KOMMISSIONENS DIREKTIV 1999/27/EG

av den 20 april 1999

om fastställande av gemenskapsmetoder för analys av amprolium, diclazuril och karbadox i djurfoder och om ändring av kommissionens direktiv 71/250/EEG, 73/46/EEG och om upphävande av direktiv 74/203/EEG

(Text av betydelse för EES)

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIV

med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen,

med beaktande av rådets direktiv 70/373/EEG av den 20 juli 1970 om införande av gemenskapsmetoder för provtagning och analys vid den officiella foderkontrollen(1), senast ändrat genom anslutningsakten för Österrike, Finland och Sverige, särsilt artikel 2 i detta, och

av följande skäl:

(1) I direktiv 70/373/EEG fastställs att den officiella foderkontrollen skall genomföras enligt gemenskapsmetoderna för analys och provtagning när det gäller att konstatera om de villkor som är fastställda i lagar och andra författningar om djurfoders beskaffenhet och sammansättning följs.

(2) I rådets direktiv 70/524/EEG av den 23 november 1970 om fodertillsatser(2), senast ändrat genom kommissionens förordning (EG) nr 45/1999(3), föreskrivs för övrigt att halten av amprolium och diclazuril skall anges i märkningen om dessa ämnen sätts till foderblandningar. Godkännandet av karbadox som fodertillsats har återkallats genom kommissionens förordning 2788/98 av den 22 december 1998 om ändring av rådets direktiv 70/524/EEG om fodertillsatser när det gäller indragning av godkännande för vissa tillväxtbefrämjande medel(4). Det är nödvändigt att utföra officiell kontroll av eventuellt olagligt bruk av förbjudna ämnen.

(3) Det bör upprättas analysmetoder i gemenskapen för kontroll av dessa ämnen.

(4) I kommissionens första direktiv 71/250/EEG av den 15 juni 1971 om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen(5), senast ändrat genom kommissionens direktiv 98/54/EG(6) fastställs analysmetoder för bland annat bestämning av senapsolja och teobromin. De beskrivna metoderna uppfyller inte längre sitt syfte mot bakgrund av nya vetenskapliga och tekniska rön. Dessa metoder bör därför utgå.

(5) I kommissionens fjärde direktiv 73/46/EEG av den 5 december 1972 om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen(7), senast ändrat genom kommissionens direktiv 98/54/EG fastställs analysmetoder för bland annat bestämning av retinol (A-vitamin). Den beskrivna metoden uppfyller inte längre sitt syfte mot bakgrund av nya vetenskapliga och tekniska rön. Denna metod bör därför utgå beträffande retinol.

(6) I kommissionens femte direktiv 74/203/EEG av den 25 mars 1974 om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen(8), ändrat genom direktiv 81/680/EEG(9), fastställs analysmetoder för bestämning av stärkelse och nedbrytningsprodukter av stärkelse med hög molekylvikt i foder som innehåller betsnitsel, betmassa, torkad betblast eller torkade betblad, potatismos, torkad jäst, inulinrika produkter eller fettgrevar, amprolium, etopabat, dinitolmid (DOT), nicarbazin och menadion (vitamin K3). Ingen av de beskrivna metoderna i det direktivet uppfyller längre sitt syfte mot bakgrund av nya vetenskapliga och tekniska rön. Detta direktiv bör därför upphävas.

(7) De åtgärder som föreskrivs i detta direktiv är förenliga med yttrandet från Ständiga foderkommittén.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Medlemsstaterna skall kräva att analyserna i samband med den officiella foderkontrollen av halten av amprolium, diclazuril och karbadox skall ske enligt de metoder som beskrivs i bilagan.

Artikel 2

Direktiv 71/250/EEG ändras på följande sätt:

1) I artikel 1 skall "senapsolja" och "teobromin" utgå.

2) Punkterna 8 och 13 i bilagan skall utgå.

Artikel 3

Direktiv 73/46/EEG ändras på följande sätt:

1) Artikel 2 skall utgå.

2) Bilaga II skall utgå.

Artikel 4

Femte direktivet 74/203/EEG skall upphävas.

Artikel 5

Medlemsstaterna skall, senast den 31 oktober 1999, sätta i kraft de lagar och andra bestämmelser som är nödvändiga för att följa detta direktiv. De skall genast underrätta kommissionen om detta.

De skall tillämpa bestämmelserna från och med den 1 november 1999.

När medlemsstaterna antar dessa bestämmelser skall de innehålla en hänvisning till detta direktiv eller åtföljas av en sådan hänvisning när de offentliggörs. Närmare föreskrifter om hur hänvisningen skall göras skall varje medlemsstat själv utfärda.

Artikel 6

Detta direktiv träder i kraft den tjugonde dagen efter det att det har offentliggjorts i Europeiska gemenskapernas officiella tidning.

Artikel 7

Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.

Utfärdat i Bryssel den 20 april 1999.

På kommissionens vägnar

Franz FISCHLER

Ledamot av kommissionen

(1) EGT L 170, 3.8.1970, s. 2.

(2) EGT L 270, 14.12.1970, s. 1.

(3) EGT L 6, 12.1.1999, s. 3.

(4) EGT L 347, 23.12.1998, s. 31.

(5) EGT L 155, 12.7.1971, s. 13.

(6) EGT L 208, 24.7.1998, s. 49.

(7) EGT L 83, 30.3.1973, s. 21.

(8) EGT L 108, 22.4.1974, s. 7.

(9) EGT L 246, 29.8.1981, s. 32.

BILAGA

DEL A

BESTÄMNING AV AMPROLIUM

1-[(4-amino-2-propyl-5-pyrimidylmetyl]-2-metyl-pyridiniumkloridhydroklorid

1. Syfte och räckvidd

Metoden avser bestämning av amprolium i djurfoder och förblandningar. Detektionsgränsen är 1 mg/kg och den undre gränsen för bestämningen 25 mg/kg.

2. Princip

Provet extraheras med en vatten-metanol-blandning. Efter utspädning med den rörliga fasen och membranfiltrering bestäms amproliumhalten genom katjonbytesvätskekromatografi (HPLC) med UV-detektor.

3. Reagens

3.1 Metanol

3.2 Acetonitril, HPLC-kvalitet

3.3 Vatten, HPLC-kvalitet

3.4 Natriumdivätefosfatlösning, c = 0,1 mol/l

Lös 13,80 g natriumdivätefosfatmonohydrat i vatten (3.3) i en 1 l mätkolv, späd till märket med vatten (3.3) och blanda.

3.5 Natriumperkloratlösning, c = 1,6 mol/l

Lös 224,74 g natriumperkloratmonohydrat i vatten (3.3) i en 1 l mätkolv, späd till märket med vatten (3.3) och blanda.

3.6 Rörlig fas för HPLC (se anmärkning 9.1).

En blandning av acetonitril (3.2), natriumdivätefosfatlösning (3.4) och natirumperkloratlösning (3.5), 450 + 450 + 100 (v + v + v). Filtrera före användning lösningen genom ett 0,22 μm membranfilter (4.3) och avlufta den (i ultraljudsbad (4.4) i minst 15 minuter).

3.7 Standardsubstans: rent amprolium, 1-[(4-amino-2-propylpyrimidin-5-yl)metyl]-2-metyl-pyridiniumkloridhydroklorid, E 750 (se punkt 9.2)

3.7.1 Standardlösning av amprolium, 500 μg/ml

Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 50 mg amprolium (3.7) i en 100 ml mätkolv, lös det i 80 ml metanol (3.1) och placera kolven i ett ultraljudsbad i 10 min (4.4). Låt lösningen anta rumstemperatur, fyll upp till märket med vatten och blanda. Lösningen kan lagras i en månad vid högst 4 °C.

3.7.2 Arbetsstandardlösning av amprolium, 50 μg/ml

Pipettera 5,0 ml av lagerstandardlösningen (3.7.1) till en 50 ml mätkolv, fyll till märket med den extraktionslösningen (3.8) och blanda. Lösningen kan lagras i en månad vid högst 4 °C.

3.7.3 Kalibreringslösningar

Överför 0,5, 1,0 och 2,0 ml av arbetsstandardlösningen (3.7.2) till ett antal 50 ml mätkolvar. Fyll till märket med den rörliga fasen (3.6) och blanda. Dessa lösningar motsvarar 0,5, 1,0 respektive 2,0 μg amprolium per ml. Dessa lösningar måste beredas på nytt före varje användning.

3.8 Extraktionslösning

Metanol-vatten-blandning (3.1) 2 + 1 (v + v)

4. Utrustning

4.1 HPLC-utrustning med injektionssystem som lämpar sig för injektionsvolymer på 100 μl

4.1.1 Vätskekromatografikolonn 125 mm x 4 mm, katjonbytare Nucleosil 10 SA, 10 μm packning, eller motsvarande

4.1.2 Variabel UV-detektor eller diodarraydetektor

4.2 Membranfilter, PTFE-material, 0,45 μm

4.3 Membranfilter, 0,22 μm

4.4 Ultraljudsbad

4.5 Mekanisk skakapparat eller magnetomrörare

5. Utförande

5.1 Allmänt

5.1.1 Blindprov

För utbytesförsöket (5.1.2) bör ett blindprov analyseras för kontroll av att varken amprolium eller andra störande ämnen är närvarande. Blindprovet bör vara av samma typ som provet och varken amprolium eller andra störande ämnen skall kunna påvisas i det.

5.1.2 Utbytesförsök

Ett utbytesförsök bör utföras genom en analys av blindprovet tillsatt ("spikat") med en mängd amprolium som motsvarar den i provet. För spikning på nivån 100 mg/kg, sätt 10,0 ml av stamstandardlösningen (3.7.1) till en 250 ml kolv och indunsta till ca 0,5 ml. Tillsätt 50 g av blindprovet, blanda ordentligt, låt stå i tio minuter och rör om igen flera gånger före extraktionen (5.2).

Om ett blindprov av samma typ som provet inte finns att tillgå (se 5.1.1) kan ett utbytestest göras med standardtillsatsmetoden. Denna innebär att det prov som skall analyseras spikas med samma mängd amprolium som finns i provet. Detta prov analyseras tillsammans med det "ospikade" provet och utbytet kan beräknas genom subtraktion.

5.2 Extraktion

5.2.1 Förblandningar (med mindre än 1 % amprolium) och djurfoder

Väg beroende på amproliumhalten in 5-40 g av provet med en noggrannhet på 0,01 g i en 500 ml E-kolv och tillsätt 200 ml extraktionslösning (3.8). Placera kolven i ultraljudsbadet (4.4) i 15 minuter. Ta kolven ur badet och skaka lösningen i 1 timme i skakapparat eller på magnetomrörare (4.5). Späd en del av lösningen med den rörliga fasen (3.6) till en amproliumhalt av 0,5-2 μg/ml och blanda (se iakttagelse 9.3). Filtrera 5-10 ml av den utspädda lösningen genom ett membranfilter (4.2). Gå vidare till HPLC-bestämningen (5.3).

5.2.2 Förblandningar (med minst 1 % amprolium)

Väg beroende på amproliumhalten in 1-4 g av förblandningen med en noggrannhet på 0,001 g i en 500 ml E-kolv och tillsätt 200 ml extraktionslösning (3.8). Placera kolven i ultraljudsbadet i 15 minuter (4.4). Ta kolven ur badet och skaka lösningen i 1 timme i skakapparat eller på magnetomrörare (4.5). Späd en del av lösningen med den rörliga fasen (3.6) till en amproliumhalt av 0,5-2 μg/ml och blanda. Filtrera 5-10 ml av den utspädda lösningen genom ett membranfilter (4.2). Gå vidare till HPLC-bestämningen (5.3).

5.3 HPLC-bestämning

5.3.1 Parametrar:

Följande villkor anges som vägledning; andra förutsättningar kan väljas om de ger motsvarande resultat.

>Plats för tabell>

Kontrollera det kromatografiska systemets stabilitet genom att flera gånger injicera kalibreringslösningen (3.7.3) som innehåller 1,0 μg/ml tills konstanta toppar och retentionstider uppnås.

5.3.2 Kalibreringskurva

Injicera varje kalibreringslösning (3.7.3) flera gånger och bestäm medeltoppareorna för varje koncentration. Konstruera en kalibreringskurva med kalibreringslösningarnas medeltoppareor längs y-axeln och de motsvarande koncentrationerna i μg/ml längs x-axeln.

5.3.3 Provlösning

Injicera provlösningen (5.2) flera gånger med samma mängd som kalibreringslösningarna och bestäm medeltopparean för amproliumtopparna.

6. Resultatberäkning

Använd medeltopparean för provlösningens amproliumtoppar för att bestämma provlösningens koncentration i μg/ml med hjälp av kalibreringskurvan (5.3.2).

Amproliuminnehållet w i mg/kg i provet fås genom följande formel:

>Hänvisning till >

[mg/kg] där

V= extraktionslösningens (3.8) volym i ml enligt 5.2 (dvs. 200 ml)

β= amproliumkoncentration i provlösningen (5.2) i μg/ml

f= spädningsfaktorn enligt 5.2

m= provportionens massa i gram

7. Utvärdering av resultat

7.1 Identitet

Analytens identitet kan bekräftas genom co-kromatografs eller genom användning av en diodarraydetektor med vars hjälp spektret för provextraktet (5.2) och kalibreringslösningen (3.7.3) innehållande 2,0 μg/ml jämförs.

7.1.1 Co-kromatografi

Ett provextrakt (5.2) spikas genom tillsats av en lämplig mängd kalibreringslösning (3.7.3). Mängden tillsatt amprolium bör vara densamma som den mängd amprolium som bestämts i provextraktet.

Endast nivån på amproliumtoppen bör förhöjas efter beaktande av både den tillsatta mängden och spädningen av extraktet. Toppens bredd måste på mitten ligga inom +- 10 % av den ursprungliga bredden på amproliumtoppen i det icke spikade provextraktet.

7.1.2 Diodarraydetektion

Resultaten utvärderas enligt följande kriterier:

a) Våglängden för provets och standardspektrets maximala absorption, noterad vid kromatogrammets toppkurva, skall inte skilja sig inom detektorns upplösning. Vid diodarraydetektion ligger upplösningen vanligen inom +- 2 nm.

b) Mellan 210 och 320 nm skall det provspektrum och det standardspektrum som noterats vid kromatogrammets toppkurva inte skilja sig åt för de delar av spektret som ligger inom 10-100 % av den relativa absorbansen. Detta kriterium är uppfyllt om samma maxima är närvarande och avvikelsen mellan de båda spektren inte vid någon mätpunkt överskrider 15 % av standardanalytens absorbans.

c) Mellan 210 och 320 nm skall den uppåtgående linjen, toppen och den nedåtgående linjen från samma provextrakt inte skilja sig från varandra i de delar av spektret som ligger inom 10-100 % av den relativa absorbansen. Detta kriterium är uppfyllt om samma maxima observeras och avvikelsen mellan de båda spektren inte vid någon mätpunkt överskrider 15 % av standardanalytens absorbans.

Om något av dessa kriterier inte är uppfyllt har närvaro av analyten inte bekräftats.

7.2 Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga

- 15 % i relation till det högre värdet för amproliuminnehåll mellan 25 och 500 mg/kg

- 75 mg/kg för amproliuminnehåll mellan 500 och 1000 mg/kg

- 7,5 % i relation till det högre värdet för amproliuminnehåll för över 1000 mg/kg

7.3 Utbyte

I fråga om spikade (rena) blindprov skall utbytet vara minst 90 %.

8. Resultat av en samordnad undersökning

En samordnad undersökning genomfördes med analys av tre fjäderfäfoder (proverna 1-3), ett mineralfoder (prov 4) och en förblandning (prov 5). Resultaten framgår av följande tabell:

>Plats för tabell>

L: antal laboratorier

n: antal individuella värden

sr: repeterbarhetens standardavvikelse

CVr: repeterbarhetens variationskoefficient

sR: reproducerbarhetens standardavvikelse

CVR: reproducerbarhetens variationskoefficient

9. Anmärkningar

9.1 Om provet innehåller tiamin kommer tiamintoppen i kromatogrammet att ligga strax före amproliumtoppen. Med denna metod måste amprolium och tiamin separeras. Om amprolium och tiamin inte separeras med den kolonn (4.1.1) som används för den här metoden skall upp till 50 % av acetonitrildelen av den rörliga fasen (3.6) ersättas med metanol.

9.2 Enligt den brittiska farmakopén uppvisar amproliumlösningens spektrum (c = 0,02 mol/l) i saltsyra (c = 0,1 mol/l) maxima vid 246 och 262 nm. Absorbansen skall vara 0,84 vid 246 nm och 0,80 vid 262 nm.

9.3 Extraktet måste alltid spädas med den rörliga fasen, i annat fall kan retentionstiden för amproliumtoppen förändras väsentligt på grund av förändringar av jonstyrkan.

DEL B

BESTÄMNING AV DICLAZURIL

(+)-4-klorfenyl-[2,6-dikloro-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-yl)fenyl]acetonitril

1. Syfte och räckvidd

Metoden avser bestämning av diclazuril i djurfoder och förblandningar. Detektionsgränsen är 0,1 mg/kg och den undre gränsen för bestämningen 0,5 mg/kg.

2. Princip

Efter tillsats av den interna standarden skall provet extraheras med surgjord metanol. För djurfoder skall en andel av extraktet renas med en C18-patron för extraktion av den fasta fasen. Diclazuril elueras från patronen med en blandning av surgjord metanol och vatten. Efter indunstning löses återstoden i DMF/vatten. För förblandningar skall extraktet indunstas och återstoden lösas i DMF/vatten. Diclazurilinnehållet bestäms genom en reversed-phase vätskekromatografi (HPLC) med UV-detektor.

3. Reagens

3.1 Vatten, HPLC-kvalitet.

3.2 Ammoniumacetat

3.3 Tetrabutylammoniumvätesulfat (TBHS)

3.4 Acetonitril, HPLC-kvalitet

3.5 Metanol, HPLC-kvalitet

3.6 N,N-dimetylformamid (DMF)

3.7 Saltsyra, ρ20 = 1,19 g/ml

3.8 Standardsubstans: diclazuril II-24: ren (+)-4-klorfenyl-[2,6-dikloro-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-yl)-fenyl]-acetonitril, E771.

3.8.1 Stamstandardlösning av diclazuril, 500 μg/ml.

Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 25 mg av standardsubstansen diclazuril (3.8) i en 50 ml mätkolv. Lös i DMF (3.6), fyll till märket med DMF (3.6) och blanda. Slå in kolven i aluminiumfolie eller använd en kolv av färgat glas. Förvara i kylskåp. Lösningen kan lagras i en månad vid högst 4 °C.

3.8.2 Standardlösning av diclazuril, 50 μg/ml.

Sätt 5,00 ml av lagerstandardlösningen (3.8.1) till en 50 ml mätkolv, fyll till märket med DMF (3.6) och blanda. Slå in kolven i aluminiumfolie eller använd en kolv av färgat glas. Förvara i kylskåp. Lösningen kan lagras i en månad vid högst 4 °C.

3.9 Intern standardsubstans: 2,6-dikloro-α-(4-klorofenyl)-4-(4,5 dihydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazine-2-(3H)-yl)-α-metylbenzen-acetonitril

3.9.1 Intern stamstandardlösning, 500 μg/ml.

Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 25 mg av den interna standardsubstansen (3.9) i en 50 ml mätkolv. Lös i DMF (3.6), fyll till märket med DMF (3.6) och blanda. Slå in kolven i aluminiumfolie eller använd en kolv av färgat glas. Förvara i kylskåp. Lösningen kan lagras i en månad vid högst 4 °C.

3.9.2 Intern standardlösning, 50 μg/ml.

Sätt 5,00 ml av den interna standardlösningen (3.9.1) till en 50 ml mätkolv, fyll till märket med DMF (3.6) och blanda. Slå in kolven i aluminiumfolie eller använd en kolv av färgat glas. Förvara i kylskåp. Lösningen kan lagras i en månad vid högst 4 °C.

3.9.3 Intern standardlösning för förblandningar, p/1000 mg/ml (p = nominell diclazurilhalt i förblandningen i mg/kg)

Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp p/10 mg av den interna standardsubstansen i en 100 ml mätkolv, lös i DMF (3.6) i ett ultraljudsbad (4.6), fyll till märket med DMF och blanda. Slå in kolven i aluminiumfolie eller använd en kolv av färgat glas. Förvara i kylskåp. Lösningen kan lagras i en månad vid högst 4 °C.

3.10 Kalibreringslösning, 2 μg/ml.

Pipettera 2,00 ml diclazurilstandardlösning (3.8.2) och 2,00 ml intern standardlösning (3.9.2) till en 50 ml mätkolv. Tillsätt 16 ml DMF (3.6), fyll till märket med vatten och blanda. Denna lösning måste beredas på nytt före varje användning.

3.11 C18 extraktionspatron för den fasta fasen, t.ex. Bond Elut, storlek: 1 cm3, sorbent: 100 mg.

3.12 Extraktionslösning: surgjord metanol.

Pipettera 5,0 ml saltsyra (3.7) till 1000 ml metanol (3.5) och blanda.

3.13 Rörlig fas för HPLC:

EluentA: ammoniumacetat - tetrabutylammoniumvätesulfatlösning.

3.13.1 Lös 5 g ammoniumacetat (3.2) och 3,4 g TBHS (3.3) i 1000 ml vatten (3.1) och blanda.

3.13.2 Eluent B: acetonitril (3.4)

3.13.3 Eluent C: metanol (3.5)

4. Utrustning

4.1 Mekanisk skakapparat

4.2 Utrustning för tertiary-gradient-HPLC

4.2.1 Kolonn för vätskekromatografi, 100 mm x 4,6 mm, Hypersil ODS, 3 μm packning, eller motsvarande

4.2.2 Variabel UV-detektor eller diodarraydetektor.

4.3 Vakuumrotationsindustare

4.4 Membranfilter, 0,45 μm.

4.5 Vakuumgrenrör

4.6 Ultraljudsbad

5. Utförande

5.1 Allmänt

5.1.1 Blindprov

Ett blindprov bör analyseras för kontroll av att varken diclazuril eller andra störande ämnen är närvarande. Blindprovet bör vara av samma typ som provet och varken diclazuril eller andra störande ämnen skall kunna påvisas i det.

5.1.2 Utbytesförsök

Ett utbytesförsök bör utföras genom en analys av blindprovet tillsatt ("spikat") med en mängd diclazuril som motsvarar den i provet. För spikning på nivån 1 mg/kg, sätt 0,1 ml av stamstandardlösningen (3.8.1) till 50 g av ett blindprov, blanda noga och låt stå i 10 minuter. Blanda sedan flera gånger före vidare hantering.

Om ett blindprov av samma typ som provet inte finns att tillgå (se 5.1.1) kan ett utbytestest göras med standardtillsatsmetoden. Denna innebär att det prov som skall analyseras spikas med samma mängd diclazuril som finns i provet. Detta prov analyseras tillsammans med det "ospikade" provet och utbytet kan beräknas genom subtraktion.

5.2 Extraktion

5.2.1 Djurfoder

Väg med 0,01 g noggrannhet upp ungefär 50 g prov. Överför detta till en 500 ml E-kolv, tillsätt 1,00 ml intern standardlösning (3.9.2) och 200 ml extraktionslösning (3.12) samt tillslut kolven. Skaka blandningen i skakapparaten (4.1) över natt. Låt stå i 10 minuter. Överför 20 ml av supernatanten till ett lämpligt glaskärl och späd med 20 ml vatten. Överför denna lösning till en extraktionspatron (3.11) och låt den gå igenom patronen genom att lägga på vakuum (4.5). Tvätta patronen med 25 ml av en blandning av extraktionslösning (3.12) och vatten, 65 + 35 (V + V). Kasta de uppsamlade fraktionerna och eluera ämnena med 25 ml av en blandning av extraktionslösning (3.12) och vatten, 80 + 20 (V + V). Indunsta med hjälp av en rotationsindunstare (4.3) denna fraktion vid 60 C tills den precis har torkat. Lös återstoden i 1,0 ml DMF (3.6), tillsätt 1,5 ml vatten och blanda. Filtrera genom ett membranfilter (4.4). Gå vidare till HPLC-bestämningen (5.3).

5.2.2 Förblandningar

Väg med 0,001 g noggrannhet upp ungefär 1 g prov. Överför detta till en 500 ml E-kolv, tillsätt 1,00 ml intern standardlösning (3.9.3) och 200 ml extraktionslösning (3.12) samt tillslut kolven. Skaka blandningen i skakapparaten (4.1) över natt. Låt stå i 10 minuter. Överför 10000/p ml (p = den nominella halten av diclazuril i förblandningen i mg/kg) av supernatanten till en rundkolv av lämplig storlek. Indunsta med en rotationsindunstare (4.3) under minskat tryck vid 60 °C tills återstoden precis har torkat. Lös återstoden i 10,0 ml DMF (3.6), tillsätt 15,0 ml vatten (3.1) och blanda. Gå vidare till HPLC-bestämningen (5.3).

5.3 HPLC-bestämning

5.3.1 Parametrar

Följande villkor anges som vägledning; andra förutsättningar kan väljas om de ger motsvarande resultat.

>Plats för tabell>

Kontrollera det kromatografiska systemets stabilitet genom att flera gånger injicera kalibreringslösningen (3.10) som innehåller 2 μg/ml till dess konstanta toppar och retentionstider uppnås.

5.3.2 Kalibreringslösning

Injicera 20 μl av kalibreringslösningen (3.10) flera gånger och bestäm medeltopphöjden (arean) för diclazuril och den interna standarden.

5.3.3 Provlösning

Injicera 20 μl av provlösningen (5.2.1 eller 5.2.2) flera gånger och bestäm medeltopphöjden (arean) för diclazuril och den interna standarden.

6. Resultatberäkning

6.1 Djurfoder

Diclazurilinnehållet w i mg/kg i provet fås genom följande formel:

>Hänvisning till >

[mg/kg] där

hd,s= topphöjd (area) för diclazuril i provlösningen (5.2.1)

hi,s= topphöjd (area) för den interna standarden i provlösningen (5.2.1)

hd,c= topphöjd (area) för diclazuril i kalibreringslösningen (3.10)

hi,c= topphöjd (area) för den interna standarden i kalibreringslösningen (3.10)

βd,c= diclazurilkoncentrationen i kalibreringslösningen i μg/ml (3.10)

m= provportionens massa i g

V= provextraktets volym enligt 5.2.1 (dvs. 2,5 ml)

6.2 Förblandningar

Diclazurilinnehållet w i mg/kg i provet fås genom följande formel:

>Hänvisning till >

[mg/kg] där

hd,c= topphöjd (area) för diclazuril i kalibreringslösningen (3.10)

hi,c= topphöjd (area) för den interna standarden i kalibreringslösningen (3.10)

hd,s= topphöjd (area) för diclazuril i provlösningen (5.2.2)

hi,s= topphöjd (area) för den interna standarden i provlösningen (5.2.2)

βd,c= diclazurilkoncentrationen i kalibreringslösningen i μg/ml (3.10)

m= provportionens massa i g

V= provextraktets volym enligt 5.2.2 (dvs. 25 ml)

p= nominell diclazurilhalt i förblandningen i mg/kg

7. Utvärdering av resultaten

7.1 Identitet

Analytens identitet kan bekräftas genom co-kromatografi eller genom användning av en diodarraydetektor med vars hjälp spektret för provextraktet (5.2.1 eller 5.2.2) och kalibreringslösningen (3.10) jämförs.

7.1.1 Co-kromatografi

Ett provextrakt (5.2.1 eller 5.2.2) spikas genom tillsats av en lämplig mängd kalibreringslösning (3.10). Mängden tillsatt diclazuril bör vara densamma som den mängd diclazuril som hittats i provextraktet.

Endast nivån på diclazuriltoppen bör förhöjas efter beaktande av både den tillsatta mängden och spädningen av extraktet. Toppens bredd måste på mitten ligga inom +- 10 % av den ursprungliga bredden på diclazuriltoppen i det icke spikade provextraktet.

7.1.2 Diodarraydetektion

Resultaten utvärderas enligt följande kriterier:

a) Våglängden för provets och standardspektrets maximala absorption, noterad vid kromatogrammets toppkurva, skall inte skilja sig inom detektorns upplösning. Vid diodarraydetektion ligger upplösningen vanligen inom +- 2 nm.

b) Mellan 230 och 320 nm skall det provspektrum och det standardspektrum som noterats vid kromatogrammets toppkurva inte skilja sig åt för de delar av spektret som ligger inom 10-100 % av den relativa absorbansen. Detta kriterium är uppfyllt om samma maxima är närvarande och avvikelsen mellan de båda spektren inte vid någon mätpunkt överskrider 15 % av standardanalytens absorbans.

c) Mellan 230 och 320 nm skall den uppåtgående linjen, toppen och den nedåtgående linjen från samma provextrakt inte skilja sig från varandra i de delar av spektret som ligger inom 10-100 % av den relativa absorbansen. Detta kriterium är uppfyllt om samma maxima observeras och avvikelsen mellan de båda spektren inte vid någon mätpunkt överskrider 15 % av standardanalytens absorbans

Om något av dessa kriterier inte är uppfyllt har närvaro av analysmaterialet inte påvisats.

7.2 Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga

- 30 % i relation till det högre värdet för diclazurilinnehåll mellan 0,5 och 2,5 mg/kg

- 0,75 mg/kg för diclazurilinnehåll mellan 2,5 och 5 mg/kg

- 15 % i relation till det högre värdet för diclazurilinnehåll för över 5 mg/kg

7.3 Utbyte

I fråga om spikade (rena) blindprov skall utbytet vara minst 80 %.

8. Resultat av samordnad undersökning

En samordnad undersökning genomfördes där fem prover analyserades av 11 laboratorier.Proverna bestod av två förblandningar, en blandad med en organisk matris (O 100) och den andra med en oorganisk matris (A 100). Den teoretiska halten är 100 mg diclazuril per kg. De tre foderblandningarna för fjäderfä kom från tre olika företag (NL) (L1/Z1/K1). Den teoretiska halten är 1 mg diclazuril per kg. Laboratorierna instruerades att av varje prov analysera ett enda prov eller ett dubbelprov. (Närmare upplysningar om den samordnade undersökningen återfinns i Journal of AOAC International, volym 77, nr 6 1994, s. 1359-1361). Resultaten framgår av följande tabell:

>Plats för tabell>

L: antal laboratorier

n: antal individuella värden

Sr: repeterbarhetens standardavvikelse

CVr: repeterbarhetens variationskoefficient

SR: reproducerbarhetens standardavvikelse

CVR: reproducerbarhetens variationskoefficient

9. Anmärkningar

Diclazurilsvaret måste tidigare ha visats vara linjärt i det koncentrationsintervall mätningarna gäller.

DEL C

BESTÄMNING AV KARBADOX

Metyl-3-(kinoxalin-2-ylmetylen)karbazat-1,4-dioxid

1. Syfte och räckvidd

Metoden avser bestämning av karbadox i djurfoder, förblandningar och beredningar. Detektionsgränsen är 1 mg/kg och den undre gränsen för bestämningen 10 mg/kg.

2. Princip

Provet jämviktas med vatten och extraheras med metanol-acetonitril. För djurfoder renas en del av det filtrerade extraktet på en aluminiumoxidkolonn. För förblandningar och foderberedningar späds en del av det filtrerade extraktet till lämplig koncentration med vatten, metanol och acetonitril. Karbadoxininnehållet bestäms genom en reversed-phase vätskekromatografs (HPLC) och UV-detektor.

3. Reagens

3.1 Metanol

3.2 Acetonitril, HPLC-kvalitet

3.3 Ättiksyra w = 100 %

3.4 Aluminiumoxid: neutral, aktivitetsgrad I

3.5 Metanol-acetonitril 1 + 1 (v + v)

Blanda 500 ml metanol (3.1) med 500 ml acetonitril (3.2).

3.6 Ättiksyra, α = 10 %

Späd 10 ml ättiksyra (3.3) till 100 ml med vatten.

3.7 Natriumacetat, CH3COONa

3.8 Vatten, HPLC-kvalitet

3.9 Acetatbuffertlösning, c = 0,01 mol/l, pH = 6,0

Lös 0,82 g natriumacetat (3.7) i 700 ml vatten (3.8) och justera pH till 6,0 med ättiksyra (3.6). Överför till en 1000 ml mätkolv, fyll på vatten (3.8) till märket och blanda.

3.10 Rörlig fas för HPLC

Blanda 825 ml acetatbuffert (3.9) med 175 ml acetonitril (3.2). Filtrera genom 0,22 μm filter (4.5) och avlufta lösningen (t.ex. i ultraljudsbad i 10 minuter).

3.11 Standardsubstans

Ren karbadox: Metyl 3-(2-quinoxalinylmetylen)karbazat N1,N4-dioxid, E 850

3.11.1 Lagerstamlösning av karbadox, 100 μg/ml (se Observera 5. Utförande):

Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 25 mg av standardsubstansen karbadox (3.11) i en 250 ml mätkolv. Lös i metanol-acetonitril (3.5) med hjälp av ultraljudsbad (4.7). Låt lösningen anta rumstemperatur efter ultraljudsbehandling, fyll upp till märket med metanol-acetonitril (3.5) och blanda. Slå in kolven i aluminiumfolie eller använd en kolv av färgat glas. Förvara i kylskåp. Lösningen kan lagras i en månad vid högst 4 °C.

3.11.2 Kalibreringslösningar

Överför 2,0, 5,0, 10,0 och 20,0 ml av arbetsstandardlösningen (3.11.1) till ett antal 100 ml mätkolvar. Tillsätt 30 ml vatten, fyll till märket med metanolacetonitril (3.5) och blanda. Slå in mätkolven i aluminiumfolie. Dessa lösningar motsvarar 2,0, 5,0, 10,0 respektive 20,0 μg/ml karbadox.Kalibreringslösningarna måste beredas på nytt före varje användning.

Observera:

För bestämning av karbadox i djurfoder som innehåller mindre än 10 mg/kg måste kalibreringslösningar med koncentrationer under 2,0 μg/ml beredas.

3.12 Vatten-[metanol-acetonitril]-blandning (3.5), 300 + 700 ( v + v).

Blanda 300 ml vatten med 700 ml av metanol-acetonitril-blandningen (3.5).

4. Utrustning

4.1 Skakapparat eller magnetomrörare.

4.2 Glasfiberfiltrerpapper (Whatman GF/A eller motsvarande)

4.3 Glaskolonn (längd 300-400 mm, intern diameter ca 10 mm) av matterat glas och med avtappningskran.

Observera:

en glaskolonn med stängningsventil eller med avsmalnande ände kan också användas. I så fall skall en tuss glassull tryckas ned i nedre änden med en glasstav.

4.4 HPLC-utrustning med injektionssystem avpassat för injektionsvolymer på 20 μl

4.4.1 Vätskekromatografikolonn: 300 mm x 4 mm, C18, 10 μm packning, eller motsvarande

4.4.2 Variabel UV-detektor eller diodarraydetektor för intervallet 225-400 nm

4.5 Membranfilter, 0,22 μm.

4.6 Membranfilter, 0,45 μm.

4.7 Ultraljudsbad

5. Utförande

Observera:

karbadox är ljuskänsligt. Utför alla moment i dämpad belysning eller använd färgade glaskärl eller glaskärl inslagna i aluminiumfolie.

5.1 Allmänt

5.1.1 Blindprov

För utbytesförsöket (5.1.2) bör ett blindprov analyseras för kontroll av att varken karbadox eller andra störande ämnen är närvarande. Blindprovet bör vara av samma typ som provet och varken karbadox eller andra störande ämnen skall kunna påvisas i det.

5.1.2 Utbytesförsök

Ett utbytesförsök bör utföras genom en analys av blindprovet tillsatt ("spikat") med en mängd karbadox som motsvarar den i provet. För spikning på nivån 50 mg/kg, sätt 5,0 ml av stamstandardlösningen (3.11.1) till en 200 ml E-kolv. Indunsta lösningen till ca 0,5 ml i ett kvävgasflöde. Tillsätt 10 g av blindprovet, blanda ordentligt och låt stå i tio minuter. Rör om igen flera gånger före extraktionen (5.2).

Om ett blindprov av samma typ som provet inte finns att tillgå (se 5.1.1) kan ett utbytestest göras med standardtillsatsmetoden. Denna innebär att det prov som skall analyseras spikas med samma mängd karbadox som finns i provet. Detta prov analyseras tillsammans med det "ospikade" provet och utbytet kan beräknas genom subtraktion.

5.2 Extraktion

5.2.1 Djurfoder

Väg med en noggrannhet av 0,01 g upp 10 g av provet och överför till en 200 ml E-kolv. Tillsätt 15,0 ml vatten, blanda och låt jämvikta i 5 min. Tillsätt 35,0 ml metanol-acetonitril-blandning (3.5), tillslut kolven och placera den i skakapparat eller på magnetomrörare i 30 minuter (4.1) Filtrera lösningen genom glasfiberfiltrerpapper (4.2). Spara denna lösning till reningssteget (5.3).

5.2.2 Förblandningar (0,1-2,0 %)

Väg med en noggrannhet av 0,001 g upp 1 g omalt prov och överför till en 200 ml E-kolv. Tillsätt 15,0 ml vatten, blanda och låt jämvikta i 5 minuter. Tillsätt 35,0 ml metanol-acetonitril-blandning (3.5), tillslut kolven och placera den i skakapparat eller på magnetomrörare i 30 minuter (4.1) Filtrera lösningen genom glasfiberfiltrerpapper (4.2). Pipettera upp en delmängd filtrat i en 50 ml mätkolv. Tillsätt 15,0 ml vatten, fyll till märket med metanol-acetonitril (3.5) och blanda. Karbadoxkoncentrationen i slutlösningen skall vara ungefär 10 μg/ml. En del av lösningen filtreras genom ett 0,45 μm membranfilter. Gå vidare till HPLC-bestämningen (5.4).

5.2.3 Foderberedningar ( > 2 %)

Väg med en noggrannhet av 0,001 g upp 0,2 g omalt prov och överför till en 250 ml E-kolv. Tillsätt 45,0 ml vatten, blanda och låt jämvikta i 5 minuter. Tillsätt 105,0 ml metanol-acetonitril-blandning (3.5), tillslut kolven och homogenisera. Ultraljudsbehandla (4.7) provet i 15 minuter och placera det i skakapparat eller på magnetomrörare i 15 minuter (4.1). Filtrera lösningen genom glasfiberfiltrerpapper (4.2).

Späd en delmängd av filtratet med vatten-metanol-acetonitril-blandningen (3.12) till en slutlig karbadoxkoncentration på 10-15 μg/ml (för en 10 % lösning blir spädningsfaktorn 10). En del av lösningen filtreras genom ett 0,45 μm membranfilter.

Gå vidare till HPLC-bestämningen (5.4).

5.3 Rening

5.3.1 Preparation av aluminiumoxidkolonnen

Väg upp 4 g aluminiumoxid (3.4) och överför det till glaskolonnen (4.3).

5.3.2 Rening av prov

Tillsätt 15 ml av det filtrerade extraktet (5.2.1) till aluminiumoxidkolonnen och häll bort de första 2 ml eluat. Samla upp nästa 5 ml och filtrera en del genom ett 0,45 μm filter (4.6). Gå vidare till HPLC-bestämningen (5.4).

5.4 HPLC-bestämning

5.4.1 Parametrar

Följande villkor anges som vägledning; andra förutsättningar kan väljas om de ger motsvarande resultat.

>Plats för tabell>

Kontrollera det kromatografiska systemets stabilitet genom att flera gånger injicera kalibreringslösningen (3.11.2) som innehåller 5,0 μg/ml tills konstanta toppar och retentionstider uppnås.

5.4.2 Kalibreringskurva

Injicera varje kalibreringslösning (3.11.2) flera gånger och bestäm medeltoppareorna för varje koncentration. Konstruera en kalibreringskurva med kalibreringslösningarnas medeltoppareor längs y-axeln och de motsvarande koncentrationerna i μg/ml längs x-axeln.

5.4.3 Provlösning

Injicera provextraktet [(5.3.2) för djurfoder, (5.2.2) för förblandningar och (5.2.3) för foderberedningars flera gånger och bestäm medeltoppareorna för karbadoxtopparna.

6. Resultatberäkning

Använd medeltopparean för provlösningens karbadoxtoppar för att bestämma provlösningens koncentration i μg/ml med hjälp av kalibreringskurvan (5.4.2).

6.1 Djurfoder

Karbadoxinnehållet w (mg/kg) i provet fås genom följande formel:

>Hänvisning till >

[mg/kg] där

β= karbadoxkoncentration i provlösningen (5.3.2) i μg/ml,

V1= extraktionsvolymen i ml (dvs. 50)

m= provportionens massa i g

6.2 Förbländningar och foderberedningar

Karbadoxinnehållet w (mg/kg) i provet fås genom följande formel:

>Hänvisning till >

[mg/kg] där:

β= Karbadoxkoncentration i provlösningen (5.2.2 eller 5.2.3) i μg/ml,

V2= extraktionsvolymen i ml (dvs. 50 för förblandningar och 150 för foderberedningar)

f= utspädningsfaktor enligt 5.2.2 (förblandningar) eller 5.2.3 (foderberedningar)

m= provportionens massa i g

7. Utvärdering av resultaten

7.1 Identitet

Analytens identitet kan bekräftas genom co-kromatografi eller genom användning av en diodarraydetektor med vars hjälp spektret för provextraktet och kalibreringslösningen (3.11.2) innehållande 10,0 μg/ml jämförs.

7.1.1 Co-kromatografi

Ett provextrakt spikas genom tillsats av en lämplig mängd kalibreringslösning (3.11.2). Mängden tillsatt karbadox bör vara densamma som den mängd som hittats i provextraktet.

Endast nivån på karbadoxtoppen bör förhöjas efter beaktande av både den tillsatta mängden och spädningen av extraktet. Toppens bredd måste på mitten ligga inom 10 % av den ursprungliga bredden.

7.1.2 Diodarraydetektion

Resultaten utvärderas enligt följande kriterier:

a) Våglängden för provets och standardspektrets maximala absorption, noterad vid kromatogrammets toppkurva, skall inte skilja sig inom detektorns upplösning. Vid diodarraydetektion ligger upplösningen vanligen inom +- 2 nm.

b) Mellan 225 och 400 nm skall det provspektrum och det standardspektrum som noterats vid kromatogrammets toppkurva inte skilja sig åt för de delar av spektret som ligger inom 10-100 % av den relativa absorbansen. Detta kriterium är uppfyllt om samma maxima är närvarande och avvikelsen mellan de båda spektren inte vid någon mätpunkt överskrider 15 % av standardanalytens absorbans.

c) Mellan 225 och 400 nm skall den uppåtgående linjen, toppen och den nedåtgående linjen från samma provextrakt inte skilja sig från varandra i de delar av spektret som ligger inom 10-100 % av den relativa absorbansen. Detta kriterium är uppfyllt om samma maxima observeras och avvikelsen mellan de båda spektren inte vid någon mätpunkt överskrider 15 % av standardanalytens absorbans.

Om något av dessa kriterier inte är uppfyllt har närvaro av analysmaterialet inte påvisats.

7.2 Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överskrida 15 % i relation till det högre resultatet för karbadoxinnehåll på över 10 mg/kg.

7.3 Utbyte

I fråga om spikade prov (blindprov) skall utbytet vara minst 90 %.

8. Resultat av samordnad undersökning

En samordnad undersökning genomfördes med 6 djurfoder, 4 förblandningar och 3 foderberedningar som analyserades av 8 laboratorier. Dubbelprover analyserades för varje prov. (Närmare uppgifter om denna samordnade undersökning återfinns i Journal of the AOAC, volym 71, 1988, s. 484-490). Resultaten (efter uteslutning av extremvärden) framgår av följande tabell:L: antal laboratorier

n: antal individuella värden

Sr: repeterbarhetens standardavvikelse

CVr: repeterbarhetens variationskoefficient

SR: reproducerbarhetens standardavvikelse

CVR: reproducerbarhetens variationskoefficient

>Plats för tabell>

>Plats för tabell>