BILAGA XX

Metod för bestämning av halter av vaxer, fettsyreetylestrar och fettsyremetylestrar med kapillärgaskromatografi

1. SYFTE

Denna metod är avsedd för bestämning av halterna av vaxer, fettsyreetylestrar och fettsyremetylestrar i olivolja. De enskilda vaxerna och alkylestrarna separeras efter antalet kolatomer. Metoden rekommenderas som ett redskap för att skilja olivolja från olivolja av olivrestprodukter (pressrester) och som en kvalitetsparameter för extrajungfruolivolja då metoden gör det möjligt att spåra otillåtna tillsatser av olja av lägre kvalitet (oavsett om det rör sig om tillsatser av jungfruolja, bomolja eller vissa doftfria oljor).

2. PRINCIP

En lämplig intern standard tillsätts oljan som därefter fraktioneras genom kromatografi på kiselgelkolonn. Den fraktion som först elueras under testförhållandena (och som har lägre polaritet än triglyceriderna) samlas upp och analyseras därefter direkt med hjälp av kapillärgaskromatografi.

3. UTRUSTNING

3.1. E-kolv, 25 ml

3.2. Vätskekromatografikolonn av glas, innerdiameter 15 mm, längd 30–40 cm, med kran.

3.3. Gaskromatograf som är anpassad till kapillärkolonn, utrustad med ett system för direktinjektion i kolonnen och bestående av följande:

3.3.1. Termostatstyrd ugn med möjlighet att programmera temperaturen.

3.3.2. Kallinjektor för direktinjektion av provet i kolonnen

3.3.3. En flamjonisationsdetektor och förstärkare.

3.3.4. Skrivare/integrator (se not 1) som är anpassad till förstärkaren (punkt 3.3.3), med responstid på högst en sekund och med variabel pappershastighet.

Not 1: Datoriserade system får också användas om gaskromatografiuppgifterna läggs in på dator.

3.3.5. Kapillärkolonn av kvarts (för analys av vaxer och metyl- och etylestrar), längd 8–12 m, innerdiameter 0,25–0,32 mm, vars vätskefas (se not 2) har en enhetlig filmtjocklek på 0,10–0,30 μm.

Not 2: Lämpliga kommersiella vätskefaser finns tillgängliga för detta syfte, t.ex. SE52, SE54 etc.

3.4. Mikrospruta, 10 μl, med härdad nål för direkt insprutning i kolonnen

3.5. Elektrisk skakanordning.

3.6. Rotationsindunstare.

3.7. Muffelugn.

3.8. Analysvåg för vägning med en noggrannhet på ± 0,1 mg.

3.9. Laboratorieglas av standardtyp.

4. REAGENSER

4.1. Kiselgel, 60-200 μm mesh. Placera kiselgelen i mufffelugnen vid 500 °C under minst fyra timmar. Efter kylning tillsätt 2 % vatten till kiselgelen. Skaka ordentligt för att homogenisera uppslamning och låt ligga i exsickator under minst tolv timmar före användning.

4.2. n-hexan, för kromatografi eller bedömning av återstoder (renheten måste kontrolleras).

VARNING – Ångorna kan fatta eld. Förvaras avskilt från värmekällor, gnistor och öppna lågor. Se till att flaskorna alltid är ordentligt förslutna. Sörj för ordentlig ventilation under användningen. Se till att det inte bildas ångor och undanröj alla eventuella brandrisker, som uppvärmningsapparater och elektriska apparater som inte är tillverkade av brandsäkra material. Ämnet är farligt vid inandning och kan orsaka skador på nervceller. Ångorna får inte inhaleras. Använd lämplig andningsutrustning vid behov. Undvik kontakt med huden och ögonen.

4.3. Etyleter för kromatografi.

VARNING – Mycket lättantändligt och måttligt giftigt. Irriterande för huden. Farligt vid inandning. Kan skada organen. Effekten kan vara fördröjd. Kan bilda explosiva peroxider. Ångorna kan fatta eld. Förvaras avskilt från värmekällor, gnistor och öppna lågor. Se till att flaskorna alltid är ordentligt förslutna. Sörj för ordentlig ventilation under användningen. Se till att det inte bildas ångor och undanröj alla eventuella brandrisker, som uppvärmningsapparater och elektriska apparater som inte är tillverkade av brandsäkra material. Låt inte etyletrarna avdunsta så mycket att de torkar eller nästan torkar. Tillsätt vatten eller en lämplig reduktionsagent för att motverka peroxidbildning. Får ej förtäras. Ångorna får inte inhaleras. Undvik längre eller upprepad hudkontakt.

4.4. n-heptan, för kromatografi, eller iso-oktan.

VARNING – Lättantändligt. Farligt vid inandning. Förvaras avskilt från värmekällor, gnistor och öppna lågor. Se till att flaskorna alltid är ordentligt förslutna. Sörj för ordentlig ventilation under användningen. Ångorna får inte inhaleras. Undvik längre eller upprepad hudkontakt.

4.5. Standardlösning av 0,05 % (m/v) laurylarakidat (se not 3) i heptan (intern standard för vaxer).

Not 3: Även palmitylpalmitat, myristylstearat eller arakidlaureat kan användas.

4.6. Standardlösning av 0,02 % (m/V) metylheptadekanoat i heptan (intern standard metylestrar och etylestrar).

4.7. Sudan-1-(1-fenylazo-2-naftol)

4.8. Bärgas: vätgas eller helium, ren, för gaskromatografi.

VARNING

Väte. Under tryck är väte mycket lättantändligt. Förvaras avskilt från värmekällor, gnistor och öppna lågor och elektriska apparater som inte är tillverkade av brandsäkra material. Se till att ventilen är stängd när flaskan inte används. Använd alltid en reduceringsventil. Fjädern ska vara helt lös innan flaskventilen öpppnas. Stå inte framför flasköppningen när ventilen öppnas. Sörj för ordentlig ventilation under användningen. För inte över väte från en flaska till en annan. Blanda inte gaser i flaskan. Se till att flaskorna inte kan slås omkull. Håll dem avskärmade från solljus och värmekällor. Förvara dem i korrosionsskyddad miljö. Använd inte skadade eller omärkta flaskor.

Helium. Komprimerad gas under högt tryck, som minskar andelen syre i luften. Se till att flaskan är försluten. Sörj för ordentlig ventilation under användningen. Gå inte in i lagringsutrymmet om det inte är ordentligt ventilerat. Använd alltid en tryckreduceringsventil. Fjädern ska vara helt lös innan flaskventilen öppnas. För inte över gas från en flaska till en annan. Se till att flaskorna inte kan slås omkull. Stå inte över flasköppningen när ventilen öppnas. Håll dem avskärmade från solljus och värmekällor. Förvara dem i korrosionsskyddad miljö. Använd inte skadade eller omärkta flaskor. Inandas inte gasen. Använd endast gasen för tekniska ändamål.

4.9. Hjälpgaser:

— Väte, rent, till gaskromatografi.

— Luft, ren, till gaskromatografi.

VARNING

Luft. Komprimerad gas vid högt tryck. Använd med försiktighet i närheten av brännbara ämnen eftersom flampunkten för de flesta organiska föreningar i luften är betydligt lägre vid högt tryck. Se till att ventilen är stängd när flaskan inte används. Använd alltid en reduceringsventil. Fjädern ska vara helt lös innan flaskventilen öpppnas. Stå inte framför flasköppningen när ventilen öppnas. För inte över gas från en flaska till en annan. Blanda inte gaser i flaskan. Se till att flaskorna inte kan slås omkull. Håll dem avskärmade från solljus och värmekällor. Förvara dem i korrosionsskyddande miljö. Använd inte skadade eller omärkta flaskor. Luft avsedd för teknisk användning får inte användas i inhalations- eller andningsutrustning.

5. METOD

5.1. Preparering av kromatografikolonnen

Slamma upp 15 g kiselgel (4.1.) i n-hexan (4.2.) och häll det i kolonnen (3.2.). Låt kiselgelen sedimentera. Slutför sedimenteringen med hjälp av en elektrisk vibrator för att göra det kromatografiska stationära fasen mer homogent packad. Skölj med 30 ml n-hexan för att avlägsna eventuella orenheter. Använd analysvåg (3.8) för att med exakthet väga upp 500 mg av provet i en 25 ml kolv (3.1) och tillsätt en passande mängd intern standard (4.5), beroende på det uppskattade vaxinnehållet, t.ex. tillsätt 0,1 mg laurylarakidat till pressad olivolja, och 0,25-0,5 mg till olivolja av pressrester samt 0,05 mg metylheptadekanoat för olivoljor (4.6).

Det preparerade provet överförs sedan till kromatografikolonnen tillsammans med två portioner n-hexan (4.2) på 2 ml vardera.

Låt lösningsmedlet stå 1 mm över kolonnmaterialet. Tillsätt ytterligare n-hexan/etyleterblandningen (99:1) och samla upp 220 ml med en hastighet på cirka 15 droppar/10 s. (Denna fraktion innehåller metyl- och etylestrarna och vaxer). (Not 4) (Not 5).

Not 4: n-hexan/etyleterblandningen (99:1) ska beredas varje dag.

Not 5: För en visuell kontroll av att elueringen av vaxerna sker korrekt kan 100μl 1-(fenylazo)-2-naftalenol (färgämnet Sudan 1) tillsättas elueringsblandningen. Färgämnets retentionstid ligger mellan vaxernas och triglyceridernas respektive retentionstid. När färgämnet når botten av kromatografikolonnen måste elueringen avslutas eftersom alla vaxer då har eluerats.

Förånga den framtagna fraktionen i en rotationsindunstare tills nästan allt lösningsmedel försvunnit. Avlägsna de sista 2 ml av lösningsmedlet med hjälp av en svag kväveström. Späd den uppsamlade fraktionen innehållande metyl- och etylestrarna med 2-4 ml n-heptan eller iso-oktan.

5.2. Analys med gaskromatografi

5.2.1. Inledande metod

Montera kolonnen i gaskromatografen (3.3) genom att ansluta inloppet till injektionssystemet och utloppet till detektorn. Kontrollera gaskromatografen (att gasanslutningarna är täta, detektorns och skrivarens effektivitet, etc.).

Om kolonnen används för första gången bör den först konditioneras. Låt en liten mängd bärargas flyta genom kolonnen och sätt sedan på gaskromatografen. Upphetta gradvis under ca. 450 °C till en temperatur på 350 °C.

Behåll denna temperatur i minst två timmar och ställ därefter in apparaturen enligt analysparametrarna (inställning av gasflöde, tändning av delningsflamma, anslutning till den elektroniska registreringen (3.3.4), inställning av temperaturen i kolonnens ugn, detektorn etc.). Ställ in signalen på en känslighet som är minst två gånger högre än den nivå som krävs för analysen. Baslinjen ska vara linjär, inte ha några toppar och får inte driva.

Om baslinjen driver nedåt tyder det på att kolonnen inte är korrekt ansluten medan en positiv drift tyder på att kolonnen inte har blivit ordentligt konditionerad.

5.2.2. Val av analysparametrar för vaxer och metyl- och etylestrar (Not 6).

Analysparametrarna väljs normalt enligt följande:

— Kolonntemperatur: 20 °C/min 5 °C/min

Från 80 °C (1′) 140 °C 335 °C (20)

— Detektortemperatur: 350 °C.

— Insprutad mängd: 1 μl lösning (2–4 ml) n-heptan.

— Bärgas: helium eller vätgas med en linjär hastighet som är optimal för den gas som valts (se tillägg A).

— Instrumentets känslighet: Lämplig för att uppfylla ovanstående krav.

Not 6: På grund av den höga sluttemperaturen tillåts en positiv drift på upp till 10 % av fullt skalutslag.

Beroende på kolonnens och gaskromatografens egenskaper kan betingelserna behöva ändras för att man ska få en separation av samtliga vaxer, en tillfredsställande upplösning av toppar (se figurerna 2, 3 och 4) och en retentionstid för den interna standarden laurylarakinat på 18 ± 3 minuter Vaxernas mest representativa topp ska motsvara minst 60 % av fullt skalutslag, medan den interna standarden för metyl- och etylestrar, metylheptadekanoat, måste ge fullt skalutslag.

Parametrarna för toppens integration bör bestämmas på ett sådant sätt att en korrekt uppskattning av de ifrågavarande toppareorna erhålls.

5.3. Analysförfarande

Sug med hjälp av en mikrospruta på 10 μl upp 10 μl av lösningen. Dra tillbaka kolven tills nålen är tom. För in nålen i injektionssystemet och injicera snabbt efter 1–2 sekunder. Efter ca. 5 sekunder dras nålen försiktigt ut.

Utför registreringen tills alla vaxer eller stigmastadiener är helt eluerade, beroende på vilken fraktion som analyseras.

Baslinjen måste alltid uppfylla de fastställda villkoren.

5.4. Identifiering av toppar

Identifiera topparna utifrån retentionstiderna genom att jämföra dem med blandningar av vaxer med kända retentionstider analyserade under samma förhållanden. Alkylestrarna identifieras utifrån blandningar av etyl- och metylestrar av de viktigaste fettsyrorna i olivoljor (palmitinsyra och oljesyra).

Figur 1 visar ett kromatogram för vaxer av jungfruolja. Figurerna 2 och 3 visar kromatogram för två extra jungfruoljor från detaljhandeln, den ena med metyl- och etylestrar och den andra utan. Figur 4 visar kromatogram för extra jungfruolja av bästa kvalitet och samma olja som tillsatts 20 % doftfri olja.

5.5. Kvantitativ analys av vaxerna

Bestäm de av toppareorna som motsvarar den interna standarden laurylarakinat och de alifatiska estrarna från C40–C46 med hjälp av integratorn.

Den totala vaxhalten bestäms som summan av de enskilda vaxerna i mg/kg fettämne, enligt följande:

där:

Ax = area motsvarande toppen för den enskilda estern, enligt elektronisk beräkning As = area motsvarande toppen för den interna standarden laurylarakinat, enligt elektronisk beräkning ms = mängden intern standard laurylarakinat, i milligram m = vikt för provet som tagits ut för analys, i gram.

5.5.1. Kvantitativ analys av metyl- och etylestrar

Bestäm med hjälp av integratorn de av toppareorna som motsvarar den interna standarden metylheptadekanoat, metylestrarna av C16 och C18-fettsyror och etylestrarna av C16 och 18-fettsyror.

Innehållet av varje enskild alkylester bestäms i mg/kg fettämne enligt följande:

där:

Ax = area motsvarande toppen för den enskilda C16- och C18-estern, enligt elektronisk beräkning As = area motsvarande toppen för den interna standarden laurylarakinat, enligt elektronisk beräkning ms = mängden intern standard metylheptadekanoat, i milligram m = vikt för provet som tagits ut för analys, i gram.

6. RESULTATREDOVISNING

Summan av de olika vaxinnehållen från C40 till C46 (Not 7) anges i mg/kg fettämnen.

Ange summan av innehållet metylestrar och etylestrar från C16 till C18 samt summan av de två produkterna.

Resultaten bör uttryckas i närmaste mg/kg.

Not 7: De komponenter som ska bestämmas kvantitativt är de med jämnt antal kolatomer bland C 40 - C 46 -estrar, jfr. exemplet på kromatogram för vaxer i olivolja i figuren nedan. Om C 46 -estern är delad rekommenderas, för identifikationssyften, analys av vaxfraktionen i olivolja av pressrester där C 56 -toppen tydligt kan urskiljas, då den är tydligt dominerande.

Ange förhållandet mellan etylestrar och metylestrar

Figur 1

Exempel på ett gaskromatogram över en vaxfraktion i olivolja (1)

Figur 2

Metylestrar, etylestrar och vaxer i jungfruolivolja

Figur 3

Metylestrar, etylestrar och vaxer i extra jungfruolivolja

Figur 4

Del av kromatogram över en extra jungfruolivolja och samma olja tillsatt med doftfri olja