Odločba Komisije

z dne 14. februarja 1991

o določitvi nekaterih analiznih metod in preskušanja surovega in toplotno obdelanega mleka

(91/180/EGS)

KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE

ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske gospodarske skupnosti,

ob upoštevanju Direktive Sveta 85/397/EGS z dne 5. avgusta 1985 o javnozdravstvenih problemih in problemih zdravstvenega varstva živali, ki vplivajo na trgovanje s toplotno obdelanim mlekom v Skupnosti [1], kakor je bila nazadnje spremenjena z Direktivo 89/662/EGS [2], in zlasti člena 10(2) Direktive,

ker člen 10(2) predvideva, da Komisija predpiše analizne metode in preskušanja, ki naj se uporabijo za spremljanje skladnosti s standardi v zvezi s surovim in toplotno obdelanim mlekom;

ker je treba za surovo mleko predpisati metode zlasti za določanje skupnega števila mikroorganizmov na plošči, števila somatskih celic, zmrziščne točke in prisotnosti antibiotikov;

ker je treba za pasterizirano mleko predpisati metode zlasti za določanje odsotnosti patogenih mikroorganizmov, števila koliformnih bakterij, skupnega števila mikroorganizmov na plošči, odsotnosti fosfataze, prisotnosti peroksidaze, odsotnosti antibiotikov in zmrziščno točko;

ker je treba za sterilizirano mleko in UVT (ultra visoka temperatura)-obdelano mleko predpisati metode zlasti za določanje skupnega števila mikroorganizmov na plošči in odsotnosti antibiotikov;

ker je iz tehničnih razlogov primerno najprej predpisati referenčne analizne metode in preskušanja za zagotovitev skladnosti z nekaterimi standardi; ker je še zlasti treba nadaljevati s proučevanjem pogojev, v katerih je treba uporabiti rutinske analitske in preskusne metode; ker so države članice v pričakovanju rezultatov te proučitve odgovorne za uporabo ustreznih rutinskih metod za zagotavljanje skladnosti s standardi, predpisanimi z Direktivo 85/397/EGS;

ker določitev referenčnih analitskih in preskusnih metod vključuje določitev analiznih postopkov, ki se uporabljajo, in predpisovanje meril natančnosti za zagotovitev enotne razlage rezultatov;

ker so ukrepi, predvideni s to odločbo, v skladu z mnenjem Stalnega veterinarskega odbora,

SPREJELA NASLEDNJO ODLOČBO:

Člen 1

Referenčni postopki za analizo in preskušanje surovega mleka so:

- določitev zmrziščne točke,

- določitev števila mikroorganizmov – štetje kolonij na plošči pri 30 oC,

- določitev števila somatskih celic,

- ugotavljanje prisotnosti antibiotikov in sulfonamidov.

Člen 2

Referenčni postopki za analizo in preskušanje pasteriziranega mleka so:

- določitev zmrziščne točke,

- določitev aktivnosti fosfataze,

- določitev aktivnosti peroksidaze,

- določitev števila mikroorganizmov – štetje kolonij na plošči pri 30 oC,

- določitev števila mikroorganizmov – štetje kolonij na plošči pri 21 oC,

- določanje števila koliformnih bakterij – štetje kolonij pri 30 oC,

- ugotavljanje prisotnosti antibiotikov in sulfonamidov,

- ugotavljanje prisotnosti patogenih mikroorganizmov.

Člen 3

Referenčni postopki za analizo in preskušanje UVT-obdelanega mleka in steriliziranega mleka so:

- določanje števila mikroorganizmov – štetje kolonij na plošči pri 30 oC,

- določitev zmrziščne točke,

- ugotavljanje antibiotikov in sulfonamidov.

Člen 4

Treba je uveljaviti referenčne postopke za analizo in preskušanje ter merila natančnosti, ki naj se uporabijo, ter odvzem vzorcev v skladu s pravili, določenimi v Prilogi 1.

Člen 5

Referenčni postopki za analizo in preskušanje iz členov 1, 2 in 3 so določeni v Prilogi 2.

Člen 6

Ta odločba se ponovno prouči pred 31. decembrom 1992, da se upošteva razvoj na znanstvenem in tehničnem področju.

Člen 7

Odločba je naslovljena na države članice.

V Bruslju, 14. februarja 1991

Za Komisijo

Ray Mac Sharry

Član Komisije

[1] UL L 226, 24.8.1985, str. 13.

[2] UL L 395, 30.12.1989, str. 13.

--------------------------------------------------

PRILOGA I

VSEBINA

| | Stran |

I. | Splošne določbe… | 187 |

II. | Vzorčenje surovega in toplotno obdelanega mleka … | 189 |

I. SPLOŠNE DOLOČBE

1. Uvod

Opisane so splošne določbe v zvezi z reagenti, opremo, prikazovanjem rezultatov, natančnostjo in poročili o preskusu. Pristojni organi držav članic in pooblaščeni laboratoriji, zadolženi za vzorčenje in preskušanje mleka, morajo spoštovati splošne določbe.

2. Reagenti

2.1 Voda

2.1.1 Kadar koli se omenja voda za raztapljanje, redčenje ali izpiranje, se uporabi destilirana, deionizirana ali demineralizirana voda vsaj enakovredne čistosti, razen če je drugače določeno. Za mikrobiološke namene voda ne vsebuje snovi, ki bi lahko učinkovale ali vplivale na rast mikroorganizmov v preskusnih pogojih.

2.1.2 Kadar koli se omenja "raztapljanje" ali "redčenje" brez nadaljnje navedbe, to pomeni "raztapljanje v vodi" ali "redčenje z vodo".

2.2 Kemikalije

Vse uporabljene kemikalije so priznane analitske kakovosti, razen če je drugače določeno.

3. Oprema

3.1 Seznami opreme

Seznami opreme, navedeni v različnih referenčnih postopkih, vsebujejo samo pribor za posebno uporabo in pribor s točno določenimi lastnostmi.

3.2 Analitska tehtnica

Analitska tehtnica pomeni tehtnico, ki lahko tehta z natančnostjo 0,1 mg.

4. Prikazovanje rezultatov

4.1 Rezultati

Če ni drugače določeno, bi morali biti rezultati, navedeni v poročilu o preskusu, aritmetična srednja vrednost, dobljena iz dveh preskusov, ki izpolnjujeta merilo ponovljivosti (5.1), navedeno za to metodo. Če merilo ponovljivosti ni izpolnjeno, je treba preskus ponoviti ali pa rezultat razglasiti za neveljaven.

4.2 Izračun deleža

Razen kadar je drugače določeno, se rezultat izračuna kot odstotek glede na maso vzorca.

5. Merila natančnosti: ponovljivost in obnovljivost

5.1 Merila natančnosti, navedena v vsakem postopku, so opredeljena, kot sledi:

5.1.1 Ponovljivost (r) je vrednost, pod katero se nahaja absolutna razlika med dvema posameznima rezultatoma preskusa, dobljenima z istim postopkom na identičnem preskusnem materialu pod enakimi pogoji (isti analitik, ista naprava, isti laboratorij, kratek časovni interval).

5.1.2 Obnovljivost (R) je vrednost, pod katero se nahaja absolutna razlika med dvema posameznima rezultatoma preskusa, dobljenima z istim postopkom na identičnem preskusnem materialu pod različnimi pogoji (različna analitika, različni napravi, različna laboratorija in/ali različen čas).

5.1.3 Če ni drugače določeno, vrednosti meril ponovljivosti in obnovljivosti, navedena v ustreznih klavzulah vsakega postopka, predstavljajo 95 % interval zaupanja, kot je določeno v ISO 5725: 2. izdaja, 1986. Izračunajo se iz rezultatov priznanega medlaboratorijskega primerjalnega preskušanja, uporabljenega za ovrednotenje postopka. Vendar pa se za del postopka medlaboratorijsko primerjalno preskušanje ni opravilo. V tem primeru sta se vrednosti ponovljivosti in obnovljivosti ocenili.

5.1.4 Medlaboratorijsko primerjalno preskušanje in študije iz 5.1.3 bi se morali načrtovati in izvajati v skladu z mednarodnimi smernicami.

6. Poročilo o preskusu

Poročilo o preskusu navaja uporabljeno analizno metodo in tudi dobljene rezultate. Poleg tega navaja vse podrobnosti v zvezi z uporabljenim postopkom, ki niso opredeljene v analizni metodi ali so poljubne, pa tudi vse druge okoliščine, ki so morda vplivale na dobljene rezultate. Poročilo o preskusu navaja vse informacije, potrebne za popolno identifikacijo vzorca.

II. VZORČENJE SUROVEGA IN TOPLOTNO OBDELANEGA MLEKA

1. Obseg in področje uporabe

Ta postopek določa referenčni postopek za vzorčenje surovega in toplotno obdelanega mleka. Postopki za vzorčenje ter prevoz in shranjevanje vzorcev se uporabljajo za surovo mleko pri oddaji mleka ter za surovo in toplotno obdelano mleko v skladiščnih cisternah in cisternah za prevoz.

Postopki, navedeni v 2, 4.4, 5 in 6, se uporabljajo za vzorčenje toplotno obdelanega mleka za neposredno potrošnjo.

2. Splošno

Vzorčenje surovega in toplotno obdelanega mleka v posodah, cisternah, itd. opravi strokovna oseba, ki je bila pred začetkom vzorčenja ustrezno usposobljena.

Če je potrebno mora pristojni organi ali preskusni laboratorij poučiti osebje, ki izvaja vzorčenje, o tehnikah vzorčenja, da se zagotovi, da je vzorec reprezentativen in skladen s celotno serijo.

Če je potrebno mora pristojni organi ali preskusni laboratorij poučiti osebje, ki izvaja vzorčenje, o označevanju vzorca, da se zagotovi nedvoumna identiteta vzorca.

3. Oprema za vzorčenje

3.1 Splošno

Oprema za vzorčenje mora biti iz nerjavečega jekla ali drugega primernega materiala ustrezne trdnosti in oblikovana tako, da je primerna za predvideni namen (mešanje, vzorčenje, itd.). Potopne naprave — mešala za mešanje tekočin v rezervoarjih morajo imeti dovolj veliko površino, da ustrezno zmešajo proizvod, ne da bi pri tem povzročili nastanek žarkega priokusa. Zajemalke morajo imeti trden in dovolj dolg ročaj, da omogočajo odvzem vzorca pri kateri koli globini rezervoarja. Volumen zajemalke ne sme biti manjši od 50 ml.

Posode za vzorce in pokrovi morajo biti iz stekla, primerne kovine ali plastike.

Materiali, iz katerih je narejena oprema za vzorčenje (vključno s posodami in pokrovi), ne smejo povzročati nobenih sprememb v vzorcu, ki bi lahko vplivale na rezultate preiskav. Vse površine opreme za vzorčenje in posod za vzorce morajo biti čiste in suhe, gladke in brez razpok, robovi pa so zaobljeni.

3.2 Oprema za vzorčenje za mikrobiološke preiskave

Poleg določb iz 3.1 mora biti oprema za vzorčenje, vključno s posodami, sterilna.

Če se ista oprema za vzorčenje uporablja za zaporedno vzorčenje, se po vsakem vzorčenju očisti in sterilizira v skladu z navodili ali zahtevami, ki jih predpiše preskusni laboratorij ali pristojni organ, in to tako, da se ohrani integriteta zaporednih vzorcev.

4. Tehnika vzorčenja

4.1 Splošno

Ne glede na preskuse, ki se bodo izvajali, se mleko pred vzorčenjem temeljito premeša, bodisi ročno ali mehansko.

Vzorec se odvzame takoj po mešanju, ko se mleko še ni umirilo.

Kadar se za različne preskuse istočasno jemlje več vzorcev mleka v cisternah, se najprej odvzame vzorec za mikrobiološko preiskavo.

Količina vzorca ustreza zahtevam preskušanja. Velikost uporabljenih posod za vzorce je taka, da so skoraj v celoti napolnjene z vzorcem, kar omogoča ustrezno mešanje vsebine pred preskušanjem, hkrati pa med transportom ne pride do penjenja.

4.2 Ročno vzorčenje

4.2.1 Vzorčenje iz veder in posod za mleko

Da bi mleko premešali, hitro premikajte mešalo gor in dol v vedru ali posodi, pri tem pa zagotovite, da je mleko primerno zmešano in da se smetana ne prijemlje vratu posode. Vzorec, ki je reprezentativen za celotno pošiljko, se mora pridobiti v skladu s 4.2.4.

4.2.2 Vzorčenje iz hladilnih bazenov ali kadi na kmetijah

Mehansko ali ročno mešajte mleko, dokler ni dovolj homogeno.

Če je količina mleka tolikšna, da mehanski mešalnik mleka ne more premešati, mešanje opravite ročno.

4.2.3 Vzorčenje iz posode za tehtanje

Bistveno je, da je mleko, potem ko je zlito v posodo za tehtanje, dovolj premešano. Morda je potrebno dodatno ročno ali mehansko mešanje, da se zagotovi enakomerna porazdelitev maščobe. Kadar količina pošiljke, ki jo je treba vzorčiti, presega zmogljivost posode za tehtanje, se mora vzorec, ki je reprezentativen za celotno pošiljko, pridobiti v skladu s 4.2.4.

4.2.4 Vzorčenje iz več posod

Kadar je količina mleka, ki jo je treba vzorčiti, v več rezervoarjih, odvzemite reprezentativno količino iz vsakega rezervoarja in navedite količino mleka, na katero se nanaša vsak posamezen vzorec. Razen kadar je treba vzorce iz vsakega rezervoarja preskušati posamično, zmešajte deleže teh reprezentativnih količin v sorazmerju s količino v rezervoarju, iz katerega je bil posamezni vzorec odvzet. Vzorec ali vzorce iz teh skupnih sorazmernih količin odvzemite po mešanju.

4.2.5 Vzorčenje iz velikih posod – skladiščne, železniške in cestne cisterne

4.2.5.1 Pred vzorčenjem mleko premešajte v skladu z ustreznim postopkom.

Za mešanje vsebine velikih posod aliskladiščnih, železniških ali cestnih cistern se priporoča uporaba mehanskih mešalnikov (4.2.5.2).

Obseg mešanja ustreza času, ko je mleko mirovalo. Za učinkovitost postopka mešanja, ki ga uporabimo v katerih koli posebnih okoliščinah, se dokaže, da je primerna za namen predvidene analize; merilo učinkovitosti mešanja zlasti vpliva na podobnost analiznih rezultatov pri vzorcih, odvzetih iz različnih delov pošiljk ali na iztoku iz cisterne v intervalih med praznjenjem. Postopek mešanja mleka velja za učinkovitega, če je razlika v vsebnosti maščobe med dvema vzorcema, odvzetima pod navedenimi pogoji, manjša od 0,1 %.

V veliki posodi, ki ima odprtino za izliv na dnu, je lahko na točki izliva majhna količina mleka, ki tudi po mešanju ni reprezentativna za celotno vsebino. Zato bi bilo po možnosti treba vzorce odvzeti skozi vhodno odprtino. V primeru odvzema vzorcev na izhodni odprtini, odlijte dovolj mleka, da zagotovite reprezentativnost vzorcev glede na celotno količino.

4.2.5.2 Mešanje vsebine velikih posod ali skladiščnih, železniških ali cestnih cistern se lahko opravi:

- z mehanskim mešalnikom, ki je vgrajen v cisterne in ga poganja elektromotor,

- s propelerjem ali mešalnikom, ki ga poganja elektromotor in je nameščen na vhodno odprtino, pri čemer je mešalnik potopljen v mleko,

- v primeru železniških ali cestnih cistern z recirkulacijo mleka skozi pretočno cev, ki je pritrjena na črpalke za praznjenje cisterne in vstavljena skozi vhodno odprtino,

- s čistim filtriranim stisnjenim zrakom. V tem primeru bi se morala uporabiti minimalni zračni tlak in volumen, da se prepreči nastanek žarkega priokusa.

4.3 Avtomatsko ali polavtomatsko vzorčenje

Avtomatske ali polavtomatske naprave za vzorčenje surovega mleka iz dobav proizvajalcev se lahko uporabijo v skladu z navodili laboratorija za preskušanje ali drugega pristojnega organa.

Taka oprema se pred uporabo in v času uporabe v rednih presledkih ustrezno preskuša, kakor predpiše odgovorni organ. Ustreznost postopkov vzorčenja je treba preveriti, da se ugotovi:

- najmanjša količina zbranega mleka, ki jo je mogoče pravilno vzorčiti,

- stopnjo morebitnega prelitja (ki je povezana z najmanjšo količino vzorca),

- sposobnost zagotoviti reprezentativen vzorec celote po pravilnem mešanju.

Pri uporabi avtomatske ali polavtomatske opreme za vzorčenje lahko odgovorni pristojni nacionalni organ predpiše:

- najmanjšo količino mleka, iz katere je treba odvzeti vzorec,

- najmanjšo količino vzorca,

- največjo količino prelitja,

- kakšno analizo je mogoče opraviti ali kakšni varnostni ukrepi se sprejmejo.

4.4 Vzorčenje toplotno obdelanega mleka za neposredno prehrano v maloprodajni embalaži

Vzorci toplotno obdelanega mleka za neposredno potrošnjo v maloprodajni embalaži morajo biti v originalnem pakiranju. Če je mogoče, je treba vzorce odvzeti iz pakirnega stroja ali hladilnice v predelovalnem obratu, takoj ko je mogoče po predelavi. Pri pasteriziranem mleku isti dan, kot je bilo predelano.

Vzorci se odvzamejo od vsakega tipa toplotno obdelanega mleka (pasterizirano, UVT-obdelano in sterilizirano) v številu, ki ustreza preiskavam, ki se bodo opravile, ter v skladu z navodili preskusnega laboratorija ali drugega pristojnega organa.

5. Identifikacija vzorca

Vzorec se označi z identifikacijsko kodo tako, da ga je mogoče brez težav identificirati s pomočjo navodil preskusnega laboratorija ali pristojnega organa, da se s tem zagotovi identiteta vzorca (glej 2).

6. Prevoz in shranjevanje vzorcev

Navodila za pogoje prevoza, shranjevanje ter čas med vzorčenjem in analizo mleka pripravi preskusni laboratorij v skladu z vrsto mleka in postopkom analize, ki se uporabi. Navodila se predpišejo v soglasju s pristojnim nacionalnim organom.

V navodila morajo biti vključene naslednje točke:

- med prevozom in hranjenjem se morajo sprejeti varnostni ukrepi, da se prepreči izpostavljenost kvarnim vonjavam in neposredni sončni svetlobi. Če je posoda za vzorce prosojna, se mora hraniti v temnem prostoru,

- vzorci surovega mleka, odvzeti za mikrobiološko analizo, se morajo prevažati in hraniti pri temperaturi med 0 °C in 4 °C. Čas med vzorčenjem in analizo mora biti kar se da kratek in v nobenem primeru ne daljši od 36 ur. Pristojni organ lahko dopusti temperaturo hranjenja med 0 °C in 6 °C, če čas med vzorčenjem in analizo ne presega 24 ur,

- vzorci pasteriziranega mleka, odvzeti za mikrobiološko analizo, se morajo prevažati in hraniti pri temperaturi med 0 °C in 4 °C. Čas med vzorčenjem in analizo mora biti kar se da kratek, v nobenem primeru pa ne daljši od 24 ur,

- vzorci mleka za mikrobiološko analizo, ko ne gre za surovo ali pasterizirano mleko, se morajo hraniti v laboratoriju na hladnem, čas med vzorčenjem in analizo pa mora biti kar se da kratek.

Posebni varnostni ukrepi za nekatere analize so podani v okviru različnih postopkov.

--------------------------------------------------

PRILOGA II

VSEBINA

| | Stran |

I. | Določitev zmrziščne točke… | 193 |

II. | Določitev aktivnosti fosfataze … | 199 |

III. | Določitev aktivnosti peroksidaze … | 202 |

IV. | Določitev skupnega števila mikroorganizmov – preskus s štetjem kolonij na plošči pri 30 oC… | 203 |

V. | Določitev skupnega števila mikroorganizmov – preskus s štetjem kolonij na plošči pri 21 oC… | 208 |

VI. | Določanje števila koliformnih bakterij – štetje kolonij pri 30 oC … | 212 |

VII. | Določanje števila somatskih celic … | 216 |

VIII. | Ugotavljanje prisotnosti antibiotikov in sulfonamidov … | 222 |

IX. | Ugotavljanje prisotnosti patogenih mikroorganizmov… | 231 |

I. DOLOČITEV ZMRZIŠČNE TOČKE

1. Obseg in področje uporabe

Ta postopek določa referenčni postopek za določanje zmrziščne točke surovega, pasteriziranega, UVT-obdelanega in steriliziranega polnega mleka, delno posnetega mleka in posnetega mleka s pomočjo naprave – krioskop v kateri se termostatsko nadzorovana kopel hladi z električnim hlajenjem, sonda krioskopa pa nadomesti stekleni živosrebrni termometer.

Na voljo sta dve vrsti instrumenta. Prvi je instrument s katerim se poišče najvišje zmrziščena "ravnini" na krivulji zamrzovanja, drugi pa se iz komercialnih razlogov namesti za odčitavanje vrednosti ob točno določenem času po začetku zamrzovanja. Ker se lahko krivulje zmrziščnih točk razlikujejo od enega mleka do drugega in med mlekom in standardnimi raztopinami, uporabljenimi za kalibracijo, je za ta referenčni postopek potrebna uporaba instrumentov, s katerimi se poišče ustrezna ravnina. Instrumenti s točno določenim časom odčitavanja se lahko uporabljajo za redne pregledne meritve.

Zmrziščna točka se lahko uporablja za ocenjevanje deleža dodane vode v mleku, pod pogojem da kislost vzorca ne presega 0,18 g mlečne kisline na 100 ml (glej 7.4).

2. Opredelitev

Zmrziščna točka mleka: Vrednost, pridobljena pri merjenju v skladu s postopkom, opisana in izražena v stopinjah Celzija ( oC).

3. Načelo

Preskusni delež mleka se podhladi na primerno temperaturo, odvisno od instrumenta, kristalizacija pa se povzroči z mehansko vibracijo, ki hitro dvigne temperaturo na ravnino, ki ustreza zamrznitvi vzorca.

Instrument se kalibrira s prilagajanjem instrumenta na pravilno odčitavanje za dve standardni raztopini, tako da se uporabi isti postopek kot za vzorce mleka. V teh pogojih ravnina prikaže zmrziščno točko mleka v stopinjah Celzija.

4. Naprave in steklovina

Običajna laboratorijska oprema ter zlasti:

4.1 Krioskop

Krioskop sestavljajo termostatsko nadzorovana hladilna kopel, sonda krioskopa (polprevodniški uporovni termometer) s spremljajočim vezjem in galvanometrom oz. "displej", mešalec vzorca ter naprava za sproženje zamrzovanja, skupaj z epruvetami za vzorce.

4.1.1 Hladilna kopel

Lahko se uporabljata dve vrsti hladilne kopeli.

4.1.1.1 Potopna kopel

Dobro izolirana posoda s primerno hladilno tekočino, ki se meša, tako da temperaturna razlika med katerima koli točkama v tekočini ne presega 0,2 oC. Temperatura tekočine ne niha za več kot ± 0,5 oC od nominalne vrednosti, ki jo navede proizvajalec.

Pomembno je, da se tekočina v hladilni posodi ohranja na konstantni ravni. Vsa površina epruvete za vzorec pod oznako za količino je prekrita s hladilno tekočino.

4.1.1.2 Cirkulacijska kopel

Stalen tok primerne hladilne tekočine kroži okrog epruvete za vzorec. Temperatura tekočine ne niha za več kot ± 0,5 oC od nominalne vrednosti, ki jo navede proizvajalec.

Primerna hladilna tekočina je 33 % (v/v) vodna raztopina etan 1,2 diola (etilen glikola).

4.1.2 Krioskop in spremljajoče vezje

Krioskop mora imeti stekleno sondo s premerom največ 1,80 ± 0,2 mm ter s premerom živega srebra največ 0,31 mm. Časovna konstanta sonde je manj kot 2 sekundi, vrednost β (glej opombo) pa je visoka. Delovna napetost, električni tok in konstanta porazdelitve morajo bili taki, da se temperatura sonde ne dvigne za več kot 0,0005 oC nad temperaturo okolice, ki je – 0,512 oC. Največje dovoljeno odstopanje upora je ± 5 %.

Kadar je sonda v delovnem položaju v krioskopu, mora konica steklenega zrnca ležati v osi epruvete za vzorec ter 44,6 ± 0,1 mm pod vrhom epruvete (glej sliko na strani 15). Zagotoviti se mora taka predloga, da se uporabniku omogoči namestitev sonde v ta položaj.

Opomba

β v skladu s formulo opredeljuje uporne in temperaturne značilnosti sonde:

–

×

=

βT2

kjer je:

T temperatura v kelvinih,

R je upor v omih pri temperaturi T,

–

×

1R je temperaturni koeficient

β je konstanta, ki je odvisna od materiala, uporabljenega za izdelavo sonde. Trenutno se priporoča vrednost, večja od 3000.

4.1.3 Merjenje in displej

4.1.3.1 Načelo merjenja

Uporabljeni instrument deluje na načelu iskanja prve "ravnine" na krivulji zmrzišča. Ravnina je del krivulje, kjer temperatura vsaj 20 sekund ostane konstantna v okviru ± 0,002 oC.

4.1.3.2 Ročno upravljanje

Upor sonde se mora uravnati z Wheatstoneovim mostom ali podobno napravo, tako da se uporabijo stabilni upori visoke kakovosti, katerih dovoljeno odstopanje ne presega ± 10 % in njihov temperaturni koeficient ni večji od 2 × 10–5 oC.

Variabilni (uravnalni) upor v svojem celotnem razponu ne sme odstopati od linearnosti za več kot 0,3 % svoje najvišje vrednosti.

Obstajati morajo načini prilagoditve uporov za namene kalibracije.

Merilna številčnica mora biti razdeljena na intervale, ki niso večji od 0,001 oC.

4.1.3.3 Avtomatsko upravljanje

Naprava za odčitavanje mora zagotoviti razlikovanje vsaj 0,001 oC na razponu od 0 to – 1 oC.

Stabilnost naprave za odčitavanje in spremljajoče vezje mora biti taka, da se zaporedne navedbe iste temperature ne razlikujejo za več kot 0,001 oC.

Linearnost vezja mora biti taka, da ne pride do nobene napake, večje od ± 0, 001 oC na kateri koli točki razpona med – 0,400 oC to – 0,600 oC, če se instrument uporablja pravilno.

4.1.4 Mešalna žička

Za mešanje preskusnega deleža se uporablja kovinska žička, ki ne reagira z mlekom in ima premer med 1 in 1,5 mm.

Mešalna žička bi se morala prilagoditi glede na amplitudo ter se namesti vertikalno tako, da je njen spodnji del v isti višini kot konica sonde krioskopa. Dovoljeno je odstopanje približno 1,5 mm nad ali pod tem položajem.

Mešalna žička mora vibrirati vstran z dovolj veliko amplitudo, ki jo navede proizvajalec (najmanj ± 1,5 mm), da se zagotovi, da med določanjem temperatura v preskusnem deležu ostaja enaka. Nikoli med običajnim mešanjem mešalna žička ne sme udariti ob sondo krioskopa ali steno epruvete.

4.1.5 Naprava za sprožanje zamrzovanja

To je lahko vsaka naprava, ki pri svojem delovanju v trenutku sproži zamrzovanje vzorca, tako da se temperatura preskusnega deleža dvigne proti zmrziščni točki. Za ta namen se lahko uporabi mešalna žička; eden od postopkov je ta, da se amplituda vibriranja za eno ali dve sekundi poveča, tako da mešalna žička udari ob steno epruvete za vzorec.

4.1.6 Epruvete za vzorce

Epruvete za vzorec (glej sliko 1) morajo biti steklene, dolge 50,8 ± 0,1 mm ter z zunanjim premerom 16,0 ± 0,1 mm in notranjim 13,5 ± 0,1 mm. Debelina stene se po celi epruveti ne sme razlikovati za več kot 0,1 mm.

Epruvete morajo imeti 29,8 mm pod koncem (21 mm nad dnom epruvete) oznako za količino, da se prikaže količina vzorca, ki je 2,5 ± 0,1 ml.

4.1.7 Vir energije

Napetost vira energije mora biti stabiliziran, bodisi z napravo ali pa od zunaj, tako da nihanje ne presega ± 1 % nominalne vrednosti, kadar omrežje niha za ± 6 %.

4.2 Analitska tehtnica

4.3 Merilna bučka z eno oznako, 1000 ml, razred A.

4.4 Sušilnik, dobro prezračen, lahko ohranja temperaturo 130 ± 1 oC

ali

Električna peč, dobro prezračena, lahko ohranja temperaturo 300 ± 25 oC

4.5 Eksikator

5. Reagenti

5.1 Voda, destilirana v napravi iz borosilikatnega stekla, zavreta in ohlajena na 20 ± 2 oC v bučki z nameščeno absorpcijsko cevko z ogljikovim dioksidom.

5.2 Natrijev klorid, analitske kakovosti, drobno mlet, pet ur sušen pri 300 ± 25 oC v peči ali pa vsaj 24 ur sušen v sušilcu pri 130 ± 1 oC in ohlajen na sobno temperaturo v učinkovitem eksikatorju.

5.3 Priprava standardnih raztopin

Zatehtajte ustrezno količino (glej Tabelo 1) suhega natrijevega klorida (5.2) v tehtalni steklenici. Raztopite v destilirani vodi (5.1), do konca prenesite v 1000 ml merilno bučko z eno oznako ter z vodo z 20 ± 2 oC razredčite do oznake.

Največ dva meseca hranite pri približno 5 oC v dobro zamašenih polietilenskih steklenicah s kapaciteto največ 250 ml.

Zmrziščna točka raztopin natrijevega klorida pri 20 oC

g NaCl/l | oC |

6,859 | –0,408 |

7,818 | –0,464 |

8,149 | –0,483 |

8,314 | –0,492 |

8,480 | –0,502 |

8,646 | –0,512 |

8,811 | –0,521 |

8,977 | –0,531 |

9,143 | –0,541 |

10,155 | –0,600 |

Pred uporabo standardne raztopine nekajkrat nežno obrnite in zavrtite steklenico, da se njena vsebino temeljito premeša. Nikoli se standardne raztopine ne sme močno stresati, da bi se vanjo vmešal zrak.

Vzorci standardne raztopine bi se morali odvzeti iz steklenice z vlivanjem raztopine v čisto suho čašo, tj. v ta namen se nikoli ne smejo uporabljati pipete.

Uporabljale naj se ne bi raztopine iz steklenic z manj kot četrtino vsebine, če pa niso konzervirane s fungicidom (npr. raztopino tiomersala, 10 g/l), naj se ne bi uporabljale raztopine, starejše od dveh mesecev.

6. Kalibracija krioskopa

Krioskop mora biti postavljen tako, da temperatura zraka v okolici ne odstopa za več kot 1 oC od temperature pri kateri se opravi kalibracija. Krioskop ne sme biti izpostavljen sončni svetlobi, prepihu in sobni temperaturi, višji od 26–27oC.

Zagotovite, da je krioskop v dobrem delovnem stanju v skladu z navodili proizvajalca ter da se je vklopil vsaj 12 ur pred kalibracijo. Preverite položaj sonde, amplitudo vibriranja mešalne žičke ter temperaturo hladilnih tekočin.

Izberite dve standardni raztopini (glej Tabelo 1 zgoraj), ki zelo tesno omejujeta pričakovane vrednosti zmrziščne točke vzorcev mleka, ki se preskušajo. Razlika med zmrziščnimi točkami pri dveh raztopinah naj bi po možnosti ne bila manjša od –0,100 oC.

(Pri nekaterih trenutno dostopnih krioskopih je vezje, ki spremlja sondo, oblikovano tako, da se uravnoteži na točno določeno vrednost zmrziščne točke v okviru merilnega razpona instrumenta. V teh primerih uporaba standardne tekočine z isto zmrziščno točko ki jo ima ena od raztopin za kalibriranje olajša postopek kalibracije, proizvajalec pa navede to vrednost).

Odpipetirajte 2,5 ± 0,1 ml ene standardne raztopine v čisto, suho epruveto za vzorec in uporabite krioskop.

Opomba

Epruvete za vzorce, ki se uporabljajo pri kalibraciji bi morale biti iz iste vrste stekla ter se oprati in sprati z demineralizirano vodo istočasno kot se operejo in sperejo epruvete, uporabljene pri preskušanju vzorcev mleka. Temperatura standardnih raztopin bi morala biti podobna temperaturi vzorcev mleka.

Prilagajajte kalibracijske kontrole, kakor prikazuje proizvajalec, dokler odčitek krioskopa ni enak zmrziščni točki standardne raztopine. Ponovite postopek z drugo standardno raztopino in na ta način postopek izmenjujte dokler zaporedna odčitavanja za vsako raztopino, brez nadaljnjega prilagajanja kalibracijskih kontrol, ne dajo pravilne vrednosti zmrziščne točke za vsako raztopino. Krioskop je tako pripravljen za uporabo in bo neposredno prikazal zmrziščno točko vzorca mleka, ne da bi se uporabil kakršenkoli popravek.

7. Priprava preskusnega vzorca

7.1 Shranite vzorce, po potrebi, pri temperaturi med 0 in 5 oC.

7.2 Iz vzorca odstranite vse vidne tujke ali trdno masleno maščobo, po potrebi s filtriranjem v čisto, suho posodo, ter vzorec nežno premešajte. Filter, če ga uporabite, ne sme reagirati z mlekom in je učinkovit, kadar se uporablja pri laboratorijski temperaturi.

7.3 Mleko se lahko preskuša kadar ima temperaturo hranjenja (med 0 in 5 oC), lahko pa se dopusti, da neposredno pred začetkom preskusa doseže laboratorijsko temperaturo. Nujno pa je, da imajo standardne raztopine in vzorci mleka ob uporabi isto temperaturo.

7.4 Istočasno s preskusom zmrziščne točke kar najbolj natančno določite kisline mleka, ki jih je mogoče titrirati. Vzorce, katerih kislost presega 0,18 g mlečne kisline na 100 ml mleka, ni mogoče pregledati.

7.5 UVT-obdelano in sterilizirano mleko pred pregledom vsaj 20 minut stojita v odprti posodi.

8. Postopek

8.1 Predhodna preverjanja

Preverite, da sta nivo in temperatura hladilne tekočine v skladu z navodili proizvajalca in da je, po potrebi, sonda krioskopa v prazni epruveti za vzorec v posodi za vzorce. Vklopite krioskop ter zagotovite, da se hladilna tekočina primerno meša ali kroži, kot je določeno. Ko je krioskop vklopljen vsaj 12 ur, preverite temperaturo hladilne tekočine ter položaj in amplitudo vibriranja mešalne žičke.

8.2 Rutinsko preverjanje kalibracije

Pred vsakim preskusnim obratovanjem izmerite zmrziščno točko standardne raztopine natrijevega klorida (npr. raztopine z zmrziščno točko pri –0,512 oC) dokler se dve zapored določeni vrednosti ne razlikujeta za več kot 0,001 oC. Če se povprečje teh vrednosti razlikuje od zmrziščne točke standardne raztopine za več kot 0,002 oC, ponovno kalibrirajte krioskop kot je opisano v 6.

Če se krioskop stalno uporablja, preverite kalibracijo vsaj enkrat vsako uro. Upoštevati je treba navodila proizvajalca.

8.3 Določitev zmrziščne točke mleka

Nekajkrat nežno obrnite in zavrtite steklenico z vzorcem mleka, da se njena vsebina premeša. Nikoli se vzorec ne sme stresati tako močno, da bi se vanj vmešal zrak.

Odpipetirajte 2,5 ± 0,1 ml mleka v čisto, suho epruveto za vzorec in odstranite vso odvečno količino s pipeto. Zagotovite, da sta sonda in mešalna žička čisti in suhi, po potrebi ju previdno obrišite z mehko, čisto krpico ki se površinsko ne kosmati, od spodaj navzgor.

Vstavite epruveto za vzorec v kalibriran krioskop v skladu z navodili proizvajalca. Mleko se bo ohladilo in zamrzovanje sprožilo pri temperaturi, ki jo določi proizvajalec, v okviru 0,1 oC.

(Pri nekaterih avtomatskih instrumentih se lahko ta temperatura prikaže na digitalnem displeju; pri ročnih instrumentih se potrebna natančnost doseže tako, da se zagotovi, da se zamrzovanje začne takrat, ko se kazalec galvanometra ali tanka črtica ujema z ustrezno oznako).

Če se iz kakršnega koli razloga zamrzovanje začne pod ali nad točno določenim temperaturnim razponom, opustite preskus in ga ponovite z drugim preskusnim deležem mleka. Če ponovitveni vzorec tudi zamrzne preden je dosežena točno določena temperatura, bi bilo treba nadaljnji delež vzorca segreti na 45 oC in ga pri tej temperaturi obdržati 5 minut, da se omogoči topljenje kristalizirane maščobe.

Ponovno ohladite na preskusno temperaturo in nemudoma opravite preskus. Temperatura mleka se bo po sprožitvi zamrzovanja hitro dvignila na vrednost, ki bo nekaj časa ostala dejansko konstantna preden bo zopet začela padati. Zmrziščna točka je enako najvišji temperaturi, ki se doseže v tem času, ta vrednost pa se evidentira.

Opomba

Čas, ko temperatura ostane konstantna, ter časovni interval med začetkom zamrzovanja in doseganjem najvišje temperature se bosta razlikovala od vzorca do vzorca, bosta pa precej krajša za vodo in standardne raztopine natrijevega klorida kot pa za mleko. Nujno je, da se evidentira temperatura, ki je najvišja.

Ko je merjenje zadovoljivo zaključeno, odstranite epruveto, sondo krioskopa sperite z vodo, jo posušite in jo od spodaj navzgor obrišite z mehko, čisto krpico ki se od zunaj ne kosmati ter nato opravite ponovno določitev na drugem deležu vzorca mleka.

Če je razlika med dobljenimi zmrziščnimi točkami večja od vrednosti ponovljivosti (0,004 oC), opravite ponovno določitev na drugem deležu vzorca. Pod pogojem, da se obe določitvi ujemata do 0,004 oC, bi se morali vrednosti evidentirati in uporabiti pri izračunavanju končnega rezultata.

8.4 Hlajenje sonde

Po uporabi instrumenta položite prazno epruveto za vzorec v posodo za vzorce ter znižajte obratovalno temperaturo, da sonda ostane hladna. (Pri nekaterih krioskopih to morda ni mogoče; v takih primerih je nujno zagotoviti, da se sonda primerno ohladi pred merjenjem, npr. tako, da se opravi nekaj navideznih določitev, dokler se ne pridobijo usklajeni odčitki).

9. Prikazovanje rezultatov

9.1 Izračun

Če se po rednem pregledu kalibracije ta potrdi, izračunajte povprečje dobljenih sprejemljivih vrednosti vzporednih zmrziščnih točk, zaokroženih na tri decimalna mesta.

Če je vsota dveh sprejemljivih vzporednih vrednosti neparno število, bi bilo treba povprečje zaokrožiti na najbližjo sodo število, kakor je prikazano v naslednjem primeru:

Zmrziščna točka ( oC)

Vzporedni vrednosti | Srednja vrednost |

| |

–0,544 | –0,545 | –0,544 |

–0,545 | –0,546 | –0,546 |

9.2 Natančnost

9.2.1 Ponovljivost (r): 0,004 oC.

9.2.2 Obnovljivost (R): 0,006 oC.

+++++ TIFF +++++

Slika 1Podroben prikaz sonde krioskopa 4.1 (položaj epruvete za vzorec glede na zrnce sonde in mešalno žičko)

II. DOLOČITEV AKTIVNOSTI FOSFATAZE

1. Obseg in področje uporabe

Ta postopek določa referenčni postopek za določitev aktivnosti fosfataze v pasteriziranem mleku.

2. Opredelitev

2.1 Fosfataza je merilo za količino aktivne alkalne fosfataze, prisotne v izdelku, izraženo kot količina fenola v mikroorganizmih, ki jih je sprostil 1 ml pasteriziranega mleka v pogojih, omenjenih v postopku.

2.2 Šteje se, da je vsako mleko, katerega aktivnost fosfataze je pod 4 μg/ml, fosfatazno negativno.

3. Načelo

Aktivnost fosfataze se ocenjuje iz količine fenola, sproščenega iz dinatrijevega fenil fosfata, dodanega vzorcu. Sproščeni fenol reagira z dibromokinonklorimidom, pri čemer nastane dibromoindofenol (modrikaste barve), ki se kolorimetrično izmeri pri 610 nm. Opravi se primerjava z vzorcem, pri katerem je bil fosfatazni encim uničen.

4. Reagenti

4.1 Pufer barijev borat hidroksid

4.1.1 V vodi raztopite 50,0 g barijevega hidroksida [Ba(OH)2.8H2O] in dopolnite do 1000 ml.

4.1.2 V vodi raztopite 22,0 g borove kisline [H3BO3] in dopolnite do 1000 ml.

4.1.3 Obe raztopini segrejte na 50 oC, zmešajte raztopini, premešajte, hitro ohladite na približno 20 oC, po potrebi uravnajte pH vrednost na 10,6 ± 0,1 z dodajanjem raztopine 4.1.1 ali 4.1.2. Filtrirajte. Shranite raztopino v tesno zamašeni posodi.

4.1.4 Pred uporabo raztopino razredčite z enako količino vode.

4.2 Pufer za razvijanje barve

V vodi raztopite 6,0 g natrijevega metaborata (NaBO2) ali 12,6 g (NaBO2.4H2O) in 20,0 g natrijevega klorida (NaCl) ter dopolnite do 1000 ml.

4.3 Pufer za redčenje barve

Z vodo razredčite 10 ml pufra za razvijanje barve (4.2) do 100 ml.

4.4 Substrat pufra

Raztopite 0,1 g dinatrijevega fenilfosfat dehidrata brez fenola v 100 ml pufra (4.1.3) ali raztopite 0,5 g dinatrijevega fenilfosfata v 4,5 ml pufra za razvijanje barve (4.2), dodajte dve kapljici raztopine dibromkinonklorimida (4.6) in pustite stati na sobni temperaturi 30 minut. Ekstrahirajte tako nastalo barvo z 2,5 ml butan-1-ola in pustite stati, da se loči butan-1-ol. Odstranite butan-1-ol in ga zavrzite. Po potrebi ponovite ekstrakcijo.

Raztopina se lahko za nekaj dni shrani v hladilniku; pred uporabo razvijte barvo in ponovno ekstrahirajte. Neposredno pred uporabo pripravite substrat pufra z razredčenjem 1 ml te raztopine na 100 ml s pufrom barijev borat hidroksid (4.1.3).

4.5 Oborina cink-baker

V vodi raztopite 3,0 g cinkovega sulfata (ZnSO4, 7H2O) in 0,6 g bakrovega (II) sulfata (CuSO4, 5H2O) in dopolnite do 100 ml.

4.6 Raztopina 2.6-dibromkinonklorimida

Raztopite 40 ± 1 mg 2.6-dibromkinonklorimida (C6H2Br2CINO6) v 10 ml 96 % (v/v) etanola.

Shranite v temno obarvani steklenici v hladilniku. Zavrzite, če se razbarva ali pa je starejša od enega meseca.

4.7 Raztopina bakrovega (II) sulfata

V vodi raztopite 0,05 g bakrovega (II) sulfata (CuSO4.5H2O) in dopolnite do 100 ml.

4.8 Standardne raztopine fenola

4.8.1 Zatehtajte 200 ± 2 mg čistega brezvodnega fenola, prenesite v 100 ml merilno bučko, dodajte vodo, zmešajte in dopolnite do oznake. Ta osnovna raztopina v hladilniku ostane stabilna nekaj mesecev.

4.8.2 Z vodo razredčite 10 ml osnovne raztopine do 100 ml in premešajte. 1 ml vsebuje 200 μg fenola.

5. Naprave in steklovina

Opombe:

(a) Vso steklovino, zamaške in pribor za vzorčenje je treba previdno očistiti. Priporoča se, da se sperejo s sveže zavreto destilirano vodo ali da se očistijo s paro.

(b) Nekatere vrste plastičnih zamaškov lahko povzročijo onesnaženje s fenolom in njihova uporaba ni dovoljena.

Običajna laboratorijska oprema ter zlasti:

5.1 Analitska tehtnica

5.2 Vodna kopel, ki se lahko ohranja pri 37 ± 1 oC.

5.3 Spektrofotometer, primeren za odčitavanje pri valovni dolžini 610 nm.

5.4 Epruvete, 16 ali 18 mm × 150 mm, po možnosti graduirane pri 5 in 10 ml.

5.5 Pipete

5.6 Stekleni liji primerne velikosti, npr. s premerom 5 cm.

5.7 Nagubani filtri s premerom vsaj 9 cm za srednjo hitrost filtriranja.

5.8 Merilne bučke za pripravo standardnih raztopin.

6. Postopek

Opombe:

(a) Med določanjem preprečite vpliv neposredne sončne svetlobe.

(b) Onesnaženje s sledovi sline ali potu lahko povzroči napačno pozitivne rezultate in se mu je treba izogibati. V zvezi s tem se posebna pozornost posveti pipetiranju.

6.1 Priprava preskusnega vzorca

6.1.1 Analizo opravite takoj po vzorčenju. Sicer pa hranite vzorec v hladilniku, vendar ne več kot dva dni.

6.2 Preskusni delež

V vsako od dveh epruvet (5.4) pipetirajte 1 ml preskusnega vzorca, pri čemer eno epruveto uporabite kot kontrolni vzorec ali negativno kontrolo.

6.3 Določanje

6.3.1 Negativno kontrolo dve minuti segrevajte v vreli vodi; prekrijte epruveto in čašo z vrelo vodo z aluminijasto folijo, da zagotovite segrevanje cele epruvete. Hitro ohladite na sobno temperaturo.

6.3.2 V preostalem delu postopka negativno kontrolo in preskusni vzorec obravnavajte na podoben način. Dodajte 10 ml substrata pufra (4.4) in zmešajte.

6.3.3 Nemudoma 60 minut inkubirajte vzorce v vodni kopeli (5.2), pri čemer vsebino občasno premešajte (vsaj štirikrat).

6.3.4 Dve minuti segrevajte v vreli vodi tako kot v 6.3.1. Hitro ohladite na sobno temperaturo.

6.3.5 V vsako epruveto dodajte 1 ml oborine cink-baker (4.5) in temeljito premešajte.

6.3.6. Filtrirajte skozi suh filtrski papir, zavrzite prva 2 ml, po potrebi ponovno filtrirajte, dokler ni filtrat popolnoma čist, ter odvzemite 5 ml v epruveti.

6.3.7 Dodajte 5 ml pufra za razvijanje barve (4.2).

6.3.8 Dodajte 0,1 ml raztopine dibromkinonklorimida (4.6), zmešajte ter pustite, da se barva razvija 30 minut pri sobni temperaturi.

6.3.9 V spektrofotometru pri valovni dolžini 610 nm izmerite absorbanco kontrolnega vzorca ali negativne kontrole.

6.3.10 Ponovite določanje z ustrezno raztopino vzorca, če absorbanca, izmerjena v skladu z 6.3.9, presega absorbanco standardne raztopine, ki vsebuje 20 μg fenola na epruveto, kakor je izmerjeno v skladu z 6.4.4. Pripravite razredčino z mešanjem enega volumenskega dela preskusnega vzorca z ustreznim volumenskim delom deleža preskusnega vzorca, previdno segretega do vrelišča, da se inaktivira fosfataza.

6.4 Priprava kalibracijske krivulje

6.4.1 Pripravite primerno serijo razredčenih standardnih raztopin, začenši pri standardni raztopini fenola (4.8.2), ki vsebuje 0 (kontrolni vzorec ali negativna kontrola), 2, 5, 10 in 20 μg fenola na mililiter in pipetirajte 1 ml vode oziroma 1 ml štirih standardnih raztopin fenola v vsako od petih epruvet.

6.4.2 V vsako epruveto dodajte 1 ml raztopine bakrovega (II) sulfata (4.7), 5 ml pufra za redčenje barve (4.3), 3 ml vode in 0,1 ml raztopine dibromkinonklorimida (4.6); premešajte.

6.4.3 Pustite, da se barva razvija 30 minut pri sobni temperaturi.

6.4.4 V spektrofotometru pri valovni dolžini 610 nm (5.3) izmerite absorbanco kontrolnega vzorca ali negativne kontrole.

6.4.5 Iz vrednosti absorbance (6.4.4), pridobljenih za vsako količino dodanega fenola (6.4.1), izračunajte regresijsko premico s postopkom najmanjših kvadratov.

7. Prikazovanje rezultatov

7.1 Izračunavanje in formule

7.1.1 Iz odčitka absorbance (6.3.9) izračunajte količino fenola, tako da uporabite dobljeno regresijsko premico (6.4.5).

7.1.2 Izračunajte fosfatazo, izraženo v mikrogramih fenola na mililiter pasteriziranega mleka po naslednji formuli:

Fosfataza = 2,4 × A × D

kjer je

A količina fenola v mikrogramih, pridobljena po 7.1.1;

D faktor redčenja razredčine v skladu z 6.3.10 (brez redčenja je D = 1);

Faktor 2,4 je faktor redčenja (5/12 1 ml preskusnega vzorca) — Glej 6.2 v zvezi s 6.3.2, 6.3.5 in 6.3.6.

7.2 Natančnost

7.2.1 Ponovljivost (r) : 2 μg fenola/ml.

7.2.2 Obnovljivost (R) : 3 (predhodno) μg fenola/ml.

7.2.3 Če se redčenje uporabi v skladu z 6.3.10, se mejni vrednosti iz 7.2.1 in 7.2.2 nanašata na rezultate, pridobljene z razredčenim vzorcem.

III. DOLOČITEV AKTIVNOSTI PEROKSIDAZE

1. Obseg in področje uporabe

Ta postopek določa referenčni postopek za dokazovanje prisotnosti ali odsotnosti encima peroksidaze v mleku kot kontrole pasterizacije.

2. Opredelitev

Pozitivna reakcija peroksidaze:

Če je mleko pravilno pasterizirano, se bo v 30 sekundah po mešanju pojavila modra barva.

Negativna reakcija peroksidaze:

V 30 sekundah po mešanju se ne bo pojavila nobena barva.

3. Načelo

Encim peroksidaze razgradi vodikov peroksid. Sproščeni atomski kisik oksidira brezbarvni 1,4-fenilendiamin v škrlatno rdeč indofenol (Storchev preskus). Intenzivnost barve je sorazmerna s koncentracijo encima.

4. Reagenti

4.1 Raztopina 1,4 fenilendiamina

Raztopite 2 g 1,4-fenilendiamina (C6H8N2) v topli (50 oC) vodi in dopolnite do 100 ml. Hranite raztopino v temno rjavi steklenici s steklenim zamaškom ter shranite v hladnem in temnem prostoru. Po pripravi raztopina 1,4-fenilendiamina v enem ali dveh dneh tvori usedlino; takrat jo je treba zavreči.

4.2 Raztopina vodikovega peroksida

V vodi razredčite 9 ml 30 % vodikovega peroksida in dopolnite do 100 ml. Za stabilizacijo na liter raztopine dodajte 1 ml koncentrirane žveplove kisline.

Raztopina vodikovega peroksida je stabilna en mesec, če se hrani v temnem in hladnem prostoru ter v steklenici z zamaškom, ki preprečuje vsak stik z organskimi spojinami.

5. Postopek

5.1 Vnesite 5 ml vzorca mleka v čisto epruveto s primernim zamaškom.

5.2 Dodajte 5 ml raztopine 1,4-fenilendiamina (4.1).

5.3 Dodajte dve kapljici raztopine vodikovega peroksida (4.2).

5.4 Opazujte pojavljanje barve v 30 sekundah po mešanju. Če se modra barva pojavi kasneje kot v 30 sekundah po dodajanju reagentov, je reakcija nespecifična.

IV. DOLOČITEV ŠTEVILA MIKROORGANIZMOV – ŠTETJE KOLONIJ NA PLOŠČI PRI 30 oC

1. Obseg in področje uporabe

Ta postopek določa referenčni postopek za določitev števila mikroorganizmov s tehniko preštevanja kolonij pri 30 oC. Ta postopek se uporablja pri surovem in pasteriziranem mleku ter UVT-obdelanem in steriliziranem mleku, 15 dni predhodno inkubiranem pri 15 oC.

2. Opredelitev

Poimenovanje "mikroorganizmi" pomeni: organizmi, ki pri aerobni inkubaciji v opisanih pogojih tvorijo kolonije, ki jih je mogoče šteti.

3. Načelo

Določena količina vzorca mleka se v petrijevkah premeša z gojiščem in 72 ur inkubira pri 30 oC. Kolonije se preštejejo in izračuna se število mikroorganizmov na 1 ml surovega ali pasteriziranega mleka ali na 0,1 ml predhodno inkubiranega UVT-obdelanega ali steriliziranega mleka.

4. Naprave in steklovina

Običajna laboratorijska oprema ter zlasti:

4.1 Naprave

4.1.1 Pečica na vroči zrak, ki lahko deluje pri 170 do 175 oC.

4.1.2 Avtoklav, ki lahko deluje pri 121 ± 1 oC.

4.1.3 Inkubator, ki lahko povsod v notranjosti ohranja temperaturo 30 ± 1 oC.

4.1.4 pH meter, s kompenzacijo temperature, točno do ± 0,1 enote pH.

4.1.5 Vodna kopel, ki lahko deluje pri 45 ± 1 oC.

4.1.6 Leča s povečavo 2–4x.

4.1.7 Leča s povečavo 8–10x.

4.1.8 Števec.

4.1.9 Mešalec, ki lahko zmeša 1 ml vzorca mleka ali decimalne razredčine z 9 ml redčila in deluje na principu ekscentrične rotacije vsebine epruvete.

4.2 Steklovina

4.2.1 Epruvete, ki imajo primerne zamaške in so dovolj velike, da vsebujejo 10 ml primarne razredčine ali nadaljnjih decimalnih razredčin, pri čemer je dovolj prostora za mešanje.

4.2.2 Bučke s prostornino 150 do 250 ml ali epruvete s približno 20 ml prostornine za gojišče.

4.2.3 Pipete (zamašene z vatastimi zamaški) iz stekla ali sterilnega sintetičnega materiala, ki imajo nelomljivo konico z nominalno prostornino 1 ml in z izlivom s premerom 1,75 do 3 mm.

4.2.4 Petrijevke iz prozornega, neobarvanega stekla ali sterilnega sintetičnega materiala, pri čemer ima spodnja posodica notranji premer približno 90–100 mm. Notranja globina bi morala biti najmanj 10 mm. Dno nima nepravilnosti, ki otežujejo preštevanje kolonij.

4.2.5 Sterilizacija steklovine:

Steklovina se sterilizira po enem od naslednjih postopkov:

(b) tako da se pusti v pečici na vroč zrak (4.1.1) pri 170 do 175 oC vsaj eno uro;

(b) tako da se pusti v avtoklavu (4.1.2) pri 121 ± 1 oC vsaj 20 minut.

Pri uporabi avtoklava je treba biti pozoren na to, da se zagotovi zadostna penetracija pare – če se oprema sterilizira v posodah, te ne smejo biti tesno zaprte, pokrovčki bučk bi morali biti rahlo pritrjeni.

Steklovina, sterilizirana v avtoklavu, bi se morala sušiti s pihanjem pare.

Pipete se morajo sterilizirati v pečici na vroč zrak (4.1.1).

5. Gojišče – štetje kolonij na mlečnem gojišču

5.1 Sestava

Ekstrakt kvasa | 2,5 g |

Tripton | 5,0 g |

Glukoza D (+) ali dekstroza | 1,0 g |

Posneto mleko v prahu | 1,0 g |

Agar | 10 do 15 g, odvisno od želirnih lastnosti uporabljenega agarja. |

Voda | 1000 ml |

Posneto mleko v prahu ne sme vsebovati inhibitornih snovi. To bi bilo treba preveriti s primerjalnimi preskusi z uporabo posnetega mleka v prahu, za katerega je znano, da ne vsebuje inhibitornih snovi.

Priprava:

V vodi suspendirajte in raztopite sestavine v naslednjem vrstnem redu: ekstrakt kvasa, tripton, glukoze in, na koncu, posneto mleko v prahu. Pri postopku bo v pomoč segrevanje suspenzije. Dodajte agar in približno 30 minut segrevajte do vretja, pri čemer neprestano mešajte, dokler se agar popolnoma ne razpusti.

Po potrebi filtrirajte skozi filtrirni papir.

S pH metrom (4.1.4) preverite pH ter ga po potrebi z raztopino (vsaj 0,1 mol/l) natrijevega hidroksida ali klorovodikove kisline uravnajte tako, da je vrednost po sterilizaciji 6,9 ± 0,1 pri 25 oC.

5.2 Porazdelitev, sterilizacija in shranjevanje gojišča

Razlijte 100 do 150 ml gojišča (5.1) v bučke ali 12 do 15 ml v epruvete (4.2.2). Bučke in epruvete zamašite.

Petnajst minut sterilizirajte v avtoklavu (4.1.2) pri 121 ± 1 oC.

Preverite pH gojišča.

Če se gojišče ne uporabi takoj, ga shranite v temnem prostoru pri temperaturi med 1 in 5 oC, vendar ne za dlje kot en mesec po pripravi.

5.3 Pripravljeno dehidrirano gojišče

Gojišče (5.1) se lahko pripravi iz že pripravljenega dehidriranega gojišča. Upoštevajte navodila proizvajalca vendar pred raztapljanjem dodajte posneto mleko v prahu, če že ni sestavni del gojišča.

Uravnajte pH na vrednost 6,9 ± 0,1 pri 25 oC, kakor je opisano v 5.1, ter razlijte, sterilizirajte in shranite gojišče kot je opisano v 5.2.

6. Redčila

6.1 Raztopina peptona in soli

Sestava:

Pepton | 1,0 g |

Natrijev klorid (NaCl) | 8,5 g |

Voda | 1000 ml |

Priprava:

Raztopite sestavine v vodi, po potrebi segrevajte.

S pH metrom (4.1.4) preverite pH ter ga po potrebi z raztopino (vsaj 0,1 mol/l) natrijevega hidroksida ali klorovodikove kisline uravnajte tako, da je vrednost po sterilizaciji 7,0 ± 0,1 pri 25 oC.

6.2 Porazdelitev, sterilizacija in shranjevanje redčil

Razlijte redčilo (6.1) v epruvete (4.2.1) v takih količinah, da po sterilizaciji vsaka epruveta vsebuje 9,0 ± 0,2 ml redčila. Zamašite epruvete.

Petnajst minut sterilizirajte v avtoklavu (4.1.2) pri 121 ± 1 oC.

Preverite pH redčila.

Če se redčilo ne uporabi takoj, ga shranite v temnem prostoru pri temperaturi med 1 in 5 oC, vendar ne za dlje kot en mesec po pripravi.

6.3 Pripravljena dehidrirana redčila

Redčilo (6.1) se lahko pripravi iz že pripravljenih dehidriranih tablet ali praškov. Upoštevajte navodila proizvajalca. Uravnajte pH, kakor je opisano v 6.1 in razlijte, sterilizirajte in shranite redčila kot je opisano v 6.2.

7. Postopek

7.1 Taljenje gojišča

Pred začetkom mikrobiološkega pregleda, hitro stalite potrebno količino gojišča ter ga v vodni kopeli (4.1.5) temperirajte na 45 ± 1 oC.

7.2 Priprava vzorca mleka

Hitro petindvajsetkrat obrnite posodo z vzorcem mleka in ga temeljito premešajte, tako da se mikroorganizmi porazdelijo čim bolj enakomerno. Preprečiti je treba penjenje ali pa omogočiti, da se pena razpusti. Časovni presledek med mešanjem in odvzemom preskusnega deleža ne bi smel biti daljši od treh minut.

7.3 Priprava primarne razredčine (10-1) (surovo in pasterizirano mleko)

S sterilno pipeto (4.2.3) prenesite 1 ml vzorca (7.2) surovega ali pasteriziranega mleka v 9 ml redčila (6.1), pri čemer se izognete stiku med pipeto in redčilom. Temperatura redčila je približno enaka temperaturi vzorca mleka. To primarno razredčino 5 do 10 sekund previdno mešajte v mešalcu (4.1.9).

Primarna razredčina 10–1 je tako pridobljena.

7.4 Priprava nadaljnjih decimalnih razredčin (surovo in pasterizirano mleko).

S sterilno pipeto (4.2.3) prenesite 1 ml primarne razredčine (7.3) v 9 ml redčila (6.1), pri čemer upoštevate navodila iz 7.3.

Razredčina 10–2 je tako pridobljena.

Te postopke ponavljajte, da pridobite nadaljnje decimalne razredčine, tako dolgo, dokler ni mogoče pričakovati pridobitve ustreznega števila mikroorganizmov (8.1.1).

7.5 Inokulacija petrijevk

7.5.1 Surovo mleko: S sterilno pipeto (4.2.3) prenesite 1 ml vzorca in/ali ustrezne decimalne razredčine v petrijevko (4.2.4). Pregledati se morata vsaj dve razredčini, pripravite eno petrijevko za vsako izbrano razredčino (8.1.1).

7.5.2 Pasterizirano mleko: S sterilno pipeto (4.2.3) prenesite 1 ml vzorca in/ali ustrezne decimalne razredčine v petrijevko (4.2.4). Pregledati se morata vsaj dve razredčini, pripravite dve petrijevki za vsako izbrano razredčino (8.1.1).

7.5.3 UVT-obdelano mleko in sterilizirano mleko (pregledano po 15 dnevni inkubaciji pri 30 oC — Priloga A Direktive, poglavje VII, točka 5):

S sterilno pipeto (4.2.3) prenesite 0,1 ml vzorca mleka (7.2) v petrijevko (4.2.4). Pripravite dve petrijevki.

7.6 Vlivanje

V vsako inokulirano petrijevko vlijte približno 15 do 18 ml gojišča (7.1).

Takoj po vlivanju premešajte, tako da petrijevko vrtite dovolj, da po inkubaciji dobite enakomerno razporejene kolonije.

Čas med koncem priprave vzorca mleka in mešanjem glede na vrsto mleka, preskusni delež ali redčenje z gojiščem ni daljši od 15 minut.

Pustite, da se strdi na čisti, hladni, vodoravni površini.

7.7 Inkubacija petrijevk

Prenesite petrijevke v inkubator (4.1.3). Petrijevke inkubirajte obrnjene na glavo. Naložite jih največ šest eno na drugo. Skladovnice petrijevk bi morale biti ločene ena od druge ter od sten in vrha inkubatorja.

Pri 30 ± 1 oC inkubirajte 72 ± 2 uri.

7.8 Preštevanje kolonij

Preštejte kolonije v petrijevkah z največ 300 kolonijami.

Preglejte petrijevke pri zmanjšani svetlobi. Za lažje preštevanje se lahko uporabita primerna leča (4.1.6) in/ali števec (4.1.8). Ne zamenjujte delcev oborjene snovi v petrijevkah z zelo majhnimi kolonijami. Pozorno preglejte dvomljive primerke, pri čemer po potrebi uporabite lečo z močnejšo povečavo (4.1.7), za ločevanje kolonij od tujkov.

Šteje se, da je razpršena kolonija posamezna kolonija. Če je manj kot četrtina petrijevke preraščena z razpršenimi kolonijami, preštejte kolonije na neprizadetem delu petrijevke in izračunajte ustrezno število za celotno petrijevko. Če je več kot četrtina petrijevke preraščena z razpršenimi kolonijami, jo zavrzite.

8. Izračun in prikazovanje rezultatov

8.1 Surovo in pasterizirano mleko

8.1.1 Uporabite število iz vseh petrijevk, ki imajo med 10 in 300 kolonij (glej 8.1.3 in 8.1.4).

8.1.2 Število mikroorganizmov na 1 ml surovega ali pasteriziranega mleka se izračuna po formuli:

d

kjer je:

∑C vsota kolonij, preštetih kot je navedeno v 8.1.1,

(n1 + 0,1 n2)d enako količini nasajenega vzorca, kjer je:

n1 število petrijevk, preštetih pri prvi razredčini,

n2 število petrijevk, preštetih pri drugi razredčini,

d faktor redčenja iz katerega se pridobi prvo število.

Število je navedeno na dve mesti natančno. Kadar je številka, ki naj se zaokroži, pet, zaokrožite tako, da je številka neposredno na levi liha.

Primer (pasterizirano mleko):

Razredčina 10–2: 278 in 290 kolonij

Razredčina 10–3: 33 in 28 kolonij

Število/ml | =278 + 290 + 33 + 282 + 0,1 × 210–2 |

| = 6290,022 |

| = 28590 |

| = 29000 |

| = 2,9 × 104 |

8.1.3 Če gre samo za števila, manjša od 10, navedite število mikroorganizmov na mililiter kot "manj kot 10 x d na ml", pri čemer je "d" recipročna vrednost najnižjega faktorja redčenja.

8.1.4 Če gre samo za števila, ki presegajo 300 kolonij, vendar pa je štetje mogoče, izračunajte ocenjeno število in pomnožite z recipročno vrednostjo faktorja redčenja. Navedite rezultat kot "ocenjeno število mikroorganizmov na ml".

8.2 UVT-obdelano in sterilizirano mleko

Šteje se, da plošče, kjer je število kolonij večje od 10 kolonij pri 0,1 ml, ne izpolnjuje več zahtev Direktive 85/397/EGS.

9. Natančnost

Rezultati mednarodno sprejetih medlaboratorijskih primerjalnih preskušanj še niso na voljo.

V. DOLOČITEV ŠTEVILA MIKROORGANIZMOV – ŠTETJE KOLONIJ NA PLOŠČI PRI 21 oC

1. Obseg in področje uporabe

Ta postopek določa referenčni postopek za določitev števila mikroorganizmov s tehniko štetja kolonij na plošči pri 21 oC na pasteriziranem mleku po petdnevni inkubaciji mleka pri 6 oC za določitev stopnje onesnaženja pasteriziranega mleka s psihrofilnimi mikroorganizmi, ki so sposobni reprodukcije v mleku pri 6 oC.

2. Opredelitev

Poimenovanje "mikroorganizmi" pomeni: organizmi, ki pri aerobni inkubaciji v opisanih pogojih tvorijo kolonije, ki jih je mogoče šteti.

3. Načelo

Pasterizirano mleko se pet dni inkubira pri 6 oC. Določena količina vzorca mleka se v petrijevkah premeša z gojiščem in 25 ur inkubira pri 21 oC. Kolonije se preštejejo in izračuna se število mikroorganizmov na 1 ml pasteriziranega mleka.

4. Naprave in steklovina

Običajna laboratorijska oprema ter zlasti:

4.1 Naprave

4.1.1 Pečica na vroči zrak, ki lahko deluje pri 170 do 175 oC.

4.1.2 Avtoklav, ki lahko deluje pri 121 ± 1 oC.

4.1.3 Inkubatorji, ki lahko ohranjajo temperaturo

(a) 6 ± 0,2 oC

(b) 21 ± 1 oC

povsod v notranjosti.

4.1.4 pH meter, s kompenzacijo temperature, točno do ± 0,1 enote pH.

4.1.5 Vodna kopel, ki lahko deluje pri 45 ± 1 oC.

4.1.6 Leča s povečavo 2–4x.

4.1.7 Leča s povečavo 8–10x.

4.1.8 Števec.

4.1.9 Mešalec, ki lahko zmeša 1 ml vzorca mleka ali decimalne razredčine z 9 ml redčila in deluje na principu ekscentrične rotacije vsebine epruvete.

4.2 Steklovina

4.2.1 Epruvete, ki imajo primerne zamaški in so dovolj velike, da vsebujejo 10 ml primarne razredčine ali nadaljnjih decimalnih razredčin, pri čemer je dovolj prostora za mešanje.

4.2.2 Bučke s prostornino 150 do 250 ml ali epruvete s približno 20 ml prostornine za gojišče.

4.2.3 Pipete (zamašene z vatastimi zamaški) iz stekla ali sterilnega sintetičnega materiala, ki imajo nelomljivo konico z nominalno prostornino 1 ml in z izlivom s premerom 1,75 do 3 mm.

4.2.4 Petrijevke iz prozornega, neobarvanega stekla ali sterilnega sintetičnega materiala, pri čemer ima spodnja posodica notranji premer približno 90-100 mm. Notranja globina bi morala biti najmanj 10 mm. Dno nima nepravilnosti, ki otežujejo preštevanje kolonij.

4.2.5 Sterilizacija steklovine

Steklovina se sterilizira po enem od naslednjih postopkov:

(a) tako da se pusti v pečici na vroč zrak (4.1.1) pri 170 do 175 oC vsaj eno uro.

(b) tako da se pusti v avtoklavu (4.1.2) pri 121 ± 1 oC vsaj 20 minut.

Pri uporabi avtoklava je treba biti pozoren na to, da se zagotovi zadostna penetracija pare, npr. če se oprema sterilizira v posodah, te ne smejo biti tesno zaprte, pokrovčki bučk bi morali biti rahlo pritrjeni.

Steklovina, sterilizirana v avtoklavu, bi se morala sušiti s pihanjem pare.

Pipete se morajo sterilizirati v pečici na vroč zrak (4.1.1).

5. Gojišče – štetje kolonij na mlečnem gojišču

5.1 Sestava

Ekstrakt kvasa | 2,5 g |

Tripton | 5,0 g |

Glukoza D(+) ali dekstroza | 1,0 g |

Posneto mleko v prahu | 1,0 g |

Agar | 10 do 15 g, odvisno od želirnih lastnosti ž uporabljenega agarja |

Voda | 1000 ml |

Posneto mleko v prahu ne vsebuje inhibitornih snovi. To bi bilo treba preveriti s primerjalnimi preskusi z uporabo posnetega mleka v prahu, za katerega je znano, da ne vsebuje inhibitornih snovi.

Priprava:

V vodi suspendirajte in raztopite sestavine v naslednjem vrstnem redu: ekstrakt kvasa, tripton, glukoze in, na koncu, posneto mleko v prahu. Pri postopku bo v pomoč segrevanje suspenzije. Dodajte agar in približno 30 minut segrevajte do vretja, pri čemer neprestano mešajte, dokler se agar popolnoma ne razpusti.

Po potrebi filtrirajte skozi filtrirni papir.

S pH metrom (4.1.4) preverite pH ter ga po potrebi z raztopino (vsaj 0,1 mol/l) natrijevega hidroksida ali klorovodikove kisline uravnajte tako, da je vrednost po sterilizaciji 6,9 ± 0,1 pri 25 oC.

5.2 Porazdelitev, sterilizacija in shranjevanje gojišča

Razlijte 100 do 150 ml gojišča (5.1) v bučke ali 12 do 15 ml v epruvete (4.2.2). Bučke in epruvete zamašite.

Petnajst minut sterilizirajte v avtoklavu (4.1.2) pri 121 ± 1 oC.

Preverite pH gojišča.

Če se gojišče ne uporabi takoj, ga shranite v temnem prostoru pri temperaturi med 1 in 5 oC, vendar ne za dlje kot en mesec po pripravi.

5.3 Pripravljeno dehidrirano gojišče

Gojišče (5.1) se lahko pripravi iz že pripravljenega dehidriranega gojišča. Upoštevajte navodila proizvajalca vendar pred raztapljanjem dodajte posneto mleko v prahu, če že ni sestavni del gojišča.

Uravnajte pH na vrednost na 6,9 ± 0,1 pri 25 oC, kakor je opisano v 5.1, ter razlijte, sterilizirajte in shranite gojišče kot je opisano v 5.2.

6. Redčila

6.1 Raztopina peptona in soli

Sestava:

Pepton | 1,0 g |

Natrijev klorid (NaCl) | 8,5 g |

Voda | 1000 ml |

Priprava:

Raztopite sestavine v vodi, po potrebi segrevajte.

S pH metrom (4.1.4) preverite pH ter ga po potrebi z raztopino (vsaj 0,1 mol/l) natrijevega hidroksida ali klorovodikove kisline uravnajte tako, da je vrednost po sterilizaciji 7,0 ± 0,1 pri 25 oC.

6.2 Porazdelitev, sterilizacija in shranjevanje redčil

Razlijte redčilo (6.1) v epruvete (4.2.1) v takih količinah, da po sterilizaciji vsaka epruveta vsebuje 9,0 ± 0,2 ml redčila. Zamašite epruvete.

Petnajst minut sterilizirajte v avtoklavu (4.1.2) pri 121 ± 1 oC. Preverite pH redčila.

Če se redčilo ne uporabi takoj, ga shranite v temnem prostoru pri temperaturi med 1 in 5 oC, vendar ne za dlje kot en mesec po pripravi.

6.3 Pripravljena dehidrirana redčila

Redčilo (6.1) se lahko pripravi iz že pripravljenih dehidriranih tablet ali praškov. Upoštevajte navodila proizvajalca. Uravnajte pH, kakor je opisano v 6.1, in razlijte, sterilizirajte in shranite redčila kot je opisano v 6.2.

7. Postopek

7.1 Taljenje gojišča

Pred začetkom mikrobiološkega pregleda, hitro stalite potrebno količino gojišča ter ga v vodni kopeli (4.1.5) temperirajte na 45 ± 1 oC.

7.2 Priprava vzorca mleka

7.2.1 V inkubatorju (4.1.3(a)) 120 ± 2 uri inkubirajte neodprt paket pasteriziranega mleka ali, če to ni mogoče, reprezentativni vzorec najmanj 100 ml pri 6 ± 0,5 oC.

7.2.2 Po inkubaciji hitro petindvajsetkrat obrnite posodo z vzorcem mleka in ga temeljito premešajte, tako da se mikroorganizmi porazdelijo čim bolj enakomerno. Preprečiti je treba penjenje ali pa omogočiti, da se pena razpusti. Časovni presledek med mešanjem in odvzemom preskusnega deleža ne bi smel biti daljši od treh minut.

7.3 Priprava primarne razredčine (10–1)

S sterilno pipeto (4.2.3) prenesite 1 ml vzorca (7.2.2) v 9 ml redčila (6.1), pri čemer se izognete stiku med pipeto in redčilom. Temperatura redčila je približno enaka temperaturi vzorca mleka. To primarno razredčino 5 do 10 sekund previdno mešajte v mešalcu (4.1.9).

Primarna razredčina 10–1 je tako pridobljena.

7.4 Priprava nadaljnjih decimalnih razredčin

S sterilno pipeto (4.2.3) prenesite 1 ml primarne razredčine (7.3) v 9 ml redčila (6.1), pri čemer upoštevate navodila iz 7.3.

Razredčina 10–2 je tako pridobljena.

Te postopke ponavljajte, da pridobite nadaljnje decimalne razredčine, tako dolgo, dokler ni mogoče pričakovati pridobitve ustreznega števila mikroorganizmov (8.1).

7.5 Inokulacija petrijevk

S sterilno pipeto (4.2.3) prenesite 1 ml vzorca in/ali ustrezne decimalne razredčine v petrijevko (4.2.4). Pregledati se morata vsaj dve razredčini. Če je to primerno, pripravite dve petrijevki za vsako izbrano razredčino (8.1).

7.6 Vlivanje

V vsako inokulirano petrijevko vlijte približno 15 do 18 ml gojišča (7.1).

Takoj po vlivanju premešajte, tako da petrijevko vrtite dovolj, da po inkubaciji dobite enakomerno razporejene kolonije.

Čas med koncem priprave vzorca mleka in mešanjem razredčine z gojiščem ni daljši od 15 minut.

Pustite, da se strdi na čisti, hladni, vodoravni površini.

7.7 Inkubacija petrijevk

Prenesite petrijevke v inkubator (4.1.3(b)). Petrijevke inkubirajte obrnjene na glavo. Naložite jih največ šest eno na drugo. Skladovnice petrijevk bi morale biti ločene ena od druge ter od sten in vrha inkubatorja.

Pri 21 ± 1 oC inkubirajte 25 ur.

7.8 Preštevanje kolonij

Preštejte kolonije v petrijevkah z največ 300 kolonijami.

Preglejte petrijevke pri zmanjšani svetlobi. Za lažje preštevanje se lahko uporabita primerna leča (4.1.6) in/ali števec (4.1.8). Ne zamenjujte delcev oborjene snovi v petrijevkah z zelo majhnimi kolonijami. Pozorno preglejte dvomljive primerke, pri čemer po potrebi uporabite lečo z močnejšo povečavo (4.1.7), za ločevanje kolonij od tujkov.

Šteje se, da je razpršena kolonija posamezna kolonija. Če je manj kot četrtina petrijevka preraščena z razpršenimi kolonijami, preštejte kolonije na neprizadetem delu petrijevke in izračunajte ustrezno število za celotno petrijevko. Če je več kot četrtina petrijevke preraščena z razpršenimi kolonijami, jo zavrzite.

8. Izračun in prikazovanje rezultatov

8.1 Uporabite število iz vseh petrijevk, ki imajo med 10 in 300 kolonij (glej 8.3 in 8.4).

8.2 Število mikroorganizmov na 1 ml pasteriziranega mleka se izračuna po formuli:

d

kjer je:

∑C vsota kolonij, preštetih kot je navedeno v 8.1,

(n1 + 0,1 n2) d enako količini nasajenega vzorca, kjer je:

n1 število petrijevk, preštetih pri prvi razredčini,

n2 število petrijevk, preštetih pri drugi razredčini,

d faktor redčenja iz katerega se pridobi prvo število.

Število je navedeno na dve mesti natančno. Kadar je številka, ki naj se zaokroži, pet, zaokrožite tako, da je številka neposredno na levi liha.

Primer:

Razredčina 10–2: 278 in 290 kolonij

Razredčina 10–3: 33 in 28 kolonij

Število/ml | =278 + 290 + 33 + 282 + 0,1 × 210–2 |

| = 6290,022 |

| = 28590 |

| = 29000 |

| = 2,9 × 104 |

8.3 Če gre samo za števila, manjša od 10, navedite število mikroorganizmov na mililiter kot "manj kot 10 × d na ml"; "d" je recipročna vrednost najnižjega faktorja redčenja.

8.4 Če gre samo za števila, ki presegajo 300 kolonij, vendar pa je štetje mogoče, izračunajte ocenjeno število in pomnožite z recipročno vrednostjo faktorja redčenja. Navedite rezultat kot "ocenjeno število mikroorganizmov na ml".

9. Natančnost

Rezultati mednarodno sprejetih medlaboratorijskih primerjalnih preskušanj še niso na voljo.

VI. DOLOČANJE ŠTEVILA KOLIFORMNIH BAKTERIJ – ŠTETJE KOLONIJ PRI 30 oC

1. Obseg in področje uporabe

Ta postopek določa referenčni postopek za določanje števila koliformnih bakterij v pasteriziranem mleku s tehniko štetja kolonij pri 30 oC.

2. Opredelitev

Poimenovanje "koliformne bakterije" pomeni bakterije, ki pri 30 oC oblikujejo značilne kolonije ali neznačilne kolonije, ki fermentirajo laktozo in pri tem v opisanih pogojih proizvajajo plin.

3. Načelo

Določena količina vzorca mleka se v petrijevkah premeša z gojiščem in 24 ur inkubira pri 30 oC. Značilne kolonije se preštejejo, po potrebi pa se s preskušanjem sposobnosti fermentacije laktoze potrdi identiteta neznačilnih kolonij. Nato se izračuna število koliformnih bakterij na 1 ml pasteriziranega mleka.

4. Naprave in steklovina

Običajna laboratorijska oprema ter zlasti:

4.1 Naprave

4.1.1 Pečica na vroči zrak, ki lahko deluje pri 170 do 175 oC.

4.1.2 Avtoklav, ki lahko deluje pri 121 ± 1 oC.

4.1.3 Inkubator, ki lahko povsod v notranjosti ohranja temperaturo 30 ± 1 oC.

4.1.4 pH meter, s kompenzacijo temperature, točno do ± 0,1 enote pH.

4.1.5 Vodna kopel, ki lahko deluje pri 45 ± 1 oC.

4.1.6 Žičnata igla iz platine-iridija ali nikelj-kroma.

4.2 Steklovina

4.2.1 Epruvete s primernimi zamaški in prostornino 20 ml za potrditveno gojišče (5.2) in epruvete durham ustrezne velikosti za uporabo z epruvetami.

4.2.2 Bučke s prostornino 150 do 250 ml za trdno selektivno gojišče (5.1).

4.2.3 Pipete (zamašene z vatastimi zamaški) iz stekla ali sterilnega sintetičnega materiala, ki imajo nelomljivo konico z nominalno prostornino 1–10 ml in z izlivom s premerom 1,75 do 3 mm.

4.2.4 Petrijevke iz prozornega, neobarvanega stekla ali sterilnega sintetičnega materiala, pri čemer ima spodnja posodica notranji premer približno 90 do 100 mm. Notranja globina bi morala biti najmanj 10 mm. Dno nima nepravilnosti, ki otežujejo preštevanje kolonij.

4.2.5 Sterilizacija steklovine:

Steklovina se sterilizira po enem od naslednjih postopkov:

(a) tako da se pusti v pečici na vroč zrak (4.1.1) pri 170 do 175 oC vsaj eno uro.

(b) tako da se pusti v avtoklavu (4.1.2) pri 121 ± 1 oC vsaj 20 minut.

Pri uporabi avtoklava je treba biti pozoren na to, da se zagotovi zadostna penetracija pare – če se oprema sterilizira v posodah, te ne smejo biti tesno zaprte, pokrovčki bučk ali steklenic bi morali biti rahlo pritrjeni.

Steklovina, sterilizirana v avtoklavu, bi se morala sušiti s pihanjem pare.

Pipete se morajo sterilizirati v pečici na vroč zrak (4.1.1).

5. Gojišče

5.1 Vijoličasto rdeči laktozni agar z žolčem (VRBL agar). Trdno selektivno gojišče.

Sestava:

Pepton | 7 g |

Ekstrakt kvasa | 3,0 g |

Laktoza (C12H22O11. H2O) | 10,0 g |

Natrijev klorid (NaCl) | 5,0 g |

Žolčne soli | 1,5 g |

Nevtralno rdeča | 0,03 g |

Kristalno vijolična | 0,002 g |

Agar | 10 do 15 g (odvisno od želirnih lastnosti uporabljenega agarja) |

Voda | 1000 ml |

Priprava:

Suspendirajte in raztopite sestavine v vodi ter pustite nekaj časa stati, nato močno premešajte.

S pH metrom (4.1.4) preverite pH ter ga po potrebi z raztopino (vsaj 0,1 mol/l) natrijevega hidroksida ali klorovodikove kisline uravnajte tako, da je vrednost po vretju 7,4 ± 0,1 pri 25 oC.

Hitro zavrite, pri čemer občasno zavrtinčite, ter takoj razlijte po 100 do 150 ml v sterilne bučke (4.2.2). Gojišče v vodni kopeli (4.1.5) temperirajte pri 45 ± 1 oC.

Ob uporabi (glej 6.4) bi bilo treba preveriti sterilnost gojišča.

Gojišče uporabite v treh urah po njegovi pripravi.

5.2 Briljantno zeleni laktozni bujon z žolčem. Potrditveno gojišče.

Sestava:

Pepton | 10 g |

Laktoza (C12H22O11. H2O) | 10 g |

Dehidriran volovski žolč | 20 g |

Brilijantno zelena | 0,0133 g |

Voda | 1000 ml |

Priprava:

V vodi z vretjem raztopite sestavine.

S pH metrom (4.1.4) preverite pH ter ga po potrebi z raztopino (vsaj 0,1 mol/l) natrijevega hidroksida ali klorovodikove kisline uravnajte tako, da je vrednost po sterilizaciji 7,2 ± 0,1 pri 25 oC.

Po 10 ml gojišča razlijte v epruvete (4.2.1), ki vsebujejo epruvete durham. Zamašite epruvete.

Petnajst minut sterilizirajte v avtoklavu (4.1.2) pri 121 ± 1 oC.

Po sterilizaciji v epruvetah durham ni mehurčkov zraka.

Preverite pH gojišča.

Če se gojišče ne uporabi takoj, ga shranite v temnem prostoru pri temperaturi med 0 in 5 oC, vendar ne za dlje kot en mesec po pripravi.

5.3 Pripravljeno dehidrirano gojišče

Gojišče (5.1, 5.2) se lahko pripravi iz že pripravljenega dehidriranega gojišča. Upoštevajte navodila proizvajalca. Uravnajte pH ter razlijte, zavrite ali sterilizirajte in shranite gojišče kot je opisano v 5.1 in 5.2.

6. Postopek

6.1 Gojišče

Uporabite gojišče (VRBL agar), kakor je opisano v 5.1.

6.2 Priprava vzorca mleka

Hitro petindvajsetkrat obrnite posodo z vzorcem mleka in ga temeljito premešajte, tako da se mikroorganizmi porazdelijo čim bolj enakomerno. Preprečiti je treba penjenje ali pa omogočiti, da se pena razpusti. Časovni presledek med mešanjem in odvzemom preskusnega deleža ne bi smel biti daljši od treh minut.

6.3 Inokulacija petrijevk

S prenosom s sterilno pipeto (4.2.3) 1 ml vzorca mleka v vsako od treh petrijevk (4.2.4) se inokulirajo 3 ml vzorca mleka (6.2).

6.4 Vlivanje

Vlijte VRBL agar (6.1) v vsako inokulirano petrijevko, in sicer približno 12 ml.

Takoj po vlivanju premešajte, tako da petrijevko vrtite dovolj, da po inkubaciji dobite enakomerno razporejene kolonije.

Čas med koncem priprave vzorca mleka in mešanjem preskusnega deleža z gojiščem ni daljši od 15 minut.

Za namene sterilnosti kot kontrolni vzorec pripravite neinokulirano petrijevko z 12 ml VRBL agarja, ki se uporabi za inokulirane petrijevke.

Pustite, da se strdi na čisti, hladni, vodoravni površini, dokler se gojišče ne utrdi.

Po popolni strditvi vlijte vsaj 4 ml VRBL agarja (6.1) na površino inokuliranega gojišča.

Pustite, da se strdi.

6.5 Inkubacija petrijevk

Prenesite petrijevke v inkubator (4.1.3). Petrijevke inkubirajte obrnjene na glavo. Naložite jih največ šest eno na drugo. Skladovnice petrijevk bi morale biti ločene ena od druge ter od sten in vrha inkubatorja.

Pri 30 ± 1 oC inkubirajte 24 ± 2 uri.

6.6 Preštevanje kolonij

6.6.1 Preštejte kolonije v petrijevkah z največ 150 kolonijami. Preštejte temno rdeče obarvane kolonije s premerom vsaj 0,5 mm, z obrobno usedlino, značilno za koliformne bakterije, ali brez nje.

6.6.2 Če imajo vse, ali le nekaj kolonij, neznačilen videz (se razlikujejo po barvi, velikosti ali pri tvorjenju usedline iz tipičnih kolonij), izvedite potrditveni preskus (6.7).

6.7 Potrditveni preskus

V skladu z navedbami v 6.6.2 izvedite potrditveni preskus na ustreznem številu (tj. 3 do 5) neznačilnih kolonij s postopkom inokulacije briljantno zelenega laktoznega bujona z žolčem (5.2) v epruvete z uporabo žičnate igle (4.1.6). Pri 30 ± 1 oC inkubirajte epruvete 24 ± 2 uri.

Šteje se, da so kolonije, ki proizvajajo plin v epruveti durham, potrjene koliformne bakterije.

7. Izračun in prikazovanje rezultatov

7.1 Uporabite števila (glej 7.4) iz petrijevk, ki vsebujejo manj kot 150 kolonij.

7.2 Če se uporabi potrditveni preskus, izračunajte število kolonij koliformnih bakterij iz odstotka potrjenih kolonij koliformnih bakterij.

7.3 Število koliformnih bakterij na 1 ml pasteriziranega mleka se izračuna po formuli:

n

kjer je:

∑C skupno število kolonij koliformnih bakterij (7.1 v povezavi s 7.2), odkritih pri pregledu vzorca mleka (3 ml),

N število mililitrov pregledanega vzorca (6.3) (3 ml).

Število je navedeno na dve mesti natančno, kadar je kolonij več kot 100. Kadar je številka, ki naj se zaokroži, pet, zaokrožite tako, da je številka neposredno na levi liha.

Če gre samo za števila, ki presegajo 150 kolonij, navedite rezultat kot "ocenjeno število koliformnih bakterij na 1 ml".

8. Natančnost

Rezultati mednarodno sprejetih medlaboratorijskih primerjalnih preskušanj še niso na voljo.

VII. DOLOČITEV ŠTEVILA SOMATSKIH CELIC

Postopek določa dva postopka kot referenčna postopka za določitev somatskih celic.

A. Mikroskopska metoda

B. Fluor opto-elektronska metoda

A. Mikroskopska metoda

1. Obseg in področje uporabe

Ta postopek določa referenčni postopek za preštevanje somatskih celic v surovem mleku.

Ta postopek določa postopek za preštevanje števila celic v vzorcu mleka, da se kalibrira in preveri točnost fluor opto-elektronskega postopka (glej B.1).

2. Opredelitev

V tem postopku so somatske celice tiste celice, npr. levkociti in epitelne celice, katerih jedra se lahko jasno obarvajo pri uporabi metilen modre.

3. Načelo

0,01 ml mleka se razmaže na 1 cm2 objektnega stekelca. Film se posuši in obarva. Štetje se opravi s pomočjo mikroskopa. Število somatskih celic, preštetih v določenem območju, se pomnoži z delovnim faktorjem, da se pridobi število celic/ml.

4. Reagenti

Uporabiti se morajo kemikalije analitske čistosti.

Raztopina barvila:

Sestava:

Metilen modra | 0,6 g |

Etanol – 99 % | 54 ml |

1,1,1-trikloroetan ali tetrakloroetan | 40 ml |

Led-ocetna kislina | 6 ml |

Opozorilo

Tetrakloretan je strupen. Če se uporablja, je treba pripravo in uporabo izvesti v digestoriju.

Priprava:

V steklenici zmešajte etanol in 1,1,1-trikloretan ali tetrakloretan ter v vodni kopeli segrevajte na 60 do 70 oC. Dodajte metilen modro, previdno premešajte, 12 do 24 ur hladite v hladilniku na 4 oC ter dodajte led-ocetno kislino. Prefiltrirajte s filtrom z velikostjo por 10 do 12 mikronov ali manj ter raztopino barvila shranite v za zrak nepropustni steklenici. Če se oblikujejo delci ali usedlina, pred uporabo še enkrat prefiltrirajte.

5. Naprave in steklovina

5.1 Mikroskop, s povečavo × 500 do × 1000.

5.2 Mikrobrizgalka, 0,01 ml s točnostjo ± 2 % ali točneje.

5.3 Objektno stekelce s površino 20 mm × 5 mm, označeno za film, ali standardno objektno stekelce in šablona 20 mm × 5 mm za film.

5.4 Uravnana vroča plošča (30–50 oC) za sušenje objektnih stekelc.

5.5 Ventilator (fen) za sušenje filma.

5.6 Vodna kopel, ki lahko deluje pri 30 do 40 oC za segrevanje vzorca mleka.

5.7 Objektno stekelce z mikrometrsko delitvijo, z razdelki po 0,01 mm.

6. Postopek

6.1 Vzorec mleka

Vzorec mleka je treba preskusiti v šestih urah po vzorčenju. Med hranjenjem temperatura vzorca ne sme preseči 6 oC. Zamrzitev je treba preprečiti.

6.2 Priprava vzorca v laboratoriju

Segrevajte vzorec v vodni kopeli (5.6) na 30 do 40 oC. Nato previdno premešajte. Shladite na temperaturo, pri kateri se je mikrobrizgalka (5.2) kalibrirala, tj. na 20 oC.

6.3 Predobdelava objektnih stekelc

Očistite objektna stekelca (5.3), npr. z etanolom, posušite z neprašnim papirjem, požgite in ohladite. Shranite v škatli, da se ne nabira prah.

6.4 Priprava filma

Iz vzorca, pripravljenega kakor je navedeno zgoraj, z mikrobrizgalko (5.2) odvzemite 0,01 ml mleka. Previdno očistite zunanji del mikrobrizgalke, ki je prišla v stik z mlekom. Položite brizgalko na objektno stekelce (5.3), pri čemer najprej orišete obliko (20 mm × 5 mm). Nato čim bolj enakomerno zapolnite površino. Posušite film na uravnani vroči plošči (5.4), dokler ni popolnoma suh.

Pripraviti in pregledati je treba vsaj dva filma iz vsakega vzorca mleka.

6.5 Obarvanje filma

Za 10 minut pomočite v raztopino barvila (4). Posušite, če je potrebno si pomagajte s fenom (5.5). Pomočite filme v vodovodno vodo dokler se odvečno barvilo ne izpere. Ponovno posušite in shranite tako, da se ne nabira prah.

6.6 Kalibracija mikroskopskega polja

Odvisno od izbrane povečave (× 500 do × 1000) z objektnim stekelcem z mikrometrsko delitvijo (5.7) določite premer mikroskopskega polja.

7. Preštevanje in izračunavanje

7.1 Preštevanje celic

Uporabite mikroskop (5.1). Namesto celic se preštevajo samo jedra. Ta so lahko prepoznavna, za preštevanje pa bi moralo v mikroskopskem polju biti vidnih vsaj polovica jeder. Preštejte črte ali polja čez srednjo tretjino filma, izognite pa se preštevanju črt ali polj izbranih izključno iz obrobnih delov filma. Skrbno pripravo filmov in s tem zanesljivost rezultatov je treba preveriti vsaj enkrat na mesec, tako da se preštejejo različni deli filma. Preštevanje se lahko izvede tudi s preštevanjem mikroskopskih polj v sistemu, tako da so vsi deli filma enakomerno zastopani.

7.2 Najmanjše število celic, ki jih je treba prešteti

Ker se mikroskopsko štetje somatskih celic lahko uporablja tudi za standardizacijo avtomatskih in mehaniziranih postopkov štetja, koeficient variacije števil pri identičnih vzorcih ne sme biti višji od koeficienta pri elektronskih instrumentih. Koeficient variacije pri vzorcu mleka, ki vsebuje 400000 do 600000 celic/ml ne bi smel presegati 5 %.

Število somatskih celic, ki jih je treba prešteti v vsakem vzorcu, mora v skladu z značilnostmi Poissonove distribucije biti vsaj 400, da se izpolni ta ponovljivost.

Poissonova distribucija predpostavlja

M = V = s2,

kjer je

M srednja vrednost.

V varianca

in

s standardno odstopanje.

Koeficient variacije je:

CV =

M

ali

CV =

ali

CV =

M (srednja vrednost) kaže število delcev (celic), ki so se preštele (tj. 400 za KV = 5 %).

7.3 Izračun delovnega faktorja

Ob uporabi 0,01 ml mleka se delovni faktor izračuna v skladu z 7.3.1 ali 7.3.2.

7.3.1 Preštevanje črt čez film

Črte, ki jih je treba prešteti, so dolge 5 mm vsaka. Širina črte se ujema s premerom mikroskopskega polja, kakor ga določi objektno stekelce z mikrometrsko delitvijo (5.7).

Delovni faktor =

20 × 100d × b

kjer je:

d premer mikroskopskega polja v mm, določen z objektnim stekelcem z mikrometrsko delitvijo (5.7)

b število v celoti preštetih črt.

7.3.2 Preštevanje mikroskopskih polj v srednji tretjini filma ali z mrežo:

Delovni faktor =

Π × d

× s

=

12 732d2× s

kjer je:

d premer mikroskopskega polja v mm, določen z objektnim stekelcem z mikrometrsko delitvijo (5.7)

s število preštetih polj.

7.4 Izračun vsebnosti celic

Število preštetih somatskih celic (7.1 in 7.2) se pomnoži z delovnim faktorjem (7.3), da se pridobi število celic na ml mleka.

7.5 Natančnost

Koeficient variacije (glej 7.2) ne sme presegati 5 %.

Rezultati mednarodno sprejetih medlaboratorijskih primerjalnih preskušanj še niso na voljo.

B. Fluor opto-elektronska metoda

1. Obseg in področje uporabe

Ta postopek določa referenčni postopek, ki se po ustrezni kalibraciji (glej A.1) lahko uporabi za štetje somatskih celic v surovem mleku – s kemičnim konzerviranjem ali brez njega.

2. Opredelitev

V tem postopku so somatske celice delci z najmanjšo intenzivnostjo fluorescence zaradi obarvanja DNA v jedru somatskih celic.

3. Načelo

Del vzorca (tj. 2 ml) se temeljito premeša s puferno raztopino in fluorescentno raztopino. Del mešanice se nato v obliki tankega filma prenese na krožečo ploščo, ki mikroskopu služi kot ravnina objekta.

Vsaka celica proizvaja električni pulz, ki se ojača in zapiše. Število somatskih celic se natisne v tisočih na ml.

4. Reagenti

Uporabiti se morajo kemikalije analitske čistosti, razen če ni drugače navedeno. Voda bi morala biti destilirana ali deionizirana ali temu enakovredne kakovosti.

4.1 Puferna raztopina

Sestava:

Kalijev vodikov ftalat | 51,0 g |

Kalijev hidroksid | 13,75 g |

Polietilenglikol-mono-p(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenileter (npr. Triton X-100), 1 vol % | 10 ml |

pH 5,7 do 5,9. Dopolnite z vodo do 10000 ml. | |

Priprava:

Posamezne sestavine se zmešajo. V za zrak neprepustni posodi se ne sme hraniti več kot sedem dni.

4.2 Fluorescentna raztopina (osnovna raztopina)

Sestava:

Etidijev bromid | 1,0 g |

Dopolnite z vodo do 1000 ml.

Priprava:

Etidijev bromid se raztopi v vodi. V za zrak in svetlobo nepropustni steklenici se lahko hrani največ dva meseca.

4.3 Fluorescentna raztopina (delovna raztopina)

20 ml osnovne raztopine (4.2) se zmeša s puferno raztopino (4.1), da dobimo 1000 ml. Delovna raztopina se ne bi smela uporabljati dlje kot sedem dni.

4.4 Čistilna raztopina

Sestava:

Puferna raztopina (4.1) | 10 ml |

Polietilenglikol-mono-p(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenileter (npr. Triton x-100), 1 vol % | 10 ml |

Amoniak, 25 vol % | 25 ml |

Dopolnite z vodo do 10000 ml.

Priprava:

Posamezne sestavine se zmešajo. Ne bi se smela hraniti v več kot 30 dni.

5. Naprave in steklovina

5.1 Naprava za štetje, ki deluje na fluorescenčno optičnem principu.

Opomba

Pred uporabo je treba instrument kalibrirati. Razmerje med prostornino delcev, ki jih je treba prešteti in pragom, nad katerim se opravi štetje, je tako določeno. Naprava se kalibrira v skladu z navodili proizvajalca tako, da se uporabijo vzorci, katerih vsebnost celic se je določila z mikroskopskim postopkom (A).

5.2 Vodna kopel s kroženjem, ki lahko deluje pri 40 ± 1 oC.

5.3 Epruveta, primerno zatesnjena, približno 15 ml.

6. Vzorec mleka

6.1 Vzorec je treba shraniti pri nizki temperaturi v epruveti (5.3). Če vzorec ni kemično konzerviran, se ne bi smel preštevati v prvih 24 urah po molži, ker bo število prenizko. Temperatura pri hranjenju ne sme biti višja od 6 oC.

6.2 Konzerviranje

Kemično konzerviranje se opravi v 24 urah. Opraviti se mora čim prej po vzorčenju.

6.2.1 Vzorec se lahko kemično konzervira tako, da se mu doda eden od naslednjih konzervansov:

- ortoborova kislina:

končna koncentracija ortoborove kisline v vzorcu ne sme presegati 0,6 g/100 ml. Tako konzervirani vzorec se lahko pri 6 do 12 oC shrani za največ nadaljnjih 24 ur,

- kalijev dikromat:

končna koncentracija kalijevega dikromata ne sme presegati 0,2 g/100 ml. Tako konzervirani vzorec se lahko pri 6 do 12 oC shrani za največ nadaljnjih 72 ur,

- natrijev azid:

vzorci se lahko konzervirajo z natrijevim azidom do končne koncentracije 0,024 g/100 ml, pod pogojem, da se vzorec ohladi na 6 do 12 oC takoj po vzorčenju ter štetje opravi v 48 urah po vzorčenju,

- bronopol:

vzorec se lahko konzervira z bronopolom do končne koncentracije 0,05 g/100 ml, pod pogojem, da se vzorec ohladi na 6 do 12 oC takoj po vzorčenju ter štetje opravi v 72 urah po vzorčenju.

6.2.2 Vzorec, ki je že konzerviran z ortoborovo kislino, se lahko konzervira še za nadaljnjih 48 ur, pri čemer se uporabi kalijev dikromat.

Opomba

Pri vzorcih, konzerviranih s kalijevim dikromatom je treba upoštevati lokalne razmere glede odvajanje odpadnih vod.

7. Postopek

7.1 Predhodna obdelava vzorca

Mleko, ki ga je treba pregledati, se po molži za vsaj 24 ur shrani pri približno 2 do 6 oC. Preštevanje vzorcev na dan molže ni priporočljivo ne da bi se opravila predhodna obdelava, ker so lahko rezultati prenizki. Če je preštevanje takega vzorca nujno, se ta vsaj tri ure predhodno obdela s kalijevim dikromatom (glej 6.2.1).

7.2 Priprava

Predhodno obdelani vzorec (glej 7.1) ali neobdelani vzorec, ki je star vsaj en dan, se v vodni kopeli (5.2) segreje na približno 40 oC. Vzorec se nato shrani pri sobni temperaturi, dokler štetje ni opravljeno.

7.3 Štetje celic

Štetje se opravi z uporabo naprave za štetje (5.1) v 15 minutah po koncu segrevanja (glej 7.2). Neposredno pred štetjem se vzorec temeljito premeša, da se somatske celice razporedijo čim bolj homogeno.

Nadaljnje redčenje in priprava vzorca se v instrumentu opravita avtomatsko.

8. Natančnost

Rezultati za ponovljivost (r) in obnovljivost (R) iz medlaboratorijskih primerjalnih preskušanj niso na voljo. V prihodnje se bodo podatki o natančnosti navedli.

Podatki, ki so na voljo na nacionalni ravni, dopuščajo naslednje ocene:

(1) Število celic med

400000

in

500000

/ml

- standardno odstopanje za ponovljivost:

sr = 20000 celic/ml

(enakovredno koeficientu variacije 5–4 %)

- standardno odstopanje za obnovljivost:

sR = 40000 celic/ml

(enakovredno koeficientu variacije 10–8 %)

9. Kontrola točnosti

Kontrola točnosti se opravi tako, da se uporabijo vzorci z znano vsebnostjo celic, določeno z mikroskopskim štetjem celic v nacionalnem referenčne laboratoriju.

VIII. UGOTAVLJANJE PRISOTNOSTI ANTIBIOTIKOV IN SULFONAMIDOV

OBSEG IN PODROČJE UPORABE

Ta postopek določa referenčni postopek za ugotavljanje antibiotikov in sulfonamidov v surovem mleku in toplotno obdelanem mleku.

Referenčni postopek vključuje:

A. Kvalitativno metodo

Ta postopek je začetni postopek, s katerim se izberejo vzorci mleka, ki vsebujejo antibiotike, vključno s sulfonamidi. Opisani postopek je eden od številnih podobnih postopkov, ki kot preskusni organizem načeloma vsi uporabljajo bacillus stearothermophilus var. calidolactis, ATTC 10149. Postopek je bil izbran kot reprezentativen za navedene preskuse.

B. Postopek za potrditev in prepoznavanje penicilina

Ta postopek se mora uporabiti, da se potrdijo rezultati kvalitativnega postopka, da se prepozna penicilin ter določi koncentracija penicilina.

A. Kvalitativni postopek

1. Obseg in področje uporabe

Postopek določa kvalitativno odkrivanje antibiotikov in sulfonamidov v surovem in toplotno obdelanem mleku, ki presegajo mejne vrednosti, določene v tabeli:

Zaznavne koncentracije različnih antibiotikov in sulfonamidov [1]

| Občutljivost preskusa |

Vsi negativni | Vsi pozitivni |

Benzilpenicilin | 0,002 | 0,006 |

Ampicilin | 0,002 | 0,005 |

Kloksacilin | 0,015 | 0,035 |

Nafcilin | 0,006 | 0,011 |

Tetraciklin | 0,10 | 0,40 |

Oksitetraciklin | 0,20 | 0,45 |

Klortetraciklin | 0,15 | 0,50 |

Kloramfenikol | 7 | 15 |

Dihidrostreptomicin | 4 | 13 |

Neomicin | 1 | 22 |

Kanamicin | 9 | 28 |

Bacitracin | 0,06 | 0,14 |

Eritromicin | 1 | 2,25 |

Rifamicin | 0,01 | 0,14 |

Diafenilsulfon | 0,01 | 0,1 |

Sulfametazin (sulfadimidin) | 0,5 | 1 |

Ekstrakt kvasa | 2 g |

Pepton | 5 g |

Mesni ekstrakt | 1 g |

Natrijev klorid | 5 g |

Agar | 10–15 g |

Voda | 1000 ml |

Priprava

Raztopite sestavine v vodi. Zavrite, pri čemer občasno zavrtinčite. Uravnajte pH, tako da je po sterilizaciji vrednost 7,4 ± 0,1 pri 25 oC.

Razlijte po 10 ml v epruvete, da pripravite poševnike z agarjem, ali po 100 ml v steklenice.

Sterilizirajte 15 minut pri 121 ± 1 oC.

5.1.2 Gojišče iz agarja

Sestava

Natrijev klorid | 2 g |

Agar | 15 g |

Voda | 1000 ml |

Raztopina trimetoprim ali tetroksoprima (glej 5.1.3) | 10 ml |

Priprava

Raztopite sestavine v vodi, razen trimetoprima ali tetroksoprima. Zavrite, pri čemer občasno zavrtinčite. Dodajte trimetoprim ali tetroksoprim in petnajst minut sterilizirajte pri 121 ± 1 °C; uravnajte pH, tako da je po sterilizaciji vrednost 7,0 ± 0,1 pri 25 oC.

5.1.3 Raztopina trimetoprima ali tetroksoprima

Sestava

Trimetoprim | 5 g |

ali tetroksoprim | 30 mg |

Etanol 96 % | 5 ml/30 ml |

Voda do | 1000 ml |

Priprava

Raztopite trimetoprim ali tetroksoprim v etanolu (5 ali 30 ml) in razredčite z vodo.

5.1.4 Hranilo

Sestava

Ekstrakt kvasa | 0,75 mg |

Glukoza | 5,0 mg |

Topni škrob | 8,0 mg |

Bromkresol škrlatno rdeča | 0,025 g |

Voda do | 50 ml |

Priprava

Raztopite hranila in indikator v vodi, po potrebi s segrevanjem, in sterilizirajte s filtracijo. Hranilo je na voljo na tržišču v obliki tablet.

5.2 Standardne raztopine penicilina

5.2.1 Pripravite 60 μg/ml = (100 IU/ml) raztopine penicilina z raztapljanjem kristalnega natrijevega ali kalijevega benzil penicilina v sterilni destilirani vodi v primerni zamašeni sterilni steklenici.

5.2.2 Pripravite delovno raztopino penicilina, tako da 1,25 ml raztopine penicilina (5.2.1) s sterilno destilirano vodo dopolnite do 1000 ml. Ta delovna raztopina vsebuje 0,075 μg (= 0,125 IU/ml).

5.2.3 Pripravite 75 ml standardne raztopine penicilina, ki vsebuje 0,004 μg/ml (= 0,0067 IU/ml), tako da dodate 71 ml mleka brez inhibitorja (5.3) 4 ml delovne raztopine penicilina (5.2.2) in premešate.

5.2.4 Raztopine penicilina, omenjene v 5.2.1 do 5.2.3, se pripravijo isti dan, kot se izvede preskus.

5.3 Mleko brez inhibitorja

Kot kontrolni vzorec pripravite mleko brez inhibitorja, tako da v sterilni destilirani vodi rekonstituirate posneto mleko v prahu (10 % m/v), ki se je predhodno preskusilo in za katerega je bilo ugotovljeno, da ne vsebuje inibitornih snovi. Namesto tega se lahko zadostna količina svežega mleka, ki se je preskusilo in za katerega je bilo ugotovljeno, da ne vsebuje inhibitornih snovi, nalije v steklenice, eno uro segreva pri 100 oC in nato shrani v hladilniku pri 0 do 6 oC za največ en teden.

5.4 Preskusni organizem

5.4.1 Kot preskusni organizem se uporablja bacillus stearothermophilus var calidolactus sev ATCC 10149. Sev je identičen sevu C 953.

5.4.2 Pripravite matično kulturo za ohranjanje preskusnega gojišča. Preskusno gojišče se hrani na poševniku s hranilnim agarjem (5.1.1). Površina poševnika z agarjem se črtasto inokulira z zanko preskusnega gojišča ter se 48 ur aerobno inkubira pri 63 ± 1 oC. Po inkubaciji se epruveta zapečati s sterilnim gumijastim zamaškom. Tako pridobljena matična kultura se lahko v hladilniku pri 0 do 5 oC hrani nekaj mesecev.

5.5 Preskusno gojišče (suspenzija spor)

5.5.1 20 ml hranilnega agarja (5.1.1) se aseptično prenese v sterilno petrijevko (4.2.2) in ohladi na sobno temperaturo.

5.5.2 S sterilno pipeto (4.2.4) prenesite 5 ml sterilne destilirane vode v epruveto z matično kulturo (5.4.2) in s sterilno zanko sperite spore s poševnika z agarjem. Suspenzija spor se hrani pri 0 do 5 oC ter se uporabi v 36 urah.

5.5.3 S sterilno pipeto (4.2.4) prenesite 0,5 ml suspenzije spor (5.5.2) na ploščo z gojiščem ter vcepek z ukrivljeno stekleno paličico temeljito razmažite po celotni površini. Pri 63 ± 1 oC (4.1.1) inkubirajte 16 do 18 ur.

Pri uporabi matične kulture (5.4.2) ali gojišča, ki je staro več kot 36 ur, bi se moral postopek kultiviranja na novem gojišču izvesti vsaj dvakrat, z intervalom, krajšim od 36 ur.

5.5.4 S sterilno pipeto (4.2.4) prenesite 10 ml destilirane vode na ploščo z gojiščem (5.5.3) ter s stekleno paličico odstranite spore s površine v suspenzijo.

Prenesite suspenzijo spor v steklenico (4.2.3) z 250 ml sterilne destilirane vode. Steklenico zaprite in jo temeljito pretresite. Kulture, ki se ne bodo takoj kultivirale na novem gojišču, bi bilo treba shraniti v hladilniku pri 0 do 6 oC.

5.5.5 V suspenziji spor je število kolonij mikroorganizmov, sposobnih za razmnoževanje, med 5 in 10 milijonov na ml na plošči gojišča z agarjem, 16 do 18 ur inkubirani pri 63 ± 1 oC. Suspenzija spor mora biti enakomerno motna, če pa vsebuje kosmiče ali usedlino, bi jo bilo treba zavreči in iz matične kulture (5.4.2) pripraviti novo suspenzijo.

5.6 Priprava epruvet/ampul

5.6.1 Stopite gojišče z agarjem (5.1.2) in ohladite na 55 oC.

5.6.2 V epruveti ali steklenici petim delom gojišča z agarjem (5.6.1) dodajte en del sveže suspenzije spor (5.5.4) in temeljito premešajte.

5.6.3 Prenesite 0,3 ml inokuliranega gojišča (5.6.2), za katerega ste izračunali, da bo tvoril 5 mm debelo plast, v sterilno epruveto ali ampulo (4.2.6) in zaprite z zamaškom ali pokrovom ali tako, da konico stopite. Pustite, da se epruvete/ampule v stoječem položaju ohladijo, da se gojišče strdi ter nato pustite stati vsaj 12 ur.

5.6.4 Epruvete/ampule se lahko uporabijo isti dan, vendar pa se lahko hranijo nekaj mesecev, pod pogojem, da se ohladijo takoj po pripravi in se hranijo pri 0 do 6 oC.

6. Postopek

6.1 Vzorce bi bilo treba preskusiti čim prej in po možnosti v 24 urah po vzorčenju, pri čemer se vzorci v vmesnem času hranijo pri 0 do 5 oC. Če vzorcev ni mogoče preskusiti v 24 urah, bi jih bilo treba hraniti globoko zamrznjene (– 30 do – 15 oC), da se na najmanjšo možno mero zmanjša inaktivacija penicilina.

6.2 Vsako epruveto/ampulo (5.6) označimo čitljivo in neizbrisno. Odstranite pokrov ali zamašek. V ustrezno stojalo (4.1.3) namestite potrebno število vzorcev in kontrolnih vzorcev (5.2 in 5.3), ki se morajo preveriti.

6.3 V vsako epruveto/ampulo dodajte 50 mikrolitrov hranila, omenjenega v 5.1.4.

6.4 Temeljito premešajte vzorec mleka in z brizgalko (4.1.4) prenesite 0,1 ml v ustrezno označeno epruveto/ampulo. Za vsak prenos vzorca uporabite čisto brizgalko za enkratno uporabo.

6.5 Dvakrat ponovite postopek, opisan v 6.4, pri čemer namesto vzorca mleka (5.2.3) uporabite standardno raztopino penicilina, ki vsebuje 0,004 μg/ml (= 0,0067 IU/ml) penicilina.

6.6 Dvakrat ponovite postopek iz 6.4, pri čemer namesto vzorca mleka uporabite kontrolni vzorec mleka brez inhibitorja (5.3).

6.7 Zaprite epruvete/ampule ter položite stojalo z epruvetami/ampulami v vodno kopel pri 63 ± 1 oC (4.1.2) za vsaj 2 ½ do 2 ¾ uri.

6.8 Vzemite stojalo z epruvetami/ampulami iz vodne kopeli.

6.9 Opazujte barvo preskusnega gojišča (glej 7).

7. Razlaga rezultatov

7.1 Škrlatno rdeče obarvano preskusno gojišče v katerem koli vzorcu mleka ali kontrolni epruveti/ampuli kaže na prisotnost antibiotikov ali sulfonamidov v vzorcu na ravni "vsi pozitivni" iz tabele na strani 39 ali blizu te ravni. Obarvanost epruvet/ampul s standardno raztopino penicilina (6.5) ostane škrlatno rdeča, da se dokaže zadostna občutljivost preskusnega gojišča.

7.2 Škrlatno rdeča obarvanost le dela preskusnega gojišča ali nepravilna obarvanost v kateri koli epruveti/ampuli z vzorcem mleka kaže na inhibitorne snovi v vzorcu med ravnmi, navedenimi v tabeli na strani 39.

7.3 Rumena obarvanost preskusnega gojišča v katerem koli vzorcu mleka ali kontrolni epruveti/ampuli kaže na odsotnost snovi, ki so zaviralne za preskusni organizem.

7.4 Če so škrlatno obarvane vse preskušene epruvete/ampule, vključno z negativnimi kontrolnimi vzorci, epruvete/ampule ne vsebujejo za razmnoževanje sposobnih spor, vzorci pa bi se morali ponovno preskusiti s sveže pripravljenim preskusnim materialom.

8. Potrditev rezultatov

8.1 Potrdite vse vzorce z reakcijami, kakor je opisano v 7.1 in 7.2, v skladu z "Metodo B".

Če je treba vzorce pred potrditvijo shraniti, morajo biti globoko zamrznjeni, da se prepreči razgradnja antibiotikov.

B. Postopek za potrditev penicilinov in določanje koncentracije

1. Obseg in področje uporabe

Postopek določa potrditveni preskus za peniciline ali druge antibiotike ter postopek za določanje koncentracije penicilina v vzorcu mleka s pozitivno (A.7.1) ali dvomljivo reakcijo (A.7.2).

Občutljivost različnih antibiotikov glede na postopek

Glej A.1.

2. Opredelitev

2.1 Vzorec mleka vsebuje antibiotike, vključno s sulfonamidi, kadar vzorec po opisanem postopku da čisto, vsaj 2 mm cono inhibicije okrog lističa.

2.2 Če vzorec, ki vsebuje antibiotike, vključno s sulfonamidi (2.1), in kateremu se je dodala penicilinaza (betalaktamaza) ne daje čiste cone ali čiste cone z manjšim premerom kot brez penicilinaze, je inhibitorna snov bodisi penicilin bodisi penicilin in drug antibiotik, vključno s sulfonamidi.

2.3 Če se cona ne aktivira s penicilinazo (2.2), inhibitorna snov v vzorcu mleka ni penicilin, ampak je lahko drug ostanek (glej Direktivo 85/397/EEC, Priloga A, poglavje VI, A.1.f. in 2 b).

Nekatere od polsintetičnih penicilinov, npr. natrijev kloksacilin, penicilinaza ne inaktivira ali jih inaktivira le deloma ali pa so popolnoma odporni ter se torej ne določijo kot penicilin (glej 7.3).

3. Načelo

Listič iz absorpcijskega papirja, prepojen z mlekom, ki se preskuša, se položi na površino gojišča z agarjem, inokuliranega z bacillus stearothermophilus, var. .calidolactis. Zaradi inkubacije, ki povzroči normalno rast organizmov, postane agar moten. Čista cona okrog lističa kaže na prisotnost v mleku snovi, ki zavirajo rast organizmov. Velikost čiste cone je med drugim odvisna od koncentracije in vrste inhibitorne snovi v mleku.

4. Naprave, steklovina in oprema

4.1 Naprave

4.1.1 Glej A.4.1.

4.1.2 Vodna kopel, ki lahko deluje pri 80 ± 1 oC.

4.2 Steklovina

Glej A.4.2.

4.3 Lističi brez inhibitorjev, s premerom 9 do 13 mm, ki lahko vsrkajo približno 130 mg mleka (po možnosti shranjenega v eksikatorju).

5. Gojišče, standardne raztopine, raztopina penicilinaze, reagenti, preskusni organizmi itd.

Sestavine gojišča morajo biti primerne za bakteriološke namene. Voda mora biti destilirana s stekleno napravo ali demineralizirana in vsaj enakovredne čistosti. Ne sme vsebovati snovi, ki so zaviralne za preskusni organizem.

5.1 Gojišče

5.1.1 Hranilni agar (A.5.1.1)

5.1.2 Preskusno gojišče za odkrivanje inhibitornih snovi

Sestava

Ekstrakt kvasa | 2,5 g |

Tripton | 5 g |

Glukoza | 1 g |

Raztopina trimetoprima ali tetroksoprima (A.5.1.3) | 10 ml |

Agar | 10–15 g (odvisno od želirnih sposobnosti) |

Voda | 1000 ml |

Priprava

S segrevanjem in mešanjem se trdne sestavine popolnoma raztopijo v vodi preden se doda raztopina trimetoprima ali tetroksoprima. Po dodajanju raztopine trimetoprima ali tetroksoprima je treba pH uravnati, tako da bo po sterilizaciji vrednost 8,0 + 0,1 pri 25 oC. Gojišče 15 minut sterilizirajte pri 121 ± 1 oC.

5.2 Standardne raztopine penicilina v mleku

Glej A.5.2.

Za količinsko opredelitev inhibitornih snovi (8) pripravite standardne raztopine penicilina v mleku brez inhibitorja (A.5.3) z naslednjimi koncentracijami:

(a) 0,004 μg/ml (0,0067 IU/ml)

(b) 0,006 μg/ml (0,01 IU/ml)

(c) 0,03 μg/ml (0,05 IU/ml)

(d) 0,06 μg/ml (0,1 IU/ml)

5.3 Raztopina penicilinaze

5.3.1. Raztopite dovolj penicilinaze (betalaktamaze) v sterilni destilirani vodi, da dobite koncentracijo 1000 U/ml. Raztopina, po možnosti razdeljena v majhne dele, se lahko za največ 4 tedne shrani pri 0 do 5 oC.

Opomba

Za penicilinazo ne obstaja enoten mednarodni standard. Za namene tega postopka se predpostavlja, da bo 10 enot penicilinaze zadostovalo za inaktivacijo 0,6 μg (= 1 IU) penicilina. Za penicilinazo neznane moči bo treba preveriti pravilnost te domneve. Sicer pa je treba ustrezno spremeniti koncentracijo raztopine penicilinaze.

5.3.2 Namesto raztopine penicilinaze se lahko uporabijo lističi s penicilinazo, ki so na voljo na tržišču, če se po kontrolnem postopku ugotovi, da vsebujejo ustrezno količino penicilinaze.

5.4 Preskusni organizem

Glej A.5.4.

5.5 Preskusno gojišče (suspenzija spor)

Glej A.5.5.

5.6 Priprava preskusnih plošč

5.6.1 Stopite preskusno gojišče za odkrivanje ihibitornih snovi (5.1.2) in ohladite na 55 oC.

5.6.2 V steklenico dodajte en del sveže suspenzije spor (5.5) toliko delom preskusnega gojišča za odkrivanje inhibitornih snovi (5.1.2), kolikor jih je potrebno za primerno gostoto kolonij v inokuliranem preskusnem gojišču, ter temeljito premešajte.

5.6.3 Inokulirano preskusno gojišče (5.6.2) prenesite v sterilno petrijevko (A.4.2.2), predhodno segreto na 55 oC, da dobite plast, debelo 0,6 do 0,8 mm. Za petrijevko z notranjim premerom 140 mm je potrebnega 15 ml preskusnega gojišča, da se pridobi plast, debelo 0,8 mm.

5.6.4 Prenesite petrijevke na hladno vodoravno površino, preverjeno z vodno tehtnico, odstranite pokrove in pustite, da se gojišče z agarjem strdi. Ko se gojišče strdi, se pokrovi namestijo nazaj na petrijevke, ki se nato obrnejo na glavo, da se kondenzacija na površini gojišča z agarjem zmanjša na najmanjšo možno mero.

5.6.5 Tako pripravljene preskusne plošče se po možnosti uporabijo isti dan, vendar pa se lahko hranijo največ dva tedna, pod pogojem, da so takoj po pripravi shranijo v zatesnjeni polietilenski vrečki pri 5 oC.

5.6.6 Za prepoznavanje vzorcev označite dno preskusnih plošč.

6. Postopek

6.1 Priprava vzorca

6.1.1 Vzorce, ki pri "Metodi A" (A.7.1 in A.7.2) dajo pozitivne ali dvomljive rezultate, je treba ponovno preskusiti, identificirati in kvantificirati kot penicilin.

6.1.2 Najprej se ti vzorci mleka 10 minut segrevajo pri 80 ± 1 oC, da se prepreči vpliv termolabilnih nespecifičnih inhibitorjev.

6.1.3 Po temeljitem premešanju se približno 10 ml segretega mleka prenese v primerno sterilno steklenico s širokim grlom. Približno 0,4 ml raztopine penicilina (5.3) se doda mleku ter temeljito premeša.

6.2 Odkrivanje inhibitorjev

6.2.1 S pomočjo čiste suhe pincete pomočite listič (4.3) v vzorec mleka (6.1.2). Odstranite preveliko količino mleka tako, da se z lističem dotaknete stene steklenice za vzorec. Listič vodoravno namestite na površino preskusne plošče (5.6) in nežno pr