KOMMISSIONENS BESLUT av den 5 februari 1996 om ändring av beslut 92/532/EEG om fastställande av provtagningsplaner och diagnostiska metoder för påvisande och bekräftelse av vissa fisksjukdomar (Text av betydelse för EES) (96/240/EG)

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR FATTAT DETTA BESLUT

med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen,

med beaktande av rådets direktiv 91/67/EEG av den 28 januari 1991 om djurhälsovillkor för utsläppande på marknaden av djur och produkter från vattenbruk (1), senast ändrad genom direktiv 95/22/EG (2), särskilt artikel 15 i detta, och

med beaktande av följande:

Provtagningsplanerna och de diagnostiska metoderna för påvisande och bekräftelse av vissa fisksjukdomar har fastställts genom kommissionens beslut 92/532/EEG (3).

Sedan detta beslut antogs har en utveckling skett i praktiken och inom vetenskapen som kräver att provtagningsplanerna och de diagnostiska metoderna uppdateras.

Denna uppdatering avser provernas storlek, vilka prover som skall tas, hur proverna skall transporteras och metoden för att isolera eventuella virus i proverna.

Samråd har skett med Vetenskapliga veterinärmedicinska kommittén som inrättats genom kommissionens beslut 81/651/EEG (4).

De åtgärder som föreskrivs i detta beslut är förenliga med yttrandet från Ständiga veterinärkommittén.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Bilagan till beslut 92/532/EEG skall ersättas med bilagan i detta beslut.

Artikel 2

Detta beslut riktar sig till medlemsstaterna.

Utfärdat i Bryssel den 5 februari 1996.

På kommissionens vägnar

Franz FISCHLER

Ledamot av kommissionen

(1) EGT nr L 46, 19.2.1991, s. 1.

(2) EGT nr L 243, 11.10.1995, s. 1.

(3) EGT nr L 337, 21.11.1992, s. 18.

(4) EGT nr L 233, 19.8.1981, s. 32.

BILAGA

DEL I

PROVTAGNING OCH DIAGNOSTIK VID VHS- OCH IHN-KONTROLLER

I. Provtagning

1. Tider för provtagning

Anläggningar skall inspekteras kliniskt minst två gånger om året mellan oktober och juni eller närhelst vattentemperaturen understiger 14 °C. Inspektionerna skall ske med minst fyra månaders mellanrum. Alla produktionsenheter (dammar, tankar, akvarier, kassar etc.) skall inspekteras med avseende på förekomst av fisk som har dött, är svag eller beter sig onormalt. Särskild uppmärksamhet skall (om möjligt) ägnas området kring vattenutsläpp, där svag fisk brukar samlas på grund av det strömmande vattnet.

2. Urval och insamling av prover

30-150 fiskar eller ovarievätskeprover skall samlas in för undersökning i samband med inspektionerna enligt tabell 1 A. Förekommer regnbågslax, skall inga fiskarter av annat slag ingå i provet. Förekommer inte regnbågslax, skall provet innehålla befintliga fiskarter om dessa är mottagliga för VHS eller IHN enligt bilaga A i direktiv 91/67/EEG om djurhälsovillkor för utsläppande på marknaden av djur och produkter från vattenbruk. De olika fiskarterna skall vara proportionellt representerade i provet. Under de första två åren av den fyraåriga kontrollperioden, innan anläggningen nått godkänd status, skall provet omfatta 150 individer för att man med 95 % säkerhet skall kunna påvisa en virusbärare vid en prevalens på 2 %, med undantag av anläggningar för laxfisk utan avelsbestånd i kustområden där provet skall omfatta 30 individer.

Under de sista två åren av kontrollperioden kan provets storlek minskas till 30 för att man med 95 % säkerhet skall kunna fastställa en andel virusbärare vid en prevalens på 10 %. Under följande år (bibehållande av godkänd status) kan provets storlek också minskas till 30.

Vid anläggningar som kan dokumentera historisk frihet från VHS och IHN under minst fyra år (baserat på ett regelbundet, officiellt hälsokontrollsprogram) kan den mindre provmängden användas under hela den inledande fyraårsperioden.

Om mer än en vattentäkt används för fiskproduktion, skall fisk från samtliga vattentäkter ingå i proven om 150 eller 30 fiskar. Om det förekommer svaga fiskar, fiskar med onormalt beteende eller sådana som nyligen dött (ej ruttnande) skall dessa i första hand ingå i provet. Om det inte finns sådana fiskar, skall provet bestå av friska individer med normalt beteende och som samlats in på sådant sätt att anläggningens alla delar såväl som alla årsklasser ingår proportionellt i provet.

3. Beredning och transport av fiskprover

Före transport eller överföring till laboratoriet skall de organdelar som skall undersökas avlägsnas från fiskarna med steril sax och pincett och överföras till plaströr som innehåller transportmedium, dvs. cellkulturvätska med 10 % kalvserum och antibiotika. En kombination av 200 IE penicillin, 200µg streptomycin och 200 µg kanamycin per milliliter rekommenderas, men även andra antibiotika med beprövad verkan får användas. De vävnader som skall undersökas är mjälten, främre njuren, och dessutom antingen hjärtat eller encephalon och, i vissa fall, ovarievätska (tabell 1).

Ovarievätska eller organdelar från tio fiskar (tabell 1) får samlas in i ett 10 ml plaströr som innehåller transportmedium på 4 ml och utgöra ett samlingsprov. Vävnaderna i varje prov bör väga minst 0,5 g.

Rören placeras i isolerade behållare (t.ex. tjockväggiga polystyrenlådor) med så mycket is eller kylklampar så att proverna behåller en temperatur mellan 0 och 5 °C under transporten till laboratoriet. Frysning skall undvikas. Provets temperatur under transporten får inte överstiga 10 °C och det bör fortfarande finnas is i transportlådan vid ankomsten.

Den virologiska undersökningen skall påbörjas så snart som möjligt och senast 48 timmar efter det att proverna samlats in eller i undantagsfall senast 72 timmar efter det att det material som skall undersökas samlats in om det är skyddat av transportmedium och temperaturkraven under transporten kan uppfyllas (1.1 tredje stycket).

Hel fisk får skickas till laboratoriet om temperaturkraven under transporten kan uppfyllas. Hel fisk får slås in i absorberande papper och skickas i plastpåsar, kylda på ovan angivna sätt. Också levande fisk får skickas.

4. Insamling av kompletterande diagnostiskt material

Efter överenskommelse med det berörda diagnostiklaboratoriet får även andra fiskvävnader samlas in och beredas för kompletterande undersökningar.

II. Beredning av prover för virologisk undersökning

1. Homogenisering av organ

På laboratoriet skall vävnaderna i rören homogeniseras fullständigt (antingen med stomacher, mixer eller mortel och stöt) och därefter blandas med det ursprungliga transportmediet. Om ett prov består av hela fiskar, dvs. fiskar kortare än sex cm, skall dessa sönderdelas med steril sax, sedan kroppen bakom analöppningen avlägsnats, samt homogeniseras enligt ovan och blandas med transportmediet. Det slutliga förhållandet mellan vävnadsmaterialet och transportmediet måste justeras till 1: 10.

2. Centrifugering av homogenat

Homogenatet skall centrifugeras i en kylcentrifug vid 2-5 °C vid 2 000-4 000 × g i 15 minuter, varefter supernatanten samlas upp och behandlas med antibiotika, t.ex. kan gentamicin 1 mg/ml vara lämpligt på detta stadium, antingen i 4 timmar vid 15 °C eller över natten vid 4 °C.

Om provet har transporterats i särskilt medium (dvs. med tillsats av antibiotika) kan man utelämna behandlingen av supernatanten med antibiotika.

Behandlingen med antibiotika utförs för att förhindra bakteriell förorening av provet och gör filtrering genom membranfilter onödig.

Om den insamlade supernatanten lagras vid - 80 °C inom 48 timmar efter provtagningen får den tinas och återanvändas endast en gång för virologisk undersökning.

Om det uppstår praktiska svårigheter (t.ex. om inkubatorn inte fungerar, problem med cellkulturer etc.) som gör det omöjligt att inokulera cellerna inom 48 timmar efter insamlandet av vävnadsproverna kan man frysa supernatanten vid - 80 °C och utföra den virologiska undersökningen inom 14 dagar.

Före inokulationen av cellerna blandas supernatanten med lika delar av en på lämpligt sätt utspädd pool av antisera till de inhemska serotyperna av i IPN-virus och inkuberas med detta i minst en timme vid 15 °C eller högst 18 timmar vid 4 °C. Antiserumets titer måste vara minst 1: 2 000 i ett 50 % plackneutralisationstest.

Syftet med att behandla alla inokulat med antiserum mot IPN-viruset (ett virus som i vissa delar av Europa finns i 50 % av alla fiskprover) är att förhindra CPE orsakad av att IPN-virus utvecklas i inokulerade cellkulturer. Detta minskar tiden för de virologiska undersökningarna såväl som antalet fall där förekomsten av CPE skulle kunna uppfattas som en potentiell indikation på VHS eller IHN.

När prover kommer från produktionsenheter som anses fria från IPN, kan behandling av inokulat med antiserum mot IPN utelämnas.

III. Virologisk undersökning

1. Cellkulturer och medier

Antingen BF-2 eller RTG-2 och antingen EPC- eller FHM-celler odlas vid 20-30 °C i lämpligt medium, t.ex. Eagle's MEM (eller modifieringar därav) med tillsats av 10 % foetalt bovinserum och antibiotika i standardkoncentrationer.

Om cellerna odlas i slutna flaskor, rekommenderas att mediet buffras med bikarbonat. Det medium som används för cellkulturer i öppna kärl kan buffras med Tris-HCl (23mM) och Na-bikarbonat (6 mM). pH-värdet måste ligga så nära 7,6 som möjligt.

Cellkulturer som skall användas för inokulering med vävnadsmaterial bör vara unga (4-48 timmar) och i aktiv tillväxt (inte konfluenta) vid inokuleringen.

2. Inokulation av cellkulturer

Antibiotikabehandlade organsuspensioner skall inokuleras i cellkulturer i två spädningar, dvs. primärspädningen plus en spädning på 1: 10 av denna som resulterar i slutliga spädningar av vävnadsmaterialet i cellkulturens medium på 1: 100 respektive 1: 1000 (för att förhindra homolog interferens). Minst två cellinjer måste inokuleras (se III.1). Förhållandet mellan inokulatets storlek och volymen av cellkulturens medium bör vara ca 1: 10.

För varje spädning och varje cellinje skall användas minst ca 2 cm² cellyta motsvarande en brunn i en cellkulturplatta med 24 brunnar. Användning av cellkulturplattor rekommenderas men andra cellodlingskärl med motsvarande eller större växtyta kan också accepteras.

3. Inkubation av cellkulturer

Inokulerade cellkulturer skall inkuberas vid 15 °C i sju-tio dagar. Om färgen i cellkulturens medium ändras från rött till gult som tecken på att mediet håller på att försuras, skall pH-värdet justeras med steril bikaronatlösning eller likvärdiga ämnen för att säkerställa cellkulturens mottaglighet för virusinfektion.

Frusna förråd av VHSV och IHNV skall titreras på cellkulturerna var sjätte månad för att visa att dessa är mottagliga för infektion.

4. Mikroskopi

Inokulerade cellkulturer skall inspekteras dagligen med avseende på förekomst av CPE med omkring 40 gångers förstoring. Om CPE kan observeras skall identifiering av virus enligt avsnitt IV påbörjas omedelbart.

5. Odling av subkulturer

Om inte CPE har utvecklats efter sju-tio dagars primärinkubation, skall subkulturer odlas med friska cellkulturer, varvid cellytan skall vara lika stor som i primärkulturen.

Lika delar av medium (supernatant) från samtliga kulturer/brunnar som utgör primärkulturen slås samman sju-tio dagar efter inokulationen. Blandningen inokuleras sedan i homologa cellkulturer outspädda och i spädning på 1: 10 (som resulterar i slutliga spädningar av supernatanten på 1: 10 respektive 1: 100) enligt beskrivning i avsnitt I.III.2. Inokuleringen får föregås av preinkubation av de utspädda lösningarna med antiserum mot IPN-virus i lämplig spädning enligt beskrivning i avsnitt I.II.2.

De inokulerade kulturerna inkuberas därefter i sju-tio dagar vid 15 °C och observeras enligt beskrivningen i avsnitt III.4.

Om toxisk CPE påträffas under inkubationens tre första dagar, får subkulturen odlas på detta stadium men cellerna måste då inkuberas i sju dagar och subkulturer odlas igen med ytterligare sju dagars inkubation. Om toxisk CPE utvecklas efter tre dagar, får cellerna passera en gång och inkuberas för att uppnå de sammanlagda 14 dagarna från primärinokulationen. Ingen toxicitet får påvisas under de sista sju dagarna av inkubationen.

IV. Identifiering av virus

1. Prover för identifiering av virus

Om CPE har påvisats i en cellkultur, skall mediet (supernatanten) samlas upp och undersökas med en eller flera av följande metoder: neutralisation, immunofluorescens (IF), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Om proverna inte har lett till en säker identifiering av viruset inom en vecka, skall det överföras till ett nationellt referenslaboratorium för fisksjukdomar eller till gemenskapens referenslaboratorium för fisksjukdomar för omedelbar identifiering.

Användningen av immunoreagenser för identifiering av virus måste vara av referenskvalitet och i fråga om titer och specificitet godkänt av det nationella referenslaboratoriet för fisksjukdomar.

2. Neutralisation

Avlägsna cellerna från det insamlade mediet genom centrifugering (2000-4000 × g) eller membranfiltrering (0,45 µm) och späd därefter mediet 1: 100 och 1: 10 000 i cellkulturmedium.

Lika delar av spädningen blandas med lika delar av följande reagenser, var och en för sig, och inkuberas i 60 minuter vid 15 °C:

>Plats för tabell>

Från varje blandning av virus och serum skall minst två cellkulturer inokuleras med 50 µl vardera och sedan inkuberas vid 15 °C. Utvecklingen av CPE kontrolleras enligt beskrivning i avsnitt III.4.

Även andra neutralisationstester med beprövad verkan får användas.

3. Immunofluorescens (IF)

För varje virusisolat som skall identifieras besås minst åtta täckglas eller motsvarande med EPC-celler med en täthet som efter 24 timmars odling ger en utväxt av ca 60-90 %. Valet av EPC-celler beror på deras goda vidhäftning mot glasytor.

När cellerna har sjunkit ned till glasytan (omkring en timme efter bestrykningen), eller när kulturerna har inkuberats i upp till 24 timmar, inokuleras det virus som skall identifieras. Fyra kulturer inokuleras i volymförhållandet 1: 10 och fyra i förhållandet 1: 100.

20-30 timmar efter inokulationen sköljs kulturerna två gånger i Eagle's MEM utan serum, fixeras i aceton och färgas därefter med hjälp av en tvåskikts IFAT. Första reagensskiktet består av poly- eller monoklonala antikroppar av referenskvalitet. Andra reagensskiktet består av ett FITC-konjugerat antiserum mot det immunglobulin som används i första skiktet. För varje testat antiserium skall minst en inokulerad högdoskultur och en inokulerad lågdoskultur bli färgad. Testet skall även omfatta lämpliga negativa och positiva kontroller.

Preparera de färgade kulturerna med glycerolsaltlösning. Undersök dem under infallande UV-ljus. Använd okular med förstoringsgrad 10 × eller 12 × och objektiv × 25 eller × 40 med bländare > 0,7 respektive > 1,3.

Vissa stammar av Egtved-virus reagerar kraftigt med antiserum mot stam F 1 i IFAT, även om de inte reagerar i neutralisationstest.

Den ovan angivna IF-metoden nämns som exempel. Även andra IF-metoder (vad gäller cellkulturer, fixering och antikroppar av referenskvalitet) med beprövad verkan får användas.

4. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Brunnarna i mikrotiterplattor (t.ex. Nunc-immunplattor, Maxisorp, Nunc, Danmark) skall över natten täckas med rekommenderade spädningar av protein-A-rensade immunoglobulinfraktioner av antikroppar av referenskvalitet.

Sedan brunnarna sköljts med buffertlösning PBS-Tween-20, tillsätts det virus som skall identifieras i två eller fyra stegs spädning och tillåts reagera med antikroppsbeläggningen i 60 minuter vid 37 °C. Efter sköljning med buffertlösning PBS-Tween-20 tillsätts biotinylerade antikroppar av en specificitet som motsvarar antikroppsbeläggningens specificitet och får reagera i 60 minuter vid 20 °C. Efter ytterligare en sköljning enligt ovan tillsätts HRP-konjugerad streptavidin och får reagera en timme vid 20 °C. Efter en sista sköljning blir det bundna enzymet synligt med hjälp av lämpliga ELISA-substrat (OPD eller andra).

Ovannämnda biotin-avidin-baserade ELISA-version nämns som exempel. Även andra ELISA-versioner med beprövad verkan får användas.

>Plats för tabell>

>Plats för tabell>

>Plats för tabell>

DEL II

DIAGNOSTISKA METODER FÖR FASTSTÄLLANDE AV IHN OCH VHS VID MISSTANKE OM UTBROTT

Diagnos på IHN och VHS skall ställas med någon av följande metoder:

- A. Konventionella virusisolering med påföljande identifiering av virus.

- B. Virusisolering med samtidig serologisk identifiering av virus.

- C. Andra diagnostiska metoder (IFAT, ELISA).

I anläggningar i godkända områden får den första diagnosen på IHN och VHS inte grundas enbart på metod C. Metod A eller B måste också användas.

Det vävnadsmaterial som är avsett för virologisk undersökning får i vissa fall åtföljas av kompletterande material för bakteriologisk, parasitologisk, histologisk eller annan undersökning för att en differentialdiagnos skall kunna ställas. Sådant material skall insamlas på de sätt som anges i OIE.

II.A. Konventionell virusisolering med påföljande serologisk identifiering av virus

II.A.I.1 Val av prover

Minst tio fiskar som visar typiska tecken på IHN eller VHS måste samlas in för undersökning.

II.A.I.2 Beredning och transport av fiskprover

Som I.I.3.

II.A.I.3 Insamling av kompletterande diagnostiskt material

Som I.I.4.

II.A.II Beredning av prover för virologisk undersökning

Som I.II.

II.A.III Virologisk undersökning

Som I.III med undantag av att antingen BF-2- eller RTG-2- och antingen EPC- eller FHM-celler får användas för inokulation med vävnadsmaterial.

II.A.IV Identifiering av virus

Som I.IV.

II.B. Virusisolering med samtidig serologisk virusidentifiering

II.B.I.1 Val av prover

Som II.A.I.1.

II.B.I.2 Beredning och transport av fiskprover

Som I.I.3.

II.B.I.3 Insamling av kompletterande diagnostiskt material

Som I.I.4.

II.B.II.1 Homogenisering av organ

Som I.II.1.

II.B.II.2 Centrifugering av homogenatet

Som I.II.2.

II.B.II.3 Behandling av supernatant med diagnostiska antiserum

Organsuspensionen som har behandlats med antibiotika och anti-IPN späds 1:10 och 1:10 000 i cellkulturmedium. Lika delar av spädning blandas med lika delar av de reagenser som räknas upp i avsnitt I.IV.2 och inkuberas i 60 minuter vid 15 °C.

II.B.III.1 Cellkulturer och medier

Antingen BF-2 eller RTG-2 och antingen EPC- eller FHM-celler odlas vid 20-30 °C i lämpligt medium, t.ex. Eagle's MEM (eller modifieringar därav) med tillsats av 10 % foetalt bovinserum och antibiotika i standardkoncentrationer.

När cellerna odlas i slutna flaskor, rekommenderas att mediet buffras med bikarbonat. Det medium som används för cellkulturer i öppna kärl kan buffras med Tris-HCl (23 mM) och Na-bikarbonat (6 mM). pH-värdet måste ligga så nära 7,6 som möjligt.

Cellkulturer som skall användas för inokulering med vävnadsmaterial bör vara unga (4-48 timmar) och i aktiv tillväxt (inte konfluenta) vid inokuleringen.

II.B.III.2 Inokulering av cellkulturer

Från varje blandning av virusserum (beredd enligt II.B.II.3) skall minst två cellkulturer per cellinje inokuleras med 50 µl vardera.

II.B.III.3 Inkubering av cellkulturer

Som I.III.3.

II.B.III.4 Mikroskopi

Inokulerade cellkulturer skall inspekteras dagligen med avseende på förekomst av CPE vid ca 40 gångers förstoring. Om något av de använda antiserumen förhindrar CPE, får viruset därmed anses indentifierat.

Om inget av de använda antiserumen har haft någon verkan, skall identifieringen fortsätta med den metodik som framgår av I.IV.

II.B.III.5 Odling av subkulturer

Om inget CPE har utvecklats efter sju dagar, skall subkulturer odlas med kulturer som inokulerats med supernatanten plus medium (II.B.II.3) i enlighet med I.III.5.

II.C. Andra diagnostiseringsmetoder

Supernatanten enligt II.A.II.2 behandlas enligt IFAT eller ELISA i enlighet med II.A.IV.3 respektive II.A.IV.4. Dessa snabba metoder skall senast 48 timmar efter provtagningen kompletteras med en virologisk undersökning enligt A eller B.

a) om resultatet är negativt, eller

b) om resultatet är positivt med material som utgör första fallet av IHN eller VHS i godkända områden.

Vävnadsmaterial kan behandlas med andra diagnostiska metoder, t.ex. IF, när det gäller frysta snitt eller immunohistokemi när det gäller vävnadsmaterial som fixerats i formalin. I dessa metoder måste alltid ingå inokulation av icke fixerat material i cellkulturer.

FÖRKORTNINGAR

BF-2 bluegill fibroblast (cellinje)

CPE cytopatisk verkan

ELISA enzyme-linked immunosorbent assay

EPC Epitelioma papulosum cyprini (cellinje)

FHM fathead minnow (cellinje)

FITC fluorescein isotiocyanat

HRP horse radish peroxidas

IF immunofluorescens

IFAT indirekt fluorescerande antikroppstest

IHN(V) smittsam hematopoetisk nekros (virus)

IPN(V) smittsam pankreatisk nekros (virus)

MEM minsta mängd medium som behövs

OPD ortofenyldiamin

PBS fosfatbuffertlösning

RTG-2 gonad av regnbågslax (cellinje)

Tris-HCl tris (hydroxymetyl) aminometane - HCl

VHS(V) viral hemorragisk septikemi (virus)

(1*) kliniska kontroller