KOMMISSIONENS DIREKTIV 92/95/EEG av den 9 november 1992 om ändring av bilagan till sjunde direktivet 76/372/EEG om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIV

med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekonomiska gemenskapen,

med beaktande av rådets direktiv 70/373/EEG av den 20 juli 1970 om införande av gemenskapsmetoder för provtagning och analys vid den officiella foderkontrollen(1), senast ändrat genom Anslutningsakten för Spanien och Portugal, särskilt artikel 2 i detta, och

med beaktande av följande:

Kommissionens sjunde direktiv 76/372/EEG av den 1 mars 1976 om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen(2), i dess lydelse enligt direktiv 81/680/EEG(3), föreskriver vilka metoder som skall användas för bestämning av aflatoxin B1.

Det finns anledning att anpassa dessa metoder med hänsyn till den vetenskapliga och tekniska utvecklingen. Det bör i synnerhet finnas en metod för kontroll av de mycket låga gränsvärden för aflatoxin som fastställs genom rådets direktiv 74/63/EEG av den 17 december 1973 om främmande ämnen och produkter i djurfoder(4), senast ändrat genom direktiv 91/132/EEG(5).

Det bör också finnas en metod för bestämning av aflatoxin B1 i närvaro av störande ämnen, t. ex. citruspulpa.

De åtgärder som anges i detta direktiv är förenliga med yttrandet från Ständiga foderkommittén.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Bilagan till direktiv 76/372/EEG skall ändras enligt bilagan till detta direktiv.

Artikel 2

Medlemsstaterna skall senast den 1 oktober 1993 sätta i kraft de lagar och andra författningar som är nödvändiga för att följa detta direktiv. De skall genast underrätta kommissionen om detta.

När en medlemsstat antar dessa bestämmelser skall de innehålla en hänvisning till detta direktiv eller åtföljas av en sådan hänvisning när de offentliggörs. Närmare föreskrifter om hur hänvisningen skall utformas skall varje medlemsstat själv utfärda.

Artikel 3

Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.

Utfärdat i Bryssel den 9 november 1992.

På kommissionens vägnar

Ray MAC SHARRY

Ledamot av kommissionen

(1) EGT nr L 170, 3.8.1970, s. 2.

(2) EGT nr L 102, 15.4.1976, s. 8.

(3) EGT nr L 246, 29.8.1981, s. 32.

(4) EGT nr L 38, 11.2.1974, s. 31.

(5) EGT nr L 66, 13.3.1991, s. 16.

BILAGA

I. Del A "Endimensionell tunnskiktskromatografi": Texten i punkt 1 "Syfte och användningsområde" skall ersättas med följande text:

"1. Syfte och användningsområde

Denna metod gör det möjligt att bestämma halten av aflatoxin B1 i råvaror och oblandade foder. Metoden kan inte användas i närvaro av citruspulpa. Den minsta mängd som kan bestämmas är 0,01 mg/kg (10 ppb).

I närvaro av störande substanser måste analysen upprepas med metod B (HPLC-metod, vätskekromatografi)."

II. Del B "Tvådimensionell tunnskiktskromatografi": Texten skall ersättas med följande text:

"B. BESTÄMNING AV AFLATOXIN B1. HPLC-METOD (vätskekromatografi).

1. Syfte och användningsområde

Denna metod är avsedd för bestämning av aflatoxin B1 i djurfoder, inklusive djurfoder som innehåller citruspulpa. Den minsta mängd som kan bestämmas är 0,001 mg/kg (1 ppb).

2. Princip

Provet extraheras med kloroform. Extraktet filtreras och ett delprov renas på en Florisil-kolonn och därefter på en C18-kolonn. Den slutliga separeringen och bestämningen görs med vätskekromatografi (HPLC), med användning av en omvänd-fas C18-kolonn för HPLC och därpå följande derivatisering med jod i vatten samt fluorescensdetektering.

Obs:

Mykotoxiner är mycket giftiga ämnen. De bör hanteras i ett speciellt dragskåp. Särskilda försiktighetsåtgärder bör vidtas när gifterna befinner sig i torrt tillstånd, eftersom de är elektrostatiska och har en tendens att spridas på arbetsplatsen.

3. Reagens

3.1 Kloroform, stabiliserad med 0,5 1,0 % (m/m) etanol. Se anmärkning 10.2.

3.2 Metanol, HPLC kvalitet för beredning av 3.6.

3.3 Aceton.

3.4 Acetonitril, HPLC kvalitet.

3.5 Elueringsmedel: Bered dagen före användningen eller avlägsna luften i lösningsmedlen med hjälp av ultraljud.

3.5.1 Aceton (3.3)/vatten, 98 + 2 (v + v).

3.5.2 Vatten/metanol (3.2), 80 + 20 (v + v).

3.5.3 Vatten/aceton (3.3), 85 + 15 (v + v).

3.6 Rörlig fas för HPLC.

Den rörliga fasen består av vatten, metanol (3.2) och acetonitril (3.4), 130+ 70+ 40 (v + v + v).

OBS: Den rörliga fasens sammansättning kan eventuellt behöva anpassas, beroende på vilken typ av HPLC kolonn som används.

3.7 Mättad jodlösning. Tillsätt 2 g jod till 400 ml vatten. Blanda under minst 90 min. och filtrera sedan genom ett membranfilter (4.15). Den mättade lösningen skyddas mot ljus för att förhindra fotokemisk nedbrytning.

3.8 Syratvättad Celite 545, eller motsvarande.

3.9 Florisil-kolonn (Waters SEP PAK), eller motsvarande.

3.10 C18 kolonn (Waters SEP PAK), eller motsvarande.

3.11 Inert gas, t. ex. kväve.

3.12 Aflatoxin B1, standardlösning i kloroform, koncentration 10ìg/ml. Kontrollera lösningens koncentration på följande sätt: Bestäm lösningens absorptionsspektrum till mellan 330 och 370 nm med hjälp av en spektrofotometer (4.23). Mät absorbansen (A) vid maximum nära 363 nm. Beräkna koncentrationen av aflatoxin B1 i ìg per ml lösning med formeln:

Koncentration (ìg/ml) = >NUM>312 × A × 1000/

>DEN>22300

=13,991 × A

3.12.1 Aflatoxin B1, stamlösning i kloroform.

Överför 2,5 ml aflatoxin B1, standardlösning (3.12), till en 50 ml mätkolv och fyll upp till märket med kloroform (3.1). Förvara lösningen svalt (4 °C), mörkt, väl tillsluten och invirad i aluminiumfolie.

3.13 Aflatoxin B1 kalibreringslösningar för HPLC.

OBS: Använd syratvättade glaskärl vid beredning av lösningarna.(Se punkt 4, Utrustning).

3.13.1 Kalibreringslösning 4 ng/ml.

Låt mätkolven med stamlösning (3.12.1) värmas till rumstemperatur i aluminiumfolien (några timmar). Överför 400 ìl av stamlösningen (200 ng aflatoxin B1) till en 50 ml mätkolv och indunsta till torrhet i en ström av inert gas (3.11). Lös upp återstoden i ca 20 ml vatten/aceton (3.5.3), fyll upp till märket med vatten/aceton och blanda väl.

3.13.2 Kalibreringslösning 3 ng/ml.

Överför 7,5 ml av kalibreringslösningen (3.13.1) till en 10 ml mätkolv, fyll upp till märket med vatten/aceton (3.5.3) och blanda väl.

3.13.3 Kalibreringslösning 2 ng/ml.

Överför 25 ml av kalibreringslösningen (3.13.1) till en 50 ml mätkolv, fyll upp till märket med vatten/aceton (3.5.3) och blanda väl.

Denna lösning kallas också referenslösning och används vid upprepad insprutning under HPLC (5.5).

3.13.4 Kalibreringslösning 1 ng/ml.

Överför 2,5 ml av kalibreringslösningen (3.13.1) till en 10 ml mätkolv, fyll upp till märket med vatten/aceton (3.5.3) och blanda väl.

3.14 Ampull med en blandning av aflatoxinerna B1, B2, G1 och G2 i koncentrationer på respektive ca 1, 0,5, 1 och 0,5 ìg/ml i 1 ml kloroform.

3.14.1 Kromatografisk testlösning.

Överför ampullens innehåll (3.14) till ett provrör med glaspropp eller flaska med skruvlock. Överför 40 ìl av lösningen till ett provrör med glaspropp (syratvättat) (4.22). Låt kloroformen avdunsta i en ström av inert gas (3.11) och lös åter upp i 10 ml vatten/aceton (3.5.3).

3.15 Reagens till kontrolltest (6).

3.15.1 Mättad natriumkloridlösning.

3.15.2 Vattenfritt granulerat natriumsulfat.

4. Utrustning

Varning! Om de glaskärl som används till vattenhaltiga aflatoxinlösningar inte är syratvättade kan detta leda till förluster. Nya glaskärl och glaskärl för engångsbruk bör hanteras särskilt försiktigt, t. ex småflaskor för provväxlare och Pasteurpipetter. Laboratorieglas som kommer i kontakt med vattenhaltiga aflatoxinlösningar bör därför läggas i blöt i utspädd syra (t. ex. svavelsyra = 2 mol/l) under flera timmar och därefter sköljas väl med destillerat vatten för att få bort all syra (t. ex. tre gånger, kontrollera med lackmuspapper). I praktiken krävs sådan behandling för den rundbottnade kolven (4.4), mätkolvar, mätglas, flaskor eller provrör som används till kalibreringslösningar och slutliga extrakt (särskilt småflaskor för provväxlare) och Pasteurpipetter, om sådana används för att överföra kalibreringslösningar eller extrakt.

4.1. Kvarn.

4.2. Såll med maskstorlek 1,0 mm, (ISO R 565).

4.3. Mekanisk skak.

4.4. Roterande vakuumtork, med rundbottnad kolv, 150 250 ml.

4.5. Utrustning för HPLC vätskekromatografi, injektor med en loop lämpad för insprutning av 250 ìl. Se tillverkarens instruktioner för hur loopen skall fyllas, helt eller delvis.

4.6. HPLC analyskolonn packad med C18 partiklar på 3 ìm eller 5 ìm.

4.7. Pulsfri pump för tillförsel av jodreagens efter kromatografering på kolonn.

4.8. Valco`s dödvolymskoppling (T-modell), rostfritt stål (1/16" x 0,75 mm).

4.9. Spiralformad reaktionsslinga i teflon eller rostfritt stål. Dimensioner på 3 000 x 0,5 mm till 5 000 x 0,5 mm har visat sig passa till 5 ìm eller 3 ìm HPLC-kolonner.

4.10. Vattenbad med termostatkontroll, inställt på 60 °C. Temperaturvariationen skall kunna hållas under 0,1 °C.

4.11. Fluorescensdetektor, med 365 nm exciteringsvåglängd och 435 nm emissionsvåglängd. (För filterinstrument: emissionsvåglängd > 400 nm). Det skall vara möjligt att påvisa minst 0,05 ng aflatoxin B1. Det kan vara lämpligt att använda ett visst mottryck (t. ex. tryckrestriktor, dvs. en spiral av teflon eller rostfritt stål förbunden med detektorns utgång), för att få bort luftbubblor i flödescellen.

4.12. Skrivare.

4.13. Elektronisk integrator (valfritt).

4.14. Veckat pappersfilter, 24 cm i diameter, Macherey-Nagel 617

>NUM>1/

>DEN>4

eller motsvarande.

4.15. Membranfilter med en porositet på 0,45 ìm, Millipore HAWP 04700 eller motsvarande.

4.16. 500 ml konisk kolv, med glaspropp.

4.17. Glaskolonn (inre diameter ca 1 cm, längd ca 30 cm), utrustad med Lueranpassad spets.

4.18. Kloroformresistent Lueranpassad kran (t. ex. Bio-rad 7328017, Analytichem A1 6078, J. T. Baker 4514 eller motsvarande).

4.19. Kemiskt resistent spruta, 10 ml, med Luerfattning.

4.20. Spruta för HPLC-insprutning av 250 ìl (se 4.5).

4.21. 100 ìl mikrospruta för beredning av kalibreringslösningar. (Kontrollera genom vägning att noggrannheten ligger inom 2 %.)

4.22. 10 ml graderade mätkolvar med glaspropp.

4.23. Spektrofotometer för mätning inom spektrats UV-område.

4.24. Utrustning för kontrolltest (6).

4.24.1 .Syratvättad 100 ml separertratt med teflonkran.

4.24.2. Värmeenhet, 40 50 °C.

5. Utförande

5.1. Provberedning

Mal provet så att det går igenom sållet (4.2.).

5.2. Analysprov

Väg upp 50 g av det preparerade provet i den koniska kolven (4.16).

5.3. Extraktion

Tillsätt 25 g Celite (3.8), 250 ml kloroform (3.1) och 25 ml vatten till analysprovet (5.2). Tillslut kolven och skaka under 30 min på en mekanisk skak (4.3). Filtrera genom ett veckat filter (4.14). Samla upp 50 ml av filtratet. Tag vid behov ett delprov av filtratet och späd med kloroform till 50 ml så att koncentrationen av aflatoxin B1 inte överstiger 4 ng/ml.

5.4. Rening (Reningen bör utföras utan betydande avbrott).

Varning!

- Laboratoriet där analyserna utförs skall omsorgsfullt skyddas mot dagsljus. Detta kan ske med hjälp av:

1) UV-absorberade beläggning på fönsterrutorna och dämpat ljus (ej direkt solljus).

2) Gardiner eller persienner och artificiellt ljus (lysrör kan accepteras).

- Lösningar som innehåller aflatoxin skall i möjligaste mån skyddas mot ljus (förvara mörkt, använd aluminiumfolie).

5.4.1. Rening på Florisil SEP PAK

5.4.1.1. Preparering av kolonnuppställningen

Montera en kran (4.18) på den korta delen av Florisil-kolonnen (3.9) (se bild 1). Tvätta kolonnen och avlägsna luften genom att ta 10 ml kloroform (3.1) och låta 8 ml gå genom kranen och snabbt passera kolonnen med hjälp av en spruta (4.19). Anslut Florisil-kolonnens långa del till en glaskolonn (4.17) och låt resterande 2 ml kloroform passera genom kolonnen till glaskolonnen. Stäng kranen. Ta bort sprutan.

5.4.1.2. Rening

Filtratet som samlats upp i 5.3 placeras på kolonnuppställningen och får rinna ut med hjälp av tyngdkraften. Skölj med 5 ml kloroform (3.1) och därefter med 20 ml metanol (3.2). Kassera elueringsvätskorna. Se till att kolonnuppställningen inte blir torr under processen. Eluera aflatoxin B1 med 40 ml aceton/vatten (3.5.1) och samla upp allt eluat i den rundbottnade kolven på den roterande torken (4.4). Koncentrera eluatet på den roterande torken vid 40 50 °C tills destillationen av aceton avstannat. (OBS: Ca 0,5 ml vätska finns då kvar i kolven. Försök har visat att ytterligare avdunstning inte är skadlig och att det inte finns kvar någon signifikant mängd aceton när 0,5 ml vätska återstår. Rester av aceton kan leda till förluster av aflatoxin B1 på C18 kolonnen). Tillsätt 1 ml metanol (3.2), snurra kolven så att aflatoxin B1 löses upp på kolvens sidor, tillsätt 4 ml vatten och blanda. Tag bort Florisil-kolonnen och kassera den. Skölj glaskolonnen med vatten och spara den för C18 reningen.

5.4.2. Rening på C18 SEP PAK

5.4.2.1. Preparering av kolonnuppställningen

Montera en kran (4.18) på den korta delen av C18 kolonnen (3.10) (se bild 1). Preparera kolonnen och avlägsna eventuell luft genom att med hjälp av en spruta (4.19) låta 10 ml metanol (3.2) gå genom kranen och snabbt passera kolven. (Luftbubblor i kolonnen syns som ljusa fläckar mot en i övrigt gråaktig bakgrund). Ta 10 ml vatten och låt 8 ml passera genom kolonnen. (Undvik att få in luft i kolonnen vid bytet från metanol till vatten). Anslut C18 kolonnens långa del till en glaskolonn (4.17) och låt resterande 2 ml vatten passera genom C18 kolonnen till glaskolonnen. Stäng kranen. Ta bort sprutan.

5.4.2.2. Rening

Överför extraktet som samlats upp i 5.4.1.2 till glaskolonnen (4.17), skölj kolven två gånger med 5 ml vatten/metanol (3.5.2) och låt rinna ut med hjälp av tyngdkraften. Se till att kolonnuppställningen inte blir torr under processen. (Om det bildas luftbubblor i den smala delen nära C18 kolonnen - stoppa flödet och slå lätt på övre delen av glaskolonnen så att luftbubblorna försvinner. Fortsätt sedan.) Eluera med 25 ml vatten/metanol. Kassera eluatet. Eluera aflatoxin B1 med 50 ml vatten/aceton (3.5.3) och samla upp allt eluat i en 50 ml mätkolv. Fyll med vatten till märket och blanda. Den provlösning som då erhålls används för kromatografi (5.5).

Varning! Filtrering av det slutliga extraktet före HPLC är normalt inte nödvändig. Om filtrering anses nödvändig får cellulosafilter inte användas eftersom de kan medföra förluster av aflatoxin B1. Teflonfilter kan accepteras.

5.5.HPLC, vätskekromatografi

(Se bild 2 för montering av utrustningen). Anslå tillräcklig tid för konditionering och stabilisering av instrumenten.

Anmärkning 1:

De flöden som anges för den rörliga fasen och för reagens efter kromatografering på kolonn är enbart vägledande. De kan behöva anpassas beroende på HPLC-kolonnens särskilda egenskaper.

Anmärkning 2:

Detektorvärdena för aflatoxin B1 är beroende av temperaturen och bör därför korrigeras för avvikelser (se bild 3). Genom att spruta in en bestämd mängd aflatoxin B1-referenslösning (3.13.3) med jämna mellanrum (dvs. var tredje insprutning), kan toppvärdena för aflatoxin B1 mellan referenslösningarna korrigeras genom användning av medelvärdet, förutsatt att skillnaden mellan värdena från de på varandra följande referenslösningarna är mycket liten ( 400 nm). Justera detektorkänsligheten så att 1 ng aflatoxin B1 ger ca 80 % av fullt utslag på skrivaren.

5.5.4. Injektor

Alla lösningar sprutas in i mängder på 250 ìl och enligt tillverkarens anvisningar.

5.5.5. Kontroll av den kromatografiska separationen

Spruta in den kromatografiska testlösningen (3.14.1). Lägsta höjden mellan två toppar skall vara lägre än 5 % av summan för de angränsande topparnas höjder.

5.5.6. Kontroll av systemets stabilitet

Spruta in referenslösning (3.13.3) före varje analysserie tills stabila toppytor ernås (OBS: Toppvärdena för aflatoxin B1 mellan på varandra följande insprutningar får inte variera med mer än 6 %). Fortsätt omedelbart med kontroll av lineariteten (5.5.7).

5.5.7. Kontroll av lineariteten

Spruta in aflatoxin B1, kalibreringslösningar (3.13.1 3.13.4). Använd referenslösningen (3.13.3) vid var tredje insprutning för korrigering av avvikelser i värdena. (OBS! Toppvärdena för referenslösningen får inte avvika med mer än 10 % under 90 minuter). Korrigera för avvikelse enligt formeln i 7. Kalibreringskurvan bör vara en rät linje genom origo (avvikelser från O i intercept får inte överstiga ± 1 standardavvikelse i Y). De erhållna värdena får inte avvika med mer än 3 % från de nominella värdena. Om dessa krav är uppfyllda, fortsätt omedelbart. I motsatt fall skall felkällorna dessförinnan identifieras och korrigeras.

5.5.8. Insprutning av provextrakt

Spruta in de renade provextrakten (5.4.2.2). Referenslösning (3.13.3) skall alltid sprutas in efter två insprutningar av provextrakt, enligt följande: referenslösning, extrakt, extrakt, referenslösning, extrakt, extrakt, referenslösning osv.

6. Kontrolltest

6.1. Behandling av extraktet (5.4.2.2)

Tillsätt 5 ml natriumkloridlösning (3.15.1) till det slutliga extrakt som erhållits i 5.4.2.2. Extrahera tre gånger med 2 ml kloroform (3.1) under en minut i separertratt (4.24.1).

Häll de uppsamlade kloroformextrakten över ca 1 g natriumsulfat (3.15.2) i ett 10 ml provrör. En liten tratt (4 cm i diameter) kan användas med en bomullspropp i den avsmalnande delen, täckt med ca 1 g natriumsulfat (3.15.2).

Tvätta natriumsulfatskiktet med några ml kloroform som samlas upp i samma provrör. Låt kloroformextraktet avdunsta till torrhet i samma provrör med hjälp av värmeenheten (4.24.2) och lös därefter upp det på nytt i 1 ml kloroform.

6.2. Förberedelser för derivatisering och tunnskiktskromatografi:

Se bilagan till rådets direktiv 76/372/EEG metod A, punkt 5.6.2.

7. Resultatberäkning

Beräkna innehållet av aflatoxin B1 (ìg/kg) i provet med hjälp av formeln:

Innehåll av aflatoxin B1 i ìg/kg = >NUM>m × Vext/

>DEN>Vm × M × >NUM>Vt/

>DEN>Vc

där:

m = mängden aflatoxin B1 i ng återgiven som B1-toppvärde, beräknat på följande sätt:

m = >NUM>P(prov)/

>DEN>P(st1) + P(st2)

× 2r(st)

>Plats för tabell>

Om ovan beskrivna tillvägagångssätt används kan formeln förkortas till:

aflatoxin B1, innehåll i ìg/kg = 20 x m.

7.1 Resultaten kan också beräknas genom mätning av toppvärdena.

8. Repeterbarhet

Se 10.1.

9. Reproducerbarhet

Se 10.1.

10. Anmärkningar

10.1 Precision

En jämförande studie(1) som genomförts på internationell nivå på blandade foder gav de resultat för repeterbarhet och reproducerbarhet som anges i tabell 1. Termen repeterbarhet (r), så som den används här, definieras som det största förhållande mellan två avläsningar av samma prov i samma laboratorium under likartade förhållanden, som inte är signifikant vid en sannolikhetsnivå på 95 %. Termen reproducerbarhet (R) definieras på motsvarande sätt vid jämförelse av två olika laboratorier. I enlighet med ISO 3534 1977, 2.35(2) och kommissionens beslut 89/610/EEG(3), anges r och R i tabell 1 också som variationskoefficienter.

>Plats för tabell>

10.2 Stabilisering av kloroform (3.1)

Florisil kolonnens absorptionsförmåga får ändras om andra stabilisatorer än etanol används. Detta bör kontrolleras enligt 10.3 om den typ av kloroform som beskrivs inte går att anskaffa.

10.3 Noggrannhet

Att metoden tillämpas korrekt skall kontrolleras genom upprepade mätningar på certifierat referensmaterial. Om sådant inte kan anskaffas skall metodens effektivitet prövas genom utbytesförsök på spikade blankprov. Medelvärdet får inte avvika från det verkliga värdet med mer än -20 till + 10 %.

>Hänvisning till >

>Hänvisning till >

(1) Egmond, H. P. van, Heisterkamp, S. H. and Paulsch, W. E. (1991). Food Additives and Contaminants 8, 17 29.

(2) ISO 3534 1977.

(3) EGT nr L 351, 2.12.1989, s. 39.

"