Odločba Komisije

z dne 21. februarja 2002

o spremembi Priloge D k Direktivi Sveta 90/426/EGS glede diagnostičnih testov za konjsko kugo

(notificirano pod dokumentarno številko K(2002) 556)

(Besedilo velja za EGP)

(2002/160/ES)

KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE –

ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske skupnosti,

ob upoštevanju Direktive Sveta 90/426/EGS z dne 26. junija 1990 o pogojih v zvezi z zdravstvenim varstvom živali, ki ureja gibanje in uvoz kopitarjev iz tretjih držav [1], kakor je bila nazadnje spremenjena z Odločbo 2001/298/ES [2], in zlasti člena 23 Direktive,

ob upoštevanju naslednjega:

(1) Priloga D k Direktivi 90/426/EGS opisuje test vezave komplementa, ki naj bi se uporabljal za diagnostiko konjske kuge.

(2) Novembra 2000 je referenčni laboratorij Skupnosti v Algetu v Španiji gostil letno srečanje nacionalnih referenčnih laboratorijev za konjsko kugo držav članic EU. Med tem srečanjem so bili predstavljeni znanstveni dokazi o resnih omejitvah testa vezave komplementa, ki je trenutno opisan v Prilogi D k Direktivi 90/426/EGS, predvsem ker je primeren samo za določanje protiteles v začetni fazi okužbe ali po cepljenju. Še več, test je v praksi zamenjan s sodobnimi testi ELISA, tako v skoraj vseh laboratorijih v Skupnosti kakor tudi v glavnih državah izvoznicah.

(3) Mednarodno sprejeti laboratorijski testi za odkrivanje protiteles proti konjski kugi so opisani v Priročniku standardov za diagnostične teste in cepiva [3] Office International des Epizootics (OIE); vendar pa najnovejša izdaja omenja samo enega od razpoložljivih testov ELISA.

(4) Zaradi tega se zdi primerno spremeniti Prilogo D k Direktivi 90/426/EGS, da se upoštevajo tehnični napredek in mednarodno sprejeti standardi.

(5) Ukrepi, predvideni s to odločbo, so v skladu z mnenjem Stalnega veterinarskega odbora –

SPREJELA NASLEDNJO ODLOČBO:

Člen 1

Priloga D k Direktivi 90/426/EGS se nadomesti s Prilogo k tej odločbi.

Člen 2

Ta odločba je naslovljena na države članice.

V Bruslju, 21. februarja 2002

Za Komisijo

David Byrne

Član Komisije

[1] UL L 224, 18.8.1990, str. 42.

[2] UL L 102, 12.4.2001, str. 63.

[3] Poglavje 2.1.11., četrta izdaja 2000.

--------------------------------------------------

PRILOGA

PRILOGA D

KONJSKA KUGA

DIAGNOSTIKA

Reagente za spodaj opisane encimskoimunske teste (ELISA) je mogoče dobiti v referenčnem laboratoriju Evropske unije ali Referenčnih laboratorijev OIE za konjsko kugo.

1. KOMPETITIVNI TEST ELISA ZA ODKRIVANJE PROTITELES PROTI VIRUSU KONJSKE KUGE (VKK) (PREDPISANI TEST)

Kompetitivni test ELISA se uporablja za odkrivanje specifičnih protiteles proti VKK v serumu katere koli vrste kopitarjev. Polispecifičen, poliklonski imunski anti-VKK serum buder (v nadaljevanju "budrin antiserum") je specifičen za serološko skupino in je z njim možno prepoznati vse znane serotipe virusa konjske kuge.

Princip testa je prekinitev reakcije med antigeni VKK in budrinim antiserumom z vzorcem preiskovanega seruma. Protitelesa proti VKK v preiskovanem serumu bodo tekmovala s tistimi iz budrinega antiseruma, kar bo posledično povzročilo manj intenzivno obarvanost od pričakovane (po dodatku z encimom označenih protiteles proti budrinim protitelesom in substrata). Serumi se lahko testirajo bodisi pri redčenju 1:5 (metoda točkovnega testa) ali pa se titrirajo (metoda titracije seruma) kjer se določijo končne točke razredčin. Vrednosti inhibicije, ki so večje kot 50 %, se lahko obravnavajo kot pozitivne.

Spodaj opisani testni protokol se uporablja v Regionalnem referenčnem laboratoriju za konjsko kugo v Pirbrightu, Združeno kraljestvo.

1.1 Postopek testa

1.1.1 Priprava plošč

1.1.1.1 V ELISA plošče nanesemo antigen VKK, ekstrahiran iz okuženih celičnih kultur in razredčen v karbonatnem/bikarbonatnem pufru, pH 9,6. ELISA plošče inkubiramo čez noč na 4 °C.

1.1.1.2 Plošče trikrat speremo s polnjenjem in praznjenjem vdolbinic s fosfatnim pufrom (PBS), pH 7,2 do 7,4, in osušimo s pivnanjem na vpojnem papirju.

1.1.2 Kontrolne vdolbinice

1.1.2.1 Pozitivne kontrolne serume titriramo v serijah dvakratnih redčenj, od 1:5 do 1:640, v stolpcu 1 v pufru za blokiranje (PBS z 0,05 % (volumski delež) Tween-20, 5,0 % (utežni delež) posnetega mleka v prahu (Cadbury’s Marvel™) in 1 % (volumski delež) govejega seruma), tako da dobimo končni volumen 50 μl/vdolbinico.

1.1.2.2 V vdolbinici A in B stolpca 2 dodamo 50 μl negativnega kontrolnega seruma v razredčini 1:5 (10 μl seruma + 40 μl pufra za blokiranje).

1.1.2.3 V vdolbinici C in D stolpca 2 (slepa kontrola) dodamo po 100 μl pufra za blokiranje.

1.1.2.4 V vdolbinice E, F, G in H stolpca 2 (budrina kontrola) dodamo po 50 μl pufra za blokiranje.

1.1.3 Metoda točkovnega testa

1.1.3.1 V po dve vdolbinici stolpcev 3 do 12 dodamo redčenje vsakega preiskovanega seruma v razmerju 1:5 v pufru za blokiranje (10 μl seruma + 40 μl pufra za blokiranje).

ali

1.1.4 Metoda titracije seruma

1.1.4.1 Pripravimo serije dvakratnih razredčin vsakega preiskovanega vzorca (1: 5 do 1: 640) v pufru za blokiranje preko osmih vdolbinic posameznega stolpca (3 do 12).

potem

1.1.5 V vse vdolbinice razen v vdolbinice slepe kontrole ELISA plošče dodamo 50 μl budrinega antiseruma, razredčenega v pufru za blokiranje, (vse vdolbinice sedaj vsebujejo končni volumen 100 μl).

1.1.5.1 Inkubiramo 1 uro pri 37 °C na rotacijskem tresalniku.

1.1.5.2 Plošče trikrat speremo in osušimo kot prej.

1.1.5.3 V vsako vdolbinico dodamo po 50 μl kunčjega anti-budrinega konjugata, označenega s hrenovo peroksidazo (HRP), redčenega v pufru za blokiranje.

1.1.5.4 Inkubiramo 1 uro pri 37 °C na rotacijskem tresalniku.

1.1.5.5 Plošče trikrat speremo in osušimo kot prej.

1.1.6 Kromogen

Pripravimo raztopino OPD (OPD = orto-fenildiamin) kromogena po navodilih proizvajalca (0,4 mg/ml v sterilni destilirani vodi) neposredno pred uporabo. Dodamo substrat (vodikov peroksid = H2O2), da dobimo končno koncentracijo 0,05 % (volumski delež) (redčenje 1:2000 30 % raztopine H2O2). Dodamo po 50 μl OPD raztopine v vsako vdolbinico in plošče za 10 minut pustimo na pultu pri temperaturi okolja. Reakcijo prekinemo z dodatkom 50 μl 1 M žveplene kisline (H2SO4)/vdolbinico.

1.1.7 Odčitavanje

Spektofotometrično odčitavamo pri valovni dolžini 492 nm.

1.2 Prikaz rezultatov

1.2.1 S pomočjo programskega paketa izpišemo vrednosti absorbance (A) in procent inhibicije (PI) za preiskovane in kontrolne serume na podlagi povprečne vrednosti budrinih kontrol, zabeleženih v štirih vdolbinicah. Podatki, prikazani kot A in PI vrednosti, se uporabijo za ugotavljanje, ali je uspešnost testa v dovoljenih mejah. Zgornje kontrolne meje (ZKM) in spodnje kontrolne meje (SKM) za budrino kontrolo so med vrednostmi A = 1,4 oziroma A = 0,4. Končni titer pozitivne kontrole na temelju 50 % PI bi moral biti pri redčenju 1:240 (v razponu od 1:120 do 1:480). Katera koli plošča, ki ne ustreza zgoraj navedenim kriterijem, mora biti zavržena. Vendar pa se lahko negativni vzorci sprejmejo, če je titer pozitivne kontrole večji kot 1:480 in so preiskovani vzorci še vedno negativni.

Dvojniki vdolbinic z negativno kontrolo seruma in dvojniki vdolbinic slepe kontrole bi morali doseči vrednost PI med + 25 % in – 25 % oziroma med + 95 % in + 105 %. Če vrednosti niso znotraj predpisanih mej, plošča ni neveljavna, da pa slutiti, da se razvija barva ozadja.

1.2.2 Diagnostični prag (mejna vrednost) preiskovanih serumov je 50 % (PI 50 %). Vzorci, ki imajo vrednosti PI večje od 50 %, se vrednotijo kot pozitivni. Vzorci, ki imajo vrednosti PI manjše od 50 %, se vrednotijo kot negativni.

Vzorci z vrednostmi PI nad in pod pragom v dvojnikih vdolbinic se obravnavajo za dvomljive. Takšne vzorce bi bilo treba ponovno testirati s točkovnim testom in s titracijo. Pozitivne vzorce se lahko tudi titrira, da se dobi stopnjo pozitivnosti.

Načrt točkovnega testa

– kont. = negativna kontrola

+ kont. = pozitivna kontrola

GP kont. = budrina kontrola

| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |

| + kont. | | Preiskovani serumi | Preiskovani serumi | Preiskovani serumi | Preiskovani serumi | Preiskovani serumi | Preiskovani serumi | Preiskovani serumi | Preiskovani serumi | Preiskovani serumi | Preiskovani serumi |

A | 1:5 | – kont. | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 |

B | 1:10 | – kont. | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 |

C | 1:20 | Slepa kont. | | | | | | | | | | |

D | 1:40 | Slepa kont. | | | | | | | | | | |

E | 1:80 | GP kont. | | | | | | | | | | |

F | 1:160 | GP kont. | | | | | | | | | | |

G | 1:320 | GP kont. | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

H | 1:640 | GP kont. | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

Načrt titracijskega testa

– kont. = negativna kontrola

+ kont. = pozitivna kontrola

GP kont. = budrina kontrola

| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |

| + kont. | | Preiskovani serumi | Preiskovani serumi | Preiskovani serumi | Preiskovani serumi | Preiskovani serumi | Preiskovani serumi | Preiskovani serumi | Preiskovani serumi | Preiskovani serumi | Preiskovani serumi |

A | 1:5 | – kont. | 1:5 | | | | | | | | | 1:5 |

B | 1:10 | – kont. | 1:10 | | | | | | | | | 1:10 |

C | 1:20 | Slepa kont. | 1:20 | | | | | | | | | 1:20 |

D | 1:40 | Slepa kont. | 1:40 | | | | | | | | | 1:40 |

E | 1:80 | GP kont. | 1:80 | | | | | | | | | 1:80 |

F | 1:160 | GP kont. | 1:160 | | | | | | | | | 1:160 |

G | 1:320 | GP kont. | 1:320 | | | | | | | | | 1:320 |

H | 1:640 | GP kont. | 1:640 | | | | | | | | | 1:640 |

2. INDIREKTNI TEST ELISA ZA ODKRIVANJE PROTITELES PROTI VIRUSU KONJSKE KUGE (VKK) (PREDPISANI TEST)

Spodaj opisani test je v skladu z opisom testa iz Poglavja 2.1.11 OIE Priročnika standardov za diagnostične teste in cepiva, četrta izdaja, 2000.

Rekombinantni VP7 protein se je uporabljal kot antigen za določanje protiteles proti VKK z visokim indeksom občutljivosti in specifičnosti. Drugi prednosti sta, da je stabilen in da ni kužen.

2.1 Postopek testa

2.1.1 Trdna faza

2.1.1.1 V ELISA plošče nanesemo rekombinantni VKK-4 VP7, razredčen v karbonatnem/bikarbonatnem pufru, pH 9,6. Plošče inkubiramo čez noč na 4 °C.

2.1.1.2 Plošče petkrat speremo z destilirano vodo, ki vsebuje 0,01 % (volumski delež) Tween 20 (spiralna raztopina). S ploščo nežno potolčemo po vpojenem materialu, da odstranimo ostanke spiralne tekočine.

2.1.1.3 Plošče blokiramo s fosfatnim pufrom (PBS) + 5 % (utežni delež) posnetega mleka v prahu (Nestlé Dry Skim Milk™), 200 μl/vdolbinico, za 1 uro na 37 °C.

2.1.1.4 Odstranimo pufer za blokiranje in nežno potolčemo s ploščo po vpojenem materialu.

2.1.2 Preiskovani vzorci

2.1.2.1 Serumski vzorci, pozitivni in negativni kontrolni serum se redčijo 1:25 v PBS + 5 % (utežni delež) posnetega mleka + 0,05 % (volumski delež) Tween 20, 100 μl na vdolbinico. Inkubiramo 1 uro na 37 °C.

Za titracijo pripravimo serije dvakratnih razredčin od 1:25 (100 μl/vdolbinico), en vzorec seruma na stolpec plošče, isto naredimo s pozitivnim in negativnim kontrolnim serumom. Inkubiramo 1 uro na 37 °C.

2.1.2.2 Plošče speremo, kot je opisano v koraku 2.1.1.2.

2.1.3 Konjugat

2.1.3.1 V vdolbinice dodamo po 100 μl anti-konjskih gama globulinov, označenih s hrenovo peroksidazo (HRP), razredčenih v PBS + 5 % mleka + 5 % Tween 20, pH 7,2. Inkubiramo 1 uro na 37 °C.

2.1.3.2 Plošče speremo, kot je opisano v koraku 2.1.1.2.

2.1.4 Kromogen/substrat

2.1.4.1 V vdolbinice dodamo po 200 μl raztopine kromogena/substrata (10 ml 80,6 mM DMAB (dimetil aminobezaldehid) + 10 ml 1,56 mM MBTH (3-metil-2-benzo-tiazolin hidrazon hidroklorid) + 5 μl H2O2)

Razvijanje barve se ustavi z dodatkom 50 μl 3N H2SO4 po približno 5 do 10 minutah (preden se začne barvati negativna kontrola).

Lahko se uporabijo tudi drugi kromogeni, kot so ABTS (2,2’-azino-bis-[3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kislina]), TMB (tetra-metil benzidin) ali OPD (orto-fenildiamin).

2.1.4.2 Plošče odčitamo pri 600 nm (ali 620 nm).

2.2 Interpretacija rezultatov

2.2.1 Izračunamo mejno vrednost, tako da vrednosti negativne kontrole dodamo 0,6 (0,6 je standardna deviacija, dobljena s skupino 30 negativnih serumov).

2.2.2 Preiskovani vzorci, ki dajo vrednosti absorbance nižje od mejne vrednosti, se smatrajo kot negativni.

2.2.3 Preiskovani vzorci, ki dajo vrednosti absorbance višje od mejne vrednosti + 0,15, se obravnavajo kot pozitivni.

2.2.4 Preiskovani vzorci, ki dajo vmesne vrednosti absorbance, so dvomljivi, tako da je potrebno za potrditev rezultata uporabiti drugo metodo.

3. BLOKING ELISA TEST ZA ODKRIVANJE PROTITELES PROTI VIRUSU KONJSKE KUGE (VKK) (PREDPISANI TEST)

Bloking test ELISA je namenjen odkrivanju specifičnih protiteles proti VKK v serumih katere koli dovzetne vrste. VP7 je glavni, antigeni, virusni protein VKK, in je ohranjen v devetih serotipih. Ker je monoklonsko protitelo (Mpt) prav tako usmerjeno proti VP7, ima test visoko občutljivost in specifičnost. Ob tem je rekombinantni VP7 antigen popolnoma neškodljiv in zato zagotavlja visoko stopnjo varnosti.

Princip testa je prekinitev reakcije med rekombinantnim VP7, antigenom, vezanim na ELISA ploščo, in markiranim Mpt, specifičnim za VP7. Protitelesa v preiskovanem serumu bodo preprečila reakcijo med antigenom in Mpt, kar bo povzročilo manjšo intenziteto obarvanja.

Spodaj opisani test se opravlja v Referenčnem laboratoriju Evropske Skupnosti za konjsko kugo v Algetu v Španiji.

3.1 Postopek testa

3.1.1 ELISA plošče

3.1.1.1 V ELISA plošče nanesemo rekombinantni VKK-4 VP7, razredčen v karbonatnem/bikarbonatnem pufru, pH 9,6. Inkubiramo čez noč na 4 °C.

3.1.1.2 Plošče petkrat speremo s fosfatnim pufrom (PBS), ki vsebuje 0,05 % (volumski delež) Tween 20 (PBST).

3.1.1.3 Ploščo stabiliziramo z obdelavo v stabilizacijski raztopini (da omogočimo daljše shranjevanje pri 4 °C brez izgube aktivnosti) in osušimo na vpojnem materialu.

3.1.2 Preiskovani vzorci in kontrole

Za pregled: | preiskovani serum in kontrole razredčimo 1: 10 neposredno na plošči v PBST, da dobimo končni volumen 100 µl/vdolbinico. Inkubiramo 1 uro pri 37 °C. |

Za titracijo: | pripravimo serijo dvakratnih razredčin preiskovanih serumov in pozitivne kontrole (100 µl/vdolbinico) od 1:10 do 1:1280 preko osmih vdolbinic. Negativna kontrola se testira pri redčenju 1: 10. |

3.1.2.1 3.1.2.2 3.1.3 Konjugat

V vsako vdolbinico dodamo po 50 μl razredčenih Mpt (monoklonska protitelesa, specifična za VP7), označenih s hrenovo peroksidazo (HRP) in nežno pomešamo, da zagotovimo homogenost. Inkubiramo 30 minut pri 37 °C.

3.1.4 Plošče petkrat speremo s PBST in osušimo s pivnanjem, kot je opisano zgoraj.

3.1.5 Kromogen/substrat

V vdolbinice dodamo po 100 μl raztopine kromogena/substrata (1 ml ABTS (2,2’-azino-bis-[3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kislina]) 5 mg/ml + 9 ml substratnega pufra (0,1 M fosfatno-citratni pufer s pH 4, ki vsebuje 0,03 % H2O2) in inkubiramo 10 minut pri sobni temperaturi. Razvoj barve se ustavi z dodatkom 100 μl 2 % (utežni delež) SDS (natrijev dodecil sulfat) v vdolbinico.

3.1.6 Odčitavanje

V ELISA čitalcu odčitamo pri 405 nm.

3.2 Interpretacija rezultatov

3.2.1 Validacija testa

Test je veljaven, ko je absorbanca (A) negativne kontrole (NK) večja od 1,0 in A pozitivne kontrole (PK) manjša od 0,2.

3.2.2 Izračun mejne vrednosti

Pozitivna mejna vrednost NK -

NK - PK× 0,3

Negativna mejna vrednost NK -

NK - PK× 0,2

Kjer je NK absorbanca negativne kontrole in PK absorbanca pozitivne kontrole.

3.2.3 Interpretacija rezultatov

Vzorci, ki imajo A manjšo od pozitivne mejne vrednosti, bi se morali obravnavati kot pozitivni na protitelesa proti VKK.

Vzorci, ki imajo A večjo od negativne mejne vrednosti, bi se morali obravnavati kot negativni na protitelesa proti VKK.

Vzorci z A med tema dvema vrednostma bi se morali obravnavati kot dvomljivi in pri teh živalih bi se moralo po dveh do treh tednih opraviti ponovno vzorčenje.

--------------------------------------------------