Kommissionens förordning (EG) nr 535/2002

av den 21 mars 2002

om ändring av bilaga C till rådets direktiv 64/432/EEG och om ändring av beslut 2000/330/EG

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR FATTAT DETTA BESLUT

med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen,

med beaktande av rådets direktiv 64/432/EEG av den 26 juni 1964 om djurhälsoproblem som påverkar handeln med nötkreatur och svin inom gemenskapen(1), senast ändrat genom kommissionens beslut 2001/298/EG(2), särskilt artikel 16.1 andra stycket i detta, och

av följande skäl:

(1) Vetenskapliga kommittén för djurs hälsa och välbefinnande antog den 11 oktober 1999 en rapport(3) om ändring av de tekniska bilagorna till rådets direktiv 64/432/EEG med hänsyn till den vetenskapliga utvecklingen när det gäller tuberkulos, brucellos och enzootisk bovin leukos.

(2) I enlighet med ovannämnda rapport bör test för att upptäcka brucellos utföras enligt den tredje utgåvan, 1996, av "Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines" från Internationella byrån för epizootiska sjukdomar (OIE).

(3) I augusti 2001 offentliggjorde OIE den fjärde utgåvan, 2000, av ovannämnda handbok, med bland annat vissa ändringar av beskrivningen av brucellostest.

(4) Det var därför nödvändigt att ändra bilaga C till direktiv 64/432/EEG för att fastställa testförfaranden som kan tillämpas för övervaknings- och handelssyften inom gemenskapen och som så långt som möjligt motsvarar OIE:s normer men också tar hänsyn till Vetenskapliga kommitténs yttrande liksom yttrandet från de nationella referenslaboratorier som samarbetar inom ramen för Europeiska unionens nätverk för nationella referenslaboratorier för brucellos.

(5) Kommissionens beslut 2000/330/EG av den 18 april 2000 om godkännande av test för påvisande av antikroppar mot bovin brucellos enligt rådets direktiv 64/432/EEG(4) bör därför ändras.

(6) De åtgärder som föreskrivs i denna förordning är förenliga med yttrandet från Ständiga veterinärkommittén.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Bilaga C till direktiv 64/432/EEG skall ersättas med bilagan till den här förordningen.

Artikel 2

Beslut 2000/330/EG ändras på följande sätt:

1. Artikel 1 skall ersättas med följande: "Artikel 1

Komplementbindningstest, buffrade brucella-antigentest och Elisa-test som utförs i enlighet med bestämmelserna i bilaga C till direktiv 64/432/EEG godkänns härmed för utfärdande av intyg.".

2. Bilagan skall utgå.

Artikel 3

Denna förordning träder i kraft den tjugonde dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska gemenskapernas officiella tidning.

Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla medlemsstater.

Utfärdad i Bryssel den 21 mars 2002.

På kommissionens vägnar

David Byrne

Ledamot av kommissionen

(1) EGT 121, 29.7.1964, s. 1977/64.

(2) EGT L 102, 12.4.2001, s. 63.

(3) SANCO/B3/R10/1999.

(4) EGT L 114, 13.5.2000, s. 37.

BILAGA

"BILAGA C

BRUCELLOS

1. IDENTIFIERING AV AGENSEN

Påvisande av organismer av brucella-morfologi i abortmaterial, vaginalt sekret eller mjölk genom modifierad syrafast eller immunspecifik färgning utgör en sannolik diagnos för brucellos, särskilt om den stöds av serologiska test.

Efter isolering bör art och biovar identifieras genom fagolys och/eller oxidativa ämnesomsättningstest och enligt kulturella, biokemiska och serologiska kriterier.

De tekniska metoder och hjälpmedel som används, standardiseringen av dessa metoder och hjälpmedel samt tolkningen av resultaten skall motsvara kraven i OIE:s "Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines", fjärde utgåvan, 2000, kapitel 2.3.1 (brucellos hos nötkreatur), kapitel 2.4.2 (brucellos hos får och getter) och kapitel 2.6.2 (brucellos hos grisar).

2. IMMUNOLOGISKA TESTER

2.1 Standarder

2.1.1 Vid beredningen av samtliga antigener som används i rose bengal-testet (RBT), serumagglutinationstestet (SAT), komplementbindningstestet (CFT) och mjölkringtestet (MRT) skall Brucella abortus biovar 1 Weybridge stam nr 99 eller USDA stam 1119-3 användas.

2.1.2 Standardreferensserum för RBT, SAT, CFT och MRT är OIE:s internationella referensstandardserum (OIEISS), tidigare kallat WHO:s andra internationella anti-Brucella abortus-serum (ISAbS)

2.1.3 Standardreferensserum för Elisa-test är följande:

- OIEISS,

- svagt positivt OIE Elisa-standardserum (OIEELISAWPSS),

- starkt positivt OIE Elisa-standardserum (OIEELISASPSS),

- negativt OIE Elisa-standardserum (OIEELISANSS).

2.1.4 De ovannämnda standardserumen kan erhållas från Veterinary Laboratories Agency (VLA), Weybridge, Förenade kungariket.

2.1.5 OIEISS, OIEELISAWPSS, OIEELISASPSS, och OIEELISANSS är internationella primärstandarder utifrån vilka sekundära nationella referensstandarder (arbetsstandarder) måste skapas för varje test i de enskilda medlemsstaterna.

2.2 Elisa-test (enzyme-linked immunosorbent assays) eller andra bindningstest för att fastställa förekomsten av bovin brucellos i serum eller mjölk

2.2.1 Material och reagens

Den metod som används liksom tolkningen av resultaten skall ha validerats i enlighet med de principer som fastställs i kapitel 1.1.3 i OIE:s "Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines", fjärde utgåvan, 2000, och bör åtminstone omfatta laboratorieundersökningar och diagnostiska undersökningar.

2.2.2 Standardisering av testet

2.2.2.1 Standardisering av testförfarandet för enskilda serumprov:

a) en 1/150(1) utspädning av OIEISS eller en 1/2 utspädning av OIEELISAWPSS eller en 1/16 utspädning av OIEELISASPSS i ett negativt serum (eller i ett negativt samlingsprov av serum) bör ge en positiv reaktion,

b) en 1/600 utspädning av OIEISS eller en 1/8 utspädning av OIEELISAWPSS eller en 1/64 utspädning av OIEELISASPSS i ett negativt serum (eller i ett negativt samlingsprov av serum) bör ge en negativ reaktion,

c) OIEELISANSS bör alltid ge en negativ reaktion.

2.2.2.2 Standardisering av testförfarandet för samlingsprov av serum:

a) en 1/150 utspädning av OIEISS eller en 1/2 utspädning av OIEELISAWPSS eller en 1/16 utspädning av OIEELISASPSS i ett negativt serum (eller i ett negativt samlingsprov av serum) som på nytt spätts ut i negativt serum med antalet prov som ingår i samlingsprovet bör ge en positiv reaktion,

b) OIEELISANSS bör alltid ge en negativ reaktion,

c) testet skall vara avpassat för att påvisa infektion hos ett enskilt djur i den grupp av djur vars serumprov slagits samman.

2.2.2.3 Standardisering av testförfarandet för samlingsprov av mjölk eller vassla:

a) en 1/1000 utspädning av OIEISS eller en 1/16 utspädning av OIEELISAWPSS eller en 1/125 utspädning av OIEELISASPSS i ett negativt serum (eller i ett negativt samlingsprov av serum) bör ge en positiv reaktion,

b) OIEELISANSS utspädd 1/10 i negativ mjölk bör alltid ge en negativ reaktion,

c) testet skall vara avpassat för att påvisa infektion hos ett enskilt djur i den grupp av djur vars mjölk- eller vasslaprov slagits samman.

2.2.3 Villkor för användning av Elisa-test för att diagnostisera bovin brucellos

2.2.3.1 Vid användning av ovannämnda kalibreringsvillkor för Elisa-test på serumprov bör den diagnostiska sensitiviteten vid ett Elisa-test vara lika stor eller större än vid ett RBT eller CFT med hänsyn till den epidemiologiska situationen vid användningstillfället.

2.2.3.2 Vid användning av ovannämnda kalibreringsvillkor för Elisa-test på samlingsprov av mjölk skall den diagnostiska sensitiviteten vid ett Elisa-test vara lika stor eller större än vid ett MRT med hänsyn till både den epidemiologiska situationen vid användningstillfället och till genomsnittliga och förväntat extrema djurhållningssystem.

2.2.3.3 När Elisa-test används för utfärdande av intyg i enlighet med artikel 6.1 eller för fastställande av besättningsstatus i enlighet med bilaga A.II.10 måste sammanslagningar av serumprov ske på ett sådant sätt att testresultaten otvivelaktigt kan hänföras till det enskilda djur som ingår i samlingsprovet. Alla kontrolltester skall utföras på serumprov från enskilda djur.

2.2.3.4 Elisa-test kan användas på prov från mjölk som tagits från en anläggning med minst 30 % lakterande mjölkkor. Om metoden används måste åtgärder vidtas för att se till att de prov som tagits för att undersökas otvivelaktigt kan hänföras till de enskilda djur som mjölken kommer från. Alla kontrolltester skall utföras på serumprov från enskilda djur.

2.3 Komplementbindningstest (CFT)

2.3.1 Antigenet består av en bakteriesuspension i fenol-saltlösning (NaCl 0,85 % (m/v) och fenol på 0,5 % (v/v)) eller i en veronalbuffert. Antigenet kan levereras i koncentrerad form under förutsättning att den spädningsfaktor som skall användas är angiven på behållarens etikett. Antigenet skall lagras vid 4 oC och får inte frysas.

2.3.2 Serum skall inaktiveras enligt följande:

- Nötkreaturserum: 56 oC till 60 oC under 30 till 50 minuter.

- Svinserum: 60 oC under 30 till 50 minuter.

2.3.3 För att utföra en riktig reaktion inom ramen för testförfarandet bör man använda en komplementdos som är högre än den som lägst behövs för en fullständig hemolys.

2.3.4 Vid komplementbindningstestet skall följande kontroller göras varje gång:

a) Kontroll av serumets antikomplementära effekt.

b) Kontroll av antigenet.

c) Kontroll av sensibiliserade röda blodkroppar.

d) Kontroll av komplementet.

e) Kontroll av sensibiliteten i början av reaktionen med hjälp av ett positivt serum.

f) Kontroll av reaktionens specificitet med hjälp av ett negativt serum.

2.3.5 Resultatberäkning

OIEISS innehåller 1000 internationella CFT-enheter (ICFTU) per ml. Om detta standardserum testas enligt en viss metod anges resultatet som en titer (TOIEISS). Testresultatet för testserumet angivet som en titer (TTESTSERUM) skall uttryckas i ICFTU per ml. För att omvandla titervärdet till ICFTU används följande formel för att beräkna faktorn (F), som krävs för att omvandla en titer av ett okänt testserum (TTESTSERUM) som testas enligt den metoden till ett ICFTU-värde:

>PIC FILE= "L_2002080SV.002501.TIF">

och innehållet av internationella CFT-enheter per ml testserum (IFCTUTESTSERUM) enligt formeln:

>PIC FILE= "L_2002080SV.002502.TIF">

2.3.6 Tolkning av resultaten

Ett serum som innehåller minst 20 ICFTU per ml anses vara positivt.

2.4 Mjölkringtest (MRT)

2.4.1 Antigenet består av en bakteriesuspension i fenol-saltlösning (NaCl 0,85 % (m/v) och fenol på 0,5 % (v/v)) färgad med hematoxylin. Antigenet skall lagras vid 4 oC och får inte frysas.

2.4.2 Antigenets sensitivitet måste standardiseras i förhållande till OIEISS på ett sådant sätt att antigenet ger en positiv reaktion med en 1/500 utspädning av OIEISS i negativ mjölk och en negativ reaktion med en 1/1000 utspädning.

2.4.3 Mjölkringtest skall utföras på prov som motsvarar innehållet i varje mjölkkärl eller innehållet i varje leveranstank från anläggningen.

2.4.4 Mjölkproven får inte ha frusits ned, hettats upp eller utsatts för kraftig skakning.

2.4.5 Reaktionen skall utföras i enlighet med en av följande metoder:

- På en mjölkpelare med en höjd av minst 25 mm och på en mjölkvolym av 1 ml som tillsatts antingen 0,03 ml eller 0,05 ml av ett av de standardiserade färgade antigenerna.

- På en mjölkpelare med en höjd av minst 25 mm och på en mjölkvolym av 2 ml som tillsatts 0,05 ml av ett av de standardiserade färgade antigenerna.

- På en mjölkvolym av 8 ml som tillsatts 0,08 ml av ett av de standardiserade färgade antigenerna.

2.4.6 Blandningen av mjölk och antigener skall inkuberas vid 37 oC under 60 minuter med positiva och negativa arbetsstandarder. En efterföljande inkubation vid 4 oC under 16 till 24 timmar ökar testets sensitivitet.

2.4.7 Tolkning av resultaten

a) negativ reaktion: färgad mjölk, färglös grädde,

b) positiv reaktion:

- identiskt färgad mjölk och grädde, eller

- färglös mjölk och färgad grädde.

2.5 Rose Bengal plate-testet (RBT)

2.5.1 Antigenet består av en bakteriesuspension i buffrad lösning för brucellaantigen vid pH 3,65 ± 0,05 och färgad med färgämnet Rose Bengal. Antigenet skall vara klart för användning vid leveransen, lagras vid 4 oC och får inte frysas.

2.5.2 Antigenet skall beredas utan angivande av cellkoncentrationen, men dess sensitivitet måste standardiseras i relation till OIEISS så att antigenet ger en positiv reaktion vid en utspädning av serumet till 1/45 och en negativ reaktion vid en utspädning till 1/55.

2.5.3 Testet skall utföras på följande sätt:

a) Serumet (20-30 μ) blandas med samma volym antigen på en vit platta eller emaljerat fat på en fläck med en diameter på ungefär 2 cm. Blandningen skakas försiktigt under 4 minuter vid rumstemperatur och agglutinationsreaktionen iakttas därefter i god belysning.

b) En automatiserad metod får användas men måste vara minst lika sensitiv och noggrann som den manuella.

2.5.4 Tolkning av resultaten

Vid varje synlig reaktion skall testet betraktas som positivt, utom vid stark uttorkning runt kanterna.

Positiva och negativa arbetsstandarder bör ingå i varje testserie.

2.6 Serumagglutinationstest (SAT)

2.6.1 Antigenet består av en bakteriesuspension i fenol-saltlösning (NaCl 0,85 % (m/v) och fenol 0,5 % (v/v)). Formaldehyd får inte användas.

Antigenet kan levereras i koncentrerad form under förutsättning att den spädningsfaktor som skall användas är angiven på behållarens etikett.

För att minska antalet felaktigt positiva testresultat får EDTA tillföras antigensuspensionen upp till 5 mM slutlig testspädning. Därefter ställs pH-värdet i antigensuspensionen på nytt till 7,2.

2.6.2 OIEISS innehåller 1000 internationella agglutinationsenheter.

2.6.3 Antigenet bereds utan angivande av cellkoncentrationen, men dess sensitivitet skall standardiseras i relation till OIEISS så att antigenet antingen ger en 50-procentig agglutination med en slutlig serumutspädning på 1/600 till 1/1000 eller en 75-procentig agglutination med en slutlig serumutspädning på 1/500 till 1/750.

Det kan också vara tillrådligt att med hjälp av en grupp definierade serum jämföra reaktiviteten hos nya och tidigare standardiserade antigenpartier.

2.6.4 Testet utförs antingen i rör eller på mikroplattor. Blandningen av antigen och serumutspädning skall inkuberas under 16 till 24 timmar vid en temperatur på 37 oC.

För varje serum skall minst tre utspädningar förberedas. Utspädningar av misstänkt serum skall göras på ett sådant sätt att avläsningen av reaktionen vid positivitetsgränsen görs i det mellersta röret (eller mellersta fördjupningen om metoden med mikroplattor används).

2.6.5 Tolkning av resultaten

Graden av brucella-agglutination i ett serum skall uttryckas i internationella enheter (IU) per ml.

Ett serum som innehåller minst 30 IU per ml skall betraktas som positivt.

3. KOMPLETTERANDE TEST

3.1 Intrakutant brucellostest (BST)

3.1.1 Villkor för användningen av testet

a) Det intrakutana brucellostestet får inte användas i syfte att utfärda intyg för handeln inom gemenskapen.

b) Det intrakutana brucellostestet utgör en av de mest specifika testmetoderna för att upptäcka brucellos hos ovaccinerade djur, även om det inte går att ställa en diagnos på grundval av enbart positiva intrakutana reaktioner.

c) Nötkreatur som testats med negativt resultat i något av de serologiska test som anges i denna bilaga och som reagerar positivt på det intrakutana brucellostestet skall betraktas som infekterade.

d) Nötkreatur som testats med positivt resultat i något av de serologiska test som anges i denna bilaga kan få genomgå ett intrakutant brucellostest till stöd för tolkningen av de serologiska testresultaten, särskilt om en korsreaktion med antikroppar mot andra bakterier inte kan utesluts i brucellosfria eller officiellt fria besättningar.

3.1.2 Testet skall utföras med en standardiserad och definierad brucellosallergen som inte innehåller jämn lipopolysackarid(LPS)-antigen, eftersom detta kan framkalla ospecifika inflammatoriska reaktioner eller störa efterföljande serologiska test.

Ett sådant preparat är Brucellin INRA som framställs av en "icke-jämn" stam av B. melitensis. Kraven för dess framställning anges i avsnitt B2 i kapitel 2.4.2 i OIE:s "Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines", fjärde utgåvan, 2000.

3.1.3 Testförfarande

3.1.3.1 En volym av 0,1 ml brucellosallergen injiceras intrakutant i svansvecket, flanken eller i sidan av halsen.

3.1.3.2 Testet avläses efter 48-72 timmar.

3.1.3.3 Hudens tjocklek på injektionsstället mäts med skjutmått med nonie före injektionen och vid den efterföljande undersökningen.

3.1.3.4 Tolkning av resultaten:

Kraftiga reaktioner upptäcks lätt genom lokal svullnad och hårdhet.

En förtjockning av huden på 1,5 till 2 mm skall betraktas som en positiv reaktion på ett intrakutant brucellostest.

3.2 cElisa-test (competitive enzyme-linked immunosorbent assay)

3.2.1 Villkor för användningen av testet

a) cElisa-testet får inte användas i syfte att utfärda intyg för handeln inom gemenskapen.

b) cElisa-testet har visat sig ha en större specificitet än till exempel det indirekta Elisa-testet och får därför användas till stöd för tolkningen av de serologiska testresultaten.

3.2.2 Testförfarande

Testet skall utföras enligt anvisningarna i OIE:s "Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines", fjärde utgåvan, 2000, kapitel 2.3.1. 2 a.

4. NATIONELLA REFERENSLABORATORIER

4.1 Uppgifter och ansvarsområden

Nationella referenslaboratorier skall ansvara för

a) godkännande av resultaten av validitetsstudier som visar om de i medlemsstaterna använda testmetoderna är pålitliga,

b) fastställande av det högsta antalet prover som skall samlas i de Elisa-testsatser som används,

c) kalibrering av de sekundära nationella referensstandardserumen (arbetsstandarder) mot de internationella primärstandardserum som avses i punkt 2.1.

d) kvalitetskontroller av samtliga antigener och partier av Elisa-testsatser som används i medlemsstaterna,

e) samarbetet inom Europeiska unionens nätverk av nationella referenslaboratorier för brucellos.

4.2 Förteckning över nationella referenslaboratorier

BELGIEN

Centre d'études et de recherches vétérinaires et agrochimiques (CERVA/CODA) Groeselenberg 99 B - 1180 Bryssel/Brussel

DANMARK

Danish Veterinary Institute Bülowsvej 27 DK - 1790 Köpenhamn

TYSKLAND

Bundesinstitut für Gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin (BGVV) Nationales Veterinärmedizinisches Referenzlabor für Brucellose Postfach 33 00 13 D - 4191 Berlin

GREKLAND

Veterinary Laboratory of Larissa Department of Microbiology 6th km of National Road Larissa-Trikala GR - 4111 10 Larissa

SPANIEN

Laboratorio Central de Veterinaria de Santa Fe Camino del Jau S/N E - 18320 Santa Fe ( Granada )

FRANKRIKE

Laboratoire national et OIE/FAO de référence pour la brucellose Agence française de sécurité sanitaire des aliments (AFSSA) BP 67 F - 94703 Maisons-Alfort Cedex

IRLAND

Brucellosis Laboratory Model Farm Road Cork Irland

ITALIEN

Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Abruzzo e del Molise Via Campo Boario I - 64100 Teramo

LUXEMBURG

State laboratory for Veterinarian Medicine 54, av Gaston Diderich B.P. 2081 L - 1020 Luxembourg

NEDERLÄNDERNA

Centraal Instituut voor DierziekteControle CIDC-Lelystad Houtribweg 39 PO Box 2004 8203 AA Lelystad Nederland

ÖSTERRIKE

Bundesanstalt für veterinärmedizinische Untersuchungen Robert-Koch-Gasse 17 A - 2340 Mödling

PORTUGAL

Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (LNIV) Estrada de Benfica, n.o 701 P - 1549-011 Lissabon

FINLAND

National Veterinary and Food Research Institute Hämeentie 57 PO Box 45 FIN - 00581 Helsinki

SVERIGE

Statens veterinärmedicinska anstalt S - 751 89 Uppsala

FÖRENADE KUNGARIKET

1. FAO/WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Brucellosis

Veterinary Laboratories Agency

New Haw Addlestone Surrey KT15 3NB Förenade kungariket

2. Immunodiagnostics Department

Veterinary Sciences Division

Stoney Road Stormont Belfast BT4 3SD Förenade kungariket

(1) I den här bilagan uttrycks utspädningar som används för att skapa flytande reagens som till exempel 1/150, vilket betyder en utspädning på 1 till 150."