Dodajo se naslednje priloge:

„

Dodatek

METODA ZA ZAZNAVANJE KRAVJEGA MLEKA IN KAZEINATA V SIRIH IZ OVČJEGA, KOZJEGA ALI BIVOLIČJEGA MLEKA ALI MEŠANIC OVČJEGA, KOZJEGA IN BIVOLIČJEGA MLEKA

1. NAMEN

Zaznavanje kravjega mleka in kazeinata v sirih iz ovčjega, kozjega in bivoličjega mleka ali mešanic ovčjega, kozjega in bivoličjega mleka z izoelektričnim fokusiranjem γ-kazeinov po plazminolizi.

2. PODROČJE UPORABE

Ta metoda je primerna za občutljivo, specifično zaznavanje surovega in toplotno obdelanega kravjega mleka in kazeinata v svežih in zorenih sirih iz ovčjega, kozjega in bivoličjega mleka ter iz mešanic ovčjega, kozjega in bivoličjega mleka. Ni pa primerna za zaznavanje mlečnih ali sirnih ponaredkov s toplotno obdelanimi proteinskimi koncentrati govejega sirila.

3. PRINCIP METODE

3.1 Izolacija kazeinov iz sira in referenčni standardi

3.2 Raztopitev izoliranih kazeinov in izpostavitev v plazminsko cepitev (EC.3.4.21.7)

3.3 Izoelektrično fokusiranje plazminsko obdelanih kazeinov v prisotnosti sečnine in obarvanje proteinov

3.4 Ocenjevanje obarvanih γ3 in γ2-kazeinskih profilov (dokaz kravjega mleka) s primerjavo primerka, pridobljenega iz vzorca, s primerki, pridobljenimi v istem gelu iz referenčnih standardov, ki vsebujejo 0 % in 1 % kravjega mleka.

4. REAGENTI

Razen če ni določeno drugače, se uporabijo analitsko čiste kemikalije. Voda je dvakrat destilirana ali enakovredne čistosti.

Opomba: Naslednje podrobnosti veljajo za laboratorijsko pripravljene poliakrilamidne gele v velikosti 265 × 125 × 0,25 mm, ki vsebujejo sečnino. Če so uporabljene druge velikosti in vrste gelov, se lahko pogoji ločitve prilagodijo.

Izoelektrično fokusiranje

4.1 Reagenti za izdelavo poliakrilamidnih gelov z vsebnostjo sečnine

4.1.1 Osnovna gelska raztopina

V vodi raztopite:

4,85 g akrilamida,

0,15 g N, N′-metilen-bis-akrilamida (BIS),

48,05 g sečnine,

15,00 g glicerola (87 % w/w)

in dopolnite do 100 ml ter raztopino shranite v rjavi steklenici v hladilniku.

Opomba: Namesto navedenih določenih količin nevrotoksičnih akrilamidov se lahko uporabi tudi komercialo dostopna mešanica akrilamidne/BIS raztopine. Če taka raztopina vsebuje 30 % w/v akrilamida in 0,8 % w/v BIS, se namesto navedenih količin za pripravek vzame 16,2 ml. Rok uporabnosti raztopine je največ 10 dni. Če je njena prevodnost več kot 5 μS, raztopino deionizirajte z mešanjem 2 g amberlita MB-3 30 minut, nato filtrirajte skozi membrano 0,45 μm.

4.1.2 Gelska raztopina

Gelsko raztopino pripravite z mešanjem dodatkov, amfolitov (*) in gelske raztopine iz zaloge (glej 4.1.1).

9,0 ml osnovne gelske raztopine,

24 mg β-alanina,

500 μl amfolita pH 3,5–9,5,

250 μl amfolita pH 5-7,

250 μl amfolita pH 6-8.

Zmešajte gelsko raztopino in jo dve do tri minute razplinjajte v ultrazvočni kopeli ali vakuumu.

Opomba: Gelsko raztopino pripravite, tik preden jo nalijete (glej 6.2).

4.1.3 Katalizatorske raztopine

4.1.3.1 N, N, N′ N′ – tetrametiletilendiamin (Temed)

4.1.3.2 40 % w/v amonijev persulfat (PER):

Raztopite 800 mg PER v vodi in dopolnite do 2 ml.

Opomba: Vedno uporabite sveže pripravljeno raztopino PER.

4.2 Kontaktna tekočina

Kerozen ali tekoči parafin.

4.3 Anodna raztopina

Raztopite 5,77 g fosforjeve kisline (85 % w/w) v vodi in dopolnite do 100 ml.

4.4 Katodna raztopina

Raztopite 2,00 g natrijevega hidroksida v vodi in dopolnite do 100 ml.

Priprava vzorca

4.5 Reagent za izolacijo proteinov

4.5.1 Razredčena ocetna kislina (25,0 ml ledocetne kisline dopolnite z vodo do 100 ml).

4.5.2 Diklorometan

4.5.3 Aceton

4.6 Pufer za raztapljanje proteinov

V vodi raztopite

5,75 g glicerola (87 % w/w),

24,03 g sečnine,

250 mg ditiotreitola

in dopolnite do 50 ml.

Opomba: Hranite v hladilniku; najdaljši rok uporabnosti je en teden.

4.7 Reagenti za plazminsko cepitev kazeinov

4.7.1 Pufer amonijevega hidrogenkarbonata

Titrirajte 0,2 mol/l raztopine amonijevega hidrogenkarbonata (1,58 g/100 ml vode), ki vsebuje 0,05 mol/l etilendiamintetraocetne kisline (EDTA, 1,46 g/100 ml) z 0,2 mol/l raztopine amonijevega karbonata (1,92 g/100 ml vode), ki vsebuje 0,05 mol/l EDTA do pH 8.

4.7.2 Goveji plazmin (EC. 3.4.21.7) z aktivnostjo najmanj 5 U/ml.

4.7.3 Raztopina ε-aminokapronske kisline za inhibiranje encimov.

Raztopite 2,624 g ε-aminokapronske kisline (6-amino-n-heksanojske kisline) v 100 ml 40 % (v/v) etanola.

4.8 Standardi

4.8.1 Certificirani referenčni standardi mešanice sesirjenega posnetega ovčjega in kozjega mleka, ki vsebuje 0 % in 1 % kravjega mleka, so na voljo na Inštitutu za referenčne materiale in meritve Komisije, 2440 Geel, Belgija.

4.8.2 Priprava laboratorijskih delovnih standardov sesirjenega bivoličjega mleka, ki vsebuje 0 % in 1 % kravjega mleka.

Posneto mleko se pripravi z 20-minutnim centrifugiranjem vzorca surovega bivoličjega mleka ali mleka goveda pri 37 °C in 2 500 g. Po hitri ohladitvi epruvete in vsebine na 6 do 8 °C se popolnoma odstrani zgornja plast maščobe. Za pripravo 1 % standarda v litrski čaši k 495 ml posnetega bivoličjega mleka dodajte 5,00 ml posnetega mleka goveda, uravnajte pH na 6,4 z dodajanjem razredčene mlečne kisline (10 % w/v). Nastavite temperaturo na 35 °C in dodajte 100 μl telečjega sirila (aktivnost sirila je 1: 10 000, pribl. 3 000 U/ml), mešajte eno minuto in nato čašo pustite eno uro pokrito z aluminijasto folijo pri 35 °C, da se naredi sirna gruda. Ko se je naredila sirna gruda, se celotno sesirjeno mleko posuši z zmrzovanjem (freeze-dry) brez predhodne homogenizacije ali odcejanja sirotke. Po tem postopku sirno grudo fino zmeljite, da dobite homogen prah. Za pripravo 0 % standarda uporabite isti postopek z naravnim posnetim bivoličjim mlekom. Standard se shrani pri – 20 °C.

Opomba: Pred pripravo standardov je priporočljivo, da se preveri čistost bivoličjega mleka z izoelektričnim fokusiranjem plazminsko obdelanih kazeinov.

Reagenti za obarvanje proteinov

4.9 Fiksir

Raztopite 150 g trikloroocetne kisline v vodi in dopolnite do 1 000 ml.

4.10 Raztopina za razbarvanje

500 ml metanola in 200 ml ledocetne kisline razredčite z destilirano vodo do 2 000 ml.

Opomba: Vsak dan pripravite svežo raztopino za razbarvanje. Lahko jo pripravite z mešanjem enakih prostornin osnovnih raztopin 50 % (v/v) metanola in 20 % (v/v) ocetne kisline.

4.11 Raztopine za obarvanje

4.11.1 Raztopina za obarvanje (osnovna raztopina 1)

Raztopite 3,0 g Coomassie Brillant Blue G-250 (C.I. 42655) v 1 000 ml 90 % (v/v) metanola z magnetnim mešalom (približno 45 minut), filtrirajte skozi dva srednje hitra nagubana filtra.

4.11.2 Raztopina za obarvanje (osnovna raztopina 2)

Raztopite 5,0 g bakrovega sulfata pentahidrata v 1 000 ml 20 % (v/v) ocetne kisline.

4.11.3 Raztopina za obarvanje (delovna raztopina)

Tik pred obarvanjem zmešajte skupaj 125 ml vsake osnovne raztopine (4.11.1, 4.11.2).

Opomba: Raztopino za obarvanje je treba pripraviti na dan uporabe.

5. OPREMA

5.1 Steklene ploščice (265 × 125 × 4 mm); valjček iz gume (širine 15 cm); nivelirna miza

5.2 Nosilna folija za gel (265 × 125 mm)

5.3 Pokrivna folija (280 × 125 mm). Na vsak dolgi rob zalepite trak lepilnega traku (280 × 6 × 0,25 mm) (glej sliko 1)

5.4 Elektrofokusirna komora s hladilno ploščo (npr. 265 × 125 mm) in ustrezen vir energije (≥ 2,5 kV) ali avtomatska elektroforezna naprava

5.5 Cirkulacijski kriostat, termostatsko nadzorovan na 12 ± 0,5 °C

5.6 Centrifuga, nastavljiva do 3 000 g

5.7 Elektrodni trakovi (≥ 265 mm dolgi)

5.8 Plastične kapalke za anodne in katodne raztopine

5.9 Trakovi za nanos vzorca (10 × 5 mm, iz viskoze ali nizkoadsorpcijski filtrirni papir)

5.10 Posode iz nerjavnega jekla ali steklene posode za obarvanje in razbarvanje (npr. pladnji za instrumente 280 × 150 mm)

5.12 Prilagodljiv palični homogenizator (premer osi 10 mm), v razponu od 8 000 do 20 000 vrtljajev/minuto

5.13 Magnetni mešalnik

5.14 Ultrazvočna kopel

5.15 Varilnik folije

5.16 Mikropipete s prostornino 25 μl

5.17 Vakuumski koncentrator ali – zamrzovalni sušilnik

5.18 Termostatsko nadzorovana vodna kopel, prilagodljiva na 35 in 40 ± 1 °C, z mešalnikom

5.19 Denzitometer za odčitavanje pri λ = 634 nm

6. POSTOPEK

6.1 Priprava vzorca

6.1.1 Izolacija kazeinov

Stehtajte količino, enakovredno 5 g suhe mase sira ali referenčnih standardov v 100-mililitrski epruveti za centrifugiranje, dodajte 60 ml destilirane vode in homogenizirajte s paličnim homogenizatorjem (8 000 do 10 000 vrt./min). Uravnajte na pH 4,6 z razredčeno ocetno kislino (4.5.1) in centrifugirajte (5 minut, 3 000 g). Odlijte maščobo in sirotko, homogenizirajte ostanek pri 20 000 vrt./min v 40 ml destilirane vode s pH 4,5, dobljenim z razredčeno ocetno kislino (4.5.1); dodajte 20 ml diklorometana (4.5.2), znova homogenizirajte in centrifugirajte (5 minut, 3 000 g). Z lopatico odstranite kazeinsko plast, ki leži med vodno in organsko fazo (glej sliko 2), in odlijte obe fazi. Znova homogenizirajte kazein v 40 ml destilirane vode (glej zgoraj) in 20 ml diklorometana (4.5.2) in centrifugirajte. Nadaljujte postopek (dva- do trikrat), dokler obe ekstrakcijski fazi ne postaneta brezbarvni. Homogenizirajte proteinski preostanek s 50 ml acetona (4.5.3) in filtrirajte prek srednje hitrega nagubanega filtrirnega papirja. Ostanek na filtru vsakič sperite z dvema ločenima 25-mililitrskima odmerkoma acetona in pustite, da se posuši na zraku ali v toku dušika, nato ga v terilnici zdrobite v fin prah.

Opomba: Izoliran suh kazein je treba hraniti pri – 20 °C.

6.1.2 Plazminsko cepljenje β-kazeinov za okrepitev γ-kazeinov

Disperzirajte 25 mg izoliranih kazeinov (6.1.1) v 0,5 ml pufra amonijevega karbonata (4.7.1) in 20 minut homogenizirajte, npr. z uporabo ultrazvočnega postopka. Ogrejte na 40 °C in dodajte 10 μl plazmina (4.7.2), zmešajte in eno uro inkubirajte pri 40 °C z neprestanim tresenjem. Za inhibicijo encima dodajte 20 μl raztopine ε-aminokapronske kisline (4.7.3), nato dodajte 200 mg sečnine v trdi obliki in 2 ml ditiotreitola.

Opomba: Da bi dobili več simetrije v fokusiranih kazeinskih trakovih, je priporočljivo, da raztopino sušite z zmrzovanjem, potem ko ste dodali ε-aminokapronsko kislino, in nato raztopite preostanek v 0,5 ml pufra za raztapljanje proteinov (4.6).

6.2 Priprava sečnine, ki vsebuje poliakrilamidne gele

Z nekaj kapljicami vode povaljajte nosilno folijo za gel (5.2) po stekleni plošči (5.1), odstranite vso odvečno vodo s papirnato brisačo ali tkanino. Na enak način povaljajte pokrivno folijo (5.3) z distančniki (0,25 mm) po drugi stekleni plošči. Položite ploščo vodoravno na nivelirno mizo.

Dodajte 10 μl Temeda (4.1.3.1) v pripravljeno in razplinjeno gelsko raztopino (4.1.2), pomešajte in dodajte 10 μl raztopine PER (4.1.3.2), dobro premešajte in takoj enakomerno nalijte na sredino pokrivne folije. En rob nosilne plošče gela (folija naj bo obrnjena navzdol) položite na pokrivno folijo in jo počasi spuščajte, tako da se med folijami naredi film gela in se enakomerno ter brez mehurčkov razširi (slika 3). Pazljivo do konca spustite nosilno ploščo gela s tanko lopatico in nanjo položite še tri steklene plošče, ki bodo namenjene za uteži. Potem ko je polimerizacija končana (po približno 60 minutah), premestite polimerizirani gel na nosilno folijo skupaj s pokrivno folijo, tako da rahlo udarite po steklenih ploščah. Skrbno očistite hrbtno stran nosilne folije ostankov gela in sečnine. Zavarite gelov sendvič v filmski tulec in shranite v hladilnik (največ šest tednov).

Opomba: Pokrivna folija z distančniki se lahko uporabi znova. Poliakrilamidni gel se lahko razreže v manjše kose, kar je priporočljivo zlasti, kadar je vzorcev malo ali če uporabljate avtomatsko elektroforezno napravo (dva gela, velikost 4,5 × 5 cm).

6.3 Izoelektrično fokusiranje

Nastavite termostat za hlajenje na 12 °C. S kerozinom zbrišite hrbtno stran nosilne folije in kapnite nekaj kapljic kerozina (4.2) na sredo hladilnega bloka. Nato po njem povaljajte gelov sendvič z nosilno stranjo navzdol in pazite, da ne nastanejo mehurčki. Obrišite ves odvečni kerozin in odstranite pokrivno folijo. Prepojite elektrodna trakova z elektrodnima raztopinama (4.3, 4.4), odrežite ju v dolžini gela in postavite v pripravljene položaje (razdalja elektrod 9,5 cm).

Pogoji za izoelektrično fokusiranje:

6.3.1 Velikost gela 265 × 125 × 0,25 mm

Korak Čas (min) Napetost (V) Tok (mA) Moč (W) Volt ure (Vh) 1. Predhodno fokusiranje 30 največ 2 500 največ 15 konstan. 4 pribl. 300 2. Vzorčno fokusiranje (7) 60 največ 2 500 največ 15 konstan. 4 pribl. 1 000 3. Končno fokusiranje 60 največ 2 500 največ 5 največ 20 pribl. 3 000 40 največ 2 500 največ 6 največ 20 pribl. 3 000 30 največ 2 500 največ 7 največ 25 pribl. 3 000

Opomba: Če sta debelina ali širina gela spremenjeni, se morata ustrezno prilagoditi vrednosti za tok in moč (npr. podvojite vrednosti za električni tok in moč, če se uporabi gel 265 × 125 × 0,5 mm).

6.3.2 Primer programa napetosti za avtomatsko elektroforezno napravo (2 gela 5,0 × 4,5 cm), elektrodi brez trakov, ki se neposredno naneseta na gel

Korak Napetost Tok Moč Začasna Volt ure 1. Predhodno fokusiranje 1 000 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 85 Vh 2. Vzorčno fokusiranje 250 V 5,0 mA 2,5 W 8 °C 30 Vh 3. Fokusiranje 1 200 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 80 Vh 4. Fokusiranje 1 500 V 5,0 mA 7,0 W 8 °C 570 Vh

V koraku 2 postavite trak za nanos vzorca na 0 Vh.

V koraku 2 odstranite trak za nanos vzorca pri 30 Vh.

6.4 Proteinsko obarvanje

6.4.1 Proteinsko fiksiranje

Po izključitvi elektrike takoj odstranite elektrodna trakova in dajte gel v posodo za obarvanje/razbarvanje, napolnjeno z 200 ml fiksirja (4.9); pustite 15 minut in neprestano stresajte.

6.4.2 Umivanje in obarvanje gelske plošče

Temeljito odtočite fiksir in dvakrat vsakič po 30 sekund spirajte gelsko ploščo s 100 ml raztopine za razbarvanje (4.10). Odlijte raztopino za razbarvanje in dopolnite posodo z 250 ml raztopine za obarvanje (4.11.3); počakajte 45 minut in z rahlim tresenjem omogočite, da se obarva.

6.4.3 Razbarvanje gelske plošče

Odlijte raztopino za obarvanje, dvakrat sperite gelsko ploščo, pri čemer vsakič uporabite 100 ml raztopine za razbarvanje (4.10), nato 15 minut tresite z 200 ml raztopine za razbarvanje in najmanj dvakrat ali trikrat ponovite korak razbarvanja, dokler ozadje ne postane čisto in brezbarvno. Nato splaknite gelsko ploščo z destilirano vodo (2 × 2 minuti) in sušite na zraku (2 do 3 ure) ali s sušilnikom za lase (10–15 minut).

Opomba 1: Fiksiranje, pomivanje, obarvanje in razbarvanje opravite pri temperaturi 20 °C. Ne uporabljajte visokih temperatur.

Opomba 2: Če raje uporabljate bolj občutljivo obarvanje s srebrom (npr. oprema za obarvanje s srebrom, protein, Pharmacia Biotech, št. kode 17–1150–01), morate plazminsko obdelane kazeinske vzorce razredčiti do 5 mg/ml.

7. OCENJEVANJE

Ocenjevanje se izvaja s primerjavo proteinskih profilov neznanega vzorca z referenčnimi standardi na istem gelu. Zaznavanje kravjega mleka v sirih iz ovčjega, kozjega in bivoličjega mleka in mešanic ovčjega, kozjega in bivoličjega mleka se izvaja prek y3- in y2-kazeinov, katerih izoelektrične točke so v razponu med pH 6,5 in pH 7,5 (slike 4a, 4b in 5). Meja zaznavnosti je manj kot 0,5 %.

7.1 Vizualna ocena

Za vizualno ocenitev količine mleka goveda je priporočljivo, da se koncentracije vzorcev in standardov prilagodijo za pridobitev iste stopnje intenzitete ovčjih, kozjih in/ali bivoličjih γ2- in γ3-kazeinov (glej „γ2 E,G,B“ in „γ3 E,G,B“ na slikah 4a, 4b in 5). Po tem se lahko neposredno presodi količina mleka goveda (manj kot, enako ali več kot 1 %) v neznanem vzorcu s primerjavo intenzitete kravjih γ3- in γ2-kazeinov (glej „γ3 C“ in „γ2 C“ na slikah 4a, 4b in 5) s tistimi od 0 % in 1 % referenčnih standardov (ovca, koza) ali laboratorijskimi vmesnimi standardi (bivolica).

7.2 Denzitometrijska ocena

Za določitev razmerja površin pod vrhovi za goveja, ovčja, kozja in/ali bivoličja kazeina γ2 in γ3 (glej sliko 5) uporabite denzitometrijo (5.19), če je na voljo. Primerjajte to vrednost z razmerjem površin pod vrhovi γ2- in γ3-kazeinov 1-odstotnega referenčnega standarda (ovca, koza) ali laboratorijskega vmesnega standarda (bivolica), analiziranega na istem gelu.

Opomba: Metoda deluje zadovoljivo, če se pokaže jasen pozitiven znak za goveja kazeina γ2 in γ3 v 1-odstotnem referenčnem standardu, vendar ne v 0-odstotnem referenčnem standardu. V nasprotnem primeru optimizirajte postopek tako, da natančno sledite podrobnostim metode.

Vzorec se šteje za pozitivnega, če sta oba goveja kazeina γ2 in γ3 ali ustrezajoče razmerje površin pod vrhovi enako ali večje, kot je stopnja 1-odstotnega referenčnega standarda.

8. VIRI

Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A. in Bocca A., „Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins“, Milchwissenschaft 45, 1990, str. 708–711.

Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A. in Del Giovine L., „A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting“, Milchwissenschaft 50, 1995, str. 83–85.

Krause I., Berner I. in Klostermeyer H., „Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte – and carrier ampholyte/immobilized pH gradient – isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier“, v: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ur.), Bode-Verlag, München, 1989, str. 389–393.

Krause Ι., Belitz H.–D. in Kaiser K.–P., „Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen“, Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 1982, str. 195–199.

Radola, B. J., „Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50–100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films“, Electrophoresis 1, 1980, str. 43–56.

Slika 1

Shematska risba pokrivne folije

Slika 2

Kazeinska plast, ki po centrifugiranju plava med vodno in organsko fazo

Slika 3

Poklopna tehnika za ulivanje zelo tankih poliakrilamidnih gelov

a = lepilni trak na distančniku (0,25 mm); b = pokrivna folija (5.3); c, e = stekleni plošči (5.1); d = gelska raztopina (4.1.2); f = nosilna folija gela (5.2)

Slika 4a

Izoelektrično fokusiranje plazminsko obdelanih kazeinov iz ovčjega in kozjega sira, ki vsebuje različne količine kravjega mleka

% CM = odstotek kravjega mleka, C = krava, E = ovca, G = koza

Prikazan je zgornji del gela izoelektričnega fokusiranja (IEF)

Slika 4b

Izoelektrično fokusiranje plazminsko obdelanih kazeinov iz sira, narejenega iz mešanic ovčjega, kozjega in bivoličjega mleka z vsebnostjo različnih količin kravjega mleka

% CM = odstotek kravjega mleka; 1+ = vzorec vsebuje 1 % kravjega mleka, v sredini sledi pa ima dodatek čistega govejega kazeina. C = krava, E = ovca, G = koza, B = bivol

Prikazana je skupna razdalja separacije za gel IEF.

Slika 5

Superpozicija denzitogramov standardnih vzorcev (SDT) in vzorcev sira, narejenega iz mešanice ovčjega, kozjega in bivoljega mleka po izometričnem fokusiranju

a, b = standardi, ki vsebujejo 0 in 1 % kravjega mleka; c–g = vzorci sirov, ki vsebujejo 0, 1, 2, 3 in 7 % kravjega mleka. C = krava, E = ovca, G = koza.

Zgornja polovica gela IEF je bila obdelana pri λ = 634 nm.