (TC) i högre koncentrationer än 1 g per kg, förutsatt att ingen påverkan sker från andra substanser som grumlar extrakten. Denna metod är snabbare än agardiffusion.

2. Princip

Provet extraheras vid bestämning av CTC med en blandning av aceton, vatten och saltsyra och vid bestämning av OTC och TC med en blandning av metanol och saltsyra.

Därefter späds extrakten ut och deras antibiotiska verkan bestäms genom mätning av ljustransmissionen hos ett odlingssubstrat som har ympats med Staphylococcus aureus och tillsatts den antibiotiska substansen. Ljustransmissionen beror på antibiotikakoncentrationen.

3. Mikroorganism: Staphylococcus aureus K 141(4)

3.1 Underhåll av parentalstammen

Inokulera S. aureus i ett provrör med snedagar som tagits från odlingssubstratet (4.1) och som tillsatts 1,5 till 3 % agar (beroende på kvaliteten). Inkubera över natten vid 37°C. Förvara odlingen i kylskåp och inokulera den på nytt med snedagar var fjärde vecka. Förbered samtidigt delodlingar för laboratoriebruk.

3.2 Beredning av inokulatet24 timmar före användning inokuleras snedagar på nytt i en delodling och inkuberas över natten vid 37°C. Slamma hela den odling som finns i ett agarrör i cirka 2 ml bassubstrat (4.1) och överför därefter suspensionen sterilt till cirka 100 ml av samma bassubstrat (4.1). Inkubera i vattenbad vid 37°C tills stammens tillväxt går in i sin logaritmiska fas (1'n 2 timmar).

4. Odlingssubstrat och reagens

4.1 Bassubstrat för bestämning(5)Pepton 5 g

Jästextrakt 1,5 g

Köttextrakt 1,5 g

Natriumklorid 3,5 g

Glukos 1,0 g

Kaliumdivätefosfat KH2PO4 pa 1,32 g

diKaliumvätefosfat K2HPO4 pa 3,68 g

Destillerat vatten till 1 000 ml

pH efter sterilisering: 6,8 7,0

4.2 Fosfatbuffertlösning, pH 4,5

Kaliumdivätefosfat KH2PO4 pa 13,6 g

Destillerat vatten till 1 000 ml

4.3 Saltsyra 0,1 M

4.4 Blandning rent aceton/vatten/saltsyra (d: 1,19) i volymsproportionerna 65/33/2

4.5 Blandning ren metanol/saltsyra (d: 1,19) i volymsproportionerna 98/2

4.6 Cirka 10-procentig (vikt/volym) formaldehydlösning

4.7 Standardsubstanser: CTC, OTC, TC, vilkas aktivitet uttrycks som väteklorid.

5. Standardlösning

Bered genom tillsats av saltsyra (4.3) till standardsubstansen (4.7) en lösning som hålls i lager med en koncentration motsvarande 400 500 µg/ml CTC/HCl, OTC/HCl eller TC/HCl. I kylskåp är denna lösning hållbar i en vecka.

6. Extraktion

6.1 Klortetracyklin

Placera 1 2 g av provet i en 200 eller 250 ml mätkolv. Tillsätt cirka 100 ml av blandningen (4.4) och skaka om under 30 minuter på en platta. Fyll på fosfatbuffertlösning, pH 4,5 (4.2) till full volym. Homogenisera och låt sedimentera.

6.2 Oxytetracyklin och tetracyklin

Placera 1 2 g av provet i en 200 eller 250 ml mätkolv. Tillsätt cirka 100 ml av blandningen (4.5) och skaka om under 30 minuter på en platta. Fyll på fosfatbuffertlösning, pH 4,5 (4.2) till full volym. Homogenisera och låt sedimentera.

7. Bestämningsmetod

7.1 Beredning av standardserien och extraktet

Späd ut standardlösningen (5) och extraktet (6) med fosfatbuffertlösningen, pH 4,5 (4.2) så att en serie koncentrationer erhålls. Vid varje bestämning ritas en kalibreringskurva för respektive koncentration så att åtminstone två värden för extraktet kan interpoleras. Utspädningsgraderna väljs beroende på stammens växtförhållanden som kan variera mellan olika laboratorier. Vanligtvis används följande metod:

7.1.1 Klortetracyklin

Späd ut standardlösningen (5) med fosfatbuffertlösningen (4.2) så att en standardarbetslösning erhålls med en koncentration motsvarande 0,2 µg/ml CTC/HCl. Gör därefter i ordning provrör med sex utspädningsgrader, var och en i dubbel uppsättning, genom att späda med fosfatbuffertlösningen (4.2) enligt följande:

>Plats för tabell>

Späd ut extraktet (6.1) med fosfatbuffertlösningen (4.2) så att en antagen CTC/HClkoncentration av 0,12 µg/ml erhålls. Placera 1 ml vardera av denna lösning i två provrör och 0,75 ml (= 0,09 µg) vardera i två andra provrör. Fyll på fosfatbuffertlösning (4.2) till 1 ml i de två senare provrören.

7.1.2 Oxytetracyklin och tetracyklin

Späd ut standardlösningen (5) med fosfatbuffertlösningen (4.2) så att en standardarbetslösning erhålls med en koncentration motsvarande 0,6 µg/ml OTC/HCl eller TC/HCl. Gör därefter i ordning provrör med sju utspädningsgrader, var och en i dubbel uppsättning, genom att späda med fosfatbuffertlösningen (4.2) enligt följande:

>Plats för tabell>

Späd ut extraktet (6.2) med fosfatbuffertlösningen (4.2) så att en antagen OTC/HCl- eller TC/HCl-koncentration av 0,48 µg/ml erhålls. Placera 1 ml vardera av denna lösning i två provrör och 0,5 ml (= 0,24 µg) vardera i två andra provrör. Fyll på fosfatbuffertlösning (4.2) till 1 ml i de två senare provrören.

7.2 Inokulering av odlingssubstratet

Inokulera bassubstratet för bestämningen (4.1) med inokulatet (3.2) så att, med fotometer vid 590 nm, 85 % ljustransmission erhålls i en 5 cm cell, respektive 92 % i en 2 cm cell, efter att apparaturen ställts in på 100 % transmission på det ej inokulerade bassubstratet (4.1).

7.3 Ympning

Placera 9 ml av det inokulerade odlingssubstratet (7.2) i varje provrör (7.1.1 eller 7.1.2). Vid ifyllningen måste utrustningen vara ren men inte nödvändigtvis steriliserad.

7.4 Inkubation

Inkubationen måste utföras i ett vattenbad som hela tiden håller 37°C ± 0,1°C under omrörning. Inkubationsperioden (vanligtvis 2∝ 3 timmar) måste vara så lång att det blir möjligt att rita transmissionskurvor med gradienter som tillåter noggrann uppmätning. Stoppa därefter den fortsatta tillväxten genom att snabbt injicera 1 ml formaldehydlösning (4.6) i varje provrör.

7.5 Mätning av tillväxten

Mät transmissionerna med fotometer vid 590 nm, varvid apparaturen ställs in på 100 % transmission på den klaraste standardlösningen (vilket innebär den högsta antibiotikahalten). Eftersom skillnaderna i grumlighet mellan de olika provrören blir mycket små bör celler på minst 2 cm (helst 5 cm) användas.

8. Resultatberäkning

Rita kalibreringskurvan på millimeterpapper genom att föra in de fotometriska transmissionerna vid respektive antibiotikakoncentrationer. Interpolera extraktets transmissionsvärden på kurvan. Beräkna provets antibiotikahalt.

9. Repeterbarhet

Skillnaden mellan två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga 10 %, relativvärde.

3. BESTÄMNING AV OLEANDOMYCIN

- genom agardiffusion -

1. Syfte och räckvidd

Med denna metod kan, också då tetracykliner förekommer i provet, oleandomycinhalter över 0,5 ppm bestämmas i foder, koncentrat och premixer.

2. Princip

Provet extraheras med en lösning av tri(hydroxymetylamino)metan i utspädd metanol. Efter centrifugering späds extraktet ut och dess antibiotiska verkan bestäms genom mätning av oleandomycinets diffusion i ett agarsubstrat som ympats med B. cereus. Diffusionen påvisas genom att mikroorganismen orsakar att det bildas hämningszoner. Dessa zoners diameter är direkt proportionell till logaritmen på antibiotikakoncentrationen.

3. Mikroorganism: B. cereus K 250 TR(6) (resistent mot tetracykliner)

3.1 Underhåll av parentalstammen

Inokulera B. cereus i ett provrör med snedagar som tagits från odlingssubstratet (4.1) till vilket 100 µg per 5 ml oxytetracyklin har tillsatts. Inkubera över natten vid cirka 30°C. Förvara odlingen i kylskåp och inokulera snedagar på nytt var fjärde vecka.

3.2 Beredning av sporsuspensionen

Samla in bakterierna från ett provrör med snedagar (3.1) med cirka 3 ml fysiologisk koksaltlösning (4.3). Ympa med denna suspension en Rouxkolv som innehåller 300 ml odlingssubstrat (4.1) med en agarkoncentration av 3 4 %. Inkubera under 3 5 dagar vid 28 30°C och samla därefter upp sporerna i 15 ml etanol (4.4), efter att sporbildningen kontrollerats i mikroskop, och homogenisera. Denna suspension är hållbar minst fem månader i kylskåp.

Fastställ genom förberedande prov på plattor med bassubstratet för bestämningen (4.1) vilken kvantitet av inokulatet som, vid de olika koncentrationer av oleandomycin som används, ger största möjliga hämningszoner som fortfarande är tydliga. Vanligtvis ligger kvantiteten mellan 0,1 och 0,2 ml per 1 000 ml. Odlingssubstratet inokuleras vid 60°C.

4. Odlingssubstrat och reagens

4.1 Bassubstrat för underhåll av parentalstammen(7)Glukos 1 g

Tryptisk pepton 10 g

Köttextrakt 1,5 g

Jästextrakt 3 g

Agar (beroende på kvalitet) 10 20 g

Destillerat vatten till 1000 ml

Justera pH-värdet till 6,5 omedelbart före användning.

4.2 Bassubstrat för bestämningen(8)

Substratet (4.1) med pH justerat till 8,8

4.3 Steril fysiologisk koksaltlösning

4.4 20-procentig etanol (volym/volym)

4.5 Ren metanol

4.6 0,5-procentig tri(hydroxymetylamino)metanlösning pa (vikt/volym)

4.7 Extraktionslösning

Ren metanol 50 ml

Destillerat vatten 50 ml

Tri(hydroxymetylamino)metan pa 0,5 g

4.8 Standardsubstans: oleandomycin med känd aktivitet

5. Standardlösning

Lös upp en del av standardsubstansen (4.8) i 5 ml metanol (4.5) och späd med lösningen (4.6) så att en oleandomycinkoncentration av 100 µg/ml erhålls.

Av denna utgångslösning bereds en standardarbetslösning S8 som innehåller 0,1 µg/ml oleandomycin genom utspädning med lösningen (4.6). Bered därefter genom successiv utspädning (1 : 1) med lösningen (4.6) följande koncentrationer:

S4 0,05 µg/ml

S2 0,025 µg/ml

S1 0,0125 µg/ml

6. Extraktion

Ta 2 10 g av provet, beroende på dess antagna oleandomycinhalt, tillsätt 100 ml lösning (4.7) och skaka om under 30 minuter på en platta.

Centrifugera, ta en del av extraktet och späd ut med lösningen (4.6) så att en antagen oleandomycinkoncentration av 0,1 µg/ml (U8) erhålls. Bered därefter koncentrationerna U4, U2 och U1 genom successiva utspädningar (1 : 1) med lösningen (4.6).

7. Bestämningsmetod

7.1 Inokulering av odlingssubstratet

Inokulera bassubstratet för bestämningen (4.2) i sporsuspensionen (3.2) vid 60°C.

7.2 Preparering av brickorna

Diffusion på agar utförs på brickor med fyra koncentrationer av standardlösningen (S8, S4, S2, S1) och fyra koncentrationer av extraktet (U8, U4, U2, U1). Samtliga fyra koncentrationer standardlösning och extrakt måste placeras på varje bricka.

Välj därför brickor med en yta som tillåter att minst åtta hål, 10 13 mm i diameter, görs i agarsubstratet. Beräkna vilken kvantitet inokulerat odlingssubstrat (7.1) som krävs för att täcka brickorna med ett jämnt, cirka 2 mm tjockt lager. Försöket bör helst utföras på brickor av planglas som är försedda med en helt jämn aluminium- eller plastring, 200 mm i diameter och 20 mm hög.

Fyll med pipett noggrant uppmätta kvantiteter antibiotikalösning, mellan 0,10 och 0,15 ml beroende på hålens diameter.

Upprepa för varje prov diffusionen minst fyra gånger med varje koncentration så att en utvärdering av 32 hämningszoner ingår i varje bestämning.

7.3 Inkubation

Inkubera brickorna under cirka 18 timmar vid 28 30°C.

8. Utvärdering

Mät hämningszonernas diameter, helst genom projektion. För in mätvärdena på semilogaritmiskt papper så att logaritmen på koncentrationerna förs in vid hämningszonernas diameter. Rita linjerna för standardlösningen respektive extraktet. Förutsatt att ingen interferens förekommer skall de båda linjerna vara parallella.

Logaritmen på den relativa aktiviteten beräknas med följande formel:

>NUM>(U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8) 7 0,602 >DEN>U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2

Reell aktivitet = antagen aktivitet × relativ aktivitet

9. Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga 10 % relativvärde.

4. BESTÄMNING AV TYLOSIN

- genom agardiffusion -

1. Syfte och räckvidd

Med denna metod kan tylosinhalter över 2 ppm bestämmas i foder, koncentrat och premixer.

2. Princip

Provet behandlas med en pH 8 fosfatbuffertlösning som i förväg upphettats till 80°C och sedan extraherats med metanol. Efter centrifugering späds extraktet ut och dess antibiotiska verkan bestäms genom mätning av tylosinets diffusion i ett agarsubstrat som ympats med Sarcina lutea. Diffusionen påvisas genom att mikroorganismen orsakar att det bildas hämningszoner. Dessa zoners diameter är direkt proportionell till logaritmen på antibiotikakoncentrationen.

3. Mikroorganism: Sarcina lutea ATCC nr 9341

3.1 Underhåll av parentalstammen

Inokulera Sarcina lutea i ett provrör med snedagar som tagits från odlingssubstratet (4.1) och justera pH-värdet till 7,0. Inkubera över natten vid cirka 35°C. Förvara odlingen i kylskåp och inokulera snedagar på nytt varje månad.

3.2 Beredning av bakteriesuspensionen

Samla in bakterierna från ett nyberett provrör med snedagar (3.1) med 2 3 ml fysiologisk koksaltlösning (4.4). Ympa med denna suspension en Rouxkolv som innehåller 250 ml odlingssubstrat (4.1) vars pH-värde justerats till 7,0. Inkubera under 24 timmar vid 35°C och samla därefter upp bakterierna i 25 ml fysiologisk koksaltlösning (4.4). Homogenisera och späd ut suspensionen så att ljustransmissionen blir cirka 75 % vid 650 nm.

Denna suspension kan användas under en vecka om den förvaras i kylskåp.

Fastställ genom förberedande prov på plattor med bassubstratet för bestämningen (4.1) vilken kvantitet av inokulatet som, vid de olika koncentrationer av tylosin som används, ger största möjliga hämningszoner som fortfarande är tydliga. Odlingssubstratet inokuleras vid 48 50°C.

4. Odlingssubstrat och reagens

4.1 Bassubstrat för bestämningen(9)

Glukos 1 g

Tryptisk pepton 10 g

Köttextrakt 1,5 g

Jästextrakt 3 g

Agar (beroende på kvalitet) 10 20 g

Destillerat vatten till 1000 ml

Justera omedelbart före användning pH-värdet till 7,0 vid underhållet av parentalstammen och beredningen av bakteriesuspensionen samt till 8,0 vid bestämningen.

4.2 Fosfatbuffertlösning, pH 8

Kaliumdivätefosfat KH2PO4 pa 0,523 g

diKaliumvätefosfat K2HPO4 pa 16,730 g

Destillerat vatten till 1000 ml

4.3 Fosfatbuffertlösning, pH 7

Kaliumdivätefosfat KH2PO4 pa 5,5 g

diKaliumvätefosfat K2HPO4 pa 13,6 g

Destillerat vatten till 1000 ml

4.4 Steril fysiologisk koksaltlösning

4.5 Ren metanol

4.6 10-procentig metanol (volym/volym)

4.7 Blandning fosfatbuffertlösning (4.2)/ren metanol i volymsproportionerna 60/40

4.8 Standardsubstans: tylosin med känd aktivitet

5. Standardlösningar

Torka standardsubstansen (4.3) i vakuumugn (5 mm kvicksilver) under tre timmar vid 60°C. Väg upp 10 50 mg i mätkolv, lös upp detta i 5 ml metanol (4.5) och späd ut lösningen med fosfatbuffertlösningen, pH 7 (4.3) så att en tylosinbaskoncentration av 1000 µg/ml erhålls.

Av denna utgångslösning bereds en standardarbetslösning S8 som innehåller 2 µg/ml tylosinbas genom utspädning med blandningen (4.7).

Bered därefter genom successiv utspädning (1 : 1) med blandningen (4.7) följande koncentrationer:

S4 1 µg/ml

S2 0,5 µg/ml

S1 0,25 µg/ml

6. Extraktion

Ta, för koncentrat, 10 g av provet och, för premixer och foder, 20 g. Tillsätt 60 ml fosfatbuffertlösning, pH 8 (4.2), som i förväg upphettats till 80°C, och homogenisera under 2 minuter (hushållsmixer, Ultra-turrax o.s.v.).

Låt stå under 10 minuter, tillsätt 40 ml metanol (4.5) och homogenisera under 5 minuter. Centrifugera extraktet och späd ut en del av det med blandningen (4.7) så att en antagen tylosinbaskoncentration av 2 µg/ml (U8) erhålls. Bered därefter koncentrationerna U4, U2 och U1 genom successiva utspädningar (1 : 1) med blandningen (4.7).

Om halterna är mindre än 10 ppm indunstas extraktet tills det är torrt i rotationsindunstare vid 35°C och återstoden löses upp i 40-procentig metanol (4.6).

7. Bestämningsmetod

7.1 Inokulering av odlingssubstratet

Inokulera vid 48 50°C bassubstratet för bestämningen (4.1) justerat till pH 8,0 i bakteriesuspensionen (3.2).

7.2 Preparering av brickorna

Diffusion på agar utförs på brickor med fyra koncentrationer av standardlösningen (S8, S4, S2, S1) och fyra koncentrationer av extraktet (U8, U4, U2, U1). Samtliga fyra koncentrationer standardlösning och extrakt måste placeras på varje bricka.

Välj därför brickor med en yta som tillåter att minst åtta hål, 10 13 mm i diameter, görs i agarsubstratet. Beräkna vilken kvantitet inokulerat odlingssubstrat (7.1) som krävs för att täcka brickorna med ett jämnt, cirka 2 mm tjockt lager. Försöket bör helst utföras på brickor av planglas som är försedda med en helt jämn aluminium- eller plastring, 200 mm i diameter och 20 mm hög.

Fyll med pipett noggrant uppmätta kvantiteter antibiotikalösning, mellan 0,10 och 0,15 ml beroende på hålens diameter.

Upprepa för varje prov diffusionen minst fyra gånger med varje koncentration så att en utvärdering av 32 hämningszoner ingår i varje bestämning.

7.3 Inkubation

Inkubera brickorna över natten vid 35 37°C.

8. Utvärdering

Mät hämningszonernas diameter, helst genom projektion. För in mätvärdena på semilogaritmiskt papper så att logaritmen på koncentrationerna förs in vid hämningszonernas diameter. Rita linjerna för standardlösningen respektive extraktet. Förutsatt att ingen interferens förekommer skall de båda linjerna vara parallella.

Logaritmen på den relativa aktiviteten beräknas med följande formel:

>NUM>(U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8) 7 0,602 >DEN>U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2

Reell aktivitet = antagen aktivitet × relativ aktivitet

9. Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga 10 % relativvärde.

5. BESTÄMNING AV VIRGINIAMYCIN

- genom agardiffusion -

1. Syfte och omfattning

Med denna metod kan virginiamycinhalter över 2 ppm bestämmas i foder, koncentrat och premixer.

2. Princip

Provet behandlas med en "Tween 80"-metanollösning. Efter centrifugering eller filtrering späds extraktet ut och dess antibiotiska verkan bestäms genom mätning av virginiamycinets diffusion i ett agarsubstrat som ympats med Sarcina lutea. Diffusionen påvisas genom att mikroorganismen orsakar att det bildas hämningszoner. Dessa zoners diameter är direkt proportionell till logaritmen på antibiotikakoncentrationen.

3. Mikroorganism: Sarcina lutea ATCC nr 9341

3.1 Underhåll av parentalstammen

Inokulera S. lutea i ett provrör med snedagar som tagits från odlingssubstratet (4.1). Inkubera över natten vid cirka 35°C. Förvara odlingen i kylskåp och inokulera snedagar på nytt var fjortonde dag.

3.2 Beredning av bakteriesuspensionen

Samla in bakterierna från ett nyberett provrör med snedagar (3.1) med 2 3 ml fysiologisk koksaltlösning (4.3). Ympa med denna suspension en Rouxkolv som innehåller 250 ml odlingssubstrat (4.1). Inkubera under 24 timmar vid 35°C och samla därefter upp bakterierna i 25 ml fysiologisk koksaltlösning (4.3). Homogenisera och späd ut suspensionen så att ljustransmissionen blir cirka 75 % vid 650 nm. Denna suspension kan användas under en vecka om den förvaras i kylskåp.

Fastställ genom förberedande prov på plattor med bassubstratet för bestämningen (4.1) vilken kvantitet av inokulatet som, vid de olika koncentrationer av virginiamycin som används, ger största möjliga hämningszoner som fortfarande är tydliga. Odlingssubstratet inokuleras vid 48 50°C.

4. Odlingssubstrat och reagens

4.1 Bassubstrat för bestämningen(10)

Glukos 1 g

Tryptisk pepton 10 g

Köttextrakt 1,5 g

Jästextrakt 3 g

Agar (beroende på kvalitet) 10 20 g

Destillerat vatten till 1000 ml

Justera pH-värdet till 6,5 före användning.

4.2 Fosfatbuffertlösning, pH 6

Kaliumdivätefosfat KH2PO4 pa 8,0 g

diKaliumvätefosfat K2HPO4 pa 2,0 g

Destillerat vatten till 1000 ml

4.3 Steril fysiologisk koksaltlösning

4.4 Ren metanol

4.5 Blandning fosfatbuffertlösning (4.2)/ren metanol i volymsproportionerna 80/20

4.6 0,5-procentig "Tween 80"-metanollösning (vikt/volym)4.7 Standardsubstans: virginiamycin med känd aktivitet

5. Standardlösningar

Framställ en lösning av standardsubstansen (4.7) i metanol som innehåller 800 µg/ml virginiamycin. Av denna utgångslösning bereds en standardarbetslösning S8 som innehåller 1 µg/ml virginiamycin genom utspädning med blandningen (4.5). Bered därefter genom successiv utspädning (1 + 1) med blandningen (4.5) följande koncentrationer:

S4 0,5 µg/ml

S2 0,25 µg/ml

S1 0,125 µg/ml

6. Extraktion

6.1 Produkter med högst 50 ppm halt virginiamycin

Ta 10 20 g av provet, tillsätt 100 ml av lösningen (4.6) och skaka om under 30 minuter på en platta. Centrifugera eller filtrera, ta 20 ml av den klara lösningen och indunsta fullständigt i rotationsindunstare. Lös upp återstoden i minst 20 ml av blandningen (4.5) så att en antagen virginiamycinkoncentration av 1 µg/ml (= U8) erhålls. Bered därefter koncentrationerna U4, U2 och U1 genom successiva utspädningar (1 : 1) med blandningen (4.5).

6.2 Produkter med över 50 ppm halt virginiamycin

Ta 1 10 g av provet, tillsätt 100 ml av lösningen (4.6) och skaka om under 30 minuter på en platta. Centrifugera eller filtrera, och späd därefter med blandningen (4.5) så att en antagen virginiamycinkoncentration av 1 µg/ml (= U8) erhålls. Bered därefter koncentrationerna U4, U2 och U1 enligt anvisningarna i punkt 6.1.

7. Bestämningsmetod

7.1 Inokulering av odlingssubstratet

Inokulera bassubstratet för bestämningen (4.1) i bakteriesuspensionen (3.2) vid 48 50°C.

7.2 Preparering av brickorna

Diffusion på agar utförs på brickor med fyra koncentrationer av standardlösningen (S8, S4, S2, S1) och fyra koncentrationer av extraktet (U8, U4, U2, U1). Samtliga fyra koncentrationer standardlösning och extrakt måste placeras på varje bricka.

Välj därför brickor med en yta som tillåter att minst åtta hål, 10 13 mm i diameter, görs i agarsubstratet. Beräkna vilken kvantitet inokulerat odlingssubstrat (7.1) som krävs för att täcka brickorna med ett jämnt, cirka 2 mm tjockt lager. Försöket bör helst utföras på brickor av planglas som är försedda med en helt jämn aluminium- eller plastring, 200 mm i diameter och 20 mm hög.

Fyll med pipett noggrant uppmätta kvantiteter antibiotikalösning, mellan 0,10 och 0,15 ml beroende på hålens diameter.

Upprepa för varje prov diffusionen minst fyra gånger med varje koncentration så att en utvärdering av 32 hämningszoner ingår i varje bestämning.

7.3 Inkubation

Inkubera brickorna under cirka 18 timmar vid 28 30°C.

8. Utvärdering

Mät hämningszonernas diameter, helst genom projektion. För in mätvärdena på semilogaritmiskt papper så att logaritmen på koncentrationerna förs in vid hämningszonernas diameter. Rita linjerna för standardlösningen respektive extraktet. Förutsatt att ingen interferens förekommer skall de båda linjerna vara parallella.

Logaritmen på den relativa aktiviteten beräknas med följande formel:

>NUM>(U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8) 7 0,602 >DEN>U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 S1 - S2

Reell aktivitet = antagen aktivitet × relativ aktivitet

9. Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga 10 % relativvärde.

(1) Samtliga kommersiellt tillverkade odlingssubstrat med liknande sammansättning, som ger samma resultat, får användas.

(2) Samtliga kommersiellt tillverkade odlingssubstrat med liknande sammansättning, som ger samma resultat, får användas.

(3) Amidsvart används för att påvisa hämningszonerna i standardlösningen (blå ringar).

(4) Denna stam som isolerats av LUFA i Kiel växer snabbare än S. aureus ATCC 6538 P.

(5) Samtliga kommersiellt tillverkade odlingssubstrat medliknande sammansättning, som ger samma resultat, får användas.

(6) Stammen har isolerats av LUFA i Kiel.

(7) Samtliga kommersiellt tillverkade odlingssubstrat med liknande sammansättning, som ger samma resultat, får användas.

(8) Samtliga kommersiellt tillverkade odlingssubstrat med liknande sammansättning, som ger samma resultat, får användas.

(9) Samtliga kommersiellt tillverkade odlingssubstrat med liknande sammansättning, som ger samma resultat, får användas.