PRILOGA I

Metode testiranja za odkrivanje in identifikacijo zadevnega škodljivega organizma iz člena 3(2)

1. Testiranje s sporami

Za odkrivanje in identifikacijo se uporabljajo poletni sporangiji in počivajoče spore, ki se pridobijo iz presejane zemlje ali neposredno iz rastlinskega materiala.

2. Metode za odkrivanje

Za ekstrakcijo spor zadevnega škodljivega organizma iz zemlje se uporabi ena od naslednjih metod:

(a) metoda presejanja zemlje, kot jo je opisal Pratt (1976) (1);

(b) metoda presejanja zemlje, kot so jo opisali van Leeuwen et al. (2005) (2);

(c) tehnika conskega centrifugiranja za visokozmogljivo obdelavo vzorcev, kot so jo opisali Wander et al. (2007) (3).

3. Metode za identifikacijo

Spore zadevnega škodljivega organizma se po ekstrakciji identificirajo z eno od naslednjih metod:

(a) morfološko identifikacijo pod svetlobnim mikroskopom pri povečavi 100x–400x;

(b) konvencionalnim PCR z uporabo primerjev na podlagi Lévesque et al. (2001) (4) in van den Boogert et al. (2005) (5);

(c) PCR v realnem času z uporabo primerjev in sond po van Gent-Pelzer et al. (2010) (6);

(d) PCR v realnem času z uporabo primerjev in sond po Smith et al. (2014) (7).

4. Viabilnost počivajočih spor

Viabilnost počivajočih spor se lahko določi z mikroskopskim pregledom ali biološkim testom. Viabilnost sporangijev se lahko določi z mikroskopskim pregledom sporangijev, položenih v laktofenol ali vodo (Przetakiewicz 2015) (8). Sporangiji z zrnato vsebino ali rahlo zaobljeno protoplazmo se lahko štejejo za viabilne. Če so trajno plazmolizirani ali brez vidne vsebine, se štejejo za mrtve.

Kot alternativa ali v primeru dvoma se lahko izvede biološki test, kot je opisan v točki 3 Priloge IV.

5. Določanje patotipov

Za določanje patotipov je potrebno sveže rakavo tkivo.

Inokulum za test se pridobi z eno od naslednjih metod:

(a) metodo SASA (Science and Advice for Scottish Agriculture), sestavljeno iz naslednjih dveh korakov: (i) pridobivanje inokuluma Staro (rjavo) rakavo tkivo se razdeli na manjše kose in posuši na zraku pri sobni temperaturi, dokler ne postane trdo. Trdno tkivo se zmelje ročno ali mehansko. Zmleti material se suho preseje, pri čemer se zbere frakcija od 25 do 75 μm, nato pa se ekstrahira s kloroformno metodo po Prattu (1976)1; (ii) pridelava svežega rakavega tkiva Približno 10 mg ekstrahiranih počivajočih spor se razporedi po površini 10 ml sterilne destilirane vode v manjši plastični petrijevki in do kalitve inkubira v temi pri 20 °C. Gomolji krompirja z majhnimi kalčki, dolgimi približno 1 do 2 mm, se položijo v prozorne plastične škatle, obložene z vlažnim vpojnim papirjem, pri čemer so označeni kalčki obrnjeni navzgor. Kalčke se obkroži s stopljenim vazelinom v brizgi Obroč vazelina mora biti neprekinjen in dovolj visok, da brez puščanja zadrži suspenzijo spor. 10 ml počivajočih spor v kali se nadalje razredči na 20 ml s sterilno vodo in s pipeto ali puhalko prenese znotraj obročev, dokler kalček ni popolnoma potopljen v suspenzijo spor. Plastične škatle so prekrite s pokrovi in inkubirane 4 dni pri temperaturi 10 °C, nato pa se škatle odprejo, inokulum in obroči vazelina se odstranijo, škatle pa se prestavijo v vlažen rastlinjak pri temperaturi 15 do 18 °C (16 ur svetlobe);

(b) metodo po Spiekermann & Kothoff (1924) (9);

(c) metodo po Potoček et al. (1991) (10);

(d) metodo po Glynne-Lemmerzahl (Glynne 1925 (11); Lemmerzahl 1930 (12); Noble and Glynne 1970 (13)).

Za določanje vseh patotipov, za katere je znano, da so pomembni za Unijo (1(D1), 2(G1), 6(O1), 18(T1) in 38(Nevşehir), se uporabi diferencialni test okužbe pri različnih sortah zadevne rastline, kot je navedeno v tabeli. Test okužbe se izvede v skladu s protokolom iz točke (d) (metoda Glynne-Lemmerzahl).

Selektivna občutljivost krompirjevih kultivarjev za določanje patotipov S. endobioticum

Kultivar Patotipi S. endobioticum 1(D1) 2(G1) 6(O1) 18(T1) 38(Nevşehir) Tomensa/evora/deodara S S S S S Irga/producent R S S S S Talent R R* R* S S Saphir R S R R S Ikar/gawin/karolin/belita R R R R R „S“: občutljiv „R“: odporen *: kaže šibko občutljivost sorte za S. endobioticum („navzočnost ne-nekrotičnih polj trosišč brez nastajanja rakavih tkiv“).

(1) Pratt MA. 1976. A wet-sieving and flotation technique for the detection of resting sporangia of Synchytrium endobioticum in soil. Annals of Applied Biology 82: 21–29.

(2) van Leeuwen GCM, Wander JGN, Lamers J, Meffert JP, van den Boogert PHJF, Baayen RP. 2005. Direct examination of soil for sporangia of Synchytrium endobioticum using chloroform, calcium chloride and zinc sulphate as extraction reagents. EPPO Bulletin 35: 25–31.

(3) Wander JGN, van den Berg W, van den Boogert PHJF, Lamers JG, van Leeuwen GCM, Hendrickx G, Bonants P. 2007. A novel technique using the Hendrickx centrifuge for extracting winter sporangia of Synchytrium endobioticum from soil. European Journal of Plant Pathology 119: 165–174.

(4) Lévesque CA, de Jong SN, Ward LJ in de Boer SH (2001) Molecular phylogeny and detection of Synchytrium endobioticum, the causal agent of potato wart. Canadian Journal of Plant Pathology 23: 200–201.

(5) van den Boogert PHJF, van Gent-Pelzer MPE, Bonants PJM, de Boer SH, Wander JGN, Lévesque CA, van Leeuwen GCM, Baayen RP. 2005. Development of PCR-based detection methods for the quarantine phytopathogen Synchytrium endobioticum, causal agent of potato wart disease. European Journal of Plant Pathology 113: 47–57.

(6) van Gent-Pelzer MPE, Krijger M, Bonants PJM. 2010. Improved real-time PCR assay for the detection of the quarantine potato pathogen, Synchytrium endobioticum, in zonal centrifuge extracts from soil and in plants. European Journal of Plant Pathology 126: 129–133.

(7) Smith DS, Rocheleau H, Chapados JT, Abbott C, Ribero S, Redhead SA, Lévesque CA, De Boer SH., 2014. Phylogeny of the genus Synchytrium and the development of TaqMan PCR assay for sensitive detection of Synchytrium endobioticum in soil. Phytopathology 104: 422–432.

(8) Przetakiewicz, J. 2015. The Viability of Winter Sporangia of Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. From Poland. American Journal of Potato Research 92:704–708.

(9) Spieckermann A, Kothoff P. 1924. Testing potatoes for wart resistance. Deutsche Landwirtschaftliche Presse 51: 114–115.

(10) Potoček J., Krajíčková K., Klabzubová S., Krejcar Z., Hnízdil M., Novák F., Perlová V.,1991. Identification of new Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. pathotypes in Czech Republic. Ochrana Rostlin 27: 191–205.

(11) Glynne MD. 1925. Infection experiments with wart disease of potatoes. Synchytrium endobioticum. Annals of Applied Biology 12: 34–60.

(12) Lemmerzahl J. 1930. A new simplified method for inoculation of potato cultivars to test for wart resistance. Züchter 2: 288–297.

(13) Noble M, Glynne MD. 1970. Wart disease of potatoes. FAO Plant Protection Bulletin 18: 125–135.