Kommissionens beslut

av den 22 februari 2001

om fastställande av provtagningsplaner och diagnostiska metoder för påvisande och bekräftelse av vissa fisksjukdomar och om upphävande av beslut 92/532/EEG

[delgivet med nr K(2001) 426]

(Text av betydelse för EES)

(2001/183/EG)

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR FATTAT DETTA BESLUT

med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen,

med beaktande av rådets direktiv 91/67/EEG av den 28 januari 1991 om djurhälsovillkor för utsläppande på marknaden av djur och produkter från vattenbruk(1), senast ändrat genom direktiv 98/45/EG(2), särskilt artikel 15 i detta, och

av följande skäl:

(1) Provtagningsplanerna och de diagnostiska metoderna för påvisande och bekräftelse av vissa fisksjukdomar fastställs i kommissionens beslut 92/532/EEG(3), senast ändrat genom kommissionens beslut 96/240/EG(4).

(2) Sedan beslut 92/532/EEG fattades har både tekniska och vetenskapliga framsteg skett, och direktiv 91/67/EEG har ändrats. Detta innebär att provtagningsplaner och diagnostiska metoder måste moderniseras.

(3) Ändringarna gäller undersökning och identifiering av virus som orsakar viral hemorragisk septikemi (VHS) och smittsam hematopoetisk nekros (IHN) samt anpassning till ändringarna av direktiv 91/67/EEG.

(4) Gemenskapens referenslaboratorium för fisksjukdomar, som inrättades genom rådets direktiv 93/53/EEG(5), har rådfrågats.

(5) De provtagningsplaner och diagnostiska metoder för påvisande och bekräftelse av vissa fisksjukdomar som infördes genom beslut 92/532/EEG måste för klarhetens skull upphävas.

(6) De åtgärder som föreskrivs i detta beslut är förenliga med yttrandet från Ständiga veterinärkommittén.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Provtagningsplaner och diagnostiska metoder för påvisande och bekräftelse av viral hemorragisk septikemi (VHS) och infektiös hematopoetisk nekros (IHN) fastställs i bilagan.

Artikel 2

Detta beslut upphäver beslut 92/532/EEG.

Artikel 3

Detta beslut riktar sig till alla medlemsstater.

Utfärdat i Bryssel den 22 februari 2001.

På kommissionens vägnar

David Byrne

Ledamot av kommissionen

(1) EGT L 46, 19.2.1991, s. 1.

(2) EGT L 189, 3.7.1998, s. 12.

(3) EGT L 337, 21.11.1992, s. 18.

(4) EGT L 79, 29.3.1996, s. 19.

(5) EGT L 175, 19.7.1993, s. 23.

BILAGA

PROVTAGNINGSPLANER OCH DIAGNOSTISKA METODER FÖR PÅVISANDE OCH BEKRÄFTELSE AV VIRAL HEMORRAGISK SEPTIKEMI (VHS) OCH INFEKTIÖS HEMATOPOETISK NEKROS (IHN)

INLEDNING

Denna bilaga

a) innehåller riktlinjer och minimikrav för provtagningsplaner och diagnostiska metoder för påvisande och bekräftelse av viral hemorragisk septikemi (VHS) och infektiös hematopoetisk nekros (IHN),

b) införlivar bestämmelserna från bilagorna B och C till direktiv 91/67/EEG om godkännande och fortsatt godkännande av zoner och av anläggningar i icke godkända zoner,

c) innehåller bestämmelser för korrekt diagnostisering av VHS och IHN och för officiellt godkännande av zoner och av anläggningar i icke godkända zoner i enlighet med artiklarna 5 och 6 i direktiv 91/67/EEG,

d) riktar sig både till de myndigheter som ansvarar för kontrollen av VHS och IHN och den laboratoriepersonal som utför testerna för dessa sjukdomar. Därför är texten inriktad på provtagningsförfaranden, principer för och tillämpning av laboratorietester och utvärdering av testresultaten samt på detaljerade beskrivningar av laboratoriemetoder. Vid behov får laboratorierna dock anpassa de test som beskrivs i denna bilaga eller använda andra test, förutsatt att det kan visas att testens känslighet och specificitet är lika god.

Del I innehåller provtagningsplaner och diagnostiska metoder för den övervakning av VHS och IHN som krävs för godkännande och fortsatt godkännande av zoner och av anläggningar i icke godkända zoner.

I del II beskrivs diagnostiska metoder för att bekräfta VHS och IHN då man misstänker sjukdom.

Del III innehåller kriterier och riktlinjer för ett officiellt hälsokontrollprogram som dokumenterar historisk frihet från VHS och/eller IHN.

I del IV ges rekommendationer för virustitrering av VHS och IHN för att bekräfta cellkulturens mottaglighet för infektion.

Förkortningarna finns förklarade i del V.

DEL I

Provtagningsplaner och diagnostiska metoder för den övervakning av VHS och IHN som krävs för godkännande och fortsatt godkännande av en zon eller en anläggning i en icke godkänd zon

I. Inspektioner och provtagning

1. Allmänna bestämmelser för kliniska hälsoinspektörer, insamling och urval av prover för den övervakning av zoner eller av anläggningar i icke godkända zoner som krävs för godkännande eller fortsatt godkännande med avseende på VHS och/eller IHN

I tabell 1A, 1B och 1C sammanfattas informationen om de kliniska hälsoinspektioner och den provtagning på vävnad och/eller ovarievätska hos fisk som enligt bilagorna B och C i direktiv 91/67/EEG måste göras i zoner, eller på anläggningar i icke godkända zoner, för godkännande eller fortsatt godkännande med avseende på VHS och/eller IHN. Ytterligare information finns i I.I.2-I.I.4. Tabell 1A och 1B skall inte tillämpas på anläggningar som är nya eller som tas i drift på nytt med fisk, ägg eller gameter från en godkänd zon eller från en godkänd anläggning i en icke godkänd zon, förutsatt att de uppfyller kraven i direktiv 91/67/EEG, bilaga C, del I.A6 a, I.A6 b, II.A3 a eller II.A3 b.

De kliniska inspektionerna måste genomföras under perioden oktober-juni eller när vattentemperaturen ligger under 14 °C. När anläggningar inspekteras kliniskt två gånger per år måste det gå minst fyra månader mellan inspektionerna. Alla produktionsenheter (dammar, tankar, kassar etc.) måste inspekteras med avseende på förekomst av fisk som har dött, är svag eller beter sig onormalt. Särskild uppmärksamhet skall ägnas området kring vattenutsläpp, där svag fisk brukar samlas på grund av det strömmande vattnet.

Fisk för provtagning skall väljas ut på följande sätt:

- Om regnbågslax förekommer skall inga andra fiskarter ingå i provet. Om regnbågslax inte förekommer skall provet innehålla befintliga fiskarter om dessa är mottagliga för VHSV eller IHNV (enligt förteckningen i bilaga A till direktiv 91/67/EEG). De olika fiskarterna skall vara proportionellt representerade i provet.

- Om mer än en vattentäkt används för fiskproduktion, skall fisk från samtliga vattentäkter ingå i proven.

- Om det förekommer svaga fiskar eller fiskar som nyligen dött (ej ruttnande) skall i första hand dessa ingå i provet. Om det inte finns sådana fiskar, skall det i provet ingå friska individer med normalt beteende som samlats in på sådant sätt att såväl anläggningens alla delar som alla årsklasser blir proportionellt representerade i provet.

2. Särskilda bestämmelser, inbegripet insamling av prover, för den övervakning av anläggningar i icke godkända zoner som krävs för godkännande eller fortsatt godkännande med avseende på VHS och/eller IHN

1. En zon eller en anläggning i en icke godkänd zon som den officiella myndigheten har satt under övervakning kan godkännas med avseende på VHS och/eller IHN på grundval av något av följande:

a) Modell A - tvåårigt övervakningsprogram:

Efter det att inga kliniska eller andra tecken på VHS och/eller IHN har konstaterats under minst två år måste alla anläggningar i den zon som skall godkännas eller alla anläggningar som skall godkännas i icke godkända zoner gå igenom en hälsoinspektion minst två gånger per år i två år. Under den tvååriga kontrollperioden som föregår godkännandet får inga kliniska eller andra tecken på VHS och/eller IHN konstateras och alla prover som skall undersökas måste samlas in i enlighet med tabell 1A. Vidare måste proverna väljas, beredas och undersökas enligt beskrivningen i I.I-I.IV och laboratorieundersökningarna måste ge negativt resultat för VHS och/eller IHN.

b) Modell B - tvåårigt övervakningsprogram med mindre provvolym:

Efter det att historisk frihet från VHS och/eller IHN har konstaterats genom ett officiellt hälsokontrollprogram som löpt under minst fyra år måste alla anläggningar i den zon som skall godkännas eller alla anläggningar som skall godkännas i icke godkända zoner gå igenom en hälsoinspektion minst två gånger per år i två år. Under den tvååriga kontrollperioden som föregår godkännandet får inga kliniska eller andra tecken på VHS och/eller IHN konstateras och alla prover som skall undersökas måste samlas in i enlighet med tabell 1B. Vidare måste proverna väljas, beredas och undersökas enligt beskrivningen i I.I-I.IV och laboratorieundersökningarna måste ge negativt resultat för VHS och/eller IHN. Ett hälsokontrollprogram måste uppfylla de kriterier och riktlinjer som anges i del III för att kunna godkännas av de officiella myndigheterna som en dokumentation på historisk frihet från VHS och/eller IHN.

2. Särskilda bestämmelser för godkännande av anläggningar som är nya eller som tas i drift på nytt med fisk, ägg eller gameter från en godkänd zon eller en godkänd anläggning i en icke godkänd zon.

Anläggningar som är nya eller som tas i drift på nytt med fisk, ägg eller gameter från en godkänd zon eller från en godkänd anläggning i en icke godkänd zon får godkännas om de uppfyller kraven i direktiv 91/67/EEG, bilaga C, del I.A6 a/b eller II.A3 a/b. Bestämmelserna för provtagning enligt modell A och B ovan (del I.I.2.1 a och I.I.2.1 b) skall därför inte gälla för sådana anläggningar.

3. Övervakningsprogram för fortsatt godkännande med avseende på VHS och/eller IHN.

Fortsatt godkännande av en zon eller av en anläggning i en icke godkänd zon med avseende på VHS och/eller IHN kräver att inspektioner och provtagning för undersökning görs i enlighet med tabell 1C. Proverna måste väljas, beredas och undersökas enligt beskrivningen i I.I-I.IV och laboratorieundersökningarna måste ge negativt resultat för VHS och/eller IHN.

3. Beredning och transport av fiskprover

Före transport eller överföring till laboratoriet skall de organdelar som skall undersökas avlägsnas från fiskarna med sterila dissektionsinstrument och överföras till sterila plaströr som innehåller transportmedium, dvs. cellodlingsmedium med 10 % kalvserum och antibiotika. En kombination av 200 IE penicillin, 200 μg streptomycin och 200 μg kanamycin per milliliter (ml) rekommenderas, men även annan antibiotika med beprövad verkan får användas. De vävnader som skall undersökas är mjälten, främre njuren och dessutom antingen hjärtat eller encephalon. I vissa fall måste ovarievätskan undersökas (tabell 1A-C).

Ovarievätska eller organdelar från högst tio fiskar (tabell 1A-C) får samlas in i ett sterilt rör som innehåller minst 4 ml transportmedium och utgör ett samlingsprov. Vävnaderna i varje prov bör väga minst 0,5 g.

Rören skall placeras i isolerade behållare (t.ex. tjockväggiga polystyrenlådor) med så mycket is eller frysklampar att proverna hålls kylda under transporten till laboratoriet. Frysning skall undvikas. Provernas temperatur under transporten får aldrig överstiga 10 °C och vid mottagningen av proverna måste det antingen finnas is kvar eller måste ett eller flera av frysblocken fortfarande vara helt eller delvis frysta.

Den virologiska undersökningen måste inledas så snart som möjligt inom 48 timmar efter insamling av proverna. I undantagsfall(1) får den virologiska undersökningen inledas senast 72 timmar efter insamlingen av prover, förutsatt att det material som skall undersökas skyddas av transportmedium och att temperaturkraven under transport uppfylls (I.I.3, punkt 3).

Hel fisk får skickas till laboratoriet om temperaturkraven under transporten kan uppfyllas. Hel fisk får slås in i absorberande papper och skickas i plastpåsar, kylda på ovan angivna sätt. Också levande fisk får skickas.

All packning och etikettering måste följa nationella och internationella transportbestämmelser.

4. Insamling av kompletterande material för diagnostik

Efter överenskommelse med det berörda diagnostiklaboratoriet får även andra fiskvävnader samlas in och beredas för kompletterande undersökningar.

II. Beredning av prover för virologisk undersökning

1. Frysning i undantagsfall

Om det uppstår praktiska svårigheter (t.ex. dåligt väder, lediga dagar, laboratorieproblem etc.) som gör det omöjligt att inokulera cellerna inom 48 timmar efter insamling av vävnadsproverna kan man frysa proverna i cellodlingsmedium vid en temperatur av - 20 °C eller lägre och göra den virologiska undersökningen inom 14 dagar. Vävnaderna får dock frysas och tinas endast en gång före undersökning. Register måste föras över skälen till varje frysning av vävnadsprover (t.ex. oväder eller cellinjer som dör).

2. Homogenisering av organ

På laboratoriet skall vävnaderna i rören homogeniseras fullständigt (antingen med stomacher eller mixer, eller med mortel och stöt med steril sand) och därefter blandas med det ursprungliga transportmediet.

Om ett prov består av hela fiskar som är mindre än 4 cm skall dessa sönderdelas med steril sax eller skalpell efter det att kroppen bakom analöppningen har avlägsnats. Om ett prov består av hela fiskar som är mellan 4 och 6 cm långa skall inälvorna inklusive njuren tas till vara. Om ett prov består av hela fiskar som är längre än 6 cm skall vävnadsprover tas enligt beskrivningen i I.I.3. Vävnadsproverna skall sönderdelas med steril sax eller skalpell, homogeniseras enligt ovan och blandas med transportmedium.

Det slutliga förhållandet mellan vävnadsmaterial och transportmedium skall på laboratoriet justeras till 1:10.

3. Centrifugering av homogenatet

Homogenatet skall centrifugeras i en kylcentrifug vid 2-5 °C vid 2000-4000 x g i 15 minuter, varefter supernatanten samlas upp och behandlas med antibiotika. Exempelvis gentamicin 1 mg/ml kan vara lämpligt på detta stadium, antingen i fyra timmar vid 15 °C eller över natten vid 4 °C.

Om provet har transporterats i särskilt medium (dvs. med tillsats av antibiotika) kan man utelämna behandlingen av supernatanten med antibiotika.

Behandlingen med antibiotika utförs för att förhindra bakteriell förorening av provet och gör filtrering genom membranfilter onödig.

Om den insamlade supernatanten lagras vid - 80 °C inom 48 timmar efter provtagningen får den tinas och återanvändas endast en gång för virologisk undersökning.

Om det uppstår praktiska svårigheter (t.ex. om inkubatorn inte fungerar eller om man får problem med cellkulturer) som gör det omöjligt att inokulera cellerna inom 48 timmar efter det att vävnadsproverna samlats in kan man frysa supernatanten vid 80 °C och utföra den virologiska undersökningen inom 14 dagar.

Före inokuleringen av cellerna blandas supernatanten med lika delar av en på lämpligt sätt utspädd pool av antiserum till de inhemska serotyperna av IPN-virus och inkuberas med detta i minst en timme vid 15 °C eller högst 18 timmar vid 4 °C. Antiserumets titer måste vara minst 1:2000 i ett 50 % plackneutralisationstest.

Syftet med att behandla alla inokulat med antiserum mot IPN-viruset (ett virus som i vissa delar av Europa finns i 50 % av alla fiskprover) är att förhindra att CPE orsakad av IPN-virus utvecklas i inokulerade cellkulturer. Detta förkortar tiden för de virologiska undersökningarna och ger färre fall där förekomsten av CPE skulle kunna uppfattas som en potentiell indikation på VHSV eller IHNV.

När prover kommer från produktionsenheter som anses fria från IPN, kan behandling av inokulat med antiserum mot IPN utelämnas.

III. Virologisk undersökning

1. Cellkulturer och medier

Antingen BF-2 eller RTG-2 och antingen EPC- eller FHM-celler odlas vid 20-30 °C i lämpligt medium, t.ex. Eagle's MEM (eller modifieringar därav) med tillsats av 10 % fetalt bovinserum och antibiotika i standardkoncentrationer.

När cellerna odlas i slutna flaskor, rekommenderas att mediet buffras med bikarbonat. Det medium som används för cellkulturer i öppna kärl kan buffras med Tris-HCl (23 mM) och natriumbikarbonat (6 mM). pH-värdet skall vara 7,6 +- 0.2.

Cellkulturer som skall användas för inokulering med vävnadsmaterial bör vara unga (4-48 timmar) och i aktiv tillväxt (inte konfluenta) vid inokuleringen.

2. Inokulering av cellkulturer

Antibiotikabehandlade organsuspensioner skall inokuleras i cellkulturer i två spädningar, dvs. primärspädningen plus en spädning på 1:10 av denna som resulterar i slutliga spädningar av vävnadsmaterialet i cellkulturens medium på 1:100 respektive 1:1000 (för att förhindra homolog interferens). Minst två cellinjer måste inokuleras (se I.III.1). Förhållandet mellan inokulatets storlek och volymen cellodlingsmedium bör vara cirka 1:10.

För varje spädning och varje cellinje skall minst cirka 2 cm2 cellyta användas, motsvarande en brunn i en cellodlingsplatta med 24 brunnar. Användning av cellodlingsplattor rekommenderas, men andra cellodlingskärl med motsvarande eller större växtyta kan också accepteras.

3. Inkubering av cellkulturer

Inokulerade cellkulturer skall inkuberas vid 15 °C i 7-10 dagar. Om färgen i cellkulturens medium ändras från rött till gult som tecken på att mediet håller på att försuras, skall pH-värdet justeras med steril bikarbonatlösning eller likvärdiga ämnen för att säkerställa cellkulturens mottaglighet för virusinfektion.

Minst var sjätte månad eller så snart man misstänker att cellernas mottaglighet för infektion har minskat skall frusna förråd av VHSV och IHNV titreras på cellkulturerna. Det rekommenderade förfarandet beskrivs i del IV.

4. Mikroskopering

Inokulerade cellkulturer måste regelbundet (minst tre gånger i veckan) kontrolleras vid 40-150 gångers förstoring för förekomst av CPE. Om tydlig CPE iakttas skall identifiering av virus enligt del I.IV påbörjas omedelbart.

5. Odling av subkulturer

Om CPE inte har utvecklats efter 7-10 dagars primärinkubation, skall subkulturer odlas med friska cellkulturer, varvid cellytan skall vara lika stor som i primärkulturen.

Lika delar av medium (supernatant) från samtliga kulturer/brunnar som utgör primärkulturen slås samman 7-10 dagar efter inokuleringen. Blandningarna inokuleras sedan i homologa cellkulturer outspädda och i spädning 1:10 (som resulterar i slutliga spädningar av supernatanten på 1:10 respektive 1:100) enligt beskrivning i I.III.2. Alternativt inokuleras portioner om 10 % av mediet som utgör primärkulturen direkt i en brunn med frisk cellkultur (odling av subkulturer från brunn till brunn). Inokuleringen får föregås av preinkubation av de utspädda lösningarna med antiserum mot IPN-virus i lämplig spädning enligt beskrivning i I.II.3.

De inokulerade kulturerna inkuberas därefter i 7-10 dagar vid 15 °C och observeras enligt beskrivningen i del I.III.4.

Om toxisk CPE påträffas under inkubationens tre första dagar får subkulturen odlas på detta stadium, men cellerna måste då inkuberas i sju dagar och subkulturer odlas igen med ytterligare sju dagars inkubation. Om toxisk CPE utvecklas efter tre dagar, får cellerna passera en gång och inkuberas för att uppnå de sammanlagda 14 dagarna från primärinokuleringen. Ingen toxicitet får påvisas under de sista sju dagarna av inkubationen.

Om bakteriell kontaminering inträffar trots antibiotikabehandling måste odlingen av subkulturer föregås av centrifugering vid 2000-4000 x g i 15-30 min. vid 2-5 °C och/eller filtrering av supernatanten genom ett 0,45 μm-filter (membran med låg proteinbindningsförmåga). Förutom odlingen av subkulturer är förfarandet detsamma som för toxisk CPE.

IV. Virusidentifiering

1. Test för identifiering av virus

Om CPE har påvisats i en cellkultur, skall mediet (supernatanten) samlas upp och undersökas med en eller flera av följande metoder: neutralisering, IF (immunofluorescens) eller ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Om dessa test inte har lett till en säker identifiering av viruset inom en vecka, skall supernatanten överföras till ett nationellt referenslaboratorium för fisksjukdomar eller till gemenskapens referenslaboratorium för fisksjukdomar för omedelbar identifiering.

2. Neutralisering

Avlägsna cellerna från den uppsamlade supernatanten genom centrifugering (2000-4000 x g) eller membranfiltrering (0,45 μm) med ett membran med låg proteinbindande förmåga och späd därefter supernatanten 1:100 och 1:10000 i cellodlingsmedium.

Lika delar av de två supernatanterna blandas med lika delar av följande reagens, vart och ett för sig, och inkuberas i 60 minuter vid 15 °C:

- Serum som innehåller gruppspecifika antikroppar mot VHSV i spädningen 1:50 (vol:vol)(2)

- Serum som innehåller gruppspecifika antikroppar mot IHNV i spädningen 1:50 (vol:vol)(3)

- Sammanslagna antiserum mot inhemska serotyper av IPNV i spädningen 1:50 (vol:vol)(4)

- Endast medium (positiv kontroll)

Minst två cellkulturer från varje blandning av virus och serum skall inokuleras med 50 μl vardera och sedan inkuberas vid 15 °C. Utveckling av CPE skall kontrolleras på det sätt som beskrvs i del I.III.4.

Vissa VHSV-stammar reagerar inte i neutralisationstest. Sådana isolat måste identifieras med IF eller ELISA.

Även andra neutralisationstest med beprövad verkan får användas.

3. IF

För varje virusisolat som skall identifieras besås minst åtta täckglas eller motsvarande med EPC-celler med en täthet som efter 24 timmars odling ger en utväxt av cirka 60-90 % EPC-celler rekommenderas för detta ändamål på grund av att de fäster väl vid glasytor, men även andra cellinjer får användas, till exempel BF-2, RTG-2 eller FHM.

När cellerna har sjunkit ned till glasytan (omkring en timme efter bestrykningen), eller när kulturerna har inkuberats i upp till 24 timmar, inokuleras det virus som skall identifieras. Fyra kulturer inokuleras i volymförhållandet 1:10 och fyra i förhållandet 1:1000. Dessa inkuberas vid 15 °C i 20-30 timmar.

Mellan 20 och 30 timmar efter inokuleringen skall kulturerna sköljas två gånger i Eagle's MEM utan serum, fixeras i 80 % iskall aceton och sedan färgas med hjälp av en tvåskikts IFAT. Första reagensskiktet består av poly- eller monoklonala antikroppar av referenskvalitet. Andra reagensskiktet består av ett fluorokromkonjugerat antiserum mot det immunglobulin som används i första skiktet. För varje testat antiserum skall minst en inokulerad högdoskultur och en inokulerad lågdoskultur färgas. Testet skall även omfatta lämpliga negativa och positiva kontroller. Fluorokromer som FITC eller TRITC är lämpliga.

Preparera de färgade kulturerna med glycerolsaltlösning. Undersök dem under infallande UV-ljus. Använd okular med förstoringsgrad 10 x eller 12 x och objektiv x 25 eller x 40 med bländare > 0,7 respektive > 1,3.

Den ovan angivna IF-metoden nämns som exempel. Även andra IF-metoder (för cellkulturer, fixering och antikroppar av referenskvalitet) med beprövad verkan får användas.

4. ELISA

Brunnar i mikrotiterplattor täcks över natt med rekommenderade utspädningar av renade immunoglobulinfraktioner av antikroppar av referenskvalitet.

Sedan brunnarna sköljts med buffertlösning PBS-Tween-20, tillsätts det virus som skall identifieras i två eller fyra stegs spädning och tillåts reagera med antikroppsbeläggningen i 60 minuter vid 37 °C. Efter sköljning med buffertlösning PBS-Tween-20 tillsätts biotinylerade antikroppar med en specificitet som motsvarar antikroppsbeläggningens specificitet och får reagera i 60 minuter vid 20 °C. Efter ytterligare en sköljning enligt ovan tillsätts HRP-konjugerat streptividin och får reagera i ytterligare en timme vid 20 °C. Efter en sista sköljning synliggörs det bundna enzymet med lämpliga ELISA-substrat (OPD eller andra).

Den ovan angivna biotin-baserade ELISA-metoden nämns som exempel. Även andra ELISA-versioner med beprövad verkan får användas.

TABELL 1A

Inspektions- och provtagningsschema för zoner och för anläggningar i icke godkända zoner för den tvååriga kontrollperiod som föregår godkännande med avseende på VHS och IHN

(i enlighet med bilagorna B och C i direktiv 91/67/EEG och bestämmelserna i del I i denna bilaga)

>Plats för tabell>

Högsta antal fiskar per bassäng: 10

TABELL 1B

Inspektions- och provtagningsschema för den tvååriga kontrollperiod som föregår godkännande med avseende på VHS och/eller IHN av zoner och av anläggningar i icke godkända zoner med en officiellt erkänd dokumenterad historisk frihet från sjukdomarna

(i enlighet med bilagorna B och C i direktiv 91/67/EEG och bestämmelserna i del I och III i denna bilaga)

>Plats för tabell>

Högsta antal fiskar per bassäng: 10

TABELL 1C

Inspektions- och provtagningsschema för zoner och för anläggningar i icke godkända zoner för fortsatt godkännande med avseende på VHS och IHN

(i enlighet med bilagorna B och C i direktiv 91/67/EEG och bestämmelserna i del I i denna bilaga)

>Plats för tabell>

Högsta antal fiskar per bassäng: 10

DEL II

Diagnosförfarande för bekräftelse av VHS och IHN vid misstänkta sjukdomsutbrott

En eller flera av följande tekniker skall användas för att ställa diagnosen VHS eller IHN:

- A. Konventionell virusisolering med efterföljande serologisk virusidentifiering.

- B. Virusisolering med samtidig serologisk virusidentifiering.

- C. Andra diagnosmetoder (IFAT, ELISA).

Enbart metod C får inte användas för att bekräfta de första fallen av VHS och/eller IHN på anläggningar i godkända zoner. Antingen metod A eller metod B måste också användas.

Det vävnadsmaterial som skall undersökas virologiskt måste i vissa fall åtföljas av kompletterande material för bakteriologisk, parasitologisk, histologisk eller annan undersökning som gör det möjligt att ställa andra diagnoser.

A. Konventionell virusisolering med efterföljande serologisk virusidentifiering

I.1 Urval av prover

Minst tio fiskar med typiska symptom på IHN eller VHS skall väljas ut för undersökning.

I.2 Beredning och transport av fiskprover

Enligt del I.I.3.

I.3 Insamling av kompletterande material för diagnostik

Enligt del I.I.4.

II. Beredning av prover för virologisk undersökning

Enligt del I.II.

III. Virologisk undersökning

Enligt del I.III.

IV. Identifiering av virus

Enligt del I.IV.

B. Virusisolering med samtidig serologisk virusidentifiering

I.1 Urval av prover

Enligt del II.A.1.

I.2 Beredning och transport av fiskprover

Enligt del I.I.3.

I.3 Insamling av kompletterande material för diagnostik

Enligt del I.I.4.

II.1 Homogenisering av organ

Enligt del I.II.2.

II.2 Centrifugering av homogenatet

Homogenatet skall centrifugeras i en kyld centrifug (2-5 °C) vid 2000-4000 x g i 15 minuter. Sedan samlas supernatanten upp och behandlas i fyra timmar vid 15 °C med antibiotika, t.ex. 1 mg/ml gentamicin, eller membranfiltreras (0,45 μm) genom ett membran med låg proteinbindande förmåga.

II.3 Behandling av supernatanten med diagnostiskt antiserum

Den antibiotikabehandlade eller membranfiltrerade organsuspensionen späds 1:10 eller 1:1000 med cellodlingsmedium och provvolymer blandas och inkuberas i 60 minuter vid 15 °C med lika delar av de reagens som anges i I.IV.2.

III.1 Cellkulturer och medier

Enligt del I.III.1.

III.2 Inokulering av cellkulturer

Minst två cellkulturer från varje blandning av virus och serum (beredd enligt del II.B.II.3) skall inokuleras med 50 μl vardera och sedan inkuberas vid 15 °C.

III.3 Inkubering av cellkulturer

Enligt del I.III.3.

III.4 Mikroskopering

Inokulerade cellkulturer skall kontrolleras dagligen för förekomst av CPE vid 40-150 gångers förstoring. Om något av de antiserum som används förhindrar CPE får viruset därmed anses indentifierat.

Om inget av de antiserum som används har haft någon verkan skall identifieringen fortsätta i enlighet med I.IV.

III.5 Odling av subkulturer

Om inget CPE har utvecklats efter 7-10 dagar skall subkulturer odlas med kulturer som inokulerats med supernatanten plus medium (II.B.II.3) i enlighet med I.III.5.

C. Andra diagnosmetoder

IFAT eller ELISA i enlighet med I.IV.3 respektive I.IV.4 kan användas på supernatant som beretts enligt I.II.2. Dessa snabba metoder skall senast 48 timmar efter provtagningen kompletteras med en virologisk undersökning enligt A eller B

a) om resultatet är negativt, eller

b) om resultatet är positivt med material som utgör första fallet av IHN eller VHS i en godkänd zon.

Vävnadsmaterial kan behandlas med andra diagnostiska metoder, t.ex. RT-PCR eller IF, när det gäller frysta snitt eller immunohistokemi när det gäller vävnadsmaterial som fixerats i formalin. I dessa metoder måste inokulering av icke fixerat material i cellkulturer alltid ingå.

DEL III

Dokumenterad historisk frihet från VHS och/eller IHN i zoner eller på anläggningar i icke godkända zoner

Riktlinjer och kriterier för officiellt hälsokontrollprogram

1. Ett hälsokontrollprogram kan påbörjas i två fall:

- Efter det att ett officiellt godkänt program för utrotning av VHSV och/eller IHNV har genomförts, som innebär att all fisk på anläggningen har avlägsnats och att anläggningen har renjorts, desinficerats och fått vara i träda innan ny fisk från godkända anläggningar har inplanterats.

- På anläggningar för fiskuppfödning där infektion med VHSV eller IHNV aldrig har inträffat.

2. Programmet för hälsokontroll måste grunda sig både på kliniska inspektioner och laboratorieundersökningar.

3. Programmet måste omfatta två årliga kliniska hälsoinspektioner enligt riktlinjerna i del I.

4. Vid minst en av de årliga inspektionerna skall 30 prover på vävnad och/eller ovarievätska samlas in från fisk på varje anläggning. Proverna skall väljas ut, beredas och genomgå laboratorieundersökning i enlighet med del I, II och IV.

5. Hälsokontrollprogrammet skall löpa över minst fyra år på alla anläggningar i den zon som skall godkännas eller på den anläggning (i en icke godkänd zon) som skall godkännas.

6. Om programmet skall kunna godkännas officiellt får inga fall av VHS eller IHN inträffa eller påvisas (inga kliniska infektioner och ingen isolering av virus).

DEL IV

Förfarande för titrering för att kontrollera om cellkulturer är mottagliga för infektion

De förfaranden för titrering som rekommenderas i del I.III.3 beskrivs nedan.

Minst två VHSV-isolat och ett IHNV-isolat skall användas. Isolaten skall representera huvudgruppen av virus inom EU, t.ex. för VHSV ett patogent isolat från regnbåge i sötvatten och ett marint isolat som är patogent för piggvar och för IHNV en europeisk stam som är patogen för regnbåge. Väldefinierade isolat från medlemsstaterna skall användas. Referensisolat kan fås från EU:s referenslaboratorium för fisksjukdomar.

Satser av virus i cellkulturer med lågt passagenummer odlas i cellodlingsflaskor på BF-2- eller RTG-2-celler för VHSV och på EPC- eller FHM-celler för IHNV. Cellodlingsmedium med Tris- eller Hepesbuffert och minst 10 % serum skall användas. Använd en låg MOI vid inokulering (< 1).

Vid full CPE skördas viruspartiklarna genom centrifugering av cellkulturens supernatant vid 2000 x g i 15 minuter, sterilfiltreras genom 0,45 ìm membranfilter och fördelas i märkta frysrör. Viruset förvaras vid - 80 °C.

En vecka efter infrysningen tinas tre replikat för varje virus i kallt vatten och titreras på respektive cellinje. Minst var sjätte månad, eller om man misstänker att en cellinje har blivit mindre mottaglig, skall varje virusisolat tinas och titreras.

Titreringsförfarandet måste beskrivas i detalj och utföras på samma sätt varje gång.

Slutpunktstitrering bör göras med minst sex replikat för varje spädningssteg. Titervärdena jämförs med tidigare titervärden. Om titern för något av de tre virusisolaten har sjunkit med en faktor av mer än 2 logaritmer jämfört med den ursprungliga titern skall cellinjen inte längre användas för övervakningsändamål.

Om olika cellinjer förvaras på laboratoriet skall varje linje undersökas för sig.

Resultaten skall sparas i minst tio år.

DEL V

Förkortningar

BF-2 bluegill fry-2 (cellinje)

CPE cytopatisk verkan

CRL Community Reference Laboratory for Fish Diseases (gemenskapens referenslaboratorium för fisksjukdomar)

ELISA enzyme-linked immunosorbent assay

EPC Epitelioma papulosum cyprini (cellinje)

FHM fathead minnow (cellinje)

FITC fluoresceinisotiocyanat

Hepes N-2-hydroxyetylpiperazin-N'-2-etansulfonsyra

HRP horse radish-peroxidas

IF immunofluorescence

IFAT indirekt fluorescerande antikroppstest

IHN(V) smittsam hematopoietisk nekros (Infectious heamatopoietic necrosis) (virus)

IPN(V) smittsam pankreatisk nekros (Infectious pancreatic necrosis) (virus)

MEM minimum essential medium

MOI multiplicity of infection (kvoten mellan antalet infektiösa viruspartiklar som tillsatts till en cellkultur och det kända antalet celler i kulturen)

OPD ortofenyldiamin

PBS fosfatbuffrad saltlösning

RTG-2 gonad av regnbågslax (cellinje)

RT-PCR polymeras-kedjereaktion med omvänt transkriptas (reversed transcriptase polymerase chain reaction)

Tris-HCl Tris-(hydroxymetyl)-aminometan-HCl

TRITC tetrametyl-rhodamin-isotiocyanat

VHS(V) viral hemorragisk septikemi (virus)

(1) Undantagsfall kan t.ex. vara då fisk samlas in i mycket avlägset belägna områden utan daglig postgång.

(2) Eller enligt referenslaboratoriets specifikation med hänsyn till att antiserum eventuellt kan vara cytotoxiska.

(3) Eller enligt referenslaboratoriets specifikation med hänsyn till att antiserum eventuellt kan vara cytotoxiska.

(4) Eller enligt referenslaboratoriets specifikation med hänsyn till att antiserum eventuellt kan vara cytotoxiska.