Kommissionens direktiv 2000/45/EG

av den 6 juli 2000

om fastställande av gemenskapsmetoder för bestämning av A-vitamin, E-vitamin och tryptofan i djurfoder

(Text av betydelse för EES)

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIV

med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen,

med beaktande av rådets direktiv 70/373/EEG av den 20 juli 1970 om införande av gemenskapsmetoder för provtagning och analys vid den officiella foderkontrollen(1), senast ändrat genom Anslutningsakten för Österrike, Finland och Sverige(2), särskilt artikel 2 i detta, och

av följande skäl:

(1) I direktiv 70/373/EEG föreskrivs att gemenskapsmetoder för provtagning och analys skall användas vid den offentliga kontrollen av att lagar och andra författningar om djurfoders kvalitet och sammansättning efterlevs.

(2) I rådets direktiv 70/524/EEG av den 23 november 1970 om fodertillsatser(3), senast ändrat genom kommissionens förordning (EG) nr 2439/1999(4), föreskrivs att halten av A- och E-vitamin skall framgå av märkningen om man tillsätter dessa ämnen i förblandningar och foder.

(3) I rådets direktiv 79/373/EEG av den 2 april 1979 om saluföring av foderblandningar(5), senast ändrat genom kommissionens direktiv 2000/16/EG(6), och i rådets direktiv 93/74/EEG av den 13 september 1993 om foder för särskilda näringsbehov(7), senast ändrat genom direktiv 96/25/EG(8), föreskrivs att det skall framgå av produktmärkningen om ett foder innehåller aminosyror.

(4) Det måste fastställas gemenskapsmetoder för bestämning av dessa ämnen.

(5) De åtgärder som föreskrivs i detta direktiv är förenliga med yttrandet från Ständiga foderkommittén.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Medlemsstaterna skall föreskriva att man vid den offentliga kontrollen skall bestämma halterna av A- och E-vitamin samt tryptofan i foder och förblandningar med de metoder som anges i bilagan till detta direktiv.

Artikel 2

Medlemsstaterna skall senast den 31 augusti 2000 sätta i kraft de lagar och andra författningar som är nödvändiga för att följa detta direktiv. De skall genast underrätta kommissionen om detta.

De skall tillämpa bestämmelserna från och med den 1 september 2000.

När en medlemsstat antar dessa bestämmelser skall de innehålla en hänvisning till detta direktiv eller åtföljas av en sådan hänvisning när de offentliggörs. Närmare föreskrifter om hur hänvisningen skall göras skall varje medlemsstat själv utfärda.

Artikel 3

Detta direktiv träder i kraft den tjugonde dagen efter det att det har offentliggjorts i Europeiska gemenskapernas officiella tidning.

Artikel 4

Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.

Utfärdat i Bryssel den 6 juli 2000.

På kommissionens vägnar

David Byrne

Ledamot av kommissionen

(1) EGT L 170, 3.8.1970, s. 2.

(2) EGT C 241, 29.8.1994, s. 1.

(3) EGT L 270, 14.12.1970, s. 1.

(4) EGT L 297, 18.11.1999, s. 8.

(5) EGT L 86, 6.4.1979, s. 30.

(6) EGT L 105, 3.5.2000, s. 36.

(7) EGT L 237, 22.9.1993, s. 23.

(8) EGT L 125, 23.5.1996, s. 35.

BILAGA

DEL A

BESTÄMNING AV VITAMIN A

1. Syfte och omfattning

Metoden avser bestämning av vitamin A (retinol) i foder och förblandningar. Vitamin A inbegriper all-trans-retinylalkohol och de av dess cis-isomerer som bestäms med denna metod. Halten av vitamin A uttrycks i IU (International Units) per kg. 1 IU motsvarar aktiviteten hos 0,300 μg all-trans-vitamin A-alkohol eller 0,344 μg all-trans-vitamin A-acetat eller 0,550 μg all-trans-vitamin A-palmitat.

Den nedre bestämningsgränsen för vitamin A är 2000 IU/kg.

2. Princip

Provet hydrolyseras med kaliumhydroxid som lösts i etanol, och vitamin A extraheras sedan över till petroleumeter. Lösningsmedlet tillåts därefter avdunsta, och återstoden av provet löses i metanol och späds vid behov till lämplig koncentration. Halten A-vitamin bestäms genom reversed phasevätskekromatografi (RP-HPLC) med UV- eller fluorescensdetektor. De kromatografiska parametrarna väljs så att all-trans-vitamin A-alkohol inte separeras från sina cis-isomerer.

3. Reagens

3.1 Etanol, σ = 96 %

3.2 Petroleumeter, kokpunktsintervall 40-60 °C

3.3 Metanol

3.4 Kaliumhydroxidlösning, β = 50 g/100 ml

3.5 Natriumaskorbatlösning, β = 10 g/100 ml (jfr 7.7)

3.6 Natriumsulfid, NA2S · x H2O där x =7-9

3.6.1 Natriumsulfid som lösts i glycerol, c = 0,5 mol/l, β = 120 g/l där x = 9 (jfr 7.8)

3.7 Fenolftalein som lösts i etanol, β = 2 g/100 ml (3.1)

3.8 2-propanol

3.9 Rörlig fas för HPLC: blandning av metanol (3.3) och vatten, t.ex. 980 + 20 (v + v). Det exakta förhållandet mellan volymerna beror på kolonnens egenskaper.

3.10 Syrefri kvävgas

3.11 All-trans-vitamin A-acetat, av extra hög renhetsgrad, med certifierad aktivitet, t.ex. 2,80 x 106 IU/g.

3.11.1 Stamlösning av all-trans-vitamin A-acetat: väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 50 mg vitamin A-acetat (3.11) i en 100 ml mätkolv. Lös det uppvägda provet i 2-propanol (3.8) och späd till märket med samma lösningsmedel. Den nominella halten av vitamin A denna l lösning är 1400 IU per ml. Den exakta halten bestäms enligt 5.6.3.1.

3.12 All-trans-vitamin A-palmitat, av extra hög renhetsgrad, med certifierad aktivitet, t.ex. 1,80 x 106 IU/g.

3.12.1 Stamlösning av all-trans-vitamin A-palmitat: väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 80 mg vitamin A-palmitat (3.12) i en 100 ml mätkolv. Lös det uppvägda palmitatet i 2-propanol (3.8) och späd till märket med samma lösningsmedel. Den nominella halten av vitamin A i denna lösning är 1400 IU per ml. Den exakta halten bestäms enligt 5.6.3.2.

3.13 2,6-di-tert-butyl-4-metylfenol (BHT) (jfr 7.5).

4. Utrustning

4.1 Vakuumrotationsindunstare

4.2 Färgade glaskärl

4.2.1 Flaskor eller e-kolvar, 500 ml, med halsar av slipat glas

4.2.2 Smalhalsade mätkolvar, 10, 25, 100 och 500 ml, med proppar av slipat glas

4.2.3 Koniska separertrattar, 1000 ml, med proppar av slipat glas

4.2.4 Rundkolvar, 250 ml, med halsar av slipat glas

4.3 Allihn-kylare, mantellängd 300 mm, med fog av slipat glas och adapter för gasinledningsrör

4.4 Veckat filterpapper för frasseparation, diameter 185 mm (t.ex. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5 HPLC-utrustning med injektionssystem

4.5.1 Kolonn för vätskekromatografi, 250 mm x 4 mm, C18, 5 eller 10 μm packning eller motsvarande (prestandakriterium: en topp för alla retinol-isomerer under HPLC-betingelser)

4.5.2 UV- eller fluorescensdetektor, med variabel inställning av våglängd

4.6 Spektrofotometer med 10 mm kvartsceller

4.7 Vattenbad med magnetomrörare

4.8 Extraktionsapparat (se figur 1) bestående av:

4.8.1 Glascylinder, 1 liter, med hals och propp i slipat glas

4.8.2 Adapter av slipat glas med en sidoarm och ett justerbart rör genom mitten. Det justerbara röret skall ha U-formad nederdel och en pip i övre änden så att det övre vätskeskiktet i cylindern kan hällas över till en separertratt.

5. Utförande

Obs:

Vitamin A är känsligt för (UV) ljus och oxidation. Alla arbetsmoment skall utföras i skydd från ljus (färgade glaskärl eller glaskärl insvepta i aluminiumfolie) och från syre (spola med kvävgas). Vid extraktionen skall luften ovanför vätskan ersättas med kvävgas (undvik övertryck genom att lätta på proppen då och då).

5.1 Beredning av prov

Mal provet så att det kan passera genom en 1 mm nätsikt, men undvik friktionsvärme. För att undvika förlust av vitamin A skall provet malas omedelbart innan det vägs och förtvålas.

5.2 Förtvålning

Väg med en noggrannhet av 0,01 g upp 2-25 g av provet, beroende på A-vitaminhalten, i en 500 ml flaska eller e-kolv (4.2.1). Tillsätt - samtidigt som flaskan eller kolven roteras - 130 ml etanol (3.1), ungefär 100 mg BHT (3.13), 2 ml natriumaskorbatlösning (3.5) och 2 ml natriumsulfidlösning (3.6). Anslut kylaren (4.3) till flaskan eller kolven och placera den i ett vattenbad med magnetomrörare (4.7). Värm till kokpunkten och låt koka under återloppskylning i 5 minuter. Tillsätt 25 ml kaliumhydroxidlösning (3.4) genom kylaren (4.3) och återloppskoka i ytterligare 25 minuter under omrörning och ett långsamt flöde av kvävgas. Skölj sedan kylaren med ungefär 20 ml vatten och kyl innehållet i flaskan eller kolven till rumstemperatur.

5.3 Extraktion

Överför genom dekantering den förtvålade lösningen kvantitativt till en 1000 ml separertratt (4.2.3) eller till en extraktionsapparat (4.8) genom att skölja med sammanlagt 250 ml vatten. Skölj ur förtvålningskärlet först med 25 ml etanol (3.1) och sedan med 100 ml petroleumeter (3.2) och för över det ursköljda provet till separertratten eller extraktionsapparaten. Förhållandet mellan totalmängden vatten och etanol i de sammanslagna lösningarna skall vara ungefär 2:1. Skaka kraftigt i 2 minuter och låt sedan stå i 2 minuter.

5.3.1 Extraktion med separertratt (4.2.3)

När vätskeskikten har separerat (jfr 7.3) överförs petroleumeterskiktet till en annan separertratt (4.2.3). Upprepa extraktionen två gånger med 100 ml petroleumeter (3.2) och två gånger med 50 ml petroleumeter (3.2).

Tvätta de sammanslagna extrakten i separertratten två gånger genom att tillsätta portioner på 100 ml vatten och sedan försiktigt rotera tratten (för att undvika att emulsioner bildas). Skaka sedan tratten upprepade gånger (fyra gånger brukar räcka) med portioner på 100 ml vatten, tills vattnet inte längre färgas vid tillsats av fenolftaleinlösning (3.7). Avlägsna vatten i suspension genom att filtrera det tvättade extraktet genom ett torrt veckat filterpapper för fasseparation (4.4) till en 500 ml mätkolv (4.2.2). Skölj ur separertratten och filtret med 50 ml petroleumeter (3.2), fyll till märket med petroleumeter (3.2) och blanda omsorgsfullt.

5.3.2 Extraktion med extraktionsapparat (4.8)

När skikten har separerat (jfr 7.3) ersätts glascylinderns (4.8.1) propp med adaptern av slipat glas (4.8.2). Den U-formade nederdelen av det justerbara röret skall vara precis ovanför gränsytan mellan skikten. Överför det övre skiktet av petroleumeter till en 1000 ml separertratt (4.2.3) genom att föra in kvävgas via sidoröret. Tillsätt 100 ml petroleumeter (3.2) till glascylindern, sätt i proppen och skaka kraftigt. Låt skikten separera och överför det övre skiktet till separertratten som ovan. Upprepa extraktionen med ytterligare 100 ml petroleumeter (3.2) och sedan två gånger med 50 ml-portioner av petroleumeter (3.2). Överför petroleumeterskikten till separertratten.

Tvätta de sammanslagna petroleumeterextrakten enligt 5.3.1 och gå vidare enligt instruktionen i den punkten.

5.4 Beredning av provlösning för HPLC

Pipettera över en volym petroleumeterlösning (från 5.3.1 eller 5.3.2) till en 250 ml rundkolv (4.2.4). Låt lösningsmedlet avdunsta i en rotationsindunstare (4.1) med undertryck och en vattenbadstemperatur på högst 40 °C tills provet är nästan torrt. Återställ normalt lufttryck genom att släppa in kvävgas (3.10) och ta ut kolven ur rotationsindunstaren. Avlägsna återstående lösningsmedel med en kvävgasström (3.10) och lös omedelbart upp återstoden av provet i en känd volym (10-100 ml) metanol (3.3) (A-vitaminhalten skall ligga i intervallet 5-30 IU/ml).

5.5 HPLC-bestämning

Vitamin A separeras i en C18, g reversed phase-kolonn (4.5.1) och halten bestäms med hjälp av en UV-detektor (325 nm) eller en fluorescensdetektor (excitation: 325 nm, emission: 475 nm) (4.5.2).

Injicera en provvolym (t.ex. 20 μl) av den metanollösning som erhölls i 5.4 och eluera med den rörliga fasen (3.9). Beräkna medeltopphöjden (arean) för flera injektioner av samma provlösning och medeltopphöjden (arean) för flera injektioner av kalibreringslösningen (5.6.2).

HPLC-betingelser

De värden som anges nedan är ungefärliga. Andra värden kan väljas om de ger motsvarande resultat.

>Plats för tabell>

5.6 Kalibrering

5.6.1 Beredning av arbetsstandardlösningar

Pipettera över 20 ml av stamlösningen av vitamin A-acetat (3.11.1) eller 20 ml av stamlösningen av vitamin A-palmitat (3.12.1) till en 500 ml flaska eller e-kolv (4.2.1) och hydrolysera enligt 5.2 men utan tillsats av BHT. Extrahera sedan med petroleumeter (3.2) enligt 5.3 och späd till 500 ml med petroleumeter (3.2). Låt 100 ml av extraktet indunsta i en rotationsindunstare (se 5.4) tills provet är nästan torrt. Avlägsna resterande lösningsmedel med en kvävgasström (3.10) och lös provet på nytt i 10,0 ml metanol (3.3). Den nominella halten av vitamin A i denna lösning är 560 IU per ml. Den exakta halten bestäms enligt 5.6.3.3. Arbetsstandardlösningen skall beredas på nytt inför varje bestämning.

Pipettera över 2,0 ml arbetsstandardlösning till en 20 ml mätkolv, späd till märket med metanol (3.3) och blanda. Den nominella halten av vitamin A i denna utspädda arbetsstandardlösning är 56 IU per ml.

5.6.2 Beredning av kalibreringslösningar och konstruktion av kalibreringskurva

För över 1,0, 2,0, 5,0 och 10,0 ml av den utspädda arbetsstandardlösning till ett antal 20 ml mätkolvar, späd till märket med metanol (3.3) och blanda. Den nominella halten av vitamin A i dessa lösningar är 2,8, 5,6, 14,0 respektive 28,0 IU per ml.

Injicera upprepade gånger 20 μl av varje kalibreringslösning och bestäm medeltopphöjderna (areorna). Använd medeltopphöjderna för att konstruera en kalibreringskurva med beaktande av resultatet av UV-kontrollen (5.6.3.3).

5.6.3 UV-standardisering av standardlösningar

5.6.3.1 Stamlösning av vitamin A-acetat

Pipettera över 2,0 ml av stamlösningen av vitamin A-acetat (3.11.1) till en 50 ml mätkolv (4.2.2) och späd till märket med 2-propanol (3.8). Den nominella halten av vitamin A i denna lösning är 56 IU per ml. Pipettera över 3,0 ml av denna utspädda vitamin A-acetatlösning till en 25 ml mätkolv och späd till märket med 2-propanol (3.8). Den nominella halten av vitamin A i denna lösning är 6,72 IU per ml. Mät UV-spektrumet för lösningen mot 2-propanol (3.8) i spektrofotometern (4.6) mellan 300 och 400 nm. Utsläckningsmaximum skall ligga mellan 325 och 327 nm.

Beräkning av A-vitaminhalten:

>PIC FILE= "L_2000174SV.003601.EPS">

5.6.3.2 Stamlösning av vitamin A-palmitat

Pipettera över 2,0 ml av stamlösningen av vitamin A-palmitat (3.12.1) till en 50 ml mätkolv (4.2.2) och späd till märket med 2-propanol (3.8). Den nominella halten av vitamin A i denna lösning är 56 IU per ml. Pipettera över 3,0 ml av denna utspädda vitamin A-palmitatlösning till en 25 ml mätkolv och späd till märket med 2-propanol (3.8). Den nominella halten av vitamin A i denna lösning är 6,72 IU per ml. Mät UV-spektrumet för lösningen mot 2-propanol (3.8) i spektrofotometern (4.6) mellan 300 och 400 nm. Utsläckningsmaximum skall ligga mellan 325 och 327 nm.

Beräkning av A-vitaminhalten:

>PIC FILE= "L_2000174SV.003602.EPS">

5.6.3.3 Arbetsstandardlösning av vitamin A

Pipettera över 3,0 ml av den outspädda arbetsstandardlösning av vitamin A som beretts enligt 5.6.1 till en 50 ml mätkolv (4.2.2) och späd till märket med 2-propanol (3.8). Pipettera över 5,0 ml av denna lösning till en 25 ml mätkolv och späd till märket med 2-propanol (3.8). Den nominella halten av vitamin A i denna lösning är 6,72 IU per ml. Mät UV-spektrumet för lösningen mot 2-propanol (3.8) i spektrofotometern (4.6) mellan 300 och 400 nm. Utsläckningsmaximum skall ligga mellan 325 och 327 nm.

Beräkning av A-vitaminhalten:

>PIC FILE= "L_2000174SV.003603.EPS">

6. Resultatberäkning

Använd medeltopphöjden (arean) för de toppar från provlösningen som motsvarar vitamin A, och bestäm provlösningens halt av vitamin A i IU/ml med hjälp av kalibreringskurvan (5.6.2).

A-vitaminhalten (IU/kg) i provet beräknas med hjälp av formeln:

>PIC FILE= "L_2000174SV.003701.EPS">

där:

β= A-vitaminhalten i provlösningen (5.4) i IU/ml

V1= provlösningens volym (5.4) i ml

V2= uttagen provvolym (5.4) i ml

m= provets vikt i gram

7. Anmärkningar

7.1 För prov med låg halt av vitamin A kan det vara lämpligt att slå ihop petroleumeterextrakten från två förtvålningsomgångar (uppvägd mängd: 25 g) till en provlösning för HPLC-bestämning.

7.2 Det prov som skall bestämmas bör inte innehålla mer än 2 g fett.

7.3 Om ingen friseparation äger rum tillsätts ungefär 10 ml etanol (3.1) för att sönderdela emulsionen.

7.4 För torskleverolja och andra rena fetter skall förtvålningstiden förlängas till 45-60 minuter.

7.5 Hydrokinon kan användas i stället för BHT.

7.6 Med en normal phase-kolonn går det att separera retinol-isomerer.

7.7 I stället för natriumaskorbatlösning kan man använda ca 150 mg askorbinsyra.

7.8 I stället för natriumsulfidlösning kan man använda ca 50 mg EDTA.

8. Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 15 % av det högre värdet.

9. Resultat av en provningsjämförelse mellan laboratorier(1)

>Plats för tabell>

Figur 1: Extraktionsapparat (4.8)

>PIC FILE= "L_2000174SV.003801.EPS">

DEL B

BESTÄMNING AV VITAMIN E

1. Syfte och omfattning

Metoden avser bestämning av vitamin E i foder och förblandningar. Halten av vitamin E uttrycks som mg DL-α-tokoferolacetat per kg. 1 mg DL-α-tokoferolacetat motsvarar 0,91 mg DL-α-tokoferol (vitamin E).

Den nedre bestämningsgränsen för E-vitamin är 2 mg/kg.

2. Princip

Provet hydrolyseras med kaliumhydroxid som lösts i etanol, och vitamin E extraheras över till petroleumeter. Lösningsmedlet tillåts därefter avdunsta, och återstoden av provet löses i metanol och späds vid behov till lämplig koncentration. E-vitaminhalten bestäms genom en reversed phasevätskekromatografi (RP-HPLC) med fluorescens- eller UV-detektor.

3. Reagens

3.1 Etanol, σ = 96 %

3.2 Petroleumeter, kokpunktsintervall 40-60 °C

3.3 Metanol

3.4 Kaliumhydroxidlösning, β = 50 g/100 ml

3.5 Natriumaskorbatlösning, β = 10 g/100 ml (jfr 7.7)

3.6 Natriumsulfid, Na2S · x H20 där x = 7-9

3.6.1 Natriumsulfid som lösts i glycerol, c = 0,5 mol/l, β = 120 g/l för x = 9 (jfr 7.8)

3.7 Fenolftalein som lösts i etanol β = 2 g/100 ml (3.1)

3.8 Rörlig fas för HPLC: blandning av metanol (3.3) och vatten, t.ex. 980 + 20 (v + v). Det exakta förhållandet mellan volymerna beror på kolonnens egenskaper.

3.9 Syrefri kvävgas

3.10 DL-α-tokoferolacetat, av extra hög renhetsgrad, med certifierad aktivitet

3.10.1 Stamlösning av DL-α-tokoferolacetat: väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 100 mg DL-α-tokoferolacetat (3.10) i en 100 ml mätkolv. Lös det uppvägda provet i etanol (3.1) och späd till märket med samma lösningsmedel. 1 ml av denna lösning innehåller 1 mg DL-α-tokoferolacetat. (Beträffande UV-kontroll, se 5.6.1.3; beträffande stabilisering, se 7.4).

3.11 DL-α-tokoferol, av extra hög renhetsgrad, med certifierad aktivitet

3.11.1 Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 100 mg DL-α-tokoferol (3.10) i en 100 ml mätkolv. Lös det uppvägda provet i etanol (3.1) och späd till märket med samma lösningsmedel. 1 ml av denna lösning innehåller 1 mg DL-α-tokoferol. (Beträffande UV-kontroll, se 5.6.2.3; beträffande stabilisering, se 7.4).

3.12 2,6-di-tert-butyl-4-metylfenol (BHT) (jfr 7.5)

4. Utrustning

4.1 Vakuumrotationsindustare

4.2 Färgade glaskärl

4.2.1 Flaskor eller e-kolvar, 500 ml, med halsar av slipat glas

4.2.2. Smalhalsade mätkolvar, 10, 25, 100 och 500 ml, med proppar av slipat glas

4.2.3 Koniska separertrattar, 1000 ml, med proppar av slipat glas

4.2.4 Rundkolvar, 250 ml, med halsar av slipat glas

4.3 Allihn-kylare, mantellängd 300 mm, med fog av slipat glas och adapter för gasinledningsrör

4.4 Veckat filterpapper för fasseparation, diameter 185 mm (t.ex. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5 HPLC-utrustning med injektionssystem

4.5.1 HPLC-kolonn, 250 mm x 4 mm, C18, 5 eller 10 μm packning eller motsvarande.

4.5.2 UV- eller fluorescensdetektor, med variabel inställning av våglängd

4.6 Spektrofotometer med 10 mm kvartsceller

4.7 Vattenbad med magnetomrörare

4.8 Extraktionsapparat (se figur 1) bestående av:

4.8.1 Glascylinder, 1 liter, med hals och propp av slipat glas

4.8.2 Adapter av slipat glas med en sidoarm och ett justerbart rör genom mitten. Det justerbara röret skall ha U-formad nederdel och en pip i övre änden så att det övre vätskeskiktet i cylindern kan hällas över till en separertratt.

5. Utförande

Obs:

Vitamin E är känsligt för (UV) ljus och oxidation. Alla arbetsmoment skall utföras i skydd från ljus (färgade glaskärl eller glaskärl insvepta i aluminiumfolie) och från syre (spola med kvävgas). Vid extraktionen skall luften ovanför vätskan ersättas med kvävgas (undvik övertryck genom att hätta på proppen då och då).

5.1 Beredning av prov

Mal provet så att det kan passera genom en 1 mm nätsikt, men undvik friktionsvärme. För att undvika förlust av vitamin E skall provet malas omedelbart innan det vägs och förtvålas.

5.2 Förtvålning

Väg med en noggrannhet av 0,01 g upp 2-25 g av provet, beroende på E-vitaminhalten, i en 500 ml flaska eller e-kolv (4.2.1). Tillsätt - samtidigt som flaskan eller kolven roteras - 130 ml etanol (3.1), ungefär 100 mg BHT (3.12), 2 ml natriumaskorbatlösning (3.5) och 2 ml natriumsulfidlösning (3.6). Anslut kylaren (4.3) till flaskan eller kolven och placera den i ett vattenbad med magnetomrörare (4.7). Värm till kokpunkten och låt koka under återloppskylning i 5 minuter. Tillsätt därefter 25 ml kaliumhydroxidlösning (3.4) genom kylaren (4.3) och återloppskoka i ytterligare 25 minuter under omrörning och ett långsamt flöde av kvävgas. Skölj sedan kylaren med ungefär 20 ml vatten och kyl innehållet i flaskan eller kolven till rumstemperatur.

5.3 Extraktion

Överför genom dekantering den förtvålade lösningen kvantitativt till en 1000 ml separertratt (4.2.3) eller till en extraktionsapparat (4.8) genom att skölja med sammanlagt 250 ml vatten. Skölj ur förtvålningskärlet först med 25 ml etanol (3.1) och sedan med 100 ml petroleumeter (3.2) och för över det ursköljda provet till separertratten eller extraktionsapparaten. Förhållandet mellan vatten och etanol i de sammanslagna lösningarna skall vara ungefär 2:1. Skaka kraftigt i 2 minuter och låt sedan stå i 2 minuter.

5.3.1 Extraktion med separertratt (4.2.3)

När vätskeskikten har separerat (jfr 7.3) överförs petroleumeterskiktet till en annan separertratt (4.2.3). Upprepa extraktionen två gånger med 100 ml petroleumeter (3.2) och två gånger med 50 ml petroleumeter (3.2).

Tvätta de sammanslagna extrakten i separertratten två gånger genom att tillsätta portioner på 100 ml vatten och sedan försiktigt rotera tratten (för att undvika att emulsioner bildas). Skaka sedan tratten upprepade gånger (fyra gånger brukar räcka) med portioner på 100 ml vatten, tills vattnet inte längre färgas vid tillsats av fenolftaleinlösning (3.7). Avlägsna vatten i suspension genom att filtrera det tvättade extraktet genom ett torrt veckat filterpapper för fasseparation (4.4) till en 500 ml mätkolv (4.2.2). Skölj ur separertratten och filtret med 50 ml petroleumeter (3.2), fyll till märket med petroleumeter (3.2) och blanda omsorgsfullt.

5.3.2 Extraktion med extraktionsapparat (4.8)

När skikten har separerat (jfr 7.3) ersätts glascylinderns (4.8.1) propp med adaptern av slipat glas (4.8.2). Den U-formade nederdelen av det justerbara röret skall vara precis ovanför gränsytan mellan skikten. Överför det övre skiktet av petroleumeter till en 1000 ml separertratt (4.2.3) genom att föra in kvävgas via sidoröret. Tillsätt 100 ml petroleumeter (3.2) till glascylindern, sätt i proppen och skaka kraftigt. Låt skikten separera och överför det övre skiktet till separertratten som ovan. Upprepa extraktionen med ytterligare 100 ml petroleumeter (3.2) och sedan två gånger med 50 ml-portioner av petroleumeter (3.2). Överför petroleumeterskikten till separertratten.

Tvätta de sammanslagna petroleumeterextrakten enligt 5.3.1 och gå vidare enligt instruktionen i den punkten.

5.4 Beredning av provlösning för HPLC

Pipettera över en volym prov från petroleumeterlösningen (från 5.3.1 eller 5.3.2) till en 250 ml rundkolv (4.2.4). Låt lösningsmedlet avdunsta i en rotationsindunstare (4.1) med undertryck och en vattenbadstemperatur på högst 40 °C tills provet är nästan torrt. Återställ normalt lufttryck genom att släppa in kvävgas (3.9) och ta ut kolven ur rotationsindunstaren. Avlägsna återstående lösningsmedel med en kvävgasström (3.9) och lös omedelbart upp återstoden av provet i en känd volym (10-100 ml) metanol (3.3) (halten av DL-α-tokoferol skall ligga inom intervallet 5-30 μg/ml).

5.5 HPLC-bestämning

Vitamin E separeras i en C18 g reversed phase-kolonn (4. 5.1) och halten bestäms med hjälp av en fluorescensdetektor (excitation: 295 nm, emission: 330 nm) eller UV-detektor (292 nm) (4.5.2).

Injicera en provvolym (t.ex. 20 μl) av den metanollösning som erhölls i 5.4 och eluera med den rörliga fasen (3.8). Beräkna medeltopphöjderna (areorna) för flera injektioner av samma provlösning och medeltopphöjderna (areorna) för flera injektioner av kalibreringslösningarna (5.6.2).

HPLC-betingelser

De värden som anges nedan är ungefärliga. Andra värden kan väljas om de ger motsvarande resultat.

>Plats för tabell>

5.6 Kalibrering (DL-α-tokoferolacetat eller DL-α-tokoferol)

5.6.1 Standardlösning av DL-α-tokoferolacetat

5.6.1.1 Beredning av arbetsstandardlösningar

Pipettera över 25 ml av stamlösningen av DL-α-tokoferolacetat (3.10.1) till en 500 ml flaska eller e-kolv (4.2.1) och hydrolysera enligt 5.2. Extrahera sedan med petroleumeter (3.2) enligt 5.3 och späd till 500 ml med petroleumeter. Låt 25 ml av extraktet indunsta i en rotationsindunstare (se 5.4) tills provet är nästan torrt. Avlägsna resterande lösningsmedel i en kvävgasström (3.9) och lös provet på nytt i 25,0 ml metanol (3.3). Lösningens nominella halt av DL-α-tokoferol är 45,5 g per ml, vilket motsvarar 50 μg DL-α-tokoferolacetat per ml. Arbetsstandardlösningen skall beredas på nytt inför varje bestämning.

5.6.1.2 Beredning av kalibreringslösningar och konstruktion av kalibreringskurva

Pipettera över 1,0, 2,0, 4,0 och 10,0 ml av arbetsstandardlösningen till ett antal 20 ml mätkolvar. Späd till märket med metanol (3.3) och blanda. Den nominella halten av DL-α-tokoferolacetat i dessa lösningar är 2,5, 5,0, 10,0 och 25,0 g/ml, vilket motsvarar 2,28, 4,55, 9,10 respektive 22,8 μg DL-α-tokoferol/ml.

Injicera upprepade gånger 20 μl av varje kalibreringslösning och bestäm medeltopphöjderna (areorna). Använd medeltopphöjderna (areorna) för att konstruera en kalibreringskurva.

5.6.1.3 UV-standardisering av stamlösningen av DL-α-tokoferolacetat (3.10.1)

Späd 5,0 ml av stamlösningen av DL-α-tokoferolacetat (3.10.1) till 25,0 ml med etanol och mät UV-spektrumet för denna lösning mot etanol (3.1) i spektrofotometern (4.6) mellan 250 och 320 nm.

Absorptionsmaximum skall ligga vid 284 nm:

>PIC FILE= "L_2000174SV.004201.EPS">

Vid denna spädning skall utsläckningsvärdet ligga mellan 0,84 och 0,88.

5.6.2 Standardlösning av DL-α-tokoferol

5.6.2.1 Beredning av arbetsstandardlösning

Pipettera över 2 ml av stamlösningen av DL-a-tokoferol (3.11.1) till en 50 ml mätkolv. Lös provet i metanol (3.3) och späd till märket med samma lösningsmedel. Lösningens nominella halt av DL-α-tokoferol är 40 μg per ml, vilket motsvarar 44,0 μg DL-α-tokoferolacetat per ml. Arbetsstandardlösningen skall beredas på nytt inför varje bestämning.

5.6.2.2 Beredning av kalibreringslösningar och konstruktion av kalibreringskurva

Pipettera över 1,0, 2,0, 4.0 och 10,0 ml av arbetsstandardlösningen till ett antal 20 ml mätkolvar. Späd till märket med metanol (3.3) och blanda. Den nominella halten av DL-α-tokoferol i dessa lösningar är 2,0, 4,0, 8,0 och 20,0 μg/ml, vilket motsvarar 2,20, 4,40, 8,79 respektive 22,0 μg DL-α-tokoferolacetat/ml.

Injicera upprepade gånger 20 μl av varje kalibreringslösning och bestäm medeltopphöjderna (areorna). Använd medeltopphöjderna (areorna) för att konstruera en kalibreringskurva.

5.6.2.3 UV-standardisering av stamlösningen av DL-α-tokoferol (3.11.1)

Späd 2,0 ml av stamlösningen av DL-α-tokoferol (3.11.1) till 25,0 ml med etanol och mät UV-spektrumet för denna lösning mot etanol (3.1) i spektrofotometern (4.6) mellan 250 och 320 nm. Absorptionsmaximum skall ligga vid 292 nm:

>PIC FILE= "L_2000174SV.004202.EPS">

Vid denna spädning skall utsläckningsvärdet ligga på 0,6.

6. Resultatberäkning

Använd medeltopphöjden (arean) för provlösningens E-vitamintoppar för att bestämma halten i provlösningen i g/ml (beräknat som α-tokoferolacetat) med hjälp av kalibreringskurvan (5.6.1.2 eller 5.6.2.2).

E-vitaminhalten w (mg/kg) i provet beräknas med hjälp av formeln:

>PIC FILE= "L_2000174SV.004203.EPS">

där:

β= halten av vitamin E i provlösningen (5.4) i μg/ml

V1= provlösningens volym (5.4) i ml

V2= uttagen provvolym (5.4) i ml

m= provets vikt i gram

7. Anmärkningar

7.1 För prov med låg halt av vitamin E kan det vara lämpligt att slå ihop petroleumeterextrakten från två förtvålningsomgångar (uppvägd mängd: 25 g) till en provlösning för HPLC-bestämning.

7.2 Det prov som skall bestämmas bör inte innehålla mer än 2 g fett.

7.3 Om ingen fasseparation äger rum tillsätts ungefär 10 ml etanol (3.1) för att sönderdela emulsionen.

7.4 Efter spektrofotometrisk bestämning av lösningen av DL-α-tokoferolacetat eller DL-α-tokoferol enligt 5.6.1.3 resp. 5.6.2.3, tillsätts ungefär 10 mg BHT (3.12) till denna (3.10.1 eller 3.10.2). Lösningen förvaras sedan i kylskåp (i högst fyra veckor).

7.5 Hydrokinon kan användas i stället för BHT.

7.6 Med en normal phase-kolonn går det att separera α-, β, χ- och δ-tokoferol.

7.7. I stället för natriumaskorbatlösning kan man använda ca 150 mg askorbinsyra.

7.8 I stället för natriumsulfidlösning kan man använda ca 50 mg EDTA.

8. Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 15 % av det högre värdet.

9. Resultat av en provningsjämförelse mellan laboratorier(2)

>Plats för tabell>

Figur 1: Extraktionsapparat (4.8)

>PIC FILE= "L_2000174SV.004401.EPS">

DEL C

BESTÄMNING AV TRYPTOFAN

1. Syfte och omfattning

Metoden avser bestämning av totalhalten tryptofan och halten fritt tryptofan i foder. Ingen åtskillnad görs mellan D- och L-formerna.

2. Princip

För bestämning av totalhalten tryptofan hydrolyseras provet i alkalisk miljö med mättad bariumhydroxidlösning och upphettas till 110 °C i 20 timmar. Efter hydrolysen tillsätts en intern standard.

För bestämning av halten fritt tryptofan extraheras provet i lätt sur miljö i närvaro av den interna standarden.

Halten av tryptofan och intern standard i hydrolysatet eller extraktet bestäms med HPLC och fluorescensdetektor.

3. Reagens

3.1 Dubbeldestillerat vatten eller vatten av motsvarande kvalitet (konduktivitet < 10 ìS/cm)

3.2 Standardämne: tryptofan (renhet/halt >= 99 %) torkat under vakuum över fosforpentoxid

3.3 Intern standard: α-metyl-tryptofan (renhet/halt >= 99 %), torkat under vakuum över fosforpentoxid

3.4 Bariumhydroxidoktahydrat (undvik att exponera Ba(OH)2 · 8 H2O för större mängder luft, eftersom det då kan bildas BaCO3 som stör bestämningen) (jfr 9.3).

3.5 Natriumhydroxid

3.6 Ortofosforsyra, w = 85 %

3.7 Saltsyra, ρ20 = 1,19 g/ml

3.8 Metanol, HPLC-kvalitet

3.9 Petroleumeter, kokpunktsintervall 40-60 °C

3.10 Natriumhydroxidlösning, c = 1 mol/l:

Lös 40,0 g NaOH (3.5) i vatten och späd till 1 liter med vatten (3.1).

3.11 Saltsyra, c = 6 mol/l:

Späd 492 ml HCl (3.7) med vatten till slutvolymen 1 liter.

3.12 Saltsyra, c = 1 mol/l:

Späd 82 ml HCl (3.7) med vatten till slutvolymen 1 liter.

3.13 Saltsyra, c = 0,1 mol/l:

Späd 8,2 ml HCl (3.7) med vatten till slutvolymen 1 liter.

3.14 Ortofosforsyra, c = 0,5 mol/l:

Späd 34 ml ortofosforsyra (3.6) med vatten (3.1) till slutvolymen 1 liter.

3.15 Koncentrerad tryptofanlösning (3.2), c = 2,50 μmol/ml:

Lös 0,2553 g tryptofan (3.2) i saltsyra (3.13) i en 500 ml mätkolv och späd till märket med saltsyra (3.13). Lösningen kan lagras vid -18 °C i högst 4 veckor.

3.16 Koncentrerad lösning av intern standard, c = 2,50 μmol/ml:

Lös 0,2728 g α-metyl-tryptofan (3.3) i saltsyra (3.13) i en 500 ml mätkolv och späd till märket med saltsyra (3.13). Lösningen kan lagras vid -18 °C i högst fyra veckor.

3.17 Standardkalibreringslösningar av tryptofan och intern standard:

Tag 2,00 ml koncentrerad tryptofanlösning (3.15) och 2,00 ml koncentrerad lösning av intern standard (α-metyl-tryptofan) (3.16). Späd med vatten (3.1) och metanol (3.8) till ungefär samma volym och metanolkoncentration (10-30 %) som det färdiga hydrolysatet.

Denna lösning skall beredas på nytt för varje bestämning.

Den skall skyddas från direkt solljus under beredningen.

3.18 Ättiksyra

3.19 1,1,1-trikloro-2-metyl-2-propanol

3.20 Etanolamin > 98 %

3.21 Lösning av 1 gram 1,1,1-trikloro-2-metyl-2-propanol (3.19) i 100 ml metanol (3.8)

3.22 Rörlig fas för HPLC: 3,00 g ättiksyra (3.18) + 900 ml vatten (3.1) + 50,0 ml lösning (3.21) av 1,1,1-trikloro-2-metyl-2-propanol (3.19) i metanol (3.8) (1 g/100 ml). Justera pH till 5,00 med etanolamin (3.20). Späd till 1000 ml med vatten.

4. Utrustning

4.1 HPLC-utrustning med en spektrofluorimetrisk detektor

4.2 HPLC-kolonn, 125 mm x 4 mm, C18, 3 μm packning eller motsvarande

4.3 pH-mätare

4.4 Polypropylenflaska, 125 ml, med vid hals och skruvkork

4.5 Membranfilter, 0,45 μm

4.6 Autoklav, 110 (+- 2) °C, 1,4 (+- 0,1) bar

4.7 Mekanisk skakapparat eller magnetomrörare

4.8 Vortexblandare

5. Utförande

5.1 Beredning av prov

Provet mals så att det kan passera genom en 0,5 mm sikt. Prov som är mycket fuktiga skall före malning antingen lufttorka vid högst 50 °C eller frystorkas. Prov med hög fetthalt skall extraheras med petroleumeter (3.9) före malning.

5.2 Bestämning av fritt tryptofan (extrakt)

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp en lämplig mängd (1-5 g) av det beredda provet (5.1) i en e-kolv. Tillsätt 100,0 ml saltsyra, c = 0,1 mol/l (3.13) och 5,00 ml koncentrerad lösning av inre standard (3.16). Skaka eller blanda i 60 minuter med en mekanisk skakapparat eller magnetomrörare (4.7). Låt sedimentera och pipetters sedan över 10,0 ml av supernatanten till en bägare. Tillsätt 5 ml ortofosforsyra, c = 0,5 mol/l (3.14). Justera pH till 3 med natriumhydroxid, c = 1,0 mol/l (3.10). Tillsätt så mycket metanol (3.8) att koncentrationen blir 10-30 % i slutvolymen. Överför en lämplig volym till en mätkolv och späd med vatten till den volym som behövs för kromatografi (ungefär samma volym som kalibreringsstandardlösningen (3.17)).

Filtrera några ml av lösningen genom ett 0,45 μm membranfilter (4.5) före injektion i HPLC-kolonnen. Gå vidare med kromatografen enligt 5.4.

Skydda standardlösning och extrakt från direkt solljus. Om extrakten inte kan analyseras samma dag kan de lagras vid 5 °C i högst tre dagar.

5.3 Bestämning av totalt tryptofan (hydrolysat)

Väg med en noggrannhet av 0,2 mg upp 0,1-1 g av det beredda provet (5.1) i en polypropylenflaska (4.4). Det uppvägda provet skall innehålla ungefär 10 mg kväve. Tillsätt 8,4 g bariumhydroxidoktahydrat (3.4) och 10 ml vatten. Blanda på en vortexblandare (4.8) eller med magnetomrörare (4.7). Lämna kvar den teflontäckta magneten i blandningen. Skölj kärlets väggar med 4 ml vatten. Sätt på skruvkorken och skruva åt den löst. Sätt kärlet i en autoklav med kokande vatten (4.6) och låt ånga i 30-60 minuter. Stäng autoklaven och autoklavera vid 110 (+- 2) °C i 20 timmar.

Sänk temperaturen till strax under 100 °C innan autoklaven öppnas. Tillsätt 30 ml rumstempererat vatten till den varma blandningen för att undvika kristallisering av Ba(OH)2 x 8 H20. Skaka eller rör försiktigt. Tillsätt 2,00 ml koncentrerad lösning av intern standard (α-metyl-tryptofan) (3.16). Kyl kärlet i vatten/is-bad i 15 minuter.

Tillsätt 5 ml ortofosforsyra, c = 0,5 mol/l (3.14). Låt kärlet vara kvar i kylbadet och neutralisera lösningen med saltsyra, c = 6 mol/l (3.11) under omrörning. Justera pH till 3,0 med saltsyra, c = 1 mol/l(/3.12). Tillsätt så mycket metanol att koncentrationen blir 10-30 % i slutvolymen. Överför en lämplig volym till en mätkolv och späd med vatten till den volym som behövs för kromatografi (t.ex. 100 ml). Tillsatsen av metanol bör göras utan att någon fällning bildas.

Filtrera några ml av lösningen genom ett 0,45 μm membranfilter (4.5) före injektion i HPLC-kolonnen. Gå vidare med kromatografen enligt 5.4.

Skydda standardlösning och hydrolysat mot direkt solljus. Om hydrolysaten inte kan analyseras samma dag kan de lagras vid 5 °C i högst tre dagar.

5.4 HPLC-bestämning

De värden för isokratisk eluering som anges nedan är ungefärliga. Andra värden kan väljas om de ger motsvarande resultat (se även 9.1 och 9.2).

>Plats för tabell>

6. Resultatberäkning

>PIC FILE= "L_2000174SV.004701.EPS">

A= topparea för intern standard, kalibreringsstandardlösning (3.17)

B= topparea för tryptofan, extrakt (5.2) eller hydrolysat (5.3)

C= volym i ml (= 2) av koncentrerad tryptofanlösning (3.15) som satts till kalibreringslösningen (3.17)

D= koncentration i μmol/ml (= 2,50) av koncentrerad tryptofanlösning (3.15) som satts till kalibreringslösningen (3.17)

E= volym i ml av koncentrerad lösning av intern standard (3.16) som satts till vid extraktionen (5.2) (= 5,00 ml) eller till hydrolysatet (5.3) (= 2,00 ml)

F= topparea för intern standard, extrakt (5.2) eller hydrolysat (5.3)

G= topparea för tryptofan, kalibreringsstandardlösning (3.17)

H= volym i ml (2,00 ml) koncentrerad lösning av intern standard (3.16) som satts till kalibreringsstandardlösningen (3.17)

W= provets vikt i g (korrigerad till den ursprungliga vikten om provet har torkats och/eller avfettats)

M= molekylvikt för tryptofan (= 204,23)

7. Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 10 % av det högre värdet.

8. Resultat av en provningsjämförelse mellan laboratorier

En provningsjämförelse i Europeiska gemenskapen (fjärde jämförelsen) har genomförts där tre prov analyserades av upp till tolv laboratorier för att hydrolysmetoden skulle kunna certifieras. Varje prov analyserades fem gånger. Resultaten anges i tabellen nedan.

>Plats för tabell>

En annan provningsjämförelse i Europeiska gemenskapen (tredje jämförelsen) har genomförts där två prov analyserades av upp till tretton laboratorier för certifiering av metoden för extrahering av fritt tryptofan. Varje prov analyserades fem gånger. Resultaten anges i tabellen nedan.

>Plats för tabell>

Ytterligare en provningsjämförelse i Europeiska gemenskapen har genomförts där fyra prov analyserades av upp till sju laboratorier för certifiering av metoden för tryptofanhydrolys. Resultatet framgår av tabellen nedan. Varje prov analyserades fem gånger.

>Plats för tabell>

9. Anmärkningar

9.1 För att få bättre separation mellan tryptofan och α-metyl-tryptofan kan man prova att använda följande kromatografiska parametrar:

>Plats för tabell>

9.2 Kromatografin varierar beroende på typen av HPLC och vilket slags packning som används i kolonnen. Det valda systemet måste klara av att ge baslinjeseparation mellan tryptofan och intern standard. Det är också viktigt att nedbrytningsprodukter tydligt kan separeras från tryptofan och intern standard. Man bör köra hydrolysat utan intern standard för att kunna upptäcka eventuella orenheter på baslinjen under den interna standarden. Det är viktigt att körtiden är så lång att alla nedbrytningsprodukter hinner elueras ut, annars kan sena elueringstoppar störa efterföljande körningar.

Kromatografisystemet måste ge linjär respons i driftsintervallet. Den linjära responsen skall mätas med en konstant koncentration (den normala) av intern standard och varierande koncentrationer av tryptofan. Det är viktigt att topparna för både tryptofan och intern standard ligger inom det linjära intervallet för HPLC-/fluorescenssystemet. Om topparna för tryptofan och/eller intern standard är för låga eller för höga bör bestämningen göras om med annan provstorlek och/eller slutvolym.

9.3 Bariumhydroxid

Bariumhydroxid blir mer svårläsligt när det åldras. Detta ger en grumlig lösning för HPLC-bestämning, vilket kan ge upphov till alltför låga värden för tryptofan.

(1) Genomförd av arbetsgruppen för foder inom Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

(2) Genomförd av arbetsgruppen för foder inom Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).