KOMMISSIONENS SJÄTTE DIREKTIV av den 20 december 1974 om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen (75/84/EEG)

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIV

med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekonomiska gemenskapen,

med beaktande av rådets direktiv av den 20 juli 1970 om införande av gemenskapsmetoder för provtagning och analys vid den officiella foderkontrollen(1), senast ändrad genom den akt(2) som bifogas fördraget om anslutning av nya medlemsstater till Europeiska ekonomiska gemenskapen och till Europeiska atomenergigemenskapen(3), särskilt artikel 2 i denna, och

med beaktande av följande:

I det direktivet krävs att den officiella foderkontrollen skall utföras med användning av gemenskapsmetoder för provtagning och analys i syfte att kontrollera att fodret motsvarar de krav som framgår av bestämmelser i lagar och andra författningar beträffande foders kvalitet och sammansättning.

I kommissionens direktiv 71/250/EEG av den 15 juni 1971(4), 71/393/EEG av den 18 november 1971(5), 72/199/EEG av den 27 april 1972(6), 73/46/EEG av den 5 december 1972(7) och 74/203/EEG av den 25 mars 1974(8) har redan ett antal gemenskapsmetoder för analys fastställts. Mot bakgrund av den utveckling som därefter skett på området är det lämpligt att nu anta en sjätte metodsamling.

De åtgärder som fastställs i detta direktiv är förenliga med Ständiga foderkommitténs yttrande.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Medlemsstaterna skall kräva att analyser vid den officiella foderkontrollen skall utföras med de metoder som beskrivs i bilagan till detta direktiv då det gäller halter av bukinolat, sulfakinoxalin och furazolidon.

De allmänna bestämmelser som anges i del 1 (Inledning) av bilagan till kommissionens första direktiv 71/250/EEG av den 15 juni 1971, med undantag av det avsnitt som behandlar prepareringen av analysprovet, skall tillämpas på de metoder som beskrivs i bilagan till detta direktiv.

Artikel 2

Medlemsstaterna skall sätta i kraft de lagar och andra författningar som är nödvändiga för att följa detta direktiv senast den 1 november 1975. De skall genast underrätta kommissionen om detta.

Artikel 3

Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.

Utfärdat i Bryssel den 20 december 1974.

På kommissionens vägnar

François-Xavier ORTOLI

Ordförande

(1) EGT nr L 170, 3.8.1970, s. 2.

(2) EGT nr L 73, 27.3.1972, s. 14.

(3) EGT nr L 73, 27.3.1972, s. 5.

(4) EGT nr L 155, 12.7.1971, s. 13.

(5) EGT nr L 279, 20.12.1971, s. 7.

(6) EGT nr L 123, 29.5.1972, s. 6.

(7) EGT nr L 83, 30.3.1973, s. 21.

(8) EGT nr L 108, 22.4.1974, s. 7.

BILAGA

1. BESTÄMNING AV BUKINOLAT (etyl-4-hydroxi-6,7-diisobutoxi-3-kinolinkarboxylat)

1. Syfte och räckvidd

Med denna metod är det möjligt att bestämma mängden bukinolat i foder, koncentrat och premixer. Lägsta gräns för bestämningen är 10 ppm. Dekokinat påverkar bestämningen.

2. Princip

Provet extraheras med kloroform. Extraktet torkas genom indunstning och återstoden löses upp i kloroform varefter lösningen undergår tunnskiktskromatografi. Bukinolatet elueras med etanol och bestäms genom spektralfotofluorescensmätning under jämförelse med standardlösningar.

3. Reagens

3.1 Kloroform pa.

3.2 96-procentig etanol pa (volymprocent).

3.3 Blandning av kloroform och etanol: blanda tio delar kloroform (3.1) med en del etanol (3.2).

3.4 80-procentig etanol pa (volymprocent).

3.5 Kiselgel G för tunnskiktskromatografi.

3.6 Standardsubstans: rent bukinolat.

3.7 Standardlösningar:

3.7.1 Standardbukinolatlösning, 0,2 mg/ml: väg med 0,1 mg noggrannhet upp 50 mg standardsubstans (3.6). Lös upp detta i kloroform (3.1) i en 250 ml mätkolv genom uppvärmning i vattenbad vid 50° C. Låt svalna till rumstemperatur, fyll på kloroform (3.1) till full volym och blanda.

3.7.2 Arbetsstandardlösningar: för delar på 5, 10, 15, 20 och 25 ml av lösningen (3.7.1) till 25 ml mätkolvar. Fyll på kloroform (3.1) till full volym och blanda. Bered lösningarna omedelbart före användning. Dessa lösningar innehåller 0,04, 0,08, 0,12, 0,16 respektive 0,20 mg bukinolat per ml.

4. Utrustning

4.1 50 och 250 ml koniska kolvar med proppar av matterat glas.

4.2 Skakapparat.

4.3 Centrifug med 15 ml rör med proppar av matterat glas.

4.4 Vattenbad inställt på 50° C.

4.5 Utrustning för tunnskiktskromatografi.

4.6 Glasplattor för tunnskiktskromatografi, 200 × 200 mm, behandlade på följande sätt: Bred ett jämnt, 0,5 mm tjockt lager kiselgel G (3.5) på plattorna och låt lufttorka under 15 minuter. Förvara plattorna i torkugnen (4.11) under två timmar och flytta dem därefter till en exsickator som innehåller kiselgel som torkmedel. Färdigtillverkade plattor är lämpliga om de ger motsvarande resultat, jämfört med plattor som behandlas på här angivet sätt.

4.7 0,50 ml mikropipetter.

4.8 Zonavskiljare för tunnskiktskromatografi.

4.9 Kortvågslampa för ultraviolett ljus.

4.10 Spektralfotofluorescensmätare med xenonlampa och två monokromatorer.

4.11 Torkugn med fläkt inställd på 100° C.

4.12 Vakuumrotationsindunstare med 250 ml kolv.

5. Utförande

5.1 Preparering av provet

Mal provet så att det i sin helhet passerar genom ett såll med 1 mm maskstorlek (enligt ISO R 565).

5.2 Extraktion

Väg med 1 mg noggrannhet upp en mängd av det fint sönderdelade och homogena provet som innehåller cirka 1,25 mg bukinolat. Placera analysprovet i en 250 ml konisk kolv (4.1) och tillsätt 100 ml kloroform (3.1). Blanda, tillslut kolven och skaka om under en timme med skakapparat (4.2). Dekantera, filtrera och avlägsna de första millilitrarna av filtratet.

Flytta 80 ml av det klara filtratet till en 150 ml bägare eller en 250 ml kolv som är ansluten till rotationsindunstaren (4.12). Indunsta i vattenbad (4.4) tills filtratet är i det närmaste torrt, lös upp den oljiga återstoden genom att upprepade gånger tillsätta några milliliter kloroform (3.1) och överför vätskorna utan förlust med en tratt med tunt rör till en 10 ml mätkolv. Fyll på kloroform (3.1) till full volym och blanda. Om lösningen inte är klar centrifugeras den under tre minuter med 3 000 varv per minut i ett tillslutet rör.

5.3 Tunnskiktskromatografi

Placera fläckvis med mikropipett (4.7) volymer på 0,25 ml av det extrakt som erhållits enligt 5.2 och av de fem standardarbetslösningarna (3.7.2) med 2 cm mellanrum på en platta för tunnskiktskromatografi (4.6).

Framkalla kromatogrammet med kloroform (3.1) tills lösningsmedlet har trängt fram så gott som till plattans övre kant och torka därefter med luftström. Framkalla med kloroform-etanolblandningen (3.3) tills lösningsmedlet har trängt 12 cm upp på plattan. Låt lösningsmedlen avdunsta. Exponera kromatogrammet för ultraviolett ljus (4.9) och markera med nål omkretsen för färgningen efter det fläckvis tillsatta bukinolatet (Rf-värde 0,4 0,6).

5.4 Eluering

Avskilj kiselgelen från varje markerad zon med zonavskiljare (4.8) och placera den i centrifugrör (4.3). Tillsätt 10 ml etanol (3.4) till varje rör, skaka om under 20 minuter och centrifugera därefter under fem minuter med 3 000 varv per minut. Dekantera de klara lösningarna i 50 ml koniska kolvar (4.1).

5.5 Fluorescensmätning

Ställ in spektralfotofluorescensmätarens (4.10) skala på 100 för eluatet av den mest koncentrerade standardlösningen med den exciteringsvåglängd mellan 200 och 280 nm som ger den intensivaste fluorescensen och med emissionsvåglängden 375 nm.

Mät de övriga eluatens (5.4) fluorescens under dessa förhållanden. Bestäm med utgångspunkt i de erhållna värdena mängden (A) bukinolat i mg per 10 ml eluat av provet.

6. Resultatberäkning

Bukinolathalten i mg per kg av provet erhålls med formeln:

>NUM>A >DEN>P 7 50 000där

A = den mängd bukinolat i mg som bestämts genom spektralfluorescensmätning,

P = analysprovets vikt i gram.

7. Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga

50 % av det högre resultatet för bukinolathalter mellan 10 och 20 ppm,

10 ppm, absolutvärde, för halter mellan 20 och 100 ppm,

10 % av det högre resultatet för halter mellan 100 och 5 000 ppm,

500 ppm, absolutvärde, för halter mellan 5 000 och 10 000 ppm,

5 % av det högre resultatet för halter över 10 000 ppm.

2. BESTÄMNING AV SULFAKINOXALIN [(2 4-aminobensensulfonamido) kinoxalin]

1. Syfte och räckvidd

Med denna metod är det möjligt att bestämma mängden sulfakinoxalin i foder, koncentrat och premixer. Lägsta gräns för bestämningen är 20 ppm. Andra sulfonamider och arsanilinsyra påverkar bestämningen.

2. Princip

Provet extraheras med dimetylformamid och kloroform. Sulfakinoxalinet hydrolyseras i alkaliskt medium. Efter neutralisering befrias det aminoderivat som bildats från kväve och förenas med N-2-aminoetyl-1-naftylamin. Lösningens optiska densitet mäts vid 545 nm.

3. Reagens

3.1 N,N-dimetylformamid pa.

3.2 Kloroform pa.

3.3 Absolut etanol.

3.4 Alkalisk saltlösning: lös upp 10 g natriumhydroxid pa och 25 g natriumklorid pa i vatten. Fyll på vatten till 500 ml och blanda.

3.5 Koncentrerad saltsyra pa, d = 1,18.

3.6 0,1-procentig natriumnitritlösning (vikt/volym): lös upp 100 mg natriumnitrit pa i vatten, fyll på vatten till 100 ml och blanda. Bereds omedelbart före användning.

3.7 0,5-procentig ammoniumsulfamatlösning (vikt/volym): lös upp 500 mg ammoniumsulfamat pa i vatten, fyll på vatten till 100 ml och blanda. Bereds omedelbart före användning.

3.8 0,1-procentig N-2-aminoetyl-1-naftylamindihydrokloridlösning (vikt/volym): lös upp 100 mg N-2-aminoetyl-1-naftylamindihydroklorid pa i 0,1-procentig saltsyra pa (volym/procent). Fyll på samma syra till 100 ml och blanda. Bereds omedelbart före användning.

3.9 Standardsubstans: rent sulfakinoxalin.

3.10 Standardlösning: Väg med 0,1 mg noggrannhet upp 250 mg standardsubstans (3.9). Lös upp detta i 50 ml natriumhydroxidlösning (25 ml lösning av 0,1 M natriumhydroxid pa + 25 ml vatten), fyll på vatten till 500 ml och blanda. Späd 5 ml av lösningen till 100 ml med vatten. 1 ml av denna lösning innehåller 25 µg sulfakinoxalin.

4. Utrustning

4.1 250 ml koniska kolvar med proppar av matterat glas.

4.2 Skakapparat.

4.3 Tratt av sintrat glas, porositet 3, 80 mm diameter, med filtrerkolv.

4.4 250 ml separertrattar.

4.5 50, 100, 250 och 500 ml mätkolvar.

4.6 Provrör 150 × 25 mm.

4.7 Ångbad.

4.8 Spektralfotometer med 20 mm celler.

5. Utförande

5.1 Preparering av provet

Mal provet så att det i sin helhet passerar genom ett såll med 1 mm maskstorlek (enligt ISO R 565).

5.2 Extraktion

Väg med 1 mg noggrannhet upp en mängd av det fint sönderdelade och homogena provet som innehåller mellan 0,25 och 1,25 mg sulfakinoxalin. Placera analysprovet i en 250 ml konisk kolv (4.1) och tillsätt 20 ml N,N-dimetylformamid (3.1). Blanda och upphetta kolven i ångbadet (4.7) under 20 minuter. Låt svalna under rinnande kallt vatten. Tillsätt 60 ml kloroform (3.2), tillslut kolven och skaka om under 30 minuter med skakapparat (4.2).

Filtrera vätskan genom en sintrad tratt (4.3) med försiktig sugning. Skölj filtrerkolven med fyra gånger 5 ml kloroform (3.2) och häll sköljvätskorna genom tratten. Överför filtratet till en separertratt (4.4), skölj filtrerkolven med cirka 15 ml kloroform (3.2) och överför sköljvätskan till separertratten.

5.3 Hydrolys

Tillsätt 50 ml alkalisk saltlösning (3.4) och 5 ml etanol (3.3) till separertratten.Blanda skikten grundligt och utan att någon emulsion bildas, antingen genom att långsamt vända tratten upp och ner cirka 20 gånger eller genom att vrida den runt rörets och proppens horisontalaxel. Låt skikten separera (separeringen är vanligtvis avslutad efter cirka 15 minuter).

Överför det översta skiktet (vätskeskiktet) till en 250 ml mätkolv (4.5). Upprepa extraktionen av kloroformskiktet med ytterligare tre gånger 50 ml alkalisk saltlösning (3.4) och tillsätt varje vätskeextrakt till innehållet i mätkolven. Fyll på vatten till full volym och blanda.

Flytta 25 ml av lösningen till en 50 ml mätkolv (4.5), tillsätt 5 ml saltsyra (3.5), fyll på vatten till full volym och blanda. Om så är nödvändigt filtreras lösningen och de första 15 millilitrarna av filtratet avlägsnas. Överför 10 ml av lösningen till vart och ett av två provrör (4.6), A och B.

5.4 Färgframkallning och mätning av den optiska densiteten

Tillsätt 2 ml natriumnitritlösning (3.6) till vart och ett av provrören, blanda och låt stå under tre minuter. Tillsätt 2 ml ammoniumsulfamatlösning (3.7), blanda och låt stå under två minuter. Tillsätt 1 ml N-2-aminoetyl-1-naftylamindihydrokloridlösning (3.8) till provrör A och 1 ml vatten till provrör B. Blanda innehållet i varje provrör grundligt. Framkalla ett lätt vakuum i provrören med vattenpump med gummianslutningar så att det upplösta kvävet avlägsnas.

Mät efter 10 minuter lösningarnas optiska densiteter, EA och EB, med spektralfotometern (4.8) vid 545 nm och med vatten som blankprov. Bestäm med utgångspunkt i värdet EA - EB mängden (A) sulfakinoxalin i provlösningen genom jämförelse med en i förväg upprättad kalibreringskurva (5.5).

5.5 Kalibreringskurva

Överför volymer på 2, 4, 6, 8 och 10 ml av standardlösningen (3.10) till en serie 100 ml mätkolvar (4.5) (detta motsvarar 50, 100, 150, 200 och 250 µg sulfakinoxalin). Tillsätt 8 ml saltsyra (3.5) till varje kolv, fyll på vatten till full volym och blanda.

Flytta med pipett 10 ml av varje lösning (motsvarande 5, 10, 15, 20 och 25 µg sulfakinoxalin) till provrör (4.6). Framkalla färgreaktionen enligt anvisningarna i punkt 5.4, första stycket. Mät de optiska densiteterna vid 545 nm med vatten som blankprov. Rita kalibreringskurvan med värdena för optisk densitet längs y-axeln och de motsvarande mängderna sulfakinoxalin i µg längs x-axeln.

6. Resultatberäkning

Sulfakinoxalinhalten i mg per kg av provet erhålls med formeln:

>NUM>A >DEN>P 7 50där:

A = mängden sulfakinoxalin i µg enligt den fotometriska mätningen,

P = analysprovets vikt i gram.

7. Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga

10 ppm, absolutvärde, för sulfakinoxalinhalter mellan 20 och 100 ppm,

10 % av det högre resultatet för halter mellan 100 och 5 000 ppm,

500 ppm, absolutvärde, för halter mellan 5 000 och 10 000 ppm,

5 % av det högre resultatet för halter över 10 000 ppm.

3. BESTÄMNING AV FURAZOLIDON [3-(5-nitrofurfurylidenamino)-oxazolidin-2-on)]

1. Syfte och räckvidd

Med denna metod är det möjligt att bestämma mängden furazolidon i foder, koncentrat och premixer. Lägsta gräns för bestämningen är 10 ppm.

2. Princip

Furazolidonet extraheras med aceton efter att provet först extraherats med petroleumeter för att avlägsna fett. Extraktet renas genom kromatografi mot en aluminiumoxidkolonn och furazolidonet elueras med aceton. Acetoneluatet torkas genom indunstning och återstoden löses upp i pentanol. Därefter extraheras furazolidonet från pentanolen med vätskeformig urealösning och extraktets optiska densitet mäts vid 375 nm.

3. Reagens

3.1 Aceton pa.

3.2 Aluminiumoxid för kromatografi, neutral, kornstorlek 0,15 0,061 nm (DIN 4188), preparerad på följande sätt: Rör om 500 g aluminiumoxid i en liter hett destillerat vatten och dekantera supernatantvätskan. Upprepa detta moment två gånger och filtrera därefter med Buchnertratt. Torka aluminiumoxiden till konstant vikt vid 105°C.

3.3 Pentylacetat pa.

3.4 Pentanol pa (material som innehåller blandade isomerer kan godtas).

3.5 Petroleumeter, kokpunktsintervall 40 60°C.

3.6 Urealösning. Blanda 90 g urea pa med 100 ml vatten och värm försiktigt så att urean löses helt.

3.7 Standardsubstans: rent furazolidon.

3.8 Standardlösning: väg med 0,1 mg noggrannhet upp 25 mg standardsubstans (3.7), lös upp detta i aceton (3.1) i en 250 ml mätkolv (4.1), fyll på aceton (3.1) till full volym och blanda. 1 ml av denna lösning innehåller 100 µg furazolidon.

4. Utrustning

4.1 100 och 250 ml mätkolvar av färgat glas.

4.2 100 ml separertrattar av färgat glas.

4.3 Lämplig extraktionsapparat, t.ex. Soxhlet eller Twisselmann.

4.4 Extraktionshylsor, 25 × 80 mm eller 28 × 100 mm.

4.5 Glasrör för kromatografi, inre diameter: 10 mm, längd: 300 mm.

4.6 Ångbad.

4.7 Spektralfotometer med 10 mm celler.

5. Utförande

OBS! Alla moment skall utföras med dämpad belysning.

5.1 Preparering av provet

Mal provet så att det i sin helhet passerar genom ett såll med 1 mm maskstorlek (enligt ISO R 565).

5.2 Extraktion

Väg med 1 mg noggrannhet upp 5 20 g av det fint sönderdelade och homogena provet (med en högsta furazolidonhalt av 1 mg) i en extraktionshylsa (4.4) och flytta detta till extraktionsapparaten (4.3). Extrahera med petroleumeter (3.5), med Soxhletapparat skall 13 17 extraktionscykler med lösningsmedlet genomföras; med andra typer av extraktorer skall detta moment ta minst 30 minuter. Avlägsna hylsan från apparaten, torka bort återstående lösningsmedel och torka hylsan och det extraherade innehållet i varm luftström.

Placera den torkade hylsan med sitt innehåll i en ren extraktionsapparat och extrahera med aceton (3.1) - med Soxhletapparat skall minst 25 extraktionscykler med lösningsmedlet genomföras. För varje annan typ av apparat skall de exakta villkoren för att uppnå fullständig extraktion fastställas i förväg. Indunsta acetonextraktet till 5 10 ml volym i ångbad (4.6) och kyl till rumstemperatur.

5.3 Kromatografi

Sätt en plugg glasull i nederdelen av kromatografiröret (4.5) och skjut ner den med en lämplig stång så att den blir 2 3 mm tjock. Bered en suspension av aluminiumoxid (3.2) i aceton (3.1), häll detta i röret och låt sedimentera. Den preparerade kolonnen bör vara cirka 200 mm hög. Låt acetonskiktet rinna av ned till toppen av kolonnen.

Överför det acetonextrakt som erhållits enligt 5.2 från kolven till kolonnen, skölj kolven flera gånger med aceton (3.1) och flytta över vätskan till kolonnen. Placera en lämplig kolv under kolonnen och eluera furazolidonet med aceton (3.1). Sammanlagt, med sköljningarna inräknade, bör cirka 150 ml aceton användas.

5.4 Extraktion och mätning av den optiska densiteten

Indunsta acetoneluatet (5.3) i ångbad (4.6) tills det precis har torkat. (I vissa fall kan det återstå en liten mängd diacetonalkohol, som uppkommit genom att acetonet kondenserats på aluminiumoxiden, men detta inverkar inte på de följande extraktionerna.) Lös upp återstoden i 10 ml pentanol (3.4) och överför lösningen till en separertratt (4.2). Upprepa detta moment med 10 ml pentylacetat (3.3) som sköljvätska. Skölj slutligen det kärl som innehöll återstoden efter extraktionen med 10 ml urealösning (3.6), tillsätt detta till separertratten och skaka om relativt kraftigt under två minuter.

Låt faserna separera under tre till fyra minuter och flytta därefter det vätskeformiga extraktet till en 100 ml mätkolv (4.1). Upprepa sköljnings- och extraktionsmomenten med ytterligare fyra gånger 10 ml urealösning (3.6) och överför de vätskeformiga extrakten till mätkolven. Späd innehållet i mätkolven till 100 ml med urealösning (3.6) och blanda. Mät lösningens optiska densitet i spektralfotometern (4.7) vid 375 nm mot urealösning (3.6) i referenscellen. Bestäm mängden furazolidon genom jämförelse med kalibreringskurvan (5.5).

5.5 Kalibreringskurva

Gör i ordning fyra kromatografikolonner enligt beskrivningen i punkt 5.3, första stycket. Fyll med pipett volymer på 2,5, 5, 7,5 respektive 10 ml av standardlösningen (3.8) i var sin kolonn. Skölj var och en av de fyra kolonnerna med 150 ml aceton (3.1) och fortsätt så som anges i punkt 5.4. Rita kalibreringskurvan med värdena för optisk densitet längs y-axeln och de motsvarande mängderna furazolidon i µg längs x-axeln.

6. Resultatberäkning

Furazolidonhalten i mg per kg av provet erhålls med formeln:

>NUM>A >DEN>P

där

A = mängden furazolidon i mikrogram enligt den fotometriska mätningen,

P = analysprovets vikt i gram.

7. Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga:

50 % av det högre värdet för furazolidonhalter mellan 10 och 20 ppm,

10 ppm, absolutvärde, för halter mellan 20 och 100 ppm,

10 % av det högre resultatet för halter mellan 100 och 5 000 ppm,

500 ppm, absolutvärde, för halter mellan 5 000 och 10 000 ppm,

5 % av det högre resultatet för halter över 10 000 ppm.