”BILAGA I

Enzymatisk bestämning av stärkelse och dess nedbrytningsprodukter, inbegripet glukos, i livsmedelsprodukter med hjälp av högupplösande vätskekromatografi (high performance liquid chromatography, HPLC)

1. Tillämpningsområde

Nedan beskrivs bestämning av halten av stärkelse och nedbrytningsprodukter därav i livsmedelsprodukter avsedda som människoföda (nedan kallat stärkelse). Stärkelsehalten bestäms genom kvantitativ analys av glukos genom högupplösande vätskekromatografi (high-performance liquid chromatography, HPLC) efter enzymatisk omvandling av stärkelse och dess nedbrytningsprodukter till glukos.

2. Definition av total glukoshalt och total glukoshalt uttryckt som stärkelse

Med total glukoshalt menas värdet Z beräknat enligt punkt 7.2.1 i denna bilaga. Det inbegriper halten av stärkelse och alla dess nedbrytningsprodukter, inbegripet glukos.

Halten av stärkelse/glukos enligt definitionen i bilaga III till förordning (EG) nr 1460/96 ska beräknas med utgångspunkt i den totala glukoshalten Z och enligt förfarandet i artikel 2.1 i denna förordning.

Halten av stärkelse (eller dextrin) enligt vad som avses i kolumn 3 i bilaga IV till kommissionens förordning (EG) nr 1043/2005 (1) ska beräknas med utgångspunkt i den totala glukoshalten Z och enligt förfarandet i artikel 2.2.1 i kommissionens förordning (EG) nr 904/2008 (2).

Den stärkelsehalt som avses i punkt 1 i denna bilaga är värdet E, beräknat enligt punkt 7.2.2 i denna bilaga. Den uttrycks i massprocent. Den är ekvivalent med den totala glukoshalten Z, uttryckt som stärkelse. Detta värde E påverkar inte ovannämnda beräkningar.

3. Princip

Proven homogeniseras och suspenderas i vatten. Stärkelsen och dess nedbrytningsprodukter i proven omvandlas enzymatiskt till glukos i två steg:

1. Stärkelse och dess nedbrytningsprodukter omvandlas delvis till lösliga glukoskedjor med hjälp av värmestabil alfaamylas vid 90 °C. För effektiv omvandling krävs att proven är helt upplösta eller föreligger i form av suspension med mycket små fasta delar.

2. De lösliga glukoskedjorna omvandlas till glukos med hjälp av amyloglukosidas vid 60 °C.

Produkter som innehåller en hög halt proteiner eller fetter klaras och filtreras.

Bestämningen av sockerarter utförs genom HPLC-analys.

Eftersom en partiell inversion av sackaros kan inträffa under enzymbehandlingen, ska halten av fria sockerarter också utföras med HPLC-analys så att den korrigerade glukoshalten kan beräknas.

4. Reagenser och andra material

Använd reagenser av för analytiska ändamål godkänd klass och avmineraliserat vatten.

4.1 Glukos, minst 99 %.

4.2 Fruktos, minst 99 %.

4.3 Sackaros, minst 99 %.

4.4 Maltosmonohydrat, minst 99 %.

4.5 Laktosmonohydrat, minst 99 %.

4.6 Lösning av värmestabilt alfaamylas (1,4-alfa-D-glukan-glukanohydrolas), med aktivitet på omkring 31 000 U/ml (1U frigör 1,0 mg maltos från stärkelse på 3 minuter vid pH 6,9 och 20 °C). Detta enzym kan innehålla en liten mängd orenheter (t.ex. glukos eller sackaros) och andra störande enzymer. Förvaras vid ca. 4 °C. Som alternativ får andra källor till alfaamylas användas om dessa leder till en slutlig lösning med jämförbar enzymaktivitet.

4.7 Amyloglukosidas (1,4-alfa-D-glukan glukohydrolas) från Aspergillus niger, pulveriserad, med aktivitet på omkring 120 U/mg eller omkring 70 U/mg (1U frigör 1 mikromol glukos från stärkelse per minut vid pH 4,8 och 60 °C). Detta enzym kan innehålla en liten mängd orenheter (t.ex. glukos eller sackaros) och andra störande enzymer (t.ex. invertas). Förvaras vid ca. 4 °C. Som alternativ får andra källor till amyloglukosidas användas om dessa leder till en slutlig lösning med jämförbar enzymaktivitet.

4.8 Zinkacetatdihydrat, p.a.

4.9 Kaliumhexacyanoferrat (II) (K4[Fe(CN)]6.3H2O), extra pure.

4.10 Natriumacetat, vattenfri, p.a.

4.11 Isättika, minst 96 volymprocent.

4.12 Natriumacetatbuffert (0,2 mol/l). Väg upp 16,4 gram natriumacetat (punkt 4.10) i en glasbägare. Lös upp i vatten och för över till en mätkolv med volymen 1 000 ml. Späd till märket med vatten och justera pH-värdet till 4,7 med hjälp av ättika (genom att använda en pH-mätare (punkt 5.7)). Denna lösning kan användas upp till sex månader om den förvaras vid 4 °C.

4.13 Amyloglukosidaslösning. Blanda en lösning av amyloglukosidaspulver (punkt 4.7) med hjälp av natriumacetatbuffert (punkt 4.12). Enzymaktiviteten ska vara tillräcklig och avpassad till stärkelsehalten i provet (exempelvis erhålls en aktivitet på omkring 600 U/ml från 0,5 g amyloglukosidaspulver 120 U/mg (punkt 4.7) i en slutlig volym om 100 ml för 1 g stärkelse i provet). Bered lösningen omedelbart före användning.

4.14 Referenslösningar. Bered lösningar av glukos, fruktos, sackaros, maltos och laktos i vatten, sådana som vanligtvis används i en HPLC-analys.

4.15 Reagens för klarning (Carrez I). Lös upp 219,5 gram zinkacetat (punkt 4.8) i vatten i en glasbägare. För över till en mätkolv med volymen 1 000 ml, tillsätt 30 ml ättika (punkt 4.11). Blanda noggrant och fyll på med vatten till märket. Denna lösning kan användas upp till sex månader om den förvaras vid rumstemperatur. Andra reagenser för klarning som är likvärdiga med Carrezlösningen kan användas.

4.16 Reagens för klarning (Carrez II). Lös upp 106,0 gram kaliumhexacyanoferrat II (punkt 4.9) i vatten i en glasbägare. För över till en mätkolv med volymen 1 000 ml. Blanda noggrant och späd med vatten till märket. Denna lösning kan användas upp till sex månader om den förvaras vid rumstemperatur. Andra reagenser för klarning som är likvärdiga med Carrezlösningen kan användas.

4.17 Mobil fas för HPLC. Bered en rörlig fas, en sådan som vanligtvis används i en HPLC-analys av socker. Om exempelvis en aminopropyl-kiselgelkolonn används, är en blandning av vatten av HPLC-kvalitet och acetonitril en vanlig rörlig fas.

5. Redskap

5.1 Standardmässiga laboratorieglas.

5.2 Veckade filter, t.ex. 185 mm.

5.3 Sprutfilter, 0,45 μm, lämpliga för vattenlösningar.

5.4 Provbehållare lämpliga för HPLC-autosampler.

5.5 Mätkolvar med volymen 100 ml.

5.6 Plastsprutor, 10 ml.

5.7 pH-mätare.

5.8 Analysvåg.

5.9 Vattenbad med termostat, justerbart till 6 °C och 90 °C.

5.10 HPLC-apparat lämplig för analys av sockerarter.

6. Förfarande

6.1 Beredning av provet för flera typer av produkter

Produkten homogeniseras.

6.2 Provmängd

Provmängden skattas med ledning av innehållsdeklarationen och förhållandena för HPLC-analys (glukosreferenslösningens koncentration), och får inte överskrida:

Väg upp provet med en noggrannhet av ± 0,1 mg.

6.3 Bestämning av blankprov

Blankprovet bestäms genom en fullständig analys (enligt beskrivningen i punkt 6.4) utan tillsättning av ett prov. Resultatet av blankprovet används för att beräkna stärkelsehalten (punkt 7.2).

6.4 Analys

6.4.1 Beredning av proverna

Homogenisera provet genom att skaka eller röra om. Den valda provmängden (punkt 6.2) vägs upp i en mätkolv (punkt 5.5) och omkring 70 ml varmt vatten tillsätts.

Tillsätt, efter upplösning eller suspendering, 50 mikroliter värmebeständigt alfaamylas (punkt 4.6) och värm vid 90 °C i 30 minuter i ett vattenbad (punkt 5.9). Kyl ned så snabbt som möjligt till 60 °C i ett vattenbad och tillsätt 5 ml amyloglukosidaslösning (punkt 4.13). För prov som kan påverka reaktionslösningens pH-värde, kontrollera pH-värdet och justera det vid behov till 4,6–4,8. Låt reagera under 60 minuter vid 60 °C. Kyl ned proven till rumstemperatur.

6.4.2 Klarning

För prover med hög protein- eller fetthalt krävs klarning genom tillsats av 1 ml Carrez I (punkt 4.15) till provlösningen. Efter skakning tillsätts 1 ml Carrez II (punkt 4.16). Skaka provet igen.

6.4.3 Behandling för HPLC-analys

Provet i mätkolven späds till märket med vatten, homogeniseras och filtreras genom ett veckat filter (punkt 5.2). Samla upp provextraktet.

Filtrera extraktet genom ett sprutfilter (punkt 5.3) med en spruta (punkt 5.6) som har försköljts med extraktet. Samla upp filtraten i provrör (punkt 5.4).

6.5 Kromatografi

HPLC utförs som normalt vid analys av socker. Om HPLC-analysen visar spår av maltos har stärkelsen omvandlats ofullständigt, vilket leder till för låg halt av glukos.

7. Beräkning och redovisning av resultat

7.1 Beräkning av HPLC-resultaten

För beräkning av stärkelsehalten krävs resultaten från två HPLC-analyser, nämligen socker i provet före (’fria sockerarter’) och efter enzymbehandlingen (enligt beskrivningen i denna metod). Dessutom ska ett blankprov bestämmas så att resultaten kan korrigeras för socker i enzymerna.

I HPLC-analysen bestäms arean under toppen genom integration och koncentrationen beräknas efter kalibrering med referenslösningar (punkt 4.14). Från glukoskoncentrationen (g/100 ml) efter enzymbehandling subtraheras glukoskoncentrationen (g/100 ml) i blankprovet. Slutligen beräknas sockerhalten (g socker/100 g prov) med hjälp av den vägda provmängden, vilket ger:

1. HPLC-analys före enzymbehandlingen, vilket ger halten (g/100 g) fria sockerarter: — glukos G — fruktos F — sackaros S

2. HPLC-analys efter enzymbehandlingen, vilket ger halten (g/100 g) sockerarter: — glukos efter korrektion för blankprovet (Ge cor) — fruktos Fe — sackaros Se

7.2 Beräkning av stärkelsehalten

7.2.1 Beräkning av total glukoshalt ’Z’

Om mängden fruktos efter enzymbehandling (Fe) är högre än mängden fruktos före enzymbehandling (F) har sackaros i provet delvis omvandlats till fruktos och glukos. Detta innebär att resultaten ska korrigeras för frisläppt glukos (Fe – F).

Z , slutlig halt glukos efter korrektion i g/100 g:

Z = (Ge cor) – (Fe – F)

7.2.2. Beräkning av den totala glukoshalten uttryckt som stärkelse

E, halt av ’stärkelse’ i g/100 g:

E = [(Ge cor) – (Fe – F)] × 0,9

8. Precision

Närmare uppgifter om en jämförelse mellan olika laboratorier av metodens precision för mätvärden från två prov återfinns här. De återspeglar prestandakraven på den metod som beskrivs i denna bilaga.

Resultat av en jämförelse mellan olika laboratorier (upplysningsvis)

Under 2008 utfördes jämförelser mellan laboratorier med deltagande från EU:s tullaboratorier.

Mätresultaten utvärderades i enlighet med Protocol for the design, conduct and interpretation of method-performance studies, W. Horwitz, (IUPAC technical report), Pure & Appl. Chem., Vol. 67, No 2, s. 331–343, 1995.

Precisionsdata återges i nedanstående tabell.