8)

I del B ska följande kapitel läggas till: ”B.63 SCREENINGTEST FÖR REPRODUKTIONS-/UTVECKLINGSTOXICITET INLEDNING 1. Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 421 (2016). OECD:s riktlinjer för kemikalietestning utvärderas med jämna mellanrum som en anpassning till den vetenskapliga utvecklingen. De ursprungliga riktlinjerna för screeningtest (421) antogs 1995, utifrån ett protokoll för ett preliminärt screeningtest för reproduktionstoxicitet som diskuterats vid två expertmöten, i London 1990 (1) och Tokyo 1992 (2). 2. Denna testmetod har uppdaterats med endpoints som är relevanta för hormonstörande ämnen, och detta är en uppföljning till den högprioriterade verksamhet som OECD inledde 1998 för att revidera befintliga testriktlinjer och ta fram nya riktlinjer för screening och testning av potentiella hormonstörande ämnen (3). OECD TG 407 (28-dagars toxicitetsstudie med upprepad oral dosering på gnagare, kapitel B.7 i denna bilaga) utökades till exempel 2008 med parametrar för att påvisa endokrin aktivitet hos testkemikalier. Syftet med uppdateringen av TG 421 var att inkludera några endpoints som är relevanta för hormonstörande ämnen i riktlinjerna för screeningtester där exponeringsperioderna omfattar några av de känsliga utvecklingsperioderna (pre- eller tidiga postnatalperioder). 3. De nya utvalda endpoints som är relevanta för hormonstörande ämnen och som också ingår i TG 443 (utökad enkelgenerationsstudie av reproduktionstoxicitet, motsvarande kapitel B.56 i denna bilaga) inkluderades i TG 421 på grundval av en förstudie som behandlade vetenskapliga och tekniska aspekter av deras inkluderande samt nödvändiga anpassningar av testets utformning för att möjliggöra ett inkluderande (4). 4. Denna testmetod är utformad för att generera begränsad information om en testkemikalies effekter på den hanliga och honliga fortplantningsförmågan, t.ex. beträffande könskörtlarnas funktion, parningsbeteende, befruktning, embryoutveckling och födsel. Den är inte ett alternativ till, eller en ersättning för, de befintliga testmetoderna B.31, B.34, B.35 eller B.56. INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN 5. Denna screeningtestmetod kan användas för att få en första information om vilka eventuella effekter en kemikalie har på reproduktion och/eller utveckling, antingen på ett tidigt stadium genom bedömning av kemikaliens toxikologiska egenskaper eller genom bedömning av kemikalien i sig. Studien kan också användas som en del av flera screeningtest för att ge en första bedömning av befintliga kemikalier för vilka ingen eller begränsad toxikologisk information finns tillgänglig, eller som en preliminär undersökning inför mer omfattande studier om reproduktion/utveckling eller när det av andra skäl anses relevant. Vid genomförande av studien bör man följa de vägledande principer och överväganden som beskrivs i OECD:s vägledning nr 19 om erkännande, bedömning och användning av kliniska tecken som humana endpoints för försöksdjur som används för säkerhetsbedömningar (5). 6. Denna testmetod ger ingen komplett information om alla aspekter av reproduktion och utveckling. Den är särskilt begränsad när det gäller att detektera postnatala uttryck av prenatal exponering, eller effekter som kan orsakas av postnatal exponering. Bland annat på grund av det ringa antalet försöksdjur i doseringsgrupperna, selektiviteten hos endpoints samt studiens begränsade varaktighet ger denna metod inga bevis för definitiva påståenden om utebliven effekt. Vid avsaknad av data från andra toxicitetstest om reproduktion/utveckling kan de positiva resultaten dessutom användas för en inledande riskbedömning och bidra till beslutsfattande gällande vilka övriga test som behövs och när. 7. Resultaten som erhölls genom de endokrinrelaterade parametrarna bör betraktas mot bakgrund av OECD:s begreppsram för provning och bedömning av hormonstörande ämnen (6). Den vidareutvecklade OECD TG 421 ingår i nivå 4 av begreppsramen som ett in vivo-test som genererar data om skadliga effekter för endokrinrelaterade endpoints. En endokrin signal kanske dock inte räcker för att påvisa att testkemikalien är ett hormonstörande ämne. 8. Vid test enligt denna metod används oral tillförsel av testkemikalien. Om tillförsel sker på annat sätt kan metoden behöva modifieras. 9. Innan testmetoden används på en blandning i syfte att samla in data för ett lagstadgat ändamål bör man överväga om, och i så fall varför, den kommer att ge godtagbara resultat för det syftet. Sådana överväganden är inte nödvändiga om blandningen måste provas enligt lag. 10. De definitioner som används finns i tillägg 1. TESTPRINCIP 11. Testkemikalien tillförs i graderade doser till flera grupper av hanar och honor. Hanarna ska behandlas i minst fyra veckor, inbegripet dagen före den planerade avlivningen (detta inkluderar minst två veckor före parning, under parningsperioden och ungefär två veckor efter parning). Eftersom hanarna endast behandlas under en begränsad period före parning utgör fertilitet ingen särskilt känslig indikator för testikeltoxicitet. Därför krävs en detaljerad histologisk undersökning av testiklarna. En två veckors doseringsperiod före parning i kombination med efterföljande observationer av parning/fertilitet och en sammanlagd doseringsperiod på minst fyra veckor, följt av en ingående histopatologisk analys av hanarnas könskörtlar, anses vara tillräckligt för att påvisa flertalet effekter på hanarnas fertilitet och spermatogenes. 12. Honorna bör behandlas under hela studien. Detta inbegriper två veckor före parning (i syfte att täcka minst två kompletta ägglossningscykler), tiden fram till befruktning, dräktighetsperioden samt minst tretton dagar efter födsel, fram till dag för planerad avlivning. 13. Studiens längd, efter acklimatisering och bedömning av ägglossningscykeln före behandling, beror på honornas kondition och ligger på runt 63 dagar (minst 14 dagar före parning, (upp till) 14 dagars parning, 22 dagars dräktighetsperiod samt 13 dagars laktation). 14. Under administreringsperioden observeras djuren varje dag noggrant för tecken på toxicitet. Djur som dör eller avlivas under testet obduceras, och i slutet av testet avlivas överlevande djur och obduceras. BESKRIVNING AV TESTMETODEN Val av djurart 15. Denna testmetod är avsedd att användas på råtta. En utförlig motivering ska ges om de parametrar som anges i denna testmetod undersöks hos en annan art av gnagare. I det internationella valideringsprogrammet för att påvisa hormonstörande ämnen i OECD TG 407 (motsvaras av kapitel B.7 i denna bilaga) var råtta den enda art som användes. Stammar med låg fertilitet eller välkänd hög incidens av utvecklingsdefekter ska inte användas. Friska tidigare obefruktade djur, som inte tidigare har använts i försök, ska användas. Försöksdjuren ska karakteriseras efter art, stam, kön, vikt och ålder. Vid testets början bör variationen i vikt mellan djuren vara minimal och får inte överstiga 20 % av vardera könets medelvikt. När en upprepad oral dos utförs som inledning till en långtidsstudie, är det att föredra att djur från samma stam och ursprung används för båda studierna. Inhysning och utfodring 16. Alla förfaranden bör överensstämma med lokala normer för laboratoriedjurvård. Temperaturen i försöksdjurens utrymmen bör vara 22 °C (± 3 °). Den relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och helst inte överstiga 70 % utom när rummet rengörs, och målet bör vara 50–60 %. Belysningen bör vara artificiell med ljusperioden 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. För utfodring kan konventionellt laboratoriefoder användas med obegränsad tillgång till dricksvatten. Valet av foder kan påverkas av behovet av att säkerställa en lämplig blandning av en testkemikalie när den administreras genom denna metod. 17. Djuren bör inhysas i små grupper med individer av samma kön. Djuren kan inhysas individuellt om det är vetenskapligt motiverat. Vid grupplacering i bur bör inte fler än fem djur inhysas i en och samma bur. För parningsprocedurerna används burar som är lämpliga för ändamålet. Dräktiga honor ska hysas individuellt och förses med bomaterial. Digivande honor ska hysas individuellt med sina ungar. 18. Fodret bör regelbundet analyseras beträffande främmande ämnen. Ett prov av fodret bör sparas tills rapporten är slutförd. Förberedelse av djuren 19. Friska yngre adulta djur fördelas slumpmässigt till kontroll- och behandlingsgrupperna. Burarna bör placeras i sådan ordning att eventuella verkningar på grund av placeringen minimeras. Djuren ska ha en unik identifiering och hållas i sina burar under minst fem dagar innan undersökningen börjar, för att göra det möjligt för dem att acklimatiseras till förhållandena i laboratoriet. Beredning av doser 20. Det rekommenderas att testkemikalien administreras oralt såvida inte andra tillförselsätt anses mer lämpliga. Vid oral administrering ges testkemikalien i regel via sond, men testkemikalien kan även ges via fodret eller dricksvattnet. 21. Vid behov kan testkemikalien upplösas eller suspenderas i en lämplig vehikel. Det rekommenderas, när så är möjligt, att man först använder en vattenbaserad lösning/suspension följt av en lösning/emulsion i olja (t.ex. majsolja) och därefter eventuell lösning i andra vehiklar. För andra vehiklar än vatten bör vehikelns toxiska egenskaper vara kända. Testkemikaliens stabilitet och homogenitet i vehikeln bör bestämmas. FÖRFARANDE Djurens antal och kön 22. Det rekommenderas att varje grupp inledningsvis innehåller minst 10 hanar och 12–13 honor. Honornas ägglossningscykler undersöks före exponeringen, och individer som inte uppvisar typiska cykler på 4–5 dagar ska inte tas med i studien. Det är därför extra honor rekommenderas initialt så att varje grupp innehåller 10 honor. Förutom vid betydande toxiska effekter förväntas detta leda till minst 8 dräktiga honor per grupp, vilket i regel utgör det minsta acceptabla antalet dräktiga honor per grupp. Syftet med detta är att säkerställa ett tillräckligt antal dräktigheter och ungar för att möjliggöra en meningsfull utvärdering av testkemikaliens potential att påverka fertilitet, dräktighet och moderskaps- och dibeteende samt tillväxt och utveckling hos F 1 -avkomman från befruktning till dag 13 post partum. Dosering 23. I allmänhet bör minst tre doseringsgrupper och en kontrollgrupp användas. Dosnivåerna kan baseras på information från akuta toxicitetstester eller på resultat från studier med upprepad dosering. Med undantag av behandlingen med testkemikalien bör djuren i kontrollgruppen hanteras på exakt samma sätt som testgruppen. Om en vehikel används för att tillföra testkemikalien bör kontrollgruppen tillföras vehikeln i den största volym som används. 24. Dosnivåerna bör väljas med hänsyn till eventuell toxicitetsdata och (toxikologisk) kinetisk data som finns tillgänglig. Hänsyn bör tas till eventuell skillnad i sensitivitet mellan dräktiga och icke-dräktiga djur. Den högsta nivån på dosen bör väljas i syfte att inducera toxiska verkningar, men inte leda till döden eller orsaka svåra lidanden. Därefter bör en fallande nivå på doserna väljas i syfte att påvisa en dosrelaterad respons och ingen påvisbar skadlig effekt vid den lägsta dosnivån (NOAEL). Två- till fyrfaldiga dosintervall är ofta optimala för de fallande doseringsnivåerna, och att lägga till en fjärde testgrupp är att föredra framför att använda mycket stora intervall (t.ex. mer än faktor 10) mellan doseringarna. 25. Vid observation av tecken på allmän toxicitet (t.ex. minskad kroppsvikt, effekter på lever, hjärta, lungor eller njurar) eller andra förändringar som kanske inte är toxiska reaktioner (t.ex. nedsatt födointag, leverförstoring) ska observerade effekter avseende endokrint känsliga endpoints tolkas med försiktighet. Toleranstest 26. Om ett försök med en doseringsnivå om minst 1 000 mg per kg kroppsvikt och dag eller, vid tillförsel via föda eller dricksvatten, en motsvarande andel i födan eller dricksvattnet och med användning av det tillvägagångssätt som beskrivits för denna studie, inte ger några observerbara toxiska effekter och om toxicitet inte förväntas på grundval av uppgifter från strukturellt närbesläktade ämnen, kan en fullständig undersökning med tre dosnivåer anses överflödig. Detta toleranstest är tillämpligt förutom i fall där sannolik exponering på människor indikerar att en högre oral doseringsnivå behövs. För andra former av tillförsel, såsom inandning eller applicering på huden, kan testkemikaliens fysikalkemiska egenskaper ofta utnyttjas för att indikera och begränsa den maximala exponeringsnivån. Administrering av doser 27. Försöksdjuren behandlas med testkemikalien dagligen under en vecka. När testkemikalien tillförs genom sondmatning bör detta ske i en engångsdos via magsond eller lämplig intubationskanyl. Den maximala vätskevolymen som kan administreras vid ett tillfälle är beroende av försöksdjurets storlek. Volymen får inte överstiga 1 ml per 100 g kroppsvikt, utom för vattenlösningar där volymen kan uppgå till 2 ml per 100 g kroppsvikt. Med undantag för irriterande eller korrosiva testkemikalier, som normalt kommer att visa stegrade verkningar vid högre koncentrationer, bör variationer av testvolymen minimeras genom justering av koncentrationen för att säkerställa en konstant volym vid alla dosnivåer. 28. För kemikalier som tillförs via fodret eller dricksvattnet är det viktigt att säkerställa att kvantiteterna av den berörda testkemikalien inte påverkar normal närings- eller vattenbalans. När testkemikalien tillförs via kosten kan antingen en konstant foderkoncentration (PPM) eller en konstant doseringsnivå i förhållande till djurens kroppsvikt användas. Det alternativ som används ska anges. En testkemikalie som tillförs genom sondmatning bör ges vid samma tid varje dag och justeras minst varje vecka så att dosnivån hålls konstant i förhållande till djurens kroppsvikt. Försöksschema 29. Behandlingen av båda könen bör påbörjas minst två veckor före parning, efter att de har acklimatiserats under minst fem dagar och efter att honorna har screenats för normala ägglossningscykler (under en tvåveckorsperiod före behandlingen). Studien bör planläggas så att bedömningen av ägglossningscykeln påbörjas kort efter att djuret ifråga blivit könsmoget. Detta kan variera något mellan olika råttstammar i olika laboratorier, t.ex. 10 veckors ålder för Sprague Dawley-råttor och 12 veckors ålder för Wistar-råttor. Moderdjur med ungar bör avlivas på dag 13 post partum, eller kort därefter. Dagen för födseln (dvs. efter avslutad förlossning) definieras som dag 0 post partum. Honor som inte uppvisar några tecken på att ha parat sig ska avlivas 24–26 dagar efter parningsperiodens sista dag. Tillförseln fortsätts för båda könen under parningsperioden. Hanar ska ges fortsatt behandling efter parningsperioden och minst till dess att en minimidoseringsperiod på totalt 28 dagar har uppnåtts. Därefter avlivas de eller hålls kvar och ges fortsatt behandling för en andra parning om så bedöms lämpligt. 30. Daglig dosering till dräktiga honor och moderdjur ska fortsätta genom hela dräktighetsperioden och minst till och med dag 13 post partum eller dagen före avlivningsdagen. När testkemikalien tillförs via inhalation eller applicering på huden ska doseringen fortsätta minst till och med dräktighetsdag 19, och doseringen bör återupptas så fort som möjligt efter födsel och inte senare än PND 4. 31. Ett diagram för försöksschemat finns i tillägg 2. Parningsprocedur 32. I regel ska 1:1-parningar (en hane per hona) användas i denna studie. Undantagssituationer kan uppstå om hanar dör. Honan ska inhysas med samma hane tills parning bevisligen har skett eller två veckor har förflutit. Honorna ska undersökas varje morgon för närvaron av sperma eller vaginalproppar. Dag 0 av dräktigheten definieras som den dag då bevis på parning bekräftas (fynd av vaginalpropp eller sperma). Om parningen inte lyckas kan man överväga ett nytt parningsförsök där honor sammanförs med hanar med fastställd fertilitet från samma grupp. Kullstorlek 33. På dag 4 efter födseln kan storleken på varje kull justeras genom att eliminera extra ungar genom slumpmässigt urval, så att det blir, så nära som möjligt, fyra eller fem ungar per kön per kull, beroende på den normala kullstorleken i den råttstam som använts. Blodprover ska tas på två av överskottsungarna och sparas för bestämning av T4-nivåer i serum. Selektiv eliminering av ungar, t.ex. utifrån kroppsvikt eller anogenitalt avstånd (AGD), är inte lämpligt. När antalet han- eller honungar inte medger fyra eller fem av varje kön per kull, är partiell anpassning acceptabelt (t.ex. sex hanar och fyra honor). Inga ungar ska elimineras när kullstorleken är mindre än det avsedda målet (8 eller 10 ungar/kull). Om det endast finns en överskottsunge utöver det avsedda målet ska endast en unge elimineras och användas för blodinsamling och eventuell bedömning av T4 i serum. 34. Om kullstorleken inte korrigeras ska två ungar per kull avlivas på dag 4 efter födseln och blodprov tas för att mäta koncentrationen av tyreoideahormoner i serum. Om det är möjligt ska dessa två ungar per kull vara honungar, så att hanungar kan reserveras för senare bedömning av bröstvårteretention, förutom då eliminering av dessa honungar innebär att det inte finns några honor kvar för den slutliga bedömningen. Inga ungar ska elimineras när kullstorleken är mindre än 8 eller 10 ungar/kull (beroende på den normala kullstorleken för den råttstam som använts). Om det endast finns en unge mer än normalt antal ungar per kull ska endast en unge elimineras och användas för blodinsamling och eventuell bedömning av T4 i serum. Observationer av levande djur Kliniska observationer 35. Allmänna kliniska observationer bör göras minst en gång per dag under hela testperioden, och oftare när tecken på toxicitet observeras. Observationerna bör företrädesvis utföras vid samma tidpunkt varje dag och med hänsyn till förväntade toppeffekter efter doseringen. Relevanta beteendeförändringar, tecken på svårartad eller förlängd födsel och alla toxicitetstecken, inbegripet dödlighet, ska registreras. Dessa rapporter ska inkludera information om toxicitetstecknens början, grad och varaktighet. Kroppsvikt samt foder- och vattenkonsumtion 36. Hanar och honor ska vägas på doseringens första dag, minst en gång i veckan därefter samt vid testets slut. Under dräktighetstiden ska honorna vägas på dag 0, 7, 14 och 20 samt inom 24 timmar efter födseln (dag 0 eller 1 post partum) och åtminstone på dag 4 och 13 post partum. Dessa observationer bör rapporteras individuellt för varje vuxet djur. 37. Under tiden före parning, dräktighetsperiod samt laktation ska foderintaget mätas åtminstone en gång i veckan. Det är inte obligatoriskt att mäta foderintaget under parningsperioden. Om testkemikalien tillförs via dricksvattnet bör även vattenkonsumtionen mätas under nämnda perioder. Ägglossningscykler 38. Ägglossningscyklerna bör övervakas innan behandlingen startar i syfte att välja ut honor med regelbundna cykler till försöket se punkt 22). Även vaginala utstryk bör övervakas dagligen från behandlingens början till dess att parning bevisligen skett. Om det vid doseringens början föreligger misstankar om akuta stresseffekter som kan störa ägglossningscyklerna kan laboratoriet exponera försöksdjuren under två veckor och därefter samla in vaginala utstryk dagligen i syfte att övervaka ägglossningscyklerna under minst två veckor före parning, med fortsatt övervakning under parningsperioden fram till dess att parning bevisligen skett. När celler från vagina eller livmoderhals samlas in bör försiktighet iakttas för att undvika skador på slemhinnan, eftersom sådana kan framkalla pseudodräktighet (7) (8). Parametrar för avkomman 39. Dräktighetsperioden bör registreras och beräknas från dräktighetsdag 0. Varje kull ska undersökas snarast möjligt efter nedkomsten i syfte att fastställa antal och kön för ungar, dödfödda, levande födda, småväxta ungar (avsevärt mindre än motsvarande kontrollungar) samt eventuella större avvikelser. 40. Levande ungar ska räknas och könsbestämmas, och kullarna ska vägas inom 24 timmar efter födseln (dag 0 eller 1 post partum) samt åtminstone på dag 4 och 13 post partum. Utöver de observationer som beskrivs i punkt 35 ska allt onormalt beteende hos ungarna registreras. 41. AGD på varje unge ska mätas på samma dag efter födseln, någon gång mellan PND 0 och PND 4. Ungarnas kroppsvikt bör samlas in under dagen för AGD-mätningen, och AGD bör normaliseras till ett mått på ungarnas storlek, företrädesvis kubikroten ur kroppsvikten (9). Antal bröstvårtor/vårtgårdar på hanungarna ska räknas på PND 12 eller 13 enligt rekommendationerna i OECD GD 151 (10). Klinisk biokemi 42. Blodprov tas från ett definierat ställe utifrån följande schema: — från minst två ungar per kull på dag 4 efter födseln, om antalet ungar så tillåter (se punkterna 33 och 34), — från alla moderdjur och minst två ungar per kull när försöket avslutas på dag 13, och — från alla vuxna hanar vid försökets slut. Alla blodprov ska förvaras under lämpliga förhållanden. Blodproverna som tas på 13 dagar gamla ungar samt vuxna hanar ska analyseras för tyreoideahormoner (T4) i serum. Ytterligare analys av T4 i blodproven från moderdjuren och de 4 dagar gamla ungarna görs om det bedöms relevant. Om det är relevant kan blodet även analyseras för andra hormoner. Ungarnas blod kan samförvaras per kull för analyser av tyreoideahormoner. Tyreoideahormonerna (T4 och TSH) bör helst mätas som ett totalvärde. 43. Följande faktorer kan påverka variationen och de absoluta koncentrationerna för hormonbestämningarna: — Tidpunkt för avlivningen beroende på hormonkoncentrationernas dygnsvariation. — Avlivningsmetod för att undvika onödig stress hos djuren som kan påverka hormonkoncentrationerna. — Testsatser för hormonbestämningar som kan skilja sig åt genom sina standardkurvor. 44. Plasmaprover särskilt avsedda för hormonbestämning bör tas vid en jämförbar tid på dagen. De numeriska värden som erhölls vid analys av hormonkoncentrationer skiljer sig åt mellan de olika analyssatser som finns i handeln. Patologi Obduktion 45. Vid avlivning eller om djur dör under pågående test ska vuxna djur undersökas makroskopiskt med avseende på avvikelser eller patologiska förändringar. Särskild uppmärksamhet bör ägnas åt organen i reproduktionssystemet. Antal implantationsställen ska registreras. Vaginala utstryk ska undersökas på morgonen samma dag som obduktionen äger rum för att fastställa ägglossningscykelns skede och möjliggöra korrelation med äggstockarnas histopatologi. 46. På samtliga hanar ska all angränsande vävnad putsas bort från testiklar och bitestiklar liksom från prostata och sädesblåsor med koaguleringskörtlar varefter våtvikten mäts snarast möjligt efter dissektion innan organen hinner torka. Utöver detta kan fler organ vägas, som till exempel muskelkomplexen levator ani och bulbocavernosus, Cowpers körtlar eller ollonet hos hanar samt äggstockspar (våtvikt) och livmoder (inklusive livmoderhals) hos honor. Om dessa organ vägs ska deras vikt registreras snarast möjligt efter dissektion. 47. Döda ungar och ungar som avlivas på dag 13 post partum, eller kort därefter, ska undersökas noga åtminstone externt för grova avvikelser. Särskild uppmärksamhet bör fästas vid de yttre reproduktionsorganen, som ska undersökas för tecken på avvikande utveckling. På dag 13 ska sköldkörteln från 1 hanunge och 1 honunge per kull bevaras. 48. Äggstockar, testiklar, accessoriska könsorgan (livmoder och livmoderhals, bitestiklar, sädesblåsor plus koaguleringskörtlar) och sköldkörtlar från samtliga vuxna försöksdjur, inklusive alla organ som uppvisar skador vid makroskopisk undersökning, ska bevaras. Fixering med formalin rekommenderas inte för rutinundersökning av testiklar och bitestiklar. I stället bör Bouins lösning eller modifierat fixeringsmedel enligt Davidson användas för dessa vävnader (11). Tunica albuginea kan punkteras försiktigt och ytligt med en nål på organets båda poler för en snabb inträngning av fixeringsmedlet. Histopatologi 49. En detaljerad histologisk undersökning ska genomföras på äggstockar, testiklar och bitestiklar (särskild uppmärksamhet bör fästas vid spermatogenesens stadier samt vid histopatologin hos den interstitala cellstrukturen i testiklarna) på försöksdjuren i den högsta doseringsgruppen samt på djuren i kontrollgruppen. Övriga organ som bevarats inklusive sköldkörtlar från ungar och vuxna djur kan undersökas om det behövs. Sköldkörtelns vikt kan bestämmas efter fixering. Putsning ska också göras väldigt försiktigt, och först efter fixeringen för att undvika vävnadsskador. Vävnadsskador kan påverka den histopatologiska analysen negativt. När förändringar observeras i gruppen med högst dosering kan undersökningen utökas till att inkludera djur från andra doseringsgrupper. Vägledningen om histopatologi (11) omfattar detaljerad information om dissektion, fixering, sektionering och histopatologi av endokrina vävnader. DATA OCH RAPPORTERING Data 50. Data bör rapporteras individuellt per djur. Alla data ska sammanställas i en tabell. Tabellen ska för varje testgrupp visa antalet djur vid testets början, antalet djur som under testets gång har dött eller avlivats av humana skäl, tidpunkten för alla dödsfall eller humana avlivningar, antalet fertila djur, antalet dräktiga honor, antalet djur som uppvisar tecken på toxicitet, en beskrivning av de toxicitetstecken som har observerats (inklusive tidpunkt då dessa först upptäcktes samt verkningarnas varaktighet och allvarlighetsgrad), typerna av histopatologiska förändringar samt all annan relevant data om kullarna. I tillägg 3 finns ett tabellformat som har visat sig vara mycket användbart för att redovisa reproduktiva effekter och utvecklingseffekter. 51. På grund av denna studies begränsade omfattning har statistiska analyser om ”signifikans” begränsat värde för flera endpoints, särskilt reproduktiva sådana. Om statistiska analyser används ska en lämplig metod för distributionen av den valda variabeln väljas ut innan testet påbörjas. Statistiska analyser av AGD och bröstvårteretention ska baseras på data för varje individuell unge med beaktande av effekter på kullen ifråga. När så är lämpligt ska kullen utgöra analysenheten. Statistiska analyser av ungarnas kroppsvikt ska baseras på data för varje individuell unge med beaktande av kullstorlek. På grund av den ringa gruppstorleken kan det också vara värdefullt att använda historiska kontrolldata (t.ex. för kullstorlek), om sådana finns, som ett stöd för tolkning av studien. Utvärdering av resultaten 52. Resultaten bör utvärderas i termer av de observerade effekterna, inklusive obduktion och mikroskopiska iakttagelser. Utvärderingen ska omfatta förhållandet mellan testkemikaliedosen och närvaron eller frånvaron av samt incidensen och allvarlighetsgraden av avvikelser, inbegripet grova skador, identifierade målorgan, infertilitet, kliniska avvikelser, verkningar på reproduktionsförmågan och kullen, avvikelser rörande kroppsvikt, verkningar på mortaliteten samt alla andra toxiska effekter. 53. Eftersom hanarna endast behandlas under en kort tid bör histopatologin hos testiklar och bitestiklar bedömas tillsammans med fertilitetsdata vid uppskattningen av effekter på reproduktionsförmågan hos hanar. Historiska kontrolldata om reproduktion/utveckling (t.ex. kullstorlek, AGD, bröstvårteretention, T4-nivåer i serum), om sådana finns, kan vara användbara vid tolkningen av studien. 54. Som kvalitetskontroll föreslås att historiska kontrolldata samlas in och att man för numeriska data beräknar variationskoefficienter, särskilt för de parametrar som kopplas till påvisande av hormonstörande ämnen. Dessa data kan sedan användas för jämförelseändamål när aktuella studier utvärderas. Testrapport 55. Testrapporten ska innehålla följande information: Testkemikalie: — Källa, satsnummer, sista förbrukningsdag om detta anges. — Testkemikaliens stabilitet, om den är känd. Monokomponentämne: — fysikaliskt tillstånd, vattenlöslighet och ytterligare relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper. — kemisk identifiering, t.ex. med IUPAC- eller CAS-namn, CAS-nummer, Smiles- eller InChI-kod, strukturformel, renhet samt motsvarande identifiering av föroreningar i förekommande fall och om det är praktiskt möjligt. Multikomponentämne, UVCB-ämnen och blandningar: — karakteriseras så långt som möjligt genom beståndsdelarnas kemiska identitet (se ovan), kvantitativa förekomst och relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper. Vehikel (i förekommande fall): — Motivering för val av vehikel om annan än vatten. Försöksdjur: — Art och stam som används. — Djurens antal, ålder och kön. — Ursprung, inhysning, foder osv. — Djurens individuella vikt vid testets början. — Motivering för val av art, om inte råtta. Testbetingelser: — Grund för valet av dosnivå. — Uppgifter om testkemikaliens sammansättning/foderberedning, uppnådd koncentration, preparatets stabilitet och homogenitet. — Uppgifter om administreringen av testkemikalien. — Omvandling från fodrets/dricksvattnets testkemikaliekoncentration (ppm) till faktisk dos (mg/kg kroppsvikt/dag), i förekommande fall. — Uppgifter om foder- och vattenkvalitet. — Detaljerad beskrivning av slumpmässighetsförfaranden för att välja ut ungar för avlivning, om avlivning skett. Resultat: — Kroppsvikt/kroppsviktsförändringar. — Foderkonsumtion och vattenkonsumtion, i förekommande fall. — Uppgifter om toxisk reaktion uppdelade efter kön och dos, inbegripet fertilitet, dräktighet och avkommans livsduglighet. — Dräktighetsperiodens längd. — Toxiska eller andra verkningar på reproduktion, avkomma, postnatal tillväxt och dylikt. — Art, allvarlighetsgrad och varaktighet för kliniska observationer (huruvida de är reversibla eller ej). — Antal vuxna honor med normal eller onormal ägglossningscykel samt cykelns varaktighet. — Antalet levande födda och postimplantationsförlust. — Uppgifter om ungarnas kroppsvikt. — AGD på samtliga ungar (och deras kroppsvikt på dagen för mätning av AGD). — Bröstvårteretention hos hanungar. — Nivåer av tyreoideahormoner hos 13 dagar gamla ungar och vuxna hanar (samt på moderdjur och 4 dagar gamla ungar om detta har uppmätts). — Antal ungar med lätt synliga avvikelser, generell bedömning av yttre könsorgan och antal småväxta ungar. — Tidpunkt för dödsfall under testet eller huruvida djuren överlevde fram till avslutningen. — Antal implantationer, kullstorlek och kullens vikt vid tiden för registrering. — Kroppsvikt vid avlivningen samt absolut och relativ organvikt för föräldradjuren. — Obduktionsfynd. — En detaljerad redogörelse av alla histopatologiska fynd. — Absorptionsdata (om sådana är kända). — Statistisk bearbetning av resultaten, i tillämpliga fall. Diskussion av resultaten. Slutsatser. Tolkning av resultaten 56. Denna studie bedömer toxicitetsverkningar på reproduktion/utveckling vid administrering av upprepade doser (se punkterna 5 och 6). Studien kan ge en indikation om behovet av vidare undersökningar och vägledning för hur uppföljande studier bör utformas. OECD:s vägledningsdokument 43 bör konsulteras som stöd vid tolkningen av reproduktions- och utvecklingsresultaten (12). OECD:s vägledningsdokument 106 om histologisk bedömning av endokrina och reproduktiva tester på gnagare (11) ger information om beredning och bedömning av (endokrina) organ och vaginala utstryk som kan vara användbar för denna testmetod. LITTERATURHÄNVISNINGAR (1) OECD (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Tillgängligt på förfrågan hos Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris. (2) OECD (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokyo, 27–29 oktober, 1992. Tillgängligt på förfrågan hos Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris. (3) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998. Tillgängligt på förfrågan hos Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris. (4) OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment nr 217, Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris. (5) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations. Series on Testing and Assessment nr 19, Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris. (6) OECD (2011). Annex I to Draft Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment nr 150, Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris. (7) Goldman, J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M. and Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research, Part B, 80 (2), 84-97. (8) Sadleir R.M.F.S (1979). Cycles and Seasons, i Auston C.R. and Short R.V. (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York. (9) Gallavan R.H. Jr, Holson J.F., Stump D.G., Knapp J.F. and Reynolds V.L. (1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights, Reproductive Toxicology, 13: 383-390. (10) OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment nr 151, Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris. (11) OECD (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment nr 106, Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris. (12) OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment nr 43, Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris. Tillägg 1 DEFINITIONER (SE ÄVEN OECD GD 150 (6)) Androgenicitet är förmågan hos en kemikalie att fungera som ett naturligt androgent hormon (t.ex. testosteron) hos ett däggdjur. Antiandrogenicitet är förmågan hos en kemikalie att undertrycka verkan av ett naturligt androgent hormon (t.ex. testosteron) hos ett däggdjur. Anti-östrogenicitet är förmågan hos en kemikalie att undertrycka verkan av ett naturligt östrogent hormon (t.ex. 17ß-östradiol) hos ett däggdjur. Antityreoid aktivitet är förmågan hos en kemikalie att undertrycka verkan av ett naturligt tyreoideahormon (t.ex. T3) hos ett däggdjur. Kemikalie: ett ämne eller en blandning. Utvecklingstoxicitet: uttryck för reproduktionstoxicitet i form av pre-, peri- eller postnatala strukturella eller funktionella störningar i avkomman. Dosering är en allmän term som omfattar dos, dess frekvens samt doseringens varaktighet. Dos är den mängd testkemikalie som administreras. Dosen uttrycks som testkemikaliens vikt per enhet kroppsvikt av försöksdjur per dag (t.ex. mg/kg kroppsvikt/dag), eller som en konstant kostkoncentration. Uppenbar toxicitet är en allmän term som beskriver tydliga tecken på toxicitet efter tillförsel av testkemikalien. Dessa bör vara tillräckliga för en riskbedömning och bör vara sådana att en ökning av den tillförda dosen kan förväntas resultera i utvecklingen av allvarliga toxicitetssymptom och sannolikt leda till mortalitet. Nedsatt fertilitet innebär störningar i fortplantningsförmågan hos hanen eller honan. Maternell toxicitet: skadliga effekter på dräktiga honor som kan ske antingen specifikt (direkt effekt) eller icke-specifikt (indirekt effekt). NOAEL är förkortningen för nivån där ingen skadlig effekt observeras. Detta är den högsta dosnivå där inga behandlingsrelaterade fynd observerats på grund av behandling. Östrogenicitet är förmågan hos en kemikalie att agera som ett naturligt östrogent hormon (t.ex. 17ß-östradiol) hos ett däggdjur. Reproduktionstoxicitet innebär skadliga effekter på avkomman och/eller en försämring av fortplantningsförmågan hos hanar och honor. Testkemikalie: varje ämne eller blandning som testas med denna testmetod. Tyreoid aktivitet är förmågan hos en kemikalie att agera som ett naturligt tyreoideahormon (t.ex. T3) hos ett däggdjur. Validering är en vetenskaplig process utformad för att karakterisera de operativa kraven och begränsningarna hos en testmetod och visa dess tillförlitlighet och relevans för ett visst ändamål. Tillägg 2 FÖRSÖKSSCHEMA SOM VISAR STUDIENS MAXIMALA VARAKTIGHET, BASERAT PÅ EN 14-DAGARS PARNINGSPERIOD ﻿Tillägg 3 SAMMANFATTNING I TABELLFORM AV EFFEKTER PÅ REPRODUKTION/UTVECKLING IAKTTAGELSER VÄRDEN Dosering (enheter) 0 (kontroll) … … … … Startade par (N) Ägglossningscykel (för oregelbundna cykler åtminstone medellängd och frekvens) Honor som bevisligen befruktats (N) Honor som blivit dräktiga (N) Befruktningsdag 1–5 (N) Befruktningsdag 6–... (21) (N) Dräktighetsperiod ≤ 21 dagar (N) Dräktighetsperiod = 22 dagar (N) Dräktighetsperiod ≥ 23 dagar (N) Moderdjur med levande ungar (N) Moderdjur med levande ungar på dag 4 post partum (N) Implantationer/moderdjur (medel) Levande ungar/moderdjur vid födseln (medel) Levande ungar/moderdjur på dag 4 (medel) Könsfördelning (m/f) vid födseln (medel) Könsfördelning (m/f) på dag 4 (medel) Kullens vikt vid födseln (medel) Kullens vikt på dag 4 (medel) Ungarnas vikt vid födseln (medel) Ungarnas vikt vid AGD-mätningen (medel – hanungar, medel – honungar) Ungarnas AGD på samma dag efter födseln, från födseln – dag 4 (medel – hanungar, medel – honungar) Ungarnas vikt på dag 4 (medel) Bröstvårteretention hos hanungarna på dag 13 (medel) Ungarnas vikt på dag 13 (medel) ONORMALA UNGAR Moderdjur med 0 Moderdjur med 1 Moderdjur med ≥ 2 FÖRLORAD AVKOMMA Prenatal/post-implantationer (implantationer minus levande födda) Honor med 0 Honor med 1 Honor med 2 Honor med ≥ 3 Postnatal (levande födda minus levande ungar på dag 13) Honor med 0 Honor med 1 Honor med 2 Honor med ≥ 3 B.64 TOXICITETSSTUDIE MED UPPREPADE DOSER KOMBINERAD MED SCREENINGTEST FÖR REPRODUKTIONS-/UTVECKLINGSTOXICITET INLEDNING 1. Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 422 (2016). OECD:s riktlinjer för kemikalietestning utvärderas med jämna mellanrum för att anpassas till den vetenskapliga utvecklingen. De ursprungliga riktlinjerna för screeningtest 422 antogs 1996 utifrån ett protokoll för upprepad dosering kombinerat med reproduktions-/utvecklingstoxicitet som diskuterats vid två expertmöten, i London 1990 (1) och i Tokyo 1992 (2). 2. I denna testmetod kombineras dels en screeningdel för reproduktions-/utvecklingstoxicitet som bygger på erfarenheter från medlemsländer som använt sig av den ursprungliga metoden på befintliga högvolymkemikalier och som gjort explorativa tester med positiva kontrollämnen (3) (4), dels en del som avser toxicitet vid upprepad dosering, i enlighet med OECD:s testriktlinje 407 (28-dagars toxicitetsstudie med upprepad oral dosering på gnagare, som motsvaras av kapitel B.7 i denna bilaga). 3. Denna testmetod har uppdaterats med endpoints som är relevanta för hormonstörande ämnen, och detta är en uppföljning till den högprioriterade verksamhet som OECD inledde 1998 för att revidera befintliga testriktlinjer och ta fram nya riktlinjer för screening och testning av potentiella hormonstörande ämnen (5). Inom ramen för denna verksamhet utökades TG 407 (motsvaras av kapitel B.7 i denna bilaga) 2008 med parametrar för att påvisa endokrin aktivitet hos testkemikalier. Syftet med uppdateringen av TG 422 var att inkludera några endpoints som är relevanta för hormonstörande ämnen i riktlinjerna för screeningtester där exponeringsperioderna omfattar några av de känsliga utvecklingsperioderna (pre- eller tidiga postnatalperioder). 4. De nya utvalda endpoints som är relevanta för hormonstörande ämnen och som också ingår i TG 443 (utökad enkelgenerationsstudie av reproduktionstoxicitet, motsvarande kapitel B.56 i denna bilaga) inkluderades i TG 422 på grundval av en förstudie som behandlade vetenskapliga och tekniska aspekter av deras inkluderande samt nödvändiga anpassningar av testets utformning för att möjliggöra ett inkluderande (6). 5. Denna testmetod är utformad för att generera begränsad information om en testkemikalies effekter på den hanliga och honliga fortplantningsförmågan, t.ex. beträffande könskörtlarnas funktion, parningsbeteende, befruktning, embryoutveckling och födsel. Den är inte ett alternativ till, eller en ersättning för, de befintliga testmetoderna B.31, B.34, B.35 eller B.56. INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN 6. Vid bedömningen och utvärderingen av de toxiska egenskaperna hos en testkemikalie kan bestämningen av toxicitet med upprepad oral dosering genomföras efter att inledande information om toxicitet har erhållits genom testning av akut toxicitet. Denna studie ger information om eventuella troliga hälsorisker vid upprepad exponering under en relativt begränsad tidsperiod. Metoden innefattar den grundläggande toxicitetsstudien med upprepad dosering som kan användas för kemikalier för vilka en 90-dagarsstudie inte är motiverad (t.ex. när produktionsvolymen inte överskrider vissa gränser) eller som en inledning till en långtidsstudie. Vid genomförandet av studien bör man alltid följa de vägledande principer och överväganden som beskrivs i OECD:s vägledningsdokument 19 om erkännande, bedömning och användning av kliniska tecken som humana endpoints för försöksdjur som används för säkerhetsbedömningar (7). 7. Metoden består dessutom av ett screeningtest för reproduktions-/utvecklingstoxicitet och kan därför även användas för att ge preliminär information om möjliga effekter på fortplantningsförmågan hos hanar och honor, t.ex. beträffande könskörtlarnas funktion, parningsbeteende, befruktning, embryoutveckling och förlossning, antingen för en tidig bedömning av testkemikaliers toxikologiska egenskaper eller för bedömning av farliga testkemikalier. Denna testmetod ger ingen komplett information om alla aspekter av reproduktion och utveckling. Metoden ger endast begränsad möjlighet att detektera postnatala uttryck på prenatal exponering, eller effekter som kan ha orsakats av postnatal exponering. Bland annat på grund av selektiviteten hos endpoints samt studiens begränsade varaktighet ger denna metod inga bevis eller definitiva svar om utebliven effekt på reproduktion/utveckling. Vid avsaknad av data från andra toxicitetstest om reproduktion/utveckling kan de positiva resultaten dessutom användas för en inledande riskbedömning och bidra till beslutsfattande gällande vilka övriga test som behövs och när. 8. Resultaten som erhölls genom de endokrinrelaterade parametrarna bör betraktas mot bakgrund av OECD:s begreppsram för provning och bedömning av hormonstörande ämnen (8). Den vidareutvecklade OECD TG 422 ingår i nivå 4 av begreppsramen som ett in vivo-test som genererar data om skadliga effekter för endokrinrelaterade endpoints. En endokrin signal kanske dock inte räcker för att påvisa att testkemikalien är ett hormonstörande ämne. 9. Denna metod lägger även vikt vid neurologiska effekter som en särskild endpoint samt behovet av noggranna kliniska observationer av djuren för att erhålla mesta möjliga information. Metoden ska identifiera kemikalier med eventuell neurotoxisk verkan, vilket kan motivera mer ingående undersökningar av den aspekten. Denna metod kan dessutom ge basindikationer på immunologiska effekter. 10. Med tanke på avsaknaden av data från andra systemtest om reproduktions/utvecklingstoxicitet, neurotoxicitet och/eller immuntoxicitet kan de positiva resultaten användas för en inledande riskbedömning och bidra till beslutsfattande gällande vilka övriga test som behövs och när. Detta test är särskilt användbart som en del av SIDS (OECD Screening Information Data Set) för att bedöma befintliga kemikalier som det finns ringa eller ingen toxikologisk information om, och det kan användas som ett alternativ till genomförande av två separata test: ett för toxicitet vid upprepad dosering (OCD TG 407, motsvaras av kapitel B.7 i denna bilaga) respektive ett för reproduktions-/utvecklingstoxicitet (OECD TG 421, motsvaras av kapitel B.63 i denna bilaga). Det kan även användas som en preliminär undersökning inför mer omfattande studier om reproduktion/utveckling, eller av andra anledningar. 11. Den allmänna uppfattningen är att det finns skillnader i sensitivitet mellan dräktiga och icke-dräktiga djur. I kombinerade tester kan det därför vara mer komplicerat att fastställa dosnivåer som är korrekta för bedömning av både generell systemtoxicitet och specifik reproduktions-/utvecklingstoxicitet än vad det är i individuella test som utförs separat. Det kan därför vara svårare att tolka testresultaten vad gäller allmän systemtoxicitet än vid genomförande av separata studier med upprepade doser, särskilt när parametrarna för serum och histopatologi inte bedöms samtidigt i studien. På grund av denna tekniska komplexitet krävs det stor erfarenhet av toxicitetstest för att utföra detta kombinerade screeningtest. Å andra sidan kan ett kombinerat test, förutom att det kräver färre försöksdjur, ge bättre möjligheter att skilja direkta effekter på reproduktion/utveckling från effekter som beror på andra (systemiska) effekter. 12. I det här testet är doseringsperioden längre än i en konventionell 28-dagars studie med upprepade doser. Det kräver dock färre djur av varje kön per grupp jämfört med när en konventionell 28-dagars studie med upprepade doser genomförs som ett komplement till ett screeningtest för reproduktions-/utvecklingstoxicitet. 13. Vid test enligt denna metod används oral tillförsel av testkemikalien. Om tillförsel sker på annat sätt kan metoden behöva modifieras. 14. Innan testmetoden används på en blandning i syfte att samla in data för ett lagstadgat ändamål bör man överväga om, och i så fall varför, den kommer att ge godtagbara resultat för det syftet. Sådana överväganden är inte nödvändiga om blandningen måste provas enligt lag. 15. De definitioner som används finns i tillägg 1. TESTPRINCIP 16. Testkemikalien tillförs i graderade doser till flera grupper av hanar och honor. Hanarna ska behandlas i minst fyra veckor, inbegripet dagen före den planerade avlivningen (detta inkluderar minst två veckor före parning, under parningsperioden och ungefär två veckor efter parning). Eftersom hanarna endast behandlas under en begränsad period före parning kan fertilitet inte anses utgöra en särskilt känslig indikator för testikeltoxicitet. Därför krävs en detaljerad histologisk undersökning av testiklarna. En två veckors doseringsperiod före parning i kombination med efterföljande observationer av parning/fertilitet och en sammanlagd doseringsperiod på minst fyra veckor, följt av en ingående histopatologisk analys av hanarnas könskörtlar, anses vara tillräckligt för att påvisa flertalet effekter på hanarnas fertilitet och spermatogenes. 17. Honorna bör behandlas under hela studien. Detta inbegriper två veckor före parning (i syfte att täcka minst två kompletta ägglossningscykler), tiden fram till befruktning, dräktighetsperioden samt minst tretton dagar efter födsel, fram till dag för planerad avlivning. 18. Studiens längd, efter acklimatisering och bedömning av ägglossningscykeln före behandling, beror på honornas kondition och ligger på runt 63 dagar (minst 14 dagar före parning, (upp till) 14 dagars parning, 22 dagars dräktighetsperiod samt 13 dagars laktation). 19. Under administreringsperioden observeras djuren varje dag noggrant för tecken på toxicitet. Djur som dör eller avlivas under testet obduceras, och i slutet av testet avlivas överlevande djur och obduceras. BESKRIVNING AV TESTMETODEN Val av djurart 20. Denna testmetod är avsedd att användas på råtta. Om de parametrar som anges i denna TG 422 undersöks hos en annan gnagarart ska detta motiveras utförligt. I det internationella valideringsprogrammet för att påvisa hormonstörande ämnen i TG 407 var råtta den enda art som användes. Stammar med låg fertilitet eller välkänd hög incidens av utvecklingsdefekter ska inte användas. Friska tidigare obefruktade djur, som inte tidigare har använts i försök, ska användas. Försöksdjuren ska karakteriseras efter art, stam, kön, vikt och ålder. Vid testets början bör variationen i vikt mellan de använda djuren vara minimal och får inte överstiga ± 20 % av vardera könets medelvikt. När en upprepad oral dos utförs som inledning till en långtidsstudie, är det att föredra att djur från samma stam och ursprung används för båda studierna. Inhysning och utfodring 21. Alla förfaranden bör överensstämma med lokala normer för laboratoriedjurvård. Temperaturen i försöksdjurens utrymmen bör vara 22 °C (± 3 °). Den relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och helst inte överstiga 70 %, utom när rummet rengörs. Belysningen bör vara artificiell med ljusperioden 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. För utfodring kan konventionellt laboratoriefoder användas med obegränsad tillgång till dricksvatten. Valet av foder kan påverkas av behovet av att säkerställa en lämplig blandning av en testkemikalie när den administreras genom denna metod. 22. Djuren bör inhysas i små grupper med individer av samma kön. Djuren kan inhysas individuellt om det är vetenskapligt motiverat. Vid grupplacering i bur bör inte fler än fem djur inhysas i en och samma bur. För parningsprocedurerna används burar som är lämpliga för ändamålet. Dräktiga honor ska hysas individuellt och förses med bomaterial. Digivande honor ska hysas individuellt med sina ungar. 23. Fodret bör regelbundet analyseras beträffande främmande ämnen. Ett prov av fodret bör sparas tills rapporten är slutförd. Förberedelse av djuren 24. Friska yngre adulta djur fördelas slumpmässigt till behandlingsgrupper och burar. Burarna bör arrangeras på ett sådant sätt att eventuella effekter på grund av burarnas placering minimeras. Djuren ska ha en unik identifiering och hållas i sina burar under minst fem dagar innan undersökningen börjar, för att göra det möjligt för dem att acklimatiseras till förhållandena i laboratoriet. Beredning av doser 25. Det rekommenderas att testkemikalien administreras oralt såvida inte andra tillförselsätt anses mer lämpliga. Vid oral administrering ges testkemikalien i regel via sond, men testkemikalien kan även ges via fodret eller via dricksvattnet. 26. Vid behov kan testkemikalien upplösas eller suspenderas i en lämplig vehikel. Det rekommenderas att man, när så är möjligt, i första hand använder en vattenbaserad lösning/suspension, i andra hand en lösning/suspension i olja (t.ex. majsolja) och i tredje hand en lösning i andra vehiklar. För andra vehiklar än vatten bör vehikelns toxiska egenskaper vara kända. Testkemikaliens stabilitet och homogenitet i vehikeln bör bestämmas. FÖRFARANDE Djurens antal och kön 27. Det rekommenderas att varje grupp inledningsvis innehåller minst 10 hanar och 12–13 honor. Honornas ägglossningscykler undersöks före exponeringen, och individer som inte uppvisar typiska cykler på 4–5 dagar ska inte tas med i studien. Det är därför extra honor rekommenderas initialt så att varje grupp innehåller 10 honor. Förutom vid betydande toxiska effekter förväntas detta leda till minst 8 dräktiga honor per grupp, vilket i regel utgör det minsta acceptabla antalet dräktiga honor per grupp. Syftet med detta är att säkerställa ett tillräckligt antal dräktigheter och ungar för att möjliggöra en meningsfull utvärdering av testkemikaliens potential att påverka fertilitet, dräktighet och moderskaps- och dibeteende samt tillväxt och utveckling hos F 1 -avkomman från befruktning till dag 13 post partum. Om avlivningar är inplanerade under testets gång bör antalet djur ökas med det antal djur som enligt planeringen ska avlivas innan testet avslutas. En extra satellitgrupp på fem djur per kön i kontroll- respektive toppdosgruppen bör övervägas för observation beträffande reversibilitet, persistens eller fördröjda toxiska verkningar under minst 14 dagar efter behandlingen. Djuren i satellitgrupperna ska inte paras och används därför inte för bedömning av reproduktions-/utvecklingstoxicitet. Dosering 28. I allmänhet bör minst tre doseringsgrupper och en kontrollgrupp användas. Om det inte finns några lämpliga data tillgängliga kan en preliminär undersökning (djur av samma stam och ursprung) utföras för att underlätta bestämningen av de doser som ska användas. Med undantag av behandlingen med testkemikalien bör djuren i kontrollgruppen hanteras på exakt samma sätt som testgruppen. Om en vehikel används för att tillföra testkemikalien bör kontrollgruppen tillföras vehikeln i den största volym som används. 29. Dosnivåerna bör väljas med hänsyn till eventuell toxicitetsdata och (toxikologisk) kinetisk data som finns tillgänglig. Hänsyn bör tas till eventuell skillnad i sensitivitet mellan dräktiga och icke-dräktiga djur. Den högsta doseringsnivån bör väljas i syfte att den ska inducera toxiska verkningar, men inte leda till döden eller orsaka uppenbart lidande. Därefter bör en fallande nivå på doserna väljas i syfte att påvisa eventuella dosrelaterade responser och frånvaro av skadliga effekter vid den lägsta dosnivån. Det är ofta optimalt med två till fyra intervall, och tillägg av en fjärde testgrupp är ofta att föredra framför användning av mycket breda intervall (exempelvis mer än faktorn 10) mellan doseringsnivåerna. 30. Vid observation av tecken på allmän toxicitet (t.ex. minskad kroppsvikt, effekter på lever, hjärta, lungor eller njurar) eller andra förändringar som kanske inte är toxiska reaktioner (t.ex. nedsatt födointag, leverförstoring) ska observerade effekter avseende endokrint känsliga endpoints tolkas med försiktighet. Toleranstest 31. Om ett försök med en doseringsnivå om minst 1 000 mg per kg kroppsvikt och dag eller, vid tillförsel i föda eller dricksvatten, en motsvarande andel i födan eller dricksvattnet (baserad på fastställd kroppsvikt) och med användning av det tillvägagångssätt som beskrivits för denna studie, inte ger några observerbara toxiska effekter och om toxicitet inte förväntas på grundval av uppgifter från strukturellt närbesläktade ämnen, kan en fullständig undersökning med flera dosnivåer anses överflödig. Toleranstestet ska tillämpas utom när mänsklig exponering anger att en högre doseringsnivå ska användas. När testkemikalien tillförs på annat sätt, t.ex. via inandning eller applicering på huden, kan dess fysikalisk-kemiska egenskaper ofta användas för att fastställa den maximala exponeringsnivå som går att uppnå. Administrering av doser 32. Försöksdjuren behandlas med testkemikalien dagligen under en vecka. När testkemikalien tillförs genom sondmatning bör detta ske i en engångsdos via magsond eller lämplig intubationskanyl. Den maximala vätskevolymen som kan administreras vid ett tillfälle är beroende av försöksdjurets storlek. Volymen får inte överstiga 1 ml per 100 g kroppsvikt, utom för vattenlösningar där volymen kan uppgå till 2 ml per 100 g kroppsvikt. Med undantag för irriterande eller korrosiva testkemikalier, som normalt kommer att visa stegrade verkningar vid högre koncentrationer, bör variationer av testvolymen minimeras genom justering av koncentrationen för att säkerställa en konstant volym vid alla dosnivåer. 33. För kemikalier som tillförs via fodret eller dricksvattnet är det viktigt att säkerställa att kvantiteterna av testkemikalien ifråga inte påverkar normal närings- eller vattenbalans. När testkemikalien tillförs via kosten kan antingen en konstant foderkoncentration (PPM) eller en konstant doseringsnivå i förhållande till djurens kroppsvikt användas. Det alternativ som används ska anges. En testkemikalie som tillförs genom sondmatning bör ges vid samma tid varje dag och justeras minst varje vecka så att dosnivån hålls konstant i förhållande till djurens kroppsvikt. Om en kombinerad studie används för att förbereda en långtidsstudie eller en fullständig studie avseende reproduktionstoxicitet bör liknande foder användas i båda testerna. Försöksschema 34. Behandlingen av båda könen bör påbörjas två veckor före parning, efter att de har acklimatiserats under minst fem dagar och efter att honorna har screenats för normala ägglossningscykler (under en tvåveckorsperiod före behandlingen). Studien bör planläggas så att bedömningen av ägglossningscykeln påbörjas kort efter att djuret ifråga blivit könsmoget. Detta kan variera något mellan olika råttstammar i olika laboratorier, t.ex. 10 veckors ålder för Sprague Dawley-råttor och 12 veckors ålder för Wistar-råttor. Moderdjur med ungar bör avlivas på dag 13 post partum, eller kort därefter. Moderdjur och ungar behöver inte nödvändigtvis avlivas på samma dag, om detta omöjliggör för moderdjuret att fasta dagen före blodprovstagningen (om fastande är att föredra). Dagen för födseln (dvs. efter avslutad förlossning) definieras som dag 0 post partum. Honor som inte uppvisar några tecken på att ha parat sig ska avlivas 24–26 dagar efter parningsperiodens sista dag. Tillförseln fortsätts för båda könen under den två veckor långa parningsperioden. Hanar ska ges fortsatt behandling efter parningsperioden och minst till dess att en minimidoseringsperiod på totalt 28 dagar har uppnåtts. Därefter avlivas de eller hålls kvar och ges fortsatt behandling för en andra parning om så bedöms lämpligt. 35. Daglig dosering till dräktiga honor och moderdjur ska fortsätta genom hela dräktighetsperioden och minst till och med dag 13 post partum eller dagen före avlivningsdagen. När testkemikalien tillförs via inhalation eller applicering på huden ska doseringen fortsätta minst till och med dräktighetsdag 19, och doseringen bör återupptas så fort som möjligt efter födseln och inte senare än PND 4. 36. Djur i satellitgrupper för vilka uppföljande observationer planeras, om sådana är inkluderade i testet, ska inte paras. Dessa djur bör hållas i ytterligare minst 14 dagar efter den första planerade avlivningen av moderdjur, utan behandling för att fördröjda eller kvarstående toxiska effekter eller återhämtning från toxiska effekter ska kunna upptäckas. 37. Ett diagram för försöksschemat finns i tillägg 2. Ägglossningscykler 38. Ägglossningscyklerna bör övervakas innan behandlingen startar i syfte att välja ut honor med regelbundna cykler till försöket se punkt 27). Även vaginala utstryk bör övervakas dagligen från behandlingens början till dess att parning bevisligen skett. Om det vid doseringens början föreligger misstankar om akuta stresseffekter som kan störa ägglossningscyklerna kan laboratoriet exponera försöksdjuren under två veckor och därefter samla in vaginala utstryk dagligen i syfte att övervaka ägglossningscyklerna under minst två veckor före parning, med fortsatt övervakning under parningsperioden fram till dess att parning bevisligen skett. När celler från vagina eller livmoderhals samlas in bör försiktighet iakttas för att undvika skador på slemhinnan, eftersom sådana kan framkalla pseudodräktighet (8) (9). Parningsprocedur 39. I regel ska 1:1-parningar (en hane per hona) användas i denna studie. Undantagssituationer kan uppstå om hanar dör. Honan ska inhysas med samma hane tills parning bevisligen har skett eller två veckor har förflutit. Honorna ska undersökas varje morgon för närvaron av sperma eller vaginalproppar. Dag 0 av dräktigheten definieras som den dag då bevis på parning bekräftas (fynd av vaginalpropp eller sperma). Om parningen inte lyckas kan man överväga ett nytt parningsförsök där honor sammanförs med hanar med fastställd fertilitet från samma grupp. Kullstorlek 40. På dag 4 efter födseln kan storleken på varje kull justeras genom att eliminera extra ungar genom slumpmässigt urval, så att det blir, så nära som möjligt, fyra eller fem ungar per kön per kull, beroende på den normala kullstorleken i den råttstam som använts. Blodprov ska tas från två av överskottsungarna och sedan slås ihop och användas för bestämning av T4-nivåer i serum. Selektiv eliminering av ungar, t.ex. utifrån kroppsvikt eller anogenitalt avstånd (AGD), är inte lämpligt. När antalet han- eller honungar inte medger fyra eller fem av varje kön per kull, är partiell anpassning acceptabelt (t.ex. sex hanar och fyra honor). Inga ungar ska elimineras när kullstorleken är mindre än det avsedda målet (8 eller 10 ungar/kull). Om det endast finns en överskottsunge utöver det avsedda målet ska endast en unge elimineras och användas för blodinsamling och eventuell bedömning av T4 i serum. 41. Om kullstorleken inte korrigeras ska två ungar per kull avlivas på dag 4 efter födseln och blodprov tas för att mäta koncentrationen av tyreoideahormoner i serum. Om det är möjligt ska dessa två ungar per kull vara honungar, så att hanungar kan reserveras för senare bedömning av bröstvårteretention, förutom då eliminering av dessa honungar innebär att det inte finns några honor kvar för den slutliga bedömningen. Inga ungar ska elimineras när kullstorleken är mindre än 8 eller 10 ungar/kull (beroende på den normala kullstorleken för den råttstam som använts). Om det endast finns en unge mer än normalt antal ungar per kull ska endast en unge elimineras och användas för blodinsamling och eventuell bedömning av T4 i serum. Observationer 42. Allmänna kliniska observationer bör göras minst en gång per dag, helst vid samma tidpunkt varje dag med hänsyn till maximalt förväntade effekter efter doseringen. Djurens hälsotillstånd bör registreras. Minst två gånger dagligen bör alla djur observeras beträffande morbiditet och mortalitet. 43. En gång före den första exponeringen (för att möjliggöra individuella jämförelser), och därefter minst en gång per vecka, ska ingående kliniska observationer göras av samtliga föräldradjur. Dessa observationer bör göras utanför buren på en ”standardarena” och helst vid samma tidpunkt varje gång. Observationerna ska registreras noggrant, helst med hjälp av ett poängsystem som definierats utförligt av testlaboratoriet. Åtgärder bör vidtas för att säkerställa att variationen i testbetingelser är minimal och att observationerna helst utförs av personer som inte känner till behandlingen. Observationerna bör omfatta, men inte begränsas till, förändringar i hud, päls, ögon, slemhinnor, förekomst av sekret och utsöndringar samt autonom aktivitet (t.ex. tårflöde, piloerektion, pupillstorlek, ovanligt andningsmönster). Förändringar i gång, hållning och reaktion på hantering liksom eventuella kramper eller spasmer, stereotypier (t.ex. överdrivet putsande, repetitivt cirklande), svåra eller förlängda förlossningar eller bisarrt beteende (t.ex. självstympning, baklängesgång) ska också registreras (10). 44. Vid ett tillfälle under studiens gång ska en bedömning göras av djurens sinnesreaktioner på olika sorters stimuli (t.ex. auditiva, visuella och proprioceptiva stimuli) (8) (9) (11), samt av djurens gripstyrka (12) och motorisk aktivitet (13), och för denna bedömning ska fem hanar och fem honor väljas ut slumpmässigt ur varje grupp. Ytterligare uppgifter om de procedurer som kan följas finns i respektive hänvisningar. Dock kan även andra procedurer än de som hänvisas till användas. När det gäller hanarna ska nämnda funktionsobservationer göras mot slutet av doseringsperioden, kort före planerad avlivning men före hematologisk eller klinisk blodprovstagning (se punkterna 53–56 inklusive fotnot 1). Honorna bör befinna sig i ett liknande fysiologiskt tillstånd vid tidpunkten för dessa funktionstester, vilka företrädesvis ska utföras en gång under den sista laktationsveckan (t.ex. LD 6–13), kort före planerad avlivning. Eventuell separation av moderdjur och deras ungar ska minimeras så långt det är möjligt. 45. Funktionsobservationer som görs en gång mot slutet av studien kan utelämnas om studien utförs som inledning till en subkronisk (90-dagars) eller en långtidsstudie. I så fall bör funktionsobservationerna i stället tas med i nämnda uppföljningsstudie. Å andra sidan kan tillgången på data om funktionsobservationer från studien med upprepad dosering öka möjligheten att välja dosnivåer för en efterföljande subkronisk studie eller långtidsstudie. 46. I undantagsfall kan funktionsobservationer utlämnas för grupper som annars skulle uppvisa tecken på toxicitet i sådan utsträckning att det väsentligen skulle påverka funktionstestets prestanda. 47. Dräktighetsperioden bör registreras och beräknas från dräktighetsdag 0. Varje kull ska undersökas snarast möjligt efter nedkomsten i syfte att fastställa antal och kön för ungar, dödfödda, levande födda, småväxta djur (ungar som är avsevärt mindre än motsvarande kontrollungar) samt eventuella större avvikelser. 48. Levande ungar ska räknas och könsbestämmas, och kullarna ska vägas inom 24 timmar efter födseln (dag 0 eller dag 1 post partum) samt åtminstone på dag 4 och 13 post partum. Utöver observationerna av föräldradjuren (se punkterna 43 och 44) ska allt onormalt beteende hos ungarna registreras. 49. AGD på varje unge ska mätas på samma dag efter födseln, någon gång mellan PND 0 och PND 4. Ungarnas kroppsvikt bör samlas in under dagen för AGD-mätningen, och AGD bör normaliseras till ett mått på ungarnas storlek, företrädesvis kubikroten ur kroppsvikten (14). Antal bröstvårtor/vårtgårdar på hanungarna ska räknas på PND 12 eller 13 enligt rekommendationerna i OECD GD 151 (15). Kroppsvikt och foder-/vattenkonsumtion 50. Hanar och honor ska vägas på behandlingens första dag, minst en gång i veckan därefter samt vid testets slut. Under dräktighetstiden ska honorna vägas på dag 0, 7, 14 och 20 samt inom 24 timmar efter födseln (dag 0 eller 1 post partum) och åtminstone på dag 4 och 13 post partum. Dessa observationer bör rapporteras individuellt för varje vuxet djur. 51. Under tiden före parning, dräktighetsperiod samt laktation ska foderintaget mätas åtminstone en gång i veckan. Det är inte obligatoriskt att mäta foderintaget under parningsperioden. Om testkemikalien tillförs via dricksvattnet bör även vattenkonsumtionen mätas under nämnda perioder. Hematologi 52. Vid ett tillfälle under studiens gång ska följande hematologiska undersökningar göras på fem hanar och fem honor som väljs ut slumpmässigt ur varje grupp: hematokrit, hemoglobinkoncentrationer, räkning av röda blodkroppar, retikulocyter, total- och differentialräkning av vita blodkroppar, blodplättsräkning samt ett mått på koaguleringstid och koaguleringsförmåga. Andra bestämningar som bör utföras, om testkemikalien eller dess förmodade metaboliteter har eller misstänks ha oxiderande egenskaper, inkluderar methemoglobinkoncentration och Heinz-kroppar. 53. Blodproven ska tas från ett angivet ställe. Honorna bör befinna sig i ett liknande fysiologiskt tillstånd under provtagningen. För att undvika praktiska problem relaterade till skillnad i dräktighetslängd kan blodprovstagningen utföras i slutet av perioden före parning i stället för strax innan, eller i samband med, avlivningen av djuren. Blodproven på hanarna ska helst tas strax innan, eller i samband med, avlivningen av djuren. Blodproven på hanarna kan också tas i slutet av perioden före parning om denna tidpunkt har föredragits för honorna. 54. Alla blodprov ska förvaras under lämpliga förhållanden. Klinisk biokemi 55. En klinisk biokemisk bedömning i syfte att undersöka större toxikologiska effekter på vävnaderna, och i synnerhet på njurar och lever, bör utföras på de blodprover som samlats in från de fem hanar och fem honor som valts ut från varje grupp. Det rekommenderas att djuren fastar natten före blodprovstagningen. ( 22 ) Undersökningar av plasma eller serum bör omfatta natrium, kalium, glukos, totalkolesterol, urinämne, kreatinin, totalprotein och albumin, minst två enzymer som indikerar effekter på leverceller (t.ex. alaninaminotransferas, aspartataminotransferas och sorbitoldehydrogenas) samt gallsyror. Mätningar av ytterligare enzymer (från lever eller annat ursprung) och bilirubin kan under vissa omständigheter ge användbar information. 56. Blodprov tas från ett definierat ställe utifrån följande schema: — från minst två ungar per kull på dag 4 efter födseln, om antalet ungar så tillåter (se punkterna 40 och 41), — från alla moderdjur och minst två ungar per kull när försöket avslutas på dag 13, och — från alla vuxna hanar, vid försökets slut. Alla blodprov ska förvaras under lämpliga förhållanden. Blodproverna som tas på 13 dagar gamla ungar samt vuxna hanar ska analyseras för tyreoideahormoner (T4) i serum. Ytterligare analys av T4 i blodproven från moderdjuren och de 4 dagar gamla ungarna görs om det bedöms relevant. Om det är relevant kan blodet även analyseras för andra hormoner. Ungarnas blod kan samförvaras per kull för analyser av tyreoideahormoner. Tyreoideahormonerna (T4 och TSH) bör helst mätas som ett totalvärde. 57. Följande urinanalyser kan utföras på fem slumpmässigt utvalda hanar från varje grupp under studiens sista vecka med hjälp av schemalagd urininsamling: utseende, volym, osmolalitet eller specifik vikt, pH, protein, glukos och blod/blodceller. 58. Dessutom bör undersökning av serummarkörer av allmänna vävnadsskador övervägas. Andra bestämningar som bör utföras om testkemikaliens kända egenskaper kan, eller misstänks, påverka relaterade metaboliska profiler omfattar kalcium, fosfat, fastevärden av triglycerider och glukos samt specifika hormoner, methemoglobin och kolinesteras. Detta behöver undersökas från fall till fall. 59. Följande faktorer kan påverka variationen och de absoluta koncentrationerna för hormonbestämningarna: — Tidpunkt för avlivningen beroende på hormonkoncentrationernas dygnsvariation. — Avlivningsmetod för att undvika onödig stress hos djuren som kan påverka hormonkoncentrationerna. — Testsatser för hormonbestämningar som kan skilja sig åt genom sina standardkurvor. 60. Plasmaprover särskilt avsedda för hormonbestämning bör tas vid en jämförbar tid på dagen. De numeriska värden som erhölls vid analys av hormonkoncentrationer skiljer sig åt mellan de olika analyssatser som finns i handeln. 61. Om historiska basdata är otillräckliga bör hänsyn tas till hematologiska och kliniska biokemiska variabler innan doseringen påbörjas eller företrädesvis för en uppsättning djur som inte ingår i försöksgrupperna. För honorna ska data samlas in från digivande djur. PATOLOGI Obduktion 62. Alla vuxna djur i undersökningen bör underkastas en fullständig detaljerad obduktion som omfattar en noggrann yttre granskning av kroppen och alla kroppsöppningar liksom av kranium och bröst- och bukhåla samt deras innehåll. Särskild uppmärksamhet bör ägnas åt organen i reproduktionssystemet. Antal implantationsställen ska registreras. Vaginala utstryk ska undersökas på dagen för obduktionen för att fastställa stadium i ägglossningscykeln och möjliggöra korrelation med histopatologin hos honornas fortplantningsorgan. 63. På samtliga hanar ska all angränsande vävnad putsas bort från testiklar och bitestiklar liksom från prostata och sädesblåsor med koaguleringskörtlar, varefter våtvikten mäts snarast möjligt efter dissektion innan organen hinner torka. Utöver detta kan fler organ vägas, som till exempel muskelkomplexen levator ani och bulbocavernosus, Cowpers körtlar eller ollonet hos hanar samt äggstockspar (våtvikt) och livmoder (inklusive livmoderhals) hos honor. Om dessa organ vägs ska deras vikt registreras snarast möjligt efter dissektion. Äggstockar, testiklar, bitestiklar, accessoriska könsorgan samt alla organ som uppvisar skador vid makroskopisk undersökning ska sparas från samtliga vuxna försöksdjur. 64. Sköldkörtlar ska sparas från alla vuxna hanar och honor samt från två 13 dagar gamla ungar från varje kull (en hane och en hona) och förvaras i det fixativ som bedöms lämpligast för en senare histopatologisk undersökning. Sköldkörtelns vikt kan bestämmas efter fixering. Putsning ska också göras väldigt försiktigt, och först efter fixeringen för att undvika vävnadsskador. Vävnadsskador kan påverka den histopatologiska analysen negativt. Blodprover bör tas från ett angivet ställe strax före eller i samband med avlivningen av djuren, och förvaras under lämpliga förhållanden (se punkt 56). 65. För minst fem vuxna hanar och honor som valts ut slumpmässigt från varje grupp (utom sådana som påträffats döende och/eller avlivats före försökets slut) ska all angränsande vävnad putsas bort från lever, njurar, binjurar, bräss, mjälte, hjärna och hjärta, beroende på vad som gäller, och organens våtvikt ska mätas snarast möjligt efter dissektion innan de hinner torka. Följande vävnader och organ bör bevaras i det mest lämpade fixeringsmediet med hänsyn till både typen av vävnad och planerade efterföljande histopatologiska undersökningar: alla större skador, hjärna (representativa områden inklusive cerebrum, cerebellum och pons), ryggmärg, ögon, mage, tunn- och tjocktarm (inklusive Peyers plack), lever, njurar, binjurar, mjälte, hjärta, bräss, luftstrupe och lungor (konserverade genom uppumpning med fixeringsmedel följt av nedsänkning), könskörtlar (testiklar och äggstockar), accessoriska könsorgan (livmoder och livmoderhals, bitestiklar, prostata, sädesblåsor plus koaguleringskörtlar), vagina, urinblåsa, lymfkörtlar (utöver den mest proximala dräneringsnoden bör en annan lymfnod tas i enlighet med laboratoriets erfarenheter (16)), perifer nerv (ischias eller tibia) helst nära muskeln, skelettmuskel och ben med benmärg (sektion eller, alternativt, ett nymonterat benmärgsaspirat). Det rekommenderas att testiklarna fixeras genom nedsänkning i Bouins lösning eller modifierat fixeringsmedel enligt Davidson (16) (17) (18). Fixering med formalin rekommenderas inte för dessa vävnader. Tunica albuginea kan punkteras försiktigt och ytligt med en nål på organets båda poler för en snabb inträngning av fixeringsmedlet. Kliniska och andra fynd kan indikera behovet av att undersöka ytterligare vävnader. Även samtliga organ som sannolikt är målorgan, baserat på kunskap om testkemikaliens egenskaper, ska konserveras. 66. Följande vävnader kan ge värdefulla tecken på endokrinrelaterade effekter: könskörtlar (äggstockar och testiklar), accessoriska könsorgan (livmoder inklusive livmoderhals, bitestiklar, sädesblåsor med koaguleringskörtlar, dorsolaterala och ventrala prostata), vagina, hypofys, hanliga bröstkörtlar och binjurar). Förändringar i hanliga bröstkörtlar är inte tillräckligt väl dokumenterade, men denna parameter kan vara väldigt känslig för ämnen med östrogen verkan. Observation av organ/vävnader som inte nämns i punkt 65 är valfria. 67. Döda ungar och ungar som avlivas på dag 13 post partum, eller kort därefter, ska undersökas noga åtminstone externt för grova avvikelser. Särskild uppmärksamhet bör fästas vid de yttre reproduktionsorganen, som ska undersökas för tecken på avvikande utveckling. Histopatologi 68. En fullständig histopatologisk analys bör utföras på bevarade organ och vävnader från de utvalda djuren i kontroll- och högdosgrupperna (med särskild tonvikt på spermatogenesens stadier i de hanliga könskörtlarna och histopatologin hos den interstitiala cellstrukturen i testiklarna). Sköldkörtlar från ungar och resterande vuxna djur kan undersökas vid behov. Dessa undersökningar bör utsträckas till djur i alla andra doseringsgrupper, om behandlingsrelaterade förändringar observeras i högdosgruppen. Vägledningen om histopatologi (10) omfattar detaljerad information om dissektion, fixering, sektionering och histopatologi av endokrina vävnader. 69. Alla stora skador bör undersökas. Målorgan från övriga dosgrupper bör undersökas som ett led i NOAEL-klarläggningsprocessen, och särskilt organ från grupper som påstås uppvisa NOAEL. 70. Om en satellitgrupp används bör en histopatologisk undersökning utföras på de vävnader och organ på vilka effekter har visats i de behandlade grupperna. DATA OCH RAPPORTERING Data 71. Data bör rapporteras individuellt per djur. Därutöver bör alla data sammanfattas i tabellform, som för varje testgrupp visar antal djur vid testets början, antal djur som hittats döda under testet eller som avlivats av humanitära skäl och tidpunkten för dödsfallen eller avlivningen, antal fertila djur, antal dräktiga honor, antal djur som visar tecken på toxicitet, en beskrivning av de tecken på toxicitet som observerats, inklusive tidpunkt för de första tecknen och deras varaktighet och allvarlighetsgrad, typ av histopatologiska förändringar, samt alla relevanta data om kullarna. I tillägg 3 finns ett tabellformat som har visat sig vara mycket användbart för bedömning av reproduktions- och utvecklingseffekter. 72. Om möjligt bör numeriska resultat utvärderas genom en lämplig och allmänt vedertagen statistisk metod. Vid jämförelser av effekten längs ett dosintervall bör man undvika användningen av multipla t-tester. Statistiska metoder ska väljas vid utformningen av studien. Statistiska analyser av AGD och bröstvårteretention ska baseras på data för varje individuell unge med beaktande av effekter på kullen ifråga. När så är lämpligt ska kullen utgöra analysenheten. Statistiska analyser av ungarnas kroppsvikt ska baseras på data för varje individuell unge med beaktande av kullstorlek. På grund av denna studies begränsade omfattning har statistiska analyser om ”signifikans” begränsat värde för flera endpoints, särskilt reproduktiva sådana. Några av de vanligaste metoderna, särskilt parametriska tester för mätning av centrala tendenser, är olämpliga. Om statistiska analyser används ska en lämplig metod för distributionen av den valda variabeln väljas ut innan testet påbörjas. Utvärdering av resultaten 73. Resultaten bör utvärderas i termer av de observerade effekterna, inklusive obduktion och mikroskopiska iakttagelser. Utvärderingen ska omfatta förhållandet mellan testkemikaliedosen och närvaron eller frånvaron av samt incidensen och allvarlighetsgraden av avvikelser, inbegripet grova skador, identifierade målorgan, infertilitet, kliniska avvikelser, verkningar på reproduktionsförmågan och kullen, avvikelser rörande kroppsvikt, verkningar på mortaliteten samt alla andra toxiska effekter. 74. Eftersom hanarna endast behandlas under en kort tid bör histopatologin hos testiklar och bitestiklar bedömas tillsammans med fertilitetsdata vid uppskattningen av effekter på hanarnas fortplantningsförmåga. Historiska kontrolldata om reproduktion/utveckling (t.ex. kullstorlek, AGD, bröstvårteretention, T4-nivåer i serum), om sådana finns, kan också vara användbara vid tolkningen av studien. 75. Som kvalitetskontroll föreslås att historiska kontrolldata samlas in och att man för numeriska data beräknar variationskoefficienter, särskilt för de parametrar som kopplas till påvisande av hormonstörande ämnen. Dessa data kan sedan användas för jämförelseändamål när aktuella studier utvärderas. Testrapport 76. Testrapporten ska innehålla följande information: Testkemikalie: — Källa, satsnummer, sista förbrukningsdag om detta anges. — Testkemikaliens stabilitet, om den är känd. Monokomponentämne: — fysikaliskt tillstånd, vattenlöslighet och ytterligare relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper. — kemisk identifiering, t.ex. med IUPAC- eller CAS-namn, CAS-nummer, Smiles- eller InChI-kod, strukturformel, renhet samt motsvarande identifiering av föroreningar i förekommande fall och om det är praktiskt möjligt. Multikomponentämne, UVCB-ämnen och blandningar: — karakteriseras så långt som möjligt genom beståndsdelarnas kemiska identitet (se ovan), kvantitativa förekomst och relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper . Vehikel (i förekommande fall): — Motivering för val av vehikel, om annan än vatten. Försöksdjur: — Art och stam som används. — Djurens antal, ålder och kön. — Ursprung, inhysning, foder osv. — Djurens individuella vikt vid testets början. — Motivering för val av art, om inte råtta. Testbetingelser: — Grund för valet av dosnivå. — Uppgifter om testkemikaliens sammansättning/foderberedning, uppnådd koncentration, beredningens stabilitet och homogenitet. — Uppgifter om administreringen av testkemikalien. — Omvandling från fodrets/dricksvattnets testkemikaliekoncentration (ppm) till faktisk dos (mg/kg kroppsvikt/dag), i förekommande fall. — Uppgifter om foder- och vattenkvalitet. — Detaljerad beskrivning av slumpmässighetsförfaranden för att välja ut ungar för avlivning, om avlivning skett. Resultat: — Kroppsvikt/kroppsviktsförändringar. — Foder- och vattenkonsumtion, i förekommande fall. — Uppgifter om toxiska reaktioner uppdelade efter kön och dos, inbegripet fertilitet, dräktighet och andra tecken på — toxicitet. — Dräktighetsperiodens längd. Toxiska eller andra verkningar på reproduktion, avkomma, postnatal tillväxt etc. — Art, allvarlighetsgrad och varaktighet för kliniska observationer (vare sig de är reversibla eller ej). — Bedömningar av sensorisk aktivitet, gripstyrka och motorisk aktivitet. — Hematologiska tester med relevanta basvärden. — Kliniska biokemiska tester med relevanta basvärden. — Antal vuxna honor med normal eller onormal ägglossningscykel samt cykelns varaktighet. — Antalet levande födda och postimplantationsförlust. — Antal ungar med grova synliga avvikelser. En generell bedömning av yttre könsorgan, antalet småväxta ungar. — Tidpunkt för dödsfall under testet eller huruvida djuren överlevde fram till avslutningen. — Antal implantationer, kullstorlek och kullens vikt vid tiden för registrering. — Uppgifter om ungarnas kroppsvikt. — AGD på samtliga ungar (och deras kroppsvikt på dagen för mätning av AGD). — Bröstvårteretention hos hanungar. — Nivåer av tyreoideahormoner hos 13 dagar gamla ungar och vuxna hanar (samt på moderdjur och 4 dagar gamla ungar om?>detta har uppmätts). — Kroppsvikt vid avlivningen samt absolut och relativ organvikt för föräldradjuren. — Obduktionsfynd. — En detaljerad redogörelse för alla histopatologiska fynd. — Absorptionsdata (om sådana är kända). — Statistisk bearbetning av resultaten, i tillämpliga fall. Diskussion av resultaten. Slutsatser. Tolkning av resultaten 77. Denna studie bedömer reproduktions-/utvecklingstoxicitet vid administrering av upprepade doser. Eftersom vikten läggs på endpoints för både allmän toxicitet och reproduktions-/utvecklingstoxicitet, kommer resultaten från studien att göra det möjligt att skilja mellan sådana reproduktions-/utvecklingseffekter som förekommer i frånvaron av allmän toxicitet och sådana som bara uttrycks på nivåer som också är giftiga för föräldradjuret (se punkterna 7–11). Studien kan ge en indikation om behovet av vidare undersökningar och vägledning för hur uppföljande studier bör utformas. OECD:s vägledningsdokument 43 bör konsulteras som stöd vid tolkningen av reproduktions- och utvecklingsresultaten (19). OECD:s vägledningsdokument 106 om histologisk bedömning av endokrina och reproduktiva tester på gnagare (16) ger information om beredning och bedömning av (endokrina) organ och vaginala utstryk som kan vara användbar för denna testmetod. LITTERATURHÄNVISNINGAR (1) OECD (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Tillgängligt på förfrågan hos Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris (2) OECD (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokyo, 27–29 oktober, 1992. Tillgängligt på förfrågan hos Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris (3) Mitsumori K., Kodama Y., Uchida O., Takada K., Saito M. Naito K., Tanaka S., Kurokawa Y., Usami, M., Kawashima K., Yasuhara K., Toyoda K., Onodera H., Furukawa F., Takahashi M. and Hayashi Y. (1994). Confirmation Study, Using Nitro-Benzene, of the Combined Repeat Dose and Reproductive/ Developmental Toxicity Test Protocol Proposed by the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). J. Toxicol Sci., 19, s. 141–149. (4) Tanaka S., Kawashima K., Naito K., Usami M., Nakadate M., Imaida K., Takahashi M., Hayashi Y., Kurokawa Y. och Tobe M. (1992). Combined Repeat Dose and Reproductive/Developmental Toxicity Screening Test (OECD): Familiarization Using Cyclophosphamide. Fundam. Appl. Toxicol ., kap. 18, s. 89–95. (5) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, den 10–11 mars 1998, tillgänglig på förfrågan hos Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris. (6) OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment nr 217, Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris. (7) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 19), Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris. (8) Goldman J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M. och Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research , Part B, 80 (2), 84-97. (9) Sadleir, R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, i Auston C.R. and Short R.V. (Eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York. (10) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document nr 60. (11) Moser V.C., McDaniel K.M. and Phillips P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol . Appl. Pharmacol ., 108, s. 267–283. (12) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C. och Riley M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol ., 1, s. 233–236. (13) Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13, 599-609. (14) Gallavan R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp och V.L. Reynolds. (1999). ”Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights”, Reproductive Toxicology, 13: 383-390. (15) OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment nr 151. Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris. (16) OECD (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, nr 106, Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris. (17) Hess RA och Moore BJ. (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. I: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press. San Diego, CA, s. 52–85. (18) Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM. (2002). Fixation of Testes and Eyes Using a Modified Davidson’s Fluid: Comparison with Bouin’s Fluid and Conventional Davidson’s fluid. Toxicol . Pathol . 30, s. 524-533. (19) OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment nr 43, Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris. (20) OECD (2011), Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption, nr 150, Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris. Tillägg 1 DEFINITIONER (SE ÄVEN (20) OECD GD 150) Androgenicitet är förmågan hos en kemikalie att fungera som ett naturligt androgent hormon (t.ex. testosteron) hos ett däggdjur. Antiandrogenicitet är förmågan hos en kemikalie att undertrycka verkan av ett naturligt androgent hormon (t.ex. testosteron) hos ett däggdjur. Anti-östrogenicitet är förmågan hos en kemikalie att undertrycka verkan av ett naturligt östrogent hormon (t.ex. 17ß-östradiol) hos ett däggdjur. Antityreoid aktivitet är förmågan hos en kemikalie att undertrycka verkan av ett naturligt tyreoideahormon (t.ex. T3) hos ett däggdjur. Kemikalie ett ämne eller en blandning. Utvecklingstoxicitet uttryck för reproduktionstoxicitet i form av pre-, peri- eller postnatala strukturella eller funktionella störningar i avkomman. Dos är den mängd testkemikalie som administreras. Dosen uttrycks som testkemikaliens vikt per enhet kroppsvikt av försöksdjuret per dag (t.ex. mg/kg kroppsvikt/dag), eller som en konstant kostkoncentration. Dosering är en allmän term som omfattar dosen, dess frekvens samt doseringens varaktighet. Uppenbar toxicitet är en allmän term som beskriver tydliga tecken på toxicitet efter tillförsel av testkemikalien. Dessa bör vara tillräckliga för en riskbedömning och bör vara sådana att en ökning av den tillförda dosen kan förväntas resultera i utvecklingen av allvarliga toxicitetssymptom och sannolikt leda till mortalitet. Nedsatt fertilitet innebär störningar i fortplantningsförmågan hos hanen eller honan. Maternell toxicitet skadliga effekter på dräktiga honor som kan ske antingen specifikt (direkt effekt) eller icke-specifikt (indirekt effekt) och som är relaterade till det dräktiga tillståndet. NOAEL är förkortningen för den nivå där ingen skadlig effekt observeras. Detta är den högsta dosnivå där inga behandlingsrelaterade fynd observerats på grund av behandling. Östrogenicitet är förmågan hos en kemikalie att agera som ett naturligt östrogent hormon (t.ex. 17ß-östradiol) hos ett däggdjur. Reproduktionstoxicitet innebär skadliga effekter på avkomman och/eller en försämring av fortplantningsförmågan hos hanar och honor. Testkemikalie varje ämne eller blandning som testas med denna testmetod. Tyreoid aktivitet är förmågan hos en kemikalie att agera som ett naturligt tyreoideahormon (t.ex. T3) hos ett däggdjur. Validering är en vetenskaplig process utformad för att karakterisera de operativa kraven och begränsningarna hos en testmetod och visa dess tillförlitlighet och relevans för ett visst ändamål. Tillägg 2 FÖRSÖKSSCHEMA SOM VISAR STUDIENS MAXIMALA VARAKTIGHET, BASERAT PÅ EN 14-DAGARS PARNINGSPERIOD Tillägg 3 SAMMANFATTNING I TABELLFORM AV EFFEKTER PÅ REPRODUKTION/UTVECKLING IAKTTAGELSER VÄRDEN Dosering (enheter)....... 0 (kontroll) … … … … Startade par (N) Ägglossningscykel (för oregelbundna cykler åtminstone medellängd och frekvens) Honor som bevisligen befruktats (N) Honor som blivit dräktiga (N) Befruktningsdag 1–5 (N) Befruktningsdag 6–... (23) (N) Dräktighetsperiod ≤ 21 dagar (N) Dräktighetsperiod = 22 dagar (N) Dräktighetsperiod ≥ 23 dagar (N) Moderdjur med levande ungar (N) Moderdjur med levande ungar på dag 4 post partum (N) Implantationer/moderdjur (medel) Levande ungar/moderdjur vid födseln (medel) Levande ungar/moderdjur på dag 4 (medel) Könsfördelning (m/f) vid födseln (medel) Könsfördelning (m/f) på dag 4 (medel) Kullens vikt vid födseln (medel) Kullens vikt på dag 4 (medel) Ungarnas vikt vid födseln (medel) Ungarnas vikt vid tidpunkten för AGD-mätningen (medel – hanungar, medel – honungar) Ungarnas AGD på samma dag efter födseln, från födseln – dag 4 (medel – hanungar, medel – honungar, notera PND) Ungarnas vikt på dag 4 (medel) Ungarnas vikt på dag 13 (medel) Bröstvårteretention hos hanungarna på dag 13 (medel) ONORMALA UNGAR Moderdjur med 0 Moderdjur med 1 Moderdjur med ≥ 2 FÖRLORAD AVKOMMA Prenatal (implantationer minus levande födda) Honor med 0 Honor med 1 Honor med 2 Honor med ≥ 3 Postnatal (levande födda minus levande ungar på PND 13) Honor med 0 Honor med 1 Honor med 2 Honor med ≥ 3 B.65 IN VITRO-MEMBRANBARRIÄRTEST FÖR HUDKORROSION INLEDNING 1. Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 435 (2015). Hudkorrosion innebär att det uppstår en irreversibel skada på huden i form av synlig nekros genom epidermis och in i dermis, efter applicering av en testkemikalie enligt definitionen i Förenta nationernas globalt harmoniserade system för klassificering och märkning av kemikalier (GHS) (1) och Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1272/2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar (CLP-förordningen) ( 24 ) . Denna testmetod, som motsvarar OECD:s uppdaterade testriktlinje 435, innefattar ett in vitro-membranbarriärtest som kan användas för att identifiera frätande kemikalier. I testmetoden används ett konstgjort membran som är utformat för att ge en liknande respons på frätande kemikalier som djurhud in situ. 2. Hudkorrosivitet har traditionellt bedömts genom applicering av testkemikalien på levande djurs hud och bedömning av omfattningen av vävnadsskador efter en fastställd tidsperiod (2). Förutom denna testmetod har ett antal andra in vitro-testmetoder godkänts som alternativ (3)(4) till standardförfarandet för in vivo-test på kaninhud (kapitel B.4 i denna bilaga, motsvarar OECD TG 404) för att identifiera frätande kemikalier (2). Enligt GHS-systemets strategi för stegvis testning och utvärdering för bedömning och klassificering av hudfrätande verkan och OECD:s vägledningsdokument om ett integrerat synsätt på testning och bedömning av hudirritation/hudkorrosion (IATA) ( Guidance Document on Integrated Approaches to Testing and Assessment (IATA) for Skin Irritation/Corrosion ) rekommenderas användning av validerade och vedertagna in vitro -testmetoder för modulerna 3 och 4 (1)(5). I vägledningsdokumentet om IATA beskrivs flera moduler som grupperar olika informationskällor och analysverktyg, och där ges också i) vägledning om hur tillgängliga testdata och icke testdata kan integreras och användas i bedömningen av kemikaliers potential för hudirritation och hudkorrosion, och ii) förslag på hur man ska gå till väga när det krävs ytterligare testning, inbegripet när negativa resultat erhålls (5). I denna modulmetod kan positiva resultat från in vitro-testmetoder användas för att klassificera en kemikalie som frätande utan behov av djurförsök, och därigenom begränsa och förfina användningen av djur och minska den smärta och ångest som kan uppstå om djur används för detta ändamål. 3. Valideringsstudier har slutförts för in vitro-membranbarriärmodellen, som finns kommersiellt tillgänglig som Corrositex ® (6)(7)(8). De visar en övergripande noggrannhet för att förutsäga hudkorrosivitet på 79 % (128/163), en sensitivitet på 85 % (76/89) och en specificitet på 70 % (52/74) för en databas med 163 ämnen och blandningar (7). Baserat på den bekräftade validiteten har denna validerade referensmetod (VRM) rekommenderats för användning som ett led i en stegvis teststrategi för att bedöma kemikaliers potential att orsaka hudkorrosion (5)(7). Innan en in vitro-membranbarriärmodell för hudkorrosion kan användas för lagstadgade ändamål bör metodens tillförlitlighet, relevans (noggrannhet) och begränsningar för det föreslagna användningsområdet bestämmas för att garantera dess likhet med VRM (9) i enlighet med de på förhand fastställda prestandastandarderna (PS) (10). OECD:s ömsesidiga erkännande av data kan endast garanteras efter det att eventuella föreslagna metoder, nya eller uppdaterade, som följer PS har granskats och inkluderats i motsvarande OECD-testriktlinje. För närvarande omfattas endast en in vitro-metod av OECD:s testriktlinje 435 och denna testmetod, nämligen den kommersiellt tillgängliga modellen Corrositex ® . 4. Andra testmetoder för hudkorrosivitet baseras på användning av rekonstruerad human hud (OECD TG 431) (3) och isolerad råtthud (OECD TG 430) (4). Enligt denna testriktlinje delas frätande kemikalier även in i underkategorier, dvs. de tre GHS-underkategorierna för frätande verkan och FN:s tre transportförpackningsgrupper för faror i samband med frätande ämnen. Denna testriktlinje antogs första gången 2006 och uppdaterades 2015 för att överensstämma med vägledningsdokumentet om IATA och uppdatera förteckningen över kvalifikationsämnen. DEFINITIONER 5. Definitioner av begreppen finns i tillägget. INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR 6. Det test som beskrivs i denna testmetod gör det möjligt att identifiera frätande testkemikalier och dela in dem i underkategorier enligt GHS/CLP (tabell 1). Testmetoden kan även användas för att fatta beslut om huruvida specifika kemikalieklasser är frätande eller ej, t.ex. organiska och oorganiska syror, syraderivat ( 25 ) och baser för vissa transporttestningsändamål (7) (11) (12). Denna testmetod beskriver ett generiskt förfarande som liknar den validerade referenstestmetoden (7). Eftersom denna testmetod inte ger adekvat information om hudirritation bör nämnas att TM B.46 (motsvarande OECD TG 439) är särskilt avsedd för hälsoeffekten hudirritation in vitro (13). För en fullständig bedömning av lokala effekter på huden efter en enstaka dermal exponering se OECD:s vägledningsdokument om IATA (5). Tabell 1 GHS-kategori och underkategorier för frätande verkan på huden (26) Kategori för frätande verkan (kategori 1) (för myndigheter som inte använder underkategorier) Underkategorier för potentiell frätande verkan (26) (för myndigheter som använder underkategorier, inklusive CLP-förordningen) Frätande på ≥ 1 av 3 djur Exponering Anmärkning Frätande Frätande, underkategori 1A ≤ 3 minuter ≤ 1 timme Frätande, underkategori 1B > 3 minuter/≤ 1 timme ≤ 14 dagar Frätande, underkategori 1C > 1 timme/≤ 4 timmar ≤ 14 dagar 7. En begränsning med den validerade referensmetoden (7) är att många icke frätande kemikalier och vissa frätande kemikalier kanske inte kommer i fråga för testning baserat på det inledande kompatibilitetstestet (se punkt 13). Vattenbaserade kemikalier med pH-värde i intervallet 4,5–8,5 kommer ofta inte i fråga för testning, men 85 % av de kemikalier som testades inom detta pH-intervall var icke frätande i djurförsök (7). In vitro-membranbarriärmetoden kan användas för att testa fasta ämnen (lösliga eller olösliga i vatten), vätskor (vattenbaserade eller icke vattenbaserade) samt emulsioner. Testkemikalier som inte orsakar en detekterbar förändring i kompatibilitetstestet (dvs. färgändring i det kemiska detektionssystemet för den validerade referenstestmetoden) kan inte testas med membranbarriärmetoden och bör därför testas med andra testmetoder. TESTPRINCIP 8. Testsystemet består av två delar: en syntetisk makromolekylär biobarriär och ett kemiskt detektionssystem. I denna testmetod påvisas via det kemiska detektionssystemet membranbarriärskada som orsakas av testkemikalier med frätande verkan efter applicering av testkemikalien på den syntetiska makromolekylära membranbarriärens yta (7), och som kan antas bero på samma frätande mekanism(er) som på levande hud. 9. Penetrationen av membranbarriären (eller genombrottet) kan mätas med hjälp av ett antal förfaranden eller kemiska detektionssystem, bland annat förändringar av färgen på ett pH-indikatorfärgämne eller andra egenskaper hos indikatorlösningen under barriären. 10. Det måste fastställas att membranbarriären är giltig, dvs. relevant och tillförlitlig, för den avsedda användningen. Detta kan till exempel göras genom att kontrollera att olika beredningar har likvärdiga barriäregenskaper, t.ex. att de kan upprätthålla en barriär mot icke frätande kemikalier och att kemikaliernas frätande egenskaper kan kategoriseras inom GHS-underkategorierna för frätande verkan (1). Klassificeringen beror på hur lång tid det tar för kemikalien att tränga igenom membranbarriären till indikatorlösningen. DEMONSTRATION AV KOMPETENS 11. Före rutinanvändning av in vitro-membranbarriärmetoden bör laboratoriet visa den tekniska kva