Odločba Komisije

z dne 14. aprila 1993

o določitvi metod za ugotavljanje ostankov snovi s hormonskim in tireostatskim delovanjem

(93/256/EGS)

KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE

ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske gospodarske skupnosti,

ob upoštevanju Direktive Sveta 85/358/EGS z dne 16. julija 1985 o spremembi Direktive 81/602/EGS o prepovedi nekaterih snovi s hormonskim ali tireostatskim delovanjem [1], kakor je bila nazadnje spremenjena z Direktivo Komisije 88/146/ES [2], in zlasti člena 5(2) Direktive,

ker člen 8(1) Direktive Sveta 64/433/EGS z dne 26. junija 1964 o zdravstvenih težavah, ki vplivajo na trgovanje s svežim mesom znotraj Skupnosti [3], kakor je nazadnje spremenjena z Direktivo 92/5/EGS [4], in drugi pododstavek člena 11(4) Direktive Sveta 85/397/EGS z dne 5. avgusta 1985 o zdravju in zdravstvenih problemih z živalmi, ki vplivajo na trgovanje s toplotno obdelanim mlekom znotraj Skupnosti [5], kakor je nazadnje spremenjena z Direktivo 89/662/EGS [6], določata, da je treba preiskave glede ostankov opraviti v skladu s preverjenimi metodami, ki so znanstveno priznane in zlasti tistimi, določenimi v direktivah Skupnosti ali drugih mednarodnih standardih;

ker opredelitev metod analiz vzorcev vključuje definicijo analitskega postopka, po katerem se jih izvaja, pravil, ki jih je treba upoštevati pri jemanju vzorcev ter meril, ki se uporabljajo pri izvajanju analize;

ker je treba sprejeti analitske postopke, ki so dovolj občutljivi za ugotavljanje prisotnosti ostankov snovi s hormonskim in tireostatskim delovanjem;

ker je vzorčenje bistveni sestavni del analitske metode; ker je zato treba določiti pravila jemanja vzorcev;

ker je za namene te Odločbe treba upoštevati merila, določena v točki 1 Priloge k Direktivi Sveta 85/591/EGS z dne 20. decembra 1985 o uvedbi metod Skupnosti za vzorčenje in analize za spremljanje in nadzor živil, namenjenih za prehrano ljudi [7];

Ker je treba ob upoštevanju razvoja znanstvenega in tehničnega znanja in zaradi jasnosti, razveljaviti Odločbo Komisije 87/410/EGS [8];

ker so ukrepi, predvideni v tej odločbi, v skladu z mnenjem Stalnega veterinarskega odbora,

SPREJELA NASLEDNJO ODLOČBO:

Člen 1

Redni analitski postopki, odobreni za ugotavljanje ostankov snovi s hormonskim in tireostatskim delovanjem, so naslednji:

- preizkus imunosti,

- tankoplastna kromatografija,

- tekočinska kromatografija,

- plinska kromatografija,

- masna spektrometrija,

- spektrometrija,

ali katera koli druga metoda, ki izpolnjuje merila, primerljiva tistim, ki so določena za sorodne metode iz Priloge.

Člen 2

Vzorci za analizo se jemljejo v skladu z naslednjimi pravili:

1. vzorec mora biti reprezentativen in dovolj velik, da omogoča ustrezno analizo in ponovljeno analizo ter vse potrditvene analize;

2. vzorec mora biti označen tako, da vedno omogoča identifikacijo;

3. postopek vzorčenja, pakiranja, hranjenja, prevoza in skladiščenja vzorca mora biti takšen, da ohranja njegovo neoporečnost in ne vpliva na rezultat preiskave. Preprečiti je treba nepooblaščen dostop do vzorcev.

Člen 3

Merila, ki se uporabljajo za redne analitske postopke za ugotavljanje ostankov snovi s hormonskim in tireostatskim delovanjem, so določena v Prilogi.

Člen 4

Ta odločba se ponovno pregleda pred 1. januarjem 1996, da se upošteva razvoj znanstvenega in tehničnega znanja.

Člen 5

Odločba Komisije 87/410/EGS se s tem razveljavi.

Člen 6

Ta odločba je naslovljena na države članice.

V Bruslju, 14. aprila 1993

Za Komisijo

René Steichen

Član Komisije

[1] UL L 191, 23.7.1985, str. 46.

[2] UL L 70, 16.3.1988, str. 16.

[3] UL 121, 29.7.1964, str. 2012/64.

[4] UL L 57, 2.3.1992, str. 1.

[5] UL L 226, 24.8.1985, str. 13.

[6] UL L 395, 30.12.1989, str. 13.

[7] UL L 372, 31.12.1985, str. 50.

[8] UL L 223, 11.8.1987, str. 18.

--------------------------------------------------

PRILOGA

1. OPREDELITEV POJMOV IN SPLOŠNE ZAHTEVE

1.1 Opredelitev pojmov

1.1.1 Redne analitske metode

Redne analitske metode so analitske metode, ki jih uporabljajo države članice za izvajanje nacionalnih načrtov za nadzor ostankov v živalih za proizvodnjo hrane in njihovih proizvodih, v skladu z Direktivo Sveta 86/469/EGS [1]. Redne metode morajo poprej validirati izvajalski laboratoriji in morajo izpolnjevati ustrezna merila, določena v tej Prilogi. Uporabijo se lahko za namene izločanja ali ugotavljanja skladnosti:

- metode, ki se uporabljajo za namene izločanja (izločilne metode) so metode, ki se uporabljajo za ugotavljanje prisotnosti analita ali razreda analitov na ravni, ki nas zanima. Te metode imajo veliko zmogljivost pretoka in vzgoje vzorcev in se uporabljajo za presejevanje velikega števila vzorcev, da se opazijo potencialni pozitivni vzorci. Namenjeni so izogibanju lažno negativnim rezultatom,

- metode, ki se uporabljajo za namene potrjevanja (potrditvene metode) so metode, ki dajejo celotno ali komplementarno informacijo in omogočajo, da se analit opredeli nedvoumno, na ravni, ki nas zanima. Te metode so namenjene preprečevanju lažno pozitivnih rezultatov kakor tudi temu, da se doseže sprejemljivo nizko verjetnost lažno negativnih rezultatov.

1.1.2 Analit

Je komponenta preizkusnega vzorca, ki jo je treba ugotoviti, določiti in/ali kvantificirati. Izraz "analit" vključuje, če je to primerno, derivate, ki se tvorijo iz analita med analizo.

Količinske mere analita je treba navesti kot:

- množino, izraženo z maso (npr.- μg, ng)

ali

- vsebnost, izražena z masnim deležem (npr. μg kg–1, ng kg–1) ali masno koncentracijo, izraženo z maso na volumsko enoto (e. g. μg l–1) ali molsko koncentracijo, izraženo z g-moli na volumsko enoto(e. g. mol l–1).

1.1.3 Vzorci

1.1.3.1 Laboratorijski vzorec

Je vzorec, kot je pripravljen za pošiljanje v laboratorij in namenjen za pregled ali preizkus.

1.1.3.2 Preizkusni vzorec

Je vzorec, pripravljen iz laboratorijskega vzorca in iz katerega bodo vzeti preizkusni deleži.

1.1.3.3 Preizkusni delež

Je količina materiala, vzetega iz preizkusnega vzorca (ali, če sta oba ista, iz laboratorijskega vzorca) in na katerem se preizkus ali opazovanje dejansko opravi.

1.1.4 Standardni analit

Je natančno določena snov vsebnosti označenega analita, najvišje čistosti, ki je na razpolago, ki se uporabi kot referenca pri analizi.

1.1.5 Referenčni material

Je material, katerega ena ali več lastnosti so bile potrjene z validirano metodo, tako da je lahko uporabljen za kalibracijo aparature ali za verificiranje merske metode.

1.1.6 Slepa določanja

1.1.6.1 Slepo določanje vzorca

Je celoten analitski postopek, ki se ga opravi na preizkusnem deležu, vzetem iz vzorca, v katerem ni analita.

1.1.6.2 Slepo določanje reagenta

Je celoten analitski postopek, ki se ga opravi z izpustitvijo preizkusnega deleža ali z uporabo enakovredne količine ustreznega topila namesto preizkusnega deleža.

1.1.7 Specifičnost

Specifičnost je zmožnost metode, da razlikuje med merjenim analitom in drugimi snovmi. Ta lastnost je pretežno funkcija uporabljenega principa merjenja, vendar se lahko spreminja glede na razred mešanice ali matrike.

Podatki v zvezi s specifičnostjo se morajo nanašati najmanj na eno snov, za katero bi lahko pričakovali, da bo povzročila dvig signala, kadar je uporabljen opisani princip merjenja, npr. homologni, analogni, metabolitski produkti ostankov, ki nas zanimajo. Iz podatkov v zvezi s specifičnostjo mora biti možno kvantitativno izpeljati obseg, do katerega lahko metoda razlikuje med analitom in drugimi snovmi pod eksperimentalnimi pogoji.

1.1.8 Točnost

V tej odločbi se to nanaša na točnost srednje vrednosti. Definicija, ki se uporablja, je določena v ISO 3534-1977 pod 2.83 (Točnost srednje vrednosti: je stopnja ujemanja med pravo vrednostjo in rezultatom srednje vrednosti, ki se jo dobi z mnogokratno ponovitvijo eksperimentalnega postopka.)

Osnovne omejitve točnosti so:

(a) naključne napake;

(b) sistematične napake.

Pri zelo velikem številu poizkusov, se točnost srednje vrednosti približa sistematični napaki. Za teoretični pregled metode je treba specificirati število poizkusov.

Merilo točnosti je razlika med srednjo vrednostjo, izmerjeno kot referenčni material in njeno pravo vrednostjo, izraženo kot odstotek prave vrednosti. Če referenčni material ni na voljo, se zadevne parametre lahko oceni z analiziranjem okrepljenega vzorčnega materiala.

V primerih, ko niso na voljo niti absolutne metode definicije ne certificirani referenčni materiali, je mogoče vsebnost analita v vzorcu opredeliti z rezultati, dobljenimi s pomočjo metode, ki izkazuje visoko stopnjo specifičnosti, točnosti in natančnosti.

1.1.9 Natančnost

Je stopnja ujemanja med rezultati, dobljenimi z izvajanjem eksperimentalnega postopka v skladu s predpisanimi pogoji (ISO 3534-1977 [2]. 2.84) in zajema ponovljivost in reproduktibilnost.

Ponovljivost:

Stopnja ujemanja med vzajemno neodvisnimi rezultati preizkusa, ki jih dobi pod pogoji ponovljivosti, t.j. z enako metodo na identičnem preizkusnem materialu v istem laboratoriju isti izvajalec z uporabo iste opreme v kratkem časovnem razmaku.

Reproduktibilnost:

Stopnja ujemanja med vzajemno neodvisnimi rezultati preizkusa, ki jih dobi pod pogoji reproduktibilnosti, t.j. z enako metodo na identičnem preizkusnem materialu v različnih laboratorijih drugi izvajalec z uporabo druge opreme.

V skladu s Prilogo k Direktivi Sveta 85/591/EGS [3] se vrednosti natančnosti za analitske metode, ki jih je treba proučiti za sprejem v okviru določb navedene Direktive, dobijo iz medlaboratorijskega poizkusa, ki je bil izveden v skladu z ISO 5725-1986 [4]. V ta namen sta izraza ponovljivost in reproduktilnost opredeljena v ISO 5725-1986. Za izvajanje takšnih poizkusov se uporabljajo vzorčni materiali s poznano vsebnostjo analita, ki se uvršča okrog najvišje mejne vrednosti ostankov, ki jo je treba uveljaviti.

Dokler pa reproduktibilnost metode ni vzpostavljena z medlaboratorijskim poizkusom, za namen teoretičnega predizbora zadevnih metod zadošča, da so na voljo podatki o ponovljivosti.

Merilo ponovljivosti in reproduktibilnosti, ki se ga uporabi, je koeficient variacije, kot je opredeljen v ISO 3534-1977, 2.35 (koeficient variacije: razmerje med standardno deviacijo in absolutno vrednostjo aritmetične srednje vrednosti).

1.1.10 Meja detekcije

Je najmanjša izmerjena vsebnost, iz katere je možno zaključiti glede prisotnosti analita z zadostno statistično gotovostjo (najmanj 95 % za nedovoljene snovi - glej 1.2.6.1).

Meja detekcije se lahko izračuna z uporabo različnih pristopov:

(a) en način je, da se izvede določitev slepih vzorcev na najmanj 20 reprezentativnih slepih vzorcih. Meja detekcije je izračunana kot navidezna vsebnost, ki ustreza vrednosti srednje vrednosti plus trikratna standardna deviacija za slepa določanja

Opomba 1:

Določiti je treba količino testnega deleža, ki se običajno uporablja v analizi.

Opomba 2:

Če se pričakuje, da dejavniki, kot so vrsta, spol, starost, krma ali drugi okoljski dejavniki lahko vplivajo na značilnosti metode, potem je potreben komplet najmanj 20 slepih vzorcev za vsako posamezno homogeno populacijo, za katero naj se metoda uporablja;

(b) druga možnost, v primeru spektrometričnih določevanj, pri katerih reprezentativna slepa določevanja dajo samo bel šum, se meja detekcije izračuna kot navidezna vsebnost, ki ustreza trikratnemu šumu od pika do pika.

1.1.11 Meja določljivosti

Je najmanjša vsebnost analita za katero je bila validirana metoda s specificirano točnostjo in natančnostjo.

1.1.12 Občutljivost

Je merilo sposobnosti metode, da razlikuje med razlikami v vsebnosti analita. V tej odločbi je občutljivost izračunana kot naklon kalibracijske krivulje na ravni, ki nas zanima.

1.1.13 Izvedljivost

Je značilnost analitskega postopka, ki je odvisna od obsega metode in jo določajo zahteve kot so zmogljivost obdelave vzorcev in stroški.

1.1.14 Uporabnost

Je seznam vzorčnih materialov in/ali analitov, za katere se metoda lahko uporabi takšna, kot je prikazana ali z določenimi manjšimi spremembami.

1.1.15 Interpretacija rezultatov

1.1.15.1 Pozitiven rezultat

Prisotnost analita v vzorcu je dokazana, kadar so v skladu z analitskim postopkom izpolnjena splošna merila ter merila, specificirana za posamezno metodo detekcije.

(a) Za snovi z nično toleranco je rezultat analize "pozitiven", če je identiteta analita v vzorcu nedvoumno dokazana.

(b) Za snovi z ugotovljeno določeno mejno vrednostjo ostankov je rezultat analize "pozitiven", če je eksperimentalno opredeljena vsebnost analita v vzorcu (po izvajanju kakršne koli korekcije za obnovitev) večja od določene najvišje mejne vrednosti ostankov, pri čemer se upošteva sprejemljiva verjetnost, da se dobi lažno pozitiven ali lažno negativen rezultat.

1.1.15.2 Negativen rezultat

Rezultat analize velja v skladu z analitskim postopkom za "negativen", kadar so splošna merila ter merila, specificirana za posamezno metodo detekcije izpolnjena v primeru ustreznih referenčnih materialov in slepih določanj ter:

(a) v primeru snovi z nično toleranco, za katere identiteta analita ni bila nedvoumno dokazana. ali

(b) v primeru snovi z določeno najvišjo mejno vrednostjo ostankov, kjer je izmerjena vsebnost analita v vzorcu pod ravnijo, specificirano v 1.1.15.1 (b) zgoraj.

Opomba:

Negativen rezultat ne dokazuje v primeru (a) da analita v vzorcu ni, ali v primeru (b), da je prava vsebina analita pod najvišjo mejno vrednostjo ostankov.

1.1.16 Ko-kromatografija,

Je postopek, pri katerem je očiščena preizkusna raztopina pred kromatografsko fazo(fazami) razdeljena v dva dela in:

(a) se za en del kot tak naredi kromatografija;

(b) v drugi del pa se doda standardni analit ter za to zmešano raztopino testne raztopine in standardnega analite se naredi kromatografija. Količina dodanega standardnega analita mora biti podobna ocenjeni količini analita v testni raztopini.

1.1.17 Imunogram

V tej odločbi je imunogram opredeljen kot grafični prikaz imunokemijskega odziva versus zadrževalni čas ali elucijski volumen kakor je dobljen iz kromatografskega ločevanja z (na splošno off-line postopkom) imunokemijsko detekcijo sestavin vzorčnega ekstrakta.

1.2 Splošne zahteve

1.2.1 Merila

V skladu s Prilogo Direktive Sveta 85/591/EGS, se spodaj določena merila uporabljajo za preizkušanje analitskih metod.

1.2.2 Presejalne metode

Za presejalne metode se ne more določiti fiksnih zahtev. Najpomembnejši vidik delovanja je, da je pojavnost lažno negativnih rezultatov na ravni, ki nas zanima, minimalna.

1.2.2.1 Specifičnost mora biti opredeljena.

1.2.2.2 Točnost in natančnost

Količinska opredelitev mogoče ni potrebna. Glede na to, ali je uporaba snovi prepovedana ali dovoljena, je lahko presejalna metoda kvalitativna ali kvantitativna. Lažno pozitivni rezultati so sprejemljivi, vendar morajo biti lažno negativni rezultati na ravni, ki nas zanima, minimalni.

1.2.2.3 Meja detekcije

Mora biti ustrezna namenu. Za snovi z določeno najvišjo mejno vrednostjo ostankov, mora biti dovolj nizka, da se ugotovi ostanke na tej ravni. Za snovi, ki niso dovoljene za uporabo pri živalih za proizvodnjo hrane, mora biti meja detekcije kolikor je mogoče nizka.

1.2.2.4 Izvedljivost:

Zaželena je visoka zmogljivost obdelave vzorcev in stroški morajo biti nizki.

1.2.3 Potrditvene metode

1.2.3.1 Specifičnost:

Potrditvene metode morajo v največji možni meri zagotavljati nedvoumne informacije o kemijski strukturi analita. Kadar se dobi enak odziv od več kot ene sestavine, potem metoda ne zmore razlikovati med temi sestavinami.

Metode, ki temeljijo samo na kromatografski analizi brez uporabe molekularne spektrometrične detekcije, niso primerne za uporabo kot potrditvene metode.

Če posamezna tehnika nima zadostne specifičnosti, se želeno specifičnost lahko doseže z analitskim postopkom, ki sestoji iz ustreznih kombinacij očiščevalnih kromatografskih separacij in spektrometrične imunokemijske detekcije, npr. PK-MS, KT-MS, KIA/PK-MS, PK-IR, KT-IR, KT/IMG.

1.2.3.2 Točnost

V primeru ponovne analize referenčnega materiala je orientacijski razpon za odklon povprečne, poskusno določene vsebnosti (po vnosu korekcije za obnovljivost) od prave vrednosti naslednji:

Prava vsebnost (masni delež) | Razpon |

≤ 1 μg kg–1 | –50 % do + 20 % |

> 1 μg kg–1do 10 mμ kg–1 | –30 % do + 10 % |

>10 μg kg–1 | –20 % do + 10 % |

1.2.3.3 Natančnost:

V primeru ponovne analize referenčnega materiala pod pogoji sledljivosti so značilne vrednosti za medlaboratorijski koeficient variacije (CV), izračunane s pomočjo Horwitzove enačbe [(CV( %) = 2(1 – 0,5 logC), kjer je C vsebnost izražena z vrednostjo na 10. potenco], naslednje:

Prava vsebnost (masni delež) | CV |

1 μg kg–1 | 40 % |

10 μg kg–1 | 32 % |

100 μg kg–1 | 23 % |

1 μg kg–1 | 16 % |

Pri analizah, izvedenih pod pogoji sledljivosti, bi bil medlaboratorijski koeficient variacije značilno nekje med eno polovico in dvema tretjinama zgoraj navedenih vrednosti.

1.2.3.4 Meja zaznavnosti:

Namenu primerno (glej 1.2.6.1).

1.2.3.5 Meja določitve:

Namenu primerno (glej 1.2.6.2).

1.2.3.6 Občutljivost:

Namenu primerno.

1.2.3.7 Izvedljivost:

Hitrost in strošek sta v primerjavi z metodami presejanja manj pomembna.

Pri potrditvenih metodah je večina vidikov izvedljivosti v primerjavi z ostalimi merili, opredeljenimi v tem sklepu, manj pomembna. Običajno zadošča, da so na razpolago potrebni reagenti in oprema.

1.2.4 Umeritvene krivulje

Če je metoda odvisna od umeritvene krivulje, je potrebno navesti naslednje podatke:

- matematično formulo, ki opisuje umeritveno krivuljo,

- sprejemljive razpone znotraj katerih se lahko gibljejo dnevne razlike v vrednostih parametrov umeritvene krivulje,

- delovni razpon umeritvene krivulje.

Kadar koli je to mogoče, je treba za nadzor kakovosti umeritvenih krivulj pri potrditvenih metodah uporabiti ustrezne interne standarde in referenčne materiale, navesti pa je treba tudi podrobne podatke za varianco spremenljivk, ki velja vsaj za delovni razpon umeritvene krivulje.

1.2.5 Dovzetnost za motnje

1.2.5.1 Za vse poskusne pogoje, pri katerih bi lahko v praksi prišlo do nihanja (npr. obstojnost reagentov, sestava vzorca, pH, temperatura), je treba navesti vse možne razlike, ki bi lahko vplivale na rezultat analize. Opis metode vključuje ukrepe za premagovanje kakršnih koli predvidljivih motenj. Po potrebi se opišejo alternativni načini detekcije, primerni za potrditev.

1.2.5.2 Če se izvaja so-kromatografija mora biti dobljen en sam vrh, porast v višini vrha (ali področja) pa je enak količini dodanega analita. Pri plinski (PK) ali tekočinski (TK) kromatografiji mora biti širina vrha pri polovični maksimalni višini v razponu med 90-110 % originalne širine, zadrževalni časi pa enaki, z dovoljenim odstopanjem do 5 %. Pri metodi tenkoplastne kromatografije (TPK) je treba točko, ki nastane zaradi analita, samo intenzivirati; ne sme se pojaviti nova točka in vidni izgled se ne sme spremeniti.

1.2.5.3 Bistvenega pomena je raziskati motnje, ki bi lahko nastale zaradi matričnih komponent.

1.2.6 Razmerje med dovoljenimi vrednostmi ostankov in analiznimi mejnimi vrednostmi

1.2.6.1 Za snovi, katerih uporaba pri živalih, ki proizvajajo hrano, ni dovoljena, mora biti meja zaznavnosti analizne metode dovolj nizka, da se s 95 % verjetnostjo lahko odkrijejo pričakovane vrednosti ostankov po nezakoniti uporabi.

1.2.6.2 Za snovi z določeno najvišjo dovoljeno vrednostjo ostanka meja določanja metode, povečana za trikratno standardno deviacijo, ki jo ta metoda povzroči pri vzorcu z najvišjo dovoljeno vrednostjo ostanka, ne sme presegati določene najvišje dovoljene vrednosti ostanka.

1.2.6.3 Za snovi z določeno najvišjo mejno vrednostjo ostanka je treba metodo potrditi pri tej vrednosti, kot tudi pri polovični in dvakratni navedeni vrednosti.

2. MERILA ZA RAZPOZNAVANJE IN KVANTIFIKACIJO OSTANKOV

2.1 Splošne zahteve

Laboratoriji, ki opravljajo analize za dokončno potrditev prisotnosti ostankov organskih snovi nizke molekulske mase, zagotovijo, da so merila za pojasnjevanje rezultatov skladna z zahtevami tega oddelka. Merila so oblikovana za razpoznavanje analita in naj bi preprečevala pojav lažno-pozitivnih rezultatov. Za pozitivno potrditev morajo analizni rezultati izpolnjevati merila, ki so določena za posamezno analizno metodo.

2.2 Splošni opis celotnega analiznega postopka

2.2.1 Priprava vzorca

Vzorec je treba odvzeti, z njim ravnati in ga obdelati na tak način, da bo verjetnost odkritja analita, če je ta prisoten, kar se da velika.

2.2.2 Dovzetnost za motnje

Navesti je treba podatke, kot so specificirani pod 1.2.5 (Dovzetnost za motnje).

2.2.3 Splošna merila za celotni postopek

2.2.3.1 Znani morajo biti specifičnost (1.1.7) in mejne vrednosti odkrivanja (1.1.10) in določanja analita v vzorcu materiala, ki se ga pregleduje po tej metodi.

Opomba:

To informacijo se da pridobiti iz podatkov, zbranih na osnovi poskusov, in/ali teoretičnih razmišljanj.

2.2.3.2 Za potrditev pozitivnega rezultata se fizikalne in kemične lastnosti analita v ustreznem vzorcu materiala med postopkom analize ne smejo razlikovati od lastnosti odgovarjajočega standardnega analita

2.2.3.3 Pozitivni ali negativni rezultat analize bo veljaven znotraj meja specifičnosti in meja zaznavnosti in določitve postopka le za analit in vzorčni material, ki je predmet preiskave.

2.2.3.4 Po možnosti naj se z vsako serijo testnih vzorcev, ki so predmet analize, skozi celoten postopek sočasno obdeluje tudi referenčni ali okrepljeni material, ki vsebuje znane količine analita. Alternativno se lahko poskusnemu vzorcu doda še interni standard.

2.2.4 Merila za nesprotno fizikalno in/ali kemično povečevanje koncentracije, prečiščevanje inseparacijo (ločevanje)

2.2.4.1 Analit naj bo v frakciji, ki je značilna za odgovarjajoči standardni analit v ustreznem vzorčnem materialu pod enakimi eksperimentalnimi pogoji.

2.2.4.2 Podatke o zadrževanju za standarde, kontrolne vzorce in preizkusne deleže je treba navesti skupaj s končnimi rezultati: pozitivnimi ali negativnimi.

2.2.5 Merila za količinske meritve

2.2.5.1 Pri vseh količinskih meritvah je treba izmeriti in navesti obnovljivost.

2.2.5.2 Medlaboratorijska odstopanja za obnovljivost morajo biti čim manjša.

2.2.5.3 Jasno mora biti navedeno, če pri končnih rezultatih je/ni bil upoštevan popravek za obnovljivost. Če je, potem je potrebno opisati uporabljeno korekcijsko metodo.

2.3 Merila za analizne metode, ki se lahko za namene potrjevanja uporabljajo le v kombinaciji z drugimi metodami

2.3.1 Zahteve za ugotavljanje kakovostipri določanju analita z PI

2.3.1.1 Naveden mora biti delovni razpon umeritvene krivulje, ki mora na splošno pokrivati koncentracije v razponu najmanj ene desetice.

2.3.1.2 Potrebnih je najmanj šest umeritvenih točk, enakomerno razporejenih vzdolž umeritvene krivulje.

2.3.1.3 Ustrezni parametri nadzora kakovosti morajo biti usklajeni s parametri iz predhodnih preskusov, npr. NSV in parametri umeritvene krivulje.

2.3.1.4 V vsak preskus morajo biti vključeni kontrolni vzorci. Stopnje koncentracij: nič ter pri nižjih, srednjih in višjih območjih delovnega razpona. Rezultati teh morajo biti usklajeni s tistimi iz predhodnih preskusov.

Vse neobdelane podatke za kontrolne vzorce in preizkusne deleže je treba navesti skupaj s končnimi rezultati: pozitivnimi ali negativnimi.

2.3.2 Merila za določitev analita s PK ali TK pri nespecifičem odkrivanju

2.3.2.1 Analit naj bi se (iz)ločil po retenzijskem času, ki je značilen za odgovarjajoči standardni analit pod enakimi eksperimentalnimi pogoji.

2.3.2.2 Najbližji maksimalni vrh v kromatogramu mora biti ločen od vrha določenega analita vsaj za eno celo širino, pri 10 % maksimalne višine.

2.3.2.3 Za dodatne informacije se lahko uporabi so-kromatografija in kromatografija z najmanj dvema kolonama različne polaritete.

2.3.3 Merila za določitev analita s TPK

2.3.3.1 Vrednost(i) Rf analita se morajo ujemati z vrednostmi Rf, značilnimi za standardni analit. Ta zahteva je izpolnjena kadar je(so) vrednosti Rf za analit znotraj območja ± 3 % vrednosti Rf za standardni analit, pod enakimi eksperimentalnimi pogoji.

2.3.3.2 Vidni izgled analita se ne sme razlikovati od vidnega izgleda standardnega analita.

2.3.3.3 Središče točke, ki je najbližje tisti, ki se pojavi zaradi analita, mora biti od nje oddaljeno vsaj za polovico vsote premerov točk.

2.3.3.4 Za dodatne informacije se lahko uporabi so-kromatografija in/ali dvodimenzionalna TPK.

2.4 Merila za analizne metode, ki se lahko uporabljajo za namene potrjevanja

2.4.1 Merila za določitev analita s TK/PI ali TK/IMG

2.4.1.1 Pri TK/IMG mora analizni vrh za IMG sestavljati vsaj pet frakcij TK.

2.4.1.2 Izpolnjeni morata biti merili 2.2.4.1 in 2.2.4.2.

2.4.1.3 Reagenti

Navedeni morajo biti vir in značilnosti protiteles in drugih reagentov.

2.4.1.4 Umeritvena krivulja

Ker je metoda odvisna od umeritvene krivulje, je potrebno navesti podatke, naštete pod 1.2.4 (Umeritvene krivulje).

Izpolnjene morajo biti zahteve po kakovosti, določene za PI (2.3.1.1 do 2.3.1.4).

2.4.1.5 Če se metoda ne uporablja skupaj z drugimi metodami, se za namene potrjevanja izvedeta dve ločevanji s TK ali dva imunograma z uporabo protiteles z različnimi specifičnostmi.

2.4.2 Merila za določitev analita s TK-SP

2.4.2.1. Izpolnjeni morata biti merili 2.3.2.1 in 2.3.2.2.

2.4.2.2 Najvišje vrednosti absorpcije v spektru analita bi morale biti pri isti valovni dolžini take kot vrednosti standardnega analita v mejah, ki jih določi resolucija detekcijskega sistema. Za ugotavljanje diodne matrike je to navadno v razponu ± 2 nm.

2.4.2.3 Spekter analita nad 220 nm se na videz ne bi smel razlikovati od spektra standardnega analita za dele dveh spektrov z relativno absorbanco >10 %. To merilo je izpolnjeno kadar so prisotne iste najvišje vrednosti in na nobeni opazovani točki razlika med dvema spektroma ne presega 10 % absorbance standardnega analita.

2.4.2.4 Če se metoda ne uporabi skupaj z drugimi metodami, je za namene potrjevanja obvezna so-kromatografija na stopnji TK. Glej 1.2.5.2 za zahteve, ki jih mora izpolnjevati so-kromatografija.

2.4.3 Merila za določitev analita s TPK-SP

2.4.3.1 Metoda mora izpolnjevati merila, določena za TPK (2.3.3.1 to 2.3.3.3).

2.4.3.2 Najvišje vrednosti absorpcije v spektru analita bi morale biti pri isti valovni dolžini kot vrednosti standardnega analita v mejah, ki jih določi resolucija detekcijskega sistema.

2.4.3.3 Spekter analita se na videz ne sme razlikovati od spektra standardnega analita.

2.4.3.4 Če se metoda ne uporabi skupaj z drugimi metodami, je za namene potrjevanja obvezna so-kromatografija na stopnji TPK. Glej 1.2.5.2 za zahteve, ki jih mora izpolnjevati so-kromatografija.

2.4.4 Merila za določitev analita s PK-MS

2.4.4.1 Merila PK

2.4.4.1.1 Izpolnjeni morata biti merili 2.3.2.1 in 2.3.2.2.

2.4.4.1.2 Če je na voljo material, primeren za ta namen, bi se moral uporabiti interni standard. Po možnosti bi moral biti stabilna oblika analita, označena z izotopom ali, če te oblike ni, povezan standard z retencijskim časom, podobnim retencijskemu času analita.

2.4.4.1.3 Razmerje med retencijskim časom analita na PK in retencijskim časom internega standarda, tj. relativni retencijski čas analita, bi moralo biti enako razmerju standardnega analita v ustrezni matriki, v mejah ± 0,5 %.

2.4.4.1.4 Če se interni standard ne uporabi, je treba za uporabo potrditvene metode identifikacijo analita podpreti z uporabo so-kromatografije.

2.4.4.2 Merila za MSNR

2.4.4.2.1 Za uporabo metode presajanja je treba izmeriti vsaj intenzivnost najbolj prisotnega diagnostičnega iona.

2.4.4.2.2 Za uporabo potrditvene metode bi bilo treba izmeriti intenzivnosti vsaj štirih diagnostičnih ionov. Če spojina z uporabljeno metodo ne da vsaj štirih diagnostičnih ionov, bi morala identifikacija analita temeljiti na rezultatih vsaj dveh neodvisnih metod PK-MSNR z različnimi derivati in/ali ionizacijskimi tehnikami, s katerimi se z vsako pridobijo trije diagnostični ioni.

Molekularni ion bi po možnosti moral biti eden od izbranih diagnostičnih ionov.

2.4.4.2.3 Relativne prisotnosti vseh diagnostičnih ionov, spremljanih iz analita, bi se morale ujemati s prisotnostjo v standardnem analitu, po možnosti v mejah ± 10 % (režim IE) ali ± 20 % (režim KI). Merila za identifikacijo analita z IR

2.4.5. Merila za identifikacijo analita z IR

2.4.5.1 Opredelitev ustreznih vrhov

Ustrezni vrhovi so najvišje vrednosti absorpcije v infrardečem spektru standardnega analita, ki izpolnjujejo naslednje zahteve.

2.4.5.1.1 Najvišja vrednost absorpcije je v številu valov v razponu od 1800-500 cm–1.

2.4.5.1.2 Intenzivnost absorpcije ni manjša od:

(a) specifične molarne absorbance 40 glede na nično absorbanco in 20 glede na osnovno linijo vrha;

ali

(b) 12,5 % relativne absorbance pri absorbanci najintenzivnejšega vrha v območju 1800-500 cm–1, kadar se obe merita glede na nično absorbanco, ter 5 % absorbance najintenzivnejšega vrha v območju 1800 - 500 cm–1, kadar se obe merita glede na njuno osnovno linijo vrha.

Opomba:

Čeprav so teoretično gledano bolj primerni ustrezni vrhovi glede na (a), pa je v praksi lažje določiti vrhove glede na (b).

2.4.5.2 Določi se število vrhov v infrardečem spektru analita, katerih frekvence se ujemajo z ustreznim vrhom standardnega analita, v mejah ± 1 cm–1.

2.4.5.3 Merila IR

2.4.5.3.1 Absorpcija mora biti prisotna na vseh območjih spektra analita, ki se ujemajo z ustreznim vrhom v referenčnem spektru standardnega analita.

2.4.5.3.2 Potrebnih je najmanj šest ustreznih vrhov v infrardečem spektru standardnega analita. Če je ustreznih vrhov manj kot šest, potem obravnavanega spektra ni mogoče uporabiti kot referenčnega spektra.

2.4.5.3.3 "Zadetek", tj. odstotek ustreznih vrhov, ugotovljenih v infrardečem spektru analita, je vsaj 50.

2.4.5.3.4 Kadar za ustrezen vrh ni enake vrednosti, mora biti ustrezno območje spektra analita skladno s prisotnostjo enakovrednega vrha.

2.4.5.3.5 Postopek se uporablja samo za vrhove absorpcije v vzorčnem spektru z intenzivnostjo, ki je vsaj 3-krat večja od šuma med dvema vrhovoma.

2.5 Druge analitske metode

Analitske metode ali kombinacije metod, ki niso obravnavane v oddelkih 2.3 in 2.4 (npr. TK-MS, MS-MS, PK-IR) se lahko uporabijo za presejanje ali v potrditvene namene, pod pogojem, da izpolnjujejo primerljiva merila, ki jim omogočajo jasno identifikacijo analita na preučevani ravni.

[1] UL L 275, 26.9.1986, str. 36.

[2] Mednarodna organizacija za standardizacijo: Statistika – slovar in simboli.

[3] UL L 372, 31.12.1985, str. 50.

[4] Mednarodna organizacija za standardizacijo: Natančnost preizkusnih metod: določitev ponovljivosti in reproduktibilnosti za standardno preizkusno metodo z medlaboratorijskimi preizkusi.

--------------------------------------------------