(10)

Följande kapitel läggs till som kapitlen C.27, C.28, C.29 och C.30: ”C.27 TOXICITETSTEST I SEDIMENT- OCH VATTENFAS PÅ CHIRONOMIDLARVER MED SPIKAT SEDIMENT INLEDNING 1. Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje 218 (2004). Syftet med testmetoden är att bedöma effekterna av långvarig kemikalieexponering på sedimentlevande larver i sötvatten av fjädermyggor Chironomus sp. Metoden är baserad på befintliga toxicitetstestprotokoll för Chironomus riparius och Chironomus tentans som har tagits fram i Europa (1) (2) (3) och Förenta staterna (4) (5) (6) (7) (8) samt ringtestats (1) (6) (9). Även övriga väldokumenterade chironomider kan användas, t.ex. Chironomus yoshimatsui (10) (11). 2. Exponeringsscenariot i denna testmetod går ut på att spika sediment med testämnet. Valet av lämpligt exponeringsscenario beror på den avsedda tillämpningen för testet. Scenariot med spikning av sediment är avsett att simulera ackumulerade nivåer av kemikalier som finns kvar i sedimentet. Detta exponeringssystem innebär spikning av sediment i ett testsystem med sediment- och vattenfas. 3. Ämnen som behöver testas på sedimentlevande organismer är sådana som i allmänhet blir kvar i sedimentet under långa tidsperioder. De sedimentlevande organismerna kan exponeras via ett antal rutter. Den relativa betydelsen av varje exponeringsrutt och den tid det tar för var och en av dem att bidra till de totala toxiska effekterna beror på den berörda kemikaliens fysikalkemiska egenskaper. För starkt adsorberande ämnen (t.ex. log Kow > 5) eller för ämnen som binds kovalent till sedimentet, kan förtäring av förorenad föda vara en betydande exponeringsrutt. För att toxiciteten hos starkt lipofila ämnen inte ska underskattas kan tillsättning av föda till sedimentet före applicering av testämnet övervägas. För att alla potentiella exponeringsrutter ska beaktas har denna testmetod fokus på långvarig exponering. Testets längd är 20–28 dagar för C. riparius och C. yoshimatsui och 28–65 dagar för C. tentans. Om korttidsdata krävs för ett specifikt ändamål, t.ex. för att undersöka effekterna av en instabil kemikalie, kan tilläggsreplikat avlägsnas efter tio dagar. 4. De endpoints som mäts är det totala antalet kläckta vuxna exemplar och utvecklingstiden fram till kläckning. Det rekommenderas att mätningar av larvernas överlevnad och tillväxt endast görs efter en tiodagarsperiod i fall där ytterligare korttidsdata krävs, med användning av ytterligare replikat enligt vad som är lämpligt. 5. För detta test rekommenderas syntetiskt sediment. Syntetiskt sediment har flera fördelar jämfört med naturliga sediment: — Variationen mellan experiment reduceras eftersom syntetiskt sediment bildar en reproducerbar ”standardmatris”, och behovet av att få fram oförorenade och rena sediment elimineras. — Testningen kan inledas när som helst utan att beakta säsongvariationer i testsedimentet och det behövs ingen förbehandling av sediment för att få bort naturligt förekommande fauna. När syntetiskt sediment används uppstår heller inte kostnader för insamling på fältet av tillräckliga mängder sediment för rutintestning. — Användning av syntetiskt sediment ger möjlighet till jämförelser av toxicitet och därmed klassificering av ämnen. 6. Definitioner finns i tillägg 1. PRINCIP FÖR TESTMETODEN 7. Chironomidlarver i första larvstadiet exponeras för ett urval koncentrationer av testkemikalien i sediment-vattensystem. Testämnet spikas i sedimentet och därefter tillförs larverna i testkärlen som har stabiliserade sediment- och vattenkoncentrationer. Kläckning av fullbildade myggor och utvecklingshastighet mäts i slutet av testet. Överlevande larver och deras vikt kan också mätas efter tio dagar om så krävs (med användning av ytterligare replikat enligt det som är lämpligt). Dessa data analyseras med användning av en regressionsmodell för att uppskatta den koncentration som skulle orsaka × % minskning av antalet fullbildade myggor eller av larvernas överlevnad eller tillväxt (t.ex. EC15, EC50 osv.) eller genom användning av statistisk hypotesprövning för att bestämma NOEC/LOEC. Hypotesprövningen kräver en jämförelse mellan effektvärden och kontrollvärden med användning av statistiska test. INFORMATION OM TESTÄMNET 8. Testämnets vattenlöslighet, ångtryck, uppmätta eller beräknade fördelning i sedimentet samt stabilitet i vatten och sediment bör vara kända. Det bör finnas en tillförlitlig analysmetod för kvantifiering av testämnet i överliggande vatten, porvatten och sediment med känd och rapporterad exakthet och detektionsgräns. Det är också bra att känna till testämnets strukturformel och renhet. Hur testämnet agerar kemiskt (t.ex. upplösning, abiotisk och biotisk nedbrytning osv.) hör också till den information som är användbar. Närmare vägledning för testning av ämnen vars fysikalkemiska egenskaper försvårar detta test finns i (12). REFERENSKEMIKALIER 9. Referenskemikalier kan testas periodiskt för att säkerställa att testprotokollet och testbetingelserna är tillförlitliga. Exempel på toxiska referensämnen som med framgång har använts i ringtest och valideringsstudier är lindan, trifluranid, pentaklorfenol, kadmiumklorid och kaliumklorid (1) (2) (5) (6) (13). TESTETS GILTIGHET 10. För att testet ska vara giltigt gäller följande villkor: — Kläckningen av vuxna exemplar i kontrollkärlen måste vara minst 70 % i slutet av testet (1) (6). — Kläckningen av vuxna exemplar av C. riparius och C. yoshimatsui i kontrollkärlen bör inträffa 12–24 dagar efter att de har införts i kärlen, för C. tentans krävs en period på 20–65 dagar. — Vid slutet av testet bör pH och koncentrationen upplöst syre mätas i varje kärl. Syrekoncentrationen bör vara minst 60 % av luftmättnadsvärdet (ASV) vid den använda temperaturen och pH i överliggande vatten bör vara 6–9 i alla testkärl. — Variationen i vattentemperatur får inte vara större än ± 1,0 °C. Vattentemperaturen kan hållas under kontroll genom att göra testningen i ett isotermiskt utrymme, varvid rumstemperaturen bör kontrolleras med lämpliga tidsintervall. METODBESKRIVNING Testkärl 11. Testet görs i 600 ml-glasbägare med 8 cm i diameter. Även andra slags kärl kan användas, men då måste det gå att garantera att överliggande vatten och sediment har lämpliga djup. Sedimentytan bör vara tillräckligt stor för att ge 2–3 cm2 per larv. Förhållandet mellan sedimentskiktets djup och överliggande vattnets djup bör vara 1:4. Testkärl och annan apparatur som kommer i kontakt med testsystemet bör vara gjorda av glas eller annat kemiskt inert material (t.ex. teflon). Val av arter 12. Den art som används i testet ska helst vara Chironomus riparius. Chironomus tentans kan också vara lämplig, men den är svårare att hantera och kräver en längre testperiod. Även Chironomus yohimatsui kan användas. I tillägg 2 finns närmare uppgifter om odlingsmetoder för Chironomus riparius. Information om odlingsbetingelser finns också för andra arter, t.ex. Chironomus tentans (4) och Chironomus yoshimatsui (11). Arternas identifiering måste bekräftas före testningen men är inte nödvändig före varje test om organismerna härrör från en odling inom laboratoriet. Sediment 13. Helst ska syntetisk sediment användas. Om naturligt sediment används bör dess egenskaper bestämmas (minst pH, halten organiskt kol, och gärna även andra parametrar såsom förhållandet C/N och granulometri). Sedimentet måste även vara fritt från föroreningar och andra organismer som kan konkurrera med eller konsumera chironomiderna. Dessutom rekommenderas att naturligt sediment som är avsett att användas i ett chironomidtoxicitetstest konditioneras i sju dagar under samma betingelser som råder i det efterföljande testet. Följande syntetiska sediment, baserat på den syntetiska jord som används i testmetod C.8 (14), rekommenderas för detta test (1) (15) (16): a) 4–5 % (torrvikt) torv så nära pH 5,5–6 som möjligt; det är viktigt att använda endast lufttorkad och finmalen torv i pulverform (partikelstorlek ≤ 1 mm). b) 20 % (torrvikt) kaolinlera (kaolinithalt helst över 30 %). c) 75–76 % (torrvikt) kvartssand (till största delen bestående av fin sand där mer än 50 % av partiklarna har storleken 50–200 μm). d) Avjoniserat vatten tillsätt så att blandningen får en slutlig fukthalt på 30–50 %. e) Kemiskt rent kalciumkarbonat CaCO3) tillsätts för att justera den slutliga sedimentblandningens pH till 7,0 ± 0,5. Den slutliga blandningens kolhalt bör vara 2 % ± 0,5 % och kan justeras med hjälp av lämpliga mängder torv och sand, enligt punkterna a och c. 14. Torv, kaolinlera och sand ska härröra från kända källor. Sedimentkomponenterna bör kontrolleras för att bekräfta avsaknaden av kemiska föroreningar (t.ex. tungmetaller, organiska klorföreningar, organiska fosforföreningar osv.) Ett exempel på hur syntetiskt sediment kan tillredas beskrivs i tillägg 3. Det är också godtagbart att blanda torra beståndsdelar om det går att demonstrera att tillsats av överliggande vatten inte leder till att sedimentets beståndsdelar separerar (t.ex. flytande torvpartiklar) och att torven eller sedimentet konditioneras tillräckligt. Vatten 15. Allt vatten som uppfyller de kemiska kriterierna för godtagbart utspädningsvatten (se tilläggen 2 och 4) är lämpligt som testvatten. Allt lämpligt vatten, naturligt vatten (ytvatten eller grundvatten), rekonstituerat vatten (se tillägg 2) och avklorerat kranvatten är godtagbart som odlings- och testvatten om chironomiderna överlever i det under odling, acklimatisering och testning utan att uppvisa tecken på stress. Vid teststart ska testvattnets pH vara mellan 6 och 9 och totalhårdheten får inte vara högre än 400 mg/l uttryckt som CaCO3. Om man misstänker växelverkan mellan hårdhetsjoner och testämnet, bör vatten med lägre hårdhet användas (i en sådan situation får Elendt Medium M4 inte användas). Samma typ av vatten bör användas under hela testningen. De vattenkvalitetsegenskaper som förtecknas i tillägg 4 bör mätas minst två gånger om året eller om man misstänker att egenskaperna har ändrats betydligt. Stamlösningar – spikat sediment 16. Spikat sediment med vald koncentration bereds i regel genom tillsättning av en lösning av testämnet direkt i sedimentet. En stamlösning av testämnet upplöst i avjoniserat vatten blandas med det syntetiska sedimentet i en rullkvarn, matningsblandare eller manuellt. Om testämnet har låg löslighet i vatten kan det lösas upp i minsta möjliga volym lämpligt organiskt lösningsmedel (t.ex. hexan, aceton eller kloroform). Denna lösning blandas sedan med 10 g fin kvartssand för ett testkärl. Lösningsmedlet får avdunsta och måste vara helt avlägsnat ur sanden, och därefter blandas sanden med lämplig mängd sediment per testbägare. Endast ämnen som avdunstar lätt får användas för att upplösa, dispergera eller emulgera testämnet. Här bör noteras att den sand som följer med testämnet och sandblandningen måste beaktas när sedimentet förbereds (dvs. sedimentet ska ha mindre mängd sand). Det är viktigt att se till att testämnet som tillsätts sedimentet fördelas omsorgsfullt och jämnt inom sedimentet. Vid behov kan delprover analyseras för att bestämma homogeniteten. TESTETS UTFORMNING 17. Testets utformning avser antalet koncentrationer och intervallen mellan dem, antalet kärl per koncentration och antalet larver per kärl. Här beskrivs utformningar för uppskattning av effektkoncentration, uppskattning av NOEC och för gränstest. Utformning för regressionsanalys 18. Effektkoncentrationen (t.ex. EC15, EC50) och det koncentrationsområde som är relevant för testämnet bör omfattas av de koncentrationer som ingår i testet. Allmänt taget gäller att exaktheten och särskilt giltigheten för uppskattningar av effektkoncentrationer (ECx) förbättras när effektkoncentrationen ligger inom området för de koncentrationer som testas. Extrapolering under lägsta positiva koncentration eller över högsta koncentration bör undvikas. Preliminära test kan användas för att hitta rätt koncentrationsområde (se punkt 27). 19. Om ECx ska uppskattas bör testet omfatta minst fem koncentrationer och tre replikat för varje koncentration. Det är under alla omständigheter tillrådligt att använda tillräckligt många testkoncentrationer för att få en god modelluppskattning. Faktorn mellan koncentrationer bör inte vara större än två (undantag kan göras i fall där dos-responskurvan har liten lutning). Antalet replikat per behandling kan minskas om antalet testkoncentrationer med olika respons ökas. En ökning av antalet replikat eller minskning av testkoncentrationsintervall tenderar att leda till ett smalare konfidensintervall för testet. Ytterligare replikat krävs om en uppskattning ska göras av larvernas överlevnad och tillväxt under en tiodagarsperiod. Upplägg för uppskattning av NOEC/NOEC 20. Om LOEC eller NOEC ska uppskattas bör fem testkoncentrationer med minst fyra replikat användas och faktorn mellan koncentrationerna bör inte vara större än två. Antalet replikat bör vara tillräckligt för att säkerställa tillräcklig statistisk styrka för att upptäcka en skillnad på 20 % jämfört med kontrollen vid nivån 5 % för signifikans (p = 0,05). För uppskattning av utvecklingshastighet är det i regel lämpligt med variansanalys (ANOVA), såsom Dunnets eller Williams test (17) (18) (19) (20). För kläckningsfrekvens kan ett Cochran-Armitage-test, Fishers exakta test (med Bonferronikorrigering) eller ett Mantel-Haenszel-test användas. Gränstest 21. Gränstest kan göras (en testkoncentration och kontroll) om inga effekter framkommit vid det preliminära testet för att fastställa testområde. Syftet med gränstest är att genomföra ett test vid en koncentration som är tillräckligt hög för att man ska kunna utesluta eventuella toxiska effekter av testämnet, och gränsen sätts vid en koncentration som inte förväntas förekomma i någon situation. 1 000 mg/kg (torrvikt) rekommenderas. I regel krävs minst sex replikat både för behandling och kontroll. Man måste kunna demonstrera tillräcklig statistisk styrka för att upptäcka en skillnad på 20 % jämfört med kontrollen vid nivån 5 % för signifikans (p = 0,05). Eftersom t-test ger kvantitativ respons (utvecklingshastighet och vikt) är t-test en lämplig statistisk metod förutsatt att data uppfyller testkraven (normalitet, homogena varianser osv.). Om dessa krav inte uppfylls kan man använda t-testet med olika varians eller ett icke-parametriskt test, såsom Wilcoxon-Mann-Whitneys test. För kläckningsfrekvens är det lämpligt att använda Fischers exakta test. FÖRFARANDE Exponeringsbetingelser Beredning av systemet med spikat sediment och vatten 22. Det förfarande för spikning som beskrivs i testmetod C.8 (Toxicitet för daggmaskar) rekommenderas för applicering av testämnet (14). Spikade sediment placeras i kärlen och överliggande vatten tillsätts så att förhållandet mellan sediment och vatten är 1:4 (se punkterna 11 och 15). Sedimentets djup bör vara 1,5–3 cm. För att undvika separation av sedimentets beståndsdelar och återsuspension av finfördelat material medan testvatten tillsätts i vattenkolumnen, kan sedimentet täckas med en plastplatta medan vattnet tillsätts, varefter plattan avlägsnas omedelbart. Även andra metoder kan vara lämpliga. 23. Testkärlen bör vara täckta (t.ex. med glasplattor). Vid behov fylls under testets gång vatten på till ursprunglig volym för att kompensera för avdunstning. Detta bör göras med destillerat eller avjoniserat vatten för att förebygga ackumulering av salter. Stabilisering 24. Efter beredning av spikat sediment och överliggande vatten rekommenderas att testämnet får fördelas från vattenfasen till sediment (3) (4) (6) (13). Detta bör helst göras med samma temperatur- och luftningsbetingelser som används vid testningen. Stabiliseringstiden beror på sedimentet och kemikalien, och kan variera mellan några timmar och flera dagar, i sällsynta fall upp till flera veckor (4–5 veckor). Eftersom en lång stabiliseringstid kan leda till att vissa kemikalier sönderfaller, eftersträvas här inte jämvikt; i stället rekommenderas en stabiliseringstid på 48 timmar. I slutet av denna jämviktsperiod ska testämnets koncentration mätas i det överliggande vattnet, porvattnet och sediment, åtminstone för den högsta koncentrationen och en lägre koncentration (se punkt 38). Dessa analytiska bestämningar av testämnet gör det möjligt att beräkna massbalans och uttrycka resultaten på grundval av uppmätta koncentrationer. Tillförsel av testorganismer 25. Fyra till fem dagar innan testorganismerna tillförs testkärlen ska äggmassorna avlägsnas från odlingarna och placeras i små kärl i odlingsmedium. Åldrat medium från stamodling eller färskt berett medium kan användas. Om färskt medium används bör en liten mängd föda, t.ex. grönalger och/eller några droppar filtrat från en finmald suspension av fiskfoder i flingform tillsättas odlingsmediet (se tillägg 2). Endast färska äggmassor får användas. I regel börjar larverna kläckas några dagar efter att äggen har lagts (2–3 dagar för Chironomus riparius vid 20 °C och 1–4 dagar för Chironomus tentans vid 23 °C och Chironomus yoshimatsui vid 25 °C), och larvernas tillväxt sker i fyra stadier på 4–8 dagar per stadium. För testet ska första stadiets larver användas (2–3 eller 1–4 dagar efter kläckningen). Bestämning av larvstadium kan möjligen göras genom mätning av huvudkapseldiameter (6). 26. Tjugo första stadiets larver fördelas slumpvis till varje testkärl som innehåller spikat sediment och vatten, med användning av en trubbig pipett. Luftningen av vattnet måste stoppas medan larverna tillsätts testkärlen och hållas stoppad i ytterligare 24 timmar efter tillsättningen (se punkterna 25 och 32). Enligt det testupplägg som används (se punkterna 19 och 20) är antalet larver per testkoncentration minst 60 för uppskattning av EC-punkt och 80 för bestämning av NOEC. Testkoncentrationer 27. Ett preliminärt test kan användas för att fastställa koncentrationerna för det definitiva testet. För detta ändamål används en serie brett spridda koncentrationer av testämnet. För att få samma ytdensitet per chironomid som ska användas för det slutliga testet, exponeras chironomiderna för varje koncentration av testämnet under en period som ger möjlighet att uppskatta lämpliga testkoncentrationer. Inga replikat krävs. 28. Testkoncentrationerna för det definitiva testet baseras på resultaten från det preliminära testet. Det ska finnas minst fem testkoncentrationer som väljs enligt beskrivningen i punkterna 18–20. Kontrollkärl 29. Kontrollkärl som inte innehåller testämne utan enbart sediment bör ingå i testet med lämpligt antal replikat (se punkterna 19 och 20). Om lösningsmedel har använts för applicering av testämnet (se punkt 16) bör det också finnas kontrollkärl med sediment och lösningsmedel. Testsystem 30. De system som används är statiska. Semistatiska system eller genomflödessystem med intermittent eller kontinuerlig förnyelse av överliggande vatten kan användas i undantagsfall, t.ex. om vattenkvalitetspecifikationerna inte är lämpliga för testorganismen eller påverkar den kemiska jämvikten (t.ex. om syrenivåerna blir för låga, koncentrationen av utsöndrade produkter blir för hög eller om mineraler släpps ut från sedimentet och påverkar pH och/eller vattenhårdheten). I regel är det dock tillräckligt och rekommendabelt att använda andra metoder för kompensering av kvaliteten på överliggande vatten, såsom luftning. Foder 31. Larverna bör ges foder helst dagligen eller minst tre gånger per vecka. Fiskfoder (suspension i vatten eller finmalt foder, t.ex. Tetra-Min eller Tetra-Phyll, se närmare i tillägg 2) i mängder om 0,25–0,5 mg (0,35–0,5 mg för C. yoshimatsui) per larv per dag anses vara lämpligt för unga larver under de tio första dagarna. För äldre larver kan det krävas lite större mängd: 0,5–1 mg per larv och dag bör vara tillräckligt för återstoden av testet. Mängden bör minskas för alla behandlingar och kontroller om det uppstår svamptillväxt eller mortalitet observeras i kontrollerna. Om svamptillväxten inte kan stoppas måste testet upprepas. Vid testning av starkt adsorberande ämnen (t.ex. log Kow > 5) eller ämnen som är kovalent bundna till sedimentet, kan mängden foder som krävs för att säkerställa överlevnad och naturlig tillväxt för organismerna tillsättas i det syntetiska sedimentet före stabiliseringsperioden. Då ska växtmaterial användas i stället för fiskfoder, t.ex. 0,5 % (torrvikt) finmalda löv från t.ex. brännässla (Urtica dioica), mullbär (Morus alba), vitklöver (Trifolium repens), spenat (Spinacia oleracea) eller annat växtmaterial (Cerophyl eller alfacellulosa). Inkubationsbetingelser 32. Skonsam luftning av överliggande vatten i testkärlen införs helst 24 timmar efter tillsättning av larverna och får pågå genom hela testet (se till att halten upplöst syre inte faller under 60 % av luftmättnadsvärdet ASV). Luftningen görs med hjälp av en Pasteur-glaspipett som är fäst 2–3 cm ovanför sedimentskiktet (en eller ett fåtal bubblor per sekund). Vid testning av flyktiga kemikalier kan man överväga att utesluta luftning av sediment-vattensystemet. 33. Testet genomförs vid konstant temperatur på 20 °C (± 2 °C). För C. tentans och C. yoshimatsui rekommenderas temperaturer på 23 °C respektive 25 °C (± 2 °C). En ljusperiod på 16 timmar används och ljusintensiteten ska vara 500–1 000 lux. Exponeringstid 34. Exponeringen inleds när larver tillsätts i spikade kärl och kontrollkärl. Den maximala exponeringstiden är 28 dagar för C. riparius och C. yoshimatsui och 65 dagar för C. tentans. Om myggor kläcks tidigare, kan testet avslutas efter minst fem dagar efter att det sista vuxna exemplaret har kläckts i kontrollen. Observationer Kläckning 35. Utvecklingstiden och totalantalet fullbildade han- och honmyggor bestäms. Hanarna är lätta att känna igen på sina fjäderantenner. 36. Testkärlen bör granskas visuellt minst tre gånger i veckan för att bedöma förekomsten av onormalt beteende (t.ex. exemplar som lämnar sedimentet, ovanligt simmande) jämfört med kontrollen. Under perioden för förväntad kläckning är det nödvändigt att dagligen räkna antalet kläckta exemplar. Kön och antal fullbildade exemplar registreras dagligen. Efter identifiering avlägsnas myggorna från kärlen. Ägg som har deponerats före testets slutförande bör registreras och därefter avlägsnas för att förhindra att larver på nytt introduceras i sedimentet. Likaså ska registrering göras av antalet synliga puppor som inte har kläckts. Vägledning om övervakning av kläckning finns i tillägg 5. Tillväxt och överlevnad 37. Om det krävs data om överlevnad och tillväxt under en tiodagarsperiod bör ytterligare testkärl införlivas från början, så att dessa därefter kan användas. Larverna i sedimentet från dessa tilläggskärl tillvaratas genom sållning med ett 250 μm-såll. Kriterierna för död är orörlighet eller utebliven reaktion på mekanisk stimulans. Larver som inte tillvaratas bör räknas som döda (larver som har dött i början av testet kan ha sönderdelats av mikrober). Torrvikten (askfri) för överlevande larver per testkärl bestäms och den genomsnittliga individuella torrvikten per kärl beräknas. Det är bra att bestämma vilket stadium överlevande larver tillhör, och för detta kan mätning av huvudkapselns bredd användas. Analytiska mätningar Testämnets koncentration 38. Innan testet inleds, dvs. före tillsättning av larver, tas prover av bulksediment från minst ett kärl per behandling för analytisk bestämning av testämnets koncentration i sedimentet. Man bör åtminstone analysera prover av överliggande vatten, porvatten och sediment i början (se punkt 24) och i slutet av testet, för den högsta koncentrationen och en lägre koncentration. Dessa bestämningar av testämneskoncentrationen ger information om testämnets beteende/fördelning i vatten-sedimentsystemet. 39. Om mellanliggande mätningar görs (t.ex. dag 7) och om det för analysen krävs stora prover som inte kan tas från testkärlen utan att testsystemet påverkas, bör de analytiska bestämningarna göras på prover som tas från extra testkärl som behandlas på samma sätt (inklusive förekomst av testorganismer) men som inte används för biologiska observationer. 40. Centrifugering vid t.ex. 10 000 g och 4 °C i 30 minuter är det rekommenderade förfarandet för att isolera porvatten. Om det har demonstrerats att testämnet inte adsorberas på filter kan även filtrering godtas. I vissa fall är det kanske inte möjligt att analysera koncentrationerna i porvattnet därför att provet är för litet. Fysikalkemiska parametrar 41. Testkärlens pH och temperatur bör mätas på lämpligt sätt (se punkt 10). Hårdhet och ammonium bör mätas i kontrollerna och ett testkärl vid den högsta koncentrationen i början och slutet av testet. DATA OCH RAPPORTERING Behandling av resultaten 42. Syftet med detta test är att bestämma testämnets effekt på utvecklingshastigheten och totalantalet fullbildade han- och honmyggor eller, om det gäller ett tiodagarstest, effekterna på larvernas överlevnad och vikt. Om det inte finns indikationer på statistiskt avvikande känslighet för hanar och honor, kan resultaten poolas för statistiska analyser. Känslighetsskillnaderna mellan hanar och honor kan bedömas statistiskt, t.ex. genom ett ”χ2-r × 2 table test”. Larvernas överlevnad och genomsnittlig individuell torrvikt per kärl måste bestämmas efter tio dagar där detta krävs. 43. Effektkoncentrationerna uttryckta och baserade på torrvikt beräknas helst på grundval av uppmätta sedimentkoncentrationer vid testets början (se punkt 38). 44. För att beräkna en punktvis uppskattning av EC50 eller något annat ECx-värde, kan statistiken per kärl användas som äkta replikat. Vid beräkning av konfidensintervallet för ett ECx-värde bör variansen mellan kärl beaktas, eller så bör man påvisa att variansen är så liten att den kan ignoreras. Om modellen anpassas med minsta kvadratmetoden bör transformation tillämpas på den kärlvisa statistiken i syfte att förbättra variansens homogenitet. ECx-värdena bör dock beräknas när responsen har transformerats tillbaka till det ursprungliga värdet. 45. När syftet med den statistiska analysen är att bestämma NOEC/LOEC genom hypotestestning, måste variansen mellan kärl beaktas, t.ex. genom nästad ANOVA. Alternativt kan mer robust testning (21) vara lämplig i situationer där de vanliga ANOVA-antagandena inte gäller. Kläckningsfrekvens 46. Kläckningsfrekvenser är dikotoma (tvåpunktsfördelade) data och kan analyseras genom Cochran-Armitage test som tillämpas på step-down-grund där monoton dos-respons förväntas och dessa data stämmer överens med förväntningen. Om inte, kan Fishers exakta test eller ett Mantel-Haenszel-test med Bonferroni-Holm-korrigerade p-värden användas. Om det finns bevis på större variation mellan replikat inom samma koncentration än det som en binomial fördelning skulle indikera (ofta kallad extra-binomial fördelning), bör ett robust Cochran-Armitage-test eller Fischers exakta test användas, enligt det som föreslås i punkt 21. Det totala antalet myggor som kläckts per kärl, ne, bestäms och divideras med antalet tillsatta larver, na enligt följande: där: ER = kläckningsfrekvens ne = antalet myggor som kläckts per kärl na = antalet larver som tillsatts per kärl 47. Ett alternativ som bäst lämpar sig för stora provstorlekar, när det finns extra-binomial varians, är att behandla kläckningsfrekvensen som en kontinuerlig respons och använda förfaranden såsom William-test när monoton dos-respons förväntas och stämmer överens med dessa data för kläckningsfrekvens. Dunnett-test är lämpligt i fall där det inte är hållbart med monotonicitet. I detta sammanhang definieras begreppet ”stort prov” som ett prov där antalet kläckta och antalet inte kläckta överstiger fem, per replikatkärl. 48. Vid användning av ANOVA-metoder bör värdena för kläckningsfrekvens först transformeras genom arcsin-sqrt-transformation eller Freeman-Tukeytransformation för att få en ungefärlig normalfördelning och jämna ut varianserna. Cochran-Armitage-test, Fishers exakta test (Bonferroni) eller Mantel-Haenszel-test kan användas när absoluta frekvenser används. För att göra arcsin-sqrt-transformation tar man inverterad sinus (sin–1) av kvadratroten av kläckningsfrekvensen. 49. ECx-värden för kläckningsfrekvenser beräknas med regressionsanalys (t.ex. probit (22), logit, Weibull, lämplig kommersiell mjukvara eller dylikt). Om regressionsanalysen inte lyckas (om det t.ex. finns mindre än två partiella responser) används andra icke-parametriska metoder såsom glidande medelvärde eller enkel interpolering. Utvecklingshastighet 50. Med genomsnittlig utvecklingstid avses den genomsnittliga tidsomfattningen mellan tillsättning av larver (testdag 0) och kläckningen av den experimentella kohorten myggor (för beräkning av den faktiska utvecklingstiden bör man beakta larvernas ålder vid tillsättningstidpunkten). Värdet för utvecklingshastighet är det reciproka värdet av tidsenheten för utveckling (enhet: 1/dag) och representerar den andel larvutveckling som sker per dag. Utvecklingshastigheten är det mått som helst ska användas för utvärdering av dessa sedimenttoxicitetsstudier eftersom variansen är lägre och homogenare samt närmare normalfördelningen i jämförelse med utvecklingstiden. Kraftfulla parametriska testförfaranden kan alltså användas baserade på utvecklingshastighet hellre än på utvecklingstid. För utvecklingshastighet som en kontinuerlig respons kan ECx-värden uppskattas med hjälp av regressionsanalys (t.ex. (23), (24)). 51. För efterföljande statistiska test antas antalet myggor observerade på inspektionsdag × ha kläckts i mitten av tidsintervallet mellan dag × och dag x-1 (l är inspektionsintervallets längd, i regel 1 dag). Genomsnittlig utvecklingshastighet per kärl (x) beräknas enligt följande: där: : genomsnittlig utvecklingshastighet per kärl i : index för inspektionsintervall m : maximiantalet inspektionsintervall : antalet myggor som kläckts under inspektionsintervallet i ne : totalantalet myggor som kläckts i slutet av experimentet (= ) xi : utvecklingshastigheten för myggor som kläckts under intervallet i där: dagi : inspektionsdag (dagar från appliceringen) li : inspektionsintervallets längd i (dagar, i regel 1 dag) Testrapport 52. Testrapporten ska innehålla minst följande uppgifter: Testämne: — Fysikalisk natur och, där det är relevant, fysikalkemiska egenskaper (vattenlöslighet, ångtryck, fördelningskoefficient i jord (eller i sediment, om tillgänglig), stabilitet i vatten osv.). — Kemiska identifieringsdata (trivialnamn, kemiskt namn, strukturformel, CAS-nummer osv.) samt renhet och analysmetod för kvantifiering av testämnet. Testarter: — Organismer som använts för testet: art, vetenskapligt namn, ursprung och odlingsbetingelser. — Information om hantering av äggmassor och larver. — Organismernas ålder när de tillförs testkärlen. Testbetingelser: — Sediment som använts (naturligt eller syntetiskt). — För naturligt sediment, insamlingsplatsens belägenhet och beskrivning av sedimentet, inbegripet i mån av möjlighet föroreningshistoria och egenskaper: pH, halten organiskt kol, C/N-kvot och granulometri (om lämpligt). — Beredning av syntetiskt sediment: beståndsdelar och egenskaper (halten organiskt kol, pH, fukthalt osv. vid testets början). — Beredning av testvatten (om rekonstituerat vatten används) och egenskaper (syrehalt, pH, konduktivitet, hårdhet osv. vid testets början). — Sedimentets och överliggande vattnets djup. — Volymen för överliggande vatten och porvatten, vikten för vått sediment med och utan porvatten. — Testkärl (material och storlek). — Metod för spikning av sediment: testkoncentrationer, antalet replikat och, i förekommande fall, använt lösningsmedel. — Fasen för stabilisering av jämvikt i systemet med spikat sediment och vatten: varaktighet och betingelser. — Inkubationsbetingelser: temperatur, ljuscykel och intensitet samt luftning (frekvens och intensitet). — Detaljerad information om utfodringen, inklusive typ av foder, beredning, mängd och utfodringsschema. Resultat: — Nominella testkoncentrationer, uppmätta testkoncentrationer och resultaten av alla analyser för bestämning av testämnets koncentration i testkärl. — Vattenkvaliteten i testkärlen – pH, temperatur, upplöst syre, hårdhet och ammonium. — Ersättning av avdunstat testvatten, i förekommande fall. — Antalet kläckta hon- och hanmyggor per kärl och dag. — Antalet larver som inte utvecklats till myggor, per kärl. — Genomsnittlig individuell torrvikt för larver per kärl och per stadium, om lämpligt. — Procentandel kläckta exemplar per replikat- och testkoncentration (han- och honmyggor poolade). — Genomsnittlig utvecklingshastighet för fullbildade myggor per replikat och behandlingsnivå (han- och honmyggor poolade). — Uppskattning av toxiska endpoints t.ex. ECx (och associerade konfidensintervall), NOEC och/eller LOEC och de statistiska metoder som använts för bestämning av dem. — Diskussion av resultaten, inbegripet inverkan på testresultatet som kan tillskrivas avvikelser från denna testmetod. LITTERATUR (1) BBA (1995), ”Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system”, redigerat av M. Streloke och H.Köpp. Berlin 1995. (2) Fleming R. m.fl. 1994), ”Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances”, Slutlig rapport till Europeiska kommissionen, rapport nr EC 3738, augusti 1994, WRc, UK. (3) SETAC (1993), ”Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments”, WOSTA Workshop, Nederländerna. (4) ASTM International/E1706-00 (2002), ”Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates”, s. 1125–1241, ASTM International 2002 Annual Book of Standards, vol. 11.05, ”Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; Pesticides”, ASTM International, West Conshohocken, PA. (5) Environment Kanada (1997), ”Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method”, Report SPE 1/RM/32, december 1997. (6) US-EPA (2000), ”Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates”, andra utgåvan, EPA 600/R-99/064, mars 2000, revidering av första utgåvan juni 1994. (7) US-EPA/OPPTS 850.1735 (1996), ”Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates”. (8) US-EPA/OPPTS 850.1790 (1996), ”Chironomid Sediment toxicity Test”. (9) Milani D., Day K. E., McLeay D. J. och Kirby R. S. (1996), ”Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Kanada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius)” Technical Report, Environment Kanada, National Water Research Institute, Burlington, Ontario, Kanada. (10) Sugaya Y. (1997), ”Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui”, Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4), s. 345–350. (11) Kawai K. (1986), ”Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera)”, Jp. J. Sanit. Zool. 37 (1), s. 47–57. (12) OECD, 2000, ”Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures”, OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, Nr 23. (13) Environment Kanada (1995), ”Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant”, Report EPS 1/RM/30, september 1995. (14) Testmetod C.8 i denna bilaga, Toxicitet hos daggmaskar. (15) Suedel B. C. och Rodgers J. H. (1994), ”Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing”, Environ. Toxicol. Chem. 13, s. 1163–1175. (16) Naylor C. och Rodrigues C., (1995), ”Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment”, Chemosphere 31, s. 3291–3303. (17) Dunnett C. W. (1964), ”A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control”, J. Amer. Statis. Assoc., 50, s. 1096–1121. (18) Dunnett C. W. (1964), ”New tables for multiple comparisons with a control”, Biometrics, 20, s. 482–491. (19) Williams D. A. (1971), ”A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control”, Biometrics, 27, s. 103–117. (20) Williams D. A. (1972), ”The comparison of several dose levels with a zero dose control”, Biometrics, 28, s. 510–531. (21) Rao J. N. K. och Scott A. J. (1992), ”A simple method for the analysis of clustered binary data”, Biometrics, 48, s. 577–585. (22) Christensen E. R. (1984), ”Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model”, Water Research 18, s. 213–221. (23) Bruce och Versteeg (1992), ”A statistical procedure for modelling continuous toxicity data”, Environmental Toxicology and Chemistry 11, s. 1485–1494. (24) Slob W. (2002), ”Dose-response modelling of continuous endpoints”, Toxicol. Sci. 66, s. 298–312. Tillägg 1 DEFINITIONER I denna testmetod gäller följande definitioner: syntetiskt sediment: rekonstituerat, konstgjort sediment som är en blandning av material avsedda att efterlikna de fysiska beståndsdelarna i naturligt sediment. överliggande vatten: det vatten som hålls ovanför sedimentet i testkärlet. porvatten: det vatten som finns i mellanrummen mellan sediment- och jordpartiklar. spikat sediment: sediment med tillsatt testämne. testkemikalie: alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod. Tillägg 2 Rekommendationer för odling av Chironomus riparius 1. Chironomus-larver kan odlas i kristalliseringskärl eller stora behållare. Fin kvartssand sprids som ett tunt skikt på cirka 5–10 mm på behållarens botten. Även kiselgur (t.ex. Merck, Art. 8117) har visat sig vara ett lämpligt substrat (det räcker med ett tunt lager på några mm). Lämpligt vatten tillsätts till ett djup på flera cm. Vattennivåerna bör fyllas på efter behov för att ersätta avdunstning och förebygga uttorkning. Vattnet kan vid behov ersättas. Det bör finnas en skonsam luftning. De kärl som innehåller larver bör hållas i en lämplig bur som hindrar vuxna exemplar från att rymma. Buren bör vara tillräckligt stor för att de vuxna exemplaren ska kunna svärma, annars kan kopulation utebli (minimum är cirka 30 × 30 × 30 cm). 2. Burarna ska hållas i rumstemperatur eller ett tempererat utrymme vid 20 ± 2 °C med en ljusperiod på 16 timmar (intensitet ca 1 000 lux) och 8 timmar mörker. Det har rapporterats att luftfuktighet under 60 % RH kan hämma reproduktion. Utspädningsvatten 3. Allt lämpligt naturligt eller syntetiskt vatten kan användas. Ofta används källvatten, avklorerat kranvatten och artificiella medier (t.ex. Elendt M4 eller M7, se nedan). Vattnet måste luftas före användningen. Vid behov kan odlingsvattnet förnyas genom att försiktigt hälla eller sifonera använt vatten från odlingskärlen utan att förstöra larvrören. Utfodring av larver 4. Chironomus-larverna ges fiskfoder i flingform (Tetra Min®, Tetra Phyll® eller motsvarande patenterat märke), cirka 250 mg per kärl och dag. Fodret kan ges i form av torrt malet pulver eller som suspension i vatten: 1,0 g flingfoder blandas med 20 ml utspädningsvatten till en homogen blandning. Beredningen kan ges med en dosering på cirka 5 ml per kärl och dag (skaka om före användning). Äldre larver kan få en större dos. 5. Utfodringen justeras enligt vattenkvaliteten. Om odlingsmediet blir grumligt bör dosen sänkas. Foderdoseringen måste övervakas noggrant. För liten mängd leder till att larverna emigrerar mot vattenkolumnen och för stor mängd leder till ökad mikrobiell aktivitet och lägre syrekoncentrationer. Båda omständigheterna kan leda till minskad tillväxt. 6. Även celler av vissa grönalger (t.ex. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) kan tillsättas när nya odlingskärl läggs upp. Utfodring av vuxna exemplar 7. Vissa testutövare har föreslagit att bomullskompresser indränkta i mättad sukroslösning kan användas som foder för vuxna exemplar. Kläckning 8. Vid 20 ± 2 °C börjar vuxna exemplar kläckas i odlingskärlen efter cirka 13–15 dagar. Hanarna är lätta att känna igen på sina fjäderantenner. Äggmassor 9. När vuxna exemplar finns i odlingsburen bör alla larver i odlingskärlen kontrolleras tre gånger per vecka för att se om gelatinösa äggmassor har deponerats. Om sådana upptäcks, bör de avlägsnas försiktigt. Äggmassorna överförs till ett litet kärl som innehåller ett prov av odlingsvattnet. De används sedan för att starta nya odlingskärl (t.ex. 2–4 äggmassor per kärl) eller för toxicitetstest. 10. Första stadiets larver bör kläckas efter 2–3 dagar. Uppläggning av nya odlingskärl 11. När odlingarna är etablerade bör det vara möjligt att lägga upp en färsk larvodling veckovis eller med längre intervall beroende på testningskraven, och avlägsna äldre kärl efter att vuxna myggor har kläckts. På detta sätt fås regelbunden tillgång till vuxna exemplar med minimal insats. Beredning av testlösningarna M4 och M7 12. M4-mediet upptäcktes av Elendt (1990). M7-mediet bereds på samma sätt som M4-mediet med undantag för de ämnen som anges i tabell 1, för vilka koncentrationerna är fyra gånger lägre i M7 jämfört med M4. En publikation om M7-mediet är under arbete (Elendt, personlig kommunikation). Testlösningen ska inte beredas enligt Elendt och Bias (1990) eftersom de angivna koncentrationerna av NaSiO3·5H2O, NaNO3, KH2PO4 och K2HPO4 inte är lämpliga. Beredning av M7-medium 13. Varje stamlösning (I) bereds individuellt och en kombinerad stamlösning (II) bereds av dessa stamlösningar (I) (se tabell 1). 50 ml av den kombinerade stamlösningen (II) och de mängder av varje stamlösning med makronäring som anges i tabell 2 och avjoniserat vatten tillsätts upp till 1 liter för att bereda M7-mediet. En stamlösning med vitaminer bereds genom att tillsätta tre vitaminer till avjoniserat vatten enligt tabell 3, och 0,1 ml av den kombinerade vitaminstamlösningen tillsätts till det slutliga M7-mediet strax före användningen (vitaminstamlösningen förvaras djupfryst i små alikvoter). Mediet luftas och stabiliseras. LITTERATUR BBA (1995), ”Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system”, redigerat av M. Streloke och H. Köpp. Berlin 1995. Tabell 1 Stamlösningar av spårelement för M4- och M7-medium Stamlösningar (I) Mängd (mg) som byggs upp till 1 liter med avjoniserat vatten Beredning av kombinerad stamlösning (II): blanda följande mängder (ml) stamlösning (I) och bygg upp till 1 liter med avjoniserat vatten Slutliga koncentrationer i testlösningarna (mg/l) M4 M7 M4 M7 H3BO3 (15) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 MnCl2 · 4H2O (15) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 LiCl (15) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 RbCl (15) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 SrCl2 · 6H2O (15) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 NaBr (15) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 Na2MoO4 · 2H2O (15) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 CuCl2 · 2H2O (15) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 ZnCl2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 CaCl2 · 2H6O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na2SeO3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 NH4VO3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 Na2EDTA · 2H2O (15) (16) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 FeSO4 · 7H2O (15) (16) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249

Tabell 2 Stamlösningar med makronäringsämnen för medium M4 och M7 Mängd som byggs upp till 1 liter med avjoniserat vatten (mg) Mängd stamlösning med makronäringsämnen som tillsätts för att bereda medium M4 och M7 (ml/l) Slutliga koncentrationer i testlösningarna M4 och M7 (mg/l) CaCl2 · 2H2O 293 800 1,0 293,8 MgSO4 · 7H2O 246 600 0,5 123,3 KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO3 64 800 1,0 64,8 NaSiO3 · 9H2O 50 000 0,2 10,0 NaNO3 2 740 0,1 0,274 KH2PO4 1 430 0,1 0,143 K2HPO4 1 840 0,1 0,184

Tabell 3 Stamlösningar med vitaminer för medium M4 och M7 Alla tre vitaminlösningar kombineras till en enda vitaminstamlösning. Mängd som byggs upp till 1 liter med avjoniserat vatten (mg) Mängd stamlösning med vitaminer som tillsätts för att bereda medium M4 och M7 (ml/l) Slutliga koncentrationer i testlösningarna M4 och M7 (mg/l) Tiaminhydroklorid 750 0,1 0,075 Cyanokobalamin (B12) 10 0,1 0,0010 Biotin 7,5 0,1 0,00075 LITTERATUR Elendt, B. P. (1990), ”Selenium Deficiency in Crustacean”, Protoplasma 154, s. 25–33. Elendt, B. P. och W. R. Bias (1990), ”Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna”, Water Research 24 (9), s. 1157–1167. Tillägg 3 BEREDNING AV SYNTETISKT SEDIMENT Sedimentsammansättning Syntetiskt sediment ska ha följande sammansättning: Beståndsdel Egenskaper % av sedimentets torrvikt Torv Sphagnum, så nära pH 5,5–6 som möjligt utan synliga växtrester och finfördelad (partikelstorlek ≤1 mm) och lufttorkad. 4–5 Kvartssand Partikelstorlek: > 50 % av partiklarna bör ha storlek inom området 50–200 μm 75–76 Kaolinitlera Kaolinithalt ≥ 30 % 20 Organiskt kol Justeras genom tillsats av torv och sand 2 (± 0,5) Kalciumkarbonat CaCO3, pulveriserat, kemiskt rent 0,05–0,1 Vatten Konduktivitet ≤ 10 μS/m 30–50 Beredning Torven lufttorkas och mals ner till ett fint pulver. En suspension av behövlig mängd torvpulver i avjoniserat vatten bereds med effektiv homogeniseringsapparat. Suspensionens pH justeras till 5,5 ± 0,5 med CaCO3. Suspensionen konditioneras minst två dagar med skonsam omrörning vid 20 ± 2 °C, för att stabilisera pH och etablera en stabil mikrobiell komponent, varefter pH uppmäts på nytt och bör vara 6,0 ± 0,5. Torvsuspensionen blandas sedan med de övriga beståndsdelarna (sand och kaolinlera) och avjoniserat vatten till ett homogent sediment med en vattenhalt som ger kring 30–50 procent torrvikt av sediment. Därefter mäts den slutliga blandningens pH på nytt och justeras vid behov till 6,5–7,5 med CaCO3. Prover tas av sedimentet för att bestämma torrvikten och halten organiskt kol. Likaså rekommenderas att det syntetiska sediment som ska användas i ett chironomidtoxicitetstest konditioneras före användningen i sju dagar i samma betingelser som råder i det efterföljande testet. Förvaring De torra beståndsdelarna för beredning av syntetiskt sediment kan lagras i ett torrt och svalt utrymme vid rumstemperatur. Berett (vått) sediment ska inte lagras för användning i test. Det bör användas omedelbart efter den 7 dagar långa konditioneringsperioden i slutet av beredningen. LITTERATUR Kapitel C.8 i denna bilaga, Toxicitet hos daggmaskar. Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998), ”Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media”, Ecotox. and Environ. Safety 39, s. 10–20. Tillägg 4 Krav på kemiska egenskaper hos utspädningsvatten Ämne Koncentrationer Partikelinnehåll < 20 mg/l Totalt organiskt kol < 2 mg/l Ojoniserad ammoniak < 1 μg/l Hårdhet som CaCO3 < 400 mg/l (17) Restklor < 10 μg/l Bekämpningsmedel med organiska fosforföreningar, totalt. < 50 ng/l Bekämpningsmedel med organiska klorföreningar plus polyklorerade bifenyler, totalt. < 50 ng/l Totalt organiskt klor < 25 ng/l Tillägg 5 Vägledning för övervakning av kläckning av chironomider Fällor placeras på testbägarna. Dessa fällor behövs från dag 20 fram till testets slut. Exempel på en fälla visas nedan. A: nylonnät B: upp-och-nedvänd plastkopp C: exponeringskärl utan läpp D: filterportar för vattenutbyte E: vatten F: sediment C. 28 TOXICITETSTEST I SEDIMENT- OCH VATTENFAS PÅ CHIRONOMID-LARVER MED SPIKAT VATTEN INLEDNING 1. Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje 219 (2004). Syftet med testmetoden är att bedöma effekterna av långvarig kemikalieexponering på sedimentlevande larver i sötvatten av fjädermyggor Chironomus sp. Den baserar sig i huvudsak på BBA-vägledningen med ett sediment-vatten-testsystem med syntetisk jord och vattenkolumnexponering (1). Metoden beaktar också existerande toxicitetstestprotokoll för Chironomus riparius och Chironomus tentans som har tagits fram i Europa och Förenta staterna (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) och ringtestats (1) (6) (9). Även övriga väldokumenterade chironomider kan användas, t.ex. Chironomus yoshimatsui (10) (11). 2. Exponeringen i denna testmetod görs med spikat vatten. Valet av lämpligt exponeringsscenario beror på den avsedda tillämpningen för testet. Vattenexponeringen med spikad vattenkolumn är avsedd att simulera vindavdrift av bekämpningsmedel och täcker den inledande toppkoncentrationen i porvatten. Metoden är också användbar för andra typer av exponering (inklusive kemikaliespill), med undantag för ackumuleringsprocesser som är längre än testperioden. 3. Ämnen som behöver testas på sedimentlevande organismer är sådana som i allmänhet blir kvar i sedimentet under långa tidsperioder. De sedimentlevande organismerna kan exponeras via ett antal rutter. Den relativa betydelsen av varje exponeringsrutt och den tid det tar för var och en av dem att bidra till de totala toxiska effekterna beror på den berörda kemikaliens fysikalkemiska egenskaper. För starkt adsorberande ämnen (t.ex. log Kow > 5) eller för ämnen som binds kovalent till sedimentet, kan förtäring av förorenad föda vara en betydande exponeringsrutt. För att toxiciteten hos starkt lipofila ämnen inte ska underskattas kan tillsättning av föda till sedimentet före applicering av testämnet övervägas. För att alla potentiella exponeringsrutter ska beaktas har denna testmetod fokus på långvarig exponering. Testets längd är 20–28 dagar för C. riparius och C. yoshimatsui och 28–65 dagar för C. tentans. Om korttidsdata krävs för ett specifikt ändamål, t.ex. för att undersöka effekterna av instabila kemikalier, kan tilläggsreplikat avlägsnas efter tio dagar. 4. De endpoints som mäts är det totala antalet kläckta vuxna exemplar och utvecklingstiden fram till kläckning. Det rekommenderas att mätningar av larvernas överlevnad och tillväxt endast görs efter en tiodagarsperiod i fall där ytterligare korttidsdata krävs, med användning av ytterligare replikat enligt vad som är lämpligt. 5. För detta test rekommenderas syntetiskt sediment. Syntetiskt sediment har flera fördelar jämfört med naturliga sediment: — Variationen mellan testningar reduceras eftersom syntetiskt sediment bildar en reproducerbar ”standardmatris”, och behovet av att få fram oförorenade och rena sediment elimineras. — Testningen kan inledas när som helst utan att beakta säsongvariationer i testsedimentet och det behövs ingen förbehandling av sediment för att få bort naturligt förekommande fauna. När syntetiskt sediment används uppstår heller inte kostnader för insamling på fältet av tillräckliga mängder sediment för rutintestning. — Användning syntetiskt sediment ger möjlighet till jämförelser av toxicitet och därmed klassificering av ämnen. Toxicitetsdata från tester med naturliga och syntetiska sediment har visat sig vara jämförbara för flera kemikalier (2). 6. Definitioner finns i tillägg 1. PRINCIP FÖR TESTMETODEN 7. Första stadiets chironomidlarver exponeras för ett urval koncentrationer av testämnet i ett sediment-vattensystem. Testet inleds genom att tillsätta första stadiets larver i testbägare som innehåller ett sediment-vatten-system och därefter spika vattnet med testämnet. Kläckning av fullbildade myggor och utvecklingshastighet mäts i slutet av testet. Överlevande larver och deras vikt kan också mätas efter tio dagar om så krävs (med användning av ytterligare replikat enligt det som är lämpligt). Dessa data analyseras med användning av en regressionsmodell för att uppskatta den koncentration som skulle orsaka × % minskning av antalet fullbildade myggor eller av larvernas överlevnad eller tillväxt (EC15, EC50 osv.) eller genom användning av statistisk hypotesprövning för att bestämma NOEC/LOEC. För hypotesprövningen krävs en jämförelse mellan effektvärden och kontrollvärden med användning av statistiska test. INFORMATION OM TESTÄMNET 8. Testämnets vattenlöslighet, ångtryck, uppmätt eller beräknad fördelning i sedimentet samt stabilitet i vatten och sediment bör vara kända. Det bör finnas en tillförlitlig analysmetod för kvantifiering av testämnet i överliggande vatten, porvatten och sediment med känd och rapporterad exakthet och detektionsgräns. Det är också bra att känna till testämnets strukturformel och renhet. Hur testämnet agerar kemiskt (t.ex. upplösning, abiotisk och biotisk nedbrytning osv.) hör också till den information som är användbar. Närmare vägledning för testning av ämnen vars fysikalkemiska egenskaper gör det svårt att genomföra detta test finns i (12). REFERENSKEMIKALIER 9. Referenskemikalier kan testas periodiskt för att säkerställa att testprotokollet och testbetingelserna är tillförlitliga. Exempel på toxiska referensämnen som med framgång har använts i ringtest och valideringsstudier är lindan, trifluranid, pentaklorfenol, kadmiumklorid och kaliumklorid (1) (2) (5) (6) (13). TESTETS GILTIGHET 10. För att testet ska vara giltigt gäller följande villkor: — Kläckningen av vuxna exemplar i kontrollkärlen måste vara minst 70 % i slutet av testet (1) (6). — Kläckningen av vuxna exemplar av C. riparius och C. yoshimatsui i kontrollkärlen bör inträffa 12–24 dagar efter att de har införts i kärlen, för C. tentans krävs en period på 20–65 dagar. — Vid slutet av testet bör pH och koncentrationen upplöst syre mätas i varje kärl. Syrekoncentrationen bör vara minst 60 % av luftmättnadsvärdet (ASV) vid den använda temperaturen och pH i överliggande vatten bör vara 6–9 i alla testkärl. — Variationen i vattentemperatur får inte vara större än ± 1,0 °C. Vattentemperaturen kan kontrolleras genom att göra testningen i ett isotermiskt utrymme, varvid rumstemperaturen bör kontrolleras med lämpliga tidsintervall. METODBESKRIVNING Testkärl 11. Testet görs i 600 ml-glasbägare med 8 cm i diameter. Även andra slags kärl kan användas, men då måste det gå att garantera att överliggande vatten och sediment har lämpliga djup. Sedimentytan bör vara tillräckligt stor för att ge 2–3 cm2 per larv. Förhållandet mellan sedimentskiktets djup och överliggande vattnets djup bör vara 1:4. Testkärl och annan apparatur som kommer i kontakt med testsystemet bör vara gjorda av glas eller annat kemiskt inert material (t.ex. teflon). Val av arter 12. Den art som används i testet ska helst vara Chironomus riparius. Chironomus tentans kan också vara lämplig, men den är svårare att hantera och kräver en längre testperiod. Även Chironomus yohimatsui kan användas. I tillägg 2 finns närmare uppgifter om odlingsmetoder för Chironomus riparius. Information om odlingsbetingelser finns också för andra arter, t.ex. Chironomus tentans (4) och Chironomus yoshimatsui (11). Arternas identifiering måste bekräftas före testningen men är inte nödvändig före varje test om organismerna härrör från en odling inom laboratoriet. Sediment 13. Helst ska syntetiskt sediment användas. Om naturligt sediment används bör dess egenskaper bestämmas (minst pH, halten organiskt kol, och gärna även andra parametrar såsom förhållandet C/N och granulometri). Sedimentet måste även vara fritt från föroreningar och andra organismer som kan konkurrera med eller konsumera chironomiderna. Dessutom rekommenderas att naturligt sediment som är avsett att användas i ett chironomidtoxicitetstest konditioneras i sju dagar under samma betingelser som råder i det efterföljande testet. Följande syntetiska sediment, baserat på den syntetiska jord som används i testmetod C.8 (14) rekommenderas för detta test (1) (15) (16): a) 4–5 % (torrvikt) torv så nära pH 5,5–6 som möjligt; det är viktigt att använda endast lufttorkad och finmalen torv i pulverform (partikelstorlek ≤ 1 mm). b) 20 % (torrvikt) kaolinlera (kaolinithalt helst över 30 %). c) 75–76 % (torrvikt) kvartssand (till största del bestående av fin sand där mer än 50 % av partiklarna har storleken 50–200 μm). d) Avjoniserat vatten tillsätt så att blandningen får en slutlig fukthalt på 30–50 %. e) Kemiskt rent kalciumkarbonat CaCO3) tillsätts för att justera den slutliga sedimentblandningens pH till 7,0 ± 0,5. f) Den slutliga blandningens kolhalt bör vara 2 % ± 0,5 % och kan justeras med hjälp av lämpliga mängder torv och sand, enligt punkterna a och c. 14. Torv, kaolinlera och sand ska härröra från kända källor. Sedimentkomponenterna bör kontrolleras för att bekräfta avsaknaden av kemiska föroreningar (t.ex. tungmetaller, organiska klorföreningar, organiska fosforföreningar osv.) Ett exempel på hur syntetiskt sediment kan tillredas beskrivs i tillägg 3. Det är också godtagbart att blanda torra beståndsdelar om det går att demonstrera att tillsats av överliggande vatten inte leder till att sedimentets beståndsdelar separerar (t.ex. flytande torvpartiklar) och att torven eller sedimentet konditioneras tillräckligt. Vatten 15. Allt vatten som uppfyller de kemiska kriterierna för godtagbart utspädningsvatten (se tilläggen 2 och 4) är lämpligt som testvatten. Allt lämpligt vatten, naturligt vatten (ytvatten eller grundvatten), rekonstituerat vatten (se tillägg 2) och avklorerat kranvatten är godtagbart som odlings- och testvatten om chironomiderna överlever i det under odling, acklimatisering och testning utan att uppvisa tecken på stress. Vid teststart ska testvattnets pH vara mellan 6 och 9 och totalhårdheten får inte vara högre än 400 mg/l uttryckt som CaCO3. Om man misstänker växelverkan mellan hårdhetsjoner och testämnet, bör vatten med lägre hårdhet användas (i en sådan situation får Elendt Medium M4 inte användas). Samma typ av vatten bör användas under hela testningen. De vattenkvalitetsegenskaper som förtecknas i tillägg 4 bör mätas minst två gånger om året eller om man misstänker att egenskaperna har ändrats betydligt. Stamlösningar – spikat vatten 16. Testkoncentrationerna beräknas på grundval av vattenkolumnens koncentrationer, dvs. det vatten som ligger över sedimentet. Testlösningar för de valda koncentrationerna bereds i regel genom utspädning av en stamlösning. Stamlösningarna ska helst beredas genom upplösning av testämnet i ett testmedium. I vissa fall kan det krävas lösningsmedel eller dispergeringsmedel för att få en stamlösning med lämplig koncentration. Exempel på lämpliga lösningsmedel är aceton, etanol, metanol, etylenglykolmonoetyleter, etylenglykoldimetyleter, dimetylformamid och trietylenglykol. Dispergeringsmedel som kan användas är Cremofor RH40, Tween 80, metylcellulosa 0,01 % och HCO-40. Lösningsmedlets koncentration i det slutliga testmediet bör vara minimal (t.ex. ≤ 0,1 ml/l) och bör vara samma för alla behandlingar. Om lösningsmedel används, får det inte ha någon betydande effekt på överlevnad eller synliga skadliga effekter på chironomidlarverna, vilket kan verifieras genom en kontroll med enbart lösningsmedel. Man bör dock in i det sista undvika att använda dessa medel. TESTETS UTFORMNING 17. Testets utformning avser antalet koncentrationer och intervallen mellan dem, antalet kärl per koncentration och antalet larver per kärl. Här beskrivs utformningar för uppskattning av effektkoncentration, uppskattning av NOEC och för gränstest. Regressionsanalys rekommenderas för att testa hypotesen. Utformning för regressionsanalys 18. Effektkoncentrationen (t.ex. EC15, EC50) och det koncentrationsområde som är relevant för testämnet bör omfattas av de koncentrationer som ingår i testet. Allmänt taget gäller att exaktheten och särskilt giltigheten för uppskattningar av effektkoncentrationer (ECx) förbättras när effektkoncentrationen ligger inom området för de koncentrationer som testas. Extrapolering under lägsta positiva koncentration eller över högsta koncentration bör undvikas. Preliminära test kan användas för att hitta rätt koncentrationsområde (se punkt 27). 19. Om ECx ska uppskattas bör testet omfatta minst fem koncentrationer och tre replikat för varje koncentration. Det är under alla omständigheter tillrådligt att använda tillräckligt många testkoncentrationer för att få en god modelluppskattning. Faktorn mellan koncentrationer bör inte vara större än två (undantag kan göras i fall där dos-responskurvan har liten lutning). Antalet replikat per behandling kan minskas om antalet testkoncentrationer med olika respons ökas. En ökning av antalet replikat eller minskning av testkoncentrationsintervall tenderar att leda till ett smalare konfidensintervall för testet. Ytterligare replikat krävs om en uppskattning ska göras av larvernas överlevnad och tillväxt under en tiodagarsperiod. Upplägg för uppskattning av NOEC/NOEC 20. Om LOEC eller LOEC ska uppskattas bör det finnas fem testkoncentrationer med minst fyra replikat och faktorn mellan koncentrationerna får inte vara större än två. Antalet replikat bör vara tillräckligt för att säkerställa tillräcklig statistisk styrka för att upptäcka en skillnad på 20 % jämfört med kontrollen vid nivån 5 % för signifikans (p = 0,05). För uppskattning av utvecklingshastighet är det i regel lämpligt med variansanalys (ANOVA), såsom Dunnets eller Williams test (17) (18) (19) (20). För kläckningsfrekvens kan ett Cochran-Armitage-test, Fishers exakta test (med Bonferronikorrigering) eller ett Mantel-Haenszel-test användas. Gränstest 21. Gränstest kan göras (en testkoncentration och kontroll) om inga effekter framkommit vid det preliminära testet för att fastställa testområde. Syftet med gränstest är att få indikation om att testämnets toxiska värde är högre än den testade gränskoncentrationen. Inga förslag på rekommenderade koncentrationer kan ges i denna testmetod, utan frågan måste bedömas av tillsynsmyndigheterna. I regel krävs minst sex replikat både för behandling och kontroll. Man måste kunna demonstrera tillräcklig statistisk styrka för att upptäcka en skillnad på 20 % jämfört med kontrollen vid nivån 5 % för signifikans (p = 0,05). Eftersom t-test ger kvantitativ respons (utvecklingshastighet och vikt) är t-test en lämplig statistisk metod förutsatt att data uppfyller testkraven (normalitet, homogena varianser osv.). Om dessa krav inte uppfylls kan man använda t-testet med olika varians eller ett icke-parametriskt test, såsom Wilcoxon-Mann-Whitneys test. För kläckningsfrekvens är det lämpligt att använda Fischers exakta test. FÖRFARANDE Exponeringsbetingelser Beredning av systemet med spikat vatten och sediment 22. Lämpliga mängder syntetiskt sediment (se punkterna 13 och 14 och tillägg 3) tillförs testkärlet så att det bildas ett lager på minst 1,5 cm. Vatten tillsätts till ett djup på 6 cm (se punkt 15). Förhållandet mellan sedimentskiktets djup och vattenskiktets djup ska inte överskrida 1:4 och sedimentskiktet ska inte vara djupare än 3 cm. Systemet sediment-vatten bör hållas under skonsam luftning i sju dagar före tillsats av testorganismer (se punkt 14 och tillägg 3). För att undvika separation av sedimentets beståndsdelar och återsuspension av finfördelat material medan testvatten tillsätts i vattenkolumnen, kan sedimentet täckas med en plastplatta medan vattnet tillsätts, varefter plattan avlägsnas omedelbart. Även andra metoder kan vara lämpliga. 23. Testkärlen bör vara täckta (t.ex. med glasplattor). Vid behov fylls under testets gång vatten på till ursprunglig volym för att kompensera för avdunstning. Detta bör göras med destillerat eller avjoniserat vatten för att förebygga ackumulering av salter. Tillförsel av testorganismer 24. Fyra till fem dagar innan testorganismerna tillförs testkärlen ska äggmassorna avlägsnas från odlingarna och placeras i små kärl i odlingsmedium. Åldrat medium från stamodling eller färskt berett medium kan användas. Om färskt medium används bör en liten mängd föda, t.ex. grönalger och/eller några droppar filtrat från en finmald suspension av fiskfoder i flingform tillsättas odlingsmediet (se tillägg 2). Endast färska äggmassor får användas. I regel börjar larverna kläckas några dagar efter att äggen har lagts (2–3 dagar för Chironomus riparius vid 20 °C och 1–4 dagar för Chironomus tentans vid 23 °C och Chironomus yoshimatsui vid 25 °C), och larvernas tillväxt sker i fyra stadier på 4–8 dagar per stadium. För testet ska första stadiets larver användas (2–3 eller 1–4 dagar efter kläckningen). Bestämning av larvstadium kan möjligen göras genom mätning av huvudkapseldiameter (6). 25. Tjugo första stadiets larver fördelas slumpvis till varje testkärl som innehåller spikat sediment och vatten, med användning av en trubbig pipett. Luftningen av vattnet måste stoppas medan larverna tillsätts testkärlen och hållas stoppad i ytterligare 24 timmar efter tillsättningen (se punkterna 24 och 32). Enligt det testupplägg som används (se punkterna 19 och 20) är antalet larver per testkoncentration minst 60 för uppskattning av EC-punkt och 80 för bestämning av NOEC. 26. Tjugofyra timmar efter tillsättning av larverna spikas den överliggande vattenkolumnen med testämnet, och en lätt luftning införs på nytt. Små volymer av testämnet tillsätts under vattenytan med hjälp av en pipett. Därefter görs försiktig omrörning av det överliggande vattnet utan att störa sedimentet. Testkoncentrationer 27. Ett preliminärt test kan användas för att fastställa koncentrationerna för det definitiva testet. För detta ändamål används en serie brett spridda koncentrationer av testämnet. För att få samma ytdensitet per chironomid som ska användas för det slutliga testet, exponeras chironomiderna för varje koncentration av testämnet under en period som ger möjlighet att uppskatta lämpliga testkoncentrationer. Inga replikat krävs. 28. Testkoncentrationerna för det definitiva testet baseras på resultaten från det preliminära testet. Det ska finnas minst fem testkoncentrationer som väljs enligt beskrivningen i punkterna 18–20. Kontrollkärl 29. Kontrollkärl som inte innehåller testämne utan enbart sediment bör ingå i testet med lämpligt antal replikat (se punkterna 19–20). Om lösningsmedel har använts för applicering av testämnet (se punkt 16) bör det också finnas kontrollkärl med sediment och lösningsmedel. Testsystem 30. De system som används är statiska. Semistatiska system eller genomflödessystem med intermittent eller kontinuerlig förnyelse av överliggande vatten kan användas i undantagsfall, t.ex. om vattenkvalitetsspecifikationerna inte är lämpliga för testorganismen eller påverkar den kemiska jämvikten (t.ex. om syrenivåerna blir för låga, koncentrationen av utsöndrade produkter blir för hög eller om mineraler som släpps ut från sediment påverkar pH och/eller vattenhårdheten). I regel är det dock tillräckligt och rekommendabelt att använda andra metoder för kompensering av kvaliteten på överliggande vatten, såsom luftning. Foder 31. Larverna bör ges foder helst dagligen eller minst tre gånger per vecka. Fiskfoder (suspension i vatten eller finmalt foder, t.ex. Tetra-Min eller Tetra-Phyll, se närmare i tillägg 2) i mängder om 0,25–0,5 mg (0,35–0,5 mg för C. yoshimatsui) per larv per dag anses vara lämpligt för unga larver under de tio första dagarna. För äldre larver kan det krävas lite större mängd: 0,5–1 mg per larv och dag bör vara tillräckligt för återstoden av testet. Mängden bör minskas för alla behandlingar och kontroller om det uppstår svamptillväxt eller mortalitet observeras i kontrollerna. Om svamptillväxten inte kan stoppas måste testet upprepas. Vid testning av starkt adsorberande ämnen (t.ex. log Kow > 5) eller ämnen som är kovalent bundna till sedimentet, kan mängden foder som krävs för att säkerställa överlevnad och naturlig tillväxt för organismerna tillsättas i det syntetiska sedimentet före stabiliseringsperioden. Då ska växtmaterial användas i stället för fiskfoder, t.ex. 0,5 % (torrvikt) finmalda löv från t.ex. brännässla (Urtica dioica), mullbär (Morus alba), vitklöver (Trifolium repens), spenat (Spinacia oleracea) eller annat växtmaterial (Cerophyl eller alfacellulosa). Inkubationsbetingelser 32. Skonsam luftning av överliggande vatten i testkärlen införs helst 24 timmar efter tillsättning av larverna och får pågå genom hela testet (se till att halten upplöst syre inte faller under 60 % av luftmättnadsvärdet ASV). Luftningen görs med hjälp av en Pasteur-glaspipett som är fäst 2–3 cm ovanför sedimentskiktet (en eller ett fåtal bubblor per sekund). Vid testning av flyktiga kemikalier kan man överväga att utesluta luftning av sediment-vattensystemet. 33. Testet genomförs vid konstant temperatur på 20 °C (± 2 °C). För C. tentans och C. yoshimatsui rekommenderas temperaturer på 23 °C respektive 25 °C (± 2 °C). En ljusperiod på 16 timmar används och ljusintensiteten ska vara 500–1 000 lux. Exponeringstid 34. Exponeringen inleds när larver tillsätts i spikade kärl och kontrollkärl. Den maximala exponeringstiden är 28 dagar för C. riparius och C. yoshimatsui och 65 dagar för C. tentans. Om myggor kläcks tidigare, kan testet avslutas efter minst fem dagar efter att det sista vuxna exemplaret har kläckts i kontrollen. OBSERVATIONER Kläckning 35. Utvecklingstiden och totalantalet fullbildade han- och honmyggor bestäms. Hanarna är lätta att känna igen på sina fjäderantenner. 36. Testkärlen bör granskas visuellt minst tre gånger i veckan för att bedöma förekomsten av onormalt beteende (t.ex. exemplar som lämnar sedimentet, ovanligt simmande) jämfört med kontrollen. Under perioden för förväntad kläckning är det nödvändigt att dagligen räkna antalet kläckta exemplar. Kön och antal fullbildade exemplar registreras dagligen. Efter identifiering avlägsnas myggorna från kärlen. Ägg som har deponerats före testets slutförande bör registreras och därefter avlägsnas för att förhindra att larver på nytt introduceras i sedimentet. Likaså ska registrering göras av antalet synliga puppor som inte har kläckts. Vägledning om övervakning av kläckning finns i tillägg 5. Tillväxt och överlevnad 37. Om det krävs data om överlevnad och tillväxt under en tiodagarsperiod bör ytterligare testkärl införlivas från början, så att dessa därefter kan användas. Larverna i sedimentet från dessa tilläggskärl tillvaratas genom sållning med ett 250 μm-såll. Kriterierna för död är orörlighet eller utebliven reaktion på mekanisk stimulans. Larver som inte tillvaratas bör räknas som döda (larver som har dött i början av testet kan ha sönderdelats av mikrober). Torrvikten (askfri) för överlevande larver per testkärl bestäms och den genomsnittliga individuella torrvikten per kärl beräknas. Det är bra att bestämma vilket stadium överlevande larver tillhör, och för detta kan mätning av huvudkapselns bredd användas. Analytiska mätningar Testämnets koncentration 38. Som ett minimum bör prover av överliggande vatten, porvatten och sediment analyseras i början (helst inom en timme från tillsats av testämne) och i slutet av testet, för den högsta koncentrationen och för en lägre koncentration. Dessa bestämningar av testämneskoncentration ger information om testsubstansens beteende/fördelning i vatten-sedimentsystemet. Provtagning av sediment vid testets början kan påverka testsystemet (t.ex. genom att larver avlägsnas) och därför måste ytterligare testkärl användas för analytiska bestämningar vid testets start samt under testets gång om så är lämpligt (se punkt 39). Mätningar i sedimentet är eventuellt inte nödvändiga om fördelningen av testämnet mellan vatten och sediment har fastställts tydligt under motsvarande betingelser (t.ex. förhållandet mellan sediment och vatten, typ av applicering, sedimentets halt av organiskt kol). 39. Om mellanliggande mätningar görs (t.ex. dag 7) och om det för analysen krävs stora prover som inte kan tas från testkärlen utan att testsystemet påverkas, bör de analytiska bestämningarna göras på prover som tas från extra testkärl som behandlas på samma sätt (inklusive förekomst av testorganismer) men som inte används för biologiska observationer. 40. Centrifugering vid t.ex. 10 000 g och 4 °C i 30 minuter är det rekommenderade förfarandet för att isolera porvatten. Om det har demonstrerats att testämnet inte adsorberas på filter kan även filtrering godtas. I vissa fall är det kanske inte möjligt att analysera koncentrationerna i porvattnet därför att provet är för litet. Fysikalkemiska parametrar 41. Mätning bör göras av pH, upplöst syre i vattnet och temperatur i testkärlen på lämpligt sätt (se punkt 10). Hårdhet och ammonium bör mätas i kontrollerna och ett testkärl vid den högsta koncentrationen i början och slutet av testet. DATA OCH RAPPORTERING Behandling av resultaten 42. Syftet med detta test är att bestämma testämnets effekt på utvecklingshastigheten och totalantalet fullbildade han- och honmyggor eller, om det gäller ett tiodagarstest, effekterna på larvernas överlevnad och vikt. Om det inte finns indikationer på statistiskt avvikande känslighet för hanar och honor, kan resultaten poolas för statistiska analyser. Känslighetsskillnaderna mellan hanar och honor kan bedömas statistiskt t.ex. genom ”χ2-r × 2 table test”. Larvernas överlevnad och genomsnittlig individuell torrvikt per kärl måste bestämmas efter tio dagar där detta krävs. 43. Effektkoncentrationerna uttryckta som koncentrationer i överliggande vatten beräknas helst på grundval av uppmätta sedimentkoncentrationer vid testets början (se punkt 38). 44. För att beräkna en punktvis uppskattning av EC50 eller något annat ECx-värde, kan statistiken per kärl användas som äkta replikat. Vid beräkning av konfidensintervallet för ett ECx-värde bör variansen mellan kärl beaktas, eller så bör man påvisa att variansen är så liten att den kan ignoreras. Om modellen anpassas med minsta kvadratmetoden bör transformation tillämpas på den kärlvisa statistiken i syfte att förbättra variansens homogenitet. ECx-värdena bör dock beräknas när responsen har transformerats tillbaka till det ursprungliga värdet. 45. När syftet med den statistiska analysen är att bestämma NOEC/LOEC genom hypotestestning, måste variansen mellan kärl beaktas, t.ex. genom nästad ANOVA. Alternativt kan mer robust testning (21) vara lämplig i situationer där de vanliga ANOVA-antagandena inte gäller. Kläckningsfrekvens 46. Kläckningsfrekvenser är dikotoma (tvåpunktsfördelade) data och kan analyseras genom Cochran-Armitage test som tillämpas på step-down-grund där monoton dos-respons förväntas och dessa data stämmer överens med förväntningen. Om inte, kan Fishers exakta test eller ett Mantel-Haenszel-test med Bonferroni-Holm-korrigerade p-värden användas. Om det finns bevis på större variation mellan replikat inom samma koncentration än det som en binomial fördelning skulle indikera (ofta kallad extra-binomial fördelning), bör ett robust Cochran-Armitage-test eller Fischers exakta test användas, enligt det som föreslås i punkt 21. 47. Det totala antalet myggor som kläckts per kärl, ne, bestäms och divideras med antalet tillsatta larver, na enligt följande: där: ER = kläckningsfrekvensen ne = antalet myggor som kläckts per kärl na = antalet larver som tillsatts per kärl 48. Ett alternativ som bäst lämpar sig för stora provstorlekar, när det finns extra-binomial varians, är att behandla kläckningsfrekvensen som en kontinuerlig respons och använda förfaranden såsom William-test när monoton dos-respons förväntas och stämmer överens med dessa data för kläckningsfrekvens. Dunnett-test är lämpligt i fall där det inte är hållbart med monotonicitet. I detta sammanhang definieras begreppet ”stort prov” som ett prov där antalet kläckta och antalet inte kläckta överstiger fem, per replikatkärl. 49. Vid användning av ANOVA-metoder bör värdena för kläckningsfrekvens först transformeras genom arcsin-kvadratsrotstransformation eller Freeman-Tukeytransformation för att få en ungefärlig normalfördelning och jämna ut varianserna. Cochran-Armitage-test, Fishers exakta test (Bonferroni) eller Mantel-Haenszel-test kan användas när absoluta frekvenser används. För att göra arcsin-kvadratrotstransformation tar man inverterad sinus (sin–1) av kvadratroten av kläckningsfrekvensen. 50. ECx-värden för kläckningsfrekvenser beräknas med regressionsanalys (t.ex. probit (22), logit, Weibull, lämplig kommersiell mjukvara eller dylikt). Om regressionsanalysen inte lyckas (om det t.ex. finns mindre än två partiella responser) används andra icke-parametriska metoder såsom glidande medelvärde eller enkel interpolering. Utvecklingshastighet 51. Med genomsnittlig utvecklingstid avses den genomsnittliga tidsomfattningen mellan tillsättning av larver (testdag 0) och kläckningen av den experimentella kohorten myggor (för beräkning av den faktiska utvecklingstiden bör man beakta larvernas ålder vid tillsättningstidpunkten). Värdet för utvecklingshastighet är det reciproka värdet av tidsenheten för utveckling: (enhet: 1/dag) och representerar den andel larvutveckling som sker per dag. Utvecklingshastigheten är det mått som helst ska användas för utvärdering av dessa sedimenttoxicitetsstudier eftersom variansen är lägre och homogenare samt närmare normalfördelningen i jämförelse med utvecklingstiden. Kraftfulla parametriska testförfaranden kan alltså användas baserade på utvecklingshastighet hellre än på utvecklingstid. För utvecklingshastighet som en kontinuerlig respons kan ECx-värden uppskattas med hjälp av regressionsanalys (t.ex. (23), (24)). 52. För efterföljande statistiska test antas antalet myggor observerade på inspektionsdag × ha kläckts i mitten av tidsintervallet mellan dag × och dag x-1 (l är inspektionsintervallets längd, i regel 1 dag). Genomsnittlig utvecklingshastighet per kärl (x) beräknas enligt följande: där: : genomsnittlig utvecklingshastighet per kärl i : index för inspektionsintervall m : maximiantalet inspektionsintervall : antalet myggor som kläckts under inspektionsintervallet i ne : totalantalet myggor som kläckts i slutet av experimentet (= ) xi : utvecklingshastigheten för myggor som kläckts under intervallet i där: dagi : inspektionsdag (dagar från appliceringen) li : inspektionsintervallets längd i (dagar, i regel 1 dag) Testrapport 53. Testrapporten ska innehålla minst följande uppgifter: Testämne: — Fysikalisk natur och, där det är relevant, fysikalkemiska egenskaper (vattenlöslighet, ångtryck, fördelningskoefficient i jord (eller i sediment, om tillgänglig), stabilitet i vatten osv.). — Kemiska identifieringsdata (trivialnamn, kemiskt namn, strukturformel, CAS-nummer osv.) samt renhet och analysmetod för kvantifiering av testämnet. Testarter: — Organismer som använts för testet: art, vetenskapligt namn, ursprung och odlingsbetingelser. — Information om hantering av äggmassor och larver. — Organismernas ålder när de tillförs testkärlen. Testbetingelser: — Sediment som använts (naturligt eller syntetiskt). — För naturligt sediment, insamlingsplatsens belägenhet och beskrivning av sedimentet, inbegripet i mån av möjlighet föroreningshistoria och egenskaper: pH, halten organiskt kol, C/N-kvot och granulometri (om lämpligt). — Beredning av syntetiskt sediment: beståndsdelar och egenskaper (halten organiskt kol, pH, fukthalt osv. vid testets början). — Beredning av testvatten (om rekonstituerat vatten används) och egenskaper (syrehalt, pH, konduktivitet, hårdhet osv. vid testets början). — Sedimentets och överliggande vattnets djup. — Volymen för överliggande vatten och porvatten, vikten för vått sediment med och utan porvatten. — Testkärl (material och storlek). — Metod för beredning av stamlösningar och testkoncentrationer. — Tillsättning av testämne: antalet koncentrationer, antalet replikat och, i förekommande fall, använt lösningsmedel. — Inkubationsbetingelser: temperatur, ljuscykel och intensitet, luftning (frekvens och intensitet). — Detaljerad information om utfodringen, inklusive typ av foder, beredning, mängd och utfodringsschema. Resultat: — Nominella testkoncentrationer, uppmätta testkoncentrationer och resultaten av alla analyser för bestämning av testämnets koncentration i testkärl. — Vattenkvaliteten i testkärlen – pH, temperatur, upplöst syre, hårdhet och ammonium. — Ersättning av avdunstat testvatten, i förekommande fall. — Antalet kläckta hon- och hanmyggor per kärl och dag. — Antalet larver som inte utvecklats till myggor, per kärl. — Genomsnittlig individuell torrvikt för larver per kärl och per stadium, om lämpligt. — Procentandel kläckta exemplar per replikat- och testkoncentration (han- och honmyggor poolade). — Genomsnittlig utvecklingshastighet för fullbildade myggor per replikat och behandlingsnivå (han- och honmyggor poolade). — Uppskattning av toxiska endpoints t.ex. ECx (och associerade konfidensintervall), NOEC och/eller LOEC, och statistiska metoder som använts för bestämning av dem. — Diskussion av resultaten, inbegripet inverkan på testresultatet som kan tillskrivas avvikelser från denna testmetod. LITTERATUR (1) BBA (1995), ”Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system”, redigerat av M. Streloke och H. Köpp. Berlin 1995. (2) Fleming R. m.fl. 1994), ”Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances”, Slutlig rapport till Europeiska kommissionen, rapport nr EC 3738, augusti 1994, WRc, UK. (3) SETAC (1993), ”Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments”, WOSTA Workshop, Nederländerna. (4) ASTM International/E1706-00 (2002), ”Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates”, s. 1125–1241, ASTM International 2002 Annual Book of Standards, vol. 11.05, ”Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; Pesticides”, ASTM International, West Conshohocken, PA. (5) Environment Kanada (1997), ”Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method”, Report SPE 1/RM/32, december 1997. (6) US-EPA (2000), ”Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates”, andra utgåvan, EPA 600/R-99/064, mars 2000, revidering av första utgåvan juni 1994. (7) US-EPA/OPPTS 850.1735 (1996), ”Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates”. (8) US-EPA/OPPTS 850.1790 (1996), ”Chironomid Sediment toxicity Test”. (9) Milani D., Day K. E., McLeay D. J. och Kirby R. S. (1996), ”Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Kanada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius)” Technical Report, Environment Kanada, National Water Research Institute, Burlington, Ontario, Kanada. (10) Sugaya Y. (1997), ”Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui”, Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4), s. 345–350. (11) Kawai K. (1986), ”Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera)”, Jp. J. Sanit. Zool. 37 (1), s. 47–57. (12) OECD, 2000, ”Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures”, OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment Nr 23. (13) Environment Kanada (1995), ”Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant”, Report EPS 1/RM/30, september 1995. (14) Kapitel C.8 i denna bilaga, Toxicitet hos daggmaskar. (15) Suedel B. C. och Rodgers J. H. (1994), ”Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing”, Environ. Toxicol. Chem. 13, s. 1163–1175. (16) Naylor C. och Rodrigues C., (1995), ”Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment”, Chemosphere 31, s. 3291–3303. (17) Dunnett C. W. (1964), ”A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control”, J. Amer. Statis. Assoc. 50, s. 1096–1121. (18) Dunnett C. W. (1964), ”New tables for multiple comparisons with a control”, Biometrics, 20, s. 482–491. (19) Williams D. A. (1971), ”A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control”, Biometrics, 27, s. 103–117. (20) Williams D. A. (1972), ”The comparison of several dose levels with a zero dose control”, Biometrics, 28, s. 510–531. (21) Rao J. N. K. och Scott A. J. (1992), ”A simple method for the analysis of clustered binary data”, Biometrics 48, s. 577–585. (22) Christensen E. R. (1984), ”Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model”, Water Research 18, s. 213–221. (23) Bruce och Versteeg (1992), ”A statistical procedure for modelling continuous toxicity data”, Environmental Toxicology and Chemistry 11, s. 1485–1494. (24) Slob W. (2002), ”Dose-response modelling of continuous endpoints”, Toxicol. Sci. 66, s. 298–312. Tillägg 1 DEFINITIONER I denna testmetod gäller följande definitioner: syntetiskt sediment: rekonstituerat, konstgjort sediment som är en blandning av material avsedda att efterlikna de fysiska beståndsdelarna i naturligt sediment. överliggande vatten: det vatten som hålls ovanför sedimentet i testkärlet. porvatten: det vatten som finns i mellanrummen mellan sediment- och jordpartiklar. spikat sediment: sediment med tillsatt testämne. testkemikalie: alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod. Tillägg 2 Rekommendationer för odling av Chironomus riparius 1. Chironomus-larver kan odlas i kristalliseringskärl eller stora behållare. Fin kvartssand sprids som ett tunt skikt på cirka 5–10 mm på behållarens botten. Även kiselgur (t.ex. Merck, Art. 8117) har visat sig vara ett lämpligt substrat (det räcker med ett tunt lager på några mm). Lämpligt vatten tillsätts till ett djup på flera cm. Vattennivåerna bör fyllas på efter behov för att ersätta avdunstning och förebygga uttorkning. Vattnet kan vid behov ersättas. Det bör finnas en skonsam luftning. De kärl som innehåller larver bör hållas i en lämplig bur som hindrar vuxna exemplar från att rymma. Buren bör vara tillräckligt stor för att de vuxna exemplaren ska kunna svärma, annars kan kopulation utebli (minimum är cirka 30 × 30 ×30 cm). 2. Burarna ska hållas i rumstemperatur eller ett tempererat utrymme vid 20 ± 2 °C med en ljusperiod på 16 timmar (intensitet ca 1 000 lux) och 8 timmar mörker. Det har rapporterats att luftfuktighet under 60 % RH kan hämma reproduktion. Utspädningsvatten 3. Allt lämpligt naturligt eller syntetiskt vatten kan användas. Ofta används källvatten, avklorerat kranvatten och artificiella medier (t.ex. Elendt M4 eller M7, se nedan). Vattnet måste luftas före användningen. Vid behov kan odlingsvattnet förnyas genom att försiktigt hälla eller sifonera använt vatten från odlingskärlen utan att förstöra larvrören. Utfodring av larver 4. Chironomus-larverna ges fiskfoder i flingform (Tetra Min®, Tetra Phyll® eller motsvarande patenterat märke), cirka 250 mg per kärl och dag. Fodret kan ges i form av torrt malet pulver eller som suspension i vatten: 1,0 g flingfoder blandas med 20 ml utspädningsvatten till en homogen blandning. Beredningen kan ges med en dosering på cirka 5 ml per kärl och dag (skaka om före användning). Äldre larver kan få en större dos. 5. Utfodringen justeras enligt vattenkvaliteten. Om odlingsmediet blir grumligt bör dosen sänkas. Foderdoseringen måste övervakas noggrant. För liten mängd leder till att larverna emigrerar mot vattenkolumnen och för stor mängd leder till ökad mikrobiell aktivitet och lägre syrekoncentrationer. Båda omständigheterna kan leda till minskad tillväxt. 6. Även celler av vissa grönalger (t.ex. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) kan tillsättas när nya odlingskärl läggs upp. Utfodring av vuxna exemplar 7. Vissa testutövare har föreslagit att bomullskompresser indränkta i mättad sukroslösning kan användas som foder för vuxna exemplar. Kläckning 8. Vid 20 ± 2 °C börjar vuxna exemplar kläckas i odlingskärlen efter cirka 13–15 dagar. Hanarna är lätta att känna igen på sina fjäderantenner. Äggmassor 9. När vuxna exemplar finns i odlingsburen bör alla larver i odlingskärlen kontrolleras tre gånger per vecka för att se om gelatinösa äggmassor har deponerats. Om sådana upptäcks, bör de avlägsnas försiktigt. Äggmassorna överförs till ett litet kärl som innehåller ett prov av odlingsvattnet. De används sedan för att starta nya odlingskärl (t.ex. 2–4 äggmassor per kärl) eller för toxicitetstest. 10. Första stadiets larver bör kläckas efter 2–3 dagar. Uppläggning av nya odlingskärl 11. När odlingarna är etablerade bör det vara möjligt att lägga upp en färsk larvodling veckovis eller med längre intervall beroende på testningskraven, och avlägsna äldre kärl efter att vuxna myggor har kläckts. På detta sätt fås regelbunden tillgång till vuxna exemplar med minimal insats. Beredning av testlösningarna M4 och M7 12. M4-mediet upptäcktes av Elendt (1990). M7-mediet bereds på samma sätt som M4-mediet med undantag för de ämnen som anges i tabell 1, för vilka koncentrationerna är fyra gånger lägre i M7 jämfört med M4. En publikation om M7-mediet är under arbete (Elendt, personlig kommunikation). Testlösningen ska inte beredas enligt Elendt och Bias (1990) eftersom de angivna koncentrationerna av NaSiO3·5H2O, NaNO3, KH2PO4 och K2HPO4 inte är lämpliga. Beredning av M7-medium 13. Varje stamlösning (I) bereds individuellt och en kombinerad stamlösning (II) bereds av dessa stamlösningar (I) (se tabell 1). Femtio ml av den kombinerade stamlösningen (II) och de mängder av varje stamlösning med makronäring som anges i tabell 2 och avjoniserat vatten tillsätts upp till 1 liter för att bereda M7-mediet. En stamlösning med vitaminer bereds genom att tillsätta tre vitaminer till avjoniserat vatten enligt tabell 3, och 0,1 ml av den kombinerade vitaminstamlösningen tillsätts till det slutliga M7-mediet strax före användningen (vitaminstamlösningen förvaras djupfryst i små alikvoter). Mediet luftas och stabiliseras. Tabell 1 Stamlösningar av spårelement för M4- och M7-medium Stamlösningar (I) Mängd (mg) som byggs upp till 1 liter med avjoniserat vatten Beredning av kombinerad stamlösning (II): blanda följande mängder (ml) stamlösning (I) och bygg upp till 1 liter med avjoniserat vatten Slutliga koncentrationer i testlösningarna (mg/l) M4 M7 M4 M7 H3BO3 (18) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 MnCl2 · 4H2O (18) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 LiCl (18) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 RbCl (18) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 SrCl2 · 6H2O (18) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 NaBr (18) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 Na2MoO4 · 2H2O (18) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 CuCl2 · 2H2O (18) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 ZnCl2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 CaCl2 · 2H6O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na2SeO3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 NH4VO3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 Na2EDTA · 2H2O (18) (19) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 FeSO4 · 7H2O (18) (19) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249 Tabell 2 Stamlösningar med makronäringsämnen för medium M4 och M7 Mängd som byggs upp till 1 liter med avjoniserat vatten (mg) Mängd stamlösning med makronäringsämnen som tillsätts för att bereda medium M4 och M7 (ml/l) Slutliga koncentrationer i testlösningarna M4 och M7 (mg/l) CaCl2 · 2H2O 293 800 1,0 293,8 MgSO4 · 7H2O 246 600 0,5 123,3 KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO3 64 800 1,0 64,8 NaSiO3 · 9H2O 50 000 0,2 10,0 NaNO3 2 740 0,1 0,274 KH2PO4 1 430 0,1 0,143 K2HPO4 1 840 0,1 0,184 Tabell 3 Stamlösningar med vitaminer för medium M4 och M7 Alla tre vitaminlösningar kombineras till en enda vitaminstamlösning.

Mängd som byggs upp till 1 liter med avjoniserat vatten (mg) Mängd stamlösning med vitaminer som tillsätts för att bereda medium M4 och M7 (ml/l) Slutliga koncentrationer i testlösningarna M4 och M7 (mg/l) Tiaminhydroklorid 750 0,1 0,075 Cyanokobalamin (B12) 10 0,1 0,0010 Biotin 7,5 0,1 0,00075 LITTERATUR BBA (1995), ”Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system”, redigerat av M. Streloke och H. Köpp. Berlin 1995. Elendt, B. P. (1990), ”Selenium Deficiency in Crustacean”, Protoplasma 154, s. 25–33. Elendt B. P. och Bias W. R.(1990), ”Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna”, Water Research 24 (9), s. 1157–1167. Tillägg 3 BEREDNING AV SYNTETISKT SEDIMENT Sedimentsammansättning Syntetiskt sediment ska ha följande sammansättning: Beståndsdel Egenskaper % av sedimentets torrvikt Torv Sphagnum, så nära pH 5,5–6 som möjligt utan synliga växtrester och finfördelad (partikelstorlek ≤1 mm) och lufttorkad. 4–5 Kvartssand Partikelstorlek: > 50 % av partiklarna bör ha storlek inom området 50–200 μm 75–76 Kaolinitlera Kaolinithalt ≥ 30 % 20 Organiskt kol Justeras genom tillsats av torv och sand 2 (± 0,5) Kalciumkarbonat CaCO3, pulveriserat, kemiskt rent 0,05–0,1 Vatten Konduktivitet ≤ 10 μS/m 30–50 Beredning Torven lufttorkas och mals ner till ett fint pulver. En suspension av behövlig mängd torvpulver i avjoniserat vatten bereds med effektiv homogeniseringsapparat. Suspensionens pH justeras till 5,5 ± 0,5 med CaCO3. Suspensionen konditioneras minst två dagar med skonsam omrörning vid 20 ± 2 °C, för att stabilisera pH och etablera en stabil mikrobiell komponent, varefter pH uppmäts på nytt och bör vara 6,0 ± 0,5. Torvsuspensionen blandas sedan med de övriga beståndsdelarna (sand och kaolinlera) och avjoniserat vatten till ett homogent sediment med en vattenhalt som ger kring 30–50 procent torrvikt av sediment. Därefter mäts den slutliga blandningens pH på nytt och justeras vid behov till 6,5–7,5 med CaCO3. Prover tas av sedimentet för att bestämma torrvikten och halten organiskt kol. Likaså rekommenderas att det syntetiska sediment som ska användas i ett chironomidtoxicitetstest konditioneras före användningen i sju dagar i samma betingelser som råder i det efterföljande testet. Förvaring De torra beståndsdelarna för beredning av syntetiskt sediment kan lagras i ett torrt och svalt utrymme vid rumstemperatur. Berett (vått) sediment ska inte lagras för användning i test. Det bör användas omedelbart efter den 7 dagar långa konditioneringsperioden i slutet av beredningen. LITTERATUR: Kapitel C.8 i denna bilaga, Toxicitet hos daggmaskar. Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998), ”Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media”, Ecotox. and Environ. Safety 39, s. 10–20. Tillägg 4 Krav på kemiska egenskaper hos utspädningsvatten Ämne Koncentrationer Partikelinnehåll < 20 mg/l Totalt organiskt kol < 2 mg/l Ojoniserad ammoniak < 1 μg/l Hårdhet som CaCO3 < 400 mg/l (20) Restklor < 10 μg/l Bekämpningsmedel med organiska fosforföreningar, totalt. < 50 ng/l Bekämpningsmedel med organiska klorföreningar plus polyklorerade bifenyler, totalt. < 50 ng/l Totalt organiskt klor < 25 ng/l Tillägg 5 Vägledning för övervakning av kläckning av chironomider Fällor placeras på testbägarna. Dessa fällor behövs från dag 20 fram till testets slut. Exempel på en fälla visas nedan. A : nylonnät B : upp-och-nedvänd plastkopp C : exponeringskärl utan läpp D : filterportar för vattenutbyte E : vatten F : sediment C.29 LÄTT BIONEDBRYTBARHET – CO2 I FÖRSLUTNA KÄRL (Headspace-test) INLEDNING 1. Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje310 (2006). Denna testmetod är en screeningmetod för utvärdering av kemikaliers lättnedbrytbarhet och ger liknande information som de sex testmetoder som beskrivs i kapitel C.4 i denna bilaga A–F. En kemikalie som ger positiva testresultat med denna metod kan anses vara lätt bionedbrytbar och sönderfaller således snabbt i miljön. 2. Den väletablerade koldioxidmetoden (1) är baserad på Sturms ursprungliga test (2) för bestämning av organiska kemikaliers bionedbrytbarhet, genom mätning av koldioxid (CO2) som produceras genom mikrobiell verksamhet, har i regel varit det första valet för testning av dåligt lösliga kemikalier och kemikalier med starkt adsorberande egenskaper. Testet väljs också för lösliga (men inte flyktiga) kemikalier, eftersom många anser att utveckling av koldioxid är det enda otvivelaktiga beviset på mikrobiell aktivitet. Avlägsnandet av upplöst organiskt kol kan påverkas av fysikalkemiska processer – adsorption, avdunstning, utfällning, hydrolys – såväl som av mikrobiell aktivitet och många icke-biologiska reaktioner som förbrukar syre; CO2 produceras sällan från organiska kemikalier på abiotisk väg. I det ursprungliga och modifierade Sturmtestet (1) (2) avlägsnas CO2 från vätskefasen till de absorberande kärlen genom s.k. sparging (luftbubblor får strömma genom vätskemediet för att avlägsna CO2), medan Larsons version (3) (4) går ut på att överföra CO2 från reaktionskärlet till absorberingsenheterna genom att låta CO2-fri luft passera genom utrymmet ovanför vätskan samtidigt som testkärlet omskakas kontinuerligt. Omskakning av reaktionskärlet används endast i Larson-modifieringen, och omrörning anges endast för olösliga ämnen i ISO 9439 (5) och i den ursprungliga US-versionen (6), enligt vilka sparging rekommenderas hellre än ersättning av gasfasen. I en annan officiell US EPA-metod (8) baserad på Gledhill-metoden (8) hålls reaktionskärlet under omskakning och förseglat från atmosfären, och CO2 som produceras samlas in i en intern alkalisk fälla direkt från gasfasen, på samma sätt som i klassiska Warburg/Barcroft-respirometerflaskor. 3. Det har dock visat sig att det för ett antal kemikalier ackumuleras oorganiskt kol i mediet vid användning av standard-Sturmtest i modifierad form (9). En koncentration på upp till 8 mg/l oorganiskt kol konstaterades under sönderfall av 20 mg C/l anilin. Uppsamling av CO2 i alkaliska fällor gav således inte en äkta bild av mängden mikrobiologiskt producerad CO2 vid mellanliggande tidpunkter under sönderfallet. Det medför att specifikationen om att minst 60 % av teoretisk maximal CO2-produktion (ThCO2) måste samlas upp inom ett tiodagarsfönster (de tio dagar som följer omedelbart efter att 10 % bionedbrytning har uppnåtts) för att en testkemikalie ska klassificeras som lätt bionedbrytbar, inte uppfylls för vissa kemikalier som skulle ges denna klassificering om man använder eliminering av upplöst organiskt kol (DOC). 4. Om procentandelen sönderdelning är lägre än förväntat, är det möjligt att oorganiskt kol har ackumulerats i testlösningen. Då kan nedbrytbarheten bedömas med andra test för biologisk nedbrytbarhet. 5. De övriga nackdelarna med Sturmtest (besvärligt, tidskrävande, högre risk för experimentella fel och kan inte användas för flyktiga kemikalier) har tidigare lett till sökning efter en teknik med förslutet kärl, annan än Gledhill, hellre än gasgenomflöde (10) (11). Boatman m.fl. (12) granskade de tidigare metoderna och valde ett system med slutet utrymme ovan för vätskeytan där CO2 frigjordes till detta utrymme i slutet av inkubationen genom försurning av mediet. CO2 uppmättes med gaskromatografi (GC)/IC i automatiskt tagna prover i gasutrymmet, medan upplöst oorganiskt kol (DIC) i vätskefasen inte beaktades. Likaså var de kärl som användes mycket små (20 ml) med endast 10 ml medium, vilket orsakade problem t.ex. vid tillsättning av de mycket små mängderna av olösliga testkemikalier, och/eller eventuellt fanns det inte tillräckliga mängder eller inga mikroorganismer i det inokulerade mediet som kunde sönderbryta testkemikalierna. 6. Dessa svårigheter har lösts genom oberoende studier gjorda av Struijs och Stoltenkamp (13) samt av Birch och Fletcher (14), där de senare byggde på erfarenheter med apparatur använd i test för anaerob biologisk nedbrytning (15). I den tidigare metoden (13) mäts CO2 i utrymmet ovanför vätskan efter försurning och jämvikt, medan den senare metoden (14) innebär att man mäter DIC i både gas- och vätskefaserna, utan behandling; över 90 % av bildat oorganiskt kol fanns i vätskefasen. Båda metoderna har fördelar jämfört med Sturmtest, i den meningen att testsystemet är mera kompakt och lätthanterligt, flyktiga kemikalier kan testas och man undviker risken för fördröjning vid mätning av producerad CO2. 7. De två principerna kombinerades i ISO Headspace CO2 Standard (16) som ringtestades (17) och denna standard utgör grunden för den testmetod som beskrivs här. De två principerna har också använts i US EPA-metoden (18). Två metoder för