Direktiva Komisije 96/54/ES

z dne 30. julija 1996

o dvaindvajseti prilagoditvi Direktive Sveta 67/548/EGS o približevanju zakonov in drugih predpisov v zvezi z razvrščanjem, pakiranjem in označevanjem nevarnih snovi tehničnemu napredku

(Besedilo velja za EGP)

KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE

ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske skupnosti,

ob upoštevanju Direktive Sveta 67/548/EGS z dne 27. junija 1967 o približevanju zakonov in drugih predpisov v zvezi z razvrščanjem, pakiranjem in označevanjem nevarnih snovi [1], kakor je bila nazadnje spremenjena z Direktivo Komisije 94/69/ES [2], in zlasti člena 28 Direktive,

ker Priloga I k Direktivi 67/548/EGS vsebuje seznam nevarnih snovi, njihovo razvrstitev, označevanje in, kjer je ustrezno, opredelitev glede na mejne koncentracije in druge parametre, ki omogočajo oceno njihovega tveganja za zdravje ljudi in okolje; ker je treba seznam nevarnih snovi v Prilogi I prilagoditi glede na trenutna znanstvena in tehnična dognanja; ker je zato treba spremeniti predgovor k Prilogi I, tako da se vključijo opombe, ki se nanašajo na označevanje pripravkov in nove skupine organskih snovi v tabeli B; ker seznam nevarnih snovi v Prilogi I zajema snovi, za katere so se Avstriji in Švedski z Aktom o pristopu Avstrije, Finske in Švedske dovolila posebna začasna odstopanja glede razvrščanja in označevanja; ker Akt o pristopu za te snovi predvideva ponovni pregled zahtev o razvrščanju in označevanju; ker se zato razvrščanje nekaterih od teh snovi ustrezno ponovno pregleda;

ker Priloga III k Direktivi 67/548/EGS vsebuje seznam stavkov o naravi posebnih tveganj, pripisanih nevarnim snovem in pripravkom; ker je treba uvesti stavek, ki označuje nevarnost nekaterih snovi in pripravkov za zdravje pri vdihavanju;

ker Priloga V k Direktivi 67/548/EGS opredeljuje metode za določanje fizikalno-kemijskih lastnosti, toksičnosti, ekotoksičnosti snovi in pripravkov; ker je potrebna prilagoditev navedene priloge tehničnemu napredku;

ker Priloga VI k Direktivi 67/548/EGS vsebuje splošna merila za razvrščanje in označevanje nevarnih snovi in pripravkov; ker je treba uvesti merila za snovi in pripravke, ki so zdravju škodljivi pri vdihavanju; ker je treba spremeniti merila za snovi in pripravke, ki povzročajo preobčutljivost; ker je treba uvesti merila za označevanje plinskih posod za propan, butan ali utekočinjeni naftni plin (LPG);

ker so določbe te direktive v skladu z mnenjem Odbora za prilagajanje tehničnemu napredku direktiv o odpravi tehničnih ovir pri trgovanju z nevarnimi snovmi in pripravki,

SPREJELA NASLEDNJO DIREKTIVO:

Člen 1

Direktiva 67/548/EGS se spremeni:

1. Priloga I se spremeni:

(a) opomba 4 v uvodu se nadomesti z:

"Opomba 4

Pripravke z vsebnostjo teh snovi je treba razvrstiti kot zdravju škodljive z uporabo stavka R 65, če ustrezajo merilom v oddelku 3.2.3 v Prilogi VI.";

(b) doda se opomba 5:

"Opomba 5

Mejne koncentracije za plinaste pripravke se izražajo kot volumen v volumskih deležih.";

(c) tabeli B v uvodu v Prilogo I k Direktivi 67/548/EGS se za organske snovi doda posebna razvrstitev:

+++++ TIFF +++++

(d) vpisi v Prilogi I k tej direktivi nadomestijo ustrezne vpise;

(e) vpisi v Prilogi II k tej direktivi se dodajo prvič;

(f) vpisi z naslednjimi številkami se črtajo:

008-002-00-3

612-045-00-9

648-011-00-5

648-025-00-1

648-157-00-X

648-158-00-5

648-159-00-0

649-192-00-3

(g) vpisi v Prilogi III k tej direktivi se spremenijo tako, da se vsa sklicevanja na stavek "R 22" nadomestijo s sklicevanji na stavek "R 65".

2. Prilogi III se doda naslednji stavek:

+++++ TIFF +++++

3. Del B Priloge V se spremeni:

(a) besedilo v Prilogi IV.A k tej direktivi nadomesti naslov in splošni uvod v delu B: Metode za določanje toksičnosti;

(b) besedilo v Prilogi IV.B k tej direktivi se vstavi za poglavjem B.1 bis;

(c) besedilo v Prilogi IV.C k tej direktivi nadomesti poglavje B.6;

(d) besedilo v Prilogi IV.D k tej direktivi nadomesti poglavje B.7;

(e) besedilo v Prilogi IV.E k tej direktivi se doda na koncu.

4. Priloga VI se spremeni z besedili iz Priloge V k tej direktivi, kakor je tam navedeno.

Člen 2

1. Brez poseganja v odstavek 2 države članice sprejmejo zakone in druge predpise, potrebne za uskladitev s to direktivo, najpozneje do 31. maja 1998. O tem takoj obvestijo Komisijo.

2. Države članice sprejmejo zakone in druge predpise, potrebne za uskladitev s točkami F, I in J iz Priloge V k tej direktivi, najpozneje do 31. oktobra 1997. O tem takoj obvestijo Komisijo.

3. Države članice se v sprejetih predpisih iz odstavkov 1 in 2 sklicujejo na to direktivo ali sklic nanjo navedejo ob njihovi uradni objavi. Način sklicevanja določijo države članice.

Člen 3

Ta direktiva začne veljati dvajseti dan po objavi v Uradnem listu Evropskih skupnosti.

Člen 4

Ta direktiva je naslovljena na države članice.

V Bruslju, 30. julija 1996

Za Komisijo

Ritt Bjerregaard

Član Komisije

[1] UL L 196, 16.8.1967, str. 1.

[2] UL L 381, 31.12.1994, str. 1.

--------------------------------------------------

ANEXO I — BILAG I — ANHANG I — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I — ANNEX I — ANNEXE I — ALLEGATO I — BIJLAGE I — ANEXO I — LIITE I — BILAGA I

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

--------------------------------------------------

ANEXO II — BILAG II — ANHANG II — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II — ANNEX II — ANNEXE II — ALLEGATO II — BIJLAGE II — ANEXO II — LIITE II — BILAGA II

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

--------------------------------------------------

ANEXO III — BILAG III — ANHANG III — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ III — ANNEX III — ANNEXE III — ALLEGATO III — BIJLAGE III — ANEXO III — LIITE III — BILAGA III

Indeks št.

+++++ TIFF +++++

--------------------------------------------------

PRILOGA IV A

DEL B: METODE ZA DOLOČANJE TOKSIČNOSTI IN DRUGIH UČINKOV NA ZDRAVJE

SPLOŠNI UVOD: DEL B

A. OPOMBA

V splošnem uvodu se uporablja naslednje številčenje:

B.15 Genska mutacija – Saccharomyces cerevisiae

B.16 Mitotična rekombinacija – Saccharomyces cerevisiae

B.17 Preskus genskih mutacij v celicah sesalcev in vitro

B.18 Poškodba in popravilo DNA – nepredvidena sinteza DNA – celic sesalcev in vitro

B.19 Preskus izmenjave med sestrinskima kromatidama in vitro

B.20 Preskus spolno vezane recesivne letalnosti pri Drosophila melanogaster

B.21 Preskus preobrazbe celic sesalcev in vitro

B.22 Preskus dominantne smrtnosti pri glodalcih

B.23 Citogenetika mikrobnih celic sesalcev in vivo

B.24 Preskus barvnih lis na kožuhu pri miših

B.25 Dedne translokacije pri miših

B.26. Preskus subkronične oralne toksičnosti: 90-dnevni ponavljajoči se oralni odmerek, uporabljen na glodalcih

B.27. Preskus subkronične oralne toksičnosti: 90-dnevni ponavljajoči se oralni odmerek, uporabljen na neglodalcih

B.28. Študija subkronične dermalne toksičnosti: 90-dnevna dermalna študija s ponavljajočim se odmerkom na glodalcih

B.29. Študija subkronične inhalacijske toksičnosti: 90-dnevna inhalacijska študija s ponavljajočim se odmerkom na glodalcih

B.30. Preskus kronične toksičnosti

B.31. Preskus razvojne strupenosti – na glodalcih in neglodalcih

B.32. Preskus rakotvornosti

B.33. Kombinirani preskus kronične toksičnosti/rakotvornosti

B.34. Preskus strupenosti za razmnoževanje na eni generaciji

B.35. Preskus strupenosti za razmnoževanje na dveh generacijah

B.36. Toksikokinetika

B. SPLOŠNE OPREDELITVE POJMOV, UPORABLJENIH V PRESKUSNIH METODAH V TEJ PRILOGI

(i) Akutna toksičnost zajema škodljive učinke, ki se pokažejo v določenem času (običajno v 14 dneh) po vnosu enkratnega odmerka snovi.

(ii) Očitna toksičnost je splošni izraz, ki opisuje očitne znake toksičnosti po vnosu preskusne snovi. Le-ti naj bi zadostovali za izdelavo ocene tveganja in bili takšni, da bi povečanje danega odmerka najverjetneje povzročilo razvoj resnih znakov toksičnosti in verjetno smrt.

(iii) Odmerek je količina dane preskusne snovi. Odmerek se izraža kot teža (v gramih ali miligramih), ali kot teža preskusne snovi na enoto teže preskusne živali (npr. v miligramih na kilogram telesne teže), ali kot konstanta koncentracije v hrani (deli na milijon ali miligrami na kilogram hrane).

(iv) Razlikovalni odmerek je največji od štirih določenih velikosti odmerkov, ki se lahko daje, ne da bi povzročil smrt, povezano s preskusno snovjo (vključno s humano usmrtitvijo).

(v) Odmerjanje je splošni izraz, ki zajema odmerek, njegovo pogostost in trajanje odmerjanja.

(vi) LD50 (srednji smrtni odmerek) je statistično izpeljan enkratni odmerek snovi, ki po pričakovanju povzroči smrt 50 % preskušenih živali. Vrednost LD50 se izraža kot teža preskusne snovi na enoto teže preskušene živali (v miligramih na kilogram).

(vii) LC50 (srednja smrtna koncentracija) je statistično izpeljana koncentracija snovi, pri kateri se lahko pričakuje, da povzroči smrt med izpostavljenostjo ali v določenem obdobju po izpostavljenosti pri 50 % živali, ki so bile izpostavljene določen čas.

Vrednost LC50 se izraža kot teža preskusne snovi na standardni volumen zraka (v miligramih na liter).

(viii) NOAEL je kratica za koncentracijo brez opaznih negativnih učinkov in predstavlja največji odmerek ali stopnjo izpostavljenosti, pri kateri ni opaziti neželenih učinkov, ki so povezani s preskusom.

(ix) Ponovljeni odmerek/subkronična toksičnost zajema neželene učinke pri preskusnih živalih, ki so posledica ponovljenega dnevnega vnosa odmerka kemikalij ali izpostavljenosti tej kemikaliji kratek čas glede na njihovo pričakovano življenjsko dobo.

(x) Največji tolerančni odmerek (MTD) je največji odmerek, ki pri živalih povzroči znake toksičnosti brez večjih učinkov na preživetje glede na preskus, pri katerem se uporabi.

(xi) Draženje kože je nastajanje vnetnih sprememb v koži po nanosu preskusne snovi.

(xii) Draženje oči je nastajanje sprememb v očesu po nanosu preskusne snovi na sprednjo očesno površino.

(xiii) Senzibilizacija kože (alergijski kontaktni dermatitis) je imunološko odvisna kožna reakcija na snov.

(xiv) Dermalna korozija je nastajanje ireverzibilne poškodbe kožnega tkiva po nanosu preskusne snovi v obdobju od 3 minut do 4 ur.

(xv) Toksikokinetika je preučevanje absorpcije, porazdelitve, metabolizma in izločanja preskusnih snovi.

(xvi) Absorpcija je (so) proces(-i) vstopanja dane snovi v telo.

(xvii) Izločanje je (so) proces(-i) odstranjevanja dane snovi in/ali njenih metabolitov iz telesa.

(xviii) Porazdelitev je (so) proces(-i) porazdeljevanja dane snovi in/ali njenih metabolitov v telesu.

(xix) Metabolizem je (so) proces(-i) strukturnega spreminjanja danih snovi v telesu bodisi z encimatskimi bodisi neencimatskimi reakcijami.

B.I Akutna toksičnost – toksičnost pri ponavljajočih se odmerkih/subkronična in kronična toksičnost

Akutni toksični učinki in organska (specifična) ali sistemska toksičnost snovi se lahko ocenijo z različnimi preskusi toksičnosti (metode B.1-B.5), s katerimi po vnosu enkratnega odmerka dobimo predhodno indikacijo toksičnosti.

Glede na toksičnost snovi je lahko primerna izbira lotevanje celotnega LD50 z mejnim preskusom, čeprav v inhalacijskih študijah ni določen noben mejni poskus, ker ni bilo mogoče določiti mejne vrednosti enkratne inhalacijske izpostavljenosti.

Upoštevati je treba metode, pri katerih se uporablja najmanjše možno število živali in ki kar najbolj zmanjšajo njihovo trpljenje, na primer metodo določenega odmerka (metoda B.1 bis) in akutni razred toksičnosti (metoda B.1 tris). Pri preskusih stopnje 1 se lahko zaključki iz prve študije dopolnijo s študijo na drugi živalski vrsti. V tem primeru se lahko uporabi standardna preskusna metoda ali se metoda prilagodi za manjše število živali.

Preskus toksičnosti s ponavljajočimi se odmerki (metode B.7, B.8 in B.9) vključuje oceno toksičnih učinkov, ki nastanejo zaradi ponavljajoče se izpostavljenosti. Za pridobitev največjega možnega števila podatkov se zahtevajo pozorna klinična opazovanja živali. Ti preskusi naj bi pomagali opredeliti toksičnost ciljnih organov ter določiti toksične in netoksične odmerke. Pri dolgoročnih študijah se lahko pokaže potreba po dodatnem podrobnejšem raziskovanju teh vidikov (metode B.26–B.30 in B.33).

B.II Mutagenost – genotoksičnost

Mutagenost se nanaša na nastanek trajnih prenosljivih sprememb v količini ali strukturi genskega materiala celic ali organizmov. Te spremembe ali "mutacije" lahko zajemajo posamezen gen ali genske segmente, zaporedje genov ali cele kromosome. Učinki na celotne kromosome lahko zajemajo strukturne in/ali številčne spremembe.

Mutagenska aktivnost snovi se ocenjuje z analizami in vitro za genetske (točkaste) mutacije pri bakterijah (metoda B.13/14) in/ali za strukturne kromosomske nepravilnosti pri celicah sesalcev (metoda B.10).

Sprejemljivi so tudi postopki in vivo, na primer mikronukleusni preskus (metoda B.12) ali analiza metafaz celic kostnega mozga (metoda B.11). Vendar so, če ni kontraindikacij, mnogo primernejše metode in vitro.

Za večji produkcijski obseg in/ali za izdelavo ali dodatno izdelavo ocene tveganja se lahko zahtevajo dodatne študije za nadaljnje raziskovanje mutagenosti ali predhodni pregled rakotvornosti, ki se lahko uporabljajo v več namenov: za potrditev rezultatov, pridobljenih v osnovnem poskusu; za raziskavo končnih točk, ki niso bile preučevane v osnovnem preskusu; za uvedbo ali razširitev študij in vivo.

V ta namen metodi B.15 in B.25 vključujeta in vivo in in vitro evkariotske sisteme in razširjeno paleto bioloških končnih točk. Ti preskusi zagotavljajo informacije o točkastih mutacijah in drugih končnih točkah v organizmih, ki so bolj kompleksni od bakterij, uporabljenih v osnovnem poskusu.

Splošno načelo je, da je treba pri odločitvi za izvedbo programa nadaljnjih študij mutagenosti le-tega oblikovati tako, da daje ustrezne dodatne informacije o mutagenskem in/ali rakotvornem potencialu preskusne snovi.

Izbira dejanskih študij, ki so v določenem primeru lahko primerne, bo odvisna od številnih dejavnikov, vključno s kemijskimi in fizikalnimi lastnostmi snovi, rezultati začetnih bakterijskih in citogenetskih analiz, metaboličnim profilom snovi, rezultati drugih študij toksičnosti in znano uporabo snovi. Zaradi množice dejavnikov, ki jih je treba upoštevati, pri izbiri poskusov ni priporočljiva uporaba toge sheme.

Nekaj splošnih načel za preskusno strategijo določa Direktiva 93/67/EGS, vendar se jasne preskusne strategije lahko najdejo v tehničnem usmeritvenem dokumentu za oceno tveganja (v nadaljevanju navodilo), ki pa je kljub temu fleksibilen in se lahko ustrezno prilagodi posebnim okoliščinam.

V nadaljevanju so razvrščene metode za nadaljnje raziskovanje na podlagi glavnih genetskih končnih točk:

Študije za raziskovanje genetskih (točkastih) mutacij

(a) Napredne ali povratne mutacijske študije z uporabo evkariotskih mikroorganizmov (Saccharomyces cerevisiae) (metoda B.15)

(b) Študije in vitro za raziskovanje napredne mutacije v celicah sesalcev (metoda B.17)

(c) Preskus spolno vezane recesivne letalnosti pri Drosophila melanogaster (metoda B.20)

(d) Preskus somatskih celičnih mutacij in vivo, preskus barvnih lis na kožuhu pri miših (metoda B.24)

Študije za raziskovanje kromosomskih nepravilnosti

(a) Citogenetske študije in vivo pri sesalcih; če pri začetnem ocenjevanju ni bila izvedena analiza metafaze celic kostnega mozga in vivo, jo je treba opraviti (metoda B.11). Poleg tega se lahko razišče citogenetika mikrobnih celic in vivo (metoda B.23)

(b) Citogenetske študije in vitro v celicah sesalcev, če niso bile opravljene pri začetnem ocenjevanju (metoda B.10)

(c) Študije dominantne smrtnosti pri glodalcih (metoda B.22)

(d) Preskus dedne translokacije pri miših (metoda B.25)

Genotoksični učinki – učinki na DNA

Genotoksičnost, označujoča potencialno škodljive učinke na genski material, ki niso nujno povezani z mutagenostjo, se lahko prepozna na podlagi povzročene poškodbe DNA brez neposrednih dokazov o mutaciji. Za takšno raziskovanje so lahko primerne naslednje metode, pri katerih se uporabljajo evkariotski mikroorganizmi ali celice sesalcev:

(a) mitotična rekombinacija pri Saccharomyces cerevisiae (metoda B.16)

(b) poškodbe in popravila DNA – nepredvidena sinteza DNA – celice sesalcev – in vitro (metoda B.18)

(c) izmenjava med sestrinskima kromatidama v celicah sesalcev – in vitro (metoda B.19)

Alternativne metode za raziskovanje rakotvornega potenciala

Na voljo so poskusi celičnih transformacij sesalcev, s katerimi se merijo zmožnosti snovi, da povzroči morfološke in vedenjske spremembe v celičnih kulturah, ki naj bi bile povezane z malignimi transformacijami – in vivo (metoda B.21). Uporabijo se lahko številne vrste celic in merila za transformacijo.

Ocena tveganja dednih učinkov pri sesalcih

Na voljo so metode za določitev dednih učinkov pri sesalcih, ki jih povzročijo genetske (točkaste) mutacije, na primer preskus specifičnega lokusa pri miših, s katerim se merijo mutacije mikrobnih celic na prvi generaciji (ni vključen v tej prilogi), ali metode za določitev kromosomskih nepravilnosti, na primer preskus dedne translokacije pri miših (metoda B.25). Takšne metode se lahko uporabijo za ocenjevanje možnega genskega tveganja snovi za človeka. Vendar pa mora biti glede na zapletenost poskusov in zelo veliko število zanje potrebnih živali, zlasti za preskus specifičnega lokusa, odločitev za tovrstne študije popolnoma utemeljena.

B.III Rakotvornost

Kemične snovi se glede na svoj domnevni mehanizem delovanja lahko delijo v genotoksične ali negenotoksične rakotvorne snovi.

Študije mutagenosti/genotoksičnosti dajejo predhodne informacije za določanje genotoksičnega rakotvornega potenciala snovi. Dodatne informacije se lahko pridobijo s preskusom toksičnosti s ponavljajočimi se odmerki, preskusom subkronične toksičnosti in preskusom kronične toksičnosti. Preskus toksičnosti s ponavljajočimi se odmerki; metoda B.7 in dolgoročne študije ponavljajočih se odmerkov vključujejo oceno o opaženih histopatoloških spremembah v teh preskusih, na primer hiperplaziji nekaterih tkiv, kar bi se lahko izkazalo za pomembno. Te študije in toksikokinetične informacije lahko pomagajo pri opredelitvi kemičnih snovi z rakotvornim potencialom, ki lahko zahtevajo nadaljnjo podrobno raziskavo tega vidika s preskusom rakotvornosti (metoda B.32) ali v številnih primerih s kombinirano študijo kronične toksičnosti/rakotvornosti (metoda B.33).

B.IV Strupenost za razmnoževanje

Strupenost za razmnoževanje se lahko izraža različno, na primer kot oslabitev reproduktivne fiziologije samcev in samic, ki je opredeljena kot "učinki na plodnost", ali povzročitev škodljivih nedednih učinkov na normalni razvoj potomcev, opredeljena kot "razvojna toksičnost", ki vključuje tudi teratogenost in učinke med laktacijo.

Za študije teratogenosti, ki so sestavni del preskušanja razvojne toksičnosti, preskusna metoda (metoda B.31) predvideva predvsem oralni vnos. Glede na fizikalne lastnosti preskusne snovi ali verjetni način človekove izpostavljenosti se lahko uporabijo alternativni načini vnosa. V takšnih primerih je treba preskusno metodo primerno prilagoditi in pri tem upoštevati ustrezne elemente 28-dnevnih preskusnih metod.

Če se zahteva preskus reprodukcije (plodnosti) na treh generacijah, se lahko opisana metoda preskusa reprodukcije na dveh generacijah (metoda B.35) razširi tako, da pokriva tudi tretjo generacijo.

B.V Nevrotoksičnost

Nevrotoksičnost se lahko izraža različno, na primer kot funkcionalne spremembe in/ali strukturne in biokemične spremembe v centralnem ali perifernem živčnem sistemu. Predhodna indikacija nevrotoksičnosti se lahko pridobi iz preskusov akutne toksičnosti. Preskus toksičnosti s ponavljajočimi se odmerki, metoda B.7, vključuje oceno nevrotoksikoloških učinkov, pri čemer se za pridobitev največjega možnega števila informacij poudarja zlasti natančno klinično opazovanje živali. Ta metoda naj bi pomagala opredeliti kemične snovi z nevrotoksičnim potencialom, pri katerih se lahko zahtevajo nadaljnje podrobne raziskave tega vidika. Poleg tega je pomembno upoštevati zmožnost snovi, da povzroči specifične nevrotoksične učinke, ki se morda v drugih študijah toksičnosti ne odkrijejo. Tako je bilo na primer opaženo, da nekatere organofosforne snovi povzročajo zapoznelo nevrotoksičnost, ki se lahko oceni z metodama B.37 in B.38 po izpostavljenosti enkratnemu odmerku ali ponavljajočim se odmerkom.

B.VI Imunotoksičnost

Imunotoksičnost se lahko izraža različno, na primer kot imunosupresija in/ali povečana odzivnost imunskega sistema, ki lahko povzroči preobčutljivost ali povzročeno avtoimunost. Preskus toksičnosti s ponavljajočimi se odmerki (metoda B.7) vključuje oceno imunotoksikoloških učinkov. Ta metoda naj bi pomagala določiti kemične snovi z imunotoksikološkim potencialom, pri katerih se lahko zahtevajo nadaljnje podrobne raziskave tega vidika.

B.VII Toksikokinetika

Toksikokinetične študije pomagajo pri interpretaciji in ovrednotenju podatkov o toksičnosti. Te študije so namenjene pojasnjevanju določenih vidikov toksičnosti preskusne snovi, rezultati pa lahko pomagajo pri načrtovanju nadaljnjih študij toksičnosti. Ne predvideva se potreba po določitvi vseh parametrov za vsak primer. Celotno zaporedje toksikokinetičnih študij (absorpcija, izločanje, porazdelitev in metabolizem) je potrebno le v redkih primerih. Za nekatere zmesi so priporočljive spremembe tega zaporedja, lahko pa zadostuje študija enkratnega odmerka (metoda B.36).

Informacije o kemični zgradbi (SAR) in fizikalno-kemijskih lastnostih lahko dajo tudi indikacije absorpcijskih značilnosti s predvidenim načinom vnosa in metaboličnih možnosti ter možnosti razporeditve v tkivu. Informacije o toksikokinetičnih parametrih se lahko pridobijo tudi iz predhodnih študij toksičnosti in toksikokinetike.

C. OPREDELITEV PRESKUSNE SNOVI

Pred začetkom katere koli študije toksičnosti je treba poznati sestavo preskusne snovi, vključno z glavnimi nečistotami in ustreznimi fizikalno-kemijskimi lastnostmi, ki vključujejo tudi stabilnost.

Fizikalno-kemijske lastnosti preskusne snovi zagotavljajo pomembne informacije za izbiro načina vnosa, načrtovanje posamezne študije ter za rokovanje in skladiščenje preskusne snovi.

Pred začetkom študije je treba razviti analitično metodo za kvalitativno in kvantitativno določitev preskusne snovi (vključno z glavnimi nečistotami, kjer je mogoče) v sredstvu za odmerjanje in biološkem materialu.

Poročilo o preskusu naj vključuje vse informacije v zvezi z identifikacijo, fizikalno-kemijskimi lastnostmi, čistostjo in obnašanjem preskusne snovi.

D. VARSTVO ŽIVALI

Pri preskušanju toksičnosti sta bistvenega pomena izvajanje stroge kontrole nad okoljskimi razmerami in uporaba primernih tehnik za varstvo živali.

(i) Nastanitveni pogoji

Okoljske razmere v preskuševalnih živalskih prostorih ali ogradah morajo biti primerne za preskusno vrsto. Za podgane, miši in morske prašičke so primerne razmere sobna temperatura 22 °C ± 3 °C z relativno vlažnostjo od 30 % do 70 %; za kunce naj bi bila temperatura 20 ± 3 °C z relativno vlažnostjo od 30 do 70 %.

Nekatere preskusne tehnike so še posebno občutljive za temperaturne učinke in v takih primerih so podrobnosti o ustreznih razmerah vključene v opis preskusne metode. Pri vseh raziskavah toksičnih učinkov je treba temperaturo in vlažnost spremljati, zabeležiti in vključiti v končno poročilo o študiji.

Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Podrobnosti o vzorcu osvetlitve je treba zabeležiti in vključiti v končno poročilo o študiji.

Razen če metoda določa drugače, se lahko živali nastanijo v kletke posamično ali v majhnih skupinah istega spola; pri skupinski nastanitvi je v kletki lahko največ pet živali.

Pomembno je, da je v poročilih o poskusih na živalih navedena vrsta uporabljene nastanitve v kletkah in število nastanjenih živali v vsaki kletki med izpostavljenostjo kemikaliji in tudi v vsakem poznejšem obdobju opazovanja.

(ii) Prehranjevalni pogoji

Hrana naj izpolnjuje vse prehranjevalne zahteve preskusne živalske vrste. Če se preskusne snovi dajejo živalim z njihovo hrano, lahko interakcija med snovjo in sestavino hrane zmanjša hranilno vrednost. Možnost take reakcije je treba upoštevati pri razlagi rezultatov preskusa. Konvencionalna laboratorijska hrana se lahko uporablja z neomejenimi količinami pitne vode. Na izbiro hrane lahko vpliva potreba po zagotovitvi ustrezne primesi preskusne snovi, če se ta snov daje s hrano.

Kontaminanti v hrani, ki lahko vplivajo na toksičnost, ne smejo biti v koncentracijah, ki lahko povzročijo motnje.

E. DOBRO POČUTJE ŽIVALI

Pri izdelavi preskusnih metod je bilo ustrezno upoštevano dobro počutje živali. Nekaj primerov je kratko opisanih v nadaljevanju, vendar seznam ni izčrpen. Natančno besedilo in/ali pogoje je treba prebrati v besedilih naslednjih metod:

- Za določitev akutne oralne toksičnosti je treba upoštevati dve alternativni metodi, "metodo nespremenljivega odmerka" in "metodo razreda akutne toksičnosti". Pri "metodi nespremenljivega odmerka" se ne uporablja smrt kot specifična končna točka ocenjevanja, uporablja se tudi manj živali. Pri ′metodi razreda akutne toksičnosti′ se povprečno uporablja 70 % manj živali kakor pri metodi B.1 za akutno oralno toksičnost. Obe alternativni metodi povzročata manj trpljenja in fizične bolečine od klasične metodologije.

- Število uporabljenih živali se zmanjša na znanstveno sprejemljiv minimum: pri metodah B.1 in B.3 se na velikost odmerka preskuša samo 5 živali istega spola; za določitev senzibilizacije kože z maksimizacijskim preskusom na morskih prašičkih (metoda B.6) se uporabi samo 10 živali (in samo 5 za negativno kontrolno skupino); zmanjša se tudi število potrebnih živali za pozitivno kontrolo pri preskusih mutagenosti in vivo (metodi B.11 in B.12).

- Bolečina in trpljenje med preskušanjem se kar najbolj zmanjšata: živali, ki kažejo hude in dolgotrajne znake trpljenja in bolečine, bo morda treba humano usmrtiti; preskusne snovi ne smejo biti odmerjene na način, za katerega je znano, da povzroča bolečine in trpljenje zaradi korozivnih ali dražilnih lastnosti snovi (metode B.1, B.2 in B.3).

- mejnih preskusov omogoča, da se preskušanju z nebistveno visokimi odmerki izognemo ne le pri preskusih akutne toksičnosti (metode B.1, B.2 in B.3), temveč tudi pri preskusih mutagenosti invivo (metodi B.11 in B.12).

- Strategija za določitev stopnje razdraženosti zdaj dopušča, da se preskus ne izvede ali se omeji na študijo ene živali, če je na razpolago dovolj znanstvenih dokazov.

Takšni znanstveni dokazi lahko temeljijo na fizikalno-kemijskih lastnostih snovi, na rezultatih že opravljenih drugih preskusov ali na rezultatih validiranih preskusov in vitro. Če je bila na primer opravljena študija akutne dermalne toksičnosti z vnosom mejnega preskusnega odmerka snovi (metoda B.3) in ni bilo opaženo draženje kože, je lahko nadaljnje preskušanje draženja kože (metoda B.4) nepotrebno; snovi, ki so se v študiji draženja kože jasno izkazale za korozivne ali močno dražilne za kožo, ni treba naprej preskušati za draženje oči (metoda B.5).

F. ALTERNATIVNO PRESKUŠANJE

Znanstveni cilj Evropske unije sta razvoj in preverjanje alternativnih tehnik, ki lahko zagotavljajo enako raven informacij kot trenutni živalski preskusi, vendar uporabljajo manjše število živali, povzročajo manj trpljenja ali se povsem izognejo uporabi živali.

Ko bodo takšne metode na razpolago, se bodo morale upoštevati, kjer je mogoče, za opredelitev nevarnosti ter posledično razvrstitev in označitev glede na njihovo dejansko nevarnost.

G. OCENJEVANJE IN INTERPRETACIJA

Ker je treba pri ocenjevanju in interpretaciji preskusov upoštevati omejitve, znotraj katerih se lahko rezultati živalskih študij in študij in vitro neposredno ekstrapolirajo na človeka, se lahko dokazi o škodljivih učinkih za človeka, če so na razpolago, uporabijo za potrditev rezultatov preskusa.

Ti rezultati se lahko uporabijo za razvrščanje in označevanje novih in obstoječih kemikalij glede učinkov na zdravje človeka na podlagi njihovih intrinzičnih lastnosti, opredeljenih in kvantificiranih s temi metodami. Ustrezna merila iz Priloge VI za razvrščanje in označevanje se nanašajo tudi na končne točke preskusnih protokolpv, ki so vključeni v teh preskusnih metodah.

Ti rezultati se lahko uporabijo tudi za študije ocene tveganja za nove in obstoječe kemikalije, potrebne preskusne strategije za te namene pa so navedene v ustreznih navodilih.

H. SKLICEVANJE NA LITERATURO

Večina teh metod je bila razvita v okviru programa OECD – smernice za preskušanje in jih je treba izvajati v skladu z načeli dobre laboratorijske prakse, da bi bilo kar najbolje zagotovljeno "medsebojno priznavanje podatkov".

Dodatne informacije se lahko najdejo v napotilih, navedenih v smernicah za preskušanje OECD, in drugi ustrezni literaturi.

--------------------------------------------------

PRILOGA IV B

"

B.1 tris AKUTNA TOKSIČNOST (ORALNA) – METODA RAZREDA AKUTNE TOKSIČNOSTI

1. METODA

1.1 Uvod

Metoda razreda akutne toksičnosti daje informacije za oceno nevarnosti in se uporablja tudi za razvrščanje nevarnosti.

Pri metodi se uporabljajo trije točno določeni odmerki, ki so ustrezno ločeni za zagotovitev razvrstitve zmesi na podlagi rezultatov študije. Poleg tega postopek, opisan v tej preskusni metodi, predvideva možnost izbire treh dodatnih točno določenih odmerkov, ki se lahko uporabijo bodisi kot alternativne možnosti na določeni stopnji odločanja bodisi za izvedbo nadaljnjega preskušanja. Uporaba (katerega koli od) dodatnih odmerkov se lahko upošteva v primerih, ko je zaželena ali potrebna nadaljnja natančnejša ocena.

Metoda uporablja določene začetne odmerke in ni namenjena izračunu natančnega LD50, temveč je namenjena določitvi obsega izpostavljenosti, kjer je smrtnost pričakovana, ker je smrt določenega deleža živali še vedno glavna končna točka tega preskusa. Rezultati preskusa naj omogočijo razvrščanje v skladu z merili iz Priloge VI. Zaradi postopnega pristopa lahko preskus traja dlje kot postopek, opisan pod točko B.1. Glavna prednost te metode je, da zahteva manjše število živali kot to zahtevata metoda akutne oralne toksičnosti (B.1) in alternativna metoda fiksnega odmerka (B.1 bis).

Glej tudi splošni uvod, del B.

1.2 Opredelitev pojmov

Glej splošni uvod, del B.

1.3 Princip preskusne metode

Skupini preskusnih živali se snov daje oralno v enem od določenih odmerkov. Snov se preskuša po postopku, ki je sestavljen iz več korakov, pri vsakem pa se uporabijo tri živali istega spola. Izvedba predhodne opazovalne študije ni potrebna. Odsotnost ali prisotnost s snovjo povezane smrtnosti živali, ki jim je bil dan en odmerek, bo določila naslednji korak, in sicer:

- nadaljnje preskušanje ni potrebno,

- naslednji korak se izvede z enakim odmerkom, vendar z živalmi drugega spola,

- naslednji korak se izvede z naslednjo večjo ali manjšo velikostjo odmerka.

1.4 Opis preskusne metode

1.4.1 Priprave

Zdrave mlade odrasle živali se naključno izberejo, označijo tako, da omogočajo individualno identifikacijo, in se nastanijo v kletkah vsaj 5 dni pred začetkom preskusa, da se lahko prilagodijo razmeram v laboratoriju. Živali so lahko skupinsko razvrščene po kletkah glede na spol in odmerek, vendar pa število živali na kletko ne sme ovirati natančnega opazovanja vsake živali.

Preskusna snov se daje živalim z enkratnim odmerkom z gastrično sondo ali ustrezno intubacijo cevke.

Po potrebi se preskusna snov raztopi ali suspendira v ustreznem nosilcu. Če je mogoče, se priporoča zlasti uporaba vodne raztopine/suspenzije, nato uporaba raztopine/emulzije v olju (npr. koruznem olju) in nato možne raztopine v drugih nosilcih. Pri nevodnih nosilcih naj bodo toksične lastnosti nosilca znane, drugače pa jih je treba določiti pred preskusom.

Živali je treba pred vnosom preskusne snovi postiti (npr. podgane čez noč ali miši 3–4 ure prej); dovoljeno je pitje vode.

1.4.2 Preskusni pogoji

1.4.2.1 Preskusne živali

Razen v primeru kontraindikacij so podgane najprimernejša vrsta glodalcev. Samice naj bodo nuliparne in ne breje.

Na začetku študije mora biti sprememba teže živali minimalna in ne sme presegati ± 20 odstotkov povprečne teže za vsak spol.

1.4.2.2 Število in spol

Za vsak korak se uporabijo tri živali istega spola. V začetni fazi se lahko uporabi katerikoli od spolov.

1.4.2.3 Velikosti odmerka

Velikost odmerka, ki bo uporabljena kot začetni odmerek, se izbere med tremi točno določenimi stopnjami, t. j. 25, 200 in 2000 mg/kg telesne teže. Začetna stopnja odmerka mora biti tista, ki bo najverjetneje povzročila smrtnost vsaj nekaterih preskušanih živali. Glede na začetni odmerek se lahko uporabi eden od diagramov poteka iz postopkov, opisanih v Prilogi 1.

Pri izbiri spola in začetnega odmerka je treba uporabiti vse informacije, ki so na razpolago, vključno z informacijami o razmerjih struktura–aktivnost. Če informacije kažejo, da pri največjem odmerku (2000 mg/kg telesne teže) smrtnost ni verjetna, je treba opraviti mejni preskus. Če ni informacij o snovi, ki bo preskušana, se zaradi dobrega počutja živali priporoča začetni odmerek 200 mg/kg telesne teže.

Občasno je lahko zaželeno pridobiti natančnejše informacije od tistih, na voljo po opravljenem preskusu s tremi točno določenimi stopnjami odmerkov, ki znašajo 25, 200 in 2000 mg/kg telesne teže. V teh primerih se lahko nadaljujejo preskusi z dajanjem dodatnih točno določenih stopenj odmerkov, ki znašajo 5, 50 ali 500 mg/kg telesne teže.

Dajanje odmerkov, pri katerih je znano, da zaradi korozivnih ali močno dražilnih lastnosti snovi zelo verjetno povzročijo hudo trpljenje in bolečine, ni potrebno.

Časovni interval med tretiranimi skupinami je odvisen od nastopa, trajanja in resnosti znakov toksičnosti. Pred začetkom tretiranja živali nasprotnega spola ali vnosom naslednjega odmerka se je treba prepričati, da so živali iz predhodnega preskusa preživele.

1.4.2.4 Mejni preskus

Opravi se lahko mejni preskus pri enkratni velikosti odmerka 2000 mg/kg telesne teže na treh živalih obeh spolov. Če nastopi s snovjo povezana smrtnost, bo morda treba opraviti dodatni preskus z odmerkom 200 mg/kg (ali 500 mg/kg) telesne teže.

1.4.2.5 Obdobje opazovanja

Živali se navadno opazujejo 14 dni, razen če jih je treba izključiti iz študije in jih humano usmrtiti ali če so bile najdene mrtve. Vendar trajanje opazovanja ne sme biti strogo določeno. Odvisno naj bo od toksičnih reakcij, časa nastopa in dolžine obdobja okrevanja ter se po potrebi tako lahko podaljša. Čas nastopa in izginotja znakov toksičnosti je pomemben, zlasti če obstaja tendenca, da znaki toksičnosti nastopijo pozneje. Vsa opazovanja se sistematično zabeležijo s posameznimi zapisi za vsako žival.

1.4.3 Postopek

Po postnem obdobju in pred dajanjem preskusne snovi se živali stehtajo. Po vnosu snovi se lahko pustijo brez hrane nadaljnje 3–4 ure. Če je odmerek razdeljen na več delov in se daje v nekem obdobju, utegne biti potrebno, da se živalim da hrana in voda v ustreznih količinah, ki so odvisne od dolžine obdobja.

Največji volumen tekočine, ki se lahko vnese naenkrat, je odvisen od velikosti živali. Pri glodalcih volumen praviloma ne bi smel prekoračiti 1 ml/100 g telesne teže; vendar se pri vodnih raztopinah lahko uporabi volumen 2 ml/100 g telesne teže. Variabilnost volumna, ki se preskuša, naj bo zmanjšana na minimum s prilagoditvijo koncentracije za zagotovitev, da imajo vse velikosti odmerka stalen volumen. Če ni mogoč vnos celotne količine v enkratnem odmerku, se nadaljuje z vnosom majhnih deležev odmerka v obdobju, ki ne sme presegati 24 ur.

Podrobnosti preskusnega postopka so opisane v Prilogi 1.

1.4.3.1 Splošno opazovanje

Pozorno klinično opazovanje je treba izvesti vsaj dvakrat na dan vnosa odmerka ali pogosteje, če to zahteva odziv živali na tretiranje, in nato vsaj enkrat na dan. Živali, najdene v umirajočem stanju, in tiste, ki kažejo hude bolečine in trajne znake hudega trpljenja, je treba humano usmrtiti. Živali, ki so bile usmrčene iz humanih razlogov, se upoštevajo na enak način kakor tiste, ki so med preskusom poginile.

Če se usmrtijo iz humanih razlogov ali so najdene mrtve, je treba čim bolj natančno zabeležiti čas smrti. Če še kažejo znake toksičnosti, je treba opraviti dodatna opazovanja. Le-ta morajo vključevati spremembe kože in kožuha, oči, sluznic in tudi dihalnega sistema, sistema ožilja, avtonomnega živčevja in centralnega živčnega sistema, somatomotorne aktivnosti in vzorcev obnašanja. Posebno pozornost je treba nameniti opazovanju tremorja, krčev, slinjenja, diareje, letargije, spanca in kome.

Vsa opazovanja se sistematično zabeležijo v tabele s posameznimi zapisi za vsako žival.

1.4.3.2 Telesna teža

Vse živali je treba stehtati neposredno pred dajanjem preskusne snovi in nato najmanj enkrat na teden. Spremembe teže morajo biti izračunane in zabeležene. Ob zaključku preskusa se preživele živali stehtajo in humano usmrtijo.

1.4.3.3 Makroskopska nekroskopija

Pri vseh preskusnih živalih, vključno s tistimi, ki med preskusom poginejo ali so iz študije odstranjene, je treba opraviti makroskopsko nekroskopijo. Vse makroskopske patološke spremembe je treba zabeležiti za vsako posamezno žival. Pri živalih, ki so preživele 24 ur ali več, se lahko izvede mikroskopski pregled organov, ki kažejo očitne znake makropatologije, ker to lahko prinese koristne informacije.

2. PODATKI

Priskrbeti je treba podatke za vsako posamezno žival. Poleg tega je treba vse podatke povzeti v obliki tabele, ki za vsako preskusno skupino prikazuje število uporabljenih živali, število živali, ki kažejo znake toksičnosti, število živali, ki so bile med preskusom najdene mrtve ali so bile usmrčene iz humanih razlogov, čas smrti posameznih živali, opis toksičnih učinkov in čas njihovega trajanja, reverzibilnost in izsledke nekroskopije.

Splošne smernice za razlago rezultatov za razvrščanje so v Prilogi 2.

3. POROČANJE

Poročilo o preskusu

Če je mogoče, poročilo o preskusu vključuje naslednje informacije:

Preskusne živali:

- vrsta/sev;

- mikrobiološki status živali, če je znan;

- število, starost in spol živali;

- izvor, nastanitveni pogoji, hrana, itd.;

- teža vsake živali na začetku preskusa, teža v tedenskih intervalih v naslednjem obdobju in teža ob zaključku preskusa.

Preskusni pogoji:

- utemeljitev izbire nosilca, če to ni voda;

- podrobnosti o dajanju preskusne snovi, vključno z volumni odmerkov in časom vnosa odmerka;

- podrobnosti o kvaliteti hrane in vode (vključno z vrsto/izvorom, izvorom vode);

- utemeljitev izbire začetnega odmerka.

Rezultati:

- tabelarni prikaz podatkov o odzivu po spolu in stopnji odmerka za vsako posamezno žival (t.j. živali, ki kažejo znake toksičnosti, vključno s smrtnostjo; narava, resnost in trajanje učinkov);

- čas nastopa znakov toksičnosti in morebitna reverzibilnost za vsako žival;

- izsledki nekroskopije in vsi histopatološki izsledki za vsako žival, če so na voljo.

Razprava o rezultatih.

Zaključki.

4. SKLICEVANJA

Ta metoda je skladna s smernicami za preskušanje OECD 423.

PRILOGA 1

PRESKUSNI POSTOPEK

1. Kakor je navedeno pod točko 1.4.2.3, naj bo začetni odmerek tisti, ki zelo verjetno povzroči smrtnost pri vsaj nekaterih tretiranih živalih. Pri izbiri začetnega odmerka se lahko upoštevajo naslednje informacije:

- podatki o fizikalno-kemijskih lastnostih;

- razmerje med strukturo in aktivnostjo;

- vsi podatki iz drugih preskusov toksičnosti; in

- predvidena uporaba preskusne snovi.

2. Ustrezne preskusne sheme iz te priloge za vsak začetni odmerek opisujejo postopek, ki mu je treba slediti. Glede na število humano usmrčenih ali poginulih živali je preskusni postopek, ki mu je treba slediti, označen s puščicami.

3. Če začetni odmerek, ki znaša 25 ali 200 mg/kg telesne teže, povzroči smrt samo ene živali nasprotnega spola, se dodatno preskušanje običajno ne izvede. Če pri drugih petih živalih niso opaženi znaki toksičnosti, pa je treba med avtopsijo upoštevati možnost, da smrtnosti ni povzročila snov v odmerku. V tem primeru je treba preskus nadaljevati z vnosom naslednjega večjega odmerka.

4. Ko pri odmerku 2000 mg/kg telesne teže pogine ena žival na spol, se pričakuje, da bo vrednost LD50 presegla 2000 mg/kg telesne teže. Ker pa je to mejni rezultat, je treba natančno opazovati odziv preostalih dveh živali vsakega spola; pojav jasnih in izrazitih znakov toksičnosti pri teh živalih seveda lahko vodi k razvrstitvi, ki ustreza vrednosti LD50 2000 mg/kg telesne teže ali manj, ali utemelji izvedbo nadaljnjega preskušanja pri isti stopnji odmerka.

5. Postopek predvideva možnost preskusa treh dodatnih točno določenih odmerkov (možnost 2). Ta možnost se lahko uporabi za izbiro alternativnega odmerka na določeni stopnji odločanja ali izvedbo dodatnega preskusa po zaključku aktualnega preskusa (možnost 1). Preskusni postopek za možnost 1 je označen s krepko tiskanimi puščicami, preskusni postopek za možnost 2 pa z navadnimi puščicami.

(a) Preskusni postopek pri začetnem odmerku 25 mg/kg telesne teže

+++++ TIFF +++++

(b) Preskusni postopek pri začetnem odmerku 200 mg/kg telesne teže

+++++ TIFF +++++

(c) Preskusni postopek pri začetnem odmerku 2000 mg/kg telesne teže

+++++ TIFF +++++

PRILOGA 2

RAZLAGA REZULTATOV NA PODLAGI PRESKUSA, KAKRŠNEGA PREDVIDEVA MOŽNOST 1

Siva okna pod oknom "prekinitev preskusa" v shemah te priloge predstavljajo mejne vrednosti za razvrstitev. V skladu s preskusnim postopkom, ki ga predvideva možnost 1, je treba ustrezni puščici slediti navzdol, dokler ne doseže zadevnega sivega okna.

(a) Razlaga rezultatov na podlagi preskusa, kakršnega predvideva možnost 1

Začetni odmerek: 25 mg/kg telesne teže

+++++ TIFF +++++

(b) Razlaga rezultatov na podlagi preskusa, kakršnega predvideva možnost 1

Začetni odmerek: 200 mg/kg telesne teže

+++++ TIFF +++++

(c) Razlaga rezultatov na podlagi preskusa, kakršnega predvideva možnost 1

Začetni odmerek: 2000 mg/kg telesne teže

+++++ TIFF +++++

"

--------------------------------------------------

PRILOGA IV C

"

B.6 SENZIBILIZACIJA KOŽE

1. METODA

1.1 Uvod

Opombe:

Občutljivost preskusov in njihova sposobnost, da odkrijejo morebitne senzibilizatorje človeške kože, veljata za pomembni v sistemu razvrščanja toksičnosti v zvezi z javnim zdravjem.

Ni ene same preskusne metode, ki bi lahko ustrezno opredelila vse snovi s potencialom za senzibilizacijo človeške kože in bila hkrati uporabna za vse snovi.

Pri izbiri preskusa je treba upoštevati dejavnike, kakršne so fizikalne lastnosti snovi, vključno z njeno sposobnostjo penetracije v kožo.

Razviti sta bili dve vrsti preskusov na morskih prašičkih: pomožni preskusi, pri katerih se alergično stanje potencira z raztopitvijo ali suspendiranjem preskusne snovi v kompletnem Freundovem adjuvantu (KFA), in preskusi, pri katerih se adjuvant ne uporablja.

Pomožni preskusi so običajno natančnejši pri napovedovanju verjetnega senzibilizacijskega učinka neke snovi na človeško kožo od tistih metod, ki ne uporabljajo kompletnega Freundovega adjuvanta, in so zato primernejši.

Med pomožnimi preskusi se pogosto uporablja maksimizacijski preskus na morskih prašičkih (GPMT). Čeprav se za odkrivanje potenciala snovi, da povzroči senzibilizacijo kože, lahko uporabijo mnoge druge metode, se GPMT šteje za najboljši pomožni preskus.

Za mnoge razrede kemikalij se preskusi, ki ne uporabljajo adjuvanta (med katerimi se največ uporablja Buehlerjev preskus), štejejo za manj občutljive.

V nekaterih primerih lahko obstajajo utemeljeni razlogi za izbiro Buehlerjevega preskusa, ki namesto intradermalne injekcije, uporabljene v preskusu maksimizacije na morskih prašičkih, vključuje lokalno nanašanje. Če se uporabi Buehlerjev preskus, mora biti ta izbira znanstveno utemeljena.

V tej metodi sta opisana maksimizacijski preskus na morskih prašičkih in Buehlerjev preskus. Uporabijo se lahko druge metode, če so dobro validirane in znanstveno utemeljene.

Če je rezultat priznanega predhodnega preskusa pozitiven, se lahko preskusna snov šteje za možnega povzročitelja senzibilizacije in ni potrebna izvedba dodatnega preskusa na morskih prašičkih. Če pa je rezultat takšnega preskusa negativen, je treba izvesti preskus na morskih prašičkih v skladu s postopkom, opisanim v tej preskusni metodi.

Glej tudi del B splošnega uvoda.

1.2 Opredelitve pojmov

Senzibilizacija kože: (alergijski kontaktni dermatitis) je imunološko pogojena kožna reakcija na neko snov. Pri človeku so značilne reakcije lahko srbenje, eritem, edem, papule, mehurji, gnojni mehurčki ali kombinacija teh reakcij. Pri drugih vrstah so reakcije lahko različne ter sta lahko vidna zgolj eritem in edem.

Indukcijska izpostavljenost: eksperimentalna izpostavljenost subjekta preskusni snovi za povzročitev hipersenzibilnega stanja.

Indukcijsko obdobje: najmanj enotedensko obdobje po indukcijski izpostavljenosti, v katerem se lahko razvije hipersenzibilno stanje.

Provokacijska izpostavljenost: eksperimentalna izpostavljenost predhodno tretiranega subjekta preskusni snovi, izvedena po indukcijskem obdobju, da bi se ugotovilo, če subjekt reagira hipersenzibilno.

1.3 Referenčne snovi

Vsakih šest mesecev je treba oceniti senzibilnost in zanesljivost uporabljene eksperimentalne tehnike z uporabo snovi, za katere se ve, da povzročajo blago do zmerno senzibilizacijo kože.

Če je preskus pravilno izveden, se lahko v pomožnem preskusu za blage/zmerne senzibilizatorje pričakuje vsaj 30 % reakcija in vsaj 15 % v neadjuvantnem preskusu.

Prednostno se uporabljajo naslednje snovi:

Števila CAS | Števila EINECS | Imena EINECS | Splošna imena |

101-86-0 | 202-983-3 | α-heksilcinamaldehid | α-heksilcinamaldehid |

149-30-4 | 205-736-8 | benzotiazol-2-tiol (merkaptobenzotiazol) | kaptaks |

94-07-7 | 202-303-5 | benzokain | nordkain |

Uporabijo se lahko druge kontrolne snovi, ki izpolnjujejo zgoraj navedena merila, če to upravičujejo okoliščine.

1.4 Princip preskusne metode

Na začetku so preskusne živali izpostavljene preskusni snovi z intradermalnimi injekcijami in/ali epidermalnim nanosom (indukcijska izpostavljenost). Po 10- do 14-dnevnem počivalnem obdobju (indukcijsko obdobje), v katerem se lahko razvije imunska reakcija, so živali izpostavljene provokacijskemu odmerku. Obseg in stopnja kožne reakcije na provokacijsko izpostavljenost pri preskusnih živalih se primerja z reakcijo, opaženo pri živalih kontrolne skupine, pri katerih med indukcijo posnemajo tretiranje in ki jih provokacijsko izpostavijo.

1.5 Opis preskusne metode

Če je odstranitev preskusne snovi nujna, se to doseže z uporabo vode ali ustreznega topila, ne da bi se spremenila obstoječa reakcija ali okrnil epidermis.

1.5.1 Maksimizacijski preskus na morskih prašičkih (GPMT)

1.5.1.1 Priprave

Zdravi mladi odrasli albino morski prašički so najmanj 5 dni pred preskusom aklimatizirani na razmere v laboratoriju. Pred preskusom so živali naključno razdeljene v skupine, ki bodo tretirane. Glede na preskusno metodo, ki je uporabljena, se dlaka lahko odvzame s striženjem, britjem ali kemično depilacijo. Pri tem je treba paziti, da koža ostane nepoškodovana. Živali je treba pred začetkom in na koncu preskusa stehtati.

1.5.1.2 Preskusni pogoji

1.5.1.2.1 Preskusne živali

Uporabljajo se albino morski prašički tistih sevov, ki se običajno uporabljajo v laboratorijih.

1.5.1.2.2 Število in spol

Uporabijo se lahko živali moškega in/ali ženskega spola. Samice morskih prašičkov morajo biti nuliparne in ne breje.

Skupina, ki bo tretirana, mora biti sestavljena iz najmanj 10, kontrolna skupina pa iz najmanj 5 živali. Če je prva skupina obsegala manj kakor 20 primerkov in druga manj kakor 10 ter ni mogoče sklepati, da je preskusna snov senzibilizator, se močno priporoča nadaljnje preskušanje na najmanj 20 preskusnih in 10 kontrolnih živali.

1.5.1.2.3 Velikost odmerkov

Koncentracija preskusne snovi, uporabljene za vsako indukcijsko izpostavljenost, naj bo sistemsko dobro tolerirana in naj ustreza najvišjemu odmerku, ki lahko povzroči blago do zmerno draženje kože. Koncentracija, ki se uporabi za provokacijsko izpostavljenost, naj ustreza najvišjemu odmerku, ki ne povzroči draženja. Če je potrebno, se lahko ustrezne koncentracije določijo s pilotno študijo, izvedeno na dveh ali treh živalih. V ta namen je priporočljiva uporaba živali, ki so bile tretirane s kompletnim Freundovim adjuvantom (KFA).

1.5.1.3 Postopek

1.5.1.3.1 Indukcija

Dan 0 – tretirana skupina

V ramenske dele, s katerih so bile odstranjene dlake, se vbrizgajo trije pari intradermalnih injekcij volumna 0,1 ml, in sicer vsaka injekcija iz para na svoji strani sredinske črte.

Injekcija 1: zmes 1:1 (v/v) KFA/voda ali fiziološka raztopina

Injekcija 2: preskusna snov v ustreznem nosilcu pri izbrani koncentraciji

Injekcija 3: preskusna snov pri izbrani koncentraciji, formulirana v zmesi 1:1 (v/v) KFA/voda ali fiziološka raztopina

V injekciji 3 so v vodi topne snovi raztopljene v vodni fazi, preden se zmešajo s KFA. Lipotopne ali netopne snovi so suspendirane v KFA, preden so kombinirane z vodno fazo. Končna koncentracija preskusne snovi mora biti enaka tisti, ki je bila uporabljena v injekciji 2.

Injekciji 1 in 2 se vbrizgata ena poleg druge in čim bliže glavi, medtem ko se injekcija 3 vbrizga proti repnemu delu preskusnega območja.

Dan 0 – kontrolna skupina

Na ista območja kakor pri tretiranih živali se dajo tri serije dveh intradermalnih injekcij volumna 0,1 ml.

Injekcija 1: zmes 1:1 (v/v) KFA/voda ali fiziološka raztopina

Injekcija 2: nerazredčeno sredstvo

Injekcija 3: 50 % m/v formulacija nosilca v zmesi 1:1 (v/v) KFA/voda ali fiziološka raztopina.

Dan 5–7 – tretirana skupina in kontrolna skupina

Približno štiriindvajset ur pred lokalnim indukcijskim nanosom, če snov ni senzibilizator kože, je preskusno območje po striženju na kratko in/ali britju tretirano z 0,5 ml 10 % natrijevega lauril sulfata v vazelinu zato, da bi bilo povzročeno lokalno draženje.

Dan 6–8 – tretirana skupina

S preskusnega območja se spet odstranijo dlake. Filtrirni papir (2 x 4 cm), povsem impregniran s preskusno snovjo v ustreznem nosilcu, se nanese na preskusno območje in je z okluzivnim povojem v stiku s kožo 48 ur. Izbira nosilca mora biti utemeljena. Trde snovi so fino uprašene in inkorporirane v ustrezni nosilec. Če je primerno, se tekočine lahko nanesejo nerazredčene.

Dan 6–8 – kontrolna skupina

S preskusnega območja se spet odstranijo dlake. Na preskusno območje se podobno nanese zgolj nosilec, ki je z okluzivnim povojem v stiku s kožo 48 ur.

1.5.1.3.2 Provokacija

Dan 20–22 – tretirana skupina in kontrolna skupina

Z bokov tretiranih in kontrolnih živali se odstrani dlaka. Na en bok živali se nanese obliž ali gaza, impregnirana s preskusno snovjo in, če je primerno, se tudi na drugi bok lahko nanese obliž ali gaza, impregnirana zgolj z nosilcem. Obliži so 24 ur v stiku s kožo z okluzivnim povojem.

1.5.1.3.3 Opazovanje in ocenjevanje: tretirana skupina in kontrolna skupina

- približno 21 ur po odstranitvi obliža je treba provokacijsko območje očistiti ter ostriči na kratko in/ali obriti in depilirati, če je treba;

- približno 3 ure pozneje (približno 48 ur od začetka provokacijskega nanosa) se opazuje in zabeleži reakcija kože glede na ocene, prikazane v dodatku;

- približno 24 ur po tem opazovanju se opravi in spet zabeleži drugo opazovanje (72 ur).

Spodbuja se hitro čekiranje preskusnih in kontrolnih živali.

Če je treba pojasniti rezultate, pridobljene v prvi provokaciji, je treba preučiti možnost izvedbe druge provokacije (t. j. ponovne provokacije), če je to primerno z novo kontrolno skupino, približno teden dni po prvi provokaciji. Ponovna provokacija se lahko izvede tudi s prvotno kontrolno skupino.

Vse kožne reakcije in kakršnikoli nenavadni izsledki, vključno s sistemskimi reakcijami, ki so posledica indukcije in postopkov provokacije, je treba opazovati in zabeležiti v skladu z ocenjevalno lestvico po Magnussonu/Kligmanu (glej dodatek). Za razjasnitev dvomljivih reakcij se lahko izvedejo drugi postopki, npr. histopatološka raziskava ali meritev debeline kožne gube.

1.5.2 Buehlerjev preskus

1.5.2.1 Priprave

Zdravi mladi odrasli albino morski prašički se najmanj 5 dni pred preskusom aklimatizirajo na razmere v laboratoriju. Pred preskusom so živali naključno razdeljene v skupine, ki bodo tretirane. Glede na uporabljeno preskusno metodo se dlaka lahko odstrani s striženjem, britjem ali morda s kemično depilacijo. Pri tem je treba paziti, da koža ostane nepoškodovana. Živali je treba pred začetkom in na koncu preskusa stehtati.

1.5.2.2 Preskusni pogoji

1.5.2.2.1 Preskusne živali

Uporabljajo se albino morski prašički tistih sevov, ki se običajno uporabljajo v laboratorijih.

1.5.2.2.2 Število in spol

Uporabijo se lahko živali moškega in/ali ženskega spola. Samice morskih prašičkov morajo biti nuliparne in ne breje.

Skupina, ki bo tretirana, mora biti sestavljena iz najmanj 20, kontrolna skupina pa iz najmanj 10 živali.

1.5.2.2.3 Velikost odmerkov

Koncentracija preskusne snovi, uporabljene za vsako indukcijsko izpostavljenost, mora ustrezati najvišjemu odmerku, ki lahko povzroči blago, vendar ne čezmerno draženje kože. Koncentracija, ki se uporabi za provokacijsko izpostavljenost, mora ustrezati najvišjemu odmerku, ki še ne povzroči draženja. Če je potrebno, se lahko ustrezne koncentracije določijo s pilotno študijo, ki se opravi na dveh ali treh živalih.

Pri preskusnih vodotopnih snoveh je najprimernejše, da se kot nosilec uporabi voda ali razredčena nedražilna raztopina surfaktanta. Za druge preskusne snovi so primernejše mešanice 80 % etanola in vode za indukcijo, za provokacijo pa aceton.

1.5.2.3 Postopek

1.5.2.3.1 Indukcija

Dan 0 – tretirana skupina

Z enega boka živali se odstrani dlaka (na kratko ostriže). Obliž, ki bo uporabljen v preskusu, je treba popolnoma impregnirati s preskusno snovjo v ustreznem nosilcu (izbira nosilca mora biti utemeljena; če je primerno, se tekočine lahko nanesejo nerazredčene).

Obliž je treba nanesti na preskusno območje in ga z okluzivnim obližem ali gazo ali ustreznim povojem držati v stiku s kožo 6 ur.

Obliž mora biti okluziven. Lahko se uporabi okrogla ali štirikotna vatna blazinica velikosti približno 4–6 cm². Za zagotovitev okluzije je primerna imobilizacija z ustrezno napravo za imobilizacijo. Če se uporabi povoj, utegne biti potrebna dodatna izpostavljenost.

Dan 0 – kontrolna skupina

Z enega boka živali je odstranjena dlaka (na kratko ostrižena). Na preskusno območje se podobno kakor pri tretirani skupini nanese zgolj nosilec. Obliž se nanese na preskusno območje tako, da je okluzivni obliž ali gaza ali ustrezen povoj v stiku s kožo 6 ur. Če se lahko dokaže, da posnemajoča kontrolna skupina ni potrebna, se lahko uporabi netretirana kontrolna skupina.

Dan 6–8 in 13–15 – tretirana in kontrolna skupina

Na dan 6–8 in spet na dan 13–15 se na istem preskusnem območju (po potrebi obritem) opravi enak nanos kakor na dan 0.

1.5.2.3.2 Provokacija

Dan 27–29 – tretirana in kontrolna skupina

Z netretiranega boka tretiranih in kontrolnih živali se odstrani dlaka (na kratko ostrižena). Na zadnji del netretiranega boka tretiranih in kontrolnih živali se nanese okluzivni obliž ali gaza, vsebujoča ustrezno količino preskusne snovi pri najvišji koncentraciji, ki še ne povzroča draženja.

Če je primerno, se okluzivni obliž ali gaza, ki vsebuje samo nosilec, nanese tudi na sprednji netretirani bok tretiranih in tudi kontrolnih živali. Obliže ali gaze je treba z ustreznim povojem držati v stiku s kožo 6 ur.

1.5.2.3.3 Opazovanje in ocenjevanje

- približno 21 ur po odstranitvi obliža je treba s provokacijskega območja odstraniti dlako;

- približno 3 ure pozneje (približno 30 ur po nanosu provokacijskega obliža) se opazujejo in zabeležijo reakcije kože glede na ocene, prikazane v dodatku;

- približno 24 ur po 30-urnem opazovanju (približno 54 ur po nanosu provokacijskega obliža) se kožne reakcije spet opazujejo in zabeležijo.

Spodbuja se hitro čekiranje preskusnih in kontrolnih živali.

Če je treba razjasniti rezultate, pridobljene v prvi provokaciji, je treba preučiti možnost za izvedbo druge provokacije (t. j. ponovne provokacije), kjer je primerno, z novo kontrolno skupino, približno teden dni po prvi provokaciji. Ponovna provokacija se lahko izvede tudi na prvotni kontrolni skupini.

Vse kožne reakcije in kakršne koli nenavadne izsledke, vključno s sistemskimi reakcijami, ki so posledica indukcije in postopkov provokacije, je treba opazovati in zabeležiti v skladu z ocenjevalno lestvico po Magnussonu/Kligmanu (glej dodatek). Za razjasnitev dvomljivih reakcij se lahko opravijo tudi drugi postopki, npr. histopatološka raziskava ali meritev debeline kožne gube.

2. PODATKI (GPMT IN BUEHLERJEV PRESKUS)

Vse podatke je treba povzeti v obliki tabele, ki za vsako posamezno žival prikazuje kožne reakcije pri posameznih opazovanjih.

3. POROČANJE (GPMT IN BUEHLERJEV PRESKUS)

Če je bila pred preskusom na morskem prašičku opravljena izločilna analiza, se mora predložiti opis ali napotitev k preskusu (npr. lokalna analiza limfnih vozlov (LLNA), preskus otekanja ušesa pri miših (MEST)), vključno s podrobnimi podatki o postopku, skupaj z rezultati, ki so bili pridobljeni s preskusnimi in referenčnimi snovmi.

Poročilo o preskusu (GPMT in Buehlerjev preskus)

Če je mogoče, poročilo o preskusu vključuje naslednje informacije:

Poskusne živali:

- sev uporabljenih morskih prašičkov;

- število, starost in spol živali;

- izvor, nastanitveni pogoji, hrana itd.;

- teža vsake živali na začetku preskusa.

Preskusni pogoji:

- tehnika priprave območja nanosa obliža;

- podrobnosti o uporabljenih materialih ter tehniki priprave in nanosa obliža;

- rezultat pilotne študije z izsledki o indukcijskih in provokacijskih koncentracijah, ki bodo uporabljene v preskusu;

- podrobnosti o pripravi preskusne snovi, nanosu in odstranitvi;

- utemeljitev izbire uporabljenega nosilca;

- koncentracije nosilca in preskusne snovi, uporabljene za indukcijsko in provokacijsko izpostavljenost, ter skupna količina snovi, ki je bila nanesena za indukcijo in provokacijo.

Rezultati:

- povzetek rezultatov zadnjega pregleda občutljivosti in zanesljivosti (glej 1.3), vključno z informacijami o snovi, koncentraciji in uporabljenem nosilcu;

- opazovanja, opravljena na posameznih živalih, vključno s sistemom ocenjevanja;

- podroben opis narave in stopnje opaženih učinkov;

- kakršnikoli histopatološki izsledki.

Razprava o rezultatih.

Zaključki.

4. SKLICEVANJE

Ta metoda je skladna s smernicami za preskušanje OECD 406.

Dodatek

TABELA:

Ocenjevalna lestvica po Magnussonu/Kligmanu za ocenjevanje reakcij pri provokacijskem preskusu z obliži

0 = | ni vidnih znakov |

1 = | diskreten ali neenakomeren eritem |

2 = | zmeren in zlit eritem |

3 = | intenziven eritem in oteklina |

"

--------------------------------------------------

PRILOGA IV D

B.7 TOKSIČNOST PRI PONAVLJAJOČIH SE ODMERKIH (28 DNI) PO ORALNI POTI

1. METODA

1.1 Uvod

Glej del B splošnega uvoda.

1.2 Opredelitev pojmov

Glej del B splošnega uvoda.

1.3 Princip preskusne metode

Preskusna snov se daje v zaporednih dnevnih odmerkih oralno več skupinam poskusnih živali, in sicer ena velikost odmerka na skupino za obdobje 28 dni. V obdobju dajanja se živali vsak dan pozorno opazujejo zaradi znakov toksičnosti. Na živalih, ki med preskusom poginejo ali so usmrčene, se opravi nekropsija, ob koncu preskusa pa se tudi preživele živali usmrtijo in se opravi nekropsija.

Metoda daje večji poudarek nevrološkim učinkom kakor specifičnim ocenjevalnim parametrom in poudarja potrebo po pozornem kliničnem opazovanju živali za pridobitev čim več informacij. Cilj te metode je opredeliti kemikalije z nevrotoksičnim potencialom, kar lahko zahteva dodatno podrobno raziskavo. Poleg tega lahko metoda pokaže imunološke učinke in toksičnost razmnoževalnih organov.

1.4 Opis preskusne metode

1.4.1 Priprave

Zdrave mlade odrasle živali so naključno razdeljene v kontrolno skupino in skupino, ki bo tretirana. Kletke je treba razporediti tako, da se kar najbolj zmanjšajo morebitni učinki, ki nastanejo zaradi razporeditve kletk. Živali se jasno identificirajo in nastanijo v kletkah vsaj 5 dni pred začetkom študije, tako da se lahko prilagodijo razmeram v laboratoriju.

Preskusna snov se vnese z gastrično sondo ali s hrano ali pitno vodo. Metoda oralnega vnosa je odvisna od namena študije in fizikalnih/kemijskih lastnosti snovi.

Po potrebi se preskusna snov raztopi ali suspendira v ustreznem nosilcu. Priporoča se, da se, če je mogoče, najprej preuči možnost uporabe vodne raztopine/suspenzije, nato pa uporabe raztopine/emulzije v olju (npr. koruznem olju), kot tretja izbira pa uporaba možne raztopine v drugih nosilcih. Pri nevodnih nosilcih morajo biti toksične lastnosti nosilca znane. Treba je določiti stabilnost preskusne snovi v nosilcu.

1.4.2 Preskusni pogoji

1.4.2.1 Preskusne živali

Najprimernejša vrsta glodalcev so podgane, čeprav se lahko uporabijo tudi druge vrste glodalcev. Uporabiti je treba mlade, zdrave odrasle živali sevov, ki se običajno uporabljajo v laboratorijih. Samice morajo biti nuliparne in ne breje. Odmerke je treba začeti vnašati čim prej po zaključku laktacije in vsekakor preden živali dopolnijo devet tednov.

Na začetku študije mora biti sprememba teže živali minimalna in ne sme presegati ± 20 % povprečne teže za vsak spol.

Če je bila pred dolgoročno študijo izvedena predhodna študija s ponavljajočim se odmerkom po oralni poti, je po možnosti v obeh študijah treba uporabiti živali istega seva in istega izvora.

1.4.2.2 Število in spol

Za vsako stopnjo odmerka se mora uporabiti najmanj 10 živali (pet samic in pet samcev). Če se načrtujejo usmrtitve živali med študijo, je treba skupno število povečati za število živali, predvidenih za usmrtitev pred zaključkom študije.

Poleg tega se satelitska skupina 10 živali (pet živali na spol) lahko tretira z veliko količino odmerka 28 dni in se naslednjih 14 dni opazuje za ugotavljanje reverzibilnosti, trajanja učinka ali zapoznelega nastopa toksičnih učinkov. Prav tako se uporabi satelitska skupina 10 kontrolnih živali (pet živali na spol).

1.4.2.3 Velikost odmerkov

Običajno je treba uporabiti najmanj tri preskusne skupine in eno kontrolno skupino. Razen pri tretiranju s preskusno snovjo je treba z živalmi v kontrolni skupini ravnati enako kakor z živalmi preskusne skupine. Če je pri vnosu preskusne snovi uporabljen nosilec, naj enak nosilec v največji uporabljeni količini prejme tudi kontrolna skupina.

Če se na podlagi ocene drugih podatkov ne pričakujejo nobeni učinki pri odmerku 1000 mg/kg telesne teže/dan, se lahko opravi mejni preskus. Če ne obstajajo ustrezni podatki, se lahko opravi študija ugotavljanja količinske meje, s katero se določijo odmerki za uporabo.

Pri izbiri velikosti odmerkov je treba upoštevati vse obstoječe podatke o toksičnosti in (toksiko-) kinetiki, ki so na razpolago za preskusno snov ali povezane snovi. Izbrati je treba največjo velikost odmerka, ki povzroči toksične učinke, vendar ne smrti ali hudega trpljenja. Nato je treba izbrati padajoče zaporedje velikosti odmerkov, da se določita vsak odziv, ki je pogojen z odmerkom, in koncentracija brez opaznih negativnih vplivov (NOAEL). Za določanje padajočih velikosti odmerkov je pogosto najbolje uporabiti dva- do štirikratne intervale, pogosto pa je primernejše, da se namesto zelo velikih intervalov (npr. več kakor faktor 10) med odmerki doda četrta preskusna skupina.

Če se snovi dajejo s hrano ali pitno vodo, je pomembno zagotoviti, da količine potrebne preskusne snovi ne spremenijo normalnega prehranjevalnega ali vodnega ravnotežja. Če se preskusna snov daje s hrano, se lahko uporabi bodisi stalna koncentracija v hrani (ppm) bodisi stalna velikost odmerka glede na telesno težo živali; opredeliti se mora uporabljena alternativa. Če je bila snov dana z gastrično sondo, mora biti odmerek vnesen vsak dan ob približno istem času in prilagojen tako, da se ohrani stalna velikost odmerka glede na telesno težo živali.

Če je bila pred dolgoročno študijo izvedena predhodna oralna študija s ponavljajočim se odmerkom, je treba v obeh študijah uporabiti podobno hrano.

1.4.2.4 Mejni preskus

Če preskus, izveden v skladu z opisanimi postopki za to študijo in pri velikosti odmerka, ki znaša najmanj 1000 mg/kg telesne teže/dan, ali pri vnosu s hrano ali vodo pri enakovredni koncentraciji hrane ali pitne vode (na podlagi telesne teže), ne ustvari opaznih toksičnih učinkov in če se na podlagi podatkov o strukturno povezanih snoveh toksičnost ne pričakuje, se popolna študija z uporabo treh velikosti odmerkov morda ne šteje za potrebno. Mejni preskus se ne uporabi samo, če človeška izpostavljenost kaže na potrebo po uporabi večjega odmerka.

1.4.2.5 Obdobje opazovanja

Obdobje opazovanja naj traja 28 dni. Živali iz satelitske skupine, ki so bile izbrane za dodatna opazovanja, naj bodo nadzorovane najmanj nadaljnjih 14 dni brez kakršnega koli tretiranja, da bi odkrili zapozneli pojav, obstojnost ali izginotje toksičnih učinkov.

1.4.3 Postopek

Preskusna snov se živalim daje dnevno, sedem dni na teden za obdobje 28 dni; uporaba petdnevnega režima odmerjanja na teden mora biti ustrezno utemeljena. Če se preskusna snov živalim intubira, je to treba izvesti z enkratnim odmerkom z gastrično sondo ali ustrezno intubacijsko cevko. Največji volumen tekočine, ki se lahko vnese naenkrat, je odvisen od velikosti poskusne živali. Volumen ne sme presegati 1 ml/100 g telesne teže, razen pri vodnih raztopinah, pri katerih se lahko uporabi 2 ml/100 g telesne teže. Razen pri dražilnih ali korozivnih snoveh, ki pri višjih koncentracijah običajno povzročijo jasne poslabšane učinke, je treba spremenljivost preskusnih volumnov kar najbolj zmanjšati s prilagoditvijo koncentracije, da bi se tako ohranil stalni volumen pri vseh velikostih odmerkov.

1.4.3.1 Splošna opazovanja

Splošna klinična opazovanja je treba opraviti vsaj enkrat na dan, po možnosti vsak dan ob istem času in ob upoštevanju obdobja največje intenzivnosti pričakovanih učinkov po vnosu odmerka. Zabeležiti je treba podatke o zdravstvenem stanju živali. Živali je treba vsaj dvakrat na dan opazovati za določitev obolevnosti in smrtnosti. Umirajoče živali ali živali, ki kažejo znake hudega trpljenja ali bolečine, je treba nemudoma po ugotovitvi tega izključiti iz študije, jih humano usmrtiti in opraviti nekropsijo.

Enkrat pred prvo izpostavljenostjo (za omogočanje primerjav na istem subjektu) in nato najmanj enkrat na teden je treba opraviti podrobna klinična opazovanja vseh živali. V ta namen je treba živali vzeti iz kletk, v katerih bivajo, jih zbrati v standardnem ograjenem prostoru in po možnosti vsakokrat opazovati ob istem času. Opazovanja je treba pazljivo zabeležiti, po možnosti z uporabo sistemov točkovanja, ki jih jasno določi zadevni preskusni laboratorij. Storiti je treba vse potrebno za kar največje zmanjšanje spreminjanja preskusnih pogojev in za zagotovitev, da opazovanja po možnosti opravijo opazovalci, ki s tretiranjem niso seznanjeni. Pozornost je med drugim treba posvetiti vsem spremembam na koži, dlaki, očeh, na sluznici, pojavu sekrecije in ekskrecije in posamezne aktivnosti (npr. solzenje, piloerekcija, velikost zenice, nenavaden ritem dihanja). Prav tako je treba zabeležiti spremembe obnašanja, drže in odziva na tretiranje, pa tudi pojav kloničnih ali toničnih krčev, stereotipov (npr. čezmerno negovanje, nenehno vrtenje v krogih) ali nenavadnega obnašanja (npr. samopohaba, vzvratna hoja).

V četrtem tednu izpostavljenosti je treba nadaljevati ocenjevanje senzorične reaktivnosti na različne vrste dražljajev (npr. slušni, vizualni in proprioceptivni dražljaji), moči prijema in motorične aktivnosti. Dodatne podrobnosti o postopkih, ki se lahko uporabijo, so navedene v literaturi (glej del B splošnega uvoda).

Funkcionalna opazovanja, predvidena za četrti teden izpostavljenosti, se lahko izpustijo, če je študija izvedena kot predhodna za nadaljnjo študijo subkroničnosti (90 dni). V tem primeru je treba funkcionalna opazovanja vključiti v to dopolnilno študijo. Po drugi strani pa se lahko podatki o funkcionalnih opazovanjih, pridobljeni med študijo s ponavljajočimi se odmerki, izkažejo za koristne pri izbiranju velikosti odmerkov za nadaljnjo študijo subkroničnosti.

Izjemoma se lahko funkcionalna opazovanja opustijo tudi za skupine, ki sicer kažejo znake toksičnosti v takšnem obsegu, da bi to lahko močno oviralo izvedbo funkcionalnega preskusa.

1.4.3.2 Telesna teža in poraba hrane/vode

Vse živali je treba stehtati najmanj enkrat na teden. Vsaj enkrat na teden je treba izmeriti obseg porabe hrane in vode. Če se preskusna snov daje s pitno vodo, je treba najmanj enkrat na teden izmeriti količino porabe vode.

1.4.3.3 Hematologija

Na koncu preskusnega obdobja je treba opraviti naslednje hematološke preiskave: hematokrit, koncentracija hemoglobina, število eritrocitov, skupno število levkocitov in diferencialna slika levkocitov, število krvnih ploščic in čas/zmožnost koagulacije.

Vzorce krvi je treba odvzeti iz določenega območja neposredno pred ali med postopkom usmrtitve živali in jih pod ustreznimi pogoji shraniti.

1.4.3.4 Klinična biokemija

Klinične biokemične preiskave, katerih cilj je preučevanje glavnih toksičnih učinkov na tkiva ter zlasti ledvice in jetra, je treba opraviti na vzorcih krvi, ki so bili živalim odvzeti neposredno pred ali med postopkom njihove usmrtitve (razen živali, ki so bile najdene umirajoče in/ali usmrčene med preskusom). Priporoča se, da se živali pred odvzemom vzorcev krvi čez noč postijo [1]. Preiskave plazme ali seruma morajo vključevati natrij, kalij, glukozo, skupni holesterol, ureo, kreatinin, skupne beljakovine in albumin, najmanj dva encima, ki sta kazalca hepatoceličnih učinkov (kot alanin-aminotransferaza, aspartat-aminotransferaza, alkalna fosfataza, gama-glutamil transpeptidaza in sorbitolna dehidrogenaza). Meritve dodatnih encimov (hepatskega ali drugega izvora) in žolčnih kislin včasih lahko dajo koristne informacije.

Po izbiri se lahko v zadnjem tednu študije izvedejo naslednje določene preiskave urina z uporabo časovno določenega zbiranja volumna urina: videz, volumen, ozmotsko neravnovesje ali specifična teža, pH, beljakovine, glukoza in kri/krvne celice.

Poleg tega se priporoča izvedba študij za preiskovanje serumskih znakov splošnih poškodb tkiva. Druge določitve, ki morajo biti izvedene, če obstaja možnost ali sum, da bodo znane lastnosti preskusne snovi vplivale na povezane metabolične profile, vključujejo kalcij, fosfat, trigliceride, posebne hormone, methemoglobin in holinesterazo. Le-ti morajo biti določeni za nekatere razrede snovi ali za posamezne primere.

Na splošno je najprimernejši fleksibilni prijem, ki je odvisen od vrste in opaženega in/ali pričakovanega učinka preskusne snovi.

Če so osnovni zgodovinski podatki neustrezni, je primerno, da se hematološki in klinični biokemični parametri določijo pred začetkom dajanja odmerkov.

1.4.3.5 Makroskopska nekropsija

Na vseh živalih iz študije se opravi kompletna makroskopska nekropsija, ki vključuje skrbno preiskavo zunanje telesne površine, vseh odprtin, lobanjske, torakalne in trebušne votline ter njihove vsebine. Jetra, ledvice, nadledvične žleze, moda, epididimide, priželjc, vranico, možgane in srce vseh živali je treba ustrezno odstraniti s sosednjih tkiv in čim prej stehtati, da se ognemo dehidraciji.

Naslednja tkiva je treba shraniti v fiksacijskem sredstvu, ki je najprimernejše za vrsto tkiva in predvideno poznejšo histopatološko preiskavo: vsa tkiva z makroskopskimi poškodbami, možgane (reprezentativne regije, ki vključujejo velike možgane, male možgane in most), hrbtenjačo, trebuh, tanko in debelo črevo (vključno s Peyerjevim skupkom limfnega tkiva), jetra, ledvice, nadledvične žleze, vranico, srce, priželjc, žlezo ščitnico, trahejo in pljuča (shranjeni z napihavanjem fiksativa in nato s potopitvijo), spolne žleze, dodatne spolne organe (npr. maternico, prostato), sečni mehur, limfne vozle (po možnosti en limfni vozel na poti vnosa in en limfni vozel, ki je oddaljen od poti vnosa in pokriva sistemske učinke), periferno živčevje (ishiatični ali tibialni živec), po možnosti v neposredni bližini mišice, in del kostnega mozga (ali kot alternativa, sveže prepariran aspirat kostnega mozga). Na podlagi kliničnih in drugih izsledkov se lahko pokaže potreba po preiskavah dodatnega tkiva. Poleg tega je treba shraniti vse organe, ki se štejejo za verjetne ciljne organe glede na znane lastnosti preskusne snovi.

1.4.3.6 Histopatološka preiskava

Celotno histopatološko preiskavo je treba opraviti na shranjenih organih in tkivih vseh živali v kontrolni skupini ter živalih v skupini, tretirani z visokim odmerkom. Te preiskave je treba razširiti na živali iz skupin, tretiranih z različnimi odmerki, če se v skupini, tretirani z visokim odmerkom, opazijo spremembe, ki jih je povzročilo tretiranje.

Preiščejo se vse makroskopske poškodbe.

Če se uporabi satelitska skupina, je treba izvesti histopatološko preiskavo na tkivih in organih, na katerih so bili v tretiranih skupinah opaženi učinki.

2. PODATKI

Priskrbeti je treba podatke za vsako posamezno žival. Poleg tega je treba vse podatke povzeti v obliki tabele, ki za vsako preskusno skupino prikazuje število živali na začetku preskusa, število živali, ki so bile med preskusom najdene mrtve ali so bile usmrčene iz humanih razlogov, in čas vsake smrti ali humane usmrtitve, število živali, ki kažejo znake toksičnosti, opis opaženih toksičnih učinkov, vključno s časom njihovega nastopa, trajanjem in resnostjo vseh toksičnih učinkov, število živali, ki kažejo poškodbe, vrsto poškodb in odstotek živali, ki kažejo posamezno vrsto poškodb.

Če je mogoče, je številčne rezultate treba ocenjevati na podlagi primerne in splošno priznane statistične metode. Statistične metode je treba izbrati med izdelavo študije.

3. POROČANJE

Poročilo o preskusu

Če je mogoče, poročilo o preskusu vključuje naslednje informacije:

Poskusne živali:

- uporabljena vrsta/sev;

- število, starost in spol živali;

- izvor, nastanitvene razmere, hrana itd.;

- teža vsake živali na začetku preskusa, v tedenskih intervalih v naslednjem obdobju in ob zaključku preskusa.

Preskusni pogoji:

- utemeljitev izbire uporabljenega nosilca, če to ni voda;

- utemeljitev izbire velikosti odmerka;

- podrobni podatki o sestavi preskusne snovi in pripravi hrane, doseženi koncentraciji, stabilnosti in homogenosti pripravka;

- podrobni podatki o dajanju preskusne snovi;

- če je primerno, sprememba koncentracije snovi, vnesene s hrano ali vodo (ppm), v dejanski odmerek (mg/kg telesne teže/dan);

- podrobni podatki o kvaliteti hrane in vode.

Rezultati:

- telesna teža/spremembe telesne teže;

- poraba hrane in, če je primerno, poraba vode;

- podatki o toksičnem odzivu po spolu in velikosti odmerka, vključno z znaki toksičnosti;

- narava, resnost in trajanje kliničnih opazovanj (reverzibilnih ali nereverzibilnih);

- ocena senzorične aktivnosti, moči prijema in motorične aktivnosti;

- hematološki preskusi z ustreznimi referenčnimi vrednostmi;

- klinični biokemični preskusi z ustreznimi referenčnimi vrednostmi;

- telesna teža ob usmrtitvi in podatki o teži organov;

- izsledki nekropsije;

- podroben opis vseh histopatoloških izsledkov;

- podatki o absorpciji, če so na razpolago;

- statistična obdelava rezultatov, kjer je to primerno.

Razprava o rezultatih.

Zaključki.

4. SKLICEVANJE

Ta metoda je skladna s smernicami za preskušanje OECD 407.

[1] Za določeno število preiskav seruma in plazme, zlasti za določanje glukoze, se priporoča, da se živali čez noč postijo. Glavni razlog za to je, da bi povečana variabilnost, ki bi se pojavila, če se žival ne bi postila, lahko pripeljala do prikritja manj opaznih učinkov in do težav pri razlagi. Po drugi strani pa lahko post čez noč spremeni splošni metabolizem živali in zlasti pri študijah prehranjevanja ovira dnevno izpostavljenost preskusni snovi. Če je bil izbran post, je treba klinične biokemične preiskave izvesti po zaključku funkcionalnih opazovanj v četrtem tednu študije.

--------------------------------------------------

PRILOGA IV E

"

B.37 ZAPOZNELA NEVROTOKSIČNOST ORGANOFOSFORNIH SNOVI PO AKUTNI IZPOSTAVLJENOSTI

1. METODA

1.1 Uvod

Pri ocenjevanju in vrednotenju toksičnih učinkov snovi je pomembno upoštevati potencial nekaterih razredov snovi, da povzročijo posebne vrste nevrotoksičnosti, ki se morda ne bi odkrile v drugih študijah toksičnosti. Nekatere organofosforne snovi, za katere je bilo ugotovljeno, da povzročajo zapoznelo nevrotoksičnost, bi morale biti predmet takšnega ocenjevanja.

Izločilne študije in vitro bi se lahko uporabile pri določanju tistih snovi, ki lahko povzročijo zapoznelo polinevropatijo; vendar negativni izsledki študij in vitro ne zagotavljajo dokazov, da preskusna snov ni nevrotoksikant.

Glej del B splošnega uvoda.

1.2 Opredelitev pojmov

Organofosforne snovi vključujejo nenabite organofosforne estre, tioestre ali anhidride organofosfornih, organofosfoničnih ali organofosforamidnih kislin ali sorodnih fosforotiotskih, fosfonotiotskih ali fosforotioamidnih kislin ali druge snovi, ki lahko povzročijo zapoznelo nevrotoksičnost, ki je včasih opažena v tem razredu snovi.

Zapoznela nevrotoksičnost je sindrom, povezan z dolgotrajnim zapoznelim nastopom ataksije, distalnimi aksonopatijami hrbtenjače in perifernega živčevja ter z inhibicijo in staranjem nevropatske ciljne esteraze (NTE) v živčnem tkivu.

1.3 Referenčne snovi

Referenčna snov se lahko preskuša na pozitivni kontrolni skupini kot dokaz, da se tudi v preskusnih laboratorijskih okoliščinah odziv preskušane vrste ni bistveno spremenil.

Primer široko uporabljenega nevrotoksikanta je tri-o-tolil fosfat (CAS 78-30-8, EINECS 201-103-5, nomenklatura CAS: tris(2-metilfenil)ester fosforjeve kisline), znan tudi kot tris-o-krezilfosfat.

1.4 Princip preskusne metode

Preskusna snov se daje oralno in z enkratnim odmerkom domačim kokošim, ki so bile zaščitene pred akutnimi holinergičnimi učinki, če je to primerno. Živali se opazujejo 21 dni za morebitne vedenjske nepravilnosti, ataksijo in paralizo. Navadno se od 24 do 48 ur po vnosu odmerka izvedejo biokemične analize, zlasti inhibicija nevropatske ciljne erastaze (NTE), na naključno izbranih kokoših iz vsake skupine. Enaindvajset dni po izpostavljenosti se usmrtijo druge kokoši in se izvede histopatološka preiskava izbranega živčnega tkiva.

1.5 Opis preskusne metode

1.5.1 Priprave

Zdrave, mlade, odrasle kokoši, ki ne kažejo znakov virusnih obolenj, niso tretirane s snovmi, ki bi vplivala na rezultat preskusa, in ki ne kažejo znakov nenavadnega obnašanja, je treba naključno razvrstiti v skupino, ki bo tretirana, in v kontrolno skupino ter jih aklimatizirati na laboratorijske razmere najmanj 5 dni pred začetkom študije.

Treba je uporabiti kletke ali ograde, ki so dovolj velike, da omogočajo prosto gibanje kokoši in olajšajo opazovanje obnašanja živali.

Običajno se preskusna snov vnaša po oralni poti z gastrično sondo, želatinastimi kapsulami ali primerljivo metodo. Tekočine se lahko vnašajo nerazredčene ali raztopljene v ustreznem nosilcu, kakršno je na primer koruzno olje; če je mogoče, je treba trdne snovi raztopiti, ker se utegne zgoditi, da se veliki odmerki v želatinastih kapsulah ne absorbirajo učinkovito. Pri nevodnih nosilcih je treba poznati njihove toksične značilnosti ali jih v nasprotnem določiti pred začetkom preskusa.

1.5.2 Preskusni pogoji

1.5.2.1 Poskusne živali

Priporoča se uporaba mladih odraslih domačih kokoši nesnic (Gallus gallus domesticus), ki so stare od 8 do 12 mesecev. Uporabiti je treba kokoši pasem standardne velikosti in sevov, običajno vzrejene v okoliščinah, ki kokošim dovoljujejo svobodno gibanje.

1.5.2.2 Število in spol

Poleg skupine, ki bo tretirana, je treba uporabiti kontrolno skupino, ki ji je vnesen zgolj nosilec, in tudi pozitivno kontrolno skupino. Kontrolno skupino, ki ji je vnesen zgolj nosilec, je treba tretirati enako kakor skupino, ki bo tretirana, razen da se živalim ne da preskusna snov.

Vsaka skupina ptic mora biti sestavljena iz zadosti kokoši, tako da se lahko usmrti najmanj šest ptic za biokemične analize (tri na vsakega od obeh časovnih terminov opazovanja) in da lahko šest primerkov preživi 21-dnevno obdobje opazovanja za patološke preiskave.

Pozitivna kontrolna skupina se lahko preskuša hkrati, lahko pa je tudi nedavno preskušena kontrolna skupina. Sestavljena naj bo iz vsaj šestih kokoši, tretiranih z znanim zapoznelim nevrotoksikantom, od katerih so tri namenjene za biokemične analize in tri za patološke preiskave. Priporoča se redno dopolnjevanje predhodnih podatkov. Nove pozitivne kontrolne podatke je treba razviti vsakokrat, ko laboratorij, ki izvaja preskuse, spremeni katerega od bistvenih elementov preskusa (npr. sev, vrsta krme, nastanitvene razmere).

1.5.2.3 Velikosti odmerkov

Za določitev velikosti odmerka, ki se bo uporabil v glavni študiji, je treba izvesti predhodno študijo z ustreznim številom kokoši in skupin velikosti odmerkov. V tej predhodni študiji, namenjeni določitvi primernega odmerka za glavno študijo, se praviloma pričakuje nekaj smrtnosti. Da bi se izognili smrti zaradi akutnih holinergičnih učinkov, se lahko uporabi atropin ali kakšno drugo zaščitno sredstvo, za katero je znano, da ne moti zapoznelih nevrotoksičnih odzivov. Za določitev največjega nesmrtonosnega odmerka preskusne snovi so na voljo številne metode (glej metodo B.1 bis). Pri izbiri odmerka so lahko v veliko pomoč podatki iz predhodnih študij na kokoših ali druge toksikološke informacije.

Odmerek preskusne snovi v glavni študiji naj bo čim večji, pri čemer je treba upoštevati rezultate predhodne študije za izbiro odmerka in najvišji mejni odmerek 2000 mg/kg telesne teže. Ne glede na število smrtnih primerov, ki se lahko pojavijo, pa naj bi preživelo zadosti živali za izvedbo biokemičnih analiz (šest) in histoloških preiskav (šest) do 21. dneva preskusa. Za preprečitev smrti zaradi akutnih holinergičnih učinkov je treba uporabiti atropin ali kakšno drugo zaščitno sredstvo, ki ne moti zapoznelih nevrotoksičnih odzivov.

1.5.2.4 Mejni preskus

Če preskus, izveden v skladu z opisanimi postopki za to študijo in pri stopnji odmerka, ki znaša najmanj 2000 mg/kg telesne teže/dan, ne povzroči nobenih očitnih toksičnih učinkov in če podatki o strukturno sorodnih snoveh ne kažejo na pojav toksičnosti, študije z uporabo večjega odmerka ni treba izvesti. Mejni preskus se ne uporabi samo, če človeška izpostavljenost kaže na potrebo po uporabi večjega odmerka.

1.5.2.5 Obdobje opazovanja

Obdobje opazovanja traja 21 dni.

1.5.3 Postopek

Potem ko se živalim da zaščitno sredstvo za preprečevanje smrti zaradi akutnih holinergičnih učinkov, se preskusna snov vnese v enkratnem odmerku.

1.5.3.1 Splošno opazovanje

Opazovanje je treba začeti takoj po izpostavitvi. Vse kokoši je treba večkrat na dan natančno opazovati prva 2 dni preskusa in nato najmanj enkrat na dan v obdobju 21 dni ali do njihove predvidene usmrtitve. Zabeležiti je treba vse znake toksičnosti, vključno s časom nastopa, vrsto, resnostjo in trajanjem vedenjskih nepravilnosti. Za ataksijo je treba uporabiti stopenjsko ocenjevalno lestvico, sestavljeno iz najmanj štirih stopenj, zabeležiti pa je treba tudi primere paralize. Najmanj dvakrat na teden je treba kokoši, ki so bile izbrane za patološka opazovanja, izpustiti iz kletk in jih pripraviti k prisilni motorični dejavnosti, kakršno je denimo plezanje po lestvi, da bi bilo olajšano opazovanje minimalnih toksičnih učinkov. Umirajoče živali ali živali, ki kažejo znake hudega trpljenja in hude bolečine, je treba odstraniti, humano usmrtiti in opraviti nekropsijo.

1.5.3.2 Telesna teža

Vse živali je treba stehtati neposredno pred dajanjem preskusne snovi in nato najmanj enkrat na teden.

1.5.3.3 Biokemija

V nekaj dneh po vnosu odmerka je treba usmrtiti šest naključno izbranih kokoši iz vsake tretirane skupine in kontrolne skupine, ki ji je vnesen zgolj nosilec, ter tri kokoši iz pozitivne kontrolne skupine (če je ta skupina preskušena hkrati), možgane in ledveno hrbtenjačo pa je treba pripraviti in analizirati za določitev morebitne inhibicije nevropatske ciljne erastaze. Poleg tega je lahko za določitev inhibicije nevropatske ciljne erastaze koristno pripraviti in analizirati ishiatično živčno tkivo. Običajno se usmrtijo po tri ptice iz kontrolne skupine in vsake tretirane skupine po 24 urah in tri po 48 urah, medtem ko se tri kokoši iz pozitivnih kontrolnih skupin usmrtijo po 24 urah. Če opazovanja kliničnih znakov intoksikacije (ki se lahko oceni z opazovanjem časa nastopa holinergičnih znakov) kažejo, da bo odstranitev toksičnega sredstva potekala zelo počasi, utegne biti primernejše, da se odvzame tkivo pri treh pticah v obeh terminih v obdobju od 24 ur in do najpozneje 72 ur po vnosu odmerka.

Na teh vzorcih se po potrebi lahko opravijo analize acetilholinesteraze (AChE). Vendar se invivo lahko AchE spontano reaktivira, kar lahko vodi k podcenjevanju zmožnosti neke snovi kot inhibitorja AChE.

1.5.3.4 Makroskopska nekropsija

Makroskopska nekropsija vseh živali (usmrčenih po načrtu in ubitih zaradi umiranja) naj vključuje opazovanje videza možganov in hrbtenjače.

1.5.3.5 Histopatološka preiskava

Živčno tkivo živali, preživelih obdobje opazovanja, in ki ni bilo uporabljeno za biokemične študije, se uporabi za mikroskopske preiskave. Tkivo je treba fiksirati in situ z uporabo tehnik škropitve. Opravi se odvzem tkiva na malih možganih (srednja longitudinalna stopnja), podaljšani hrbtenjači, hrbtenjači in perifernem živčevju. Vzorce hrbtenjače je treba odvzeti z zgornjega vratnega predela, srednjega prsnega in ledveno-križnega predela. Odvzamejo se tudi vzorci distalnega dela tibialnega živca in njegovih vej v smeri dvoglave mečne mišice in shiatičnega živca. Vzorce tkiva je treba obarvati z ustreznimi mielinskimi in specifičnimi aksonskimi barvili.

2. PODATKI

Če so rezultati na končnih točkah, izbranih v tej metodi (biokemija, histopatologija in opazovanje obnašanja), negativni, dodatno preskušanje zapoznele nevrotoksičnosti navadno ni potrebno. Dvoumni in nedokončni rezultati za te končne točke lahko zahtevajo dodatno ocenjevanje.

Priskrbeti je treba podatke za vsako posamezno žival. Poleg tega je treba vse podatke povzeti v obliki tabele, ki za vsako preskusno skupino prikazuje število živali na začetku preskusa, število živali, ki kažejo poškodbe, vedenjske spremembe in biokemične učinke, vrste in resnost teh poškodb ali učinkov in odstotek živali, ki jih je prizadela posamezna vrsta in resnost poškodbe ali učinka.

Izsledke te študije je treba ocenjevati glede na pojav, resnost in korelacije vedenjskih, biokemičnih in histopatoloških učinkov ter katerih koli drugih opaženih učinkov v tretiranih in kontrolnih skupinah.

Številčne rezultate je treba ocenjevati na podlagi primernih in splošno priznanih statističnih metod. Uporabljene statistične metode je treba izbrati pri izdelavi študije.

3. POROČANJE

Poročilo o preskusu

Če je mogoče, poročilo o preskusu vključuje naslednje informacije:

Poskusne živali:

- uporabljen sev;

- število in starost živali;

- izvor, nastanitveni pogoji, itd.;

- teža vsake živali na začetku preskusa.

Preskusni pogoji:

- podrobni podatki o pripravi preskusne snovi, stabilnosti in homogenosti, kjer je primerno;

- utemeljitev izbire uporabljenega nosilca;

- podrobni podatki o dajanju preskusne snovi;

- podrobni podatki o kvaliteti hrane in vode;

- utemeljitev izbire odmerka;

- opis danih odmerkov, vključno s podrobnimi podatki o nosilcu in volumnu ter fizikalni obliki dane snovi;

- vrsta zaščitnega sredstva in podrobni podatki o njegovem vnosu.

Rezultati:

- podatki o telesni teži;

- podatki o toksičnem odzivu glede na skupino, vključno s smrtnostjo;

- narava, resnost in trajanje kliničnih opazovanj (reverzibilnih ali nereverzibilnih);

- natančen opis biokemičnih metod in njihovih izsledkov;

- izsledki nekropsije;

- podroben opis vseh histopatoloških izsledkov;

- statistična obdelava rezultatov, kjer je primerno.

Razprava o rezultatih.

Zaključki.

4. SKLICEVANJE

Ta metoda je skladna s smernicami za preskušanje OECD TG 418.

B.38 ZAPOZNELA NEVROTOKSIČNOST ORGANOFOSFORNIH SNOVI – 28-DNEVNA ŠTUDIJA S PONAVLJAJOČIMI SE ODMERKI

1. METODA

1.1 Uvod

Pri ocenjevanju in vrednotenju toksičnih učinkov snovi je pomembno upoštevati potencial določenih razredov snovi, da povzročijo posebne vrste nevrotoksičnosti, ki se morda ne odkrijejo v drugih študijah toksičnosti. Nekatere organofosforne snovi, za katere je bilo opaženo, da povzročajo zapoznelo nevrotoksičnost, bi morale biti predmet takšnega ocenjevanja.

Izločilne študije in vitro bi se lahko uporabile za določanje tistih snovi, ki lahko povzročijo zapoznelo polinevropatijo; vendar negativni izsledki študij in vitro ne zagotavljajo dokazov, da preskusna snov ni nevrotoksikant.

Ta 28-dnevni preskus zapoznele nevrotoksičnosti daje informacije o morebitnih nevarnostih za zdravje, ki jih lahko povzroči ponovna izpostavljenost v določenem obdobju. Prav tako bo zagotovil informacije o odzivu na odmerke in omogočil oceno stopnje koncentracije brez opaznih negativnih vplivov (NOAEL), ki se lahko uporablja za določitev meril o varnosti za izpostavljenost.

Glej del B splošnega uvoda.

1.2 Opredelitev pojmov

Organofosforne snovi vključujejo nenabite organofosforne estre, tioestre ali anhidride organofosfornih, organofosfoničnih ali organofosforamidnih kislin ali sorodnih fosforotiotskih, fosfonotiotskih ali fosforotioamidskih kislin ali druge snovi, ki lahko povzročijo zapoznelo nevrotoksičnost, ki se včasih zasledi v tem razredu snovi.

Zapoznela nevrotoksičnost je sindrom, povezan z dolgotrajnim zapoznelim nastopom ataksije, distalnimi aksonopatijami hrbtenjače in perifernega živčevja ter z inhibicijo in staranjem nevropatske ciljne esteraze (NTE) v živčnem tkivu.

1.3 Princip preskusne metode

Dnevni odmerki preskusne snovi se domačim kokošim dajejo oralno 28 dni. Živali je treba najmanj enkrat na dan opazovati zaradi morebitnih vedenjskih nepravilnosti, ataksije in paralize do štirinajstega dneva po vnosu zadnjega odmerka. Navadno se od 24 do 48 ur po vnosu zadnjega odmerka opravijo biokemične analize, zlasti inhibicije nevropatske ciljne esteraze (NTE), na naključno izbranih kokoših iz vsake skupine. Dva tedna po vnosu zadnjega odmerka se usmrtijo druge kokoši in izvede se histopatološka preiskava izbranega živčnega tkiva.

1.4 Opis preskusne metode

1.4.1 Priprave

Zdrave, mlade, odrasle kokoši, ki ne kažejo znakov virusnih obolenj, niso tretirane s snovmi, ki bi vplivala na rezultat preskusa, in ki ne kažejo znakov nenavadnega obnašanja, je treba naključno razvrstiti v skupino, ki bo tretirana, in kontrolno skupino ter jih aklimatizirati na laboratorijske razmere najmanj 5 dni pred začetkom študije.

Uporabiti je treba kletke ali ograde, ki so dovolj velike, da omogočajo prosto gibanje kokoši in olajšajo opazovanje obnašanja živali.

Običajno je treba odmerek dajati oralno vsak dan in sedem dni na teden, po možnosti z gastrično sondo ali želatinastimi kapsulami. Tekočine se lahko vnašajo nerazredčene ali raztopljene v ustreznem nosilcu, kakršno je na primer koruzno olje; če je mogoče, je treba trdne snovi raztopiti, ker se utegne zgoditi, da se veliki odmerki v želatinastih kapsulah ne absorbirajo učinkovito. Pri nevodnih nosilcih je treba poznati njihove toksične značilnosti ali jih v nasprotnem določiti pred začetkom preskusa.

1.4.2 Preskusni pogoji

1.4.2.1 Poskusne živali

Priporoča se uporaba mladih odraslih domačih kokoši nesnic (Gallus gallus domesticus), ki so stare od 8 do 12 mesecev. Uporabiti je treba kokoši pasem standardne velikosti in sevov, običajno vzrejene v okoliščinah, ki kokošim dovoljujejo svobodno gibanje.

1.4.2.2 Število in spol

Običajno je treba uporabiti najmanj tri skupine za tretiranje in eno kontrolno skupino. Slednjo skupino je treba tretirati enako kakor skupino za tretiranje, razen da se živalim ne da preskusna snov.

Vsaka skupina ptic naj bo sestavljena iz zadosti kokoši, da se lahko najmanj šest ptic usmrti za biokemične analize (tri na vsakega od obeh časovnih terminov opazovanja) in da lahko šest ptic preživi 14-dnevno obdobje opazovanja za patološke preiskave.

1.4.2.3 Velikost odmerkov

Pri izbiri velikosti odmerkov je treba upoštevati tri rezultate preskusa zapoznele nevrotoksičnosti po akutni izpostavljenosti in vse druge obstoječe podatke o toksičnosti ali toksikokinetiki za preskusno zmes. Izbrati je treba največji odmerek, ki bi povzročil toksične učinke, po možnosti zapoznelo nevrotoksičnost, ne pa smrti ali hudega trpljenja. Nato je treba izbrati padajoče zaporedje velikosti odmerkov, da se dokažeta vsak odziv, ki je pogojen z odmerkom, in koncentracija brez opaznih negativnih vplivov pri najmanjšem odmerku.

1.4.2.4 Mejni preskus

Če preskus z velikostjo odmerka, ki znaša najmanj 2000 mg/kg telesne teže/dan, z uporabo predpisanih postopkov za to študijo ne povzroči nobenih opaznih toksičnih učinkov in če podatki o strukturno sorodnih snoveh ne kažejo na pojav toksičnosti, študije z uporabo višjega odmerka ni treba izvesti. Mejni preskus se ne uporabi samo, če izpostavljenost človeka kaže na potrebo po uporabi večjega odmerka.

1.4.2.5 Obdobje opazovanja

Vse živali je treba med obdobjem izpostavljenosti in 14 dni po njem opazovati najmanj enkrat na dan, razen če je bila predvidena nekropsija.

1.4.3 Postopek

Živalim se dajejo odmerki preskusne snovi sedem dni na teden v obdobju 28 dni.

1.4.3.1 Splošna opazovanja

Opazovanja je treba začeti, takoj ko se lotimo tretiranja. Vse kokoši je treba najmanj enkrat na dan natančno opazovati vseh 28 dni tretiranja in naslednjih 14 dni ali do predvidene usmrtitve. Zabeležiti je treba vse znake toksičnosti, vključno s časom nastopa, vrsto, resnostjo in trajanjem. Opazovanja naj med drugim vključujejo vedenjske nepravilnosti. Ataksijo je treba meriti z vrstilno ocenjevalno lestvico, sestavljeno iz najmanj štirih stopenj, zabeležiti pa je treba tudi primere paralize. Najmanj dvakrat na teden je treba kokoši izpustiti iz kletk in jih pripraviti k prisilni motorični dejavnosti, kakršno je denimo plezanje po lestvi, da bi bilo olajšano opazovanje minimalnih toksičnih učinkov. Umirajoče živali ali živali, ki kažejo znake hudega trpljenja ali hude bolečine, je treba odstraniti, humano usmrtiti in opraviti nekropsijo.

1.4.3.2 Telesna teža

Vse kokoši je treba neposredno pred prvim dajanjem preskusne snovi in nato najmanj enkrat na teden stehtati.

1.4.3.3 Biokemija

V nekaj dneh po vnosu zadnjega odmerka je treba usmrtiti šest naključno izbranih kokoši iz tretirane in iz kontrolne skupine, možgane in ledveno hrbtenjačo pa je treba pripraviti in analizirati za določitev morebitne inhibicije nevropatske ciljne esteraze (NTE). Poleg tega je za določitev inhibicije nevropatske ciljne esteraze lahko koristno pripraviti in analizirati ishiatično živčno tkivo. Navadno se po 24 urah usmrtijo po tri ptice iz kontrolne in iz vsake tretirane skupine ter tri živali 48 ur po vnosu zadnjega odmerka. Če podatki iz študije akutne izpostavljenosti ali drugih študij (npr. toksikokinetika) kažejo, da je bolj priporočljiv drug čas usmrtitve po zadnjem vnosu odmerka, je treba uporabiti ta čas in razloge za tako ravnanje utemeljiti.

Na teh vzorcih se po potrebi lahko izvedejo analize acetilholinesteraze (AChE). Vendar se AChE invivo lahko spontano reaktivira, kar lahko vodi k podcenjevanju učinkovitosti neke snovi kot inhibitorja AChE.

1.4.3.4 Makroskopska nekropsija

Makroskopska nekropsija vseh živali (tistih, ki so usmrčene po programu, in tistih, ki so usmrčene, ko že umirajo) naj vključuje opazovanje videza možganov in hrbtenjače.

1.4.3.5 Histopatološka preiskava

Živčno tkivo živali, preživelih obdobje opazovanja, ki ni bilo uporabljeno za biokemijske študije, je treba uporabiti za mikroskopske preiskave. Tkivo je treba fiksirati in situ z uporabo tehnik škropitve. Odvzem tkiva se opravi na malih možganih (srednja longitudinalna stopnja), podaljšani hrbtenjači, hrbtenjači in perifernem živčevju. Vzorce hrbtenjače je treba odvzeti z zgornjega vratnega predela, srednjega prsnega in ledveno-križnega predela. Odvzamejo se tudi vzorci distalnega dela tibialnega živca in njegovih vej v smeri dvoglave mečne mišice ter ishiatičnega živca. Vzorce tkiva je treba obarvati z ustreznimi mielinskimi in aksonskimi barvili. Mikroskopsko preiskavo je na začetku treba opraviti na shranjenem tkivu vseh živali kontrolne skupine in skupine, tretirane z velikim odmerkom. Če v slednji skupini obstajajo dokazi o učinkih, je treba izvesti tudi mikroskopsko preiskavo tkiv kokoši iz skupin s srednjim in nizkim odmerkom.

2. PODATKI

Če so rezultati na končnih točkah, izbranih v tej metodi (biokemija, histopatologija in opazovanje obnašanja), negativni, dodatno presku