„PRILOGA XVIII

DOLOČANJE RAZLIKE MED DEJANSKO IN TEORETIČNO VSEBNOSTJO TRIACILGLICEROLOV Z EKVIVALENTNIM OGLJIKOVIM ŠTEVILOM (ECN) 42

1. NAMEN

Določanje absolutne razlike med eksperimentalnimi vrednostmi triacilglicerolov (TAG) z ekvivalentnim ogljikovim številom 42 (ECN42HPLC) v olju, dobljenimi s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti, in teoretično vrednostjo triacilglicerolov z ekvivalentnim ogljikovim številom 42 (ECN 42teoretično), izračunano na podlagi sestave maščobnih kislin.

2. PODROČJE UPORABE

Standard se uporablja za oljčna olja. Metoda se uporablja za odkrivanje prisotnosti majhnih količin semenskih olj (bogatih z linolno kislino) v vsaki posamezni kategoriji oljčnih olj.

3. PRINCIP

Vsebnost triacilglicerolov z ECN 42, določena z analizo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC), in teoretična vsebnost triacilglicerolov z ECN 42 (izračunana na podlagi določitve sestave maščobnih kislin s plinsko-tekočinsko kromatografijo) sta v okviru določene mejne vrednosti za pristna oljčna olja. Če je razlika večja od vrednosti, sprejetih za posamezno vrsto olja, to pomeni, da olje vsebuje semenska olja.

4. METODA

Metoda za izračun teoretične vsebnosti triacilglicerolov z ECN 42 in razlike glede na podatke tekočinske kromatografije visoke ločljivosti se v bistvu izvaja z uskladitvijo analitičnih podatkov, dobljenih z drugimi metodami. Razlikovati je mogoče med tremi fazami: določanjem sestave maščobnih kislin s kapilarno plinsko kromatografijo, izračunom teoretične sestave triacilglicerolov z ECN 42 in določanjem triacilglicerolov z ECN 42 s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti.

4.1 Oprema

4.1.1 Bučke z okroglim dnom, 250 in 500 ml.

4.1.2 Čaše, 100 ml.

4.1.3 Steklena kromatografska kolona z notranjim premerom 21 mm, dolžine 450 mm, s petelinčkom in standardiziranim konusom (z notranjim obrusom) na vrhu.

4.1.4 Liji ločniki, 250 ml, s standardiziranim konusom (z zunanjim obrusom) na dnu, primerni za pritrditev na vrh kolone.

4.1.5 Steklena paličica dolžine 600 mm.

4.1.6 Stekleni lij s premerom 80 mm.

4.1.7 Merilne bučke, 50 ml.

4.1.8 Merilne bučke, 20 ml.

4.1.9 Rotacijski izparilnik.

4.1.10 Kromatograf za tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti, ki omogoča termostatski nadzor temperature kolone.

4.1.11 Injektorji za vnos 10 μl.

4.1.12 Detektor: diferencialni refraktometer. Občutljivost celotne skale mora biti najmanj 10–4 enote lomnega količnika.

4.1.13 Kolona: jeklena cevka, dolga 250 mm in z notranjim premerom 4,5 mm, polnjena z delci silicijevega dioksida premera 5 μm, z 22 do 23 % ogljika v obliki oktadecilsilana.

4.1.14 Programska oprema za obdelavo podatkov.

4.1.15 Stekleničke (viale) s prostornino približno 2 ml, s teflonskimi tesnili in navojnimi zamaški.

4.2 Reagenti

Reagenti morajo biti analitsko čisti. Elucijska topila morajo biti razplinjena in se jih lahko večkrat reciklira brez vpliva na ločevanje.

4.2.1 Petroleter 40–60 °C za kromatografijo ali heksan.

4.2.2 Sveže destilirani etil eter brez peroksidov.

4.2.3 Elucijsko topilo za čiščenje olja s kolonsko kromatografijo, mešanica petroletra/etil etra 87/13 (v/v).

4.2.4 Silikagel, 70–230 mesh, tip Merck 7734, s standardizirano 5-odstotno vsebnostjo vode (w/w/).

4.2.5 Steklena volna.

4.2.6 Aceton za HPLC.

4.2.7 Acetonitril ali propionitril za HPLC.

4.2.8 Elucijsko topilo za HPLC: acetonitril + aceton (treba je prilagoditi deleže, da se doseže želeno ločevanje; začnite z mešanico 50: 50) ali propionitril.

4.2.9 Topilo za raztapljanje vzorca: aceton.

4.2.10 Referenčni trigliceridi: uporabijo se lahko komercialni trigliceridi (tripalmitin, triolein itd.) in se potem retencijski časi zapisujejo glede na ekvivalentno ogljikovo število; ali alternativno, referenčni kromatogram, dobljen s sojinim oljem, mešanico 30: 70 sojino olje – oljčno olje in čistim oljčnim oljem (glej opombi 1 in 2 ter slike 1 do 4).

4.2.11 6-mililitrska kolona za ekstrakcijo v trdni fazi, s fazo 1 g silikagela.

4.3 Priprava vzorcev

Ker lahko zaradi številnih motečih snovi dobimo lažno pozitivne rezultate, je treba vzorec vedno očistiti po metodi IUPAC št. 2507, ki se uporablja za določanje polarnih spojin v maščobah za cvrtje.

4.3.1 Priprava kromatografske kolone

V kolono (4.1.3) vlijemo približno 30 ml elucijskega topila (4.2.3), nato v kolono vstavimo nekaj steklene volne (4.2.5) in jo s stekleno paličico potisnemo na dno (4.1.5).

V 100-mililitrski čaši raztopimo 25 g silikagela (4.2.4) v 80 ml elucijske mešanice (4.2.3.), nato jo skozi stekleni lij prenesemo v kolono (4.1.6).

Da zagotovimo popoln prenos silikagela v kolono, speremo čašo z elucijsko mešanico in tudi to tekočino prenesemo v kolono.

Odpremo petelinček in pustimo, da topilo eluira iz kolone, dokler ne sega približno 1 cm nad silikagel.

4.3.2 Kolonska kromatografija

Z natančnostjo 0,001 g natehtamo 2,5 ± 0,1 g olja, po potrebi predhodno prefiltriranega, homogeniziranega in dehidriranega, v 50-mililitrsko merilno bučko (4.1.7).

Raztopimo ga v približno 20 ml elucijskega topila (4.2.3). Po potrebi nekoliko segrejemo, da pospešimo raztapljanje. Ohladimo pri sobni temperaturi in volumen prilagodimo z elucijskim topilom.

Z merilno pipeto vnesemo 20 ml raztopine v kolono, pripravljeno v skladu s točko 4.3.1, odpremo petelinček in pustimo, da topilo eluira do višine plasti silikagela.

Nato eluiramo s 150 ml elucijskega topila (4.2.3.), pri čemer hitrost pretoka topila prilagodimo na približno 2 ml/min (150 ml bo šlo skozi kolono v približno 60–70 minutah).

Eluat se zbira v 250-mililitrski bučki z okroglim dnom (4.1.1), ki je bila predhodno tarirana v peči in natančno stehtana. Topilo odstranimo pri znižanem tlaku v rotacijskem izparilniku (4.1.9) in stehtamo ostanek, ki se bo uporabil za pripravo raztopine za analizo HPLC in pripravek metil estra.

Izkoristek vzorca iz kolone mora biti najmanj 90-odstoten za kategorije oljčnega olja ekstra deviško, deviško, navadno in rafinirano, ter najmanj 80-odstoten za lampante oljčno olje in olje iz oljčnih tropin.

4.3.3 Čiščenje z ekstrakcijo v trdni fazi

Kolona s silikagelom za ekstrakcijo v trdni fazi se aktivira s 6 ml heksana (4.2.3) v vakuumu, pri čemer je treba preprečiti izsušitev.

Z natančnostjo 0,001 g natehtamo 0,12 g v 2-mililitrsko vialo (4.1.15) in razredčimo z 0,5 ml heksana (4.2.3).

Raztopino vnesemo v kolono za ekstrakcijo v trdni fazi in eluiramo z 10 ml heksana/dietil etra (87: 13 v/v) (4.2.3) v vakuumu.

Zbrana frakcija se v rotacijskem izparilniku (4.1.9) odpari do suhega pod znižanim tlakom pri sobni temperaturi. Ostanek se raztopi v 2 ml acetona (4.2.6) za analizo triacilglicerolov (TAG).

4.4 Analiza HPLC

4.4.1 Priprava vzorcev za kromatografsko analizo

5-odstotno raztopino vzorca za analizo pripravimo tako, da v 10-mililitrsko merilno bučko natehtamo 0,5 ± 0,001 g vzorca in dolijemo topilo do oznake 10 ml (4.2.9).

4.4.2 Postopek

Pripravimo kromatografski sistem. Elucijsko topilo (4.2.8) črpamo s hitrostjo 1,5 ml/min, da očistimo celotni sistem. Počakamo, da dobimo stabilno bazno linijo.

Vbrizgamo 10 μl vzorca, pripravljenega v skladu s točko 4.3.

4.4.3 Izračun in izražanje rezultatov

Uporabimo metodo normalizacije površine, tj. predpostavimo, da je vsota površin vrhov, ki ustreza triacilglicerolom z ekvivalentnim ogljikovim številom od ECN 42 do ECN 52, enaka 100 %.

Izračunamo relativni odstotni delež posameznega triglicerida z uporabo enačbe:

.

Rezultate je treba podati na vsaj dve decimalni mesti natančno.

Glej opombe od 1 do 4.

4.5 Izračun sestave triacilglicerolov (mol %) na podlagi podatkov o sestavi maščobnih kislin (površinski %)

4.5.1 Določanje sestave maščobnih kislin

Sestava maščobnih kislin se določi na podlagi standarda ISO 5508 s kapilarno kolono. Metil estri se pripravijo v skladu z dokumentom Mednarodnega sveta za oljčno olje COI/T.20/Dok. št. 24.

4.5.2 Maščobne kisline za izračun

Gliceridi se razvrstijo glede na ekvivalentno ogljikovo število (ECN), pri čemer se upoštevajo naslednje ekvivalence med ECN in maščobnimi kislinami. Upoštevane so bile samo maščobne kisline s 16 in 18 ogljikovimi atomi, ker so samo te pomembne za oljčno olje. Maščobne kisline je treba normalizirati do 100 %.

Maščobna kislina (MK) Kratica Molekulska masa (M) ECN Palmitinska kislina P 256,4 16 Palmitoleinska kislina Po 254,4 14 Stearinska kislina S 284,5 18 Oleinska kislina O 282,5 16 Linolna kislina L 280,4 14 Linolenska kislina Ln 278,4 12

4.5.3 Pretvorba površinskega % v mole za vse maščobne kisline (1)

4.5.4 Normalizacija maščobnih kislin do 100 % (2)

Rezultat pomeni odstotni delež posamezne maščobne kisline v mol % na vseh (1, 2, 3) položajih triacilglicerolov.

Nato so izračunata vsoti nasičenih maščobnih kislin P in S (NMK) ter nenasičenih maščobnih kislin Po, O, L in Ln (NEMK)(3):

4.5.5 Izračun sestave maščobnih kislin na položajih 2 ter 1 in 3 triacilglicerolov

Maščobne kisline so razdeljene na naslednje tri skupine: ena za položaj 2 in dve enaki za položaja 1 in 3, z različnimi koeficienti za nasičene (P in S) in nenasičene kisline (Po, O, L in Ln).

4.5.5.1 Nasičene maščobne kisline na položaju 2 [P(2) in S(2)] (4)

4.5.5.2 Nenasičene maščobne kisline na položaju 2 [Po(2), O(2), L(2) in Ln(2)] (5):

4.5.5.3 Maščobne kisline na položajih 1 in 3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) in Ln(1,3)] (6):

4.5.6 Izračun triacilglicerolov

4.5.6.1 TAG s samo eno maščobno kislino (AAA, tukaj LLL, PoPoPo) (7)

4.5.6.2 TAG z dvema maščobnima kislinama (AAB, tukaj PoPoL, PoLL) (8)

4.5.6.3 TAG s tremi različnimi maščobnimi kislinami (ABC, tukaj OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn) (9)

4.5.6.4 Triacilgliceroli z ekvivalentnim ogljikovim številom (ECN 42)

Triacilgliceroli z ECN 42 se izračunajo po enačbah 7, 8 in 9, nato pa se navedejo v vrstnem redu pričakovane elucije v HPLC (običajno samo trije vrhovi).

LLL

PoLL in položajni izomer LPoL

OLLn ter položajna izomera OLnL in LnOL

PoPoL in položajni izomer PoLPo

PoOLn ter položajna izomera OPoLn in OLnPo

PLLn ter položajna izomera LLnP in LnPL

PoPoPo

SLnLn in položajni izomer LnSLn

PPoLn ter položajna izomera PLnPo in PoPLn

Triacilglicerole z ECN 42 dobimo z vsoto devetih triacilglicerolov, vključno z njihovimi položajnimi izomeri. Rezultate je treba podati na vsaj dve decimalni mesti natančno.

5. VREDNOTENJE REZULTATOV

Primerjata se izračunana teoretična vsebnost in vsebnost, določena z analizo HPLC. Če je absolutna razlika, ki jo dobimo, ko od podatkov HPLC odštejemo teoretične podatke, večja od vrednosti, navedenih za ustrezno kategorijo olja v standardu, vzorec vsebuje semensko olje.

Rezultati so podani na dve decimalni mesti natančno.

6. PRIMER (ŠTEVILKE SE NANAŠAJO NA ODDELKE V BESEDILU METODE)

— 4.5.1 Izračun mol % maščobnih kislin na podlagi podatkov plinsko-tekočinske kromatografije (normaliziran površinski %)

Glede sestave maščobnih kislin s plinsko-tekočinsko kromatografijo dobimo naslednje podatke:

MK P S Po O L Ln M 256,4 284,5 254,4 282,5 280,4 278,4 Površinski % 10,0 3,0 1,0 75,0 10,0 1,0

— 4.5.3 Pretvorba površinskega % v mole za vse maščobne kisline (glej enačbo 1)

mol P = mol S = mol Po = mol O = mol L = mol Ln = Skupaj = 0,35821 mol TAG

— 4.5.4 Normalizacija molov maščobnih kislin do 100 % (glej enačbo 2)

mol % P(1,2,3) = mol % S(1,2,3) = mol % Po(1,2,3) = mol % O(1,2,3) = mol % L(1,2,3) = mol % Ln(1,2,3) = Skupaj mol % = 100 %

Vsota nasičenih in nenasičenih maščobnih kislin na položajih 1, 2 in 3 TAG (glej enačbo 3):

— 4.5.5 Izračun sestave maščobnih kislin na položajih 2 ter 1 in 3 TAG

— 4.5.5.1 Nasičene maščobne kisline na položaju 2 [P(2) in S(2)] (glej enačbo 4)

— 4.5.5.2 Nenasičene maščobne kisline na položaju 2 [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) in Ln(1,3)] (glej enačbo 5)

— 4.5.5.3 Maščobne kisline na položajih 1 in 3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) in Ln(1,3)] (glej enačbo 6)

— 4.5.6 Izračun triacilglicerolov

Iz izračunane sestave maščobnih kislin na položajih sn-2 in sn-1,3:

MK in Položaja 1 in 3 Položaj 2 P 16,004 % 0,653 % S 4,325 % 0,177 % Po 1,015 % 1,262 % O 68,526 % 85,296 % L 9,204 % 11,457 % Ln 0,927 % 1,153 % Vsota 100,0 % 100,0 %

se izračunajo naslednji triacilgliceroli:

LLL

PoPoPo

PoLL z enim položajnim izomerom

SLnLn z enim položajnim izomerom

PoPoL z enim položajnim izomerom

PPoLn z dvema položajnima izomeroma

OLLn z dvema položajnima izomeroma

PLLn z dvema položajnima izomeroma

PoOLn z dvema položajnima izomeroma

— 4.5.6.1 TAG z eno maščobno kislino (LLL, PoPoPo) (glej enačbo 7)

— 4.5.6.2 TAG z dvema maščobnima kislinama (PoLL, SLnLn, PoPoL) (glej enačbo 8)

0,03210 mol PoLL

0,00094 mol SLnLn

0,00354 mol PoPoL

— 4.5.6.3 TAG s tremi različnimi maščobnimi kislinami (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) Glej enačbo 9

0,00761 mol PPoLn

0,43655 mol OLLn

0,06907 mol PLLn

0,04812 mol PoOLn

ECN 42 = 0,69512 mol TAG

Opomba 1: Vrstni red elucije se lahko določi z izračunom ekvivalentnih ogljikovih števil, pogosto definiranih z odnosom , kjer je CN ogljikovo število in n število dvojnih vezi; veliko bolj natančno jo je mogoče izračunati z upoštevanjem izvora dvojnih vezi. Če so no, nl in nln števila dvojnih vezi, ki se pripisujejo oleinski, linolni oziroma linolenski kislini, se ekvivalentno ogljikovo število lahko izračuna s pomočjo relacije v enačbi:

kjer se koeficienti do, dl in dln lahko izračunajo s pomočjo referenčnih trigliceridov. Pod pogoji, določenimi v tem postopku, bo dobljena relacija približno:

Opomba 2: Z več referenčnimi trigliceridi je mogoče izračunati tudi resolucijo glede na triolein:

triolein

z uporabo reduciranega retenzijskega časa

Graf log α kot funkcija f (število dvojnih vezi) omogoča, da se določijo retenzijske vrednosti za vse trigliceride maščobnih kislin, vsebovanih v referenčnih trigliceridih – glej sliko 1.

Opomba 3: Učinkovitost kolone mora omogočati jasno ločevanje vrha trilinoleina od vrhov trigliceridov s sosednjim retenzijskim časom. Elucija se izvede do vrha ECN 52.

Opomba 4: Pravilna meritev površin vseh vrhov, upoštevnih za to določanje, je zagotovljena, če drugi vrh za ECN 50 pokriva 50 % celotne lestvice rekorderja.

Slika 1

Graf log α kot funkcija f (število dvojnih vezi)

Slika 2

Oljčno olje z nizko vsebnostjo linolne kisline

(a)

(b)

Slika 3

Oljčno olje z visoko vsebnostjo linolne kisline

(a)

(b)