Direktiva Komisije

z dne 18. novembra 1987

o deveti prilagoditvi tehničnemu napredku Direktive Sveta 67/548/EGS o približevanju zakonov in drugih predpisov v zvezi z razvrščanjem, pakiranjem in označevanjem nevarnih snovi

(88/302/EGS)

KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE

ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske gospodarske skupnosti,

ob upoštevanju Direktive Sveta 67/548/EGS z dne 27. junija 1967 o približevanju zakonov in drugih predpisov v zvezi z razvrščanjem, pakiranjem in označevanjem nevarnih snovi [1], kakor je bila šestič spremenjena z Direktivo 79/831/EGS [2], in zlasti člena 19 Direktive,

ker člen 3(1) Direktive 67/548/EGS predvideva, da se fizikalno-kemijske lastnosti, strupenost in strupenost za okolje snovi in pripravkov določijo v skladu z metodami, opisanimi v Prilogi V;

ker člen 3(2) Direktive 67/548/EGS predvideva, da se prava ali možna nevarnost snovi ali pripravka, ki jo lahko predstavlja za okolje, oceni v skladu z značilnostmi, določenimi v prilogah VII in VIII;

ker Priloga V k različici, predstavljeni z Direktivo Komisije 84/449/EGS [3], trenutno vsebuje le tiste preskusne metode, ki so v skladu z značilnostmi, podrobno navedenimi v Prilogi VII, in ker je treba tudi dati na razpolago preskusne metode, ki so v skladu z značilnostmi, podrobno navedenimi v Prilogi VIII;

ker so določbe iz te direktive v skladu z mnenjem Odbora za prilagajanje tehničnemu napredku direktiv o odpravi tehničnih ovir pri trgovanju z nevarnimi snovmi in pripravki,

SPREJELA NASLEDNJO DIREKTIVO:

Člen 1

Besedilo Priloge k tej direktivi se doda Prilogi V k Direktivi 67/548/EGS.

Člen 2

Države članice sprejmejo in objavijo določbe, potrebne za uskladitev s to direktivo, pred 31. decembrom 1988, in o tem takoj obvestijo Komisijo. Te določbe se začnejo uporabljati najpozneje 30. junija 1989.

Člen 3

Ta direktiva je naslovljena na države članice.

V Bruslju, 18. novembra 1987

Za Komisijo

Stanley Clinton Davis

Član Komisije

[1] UL 196, 16.8.1967, str. 1/67.

[2] UL L 259, 15.10.1979, str. 10.

[3] UL L 251, 19.9.1984, str. 1.

--------------------------------------------------

PRILOGA

Tukaj opisane preskusne metode so namenjene določitvi nekaterih toksikoloških in ekotoksikoloških lastnosti, naštetih v Prilogi VIII k Direktivi Sveta 79/831/EGS. Opisane so preskusne metode, ki ustrezajo stopnji 1 in stopnji 2 Priloge VIII, vendar ti preskusi niso porazdeljeni na podlagi različnih stopenj.

KAZALO

| Stran |

DEL B: Metode za določanje strupenosti … | 4 |

Splošni uvod: Del B … | 4 |

Preskus subkronične oralne strupenosti: 90-dnevni preskus s ponovljenim oralnim odmerkom na glodalcih … | 8 |

Preskus subkronične oralne strupenosti: 90-dnevni preskus s ponovljenim oralnim odmerkom na neglodalcih … | 12 |

Študija subkronične strupenosti v stiku s kožo: 90-dnevna študija s ponovljenim dermalnim odmerkom na glodalcih … | 16 |

Študija subkronične inhalatorne strupenosti: 90-dnevna študija s ponovljenim inhalacijskim odmerkom na glodalcih … | 20 |

Preskus teratogenosti – glodalci in neglodalci … | 24 |

Preskus kronične strupenosti … | 27 |

Preskus rakotvornosti … | 32 |

Kombiniran preskus kronične strupenosti/rakotvornosti … | 37 |

Preskus strupenosti za razmnoževanje na eni generaciji … | 43 |

Preskus strupenosti za razmnoževanje na dveh generacijah … | 47 |

Toksikokinetika … | 51 |

Preskus mutagenosti in presejalna študija rakotvornosti … | 55 |

—Genska mutacija – Saccharomyces cerevisiae… | 55 |

—Mitotična rekombinacija – Saccharomyces cerevisiae… | 58 |

—Preskus genske mutacije na sesalskih celicah in vitro… | 61 |

—Okvare in popravljanje DNK – nenačrtna sinteza DNK – sesalske celice in vitro… | 64 |

—Preskus izmenjave sestrskih kromatid in vitro… | 68 |

—Preskus spolno vezane recesivne smrtnosti na Drosophila melanogaster… | 71 |

—Preskus celične transformacije sesalskih celic in vitro… | 73 |

—Preskus dominantne smrtnosti na glodalcih … | 76 |

—Citogenetski preskus na zarodnih sesalskih celicah in vivo… | 79 |

—Preskus pojava madežev na miših … | 82 |

—Preskus dedne translokacije na miših … | 85 |

DEL C: Metode za določanje strupenosti za okolje … | 88 |

Splošni uvod: Del C … | 88 |

Preskus zaviranja rasti alg … | 89 |

Strupenost za deževnike: Preskus z umetnimi tlemi … | 95 |

Biorazgradnja: Zahn – Wellensov preskus … | 99 |

Biorazgradnja: Simulacijski preskusi v aktivnem blatu … | 106 |

Biorazgradnja: Preskus zaviranja dihanja aktivnega blata … | 118 |

Biorazgradnja: Spremenjeni SCAS preskus … | 123 |

DEL B: METODE ZA DOLOČANJE STRUPENOSTI

SPLOŠNI UVOD: DEL B

DOLGODOBNE ŠTUDIJE

Subkronične študije, kronične študije,študije rakotvornosti

Določitev preskusne snovi in obdelovalne zmesi

Sestava preskusne snovi, vključno z glavnimi nečistotami, in ustrezne fizikalno-kemijske lastnosti, vključno z stabilnostjo, morajo biti znane pred začetkom vsake študije strupenosti.

Fizikalno-kemijske lastnosti preskusne snovi dajejo pomembne podatke za izbor načina dajanja, zasnovo subkroničnih, kroničnih študij ali študij rakotvornosti ter ravnanje s preskusnimi snovmi in njihovo shranjevanje.

Podatki o kemijski sestavi in fizikalno-kemijskih lastnostih lahko kažejo tudi na absorpcijske značilnosti glede na predviden način dajanja snovi ter o metabolnih možnostih in možnostih razporeditve v tkivih. Lahko obstajajo tudi podatki o toksikokinetičnih parametrih iz predhodnih študij strupenosti in toksikokinetike.

Analitsko metodo za kvalitativno in kvantitativno določanje preskusne snovi (vključno z glavnimi nečistotami, kadar je to mogoče) v odmerjenem mediju in biološkem materialu je treba razviti pred začetkom študije.

Preskusne živali: izbira vrst in sevov

Ker je treba živali tretirati večino njihove življenjske dobe, se študije omejujejo na preskusne vrste, ki jih ni težko vzdrževati in ki imajo kratko življensko dobo. Zelo zaželeno je poznati pojavnost spontanih bolezni in tumorjev na sevu uporabljene živali, v podobnih pogojih vzdrževanja.

Sevi morajo biti dobro poznani in brez prirojenih okvar, ki bi vplivale na preskus. Uporaba sevov, pridobljenih s parjenjem sorodnikov ali križancev prve generacije F1, ima v tem smislu nekaj prednosti, toda kadar je na voljo dovolj osnovnih podatkov o sevih, križanih nesorodnih sevov, z živalmi ki izhajajo iz zaprtih kolonij, so ti prav tako sprejemljivi.

Oskrba živali, hrana in oskrba z vodo

Preskusi in študije na živalih se izvajajo v skladu z nacionalnimi predpisi pri tem pa je potrebno upoštevati humana načela ter mednarodni razvoj na področju zaščite živali.

Za pridobitev pomenljivih rezultatov so obvezni strog nadzor stanja bivalnega okolja in ustrezne tehnike oskrbe živali. Dejavniki, kot so pogoji bivanja, istočasne bolezni, terapija z zdravili, nečistote v hrani, zraku, vodi in stelji ter splošne zmogljivosti oskrbe živali lahko bistveno vplivajo na izid študij s ponovljenim odmerkom. Na splošno mora biti poznan učinek kemijskih sterilizacijskih snovi na študijo.

Hrana mora izpolnjevati vse hranilne potrebe preskusne vrste in ne sme vsebovati nečistot, ki bi lahko vplivale na izid preskusa. Glodalce je treba hraniti in napajati ad libitum, hrana pa je treba menjati najmanj enkrat tedensko. Trenutno se uporabljajo trije tipi hrane: konvencionalna hrana, sintetična hrana in različne vrste hrane z znano kvantitativno sestavo.

Dobavitelji morajo za vsako izbrano hrano na podlagi rednega spremljanja preverjati hranilno vrednost in stopnjo kontaminantov v osnovni hrani ter posredovati podatke laboratoriju za vsako serijo hrane. Zelo zaželeno je poznavanje učinkov prehrambnega režima na metabolizem, kakor tudi na razvoj tumorjev in življensko dobo živali.

Poleg tega lahko preskuševalni laboratorij opravi kontrolne analize osnovne hrane za sestavine hrane in nenamerne kontaminante, vključno z rakotvornimi snovmi. Če se to opravi, je treba rezultate analiz shraniti in vključiti v zaključno poročilo o vsaki preskusni snovi.

Običajne prehrambne sestavine, za katere je poznano, da vplivajo na rakotvornost (npr. antioksidanti, nenasičene maščobne kisline, selen), ne smejo biti prisotne v motečih koncentracijah. Zaradi potencialnega vpliva mnogih običajnih kontaminantov v hrani na oceno rakotvornosti je treba posebno pozornost usmeriti na prisotnost ostankov pesticidov, organoklorovih spojin, policikličnih aromatičnih ogljikovodikov, estrogena, težkih kovin, nitrosaminov in mikotoksinov v hrani.

Kadar se preskusna snov daje z vodo ali hrano, so bistveni preskusi stabilnosti. Preskuse stabilnosti in homogenosti ustrezno opravljene še pred študijami pri ponovljenih odmerkih, se uporabi za določitev pogostosti priprave hrane in zahtevanega spremljanja.

Med sterilizacijo hrane morajo biti poznani učinki takšnih postopkov na preskusno snov in prehrambne sestavine. Izvesti je treba vse ustrezne prilagoditve.

Med preskusi rakotvornosti se morajo raziskovalci zavedati možnih kontaminantov v uporabljeni vodi. Voda, dovoljena za človeško porabo, je sicer zadovoljiva, na razpolago pa morajo biti podatki o njeni sestavi.

Koncentracijo preskusne snovi v hrani bo verjetno treba prilagoditi rasti živali, da bi se vzdrževal ustrezen konstanten vnos preskusne snovi glede na telesno maso.

Hranilna vrednost kontrolne in preskusne hrane mora biti kolikor je mogoče podobna. Zaradi tega je treba upoštevati hranilno vrednost preskusne snovi, vmešane v hrano. Izkušnje kažejo, da do 5 % nehranilnih preskusnih snovi v hrani verjetno ne bo pomembno vplivalo na hranilno vrednost hrane.

1. Inhalacijske študije

Ker se je pokazalo, da ni mogoče določiti ene same mejne inhalacijske vrednosti, ni opredeljen nikakršen mejni preskus.

2. Študija teratogenosti

Preskusna metoda je predvsem usmerjena k načinu dajanja po oralni poti. Mogoče je uporabiti tudi druge načine, odvisno od fizikalnih lastnosti preskusne snovi ali možnega načina izpostavljenosti človeka. V takšnih primerih je treba preskusno metodo ustrezno prilagoditi, upoštevajoč ustrezne elemente 28 dnevnih preskusnih metod.

3. Toksikokinetika

Študije toksikokinetike pomagajo pri razlagi in oceni podatkov o strupenosti. Te študije so namenjene pojasnjevanju nekaterih vidikov strupenosti preskušane kemikalije, rezultati pa so lahko v pomoč pri planiranju nadaljnjih študij strupenosti. Potreba po določanju vseh parametrov v vsakem posameznem primeru ni predvidena. Le v redkih primerih bo potreben celotno zaporedje študij toksikokinetike (absorpcija, izločanje, porazdelitev in metabolizem). Za nekatere sestavine so lahko priporočljive spremembe v tem zaporedju ali pa zadostuje že študija pri enem samem odmerku.

Opredelitev pojmov

Toksikokinetika: | študija o absorpciji, porazdelitvi, metabolizmu in izločanju preskusnih snovi; |

Absorpcija: | proces(i), s katerim(i) dana snov vstopi v telo; |

Izločanje: | proces(i), s katerem(i) se dana snov in/ali njeni metaboliti odstranijo iz telesa; |

Porazdelitev: | proces(i), s katerem(i) se absorbirana snov in/ali njeni metaboliti porazdelijo v telesu; |

Metabolizem: | proces(i), s katerem(i) se dane snovi strukturalno spremenijo v telesu, bodisi z encimskimi ali neencimskimi reakcijami. |

4. Akutna in subakutna študija na drugi vrsti

Namen študije na drugi vrsti je dopolniti zaključke, izpeljane iz prve študije.

V primeru študije na drugi vrsti se lahko uporabi že opisana preskusna metoda ali pa se jo prilagodi za manjše število živali.

5. Študije plodnosti

Kadar je zahtevan preskus razmnoževanja na treh generacijah, je mogoče opisano metodo za preskus razmnoževanja na dveh generacijah razširiti tako, da zajame še tretjo generacijo.

6. Študije mutagenosti

Dodatni preskusi mutagenosti, vključno s presejalnimi preskusi za rakotvornost

V Prilogi VIII k Direktivi so navedene dodatne študije za nadaljnjo raziskavo mutagenosti ali predhodni presejalni preskus rakotvornosti. Študije, opisane v tem oddelku, je na splošno mogoče uporabiti za raziskavo obeh vidikov.

Uvod

Uvodna ocena mutagene aktivnosti snovi sestoji iz preskusov genskih (točkastih) mutacij pri bakterijah in citogenetskih okvar na sesalskih celicah (in vitro ali in vivo); ustrezne metode teh študij iz "osnovne zbirke preskusov" so bile opisane predhodno. Ta oddelek se ukvarja z dopolnilnimi študijami, primernimi za potrditev in/ali razširitev rezultatov, pridobljenih v osnovni zbirki preskusov in ki jih je mogoče uporabiti v več namenov:

1. za potrditev rezultatov, pridobljenih v osnovni zbirki preskusov;

2. za raziskavo ciljnih učinkov, ki v osnovni zbirki niso bili obravnavani;

3. za začetek ali razširitev in vivo študij.

Za te namene niz opisanih preskusov zajema in vitro in in vivo evkariontske sisteme ter razširjen obseg bioloških ciljnih učinkov. Ti preskusi zagotavljajo podatke o točkastih mutacijah v organizmih, ki so bolj kompleksni od bakterij, uporabljenih v osnovni zbirki, ter dopolnjujejo podatke o sposobnosti snovi, da povzroči kromosomske aberacije.

Opisani so tudi preskusi za druge ciljne učinke, ki ne zajemajo točkastih mutacij in kromosomskih aberacij. Ti dajejo dopolnilne podatke in jih je mogoče, kot je to primerno, uporabiti v preskusnih načrtih.

Splošno načelo je, da v primeru načrtovanja programa za nadaljnje študije mutagenosti, se te študije zasnuje tako, da bodo zagotavljale relevantne dodatne podatke o mutagenem in/ali rakotvornem potencialu te snovi.

Dejanske študije, ki lahko ustrezajo v točno določenem primeru, bodo odvisne od številnih dejavnikov, vključno s kemijskimi in fizikalnimi značilnostmi snovi, rezultati začetnih bakterijskih in citogenetskih preskusov, metaboličnim profilom snovi, rezultati drugih študij strupenosti ter poznanimi uporabami snovi. Strog razpored za izbiro preskusov je zatorej glede na raznovrstnost dejavnikov, ki bi jih bilo treba upoštevati, neustrezen. Kljub temu pa je mogoče slediti nekaterim splošnim načelom. Če je bil preskus v osnovni zbirki pozitiven, morajo dopolnilne študije vključevati najmanj en preskus, s katerim je mogoče odkriti enak genetski ciljni učinek. Če sta bila oba preskusa v osnovni zbirki negativna, je običajno treba kot dopolnilni študiji opraviti preskus genske mutacije in preskus kromosomske aberacije. Prav tako je lahko ustrezno pridobiti dodatne podatke s pomočjo indikatorskih preskusov (kot so navedeni spodaj).

Metode takšnih raziskav so spodaj razvrščene po skupinah na podlagi njihovega osnovnega genetskega ciljnega učinka.

Študije za preiskavo genskih (točkastih) mutacij

Eden izmed naslednjih preskusov je lahko primeren za nadaljnjo raziskavo potenciala snovi, da povzroči genske (točkaste) mutacije:

(a) Študije naprednih ali povratnih mutacij z uporabo evkariontskih mikroorganizmov (Saccharomyces cerevisiae).

(b) In vitro študije za raziskavo napredne mutacije v sesalskih celicah.

(c) Spolno vezan preskus recesivne smrtnosti na Drosophila melanogaster.

(d) In vivo preskus mutacije v somatskih celicah: preskus pojava madežev na miših.

Študije za raziskavo kromosomskih aberacij

Eden izmed naslednjih preskusov je lahko primeren za nadaljnjo raziskavo potenciala snovi, da povzroči kromosomske aberacije:

(a) In vivo citogenetske študije na sesalcih;

Upoštevati je treba in vivo analizo metafaze celic kostnega mozga, če ta ni bila vključena v začetno oceno (osnovna zbirka preskusov). Poleg tega je treba opraviti in vivo citogenetsko preiskavo zarodnih celic;

(b) In vitro citogenetske študije na sesalskih celicah, če niso bile vključene v začetno oceno;

(c) Študije dominantne smrtnosti na glodalcih;

(d) Preskus dedne translokacije na miših.

Indikatorski preskusi vplivov na DNK

Na voljo so metode, ki dajejo indikacijo nekaterih vplivov na DNK, katerih ciljni učinek pa ni mutagen pojav. Te študije lahko prispevajo podatke, ki dopolnjujejo že pridobljene podatke iz študij mutagenosti, in ki so lahko koristni pri razlagi takšnih študij. Kadar so potrebne takšne študije, je lahko ustrezna ena izmed naslednjih metod z uporabo evkariontskih mikroorganizmov ali sesalskih celic:

(a) Mitotična rekombinacija na Saccharomyces cerevisiae;

(b) Poškodbe in popravljanje DNK – nenačrtna sinteza DNK –sesalske celice (in vitro)

(c) Preskus izmenjave med sestrskimi kromatidami v sesalskih celicah (in vitro)

Drugi indikatorski preskusi rakotvornega potenciala

Na voljo so preskusi transformacije sesalskih celic, ki merijo sposobnost snovi, da povzroči morfološke in vedenjske spremembe v celični kulturi, ki naj bi bile povezane z maligno transformacijo in vivo. Uporabiti je mogoče veliko različnih celičnih tipov in kriterijev za transformacijo.

Ocena tveganja za dedne učinke na sesalcih

Na voljo so metode za določanje dednih učinkov na sesalcih, povzročenih z genskimi (točkastimi) mutacijami (preskus specifičnih lokusov na miših [1]) ali za kromosomske aberacije (preskus dedne translokacije na miših). Takšne metode je mogoče uporabiti pri ocenjevanju možnega genetskega tveganja snovi za človeka. Upoštevajoč kompleksnost teh preskusov in zelo veliko število potrebnih živali, zlasti za preskus specifičnih lokusov pri miših, pa je pred samim začetkom teh študij potrebna trdna utemeljitev.

PRESKUS SUBKRONIČNE ORALNE STRUPENOSTI

90-DNEVNI PRESKUS S PONOVLJENIM ORALNIM ODMERKOM NA GLODALCIH

1. METODA

1.1 Uvod

Glej Splošni uvod dela B.

1.2 Opredelitev pojmov

Glej Splošni uvod dela B.

1.3 Referenčne snovi

Jih ni.

1.4 Princip preskusne metode

Preskusna snov se daje dnevno, oralno, v graduiranih odmerkih nekaj skupinam preskusnih živali, po en odmerek na skupino v obdobju 90 dni. V obdobju dajanja se živali opazujejo dnevno, da bi se odkrilo znake strupenosti. Na živalih, ki med preskusom poginejo, se opravi nekropsija, po zaključku preskusa pa se nekropsija opravi tudi na preživelih živalih.

1.5 Merila kakovosti

Jih ni.

1.6 Opis preskusne metode

Priprave

Živali se vzdržujejo v preskusnih nastanitvenih in prehranjevalnih pogojih najmanj pet dni pred preskusom. Pred preskusom se naključno izberejo zdrave mlade živali razporedijo v preskusne in kontrolne skupine.

Preskusna snov se lahko daje s hrano, z gavažo, v kapsulah ali s pitno vodo. Vsem živalim je treba dajati odmerke z enako metodo tekom celotnega preskusnega obdobja. Če se za lažje dajanje odmerkov uporabi nosilec ali drugi dodatki, se je treba prepričati, da le-ti ne povzročajo strupenih učinkov. Če je ustrezno, se lahko uporabijo pretekli podatki.

Preskusni pogoji

Preskusne živali

Če ni kontraindikacij, je priporočena vrsta podgana. Uporabiti je treba splošno uporabljene laboratorijske seve mladih zdravih živali. Najprimernejši čas za začetek dajanja odmerkov je, preden podgane dopolnijo šest tednov, v nobenem primeru pa ne smejo biti stare več kot osem tednov. Na začetku študije nihanje v teži uporabljenih živali ne sme presegati ± 20 % srednje vrednosti. Kadar se subkronična oralna študija izvaja kot predhodnica dolgodobni študiji oralne strupenosti, je treba v obeh študijah uporabiti isto vrsto in sev.

Število in spol

Za vsako velikost odmerka je treba uporabiti najmanj 20 živali (10 samic in 10 samcev). Samice naj bodo nuliparne in nebreje. Če so načrtovana vmesna žrtvovanja, je treba število povečati za število živali, ki naj bi bile žrtvovane še pred zaključkom študije. Poleg tega se lahko z odmerkom visoke velikosti 90 dni tretira satelitsko skupino 20 živali (10 živali na spol) in na njih opazuje povratnost, obstojnost ali zapozneli pojav strupenih učinkov v 28 dneh po tretiranju.

Velikosti odmerka

Uporabiti je treba najmanj tri velikosti odmerka in kontrolno skupino. Razen tretiranja s preskusno snovjo je treba z živalmi v kontrolni skupini ravnati na popolnoma enak način kot z živalmi iz preskusne skupine. Kadar je za lažje dajanje odmerkov uporabljen nosilec, ga je treba pri kontrolni skupini odmeriti na enak način kot pri preskusnih skupinah, dobiti pa morajo tudi enako količino nosilca, kot jo je dobila skupina z najvišjo velikostjo odmerka. Najvišja velikost odmerka bi morala povzročiti strupene učinke, vendar malo smrtnih primerov ali nobenega. Najnižja velikost odmerka ne sme povzročiti nikakršnih znakov strupenosti. Kadar imamo na voljo uporabno oceno izpostavljenosti človeka, mora najnižja velikost to presegati. V najboljšem primeru bi morala srednja velikost odmerka povzročiti minimalne opazne strupene učinke. Če je uporabljena več kot ena srednja velikost odmerka, je treba te velikosti razporediti tako, da dobimo stopnjevanje strupenih učinkov.

Za pomenljivo oceno rezultatov v skupinah z nizkim in srednjim odmerkom ter v kontrolnih skupinah mora biti pojav smrtnih primerov nizek.

Kadar se preskusna snov daje s hrano, se lahko uporabi ali konstantna koncentracija v hrani (ppm ali mg/kilogram hrane) ali konstantna velikost odmerka glede na telesno maso živali; uporabljeni izbor je treba natančno opredeliti. Kadar se snov daje z gavažo, je treba odmerek dati vsak dan ob približno istem času. Velikosti odmerka je treba prilagajati v časovnih presledkih (tedensko ali dvotedensko), da se ohrani konstantna velikost odmerka glede na telesno maso živali.

Mejni preskus

Če 90-dnevni preskus, opravljen v skladu s spodaj obrazloženo metodo, pri odmerku velikosti 1000 mg/kilogram telesne mase/dan, ali pri višji velikosti odmerka, povezani z možno izpostavljenostjo človeka, kadar je ta poznana, ne pokaže nikakršnih znakov strupenih učinkov, nadaljnji preskusi verjetno ne bodo potrebni. V primeru snovi z nizko strupenostjo je pomembno zagotoviti, da količine in druge lastnosti uporabljene preskusne snovi, dane s hrano, ne sovpadajo z zahtevami normalne prehrane.

Čas opazovanja

Vse živali je treba dnevno opazovati in beležiti znake strupenosti vključno s časom njihovega pojava, stopnjo in trajanjem. Zabeležiti je treba čas smrti in čas, ko se znaki strupenosti pojavijo in izginejo.

Postopek

Najprimerneje je, da se živalim odmerek preskusne snovi daje sedem dni na teden, v obdobju 90 dni. Živali iz katere koli satelitske skupine, za katero so načrtovana nadaljnja opazovanja, je treba vzdrževati še nadaljnjih 28 dni brez tretiranja, da se odkrije okrevanje ali obstojnost strupenih učinkov.

Opazovanje v kletkah naj vključuje spremembe na koži in krznu, v očeh in sluznici, ter v dihalnem in krvožilnem sistemu, avtonomnem in osrednjem živčnem sistemu, somatomotorični aktivnosti ter vedenjskem vzorcu. Tedensko je treba meriti porabo hrane (in porabo vode, kadar se preskusna snov daje s pitno vodo) in živali vsak teden stehtati.

Redno opazovanje živali je potrebno za zagotovitev, da med preskusom ne pride do izgube živali zaradi kanibalizma, avtolize tkiv ali napačne postavitve. Na koncu preskusnega obdobja se na vseh preživelih živalih iz nesatelitske preskusne skupine opravi nekropsija. Umirajoče živali je treba odstraniti in opraviti nekropsijo takoj, ko je to opaženo.

Naslednji pregledi se običajno opravijo na vseh živalih, vključno s kontrolnimi skupinami:

(a) Oftalmološki pregled z uporabo oftalmoskopa ali podobne ustrezne opreme je treba opraviti pred dajanjem preskusne snovi in ob zaključku študije, po možnosti na vseh živalih, najmanj pa na skupinah z visokim odmerkom in kontrolnih skupinah. Če se odkrijejo spremembe v očeh, je treba pregledati vse živali.

(b) Hematološko preiskavo, vključno s hematokritom, koncentracijo hemoglobina, številom eritrocitov, skupnim in diferencialnim številom levkocitov ter merjenjem zmožnosti koagulacije, kot je čas koagulacije, protrombinski čas, tromboplastinski čas ali število krvnih ploščic, je treba opraviti na koncu preskusnega obdobja.

(c) Klinično biokemijsko določitev na krvi je treba izvesti na koncu preskusnega obdobja. Preskusna področja, ki štejejo za ustrezna vsem študijam, so ravnovesje elektrolitov, presnova ogljikovih hidratov, delovanje jeter in ledvic. Izbor določenih preskusov bo odvisen od opazovanj načina delovanja snovi. Predlagane določitve so: meritve kalcija, fosforja, klora, natrija, kalija, glukoze na tešče (z obdobjem teščosti, ustreznim za posamezno vrsto), serumske glutaminske piruvične transaminaze [2], serumske glutaminske oksaloacetat transaminaze [3], ornitin-dekarboksilaze, gama-glutamil-transpeptidaze, sečnine, albumina, kreatinina v krvi, skupnega bilirubina in skupnih serumskih proteinov. Druge določitve, ki bi lahko bile potrebne za ustrezno oceno strupenosti vključujejo analize lipidov, hormonov, kislinsko-bazično ravnovesje, methemoglobina in aktivnost holinesteraze. Po potrebi je mogoče opraviti dodatne klinično biokemijske preiskave, da bi se razširilo raziskavo opaženih učinkov.

(d) Analize urina ni treba opravljati rutinsko, ampak samo takrat, kadar gre za indikacije, ki temeljijo na pričakovani ali opaženi strupenosti.

Če so predhodni podatki normalnih vrednosti neustrezni, je treba pozornost usmeriti na hematološke in klinično biokemijske parametre pred začetkom dajanja odmerkov.

Makroskopska nekropsija

Na vseh živalih je treba opraviti temeljito makroskopsko nekropsijo, ki vključuje pregled zunanje površine telesa, vseh telesnih odprtin ter lobanjske, prsne in trebušne votline ter njihove vsebine. Jetra, ledvice, nadledvične žleze in moda je treba čim prej po seciranju, še vlažne, stehtati, da se izognemo izsušitvi.

Naslednje organe in tkiva je treba ohraniti v ustreznem mediju za morebitne poznejše histopatološke preiskave: vse vidne lezije, možgane – vključno z deli podaljšane hrbtenjače/ponsa, skorjo malih možganov in možgansko skorjo, hipofizo, ščitnico/obščitnico in tkivo priželjca, sapnik in pljuča, srce, aorto, (žleze slinavke), jetra, vranico, ledvice, nadledvične žleze, trebušno slinavko, spolne žleze, maternico (pomožni spolni organi), (kožo), požiralnik, želodec, dvanajsternik, zgornje tanko črevo, spodnje tanko črevo, slepo črevo, debelo črevo, danko, sečni mehur, reprezentativni limfni vozel, (mlečna žleza samic), (stegensko mišičevje), periferni živec, prsnico s kostnim mozgom, (oči), (stegnenico, vključno s površino sklepa), (hrbtenjača na treh ravneh – vratni, prsni in ledveni) in (eksorbitalne žlezne solznice). Tkiva, navedena v oklepajih, je treba pregledati le, če kažejo znake strupenosti ali če gre za indikacijo, da so to ciljni organi.

Histopatološka preiskava

(a) Popolno histopatološko preiskavo je treba opraviti na organih in tkivih živali v kontrolni skupini in skupini z visokim odmerkom.

(b) Pregledati je treba vse vidne lezije.

(c) Ciljne organe je treba pregledati v skupinah z drugimi odmerki.

(d) Na pljučih živali iz skupin z nižjimi in srednje velikimi odmerki je treba opraviti histopatološko preiskavo, da bi se odkrilo znake okužbe, ker je tako mogoče ustrezno oceniti zdravstveno stanje živali. Upoštevati je treba tudi histopatološko preiskavo jeter in ledvic v teh skupinah. Nadaljnje histopatološke preiskave na živalih v teh skupinah verjetno ne bodo potrebne na rutinski osnovi, vedno pa se morajo opraviti na organih, ki kažejo znake lezij v skupini z visokim odmerkom.

(e) Kadar je uporabljena satelitska skupina, je treba opraviti histopatološko preiskavo na tkivih in organih, na katerih so prepoznani učinki v preskusnih skupinah.

2. PODATKI

Podatki se povzamejo v obliki tabele, iz katere je za vsako preskusno skupino razvidno število živali na začetku preskusa, število živali, pri katerih so opažene lezije in odstotek živali, ki kažejo določen tip lezije. Rezultate je treba oceniti z ustrezno statistično metodo. Uporabiti je mogoče katero koli priznano statistično metodo.

3. POROČILO

3.1 Poročilo o preskusu

Če je mogoče, se v poročilo o preskusu vključijo naslednji podatki:

- vrsta, sev, vir, okoljski pogoji, hrana,

- preskusni pogoji,

- velikosti odmerka (vključno z nosilcem, če je ta uporabljen) in koncentracije,

- podatki o odzivu strupenosti po spolu in odmerku,

- če je možno, velikost odmerka, pri katerem ni opaženega učinka,

- čas smrti med študijo ali preživetje živali do zaključka,

- opis strupenih ali drugih učinkov,

- čas opazovanja vsakega znaka abnormalnosti in njegov nadaljnji potek,

- podatki o hrani in telesni masi,

- oftalmološke ugotovitve,

- opravljeni hematološki preskusi in vsi rezultati,

- opravljeni klinično biokemijski preskusi in vsi rezultati (vključno z rezultati vsake analize urina),

- ugotovitve nekropsije,

- podroben opis vseh histopatoloških ugotovitev,

- statistična obdelava rezultatov, kadar je to primerno,

- obravnava rezultatov,

- razlaga rezultatov.

3.2 Ocena in razlaga

Glej Splošni uvod dela B.

4. VIRI

Glej Splošni uvod dela B.

PRESKUS SUBKRONIČNE ORALNE STRUPENOSTI

90-DNEVNI PRESKUS S PONOVLJENIMI ORALNIMI ODMERKI NA NEGLODALCIH

1. METODA

1.1 Uvod

Glej Splošni uvod dela B.

1.2 Opredelitev pojmov

Glej Splošni uvod dela B.

1.3 Referenčne snovi

Jih ni.

1.4 Princip preskusne metode

Preskusna snov se daje dnevno, oralno, v graduiranih odmerkih nekaj skupinam preskusnih živali (neglodalci), po en odmerek na skupino v obdobju 90 dni. V obdobju dajanja se živali opazujejo dnevno, da bi se odkrilo znake strupenosti. Na živalih, ki med preskusom poginejo, se opravi nekropsija, po zaključku preskusa pa se nekropsija opravi tudi na preživelih živalih.

1.5 Merila kakovosti

Jih ni.

1.6 Opis preskusne metode

Priprave

Živali se vzdržujejo v preskusnih nastanitvenih in prehranjevalnih pogojih najmanj pet dni pred preskusom. Pred preskusom se naključno izberejo zdrave mlade živali in razporedijo v preskusne ter kontrolne skupine.

Preskusna snov se lahko daje s hrano, lahko pa je bolj ustrezno tudi dajanje v kapsulah. Uporabiti je mogoče tudi druge načine oralnega dajanja. Vsem živalim je treba dajati odmerke z enako metodo tekom celotnega preskusnega obdobja. Če se za lažje dajanje odmerkov uporabi nosilec ali drugi dodatki, se je treba prepričati, da le-ti ne povzročajo strupenih učinkov. Če je ustrezno, se lahko uporabijo pretekli podatki.

Preskusni pogoji

Preskusne živali

Najpogosteje uporabljeni neglodalec je pes, po možnosti točno določene pasme. Uporabijo se lahko tudi druge vrste neglodalcev. Uporabiti je treba mlade, zdrave živali, najboljši čas za začetek dajanja odmerkov v primeru psa je pri štirih do šestih mesecih in najpozneje do devetega meseca starosti. Kadar se preskus subkronične oralne strupenosti izvaja kot predhodnik dolgodobnega preskusa, je treba v obeh preskusih uporabiti isto vrsto/pasmo.

Število in spol

Za vsako velikost odmerka je treba uporabiti najmanj osem živali (štiri samice in štiri samce). Število živali ob zaključku študije mora biti ustrezno za pridobitev pomenljive ocene strupenih učinkov.

Velikosti odmerka

Uporabiti je treba najmanj tri velikosti odmerka in kontrolo. Razen tretiranja s preskusno snovjo, je treba z živalmi v kontrolni skupini ravnati na popolnoma enak način kot z živalmi iz preskusne skupine. Najvišja velikost odmerka naj bi povzročila strupene učinke, vendar ne sme povzročiti smrtnih primerov. Najnižja velikost odmerka ne sme povzročiti nikakršnih strupenih učinkov. Kadar je na razpolago uporabna ocena izpostavljenosti človeka, mora najnižja velikost odmerka to presegati. V najboljšem primeru bi morala srednja velikost odmerka povzroči minimalne opazne strupene učinke. Če je uporabljena več kot ena srednja velikost odmerka, je treba te velikosti razporediti tako, da dobimo stopnjevanje strupenih učinkov.

V skupinah z nizkim in srednjim odmerkom ter v kontrolnih skupinah ne sme biti nobenih smrtnih primerov. V primeru snovi z nizko strupenostjo je pomembno zagotoviti, da količine preskusne snovi, dane s hrano, ne sovpadajo z normalno prehrano.

Kadar se preskusna snov daje s hrano, se lahko uporabi ali konstantna koncentracija v hrani (ppm ali mg/kilogram hrane) ali konstantna velikost odmerka glede na telesno maso živali; uporabljeni izbor je treba natančno opredeliti.

Kadar se odmerek daje direktno, na primer s kapsulo, ga je treba dati vsak dan ob približno enakem času in po potrebi prilagajati v tedenskih časovnih presledkih, da se ohrani konstantna velikost odmerka glede na telesno maso živali.

Kadar se subkronični preskus izvaja kot predhodnik dolgodobnemu preskusu, je treba v obeh študijah uporabiti podobno hrano.

Mejni preskus

Če 90-dnevna študija, opravljena v skladu s spodaj obrazloženo metodo, pri odmerku velikosti 1000 mg/kilogram telesne mase/dan, ali pri višji velikosti odmerka, povezani z možno izpostavljenostjo človeka, kadar je ta poznana, ne pokaže nikakršnih znakov strupenih učinkov, nadaljnji preskusi verjetno ne bodo potrebni. V primeru snovi z nizko strupenostjo je pomembno zagotoviti, da količine in druge lastnosti uporabljene preskusne snovi, dane s hrano, ne sovpadajo z normalnimi prehrambnimi zahtevami.

Čas opazovanja

Vse živali je treba dnevno opazovati in beležiti znake strupenosti vključno s časom njihovega nastopa, stopnjo in trajanjem. Zabeležiti je treba čas smrti in čas, ko se znaki strupenosti pojavijo in izginejo.

Postopek

Najprimerneje je, da se živalim odmerek preskusne snovi daje sedem dni na teden v obdobju 90 dni. Na podlagi praktičnih ocen, kadar se snov daje drugače, ne s hrano, pa je sprejemljivo tudi dajanje odmerkov pet dni v tednu.

Opazovanje naj vključuje, vendar naj se ne omejuje le na spremembe na koži in krznu, na očeh in sluznicah ter v dihalnem in krvožilnem sistemu, avtonomnem in osrednjem živčnem sistemu, somatomotorični aktivnosti ter vedenjskem vzorcu. Tedensko je treba meriti porabo hrane (in porabo vode, kadar se preskusna snov daje s pitno vodo) in živali vsak teden stehtati.

Temeljit klinični pregled živali je treba opraviti vsak dan z ustreznimi ukrepi, da se čimbolj zmanjša izguba živali med preskusom. Na koncu obdobja izpostavljenosti se na vseh preživelih živalih opravi nekropsija. Umirajoče živali je treba odstraniti in opraviti nekropsijo takoj, ko je to opaženo.

Naslednji pregledi se običajno opravijo na vseh živalih, vključno s kontrolnimi skupinami:

(a) Oftalmološki pregled z uporabo oftalmoskopa ali podobne ustrezne opreme je treba opraviti pred dajanjem preskusne snovi in ob zaključku študije, po možnosti na vseh živalih, najmanj pa na skupinah z visokim odmerkom in kontrolnih skupinah. Če se odkrijejo spremembe v očeh, je treba pregledati vse živali.

(b) Hematološko preiskavo, vključno s hematokritom, koncentracijo hemoglobina, številom eritrocitov, skupnim in diferencialnim številom levkocitov ter merjenjem zmožnosti koagulacije, kot je čas koagulacije, protrombinski čas, tromboplastinski čas ali število trombocitov, je treba opraviti na začetku preskusnega obdobja, potem pa bodisi vsak mesec bodisi sredi preskusnega obdobja, ter končno še na koncu preskusnega obdobja.

(c) Klinično biokemijsko določitev na krvi je treba izvesti na začetku preskusnega obdobja, potem pa bodisi v mesečnih časovnih presledkih bodisi sredi preskusnega obdobja, ter končno še na koncu preskusnega obdobja. Preskusna področja, ki štejejo za ustrezna vsem študijam, so ravnovesje elektrolitov, presnova ogljikovih hidratov, delovanje jeter in ledvic. Izbor določenih preskusov bo odvisen od opazovanj načina delovanja snovi. Predlagane določitve so: meritve kalcija, fosforja, klora, natrija, kalija, glukoze na tešče (z obdobjem teščosti, ustreznim za posamezno vrsto/pasmo), serumske glutaminske piruvične transaminaze [4], serumske glutaminske oksaloacetne transaminaze [5], ornitin-dekarboksilaze, gama-glutamil-transpeptidaze, sečnine, albumina, kreatinina v krvi, skupnega bilirubina in skupnih serumskih proteinov. Druge določitve, ki bi lahko bile potrebne za ustrezno oceno strupenosti vključujejo analize lipidov, hormonov, kislinsko-bazičnega ravnovesja, methemoglobina in aktivnost holinesteraze. Po potrebi je mogoče opraviti dodatne klinično biokemijske preiskave, da bi se razširilo raziskavo opaženih učinkov. Neglodalci naj bodo, preden se jim vzame vzorce krvi, nekaj časa tešči (ne dlje kot 24 ur).

(d) Analize urina ni treba opravljati rutinsko, ampak samo takrat, kadar gre za indikacije, ki temeljijo na pričakovani ali opaženi strupenosti.

Makroskopska nekropsija

Na vseh živalih je treba opraviti temeljito makroskopsko nekropsijo, ki vključuje pregled zunanje površine telesa, vseh telesnih odprtin ter lobanjske, prsne in trebušne votline ter njihove vsebine. Jetra, ledvice, nadledvične žleze, ščitnica (z obščitnicami) in moda je treba čim prej po seciranju, še vlažne, stehtati, da se izognemo izsušitvi.

Naslednje organe in tkiva je treba shraniti v ustreznem mediju za morebitne poznejše histopatološke preiskave: vse vidne lezije, možgane – vključno z deli podaljšane hrbtenjače/mosta, skorjo malih možganov in možgansko skorjo, hipofizo, ščitnico/obščitnico in tkivo priželjca, (sapnik), pljuča, srce, aorto, žleze slinavke, jetra, vranico, ledvice, nadledvične žleze, trebušno slinavko, spolne žleze, maternico (pomožne spolne organe), (kožo), žolčnik, požiralnik, želodec, dvanajsternik, zgornje tanko črevo, spodnje tanko črevo, slepo črevo, debelo črevo, danko, sečni mehur, reprezentativni limfni vozel, (mlečno žlezo samic), (stegensko mišičevje), periferne živce, (oči), prsnico s kostnim mozgom, (stegnenico, vključno s površino sklepa) in (hrbtenjačo na treh ravneh – vratni, prsni in ledveni). Tkiva, navedena v oklepajih, je treba pregledati le, če kažejo znake strupenosti ali če gre za indikacijo, da so to ciljni organi.

Histopatološka preiskava

Temeljito histopatološko preiskavo je treba opraviti na organih in tkivih živali v kontrolni skupini in skupini z visokim odmerkom. Nadaljnje histopatološke preiskave v skupinah z drugimi odmerki je treba opraviti na organih, ki kažejo lezije v skupini z visokim odmerkom, ali če klinična opazovanja pokažejo, da je zanje to potrebno.

2. PODATKI

Podatki se povzamejo v obliki tabele, iz katere je za vsako preskusno skupino razvidno število živali na začetku preskusa, število živali, pri katerih so opažene lezije, tipe lezij, in odstotek živali, ki kažejo določen tip lezije. Rezultate je treba oceniti z ustrezno statistično metodo. Uporabiti je mogoče katero koli priznano statistično metodo.

3. POROČILO

3.1 Poročilo o preskusu

Če je mogoče, se v poročilo o preskusu vključijo naslednji podatki:

- vrsta/pasma ali sev, vir, okoljski pogoji, hrana,

- preskusni pogoji,

- velikosti odmerka (vključno z nosilcem, če je ta uporabljen) in koncentracije,

- podatki o odzivu strupenosti po spolu in odmerku,

- če je možno, velikost odmerka, pri kateri ni opaženega učinka,

- čas smrti med študijo ali preživetje živali do zaključka,

- opis strupenosti ali drugih učinkov (s posebno pozornostjo na kliničnih odkritjih)

- čas opazovanja vsakega znaka abnormalnosti in njegov nadaljnji potek,

- podatki o hrani in telesni masi,

- oftalmološke ugotovitve,

- opravljeni hematološki preskusi in vsi rezultati,

- opravljeni klinično biokemijski preskusi in vsi rezultati (vključno z rezultati vsake analize urina),

- ugotovitve nekropsije,

- podroben opis vseh histopatoloških ugotovitev,

- statistična obdelava rezultatov, kadar je to primerno,

- obravnava rezultatov,

- razlaga rezultatov.

3.2 Ocena in razlaga

Glej Splošni uvod dela B.

4. VIRI

Glej Splošni uvod dela B.

ŠTUDIJA SUBKRONIČNE STRUPENOSTI V STIKU S KOŽO

90-DNEVNA ŠTUDIJA S PONOVLJENIM DERMALNIM ODMERKOM NA GLODALCIH

1. METODA

1.1 Uvod

Glej Splošni uvod dela B.

1.2 Opredelitev pojmov

Glej Splošni uvod dela B.

1.3 Referenčne snovi

Jih ni.

1.4 Princip preskusne metode

Preskusna snov se daje dnevno na kožo v graduiranih odmerkih nekaj skupinam preskusnih živali, po en odmerek na skupino v obdobju 90 dni. V obdobju dajanja se živali opazujejo dnevno, da bi se odkrilo znake strupenosti. Na živalih, ki med preskusom poginejo, se opravi nekropsija, po zaključku preskusa pa se nekropsija opravi tudi na preživelih živalih.

1.5 Merila kakovosti

Jih ni.

1.6 Opis preskusne metode

Priprave

Živali se vzdržujejo v preskusnih nastanitvenih in prehranjevalnih pogojih najmanj pet dni pred preskusom. Pred preskusom se naključno izberejo zdrave mlade živali in se razporedijo v preskusne ter kontrolne skupine. Pred samim preskusom se na hrbtnem predelu telesa preskusnih živali ostriže krzno. Lahko se ga obrije, vendar je treba to opraviti približno 24 ur pred preskusom. Živalim je običajno treba krzno ponovno ostriči ali obriti približno v tedenskih časovnih presledkih. Med striženjem ali britjem krzna je treba paziti, da se ne odrgne kožo. Za nanos preskusne snovi je treba očistiti najmanj 10 % telesne površine. Pri odločitvi o področju, ki ga je treba očistiti, in velikosti pokrivala, je treba upoštevati maso živali. Pri preskušanju trdnih snovi, ki jih je, kadar je primerno, mogoče uprašiti, je treba preskusno snov dovolj navlažiti z vodo ali, kadar je potrebno, ustreznim nosilcem, da se zagotovi dober stik s kožo. Tekoče preskusne snovi se ponavadi uporabljajo nerazredčene. Snovi se nanaša vsak dan pet do sedem dni na teden.

Preskusni pogoji

Preskusne živali

Uporabijo se odrasla podgana, kunec ali morski prašiček. Mogoče je uporabiti tudi druge vrste, vendar je njihovo uporabo treba utemeljiti. Na začetku preskusa nihanje v teži ne sme presegati ± 20 % srednje vrednosti. Kadar se subkronična dermalna študija izvaja kot predhodnica dolgodobne študije, je treba v obeh študijah uporabiti isto vrsto in sev.

Število in spol

Za vsako velikost odmerka je treba uporabiti najmanj 20 živali (10 samic in 10 samcev) z zdravo kožo. Samice naj bodo nuliparne in nebreje. Če so načrtovana vmesna žrtvovanja, je treba število povečati za število živali, ki naj bi bile žrtvovane še pred zaključkom študije. Poleg tega se lahko satelitsko skupino 20 živali (10 živali na spol) tretira z odmerkom visoke velikosti 90 dni in na njih v 28 dneh po tretiranju opazuje povratnost, obstojnost ali zapozneli pojav strupenih učinkov.

Velikosti odmerka

Zahtevane so najmanj tri velikosti odmerka s kontrolno skupino ali kontrolno skupino nosilca, v kolikor je uporabljen nosilec. Čas izpostavljenosti naj traja najmanj šest ur na dan. Preskusno snov je treba nanesti vsak dan približno ob enakem času, količino nanesene snovi pa prilagajati v časovnih presledkih (tedensko ali dvotedensko), da se ohrani konstantna velikost odmerka glede na telesno maso živali. Razen tretiranja s preskusno snovjo je treba z živalmi v kontrolni skupini ravnati na popolnoma enak način kot z živalmi iz preskusne skupine. Kadar se za lažje dajanje odmerkov uporabi nosilec, ga je treba na kontrolni skupini odmeriti na enak način kot na preskusnih skupinah, odmerek nosilca pa naj bo enak, kot pri preskusni skupini z najvišjo velikostjo odmerka. Najvišja velikost odmerka bi morala povzročiti strupene učinke, vendar sme povzročiti malo oziroma nobenega smrtnega primera. Najnižja velikost odmerka ne sme povzročiti nikakršnih znakov strupenosti. Kadar je na razpolago uporabna ocena izpostavljenost človeka, mora najnižja velikost to presegati. V najboljšem primeru mora srednja velikost odmerka povzročiti minimalne opazne strupene učinke. Če je uporabljena več kot ena srednja velikost odmerka, je treba te velikosti razporediti tako, da dobimo stopnjevanje strupenih učinkov. Za pomenljivo oceno rezultatov mora biti pojav smrtnih primerov v skupinah z nizkim in srednjim odmerkom ter v kontrolnih skupinah nizek.

Če nanos preskusne snovi povzroči hudo vnetje kože, je treba koncentracijo zmanjšati, kar ima lahko za posledico zmanjšanje ali odsotnost strupenih učinkov pri visoki velikosti odmerka. Če je koža hudo poškodovana, bo morda treba zaključiti študijo in začeti novo študijo z nižjimi koncentracijami.

Mejni preskus

Če predhodna študija pri velikosti odmerka 1000 mg/kilogram, ali pri višji velikosti odmerka, povezani z možno izpostavljenostjo človeka, kadar je ta poznana, ne pokaže nikakršnih znakov strupenih učinkov, nadaljnji preskusi verjetno ne bodo potrebni.

Čas opazovanja

Preskusne živali je treba dnevno opazovati, da bi se odkrili znaki strupenosti. Zabeležiti je treba čas smrti in čas, ko se znaki strupenosti pojavijo in izginejo.

Postopek

Živali je treba hraniti v kletkah vsako posebej. Najprimerneje je, da se živalim odmerek preskusne snovi daje sedem dni na teden, v obdobju 90 dni.

Živali iz katere koli satelitske skupine, za katero so načrtovana nadaljnja opazovanja, je treba ohranjati še nadaljnjih 28 dni brez tretiranja, da bi se odkrilo okrevanje ali obstojnost strupenih učinkov. Čas izpostavljenosti naj bo šest ur na dan.

Preskusno snov je treba nanesti enakomerno na območje, ki znaša približno 10 % celotne telesne površine. V primeru zelo strupene snovi je lahko površina pokritosti manjša, vendar mora kljub temu biti v celoti pokrita s čim tanjšo in čim bolj enakomerno plastjo.

V času izpostavljenosti se preskusna snov ohranja v stiku s kožo s porozno obvezo iz gaze in lepilnim trakom, ki ne draži kože. Preskusno območje je treba še dodatno pokriti na primeren način, da se obvezo iz gaze in preskusno snov obdrži na mestu ter zagotovi, da živali ne morejo zaužiti preskusne snovi. Za preprečitev zaužitja preskusne snovi je mogoče uporabiti opremo, ki omejuje gibanje živali, vendar pa popolna imobilizacija ni priporočljiva metoda.

Na koncu obdobja izpostavljenosti se, kjer je mogoče, odstrani ostanke preskusne snovi z vodo ali s kakšno drugo ustrezno metodo čiščenja kože.

Vse živali je treba dnevno opazovati in beležiti znake strupenosti vključno s časom njihovega nastopa, stopnjo in trajanjem. Opazovanje v kletkah naj vključuje opazovanje sprememb na koži in krznu, v očeh in sluznicah ter v dihalnem in krvožilnem sistemu, avtonomnem in osrednjem živčnem sistemu, somatomotorični aktivnosti ter vedenjskem vzorcu. Tedensko je treba meriti porabo hrane in živali vsak teden stehtati. Redno opazovanje živali je potrebno, da se zagotovi, da med preskusom ne pride do izgube živali zaradi kanibalizma, avtolize tkiv ali napačne postavitve. Na koncu preskusnega obdobja se na vseh preživelih živalih iz nesatelitske preskusne skupine opravi nekropsija. Umirajoče živali je treba odstraniti in opraviti nekropsijo takoj, ko je to opaženo.

Naslednji pregledi se običajno opravijo na vseh živalih, vključno s kontrolnimi skupinami:

(a) Oftalmološki pregled z uporabo oftalmoskopa ali podobne ustrezne opreme je treba opraviti pred dajanjem preskusne snovi in ob zaključku študije, po možnosti na vseh živalih, najmanj pa na skupinah z visokim odmerkom in kontrolnih skupinah. Če se odkrijejo spremembe v očeh, je treba pregledati vse živali.

(b) Hematološko preiskavo, vključno s hematokritom, koncentracijo hemoglobina, številom eritrocitov, skupnim in diferencialnim številom levkocitov ter merjenjem zmožnosti koagulacije, kot je čas koagulacije, protrombinski čas, tromboplastinski čas ali število trombocitov, je treba opraviti na koncu preskusnega obdobja.

(c) Klinično biokemijsko določitev na krvi je treba izvesti na koncu preskusnega obdobja. Preskusna področja, ki štejejo za ustrezna vsem študijam, so ravnovesje elektrolitov, presnova ogljikovih hidratov, delovanje jeter in ledvic. Izbor določenih preskusov bo odvisen od opazovanj načina delovanja snovi. Predlagane določitve so meritve kalcija, fosforja, klora, natrija, kalija, glukoze na tešče (z obdobjem teščosti, ustreznim za posamezno vrsto), serumske glutaminske piruvične transaminaze [6], serumske glutaminske oksaloacetat transaminaze [7], ornitin-dekarboksilaze, gama-glutamil-transpeptidaze, sečnine, albumina, kreatinina v krvi, skupnega bilirubina in skupnih serumskih proteinov

Druge določitve, ki bi lahko bile potrebne za ustrezno oceno strupenosti vključujejo analize lipidov, hormonov, kislinsko-bazično ravnovesje, methemoglobina in aktivnost holinesteraze. Po potrebi je mogoče opraviti dodatne klinično biokemijske preiskave, da bi se razširilo raziskavo opaženih učinkov.

(d) Analize urina ni treba opravljati rutinsko, ampak samo takrat, kadar gre za indikacije, ki temeljijo na pričakovani ali opaženi strupenosti.

Če so predhodni podatki normalnih vrednosti neustrezni, je treba pozornost usmeriti na hematološke in klinično biokemijske parametre pred začetkom dajanja odmerkov.

Makroskopska nekropsija

Na vseh živalih je treba opraviti temeljito makroskopsko nekropsijo, ki vključujejo pregled zunanje površine telesa, vseh telesnih odprtin ter lobanjske, prsne in trebušne votline ter njihove vsebine. Jetra, ledvice, nadledvične žleze in moda je treba čim prej po seciranju, še vlažne, stehtati, da se izognemo izsušitvi. Naslednje organe in tkiva je treba shraniti v ustreznem mediju za morebitne nadaljnje histopatološke preiskave: vse vidne lezije, možgane – vključno z deli podaljšane hrbtenjače/mosta, skorjo malih možganov in možgansko skorjo, hipofizo, ščitnico/obščitnico in tkivo priželjca, (sapnik), pljuča, srce, aorto, žleze slinavke, jetra, vranico, ledvice, nadledvične žleze, trebušno slinavko, spolne žleze, maternico, pomožne spolne organe, žolčnik (če je prisoten), požiralnik, želodec, dvanajsternik, zgornje tanko črevo, spodnje tanko črevo, slepo črevo, debelo črevo, danko, sečni mehur, reprezentativni limfni vozel, (mlečno žlezo samic), (stegensko mišičevje), periferni živec, (oči), (prsnico s kostnim mozgom), (stegnenica, vključno s površino sklepa), (hrbtenjačo na treh ravneh – vratni, prsni in ledveni) in (eksorbitalne žlezne solznice). Tkiva, navedena v oklepajih, je treba pregledati le, če kažejo znake strupenosti ali če gre za indikacijo, da so to ciljni organi.

Histopatološka preiskava

(a) Popolno histopatološko preiskavo je treba opraviti na normalni in tretirani koži ter organih in tkivih živali v kontrolni skupini in skupini z visokim odmerkom.

(b) Pregledati je treba vse vidne lezije.

(c) Pregledati je treba ciljne organe v skupinah z drugimi odmerki.

(d) Kadar so uporabljene podgane, je treba na pljučih živali iz skupin z nižjimi in srednje velikimi odmerki opraviti histopatološko preiskavo, da bi se odkrili znaki okužbe, saj se tako lahko ustrezno oceni zdravstveno stanje živali. Nadaljnje histopatološke preiskave na živalih v teh skupinah verjetno ne bodo potrebne na rutinski osnovi, vedno pa se morajo opraviti na organih, ki pokažejo znake lezij v skupini z visokim odmerkom.

(e) Kadar je uporabljena satelitska skupina, je treba opraviti histopatološko preiskavo na tkivih in organih, na katerih so v preskusnih skupinah opazni učinki.

2. PODATKI

Podatki se povzamejo v obliki tabele, iz katere je za vsako preskusno skupino razvidno število živali na začetku preskusa, število živali, pri katerih so opažene lezije, tipe lezij, in odstotek živali, ki kažejo določen tip lezije. Rezultate je treba oceniti z ustrezno statistično metodo. Uporabiti je mogoče katero koli priznano statistično metodo.

3. POROČILO

3.1 Poročilo o preskusu

Če je mogoče, se v poročilo o preskusu vključijo naslednji podatki:

- vrsta, sev, vir, okoljski pogoji, hrana,

- preskusni pogoji,

- velikosti odmerka (vključno z nosilcem, če je ta uporabljen) in koncentracije,

- podatki o odzivu strupenosti po spolu in odmerku,

- če je možno, velikost odmerka, pri kateri ni opaženega učinka,

- čas smrti med študijo ali preživetje živali do zaključka,

- opis strupenih ali drugih učinkov,

- čas opazovanja vsakega znaka abnormalnosti in njegov nadaljnji potek,

- podatki o hrani in telesni masi,

- oftalmološke ugotovitve,

- opravljeni hematološki preskusi in vsi rezultati,

- opravljeni klinični biokemijski preskusi in vsi rezultati (vključno z rezultati vsake analize urina),

- ugotovitve nekropsije,

- podroben opis vseh histopatoloških ugotovitev,

- statistična obdelava rezultatov, kadar je to mogoče,

- obravnava rezultatov,

- razlaga rezultatov.

3.2 Ocena in razlaga

Glej Splošni uvod dela B.

4. VIRI

Glej Splošni uvod dela B.

ŠTUDIJA SUBKRONIČNE INHALACIJSKE STRUPENOSTI

90-DNEVNA ŠTUDIJA S PONOVLJENIM INHALACIJSKIM ODMERKOM NA GLODALCIH

1. METODA

1.1 Uvod

Glej Splošni uvod dela B.

1.2 Opredelitev pojmov

Glej Splošni uvod dela B.

1.3 Referenčne snovi

Jih ni.

1.4 Princip preskusne metode

Več skupin preskusnih živali se za določeno obdobje dnevno izpostavi preskusni snovi v graduiranih koncentracijah, pri čemer se uporablja ena koncentracija na skupino v obdobju 90 dni. Kadar je uporabljen nosilec, ki pomaga sproščati ustrezno koncentracijo preskusne snovi v ozračje, je treba uporabiti kontrolno skupino za nosilec. V obdobju dajanja se živali opazujejo dnevno, da bi se odkrilo znake strupenosti. Na živalih, ki med preskusom poginejo, se opravi nekropsija, po zaključku preskusa pa se nekropsija opravi tudi na preživelih živalih.

1.5 Merila kakovosti

Jih ni.

1.6 Opis preskusne metode

Priprave

Živali se vzdržujejo v preskusnih nastanitvenih in prehranjevalnih pogojih najmanj pet dni pred preskusom. Pred preskusom se naključno izberejo zdrave mlade živali in se razporedijo v preskusne ter kontrolne skupine. Kadar je potrebno, se lahko preskusni snovi doda ustrezni nosilec, ki pomaga sproščati ustrezno koncentracijo snovi v ozračje. Če je za lažje odmerjanje uporabljen nosilec ali drugi dodatki, se je treba prepričati, da le-ti ne povzročajo strupenih učinkov. Če je ustrezno, se lahko uporabi pretekle podatke.

Preskusni pogoji

Preskusne živali

Če ni kontraindikacij, je priporočena vrsta podgana. Uporabiti je treba splošno uporabljene laboratorijske seve mladih zdravih živali. Na začetku študije nihanje v teži uporabljenih živali ne sme presegati ± 20 % ustrezne srednje vrednosti. Kadar se subkronična inhalacijska študija izvaja kot predhodnica dolgodobni študiji, je treba v obeh študijah uporabiti isto vrsto in sev.

Število in spol

Za vsako koncentracijo izpostavljenosti je treba uporabiti najmanj 20 živali (10 samic in 10 samcev). Samice naj bodo nuliparne in nebreje. Če so načrtovana vmesna žrtvovanja, je treba število povečati za število živali, ki naj bi bile žrtvovane še pred zaključkom študije. Poleg tega se lahko satelitsko skupino 20 živali (10 živali na spol) tretira z odmerkom visoke velikosti 90 dni in na njih v 28 dneh po tretiranju opazuje povratnost, obstojnost ali zapozneli pojav strupenih učinkov.

Koncentracije izpostavljenosti

Zahtevane so najmanj tri koncentracije, s kontrolno skupino ali kontrolno skupino nosilca (ki ustreza koncentraciji nosilca pri najvišji koncentraciji), v kolikor je nosilec uporabljen. Razen tretiranja s preskusno snovjo je treba z živalmi v kontrolni skupini ravnati na popolnoma enak način kot z živalmi iz preskusne skupine. Najvišja koncentracija bi morala povzročiti strupene učinke, vendar malo oziroma nobenega smrtnega primera. Kadar je na voljo uporabna ocena izpostavljenosti človeka, mora najnižja velikost to presegati. V najboljšem primeru mora srednja koncentracija povzroči minimalne opazne strupene učinke. Če je uporabljena več kot ena srednja koncentracija, je treba te koncentracije razporediti tako, da dobimo stopnjevanje strupenih učinkov. Za pomenljivo oceno rezultatov mora biti pojav smrtnih primerov v skupinah z nizko in srednjo koncentracijo ter v kontrolnih skupinah nizek.

Čas izpostavljenosti

Dnevna izpostavljenost naj traja šest ur po uravnoteženju koncentracij v komorah. Za izpolnitev posebnih zahtev je mogoče čas izpostavljenosti podaljšati ali skrajšati.

Oprema

Preskus se na živalih izvede v napravah za inhalacijo, ki so oblikovane tako, da ohranijo dinamičen pretok zraka z najmanj 12 spremembami zraka na uro, s čimer se zagotovi ustrezna vsebnost kisika in enakomerno porazdeljeno ozračje izpostavljenosti. Kadar je uporabljena komora, naj bo oblikovana tako, da bo natrpanost s preskusnimi živalmi minimalna, njihova izpostavljenost z inhalacijo preskusne snovi pa maksimalna. Na splošno velja, da naj za zagotovitev stabilnosti ozračja v komori skupna količina preskusnih živali ne presega 5 % prostornine preskusne komore. Uporabiti je mogoče komore, v katerih so živali izpostavljene samo z usti in nosom, z glavo ali s celotnim telesom; pri prvih dveh je vnos preskusne snovi po drugih poteh minimalno.

Čas opazovanja

Preskusne živali je treba dnevno opazovati, da bi se odkrili znaki strupenosti, med celotnim obdobjem tretiranja in okrevanja. Zabeležiti je treba čas smrti in čas, ko se znaki strupenosti pojavijo in izginejo.

Postopek

Živali se izpostavijo preskusni snovi dnevno, pet do sedem dni na teden, za obdobje 90 dni. Živali iz katere koli satelitske skupine, za katero so načrtovana nadaljnja opazovanja, je treba ohranjati še nadaljnjih 28 dni brez tretiranja, da bi se odkrilo okrevanje ali obstojnost strupenih učinkov. Temperaturo, pri kateri se preskus izvaja, je treba ohranjati na 22 ± 3 °C. Relativno vlažnost je najprimerneje ohranjati med 30 % in 70 %, toda v nekaterih primerih (npr. preskušanje aerosolov) to ni izvedljivo. Med izpostavljenostjo je treba odvzeti hrano in vodo.

Uporabiti je treba dinamični inhalacijski sistem z ustreznim analitskim kontrolnim sistemom koncentracije. Priporočljiv je poskusni preskus, da se določijo ustrezne koncentracije izpostavljenosti. Dotok zraka je treba prilagoditi, da bi se zagotovilo homogene pogoje po vsej komori. Sistem naj zagotovi kar najhitrejšo vzpostavitev stabilnih pogojev izpostavljenosti.

Meritve ali spremljanje naj zajema:

(a) Stopnjo pretoka zraka (neprekinjeno);

(b) Dejansko koncentracijo preskusne snovi, merjeno v dihalnem območju. Med vsakodnevno izpostavljenostjo naj koncentracija ne odstopa za več kot ± 15 % od srednje vrednosti. Vendar pa v primeru prahu in aerosolov ta raven kontrole ni nujno dosegljiva, zato je sprejemljiv širši razpon. V obdobju celotnega trajanja študije naj bodo vsakodnevne koncentracije, kolikor je to mogoče, konstantne. Med razvijanjem sistema sproščanja, je treba opraviti analizo velikosti delcev, da bi se določila stabilnost koncentracij aerosola. Med izpostavljenostjo se, kadar je to potrebno, izvede analiza za ugotovitev doslednosti porazdelitve velikosti delcev;

(c) Temperatura in vlažnost;

(d) med izpostavljenostjo in po njej potekajo opazovanja in se sistematično beležijo; podatke je treba beležiti za vsako posamezno žival posebej. Vse živali je treba dnevno opazovati in beležiti znake strupenosti vključno s časom njihovega nastopa, stopnjo in trajanjem. Opazovanja v kletkah naj vključujejo: spremembe na koži in krznu, v očeh, sluznicah, dihalnem in krvožilnem sistemu, avtonomnem in osrednjem živčnem sistemu, somatomotorični aktivnosti ter vedenjskem vzorcu. Tedensko je treba meriti porabo hrane in živali vsak teden stehtati. Redno opazovanje živali je potrebno da se zagotovi, da med študijo ne pride do izgube živali zaradi kanibalizma, avtolize tkiv ali napačne postavitve. Na koncu obdobja izpostavljenosti, se na vseh preživelih živalih opravi nekropsija. Umirajoče živali je treba odstraniti in opraviti nekropsijo takoj, ko je to opaženo.

Naslednji pregledi se običajno opravijo na vseh živalih, vključno s kontrolnimi skupinami:

(a) Oftalmološki pregled z uporabo oftalmoskopa ali podobne ustrezne opreme je treba opraviti pred izpostavitvijo preskusni snovi in ob zaključku študije, po možnosti na vseh živalih, najmanj pa na skupinah z visokim odmerkom in kontrolnih skupinah. Če se odkrijejo spremembe v očeh, je treba pregledati vse živali;

(b) Hematološko preiskavo, vključno s hematokritom, koncentracijo hemoglobina, številom eritrocitov, skupnim in diferencialnim številom levkocitov ter merjenjem zmožnosti koagulacije, kot je čas koagulacije, protrombinski čas, tromboplastinski čas ali število trombocitov, je treba opraviti na koncu preskusnega obdobja;

(c) Klinično biokemijsko določitev na krvi je treba izvesti na koncu preskusnega obdobja. Preskusna področja, ki štejejo za ustrezna vsem študijam, so ravnovesje elektrolitov, presnova ogljikovih hidratov, delovanje jeter in ledvic. Izbor določenih preskusov bo odvisen od opazovanj načina delovanja snovi. Predlagane določitve so meritve kalcija, fosforja, klora, natrija, kalija, glukoze na tešče (z obdobjem teščosti, ustreznim za posamezno vrsto), serumske glutaminske piruvične transaminaze [8], serumske glutaminske oksaloacetat transaminaze [9], ornitin-dekarboksilaze, gama-glutamil-transpeptidaze, sečnine, albumina, kreatinina v krvi, skupnega bilirubina in skupnih serumskih proteinov. Druge določitve, ki bi lahko bile potrebne za ustrezno oceno strupenosti vključujejo analize lipidov, hormonov, ravnovesja kislinsko-bazično ravnovesje, methemoglobina in aktivnost holinesteraze. Po potrebi je mogoče opraviti dodatne klinično biokemijske preiskave, da bi se razširilo raziskavo opaženih učinkov.

(d) Analize urina ni treba opravljati rutinsko, ampak samo takrat, kadar gre za indikacijo, ki temelji na pričakovani ali opaženi strupenosti.

Če so predhodni podatki normalnih vrednosti neustrezni, je treba pozornost usmeriti na hematološke in klinično biokemijske parametre pred začetkom dajanja odmerkov.

Makroskopska nekropsija

Na vseh živalih je treba opraviti popolno makroskopsko nekropsijo, ki vključuje pregled zunanje površine telesa, vseh telesnih odprtin ter lobanjske, prsne in trebušne votline ter njihove vsebine. Jetra, ledvice, nadledvične žleze, ščitnica (in obščitnice) in moda je treba čim prej po seciranju, še vlažne, stehtati, da se izognemo izsušitvi. Naslednje organe in tkiva je treba shraniti v ustreznem mediju za morebitne poznejše histopatološke preiskave: vse vidne lezije, pljuča – ki jih je treba odstraniti nepoškodovana, stehtati in obdelati z ustreznim fiksirjem, da se zagotovi ohranjenost pljučne strukture (oblivanje s fiksativom velja za učinkovit postopek), tkiva nosu in žrela, možgani – vključno z deli podaljšane hrbtenjače/mosta, skorjo malih možganov in možgansko skorjo, hipofizo, ščitnico/obščitnic in tkivo priželjca, sapnik, pljuča, srce, aorto, žleze slinavke, jetra, vranico, ledvice, nadledvične žleze, trebušno slinavko, maternico (pomožne spolne organe), (kožo), žolčnik (če je prisoten), požiralnik, želodec, dvanajsternik, zgornje tanko črevo, spodnje tanko črevo, slepo črevo, debelo črevo, danka, sečni mehur, reprezentativni limfni vozel, (mlečno žleza samic), (stegensko mišičevje), periferni živec, (oči), prsnico s kostnim mozgom, (stegnenico, vključno s površino sklepa) in (hrbtenjačo na treh ravneh – vratni, prsni in ledveni). Tkiva, navedena v oklepajih, je treba pregledati le, če kažejo znake strupenosti ali če gre za indikacijo, da so to ciljni organi.

Histopatološka preiskava

(a) Popolno histopatološko preiskavo je treba opraviti na dihalih in drugih organih in tkivih vseh živali v kontrolni skupini in skupini z visokim odmerkom.

(b) Pregledati je treba vse vidne lezije.

(c) Pregledati je treba ciljne organe v skupinah z drugimi odmerki.

(d) Pljuča živali iz skupin z nižjimi in srednje velikimi odmerki je treba prav tako izpostaviti histopatološki preiskavi, saj se tako lahko ustrezno oceni zdravstveno stanje živali. Nadaljnje histopatološke preiskave na živalih v teh skupinah verjetno ne bodo potrebne na rutinski osnovi, vedno pa se morajo opraviti na organih, na katerih so v skupini z visokim odmerkom opazni znaki lezij.

(e) Kadar je uporabljena satelitska skupina, je treba opraviti histopatološko preiskavo na tkivih in organih, na katerih so v preskusnih skupinah opaženi učinki.

2. PODATKI

Podatki se povzamejo v obliki tabele, iz katere je za vsako preskusno skupino razvidno število živali na začetku preskusa, število živali, na katerih so opažene lezije, tipe lezij, in odstotek živali, ki kažejo določen tip lezije. Rezultate je treba oceniti z ustrezno statistično metodo. Uporabiti je mogoče katero koli priznano statistično metodo.

3. POROČILO

3.1 Poročilo o preskusu

Če je mogoče, se v poročilo o preskusu vključijo naslednji podatki:

- vrsta, sev, vir, okoliški pogoji, hrana,

- preskusni pogoji:

Opis aparature za izpostavljenost: vključno z obliko, tipom, dimenzijami, virom zraka, sistemom za sproščanje delcev in aerosolov, metodo klimatiziranja, obdelavo izpušnega zraka in metodo nastanitve živali v preskusne komore, kadar so te uporabljene. Opisati je treba opremo za merjenje temperature, vlažnosti in, kadar je to primerno, stabilnosti koncentracij aerosola ali velikosti delcev.

Podatki o izpostavljenosti: zbrati jih je treba v tabeli in prikazati srednje vrednosti ter meritev nihanj (npr. standardno odstopanje), zajemati pa morajo:

(a) stopnje pretoka zraka skozi naprave za inhalacijo;

(b) temperaturo in vlažnost zraka;

(c) nominalne koncentracije (skupna količina preskusne snovi, dane v napravo za inhalacijo in deljeno s prostornino zraka);

(d) vrsto nosilca, če je ta uporabljen;

(e) dejanske koncentracije na preskusnem dihalnem območju;

(f) mediano velikosti delcev (kjer je to primerno),

- podatki o odzivu strupenosti po spolu in koncentraciji,

- če je možno, velikost koncentracije, pri kateri ni opaženega učinka,

- čas smrti med študijo ali preživetje živali do zaključka,

- opis strupenih ali drugih učinkov,

- čas opazovanja vsakega znaka abnormalnosti in njegov nadaljnji potek,

- podatki o hrani in telesni masi,

- oftalmološke ugotovitve,

- opravljeni hematološki preskusi in rezultati,

- opravljeni klinično biokemijski poskusi in rezultati (vključno z rezultati vsake analize urina),

- ugotovitve nekropsije,

- podroben opis vseh histopatoloških ugotovitev,

- statistična obdelava rezultatov, kadar je to mogoče,

- obravnava rezultatov,

- razlaga rezultatov.

3.2 Ocena in razlaga

Glej Splošni uvod dela B.

4. VIRI

Glej Splošni uvod dela B.

ŠTUDIJA TERATOGENOSTI – GLODALCI IN NEGLODALCI

1. METODA

1.1 Uvod

Glej Splošni uvod dela B.

1.2 Opredelitev pojmov

Glej Splošni uvod dela B.

1.3 Referenčne snovi

Jih ni.

1.4 Princip preskusne metode

Preskusna snov se daje v graduiranih odmerkih ali koncentracijah najmanj v času brejosti, ki zajema obdobje organogeneze, in sicer nekaj skupinam brejih preskusnih živali, pri čemer se uporabi en odmerek na skupino. Tik pred pričakovanim datumom skotitve se samico žrtvuje, odstrani maternico in pregleda vsebino. Ta preskusna metoda zajema embriotoksičnost in fetotoksičnost.

1.5 Merila kakovosti

Jih ni.

1.6 Opis preskusne metode

Priprave

Laboratorijskim pogojem se najmanj pet dni pred preskusom prilagodijo zdrave mlade odrasle samice približno enake starosti in velikosti, ki se še niso parile, nato pa se jih pari s samci z ugotovljeno plodnostjo. Oplojene samice se naključno izberejo in razporedijo v preskusne skupine.

Do parjenja lahko pride po naravni poti ali pa se opravi umetna osemenitev. Preskusna snov se samicam daje dnevno, s čimer se začne tik po ugnezditvi in nadaljuje skozi celotno obdobje organogeneze. Dan pred rokom kotitve se zarodki skotijo s histerektomijo in se pregledajo za visceralne ali skeletne anomalije, vključno z zaostalostjo rasti, pozno osifikacijo in črevesnimi krvavitvami.

Preskusni pogoji

Preskusne živali

Običajno uporabljene vrste so podgana, miš, hrček in kunec. Priporočeni vrsti sta podgana in kunec. Uporabijo naj se splošno uporabljani laboratorijski sevi. Sev ne sme imeti nizke plodnosti, in mora biti karakteriziran glede odziva na teratogene snovi. Živali je treba razvrstiti po kletkah posamezno.

Število in spol

Za vsako velikost odmerka je zahtevanih najmanj 20 brejih samic podgane, miši ali hrčka ali 12 brejih samic kunca. Cilj je zagotoviti dovolj velik zarod in zadostno število mladičev, da se mogoči ocena potencialnega teratogenega učinka snovi.

Velikosti odmerka

Uporabiti je treba najmanj tri velikosti odmerka in kontrolo. Kadar se preskusna snov daje z nosilcem, je treba uporabiti tudi kontrolno skupino za nosilec. Pri uporabi nosilca je treba poznati njegove toksikološke lastnosti; ta ne sme biti teratogen ali imeti učinkov na razmnoževanje. Razen tretiranja s preskusno snovjo je treba z živalmi v kontrolni skupini(ah) ravnati na popolnoma enak način kot z živalmi iz preskusne skupine. Najvišja velikost odmerka preskusne snovi, v kolikor ni omejena s fizikalnimi/kemijskimi ali biološkimi lastnostmi snovi, mora v najboljšem primeru povzročiti nekaj očitne maternalne strupenosti, kot je majhna izguba na teži, ne sme pa povzročiti več kot 10 % smrtnih primerov pri materah. Nizka velikost odmerka ne sme sprožiti vidnih učinkov, ki jih je mogoče pripisati preskusni snovi. Srednje velik odmerek ali odmerke je treba geometrično razporediti med visokimi in nizkimi velikostmi odmerka.

Mejni preskus

V primeru snovi z nizko strupenostjo, če odmerek velikosti najmanj 1000 mg/kilogram ne povzroči nikakršnih znakov embriotoksičnosti ali teratogenosti, nadaljnje študije pri drugih velikostih odmerka verjetno ne bodo potrebne.

Čas izpostavljenosti

Dan 0 v preskusu je dan, ko je opažen vaginalni zamašek in/ali semenčeca (kadar je to izvedljivo). Čas odmerjanja naj se pokriva s časom glavne organogeneze. Pri podganah in miših je to lahko 6. do 15. dan, pri hrčkih 6. do 14. dan ali 6. do 18. dan pri kuncih. Če se na dan 0 opazuje parjenje ali umetna osemenitev, je treba navedene čase prilagoditi tako, da se doda en dan. Lahko pa se čas odmerjanja podaljša na približno en dan pred pričakovanim dnevom kotitve.

Čas opazovanja

Najmanj enkrat na dan je treba opraviti temeljit klinični pregled. Dodatna opazovanja je treba opraviti vsak dan in sprejeti ustrezne ukrepe, da bi bila izguba živali med študijo čim manjša.

Postopek

Preskusno snov se daje oralno z gavažo. Preskusno snov je treba dati vsak dan približno ob istem času.

Samice preskusnih živali se tretirajo s preskusno snovjo vsak dan tekom ustreznega obdobja tretiranja. Odmerek je lahko odvisen od teže samic na začetku dajanja snovi ali pa se, glede na hitro pridobitev na teži v času brejosti živali redno tehta, nakar se odmerek odmeri glede na nazadnje ugotovljeno maso. Znake strupenosti je treba beležiti, kot se jih opazi, vključno s časom nastopa, stopnjo in trajanjem. Samice, ki kažejo znake abortusa ali prezgodnje skotitve, je treba žrtvovati in opraviti temeljit makroskopski pregled. Obdobje opazovanja po tretiranju naj se nadaljuje do približno zadnjega dneva pred rokom skotitve; cilj tega je zajeti večji del obdobja brejosti in izogniti se zapletom pri razlagi rezultatov, do katerih lahko pride po naravni skotitvi. Opazovanja v kletkah naj vključujejo, vendar naj ne bodo omejena na spremembe na koži in krznu, v očeh in sluznicah, ter v dihalnem in krvožilnem sistemu, avtonomnem in osrednjem živčnem sistemu, somatomotorični aktivnosti ter vedenjskem vzorcu. Tedensko je treba meriti porabo hrane. Živali je treba vsak teden stehtati.

Nekropsija

V primeru smrti v času ali na koncu študije je treba samico makroskopsko pregledati za kakršne koli abnormalnosti ali patološke spremembe, ki so lahko vplivale na brejost. Takoj po smrti je treba odstraniti maternico, vsebino pa pregledati za primere smrti zarodka ali ploda ter za število živih zarodkov. Ponavadi je mogoče opredeliti čas smrti in utero, kadar gre za tak primer. Pri podganah in kuncih je mogoče določiti število corpora lutea. Določiti je treba spol zarodkov in stehtati vsak zarodek posebej, zabeležiti teže ter izračunati povprečno maso zarodka. Po odstranitvi je treba vsak zarodek zunanje pregledati. Pri podganah, miših in hrčkih je treba eno tretjino do ene polovice vsakega zaroda pripraviti in pregledati za skeletne anomalije, preostali del vsakega zaroda pa pripraviti in pregledati za anomalije mehkega tkiva z uporabo ustreznih metod. Pri kuncih se z natančnim seciranjem vsak zarodek pregleda najprej za visceralne anomalije, nato pa še za skeletne anomalije.

2. PODATKI

Podatki se povzamejo v obliki tabele, iz katere je za vsako preskusno skupino razvidno število živali na začetku preskusa, število brejih živali, število in odstotke živih zarodkov in zarodke s kakršnimi koli abnormalnostmi mehkega tkiva ali skeletnimi abnormalnostmi ter njihovo povezavo z določenim zarodom. Rezultate je treba oceniti z ustrezno statistično metodo. Uporabiti je mogoče katero koli priznano statistično metodo.

3. POROČILO

3.1 Poročilo o preskusu

Če je mogoče, se v poročilo o preskusu vključijo naslednji podatki:

- vrsta, sev, vir, okoljski pogoji, hrana,

- preskusni pogoji,

- velikosti odmerka (vključno z nosilcem, če je ta uporabljen) in koncentracije,

- podatki o odzivu strupenosti po odmerku,

- če je možno, velikost odmerka, pri kateri ni opaženega učinka,

- čas smrti med študijo ali preživetje živali do zaključka,

- opis strupenih ali drugih učinkov,

- čas opazovanja vsakega znaka abnormalnosti in njegov nadaljnji potek,

- podatki o hrani in telesni masi,

- trajanje brejosti in podatki o zarodu (vključno s preteklimi podatki),

- podatki o zarodku (živ/mrtev, spol, okvare mehkega tkiva in okvare skeleta),

- podatki o zarodu (živ/mrtev, spol, okvare mehkega tkiva in okvare skeleta za vsak zarod),

- statistična obdelava rezultatov,

- obravnava rezultatov,

- razlaga rezultatov.

3.2 Ocena in razlaga

Glej Splošni uvod dela B.

4. VIRI

Glej Splošni uvod dela B.

PRESKUS KRONIČNE STRUPENOSTI

1. METODA

1.1 Uvod

Glej Splošni uvod dela B.

1.2 Opredelitev pojmov

Glej Splošni uvod dela B.

1.3 Referenčne snovi

Jih ni.

1.4 Princip preskusne metode

Preskusna snov se običajno daje sedem dni na teden na ustrezen način nekaj skupinam preskusnih živali, in sicer po en odmerek na skupino večji del življenjske dobe živali. Med in po izpostavljenosti preskusni snovi se živali dnevno opazujejo, da bi se odkrilo znake strupenosti.

1.5 Merila kakovosti

Jih ni.

1.6 Opis preskusne metode

Priprave

Živali se vzdržujejo v preskusnih nastanitvenih in prehranjevalnih pogojih najmanj pet dni pred preskusom. Pred preskusom se naključno izberejo zdrave mlade živali in se razporedijo v preskusne ter kontrolne skupine.

Preskusni pogoji

Preskusne živali

Priporočena vrsta je podgana. Na podlagi rezultatov predhodno opravljenih študij je mogoče uporabiti tudi druge vrste (glodalce ali neglodalce). Uporabiti je treba splošno uporabljene laboratorijske seve mladih zdravih živali, dajanje odmerkov pa naj se začne čim prej, potem ko se žival odstavi od sesanja.

Na začetku študije nihanje v teži uporabljenih živali ne sme presegati ± 20 % srednje vrednosti. Kadar se subkronična oralna študija izvaja kot predhodnica dolgodobni študiji, je treba v obeh študijah uporabiti isto vrsto/pasmo in sev.

Število in spol

Pri glodalcih je treba za vsako velikost odmerka in sočasno kontrolno skupino uporabiti najmanj 40 živali (20 samic in 20 samcev). Samice naj bodo nuliparne in nebreje. Če so načrtovana vmesna žrtvovanja, je treba število povečati za število živali, ki naj bi bile žrtvovane še pred zaključkom študije.

Pri neglodalcih zadostuje tudi manjše število živali, vendar najmanj štiri na spol na skupino.

Velikosti odmerka in pogostost izpostavljenosti

Uporabiti je treba najmanj tri velikosti odmerka poleg sočasne kontrolne skupine. Najvišja velikost odmerka bi morala sprožiti očitne znake strupenosti, ne da bi povzročila preveliko smrtnost. Najnižja velikost odmerka ne sme povzročiti nikakršnih znakov strupenosti.

Srednje velik odmerek ali odmerke je treba določiti na sredini med visokimi in nizkimi odmerki.

Pri izbiranju velikosti odmerka je treba upoštevati podatke iz predhodnih preskusov in študij strupenosti.

Pogostost izpostavljenosti je običajno dnevna. Če se kemikalija daje v pitni vodi ali vmeša v hrano, mora biti le-ta ves čas na voljo.

Kontrole

Uporabiti je treba sočasno kontrolno skupino, ki je v vseh pogledih identična preskusnim skupinam, razen glede izpostavljenosti preskusni snovi.

V posebnih okoliščinah, kot so inhalacijske študije z aerosoli ali uporaba emulgatorjev v oralnih študijah, katerih biološka aktivnost ni poznana, je treba uporabiti tudi sočasno negativno kontrolno skupino. Negativna kontrolna skupina se obravnava enako kot preskusne skupine, razen da živali niso izpostavljene preskusni snovi ali kateremu koli nosilcu.

Način dajanja

Dva glavna načina dajanja sta oralno in inhalacijsko. Izbira načina dajanja je odvisna od fizikalnih in kemijskih lastnosti preskusne snovi in verjetnega načina izpostavljenosti pri ljudeh.

Pri uporabi dermalnega načina, se pojavljajo znatne praktične težave. Na kronično sistemsko strupenost, ki je rezultat absorpcije skozi kožo, je mogoče sklepati iz rezultatov kakšnega drugega oralnega preskusa, za ugotovitev obsežnosti absorpcije skozi kožo pa izhajati iz predhodnih preskusov strupenosti pri dajanju skozi kožo.

Oralne študije

Kadar se preskusna snov absorbira iz prebavnega trakta in če je zaužitje eden od možnih načinov izpostavljenosti ljudi, ima, razen v primeru kontraindikacij, prednost oralni način dajanja.

Živali lahko preskusno snov sprejmejo s hrano, raztopljeno v pitni vodi ali v kapsuli.

Najprimerneje je dajati odmerke sedem dni na teden, saj se s petdnevnim dajanjem odmerkov na teden dopušča okrevanje ali odprava strupenosti v času, ko se odmerkov ne daje, to pa bi vplivalo na rezultat ter poznejšo oceno. Vendar pa na podlagi praktičnih ugotovitev velja, da je tudi petdnevno dajanje odmerkov na teden sprejemljivo.

Inhalacijske študije

Ker inhalacijske študije povzročajo bolj zapletene tehnične težave kot drugi načini dajanja, so na tem mestu podane podrobnejše smernice v zvezi s tem načinom dajanja. Upoštevati je treba tudi to, da je lahko v posebnih primerih veljavna alternativa intratrahealna instilacija.

Dolgotrajne izpostavljenosti se običajno zasnovane po vzorcu predvidene izpostavljenosti ljudi, pri čemer se živali izpostavlja ali šest ur na dan po izenačitvi koncentracij v komori, in sicer pet dni na teden (izpostavljenost s prekinitvami), ali, ustrezno možni izpostavljenosti preko okolja, 22 do 24 ur na dan sedem dni na teden (stalna izpostavljenost), pri čemer je približno ena ura na dan približno ob istem času namenjena hranjenju živali in vzdrževanju komore. V obeh primerih so živali običajno izpostavljene nespremenljivim koncentracijam preskusne snovi. Bistvena razlika med izpostavljenostjo s prekinitvami in stalno izpostavljenostjo je v tem, da ima prva 17- do 18-urno obdobje, v katerem lahko živali okrevajo od učinkov vsakodnevne izpostavljenosti, s celo daljšimi obdobji okrevanja med vikendi.

Izbira med izpostavljenostjo s prekinitvami in stalno izpostavljenostjo je odvisna od ciljev študije in izpostavljenosti ljudi, ki na bi se jo simuliralo. Vendar je treba upoštevati tudi nekatere tehnične težave. Na primer, prednosti stalne izpostavljenosti pri simulaciji okoljskih pogojev lahko izniči potreba po napajanju in hranjenju med izpostavljenostjo in potreba po bolj zapletenih (in zanesljivih) tehnikah sproščanja aerosola in hlapov ter tehnikah spremljanja.

Komore za izpostavljanje

Živali je treba preskušati v komorah za inhalacijo, ki so oblikovane tako, da ohranijo dinamičen pretok zraka v količini najmanj 12 sprememb zraka na uro, da se zagotovi ustrezna vsebnost kisika in enakomerno porazdeljeno ozračje izpostavljenosti. Kontrolne komore in komore za izpostavljanje morajo biti po strukturi in obliki identične, da se zagotovijo primerljivi pogoji izpostavljenosti v vseh pogledih, razen glede izpostavljenosti preskusnim snovem. Na splošno se znotraj komore vzdržuje rahel negativen pritisk, da bi se preprečilo uhajanje preskusne snovi v okolico. Natrpanost s preskusnimi živalmi v komorah naj bo minimalna. Na splošno velja, da naj za zagotovitev stabilnosti ozračja v komori skupna količina preskusnih živali ne presega 5 % prostornine preskusne komore.

Meritve ali spremljanje naj zajema:

(i) Pretok zraka: stopnjo pretoka zraka skozi komoro je treba stalno spremljati;

(ii) Koncentracijo: med vsakodnevno izpostavljenostjo, naj preskusna snov ne odstopa za več kot ± 15 % od srednje vrednosti;

(iii) Temperatura in vlažnost: pri glodalcih je treba temperaturo ohranjati na 22 ± 2 °C, vlažnost v komori pa med 30 % in 70 %, razen kadar se uporabi voda za suspendiranje preskusne snovi v ozračju komore. Priporočljivo je oboje stalno spremljati;

(iv) Meritve velikosti delcev: v ozračjih komor s tekočimi ali trdnimi aerosoli je treba določiti porazdelitev velikosti delcev. Delci aerosolov morajo biti take velikosti, da jih uporabljena preskusna žival lahko vdihne. Vzorce ozračij komor je treba vzeti v območju dihanja živali. Vzorec zraka mora predstavljati porazdelitev delcev, katerim so živali izpostavljene, in mora na gravimetrični podlagi predstavljati ves suspendiran aerosol, tudi kadar večina aerosola ni vdihljiva. Analizo velikosti delcev je treba opraviti pogosto v času razvijanja sproščanja koncentracij, da bi se zagotovila stabilnost aerosola, po potrebi pa tudi pozneje med izpostavljenostjo, da bi se ustrezno določila doslednost porazdelitve delcev, ki so jim živali izpostavljene.

Trajanje študije

Obdobje dajanja naj traja najmanj 12 mesecev.

Postopek

Opazovanja

Najmanj enkrat na dan je treba opraviti natančen klinični pregled. Dodatna opazovanja je treba opraviti vsak dan z ustreznimi ukrepi, da se zagotovi minimalna izguba živali med študijo, na primer nekropsija ali zamrznitev mrtvih živali ter izolacija ali žrtvovanje slabotnih ali umirajočih živali. Opraviti je treba natančna opazovanja za ugotovitev nastopa in širjenja vseh strupenih učinkov, ter za zmanjšanje izgube zaradi bolezni, avtolize ali kanibalizma na minimum.

Klinične znake, vključno z nevrološkimi in očesnimi spremembami ter smrtnostjo, je treba zabeležiti za vse živali. Zabeležiti je treba čas nastopa in širjenja strupenih stanj, vključno s sumi na tumorje.

Telesno maso je treba za vsako žival posebej beležiti enkrat na teden v prvih 13. tednih preskusnega obdobja, pozneje pa najmanj enkrat na štiri tedne. Vnos hrane je treba določiti tedensko v prvih 13 tednih študije, potem pa v približno tri mesečnih časovnih presledkih, razen če zdravstveno stanje ali spremembe telesne mase ne zahtevajo drugače.

Hematološka preiskava

Hematološko preiskavo (npr. vsebnost hemoglobina, hematokrit, skupno število eritrocitov, skupno število levkocitov, trombocitov ali druga merjenja zmožnosti koagulacije) je treba opraviti pri treh mesecih, šestih mesecih, potem pa približno v šest mesečnih časovnih presledkih in ob zaključku na vzorcih krvi, odvzetih na vseh neglodalcih in na 10. podganah/spol iz vseh skupin. Če je mogoče, naj bodo krvni vzorci vsakokrat odvzeti na istih podganah. Poleg tega je treba na neglodalcih odvzeti en vzorec še pred preskusom.

Če klinična opažanja kažejo na poslabšanje zdravja živali med študijo, je treba na obolelih živalih opraviti pregled diferencialne krvne slike.

Pregled diferencialne krvne slike se opravi na vzorcih živali iz skupine z najvišjim odmerkom ter kontrolnih skupin. Na naslednji skupini ali skupinah z nizkim odmerkom se pregled diferencialne krvne slike opravi le, kadar gre za večjo neskladnost med skupino z najvišjim odmerkom in kontrolnimi skupinami, ali kadar pride do patoloških ugotovitev.

Analiza urina

Za analizo je treba odvzeti vzorce urina na vseh neglodalcih in na 10. podganah/spol iz vseh skupin, če je mogoče, vsakokrat na istih podganah, tako kot pri hematološki preiskavi. Za vsako posamezno žival ali skupino vzorcev/spol/skupino pri glodalcih je treba določiti naslednje:

- videz: prostornina in gostota pri posameznih živalih,

- proteini, glukoza, ketoni, kri (polkvantitativno določanje),

- mikroskopija sedimenta (polkvantitativno določanje).

Klinična kemija

V približno šest mesečnih časovnih presledkih in ob zaključku se na vseh neglodalcih in na 10. podganah/spol iz vseh skupin, po možnosti vsakokrat na istih podganah, odvzamejo vzorci krvi za meritve na področju klinične kemije. Poleg tega naj se na neglodalcih odvzame en vzorec še pred preskusom. Iz navedenih vzorcev se pripravi plazma in se določi naslednje:

- skupna koncentracija proteinov,

- koncentracija albumina,

- preskus delovanja jeter (kot je aktivnost alkalne fosfataze, aktivnost glutamične piruvične transaminaze [10] in aktivnost glutamične oksaloacetat transaminaze [11]), gama-glutamil-transpeptidaza, ornitin-dekarboksilaza,

- presnova ogljikovih hidratov, kot je krvna glukoza na tešče,

- preskusi delovanja ledvic, kot je sečnina v krvi.

Makroskopska nekropsija

Temeljito makroskopsko nekropsijo je treba opraviti na vseh živalih, vključno s tistimi, ki so umrle med preskusom ali so bile žrtvovane potem, ko se je odkrilo, da so v umirajočem stanju. Pred žrtvovanjem je treba vsem živalim odvzeti vzorce krvi za diferencialno krvno sliko. Vse makroskopsko vidne lezije, tumorje ali lezije, pri katerih gre za sum tumorja, je treba shraniti. Prizadevati si je treba za korelacijo makroskopskih opazovanj z mikroskopskimi ugotovitvami.

Vse organe in tkiva je treba shraniti za histopatološke preiskave. To ponavadi vključuje naslednje organe in tkiva: možgane [12] (podaljšano hrbtenjačo/most, skorjo malih možganov in možgansko skorj), hipofizo, ščitnico (vključno z obščitnicami), priželjc, pljuča (vključno s sapnikom), srce, aoro, žleze slinavke, jetra [13], vranico, ledvice [14], nadledvične žleze [15], požiralnik, želodec, dvanajsternik, zgornje tanko črevo, spodnje tanko črevo, slepo črevo, debelo črevo, danko, maternico, sečni mehur, limfne vozle, trebušno slinavko, spolne žleze [16], pomožne spolne organe, mlečno žlezo samic, kožo, mišičevje, periferni živec, hrbtenjača (vratni, prsni in ledveni del), prsnica s kostnim mozgom ter stegnenica (vključno s sklepom) in oči. Vpihovanje pljuč in sečnega mehurja s fiksativom je najboljši način za ohranitev teh tkiv; vpihovanje pljuč pri inhalacijskih študijah je nujno za ustrezno histopatološko preiskavo. V posebnih študijah, kot so inhalacijske študije, je treba proučiti celotna dihala, vključno z nosom, žrelom in grlom.

Če so opravljeni drugi klinični pregledi, morajo biti podatki, pridobljeni v teh postopkih, na voljo pred mikroskopskim pregledom, saj lahko to daje patologu pomembne smernice.

Histopatologija

Vse vidne spremembe, zlasti tumorje in druge lezije, ki nastanejo na katerem koli organu, je treba mikroskopsko pregledati. Poleg tega so priporočeni še naslednji postopki:

(a) Mikroskopski pregled vseh ohranjenih organov in tkiv s popolnim opisom vseh lezij, odkritih pri:

1. vseh živalih, ki so umrle ali bile žrtvovane med študijo;

2. vseh skupinah z visokimi odmerki in kontrolnih skupinah;

(b) Organi ali tkiva, ki kažejo abnormalnosti, ki je povzročila ali verjetno povzročila preskusna snov se pregledajo tudi pri skupini z nizkim odmerkom

(c) Kadar rezultat preskusa kaže na znatno zmanjšanje normalne življenjske dobe živali ali na sprožitev učinkov, ki lahko vplivajo na odziv strupenosti, je treba pregledati naslednjo skupino z nizkim odmerkom, kot je opisano zgoraj;

(d) Podatki o pojavu lezij, ki so običajne pri sevu uporabljenih živali pod enakimi laboratorijskimi pogoji, npr. pretekli kontrolni podatki, so nepogrešljivi za pravilno oceno pomembnosti sprememb, opaženih na tretiranih živalih.

2. PODATKI

Podatki se povzamejo v obliki tabele, iz katere je za vsako preskusno skupino razvidno število živali na začetku preskusa, število živali, pri katerih so opažene lezije, in odstotek živali, ki kažejo določen tip lezije. Rezultate je treba oceniti z ustrezno statistično metodo. Uporabiti je mogoče katero koli priznano statistično metodo.

3. POROČILO

3.1 Poročilo o preskusu

Če je mogoče, se v poročilo o preskusu vključijo naslednji podatki:

- vrsta, sev, vir, okoljski pogoji, hrana,

- preskusni pogoji:

Opis opreme za izpostavljenost:

vključno z obliko, tipom, dimenzijami, virom zraka, sistemom za sproščanje delcev in aerosolov, metodo klimatiziranja, obdelavo izpušnega zraka in metodo nastanitve živali v preskusne komore, kadar so te uporabljene. Opisati je treba opremo za merjenje temperature, vlažnosti in, kadar je ustrezno, stabilnosti koncentracij aerosola ali velikosti delcev.

Podatki o izpostavljenosti:

zbrati jih je treba v tabeli in prikazati s srednjimi vrednostmi ter meritvami nihanj (npr. standardno odstopanje), zajemati pa morajo:

(a) stopnje pretoka zraka skozi naprave za inhalacijo;

(b) temperaturo in vlažnost zraka;

(c) nominalne koncentracije (skupna količina preskusne snovi, dane v naprave za inhalacijo deljeno s prostornino zraka);

(d) vrsto nosilca, če je ta uporabljen;

(e) dejanske koncentracije na preskuševalnem dihalnem območju;

(f) mediano velikosti delcev (kjer je to primerno),

- velikosti odmerkov (vključno z nosilcem, če je uporabljen) in koncentracije,

- podatki o odzivu strupenosti po spolu in koncentraciji,

- velikost odmerka, pri kateri ni opaženega učinka,

- čas smrti med študijo ali preživetje živali do zaključka,

- opis strupenih ali drugih učinkov,

- čas opazovanja vsakega znaka abnormalnosti in njegov nadaljnji potek,

- podatki o hrani in telesni masi,

- oftalmološke ugotovitve,

- opravljeni hematološki preskusi in vsi rezultati,

- opravljeni klinično biokemijski preskusi in vsi rezultati (vključno z rezultati vsake analize urina),

- ugotovitve nekropsije,

- podroben opis vseh histopatoloških ugotovitev,

- statistična obdelava rezultatov, kadar je to ustrezno,

- obravnava rezultatov,

- razlaga rezultatov.

3.2 Ocena in razlaga

Glej Splošni uvod dela B.

4. VIRI

Glej Splošni uvod dela B.

PRESKUS RAKOTVORNOSTI

1. METODA

1.1 Uvod

Glej Splošni uvod dela B.

1.2 Opredelitev pojmov

Glej Splošni uvod dela B.

1.3 Referenčne snovi

Jih ni.

1.4 Princip preskusne metode

Preskusna snov se običajno daje sedem dni na teden na ustrezen način nekaj skupinam preskusnih živali, in sicer po en odmerek na skupino večji del življenjske dobe živali. Med in po izpostavljenosti preskusni snovi se živali opazujejo dnevno, da bi se odkrilo znake strupenosti, zlasti razvoj tumorjev.

1.5 Merila kakovosti

Jih ni.

1.6 Opis preskusne metode

Živali se vzdržujejo v preskusnih nastanitvenih in prehranjevalnih pogojih najmanj pet dni pred preskusom. Pred preskusom se naključno izberejo zdrave mlade živali in se razporedijo v preskusne ter kontrolne skupine.

Preskusne živali

Na podlagi rezultatov predhodno opravljenih študij je mogoče uporabiti tudi druge vrste (glodalce ali neglodalce). Uporabiti je treba splošno uporabljene laboratorijske seve mladih zdravih živali, dajanje odmerkov pa naj se začne čim prej, potem ko se žival odstavi od sesanja.

Na začetku študije nihanje v teži uporabljenih živali ne sme presegati ± 20 % srednje vrednosti. Kadar se subkronična oralna študija izvaja kot predhodnica dolgodobni študiji, je treba v obeh študijah uporabiti isto vrsto/pasmo in sev.

Število in spol

Pri glodalcih je treba za vsako velikost odmerka in sočasno kontrolno skupino uporabiti najmanj 100 živali (50 samic in 50 samcev). Samice naj bodo nuliparne in nebreje. Če so načrtovana vmesna žrtvovanja, je treba število povečati za število živali, ki naj bi bile žrtvovane še pred zaključkom študije.

Velikosti odmerkov in pogostost izpostavljenosti

Uporabiti je treba najmanj tri velikosti odmerkov poleg sočasne kontrolne skupine. Najvišja velikost odmerka bi morala sprožiti znake minimalne strupenosti, kot je rahel zastoj pri pridobivanju telesne mase (manj kot 10 %), ne da bi se pri tem bistveno spremenila normalna življenjska doba zaradi drugih učinkov, razen tumorjev.

Najnižja velikost odmerka ne sme vplivati na normalno rast, razvoj in življenjsko dobo živali ali povzročiti kakršne koli znake strupenosti. Na splošno ta ne sme biti nižja od 10 % visokega odmerka.

Srednje velik odmerek ali odmerke je treba določiti na sredini med visokimi in nizkimi odmerki.

Pri izbiranju velikosti odmerka je treba upoštevati podatke iz predhodnih preskusov in študij strupenosti.

Pogostost izpostavljenosti je običajno dnevna. Če se kemikalija daje v pitni vodi ali vmeša v hrano, mora biti ta ves čas na voljo.

Kontrole

Uporabiti je treba sočasno kontrolno skupino, ki je v vseh ozirih identična preskusnim skupinam, razen glede izpostavljenosti preskusni snovi.

V posebnih okoliščinah, kot so inhalacijske študije z aerosoli ali uporaba emulgatorjev v oralnih študijah, katerih biološka aktivnost ni znana, je treba uporabiti dodatno kontrolno skupino, ki ni izpostavljena nosilcu.

Način dajanja

Trije glavni načini dajanja so oralni, dermalni in inhalacijski. Izbira načina dajanja je odvisna od fizikalnih in kemijskih lastnosti preskusne snovi in verjetnega načina izpostavljenosti pri ljudeh.

Oralne študije

Kadar se preskusna snov absorbira iz prebavnega trakta in če je zaužitje eden od možnih načinov izpostavljenosti ljudi, ima, razen v primeru kontraindikacij, prednost oralni način dajanja. Živali lahko preskusno snov sprejmejo s hrano, raztopljeno v pitni vodi ali v kapsuli.

Najprimerneje je dajati odmerke sedem dni na teden, saj se s petdnevnim dajanjem odmerkov na teden dopušča okrevanje ali odprava strupenosti v času, ko se odmerkov ne daje, to pa bi vplivalo na rezultat ter poznejšo oceno. Vendar pa na podlagi praktičnih ugotovitev velja, da je tudi petdnevno dajanje odmerkov na teden sprejemljivo.

Dermalne študije

Odločiti se je mogoče za izpostavljenost z barvanjem kože, s čimer se simulira glavni način izpostavljenosti človeka, kar služi kot modelni sistem za povzročitev kožnih lezij.

Inhalacijske študije

Ker inhalacijske študije povzročajo kompleksnejše tehnične težave kot drugi načini dajanja, so na tem mestu podane podrobnejše smernice v zvezi s tem načinom dajanja. Upoštevati je treba tudi to, da je lahko v posebnih primerih veljavna alternativa intratrahealna instilacija.

Dolgotrajne izpostavljenosti so običajno zasnovane po vzorcu predvidene izpostavljenosti ljudi, pri čemer se živali izpostavlja ali šest ur na dan po izenačitvi koncentracij v komori, in sicer pet dni na teden (izpostavljenost s prekinitvami), ali, ustrezno možni izpostavljenosti preko okolja, 22 do 24 ur na dan sedem dni na teden (stalna izpostavljenost), pri čemer je približno ena ura na dan približno ob istem času namenjena hranjenju živali in vzdrževanju komor. V obeh primerih so živali običajno izpostavljene nespremenljivim koncentracijam preskusne snovi.

Velika razlika med izpostavljenostjo s prekinitvami in stalno izpostavljenostjo je v tem, da ima prva 17- do 18-urno obdobje, v katerem lahko živali okrevajo od učinkov vsakodnevne izpostavljenosti, s celo daljšimi obdobji okrevanja med vikendi.

Izbira med izpostavljenostjo s prekinitvami in stalno izpostavljenostjo je odvisna od ciljev študije in izpostavljenosti ljudi, ki na bi se jo simuliralo. Vendar je treba upoštevati tudi nekatere tehnične težave. Na primer prednosti stalne izpostavljenosti pri simulaciji okoljskih pogojev lahko izniči potreba po napajanju in hranjenju med izpostavljenostjo in potreba po bolj zapletenih (in zanesljivih) tehnikah sproščanja aerosola in hlapov ter tehnikah spremljanja.

Komore za izpostavljanje

Živali je treba preskušati v komorah za inhalacijo, ki so oblikovane tako, da ohranijo dinamičen pretok zraka v količini najmanj 12 sprememb zraka na uro, s čimer se zagotovi ustrezna vsebnost kisika in enakomerno porazdeljeno ozračje izpostavljenosti. Kontrolne komore in komore za izpostavljanje morajo biti po strukturi in obliki identične, da se zagotovijo primerljivi pogoji izpostavljenosti, v vseh ozirih, razen glede izpostavljenosti preskusnim snovem. Na splošno se znotraj komore vzdržuje rahel negativen pritisk, da bi se preprečilo uhajanje preskusne snovi v okolico. Natrpanost s preskusnimi živalmi v komorah naj bo minimalna. Na splošno velja, da naj za zagotovitev stabilnosti ozračja v komori skupna količina preskusnih živali ne presega 5 % prostornine preskusne komore.

Meritve ali spremljanje naj zajema:

(i) Pretok zraka: stopnjo pretoka zraka skozi komoro je treba stalno spremljati;

(ii) Koncentracijo: med vsakodnevno izpostavljenostjo, naj preskusna snov ne odstopa za več kot ± 15 % od srednje vrednosti. Med celotno študijo naj bodo vsakodnevne koncentracije kolikor je mogoče nespremenljive.

(iii) Temperatura in vlažnost: pri glodalcih je treba temperaturo ohranjati na 22 ± 2 °C, vlažnost v komori pa med 30 % in 70 %, razen kadar se uporabi voda za suspendiranje preskusne snovi v ozračju komore. Najprimerneje je oboje stalno spremljati;

(iv) Meritve velikosti delcev: v ozračjih komor s tekočimi ali trdnimi aerosoli je treba določiti porazdelitev velikosti delcev. Delci aerosolov morajo biti take velikosti, da jih uporabljena preskusna žival lahko vdihne. Vzorce ozračij komor je treba vzeti v območju dihanja živali. Vzorec zraka mora predstavljati porazdelitev delcev, katerim so živali izpostavljene, in mora na gravimetrični podlagi predstavljati ves suspendiran aerosol, tudi kadar večina aerosola ni vdihljiva. Analizo velikosti delcev je treba opraviti pogosto v času razvijanja sproščanja koncentracij, da bi se zagotovila stabilnost aerosola, po potrebi pa tudi pozneje med izpostavljenostjo, da bi se ustrezno določila doslednost porazdelitve delcev, ki so jim živali izpostavljene.

Trajanje študije

Trajanje preskusa rakotvornosti zajema večji del normalne življenjske dobe živali. Preskus na miših in hrčkih naj se zaključi pri 18. mesecih, na podganah pa pri 24. mesecih; v primeru nekaterih živalskih sevov z daljšo življenjsko dobo in/ali nižjo spontano stopnjo tumorjev, pa naj se preskus na miših in hrčkih zaključi pri 24. mesecih, na podganah pa pri 30. mesecih. Sprejemljivo je tudi, da se tako podaljšana študija zaključi, ko število preživelih živali v skupini z najnižjim odmerkom ali v kontrolni skupini doseže 25 %. Kadar se zaključi preskus, v katerem gre za očitno razliko v odzivu glede na spol, je treba vsak spol obravnavati posebej. Kadar zaradi očitnih znakov strupenosti pride do prezgodnje smrti samo v skupini z visokim odmerkom, to ne pomeni, da je treba preskus zaključiti, če pojav strupenosti v drugih skupinah ne povzroča težav. Da bi bil negativen rezultat sprejemljiv, v nobeni skupini ne sme priti do več kot 10 % izgube živali zaradi avtolize, kanibalizma ali težav z izvajanjem, in preživetje v vseh skupinah v 18. mesecu pri miših in hrčkih ter v 24. mesecu pri podganah ne sme biti manjše od 50 %.

Postopek

Opazovanja

Vsakodnevno opazovanje v kletkah naj vključuje spremembe na koži in krznu, v očeh in sluznicah, ter v dihalnem in krvožilnem sistemu, avtonomnem in osrednjem živčnem sistemu, somatomotorični aktivnosti ter vedenjskem vzorcu.

Redno opazovanje živali je potrebno za zagotovitev, da če je le mogoče med preskusom ne pride do izgube živali zaradi kanibalizma, avtolize tkiv ali napačne postavitve. Kadar se opazi umirajoče živali, jih je treba odstraniti in opraviti nekropsijo.

Za vse živali je treba zabeležiti klinične znake in smrtnost. Posebno pozornost je treba posvetiti razvoju tumorjev: zabeležiti je treba čas nastopa, mesto, velikosti, videz in napredovanje vseh makroskopsko vidnih ali otipljivih tumorjev.

Porabo hrane (in porabo vode, kadar se preskusna snov daje s pitno vodo) je treba v prvih 13 tednih študije meriti tedensko, potem pa približno v tri mesečnih časovnih presledkih, razen če spremembe zdravstvenega stanja ali telesne mase ne zahtevajo drugače.

Telesno maso vsake posamezne živali je treba v prvih 13. mesecih preskusnega obdobja zabeležiti enkrat tedensko, potem pa še najmanj enkrat na štiri tedne.

Klinični pregledi

Hematologija

Če opazovanja v kletkah kažejo na poslabšanje zdravja živali med študijo, je treba na obolelih živalih opraviti pregled diferencialne krvne slike.

V 12. mesecu, 18. mesecu in tik pred žrtvovanjem se živalim odvzame vzorec krvi. Pregled diferencialne krvne slike se opravi na vzorcih živali iz skupine z najvišjim odmerkom ter kontrolnih skupin. Če se na podlagi teh podatkov, zlasti tistih, pridobljenih tik pred žrtvovanjem, ali podatkov, dobljenih po patološkem pregledu, pokaže potreba, je treba opraviti pregled diferencialne krvne slike tudi na naslednji skupini ali skupinah z nižjim odmerkom.

Makroskopska nekropsija

Popolno makroskopsko nekropsijo je treba opraviti na vseh živalih, vključno s tistimi, ki so umrle med preskusom ali so bile žrtvovane potem, ko se je odkrilo, da so v umirajočem stanju. Vse velike vidne lezije, tumorje ali lezije, pri katerih gre za sum tumorja, je treba shraniti.

Naslednje