2.

Doda se del D: „D. Metoda prebave zbirnega vzorca z magnetnim mešanjem/‚izolacijo na filtru‘ in odkrivanjem ličink s testom lateksne aglutinacije Ta metoda se šteje kot enakovredna le za testiranje mesa domačih prašičev. 1. Oprema in reagenti (a) nož ali škarje in pinceta za rezanje vzorcev; (b) pladnji, razdeljeni na 50 kvadratov, od katerih vsak lahko drži vzorec po približno 2 g mesa, ali druga orodja, ki zagotavljajo enaka jamstva v zvezi s sledljivostjo vzorcev; (c) mešalec z ostrim rezilom za sekljanje. Če so vzorci težji od 3 g, je treba uporabiti strojček za mletje mesa z luknjami premera med 2 in 4 mm ali škarje. V primeru zamrznjenega mesa ali jezika (po odstranitvi površinske plasti, ki ni prebavljiva) je potreben strojček za mletje mesa, velikost vzorca pa je treba znatno povečati; (d) magnetni mešalci s termostatsko nadzorovano grelno ploščo in približno 5 cm dolgimi teflonskimi mešalnimi paličicami; (e) steklene čaše s 3-litrsko prostornino; (f) sita s 180-mikronsko mrežo iz nerjavečega jekla in zunanjim premerom 11 cm; (g) jeklena naprava za filtriranje s filtri z 20-mikronsko mrežo z jeklenim lijem; (h) vakuumska črpalka; (i) kovinske ali plastične posode z 10- do 15-litrsko prostornino za zbiranje digestivne tekočine; (j) 3D rotacijski stresalnik; (k) aluminijasta folija; (l) 25 % klorovodikova kislina; (m) pepsin z močjo: 1: 10 000 NF (US National Formulary), kar ustreza 1: 12 500 BP (British Pharmacopoeia) in 2 000 FIP (International Pharmaceutical Federation), ali stabilizirana raztopina pepsina z najmanj 660 enot Evropske farmakopeje/ml; (n) voda iz pipe, segreta na 46 do 48 °C; (o) tehtnica z natančnostjo 0,1 g; (p) pipete različnih velikosti (1, 10 in 25 ml), mikropipete v skladu z navodili proizvajalca glede lateksne aglutinacije in držala za pipete; (q) filtri z 20-mikronsko najlonsko mrežo, premera, ki ustreza filtracijskemu sistemu; (r) plastične ali jeklene klešče velikosti 10–15 cm; (s) koničaste epruvete s prostornino 15 ml; (t) pestilo s teflonsko ali jekleno stožčasto konico, ki ustreza koničastim epruvetam; (u) termometer z natančnostjo 0,5 °C v območju od 1 do 100 °C; (v) kartice za lateksno aglutinacijo iz kompleta za dokaz antigena Trichin-L, potrjenega pod oznako št. EURLP_D_001/2011; (w) puferska raztopina s konzervansom (vzorec razredčila) iz kompleta za dokaz antigena Trichin-L, potrjenega pod oznako št. EURLP_D_001/2011; (x) puferska raztopina s konzervansom (negativna kontrola) iz kompleta za dokaz antigena Trichin-L, potrjenega pod oznako št. EURLP_D_001/2011; (y) puferska raztopina z antigeni Trichinella spiralis in konzervansom (pozitivna kontrola) iz kompleta za dokaz antigena Trichin-L, potrjenega pod oznako št. EURLP_D_001/2011; (z) puferska raztopina s polistirenskimi delci, prekritimi s protitelesi, in konzervansom (kroglice iz lateksa) iz kompleta za dokaz antigena Trichin-L, potrjenega pod oznako št. EURLP_D_001/2011; (aa) paličice za enkratno uporabo. 2. Odvzem vzorcev Kot je določeno v Poglavju I(2). 3. Postopek I. Pri popolnih skupkih (100 g vzorca hkrati) je treba upoštevati postopek iz točk (a) do (i) Poglavja I(3)(I). Poleg tega se uporablja naslednji postopek: (a) filter z 20-mikronsko najlonsko mrežo se postavi na stojalo za filtriranje. Stožčasti jekleni lij za filtriranje se namesti na blok filtracijske enote, jekleno sito s 180-mikronsko mrežo pa se postavi na lij. Vakuumska črpalka se poveže s stojalom za filtriranje ter kovinsko ali plastično posodo za zbiranje digestivne tekočine. (b) preneha se z mešanjem, digestivna tekočina pa se preko sita vlije v lij za filtriranje. Čaša se izpere z 250 ml tople vode. Ko se digestivna tekočina uspešno filtrira, je treba tekočino za izpiranje vliti v filtracijsko enoto; (c) s kleščami se prime filtracijska membrana za rob. Filtracijska membrana se najmanj štiri krat prepogne in vloži v 15-mililitrsko stožčasto cev; (d) Filtracijska membrana se porine na dno 15-mililitrske stožčaste cevi s pomočjo pestila in močno pritisne z zaporednimi gibi pestila naprej in nazaj, ki mora biti nameščen znotraj zgibka filtracijske membrane po navodilih proizvajalca; (e) V 15-mililitrsko stožčasto cev se s pipeto doda vzorec razredčila, filtracijska membrana pa se homogenizira s pestilom z zaporednimi gibi naprej in nazaj nizke amplitude, pri čemer se je treba po navodilih proizvajalca izogibati nenadnim gibom, da se omeji pljuskanje tekočine; (f) vsak vzorec, negativna kontrola in pozitivna kontrola se po navodilih proizvajalca s pipeto nanesejo na različna polja kartice za aglutinacijo; (g) kroglice iz lateksa se po navodilih proizvajalca s pipeto dodajo na vsako polje kartice za aglutinacijo, pri čemer ne smejo priti v stik z vzorci in kontrolami. Kroglice iz lateksa se nato v vsakem polju nežno premešajo s paličico za enkratno uporabo, dokler homogena tekočina ne prekrije celotno polje; (h) kartica za aglutinacijo se postavi v 3D stresalnik in meša po navodilih proizvajalca; (i) Po času, določenem v navodilih proizvajalca, se mešanje zaustavi, kartica za aglutinacijo se postavi na ravno površino in odčitajo se rezultati reakcije. Pri pozitivnem vzorcu se morajo pojaviti agregati kroglic. Pri negativnem vzorcu mora suspenzija ostati homogena brez agregatov kroglic; (j) Vsa oprema, ki je bila v stiku z mesom, se mora med zaporednima uporabama natančno razkužiti, tako da se jo za nekaj sekund potopi v toplo vodo (60 °C do 90 °C). Površine, na katerih ostanejo ostanki mesa ali inaktivirane ličinke, se lahko očistijo s čisto gobico in tekočo vodo. Po zaključku postopka se lahko za razmastitev opreme doda nekaj kapljic detergenta. Nato se mora vsak kos večkrat natančno sprati, da se odstranijo vse sledi detergenta; (k) pestilo je treba natančno razkužiti med zaporednima uporabama, tako da se ga za nekaj sekund potopi v vsaj 250 ml tople vode (60 °C to 90 °C). Ostanki mesa ali inaktivirane ličinke, ki bi lahko ostale na njegovi površini, se morajo odstraniti s čisto gobico in tekočo vodo. Po zaključku postopka se lahko za razmastitev pestila doda nekaj kapljic detergenta. Nato se mora pestilo večkrat natančno sprati, da se odstranijo vse sledi detergenta; II. Skupki z manj kot 100 g, kot je določeno v poglavju I(3)(II) Pri skupkih z manj kot 100 g se upošteva postopek iz poglavja I(3)(II). III. Pozitivni ali dvomljivi rezultati Kadar se pri pregledu skupnega vzorca ugotovi pozitiven ali nejasen rezultat lateksne aglutinacije, se v skladu s poglavjem I(2)(a) od vsakega prašiča odvzame dodaten 20-gramski vzorec. 20-gramski vzorci od petih prašičev se združijo in pregledajo z metodo iz točke I. Tako se morajo pregledati vzorci od 20 skupin petih prašičev. Kadar je lateksna aglutinacija pri skupini petih prašičev pozitivna, se od posameznih živali iz skupine odvzamejo dodatni 20-gramski vzorci, vsak vzorec pa se ločeno pregleda z eno od metod iz poglavja I. Vzorci parazitov se hranijo v 90 % etanolu, da se lahko ohranijo in da lahko referenčni laboratorij EU ali nacionalni referenčni laboratorij identificira vrsto parazitov. Po odvzemu parazitov je treba pozitivne tekočine razkužiti s segrevanjem na najmanj 60 °C.“