Direktiva Komisije 2003/126/ES

z dne 23. decembra 2003

o analitski metodi za določanje sestavin živalskega izvora pri uradnem nadzoru krme

(Besedilo velja za EGP)

KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE –

ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske skupnosti,

ob upoštevanju Direktive Sveta 70/373/EGS [1] z dne 20 julija 1970 o uvedbi metod vzorčenja in analiz Skupnosti za uradni nadzor krme in zlasti člena 2 Direktive,

ob upoštevanju naslednjega:

(1) Na podlagi Direktive 70/373/EGS se zaradi preverjanja skladnosti z zahtevami zakonov in drugih predpisov, ki urejajo kakovost in sestavo krme, uradni nadzor krme izvaja z uporabo metod vzorčenja in analiz Skupnosti.

(2) Določbe o označevanju krme in zahteve, ki prepovedujejo uporabo nekaterih vrst živalskih beljakovin v krmi za nekatere kategorije živali, opredeljujejo potrebo, da se zagotovijo zanesljive analitske metode za ugotavljanje njihove prisotnosti in, če je to primerno, njihovega odstotka.

(3) Metoda, opisana v Direktivi Komisije 98/88/ES z dne 13. novembra 1998 o določitvi smernic za mikroskopsko identifikacijo in oceno sestavin živalskega izvora za uradni nadzor krme [2], je trenutno edina metoda, potrjena za nadzor prisotnosti živalskih beljakovin, vključno z beljakovinami, obdelanimi pri 133 °C/3 Bar/20’, v krmi.

(4) Primerjalna študija za določanje predelanih živalskih beljakovin je nedavno pokazala, da je sprememba pri uporabi mikroskopskih testov, določenih z Direktivo 98/88/ES, povzročila znatne razlike v občutljivosti, specifičnosti in točnosti metode. Da bi uskladili in izboljšali določanje predelanih živalskih beljakovin, je določbe v zvezi z mikroskopsko metodo treba nadalje podrobno opredeliti in jih predpisati kot obvezne. Potrebno je zagotoviti, da so analitiki, ki uporabljajo metodo, ustrezno usposobljeni, ker je učinkovitost odvisna od znanja analitika.

(5) Direktivo 98/88/EGS je torej treba nadomestiti.

(6) Ukrepi, predvideni s to direktivo, so v skladu z mnenjem Stalnega odbora za prehranjevalno verigo in zdravje živali –

SPREJELA NASLEDNJO DIREKTIVO:

Člen 1

Države članice zagotovijo, da se pri izvajanju uradnih analiz krme, v okviru usklajenega programa nadzora na področju prehrane živali skladno z Direktivo Sveta 95/53/ES [3], katerih namen je uradno nadzorovati prisotnost sestavin živalskega izvora v krmi, jih identificirati in in/ali oceniti njihovo količino, analiza izvede v skladu z določbami Priloge k tej direktivi.

Člen 2

Države članice zagotovijo, da se laboratoriji, ki izvajajo uradni nadzor glede prisotnosti živalskih sestavin v krmi, redno udeležujejo medlaboratorijskih preskusov za preverjanje izvajanja metode, in da laboratorijsko osebje, ki analize izvaja, pridobi ustrezno usposobljenost.

Člen 3

Direktiva 98/88/ES se razveljavi.

Sklicevanja na razveljavljeno direktivo se štejejo za sklicevanja na to direktivo.

Člen 4

1. Države članice sprejmejo zakone in druge predpise, potrebne za uskladitev s to direktivo, najpozneje do 1. julija 2004. Komisiji takoj predložijo besedilo navedenih določb in primerjalno tabelo med navedenimi določbami in to direktivo.

Države članice se v sprejetih predpisih sklicujejo na to direktivo ali pa sklic nanjo navedejo ob njihovi uradni objavi. Način sklicevanja določijo države članice.

2. Države članice predložijo Komisiji besedila predpisov nacionalne zakonodaje, sprejetih na področju, ki ga ureja ta direktiva.

Člen 5

Ta direktiva začne veljati dvajseti dan po objavi v Uradnem listu Evropske unije.

Člen 6

Ta direktiva je naslovljena na države članice.

V Bruslju, 23. decembra 2003

Za Komisijo

David Byrne

Član Komisije

[1] UL L 170, 3.8.1970, str. 2 Direktiva, kakor je bila nazadnje spremenjena z Uredbo (ES) št. 807/2003 (UL L 122, 16.5.2003, str. 36).

[2] UL L 318, 27.11.1998, str. 45.

[3] UL L 265, 8.11.1995, str. 17. Direktiva, kakor je bila nazadnje spremenjena z Direktivo 2001/46/ES Evropskega parlamenta in Sveta (UL L 234, 1.9.2001, str. 55).

--------------------------------------------------

PRILOGA

Zahteve za mikroskopsko odkrivanje, identifikacijo ali oceno sestavin živalskega izvora v krmi

1. Cilj in področje uporabe

Te zahteve se uporabljajo, kjer se odkrivanje sestavin živalskega izvora (opredeljenih kot proizvodi iz predelave teles in telesnih delov sesalcev, perutnine in rib) v krmi izvaja z mikroskopskimi preiskavami v okviru usklajenega programa nadzora na področju prehrane živali skladno z Direktivo Sveta 95/53/ES. Če se metode v tej prilogi uporabljajo pri vseh uradnih testih, se lahko izvedejo tudi dodatni testi, ki temeljo na nekoliko spremenjeni ali drugi metodi, da bi se izboljšalo odkrivanje nekaterih vrst živalskih sestavin ali da se nadalje podrobneje opredeli izvor živalskih sestavin. Nadalje se pri pregledovanju nekaterih posebnih živalskih sestavin, kot so plazma ali kosti v loju (glej tudi točko 9), lahko uporabi variantni protokol, če so te analize opravljene poleg analiz, ki so predvidene z usklajenim programom nadzora.

2. Občutljivost

V krmi lahko zaznamo, odvisno od sestavin živalskega izvora, zelo majhne količine (< 0,1 %).

3. Princip

Za identifikacijo se uporabi reprezentativni vzorec, vzet v skladu z določbami Direktive Komisije 76/371/EGS z dne 1. marca 1976 o določitvi metod Skupnosti za vzorčenje pri uradnem nadzoru krme [1], ki je bil ustrezno pripravljen Za obdelavo krme, ki ima nizko vsebnost vlage, je ustrezen naslednji protokol. Krma s količino vlage večje kot 14 % se pred obdelavo osuši (kondenzira). Posebno krmo ali sestavine te krme (npr. maščobe, olja) je treba namensko obdelati (glej točko 9). Sestavine živalskega izvora se identificirajo na podlagi tipičnih, mikroskopsko prepoznavnih značilnosti (to je mišičnih vlaken in drugih mesnih delcev, hrustanca, kosti, roževine, ščetin, krvi, perja, jajčnih lupin, ribjih kosti, luskin). Identifikacija se mora izvesti na presejani frakciji (6.1) in koncentrirani usedlini (6.2) vzorca.

4. Reagenti

4.1 Sredstvo za pripravo preparatov

4.1.1 Kloralhidrat (vodni, 60 % m/v)

4.1.2 Lug (NaOH 2,5 % m/v or KOH 2,5 % m/v) za presejane frakcije

4.1.3 Parafinsko olje ali glicerol (viskoznost: 68-81) za mikroskopska opazovanja v usedlini

4.2 Sredstva za izpiranje

4.2.1 Alkohol, 96 %

4.2.2 Aceton

4.3 Sredstvo za koncentriranje

4.3.1 Tetrakloretilen (gostota 1,62)

4.4 Reagenti za obarvanje

4.4.1 Jod/raztopina kalijevega jodida (raztopimo 2 g kalijevega jodida v 100 ml vode in dodamo 1 g joda ter pogosto pretresite)

4.4.2 Rdeči alizarin (razredčimo 2,5 ml 1M hidrosolne kisline v 100 ml vode in raztopini dodamo 200 mg rdečega alizarina)

4.4.3 Cistinski reagent (2 g svinčevega acetata, 10 g NaOH/100 ml H2O)

4.4.4 Raztopina jod/kalijev jodid (raztopljen v 70 % etanolu)

4.5 Reagent za beljenje

4.5.1 Komercialna raztopina natrijevega hipoklorita (9.6 % aktivnega klora)

5. Oprema in pripomočki

5.1 Analitska tehtnica (točnost 0,01 g razen za koncentrirano usedlino: 0,001 g)

5.2 Pribor za mletje (drobilni mlin ali terilnica, posebej za krmo, ki ob analizi vsebuje > 15 % maščobe)

5.3 Sito z mrežico s kvadratnimi odprtinami širine največ do 0,50 mm

5.4 Lij ločnik ali konična čaša za usedlino

5.5 Stereomikroskop (najmanj 40-kratna povečava)

5.6 Sestavljeni mikroskop (najmanj 400-kratna povečava), prepustna svetloba/polarizirana svetloba

5.7 Standardna laboratorijska steklovina

Vsa oprema se mora temeljito očistiti. Liji ločniki in steklovina se morajo oprati v pomivalnem stroju. Sita se morajo očistiti z uporabo krtače s trdimi ščetinami.

6. Postopek

Peletirano krmo lahko predhodno presejemo, če se obe frakciji analizirata kot posamezen vzorec.

Obdelamo najmanj 50 g vzorca (previdno zdrobimo s primerno opremo za drobljenje (5.2), če je potrebno, da dobimo ustrezno strukturo). Iz zmletega materiala vzamemo dva reprezentativna dela, enega za presejano frakcijo (najmanj 5 g) (6.1) in enega za koncentrirano usedlino (najmanj 5 g) (6.2). Za identifikacijo se dodatno lahko uporabi barvanje z reagenti za barvanje (6.3).

Za identifikacijo narave živalskih beljakovin in izvora delcev se za odločitev lahko uporabi sistem podpore, kot je Aries, in se lahko dokumentirajo referenčni vzorci.

6.1 Identifikacija sestavin živalskega izvora v presejanih frakcijah

Najmanj 5 g vzorca presejemo skozi sito (5.3) v dve frakcijah.

Presejana(e) frakcija(e) z velikimi delci (ali reprezentativni del frakcije) v tankem sloju nanesemo na primerno podlago ter jih pri različnih povečavah sistematično pregledamo pod stereomikroskopom (5.5), da bi ugotovili sestavine živalskega izvora.

Mikroskopski preparat iz presejane(ih) frakcije(-) z drobnimi delci pri različnih povečavah sistematično pregledamo pod sestavljenim mikroskopom (5.6), da bi ugotovili sestavine živalskega izvora.

6.2 Identifikacija sestavin živalskega izvora v koncentrirani usedlini

V lij ločnik ali konično čašo za usedlino prenesemo najmanj 5 g (točnost do 0,01 g) vzorca in ga obdelamo z najmanj 50 ml tetrakloretilena (4.3.1). Mešanico večkrat pretresemo ali premešamo.

- Če uporabimo zaprt lij ločnik, usedlino pustimo stati (najmanj tri minute), dokler se usedlina ne loči. Usedlino spet pretresemo in jo ponovno pustimo stati najmanj tri minute. Usedlino ponovno ločimo.

- Če uporabimo odprto čašo, usedlino pustimo stati vsaj pet minut, dokler se usedlina ne loči.

Celotno usedlino osušimo in nato stehtamo (točnost do 0,001 g). Tehtanje je potrebno le, če se zahteva ocena. Če usedlina vsebuje mnogo velikih delcev, jo lahko skozi sito (5.3) presejemo v dve frakcijah. Pod stereomikroskopom (5.5) in sestavljenim mikroskopom (5.6) preiščemo posušeno usedlino, da bi ugotovili kostne sestavine.

6.3 Uporaba sredstev za pripravo preparatov in reagentov za obarvanje

Mikroskopsko identifikacijo sestavin živalskega izvora lahko izboljšamo tudi s pomočjo posebnih sredstev za pripravo preparatov in reagentov za obarvanje.

Kloralhidrat (4.1.1): | S previdnim segrevanjem se vidi zgradba celic jasneje, ker zrnca škroba želatinirajo in se izloči nezaželena vsebina celic. |

Lug (4.1.2): | Bodisi natrijev hidroksid ali kalijev hidroksid očisti krmo in pomaga pri odkrivanju mišičnih vlaken, dlak in drugih keratinskih struktur. |

Parafinsko olje in glicerol (4.1.3): | V tem sredstvu za pripravo preparatov se kostne sestavine zelo dobro identificirajo, ker ostane večina votlinic (lacunae) v kosteh napolnjena z zrakom, tako da so vidne kot črne luknjice velikosti 5 do 15 μm. |

Raztopina jod/kalijev jodid (4.4.1): | Uporablja se za ugotovitev škroba (modro-vijolična barva) in proteinov (rumeno-oranžna barva). Če je treba, raztopino razredčimo. |

Raztopina rdečega alizarina (4.4.2): | Rdeče/rožnato obarvanje kosti, ribjih kosti ali luskin. Preden usedlino osušimo (glej razdelek 6.2), celotno usedlino prenesemo v stekleno epruveto in dvakrat izperemo s približno 5 ml alkohola (4.2.1) (vsakič uporabimo vortex, topilo pustimo stati približno eno minuto, nato ga odlijemo). Preden uporabimo reagent za obarvanje, usedlino obelimo tako, da dodamo najmanj 1 ml raztopine natrijevega hipoklorita (4.5.1). Reakcija naj traja 10 minut. Epruveto napolnimo z vodo, usedlino pustimo stati dve do tri minute, vodo in suspendirane delce nato odlijemo. Usedlino izperemo še dvakrat s približno 10 ml vode (uporabimo vortex, pustimo stati, vsakič vodo odlijemo). Dodamo dve do 10 ali več kapljic (odvisno od količine ostankov) raztopine rdečega alizarina. Mešanico pretresemo in počakamo nekaj sekund, da reakcija nastopi. Obarvano usedlino izperemo dvakrat s približno 5 ml alkohola (4.2.1), nato pa še izperemo z acetonom (4.2.2) (vsakič uporabimo vortex, pustimo topilo stati približno eno minut in ga odlijemo). Usedlina je pripravljena, da jo osušimo. |

Cistinski reagent (4.3.3): | Pri previdnem segrevanju postanejo sestavine, ki vsebujejo cistin (dlake, perje itd.), črno-rjave. |

6.4. Preiskava krme na morebitno vsebnost ribje moke

Pod sestavljenim mikroskopom pregledamo najmanj en mikroskopski preparat iz drobno presejane frakcije in drobne frakcije usedline (glej razdelke 6.1 in 6.2).

Kadar oznaka navaja, da sestavine vsebujejo ribjo moko ali kadar obstaja sum na vsebnost ribje moke ali kadar odkrijemo vsebnost ribje moke že pri začetni preiskavi, iz izvirnega vzorca pregledamo najmanj dva dodatna mikroskopska preparata iz drobno presejane frakcije ter frakcije celotne usedline.

7. Izračun in ovrednotenje

Države članice zagotovijo, da se postopki, opisani v tej točki, uporabljajo pri opravljanju uradne analize z namenom, da se oceni količina (in ne zgolj vsebnost) živalskih sestavin.

Izračun je možno narediti le, če sestavine živalskega izvora vsebujejo delce kosti.

Delce kosti toplokrvnih kopenskih vrst (npr. sesalcev in ptic) je v mikroskopskih preparatih možno ločiti od različnih vrst ribjih kosti na podlagi tipičnih kostnih votlinic (lacunae). Delež sestavin živalskega izvora določimo v materialu vzorca glede na:

- ocenjeni delež (masni %) kostnih delcev v koncentrirani usedlini in

- delež (masni %) kosti v sestavinah živalskega izvora.

Ocena mora temeljiti na najmanj treh mikroskopskih preparatih (če je možno) in na najmanj petih poljih na preparatu. Koncentrirana usedlina v krmnih mešanicah praviloma ne vsebuje samo delcev kosti kopenskih živali in rib, ampak tudi druge drobce visoke specifične mase, npr. minerale, pesek, delce olesenelih rastlin in podobno.

7.1 Ocenjena vrednost odstotnega deleža delcev kosti

% delci kosti kopenskih živali = (S x c)/W

% delci ribjih kosti in luskin = (S x d)/W

(S = masa usedline (mg), c = korekcijski faktor ( %) za ocenjeni delež kosti kopenskih živali v usedlini, d = korekcijski faktor ( %) za ocenjeni delež delcev ribjih kosti in luskin v usedlini, W = masa materiala vzorca snovi za sedimentacijo (mg)).

7.2 Ocenjena vrednost sestavin živalskega izvora

Delež kosti se v živalskih proizvodih lahko zelo razlikuje. (Odstotni delež kosti pri kostni moki je reda velikosti 50 do 60 %, pri mesni moki reda velikosti 20 do 30 %; pri ribji moki se vsebnost kosti in luskin razlikuje glede na kategorijo in izvor ribje moke, običajno pa je reda velikosti 10 do 20 %).

Če je vrsta živalske moke, prisotne v vzorcu, poznana, je mogoče oceniti vsebnost:

Ocenjena vsebnost sestavin proizvodov kopenskih živali ( %) = (S x c)/(W x f) x 100

Ocenjena vsebnost sestavin ribjih proizvodov ( %) = (S x d)/(W x f) x 100

(S = masa usedline (mg), c = korekcijski faktor ( %) za ocenjeni delež kostnih sestavin kopenskih živali v usedlini, d = korekcijski faktor ( %) za ocenjeni delež delcev ribjih kosti in luskin v usedlini, f = korekcijski faktor za delež kosti v sestavinah živalskega izvora v pregledanem vzorcu, W = masa materiala vzorca za sedimentacijo (mg)).

8. Izražanje rezultatov preiskave

Poročilo mora vsebovati podatke o prisotnosti sestavin kopenskih živali in ribje moke. O različnih primerih poročamo na naslednji način:

8.1 Za prisotnost sestavin izvora kopenskih živali:

- Kolikor je bilo razvidno iz mikroskopske preiskave, ni bilo v dostavljenem vzorcu ugotovljenih nobenih sestavin izvora kopenskih živali,

ali:

- Kolikor je bilo razvidno iz mikroskopske preiskave, so bile v dostavljenem vzorcu ugotovljene sestavine izvora kopenskih živali.

8.2 Za prisotnost ribje moke:

- Kolikor je bilo razvidno iz mikroskopske preiskave, ni bilo v dostavljenem vzorcu ugotovljenih nobenih sestavin ribjega izvora,

ali:

- Kolikor je bilo razvidno iz mikroskopske preiskave, so bile v dostavljenem vzorcu ugotovljene sestavine ribjega izvora.

V primeru ugotovljenih sestavin ribjega izvora ali izvora kopenskih živali lahko poročilo o rezultatih preiskave, če se zahteva, nadalje navede oceno količine ugotovljenih sestavin (x %, < 0,1 %, 0,1-0,5 %, 0,5-5 % or > 5 %), podrobno opredeli vrsto kopenske živali, če je možno, in ugotovljene živalske sestavine (mišična vlakna, hrustanec, kosti, roževina, ščetine, kri, perje, jajčne lupine, ribje kosti, luskine).

Kadar se ocenjuje količina živalskih sestavin, se navede korekcijski faktor f, ki je bil uporabljen.

Kadar identificirajo kostne sestavine kopenskih živali, mora poročilo vsebovati dodatni stavek:

"Možnost, da so bile zgornje sestavine pridobljene iz sesalcev, ne more biti izključena."

Ta stavek ni potreben, če so bili delci kosti kopenskih živali opredeljeni kot delci kosti perutnine ali sesalcev.

9. Izbirni protokol za analizo maščobe ali olja

Za analizo maščobe ali olja se lahko uporabi naslednji protokol:

- Če je maščoba trdna, jo segrevamo v na primer mikrovalovni pečici, dokler ne postane tekoča.

- Z uporabo pipete prenesemo 40 ml maščobe od dna vzorca v centrifugirko.

- Centrifugiramo 10 minut pri 4000 vrt/min.

- Če je maščoba trdna po centrifugiranju, jo v pečici ponovno segrevamo, dokler ne postane tekoča. Ponovno centrifugiramo pet minut pri 4000 vrt/min.

- Z uporabo žličke ali spatule prenesemo polovico dekantirane nečistoče v majhno petrijevko ali na mikroskopsko stekelce za mikroskopsko identifikacijo morebitne vsebnosti živalskih sestavin (mesnih vlaken, perja, delcev kosti). Za mikroskopijo se kot sredstvo za pripravo preparatov priporoča uporabo parafinskega olja ali glicerola.

- Ostanki nečistoče se uporabijo za usedlino, kakor je opisano v točki 6.2.

[1] UL L 102, 15.4.1976, str. 1.

--------------------------------------------------