KOMMISSIONENS DIREKTIV av den 18 november 1987 om anpassning till tekniska framsteg för nionde gången av rådets direktiv 67/548/EEG om tillnärmning av lagar och andra författningar om klassificering, förpackning och märkning av farliga ämnen (88/302/EEG)

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIV

med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekonomiska gemenskapen,

med beaktande av rådets direktiv 67/548/EEG av den 27 juni 1967 om tillnärmning av lagar och andra författningar om klassificering, förpackning och märkning av farliga ämnen(1) i dess lydelse efter den sjätte ändringen genom direktiv 79/831/EEG(2), särskilt artikel 19 i detta, och

med beaktande av följande:

Enligt artikel 3.1 i direktiv 67/548/EEG skall ämnens och preparats fysikaliskt-kemiska egenskaper, toxicitet och ekotoxicitet bestämmas med de metoder som anges i bilaga 5.

Enligt artikel 3.2 i direktiv 67/548/EEG skall den verkliga eller potentiella miljöfarligheten hos ett ämne eller preparat fastställas med avseende på de egenskaper som anges i bilaga 7 och 8.

Bilaga 5 i dess lydelse enligt kommissionens direktiv 84/449/EEG(3) innehåller endast testmetoder för de egenskaper som anges i bilaga 7. Det är således nödvändigt att även tillhandahålla testmetoder för de egenskaper som anges i bilaga 8.

Bestämmelserna i detta direktiv har tillstyrkts av Kommittén för anpassning till teknisk utveckling av direktiven om avskaffande av tekniska handelshinder för farliga ämnen och preparat.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Texten i bilagan till detta direktiv skall läggas till i bilaga 5 till direktiv 67/548/EEG.

Artikel 2

Medlemsstaterna skall före den 31 december 1988 anta och offentliggöra de bestämmelser som är nödvändiga för att följa detta direktiv och skall genast underrätta kommissionen om detta. Bestämmelserna skall tillämpas senast den 30 juni 1989.

Artikel 3

Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.

Utfärdat i Bryssel den 18 november 1987.

På kommissionens vägnar

Stanley CLINTON DAVIS

Ledamot av kommissionen

(1) EGT nr 196, 16.8.1967, s. 1/67.

(2) EGT nr L 259, 15.10.1979, s. 10.

(3) EGT nr L 251, 19.9.1984, s. 1.

BILAGA

De testmetoder som beskrivs i denna bilaga är till för bestämning av vissa av de toxikologiska och ekotoxikologiska egenskaper som förtecknas i bilaga 8 till rådets direktiv 79/831/EEG. De testmetoder som beskrivs är tillämpliga för nivå 1 och nivå 2 i bilaga 8, men testerna har inte specificerats efter nivå.

INNEHÅLLSFÖRTECKNING

Sida

DEL B: Metoder för bestämning av toxicitet 6

Allmän inledning: DEL B 6

Test avseende subkronisk oral toxicitet: 90 dagars repeterad oraltest på gnagare 10

Test avseende subkronisk oral toxicitet: 90 dagars repeterad oraltest på icke-gnagare 14

Test avseende subkronisk dermal toxicitet: 90 dagars repeterad dermaltest på gnagare 18

Test avseende subkronisk inhalationstoxicitet: 90 dagars repeterad inandningstest på gnagare 22

Teratogenicitetstest - på gnagare och icke-gnagare 26

Test avseende kronisk toxicitet 29

Test avseende cancerogenicitet 34

Kombinerat test avseende kronisk toxicitet och cancerogenicitet 39

Reproduktionstoxicitetstest på en generation 45

Reproduktionstoxicitetstest på två generationer 49

Toxikokinetik 53

Mutagenicitetstest och screening för cancerogenicitet 57

- Genmutation Saccharomyces cerevisiae 57

- Mitotisk rekombination Saccharomyces cerevisiae 60

- Genmutationstest in vitro på däggdjursceller 63

- DNA-skada och DNA-reparation felaktig DNA-syntes däggdjursceller in vitro 66

- Test avseende systerkromatidbyten in vitro 70

- Könsbunden recessiv letal test på Drosophila melanogaster 73

- Celltransformationstest in vitro på däggdjursceller 75

- Dominant letal test på gnagare 78

- Cytogenetisk test på könsceller från däggdjur in vivo 81

- Fläcktest på mus 84

- Test avseende ärftlig translokation på mus 87

DEL C: Metoder för bestämning av ekotoxicitet 90

Allmän inledning: Del C 90

Test avseende tillväxthämning hos alger 91

Toxicitet hos daggmaskar: test i syntetisk jord 97

Biologisk nedbrytbarhet Zahn-Wellens test 101

Biologisk nedbrytbarhet: Aktiverat slam Simulationstest 108

Biologisk nedbrytbarhet: Aktiverat slam Respirationshämningstest 120

Biologisk nedbrytbarhet: Modifierat SCAS test 125

DEL B: METODER FÖR BESTÄMNING AV TOXICITET ALLMÄN INLEDNING: DEL B

LÅNGTIDSUNDERSÖKNINGAR Undersökning av subkronisk/kronisk toxicitet och cancerogenicitet

Egenskaper hos testämnet och behandlingsblandningen

Testämnets sammansättning, inbegripet de viktigaste orenheterna, och dess relevanta fysikaliska-kemiska egenskaper, inbegripet ämnets stabilitet, måste vara kända innan en toxicitetsundersökning inleds.

Testämnets fysikaliska-kemiska egenskaper ger viktig vägledning vid val av tillförselväg, utformning av undersökningar av subkronisk/kronisk toxicitet eller cancerogenicitet samt hantering och lagring av testämnet.

Uppgifter om testämnets kemiska struktur och fysikaliska-kemiska egenskaper kan dessutom ge en antydan om absorptionsförmågan vid en bestämd tillförselväg, liksom upplysa om ämnets uppträdande i fråga om metabolism och distributionen i vävnaderna. Uppgifter om toxikokinetiska parametrar kan dessutom finnas tillgängliga från tidigare undersökningar om toxicitet och toxikokinetik.

En analysmetod för kvalitativ och kvantitativ bestämning av testämnet (om möjligt inbegripet viktiga orenheter) i doseringsmediet och i biologiska material bör utvecklas innan en undersökning inleds.

Försöksdjur: Val av arter och stammar

Eftersom det är nödvändigt att behandla djuren under en större del av deras livstid har undersökningarna en tendens att begränsas till arter av försöksdjur som är lätta att hålla och har en relativt kort livslängd. Det är högst önskvärt att man känner till incidensen av spontana sjukdomar och tumörer i de använda djurstammarna, när de hålls under liknande förhållanden.

Stammar bör vara väl beskrivna och fria från störande medfödda defekter. Användning av inavlade stammar eller F 1-hybrider kan vara till viss fördel i detta sammanhang, men om det finns tillräcklig bakgrundsinformation om utavlade stammar kan även djur från stängda bestånd användas.

Djurvård, utfodring och vattning

Djurförsök och undersökningar skall utföras i enlighet med nationella bestämmelser varvid hänsyn skall tas till humana principer och den senaste internationella utvecklingen på området för djurs välbefinnande.

En strikt kontroll av miljöförhållandena samt lämpliga djurvårdsmetoder är en grundförutsättning för att erhålla meningsfulla resultat. Sådana faktorer såsom förvaringsrum, tillstötande sjukdomar, medicinsk behandling, orenheter i foder, luft, vatten och bäddmaterial kan ha en avgörande betydelse för resultatet av undersökningar med upprepad dosering. I allmänhet bör man känna till kemiska steriliseringsmedels verkningar på undersökningen.

Fodret skall motsvara alla de näringskrav som försöksdjuren har och vara fria från orenheter som kan påverka testresultatet. Gnagare bör utfodras och vattnas ad libitum, och fodret bör bytas minst en gång i veckan. För närvarande används tre olika fodersorter: konventionella, syntetiska och olika fodersorter med angiven sammansättning.

Oavsett vilket foder man väljer måste leverantörerna regelbundet kontrollera näringsvärdet och graden av orenheter i basfodret och skicka denna information till laboratoriet tillsammans med varje fodersändning. Det är högst önskvärt att man på förhand känner till fodersammansättningens verkningar på metabolismen, utvecklingen av tumörer och djurens livslängd.

Försökslaboratoriet kan dessutom utföra ytterligare kontroller av basfodret för att analysera fodrets beståndsdelar samt oavsiktligt tillsatta orenheter, inbegripet cancerogener. I detta fall bör analysresultaten behållas och inbegripas i slutrapporten för varje enskilt testämne.

Vanliga foderbeståndsdelar som man vet påverkar cancerogeniciteten (t. ex. antioxidanter, omättade fettsyror, selen) bör inte ingå i fodret i skadliga koncentrationer. Till följd av den potentiella inverkan som sådana orenheter som normalt förekommer i fodret har vid bedömningen av cancerogenecitet är det nödvändigt att särskilt uppmärksamma närvaron av bekämpningsmedelsrester, organiska klorföreningar, polycykliska aromatiska kolväten, östrogen, tungmetaller, nitrosaminer och mykotoxiner i fodret.

Om testämnet tillförs via vattnet eller fodret är stabilitetstester av grundläggande betydelse. Innan undersökningen inleds bör lämpliga stabilitets- och homogenitetstester med upprepad dosering utföras för att fastställa frekvensen av foderberedningen och den kontroll som krävs.

Om fodret steriliseras måste den verkan en sådan behandling har på testämnet samt fodrets näringsbeståndsdelar vara känd. Vid behov måste tillämpliga anpassningar företas.

Vid tester av cancerogenicitet bör forskarna vara uppmärksamma på eventuella föroreningar i det vatten som används. Vatten som är tjänligt som dricksvatten är normalt det lämpligaste, och en vattenanalys bör finnas tillgänglig.

Det kan vara nödvändigt att ändra testämnets koncentration i fodret när djuret växer, för att bibehålla ett rimligt konstant intag av testämnet i förhållande till kroppsvikt.

Näringsvärdet i det foder som ges till kontroll- respektive försöksdjur bör vara så lika som möjligt. Till följd av detta är det nödvändigt att ta hänsyn till näringsvärdet i det testämne som iblandas i fodret. Erfarenheten har visat att upp till 5 % av näringsfria testämnen i fodret sannolikt inte har något inflytande på fodrets näringsvärde.

1. Inhalationssundersökningar

Inget gränstest har fastställts eftersom det inte har varit möjligt att definiera ett enhetligt gränsvärde för exponering genom inhalation.

2. Teratogenicitetsundersökningar

Denna testmetod används främst vid oral tillförsel. Andra tillförselvägar kan dock användas beroende på testämnets fysikaliska egenskaper eller sannolik exponeringsform för människor. I sådana fall bör testmetoden anpassas med hänsyn till de relevanta kriterierna för 28-dagarsstudien.

3. Toxikokinetik

Toxikokinetiska undersökningar bidrar till att tolka och utvärdera uppgifter om toxicitet. Syftet med dessa undersökningar är att förklara vissa aspekter av den testade kemikaliens toxicitet. Resultatet kan bidra till att utforma ytterligare toxicitetsundersökningar. Det är inte nödvändigt att i samtliga fall bestämma alla parametrar. Endast vid sällsynta tillfällen är det nödvändigt att genomföra hela raden av toxikokinetiska undersökningar (absorption, utsöndring, distribution och metabolism). I fråga om vissa kemiska förbindelser kan det vara lämpligt att ändra denna följdordning, och i vissa fall kan en enkel dos vara tillräcklig.

Definitioner

>Plats för tabell>

4. Undersökning av akut och subakut toxicitet på en andra djurart

Syftet med en undersökning på en andra djurart är att komplettera de resultatet som erhållits på grundval av undersökningen på den första djurarten.

Vid en undersökning på en andra art kan den testmetod som redan beskrivits användas eller anpassas för ett mindre antal djur.

5. Fertilitetsundersökning

Om en reproduktionstest av tre generationer är nödvändig kan den metod som beskrivs för en reproduktionstest av två generationer utvidgas till att omfatta en tredje generation.

6. Mutagenicitetsundersökning

Ytterligare mutagenicitetstester inbegripet "screening" test för cancerogenicitet

I bilaga 8 till direktivet anges kompletterande undersökningar av mutagenicitet och prescreening för cancerogenetisk verkan. De undersökningar som anges i detta avsnitt kan i allmänhet användas för att undersöka båda dessa aspekter.

Inledning

Den initiala bedömningen av ett ämnes mutagena aktivitet består i ett test för gen(punkt)mutationer i bakterier liksom för cytogenetisk skada i däggdjursceller (in vitro eller in vivo). Lämpliga metoder för dessa "bastester" beskrivs ovan. Detta avsnitt rör ytterligare undersökningar som är lämpliga för att verifiera och/eller komplettera de resultat som erhållits vid bastesterna, och som kan användas för att

1. bekräfta resultat som erhållits vid bastesterna,

2. undersöka endpoints som inte undersöktes i bastesterna,

3. inleda eller utvidga in vivo-undersökningar.

Till följd av detta omfattar de beskrivna testerna både in vitro och in vivo eukaryotiska system samt en utvidgad rad biologiska endpoints. Testerna ger upplysningar om punktmutationer i mer komplexa organismer än de bakterier som används i bastesterna, och ger fler upplysningar om ett ämnes förmåga att inducera kromosomförändringar.

Även tester för andra endpoints än punktmutationer och kromosomförändringar beskrivs. Dessa tester ger kompletterande upplysningar och kan på tillämpligt sätt användas i testscheman.

I allmänhet bör ett program om ytterligare undersökning av mutagenicitet utformas så att det ger ytterligare relevant information om det ifrågavarande ämnets mutagenetiska och/eller cancerogenetiska potential.

Vilka undersökningar som är lämpliga i ett visst fall kommer att bero på flera faktorer, t. ex. ämnets kemiska och fysikaliska egenskaper, resultaten av de initiala bakteriologiska och cytogenetiska undersökningarna, ämnets metaboliska egenskaper, resultaten av andra undersökningar om toxicitet samt befintlig kunskap om ämnets användning. Med tanke på de olika faktorer som man kan behöva ta hänsyn till är ett strikt schema för val av tester därför inte lämpligt. Några allmänna principer kan dock ge viss vägledning. Om ett test var positivt i bastesterna bör de kompletterande undersökningarna inbegripa åtminstone ett test som kan spåra samma genetiska endpoints. Om båda undersökningarna i bastesterna var negativa bör ett test för genmutationer liksom ett test för kromosomförändringar normalt utföras som kompletterande undersökningar. Det kan dessutom vara lämpligt att skaffa fram ytterligare data genom indikatortesterna (se nedan).

Metoder för sådana tester anges nedan indelade i grupper på grundval av deras viktigaste genetiska endpoints.

Tester för undersökning av gen(punkt)mutationer

För ytterligare tester av ett ämnes potential att framkalla gen(punkt)mutationer kan följande tester vara lämpliga:

a) Framåt- eller tillbakamutationstester med användning av eukaryotiska mikroorganismer (Saccharomyces cerevisiae).

b) In vitro-tester av framåtmutation i däggdjursceller.

c) Könsbunden recessiv letal test på Drosophila melanogaster.

d) In vivo-test för undersökning av somatisk cellmutation: Fläcktest på mus.

Tester för undersökning av kromosomförändringar

För ytterligare tester av ett ämnes potential att framkalla kromosomförändringar kan följande tester vara lämpliga:

a) Cytogenetiskt in vivo-test med däggdjur

Här kan man överväga att utföra en metafasanalys av benmärgsceller in vivo, om detta inte har gjorts inom ramen för den initiala undersökningen (bastesterna). Dessutom kan cytogenetiska in vivo-tester av könsceller företas.

b) Cytogenetiskt in vitro-test med däggdjursceller, om detta inte har gjorts inom ramen för den initiala undersökningen.

c) Dominant letal test med gnagare.

d) Test för undersökning av ärftlig translokation med mus.

Indikatortest för verkningar på DNA

Det finns metoder genom vilka man kan konstatera vissa verkningar på DNA, men som inte har en mutagen verkan som "endpoint". Dessa undersökningar kan ge upplysningar som kompletterar resultaten av undersökningarna om mutagenocitet och som kan vara till nytta vid tolkningen av sådana undersökningar. Om det finns ett behov av sådan undersökningar kan följande tester, med användning av eukaryotiska mikroorganismer eller däggdjursceller, anses vara lämpliga:

a) Mitotisk rekombination med Saccharomyces cerevisiae.

b) DNA-skador och DNA-reparation felaktig DNA-syntes däggdjursceller (in vitro).

c) Undersökning av systerkromatidbyten med däggdjursceller (in vitro).

Andra indikatortester för cancerogenetisk potential

Det finns tester för att mäta ett ämnes potential att inducera morfologiska och beteendemässiga förändringar i cellkulturer som tros vara förbundna med maligna transformationer in vivo. Ett rad olika celltyper och kriterier för transformation kan användas.

Bedömning av risken för ärftliga verkningar i däggdjur

Det finns metoder för att mäta ärftliga verkningar i intakta däggdjur framkallade av gen(punkt)mutationer (som i det särskilda locustestet med mus(1)) eller av kromosomförändringar (som i testet för ärftlig translokation med mus). Sådana metoder kan användas vid bedömning av ett ämnes eventuella genetiska risk för människor. Till följd av komplexiteten av dessa tester och det mycket stora antal djur som krävs, särskilt för det specifika locustestet, måste det finnas starka motiv innan dessa tester utförs.

TEST AVSEENDE SUBKRONISK ORAL TOXICITET 90 DAGARS REPETERAD ORALTEST PÅ GNAGARE

1. METOD

1.1. Inledning

Se allmän inledning till del B.

1.2. Definitioner

Se allmän inledning till del B.

1.3. Referensämnen

Inga.

1.4. Testmetodsprincip

Testämnet tillförs oralt dagligen i graderade doser till flera grupper av försöksdjur, en dos per grupp i 90 dagar. Under doseringsperioden observeras djuren dagligen för tecken på toxicitet. Djur som dör under försöket obduceras, och i slutet av försöket avlivas och obduceras överlevande djur.

1.5. Kvalitetskriterier

Inga.

1.6. Metodbeskrivning

Förberedelser

I minst fem dagar före försöket skall djuren hållas under testbetingelser vad beträffar miljö och utfodring. Före försöket fördelas unga friska djur slumpmässigt i behandlings- och kontrollgrupper.

Testämnet kan tillföras via fodret, med magsond, i kapslar, eller via dricksvattnet. Samma tillförselmetod skall användas för alla djur under hela behandlingsperioden. Om vehikel eller annan tillsats används för att underlätta dosering skall det vara fastställt att de inte framkallar några toxiska verkningar. I lämpliga fall kan tidigare insamlade data användas.

Försöksbetingelser

Försöksdjur

Om det inte finns kontraindikationer skall i första hand råttor användas. Unga friska djur från vanligen nyttjade laboratoriestammar skall användas. Helst skall dosering inledas innan råttorna är sex veckor gamla, och under inga omständigheter efter åtta veckors ålder. Vid inledningen av försöket får vikten hos de djur som används inte avvika mer än ± 20 % från genomsnittsvikten. Om ett test av subkronisk toxicitet med oral tillförsel utförs som en förundersökning till en långtidsundersökning skall samma djurart och stam användas i båda undersökningarna.

Antal och kön

Minst 20 djur (10 hondjur och 10 handjur) skall användas på varje dosnivå. Hondjuren får inte ha fött ungar och får inte vara dräktiga. Vid planenligt avlivande av försöksdjur under försöket skall det ursprungliga antalet djur ökas med det antal djur som planenligt skall avlivas innan försöket slutförs. Dessutom kan en satellitgrupp bestående av 20 djur (10 av vardera kön) behandlas med den högsta dosen i 90 dagar och därefter observeras i 28 dagar för reversibilitet, persistens eller fördröjt uppträdande av toxiska verkningar.

Dosnivåer

Minst tre dosnivågrupper samt en kontrollgrupp skall användas. Djuren i kontrollgruppen skall behandlas på samma sätt som djuren i testgrupperna, bortsett från att de inte skall tillföras testämnet. Om vehikel används för att underlätta dosering skall kontrollgruppen tillföras vehikeln på samma sätt som behandlingsgrupperna. Vidare skall vehikeln tillföras kontrollgruppen i samma mängd som emottas av försöksdjuren i gruppen med den högsta dosnivån. Den högsta dosnivån bör medföra toxiska verkningar men inte leda till någon, eller endast begränsad, dödlighet. Den lägsta dosnivån bör inte medföra några tecken på toxicitet. Om det finns en användbar uppskattning av människors exponering för testämnet bör den lägsta dosnivån vara högre än denna. Idealt skall medeldosen endast medföra minsta möjliga observerbara toxiska verkningar. Om fler än en medeldos används skall dosnivåerna väljas på ett sådant sätt att en gradering av de toxiska verkningarna erhålls.

I de grupper som behandlas med låg- och medeldoser och i kontrollgruppen bör antalet dödsfall vara lågt för att en utvärdering av resultaten skall vara meningsfylld.

Om testämnet tillförs via fodret kan antingen en konstant koncentration (ppm eller mg/kg foder) eller en konstant dosnivå i förhållande till djurens kroppsvikt användas. Det alternativ som används skall anges. Om ett testämne tillförs via magsond skall dosen ges vid samma tid varje dag. Dosnivåerna skall justeras med jämna mellanrum (varje eller varannan vecka) för att hålla dosnivån konstant i förhållande till djurens kroppsvikt.

Gränstest

Om ett 90-dagarsförsök som utförs i enlighet med nedan beskrivna metod och med en dosnivå på 1 000 mg/kg kroppsvikt och dag, eller en högre dosnivå om detta motiveras av kännedom om eventuell exponering för människor, inte medför några tecken på toxiska verkningar kan ytterligare tester anses vara överflödiga. Om ett testämne med låg toxicitet tillförs via fodret är det viktigt att säkerställa att mängden av och egenskaperna hos den aktuella testämnet inte påverkar normala näringskrav.

Observationsperiod

Samtliga djur skall observeras dagligen och tecken på toxicitet skall registreras tillsammans med tidpunkten då de uppträdde för första gången samt graden och varaktigheten av toxiciteten. Tidpunkten för dödsfall och tidpunkten vid vilken tecken på toxicitet uppträder respektive försvinner bör registreras.

Förfarande

Idealt tillförs testämnet varje dag i 90 dagar. Djur i en eventuell satellitgrupp som planerats för uppföljning skall observeras i ytterligare 28 dagar utan behandling för att fastställa om de toxiska verkningarna försvinner eller håller i sig.

Observation av djuren i burarna skall omfatta hud- och pälsförändringar, ögon, slemhinnor, respirations- och cirkualtionssystemen, autonoma och centrala nervsystemet samt kroppsmotorik och beteendemönster. Foderintaget (och vattenkonsumtionen om testämnet tillförs via dricksvattnet) skall mätas varje vecka och djuren skall vägas en gång i veckan.

Det är nödvändigt att observera djuren regelbundet för säkerställa att så få djur som möjligt faller bort från studien till följd av kannibalism, autolys av vävnader eller förväxling. I slutet av testperioden avlivas och obduceras alla överlevande djur, utom djuren i satellitgruppen. Så snart döende djur upptäcks skall dessa avlägsnas, avlivas och obduceras.

Följande undersökningar skall genomföras på alla djur, inbegripet kontrollgruppen:

a) Innan testämnet tillförs samt sedan försöket avslutats skall en oftamologisk undersökning utföras med användning av ett oftalmoskop eller liknande lämplig utrustning, helst på alla djur men åtminstone på djuren i den högsta dosgruppen och i kontrollgruppen. Om förändringar i ögonen observeras bör alla djur undersökas.

b) Vid slutet av testperioden skall en hematologisk undersökning utföras, inbegripet hematokrit- och hemoglobinkoncentration, erytrocyträkning, total och differentialräkning av leukocyter, mätning av koaguleringsförmågan, t. ex. koagulationstid, protombintid, tromboplastintid eller blodplättsräkning.

c) Vid slutet av försöksperioden skall en klinisk-biokemisk blodanalys utföras. För denna undersökning är följande analysområden lämpliga: elektrolytbalans, kolhydratmetabolism, lever- och njurfunktion. Valet av specifika analyser kommer att påverkas av observationer av testämnets verkningssätt. Följande bestämningar föreslås: kalcium, fosfor, klorid, natrium, kalium, fasteglukos (fasteperioden beror på djurarten), glutaminsyra-pyrodruvsyra-transaminas(2), glutaminsyra-oxalättiksyra-transaminas(3), ornitin dekaroxylas, gamma-glutamyl-transpeptidas, urinkväve, albumin, blod-kreatinin, totalt bilirubin och totalt serumprotein. Andra bestämningar som kan vara nödvändiga för en tillfredsställande toxikologisk bedömning inbegriper lipidsanalys, hormoner, syra/basbalans, methemoglobin och kolinesterasaktivitet. Ytterligare klinisk-biokemiska analyser kan vid behov utföras för att vidare utreda de observerade verkningar.

d) En urinanalys krävs i regel inte, men kan dock vara nödvändig om en toxisk verkan förväntas eller observeras.

Om tidigare insamlade basdata är otillräckliga bör man överväga att bestämma hematologiska och klinisk-biokemiska parametrar innan man inleder försöket.

Makroskopisk undersökning

Alla försöksdjur skall genomgå en fullständig makroskopisk undersökning som inbegriper undersökning av alla externa kroppsytor, alla kroppsöppningar liksom kranie-, bröstkorgs- och bukhålan samt deras innehåll. Lever, njurar, binjurar och testiklar skall vägas våta så snart som möjligt efter dissektion för att undvika uttorkning.

Följande vävnader och organ skall förvaras i lämpligt medium för eventuell senare histopatologisk undersökning: alla vävnader och organ som uppvisar lesioner, hjärnan inbegripet snitt av medulla/pons, lillhjärnbarken och hjärnbarken, hypofysen, sköldkörteln/bisköldkörteln, thymusvävnad, luftstrupe och lungor, hjärta, stora kroppspulsådern, (spottkörtlar), lever, mjälte, njurar, binjurar, bukspottskörtel, könskörtlar, livmoder, (associerade könsorgan), (hud), matstrupe, magsäck, tolvfingertarm, tomtarmen, ileum, cekum, colon, ändtarm, urinblåsan, representativa lymfkörtlar, (kvinnliga bröstkörtlar), (lårmuskulatur), nerver från det perifera nervsystemet, bröstbenet med benmärg, (ögon), (femur, inbegripet ledyta), (ryggmärg på tre nivåer vid halsen, mitt för bröstkorgen och från ländområdet), och (exorbitala tårkörtlar). De vävnader som anges inom paranteser behöver endast undersökas om det finns tecken på toxicitet eller i samband med målorgan.

Histopatologisk undersökning

a) En fullständig histopatologisk undersökning skall utföras på organ och vävnader från djuren i kontroll- och högdosgrupperna.

b) Alla allvarliga lesioner skall undersökas.

c) Målorganen i andra doseringsnivågrupper skall också undersökas.

d) Lungorna från djur i låg- och medeldosgrupperna skall undersökas histopatologiskt för tecken på infektion, eftersom detta ger en lämplig uppfattning om djurens hälsotillstånd. Man bör även överväga en histopatologisk undersökning av lever och njurar från djur i dessa grupper. Ytterligare histopatologiska undersökningar av djur i dessa grupper krävs inte rutinmässigt, men organ som har visat tecken på lesioner hos högdosgruppen måste alltid undersökas.

e) Djur i en eventuell satellitgrupp skall underkastas en histopatologisk undersökning av de organ och vävnader som har uppvisat toxiska verkningar i de behandlade grupperna.

2. DATA

Data skall ställas upp i tabellform och för varje grupp anges antal djur vid inledningen av försöket, antal djur med lesioner och den procent djur som uppvisar varje slag av lesion. Resultaten skall utvärderas på grundval av en lämplig statistisk metod. Alla erkända statistiska metoder får användas.

3. RAPPORTERING

3.1. Testrapport

Testrapporten skall om möjligt innehålla följande:

- Djurart, stam, härkomst, miljöbetingelser, foder.

- Försöksbetingelser.

- Dosnivåer (med angivande av vehikel, om sådan använts) och koncentrationer.

- Uppgifter om toxisk reaktion uppdelade efter kön och dos.

- Icke toxisk dos, om sådan fastställts.

- Tidpunkten för dödsfall under försöket eller överlevnad till slutet av försöket.

- Beskrivning av toxiska och andra verkningar.

- Tidpunkten för observation av varje abnormalt tecken och dess senare utveckling.

- Uppgifter om foder och kroppsvikt.

- Oftamologiska rön.

- Hematologiska undersökningar och alla resultat.

- Använda klinisk-biokemiska analyser och alla resultat (inbegripet resultat av en eventuell urinanalys).

- Obduktionsrön.

- Detaljerad beskrivning av alla histopatologiska rön.

- Statistisk behandling av resultaten i lämpliga fall.

- Diskussion om resultaten.

- Tolkning av resultaten.

3.2. Utvärdering och tolkning

Se allmän inledning till del B.

4. HÄNVISNINGAR

Se allmän inledning till del B.

TEST AVSEENDE SUBKRONISK ORAL TOXICITET 90 DAGARS REPETERAD ORALTEST PÅ ICKE-GNAGARE

1. METOD

1.1. Inledning

Se allmän inledning till del B..

1.2. Definitioner

Se allmän inledning till del B.

1.3. Referensämnen

Inga.

1.4. Testmetodsprincip

Testämnet tillförs oralt dagligen i graderade doser till flera grupper av försöksdjur (icke-gnagare), en dos per grupp i 90 dagar. Under doseringsperioden skall djuren observeras dagligen för tecken på toxicitet. Djur som dör under försöket obduceras, och i slutet av försöket avlivas och obduceras överlevande djur.

1.5. Kvalitetskriterier

Inga.

1.6. Metodbeskrivning

Förberedelser

I minst fem dagar före försöket skall djuren hållas under testbetingelser vad beträffar miljö och utfodring. Före försöket fördelas unga friska djur slumpmässigt i behandlings- och kontrollgrupper.

Testämnet kan tillföras via fodret eller i kapslar om detta är lämpligare. Samma tillförselmetod skall användas för alla djur under hela behandlingsperioden. Om vehikel eller annan tillsats används för att underlätta doseringen skall det vara fastställt att de inte framkallar några toxiska verkningar. I lämpliga fall kan tidigare insamlade data användas.

Försöksbetingelser

Försöksdjur

Det vanligen nyttjade försöksdjuret (icke-gnagare) är hunden, som helst skall vara av en definierad ras. Andra icke-gnagare får användas. Unga friska djur skall användas och i fråga om hundar skall dosering helst inledas mellan fyra och sex månaders ålder och och inte senare än nio månaders ålder. Om ett test av subkronisk toxicitet med oral tillförsel utförs som en förundersökning till en långtidsundersökning skall samma art/ras användas i båda undersökningarna.

Antal och kön

Minst åtta djur (fyra hondjur och fyra handjur) skall användas på varje doseringsnivå. Antal överlevande djur vid försökets avslutning skall vara tillräckligt högt för att säkerställa en meningsfull utvärdering av toxiska verkningar.

Dosnivåer

Minst tre dosnivågrupper och en kontrollgrupp skall användas. Djuren i kontrollgruppen skall behandlas på samma sätt som djuren testgrupperna, bortsett från att de inte skall tillföras testämnet. Den högsta dosnivån bör medföra toxiska verkningar men inga dödsfall. Den lägsta dosnivån bör inte ge några tecken på toxicitet. Om det finns en användbar uppskattning av människans exponering för ämnet skall den lägsta nivån vara högre än denna. Idealt skall medeldosen medföra minsta möjliga observerbara toxiska verkningar. Om fler än en medeldos används skall dosnivåerna väljas på ett sådant sätt att en gradering av de toxiska verkningarna erhålls.

I de grupper som behandlas med låg- och medeldoser och i kontrollgruppen bör inga dödsfall förekomma.

Om ämnen med låg toxicitet tillförs via fodret är det viktigt att säkerställa att mängden av det aktuella testämnet inte påverkar normala näringskrav.

Om testämnet tillförs via fodret kan antingen en konstant koncentration (ppm eller mg/kg foder) eller en konstant koncentration i förhållande till djurens kroppsvikt användas. Det alternativ som används skall anges. Om ett testämne tillförs direkt, t. ex. via en kapsel, skall dosen ges vid samma tid varje dag och dosnivåerna skall vid behov justeras varje vecka för att hålla dosnivån konstant i förhållande till djurens kroppsvikt. Om ett test av subkronisk toxicitet genom oral tillförsel utförs som en förundersökning till en långtidsundersökning skall samma foder användas i båda undersökningarna.

Gränstest

Om ett 90-dagarsförsök som utförs i enlighet med nedan beskrivna metod och med en dosnivå på 1 000 mg/kg kroppsvikt och dag, eller en högre dosnivå om detta motiveras av kännedom om eventuell exponering för människor, inte medför några tecken på toxiska verkningar kan ytterligare tester anses vara överflödiga. Om ett testämne med låg toxicitet tillförs via fodret är det viktigt att säkerställa att mängden av och egenskaperna hos den aktuella testämnet inte påverkar normala näringskrav.

Observationsperiod

Samtliga djur skall observeras dagligen och tecken på toxicitet skall registrera tillsammans med tidpunkten då de uppträdde för första gången samt graden och varaktigheten av toxiciteten. Tidpunkten för dödsfall och tidpunkten då tecken på toxicitet uppträder och försvinner skall registreras.

Förfarande

Idealt tillförs testämnet varje dag i 90 dagar. Av främst praktiska skäl är det emellertid godtagbart med dosering fem dagar i veckan om ämnet tillförs på annat sätt än via fodret.

Observation av djuren i burarna skall omfatta hud- och pälsförändringar, ögon och slemhinnor och även respirations- och cirkulationssystem, autonoma och centrala nervsystemet samt kroppsmotorik och beteendemönster. Foderintaget (och vattenkonsumtionen om testämnet tillförs via dricksvattnet) skall mätas varje vecka och djuren skall vägas en gång i veckan.

Det är nödvändigt att observera djuren regelbundet för att säkerställa att så få djur som möjligt faller bort från studien till följd av kannibalism, autolys av vävnader eller förväxling. I slutet av testeperioden avlivas och obduceras alla överlevande djur, utom djuren i satellitgruppen. Så snart döende djur upptäcks skall dessa avlägsnas och obduceras.

Följande undersökningar skall utföras på alla djur, inbegripet kontrollgruppen:

a) En oftamologisk undersökning med användning av ett oftalmoskop eller liknande lämplig utrustning skall utföras innan testämnet tillförs samt sedan försöket avslutats, helst på alla djur men åtminstone på djuren i högdos- och kontrollgrupperna. Om förändringar i ögonen observeras skall alla djur undersökas.

b) En hematologisk undersökning, inbegripet hematokrit- och hemoglobinkoncentration, erytrocyträkning, total och differentiell leukocyträkning, mätning av koagulationsnivån, t. ex. koagulationstid, protombintid, tromboplastintid eller blodplättsräkning, skall företas i början av försöket, och sedan antingen varje månad eller när halva försökstiden har gått, och slutligen i slutet av försöksperioden.

c) En klinisk-biokemisk blodanalys skall företas i slutet av försöksperioden. För denna undersökning är följande analyser lämpliga: elektrolytbalans, kolhydratmetabolism, lever- och njurfunktion. Valet av specifika analyser kommer att påverkas av observationer av testämnets verkningssätt. Följande bestämningar föreslås: kalcium, fosfor, klorid, natrium, kalium, fasteglukos (fasteperioden beror på djurarten), glutaminsyra-pyrodruvsyra-transaminas(4), glutaminsyra-oxalättiksyra-transaminas(5), ornitin dekaroxylas, gamma-glutamyl-transpeptidas, urinkväve, albumin, blod-kreatinin, totalt bilirubin och totalt serumprotein. Andra bestämningar som kan vara nödvändiga för en tillfredsställande toxikologisk bedömning inbegriper analyser av lipider, hormoner, syra/basbalans, methemoglobin och kolinesterasaktivitet. Ytterligare klinisk-biokemiska analyser kan utföras då sådana behövs för en vidare undersökning av observerade verkningar.

d) En urinanalys krävs i regel inte, men kan dock vara nödvändig om en toxisk verkan förväntas eller observeras.

Makroskopisk undersökning

Alla djur bör underkastas en fullständig makroskopisk undersökning som inbegriper undersökning av alla externa kroppsytor, alla kroppsöppningar liksom kranie-, bröstkorgs- och bukhålan samt deras innehåll. Lever, njurar, binjurar och testiklar skall vägas våta så snart som möjligt efter dissektion för att undvika uttorkning.

Följande vävnader och organ bör bevaras i lämpligt medium för eventuell senare histopatologisk undersökning: alla vävnader och organ som uppvisar lesioner, hjärnan inbegripet snitt av medulla/pons, lillhjärnbarken och hjärnbarken, hypofysen, sköldkörteln/bisköldkörteln, thymusvävnad, (luftstrupe) och lungor, hjärta, stora kroppspulsådern, spottkörtlar, lever, mjälte, njurar, binjurar, bukspottskörtel, könskörtlar, livmoder, (associerade könsorgan), (hud), matstrupe, magsäck, tolvfingertarm, tomtarmen, ileum, cekum, colon, ändtarm, urinblåsan, representativa lymfkörtlar, (kvinnliga bröstkörtlar), (lårmuskulatur), nerver från det perifera nervsystemet, bröstbenet med benmärg, (ögon), (femur, inbegripet ledyta), (ryggmärg på tre nivåer vid halsen, mitt för bröstkorgen och från ländområdet). De vävnader som anges inom paranteser behöver endast undersökas om det finns tecken på toxicitet eller i samband med målorgan.

Histopatologisk undersökning

En fullständig histopatologisk undersökning skall utföras på organ och vävnader från kontroll- och högdosgrupperna. Ytterligare histopatologiska undersökningar av andra dosgrupper bör utföras på organ som utvisar lesioner i högdosgruppen, eller för vilka kliniska obserationer påvisar behov av en sådan undersökning.

2. DATA

Data skall ställas upp i tabellform och för varje grupp anges antal djur vid försökets inledning, antal djur med lesioner och procent djur som uppvisar varje slag av lesion. Resultaten skall utvärderas på grundval av en lämplig statistisk metod. Alla erkända statistiska metoder får användas.

3. RAPPORTERING

3.1. Testrapport

Testrapporten skall om möjligt innehålla följande:

- Djurart, stam, härkomst, miljöbetingelser, foder.

- Försöksbetingelser.

- Dosnivåer (med angivande av vehikel om sådan använts) och koncentrationer.

- Uppgifter om toxisk reaktion efter kön och dosnivå.

- Icke toxisk dos, om sådan fastställts.

- Tidpunkt för dödsfall under försöket eller överlevnad till slutet av försöket.

- Beskrivning av toxiska och andra verkningar (särskilt kliniska rön).

- Tidpunkt för observation av varje abnormalt tecken och dess senare utveckling.

- Uppgifter om foder och kroppsvikt.

- Oftamologiska rön.

- Hematologiska undersökningar och alla resultat.

- Använda klinisk-biokemiska tester och alla resultat (inbegripet resultat av en eventuell urinanalys).

- Obduktionsrön.

- Detaljerad beskrivning av alla histopatologiska rön.

- Statistisk behandling av resultaten i lämpliga fall

- Diskussion om resultaten.

- Tolkning av resultaten.

3.2. Utvärdering och tolkning

Se allmän inledning till del B.

4. REFERENSER

Se allmän inledning till del B.

TEST AVSEENDE SUBKRONISK DERMAL TOXICITET 90 DAGARS REPETERAD DERMALTEST PÅ GNAGARE

1. METOD

1.1. Inledning

Se allmän inledning till del B.

1.2. Definitioner

Se allmän inledning till del B.

1.3. Referensämnen

Inga.

1.4. Testmetodsprincip

Testämnet appliceras dagligen på huden i graderade doser till flera grupper av försöksdjur, en bestämd dos per grupp i 90 dagar. Under försöksperioden skall djuren observeras dagligen för tecken på toxicitet. Djur som dör under försöket obduceras och i slutet av försöket avlivas och obduceras överlevande djur.

1.5. Kvalitetskriterier

Inga.

1.6. Metodbeskrivning

Förberedelser

I minst fem dagar före försöket skall djuren hållas under testbetingelserna vad beträffar miljö och utfodring. Före försöket fördelas unga friska djur slumpmässigt i behandlings- och kontrollgrupper. Kort innan försöket klipps ryggpälsen bort på försöksdjuren. Om pälsen rakas bort bör detta ske ca 24 timmar innan försöket inleds. Klippning och rakning måste normalt upprepas varje vecka. Vid klippning eller rakning skall försiktighet iakttas så att huden inte skadas. Minst 10 % av djurets kroppsyta skall göras klar för applicering av testämnet. Djurets vikt måste beaktas vid bestämning av hur stort område som skall klippas. Vid test av fasta ämnen, vilka vid behov kan pulveriseras, skall testämnet fuktas tillräckligt med vatten eller, vid behov, med lämplig vehikel, för att säkerställa god kontakt med huden. Flytande testämnen används vanligen outspädda. Daglig applicering fem till sju dagar i veckan skall ske.

Försöksbetingelser

Försöksdjur

Vuxna råttor eller kaniner får användas. Andra djurarter kan användas men detta måste motiveras. Djur av vanligen nyttjade laboratoriestammar skall användas. Vid inledning av försöket får vikten hos de djur som används inte avvika mer än ± 20 % från genomsnittsvikten. Om ett test av subkronisk toxicitet med dermal tillförsel utförs som en förundersökning till en långtidsundersökning skall samma djurart och stam användas i båda under-sökningarna.

Antal och kön

Minst 20 djur (10 hondjur och 10 handjur) med frisk hud skall användas på varje doseringsnivå. Hondjuren får inte ha fött ungar och får inte vara dräktiga. Vid planenligt avlivande av försöksdjur under försöket skall det ursprungliga antalet djur ökas med det antal djur som planenligt skall avlivas innan försöket slutförs. Dessutom kan en satellitgrupp bestående av 20 djur (10 av vardera kön) behandlas med den högsta dosen i 90 dagar och därefter observeras i 28 dagar för reversibilitet, persistens eller fördröjt uppträdande av toxiska verkningar.

Dosnivåer

Minst tre dosnivågrupper och en kontrollgrupp skall användas. Om vehikel används skall, förutom kontrollgruppen, en vehikelkontrollgrupp användas. Exponeringsperioden bör vara minst sex timmar per dag. Applicering av testämnet bör ske vid samma tidpunkt varje dag och den mängd ämne som används skall justeras regelbundet (varje eller varannan vecka) för att säkerställa att den hålls konstant i förhållande till djurets kroppsvikt. Djuren i kontrollgrupen skall behandlas på samma sätt som försöksdjuren, bortsett från applicering av testämnet. Om vehikel används för att underlätta doseringen skall vehikelkontrollgruppen doseras på samma sätt som försöksgrupperna och ges samma mängd ämne som den som appliceras på djuren i den försöksgrupp med den den högsta doseringsnivån. Den högsta doseringsnivån bör medföra toxiska verkningar men inte leda till någon, eller endast begränsad, dödlighet. Den lägsta doseringsninvån bör inte ha någon toxisk verkan. Om det finns en användbar uppskattning av människors högsta exponering för ämnet bör den lägsta dosnivån vara högre än denna. Idealt skall medeldosen medföra minsta möjliga observerbara toxiska verkningar. Om flera medel-dosnivåer används skall de väljas på ett sätt att en gradering av de toxiska verkningarna. erhålls. I lågdos-, medeldos- och kontrollgrupperna bör antalet dödsfall vara få för att möjliggöra en meningsfull utvärdering av resultaten.

Om testämnet medför allvarlig hudirritation bör koncentrationen sänkas, vilket kan leda till en minskning eller ett fullständigt bortfall av de övriga toxiska verkningarna vid den högsta doseringsnivån. Om huden har skadats allvarligt kan det vara nödvändigt att avbryta försöket och utföra ett nytt försök med en lägre koncentration.

Gränstest

Om en dos av 1 000 mg/kg kroppsvikt och dag eller en högre doseivå som fastställts på grundval av kännedom om exponering för människor, inte medför någon toxisk verkan kan ytterligare testning anses överflödig.

Observationsperiod

Samtliga djur skall observeras dagligen och tecken på toxicitet registreras. Tidpunkten för dödsfall och tidpunkten vid vilken tecken på toxicitet uppträder respektive försvinner skall registreras.

Förfarande

Djuren skall hållas i var sin bur. Idealt appliceras testämnet varje dag i 90 dagar.

Djur i en eventuell satellitgrupp som planerats för uppföljning bör hållas under observation i ytterligare 28 dagar utan applicering av testämne för att fastställa om de toxiska verkningarna försvinner eller håller i sig. Exponeringsperioden bör vara sex timmar per dag.

Testämnet skall appliceras jämnt över ett område som motsvarar ca 10 % av den total kroppsytan. Vid användning av kraftigt toxiska ämnen kan en mindre yta täckas, men ämnet skall appliceras på ytan i ett så tunt och jämnt lager som möjligt.

Testämnet hållas i kontakt med huden med en porös gaskompress och icke hudirriterande tejp. Testytan skall vidare täckas på lämpligt sätt för att säkerställa att gaskompressen och testämnet hålls på plats och att djuren inte kan svälja testämnet. För att förhindra att djuren intar testämnet kan rörelsehindrande anordningar användas, men total immobilisering rekommenderas inte.

I slutet av exponeringsperiodens skall resterande testämne avlägsnas, i lämpliga fall med vatten eller med annan lämplig metod för rengöring av huden.

Samtliga djur skall observeras dagligen och tecken på toxicitet skall registreras tillsammans med tidpunkten då de uppträdde för första gången samt graden och varaktigheten av toxiciteten. Observationer av djuren i burarna skall omfatta hud- och pälsförändringar, ögon, slemhinnor, respirations- och cirkulationssystem, autonoma och centrala nervsystemet, kroppsmotorik samt beteendemönster. Foderintag och djurens vikt skall registreras en gång i veckan. Det är nödvändigt att observera djuren regelbundet för säkerställa att så få djur som möjligt faller bort från studien till följd av kannibalism, autolys av vävnader eller förväxling. I slutet av testperioden avlivas och obduceras alla överlevande djur, utom djuren i satellitgruppen. Så snart döende djur upptäcks skall dessa avlägsnas, avlivas och obduceras.

Följande undersökningar utförs normalt på alla djur, inbegripet kontrollgruppen:

a) Innan testämnet appliceras samt sedan försöket avslutats utförs en oftamologisk undersökning med användning av ett oftalmoskop eller liknande lämplig utrustning, helst på alla djur men åtminstone på djuren i högdos- och kontrollgrupperna. Om förändringar i ögonen observeras skall alla djur undersökas.

b) Vid slutet av testperioden skall en hematologisk undersökning utföras, inbegripet hematokrit- och hemoglobinkoncentration, erytrocyträkning, total och differentiell leukocyträkning, mätning av koagulationsnivån, t. ex. koagulationstid, protombintid, tromboplastintid eller blodplättsräkning.

c) Vid slutet av försöksperioden skall en klinisk-biokemisk blod analys utföras. För denna undersökning är följande analysområden lämpliga: elektrolytbalans, kolhydratmetabolism, lever- och njurfunktion. Valet av specifika analyser kommer att påverkas av observationer av testämnets verkningssätt. Följande bestämningar föreslås: kalcium, fosfor, klorid, natrium, kalium, fasteglukos (fasteperioden beror på djurarten), glutaminsyra-pyrodruvsyra-transaminas(6), glutaminsyra-oxalättiksyra-transaminas(7), ornitin dekarboxylas, gamma-glutamyl-transpeptidas, urinkväve, albumin, blodkreatinin, totalt bilirubin och totalt serumprotein.

Andra bestämningar som kan vara nödvändiga för en tillfredsställande toxikologisk bedömning inbegriper analyser av lipider, hormoner, syra/basbalans, methemoglobin och kolinesterasaktivitet. Ytterligare klinisk-biokemiska analyser kan utföras då sådana behövs för en vidare undersökning av observerade verkningar.

d) En urinanalys krävs i regel inte, men kan dock vara nödvändig om en toxisk verkan förväntas eller observeras.

Om tidigare insamlade basdata är otillräckliga bör man överväga att bestämma hematologiska och klinisk-biokemiska parametrar innan man inleder försöket.

Makroskopisk undersökning

Alla djur bör underkastas en fullständig obduktion som inbegriper undersökning av alla externa kroppsytor, alla kroppsöppningar liksom kranie-, bröstkorgs- och bukhålan samt deras innehåll. Lever, njurar, binjurar och testiklar skall vägas våta så snart som möjligt efter dissektion för att undgå uttorkning. Följande vävnader och organ bör bevaras i ett lämpligt medium för en eventuell framtida histopatologisk undersökning: alla vävnader och organ som uppvisar lesioner, hjärnan inbegripet snitt av medulla/pons, lillhjärnbarken och hjärnbarken, hypofysen, sköldkörteln/bisköldkörteln, thymusvävnad, (luftstrupe) och lungor, hjärta, stora kroppspulsådern, spottkörtlar, lever, mjälte, njurar, binjurar, bukspottskörtel, könskörtlar, livmoder, associerade könsorgan, gallblåsa (om sådan finns), matstrupe, magsäck, tolvfingertarm, tomtarmen, ileum, cekum, colon, ändtarm, urinblåsan, representativa lymfkörtlar, (kvinnliga bröstkörtlar), (lårmuskulatur), nerver från det perifera nervsystemet, (bröstbenet med benmärg), (ögon), (femur, inbegripet ledyta), (ryggmärg på tre nivåer vid halsen, mitt för bröstkorgen och från ländområdet), och (exorbitala tårkörtlar). De vävnader som anges inom paranteser behöver endast undersökas om det finns tecken på toxicitet eller i samband med målorgan.

Histopatologisk undersökning

a) En fullständig histopatologisk undersökning skall utföras på obehandlad och behandlad hud och på organ och vävnader från alla djur i kontroll- och högdosegrupperna.

b) Alla allvarliga lesioner skall undersökas.

c) Målorgan i andra dosgrupper skall också undersökas.

d) Om råttor används skall lungorna från djur i låg- och medeldoserupperna undersökas histopatologiskt för tecken på infektion, eftersom detta ger en lämplig uppfattning om djurens hälsotillstånd. Ytterligare histopatologiska undersökningar av djur i dessa grupper krävs inte rutinmässigt, men organ som har uppvisat tecken på lesioner i högdosgruppen skall alltid undersökas.

e) Djur i en eventuell satellitgrupp bör underkastas en histopatologisk undersökning av de organ och vävnader som har visat tecken på toxisk verkan hos djur i de behandlade grupperna.

2. DATA

Data skall ställas upp i tabellform och för varje grupp skall anges antal djur i början av försöket, antal djur med lesioner och den procent djur som uppvisar varje slag av lesion. Resultaten skall utvärderas på grundval av en lämplig statistisk metod. Alla erkända statistiska metoder får användas.

3. RAPPORTERING

3.1. Testrapport

Testrapporten skall om möjligt innehålla följande:

- Djurart, stam, härkomst, miljöbetingelser, foder.

- Försöksbetingelser.

- Dosnivåer (med angivande av vehikel om sådan använts) och koncentrationer.

- Upplysningar om toxisk reaktion uppdelade efter kön och dos.

- Icke-toxisk dos, om sådan har fastställts.

- Tidpunkten för dödsfall under försöket eller överlevnad till slutet av försöket.

- Beskrivning av toxiska och andra verkningar.

- Tidpunkt för observation av varje abnormalt tecken och dess senare utveckling.

- Uppgifter om foder och kroppsvikt.

- Oftamologiska rön.

- Hematologiska undersökningar och samtliga resultat.

- Använda klinisk-biokemiska undersökningar och samtliga resultat (inbegripet resultat av en eventuell urinanalys).

- Obduktionsrön.

- Detaljerad beskrivning av alla histopatologiska rön.

- Eventuell statistisk bearbetning av resultaten.

- Diskussion av resultaten.

- Tolkning av resultaten.

3.2. Utvärdering och tolkning

Se den allmäna inledningen till del B.

4. REFERENSER

Se den allmäna inledningen till del B.

TEST AVSEENDE SUBKRONISK INHALATIONSTOXICITET 90 DAGARS REPETERAD INHALATIONSTEST PÅ GNAGARE

1. METOD

1.1. Inledning

Se allmän inledning till del B.

1.2. Definitioner

Se allmän inledning till del B.

1.3. Referensämnen

Inga.

1.4. Testmetodsprincip

Flera grupper av försöksdjur exponeras dagligen under en angiven period för graderade koncentrationer av testämnet, en bestämd koncentration per grupp i 90 dagar. Om vehikel används för att underlätta framtagning av lämplig koncentration av testämnet i luften, skall en kontrollgrupp som utsätts för vehiklen användas. Under försöksperioden observeras djuren dagligen för tecken på toxicitet. Djur som dör under testet skall obduceras och i slutet av testet avlivas och obduceras överlevande djur.

1.5. Kvalitetskriterier

Inga.

1.6. Metodbeskrivning

Förberedelser

I minst fem dagar före försöket skall djuren hållas under testbetingelser vad beträffar miljö och utfodring. Före testet fördelas friska unga djur slumpmässigt i behandlings- och kontrollgrupper. Vid behov kan en vehikel tillsättas för att underlätta framtagning av lämplig koncentration av testämnet i luften. Om vehikel eller annan tillsats används för att underlätta dosering skall det vara fastställt att den inte framkallar några toxiska verkningar. I lämpliga fall kan tidigare insamlade data användas.

Försöksbetingelser

Försöksdjur

Om det inte finns kontraindikationer skall i första hand råttor användas. Unga friska djur från vanligen nyttjade laboratoriestammar skall användas. Vid inledning av testet får vikten hos de djur som används inte avvika mer än ± 20 % från en lämplig genomsnittsvikt. Om ett test av subkronisk toxicitet genom inhalation utförs som en förundersökning till en långtidsundersökning skall samma djurart och stam användas i båda undersökningarna.

Antal och kön

Minst 20 djur (10 hondjur och 10 handjur) används på varje koncentrationsnivå. Hondjuren får inte ha fött ungar och får inte vara dräktiga. Vid planenligt avlivande av djur under testet skall det ursprungliga antalet djur ökas med det antal djur som planenligt skall avlivas innan studien slutförs. Dessutom kan en satellitgrupp bestående av 20 djur (10 av vardera könet) tillföras den högsta koncentrationen i 90 dagar och därefter observeras i 28 dagar för reversibilitet, persistens eller fördröjt uppträdande av toxiska verkningar.

Exponeringskoncentrationer

Minst tre koncentrationsnivågrupper och en kontrollgrupp eller en kontrollgrupp som tillförs vehikeln (i en koncentration som motsvarar den högsta koncentrationen av vehikeln) skall användas. Djuren i kontrollgruppen skall behandlas på samma sätt som djuren i behandlingsgrupperna, bortsett från att de inte skall utsättas för testämnet. Den högsta koncentrationsnivån bör medföra toxiska verkningar men inte leda till någon, eller begränsad, dödlighet. Den lägsta koncentrationsnivån skall inte medföra några tecken på toxicitet. Om det finns en användbar uppskattning av människans exponering för ämnet skall den lägsta nivån vara högre än denna. Idealt skall medelkoncentrationen ge minsta möjliga observerbara toxiska verkningar. Om fler än en medelkoncentration används skall koncentrationsnivåerna väljas på ett sådant sätt att en gradering av de toxiska verkningarna erhålls. I låg-, medelkoncentrations- och kontrollgrupperna skall antalet dödsfall vara få för att möjliggöra en meningsfull utvärderingen av resultaten.

Exponeringstid

Den dagliga exponeringsprioden är sex timmar och en jämn fördelning av koncentrationen i kamrarna måste säkerställas. Vid särskilda omständigheter kan även andra perioder användas.

Utrustning

Djuren skall testas med inhalationsutrustning som utformats så att den upprätthåller en dynamisk luftcirkulation med minst 12 luftväxlingar per timme, för att säkerställa en tillräcklig syrehalt och en jämnt fördelad exponerings-atmosfär. Om exponeringskammare används skall den vara så utformad att trängseln bland försöksdjuren minimeras och exponeringen för testämnet genom inhalation maximeras. Som en allmän regel för att säkerställa en stabil atmosfär i en kammare, skall försöksdjurens totala "volym" inte överstiga 5 % av exponeringskammarens volym. Exponeringen kan göras genom kammare för mun-näsa, enbart huvudet eller hela försöksdjurets kropp; vid användning av de två första metoderna minskar man möjligheten att testämnet upptas via andra vägar.

Observationsperiod

Alla försöksdjur skall observeras dagligen för tecken på toxicitet under hela försöket och under återhämtningsperioden. Tidpunkten för dödsfall och tidpunkten vid vilken tecken på toxicitet uppträder respektive försvinner skall registreras.

Förfarande

Djuren skall exponeras för testämnet dagligen, fem till sju dagar i veckan, i 90 dagar. En eventuell satellitgrupp avsedd för efterföljande observationer bör hållas under observation i ytterligare 28 dagar, utan tillförsel av testämne, så att man har möjlighet att registrera om de toxiska verkningarna försvinner eller persisterar. Temperaturen under försöket skall hållas vid 22 ± 3 C. Under ideala betingelser skall den relativa luftfuktigheten hållas mellan 30 % och 70 %, men i vissa fall (t. ex. test med aerosoler) kan detta vara praktiskt ogenomförbart. Under exponeringen skall djuren undanhållas foder och vatten.

Ett dynamiskt respirationssystem med ett lämpligt analytiskt kontrollsystem skall användas. Ett försökstest rekommenderas för att fastställa lämpliga exponeringskoncentrationer. Luftgenomströmningen skall justeras för att säkerställa att betingelserna är homogena i hela exponeringskammaren. Systemet skall vara sådant att det så snabbt som möjligt går att säkerställa stabila exponeringsbetingelser.

Följande skall mätning eller kontrollers:

a) Luftgenomströmningen: Luftgenomströmningen i kammaren skall helst kontrolleras fortlöpande.

b) Den faktiska koncentrationen av testämnet mätt i respirationszonen. Under den dagliga exponeringsperioden skall koncentrationen inte avvika mer än ± 15 % från den genomsnittliga koncentrationen. En sådan kontrollnivå kan emellertid var omöjlig att uppnå vid test med stoft och vissa aerosoler, och i sådana fall kan större avvikelser accepteras. Under inkörning av urustningen bör analys göras av partikelstorleken för att bestämma aerosolkoncentrationens stabilitet. Under exponeringen skall analyser göras så ofta som möjligt för att bestämma fördelningen av partikelstorleken.

c) Temperatur och luftfuktighet.

d) Under och efter exponering skall observationer göras och registreras systematiskt för varje enskilt djur. Alla djur skall observeras dagligen och tecken på toxicitet skall registeras, inbegripet när dessa tecken uppträder för första gången, hur länge de varar, och hur kraftiga de är. Inspektioner av djuren i burarna skall omfatta hud- och pälsförändringar, ögon, slemhinnor, respirations- och cirkulationssystem, autonoma och centrala nervsystemet samt kroppsmotorik och beteendemönster. Foderintaget och djurens vikt skall registreras en gång i veckan. Regelbunden inspektion av djuren är nödvändig för att minimera förlust av djur som ingår i försöket till följd av kannibalism, autolys av vävnader eller förväxling. Vid försökets avslutning skall alla överlevande djur avlivas och obduceras. Så snart döende djur upptäcks skall dessa avlägsnas och obduceras.

Alla djur inklusive kontrollgruppen genomgå följande undersökning:

a) Före exponering för testämnet samt sedan försöket avslutats skall en oftamologisk undersökning med användning av ett oftalmoskop eller liknande lämplig utrustning utföras, helst på alla djur men åtminstone på högdos- och kontrollgrupperna. Om förändringar i ögonen observeras skall alla djur undersökas.

b) Vid slutet av försöket skall en hematologisk undersökning utföras, inbegripet hematokrit, hemoglobinkoncentration, erytrocyträkning, total och differentiell leukocyträkning samt ett mått på koaguleringsförmågan, t. ex. koagulationstid, protombintid, tromboplastintid eller blodplättsräkning.

c) Vid slutet av försöksperioden skall en klinisk-biokemisk blodanalys utföras. För denna undersökning är följande analyser lämpliga: elektrolytbalans, kolhydratmetabolism, lever- och njurfunktion. Valet av specifika analyser kommer att påverkas av observationer av testämnets verkningssätt. Följande bestämningar föreslås: kalcium, fosfor, klorid, natrium, kalium, fasteglukos (fasteperioden beror pådjurarten), glutaminsyra-pyrodruvsyra-transaminas(8), glutaminsyra-oxalättiksyra-transaminas(9), ornitin dekarboxlas, gamma-glutamyltranspeptidas, urinkväve, albumin, blod-kreatinin, totalt bilirubin och totalt serumprotein.

Andra bestämningar som kan vara nödvändiga för en adekvat toxikologisk utvärdering inbegriper analyser av lipider, hormoner, syra/basbalansen, metehemoglobin och kolinesterasaktivitet. Ytterligare klinisk-biokemiska analyser kan vid behov utföras för att vidare utreda de observerade verkningar.

d) En urinanalys krävs i regel inte, men kan dock vara nödvändig om en toxisk verkan förväntas eller observeras.

Om tidigare insamlade grundläggande uppgifter är otillräckliga bör man överväga att bestämma hematologiska och klinisk-biokemiska parametrar innan man inleder försöket.

Makroskopisk undersökning

Alla försöksdjur skall genomgå en fullständig makroskopisk undersökning som inbegriper undersökning av alla externa kroppsytor, alla kroppsöppningar liksom kranie-, bröstkorgs- och bukhålan samt deras innehåll. Lever, njurar, binjurar och testiklar skall vägas våta så snart som möjligt efter dissektion för att undvika uttorkning. Följande vävnader och organ skall förvaras i lämpligt medium för eventuell senare histopatologisk undersökning: alla vävnader och organ som företer allvarliga lesioner, lungor som skall tas ut hela och oskadade, vägas och behandlas med ett lämpligt fixativ för att säkerställa att lungstrukturen bibehålls (perfusion med ett fixativ anses vara ett effektivt förfarande), vävnader i näs-svalgrummet, hjärnan inbegripet snitt av medulla/pons, lilllhjärnbarken och hjärnbarken, hypofysen, sköldkörteln/bisköldkörteln, thymusvävnad, luftstrupe och lungor, hjärta, stora kroppspulsådern, spottkörtlar, lever, mjälte, njurar, binjurar, bukspottskörtel, könskörtlar, livmoder, (associerade könsorgan), (hud), gallblåsa (om sådan finns), matstrupe, magsäck, tolvfingertarm, tomtarmen, ileum, cekum, colon, ändtarm, urinblåsan, representativa lymfkörtlar, (kvinnliga bröstkörtlar), (lårmuskulatur), nerver från det perifera nervsystemet, (ögon), bröstbenet med benmärg, (femur, inbegripet ledyta) och (ryggmärg på tre nivåer vid halsen, mitt för bröstkorgen och från ländområdet). De vävnader som anges inom parenteser behöver endast undersökas om det finns tecken på toxicitet eller i samband med målorgan.

Histopatologisk undersökning

a) En fullständig histopatologisk undersökning skall utföras på luftvägarna och andra organ och vävnader från alla djur i kontroll- och högdosgrupperna.

b) Alla allvarliga lesioner skall undersökas.

c) Målorganen från andra dosgrupper skall undersökas.

d) Lungor från djur i lågdos- och medeldosgrupperna skall underkastas en histopatologisk undersökning eftersom detta ger en lämplig uppfattning om djurens hälsotillstånd. Ytterligare histopatologiska undersökningar av djur från dessa grupper krävs inte rutinmässigt, men sådana organ som har visat tecken på förändringar i högdosgruppen skall alltid undersökas.

e) Om en satellitgrupp har använts bör en histopatologisk undersökning göras på sådana organ och vävnader som har visat tecken på toxisk verkan hos djur i behandlade grupperna.

2. DATA

Data skall ställas upp i tabellform och för varje grupp skall anges antalet djur i början av försöket, antal djur med lesioner och den procent djur som uppvisar varje slag av lesion. Resultaten skall utvärderas på grundval av en lämplig statistisk metod. Alla erkända statistiska metoder får användas.

3. RAPPORTERING

3.1. Testrapport

Testrapporten skall om möjligt innehålla följande:

- Djurart, stam, härkomst, miljöbetingelser, foder.

- Testbetingelser:

Beskrivning av exponeringsapparaturen: inklusive utformning, typ, dimensioner, luftkälla, system för framställning av finfördelade ämnen och aerosoler, metod att konditionera luften och sätt att hålla djuren i en försökskammare när sådan används. Utrustning för mätning av temperatur, luftfuktighet och finfördelade aerosolers koncentration och storlek skall beskrivas.

Exponeringsdata: Dessa skall ställas upp i tabellform och presenteras med medelvärden och ett spridningsmått (t. ex. standardavvikelse) och skall, om möjligt, omfatta

a) luftgenomströmningen genom inhalationsutrustningen,

b) luftens temperatur och fuktighet,

c) nominella koncentrationer (total mängd testämne som tillförts inhalationsutrustningen, dividerat med luftvolymen),

d) typ av vehikel, om sådan används,

e) faktiska koncentrationer i försökets respirationszon,

f) partiklarnas medianstorlek (i tillämpliga fall),

- Upplysningar om toxisk reaktion uppdelade efter kön och koncentration.

- Icke toxisk dos, om sådan har fastställts.

- Tidpunkten för dödsfall under testet eller överlevnad till slutet av testet.

- Beskrivning av toxiska och andra verkningar.

- Tidpunkten för observation av varje abnormt tecken och dess senare utveckling.

- Uppgifter om foder och kroppsvikt.

- Oftamologiska rön.

- Utförda hematologiska undersökningar och alla resultat.

- Utförda klinisk-biokemiska undersökningar och alla resultat (inbegripet resultat av en eventuell urinanalys).

- Obduktionsrön.

- detaljerad beskrivning av alla histopatologiska rön.

- Statistisk behandling av resultaten när detta är möjligt,

- Diskussion om resultaten,

- Tolkning av resultaten.

3.2. Utvärdering och tolkning

Se allmän inledning till del B.

4. REFERENSER

Se allmän inledning till del B.

TERATOGENICITETSTEST PÅ GNAGARE OCH ICKE-GNAGARE

1. METOD

1.1. Inledning

Se allmän inledning till del B.

1.2. Definitioner

Se allmän inledning till del B.

1.3. Referensämnen

Inga.

1.4. Testmetodsprinciper

Testämnet tillförs i graderade doser eller koncentrationer till flera grupper av dräktiga försöksdjur under åtminstone den del av dräktighetsperioden som omfattar organogenes, en dos per grupp. Kort före den förväntade födslotidpunkten avlivas moderdjuret, livmodern avlägsnas och innehållet undersöks. Denna testmetod omfattar toxicitet i embryo och foster.

1.5. Kvalitetskriterier

Inga.

1.6. Metodbeskrivning

Förberedelser

Unga friska vuxna hondjur, som inte har varit parade, som är ungefär lika gamla och av samma storlek acklimatiseras till laboratoriebetingelserna under fem dagar före försöket och paras därefter med handjur vars fruktbarhet är fastställd på förhand. Inseminerade hondjur födelas slumpmässigt i behandlingsgrupper.

Parning kan ske naturligt eller genom insemination. Hondjuren tillförs testämnet dagligen med början kort efter implantationen och därefter under hela organogenesperioden. Dagen innan den förväntade födslodagen avlägsnas fostret genom hysterektomi och undersöks för abnormiteter i organ eller skelett, inbegripet växtretardation, försenad benbildning och blödningar i tarmarna.

Försöksbetingelser

Försöksdjur

De vanligen nyttjade försöksdjuren är råttor, möss, hamstrar och kaniner. I första hand bör råttor och kaniner användas. Vanligen nyttjade laboratoriestammar skall användas. Stammarna skall inte ha låg fertilitet och bör vara kända för att reagera på teratogener. Djuren skall hållas i varsin bur.

Antal och kön

Minst 20 dräktiga råttor, möss eller hamstrar eller 12 dräktiga kaniner används på varje dosnivå. Syftet är att säkerställa att tilllräckligt många kullar erhålls för att kunna bedöma ämnets teratogena potential.

Dosnivåer

Minst tre olika dosnivågrupper och en kontrollgrupp skall användas. Om vehikel används bör även en vehikelkontrollgrupp användas. Om vehikel används måste dess toxikologiska verkningar vara kända. Den bör inte vara teratogenisk eller påverka reproduktionen. Djuren i kontrollgruppen/kontrollgrupperna skall behandlas på samma sätt som djuren i behandlingsgruppen, bortsett från att de inte skall tillföras testämnet. Såvida det inte finns begränsningar till följd av testämnet fysikaliska-kemiska egenskaper bör den högsta dosen under ideala omständigheter ha viss omedelbar observerbar toxicitet hos moderdjuret, t. ex. viktförlust, men inte leda till mer än 10 % dödlighet bland moderdjuren. Den lägsta dosen bör inte ha någon toxisk verkan. Medeldoser (eventuellt flera) graderas geometriskt mellan den högsta och den lägsta dosen.

Gränstest

Om ett testämne med låg toxicitet vid en dosnivå på 1 000 mg/kg kroppsvikt och dag inte medför några tecken på embryonal toxicitet eller teratogenicitet kan ytterligare tester anses vara överflödiga.

Exponeringstid

Som dag 0 i försöket räknas den dag då man (om det är möjligt) observerar en vaginalpropp och/eller sperma. Exponeringsperioden bör täcka den huvudsakliga delen av organogenes. Detta kan inträffa som dag 6 till 15 för råtta och mus, dag 6 till 14 för hamster eller dag 6 till 18 för kanin. Om dag 0 fastställs på grundval av parning eller artificiell insemination bör dessa perioder justeras genom att lägga till en dag före den förväntade födslodagen.

Observationstid

En noggrann klinisk undersökning skall utföras minst en gång om dagen. Ytterligare observationer bör göras dagligen och lämpliga åtgärder bör vidtas för att minimiera förlust av djur under försöket.

Förfarande

Testämnet tillförs oralt via magsond. Testämnet bör tillföras omkring samma tid varje dag.

Hondjuren behandlas med testämnet dagligen under en lämplig behandlingsperiod. Dosen kan baseras på honjurets kroppsvikt vid doseringsperiodens början eller så kan, med hänsyn till den snabba viktökning som sker under dräktigheten, djuren vägas regelbundet och dosen baseras på den senast registrerade vikten. Tecken på toxicitet skall registrera tillsammans med tidpunkten då de uppträdde för första gången samt graden och varaktigheten av toxiciteten. Hondjur som visar tecken på att abortera eller föda för tidigt skall avlivas och genomgå en makroskopisk undersökning. Observationen fortsätter efter doseringsperioden fram till omkring en dag före den beräknade födslotidpunkten. Syftet är att omfatta merparten av dräktighetsperioden men att undgå de tolkningssvårigheter som kan förekomma i samband med en naturlig födsel. Observationerna skall omfatta, men inte nödvändigtvis begränsas till hud- och pälsförändringar, ögon, slemhinnor, respirations- och cirkulationssystemen, autonoma och centrala nervsystemet samt kroppsmotorik och beteendemönster. Foderintaget skall mätas varje vecka och djuren skall vägas en gång i veckan.

Makroskopisk undersökning

Moderdjur som dör under eller i slutet av försöket skall undersökas makroskopiskt för strukturella abnormiteter eller patologiska förändringar som kan ha påverkat dräktigheten. Kort efter dödsfall avlägsnas livmodern och innehållet undersöks i syfte att fastställa eventuella döda foster på embryo- eller fosterstadiet och antalet levande foster. Vid dödsfall i livmodern är det normalt möjligt att uppskatta tidpunkten för dödsfallet. Hos råttor och kaniner kan antalet corpora lutea fastställas. Fostrens kön registreras och de vägs individuellt varvid vikten registreras och fostrens medelvikt beräknas. Sedan fostren avlägsnats undersöks varje foster externt. Hos råttor, möss och hamstrar förbereds mellan en tredjedel och hälften av varje kull och undersöks för abnormiteter i skelettet, medan den andra delen av kullen förbereds och undersöks för abnormiteter i mjukdelarna med användning av lämpliga metoder. Kaninfoster undersöks individuellt genom noggrann dissektion i syfte att fastställa abnormiteter i organ och därefter undersöka abnormiteter i skelettet.

2. DATA

Data skall ställas upp i tabellform och för varje grupp anges antal djur i början av försöket, antal djur som blev dräktiga, antal och procent levande foster och foster med eventuella mjukdels- eller skelettabnormiteter samt deras samhörighet till olika kullar. Utvärderingen av resltat skall grundas på en lämplig statistisk metod. Alla erkända statistiska metoder får användas.

3. RAPPORTERING

3.1. Testrapport

Testrapporten skall om möjligt innehålla följande uppgifter:

- Djurart, stam, härkomst, miljöbetingelser, foder.

- Försöksbetingelser.

- Doseringsnivå (med angivande av vehikel, om sådan använts) och koncentrationer.

- Uppgifter om toxisk reaktion uppdelade efter dos.

- Icke toxisk dos, om sådan fastställts.

- Tidpunkten för dödsfall under försöket eller överlevnad till slutet av försöket.

- Beskrivning av toxiska och andra verkningar.

- Tidpunkten för observation av varje abnormalt tecken och dess senare utveckling.

- Uppgifter om foder och kroppsvikt

- Dräktighetens längd och upplysningar för varje kull (inklusive historiska data).

- Uppgifter om fostrer (levande/döda, kön, mjukdels- och skelettabnormiteter).

- Uppgifter om kullar ((levande/döda, kön, mjukdels- och skelettabnormiteter för varje kull).

- Statistisk behandling av resultaten.

- Diskussion om resultaten.

- Tolkning av resultaten.

3.2. Utvärdering och tolkning

Se allmän inledning till del B.

4. HÄNVISNINGAR

Se allmän inledning till del B.

TEST AVSEENDE KRONISK TOXICITET

1. METOD

1.1. Inledning

Se allmän inledning till del B.

1.2. Definitioner

Se allmän inledning till del B.

1.3. Referensämnen

Inga.

1.4. Testmetodsprincip

Testämnet tillförs normalt sju dagar i veckan på lämpligt sätt till flera grupper av försöksdjur, en dos per grupp, under huvuddelen av deras livslängd. Under och efter exponering för testämnet observeras försöksdjuren dagligen för tecken på toxicitet.

1.5. Kvalitetskriterier

Inga.

1.6. Metodbeskrivning

Förberedelser

I minst fem dagar före försöket skall djuren hållas under testbetingelser vad beträffar miljö och utfodring. Före försöket fördelas friska unga djur slumpmässigt i behandlings- och kontrollgrupper.

Försöksbetingelser

Försöksdjur

I första hand skall råttor användas. På grundval av resultat från tidigare utförda undersökningar kan andra arter (gnagare eller icke-gnagare) användas. Unga friska djur av vanligen nyttjade laboratoriestammar skall användas och dosering skall inledas så snart som möjligt efter avvänjning.

I början av försöket får vikten hos de djur som används inte avvika mer än ± 20 % från genomsnittsvikten. Om ett test av subkronisk toxicitet utförs som en förundersökning till en långtidsundersökning skall samma djurart/ras och stam användas i båda undersökningarna.

Antal och kön

I fråga om gnagare skall minst 40 djur (20 hondjur och 20 handjur) användas för varje dosnivågrupp och för kontrollgruppen. Hondjuren får inte ha fött ungar och får inte vara dräktiga. Vid planenligt avlivande av försöksdjur under försöket skall det ursprungliga antalet djur ökas med det antal djur som planenligt skall avlivas innan försöket slutförs.

För icke-gnagare godkäns ett mindre antal djur, dock minst fyra till sex per grupp.

Dosnivåer och exponeringsperioder

Minst tre dosnivågrupper och en kontrollgrupp skall användas. Den högsta dosen bör ha en tydlig toxisk verkan utan att förorsaka omfattande dödlighet. Den lägsta dosen bör inte ha någon toxisk verkan.

Medeldosen (eventuellt flera) bör ligga mitt emellan den högsta och den lägsta dosen.

Vid val av dosnivåer bör hänsyn tas till data från tidigare tester av toxicitet.

Djuren exponeras normalt dagligen för testämnet. Om ämnet tillförs via dricksvattnet eller fodret bör detta finnas tillgänglig kontinuerligt.

Kontrollgrupper

En kontrollgrupp som i alla avseenden motsvarar de behandlade grupperna, bortsett från tillförseln av testämnet, skall användas.

Under särskilda omständigheter, t. ex. vid inhalationstester där aerosoler används, eller där en emulgator med okänd biologisk verkan används i tester med oral tillförsel, skall även en negativ motsvarande kontrollgrupp användas. Den negativa kontrollgruppen skall behandlas på samma sätt som försöksgrupperna, bortsett från exponering för testämne eller eventuell vehikel.

Tillförselvägar

Det finns två huvudsakliga tillförselvägar: oralt och genom inhalation. Valet av tillförselväg beror på testämnets fysikaliska och kemiska egenskaper och det sätt på vilket människor sannolikt exponeras för testämnet.

Derma tillförsel av testämnet är kopplat till en mängd praktiska problem. Om kronisk systemisk toxicitet är ett resultat av perkutan absorption framgår detta normalt genom en ytterligare test med oral tillförsel, kombinerat med kännedom om graden av perkutan absorption på grundval av tidigare perkutana toxicitetstester.

Tester med oral tillförsel

Om testämnet absorberas i mag-tarmkanalen och om människor utsätts för tillförsel genom ingestion, är oral tillförsel att föredra såvida inte kontraindiktioner föreligger.

Djuren tillförs testämnet via fodret, upplöst i dricksvattnet, eller i en kapsel.

Idealt tillförs djuren testämnet sju dagar i veckan eftersom en begränsning av doseringen till fem dagar i veckan kan leda till återhämtning eller abstinenstoxicitet mellan exponeringsperioderna, vilket kan påverka resultaten och utvärdering av resultaten. Av praktiska skäl godkänns dock dosering fem dagar i veckan.

Inhalation

Eftersom inhalationstester inbegriper mer komplexa tekniska problem än andra tillförselvägar för testämnen behövs en mer detaljerad vägledning av denna tillförselväg. Det bör påpekas att under vissa omständigheter kan intratrakeal instillation vara ett alternativ.

Försök med långtidsexponering utförs normalt på grundval av planerad exponering för människor. Djuren exponeras antingen fem dagar i veckan, sex timmar dagligen, sedan jämvikt uppnåtts för koncentrationen i kammaren (intermittent exponering), eller så utgår man från möjlig miljöexponering, varvid djuren exponeras sju dagar i veckan, 22-24 timmar om dagen sju dagar i veckan (kontinuerlig exponering), med omkring en timme om dagen vid ett bestämt klockslag för utfodring av djuren och rengöring av kamrarna. I båda fallen exponeras djuren normalt för bestämda koncentrationer av testämnet. En viktig skillnad mellan intermittent och kontinuerlig exponering, som man bör vara uppmärksam på, är att intermittent exponering inbegriper en exponeringsfri period av 17-18 timmar per dag, och en ännu längre period under helgerna, då djuren kan återhämta sig från verkningarna av varje daglig exponering.

Valet mellan intermittent och kontinuerlig exponering beror på syftet med försöket och den exponering för människor som simuleras. Man måste dock beakta en rad tekniska problem. Fördelen med kontinuerlig exponering, när det handlar om att simulera miljöbetingelser, kan t. ex. gå förlorad till följd av nödvändigheten att vattna och utfodra djuren under exponeringsperioden och även behovet av mer komplicerad (och pålitlig) teknik för generering och kontroll av aerosoler och luftfuktighet.

Exponeringskammare

Djuren skall testas i en inhalationskammare som utformats så att den upprätthåller en dynamisk luftcirkulation med minst 12 luftväxlingar per timme, för att säkerställa en tillräcklig syrehalt och en jämnt fördelad exponeringsatmosfär. Kontroll- och exponeringskammare skall vara identiska i fråga om konstruktion och utformning för att säkerställa att exponeringsförhållandena är de samma i alla avseende förutom exponering för testämnet. Ett normalt undertryck skall upprätthållas i kammaren för att förhindra att testämnet sipprar ut i det omgivande rummet. Exponeringskammaren skall vara så utformade att trängseln bland försöksdjuren minimeras. Som en allmän regel för att säkerställa en stabil atmosfär i en kammare, skall försöksdjurens totala "volym" inte överstiga 5 % av exponeringskammarens volym.

Följande skall mätas eller kontrolleras:

i) Luftgenomströmning: luftgenomströmningen i kammaren skall helst kontrolleras fortlöpande:

ii) Koncentration: Under den dagliga exponeringsperioden skall koncentrationen av testämnet inte avvika mer än ± 15 % från den genomsnittliga koncentrationen.

iii) Temperatur och luftfuktighet: För gnagare hålls temperaturen vid 22 ± 2 °C och fuktigheten i kammaren mellan 30 % och 70 %, förutom när vatten används för suspension av testämnet i kammarens atmosfär. Helst skall båda kontrolleras fortlöpande.

iv) Mätning av partikelstorlek: Om atmosfärer med flytande eller fasta aerosoler används i kammare bör man analysera fördelningen av partikelstorleken. Aerosolpartiklarna skall vara möjliga att inhalera för de försöksdjur som används. Provtagning skall ske av kammarens atmosfär i djurens respirationsszon. Luftproven skall vara representativa för den partikelfördelning som djurens exponeras för och det skall genom gravimetrisk analys vara möjligt att på grundval av desas luftprover beskriva hela aerosolen, även om en stor del av den inte är möjlig att inhalera. Under inkörning av urustningen bör analys göras av partikelstorleken för att bestämma aerosolkoncentrationens stabilitet. Under exponeringen skall analyser göras så ofta som det är nödvändigt för att korrekt bestämma om den fördelning av partikelstorleken som djuren exponeras för är konstant.

Exponeringsperiod

Exponeringsperioden skall vara minst 12 månader.

Förfarande

Observationer

En grundlig klinisk undersökning skall göras minst en gång om dagen. Andra observationer skall göras dagligen och lämpliga åtgärder skall vidtas för att minimera förlust av djur som ingår i studien, t. ex. skall djur som hittas döda obduceras eller nedfrysas, och svaga eller döende djur skall isoleras eller avlivas. Noggranna observationer är nödvändiga för säkerställa att så få djur som möjligt faller bort från studien till följd av sjukdom, kannibalism eller autolys av vävnader.

Klinska tecken, inbegripet neurologiska förändringar, förändringar i ögon och dödlighet skall registreras för alla djur. Tidpunkten då toxiska tecken uppträder för första gången, hur denna toxicitet utvecklas samt misstanke om förekomst av tumörer skall registreras.

Varje djur skall vägas en gång i veckan under försöksperiodens första 13 veckor och därefter minst en gång var fjärde vecka. Foderintaget skall fastställas en gång i veckan under försöksperiodens första 13 veckor och därefter ca var tredje månad, om inte hälsotillstånd eller förändring i kroppsvikt kräver annat.

Hematologisk undersökning

En hematologisk undersökning (t. ex. hemoglobinkoncentration, erytrocyträkning, total leukocyträkning, räkning av blotplättar samt mått på koaguleringsförmågan) skall företas efter tre månader, sex månader samt därefter ca var sjätte månad samt vid försökets avslutning på blodprover som i fråga om icke-gnagare tas på varje enskilt djur, och i fråga om råttor på tio djur av varje kön i alla grupper. Om det är möjligt skall proverna tas från samma råttor varje gång. I fråga om icke-gnagare skall dessutom ett prov tas innan försöket inleds.

Om kliniska observationer tyder på att djurens hälsotillstånd har försämrats under försöket skall en differentialräkning på prover från de ifrågavarande djuren företas.

En differentialräkning skall företas på prover från djur i den grupp som har varit exponerad för den högsta dosen och djur från kontrollgruppen. En differentialräkning på prover från djur i den grupp som har fått den näst högsta dosen skall endast företas om det är stor skillnad mellan den högst doserade gruppen och kontrollgruppen, eller om patologiska rön indicerar detta.

Urinanalys

Urinprov för analys skall tas från alla icke-gnagare och från tio råttor per kön i alla grupper, helst från samma råttor varje gång med samma intervaller som vid den hematologiska undersökningen. Följande undersökningar skall utföras på prover antingen från varje enskild djur eller, i fråga om gnagare, på en samlad urinprovs/kön/grupp:

- Utseende: volym och densitet för enskilda djur.

- Protein, glukos, keton, ockult blod (semikvantitativt).

- Sedimentmikroskopi (semikvantitativt).

Klinisk-kemisk undersökning

Omkring var sjätte månad samt vid försökets avslutning skall blodprov för klinisk-kemisk undersökning tas från varje enskild djur när det gäller icke-gnagare och tio råttor per kön i alla grupper, helst från samma råttor varje gång. I fråga om icke-gnagare skall dessutom prov tas innan försöket inleds. Plasma från proverna skall underkastas följande undersökningar:

- Total proteinkoncentration.

- Albuminkoncentration.

- Test av leverfunktion t. ex. alkalisk fosfataktivitet, glutaminsyra-pyrodruvsyra-transaminasaktivitet(10), och glutaminsyra-oxalättiksyra-transaminasaktivitet(11), gamma-glutamyl-transpeptidas, ornitin dekaroxylas.

- Kolhydratmetabolism, t. ex. fasteglukos.

- Test av njurfunktion, t. ex. urinämne.

Makroskopisk undersökning

Alla försöksdjur, även de som dör under försöket eller döende djur som avlivas, skall underkastas en fullständig makroskopisk undersökning. Vid avlivning skall blodprov tas från alla djur för differentialräkning. Alla makroskopiska synliga lesioner, tumörer eller lesioner som misstänks vara tumörer, skall bevaras. Makroskopiska observationer skall så långt det går korreleras med mikroskopiska rön.

Alla vävnader och organ bör bevaras för histopatologisk undersökning. Detta gäller normalt följande organ och vävnader: hjärnan(12), (medulla/pons, lillhjärnbarken och hjärnbarken), hypofysen, sköldkörteln (inbegripet bisköldkörteln), thymus, lungor (inbegripet luftstrupe), hjärta, stora kroppspulsådern, spottkörtlar, lever(3), mjälte, njurar(3), binjurar(3), matstrupe, magsäck, tolvfingertarm, tomtarmen, ileum, cekum, colon, ändtarm, livmoder, urinblåsan, lymfkörtlar, bukspottskörtel, könskörtlar(3), associerade könsorgan, kvinnliga bröstkörtlar, hud, muskulatur, nerver från det perifera nervsystemet, ryggmärg (på tre nivåer vid halsen, mitt för bröstkorgen och från ländområdet), bröstbenet med benmärg och femur (inbegripet ledyta) och ögon. Det bästa sättet att bevara lungor och urinblåsa är att blåsa upp dem med ett fixermedel. I samband med inhalationstester är det av grundläggande betydelse för de hispatologiska testerna att lungorna blåses upp. Vid särskilda tester såsom inhalationstester skall hela luftsystemet undersökas, inbegripet näsa, svalg och luftrör.

Om andra kliniska undersökningar utförs skall den information som erhålls från dessa finnas tillgänglig innan en mikroskopisk undersökning företas, eftersom detta kan vara av betydande värde för patologen.

Histopatologisk undersökning

Alla synliga förändringar, särskilt tumörer och andra lesioner som inträffar i ett organ skall undersökas mikroskopiskt. Dessutom rekommenderas följande:

a) Mikroskopisk undersökning av alla bevarade organ och vävnader med en fullständigt beskrivning av alla lesioner som påträffats i

1) alla djur som dog eller avlivades under försöket,

2) alla djur i högdos- och kontrollgrupperna.

b) Sådana organ eller vävnader som uppvisar abnormitet som orsakats av, eller kan ha orsakats av, testämnet skall även undersökas i lågdosgrupperna.

c) Om försöksresultaten visar på betydliga förändringar i djurets normala livslängd eller induktion av verkningar som kan påverka en toxisk reaktion, bör djuren i nästa lägre dosnivå undersökas i enlighet med ovan beskrivna riktlinjer.

d) Information om normalt förekommande lesioner hos den använda laboriatoriestammen, under samma laboratorievillkor, dvs. tidigare insamlade data, är oumbärligt för en korrekt bedömning av betydelsen av de förändringar som observerats i de behandlade djuren.

2. DATA

Data skall ställas upp i tabellform och för varje behandlingsgrupp skall anges antal djur i början av försöket, antal djur som uppvisar lesioner och den procentdel djur som uppvisar varje slag av lesion. Utvärderingen av resultaten bör ske på grundval av en lämplig statistisk metod. Alla erkända statisktiska metoder för användas.

3. RAPPORTERING

3.1. Testrapport

Testrapporten skall om möjligt innehålla följande uppgifter:

- Djurart, stam, härkomst, miljöbetingelser, foder.

- Försöksbetingelser:

Beskrivning av exponeringsapparaturen:

Inklusive utformning, typ, dimensioner, luftkälla, system för framställning av finfördelade ämnen och aerosoler, metod att konditionera luften och sätt att hålla djuren i en försökskammare när sådan används. Utrustning för mätning av temperatur, luftfuktighet och finfördelade aerosolers koncentration och storlek skall beskrivas.

Exponeringsdata:

Dessa skall ställas upp i tabellform och presenteras med medelvärden och ett spridningsmått (t. ex. standardavvikelse) och skall, om möjligt, omfatta

a) luftgenomströmningen genom inhalationsutrustningen,

b) luftens temperatur och fuktighet,

c) nominella koncentrationer (total mängd testämne som tillförts inhalationsutrustningen, dividerat med luftvolymen),

d) typ av vehikel, om sådan används;

e) faktiska koncentrationer i försökets respirationszon,

f) partiklarnas medianstorlek.

- Dosnivåer (med angivande av vehikel, om sådan har använts) och koncentrationer.

- Uppgifter om toxisk reaktion uppdelade efter kön och dos.

- Icke-toxisk dos, om sådan har fastställts.

- Tidpunkten för observation av varje abnormt tecken och dess senare utveckling.

- Beskrivning av toxiska och andra verkningar,

- Tidpunkten för observation av varje abnormt tecken och dess senare utveckling.

- Uppgifter om foder och kroppsvikt,

- Oftamologiska rön.

- Utförda hematologiska undersökningar och alla resultat.

- Utförda linisk-biokemiska undersökningar och alla resultat (inbegripet resultat av en eventuell urinanalys).

- Obduktionsrön.

- Detaljerad beskrivning av alla histopatologiska rön.

- Statistisk behandling av resultaten i lämpliga fall.

- Diskussion av resultaten.

- Tolkning av resultaten.

3.2. Utvärdering och tolkning

Se allmän inledning till del B.

4. HÄNVISNINGAR

Se allmän inledning till del B.

TEST AVSEENDE CANCEROGENICITET

1. METOD

1.1. Inledning

Se allmän inledning till del B.

1.2. Definitioner

Se allmän inledning till del B.

1.3. Referensämnen

Inga.

1.4. Testmetodsprincip

Testämnet tillförs normalt sju dagar i veckan på lämpligt sätt till flera grupper av försöksdjur, en bestämd dos per grupp under huvuddelen av deras livslängd. Under och efter exponering för testämnet observeras försöksdjuren dagligen för tecken på toxicitet, särskilt utveckling av tumörer.

1.5. Kvalitetskriterier

Inga.

1.6. Metodbeskrivning

I minst fem dagar före försöket skall djuren hållas under testbetingelser vad beträffar miljö och utfodring. Före försöket fördelas friska unga djur slumpmässigt i behandlings- och kontrollgrupper.

Försöksdjur

På grundval av resultaten från tidigare utförda tester kan andra arter (gnagare eller icke-gnagare) användas. Unga friska djur av vanligen nyttjade laboratoriestammar skall användas och dosering skall inledas så snart som möjligt efter avvänjning.

I början av försöket får vikten hos de djur som används inte avvika mer än ± 20 % från genomsnittsvikten. Om ett test av subkronisk toxicitet med oral tillförsel utförs som en förundersökning till en långtidsundersökning skall samma djurart användas i båda undersökningarna.

Antal och kön

I fråga om gnagare skall minst 100 djur (50 hondjur och 50 handjur) användas på varje dosnivå och för motsvarande kontrollgrupp. Hondjuren får inte ha fött ungar och får inte vara dräktiga. Vid planenligt avlivande av försöksdjur under försöket skall det ursprungliga antalet djur ökas med det antal djur som planenligt skall avlivas innan försöket slutförs.

Dosnivåer och exponeringsperioder

Minst tre dosnivågrupper skall användas förutom den motsvarande kontrollgruppen. Den högsta dosen bör framkalla minimala toxicitetstecken, t. ex. en liten minskning av kroppsviktstillväxten (mindre än 10 %), utan att leda till väsentliga ändringar av den normala livslängden, med undantag för fall av tumörer.

Den lägsta dosen bör inte påverka normal tillväxt, utveckling och livslängd eller framkalla några tecken på toxicitet. I allmänhet bör den lägsta dosen inte vara mindre än 10 % av den högsta dosen.

Medeldosen (eventuellt flera) bör ligga mitt emellan den högsta och den lägsta dosen.

Vid val av dosnivåer bör hänsyn tas till data från tidigare tester och undersökningar av toxicitet.

Djuren exponeras normalt dagligen. Om ämnet administreras via dricksvattnet eller fodret bör detta finnas tillgänglig kontinuerligt.

Kontrollgrupper

En motsvarande kontrollgrupp skall användas och behandlas på samma sätt som försöksgrupperna, bortsett från exponering för testämnet.

Under särskilda omständigheter, t. ex. vid inhalationstester där aerosoler används, eller där en emulgator med okänd biologisk verkan används i tester med oral tillförsel, används en ytterligare kontrollgrupp som inte skall exponeras för vehikel eller testämne.

Tillförselvägar

Det finns tre huvudsakliga tillförselvägar: oral tillförsel, dermal tillförsel respektive tillförsel genom inhalation. Valet av tillförselväg beror på testämnets fysikaliska och kemiska egenskaper och det sätt på vilket människor sannolikt exponeras för testämnet.

Oral tillförsel

Om testämnet absorberas i mag-tarmkanalen och om människor exponeras genom munnen, är test med oral tillförsel att föredra såvida inte kontraindikationer föreligger. Djuren tillförs testämnet via fodret, upplöst i dricksvattnet, eller via en kapsel.

Idealt skall djuren tillföras testämnet sju dagar i veckan eftersom en begränsning av doseringen till fem dagar i veckan kan leda till återhämtning eller abstinenstoxicitet mellan exponeringsperioderna, vilket kan påverka resultaten och efterföljande utvärdering. Av praktiska skäl godkänns dock dosering fem dagar i veckan.

Dermal tillförsel

Exponering på huden genom pensling kan väljas som modell för framkallande av hudlesioner i avsikt att simulera en huvudsaklig form av exponering för människor.

Tillförsel genom inhalation

Eftersom inhalationstester inbegriper mer komplexa tekniska problem än andra tillförselvägar för testämnen behövs en mer detaljerad vägledning av detta administrationssätt. Det bör påpekas att intratrakeal instillation kan vara ett alternativ under vissa omständigheter.

Försök med långtidsexponering utförs normalt på grundval av möjlig mänsklig exponering varvid djuren exponeras sex timmar om dagen fem dagar i veckan sedan jämvikt uppnåtts för koncentrationen i kammaren (intermittent exponering), eller så utgår man från möjlig miljöexponering varvid djuren exponeras sju dagar i veckan 22-24 timmar om dagen (kontinuerlig exponering) med omkring en timme om dagen vid ett bestämt klockslag för utfodring av djuren och rengöring av kamrarna. I båda fallen exponeras djuren normalt för bestämda exponeringskoncentrationer.

En viktig skillnad mellan intermittent och kontinuerlig exponering, som man bör vara uppmärksam på, är att intermittent exponering inbegriper en exponeringsfri period av 17-18 timmar per dag, och en ännu längre period under helgerna, då djuren kan återhämta sig från verkningarna av varje daglig exponering.

Valet mellan intermittent och kontinuerlig exponering beror på syftet med försöket och den mänskliga exponering som simuleras. Man måste dock ta hänsyn till en rad tekniska problem. Fördelen vid kontinuerlig exponering, när det handlar om att simulera miljöbetingelser, kan t. ex. gå förlorad till följd av nödvändigheten att vattna och utfodra djuren under exponeringsperioden och även behovet av bättre utvecklade (och pålitliga) tekniker för generering och kontroll av aerosoler och luftfuktighet.

Exponeringskammare

Djuren skall testas i en inhalationskammare som utformats så att den upprätthåller en dynamisk luftcirkulation med minst 12 luftväxlingar per timme, för att säkerställa en tillräcklig syrehalt och en jämnt fördelad exponeringsatmosfär. Kontroll- och exponeringskammare skall vara identiska i fråga om konstruktion och utformning för att säkerställa att exponeringsförhållandena är desamma i alla avseende förutom exponering för testämnet. Ett normalt undertryck skall upprätthållas i kammaren för att förhindra att testämnet sipprar ut i det omgivande rummet. Exponeringskammaren skall vara så utformade att trängseln bland försöksdjuren minimeras. Som en allmän regel för att säkerställa en stabil atmosfär i en kammare, skall försöksdjurens totala "volym" inte överstiga 5 % av exponeringskammarens volym.

Följande skall mätas eller kontrolleras:

i) Luftgenomströmningen: Luftgenomströmningen i kammaren skall helst kontrolleras fortlöpande.

ii) Koncentrationen: Under den dagliga exponeringsperioden skall koncentrationen inte avvika mer än ± 15 % från den genomsnittliga koncentrationen. Under hela försöksperioden skall den dagliga koncentrationen hållas så konstant som möjligt.

iii) Temperatur och luftfuktighet: För gnagare hålls temperaturen vid 22 ± 2 °C och fuktigheten i kammaren mellan 30 % och 70 %, förutom när vatten används för suspension av testämnet i kammarens atmosfär. Helst skall båda kontrolleras fortlöpande.

iv) Mätning av partikelstorlek: Om atmosfärer med flytande eller fasta aerosoler används i kammare bör man analysera fördelningen av partikelstorleken. Aerosolpartiklarna skall vara möjliga att inhalera för de försöksdjur som används. Provtagning skall ske av kammarens atmosfär i djurens respirationsszon. Luftproven skall vara representativa för den partikelfördelning som djurens exponeras för och det skall genom gravimetrisk analys vara möjligt att på grundval av desas luftprover beskriva hela aerosolen, även om en stor del av den inte är möjlig att inhalera. Under inkörning av urustningen bör analys göras av partikelstorleken för att bestämma aerosolkoncentrationens stabilitet och därefter skall analyser göras under exponeringsperioden så ofta som det är nödvändigt för att korrekt bestämma om den fördelning av partikelstorleken som djuren exponeras för är konstant.

Exponeringsperiod

En test för cancerogenicitet omfattar merparten av försöksdjurens normala livslängd. Om mus eller hamster används bör försöket vara i 18 månader, och om råttor används, i 24 månader. Vid användning av vissa djurstammar med längre livslängd och/eller en låg spontan förekomst av tumörer bör försöket vara i 24 månader med mus och hamster och i 30 månader med råtta. Det accepteras dock att ett sådant förlängt försök avslutas när antalet överlevande djur i den grupp som exponeras för den lägsta dosen, eller kontrollgruppen har nått 25 %. Om det är en uppenbar skillnad i djurens kön bör varje kön betraktas som ett försök för sig själv, och försökets längd anpassas till detta. Om prematura dödsfall uppträder i den grupp som exponeras för den högsta dosen och om det är uppenbart att detta orsakats av toxiska verkningar, är det inte nödvändigt att avsluta försöket, under forutsättning att de toxiska verkningarna inte skapar problem i andra grupper. För att ett negativt testresultat skall kunna accepteras får högst 10 % av varje grupp falla utanför försöket på grund av autolys av vävnader, kannibalism eller praktiska problem, och överlevandeprocenten i alla grupper får inte vara lägre än 50 % efter 18 månaders försök med användning av mus och hamster, och efter 24 månader med användning av råtta.

Förfarande

Observationer

Daglig observation av djuren i burarna skall omfatta hud- och pälsförändringar, ögon, slemhinnor, respirations- och cirkulationssystem, autonoma och centrala nervsystemet samt kroppsmotorik och beteendemönster.

Det är nödvändigt att observera djuren regelbundet för säkerställa att så få djur som möjligt faller bort från studien till följd av kannibalism, autolys av vävnader eller förväxling. Så snart döende djur upptäcks skall dessa avlägsnas, avlivas och obduceras.

Kliniska tecken och dödlighet skall registreras för varje djur. Särskilt uppmärksamhet skall ägnas åt tumörutveckling: den tidpunkt då tecken uppträder för första gången, lokalisering, dimensioner, framträdande och utveckling av varje tydligt synliga eller palpabla tumörer.

Foderintaget (och vattenkonsumtionen om testämnet tillförs via dricksvattnet) skall mätas en gång i veckan under försöksperiodens första 13 veckor och därefter omkring var tredje månad, såvida inte djurens hälsotillstånd eller förändring av kroppsvikt kräver annat.

Varje enskild djur skall vägas en gång i veckan under försöksperiodens första 13 veckor och därefter minst en gång var fjärde vecka.

Kliniska undersökningar

Hematologisk undersökning

Om kliniska observationer av djuren i burarna tyder på att djurens hälsotillstånd har försämrats under försöket skall en differentialräkning på prover från de ifrågavarande djuren företas.

Efter 12 månader, 18 månader och innan djuren avlivas skall ett blodutstryk tas från varje djur. En differentialräkning skall företas på prover från djur i den högdos- och kontrollgrupperna. Om dessa data, särskilt de som tagits fram strax innan avlivning, eller data från den patologiska undersökningen så kräver, skall en differentialräkning företas på djur i den grupp som har fått den näst högsta dosen.

Makroskopisk undersökning

Alla försöksdjur, även de som dör under försöket eller döende djur som avlivas under försöket skall genomgå en fullständig makroskopisk undersökning. Alla makroskopiska synliga lesioner, tumörer eller lesioner som misstänks vara tumörer, skall bevaras.

Följande vävnader och organ bör bevaras i lämplig media för eventuell senare histopatologisk undersökning: hjärnan (inberipet snitt av medulla/pons, lillhjärnbarken och hjärnbarken), hypofysen, sköldkörteln och bisköldkörteln, thymusvävnad, luftstrupe och lungor, hjärta, stora kroppspulsådern, spottkörtlar, lever, mjälte, njurar, binjurar, buksp