(6)

Följande kapitel C.31–C.46 ska läggas till: ” C.31. TEST PÅ LANDVÄXTER: TEST AV GRODDPLANTORS UTVECKLING OCH TILLVÄXT INLEDNING 1. Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 208 (2006). Testmetoder ses regelbundet över med avseende på den vetenskapliga utvecklingen och tillämpligheten för lagstadgad användning. Syftet med denna uppdaterade testmetod är att bedöma de potentiella effekterna av kemikalier på groddplantors utveckling och tillväxt. Den omfattar inte kroniska effekter eller effekter på fortplantningen (dvs. fröproduktion, blomning, fruktmognad). Exponeringsförhållandena och testkemikaliens egenskaper måste beaktas för att säkerställa att lämpliga testmetoder används (t.ex. då man testar metaller eller metallföreningar bör man beakta effekterna av pH och tillhörande motjoner) (1). Denna testmetod omfattar inte plantor som utsätts för kemiska ångor. Testmetoden kan användas för kontroll av allmänna kemikalier, biocider och växtskyddsmedel (dvs. bekämpningsmedel). Den har utarbetats på grundval av befintliga metoder (2) (3) (4) (5) (6) (7). Andra hänvisningar som gäller växttester beaktades också (8) (9) (10). De definitioner som används återfinns i tillägg 1. PRINCIP FÖR TESTMETODEN 2. Testet utgör en utvärdering av effekterna på utvecklingen och tillväxten av högre växters groddplantor efter att de har exponerats för testkemikalien i jord (eller annan lämplig jordmatris). Fröna placeras i kontakt med jord som behandlats med testkemikalien och utvärderas i regel efter 14–21 dagar efter det att 50 % av plantorna i kontrollgruppen har grott. Som endpoints används visuell bedömning av fröplantornas grodd, groddarnas torrvikt (alternativt färskvikt) och i vissa fall groddarnas höjd, samt en bedömning av synliga skadliga effekter på plantans olika delar. Dessa mätningar och observationer jämförs med dem som görs på obehandlade kontrollväxter. 3. Beroende på den förväntade exponeringsvägen blandas testkemikalien antingen ner i jorden (eller eventuellt i en syntetisk jordmatris) eller appliceras ovanpå jorden, vilket i båda fallen är lämpliga motsvarigheter för kemikaliens potentiella exponeringsvägar. Iblandning i jord sker genom att behandla jord i större partier. Efter iblandningen av kemikalien överförs jorden till krukor, och därefter planteras de växtarter som ska testas i jorden. Applicering ovanpå jorden ska göras i krukor i vilka fröna redan har planterats. Testenheterna (dvs. kontroller samt behandlad jord och frön) placeras sedan under förhållanden som främjar växternas grobarhet och tillväxt. 4. Testet kan utföras för att fastställa dos-respons-kurvan, eller som ett toleranstest vid en enda koncentration/frekvens beroende på syftet med studien. Om resultaten från testet med en enda koncentration/frekvens överskrider en viss toxicitetsnivå (t.ex. om effekter större än x % observeras), ska ett preliminärt test utföras för att fastställa toxicitetens övre och nedre gränser, följt av ett test med flera olika koncentrationer/frekvenser för att generera en dos-responskurva. En lämplig statistisk analys används för att erhålla den effektiva koncentrationen ECx eller den effektiva appliceringsfrekvensen ERx (t.ex. EC25, EC50, ER25, ER50) för den/de känsligaste parametern/parametrarna som är av intresse. Den högsta koncentrationen utan observerad effekt (NOEC) och den lägsta koncentrationen med observerad effekt (LOEC) kan också beräknas i detta test. INFORMATION OM TESTKEMIKALIEN 5. Följande information är användbar för identifiering av förväntad exponeringsväg för kemikalien och vid utformningen av testet: strukturformel, renhetsgrad, vattenlöslighet, löslighet i organiska lösningsmedel, fördelningskoefficient 1-oktanol/vatten, sorptionsegenskaper i jord, ångtryck, kemisk stabilitet i vatten och ljus, samt bionedbrytbarhet. TESTETS GILTIGHET 6. För att testet ska anses vara giltigt måste följande kriterier uppfyllas för kontrollerna: — Fröplantornas grobarhet ska vara minst 70 %. — Fröplantorna får inte uppvisa synliga fytotoxiska effekter (t.ex. kloros, nekros, vissning, deformerade blad och stjälkar), och plantorna ska uppvisa normala variationer i tillväxt och morfologi för den berörda arten. — Den genomsnittliga överlevnaden för grodda fröplantor i kontrollerna är minst 90 % under testets gång. — Miljöförhållandena för en viss art ska vara identiska och växtmedierna ska innehålla samma mängd jordmatris, stödmedier eller substrat från samma källa. REFERENSKEMIKALIE 7. Ett referensämne kan testas regelbundet för att kontrollera att testets utförande, de aktuella testplantornas respons och provningsvillkoren inte förändrats nämnvärt under testets gång. Alternativt kan mätningshistoriken för biomassa eller tillväxt i kontrollerna användas för att utvärdera testsystemets prestanda vid ett särskilt laboratorium, och kan då fungera som en åtgärd för intern kvalitetskontroll. BESKRIVNING AV TESTMETODEN Naturlig jord – artificiellt substrat 8. Växter kan odlas i krukor med lerig sand, sandjord eller sandig lättlera som innehåller upp till 1,5 % organiskt kol (ca 3 % organiskt material). Kommersiell planteringsjord eller syntetisk jord som innehåller upp till 1,5 % organiskt kol kan också användas. Lerjord bör inte användas om testkemikalien är känd för att ha en hög affinitet för lera. Jord tagen på fältet bör siktas till 2 mm partikelstorlek i syfte att homogenisera den och avlägsna grova partiklar. Typ och textur, procentandel organiskt kol, pH-värde och salthalt såväl som den elektroniska värmeledningsförmågan i den färdigberedda jorden ska rapporteras. Jorden bör klassificeras enligt ett enhetligt klassificeringssystem (11). Jorden kan pastöriseras eller värmebehandlas i syfte att minska effekterna av patogener. 9. Naturlig jord kan försvåra tolkningen av resultaten och öka variabiliteten på grund av olika fysikaliska/kemiska egenskaper och populationer av mikroorganismer. Dessa variabler påverkar i sin tur vattenbindningsförmågan, förmågan att binda kemikalier, luftningen och innehållet av näringsämnen och spårelement. Utöver skillnaderna i dessa fysikaliska faktorer finns det även skillnader när det gäller kemiska egenskaper såsom pH och redoxpotential, som kan påverka testkemikaliens biotillgänglighet (12) (13) (14). 10. Artificiella substrat används normalt inte för testning av bekämpningsmedel, men de kan användas för testning av allmänna kemikalier eller om man vill minimera variabiliteten i naturliga jordar och förbättra jämförbarheten i analysresultaten. De substrat som används bör bestå av inaktivt material som minimerar interaktionen med testkemikalien, lösningsmedlet, eller båda. Syratvättad kvartssand, mineralull och glaspärlor (t.ex. 0,35–0,85 mm i diameter) har konstaterats vara lämpliga inaktiva material som absorberar testkemikalien i lägsta möjliga grad (15) och gör det möjligt för fröplantan att ta upp största möjliga mängd av kemikalien via rötterna. Olämpliga substrat inbegriper vermikulit, perlit eller andra högabsorberande material. Näringsämnen för växternas tillväxt bör tillhandahållas för att se till att plantorna inte utsätts för stress på grund av näringsbrist, och om möjligt bör detta bedömas genom kemisk analys eller visuell bedömning av kontrollplantorna. Kriterier för urvalet av testarter 11. De arter som valts ut ska vara tillräckligt omfattande, t.ex. med tanke på deras taxonomiska mångfald inom växtriket, deras utbredning, mängd, artspecifika livscykelegenskaper och naturligt förekomstområde, så att en rad olika reaktioner uppstår(8) (10) (16) (17) (18) (19) (20). Följande egenskaper hos eventuella testarter bör beaktas vid urvalet: — arten har likformiga frön som lätt kan erhållas från tillförlitliga standardutsädeskällor och som har enhetlig, tillförlitlig och jämn grobarhet, liksom en enhetlig planttillväxt, — plantan kan enkelt laboratorietestas, och kan ge tillförlitliga och reproducerbara resultat inom och mellan provningsanläggningar, — känsligheten hos den art som testas bör överensstämma med reaktionen hos växter i miljön som exponeras för kemikalien, — arterna har i viss utsträckning använts i tidigare toxicitetstester, och deras användning exempelvis i bioanalyser av herbicider, undersökningar av tungmetaller, stresstester med salthalt eller mineraler eller allelopatistudier visar på känslighet för många olika stressfaktorer, — de är kompatibla med testmetodens tillväxtförutsättningar, — de uppfyller giltighetskriterierna för testet. Vissa av de historiskt sett mest använda testarterna förtecknas tillägg 2 och potentiella växtarter som inte är grödor i tillägg 3. 12. Det antal arter som ska testas beror på de tillämpliga lagstadgade kraven, och därför anges detta inte i denna testmetoden. Applicering av testkemikalien 13. Kemikalien ska appliceras via en lämplig vehikel (t.ex. vatten, aceton, etanol, polyetylenglykol, gummi arabicum, sand). Blandningar (sammansatta produkter eller beredningar) som innehåller olika aktiva substanser och hjälpämnen kan också testas. Iblandning i jord/artificiellt substrat 14. Kemikalier som är vattenlösliga eller suspenderade i vatten kan tillsättas i vatten, och lösningen kan sedan blandas med jord med en lämplig blandningsanordning. Denna typ av test kan vara lämplig om exponering för kemikalien sker via jord eller jordens porvatten och man oroar sig för plantans upptagning av kemikalien genom rötterna. Jordens vattenbindningsförmåga bör inte överskridas genom tillsättning av testkemikalien. Den mängd vatten som tillsatts ska vara samma för varje testkoncentration, men bör begränsas för att förhindra att jorden klumpar ihop sig. 15. Ämnen med låg vattenlöslighet bör lösas upp i ett lämpligt flyktigt lösningsmedel (t.ex. aceton, etanol) och blandas med sand. Lösningsmedlet kan därefter avlägsnas från sanden med hjälp av en luftström medan sanden ständigt blandas. Den behandlade sanden blandas med testjorden. En andra kontroll bereds med endast sand och lösningsmedel. Lika stora mängder sand, med lösningsmedel som blandas i och avlägsnas, tillsätts alla behandlingsnivåer och den andra kontrollen. För fasta, olösliga testkemikalier blandas torr jord med kemikalien i en lämplig blandare. Därefter fylls krukorna med jord och fröna sås omedelbart. 16. När ett artificiellt substrat används i stället för jord kan kemikalier som är lösliga i vatten upplösas i näringslösningen strax innan testet inleds. Kemikalier som är olösliga i vatten, men som kan suspenderas i vatten med hjälp av ett lösningsmedel, bör tillsättas näringslösningen med bärämnet. Icke vattenlösliga kemikalier, för vilka det inte finns något giftfritt vattenlösligt bärämne, bör lösas i ett lämpligt flyktigt lösningsmedel. Lösningen blandas med sand eller glaspärlor, placeras i en vacuumrotationsapparat och evaporeras, vilket gör att sanden eller glaspärlorna täcks med ett jämnt lager av kemikalien. En vägd andel pärlor bör extraheras med samma organiska lösningsmedel och testkemikalien innan krukorna fylls. Applicering på ytan 17. För växtskyddsprodukter appliceras testkemikalien ofta genom att jordytan besprutas med provlösningen. All utrustning som används i testerna, inklusive utrustning som används för att bereda och tillföra testkemikalien, bör ha sådan utformning och kapacitet att testerna där denna utrustning används kan genomföras på ett korrekt sätt och ger en reproducerbar täckning. Täckningen bör vara enhetlig på alla jordytor. Man bör undvika att kemikalierna adsorberas till eller reagerar med utrustningen (t.ex. plaströr och lipofila kemikalier eller delar av stål). Testkemikalien sprutas på jordytan på ett sätt som simulerar besprutning med typiska besprutningsbehållare. I allmänhet bör besprutningsvolymerna motsvara normal jordbrukspraxis och volymerna (mängd vatten etc.) bör rapporteras. Munstyckets typ bör väljas ut för att ge en jämn täckning av jordytan. Om lösningsmedel och bärämnen används bör en andra grupp kontrollplantor etableras som endast besprutas med lösningsmedlet eller bärämnet. Detta är inte nödvändigt för växtskyddsprodukter som testas som beredningar. Kontroll av testkemikaliens koncentration/dos 18. Koncentrationerna och appliceringsdosen måste bekräftas genom en lämplig analytisk kontroll. För lösliga kemikalier kan alla koncentrationer/doser bekräftas genom en analys av testlösningen med den högsta koncentrationen som används för testet och med dokumentering av senare utspädning och användning av kalibrerad appliceringsutrustning (t.ex. kalibrerade glaskärl för analys, kalibrerad besprutningsutrustning). För olösliga kemikalier måste en kontroll av ämnen som består av föreningar kompletteras med vikten av den testkemikalie som tillförs jorden. Om homogeniteten måste påvisas kan det bli nödvändigt att göra en analys av jorden. FÖRFARANDE Testupplägg 19. Frön av samma arter planteras i krukor. Antalet frön per kruka beror på arten, krukstorleken och testets varaktighet. Antalet plantor per kruka bör inte vara större än att det finns lämpliga förutsättningar för tillväxt och att man undviker trängsel under hela testet. Högsta tillåtna planteringstäthet är cirka 3–10 frön per 100 cm2 beroende på frönas storlek. Till exempel är det lämpligt att ha en till två plantor av majs, sojabönor, tomat, gurka eller sockerbetor per 15 cm behållare, tre plantor av raps eller ärtor per 15 cm behållare, och fem till tio plantor av lök, vete eller andra små frön per 15 cm behållare. Antalet frön och replikatkrukor (replikatet definieras som en kruka, vilket betyder att plantor i samma kruka inte utgör ett replikat) bör vara lämpligt för att en optimal statistisk analys ska kunna utföras (21). Det bör noteras att variabiliteten blir större för arter med färre stora frön per kruka (replikat) jämfört med arter där det är möjligt att använda ett större antal små frön per kruka. Genom att plantera lika många frön i varje kruka kan denna variabilitet minimeras. 20. Kontrollgrupperna används för att säkerställa att observerade effekter endast kan länkas till eller tillskrivas exponering för testkemikalien. En lämplig kontrollgrupp bör vara identisk i alla avseenden med testgruppen med undantag för exponeringen för testämnet. I ett givet test ska alla testplantor inklusive kontrollerna komma från samma källa. För att förhindra systematiska avvikelser måste en slumpmässig anvisning av test- och kontrollkrukor göras. 21. Frön som behandlats med en insekticid eller fungicid (dvs. behandlade frön) bör undvikas. Användningen av vissa icke-systemiska kontaktfungicider (t.ex. kaptan, tiram) är dock tillåten enligt vissa tillsynsmyndigheter (22). Om utsädesburna patogener utgör ett problem får fröna kortvarigt doppas i en svag 5-procentig hypokloritlösning och sedan tvättas noggrant i rinnande vatten och torkas. Ingen efterbehandling med andra bekämpningsmedel är tillåten. Testbetingelser 22. Testförhållandena ska likna de nödvändiga förhållandena för normal tillväxt för de arter och sorter som testas (i tillägg 4 finns exempel på testförhållanden). De groende plantorna bör hållas enligt god odlingspraxis i miljökammare, fytotroner eller växthus. När man använder dessa drivanläggningar omfattar denna praxis vanligen kontroll och tillräckligt frekvent (t.ex. dagligen) registrering av temperatur, luftfuktighet, koldioxidhalt, belysning (ljusintensitet, våglängd, fotosyntetiskt aktiv strålning) och ljusperiod, bevattning, m.m. för att säkerställa god tillväxt, vilken bedöms genom kontroll av de utvalda arterna. Temperaturen i växthusen bör regleras genom ventilation, uppvärmning och/eller kylning. Följande förhållanden rekommenderas vanligen för tester i växthus: — temperatur: 22 ± 10 °C, — fuktighet: 70 ± 25 %, — fotoperiod: minst 16 h ljus, — ljusintensitet: 350 ± 50 μE/m2/s. Det kan bli nödvändigt med extrabelysning om intensiteten minskar till under 200 μE/m2/s, våglängd 400–700 nm, med undantag för vissa arter som är mindre ljuskrävande. Miljöförhållandena bör övervakas och rapporteras under undersökningens gång. Växterna ska odlas i krukor av icke-porös plast eller glaserade krukor med en bricka eller ett fat under. Krukorna kan placeras om regelbundet för att minimera variabiliteten i växternas tillväxt (på grund av skillnader i testbetingelserna inom tillväxtanläggningen). Krukorna måste vara tillräckligt stora för att möjliggöra normal tillväxt. 23. Näringsämnen i jorden får kompletteras vid behov för att upprätthålla god växtkraft. Man kan bedöma om det finns behov av ytterligare näringsämnen och när dessa ska tillsättas genom observation av kontrollplantorna. Det rekommenderas att man vattnar testbehållarna underifrån (t.ex. med hjälp av glasfibervekar). Till att börja med kan man emellertid vattna ovanifrån för att stimulera frönas groning, och vid applicering på jordytan underlättar det även upptagningen av kemikalien i jorden. 24. De särskilda växtförhållandena bör anpassas för den art som testas och den testkemikalie som undersöks. Kontroller och testade plantor måste hållas under samma miljöförhållanden, men lämpliga åtgärder bör vidtas för att förhindra korsexponering (t.ex. av flyktiga kemikalier) mellan olika testkärl och av testkemikalien till kontrollerna. Att testa en enda koncentration/dos 25. I syfte att fastställa lämplig koncentration/dos av en kemikalie för att utföra tester med en enda koncentration eller dos (belastningstest/gränstest), måste ett antal faktorer beaktas. För allmänna kemikalier inbegriper dessa faktorer kemikaliens fysikalisk-kemiska egenskaper. För växtskyddsprodukter måste man beakta testkemikaliens fysikalisk-kemiska egenskaper och användningsmönster, dess högsta koncentration eller appliceringsdos, antalet behandlingar per säsong och/eller testkemikaliens beständighet. För att avgöra om en allmän kemikalie har fytotoxiska egenskaper kan det vara lämpligt att testa vid en högsta halt på 1 000 mg/kg torr jord. Preliminärt test 26. Vid behov kan ett preliminärt test utföras för att ge vägledning om de koncentrationer och doser som ska testas i den definitiva dos-responsstudien. I det preliminära testet ska testkoncentrationerna/-doserna vara jämnt fördelade (t.ex. 0,1, 1,0, 10, 100 och 1 000 mg/kg torr jord). För växtskyddsprodukter kan koncentrationerna/doserna grundas på den rekommenderade eller högsta tillåtna koncentrationen eller appliceringsdosen, t.ex. 1/100, 1/10, 1/1 av den rekommenderade/högsta tillåtna koncentrationen eller dosen. Testning av flera olika koncentrationer/doser 27. Syftet med tester med flera koncentrationer/doser är att fastställa ett dos-responssamband och att fastställa ett ECx- eller ERx-värde för grodd, biomassa och/eller synliga effekter jämfört med kontroller som inte exponerats, beroende på vad som krävs av tillsynsmyndigheterna. 28. Antalet koncentrationer eller doser och intervallen mellan dem ska vara tillräckligt stora för att ett tillförlitligt dos-responssamband och en regressionsformel ska framträda och för att ge en uppskattning av ECx eller ERx. De valda koncentrationerna och doserna bör omfatta de ECx- och ERx-värden som ska fastställas. Om till exempel ett EC50-värde krävs det skulle vara önskvärt för att testa doser som framkallar en effekt på mellan 20 och 80 %. Det rekommenderade antalet testkoncentrationer och testdoser som behövs för att uppnå detta är minst fem i en geometrisk serie plus en obehandlad kontroll, och ska skilja sig åt med en faktor på högst tre. För varje test- och kontrollgrupp bör antalet replikat vara minst fyra och det totala antalet frön bör vara minst 20. Ytterligare replikat av vissa växter med låg grobarhet eller varierande tillväxt kan behövas för att öka testets statistiska styrka. Om ett större antal koncentrationer och doser används kan antalet replikat minskas. Om NOEC ska uppskattas kan det behövas ytterligare replikat för att uppnå önskad statistisk styrka (23). Observationer 29. Under observationsperioden, dvs. 14 till 21 dagar efter det att 50 % av kontrollplantorna har grott (även i kontroller med lösningsmedel i förekommande fall), studeras plantorna ofta (minst en gång i veckan och om möjligt dagligen) med avseende på groning och visuell fytotoxicitet och mortalitet. I slutet av provet registreras mätningarna av groningen i procent och de överlevande plantornas biomassa, samt synliga skadliga effekter på olika delar av plantorna. Det sistnämnda inbegriper yttre avvikelser hos de fröplantor som grott, hämmad tillväxt, kloros, missfärgning, mortalitet och effekter på växternas utveckling. Den slutliga biomassan kan mätas med hjälp av den slutliga genomsnittliga torrvikten för de överlevande växternas skott, genom att skörda skotten vid markytan och torka dem tills de uppnår konstant vikt vid 60 °C. Alternativt kan den slutliga biomassan fastställas med hjälp av skottens färskvikt. Skottens höjd kan utgöra en annan endpoint, om så krävs av tillsynsmyndigheterna. Ett enhetligt system för bedömning av visuella skador bör användas för att utvärdera observerbara toxiska reaktioner. Exempel på kvalitativa och kvantitativa visuella bedömningar återfinns i hänvisningarna (23) (24). DATA OCH RAPPORTERING Statistisk analys Test av en enda koncentration/dos 30. Data för varje växtart bör analyseras med hjälp av en lämplig statistisk metod (21). Effektnivån vid testkoncentrationen/-dosen bör rapporteras, eller avsaknaden av en viss effekt vid testkoncentrationen/dosen (t.ex. <x % effekt iakttagen vid koncentrationen eller dosen y). Test av flera koncentrationer/doser 31. Ett dos/respons-samband fastställs i form av en regressionsformel. Olika modeller kan användas. För uppskattning av ECx eller ERx (t.ex. EC25, ER25, EC50, ER50) och dess konfidensgränser för groning kan det till exempel vara lämpligt att använda dikotoma data eller logit-, probit-, Weibull- eller Spearman-Karbermetoderna, den modifierade Spearman-Karbermetoden osv. Om plantornas tillväxt (vikt och höjd) utgör kontinuerliga endpoints kan ECx eller ERx och motsvarande konfidensgränser uppskattas med hjälp av en lämplig regressionsanalys (t.ex. Bruce och Versteegs icke-linjära regressionsanalys (25)). Om möjligt ska R2 vara 0,7 eller högre för de mest känsliga arterna, och de testkoncentrationer/doser som används ska omfatta effekter på 20–80 %. Om NOEC ska uppskattas bör företrädesvis kraftfulla statistiska tester användas, och dessa bör väljas på grundval av datafördelningen (21) (26). Testrapport 32. Testrapporten ska presentera resultaten av undersökningarna samt en detaljerad beskrivning av testbetingelserna, en grundlig diskussion av resultaten, en dataanalys och de slutsatser som dragits från analysen. En schematisk sammanställning och sammanfattning av resultaten bör tillhandahållas. Rapporten ska innehålla följande: Testkemikalie: — kemiska identifieringsdata, testkemikaliens relevanta egenskaper (t.ex. log Pow, vattenlöslighet, ångtryck och uppgifter om omvandling, spridning och fördelning i miljön, om dessa finns tillgängliga), — uppgifter om beredning av provlösningen och kontroll av testkoncentrationerna enligt vad som anges i punkt 18. Testade arter: — uppgifter om testorganismen: art/sort, växtfamilj, vetenskapligt namn och svenskt namn, fröets källa och historia (så detaljerat som möjligt, dvs. namnet på leverantören, grobarhet i procent, fröstorleksklass, klass, sändnings- och partinummer, frösättningsår eller den växtsäsong då fröet insamlades, datum då grobarheten fastställdes), grobarhet osv., — antal testade arter med enkla eller dubbla hjärtblad, — motivering för val av arter, — beskrivning av lagring, behandling och underhåll av fröna. Testbetingelser: — testanordningar (t.ex. odlingskammare, fytotron och växthus). — beskrivning av testsystemet (t.ex. krukmått, krukmaterial och jordmängder), — jordegenskaper (textur eller typ: fördelning och klassificering av jordpartiklar, fysikaliska och kemiska egenskaper inklusive procentandel organiska ämnen, procentandel organiskt kol och pH-värde), — förberedelse av jorden/substratet (t.ex. jord, syntetisk jord, sand och annat) innan testet, — beskrivning av näringsmediet om ett sådant använts, — applicering av testkemikalien: beskrivning av appliceringsmetoden, beskrivning av utrustningen, exponeringsdos och volym inklusive kemisk verifiering, beskrivning av kalibreringsmetoden och beskrivning av miljöförhållandena under appliceringen, — tillväxtförhållanden: ljusintensitet (t.ex. fotosyntetiskt aktiv strålning), fotoperiod, högsta/lägsta temperatur, bevattningsschema och -metod, gödsling, — antal frön per kruka, antal plantor per dos, antal replikat (krukor) per exponeringsdos, — antal och typ av kontroller (negativa och /eller positiva kontroller, lösningsmedelskontroll i förekommande fall), — testets varaktighet. Resultat: — tabell för alla endpoints för varje replikat, testkoncentration/-dos och art, — antal groddar och procentandel groning jämfört med kontrollerna, — mätning av plantornas biomassa (skottens torrvikt eller färskvikt) uttryckt som en procentandel av kontrollerna, — skottens höjd uttryckt som en procentandel av kontrollerna, om detta har uppmätts, — synbara skador i procent och kvalitativ och kvantitativ beskrivning av synbara skador (kloros, nekros, vissning, deformerade blad och stjälkar såväl som eventuell frånvaro av effekter) orsakade av testkemikalien i jämförelse med kontrollplantorna, — beskrivning av den bedömningsskala som används för att bedöma synbara skador, om en visuell bedömning görs, — för endosstudier bör procentandelen skador rapporteras, — ECx eller ERx (t.ex. EC50, ER50, EC25, ER25) och därtill hörande konfidensgränser. Om regressionsanalys utförs ska standardfelet för regressionsformeln anges, och standardfelet för bedömningar av enskilda parametrar (t.ex. lutning, skärningspunkt), — NOEC (och LOEC) om dessa värden beräknas, — beskrivning av de statistiska metoder och antaganden som använts, — grafisk framställning av dessa uppgifter och dos-responssambandet för den art som testats. Avvikelser från de förfaranden som beskrivs i denna testmetod och ovanliga händelser under testets gång. LITTERATUR (1) Schrader, G., Metge, K., och Bahadir, M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189–193. (2) Internationella standardiseringsorganisationen. (1994). ISO 11269-1 Markundersökningar – Bestämning av föroreningars effekt på markfloran – Del 1: Metod för bestämning av tillväxthämning hos rötter. (3) Internationella standardiseringsorganisationen. (1996). ISO 11269-2 Markundersökningar – Bestämning av föroreningars effekt på markfloran – Del 2: Kemikaliers inverkan på utveckling och tillväxt hos högre växter. (4) American Standard for Testing Material (ASTM). (2002). E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests. (5) U.S. EPA. (1982). FIFRA, 40CFR, Del 158.540. Underavdelning J, delarna 122-1 och 123-1. (6) US EPA. (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines: — 850.4000: Background – Non-target Plant Testing; — 850.4025: Target Area Phytotoxicity; — 850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence); — 850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test; — 850.4225: Seedling Emergence, Tier II; — 850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test. (7) AFNOR, X31-201. (1982). Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1. (1993). Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines. (8) Boutin, C., Freemark, K. E. and Keddy, C. J. (1994). Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Non-target plant testing and evaluation. Technical Report Series No.145. Canadian Wildlife Service (Headquarters), Environment Canada, Hull, Québec, Kanada. (9) Forster, R., Heimbach, U., Kula, C. och Zwerger, P. (1997). Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms – A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. Nr 48. (10) Hale, B., Hall, J. C., Solomon, K. och Stephenson, G. (1994). A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario, Kanada. (11) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) och Soil Sc. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962). (12) Audus, L. J. (1964). Herbicide behaviour in the soil. I: Audus, L. J. (red.) The Physiology and Biochemistry of Herbicides, London, New York, Academic Press, NY, kapitel 5, s. 163–206. (13) Beall, M. L., Jr. och Nash, R. G. (1969). Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil, J. Agro. 61, 571–575. (14) Beetsman, G. D., Kenney, D. R. och Chesters, G. (1969). Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties, J. Agro. 61, 247–250. (15) U.S. Food and Drug Administration (FDA). (1987). Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, 14 s., FDA, Washington, DC. (16) McKelvey, R. A., Wright, J. P., Honegger, J. L. och Warren, L. W. (2002). A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Management Science, vol. 58, 1161–1174. (17) Boutin, C., Elmegaard, N. och Kjær, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology, vol. 13:4, 349–369. (18) Boutin, C. och Rogers, C. A. (2000). Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides – An analysis with two databases. Ecotoxicology, vol. 9:4, 255–271. (19) Boutin, C. och Harper, J. L. (1991). A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9, 155–271. (20) Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T. E., Batchelor, S. P. och Maguire, R. J. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Envir. Toxicol. Chem. 19:10, 2532–2541. (21) OECD (2006). Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment nr 54, Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris. (22) Hatzios, K. K. och Penner, D. (1985). Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1, 1–63. (23) Hamill, P. B., Marriage, P. B. och G. Friesen. (1977). A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Science 25, 386–389. (24) Frans, R. E. och Talbert, R. E. (1992). Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. I: B. Truelove (red.) Research Methods in Weed Science, andra upplagan, Southern Weed Science Society, Auburn, 15–23. (25) Bruce, R. D. och Versteeg, D. J. (1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. Environmental Toxicology and Chemistry 11, 1485–1492. (26) Kapitel C.33 i denna bilaga: Reproduktionstest för daggmaskar (Eisenia fetida och Eisenia andrei). Tillägg 1 Definitioner Aktiv substans (eller verksamt ämne) : ett ämne som har skapats för att ge en viss biologisk verkan (t.ex., insektsbekämpning, bekämpning av växtsjukdomar, ogräsbekämpning på exponeringsområdet), även kallat verksam beståndsdel av teknisk kvalitet, verksamt ämne. Kemikalie : ett ämne eller en blandning. Växtskyddsprodukter eller växtskyddsmedel eller bekämpningsmedel : ämnen med en särskild biologisk aktivitet som avsiktligt används för att skydda grödor mot skadedjur (t.ex. svampsjukdomar, insekter och konkurrerande plantor). ECx (x % Effect Concentration) eller ERx (x % Effect Rate) : den koncentration eller den dos som leder till en oönskad ändring med x % av den endpoint i testet som mäts i förhållande till kontrollen (t.ex. en 25 % eller 50 % minskning av grobarheten, skottens vikt, det slutliga antalet plantor, eller ökning av de synbara skadorna skulle utgöra EC25/ER25 respektive EC50/ER50). Groning : koleoptilens eller hjärtblandens framträdande ovanför markytan. Beredning : den kommersiella sammansatta produkt som innehåller det verksamma ämnet (den aktiva substansen), även kallat slutlig beredning (8) eller typisk slutanvändningsprodukt (TEP, typical end-use product). Lägsta koncentration med observerad effekt (LOEC) : den lägsta koncentration av testkemikalien vid vilken effekt har noterats. I detta test har en koncentration som motsvarar LOEC en statistiskt signifikant effekt (p < 0,05) efter en given exponeringstid jämfört med kontrollen, och är högre än NOEC-värdet. Växter som inte är målarter : växter som befinner sig utanför målområdet. För växtskyddsprodukter gäller detta vanligtvis växter som befinner sig utanför det behandlade området. Nolleffektkoncentrationen (NOEC) : den högsta koncentrationen av testkemikalien vid vilken ingen effekt har noterats. I detta test har en halt som motsvarar NOEC ingen statistiskt signifikant effekt (p < 0,05) efter en given exponeringstid jämfört med ett kontrollprov. Fytotoxicitet : negativa avvikelser (av uppmätta och visuella utvärderingar) från plantornas normala typexempel när det gäller utseende och tillväxt som reaktion på en bestämd kemikalie. Replikat : den experimentella enhet som motsvarar kontrollgruppen och/eller testgruppen. I dessa undersökningar definieras en kruka som replikat. Visuell bedömning : värdering av synliga skador som grundar sig på observationer av upprätt växt, växtkraft, missbildningar, kloros, nekros och helhetsutseende jämfört med en kontroll. Testkemikalie : alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod. Tillägg 2 Förteckning över arter som historiskt sett har använts för växttester Familj Art Svenskt namn DICOTYLEDONAE Apiaceae (Umbelliferae) Daucus carota Morot Asteraceae (Compositae) Helianthus annuus Solros Asteraceae (Compositae) Lactuca sativa Sallat Brassicaceae (Cruciferae) Sinapis alba Vitsenap Brassicaceae (Cruciferae) Brassica campestris var. chinensis Salladskål Brassicaceae (Cruciferae) Brassica napus Raps Brassicaceae (Cruciferae) Brassica oleracea var. capitata Vitkål Brassicaceae (Cruciferae) Brassica rapa Rova Brassicaceae (Cruciferae) Lepidium sativum Kryddkrasse Brassicaceae (Cruciferae) Raphanus sativus Rädisa Chenopodiaceae Beta vulgaris Sockerbeta Cucurbitaceae Cucumis sativus Gurka Fabaceae (Leguminosae) Glycine max (G. soja) Sojaböna Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus aureus Mungböna Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus vulgaris Böna Fabaceae (Leguminosae) Pisum sativum Ärtor Fabaceae (Leguminosae) Trigonella foenum-graecum Bockhornsklöver Fabaceae (Leguminosae) Lotus corniculatus Käringtand Fabaceae (Leguminosae) Trifolium pratense Rödklöver Fabaceae (Leguminosae) Vicia sativa Vicker Linaceae Linum usitatissimum Lin Polygonaceae Fagopyrum esculentum Bovete Solanaceae Solanum Lycopersicon Tomat MONOCOTYLEDONAE Liliaceae (Amarylladaceae) Allium cepa Lök Poaceae (Gramineae) Avena sativa Havre Poaceae (Gramineae) Hordeum vulgare Korn Poaceae (Gramineae) Lolium perenne Engelskt rajgräs Poaceae (Gramineae) Oryza sativa Ris Poaceae (Gramineae) Secale cereale Råg Poaceae (Gramineae) Sorghum bicolor Durra Poaceae (Gramineae) Triticum aestivum Vete Poaceae (Gramineae) Zea mays Majs Tillägg 3 Förteckning över potentiellt användbara arter som inte är grödor OECD:s potentiellt användbara arter för testning av toxicitet Anmärkning: Följande tabell innehåller uppgifter om 52 arter som inte är grödor (hänvisningar ges inom parentes för varje post). Grobarhetssiffrorna kommer från publicerade källor och är bara tänkta som allmän vägledning. Den enskilda erfarenheten kan variera beroende på den källa fröna kommer ifrån och andra faktorer. FAMILJ Arter Vetenskapligt namn (svenskt namn) Livslängd (9) & livsmiljö Frövikt (mg) Fotoperiod för groning eller tillväxt (10) Planteringsdjup (mm) (11) Groningstid (dagar) (12) Särskild behandling (13) Toxicitetstest (14) Fröleve-rantörer (15) Andra hänvisningar (16) APIACEAE Torilis japónica (rödkörvel) А, В störda områden, häckar, betesmarker (16, 19) 1,7–1,9 (14, 19) L = M (14) 0 (1, 19) 5 (50 %) (19) kall stratifiering (7, 14, 18, 19) mognande evt. nödvändigt (19) grobarheten hämmas av mörker (1, 19) inga särskilda behandlingar (5) EFTER (5) ASTERACEAE Bellis perennis (tusensköna) Ρ gräsmark, åkermark, gräsmattor (16, 19) 0,09–0,17 (4, 19) L = M (14) 0 (4) 3 (50 %) (19) 11 (100 %) (18) grobarheten påverkas ej av strålning (18, 19) inga särskilda behandlingar (4, 14) EFTER (4) A, D, F 7 Centaurea cyanus (blåklint) A fält, vägkanter, öppen miljö (16) 4,1–4,9 (4, 14) L = M (14) 0–3 (2, 4, 14) 14–21 (100 %) (14) Inga särskilda behandlingar (2, 4) EFTER (2,4) A, D, E, F 7 Centaurea nigra (svartklint) Ρ fält, vägkanter, öppen miljö (16, 19) 2,4–2,6 (14, 19) L = M (14) 0 (19) 3 (50 %) (19) 4 (97 %) (18) mognande evt. nödvändigt (18, 19) grobarheten hämmas av mörker (19) inga särskilda behandlingar (5, 14, 26) EFTER (5, 22, 26) A Inula helenium (ålandsrot) Ρ fuktiga, störda områden (16) 1–1,3 (4, 14, 29) 0 (4, 29) inga särskilda behandlingar (4) EFTER (4) A, F Leontodon hispidus (sommarfibbla) Ρ fält, vägkanter, störda områden (16, 19) 0,85–1,2 (14, 19) L = M (14) 0 (19) 4 (50 %) (19) 7 (80 %) (18) grobarheten hämmas av mörker (17, 18, 19) inga särskilda behandlingar (5, 23) EFTER (5, 22, 23) Rudbeckia hirta (sträv rudbeckia) Β, Ρ störda områden (16) 0,3 (4, 14) L = M (14) 0 (4, 33) < 10 (100 %) (33) inga särskilda behandlingar (4, 14, 33) EFTER (4, 33) C, D, E, F Solidago canadensis (kanadensiskt gullris) Ρ betesmark, öppna områden (16) 0,06–0,08 (4, 14) L = M (11) 0 (4) 14–21 (11) blanda med lika delar sand och blötlägg i 500ppm gibberellinsyra i 24 timmar (11) inga särskilda behandlingar (4) EFTER (4) E, F Xanthium pensylvanicum (gullfrö) A fält, öppen miljö (16) 25–61 (14, 29) 0 (1) 5 (29) grobarheten kan begränsas av mörker (1) blötlägg i varmt vatten i 12 timmar (29) FÖRE & EFTER (31) A Xanthium spinosum (tistelgullfrö) A öppen miljö (16) 200 (14) L = M (14) L > M (6) 10 (6) scarifiering (14) inga särskilda behandlingar (6) FÖRE & EFTER (6) A Xanthium strumarium (mörkt gullfrö) A fält, öppen miljö (16) 67,4 (14) L = M (14) 10–20 (6, 21) inga särskilda behandlingar (6, 14, 21) FÖRE & EFTER (6, 21, 28, 31) A BRASSICACEAE Cardamine pratensis (ängsbräsma) Ρ fält, vägkanter, gräsmattor(16, 19) 0,6 (14, 19) L = M (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 15 (98 %) (18) grobarheten hämmas av mörker (18, 19) inga särskilda behandlingar (5, 14, 22) EFTER (5, 22) F CARYOPHYLLACEAE Lychnis flos-cuculi (gökblomster) Ρ (16) 0,21 (14) L = M (14) < 14 (100 %) (14, 25) mognande evt. nödvändigt (18) inga särskilda behandlingar (5, 14, 15, 22 och 26) EFTER (5, 15, 22–26) F CHENOPODIACEAE Chenopodium album (svinmålla) A åkerkanter, störda områden (16, 19) 0,7–1,5 (14, 19, 34) L = M (14) 0 (1, 19) 2 (50 %) (19) behandlingen varierar beroende på frönas färg (19) torrlagring under vintervila (19) grobarheten hämmas av mörker (1, 18, 19) kall stratifiering (18) inga särskilda behandlingar (14, 34) FÖRE & EFTER (28, 31, 34) A 32 CLUSIACEAE Hypericum perforatum (johannesört) Ρ fält, åkermark, öppen miljö (16, 19) 0,1–0,23 (14, 19) L = M (14) 0 (1, 19) 3 (19) 11 (90 %) (18) grobarheten hämmas av mörker (1, 18, 19) inga särskilda behandlingar (5, 14, 15, 25, 27) EFTER (5, 15, 25, 27) A, E, F CONVOLVULACEAE Ipomoea hederacea (murgrönsvinda) A vägkanter, öppen miljö, veteåkrar (16) 28,2 (14) L > M (6, 10) 10–20 (6, 10, 21) 4 (100 %) (10) grobarheten påverkas inte av strålning (1) inga särskilda behandlingar (6, 21) FÖRE & EFTER (6, 12, 21, 28) A CYPERACEAE Cyperus rotundus (runt cypergräs) Ρ åkermark, betesmark, vägkanter (16, 30) 0,2 (14) L = M (14) 0 (1) 10–20 (6, 10). 12 (91 %) (10) grobarheten hämmas av mörker (1) inga särskilda behandlingar (6, 10, 14) FÖRE & EFTER (6, 28, 31) B 7 FABACEAE Lotus corniculatus (käringtand) Ρ gräsbevuxna områden, vägkanter, öppen miljö (16, 19) 1–1,67 (14, 19) L = M (14) 1 (50 %) (19) scarifiering (14, 19) grobarheten påverkas inte av strålning (18, 19) inga särskilda behandlingar (23, 25) EFTER (5, 23, 25) A, D, E, F Senna obtusifolia (sojasenna) A fuktiga skogar (16) 23–28 (9) L = M (14) L > M (9) 10–20 (6,9) blötlägg fröna i vatten i 24 timmar (9) scarifiering (14) frönas livskraft beror på färgen (1) inga särskilda behandlingar (6) EFTER (6,9) A Sesbania exaltata (svenskt namn saknas) A alluvial jord (16) 11–13 (9, 14) L > M (9) 10–20 (9, 21) blötlägg fröna i vatten i 24 timmar (9) grobarheten påverkas inte av strålning (1) inga särskilda behandlingar (21) FÖRE & EFTER (9, 21, 28, 31) A Trifolium pratense (rödklöver) Ρ fält, vägkanter, åkermark (16, 19) 1,4–1,7 (14, 19) L = M (14) 1 (50 %) (19) scarifiering (14, 18) mognande evt. nödvändigt (19) grobarheten påverkas inte av strålning (1, 19) inga särskilda behandlingar (5) EFTER (5) A, E, F LAMIACEAE Leonurus cardiaca (hjärtstilla) Ρ öppna områden (16) 0,75–1,0 (4, 14) L = M (14) 0 (4) inga särskilda behandlingar (4, 14) EFTER (4) F Mentha spicata (grönmynta) Ρ fuktiga områden (16) 2,21 (4) 0 (4) inga särskilda behandlingar (4) EFTER (4) F Nepeta cataria (kattmynta) Ρ störda områden (16) 0,54 (4, 14) L = M (14) 0 (4) inga särskilda behandlingar (2, 4, 14) EFTER (2, 4) F Prunella vulgaris (brunört) Ρ åkermark, gräsbevuxna områden, störda områden (16, 19) 0,58–1,2 4, 14, 19 L = M (14) 0 4, 19 5 (50 %) (19) 7 (91 %) (18) grobarheten hämmas av mörker (18, 19) större grobarhet med större frön (1) inga särskilda behandlingar (4, 14, 22) EFTER (4, 22) A, F Stachys officinalis (humlesuga) Ρ gräsmark, åkerkanter (19) 14–18 (14, 19) L = M (14) 7 (50 %) (19) inga särskilda behandlingar (5, 14, 22) EFTER (5, 22) F MALVACEAE Abutilón theophrasti (lindmalva) A fält, öppen miljö (16) 8,8 (14) L = M (14) 10–20 (6, 10, 21) 4 (84 %) (10) scarifiering (14) inga särskilda behandlingar (5, 10, 21) FÖRE & EFTER (6, 22, 28, 31) A, F Sida spinosa (taggmalva) A fält, vägkanter (16) 3,8 (14) L = M (14) 10–20 6, 21 scarifiering (14) grobarheten påverkas inte av strålning (1) inga särskilda behandlingar (6, 21) FÖRE & EFTER 6, 21, 28, 31 A, F PAPAVERACEAE Papaver rhoeas (kornvallmo) A fält, åkermark, störda områden (16, 19) 0,1–0,3 4, 14, 19, 29 L = M (14) 0 (4, 29) 4 (50 %) (19) kall stratifiering & scarifiering (1, 19, 32) inga särskilda behandlingar (4, 14, 29) EFTER (4) A, D, E, F, G POACEAE Agrostis tenuis (rödven) gräsmattor, betesmark (16) 0,07 (14) L > M (Ю) 20 (10) 10 (62 %) (10) grobarheten hämmas av mörker (1, 17–19) inga särskilda behandlingar (10) EFTER (10) A, E Alopecurus myosuroides (renkavle) A fält, öppen miljö (16) 0,9–1,6 (29, 34) L = M (14) 2 (29) < 24 (30 %) (34) scarifiering (14) behandla med 101 mg/l KNO3 (14) varm stratifiering (1) grobarheten hämmas av mörker (1) inga särskilda behandlingar (34) FÖRE & EFTER (28, 34) A 32 Avena fatua (flyghavre) A odlade områden, öppen miljö (16) 7–37,5 (14, 30) L = M (14) L > M (6) 10–20 (6, 10). 3 (70 %) (18) scarifiering (7, 32) mörker hämmar grobarheten (1) kall stratifiering (1, 18) inga särskilda behandlingar (6, 10, 14) FÖRE & EFTER (6, 10, 28, 31) A Bromus tectorum (taklosta) A fält, vägkanter, åkermark (16) 0,45–2,28 (14, 29) L = M (14) 3 (29) mognadsperiod (1, 7, 32) grobarheten hämmas av ljus (1) inga särskilda behandlingar (14) FÖRE & EFTER (28, 31) A Cynosurus cristatus (kamäxing) P fält, vägkanter, öppen miljö (16, 19) 0,5–0,7 (14, 19, 29) L = M (14) 0 (29) 3 (50 %) (19) grobarheten påverkas inte av strålning (19) inga särskilda behandlingar (14, 29) EFTER (5) A Digitaria sanguinalis (blodhirs) A fält, gräsmattor, öppen miljö (16) 0,52–0,6 (14, 30) L = M (14) 10-20 (21) 7 (75 %) 14 (94 %) (7) scarifiering, kall stratifiering, & mognande (1, 7, 14, 32) behandlas med 101 mg/l KNO3 (14) grobarheten hämmas av mörker (1) inga särskilda behandlingar (21) FÖRE & EFTER (18, 25, 31) A Echinochloa crus-galli (hönshirs) A (16) 1,5 (14) L = M (14) L > M (3) 10–20 (7, 21) scarifiering (7, 32) grobarheten påverkas inte av strålning (1) inga särskilda behandlingar (3, 14, 21) FÖRE & EFTER (3, 21, 28, 31) A Elymus canadensis (kanadaelm) P strandnära, störda områden (16) 4–5 (14, 30) L = M (11) 1 (11) 14–28 (11) inga särskilda behandlingar (2, 11) EFTER (2) C, D, E Festuca pratensis (ängssvingel) P fält, fuktiga områden (16, 19) 1,53–2,2 (16, 19) L = M (14) L > M (10) 20 (10) 9 (74 %) (10) 2 (50 %) (19) inga särskilda behandlingar (10, 19) EFTER (10) A 7 Hordeum pusillum (dvärgkorn) A betesmark, vägkanter, öppen miljö (16) 3,28 (14) Varm stratifiering (1) grobarheten påverkas inte av strålning (1) FÖRE (31) 7 Phieum pratense (timotej) P betesmark, åkermark, störda områden (16, 19) 0,45 (14, 19) L > M (10, 14) 0–10 (10, 19) 2 (74 %) (10) 8 (50 %) (19) grobarheten hämmas av mörker (19) grobarheten påverkas inte av strålning (17) inga särskilda behandlingar (10, 14, 17, 19) EFTER (10) A, E POLYGONACEAE Polygonum convolvulus (åkerbinda) A öppen miljö, vägkanter (16) 5–8 (4, 14, 29) L = M (20) 0–2 (4, 29) Kall stratifiering i 4–8 veckor (1, 2, 4, 20, 29) grobarheten påverkas inte av strålning (1) FÖRE & EFTER 1, 2, 20, 28, 31 A 32 Polygonum lapathifolium (pilört) A fuktig jord (16) 1,8–2,5 (14) L > M (6) 5 (94 %) (18) Grobarheten påverkas inte av strålning (1) grobarheten hämmas av mörker (18) kall stratifiering (1) inga särskilda behandlingar (5) FÖRE & EFTER (6) A, E Polygonum pennsylvanicum (svenskt namn saknas) A fält, öppen miljö (16) 3,6–7 (14, 29) 2 (29) kall stratifiering i 4 v. vid 0–5 °C (1, 29) grobarheten hämmas av mörker (1) FÖRE (31) A, E Polygonum persicaria (åkerpilört) A störda områden, åkermark (16, 19) 2,1–2,3 (14, 19) L > M (13) 0 (19) < 14 (13) 2 (50 %) (19) scarifiering, kall stratifiering, behandling med gibberellinsyra (14) kall stratifiering, mognande (17–19) grobarheten hämmas av mörker (19) inga särskilda behandlingar (13) EFTER (13) A 32 Rumex crispus (krusskräppa) P åkermark, vägkanter, öppna områden (16, 19) 1,3–1,5 (4, 14, 19) L = M (14, 33) 0 (4, 19, 33) 3 (50 %) (19) 6 (100 %) (33) grobarheten hämmas av mörker (18, 19) mognande evt. nödvändigt (18) inga särskilda behandlingar (4, 14, 33) EFTER (4, 33) A, E 32 PRIMULACEAE Anagallis arvensis (rödmire) A åkermark, öppna områden, störda områden (16, 19) 0,4–0,5 (4, 14, 19) L = M (14) 1 (50 %) (19) kall stratifiering, behandling med gibberellinsyra (1,14, 18, 19, 32) ljus krävs för groning (1) inga särskilda behandlingar (2, 4) EFTER (2,4) A, F RANUNCULACEAE Ranunculus acris (smörblomma) Ρ åkermark, vägkanter, öppna områden (16, 19) 1,5–2 (14, 19, 29) L = M (14) 1 (29) 41–56 (19, 29) inga särskilda behandlingar (5, 14, 22, 24–26) EFTER (5, 22, 24–26) 32 ROSACEAE Geum urbanum (nejlikrot) Ρ häckar, fuktiga områden (16, 19) 0,8–1,5 (14, 19) L = M (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 16 (79 %) (18) grobarheten hämmas av mörker (18, 19) varm stratifiering (1) inga särskilda behandlingar (5, 14, 22, 25, 26) EFTER (5, 22, 25, 26) A RUBIACEAE Galium aparine (snärjmåra) A åkermark, fuktiga områden, störda områden (16, 19) 7–9 (14, 19) L = M (14) 5 (50 %) (19) 6 (100 %) (18) kall stratifiering (1, 18, 19) grobarheten påverkas inte av strålning (18, 19) ljus hämmar grobarheten (1) inga särskilda behandlingar (6, 14) FÖRE & EFTER (6, 28) A 32 Galium mollugo (stormåra) Ρ häckvallar, öppna områden (8) 7 (29) L = M (14) 2 (29) inga särskilda behandlingar (5, 14, 22, 24, 26, 29) EFTER (5, 22, 24, 26) A SCROPHULARIACEAE Digitalis purpurea (fingerborgsblomma) Β, P häckar, öppna områden (16, 19) 0,1–0,6 (4, 14, 19) L = M (14) 0 4, 19 6 (50 %) (19) 8 (99 %) (18) grobarheten hämmas av mörker (1, 17 och 19) inga särskilda behandlingar (4, 22 och 26) EFTER (4, 22–26) D, F, G Veronica persica (trädgårdsveronika) A åkermark, öppna områden, störda områden (16, 19) 0,5–0,6 (14, 19) L = M (14) 0 (19) 3 (19) 5 (96 %) (18) grobarheten hämmas av mörker (18, 19) kall stratifiering (18) inga särskilda behandlingar (14) FÖRE & EFTER (28) A 32 Fröleverantörer som anges i tabellen Leverantörs-ID Leverantörsuppgifter A Herbiseed New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ ENGLAND +44 (0) 1189 349 464 www.herbiseed.com B Tropilab Inc. 8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771-3948 USA (727) 344 – 4050 www.tropilab.com C Pterophylla – Native Plants & Seeds #316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0 KANADA (519) 586 – 3985 D Applewood Seed Co. 5380 Vivian St., Arvada, CO 80002 USA (303) 431 – 7333 www.applewoodseed.com E Ernst Conservation Seeds 9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335 USA (800) 873 – 3321 www.ernstseed.com F Chiltern Seeds Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB ENGLAND + 44 1229 581137 www.chilternseeds.co.uk G Thompson & Morgan P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7 KANADA (800) 274 – 7333 www.thompson-morgan.com HÄNVISNINGAR (1) Baskin, C. C. och Baskin, J. M. (1998). Seeds. Academic Press, Toronto (2) Blackburn, L. G. och Boutin, C. (2003). Subtle effects of herbicide use in the context of genetically modified crops: a case study with glyphosate (Round-Up®). Ecotoxicology, 12, 271–285. (3) Boutin, C., Lee, H-B., Peart, T., Batchelor, P. S och Maguire, R. J. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Environmental Toxicology & Chemistry, 19:10, 2532–2541. (4) Boutin, C., Elmegaard, N. och Kjaer, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: implications for risk assessment. Ecotoxicology, 13, 349–369. (5) Breeze, V., Thomas, G. och Butler, R. (1992). Use of a model and toxicity data to predict the risks to some wild plant species from drift of four herbicides. Annals of Applied Biology, 121, 669–677. (6) Brown, R. A. och Farmer, D. (1991). Track-sprayer and glasshouse techniques for terrestrial plant bioassays with pesticides. I: Plants for toxicity assessment, vol. 2. ASTM STP 1115, J. W. Gorsuch, W. R. Lower, W. Wang och M. A. Lewis (red.). American Society for Testing & Materials, Philadelphia. s. 197–208. (7) Buhler, D. D. och Hoffman, M. L. (1999). Anderson's guide to practical methods of propagating weeds and other plants. Weed Science Society of America, Lawrence, K. (8) Clapham, P. A., Tutin, T. G. och Warburg, E .F. (1981). Excursion flora of the British Isles, tredje upplagan. Cambridge University Press, Cambridge (9) Clay, P. A. och Griffin, J. L. (2000). Weed seed production and seedling emergence response to late-season glyphosate applications. Weed Science, 48, 481–486. (10) Cole, J. F. H. och Canning, L. (1993). Rationale for the choice of species in the regulatory testing of the effects of pesticides on terrestrial non-target plants. BCPC – Weeds. s. 151–156. (11) Fiely, M. (Ernst Conservation Seeds). (2004). Pers. med. (www.ernstseed.com) (12) Fletcher, J. S., Johnson, F. L. och McFarlane, J. C. (1990). Influence of greenhouse versus field testing and taxonomic differences on plant sensitivity to chemical treatment. Environmental Toxicology & Chemistry, 9, 769–776. (13) Fletcher, J. S., Pfleeger, T. G., Ratsch, H. C. och Hayes, R. (1996). Potential impact of low levels of chlorsulfuron and other herbicides on growth and yield of nontarget plants. Environmental Toxicology & Chemistry, 15:7, 1189–1196. (14) Flynn, S., Turner, R. M., och Dickie, J. B. (2004). Seed Information Database (utgåva 6.0, oktober 2004) Royal Botanic Gardens, Kew (www.rbgkew.org.uk/data/sid) (15) Franzaring, J., Kempenaar, C. och van der Eerden, L. J. M. (2001). Effects of vapours of chlorpropham and ethofumesate on wild plant species. Environmental Pollution, 114, 21–28. (16) Gleason, H.A. och Cronquist, A. (1991). Manual of vascular plants of northeastern United States and adjacent Canada, andra upplagan. New York Botanical Garden, Bronx, NY (17) Grime, J. P. (1981). The role of seed dormancy in vegetation dynamics. Annals of Applied Biology, 98, 555–558. (18) Grime, J. P., Mason, G., Curtis, A. V., Rodman, J., Band, S. R., Mowforth, M. A. G., Neal, A. M. och Shaw, S. (1981). A comparative study of germination characteristics in a local flora. Journal of Ecology, 69, 1017–1059. (19) Grime, J. P., Hodgson, J. G. och Hunt, R. (1988). Comparative plant ecology: a functional approach to common British species. Unwin Hyman Ltd., London (20) Kjaer, C. (1994). Sublethal effects of chlorsulfuron on black bindweed (Polygonum convolvulus L.). Weed Research, 34, 453–459. (21) Klingaman, T. E., King, C. A. och Oliver, L. R. (1992). Effect of application rate, weed species, and weed stage of growth on imazethapyr activity. Weed Science, 40, 227–232. (22) Marrs, R. H., Williams, C. T., Frost, A. J. och Plant, R. A. (1989). Assessment of the effects of herbicide spray drift on a range of plant species of conservation interest. Environmental Pollution, 59, 71–86. (23) Marrs, R. H., Frost, A. J. och Plant, R.A. (1991). Effects of herbicide spray drift on selected species of nature conservation interest: the effects of plant age and surrounding vegetation structure. Environmental Pollution, 69, 223–235. (24) Marrs, R. H., Frost, A. J. och Plant, R.A. (1991). Effects of mecoprop drift on some plant species of conservation interest when grown in standardized mixtures in microcosms. Environmental Pollution, 73, 25–42. (25) Marrs, R. H., Frost, A. J., Plant, R. A. och Lunnis, P. (1993). Determination of buffer zones to protect seedlings of non-target plants from the effects of glyphosate spray drift. Agriculture, Ecosystems, & Environment, 45, 283–293. (26) Marrs, R. H. och Frost, A. J. (1997). A microcosm approach to detection of the effects of herbicide spray drift in plant communities. Journal of Environmental Management, 50, 369–388. (27) Marshall, E. J. P. och Bernie, J. E. (1985). Herbicide effects on field margin flora. BCPC – Weeds. s. 1021–1028. (28) McKelvey, R. A., Wright, J. P. och Honegger, J. L. (2002). A comparison of crop and non-crop plants as sensitive species for regulatory testing. Pest Management Science, 58, 1161–1174. (29) Morton, S. (Herbiseed). (2004). Pers. med. (http://www.herbiseed.com) (30) USDA, NRCS. (2004). The Plants Database, version 3.5. (http://plants.usda.gov). National Plant Data Centre, Baton Rouge, LA 70874-4490 USA (31) USEPA. (1999). One-Liner Database. [U.S. E.P.A./Office of Pesticide Programs/Environmental Fate and Effects Division/Environmental Epidemiology Branch]. (32) Webster, R. H. (1979). Technical Report No. 56: Growing weeds from seeds and other propagules for experimental purposes. Agricultural Research Council Weed Research Organization, Oxford. (33) White, A. L. och Boutin, C. (National Wildlife Research Centre, Environment Canada). (2004). Pers. med. (34) Zwerger, P. och Pestemer, W. (2000). Testing the phytotoxic effects of herbicides on higher terrestrial non-target plants using a plant life-cycle test. Z. PflKrankh. Pflschutz: Sonderh., 17, 711–718. Tillägg 4 Exempel på lämpliga odlingsbetingelser för vissa arter av grödor Följande betingelser har befunnits lämpliga för tio arter av grödor, och de kan användas som vägledning för tester i odlingskammare med vissa andra arter: Koncentration av koldioxid: 350 ± 50 ppm. Relativ luftfuktighet 70 ± 5 % under ljusperioder och 90 ± 5 % under mörkerperioder. Temperatur: 25 ± 3 °C under dagen, 20 ± 3 °C under natten. Fotoperiod: 16 h ljus/8 h mörker. Ljuset ska ha en genomsnittlig våglängd på 400–700 nm. Ljus: luminans 350 ± 50 μE/m2/s, uppmätt högst upp i krontaket. Grödorna är följande: — tomat (Solanum lycopersicon), — gurka (Cucumis sativus), — trädgårdssallat (Lactuca sativa), — sojaböna (Glycine max), — kål (Brassica oleracea var. capitata), — morot (Daucus carota), — havre (Avena sativa), — engelskt rajgräs (Lolium perenne), — sockermajs (Zea mays), — lök (Allium cepa). C.32. REPRODUKTIONSTEST FÖR SMÅRINGMASKAR (ENCHYTRAEIDAE) INLEDNING 1. Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 220 (2004). Den är utformad för att användas för bestämning av effekterna av kemikalier på reproduktionskapaciteten hos småringmasken Enchytraeus albidus (vit ringmask) Henle 1873, i jord. Den bygger främst på en metod som har utvecklats av den federala tyska miljöskyddsmyndigheten (1) och som har ringtestats (2). Andra metoder för testning av kemikaliers toxicitet för småringmaskar och daggmaskar har också övervägts (3) (4) (5) (6) (7) (8). INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN 2. Marklevande ringmaskar av släktet Enchytraeus är ekologiskt relevanta för ekotoxikologisk testning. Småringmaskar påträffas ofta i jordar som innehåller daggmaskar, men samtidigt är de ofta vanliga i många jordar där daggmaskar saknas. Småringmaskar kan användas i laboratorietester samt i studier under fältliknande förhållanden och i fältstudier. Ur praktisk synvinkel är många småringmaskar lätta att hantera och föda upp, och deras reproduktionscykel är betydligt kortare än daggmaskarnas. Ett reproduktionstest med småringmaskar tar därför bara 4–6 veckor, medan det för daggmaskar (Eisenia fetida) tar 8 veckor. 3. Grundläggande information om småringmaskarnas ekologi och ekotoxikologi i terrester miljö finns i (9) (10) (11) (12). PRINCIP FÖR TESTMETODEN 4. Adulta småringmaskar exponeras för en serie koncentrationer av testkemikalien som blandats ner i syntetisk jord. Testet kan delas upp i två etapper: (a) ett preliminärt test, om inte tillräcklig information finns att tillgå, där dödligheten är den huvudsakliga endpoint som ska bedömas efter två veckors exponering och (b) ett definitivt reproduktionstest där det totala antalet avkommor som produceras av föräldradjuren samt föräldradjurens överlevnad bedöms. Varaktigheten för det definitiva testet är 6 veckor. Efter de första tre veckorna avlägsnas adulterna och morfologiska förändringar registreras. Efter ytterligare tre veckor räknas den avkomma som kläckts ur de kokonger som producerats av adulterna. Reproduktionskapaciteten hos de djur som exponerats för testkemikalien jämförs med kontrollen eller kontrollerna för att fastställa (i) den koncentation vid vilken inga verkningar observeras (NOEC) och/eller (ii) ECx (t.ex. EC10, EC50) genom att använda en regressionsmodell för att beräkna den koncentration som orsakar en minskning av reproduktionskapaciteten med x %. ECx bör ligga inom intervallet av testkoncentrationer (t.ex. EC10, EC50) så att ECx interpoleras snarare än extrapoleras. INFORMATION OM TESTKEMIKALIEN 5. Testkemikaliens vattenlöslighet, log Kow, fördelningskoefficient jord/vatten (t.ex. kapitel C.18 eller C.19 i denna bilaga) och ångtryck bör helst vara kända. Helst ska det finnas ytterligare information om testkemikaliens omvandling, spridning och fördelning i jord, såsom fotolys- och hydrolyshastighet. 6. Testmetoden kan användas för kemikalier som är lösliga eller olösliga i vatten. Testkemikaliens appliceringsmetod måste dock anpassas i enlighet med detta. Testmetoden kan inte användas för flyktiga kemikalier, dvs. kemikalier för vilka Henrys konstant eller fördelningskoefficienten luft/vatten är större än ett, eller kemikalier för vilka ångtrycket överstiger 0,0133 Pa vid 25 °C. TESTETS GILTIGHET 7. För att testet ska vara giltigt måste följande kriterier uppfyllas för kontrollerna: — Dödligheten hos adulter bör inte överstiga 20 % i slutet av det preliminära testet och efter de första tre veckorna av reproduktionstestet. — Om man antar att tio adulter per kärl används i testets inledning bör i genomsnitt minst 25 juveniler per kärl ha producerats i slutet av testet. — Variationskoefficienten för det genomsnittliga antalet avkommor bör inte vara högre än 50 % i slutet av reproduktionstestet. Om ett test inte uppfyller ovanstående kriterier för testresultatens giltighet bör testet avslutas, såvida inte en motivering för att fortsätta med testet kan ges. Motiveringen ska ingå i testrapporten. REFERENSKEMIKALIE 8. En referenskemikalie ska testas antingen regelbundet eller eventuellt som ett inslag i varje test för att kontrollera att testorganismernas reaktion inte har förändrats avsevärt med tiden. En lämplig referenskemikalie är karbendazim, som visat sig påverka småringmaskars överlevnad och fortplantning (13) (14). Andra kemikalier vars toxicitetsdata är välkända kan också användas. En beredning av karbendazim som har handelsbeteckningen Derosal™ och levereras av företaget AgrEvo (Frankfurt, Tyskland), och som innehåller 360 g/l (32,18 %) verksamt ämne har använts i ett ringtest (2). EC50-värdet för reproduktionen som fastställdes i ringtestet var i storleksordningen 1,2 ± 0,8 mg verksamt ämne/kg torrvikt (2). Om en positiv giftekvivalent ingår i testserien används en koncentration och antalet replikat bör vara detsamma som i kontrollerna. För karbendazim rekommenderas testning av 1,2 mg verksamt ämne/kg torrvikt (testad som en flytande beredning). BESKRIVNING AV TESTET Utrustning 9. Testkärlen bör vara tillverkade av glas eller annat kemiskt inert material. Glasburkar (t.ex. kärlvolym: 0,20–0,25 liter, diameter: ≈ 6 cm) är lämpliga att använda. Kärlen bör ha transparenta lock (t.ex. glas eller polyeten) som utformats för att minska vattenavdunstningen samtidigt som de möjliggör gasväxling mellan jord och luft. Locken bör vara genomskinliga för att möjliggöra ljusgenomsläpplighet. 10. Dessutom behövs normal laboratorieutrustning, särskilt följande: — torkskåp, — stereomikroskop, — pH-mätare och fotometer, — en lämplig exakt våg, — lämplig utrustning för temperaturreglering, — lämplig utrustning för reglering av luftfuktigheten (inte nödvändigt om exponeringskärlen har lock), — inkubator eller ett litet rum med luftkonditionering, — pincett, krokar eller öglor, — framkallningskärl. Beredning av den syntetiska jorden 11. I detta test används en syntetisk jord (5) (7) med följande sammansättning (baserad på torrvikt, torkad till en konstant vikt vid 105 °C): — 10 % vitmosstorv (Sphagnum), lufttorkad och finfördelad (en partikelstorlek på 2 ± 1 mm är godtagbar). Man bör kontrollera att en jord som bereds med en färsk torvblandning är lämplig för maskodling innan den används i ett test, — 20 % kaolinlera (kaolinithalt helst över 30 %), — cirka 0,3–1,0 % kalciumkarbonat (CaCO3, pulvriserat, av analyskvalitet) som tillsätts för att få ett pH-värde på 6,0 ± 0,5. Mängden tillsatt kalciumkarbonat beror främst på torvens kvalitet/beskaffenhet, — ungefär 70 % lufttorkad kvartssand (beroende på vilken mängd CaCO3 som krävs), främst fin sand där mer än 50 % av partiklarna har storleken 50–200 μm. Man bör kunna visa att en artificiell jord är lämplig för odling av maskar och för att uppnå kriterierna för testresultatets giltighet innan jorden används i ett definitivt test. Det är särskilt tillrådligt att göra en sådan kontroll för att säkerställa att testutförandet inte äventyras om halten av organiskt kol i den syntetiska jorden minskar, t.ex. genom att sänka torvhalten till 4–5 % och öka sandhalten i motsvarande grad. Med en sådan minskning av halten organiskt kol kan möjligheterna till adsorption av testkemikalien till jorden (organiskt kol) minskas, och då blir testkemikalien bättre tillgänglig för maskarna. Det har visats att Enchytraeus albidus kan uppfylla giltighetskriterierna för reproduktion vid testning i fältjordar med en halt av organiskt kol som är lägre än den ovannämnda (t.ex. 2,7 %) (15), och det finns viss erfarenhet av att detta också kan uppnås i syntetisk jord med 5 % torv. Anmärkning: Vid användning av naturlig jord i ytterligare tester (t.ex. senare steg) bör jordens lämplighet och uppnåendet av kriterierna för testresultatets giltighet också påvisas. 12. Jordens torra beståndsdelar blandas omsorgsfullt (t.ex. i en storskalig laboratorieblandare). Detta bör göras minst en vecka innan testet inleds. Jordblandningen ska lagras i två dagar i syfte att nå surhetsjämvikt. För bestämning av pH-värdet används en blandning av jord och en lösning med 1 M kaliumklorid (KCl) eller 0,01 M kalciumklorid (CaCl2) i förhållandet 1:5 (se (16) och tillägg 3). Om marken är surare än det intervall som krävs (se punkt 11) kan detta justeras genom tillsats av lämplig mängd CaCO3. Om marken är för alkalisk kan detta justeras genom tillsats av en större mängd av blandningen som avses i punkt 11, förutom att CaCO3 utesluts. 13. Den syntetiska jordens maximala vattenhållningskapacitet (WHC) bestäms i enlighet med de förfaranden som beskrivs i tillägg 2. En eller två dagar innan testet inleds förhandsfuktas den torra syntetiska jorden med tillräcklig mängd avjonat vatten till dess att den har en vattenhalt som motsvarar cirka hälften av den slutliga vattenhalten, dvs. 40–60 % av maximal vattenhållningskapacitet. I början av testet delas den förhandsfuktade jorden upp i portioner som motsvarar antalet testkoncentrationer (och referenskemikalie i förekommande fall) och kontroller som används i testet. Fukthalten justeras till 40–60 % av maximal vattenhållningskapacitet genom tillsats av testkemikalielösningen och/eller av destillerat eller avjonat vatten (se punkterna 19–21). Fukthalten bestäms i början och i slutet av testet (genom torkning till konstant vikt vid 105 °C) och bör hållas inom det optimala intervallet för maskarnas överlevnad. En summarisk kontroll av jordens fukthalt kan göras genom att man försiktigt pressar jorden i handen. Om vattenhalten är korrekt ska små vattendroppar sippra ut mellan fingrarna. Urval och förberedelse av försöksdjuren 14. Den rekommenderade testarten är Enchytraeus albidus Henle 1837 (vit ringmask), en medlem av familjen Enchytraeidae (ordning Oligochaeta, fylum Annelida). E. albidus är en av de största arterna av småringmaskar, med dokumenterade exemplar på upp till 35 mm längd (17) (18). E. albidus förekommer över hela världen och återfinns i marina, limniska och terrestra livsmiljöer på land, främst i multnande organiskt material (tång, kompost) och i sällsynta fall på ängar (9). Dess breda ekologiska tolerans och vissa morfologiska variationer tyder på att det finns olika raser. 15. E. albidus finns kommersiellt tillgänglig som fiskfoder. Man bör kontrollera om odlingen är kontaminerad av andra, vanligtvis mindre arter (1) (19). Om kontaminering förekommer bör alla maskar tvättas med vatten i en petriskål. Stora adulta exemplar av E. albidus bör därefter väljas ut (med hjälp av stereomikroskop) för att starta en ny odling, och alla andra maskar kasseras. E. albidus kan lätt odlas i många olika organiska material (se tillägg 4). Livscykeln för E. albidus är kort eftersom maskarna blir könsmogna mellan 33 dagars (vid 18 °C) och 74 dagars ålder (vid 12 °C) (1). Endast odlingar som har hållits utan problem i laboratoriet i minst fem veckor (en generation) används för testet. 16. Andra arter av släktet Enchytraeus är också lämpliga, t.ex. E. buchholzi Vejdovsky 1879 eller E. crypticus Westheide & Graefe 1992 (se tillägg 5). Om andra arter av släktet Enchytraeus används bör de identifieras tydligt och motiveringen för valet av art bör rapporteras. 17. I testerna används adulta maskar. De bör ha ägg (vita fläckar) i clitellum (gördeln), och de bör vara av ungefär samma storlek (ca 1 cm långa). Det är inte nödvändigt att synkronisera uppfödningskulturen. 18. Om småringmaskarna inte föds upp i samma jordtyp och under de förutsättningar (inklusive utfodring) som ska användas för det slutliga testet måste de acklimatiseras i minst 24 timmar och upp till 3 dagar. Ett större antal adulter än vad som krävs för att utföra testet bör inledningsvis acklimatiseras för att skadade eller på annat sätt olämpliga exemplar ska kunna kasseras. I slutet av acklimatiseringsperioden ska endast maskar som innehåller ägg och som inte uppvisar några beteendestörningar (t.ex. försöker ge sig iväg upp ur jorden) väljas ut för testet. Maskarna avlägsnas försiktigt med hjälp av urmakarpincett, krokar eller öglor och placeras i en petriskål som innehåller en mindre mängd sötvatten. Rekonstituerat sötvatten som föreslås i kapitel C.20 i denna bilaga (Reproduktionstest för Daphnia magna) lämpar sig bäst för detta ändamål eftersom avjonat eller avmineraliserat vatten eller kranvatten skulle kunna skada odlingen. Maskarna kontrolleras under stereomikroskop och de som inte innehåller ägg kasseras. Man måste vara noga med att avlägsna och kasta bort eventuella kvalster eller hoppstjärtar som kan ha infekterat kulturerna. Friska maskar som inte används i testet återbördas till stamkulturen. Beredning av testkoncentrationer Testkemikalier som är lösliga i vatten 19. En lösning av testkemikalien bereds i avjonat vatten i tillräcklig mängd för att räcka till alla replikat av en testkoncentration. Det rekommenderas att man använder en lämplig mängd vatten för att nå önskad fukthalt, dvs. 40–60 % av maximal vattenhållningskapacitet (se punkt 13). Varje lösning av testkemikalien blandas grundligt med ett parti förhandsfuktad jord innan den tillsätts i testkärlet. Testkemikalier som är olösliga i vatten 20. För kemikalier som inte är lösliga i vatten men som är lösliga i organiska lösningsmedel kan testkemikalien lösas upp i minsta möjliga volym i en lämplig vehikel (t.ex. aceton). Endast flyktiga lösningsmedel bör användas. Vehikeln sprejas på eller blandas med en liten mängd fin kvartssand, till exempel 2,5 g. Vehikeln avlägsnas genom avdunstning i ett dragskåp i minst 1 timme. Blandningen av kvartssand och testkemikalie tillförs den på förhand fuktade jorden och blandas omsorgsfullt efter tillsats av lämplig mängd avjonat vatten för att få den fuktighet som krävs. Den slutliga blandningen överförs till testkärlen. 21. För kemikalier som är svårlösliga i vatten och i organiska lösningsmedel blandas motsvarande 2,5 g finmald kvartssand per testkärl med den mängd testkemikalie som ger önskad testkoncentration. Blandningen av kvartssand och testkemikalie tillförs den förhandsfuktade jorden och blandas omsorgsfullt efter tillsats av lämplig mängd avjonat vatten för att få önskad fukthalt. Den slutliga blandningen fördelas mellan testkärlen. Förfarandet upprepas för varje testkoncentration, och en lämplig kontroll upprättas också. 22. Kemikalier bör normalt inte testas i koncentrationer som överstiger 1 000 mg/kg torrvikt jord. Testning vid högre koncentrationer kan dock vara nödvändig i enlighet med syftet för ett visst test. TESTFÖRFARANDE Testgrupper och kontroller 23. För varje koncentration av testkemikalien placeras en mängd jord som motsvarar 20 g torrvikt i testkärlet (se punkterna 19–21). Man bereder även kontroller utan testkemikalien. Foder tillsätts varje kärl i enlighet med de förfaranden som beskrivs i punkt 29. Tio maskar fördelas slumpvis till varje testkärl. Maskarna överförs försiktigt till varje testkärl och placeras på ytan av jorden, t.ex. med hjälp av urmakarpincett, krokar eller öglor. Antalet replikat för testkoncentrationer och för kontroller beror på testupplägget (se punkt 34). Testkärlen placeras slumpvis i inkubatorn och deras positioner ändras slumpvis varje vecka. 24. Om en vehikel används för applicering av testkemikalien bör man utöver testserierna även ha en kontrollserie som innehåller kvartssand som sprejats eller blandats med lösningsmedel. Lösningsmedlet eller dispergeringsmedlet bör ha samma koncentration som den som används i de testkärl som innehåller testkemikalien. Man bör ha en kontrollserie som innehåller ytterligare kvartssand (2,5 g per kärl) för kemikalier som kräver tillförsel i enlighet med de förfaranden som beskrivs i punkt 21. Testbetingelser 25. Testtemperaturen ska vara 20 ± 2 °C. För att minska risken för att maskar tar sig upp ur jorden ska testet utföras under kontrollerade ljus-/mörkercykler (helst 16 h ljus/8 h mörker) med en belysning på 400–800 lux i området med testkärlen. 26. För att kontrollera jordens fuktighet ska kärlen vägas vid testets början och därefter en gång i veckan. Viktförluster ska utjämnas genom tillsats av lämplig mängd avjonat vatten. Det bör noteras att förlusten av vatten kan minskas genom att man bibehåller en hög luftfuktighet (> 80 %) i inkubatorn. 27. Fukthalt och pH ska mätas i början och slutet av både det preliminära och det definitiva testet. Mätningarna bör göras i de kontroller och de behandlade jordprover (alla koncentrationer) som beretts och underhålls på samma sätt som testkulturerna men som inte innehåller maskar. Foder bör endast tillföras dessa jordprover i början av testet för att främja den mikrobiella aktiviteten. Mängden foder bör vara densamma som i testkulturerna. Det är inte nödvändigt att tillföra ytterligare foder till dessa kärl under testets gång. Utfodring 28. Ett foder som kan livnära populationen med småringmaskar kan användas. Valsad havre, som helst ska autoklaveras före användning för att undvika kontaminering av mikroorganismer (uppvärmning går också bra), har befunnits vara ett lämpligt foder. 29. Fodret tillförs först genom att 50 mg malda havregryn blandas ned i jorden i varje kärl innan maskarna införs. Därefter tillförs födan veckovis fram till dag 21. Ingen utfodring görs på dag 28 eftersom adulterna har avlägsnats i detta skede och juvenilerna har relativt lite behov av extra foder efter denna dag. Utfodringen under testet utgörs av 25 mg malda havregryn per kärl försiktigt placerad på ytan av jorden för att undvika att skada maskarna. För att minska tillväxten av mögel bör havreflingorna grävas ner i jorden genom att man täcker dem med små mängder jord. Om fodret förblir oätet bör fodergivan minskas. Utformning av det preliminära testet 30. Vid behov kan ett preliminärt test utföras med t.ex. fem koncentrationer av testkemikalien på 0,1, 1,0, 10, 100 och 1 000 mg/kg (torrvikt jord). Ett replikat för varje exponering och kontroll är tillräckligt. 31. Det preliminära testets varaktighet är två veckor. Vid slutet av provet bedöms maskarnas dödlighet. En mask registreras som död om den inte reagerar på mekanisk retning på främre delen. Ytterligare information rörande dödligheten kan också vara användbar för att avgöra vilket koncentrationsintervall som ska användas i det definitiva testet. Förändringar i adulternas beteende (t.ex. oförmåga att gräva ner sig i jorden, maskar ligger orörliga mot testkärlets glasvägg) och morfologi (t.ex. öppna sår) bör därför också registreras, liksom eventuell förekomst av juveniler. Det senare kan fastställas med hjälp av den färgningsmetod som beskrivs i tillägg 6. 32. Ett approximativt värde på LC50 kan fastställas genom beräkning av mortalitetsuppgifternas geometriska medelvärde. När man fastställer koncentrationsintervallet för det definitiva testet antas effekterna på fortplantningen vara lägre än LC50 med en faktor på upp till 10. Detta är dock ett empiriskt förhållande och i ett enskilt fall kan det skilja sig. Ytterligare iakttagelser i det preliminära testet, t.ex. förekomst av juveniler, kan bidra till att finjustera det koncentrationsintervall för testkemikalien som ska användas i det definitiva testet. 33. För att en noggrann bestämning av LC50 ska kunna göras rekommenderas att testet utförs med minst fyra replikat för varje koncentration av testkemikalien och ett tillräckligt antal koncentrationer för att framkalla minst fyra olika statistiskt signifikanta genomsnittliga responser på dessa koncentrationer. Ett liknande antal koncentrationer och replikat för kontrollerna ska användas när detta är tillämpligt. Utformning av det definitiva reproduktionstestet 34. Tre utformningar föreslås på grundval av de rekommendationer som ett ringtest ger upphov till (2). — För bestämning av NOEC bör minst fem koncentrationer i en geometrisk serie testas. Det rekommenderas att man använder fyra replikat för varje testkoncentration plus åtta kontroller. Koncentrationerna bör skilja sig åt med en faktor på högst 1,8. — För bestämning av ECx (t.ex. EC10, EC50), bör minst fem koncentrationer testas, och ECx ska ligga innanför intervallet av testkoncentrationer så att det blir möjligt att interpolera snarare än extrapolera ECx. Det rekommenderas att man använder minst fyra replikat för varje testkoncentration och fyra kontrollreplikat. Koncentrationernas inbördes avståndsfaktor kan variera, dvs. den kan vara mindre än eller lika med 1,8 i det förväntade effektintervallet och större än 1,8 vid högre och lägre koncentrationer. — Ett kombinerat tillvägagångssätt möjliggör bestämning av både NOEC och ECx. Man bör använda åtta testkoncentrationer i en geometrisk serie. Fyra replikat per exponering plus åtta kontroller rekommenderas. Koncentrationerna bör skilja sig åt med en faktor på högst 1,8. 35. Varje testkärl ska innehålla tio adulter (se punkt 23). Foder tillsätts i testbehållarna i början av testet och därefter en gång per vecka (se punkt 29) upp till och inklusive dag 21. Dag 21 genomsöks jordproven försiktigt för hand och de levande adulta maskarna undersöks och räknas, och förändringar i beteende (t.ex. oförmåga att gräva ner sig i jorden, maskar ligger orörliga mot testkärlets glasvägg) och morfologi (t.ex. öppna sår) registreras. Alla adulter avlägsnas från testkärlen och testjorden. Testjorden med de kokonger som har producerats inkuberas i ytterligare tre veckor under samma testförhållanden, förutom att utfodring sker endast dag 35 (25 mg malda havregryn per kärl). 36. Efter sex veckor räknas de nykläckta maskarna. Det rekommenderas att man använder metoden som bygger på kontrastfärgning med rött (se tillägg 6), även om andra våta (men inte varma) extraktions- och flotationstekniker (se tillägg 6) också har visat sig vara lämpliga (4) (10) (11) (20). Röd kontrastfärgning rekommenderas eftersom våt extraktion från ett jordsubstrat kan förhindras av grumlighet som orsakas av suspenderade lerpartiklar. Toleranstest 37. Om inga effekter observeras vid den högsta koncentrationen i det preliminära testet (dvs. 1 000 mg/kg), kan reproduktionstestet utföras som ett toleranstest med 1 000 mg/kg för att visa att NOEC för reproduktion är större än detta värde. Sammanfattning och tidsplan för testet 38. Stegen i testet kan sammanfattas på följande sätt: Tid Preliminärt test Definitivt test Dag – 7 eller tidigare — Bered syntetisk jord (blanda torra beståndsdelar) — Bered syntetisk jord (blanda torra beståndsdelar) Dag – 5 — Kontrollera pH i den syntetiska jorden — Mät jordens maximala vattenhållningskapacitet — Kontrollera pH i den syntetiska jorden — Mät jordens maximala vattenhållningskapacitet Dag – 5 till – 3 — Sortera maskar för acklimatisering — Sortera maskar för acklimatisering Dag – 3 till 0 — Låt maskarna acklimatisera sig i minst 24 timmar — Låt maskarna acklimatisera sig i minst 24 timmar Dag – 1 — Förhandsfukta den syntetiska jorden och fördela i partier — Förhandsfukta den syntetiska jorden och fördela i partier Dag 0 — Bered stamlösningar — Applicera testkemikalien — Väg testsubstratet i testkärlen — Blanda ner foder — Tillsätt maskarna — Mät jordens pH-värde och vattenhalt — Bered stamlösningar — Applicera testkemikalien — Väg testsubstratet i testkärlen — Blanda ner foder — Tillsätt maskarna — Mät jordens pH-värde och vattenhalt Dag 7 — Kontrollera jordens fukthalt — Kontrollera jordens fukthalt — Utfodra Dag 14 — Fastställ dödligheten bland adulter — Uppskatta antalet juveniler — Mät jordens pH-värde och vattenhalt — Kontrollera jordens fukthalt — Utfodra Dag 21 — Observera beteendet hos adulter — Avlägsna adulter — Fastställ dödligheten bland adulter — Kontrollera jordens fukthalt — Utfodra Dag 28 — Kontrollera jordens fukthalt — Ingen utfodring Dag 35 — Kontrollera jordens fukthalt — Utfodra Dag 42 — Räkna juveniler — Mät jordens pH-värde och vattenhalt DATA OCH RAPPORTERING Behandling av resultaten 39. Även om en översikt ges i tillägg 7 ges ingen definitiv statistisk vägledning för hur testresultaten ska analyseras i denna testmetod. 40. I det preliminära testet är den huvudsakliga endpointen dödlighet. Förändringar i adulternas beteende (t.ex. oförmåga att gräva ner sig i jorden, maskar ligger orörliga mot testkärlets glasvägg) och morfologi (t.ex. öppna sår) bör dock också registreras, liksom eventuell förekomst av juveniler. Probitanalys (21) eller logistisk regressionsanalys bör normalt användas för bestämning av LC50. I de fall då denna analysmetod är olämplig (t.ex. om färre än tre koncentrationer med partiell dödlighet finns tillgängliga) kan alternativa metoder tillämpas. Exempel på sådana är glidande medelvärden (22), den modifierade Spearman-Karbermetoden (23) eller enkel interpolering (t.ex. det geometriska medelvärdet av LC0 och LC100, som beräknats genom att kvadratroten av LC0 multiplicerats med LC100). 41. I det definitiva testet är endpointen fekunditet (dvs. antalet avkommor som producerats). Liksom i det preliminära testet bör alla andra skadliga tecken registreras i slutrapporten. Den statistiska analysen gör det nödvändigt att beräkna det aritmetiska medelvärdet och standardavvikelsen per testkärl och per kontroll för reproduktionen. 42. Om en variansanalys har utförts kan standardavvikelsen s och frihetsgraderna df ersättas av den sammanlagda uppskattningen av variansen som erhållits från variansanalysen (ANOVA) respektive dess frihetsgrader – förutsatt att variansen inte är beroende av koncentrationen. I detta fall ska de enskilda varianserna i kontroll- och testenheter användas. Dessa värden beräknas normalt med hjälp av kommersiell programvara för statistik med användning av resultaten per kärl som replikat. Om det förefaller vara rimligt att slå ihop data för negativa kontroller och kontroller med lösningsmedel snarare än att testa mot en av dem bör de testas för att säkerställa att det inte finns betydande skillnader mellan dem (för lämpliga tester se punkt 45 och tillägg 7). 43. Ytterligare statistisk testning och slutsatser beror på om värdena för replikaten är normalt fördelade och enhetliga med avseende på variansen. Uppskattning av NOEC 44. Man bör främst använda kraftfulla tester. Man bör använda information t.ex. från tidigare erfarenheter med ringtester eller andra tidigare uppgifter om huruvida data är ungefär normalt fördelade. Variansens homogenitet (homoskedasticitet) är av mer avgörande betydelse. Erfarenheter visar att variansen ofta ökar med ett ökande medelvärde. I dessa fall kan en datatransformation leda till homoskedasticitet. En sådan omvandling bör dock bygga på erfarenheterna från tidigare uppgifter i stället för på uppgifter som håller på att undersökas. Med homogena data bör flera t-tester, såsom Williams test (α = 0,05, asymmetriskt) (24) (25) eller i vissa fall Dunnetts test (26) (27), utföras. När det gäller ojämn förökning bör det noteras att t-värdena i tabellen måste korrigeras i enlighet med Dunnett och Williams. Ibland ökar/minskar reaktionerna inte regelbundet på grund av stor variation. I ett sådant fall med kraftig avvikelse från monotonicitet är Dunnetts test lämpligare. Om det finns avvikelser från homoskedasticiteten kan det vara rimligt att närmare undersöka de möjliga effekterna på variansen för att besluta om t-testerna kan tillämpas utan att förlora mycket av sin effekt (28). Alternativt kan ett multipelt U-test tillämpas, t.ex. Bonferronis U-test enligt Holm (29), eller, när dessa data uppvisar heteroskedasticitet men i övrigt är förenliga med en bakomliggande monoton dos-respons, ett annat icke-parametriskt test (t.ex. Jonckheere-Terpstra (30) (31) eller Shirley (32) (33)), och är i allmänhet att föredra framför t-tester med ojämn varians (se även diagrammet i tillägg 7). 45. Om ett toleranstest har utförts och de nödvändiga förutsättningarna för parametriska testförfaranden (normalitet, homogenitet) är uppfyllda, kan ett parvist Students t-test användas eller i annat fall Mann och Whitneys U-testförfarande (29). Bestämning av ECx 46. När man beräknar ECx-värden används medelvärdena per testkärl för regressionsanalys (linjär eller icke-linjär), efter att en lämplig dos-responsfunktion har erhållits. För maskarnas tillväxt som en kontinuerlig respons kan ECx-värdena uppskattas genom användning av en lämplig regressionsanalys (35). Bland lämpliga funktioner för dikotoma data (mortalitet/överlevnad och antal avkommor) återfinns de normala sigmoida eller logistiska funktionerna eller Weibull-funktionen med två till fyra parametrar, varav vissa även kan uttrycka hormetiska responser. Om en dos-respons-funktion anpassas genom linjär regressionsanalys bör en signifikant determinationskoefficient (r2) och/eller lutning konstateras med regressionsanalysen innan ECx uppskattas genom att ett värde som motsvarar x % av genomsnittet för kontrollen infogas i den ekvation som utgör resultatet av regressionsanalysen. De 95-procentiga konfidensgränserna beräknas enligt Fieller (hänvisning i Finney (21)) eller andra lämpliga moderna metoder. 47. Alternativt kan responsen uttryckas som en procentandel eller en andel av den modellparameter som tolkas som den genomsnittliga responsen för kontrollen. I dessa fall kan den normala (logistiska, Weibullska) sigmoida kurvan ofta lätt anpassas till resultaten med hjälp av probitregressionsförfarandet (21). I dessa fall måste viktningsfunktionen justeras för metriska responser i enlighet med Christensen (36). Om hormesis har iakttagits bör probitanalysen dock ersättas med en logistisk funktion eller en Weibullfunktion, i båda fallen med fyra parametrar, anpassad genom ett icke-linjärt regressionsförfarande (36). Om en lämplig dos-responsfunktion inte kan anpassas till data kan man använda alternativa metoder för att uppskatta ECx och dess konfidensgränser, t.ex. glidande medelvärden efter Thompson (22) och det modifierade Spearman-Karberförfarandet (23). TESTRAPPORT 48. Testrapporten ska innehålla följande uppgifter: Testkemikalie: — fysikalisk form och i tillämpliga fall fysikalisk-kemiska egenskaper (t.ex. vattenlöslighet, ångtryck), — kemisk identifiering av testkemikalien i enlighet med IUPAC-nomenklatur, CAS-nummer, sändning, parti, strukturformel och renhet, — provets utgångsdatum. Testade arter: — de använda försöksdjuren: art, vetenskapligt namn, källa och uppfödningsbetingelser. Testbetingelser: — ingredienser till och beredning av den syntetiska jorden, — appliceringsmetod för testkemikalien, — beskrivning av testbetingelserna, inklusive temperatur, vattenhalt, pH-värde etc., — fullständig beskrivning av experimentets utformning och förfaranden. Testresultat: — dödligheten bland adulter efter två veckor samt antal juveniler i slutet av det preliminära testet, — dödligheten bland adulter efter tre veckors exponering och fullständiga uppgifter om juvenilerna i slutet av det definitiva testet, — alla observerade fysiska eller patologiska symtom eller beteendeförändringar hos testorganismerna, — LC50, NOEC och/eller ECx (t.ex. EC50, EC10) för reproduktionen om vissa av dem är tillämpliga med konfidensintervallen, och en kurva som representerar den anpassade modell som har använts för beräkningen, samt alla uppgifter och observationer som kan vara till nytta vid tolkningen av resultaten. Avvikelser från de förfaranden som beskrivs i denna testmetod och ovanliga händelser under testets gång. LITTERATUR (1) Römbke, J. (1989). Entwicklung eines Reproduktionstests an Bodenorganismen – Enchytraeen. Abschlußbericht des Battelle-Instituts e.V. Frankfurt für das Umweltbundesamt (Berlin), FE-Vorhaben 106 03 051/01. (2) Römbke J. och Moser, T. (1999). Organisation and Performance of an International Ringtest for the Validation of the Enchytraeid Reproduction Test. UBA-Texte 4/99, s. 150 + 223. (3) Westheide, W. och Bethge-Beilfuss, D. (1991). The sublethal enchytraeid test system: guidelines and some results, i: Modern Ecology: Basic and Applied Aspects. Esser, G. och Overdieck, D. (red.), s. 497–508. Elsevier, Amsterdam. (4) Dirven-Van Breemen, E., Baerselmann, R. och Notenboom, J. (1994). Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Annelida) i Bodemecotoxicologisch Onderzoek. RIVM Rapport nr 719102025, s. 46. (5) Kapitel C.8 i denna bilaga: Toxicitet för daggmaskar. (6) ISO (Internationella standardiseringsorganisationen) (1999). Markundersökningar – Föroreningars effekt på daggmaskar (Eisenia fetida) – Del 1: Bestämning av akut toxicitet med artificiell jord, nr 11268-1. ISO, Genève. (7) ISO (Internationella standardiseringsorganisationen) (1999). Markundersökningar – Föroreningars effekt på daggmaskar (Eisenia fetida) – Del 2: Bestämning av effekter på reproduktion, nr 11268-2. ISO, Genève. (8) Rundgren, S. och A. K. Augustsson. (1998). Test on the enchytraeid Cognettia sphagnetorum (Vejdovsky 1877). I: Løkke, H. och C. A. M. Van Gestel, Handbook of soil invertebrate toxicity tests. John Wiley and Sons, Chichester, 73–94. (9) Kasprzak, K. (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23, 217–232. (10) Römbke, J. (1996). Enchytraeen (Oligochaeta) als Bioindikator, UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 7, 246–249. (11) Dunger, W. och Fiedler, H. J. (1997). Methoden der Bodenbiologie. G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York. (12) Didden, W. A. M. (1994). Ecology of terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37, 2–29. (13) Becker, H. (1991). Bodenorganismen – Prüfungskategorien der Forschung. UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 3, 19–24. (14) Römbke, J. och Federschmidt, A. (1996). Effects of the fungicide Carbendazim on Enchytraeidae in laboratory and field tests, Newsletter on Enchytraeidae 4, 79–96. (15) Römbke, J., Riepert, F. och Achazi R. (2000). Enchytraeen als Testorganismen. I: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. och Eisentraeger, A. (red.). Spektrum Verl., Heidelberg. 59–81. (16) ISO (Internationella standardiseringsorganisationen) (1994). Markundersökningar – Bestämning av pH, nr 10390. ISO, Genève. (17) Bell, A. W. (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902, 1–13. (18) Nielsen, C.O. och Christensen, B. (1959). The Enchytraeidae, critical revision and taxonomy of European species. Natura Jutlandica 8–9, 1–160. (19) Bouguenec, V. och Giani, N. (1987). Deux nouvelles especes d'Enchytraeus (Oligochaeta, Enchytraeidae) et rediscription d'E. bigeminus. Remarques sur le genre Enchytraeus. Ann. Limnol. 23, 9–22. (20) Korinkova, J. och Sigmund, J. (1968). The colouring of bottom-fauna samples before sorting, Vestnik Ceskoslovensko Spolecnosti Zoologicke 32, 300–305. (21) Finney D. J. (1971). Probit Analysis (tredje upplagan), s. 19–76. Cambridge Univ. Press. (22) Finney D. J. (1978). Statistical Method in Biological Assay. Charles Griffin & Company Ltd, London. (23) Hamilton, M. A., R. C. Russo och R. V. Thurston. (1977). Trimmed Spearman-Karber Method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environ. Sci. Technol. 11:7, 714–719; korrigering i Environ. Sci. Technol. 12 (1998), 417. (24) Williams, D. A., (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27, 103–117. (25) Williams, D. A., (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28, 519–531. (26) Dunnett, C. W., (1955). A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control. Amer. Statist. Ass. J. 50, 1096–1121. (27) Dunnett, C. W., (1964) New Tables for Multiple Comparisons with a Control. Biometrics, 20, 482–491. (28) Hoeven, N. van der, (1998). Power analysis for the NOEC: What is the probability of detecting small toxic effects on three different species using the appropriate standardized test protocols? Ecotoxicology 7, 355–361. (29) Holm, S. (1979): A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand. J. Statist. 6, 65–70. (30) Jonckheere, A. R. (1954). A Distribution-free k-Sample Test Against Ordered Alternatives, Biometrika 41, 133–145. (31) Terpstra, T. J. (1952). The Asymptotic Normality and Consistency of Kendall's Test Against Trend, When Ties are Present in One Ranking, Indagationes Math. 14, 327–333. (32) Shirley, E. A. (1979). The comparison of treatment to control group means in toxicology studies, Applied Statistics 28, 144–151. (33) Williams, D. A. (1986). A Note on Shirley's Nonparametric Test for Comparing Several Dose Levels with a Zero-Dose Control, Biometrics 42, 183–186. (34) Sokal, R. R. och F. J. Rohlf. (1981). Biometry. The Principle and practice of statistics in biological research. Andra upplagan. W. H. Freeman and Company. New York. (35) Christensen, E.R. (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18, 213–221. (36) Van Ewijk, P. H. och J. A. Hoekstra. (1994). Calculation of the EC50 and its confidence interval when sub-toxic stimulus is present. Ecotox, Environ. Safety. 25, 25–32. Tillägg 1 Definitioner I denna testmetod gäller följande definitioner: Kemikalie : ett ämne eller en blandning. ECx (koncentration som orsakar x % effekt): den koncentration som orsakar en x-procentig effekt på testorganismerna efter en given exponeringstid jämfört med ett kontrollprov. I detta test uttrycks effektkoncentrationerna som testkemikaliens vikt per torrvikt testjord. LC0 (letal koncentration 0 %): den koncentration av testkemikalien som inte orsakar någon av de exponerade testorganismernas död under en given tidsperiod. I detta test uttrycks LC0-värdet som testkemikaliens vikt per torrvikt testjord. LC50 (letal koncentration 50 %): den koncentration av testkemikalien som orsakar 50 % av de exponerade testorganismernas död under en given tidsperiod. I detta test uttrycks LC50-värdet som testkemikaliens vikt per torrvikt testjord. LC100 (letal koncentration 100 %): den koncentration av testkemikalien som orsakar alla de exponerade testorganismernas död under en given tidsperiod. I detta test uttrycks LC100-värdet som testkemikaliens vikt per torrvikt testjord. Lägsta koncentration med observerad effekt (LOEC) : den lägsta koncentrationen av testkemikalien som har en statistiskt signifikant effekt (p < 0,05). I detta test uttrycks LOEC-värdet som testkemikaliens vikt per torrvikt testjord. Alla testkoncentrationer som överstiger LOEC bör normalt uppvisa en effekt som statistiskt skiljer sig från kontrollen. Eventuella avvikelser från detta när man fastställer LOEC måste motiveras i testrapporten. Nolleffektkoncentrationen (NOEC) : den högsta koncentration av testkemikalien omedelbart under LOEC-värdet vid vilken ingen effekt observeras. I detta test har en halt som motsvarar NOEC ingen statistiskt signifikant effekt (p < 0,05) efter en given exponeringstid jämfört med ett kontrollprov. Reproduktionstakt : det genomsnittliga antalet avkommor som producerats per ett antal adulter under testperioden. Testkemikalie : varje ämne eller blandning som testas med denna testmetod. Tillägg 2 Fastställande av den maximala vattenhållningskapaciteten Bestämning av den syntetiska jordens vattenhållningskapacitet Följande metod har visat sig vara lämplig. Den beskrivs i bilaga C till ISO DIS 11268-2. Samla in en fastställd kvantitet (t.ex. 5 g) testjordsubstrat med hjälp av en lämplig anordning (jordborr med rör osv.). Täck botten av röret med en bit filterpapper och fyll det med vatten. Placera det därefter på en ställning i ett vattenbad. Röret bör gradvis nedsänkas i vattnet tills vattenytan är ovanför jordytan. Det bör därefter lämnas i vattnet i cirka 3 timmar. Eftersom allt vatten som absorberas av jordens kapillärer inte kan hållas kvar bör jordprovet dräneras i 2 timmar genom att röret placeras på en bädd av mycket fuktig finmald kvartssand i ett slutet kärl (för att förhindra uttorkning). Provet bör sedan torkas till en konstant vikt vid 105 °C och vägas. Vattenhållningskapaciteten (WHC) ska beräknas enligt följande: där S = vattenmättat substrat + rörets vikt + filterpapprets vikt T = emballagevikt (rörets vikt + filterpapprets vikt) D = substratets torrvikt HÄNVISNINGAR: ISO (Internationella standardiseringsorganisationen) (1999). Markundersökningar – Föroreningars effekt på daggmaskar (Eisenia fetida). Del 2: Bestämning av effekter på reproduktion, nr 11268-2. ISO, Genève. Tillägg 3 Bestämning av jordens ph-värde Följande metod för bestämning av pH-värdet i ett jordprov bygger på beskrivningen i ISO 10390 (Markundersökningar – Bestämning av pH). En bestämd mängd jord torkas i rumstemperatur i minst 12 timmar. En suspension av jorden (som innehåller minst 5 gram jord) bereds därefter i fem gånger sin volym med antingen 1 M kaliumklorid (KCl) av analyskvalitet eller 0,01 M kalciumkloridlösning (CaCl2) av analyskvalitet. Suspensionen skakas därefter omsorgsfullt i fem minuter. Efter skakning får suspensionen stå och klarna i minst 2 timmar men högst 24 timmar. Vätskefasens pH mäts sedan med en pH-mätare som före varje mätning kalibrerats med lämpliga buffertlösningar (t.ex. pH 4,0 och 7,0). HÄNVISNINGAR: ISO (Internationella standardiseringsorganisationen) (1994). Markundersökningar – Bestämning av pH, nr 10390. ISO, Genève. Tillägg 4 Odlingsförhållanden för Enchytraeus sp. Småringmaskar av arten Enchytraeus albidus (liksom andra Enchytraeus-arter) kan odlas i stora plastlådor (t.ex. 30 × 60 × 10 cm) fyllda med en blandning av syntetisk jord och naturlig, okontaminerad trädgårdsjord i förhållandet 1:1. Kompostmaterial bör undvikas eftersom det kan innehålla giftiga kemikalier såsom tungmetaller. Fauna bör avlägsnas från jorden före användning (t.ex. genom djupfrysning). Ett substrat som består endast av syntetisk jord kan också användas men reproduktionstakten kan vara lägre än den som kan uppnås med ett blandat jordsubstrat. Det substrat som används för odling bör ha pH 6,0 ± 0,5. Kulturen förvaras mörkt vid en temperatur på 15–20 ± 2 °C. Temperaturen får inte överstiga 23 °C. Jorden ska hållas fuktig men får inte bli våt. Fukthalten är lämplig om det sipprar fram små vattendroppar mellan fingrarna när jorden pressas försiktigt i handen. Man måste undvika att anoxiska förhållanden utvecklas genom att se till att odlingsbehållarnas lock möjliggör tillräckligt gasutbyte med atmosfären. Jorden luckras försiktigt varje vecka för att underlätta luftning. Maskarna kan utfodras med havreflingor. Havreflingorna bör förvaras i slutna kärl och autoklaveras eller hettas upp före användning för att undvika angrepp av mjölkvalster (t.ex. Glyzyphagus sp., Astigmata, Acarina) eller rovkvalster (t.ex. Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina). Efter värmebehandlingen bör flingorna malas så att de enkelt kan spridas på jordytan. Havreflingorna kan då och då kompletteras med vitaminer, mjölk och torskleverolja. Andra lämpliga foderkällor är bagerijäst och fiskfodret TetraMin. Utfodring sker ungefär två gånger i veckan. En lämplig mängd havreflingor strös på jordytan eller blandas omsorgsfullt ner i substratet när jorden luckras upp för att underlätta luftning. Den absoluta mängden foder som ges beror på antalet maskar i substratet. Mängden foder bör ökas om allt äts upp inom en dag efter utfodring. Omvänt gäller att om fodret ligger kvar på markytan vid den andra utfodringen (en vecka senare) bör mängden foder minskas. Foder som är angripet av svamp avlägsnas och ersätts. Efter tre månader överförs maskarna till ett nyberett substrat. Odlingsförhållandena anses vara tillfredsställande om maskarna: (a) inte försöker ta sig upp ur jordsubstratet, (b) rör sig snabbt genom jorden, (c) har en glansig yta utan vidhäftande jordpartiklar, (d) har en mer eller mindre vitaktig färg, (e) är av varierande ålder i odlingarna och (f) förökar sig kontinuerligt. Tillägg 5 Testförfarande med andra Enchytraeus-arter Val av art Andra arter än E. albidus kan användas, men testförfarandet och giltighetskriterierna bör anpassas i enlighet med detta. Eftersom många Enchytraeus-arter är lätt tillgängliga och kan hållas på ett tillfredsställande sätt i laboratoriemiljö, är det viktigaste kriteriet för urval av andra arter än E. albidus artens ekologiska betydelse och dessutom likvärdig känslighet. Det k