BILAGA I

System för de tester som ska utföras i enlighet med artiklarna 3, 4, 5 och 7

1. ALLMÄNNA PRINCIPER FÖR FÖREKOMST AV DEN ANGIVNA SKADEGÖRAREN

1.1 Förekomst av den angivna skadegöraren misstänks om positivt resultat erhålls i det första testet för påvisande som utförs på den angivna växten eller på vattenprover.

1.2 Förekomst av den angivna skadegöraren bekräftas i följande fall: a) Om det första eller andra testet för påvisande är selektiv isolering som ger upphov till kolonier med typisk morfologi, och positiva resultat erhålls i två identifieringstester som utförs på kolonierna. b) Om det första och andra testet är andra tester än selektiv isolering, och positiva resultat erhålls i två identifieringstester efter det att provet har genomgått selektiv isolering som ger upphov till kolonier med typisk morfologi. Ett av dessa två identifieringstester ska vara ett test som avses i punkt 2.2 e, f och g.

2. TESTER

2.1 Tester för påvisande

Testerna för påvisande ska konsekvent kunna påvisa minst 104 celler/ml återsuspenderad pellet som tagits från asymtomatiska prover.

Det andra testet för påvisande ska baseras på andra biologiska principer eller andra nukleotidregioner än det första testet för påvisande.

Testerna för påvisande är följande:

a) Immunofluorescensanalys, enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder.

b) Isolering av den angivna skadegöraren på det semiselektiva odlingsmediet mSMSA, enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder.

c) Konventionellt PCR-test med de primrar som beskrivs av Pastriket al. (2002) (1), enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder.

d) TaqMan®-realtids-PCR med de primrar och prober som beskrivs av i) Weller et al. (2000) (2), enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder, ii) Vreeburg et al. (2016) (3), med en TaqMan®-prob som modifierats från den ursprungliga prob som beskrivs av Weller et al. (2000), enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder, iii) Vreeburg et al. (2018) (4) (det s.k. NYtor-testet), enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder, iv) Massart et al. (2014) (5), enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder.

e) LAMP (loopmedierad isotermisk amplifiering) med de primrar som beskrivs av Lenarčič et al. (2014) (6) (endast för symtomatiskt växtmaterial), enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder.

2.2 Identifieringstester

Identifieringstesterna är följande:

a) Immunofluorescensanalys, enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder.

b) Konventionella PCR-tester med de primrar som beskrivs av Pastrik et al. (2002), enligt den ingående beskrivningen i internationella diagnosstandarder.

c) TaqMan®-realtids-PCR med de primrar och prober som beskrivs av i) Weller et al. (2000), enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder, ii) Vreeburg et al. (2016), med en TaqMan®-prob som modifierats från den ursprungliga prob som beskrivs av Weller et al. (2000), enligt den ingående beskrivningen i internationella diagnosstandarder, iii) Vreeburg et al. (2018) (det s.k. NYtor-testet), enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder, iv) Massart et al. (2014), enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder.

d) LAMP (loopmedierad isotermisk amplifiering) med de primrar som beskrivs av Lenarčič et al. (2014), enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder.

e) Fylotypspecifikt multiplext konventionellt PCR-test (Opina et al. [1997] (7), Fegan & Prior [2005] (8)), enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder.

f) DNA-streckkodning (Wicker et al. [2007] (9)), enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder.

g) MALDI-TOF-masspektometri (van de Bilt et al. [2018] (10)), enligt beskrivningen i internationella diagnosstandarder.

3. FLÖDESSCHEMAN ÖVER FÖRFARANDEN

Flödesschema nr 1: Diagnostiskt förfarande för förekomst av den angivna skadegöraren i prover av den angivna växten.

a Isolering kan användas som det första eller andra testet för påvisande. Om förekomst av den angivna skadegöraren misstänks på odlingsmediet ska kolonierna renas för att erhålla renkulturer på vilka två identifieringstester ska utföras.

b Ett av dessa två identifieringstester ska vara ett test som avses i punkt 2.2 e, f och g. Positiva resultat i de två identifieringstesterna krävs för att bekräfta förekomsten av skadegöraren.

c Det tredje testet för påvisande ska baseras på andra biologiska principer eller andra nukleotidregioner.

Flödesschema nr 2: Diagnostiskt förfarande för den angivna skadegöraren i vattenprover.

a Ett av dessa två identifieringstester ska vara ett test som avses i punkt 2.2 e, f och g. Positiva resultat i de två identifieringstesterna krävs för att bekräfta förekomsten av skadegöraren.

4. PROVBEREDNING

4.1 Prover av asymtomatiska knölar

Standardprovet ska omfatta 200 knölar per test. Det lämpliga laboratorieförfarandet för att behandla naveländarna så att extraktet för påvisande av den angivna skadegöraren kan erhållas beskrivs i internationella diagnosstandarder.

4.2 Prover av asymtomatiska angivna växter

Latenta infektioner ska påvisas med användning av samlingsprover av stjälksegment eller bladskaft. Förfarandet får användas för upp till 200 stjälkdelar eller 200 bladskaft från olika växter i ett prov. Det lämpliga laboratorieförfarandet för att desinficera och behandla stjälk- eller bladskaftssegmenten så att extraktet för påvisande av den angivna skadegöraren kan erhållas beskrivs i internationella diagnosstandarder.

4.3 Prover av symtomatiskt material från de angivna växterna

Vävnadssegment ska avlägsnas aseptiskt från kärlringen på potatisknölar eller från stjälkens kärlsträngar på angivna växter som visar symtom på vissning. Det lämpliga laboratorieförfarandet för att behandla dessa vävnader så att extraktet för påvisande av den angivna skadegöraren kan erhållas beskrivs ingående i internationella diagnosstandarder.

4.4 Prover av ytvatten eller återcirkulerande vatten (inklusive vatten från potatisbearbetning eller avloppsvatten)

Det huvudsakliga testet för påvisande av den angivna skadegöraren i prover av ytvatten, vatten från återcirkulationssystem och avloppsvatten (från potatisbearbetningsindustrin) är selektiv isolering. Det lämpliga laboratorieförfarandet för att behandla vattenprover beskrivs i internationella diagnosstandarder.

(1) Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G., Pukall, R. (2002), ”Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control”, European Journal of Plant Pathology, 108, s. 831–842.

(2) Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Boonham, N., Stead, D.E. (2000), ”Detection of Ralstonia solanacearum strains with a quantitative, multiplex, real-time, fluorogenic PCR (TaqMan) assay”, Applied and Environmental Microbiology, 66, s. 2853–2858 (https://journals.asm.org/doi/10.1128/AEM.66.7.2853-2858.2000).

(3) Vreeburg, R.A.M., Bergsma-Vlami, M., Bollema, R.M., de Haan, E.G., Kooman-Gersmann, M., Smits-Mastebroek, L., Tameling, W.I.L., Tjou-Tam-Sin, N.N.A., van de Vossenberg B.T.L.H, Janse, J.D. (2016), ”Performance of real-time PCR and immunofluorescence for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and Ralstonia solanacearum in potato tubers in routine testing”, Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, 46, s. 112–121.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol, A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018), ”Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach”, EPPO Bulletin, 48, s. 86–96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014), ”Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay”, European Journal of Plant Pathology, 138, s. 29–37.

(6) Lenarčič, R., Morisset, D., Pirc, M., Llop, P., Ravnikar, M., Dreo, T. (2014), ”Loop-mediated isothermal amplification of specific endoglucanase gene sequence for detection of the bacterial wilt pathogen Ralstonia solanacearum”, PLoS ONE, 9(4), e96027 (https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096027).

(7) Opina, N., Tavner, F., Holloway, G., Wang, J.F., Li, T.H., Maghirang, R., Fegan, M., Hayward, A.C., Viji Krishnapillai, A., Wai-Foong Hong, Holloway, B.W, Timmis, J.N. (1997), ”A novel method for development of species and strainspecific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum)”, Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology, 5, s. 19–30.

(8) Fegan, M., Prior, P. (2005), ”How complex is the ’Ralstonia solanacearum species complex’”, Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex (red. Allen C, Hayward AC & Prior P), s. 449–461, American Phytopathological Society, St Paul, MN (Förenta staterna).

(9) Wicker, E., Grassart, L., Coranson-Beaudu, R., Mian, D., Guilbaud, C., Fegan, M., Prior, P. (2007), ”Ralstonia solanacearum strains from Martinique (French West Indies) exhibiting a new pathogenic potential”, Applied and Environmental Microbiology, 73, s. 6790–6801.

(10) van de Bilt, J.L.J., Wolsink, M.H.L., Gorkink-Smits, P.P.M.A., Landman, N.M., Bergsma-Vlami, M. (2018), ”Application of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry for rapid and accurate identification of Ralstonia solanacearum and Ralstonia pseudosolanacearum”, European Journal of Plant Pathology (https://doi.org/10.1007/s10658-018-1517-5).