Seznam in opis analiznih metod iz prvega pododstavka člena 120g Uredbe Sveta (ES) št. 1234/2007 (1)

(objavljena na podlagi člena 15(2) Uredbe Komisije (ES) št. 606/2009 z dne 10. julija 2009 (2) )

2010/C 43/01

V tabeli v nadaljevanju je seznam analiznih metod, ki se uporabljajo za nadzor mejnih vrednosti in zahtev, postavljenih s predpisi Skupnosti za izdelavo proizvodov iz grozdja in vina. V tretjem stolpcu je za vsak zadevni parameter naveden sklic na ustrezno analizno metodo, opisano v zadnji izdaji „Zbirke mednarodnih analiznih metod za vino in mošt“ („Recueil des méthodes internationales d'analyse des vins et des moûts“) (2009) Mednarodne organizacije za trto in vino (OIV), ki je bila na voljo v času objave tega dokumenta. Za vsak parameter so opisane le referenčne metode („tip I“ ali „tip II“ po razvrstitvi OIV), razen kar zadeva parametre, za katere trenutno ni potrjene metode tipa I ali II. Opis metod je vključen v Prilogo k sporočilu.

Opozorilo:

V oddelku I Priloge A Zbirke OIV so opredeljeni različni tipi analiznih metod, zlasti tipa I (referenčna metoda merila), tipa II (referenčna metoda) in tipa IV (začasna metoda).

Analizne metode za svinec in kadmij so zdaj opisane v Uredbi Komisije (ES) št. 333/2007 z dne 28. marca 2007 (Priloga C-3) (3). Poleg tega so v Prilogi II.4 Uredbe (ES) št. 401/2006 z dne 23. februarja 2006 (4) postavljena splošna merila v zvezi z analiznimi metodami za ohratoksin A, zato za to snov ni treba opisati posebne metode za proizvode iz grozdja in vina.

SEZNAM ANALIZNIH METOD

Organi OIV posodabljajo opise nekaterih analiznih metod. Ti opisi bodo objavljeni v enem od naslednjih sporočil Komisije, ko bo OIV objavila posodobljeno besedilo v izdaji Zbirke mednarodnih analiznih metod za leto 2010.

(1) UL L 299, 16.11.2007.

(2) UL L 193, 24.7.2009, str. 1.

(3) UL L 88, 29.3.2007, str. 29.

(4) UL L 70, 9.3.2006, str. 12.

PRILOGA

KAZALO

1. GOSTOTA PRI 20 °C IN SPECIFIČNA TEŽA PRI 20 °C (OIV-AS2-01-MASVOL) – Metoda tipa I

2. REFRAKTOMETRIČNO DOLOČANJE KONCENTRACIJE SLADKORJA V GROZDNEM MOŠTU, ZGOŠČENEM GROZDNEM MOŠTU IN REKTIFICIRANEM ZGOŠČENEM GROZDNEM MOŠTU (OIV-AS2-02-SUCREF) – Metoda tipa I

3. SKUPNI SUHI EKSTRAKT (OIV-AS-2-03-EXTSEC) Skupna suha snov – Metoda tipa I

4. DOLOČITEV IZOTOPSKEGA RAZMERJA 18 O/ 16 O V VODI VINA (OIV-AS-2-09-MOUO18) – Metoda tipa II

5. KAZALEC FOLIN-CIOCALTEU (OIV-AS-2-10-INDFOL) – Metoda tipa IV

6. GLUKOZA IN FRUKTOZA (OIV-AS-311-02-GLUFRU) – Metoda tipa II

7. DOLOČITEV SLADKORJEV S TEKOČINSKO KROMATOGRAFIJO VISOKE LOČLJIVOSTI (HPLC) (SAHAROZA) (OIV-AS-311-03-SUCRES) – Metoda tipa II

8. UGOTAVLJANJE OBOGATITVE GROZDNEGA MOŠTA, ZGOŠČENEGA GROZDNEGA MOŠTA, REKTIFICIRANEGA ZGOŠČENEGA GROZDNEGA MOŠTA IN VIN Z UPORABO NUKLEARNE MAGNETNE RESONANCE DEVTERIJA (SNIF-NMR/RMN-FINS) (OIV-AS-311-05-ENRRMN) – Metoda tipa I

9. VOLUMENSKI DELEŽ ALKOHOLA (OIV-AS-312-01-TALVOL) – Metoda tipa I

10. DOLOČITEV RAZMERJA 13 C/ 12 C Z IZOTOPSKO MASNO SPEKTROMETRIJO V VINSKEM ETANOLU ALI ETANOLU S FERMENTACIJO MOŠTA, ZGOŠČENEGA MOŠTA ALI REKTIFICIRANEGA ZGOŠČENEGA MOŠTA (OIV-AS-312-06-ETHANO) – Metoda tipa II

11. SKUPNE KISLINE (OIV-AS-313-01-ACITOT) – Metoda tipa I

12. HLAPNE KISLINE (OIV-AS-313-02-ACIVOL) – Metoda tipa I

13. CITRONSKA KISLINA (OIV-AS-313-09-ACIENZ) – Metoda tipa II

14. SORBINSKA KISLINA (OIV-AS-313-14-ACISOR) – Metoda tipa IV

15. pH (OIV-AS-313-15-PH) – Metoda tipa I

16. HKRATNA DOLOČITEV L-ASKORBINSKE IN D-IZOASKORBINSKE KISLINE S HPLC IN UV-DETEKCIJO (OIV-AS-313-22-ACASCO – Metoda tipa II

17. OGLJIKOV DIOKSID (OIV-AS-314-01-DIOCAR) – Metoda tipa II

18. DOLOČITEV OGLJIKOVEGA DIOKSIDA V VINU Z MANOMETRIČNO METODO (OIV-AS314-04-CO2MAN) – Metoda tipa II

19. MERJENJE NADTLAKA PENEČIH IN BISER VIN (OIV-AS-314-02-SURPRES) – Metoda tipa I

20. Določitev lizocima v vinu s HPLC (OIV-AS-315-14) – Metoda tipa IV

21. SULFATI (OIV-AS-321-05-SULFAT) – Metoda tipa II

22. ŽELEZO (OIV-AS-322-05-FER) – Metoda tipa IV

23. BAKER (OIV-AS 322-06) – Metoda tipa IV

24. ŽVEPLOV DIOKSID (OIV-AS-323-04-DIOSU) – Metoda tipa II

1 GOSTOTA PRI 20 °C IN SPECIFIČNA TEŽA PRI 20 °C (OIV-AS2-01-MASVOL) – METODA TIPA I

1. OPREDELITEV POJMOV

Gostota je masa na enoto prostornine vina ali mošta pri 20 °C. Izražena je v gramih na mililiter in označena s simbolom ρ20 °C.

Specifična teža pri 20 °C (ali relativna gostota 20 °C/20 °C) je z decimalnim številom izraženo razmerje med gostoto neke prostornine vina ali mošta pri 20 °C in gostoto enake prostornine vode pri enaki temperaturi. Označena je s simbolom .

2. PRINCIP METOD

Gostota in specifična teža pri 20 °C se merita na testnem vzorcu:

bodisi s piknometrijo: referenčna metoda

bodisi z denzimetrijo z uporabo hidrostatske tehtnice ali z elektronsko denzimetrijo.

Opomba

Za zelo natančno merjenje je potrebna korekcija gostote zaradi vpliva žveplovega dioksida po formuli:

ρ20 °C = ρ′20 °C – 0,0006 × S pri čemer je ρ20 °C = korigirana gostota ρ′20 °C = ugotovljena gostota S = koncentracija skupnega žveplovega dioksida v gramih na liter

3. POPREJŠNJA OBDELAVA VZORCA

Če vino ali mošt vsebuje znatne količine ogljikovega dioksida, ga večino odstranimo z mešanjem 250 ml vina v litrski bučki ali s filtracijo pod zmanjšanim pritiskom skozi 2 g bombažne vate, nameščene v razširjeno epruveto.

4. REFERENČNA METODA

4.1 Aparature

Običajna laboratorijska oprema, zlasti:

4.1.1 Piknometer iz nepregornega stekla (1), prostornine približno 100 ml in s snemljivim termometrom, povezanim z obrusom in umerjenim v desetinkah stopinje od 10 do 30 °C (slika 1). Termometer mora biti standardiziran.

Piknometer ima stransko cevko dolžine 25 mm in notranjega premera 1 mm (največ), ki se končuje s koničnim obrusom. Ta stranska cevka je lahko pokrita z „zbiralnim zamaškom“, ki ima prav tako konični obrus in se končuje z vodoravnim prerezom. Ta zamašek se uporablja kot raztezna celica.

Oba obrusa aparature morata biti narejena zelo pazljivo.

4.1.2 Tara posoda, in to z enako zunanjo prostornino (natančno do najmanj 1 ml) kakor piknometer in maso, enako masi piknometra, napolnjenega s tekočino specifične teže 1,01 (raztopina natrijevega klorida 2,0 % m/v).

Toplotno izolirana posoda, ki se točno prilega piknometru.

4.1.3 Dvoramenska tehtnica z merilnim območjem vsaj 300 g in možnostjo odčitavanja na 0,1 mg natančno

ali

enoramenska tehtnica z merilnim območjem vsaj 200 g in možnostjo odčitavanja na 0,1 mg natančno.

4.2 Umerjanje piknometra

Pri umerjanju piknometra se določijo naslednje vrednosti:

— masa praznega piknometra,

— prostornina piknometra pri 20 °C,

— masa piknometra, napolnjenega z vodo pri 20 °C.

4.2.1 Metoda z uporabo dvoramenske tehtnice

Tara posodo postavimo na levo stran tehtnice ter čist in suh piknometer, opremljen z „zbiralnim zamaškom“, na desno stran tehtnice. Posodi, ki drži piknometer, dodamo uteži in zapišemo maso, ki je potrebna za ravnovesje: to maso označimo s p gramov.

Piknometer pazljivo napolnimo z destilirano vodo pri sobni temperaturi in pritrdimo termometer; piknometer pazljivo obrišemo in postavimo v toplotno izolirano posodo. Mešamo z obračanjem posode, dokler nima temperatura, ki jo odčitamo na termometru, konstantne vrednosti. Na vrhu stranske cevke točno uravnamo raven vode. Stransko cevko osušimo in zapremo z zbiralnim zamaškom; natančno odčitamo temperaturo t v oC in po možnosti upoštevamo korekcijo netočnosti temperaturne skale. Stehtamo z vodo napolnjeni piknometer proti tara posodi in zapišemo maso p′ v gramih, ki je potrebna za vzpostavitev ravnotežja.

Izračun:

Tariranje praznega piknometra: masa praznega piknometra= p + m, pri čemer je m= masa zraka v piknometru m= 0,0012 (p – p′).

Prostornina pri 20 °C: V20 °C= (p + m – p′) × Ft pri čemer je Ft= faktor iz tabele I za temperaturo t °C. V20 °C mora biti dan na ± 0,001 ml natančno.

Masa vode pri 20 °C: M20 °C= V20 °C × 0,998203 pri čemer je 0,998203= gostota vode pri 20 °C.

4.2.2 Metoda z uporabo enoramenske tehtnice

Določimo:

— maso čistega in suhega piknometra: označimo jo s P,

— maso piknometra, napolnjenega z vodo pri t oC, po postopku, opisanem v točki 4.2.1: označimo jo s P1,

— maso tara posode: T0.

Izračun:

Tariranje praznega piknometra:

masa praznega piknometra= P – m pri čemer je m= masa zraka v piknometru, m= 0,0012 (P1 – P).

Prostornina pri 20 °C: V20 °C= [P1 – (P – m)] × Ft pri čemer je Ft= faktor iz tabele I za temperaturo t °C.

Prostornina pri 20 °C mora biti dana na ± 0,001 ml natančno.

Masa vode pri 20 °C: M20 °C= V20 °C × 0,998203 pri čemer je 0,998203= gostota vode pri 20 °C

4.3 Metoda merjenja

4.3.1. Metoda z uporabo dvoramenske tehtnice

Stehtamo piknometer, napolnjen s pripravljenim testnim vzorcem (točka 3) po postopku, opisanem v točki 4.2.1.

S p″ označimo maso v gramih, ki je potrebna za vzpostavitev ravnovesja pri t °C.

Masa tekočine v piknometru = p + m – p″

Navidezna gostota pri t °C:

ρt °C = (p + m – p″)/V20 °C

Izračunamo gostoto pri 20 °C, pri čemer uporabimo eno od v nadaljevanju navedenih korekcijskih tabel glede na vrsto merjene tekočine: suho vino (tabela II), naravni ali zgoščeni mošt (tabela III), sladko vino (tabela IV).

Specifično težo 20 °C/20 °C vina izračunamo tako, da delimo gostoto pri 20 °C z 0,998203.

4.3.2 Metoda z uporabo enoramenske tehtnice

Stehtamo tara posodo in njeno maso označimo s T1.

Izračunamo dT = T1 – T0.

Masa praznega piknometra v času merjenja = P – m + dT.

Stehtamo piknometer, napolnjen s pripravljenim testnim vzorcem (točka 3), po postopku iz točke 4.2.1. Njegovo maso pri t °C označimo s P2.

Masa tekočine v piknometru pri t °C = P2 – (P – m + dT).

Navidezna gostota pri t °C:

ρt °C = (P2 – (P – m + dT)/V20 °C

Izračunamo gostoto testirane tekočine pri 20 °C (suho vino, naravni ali zgoščeni mošt ali sladko vino), kakor je opisano v točki 4.3.1 zgoraj.

Specifično težo 20 °C/20 °C izračunamo tako, da gostoto pri 20 °C delimo z 0,998203.

4.3.3 Ponovljivost merjenja gostote

za suha in polsladka vina: r = 0,00010

in za sladka vina: r = 0,00018

4.3.4 Obnovljivost merjenja gostote

za suha in polsladka vina: R = 0,00037

in za sladka vina: R = 0,00045.

TABELA I

Faktor F,

s katerim moramo pomnožiti maso vode v nepregornem piknometru pri t °C za izračun prostornine piknometra pri 20 °C

(Glej tabelo I iz Priloge II k metodi AS2-01, opisani v Zbirki mednarodnih analiznih metod OIV.)

TABELA II

Temperaturne korekcije c za gostoto suhih in suhih dealkoholiziranih vin, izmerjeno s steklenim nepregornim piknometrom pri t °C, popravek rezultata na vrednost pri 20 °C

(Glej tabelo II iz Priloge II k metodi AS2-01, opisani v Zbirki mednarodnih analiznih metod OIV.)

ρ20 = ρ t ± (c/(1 000) – če je t °C nižja od 20 °C + če je t °C višja od 20 °C

TABELA III

Temperaturne korekcije c za gostoto naravnega ali zgoščenega mošta, izmerjeno s steklenim nepregornim piknometrom pri t °C , popravek rezultata na vrednost pri 20 °C

(Glej tabelo III iz Priloge II k metodi AS2-01, opisani v Zbirki mednarodnih analiznih metod OIV.)

ρ20 = ρ t ± (c/(1 000) – če je t °C nižja od 20 °C + če je t °C višja od 20 °C

TABELA IV

Temperaturne korekcije c za gostoto vin z volumenskim deležem alkohola 13 % in več, ki vsebujejo preostanek sladkorja, izmerjeno s steklenim nepregornim piknometrom pri t °C, popravek rezultata na vrednost pri 20 °C

(Glej tabelo IV iz Priloge II k metodi AS2-01, opisani v Zbirki mednarodnih analiznih metod OIV.)

ρ20 = ρ t ± (c/(1 000) – če je t °C nižja od 20 °C + če je t °C višja od 20 °C

2 REFRAKTOMETRIČNO DOLOČANJE KONCENTRACIJE SLADKORJA V GROZDNEM MOŠTU, ZGOŠČENEM GROZDNEM MOŠTU IN REKTIFICIRANEM ZGOŠČENEM GROZDNEM MOŠTU (OIV-AS2-02-SUCREF) – METODA TIPA I

1. PRINCIP METODE

Lomni količnik pri 20 °C, izražen bodisi kot absolutna vrednost bodisi kot masni delež saharoze, je dan v ustrezni tabeli in z uporabo te tabele lahko določimo koncentracijo sladkorja v gramih na liter in v gramih na kilogram za grozdni mošt, zgoščeni grozdni mošt in rektificirani zgoščeni grozdni mošt.

2. APARATURE

2.1 Abbéjev refraktometer

Uporabljeni refraktometer mora imeti skalo, ki prikazuje:

— bodisi masni delež saharoze do 0,1 % natančno

— bodisi lomne količnike na štiri decimalna mesta natančno.

Refraktometer mora biti opremljen s termometrom s skalo od najmanj + 15 °C do + 25 °C in s pripravo za kroženje vode, ki omogoča meritve pri temperaturi 20 °C ± 5 °C.

Navodila za uporabo instrumenta moramo natančno upoštevati, zlasti glede kalibracije in vira svetlobe.

3. PRIPRAVA VZORCA

3.1 Mošt in zgoščeni mošt

Po potrebi mošt prefiltriramo prek štirikrat preganjene suhe gaze, zavržemo prvih nekaj kapljic filtrata in nato določimo vrednosti na filtratu.

3.2 Rektificirani zgoščeni mošt

Glede na koncentracijo uporabimo bodisi rektificirani zgoščeni mošt bodisi raztopino, ki jo dobimo tako, da v 200 g rektificiranega zgoščenega mošta dodajamo vodo, dokler ne dobimo 500 g, pri tem pa morajo biti vsa tehtanja natančna.

4. POSTOPEK

Vzorec segrejemo na temperaturo skoraj 20 °C. Manjši testni vzorec nanesemo na nižjo prizmo refraktometra, pri čemer pazimo (kajti prizme so pritrjene tesno skupaj), da testni vzorec enakomerno pokrije stekleno površino. Meritev opravimo v skladu z navodili za uporabo instrumenta.

Odčitamo masni delež saharoze na 0,1 % natančno ali odčitamo lomni količnik na štiri decimalna mesta natančno.

Opravimo vsaj dve meritvi na istem pripravljenem vzorcu. Zabeležimo temperaturo t °C.

5. IZRAČUN

5.1 Korekcija temperature

5.1.1 Instrumenti, umerjeni na masni delež saharoze (v %): korekcija temperature je dana v tabeli I.

5.1.2 Instrumenti, umerjeni na lomni količnik: v tabeli II poiščemo količnik, merjen pri t °C, in nato (v stolpcu ena) še ustrezno vrednost, ki prikazuje masni delež saharoze pri t °C. Ta vrednost je korigirana zaradi temperature in je izražena kot koncentracija pri 20 °C na podlagi tabele I.

5.2 Koncentracija sladkorja v moštu in zgoščenem moštu

V tabeli II poiščemo masni delež saharoze pri 20 °C in v isti vrstici še koncentracijo sladkorja v gramih na liter in v gramih na kilogram. Koncentracija sladkorja je izražena kot vrednost invertnega sladkorja na eno decimalno mesto natančno.

5.3 Koncentracija sladkorja v rektificiranem zgoščenem moštu

V tabeli III poiščemo masni delež saharoze pri 20 °C in v isti vrstici še koncentracijo sladkorja v gramih na liter in gramih na kilogram. Koncentracija sladkorja je izražena kot vrednost invertnega sladkorja na eno decimalno mesto natančno.

Če je bila meritev opravljena na razredčenem rektificiranem zgoščenem moštu, rezultat pomnožimo s faktorjem razredčitve.

5.4 Lomni količnik mošta, zgoščenega mošta in rektificiranega zgoščenega mošta

V tabeli II poiščemo masni delež saharoze pri 20 °C in v isti vrstici še lomni količnik pri 20 °C. Količnik je izražen na štiri decimalna mesta natančno.

Opomba: Delež potencialnega alkohola v moštu, zgoščenem moštu in rektificiranem zgoščenem moštu je mogoče določiti na podlagi tabele ekvivalentnosti iz Priloge I Uredbe Komisije (ES) št. 1623/2000 z dne 25. julija 2000 (UL L 194, 31.7.2009).

TABELA I

Korekcija, ki jo moramo narediti, kadar določamo masni delež saharoze pri temperaturi, različni od 20 °C

(Glej tabelo I iz Priloge k metodi AS2-02, opisani v Zbirki mednarodnih analiznih metod OIV.)

TABELA II

V tabeli so dane koncentracije sladkorja v moštu in zgoščenem moštu v gramih na liter in gramih na kilogram, ki so bile določene z refraktometrom, umerjenim bodisi na masni delež saharoze pri 20 °C bodisi na lomni količnik pri 20 °C. Dana je tudi gostota pri 20 °C.

(Glej tabelo II iz Priloge k metodi AS2-02, opisani v Zbirki mednarodnih analiznih metod OIV.)

TABELA III

V tabeli so dane koncentracije sladkorja v rektificiranem zgoščenem moštu v gramih na liter in gramih na kilogram, ki so bile določene z refraktometrom, umerjenim bodisi na masni delež saharoze pri 20 °C bodisi na lomni količnik pri 20 °C. Dana je tudi gostota pri 20 °C.

(Glej tabelo III iz Priloge k metodi AS2-02, opisani v Zbirki mednarodnih analiznih metod OIV.)

3 SKUPNI SUHI EKSTRAKT (OIV-AS-2-03-EXTSEC) SKUPNA SUHA SNOV – METODA TIPA I

1. OPREDELITEV POJMA

Skupni suhi ekstrakt ali skupna suha snov vključuje vse snovi, ki pri določenih fizikalnih pogojih niso hlapne. Ti fizikalni pogoji morajo biti takšni, da se snovi, ki sestavljajo ekstrakt, med testiranjem čim manj spremenijo.

Ekstrakt brez sladkorja je razlika med skupnim suhim ekstraktom in skupnimi sladkorji.

Reducirani ekstrakt je razlika med skupnim suhim ekstraktom in skupnimi sladkorji nad koncentracijo 1 g/l, kalijevim sulfatom nad koncentracijo 1 g/l, navzočim manitolom ali katero koli kemično snovjo, ki je bila lahko dodana vinu.

Preostali ekstrakt je razlika med ekstraktom brez sladkorja in nehlapnimi kislinami, izraženimi kot vinska kislina.

Ekstrakt se izraža v gramih na liter in mora biti določen na 0,5 g natančno.

2. PRINCIP METODE

(Organi OIV posodabljajo opis te analizne metode. Objavljen bo v enem od naslednjih sporočil Komisije, ko bo OIV objavila posodobljeno besedilo v izdaji Zbirke mednarodnih analiznih metod za leto 2010. Dokler zadevna organizacija tega besedila ne objavi, si je mogoče informativno pomagati s poglavjem 4 Priloge k Uredbi Komisije (EGS) št. 2676/90.)

4 DOLOČITEV IZOTOPSKEGA RAZMERJA 18O/16O V VODI VINA (OIV-AS-2-09-MOUO18) – METODA TIPA II

(p.m.)

(Organi OIV posodabljajo opis te analizne metode. Objavljen bo v enem od naslednjih sporočil Komisije, ko bo OIV objavila posodobljeno besedilo v izdaji Zbirke mednarodnih analiznih metod za leto 2010. Dokler zadevna organizacija tega besedila ne objavi, si je mogoče informativno pomagati s poglavjem 43 Priloge k Uredbi Komisije (EGS) št. 2676/90.)

5 KAZALEC FOLIN-CIOCALTEU (OIV-AS-2-10-INDFOL) – METODA TIPA IV

1. OPREDELITEV POJMA

Kazalec Folin-Ciocalteu je rezultat, ki ga dobimo s spodaj opisano metodo.

2. PRINCIP

Vse fenolne spojine v vinu oksidirajo z reagentom Folin-Ciocalteu. Ta reagent pripravimo iz mešanice fosfovolframove kisline (H3PW12O40) in fosfomolibdične kisline (H3PMo12O40), ki se po oksidaciji fenolov reducira v mešanico modrih oksidov volframa (W8O23) in molibdena (Mo8O23).

Nastalo modro obarvanje ima maksimalno absorpcijo v območju 750 nm in je sorazmerno s celotno količino fenolnih spojin, ki so navzoče od začetka.

3. REAGENTI

Imeti morajo kakovost analitičnega reagenta. Uporabimo destilirano vodo ali vodo enakovredne čistosti.

3.1 Reagent Folin-Ciocalteu

Reagent je na voljo na trgu in je že pripravljen za uporabo. Pripravimo ga lahko na naslednji način: v 700 ml destilirane vode raztopimo 100 g natrijevega volframata (Na2WO4 × 2H2O) in 25 g natrijevega molibdata (Na2MoO4 × 2H2O). Dodamo 50 ml 85 % fosforne kisline (ρ20 = 1,71 g/ml) in 100 ml koncentrirane klorovodikove kisline (ρ20 = 1,19 g/ml). Segrejemo do vrenja in vremo 10 ur v pogojih refluksa. Nato dodamo 150 g litijevega sulfata. (Li2SO4 × H2O) in nekaj kapljic broma in pustimo vreti še 15 minut. Pustimo, da se ohladi, in dopolnimo do enega litra z destilirano vodo.

3.2 Brezvodni natrijev karbonat, Na2CO3, pripravljen v 20 % raztopini m/v.

4. APARATURE

Običajna laboratorijska oprema, zlasti:

4.1 100 ml merilne bučke.

4.2 Spektrofotometer, ki deluje pri 750 nm.

5. POSTOPEK

5.1 Rdeče vino

V 100 ml merilno bučko (točka 4.1) nalijemo dosledno v naslednjem vrstnem redu:

1 ml vina, poprej razredčenega v razmerju 1 : 5,

50 ml destilirane vode,

5 ml reagenta Folin-Ciocalteu (3.1),

20 ml raztopine natrijevega karbonata (3.2).

Dopolnimo do 100 ml z destilirano vodo.

Premešamo, da se tekočina homogenizira. Počakamo 30 minut, da se reakcija stabilizira. Določimo absorpcijo pri 750 nm prek dolžine poti 1 cm glede na slepi vzorec, v katerega smo namesto vina dali destilirano vodo.

Če absorpcija ni okrog 0,3, moramo ustrezno razredčiti.

5.2 Belo vino

Izvedemo enak postopek z 1 ml nerazredčenega vina.

5.3 Rektificirani zgoščeni mošt

5.3.1 Priprava vzorca

Uporabimo raztopino s koncentracijo sladkorja 25 % (m/m) (25 oBrix), ki jo pripravimo, kakor je opisano v točki 4.1.2 poglavja „pH“.

5.3.2 Meritev

Nadaljujemo po postopku, opisanem za rdeče vino (točka 5.1), pri čemer uporabimo 5 ml vzorec, ki je pripravljen v skladu s točko 5.3.1, in merimo absorpcijo glede na kontrolni vzorec, pripravljen s 5 ml 25 % (m/m) raztopine invertnega sladkorja.

6. IZRAŽANJE REZULTATOV

6.1 Izračun

Rezultat izrazimo v obliki kazalca, ki ga dobimo s pomnožitvijo absorpcije s 100 pri rdečih vinih, razredčenih v razmerju 1 : 5 (ali z ustreznim faktorjem za druga redčenja), in z 20 pri belih vinih. Pri rektificiranem zgoščenem moštu ga pomnožimo s 16.

6.2 Ponovljivost

Razlika med rezultati dveh določitev, ki jih opravi isti analitik istočasno ali zelo hitro eno za drugo, ne sme biti večja od 1.

Dobro ponovljivost rezultatov dosežemo, če uporabljamo zelo čiste aparature (merilne bučke in spektrofotometrske kivete).

6 GLUKOZA IN FRUKTOZA (OIV-AS-311-02-GLUFRU) – METODA TIPA II

1. OPREDELITEV POJMA

Glukozo in fruktozo lahko določamo individualno z encimsko metodo, katere edini cilj je izračun razmerja glukoza/fruktoza.

2. PRINCIP

Glukoza in fruktoza sta fosforilirani z adenozin-trifosfatom (ATP) med encimsko reakcijo, ki jo katalizira heksokinaza (HK), in proizvedeta glukozo 6-fosfat (G6P) in fruktozo 6-fosfat (F6P):

glukoza + ATP←→G6P + ADP

fruktoza + ATP←→F6P + ADP

Glukoza-6-fosfat najprej oksidira v glukonat-6-fosfat z nikotinamidadenindinukleotidfosfatom (NADP) v navzočnosti encima glukoza 6-fosfat dehidrogenaza (G6PDH). Količina proizvedenega reduciranega nikotinamidadenindinukleotidfosfata (NADPH) ustreza količini glukoze 6-fosfat in tako tudi količini glukoze.

G6P + NADP+←→glukonat 6-fosfat + NADPH + H+

Reducirani nikotinamidadenindinukleotidfosfat določimo iz njegove absorpcije pri 340 nm.

Na koncu te reakcije fruktoza 6-fosfat preide v glukozo 6-fosfat z delovanjem fosfoglukoze izomeraze (PGI):

F6P←→G6P

Glukoza-6-fosfat ponovno reagira z nikotinamidadenindinukleotidfosfatom, rezultat česar je glukonat 6-fosfat in reducirani nikotinamidadenindinukleotidfosfat, tega pa nato določimo.

3. APARATURE

— Spektrofotometer, ki omogoča meritve pri 340 nm, pri valovni dolžini, pri kateri je absorpcija NADPH največja. Ker merimo absolutno absorpcijo (ne uporabljamo umeritvenih krivulj, ampak opravimo standardizacijo z upoštevanjem ekstrakcijskega koeficienta NADPH), moramo preveriti lestvice valovnih dolžin in spektralne absorpcije opreme. Če tega nimamo na voljo, lahko uporabimo spektrofotometer z nekontinuiranim spektrom, ki omogoča meritve pri 334 nm ali 365 nm.

— Steklene kivete z dolžino optične poti 1 cm ali kivete za enkratno uporabo.

— Pipete za uporabo pri raztopinah za encimski test: 0,02; 0,05; 0,1; 0,2 ml.

4. REAGENTI

4.1 Raztopina 1: puferska raztopina (0,3 M trietanolamin, pH 7,6, 4 × 10–3 M v Mg2+): raztopimo 11,2 g trietanolamin hidroklorida ((C2H5)3N × HCl) in 0,2 g MgSO4 × 7H2O v 150 ml dvakrat destilirane vode, dodamo približno 4 ml 5 M raztopine natrijevega hidroksida (NaOH), da dobimo pH vrednost 7,6, in dopolnimo do 200 ml.

Ta puferska raztopina je pri +4 °C stabilna štiri tedne.

4.2 Raztopina 2: raztopina nikotinamidadenindinukleotidfosfata (približno 11,5 × 10–3 M): raztopimo 50 mg dinatrijevega nikotinamidadenindinukleotidfosfata v 5 ml dvakrat destilirane vode.

Ta raztopina je pri +4 °C stabilna štiri tedne.

4.3 Raztopina 3: raztopina adenozin 5'-trifosfata (približno 81 × 10–3 M): raztopimo 250 mg dinatrijevega adenozin 5'-trifosfata in 250 mg natrijevega hidrogenkarbonata (NaHCO3) v 5 ml dvakrat destilirane vode.

Ta raztopina je pri + 4 °C stabilna štiri tedne.

4.4 Raztopina 4: heksokinaza/glukoza 6-fosfat dehidrogenaza: zmešamo 0,5 ml heksokinaze (2 mg protein/ml ali 280 U/ml) z 0,5 ml glukoza 6-fosfata dehidrogenaze (1 mg protein/ml).

Ta mešanica je pri + 4 °C stabilna eno leto.

4.5 Raztopina 5: fosfoglukoza izomeraza (2 mg protein/ml ali 700 U/ml). Uporabimo nerazredčeno suspenzijo.

Pri + 4 °C je stabilna eno leto.

Opomba:

Vse zgoraj navedene raztopine so na voljo na trgu.

5. POSTOPEK

5.1 Priprava vzorca

Glede na ocenjeno količine glukoze + fruktoze na liter vzorec razredčimo po naslednjem postopku:

Meritev pri 340 in 334 nm Meritev pri 365 nm Redčenje z vodo Faktor redčenja F do 0,4 g/l do 0,8 g/l — — do 4,0 g/l do 8,0 g/l 1 + 9 10 do 10,0 g/l do 20,0 g/l 1 + 24 25 do 20,0 g/l do 40,0 g/l 1 + 49 50 do 40,0 g/l do 80,0 g/l 1 + 99 100 nad 40,0 g/l nad 80,0 g/l 1 + 999 1 000

5.2 Določitev

S spektrofotometrom, nastavljenim na valovno dolžino 340 nm, opravimo meritve, pri čemer zrak (na poti žarka ni nobene kivete) ali vodo uporabimo kot referenco.

Temperatura med 20 in 25 °C.

V dve kiveti z optično potjo 1 cm damo naslednje:

Referenčna kiveta Vzorčna kiveta Raztopina 1 (4.1) (pri 20 °C) 2,50 ml 2,50 ml Raztopina 2 (4.2) 0,10 ml 0,10 ml Raztopina 3 (4.3) 0,10 ml 0,10 ml Vzorec za meritev 0,20 ml Dvakrat destilirana voda 0,20 ml

Mešamo in po približno treh minutah odčitamo absorpcijo raztopin (A1). Reakcijo sprožimo z dodajanjem:

Raztopina 4 (4.4) 0,02 ml 0,02 ml

Mešamo; počakamo 15 minut; odčitamo absorpcijo in preverimo, ali se reakcija po dveh minutah konča (A2).

Takoj dodamo:

Raztopina 5 (4.5) 0,02 ml 0,02 ml

Mešamo; odčitamo absorpcijo po 10 minutah in preverimo, ali se reakcija po dveh minutah konča (A3).

Izračunamo razlike v absorpciji:

A2 – A1 ustreza glukozi,

A3 – A2 ustreza fruktozi,

za referenčno in vzorčno kiveto.

Izračunamo razlike v absorpciji za referenčno kiveto (Δ AR) in vzorčno kiveto (Δ AS) in nato dobimo:

za glukozo: ΔAG = ΔAS – ΔAR

za fruktozo: ΔAF = ΔAS – ΔAR

Opomba:

Čas, ki je potreben, da se konča aktivnost encimov, se lahko od ene serije do druge razlikuje. Gornja vrednost je samo napotek in jo je priporočljivo določiti za vsako posamezno serijo.

5.3 Izražanje rezultatov

5.3.1 Izračun

Splošna formula za izračun koncentracije je:

C= ((V × M)/(ε × d × v × 1 000)) Δ A (g/l)

V= prostornina testne raztopine (ml)

v= prostornina vzorca (ml)

M= molekulska masa snovi, ki jo določamo

d= dolžina optične poti v kiveti (cm)

ε= absorpcijski koeficient NADPH pri 340 nm (ε = 6,3 mmol–1 × l × cm–1)

V= 2,92 ml za določitev glukoze

V= 2,94 ml za določitev fruktoze

v= 0,20 ml

M= 180

d= 1

zato je:

za glukozo: Cg/l = 0,417 × ΔAG

za fruktozo: Cg/l = 0,420 × ΔAF

Če je bil vzorec med pripravo razredčen, rezultat pomnožimo s faktorjem redčenja F.

Opomba:

Če so meritve opravljene pri 334 ali 365 nm, dobimo naslednje:

— meritev pri 334 nm: ε = 6,2 (mmol–1 × l × cm–1) za glukozo: Cg/l = 0,425 × ΔAG za fruktozo: Cg/l = 0,428 × ΔAF

— meritev pri 365 nm: ε = 3,4 (mmol–1 × l × cm–1) za glukozo: Cg/l = 0,773 × ΔAG za fruktozo: Cg/l = 0,778 × ΔAF

5.3.2 Ponovljivost (r)

r= 0,056 xi

5.3.3 Obnovljivost (R)

R= 0,12 + 0,076 xi

xi= koncentracija glukoze ali fruktoze v g/l

7 DOLOČITEV SLADKORJEV S TEKOČINSKO KROMATOGRAFIJO VISOKE LOČLJIVOSTI (HPLC) (SAHAROZA) (OIV-AS-311-03-SUCRES) – METODA TIPA II

(p.m.)

[Organi OIV posodabljajo opis te analizne metode. Objavljen bo v enem od naslednjih sporočil Komisije, ko bo OIV objavila posodobljeno besedilo v izdaji Zbirke mednarodnih analiznih metod za leto 2010. Dokler zadevna organizacija tega besedila ne objavi, si je mogoče informativno pomagati s poglavjem 6(3) Priloge k Uredbi Komisije (EGS) št. 2676/90.]

8 UGOTAVLJANJE OBOGATITVE GROZDNEGA MOŠTA, ZGOŠČENEGA GROZDNEGA MOŠTA, REKTIFICIRANEGA ZGOŠČENEGA GROZDNEGA MOŠTA IN VIN Z UPORABO NUKLEARNE MAGNETNE RESONANCE DEVTERIJA (SNIF-NMR/RMN-FINS) (OIV-AS-311-05-ENRRMN) – METODA TIPA I

(p.m.)

[Znanstveni organi OIV znova preučujejo opis te analizne metode. Objavljen bo v sporočilu Komisije, ko bo generalna skupščina OIV sprejela dokončno besedilo. Dokler OIV te odločitve ne sprejme, si je mogoče informativno pomagati s poglavjem 8 Priloge k Uredbi Komisije (EGS) št. 2676/90.]

9 VOLUMENSKI DELEŽ ALKOHOLA (OIV-AS-312-01-TALVOL) – METODA TIPA I

(p.m.)

[Organi OIV posodabljajo opis teh analiznih metod. Objavljene bodo v enem od naslednjih sporočil Komisije, ko bo OIV objavila posodobljeno besedilo v izdaji Zbirke mednarodnih analiznih metod za leto 2010. Dokler zadevna organizacija tega besedila ne objavi, si je mogoče informativno pomagati s poglavjem 3 Priloge k Uredbi Komisije (EGS) št. 2676/90.]

10 DOLOČITEV RAZMERJA 13C/12C Z IZOTOPSKO MASNO SPEKTROMETRIJO V VINSKEM ETANOLU ALI ETANOLU S FERMENTACIJO MOŠTA, ZGOŠČENEGA MOŠTA ALI REKTIFICIRANEGA ZGOŠČENEGA MOŠTA (OIV-AS-312-06-ETHANO) – METODA TIPA II

1. PODROČJE UPORABE

Metoda omogoča meritev razmerja izotopov 13C/12C v vinskem etanolu ali etanolu s fermentacijo proizvodov iz vinske trte (mošta, zgoščenega mošta, rektificiranega zgoščenega mošta).

2. REFERENČNI STANDARDI

ISO: 5725:1994 „Točnost (pravilnost in natančnost) meritvenih metod in rezultati: Osnovna metoda za določitev ponovljivosti in obnovljivosti metode standardne meritve“. V-PDB: Vienna-Pee-Dee Belemnite (RPDB = 0,0112372). Metoda OIV AS-311-O5-ENRRMN „Zaznavanje obogatitve grozdnega mošta, zgoščenega grozdnega mošta, rektificiranega zgoščenega grozdnega mošta in vina z uporabo jedrske magnetne resonance devterija (SNIF-NMR).“

3. IZRAZI IN OPREDELITEV POJMOV

13C/12 : razmerje izotopov ogljika 13 (13C) in ogljika 12 (12C) za določen vzorec. δ13C : vsebnost ogljika 13 (13C), izražena v delih na 1 000 (‰). SNIF-NMR : frakcioniranje posebnega naravnega izotopa z jedrsko magnetno resonanco. V-PDB : Vienna-Pee-Dee Belemnit. PDB je osnovni referenčni material za merjenje naravnih variacij vsebnosti izotopa ogljika 13, ki sestoji iz kalcijevega karbonata iz krednega belemnita iz formacije Pee Dee v Južni Karolini (ZDA). Njegovo razmerje izotopov 13C/12C ali RPDB je 0,0112372. Zaloge PDB so že dolgo izčrpane, vendar še vedno ostaja glavna referenca za določitev naravnih variacij vsebnosti izotopa ogljika 13 in služi za umerjanje referenčnega materiala, ki je na voljo v Mednarodni agenciji za jedrsko energijo (IAEA) na Dunaju. Izotopske navedbe naravno prisotnega ogljika 13 so običajno izražene v razmerju do V-PDB. m/z : razmerje mase do naboja.

4. PRINCIP

Med fotosintezo rastline asimilirajo ogljikov dioksid z dvema bistvenima oblikama metabolizma, C3 metabolizmom (Calvinov cikel) in C4 metabolizmom (Hatch in Slack). Ta dva mehanizma fotosinteze predstavljata različna tipa izotopskega frakcioniranja. Proizvodi, ki izvirajo iz C4 rastlin, kot so sladkorji in alkohol, pridobljen s fermentacijo, imajo večjo vsebnost ogljika 13 kot podobni proizvodi, ki izvirajo iz C3 rastlin. Večina rastlin, vključno z vinskimi trtami in sladkorno peso, pripada skupini C3. Sladkorni trs in koruza pripadata skupini C4. Merjenje vsebnosti ogljika 13 omogoča ugotavljanje in vrednotenje sladkorjev C4 porekla (izoglukoza sladkornega trsa ali koruze), ki so dodani proizvodom iz grozdja (grozdni mošt, vina itd.). Podatki o vsebnosti ogljika 13, skupaj s podatki, dobljenimi s SNIF-NMR, omogočajo določitev dodanih količin mešanic sladkorjev ali alkoholov, pridobljenih iz C3 in C4 rastlin.

Vsebnost ogljika 13 se določi pri ogljikovem dioksidu, proizvedenemu med popolnim sežiganjem vzorca. Številčnost bistvenih izotopomerov mas 44 (12C16O2), 45 (13C16O2 in 12C17O16O) in 46 (12C16O18O), dobljenih iz različnih možnih kombinacij izotopov 18O, 17O, 16O, 13C in 12C, se določi iz ionskih tokov, ki jih izmerijo trije različni kolektorji masnega izotopskega spektrometra. Prispevki izotopomerov 13C17O16O in 12C17O2 se lahko prezrejo zaradi njihove nizke stopnje. Ionski tok za m/z = 45 se popravi za prispevek 12C17O16O, ki se izračuna v skladu s trenutno jakostjo, izračunano za m/z = 46, ob upoštevanju relativne številčnosti 18O in 17O (korekcija Craig). Primerjava z referenco, umerjeno na podlagi mednarodne reference V-PDB, dopušča izračun vrednosti δ13C na relativni skali.

5. REAGENTI

Material in gorivo sta odvisna od opreme (točka 6), ki se uporablja v laboratoriju. Sistemi, ki se običajno uporabljajo, temeljijo na elementarnih analizatorjih. Te sisteme je mogoče opremiti tako, da omogočajo vnašanje vzorcev v nepredušnih kovinskih kapsulah ali injiciranje tekočih vzorcev z brizgo skozi tesnilo.

Odvisno od vrste instrumenta, ki se uporablja, je mogoče uporabiti naslednje referenčne materiale, reagente in goriva:

— referenčni materiali

— na voljo iz IAEA: Ime Material δ13C do V-PDB (9) — IAEA-CH-6 Saharoza –10,4 ‰ — IAEA-CH-7 Polietilen –31,8 ‰ — NBS22 Olje –29,7 ‰ — USG24 Grafit –16,1 ‰

— na voljo iz IRMM v Geelu (B) (Inštitut za referenčni material in meritve): Ime Material δ13C do V-PDB (9) — CRM/BCR 656 Vinski alkohol –26,93 ‰ — CRM/BCR 657 Glukoza –10,75 ‰ — CRM/BCR 660 Vodno-alkoholna raztopina (12 % vol.) –26,72 ‰

— standardni delovni vzorec z znanim razmerjem 13C/12C, umerjen na podlagi mednarodnih referenčnih materialov,

— okvirni seznam goriv za sisteme kontinuiranega pretoka: — helij za analizo (CAS 07440-59-7), — kisik za analizo (CAS 07782-44-7), — ogljikov dioksid za analizo, uporabljen kot sekundarni referenčni plin za vsebnost ogljika 13 (CAS 00124-38-9), — oksidacijski reagent za peč sistema sežiganja, na primer bakrov (II) oksid za elementarno analizo (CAS 1317-38-0), — sušilno sredstvo za odstranjevanje vode, proizvedene pri sežiganju, na primer anhidron za elementarno analizo (magnezijev perklorat) (CAS 10034-81-8) (ni potrebno za opremo s sistemom za odstranjevanje vode s kriogenimi posodami ali selektivno prepustnimi kapilarami).

6. OPREMA IN MATERIAL

6.1 Masni spektrometer razmerja izotopov (IRMS)

Masni spektrometer razmerja izotopov (IRMS), ki lahko določi relativno vsebnost 13C naravno prisotnega plina CO2 z notranjo točnostjo 0,05 ‰ ali več, izraženo kot relativna vrednost (točka 9). Notranja točnost je določena kot razlika med dvema meritvama istega vzorca CO2. Masni spektrometer za merjenje razmerij izotopov je običajno opremljen s trojnim kolektorjem, ki istočasno meri jakosti za m/z = 44, 45 in 46. Masni spektrometer razmerja izotopov mora biti opremljen z dvojnim dovodom, da lahko izmenično meri neznani vzorec in referenčni vzorec, ali imeti integriran sistem, ki izvaja kvantitativno sežiganje vzorcev in loči ogljikov dioksid od drugih proizvodov pri sežiganju pred merjenjem v masnem spektrometru.

6.2 Oprema za sežiganje

Oprema za sežiganje, ki lahko kvantitativno spremeni etanol v ogljikov dioksid in odstrani vse druge proizvode pri sežiganju, vključno z vodo, brez kakršne koli izotopske frakcionacije. Oprema je lahko sistem kontinuiranega pretoka, integriran z masnim spektrometrom (točka 6.2.1), ali ločen sistem za sežiganje (točka 6.2.2). Oprema mora dopuščati točnost, ki je vsaj enaka tisti iz točke 11.

6.2.1 Sistemi kontinuiranega pretoka

Ti vključujejo elementarni analizator ali plinski kromatograf s sprotnim sistemom sežiganja.

Potrebna je naslednja laboratorijska oprema za sisteme, opremljene za vnašanje vzorcev v kovinskih kapsulah:

— umerjena mikrobrizga ali mikropipeta z ustreznimi lijaki,

— tehtnica s točnostjo 1 μg ali več,

— pincete za inkapsulacijo,

— kositrne kapsule za tekoče vzorce,

— kositrne kapsule za trdne vzorce.

Opomba:

Da bi zmanjšali tveganje izhlapevanja vzorcev etanola, se lahko absorbcijski material (na primer Chromosorb W 45-60 mesh) vloži v kapsule, najprej pa se preveri z meritvijo brez vzorca, da ta material ne vsebuje občutne količine ogljika, ki bi lahko vplival na rezultate.

Potrebna je naslednja laboratorijska oprema pri uporabi elementarnega analizatorja, opremljenega s tekočinskim brizgalnikom ali v primeru pripravljalnega sistema kromatografije sežiganja:

— brizga za tekočine,

— bučke z nepredušnimi zapiralnimi sistemi in inertnimi tesnili.

Laboratorijska oprema z zgornjih seznamov služi kot primer in jo je mogoče nadomestiti z drugo opremo z enakovredno zmogljivostjo, odvisno od vrste sežiganja in masnega spektrometra, ki se uporablja v laboratoriju.

6.2.2. Ločeni pripravljalni sistem

Vzorci ogljikovega dioksida, dobljeni s sežiganjem vzorcev, ki se analizirajo, in referenčni vzorec se zberejo v bučkah, ki se nato postavijo v dvojni dovod spektrometra za izotopsko analizo. Lahko se uporabi različna oprema za sežiganje, opisana v literaturi:

— zaprt sistem sežiganja s kroženjem kisika,

— elementarni analizator s pretokom helija in kisika,

— hermetično zaprta bučka z bakrovim (II) oksidom kot oksidacijskim agentom.

7. PRIPRAVA VZORCEV ZA POSKUSE

Etanol je treba izločiti od vina pred izotopskim poskusom. To se izvede z destilacijo vina, kot je navedeno v točki 3.1 metode SNIF-NMR (OIV - MA-E-AS311-05-ENRRMN).

V primeru grozdnega mošta, zgoščenega grozdnega mošta in rektificiranega zgoščenega grozdnega mošta je treba sladkorje najprej fermentirati v etanolu, kot je navedeno v točki 3.2 metode SNIF-NMR (OIV - MA-E-AS311-05-ENRRMN).

8. POSTOPEK

Vse faze priprave je treba izvesti brez občutne izgube etanola z izhlapevanjem, ki bi spremenila izotopsko sestavo vzorca.

Naslednji opis se nanaša na postopke, ki se običajno uporabljajo za sežiganje vzorcev etanola z uporabo trgovskega avtomatiziranega sistema za sežiganje. Vse druge metode, ki zagotavljajo, da se ves vzorec etanola spremeni v ogljikov dioksid brez izgube etanola z izhlapevanjem, se lahko uporabijo za pripravo ogljikovega dioksida za izotopsko analizo.

Eksperimentalni postopek, ki temelji na uporabi elementarnega analizatorja:

(a) vložitev vzorcev v kapsule: — uporabimo kapsule, pincete in pripravljalni pladenj, vse mora biti čisto, — s pinceto vzamemo ustrezno veliko kapsulo, — z mikropipeto vnesemo ustrezno količino tekočine v kapsulo, — Opomba: Potrebnega je 3,84 mg čistega etanola ali 4,17 mg destilata z vsebnostjo alkohola 92 % m/m za pridobitev 2 mg ogljika. Na tej osnovi je treba izračunati ustrezno količino destilata, v skladu s količino potrebnega ogljika, z upoštevanjem občutljivosti masnega spektrometra, — s pinceto kapsulo zapremo, — vsaka kapsula mora biti hermetično zaprta. Če ni, jo je treba zavreči in pripraviti novo, — za vsak vzorec je treba pripraviti dve kapsuli, — kapsule se postavijo na ustrezno mesto na pladnju avtomatske naprave za vzorčenje elementarnega analizatorja. Vsako kapsulo je treba skrbno opremiti s serijsko številko, — kapsule z delovnimi vzorci sistematično postavimo na začetek in konec serije vzorcev, — v serijo vzorcev redno vstavimo kontrolne vzorce;

(b) pregledovanje in nastavljanje elementarne analize in masnega spektrometra: — temperaturo peči elementarnega analizatorja ter pretoke helija in kisika nastavimo za optimalno sežiganje vzorca, — elementarno analizo in sistem masne spektrometrije preverimo za uhajanje (na primer preverjanje ionskega toka, pri čemer je m/z = 28 za N2), — masni spektrometer nastavimo za merjenje ionskih tokov, pri čemer je m/z = 44, 45 in 46, — sistem preverimo z znanimi kontrolnimi vzorci pred meritvijo vzorcev;

(c) izvajanje serije meritev Vzorci, postavljeni na avtomatsko napravo za vzorčenje elementarnega analizatorja (ali kromatografa), se vnašajo zaporedoma. Ogljikov dioksid iz vsakega sežiganja vzorca eluira proti masnemu spektrometru, ki meri ionske tokove. Z napravami povezan računalnik beleži ionske tokove in izračuna vrednost δ za vsak vzorec (točka 9).

9. IZRAČUN

Namen metode je meritev razmerja izotopov 13C/12C etanola, dobljenega iz vina ali proizvodov, dobljenih iz grozdja po fermentaciji. Razmerje izotopov 13C/12C se lahko izrazi z njegovim odstopanjem od delovnega vzorca. Izotopsko odstopanje ogljika 13 (δ13C) se nato izračuna na lestvici delta na tisoč (δ/1 000) s primerjavo rezultatov, dobljenih za vzorec, ki se meri, s tistimi za delovni vzorec, ki je bil predhodno umerjen na podlagi osnovne mednarodne reference (V-PDB). Vrednosti δ13C so izražene v razmerju z delovnim vzorcem, kot sledi:

δ13Csam/ref ‰ = 1 000 × (Rsam – Rref)/Rref

pri čemer sta Rsam oziroma Rref izotopski razmerji 13C/12C vzorca ter ogljikovega dioksida, uporabljenega kot referenčni plin.

Vrednosti δ13C so izražene v razmerju z V-PDB, kot sledi:

δ13Csam/V-PDB ‰ = δ13Csam/ref + δ13Cref/V-PDB + (δ13Csam/ref × δ13Cref/V-PDB)/1 000

pri čemer je δ13Cref/V-PDB predhodno določeno izotopsko odstopanje delovnega vzorca od V-PDB.

Med merjenjem lahko pride do manjših variacij zaradi sprememb meritvenih pogojev. V tem primeru je treba vrednosti δ13C vzorca popraviti skladno z razliko med vrednostjo δ13C delovnega standarda in njegovo resnično vrednostjo, predhodno umerjene na podlagi V-PDB s primerjavo z enim od mednarodnih referenčnih materialov. Med dvema meritvama delovnega standarda se lahko za variacijo, in zato tudi korekcijo, ki se uporabi za rezultate, dobljene iz vzorcev, predvideva, da je linearna. Delovni standard je treba izmeriti na začetku in koncu serije vzorcev. Nato je mogoče izračunati korekcijo za vsak vzorec z uporabo linearne interpolacije.

10. ZAGOTAVLJANJE KAKOVOSTI IN NADZOR

Preverimo, da se vrednost 13C za delovni vzorec ne razlikuje za več kot 0,5 ‰ od dopustne vrednosti. V nasprotnem primeru je treba pregledati nastavitve spektrometra in jih po potrebi nastaviti.

Za vsak vzorec preverimo, da je razlika v rezultatih za dve kapsuli, merjeni zaporedno, manjša od 0,3 ‰. Končni rezultat za določeni vzorec je povprečna vrednost obeh kapsul. Če je odstopanje večje od 0,3 ‰, je treba merjenje ponoviti.

Pregledi pravilnih meritev lahko temeljijo na ionskem toku, pri čemer je m/z = 44, ki je sorazmeren s količino ogljika, injiciranega v elementarni analizator. Na podlagi standardnih pogojev naj bi bil ionski tok skoraj konstanten za analizirane vzorce. Občutno odstopanje lahko pomeni izhlapevanje etanola (na primer nepopolna zatesnitev na kapsuli) ali nestabilnost elementarnega analizatorja ali masnega spektrometra.

11. UČINKOVITOST METODE (TOČNOST)

Prva skupna študija (točka 11.1) je bila izvedena za destilate, ki vsebujejo alkohol vinskega porekla ter alkohol sladkornega trsa in sladkorne pese, kot tudi različne mešanice alkohola teh treh porekel. Ker ta študija ni vključevala postopka destilacije, so se upoštevali dodatni podatki drugih medlaboratorijskih študij o vinu (točka 11.2) ter zlasti serija poskusov ustreznosti (točka 11.3) za izotopske meritve. Rezultati kažejo na to, da pod ustreznimi pogoji, zlasti tistimi za meritev s SNIF-NMR, različni sistemi destilacije ne predstavljajo občutne variacije pri določitvi vrednosti δ13C vinskega etanola. Dobljeni parametri točnosti za vino so skoraj identični s parametri, dobljenimi v skupni študiji o destilatih (točka 11.1).

11.1 Skupna študija o destilatih

Leto medlaboratorijskih poskusov: 1996 Število laboratorijev: 20 Število vzorcev: Šest vzorcev v dvojni slepi primerjavi Analit: δ13C etanola





Šifra vzorca Alkohol vinskega porekla Alkohol sladkorne pese Alkohol sladkornega trsa A & G 80 % 10 % 10 % B & C 90 % 10 % 0 % D & F 0 % 100 % 0 % E & I 90 % 0 % 10 % H & K 100 % 0 % 0 % J & L 0 % 0 % 100 %





Vzorci A/G B/C D/F E/I H/K J/L Število laboratorijev po odstranitvi izpadlih rezultatov 19 18 17 19 19 19 Število sprejetih rezultatov 38 36 34 38 38 38 Povprečna vrednost (δ13C) ‰ –25,32 –26,75 –27,79 –25,26 –26,63 –12,54 Sr 2 0,0064 0,0077 0,0031 0,0127 0,0069 0,0041 Standardni odklon ponovljivosti (Sr) ‰ 0,08 0,09 0,06 0,11 0,08 0,06 Meja ponovljivosti r (2,8 × Sr) ‰ 0,22 0,25 0,16 0,32 0,23 0,18 SR 2 0,0389 0,0309 0,0382 0,0459 0,0316 0,0584 Standardni odklon obnovljivosti (SR) ‰ 0,20 0,18 0,20 0,21 0,18 0,24 Meja obnovljivosti R (2,8 × SR) ‰ 0,55 0,49 0,55 0,60 0,50 0,68

11.2 Medlaboratorijska študija o dveh vinih in enem alkoholu

Leto medlaboratorijskih poskusov: 1996 Število laboratorijev: 14 za destilacijo vina, od katerih jih je sedem tudi merilo δ13C vinskega etanola Osem za meritev δ13C vzorca alkohola Število vzorcev: Tri (belo vino 9,3 % vol., belo vino 9,6 % vol. in alkohol 93 % m/m) Analit: δ13C etanola





Vzorci Rdeče vino Belo vino Alkohol Število laboratorijev 7 7 8 Število sprejetih rezultatov 7 7 8 Povprečna vrednost (δ13C) ‰ –26,20 –26,20 –25,08 Varianca obnovljivosti SR 2 0,0525 0,0740 0,0962 Standardni odklon obnovljivosti (SR) ‰ 0,23 0,27 0,31 Meja obnovljivosti R (2,8 × SR) ‰ 0,64 0,76 0,87

Sodelujoči laboratoriji so uporabili različne sisteme destilacije. Izotopske določitve (δ13C), izvedene v enem samem laboratoriju, niso pri nobenem destilatu skupne študije pokazale niti nenormalnih vrednosti niti vrednosti, ki bi se občutno razlikovale od povprečnih vrednosti. Variacija v rezultatih (S2 = 0,0059) je primerljiva z variancami ponovljivosti Sr 2 v skupni študiji o destilatih (točka 11.1).

11.3 Rezultati poskusov ustreznosti pri izotopskih poskusih

Od decembra 1994 so se mednarodni poskusi ustreznosti za določitev izotopskih meritev za vino in alkohol (destilati s 96 % vol.) redno opravljali. Rezultati omogočajo sodelujočim laboratorijem preverjanje kakovosti njihovih analiz. Statistični rezultati dopuščajo upoštevanje variacije pri meritvah pod pogoji obnovljivosti in zato oceno parametrov variance in mejo obnovljivosti. Dobljeni rezultati za določitev δ13C za etanol v vinu in destilatih so povzeti v naslednji tabeli:

Datum Vina Destilati N SR SR 2 R N SR SR 2 R December 1994 6 0,210 0,044 0,59 6 0,151 0,023 0,42 Junij 1995 8 0,133 0,018 0,37 8 0,147 0,021 0,41 December 1995 7 0,075 0,006 0,21 8 0,115 0,013 0,32 Marec 1996 9 0,249 0,062 0,70 11 0,278 0,077 0,78 Junij 1996 8 0,127 0,016 0,36 8 0,189 0,036 0,53 September 1996 10 0,147 0,022 0,41 11 0,224 0,050 0,63 December 1996 10 0,330 0,109 0,92 9 0,057 0,003 0,16 Marec 1997 10 0,069 0,005 0,19 8 0,059 0,003 0,16 Junij 1997 11 0,280 0,079 0,78 11 0,175 0,031 0,49 September 1997 12 0,237 0,056 0,66 11 0,203 0,041 0,57 December 1997 11 0,127 0,016 0,36 12 0,156 0,024 0,44 Marec 1998 12 0,285 0,081 0,80 13 0,245 0,060 0,69 Junij 1998 12 0,182 0,033 0,51 12 0,263 0,069 0,74 September 1998 11 0,264 0,070 0,74 12 0,327 0,107 0,91 Izmerjeno povprečje 0,215 0,046 0,60 0,209 0,044 0,59 N : število sodelujočih laboratorijev

11.4 Meje ponovljivosti in obnovljivosti

Na podlagi podatkov različnih medlaboratorijskih poskusov iz zgornjih tabel je mogoče za to metodo določiti naslednje meje ponovljivosti in obnovljivosti, vključno s fazo destilacije:

meja ponovljivosti r: 0,24

meja obnovljivosti R: 0,6

11 SKUPNE KISLINE (OIV-AS-313-01-ACITOT) – METODA TIPA I

1. OPREDELITEV POJMA

Skupne kisline vina so vsota titracijskih kislin, dobljenih s titracijo do pH 7 s standardno raztopino baze.

Ogljikov dioksid k skupnim kislinam ni prištet.

2. PRINCIP METODE

Potenciometrična titracija ali titracija z indikatorjem bromtimol modro in primerjava z barvnim standardom končne točke.

3. REAGENTI

3.1 Puferska raztopina pH 7,0:

monokalijev fosfat (KH2PO4) … 107,3 g

1 M raztopina natrijevega hidroksida (NaOH) … 500 ml

voda do … 1 000 ml

Lahko uporabimo že pripravljene referenčne puferske raztopine, ki so na voljo na trgu.

3.2 0,1 M raztopina natrijevega hidroksida (NaOH)

3.3 Raztopina indikatorja bromtimol modro 4 g/l:

bromtimol modro (C27H28Br2O5S) … 4 g nevtralni etanol, 96 % vol … 200 ml Raztopimo in dodamo: vodo brez CO2 … 200 ml 1 M raztopino natrijevega hidroksida, in to do nastopa modro zelene barve (pH 7) … 7,5 ml vodo do … 1 000 ml

4. APARATURE

4.1 Vodna vakuumska črpalka

4.2 500 ml vakuumska bučka

4.3 Potenciometer s skalo v pH enotah in dve elektrodi. Steklena elektroda mora biti shranjena v destilirani vodi. Kalomelova (nasičeni kalijev klorid) elektroda mora biti shranjena v nasičeni raztopini kalijevega klorida. Najpogosteje se uporablja kombinirana elektroda, ki mora biti shranjena v destilirani vodi.

4.4 Merilni valji, 50 ml (vino), 100 ml (rektificirani zgoščeni mošt)

5. POSTOPEK

5.1 Priprava vzorca

5.1.1 Vina

Odstranitev ogljikovega dioksida. V vakuumsko bučko nalijemo približno 50 ml vina in priključimo na vodno vakuumsko črpalko za eno do dve minuti, vmes pa ves čas stresamo.

5.1.2 Rektificirani zgoščeni mošt

V bučko odtehtamo točno 200 g rektificiranega zgoščenega mošta. Dolijemo 500 ml vode do oznake. Homogeniziramo.

5.2 Potenciometrična titracija

5.2.1 Umerjanje pH metra

V skladu s proizvajalčevimi navodili mora biti pH meter umerjen na 20 °C, s pufersko raztopino pH 7,00 pri 20 °C.

5.2.2 Metoda merjenja

V merilni valj (točka 4.4) nalijemo prostornino vzorca, to je 1 ml vina oziroma 50 ml rektificiranega zgoščenega mošta, ki je pripravljen v skladu s točko 5.1. Dodamo približno 10 ml destilirane vode in nato še 0,1 M raztopino natrijevega hidroksida (točka 3.2) iz birete, dokler ni pH enak 7 pri 20 °C. Alkalno tekočino moramo dodajati počasi in raztopino nepretrgoma stresati. Prostornino dodanega 0,1 M NaOH označimo z n ml.

5.3 Titracija v navzočnosti indikatorja (bromtimol modro)

5.3.1 Poprejšnji test: določitev barve v končni točki

V merilni valj (točka 4.4) nalijemo 25 ml prevrete destilirane vode, 1 ml raztopine bromtimol modro (točka 3.3) in prostornino vzorca, pripravljenega v skladu z opisom (točka 5.1), in to 10 ml vina oziroma 50 ml rektificiranega zgoščenega mošta. Dodamo 0,1 M raztopino natrijevega hidroksida (točka 3.2), dokler se barva ne spremeni v modro-zeleno. Potem dodamo 5 ml puferske raztopine pH 7,0 (3.1).

5.3.2 Merjenje

V merilni valj (točka 4.4) nalijemo 30 ml prevrete destilirane vode, 1 ml raztopine bromtimol modro (točka 3.3) in prostornino vzorca, pripravljenega v skladu z opisom v točki 5.1, in to 10 ml vina oziroma 50 ml rektificiranega zgoščenega mošta. Dodamo 0,1 M raztopino natrijevega hidroksida (točka 3.2), dokler ne dosežemo enakega barvnega odtenka kakor v poprejšnjem testu (točka 5.3.1). Prostornino dodanega 0,1 M natrijevega hidroksida označimo z n ml.

6. IZRAŽANJE REZULTATOV

6.1 Izračun

6.1.1 Vina

Skupne kisline, izražene v tisočinkah enote na liter, so dane kot:

A = 10 n

Rezultat je dan na eno decimalno mesto natančno.

Skupne kisline, izražene v gramih vinske kisline na liter, so dane kot:

A′ = 0,075 × A

Rezultat je dan na eno decimalno mesto natančno.

6.1.2 Rektificirani zgoščeni mošt

— Skupne kisline, izražene v tisočinkah enote na kilogram rektificiranega zgoščenega mošta, so dane kot a = 5 × n.

— Skupne kisline, izražene v tisočinkah enote na kilogram skupnih sladkorjev, so dane kot — A = (500 × n)/P — P = % koncentracija (m/m) skupnih sladkorjev.

Rezultat je dan na eno decimalno mesto natančno.

6.2 Ponovljivost (r) pri titraciji z indikatorjem (5.3):

r = 0,9 tisočinke enote/liter r = 0,07 g vinske kisline/liter

za bela, rozé in rdeča vina.

6.3 Obnovljivost (R) pri titraciji z indikatorjem (5.3):

Za bela in rozé vina: R = 3,6 tisočinke enote/liter R = 0,3 g vinske kisline/liter

Za rdeča vina: R = 5,1 tisočinke enote/liter R = 0,4 g vinske kisline/liter

12 HLAPNE KISLINE (OIV-AS-313-02-ACIVOL) – METODA TIPA I

1. OPREDELITEV POJMA

Hlapne kisline sestavljajo homologi ocetne kisline, ki v vinu nastopajo v prosti obliki ali v obliki soli.

2. PRINCIP METODE

Titracija hlapnih kislin, ki jih iz vina ločimo s parno destilacijo, in titracija destilata.

Ogljikov dioksid poprej odstranimo iz vina.

Kislost prostega in skupnega žveplovega dioksida v destilatu, dobljenem pod temi pogoji, odštejemo od kislosti destilata.

Če je bila vinu dodana sorbinska kislina, odštejemo od hlapne kislosti tudi njeno kislost.

Opomba:

Del salicilne kisline, ki se v nekaterih državah uporablja za stabilizacijo vin pred analizo, je navzoč v destilatu. Ta del moramo določiti in odšteti od kislosti. Metoda za določitev je dana v oddelku 7 tega poglavja.

3. REAGENTI

3.1 Kristalinična vinska kislina (C4H6O6)

3.2 0,1 M raztopina natrijevega hidroksida (NaOH)

3.3 1 % raztopina fenolftaleina v 96 % vol nevtralnem alkoholu

3.4 Klorovodikova kislina (ρ20 = 1,18 do 1,19 g/ml), razredčena 1/4 (v/v)

3.5 0,005 M raztopina joda (I2)

3.6 Kristalinični kalijev jodid (KJ)

3.7 Raztopina škroba, 5 g/l:

5 g škroba zmešamo s približno 500 ml vode. Med nenehnim mešanjem segrejemo do vrenja in pustimo vreti 10 minut. Dodamo 200 g natrijevega klorida. Ko se ohladi, razredčimo na 1 liter.

3.8 Nasičena raztopina natrijevega borata (Na2B4O7 × 10H2O), kar je približno 55 g/l pri 20 °C.

4. APARATURE

4.1 Parni destilator, sestavljen iz:

1. parnega generatorja; para ne sme vsebovati ogljikovega dioksida;

2. bučke s parno cevko;

3. destilacijske kolone;

4. kondenzatorja.

Ta oprema mora ustrezati naslednjim trem pogojem:

(a) V bučko damo 20 ml prevrete vode. Ulovimo 250 ml destilata in mu dodamo 0,1 ml 0,1 M raztopine natrijevega hidroksida (točka 3.2) in 2 kapljici raztopine fenolftaleina (točka 3.3). Rožnata barva mora biti obstojna najmanj 10 sekund (kar pomeni, da para ne vsebuje ogljikovega dioksida).

(b) V bučko damo 20 ml 0,1 M raztopine ocetne kisline. Ulovimo 250 ml destilata. Titriramo z 0,1 M raztopino natrijevega hidroksida (točka 3.2), katere prostornina mora biti najmanj 19,9 ml (kar pomeni, da je predestilirane najmanj 99,5 % ocetne kisline).

(c) V bučko damo 20 ml 1 M raztopine mlečne kisline. Ulovimo 250 ml destilata in titriramo kislino z 0,1 M raztopino natrijevega hidroksida (točka 3.2).

Prostornina dodane raztopine natrijevega hidroksida mora biti manjša ali enaka 1,0 ml (kar pomeni, da je predestilirane največ 0,5 % mlečne kisline).

Katera koli aparatura oziroma postopek, ki ustreza tem pogojem, zadosti zahtevam uradnih mednarodnih aparatur oziroma postopkov.

4.2 Vodna črpalka

4.3 Vakuumska bučka

5. POSTOPEK

5.1 Priprava vzorca: odstranitev ogljikovega dioksida

V vakuumsko bučko nalijemo približno 50 ml vina; z uporabo vodne črpalke v bučki vzpostavimo vakuum za približno minuto ali dve in medtem nenehno stresamo.

5.2 Destilacija s paro

V bučko nalijemo 20 ml vina brez ogljikovega dioksida, kakor je opisano v točki 5.1. Dodamo približno 0,5 g vinske kisline (točka 3.1). Zberemo vsaj 250 ml destilata.

5.3 Titracija

Titriramo z 0,1 M raztopino natrijevega hidroksida (točka 3.2) ob dodatku dveh kapljic fenolftaleina (točka 3.3) kot indikatorja. Prostornino porabljenega natrijevega hidroksida označimo z n ml.

Dodamo štiri kapljice razredčene raztopine klorovodikove kisline (točka 3.4), 2 ml raztopine škroba (točka 3.7) in nekaj kristalov kalijevega jodida (točka 3.6). Prosti žveplov dioksid titriramo z 0,005 M raztopino joda (točka 3.5). Porabljeno prostornino označimo kot n′ ml.

Dodamo nasičeno raztopino natrijevega borata (točka 3.8), dokler se ponovno ne pokaže rožnato obarvanje. Skupni žveplov dioksid titriramo z 0,005 M raztopino joda (točka 3.5). Porabljeno prostornino označimo z n″ ml.

6. IZRAŽANJE REZULTATOV

6.1 Izračun

Hlapne kisline, izražene v tisočinkah enote na liter, in to na eno decimalno mesto natančno, so dane kot:

A = 5 (n – 0,1 n′ – 0,05 n″).

Hlapne kisline, izražene v gramih ocetne kisline na liter, in to na dve decimalni mesti natančno, so dane kot:

0,300 (n – 0,1 n′ – 0,05 n″).

6.2 Ponovljivost (r)

r = 0,7 tisočinke enote/liter r = 0,04 g ocetne kisline/liter

6.3 Obnovljivost (R)

R = 1,3 tisočinke enote/liter R = 0,08 g ocetne kisline/liter

6.4 Vina z navzočo sorbinsko kislino

Ker se 96 % sorbinske kisline predestilira v destilat prostornine 250 ml, moramo njeno kislost odšteti od hlapnih kislin, pri čemer pa upoštevamo, da 100 mg sorbinske kisline ustreza kislosti 0,89 tisočinke enote ali 0,053 g ocetne kisline, in upoštevamo koncentracijo sorbinske kisline v mg/l, kakor je bila določena z uporabo drugih metod.

7. DOLOČITEV SALICILNE KISLINE V DESTILATU HLAPNIH KISLIN

7.1 Princip

Pri določitvi hlapnih kislin in korekciji na žveplov dioksid navzočnost salicilne kisline po povečanju kislosti raztopine in dodatku železove (III) soli pokaže vijolično obarvanje.

Določitev salicilne kisline, ki je ob hlapnih kislinah v destilatu, poteka v drugem destilatu enake prostornine, kakor je tista, v kateri smo določili hlapne kisline. V tem destilatu vsebnost salicilne kisline določamo s primerjalno kolorimetrično metodo. Odštejemo jo od kislosti hlapnih kislin destilata.

7.2 Reagenti

7.2.1 Klorovodikova kislina (HCl) (ρ20 = 1,18 do 1,19 g/ml)

7.2.2 0,1 M raztopina natrijevega tiosulfata (Na2S2O3 × 5H2O)

7.2.3 10 % (m/v) raztopina železovega (III) sulfata in amonija (Fe2(SO4)3 × (NH4)2SO4 × 24H2O)

7.2.4 0,01 M raztopina natrijevega salicilata. Raztopina vsebuje 1,60 g/l natrijevega salicilata (NaC7H5O3).

7.3 Postopek

7.3.1 Identifikacija salicilne kisline v destilatu hlapnih kislin

Takoj po določitvi hlapnih kislin in korekciji na prosti in skupni žveplov dioksid damo v erlenmajerico 0,5 ml klorovodikove kisline (točka 7.2.1), 3 ml 0,1 M raztopine natrijevega tiosulfata (točka 7.2.2) in 1 ml raztopine amonijevega železovega (III) sulfata (točka 7.2.3).

Ob navzočnosti salicilne kisline se pokaže vijolično obarvanje.

7.3.2 Določitev salicilne kisline

Na zgoraj navedeni erlenmajerici označimo prostornino destilata. Erlenmajerico spraznimo in izplaknemo.

V isto erlenmajerico damo novih 20 ml vina, parno destiliramo in zberemo destilat do poprej narejene oznake. Dodamo 0,3 ml čiste klorovodikove kisline (točka 7.2.1) in 1 ml raztopine amonijevega železovega (III) sulfata (točka 7.2.3). Vsebina erlenmajerice se obarva vijolično.

V erlenmajerico, enako označeni erlenmajerici, damo destilirano vodo do enake ravni, kakor je raven destilata. Dodamo 0,3 ml čiste klorovodikove kisline (točka 7.2.1) in 1 ml raztopine amonijevega železovega (III) sulfata (točka 7.2.3). Iz birete dodajamo 0,01 M raztopino natrijevega salicilata (točka 7.2.4), dokler ne dobimo enako intenzivnega vijoličnega barvnega odtenka, kakor je v erlenmajerici z destilatom vina.

Prostornino raztopine, ki smo jo dodali iz birete, označimo z n′′′ ml.

7.4 Korekcija hlapnih kislin

Od prostornine n ml 0,1 M raztopine natrijevega hidroksida, ki smo ga porabili za titracijo kislin destilata pri določitvi hlapnih kislin, odštejemo prostornino 0,1 × n′′′ ml.

13 CITRONSKA KISLINA (OIV-AS-313-09-ACIENZ) – METODA TIPA II

1. PRINCIP METODE

V reakciji, ki jo katalizira encim citrat liaza (CL), se citronska kislina pretvori v oksaloacetat in acetat:

citrat ←→ oksaloacetat + acetat

V navzočnosti malat dehidrogenaze (MDH) in laktat dehidrogenaze (LDH) se oksaloacetat in njegov dekarboksilacijski derivat, piruvat, reducirata z reducirano obliko nikotinamid adenin dinukleotida (NADH) v L-malat in L-laktat:

oksaloacetat + NADH + H+ ←→ L-malat + NAD+

piruvat + NADH + H+ ←→ L-laktat + NAD+

Pri teh reakcijah je količina NADH, ki se oksidira v NAD+, sorazmerna s količino navzočega citrata. Oksidacija NADH se določi z zmanjšanjem absorpcije pri valovni dolžini 340 nm.

2. REAGENTI

2.1 Puferska raztopina pH 7,8

(0,51 M glicilglicina; pH 7,8; Zn2+ (0,6 × 10–3 M):

7,13 g glicilglicina raztopimo v približno 70 ml dvakrat destilirane vode.

pH uravnamo na 7,8 s približno 13 ml 5 M raztopine natrijevega hidroksida, dodamo 10 ml raztopine cinkovega klorida (80 mg ZnCl2 v 100 ml H2O) in dopolnimo z dvakrat destilirano vodo do 100 ml.

Ta raztopina ostane pri 4 °C stabilna najmanj 4 tedne.

2.2 Raztopina reduciranega nikotinamid adenin dinukleotida (NADH) (približno 6 × 10–3 M): 30 mg NADH in 60 mg NaHCO3 raztopimo v 6 ml dvakrat destilirane vode.

2.3 Raztopina malat dehidrogenaze/laktat dehidrogenaze (MDH/LDH, 0,5 mg MDH/ml, 2,5 mg LDH/ml):

zmešamo 0,1 ml MDH (5 mg MDH/ml), 0,4 ml raztopine amonijevega sulfata (3,2 M) in 0,5 ml LDH (5 mg/ml). Pri 4 °C je ta suspenzija stabilna najmanj eno leto.

2.4 Citrat liaza CL (5 mg proteina/ml): 168 mg liofilizata raztopimo v 1 ml ledeno mrzle vode. Ta raztopina pri 4 °C ostane stabilna najmanj en teden, če jo zamrznemo, pa najmanj štiri tedne.

Pred določanjem je priporočljivo preveriti aktivnost encimov.

2.5 Polivinilpolipirolidon (PVPP)

Opomba: Vsi zgoraj navedeni reagenti so na voljo na trgu.

3. APARATURE

3.1 Spektrofotometer, ki omogoča meritve pri 340 nm, tj. pri valovni dolžini, pri kateri je absorpcija NADH največja.

Lahko pa uporabimo tudi spektrofotometer z nekontinuiranim spektrom, ki omogoča meritve pri 334 nm ali 365 nm. Ker merimo absolutno absorpcijo (tj. ne uporabljamo umeritvenih krivulj, ampak opravimo standardizacijo z upoštevanjem ekstrakcijskega koeficienta NADH), moramo preveriti lestvice valovnih dolžin in spektralno absorpcijo aparature.

3.2 Steklene kivete z dolžino optične poti 1 cm ali plastične kivete za enkratno uporabo

3.3 Mikropipete za odvzemanje količin v območju prostornin od 0,02 do 2 ml

4. PRIPRAVA VZORCA

Določitev citrata se navadno izvede neposredno v vinu brez poprejšnje odstranitve pigmentacije (barvil) in brez razredčevanja, če je vsebnost citronske kisline manjša od 400 mg/l. Če je večja, vino razredčimo, dokler koncentracija citrata ni od 20 do 400 mg/l (tj. od 5 do 80 μg citrata v testnem vzorcu).

Pri rdečih vinih, ki vsebujejo veliko fenolnih spojin, se priporoča poprejšnja obdelava s PVPP:

Napravimo vodno suspenzijo približno 0,2 g PVPP in pustimo stati 15 minut. Prefiltriramo prek nagubanega filter papirja.

V 50 ml erlenmajerico nalijemo 10 ml vina in dodamo vlažen PVPP, ki ga s filtra odstranimo s spatulo. Stresamo dve do tri minute. Filtriramo.

5. POSTOPEK

S spektrofotometrom pri valovni dolžini 340 nm določimo absorpcijo na 1 cm kivetah, pri čemer zrak uporabljamo kot slepi vzorec za (referenčno) absorpcijo (na optični poti ni nobene kivete). V 1 cm kiveto damo naslednje:

Referenčna kiveta (ml) Vzorčna kiveta (ml) Raztopina 2.1 1,00 ml 1,00 ml Raztopina 2.2 0,10 ml 0,10 ml Vzorec za meritev — 0,20 ml Dvakrat destilirana voda 2,00 ml 1,80 ml Raztopina 2.3 0,02 ml 0,02 ml

Mešamo in po približno petih minutah odčitamo absorpcijo raztopin v referenčni in vzorčni kiveti (A1).

Dodamo:

Raztopina 2.4 0,02 ml 0,02 ml

Mešamo; počakamo, dokler se reakcija ne konča (okrog pet minut), in odčitamo absorpcije raztopin v referenčni in vzorčni kiveti (A2).

Izračunamo razliko absorpcij (A1 – A2) za referenčno kiveto in kiveto z vzorcem in dobimo Δ AR in Δ AS.

Na koncu izračunamo razliko med temi razlikami:

ΔA = ΔAS – ΔAR

Opomba: Čas, ki je potreben, da se konča aktivnost encimov, se lahko od ene serije do druge razlikuje. Zgornja vrednost je samo napotek in jo je priporočljivo določiti za vsako posamezno serijo.

6. IZRAŽANJE REZULTATOV

Koncentracija citronske kisline je izražena v miligramih na liter, zaokrožena na najbližje celo število.

6.1. Izračun

Splošna formula za izračun koncentracije v mg/l je:

C = ((V × PM)/(ε × d × v)) × ΔA

pri čemer je V = prostornina testne raztopine v ml (tukaj 3,14 ml) v = prostornina vzorca v ml (tukaj 0,2 ml) M = molekulska masa snovi, ki jo določamo (tukaj M = 192,1 za brezvodno citronsko kislino) d = dolžina optične poti v kiveti v cm (tukaj 1 cm) ε = absorpcijski koeficient NADH (pri 340 nm) ε = 6,3 mmol–1 × l × cm–1,

zato je:

C = 479 × ΔA

Če je bil vzorec med pripravo razredčen, rezultat pomnožimo s faktorjem razredčitve.

Opomba: Pri 334 nm: C = 488 × ΔA (= 6,2 mmol–1 × l × cm–1).

Pri 365 nm: C = 887 × ΔA (= 3,4 mmol–1 × l × cm–1).

6.2 Ponovljivost (r)

Koncentracija citronske kisline, manjša od 400 mg/l: r = 14 mg/l.

Koncentracija citronske kisline, večja od 400 mg/l: r = 28 mg/l.

6.3 Obnovljivost (R)

Koncentracija citronske kisline, manjša od 400 mg/l: R = 39 mg/l.

Koncentracija citronske kisline, večja od 400 mg/l: R = 65 mg/l.

14 SORBINSKA KISLINA (OIV-AS-313-14-ACISOR) – METODA TIPA IV

1. PRINCIP METOD

1.1 Določitev z ultravijolično absorpcijsko spektrofotometrijo

Sorbinsko kislino (trans, trans, 2,4-heksadienoična kislina), ki jo ekstrahiramo s parno destilacijo, določimo v vinskem destilatu z ultravijolično absorpcijsko spektrofotometrijo. Snovi, ki interferirajo v ultravijolični svetlobi, odstranimo z izhlapevanjem do suhega, pri čemer uporabimo rahlo alkalen kalcijev hidroksid. Tankoplastno kromatografijo (občutljivost 1 mg/l) uporabimo za potrditev ravni pod 20 mg/l.

1.2 Določitev s plinsko kromatografijo

Sorbinsko kislino, ekstrahirano v etilnem etru, določimo s plinsko kromatografijo z internim standardom.

1.3 Ugotavljanje sledi s tankoplastno kromatografijo

Sorbinsko kislino, ekstrahirano v etilnem etru, ločimo s tankoplastno kromatografijo in njeno koncentracijo ocenimo delno kvantitativno.

2. DOLOČITEV Z ULTRAVIJOLIČNO ABSORPCIJSKO SPEKTROFOTOMETRIJO

2.1 Reagenti

2.1.1 Kristalinična vinska kislina, C4H6O6

2.1.2 Približno 0,02 M raztopina kalcijevega hidroksida, Ca(OH)2

2.1.3 Referenčna raztopina sorbinske kisline, 20 mg/l:

20 mg sorbinske kisline C6H8O2 raztopimo v približno 2 ml 0,1 M raztopine natrijevega hidroksida. Nalijemo v 1 000 ml merilno bučko in dopolnimo z vodo do oznake. Lahko tudi raztopimo 26,8 mg kalijevega sorbata C6H7KO2 v vodi in dopolnimo z vodo do 1 000 ml.

2.2 Aparature

2.2.1 Parni destilator (glej poglavje „Hlapne kisline“)

2.2.2 Vodna kopel s temperaturo 100 °C

2.2.3 Spektrofotometer za merjenje absorpcije pri valovni dolžini 256 nm, s kremenčevo kiveto z 1 cm optično potjo.

2.3 Postopek

2.3.1 Destilacija

V bučko parnega destilatorja nalijemo 10 ml vina in dodamo od 1 do 2 g vinske kisline (2.1.1). Zberemo 250 ml destilata.

2.3.2 Umeritvena krivulja

Z redčenjem referenčne raztopine (točka 2.1.3) pripravimo štiri razredčene referenčne raztopine, ki vsebujejo po 0,5, 1,0, 2,5 in 5 mg sorbinske kisline na liter. Njihovo absorpcijo merimo s spektrofotometrom pri 256 nm, pri čemer absorpcijo destilirane vode uporabimo za slepi vzorec. Izdelamo krivuljo, ki prikazuje spremembo absorpcije kot funkcijo koncentracije. Sprememba je linearna.

2.3.3 Določitev

5 ml destilata nanesemo v izparilno posodo s premerom 55 mm in dodamo 1 ml raztopine kalcijevega hidroksida (točka 2.1.2). Izparimo do suhega na vodni kopeli.

Ostanek raztopimo v več ml destilirane vode, prelijemo celotno količino v 20 ml merilno bučko in dopolnimo do oznake z vodo za izplakovanje. S spektrofotometrom izmerimo absorpcijo pri 256 nm proti slepemu vzorcu iz raztopine, ki jo pripravimo tako, da 1 ml raztopine kalcijevega hidroksida (točka 2.1.2) dopolnimo z vodo do 20 ml.

Vrednost izmerjene absorpcije vnesemo na umeritveno krivuljo in poiščemo koncentracijo C sorbinske kisline v raztopini.

Opomba: Pri tej metodi lahko zanemarimo izgubo zaradi izhlapevanja in absorpcijo izmerimo na obdelanem destilatu, ki je razredčen z destilirano vodo v razmerju ¼.

2.4 Izražanje rezultatov

2.4.1 Izračun

Koncentracijo sorbinske kisline v vinu, izraženo v mg na liter, dobimo s

100 × C,

pri čemer je C = koncentracija sorbinske kisline v raztopini, ki jo analiziramo z uporabo spektrofotometrije in je izražena v mg na liter.

3. DOLOČITEV S PLINSKO KROMATOGRAFIJO

3.1 Reagenti

3.1.1 Etilni eter, (C2H5)2O, destiliran neposredno pred uporabo

3.1.2 Interna referenčna raztopina: raztopina undekanoične kisline, C11H22O2, v 95 % vol etanolu jakosti 1 g/l

3.1.3 Vodna raztopina žveplove kisline, H2SO4 (ρ20 = 1,84 g/ml), razredčene 1 : 3 (v/v)

3.2 Aparature

3.2.1 Plinski kromatograf s plamensko-ionizacijskim detektorjem in kolone iz nerjavečega jekla (4 m × 1/8 palca), poprej obdelan z dimetildiklorosilanom in pakiran skupaj s trdno fazo iz mešanice dietilenglikol sukcinata (5 %) in fosforne kisline (1 %) (DEGS – H3PO4) ali iz mešanice dietilenglikol adipata (7 %) in fosforne kisline (1 %) (DEGA – H3PO4), vezane na Gaschrom Q 80–100 mesh.

Obdelava kolone z dimetilklorosilanom (DMDCS) – prek kolone pretočimo raztopino, ki vsebuje od 2 do 3 g DMDCS v toluenu. Takoj operemo z metanolom, zatem z nitrogenom, s heksanom in ponovno z nitrogenom. Po vsem tem je pripravljena za pakiranje.

Delovni pogoji:

Temperatura peči: 175 °C

Temperatura injektorja in detektorja: 230 °C

Nosilni plin: nitrogen (hitrost pretoka = 200 ml/min).

3.2.2 Mikrobrizga s kapaciteto 10 μl, umerjena na 0,1 μl

Opomba: Lahko uporabimo tudi druge vrste kolon, ki omogočajo uspešno ločevanje, zlasti kapilarne kolone (npr. FFAP).

Opisana metoda dela je dana le kot primer.

3.3 Postopek

3.3.1 Priprava vzorca za analizo

V približno 40 ml stekleno epruveto, ki ima steklen zamašek z obrusom, nalijemo 20 ml vina, dodamo 2 ml interne referenčne raztopine (točka 3.1.2) in 1 ml razredčene žveplove kisline (točka 3.1.3).

Z obračanjem epruvete okoli osi raztopino dobro premešamo in dodamo 10 ml etilnega etra (točka 3.1.1). Ekstrahiramo sorbinsko kislino v organski fazi, tako da epruveto pet minut stresamo. Pustimo, da se ustali.

3.3.2 Priprava referenčne raztopine

Izberemo vino, pri katerem kromatogram ekstrakta etra ne kaže vršne vrednosti, ki ustreza izluženju sorbinske kisline. To vino močno nasitimo s sorbinsko kislino pri koncentraciji 100 mg na liter. 20 ml vzorca, ki smo ga tako pripravili, obdelamo v skladu s postopkom iz točke 3.3.1.

3.3.3 Kromatografija

Z mikrobrizgo izmenično vbrizgamo v kromatograf 2 μl faze z ekstrahiranim etrom, pripravljene, kot je navedeno v točki 3.3.2, in 2 μl faze z ekstrahiranim etrom, pripravljene, kot je navedeno v točki 3.3.1.

Oba kromatograma zabeležimo: preverimo retencijski čas sorbinske kisline in internega standarda. Izmerimo višino (ali področje) obeh zabeleženih vršnih vrednosti.

3.4 Izražanje rezultatov

3.4.1 Izračun

Koncentracijo sorbinske kisline v analiziranem vinu, izraženo v mg na liter, dobimo z naslednjim izrazom:

100 × (h/(H) × (l/i)

H= vršna vrednost sorbinske kisline v referenčni raztopini

h= vršna vrednost sorbinske kisline v vzorcu za analizo

l= vršna vrednost internega standarda v referenčni raztopini

i= vršna vrednost internega standarda v vzorcu za analizo

Opomba: Koncentracijo sorbinske kisline lahko enako določimo iz meritev področij pod ustreznimi vršnimi vrednostmi.

15 PH (OIV-AS-313-15-PH) – METODA TIPA I

1. PRINCIP

Izmerimo razliko v potencialu med dvema elektrodama, potopljenima v analizirano tekočino. Ena od elektrod ima potencial, ki je funkcija pH tekočine, druga pa ima določen in znan potencial in se uporablja kot referenčna elektroda.

2. APARATURE

2.1 pH meter s skalo, umerjeno v pH enotah, ki omogoča merjenje z natančnostjo najmanj ± 0,05 pH enote.

2.2 Elektrode:

2.2.1 Steklena elektroda, shranjena v destilirani vodi

2.2.2 Referenčna kalomelova (nasičeni kalijev klorid) elektroda, shranjena v nasičeni raztopini kalijevega klorida

2.2.3 Ali kombinirana elektroda, shranjena v destilirani vodi

3. REAGENTI

3.1 Puferske raztopine

3.1.1 Nasičena raztopina kalijevega hidrogentartrata, ki vsebuje najmanj 5,7 g kalijevega hidrogentartrata na liter (C4H5KO6) pri 20 °C. To raztopino lahko hranimo do dveh mesecev, če dodamo 0,1 g timola na 200 ml.

pH 3,57 pri 20 °C 3,56 pri 25 °C 3,55 pri 30 °C

3.1.2 Raztopina kalijevega hidrogenftalata, 0,05 M, ki vsebuje 10,211 g kalijevega hidrogenftalata (C8H5KO4) na liter pri 20 °C. (Rok trajanja največ dva meseca.)

pH 3,999 pri 15 °C 4,003 pri 20 °C 4,008 pri 25 °C 4,015 pri 30 °C

3.1.3 Raztopina vsebuje:

monokalijev fosfat, KH2PO4 … 3,402 g dikalijev fosfat, K2HPO4 … 4,354 g vodo do … 1 l

(Rok trajanja največ dva meseca.)

pH 6,90 pri 15 °C 6,88 pri 20 °C 6,86 pri 25 °C 6,85 pri 30 °C

Opomba: Lahko uporabimo tudi referenčne puferske raztopine, ki so na voljo na trgu.

4. POSTOPEK

4.1 Priprava vzorca za analizo

4.1.1 Za mošt in vino:

uporabimo neposredno mošt ali vino.

4.1.2 Za rektificirani zgoščeni mošt:

rektificirani zgoščeni mošt razredčimo z vodo, da dobimo koncentracijo 25 ± 0,5 % (m/m) skupnih sladkorjev (25 oBrix).

Če je P odstotek koncentracije (m/m) skupnih sladkorjev v rektificiranem zgoščenem moštu, stehtamo maso 2 500/P

in dopolnimo z vodo do 100 g. Elektroprevodnost uporabljene vode mora biti manj kakor 2 mikrosimensa na cm.

4.2 Nastavitev aparature na ničlo

Nastavitev na ničlo opravimo pred vsakršnim merjenjem v skladu z navodili, ki so priložena aparaturi.

4.3 Umerjanje pH metra

pH meter umerimo pri 20 °C z uporabo puferskih raztopin s pH vrednostjo 6,88 in 3,57 pri 20 °C.

Uporabimo pufersko raztopino s pH 4,00 pri 20 °C, da preverimo umeritev skale.

4.4 Določitev

Elektrodo potopimo v vzorec za analizo, ki mora imeti temperaturo med 20 in 25 °C, vendar čim bliže 20 °C. Vrednost pH odčitamo neposredno na skali.

Na istem vzorcu opravimo vsaj dve določitvi.

Končni rezultat dobimo z aritmetično sredino določitev.

5. IZRAŽANJE REZULTATOV

Vrednost pH mošta, vina ali 25 % (m/m) (25 oBrix) raztopine rektificiranega zgoščenega mošta izrazimo na dve decimalni mesti natančno.

16 HKRATNA DOLOČITEV L-ASKORBINSKE IN D-IZOASKORBINSKE KISLINE S HPLC IN UV-DETEKCIJO (OIV-AS-313-22-ACASCO) – METODA TIPA II

1. UVOD

Askorbinska kislina je antioksidant, ki je naravno prisoten v celem nizu živil. Običajna količina askorbinske kisline v grozdju se med nastajanjem mošta in vinifikacijo zmanjšuje. Moštu in vinom jo je mogoče v določenih mejah dodati.

Opisana metoda je bila potrjena na podlagi medlaboratorijskih poskusov z analizami vzorcev vina, ki jim je bilo dodanih od 30 do 150 mg L-askorbinske kisline in od 10 do 100 mg D-izoaskorbinske kisline na liter.

2. PODROČJE UPORABE

Ta metoda je ustrezna za hkratno določitev L-askorbinske kisline in D-izoaskorbinske kisline (eritorbinska kislina) v vinu s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti in UV-detekcijo v območju od 3 do 150 mg/l.

Za koncentracije, višje od 150 mg/l, je treba vzorec razredčiti.

3. PRINCIP

Vzorci se po membranskem filtriranju neposredno injicirajo v sistem HPLC. Analiti se ločijo na reverzno-fazni koloni, nato pa se na njih izvede UV-detekcija pri valovni dolžini 266 nm. Količina L-askorbinske in D-izoaskorbinske kisline se določi glede na eksterni standard.

Opomba: Kolone in pogoji delovanja so dani le kot primer. Lahko uporabimo tudi druge vrste kolon, ki zagotavljajo uspešno ločevanje.

4. REAGENTI IN PRODUKTI

4.1 Reagenti

4.1.1 n-oktilamin, čistost ≥ 99,0 %

4.1.2 Natrijev acetat × 3H2O, čistost ≥ 99,0 %

4.1.3 Čista ocetna kislina, 100 %

4.1.4 Fosforna kislina, približno 25 %

4.1.5 Oksalna kislina, čistost ≥ 99,0 %

4.1.6 Askorbat oksidaza

4.1.7 Zelo koncentrirana L-askorbinska kislina, čistost ≥ 99,5 %

4.1.8 D-izoaskorbinska kislina, čistost ≥ 99,0 %

4.1.9 Dvakrat destilirana voda

4.1.10 Metanol, p.A. 99,8 %

4.2 Priprava mobilne faze

4.2.1 Raztopine za mobilno fazo

Pripravimo naslednje raztopine za mobilno fazo:

4.2.1.1 12,93 g n-oktilamina v 100 ml metanola

4.2.1.2 68,05 g natrijevega acetata × 3H2O v 500 ml dvakrat destilirane vode

4.2.1.3 12,01 g čiste ocetne kisline v 200 ml dvakrat destilirane vode

4.2.1.4 Puferska raztopina (pH 5,4): 430 ml raztopine natrijevega acetata (4.2.1.2) in 70 ml raztopine ocetne kisline (4.2.1.3)

4.2.2 Priprava mobilne faze

V čašo s približno 400 ml dvakrat destilirane vode dodamo 5 ml raztopine n-oktilamina (4.2.1.1). pH tako pridobljene raztopine uravnamo na vrednost od 5,4 do 5,6, tako da po kapljicah dodajamo 25 % fosforno kislino (4.1.4). Dodamo 50 ml puferske raztopine (4.2.1.4), spojino premestimo v merilno bučko prostornine 1 000 ml in nato dopolnimo z dvakrat destilirano vodo. Mobilno fazo je treba pred uporabo filtrirati z membrano (regenerirana celuloza s porami premera 0,2 μm) in jo po možnosti razpliniti s helijem (približno 10 minut) glede na potrebe uporabljenega sistema HPLC.

4.3 Priprava referenčne raztopine

Opomba:

Vse referenčne raztopine (osnovno raztopino iz točke 4.3.1 in delovne raztopine iz točke 4.3.2) je treba pripraviti vsak dan sproti in jih pred injiciranjem po možnosti shraniti v hladilniku.

4.3.1 Priprava osnovne raztopine (1 mg/ml)

Pripravimo vodno raztopino 2 % oksalne kisline in raztopljeni kisik odstranimo tako, da v raztopino spustimo mehurčke dušika.

Natehtamo natančno 100 mg L-askorbinske in 100 mg D-izoaskorbinske kisline ter ju damo v 100 ml merilno bučko, ki jo nato napolnimo z 2 % vodno raztopino oksalne kisline.

4.3.2 Priprava delovnih raztopin

Delovne raztopine pripravimo tako, da osnovno raztopino (4.3.1) razredčimo do želene koncentracije z 2 % raztopino oksalne kisline. Priporočena je koncentracija od 10 do 120 mg/l. Količine 100 μl, 200 μl, 400 μl, 800 μl oziroma 1 200 μl na 10 ml na primer ustrezajo koncentracijam 10, 20, 40, 80 oziroma 120 mg/l.

5. APARATURE

Običajna laboratorijska oprema, zlasti:

5.1 Črpalka HPLC

5.2 Injektor z zanko, primeren za vbrizgavanje 20 μl

5.3 UV-detektor

6. ZAJEMANJE

Vzorce vina pred injiciranjem filtriramo skozi membrano s porami premera 0,2 μm.

Za koncentracije, višje od 150 mg/l, je treba vzorec razredčiti.

7. POSTOPEK

7.1 Pogoji uporabe sistema HPLC

V kromatograf injiciramo 20 μl vzorca, filtriranega skozi membrano.

Predkolona : na primer Nucléosil 120 C18 (4 cm × 4 mm × 7 μm) Kolona : na primer Nucléosil 120 C18 (25 cm × 4 mm × 7 μm) Prostornina injiciranja : 20 μl Mobilna faza : glej 4.2.2, izokratska Pretok : 1 ml/min UV-detekcija : 266 nm Cikel izplakovanja : Uporabimo vsaj 30 ml dvakrat destilirane vode ter zatem še 30 ml metanola in 30 ml acetonitrila.

7.2 Opredelitev/potrditev

Vršne vrednosti se opredelijo s primerjavo retencijskega časa referenčnih snovi in retencijskega časa vzorcev. S kromatografskim sistemom, opisanim kot primer, znaša retencijski čas za L-askorbinsko kislino 7,7 minute, za D-izoaskorbinsko kislino pa 8,3 minute (glej sliko 1, kromatogram A).

Za potrditev pozitivnih rezultatov je treba te vzorce obdelati s spatulo askorbat oksidaze in ponoviti meritev (glej sliko 1, kromatogram B).

Ker askorbat oksidaza povzroči razpad L-askorbinske in D-izoaskorbinske kisline, ne bi smeli v retencijskem času teh dveh kislin zaznati nobenega njunega signala. Če zaznamo prekrivanje vrhov, je treba pri izračunu koncentracije analitov upoštevati njihovo površino.

Opomba: Priporočljivo je, da se analiza vzorcev, obdelanih z askorbat oksidazo, opravi ob koncu sklopa meritev, po katerem se s ciklom izplakovanja s kolone odstranijo ostanki askorbat oksidaze; v nasprotnem primeru bi lahko ostanki askorbat oksidaze povzročili spremembo L-askorbinske in D-izoaskorbinske kisline med meritvijo HPLC, kar bi lahko vplivalo na rezultat.

8. IZRAČUN

Na podlagi delovnih raztopin (4.3.2) izrišemo umeritveno krivuljo. Količina L-askorbinske in D-izoaskorbinske kisline se po metodi eksternega standarda določi tako, da se izmerijo površine vrhov, ki se nato primerjajo z ustrezno koncentracijo na umeritveni krivulji.

Izražanje rezultatov

Rezultati se izrazijo v mg L-askorbinske oziroma D-izoaskorbinske kisline na liter, in sicer na eno decimalno mesto natančno (na primer 51,3 mg/l).

Za koncentracije, višje od 150 mg/l, je treba upoštevati razredčenje.

9. NATANČNOST

Metoda je bila preizkušena v okviru medlaboratorijskega poskusa, ki ga je leta 1994 pripravil nekdanji Zvezni urad za javno higieno (Bundesgesundheitsamt, Nemčija) in v katerem je sodelovalo 27 laboratorijev. Program medlaboratorijskega poskusa se je skladal z odstavkom 35 nemškega zakona o živilih, ki ga je OIV sprejela do uvedbe novega protokola (OENO 6/2000).

V študijo so bili zajeti štirje različni vzorci vina (dve beli in dve rdeči vini), pri čemer je bilo na posameznem vzorcu izvedenih pet ponovitev. Ker ni bilo mogoče pripraviti dovolj stabilnih vzorcev analitov (različne hitrosti razpadanja), je bilo odločeno, da se udeležencem pošljejo določene količine čistih referenčnih snovi in vzorci vina. Laboratorijem je bilo naročeno, naj referenčne snovi kvantitativno prenesejo v vzorce vina in jih takoj analizirajo. Analiziranih je bilo od 30 do 150 mg L-askorbinske kisline na liter in od 10 do 100 mg D-izoaskorbinske kisline na liter. Podrobni rezultati študije so predstavljeni v PRILOGI, ki jo je objavil OIV. Ocena je bila opravljena na podlagi standarda DIN/ISO 5725 (različica iz leta 1988).

Standardni odklon ponovljivosti (sr) in obnovljivosti (sR) je ustrezal koncentraciji L-askorbinske oziroma D-izoaskorbinske kisline. Parameter dejanske točnosti je mogoče izračunati z naslednjimi enačbami:

L-askorbinska kislina sr = 0,011x + 0,31 sR = 0,064x + 1,39 koncentracija L-askorbinske kisline (mg/l) D-izoaskorbinska kislina

D-izoaskorbinska kislina sr = 0,014x + 0,31 sR = 0,079x + 1,29 x: koncentracija D-izoaskorbinske kisline (mg/l)

Primer:

50 mg D-izoaskorbinske kisline na liter sr = 1,0 mg/l

sR = 5,2 mg/l

10. DRUGE ZNAČILNOSTI ANALIZE

10.1 Meja zaznavnosti

Meja zaznavnosti za to metodo je bila ocenjena na 3 mg/l za L-askorbinsko in D-izoaskorbinsko kislino.

10.2 Pravilnost

Povprečna stopnja ponovne pridobitve, izračunana na podlagi medlaboratorijskega poskusa, izvedenega na štirih vzorcih (glej PRILOGO, objavljeno v Zbirki OIV), je bila:

— 100,6 % za L-askorbinsko kislino

— 103,3 % za D-izoaskorbinsko kislino

17 OGLJIKOV DIOKSID (OIV-AS-314-01-DIOCAR) – METODA TIPA II

1. PRINCIP METODE

1.1 Mirna vina (nadtlak CO2 ≤ 0,5 × 105 Pa) (2)

Prostornino vina, vzetega iz vzorca, ohladimo na približno 0 °C in zmešamo z zadostno količino natrijevega hidroksida, da dobimo pH 10 do 11. Titracijo izvedemo s kislo raztopino v navzočnosti karbonske anhidraze. Vsebnost ogljikovega dioksida izračunamo iz prostornine kisline, ki jo potrebujemo, da spremenimo pH z 8,6 (bikarbonatna oblika) na 4,0 (ogljikova kislina). Pod enakimi pogoji izvedemo slepo titracijo na razplinjenem vinu, da upoštevamo prostornino natrijevega hidroksida, ki jo sprejmejo vinske kisline.

1.2 Peneča in biser vina

Vzorec vina za analizo ohladimo skoraj do ledišča. Ko odvzamemo količino, ki jo bomo uporabili kot slepi vzorec po dekarbonizaciji, preostalo količino v steklenici napravimo alkalno, da se ves ogljikov dioksid veže v obliki Na2CO3. Titracijo izvedemo s kislo raztopino v navzočnosti karbonske anhidraze. Vsebnost ogljikovega dioksida izračunamo iz prostornine kisle raztopine, ki je potrebna, da se pH spremeni z 8,6 (bikarbonatna oblika) na 4,0 (ogljikova kislina). Pod enakimi pogoji izvedemo slepo titracijo na razplinjenem vinu, da upoštevamo prostornino natrijevega hidroksida, ki jo sprejmejo vinske kisline.

2. OPIS METODE

2.1 Mirna vina (nadtlak CO2 ≤ 0,5 × 105 Pa)

2.1.1 Aparaturi

2.1.1.1 Magnetno mešalo

2.1.1.2 pH meter

2.1.2 Reagenti

2.1.2.1 Raztopina natrijevega hidroksida (NaOH), 0,1 M

2.1.2.2 Raztopina žveplove kisline (H2SO4), 0,05 M

2.1.2.3 Raztopina karbonske anhidraze, 1 g/l

2.1.3 Postopek

Vzorec vina ohladimo na približno 0 °C skupaj z 10 ml pipeto, ki je bila uporabljena za odvzem vzorca.

25 ml raztopine natrijevega hidroksida (točka 2.1.2.1) damo v 100 ml čašo; dodamo dve kapljici vodne raztopine ogljikove anhidraze (točka 2.1.2.3). S pipeto, ohlajeno na 0 °C, dodamo 10 ml vina.

Čašo postavimo na magnetno mešalo, namestimo elektrodo in magnet in počasi mešamo.

Ko tekočina doseže sobno temperaturo, jo počasi titriramo z raztopino žveplove kisline (točka 2.1.2.2), dokler pH ne doseže 8,6.

Nadaljujemo titracijo z žveplovo kislino (točka 2.1.2.2), dokler pH ne doseže 4,0. Z n ml označimo porabljeno prostornino med pH vrednostma 8,6 in 4,0.

Iz približno 50 ml vzorca vina odstranimo CO2, tako da ga tri minute stresamo v vakuumu, pri čemer se bučka greje v vodni kopeli pri približno 25 °C.

Ponovimo gornji postopek na 10 ml razplinjenega vina. Z n′ označimo porabljeno prostornino.

2.1.4 Izražanje rezultatov

1 ml titrirane 0,05 M raztopine žveplove kisline ustreza 4,4 mg CO2.

Količina CO2 v gramih na liter vina je dana s formulo:

0,44 (n – n′)

Izražena je na dve decimalni mesti natančno.

Opomba: Če vino vsebuje malo CO2 (CO2 < 1 g/l), ni treba dodati encima karbonska anhidraza, ki katalizira hidracijo CO2.

2.2 Peneča in biser vina

2.2.1 Aparaturi

2.2.1.1 Magnetno mešalo

2.2.1.2 pH meter

2.2.2 Reagenti

2.2.2.1 Natrijev hidroksid (NaOH), 50 % (m/m)

2.2.2.2 Raztopina žveplove kisline (H2SO4), 0,05 M

2.2.2.3 Raztopina karbonske anhidraze, 1 g/l

2.2.3 Postopek

Označimo raven vina v steklenici in ga nato ohlajamo, dokler ne začne zmrzovati.

Nato pustimo, da se steklenica nekoliko ogreje, in jo pri tem stresamo, da ledeni kristalčki zginejo.

Hitro odstranimo zamašek in od 45 do 50 ml vina damo v merilni valj za slepo titracijo. Točno prostornino odvzetega vina (v ml) določimo tako, da jo odčitamo na valju, ko se ponovno segreje na sobno temperaturo.

Takoj po odvzemu slepega vzorca v steklenico s prostornino 750 ml dodamo 20 ml raztopine natrijevega hidroksida (točka 2.2.2.1).

Počakamo, da se vino segreje na sobno temperaturo.

V 100 ml čašo damo 30 ml prevrete destilirane vode in dve kapljici raztopine karbonske anhidraze (točka 2.2.2.3). Dodamo 10 ml vina, potem ko smo napravili, da je postalo alkalno.

Čašo postavimo na magnetno mešalo, namestimo elektrodo in magnet in počasi mešamo.

Počasi titriramo z raztopino žveplove kisline (točka 2.2.2.2), dokler pH ne doseže 8,6.

Nadaljujemo titracijo z žveplovo kislino (točka 2.2.2.2), dokler pH ne doseže 4,0. Z n ml označimo porabljeno prostornino med pH vrednostma 8,6 in 4,0.

Iz v ml vina, ki smo ga dali na stran za slepo titracijo, odvzamemo CO2, tako da ga tri minute stresamo pod vakuumom v bučki, ki se greje v vodni kopeli pri približno 25 °C. Odvzamemo 10 ml razplinjenega vina in dodamo 30 ml prevrete destilirane vode, dodamo dve do tri kapljice raztopine natrijevega hidroksida (točka 2.2.2.1), da dobimo pH od 10 do 11. Nato izvedemo zgoraj opisani postopek. Z n′ označimo prostornino dodane 0, M žveplove kisline.

2.2.4 Izražanje rezultatov

1 ml 0,05 M žveplove kisline ustreza 4,4 mg CO2.

Izpraznimo steklenico vina, potem ko smo napravili, da je postalo alkalno, in določimo na približno 1 ml natančno začetno prostornino vina, tako da do oznake dopolnimo z vodo; zabeležimo z V ml.

Količina CO2 v gramih na liter vina je dana s formulo:

0,44(n – n′) × ((V – v + 20)/(V – v))

Rezultat izrazimo na dve decimalni mesti natančno.

2.3 Izračun teoretičnega nadtlaka

Nadtlak pri 20 °C (Paph20), izražen v paskalih, je dan z naslednjo formulo:

Paph20 = ((Q)/(1,951 × 10–5(0,86 – 0,01 A)(1 – 0,00144 S))) – Patm

pri čemer je:

Q : vsebnost CO2 v g/l vina A : alkoholna stopnja vina pri 20 °C S : vsebnost sladkorja v vinu v g/l Patm : zračni tlak v atmosferi, izražen v Pa

18 DOLOČITEV OGLJIKOVEGA DIOKSIDA V VINU Z MANOMETRIČNO METODO (OIV-AS314-04-CO2MAN) – METODA TIPA II

(p.m.)

[Organi OIV posodabljajo opis te analizne metode. Objavljen bo v enem od naslednjih sporočil Komisije, ko bo OIV objavila posodobljeno besedilo v izdaji Zbirke mednarodnih analiznih metod za leto 2010.]

19 MERJENJE NADTLAKA PENEČIH IN BISER VIN (OIV-AS-314-02-SURPRES) – METODA TIPA I

1. PRINCIP

Po tem ko dosežemo konstantno temperaturo in steklenico pretresemo, izmerimo nadtlak s pomočjo afrometra (merilnik tlaka). Nadtlak je izražen v paskalih (Pa) (metoda tipa I). Metoda se uporablja tudi za gazirana peneča vina in gazirana biser vina.

2. OPREMA

Aparatura za merjenje nadtlaka v steklenicah s penečim in biser vinom se imenuje afrometer. Ima različno obliko glede na način, kako je steklenica zamašena (kovinska kronska zaporka, navojna zaporka, plutovinast zamašek ali plastični zamašek).

2.1 Za steklenice z zaporkami

Sestavljen je iz treh delov (slika 1):

— Vrhnji del (vijačno držalo za iglo) je sestavljen iz manometra, ročno nastavljivega obroča, brezkončnega vijaka, ki zdrsi v osrednji del, in igle, ki prebode zaporko. Igla ima stransko odprtino, ki prenaša tlak na manometer. Spoj omogoča trdno prileganje na zaporko steklenice.

— Osrednji del (ali matica) omogoča centriranje zgornjega dela. Privit je na spodnji del in drži celotno aparaturo trdno na steklenici.

— Spodnji del (objemka) je opremljen z držajem, ki se potisne pod obroč steklenice in tako drži celotno aparaturo skupaj. Obstajajo obroči za vse vrste steklenic.

2.2 Za steklenice z zamaški

Sestavljen je iz dveh delov (slika 2):

— Vrhnji del je enak prejšnji aparaturi, le da je igla daljša. Sestavljena je iz dolge votle cevi s konico na enem koncu za lažje predrtje zamaška. To konico je mogoče odstraniti; ko je zamašek predrt, konica pade v vino.

— Spodnji del je sestavljen iz matice in podlage, ki naleže na zamašek. Ta je sestavljena iz štirih nastavnih vijakov, ki držijo celo aparaturo na zamašku.

Opombe glede manometrov, ki opremljajo ti dve aparaturi:

— Lahko so mehanske naprave z Bourdon cevjo ali digitalne s piezoelektričnimi senzorji. V prvem primeru mora biti Bourdon cev izdelana iz nerjavnega jekla.

— Umerjeni so v paskalih (Pa). Za peneča vina je za mersko enoto bolje uporabljati 105 paskalov (105 Pa) ali kilopaskale (kPa).

— Sodijo v različne razrede. Razred manometra pomeni natančnost odčitavanja glede na celotno skalo, izraženo v odstotkih (npr. 1 000 kPa manometra razreda I pomeni, da se največji tlak 1 000 kPa lahko odčita na 10 kPa natančno). Za natančna merjenja se priporočajo instrumenti razreda I.

3. POSTOPEK

Meritve je treba opraviti na steklenicah, ki imajo najmanj 24 ur konstantno temperaturo. Ko predremo zaporko, plutovinasti ali plastični zamašek, moramo steklenico močno stresati, dokler tlak ne postane konstanten in lahko odčitamo vrednost.

3.1 Steklenice z zaporkami

Držaj potisnemo pod obroč steklenice. Matico privijemo, tako da bo celotna aparatura privita na steklenico. Vrhnji del je privit na matico. Da se izognemo uhajanju plina, je treba zaporko predreti čim hitreje, tako da se spoj dotakne zaporke. Steklenico je nato treba močno stresti, dokler ne doseže konstantnega tlaka, ki je potreben za odčitavanje.

3.2 Steklenice z zamaški

Konico nastavimo na konec igle. Vse skupaj položimo na zamašek. Štiri vijake privijemo na zamašek. Privijemo vrhnji del (igla predre zamašek). Konica mora pasti v steklenico, tako da se tlak prenese na manometer. Odčitavanje se opravi šele po tem, ko pretresemo steklenico, da doseže konstantni tlak. Po odčitavanju konico poberemo.

4. IZRAŽANJE REZULTATOV

Nadtlak pri 20 °C (Paph20) je izražen v paskalih (Pa) ali v kilopaskalih (kPa). Izraziti ga je treba v skladu z natančnostjo manometra (npr. pri manometrih razreda I s celotno skalo 1 000 kPa kot 6,3 × 105 Pa ali 630 kPa in ne kot 6,33 × 105 Pa ali 633 kPa).

Če je temperatura, pri kateri se opravi meritev, drugačna od 20 °C, je potrebna korekcija, tako da se izmerjeni tlak pomnoži z ustreznim koeficientom (glej tabelo 1).

Tabela 1

Razmerje med nadtlakom Paph20 penečih in biser vin pri temperaturi 20 °C z nadtlakom Papht pri temperaturi t

°C 0 1,85 1 1,80 2 1,74 3 1,68 4 1,64 5 1,59 6 1,54 7 1,50 8 1,45 9 1,40 10 1,36 11 1,32 12 1,28 13 1,24 14 1,20 15 1,16 16 1,13 17 1,09 18 1,06 19 1,03 20 1,00 21 0,97 22 0,95 23 0,93 24 0,91 25 0,88

5. NADZIRANJE REZULTATOV

Metoda neposrednega določanja fizikalnih parametrov (metoda tipa I)

Preverjanje afrometrov

Afrometre je treba redno preverjati (najmanj enkrat letno).

Preverjanje se opravi s pomočjo kalibracijskega instrumenta. Ta omogoča primerjanje testnega manometra in visoko kakovostnega referenčnega manometra, ki je umerjen po nacionalnih standardih in ki ga namestimo vzporedno. Pri preverjanju primerjamo vrednosti, ki jih pokažeta obe aparaturi, tako za naraščajoč kot za padajoč tlak. Če med njima obstaja razlika, je mogoče manometer prilagoditi s pomočjo nastavitvenega vijaka.

Laboratoriji in pooblaščene organizacije so vse opremljene s kalibracijskimi instrumenti. Prav tako je aparature mogoče dobiti pri proizvajalcih manometrov.

20 DOLOČITEV LIZOCIMA V VINU S HPLC (OIV-AS-315-14) – METODA TIPA IV

1. UVOD

Za lizocim je najbolje uporabiti analizno metodo, ki ne temelji na encimskem delovanju.

2. PODROČJE UPORABE

Ta metoda omogoča določanje količine lizocima (mg proteina na liter) v belih in rdečih vinih neodvisno od encimske dejavnosti (ki lahko ne bi uspela zaradi delne denaturacije ali pojavov kompleksiranja in koprecipitacije) matrike.

3. OPREDELITEV POJMA

Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) omogoča analitski pristop, ki temelji na sterični, polarni ali adsorpcijski interakciji med trdno fazo in analitom ter zato ni povezan z dejansko encimsko dejavnostjo proteina.

4. PRINCIP

Analiza se izvaja s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC), pri kateri se povežeta spektrofotometrični in spektrofluorimetrični detektor. Neznana vsebina vzorca vina se izračuna glede na površino kromatografskega vrha, in sicer z uporabo metodologije eksternega standarda.

5. REAGENTI

5.1 Topila in raztopine

Acetonitril (CH3CN) za analizo HPLC

Čista trifluorocetna kislina (TFA)

Deionizirana voda za analizo HPLC

Standardna raztopina: vinska kislina (1 g/l), etanol (10 % v/v), katerega pH vrednost uravnamo na 3,2 z nevtralnim kalijevim tartratom

5.2 Topila za elucijo (eluenti)

A : CH3CN 1 %, TFA 0,2 %, H2O = 98,8 % B : CH3CN 70 %, TFA 0,2 %, H2O = 29,8 %

5.3 Referenčne raztopine

Od 1 do 250 mg standardnega lizocima na liter, raztopljenega v modelni raztopini z nenehnim mešanjem, ki traja vsaj 12 ur

6. MATERIAL

6.1 Naprava HPLC s črpalnim sistemom, ki omogoča gradientno elucijo

6.2 Ležišče za termostatirano kolono (pečica)

6.3 Spektrofotometrični detektor, povezan s spektrofluorimetričnim detektorjem

6.4 Injekcijska zanka, 20 μl

6.5 Polimerna kolona z reverzno fazo s fenilnimi funkcionalnimi skupinami (premer por = 1 000 Å, meja izločanja = 1 000 000 Da), na primer Tosoh Bioscience TSK-gel Phényl 5PW RP 7,5 cm × 4,6 mm ID

6.6 Predkolona iz enakega materiala kot kolona, na primer Tosoh Bioscience TSK-gel Phényl 5PW RP Guardgel 1,5 cm × 3,2 mm ID

7. PRIPRAVA VZORCA

Vzorcem vina povečamo kislost s HCl (10 M), razredčeno v razmerju 1:10, in jih filtriramo s poliamidnim filtrom s porami premera 0,22 μm (5 minut po dodajanju). Kromatografsko analizo izvedemo takoj po filtriranju.

8. DELOVNI POGOJI

8.1 Pretok topila: 1 ml/min

8.2 Temperatura kolone: 30 °C

8.3 Spektrofotometrična detekcija: 280 nm

8.4 Spektrofluorimetrična detekcija: λ ex = 276 nm; λ em = 345 nm; Dobitek = 10

8.5 Program gradientne elucije

Čas (min) Raztopina A % Raztopina B % Gradient 0 100 0 izokratski 3 100 0 linearni 10 65 35 izokratski 15 65 35 linearni 27 40,5 59,5 linearni 29 0 100 izokratski 34 0 100 linearni 36 100 0 izokratski 40 100 0

8.6 Povprečni retencijski čas lizocima: 25,50 minute

9. IZRAČUN

Izvedena je bila trojna analiza referenčnih raztopin za naslednje koncentracije lizocima: 1, 5, 10, 50, 100, 200 in 250 mg/l. Na vsakem kromatogramu se področje vrha, ki ustreza lizocimu, prenese na diagram glede na ustrezno koncentracijo, s čimer dobimo linearno regresijsko premico, izraženo s formulo Y = ax + b. Determinacijski koeficient r2 mora znašati > 0,999.

10. ZNAČILNOSTI METODE

Da bi ocenili ustreznost metode za uresničitev zastavljenega cilja, je bila izvedena validacijska študija ob upoštevanju linearnosti, meja zaznavnosti in določljivosti ter točnosti metode. Zadnji parameter je bil določen z opredelitvijo ravni točnosti in natančnosti metode.

Območje linearnosti (mg/l) Nagib premice Determinacijski koeficient (r2) MZ (mg/l) MD (mg/l) Ponovljivost (n = 5) RSD % Obnovljivost (n = 5) RSD % Std1 R. V.2 B. V.3 Std1 UV 5–250 3,786 0,9993 1,86 6,20 4,67 5,54 0,62 1,93 FLD 1–250 52,037 0,9990 0,18 0,59 2,61 2,37 0,68 2,30

Tabela 1: Podatki v zvezi z značilnostmi metode: Std1 standardna raztopina; R. V.2 rdeče vino; B. V.3 belo vino

10.1 Linearnost metode

Na podlagi rezultatov, pridobljenih z linearno regresijsko analizo, se je izkazalo, da je metoda linearna za območja, navedena v tabeli 1.

10.2 Meja zaznavnosti in določljivosti

Meja zaznavnosti (MZ) oziroma meja določljivosti (MD) sta bili izračunani kot signal, ki je bil 3-krat oziroma 10-krat intenzivnejši od kromatografskega šuma ozadja v delovnih pogojih na dejanski matriki (tabela 1).

10.3 Točnost metode

Upoštevata se parametra ponovljivosti in obnovljivosti. V tabeli 1 so navedene vrednosti teh parametrov (izražene kot % standardnega odklona meritev, ponovljenih z različnimi koncentracijami), ugotovljene pri standardni raztopini, belem vinu in rdečem vinu.

10.4. Natančnost metode

Delež ponovne pridobitve je bil izračunan na podlagi standardnih raztopin, ki so vsebovale od 5 do 50 mg lizocima na liter in jim je bila dodana količina lizocima v skladu s spodnjo tabelo.

Začetna nominalna vsebnost (mg/l) Dodatek (mg/l) Teoretična vsebnost (mg/l) Ugotovljena vsebnost (mg/l) Standardni odklon Ponovna pridobitev (%) UV 280 nm 50 13,1 63,1 62,3 3,86 99 FD 50 13,1 63,1 64,5 5,36 102 UV 280 nm 5 14,4 19,4 17,9 1,49 92,1 FD 5 14,4 19,4 19,0 1,61 97,7

21 SULFATI (OIV-AS-321-05-SULFAT) – METODA TIPA II

1. PRINCIP METOD

1.1 Referenčna metoda

Obarjanje barijevega sulfata in tehtanje. Barijev fosfat, ki je obarjen v enakih pogojih, odstranimo tako, da oborino operemo v klorovodikovi kislini.

Pri moštu ali vinih, bogatih z žveplovim dioksidom, je priporočljivo, da jih pred razžveplanjem prevremo v nepredušni posodi.

1.2 Metoda hitrega testa

Vina razvrščamo v več kategorij z uporabo tako imenovane metode omejitev, ki temelji na obarjanju barijevega sulfata s titrantom barijevih ionov.

2. REFERENČNA METODA

2.1 Reagenti

2.1.1 2 M raztopina klorovodikove kisline

2.1.2 Raztopina barijevega klorida z 200 g/l BaCl2 × 2H2O

2.2 Postopek

2.2.1 Splošni postopek

Odmerimo 40 ml vzorca za analizo in ga nalijemo v 50 ml epruveto za centrifugiranje; dodamo 2 ml 2 M klorovodikove kisline in 2 ml raztopine barijevega klorida z 200 g/l. Premešamo s steklenim mešalom; mešalo splaknemo z malo destilirane vode in pustimo stati pet minut. Centrifugiramo pet minut, nato pazljivo dekantiramo tekočino, zbrano na površju.

Nato oborino barijevega sulfata operemo takole: dodamo 10 ml 2 M klorovodikove kisline, oborino vložimo v suspenzijo in centrifugiramo pet minut, potem pa pazljivo dekantiramo tekočino, zbrano na površju. Postopek izpiranja izvedemo dvakrat v enakih pogojih, pri čemer vsakokrat uporabimo 15 ml destilirane vode.

Z izpiranjem z destilirano vodo oborino kvantitativno prenesemo v tarirano platinsko kapsulo in jo postavimo nad vodno kopel pri 100 °C, dokler popolnoma ne izpari. Posušeno oborino večkrat za kratek čas kalciniramo nad plamenom, dokler se ne pokaže bel ostanek. Pustimo, da se ohladi v eksikatorju, in stehtamo.

m = masa dobljenega barijevega sulfata v miligramih

2.2.2 Posebni postopek: žveplani mošt in vino z visoko vsebnostjo žveplovega dioksida

Najprej odstranimo žveplov dioksid.

25 ml vode in 1 ml čiste klorovodikove kisline (ρ20 = 1,15 do 1,18 g/ml) nalijemo v 500 ml erlenmajerico, ki ima kapalni lijak in odvodno cevko. Raztopino prevremo, s čimer odstranimo zrak, in dolijemo 100 ml vina skozi kapalni lijak. Nadaljujemo vrenje, dokler se prostornina tekočine v erlenmajerici ne zmanjša na okoli 75 ml, in jo nato po ohlajanju kvantitativno prenesemo v 100 ml merilno bučko. Dopolnimo z vodo do oznake. Določimo sulfate v 40 ml vzorcu, kakor je navedeno v točki 2.2.1.

2.3 Izražanje rezultatov

2.3.1 Izračuni:

Vsebnost sulfatov, izražena v miligramih na liter kalijevega sulfata (K2SO4), je:

18,67 × m

Vsebnost sulfatov v moštu ali vinu je izražena v miligramih na liter kalijevega sulfata, brez decimalne vejice.

2.3.2 Ponovljivost

do 1 000 mg/l: r = 27 mg/l

okrog 1 500 mg/l: r = 41 mg/l

2.3.3 Obnovljivost

do 1 000 mg/l: R = 51 mg/l

okrog 1 500 mg/l: R = 81 mg/l

22 ŽELEZO (OIV-AS-322-05-FER) – METODA TIPA IV

1. PRINCIP METOD

REFERENČNA METODA

Po ustrezni razredčitvi vina in odstranitvi alkohola železo določimo neposredno z atomsko absorpcijsko spektrofotometrijo.

OBIČAJNA METODA

Po razkroju v 30 % raztopini vodikovega peroksida se skupno železo, ki je v obliki Fe(III), skrči na obliko Fe(II) in ga določimo z obarvanjem, ki ga povzroči ortofenantrolin.

2. REFERENČNA METODA

2.1 Reagenti

2.1.1 Koncentrirana standardna raztopina železa, ki vsebuje 1 g Fe(III) na liter

Uporabimo standardno raztopino (1 g/l), ki je na voljo na trgu. Pripravimo jo tako, da 8,6341 g železovega amonijevega sulfata (FeNH4(SO4)2 × 12H2O) raztopimo v destilirani vodi, ki ji rahlo povečamo kislost z 1 M klorovodikovo kislino, in dopolnimo do enega litra.

2.1.2 Razredčena standardna raztopina železa, ki vsebuje 100 mg železa na liter

2.2 Aparature

2.2.1 Rotacijski izparilnik s termostatsko nadzorovano vodno kopeljo

2.2.2 Atomski absorpcijski spektrofotometer z gorilnikom na zmes zraka in acetilena

2.2.3 Žarnica z železovo votlo katodo

2.3 Postopek

2.3.1 Priprava vzorca

Alkohol odstr