Uredba Komisije (ES) št. 535/2002

z dne 21. marca 2002

o spremembah Priloge C k Direktivi Sveta 64/432/EGS in o spremembi Odločbe 2000/330/ES

KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE –

ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske skupnosti,

ob upoštevanju Direktive Sveta 64/432/EGS z dne 26. junija 1964 o problemih zdravstvenega varstva živali, ki vplivajo na trgovino z govedom in prašiči med državami članicami Skupnosti [1], nazadnje spremenjene z Odločbo Komisije 2001/298/ES [2], in člena 16(1), drugi odstavek, Direktive,

ob upoštevanju naslednjega:

(1) 11. oktobra 1999 je Znanstveni odbor za zdravstveno varstvo in dobro počutje živali sprejel poročilo [3] o spremembi tehničnih prilog k Direktivi 64/432/EGS zaradi upoštevanja znanstvenega razvoja v zvezi s tuberkulozo, brucelozo in enzootsko govejo levkozo.

(2) V skladu z zgoraj navedenim poročilom je treba teste za brucelozo izvajati v skladu s Priročnikom standardov za diagnostične teste in vakcine, tretja izdaja, 1996, Office International des Epizootics (OIE).

(3) Avgusta 2001 je OIE objavila četrto izdajo 2000 navedenega priročnika, ki vsebuje nekatere spremembe opisa testov za brucelozo.

(4) Zaradi tega je bilo treba spremeniti Prilogo C k Direktivi 64/432/EGS, tako da določa testne postopke, uporabne za namene nadzora in trgovine v Skupnosti, ki čim bolj odsevajo standarde OIE, ob tem pa upoštevajo nasveteZnanstvenega odbora in nacionalnih referenčnih laboratorijev držav članic, ki sodelujejo v okvirju Mreže nacionalnih referenčnih laboratorijev za brucelozo Evropske unije.

(5) Odločbo Komisije 2000/330/ES z dne 18. aprila 2000 o odobritvi testov za odkrivanje protiteles proti brucelozi goveda v okviru Direktive Sveta 64/432/EGS [4] je treba ustrezno spremeniti.

(6) Ukrepi iz te uredbe so v skladu z mnenjem Stalnega veterinarskega odbora –

SPREJELA NASLEDNJO UREDBO:

Člen 1

Priloga C k Direktivi 64/432/EGS se nadomesti s prilogo k tej uredbi.

Člen 2

Odločba 2000/330/ES se spremeni:

1. Člen 1 se nadomesti:

"Člen 1

Reakcija vezanja komplementa, testi z aglutinacijo antigena v pufru in ELISA testi, opravljeni v skladu z določbami Priloge C k Direktivi 64/432/EGS, se odobrijo za namene atestiranja."

2. Priloga se črta.

Člen 3

Ta uredba začne veljati dvajseti dan po objavi v Uradnem listu Evropskih skupnosti.

Ta uredba je v celoti zavezujoča in se neposredno uporablja v vseh državah članicah.

V Bruslju, 21. marca 2002

Za Komisijo

David Byrne

Član Komisije

[1] UL 121, 29.7.1964, str. 1977/64.

[2] UL L 102, 12.4.2001, str. 63.

[3] SANCO/B3/R10/1999.

[4] UL L 114, 13.5.2000, str. 37.

--------------------------------------------------

PRILOGA

PRILOGA C

BRUCELOZA

1. DOLOČITEV POVZROČITELJA

Dokaz mikroorganizmov z morfologijo brucel z modificiranim barvanjem za acidorezistentne bakterije ali imunskospecifičnim barvanjem v zvrženem materialu, vaginalnih izcedkih ali mleku daje dokaz za domnevo bruceloze, zlasti če je podprt s serološkimi testi.

Po izolaciji je treba določiti vrsto in biovar z lizo z bakteriofagom in/ali testi oksidativnega metabolizma, gojiščno preiskavo ter biokemičnimi in serološkimi kriteriji.

Uporabljene tehnike in mediji, njihova standardizacija in interpretacija rezultatov morajo ustrezati tistim iz Priročnika standardov za diagnostične teste in vakcine OIE, četrta izdaja, 2000, Poglavje 2.3.1 (bruceloza goveda), Poglavje 2.4.2 (bruceloza ovc in koz) in Poglavje 2.6.2 (bruceloza prašičev).

2. IMUNOLOŠKI TESTI

2.1 Standardi

2.1.1 Za pripravo vseh antigenov, uporabljanih v rose bengal testu (RBT), seroaglutinacijskem testu (SA), reakciji vezanja komplementa (RVK) in mlečnem prstanastem preskusu (MPP) se mora uporabljati Brucella abortus biovar 1 Weybridge sev št. 99 ali USDA sev 1119-3.

2.1.2 Standardni referenčni serum za RBT, SA, RVK in MPP je mednarodni standardni referenčni serum OIE (OIEISS), prej imenovan drugi mednarodni standardni serum proti Brucelli abortus WHO (ISAbS).

2.1.3 Standardni referenčni serumi za ELISA teste so:

- OIEISS,

- šibek pozitivni OIE ELISA standardni serum (OIEELISAWPSS),

- močan pozitivni OIE ELISA standardni serum (OIEELISASPSS),

- negativni OIE EISA standardni serum (OIEELISANSS).

2.1.4 Zgoraj našteti standardni serumi so na voljo pri Veterinary Laboratories Agency (VIA), Weybridge, Združeno kraljestvo.

2.1.5 OIEISS, OIEELISAWPSS, OIEELISASPSS in OIEELISANSS so primarni mednarodni standardi, iz katerih se morajo določiti sekundarni nacionalni referenčni standardi ("delovni standardi") za vsak test v vsaki državi članici.

2.2 Encimskoimunski testi (ELISA testi) ali drugi testi z markiranimi protitelesi za odkrivanje bruceloze goveda v serumu ali mleku

2.2.1 Material in reagenti

Uporabljena tehnika in interpretacija rezultatov morata biti validirani v skladu s principi iz poglavja 1.1.3 Priročnika standardov za diagnostične teste in vakcine OIE, četrta izdaja, 2000, in bi morali vključevati najmanj laboratorijske in diagnostične študije.

2.2.2 Standardizacija testa

2.2.2.1 Standardizacija postopka testa za posamezne vzorce seruma:

(a) predrazredčina 1/150 [1] OIEISS, predrazredčina 1/2 OIEELISAWPSS ali predrazredčina 1/16 OIEELISASPSS bi morale v negativnem serumu (ali negativnem skupinskem vzorcu serumov) dati pozitivno reakcijo;

(b) predrazredčina 1/600 OIEISS, predrazredčina 1/8 OIEELISAWPSS ali predrazredčina 1/64 OIEELISASPSS bi morale v negativnem serumu (ali negativnem skupinskem vzorcu serumov) dati negativno reakcijo;

(c) OIEELISANSS bi moral vedno dati negativno reakcijo.

2.2.2.2 Standardizacija postopka testa za skupinske vzorce serumov:

(a) predrazredčina 1/150 OIEISS, predrazredčina 1/2 OIEELISAWPSS ali predrazredčina 1/16 OIEELISASPSS bi morale v negativnem serumu (ali negativnem skupinskem vzorcu serumov) in ponovno razredčene v negativnih serumih s številom vzorcev, ki sestavljajo skupinski vzorec, dati pozitivno reakcijo;

(b) OIEELISANSS bi moral vedno dati negativno reakcijo;

(c) test mora zadostovati za odkrivanje okužbe ene same živali v skupini živali, iz katere so zbrani vzorci skupinskega vzorca.

2.2.2.3 Standardizacija postopka testa za skupinske vzorce mleka ali sirotke:

(a) predrazredčina 1/1000 OIEISS, predrazredčina 1/16 OIEELISAWPSS ali predrazredčina 1/125 OIEELISASPSS bi morale v negativnem serumu (ali negativnem skupnem vzorcu serumov) in ponovno razredčene 1/10 v negativnem mleku dati pozitivno reakcijo;

(b) OIEELISANSS, razredčen 1/10 v negativnem mleku, bi moral vedno dati negativno reakcijo;

(c) test mora zadostovati za odkrivanje okužbe ene same živali v skupini živali, iz katere so zbrani vzorci mleka ali sirotke za skupinski vzorec.

2.2.3 Pogoji za uporabo ELISA testov za diagnostiko bruceloze goveda:

2.2.3.1 Z uporabo zgoraj omenjenih pogojev za kalibracijo ELISA testov vzorcev seruma je diagnostična občutljivost ELISA testa enaka ali večja kot občutljivost RBT ali RVK, ob upoštevanju epidemiološke situacije, pri kateri je uporabljen.

2.2.3.2 Z uporabo zgoraj omenjenih pogojev za kalibracijo ELISA testa skupinskih vzorcev mleka je diagnostična občutljivost ELISA testa enaka ali večja kot občutljivost MPP, ob upoštevanju ne samo epidemiološke situacije, ampak tudi povprečnih in pričakovanih ekstremnih sistemov reje.

2.2.3.3 2.2.3.3. Če se ELISA testi uporabljajo za atestiranje v skladu s členom 6(1) ali za ugotavljanje in vzdrževanje statusa črede v skladu s Prilogo A(II)(10), je treba zbiranje vzorcev seruma v skupinski vzorec izvesti tako, da bo rezultat testa nesporno povezan s posamezno živaljo, vključeno v skupinski vzorec. Katerikoli test za potrditev se mora opraviti na vzorcih seruma, ki so odvzeti posameznim živalim.

2.2.3.4 ELISA testi se lahko uporabljajo na vzorcu mleka iz mleka, ki ga odda kmetija in v katerem je zajetih vsaj 30 % krav mlekaric, ki niso presušene. Če se uporablja ta metoda, je treba z ukrepi zagotoviti, da je mogoče preiskovane vzorce nesporno povezati s posameznimi živalmi, od katerih je mleko pridobljeno. Katerikoli test za potrditev se mora opraviti na vzorcih seruma, odvzetih posameznim živalim.

2.3 Reakcija vezanja komplementa (RVK)

2.3.1 Antigen je suspenzija bakterij v fiziološki raztopini s fenolom (koncentracija NaCl 0,85 % in volumski delež fenola 0,5 %) ali v veronalnem pufru. Antigeni se lahko dobavijo v koncentriranem stanju, pod pogojem, da je na etiketi stekleničke naveden faktor razredčitve, ki ga je treba uporabiti. Antigen je treba hraniti na 4 °C in ne zamrznjen.

2.3.2 Serume je treba inaktivirati na naslednji način:

- goveji serum: 56 do 60 °C za 30 do 50 minut,

- prašičji serum: 60 °C za 30 do 50 minut.

2.3.3 Da bi se lahko v postopku testa izvedla prava reakcija, je treba uporabiti dozo komplementa, ki je višja od minimalno potrebne za popolno hemolizo.

2.3.4 Pri izvajanju reakcije vezanja komplementa je treba vedno opraviti naslednje kontrole:

(a) kontrola antikomplementarnega delovanja seruma;

(b) kontrola antigena;

(c) kontrola senzibiliziranih eritrocitov;

(d) kontrola komplementa;

(e) kontrola občutljivosti s pozitivnim serumom na začetku reakcije;

(f) kontrola specifičnosti reakcije z negativnim serumom.

2.3.5 Izračun rezultatov

OIEISS vsebuje 1000 internacionalnih RVK enot (ICFTU) na mililiter. Če se v dani metodi testira OIEISS, se rezultat poda kot titer T OIEISS. Rezultat testa za testirani serum se poda kot titer T TESTSERUM in mora biti podan v ICFTU na mililiter. Za pretvorbo vrednosti titra v ICFTU se lahko faktor (F), potreben za pretvorbo titra neznanega, s to metodo testiranega seruma T TESTSERUM v ICFTU, določi s formulo:

F =1000 × 1/T

OIEISS

in vsebnost internacionalnih RVK enot na ml testiranega seruma (ICFTUTESTSERUM) s formulo:

ICFTU

= F × T

testserum

2.3.6 Interpretacija rezultatov

Serum, ki vsebuje 20 ali več ICFTU na ml, se pojmuje za pozitivnega.

2.4 Mlečni prstanasti preskus (MPP)

2.4.1 Antigen je suspenzija bakterij v fiziološki raztopini s fenolom (koncentracija NaCl 0,85 % in volumski delež fenola 0,5 %), obarvana s hematoksilinom. Antigen je treba hraniti na 4 °C in ne zamrznjen.

2.4.2 Občutljivost antigena je treba standardizirati glede na OIEISS, tako da antigen povzroči pozitivno reakcijo z razredčino 1/500 OIEISS v negativnem mleku, medtem ko bi morala biti razredčina 1/1000 negativna.

2.4.3 Prstanasti preskus je treba opraviti na vzorcih, ki so reprezentativni za vsebino vsake posode za mleko ali večjega rezervoarja s kmetije.

2.4.4 Vzorci mleka ne smejo biti zamrzovani, greti ali močno treseni.

2.4.5 Reakcija mora biti opravljena z uporabo ene od naslednjih metod:

- s stolpcem mleka višine vsaj 25 mm in volumnom mleka 1 ml, na kar se doda 0,03 ali 0,05 ml enega izmed standardiziranih obarvanih antigenov,

- s stolpcem mleka višine vsaj 25 mm in z volumnom mleka 2 ml, na kar se doda 0,05 ml enega izmed standardiziranih obarvanih antigenov,

- z volumnom mleka 8 ml, čemur se doda 0,08 ml enega izmed standardiziranih obarvanih antigenov.

2.4.6 Mešanico mleka in antigenov je treba 60 minut inkubirati na 37 °C skupaj s pozitivnimi in negativnimi delovnimi standardi. Nadaljnja inkubacija za 16 do 24 ur na 4 °C poveča občutljivost testa.

2.4.7 Interpretacija rezultatov:

(a) negativna reakcija: obarvano mleko, neobarvana smetana;

(b) pozitivna reakcija:

- enako obarvana mleko in smetana, ali

- neobarvano mleko in obarvana smetana.

2.5 Rose bengal test na plošči (RBT)

2.5.1 Antigen je suspenzija bakterij v puferirani raztopini za razredčevanje Brucella antigena s pH 3,65 ± 0,05, obarvana z rose bengal barvilom. Antigen se dostavi pripravljen za uporabo, nakar ga je treba hraniti na 4 °C in ne zamrzovati.

2.5.2 Antigen se pripravi ne glede na koncentracijo celic, njegova občutljivost pa mora biti standardizirana glede na OIEISS tako, da antigen povzroči pozitivno reakcijo z razredčino seruma 1/45 in negativno reakcijo z razredčino 1/55.

2.5.3 RBT se izvaja na naslednji način:

(a) serum (20–30 μl) se pomeša z enakim volumnom antigena na beli keramični ploščici ali plošči iz emajla, da nastane področje s premerom približno 2 cm. Mešanica se na sobni temperaturi nežno ziblje 4 minute, potem pa pri dobrih svetlobnih pogojih opazuje, ali se pojavi aglutinacija;

(b) uporabi se lahko avtomatizirana metoda, ki pa mora biti vsaj tako občutljiva in točna kot ročna metoda.

2.5.4 Interpretacija rezultatov

Kakršna koli vidna reakcija se pojmuje za pozitivno, razen če je prišlo ob robovih do pretirane izsušitve.

Pri vsaki seriji testov bi bilo treba vključiti pozitivne in negativne delovne standarde.

2.6 Seroaglutinacijski test (SA)

2.6.1 Antigen je suspenzija bakterij v fiziološki raztopini s fenolom (koncentracija NaCl 0,85 % in volumski delež fenola 0,5 %). Formaldehida se ne sme uporabljati.

Antigeni se lahko dobavijo v koncentriranem stanju, pod pogojem, da je na etiketi stekleničke naveden faktor razredčitve, ki ga je treba uporabiti.

Suspenziji antigena se lahko doda EDTA do 5 mM v končni testni razredčini, da se zmanjša število lažnih pozitivnih rezultatov seroaglutinacijskega testa. Naknadno je treba korigirati pH suspenzije antigena na pH 7,2.

2.6.2 OIEISS vsebuje 1000 internacionalnih enot aglutininov.

2.6.3 Antigen se pripravi ne glede na koncentracijo celic, njegova občutljivost pa mora biti standardizirana glede na OIEISS tako, da antigen povzroči bodisi 50 % aglutinacijo s končno razredčino seruma 1/600 do 1/1000 bodisi 75 % aglutinacijo s končno razredčino seruma 1/500 do 1/750.

Priporočljivo bi bilo tudi primerjati reaktivnost novih in prej standardiziranih serij antigena ob pomoči serije definiranih serumov.

2.6.4 Test se naredi v epruvetah ali na mikroploščah. Mešanico antigena in razredčin seruma je treba inkubirati za 16 do 24 ur na 37 °C.

Za vsak serum se morajo pripraviti vsaj tri razredčine. Razredčine preiskovanega seruma morajo biti narejene tako, da se reakcija na meji pozitivnosti odčita v sredinski epruveti (ali vdolbini pri metodi z mikroploščo).

2.6.5 Interpretacija rezultatov:

Stopnja aglutinacije brucel v serumu mora biti izražena v IE na ml.

Serum, ki vsebuje 30 ali več IE na ml, se pojmuje kot pozitiven.

3. DOPOLNILNI TESTI

3.1 Intrakutani test za brucelozo (Brucellosis skin test – BST)

3.1.1 Pogoji za uporabo BST

(a) Intrakutani test za brucelozo se ne uporablja v namene atestiranja za trgovino med državami članicami ES.

(b) Intrakutani test za brucelozo je eden od najbolj specifičnih testov za zaznavanje bruceloze pri necepljenih živalih, vendar pa diagnoze samo na podlagi pozitivnih intradermalnih reakcij ne bi smeli postavljati.

(c) Govedo, ki je bilo v enem od seroloških testov iz te priloge negativno in ki reagira pozitivno na BST, se pojmuje za okuženo.

(d) Govedo, ki je bilo v enem od seroloških testov iz te priloge pozitivno, se lahko testira z BST za podporo interpretaciji rezultatov seroloških testov, zlasti če se pri čredah, ki so proste ali uradno proste bruceloze, ne more izključiti navzkrižna reakcija s protitelesi proti drugim bakterijam.

3.1.2 Test se mora opraviti z uporabo standardiziranega in definiranega preparata brucelnega alergena, ki ne vsebuje gladkega lipopolisaharidnega (LPS) antigena, ki lahko povzroči nespecifične vnetne reakcije ali moti naknadne serološke teste.

Eden od takšnih preparatov je Brucellin INRA, ki je pripravljen iz hrapavega seva B. melitensis. Zahteve za njegovo izdelavo so natančneje opisane v Oddelku B2 Poglavja 2.4.2 Priročnika standardov za diagnostične teste in vakcine OIE, četrta izdaja, 2000.

3.1.3 Postopek testa

3.1.3.1 0,1 ml brucelnega alergena se vbrizga intradermalno v obrepno gubo, kožo boka ali ob strani v vrat.

3.1.3.2 Test se odčita po 48–72 urah.

3.1.3.3 Debelina kože na mestu injekcije se izmeri s kutimetrom pred aplikacijo in pri ponovnem pregledu.

3.1.3.4 Interpretacija rezultatov:

Močne reakcije se zlahka prepoznajo po lokalni oteklini in zatrdlini.

Zadebelitev kože za 1,5 do 2 mm se pojmuje za pozitivno reakcijo na BST.

3.2 Kompetitivni encimskoimunski test (cELISA)

3.2.1 Pogoji za uporabo cELISA testa

(a) cELISA test za brucelozo se ne uporablja v namene atestiranja za trgovino med državami članicami ES.

(b) Izkazalo se je, da je cELISA test bolj specifičen kot na primer indirektni ELISA test in se zato lahko uporablja za podporo interpretacije rezultatov seroloških testov.

3.2.2 Postopek testa

Test se izvede v skladu z navodili iz Priročnika standardov za diagnostične teste in vakcine OIE, četrta izdaja, 2000, Poglavje 2.3.1(2)(a).

4. NACIONALNI REFERENČNI LABORATORIJI

4.1 Naloge in dolžnosti

Nacionalni referenčni laboratoriji so odgovorni za:

(a) odobritev rezultatov ocenjevalnih študij za dokaz zanesljivosti metode za testiranje, ki se uporablja v državi članici;

(b) določitev maksimalnega števila vzorcev, ki se jih lahko pri uporabljanih ELISA kitih združi v skupinski vzorec.

(c) kalibracijo standardnih sekundarnih nacionalnih referenčnih standardnih serumov ("delovni standardi") s primarnim mednarodnim standardnim serumom, navedenim v odstavku 2.1;

(d) kontrolo kvalitete vseh serij antigenov in ELISA kitov, ki se uporabljajo v državi članici;

(e) sodelovanje v Mreži nacionalnih referenčnih laboratorijev za brucelozo Evropske unije.

4.2 Seznam nacionalnih referenčnih laboratorijev

BELGIJA

Centre d’études et de recherches vétérinaires et agrochimiques (CERVA/CODA)

Groeselenberg 99

B-1180

Bruxelles/Brussel

DANSKA

Danish Veterinary Institute

Bulowsvej 27

DK-1790

Copenhagen

NEMČIJA

Bundesinstitut für Gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin (BGW)

Nationales Veterinärmedizinisches Referenzlabor für Brucellose

Postfach 33 00 13

D-14191

Berlin

GRČIJA

Veterinary Laboratory of Larissa

Department of Microbiology

6th km of National Road Larissa-Trikala

GR-4111 10

Larissa

ŠPANIJA

Laboratorio Central de Veterinaria de Santa Fé

Camino del Jau S/N

E-18320

Santa Fé (Granada)

FRANCIJA

Laboratoire national et OIE/FAO de référence pour la brucellose

Agence française de sécurité sanitaire des aliments (AFSSA)

BP 67

F-94703

Maisons-Alfort

Cedex

IRSKA

Brucellosis Laboratory

Model Farm Road

Cork

Ireland

ITALIJA

Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell‘Abruzzo e del Molise

Via Campo Boario

I-64100

Teramo

LUKSEMBURG

State Laboratory for Veterinarian Medicine

54, avenue Gaston Diderich

B.P. 2081

L-1020

Luksemburg

NIZOZEMSKA

Centraal Instituut voor DierziekteControle

CIDC-Lelystad

Houtribweg 39

P.O. Box 2004

8203 AA

Lelystad

Nederland

AVSTRIJA

Bundesanstalt für veterinärmedizinische Untersuchungen

Robert-Koch-Gasse 17

A-2340

Mödling

PORTUGALSKA

Laboratorio Nacional de Investigaçao Veterinaria (LNIV)

Estrada de Benficao 701

P-1549

Lisboa

FINSKA

National Veterinary and Food Research Institute

Hämeentie 57

PO Box 45

FIN-00581

Helsinki

ŠVEDSKA

National Veterinary Institute

S-751 89

Uppsala

ZDRUŽENO KRALJESTVO

1. FAO/WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Brucellosis

Veterinary Laboratories Agency

New Haw

Addlestone

Surrey

KT15 3NB

United Kingdom

2. Immunodiagnostics Department

Veterinary Sciences Division

Stoney Road Stormont

Belfast

BT4 3SD

United Kingdom

[1] Za namen te priloge so razredčine za tekoče reagente izraene tako, da na primer 1/150 pomeni razredčino 1: 150.

--------------------------------------------------