RÅDETS DIREKTIV av den 29 mars 1977 om biologisk kontroll av befolkningen med hänsyn till risken för blyförgiftning (77/312/EEG)

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS RÅD HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIV

med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekonomiska gemenskapen, särskilt artikel 235 i detta,

med beaktande av kommissionens förslag,

med beaktande av Europaparlamentets yttrande(1),

med beaktande av Ekonomiska och sociala kommitténs yttrande(2), och

med beaktande av följande:

En av Europeiska ekonomiska gemenskapens viktigaste uppgifter är att främja en harmonisk utveckling av ekonomiska verksamheter inom gemenskapen och en fortsatt och balanserad tillväxt. Ingetdera kan uppnås om inte föroreningar och olägenheter bekämpas, livskvaliteten förbättras och miljön skyddas.

De olika användningsområdena för bly förorsakar för närvarande att detta ämne förorenar miljön på många områden.

De olika blyföroreningskällorna i miljön gör det svårt att bestämma en enskild individs totala exponering för denna förorening och därför kräver skyddet för människors hälsa en så noggrann kontroll av individens totala blyupptagning som möjligt.

Biologisk kontroll av befolkningen med hänsyn till risken för blyförgiftning bör utföras och resultaten av denna kontroll utvärderas så att nya förslag kan utarbetas när detta är lämpligt.

Det är önskvärt att fastställa tekniska förfaranden och biologiska referensnivåer för sådan kontroll.

Mätningen av blodets blyhalt är för närvarande det bästa sättet att bedöma den blymängd som en individ nyligen har tagit upp som en följd av exponering för bly i miljön. Den enzymatiska aktiviteten hos delta-aminolevulinsyredehydratas (ALAD) kan användas som vägledande eller kompletterande prov för att bestämma blyexponering.

Europeiska gemenskapernas åtgärdsprogram för miljön(3) föreskriver samordning av nationella program vars syfte är att förbättra livskvaliteten och prioritera undersökningar av blyförorening.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Medlemsstaterna skall vidta nödvändiga åtgärder för att kunna tillämpa ett gemensamt förfarande för biologisk kontroll för att bedöma befolkningens exponering för blyföroreningar utanför arbetsmiljön.

Artikel 2

Detta gemensamma förfarande vars tillämpning skall begränsas till fyra år skall grundas på mätningen av blodets blyhalt.

Som ett vägledande eller kompletterande prov kan också ALAD-mätning användas i enlighet med de förfaranden som fastställs i bilagorna II och III.

Artikel 3

1. Villkoren för biologisk kontroll skall fastställas med hjälp av

- provtagning och analysförfaranden,

- provtagningsfrekvens.

2. Blodprovstagning skall utföras på frivilliga.

Artikel 4

Provtagning skall utföras på

- grupper på minst 100 personer i tätortsområden med mer än 0,5 miljonær invånare,

- grupper på minst 100 personer så långt detta är genomförbart, utvalda bland människor som exponeras för betydande källor till blyförorening,

- riskgrupper som bestäms av de behöriga myndigheterna i medlemsstaterna.

I varje medlemsstat skall under varje undersökningskampanj minst 50 analyser per miljon invånare utföras.

Artikel 5

Provtagningen på grupperna som anges i artikel 4 skall utföras med minst 24 månaders mellanrum under åtminstone två undersökningskampanjer i varje område som undersöks under programmets löptid. Under den andra undersökningskampanjen behöver proven inte nödvändigtvis tas på samma personer som i den första kampanjen.

Artikel 6

För att utvärdera resultaten av den biologiska kontrollen med hänsyn till de åtgärder som föreskrivs i artikel 8 skall följande blyhalter i blodet, vilka beaktar förhållandet mellan dos och verkan som anges i bilaga I, tillsammans användas som referensnivåer:

- Högst 20 mikrogram bly/100 milliliter blod för 50 % av den undersökta befolkningsgruppen.

- Högst 30 mikrogram bly/100 milliliter blod för 90 % av den undersökta befolkningsgruppen.

- Högst 35 mikrogram bly/100 milliliter blod för 98 % av den undersökta befolkningsgruppen.

Artikel 7

Blodets blyhalt skall bestämmas enligt följande:

- Medlemsstaterna skall meddela kommissionen namnen på de laboratorier som deltar i det biologiska kontrollprogrammet samt de analysmetoder som används.

- Kommissionen skall i samarbete med medlemsstaterna upprätta de interkalibreringsprogram där de ovan nämnda laboratorierna skall delta.

- Kommissionen skall i samarbete med medlemsstaterna undersöka resultaten av dessa program för att kunna förbättra jämförbarheten i analysmetoderna.

Artikel 8

Om analysresultaten visar att de referensnivåer som anges i artikel 6 har överskridits i ett eller flera fall skall medlemsstaterna

- kontrollera resultatens giltighet,

- vidta åtgärder för att spåra de exponeringskällor som är skuld till att nivåerna överskridits; detta skall också innefatta alla individer med en blyhalt i blodet av över 35 A mikrogram bly/100 milliliter,

- vidta alla lämpliga åtgärder enligt vad de behöriga nationella myndigheterna bestämmer.

Artikel 9

1. Inom sex månader efter anmälan av detta direktiv skall medlemsstaterna utse de behöriga nationella myndigheter som till kommissionen skall vidarebefordra följande:

- Resultaten av den biologiska kontrollen av de befolkningsgrupper som anges i artikel 4 tillsammans med detaljer om analysmetoder, undersökta befolkningsgrupper och områden inom vilka proven har tagits. De undersökta personerna skall åtnjuta fullständig anonymitet. Kommissionen och medlemsstaterna skall komma överens om de förfaranden och den metod genom vilka dessa data skall vidarebefordras.

- Information om de orsaker eller faktorer som kan antas ha resulterat i att referensnivåerna i artikel 6 har överskridits.

2. Den behöriga nationella myndigheten skall också anmäla de åtgärder som vidtagits enligt artikel 8 tredje strecksatsen till kommissionen.

Artikel 10

Åtminstone två gånger om året skall kommissionen sammankalla ett möte med företrädare för medlemsstaternas regeringar som i synnerhet skall

- säkerställa att den biologiska kontrollen genomförs och i synnerhet att bestämmelserna i artiklarna 4 och 5 harmoniseras,

- se till att de analyser som utförs är jämförbara,

- undersöka informationen och underlätta informationsutbyte mellan medlemsstaterna om resultaten av den biologiska kontrollen och om de åtgärder som vidtagits enligt artikel 8.

Artikel 11

På grundval av den information som samlats enligt artikel 9 skall kommissionen i samarbete med de behöriga nationella myndigheterna upprätta

- en årlig sammanfattande rapport om genomförandet av programmet, som skall vidarebefordras till medlemsstaterna, rådet och Europaparlamentet,

- en allmän rapport vid programmets slut som skall utgöra grunden för ytterligare förslag som tar hänsyn till den utveckling som skett i fråga om vetenskaplig och teknisk kunskap.

Artikel 12

Medlemsstaterna skall vidta de åtgärder som är nödvändiga för att det förfarande som fastställs genom detta direktiv skall kunna träda i kraft inom 12 månader efter dagen för anmälan och skall genast underrätta kommissionen om detta.

Artikel 13

Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.

Utfärdat i Bryssel den 29 mars 1977.

På rådets vägnar

T. BENN

Ordförande

(1) EGT nr C 28, 9.2.1976, s. 31.

(2) EGT nr C 50, 4.3.1976, s. 9.

(3) EGT nr C 112, 20.12.1973, s. 3.

BILAGA I

FÖRHÅLLANDET MELLAN DOS OCH VERKAN

De nivåer för blyhalt i blodet som används för bedömningen av resultatet av biologisk kontroll grundar sig på analys av vetenskapliga data om de olika förgiftningseffekterna av bly. Med denna analys, som tar hänsyn till den normala avvikelsen i de biologiska värdena inom befolkningen, är det möjligt att fastställa halvkvantitativa samband mellan dos och verkan. Följande förhållande mellan dos och verkan används som referensunderlag för detta direktivs genomförande.

En minskning i ALAD-aktivitet i de röda blodkropparna som ett resultat av exponering för bly kan tolereras för befolkningen förutsatt att minskningen inte påverkar bildandet av röda blodkroppar. För blyhalter i blodet under 15-20 µg/100 ml anses en minskning av ALAD-aktiviteten för närvarande inte påverka bildandet av röda blodkroppar.

En ökning av protoporfyrhalten i de röda blodkropparna (PPE) tyder på interferens med kroppens användning av järn varvid hemoglobinsyntesen hämmas. En ökning av PPE har hittats i blyhalter i blodet på över 20-30 µg/100 ml. En ökning av PPE kan emellertid ha andra orsaker.

Interferens med glutathione-syntesen kan tolereras endast för en bråkdel av befolkningen och endast om den är mycket liten och inte resulterar i andra subkliniska symptom. Denna oacceptabla interferens med glutathione-syntesen uppträder inte vid blyhalter i blodet under 30 µg/100 ml.

En märkbar ökning av utsöndringen av delta-aminolevulinsyra i urinen (ALAU) är ett märkbart tecken på störning i ämnesomsättningen av porfyrin och sålunda ett tecken på hälsoförsämring. En statistiskt signifikant ökning av ALAU börjar uppträda vid blyhalter i blodet på över 35 µg/100 ml.

BILAGA II

SAMBANDET MELLAN BLYHALTEN I BLODET OCH ENZYMAKTIVITET

Med beaktande av artikel 2 i detta direktiv skall förhållandet mellan blyhalten i blodet och ALADenzymaktiviteten mätas i enlighet med den europeiska standardmetoden (bilaga 3) enligt följande:

Blyhalt i blodet

(µg/100 ml blod)

35

30

20

ALAD

(enheter/liter)

20

25

35

Om de ALAD-värden som uppmäts är märkbart högre än gränsvärdena ovan för olika sektorer av befolkningen krävs inte bekräftande mätningar av blyinnehållet i blodet.

BILAGA III

TEKNISKA FÖRESKRIFTER FÖR MÄTNING AV ALAD-AKTIVITET

Europeisk standardiserad metod för att bestämma aktiviteten hos delta-aminolevulinsyredehydratas

Principen i den valda metoden för att bestämma aktiviteten hos delta-aminolevulinsyredehydratas är välkänd. Den grundar sig på enzyminkubation med ett överskott på delta-aminolevulinsyresubstrat. Porphobilinogen (PBG) som bildas efter en viss tid blandas med modifierad Ehrlich-reagens och den färg som erhålls mäts mot vitt med hjälp av en fotometer. Mängden porphobilinogen som produceras utgör ett mått på ALAD-aktiviteten.

METOD

Ljusets inverkan

Nyligen gjorda experiment har visat att PBG i synnerhet är mycket känslig för ljus. Hela analysen bör sålunda utföras utan något direkt solljus någonstans i laboratoriet (gäller alltså inte endast på det ställe där analysen utförs).

Fas ett - Blodprovstagning och förvaring före analysen

- Ta ett prov på 2 ml venöst blod med hjälp av en plastspruta (utan blystabilisering) i närvaro av torr heparin (> 5 mg).

- Förbered omedelbart fyra prover på 0,2 ml fördelade på fyra plasttuber (utan blystabilisering) och kyl ner dem till 4 °C. Graderade pipetter av Marbourg-typ bör användas.

- Om proven analyseras inom tre timmar är det inte nödvändigt att kyla dem.

- Proven bör inte förvaras vid 4 °C längre än 24 timmar.

- Omedelbart före analysen bör alla proven placeras i ett iskallt vattenbad i 10 minuter.

Anmärkning: Plastmaterial som får användas innefattar t.ex. polyten, polystyren och polypropylen. Förvaringsperioden på 24 timmar vid 4 °C är en försiktig beräkning. Denna intervall är tillräckligt lång för att provet skall kunna avlägsnas för analys från den plats där det togs till ett centralt laboratorium. Tre av fyra blodprov används för att mäta ALAD och det fjärde för kontroll.

Fas två - Avläsning av hematokrit

Denna avläsning måste göras

- vid samma tidpunkt som blodprovet,

- genom kapillärmetod genom att använda två prov.

Efter det att den ena änden på röret har stängts bör proven centrifugeras vid en hastighet av minst 30 000 varv/minut och i minst fem minuter.

Anmärkning: Denna avläsning bör företrädesvis göras genast men i varje fall senast 24 timmar efter det att blodprovet togs. Om möjligt bör en mikrohematokrit-centrifug användas.

Fas tre - Hemolys

- Ta tre blodprov som har "tinats", använd 1,3 ml destillerat vatten (uppvärmt till 37 °C) och hemolysera i 10 minuter vid 37 ± 0,2 °C.

- Använd företrädesvis en 2 ml graderad pipett för att tillsätta vatten och blanda omsorgsfullt.

- Skaka inte proven på detta stadium.

Anmärkning: Det har bestämts att vatten hellre bör användas än Triton X 100 för hemolys. Hemolysexperiment där Triton X 100 användes resulterade i en betydligt långsammare ALAD-aktivitet som ännu inte har kunnat förklaras och som kan vara en artefakt.

Fas fyra - Tillsättning av ALA-lösning till hemolysaten

- Bered ALA-lösningen.

- Den bör beredas minst fem timmar i förväg.

- Hetta upp denna lösning till 37 °C i minst 10 minuter innan den tillsätts.

- Tillsätt 1 ml av denna lösning till hemolysaten, företrädesvis genom att använda en 1 ml volymetrisk pipett och blanda.

Anmärkning: Ett pH-värde på 6,4 har valts eftersom experiment har visat att det är vid detta pH-värde som den bästa överensstämmelsen finns mellan ALAD-aktivitet och blyhalter i blodet hos normala befolkningar. Det är inte nödvändigt att erhålla maximal aktivitet (som kan ske genom att höja pH-värdet) eftersom aktiviteterna som skall mätas redan är ganska höga.

Fas fem - Beredning av kontrollprovet

- Ta 0,2 ml blod som behandlats vid mätning av ALAD fram till den punkt då ALA-lösningen tillsätts; i stället för denna, tillsätt 1 ml TCA-HgCl2-lösning, 1 ml ALA-lösning, och gå sedan tillväga som när ALAD mäts (se nedan).

- Tillsätt lösningarna genom att använda volymetriska pipetter.

Anmärkning: Bara ett kontrollprov jämförs med en serie på tre provningar för varje blodprov. Om det OD som erhålls för kontrollprovet är mycket högt bör förfarandet upprepas för att kontrollera det.

Fas sex - Inkubation

- 60 minuter vid 37 ± 0,2 °C i ett vattenbad.

- Inkubationstiden beräknas från tillsättningen av ALA-lösning.

Anmärkning: Inkubationsperioden på 60 minuter har valts för att ALAD-aktiviteten skall öka på naturligt sätt förutsatt att ingen annan fas leder till ett konstlad ökning av aktiviteten. Experiment har visat att förhållandet mellan inkubationstid och aktivitet är linjärt för intervaller på över två timmar.

Inkubationstemperaturen har hållits vid 37 °C av praktiska skäl.

Fas sju - Avbrott i PBG-reaktionen

- Tillsätt 1 ml TCA-HgCl2-lösning till inkubationsblandningen företrädesvis genom att använda en 1 ml volymetrisk pipett.

Fas åtta - Centrifugering och filtrering

- 30 000 varv/minut.

- Filtrering genom användning av Whatman-papper nr 54 eller motsvarande (syrebeständigt).

Anmärkning: Centrifugeringen bör vara omkring 10 minuter. Filtreringsfasen är inkluderad för att undvika överföring genom pipett av små partiklar till ytan på den flytande vätskan. Dessa partiklar tycks producera en färgreaktion med Ehrlichs reagens. Ett antal provningar har visat att innefattandet av filtreringsfasen leder till bättre reproducerbarhet. Denna fas kan om nödvändigt ersättas av en andra centrifugering.

Fas nio - Reaktion med Ehrlichs reagens

- Blanda 1 ml flytande vätska med 1 ml modifierad Ehrlichs reagens med hjälp av en 1 ml volymetrisk pipett.

- Använd en Vortex-typblandare för att säkerställa att blandningen är homogen.

- Låt reaktionen fortsätta i fem minuter innan extinktionen mäts.

Anmärkning: För att erhålla en homogen blandning är det mycket viktigt att säkerställa att den filtrerade flytande vätskan är väl blandad med Ehrlichs reagens.

Fas tio - Mätning av extinktionen

- Kalibrera spektrofotometern med hjälp av en fenolftalin-lösning i en basisk buffert.

- Jämför mätningen av extinktionen av provet med kontrollprovet vid 555 nm i en 1 cm cell (eller 2 cm om absorptionen är mycket låg).

Fas elva - Beräkning av enzymaktivitet

- Ekvationen för att beräkna enzymaktiviteten är följande:

OD korr. × 35 × 2 × 100 × K Hct. % × 60 × 62 = µmoles ALA/mn/ml RBC = U/ml

där

Od= uppmätt extinktion

60 = inkubationstid

35 = spädningsfaktor

62 = molal extinktionkoefficient i cm2/µmol

K = spektrofotometrisk korrektionskoefficient.

Anmärkning: De föreslagna enheterna överensstämmer med rekommendationerna från Internationella biokemistförbundet om enzymnomenklaturen.

LÖSNINGAR

1. Beredning av en ALA-lösning

Lösning A:

1,78 g Na2HPO4 7 2H2O upplöst i 100 ml destillerat vatten (helst dejoniserat).

Lösning B:

1,38 g NaH2PO4 7 1H2O upplöst i 100 ml destillerat vatten.

29 ml av lösning A + 71 ml av lösning B ger en buffert på 0,1 M natriumfosfat vid PH 6,4.

Denna buffertstyrka är nödvändig för att förhindra ändring av pH-värdet i den lösning som är under reaktion.

167,6 mg ALA-HCl löses upp i lösning B (som alltid måste vara sur); pH-värdet ändras till 6,4 på grund av lösning A. Volymen fylls till 100 ml genom användning av buffertlösningen 0,1 M natriumfosfat vid pH 6,4. Denna beredning ger en lösning på 0,01 M ALA.

2. TCA-HgCl2- lösning

1,35 g HgCl2 löses i 100 ml 10 % triklorättiksyra

3. Ehrlichs reagenslösning

Reagenser:

2,5 p-dimetylaminobenzaldehyd (pDMAB),

0,25 g HgCl2 upplöst i 10 ml isad ättiksyra,

perklorsyra SG 1,7,

isad ättiksyra.

Beredning:

Lös up pDMAB i 50 ml ättiksyra. Tillsätt 24,5 ml perklorsyra och 4 ml HgCl2 lösning. Blanda, kyl och fyll på till 100 ml med isad ättiksyra i en graderad flaska(1). Förvara i en mörk flaska.

Kalibrering:

Kalibrering på gemenskapsnivå bör utföras varje år av ett laboratorium som utsetts av medlemsstaterna gemensamt.

(1) Skulle det på detta stadium visa sig en brunfärgning skall reagensen kasseras.