PRILOGA I

Shema za teste, ki jih je treba opraviti v skladu s členi 3, 4, 5 in 7

1. SPLOŠNA NAČELA O NAVZOČNOSTI ZADEVNEGA ŠKODLJIVEGA ORGANIZMA

1.1 Sum navzočnosti zadevnega škodljivega organizma obstaja, kadar je rezultat prvega testa za ugotavljanje navzočnosti, opravljenega na zadevni rastlini ali vzorcih vode, pozitiven.

1.2 navzočnost zadevnega škodljivega organizma je potrjena v naslednjih primerih: (a) kadar je prvi ali drugi test za ugotavljanje navzočnosti selektivna izolacija, pri kateri dobimo kolonije značilne morfologije, pozitivni rezultati pa se pridobijo z dvema identifikacijskima testoma, opravljenima na kolonijah; (b) kadar prvi in drugi test nista selektivna izolacija ter se pozitivni rezultati pridobijo v dveh identifikacijskih testih po selektivni izolaciji vzorca, ki nastane v kolonijah z značilno morfologijo. Eden od teh dveh identifikacijskih testov je test iz točk 2.2(e), (f) in (g).

2. TESTI

2.1 Testi za ugotavljanje navzočnosti

Testi za ugotavljanje navzočnosti so taki, da dosledno ugotovijo vsaj 104 celic/ml resuspendiranega peleta, pripravljenega iz asimptomatskih vzorcev.

Drugi test za ugotavljanje navzočnosti temelji na drugih bioloških osnovah ali drugih nukleotidnih regijah, kot pri prvem testu za ugotavljanje navzočnosti.

Testi za ugotavljanje navzočnosti so naslednji:

(a) imunofluorescenčni testi, kot so opisani v mednarodnih diagnostičnih standardih;

(b) izolacija zadevnega škodljivega organizma na polselektivnem gojišču mSMSA, kot je opisano v mednarodnih diagnostičnih standardih;

(c) konvencionalni test PCR, pri katerem se uporabljajo primerji Pastrik et al. (2002) (1), kot je opisano v mednarodnih diagnostičnih standardih;

(d) TaqMan® testi PCR v realnem času z uporabo primerjev in sond: (i) Weller et al. (2000) (2), kot je opisano v mednarodnih diagnostičnih standardih; (ii) Vreeburg et al. (2016) (3) (z uporabo sonde TaqMan®, spremenjene iz prvotne sonde, ki so jo opisali Weller in drugi, 2000), kot je opisano v mednarodnih diagnostičnih standardih; (iii) Vreeburg et al. (2018) (4) (t. i. test NYtor), kot je opisano v mednarodnih diagnostičnih standardih; (iv) Massart et al. (2014) (5), kot je opisano v mednarodnih diagnostičnih standardih;

(e) Test LAMP (loop-mediated isothermal amplification; z zanko posredovano izotermno pomnoževanje) z uporabo primerjev Lenarčič et al. (2014) (6) (samo za simptomatski rastlinski material), kot je opisano v mednarodnih diagnostičnih standardih.

2.2 Identifikacijski testi

Identifikacijski testi so naslednji:

(a) imunofluorescenčni testi, kot so opisani v mednarodnih diagnostičnih standardih;

(b) konvencionalni testi PCR, pri katerem se uporabljajo primerji Pastrik et al. (2002), kot je opisano v mednarodnih diagnostičnih standardih;

(c) TaqMan® testi PCR v realnem času z uporabo primerjev in sond: (i) Weller et al. (2000), kot je opisano v mednarodnih diagnostičnih standardih; (ii) Vreeburg et al. (2016) (z uporabo sonde TaqMan®, spremenjene iz prvotne sonde, ki so jo opisali Weller idr. (2000)), kot je opisano z vsemi podrobnostmi v mednarodnih diagnostičnih standardih; (iii) Vreeburg et al. (2018) (t. i. test NYtor), kot je opisano v mednarodnih diagnostičnih standardih; (iv) Massart et al. (2014), kot je opisano v mednarodnih diagnostičnih standardih;

(d) test LAMP (loop-mediated isothermal amplification; z zanko posredovano izotermno pomnoževanje) z uporabo primerjev Lenarčič et al. (2014), kot je opisano v mednarodnih diagnostičnih standardih;

(e) za filotipe specifični multipli konvencionalni test PCR(Opina et al. (1997) (7); Fegan in Prior (2005) (8)), kot je opisano v mednarodnih diagnostičnih standardih;

(f) določanje črtne kode DNK (Wicker et al (2007) (9)), kot je opisano v mednarodnih diagnostičnih standardih;

(g) MALDI-TOF MS (van de Bilt et al (2018) (10)), kot je opisano v mednarodnih diagnostičnih standardih.

3. DIAGRAMI POTEKA POSTOPKOV

Diagram poteka št. 1: Diagnostični postopek za navzočnost zadevnega škodljivega organizma v vzorcih zadevne rastline.

a Izolacija se lahko uporabi kot prvi ali drugi test za ugotavljanje navzočnosti. Če obstaja sum na navzočnost zadevnega škodljivega organizma na gojišču, se kolonije očistijo, da se pridobijo čiste kulture, na katerih se opravita dva identifikacijska testa.

b Eden od teh dveh identifikacijskih testov je test iz točk 2.2(e), (f) in (g). Za potrditev navzočnosti škodljivega organizma morajo biti rezultati obeh identifikacijskih testov pozitivni.

c Tretji test odkrivanja temelji na drugih bioloških osnovah ali različnih nukleotidnih regijah.

Diagram poteka št. 2: Diagnostični postopek za zadevni škodljivi organizem v vzorcih vode.

a Eden od teh dveh identifikacijskih testov je test iz točk 2.2(e), (f) in (g). Za potrditev navzočnosti škodljivega organizma morajo biti rezultati obeh identifikacijskih testov pozitivni.

4. PRIPRAVA VZORCEV

4.1 Vzorci asimptomatskih gomoljev

Standardni vzorec vsebuje 200 gomoljev na test. Ustrezen laboratorijski postopek za pripravo ekstrakta iz popkov za določanje škodljivega organizma je opisan v mednarodnih diagnostičnih standardih.

4.2 Vzorci asimptomatskih zadevnih rastlin

Odkrivanje latentnih okužb se izvede na sestavljenih vzorcih delov stebel ali listnih pecljev. Postopek se lahko uporabi za največ 200 delov stebel ali 200 listnih pecljev iz različnih rastlin v enem vzorcu. Ustrezen laboratorijski postopek za razkuževanje in pripravo delov stebla ali listnega peclja za pridobitev ekstrakta za odkrivanje zadevnega škodljivega organizma je opisan v mednarodnih diagnostičnih standardih.

4.3 Vzorci iz simptomatskega materiala zadevnih rastlin

Deli tkiva se aseptično odstranijo iz žilnega obroča v gomolju krompirja ali iz žilnih trakov v steblih zadevnih rastlin, ki kažejo simptome venenja. Ustrezen laboratorijski postopek za obdelavo teh tkiv za pridobitev ekstrakta za odkrivanje zadevnega škodljivega organizma je podrobno opisan v mednarodnih diagnostičnih standardih.

4.4 Vzorci površinske vode ali vode za recirkulacijo (vključno s predelavo krompirja ali z iztoki odplak)

Glavni test za ugotavljanje navzočnosti zadevnega škodljivega organizma v vzorcih površinske vode, vode iz sistemov recirkulacije in vzorcev odplak (predelava krompirja) je selektivna izolacija. Ustrezen laboratorijski postopek za pripravo vzorcev vode je opisan v mednarodnih diagnostičnih standardih.

(1) Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G., Pukall, R. (2002) Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831–842.

(2) Weller, S.A, Elphinstone, J.G., Smith, N., Boonham, N., Stead, D.E. (2000). Detection of Ralstonia solanacearum strains with a quantitative, multiplex, real-time, fluorogenic PCR (TaqMan) assay. Applied and Environmental Microbiology, 66, 2853–2858. https://journals.asm.org/doi/10.1128/AEM.66.7.2853-2858.2000.

(3) Vreeburg, R.A.M., Bergsma-Vlami, M., Bollema, R.M., de Haan, E.G., Kooman-Gersmann, M., Smits-Mastebroek, L., Tameling, W.I.L., Tjou-Tam-Sin, N.N.A., van de Vossenberg B.T.L.H, Janse, J.D. (2016). Performance of real-time PCR and immunofluorescence for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and Ralstonia solanacearum in potato tubers in routine testing. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 46, 112–121.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach. EPPO Bulletin 48, 86–96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay. European Journal of Plant Pathology 138, 29–37.

(6) Lenarčič, R., Morisset, D., Pirc, M., Llop, P., Ravnikar, M., Dreo, T. (2014). Loop-mediated isothermal amplification of specific endoglucanase gene sequence for detection of the bacterial wilt pathogen Ralstonia solanacearum. PLoS ONE 9(4), e96027. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096027.

(7) Opina, N., Tavner, F., Holloway, G., Wang, J.F., Li, T.H., Maghirang, R., Fegan, M., Hayward, A.C., Viji Krishnapillai, A., Wai-Foong Hong, Holloway, B.W, Timmis, J.N. (1997). A novel method for development of species and strainspecific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 5, 19–30.

(8) Fegan, M., Prior, P. (2005). How complex is the “Ralstonia solanacearum species complex”. In Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex (ur. Allen C, Hayward AC in Prior P), str. 449–461. American Phytopathological Society, St Paul, MN (ZDA).

(9) Wicker, E., Grassart, L., Coranson-Beaudu, R., Mian, D., Guilbaud, C., Fegan, M., Prior, P. (2007). Ralstonia solanacearum strains from Martinique French West Indies) exhibiting a new pathogenic potential. Applied and Environmental Microbiology, 73, 6790–6801.

(10) van de Bilt, J.L.J., Wolsink, M.H.L., Gorkink-Smits, P.P.M.A., Landman, N.M., Bergsma-Vlami, M. (2018). Application of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry for rapid and accurate identification of Ralstonia solanacearum and Ralstonia pseudosolanacearum. European Journal of Plant Pathology, https://doi.org/10.1007/s10658-018-1517-5.