KOMMISSIONENS DIREKTIV 2006/56/EG

av den 12 juni 2006

om ändring av bilagorna till rådets direktiv 93/85/EEG om bekämpning av ljus ringröta på potatis

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIV

med beaktande av fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen,

med beaktande av rådets direktiv 93/85/EEG av den 4 oktober 1993 (1) om bekämpning av ljus ringröta på potatis, särskilt artikel 12, och

av följande skäl:

En av de viktigaste skadegörarna på potatis är Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., den sjukdomsalstrande organism som orsakar ljus ringröta på potatis (nedan kallad ”skadegöraren”).

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Bilagorna till direktiv 93/85/EEG skall ersättas med motsvarande bilagor till det här direktivet.

Artikel 2

1. Medlemsstaterna skall senast den 31 mars 2007 anta och offentliggöra de lagar och andra författningar som är nödvändiga för att följa detta direktiv. De skall genast överlämna texterna till dessa bestämmelser till kommissionen tillsammans med en jämförelsetabell för dessa bestämmelser och bestämmelserna i detta direktiv.

De skall tillämpa dessa bestämmelser från och med den 1 april 2007.

När en medlemsstat antar dessa bestämmelser skall de innehålla en hänvisning till detta direktiv eller åtföljas av en sådan hänvisning när de offentliggörs. Närmare föreskrifter om hur hänvisningen skall göras skall varje medlemsstat själv utfärda.

2. Medlemsstaterna skall omgående till kommissionen överlämna texten till de centrala bestämmelser i nationell lagstiftning som de antar inom det område som omfattas av detta direktiv.

Artikel 3

Detta direktiv träder i kraft den tredje dagen efter det att det har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning.

Artikel 4

Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.

(1) EGT L 259, 18.10.1993, s. 2.

BILAGA I

TESTPROGRAM FÖR ATT DIAGNOSTICERA, UPPTÄCKA OCH IDENTIFIERA DEN BAKTERIE SOM ORSAKAR LJUS RINGRÖTA, CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (Smith) Davis et al. ssp. SEPEDONICUS (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al.

TESTPROGRAMMETS OMFATTNING

I programmet beskrivs de olika förfaranden som ingår i

i) diagnos av ljus ringröta på potatisknölar och potatisplantor,

ii) upptäckt av Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus i prover av potatisknölar och potatisplantor,

iii) identifiering av Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (C. m. ssp. sepedonicus).

ALLMÄNNA PRINCIPER

Optimerade protokoll för de olika metoderna, validerade reagenser och närmare uppgifter om beredningen av test- och kontrollmaterial finns i tilläggen. En förteckning över de laboratorier som togs med i optimeringen och valideringen av protokoll finns i tillägg 1.

Eftersom protokollen omfattar upptäckt av en karantänsorganism och användning av C. m. subsp. sepedonicus som kontrollmaterial, är det nödvändigt att förfarandena tillämpas under lämpliga karantänförhållanden med lämpliga anordningar för avfallshantering och i enlighet med lämpliga licenser utfärdade av de officiella växtinspektionsmyndigheterna.

Testparametrarna skall utformas så att de säkerställer enhetliga och reproducerbara upptäckter av halter av C. m. subsp. sepedonicus på de fastställda tröskelvärdena i de valda metoderna.

En noggrann förberedning av de positiva kontrollerna är av största vikt.

Testning i enlighet med de föreskrivna tröskelvärdena fordrar även att utrustningen ställs in, underhålls och kalibreras på ett korrekt sätt, att reagenserna handhas och förvaras varsamt och att samtliga åtgärder för att förhindra nedsmittning mellan prover vidtas, t.ex. separering av positiva kontroller från prover. Standarder för kvalitetskontroll skall tillämpas för att undvika administrativa och andra fel, särskilt när det gäller märkning och dokumentering.

En misstänkt förekomst enligt artikel 4.2 i direktiv 93/85/EEG innebär ett positivt resultat vid diagnostiska tester eller screeningtester som utförs på ett prov i enlighet med vad som anges i flödesdiagrammen.

Om det första screeningtestet (IF eller PCR/FISH) är positivt, misstänks nedsmittning med C. m. subsp. sepedonicus och ett andra screeningtest skall göras. Om det andra screeningtestet är positivt bekräftas misstanken (misstänkt förekomst) och testerna i enlighet med programmet skall fortsätta. Om det andra screeningtestet är negativt betraktas provet som icke smittat med C. m. subsp. sepedonicus.

Ett positivt IF-test enligt artikel 4.2 definieras som en positiv IF-avläsning verifierad av ett andra screeningtest (PCR/FISH).

Bekräftad närvaro enligt artikel 5.1 i direktiv 93/85/EEG innebär isolering och identifiering av en renkultur av C. m. subsp. sepedonicus med bekräftad patogenitet.

1. FRAMSTÄLLNING VIA FLÖDESDIAGRAM

1.1 Program för diagnos på ljus ringröta på potatisknölar och potatisplantor med symptom på ljus ringröta

Testförfarandet är avsedd för potatisknölar och potatisplantor som uppvisar typiska eller misstänkta symptom på ljus ringröta. Den omfattar ett snabbscreeningtest, isolering av patogenet från infekterad kärlringsvävnad på diagnostiskt substrat och vid positivt utslag identifiering av kulturen som C. m. subsp. sepedonicus.

1.2 Program för upptäckt och identifiering av Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus i prover av asymptomatiska potatisknölar

Princip

Syftet med testförfarandet är att upptäcka latenta infektioner i potatisknölar. Minst två positiva screeningtest baserade på olika biologiska principer skall verifieras genom isolering av patogenet, vid isolering av typiska kolonier följt av identifiering av en renkultur som C. m. subsp. sepedonicus. Endast ett positivt screeningtest är inte tillräckligt för att provet skall kunna betraktas som misstänkt.

Screening- och isoleringstesterna skall möjliggöra en bestämningsgräns på 103–104 celler/ml återsuspenderade pellet, som är medtagna som positiva kontroller i varje testserie.

1.3 Program för upptäckt och identifiering av Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus i prover av asymptomatiska potatisplantor

2. OKULÄR UNDERSÖKNING AVSEENDE SYMPTOM PÅ LJUS RINGRÖTA

2.1 Potatisplantor

På grund av de klimatförhållanden som råder i Europa påträffas symptom sällan på ute på fältet och ofta endast i slutet av säsongen. Dessutom är symptomen ofta dolda eller förväxlas med andra sjukdomar, åldrande eller mekaniska skador. Därför kan symptom lätt förbigås vid fältinspektioner. Vissningssymptomen skiljer sig avsevärt från symptomen på mörk ringröta. Vissningen är vanligtvis långsam och begränsad till bladkanterna. Unga infekterade blad fortsätter ofta att utvecklas, om än i mindre utsträckning i infekterade områden. Detta ger upphov till blad med oregelbundna former. Blad vars kärlringvävnad blockerats längre ned på stjälken utvecklar ofta bleka områden på bladytan i olika nyanser av gul och orange. Småblad och blad, och även stjälkar, kan till slut dö. Ofta krymper blad och knölar emellertid endast i storlek. Ibland försvagas plantornas tillväxt. Färgbilder av en rad symptom finns på kommissionens webbplats (http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.2 Potatisknölar

De första symptomen är lätt glasaktighet eller genomskinlighet hos vävnaden, särskilt nära naveländan, utan att området runt kärlsystemet har mjukats upp. Kärlringen vid naveländan kan vara en aning mörkare än normalt. Det första klart identifierbara symptomet är att kärlringen har en gulaktig färg, och då knölen pressas försiktigt tränger strängar av ostliknande material fram ur kärlringen. Denna utsöndring innehåller miljontals bakterier. Kärlringsvävnaden kan bli brunaktig, och symptomen hos knölarna är på detta stadium snarlika dem på mörk ringröta orsakad av Ralstonia solanacearum. Först kan dessa symptom begränsas till en del av ringen, inte nödvändigtvis nära naveländan, och de kan gradvis breda ut sig till hela ringen. Då infektionen fortsätter förstörs kärlringen, och yttre cortex kan skiljas från inre cortex. I ett framskridet stadium av infektionen uppträder sprickor på ytan av knölen, som ofta är rödbrun vid kanterna. I Europa har nyligen ett flertal fall inträffat där inre cortex ruttnar på samma gång som kärlringen, vilket leder till ett sekundärt angrepp med inre urgröpning och nekros. Sekundära svamp- eller bakterieangrepp kan dölja symptomen, och det kan vara svårt, till och med omöjligt, att skilja symptom på framskriden ljus ringröta från andra former av röta hos knölar. Atypiska symptom kan förekomma. Färgbilder på en rad symptom finns på kommissionens webbplats (http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

3. PREPARERING AV PROVER

3.1 Potatisknölar

Anmärkning:

— Den standardiserade provmängden är 200 knölar per test. Vid intensivare provtagning krävs fler tester på prover av denna storlek. Ett större antal knölar i provet medför inhibering eller svårighet att tolka resultaten. Förfarandet kan emellertid användas för prover med färre än 200 knölar, om det endast finns färre knölar tillgängliga.

— Valideringen av samtliga nedan behandlade metoder för upptäckt har skett på grundval av test av stickprover på 200 knölar.

— Det nedan beskrivna potatisextraktet kan även användas för upptäckt av den bakterie som orsakar mörk ringröta hos potatis, Ralstonia solanacearum.

Frivillig förbehandling före provpreparering:

Tvätta knölarna. Använd lämpliga desinfektionsmedel (vid PCR-test klorföreningar för att avlägsna eventuellt patogent DNA) och tvättmedel mellan varje stickprov. Lufttorka knölarna. Detta rengöringsförfarande är användbart (men det inte är obligatoriskt) i synnerhet vid jordiga prover och om ett PCR-test eller ett direkt isoleringstest skall göras.

3.1.1 Avlägsna med en ren, desinficerad skalpell eller grönsakskniv epidermis från varje knöls navelända så att kärlvävnaden blir synlig. Skär försiktigt ur en liten kärna av kärlringvävnad i naveländan och minimera mängden icke-kärlringvävnad (se kommissionens webbplats på adress http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Anmärkning:

Lägg undan alla knölar med misstänkta symptom på brunröta och testa dem separat.

Om misstänkta symptom på ljus ringröta iakttas vid avlägsnandet av naveländan bör en okulär inspektion av denna knöl ske efter det att knölen skurits av nära naveländan. Alla skurna knölar med misstänkta symptom bör förvaras i två dagar i rumstemperatur och lagras under karantänförhållanden (4–10 °C) tills alla tester slutförts. Alla knölar i provet, inklusive dem med misstänkta symptom, bör förvaras i enlighet med bilaga II.

3.1.2 Samla naveländarna i oanvända avfallsbehållare som kan tillslutas och/eller förseglas (om behållare återanvänds bör de rengöras noggrant och desinficeras med klorföreningar). Naveländarna bör helst behandlas omedelbart. Om detta inte är möjligt bör de förvaras i behållaren, utan tillsats av buffert, nedkylda under högst 72 timmar eller i rumstemperatur under högst 24 timmar. Torkning och förkorkning av ändarna samt framväxt av saprofyter under förvaringen kan hindra att den bakterie som orsakar ljus ringröta upptäcks.

3.1.3 Behandla naveländarna enligt något av följande förfaranden: antingen

a) täck naveländarna genom att tillsätta en tillräcklig mängd (ungefär 40 ml) extraktionsbuffert (tillägg 3) och skaka på en rotationsskak (50–100 r/min) under 4 timmar vid en temperatur lägre än 24 °C eller under 16–24 timmar nedkylt, eller

b) homogenisera naveländarna i en tillräcklig mängd (ungefär 40 ml) extraktionsbuffert (tillägg 3), antingen i en mixer (t.ex. Waring mixer eller Ultra Thurrax) eller genom att krossa dem i en förseglad engångspåse för finfördelning (t.ex. Stomacherpåse eller stark polyten från Bioreba, 150 × 250 mm, steriliserad genom strålning) med en gummihammare eller lämplig malapparat (t.ex. Homex).

Anmärkning:

Risken för korskontaminering av proverna är hög när de homogeniseras med en mixer. Vidta försiktighetsåtgärder så att det inte alstras aerosoler eller uppkommer spill under extraheringen. Se till att nyligen steriliserade mixerblad och behållare används för varje prov. Om PCR-test skall användas, undvik överföring av DNA till behållare eller malapparat. Krossning i engångspåsar och användning av engångsrör rekommenderas när PCR-test används.

3.1.4 Dekantera supernatanten. Om den är mycket grumlig, separera genom långsam centrifugering (högst 180 g under 10 minuter vid en temperatur på 4–10 °C) eller genom vakuumfiltrering (40–100 µm), varvid filtret tvättas med ytterligare (ca 10 ml) extraktionsbuffert (tillägg 3).

3.1.5 Koncentrera bakteriedelen genom centrifugering vid 7 000 g under 15 minuter (eller 10 000 g under 10 minuter) vid en temperatur av 4–10 °C och häll bort supernatanten utan att störa pelleten.

3.1.6 Återsuspendera pelleten i 1,5 ml pelletbuffert (tillägg 3). Använd 500 µl för att testa för C. m. subsp. sepedonicus, 500 µl för Ralstonia solanacearum och 500 µl i referenssyfte. Tillsätt steril glycerol till en slutkoncentrationen av 10–25 volymprocent till 500 µl av referensdelprovet och till det återstående testdelprovet. Skaka och förvara vid –16 till –24 °C (veckor) eller vid –68 till –86 °C (månader). Förvara testdelproven vid 4–10 °C under testningen.

Upprepade nedfrysningar och upptiningar är inte tillrådliga.

Om transport av extraktet krävs, se till att leveransen sker i en kall behållare inom 24–48 timmar.

3.1.7 Det är absolut nödvändigt att alla C. m. subsp. sepedonicus-positiva kontroller och prover hanteras separat för att undvika nedsmittning. Detta gäller även för IF-glas och samtliga test.

3.2 Potatisplantor

Anmärkning:

För upptäckt av latenta populationer av C. m. subsp. sepedonicus rekommenderas testning av blandprover. Förfarandet kan även lätt användas för blandprover bestående av upp till 200 stjälkdelar. (Om undersökningar görs bör dessa grundas på ett statistiskt representativt prov av den plantpopulation som undersöks.)

3.2.1 Med en ren, desinficerad kniv eller sekatör avlägsnas ett 1–2 cm långt segment av basen på varje stjälk strax ovanför markytan.

Desinficera stjälksegmentet hastigt i 70-procentig etanol och torka omedelbart med mjukpapper.

Samla stjälksegmenten i en tillsluten steril behållare enligt följande provtagningsförfaranden:

3.2.2 Behandla stjälksegmenten enligt något av följande förfaranden: antingen

a) täck segmenten genom att tillsätta en tillräcklig mängd (ungefär 40 ml) extraktionsbuffert (appendix 3) och skaka på en rotationsskak (50–100 r/min) under 4 timmar vid en temperatur under 24 °C eller under 16-24 timmar nedkylt, eller

b) behandla omedelbart segmenten genom att krossa dem i en kraftig förseglad engångspåse för finfördelning (t.ex. Stomacherpåse eller Bioreba) i en tillräcklig mängd extraktionsbuffert (tillägg 3) med en gummihammare eller lämplig malapparat (t.ex. Homex). Om detta inte är möjligt, förvara stjälksegmenten under högst 72 timmar nedkylda eller under högst 24 timmar i rumstemperatur.

3.2.3 Dekantera supernatanten efter det att blandningen fått stå och sjunka under 15 minuter.

3.2.4 Ytterligare klarnande av extraheringen eller koncentrationen av bakteriedelen krävs vanligtvis inte men kan åstadkommas genom filtrering och/eller centrifugering enligt avsnitten 3.1.4–3.1.6.

3.2.5 Dela det outspädda eller koncentrerade provextraktet i två lika stora delar. Bibehåll ena hälften vid en temperatur av 4–10 °C under testet och lagra den andra hälften med 10–25-procentig (v/v) steril glycerol vid en temperatur av –16 till –24 °C (veckor) eller –68 till –86 °C (månader) för det fall att ytterligare tester krävs.

4. IF-TEST

Princip

Det rekommenderas att IF-test används som huvudsakligt screeningtest på grund av dess dokumenterade effektivitet när det gäller att uppnå de föreskrivna bestämningsgränserna.

Om IF-testet används som huvudsakligt screeningtest och resultatet är positivt, skall ett andra screeningtest med PCR- eller FISH-tester göras. Om IF-testet används som ett andra screeningtest och resultatet är positivt, krävs ytterligare testning enligt flödesschemat för att analysen skall bli fullständig.

Anmärkning:

Använd alltid en polyklonal antikropp om IF-test används som huvudsakligt screeningtest. Om ett IF-test med en polyklonal antikropp är positivt, kan ytterligare screening av provet med en monoklonal antikropp ge högre specificitet men vara mindre känsligt.

Använd antikroppar till en referensstam av C. m. subsp. sepedonicus. Det rekommenderas att titer bestäms för varje nytt parti antikroppar. Titern definieras som den högsta utspädning vid vilken en optimal reaktion sker när en suspension av 105–106 celler per ml av den homologa stammen av C. m. subsp. sepedonicus testas och när ett lämpligt fluorescein isothiocyanat konjugat (FITC) i överensstämmelse med tillverkarens rekommendationer används. De monoklonala eller polyklonala antikropparna bör ha en IF-titer av minst 1:2000. Vid testningen bör antikropparna användas vid en arbetsutspädning (arbetsutspädningar) nära eller vid titern. Använd validerade antikroppar (se kommissionens webbplats på adress http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Testet bör göras på nypreparerade provextrakt. Vid behov kan det göras på extrakt som lagrats i glycerol vid en temperatur på –68 till –86 °C. Glycerolen kan avlägsnas från provet genom tillsats av 1 ml pelletbuffert (tillägg 4), omcentrifugering under 15 minuter vid 7 000 g och återsuspension i en lika stor volym av pelletbuffert. Detta krävs vanligtvis inte, särskilt inte om glasproverna har fixerats på glasen med flambering (se 2.2).

Bered separata positiva kontrollglas av den homologa stammen eller någon annan referensstam av C. m. subsp. sepedonicus, som suspenderats i potatisextrakt, såsom anges i tillägg 2, alternativt i en buffert.

Naturligt infekterad vävnad (som har bevarats genom frystorkning eller nedfrysning vid en temperatur av –16 till –24 °C) bör om möjligt användas som en liknande kontroll på samma glas.

Som negativ kontroll använd delprover av provextrakt som tidigare givit negativt svar när de testats.

Använd multispot-objektglas med helst 10 fönster av minst 6 mm diameter.

Testa kontrollmaterialen på exakt samma sätt som provet (proven).

4.1 Preparera testobjektglasen enligt något av följande förfaranden:

i) För pelletar med relativt litet stärkelsesediment: Pipettera på det första glaset en uppmätt standardvolym (15 µl är lämpligt för 6 mm fönsterdiameter – öka volymen för större fönster) av en 1/100-utspädning av den återsuspenderade potatispelleten. Pipettera en motsvarande volym av koncentrerad pellet (1/1) på de återstående fönstren på raden. Den andra raden kan användas som duplikat eller för ett andra prov enligt figur 1.

ii) För andra pelletar: Preparera decimala utspädningar (1/10 och 1/100) av den återsuspenderade pelleten i pelletbuffert. Pipettera en uppmätt standardvolym (15 µl är lämpligt för 6 mm fönsterdiameter – öka volymen för större fönster) av den återsuspenderade pelleten och varje utspädning på en fönsterrad. Den andra raden kan användas som duplikat eller för ett andra prov enligt figur 2.

4.2 Torka dropparna i omgivande temperatur eller genom uppvärmning vid en temperatur av 40–45 °C. Fixera bakteriecellerna på glaset antingen genom upphettning (15 minuter vid 60 °C), flambering med 95-procentig etanol eller enligt särskilda instruktioner från leverantören av antikropparna.

Vid behov får fixerade glas lagras frysta i en torkad låda under så kort tid som möjligt (maximalt 3 månader) innan vidare testning sker.

IF-förfarande

i) Enligt testglaspreparering i 4.1 i: Bered en serie dubbla utspädningar av antikroppen i IF-buffert. Den första brunnen bör ha 1/2 av titern (T/2), de övriga 1/4 av titern (T/4), 1/2 av titern (T/2), titern (T) och två gånger titern (2T).

ii) Enligt testglaspreparering i 4.1 ii: Preparera arbetsutspädningen av antikropp i IF-buffert. Arbetsutspädningen påverkar specificiteten.

Figur 1. Preparering av testglaset enligt 4.1 i och 4.3 i.

Utspädningar av återsuspenderade pelletar 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Utspädning av återsuspenderad pellet (T = titer) T/2 T/4 T/2 T 2T  Dubbla utspädningar av antiserum/antikropp Prov 1 1 2 3 4 5 Duplikat av prov 1 eller prov 2 6 7 8 9 10





Figur 2. Preparering av testglaset enligt 4.1 ii och 4.3 ii.

Arbetsutspädning av antiserum/antikropp 1/1 1/10 1/100 tom tom  Decimal utspädning av återsuspenderad pellet Prov 1 1 2 3 4 5 Duplikat av prov 1 eller prov 2 6 7 8 9 10

4.3.1 Ordna glasen på fuktigt mjukpapper. Täck varje testfönster fullständigt med antikropputspädning(ar). Den volym antikroppar som tillsätts varje fönster skall vara minst lika stor som volymen tillsatt extrakt.

Följande förfarande bör följas om det saknas särskilda instruktioner från leverantören av antikropparna:

4.3.2 Inkubera objektglasen på fuktigt papper övertäckta under 30 minuter vid omgivande temperatur (18–25 °C).

4.3.3 Skaka av dropparna från glaset och skölj glasen noga med IF-buffert. Tvätta genom att under 5 minuter sänka ned i IF-buffert – Tween (tillägg 3) och därefter under 5 minuter i IF-buffert. Undvik uppkomst av aerosoler eller överföring av droppar som kan orsaka korskontaminering. Avlägsna noga överskottsfukt genom att försiktigt torka med läskpapper.

4.3.4 Ordna glasen på fuktigt mjukpapper. Täck testfönstren med den utspädning av FITC-konjugat som används för att bestämma titern. Den volym konjugat som tillsätts fönstren skall vara lika med volymen tillsatt antikropp.

4.3.5 Inkubera glasen på fuktigt papper övertäckta under 30 minuter vid omgivande temperatur (18–25 °C).

4.3.6 Skaka av konjugatdropparna från glaset. Skölj och tvätta som ovan (4.3.3).

Avlägsna noga överskottsfukt.

4.3.7 Pipettera 5–10 µl 0,1 M fosfatbuffrad glycerol (tillägg 3) eller en inbäddningslösning som motverkar blekning som finns tillgänglig i handeln på varje fönster och lägg på ett täckglas.

Avläsning av IF-testet:

4.4.1 Undersök testglasen i ett epifluorescensmikroskop med filter lämpliga för FITC under olje- eller vattenimmersion vid 500–1 000 gångers förstoring. Scanna fönstren utefter två diametrar i rät vinkel och runt perimetern. Om proverna inte uppvisar några eller ett litet antal celler, observera minst 40 mikroskopfält.

Kontrollera glaset med positiv kontroll först. Cellerna skall vara klart fluorescerande och helt färgade vid den fastställda antikroppstitern eller arbetsutspädningen. IF-testet (avsnitt 4) skall återupprepas om färgningen är avvikande.

4.4.2 Sök efter ljusa fluorescerande celler med morfologi som är karakteristisk för C. m. subsp. Sepedonicus i testfönstren på testglasen (se kommissionens webbplats med adress http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorescensintensiteten skall minst motsvara den positiva kontrollstammens vid samma antikroppsutspädning. Celler med ojämn eller ofullständig färgning eller med svag fluorescens skall ej beaktas.

Om smitta misstänks skall testet upprepas. Detta kan vara fallet om alla glas i ett parti uppvisar positiva celler på grund av smitta av en buffert eller om positiva celler påträffas (utanför glasets fönster) på objektglasöverdraget.

4.4.3 Immunofluorescenstestets specificitet ger upphov till ett flertal problem. Bestånd av fluorescerande celler med atypisk morfologi och korsreagerande saprofytiska bakterier som har en liknande storlek och morfologi som C. m. sepedonicus kan förekomma hos potatisar i naveländarna och i pelletar av stjälksegmentet.

4.4.4 Endast fluorescerande celler med typisk storlek och morfologi vid titern eller vid arbetsutspädningen av antikropparna skall beaktas, såsom i 4.3.

4.4.5 Tolkning av IF-testet:

i) För varje prov med ljusa fluorescerande celler med karakteristisk morfologi, bestäm medeltalet typiska celler per mikroskopfält och beräkna antal typiska celler per ml återsuspenderad pellet (tillägg 4). IF-testet är positivt om proven innehåller minst 5 × 103 typiska celler per ml återsuspenderad pellet. Provet betraktas som potentiellt smittat och ytterligare tester krävs.

ii) IF-testet är negativt om proven innehåller färre än 5 × 103 celler per ml återsuspenderad pellet och provet betraktas som negativt. Inga ytterligare tester krävs.

5. FISH-TEST

Princip

Om FISH-testet används som första screeningtest och resultatet är positivt, skall ett andra screeningtest i form av ett IF-test göras. Om FISH-testet används som andra screeningtest och resultatet är positivt, krävs ytterligare testning enligt flödesschemat för att diagnosen skall bli fullständig.

Anmärkning:

Använd validerade C. m. subsp. sepedonicus-specifika oligo-prober (tillägg 7). Preliminär testning med denna metod bör möjliggöra reproducerbar upptäckt av minst 103–104 celler av C. m. subsp. sepedonicus per ml som tillsätts till provextrakt som tidigare testats och gett negativt svar.

Följande förfarande bör helst tillämpas på nypreparerade provextrakt men kan även tillämpas på provextrakt som lagrats i glycerol vid en temperatur av –16 till –24 °C eller –68 till –86 °C.

Som negativa kontroller använd delprover av provextrakt som tidigare givit negativt svar när de testats avseende C. m. subsp. sepedonicus.

Som positiva kontroller preparera suspensioner innehållande 105–106 celler per ml av C. m. subsp. sepedonicus (dvs. stam NCPPB 4053 eller PD 406) i 0,01 M fosfatbuffert från en 3–5 dagar gammal kultur (preparering se tillägg 2). Preparera separata positiva kontrollglas av den homologa stammen eller någon annan referensstam av C. m. subsp. sepedonicus, som suspenderats i potatisextrakt, såsom anges i tillägg 2.

Användningen av FITC-märkt eubakteriell prob fungerar som en kontroll av hybridiseringsprocessen, eftersom den färgar alla eubakterier som finns i provet.

Testa kontrollmaterialen exakt som provet (proven).

5.1 Fixering av potatisextrakt

Följande protokoll utgår ifrån Wullings et al., (1998):

5.1.1 Preparera fixeringslösningen (se tillägg 7).

5.1.2 Pipettera 100 µl av varje provextrakt i ett Eppendorf-rör och centrifugera under 8 minuter på 7 000 g.

5.1.3 Avlägsna supernatanten och lös pelleten i 500 µl fixeringsvätska som preparerats < 24 timmar tidigare. Skaka och inkubera över natten i 4 °C.

En alternativ fixeringsvätska är 96-procentig etanol. Vid användning av denna, lös pelleten från steg 5.1.2 i 50 µl 0,01 M fosfatbuffert och 50 µl 96-procentig etanol. Skaka och inkubera vid 4 °C under 30–60 minuter.

5.1.4 Centrifugera under 8 minuter på 7 000 g, avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 75 µl 0,01 M fosfatbuffert (se tillägg 3).

5.1.5 Droppa 16 µl av de fixerade suspensionerna på ett rent multitest-objektglas, såsom anges i fig. 3. Förse varje glas med två olika prover som är outspädda, och använd 10 µl för att göra en 1:100 utspädning (i 0,01 M fosfatbuffert). Den återstående provlösningen (49 µl) kan lagras vid –20 °C efter tillsats av 1 volym 96-procentig etanol. Om FISH-testet skall upprepas, avlägsna etanolen genom centrifugering, och tillsätt en lika stor volym 0,01 M fosfatbuffert (omskakas).

Figur 3. FISH-glasets layout

Prov 1 Blankprov Blankprov Blankprov Prov 2 Fönster 1 Fönster 2 Fönster 3 Fönster 4 Fönster 5 Prov 1 Blankprov Blankprov Blankprov Prov 2 Fönster 6 Fönster 7 Fönster 8 Fönster 9 Fönster 10 Täckglas 1 Täckglas 2

5.1.6 Lufttorka glasen (eller torka på objektglastork vid 37 °C) och fixera dem genom flambering.

Förfarandet kan på detta stadium avbrytas, och hybridiseringen kan fortsätta följande dag. Glasen bör förvaras dammfritt och torrt i rumstemperatur.

5.2 Förhybridisering och hybridisering

5.2.1 Preparera en lysozymlösning innehållande 10 mg lysozym (Sigma L-6876) i 10 ml buffert (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0). Denna lösning kan lagras men bör nedfrysas och upptinas endast en gång. Täck varje prov väl med ungefär 50 µl lysozymlösning och inkubera under 10 minuter vid rumstemperatur. Doppa därefter glasen i demineraliserat vatten en enda gång och torka med filterpapper.

Alternativt kan man i stället för lysozym tillsätta 50 µl av 40–400µg ml–1 proteas K i en buffert (20 mM Tris-HCl, 2mM CaCl2, pH 7,4) till varje brunn och inkubera vid 37 °C under 30 minuter.

5.2.2 Torka cellerna i en serie av etanol om 50 %, 80 % och 96 % under 1 minut vardera. Lufttorka glasen i en hållare för objektglas.

5.2.3 Preparera en fuktkammare för inkubation genom att täcka botten av en lufttät behållare med mjuk- eller filterpapper doppat i 1x hybmix (tillägg 7). Preinkubera behållaren i hybridiseringsugn vid 55 °C under minst 10 minuter.

5.2.4 Preparera hybridiseringslösningen (tillägg 7) med 45 µl per glas, och preinkubera under 5 minuter vid 55 °C.

5.2.5 Placera glasen på en värmeplatta vid 45 °C och tillsätt 10 µl hybridiseringslösning till var och en av de 4 brunnarna på glaset (glasen).

5.2.6 Anbringa 2 täckglas (24 × 24 mm) på varje glas utan att låta någon luft komma emellan. Placera glasen i den redan uppvärmda fuktkammaren och hybridisera över natten i ugn vid 55 °C i mörker.

5.2.7 Preparera 3 bägare innehållande 1 l ultrarent vatten, 1 l 1x hybmix (334 ml 3x hybmix och 666 ml ultrarent vatten) och 1 l av 1/2x hybmix (167 ml 3x hybmix och 833 ml ultrarent vatten). Preinkubera var och en i vattenbad vid 55 °C.

5.2.8 Avlägsna täckglasen från glasen och placera glasen i en hållare för objektglas.

5.2.9 Tvätta bort probe-överskott genom inkubation under 15 minuter i bägaren med 1x hybmix vid 55 °C.

5.2.10 För över hållaren för objektglas till 1/2 hybmix tvättlösning och inkubera under ytterligare 15 minuter

5.2.11 Doppa glasen hastigt i ultrarent vatten och placera dem på filterpapper. Avlägsna överskottsfukt genom att försiktigt täcka ytan med filterpapper. Pipettera 5–10 μl av inbäddningslösning som motverkar blekning (t.ex. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA eller liknande) på varje fönster och lägg ett stort täckglas (24 × 60 mm) över hela glaset.

5.3 Tolkning av FISH-testet

5.3.1 Observera glasen omedelbart i ett mikroskop utrustat för epifluorescensmikroskopi vid 630 eller 1000x förstoring under oljeimmersion. Med ett filter lämpligt för fluoresceinisothiocyanat (FITC) färgas eubakteriecellerna (inklusive de flesta gramnegativa cellerna) i provet fluorescerande gröna. Med ett filter för tetrametylrodamin-5-isotiocyanat framträder Cy3-infärgade celler av C. m. subsp. sepedonicus som fluroscerande röda. Jämför cellmorfologin med de positiva kontrollernas cellmorfologi. Cellerna skall vara klart fluorescerande och helt färgade. FISH-testet (avsnitt 9.4) skall återupprepas om färgningen är avvikande. Scanna fönstren utefter två diametrar i rät vinkel och runt perimetern. På de prover som inte uppvisar några celler eller endast ett litet antal celler, observera minst 40 mikroskopfält.

5.3.2 Sök efter klart fluorescerande celler med karakteristisk morfologi av C. m. subsp. sepedonicus i fönstren på glasen med prover (se kommissionens webbplats med adress http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intensiteten hos fluorescensen skall vara likvärdig med eller större än fluorescensen hos den positiva kontrollstammen. Celler med ojämn eller ofullständig färgning eller med svag fluorescens beaktas inte.

5.3.3 Om smitta misstänks skall testet upprepas. Detta kan vara fallet om alla glas i ett parti uppvisar positiva celler på grund av smitta av en buffert eller om positiva celler påträffas (utanför glasets fönster) på objektglasöverdraget.

5.3.4 FISH-testets specificitet medför flera problem. Bestånd av fluorescerande celler med atypisk morfologi och korsreagerande saprofytiska bakterier som har en liknande storlek och morfologi som C. m. subsp. sepedonicus kan förekomma hos potatisar, dels i naveländarna, dels i pelletar av stjälksegmentet, även om de är mycket mer lågfrekventa än i IF-test.

5.3.5 Endast fluorescerande celler med typisk storlek och morfologi tas i beaktande (se 5.3.2).

5.3.6 Tolkning av resultaten från FISH-test:

i) Giltiga resultat från FISH-test erhålls om klart fluorescerande gröna celler med storlek och morfologi som är typiskt för C. m. subsp. sepedonicus observeras när ett FITC-filter används respektive klart fluorescerande röda celler när ett rodamin-filter används i alla positiva kontroller och inte i någon av de negativa kontrollerna. För varje prov med ljusa fluorescerande celler med karakteristisk morfologi, bestäm medeltalet typiska celler per mikroskopfält och beräkna antal typiska celler per ml återsuspenderad pellet (tillägg 4). Prover som innehåller minst 5 × 103 typiska celler per ml återsuspenderad pellet betraktas som potentiellt smittade. Ytterligare provtagning krävs. Prover som innehåller färre än 5 × 103 typiska celler per ml återsuspenderad pellet betraktas som negativa.

ii) FISH-testet är negativt om klart fluorescerande röda celler med storlek och morfologi som är typiskt för C. m. subsp. sepedonicus inte observeras när rodamin-filtret används, förutsatt att typiska klart fluorescerande röda celler observeras i de positiva kontrollpreparaten när rodamin-filtret används.

6. PCR-TEST

Principer

Om ett PCR-test används som huvudsakligt screeningtest och resultatet är positivt, skall ett andra screeningtest i form av ett IF-test göras. Om PCR-testet används som andra screeningtest och resultatet är positivt, krävs ytterligare testning enligt flödesschemat för att diagnosen skall bli fullständig.

Fullt utnyttjande av denna metod som huvudsakligt screeningtest rekommenderas endast när särskild fackkompetens har uppnåtts.

Anmärkning:

Preliminär testning med denna metod bör möjliggöra reproducerbar upptäckt av 103–104 celler av C. m. subsp. sepedonicus per ml som tillsätts till provextrakt som tidigare testats och gett negativt svar. Optimeringsexperiment kan krävas för att uppnå maximal sensitivitets- och specificitetsnivå i alla laboratorier.

Använd validerade PCR-reagens och PCR-protokoll. Välj helst en metod med internkontroll.

Vidta lämpliga åtgärder för att undvika nedsmittning av prover med mål-DNA. PCR-testerna bör utföras av erfarna tekniker i specialiserade molekylärbiologiska laboratorier för att minimera risken för nedsmittning av mål-DNA.

Negativa kontroller (för DNA-extraktions- och PCR-förfaranden) bör alltid behandlas som slutliga prov i förfarandet för att tydligt kunna visa om överföring till mål-DNA har inträffat eller ej.

Följande negativa kontroller bör ingå i PCR-testet:

— Provextrakt som tidigare givit negativt svar när det testats med avseende på C. m. subsp. Sepedonicus.

— Buffertkontroller som används för extrahering av bakterien och DNA från provet.

— PCR-reaktionsblandningen.

Följande positiva kontroller bör tas med:

— Delprover av återsuspenderad pellet till vilka C. m. subsp. sepedonicus har tillsatts (information om preparering finns i tillägg 2).

— En suspension av 106 celler per ml av C. m. subsp. sepedonicus i vatten från ett virulent isolat (t.ex. NCPPB 2140 eller NCPPB 4053).

— Om möjligt använd dessutom DNA från positiva kontrollprover i samband med att PCR-test.

För att undvika risk för smitta, preparera positiva kontroller i en separat omgivning från de prover som skall testas.

Provextrakten bör vara så fria från jord som möjligt. Om PCR-protokoll skall användas kan det därför i vissa fall vara tillrådligt att preparera extraheringar från tvättade potatisar.

6.1 Metoder för rening av DNA

Använd positiva och negativa kontrollprover såsom beskrivs ovan.

Preparera kontrollmaterialen exakt som provet (proven).

Det finns en rad olika metoder för att rena mål-DNA från komplexa provsubstrat och på så sätt avlägsna inhibitorer av PCR och andra enzymreaktioner och koncentrera mål-DNA i provextraktet.

Följande metod har optimerats för att användas tillsammans med den validerade PCR-metod som visas i tillägg 6.

6.1 a) Metod enligt Pastrik (2000)

1. Pipettera 220 µl av lyseringsbuffert (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) i ett 1,5 ml Eppendorf-rör.

2. Tillsätt 100 µl provextrakt och placera i värmeblock eller vattenbad vid 95 °C under 10 minuter.

3. Ställ röret på kylning under 5 minuter.

4. Tillsätt 80 µl Lysozym utgångslösning (50 mg lysozym per ml i 10 mM Tris HCl, pH 8,0) och inkubera vid 37 °C under 30 minuter.

5. Tillsätt 220 µl Easy DNA® lösning A (Invitrogen), blanda väl genom skakning och inkubera vid 65 °C under 30 minuter.

6. Tillsätt 100 µl Easy DNA® lösning B (Invitrogen), skaka kraftigt tills fällningen svävar fritt i röret och provet är jämnt trögflytande.

7. Tillsätt 500 µl kloroform och skaka tills viskositeten ökar och blandningen är homogen.

8. Centrifugera vid 15 000 g under 20 minuter vid 4 °C för att separera faserna och bilda interfasen.

9. För över den övre fasen till ett rent Eppendorf-rör.

10. Tillsätt 1 ml 100-procentig etanol (–20 °C), skaka snabbt och inkubera under nedkylning under 10 minuter.

11. Centrifugera vid 15 000 g under 20 minuter vid 4 °C och avlägsna etanolen från pelleten.

12. Tillsätt 500 µl 80-procentig etanol (–20 °C) och blanda genom att vända upp och ned på röret.

13. Centrifugera vid 15 000 g under 10 minuter vid 4 °C, spara pelleten och avlägsna etanolen.

14. Låt pelleten lufttorka eller torka i en DNA speed vac.

15. Återsuspendera pelleten i 100 µl sterilt ultrarent vatten och låt stå i rumstemperatur under minst 20 minuter.

16. Lagra vid –20 °C fram till användning för PCR.

17. Blanda ned alla eventuella vita fällningar genom centrifugering och använd 5 µl av supernatanten innehållande DNA till PCR.

6.1 b) Andra metoder

Andra metoder för extraktion av DNA (t.ex. Qiagen DNeasy Plant Kit) skulle kunna användas, förutsatt att det är belagt att de har lika stor inverkan när det gäller att rena DNA från kontrollprover innehållande 103–104 patogena celler per ml.

6.2 PCR

6.2.1 Preparera test- och kontrolltemplat för PCR enligt det validerade protokollet (tillägg 6). Preparera en decimal utspädning av DNA-provextrakt (1:10 i ultrarent vatten).

6.2.2 Preparera lämplig PCR-reaktionsblandning i en omgivning fri från smitta enligt det offentliggjorda protokollet (tillägg 6). Det validerade PCR-protokollet är en multiplexreaktion som även omfattar en intern PCR-kontroll.

6.2.3 Tillsätt 5 µl DNA-extrakt per 25 µl PCR-reaktion i sterila PCR-rör.

6.2.4 Blanda i ett negativt kontrollprov innehållande PCR-reaktionsblandning och tillsätt ultrarent vatten av samma ursprung som det som användes i PCR-blandningen i stället för provet.

6.2.5 Placera rören i samma termocykelapparat som användes vid föregående testning och kör lämpligt optimerat PCR-program (tillägg 6).

6.3 Analys av PCR-produkten

6.3.1 Lös PCR-produkten med agarosgelelektrofores. Använd minst 12 µl av amplifierad DNA-reaktionsblandning från varje prov blandat med 3 µl laddningsbuffert (tillägg 6) i 2,0 % (w/v) agarosgel i tris-acetat-EDTA (TAE)-buffert (tillägg 6) vid 5–8 V per cm. Använd en lämplig DNA-markör, t.ex. 100 bp storleksmarkör.

6.3.2 Påvisa DNA-band genom att färga i etidiumbromid (0,5 mg per l) under 30-45 minuter, varvid lämpliga försiktighetsåtgärder bör vidtas vid hanteringen av mutagenen etidiumbromid.

6.3.3 Observera det färgade gelet i kortvågs-UV-genomlysning (t.ex. λ = 302 nm) och sök efter amplifierade DNA-produkter av förväntad storlek (tillägg 6) och dokumentera.

6.3.4 För varje ny upptäckt/nytt fall verifiera autenticiteten hos PCR-produkten genom att utföra restriktionsenzymanalys på ett prov av det återstående amplifierade DNA genom inkubation vid optimal temperatur och under optimal tid med en lämplig enzym och buffert (se tillägg 6). Lös de uppdelade fragmenten genom agarosgelelektrofores, som ovan, och observera det karakteristiska restriktionsfragmentsmönstret vid UV-genomlysning efter färgning i etidiumbromid, och jämför med den ouppdelade och uppdelade positiva kontrollen.

Tolkning av PCR-resultaten:

PCR-testet är negativt om det C. m. subsp. sepedonicus-specifika PCR-produkten av den förväntade storleken inte upptäcks i provet, men upptäcks i alla positiva kontrollprover (i fallet multiplex-PCR med plantspecifika interna kontrollprimrar skall en andra PCR-produkt av förväntad storlek amplifieras med provet i fråga).

PCR-testet är positivt om det C. m. subsp. sepedonicus-specifika PCR-produkten av den förväntade storleken och det förväntade restriktionsmönstret (vid behov) upptäcks, förutsatt att det inte amplifierats från någon av de negativa kontrollproven. Tillförlitlig bekräftelse av ett positivt resultat kan även erhållas genom att testet upprepas med en andra uppsättning PCR-primrar (avsnitt 9.3).

Anmärkning:

Inhibering av PCR kan misstänkas om den förväntade produkten erhålls från det positiva kontrollprovet innehållande C. m. subsp. sepedonicus i vatten men negativa resultat erhålls från positiva kontroller med C. m. subsp. sepedonicus i potatisextrakt. I multiplexa PCR-protokoll med interna PCR-kontroller anges inhibering av reaktionen när inget av de båda produkterna erhålls.

Smitta kan misstänkas om den förväntade produkten erhålls från en eller flera av de negativa kontrollerna.

7. BIOTEST

Anmärkning:

Preliminär testning med denna metod bör möjliggöra reproducerbar upptäckt av 103–104 koloniformande enheter av C. m. subsp. sepedonicus per ml som tillsätts till provextrakt som tidigare testats och gett negativt svar (information om prepareringen finns i tillägg 2).

Högst känslighetsnivå för upptäckt kan förväntas då nyligen preparerade provextrakt används och optimala tillväxtförhållanden tillämpas. Metoden kan emellertid med framgång tillämpas på extrakt som har lagrats i glycerol vid –68 till –86 °C.

Vissa sorters äggplantor utgör ett utmärkt selektivt förökningssubstrat för tillväxt av C. m. subsp. sepedonicus, även i avsaknad av symptom, och är också utmärkta för bekräftande värdtest.

Tillväxtförhållandena bör vara optimala för att minska risken för falska negativa testresultat.

Detaljerad information om odling finns i tillägg 8.

7.1 Fördela hela det återstående testdelprovet av den återsuspenderade pelleten från avsnitt 3.1.6 eller 3.2.5 mellan äggplantorna genom att tillämpa en av nedan angivna metoder (7.3 eller 7.4). Använd endast plantor på bladstadium 2–3 upp till full utveckling av trebladsstadiet. För att säkerställa fullständig användning av den återsuspenderade pelleten och effektiv inokulation kommer de nedan beskrivna förfarandena att kräva 15–25 äggplantor per prov.

7.2 Undvik att vattna äggplantorna 1–2 dagar före inokulationen för att minska saftspänningen.

Inokulation genom skåra

7.3.1 Håll plantan mellan två fingrar, droppa med hjälp av en pipett en droppe (ca 5–10 µl) av det uppslammade koncentrerade extraktet på stjälken mellan hjärtbladen och det första bladet.

7.3.2 Med en steril skalpell görs en diagonal skåra ungefär 1,0 cm lång och ungefär lika djup som två tredjedelar av stjälkens diameter med början vid droppen med det koncentrerade extraktet.

7.3.3 Förslut skåran med sterilt vaselin från en spruta.

7.4 Inokulation med en spruta

7.4.1 Inokulera äggplantornas stjälkar precis ovanför hjärtbladen med en spruta som är försedd med injektionsnål (minst 23G). Fördela provet mellan äggplantorna.

7.5 Som positiva kontroller, inokulera 5 plantor med en vattensuspension av 105 till 106 celler per ml av känd kultur av C. m. subsp. sepedonicus och, vid behov, med naturligt angripen knölvävnad (se avsnitt 4) genom samma inokuleringsmetod (7.3 eller 7.4).

7.6 Som negativa kontroller, inympa 5 plantor med steril pelletbuffert genom samma inokuleringsmetod (7.3 eller 7.4).

7.7 Inkubera plantorna i karantänsanläggningar upp till 4 veckor vid 18–24 °C. Inkubera plantorna med tillräckligt ljus och fuktighet (70–80 %) och vatten för att förhindra vattenmättnad eller vissnande på grund av vattenbrist. C. m. sepedonicus celler dör vid temperaturer över 30 °C, och den optimala temperaturen är 21 °C. För att undvika nedsmittning, inkubera positiva och negativa kontrollplantor på strikt separata bänkar i ett växthus eller odlingsrum eller, vid platsbrist, se till att hanteringen sker strikt separat. Om plantor från olika prover skall inkuberas tätt tillsammans, separera dem med lämpliga skärmar. Vid gödning, bevattning, inspektion och annan behandling, var noga med att undvika korskontaminering. Det är mycket viktigt att hålla växthus och odlingsrum fria från alla skadeinsekter eftersom de kan överföra bakterien från prov till prov.

7.8 Efter en vecka undersöks plantorna på vanligt sätt efter symptom. Räkna antalet plantor som uppvisar symptom. C. m. subsp. sepedonicus orsakar vissnade blad hos äggplantor, vilket kan börja som slapphet längs kanterna eller mellan nerverna. Vissnad vävnad kan till en början se mörkgrön eller fläckig ut, men bleknar innan den blir nekrotisk. Vissnade områden mellan bladnerverna ser ofta feta och vattenfyllda ut. Nekrotisk vävnad har ofta en klart gul kant. Plantorna dör nödvändigtvis inte; ju längre tid som går innan symptomen visar sig, desto större är chansen för överlevnad. Plantorna kan kväva infektionen. Unga äggplantor är mycket mottagligare för små populationer av C. m. subsp. sepedonicus än äldre plantor. Därför är det nödvändigt att använda plantor på eller lite före bladstadium 3.

Vissnandet kan också orsakas av andra bakterie- eller svamppopulationer som finns i det koncentrerade extraktet av knölarnas vävnad. Dessa kan utgöras av Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora subsp. carotovora och E. carotovora subsp. atroseptica, Erwinia chrysanthemi, Phoma exigua var. foveata och stora bestånd av saprofytiska bakterier. Särskilt Erwinia chrysanthemi kan orsaka bladsymptom och vissnande som är mycket lika symptomen på C. m. sepedonicus. Den enda skillnaden är svartnandet av stjälkarna vid infektion med Erwinia chrysanthemi. Andra typer av vissnande kan skiljas från det vissnande som orsakas av C. m. subsp. sepedonicus eftersom hela blad eller hela plantor vissnar snabbt. Även gramfärgning kan göras: detta test skiljer C. m. subsp. sepedonicus från Erwinia spp.

7.9 Så snart symptom observeras på äggplantorna bör en reisolation göras, varvid segment av vissnad bladvävnad eller stjälkvävnad används (information om finfördelning av vävnad finns i 3.1.3). Desinficera ytan på äggplantornas blad och stjälkar genom att torka av dem med 70-procentig etanol. Gör ett IF-test eller PCR-test på äggplantans växtsaft och isolera på lämpliga (selektiva) substrat (se avsnitt 8). Även gramfärgning (tillägg 9) kan prepareras. Identifiera renkulturer av presumtiv C. m. subsp. sepedonicus och bekräfta skadegöraren (se avsnitten 9 och 10).

7.10 Under vissa omständigheter, i synnerhet då tillväxtförhållandena inte är optimala, är det möjligt för C. m. subsp. sepedonicus att existera som en latent infektion i äggplantorna, till och med efter inkubationsperioder på upp till 4 veckor. Om inga symptom observeras efter 4 veckor: utför IF/PCR på ett blandprov av 1 cm stjälksegment från varje testplanta taget ovanför inokuleringsstället. Om testet är positivt bör en omisolering på lämpliga (selektiva) substrat göras enligt förfarandet i avsnitt 8. Identifiera renkulturer av presumtiv C. m. subsp. sepedonicus och bekräfta patogenitet (avsnitten 9 och 10).

Tolkning av resultatet av biotestet

Giltiga resultat från biotest erhålls om plantor från den positiva kontrollen uppvisar typiska symptom, bakterier kan omisoleras från dessa plantor och inga symptom återfinns på de negativa kontrollerna.

Biotestet är negativt om testplantorna inte är infekterade med C. m. subsp. sepedonicus och under förutsättning att C. m. subsp. sepedonicus påvisas i de positiva kontrollerna.

Biotestet är positivt om testplantorna är infekterade med C. m. subsp. sepedonicus.

8. ISOLERING AV C. M. SUBSP. SEPEDONICUS

Anmärkning:

Diagnosen är endast fullständig om C. m. subsp. sepedonicus isoleras, därefter identifieras (se avsnitt 9) och bekräftas av ett patogenitetstest (avsnitt 10). Trots att C. m. subsp. sepedonicus är en skadegörare som är svår att hantera är det möjligt att isolera den utgående från vävnad som visar symptom på angrepp.

Den kan emellertid kvävas av snabbt växande saprofytiska bakterier och därför är det svårt att utföra isolering direkt från pelleten av stjälk- eller knölvävnad (avsnitt 3.1.6 eller 3.2.5). Med ett selektivt substrat och lämplig utspädning av den återsuspenderade pelleten från potatisarnas naveländar eller stjälkar kan det vara möjligt att utföra direkt isolering av C. m. subsp. sepedonicus.

Isolering bör göras från alla potatisknölar och stjälksegment och från äggplantor som visserligen inte uppvisat symptom vid observation men vars blandprov givit negativt svar vid IF-/PCR-test (se avsnitt 7.10). Om nödvändigt bör finfördelning av äggplantsstjälkar utföras som i avsnitt 3.1.3.

Som positiva kontroller preparera decimala utspädningar från en suspension av 106 kolonibildande enheter per ml av C. m. subsp. sepedonicus (t.ex. NCPPB 4053 eller PD 406). För att undvika risk för nedsmittning, preparera positiva kontroller som är fullständigt åtskilda från de prover som skall testas.

För varje nyligen preparerat parti av selektivt substrat bör dess lämplighet för tillväxt av patogenet testas innan det används för att testa rutinprover.

Testa kontrollmaterialen exakt som provet (proven).

8.1 Odling på selektivt substrat

8.1.1 Från ett delprov på 100 µl från ett återsuspenderat potatispelletprov eller äggplantsväxtsaft gör exponentiella utspädningar i en pelletbuffert (tillägg 3).

8.1.2 Isolering från outspädd potatispellet misslyckas vanligen på grund av den komplicerade tillväxtkaraktären hos C. m. subsp. sepedonicus och konkurrens från saprofyterna. Eftersom bakterien vanligen förekommer i stora populationer i infekterade vävnader kan saprofyter vanligen spädas, samtidigt som patogenet kvarstår. Det rekommenderas därför att 100 µl från varje prov, 1/100 till 1/10 000 utspädningar sprids ut på MTNA-substrat eller NCP-88-substrat (tillägg 5) (om en 90 mm petriskål används, anpassa volymen efter alternativa skålstorlekar), varvid racklor och racklingsteknik används.

Anmärkning:

Ett alternativt tillvägagångssätt är att sprida ut den ursprungliga 100 µl potatispelletdelprovet på en första agarplatta med en rackla och därefter överföra racklan till en andra agarplatta, där alla eventuella rester på racklan stryks ut. Upprepa slutligen förfarandet på en tredje platta för att på så sätt få till stånd en utspädningsplatt-effekt med hjälp av racklan.

8.1.3 Inkubera plattorna i mörker vid 21–23 °C.

8.1.4 Inledande undersökningar av plattorna, inklusive, genom hänvisning till kontrollplattorna, räkning av alla C. m. subsp. sepedonicus–liknande kolonier sker efter 3 dagar, och ytterligare räkning sker efter 5, 7 och slutligen 10 dagar.

8.2 Rening av misstänkta kolonier

Anmärkning:

Subkulturodling av C. m. subsp. sepedonicus-liknande kolonier bör ske på YGM-substrat för inokulering av äggplantor och/eller efterföljande identifiering. Detta bör ske innan plantorna blir alltför stora, det vill säga helst efter 3–5 dagar.

8.2.1 Stryk C. m. subsp. sepedonicus-liknande kolonier på ett av följande substrat (formler anges i tillägg 5):

Näringsagar med dextros (endast för renkultur).

Agar med jäst, pepton och glukos.

Agar med jästextrakt och mineralsalter.

Inkubera i 21–24 °C i upp till 10 dagar.

C. m. subsp. sepedonicus växer långsamt och producerar knappnålsliknande, krämfärgade, kupolformade kolonier inom 10 dagar. (Foton på typiska kolonier av C. m. subsp. sepedonicus finns på kommissionens webbplats med adress http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

8.2.2 Stryk på nytt för att uppnå renhet.

Tillväxttakten förbättras genom renkulturodling. Typiska kolonier är krämvita eller elfenbensvita, ibland gula, runda, släta, upphöjda, kupolkonvexa, slemaktiga till flytande, har hela kanter och är vanligtvis 1–3 mm i diameter.

En enkel gramfärgning (tillägg 9) kan utföras för att underlätta att välja kolonier för ytterligare testning.

8.2.3 Identifiera presumtiva kulturer (se avsnitt 9) och gör ett patogenitetstest (se avsnitt 10).

9. IDENTIFIERING

Identifiera renkulturer av presumtiva C. m. subsp. sepedonicus-isolat genom att utföra minst två av följande tester baserade på olika biologiska principer.

Ta med kända referensstammar när så är lämpligt vid varje test som utförs.

9.1 Nutrient- och enzymatiska identifikationstester

Fastställ följande fenotypiska egenskaper som alltid är närvarande eller frånvarande i C. m. subsp. sepedonicus enligt metoderna Lelliott och Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001), anonym (1987).

Alla substrat bör inkuberas vid 21 °C och undersökas efter 6 dagar. Om ingen tillväxt har skett, inkubera i upp till 20 dagar.

Alla tester skall inbegripa en känd C. m. subsp. sepedonicus-kontroll. Näringstester och fysiologiska tester skall utföras med inokulat från subkulturer på näringsagar. De morfologiska jämförelserna skall göras på grundval av odlingar på näringsagar med dextros.

Försök Förväntat resultat Oxidations-/fermenteringstest (O/F-test) Inert eller svagt oxidativa Oxidasaktivitet – Tillväxt vid 37 °C – Ureasaktivitet – Hydrolys av aesculin + Hydrolys av stärkelse – eller svag Tolerans hos 7-procentig NaCl – Produktion av indol - Katalasaktivitet + Produktion av H2S – Utnyttjande av citrat – Smältning av gelatin – Syra från glycerol - Syra från laktos – eller svag Syra från ramnos – Syra från salicin – Gramfärgning (tillägg 9) +

9.2 IF-test

a) Preparera en suspension av ungefär 106 celler per ml i IF-buffert (tillägg 3).

b) Preparera en serie dubbla utspädningar av ett lämpligt antiserum.

c) Tillämpa IF-förfarandet (avsnitt 4).

d) Ett positivt IF-test erhålls om kulturen har samma IF-titer som den positiva kontrollen.

9.3 PCR-test

a) Preparera en suspension av ungefär 106 celler per ml i ultrarent vatten.

b) Upphetta 100 µl av cellsuspensionen i tillslutna rör i värmeblock eller kokande vattenbad i 100 °C under 4 minuter. Vid behov, tillsats av nyligen preparerad NaOH till en slutkoncentration av 0,05 M kan bidra till lysering av cellen. Proverna kan därefter lagras i –16 till –24 °C fram till användning.

c) Tillämpa lämpliga PCR-förfaranden för att amplifiera C. m. subsp. sepedonicus-specifika PCR-produkter (t.ex. Pastrik, 2000; se tillägg 4; Li och de Boer, 1995; Mills et al., 1997; Pastrik och Rainey, 1999; Schaad et al., 1999).

d) En positiv identifiering av C. m. subsp. sepedonicus erhålls om PCR-produkterna har samma storlek och samma RFLP (restriction fragment length polymorphisms) som den positiva kontrollstammen.

9.4 FISH-test

a) Preparera en suspension av ungefär 106 celler per ml i ultrarent vatten.

b) Tillämpa FISH-förfarandet (avsnitt 5).

c) Ett positivt FISH-test föreligger om samma reaktioner erhålls från kulturen och den positiva kontrollen.

9.5 Fettsyraprofilering (FAP)

a) Odla kulturen på trypticase-soja-agar (Oxoid) under 72 timmar i 21 °C (+/– 1°).

b) Tillämpa ett lämpligt FAP-förfarande (Janse, 1991; Stead, 1992).

c) Ett positivt FAP-test erhålls om den presumtiva kulturen har samma profil som den positiva kontrollen. Förekomsten av karakteristiska fettsyror är 15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso samt 16:0 och 17:0 Anteiso, vilket i hög grad tyder på C. m. sepedonicus. Andra sorter, såsom Curtobacterium, Arthrobacter and Micrococcus, innehåller också vissa av dessa syror, men 15:1 Anteiso A är en ovanligt syra i dessa bakterier. Den uppträder emellertid i alla Clavibacter spp. med en andel på 1–5 %. I C. m. sepedonicus är andelen vanligtvis omkring 5 %.

9.6 BOX-PCR

a) Preparera en suspension av ungefär 106 celler per ml i ultrarent vatten.

b) Utför testet enligt förfarandet (Smith et al., 2001).

10. VERIFIERINGSTEST

Patogenitetstestet skall utföras som en slutlig bekräftelse på en diagnos av C. m. subsp. sepedonicus och för att bedöma virulensen hos kulturer identifierade som C. m. subsp. Sepedonicus.

10.1 Preparera ett inokulat av ca 106 celler per ml av 3-dagarskulturer av det isolat som skall kontrolleras och en lämplig positiv kontrollstam av C. m. subsp. sepedonicus.

10.2 Inokulera 5–10 äggplantsstjälkar av unga småplantor i bladstadium 3 (avsnitt 7.3 eller 7.4).

10.3 Inkubera i 18–24 °C med tillräckligt ljus och hög relativ luftfuktighet med lämplig bevattning för att undvika vattenmättnad eller stress till följd av torka (avsnitt 7.7). Med renkulturer bör typiskt vissnande uppnås inom 2 veckor, men plantor som inte visar symptom (se avsnitt 7.8) efter denna tid bör inkuberas i upp till 3 veckor vid temperaturer som främjar äggplantornas tillväxt men som inte överstiger 25 °C (tillägg 8). Om inga symptom föreligger efter 3 veckor, kan det inte fastslås att kulturen är en patogen form av C. m. subsp. sepedonicus.

10.4 Isolera från plantor med symptom genom att avlägsna ett segment från stjälken på 2 cm ovanför inokuleringspunkten. Finfördela och suspendera i en liten volym sterilt destillerat vatten eller 50 mM fosfatbuffert (tillägg 3). Isolera från suspensionen genom utspädning. Rackla eller stryk därefter på MTNA och YPGA (tillägg 5), inkubera under 3–5 dagar i 21–23 °C och observera bildandet av kolonier typiska för C. m. subsp. sepedonicus.

Tillägg 1 Laboratorier som utför optimering och validering av protokoll Laboratorium (1) Plats Land Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Wien och Linz Österrike Departement Gewasbescherming Merelbeke Belgien Plantedirektoratet Lyngby Danmark Central Science Laboratory York England Scottish Agricultural Science Agency Edinburgh Skottland Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité de Bactériologie Angers Frankrike Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre Le Rheu Frankrike Biologische Bundesanstalt Kleinmachnow Tyskland Pflanzenschutzamt Hannover Hannover Tyskland State Laboratory Dublin Irland Plantenziektenkundige Dienst Wageningen Nederländerna Norwegian Crop Research Institute, Plant Protection Centre Ås Norge Direcção-Geral de Protecção das Culturas Lissabon Portugal Nacionalni institut za biologijo Ljubljana Slovenien Centro de Diagnostico de Aldearrubia Salamanca Spanien (1) Kontaktuppgifter för personalen finns på kommissionens webbplats (http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Tillägg 2 Preparering av positiva och negativa kontroller för screeningtesterna av naveländar PCR/IF och FISH Framställ en 72-timmarskultur av en virulent stam av C. m. subsp. sepedonicus (NCPPB 4053 eller PD 406) på MTNA och suspendera i 10 mM fosfatbuffert för att erhålla en celltäthet av omkring 1-2 × 108 kolonibildande enheter per ml. Detta erhålls vanligtvis genom en svagt grumlig suspension med en optisk densitet av 0,20 vid 600 nm. Avlägsna naveländarna från 200 knölar tagna från en odling som är känd för att vara fri från C. m. subsp. sepedonicus och där potatis med vitt skal odlas. Behandla naveländarna på vanligt sätt och suspendera pelleten i 10 ml. Preparera 10 sterila 1,5 ml mikrorör med 900 µl av den återsuspenderade pelleten. Överför 100 µl av suspensionen av C. m. subsp. sepedonicus till det första mikroröret. Skaka. Fastställ decimala kontamineringsnivåer genom ytterligare spädning i de andra fem mikrorören. De sex smittade mikrorören används som positiva kontroller. De fyra icke-smittade mikrorören används som negativa kontroller. Märk mikrorören i överensstämmelse härmed. Preparera delprover på 100 µl i steril 1,5 ml mikrorör och erhåll på så sätt 9 repliker av varje kontrollprov. Lagra i –16 till –24 °C fram till användning. Förekomsten och kvantifieringen av C. m. subsp. sepedonicus i kontrollproverna bör först bekräftas via IF. För PCR-testet, gör DNA-extraktion från de positiva och negativa kontrollproven för varje serie av testprover. För IF- och FISH-testen, gör testerna på de positiva och negativa kontrollproven för varje serie av testprover. För IF-, FISH- and PCR-testerna skall C. m. subsp. sepedonicus påvisas i minst 106–104 celler/ml i de positiva kontrollerna och inte i någon i de negativa kontrollerna.

Tillägg 3 Buffertar för testförfarandena ALLMÄN ANMÄRKNING: Oöppnade steriliserade buffertar kan förvaras i upp till ett år. 1. Buffertar för extraktionsförfarande 1.1 Extraktionsbuffert (50 mM fosfatbuffert, pH 7,0) Denna buffert används för extraktion av bakterien från plantvävnader genom homogenisering eller skakning. Na2HPO4 (vattenfri) 4,26 g KH2PO4 2,72 g Destillerat vatten 1,00 l Lös upp ingredienserna, kontrollera pH och sterilisera i autoklav i 121 °C under 15 minuter. Ytterligare komponenter kan vara av nytta enligt följande: Syfte Kvantitet (per l) Lubrolflingor Deflockulering (1) 0,5 g DC-silikonskumdämpning Skumdämpningsmedel (1) 1,0 ml Tetranatriumpyrofosfat Antioxidant 1,0 g Polyvinylpyrrolidon-40 000 (PVP-40) Bindning av PCR-inhibitorer 50 g 1.2 Pelletbuffert (10 mM fosfatbuffert, pH 7,2) Denna buffert används för återsuspension och utspädning av extrakt av naveländar från potatisknölar efter koncentration till en pellet följd av centrifugering. Na2HPO4.12H2O 2,7 g NaH2PO4.2H2O 0,4 g Destillerat vatten 1,00 l Lös upp ingredienserna, kontrollera pH och sterilisera i autoklav i 121 °C under 15 minuter. 2. Buffertar för IF-test 2.1 IF-buffert (10 mM fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,2) Denna buffert används för utspädning av antikroppar. Na2HPO4.12H2O 2,7 g NaH2PO4.2H2O 0,4 g NaCl 8,0 g Destillerat vatten 1,0 l Lös upp ingredienserna, kontrollera pH och sterilisera i autoklav i 121 °C under 15 minuter. 2.2 IF-buffert – Tween Denna buffert används för att tvätta objektglas. Tillsätt 0,1 % Tween 20 till IF-bufferten. 2.3 Fosfatbuffrad glycerol, pH 7,6 Denna buffert används som monteringsvätska på fönstren av IF-glas för att förbättra fluorescensen. Na2HPO4.12H2O 3,2 g NaH2PO4.2H2O 0,15 g Glycerol 50 ml Destillerat vatten 100 ml Inbäddningslösning som motverkar blekning finns i handeln, t.ex. Vectashield® (Vector Laboratories) och Citifluor® (Leica). (1) Används med homogeniseringsextraktionsmetoden.

Tillägg 4 Bestämning av kontamineringsnivå i IF- och FISH-tester 1. Räkna medeltalet typiska fluorescerande celler per synligt fält (c). 2. Beräkna antalet typiska fluorescerande celler per objektglasfönster (C). C = c × S/s där S = multispotglasets fönsteryta, och s = objektivfältets yta

s = πi2/4G2K2 där i = synfältskoefficient (varierar från 8 till 24 beroende på typen av okular) K = tubkoefficient (1 eller 1,25) G = objektivets förstoring (100×, 40× osv.). 3. Beräkna antalet typiska fluorescerande celler per ml återsuspenderad pellet (N) N = C × 1 000/y × F där y = volym av återsuspenderad pellet på varje fönster, och F = den återsuspenderade pelletens utspädningsfaktor.

Tillägg 5 Substrat för isolering och odling av C. m. subsp. sepedonicus a) Allmänna odlingssubstrat Näringsagar (NA) Näringsagar (Difco) 23,0 g Destillerat vatten 1,0 l Lös upp ingredienserna och sterilisera i autoklav i 121 °C under 15 minuter. Näringsagar med dextros (NDA) Difco Bacto näringsagar innehållande 1-procentig D(+)-glukos (monohydrat). Steriliseras i autoklav vid 115 °C i 20 minuter. Agar med jäst, pepton och glukos (YPGA) Jästextrakt (Difco) 5,0 g Bacto pepton (Difco) 5,0 g D(+)-glukos (monohydrat) 10,0 g Bacto agar (Difco) 15,0 g Destillerat vatten 1,0 l Lös upp ingredienterna och sterilisera i autoklav i 121 °C under 15 minuter. Agar med jästextrakt och mineralsalter (YGM) Bacto jästextrakt (Difco) 2,0 g D(+)-glukos (monohydrat) 2,5 g K2HPO4 0,25 g KH2PO4 0,25 g MgSO4.7H2O 0,1 g MnSO4.H2O 0,015 g NaCl 0,05 g FeSO4.7H2O 0,005 g Bacto agar (Difco) 18 g Destillerat vatten 1,0 l Lös upp ingredienserna och sterilisera 0,5 liter av substrat i autoklav vid 115 °C under 20 minuter. b) Validerade selektiva odlingssubstrat MTNA-substrat Om inte annat anges kommer substratens beståndsdelar från BDH Jästextrakt (Difco) 2,0 g Mannitol 2,5 g K2HPO4 0,25 g KH2PO4 0,25 g NaCl 0,05 g MgSO4.7H2O 0,1 g MnSO4.H2O 0,015 g FeSO4.7H2O 0,005 g Agar (Oxoid nr 1) 16,0 g Destillerat vatten 1,0 l Lös upp ingredienserna, justera pH till 7,2. Efter sterilisering i autoklav vid 121 °C i 15 minuter och nedkylning till 50 °C, tillsätt följande antibiotika: trimetoprim 0,06 g, nalidixinsyra 0,002 g och amfotericin B 0,01 g. Antibiotiska utgångslösningar: trimetoprim (Sigma) and nalidixinsyra (Sigma) (båda vid 5 mg/ml), i 96-procentig metanol, amfotericin B (Sigma) (1 mg/ml) i dimetylsulfoxid. Utgångslösningarna är filtersteriliserade. Anmärkning: Bassubstratens hållbarhet är 3 månader. Efter tillsats av antibiotika är hållbarheten 1 månad vid förvaring nedkylt. NCP-88-substrat Näringsagar (Difco) 23 g Jästextrakt (Difco) 2 g D-mannitol 5 g K2HPO4 2 g KH2PO4 0,5 g MgSO4.7H2O 0,25 g Destillerat vatten 1,0 l Lös upp ingredienserna, justera pH till 7,2. Efter sterilisering i autoklav och nedkylning till 50 °C, tillsätt följande antibiotika: polymyxin B-sulfat (Sigma) 0,003 g, nalidixinsyra (Sigma) 0,008 g och cykloheximid (Sigma) 0,2 g. Lös antibiotikan i utgångslösningarna enligt följande: nalidixinsyra i 0,01 M NaOH, cykloheximid i 50 % etanol, polymyxin B-sulfat i destillerat vatten. Utgångslösningarna är filtersteriliserade. Anmärkning: Bassubstratens hållbarhet är 3 månader. Efter tillsats av antibiotika är hållbarheten 1 månad vid förvaring nedkylt.

Tillägg 6 Validerade PCR-protokoll och PCR-reagens Anmärkning: Preliminär testning bör möjliggöra reproducerbar upptäckt av minst 103–104 celler av C. m. subsp. sepedonicus per ml provextrakt. Den preliminära testningen bör dessutom inte visa några falska positiva resultat med en grupp utvalda bakteriestammar. 1. Multiplexa PCR-protokoll med intern PCR-kontroll (Pastrik, 2000) 1.1 Oligonukleotidprimrar Forward primer PSA-1 5′- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3′ Reverse primer PSA -R 5′- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3′ Forward primer NS-7-F 5′- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3′ Reverse Primer NS-8-R 5′- tcc gca ggt tca cct acg ga -3′ Förväntad storlek på produkter från DNA-templat från C. m. subsp. sepedonicus = 502 bp (PSA-primerset). Förväntad storlek på produkter från 18S rRNA intern PCR-kontroll = 377 bp (NS-primerset). 1.2 PCR-reaktionsblandningen Reagens Kvantitet per reaktion Slutlig koncentration Sterilt ultrarent vatten 15,725 µl 10× PCR-buffert (1) (15 mM MgCl2) 2,5 µl 1× (1,5 mM MgCl2) BSA (fraktion V) (10 %) 0,25 µl 0,1 % d-nTP-blandning (20 mM) 0,125 µl 0,1 mM Primer PSA-1 (10µM) 0,5 µl 0,2 µM Primer PSA-R (10µM) 0,5 µl 0,2 µM Primer NS-7-F (10µM) (2) 0,1 µl 0,04 µM Primer NS-8-R (10µM) (2) 0,1 µl 0,04 µM Taq polymerase (5U/µl) (1) 0,2 µl 1,0 U Provvolym 5,0 µl Total volym 25,0 µl 1.3 PCR-reaktionsbetingelser Kör följande program: 1 cykel: i) 3 minuter vid 95 °C (denaturering av DNA-templat) 10 cykler: ii) 1 minut vid 95 °C (denaturering av DNA-templat) iii) 1 minut vid 64 °C (påkoppling av primers) iv) 1 minut vid 72 °C (förlängning av kopia) 25 cykler: v) 30 sekunder vid 95 °C (denaturering av DNA-templat) vi) 30 sekunder vid 62 °C (påkoppling av primers) vii) 1 minut vid 72 °C (förlängning av kopia) 1 cykel: viii) 5 minuter vid 72 °C (slutlig förlängning) ix) håll temperaturen vid 4 °C. Anmärkning: Det här programmet är optimerat för användning med en MJ Research PTC 200 termocykelapparat. Vid användning av andra modeller kan det komma att krävas modifiering av cyklerna ii, iii, iv, v, vi och vii. 1.4 Restriktionsenzymanalys av produkten PCR-produkter som amplifierats från DNA från C. m. subsp. sepedonicus producerar distinkt RFLP (”restriction fragment length polymorphism”) med enzymet Bgl II efter inkubation vid 37 °C under 30 minuter. De restriktionsfragment som erhållits från fragment specifika för C. m. subsp. sepedonicus är 282 bp och 220 bp i storlek. 2. Preparering av laddningsbuffert 2.1 Bromtymolblått (10-procentig utgångslösning) Bromtymolblått 5 g Destillerat vatten (dubbeldestillerat) 50 ml 2.2 Laddningsbuffert Glycerol (86 %) 3,5 ml Bromtymolblått (5,1) 300 µl Destillerat vatten (dubbeldestillerat) 6,2 ml 3. 10× Tris-Acetat-EDTA (TAE) buffert, pH 8,0 Tris-buffert 48,4 g Iskall ättiksyra 11,42 ml EDTA (dinatriumsalt) 3,72 g Destillerat vatten 1,00 l Späd till 1x före användning. Finns även att köpa i handeln (t.ex. Invitrogen eller motsvarande). (1) Metoderna validerades med Taq polymeras från Perkin Elmer (AmpliTaq eller Gold) och Gibco BRL. (2) Koncentrationen av primrarna NS-7 F och NS-8-R optimerades för extraktion av potatisars naveländar med användning av homogeniseringsmetoden och DNA-rening enligt Pastrik (2000) (se avsnitt 6.1 a och 6.2). Reoptimering av reagenskoncentrationerna krävs om extraktion genom skakning eller andra metoder för isolering av DNA används.

Tillägg 7 Validerade reagens för FISH-test 1. Oligo-prober Cms-specifik probe CMS-CY3-01: 5’- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3’ Icke-specifik eubacterial prob EUB-338-FITC: 5’- gct gcc tcc cgt agg agt-3’ 2. Fixeringslösning (VARNING! FIXERINGSVÄTSKAN INNEHÅLLER PARAFORMALDEHYD, SOM ÄR GIFTIG. BÄR HANDSKAR OCH ANDAS INTE IN GASEN. DET ÄR TILLRÅDLIGT ATT ARBETA I ETT DRAGSKÅP.) i) Upphetta 9 ml vatten av molekylärbiologisk kvalitet (t.ex. ultrarent vatten) till ca 60 °C och tillsätt 0,4 g paraformaldehyd. Paraformaldehyden löses efter tillsats av 5 droppar 1N NaOH och omrörning med magnetomrörare. ii) Justera pH till 7,0 genom tillsats av 1 ml 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,0) och 5 droppar 1N HCl. Kontrollera pH med indikatorpapper och justera vid behov med HCl eller NaOH. (VARNING! ANVÄND INTE EN PH-MÄTARE I VÄTSKOR MED PARAFORMALDEHYD.) iii) Filtrera lösningen genom ett 0,22 µm membranfilter och förvara dammfritt i 4 °C fram till användning. iv) Anmärkning: Alternativ fixeringslösning: 96-procentig etanol. 3. 3x Hybmix NaCl 2,7 M Tris-HCl 60 mM (pH 7,4) EDTA (filter steriliserat och autoklaverat) 15 mM Späd till 1x i enlighet med kraven. 4. Hybridiseringslösning 1× Hybmix Natriumdodecylsulfat (SDS) 0,01 % prob EUB 338 5 ng/μl prob CMSCY301 5 ng/μl Preparera de kvantiteter av hybridiseringslösning som anges i beräkningarna i tabell 1. För varje glas (innehållande 2 olika prover i duplikat) krävs 90 μl hybridiseringslösning. Tabell: Föreslagna kvantiteter för preparering av hybridiseringslösning. 2 glas 8 glas Sterilt ultrarent vatten 50,1 200,4 3x hybmix 30,0 120,0 1 % SDS 0,9 3,6 Probe EUB 338 (100 ng/μl) 4,5 18,0 Probe CMSCY301 (100 ng/μl) 4,5 18,0 Total volym (μl) 90,0 360,0 Anmärkning: Lagra alla lösningar innehållande ljuskänsliga oligo-prober mörkt i -20 °C. Skydda mot direkt solljus eller elektriskt ljus vid användning. 5. 0,1 M fosfatbuffert, pH 7,0 Na2HPO4 8,52 g KH2PO4 5,44 g Destillerat vatten 1,00 l Lös upp ingredienserna, kontrollera pH och sterilisera i autoklav i 121 °C under 15 minuter.

Tillägg 8 Odling av äggplantor Så fröer av äggplanta (Solanum melongena) i steril såjord. Plantera ut fröplantorna i steril planteringsjord då hjärtbladen är helt utvecklade (10 till 14 dagar). Äggplantor bör odlas i växthus under följande miljöförhållanden: Dagslängd 14 timmar eller naturlig dagslängd om längre Temperatur: dag: 21–24 °C natt: 15 °C

Mottagliga äggplantssorter: ”Black Beauty” ”Long Tom” ”Rima” ”Balsas” Information om leverantören finns på kommissionens webbplats (http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).