KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EG) nr 1459/98 av den 8 juli 1998 om en referensmetod för bestämning av vanillin i koncentrerat smör, smör eller grädde

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DENNA FÖRORDNING

med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen,

med beaktande av rådets förordning (EEG) nr 804/68 av den 27 juni 1968 om den gemensamma organisationen av marknaden för mjölk och mjölkprodukter (1), senast ändrad genom förordning (EG) nr 1587/96 (2), särskilt artiklarna 6.6 och 12.3 i denna, och

med beaktande av följande:

I kommissionens förordning (EG) nr 2571/97 om försäljningen av smör till sänkta priser och om beviljande av stöd för grädde, smör och koncentrerat smör avsett att användas i framställningen av konditorivaror, glass och andra livsmedel (3), föreskrivs spårning av grädde, smör och koncentrerat smör under olika förhållanden i syfte att kontrollera den slutliga användningen av dessa produkter.

På grund av spårningens betydelse för att ordningen skall fungera korrekt och för att aktörer som deltar i den skall behandlas likvärdigt bör gemensamma metoder införas för att bestämma de spårämnen som anges i förordning (EG) nr 2571/97.

Det är svårt att fastställa sådana referensmetoder för alla spårämnen samtidigt. Att införa en referensmetod för bestämning av vanillin i koncentrerat smör, smör eller grädde är ett ytterligare steg i denna riktning.

De åtgärder som föreskrivs i denna förordning är förenliga med yttrandet från Förvaltningskommittén för mjölk och mjölkprodukter.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Den analysmetod som fastställs i bilagan skall tillämpas som referensmetod för bestämning av vanillin i koncentrerat smör, smör eller grädde i enlighet med förordning (EG) nr 2571/97.

Koncentrerat smör, smör eller grädde har spårats i överensstämmelse med artikel 6 i förordning (EG) nr 2571/97 om resultaten överensstämmer med specifikationerna i punkt 8 i bilagan.

Artikel 2

Denna förordning träder i kraft den tredje dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska gemenskapernas officiella tidning.

Den skall tillämpas från och med den 1 september 1998.

Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla medlemsstater.

Utfärdad i Bryssel den 8 juli 1998.

På kommissionens vägnar

Franz FISCHLER

Ledamot av kommissionen

(1) EGT L 148, 28.6.1968, s. 13.

(2) EGT L 206, 16.8.1996, s. 21.

(3) EGT L 350, 20.12.1997, s. 3.

BILAGA

Bestämning av vanillininnehåll i koncentrerat smör, smör och grädde med HPLC

1. Användningsområde

Med denna metod bestäms mängden vanillin i koncentrerat smör, smör eller grädde.

Den skall tillämpas på prover som erhållits i enlighet med förordning (EG) nr 2571/97.

2. Princip

En känd mängd av provet extraheras med en blandning av isopropanol/etanol/acetonitril (1:1:2). Utfällning av största delen fett genom avkylning till mellan -15 °C och -20 °C, åtföljd av centrifugering.

Efter utspädning med vatten, bestämning av vanillininnehållet med HPLC.

3. Utrustning

Sedvanlig laboratorieutrustning, i synnerhet följande:

3.1 Frys med en temperatur på mellan -15 °C och -20°C.

3.2 Engångssprutor, 2ml.

3.3 Membranmikrofilter med 0,45 ìm porstorlek som är resistent mot en lösning som innehåller 5 % extraktionslösning (4.4).

3.4 Vätskekromatografisystem bestående av en pump (flöde på 1,0 ml/min), en injektor (20 ìl-injektion, automatisk eller manuell), en UV-detektor (inställd på 306 nm, 0,01 AU fullt utslag), en skrivare eller integrator och en kolonntermostat inställd på 25 °C.

3.5 Analyskolonn (250 mm × 4,6 mm innerdiameter) packad med Lichrospher RP 18 (Merck, 5 ìm) eller motsvarande.

3.6 Förkolonn (ca 20 mm × 3 mm innerdiameter), torrpackad med Perisorb RP 18 (30-40 ìm) eller motsvarande.

4. Reagenser

Alla använda reagenser skall vara av godkänd analytisk kvalitet.

4.1 Isopropanol

4.2 Etanol 96 % (v/v)

4.3 Acetonitril

4.4 Extraktionslösning

Blanda isopropanol (4.1), etanol (4.2) och acetonitril (4.3) i förhållandet 1:1:2 (v/v).

4.5 Vanillin (4-hydroxi-3-metoxibensaldehyd)

4.5.1 Vanillin-stamlösning (=500 ìg/ml)

Väg med 0,1 mg noggrannhet upp ca 50 mg (CM mg) vanillin (4.5) i en 100 ml mätkolv, tillsätt 25 ml extraktionslösning (4.4) och späd till märket med vatten.

4.5.2 Vanillin-standardlösning (=10 ìg/ml)

Överför med pipett 5,00 ml vanillin-stamlösning (4.5.1) till en mätkolv på 250 ml och späd till märket med vatten.

4.6 Metanol, HPLC-kvalitet

4.7 Isättika

4.8 Vatten av HPLC-kvalitet

4.9 HPLC rörlig fas

Blanda 300 ml metanol (4.6), ca 500 ml vatten (4.8) och 20,0 ml isättika (4.7) i en mätkolv på 1 000 ml och späd till märket med vatten (4.8). Filtrera genom 0,45 ìm filter.

5. Utförande

5.1 Provberedning

5.1.1 Smör

Värm provet tills det börjar smälta. Undvik lokal överhettning över 40 °C. När provet blir tillräckligt plastiskt skall det homogeniseras genom skakning. Rör om smöret i 15 s. innan ett prov tas. Väg upp 5 g (SM g) smör på 1 mg när och överför det till en mätkolv på 100 ml.

5.1.2 Koncentrerat smör

Omedelbart före provtagningen placeras behållaren med koncentrerat smör i en ugn med 40-50 °C värme tills det har smält fullständigt. Blanda provet genom att snurra eller röra. Undvik att luftbubblor bildas på grund av alltför häftig omrörning. Väg upp 4 g (SM g) koncentrerat smör på 1 mg när och överför det till en 100 ml mätkolv.

5.1.3 Grädde

Värm upp provet i ett vattenbad eller en inkubator med temperatur på 35-40 °C. Fördela fettet homogent genom att snurra och, om nödvändigt, röra. Kyl ned provet snabbt till 20 ± 2 °C. Provet bör se homogent ut, annars bör förfarandet upprepas. Väg upp 10 g (SM g) grädde på 1 mg när och överför det till en 100 ml mätkolv.

5.2 Beredning av provlösningen

Tillsätt ca 75 ml extraktionslösning (4.4) till provmängden (5.1.1, 5.1.2 eller 5.1.3), rör om eller skaka kraftligt under 15 minuter och späd till märket med extraktionslösning (4.4). Överför ca 10 ml av detta extrakt till ett provrör som försetts med en propp. Placera provröret i frysen (3.1) och låt det stå ca 30 minuter. Centrifugera det kalla extraktet 5 min vid ca 2 000 varv/min och häll upp omedelbart. Låt den upphällda lösningen svalna till rumstemperatur. Överför med pipett 5,00 ml upphälld lösning till en 100 ml mätkolv och späd till märket med vatten. Filtrera en alikvot genom ett membranmikrofilter (3.3). Filtratet är färdigt för bestämning genom HPLC.

5.3 Kalibrering

Överför med pipett 5,00 ml av vanillin-standardlösningen (4.5.2) till en 100 ml mätkolv. Tillsätt 5,0 ml extraktionslösning (4.4) och späd till märket med vatten. Denna lösning innehåller 0,5 ìg/ml vanillin.

5.4 Bestämning med HPLC

Låt kromatografisystemet stabiliseras under ca 30 min. Injicera standardlösningen (5.3). Upprepa detta tills skillnaden i toppyta eller topphöjd mellan två på varandra följande injektioner är mindre än 2 %. Vid ovannämnda betingelser är retentionstiden för vanillin ca 9 min. Analysera standardlösningen (5.3) i duplikat genom att injicera 20 ìl. Injicera 20 ìl av provlösningarna (5.2). Bestäm ytan eller höjden på den erhållna vanillintoppen. Upprepa injektionen av standardlösningen (5.3) i duplikat efter 10 injektioner av provlösningar (5.2).

6. Beräkning av resultaten

Beräkna den genomsnittliga toppytan (eller topphöjden) (AC) av de vanillintoppar som härrör från de duplikatinjektioner som omger varje serie av provlösningar (totalt 4 ytor).

Beräkna responsfaktorn (R):

R = >NUM>AC/

>DEN>CM

där CM är vanillinmassan i mg (4.5.1).

Halten (mg/kg) av vanillin (C) i provet ges av:

C = >NUM>AS × 20 × 0,96

>DEN>SM × R

där

AS: toppyta för provets vanillintopp

SM: provets massa i g (5.1.1, 5.1.2 eller 5.1.3)

20: faktor som tar hänsyn till utspädningarna av standardlösningen och provet

0,96 = korrigeringsfaktor för fetthalten i första utspädningen av provet

OBS:

I stället för toppyta kan topphöjd andvändas (se 8.3)

7. Metodens noggrannhet

7.1 Repeterbarhet (r)

Skillnaden mellan resultaten från två bestämningar som med kortast möjliga mellanrum utförts av en person som använder samma utrustning på identiskt provmaterial får inte vara större än 16 mg/kg.

7.2 Reproducerbarhet (R)

Skillnaden mellan resultaten från två bestämningar som utförts i olika laboratorier med hjälp av olika utrustning på identiskt provmaterial får inte vara större än 27 mg/kg.

8. Toleransgränser

8.1 Tre prover måste tas från den spårade produkten för att homogeniteten skall kunna kontrolleras.

8.2 Spårämne som erhållits antingen från vanilj eller från syntetisk vanillin.

8.2.1 250 gram 4-hydroxi-3-metoxibensaldehyd iblandas per ton.

8.2.2 Med ett konventionellt konfidensintervall på 95 % (CrD95) skall genomsnittet av individuella analyser av vart och ett av de tre proven som tagits för att kontrollera homogenitet inte understiga 236,0 mg/kg.

8.2.3 Utöver kriteriet i 8.2.2 används det lägsta analysresultatet för produkten för kontroll av att spårämnet är jämnt fördelat. Detta sker genom en jämförelse med följande gränser:

- 221,5 mg/kg (95 % av den minsta tillåtna iblandningen med konventionellt konfidensintervall [ISO CrD95]).

- 159,0 mg/kg (70 % av den minsta tillåtna iblandningen med konventionellt konfidensintervall [ISO CrD95]).

Koncentrationen av spårämne i det prov som ger det lägsta resultatet jämförs med en interpolering mellan 221,5 mg/kg och 159,0 mg/kg.

8.3 Spårämne som erhållits enbart från vaniljbönor eller fullständiga extrakt därav.

8.3.1 100 gram 4-hydroxi-3-metoxibensaldehyd iblandas per ton.

8.3.2 Med ett konventionellt konfidensintervall på 95 % (CrD95) skall genomsnittet av individuella analyser av vart och ett av de tre proven som tagits för kontroll av homogenitet inte understiga 86,0 mg/kg.

8.3.3 Utöver kriteriet i 8.3.2 används det lägsta analysresultatet för produkten för kontroll av att spårämnet är jämnt fördelat. Detta sker genom en jämförelse med följande gränser:

- 79,0 mg/kg (95 % av den minsta tillåtna iblandningen med konventionellt konfidensintervall [ISO CrD95]).

- 54,0 mg/kg (70 % av den minsta tillåtna iblandningen med konventionellt konfidensintervall [ISO CrD95]).

Koncentrationen av spårämne i det prov som ger det lägsta resultatet jämförs med en interpolering mellan 79,0 mg/kg och 54,0 mg/kg.

9. Anmärkningar

9.1 Repeterbarheten r är det värde under vilket den absoluta skillnaden mellan två individuella provresultat som har erhållits med samma metod på identiskt provmaterial under samma förhållanden (samma apparatur, samma laboratorium och ett kort tidsintervall) kan förväntas ligga inom en angiven sannolikhet. I frånvaro av andra indikationer är sannolikheten 95 %.

9.2 Reproducerbarheten R är det värde under vilket den absoluta skillnaden mellan två individuella provresultat som har erhållits med samma metod på identiskt provmaterial under olika förhållanden (olika personer, olika apparatur, olika laboratorier och/eller olika tidsintervall) kan förväntas ligga inom en angiven sannolikhet. I frånvaro av andra indikationer är sannolikheten 95 %.

9.3 Utbytet av tillsatt vanillin vid en nivå av 250 mg/kg smörolja varierar mellan 97,0 och 103,8. Den påträffade genomsnittshalten var 99,9 % med en standardavvikelse på 2,7 %.

9.4 Standardlösningen innehåller 5 % extraktionslösning för att kompensera för den toppbreddning som orsakas av närvaro av 5 % av extraktionslösningen i proven. Detta möjliggör kvantifiering med hjälp av topphöjden.

9.5 Analysen bygger på en linjär kalibreringskurva med en nollskärningspunkt. Genom användning av lämpliga utspädningar av standardlösningen (4.5.2) bör linjariteten kontrolleras första gången analysen utförs och sedan regelbundet och efter byten eller reparationer av HPLC-utrustningen.