BILAGA VI

1. METOD

Metoden motsvarar OECD TG 221 (2006) (1). Det finns ett brett samförstånd hos EU:s myndigheter om att Lemna-testet är ett lämpligt alternativ till ett algtest för kraftigt färgade substanser (2)(3).

1.1 INLEDNING

Metoden är avsedd för bestämning av substansers toxicitet mätt som tillväxthämning hos sötvattensväxter av släktet Lemna (andmat). Metoden bygger på existerande standardmetoder (4, 5, 6, 7, 8 och 9) som har modifierats enligt nya forskningsrön och genom samråd, i regel mellan experter. Den föreslagna metoden har validerats genom ett internationellt ringtest, dvs. en provningsjämförelse mellan olika laboratorier i världen (10).

Metoden används för toxicitetstest med hjälp av Lemna gibba och Lemna minor. Båda dessa arter har studerats ingående och har använts i test med de standardmetoder som det hänvisas till ovan. Taxonomin för Lemna spp. är komplicerad på grund av mångfalden fenotyper. Hos Lemna kan responsen på toxiska substanser variera på grund av genetiska skillnader, men för närvarande saknas det tillräckligt med underlag om dessa orsaker för att man ska kunna rekommendera en bestämd klon för användning med den aktuella metoden. Observera att testet inte utförs axeniskt (dvs. med en-arts-kultur fri från infektion av mikroorganismer), men åtgärder vidtas i skeden under testets gång för att hålla kontamination från andra organismer så låg som möjligt.

Dokumentet innehåller ingående beskrivningar av semistatiskt testförfarande (med regelbunden förnyelse av testlösningar), statiskt testförfarande (utan förnyelse av testlösningar) och genomflödestest (med kontinuerligt byte av testlösning). Beroende på lagstadgade krav och syftet med testet kan semistatiskt testförfarande eller genomflödestest komma i fråga i vissa fall, t.ex. för substanser som snabbt försvinner ur lösningen genom avdunstning, ljusnedbrytning, utfällning eller biologisk nedbrytning. Närmare riktlinjer finns i (11).

1.2 DEFINITIONER

I denna metodbeskrivning används följande definitioner och förkortningar med de betydelser som här anges:

biomassa: torrvikt av levande materia i en population. I detta test mäts vanligtvis ersättningsmått för vikten, som t.ex. antalet fronder (bladliknande del av planta) eller deras totala area. Termen ”biomassa” hänför sig således även till dessa ersättningsmått.

ECx : beteckning på den koncentration av testsubstansen som är löst i testmediet och som reducerar tillväxten av Lemna med x % (t.ex. 50 %) inom en bestämd exponeringstid, som måste specificeras om den avviker från den fullständiga eller normala tiden för testets genomförande. För att entydigt ange om EC-värdet bygger på tillväxthastighet eller producerad mängd biomassa används beteckningen ErC för tillväxthastighet och EyC för producerad mängd biomassa, åtföljt av mätvariabeln, t.ex. ErC (n), där n = ”antal fronder”.

effektmått (eng. ”endpoint”): den allmänna faktor som genom inverkan av en testsubstans i ett prov förändras jämfört med ett kontrollprov utan testsubstans. I det aktuella testet är effektmåttet tillväxthämning, som kan uttryckas med olika responsvariabler baserade på en eller flera mätvariabler.

fenotyp: observerbara egenskaper hos en organism vilka bestäms av interaktionen mellan organismens gener och dess omgivning.

frond: enskild bladliknande del av andmatsplantans struktur. Det är den minsta enhet, dvs. individ, som har förökningsförmåga.

genomflödestest: testlösningen ersätts hela tiden kontinuerligt med färsk lösning.

klon: organism eller cell som uppstått från en enskild individ genom asexuell (vegetativ) förökning. Individer från samma klon är därför genetiskt identiska.

kloros: gulning av bladvävnad.

koloni: samling av moder- och dotterfronder (vanligtvis 2–4 stycken) som sitter fast vid varandra. Ibland används termen ”planta”.

koncentration utan observerad effekt (”NOEC – No Observed Effect Concentration”): koncentration av testsubstansen som ligger omedelbart under LOEC.

lägsta koncentration med observerad effekt (”LOEC – Lowest Observed Effect Concentration”): den lägsta koncentration av testsubstansen vid vilken man kan iaktta att den har en statistiskt signifikant reducerande effekt på tillväxten (vid p < 0,05) inom en given exponeringstid, jämfört med ett kontrollprov (i fortsättningen kortfattat benämnt ”kontroll”). Ytterligare ett villkor är att alla koncentrationer av testsubstansen vilka ligger över LOEC måste ha en skadlig effekt lika med eller större än den effekt som observeras vid LOEC. Om dessa båda dessa villkor inte är uppfyllda, måste en fullständig redogörelse lämnas för hur LOEC (och därmed NOEC) har valts.

monokultur: kultur bestående av en enda art.

mätvariabler: alla slags variabler som mäts för att uttrycka testets effektmått med hjälp av en eller flera responsvariabler. I den aktuella metoden är frondantal, total frondarea, färskvikt och torrvikt mätvariabler.

nekros: död bladvävnad. Syns på att den är vit eller vattenindränkt.

producerad mängd biomassa: storleken på en mätvariabel för biomassa vid exponeringstidens slut minskad med storleken på samma mätvariabel vid exponeringstidens början.

responsvariabel: variabel för bestämning av toxicitet. Variabeln fås fram genom att man använder olika beräkningsmetoder på mätvariabler som beskriver biomassa. I den aktuella metoden är tillväxthastighet och producerad mängd biomassa responsvariabler som beräknas med hjälp av mätvariabler såsom frondantal, total frondarea, färskvikt eller torrvikt.

semistatiskt testförfarande (med regelbunden förnyelse av testlösning): testlösningen byts med bestämda intervall under testet, dvs. förbrukad lösning tas regelbundet bort och ersätts med färsk.

statiskt testförfarande: testlösningen byts inte under testet.

svullen frond: frond med ”buckligt” eller svullet utseende.

testmedium: syntetiskt odlingsmedium där testplantorna befinner sig när de exponeras för testsubstansen. Testsubstansen är normalt löst i testmediet.

tillväxt: ökning av en mätvariabel – t.ex. frondantal, torrvikt, våtvikt eller total frondarea – mätt över tiden för testets genomförande.

tillväxthastighet (genomsnittlig specifik tillväxthastighet): logaritmisk ökning av mängden biomassa under exponeringstiden.

1.3 PRINCIPER

Exponentiellt växande växtkulturer av släktet Lemna får växa som monokulturer i olika koncentrationer av testsubstansen under loppet av sju dagar. Syftet är att genom bestämning av mätvariabler kvantifiera testsubstansens effekter på tillväxten under tiden för testets genomförande. Antalet fronder är den primära mätvariabeln. Minst ytterligare en mätvariabel – total frondarea, torrvikt eller färskvikt – mäts, eftersom en del substanser kan påverka andra mätvariabler mer än de påverkar frondantalet. För att kvantifiera testsubstansens effekter jämförs tillväxten i testlösningarna med tillväxten i kontrollerna. Därefter bestäms den koncentration som åstadkommer en bestämd procent (x) av tillväxthämning, t.ex. 50 %. Denna koncentration betecknas som ECx, t.ex. EC50 i fallet med 50 % tillväxthämning.

Effektmåttet i testet är tillväxthämningen uttryckt som den logaritmiska ökningen av mätvariabeln – dvs. den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten – under exponeringstiden. Med hjälp av de genomsnittliga specifika tillväxthastigheter som registrerats i en serie testlösningar bestäms den koncentration som åstadkommer en bestämd procent (x) av tillväxthämning, t.ex. 50 %. Denna koncentration betecknas som ErCx, t.ex. ErC50 i fallet 50 %.

Ytterligare en responsvariabel som används i metoden är den producerade mängden biomassa, en variabel som i vissa länder är föreskriven i lagen. Den definieras som storleken på en mätvariabel för biomassa vid exponeringstidens slut minskad med storleken på samma mätvariabel vid exponeringstidens början. Med hjälp av den producerade mängd biomassa som registrerats i en serie testlösningar bestäms den koncentration som åstadkommer en bestämd procent (x) av tillväxthämning, t.ex. 50 %. Denna koncentration betecknas som EyCx, t.ex. EyC50 i fallet 50 %.

Utöver detta kan man statistiskt bestämma den lägsta koncentrationen med observerad effekt (LOEC) och koncentrationen utan observerad effekt (NOEC).

1.4 TESTSUBSTANS

Man bör ha tillgång till en analysmetod som är tillräckligt känslig för kvantitetsbestämning av testsubstansen i testmediet.

Bland annat följande uppgifter om testsubstansen kan vara av värde när man fastställer testbetingelserna: strukturformel, renhetsgrad, vattenlöslighet, stabilitet i vatten och ljus, pKa, Kow, ångtryck och biologisk nedbrytbarhet. Löslighet i vatten och ångtryck kan användas för att beräkna Henrys konstant. Storleken på denna konstant visar om det är sannolikt att förlusterna av testsubstansen under tiden för testets genomförande kommer att vara betydande, och om man behöver vidta åtgärder för att behärska dessa förluster. Om uppgifterna om testsubstansens löslighet och stabilitet är osäkra, bör man bedöma dessa egenskaper under testbetingelserna, dvs. i det odlingsmedium, vid den temperatur och under de belysningsförhållanden som används i testet.

När det är särskilt viktigt att reglera testmediets pH, t.ex. vid test av hydrolytiskt instabila metaller eller substanser (dvs. sådana som bryts ned i vatten), bör man tillsätta en buffert i odlingsmediet (se första stycket i avsnitt 1.7.4). Ytterligare vägledning för test av substanser med fysikalisk-kemiska egenskaper som gör dem besvärliga att testa finns i (11).

1.5 REFERENSSUBSTANS

En eller flera referenssubstanser – t.ex. 3,5-diklorfenol som används i det internationella ringtestet (10) – bör testas för att kontrollera testresultatens giltighet. En referenssubstans bör testas minst två gånger per år. Om testen utförs mer sällan bör referenssubstansen testas direkt i samband med respektive test.

1.6 KRITERIER FÖR TESTRESULTATENS GILTIGHET

För att testresultaten ska vara giltiga måste fördubblingstiden för frondantalet i kontrollen vara mindre än 2,5 dagar (60 timmar). Det motsvarar en ökning på ca 700 % på 7 dagar och en genomsnittlig specifik tillväxthastighet på 0,275 d–1. Med de testmedier och testbetingelser som beskrivs för den aktuella metoden kan detta kriterium uppfyllas med statiskt testförfarande (8). Kriteriet bör också kunna uppfyllas vid semistatiskt testförfarande och genomflödestest. Beräkningen av fördubblingstiden beskrivs i avsnitt 2.1.

1.7 METODBESKRIVNING

1.7.1 Utrustning

All utrustning som befinner sig i kontakt med testmedier ska vara av glas eller annat kemiskt inert material. Glasutrustning, som används för odling och test, ska vara rengjord från kemiska föroreningar som kan läcka in i testmediet, och glaset ska vara sterilt. Provkärlen ska vara så vida att fronderna från de olika kolonierna i kontrollerna kan växa utan att de täcker varandra i slutet av testet. Det gör inget om rötterna vidrör botten av provkärlen, men alla provkärl bör vara minst 20 mm djupa och ha en volym på minst 100 ml. Så länge dessa krav är uppfyllda har valet av provkärl ingen avgörande betydelse. Glasbägare och kristalliseringsskålar samt Petriskålar av glas – alla med passande storlekar – har alla visat sig vara lämpliga. Provkärlen måste vara tillslutna för att avdunstning och oavsiktlig kontamination ska hållas så låg som möjlig, samtidigt som erforderlig luftväxling ska vara möjlig. Provkärlen – framför allt lock, proppar eller andra typer av förslutningar – måste vara sådana att det inte förekommer någon skuggverkan eller förändringar av ljusets spektrala egenskaper.

Odlingar och provkärl får inte förvaras tillsammans. Bäst är att använda separata klimatkammare, inkubatorer eller klimatrum. Belysning och temperatur måste kunna regleras och hållas på konstant nivå (se avsnitt 1.7.8).

1.7.2 Testorganism

Som organism för testet används Lemna gibba eller Lemna minor. Tillägg 1 innehåller kortfattade beskrivningar av andmatsarter som har använts för toxicitetstest. Växtmaterial kan tas från en kultursamling, införskaffas från ett annat laboratorium eller samlas in i naturen. Plantor som samlas in i naturen ska under minst 8 veckor hållas i samma medium som används för testet. Det får inte finnas några uppenbara kontaminationskällor på platser som används för insamling i naturen. Växtmaterial som införskaffas från andra laboratorier eller från kultursamlingar ska förvaras under minst 3 veckor på samma sätt som för plantor från naturen. Man ska alltid redovisa ursprunget – om det är känt – för växtmaterialet, de arter och den klon som används för testet.

Man ska använda monokulturer utan synliga föroreningar i form av andra organismer såsom alger och protozoer. Friska plantor av L. minor består av kolonier med 2–5 fronder, medan friska kolonier av L. gibba kan omfatta upp till 7 fronder.

Kvaliteten och enhetligheten hos plantorna som används för testet har ett stort inflytande på testresultatet, och de bör därför väljas ut med omsorg. Unga, snabbväxande plantor utan synliga skador eller missfärgningar (på grund av kloros) ska användas. Att en kultur är högvärdig syns på att den har en stor andel kolonier med minst 2 fronder. Ett stort antal enstaka fronder är ett tecken på miljöstress, t.ex. på grund av näringsbrist. Använd inte växtmaterial från sådana kulturer för test.

1.7.3 Odling

För att göra odlingen mindre arbetskrävande – t.ex. när inga test av Lemna är inplanerade under en längre tid – kan kulturerna förvaras under reducerad belysning och temperatur (4–10 °C). Närmare uppgifter om detta och andra uppgifter om behandling av stamkulturer finns i tillägg 2. Om det märks tydliga tecken på föroreningar i form av alger eller andra organismer krävs ytsterilisering av ett delprov av fronder från Lemna. Det förs sedan över till färskt medium (se tillägg 2). I detta fall måste den återstående delen av den kontaminerade kulturen kasseras.

Minst 7 dagar före testet förs en tillräcklig mängd kolonier aseptiskt över till färskt medium och odlas under 7–10 dagar under testbetingelser.

1.7.4 Testmedier

För Lemna minor och Lemna gibba, rekommenderas olika medier (se nedan). Man bör noggrant överväga om man ska tillsätta en pH-buffert i testmediet: MOPS [(4-morfolino)propansulfonsyra, CAS-nr 1132–61–2; Einecs-nr 214–478–5] i mediet för L. minor och NaHCO3 i mediet för L. gibba när man misstänker att mediet kan reagera med testsubstansen och påverka dess toxicitetseffekt. Steinbergs medium (12) kan också användas förutsatt att kriterierna för testresultatens giltighet är uppfyllda.

En modifierad form av det odlingsmedium för Lemna som är standardiserat av det svenska standardiseringsorganet SIS rekommenderas för odling och test med L. minor. Sammansättningen av detta medium återfinns i tillägg 3.

Odlingsmediet 20X-AAP, som beskrivs i tillägg 3, rekommenderas för odling och test med L. gibba.

Steinbergs medium, som beskrivs i tillägg 3, passar också för L. minor men kan också användas för L. gibba så länge kriterierna för testresultatens giltighet är uppfyllda.

1.7.5 Testlösningar

Testlösningarna bereds vanligtvis genom utspädning av en stamlösning. Stamlösningar av testsubstansen bereds normalt genom att substansen löses i ett odlingsmedium.

Den högsta koncentrationen av testsubstansen bör normalt inte överskrida dess vattenlöslighet under testbetingelserna. Observera dock att Lemna spp. flyter på vätskeytan och kan exponeras för substanser som samlas i gränsytan mellan vatten och luft, t.ex. hydrofoba substanser och substanser med låg vattenlöslighet. Under sådana omständigheter kommer plantan att exponeras för andra koncentrationer av substansen än de som förekommer i lösningen. Koncentrationerna kan därför – beroende på testsubstansens egenskaper – överskrida vattenlösligheten. För testsubstanser med låg vattenlöslighet kan det bli nödvändigt att bereda en koncentrerad stamlösning eller en dispersion med hjälp av ett organiskt lösningsmedel eller dispergeringsmedel för att underlätta tillsatsen av exakta mängder testsubstans i testmediet och bidra till dispergeringen och upplösningen av substansen. Man ska därför så långt som möjligt undvika att använda sådana substanser. Det får inte uppstå fytotoxicitet genom att man tvingas använda lösnings- eller dispergeringsmedel för att bereda testlösningen. Exempel på vanliga lösningsmedel, som inte förorsakar fytotoxicitet vid koncentrationer upp till 100 μl/l, är aceton och dimetylformamid. Om ett lösnings- eller dispergeringsmedel används, bör dess slutkoncentration redovisas och hållas så låg som möjligt (≤ 100 μl/l). Alla test- och kontrollösningar bör ha samma koncentration av lösnings- eller dispergeringsmedel. Mer information om användningen av dispergeringsmedel finns i (11).

1.7.6 Test- och kontrollgrupper

Förkunskap om testsubstansens toxicitet för Lemna, t.ex. erhållen genom ett förberedande test av koncentrationsintervallet för toxiciteten, underlättar valet av lämpliga testkoncentrationer. I det slutliga toxicitetstestet ska det normalt finnas minst 5 koncentrationer ordnade i geometrisk serie. Separationsfaktorn mellan testkoncentrationerna bör inte överskrida 3,2, men om dos-respons-kurvan är flack, kan en större separationsfaktor användas. Om färre än 5 koncentrationer används ska en motivering lämnas. Minst 3 replikat ska användas för respektive testkoncentration.

När man fastställer intervallet av testkoncentrationer (för det förberedande testet eller för det slutliga toxicitetstestet), ska man beakta följande:

I varje test ska ingå kontroller med samma näringsmedium, frondantal, antal kolonier, miljöbetingelser och förfaranden som för provkärlen, men utan testsubstans. Om ett lösnings- eller dispergeringsmedel används som hjälpmedel i testet, krävs ytterligare ett kontrollprov, nu med samma koncentration av lösnings- eller dispergeringsmedlet som i provkärlen med testsubstansen. Antalet replikatkärl med kontroller – och i tillämpliga fall kärl med lösnings- eller dispergeringsmedel – ska vara minst lika med – eller helst dubbelt så många som – antalet kärl som används för respektive testkoncentration.

Om NOEC inte behöver bestämmas, får testförfarandet modifieras genom att öka antalet koncentrationer och minska antalet replikat per koncentration. Antalet kontrollreplikat måste dock vara minst tre.

1.7.7 Exponering

Kolonier med 2–4 synliga fronder förs över från ympkulturen och fördelas slumpmässigt i provkärlen under aseptiska förhållanden. Alla provkärl ska vardera innehålla sammanlagt 9–12 fronder. Antalet fronder och kolonier ska vara detsamma i alla provkärl. Erfarenheter från användning av denna metod och resultat från ringtest har visat att 3 replikat per testlösning (testkoncentration), där alla replikat från början innehåller 9–12 fronder, är tillräckligt för att man ska upptäcka skillnader i tillväxt mellan testlösningarna på cirka 4–7 procents tillväxthämning (beräknad enligt tillväxthastighet) och 10–15 procents tillväxthämning (beräknad enligt producerad mängd biomassa) (10).

Provkärlen måste placeras slumpmässigt i inkubatorn för att minimera inflytandet av rumsbetingade skillnader i ljusintensitet och temperatur. Det krävs också blockvis fördelning eller slumpmässig omplacering av kärlen vid varje mättillfälle, eller oftare.

Om ett förberedande stabilitetstest visar att koncentrationen av testsubstansen inte kan upprätthållas under tiden för testets genomförande (7 dagar) – dvs. den uppmätta koncentrationen sjunker under 80 % av det uppmätta startvärdet – bör semistatiskt testförfarande användas. I det fallet exponeras kolonierna för nyberedda test- och kontrollösningar vid minst 2 tillfällen under testet, t.ex. på dag 3 och 5. Intervallen för byte till färskt medium beror på stabiliteten hos testsubstansen – det kan krävas kortare intervall för att upprätthålla nära nog konstanta koncentrationer av mycket instabila eller flyktiga substanser. I visa fall måste man använda genomflödestest (se 11 och 13).

Exponering genom besprutning av fronderna ingår inte i denna testmetod. Besprutningsmetoden beskrivs i 14.

1.7.8 Inkubationsbetingelser

Kontinuerlig belysning med varmt eller kallt vitt ljus från lysrör används för att åstadkomma en ljusintensitet i intervallet 85–135 μE·m–2·s–1, varvid intensiteten ska mätas inom ett fotosyntetiskt aktivt våglängdsområde (400–700 nm) i punkter på samma avstånd från ljuskällan som Lemna-fronderna (denna intensitet motsvarar en belysningsstyrka på 6 500–10 000 lux). Ljusintensiteten får inte variera mer än ± 15 % över testytan. Metoden för detektering och mätning av ljuset – framför allt typen av ljussensor – påverkar mätvärdet. Sfäriska sensorer – som mäter ljuset från alla vinklar ovanför och under mätplanet – och sensorer av solsensortyp (med cosinuskoefficient för infallsvinkeln) – som mäter ljuset från alla vinklar ovanför mätplanet – är att föredra framför riktade sensorer. De förstnämnda sensorerna ger större mätutslag för en diffus ljuskälla av den typ som beskrivits här.

Temperaturen i provkärlen ska vara 24 ±2 °C. pH i kontrollmediet får inte öka mer än 1,5 under testets gång. En avvikelse på mer än 1,5 gör dock inte testresultaten ogiltiga om det kan visas att kriterierna för testresultatens giltighet är uppfyllda. I speciella fall – t.ex. vid test av instabila substanser eller metaller – måste förskjutningen av pH kontrolleras extra noggrant. Se vidare (11).

1.7.9 Tid för testets genomförande

Testet ska avslutas 7 dagar efter det att plantorna har placerats i provkärlen.

1.7.10 Mätningar och analytiska bestämningar

Räkna och registrera frondantalet i provkärlen vid testets början. Se noga till att ta med alla uppstickande, väl synliga fronder. Bestäm antalet fronder – både sådana som framstår som normala och sådana som framstår som onormala – vid början av testet och därefter minst var tredje dag under exponeringstiden (dvs. vid minst 2 tillfällen under 7-dagarsperioden), samt vid slutet av testet. Registrera förändringar i plantutvecklingen. Det kan t.ex. gälla frondstorlek; utseende; tecken på nekros, kloros eller svullna fronder; kollaps av kolonier eller försämrad flytförmåga; rötternas längd och utseende. Registrera också betydelsefulla inslag i testmediet, t.ex. förekomst av oupplöst material och algtillväxt i provkärlet.

Utöver bestämningar av frondantalet under testet ska de effekter testsubstansen har på en eller flera av följande mätvariabler bestämmas:

Fördelen med variabeln ”total frondarea” är att den kan bestämmas för alla prov- och kontrollkärl vid början, under och vid slutet av testet. Torr- eller färskvikt måste bestämmas vid början av testet med hjälp av ett prov från ympkulturen som är representativt för vad som används för att starta testet, och vid slutet av testet med hjälp av växtmaterial från alla prov- och kontrollkärl. Om frondarean inte bestäms, är mätning av torrvikten att föredra framför mätning av färskvikten.

Total frondarea, torrvikt och färskvikt kan bestämmas på följande sätt:

1.7.10.1 Mätfrekvens och analytiska bestämningar

Vid statiskt testförfarande mäts pH i alla testlösningar (testkoncentrationer) vid början och slutet av testet. Vid semistatiskt testförfarande mäts pH i varje färsk testlösning och motsvarande förbrukade lösning.

Ljusintensiteten ska mätas i klimatkammaren, inkubatorn eller klimatrummet i punkter på samma avstånd från ljuskällan som Lemna-fronderna har. Mätningar ska göras minst 1 gång under testets genomförande. Temperaturen hos mediet i ett särskilt kärl med enbart testmedium, som hålls under samma betingelser i klimatkammaren, inkubatorn eller klimatrummet, ska registreras minst 1 gång per dag.

Under testets gång bestäms koncentrationerna av testsubstansen med lämpliga intervall. Vid statiskt testförfarande är minimikravet att koncentrationerna ska bestämmas vid början och slutet av testet.

Om man vid semistatiskt testförfarande bedömer att koncentrationen av testsubstansen inte kommer att ligga kvar inom ± 20 % av den nominella koncentrationen, måste man analysera alla nyberedda testlösningar liksom alla förbrukade lösningar efter byte till ny färsk lösning (se tredje stycket i avsnitt 1.7.7). För test, där den uppmätta startkoncentrationen av testsubstansen inte ligger inom ± 20 % av det nominella värdet – dvs. det värde som bestäms vid beredningen – men där det på ett tillfredsställande sätt kan påvisas att startkoncentrationerna är repeterbara och stabila – dvs. att de ligger inom intervallet 80–120 % av startkoncentrationen – räcker det med att kemiska bestämningar utförs enbart för de högsta och lägsta testkoncentrationerna. I samtliga fall behöver bestämning av testsubstansens koncentrationer före byte till färsk testlösning bara utföras på ett enda replikatkärl för varje testkoncentration (eller på det samlade innehållet från samtliga replikat för respektive testkoncentration).

Vid genomflödestest kan man använda ett liknande förfarande som vid semistatiskt testförfarande – inklusive analys vid början, halvvägs igenom testet och vid slutet av testet – men i detta fall har mätning av förbrukade lösningar inte relevans. Vid genomflödestest ska daglig kontroll göras av flödeshastigheten hos spädningsmedlet och testsubstansen, eller stamlösningen av testsubstansen.

Om man kan påvisa att koncentrationen av testsubstansen under hela testets gång på ett tillfredsställande sätt har hållit sig inom ± 20 % av den nominella eller uppmätta startkoncentrationen, kan analysen av resultaten baseras på nominella eller uppmätta startvärden. Om avvikelsen från den nominella eller uppmätta startkoncentrationen är större än ± 20 %, ska analysen av resultaten baseras på det geometriska medelvärdet av koncentrationen under exponeringen, eller på modeller som beskriver den avtagande koncentrationen av testsubstansen (11).

1.7.11 Gränstest

Under vissa omständigheter – t.ex. när ett förberedande test tyder på att testsubstansen inte har några toxiska effekter vid koncentrationer upp till 100 mg/l – eller upp till dess löslighetsgräns i testmediet om den gränsen är lägre – kan man utföra ett gränstest. Man jämför då responsen mellan en kontrollgrupp och en testgrupp (med en koncentration på 100 mg/l eller lika med löslighetsgränsen). Jämförelsen måste underbyggas med en analys av exponeringskoncentrationen, dvs. den verkliga koncentrationen som kan variera över tiden för testets genomförande. Det gör man för att se till att den nominella koncentrationen är lika med den faktiska testkoncentrationen. Alla testbetingelser samt kriterier för testresultatens giltighet som beskrivits tidigare gäller även för gränstest, med undantaget att antalet testreplikat ska vara dubbelt så stort. Tillväxten i kontrollgruppen och testgruppen kan analyseras med en statistisk metod för jämförelse av medelvärden, t.ex. t-test (”Students t-test”).

2. BERÄKNINGAR OCH STATISTISKA METODER

2.1 FÖRDUBBLINGSTID

Fördubblingstiden (Td) för frondantalet är ett kriterium på testresultatens giltighet (se avsnitt 1.6). Den bestäms med hjälp av värdet på den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten i kontrollkärlen (μ):

Td = ln 2/μ

Bestämningen av μ beskrivs i första och andra styckena i avsnitt 2.2.1 nedan.

2.2 RESPONSVARIABLER

Syftet med testet är att bestämma testsubstansens effekter på tillväxten av Lemna. Två responsvariabler används eftersom lagbestämmelser och etablerade variabler skiljer sig åt mellan medlemsstaterna. För att testresultaten ska kunna godtas i samtliga medlemsstater ska effekterna bedömas med hjälp av båda de responsvariabler (a och b) som beskrivs nedan.

Observera att de värden på toxiciteten som beräknas med hjälp av dessa två responsvariabler inte är jämförbara, och man måste ha denna skillnad i åtanke när man använder resultaten från testet. ECx-värden som grundar sig på den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten (ErCx) är i allmänhet högre än de som grundar sig på den producerade mängden biomassa (EyCx) om de föreskrivna testbetingelserna är uppfyllda. Detta ska inte tolkas som en skillnad i mätkänslighet mellan de två responsvariablerna – skillnaden beror bara på att värdena erhållits på två olika sätt. Responsvariabeln ”genomsnittlig specifik tillväxthastighet” grundar sig på den allmänna exponentiella tillväxtutvecklingen hos andmat i obegränsade kulturer, där toxiciteten bestäms på basis av testsubstansens inverkan på tillväxthastigheten, oberoende av den absoluta nivån på den specifika tillväxthastigheten i kontrollen, responskurvans lutning och tiden för testets genomförande. Responsvariabeln ”producerad mängd biomassa” är däremot beroende av alla de tre sistnämnda variablerna. EyCx är beroende både av den specifika tillväxthastigheten hos de andmatsarter som används i de enskilda testen och av den maximala specifika tillväxthastigheten, som kan variera mellan olika arter, och till och med mellan olika kloner. Responsvariabeln ”producerad mängd biomassa” får inte användas för jämförelser av känsligheten för toxiska substanser mellan olika andmatsarter, inte ens mellan olika kloner. Ur vetenskaplig synpunkt är värdet på den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten att föredra för bestämning av toxiciteten. Toxicitetsbestämning med hjälp av värdet på producerad mängd biomassa har tagits med i testmetoden för att tillgodose vissa länders nuvarande lagstiftningskrav.

Toxiciteten bestäms med hjälp av två tillväxtvariabler: 1) frondantal, och 2) total frondarea, torrvikt eller färskvikt. Att två variabler används beror på att vissa substanser kan ha mycket större effekt på andra mätvariabler än på frondantalet. Om man bara höll sig till frondantalet skulle man inte märka detta förhållande.

Frondantal samt övriga registrerade mätvariabler för respektive mättillfälle – t.ex. total frondarea, torrvikt eller färskvikt – förs in i en tabell tillsammans med koncentrationerna av testsubstansen. De efterföljande beräkningarna, för att bestämma t.ex. LOEC, NOEC eller ECx, ska grundas på värdena för de enskilda replikaten, inte på beräknade medelvärden för respektive testgrupp.

2.2.1 Genomsnittlig specifik tillväxthastighet

Den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten för en given tidsperiod beräknas som den logaritmiska ökningen av två tillväxtvariabler: frondantal och ytterligare en variabel (total frondarea, torrvikt eller färskvikt). Använd nedanstående formel för alla replikat av kontroll- och testlösningar:

där:

Beräkna ett medelvärde av tillväxthastigheten för varje testgrupp och kontrollgrupp tillsammans med variansskattningar.

Den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten ska beräknas för hela tiden för testets genomförande – ”i” i formeln betecknar början av tiden för testets genomförande, och ”j” slutet. Beräkna ett medelvärde av den genomsnittliga tillväxthastigheten för varje testkoncentration och kontrollgrupp tillsammans med variansskattningar. Bestäm dessutom tillväxthastigheten för flera intervall av exponeringstiden för att kunna bedöma testsubstansens tidsberoende effekt, t.ex. genom analys av logaritmiska tillväxtkurvor. Stora skillnader mellan tillväxthastigheten i respektive intervall och genomsnittsvärdet tyder på en avvikelse från exponentiell tillväxt, och att tillväxtkurvorna måste studeras närmare. Vid en konservativ bedömning kan man i detta fall jämföra testlösningarnas specifika tillväxthastigheter under det tidsintervall som har den största tillväxthämningen med tillväxthastigheterna för kontrollerna under samma tidsintervall.

Den procentuella tillväxthämningen (Ir) beräknas sedan för varje testkoncentration (testgrupp) med formeln

där:

2.2.2 Producerad mängd biomassa

Effekterna på den producerade mängden biomassa bestäms med hjälp av två mätvariabler, varav den ena är frondantalet, och den andra någon av variablerna total frondarea, torrvikt eller färskvikt. Mätningarna görs vid början och slutet av testet. För torrvikt och färskvikt bestäms den initiala biomassan med hjälp av ett prov bestående av fronder från samma kultur som används för att ympa provkärlen (se andra stycket i avsnitt 1.7.3). Beräkna ett medelvärde av den producerade mängden biomassa för varje testkoncentration och kontroll tillsammans med variansskattningar. Den genomsnittliga procentuella reduktionen av den producerade mängden biomassa (% Iy) beräknas för varje testgrupp med formeln

där:

2.2.3 Plottning av dos-respons-kurvor

Dos-respons-kurvor ska plottas med den genomsnittliga procentuella hämningen av responsvariabeln (Ir eller Iy) längs y-axeln och logaritmen av testsubstansens koncentration längs x-axeln. (Ir och Iy beräknas enligt avsnitt 2.2.1 respektive 2.2.2 ovan.)

2.2.4 Bestämning av ECx

Bestämningar av ECx – t.ex. EC50 – ska baseras både på genomsnittlig specifik tillväxthastighet (ErCx) och på producerad mängd biomassa (EyCx). De sistnämnda två responsvariablerna ska i sin tur bestämmas med hjälp av frondantal och en ytterligare mätvariabel (total frondarea, torrvikt eller färskvikt). Orsaken till att man ska använda två mätvariabler är att det finns testsubstanser vars inverkan på frondantalet skiljer sig åt från inverkan på andra mätvariabler. Toxicitetsparametrarna bör därför vara 4 ECx-värden för varje beräknad tillväxthämningsnivå x: ErCx (frondantal), ErCx (total frondarea, torrvikt eller färskvikt), EyCx (frondantal) samt EyCx (total frondarea, torrvikt eller färskvikt).

2.3 STATISTISK BEHANDLING

Målet är att bestämma det kvantitativa förhållandet mellan koncentration och respons med hjälp av regressionsanalys. Man kan använda viktad linjär regression efter att ha gjort en linjär transformation av responsdata, t.ex. till probit-, logit- eller Weibullvärden (16). Icke-linjära regressionsmetoder är dock att föredra, eftersom de är bättre anpassade för att hantera sådana oregelbundenheter i data som inte går att undvika, liksom de hanterar avvikelser från jämna fördelningskurvor bättre. I närheten av nollpunkten (ingen tillväxthämning) och fullständig tillväxthämning kan sådana oregelbundenheter bli felaktigt uppförstorade genom lineariseringen och därigenom störa analysen (16). Observera att standardmetoder för analys med probit-, logit- eller Weibulltransformationer är avsedda för dikotoma data (dvs. tvåpunktsfördelade data, t.ex. dödlighet–överlevnad) och därför måste modifieras för att kunna användas för data om tillväxthastighet eller producerad mängd biomassa. Speciella metoder för bestämning av ECx-värden ur kontinuerliga data återfinns i (17), (18) och (19).

För varje analyserad responsvariabel används förhållandet mellan koncentration och responsvärde för att beräkna punktskattningar av ECx-värden. Om möjligt ska det 95-procentiga konfidensintervallet bestämmas för varje skattning. Anpassningsgraden (”goodness of fit”) mellan responsdata och regressionsmodellen ska bestämmas, antingen grafiskt eller statistiskt. Regressionsanalys ska göras på responsvärden från enskilda replikat, inte på medelvärden från testgrupper.

När tillgängliga regressionsmodeller eller regressionsmetoder inte lämpar sig för de aktuella dataserierna kan skattningar av EC50-värden och konfidensintervall också bestämmas genom linjär interpolation och bootstrap (20).

För skattning av LOEC (och därmed även av NOEC) jämförs medelvärden från testlösningarna med hjälp av variansanalysmetoder (ANOVA). Medelvärdet för respektive koncentration jämförs sedan med medelvärdet av kontrollvärdena med hjälp av en passande metod för multipeljämförelse eller trendtest, t.ex. Dunnetts eller Williams test (21, 22, 23 och 24). Man måste avgöra om ANOVA-antagandet om varianshomogenitet är uppfyllt. Det kan göras grafiskt eller med ett etablerat test (25), t.ex. Levenes eller Bartletts test. Skulle antagandet inte vara uppfyllt kan man ibland korrigera för detta genom logaritmisk transformation av data. Om heterogeniteten i variansen är extremt stor och inte kan korrigeras genom transformation, ska man överväga användning av analys med metoder som t.ex. Jonckheeres trendtest av ”step-down”-typ. Mer information om bestämning av NOEC finns i (19).

Nya forskningsrön har lett till att man avråder från användning av NOEC-värdet. Det ska ersättas med punktskattningar av ECx baserade på regressionsanalys. För detta Lemna-test har ännu inget passande värde på x fastställts. Ett intervall på 10–20 % förefaller dock vara lämpligt, beroende på vilken responsvariabel som används. Både EC10 och EC20 bör redovisas.

3. REDOVISNING

3.1 TESTRAPPORT

Testrapporten ska innehålla följande uppgifter:

Testsubstans:

Testarter:

Testbetingelser:

Resultat:

4. LITTERATUR

Guidance on information requirements and chemical safety assessment – Chapter R.7b: Endpoint specific guidance; Table 7.8.3 Summary of difficult substance testing issues. Se

ASTM International (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415–91 (Förnyat godkännande 1998). s. 733–742. Återfinns i Annual Book of ASTM Standards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA, USA.

Environment Canada (1999). Biological Test Method: Test for Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte, Lemna minor. EPS 1/RM/37–120 s.

Environment Canada (1993). Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145.

Sims I., Whitehouse P. och Lacey R. (1999). The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc – Environment Agency.

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.

ISO DIS 20079. Water Quality – Determination of the Toxic Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed (Lemna minor) – Duckweed Growth Inhibition Test.

Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with duckweed (Lemna minor L.). Environmental Research Laboratory – Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA-600/3–77 108. September 1977.

Lockhart W. L., Billeck B. N. och Baron C. L. (1989). Bioassays with a floating plant (Lemna minor) for effects of sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, s. 353–359.

Huebert, D.B. och Shay J.M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, s. 481–483.

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. och Christensen, E.R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, s. 157–167.

Bruce R.D. och Versteeg D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, s. 1485–1494.

OECD (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of Ecotoxicity Data.

Norberg-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05–88. USEPA, Duluth, MN, USA.

Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, s. 1096–1121.

Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482–491.

Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27, s. 103–117.

Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28, s. 510–531.

Brain P. och Cousens R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, s. 93–96.

Tillägg 1

Beskrivning av Lemna spp.

Den vattenväxt som i allmänt språkbruk kallas andmat – Lemna spp. – tillhör familjen Lemnaceae som förekommer över hela världen i ett antal arter av fyra släkten. Deras olika utseenden och taxonomi har beskrivits ingående (1, 2). Lemna gibba och L. minor är arter som är vanliga i tempererade zoner och som ofta används i toxicitetstest. Bägge arterna lever i vatten med flytande eller nedsänkt skivlik stam (frond) utan blad. Från mitten av den undre ytan på varje frond utgår en hårfin rot. Lemna spp. blommar sällan – plantorna förökar sig i stället vegetativt genom avsnörning av fronder (3). I jämförelse med äldre plantor tenderar de yngre att vara blekare, ha kortare rötter och bestå av 2–3 fronder av olika storlek. Egenskaperna hos Lemna – enkel uppbyggnad, vegetativ förökning och kort generationstid – gör plantor av detta släkte mycket lämpliga för laboratorietest (4, 5).

Eftersom känsligheten för toxisk påverkan sannolikt varierar mellan arterna, godtas enbart jämförelser av känsligheten inom en och samma art.

Litteratur – exempel på Lemna-arter som har använts vid test

Lemna aequinoctialis: Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiatavhandling 1996:2. Institutionen för systemekologi, Stockholms universitet.

Lemna major: Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29, s. 935–941.

Lemna minor: United States Environmental Protection Agency (USEPA) (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., ”Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8 s.

Association Française de Normalisation (AFNOR) (1996). XP T 90–337: Détermination de l’inhibition de la croissance de Lemna minor. 10 s.

SIS – Svenska standardiseringsinstitutet (1995). Vattenundersökningar – Bestämning av tillväxthämning (7 dygn) hos flytbladsväxten Lemna minor, andmat. SS 02 82 13. 15 s.

Lemna gibba: ASTM International (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415–91 (Förnyat godkännande 1998). S. 733–742.

United States Environmental Protection Agency (USEPA) (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., ”Public draft”. EPA 712-C-96–156. 8 s.

Lemna paucicostata: Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981). Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10, s. 1959–1969.

Lemna perpusilla: Clark, J. R. m.fl. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5, s. 87–96.

Lemna trisulca: Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12, s. 481–483.

Lemna valdiviana: Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19, s. 2102–2111.

Lemna-arter för test kan erhållas från följande institutioner:

University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria Department of Botany, University of Toronto Toronto, Ontario, KANADA, M5S 3 B2 Tfn +1 4169783641 Fax +1 4169785878 E-post: jacreman@botany.utoronto.ca Internet: http://www.botany.utoronto.ca/utcc

North Carolina State University Forestry Dept Duckweed Culture Collection Campus Box 8002 Raleigh, NC 27695–8002 FÖRENTA STATERNA Tfn +1 9195157572 E-post: astomp@unity.ncsu.edu

Institutionen före tillämpad miljövetenskap (ITM) Stockholms universitet SE-106 91 Stockholm SVERIGE Tfn +46 86747240 Fax +46 86747636

Federal Environmental Agency (UBA) FG III 3.4 Schichauweg 58 12307 Berlin TYSKLAND E-post: lemna@uba.de Internet: http://www.umweltbundesamt.de/contact.htm

Litteratur

1. Hillman, W.S. (1961). The Lemnaceae or duckweeds: A review of the descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27, s. 221–287.

2. Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed (Lemnaceae). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, Schweiz.

3. Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utilization of duckweeds (Lemnaceae family). ISBN 82-991150-0-0. Norges lantbruksvetenskapliga forskningsråd, Universitetet i Oslo.

4. Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11, s. 1–14.