(19)

V delu C se dodajo naslednja poglavja: „C.47 Ribe, preskus toksičnosti za zgodnje razvojne stopnje UVOD 1. Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici za preskušanje OECD (TG) 210 (2013). Preskusi zgodnjih razvojnih stopenj rib so namenjeni opredelitvi letalnih in subletalnih učinkov kemikalij na stopnje in vrste rib, ki se preskušajo. So pomemben vir informacij za oceno kroničnih letalnih in subletalnih učinkov kemikalije na druge vrste rib. 2. Smernica za preskušanje št. 210 temelji na predlogu Združenega kraljestva, ki je bil obravnavan na srečanju strokovnjakov OECD v Medmenhamu (Združeno kraljestvo) novembra 1988 in posodobljen leta 2013, da bi odražal izkušnje pri uporabi preskusa in priporočila z delavnice OECD o preskušanju toksičnosti za ribe, ki je potekala septembra 2010 (1). NAČELO PRESKUSA 3. Ribe so v zgodnjih razvojnih stopnjah izpostavljene različnim koncentracijam preskusne kemikalije, raztopljene v vodi. Če je mogoče, se uporabijo pretočni pogoji; če to ni mogoče, so sprejemljivi tudi polstatični pogoji. Za podrobnosti glej dokument s smernicami OECD za preskušanje toksičnosti zahtevnih snovi in zmesi za vodno okolje (2). Preskus se začne tako, da se oplojene ikre vstavijo v preskusne komore, kjer ostanejo toliko časa, kolikor je potrebnega, da kontrolne ribe te vrste dosežejo življenjsko stopnjo mladice. Ocenijo se letalni in subletalni učinki ter se primerjajo s kontrolnimi vrednostmi za določitev najnižje koncentracije z opaženim učinkom (LOEC) ter za posledično določitev (i) koncentracije brez opaznega učinka (NOEC) in/ali (ii) ECx (npr. EC10, EC20) z regresijskim modelom, s katerim se oceni koncentracija, ki bi povzročila x-odstotno spremembo izmerjenega učinka. Poročanje o pomembnih koncentracijah z učinkom in parametrih je lahko odvisno od regulativnega okvira. Preskusne koncentracije bi morale oklepati vrednost ECx, tako da vrednost ECx nato izvira iz interpolacije in ne iz ekstrapolacije (za opredelitev pojmov glej Dodatek 1). INFORMACIJE O PRESKUSNI KEMIKALIJI 4. Preskusna kemikalija je kemikalija, ki se preskuša. Poznati je treba topnost v vodi (glej poglavje A.6 te priloge) in parni tlak (glej poglavje A.4 te priloge), na voljo pa mora biti tudi zanesljiva analitska metoda za kvantifikacijo kemikalije v preskusnih raztopinah z znano in izpričano točnostjo ter mejo določljivosti. Čeprav preskus ni obvezen, lahko rezultati preskusa akutne toksičnosti (glej poglavji C.1 in C.49 te priloge), po možnosti izvedenega z vrstami, izbranimi za ta preskus, zagotovijo koristne informacije. 5. Če se preskusna metoda uporablja za preskušanje zmesi, mora biti njena sestava v čim večji meri opredeljena, npr. s kemijsko identiteto sestavin, kvantitativnim pojavljanjem in specifičnimi lastnostmi snovi (kot so tiste, navedene zgoraj). Pred uporabo preskusne metode za regulativno preskušanje zmesi je treba proučiti, ali bo zagotovila sprejemljive rezultate za predvideni regulativni namen. 6. Druge uporabne informacije so strukturna formula, čistost snovi, topnost v vodi, stabilnost v vodi in na svetlobi, pKa, Pow ter rezultati preskusa za lahko biološko razgradljivost (npr. poglavji C.4 in C.29 te priloge). VELJAVNOST PRESKUSA 7. Za veljavnost preskusa morajo biti izpolnjeni naslednji pogoji: — koncentracija raztopljenega kisika mora biti med celotnim preskusom večja od 60 % nasičenosti z zrakom, — razlika v temperaturi vode v različnih preskusnih komorah ali v zaporednih dneh med preskusom nikoli ne sme biti večja od ±1,5 °C in jo je treba ohranjati znotraj temperaturnih območij, določenih za preskusno vrsto (Dodatek 2), — obvezna je analitska meritev preskusnih koncentracij, — število vseh preživelih oplojenih iker ter preživetje po izvalitvi v kontrolah in, kadar je primerno, v kontrolah s topilom mora biti večje ali enako mejnim vrednostim iz Dodatka 2. 8. Če se opazi manjše odstopanje od meril za veljavnost preskusa, je treba posledice obravnavati glede na zanesljivost preskusnih podatkov in ta obravnavanja vključiti v poročilo. Poročati je treba o učinkih na preživetje, izvalitev ali rast v kontroli s topilom v primerjavi z negativno kontrolo ter jih obravnavati glede na zanesljivost preskusnih podatkov. OPIS METODE Preskusne komore 9. Uporabijo se lahko kakršne koli steklene, nerjavne ali druge kemijsko inertne posode. Ker je znano, da silikon zelo dobro absorbira lipofilne snovi, je treba uporabo silikonskih cevi pri študijah s pretočnimi postopki in uporabo silikonskih tesnil pri stiku z vodo čim bolj omejiti npr. z uporabo steklenih akvarijev iz enega kosa. Posode morajo biti dovolj velike, da omogočajo ustrezno rast v kontroli, vzdrževanje koncentracije raztopljenega kisika (npr. za majhne vrste rib to zagotavlja posoda s prostornino 7 litrov) in skladnost s stopnjo obremenitve iz odstavka 19. Priporočljivo je, da se preskusne komore naključno postavijo v preskusno območje. Bolj kot povsem naključna zasnova se priporoča zasnova naključne razdelitve v bloke, pri kateri se v vsakem bloku izvedejo vsa tretiranja. Preskusne komore morajo biti zaščitene pred neželenimi motnjami. Preskusni sistem mora biti po možnosti dovolj dolgo izpostavljen koncentracijam preskusne kemikalije, da pred vnosom preskusnih organizmov dokaže stabilnost koncentracij za izpostavljanje. Izbira vrst 10. Priporočene vrste rib so navedene v preglednici 1. To ne izključuje uporabe drugih vrst, vendar bo morda treba temu prilagoditi preskusni postopek, da se zagotovijo primerni preskusni pogoji. V tem primeru je treba utemeljiti izbiro vrste in preskusne metode. Vzdrževanje plemenskih rib 11. Podrobnosti o vzdrževanju plemenskih rib v zadovoljivih pogojih lahko najdemo v Dodatku 3 in v virih (3) (4) (5). Ravnanje z oplojenimi ikrami, zarodki in ličinkami 12. Oplojene ikre, zarodki in ličinke se lahko na začetku izpostavijo v glavni posodi v manjših steklenih ali posodah iz nerjavnega jekla, ki imajo mrežaste stranice ali konce, da se lahko skozi posodo pretaka preskusna raztopina. Neturbulentni tok skozi te majhne posode se lahko doseže tako, da se posode obesijo na držalo, nameščeno tako, da premika posodo gor in dol, vendar tako, da so organizmi ves čas potopljeni. Oplojene ikre salmonidnih rib lahko ležijo na podstavkih ali mrežah z dovolj velikimi luknjicami, da lahko ličinke, ko se izležejo, padejo skoznje. 13. Kadar se za zadrževanje iker v glavni preskusni posodi uporabljajo posodice, rešetke ali mreže za ikre, je treba te priprave, ko se ličinke izležejo, odstraniti v skladu s smernicami iz Dodatka 3, obdržijo se le mreže, da ličinke ne pobegnejo. Če je treba ličinke prenesti, se te ne smejo izpostaviti zraku in pri spuščanju ličink iz posod za ikre se ne smejo uporabljati lovilne mrežice. Čas prenosa je različen glede na vrsto in ga je treba zapisati v poročilo. Prenos pa ni vedno nujno potreben. Voda 14. Za preskusno vodo se lahko uporabi katera koli voda, v kateri preskusna vrsta dokaže sposobnost primernega dolgotrajnega preživetja in rasti (glej Dodatek 4). Kakovost vode mora biti ves čas trajanja preskusa konstantna. Da voda za redčenje ne bi neprimerno vplivala na rezultat preskusa (na primer s kompleksacijo preskusne kemikalije) ali škodljivo učinkovala na produktivnost plemenskih rib, je treba v časovnih razmikih jemati vzorce za analizo. Meritve težkih kovin (npr. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), glavnih anionov in kationov (e.g. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl–, SO42–), amonijaka, skupnih preostalih klornih pesticidov, skupnega organskega ogljika in suspendiranih trdnih snovi je treba izvesti na primer dvakrat letno, kadar je voda za redčenje po svoji kakovosti relativno konstantna. Če je znano, da je kakovost vode spremenljiva, je treba meritve izvajati pogosteje; pogostost je odvisna od tega, kako spremenljiva je kakovost. Nekatere kemijske lastnosti sprejemljive vode za redčenje so navedene v Dodatku 4. Preskusne raztopine 15. Za pretočne preskuse je potreben sistem, ki stalno odmerja in redči osnovno raztopino preskusne kemikalije (npr. merilna črpalka, proporcionalni razredčevalnik, sistem naprav za nasičenje), da dovaja niz koncentracij v preskusne komore. Pretok osnovnih raztopin in vode za redčenje je treba med preskusom preverjati v časovnih razmikih in se ne sme razlikovati za več kot 10 % med celotnim preskusom. Ugotovljeno je bilo, da je primeren pretok enak prostornini vsaj petih preskusnih komor na 24 ur (3). Ob upoštevanju stopnje obremenitve iz odstavka 19 je za preprečitev hitre odstranitve hrane mogoče uporabiti tudi manjši pretok, npr. 2–3 preskusne komore. 16. Preskusne raztopine izbranih koncentracij se pripravijo z redčenjem osnovne raztopine. Osnovno raztopino je treba po možnosti pripraviti preprosto z mešanjem ali stresanjem preskusne kemikalije v vodi za redčenje z uporabo mehanskih sredstev (npr. z mešanjem in/ali ultrazvokom). Za pridobitev primerno koncentrirane osnovne raztopine se lahko uporabijo kolone za nasičevanje raztopine ali metode pasivnega odmerjanja (6). Uporaba topila kot nosilca ni priporočljiva. Če je topilo potrebno, je treba vzporedno izvajati kontrolo s topilom z enako koncentracijo topila kot pri tretiranjih s kemikalijo; odmerek topila bi moral biti po možnosti enak pri vseh koncentracijah in pri kontroli s topilom. Pri nekaterih sistemih razredčevalnikov je to tehnično težko izvedljivo; pri njih mora biti koncentracija topila pri kontroli s topilom enaka najvišji koncentraciji topila v tretirani skupini. Za snovi, ki jih je težko preskušati, glej Dokument s smernicami OECD št. 23 za preskušanje toksičnosti zahtevnih snovi in zmesi za vodno okolje (2). Če se uporabi topilo, se izbere na podlagi kemijskih lastnosti snovi. V skladu z Dokumentom s smernicami OECD št. 23 se priporoča največja koncentracija 100 μl/l. Da bi se izognili možnemu učinku topila na izmerjene končne točke (7), se priporoča čim nižja koncentracija topila. 17. Za polstatični preskus se lahko uporabita dva različna postopka obnove. Bodisi se pripravijo nove preskusne raztopine v čistih posodah ter se preživele ikre in ličinke nežno prenesejo v nove posode bodisi preskusni organizmi ostanejo v preskusnih posodah, medtem ko se zamenja del (vsaj dve tretjini) preskusne raztopine/prostornine kontrole. POSTOPEK Pogoji izpostavljenosti Trajanje 18. Preskus je treba začeti čim prej po tem, ko se ikre oplodijo in se po možnosti potopijo v preskusne raztopine pred začetkom brazdanja blastodiska, ali čim prej po tej stopnji. Trajanje preskusa bo odvisno od uporabljene vrste. Nekatera priporočena trajanja so navedena v Dodatku 2. Obremenitev 19. Število oplojenih iker mora biti na začetku preskusa dovolj veliko, da izpolnjuje statistične zahteve. Ikre je treba naključno porazdeliti med tretiranja in za vsako koncentracijo je treba uporabiti vsaj 80 iker, ki morajo biti enakomerno porazdeljene med vsaj štiri ponovitvene preskusne komore. Stopnja obremenitve (biomasa na prostornino preskusne raztopine) mora biti dovolj nizka, da se lahko v razvojni stopnji ikre in ličinke brez prezračevanja ohranja koncentracija raztopljenega kisika, ki znaša vsaj 60 % nasičenosti z zrakom. Za pretočne preskuse je priporočena stopnja obremenitve, ki nikoli ne presega 0,5 g/l mokre teže na 24 ur in ne presega 5 g/l raztopine (3). Svetloba in temperatura 20. Obdobje osvetljenosti in temperatura vode morata biti ustrezna za preskusno vrsto (glej Dodatek 2). Hranjenje 21. Hrana in hranjenje sta ključna, zato je bistveno, da se pravilna hrana za posamezno življenjsko stopnjo dovaja v ustreznem trenutku in v količini, ki je ustrezna za normalno rast. Hranjenje mora biti med različnimi ponovljenimi vzorci približno enako, razen če se ne prilagodi zaradi smrtnosti. Ostanke hrane in iztrebke je treba odstraniti, da se prepreči kopičenje odpadkov. Načini hranjenja so podrobno opisani v Dodatku 3, vendar se s pridobljenimi izkušnjami hrana in načini hranjenja stalno izpopolnjujejo, da se izboljšata preživetje in rast. Z živo hrano se bogati okolje, zato jo je treba uporabljati namesto suhe ali zamrznjene hrane ali kot njen dodatek vedno, ko to omogočata vrsta in razvojna stopnja. Preskusne koncentracije 22. Običajno je potrebnih pet koncentracij preskusne kemikalije z najmanj štirimi ponovljenimi vzorci na koncentracijo, ki se med seboj razlikujejo za konstantni faktor, ki ni večji od 3,2. Če so na voljo informacije o preskušanju akutne toksičnosti, po možnosti z istimi vrstami in/ali preskusom za določanje območja delovanja, jih je treba upoštevati (1) pri izbiri območja preskusnih koncentracij. Pri izbiri območja preskusnih koncentracij je treba upoštevati vse vire informacij, vključno z viri, kot so navzkrižno branje ali podatki preskusa akutne toksičnosti za ribji zarodek. Kadar je treba določiti le empirične NOEC, je kot končni preskus lahko sprejemljiv mejni preskus ali podaljšani mejni preskus z manj kot petimi koncentracijami. Če se uporabi manj kot pet koncentracij, je treba to utemeljiti. Koncentracij preskusne kemikalije, ki so višje od LC50 po 96 urah ali 10 mg/l, katera koli je nižja, ni treba preskušati. Kontrole 23. Poleg niza koncentracij preskusne kemikalije je treba izvesti tudi kontrolo z vodo za redčenje in po potrebi kontrolo s topilom, ki kot nosilec vključuje le topilo (glej odstavek 16). Pogostost analitskega določanja in meritev 24. Pred začetkom obdobja izpostavljenosti je treba pri vseh ponovljenih vzorcih zagotoviti ustrezno delovanje sistema za dovajanje kemikalije (na primer z meritvijo preskusnih koncentracij). Vzpostaviti je treba analitske metode, vključno z ustrezno mejo določljivosti (LOQ) in zadostnim znanjem o stabilnosti snovi v preskusnem sistemu. Med preskusom se koncentracije preskusne kemikalije določijo v rednih časovnih razmikih za opredeljevanje izpostavljenosti. Potrebnih je najmanj pet določitev. Pri pretočnih sistemih je treba vsaj enkrat tedensko izvesti analitske meritve preskusne kemikalije pri enem ponovljenem vzorcu na koncentracijo, pri čemer je treba ponovljene vzorce sistematično menjavati. Dodatne analitske določitve pogosto izboljšajo kakovost rezultatov preskusa. Vzorce bo morda treba filtrirati (npr. skozi pore, velike 0,45 μm), da se odstranijo delci, ali centrifugirati, da se zagotovijo določitve kemikalije v dejanski raztopini. Za zmanjšanje adsorpcije preskusne kemikalije je treba zagotoviti, da so filtri pred uporabo nasičeni. Če izmerjene koncentracije ne ostanejo v območju 80–120 % nominalne koncentracije, je treba koncentracije z učinkom pri pretočnih preskusih določiti in izraziti glede na aritmetično sredino koncentracij (za izračun aritmetične sredine (8) glej Dodatek 6 k preskusni metodi C.20), pri polstatičnih preskusih pa izraziti glede na geometrijsko sredino izmerjenih koncentracij (glej poglavje 5 Dokumenta s smernicami OECD za preskušanje toksičnosti zahtevnih snovi in zmesi za vodno okolje (2)). 25. Med preskusom je treba raztopljeni kisik, pH in temperaturo v vseh preskusnih posodah meriti vsaj enkrat tedensko, slanost in trdoto, če je to upravičeno, pa na začetku in koncu preskusa. Temperatura se po možnosti stalno spremlja v vsaj eni preskusni posodi. Opazovanja 26. Stopnje razvoja zarodka : embrionalno stopnjo na začetku izpostavljenosti preskusni kemikaliji je treba čim natančneje preveriti. To se lahko naredi z uporabo reprezentativnega vzorca iker, ki so primerno konzervirane in očiščene. 27. Izvalitev in preživetje : vsaj enkrat na dan je treba opazovati izvalitev in preživetje ter zapisati vrednosti. Če se v zgodnjem razvoju zarodka (na primer prvi ali drugi dan preskusa) na ikrah opazijo glive, je treba te ikre prešteti in odstraniti. Mrtve zarodke, ličinke in mladice je treba odstraniti čim prej po tem, ko se opazijo, ker se lahko hitro razkrojijo in razpadejo zaradi delovanja drugih rib. Izjemna pazljivost je potrebna pri odstranjevanju posameznih mrtvih osebkov, da se fizično ne poškodujejo sosednje ikre/ličinke. Znaki smrti se razlikujejo glede na vrsto in razvojno stopnjo. Na primer: — pri oplojenih ikrah: zlasti v zgodnjih stopnjah opazna izguba prosojnosti in sprememba barve, ki jo povzroči koagulacija in/ali obarjanje beljakovin, ki povzročajo bel moten videz; — pri zarodkih, ličinkah in mladicah: negibnost in/ali odsotnost dihalnega gibanja in/ali odsotnost srčnega utripa in/ali pomanjkanje odzivanja na mehanske dražljaje. 28. Nenormalen videz : število ličink ali mladic, pri katerih se kaže nenormalna oblika telesa, je treba zapisovati v ustreznih časovnih razmikih, ki so odvisni od trajanja preskusa, pri čemer je treba opisati naravo anomalije. Opozoriti je treba, da so nenormalne ličinke in mladice lahko naraven pojav in jih je v kontrolah pri nekaterih vrstah lahko več odstotkov. Kadar so deformacije in z njimi povezano nenormalno vedenje tako hudi, da organizem znatno trpi in si ne bo več mogel opomoči, se lahko izloči iz preskusa. Te živali je treba evtanazirati in jih v nadaljnji analizi podatkov zajeti v odstotek smrtnosti. Normalen razvoj zarodka je evidentiran za večino vrst, priporočenih za to preskusno metodo (9) (10) (11) (12). 29. Nenormalno vedenje : anomalije, npr. hiperventilacijo, nekoordinirano plavanje, netipično mirovanje in netipično vedenje pri hranjenju, je treba zapisovati v rednih časovnih razmikih, ki so odvisni od trajanja preskusa (npr. enkrat na dan pri toplovodnih vrstah). Čeprav je te učinke težko kvantificirati, lahko, če so opaženi, pripomorejo k razlagi podatkov o smrtnosti. 30. Teža : na koncu preskusa se vse preživele ribe stehtajo vsaj na podlagi ponovljenih vzorcev (v poročilo se vključita število živali v ponovljenem vzorcu in srednja vrednost teže na žival): priporoča se, da se v poročilo vključi mokra teža (osušena s pivnikom), vendar se lahko vanj vključijo tudi podatki o suhi teži (13). 31. Dolžina : na koncu preskusa se izmeri dolžina posameznih osebkov. Priporočljiva je meritev skupne dolžine, če pa pride do razpada repne plavuti ali erozije plavuti, se lahko uporabi standardna dolžina. Izbrano metodo je treba uporabiti pri vseh ribah v danem preskusu. Dolžina posameznega osebka se lahko izmeri na primer s kljunastim merilom, digitalnim fotoaparatom ali kalibriranim okularnim mikrometrom. Običajne najmanjše dolžine so opredeljene v Dodatku 2. PODATKI IN POROČANJE Obdelava rezultatov 32. Priporočljivo je, da zasnova preskusa in izbira statističnega testa zagotavljata ustrezno moč (80 % ali več) opažanja biološko pomembnih sprememb pri končnih točkah, kjer se poroča o NOEC. Poročanje o pomembnih koncentracijah z učinkom in parametrih je lahko odvisno od regulativnega okvira. Če se poroča o ECx, morata zasnova preskusa in izbira regresijskega modela omogočati oceno vrednosti ECx, tako da (i) 95-odstotni interval zaupanja za ECx ne bo vseboval ničle in ne bo preširok, (ii) da 95-odstotni interval zaupanja za napovedano srednjo vrednost ECx ne bo vseboval srednje vrednosti kontrole in (iii) da ne bo statistično značilne neprilagojenosti regresijskega modela podatkom. Pri obeh pristopih je treba opredeliti odstotek spremembe pri vsaki končni točki, ki je pomemben za zaznavanje ali oceno. Preskus mora biti zasnovan tako, da to omogoča. Kadar zgoraj navedeni pogoji za določitev ECx niso izpolnjeni, je treba uporabiti pristop NOEC. Enak odstotek spremembe najverjetneje ne bo veljal za vse končne točke, poleg tega izvedljivega preskusa najverjetneje ne bo mogoče zasnovati tako, da bodo ta merila izpolnjena pri vseh končnih točkah, zato se je treba pri ustreznem načrtovanju preskusa osredotočiti na končne točke, ki so pomembne za preskus. Statistični diagrami in smernice za oba pristopa so na voljo v dodatkih 5 in 6; namenjeni so pomoči pri obdelavi podatkov in izbiri najustreznejšega statističnega testa ali modela. Lahko se uporabijo tudi drugi statistični pristopi, vendar le, če so znanstveno utemeljeni. 33. Variacije je treba v vsakem nizu ponovljenih vzorcev analizirati z analizo variance ali s postopki kontingenčne tabele ter na podlagi zgornje izbire izbrati ustrezne metode statistične analize. Da bi naredili večkratno primerjavo med rezultati pri posameznih koncentracijah in rezultati kontrol, se za zvezne odzive priporoča uporaba regresijskega testa po Jonckheere-Terpstraju ali Williamsov test, za kvantizirane odzive, ki so skladni z monotonim odzivom na koncentracijo in ki ne kažejo ekstra-binomske variance (14), pa se priporoča uporaba regresijskega Cochran-Armitagevega testa. Pri ekstra-binomskih variancah se priporoča Rao-Scottova prilagoditev Cochran-Armitagevega testa (15) (16) ali pa se pri deležih ponovljenih vzorcev uporabi Williamsov test, Dunnettov test (po arkus sinus-korenski pretvorbi) ali test po Jonckheere-Terpstraju. Kadar podatki niso skladni z monotonim odzivom na koncentracijo, je za zvezne odzive uporabna Dunnettova, Dunnova ali Mann-Whitneyjeva metoda, za kvantizirane odzive pa Fisherjev eksaktni test (14) (17) (18). Pri uporabi statističnih metod ali modelov je treba paziti, da so izpolnjene vse zahteve za posamezno metodo ali model (npr. da je v zasnovi preskusa ter uporabljenem preskusu ali modelu ocenjena in upoštevana variabilnost med različnimi komorami). Ovrednotiti je treba normalnost podatkov; v Dodatku 5 je navedeno, kaj je treba storiti z ostanki iz analize variance. V Dodatku 6 so navedeni dodatni napotki za obravnavo regresijskega pristopa. Upoštevati je treba pretvorbe, ki omogočajo izpolnjevanje zahtev statističnega testa. Pri pretvorbah, ki omogočajo ustreznost regresijskega modela, pa je potrebna previdnost, saj na primer 25-odstotna sprememba nepretvorjenega odziva ni enaka 25-odstotni spremembi pretvorjenega odziva. Pri vseh analizah je enota analize in preskusna enota preskusna komora in ne posamezna riba, kar morajo odražati tudi preskusi domnev in regresija (3) (14) (19) (20). Poročilo o preskusu 34. V poročilo o preskusu se vključijo naslednji podatki: Preskusna kemikalija: Snov iz ene sestavine: — fizični videz, topnost v vodi in dodatne pomembne fizikalno-kemijske lastnosti; — kemijski identifikacijski podatki, kot so ime po nomenklaturi IUPAC ali ime CAS, številka CAS, koda po sistemu SMILES ali identifikatorju InChI, strukturna formula, čistost, kemijska identiteta nečistot, kot je ustrezno in praktično izvedljivo, itd. (vključno z vsebnostjo organskega ogljika, če je to ustrezno). Snov z več sestavinami, UVCB in zmesi: — čim obsežnejša opredelitev lastnosti, na primer s kemijsko identiteto (glej zgoraj), kvantitativnim pojavljanjem in ustreznimi fizikalno-kemijskimi lastnostmi sestavin. Preskusna vrsta: — znanstveno ime, sev, vir, metoda zbiranja oplojenih iker in nadaljnje ravnanje. Preskusni pogoji: — uporabljeni preskusni postopek (npr. polstatični ali pretočni, obremenitev); — obdobje osvetljenosti; — zasnova preskusa (npr. število preskusnih komor in ponovljenih vzorcev, število iker na ponovljeni vzorec, material in velikost preskusnih komor (višina, širina, prostornina), prostornina vode na preskusno komoro); — metoda priprave osnovnih raztopin in pogostost obnove (navesti je treba sredstvo za raztapljanje in njegovo koncentracijo, če je to uporabljeno); — metoda odmerjanja preskusne kemikalije (npr. črpalke, sistemi za redčenje); — analitski izkoristek metode in nominalne preskusne koncentracije, meja določljivosti, srednje izmerjene vrednosti in njihovi standardni odkloni v preskusnih posodah ter metoda, po kateri so bile pridobljene, in dokazi, da se meritve nanašajo na koncentracije preskusne kemikalije v dejanski raztopini; — značilnosti vode za redčenje: pH, trdota, temperatura, koncentracija raztopljenega kisika, ravni preostalega klora (če so bile merjene), skupni organski ogljik (če je bil merjen), suspendirane trdne snovi (če so bile merjene), slanost preskusnega medija (če je bila merjena) in druge izvedene meritve; — kakovost vode v preskusnih posodah: pH, trdota, temperatura in koncentracija raztopljenega kisika; — podrobne informacije o hranjenju (npr. vrsta hrane, vir, dana količina in pogostost). V poročilu se navedejo posamezni rezultati (ali rezultati na podlagi ponovljenih vzorcev) ter srednja vrednost in koeficient variacije, kot je ustrezno, za naslednje končne točke: — dokazi, da kontrole ustrezajo standardom sprejemljivega preživetja za to preskusno vrsto (Dodatek 2); — podatki o smrtnosti za posamezne stopnje (zarodek, ličinka, mladica) in skupna smrtnost; — število dni, potrebno, da se izležejo ličinke, število izleženih ličink na dan, konec izvalitve; — število zdravih rib na koncu preskusa; — podatki o dolžini (opredeliti je treba, ali je bila uporabljena standardna ali skupna dolžina) in teži preživelih živali; — pojav, opis in število morebitnih morfoloških anomalij; — pojav, opis in število morebitnih učinkov na vedenje; — pristop k statistični analizi (regresijska analiza ali analiza variance) in obdelava podatkov (uporabljeni statistični test ali model); — koncentracija brez opaznega učinka za vsak ocenjeni odziv (NOEC); — najnižja koncentracija z opaženim učinkom (p = 0,05) za vsak ocenjeni odziv (LOEC); — ECx za vsak ocenjeni odziv, če je ustrezno, intervali zaupanja (npr. 90-odstotni ali 95-odstotni) in graf prilagojenega modela, uporabljenega za izračun, naklon krivulje odziva na koncentracijo, formula regresijskega modela, ocenjeni parametri modela in njihove standardne napake. Odstopanja od preskusne metode Razprava o rezultatih, vključno z vsemi vplivi odstopanj od preskusne metode na rezultat preskusa Preglednica 1 Ribje vrste, priporočene za preskušanje SLADKOVODNE RIBE ESTUARSKE in MORSKE RIBE Oncorhynchus mykiss šarenka Cyprinodon variegatus ovčjeglavi zobati krapovec Pimephales promelas črnoglavi pisanec Menidia sp. gavun Danio rerio cebrica Oryzias latipes japonska medaka VIRI (1) OECD (2012). Fish Toxicity Testing Framework, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment, št. 171. OECD, Pariz. (2) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, št. 23. OECD, Pariz. (3) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials, E 1241–88. 26 str. (4) Brauhn, J. L. in R. A. Schoettger (1975). Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel catfish and Bluegills. Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011. Duluth, Minnesota. (5) Brungs, W. A. in B. R. Jones (1977). Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures. Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota. (6) Adolfsson-Erici et al. (2012). A flow-through passive dosing system for continuously supplying aqueous solutions of hydrophobic chemicals to bioconcentration and aquatic toxicity tests. Chemosphere 86, 593–599. (7) Hutchinson, T. H. et al. (2006). Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Aquatic Toxicology, zv. 76, 69–92. (8) Poglavje C.20 te priloge, Preskus razmnoževanja vrste Daphnia magna. (9) Hansen, D. J. in P. R. Parrish (1977). Suitability of sheepshead minnows (Cyprindon variegatus) for life-cycle toxicity tests. V: Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (ur. F. L. Mayer in J. L. Hamelink). ASTM STP 634. (10) Kimmel, H. B. et al. (1995). Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics, 203: 253–310. (11) Gonzalez-Doncel, M. et al. (2005). A quick reference guide to the normal development of Oryzias latipes (Teleostei, Adrinichthydae) Journal of Applied Ichthyology, 20: 1–14. (12) Devlin, E. W. et al. (1996). Prehatching Development of the Fathead Minnow, Pimephales promelas Rafinesque. EPA/600/R-96/079. USEPA, Office of Research and Development, Washington, D.C. (13) Oris, J. T., S. C. Belanger in A. J. Bailer, (2012). Baseline characteristics and statistical implications for the OECD 210 Fish Early Life Stage Chronic Toxicity Test. Environmental Toxicology and Chemistry 31; 2, 370–376. (14) OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment, št. 54, OECD, Pariz. (15) Rao, J. N. K. in A. J. Scott (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics, zv. 48, 577–585. (16) Rao, J. N. K. in A. J. Scott (1999). A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data. Statistics in Medicine 18, 1373–1385. (17) Dunnett, C. W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. Journal of Ameican Statistical Association, 50, 1096–1121. (18) Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, zv. 20, 482–491. (19) Rand, G. M. in S. R. Petrocelli (1985). Fundamentals of Aquatic Toxicology. Hemisphere Publication Corporation, New York. (20) McClave, J. T., J. H. Sullivan in J. G. Pearson (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data, Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium. ASTM, Philadelphia. Dodatek 1 OPREDELITVE POJMOV Dolžina do razcepa repne plavuti (FL): je dolžina od konice nosu do konca zajede med repnima plavutnicama in se uporablja za ribe, pri katerih je težko določiti, kje se konča hrbtenica (www.fishbase.org). Standardna dolžina (SL): je dolžina ribe od konice nosu do posteriornega konca zadnjega hrbteničnega vretenca ali posteriornega konca osrednjega dela hipuralne plošče, kjer se konča hrbtenica. Ta meritev torej ne vključuje dolžine repne plavuti (www.fishbase.org). Skupna dolžina (TL): je dolžina od konice nosu do skrajnega dela daljšega režnja repne plavuti in se običajno izmeri tako, da sta režnja stisnjena ob sredinski črti. To je meritev, ki se izvede v ravni črti in ne upošteva oblike telesa (www.fishbase.org). Slika 1 Opis različnih uporabljenih dolžin Kemikalija: snov ali zmes. ECx : (učinkovita koncentracija za x-odstotni učinek) je koncentracija, ki v primerjavi s kontrolo povzroči x-odstotni učinek na preskusni organizem v danem obdobju izpostavljenosti. EC50 je na primer koncentracija, pri kateri je ocenjeno, da bo imela v določenem obdobju izpostavljenosti učinek na končno točko preskusa pri 50 % izpostavljene populacije. Najnižja koncentracija z opaženim učinkom (LOEC) je najnižja preskušena koncentracija preskusne kemikalije, pri kateri se opazi, da ima kemikalija statistično značilen učinek (pri p < 0,05) v primerjavi s kontrolo. Vendar bi morale imeti vse preskusne koncentracije nad vrednostjo LOEC škodljiv učinek, ki je enak ali večji od škodljivega učinka, opaženega pri vrednosti LOEC. Če teh dveh pogojev ni mogoče izpolniti, bi bilo treba podrobno pojasniti izbiro vrednosti LOEC (in s tem tudi NOEC). Smernice so zajete v dodatkih 5 in 6. Koncentracija brez opaznega učinka (NOEC) je preskusna koncentracija takoj pod vrednostjo LOEC, ki v primerjavi s kontrolo nima statistično značilnega učinka (p < 0,05) v danem obdobju izpostavljenosti. Preskusna kemikalija: vsaka snov ali zmes, preskušena s to preskusno metodo. UVCB: snovi z neznano ali spremenljivo sestavo, kompleksni reakcijski produkti ali biološki materiali. IUPAC: Mednarodna zveza za čisto in uporabno kemijo. SMILES: sistem za poenostavljen zapis strukture molekul. Dodatek 2 PRESKUSNI POGOJI, TRAJANJE IN MERILA PREŽIVETJA ZA PRIPOROČENE VRSTE VRSTE PRESKUSNI POGOJI PRIPOROČENO TRAJANJE PRESKUSA Tipična najmanjša srednja skupna dolžina kontrolnih rib na koncu študije (mm) (98) PREŽIVETJE V KONTROLAH (najmanjši %) Temperatura (°C) Slanost (0/00) Obdobje osvetljenosti (ure) Uspeh izvalitve Preživetje po izvalitvi Sladkovodne ribe: Oncorhynchus mykiss šarenka 10 ± 1,5 (99) 12–16 (100) 2 tedna po tem, ko se kontrolne ribe začnejo hraniti same (ali 60 dni po izvalitvi) 40 75 % 75 % Pimephales promelas črnoglavi pisanec 25 ± 1,5 16 32 dni od začetka preskusa (ali 28 dni po izvalitvi) 18 70 % 75 % Danio rerio cebrica 26 ± 1,5 12–16 (101) 30 dni po izvalitvi 11 70 % 75 % Oryzias latipes japonska medaka 25 ± 2 12–16 (101) 30 dni po izvalitvi 17 80 % 80 % Estuarske in morske ribe: Cyprinodon variegatus ovčjeglavi zobati krapovec 25 ± 1,5 15–35 (102) 12–16 (101) 32 dni od začetka preskusa (ali 28 dni po izvalitvi) 17 75 % 80 % Menidia sp. gavun 22–25 15–35 (102) 13 28 dni 20 80 % 60 % Dodatek 3 NAVODILA ZA HRANJENJE PLEMENSKIH RIB IN PRESKUSNIH ŽIVALI PRIPOROČENIH VRST TER RAVNANJE Z NJIMI VRSTE HRANA (*9) ČAS PRENOSA PO IZVALITVI ČAS DO PRVEGA HRANJENJA Plemenske ribe Pravkar izležene ličinke Mladice Vrsta Pogostost Sladkovodne ribe: Oncorhynchus mykiss šarenka hrana za postrvi brez (1) začetna hrana za postrvi BSN 2–4 hranjenja na dan 14–16 dni po izvalitvi ali ob splavanju (ni nujno) 19 dni po izvalitvi ali splavanju Pimephales promelas črnoglavi pisanec BSN, hrana v kosmičih, FBS BSN BSN48, hrana v kosmičih 2–3 hranjenja na dan ob 90-odstotni izvalitvi 2 dneva po izvalitvi Danio rerio cebrica BSN, hrana v kosmičih komercialna hrana za ličinke, praživali (2), beljakovine (3) BSN48, hrana v kosmičih BSN enkrat na dan, hrana v kosmičih dvakrat na dan ob 90-odstotni izvalitvi 2 dneva po izvalitvi Oryzias latipes japonska medaka hrana v kosmičih BSN, hrana v kosmičih (ali praživali ali kotačniki) BSN48, hrana v kosmičih (ali kotačniki) BSN enkrat na dan, hrana v kosmičih dvakrat na dan ali hrana v kosmičih in kotačniki enkrat na dan ni relevantno 6–7 dni po drstitvi Estuarske in morske ribe: Cyprinodon variegatus ovčjeglavi zobati krapovec BSN, hrana v kosmičih, FBS BSN BSN48 2–3 hranjenja na dan ni relevantno 1 dan po izvalitvi/splavanju Menidia sp. gavun BSN48, hrana v kosmičih BSN BSN48 2–3 hranjenja na dan ni relevantno 1 dan po izvalitvi/splavanju Dodatek 4 NEKATERE KEMIJSKE LASTNOSTI SPREJEMLJIVE VODE ZA REDČENJE Sestavina Mejna koncentracija delci 5 mg/l skupni organski ogljik 2 mg/l neionizirani amonijak 1 μg/l preostali klor 10 μg/l skupni organofosforni pesticidi 50 ng/l skupni organoklorni pesticidi in poliklorirani bifenili 50 ng/l skupni organski klor 25 ng/l aluminij 1 μg/l arzen 1 μg/l krom 1 μg/l kobalt 1 μg/l baker 1 μg/l železo 1 μg/l svinec 1 μg/l nikelj 1 μg/l cink 1 μg/l kadmij 100 ng/l živo srebro 100 ng/l srebro 100 ng/l Dodatek 5 STATISTIČNE SMERNICE ZA DOLOČITEV VREDNOSTI NOEC Splošno Enota analize je ponovitveni akvarij. Pri neprekinjenih meritvah, kot je meritev velikosti, je treba izračunati srednjo vrednost ali mediano ponovljenih vzorcev, te vrednosti ponovljenih vzorcev pa so podatki, ki se uporabijo za analizo. Dokazati je treba moč uporabljenih preskusov, po možnosti na podlagi ustrezne zbirke preteklih podatkov za vsak laboratorij. Za vsako končno točko pri statističnem testu, ki bo uporabljen, je treba navesti učinek na velikost, ki ga je mogoče opaziti s 75- do 80-odstotno močjo. V zbirkah podatkov, ki so bile na voljo v času razvoja te preskusne metode, se določi možna moč ob uporabi priporočljivih statističnih postopkov. Posamezni laboratorij mora dokazati, da lahko izpolnjuje to zahtevo po moči, tako da sam izvede analizo moči ali dokaže, da koeficient variacije (v nadaljnjem besedilu: KV) za vsak odziv ne presega 90. centila KV, uporabljenih pri pripravi smernic za preskušanje. Ti KV so navedeni v preglednici 1. Če so na voljo le srednje vrednosti ali mediane ponovljenih vzorcev, KV znotraj ponovljenega vzorca ni treba upoštevati. Preglednica 1 90. centil KV pri izbranih sladkovodnih vrstah Vrsta Odziv KV med ponovljenimi vzorci KV znotraj ponovljenega vzorca šarenka dolžina 17,4 9,8 teža 10,1 28 črnoglavi pisanec dolžina 16,9 13,5 teža 11,7 38,7 cebrica dolžina 43,7 11,7 teža 11,9 32,8 Pri skoraj vseh statističnih testih, ki se uporabljajo za oceno laboratorijskih toksikoloških študij, so najpogostejše primerjave med tretiranimi skupinami in kontrolo. Zato ni ustrezno zahtevati F-testa statistične značilnosti z analizo variance pred uporabo Dunnettovega ali Williamsovega testa oziroma Kruskal-Wallisovega testa statistične značilnosti pred uporabo testa po Jonckheere-Terpstraju, Mann-Whitneyjevega testa ali Dunnovega testa (Hochberg in Tamhane 1987; Hsu 1996; Dunnett 1955, 1964; Williams 1971, 1972, 1975, 1977; Robertson et al. 1988; Jonckheere 1954; Dunn 1964). Dunnettov test vključuje prilagoditev številčnosti, na deleža lažno pozitivnih in lažno negativnih rezultatov pri njem pa negativno vpliva uporaba F-testa za referenco. Podobno regresijski Williamsov test in regresijski test po Jonckheere-Terpstraju, pri katerih se ves čas uporablja stopnja značilnosti 0,05, ohranjata splošni 5-odstotni delež lažnih pozitivnih rezultatov, na ta delež in moč preskusov pa negativno vpliva uporaba F-testa ali Kruskal-Wallisovega testa za referenco. Mann-Whitneyjev in Dunnov test je treba prilagoditi številčnosti, pri čemer se priporoča Bonferroni-Holmova prilagoditev. Za podrobno razpravo o večini priporočil glede preskušanja domnev in preverjanja predpostavk, na katerih temeljijo ti testi, glej OECD (2006), ki vsebuje tudi obširno bibliografijo. Tretiranje kontrol, če se uporabi topilo Če se uporabi topilo, je treba vključiti kontrolo z vodo za redčenje in kontrolo s topilom. Obe kontroli je treba primerjati pri vsakem odzivu in ju združiti za statistično analizo, če med njima niso bile ugotovljene značilne razlike. Sicer je treba za določitev vrednosti NOEC ali oceno ECx uporabiti kontrolo s topilom, kontrola z vodo pa se ne uporabi. Glej omejitve meril za veljavnost preskusa (odstavek 7). Pri dolžini, teži in deležu izleženih iker, umrlih ličink ali nenormalnih ličink ter prvem ali zadnjem dnevu valitve ali splavanja je treba uporabiti T-test ali Mann-Whitneyjev test za primerjavo kontrole z vodo za redčenje in kontrole s topilom z ravnjo značilnosti 0,05, pri čemer tretirane skupine niso upoštevane. Rezultate teh testov je treba vključiti v poročilo. Meritve velikosti (dolžina in teža) Podatki o dolžini in teži posameznih rib so lahko porazdeljeni normalno ali logaritemsko normalno. V obeh primerih so srednje vrednosti ponovljenih vzorcev običajno normalno porazdeljene s centralnim limitnim izrekom in potrjene na podlagi podatkov iz več kot 100 študij o zgodnjih razvojnih fazah treh sladkovodnih vrst. Kadar podatki ali zbirke preteklih podatkov kažejo na logaritemsko normalno porazdelitev podatkov o velikosti posameznih rib, se lahko namesto tega za vrednosti pri posameznih ribah logaritmirajo srednje vrednosti ponovljenih vzorcev, podatki za analizo pa so lahko nato antilogaritem teh logaritmov srednjih vrednosti ponovljenih vzorcev. Oceniti je treba skladnost podatkov z normalno porazdelitvijo in homogenostjo variance. Za ta namen je treba uporabiti ostanke iz analize variance, pri čemer je koncentracija edina razlagalna razredna spremenljivka. Lahko se uporabi vizualno določanje z razsevnih grafikonov in histogramov ali histogramov s številkami. Namesto tega se lahko uporabi formalni test, na primer Shapiro-Wilkov ali Anderson-Darlingov test. Skladnost s homogenostjo variance se lahko oceni z vizualnim pregledom omenjenega razsevnega grafikona ali formalno z Levenejevim testom. Normalnost ali homogenost variance je treba oceniti samo pri parametričnih testih (npr. Williamsov ali Dunnettov test). Pozornost je treba nameniti možnim osamelcem in njihovemu vplivu na analizo. Uporabita se lahko Tukeyjev test osamelcev in vizualni pregled zgoraj opisanih prikazov ostankov. Opozoriti je treba, da opazovanja vključujejo celotne ponovljene vzorce, zato se osamelci izločijo iz analize šele po temeljitem premisleku. Statistični testi, ki upoštevajo značilnosti zasnove preskusa in biološka pričakovanja, so regresijski trendnostni testi, kot sta Williamsov test ali test po Jonckheere-Terpstraju. Ti testi predvidevajo monoton odziv na koncentracijo, zato je treba skladnost podatkov oceniti ob upoštevanju te predpostavke. Mogoča je vizualna ocena razsevnega grafikona srednjih vrednosti ponovljenih vzorcev v odvisnosti od preskusnih koncentracij. Pri tem se lahko razsevni grafikon prekrije z razdeljenim linearnim grafom, kar omogoči povezavo srednjih vrednosti koncentracij, uteženih z velikostjo ponovljenega vzorca. Veliko odstopanje razdeljenega linearnega grafa od monotonosti pomeni, da bo morda treba uporabiti netrendnostne teste. Namesto tega se lahko uporabijo formalni testi. Preprost formalni test je izračun linearnih in kvadratnih kontrastov srednjih vrednosti koncentracij. Če je kvadratni kontrast statistično značilen, linearni kontrast pa ni, to pomeni, da morda obstaja težava, povezana z monotonostjo, ki jo je treba nadalje ovrednotiti na podlagi prikazov. Pri težavah z normalnostjo ali homogenostjo variance se lahko ti kontrasti oblikujejo na podlagi podatkov o pretvorbi porazdelitve. Uporabijo se lahko tudi drugi postopki, na primer Bartholomewjev test monotonosti, vendar so ti kompleksnejši. Slika 2 Diagram poteka za določitev vrednosti NOEC pri meritvah velikosti (dolžina in teža) Razen če podatki niso skladni z zahtevami zanju, se vrednosti NOEC določijo z regresijsko uporabo Williamsovega testa ali testa po Jonckheere-Terpstraju. Za podrobnosti o teh postopkih glej OECD (2006). Za podatke, ki niso skladni z zahtevami za regresijski trendnostni test, se lahko uporabita Dunnettov test ali Tamhane-Dunnettov (T3) test, ki vključujeta prilagoditev številčnosti. Oba testa predpostavljata normalnost, Dunnettov test pa tudi homogenost variance. Kadar navedeni pogoji niso izpolnjeni, se lahko uporabi Dunnov neparametrični test. Za podrobnosti o teh testih glej OECD (2006). Slika 2 prikazuje, kako se odločiti za pravi test. Izvalitev iker in preživetje ličink Podatki se nanašajo na delež iker, ki se izležejo, ali ličink, ki preživijo v posameznih ponovljenih vzorcih. Pri teh deležih je treba oceniti ekstrabinomsko varianco, ki je pri takih meritvah običajna, ni pa splošna. Diagram poteka na sliki 3 je smernica za izbiro ustreznega testa; glej besedilo za podrobne opise. Običajno se uporabljata dva testa. To sta Taronejev C(α)-test (Tarone 1979) in test hi-kvadrat, ki se posebej uporabita pri vsaki preskusni koncentraciji. Če se ekstra-binomska varianca odkrije celo pri eni sami preskusni koncentraciji, je treba uporabiti metode, ki so primerne za to. Formula 1 Taronejev C(α)-test (Tarone 1979) pri čemer je ̂ srednja vrednost deleža pri določeni koncentraciji, m je število ponovitvenih akvarijev, nj je število osebkov v ponovljenem vzorcu j, xj pa število osebkov v navedenem ponovljenem vzorcu, ki se na primer niso izlegli ali so umrli. Ta test se uporabi za vsako koncentracijo posebej. Ta test nekateri vidijo kot prilagojeni test hi-kvadrat, vendar so omejene simulacije moči, ki jih je izvedel Tarone, pokazale, da ima večjo moč od testa hi-kvadrat. Slika 3 Diagram poteka za določitev vrednosti NOEC pri izvalitvi iker in smrtnosti ličink Kadar ne obstajajo statistično značilni dokazi o ekstra-binomski varianci, se lahko uporabi regresijski Cochran-Armitagev test. Ta test ne upošteva ponovljenih vzorcev, zato se pri obstoju takih dokazov priporoča uporaba Rao-Scottove prilagoditve Cochran-Armitagevega testa (RSCA), ki upošteva ponovljene vzorce, velikost ponovljenih vzorcev in ekstra-binomsko varianco. Uporabiti je mogoče tudi regresijski Williamsov test, regresijski test po Jonckheere-Terpstraju in Dunnettov test, kakor so opisani za meritve velikosti. Ti testi se lahko uporabijo ne glede na to, ali obstaja ekstra-binomska varianca, vendar je njihova moč nekoliko manjša (Agresti 2002; Morgan 1992; Rao in Scott 1992, 1999; Fung et al. 1994, 1996). Prvi ali zadnji dan valitve ali splavanja Odziv je celo število, ki označuje preskusni dan, ko je bila opažena navedena opazka za določen ponovitveni akvarij. Območje vrednosti je običajno zelo omejeno in deleži povezanih vrednosti so običajno visoki, npr. vsi ponovljeni kontrolni vzorci imajo isti prvi dan valitve, ta pa je isti tudi pri eni ali dveh nizkih preskusnih koncentracijah. Parametrični testi, kot sta Williamsov in Dunnettov test, niso primerni za te podatke. Če ni dokazov o resni nemonotonosti, ima regresijski test po Jonckheere-Terpstraju veliko moč zaznavanja učinkov preskusne kemikalije. V nasprotnem primeru se lahko uporabi Dunnov test. Anomalije pri ličinkah Odziv je število ličink, pri katerih se odkrijejo kakršne koli anomalije. Ta odziv ima pogosto nizko pojavnost, pri njem se pojavljajo nekatere težave, ki so prisotne pri določanju prvega dneva valitve, včasih pa je zanj značilna tudi neenakomernost pri odzivu na koncentracijo. Če podatki vsaj približno sledijo monotoni krivulji koncentracije, je regresijski test po Jonckheere-Terpstraju dovolj močan za zaznavanje učinkov. V nasprotnem primeru se lahko uporabi Dunnov test. Viri Agresti, A. (2002). Categorical Data Analysis, druga izdaja. Wiley, Hoboken. Dunnett, C. W. (1955). A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control. J. American Statistical Association, št. 50, 1096–1121. Dunn, O. J. (1964). Multiple Comparisons Using Rank Sums. Technometrics, št. 6, 241–252. Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, zv. 20, 482–491. Fung, K. Y., D. Krewski, J. N. K. Rao, A. J. Scott (1994). Tests for Trend in Developmental Toxicity Experiments with Correlated Binary Data. Risk Analysis, št. 14, 639–648. Fung, K. Y., D. Krewski, R. T. Smythe (1996). A comparison of tests for trend with historical controls in carcinogen bioassay. Canadian Journal of Statistics, št. 24, 431–454. Hochberg, Y. in A. C. Tamhane (1987). Multiple Comparison Procedures. Wiley, New York. Hsu, J. C. (1996). Multiple Comparisons: Theory and Methods. Chapman and Hall/CRC Press, Boca Raton. Jonckheere, A. R. (1954). A distribution-free k-sample test against ordered alternatives. Biometrika, št. 41, 133. Morgan, B. J. T. (1992). Analysis of Quantal Response Data. Chapman and Hall, London. OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series on Testing and Assessment, št. 54. Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj (OECD), Pariz. Rao, J. N. K. in Scott A. J. (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics, zv. 48, 577–585. Rao, J. N. K. in Scott A. J. (1999). A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data. Statistics in Medicine, št. 18, 1373–1385. Robertson, T., Wright F. T. in Dykstra R. L. (1988). Order restricted statistical inference. Wiley. Tarone, R. E. (1979). Testing the goodness of fit of the Binomial distribution. Biometrika, št. 66, 585–590. Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, zv. 27, 103–117. Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, zv. 28, 519–531. Williams, D. A. (1975). The Analysis of Binary Responses from Toxicological Experiments Involving Reproduction and Teratotlogy. Biometrics zv. 31, 949–952. Williams, D. A. (1977). Some inference procedures for monotonically ordered normal means. Biometrika št. 64, 9–14. Dodatek 6 STATISTIČNE SMERNICE ZA REGRESIJSKE OCENE Splošno Opazovanja, uporabljena za prilagoditev modela, so srednje vrednosti ponovljenih vzorcev (dolžina in teža) ali deleži ponovljenih vzorcev (izležene ikre in smrtnost ličink) (OECD 2006). Običajno se priporoča utežena regresija, ki za utež uporablja velikost ponovljenega vzorca. Mogoči so tudi drugi načrti uteženja, kot je uteženje s predvideno srednjo vrednostjo odziva ali kombinacija tega in velikosti ponovljenega vzorca. Uteženje z obratno vrednostjo variance znotraj vzorca koncentracije ni priporočljivo (Bunke et al. 1999; Seber in Wild 2003; Motulsky in Christopoulos 2004; Huet et al. 2003). Pri vseh pretvorbah odzivov pred analizo je treba ohraniti neodvisnost opazovanj in ECx, njihove meje zaupanja pa je treba izraziti v izvirnih enotah meritve in ne v pretvorjenih enotah. 20-odstotna sprememba logaritma dolžine na primer ne ustreza 20-odstotni spremembi dolžine (Lyles et al. 2008; Draper in Smith 1999). V diagramu poteka na sliki 4 je predstavljen pregled ocen ECx. Podrobnosti so opisane v spodnjem besedilu. Slika 4 Diagram poteka za oceno ECx srednjih vrednosti ponovljenih vzorcev pri meritvah dolžine, teže, deleža izleženih iker ali umrlih ličink; za več podrobnosti glej besedilo Obravnavanja izvalitve iker in smrtnosti ličink Za izvalitev iker in smrtnost ličink je običajno najbolje prilagoditi padajoči model, lahko pa se prilagodi probit model, kot je opisano spodaj. To pomeni, da je treba modelirati delež iker, ki se ne izležejo, ali ličink, ki umrejo. ECx se namreč nanaša na koncentracijo, pri kateri se zgodi sprememba, ki ustreza x % srednje vrednosti odziva v kontroli. Če se ne izleže 5 % kontrolnih iker in se modelira neuspešnost izvalitve, se EC20 nanaša na koncentracijo, pri kateri se zgodi sprememba, ki ustreza 20 % 5-odstotne neuspešnosti izvalitve v kontroli, to pa je sprememba v višini 0,2 * 0,05 = 0,01 ali 1 odstotne točke 6-odstotne neuspešnosti izvalitve. Tako majhna sprememba se ne more smiselno oceniti na podlagi razpoložljivih podatkov in ni biološko pomembna. Če pa bi se modeliral delež izleženih iker, bi bil kontrolni delež v zgornjem primeru 95 %, 20-odstotno zmanjšanje srednje vrednosti v kontroli pa bi pomenilo spremembo v višini 0,95 * 0,2 = 0,18, tj. spremembo s 95-odstotne uspešnosti izvalitve na 77-odstotno (= 95 – 18) uspešnost izvalitve, to pa je koncentracija z učinkom, ki se lahko oceni in bo za raziskovalce najverjetneje zanimivejša. To ne velja za meritve velikosti, čeprav škodljivi učinki na velikost običajno pomenijo zmanjšanje velikosti. Modeli za velikost (dolžina ali teža), uspešnost izvalitve iker in preživetje ličink Razen Brain-Cousensovega hormetičnega modela so vsi modeli opisani in priporočeni v OECD (2006). Tako imenovani modeli OECD 2–5 so poleg tega obravnavani v okviru preskusov ekotoksičnosti v Slob (2002). Seveda obstajajo tudi številni drugi modeli, ki bi lahko bili uporabni. Bunke et al. (1999) navajajo številne modele, ki niso navedeni tukaj, poleg tega obstaja mnogo sklicevanj na druge modele. Spodaj navedeni modeli so predlagani kot posebej ustrezni za ekotoksikološke preskuse in se pogosto uporabljajo. Pri 5 preskusnih koncentracijah in kontroli: — Bruce-Versteegov model, — preprosti eksponentni model (OECD 2), — eksponentni model s parametrom oblike (OECD 3), — preprosti eksponentni model s spodnjo mejo (OECD 4). Pri 6 ali več preskusnih koncentracijah in kontroli: — eksponentni model s parametrom oblike in spodnjo mejo (OECD 5), — Michaelis-Mentenov model, — Hillov model. Kadar je vidna hormeza (najverjetneje ne pri uspešnosti izvalitve iker ali preživetju ličink, včasih pa pri opazovanjih velikosti): — Brain-Cousensov hormetični model (Brain in Cousens 1989). Drugi modeli za neuspešnost izvalitve iker in smrtnost ličink — Modeli za naraščajoče vrednosti teh odzivov se lahko ob odsotnosti ekstra-binomske variance prilagodijo s probit (ali logističnimi) modeli, nato se v prilagoditvi modela oceni kontrolna pojavnost. To ni najbolj priporočljiva metoda, saj kot enoto analize upošteva posamezni osebek in ne ponovljeni vzorec (Morgan 1992; O'Hara Hines in Lawless 1993; Collett 2002, 2003). Prileganje posameznih modelov — Vizualno je treba primerjati opaženo in predvideno odstotno zmanjšanje pri vsaki preskusni koncentraciji (Motulsky in Christopoulos 2004; Draper in Smith 1999). — Z F-testom se srednja kvadratna napaka regresije primerja s čisto srednjo kvadratno napako (Draper in Smith 1999). — Preveriti je treba, ali se vse postavke v modelu statistično značilno razlikujejo od ničle (tj. določite, ali so postavke modela statistično značilne) (Motulsky in Christopoulos 2004). — Pregled ostankov iz regresije se primerja s preskusnimi koncentracijami, po možnosti na logaritemski skali za koncentracije. Ta pregled ne sme vsebovati vzorcev; točke morajo biti naključno razporejene okoli vodoravne črte pri ničelni višini. — Oceniti je treba skladnost podatkov z normalno porazdelitvijo in homogenostjo variance, kot je navedeno v Dodatku 5. — Poleg tega je treba oceniti normalnost ostankov iz regresijskega modela, pri čemer se uporabijo metode, ki so v Dodatku 5 navedene za ostanke iz analize variance. Primerjava modelov — Uporabiti je treba Akaikejev informacijski kriterij AICc. Manjše vrednosti AICc pomenijo boljše prileganje, in če je AICc(B) – AICc(A) ≥ 10, je model A skoraj zagotovo boljši od modela B (Motulsky in Christopoulos 2004). — Vizualna primerjava obeh modelov bo razkrila, kako dobro izpolnjujeta zgornja merila za posamezne modele. — Priporoča se upoštevanje načela varčnosti, po katerem se uporabi najpreprostejši model, ki se razmeroma dobro prilega podatkom (Ratkowsky 1993; Lyles et al. 2008). Kakovost ocene ECx Interval zaupanja za ECx ne sme biti preširok. Za določitev največje širine intervala zaupanja, ki bo še zagotavljala uporabnost ECx, je potrebna statistična presoja. Simulacije regresijskih modelov, prilagojenih valitvi iker in podatkom o velikosti, kažejo, da približno 75 % intervalov zaupanja za ECx (x = 10, 20 ali 30) zajema največ dve preskusni koncentraciji. To je splošna smernica o tem, kaj je sprejemljivo, in praktična smernica o tem, kaj je mogoče doseči. Številni avtorji trdijo, da bi bilo treba intervale zaupanja za vse parametre modelov vključiti v poročilo in da široki intervali zaupanja za parametre modelov kažejo nesprejemljivost modelov (Ott in Longnecker 2008; Alvord in Rossio 1993; Motulsky in Christopoulos 2004; Lyles et al. 2008; Seber in Wild 2003; Bunke et al. 1999; Environment Canada 2005). Interval zaupanja za ECx (ali kateri koli drug parameter modela) ne sme vključevati ničle (Motulsky in Christopoulos 2004). V regresijskih modelih je to ekvivalent najmanjše značilne razlike, ki se pogosto navaja pri pristopih s preskušanjem predpostavk (npr. Wang et al. 2000). Ustreza tudi intervalu zaupanja za srednje vrednosti odzivov pri LOEC, ki niso zajete v srednjo vrednost v kontroli. Treba se je vprašati, ali je parametre mogoče znanstveno oceniti. Če je interval zaupanja za y0 na primer ± 20 %, ocena EC10 ni verodostojna. Če model predvideva 20-odstotni učinek pri koncentraciji C, največji opaženi učinek pri koncentraciji C in nižjih koncentraciji pa je 10-odstoten, ocena EC20 ni verodostojna (Motulsky in Christopoulos 2004; Wang et al. 2000; Environment Canada 2005). ECx ne bi smela zahtevati ekstrapolacije zunaj območja pozitivnih koncentracij (Draper in Smith 1999; OECD 2006). Splošna smernica bi lahko bila, da ECx ne sme biti za več kot približno 25 % nižja od najnižje ali višja od najvišje preskušene koncentracije. Viri Alvord, W. G., Rossio, J. L. (1993). Determining confidence limits for drug potency in immunoassay. Journal of Immunological Methods št. 157, 155–163. Brain, P. in Cousens, R. (1989). An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed res. zv. 29: 93–96. Bunke, O., Droge, B. in Polzehl, J. (1999). Model selection, transformations and variance estimation in nonlinear regression. Statistics, št. 33, 197–240. Collett, D. (2002). Modelling Binary Data, druga izdaja. Chapman and Hall, London. Collett, D. (2003). Modelling Survival Data in Medical Research, druga izdaja. Chapman and Hall, London. Draper, N. R., in Smith, H. (1999). Applied Regression Analysis, tretja izdaja. New York: John Wiley & Sons. Environment Canada (2005). Guidance Document on Statistical Methods for Environmental Toxicity Tests, Report EPS 1/RM/46. Huet, S., A. Bouvier, M.-A. Poursat, E. Jolivet (2003). Statistical Tools for Nonlinear Regression: A Practical Guide with S-PLUS and R Examples. Springer Series in Statistics, New York. Lyles, R. H., C. Poindexter, A. Evans, M. Brown in C. R. Cooper (2008). Nonlinear Model-Based Estimates of IC50 for Studies Involving Continuous Therapeutic Dose-Response Data. Contemp Clin Trials, november 2008, št. 29(6): 878–886. Morgan, B. J. T. (1992). Analysis of Quantal Response Data. Chapman and Hall, London. Motulsky, H., A. Christopoulos (2004). Fitting Models to Biological Data Using Linear and Nonlinear Regression: A Practical Guide to Curve Fitting. Oxford University Press, ZDA. O'Hara Hines, R. J. and J. F. Lawless (1993). Modelling Overdispersion in Toxicological Mortality Data Grouped over Time. Biometrics, zv. 49, str. 107–121. OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series Testing and Assessment, št. 54. Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, OECD, Pariz. Ott, R. L., M. T. Longnecker (2008). An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, šesta izdaja. Brooks-Cole, Belmont, California. Ratkowsky, D. A. (1993). Principles of nonlinear regression. Journal of Industrial Microbiology, št. 12, 195–199. Seber, G. A. F., C. J. Wild (2003). Nonlinear Regression. Wiley. Slob W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci., št. 66, 298–312. Wang, Q., D. L. Denton in R. Shukla (2000). Applications and Statistical Properties Of Minimum Significant Difference-Based Criterion Testing In a Toxicity Testing Program. Environmental Toxicology and Chemistry, zv. 19, str. 113–117, 2000. C.48 Kratkotrajni preskus razmnoževanja rib. UVOD 1. Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici za preskušanje OECD (TG) 229 (2012). Preskus z ribami, s katerim je mogoče zaznati nekatere kemikalije z endokrinim delovanjem, je treba razviti in validirati zaradi pomislekov, da bi lahko okoljske ravni kemikalij zaradi interakcije teh kemikalij z endokrinim sistemom povzročile škodljive učinke za ljudi in prostoživeče živali. OECD se je leta 1998 začela ukvarjati s prednostno nalogo revidiranja obstoječih smernic ter priprave novih smernic za presejalne preskuse in preskušanje možnih povzročiteljev endokrinih motenj. Del naloge je bila priprava smernic za presejalno preskušanje kemikalij, ki so aktivne v endokrinem sistemu ribjih vrst. Kratkotrajni preskus razmnoževanja rib je prestal obsežen validacijski program, ki je vključeval medlaboratorijske študije z izbranimi kemikalijami, s katerimi sta bili dokazani ustreznost in zanesljivost preskusa za zaznavanje kemikalij, ki vplivajo na razmnoževanje rib z različnimi mehanizmi, vključno z endokrinimi načini (1) (2) (3) (4) (5). Vse končne točke iz smernic za preskušanje OECD so bile potrjene pri črnoglavem pisancu, podniz končnih točk pa je bil potrjen pri japonski medaki (tj. vitelogenin in sekundarne spolne značilnosti) in cebrici (tj. vitelogenin). Delo v zvezi s potrditvijo je delno medsebojno strokovno pregledala skupina strokovnjakov, ki so jih imenovali nacionalni koordinatorji programa smernic za preskušanje OECD (6), delno pa neodvisna skupina strokovnjakov, ki jih je najela Agencija ZDA za varstvo okolja (29). Preskus ni namenjen opredelitvi posebnih mehanizmov hormonskih motenj, ker imajo preskusne živali nepoškodovano os hipotalamus – hipofiza – spolne žleze (v nadaljnjem besedilu: os HPG), ki se lahko odziva na kemikalije, ki vplivajo na os HPG na različnih ravneh. 2. V tej preskusni metodi je opisan presejalni preskus in vivo, v katerem se spolno zreli ribji samci in drsteče se ribje samice zadržujejo skupaj ter so izpostavljeni kemikaliji v omejenem delu svojega življenjskega cikla (21 dni). Ob koncu 21-dnevnega obdobja izpostavljenosti se pri samcih in samicah izmerita dve biološko označevalni končni točki kot indikatorja endokrinega delovanja preskusne kemikalije; ti končni točki sta vitelogenin in sekundarne spolne značilnosti. Vitelogenin se meri pri črnoglavem pisancu, japonski medaki in cebrici, sekundarne spolne značilnosti pa pri črnoglavem pisancu in japonski medaki. Poleg tega se vsak dan med celotnim preskusom spremlja kvantitativna plodnost. Spolne žleze se shranijo in lahko se oceni histopatologija, da se ugotovi, ali so preskusne živali sposobne za razmnoževanje, in se okrepi zanesljivost dokazov za druge končne točke. 3. Ta biološki preskus je presejalna študija razmnoževanja in vivo, njegovo uporabo pa je treba obravnavati v okviru temeljnega okvira OECD za preskušanje in oceno kemikalij, ki povzročajo endokrine motnje (ang. OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals) (30). V tem temeljnem okviru je kratkotrajni preskus razmnoževanja rib predlagan na ravni 3 kot preskus in vivo, ki zagotavlja podatke o izbranih endokrinih mehanizmih/poteh. ZAČETNI PREUDARKI IN OMEJITVE 4. Vitelogenin (v nadaljnjem besedilu: VTG) običajno proizvajajo jetra samic oviparnih vretenčarjev kot odziv na endogeni estrogen v krvnem obtoku. Je predhodna sestavina beljakovin jajčnega rumenjaka, ki po nastanku v jetrih potuje po krvožilju do jajčnika, kjer jo absorbirajo in spremenijo razvijajoča se jajčeca. Vitelogenina v plazmi nezrelih ribjih samic in samcev skoraj ni mogoče zaznati, ker nimajo dovolj estrogena v obtoku; jetra pa so sposobna sinteze in izločanja vitelogenina kot odziv na spodbujanje z eksogenim estrogenom. 5. Meritev vitelogenina je namenjena zaznavanju kemikalij z različnimi estrogenimi načini delovanja. Estrogene kemikalije je mogoče zaznati z merjenjem indukcije vitelogenina pri ribjih samcih in je bilo obsežno dokumentirano v medsebojno strokovno pregledani znanstveni literaturi (npr. (7)). Indukcija vitelogenina je bila dokazana tudi po izpostavljenosti androgenom, ki se lahko aromatizirajo (8) (9). Zaradi zmanjšanja ravni estrogena v krvnem obtoku pri samicah, na primer z zaviranjem aromataze, ki spremeni endogeni androgen v naravni estrogen 17β-estradiol, se zmanjša raven VTG, ki se uporablja za zaznavanje kemikalij, ki imajo lastnosti zaviranja aromataze (10) (11). Biološka pomembnost odziva vitelogenina na zaviranje estrogena/aromataze je bila dokazana in obsežno dokumentirana. Vendar je mogoče, da lahko na nastajanje VTG pri samicah vplivajo tudi splošna toksičnost in neendokrini toksični načini delovanja, npr. hepatotoksičnost. 6. Več merilnih metod je bilo uspešno pripravljenih in standardiziranih za redno uporabo. Med njimi so metode encimskega imunskega testa (ELISA), ki so specifične za posamezne vrste in uporabljajo imunokemijo za kvantifikacijo VTG, nastalega v majhnih vzorcih krvi ali jeter, ki so bili odvzeti pri posameznih ribah (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18). Za meritev VTG se vzorčijo kri črnoglavega pisanca, kri ali homogenat glave/repa cebrice in jetra medake. Pri medaki je korelacija med VTG, izmerjenim v krvi, in VTG, izmerjenim v jetrih, dobra (19). V Dodatku 6 so navedeni priporočeni postopki za odvzem vzorcev za analizo VTG. Kompleti za merjenje VTG so splošno dostopni; taki kompleti morajo temeljiti na validirani metodi ELISA, specifični za posamezno vrsto. 7. Sekundarne spolne značilnosti ribjih samcev nekaterih vrst so vidne že navzven, mogoče jih je kvantificirati in se odzivajo na ravni endogenih androgenov v krvnem obtoku; to velja za črnoglavega pisanca in medako, vendar ne za cebrico, ki nima sekundarnih spolnih značilnosti, ki bi jih bilo mogoče kvantificirati. Samice so sposobne razviti moške sekundarne spolne značilnosti, če so izpostavljene androgenim kemikalijam v vodi. V znanstveni literaturi je na voljo več študij, ki dokumentirajo te vrste odziva pri črnoglavem pisancu (20) in medaki (21). Zmanjšanje sekundarnih spolnih značilnosti pri samcih je treba zaradi majhne statistične moči razlagati previdno, pri čemer mora razlaga temeljiti na strokovni presoji in zanesljivosti dokazov. Ker cebrica nima sekundarnih spolnih značilnosti, ki bi jih bilo mogoče kvantificirati in bi se odzivale na kemikalije z androgenim delovanjem, je njena uporaba v tem preskusu omejena. 8. Pri črnoglavem pisancu je glavni indikator eksogene izpostavljenosti androgenom število drstnih izpuščajev na nosu ribje samice. Pri medaki je glavni označevalec eksogene izpostavljenosti androgenim kemikalijam pri ribjih samicah število bradavičastih podaljškov. V Dodatku 5A in Dodatku 5B so navedeni priporočeni postopki za oceno spolnih značilnosti pri črnoglavem pisancu oziroma medaki. 9. 21-dnevni preskus z ribami vključuje oceno kvantitativnega proizvajanja iker in shranitev spolnih žlez za neobvezno histopatološko preiskavo. Nekateri regulativni organi lahko zahtevajo to dodatno končno točko za celovitejšo oceno sposobnosti preskusnih živali za razmnoževanje ali kadar izpostavljenost kemikaliji ni vplivala na vitelogenin in sekundarne spolne značilnosti. Čeprav so nekatere končne točke zelo diagnostične (npr. indukcija VTG pri samcih in tvorjenje izpuščajev pri samicah), vse končne točke (npr. plodnost in histopatologija spolnih žlez) v preskusu niso namenjene nedvoumni določitvi specifičnih celičnih mehanizmov delovanja. Šele ko so končne točke obravnavane skupaj, omogočajo sklepanje o možnih endokrinih motnjah in zagotovijo smernice za nadaljnje preskušanje. Čeprav plodnost ni izrecno povezana z endokrinim delovanjem, je zaradi dokazane občutljivosti na poznane kemikalije z endokrinim delovanjem (5) pomembna končna točka, ki jo je treba vključiti, saj je ob odsotnosti vpliva na to in druge končne točke mogoče z večjo gotovostjo trditi, da spojina najverjetneje ne deluje endokrino. Kadar pa vpliv na plodnost obstaja, to močno okrepi zanesljivost dokazov in sklepanje. Smernice glede razlage podatkov in sprejemljivosti rezultatov preskusa so navedene pozneje v okviru te preskusne metode. 10. Pojmi, uporabljeni pri tej preskusni metodi, so opredeljeni v Dodatku 1. NAČELO PRESKUSA 11. V preskusu so ribji samci in samice v razmnoževalnem stanju skupaj izpostavljeni v preskusnih posodah. Njihova odraslost in razmnoževalno stanje omogočata jasno razlikovanje po spolu in zato s spolom povezano analizo posamezne končne točke ter zagotavljata njihovo občutljivost na eksogene kemikalije. Na koncu preskusa se spol potrdi z makroskopskim pregledom spolnih žlez po ventralnem odprtju trebuha s škarjami. Pregled ustreznih pogojev biološkega preskusa je naveden v Dodatku 2. Preskus se običajno začne z ribo, ki je bila vzorčena iz populacije, ki je zmožna drstenja; starajoče se živali se ne smejo uporabiti. Smernice glede starosti rib in razmnoževalnega stanja so navedene v razdelku Izbira rib. Preskus se izvede s tremi koncentracijami kemikalije za izpostavljanje, kontrolo z vodo in po potrebi kontrolo s topilom. Pri cebricah se uporabita dve posodi ali ponovljena vzorca na tretiranje (vsaka posoda vsebuje 5 samcev in 5 samic). Pri črnoglavem pisancu se uporabijo štiri posode ali ponovljeni vzorci na tretiranje (vsaka posoda vsebuje 2 samca in 4 samice). To je namenjeno prilagoditvi teritorialnega vedenja samcev črnoglavega pisanca ob hkratni ohranitvi ustrezne moči preskusa. Pri medaki se uporabijo štiri posode ali ponovljeni vzorci na tretiranje (vsaka posoda vsebuje 3 samce in 3 samice). Izpostavljenost traja 21 dni, vzorčenje rib pa se izvede 21. dan izpostavljenosti. Kvantitativna plodnost se spremlja na dnevni ravni. 12. Pri vzorčenju na 21. dan se vse živali humano usmrtijo. Sekundarne spolne značilnosti se merijo pri črnoglavem pisancu in medaki (glej Dodatek 5A in Dodatek 5B); vzorci krvi se za določanje VTG odvzamejo pri cebrici in črnoglavem pisancu, pri čemer se lahko pri cebricah namesto tega za določanje VTG odvzame glava/rep (Dodatek 6), za analizo VTG pri medaki pa se odvzamejo jetra (Dodatek 6); spolne žleze se fiksirajo cele ali secirane za morebitno histopatološko oceno (22). MERILA ZA SPREJEMLJIVOST PRESKUSA 13. Za sprejemljivost rezultatov preskusa morajo biti izpolnjeni naslednji pogoji: — smrtnost v kontrolah z vodo (ali topilom) ob koncu obdobja izpostavljenosti ne sme presegati 10 %, — koncentracija raztopljenega kisika mora biti v obdobju izpostavljenosti ves čas vsaj 60 % nasičenosti z zrakom (ASV), — razlika v temperaturi vode v različnih preskusnih posodah v obdobju izpostavljenosti nikoli ne sme biti večja od ± 1,5 °C in jo je treba vzdrževati v območju 2 °C znotraj temperaturnih območij, določenih za preskusno vrsto (Dodatek 2), — na voljo morajo biti dokazi, da so se koncentracije preskusne kemikalije v raztopini zadovoljivo vzdrževale v okviru ± 20 % srednjih vrednosti meritev, — na voljo morajo biti dokazi, da se ribe aktivno drstijo v vseh ponovljenih vzorcih pred začetkom izpostavljenosti kemikaliji in v ponovljenih kontrolnih vzorcih ves čas trajanja preskusa. OPIS METODE Oprema 14. Običajna laboratorijska oprema in zlasti naslednje: a. oksimetri in merilniki pH, b. oprema za določanje trdote in alkalnosti vode, c. ustrezne naprave za nadzor temperature in, po možnosti, stalno spremljanje, d. akvariji iz kemijsko inertnih materialov in primerne prostornine glede na priporočeno obremenitev in gostoto rib (glej Dodatek 2), e. substrat za drstenje pri črnoglavem pisancu in cebrici, za podrobnosti glej Dodatek 4, f. ustrezno natančna tehtnica (tj. natančna na 0,5 mg). Voda 15. Za preskusno vodo se lahko uporabi katera koli voda, v kateri kaže preskusna vrsta primerno dolgotrajno preživetje in rast. Kakovost vode mora biti ves čas trajanja preskusa konstantna. Vrednost pH vode mora biti med 6,5 in 8,5, znotraj enega preskusa pa mora biti v območju ± 0,5 pH enote. Za zagotovitev, da voda za redčenje ne bi neprimerno vplivala na rezultat preskusa (na primer s kompleksacijo preskusne kemikalije), je treba redno odvzemati vzorce za analizo. Izvajati je treba meritve težkih kovin (npr. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd in Ni), glavnih anionov in kationov (npr. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl– in SO4 2–), pesticidov (npr. skupnih organofosfornih in skupnih organoklornih pesticidov), skupnega organskega ogljika in suspendiranih trdnih snovi, na primer vsake tri mesece, kadar se ve, da je voda za redčenje relativno konstantne kakovosti. Če se dokaže, da je bila kakovost vode konstantna vsaj eno leto, se lahko meritve izvajajo manj pogosto, časovni razmiki pa se lahko podaljšajo (npr. na vsakih šest mesecev). Nekatere kemijske značilnosti sprejemljive vode za redčenje so navedene v Dodatku 3. Preskusne raztopine 16. Preskusne raztopine izbranih koncentracij se pripravijo z redčenjem osnovne raztopine. Osnovno raztopino je treba po možnosti pripraviti preprosto z mešanjem ali stresanjem preskusne kemikalije v vodi za redčenje z uporabo mehanskih sredstev (npr. z mešanjem ali ultrazvokom). Za pridobitev primerno koncentrirane osnovne raztopine se lahko uporabijo kolone za nasičevanje raztopine. Uporaba topila kot nosilca ni priporočljiva. Če je topilo potrebno, je treba vzporedno izvajati kontrolo s topilom z enako koncentracijo topila kot pri tretiranjih s kemikalijami. Za kemikalije, ki jih je težko preskusiti, je lahko topilo tehnično najboljša rešitev; upoštevati je treba dokument s smernicami OECD za preskušanje toksičnosti zahtevnih snovi in zmesi v vodnem okolju (23). Topilo se izbere na podlagi kemijskih lastnosti snovi ali zmesi. V dokumentu s smernicami OECD se priporoča največ 100 μl/l, kar je treba upoštevati. Vendar so bili v zadnjem pregledu (24) izraženi dodatni pomisleki glede uporabe topil za preskušanje endokrinega delovanja. Zato se priporoča, da se koncentracije topila, če je to sploh potrebno, kar najbolj zmanjšajo, kadar koli je to tehnično izvedljivo (glede na fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije). 17. Uporabi se pretočni preskusni sistem. Ta sistem stalno odmerja in redči osnovno raztopino preskusne kemikalije (npr. merilna črpalka, proporcionalni razredčevalnik in sistem naprav za nasičenje), da dovaja niz koncentracij v preskusne komore. Pretok osnovnih raztopin in vode za redčenje je treba med preskusom preverjati v ustreznih časovnih razmikih, po možnosti vsak dan, in se ne sme razlikovati za več kot 10 % med celotnim preskusom. Izogibati se je treba uporabi nizkokakovostnega plastičnega cevnega materiala ali drugih materialov, ki lahko vsebujejo biološko aktivne kemikalije. Pri izbiri materiala za pretočni sistem je treba upoštevati morebitno adsorpcijo preskusne kemikalije v ta material. Vzdrževanje rib 18. Preskusne ribe je treba izbrati iz laboratorijske populacije, po možnosti iz enega staleža, ki se je vsaj dva tedna pred preskusom aklimatizirala v podobnih pogojih kakovosti vode in osvetljenosti, kot so tisti, ki se uporabijo v preskusu. Pomembno je, da sta stopnja obremenitve in gostota rib (za opredelitvi glej Dodatek 1) primerni za uporabljene preskusne vrste (glej Dodatek 2). 19. Po 48 urah prilagajanja se zabeleži smrtnost in uporabijo se naslednja merila: — smrtnost v sedmih dneh je večja od 10 % populacije: celotna serija se zavrne; — smrtnost med 5 % in 10 % populacije: aklimatizacija dodatnih sedem dni; če je v teh dodatnih sedmih dneh smrtnost večja od 5 %, se celotna serija zavrne; — smrtnost v sedmih dneh je manjša od 5 % populacije: serija se sprejme. 20. Bolezni rib se v obdobju aklimatizacije, obdobju pred izpostavljenostjo ali v obdobju izpostavljenosti ne smejo zdraviti. Obdobje pred izpostavljenostjo in izbira rib 21. Priporoča se eno- do dvotedensko obdobje pred izpostavljenostjo, pri čemer so živali v posodah, podobnim posodam v dejanskem preskusu. Ribe je treba v celotnem obdobju vzdrževanja in med fazo izpostavljenosti hraniti ad libitum. Faza izpostavljenosti se začne s spolno dimorfnimi odraslimi ribami iz laboratorijske zaloge razmnoževalno zrelih živali (npr. z jasno vidnimi sekundarnimi spolnimi značilnostmi pri črnoglavem pisancu in medaki) in aktivnim drstenjem. V splošnem (vendar se to ne sme upoštevati brez opazovanja dejanskega razmnoževalnega stanja zadevne serije rib) morajo biti črnoglavi pisanci stari približno 20 (± 2) tednov, če so bili v celotni življenjski dobi gojeni pri 25 ± 2 °C. Japonske medake morajo biti stare približno 16 (± 2) tednov, če so bile v celotni življenjski dobi gojene pri 25 ± 2 °C. Cebrice morajo biti stare približno 16 (± 2) tednov, če so bile v celotni življenjski dobi gojene pri 26 ± 2 °C. V fazi pred izpostavljenostjo je treba vsak dan oceniti proizvajanje iker. Priporoča se, da se pred vključitvijo v fazo izpostavljenosti v preskusu v vseh ponovitvenih akvarijih opazuje drstenje. V tej fazi ni mogoče zagotovi kvantitativnih smernic glede želenega dnevnega proizvajanja iker, vendar je precej običajno povprečno drstenje > 10 iker dnevno na samico pri vsaki vrsti. Za porazdelitev ponovljenih vzorcev na različne stopnje preskusa je treba uporabiti zasnovo naključne porazdelitve v bloke glede na proizvajanje iker, s čimer se bo zagotovila uravnotežena porazdelitev ponovljenih vzorcev. ZASNOVA PRESKUSA 22. Uporabijo se tri koncentracije preskusne kemikalije, ena kontrola (z vodo) in po potrebi ena kontrola s topilom. Podatki se lahko analizirajo, da se določijo statistično značilne razlike med odzivi na tretiranje in odzivi v kontrolah. Te analize bodo pokazale, ali je za kemikalijo potrebno nadaljnje dolgotrajno preskušanje glede škodljivih učinkov (in sicer na preživetje, razvoj, rast in razmnoževanje) namesto uporabe za oceno tveganja (25). 23. Pri cebrici se na 21. dan preskusa samci in samice iz posameznih stopenj tretiranja (5 samcev in 5 samic v vsakem od dveh ponovljenih vzorcev) ter kontrol vzorčijo za meritev vitelogenina. Pri medaki se na 21. dan preskusa samci in samice iz posameznih stopenj tretiranja (3 samci in 3 samice v vsakem od štirih ponovljenih vzorcev) ter kontrol vzorčijo za meritev vitelogenina in sekundarnih spolnih značilnosti. Pri črnoglavem pisancu se na 21. dan izpostavljenosti samci in samice iz posameznih stopenj tretiranja (2 samca in 4 samice v vsakem od štirih ponovljenih vzorcev) in kontrol vzorčijo za meritev vitelogenina in sekundarnih spolnih značilnosti. Potrebna je kvantitativna ocena plodnosti, tkivo spolnih žlez pa je po potrebi treba fiksirati cele ali secirane za morebitno histopatološko oceno. Izbira preskusnih koncentracij 24. Za namen tega preskusa je treba najvišjo preskusno koncentracijo določiti z najvišjo tolerančno koncentracijo (v nadaljnjem besedilu: MTC), ki se določi s študijo za določanje območja delovanja ali na podlagi drugih podatkov o toksičnosti, ali 10 mg/l ali največjo topnostjo v vodi, pri čemer se uporabi najnižja od teh vrednosti. MTC je opredeljena kot najvišja preskusna koncentracija kemikalije, ki povzroči manj kot 10-odstotno smrtnost. Pri uporabi tega pristopa se domneva, da obstajajo empirični podatki o akutni toksičnosti ali drugi podatki o toksičnosti, na podlagi katerih se lahko oceni MTC. Ocena MTC je lahko netočna in običajno zahteva strokovno presojo. 25. Potrebne so tri preskusne koncentracije, ki se med seboj razlikujejo za konstantni faktor, ki ne presega 10, in kontrola z vodo za redčenje (ter po potrebi kontrola s topilom). Priporoča se območje faktorjev razmika med 3,2 in 10. POSTOPEK Izbira in tehtanje preskusnih rib 26. Pomembno je, da se že na začetku preskusa čim bolj zmanjša variacija teže rib. Primerna območja velikosti za različne vrste, priporočene za uporabo v tem preskusu, so navedena v Dodatku 2. Za celotno serijo rib, uporabljenih v preskusu, je treba teže posameznih ribjih samcev in samic na začetku preskusa po možnosti vzdrževati v območju ± 20 % aritmetične sredine teže istega spola. Priporočljivo je, da se pred preskusom stehta podvzorec staleža rib, da se oceni srednja vrednost teže. Pogoji izpostavljenosti Trajanje 27. Preskus traja 21 dni po obdobju pred izpostavljenostjo. Priporočeno obdobje pred izpostavljenostjo traja en teden do dva tedna. Hranjenje 28. Ribe je treba hraniti ad libitum s primerno hrano (Dodatek 2) dovolj pogosto, da se vzdržuje telesna kondicija. Paziti je treba, da ne pride do rasti mikrobov in motnosti vode. Kot splošna smernica se lahko dnevni obrok razdeli na dva ali tri enake dele za večkratno krmljenje, pri čemer morajo med posameznimi krmljenji preteči vsaj tri ure. En večji obrok je sprejemljiv zlasti ob koncih tedna. Hranjenje rib je treba prekiniti 12 ur pred vzorčenjem/nekropsijo. 29. Pri ribji hrani je treba oceniti prisotnost onesnaževal, kot so organoklorni pesticidi, policiklični aromatski ogljikovodiki (PAH) in poliklorirani bifenili (PCB). Izogibati se je treba hrani z višjo ravnjo fitoestrogenov, ki bi lahko ogrozili odziv preskusa na znani agonist estrogena (npr. 17b-estradiol). 30. Nezaužito hrano in iztrebke je treba odstraniti iz preskusnih posod vsaj dvakrat na teden, npr. s previdnim čiščenjem dna posameznega akvarija z uporabo sifona. Svetloba in temperatura 31. Obdobje osvetljenosti in temperatura vode morata biti ustrezna za preskusno vrsto (glej Dodatek 2). Pogostost analitskega določanja in meritev 32. Pred začetkom obdobja izpostavljenosti je treba zagotoviti ustrezno delovanje sistema za dovajanje kemikalije. Vzpostaviti je treba vse potrebne analitske metode, vključno z zadostnim znanjem o stabilnosti kemikalije v preskusnem sistemu. Med preskusom se koncentracije preskusne kemikalije določijo v rednih časovnih razmikih, kot sledi: pretoke redčila in osnovne raztopine toksične snovi je treba po možnosti preveriti vsak dan, vendar vsaj dvakrat na teden, pri čemer se med celotnim preskusom ne smejo razlikovati za več kot 10 %. Priporoča se, da se dejanske koncentracije preskusne kemikalije izmerijo v vseh posodah na začetku preskusa in nato v tedenskih časovnih razmikih. 33. Priporoča se, da rezultati temeljijo na izmerjenih koncentracijah. Če pa se je koncentracija preskusne kemikalije v raztopini zadovoljivo vzdrževala znotraj ± 20 % nominalne koncentracije ves čas preskusa, lahko rezultati temeljijo na nominalnih ali izmerjenih vrednostih. 34. Vzorce bo morda treba filtrirati (npr. z uporabo filtra z velikostjo por 0,45 μm) ali centrifugirati. Če je filtracija potrebna, je priporočeni postopek centrifugiranje. Če pa se preskusni material ne adsorbira na filtrih, je lahko sprejemljivo tudi filtriranje. 35. Med preskusom je treba vsaj enkrat na teden v vseh preskusnih posodah izmeriti raztopljeni kisik, temperaturo in vrednost pH. Skupno trdoto in alkalnost je treba vsaj enkrat na teden izmeriti v kontrolah in eni posodi pri najvišji koncentraciji. Temperatura se po možnosti stalno spremlja v vsaj eni preskusni posodi. Opazovanja 36. Med potekom preskusa ali ob prekinitvi preskusa se ocenijo številni splošni (npr. preživetje) in biološki odzivi (npr. ravni VTG). Vsak dan je treba kvantitativno spremljati plodnost. Merjenje in ocena teh končnih točk ter njihova uporabnost so opisani v nadaljevanju. Preživetje 37. Ribe je treba v obdobju preskusa pregledati vsak dan, zabeležiti vsako umrlo ribo, mrtve ribe pa čim prej odstraniti. Mrtve ribe se ne smejo nadomestiti niti v kontrolnih posodah niti v tretiranih posodah. Spol rib, ki poginejo med preskusom, je treba določiti z makroskopsko oceno spolnih žlez. Vedenje in videz 38. Zapisati je treba vsako nenormalno vedenje (glede na kontrole); to lahko vključuje znake splošne toksičnosti, vključno s hiperventilacijo, nekoordiniranim plavanjem, izgubo ravnotežja in netipičnim mirovanjem ali hranjenjem. Zapisati je treba tudi zunanje anomalije (kot sta hemoragija in razbarvanje). Take znake toksičnosti je treba pri razlagi podatkov previdno obravnavati, ker lahko nakazujejo koncentracije, pri katerih biomarkerji endokrinega delovanja niso zanesljivi. Taka opažanja v zvezi z vedenjem lahko zagotovijo tudi koristne kvalitativne informacije, ki kažejo možne zahteve za prihodnje preskušanje rib. Pri črnoglavem pisancu, ki je bil izpostavljen androgenom, je bila na primer opažena teritorialna agresivnost normalnih samcev ali maskuliniziranih samic; pri cebrici se značilno vedenje pri parjenju in drstenju po svitanju zmanjša ali ga ovira izpostavljenost estrogenom ali antiandrogenom. 39. Ker se lahko nekateri vidiki videza (zlasti barva) pri rokovanju hitro spremenijo, je pomembno, da se kvalitativno opazovanje izvede pred odstranitvijo živali iz preskusnega sistema. Dosedanje izkušnje s črnoglavim pisancem kažejo, da lahko nekatere kemikalije z endokrinim delovanjem na začetku povzročijo spremembe naslednjih zunanjih značilnosti: barve telesa (svetla ali temna), vzorcev obarvanja (prisotnost navpičnih prog) in oblike telesa (glava in območje prsi). Zato je treba opazovanje fizičnega videza rib izvesti med potekom preskusa in ob koncu študije. Plodnost 40. Dnevna kvantitativna opazovanja drstenja je treba zapisati za vsak ponovljeni vzorec. Proizvajanje iker je treba zapisati kot število iker dnevno na preživelo samico za vsak ponovljeni vzorec. Ikre se vsak dan odstranijo iz preskusnih komor. Pri črnoglavem pisancu in cebrici se v preskusno komoro namestijo substrati za drstenje, ki ribam omogočajo normalne pogoje drstenja. V Dodatku 4 je na voljo več podrobnosti o priporočenih substratih za drstenje za cebrico (Dodatek 4A) in črnoglavega pisanca (Dodatek 4B). Substrat za drstenje pri medaki ni potreben, zato ga ni treba namestiti. Humana usmrtitev rib 41. Ribe je treba 21. dan, tj. ob prekinitvi izpostavljenosti, evtanazirati s primernimi količinami trikaina (trikain metan sulfonat, metakain, MS-222 (št. CAS 886-86-2), 100–500 mg/l, pufran s 300 mg/l NaHCO3 (natrijev bikarbonat, št. CAS 144-55-8)), da se zmanjša draženje sluznice; kri ali tkivo se nato vzorči za določitev VTG, kot je pojasnjeno v razdelku o vitelogeninu. Opazovanje sekundarnih spolnih značilnosti 42. Nekatere kemikalije z endokrinim delovanjem lahko povzročijo spremembe pri določenih sekundarnih spolnih značilnostih (število drsnih izpuščajev pri samcih črnoglavega pisanca, bradavičasti podaljški pri samcih medake). Kemikalije z nekaterimi načini delovanja lahko povzročijo nenormalno pojavnost sekundarnih spolnih značilnosti pri živalih nasprotnega spola; agonisti receptorjev za androgene, kot so trenbolon, metiltestosteron in dihidrotestosteron, lahko na primer pri samici črnoglavega pisanca povzročijo razvoj izrazitih drstnih izpuščajev, pri samici medake pa razvoj bradavičastih podaljškov (11) (20) (21). Obstajajo tudi poročila, da lahko agonisti receptorjev za estrogene zmanjšajo število drstnih izpuščajev in velikost dorzalne strani trupa pred hrbtno plavutjo pri odraslih samcih črnoglavega pisanca (26) (27). Taka splošna morfološka opažanja lahko zagotovijo koristne kvalitativne in kvantitativne informacije, ki kažejo možne zahteve za prihodnje preskušanje rib. Število in velikost drstnih izpuščajev pri črnoglavem pisancu in bradavičastih podaljškov pri medaki se lahko kvantificira neposredno ali bolj praktično na shranjenih vzorcih. Priporočeni postopki za oceno sekundarnih spolnih značilnosti pri črnoglavem pisancu in medaki so navedeni v Dodatku 5A oziroma Dodatku 5B. Vitelogenin (VTG) 43. Kri se odvzame iz repne arterije/vene s heparinizirano mikrohematokritsko kapilarno cevko ali namesto tega s srčno punkcijo z brizgo. Količine zbrane krvi so odvisne od velikosti ribe ter so običajno v območju 5–60 μl na posameznega črnoglavega pisanca in 5–15 μl na posamezno cebrico. Plazma se od krvi loči s centrifugiranjem in shrani z zaviralci proteaze pri –80 °C, dokler se pri njej ne izvede analiza vitelogenina. Alternativno se lahko pri medaki kot tkivni vir za določanje VTG uporabijo jetra in pri cebrici homogenat glave/repa (Dodatek 6). Meritev VTG mora temeljiti na validirani homologni metodi ELISA, pri čemer se uporabijo homologni standard VTG in homologna protitelesa. Priporoča se uporaba metode, s katero je mogoče zaznati tako nizke ravni VTG, kot je nekaj ng/ml plazme (ali ng/mg tkiva), kar je raven ozadja pri neizpostavljenih ribjih samcih. 44. Nadzor kakovosti analize VTG se zagotovi z uporabo standardov, slepih vzorcev in vsaj dvema analizama. Za vsako metodo ELISA je treba izvesti preskus vpliva matriksa (učinek razredčenja vzorca), da se določi najmanjši faktor razredčenja vzorca. Vsaka plošča ELISA, uporabljena za preskuse VTG, mora vsebovati naslednje vzorce za nadzor kakovosti: vsaj 6 kalibracijskih standardov, ki zajemajo območje pričakovanih koncentracij VTG, in vsaj en nespecifično vezalni preskus slepega vzorca (analiziran v dveh ponovitvah). Absorpcija teh slepih vzorcev mora biti manj kot 5 % največje absorpcije kalibracijskega standarda. Analizirana bosta vsaj dva alikvota (jamice s ponovljenimi vzorci) posameznega razredčenja vzorca. Jamice s ponovljenimi vzorci, ki se razlikujejo za več kot 20 %, je treba ponovno analizirati. 45. Korelacijski koeficient (R2) za umeritvene krivulje mora biti večji od 0,99. Vendar visoka korelacija ni dovolj za zagotovitev ustrezne napovedi koncentracije v vseh območjih. Poleg dovolj visoke korelacije za umeritveno krivuljo mora biti koncentracija posameznega standarda, kot je izračunana po umeritveni krivulji, med 70 in 120 % nominalne koncentracije. Če se nominalne koncentracije oddaljujejo od regresijske premice kalibracije (npr. pri nižjih koncentracijah), bo umeritveno krivuljo morda treba razdeliti na nizke in visoke razpone ali uporabiti nelinearni model, ki bo ustrezal podatkom o absorpciji. Če se krivulja razdeli, mora biti R2 na obeh delih > 0,99. 46. Meja zaznavnosti (LOD) je opredeljena kot koncentracija najnižjega analitskega standarda, meja določljivosti (LOQ) pa je opredeljena kot koncentracija najnižjega analitskega standarda, pomnoženega z najnižjim faktorjem razredčenja. 47. Vsak dan izvedbe preskusa VTG se analizira obogateni vzorec, pripravljen z med preskusnim referenčnim standardom (Dodatek 7). Razmerje med pričakovano koncentracijo in izmerjeno koncentracijo se sporoči skupaj z rezultati posameznih nizov preskusov, izvedenih isti dan. Ocena histopatologije spolnih žlez 48. Regulativni organi lahko zahtevajo izvedbo histopatologije spolnih žlez, da se prouči ciljni organ na osi HPG po izpostavljenosti kemikaliji. Zato se spolne žleze fiksirajo cele ali secirane. Kadar je potrebna histopatologija, se pri oceni endokrinega delovanja preskusne kemikalije iščejo posebni odzivi na spolnih žlezah, povezani z endokrinim sistemom. Ti diagnostični odzivi vključujejo predvsem prisotnost oocitov na modih, hiperplazijo Leydigovih celic, slabše tvorjenje rumenjaka, povečanje spermatogonijev in perifolikularno hiperplazijo. Za druge lezije spolnih žlez, kot so atrezija oocitov, degeneracija mod in spremembe glede na razvojno stopnjo, lahko obstajajo različni vzroki. V dokumentu s smernicami za histopatologijo spolnih žlez rib so podrobno opredeljeni postopki, ki se uporabljajo pri seciranju, fiksiranju, odstranitvi in histopatološki oceni spolnih žlez (22). PODATKI IN POROČANJE Ocena odzivov biomarkerja z analizo variance 49. Za opredelitev možnega endokrinega delovanja kemikalije se z analizo variance primerjajo odzivi med tretiranimi in kontrolnimi skupinami. Kadar se uporabi kontrola s topilom, je treba za vsako končno točko izvesti primeren statistični test med vodo za redčenje in kontrolami s topilom. Smernice za obravnavanje podatkov o vodi za redčenje in kontroli s topilom pri nadaljnji statistični analizi so navedene v OECD, 2006c (28). Vse podatke o biološkem odzivu je treba analizirati in vključiti v poročilo za vsak spol posebej. Če niso izpolnjene zahtevane domneve za parametrske metode – nenormalna porazdelitev (npr. Shapiro-Wilkov test) ali heterogena varianca (Bartlettov ali Levenejev test), je potreben razmislek o preoblikovanju podatkov, da se poenotijo variance pred izvedbo analize variance ali pred izvedbo tehtane analize variance. Za nemonoton odziv na odmerek se lahko uporabi Dunnettov test (parametrski) večkratnih primerjav med pari ali Mann-Whitneyjev test z Bonferronijevo prilagoditvijo (neparametrski). Če je odziv na odmerek približno monoton, se lahko uporabijo drugi statistični testi (npr. test po Jonckheere-Terpstraju ali Williamsov test). Za lažjo izbiro najprimernejšega statističnega testa je v Dodatku 8 zagotovljen diagram poteka za statistično analizo. Dodatne informacije so na voljo tudi v dokumentu OECD z naslovom „Sodobni pristopi pri statistični analizi podatkov o ekotoksičnosti: smernice za uporabo“ (ang. Document on Current Approaches to Statistical Analysis of Ecotoxicity Data) (28). Poročanje o rezultatih preskusa 50. Podatki študije morajo vključevati naslednje: Preskusni laboratorij: — odgovorno osebje in njihove obveznosti v zvezi s študijo; — vsak laboratorij mora dokazati usposobljenost s sklopom reprezentativnih kemikalij. Preskusna kemikalija: — opredelitev lastnosti preskusne kemikalije; — fizikalno stanje in ustrezne fizikalno-kemijske lastnosti; — metoda in pogostost priprave preskusnih koncentracij; — informacije o stabilnosti in biološki razgradljivosti. Topilo: — opredelitev lastnosti topila (vrsta, uporabljena koncentracija); — utemeljitev izbire topila (če to ni voda). Preskusne živali: — vrsta in sev; — dobavitelj in specifični objekt dobavitelja; — starost rib na začetku preskusa in razmnoževalno stanje/stanje drstenja; — podrobnosti o postopku aklimatizacije živali; — telesna teža rib na začetku izpostavljenosti (iz podvzorca staleža rib). Preskusni pogoji: — uporabljeni preskusni postopek (vrsta preskusa, stopnja obremenitve, gostota rib itd.); — metoda priprave osnovnih raztopin in pretok; — nominalne preskusne koncentracije, tedensko izmerjene koncentracije preskusnih raztopin in uporabljena analitska metoda, sredine izmerjenih vrednosti in standardnih odklonov v preskusnih posodah ter dokazi, da se meritve nanašajo na koncentracije preskusne kemikalije v dejanski raztopini; — značilnosti vode za redčenje (vključno s pH, trdoto, alkalnostjo, temperaturo, koncentracijo raztopljenega kisika, ravnmi preostalega klora, skupnim organskim ogljikom, suspendiranimi trdnimi snovmi in drugimi izvedenimi meritvami); — kakovost vode v preskusnih posodah: pH, trdota, temperatura in koncentracija raztopljenega kisika; — podrobne informacije o hranjenju (npr. vrsta hrane, vir, dana količina in pogostost dajanja ter analiza zadevnih onesnaževal, če je na voljo (npr. PCB, PAH in organoklorni pesticidi)). Rezultati: — dokazi, da kontrole izpolnjujejo merila za sprejemljivost preskusa; — podatki o smrtnosti za posamezne preskusne koncentracije in kontrole; — uporabljene tehnike statistične analize, obdelava podatkov in utemeljitev uporabljenih tehnik; — podatki o bioloških opažanjih splošne morfologije, vključno s sekundarnimi spolnimi značilnostmi, proizvajanjem iker in VTG; — rezultati analiz podatkov, po možnosti v obliki tabel in grafov; — pojav kakršnih koli neobičajnih reakcij rib in kakršnih koli vidnih učinkov, ki jih povzroči preskusna kemikalija. SMERNICE ZA RAZLAGO IN SPREJEMLJIVOST REZULTATOV PRESKUSA 51. V tem razdelku je navedenih nekaj preudarkov, ki jih je treba upoštevati pri razlagi rezultatov preskusa za različne izmerjene končne točke. Rezultate je treba razlagati previdno, kadar se zdi, da preskusna kemikalija povzroča očitno toksičnost ali vpliva na splošno stanje preskusne živali. 52. Pri določanju območja preskusnih koncentracij je treba paziti, da se ne preseže najvišja tolerančna koncentracija, da bo mogoča smiselna razlaga podatkov. Kadar ni znakov toksičnih učinkov, je pomembno, da se izvede vsaj eno tretiranje. Znake bolezni in znake toksičnih učinkov je treba temeljito oceniti in o njih poročati. Možno je na primer, da na nastajanje VTG pri samicah vplivajo tudi splošna toksičnost in neendokrini toksični načini delovanja, npr. hepatotoksičnost. Vendar se lahko razlaga učinkov podkrepi z drugimi stopnjami tretiranja, na katere ne vpliva sistemska toksičnost. 53. V zvezi s sprejemljivostjo rezultatov preskusa je treba upoštevati nekaj vidikov. Ravni VTG v kontrolnih skupinah samcev in samic morajo biti praviloma izrazite ter ločene za približno tri rede velikosti pri črnoglavem pisancu in cebrici ter približno en red velikosti pri medaki. Primeri območja vrednosti v kontrolnih in tretiranih skupinah so navedeni v validacijskih poročilih (1) (2) (3) (4). Visoke vrednosti VTG pri kontrolnih samcih bi lahko ogrozile odzivnost preskusa in njegovo zmožnost zaznavanja šibkih agonistov estrogena. Nizke vrednosti VTG pri kontrolnih samicah bi lahko ogrozile odzivnost preskusa ter njegovo zmožnost zaznavanja zaviralcev aromataze in antagonistov estrogena. Pri pripravi zadevnih smernic so bile uporabljene validacijske študije. 54. Pri kvantifikaciji proizvajanja iker lahko pride do pomembnih variacij [koeficient variacije (KV) je lahko v območju 20–60 %], ki omejujejo zmožnost preskusa za zaznavanje statistično značilnega zmanjšanja proizvajanja iker, manjšega od 70 %, ko se KV približa 50 % ali jih preseže. Kadar je KV omejen na nižje vrednosti (približno 20–30 %), ima preskus sprejemljivo moč (80 %) zaznavanja 40–50-odstotnega zmanjšanja proizvajanja iker. Zasnova preskusa, ki se uporablja za črnoglavega pisanca in vključuje štiri ponovljene vzorce na stopnjo tretiranja, bi morala omogočati večjo moč za končno točko plodnosti v primerjavi z zasnovo preskusa z le dvema ponovljenima vzorcema. 55. Če laboratorij še ni izvedel preskusa ali je prišlo do znatnih sprememb (npr. sprememba seva ali dobavitelja rib), se priporoča izvedba študije tehnične usposobljenosti. Priporočljivo je, da se uporabijo kemikalije, ki zajemajo različne načine delovanja ali vplive na številne preskusne končne točke. V praksi se spodbuja, naj vsak laboratorij vzpostavi lastne podatke o kontrolah iz preteklih preskusov za samce in samice ter pozitivno kontrolo za estrogeno delovanje (npr. 17β-estradiol pri 100 ng/l ali znan šibek agonist), ki povzroči povečanje VTG pri ribjih samcih, pozitivno kontrolo za zaviranje aromataze (npr. fadrozol ali prokloraz pri 300 μg/l), ki povzroči zmanjšanje VTG pri ribjih samicah, in pozitivno kontrolo za androgeno delovanje (npr. 17β-trenbolon pri 5 μg/l), ki povzroči indukcijo sekundarnih spolnih značilnosti pri samicah črnoglavega pisanca in medake. Vsi ti podatki se lahko primerjajo z razpoložljivimi podatki iz validacijskih študij (1) (2) (3), da se zagotovi usposobljenost laboratorija. 56. Na splošno je treba meritve VTG šteti za pozitivne, če je pri samcih prišlo do statistično značilnega povečanja (p < 0,05) ali pri samicah do statistično značilnega zmanjšanja (p < 0,05) vsaj pri največjem preskušenem odmerku v primerjavi s kontrolno skupino ter ob odsotnosti znakov splošne toksičnosti. Pozitiven rezultat je nadalje podprt s prikazom biološko verjetnega razmerja med odmerkom in krivuljo odziva. Kot je bilo navedeno, zmanjšanje VTG morda ni v celoti endokrinega izvora; vendar je treba pozitiven rezultat na splošno razlagati kot dokaz endokrinega delovanja in vivo ter si prizadevati za nadaljnjo pojasnitev. 57. Regulativni organi lahko zahtevajo oceno histopatologije spolnih žlez, da se določi, ali so preskusne živali sposobne za razmnoževanje, in da se omogoči ocena zanesljivosti dokazov pri rezultatih preskusov. Izvedba histopatologije spolnih žlez morda ne bo potrebna, kadar so VTG ali sekundarne spolne značilnosti pozitivne (tj. povečanje ali zmanjšanje VTG ali indukcija sekundarnih spolnih značilnosti). VIRI (1) OECD (2006a). Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine active Substances (Phase 1A). OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment, št. 60, Pariz. (2) OECD (2006b). Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine active Substances (Phase 1B). OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment, št. 61, Pariz. (3) OECD (2007). Final report of the Validation of the 21-day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine Active Substances. Phase 2: Testing Negative Substances. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment, št. 78, Pariz. (4) Owens, J. W. (2007). Phase 3 report of the validation of the OECD Fish Screening Assay. CEFIC LRI Project, Endocrine. http://www.cefic-lri.org/index.php?page=projects (prevzeto 18.9.2008). (5) US EPA (2007). Validation of the Fish Short-Term Reproduction Assay: Integrated Summary Report. 15. december 2007. US Environmental Protection Agency, Washington, DC, 104 str. (6) OECD (2008). Report of the Validation Peer Review for the 21-Day Fish Endocrine Screening Assay and Agreement of the Working Group of the National Coordinators of the Test Guidelines Programme on the Follow-up of this Report. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment, št. 94, Pariz. (7) Sumpter, J. P. in S. Jobling (1995). Vitellogenesis as a biomarker for estrogenic contamination of the aquatic environment. Environmental Health Perspectives, zv. 103/Dop. 7:173–8 Review. (8) Pawlowski, S. et al. (2004). Androgenic and estrogenic effects of the synthetic androgen 17alpha-methyltestosterone on sexual development and reproductive performance in the fathead minnow (Pimephales promelas) determined using the gonadal recrudescence assay. Aquatic Toxicology, zv. 68(3): 277–91. (9) Andersen, L. et al. (2006). Short-term exposure to low concentrations of the synthetic androgen methyltestosterone affects vitellogenin and steroid levels in adult male zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology, zv. 76(3–4): 343–52. (10) Ankley, G. T. et al. (2002). Evaluation of the aromatase inhibitor fadrozole in a short-term reproduction assay with the fathead minnow (Pimephales promelas). Toxicological Sciences, 67(1): 121–30. (11) Panter, G. H. et al. (2004). Successful detection of (anti-)androgenic and aromatase inhibitors in pre-spawning adult fathead minnows (Pimephales promelas) using easily measured endpoints of sexual development. Aquatic Toxicology, zv. 70(1): 11–21. (12) Parks, L. G. et al. (1999). Fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin: purification, characterization and quantitative immunoassay for the detection of estrogenic compounds. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C Pharmacology, toxicology and endocrinology, 123(2): 113–25. (13) Panter, G. H. et al. (1999). Application of an ELISA to quantify vitellogenin concentrations in fathead minnows (Pim