BILAGA I

System för de tester som ska utföras i enlighet med artiklarna 3, 4, 5, 7 och 8

1. ALLMÄNNA PRINCIPER FÖR FÖREKOMST AV DEN ANGIVNA SKADEGÖRAREN

1.1 Förekomst av den angivna skadegöraren misstänks om positivt resultat erhålls i det första testet för påvisande som utförs på den angivna växten. För symtomatiskt växtmaterial får det första testet för påvisande vara selektiv isolering.

1.2 Förekomst av den angivna skadegöraren bekräftas på symtomatiska prover av de angivna växterna i följande fall: a) Om det första testet för påvisande är selektiv isolering som ger upphov till kolonier med typisk morfologi, och positiva resultat erhålls i två identifieringstester. b) Om det första testet för påvisande är ett annat test än selektiv isolering, och i) positiva resultat erhålls i två identifieringstester efter det att provet har genomgått selektiv isolering, ii) positiva resultat erhålls i ett andra test för påvisande som inte är selektiv isolering.

1.3 Förekomst av den angivna skadegöraren bekräftas på asymtomatiska prover av de angivna växterna i följande fall: a) Om positivt resultat erhålls i det andra testet för påvisande, förutsatt att det första eller andra testet för påvisande är ett molekylärt (DNA-baserat) test (TaqMan®-realtids-PCR eller konventionell PCR). b) För prover som tas i en medlemsstat eller i ett område i en medlemsstat där den angivna skadegöraren inte har någon känd förekomst och för prover som har sitt ursprung i en annan medlemsstat: om positivt resultat erhålls i det andra testet för påvisande i enlighet med led a, och positiva resultat erhålls i två identifieringstester som utförs efter det att provet har genomgått selektiv isolering.

2. TESTER

2.1 Tester för påvisande

Testerna för påvisande ska konsekvent kunna påvisa minst 104 celler/ml återsuspenderad pellet.

Det andra testet för påvisande ska baseras på andra biologiska principer eller andra nukleotidregioner än det första testet för påvisande.

Testerna för påvisande är följande:

a) Immunofluorescensanalys, enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder.

b) FISH-test (van Beuningen et al. [1995] (1), enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder.

c) Isolering, enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder. Ett av följande två alternativ ska användas: i) Direkt isolering på semiselektiva (eller icke-selektiva) odlingsmedier, enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder. ii) Efter anrikning genom bioassay, isolering enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder.

d) Konventionellt PCR-test med de primrar som beskrivs av Pastrik (2000) (2), enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder.

e) TaqMan®-realtids-PCR med de primrar och prober som beskrivs av i) Schaad et al. (1999) (3), enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder, ii) Vreeburg et al. (2018) (4) (det s.k. NYtor-testet), enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder, iii) Gudmestad et al. (2009) enligt anpassningen av Vreeburg et al. (2018)4, enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder, iv) Massart et al. (2014) (5), enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder.

2.2 Identifieringstester

Identifieringstesterna är följande:

a) Immunofluorescensanalys, enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder.

b) Konventionellt PCR-test (Pastrik [2000]), enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder.

c) TaqMan®-realtids-PCR med de primrar och prober som beskrivs av i) Schaad et al. (1999), enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder, ii) Vreeburg et al. (2018) (det s.k. NYtor-testet), enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder, iii) Gudmestad et al. (2009) enligt anpassningen av Vreeburg et al. (2018), enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder, iv) Massart et al. (2014), enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder.

d) DNA-streckkodning, enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder.

e) MALDI-TOF-masspektometri (Zaluga et al. [2011] (6), enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder.

3. FLÖDESSCHEMAN ÖVER FÖRFARANDEN

Flödesschema nr 1: Diagnostiskt förfarande för förekomst av den angivna skadegöraren i symtomatiska prover av den angivna växten.

a Isolering kan användas som det första eller andra testet för påvisande. Om förekomst av den angivna skadegöraren misstänks på odlingsmediet ska kolonierna renas för att erhålla renkulturer på vilka två identifieringstester ska utföras. Positiva resultat i de två identifieringstesterna krävs för att bekräfta förekomsten av skadegöraren.

b Det tredje testet för påvisande ska baseras på andra biologiska principer eller andra nukleotidregioner.

Flödesschema nr 2: Diagnostiskt förfarande för den angivna skadegöraren i asymtomatiska prover av den angivna växten.

a Isolering ska inte användas.

b Det tredje testet för påvisande ska baseras på andra biologiska principer eller andra nukleotidregioner. Isolering ska inte användas.

c För de prover som avses i punkt 1.3 b krävs isolering av den angivna skadegöraren från provet följt av två positiva identifieringstester för att bekräfta förekomst av den angivna skadegöraren efter det andra positiva testet för påvisande.

4. PROVBEREDNING

4.1 Prover av asymtomatiska knölar

Standardprovet ska omfatta 200 knölar per test. Det lämpliga laboratorieförfarandet för att behandla naveländarna så att extraktet för påvisande av den angivna skadegöraren kan erhållas beskrivs i internationella diagnosstandarder.

4.2 Prover av annat asymtomatiskt växtmaterial än knölar

Latenta infektioner ska påvisas med användning av samlingsprover av stjälksegment. Förfarandet får användas för upp till 200 stjälkdelar från olika växter i ett prov. Det lämpliga laboratorieförfarandet för att desinficera och behandla stjälksegmenten så att extraktet för påvisande av den angivna skadegöraren kan erhållas beskrivs i internationella diagnosstandarder.

4.3 Prover av symtomatiska angivna växter

Vävnadssegment ska avlägsnas aseptiskt från kärlringen på knölar eller från stjälkens kärlsträngar på angivna växter som visar symtom på vissning. Det lämpliga laboratorieförfarandet för att behandla dessa vävnader så att extraktet för påvisande av den angivna skadegöraren kan erhållas beskrivs ingående i internationella diagnosstandarder.

(1) van Beuningen, A.R., Derks, H., Janse, J.D. (1995), ”Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in situ hybridization (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe”, Züchtungs Forschung, 1, 266–269.

(2) Pastrik, K.H. (2000), ”Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA”, European Journal of Plant Pathology, 106, 155–165.

(3) Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A., Knorr, D. (1999), ”Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIOPCR and an automated real-time fluorescence detection system”, Plant Disease, 83, 1095–1100.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018), ”Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach”, EPPO Bulletin, 48, 86–96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014), ”Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay”, European Journal of Plant Pathology, 138, 29–37.

(6) Zaluga, J., Heylen, K., Van Hoorde, K., Hoste, B., Vaerenbergh, J., Maes, M., De Vos, P. (2011), ”GyrB sequence analysis and MALDI-TOF MS as identification tools for plant pathogenic Clavibacter”, Systematic and applied microbiology, 34, 400–407 (10.1016/j.syapm.2011.05.001).