(19)

I del C ska följande kapitel läggas till: ”C.47 Toxicitetstest på fisk i tidiga levnadsstadier INLEDNING 1. Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 210 (2013). Tester på fisk i tidiga levnadsstadier är avsedda att definiera letala och subletala effekter av kemikalier i de stadier och arter som testas. De ger information av värde för skattningen av kemikaliens kroniska letala och subletala effekter på andra fiskarter. 2. Testriktlinje 210 baseras på ett förslag från Storbritannien. Förslaget diskuterades vid ett möte med OECD-experter i Medmenham (Storbritannien) i november 1988 och uppdaterades ytterligare 2013 för att avspegla erfarenheten från användningen av testet samt rekommendationer från en OECD-arbetsgrupp i september 2010 om testning av toxicitet för fisk (1). TESTPRINCIP 3. Fisk i tidiga levnadsstadier exponeras för en serie koncentrationer av testkemikalien upplöst i vatten. Genomflödessystem är att föredra, men om det inte är möjligt är semistatiska system godtagbara. För närmare uppgifter bör OECD:s vägledningsdokument om akvatisk toxicitetstestning av svåra ämnen och blandningar konsulteras (2). Testet inleds med att befruktade ägg placeras i testbehållare och får fortgå under en artspecifik tidsperiod som är nödvändig för att kontrollfisken ska nå yngelstadiet. Letala och subletala effekter bedöms och jämförs med kontrollvärden för att bestämma den lägsta koncentrationen med observerad effekt (LOEC), i syfte att bestämma i) nolleffektkoncentration (NOEC) och/eller ii) ECx (t.ex. EC10, EC20 ) med hjälp av en regressionsmodell för att uppskatta den koncentration som skulle orsaka en förändring av den uppmätta effekten på x %. Rapporteringen av relevanta effektkoncentrationer och parametrar kan bero på regelverket. ECx bör ligga inom intervallet av testkoncentrationer så att ECx interpoleras snarare än extrapoleras (se tillägg 1 för definitioner). INFORMATION OM TESTKEMIKALIEN 4. Testkemikalien avser vad som testas. Testkemikaliens vattenlöslighet (se kapitel A.6 i denna bilaga) och ångtryck (se kapitel A.4 i denna bilaga) bör vara kända och det bör finnas tillgång till en tillförlitlig analysmetod med känd och rapporterad noggrannhet och kvantifieringsgräns för att kvantifiera kemikalien i testlösningarna. Även om det inte är nödvändigt att genomföra testet kan resultaten från ett test av akut toxicitet (se kapitel C.1 eller C.49 i denna bilaga), företrädesvis med samma art som används för detta test, ge användbar information. 5. Om testmetoden används för att testa en blandning bör dess sammansättning karakteriseras så långt detta är möjligt, t.ex. genom beståndsdelarnas kemiska identitet, deras kvantitativa förekomster och deras ämnesspecifika egenskaper (såsom de som nämns ovan). Innan testmetoden för lagstadgad testning av en blandning används bör man överväga om den kommer att ge godtagbara resultat för det avsedda tillsynsändamålet. 6. Till information som bör anges hör bl.a. testämnets strukturformel, renhet, vattenlöslighet, stabilitet i vatten och ljus, pKa, Pow och resultaten från test avseende biologisk lättnedbrytbarhet (t.ex. kapitel C.4 eller C.29 i denna bilaga). TESTETS GILTIGHET 7. För att ett test ska vara giltigt måste följande villkor uppfyllas: — Koncentrationen löst syre bör vara > 60 % av luftmättnadsvärdet under hela testet. — Under testet bör vattentemperaturen inte variera med mer än ± 1,5 °C mellan olika testbehållare eller mellan påföljande dagar. Vattentemperaturen bör hållas inom de temperaturgränser som specificerats för den art som används (tillägg 2). — Analytisk mätning av testkoncentrationerna är obligatorisk. — Den totala överlevnaden för de befruktade äggen samt framgångsfrekvens efter kläckning i kontrollgrupperna och, i tillämpliga fall, i kontrollerna med lösningsmedel, måste vara större än eller lika med de gränsnivåer som anges i tillägg 2. 8. Om en mindre avvikelse från giltighetskriterierna observeras bör konsekvenserna av detta betraktas i förhållande till testuppgifternas tillförlitlighet. Dessa överväganden bör ingå i rapporten. Effekter på överlevnad, kläckning eller tillväxt som uppstår i lösningsmedelskontrollen jämfört med den negativa kontrollen ska rapporteras och diskuteras mot bakgrund av testuppgifternas tillförlitlighet. BESKRIVNING AV TESTMETODEN Testbehållare 9. Alla typer av kärl av glas, rostfritt stål eller andra kemiskt inerta kärl kan användas. Eftersom det är känt att silikon har en stark absorptionsförmåga i fråga om lipofila ämnen, bör användningen av silikonrör i genomflödesstudier och silikonlock som är i kontakt med vatten minimeras genom att t.ex. använda modulglasakvarier. Kärlen bör vara tillräckligt stora för att möjliggöra ordentlig tillväxt i kontrollgruppen, underhåll av koncentrationen löst syre (för små fiskarter uppnås detta t.ex. genom en sjulitersbehållare) och efterlevnad av de kriterier för lämplig fisktäthet som anges i punkt 19. Testbehållarna ska helst placeras slumpvis i testutrymmet. En randomiserad blockutformning med en behandling per block är att föredra framför en fullständigt randomiserad utformning. Testbehållarna bör avskärmas från oönskade störningar. Testsystemet bör helst konditioneras med koncentrationer av testämnet under en tillräckligt lång tid för att uppvisa stabila exponeringskoncentrationer innan testorganismer tillsätts. Val av art 10. Rekommenderade fiskarter anges i tabell 1. Det hindrar inte att andra arter används, men då måste testförfarandet eventuellt justeras så att lämpliga testförhållanden kan säkerställas. I ett sådant fall måste testrapporten innehålla en motivering för valet av art och testmetod. Hållande av avelsfisk 11. Närmare uppgifter om lämplig förvaring av avelsbeståndet finns i tillägg 3 och i hänvisningarna (3), (4), (5). Hantering av befruktade ägg, embryon och yngel 12. Fertiliserade ägg, embryon och yngel kan till en början exponeras i mindre kärl av glas eller rostfritt stål, placerade i huvudkärlet, med sidor eller ändar av nät som möjliggör ett flöde av testlösning genom kärlet. För att få ett icke-turbulent flöde genom dessa små kärl kan de hållas hängande från en arm som sänker och höjer kärlen (de får dock inte höjas över ytan). Befruktade ägg av laxfiskar kan hållas på ställningar eller galler med så stora öppningar att ynglen kan falla igenom efter kläckningen. 13. Om äggbehållare, galler eller nät har använts för att hålla äggen inom huvudkärlet tas dessa tillbehör bort efter att ynglen har kläckts, enligt vägledningen i tillägg 3, med undantag av nät som behövs för att hålla ynglen på plats. Om ynglen måste flyttas får de inte utsättas för luft, och håvar får inte användas för att släppa ut ynglen från äggbehållarna. Överföringstidpunkten varierar beroende på art och bör dokumenteras i rapporten. Det är dock inte alltid nödvändigt med en överföring. Vatten 14. Allt vatten i vilket testarten uppvisar lämplig långsiktig överlevnad och tillväxt kan användas som testvatten (se tillägg 4). Vattnet ska hålla jämn kvalitet under hela testperioden. För att säkerställa att utspädningsvattnet inte påverkar testresultaten på oönskat sätt (t.ex. genom komplexbildning med testkemikalien) eller har skadliga verkningar på avelsbeståndets prestanda, ska vattenprover tas regelbundet för analys. Mätningar av tungmetaller (t.ex. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), viktiga anjoner och katjoner (t.ex. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl–, SO4 2–), ammoniak, totala återstoden av klorhaltiga bekämpningsmedel, totala halten organiskt kol och uppslammade partiklar bör göras t.ex. halvårsvis i fall där man vet att utspädningsvattnet håller en relativt jämn kvalitet. Om man vet att vattnet är av varierande kvalitet måste mätningarna utföras oftare. Frekvensen beror på hur variabel kvaliteten är. I tillägg 4 anges ett antal kemiska egenskaper för godtagbart utspädningsvatten. Testlösningar 15. För genomflödestest behövs ett system som kontinuerligt portionerar och späder ut en stamlösning av testkemikalien (t.ex. med mätpump, proportionalitetslösningssystem, mättnadskärlsystem) för att tillföra en serie koncentrationer till testbehållarna. Stamlösningens och utspädningsvattnets flödeshastighet bör kontrolleras regelbundet under testets gång och får inte variera med mer än 10 % under hela testet. En flödeshastighet som motsvarar minst fem testbehållarvolymer per 24 timmar har konstaterats vara lämplig (3). Om den fisktäthet som anges i punkt 19 följs, är dock en lägre flödeshastighet på t.ex. 2–3 testbehållarvolymer möjlig för att förhindra att fodret försvinner snabbt. 16. Testlösningar med de valda koncentrationerna bereds genom utspädning av en stamlösning. Stamlösningen bör helst beredas genom att man helt enkelt blandar eller skakar testkemikalien i utspädningsvattnet på mekanisk väg (t.ex. omrörning och/eller ultraljud). Mättnadskolonner (löslighetskolonner) eller passiva doseringsmetoder (6) kan användas för att få en stamlösning med lämplig koncentration. Användning av lösningsmedel som bärämne rekommenderas inte. Om det är nödvändigt att använda lösningsmedel bör man införa en lösningsmedelskontroll som testas parallellt med samma lösningsmedelskoncentration som i de kemiska behandlingarna, dvs. lösningsmedelshalten bör helst vara lika i alla koncentrationer och i lösningsmedelskontrollen. För vissa utspädningssystem kan detta vara tekniskt svårt. I dessa fall bör lösningsmedelskoncentrationen i lösningsmedelskontrollen vara lika med den högsta lösningsmedelskoncentrationen i behandlingsgruppen. För ämnen som är svåra att testa bör OECD:s vägledningsdokument nr 23 om akvatisk toxicitetstestning av svåra ämnen och blandningar konsulteras (2). Om lösningsmedel används avgörs valet av lösningsmedel av ämnets kemiska egenskaper. I OECD:s vägledningsdokument nr 23 rekommenderas en maximal koncentration på 100 μl/l. För att undvika eventuella effekter av lösningsmedlet på de endpoints som mäts (7) rekommenderas en så låg koncentration av lösningsmedel som möjligt. 17. Vid semistatiskt test kan man välja mellan två olika förnyelseförfaranden. Antingen kan nya testlösningar beredas i rena kärl och de överlevande äggen och ynglen försiktigt överföras till de nya kärlen, eller så kan testorganismerna vara kvar i kärlen medan en andel (minst två tredjedelar) av testlösningen/kontrollvolymen byts ut. FÖRFARANDE Exponeringsförhållanden Löptid 18. Testet bör inledas så snart som möjligt efter det att äggen befruktats. Äggen ska helst nedsänkas i testlösningarna innan klyvningen av blastodisken inleds, eller så snart som möjligt efter denna tidpunkt. Testperiodens längd beror på den art som används. Vissa rekommendationer gällande testperiodens längd finns i tillägg 2. Fisktäthet 19. Antalet befruktade ägg vid testperiodens början bör vara tillräckligt med tanke på statistiska krav. Äggen fördelas slumpmässigt mellan behandlingsgrupperna. För varje koncentration bör minst 80 ägg användas, jämnt fördelade mellan minst fyra likadana testbehållare per koncentration. Fisktätheten (biomassa per volym testlösning) får inte vara högre än att man kan hålla koncentrationen löst syre på minst 60 % av luftmättnadsvärdet (ASV) utan luftning under ägg- och yngelstadiet. För genomflödestest rekommenderas en fisktäthet som inte överskrider 0,5 g/l våtvikt per 24 timmar och som under inga omständigheter överskrider 5 g/l lösning (3). Ljus och temperatur 20. Fotoperioden och vattentemperaturen bör vara anpassade för den art som testas (se tillägg 2). Utfodring 21. Foder och utfodring är av avgörande betydelse, och det är viktigt att man vid lämpliga tidpunkter ger rätt foder för varje levnadsstadium och i en tillräckligt stor mängd för att stödja normal tillväxt. Utfodringen bör vara ungefär lika i alla replikat om mängden inte justeras för att ta hänsyn till dödlighet. Överbliven mat och avföring bör avlägsnas, om så behövs, för att undvika ackumulering av avfallsprodukter. Detaljerade utfodringssystem anges i tillägg 3, men allteftersom man vinner nya erfarenheter rationaliseras utfodringssystemen kontinuerligt för att förbättra överlevnaden och optimera tillväxten. Levande foder utgör en källa till miljöberikning och bör därför användas i stället för eller som komplement till torkad eller fryst mat, när så är lämpligt för arten och levnadsstadiet. Testkoncentrationer 22. I regel krävs fem koncentrationer med minst fyra replikat per koncentration och ett fast koncentrationsförhållande som inte överstiger 3,2. Om information om testning av akut toxicitet finns tillgänglig, företrädesvis med samma art och/eller ett intervallbestämmande test, bör sådana uppgifter beaktas (1) vid valet av lämpliga testkoncentrationer. Alla informationskällor bör dock övervägas vid valet av lämpliga testkoncentrationer, inklusive källor som t.ex. jämförelser med strukturlika ämnen och testdata för akut toxicitet för fiskembryon. Ett gränstest eller en utökat gränstest med färre än fem koncentrationer som definitivt test kan vara godtagbart om endast empiriska NOEC ska fastställas. Om färre än fem koncentrationer används måste detta motiveras. Testkemikaliekoncentrationer som är högre än LC50 under 96 timmar eller 10 mg/l, beroende på vilken som är lägre, behöver inte testas. Kontroller 23. En kontrollsats med utspädningsvatten och, vid behov, en kontrollsats med endast lösningsmedlet bör köras utöver serierna med testkemikaliekoncentrationer (se punkt 16). Frekvens för analytiska bestämningar och mätningar 24. Innan exponeringsperioden inleds bör man se till att systemet för kemisk tillförsel fungerar i alla replikat (t.ex. genom att mäta testkoncentrationerna). Nödvändiga analytiska metoder bör fastställas, inklusive en lämplig kvantifieringsgräns (LOQ), och det är viktigt att inhämta tillräcklig kunskap om ämnets stabilitet i testsystemet. Under testets gång bestäms testkemikaliens koncentrationer med jämna mellanrum för att karakterisera exponeringen. Minst fem bestämningar behövs. I genomflödessystem bör analytiska mätningar av den undersökta kemikalien utföras i ett replikat per koncentration åtminstone en gång i veckan genom att systematiskt mäta olika replikat. Ytterligare analytiska bestämningar förbättrar ofta kvaliteten på testresultatet. Proverna kan behöva filtreras för att avlägsna eventuella partiklar (t.ex. med porstorlek 0,45 μm) eller centrifugeras för att se till att de analytiska bestämningarna görs på kemikalien i en äkta lösning. Filtren bör vara mättade före användning i syfte att minska adsorption av testkemikalien. När de uppmätta koncentrationerna inte håller sig inom 80–120 % av den nominella koncentrationen bör effektkoncentrationerna bestämmas och uttryckas i förhållande till koncentrationens aritmetiska medelvärde för genomflödestest (se tillägg 6 till testmetod C.20 för beräkning av det aritmetiska medelvärdet (8)), och uttryckas i förhållande till det geometriska medelvärdet av de uppmätta koncentrationerna för semistatiska tester (se kapitel 5 i OECD:s vägledningsdokument om akvatisk toxicitetstestning av svåra ämnen och blandningar (2)). 25. Under testets gång bör löst syre, pH och temperatur mätas i alla testkärl minst en gång i veckan. Salthalt och hårdhet, om relevant, bör mätas i början och slutet av testet. Temperaturen bör helst övervakas kontinuerligt i minst ett testkärl. Observationer 26. Stadiet för embryonal utveckling : Det embryonala stadiet när exponeringen för testämnet inleds bör bekräftas så exakt som möjligt. Detta kan göras på ett representativt prov av ägg som har förvarats och rengjorts på lämpligt sätt. 27. Kläckning och överlevnad : observationer av kläckning och överlevnad bör göras minst en gång per dag. Alla antal bör registreras. Om svamp observeras på äggen i ett tidigt skede av embryoutvecklingen (t.ex. dag ett eller två av testet), bör dessa ägg räknas och tas bort. Döda embryon, yngel och ungfisk bör avlägsnas så snart de observeras, eftersom de snabbt kan förruttna och sönderdelas av de andra fiskarna. Yttersta försiktighet bör iakttas när döda individer avlägsnas så att man inte orsakar fysiska skador på närliggande ägg eller yngel. Tecken på dödlighet varierar beroende på art och levnadsstadium. Exempel: — Befruktade ägg: särskilt i tidiga stadier en tydlig förlust av genomskinlighet och färgförändringar orsakade av koagulering eller utfällning av protein, vilket leder till ett vitt ogenomskinligt utseende. — Embryon, yngel och ungfiskar: orörlighet och/eller avsaknad av andningsrörelse och/eller avsaknad av hjärtslag och/eller avsaknad av reaktion på mekanisk retning. 28. Onormalt utseende : antalet yngel eller ungfisk som har onormal kroppsform bör registreras med intervall vars längd bestäms enligt testperiodens längd och karaktären hos de abnormiteter det gäller. Det bör noteras att onormala yngel och ungfiskar även förekommer av naturliga skäl, och kan för vissa arter uppgå till flera procent i kontrollen eller kontrollerna. Om missbildningar och relaterat onormalt beteende anses så svåra att organismen orsakas väsentligt lidande och den har nått en punkt där den inte kommer att återhämta sig kan organismen tas bort från testet. Sådana djur bör avlivas och anges som döda i den påföljande dataanalysen. Normal embryoutveckling har dokumenterats för de flesta arter som rekommenderas i denna metod (9) (10) (11) (12). 29. Onormalt beteende : abnormiteter som hyperventilation, okoordinerat simmande, atypisk passivitet och atypiskt utfodringsbeteende bör registreras med lämpliga intervall beroende på testperiodens längd (t.ex. en gång om dagen för varmvattensarter). Sådana verkningar kan vara svåra att kvantifiera men kan, när de observeras, vara till hjälp vid tolkningen av dödlighetsdata. 30. Vikt : i slutet av testet vägs alla överlevande fiskar minst per replikat (antal djur i replikatet samt djurens medelvikt rapporteras). Våtvikt (avtorkning) är att föredra, men även torrviktsdata kan rapporteras (13). 31. Längd : vid testets slut mäts individuella längder. Total längd rekommenderas, men om det förekommer röta på stjärtfenan eller frätning av fenorna kan standardlängd användas. Samma metod bör användas för all fisk i ett givet test. Individuell längd kan mätas med t.ex. skjutmått, digital kamera eller kalibrerad okulär mikrometer. Vanliga minimilängder anges i tillägg 2. DATA OCH RAPPORTERING Behandling av resultaten 32. Försöket och urvalet av det statistiska testet bör utformas för att ge tillräcklig effekt (80 % eller högre) så att det är möjligt att upptäcka förändringar av biologisk betydelse i endpoints när NOEC ska rapporteras. Rapporteringen av relevanta effektkoncentrationer och parametrar kan bero på regelverket. Om en effektkoncentration (ECx) ska rapporteras bör utformningen av försöket och valet av regressionsmodell möjliggöra uppskattning av ECx, så att i) det 95-procentiga konfidensintervall som rapporteras för ECx inte innehåller noll och inte är alltför brett, ii) det 95-procentiga konfidensintervallet för det beräknade medelvärdet vid ECx inte innehåller kontrollmedelvärdet, och iii) det inte finns betydande ”lack-of-fit” (bristande anpassning) för regressionsmodellen jämfört med data. Båda tillvägagångssätten kräver identifiering av den procentuella förändring i varje endpoint som det är viktigt att upptäcka eller uppskatta. Försöket bör utformas för att möjliggöra denna identifiering. När ovannämnda villkor för att bestämma ECx inte är uppfyllda bör NOEC-metoden användas. Samma procentuella förändringar är sannolikt inte tillämpliga på alla endpoints, och det är inte heller sannolikt att man kan utforma försök som uppfyller ovannämnda kriterier för alla endpoints. Därför är det viktigt att fokusera på de endpoints som är relevanta för varje försök för att kunna utforma försöket på lämpligt sätt. Statistiska flödesdiagram och vägledning för varje metod finns i tilläggen 5 och 6, med riktlinjer för databehandling och råd för att underlätta valet av lämpligaste statistiska test eller metod. Andra statistiska metoder kan användas under förutsättning att de är vetenskapligt motiverade. 33. Det är nödvändigt att analysera variationerna inom varje replikatgrupp med hjälp av variansanalys eller kontingenstabellprocedurer. Lämpliga statistiska analysmetoder bör användas baserat på denna analys. För multipla jämförelser mellan resultaten vid enskilda koncentrationer och resultaten för kontrollerna rekommenderas Jonckheere-Terpstras step-down-test eller Williams test för kontinuerlig respons och Cochran-Armitages step-down-test för dikotom respons som överensstämmer med en monoton koncentrationsrespons där bevis saknas för extrabinomial varians (14). När det finns bevis för extrabinomial varians rekommenderas Rao-Scott-modifieringen av Cochran-Armitage-testet (15) (16), eller Williams- eller Dunnetts-testet (efter en arcsin-kvadratrot-transformation) eller Jonckheere-Terpstra-testet för att reproducera proportionerna. Om uppgifterna inte överensstämmer med en monoton koncentrationsrespons kan Dunnetts-, Dunns- eller Mann-Whitney-metoderna vara användbara för kontinuerlig respons, och Fishers exakta test för dikotom respons (14) (17) (18). Statistiska metoder eller modeller bör användas med försiktighet så att man säkerställer att kraven för metoden eller modellen är uppfyllda (variationer mellan behållare ska t.ex. uppskattas och anges i det försök eller de tester och modeller som används). Uppgifterna ska utvärderas för normalitet. Information om hur rester från ANOVA bör hanteras ges i tillägg 5. I tillägg 6 diskuteras ytterligare överväganden i samband med regressionsmetoden. Förändringar för att uppfylla kraven för statistiska tester bör övervägas. Transformationer för att anpassa en regressionsmodell kräver dock stor omsorg. En förändring på 25 % i den otransformerade responsen motsvarar inte en förändring på 25 % i en transformerad respons. För alla analyser gäller att analysenheten inte är den enskilda fisken, utan testbehållaren. Försöksenheten och både hypotesprövningarna och regressionen bör därför avspegla detta (3) (14) (19) (20). Testrapport 34. Testrapporten ska innehålla följande information: Testkemikalie: Monokomponentämne: — fysiskt utseende, vattenlöslighet och ytterligare relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper, — kemisk beteckning, såsom IUPAC- eller CAS-namn, CAS-nummer, SMILES- eller InCh-kod, strukturell formel, renhet, kemisk beteckning för orenheter i förekommande fall och när så är praktiskt möjligt osv. (vid behov, inklusive halten organiskt kol). Multikomponentämne, UVCB och blandningar: — karakteriseras så långt som möjligt, t.ex. genom kemisk beteckning (se ovan), kvantitativ förekomst och relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper hos komponenterna. Testade arter: — vetenskapligt namn, stam, härkomst och metod för insamling av befruktade ägg och efterföljande hantering. Testbetingelser: — använt testförfarande (t.ex. semistatiskt, genomflöde, fisktäthet), — ljusperiod(er). — testets upplägg (t.ex. antal testbehållare och replikat, antal ägg per replikat, testbehållarens material och storlek (höjd, bredd, volym), vattenvolym per testbehållare), — metoden för beredning av stamlösningar och förnyelsefrekvensen (i förekommande fall bör även solubiliseringsmedlet och dess koncentration anges), — doseringsmetod för testkemikalien (t.ex. pumpar, utspädningssystem), — metodens återvinningseffektivitet och nominella testkoncentrationer, kvantifieringsgränsen, de uppmätta värdenas medelvärden och deras standardavvikelser i testkärlen samt den metod med vilken dessa erhölls och bevis för att mätningarna hänför sig till testkemikaliens koncentrationer i en äkta lösning, — utspädningsvattnets egenskaper: pH, hårdhet, koncentrationen löst syre, restklornivåer (om de har uppmätts), totalt organiskt kol (om det har uppmätts), uppslammade partiklar (om det har uppmätts), testmediets salthalt (om den har uppmätts) och resultatet av alla övriga mätningar, — vattenkvaliteten i testkärlen: pH, hårdhet, temperatur och koncentrationen löst syre, — detaljerade uppgifter om utfodringen (t.ex. typ av foder, källa, hur mycket fiskarna har fått och hur ofta). Resultaten rapporteras individuellt (eller per replikat) och som medelvärde och variationskoefficient, när så är lämpligt, för följande endpoints: — bevis för att kontrollerna uppfyller normerna för total överlevnad för testdjur (tillägg 2), — data om dödlighet i varje stadium (embryo-, yngel- och ungfiskstadiet) och kumulativ dödlighet, — antalet dagar fram till kläckning, antal kläckta yngel per dag och tidpunkten för kläckningens slut, — antal friska exemplar vid testets avslutning, — data om längd (ange antingen standard eller totalt) och vikt för överlevande djur, — förekomst, beskrivning av och antal morfologiska abnormiteter (i förekommande fall), — förekomst, beskrivning av och antal beteendemässiga effekter (i förekommande fall), — metod för den statistiska analysen (regressionsanalys eller variansanalys) samt databehandling (använt statistiskt test eller använd modell), — nolleffektkoncentration (NOEC) för varje respons som har varit föremål för bedömning, — lägsta koncentration med observerad effekt (vid p = 0,05) för varje bedömd respons (LOEC), — ECx för varje bedömd respons (i förekommande fall) samt konfidensintervall (t.ex. 90 % eller 95 %) och kurvan för den anpassade modell som använts för att beräkna ECx, lutningen för koncentration-respons-kurvan, formeln för regressionsmodellen och uppskattade modellparametrar och deras standardfel. Eventuella avvikelser från testmetoden. Diskussion av resultaten, inbegripet eventuell inverkan på testresultatet av avvikelser från denna testmetod. Tabell 1 Fiskarter som rekommenderas för testning SÖTVATTEN BRACK- och HAVSVATTEN Oncorhynchus mykiss Regnbåge Cyprinodon variegatus Sheepshead minnow (art av tandkarp) Pimephales promelas Knölskallelöja Menidia sp. Silverlax Danio rerio Sebrafisk Oryzias latipes Medaka (japansk risfisk) LITTERATUR (1) OECD (2012), Fish Toxicity Testing Framework, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment nr 171, OECD, Paris. (2) OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment. nr 23, OECD Paris. (3) ASTM (1988), Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials, E 1241-88. s. 26 ff. (4) Brauhn, J.L. och R.A. Schoettger (1975), Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel catfish and Bluegills, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota. (5) Brungs, W.A. och B.R. Jones (1977), Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota. (6) Adolfsson-Erici, m.fl. (2012), A flow-through passive dosing system for continuously supplying aqueous solutions of hydrophobic chemicals to bioconcentration and aquatic toxicity tests, Chemosphere 86, 593–599. (7) Hutchinson, T.H. m.fl. (2006), Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review, Aquatic Toxicology, 76, 69–92. (8) Kapitel C.20 i denna bilaga, Reproduktionstest på Daphnia magna. (9) Hansen, D.J. och P.R. Parrish (1977), Suitability of sheepshead minnows (Cyprindon variegatus) for life-cycle toxicity tests, In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (redigerad av F.L. Mayer och J.L. Hamelink), ASTM STP 634. (10) Kimmel, H. B. m.fl. (1995), Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics, 203:253–310. (11) Gonzalez-Doncel, M. m.fl. (2005), A quick reference guide to the normal development of Oryzias latipes (Teleostei, Adrinichthydae) Journal of Applied Ichthyology, 20:1–14. (12) Devlin, E.W. m.fl. (1996), Prehatching Development of the Fathead Minnow, Pimephales promelas Rafinesque. EPA/600/R-96/079. USEPA, Office of Research and Development, Washington, D.C. (13) Oris, J.T., S.C. Belanger och A.J. Bailer, (2012), Baseline characteristics and statistical implications for the OECD 210 Fish Early Life Stage Chronic Toxicity Test, Environmental Toxicology and Chemistry 31, 2, 370–376. (14) OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment nr 54, OECD, Paris. (15) Rao, J. N. K. och A. J. Scott (1992), A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577–585. (16) Rao, J. N. K. och A. J. Scott (1999), A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373–1385. (17) Dunnett, C. W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of Ameican Statistical Association, 50, 1096-1121. (18) Dunnett, C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. Biometrics, 20, 482–491. (19) Rand, G.M. och S.R. Petrocelli (1985), Fundamentals of Aquatic Toxicology. Hemisphere Publication Corporation, New York. (20) McClave, J.T., J.H. Sullivan och J.G. Pearson (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data, Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia. Tillägg 1 DEFINITIONER FL : längd från nosspetsen till stjärtfenans delning, används för fiskarter där det är svårt att säga var ryggraden slutar (www.fishbase.org) SL : standardlängd, längd från nosspetsen till bakre delen av den sista ryggkotan eller bakre slutet av den mellersta delen av hypuralplattan. Enkelt uttryckt utesluter denna mätning stjärtfenans längd. (www.fishbase.org) TL : total längd, längd från nosspetsen till slutet av stjärtfenans längre flik, mäts vanligen med flikarna komprimerade längs mittlinjen. Detta är ett linjärt mått, som inte mäter kroppskurvan (www.fishbase.org) Figur 1 Beskrivning av de olika längder som används Standardlängd FL Fork length Total längd Kemikalie : ett ämne eller en blandning. ECx : (koncentration som orsakar x % effekt): den koncentration som orsakar en x-procentig effekt på testorganismerna inom en given exponeringstid jämfört med ett kontrollprov. EC50 är till exempel den koncentration som beräknas ha en effekt på en av testets endpoints i 50 % av en exponerad population under en fastställd exponeringstid. Lägsta koncentration med observerad effekt (LOEC): den lägsta testade koncentration vid vilken man kan fastställa att testkemikalien har en statistiskt signifikant effekt (vid p < 0,05) jämfört med kontrollen. Alla testkoncentrationer ovanför LOEC bör ha skadliga verkningar som är lika stora som eller större än de verkningar som observeras vid LOEC. Om dessa två villkor inte är uppfyllda bör en fullständig förklaring ges till hur man har valt LOEC (och därmed NOEC). Vägledning ges i tilläggen 5 och 6. Nolleffektkoncentration (NOEC) : den testkoncentration omedelbart under LOEC som inom en fastställd exponeringsperiod inte framkallar några statistiskt signifikanta verkningar (p < 0,05) jämfört med kontrollen. Testkemikalie : alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod. UVCB-ämne : ämne med okänd eller varierande sammansättning, komplexa reaktionsprodukter eller biologiskt material. IUPAC : Internationella kemiunionen. SMILES : Simplified Molecular Input Line Entry Specification Tillägg 2 TESTBETINGELSER, TESTPERIOD OCH ÖVERLEVNADSKRITERIER FÖR REKOMMENDERADE ARTER ARTER TESTBETINGELSER REKOMMENDERAD LÄNGD FÖR TESTPERIODEN Normal minsta genomsnittliga totallängd för kontrollfisk i slutet av undersökningen (mm) (98) ÖVERLEVNAD I KONTROLLER (minimum) Temperatur (°C) Salthalt (0/00) Fotoperiod (timmar) Kläckningsframgång Framgång efter kläckning Sötvatten: Oncorhynchus mykiss Regnbåge 10 ± 1,5 (99) 12–16 (100) 2 veckor efter det att kontrollerna börjar födosöka (eller 60 dagar efter kläckning) 40 75 % 75 % Pimephales promelas Knölskallelöja 25 ± 1,5 16 32 dagar från testets början (eller 28 dagar efter kläckning) 18 70 % 75 % Danio rerio Sebrafisk 26 ± 1,5 12–16 (101) 30 dagar efter kläckning 11 70 % 75 % Oryzias latipes Medaka (japansk risfisk) 25 ± 2 12–16 (101) 30 dagar efter kläckning 17 80 % 80 % Brack- och havsvatten: Cyprinodon variegatus Sheepshead minnow (art av tandkarp) 25 ± 1,5 15–35 (102) 12–16 (101) 32 dagar från testets början (eller 28 dagar efter kläckning) 17 75 % 80 % Menidia sp. Silverlax 22–25 15–35 (102) 13 28 dagar 20 80 % 60 % Tillägg 3 VÄGLEDNING OM UTFODRING OCH HANTERING AV FISKYNGEL OCH TESTDJUR FRÅN REKOMMENDERADE ARTER ARTER FODER (*9) ÖVERFÖRINGSTIDPUNKT EFTER KLÄCKNING TID TILL FÖRSTA UTFODRING Fiskyngel Nyligen kläckta yngel Ungfisk Typ Frekvens Sötvatten: Oncorhynchus mykiss Regnbåge Öringfoder Inget (1) Startfoder för öring, BSN 2–4 utfodringar per dag 14–16 dagar efter kläckning eller när de simmar upp (ej nödvändigt) 19 dagar efter kläckning eller när de simmar upp Pimephales promelas Knölskallelöja BSN, flingfoder, FBS BSN BSN48, flingfoder 2–3 gånger om dagen När kläckningen är 90 % 2 dagar efter kläckning Danio rerio Sebrafisk BSN, flingfoder Kommersiellt yngelfoder, protozoer (2), protein (3) BSN48, flingfoder BSN en gång per dag Flingfoder två gånger per dag När kläckningen är 90 % 2 dagar efter kläckningen Oryzias latipes Medaka (japansk risfisk) Flingfoder BSN, flingfoder (eller protozoer eller hjuldjur) BSN48, flingfoder (eller hjuldjur) BSN en gång per dag, flingfoder två gånger per dag eller flingfoder och hjuldjur en gång per dag Ej tillämpligt 6–7 dagar efter lek Brack- och havsvatten: Cyprinodon varieqatus Sheepshead minnow (art av tandkarp) BSN, flingfoder, FBS BSN BSN48 2–3 utfodringar per dag Ej tillämpligt 1 dag efter kläckning/uppsimning Menidia sp. Silverlax BSN48, flingfoder BSN BSN48 2–3 utfodringar per dag Ej tillämpligt 1 dag efter kläckning/uppsimning Tillägg 4 NÅGRA KEMISKA EGENSKAPER FÖR GODTAGBART UTSPÄDNINGSVATTEN Komponent Koncentrationsgränsvärde Partiklar 5 mg/l Halt av organiskt kol 2 mg/l Icke-joniserad ammoniak 1 μg/l Resterande mängd klor 10 μg/l Total mängd bekämpningsmedel som innehåller organiska fosforföreningar < 50 ng/l Total mängd bekämpningsmedel som innehåller organiska klorföreningar plus polyklorerade bifenyler < 50 ng/l Total mängd organiskt klor < 25 ng/l Aluminium 1 μg/l Arsenik 1 μg/l Krom 1 μg/l Kobolt 1 μg/l Koppar 1 μg/l Järn 1 μg/l Bly 1 μg/l Nickel 1 μg/l Zink 1 μg/l Kadmium < 100 ng/l Kvicksilver < 100 ng/l Silver < 100 ng/l Tillägg 5 STATISTISK VÄGLEDNING FÖR BESTÄMNING AV NOEC Allmänt Analysenheten är replikatkärlet. För kontinuerliga mätningar, såsom storlek, bör medel- eller medianvärdet för replikatet räknas ut och dessa replikatvärden utgör de data som ska analyseras. Styrkan hos det test som används bör påvisas, företrädesvis baserat på en lämplig historisk databas för varje laboratorium. Den storlekseffekt som kan upptäckas med 75–80 % styrka bör anges för varje endpoint med de statistiska test som ska användas. De databaser som finns tillgängliga när testmetoden utvecklas avgör den styrka som är möjlig med de rekommenderade statistiska förfarandena. Enskilda laboratorier ska visa att de kan uppnå denna styrka genom att utföra egna styrkeanalyser eller genom att visa att variationskoefficienten (VC) för varje respons inte överstiger den 90:e percentilen för de variationskoefficienter som används för att utveckla testriktlinjen. Variationskoefficienterna anges i tabell 1. Om endast medel- eller medianvärden finns tillgängliga för replikatet kan variationskoefficienten inom replikatet ignoreras. Tabell 1 Variationskoefficienter 90:e percentilen för utvalda sötvattensarter Art Respons VC_mellan replikat VC_inom replikat Regnbåge Längd 17,4 9,8 Vikt 10,1 28 Knölskallelöja Längd 16,9 13,5 Vikt 11,7 38,7 Sebrafisk Längd 43,7 11,7 Vikt 11,9 32,8 För nästan alla statistiska tester som används för att utvärdera toxikologiska laboratorieundersökningar är det jämförelserna mellan behandlings- och kontrollgrupperna som är intressanta. Därför är det inte lämpligt att kräva ett signifikanstest enligt ANOVA F innan man använder Dunnetts eller Williams test eller kräva ett signifikanstest enligt Kruskal-Wallis innan man använder Jonckheere-Terpstra-, Mann-Whitney- eller Dunn-testet (Hochberg och Tamhane 1987, Hsu 1996, Dunnett 1955, 1964, Williams 1971, 1972, 1975, 1977, Robertson m.fl. 1988, Jonckheere 1954, Dunn 1964). Dunnetts test har en inbyggd multiplicitetsjustering och dess falska positiva och negativa värden påverkas negativt om F-testet används som grindvakt. På samma sätt erhålls en negativ påverkan av Williams och Jonckheere-Terpstras tester av step-down-typ med användning av en signifikansnivå på 0,05 vid varje steg med bevarande av ett totalt falskt värde på 5 % samt det värdet och testets styrka om F-testet eller Kruskal-Wallis test används som grindvakt. Mann-Whitneys och Dunns tester måste justeras för multiplicitet, och här rekommenderas justeringen enligt Bonferroni-Holm. En ingående diskussion av de flesta av rekommendationerna om hypotesprövning och verifiering av underliggande antaganden för dessa tester återfinns i OECD (2006), som även innehåller en omfattande litteraturförteckning. Behandling av kontroller när lösningsmedel används Om lösningsmedel används bör både en kontroll av utspädningsvattnet och lösningsmedlet ingå i förfarandet. De två kontrollerna bör jämföras för varje respons och kombineras för statistisk analys om ingen signifikant skillnad påvisas mellan kontrollerna. I annat fall bör lösningsmedelskontrollen användas för NOEC-bestämningen eller skattningen av ECx. Då används ingen vattenkontroll. Se begränsning av giltighetskriterier (punkt 7). För längd, vikt, andelen kläckta ägg, dödlighet hos yngel eller onormala yngel samt första och sista dagen för kläckning eller uppsimning bör T-testet eller Mann-Whitneys test användas för att jämföra kontrollen av utspädningsvatten och av lösningsmedel vid en signifikansnivå på 0,05. I detta fall ignoreras alla behandlingsgrupper. Resultaten av dessa tester bör rapporteras. Storleksmätningar (längd och vikt) Individuella fiskars längd- och viktvärden kan ha en normal eller log-normalfördelning. I båda fallen brukar replikatens medelvärden vara normalt fördelade enligt den centrala gränsvärdessatsen och bekräftas av data från över 100 ELS-studier av tre sötvattensarter. Om data eller historiska databaser tyder på en log-normalfördelning för individuella fiskars storleksvärden kan medelvärdet av replikatets logaritmer för de individuella värdena beräknas och analysdata kan då vara antiloggar för dessa medelvärden av replikatets logaritmer. Data bör utvärderas för överensstämmelse med en normalfördelning och variansens homogenitet. Residualer från ANOVA-modellen med koncentration som enda förklarande klassvariabel bör användas för detta ändamål. Visuell bestämning med hjälp av punktdiagram och histogram eller stam-blad-diagram kan användas. Alternativt kan ett formellt test som Shapiro-Wilk eller Anderson-Darling användas. Överensstämmelse med variansens homogenitet kan bedömas med hjälp av en visuell undersökning av samma punktdiagram eller formellt genom Levenes test. Endast parametriska tester (Williams, Dunnett) behöver utvärderas för normalitet eller variansens homogenitet. Eventuella avvikande värden och deras inverkan på analysen bör uppmärksammas. Tukeys test för avvikande värden samt visuell inspektion av samma residualdiagram som beskrivs ovan kan användas. Det är viktigt att tänka på att observationerna rör hela replikaten och avvikande värden bör därför utelämnas från analysen först efter noggrant övervägande. De statistiska tester som använder inslag av experimentell design och biologiska förväntningar är trendtester av step-down-typ, som Williams och Jonckheere-Terpstra. Dessa tester förutsätter en monoton koncentrationsrespons och data bör bedömas för överensstämmelse med detta antagande. Detta kan ske visuellt genom ett punktdiagram för replikatets medelvärden mot testkoncentrationen. Det kan vara till hjälp att täcka punktdiagrammet med ett punktvis linjärt diagram som kopplar koncentrationens medelvärden viktade med samma provstorlek för replikatet. Om det punktvisa linjära diagrammet visar en kraftig avvikelse från monotonicitet är det eventuellt nödvändigt att använda icke-trendtester. Alternativt kan formella tester användas. Ett enkelt formellt test är att beräkna linjära och kvadratiska kontraster i koncentrationens medelvärden. Om den kvadratiska kontrasten är betydande och den linjära kontrasten är icke-betydande tyder detta på ett eventuellt problem med monotonicitet, som bör utvärderas ytterligare med hjälp av diagrammen. Om normaliteten eller variansens homogenitet är problematiska kan dessa kontraster konstrueras från transformerade rangordnade data. Alternativa förfaranden såsom Bartholomews test för monotonicitet kan användas, men då måste komplexitet läggas till. Figur 2 NOEC-flödesdiagram för storleksmätningar (längd och vikt) Om data inte överensstämmer med kraven för dessa tester bestäms NOEC genom ett Williams- eller Jonckheere-Terpstra-test av step-down-typ. Information om dessa förfaranden ges i OECD (2006). För data som inte överensstämmer med kraven för ett trendtest av step-down-typ kan Dunnetts eller Tamhane-Dunnetts (T3) test användas, eftersom båda testerna har inbyggda justeringar för multiplicitet. Dessa tester förutsätter normalitet och, när det gäller Dunnett, variansens homogenitet. Om dessa villkor inte är uppfyllda kan Dunns icke-parametriska test användas. OECD (2006) innehåller information om alla dessa tester. I figur 2 ges en översikt av hur man väljer test. Kläckta ägg och överlevande yngel Data är andelen kläckta ägg eller yngel som överlever i de individuella replikaten. Dessa andelar bör bedömas för extrabinomial varians, som är vanligt men inte generellt för sådana mätningar. Flödesschemat i figur 3 ger vägledning om hur man väljer test, se texten för detaljerade beskrivningar. Två tester används ofta, nämligen Tarones C(α)-test (Tarone, 1979) och chi-två-test, varje test tillämpas separat för varje testkoncentration. Om extrabinomial varians påträffas i en testkoncentration bör metoder som omfattar detta användas. Formel 1: Tarones C (α)-test (Tarone 1979) där ̂ är den genomsnittliga andelen för en given koncentration, m är antalet replikatkärl nj är antalet ämnen i replikat j, och xj är antalet djur i replikatet som svarar, t.ex. ej kläckta djur eller döda djur. Detta test ska tillämpas separat på varje koncentration. Testet kan betraktas som ett justerat chi-två-test, men begränsade kraftsimulationer som har utförts av Tarone har visat att det är mer kraftfullt än ett chi-två-test. Figur 3 NOEC-flödesschema för kläckta ägg och dödlighet hos yngel Om det inte finns några tydliga tecken på extrabinomial varians kan ett Cochran-Armitage-test av step-down-typ användas. Detta test ignorerar replikaten, så när det finns sådana belägg beaktar Rao-Scott-justeringen av Cochran-Armitages test (RSCA) replikaten, replikatens storlekar och den extrabinomiala variansen, och rekommenderas därför. Alternativa tester är Williams- och Jonckheere-Terpstra-tester av step-down-typ och Dunnetts test, enligt beskrivningen av storleksmätningar. Dessa tester är tillämpliga vare sig extrabinomial varians förekommer eller ej, men har något mindre kraft (Agresti 2002, Morgan 1992, Rao och Scott 1992, 1999, Fung m.fl. (1994, 1996). Första eller sista dagen för kläckning eller uppsimning Responsen är ett heltal, som anger den testdag då den angivna observationen iakttas för ett visst replikatkärl. Urvalet av värden är i regel mycket begränsat och det förekommer ofta en hög andel bundna värden, t.ex. att samma första kläckningsdag observeras i alla kontrollreplikat och kanske i en eller två låga testkoncentrationer. Parametriska tester såsom Williams och Dunnett är inte lämpliga för sådana data. Om det inte finns bevis på allvarlig icke-monotonicitet är ett Jonckheere-Terpstra-test av step-down-typ mycket kraftfullt för att upptäcka effekter av testkemikalien. Annars kan Dunns test användas. Abnormiteter hos yngel Responsen är antalet yngel som befunnits vara onormala på något sätt. Denna respons har ofta låg incidens och kan uppvisa samma problem som första kläckningsdatumet. Oregelbunden koncentrationsrespons kan också förekomma. Om data åtminstone grovt liknar en monoton koncentrationsform är ett Jonckheere-Terpstra-test av step-down typ kraftfullt för att upptäcka effekter. Annars kan Dunns test användas. LITTERATURHÄNVISNINGAR Agresti, A. (2002), Categorical Data Analysis, second edition, Wiley, Hoboken. Dunnett, C. W. (1955), A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control, J. American Statistical Association 50, 1096–1121. Dunn O.J. (1964 ), Multiple Comparisons Using Rank Sums, Technometrics 6, 241–252. Dunnett, C. W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics 20, 482–491. Fung, KY, D. Krewski, J.N.K. Rao, A.J. Scott (1994), Tests for Trend in Developmental Toxicity Experiments with Correlated Binary Data, Risk Analysis 14, 639–648. Fung, K.Y., D. Krewski, R.T. Smythe (1996), A comparison of tests for trend with historical controls in carcinogen bioassay, Canadian Journal of Statistics 24, 431–454. Hochberg, Y. och A.C. Tamhane (1987), Multiple Comparison Procedures, Wiley, New York. Hsu, J.C. (1996), Multiple Comparisons: Theory and Methods, Chapman and Hall/CRC Press, Boca Raton. Jonckheere, A. R. (1954), A distribution-free k-sample test against ordered alternatives, Biometrika 41, 133. Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London. OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series on Testing and Assessment. nr 54. Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD), Paris. Rao J.N.K. och Scott A.J. (1992) – A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577–585. Rao J.N.K. och Scott A.J. (1999) – A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373–1385. Robertson, T., Wright F.T. och Dykstra R.L. (1988), Order restricted statistical inference, Wiley. Tarone, R.E. (1979), Testing the goodness of fit of the Binomial distribution, Biometrika 66, 585–590. Williams, D. A. (1971), A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics 27, 103–117. Williams, D. A. (1972), The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics 28, 519–531. Williams, D. A. (1975), The Analysis of Binary Responses from Toxicological Experiments Involving Reproduction and Teratotlogy, Biometrics 31, 949–952. Williams, D. A. (1977), Some inference procedures for monotonically ordered normal means, Biometrika 64, 9–14. Tillägg 6 STATISTISK VÄGLEDNING FÖR REGRESSIONUPPSKATTNINGAR Allmänt De observationer som används för att anpassa modellen är replikatets medelvärden (längd och vikt) eller replikatets proportioner (kläckta ägg och dödlighet hos yngel) (OECD 2006). Viktad regression med användning av replikatets urvalsstorlek som vikt rekommenderas allmänt. Andra viktningssystem är dock möjliga, såsom viktning genom förutsagd genomsnittlig respons eller en kombination av detta och replikatets urvalsstorlek. Viktning genom ömsesidig urvalsvarians inom koncentrationen rekommenderas inte (Bunke m.fl. 1999, Seber och Wild, 2003, Motulsky och Christopoulos 2004, Huet m.fl. 2003). Oberoende observationer bör bevaras vid eventuell transformation av responser före analys, och ECx och dess konfidensgränser bör uttryckas i de ursprungliga mätenheterna, inte i transformerade enheter. En förändring på 20 % i logaritmen för längd motsvarar t.ex. inte en förändring på 20 % i längd (Lyles m.fl. 2008, Draper och Smith 1999). Flödesdiagrammet i figur 4 ger en översikt av ECx-uppskattningar. Detaljerna beskrivs i texten nedan. Figur 4 Flödesschema för ECx-uppskattning av replikatets genomsnittliga längd, vikt eller andelen kläckta ägg eller dödlighet hos yngel, se texten för mer information Överväganden rörande antalet kläckta ägg och dödlighet hos yngel För kläckta ägg och dödlighet hos yngel är det i regel bäst att anpassa en minskande modell om man inte anpassar en probitmodell såsom beskrivs nedan. Det innebär att man bör modellera andelen ägg som inte kläcks eller andelen döda yngel. Anledningen till detta är att ECx avser en koncentration vid vilken det finns en förändring som motsvarar x % av kontrollens responsmedelvärde. Om 5 % av kontrolläggen inte kläcks och man modellerar antalet misslyckade kläckningar, avser EC20 en koncentration vid vilken det sker en förändring som motsvarar 20 % ej kläckta ägg och 5 % kläckta ägg i kontrollen, vilket i sin tur motsvarar en förändring på 0,2 × 0,05 = 0,01 eller 1 procentenhet mot 6 % ej kläckta ägg. En sådan liten förändring kan inte beräknas på något meningsfullt sätt från tillgängliga data och är inte biologiskt viktig. Om man däremot modellerar andelen kläckta ägg skulle kontrollandelen i detta exempel motsvara 95 % och en minskning på 20 % av kontrollmedelvärdet skulle motsvara en förändring på 0,95 × 0,2 = 0,18, dvs. 95 % kläckta ägg till 77 % (= 95-18) kläckta ägg. Denna effektkoncentration kan uppskattas och är förmodligen av större intresse. Detta problem förekommer inte i storleksmätningar, men negativa effekter på storleken innebär i regel minskad storlek. Modeller för storlek (längd eller vikt) och kläckta ägg eller överlevande yngel. Med undantag för Brain-Cousins hormetiska modell beskrivs och rekommenderas alla dessa modeller i OECD (2006). Den så kallade OECD 2-5 diskuteras också i samband med ekotoxicitetsförsök i Slob (2002). Det finns naturligtvis många andra modeller som kan vara användbara. Bunke, m.fl. (1999) anger ett antal modeller som inte ingår här och det finns många hänvisningar till andra modeller. De metoder som anges nedan anses vara särskilt lämpliga för ekotoxicitetsförsök och är allmänt vedertagna. Metod med fem testkoncentrationer plus kontroll. — Bruce-Versteeg. — Enkel exponentiell metod (OECD 2). — Exponentiell metod med formparameter (OECD 3). — Enkel exponentiell metod med nedre gräns (OECD 4). Metod med sex eller fler testkoncentrationer plus kontroll. — Exponentiell metod med formparameter och nedre gräns (OECD 5). — Michaelis-Menton. — Hill. Om det finns synliga tecken på hormesis (osannolikt vad gäller kläckningsframgång och yngelöverlevnad, men förekommer ibland i storleksobservationer). — Brain-Cousins Hormetic, Brain and Cousens (1989). Alternativa modeller för misslyckade kläckningar och dödlighet hos yngel — Ökande modeller för dessa responser kan anpassas med hjälp av probitmodeller (eller logistiska modeller) om det inte finns några belägg för extrabinomial varians och kontrollincidensen uppskattas i modellanpassningen. Denna metod är dock inte att föredra eftersom den behandlar individen, inte replikaten, som analysenheter (Morgan 1992, O'Hara Hines och Lawless 1993, Collett 2002, 2003). Anpassningsgraden (”goodness of fit”) för en enskild modell — Gör en visuell jämförelse av observerade och förutsagda procentuella minskningar för varje testkoncentration (Motulsky och Christopoulos 2004, Draper och Smith 1999). — Jämför regressionens medelkvadratsumma och den rena medelkvadratsumman genom användning av F-test (Draper och Smith 1999). — Kontrollera att varje term i modellen avviker nämnvärt från 0 (fastställ om alla modelltermer är viktiga) (Motulsky och Christopoulos 2004). — Residualdiagram från regressionen mot testkoncentrationen, möjligen enligt en log(konc.)skala. Diagrammet bör inte ha något mönster, utan punkterna bör vara slumpmässigt utspridda längs en horisontell linje vid nollhöjd. — Uppgifterna bör utvärderas för normalitet och variansens homogenitet på samma sätt som anges i tillägg 5. — Dessutom bör residualernas normalitet i regressionsmodellen bedömas med hjälp av samma metoder som anges i tillägg 5 för residualer från ANOVA. Jämför modellerna. — Använd Akiakes AICC-kriterier. Mindre AICC värden anger bättre anpassningar. Om AICc(B)-AICc(A)≥10 är modell A nästan säkert bättre än modell B (Motulsky och Christopoulos (2004). — Jämför de två modellerna visuellt genom att titta på hur väl de uppfyller det enskilda modellkriteriet ovan. — Sparsamhetsprincipen rekommenderas, vilket innebär att den enklaste modellen som passar uppgifterna rimligt väl används (Ratkowsky 1993, m.fl. Lyles 2008). ECx-skattningens kvalitet Konfidensintervallet (KI) för ECx bör inte vara för brett. Det krävs en statistisk bedömning för att avgöra hur stort konfidensintervallet får vara för att ECx fortfarande ska vara användbart. Simuleringar för regressionsmodeller som är anpassade till antal kläckta ägg och storleksdata visar att ett konfidensintervall på cirka 75 % för ECx (X = 10, 20 eller 30) inte sträcker sig över fler än två testkoncentrationer. Detta ger allmän vägledning om vad som är acceptabelt och praktiska råd om vad som är möjligt. Ett flertal författare hävdar att det är nödvändigt att rapportera konfidensintervall för alla modellparametrar och att breda konfidensintervall för modellparametrar tyder på att modellen är oacceptabel (Ott och Longnecker 2008, Alvord och Rossio 1993 Motulsky och Christopoulos 2004, Lyles m.fl. 2008, Seber och Wild 2003, Bunke m.fl. 1999, Environment Canada 2005). KI för ECx (eller någon annan modellparameter) får inte innehålla noll (Motulsky och Christopoulos 2004). Detta är motsvarigheten i regressionsmodeller till den minsta signifikanta skillnad som ofta citeras i hypotestestmetoder (t.ex. Wang m.fl. 2000). Det motsvarar också konfidensintervallet för de genomsnittliga LOEC-responser som inte innehåller kontrollmedelvärdet. Man bör fråga sig om parameterskattningarna är vetenskapligt trovärdiga. Om konfidensintervallet för y0 är ± 20 % är t.ex. ingen EC10-skattning rimlig. Om modellen förutsäger en effekt på 20 % vid koncentration C och den maximala observerade effekten vid C och lägre koncentrationer är 10 %, är EC20 inte rimlig (Motulsky och Christopoulos 2004, Wang m.fl. 2000, Environment Canada 2005). ECx bör inte kräva extrapolering utanför positiva koncentrationer (Draper och Smith 1999, OECD 2006). En allmän vägledning kan t.ex. vara att ECx inte är mer än omkring 25 % lägre än den lägsta testade koncentrationen eller över den högsta testade koncentrationen. LITTERATURHÄNVISNINGAR Alvord, W.G., Rossio, J.L. (1993), Determining confidence limits for drug potency in immunoassay, Journal of Immunological Methods 157, 155–163. Brain, P. och Cousens, R. (1989), An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed res. 29: 93–96. Bunke, O., Droge, B. och Polzehl, J. (1999). Model selection, transformations and variance estimation in nonlinear regression. Statistics 33, 197–240. Collett, D. (2002), Modelling Binary Data, andra upplagan, Chapman and Hall, London. Collett, D. (2003), Modelling Survival Data in Medical Research, andra upplagan, Chapman and Hall, London. Draper, N. R. och Smith, H. (1999), Applied Regression Analysis, tredje upplagan. New York: John Wiley & Sons. Environment Canada (2005), Guidance Document on Statistical Methods for Environmental Toxicity Tests, Report EPS 1/RM/46 Huet, S., A. Bouvier, M.-A. Poursat, E. Jolivet (2003), Statistical Tools for Nonlinear Regression: A Practical Guide with S-PLUS and R Examples, Springer Series in Statistics, New York. Lyles, R. H., C. Poindexter, A. Evans, M. Brown, och C.R. Cooper (2008), Nonlinear Model-Based Estimates of IC50 for Studies Involving Continuous Therapeutic Dose-Response Data, Contemp Clin Trials. 29 november 2008, 29 (6): 878–886 Morgan, B.J.T. (1992), Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London. Motulsky, H., A. Christopoulos (2004), Fitting Models to Biological Data Using Linear and Nonlinear Regression: A Practical Guide to Curve Fitting, Oxford University Press, USA. O'Hara Hines, R. J. och J. F. Lawless (1993), Modelling Overdispersion in Toxicological Mortality Data Grouped over Time, Biometrics Vol. 49, s. 107–121 OECD (2006), Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series Testing and Assessment, nr 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris. Ott, R.L., M.T. Longnecker, An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, sjätte upplagan, 2008, Brooks-Cole, Belmont, CA. Ratkowsky, D.A. (1993), Principles of nonlinear regression, Journal of Industrial Microbiology 12, 195–199. Seber, G.A.F., C.J. Wild, Nonlinear Regression, Wiley, 2003 Slob W. (2002), Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci., 66, 298–312 Wang, Q., D.L. Denton, och R. Shukla (2000), Applications and Statistical Properties Of Minimum Significant Difference-Based Criterion Testing In a Toxicity Testing Program, Environmental Toxicology and Chemistry, vol. 19, s. 113–117, 2000. C.48 Korttidstest av reproduktion hos fisk INLEDNING 1. Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 229 (2012). Behovet av att utveckla och validera ett test på fisk som kan påvisa endokrint aktiva kemikalier härrör från farhågor att koncentrationen av kemikalier i miljön kan orsaka negativa effekter både hos människor och vilda djur på grund av samspelet mellan dessa kemikalier och det endokrina systemet. OECD inledde 1998 en högprioriterad verksamhet för att se över befintliga riktlinjer och utveckla nya riktlinjer för undersökning och testning av potentiellt endokrinstörande ämnen. Ett inslag i verksamheten var att utveckla en testmetod för undersökning av kemikalier som är verksamma på det endokrina systemet hos fiskarter. Det kortvariga reproduktionstestet på fisk genomgick ett omfattande valideringsprogram bestående av interlaborativa studier med utvalda kemikalier för att demonstrera testets relevans och tillförlitlighet för påvisning av kemikalier som påverkar reproduktionen hos fisk genom flera olika mekanismer, inklusive endokrina modaliteter (1, 2, 3, 4, 5). Alla endpoints i OECD:s testriktlinje har validerats för knölskallelöja, och en underordnad uppsättning endpoints har validerats för medaka (japansk risfisk) (dvs. vitellogenin och sekundära könskaraktärer) samt för sebrafisk (dvs vitellogenin). Valideringsarbetet har granskats av en expertpanel utsedd av de nationella samordnarna för OECD:s testmetodprogram (Test Guideline Programme) (6) och dels av en oberoende expertpanel på uppdrag av Förena staternas Environmental Protection Agency (29). Testet är inte utformat för att upptäcka särskilda hormonstörande mekanismer eftersom försöksdjuren har en intakt hypotalamus-hypofys-gonad-axel (HPG-axel), som kan reagera på kemikalier som påverkar HPG-axeln på olika nivåer. 2. Denna metod beskriver ett screeningtest in vivo där könsmogna lekande hanar och honor hålls tillsammans och exponeras för en kemikalie under en begränsad del av deras livscykel (21 dagar). Vid slutet av den 21 dagar långa exponeringstiden mäts en eller två biomarkörer som endpoints hos hanar och honor som indikatorer på testkemikaliens endokrina aktivitet. Dessa endpoints är vitellogenin och sekundära könskaraktärer. Vitellogenin mäts hos knölskallelöja, medaka och sebrafisk, medan de sekundära könskaraktärerna mäts hos knölskallelöja och medaka. Dessutom övervakas kvantitativ fruktsamhet (fekunditet) dagligen under hela testet. Könskörtlar bevaras också och histopatologi kan utvärderas för att bedöma försöksdjurens reproduktiva lämplighet och komplettera den sammanvägda bedömningen av andra endpoints. 3. Denna bioanalys tjänar som en reproduktiv in vivo-screeninganalys och dess tillämpning bör ses mot bakgrund av OECD:s konceptuella ramverk för testning och bedömning av endokrinstörande kemikalier (30). I denna begreppsram föreslås det kortvariga reproduktionstestet på fisk på nivå 3 som en in vivo-analys som ger data om valda endokrina mekanismer eller vägar. INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR 4. Vitellogenin (VTG) produceras vanligen i levern hos honor av äggläggande ryggradsdjur som respons på cirkulerande endogent östrogen. Det är en prekursor till ägguleproteiner, och när det väl har producerats i levern förs det med blodet till äggstockarna, där det tas upp och modifieras av ägg som är under utveckling. Vitellogenin är nästan inte påvisbart i plasman hos icke könsmogna hon- och hanfiskar eftersom de saknar tillräckliga halter av cirkulerande östrogen. Levern kan dock bilda och utsöndra vitellogenin som respons på exogen östrogenstimulans. 5. Mätningen av vitellogenin tjänar till att påvisa kemikalier med olika östrogena verkningsmekanismer. Man kan påvisa ämnen med östrogena kemikalier genom mätning av vitellogenininduktionen hos hanfiskar, och detta har dokumenterats många gånger i den fackgranskade vetenskapliga litteraturen (t.ex. (7)). Vitellogenininduktion har också påvisats efter exponering för aromatiserbara androgener (8, 9). En minskning av nivåerna av cirkulerande östrogen hos honor, till exempel genom hämning av aromatasen som omvandlar det endogena androgenet till det naturliga östrogenet 17-beta-östradiol, orsakar en minskning av VTG-koncentrationen, som används för att påvisa kemikalier med aromatashämmande egenskaper (10, 11). Den biologiska relevansen av den vitellogeninrespons som följer östrogen hämning och aromatashämning har fastställts och har dokumenterats i stora drag. Det är dock möjligt att produktionen av VTG hos honor även kan påverkas av allmän toxicitet och icke-endokrina toxiska verkningsmekanismer, t.ex. hepatotoxicitet. 6. Flera mätmetoder har framgångsrikt utvecklats och standardiserats för rutinmässig användning. Detta gäller artspecifika testmetoder för ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) som använder immunokemiska tekniker för kvantifiering av det VTG som producerats i små blod- eller leverprover som insamlats från enskilda fiskar (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18). Prov tas på blod från knölskallelöja, blod eller huvud/stjärthomogenat från sebrafisk och lever från medaka för mätning av VTG. Hos medaka finns det en god korrelation mellan VTG mätt i blod och i leverprover (19). Tillägg 6 innehåller de rekommenderade förfarandena för provtagning för analys av VTG. Utrustning för mätning av VTG är lätt att få tag på. Denna utrustning bör bygga på en validerad artspecifik ELISA-metod. 7. De sekundära könskaraktärerna hos hanarna av vissa fiskarter är externt synliga, kvantifierbara och mottagliga för cirkulerande nivåer av endogena androgener. Detta är fallet för knölskallelöja och medaka, men inte för sebrafisk, som inte har några kvantifierbara sekundära könskaraktärer. Honor behåller förmågan att utveckla sekundära hanliga könskaraktärer om de exponeras för androgena kemikalier i vattnet. Flera studier finns tillgängliga i den vetenskapliga litteraturen som dokumenterar denna typ av respons hos knölskallelöja (20) och medaka (21). En minskning av de sekundära könskaraktärerna hos hanar bör tolkas med försiktighet på grund av dålig statistisk giltighet, och bör i stället bygga på en expertbedömning och på vikten av de sammanlagda bevisen. Det finns begränsningar för användningen av sebrafisk i detta test, eftersom dessa fiskar inte har några kvantifierbara sekundära könskaraktärer som är mottagliga för androgena kemikalier. 8. Hos knölskallelöja är den viktigaste indikatorn på exogen exponering för androgener antalet parningstuberkler på honornas nosar. Hos medaka utgör antalet papillära utväxter det huvudsakliga kännetecknet hos honor för exogen exponering för androgena kemikalier. I tilläggen 5A och 5B anges rekommenderade förfaranden som man bör följa när man utvärderar könskaraktärerna hos knölskallelöja och medaka. 9. Det 21 dagar långa fisktestet omfattar utvärdering av kvantitativ äggproduktion och bevarande av könskörtlar för valfri histopatologisk undersökning. Vissa tillsynsmyndigheter kan kräva denna ytterligare endpoint för en mer komplett utvärdering av testdjurens reproduktiva lämplighet, eller i fall där vitellogenin och sekundära könskaraktärer inte reagerat för kemisk exponering. Vissa endpoints kan vara mycket diagnostiska (t.ex. VTG-induktion hos hanar och knölbildning hos honor), men inte alla endpoints (t.ex. fruktsamhet och könskörtlarnas histopatologi) i testet är avsedda att entydigt identifiera specifika cellulära verkningsmekanismer. Det är snarare uppsättningen endpoints i stort som gör det möjligt att dra slutsatser om eventuella endokrina störningar, och därmed ge vägledning för vidare testning. Fruktsamhet är inte är endokrinspecifikt, men är bevisat känsligt för kända endokrinaktiva kemikalier (5) och är därför en viktig endpoint att inkludera. Om fruktsamhet och andra endpoints inte påverkas kan man nämligen vara mer säker på att en sammansättning sannolikt inte är endokrinaktiv. Om fruktsamheten påverkas kommer denna endpoint emellertid att bidra starkt till interferenser i vikten av de sammanlagda bevisen. Närmare vägledning om tolkning av data och acceptans av testresultat ges i testmetoden. 10. Definitioner som används i denna testmetod finns i tillägg 1. TESTPRINCIP 11. Med denna metod exponeras han- och honfiskar som är i ett reproduktivt stadium tillsammans i testkärlen. Deras status som vuxna djur i reproduktivt stadium gör att könen är tydligt särskiljbara och att de är mottagliga för exogena kemikalier, och därmed kan man göra en könsrelaterad analys av varje endpoint. Vid slutet av testet bekräftas könet med hjälp av makroskopisk undersökning av könskörtlarna efter att buken öppnats ventralt med sax. En översikt över de relevanta betingelserna för ett biologiskt test återfinns i tillägg 2. Testet inleds normalt med fisk som tagits från en population som befinner sig i lekstadium. Äldre djur bör inte användas. Vägledning om fiskarnas ålder och reproduktiva status finns i avsnittet om urval av fisk. Testet genomförs med tre kemiska exponeringskoncentrationer och en vattenkontroll, och vid behov en lösningsmedelskontroll. Två kärl eller replikat per behandling används för sebrafisk (varje kärl innehåller fem hanar och fem honor), medan fyra kärl eller replikat per behandling används för knölskallelöja (varje kärl innehåller två hanar och fyra honor). Detta är för att tillgodose knölskallelöjhanens territoriella beteende samtidigt som testets giltighet upprätthålls. Fyra kärl eller replikat per behandling används för medaka (varje kärl innehåller 3 hanar och 3 honor). Exponeringens varaktighet är 21 dagar, och provtagningen på fiskarna sker på dag 21 av exponeringen. Kvantitativ fruktsamhet övervakas dagligen. 12. Vid provtagningen på dag 21 avlivas alla djuren på ett humant sätt. De sekundära könskaraktärerna mäts hos knölskallelöja och medaka (se tillägg 5A och 5B), blodprov tas för bestämning av VTG i sebrafisk och knölskallelöja eller huvud/stjärt samlas in för bestämning av VTG i sebrafisk (tillägg 6), och levern samlas in för VTG-analys av medaka (tillägg 6). Könskörtlarna fixeras antingen hela eller dissekeras för eventuell histopatologisk bedömning (22). KRITERIER FÖR GODKÄNNANDE AV TESTET 13. För att testresultaten ska kunna godtas måste följande villkor uppfyllas: — Dödligheten i vatten- eller lösningsmedelskontrollen bör inte överstiga 10 % i slutet av exponeringsperioden. — Koncentrationen löst syre bör vara minst 60 % av luftmättnadsvärdet (ASV) under hela exponeringsperioden. — Vattentemperaturen bör inte vid någon tidpunkt under exponeringsperioden variera med mer än ± 1,5 °C mellan olika testkärl, och får variera med högst 2 °C från de temperaturgränser som specificerats för den art som används i testet (se tillägg 2). — Bevis bör finnas tillgängliga som visar att koncentrationen av testkemikalien i lösningen på ett tillfredsställande sätt har hållits inom ± 20 % av de genomsnittliga uppmätta värdena. — Bevis för att fisken aktivt leker i alla replikat innan den kemiska exponeringen inleds och i kontrollreplikaten under testet. BESKRIVNING AV TESTMETODEN Utrustning 14. Normal laboratorieutrustning, och särskilt följande: a. syrgas- och pH-mätare, b. utrustning för bestämning av vattnets hårdhet och alkalinitet, c. lämplig utrustning för temperaturreglering, helst med kontinuerlig övervakning, d. akvarier tillverkade av kemiskt inert material och tillräckligt stora för den rekommenderade fisk- och antalstätheten (se tillägg 2), e. leksubstrat för knölskallelöja och sebrafisk (tillägg 4 innehåller de uppgifter som behövs), f. lämplig precisionsvåg (t.ex. noggrannhet ± 0,5 mg). Vatten 15. Allt vatten i vilket testarten uppvisar lämplig överlevnad och tillväxt kan användas som testvatten. Vattnet ska hålla jämn kvalitet under hela testperioden. Vattnets pH bör ligga inom intervallet 6,5–8,5 men får dock under ett givet test variera med högst ± 0,5 pH-enheter. För att säkerställa att utspädningsvattnet inte påverkar testresultaten på oönskat sätt (t.ex. genom komplexbildning med testkemikalien) bör vattenprover tas regelbundet för analys. Mätningar av tungmetaller (t.ex. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd och Ni), viktiga anjoner och katjoner (t.ex. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl– och SO4 2–), bekämpningsmedel (t.ex. total mängd organiska fosforföreningar eller total mängd organiska klorföreningar), halten organiskt kol och uppslammade partiklar bör göras t.ex. var tredje månad i fall där man vet att utspädningsvattnet håller en relativt jämn kvalitet. Om vattenkvaliteten har visat sig vara jämn under minst ett år kan dessa kontroller göras med längre intervaller (t.ex. var sjätte månad). Några kemiska egenskaper för godtagbart utspädningsvatten anges i tillägg 3. Testlösningar 16. Testlösningar med de valda koncentrationerna bereds genom utspädning av en stamlösning. Stamlösningen bör helst beredas genom att man helt enkelt blandar eller skakar testkemikalien i utspädningsvattnet på mekanisk väg (t.ex. omrörning eller ultraljud). Mättnadskolonner (löslighetskolonner) kan användas för att få en stamlösning med lämplig koncentration. Användning av lösningsmedel som bärämne rekommenderas inte. Om ett lösningsmedel måste användas kan man dock inrätta en lösningsmedelskontroll som testas parallellt med samma lösningsmedelskoncentration som i de kemiska behandlingarna. För kemikalier som är svåra att testa kan lösningsmedel tekniskt sett vara den bästa lösningen. OECD:s vägledningsdokument om akvatisk toxicitetstestning av svåra ämnen och blandningar bör konsulteras i sådana fall (23). Valet av lösningsmedel avgörs av testkemikaliens eller blandningens kemiska egenskaper. OECD:s vägledningsdokument rekommenderar högst 100 μl/l, en rekommendation som bör iakttas. En färsk undersökning (24) visade dock på ytterligare problem vid användning av lösningsmedel när man testar för endokrin aktivitet. Det rekommenderas därför att koncentrationen av ett eventuellt lösningsmedel begränsas till ett minimum om det är tekniskt genomförbart (beroende på testkemikaliens fysikalisk-kemiska egenskaper). 17. Ett genomflödestestsystem ska användas. Ett sådant system portionerar och späder kontinuerligt ut en stamlösning av testkemikalien (t. ex. med mätpump, proportionalitetslösningssystem och mättnadskärlsystem) för att tillföra en serie koncentrationer till testbehållarna. Stamlösningens och utspädningsvattnets flödeshastighet bör kontrolleras regelbundet under testets gång, helst dagligen, och får inte variera med mer än 10 % under hela testet. Man bör vara noga med att undvika att använda plaströr av låg kvalitet eller andra material som kan innehålla biologiskt aktiva kemikalier. Vid val av materialet för genomflödessystemet bör man beakta möjligheten att testkemikalien eventuellt kan adsorberas till detta material. Fiskhållning 18. Testfiskarna ska tas från en laboratoriepopulation från en enda stam som under minst två veckor före testets början har acklimatiserats för testet genom att hållas i vatten med samma kvalitet och ljusförhållanden som det som används i testet. Det är viktigt att fisk- och antalstätheten (för definitioner, se tillägg 1) anpassas för de arter som testas (se tillägg 2). 19. Efter en anpassningsperiod på 48 timmar ska dödligheten registreras och följande kriterier tillämpas: — Om mortaliteten under sju dagar är högre än 10 % av beståndet bör hela beståndet förkastas. — Om mortaliteten ligger mellan 5 % och 10 % av beståndet fortsätts acklimatiseringen under ytterligare sju dagar. Om mer än 5 % av beståndet har dött under den andra sjudagarsperioden ska hela beståndet förkastas. — Om mortaliteten under sju dagar är lägre än 5 % av beståndet kan beståndet godtas. 20. Fiskarna bör inte ges någon behandling mot sjukdomar under acklimatiseringsperioden, under förexponeringen, eller under exponeringsperioden. Förexponering och urval av fisk 21. En förexponeringsperiod på en till två veckor rekommenderas då djuren placeras i kärl som liknar de som används i det verkliga testet. Fiskarna bör utfodras ad libitum under hela djurhållningsperioden och under exponeringsfasen. Exponeringen inleds med sexuellt dimorf vuxen fisk från en laboratoriesamling med könsmogna djur (t.ex. med tydligt synbara sekundära könskaraktärer när det gäller knölskallelöja och medaka) som aktivt leker. För allmän vägledning (detta bör inte betraktas isolerat från observationer av ett fiskbestånds faktiska reproduktiva status), bör knölskallelöjorna vara ungefär 20 (± 2) veckor gamla, förutsatt att de har odlats vid en temperatur på 25 ± 2 °C under hela sin livstid. Medaka bör vara ungefär 16 (± 2) veckor, förutsatt att de har odlats vid en temperatur på 25 ±2 °C under hela sin livstid. Sebrafiskar bör vara ungefär 16 (± 2) veckor, förutsatt att de har odlats vid en temperatur på 26 ± 2 °C under hela sin livstid. Äggproduktionen bör utvärderas dagligen under förexponeringsfasen. Det rekommenderas att lek observeras i alla replikatkärl innan de tas med i testets exponeringsfas. Det är inte möjligt att ge kvantitativ vägledning om önskvärd daglig äggproduktion i detta skede, men det är relativt vanligt att observera genomsnittlig lek på > 10 ägg/hona/dag för varje art. En randomiserad blockutformning baserad på äggproduktionen bör användas för att fördela replikaten till de olika testnivåerna. Syftet är att säkerställa en balanserad fördelning av replikaten. TESTETS UTFORMNING 22. Tre koncentrationer av testkemikalien, en kontroll (vatten) och, vid behov, en lösningsmedelskontroll används. Uppgifterna kan analyseras för att fastställa statistiskt signifikanta skillnader mellan responsen i behandlingarna och i kontrollen. Dessa analyser kommer att klargöra huruvida ytterligare testning av mer långsiktiga negativa effekter (dvs. överlevnad, utveckling, tillväxt och reproduktion) krävs för kemikalien, snarare än att de används för riskbedömning (25). 23. För sebrafisk undersöks på dag 21 av försöket hanar och honor från varje behandlingsnivå (fem hanar och fem honor i vart och ett av de två replikaten) och från kontrollen eller kontrollerna för mätning av vitellogenin. För medaka undersöks på dag 21 av försöket hanar och honor från varje behandlingsnivå (tre hanar och tre honor i var och en av de fyra replikaten) och från kontrollen eller kontrollerna för mätning av vitellogenin och sekundära könskaraktärer. För knölskallelöja undersöks på dag 21 av exponeringen hanar och honor (två hanar och fyra honor i vart och ett av de fyra replikaten) och från kontrollen eller kontrollerna för mätning av vitellogenin och sekundära könskaraktärer. En kvantitativ bedömning av fruktsamheten krävs, och könskörtelvävnaderna bör fixeras hela eller dissekerade för eventuell histopatologisk utvärdering, om så är nödvändigt. Val av testkoncentrationer 24. Vid utförandet av detta prov bör den högsta testkoncentrationen fastställas utifrån den högsta tolererade koncentrationen (MTC), vilken bestäms på grundval av ett preliminärt test eller andra uppgifter om toxicitet, eller 10 mg/l, eller högsta löslighet i vatten, beroende på vilket som är lägst. MTC definieras som den högsta testade koncentrationen av testkemikalien som leder till mindre än 10 % dödlighet. Denna metod förutsätter att det finns empiriska uppgifter om akut toxicitet eller toxikologiska uppgifter utifrån vilka MTC kan uppskattas. Uppskattningar av MTC-koncentrationen kan vara otillförlitliga och kräver vanligen ett visst mått av fackmässigt omdöme. 25. För detta krävs tre testkoncentrationer som skiljer sig åt med en konstant faktor som inte överstiger 10 och en kontroll med utspädningsvatten (och en lösningsmedelskontroll vid behov). Ett intervall för spridningsfaktorer på mellan 3,2 och 10 rekommenderas. FÖRFARANDE Val och vägning av testfiskarna 26. Det är viktigt att minimera fiskarnas variationer i vikt vid början av testet. I tillägg 2 anges lämpliga storleksintervaller för de arter som rekommenderas för användning i detta test. För hela det fiskbestånd som används i testet bör variationen mellan individernas vikt för hanar och honor vid testets början om möjligt hållas inom ± 20 % av den aritmetiska medelvikten för samma kön. Det rekommenderas att ett delprov av fiskbeståndet vägs före testet i syfte att uppskatta medelvikten. Exponeringsförhållanden Löptid 27. Testperiodens längd är 21 dagar efter en förexponeringsperiod. Den rekommenderade förexponeringsperioden är en till två veckor. Utfodring 28. Fiskarna bör utfodras ad libitum med lämpligt foder (tillägg 2) i tillräcklig mängd för att upprätthålla kroppskonditionen. Det är viktigt att se till att det inte uppstår mikrobtillväxt eller att vattnet blir grumligt. Som en allmän vägledning kan sägas att den dagliga fodergivan kan delas upp i två eller tre lika stora delar för flera utfodringstillfällen per dag, med minst tre timmar mellan varje utfodring. En enda större giva kan godtas, särskilt under veckosluten. Fiskarna ska inte ges något foder under de tolv timmar som föregår provtagningen/obduktionen. 29. Fiskfodret bör utvärderas med avseende på förekomst av föroreningar såsom bekämpningsmedel som innehåller organiska klorföreningar, polycykliska aromatiska kolväten (PAH) och polyklorerade bifenyler (PCB). Man bör undvika att ge foder som har en hög nivå av fytoöstrogener som kan äventyra testresponsen för kända östrogenagonister (t.ex. 17b-östradiol). 30. Oätet foder och fekalt material ska avlägsnas från testkärlen minst två gånger i veckan, t.ex. genom omsorgsfull rengöring av akvariets botten med hjälp av en hävert. Ljus och temperatur 31. Fotoperioden och vattentemperaturen bör vara anpassade för den art som testas (se tillägg 2). Frekvens för analytiska bestämningar och mätningar 32. Innan exponeringstiden inleds bör man se till att det kemiska tillsatssystemet fungerar på lämpligt sätt. Alla nödvändiga analysmetoder bör fastställas, och man bör ha tillräckliga kunskaper om den kemiska stabiliteten i testsystemet. Under testets gång bestäms testkemikaliens koncentrationer med jämna mellanrum, enligt följande: flödeshastigheten för stamlösningarna med utspädnings- och testämne bör helst kontrolleras dagligen men minst två gånger per vecka, och bör inte variera med mer än 10 % genom hela testet. Det rekommenderas att de faktiska testkoncentrationerna mäts i samtliga kärl vid testets början och därefter varje vecka. 33. Det rekommenderas att resultaten baseras på de uppmätta koncentrationerna. Om koncentrationen av testkemikalien i lösningen på ett tillfredsställande sätt har hållits inom ± 20 % av den nominella koncentrationen under hela testperioden kan resultaten baseras antingen på nominella eller uppmätta värden. 34. Proverna kan behöva filtreras (t.ex. genom porstorlek 0,45 μm) eller centrifugeras. I sådana fall rekommenderas centrifugering. Om testmaterialet inte adsorberas på filter kan dock även filtrering godtas. 35. Under testet bör halten löst syre, temperaturen och pH-värdet mätas i samtliga kärl minst en gång per vecka. Den totala hårdheten och alkaliniteten bör mätas i kontrollerna och i ett kärl med den högsta koncentrationen minst en gång per vecka. Temperaturen bör helst övervakas kontinuerligt i minst ett testkärl. Observationer 36. Ett antal allmänna (t.ex. överlevnad) och biologiska responser (t.ex. VTG-nivåer) bedöms under testets gång eller vid testets slut. Daglig kvantitativ övervakning av fruktsamheten krävs. Mätningen och utvärderingen av dessa endpoints och deras användbarhet beskrivs nedan. Överlevnad 37. Fiskarna bör undersökas en gång per dag under testperioden. All mortalitet bör registreras, och döda fiskar bör avlägsnas så snart som möjligt. Döda fiskar ska inte ersättas, vare sig i kontrollerna eller behandlingskärlen. Könet på de fiskar som dött under testet bör fastställas genom makroskopisk utvärdering av könskörtlarna. Beteende och utseende 38. Allt onormalt beteende (i jämförelse med kontrollerna) ska registreras. Detta kan omfatta tecken på allmän toxicitet, inklusive hyperventilering, okoordinerat simbeteende, förlust av balansen och atypisk passivitet eller atypiskt ätbeteende. Dessutom bör yttre abnormiteter (t.ex. blödningar eller missfärgning) noteras. Sådana tecken på toxicitet bör övervägas noga vid tolkningen av data eftersom de kan vara tecken på koncentrationer vid vilka biomarkörerna för endokrin aktivitet inte är tillförlitliga. Sådana observationer rörande beteendet kan också tillhandahålla kvalitativ information som påverkar framtida krav för tester på fisk. Till exempel har territoriell aggressivitet observerats hos normala hanar och maskuliniserade honor av knölskallelöja under exponering för androgener, och för sebrafiskar har det typiska parnings- och romläggningsbeteendet efter ljusperiodens början vid gryningen reducerats eller fördröjts på grund av exponering för östrogener eller antiandrogener. 39. Eftersom vissa aspekter av utseendet (huvudsakligen färgen) snabbt kan ändras vid hantering är det viktigt att kvalitativa iakttagelser görs innan djuren avlägsnas från testsystemet. Erfarenheterna hittills med knölskallelöja tyder på att vissa endokrint aktiva kemikalier kan till en början åstadkomma förändringar av följande yttre egenskaper: kroppsfärg (ljus eller mörk), färgmönster (förekomst av vertikala strimmor) och kroppsform (huvudet och det pektorala området). Därför bör observationer av fiskarnas fysiska utseende göras under testets gång och vid studiens slut. Fruktsamhet 40. Dagliga kvantitativa observationer av lek bör registreras per replikat. Äggproduktion bör registreras som antalet ägg/överlevande honor/dag per replikat. Äggen tas bort dagligen från testkärlen. Leksubstrat bör placeras i testkärlet för knölskallelöja och sebrafisk så att fisken kan leka under normala förhållanden. Tillägg 4 innehåller närmare information om rekommenderade leksubstrat för sebrafisk (tillägg 4A) och knölskallelöja (tillägg 4B). Medaka anses inte behöva leksubstrat. Human avlivning av fisk 41. På dag 21, dvs. vid slutet av exponeringen, bör fiskarna avlivas med lämpliga mängder trikain (trikainmetansulfonat, metakain, MS-222 (CAS-nr 886-86-2), 100–500 mg/l buffrat med 300 mg/l NaHCO3 (natriumvätekarbonat, CAS-nr 144-55-8) för att minska irritationen på slemhinnorna. Prov tas sedan på blod eller vävnad för bestämning av VTG, så som förklarades i avsnittet om vitellogenin. Observation av sekundära könskaraktärer 42. Vissa endokrint aktiva kemikalier kan medföra förändringar i särskilda sekundära könskaraktärer (antal parningstuberkler hos knölskallelöjhanar, papillära utväxter hos medakahanar). Framför allt kan kemikalier med vissa verkningsmekanismer ge upphov till en onormal förekomst av sekundära könskaraktärer hos djur av det motsatta könet. Till exempel kan agonister som påverkar androgenreceptorer, såsom trenbolon, metyltestosteron och dihydrotestosteron, göra så att honor av knölskallelöja utvecklar tydliga parningstuberkler och att medakahonor utvecklar papillära utväxter (11, 20, 21). Det har också rapporterats att agonister som påverkar östrogenreceptorer kan minska antalet parningstuberkler och storleken på den dorsala nackvalken hos vuxna hanar av knölskallelöja (26, 27). Sådana makromorfologiska iakttagelser kan tillhandahålla användbar kvalitativ och kvantitativ information som kan påverka eventuella framtida krav för test på fisk. Antalet och storleken på parningstuberklerna hos knölskallelöja och de papillära utväxterna hos medaka kan mätas direkt eller mer praktiskt på konserverade exemplar. Rekommenderade förfaranden för utvärdering av sekundära könskaraktärer hos knölskallelöja och medaka finns i bilaga 5A respektive 5B. Vitellogenin (VTG) 43. Blod samlas in från den kaudala artären/venen med ett hepariniserat mikrohematokrit-centrifugerat kapillärrör, eller alternativt genom hjärtpunktering med en spruta. Beroende på fiskens storlek kan man i allmänhet samla in mellan 5–60 μl blod per individ för knölskallelöja, och 5–15 μl per individ för sebrafisk. Plasman avskiljs från blodet genom centrifugering och lagras med proteashämmare vid –80 °C tills de analyseras med avseende på VTG. Alternativt använder man levern hos medaka, och för sebrafiskar kan huvud/stjärthomogenatet användas som vävnadskälla för bestämning av VTG (tillägg 6). Mätningen av VTG bör baseras på en validerad homolog ELISA-metod med användning av en homolog VTG-standard och homologa antikroppar. Det rekommenderas att man använder en metod som kan påvisa VTG-nivåer som är så låga som ett fåtal ng/ml plasma (eller ng/mg vävnad), vilket är bakgrundsnivån hos oexponerade hanfiskar. 44. Kvalitetskontrollen av VTG-analysen genomförs med hjälp av standarder, blankprov och minst duplikatanalyser. För varje ELISA-metod bör ett test för matriseffekt (effekten av provutspädning) genomföras för att bestämma den minsta utspädningsfaktorn för proven. Varje ELISA-platta som används för VTG-tester bör omfatta följande kvalitetskontrollprov: minst sex kalibreringsstandarder som täcker intervallet för de väntade VTG-koncentrationerna, och minst ett icke-specifikt blankprov för bindningsbestämning (som analyseras i två exemplar). Absorbansen i dessa blankprov bör vara mindre än 5 % av den högsta absorbansen i kalibreringsstandarderna. Minst två alikvoter (brunnsduplikat) av varje provutspädning analyseras. Brunnsduplikat som avviker med mer än 20 % bör analyseras på nytt. 45. Korrelationskoefficienten (R2) för kalibreringskurvor ska vara högre än 0,99. En hög korrelation är dock inte tillräcklig för att garantera en adekvat prediktion av koncentrationerna inom alla intervaller. Förutom att kalibreringskurvan har en tillräckligt hög korrelationsgrad bör koncentrationen för varje standard, som beräknats utifrån kalibreringskurvan, ligga på mellan 70 och 120 % av dess nominella koncentration. Om de nominella koncentrationerna tenderar att avvika från kalibreringens regressionslinje (t.ex. vid lägre koncentrationer) kan det vara nödvändigt att dela upp kalibreringskurvan i låga respektive höga intervaller eller att använda en icke-linjär modell som gör att absorbansdata kan passas in på ett lämpligt sätt. Om kurvan delas upp bör R2 > 0,99 gälla för båda linjesegmenten. 46. Detektionsgränsen (LOD) definieras som koncentrationen i den lägsta analytiska standarden, och gränsen för kvantifiering (LOQ) definieras som koncentrationen i den lägsta analytiska standarden multiplicerad med den lägsta utspädningsfaktorn. 47. Varje dag som VTG-tester utförs ska ett berikningsprov analyseras som beretts med en referensstandard för tester mellan laboratorier (tillägg 7). Förhållandet mellan den förväntade koncentrationen och den uppmätta koncentrationen rapporteras tillsammans med resultaten från varje försöksomgång som utförs på samma dag. Utvärdering av histopatologiska undersökningar av könskörtlar 48. Tillsynsmyndigheterna kan kräva histopatologiska undersökningar av könskörtlarna för att studera målorganet på HPG-axeln efter kemisk exponering. Könskörtlarna fixeras antingen hela eller dissekeras. När en histopatologisk undersökning krävs tittar man på särskilda hormonrelaterade responser i könskörtlarna inom ramen för bedömningen av testkemikaliens endokrina aktivitet. Dessa diagnostiska responser omfattar huvudsakligen förekomsten av oocyter i testiklarna, Leydig-cellhyperplasi, minskad äggulebildning, ökade spermatogonier och perifollikulär hyperplasi. Andra skador på könskörtlarna, t.ex. oocyter i atresi, degenerering av testiklarna och stadieförändringar, kan ha olika orsaker. Vägledningsdokumentet om histopatologiska undersökningar av könskörtlar hos fiskar innehåller förfaranden för dissekering, fixering, uppdelning och histopatologisk utvärdering av könskörtlar (22). DATA OCH RAPPORTERING Utvärdering av biomarkörresponser med variansanalys (ANOVA) 49. För att identifiera en kemikalies potentiella aktivitet jämförs responser mellan behandlings- och kontrollgrupperna med hjälp av variansanalys (ANOVA). Om en lösningsmedelskontroll används bör ett lämpligt statistiskt test utföras mellan utspädningsvatten- och lösningsmedelskontrollerna för varje endpoint. Vägledning om hur man ska hantera data rörande utspädningsvatten- och lösningsmedelskontrollerna i den efterföljande statistiska analysen finns i OECD, 2006c (28). Alla biologiska responsdata bör analyseras och rapporteras separat per kön. Om de antaganden som krävs för parametriska metoder inte uppfylls – onormal fördelning (t.ex. Shapiro-Wilks test) eller heterogen varians (Bartletts test eller Levenes test) – bör man överväga att homogenisera varianserna genom transformering av data före ANOVA utförs. Alternativt kan en viktad ANOVA övervägas. Dunnetts test (parametriserade) på en eller flera parvisa jämförelser eller Mann-Whitneys test med parametrisk justering (Bonferroni) kan användas för icke-monotona dos-responser. Andra statistiska tester kan användas (t.ex. Jonckheere-Terpstras test eller Williams test) om dos-responsen är ungefärligen monoton. Det statistiska flödesschemat i bilaga 8 kan vara till hjälp när man beslutar vilket statistiskt test som är det mest ändamålsenliga att använda. Ytterligare information kan också erhållas från OECD:s dokument Current Approaches to Statistical Analysis of Ecotoxicity Data (28). Rapportering av testresultat 50. Studiedata bör inbegripa följande: Testanläggning: — ansvarig personal och deras studieansvar, — varje laboratorium ska ha demonstrerat sina kunskaper i användningen av ett antal representativa kemikalier. Testkemikalie: — karakterisering av testkemikalien, — fysikalisk form och relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper, — metod för beredning av testkoncentrationerna och hur ofta detta sker, — information om stabilitet och biologisk nedbrytbarhet. Lösningsmedel: — karakterisering av lösningsmedlet (beskaffenhet, använd koncentration), — motivering av valet av lösningsmedel (om annat än vatten). Försöksdjur: — art och stam, — leverantör och specifik leverantörsanläggning, — fiskens ålder vid testets början och dess reproduktiva status samt lekstatus, — uppgifter om förfarandet för acklimatisering av djuren, — fiskens kroppsvikt vid början av exponeringen (från ett delprov av fiskbeståndet). Testbetingelser: — testförfarande som har använts (typ av test, fisktäthet, antalstäthet, osv.), — metod för beredning av stamlösningar och flödeshastighet, — nominella testkoncentrationer, uppmätta koncentrationer av testlösningarna varje vecka och den använda analysmetoden, medelvärden av de uppmätta värdena och standardavvikelserna i testkärlen samt bevis för att mätningarna hänför sig till testkemikaliens koncentrationer i en äkta lösning, — utspädningsvattnets egenskaper (t.ex. pH, hårdhet, alkalinitet, temperatur, halten löst syre, restklornivåer, halten organiskt kol, uppslammade partiklar och eventuella andra gjorda mätningar), — vattenkvaliteten i testkärlen: pH, hårdhet, temperatur och halten löst syre, — detaljerade uppgifter om utfodringen (t.ex. typ av foder, källa, hur mycket fiskarna har fått och hur ofta samt, om möjligt, en analys av relevanta förorenande ämnen (t.ex. PCB, polycykliska aromatiska kolväten och bekämpningsmedel som innehåller organiska klorföreningar). Resultat — bevis för att kontrollerna uppfyller testets godkännandekriterier, — uppgifter om dödlighet i alla koncentrationer och i kontrollen, — de statistiska analystekniker som har använts, behandlingen av data och motivering av de tekniker som har använts, — uppgifter om biologiska observationer av makromorfologi, inklusive sekundära könskaraktärer, äggproduktion och VTG, — resultaten av dataanalyserna, helst i tabellform och grafisk form, — förekomsten av eventuella ovanliga reaktioner hos fiskarna och eventuella synliga effekter som har orsakats av testkemikalien. RIKTLINJER FÖR TOLKNING OCH GODKÄNNANDE AV TESTRESULTATEN 51. Detta avsnitt innehåller några överväganden som ska beaktas vid tolkningen av testresultaten för de olika endpoints som uppmätts. Resultaten bör tolkas med försiktighet när testkemikalien förefaller orsaka uppenbar toxicitet eller inverka på försöksdjurens allmäntillstånd. 52. När man fastställer intervallet för testkoncentrationerna bör man vara noga med att inte överskrida den högsta tolererade koncentrationen för att möjliggöra en meningsfull tolkning av data. Det är viktigt att ha minst en behandling där det inte finns några tecken på toxiska effekter. Tecken på sjukdom och tecken på toxiska effekter bör utvärderas noggrant och rapporteras. Det är till exempel möjligt att produktionen av VTG hos honor även kan påverkas av den allmänna toxiciteten och av icke-endokrina toxiska verkningsmekanismer, t.ex. hepatotoxicitet. Tolkningen av effekterna kan dock stärkas av andra behandlingsnivåer på vilka effekterna inte kompliceras av systemisk toxicitet. 53. Det finns en del aspekter som ska beaktas vid godkännandet av testresultaten. Som vägledning bör VTG-nivåerna i kontrollgrupperna med hanar och honor vara klart avgränsade och åtskilda med omkring tre storleksordningar för knölskallelöja och sebrafisk, och med ungefär en storleksordning för medaka. Exempel på intervallerna för de värden som påträffats i kontroll- och behandlingsgrupperna finns i valideringsrapporterna (1, 2, 3, 4). Höga VTG-värden hos hanar i kontrollen skulle kunna äventyra testresponsen och testets förmåga att påvisa svaga östrogenagonister. Låga VTG-värden hos honor i kontrollen skulle kunna äventyra testresponsen och testets förmåga att påvisa aromatashämmare och östrogenantagonister. Valideringsstudierna användes för att utarbeta dessa riktlinjer. 54. När det gäller kvantifieringen av äggproduktionen kan den uppvisa stora variationer [variationskoefficienten (CV) kan sträcka sig från 20 % till 60 %]. Detta påverkar möjligheterna att genom analysen detektera en signifikant minskning i äggproduktionen som är mindre än 70 %, allteftersom CV närmar 50 % eller mer. När CV begränsas till lägre värden (cirka 20–30 %) ger analysen en godtagbar effekt (80 %) för att detektera en minskning på 40–50 % i äggproduktionen. Den testmetod som används för knölskallelöja, inklusive fyra replikat per behandlingsnivå, bör ge större styrka för endpointen fruktsamhet, jämfört med en testmetod med endast två replikat. 55. Om ett laboratorium inte har utfört testet tidigare eller väsentliga förändringar (t.ex. förändringar av fiskstammen eller leverantören) har gjorts är det lämpligt att en teknisk kompetensstudie utförs. Det rekommenderas att man använder kemikalier som omfattar en rad olika verkningsmekanismer eller som påverkar ett antal olika endpoints. I praktiken uppmuntras varje laboratorium att samla in egna historiska kontrolldata för hanar och honor och att utföra ett test med en positiv kontrollkemikalie för östrogenaktivitet (t.ex. 17-beta-estradiol vid 100 ng/l, eller en känd svag agonist) som leder till ökade VTG-nivåer i hanfiskar, en positiv kontrollkemikalie för aromatashämmande effekter (t.ex. fadrozol eller prokloraz vid 300 μg/l) som leder till minskade VTG-nivåer hos honfiskar, och en positiv kontrollkemikalie för androgen aktivitet (t.ex. 17-beta-trenbolon vid 5 μg/l), som leder till induktion av sekundära könskaraktärer hos honor av knölskallelöja och medaka. Alla dessa data kan jämföras med tillgängliga data från valideringsstudierna (1, 2, 3) för att säkerställa laboratoriekompetensen. 56. I allmänhet bör VTG-mätningar anses vara positiva om det finns en statistiskt signifikant ökning av VTG hos hanar (p < 0,05), eller en statistiskt signifikant minskning hos honor (p < 0,05), åtminstone vid den högsta testdosen jämfört med kontrollgruppen och i avsaknad av tecken på allmän toxicitet. Ett positivt resultat bekräftas ytterligare om man kan påvisa ett biologiskt sannolikt samband mellan dosen och responskurvan. Som nämndes tidigare behöver inte minskningen av VTG uteslutande bero på endokrina orsaker. I allmänhet bör ett positivt resultat dock tolkas som bevis för endokrin aktivitet in vivo, och normalt bör man då vidta åtgärder för ytterligare klargöranden. 57. Tillsynsmyndigheterna kan kräva utvärdering av histopatologiska undersökningar av könskörtlarna för att fastställa försöksdjurens reproduktiva lämplighet och möjliggöra en sammanvägd bedömning av testresultaten. Histopatologisk undersökning av könskörtlarna kanske inte är nödvändig i fall där antingen VTG eller de sekundära könskaraktärerna är positiva (dvs. en ökning eller minskning av VTG eller induktion av sekundära könskaraktärer). LITTERATUR (1) OECD (2006a). Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine active Substances (Phase 1A). OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment nr 60, Paris. (2) OECD (2006b). Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine active Substances (Phase 1B). OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment nr 61, Paris. (3) OECD (2007). Final report of the Validation of the 21-day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine Active Substances. Phase 2: Testing Negative Substances. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment nr 78, Paris. (4) Owens, J. W. (2007). Phase 3 report of the validation of the OECD Fish Screening Assay. CEFIC LRI Project, Endocrine. http://www.cefic-lri.org/index.php?page=projects (hämtad 18 september 2008). (5) U.S. EPA (2007). Validation of the Fish Short-Term Reproduction Assay: Integrated Summary Report. 15 december 2007. US Environmental Protection Agency, Washington, DC. s. 104. (6) OECD (2008). Report of the Validation Peer Review for the 21-Day Fish Endocrine Screening Assay and Agreement of the Working Group of the National Coordinators of the Test Guidelines Programme on the Follow-up of this Report. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment nr 94, Paris. (7) Sumpter JP och S. Jobling (1995). Vitellogenesis as a biomarker for estrogenic contamination of the aquatic environment. Environmental Health Perspectives, 103 Suppl 7:173–178 Review. (8) Pawlowski S., m.fl. (2004). Androgenic and estrogenic effects of the synthetic androgen 17alpha-methyltestosterone on sexual development and reproductive performance in the fathead minnow (Pimephales promelas) determined using the gonadal recrudescence assay. Aquatic Toxicology, 68:3, 277–291. (9) Andersen L., m.fl. (2006). Short-term exposure to low concentrations of the synthetic androgen methyltestosterone affects vitellogenin and steroid levels in adult male zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology, 76:3–4, 343–352. (10) Ankley GT, m.fl. (2002). Evaluation of the aromatase inhibitor fadrozole in a short-term reproduction assay with the fathead minnow (Pimephales promelas). Toxicological Sciences, 67(1):121–130. (11) Panter G.H., m.fl. (2004). Successful detection of (anti-)androgenic and aromatase inhibitors in pre-spawn