DIREKTIVA KOMISIJE 2006/56/ES

z dne 12. junija 2006

o spremembi prilog k Direktivi Sveta 93/85/EGS o obvladovanju krompirjeve obročkaste gnilobe

KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE –

ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske skupnosti,

ob upoštevanju Direktive Sveta 93/85/EGS z dne 4. oktobra 1993 (1) o obvladovanju krompirjeve obročkaste gnilobe in zlasti člena 12 Direktive,

ob upoštevanju naslednjega:

Eden izmed pomembnih škodljivih organizmov za krompir bakterija Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., povzročiteljica krompirjeve obročkaste gnilobe (v nadaljnjem besedilu „organizem“).

Direktiva Sveta 93/85/EGS je določila podrobne ukrepe, ki jih morajo države članice sprejeti proti temu organizmu, da se določi kraj in obseg njegove razširjenosti, preprečijo njegovo pojavljanje in širjenje; in če se odkrije, prepreči njegovo širjenje in da se obvladuje z namenom izkoreninjenja.

Od takrat je prišlo do bistvenega napredka pri razumevanju biologije ter postopkih odkrivanja in identifikacije organizma; poleg tega praktične izkušnje, pridobljene pri obvladovanju organizma, zahtevajo ponovni pregled nekaterih tehničnih določb, ki se nanašajo na ukrepe za obvladovanje.

Glede postopkov odkrivanja in identifikacije so vključeni tudi nedavno razviti postopki, kot sta fluorescentna in-situ hibridizacija (FISH) in verižna reakcija s polimerazo (PCR), prav tako pa tudi izboljšave različnih tehničnih elementov trenutnih postopkov odkrivanja in identifikacije.

Izboljšane določbe glede tehničnih elementov ukrepov za obvladovanje so uvedene v zvezi z: načinom konzerviranja testiranih vzorcev za zagotavljanje izsleditve organizma, elementov za ugotavljanje obsega verjetne okužbe, podrobnostmi v zvezi z obveščanjem o potrjeni navzočnosti organizma in ustreznem okuženem območju, izvedbenimi ukrepi na mestih pridelave, ki so bila določena za okužena in v razmejenih območjih.

Ukrepi, predvideni s to direktivo, so v skladu z mnenjem Stalnega odbora za zdravstveno varstvo rastlin –

SPREJELA NASLEDNJO DIREKTIVO:

Člen 1

Priloge k Direktivi 93/85/EGS se nadomestijo z ustreznim besedilom Priloge k tej direktivi.

Člen 2

1. Države članice sprejmejo in objavijo zakone in druge predpise, potrebne za uskladitev s to direktivo, najpozneje do 31. marca 2007.

Komisiji takoj sporočijo besedilo navedenih določb in primerjalno tabelo med navedenimi določbami in Direktivo. Te predpise uporabljajo od 1. aprila 2007.

Države članice se v sprejetih predpisih sklicujejo na to direktivo ali pa sklic nanjo navedejo ob njihovi uradni objavi. Način sklicevanja določijo države članice.

2. Države članice Komisiji takoj predložijo besedila temeljnih predpisov nacionalne zakonodaje, sprejetih na področju, ki ga ureja ta direktiva.

Člen 3

Ta direktiva začne veljati tretji dan po objavi v Uradnem listu Evropske unije.

Člen 4

Ta direktiva je naslovljena na države članice.

(1) UL L 259, 18.10.1993, str. 2.

PRILOGA I

TESTNA SHEMA ZA DIAGNOSTICIRANJE, ODKRIVANJE IN IDENTIFIKACIJO BAKTERIJE KROMPIRJEVE OBROČKASTE GNILOBE, CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (Smith) Davis et al. ssp. SEPEDONICUS (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al.

PODROČJE UPORABE TESTNE SHEME

Ta shema opisuje različne postopke za:

(i) Diagnosticiranje krompirjeve obročkaste gnilobe v gomoljih in rastlinah krompirja;

(ii) Odkrivanje bakterije Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus v vzorcih gomoljev in rastlin krompirjeva;

(iii) Identifikacija Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (C. m. subsp. sepedonicus).

SPLOŠNA NAČELA

V dodatkih so določeni optimizirani protokoli različnih metod, potrjenih reagentov in podrobnosti za pripravo testnih in kontrolnih materialov. V Dodatku 1 je naveden seznam laboratorijev, ki so vključeni v optimizacijo in potrjevanje protokolov.

Ker protokoli vključujejo odkrivanje karantenskega organizma in bodo vključevali uporabo kultur C. m. subsp. sepedonicus kot kontrolnih materialov, ki so sposobne preživeti, bo treba postopke opravljati v primernih karantenskih pogojih z ustreznimi napravami za odstranjevanje odpadkov in na podlagi ustreznih dovoljenj, ki jih izdajo uradni organi za rastlinsko karanteno.

Parametri testiranja morajo zagotoviti dosledno in ponovljivo odkrivanje stopenj C. m. subsp. sepedonicus na določenih pragovih izbranih metod.

Nujna je natančna priprava pozitivnih kontrol.

Za testiranje po zahtevanih pragih so potrebne pravilne nastavitve, vzdrževanje in umerjanje opreme, previdnost pri ravnanju z reagenti in njihovo ohranjanje ter vsi ukrepi za preprečevanje okužbe med vzorci, npr. ločitev pozitivnih kontrol od testnih vzorcev. Uporabljati se morajo standardi obvladovanja kakovosti, da bi se lahko izognili upravnim in drugim napakam, zlasti pri označevanju in dokumentaciji.

Domnevi pojav, kot je določeno v členu 4(2) Direktive 93/85/EGS, pomeni pozitivni rezultat pri diagnostičnih ali presejalnih testih, ki se opravijo na vzorcu, kot je določeno v puščičnih diagramih.

Če je prvi presejalni test (IF ali PCR/FISH) pozitiven, potem se sumi na okužbo z bakterijo Cms in opraviti se mora drugi presejalni test. Če je drugi presejalni test pozitiven, potem je sum potrjen (domnevni pojav) in testiranje v skladu s shemo se mora nadaljevati. Če je drugi presejalni test negativen, potem se šteje, da vzorec ni okužen z bakterijo Cms.

Torej je pozitivni IF test, kot je določen v členu 4(2) Direktive 93/85/EGS, opredeljen kot pozitivni rezultat IF, ki je potrjen z drugim presejalnim testom (PCR/FISH).

Potrjena navzočnost, kot je določena v členu 5(1) Direktive 93/85/EGS pomeni izolacijo in identifikacijo čiste kulture C. m. subsp. sepedonicus s potrditvijo patogenosti.

1. PREDSTAVITEV S PUŠČIČNIMI DIAGRAMI

1.1 Shema odkrivanja za diagnosticiranje obročkaste gnilobe v gomoljih in rastlinah krompirja s simptomi obročkaste gnilobe

Postopek testiranja je namenjen gomoljem in rastlinam krompirja z značilnimi simptomi obročkaste gnilobe ali simptomi, ki vzbujajo sum na obročkasto gnilobo. Vključuje hitri presejalni test, izolacijo patogena iz okuženega vaskularnega tkiva na diagnostičnem gojišču in v primeru pozitivnega rezultata identifikacijo kulture kot bakterije C. m. subsp. sepedonicus.

1.2 Shema za odkrivanje in identifikacijo bakterije Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus v vzorcih asimptomatičnih gomoljev krompirja

Načelo

Postopek testiranja je namenjen odkrivanju latentnih okužb v gomoljih krompirja. Pozitiven rezultat vsaj dveh presejalnih testov, ki temeljita na različnih bioloških načelih, mora biti dopolnjen z izolacijo patogena, ki ji v primeru izolacije tipičnih kolonij sledi potrditev čiste kulture kot C. m. subsp. sepedonicus. Pozitiven rezultat samo enega presejalnega testa ni dovolj, da bi vzorec obravnavali kot sumljiv.

Presejalni testi in izolacijski testi morajo dopuščati prag odkrivanja 103 do 104 celic/ml resuspendirane pelete, vključene kot pozitivne kontrole v vsaki seriji testov.

1.3 Shema za odkrivanje in identifikacijo bakterije Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus v vzorcih asimptomatičnih rastlin krompirja

2. VIZUALNI PREGLED ZA ODKRIVANJE SIMPTOMOV OBROČKASTE GNILOBE

2.1 Rastline krompirja

V evropskih vremenskih razmerah redko najdemo simptome na polju in pogosto samo ob koncu sezone. Poleg tega so simptomi pogosto prikriti ali se zamenjujejo z drugimi boleznimi, staranjem ali mehanskimi poškodbami. Zato lahko zlahka spregledamo simptome na terenskih uradnih pregledih. Simptomi venenja so precej različni od simptomov rjave gnilobe; venenje je običajno počasno in na začetku omejeno na robove listov. Mladi okuženi listi se še naprej razvijajo, čeprav manj na okuženih območjih. To povzroča čudno oblikovane liste. Listi, prizadeti z blokado vaskularnega tkiva na spodnjem delu stebla, imajo pogosto klorotične, rumeno oranžne vmesne dele. Okuženi lističi, listi in celo stebla lahko sčasoma odmrejo. Pogosto so listi in gomolji samo manjše velikosti. Včasih so rastline okrnjene. Barvne slike razpona simptomov so dostopne na spletni strani: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

2.2 Gomolji krompirja

Prvi simptomi so rahlo steklast videz ali prosojnost tkiva brez omehčanja okoli vaskularnega sistema, predvsem v bližini stolona. Vaskularni obroček na stolonu je lahko rahlo temnejše barve kot ponavadi. Prvi lahko prepoznavni simptom predstavlja rumenkasto obarvan vaskularni obroček in če gomolj rahlo stisnemo, se iz žil pocedijo majhne količine siraste mase. Ta izcedek vsebuje na milijone bakterij. V tej fazi se lahko vaskularno tkivo obarva rjavo in simptomi gomolja so podobni simptomom rjave gnilobe, ki jo povzroča Ralstonia solanacearum. Ti simptomi so lahko sprva omejeni le na del obročka, ki ni nujno v bližini stolona, in se lahko postopoma razširijo na celoten obroček. Z napredovanjem okužbe se pojavi uničenje vaskularnega tkiva; zunanji korteks se lahko oddvoji od notranjega korteksa. V poznejših fazah okužbe se na površini gomolja pojavijo razpoke, ki so ob robu pogosto rdečkastorjave barve. V zadnjem času se je v Evropi pojavilo nekaj primerov, ko je osrednji korteks gnil istočasno kot vaskularni obroček, kar je pripeljelo do sekundarnega napada z notranjim votlenjem in nekrozo. Sekundarni napad gliv ali bakterij lahko prikrije simptome in tako oteži ali onemogoči razločevanje simptomov obročkaste gnilobe v poznem stadiju od ostalih gnilob gomoljev. Možni so neznačilni simptomi. Barvne slike razpona simptomov so dostopne na spletni strani: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

3. PRIPRAVA VZORCEV

3.1 Gomolji krompirja

Opomba:

— Standardna velikost vzorca je 200 gomoljev na test. Intenzivnejše vzorčenje zahteva več testov na vzorcih te velikosti. Večje število gomoljev v vzorcu bo povzročilo inhibicijo ali otežilo interpretacijo rezultatov. Vendar pa se postopek lahko ustrezno uporabi za vzorce z manj kot 200 gomolji, če je na voljo manj gomoljev.

— Potrditev vseh spodaj opisanih metod odkrivanja temelji na testiranju vzorca z 200 gomolji.

— Spodaj opisani krompirjev ekstrakt se lahko uporabi tudi za odkrivanje bakterije krompirjeve rjave gnilobe, Ralstonia solanacearum.

Izbirna vnaprejšnja predobdelava pred pripravo vzorca:

Operemo gomolje. Uporabimo ustrezna razkužila (klorove spojine, kadar se uporabi test PCR, da se odstrani morebitno patogeno DNK) in detergente med vsakim vzorcem. Gomolje posušimo na zraku. Ta postopek pranja je zlasti koristen (vendar ni obvezen) pri vzorcih z odvečno zemljo in če se bosta izvedla test PCR ali postopek neposredne izolacije.

3.1.1 S čistim in razkuženim skalpelom ali nožem za zelenjavo odstranimo povrhnjico na območju stolona vsakega gomolja, tako da vaskularno tkivo postane vidno. Previdno izrežemo majhno jedro vaskularnega tkiva na območju stolona in pazimo, da je nevaskularnega tkiva čim manj (glej spletno stran: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

Opomba:

Ločimo vse gomolje s sumljivimi simptomi obročkaste gnilobe in posebej testiramo.

Če med odstranitvijo jedra stolona opazimo sumljive simptome obročkaste gnilobe, je treba ta gomolj prerezati blizu stolona in ga vizualno pregledati. Vsak prerezan gomolj s sumljivimi simptomi je treba suberizirati na sobni temperaturi dva dni in nato shraniti v karanteni (pri 4 do 10 °C), dokler niso vsi testi končani. Vsi gomolji v vzorcu, vključno tisti s sumljivimi simptomi, se shranjujejo v skladu s Prilogo II.

3.1.2 Jedra stolonov damo v neuporabljene posode za enkratno uporabo, ki jih lahko zapremo in/ali hermetično zapremo (če se posode večkrat uporabijo, jih moramo temeljito očistiti in razkužiti s klorovimi spojinami). Zaželeno je, da se jedra stolonov obdelajo takoj. Če to ni mogoče, jih shranimo v posodi brez dodanega pufra v hladilniku za največ 72 ur ali na sobni temperaturi ne več kot 24 ur. Sušenje in suberizacija jeder ter rast saprofitov med shranjevanjem lahko ovira odkritje bakterije obročkaste gnilobe.

3.1.3 Jedra stolonov obdelamo po enem od naslednjih postopkov:

(a) Prekrijemo jedra z zadostno količino (približno 40 ml) ekstrakcijskega pufra (Dodatek 3) in pretresemo na rotacijskem stresalniku (50-100 vrt/min) 4 ure pri temperaturi pod 24 °C in 16 do 24 ur pri temperaturi hladilnika, ali

(b) homogeniziramo jedra z zadostno količino (približno 40 ml) ekstrakcijskega pufra (Dodatek 3), bodisi v mešalcu (npr. Waring ali Ultra Thurax) ali pa jih zmeljemo v zaprti meceracijski vrečki za enkratno uporabo (npr. močan tesnilni politen Stomacher ali Bioreba, 150 mm × 250 mm; steriliziran z obsevanjem), pri čemer uporabimo gumijast bat ali ustrezno aparaturo za mletje (npr. Homex).

Opomba:

Če se vzorci homogenizirajo z mešalcem, je tveganje navzkrižne okužbe vzorcev veliko. Z ustreznimi ukrepi se ognemo nastajanju pršenja ali razlitju med postopkom ekstrakcije. Za vsak vzorec moramo uporabiti sveže razkužena rezila in posodo mešalca. Če uporabljamo test PCR, se moramo izogibati prenosu DNK na posodah ali aparaturah za mletje. Mletje v vrečkah za enkratno uporabo in uporaba cevk za enkratno uporabo se priporoča pri testu PCR.

3.1.4 Odlijemo supernatant. V primeru prevelike motnosti, sčistimo s počasnim centifugiranjem (ne več kot 180 g za 10 min pri temperaturi 4 do 10 °C) ali z vakumsko filtracijo (40 do 100 µm), pri čemer filter operemo z dodatnim (10 ml) ekstrakcijskim pufrom (Dodatek 3).

3.1.5 Skoncentriramo bakterijsko frakcijo s centrifugiranjem na 7 000 g 15 minut (ali 10 000 g 10 minut) pri temperaturi 4 do 10 °C in odlijemo supernatant brez premešavanja pelete.

3.1.6 Resuspendiramo peleto v 1,5 ml peletnega pufra (Dodatek 3). Uporabimo 500 µl za testiranje C. m. subsp. sepedonicus, 500 µl za Ralstonia solanacearum in 500 µl za referenčne namene. Dodamo sterilni glicerol končni koncentraciji 10-25 % (v/v) 500 µl referenčnega alikvota in preostanku testnega alikvota, premešamo z vrtinčenjem in shranimo pri –16 do –24 °C (tedni) ali pri –68 do –86° C (meseci). Testne alikvote hranimo pri 4 do 10 °C med testiranjem.

Večkratno zamrzovanje in tajanje ni priporočljivo.

Če je potreben transport ekstrakta, zagotovimo dostavo v hladilni skrinji v 24-ih do 48-ih urah.

3.1.7 Zelo pomembno je, da se pozitivne kontrole in vzorci C. m. subsp. sepedonicus obravnavajo ločeno, da se izognemo okužbi. To velja za stekelca IF in vse teste.

3.2 Rastline Krompirja

Opomba:

Za odkrivanje latentnih populacij C. m. subsp. sepedonicus, je priporočljivo testirati sestavljene vzorce. Postopek se lahko ustrezno uporabi za sestavljene vzorce z do 200 delov stebel. (Kadar se opravljajo raziskave, morajo temeljiti na statistično reprezentativnem vzorcu rastlinske populacije, ki jo proučujemo.)

3.2.1 S čistim razkuženim nožem ali vrtnarskimi škarjami odstranimo 1-2 centimetrski del iz spodnjega dela stebla, tik nad površino zemlje.

Na kratko razkužimo dele stebel s 70 % etanolom in nemudoma popivnamo s pivnim papirjem.

Dele stebel damo v zaprto sterilno posodo v skladu z naslednjimi postopkom vzorčenja:

3.2.2 Dele stebel obdelamo po enem od naslednjih postopkov:

(a) Prekrijemo delce z zadostno količino (približno 40 ml) ekstrakcijskega pufra (Dodatek 3) in pretresemo na rotacijskem stresalniku (50-100 vrt/min) 4 ure pri temperaturi pod 24 °C in 16 do 24 ur pri temperaturi hladilnika; ali

(b) nemudoma obdelamo z mletjem delov v močni maceracijski vrečki (npr. Stomacher ali Bioreba) z ustrezno količino ekstrakcijskega pufra (Dodatek 3) in gumijastim batom ali ustrezno aparaturo za mletje (npr. Homex). Če to ni mogoče, shranimo dele stebel v hladilniku za največ 72 ur ali za največ 24 ur na sobni temperaturi.

3.2.3 Odlijemo supernatant, potem ko pustimo 15 minut, da se usedlina usede.

3.2.4 Nadaljnje čiščenje ekstrakta ali koncentracije bakterijske frakcije navadno ni potrebno, lahko pa ga dosežemo s filtriranjem in/ali centrifugiranjem, kot je opisano v oddelku 3.1.4 do 3.1.6.

3.2.5 Razdelimo čisti ali koncentriran ekstrakt vzorca na dva enaka dela. Eno polovico med testiranjem hranimo pri 4 do 10 °C, drugo pa shranimo z 10-25 % (v/v) sterilnim glicerolom pri –16 do –24 °C (tedni) ali pri –68 do –86 °C (meseci), če je potrebno nadaljnje testiranje.

4. TEST IF

Načelo

Uporaba testa IF kot glavnega presejalnega testa je priporočena, ker je dokazano obstojen pri doseganju zahtevanih pragov.

Kadar se uporabi test IF kot glavni presejalni test in je odčitek IF pozitiven, se kot drugi presejalni test opravita testa PCR ali FISH. Kadar se test IF uporabi kot drugi presejalni test in je odčitek IF pozitiven, je za dokončanje analize potrebno nadaljnje testiranje v skladu z diagramom poteka.

Opomba:

Vedno uporabimo poliklonsko protitelo, kadar se test IF uporabi kot glavni presejalni test. V primeru pozitivnega odčitka IF pri poliklonskem protitelesu nadaljnje preverjanje vzorca z monoklonskim protitelesom lahko poskrbi za večjo natančnost vendar je lahko manj občutljivo.

Uporabimo protitelesa na referenčni sev C. m. subsp. sepedonicus. Priporočljivo je, da se titer določi za vsako novo serijo protiteles. Titer je opredeljen kot največja razredčina, pri kateri se doseže optimalna reakcija, kadar testiramo suspenzijo z 105 do 106 celic na ml homolognega seva C. m. subsp. sepedonicus in uporabljamo ustrezno razredčino fluorescein izotiocinatovega (FITC) konjugata v skladu z navodili proizvajalca. Surova poliklonska ali monoklonska protitelesa morajo imeti titer IF vsaj 1:2 000. Med testiranjem je treba protitelesa uporabljati na delovni(-ih) razredčini(-ah), ki je (so) blizu ali enaka(-e) titru. Uporabimo potrjena protitelesa (glej spletno stran http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Test je treba opravi na sveže pripravljenih ekstraktih vzorcev. Če je potrebno, se lahko uspešno opravi na ekstraktih, hranjenih pri –68 do –86 °C pod glicerolom. Glicerol se lahko odstrani iz vzorca z dodajanjem 1 ml peletnega pufra (Dodatek 4), ponovnim 15-minutnim centrifugiranjem na 7 000 g in resuspenzijo v enaki prostornini peletnega pufra. To pogosto ni potrebno, zlasti če so vzorci na objektna stekelca fiksirani nad plamenom (glej 2.2).

Pripravimo ločena objektna stekelca pozitivne kontrole homolognega seva ali katerega koli referenčnega seva C. m. subsp. sepedonicus, suspendiranega v ekstraktu krompirja, kot je določeno v Dodatku 2, ali po izbiri v pufru.

Če je mogoče, uporabimo naravno okuženo tkivo (ohranjeno z liofilizacijo ali zamrznitvijo pri temperaturi –16 do –24 °C) kot podobno kontrolo na istem objektnem stekelcu.

Za negativne kontrole uporabimo alikvote ekstrakta vzorca, ki je bil predhodno testiran z negativnim rezultatom.

Uporabimo mikroskopska objektna stekelca z več vdolbinicami z po možnosti 10 okenci premera vsaj 6 mm.

Kontrolni material testiramo na enak način kot vzorec ali vzorce.

4.1 Testna objektna stekelca pripravimo po enem od naslednjih postopkov:

(i) Za pelete z relativno majhno škrobno usedlino: S pipeto kanemo odmerjeno standardno količino (15 µl je primerno za okenca s premerom 6 mm - povečamo količino za večja okenca) razredčine 1/100 resuspendirane krompirjeve pelete na prvo okence. Nato s pipeto kanemo podobno količino nerazredčene pelete (1/1) na preostala okenca v vrsti. Druga vrsta se lahko uporabi kot ponovitev ali za drugi vzorec, kot je prikazano na sliki 1.

(ii) Za druge pelete: Pripravimo desetkratne razredčine (1/10 in 1/100) resuspendirane pelete v peletnem pufru. S pipeto kanemo odmerjeno standardno količino (15 µl je primerno za okenca s premerom 6 mm - povečamo količino za večja okenca) resuspendirane pelete in vsake razredčine na vrsto okenc. Druga vrsta se lahko uporabi kot ponovitev ali za drugi vzorec, kot je prikazano na sliki 2.

4.2 Kapljice posušimo na sobni temperaturi ali s segrevanjem pri temperaturah od 40 do 45 °C. Fiksiramo bakterijske celice na objektno stekelce bodisi s segrevanjem (15 min pri 60 °C), nad plamenom, s 95-odstotnim etanolom ali v skladu s posebnimi navodili dobavitelja protiteles.

Po potrebi se fiksirana objektna stekelca lahko shranijo zmrznjena v sušilni posodi, za kolikor je mogoče kratek čas (do največ 3 mesece) pred nadaljnjim testiranjem.

Postopek IF:

(i) V skladu s pripravo objektnih stekelc v 4.1(i): Pripravimo niz dvakratnih razredčin protitelesa v pufru IF. Prva vdolbinica mora imeti 1/2 titra (T/2), druge pa 1/4 titra (T/4), 1/2 titra (T/2), titer (T) in dvakratni titer (2T).

(ii) V skladu s pripravo objektnih stekelc v 4.1(ii): Pripravimo delovno razredčino (WD) protitelesa v pufru IF. Delovna razredčina vpliva na specifičnost.

Slika 1. Priprava testnega objektnega stekelca v skladu s 4.1(i) in 4.3(i)

Razredčine resuspendirane pelete 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Razredčina resuspendirane pelete (T = titer) T/2 T/4 T/2 T 2T  Dvakratne razredčine antiseruma/protitelea Vzorec 1 1 2 3 4 5 Ponovitev vzorca 1 ali vzorec 2 6 7 8 9 10





Slika 2. Priprava testnega objektnega stekelca v skladu s 4.1(ii) in 4.3(ii)

Delovna razredčina antiseruma/protitelesa 1/1 1/10 1/100 prazno prazno  Desetkratna razredčina resuspendirane pelete Vzorec 1 1 2 3 4 5 Ponovitev vzorca 1 ali vzorec 2 6 7 8 9 10

4.3.1 Objektna stekelca razporedimo po vlažnem papirju. Vsako testno okence popolnoma prekrijemo z razredčino ali razredčinami protiteles. Količina protiteles, ki se nanese na vsako okence, mora biti vsaj enaka količini uporabljenega ekstrakta.

Kadar ni posebnih navodil od dobavitelja protiteles, se izvede naslednji postopek:

4.3.2 Inkubiramo objektna stekelca na vlažnem papirju v komori pri sobni temperaturi (18 do 25 °C) 30 minut.

4.3.3 Otresemo kapljice z vsakega objektnega stekelca in pazljivo splaknemo s pufrom IF. Operemo, tako da potopimo za 5 minut v pufer IF-Tween (Dodatek 3) in nato za 5 minut v pufer IF. Izogibamo se povzročanju pršenja in prenašanju kapljic, ki bi lahko povzročilo navzkrižno okužbo. Pazljivo odstranimo odvečno vlago z nežnim pivnanjem.

4.3.4 Objektna stekelca razporedimo po vlažnem papirju. Testna okenca prekrijemo z razredčino konjugata FITC, ki se uporablja za določitev titra. Količina konjugata, nanesenega na okenca, mora biti enaka količini nanesenega protitelesa.

4.3.5 Inkubiramo objektna stekelca na vlažnem papirju v komori pri sobni temperaturi (18 do 25 °C) 30 minut.

4.3.6 Otresemo kapljice konjugata z objektnega stekelca. Splaknemo in operemo tako kot prej (4.3.3).

Pazljivo odstranimo odvečno vlago.

4.3.7 S pipeto kanemo 5 do 10 µl 0,1 M glicerola s fosfatnim pufrom (Dodatek 3) ali komercialno prekrivno sredstvo proti bledenju in pokrijemo s krovnim stekelcem.

Branje testa IF:

4.4.1 Pregledamo objektna stekelca pod mikroskopom, opremljenim z virom epiflourescentne svetlobe in filtri, ki so primerni za vzbujanje FITC, v imerzijskem olju ali vodi, pri povečavi 500–1 000. Okenca pregledamo po črtah dveh pravokotnih premerov in po obodu. Pri vzorcih, ki nimajo ali imajo majhno število celic, pregledamo vsaj 40 mikroskopskih polj.

Najprej pregledamo objektno stekelce pozitivne kontrole. Celice morajo biti svetlo fluorescentne in popolnoma obarvane pri določenem titru protiteles ali delovni razredčini. Test IF (oddelek 4) se mora ponoviti v primeru odstopanja pri obarvanju.

4.4.2 Iščemo svetlo fluorescentne celice z značilno morfologijo C. m. subsp. sepedonicus v testnih okencih testnih objektnih stekelc (glej spletno stran http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intenzivnost fluorescence mora biti enaka ali večja kot pri sevu pozitivne kontrole pri enaki razredčini protitelesa. Celice, ki niso popolnoma obarvane, ali s šibko fluorescenco, se ne upoštevajo.

Če se sumi na okužbo, se test ponovi. To se lahko zgodi v primeru, ko vsa objektna stekelca v seriji kažejo pozitivne celice zaradi okužbe pufra ali če odkrijemo pozitivne celice (zunaj okenca objektnega stekelca) na zgornji plasti objektnega stekelca.

4.4.3 S specifičnostjo imunoflourescentnega testa je povezanih nekaj težav. V peletah jedra stolona in delov stebel krompirja se bodo verjetno pojavile populacije fluorescentnih celic ozadja z neznačilno morfologijo in navzkrižno reagirajoče saprofitske bakterije, podobne velikosti in morfologije kot C. m. sepedonicus.

4.4.4 Upoštevamo samo fluorescentne celice značilne velikosti in morfologije v titru ali delovni razredčini protiteles kot v 4.3.

4.4.5 Interpretacija odčitka IF:

(i) Če najdemo svetlo fluorescentne celice z značilno morfologijo, ocenimo povprečno število značilnih celic na mikroskopsko polje in izračunamo število značilnih celic na ml resuspendirane pelete (Dodatek 4). Odčitek IF je pozitiven pri vzorcih z vsaj 5 × 103 značilnih celic na ml resuspendirane pelete. Vzorec se šteje za potencialno okuženega in potrebno je nadaljnje testiranje.

(ii) Odčitek IF je negativen pri vzorcih z manj kot 5 × 103 celic na ml resuspendirane pelete in vzorec se šteje za negativnega. Nadaljnje testiranje ni potrebno.

5. TEST FISH

Načelo

Kadar se uporabi test FISH kot glavni presejalni test in je rezultat pozitiven, se kot obvezni drugi presejalni test opravi test IF. Kadar se test FISH uporabi kot drugi presejalni test in je rezultat pozitiven, je za končno diagnozo potrebno nadaljnje testiranje v skladu z diagramom poteka.

Opomba:

Uporabimo potrjene oligo-sonde, specifične za C. m. subsp. sepedonicus (Dodatek 7). Predhodno testiranje s to metodo mora omogočati ponovljivo odkrivanje vsaj 103 do 104 celic C. m. subsp. sepedonicus na ml dodano ekstraktom vzorcev, ki so bili prej testirani z negativnim rezultatom.

Naslednji postopek je najbolje izvesti na sveže pripravljenem ekstraktu vzorca, vendar ga prav tako lahko uspešno izvedemo na ekstraktu vzorca, ki je bil predhodno shranjen pri –16 do –24 °C ali –68 do –86 °C pod glicerolom.

Za negativne kontrole uporabimo alikvote ekstrakta vzorca, ki je bil predhodno testiran z negativnim rezultatom na C. m. subsp. sepedonicus.

Za pozitivne kontrole pripravimo suspenzije, ki vsebujejo 105 do 106 celic na ml C. m. subsp. sepedonicus (npr. sev NCPPB 4053 ali PD 406) v 0,01 M fosfatnega pufra (PB) iz 3- do 5-dnevne kulture (za pripravo glej Dodatek 2). Pripravimo ločena objektna stekelca pozitivne kontrole homolognega seva ali katerega drugega referenčnega seva C. m. subsp. sepedonicus, suspendiranega v ekstraktu krompirja, kot je določeno v Dodatku 2.

Uporaba evbakterijske oligo-sonde z oznako FITC nudi kontrolo za proces hibridizacije, saj obarva vse evbakterije, ki se nahajajo v vzorcu.

Kontrolni material testiramo na enak način kot vzorec ali vzorce.

5.1 Fiksacija ekstrakta krompirja

Naslednji protokol temelji na Wullings in drugi, (1998):

5.1.1 Pripravimo fiksirno raztopino (glej Dodatek 7).

5.1.2 S pipeto kanemo 100 µl vsakega ekstrakta vzorca v Eppendorfovo epruveto in centrifugiramo 8 min na 7 000 g.

5.1.3 Odlijemo supernatant in raztopimo peleto v 500 µl preparata za fiksiranje, pripravljenega manj kot 24 ur pred tem. Premešamo z vrtinčenjem in inkubiramo čez noč pri 4 °C.

Alternativni preparat za fiksiranje je 96 % etanol. Pri tem je treba raztopiti peleto iz stopnje 5.1.2 v 50 µl 0,01 M PB in 50 µl 96 % etanola. Premešamo z vrtinčenjem in inkubiramo 30 do 60 minut pri 4 °C.

5.1.4 Centrifugiramo 8 minut pri 7 000 g, odlijemo supernatant in resuspendiramo peleto v 75 µl 0,01 M PB (glej Dodatek 3).

5.1.5 Kanemo 16 µl fiksirane suspenzije na čisto multitestno objektno stekelce, kot je prikazano na sliki 3. Za vsako objektno stekelce uporabimo 2 različna nerazredčena vzorca in uporabimo 10 µl za pripravo razredčine 1:100 (v 0,01 M PB). Preostala raztopina vzorca (49 µl) se lahko shrani pri –20 °C, potem ko dodamo eno količino 96 % etanola. V primeru, ko je treba preskušanje FISH ponoviti, odstranimo etanol s centrifugiranjem in dodamo enako količino 0,01 M PB (premešamo z vrtinčenjem).

Slika 3 Razporeditev za objektno stekelce FISH

Vzorec 1 Prazno Prazno Prazno Vzorec 2 okence 1 okence 2 okence 3 okence 4 okence 5 Vzorec 1 Prazno Prazno Prazno Vzorec 2 okence 6 okence 7 okence 8 okence 9 okence 10 Krovno stekelce 1 Krovno stekelce 2

5.1.6 Objektna stekelca posušimo na zraku (ali v sušilniku za stekelca pri 37 °C) in jih fiksiramo nad plamenom.

Na tej stopnji se postopek lahko prekine in nadaljuje s hibridizacijo naslednji dan. Objektna stekelca se shranijo v prostoru brez prahu in na suhem pri sobni temperaturi.

5.2 Predhibridizacija in hibridizacija

5.2.1 Pripravimo raztopino lizocima, ki vsebuje 10 mg lizocima (Sigma L-6876) v 10 ml pufra (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0). Ta raztopina se lahko shrani, vendar jo lahko samo enkrat zamrznemo in odtalimo. Vsak vzorec dobro prekrijemo s približno 50 µl raztopine lizocima in 10 minut inkubiramo pri sobni temperaturi. Nato samo enkrat pomočimo objektna stekelca v demineralizirano vodo in osušimo s filtrirnim papirjem.

Alternativno namesto lizocima dodamo 50 µl 40-400 ug ml–1 proteinaze K v pufru (20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7,4) na vsako vdolbinico in inkubiramo 30 minut pri 37 °C.

5.2.2 Dehidriramo celice v stopenjski seriji 50 %, 80 % in 96 % etanola, v vsakem po eno minuto. Objektna stekelca posušimo v stojalu za stekelca.

5.2.3 Pripravimo vlažno inkubacijsko komoro, tako da pokrijemo dno hermetične posode z pivnim ali filtrirnim papirjem, prepojenim z 1x hybmix. (Dodatek 7). Predinkubiramo posodo v hibridizacijski pečici vsaj 10 minut pri 55 °C.

5.2.4 Pripravimo hibridizacijsko raztopino (Dodatek 7), pri čemer nanesemo 45 µl na objektno stekelce in predinkubiramo 5 minut pri 55 °C.

5.2.5 Položimo objektna stekelce na vročo ploščo pri 45 °C in nanesemo 10 µl hibradizacijske raztopine na vse štiri vdolbinice na objektnem stekelcu ali stekelcih.

5.2.6 Nanesemo 2 krovni stekelci (24 × 24 mm) na vsako objektno stekelce in pazimo, da se ne napravijo zračni mehurčki. Objektna stekelca položimo v prej ogreto vlažno komoro in čez noč v temi hibridiziramo v pečici pri 55 °C.

5.2.7 Pripravimo 3 čaše, ki vsebujejo 1 l ultra čiste vode (UPW), 1 l 1x hybmixa (334 ml 3x hybmixa in 666 ml UPW) in 1 l 1/2x hybmixa (167 ml 3x hybmixa in 833 ml UPW). Vsako predinkubiramo v vodni kopeli pri 55 °C.

5.2.8 Odstranimo krovna stekelca z objektnih stekelc in namestimo objektna stekelca v stojalo za stekelca.

5.2.9 Izperemo odvečno sondo z inkubiranjem v čaši z 1x hybmixom pri 55 °C 15 minut.

5.2.10 Prenesemo stojalo za stekelca v pralno raztopino 1/2 hybmix in inkubiramo nadaljnjih 15 minut.

5.2.11 Objektna stekelca na hitro pomočimo v UPW in jih položimo na filtrirni papir. Odstranimo odvečno vlago, tako da površino nalahno prekrijemo s filtrirnim papirjem. S pipeto kanemo 5 do 10 μl prekrivne raztopine proti bledenju (npr. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA ali enakovredni) na vsako okence in položimo široko krovno stekelce (24 × 60 mm) čez celo objektno stekelce.

5.3 Branje testa FISH

5.3.1 Nemudoma pregledamo objektna stekelca pod mikroskopom, opremljenim z virom epiflourescentne svetlobe, pri povečavi 630 ali 1 000x v imerzijskem olju. S filtrom, primernim za fluorescein izotiocinat (FITC), se evbakterijske celice (vključno z večino gram negativnih celic) v vzorcu obarvajo fluorescentno zeleno. Z uporabo filtra za tetrametilrodamin-5-izotiocinat, izgledajo celice C. m. subsp. sepedonicus, obarvane s Cy3, fluorescentno rdeče. Primerjamo morfologijo celic s tistimi iz pozitivnih kontrol. Celice morajo biti svetlo fluorescentne in popolnoma obarvane. V primeru odstopanja pri obarvanju se mora ponoviti test FISH (oddelek 9.4). Okenca pregledamo po črtah dveh pravokotnih premerov in po obodu. Pri vzorcih, ki nimajo ali imajo majhno število celic, pregledamo vsaj 40 mikroskopskih polj.

5.3.2 Iščemo svetlo fluorescentne celice z značilno morfologijo C. m. subsp. sepedonicus v testnih okencih testnih objektnih stekelc (glej spletno stran http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intenzivnost fluorescence mora biti enaka ali večja kot pri sevu pozitivne kontrole. Celice, ki niso popolnoma obarvane, ali s šibko fluorescenco se ne upoštevajo.

5.3.3 Če se sumi na okužbo, se test ponovi. To se lahko zgodi v primeru, ko vsa objektna stekelca v seriji kažejo pozitivne celice zaradi okužbe pufra ali če odkrijemo pozitivne celice (zunaj okenca objektnega stekelca) na zgornji plasti objektnega stekelca.

5.3.4 S specifičnostjo testa FISH je povezanih nekaj težav. V peletah jedra stolona in delov stebel krompirja se lahko pojavijo populacije fluorescentnih celic ozadja z neznačilno morfologijo in navzkrižno reagirajoče saprofitske bakterije, podobne velikosti in morfologije kot C. m. sepedonicus, čeprav veliko manj pogosto kot pri testu IF.

5.3.5 Upoštevamo samo fluorescentne celice značilne velikosti in morfologije, glej 5.3.2.

5.3.6 Interpretacija rezultatov testa FISH:

(i) Veljavne rezultate testa FISH dobimo, če z uporabo filtra FITC opazimo svetlo zeleno fluorescentne celice, velikosti in morfologije značilne za C. m. subsp. sepedonicus, in svetlo rdeče fluorescentne celice z uporabo filtra rodamin, pri vseh pozitivnih kontrolah in pri nobeni od negativnih kontrol. Če najdemo svetlo fluorescentne celice z značilno morfologijo, ocenimo povprečno število značilnih celic na mikroskopsko polje in izračunamo število značilnih celic na ml resuspendirane pelete (Dodatek 4). Vzorci z vsaj 5 × 103 značilnih celic na ml resuspendirane pelete se štejejo za potencialno okužene. Potrebno je nadaljnje testiranje. Vzorci z manj kot 5 × 103 značilnih celic na ml resuspendirane pelete se štejejo za negativne.

(ii) Test FISH je negativen, če z uporabo filtra rodamin ne opazimo svetlo rdeče fluorescentnih celic, velikosti in morfologije značilne za C. m. subsp. sepedonicus, če z uporabo filtra rodamin opazimo značilne svetlo rdeče fluorescentne celice pri preparatih pozitivnih kontrol.

6. TEST PCR

Načela

Kadar se uporabi test PCR kot glavni presejalni test in je rezultat pozitiven, se kot obvezni drugi presejalni test opravi test IF. Kadar se test PCR uporabi kot drugi presejalni test in je rezultat pozitiven, je za končno diagnozo potrebno nadaljnje testiranje v skladu z diagramom poteka.

Popolna uporaba te metode kot glavnega presejalnega testa je priporočena samo ob pridobitvi specialističnega strokovnega znanja.

Opomba:

Predhodno testiranje s to metodo mora omogočati ponovljivo odkrivanje vsaj 103 do 104 celic C. m. subsp. sepedonicus na ml dodano ekstraktom vzorcev, ki so bili prej testirani z negativnim rezultatom. Lahko so potrebni optimizacijski poskusi za dosego maksimalnih stopenj občutljivosti in specifičnosti v vseh laboratorijih.

Uporabimo potrjene reagente in protokole PCR. Raje izberemo metodo z notranjo kontrolo.

Uporabimo ustrezno previdnostne ukrepe, da se ognemo okužbi vzorca s ciljno DNK. Test PCR morajo opravljati izkušeni tehniki v namenskih laboratorijih za molekularno biologijo, da bi čim bolj zmanjšali možnost okužbe s ciljno DNK.

Negativne kontrole (za ekstrakcijo DNK in postopke PCR) morajo biti vedno obravnavane kot končni vzorci v postopku, da je očitno, ali se je zgodil kak prenos DNK.

V test PCR se morajo vključiti naslednje negativne kontrole:

— Ekstrakt vzorca, ki je prej testiran z negativnim rezultatom na C. m. subsp. Sepedonicus.

— Kontrole pufrov, ki se uporabljajo za ekstrakcijo bakterije in DNK iz vzorca.

— Reakcijska zmes PCR.

Morajo se vključiti naslednje pozitivne kontrole:

— Alikvoti resuspendiranih pelet, ki jim je bila dodana C. m. subsp. sepedonicus (za pripravo glej Dodatek 2).

— Suspenzija 106 celic na ml C. m. subsp. sepedonicus v vodi iz virulentnega izolata (npr. NCPPB 2140 ali NCPPB 4053).

— Po možnosti se uporabi tudi DNKA, izvlečen iz pozitivnih kontrolnih vzorcev v testu PCR.

Da se ognemo potencialni okužbi, pripravimo pozitivne kontrole v okolju, ločenem od vzorcev, ki jih nameravamo testirati.

Na ekstraktih vzorca mora biti čim manj zemlje. Zato bi bilo v nekaterih primerih priporočljivo pripraviti ekstrakte iz umitih krompirjev, če se uporabijo protokoli PCR.

6.1 Metode prečiščevanja DNK

Uporabimo vzorce pozitivne in negativne kontrole, kot je opisano zgoraj.

Kontrolni material pripravimo na enak način kot vzorec ali vzorce.

Na voljo je več metod prečiščevanja ciljne DNK iz kompleksnih substratov vzorca, pri čimer se odstrani inhibitorje PCR in druge encimske reakcije in v ekstraktu vzorca skoncentrira ciljna DNK.

Naslednja metoda je bila optimizirana za uporabo s potrjeno metodo PCR, prikazano v Dodatku 6.

6.1(a) Pastrikova metoda (2000):

1. S pipeto kanemo 220 µl lizirnega pufra (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) v 1,5 ml Eppendorfovo epruveto.

2. Dodamo 100 µl ekstrakta vzorca in položimo na grelno površino ali v vodno kopel pri 95 °C za 10 minut.

3. Za 5 minut položimo epruveto na led.

4. Dodamo 80 µl osnovne raztopine lizocima (50 mg lizocima na ml v 10 mM Tris HCl, pH 8,0) in 30 minut inkubiramo pri 37 °C.

5. Dodamo 220 µl Easy DNA® raztopine A (Invitrogen), dobro premešamo z vrtinčenjem in 30 minut inkubiramo pri 65 °C.

6. Dodamo 100 µl Easy DNA® raztopine B (Invitrogen), močno premešamo z vrtinčenjem, da oborina prosto plava v epruveti in je vzorec enotno viskozen.

7. Dodamo 500 µl kloroforma in premešamo z vrtinčenjem, dokler se viskoznost ne zmanjša in zmes ne postane homogena.

8. 20 minut centrifugiramo pri 15 000 g pri 4 °C, da ločimo faze in oblikujemo interfazo.

9. Zgornjo fazo prenesemo v svežo Eppendorfovo epruveto.

10. Dodamo 1 ml 100 % etanola (–20 °C), na kratko premešamo z vrtinčenjem in 10 minut inkubiramo na ledu.

11. 10 minut centrifugiramo pri 15 000 g pri 4 °C in odstranimo etanol iz pelete.

12. Dodamo 500 µl 80 % etanola (–20 °C) in premešamo tako, da obračamo epruveto.

13. 10 minut centrifugiramo pri 15 000 g pri 4 °C, ohranimo peleto in odstranimo etanol.

14. Pustimo, da se peleta posuši na zraku ali v vakumski centrifugi.

15. Resuspendiramo peleto v 100 µl sterilne UPW in vsaj 20 minut pustimo na sobni temperaturi.

16. Shranimo pri –20 °C dokler je ne potrebujemo za PCR.

17. S centrifugiranjem odvrtimo vso belo oborino in uporabimo 5 µl supernatanta, ki vsebuje DNK za PCR.

6.1(b) Druge metode

Druge metode za ekstrakcijo DNK (npr. Qiagen DNeasy Plant Kit) se lahko uporabijo, če so dokazano enako učinkovite pri prečiščevanju DNK iz kontrolnih vzorcev, ki vsebujejo 103 do 104 patogenih celic na ml.

6.2 PCR

6.2.1 Pripravimo testne in kontrolne matrice za PCR v skladu z potrjenim protokolom (Dodatek 6). Pripravimo desetkratno razredčino ekstrakta vzorca DNK (1:10 v UPW).

6.2.2 Pripravimo ustrezno reakcijsko zmes PCR v neokuženem okolju v skladu z objavljenim protokolom (Dodatek 6). Potrjeni protokol PCR je multipla reakcija, ki vključuje tudi notranjo kontrolo PCR.

6.2.3 Dodamo 5 µl ekstrakta DNK na 25 µl reakcijske zmesi PCR v sterilne epruvete PCR.

6.2.4 Vključimo vzorec negativne kontrole, ki vsebuje samo reakcijsko zmes PCR, in dodamo isti vir UPW, kot je bil uporabljen v zmesi PCR pri vzorcu.

6.2.5 Namestimo epruvete v isti ciklični termostat, kot je bil uporabljen pri predhodnem testiranju, in zaženemo ustrezno optimiziran program PCR. (Dodatek 6).

6.3 Analiza produkta PCR

6.3.1 Odkrijemo pomnožke PCR z elektroforezo v agaroznem gelu. Odlijemo vsaj 12 µl pomnožene reakcijske zmesi DNK iz vsakega vzorca, zmešane s 3 µl nanašalnega pufra (Dodatek 6) v 2,0 % (w/v) agarozne gele v tris-acetat-EDTA (TAE) pufru (Dodatek 6) pri 5–8 V na cm. Uporabimo ustrezni označevalec DNK, npr. lestvico 100 bp.

6.3.2 Razkrijemo proge DNK z obarvanjem v etidijevem bromidu (0,5 mg na L) 30 do 45 minut, pri čemer se ustrezno zavarujemo pri ravnanju s to mutageno snovjo.

6.3.3 Opazujemo obarvani gel pod kratkovalovno UV presvetlitvijo. (npr. λ = 302 nm) in iščemo pomnožene produkte PCR pričakovane velikosti (Dodatek 6) ter dokumentiramo.

6.3.4 Za vse nove ugotovitve/primere preverimo avtentičnost pomnožka PCR, tako da opravimo analizo restrikcije encima na vzorcu preostale pomnožene DNK z inkubacijo pri optimalni temperaturi in času z ustreznim encimom in pufrom (glej Dodatek 6). Odkrijemo raztopljene delce z elektroforezo v agaroznem gelu kot prej in opazujemo značilne vzorce restrikcijskih delcev pod UV presvetlitvijo po obarvanju z etidijevim bromidom in primerjamo z neraztopljeno in raztopljeno pozitivno kontrolo.

Interpretacija rezultatov testa PCR:

Test PCR je negativen, če v zadevnem vzorcu ne opazimo za C. m. subsp. sepedonicus značilnega pomnožka PCR pričakovane velikosti, pojavi pa se v vseh pozitivnih kontrolnih vzorcih (v primeru multple PCR z za rastlino značilnimi začetniki za notranje kontrole: drugi produkt PCR se mora povečati pri zadevnem vzorcu).

Test PCR je pozitiven, če odkrijemo za C. m. subsp. sepedonicus značilen pomnožek PCR pričakovane velikosti in vzorca restrikcije (če je potrebno), pod pogojem, da ni pomnožen iz nobenega negativnega kontrolnega vzorca. Zanesljiva potrditev pozitivnega rezultata se lahko pridobi s ponovitvijo testa z drugim nizom začetnikov PCR. (oddelek 9.3).

Opomba:

Inhibicija PCR se lahko pričakuje, če se pričakovani pomnožek pridobi iz vzorca pozitivne kontrole, ki vsebuje C. m. subsp. sepedonicus v vodi, vendar so negativni rezultati pridobljeni iz pozitivnih kontrol C. m. subsp. sepedonicus v ekstraktih krompirja. V multiplih protokolih PCR z notranjo kontrolo PCR kaže na inhibicijo reakcije, kadar ni pridobljen nobeden od obeh pomnožkov.

Na okužbo se sumi, če je pričakovani pomnožek pridobljen iz ene ali več negativnih kontrol.

7. BIOLOŠKI TEST

Opomba:

Predhodno testiranje s to metodo mora omogočati ponovljivo odkrivanje vsaj 103 do 104 enot C. m. subsp. sepedonicus, ki ustvarjajo kolonije na ml, dodano ekstraktom vzorcev, ki so bili prej testirani z negativnim rezultatom (za pripravo glej Dodatek 2).

Največjo občutljivost pri odkrivanju lahko pričakujemo pri uporabi sveže pripravljenih ekstraktov vzorca in v optimalnih rastnih pogojih. Vendar pa se metoda lahko uspešno uporabi tudi pri ekstraktih, ki so bili shranjeni v glicerolu pri –68 do –86 °C.

Nekatere sorte jajčevca so odlično obogatitveno gojišče za rast C. m. subsp. sepedonicus tudi kadar ni simptomov in so prav tako tudi odličen potrditveni gostiteljski test.

Rastni pogoji morajo biti optimalni, tako da se zmanjša nevarnost napačnih negativnih rezultatov teta.

Za podrobnosti o kulturi glej Dodatek 8.

7.1 Med jajčevce porazdelimo ves preostali testni alikvot resuspendirane pelete iz oddelka 3.1.6 ali 3.2.5, z uporabo ene od spodnjih metod (7.3 ali 7.4). Uporabimo samo rastline v stadiju olistanosti 2–3 do popolne razvitosti tretjega pravega lista. Da bi zagotovili popolno uporabo resuspendirane pelete, kakor tudi učinkovito inokulacijo, se za spodnje postopke zahteva 15–25 jajčevcev na vzorec.

7.2 1 do 2 dni pred inokulacijo ne zalivamo jajčevcev, da se zmanjša turgor.

Inokulacija z zarezo

7.3.1 Ko držimo rastlino med dvema prstoma, s pipeto kanemo kapljico (približno 5 do 10 µl) suspendirane pelete na steblo med kličnima lista in prvim listom.

7.3.2 S sterilnim skalpelom diagonalno zarežemo od peletne kapljice naprej, pri čemer je zareza dolga približno 1,0 cm in globoka 2/3 debeline stebla.

7.3.3 Zarezo zapremo s sterilnim vazelinom iz brizgalke.

7.4 Inakulacija z brizgalko

Inakuliramo steblo jajčevca tik nad kličnim listom z uporabo brizgalke, ki ima hipodermično iglo (ne manj kot 23G). Porazdelimo vzorec med jajčevce.

7.5 Za pozitivno kontrolo inokuliramo 5 rastlin z vodno raztopino 105 do 106 celic na ml znane kulture C. m. subsp. sepedonicus in, kadar je mogoče, z naravno okuženim tkivom gomolja (glej Oddelek 4) z isto inokulacijsko metodo (7.3 ali 7.4).

7.6 Za negativno kontrolo inokuliramo 5 rastlin s sterilnim peletnim pufrom z isto inokulacijsko metodo (7.3 ali 7.4).

7.7 Inkubiramo rastline v karantenskih prostorih do 4 tedne pri 18 do 24 °C. Inkubiramo rastline z zadostno svetlobo in visoko vlažnostjo (70–80 %) ter zalivamo, da preprečimo nalaganje vode ali venenje. Celice C. m. sepedonicus umrejo pri temperaturi nad 30 °C, optimalna temperatura pa je 21 °C. Da se izognemo okužbi, inkubiramo rastline pozitivne in negativne kontrole na jasno ločenih klopeh v rastlinjaku ali rastnem prostoru ali v primeru omejenega prostora zagotovimo strogo ločitev med obravnavanjem. Če morajo biti rastline za različne vzorce inkubirane tesno skupaj, jih ločimo z ustreznimi zasloni. Pri gnojenju, zalivanju, preverjanju in drugih posegih moramo močno paziti da ne pride do navzkrižne okužbe. Bistvenega pomena je, da v rastlinjaku ali rastnem prostoru ni insektov, saj ti lahko prenesejo bakterije iz vzorca na vzorec.

7.8 Po enem tednu redno preverjamo simptome. Preštejemo število rastlin, ki kažejo simptome. C. m. subsp. sepedonicus povzroča venenje listov jajčevcev, kar se lahko začne kot obrobna ali medžilna mlahavost. Ovenelo tkivo je lahko sprva temno zeleno ali lisasto, vendar postane bledo preden postane nekrotično. Medžilno venenje ima pogosto masten, razmočen videz. Nekrotično tkivo ima pogosto svetlo rumen rob. Ni nujno, da rastline odmrejo; čim kasneje se simptomi razvijejo, večja je možnost preživetja. Rastline lahko okužbo prebolijo. Mlade rastline so veliko bolj dovzetne za manjše populacije C. m. subsp. sepedonicus kot starejše rastline, zato je potrebno uporabiti rastline na ali stadijem olistanosti 3.

Do venenja lahko pride tudi zaradi populacij drugih bakterij ali gliv v peleti gomoljnjega tkiva. Sem so vključene Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora subsp. carotovora in E. carotovora subsp. atroseptica, Erwinia chrysanthemi, Phoma exigua var. foveata, kakor tudi velike populacije saprofitskih bakterij. Zlasti Erwinia chrysanthemi lahko povzroči listne simptome in venenje, ki so zelo podobni simptomom C. m. sepedonicus. Edina razlika je črnenje stebel pri okužbah z Erwinia chrysanthemi. Drugo venenje je moč razlikovati od tistega, ki ga povzroča C. m. subsp. sepedonicus, saj celi listi ali cela rastlina hitro venijo. Lahko se pripravi tudi obarvanje po Gramu: s tem testom razločimo med C. m. subsp. sepedonicus in Erwinia spp.

7.9 Kakor hitro pri jajčevcih opazimo simptome, je treba opraviti ponovno izolacijo, z uporabo delov ovenelega listnega tkiva ali stebelnega tkiva od rastlin (glej 3.1.3 za maceracijo tkiva). Površinsko razkužimo liste in stebla jajčevca, tako da jih obrišemo s 70 % etanolom. Opravimo test IF ali PCR na soku jajčevca in izoliramo na primerno (selektivno) gojišče (glej oddelek 8). Lahko se pripravi tudi obarvanje po Gramu (Dodatek 9). Identificiramo prečiščene kulture domnevne C. m. subsp. sepedonicus in potrdimo patogenost (glej oddelek 9 in 10).

7.10 V nekaterih okoliščinah, zlasti kadar rastni pogoji niso optimalni, lahko C. m. subsp. sepedonicus obstaja kot latentna okužba v jajčevcih, tudi po izteku inkubacijskega obdobja do 4 tedne. Če se simptomi po 4 tednih ne pojavijo, opravimo test IF/PCR na sestavljenem vzorcu 1 centimetrskih delcev stebla vsake testne rastline, ki se odvzame nad mestom inokulacije. Če je test pozitiven, se mora opraviti ponovna izolacija na primernem (selektivnem) gojišču, po postopku iz oddelka 8. Identificiramo prečiščene kulture domnevne C. m. subsp. sepedonicus in potrdimo patogenost (glej oddelek 9 in 10).

Interpretacija rezultatov biološkega testa

Veljavne rezultate biološkega testa pridobimo, če rastline pozitivne kontrole kažejo značilne simptome, če se bakterija lahko ponovno izolira iz teh rastlin in če negativne kontrole ne kažejo nobenih simptomov.

Biološki test je negativen, če testne rastline niso okužene z bakterijo C. m. subsp. sepedonicus, pod pogojem da smo v pozitivni kontroli odkrili bakterije C. m. subsp. sepedonicus.

Biološki test je pozitiven, če so testne rastline okužene z bakterijo C. m. subsp. sepedonicus.

8. IZOLACIJA C. M. SUBSP. SEPEDONICUS

Opomba:

Diagnoza se lahko potrdi le, če se C. sepedonicus izolira in nato identificira (glej oddelek 9) ter potrdi s patogenim testom (oddelek 10). Čeprav je C. m. subsp. sepedonicum zahteven organizem, ga lahko izoliramo iz simptomatičnega tkiva.

Lahko pa ga prerasejo hitro rastoče saprofitske bakterije, zato je izolacija neposredno iz pelete tkiva gomolja ali stebla težka (oddelek 3.1.6 ali 3.2.5). S selektivnim gojiščem in primerno razredčitvijo resuspendiranih pelet iz jedra stolona ali stebla krompirja, je možna neposredna izolacija C. m. subsp. sepedonicus.

Izolacijo je treba opraviti na vseh simptomatičnih gomoljih krompirja ali delih stebla in jajčevcih, kjer niso bili opaženi nobeni simptomi, vendar je bil test IF/PCR sestavljenega vzorca pozitiven (glej oddelek 7.10). Kdaj je to potrebno, se maceracija stebel jajčevca izvede kot je opisano v oddelku 3.1.3.

Za pozitivno kontrolo pripravimo desetkratne razredčitve iz suspenzije 106 cfu na ml C. m. subsp. sepedonicus (npr. NCPPB 4053 ali PD 406). Da se izognemo možnosti okužbe pripravimo pozitivne kontrole popolnoma ločeno od vzorcev, ki se testirajo.

Pri vsakem novo pripravljenem selektivnem gojišču je treba preveriti njegovo primernost za rast patogena, preden se uporabi za testiranje rutinskih vzorcev.

Kontrolni material testiramo na enak način kot vzorec ali vzorce.

8.1 Razmaz na selektivno gojišče

8.1.1 Iz 100 µl alikvota resuspendirane pelete krompirjevega vzorca ali soka jajčevca naredimo 10 plastne razredčine v peletnem pufru (Dodatek 3).

8.1.2 Izolacija iz nerazredčene krompirjeve pelete navadno ne uspe, zaradi hitre rasti Cms in saprofitov. Ker je bakterija navadno prisotna v visokih populacijah v okuženem tkivu, se saprofiti običajno lahko odstranijo z razredčenjem, medtem ko patogen ostane. Zato je priporočljivo razširiti 100 µl iz vsakega vzorca, 1/100 do 1/10 000 razredčin na gojišče MTNA ali na gojišče NCP-88 (Dodatek 5) (pri uporabi petrijevk s premerom 90 mm – prilagodimo obseg za petrijevke drugih velikosti), z uporabo trosilnikov (hokejske palice) in trosilnih tehnik.

Opomba:

Alternativna možnost je, da raztrosimo prvotni alikvot po 100 µl krompirjeve pelete na prvo agar ploščo s trosilnikom in potem odstranimo trosilnik na drugo agar ploščo, pri čemer odstranimo vse ostanke s trosilnika; to ponovimo na koncu še pri tretji plošči.

8.1.3 Plošče inkubiramo v temi pri 21 do 23 °C.

8.1.4 Prva preverjanja plošč, vključno z štetjem kolonij podobnih C. m. subsp. sepedonicus, v primerjavi s kontrolnimi ploščami, se opravi po treh dneh, z nadaljnjim štetjem po 5, 7, eventualno 10 dneh.

8.2 Čiščenje sumljivih kolonij

Opomba:

Cepljenje kultur kolonij podobnih C. m. subsp. sepedonicus se izvaja na gojišču YGM za inokulacijo jajčevca in/ali kasnejšo identifikacijo; to se izvede preden postanejo plošče preveč zaraščene, t.j. najbolje po 3-5 dneh.

8.2.1 Napravimo proge kolonij podobnih C. m. subsp. sepedonicus na enem od naslednjih gojišč: (formule so navedene v Dodatku 5):

hranilni agar z dekstrozo (samo za uporabo cepljenja kultur),

agar s kvasom, peptonom in glukozo

agar s kvasnim ekstraktom in mineralnimi solmi.

Do 10 dni inkubiramo pri 21 °C do 24 °C.

C. m. subsp. sepedonicus raste počasi, navadno proizvaja točkaste, kupolaste, kremaste kolonije v 10 dneh. (Za fotografije značilnih kolonij C. m. subsp. sepedonicus glej spletno stran: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

8.2.2 Ponovno napravimo proge, da zagotovimo čistost.

Stopnje rasti se izboljšajo s cepljenjem kultur. Značilne kolonije so kremno bele ali slonokoščene barve, občasno rumene, zaokrožene, gladke, privzdignjene, konveksne, sluzaste, s celimi robovi in običajno premera 1 do 3 mm.

Preprosto obarvanje po Gramu (Dodatek 9) lahko pomaga pri izbiri kolonij za nadaljnje testiranje.

8.2.3 Identificiramo domnevne kulture (glej oddelek 9) in opravimo patogeni test (glej oddelek 10).

9. IDENTIFIKACIJA

Identificiramo čiste kulture domnevnih C. m. subsp. sepedonicus izolatov z uporabo vsaj dveh od spodaj opredeljenih testov, ki temeljijo na različnih bioloških principih.

Pri vsakem opravljenem testu vključi znane referenčne seve, kjer je to primerno.

9.1 Hranilni in encimski identifikacijski test

Opredelimo naslednje fenotipske lastnosti, ki so univerzalno prisotne ali odsotne v C. m. subsp. sepedonicus po metodah Lelliota in Steada (1987), Klementa in ostalih (1990), Schaada (2001), neznanega avtorja (1987).

Vsa gojišča je treba inkubirati pri 21 °C in pregledati po šestih dneh. Če se rast ni pojavila, inkubiramo do 20 dni.

Vsi testi morajo vključevati kontrolo z znano bakterijo C. m. subsp. sepedonicum. Pri hranilnih in fizioloških testih je treba uporabiti inokulum iz precepljenih kultur na hranilnem agarju. Morfološke primerjave je treba opraviti na kulturah na hranilnem agarju z dekstrozo.

Testi Pričakovani rezultati Oksidacija/Fermentacija (O/F) test inerten ali šibko oksidativen Oksidaza – Rast pri 37 °C – Ureazna aktivnost – Hodroliza eskulina + Hidroliza škroba – ali šibka Rast v 7 % NaCl – Proizvodnja indola – Katalaza + Proizvodnja H2S – Uporaba citrata – Utekočinjenje želatine – Kislina iz glicerola – Kislina iz laktoze – ali šibka Kislina iz ramnoze – Kislina iz salicina – Obarvanje po Gramu (Dodatek 9) +

9.2 Test IF

(a) Pripravimo suspenzijo približno 106 celic na ml v pufru IF (Dodatek 3)

(b) Pripravimo dvojne serije razredčin primernega antiseruma.

(c) Uporabi postopek IF (oddelek 4).

(d) Test IF je pozitiven, če je titer kulture enak titru pozitivne kontrole. A

9.3 Test PCR

(a) Pripravimo suspenzijo približno 106 celic na ml v ultra čisti vodi (UPW).

(b) Segrejemo 100 µl celične suspenzije v zaprtih epruvetah v grelni posodi ali vreli vodi pri 100 °C za 4 minute. Po potrebi lahko dodatek sveže pripravljenega NaOH končni koncentraciji 0,05 M pomaga celični liziji. Vzorci se potem lahko shranijo pri –16 do –24 °C, dokler jih ne rabimo.

(c) Uporabimo ustrezne postopke PCR za pomnoženje specifičnih pomnožkov C. m. subsp. sepedonicus (npr. Pastrik, 2000; glej Dodatek 4; Li in de Boer, 1995; Mills in drugi., 1997; Pastrik in Rainey, 1999; Schaad in drugi, 1999.

(d) Pozitivna identifikacija C. m. subsp. sepedonicus je dosežena, če so pomnožki PCR iste velikosti in imajo isto restrikcijske dolžine delcev poliorfozmov kot pozitivni kontrolni sev.

9.4 Test FISH

(a) Pripravimo suspenzijo približno 106 celic na ml v UPW.

(b) Uporabimo postopek FISH (oddelek 5).

(c) Pozitiven test FISH je dosežen, če pride do istih reakcij pri kulturi in pozitivnih kontrolah.

9.5 Profiliranje maščobnih kislin (FAP)

(a) Kulturo vzgajamo 72 ur pri 21 °C (+/– 1°) na triptikaznem sojinem agarju.

(b) Izvedemo ustrezni postopek FAP (Janse, 1991; Stead, 1992).

(c) Pozitiven FAP test je dosežen, če je profil domnevne kulture enak profilu pozitivne kontrole. Navzočnost značilnih maščobnih kislin je 15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 in 17:0 Anteiso močno kaže na C. m. sepedonicus. Drugi rodovi kot so Curtobacterium, Arthrobacter in Micrococcus imajo prav tako nekatere od teh kislin, vendar je 15:1 Anteiso A redka kislina v the bakterijah, pojavlja pa se v vseh Clavibacter spp. med 1 in 5 %. Vrednost v C. m. sepedonicus je običajno okoli 5 %.

9.6 BOX-PCR

(a) Pripravimo suspenzijo približno 106 celic na ml v UPW.

(b) Uporabimo test v skladu s postopkom (Smith in drugi., 2001).

10. POTRDITVENI TEST

Test patogenosti se mora opraviti kot končna potrditev diagnoze C. m. subsp. sepedonicus in za oceno virulentnosti kultur, identificiranih kot C. m. subsp. Sepedonicus:

10.1 Pripravimo inokulum približno 106 celic na ml iz tridnevne kulture izolata, ki se testira in ustrezne seve pozitivne kontrole C. m. subsp. sepedonicus.

10.2 Inokuliramo 5–10 stebel jajčevca mladih rastlin v listni fazi 3 (oddelek 7.3 ali 7.4).

10.3 Inkubiramo pri 18 do 24 °C pri ustrezni svetlobi in visoko relativno vlažnostjo ter ustrezno zalivamo, da preprečimo nalaganje vode ali sušni stres (oddelek 7.7). Pri čistih kulturah se značilno venenje pojavi v 2 tednih, vendar se rastline, ki po tem času ne kažejo simptomov (glej oddelek 7.8) inkubira do 3 tedne, pri temperaturi značilni za rast jajčevcev, vendar ne več kot pri 25 °C (Dodatek 8). Če se po 3 tednih simptomi ne pojavijo, se kultura ne more potrditi kot patogena oblika C. m. subsp. sepedonicus.

10.4 Izoliramo iz simptomatičnih rastlin, tako da odstranimo del stebla 2 cm nad mesto inokulacije. Zmeljemo in suspendiramo v majhni količini sterilne destilirane vode ali 50 mM fosfatnega pufra (Dodatek 3). Izoliramo iz suspenzije s trosenjem razredčine ali progami na MTNA in YPGA (Dodatek 5), inkubiramo 3-5 dni pri 21 do 23 °C in pregledamo, če nastanejo značilne kolonije bakterije C. m. subsp. sepedonicus.

Dodatek 1 Laboratoriji, ki so vključeni v optimizacijo in potrjevanje protokolov Laboratorij (1) Kraj Država Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Dunaj in Linz Avstrija Departement Gewasbescherming Merelbeke Belgija Plantedirektoratet Lyngby Danska Central Science Laboratory York Anglija Scottish Agricultural Science Agency Edinburgh Škotska Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité de Bactériologie Angers Francija Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre Le Rheu Francija Biologische Bundesanstalt Kleinmachnow Nemčija Pflanzenschutzamt Hannover Hannover Nemčija State Laboratory Dublin Irska Plantenziektenkundige Dienst Wageningen Nizozemska Norwegian Crop Research Institute, Plant Protection Centre Aas Norveška Direcção-Geral de Protecção das Culturas Lizbona Portugalska Nacionalni institut za biologijo Ljubljana Slovenija Centro de Diagnóstico de Aldearrubia Salamanca Španija (1) Za stik z znanstveniki: glej spletno stran http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

Dodatek 2 Priprava pozitivnih in negativnih kontrol za presejalne teste na stolonu PCR/IF in FISH Izdelamo 72-urno kulturo virulentnega seva bakterije C. m. subsp. sepedonicus [NCPPB 4053 ali PD 406] na osnovnem gojišču MTNA in suspendiramo v 10 mM fosfatnega pufra, da dobimo gostoto celic približno 1 do 2 × 108 cfu na ml. To običajno dosežemo pri rahlo motni suspenziji, ekvivalentni optični gostoti 0,20 pri 600 nm. Odstranimo jedra stolonov 200 gomoljev iz sorte z belo kožo, za katero je znano, da je neokužena z C. m. subsp. sepedonicus. Obdelamo jedra stolona kot običajno in resuspendiramo peleto v 10 ml. Pripravimo 10 sterilnih 1,5 ml mikroepruvet z 900 µl resuspendirane pelete. Prenesemo 100 µl suspenzije C. m. subsp. sepedonicus v prvo mikroepruveto. Vrtinčimo. Vzpostavimo desetkratne stopnje okužbe z nadaljnjim razredčenjem v naslednjih petih mikroepruvetah. Šest okuženih mikroepruvet uporabimo za pozitivne kontrole. Štiri neokužene mikroepruvete uporabimo za negativne kontrole. Mikroepruvete ustrezno označimo. Pripravimo alikvote po 100 µl v sterilnih 1,5 ml mikroepruvetah in tako dobimo 9 ponovitev vsakega kontrolnega vzorca. Shranimo pri –16 do –24 °C do uporabe. Navzočnost in količina C. m. subsp. sepedonicus v kontrolnih vzorcih se najprej potrdi s testom IF. Za test PCR opravimo ekstrakcijo DNK iz pozitivnih in negativnih kontrolnih vzorcev pri vsaki seriji testnih vzorcev. Za testa IF in FISH opravimo analizo pozitivnih in negativnih kontrolnih vzorcev pri vsaki seriji testnih vzorcev. Za teste IF, FISH in PCR mora biti C. m. subsp. sepedonicus odkrita v vsaj 106 in 104 celic/ml pozitivnih kontrol in v nobeni od negativnih kontrol.

Dodatek 3 Pufri za testne postopke SPLOŠNO: Neodprti sterilizirani pufri se lahko shranjujejo do enega leta. 1. Pufri za postopke ekstrakcije 1.1 Ekstrakcijski pufer (50 mM fosfatni pufer, pH 7,0) Ta pufer se uporablja za ekstrakcijo bakterije iz rastlinskih tkiv s homogenizacijo ali tresenjem. Na2HPO4 (brez vode) 4,26 g KH2PO4 2,72 g Destilirana voda 1,00 L Raztopimo sestavine, preverimo pH in steriliziramo v avtoklavu pri 121 °C 15 min. Dodatne sestavine so lahko koristne: Namen Količina (na L) Kosmiči Lubrol Deflokulant (1) 0,5 g Protipenilno sredstvo DC silikon Sredstvo proti penjenju (1) 1,0 ml Tetranatrijev pirofosfat Antioksidant 1,0 g Polivinilpirolidon-40 000 (PVP-40) Vezava inhibitorjev PCR 50 g 1.2 Peletni pufer (10 mM fosfatni pufer, pH 7,2) Ta pufer se uporablja za resuspendiranje in redčenje ekstraktov jeder stolonov gomoljev krompirja, ki sledi koncentraciji v peleto s centrifugiranjem. Na2HPO4.12H2O 2,7 g NaH2PO4.2H2O 0,4 g Destilirana voda 1,00 L Raztopimo sestavine, preverimo pH in steriliziramo v avtoklavu pri 121 °C 15 minut. 2. Pufri za test IF 2.1 Pufer IF (10 mM fosfatni pufer s soljo (PBS), pH 7,2) Ta pufer se uporablja za redčenje protiteles. Na2HPO4.12H2O 2,7 g NaH2PO4.2H2O 0,4 g NaCl 8,0 g Destilirana voda 1,0 L Raztopimo sestavine, preverimo pH in steriliziramo v avtoklavu pri 121 °C 15 minut. 2.2 Pufer IF-Tween Ta pufer se uporablja za spiranje objektnih stekelc. Pufru IF dodamo 0,1 % Tweena 20. 2.3 Glicerol s fosfatnim pufrom, pH 7,6 Ta pufer se uporablja kot prekrivna tekočina na okencih objektnih stekelc IF, da se ojači flourescenca. Na2HPO4.12H2O 3,2 g NaH2PO4.2H2O 0,15 g Glicerol 50 ml Destilirana voda 100 ml Prekrivne raztopine proti bledenju so v komercialne namene dostopne npr. pri Vectashield® (Vector Laboratories) ali Citifluor® (Leica). (1) Za uporabo z metodo ekstrakcije s homogenizacijo

Dodatek 4 Ugotavljanje stopnje okužbe v testih IF in FISH 1. S štetjem določimo povprečno število značilnih fluorescentnih celic na polje (c) 2. Izračunamo število značilnih fluorescentnih celic na okence (C) C = c × S/s kjer je S = površina okenca na objektnem stekelcu z več okenci, in s = površina polja objektiva

s = πi2/4G2K2 kjer je i = koeficient polja (odvisen od vrste okularja in znaša od 8 do 24), K = koeficient tubusa (1 ali 1,25), G = povečava objektiva (100x, 40x itd.). 3. Izračunamo število značilnih fluorescentnih celic na ml pelete (N) N = C × 1 000/y × F kjer je y = prostornina resuspendirane pelete na okencu, in F = faktor resuspendirane razredčitve pelete.

Dodatek 5 Gojišča za izolacijo in gojenje bakterije C. m. subsp. sepedonicus (a) Splošna rastna gojišča Hranilni agar (NA) Hranilni Agar (Difco) 23,0 g Destilirana voda 1,0 L Raztopimo sestavine in steriliziramo v avtoklavu pri 121 °C 15 min. Hranilni agar z dekstrozo (NDA) Hranilni agar Difco bacto, ki vsebuje 1 % D(+)-glukoze (monohidrat). Steriliziramo v avtoklavu pri 115 °C 20 minut. Agar s kvasom, peptonom in glukozo (YPGA) Kvasni ekstrakt (Difco) 5,0 g Pepton Bacto (Difco) 5,0 g D(+)-glukoza (monohidrat) 10,0 g Agar Bacto (Difco) 15,0 g Destilirana voda 1,0 L Raztopimo sestavine in steriliziramo v avtoklavu pri 121 °C 15 min. Gojišče s kvasnim ekstraktom in mineralnimi solmi (YGM) Kvasni ekstrakt Bacto (Difco) 2,0 g D(+)-glukoza (monohidrat) 2,5 g K2HPO4 0,25 g KH2PO4 0,25 g MgSO4.7H2O 0,1 g MnSO4.H2O 0,015 g NaCl 0,05 g FeSO4.7H2O 0,005 g Agar Bacto (Difco) 18 g Destilirana voda 1,0 L Raztopimo sestavine in steriliziramo 0,5 litra gojišča v avtoklavu pri 115 °C 20 min. (b) Potrjena selektivna rastna gojišča Gojišče MTNA Če ni drugače navedeno, so vse sestavine gojišča iz BDH. Kvasni ekstrakt (Difco) 2,0 g Manitol 2,5 g K2HPO4 0,25 g KH2PO4 0,25 g NaCl 0,05 g MgSO4.7H2O 0,1 g MnSO4.H2O 0,015 g FeSO4.7H2O 0,005 g Agar (Oxoid št. 1) 16,0 g Destilirana voda 1,0 L Raztopimo sestavine, uravnamo pH na 7,2. Po sterilizaciji v avtoklavu (pri 121 °C 15 minut) in ohladitvi na 50 °C, dodamo antibiotike: trimetoprim 0,06 g, nalidiksično kislino 0,002 g, amfotericin B 0,01 g. Osnovne antibiotične raztopine: trimetoprim (Sigma) in nalidiksična kislina (Sigma) (oboje pri 5 mg/ml) v 96 % metanolu, amfotericin B (Sigma) (1 mg/ml) v dimetilsulfoksidu. Osnovne raztopine so sterilizirane s filtriranjem. Opomba: Trajnost osnovnega gojišča je 3 mesece. Ko se dodajo antibiotiki, je trajnost 1 mesec, če se shranjuje v hladilniku. Gojišče NCP-88 Hranilni agar (Difco) 23 g Kvasni ekstrakt (Difco) 2 g D-manitol 5 g K2HPO4 2 g KH2PO4 0,5 g MgSO4.7H2O 0,25 g Destilirana voda 1,0 L Raztopimo sestavine, uravnamo pH na 7,2. Po sterilizaciji v avtoklavu in ohladitvi na 50 °C, dodamo naslednje antibiotike: Polimiksin B sulfat (Sigma) 0,003 g, nalidiksično kislino (Sigma) 0,008 g, Cikloheksimid (Sigma) 0,2 g. Raztopimo antibiotike v osnovnih raztopinah: nalidiksično kislino v 0,01 M NaOH, cikloheksimid v 50 % etanolu, polimiksin B sulfat v destilirani vodi. Osnovne raztopine so sterilizirane s filtriranjem. Opomba: Trajnost osnovnega gojišča je 3 mesece. Ko se dodajo antibiotiki, je trajnost 1 mesec, če se shranjuje v hladilniku.

Dodatek 6 Potrjeni protokol in potrjeni reagenti PCR Opomba: Predhodno testiranje mora omogočiti ponovljivo odkrivanje vsaj 103 do104 celic bakterije C. m. sepedonicus na ml ekstrakta vzorca. Predhodno testiranje prav tako ne sme kazati lažno pozitivnih rezultatov pri naboru izbranih bakterijskih sevov. 1. Multipli protokol PCR z notranjo kontrolo PCR (Pastrik, 2000) 1.1 Začetni oligonukleotidi Naprej začetni oligonukleotid PSA-1 5’- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3’ Nazaj začetni oligonukleotid PSA –R 5’- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3’ Naprej začetni oligonukleotid NS-7-F 5’- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3’ Nazaj začetni oligonukleotid NS-8-R 5’- tcc gca ggt tca cct acg ga -3’ Pričakovana velikost pomnožkov iz matrice DNK C. m. subsp. sepedonicus = 502 bp (niz začetnih oligonukleotidov PSA). Pričakovana velikost pomnožkov iz 18S rRNA notranje kontrole PCR = 377 bp (niz začetnih oligonukleotidov NS). 1.2 Reakcijska zmes PCR Reagent Količina na reakcijo Končna koncentracija Sterilna UPW 15,725 µl 10x pufer PCR (1) (15 mM MgCl2) 2,5 µl 1x (1,5 mM MgCl2) BSA (frakcija V) (10 %) 0,25 µl 0,1 % Zmes d-nTP (20 mM) 0,125 µl 0,1 mM Začetni oligonukleotid PSA-1 (10 µM) 0,5 µl 0,2 µM Začetni oligonukleotid PSA-R (10 µM) 0,5 µl 0,2 µM Začetni oligonukleotid NS-7-F (10 µM) (2) 0,1 µl 0,04 µM Začetni oligonukleotid NS-8-R (10 µM) (2) 0,1 µl 0,04 µM Taq polimeraza (5U/µl) (1) 0,2 µl 1,0 U Prostornina vzorca 5,0 µl Skupna prostornina: 25,0 µl 1.3 Pogoji reakcije PCR Izvedemo naslednji program: 1 cikel: (i) 3 minute pri 95 °C (denaturacija matrice DNK) 10 ciklov: (ii) 1 minuta pri 95 °C (denaturacija matrice DNK) (iii) 1 minuta pri 64 °C (prileganje začetnih oligonukleotidov) (iv) 1 minuta pri 72 °C (podaljševanje kopije) 25 ciklov: (v) 30 sekund pri 95 °C (denaturacija matrice DNK) (vi) 30 sekund pri 62 °C (prileganje začetnih oligonukleotidov) (vii) 1 minuta pri 72 °C (podaljševanje kopije) 1 cikel: (viii) 5 minut pri 72 °C (končno podaljševanje) (ix) pustimo pri 4 °C Opomba: Ta program je optimiziran za uporabo s cikličnim termostatom MJ Research PTC 200. Z uporabo drugih modelov bo lahko potrebna prilagoditev trajanja stopenj ciklov (ii), (iii) (iv), (v), (vi) in (vii). 1.4 Restrikcijska encimska analiza pomnožka Produkti PCR, pomnoženi iz DNK bakterije C. m. subsp. sSepedonicus, proizvedejo značilen polimorfizem dolžin restrikcijskih fragmentov z encimom Bgl II po inkubaciji pri 37 °C za 30 minut. Restrikcijski fragmenti, pridobljeni iz specifičnega fragmenta C. m. subsp. sepedonicus, so velikosti 282 bp in 220 bp. 2. Priprava nanašalnega pufra 2.1 Bromfenol modro (10 % osnovna raztopina) Bromfenol modro 5 g Destilirana voda (bidest) 50 ml 2.2 Nanašalni pufer Glicerol (86 %) 3,5 ml Bromfenol modro (5.1) 300 µl Destilirana voda (bidest) 6,2 ml 3. 10x Tris acetatni pufer EDTA (TAE), pH 8,0 Tris pufer 48,4 g Ledocetna kislina 11,42 ml EDTA (dinatrijeva sol) 3,72 g Destilirana voda 1,00L Razredčimo do 1x pred uporabo. Dostopno tudi v komercialne namene (npr. Invitrogen ali enakovredno). (1) Metode so bile potrjene z uporabo Taq polimeraze v Perkin Elmer (AmpliTaq ali Gold) in Gibco BRL. (2) Koncentracija začetnih oligonukleotidov NS-7 F in NS-8-R je bila optimizirana za ekstrakcijo jeder stolonov krompirja z uporabo metode s homogenizacijo in prečiščevanja DNK po Pastriku (2000) (glej oddelka 6.1.a in 6.2). Ponovna optimizacija koncentracij reagenta bo potrebna, če se uporabi ekstrakcija s tresenjem ali druga metoda izolacije DNK.

Dodatek 7 Potrjeni reagenti za test FISH 1. Oligo-sonde specifična sonda za Cms CMS-CY3-01: 5’- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3’ Nespecifična evbakterijska sonda EUB-338-FITC: 5’- gct gcc tcc cgt agg agt-3’ 2. Fiksirna raztopina [OPOZORILO! FIKSIRNA RAZTOPINA VSEBUJE PARAFORMALDEHID, KI JE TOKSIEN. NOSITE ROKAVICE IN NE VDIHAVAJTE. PRIPOROČLJIVO JE DELATI V DIGESTORIJU] (i) Segrejemo 9 ml vode molekulske stopnje (npr. ultra čiste vode (UPW)) na približno 60 °C in dodamo 0,4 g paraformaldehida. Paraformaldehid se raztopi, ko dodamo 5 kapljic 1N NaOH in pomešamo z magnetskim mešalcem. (ii) Uravnamo pH na 7,0 z dodatkom 1 ml 0,1 M fosfatnega pufra (PB; pH 7,0) in 5 kapljic 1N HCl. Preverimo pH z lakmusovim papirjem in po potrebi uravnamo z HCl ali NaOH. [OPOZORILO! MERILNIKA PH NE UPORABLJAJTE V RAZTOPINAH S PARAFORMALEDEHIDOM] (iii) Filtriramo raztopino skozi 0,22 µm membranski filter in skrbimo, da se ne zapraši, ter hranimo pri 4 °C do nadaljnje uporabe. (iv) Opomba: Alternativna fiksirna raztopina: 96 % etanol. 3. 3x Hybmix NaCl 2.7 M Tris-HCl 60 mM (pH 7,4) EDTA (sterilizirano s filtriranjem in shranjeno v avtoklavu) 15 mM Razredčimo po potrebi do 1x. 4. Hibridizacijska raztopina 1x Hybmix Natrijev dodecil sulfat (SDS) 0,01 % Sonda EUB 338 5 ng/μl Sonda CMSCY301 5 ng/μl Pripravimo količine hibridizacijske raztopine v skladu z izračuni v tabeli. Za vsako objektno stekelce (ki vsebuje 2 različna vzorca v ponovitvi) je potrebno 90 μl hibridizacijske raztopine. Tabela: Predlagane količine za pripravo hibridizacijske zmesi. 2 objektni stekelci 8 objektnih stekelc Sterilna UPW 50,1 200,4 3x hybmix 30,0 120,0 1 % SDS 0,9 3,6 Sonda EUB 338 (100 ng/μl) 4,5 18,0 Sonda CMSCY301 (100 ng/μl) 4,5 18,0 Skupna prostornina (μl) 90,0 360,0 NB.: Shranimo vse raztopine, ki vsebujejo na svetlobo občutljive oligo-sonde v temi pri –20 °C. Zaščitimo pred neposredno sončno svetlobo ali električno razsvetljavo med uporabo. 5. 0,1 M fosfatni pufer, pH 7,0 Na2HPO4 8,52 g KH2PO4 5,44 g Destilirana voda 1,00 L Raztopimo sestavine, preverimo pH in steriliziramo v avtoklavu pri 121 °C 15 minut.

Dodatek 8 Kultura jajčevcev Semena jajčevca (Solanum melongena) posejemo v pasteriziran kompost za semena. Ko imajo sadike popolnoma razprta klična lista (10 do 14 dni), jih presadimo v pasteriziran kompost za lončnice. Jajčevce moramo gojiti v rastlinjaku z naslednjimi okoljskimi pogoji: Dolžina dneva: 14 ur ali naravna dolžina dneva, če je daljša; Temperatura: dnevna: 21 do 24 °C, nočna: 15 °C.

Dovzetne sorte jajčevcev: „Black Beauty“, „Long Tom“, „Rima“, „Balsas“ Dobavitelj: glej spletno mesto http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main