Deveta Direktiva Komisije

z dne 31. julija 1981

o določitvi metod analize Skupnosti pri uradnem nadzoru krme

(81/715/EGS)

KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE

ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske gospodarske skupnosti,

ob upoštevanju Direktive Sveta 70/373/EGS z dne 20. julija 1970 o uvedbi metod vzorčenja in analize Skupnosti pri uradnem nadzoru krme [1], kakor je bila nazadnje spremenjena z Aktom o pristopu Grčije, zlasti člena 2 Direktive,

ker navedena direktiva zahteva, da se uradni nadzor krme izvaja z uporabo metod Skupnosti za vzorčenje in analize z namenom preverjanja izpolnjevanja zahtev, določenih z zakoni in drugimi predpisi v zvezi s kakovostjo in sestavo krme;

ker so direktive Komisije 71/250/EGS [2], 71/393/EGS [3], 72/199/EGS [4], 73/46/EGS [5], 74/203/EGS [6], 75/84/EGS [7], 76/372/EGS [8] in 78/633/EGS [9], kakor so bile nazadnje spremenjene z Direktivo z dne 30. julija 1981, že določile številne metode Skupnosti za analizo; ker je zaradi napredka dela od tedaj priporočljivo, da se sprejme deveti sklop metod;

ker so ukrepi, predvideni v tej direktivi, v skladu z mnenjem Stalnega odbora za krmo,

SPREJELA NASLEDNJO DIREKTIVO

Člen 1

Države članice zahtevajo, da se analize za uradni nadzor vsebnosti avoparcina in monensin natrija v krmi opravljajo skladno z metodami, opisanimi v Prilogi.

Člen 2

Države članice s 1. decembrom 1981 sprejmejo zakone in druge predpise, potrebne za uskladitev s to direktivo in o tem takoj obvestijo Skupnost.

Člen 3

Ta direktiva je naslovljena na države članice.

V Bruslju, 31. julija 1981

Za Komisijo

Gaston Thorn

Predsednik

[1] UL L 170, 3.8.1970, str. 2.

[2] UL L 155, 12.7.1971, str. 13.

[3] UL L 279, 20.12.1971, str. 7.

[4] UL L 123, 29.5.1972, str. 6.

[5] UL L 83, 30.3.1973, str. 21.

[6] UL L 108, 22.4.1974, str. 7.

[7] UL L 32, 5.2.1975, str. 26.

[8] UL L 102, 15.4.1976, str. 8.

[9] UL L 206, 29.7.1978, str. 43.

--------------------------------------------------

PRILOGA

1. DOLOČANJE AVOPARCINA Z DIFUZIJO V AGARSKEM GOJIŠČU

1. NAMEN IN PODROČJE UPORABE

S tem postopkom določamo vsebnost avoparcina v krmi in premiksih. Spodnja meja za določitev je 2 mg/kg (2 ppm). Vsebnost polietrnih antibiotikov lahko vpliva na določanje.

2. NAČELO

Vzorec ekstrahiramo z mešanico acetona, vode in klorovodikove kisline. Antibiotično aktivnost ekstrakta določimo tako, da izmerimo difuzijo avoparcina v agarskem gojišču, inokuliranem z Bacillus subtilis. Znak difuzije je oblikovanje inhibicijskih con mikroorganizma. Za premer teh con velja, da je premosorazmeren z logaritmom koncentracije antibiotika na obseg uporabljenih koncentracij antibiotika.

3. MIKROORGANIZEM: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054)

3.1 Ohranjanje prvotne kulture

Epruvete, ki vsebujejo poševne nanose gojišč (4.1), inokuliramo z Bacillus subtilisin pustimo čez noč pri 30 °C. Kulturo shranimo v hladilniku pri približno 4 °C. Vsak mesec znova inokuliramo.

3.2 Priprava suspenzije spor [1]

Z 2 do 3 ml sterilne vode posnamemo mlado kulturo z agarskega gojišča (3.1). S to suspenzijo inokuliramo 300 ml gojišč (4.1), postavljenih v rouxovo bučo, in inkubiramo tri do pet dni pri 30 °C. Mikroskopsko preverimo razvoj spor, nato posnamemo mlado kulturo s 15 ml etanola (4.2) in dobro premešamo. Ta suspenzija se lahko shrani vsaj za pet mesecev pri približno 4 °C.

4. GOJIŠČA IN REAGENTI

4.1 Gojišče [2]

Pepton | 6,0 g |

Tripton | 4,0 g |

Kvasni ekstrakt | 3,0 g |

Mesni ekstrakt | 1,5 g |

Glukoza | 1,0 g |

Agar | 15,0 g |

Voda | 1000 ml |

pH 6,5 (po sterilizaciji). | |

4.2 20-odstotni etanol (v/v): razredčimo 200 ml etanola z 800 ml vode.

4.3 Klorovodikova kislina, d: od 1,18 do 1,19.

4.4 Raztopina natrijevega hidroksida 2 M.

4.5 Fosfatni pufer, 0,1 M:

Kalijev dihidrogenfosfat, KH2PO4: 13,6 g.

Voda do 1000 ml.

Uravnamo pH na 4,5.

4.6 Mešanica metanola, vode in klorovodikove kisline (4.3): 65/32,5/2,5 (v/v/v).

4.7 Standardna snov: avoparcinsulfat z znano aktivnostjo.

5. STANDARDNE RAZTOPINE

Pazljivo odmerimo približno 10 mg standardne snovi (4.7) in jo raztopimo v fosfatnem pufru (4.5) ter razredčimo s tem pufrom, da dobimo osnovno raztopino, ki vsebuje 100 μg avoparcina na ml. Ta raztopina ostane nespremenjena do sedem dni, če jo hranimo v zaprti buči pri 4 °C.

5.1 Za premikse

Z zaporednim razredčevanjem s pufrom (4.5) pripravimo iz te osnovne raztopine naslednje raztopine:

S8 | 4,0 μg/ml |

S4 | 2,0 μg/ml |

S2 | 1,0 μg/ml |

S1 | 0,5 μg/ml |

5.2 Za krmo

Z zaporednim razredčevanjem s pufrom (4.5) pripravimo iz osnovne raztopine naslednje raztopine:

S8 | 2,0 μg/ml |

S4 | 1,0 μg/ml |

S2 | 0,5 μg/ml |

S1 | 0,25 μg/ml |

6. PRIPRAVA EKSTRAKTA IN PRESKUSNIH RAZTOPIN

6.1 Premiksi

Na 10 mg natančno odtehtamo toliko vzorca, da vsebuje 10 do 100 mg avoparcina. Položimo ga v 100-mililitrsko merilno bučo skupaj s 60 ml mešanice (4.6) in pretresamo 15 minut z mehanskim stresalnim aparatom. Preverimo pH in ga po potrebi s klorovodikovo kislino (4.3) uravnamo na pH 2. Bučo napolnimo z mešanico (4.6) in dobro premešamo. Del raztopine filtriramo s primernim filtrirnim papirjem (npr. whatman št. 1), pri tem pa odlijemo prvih 5 ml filtrata. Vzamemo nekaj filtrata in pH z raztopino natrijevega hidroksida (4.4) uravnamo na 4,5. To raztopino razredčimo s fosfatnim pufrom (4.5), da dobimo pričakovano koncentracijo avoparcina 4 μg/ml (= U8).

Iz raztopine U8 pripravimo raztopine U4 (pričakovana vsebnost: 2 μg/ml), U2 (pričakovana vsebnost: 1 μg/ml) in U1 (pričakovana vsebnost: 0,5 μg/ml), in sicer z zaporednim razredčevanjem (1 + 1) s pufrom (4.5).

6.2 Krma

Odmerimo 50 g vzorca in 100 ml mešanice (4.6), pretresamo 30 minut z mehanskim stresalnim aparatom. Ekstrakt zbistrimo s centrifugiranjem (z uporabo zaprtih centrifugirnih epruvet), odvzamemo del zbistrenega ekstrakta (glej tabelo spodaj) in pH uravnamo na 4,5 z raztopino natrijevega hidroksida (4.4). Razredčimo s pufrom (4.5), da dobimo U8 (glej tabelo spodaj). Iz raztopine U8 pripravimo raztopine U4 (pričakovana vsebnost: 1 μg/ml), U2 (pričakovana vsebnost: 0,5 μg/ml) in U1 (pričakovana vsebnost: 0,25 μg/ml), in sicer z zaporednim razredčevanjem (1 + 1) s pufrom (4.5).

Domnevna vsebnost avoparcina (mg/kg) | 5 | 7,5 | 10 | 15 | 20 | 40 |

Teža vzorca (g (± 0, 1 g)) | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |

Prostornina zmesi (4.6) (ml) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |

Prostornina bistrega ekstrakta (ml) | 20 | 15 | 20 | 15 | 20 | 10 |

Končna prostornina (ml): U8 | 25 | 25 | 50 | 50 | 100 | 100 |

Pričakovana koncentracija U8 (μg/ml) | 2 | pribl. 2 | 2 | pribl. 2 | 2 | 2 |

7. PRESKUSNI POSTOPEK

7.1 Inokulacija preskusnega gojišča

Preskusno gojišče (4.1) inokuliramo s suspenzijo spor (3.2) pri 50 do 60 °C. S predhodnimi preskusi na ploščah s preskusnim gojiščem (4.1) določimo količino suspenzije spor, ki je potrebna, da pridobimo največje in najjasnejše inhibicijske cone z različnimi koncentracijami avoparcina.

7.2 Priprava plošč

Difuzija skozi agar se izvaja na ploščah s štirimi koncentracijami običajne raztopine (S8, S4, S2 in S1) in s štirimi koncentracijami preskusne raztopine (U8, U4, U2 in U1) na vsaki izmed njih. Na vsako ploščo moramo nanesti vse štiri koncentracije ekstrakta in standardne raztopine. V ta namen izberemo plošče, ki so dovolj velike za vsaj osem vdolbin s premerom od 10 do 13 mm, z najmanj 30 mm razdalje med središči, ki jih je treba vdolbsti v agarsko gojišče. Preskus se lahko izvaja na tankih steklenih ploščah, na katerih je obroč iz obdelanega aluminija ali plastike, premera 200 mm in višine 20 mm.

Na plošče nanesemo določeno količino gojišča (4.1), ki je inokulirano skladno s točko 7.1, da dobimo približno 2 mm debelo plast (60 ml za ploščo s premerom 200 mm). Počakajmo, da se površina utrdi. Nato izdolbemo vdolbine in vlijemo vanje natančno odmerjeno količino preskusne in standardne raztopine (med 0,10 in 0,15 ml na vdolbino, glede na premer). Vsako koncentracijo uporabimo vsaj štirikrat, tako da je pri vsakem preskusu treba oceniti 32 inhibicijskih con.

7.3 Inkubacija

Plošče inkubiramo od 16 do 18 ur pri 30 °C.

8. DOLOČANJE VREDNOSTI

Premer inhibicijskih con izmerimo do 0,1 mm natančno. Zabeležimo srednje vrednosti za vsako koncentracijo na semilogaritemskem grafu, ki kaže logaritem koncentracij glede na premere inhibicijskih con. Na grafu prikažemo najustreznejše premice, in sicer za običajno raztopino in tudi za ekstrakt, kakor je navedeno v spodnjem primeru.

Z naslednjo enačbo določimo "najustreznejšo" točko za najvišjo raven običajne raztopine (SL):

SL =

10

Z naslednjo enačbo določimo "najustreznejšo" točko za najvišjo raven običajne raztopine (SH):

SH =

10

Podobno izračunamo "najustreznejše" točke za najnižjo (UL) in najvišjo (UH) raven ekstrakta, in sicer tako, da v zgornjih enačbah U1, U2, U4 in U8 nadomestimo s S1, S2, S4 in S8.

Zabeležimo izračunane vrednosti SL in SH na istem grafu in jih povežemo, da dobimo "najustreznejšo" črto za standardno raztopino. Podobno zabeležimo vrednosti UL in UH ter jih povežemo, da dobimo "najustreznejšo" črto za ekstrakt.

Če ni interferenc, bi morale biti črte vzporedne. Iz praktičnih razlogov lahko črte štejemo za vzporedne, če med vrednostmi (SH-SL) ter (UH-UL) in njihovimi srednjimi vrednostmi ni več kakor 10 % odklona.

Če premice niso vzporedne, lahko izločimo bodisi U1 in S1 ali U8 in S8, z vrednostmi SL, SH, UL in UH pa z alternativnimi enačbami izračunamo alternativne "najustreznejše" premice:

(a′)SL = 5S 1+ 2S2 − S46 | ali | 5S2+ 2S4 − S86 |

(b′)SH = 5S 4+ 2S2 – S16 | ali | 5S8 + 2S4 − S26 |

Podobno velja za UL in UH. Za alternativne "najustreznejše" premice preverimo vzporednost kakor zgoraj. Če rezultat izračunamo na treh ravneh, moramo to zabeležiti v končnem poročilu.

Kadar premice štejemo za vzporedne, izračunamo logaritem relativne dejavnosti (log. A) z uporabo ene izmed naslednjih formul:

Za štiri ravni

log. A =

U

+ U

+ U

+ U

− S

− S

− S

− S

8 × 0,602U4+ U8 + S4+ S8 − U1 − U2 − S1 − S2

Za tri ravni

log. A =

U

+ U

+ U

− S

− S

– S

4 × 0,401U4 + S4 − U1 − S1

ali

log. A =

U

+ U

+ U

– S

− S

− S

8 × 0,401U8 + S8 − U2 − S2

Dejanska dejavnost = domnevna dejavnost × relativna dejavnost.

Če relativno delovanje presega razpon od 0,5 do 2,0, ponovimo preskus tako, da ustrezno prilagodimo koncentracije ekstrakta, če je to mogoče, sicer prilagodimo standardne raztopine. Kadar relativnega delovanja ne moremo pripeljati do zahtevanih vrednosti, moramo vse rezultate jemati kot približke in to tudi zabeležiti v končnem poročilu.

Kadar se črte ne štejejo za vzporedne, postopek določevanja ponovimo. Če vzporednosti še vedno ne dosežemo, je treba določanje šteti kot nezadovoljivo.

9. PONOVLJIVOST

Razlika med rezultati dveh določevanj, ki jih na istem vzorcu izvaja isti analitik, ne sme presegati:

- 2 mg/kg v absolutni vrednosti za vsebnost avoparcina od 2 do 10 mg/kg,

- 20 % pri najvišjih vrednostih za vsebnosti od 10 do 25 mg/kg,

- 5 mg/kg v absolutni vrednosti za vsebnosti od 25 do 50 mg/kg,

- 10 % pri najvišjih vrednostih za vsebnosti nad 50 mg/kg.

2. DOLOČANJE MONENSIN NATRIJA Z DIFUZIJO V AGARSKEM GOJIŠČU

1. NAMEN IN OBSEG

S tem postopkom določamo vsebnost monensin natrija v krmi in premiksih. Spodnja meja za določevanje je 10 mg/kg (10 ppm) [3].

2. NAČELO

Vzorec ekstrahiramo z 90-odstotnim metanolom. Ekstrakt obdelamo z ustreznimi postopki glede na vsebnost monensin natrija v vzorcu. Njegovo antibiotično delovanje določimo tako, da izmerimo difuzijo monensin natrija v agarskem gojišču, inokuliranem z Bacillus subtilis. Znak difuzije je oblikovanje inhibicijskih con mikroorganizma. Za premer teh con velja, da je premosorazmeren z logaritmom koncentracije antibiotika na obseg uporabljenih koncentracij antibiotika. Občutljivost preskusnega sistema se zmanjša v prisotnosti natrijevih ionov.

3. MIKROORGANIZEM: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054)

3.1 Ohranjanje prvotne kulture

Epruvete, ki vsebujejo poševne nanose gojišč (4.1), inokuliramo z Bacillus subtilis in pustimo čez noč pri 30 °C. Kulturo shranimo v hladilniku pri približno 4 °C. Vsak mesec znova inokuliramo.

3.2 Priprava suspenzije spor [4]

Z 2 do 3 ml sterilne vode posnamemo mlado kulturo z agarskega gojišča (3.1). S to suspenzijo inokuliramo 300 ml gojišč (4.1), postavljenih v rouxovo bučo, in inkubiramo tri do pet dni pri 30 °C. Mikroskopsko preverimo razvoj spor, nato posnamemo mlado kulturo s 15 ml 20-odstotnega etanola (4.3) in dobro premešamo. Ta suspenzija se lahko shrani za vsaj pet mesecev pri približno 4 °C.

4. GOJIŠČA IN REAGENTI

4.1 Gojišče [5]

Tripton | 6,0 g |

Kvasni ekstrakt | 3,0 g |

Mesni ekstrakt | 1,5 g |

Glukoza | 1,0 g |

Agar (odvisno od kakovosti) | 15,0 g |

Voda | 1000 ml |

pH 6,5 (po sterilizaciji). | |

4.2 Preskusno gojišče

Glukoza | 10,0 g |

Kvasni ekstrakt | 2,5 g |

Dikalijev hidrogenfosfat, K2HPO4 | 0,69 g |

Kalijev dihidrogenfosfat, K2HPO4 | 0,45 g |

Agar (odvisno od kakovosti) | 10,0 do 20,0 g |

Voda | 1000 ml |

pH 6 (po sterilizaciji). | |

4.3 20-odstotni etanol (v/v): razredčimo 200 ml etanola z 800 ml vode.

4.4 Metanol, anhidriden.

4.5 90-odstotni metanol (v/v): razredčimo 900 ml metanola (4.4) s 100 ml vode.

4.6 50-odstotni metanol (v/v): razredčimo 500 ml metanola (4.4) s 500 ml vode.

4.7 Aluminijev oksid, v zrncih (alcoa F, 20 mesh; aktivirani aluminijev oksid UG1: F. Lancaster and Co., ali ekvivalent).

4.8 Standardne snovi: monensin natrij z znano aktivnostjo (npr. iz International Laboratory for Biological Standards, Central Veterinary Laboratory, Weybridge, UK-Surrey KT 15 3NB).

5. NAPRAVE

5.1 Rotacijski vakuumski izparilnik z 250-mililitrsko bučo z okroglim dnom.

5.2 Steklena cev za kromatografijo, notranji premer: 25 mm, dolžina: 400 mm, z odprtim koncem, ki ima v premeru 2 mm.

5.3 Steklena cev za kromatografijo, notranji premer: 11 mm, dolžina: približno 300 mm, z odprtim koncem, ki ima v premeru 2 mm.

6. STANDARDNE RAZTOPINE

Natančno odmerjeno količino standardne snovi (4.8) raztopimo v metanolu (4.4) in razredčimo, da dobimo osnovno raztopino, ki vsebuje 800 μg monensin natrija na ml. Ta raztopina ostane nespremenjena do štirinajst dni, če jo hranimo v zaprtih bučah pri 4 °C.

Z zaporednim razredčevanjem s 50-odstotnim metanolom (4.6) pripravimo iz te osnovne raztopine naslednje raztopine:

S8 | 8,0 μg/ml |

S4 | 4,0 μg/ml |

S2 | 2,0 μg/ml |

S1 | 1,0 μg/ml |

7. PRIPRAVA EKSTRAKTA

7.1 Ekstrakcija

7.1.1 Premiksi

Odtehtamo 2 g vzorca, dodamo 100 ml 90-odstotnega metanola (4.5) ter nekaj minut homogeniziramo in centrifugiramo. Supernatantno raztopino razredčimo s 50-odstotnim metanolom (4.6), da dobimo pričakovano koncentracijo monensin natrija 8 μg/ml (= U8).

7.1.2 Krma z vsebnostjo monensin natrija najmanj 50 ppm

Odtehtamo 10 do 20 g vzorca, dodamo 100 ml 90-odstotnega metanola (4.5), 15 minut homogeniziramo in pustimo, da se umiri.

V ožji del steklene epruvete (5.2) vstavimo zamašek iz vate in z rahlim trkanjem dodamo aluminijev oksid (4.7), da dobimo 75 do 80 mm visok steber.

Ekstrakt prelijemo na steber aluminijevega oksida in zberemo filtrat. Z vodo razredčimo 30 ml filtrata na 50 ml. Še naprej redčimo s 50-odstotnim metanolom (4.6), da dobimo pričakovano koncentracijo monensin natrija 8 μg/ml (= U8).

7.1.3 Krma z vsebnostjo monensin natrija pod 50 ppm (do 10 ppm)

Odtehtamo 10 do 20 g vzorca, dodamo 100 ml 90-odstotnega metanola (4.5) in 15 minut homogeniziramo. Centrifugiramo, da se zbistri.

Za vzorec, ki vsebuje 20 ppm monensin natrija, vzamemo 40 ml supernatantne tekočine. Za vzorec, ki vsebuje 10 ppm, vzamemo 80 ml in izparevamo, dokler se ne posuši, v vakuumu na rotacijskem izparilniku (5.1) pri največ 40 °C. Preostanek raztopimo v 10 ml 90-odstotnega metanola (4.5).

V ožji del steklene epruvete (5.3) vstavimo zamašek iz vate in z rahlim trkanjem dodamo aluminijev oksid (4.7), da dobimo 75 do 80 mm visok steber.

Raztopino preostanka v metanolu prelijemo na steber aluminijevega oksida in zberemo filtrat. Steber splaknemo z 10 ml 90-odstotnega metanola (4.5) in zmešamo to tekočino s filtratom.

Raztopino izparevamo v vakuumu na rotacijskem izparilniku (5.1) pri manj kakor 40 °C, dokler se ne posuši. Preostanek raztopimo v 10 ml anhidridnega metanola (4.4) in dolijemo vodo, da dobimo 20 ml. Raztopino centrifugiramo vsaj pet minut pri 4000 obr./min. Še naprej redčimo s 50-odstotnim metanolom (4.6), da dobimo pričakovano vsebnost monensin natrija 8 μg/ml (= U8).

7.2 Preskusne raztopine

Z raztopino U8 pripravimo raztopine U4 (pričakovana vsebnost: 4 μg/ml), U2 (pričakovana vsebnost: 2 μg/ml) in U1 (pričakovana vsebnost: 1 μg/ml), in sicer z zaporednim razredčevanjem (1 + 1) s 50-odstotnim metanolom (4.6).

8. PRESKUSNI POSTOPEK

8.1 Inokulacija preskusnega gojišča

Preskusno gojišče (4.2) inokuliramo s suspenzijo spor (3.2) pri 50 do 60 °C. S predhodnimi preskusi na ploščah s preskusnim gojiščem (4.2) določimo količino suspenzije spor, ki je potrebna, da se pridobi največje in najjasnejše inhibicijske cone z različnimi koncentracijami monensin natrija.

8.2 Priprava plošč

Difuzija skozi agar se izvaja na ploščah s štirimi koncentracijami običajne raztopine (S8, S4, S2 in S1) in s štirimi koncentracijami preskusne raztopine (U8, U4, U2 in U1) na vsaki izmed njih. Na vsako ploščo moramo nanesti vse štiri koncentracije ekstrakta in standardne raztopine. V ta namen izberemo plošče, ki so dovolj velike za vsaj osem vdolbin s premerom od 10 do 13 mm, z najmanj 30 mm razdalje med središči, ki jih je treba vdolbsti v agarsko gojišče. Preskus se lahko izvaja na tankih steklenih ploščah, na katerih je obroč iz obdelanega aluminija ali plastike, premera 200 mm in višine 20 mm.

Na plošče nanesemo določeno količino gojišča (4.2), inokuliranega skladno s točko 8.1, da dobimo približno 2 mm debelo plast (60 ml za ploščo s premerom 200 mm). Počakamo, da se površina utrdi. Nato izdolbemo vdolbine in vanje vlijemo natanko odmerjeno količino preskusne in standardne raztopine (med 0,10 in 0,15 ml na vdolbino, glede na premer). Vsako koncentracijo uporabimo vsaj štirikrat, tako da je pri vsakem preskusu treba oceniti 32 inhibicijskih con.

8.3 Inkubacija

Plošče inkubiramo približno 18 ur pri temperaturi od 35 do 37 °C.

9. DOLOČANJE VREDNOSTI

Premer inhibicijskih con izmerimo do 0,1 mm natančno. Zabeležimo srednje vrednosti za vsako koncentracijo na semilogaritemskem grafu, ki kaže logaritem koncentracij glede na premer inhibicijskih con. Na grafu prikažemo najustreznejše premice, in sicer za običajno raztopino, pa tudi za ekstrakt, kakor je navedeno v spodnjem primeru.

Z naslednjo enačbo določimo "najustreznejšo" točko za najnižjo raven standardne raztopine (SL):

SL =

10

Z naslednjo enačbo določimo "najustreznejšo" točko za najvišjo raven običajne raztopine (SH):

SH =

10

Podobno izračunamo "najustreznejše" točke za najnižjo (UL) in najvišjo (UH) raven ekstrakta, in sicer tako, da v zgornjih enačbah U1, U2, U4 in U8 nadomestimo s S1, S2, S4 in S8.

Zabeležimo izračunane vrednosti SL in SH na istem grafu ter jih povežemo, da dobimo "najustreznejšo" črto za standardno raztopino. Podobno zabeležimo vrednosti UL in UH ter jih povežemo, da dobimo "najustreznejšo" črto za ekstrakt.

Če ni interferenc, bi morale biti črte vzporedne. Iz praktičnih razlogov lahko štejemo črte za vzporedne, če med vrednostmi (SH-SL) in (UH-UL) ter njihovimi srednjimi vrednostmi ni več kakor 10 % odklona.

Če premice niso vzporedne, lahko izločimo bodisi U1 in S1 ali U8 in S8, z vrednostmi SL, SH, UL in UH pa z alternativnimi enačbami izračunamo alternativne "najustreznejše" premice:

(a ′)SL = 5S 1+ 2S2 − S46 | ali | 5S2 + 2S 4− S86 |

(b ′)SH = 5S 4+ 2S2 – S16 | ali | 5S8 + 2S4 − S26 |

Podobno velja tudi za UL in UH. Za alternativne najustreznejše premice preverimo vzporednost kakor zgoraj. Če rezultat izračunamo na treh ravneh, moramo to zabeležiti v končnem poročilu.

Kadar premice štejemo za vzporedne, izračunamo logaritem relativne dejavnosti (log. A) z uporabo ene izmed naslednjih formul:

Za štiri ravni

log. A =

U

+ U

+ U

+ U

− S

− S

− S

− S

8 × 0,602U4 + U8 + S4 + S8 − U1 − U2 − S1 − S2

Za tri ravni

log. A =

U

+ U

+ U

− S

− S

− S

4 × 0,401U4+ S4 − U1 − S1

ali

log. A =

U

+ U

+ U

− S

− S

− S

8 × 0,401U8 + S8 − U2 − S2

Dejanska dejavnost = domnevna dejavnost × relativna dejavnost.

Če relativno delovanje presega razpon od 0,5 do 2,0, ponovimo preskus tako, da ustrezno prilagodimo koncentracije ekstrakta, če je to mogoče, sicer prilagodimo standardne raztopine. Kadar relativnega delovanja ne moremo pripeljati do zahtevanih vrednosti, moramo vse rezultate jemati kot približke in to tudi zabeležiti v končnem poročilu.

Kadar se črte ne štejejo za vzporedne, postopek določevanja ponovimo. Če vzporednosti še vedno ne dosežemo, je treba določanje šteti kot nezadovoljivo.

10. PONOVLJIVOST

Razlika med rezultati dveh določevanj, ki jih na istem vzorcu izvaja isti analitik, ne sme presegati:

- 20 % pri najvišjih vrednostih vsebnosti monensin natrija od 10 do 25 mg/kg,

- 5 mg/kg absolutne vrednosti za vsebnosti od 25 do 50 mg/kg,

- 10 % pri najvišjih vrednostih vsebnosti nad 50 mg/kg.

[1] Uporabimo lahko tudi druge postopke, če je dokazano, da dajejo podobne suspenzije spor.

[2] Uporabimo lahko katerokoli običajno gojišče, ki ima podobno sestavo in daje enake rezultate.

[3] 1 mg monensin natrija ustreza 1000 enot UK.

[4] Uporabimo lahko tudi druge postopke, če je dokazano, da dajejo podobne suspenzije spor.

[5] Uporabimo lahko katerokoli komercialno gojišče, ki ima podobno sestavo in daje enake rezultate.

--------------------------------------------------