6.

Bilaga VII skall ersättas med följande: ”BILAGA VII BESTÄMNING AV PROCENTANDELEN 2-GLYCERYLMONOPALMITAT 1. SYFTE OCH TILLÄMPNINGSOMRÅDE Metoden avser bestämning av procentandelen palmitinsyra i 2-ställning för triglycerider genom bestämning av 2-glycerylmonopalmitat. Metoden kan tillämpas på flytande vegetabiliska oljor vid en temperatur på 20 °C. 2. PRINCIP Efter beredning av oljeprovet tillsätts pankreaslipas. Detta leder till partiell och specifik hydrolys i 1- och 3-ställning för triglyceridmolekylen varigenom monoglycerider i 2-ställning uppkommer. Procentandelen 2-glycerylmonopalmitat i monoglyceridfraktionen bestäms, efter silylering, med kapillärgaskromatografi. 3. UTRUSTNING 3.1 E-kolv 25 ml 3.2 Glasbägare, 100, 250 och 300 ml 3.3 Kromatografikolonn av glas, innerdiameter 21–23 mm, längd 400 mm, med porös glasskiva och kran 3.4 Graderade provrör 10, 50, 100 och 200 ml 3.5 Kolvar 100 och 250 ml 3.6 Rotationsindunstare 3.7 Centrifugrör 10 ml, med konformad botten och slipad propp 3.8 Centrifug för rör 10 och 100 ml 3.9 Termostat som håller temperaturen på 40 + 0,5 °C 3.10 Mätpipetter, 1 och 2 ml 3.11 Injektionsspruta 1 ml 3.12 Spruta 100 μl 3.13 Tratt, 1 000 ml 3.14 Kapillärgaskromatograf med ”on column” -injektor för direktinjektion av provet i kolonnen och en ugn som kan hålla vald temperatur med en noggrannhet på + 1 °C 3.15 ”On column” -injektor för direktinjektion av provet i kolonnen 3.16 En flamjonisationsdetektor och elektrometer 3.17 Skrivare/integrator som är anpassad till elektrometern, med responstid på högst 1 sekund och med variabel pappershastighet 3.18 Kapillärkolonn av glas eller kvarts, längd 8–12 meter, innerdiameter 0,25–0,32 mm, belagd med 5-procentig metylpolysiloxan eller fenylmetylpolysiloxan (tjocklek 0,10–0,30 μm) som kan användas vid 370 °C 3.19 Spruta 10 μl med härdad nål, minst 7,5 cm, för direktinjektion i kolonnen 4. REAGENS 4.1 Kiselgel med en kornstorlek på 0,063–0,200 mm (70/280 mesh), beredd enligt följande: placera kiselgelen i en porslinskapsel, torka i ugnen vid 160 °C i 4 timmar, låt svalna i exsickator. Tillsätt en mängd vatten som motsvarar 5 % av kiselgelens vikt, enligt följande: mät upp 152 g kiselgel i en E-kolv på 500 ml och tillsätt 8 g destillerat vatten, sätt på proppen och skaka lätt så att vattnet blir jämnt fördelat. Låt stå i minst 12 timmar före användning. 4.2 n-hexan för kromatografi 4.3 Isopropanol 4.4 Isopropanol, vattenlösning 1:1 (v/v) 4.5 Pankreaslipas. Lipaset skall ha en aktivitet på 2,0–10 lipasenheter/mg (i handeln finns det pankreaslipas med en aktivitet på 2–10 enheter per mg enzym). 4.6 Buffertlösning av tris(hydroximetyl)aminometan: vattenlösning 1 M där pH justeras till 8 (kontrolleras med potentiometer) genom tillsats av koncentrerad HCI (1:1 v/v) 4.7 Natriumkolat, enzymkvalitet, 1-procentig vattenlösning (lösningen bör användas inom 15 dagar efter det att den beretts 4.8 Kalciumklorid, 22-procentig vattenlösning 4.9 Dietyleter för kromatografi 4.10 Elueringsmedel: blandning n-hexan/dietyleter (87:13) (v/v) 4.11 Natriumhydroxid, lösning på 12 viktprocent 4.12 Fenolftalein, 1-procentig lösning i etanol 4.13 Bärgas: vätgas eller helium, för gaskromatografi 4.14 ”Make-up” -gas: vätgas, minst 99 %, fri från fukt och organiska ämnen – och luft för gaskromatografi, av samma renhetsgrad 4.15 Silyleringsreagens: blandning pyridin/hexametyldisilazan, trimetylklorsilan 9:3:1 (v/v/v). (Det finns färdiga lösningar i handeln. Andra silyleringsreagenser kan användas, t.ex. bis-trimetylsilyltrifluoracetamid + 1 % trimetylklorsilan, utspätt med lika mängd vattenfritt pyridin.) 4.16 Referensprover: rena monoglycerider eller blandningar av monoglycerider med en liknande procentuell sammansättning som provet 5. FÖRFARANDE 5.1 Provberedning 5.1.1 Oljor med en halt av fria syror lägre än 3 % behöver inte neutraliseras före kromatografi på kolonn med kiselgel. Oljor med en halt av fria syror över 3 % skall neutraliseras i enlighet med punkt 5.1.1.1. 5.1.1.1 Häll 50 g olja och 200 ml n-hexan i en tratt på 1 000 ml (3.13). Tillsätt 100 ml isopropanol och en mängd 1-procentig natriumhydroxidlösning (4.11) som motsvarar oljans fria syrahalt ökat med 5 %. Skaka kraftigt i 1 minut. Tillsätt 100 ml destillerat vatten, skaka igen och låt stå. Efter dekantering, avlägsna det nedre skiktet som innehåller tvål. Avlägsna eventuella mellanliggande skikt (slem och olösliga ämnen). Tvätta den neutraliserade hexanlösningen av oljan flera gånger med 50–60 ml lösning av isopropanol och vatten 1:1 (v/v) (4.4) till dess den rosafärgade tonen på fenolftaleinet försvunnit. Avlägsna det mesta av hexanet genom vakuumdestillation (t.ex. med en rotationsindunstare) och för över oljan till en kolv på 100 ml (3.5). Torka oljan i vakuum till dess att lösningsmedlet har försvunnit helt. När så skett bör oljans syrahalt ligga under 0,5 %. 5.1.2 Häll 1,0 g olja som beretts enligt ovan i en 25 ml E-kolv (3.1) och lös upp i 10 ml lösningsmedel (4.10). Låt lösningen stå i minst 15 minuter före kromatografi på kolonn med kiselgel. Om lösningen är grumlig, centrifugera den för att uppnå optimala förhållanden för kromatografi. (Till detta används t.ex. SPE-kolonner på 500 g med kiselgel, färdiga för användning). 5.1.3 Preparering av kromatografikolonnen Häll i ca 30 ml lösningsmedel (4.10) i kolonnen (3.3), placera en bomullstuss i den nedre delen av kolonnen med hjälp av en glasstav och pressa ut luften. Slamma upp 25 g kiselgel (4.1) i ca 80 ml lösningsmedel i en glasbägare och häll i den i kolonnen med hjälp av en tratt. Kontrollera att all kiselgel har hamnat i kolonnen. Tvätta med lösningsmedlet (4.10), öppna kranen och låt vätskenivån sjunka till ca 2 mm ovanför kiselgelens övre nivå. 5.1.4 Kromatografi Väg upp exakt 1,0 g av provet som beretts enligt punkt 5.1 i en E-kolv på 25 ml (3.1). Lös upp provet i 10 ml elueringsmedel (4.10). Häll lösningen i kromatografikolonnen som förberetts enligt punkt 5.1.3. Rubba inte kolonnytan. Öppna kranen och fyll på med provlösning upp till kiselgelen. Eluera med 150 ml elueringsmedel. Ställ in flödeshastigheten på 2 ml/min (så att 150 ml rinner igenom kolonnen på ca 60–70 minuter). Samla upp eluatet i en 250 ml rundkolv som tarerats i förväg. Förånga lösningsmedlet i vakuum och avlägsna lösningsmedelsresterna med en ström av kvävgas. Väg kolven och beräkna mängden extrakt som erhållits. (Vid användning av SPE-kolonn med kiselgel som är färdig för användning, förfar enligt följande: Fyll på 1 ml lösning (5.1.2.) i kolonnerna, som dessförinnan förberetts med 3 ml n-hexan. När lösningen passerat genom kolonnen, eluera med 4 ml n-hexan/dietyleter 9:1 (v/v). Samla upp eluatet i ett 10 ml rör och förånga med en ström av kvävgas tills all vätska försvunnit. Tillsätt pankreaslipas till torrsubstansen (5.2.). Det är absolut nödvändigt att kontrollera fettsyresammansättningen både före och efter passagen genom SPE-kolonnen). 5.2 Hydrolys med pankreaslipas 5.2.1 Väg upp 0,1 g olja som beretts enligt punkt 5.1. i centrifugröret. Tillsätt 2 ml buffertlösning (4.6.), 0,5 ml natriumkolatlösning (4.7.) och 0,2 ml kalciumkloridlösning och skaka väl efter varje tillsats. Förslut röret med den slipade proppen och placera det i termostaten vid en temperatur på 40 + 0,5 °C. 5.2.2 Tillsätt 20 mg lipas, blanda väl (undvik att blöta ner proppen) och placera röret i termostaten under exakt 2 minuter, ta ut det, skaka väl under exakt 1 minut och låt svalna. 5.2.3 Tillsätt 1 ml dietyleter, sätt i proppen och skaka väl, centrifugera och överför därefter eterlösningen till ett rent och torrt rör med hjälp av en spruta. 5.3 Beredning av silylerade derivat och förberedelser för gaskromatografi 5.3.1 För över 100 μl lösning (5.2.3.) till ett 10 ml provrör med konisk botten med hjälp av en spruta. 5.3.2 Avlägsna lösningsmedlet med svag kvävgasström, tillsätt 200 μl silyleringsreagens (4.15.), sätt i proppen i provröret och låt stå i 20 minuter. 5.3.3 Tillsätt efter 20 minuter 1–5 ml n-hexan (beroende på de kromatografiska betingelserna): den lösning som erhålls är färdig att användas för gaskromatografi. 5.4 Gaskromatografi Följande analysparametrarna används: — Injektortemperatur (”on column” -injektor) under lösningens kokpunkt (68 °C) — Detektortemperatur: 350 °C — Kolonntemperatur: programmering av ugnstemperatur: 60 °C under 1 minut, öka med 15 °C per minut upp till 180 °C, sedan med 5 °C per minut upp till 340 °C, denna temperatur bibehålls sedan under 13 minuter. — Bärgas: vätgas eller helium, reglerad till lämplig linjär hastighet för den upplösning som visas i figur 1. Retentionstiden för triglyceriden C54 bör vara 40 + 5 minuter (se figur 2). (Analysparametrarna ovan är vägledande. De bör optimeras av den som utför analysen så att önskad upplösning erhålls. Toppen för 2-glycerylmonopalmitat skall ha en minsta höjd på 10 % av skrivarens skala.) — Kvantitet av det injicerade ämnet: 0,5–1 μl av lösningen (5 ml) med n-hexan (5.3.3.). 5.4.1 Identifiering av toppar De enskilda monoglyceriderna bör identifieras genom att retentionstiderna jämförs med dem som erhållits för standardblandningar med monoglycerider under samma förhållanden. 5.4.2 Kvantitativ analys Arean för varje topp beräknas med hjälp av en elektronisk integreringsenhet. 6. BERÄKNING AV RESULTAT Andelen glycerilmonopalmitat beräknas genom en jämförelse mellan arean för motsvarande topp och summan av toppareorna för samtliga monoglycerider (se figur 2), enligt formeln: Glycéril monopalmitate (%): där: Ax = topparean för glycerilmonopalmitat ΣA = summan av toppareorna för alla monoglycerider Resultatet skall anges med en decimal. 7. ANALYSRAPPORT Följande skall anges i analysrapporten: — Hänvisning till denna metod — Alla uppgifter som behövs för att fullständigt identifiera provet — Analysresultat — Alla avvikelser från metoden, vare sig de hänför sig till ett beslut av de berörda parterna eller något annat skäl — Uppgifter om laboratoriet, analysdag och underskrift av de ansvariga på laboratoriet Figur 1 Kromatogram över reaktionsprodukter från silylering som erhållits genom att lipas fått verka på en raffinerad olivolja med tillsats av 20 % esterifierad olja (100 %). Figur 2 Kromatogram över: A) Olja som inte esterifierats efter lipas; efter silylering; under dessa betingelser (kapillärkolonn 8–12 m), elueras vaxfraktionen samtidigt som diglyceridfraktionen eller kort därefter. Efter lipaset skall triglyceridhalten inte överstiga 15 %. Kromatogram över: B) Olja som esterifierats efter lipas; efter silylering; under dessa betingelser (kapillärkolonn 8–12 m), elueras vaxfraktionen samtidigt som diglyceridfraktionen eller kort därefter. Efter lipaset skall triglyceridhalten inte överstiga 15 %. 8. ANMÄRKNINGAR Anmärkning 1: BEREDNING AV LIPAS I handeln finns det lipaser med lämplig aktivitet. Det går också att bereda lipas i laboratorium enligt följande: Kyl 5 kg färsk bukspottskörtel från svin till 0 °C. Ta bort omgivande fett och bindväv och kör återstoden i mixer så att en tunn massa erhålles. Rör massan i 4–6 timmar med 2,5 liter vattenfritt aceton och centrifugera sedan. Extrahera återstoden tre gånger till med samma mängd vattenfritt aceton, och sedan två gånger med en blandning av aceton/dietyleter (1:1) (v/v) och därefter två gånger med dietyleter. Torka återstoden i vakuum i 48 timmar så att ett stabilt pulver erhålls. Detta skall lagras i kylskåp och skyddas från fukt. Anmärkning 2: KONTROLL AV LIPASAKTIVITETEN Bered en olivoljeemulsion enligt följande: Bered i mixer i 10 minuter en blandning av 165 ml lösning av gummi arabicum 100 g/l, 15 g krossad is och 20 ml av en neutraliserad olivolja. Häll 10 ml av lösningen i en 50 ml glasbägare, tillsätt sedan 0,3 ml natriumkolatlösning på 0,2 g/ml och 20 ml destillerat vatten. Placera bägaren i en termostat inställd på 37 °C. Sänk ned pH-elektroderna i bägaren och lägg i omröraren. Tillsätt med hjälp av en byrett droppvis 0,1 N natriumhydroxidlösning tills pH går upp till 8,3. Tillsätt en mängd lipassuspension i pulverform till vattnet (0,1 g/ml lipas). När pH-värdet uppmäts till 8,3, starta kronometern och tillsätt natriumhydroxidlösningen droppvis i den takt som krävs för att pH-värdet skall ligga kvar på 8,3. Anteckna varje minut mängden använd lösning. Plotta mätvärdena i ett koordinatsystem med tiden på x-axeln och antal ml 0,1 N alkalilösning som gått åt för att bibehålla konstant pH på y-axeln. Resultatet skall bli en rät linje. Lipasaktiviteten mätt i lipasenheter per mg erhålls genom följande formel: där: A är aktiviteten i lipasenheter/mg V är antalet ml 0,1 N natriumhydroxidlösning per minut (grafisk beräkning) N är normaliteten hos natriumhydroxidlösningen m är massan i mg av försökslipaset Lipasenheten definieras som den mängd enzym som frigör 10 mikroekvivalenter syra per minut.”