6.

Priloga VII se nadomesti z naslednjim: „PRILOGA VII DOLOČANJE ODSTOTNEGA DELEŽA 2-GLICERIL MONOPALMITATA 1. PREDMET UREJANJA IN PODROČJE UPORABE S to metodo je opisan analitski postopek za določevanje odstotnega deleža palmitinske kisline na položaju 2 v trigliceridih z ovrednotenjem 2-gliceril monopalmitata. To metodo uporabljamo za rastlinska olja, tekoča pri sobni temperaturi (20 °C). 2. PRINCIP Po pripravi pustimo, da na vzorec olja učinkuje pankreatična lipaza: poteče delna hidroliza, specifična za položaja 1 in 3 v molekuli triglicerida, ki povzroči nastanek 2-monoacilglicerolov. Odstotni delež 2-gliceril monopalmitata v monoacilglicerolni frakciji se po sililiranju določi s kapilarno plinsko kromatografijo. 3. APARATURE IN OBIČAJNA LABORATORIJSKA OPREMA 3.1 Erlenmajerica, 25 ml 3.2 Čaše 100, 250 in 300 ml 3.3 Steklena kromatografska kolona z notranjim premerom 21–23 mm, dolžine 400 mm, opremljena s sintrano stekleno ploščico in petelinčkom 3.4 Merilni valji prostornine 10, 50, 100 in 200 ml 3.5 Bučke prostornine 100 in 250 ml 3.6 Rotavapor 3.7 Epruvete za centrifugiranje prostornine 10 ml s koničnim dnom in obrušenim zamaškom 3.8 Centrifuga za epruvete prostornine 10 in 100 ml 3.9 Termostat, ki omogoča vzdrževanje temperature pri 40 °C ± 0,5 °C 3.10 Merilni pipeti prostornine 1 in 2 ml 3.11 Brizgalka prostornine 1 ml 3.12 Mikrobrizgalka prostornine 100 μl 3.13 Lij-ločnik, 1 000 ml 3.14 Plinski kromatograf za kapilarne kolone, opremljen z injicirnim sistemom za hladno injiciranje vzorca neposredno v kolono in pečjo, ki lahko vzdržuje izbrano temperaturo znotraj 1 °C 3.15 Injektor za hladno injiciranje vzorca neposredno v kolono 3.16 Plamensko ionizacijski detektor in elektrometer 3.17 Rekorder-integrator, kompatibilen z elektrometrom, z odzivnim časom, manjšim od 1 sekunde, in nastavljivo hitrostjo pomika papirja 3.18 Steklena ali kvarčna kapilarna kolona dolžine 8 do 12 m, z notranjim premerom 0,25 do 0,32 mm, pokrita z metilpolisiloksanom ali 5-odstotnim fenil metilpolisiloksanom, debeline 0,10–0,30 μm, ki jo je mogoče uporabiti pri 370 °C 3.19 Mikrobrizgalka prostornine 10 μl z nesnemljivo, vsaj 7,5 cm dolgo iglo, za neposredno vbrizganje na začetek kolone 4. REAGENTI 4.1 Silikagel z velikostjo delcev med 0,063 in 0,200 mm (70/280 mesh), pripravljen na naslednji način: silikagel damo v porcelansko posodico, ga pri 160 °C 4 ure sušimo v sušilniku, nato pa pustimo, da se na sobni temperaturi ohladi v eksikatorju. Nato dodamo količino vode, ki ustreza 5 % teže silikagela: v erlenmajerico prostornine 500 ml natehtamo 152 g silikagela in dodamo 8 g destilirane vode, zamašimo ter homogeniziramo. Pred uporabo pustimo mirovati vsaj 12 ur. 4.2 n-heksan (kromatografske čistoče) 4.3 Izopropanol 4.4 Izpropanol, vodna raztopina 1/1 (V/V) 4.5 Pankreatična lipaza. Aktivnost uporabljene lipaze mora biti med 2,0 in 10 lipaznimi enotami na mg (V prodaji so pankreatične lipaze z aktivnostjo med 2 in 10 enotami na mg encima.) 4.6 Pufrska raztopina tris-hidroksi-metilaminometana: 1 M vodna raztopina, ki ji s koncentrirano HCI (1/1 V/V) uravnamo pH na vrednost 8 (preverimo s pH-metrom) 4.7 Natrijev holat, encimske čistosti, 0,1-odstotna vodna raztopina (to raztopino je treba uporabiti v petnajstih dneh po pripravi) 4.8 Kalcijev klorid, 22-odstotna vodna raztopina 4.9 Dietil eter kromatografske čistoče 4.10 Elucijsko topilo: mešanica n-heksana/dietilnega etra (87/13) (V/V) 4.11 Natrijev hidroksid, 12-odstotna raztopina v masnih odstotkih 4.12 Fenolftalein, 1-odstotna raztopina v etanolu 4.13 Nosilni plin: vodik ali helij, za plinsko kromatografijo 4.14 Pomožna plina: vodik, najmanj 99-odstoten, brez vlage in organskih snovi, in zrak, za plinsko kromatografijo in enake čistoče 4.15 Regent za silaniziranje: mešanica piridina, heksametildisilazana, trimetilklorosilana v razmerju 9:3:1 (V/V/V) (V prodaji so raztopine, pripravljene za uporabo. Uporabimo lahko tudi druge reagente za silaniziranje, zlasti bis-trimetilsilil trifluoroacetamid + 1-odstoten trimetilklorosilan, razredčen z enako količino brezvodnega piridina.) 4.16 Referenčni vzorci: čisti monogliceridi ali mešanice monogliceridov, za katere je znano, da imajo podobno odstotkovno sestavo kot vzorec. 5. POSTOPEK 5.1 Priprava vzorca 5.1.1 Olj z deležem prostih kislin, manjšim od 3 %, pred kolonsko kromatografijo ni treba nevtralizirati s silikagelom. Olja, katerih delež prostih kislin je večji od 3 %, je treba nevtralizirati v skladu s točko 5.1.1.1. 5.1.1.1 V lij-ločnik prostornine 1 000 ml (3.13) vlijemo 50 g olja in 200 ml n-heksana. Dodamo 100 ml izopropanola in tako količino 12-odstotne raztopine natrijevega hidroksida (4.11), da ustreza deležu prostih kislin, povečanemu za 5 odstotkov. Eno minuto močno stresamo. Dodamo 100 ml destilirane vode, ponovno pretresemo in pustimo, da se usede. Po ločevanju odstranimo spodnjo plast, ki vsebuje mila. Odstranimo morebitne vmesne plasti (sluz in netopne snovi). Heksansko raztopino nevtraliziranega olja izpiramo z zaporednimi 50- do 60-mililitrskimi odmerki raztopine izopropanola in vode 1/1 (V/V) (4.4) tako dolgo, da je izpiralna faza nevtralna na fenolftalein. Večino heksana odstranimo z destilacijo v vakuumu (uporabimo na primer rotavapor) in olje prelijemo v 100-mililitrsko bučko (3.5). Olje sušimo v vakuumu, dokler se topilo v celoti ne odstrani. Po koncu tega postopka mora biti vsebnost kislin v olju manjša od 0,5 %. 5.1.2 V erlenmajerico prostornine 25 ml damo 1,0 g olja, pripravljenega po spodnjih navodilih (3.1), in ga raztopimo v 10 ml razvijalne mešanice (4.10). Pred kolonsko kromatografijo s silikagelom raztopino pustimo mirovati najmanj 15 minut. Če je raztopina motna, jo centrifugiramo, da zagotovimo optimalne pogoje za kromatografijo. (Uporabimo lahko komercialne 500-mg silikagelne kartuše SPE.) 5.1.3 Priprava kromatografske kolone V kolono (3.3) vlijemo približno 30 m razvijalnega topila (4.10), s stekleno paličko v spodnji del kolone vstavimo košček vate; stisnemo, da odstranimo zrak. V čaši pripravimo raztopino 25 g silikagela (4.1) v približno 80 ml razvijalne raztopine in jo z lijakom prelijemo v kolono. Preverimo, da smo v kolono dali ves silikagel; speremo z elucijskim topilom (4.10), odpremo petelinček in pustimo, da raven tekočine seže približno 2 mm nad zgornjo raven silikagela. 5.1.4 Kolonska kromatografija V erlenmajerico prostornine 25 ml (3.1.) natehtamo natanko 1,0 g vzorca, ki smo ga pripravili v skladu s točko 5.1. Vzorec raztopimo v 10 ml elucijskega topila (4.10). Raztopino prelijemo v kromatografsko kolono, ki smo jo pripravili v skladu s točko 5.1.3. Pazimo, da ne premešamo površine kolone. Odpremo ventil in pustimo raztopino vzorca odtekati, dokler ne doseže ravni silikagela. Eluiramo s 150 ml razvijalnega topila. Količino pretoka nastavimo na 2 ml/min (tako da 150 ml odteče v kolono v približno 60–70 minutah). Eluat zberemo v 250-mililitrsko bučko z znano maso. V vakuumu odparimo topilo in njegove zadnje sledi odstranimo s tokom dušika. Bučko stehtamo in izračunamo pridobljeni ekstrakt (Če uporabljamo silikagelne kartuše SPE, storimo naslednje: v kartuše, ki smo jih predhodno kondicionirali s 3 ml n-heksana, vlijemo 1 ml raztopine (5.1.2). Po filtraciji raztopine razvijemo s 4 ml n-heksana/dietilnega etra 9/1 (V/V). Eluat zberemo v 10-mililitrsko epruveto in ga z uvajanjem toka dušika odparimo do suhega. Na suhem preostanku pustimo učinkovati pankreatično lipazo (5.2). Ključno je, da pred in po uporabi kartuše SPE preverimo sestavo maščobnih kislin. 5.2 Hidroliza s pankreatično lipazo 5.2.1 V epruveto centrifuge natehtamo 0,1 g olja, pripravljenega v skladu s točko 5.1. Dodamo 2 ml pufrske raztopine (4.6), 0,5 ml raztopine natrijevega holata (4.7) in 0,2 ml raztopine kalcijevega klorida, pri čemer po vsakem dodajanju dobro pretresemo. Epruveto zapremo z obrušenim zamaškom in jo namestimo v termostat, naravnan na 40 ± 0,5 °C. 5.2.2 Dodamo 20 mg lipaze, previdno pretresemo (pazimo, da ne zmočimo zamaška) in damo epruveto za natanko 2 minuti v termostat, nato jo damo ven, jo natanko 1 minuto močno stresamo in pustimo, da se ohladi. 5.2.3 Dodamo 1 ml dietilnega etra, zamašimo in močno stresamo, nato centrifugiramo ter raztopino etra z mikrobrizgalko prenesemo v čisto in suho epruveto. 5.3 Priprava silaniziranih derivatov in plinska kromatografija 5.3.1 Z mikrobrizgalko prenesemo 100 μl raztopine (5.2.3) v epruveto prostornine 10 ml s koničastim dnom. 5.3.2 Topilo odstranimo z uvajanjem rahlega toka dušika, dodamo 200 μl reagenta za silaniziranje (4.15), zamašimo epruveto in pustimo mirovati 20 minut. 5.3.3 Po 20 minutah dodamo 1 do 5 ml n-heksana (odvisno od kromatografskih pogojev): raztopina, ki jo dobimo, je nared za plinsko kromatografijo. 5.4 Plinska kromatografija Pogoji za postopek so naslednji: — temperatura injektorja (injektor za vbrizgavanje v kolono) mora biti nižja od temperature vrelišča topila (68 °C), — temperatura detektorja: 350 °C, — temperatura kolone: programiranje temperature peči: 1 minuto pri 60 °C, s hitrostjo segrevanja 15 °C na minuto, dokler ne dosežemo temperature 180 °C, nato s hitrostjo 5 °C na minuto, dokler ne dosežemo temperature 340 °C, nato 13 minut pri 340 °C, — nosilni plin: vodik ali helij, nastavljen na ustrezno linearno hitrost, da dosežemo resolucijo, navedeno na Sliki 1. Retencijski čas triglicerida C54 mora biti 40 + 5 minut (glej Sliko 2); (Pogoji za spodaj navedene postopke so okvirni. Vsak izvajalec jih mora optimizirati, da doseže želeno resolucijo. Najmanjša višina vrha za 2-gliceril monopalmitat mora biti enaka 10 % polne skale rekorderja.), — količina injicirane snovi: 0,5-1 μl raztopine (5 ml) n-heksana (5.3.3). 5.4.1 Identifikacija vrhov Posamezne monoacilglicerole identificiramo na podlagi dobljenih retencijskih časov in glede na čase, dobljene za standardne mešanice monogliceridov, analizirane pri enakih pogojih. 5.4.2 Kvantitativna analiza Površina vsakega vrha se izračuna z elektronskim integratorjem. 6. PODAJANJE REZULTATOV Odstotek gliceril monopalmitata izračunamo iz razmerja med ustrezno površino vrha in vsoto površin vrhov vseh monoacilglicerolov (glej Sliko 2), in sicer na podlagi formule: gliceril monopalmitat (%): kjer je: Ax = površina vrha gliceril monopalmitata ΣA = vsota površin vseh vrhov monoacilglicerolov Rezultat je treba podati na eno decimalko natančno. 7. POROČILO O ANALIZI V poročilu o analizi je treba podrobno navesti: — sklicevanje na to metodo, — vse informacije, potrebne za popolno identifikacijo vzorca, — rezultat analize, — vsako odstopanje od te metode, ne glede na to, ali gre za odločitev zadevnih oseb ali zaradi kakega drugega razloga, — podrobne podatke o laboratoriju, datum analize in podpis njenih odgovornih oseb. Slika 1 Kromatogram proizvodov reakcije silaniziranja, dobljenih z delovanjem lipaze na rafiniranem oljčnem olju, ki mu je dodanih 20 % 100 % zaestrenega olja Slika 2 Kromatogram (A) nezaestrenega oljčnega olja po delovanju lipaze, in silaniziranega; pri teh pogojih (kapilarna kolona 8–12 m) frakcija voskov eluira hkrati s frakcijo diacilglicerolov ali malo zatem. Vsebnost triacilglicerolov po lipazi ne sme preseči 15 %. Kromatogram: (B) zaestrenega olja po delovanju lipaze; po silaniziranju; pri teh pogojih (kapilarna kolona 8–12 m) frakcija voskov eluira hkrati s frakcijo diglicerida ali malo zatem. Vsebnost trigliceridov po lipazi ne sme preseči 15 % 8. OPOMBE Opomba 1. PRIPRAVA LIPAZE Lipaze z zadostno aktivnostjo so komercialno dostopne. Lahko jih pripravimo tudi v laboratoriju, in sicer na naslednji način: 5 kg sveže prašičje trebušne slinavke ohladimo na 0 °C. Odstranimo okoliško trdo maščevje in vezno tkivo ter jo zmeljemo v mlinčku z rezili, da dobimo kašasto tekočino. To tekočino 4 do 6 ur mešamo z 2,5 litra brezvodnega acetona in nato centrifugiramo. Izvleček naredimo še trikrat z enako količino acetona, nato dvakrat z mešanico acetona/dietilnega etra (1/1) (V/V) in dvakrat z dietilnim etrom. Preostanek 48 ur sušimo v vakuumu, da dobimo stabilen prah, ki ga je treba dolgo časa hraniti v hladilniku in pred vlago. Opomba 2. PREVERJANJE AKTIVNOSTI LIPAZE Oljno emulzijo pripravimo na naslednji način: V mešalniku 10 minut mešamo mešanico 165 ml raztopine gumarabikuma (100 g/l), 15 g zdrobljenega ledu in 20 ml predhodno nevtraliziranega oljčnega olja. V čašo prostornine 50 ml zaporedoma damo 10 ml te emulzije, nato 0,3 ml raztopine natrijevega holata (0,2 g/ml) in 20 ml destilirane vode. Čašo damo v termostat, naravnan na 37 °C; namestimo elektrode pH metra in spiralni mešalnik. Z bireto po kapljicah dodajamo raztopino natrijevega hidroksida 0,1 N, dokler ne dobimo pH vrednosti 8,3. Dodamo ustrezno količino v vodi raztopljene lipaze v prahu (0,1 g/ml lipaze). Takoj ko pH meter pokaže pH 8,3, sprožimo štoparico in po kapljah dodajamo raztopino natrijevega hidroksida, in sicer s tako hitrostjo, da ohranimo pH vrednost 8,3. Vsako minuto odčitamo volumen porabljene raztopine. Podatke zabeležimo v sistem koordinatnih osi, in sicer odčitke časa navedemo kot absciso, kot ordinato pa ml alkalne raztopine 0,1 N, ki smo jih porabili za ohranitev konstantnega pH. Dobiti moramo linearen graf. Aktivnost lipaze, izmerjena v lipaznih enotah na mg, je izražena z naslednjo formulo: kjer je: A aktivnost v lipaznih enotah/mg V število ml raztopine natrijevega hidroksida 0,1 N na minuto (izračunano iz grafa) N normalnost raztopine natrijevega hidroksida m masa vzorca lipaze v mg. Lipazna enota je opredeljena kot količina encima, ki sprosti 10 mikro-ekvivalentov kisline na minuto.“;