Kommissionens förordning (EG) nr 2091/2002

av den 26 november 2002

om ändring av förordning (EG) nr 2870/2000 om fastställande av gemenskapens referensmetoder för analys av spritdrycker

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DENNA FÖRORDNING

med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen,

med beaktande av rådets förordning (EEG) nr 1576/89 av den 29 maj 1989 om allmänna bestämmelser för definition, beskrivning och presentation av spritdrycker(1), ändrad genom Anslutningsakten för Österrike, Finland och Sverige, särskilt artikel 4.8 i denna, och

av följande skäl:

(1) De referensmetoder som fastställs i kommissionens förordning (EG) nr 2870/2000 av den 19 december 2000 om fastställande av gemenskapens referensmetoder för analys av spritdrycker(2) beskrivs i bilagan till den förordningen.

(2) Inom ett forskningsprogram med stöd från kommissionen har fyra analysmetoder för att bestämma anetol i spritdrycker smaksatta med anis, glycyrrhizinsyra och chalkoner i pastis samt äggula i ägglikör och likör baserad på ägg validerats enligt internationellt vedertagna kriterier.

(3) Dessa fyra metoder kan godkännas som gemenskapens referensmetoder och bör läggas till i bilagan till förordning (EG) nr 2870/2000.

(4) De åtgärder som föreskrivs i denna förordning är förenliga med yttrandet från kommittén för genomförande av regler om spritdrycker.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Bilagan till förordning (EG) nr 2870/2000 skall ändras på följande sätt:

1. I bilagan skall "(p.m.)" strykas i punkterna V, VI, VII och IX.

2. Kapitlen V, VI, VII och IX i bilagan till den här förordningen skall läggas till efter kapitel III.

Artikel 2

Denna förordning träder i kraft den sjunde dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska gemenskapernas officiella tidning.

Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla medlemsstater.

Utfärdad i Bryssel den 26 november 2002.

På kommissionens vägnar

Franz Fischler

Ledamot av kommissionen

(1) EGT L 160, 12.6.1989, s. 1.

(2) EGT L 333, 29.12.2000, s. 20.

BILAGA

V. ANETOL. GASKROMATOGRAFISK BESTÄMNING AV TRANS-ANETOL I SPRITDRYCKER

1. Tillämpningsområde

Metoden används för att med hjälp av kapillär gaskromatografi bestämma koncentrationen av trans-anetol i spritdrycker smaksatta med anis.

2. Referenser

ISO 3696:1987 Vatten för analys - Krav och provningsmetoder

3. Princip

Koncentrationen av trans-anetol i spritdrycken bestäms med gaskromatografi (GC). Samma kvantitet av en inre standard, t.ex. 4-allylanisol (estragol) när ingen estragol finns naturligt i provet, sätts till provet och till en referenslösning med känd koncentration av trans-anetol. Båda späds sedan med en 45-procentig etanollösning och sprutas direkt in i GC-systemet. För likörer som innehåller höga halter av socker krävs extration innan provet förbereds och analyseras.

4. Reagens och material

Vid analysen skall endast reagens med en renhetsgrad på minst 98 % användas. Vatten med en renhetsgrad av minst 3 enligt ISO 3696 skall användas.

Referenskemikalierna bör lagras kallt (cirka 4 °C), skyddade från ljus, i aluminiumbehållare eller i färgade (bruna) reagensflaskor av glas. Propparna bör helst förseglas med aluminium. Trans-anetolen måste "tinas" från kristallform före användning, men temperaturen får då aldrig överskrida 35 °C.

4.1. Etanol, 96 % (vol.) (CAS 64-17-5)

4.2. 1-metoxi-4-(1-propenyl)-bensen (trans-anetol) (CAS 4180-23-8)

4.3. 4-allylanisol (estragol) (CAS 140-67-0), föreslagen inre standard (IS)

4.4. Etanol, 45 % (vol.)

Tillsätt 560 g destillerat vatten till 378 g 96-procentig etanol (vol.).

4.5. Beredning av standardlösningar

Alla standardlösningar bör förvaras i rumstemperatur (15-35 °C), skyddade från ljus, i aluminiumbehållare eller i färgade (bruna) reagensflaskor av glas. Proppen bör helst förseglas med aluminium.

Trans-anetol och 4-allylanisol är praktiskt taget olösliga i vatten och måste därför lösas upp i lite 96-procentig etanol (4.1) innan 45-procentig etanol (4.4) tillsätts.

Nya stamlösningar måste beredas varje vecka.

4.5.1. Standardlösning A

Stamlösning av trans-anetol (koncentration: 2 g/l)

Väg upp 40 mg trans-anetol (4.2) i en 20 ml mätkolv (eller 400 mg i en 200 ml mätkolv etc.). Tillsätt 96-procentig etanol (4.1) och späd till märket med 45-procentig etanol (4.4). Blanda omsorgsfullt.

4.5.2. Standardlösning B, inre standard

Stamlösning av inre standard, t.ex. estragol (koncentration: 2 g/l)

Väg upp 40 mg estragol (4.3) i en 20 ml mätkolv (400 mg i en 200 ml mätkolv etc.). Tillsätt 96-procentig etanol (4.1) och späd till märket med 45-procentig etanol (4.4). Blanda omsorgsfullt.

4.5.3. Lösningar för att kontrollera att flamjonisationsdetektorns respons är linjär

En kontroll av att flamjonisationsdetektorns respons är linjär måste göras för analysen med beaktande av olika koncentrationer av trans-anetol i sprit, mellan 0 g/l upp till 2,5 g/l. Vid analysförfarandet skall de okända proven som skall analyseras spädas tio gånger (8.3). För villkoren för den analys som anges i metoden skall standardlösningar, som motsvarar koncentrationer på 0; 0,05; 0,1; 1,15; 0,2 respektive 0,25 g/l av trans-anetol i det prov som skall analyseras, förberedas på följande sätt: Mät upp 0,5; 1; 1,5; 2 och 2,5 ml av standardlösning A (4.5.1) och för över till i mätkolvar som rymmer 20 ml. Pipettera upp 2 ml inre standardlösning B (4.5.2) i varje mätkolv och späd till märket med 45-procentig etanol (4.4). Blanda omsorgsfullt.

Blanklösningarna (8.4) skall användas på samma sätt som 0 g/l-lösningen.

4.5.4. Standardlösning C

Pipettera upp 2 ml av standardlösning A (4.5.1) i en 20 ml mätkolv, tillsätt sedan 2 ml inre standardlösning B (4.5.2) och späd till märket med 45-procentig etanol (4.4). Blanda omsorgsfullt.

5. Utrustning

5.1. En kapillär gaskromatograf med flamjonisationsdetektor (FID) och integrator eller annat databehandlingssystem för mätning av topphöjder och toppareor och med automatisk provväxlare eller den utrustning som krävs för manuell injektion.

5.2. Injektor av typen splitless/split

5.3. Kapillärkolonn, till exempel:

Längd: 50 m

Inre diameter: 0,32 mm

Filmtjocklek: 0,2 μm

Stationär fas: FFAP - modifierad TPA-polyetylenglykol, en tvärbunden porös polymer

5.4. Vanlig laboratorieutrustning: mätkolvar av klass A, analysvåg (noggrannhet: ± 0,1 mg).

6. Betingelser för gaskromatografi

Kolonntypen, kolonnens dimensioner och GC-betingelserna bör vara sådana att anetol och inre standard separeras från varandra och från eventuella interfererande ämnen. Typiska data för exempelkolonnen i 5.3 är:

6.1. Bärgas: analytiskt ren helium

6.2. Flödeshastighet: 2 ml/min

6.3. Injektortemperatur: 250 °C

6.4. Detektortemperatur: 250 °C

6.5. Data för ugnstemperatur: isotermisk, 180 °C, körtid 10 minuter

6.6. Injektionsvolym: 1 μl, split 1:40

7. Prov

Proven skall förvaras i rumstemperatur, skyddade mot ljus och kyla.

8. Utförande

8.1. Kontroll av estragol i proven

För att kontrollera att ingen estragol finns naturligt i provet skall ett blankprov analyseras utan tillsats av inre standard. Om estragol finns naturligt i provet måste en annan inre standard väljas (t.ex. mentol).

Pipettera upp 2 ml prov i en 20 ml mätkolv och späd till märket med 45-procentig etanol (4.4). Blanda omsorgsfullt.

8.2. Beredning av okända prov

Pipettera upp 2 ml prov i en 20 ml mätkolv, tillsätt 2 ml inre standardlösning B (4.5.2) och späd till märket med 45-procentig etanol (4.4). Blanda omsorgsfullt.

8.3. Blankprov

Pipettera upp 2 ml inre standardlösning B (4.5.2) i en 20 ml mätkolv och späd till märket med 45-procentig etanol (4.4). Blanda omsorgsfullt.

8.4. Test av linjär respons

Innan analysen påbörjas skall man kontrollera att flamjonisationsdetektorns respons är linjär genom att tre identiska prov av var och en av standardlösningarna (4.5.3) analyseras.

Använd integratorns topphöjder eller toppareor för att konstruera en kurva med stamlösningens koncentration i g/l mot kvoten R för varje prov.

R= topphöjden eller topparean för trans-anetol dividerat med topphöjden respektive topparean för estragol.

En rät linje skall erhållas.

8.5. Bestämning

Injicera först blanklösningen (8.4), sedan standardlösning C (4.5.4) och därefter en av standardlösningarna för linearitetstest (4.5.3), som kommer att fungera som en kvalitetskontroll (standardlösningen kan väljas efter den troliga koncentrationen av trans-anetol i det okända provet). Injicera slutligen fem okända prov (8.3). Injicera ett linearitetsprov (kvalitetskontroll) efter vart femte okänt prov för att kontrollera att analyskvaliteten är jämn.

9. Beräkning av responsfaktor

Mät antingen topparea (med en integrator eller andra datasystem) eller topphöjd (manuell integration) för trans-anetol och inre standard.

9.1. Beräkning av responsfaktor (RFi)

Responsfaktorn beräknas på följande sätt:

RFi = (Ci/area eller höjdi)*(area eller höjd is/Cis)

där

Ci är koncentrationen av trans-anetol i standardlösning A (4.5.1)

Cis är koncentrationen av inre standard i standardlösning B (4.5.2)

area i är topparean (eller topphöjden) för trans-anetol

areais är topparean (eller topphöjden) för den inre standarden

RFi beräknas från fem prov av lösning C (4.5.4)

9.2. Analys av lösningarna för linearitetstest

Injicera testlösningarna för linearitet (4.5.3).

9.3. Analys av provet

Injicera det okända provet (8.2)

10. Resultatberäkning

Använd följande formel för att beräkna koncentrationen av trans-anetol:

ci = Cis * (area eller höjdi/area eller höjdis)*RFi

där

ci är koncentrationen av trans-anetol i det okända provet

Cis är koncentrationen av inre standard i det okända provet (4.5.2)

Area eller höjdi är topparean eller topphöjden för trans-anetol

Area eller höjdis är topparean eller topphöjden för den inre standarden

RFi är responskoefficienten (beräknad enligt 9.1)

Koncentrationen av trans-anetol uttrycks i gram per liter, med en decimals noggrannhet.

11. Kvalitetssäkring och kvalitetskontroll

I kromatogrammen skall anetol och inre standard vara åtskilda från varandra och från eventuella interfererande ämnen. RFi-värdet beräknas från resultatet av fem injektioner av lösning C (4.5.4). Om variationskoefficienten (CV % = (standardavvikelse/medelvärde) * 100)) ligger inom ± 1 % är genomsnittsvärdet för RFi godtagbart.

Beräkningen ovan skall användas för att få fram koncentrationen av trans-anetol i det prov av linearitetslösningarna (4.5.3) som valts ut för kvalitetskontroll.

Om de genomsnittliga beräknade resultaten från analysen av den linearitetslösning som valts ut som prov för intern kvalitetskontroll (IQC) ligger inom ± 2,5 % av de teoretiska värdena kan resultaten för de okända proven godtas.

12. Behandling för GC-analys av prov av sprit med högt sockerinnehåll och av prov av likörer

Extraktion av alkohol från en sockerrik spritdryck för att det skall gå att bestämma koncentrationen av trans-anetol med kapillär gaskromatografi.

12.1. Princip

En alikvot tas ut av provet från likören och till denna tillsätts inre standard i en koncentration motsvarande analytkoncentrationen (koncentrationen av trans-anetol) i likören. Till detta tillsätts natriumfosfat-12-hydrat och vattenfritt ammoniumsulfat. Denna blandning skakas väl och kyls, varvid två skikt bildas. Det övre skiktet, som består av alkohol, avlägsnas. En alikvot av detta alkoholskikt tas ut och späds med 45-procentig etanol (4.4) (Anm: ingen inre standard tillsätts i detta skede, eftersom sådan redan har tillsatts). Den lösning som erhålls analyseras med gaskromatografi.

12.2. Reagens och material

Vid extraktionen skall man endast använda reagens med en renhetsgrad på över 99 %.

12.2.1. Vattenfritt ammoniumsulfat (CAS 7783-20-2)

12.2.2. Dibasisk natriumfosfat-12-hydrat (CAS 10039-32-4)

12.3. Utrustning

E-kolvar, separerkolvar, kylningsutrustning.

12.4. Utförande

12.4.1. Kontroll av estragol i proven

För att kontrollera att ingen estragol finns naturligt i provet skall extraktion (12.6.2) av ett blankprov göras utan tillsats av inre standard. Om estragol finns naturligt i provet måste en annan inre standard väljas.

12.4.2. Extraktion

Pipettera upp 5 ml 96-procentig etanol (4.1) i en E-kolv, väg upp 50 mg inre standard (4.3) i E-kolven och tillsätt 50 ml prov. Tillsätt 12 g vattenfritt ammoniumsulfat (12.2.1) och 8,6 g dibasisk natriumfosfat-12-hydrat (12.2.2). Sätt propp i E-kolven.

Skaka E-kolven i minst 30 minuter. En mekanisk skak får användas, men inte en magnetomrörare med teflonhölje, eftersom teflonet absorberar en del av analyten. Observera att de tillsatta salterna inte löses upp helt.

Låt den tillslutna E-kolven stå i kylskåp (T < 5 °C) i minst två timmar.

Efter två timmar skall det finnas två distinkta skikt och en fast fällning. Alkoholskiktet skall ha klarnat. Om så inte är fallet, ställ tillbaka E-kolven i kylskåpet tills all grumling är borta och skikten är helt åtskilda.

När alkoholskiktet har klarnat tar man försiktigt ut en alikvot (t.ex. 10 ml) utan att röra vattenskiktet, häller upp den i ett mörkfärgat kärl och tillsluter detta ordentligt.

12.4.3. Beredning av det extraherade provet för analys

Låt extraktet (12.4.2) anta rumstemperatur.

Ta ut 2 ml av alkoholskiktet i det tempererade provet och pipettera upp det i en 20 ml mätkolv. Späd till märket med 45-procentig etanol (4.4) och blanda omsorgsfullt.

12.5. Bestämning

Följ anvisningarna i 8.5.

12.6. Resultatberäkning

Använd följande formel för att beräkna resultaten:

Ci = (mis/V) * (areai/areais) * RFi

där

mis är den inre standardens (4.3) vikt (12.4.2) (i mg)

V är det okända provets volym (50 ml)

RFi är responsfaktorn (9.1)

areai är topparean för trans-anetol

areais toppenarean för den inre standarden

Resultaten uttrycks i g/l, med en decimals noggrannhet.

12.7. Kvalitetskontroll och kvalitetssäkring

Följ anvisningarna i punkt 11.

13. Metodutvärdering (noggrannhet)

Statistiska resultat från provningsjämförelsen:

Värdena för anetol anges i tabellerna nedan.

Följande data erhölls från en internationell metodstudie som utfördes enligt internationellt vedertagna förfaranden.

>Plats för tabell>

>Plats för tabell>

Provtyper:

A Pastis, dubbelblindprov

B Pastis, dubbelblindprov

C Pastis, dubbelblindprov

D Pastis, dubbelblindprov

E Pastis, ett prov

F Pastis, ett prov

>Plats för tabell>

Provtyper:

G Ouzo, "split levels" (*)

H Anis, dubbelblindprov

I Likör smaksatt med anis, dubbelprov

J Likör smaksatt med anis, dubbelprov

VI. GLYCYRRHIZINSYRA. BESTÄMNING AV GLYCYRRHIZINSYRA MED HPLC

1. Tillämpningsområde

Metoden används för att med hjälp av HPLC bestämma koncentrationen av glycyrrhizinsyra i spritdrycker smaksatta med anis. Enligt förordning (EEG) nr 1576/89 skall alla spritdrycker smaksatta med anis som går under benämningen "pastis" innehålla mellan 0,05 och 0,5 g glycyrrhizinsyra per liter.

2. Referenser

ISO 3696:1987 Vatten för analys - Krav och provningsmetoder

3. Princip

Koncentrationen av glycyrrhizinsyra bestäms med HPLC med UV-detektion. En standardlösning och provet filtreras och injiceras separat direkt i HPLC-systemet.

4. Reagens och material

Vid analysen skall endast reagens av HPLC-kvalitet, absolut etanol och vatten av klass 3 enligt ISO 3696 användas.

4.1. 96-procentig etanol (vol.) (CAS 64-17-5)

4.2. Ammoniumglycyrrhizinat, C42H62O16.NH3 (ammoniumsaltet av glycyrrhizinsyra)

(Molekylvikt 839,98) (CAS 53956-04-0): renhet minst 90 %

(Molekylvikt för glycyrrhizinsyra 822,94)

4.3. Isättika, CH3COOH, (CAS 64-19-7)

4.4. Metanol, CH3OH, (CAS 67-56-1)

4.5. 50-procentig etanol (vol.)

För 1000 ml vid 20°C:

- 96-procentig etanol (4.1): 521 ml

- Vatten (2.0): 511 ml

4.6. Beredning av elueringslösningar för HPLC

4.6.1. Elueringslösning A (exempel):

80 delar (volym) vatten (2.0)

20 delar (volym) ättiksyra (4.3)

Avlufta elueringslösningen i fem minuter.

Anm.

Om det vatten som används inte har mikrofiltrerats bör den färdigberedda elueringslösningen filtreras genom ett filter för organiska lösningsmedel med en porstorlek på högst 0,45 μm.

4.6.2. Elueringslösning B

Metanol (4.4)

4.7. Beredning av standardlösningar

Alla standardlösningar måste beredas på nytt efter två månader.

4.7.1. Referenslösning C

Väg upp 25 mg ammoniumglycyrrhizinat (4.2) till närmaste 0,1 mg i en 100 ml mätkolv. Tillsätt lite 50-procentig etanol (4.5) och lös upp ammoniumglycyrrhizinatet. När saltet har lösts, späd till märket med 50-procentig etanol (4.5).

Filtrera genom ett filter för organiska lösningsmedel.

4.7.2. Standardlösningar (används för att kontrollera att analysutrustningen ger en linjär respons)

Bered en 1,0 g/l stamlösning genom att väga upp 100 mg ammoniumglycyrrhizinat till närmaste 0,1 mg i en 100 ml mätkolv. Tillsätt lite 50-procentig etanol (4.5) och lös upp ammoniumglycyrrhizinatet. När saltet har lösts, späd till märket med 50-procentig etanol (4.5).

Förbered minst fyra andra lösningar som motsvarar koncentrationer på 0,05; 0,1; 0,25 och 0,5 g/l ammoniumglycyrrhizinatet genom att pipettera upp 5 ml, 10 ml, 25 ml respektive 50 ml av 1,0 g/l-lösningen i separata 100 ml mätkolvar. Späd sedan till märket med 50-procentig etanol (4.5) och blanda omsorgsfullt.

Filtrera samtliga lösningar genom ett filter för organiska lösningsmedel.

5. Utrustning

5.1. Separationssystem

5.1.1. HPLC-system

5.1.2. Pumpsystem som ger ett konstant eller programmerat flöde med stor noggrannhet

5.1.3. Detektionssystem som bygger på UV-spektrofotometri: skall ställas in på 254 nm

5.1.4. Avluftningssystem för lösningsmedel

5.2. Integrator eller skrivare som är kompatibel med resten av systemet

5.3. Kolonn (exempel):

Material: rostfritt stål eller glas

Inre diameter: 4-5 mm

Längd: 100-250 mm

Stationär fas: tvärbunden silica med en (helst sfärisk) oktadekan (C18) som funktionell grupp, maximal partikelstorlek: 5 μm.

5.4. Laboratorieutrustning

5.4.1. Analysvåg med en noggrannhet på 0,1 mg

5.4.2. Mätkolvar av glas av A-klass

5.4.3. System för mikromembranfiltrering för små volymer

6. Betingelser för kromatografi

6.1. Elueringsdata (exempel):

- Flödeshastighet 1 ml/minut

- Lösningsmedel A = 30 %

- Lösningsmedel B = 70 %

6.2. Detektion:

- UV = 254 nm

7. Utförande

7.1. Beredning av prov

Filtrera vid behov genom ett filter för organiska lösningsmedel (pordiameter: 0,45 μm).

7.2. Bestämning

När kromatografibetingelserna är stabila:

- Injicera 20 μl av referenslösning C (4.7.1).

- Injicera 20 μl av provlösningen.

- Jämför de två kromatogrammen. Identifiera glycyrrhizinsyratopparna med hjälp av deras retentionstider. Mät deras area (eller höjd) och beräkna koncentrationen i g/l med två decimalers noggrannhet med följande formel:

>Hänvisning till >

där

c är koncentrationen glycyrrhizinsyra i gram per liter i den spritdryck som analyseras,

C är koncentration ammoniumglycyrrhizinat i gram per liter i referenslösningen,

h är glycyrrhizinsyratoppens area (eller höjd) för den spritdryck som analyseras,

H är glycyrrhizinsyratoppens area (eller höjd) för referenslösningen,

P är renhetsgraden hos det ammoniumglycyrrhizinat som används som referens (i %),

823 är massan av en mol glycyrrhizinsyra,

840 är massan av en mol ammoniumglycyrrhizinat.

8. Metodutvärdering (noggrannhet)

Statistiska resultat från provningsjämförelsen:

Värdena för glycyrrhizinsyra anges i tabellen nedan.

Följande data erhölls från en internationell metodstudie som utfördes enligt internationellt vedertagna förfaranden.

>Plats för tabell>

>Plats för tabell>

Provtyper:

A Pastis, dubbelblindprov

B Pastis, "split levels" (*)

C Pastis, dubbelblindprov

D Pastis, dubbelblindprov

E Pastis, dubbelblindprov

VII. CHALKONER. HPLC-METOD FÖR KONTROLL AV NÄRVARON AV CHALKONER I PASTIS

1. Tillämpningsområde

Metoden används för att bestämma om drycker smaksatta med anis innehåller chalkoner. Chalkoner är naturliga flavonoidfärgämnen som finns i lakritsrot (Glycyrrhiza glabra).

För att en spritdryck smaksatt med anis skall få kallas "pastis" måste den innehålla chalkoner (förordning (EEG) nr 1576/89).

2. Referenser

ISO 3696:1987 Vatten för analys - Krav och provningsmetoder

3. Princip

En referenslösning av extrakt av lakritsrot bereds. Närvaron eller frånvaron av chalkoner bestäms med HPLC med UV-detektion.

4. Reagens och material

Vid analysen skall endast reagens av HPLC-kvalitet användas. Etanolen skall vara 96-procentig (vol.). Endast vatten av klass 3 enligt ISO 3696 skall användas.

4.1. Etanol, 96 % (vol.) (CAS 64-17-5)

4.2. Acetonitril, CH3CN, (CAS 75-05-8)

4.3. Referensämne: Glycyrrhiza glabra: (lakritsrot)

Grovmalen lakritsrot (Glycyrrhiza glabra). Genomsnittlig storlek på de stavformade partiklarna: längd: 10-15 mm; tjocklek: 1-3 mm.

4.4. Natriumacetat, CH3COONa, (CAS 127-09-3)

4.5. Isättika, CH3COOH, (CAS 64-19-7)

4.6. Beredning av lösningar

4.6.1. Etanol, 50 % (vol.)

För att bereda 1000 ml vid 20 °C:

- 96-procentig (vol.) etanol (4.1): 521 ml

- Vatten (2.0): 511 ml

4.6.2. Lösningsmedel A: acetonitril

Acetonitril (4.2) av HPLC-kvalitet

Avlufta

4.6.3. Lösningsmedel B: 0,1 M natriumacetatbuffert, pH 4,66

Väg upp 8,203 g natriumacetat (4.4), tillsätt 6,005 g isättika (4.5) och späd till 1000 ml med vatten (2) i en mätkolv.

5. Beredning av referensextrakt av Glycyrrhiza glabra (4.3)

5.1. Väg upp 10 g mald lakritsrot (Glycyrrhiza glabra) (4.3) och för över till en destilleringsrundkolv.

- Tillsätt 100 ml 50-procentig etanol (4.6.1).

- Återloppskoka i en timme.

- Filtrera.

- Spara filtratet.

5.2. Ta vara på lakritsrotextraktet från filtret.

- Placera det i en destilleringsrundkolv.

- Tillsätt 100 ml 50-procentig etanol (4.6.1).

- Återloppskoka i en timme.

- Filtrera. Spara filtratet.

5.3. Extraktionen av lakritsrot skall göras tre gånger i följd.

5.4. Slå samman de tre filtraten.

5.5. Låt lösningsmedelsfasen (från 5.4) avdunsta i en rotationsindunstare.

5.6. Lös resterande extrakt (från 5.5) i 100 ml 50-procentig etanol (4.6.1).

6. Utrustning

6.1. Separationssystem

6.1.1. HPLC-system

6.1.2. Pumpsystem som ger ett konstant eller programmerat flöde med stor noggrannhet

6.1.3. Spektrofotometriskt detektionssystem med UV/synligt ljus som kan ställas in på 254 och 370 nm

6.1.4. Avluftningssystem för lösningsmedel

6.1.5. Kolonnugn som kan ställas in på 40 ± 0,1 °C.

6.2. Integrator eller skrivare som är kompatibel med resten av systemet.

6.3. Kolonn

Material: rostfritt stål eller glas

Inre diameter: 4-5 mm

Stationär fas: tvärbunden silica med en oktadekan (C18) som funktionell grupp, maximal partikelstorlek: 5 μm (tvärbunden fas).

6.4. Vanlig laboratorieutrustning, bland annat:

6.4.1. Analysvåg (noggrannhet: ± 0,1 mg)

6.4.2. Destillationsapparat med återloppskondensator, som består av exempelvis

- en 250 ml rundkolv med standardkoppling av slipat glas,

- en 30 cm lång återloppskondensator, och

- en värmekälla (utrustningen måste vara utformad så att pyrogena reaktioner med extraktet undviks).

6.4.3. Rotationsindunstare

6.4.4. Filtreringsanordning (Buchner-tratt)

6.5. Kromatografibetingelser (exempel):

6.5.1. Elueringsegenskaper hos lösningsmedlen A (4.6.2) och B (4.6.3)

- Gå från en gradient på 20/80 (v/v) till 50/50 (v/v) på femton minuter.

- Gå från en gradient på 50/50 (v/v) till 75/25 (v/v) på fem minuter.

- Håll samma koncentration 75/25 (v/v) i fem minuter.

- Stabilisering av kolonnen mellan injektioner:

- Samma koncentration, 20/80 (v/v), i fem minuter.

6.5.2. Flödeshastighet: 1 ml/minut

6.5.3. Inställning för UV-detektor:

Detektorn skall ställas in på 370 nm för detektion av chalkoner och sedan på 254 nm för bestämning av glycyrrhizinsyra.

Anm.:

Ändringen av våglängd (från 370 nm till 254 nm) skall göras 30 sekunder innan toppen för glycyrrhizinsyra börjar komma.

7. Utförande

7.1. Beredning av prov

Filtrera genom ett filter för organiska lösningsmedel (pordiameter: 0,45 μm).

7.2. Beredning av resterande lakritsrotsextrakt (5.6)

Späd 1:10 med 50-procentig etanol (4.6.1) före analys.

7.3. Bestämning

7.3.1. Injicera 20 μl av det beredda lakritsrotsextraktet (7.2). Gör analysen under de kromatografibetingelser som beskrivs ovan (6.5).

7.3.2. Injicera 20 μl av provet (7.1) (prov av spritdryck smaksatt med anis). Gör analysen under de kromatografibetingelser som beskrivs ovan (6.5).

7.3.3. Jämför de två kromatogrammen. Det skall finnas stora likheter mellan dem i slutzonen för chalkoner (vid detektion vid 370 nm under ovan beskrivna analysbetingelser) (se figur 1).

8. Typiskt kromatogram för pastis

Figur 1

Kromatogram erhållet med den ovan beskrivna metoden som visar att en pastis innehåller chalkoner. Topparna 1-8 är chalkoner och topp 9 glycyrrhizinsyra.

>PIC FILE= "L_2002322SV.002301.TIF">

9. Metodutvärdering (noggrannhet)

Resultat från provningsjämförelsen:

Tabellen nedan visar resultaten av analyser avseende chalkoner i pastis och spritdrycker smaksatta med anis.

Följande data erhölls från en internationell metodstudie som utfördes enligt internationellt vedertagna förfaranden.

>Plats för tabell>

>Plats för tabell>

>Plats för tabell>

Provtyper:

A Pastis, dubbelblindprov

B Pastis, ett prov

C Pastis, ett prov

D "Pastis" (utan chalkoner), dubbelblindprov

E "Pastis" (utan chalkoner), dubbelblindprov

F Likör smaksatt med anis (utan chalkoner), dubbelblindprov

G Likör smaksatt med anis (utan chalkoner), dubbelblindprov

H Ouzo (utan chalkoner), ett prov

I Ouzo (utan chalkoner), ett prov

J Anis (utan chalkoner), dubbelblindprov

K "Pastis" (utan chalkoner), dubbelblindprov

IX. Äggula. Bestämning av koncentrationen av äggula i spritdrycker - fotometrisk metod

1. Tillämpningsområde

Metoden används för att bestämma koncentrationen äggula i intervallet 40-250 g/l i ägglikör och likör med ägg.

2. Referenser

ISO 3696:1987 Vatten för analys - Krav och provningsmetoder

3. Princip

De etanollösliga fosforhaltiga ämnen som finns i äggula extraheras och bestäms fotometriskt i form av ett komplex av fosfor och molybdat.

4. Reagens och material

4.1. Dubbeldestillerat vatten

4.2. Kiselgur

4.3. Etanol, 96 % (vol.) (CAS 64-17-5)

4.4. 15-procentig lösning av magnesiumacetat (CAS 16674-78-5)

4.5. 10-procentig svavelsyra (CAS 7664-93-9)

4.6. 1 N svavelsyra

4.7. 0,16 g/l lösning av kaliumdivätefosfat (CAS 778-77-0), KH2PO4

4.8. Reagens för fosfatbestämning:

Lös 20 g ammoniummolybdat (CAS 12054-85-2), (NH4)6Mo7O24.4H2O, i 400 ml vatten vid 50 °C.

Lös i ett annat kärl 1 g ammoniumvanadat (CAS 7803-55-6), NH4VO3, i 300 ml hett vatten, låt svalna och tillsätt sedan 140 ml koncentrerad salpetersyra (CAS 7697-37-2). Blanda de två avsvalnade lösningarna i en 1000 ml mätkolv och späd till märket.

5. Utrustning

5.1. 100 ml E-kolv

5.2. Ultraljudsbad (eller magnetomrörare)

5.3. 100 ml mätkolv

5.4. 20 °C vattenbad

5.5. Filter (Whatman nr 4 eller motsvarande)

5.6. Degel i porslin (eller platina)

5.7. Kokande vattenbad

5.8. Värmeplatta

5.9. Förbränningsugn (muffelugn)

5.10. 50 ml mätkolv

5.11. 20 ml mätkolv

5.12. Spektrofotometer inställd på 420 nm

5.13. 1 cm kyvett

6. Prov

Proven skall lagras vid rumstemperatur före analys.

7. Utförande:

7.1. Beredning av prov

7.1.1. Väg upp 10 g prov i en 100 ml E-kolv (5.1).

7.1.2. Tillsätt stegvis 70 ml etanol (4.3) i små portioner, rotera kolven mellan tillsatserna, och placera den sedan i ett ultraljudsbad (5.2) i femton minuter (eller rör om med magnetomrörare (5.2) i tio minuter vid rumstemperatur).

7.1.3. Överför kolvens innehåll till en 100 ml mätkolv (5.3) genom att skölja med etanol (4.3). Späd till märket med etanol (4.3) och placera mätkolven i ett 20 °C vattenbad (5.4). Späd till märket vid 20 °C.

7.1.4. Tillsätt en liten mängd kiselgur (4.2) och filtrera (5.5). Häll bort de första 20 ml.

7.1.5. Överför 25 ml av filtratet till en degel av porslin (eller platina) (5.6). Filtratet skall sedan koncentreras genom varsam avdunstning i ett kokande vattenbad (5.7), med tillsats av 5 ml 15-procentig magnesiumacetatlösning (4.4).

7.1.6. Placera degeln på en värmeplatta (5.8) och värm tills filtratet precis har torkat.

7.1.7. Förbränn filtratet till aska genom att hetta upp det till glödpunkten vid 600 °C i en förbränningsugn (5.9) tills endast vit aska återstår. Förbränningen skall pågå minst 1,5 timmar, men över natt går också bra.

7.1.8. Lös askan i 10 ml 10-procentig svavelsyra (4.5) och överför lösningen till en 50 ml mätkolv (5.10) genom att skölja upprepade gånger med destillerat vatten (4.1). Späd till märket vid rumstemperatur med destillerat vatten (4.1). En 5 ml alikvot av denna lösning av askan skall användas för att bereda provlösningen för fotometribestämning.

7.2. Fotometrisk fosfatbestämning

7.2.1. Referenslösning

7.2.1.1. Häll 10 ml 10-procentig svavelsyra (4.5) i en 50 ml mätkolv (5.10) och späd till märket med destillerat vatten (4.1).

7.2.1.2. Tillsätt 1 ml 1 N svavelsyra (4.6) och 2 ml fosfatreagens (4.8) till en 5 ml alikvot av denna lösning (7.2.1.1), i en 20 ml mätkolv (5.11). Späd till märket med destillerat vatten (4.1).

7.2.1.3. Förslut med en löst sittande propp, skaka och hetta upp i kokande vattenbad (5.7) i tio minuter. Kyl sedan lösningen i 20 °C vattenbad (5.4) i tjuga minuter.

7.2.1.4. Fyll en 1 cm kyvett (5.13) med denna referenslösning.

7.2.2. Provlösning

7.2.2.1. Tillsätt 1 ml 1 N svavelsyra (4.6) och 2 ml fosfatreagens (4.8) till en 5 ml alikvot av asklösningen (7.1.8) i en 20 ml mätkolv (5.11). Späd till märket med destillerat vatten (4.1).

7.2.2.2. Förslut med en löst sittande propp, skaka och hetta upp i kokande vattenbad (5.7) i tio minuter. Kyl sedan lösningen i 20 °C vattenbad (5.4) i tjugo minuter.

7.2.2.3. Den gula lösning som erhålls skall genast analyseras spektrofotometriskt (5.12) i en 1 cm kyvett (5.13) vid 420 nm mot referenslösningen (7.2.1.4).

7.2.3. Kalibreringskurva

7.2.3.1. Gör lösningar till kalibreringen genom att tillsätta 2 ml alikvoter av fosfatreagenset (4.8) till 20 ml mätkolvar (5.11) som var och en innehåller 1 ml 1 N svavelsyra (4.6) och 0, 2, 4, 6, 8 respektive 10 ml kaliumdivätefosfatlösning (4.7). Späd till märket med destillerat vatten (4.1).

7.2.3.2. Förslut med en löst sittande propp, skaka och hetta upp i kokande vattenbad (5.7) i tio minuter. Kyl sedan lösningarna i 20 °C vattenbad (5.4) i tjugo minuter. Analysera spektrofotometriskt (5.12) i en 1 cm kyvett (5.13) vid 420 nm mot referenslösningen (7.2.1.4).

7.2.3.3. Konstruera kalibreringskurvan

>Plats för tabell>

8. Redovisning av resultaten

Koncentrationen av äggula uttryckt i g/l beräknas med följande formel:

>Hänvisning till >

där

110 är konverteringsfaktorn för total mängd av P2O5 i gram i 100 g äggula,

mg P2O5 är värdet som erhålls från kalibreringskurvan,

densitet massa per volymsenhet (g/ml) av äggbaserad likör vid 20 °C,

E den äggbaserade likörens vikt i g,

40 spädningsfaktorn för en 5 ml alikvot av asklösning.

9. Metodutvärdering (noggrannhet)

Statistiska resultat från provningsjämförelsen:

Värdena för äggula anges i tabellen nedan.

Följande data erhölls från en internationell metodstudie som utfördes enligt internationellt vedertagna förfaranden.

>Plats för tabell>

>Plats för tabell>

Provtyper:

A Advocaat, dubbelblindprov

B Advocaat, dubbelblindprov

C Advocaat, dubbelblindprov

D Advocaat, (utspädd) "split levels" (*)

E Advocaat, dubbelblindprov