(8)

V delu B se dodajo naslednja poglavja: „B.63 PRESEJALNI PRESKUS TOKSIČNOSTI ZA RAZMNOŽEVANJE/RAZVOJ UVOD 1. Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici OECD za preskušanje (TG) 421 (2016). Smernice OECD za preskušanje kemikalij se redno pregledujejo ob upoštevanju znanstvenega napredka. Prvotna smernica za presejalni preskus 421 je bila sprejeta leta 1995 na podlagi protokola za ‚predhodni presejalni preskus toksičnosti za razmnoževanje‘, o katerem se je razpravljalo na dveh strokovnih srečanjih, in sicer leta 1990 v Londonu (1) in leta 1992 v Tokiu (2). 2. Ta preskusna metoda je bila posodobljena z ustreznimi končnimi točkami za endokrine motilce kot nadaljnji ukrep v okviru prednostne dejavnosti, ki jo je OECD začela izvajati leta 1998, da bi pregledala obstoječe smernice za preskušanje ter pripravila nove smernice za presejalne preskuse in preskušanje potencialnih endokrinih motilcev (3). Smernica OECD za preskušanje 407 (28-dnevna študija oralne toksičnosti s ponavljajočimi se odmerki na glodavcih, poglavje B.7 te priloge) je bila na primer leta 2008 izboljšana s parametri, primernimi za zaznavanje endokrinega delovanja preskusnih kemikalij. Namen posodobitve Smernice za preskušanje 421 je bil, da se v smernice za presejalno preskušanje vključijo nekatere ustrezne končne točke za endokrine motilce, kadar obdobja izpostavljenosti zajemajo nekatera občutljiva obdobja med razvojem (pred rojstvom ali malo po rojstvu). 3. Izbrane dodatne ustrezne končne točke za endokrine motilce, ki so tudi del Smernice za preskušanje 443 (razširjene študije toksičnosti za razmnoževanje na eni generaciji, poglavje B.56 te priloge), so bile v Smernico za preskušanje 421 vključene na podlagi študije izvedljivosti, s katero so se obravnavala znanstvena in tehnična vprašanja, povezana z njihovo vključitvijo, ter morebitne prilagoditve načrta preskusa, potrebne za njihovo vključitev (4). 4. Ta preskusna metoda naj bi zagotovila omejene informacije v zvezi z učinki preskusne kemikalije na sposobnost razmnoževanja pri samcih in samicah, kot so funkcija spolnih žlez, obnašanje pri parjenju, spočetje, razvoj zarodka in kotitev. Ni alternativa obstoječim preskusnim metodam B.31, B.34, B.35 ali B.56 niti jih ne nadomešča. ZAČETNI PREUDARKI 5. Ta metoda presejalnega preskusa se lahko uporablja za zagotovitev začetnih informacij o morebitnih učinkih na razmnoževanje in/ali razvoj bodisi v zgodnji fazi ocenjevanja toksikoloških lastnosti kemikalij bodisi v zvezi s kemikalijami, ki vzbujajo zaskrbljenost. Uporabi se lahko tudi v okviru sklopa začetnih presejalnih preskusov za obstoječe kemikalije, za katere je na voljo malo ali nič toksikoloških informacij, kot študija za določanje območja odmerka za obsežnejše razmnoževalne/razvojne študije ali če se zdi pomembna kako drugače. Pri izvajanju študije je treba upoštevati vodilna načela in preudarke iz Smernice OECD 19 o prepoznavanju, oceni in uporabi kliničnih znakov kot humanih končnih točk za preskusne živali, ki se uporabljajo pri ocenah varnosti (5). 6. Ta preskusna metoda ne zagotavlja popolnih informacij o vseh vidikih razmnoževanja in razvoja. Zlasti zagotavlja samo omejene načine, kako po rojstvu zaznavati pojavne oblike izpostavljenosti pred rojstvom ali učinke, ki jih lahko povzroči izpostavljenost po rojstvu. Zaradi (med drugim) razmeroma majhnega števila živali v skupinah, ki prejemajo odmerke, selektivnosti končnih točk in kratkotrajnosti študije ta metoda ne zagotavlja dokazov za dokončne trditve o neobstoju učinkov. Če ni podatkov iz drugih preskusov toksičnosti za razmnoževanje/razvoj, so poleg tega pozitivni rezultati koristni za začetno oceno nevarnosti in prispevajo k odločitvam v zvezi z nujnostjo in časovnim okvirom dodatnega preskušanja. 7. Rezultate, ki se dobijo s parametri, povezanimi z endokrinim sistemom, je treba obravnavati v okviru temeljnega okvira OECD za preskušanje in ocenjevanje kemikalij, ki povzročajo endokrine motnje (Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals) (6). V tem temeljnem okviru je izboljšana Smernica OECD za preskušanje 421 vključena na ravni 4 kot preskus in vivo , ki zagotavlja podatke o škodljivih učinkih na ustrezne končne točke za endokrini sistem. Vendar zgolj endokrinega signala ni mogoče šteti za zadosten dokaz, da je preskusna kemikalija endokrini motilec. 8. Pri tej preskusni metodi je predvideno oralno dajanje preskusne kemikalije. Če se uporabijo drugi načini izpostavljenosti, so morda potrebne prilagoditve. 9. Preden se preskusna metoda uporabi na zmesi, da bi se pridobili podatki za predvideni regulativni namen, je treba preučiti, ali in zakaj lahko zagotovi ustrezne rezultate za navedeni namen. Kadar obstaja regulativna zahteva za preskušanje zmesi, taki preudarki niso potrebni. 10. Opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1. NAČELO PRESKUSA 11. Preskusna kemikalija se daje v stopnjevanih odmerkih več skupinam samcev in samic. Samcem je treba dajati odmerke najmanj štiri tedne in do vključno dneva pred predvideno usmrtitvijo (to vključuje vsaj dva tedna pred parjenjem, obdobje parjenja in približno dva tedna po parjenju). Glede na omejeno obdobje odmerjanja pred parjenjem pri samcih plodnost morda ni posebno občutljiv kazalnik toksičnosti za moda. Zato je bistven podroben histološki pregled mod. Kombinacija dvotedenskega obdobja odmerjanja pred parjenjem in poznejših opazovanj parjenja/plodnosti s skupno vsaj štiritedenskim obdobjem odmerjanja, ki mu sledi podroben histopatološki pregled spolnih žlez samcev, se šteje za zadostno, da se lahko zazna večina učinkov na plodnost pri samcih in spermatogenezo. 12. Samicam je treba dajati odmerke med celotno študijo. To vključuje dva tedna pred parjenjem (da se zajameta vsaj dva popolna pojatvena cikla), različen čas do spočetja, trajanje brejosti in vsaj 13 dni po kotitvi, do vključno dneva pred predvideno usmrtitvijo. 13. Trajanje študije (po aklimatizaciji in oceni pojatvenega cikla pred odmerjanjem) je odvisno od delovanja samice in traja približno 63 dni (vsaj 14 dni pred parjenjem, (do) 14 dni parjenja, 22 dni brejosti, 13 dni laktacije). 14. V obdobju dajanja odmerkov je treba živali vsak dan pozorno opazovati, ali kažejo znake zastrupitve. Na živalih, ki med preskusnim obdobjem poginejo ali so usmrčene, se opravi obdukcija, ob koncu preskusa pa se tudi preživele živali usmrtijo in obducirajo. OPIS METODE Izbira živalskih vrst 15. Pri tej preskusni metodi naj bi se uporabljale podgane. Če se parametri, določeni pri tej preskusni metodi, preiskujejo na drugi vrsti glodavcev, je treba to podrobno utemeljiti. V mednarodnem validacijskem programu za zaznavanje endokrinih motilcev v Smernicah OECD za preskušanje 407 (ustreza poglavju B.7 te priloge) je bila podgana edina uporabljena vrsta. Sevi z nizko plodnostjo ali dobro znano visoko pojavnostjo razvojnih napak se ne smejo uporabljati. Uporabiti je treba zdrave živali, ki se še niso parile in niso bile izpostavljene predhodnim preskusnim postopkom. Opredeliti je treba vrsto, sev, spol, težo in starost preskusnih živali. Na začetku študije morajo biti razlike v teži uporabljenih živali čim manjše in ne smejo presegati 20 % povprečne teže za vsak spol. Če se študija izvaja kot predhodna študija za dolgotrajno študijo ali študijo celotne generacije, je priporočljivo, da se v obeh študijah uporabijo živali iz istega seva in vira. Nastanitev in hranjenje 16. Vsi postopki morajo biti v skladu z lokalnimi standardi oskrbe laboratorijskih živali. Temperatura v prostoru s preskusnimi živalmi mora znašati 22 °C (± 3 o ). Čeprav mora biti relativna vlažnost vsaj 30-odstotna in po možnosti ne sme presegati 70 %, razen med čiščenjem prostora, si je treba prizadevati za 50–60-odstotno vlažnost. Osvetlitev mora biti umetna s svetlobnim ciklom 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporablja običajna laboratorijska hrana z neomejeno količino pitne vode. Na izbiro hrane lahko vpliva potreba po zagotovitvi ustrezne primesi preskusne kemikalije, če se daje po tej metodi. 17. Živali morajo biti nastanjene v majhnih skupinah istega spola; posamično so lahko nastanjene, če je to znanstveno utemeljeno. Pri skupinski nastanitvi je lahko v kletki največ pet živali. Parjenje se mora izvajati v kletkah, ki so primerne za ta namen. Breje samice morajo biti v svojih kletkah in imeti na voljo material za izdelavo gnezda. Samice v laktaciji so v svojih kletkah skupaj z mladiči. 18. Hrano je treba redno analizirati, da ne vsebuje kontaminantov. Vzorec hrane je treba hraniti, dokler poročilo ni končano. Priprava živali 19. Zdrave mlade odrasle živali se naključno dodelijo kontrolnim in tretiranim skupinam. Kletke je treba razporediti tako, da se čim bolj zmanjšajo morebitni učinki, ki nastanejo zaradi razporeditve kletk. Živali se označijo z enkratnimi oznakami in zadržijo v kletkah vsaj pet dni pred začetkom študije, da se prilagodijo na laboratorijske razmere. Priprava odmerkov 20. Priporoča se, da se preskusna kemikalija daje oralno, razen če se šteje drug način dajanja za primernejšega. Če se izbere oralni način, se preskusna kemikalija običajno daje z gavažo, lahko pa tudi s hrano ali pitno vodo. 21. Po potrebi se preskusna kemikalija raztopi ali suspendira v ustreznem vehiklu. Priporočljivo je, da se, če je mogoče, najprej preuči možnost uporabe vodne raztopine/suspenzije, nato raztopine/emulzije v olju (npr. koruznem), šele potem pa možnost raztopine v drugih vehiklih. V primeru vehiklov, ki niso voda, je treba poznati toksične lastnosti takega vehikla. Določiti je treba stabilnost in homogenost preskusne kemikalije v vehiklu. POSTOPEK Število in spol živali 22. Priporočljivo je, da se v vsaki skupini začne z vsaj 10 samci in 12–13 samicami. Pri samicah se pred izpostavitvijo oceni pojatvena cikličnost; živali, ki nimajo značilnih 4–5-dnevnih ciklusov, se ne vključijo v študijo; zato se priporočajo dodatne samice za zagotovitev, da je v vsaki skupini 10 samic. Razen v primeru izrazitih toksičnih učinkov naj bi se tako dobilo vsaj 8 brejih samic na skupino, kar je običajno najnižje sprejemljivo število brejih samic na skupino. Cilj je dobiti dovolj brejih samic in mladičev, da je zagotovljeno smiselno ovrednotenje potenciala preskusne kemikalije za vplivanje na plodnost, brejost in materinsko obnašanje ter sesanje, rast in razvoj potomcev F 1 od spočetja do 13. dne po skotitvi. Odmerjanje 23. Običajno je treba uporabiti najmanj tri preskusne skupine in eno kontrolno skupino. Velikosti odmerkov lahko temeljijo na informacijah iz preskusov akutne toksičnosti ali rezultatih študij s ponavljajočimi se odmerki. Razen tretiranja s preskusno kemikalijo je treba živali v kontrolni skupini obravnavati enako kot živali v preskusni skupini. Če se pri dajanju preskusne kemikalije uporablja vehikel, mora kontrolna skupina prejeti največjo uporabljeno količino vehikla. 24. Pri izbiri velikosti odmerkov je treba upoštevati vse obstoječe podatke o toksičnosti in (toksiko-)kinetiki, ki so na voljo. Upoštevati je treba tudi, da lahko obstajajo razlike v občutljivosti med brejimi in nebrejimi živalmi. Izbrati je treba največjo velikost odmerka, da se povzročijo toksični učinki, ne pa tudi pogin ali hudo trpljenje. Nato je treba izbrati padajoče zaporedje velikosti odmerkov, da se pokažejo vsi odzivi, ki so odvisni od odmerjanja, in ugotovi najmanjša velikost odmerka, pri kateri ni opaženih škodljivih učinkov (NOAEL). Za določanje padajočih velikosti odmerkov je velikokrat najbolje uporabiti dva- do štirikratne intervale, namesto zelo velikih intervalov (npr. večjih od desetkratnika) med odmerjanji pa je pogosto primerneje dodati še četrto preskusno skupino. 25. Če se ugotovijo splošna toksičnost (npr. zmanjšana telesna teža, učinki na jetra, srce, pljuča ali ledvice itd.) ali druge spremembe, ki morda niso toksične reakcije (npr. zmanjšan vnos hrane, povečanje jeter), je potrebna previdnost pri razlagi ugotovljenih učinkov na endokrine občutljive končne točke. Mejni preskus 26. Če pri oralni študiji pri odmerku, velikem najmanj 1 000 mg/kg telesne teže/dan, ali pri enakovrednem deležu v hrani ali pitni vodi pri vnosu s hrano ali pitno vodo, pri katerem so uporabljeni postopki, opisani za to študijo, ne nastanejo opazni toksični učinki in če na podlagi podatkov o strukturno sorodnih snoveh toksičnost ni pričakovana, popolna študija z več velikostmi odmerkov morda ni potrebna. Mejni preskus se uporabi, razen če izpostavljenost človeka nakazuje potrebo po uporabi večjega oralnega odmerka. Pri drugih načinih dajanja, na primer pri vdihavanju ali dermalni aplikaciji, lahko fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije pogosto določajo največjo dosegljivo koncentracijo. Dajanje odmerkov 27. Živalim se dajejo odmerki preskusne kemikalije sedem dni na teden. Če se preskusna kemikalija daje z gavažo, jo je treba živali dati v enkratnem odmerku z uporabo želodčne sonde ali primerne intubacijske kanile. Največja količina tekočine, ki se lahko da naenkrat, je odvisna od velikosti preskusne živali. Količina ne sme presegati 1 ml/100 g telesne teže, razen v primeru vodnih raztopin, za katere se lahko uporabi 2 ml/100 g telesne teže. Razen pri dražilnih ali jedkih preskusnih kemikalijah, ki pri večjih koncentracijah navadno povzročijo močnejše učinke, je treba s prilagajanjem koncentracije čim bolj zmanjšati spremenljivost preskusne količine, da se zagotovi stalna količina pri vseh velikostih odmerkov. 28. Pri preskusnih kemikalijah, ki se dajejo s hrano ali pitno vodo, je treba zagotoviti, da količine uporabljene preskusne kemikalije ne vplivajo na normalno prehranjevanje ali vodno ravnotežje. Če se preskusna kemikalija daje s hrano, se lahko uporabi konstantna koncentracija v hrani (ppm) ali pa konstantna velikost odmerka glede na telesno težo živali; uporabljeni način je treba navesti. Če se preskusna kemikalija daje z gavažo, je treba odmerke dajati vsak dan ob približno istem času in jih najmanj enkrat tedensko prilagajati, da se vzdržuje konstantna velikost odmerka glede na telesno težo živali. Načrt za poskus 29. Odmerjanje obema spoloma se mora začeti vsaj 2 tedna pred parjenjem, potem ko so se živali aklimatizirale vsaj pet dni in so bile samice pregledane, ali imajo normalen pojatveni ciklus (v dvotedenskem obdobju pred tretiranjem). Študija mora biti načrtovana tako, da se ocenjevanje pojatvenega ciklusa začne kmalu potem, ko živali dosežejo polno spolno zrelost. To se lahko pri različnih sevih podgan v različnih laboratorijih nekoliko razlikuje, npr. pri podganah seva Sprague Dawley se zgodi pri 10 tednih starosti, pri podganah seva Wistar pa pri približno 12 tednih starosti. Matere s potomci je treba usmrtiti 13. dan po porodu ali kmalu zatem. Dan rojstva (tj. ko je končana kotitev) je opredeljen kot poporodni dan 0. Samice, za katere ni dokazov o kopulaciji, se usmrtijo 24–26 dni po zadnjem dnevu obdobja parjenja. Odmerjanje se pri obeh spolih nadaljuje še v obdobju parjenja. Po obdobju parjenja je treba samcem dajati odmerke še vsaj toliko časa, dokler ni doseženo najkrajše skupno obdobje odmerjanja 28 dni. Nato se usmrtijo ali pa se ohranijo pri življenju in se jim še naprej dajejo odmerki za morebitno drugo parjenje, če se šteje za ustrezno. 30. Dnevno dajanje odmerkov starševskim samicam se mora nadaljevati skozi celotno brejost in vsaj do vključno 13. dne po porodu ali dneva pred usmrtitvijo. Pri študijah, pri katerih se preskusna kemikalija prejema z vdihavanjem ali po dermalni poti, se mora odmerjanje nadaljevati vsaj do vključno 19. dne brejosti, pri čemer je treba odmerjanje znova začeti takoj, ko je to mogoče, in najpozneje 4. dne po porodu. 31. Diagram načrta poskusa je prikazan v Dodatku 2. Postopek parjenja 32. Običajno je treba pri tej študiji uporabiti parjenje 1: 1 (en samec na eno samico). Izjeme so možne v primeru občasnih poginov samcev. Samica mora biti nastanjena z istim samcem, dokler ni dokazov o kopulaciji ali dokler ne pretečeta dva tedna. Vsako jutro je treba samice pregledati za prisotnost semenčic ali vaginalnega zamaška. Dan brejosti 0 je opredeljen kot dan, na katerega so potrjeni dokazi o parjenju (opažen je vaginalni čep ali semenčice). Če parjenje ni uspešno, se lahko razmisli o ponovnem parjenju samic z dokazanimi samci iste skupine. Velikost legla 33. Četrti dan po skotitvi se lahko velikost posameznega legla prilagodi z naključno izločitvijo odvečnih mladičev, tako da so po možnosti v vsakem leglu štirje ali pet mladičev vsakega spola, odvisno od običajne velikosti legla pri uporabljenem sevu podgan. Dvema od odvečnih mladičev je treba odvzeti vzorce krvi, jih združiti in uporabiti za določitev ravni T4 v serumu. Selektivno izločanje mladičev, npr. na podlagi telesne teže ali zadnjično-genitalne razdalje, ni ustrezno. Kadar zaradi števila mladih samcev in samic ni mogoče, da bi bili v vsakem leglu štirje ali pet mladičev na spol, je sprejemljiva tudi delna prilagoditev (na primer šest samcev in štiri samice). Mladiči se ne izločijo, če velikost legla pade pod ciljno vrednost za izločitev (8 ali 10 mladičev/leglo). Če je nad ciljno vrednostjo za izločitev na voljo samo en mladič, se izloči samo en mladič, ki se mu odvzame vzorec krvi za morebitne ocene T4 v serumu. 34. Če velikost legla ni prilagojena, se 4. dan po porodu usmrtita dva mladiča na leglo, ki se jima odvzamejo vzorci krvi za meritve serumskih koncentracij hormona ščitnice. Če je mogoče, naj bosta dva mladiča na leglo samici, da se mladi samci prihranijo za ocene razvitosti prsnih bradavic, razen če z izločitvijo teh mladičev ne bi bilo več na voljo samic za oceno ob usmrtitvi. Mladiči se ne izločijo, če velikost legla pade pod ciljno vrednost za izločitev 8 ali 10 mladičev na leglo (odvisno od običajne velikosti legla pri uporabljenem sevu podgan). Če je glede na običajno velikost legla na voljo en sam mladič, se izloči samo en mladič, ki se mu odvzame vzorec krvi za morebitne ocene T4 v serumu. Opazovanja živih živali Klinična opazovanja 35. Med preskusnim obdobjem so splošna klinična opazovanja potrebna vsaj enkrat na dan, če se opazijo znaki toksičnosti, pa tudi pogosteje. Po možnosti jih je treba opraviti vsak dan ob istem času in ob upoštevanju obdobja največje intenzivnosti pričakovanih učinkov po vnosu odmerka. Evidentirati je treba pomembne vedenjske spremembe, znake težke ali podaljšane kotitve in vse znake toksičnosti, vključno s smrtnostjo. Pri znakih toksičnosti je treba evidentirati njihov čas nastanka, jakost in trajanje. Telesna teža in poraba hrane/vode 36. Samce in samice je treba stehtati prvi dan dajanja odmerka, nato pa vsaj enkrat tedensko in ob usmrtitvi. Med brejostjo je treba samice stehtati na dneve 0, 7, 14 in 20, v 24 urah po kotitvi (dan 0 ali 1. dan po porodu) ter vsaj 4. in 13. dan po porodu. O teh opažanjih je treba posebej poročati za vsako odraslo žival. 37. Porabo hrane je treba v obdobju pred parjenjem, med brejostjo in laktacijo meriti vsaj enkrat na teden. Med parjenjem merjenje porabe hrane ni obvezno. V teh obdobjih je treba meriti tudi porabo vode, če se preskusna kemikalija daje s pitno vodo. Pojatveni ciklusi 38. Pojatvene cikluse je treba spremljati pred začetkom tretiranja, da se za študijo izberejo samice z rednimi ciklusi (glej odstavek 22). Dnevno je treba spremljati tudi vaginalne brise, in sicer od začetka obdobja tretiranja do dokazov o parjenju. Če obstajajo pomisleki glede učinkov akutnega stresa, zaradi katerih bi se lahko z začetkom odmerjanja spremenili pojatveni ciklusi, lahko laboratoriji preskusne živali izpostavijo za 2 tedna in nato odvzamejo vaginalne brise, da dnevno spremljajo pojatveni ciklus vsaj dva tedna v obdobju pred parjenjem, pri čemer se spremljanje nadaljuje, dokler ni dokazov o parjenju. Med jemanjem celic nožnice/materničnega vratu je treba paziti, da ne pride do poškodb sluznice in posledično do psevdogravidnosti (7) (8). Parametri pri potomcih 39. Evidentirati je treba trajanje brejosti, ki se računa od dneva brejosti 0. Vsako leglo je treba pregledati čim prej po skotitvi, da se ugotovijo število in spol mladičev, mrtvorojenih, živorojenih in spačkov (mladičev, ki so znatno manjši od ustreznih kontrolnih mladičev) ter večje nepravilnosti. 40. Žive mladiče je treba prešteti in določiti njihov spol, legla pa je treba stehtati v 24 urah po kotitvi (dan 0 ali 1. dan po porodu) ter vsaj 4. in 13. dan po porodu. Poleg opažanj, opisanih v odstavku 35, je treba evidentirati vsako nenavadno vedenje potomcev. 41. Zadnjično-genitalno razdaljo vsakega mladiča je treba izmeriti na isti poporodni dan, in sicer med poporodnim dnem 0 in 4. dnem po porodu. Podatke o telesni teži mladičev je treba zbrati na dan, ko se meri zadnjično-genitalna razdalja, slednjo pa je treba normirati na mero velikosti mladiča, po možnosti kubični koren telesne teže (9). Število prsnih bradavic/areol pri mladih samcih je treba prešteti 12. ali 13. dan po porodu, kot je priporočeno v Smernici OECD 151 (10). Klinična biokemija 42. Vzorci krvi z določenega mesta se vzamejo po naslednjem razporedu: — vsaj dvema mladičema na leglo 4. dan po porodu, če število mladičev to omogoča (glej odstavka 33 in 34); — vsem materam in vsaj dvema mladičema na leglo ob usmrtitvi 13. dan ter — vsem odraslim samcem ob usmrtitvi. Vsi vzorci krvi se shranijo v ustreznih pogojih. V vzorcih krvi mladičev, starih 13 dni, in odraslih samcev se ocenijo serumske koncentracije hormonov ščitnice (T4). Dodatna ocena T4 v vzorcih krvi mater in mladičev, starih 4 dni, se izvede po potrebi. Po potrebi se lahko izmerijo tudi drugi hormoni. Za analize hormonov ščitnice se lahko kri mladičev združi po leglih. Hormona ščitnice (T4 in TSH) je treba po možnosti meriti ‚skupaj‘. 43. Na spremenljivost in absolutne koncentracije pri določanju hormonov lahko vplivajo naslednji dejavniki: — čas usmrtitve zaradi spreminjanja koncentracij hormonov preko dneva; — način usmrtitve, da se prepreči nepotreben stres pri živalih, ki lahko vpliva na koncentracije hormonov; — preskusni kompleti, ki se uporabljajo za določanje hormonov in se lahko razlikujejo po standardnih krivuljah. 44. Vzorce plazme, ki so predvideni posebej za določanje hormonov, je treba odvzeti ob primerljivih urah dneva. Številčne vrednosti, pridobljene pri analiziranju koncentracij hormonov, so pri različnih kompletih za analize, ki so na voljo na trgu, različne. Patologija Makroskopska obdukcija 45. Ob usmrtitvi ali poginu med študijo je treba odrasle živali makroskopsko pregledati za kakršne koli anomalije ali patološke spremembe. Posebno pozornost je treba posvetiti organom reproduktivnega sistema. Evidentirati je treba število ugnezditev. Zjutraj na dan obdukcije je treba pregledati vaginalne brise, da se ugotovi faza pojatvenega ciklusa in omogoči korelacija s histopatološkimi preiskavami jajčnikov. 46. Z mod, nadmodkov ter prostate in semenskih mešičkov s koagulacijskimi žlezami kot celote je treba pri vseh odraslih samcih, kot je ustrezno, odstraniti vsa priraščena tkiva in nato čim prej po disekciji izmeriti njihovo mokro težo, da se ne izsušijo. Poleg tega lahko teža neobveznih organov vključuje sistem mišice levator ani z bulbokavernozno mišico, Cowperjevi žlezi in glavico penisa pri samcih ter oba jajčnika (mokra teža) in maternico (vključno z materničnim vratom) pri samicah; če se navedeno vključi, je treba te teže zbrati čim prej po disekciji. 47. Pri poginulih mladičih in mladičih, usmrčenih 13. dan po porodu ali kmalu zatem, je treba skrbno pregledati vsaj zunanjost, da se odkrijejo večje nepravilnosti. Posebno pozornost je treba posvetiti zunanjim reproduktivnim genitalijam, pri katerih je treba pregledati, ali so se pojavili znaki spremenjenega razvoja. Na 13. dan je treba shraniti ščitnico enega mladega samca in ene mlade samice na leglo. 48. Pri vseh odraslih živalih je treba shraniti jajčnike, moda, pomožne spolne organe (maternico in maternični vrat, nadmodke, prostato, semenska mešička s koagulacijskimi žlezami), ščitnico in vse organe, na katerih se kažejo makroskopske lezije. Za redni pregled mod in nadmodkov fiksacija v formalinu ni priporočljiva. Sprejemljiva metoda za ta tkiva je uporaba Bouinovega ali prilagojenega Davidsonovega fiksativa (11). Tunico albugineo je dovoljeno nežno in plitvo punktirati na obeh polih organa z iglo, da lahko fiksativ hitro prodre v tkivo. Histopatologija 49. Podrobno histopatološko preiskavo je treba izvesti na jajčnikih, modih in nadmodkih (s posebnim poudarkom na fazah spermatogeneze in histopatologiji intersticijske celične strukture mod) živali iz skupine z največjim odmerkom in kontrolne skupine. Drugi shranjeni organi, vključno s ščitnicami mladičev in odraslih živali, se lahko pregledajo po potrebi. Teža ščitnice se lahko določi po fiksaciji. Pri odstranjevanju priraščenih tkiv je prav tako potrebna velika previdnost, opravi pa se lahko šele po fiksaciji, da se preprečijo poškodbe tkiv, ki lahko ogrozijo histopatološko analizo. Preiskave je treba razširiti na živali iz skupin z drugimi odmerjanji, če se v skupini z največjim odmerkom opazijo spremembe. Več informacij o disekciji, fiksaciji, sekciji in histopatologiji endokrinih tkiv je na voljo v napotkih o histopatologiji (11). PODATKI IN POROČANJE Podatki 50. Podatke je treba navesti za vsako žival posebej. Poleg tega je treba vse podatke povzeti v obliki preglednice, ki za vsako preskusno skupino prikazuje število živali na začetku preskusa, število živali, poginulih med preskusom ali usmrčenih iz humanih razlogov, čas pogina ali usmrtitve iz humanih razlogov, število plodnih živali, število brejih samic, število živali, ki kažejo znake toksičnosti, opis znakov zaznane toksičnosti, vključno s časom začetka, trajanjem in resnostjo morebitnih toksičnih učinkov, vrsto histopatoloških sprememb in vse ustrezne podatke o leglu. Format zbirnega poročila v obliki preglednice, ki se je izkazal kot zelo koristen za oceno učinkov na razmnoževanje/razvoj, je naveden v Dodatku 3. 51. Zaradi omejenega obsega študije imajo statistične analize v obliki preskusov ‚pomembnosti‘ omejeno vrednost za številne končne točke, zlasti končne točke razmnoževanja. Če se uporabijo statistične analize, mora biti izbrana metoda ustrezna za porazdelitev preučevane spremenljivke, izbrati pa jo je treba pred začetkom študije. Statistična analiza zadnjično-genitalne razdalje in razvitosti prsnih bradavic mora temeljiti na podatkih za posameznega mladiča, pri čemer se upoštevajo učinki legla. Kadar je ustrezno, je enota analize leglo. Statistična analiza telesne teže mladičev mora temeljiti na podatkih za posameznega mladiča, pri čemer se upošteva velikost legla. Zaradi majhnosti skupine je lahko uporaba podatkov o kontrolah iz preteklih preskusov (npr. za velikost legla), če so na voljo, prav tako koristna kot pomoč pri razlagi študije. Vrednotenje rezultatov 52. Ugotovitve te toksikološke študije je treba ovrednotiti glede na opažene učinke, obdukcijo in mikroskopske ugotovitve. Vrednotenje vključuje razmerje med odmerkom preskusne kemikalije in navzočnostjo ali odsotnostjo pojava in resnosti anomalij, vključno z makroskopskimi lezijami, ugotovljenimi ciljnimi organi, neplodnostjo, kliničnimi anomalijami, prizadeto zmogljivostjo reproduktivnosti in legla, spremembami telesne mase, učinki na smrtnost in drugimi toksičnimi učinki. 53. Zaradi kratkotrajnega tretiranja samca je treba pri ocenjevanju učinkov na razmnoževanje pri samcih histopatologijo mod in nadmodkov obravnavati skupaj s podatki o plodnosti. Kot pomoč pri razlagi študije je lahko koristna tudi uporaba podatkov o kontrolah iz preteklih preskusov, ki se nanašajo na razmnoževanje/razvoj (npr. za velikost legla, zadnjično-genitalno razdaljo, razvitost prsnih bradavic, ravni T4 v serumu), če so na voljo. 54. Za kontrolo kakovosti se predlagata zbiranje podatkov o kontrolah iz preteklih preskusov in izračun koeficientov variacije za številčne podatke, zlasti za parametre, povezane z zaznavanjem endokrinih motilcev. Ti podatki se lahko uporabijo za primerjave, ko se vrednotijo dejanske študije. Poročilo o preskusu 55. V poročilo o preskusu se vključijo podatki, navedeni v nadaljevanju. Preskusna kemikalija: — vir, številka serije, rok uporabe, če je na voljo; — stabilnost preskusne kemikalije, če je znana. Snov iz ene sestavine — fizični videz, topnost v vodi in dodatne ustrezne fizikalno-kemijske lastnosti; — kemijski identifikacijski podatki, kot so ime po nomenklaturi IUPAC ali ime CAS, številka CAS, koda po sistemu SMILES ali identifikatorju InChI, strukturna formula, čistost, kemijska identiteta nečistoč, kot je ustrezno in praktično izvedljivo, itd. Snov z več sestavinami, UVCB in zmesi: — čim obsežnejša opredelitev lastnosti s kemijsko identiteto (glej zgoraj), kvantitativnim pojavljanjem in ustreznimi fizikalno-kemijskimi lastnostmi sestavin. Vehikel (po potrebi): — utemeljitev izbire vehikla, če ta ni voda. Preskusne živali: — uporabljena vrsta/sev; — število, starost in spol živali; — izvor, nastanitvene razmere, prehrana itd.; — teža posamezne živali na začetku preskusa. — utemeljitev vrste, če to ni podgana. Preskusni pogoji: — utemeljitev izbire velikosti odmerkov; — podrobni podatki o formulaciji preskusne kemikalije in pripravi hrane, doseženih koncentracijah, stabilnosti in homogenosti pripravka; — podrobnosti o dajanju preskusne kemikalije; — preračunavanje koncentracije preskusne kemikalije v hrani ali vodi (ppm) v dejanski odmerek (mg/kg telesne teže/dan), če je ustrezno; — podrobnosti o kakovosti hrane in vode; — podroben opis postopka naključnega izbiranja mladičev za izločitev, če se izločijo. Rezultati: — telesna teža/spremembe telesne teže; — poraba hrane, in če je na voljo, poraba vode; — podatki o toksičnem odzivu po spolu in odmerku, vključno s plodnostjo in brejostjo, ter drugi znaki toksičnosti; — trajanje brejosti; — toksični ali drugi učinki na razmnoževanje, potomce, poporodno rast itd.; — vrsta, resnost in trajanje kliničnih opažanj (s podatki o popravljivosti); — število odraslih samic z normalnim ali nenormalnim pojatvenim ciklusom in trajanje ciklusa; — število živorojenih in izgub po ugnezditvi; — podatki o telesni teži mladičev; — zadnjično-genitalna razdalja vseh mladičev (in telesna teža na dan meritve zadnjično-genitalne razdalje); — razvitost prsnih bradavic pri mladih samcih; — ravni ščitničnega hormona pri mladičih, starih 13 dni, in odraslih samcih (ter materah in mladičih, starih 4 dni, če se merijo); — število mladičev z večjimi vidnimi anomalijami, splošna ocena zunanjih genitalij, število spačkov; — čas pogina med študijo oziroma ali so živali preživele do zaključka študije; — število ugnezditev, velikost legla in teže legla ob evidentiranju; — telesna teža ob usmrtitvi in podatki o teži organov za starševske živali; — izsledki obdukcije; — podroben opis ugotovitev histopatoloških preiskav; — podatki o absorpciji (če so na voljo); — statistična obdelava rezultatov, če je to primerno. Obravnava rezultatov. Sklepne ugotovitve. Razlaga rezultatov 56. Študija bo zagotovila vrednotenje toksičnosti za razmnoževanje/razvoj, povezane z dajanjem ponovljenih odmerkov (glej odstavka 5 in 6). Pokazala bo lahko na potrebo po dodatnih preiskavah in zagotovila smernice za zasnovo poznejših študij. Za pomoč pri razlagi rezultatov o razmnoževanju in razvoju glej Smernico OECD 43 (12). Smernica OECD 106 o histološkem vrednotenju preskusov endokrinega in razmnoževalnega sistema pri glodavcih (11) zagotavlja informacije o pripravi in ocenjevanju (endokrinih) organov in vaginalnih brisov, ki so lahko koristne za to smernico za preskušanje. VIRI (1) OECD (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Na voljo na zahtevo pri Organizaciji za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz. (2) OECD (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokio, 27.–29. oktober 1992. Na voljo na zahtevo pri Organizaciji za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz. (3) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10.–11. marec 1998. Na voljo na zahtevo pri Organizaciji za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz. (4) OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (št. 217), Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz. (5) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations. Series on Testing and Assessment (št. 19), Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz. (6) OECD (2011). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (št. 150), Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz. (7) Goldman, J. M., Murr, A. S., Buckalew, A. R., Ferrell, J. M., in Cooper, R. L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research, del B, 80 (2), 84–97. (8) Sadleir, R. M. F. S. (1979). Cycles and Seasons, v: Auston, C. R., in Short, R. V. (ur.). Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York. (9) Gallavan, R. H., Jr., Holson, J. F., Stump, D. G., Knapp, J. F., in Reynolds, V. L. (1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights, Reproductive Toxicology, 13: 383-390. (10) OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (št. 151), Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz. (11) OECD (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (št. 106), Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz. (12) OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (št. 43), Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz. Dodatek 1 OPREDELITVE POJMOV (GLEJ TUDI SMERNICO OECD 150 (6)) Androgenost je zmožnost kemikalije, da deluje tako kot naravni androgeni hormon (npr. testosteron) v sesalskem organizmu. Antiandrogenost je zmožnost kemikalije, da zavira delovanje naravnega androgenega hormona (npr. testosterona) v sesalskem organizmu. Antiestrogenost je zmožnost kemikalije, da zavira delovanje naravnega estrogenega hormona (npr. 17 β-estradiola) v sesalskem organizmu. Protiščitnično delovanje je zmožnost kemikalije, da zavira delovanje naravnega ščitničnega hormona (npr. T3) v sesalskem organizmu. Kemikalija je snov ali zmes. Toksičnost za razvoj: pojavna oblika toksičnosti za razmnoževanje, ki se pri potomcih kaže kot pred-, ob- in poporodna strukturna ali funkcionalna motnja. Odmerjanje je splošen izraz, ki vključuje odmerek ter pogostnost in trajanje dajanja odmerka. Odmerek je količina dane preskusne kemikalije. Izražen je kot masa preskusne kemikalije na enoto telesne teže preskusne živali na dan (npr. mg/kg telesne teže/dan) ali kot konstantna koncentracija v hrani. Očitna toksičnost je splošen izraz, ki opisuje jasne znake toksičnosti po dajanju preskusne kemikalije. Ti morajo zadostovati za oceno nevarnosti in biti takšni, da bi povečanje danega odmerka najverjetneje povzročilo razvoj resnih znakov toksičnosti in verjetno smrt. Škodovanje plodnosti pomeni motnje razmnoževalnih funkcij ali sposobnosti za razmnoževanje pri samcih ali samicah. Toksičnost pri materi: škodljivi učinki na breje samice, ki se pojavijo bodisi specifično (neposredni učinek) bodisi nespecifično (posredni učinek). NOAEL je kratica za raven brez opaženih škodljivih učinkov (no-observed-adverse-effect level). To je največji odmerek, pri katerem ni opaženih škodljivih učinkov zaradi tretiranja. Estrogenost je zmožnost kemikalije, da deluje tako kot naravni estrogeni hormon (npr. 17 β-estradiola) v sesalskem organizmu. Toksičnost za razmnoževanje pomeni škodljive učinke na potomstvo in/ali poškodovane razmnoževalne funkcije ali prizadete sposobnosti za razmnoževanje pri samcih in samicah. Preskusna kemikalija je vsaka snov ali zmes, preskušena s to preskusno metodo. Ščitnično delovanje je zmožnost kemikalije, da deluje tako kot naravni ščitnični hormon (npr. T3) v sesalskem organizmu. Validacija je znanstveni postopek, oblikovan za določanje zahtev glede delovanja in omejitev preskusne metode ter za prikaz njene zanesljivosti in ustreznosti za določen namen. Dodatek 2 DIAGRAM NAČRTA ZA POSKUSE Z NAVEDBO NAJDALJŠEGA TRAJANJA ŠTUDIJE NA PODLAGI POLNEGA 14-DNEVNEGA OBDOBJA PARJENJA ﻿Dodatek 3 ZBIRNO POROČILO O UČINKIH NA RAZMNOŽEVANJE/RAZVOJ V OBLIKI PREGLEDNICE OPAŽANJA VREDNOSTI Odmerjanje (enote) 0 (kontrola) … … … … Začetni pari (N) Ciklus estrusa (vsaj srednja dolžina in pogostnost nerednih ciklusov) Samice, ki kažejo znake kopulacije (N) Samice, ki so dosegle brejost (N) Dnevi spočetja 1–5 (N) Dnevi spočetja 6–... (21) (N) Brejost≤ 21 dni (N) Brejost = 22 dni (N) Brejost ≥ 23 dni (N) Matere z živimi novorojenimi mladiči (N) Matere z živimi mladiči 4. dan po porodu (N) Ugnezditve/mati (srednja vrednost) Živi mladiči/mati ob rojstvu (srednja vrednost) Živi mladiči/mati 4. dan (srednja vrednost) Razmerje med spoloma (m/ž) ob rojstvu (srednja vrednost) Razmerje med spoloma (m/ž) 4. dan (srednja vrednost) Teža legla ob rojstvu (srednja vrednost) Teža legla 4. dan (srednja vrednost) Teža mladičev ob rojstvu (srednja vrednost) Teža mladičev ob meritvi zadnjično-genitalne razdalje (srednja vrednost pri samcih, srednja vrednost pri samicah) Zadnjično-genitalna razdalja pri mladičih na isti dan po porodu, od rojstva do 4. dne (srednja vrednost pri samcih, srednja vrednost pri samicah, označi dan po porodu) Teža mladičev 4. dan (srednja vrednost) Razvitost prsnih bradavic pri mladih samcih 13. dan (srednja vrednost) Teža mladičev 13. dan (srednja vrednost) MLADIČI Z ANOMALIJAMI Matere z 0 Matere z 1 Matere z ≥ 2 IZGUBA POTOMSTVA Predporodna/po ugnezditvi (ugnezditve minus živorojeni) Samice z 0 Samice z 1 Samice z 2 Samice s ≥ 3 Poporodna (živorojeni minus živi 13. dan po porodu) Samice z 0 Samice z 1 Samice z 2 Samice s ≥ 3 B.64 KOMBINIRANA ŠTUDIJA TOKSIČNOSTI PRI PONOVLJENIH ODMERKIH S PRESEJALNIM PRESKUSOM TOKSIČNOSTI ZA RAZMNOŽEVANJE/RAZVOJ UVOD 1. Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici OECD za preskušanje (TG) 422 (2016). Smernice OECD za preskušanje kemikalij se redno pregledujejo ob upoštevanju znanstvenega napredka. Prvotna smernica za presejalni preskus 422 je bila sprejeta leta 1996 na podlagi protokola za ‚kombinirani presejalni preskus pri ponovljenih odmerkih za razmnoževanje/razvoj‘, o katerem se je razpravljalo na dveh strokovnih srečanjih, in sicer leta 1990 v Londonu (1) in leta 1992 v Tokiu (2). 2. Ta preskusna metoda združuje del, ki vključuje presejalni preskus toksičnosti za razmnoževanje/razvoj in ki temelji na izkušnjah, pridobljenih v državah članicah z uporabo prvotne metode na obstoječih kemikalijah, ki se proizvajajo v velikih količinah, in pri raziskovalnih preskusih s snovmi za pozitivno kontrolo (3) (4), ter del, ki vključuje preskus toksičnosti s ponavljajočimi se odmerki, v skladu s Smernico OECD za preskušanje 407 (28-dnevna študija oralne toksičnosti s ponavljajočimi se odmerki na glodavcih, ki ustreza poglavju B.7 te priloge). 3. Ta preskusna metoda je bila posodobljena z ustreznimi končnimi točkami za endokrine motilce kot nadaljnji ukrep v okviru prednostne dejavnosti, ki jo je OECD začela izvajati leta 1998, da bi pregledala obstoječe smernice za preskušanje ter pripravila nove smernice za presejalne preskuse in preskušanje potencialnih endokrinih motilcev (5). V tem okviru je bila Smernica za preskušanje 407 (ki ustreza poglavju B.7 te priloge) leta 2008 izboljšana s parametri, primernimi za zaznavanje endokrinega delovanja preskusnih kemikalij. Namen posodobitve Smernice za preskušanje 422 je bil vključitev nekaterih ustreznih končnih točk za endokrine motilce v smernice za presejalno preskušanje, pri katerih obdobja izpostavljenosti zajemajo nekatera občutljiva obdobja med razvojem (pred rojstvom in malo po rojstvu). 4. Izbrane dodatne končne točke, pomembne za endokrine motilce, ki so tudi del Smernice za preskušanje št. 443 (razširjene študije toksičnosti za razmnoževanje na eni generaciji, ki ustreza poglavju B.56 te priloge), so bile v Smernico za preskušanje št. 422 vključene na podlagi študije izvedljivosti, s katero so se obravnavala znanstvena in tehnična vprašanja njihove vključitve ter morebitne prilagoditve načrta preskusa, potrebne za njihovo vključitev (6). 5. Ta preskusna metoda naj bi zagotovila omejene informacije v zvezi z učinki preskusne kemikalije na sposobnost razmnoževanja pri samcih in samicah, kot so funkcija spolnih žlez, obnašanje pri parjenju, spočetje, razvoj zarodka in kotitev. Ni alternativa obstoječim preskusnim metodam B.31, B.34, B.35 ali B.56 niti jih ne nadomešča. ZAČETNI PREUDARKI 6. Pri ocenjevanju in vrednotenju toksičnih lastnosti preskusne kemikalije se lahko metoda s ponavljanjem odmerkov uporabi za določitev oralne toksičnosti, potem ko se s preskusi akutne toksičnosti že pridobijo začetne informacije o toksičnosti. Ta študija zagotavlja informacije o morebitnih nevarnostih za zdravje, ki jih lahko povzroči večkratna izpostavljenost v razmeroma omejenem obdobju. Metoda obsega osnovno študijo toksičnosti s ponavljajočimi se odmerki, ki se lahko uporabi za kemikalije, za katere ni upravičena 90-dnevna študija (npr. če obseg proizvodnje ne presega določenih mej), ali pa se izvede kot predhodna študija za dolgoročno študijo. Pri izvajanju študije je treba upoštevati vodilna načela in premisleke iz Smernice OECD 19 o prepoznavanju, oceni in uporabi kliničnih znakov kot humanih končnih točk za preskusne živali, ki se uporabljajo pri ocenah varnosti (7). 7. Poleg tega vključuje presejalni preskus toksičnosti za razmnoževanje/razvoj, zato se lahko uporabi za zagotovitev začetnih informacij o morebitnih učinkih na sposobnost razmnoževanja pri samcih in samicah, kot so funkcija spolnih žlez, obnašanje pri parjenju, spočetje, razvoj zarodka in kotitev, bodisi v zgodnji fazi ocenjevanja toksikoloških lastnosti preskusnih kemikalij bodisi v zvezi s kemikalijami, ki vzbujajo zaskrbljenost. Ta preskusna metoda ne zagotavlja popolnih informacij o vseh vidikih razmnoževanja in razvoja. Zlasti zagotavlja samo omejene načine, kako po rojstvu zaznati pojavne oblike izpostavljenosti pred rojstvom ali učinke, ki jih lahko povzroči izpostavljenost po rojstvu. Zaradi (med drugim) selektivnosti končnih točk in kratkotrajnosti študije ta metoda ne zagotavlja dokazov za dokončne trditve o neobstoju učinkov na razmnoževanje/razvoj. Če ni podatkov iz drugih preskusov toksičnosti za razmnoževanje/razvoj, so poleg tega pozitivni rezultati koristni za začetno oceno nevarnosti in prispevajo k odločitvam v zvezi z nujnostjo in časovnim okvirom dodatnega preskušanja. 8. Rezultate, ki se dobijo s parametri, povezanimi z endokrinim sistemom, je treba obravnavati znotraj temeljnega okvira OECD za preskušanje in ocenjevanje kemikalij, ki povzročajo endokrine motnje (Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals) (8). V tem temeljnem okviru je izboljšana Smernica OECD za preskušanje 422 vključena na ravni 4 kot preskus in vivo , ki zagotavlja podatke o škodljivih učinkih na ustrezne končne točke za endokrini sistem. Vendar zgolj endokrinega signala ni mogoče šteti za zadosten dokaz, da je preskusna kemikalija endokrini motilec. 9. Pri preskusni metodi je poudarek tudi na nevroloških učinkih kot specifični končni točki, poudarjena je tudi potreba po pozornem kliničnem opazovanju živali, da se pridobi čim več informacij. S to metodo naj bi se opredelile kemikalije z nevrotoksičnim potencialom, zaradi česar je morda upravičena dodatna poglobljena raziskava tega vidika. Poleg tega lahko metoda v osnovi nakaže imunološke učinke. 10. Če ni podatkov iz drugih študij sistemske toksičnosti, toksičnosti za razmnoževanje/razvoj, nevrotoksičnosti in/ali imunotoksičnosti, so pozitivni rezultati koristni za začetno oceno tveganj in prispevajo k odločitvam v zvezi z nujnostjo in časom dodatnega preskušanja. Preskus je lahko še zlasti koristen v okviru osnovnega pregleda OECD v zvezi s podatki o kemikaliji (SIDS) za oceno obstoječih kemikalij, o katerih je na voljo malo ali nič toksikoloških informacij, in se lahko uporabi namesto dveh ločenih preskusov toksičnosti pri ponovljenih odmerkih (Smernica OECD za preskušanje 407, ki ustreza poglavju B.7 te priloge) oziroma toksičnosti za razmnoževanje/razvoj (Smernica OECD za preskušanje 421, ki ustreza poglavju B.63 te priloge). Uporabi se lahko tudi kot študija za določanje območja odmerka za obsežnejše razmnoževalne/razvojne študije ali kadar je kako drugače pomembna. 11. Na splošno se domneva, da obstajajo razlike v občutljivosti med brejimi in nebrejimi živalmi. Posledično je lahko pri tem kombiniranem preskusu bolj zapleteno določiti velikosti odmerkov, ki so ustrezni za oceno tako splošne sistemske toksičnosti kot specifične toksičnosti za razmnoževanje/razvoj, kot pa če se posamezni preskusi izvedejo ločeno. Poleg tega je lahko razlaga rezultatov preskusa v zvezi s splošno sistemsko toksičnostjo težja, kot če se izvede ločena študija s ponovljenimi odmerki, zlasti če serumski in histopatološki parametri v študiji niso ocenjeni hkrati. Zaradi teh tehničnih težav so za izvajanje tega kombiniranega presejalnega preskusa potrebne bogate izkušnje s preskušanjem toksičnosti. Po drugi strani pa lahko kombinirani preskus, poleg tega da vključuje manjše število živali, zagotovi tudi boljši način za razlikovanje med neposrednimi učinki na razmnoževanje/razvoj in učinki, ki so glede na druge (sistemske) učinke drugotnega pomena. 12. Pri tem preskusu je obdobje odmerjanja daljše kot pri običajni 28-dnevni študiji s ponovljenimi odmerki. Vendar se pri njem uporabi manj živali vsakega spola na skupino, kot če se običajna 28-dnevna študija s ponovljenimi odmerki izvede poleg presejalnega preskusa toksičnosti za razmnoževanje/razvoj. 13. Pri tej preskusni metodi je predvideno oralno dajanje preskusne kemikalije. Če se uporabijo drugi načini izpostavljenosti, so morda potrebne prilagoditve. 14. Preden se preskusna metoda uporabi na zmesi, da bi se pridobili podatki za predvideni regulativni namen, je treba preučiti, ali in zakaj lahko zagotovi ustrezne rezultate za navedeni namen. Kadar obstaja regulativna zahteva za preskušanje zmesi, taki preudarki niso potrebni. 15. Opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1. NAČELO PRESKUSA 16. Preskusna kemikalija se daje v stopnjevanih odmerkih več skupinam samcev in samic. Samcem je treba dajati odmerke najmanj štiri tedne, do vključno dneva pred predvideno usmrtitvijo (to vključuje vsaj dva tedna pred parjenjem, obdobje parjenja in približno dva tedna po parjenju). Glede na omejeno obdobje odmerjanja pred parjenjem pri samcih plodnost morda ni posebno občutljiv kazalnik toksičnosti za moda. Zato je bistven podroben histološki pregled mod. Kombinacija dvotedenskega obdobja odmerjanja pred parjenjem in poznejših opazovanj parjenja/plodnosti s skupno vsaj štiritedenskim obdobjem odmerjanja, ki mu sledi podroben histopatološki pregled spolnih žlez samcev, se šteje za zadostno, da se lahko zazna večina učinkov na plodnost pri samcih in spermatogenezo. 17. Samicam je treba dajati odmerke med celotno študijo. To vključuje dva tedna pred parjenjem (da se zajameta vsaj dva popolna pojatvena cikla), različen čas do spočetja, trajanje brejosti in vsaj 13 dni po kotitvi, do vključno dneva pred predvideno usmrtitvijo. 18. Trajanje študije po aklimatizaciji in oceni pojatvenega cikla pred odmerjanjem je odvisno od delovanja samice in traja približno 63 dni (vsaj 14 dni pred parjenjem, (do) 14 dni parjenja, 22 dni brejosti, 13 dni laktacije). 19. V obdobju dajanja odmerkov je treba živali vsak dan pozorno opazovati, ali kažejo znake zastrupitve. Na živalih, ki med preskusom poginejo ali so usmrčene, se opravi obdukcija, ob koncu preskusa pa se tudi preživele živali usmrtijo in se na njih opravi obdukcija. OPIS METODE Izbira živalskih vrst 20. Pri tej preskusni metodi naj bi se uporabljale podgane. Če se parametri, določeni v tej smernici za preskušanje 422, preiskujejo na drugi vrsti glodavcev, je treba to podrobno utemeljiti. V mednarodnem validacijskem programu za zaznavanje endokrinih motilcev na podlagi Smernice OECD za preskušanje 407 je bila podgana edina uporabljena vrsta. Sevi z nizko plodnostjo ali dobro znano visoko pojavnostjo razvojnih napak se ne smejo uporabljati. Uporabiti je treba zdrave živali, ki se še niso parile in niso bile izpostavljene predhodnim preskusnim postopkom. Opredeliti je treba vrsto, sev, spol, težo in starost preskusnih živali. Na začetku študije morajo biti razlike v teži uporabljenih živali čim manjše in ne smejo presegati ± 20 % povprečne teže za vsak spol. Če se študija izvaja kot predhodna študija za dolgotrajno študijo ali študijo celotne generacije, je priporočljivo, da se v obeh študijah uporabijo živali iz istega seva in vira. Nastanitev in hranjenje 21. Vsi postopki morajo biti v skladu z lokalnimi standardi oskrbe laboratorijskih živali. Temperatura v prostoru s preskusnimi živalmi mora znašati 22 °C (± 3 °C). Relativna vlažnost mora biti vsaj 30-odstotna in po možnosti ne sme presegati 70 %, razen med čiščenjem prostora. Osvetlitev mora biti umetna s svetlobnim ciklom 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporablja običajna laboratorijska hrana z neomejeno količino pitne vode. Na izbiro hrane lahko vpliva potreba po zagotovitvi ustrezne primesi preskusne kemikalije, če se daje po tej metodi. 22. Živali morajo biti nastanjene v majhnih skupinah istega spola; posamično so lahko nastanjene, če je to znanstveno utemeljeno. Pri skupinski nastanitvi je lahko v kletki največ pet živali. Parjenje se mora izvajati v kletkah, ki so primerne za ta namen. Breje samice morajo biti v svojih kletkah in imeti na voljo material za izdelavo gnezda. Samice v laktaciji so v svojih kletkah skupaj z mladiči. 23. Hrano je treba redno analizirati, da ne vsebuje kontaminantov. Vzorec hrane je treba hraniti, dokler poročilo ni končano. Priprava živali 24. Zdrave mlade odrasle živali se naključno izberejo ter dodelijo tretiranim skupinam in kletkam. Kletke je treba razporediti tako, da se čim bolj zmanjšajo morebitni učinki, ki nastanejo zaradi razporeditve kletk. Živali se označijo z enkratnimi oznakami in zadržijo v kletkah vsaj pet dni pred začetkom študije, da se prilagodijo na laboratorijske razmere. Priprava odmerkov 25. Priporoča se, da se preskusna kemikalija daje oralno, razen če se šteje drug način dajanja za primernejšega. Če se izbere oralni način, se preskusna kemikalija običajno daje z gavažo, lahko pa tudi s hrano ali pitno vodo. 26. Po potrebi se preskusna kemikalija raztopi ali suspendira v ustreznem vehiklu. Priporočljivo je, da se, če je mogoče, najprej preuči možnost uporabe vodne raztopine/suspenzije, nato raztopine/suspenzije v olju (npr. koruznem), šele potem pa možnost raztopine v drugih vehiklih. Pri nevodnih vehiklih je treba poznati njihove toksične lastnosti. Določiti je treba stabilnost in homogenost preskusne kemikalije v vehiklu. POSTOPEK Število in spol živali 27. Priporočljivo je, da se v vsaki skupini začne z vsaj 10 samci in 12–13 samicami. Pri samicah se pred izpostavitvijo oceni pojatvena cikličnost; živali, ki nimajo značilnih 4–5-dnevnih ciklusov, se ne vključijo v študijo; zato se priporočajo dodatne samice za zagotovitev, da je v vsaki skupini 10 samic. Razen v primeru izrazitih toksičnih učinkov naj bi se tako dobilo vsaj 8 brejih samic na skupino, kar je običajno najnižje sprejemljivo število brejih samic na skupino. Cilj je dobiti dovolj brejih samic in mladičev, da je zagotovljeno smiselno ovrednotenje potenciala preskusne kemikalije za vplivanje na plodnost, brejost in materinsko obnašanje ter sesanje, rast in razvoj potomcev F 1 od spočetja do 13. dne po skotitvi. Če so med potekom študije načrtovane usmrtitve, je treba število povečati za število živali, predvidenih za usmrtitev pred zaključkom študije. Razmisliti je treba o dodatni satelitski skupini petih živali vsakega spola v kontrolni skupini in skupini, tretirani z največjim odmerkom, na katerih bi se vsaj 14 dni po tretiranju opazovale popravljivost, obstojnost ali zapoznelost nastopa sistemskih toksičnih učinkov. Živali iz satelitske skupine se ne parijo, zato se ne uporabijo za oceno toksičnosti za razmnoževanje/razvoj. Odmerjanje 28. Običajno je treba uporabiti najmanj tri preskusne skupine in eno kontrolno skupino. Če niso na voljo ustrezni podatki o splošni toksičnosti, se lahko opravi študija za določanje območja (na živalih istega seva in izvora), s pomočjo katere se določijo odmerki, ki bodo uporabljeni. Razen tretiranja s preskusno kemikalijo je treba živali v kontrolni skupini obravnavati enako kot živali v preskusni skupini. Če se pri dajanju preskusne kemikalije uporablja vehikel, mora kontrolna skupina prejeti največjo uporabljeno količino vehikla. 29. Pri izbiri velikosti odmerkov je treba upoštevati vse obstoječe podatke o toksičnosti in (toksiko-)kinetiki, ki so na voljo. Upoštevati je treba tudi, da lahko obstajajo razlike v občutljivosti med brejimi in nebrejimi živalmi. Izbrati je treba največjo velikost odmerka, ki povzroči toksične učinke, ne pa tudi pogina ali očitnega trpljenja. Nato je treba izbrati padajoče zaporedje velikosti odmerkov, da se pokažejo vsi odzivi, ki so odvisni od odmerjanja, in ugotovi največja velikost odmerka, pri kateri ni škodljivih učinkov. Velikokrat je najbolje uporabiti dva- do štirikratne intervale, namesto zelo velikih intervalov (npr. večjih od desetkratnika) med odmerjanji pa je pogosto primerneje dodati še četrto preskusno skupino. 30. Če se ugotovijo splošna toksičnost (npr. zmanjšana telesna teža, učinki na jetra, srce, pljuča ali ledvice itd.) ali druge spremembe, ki morda niso toksične reakcije (npr. zmanjšan vnos hrane, povečanje jeter), je potrebna previdnost pri razlagi ugotovljenih učinkov na endokrine občutljive končne točke. Mejni preskus 31. Če oralna študija pri odmerku, velikem najmanj 1 000 mg/kg telesne teže/dan, ali pri enakovrednem deležu v hrani ali pitni vodi pri vnosu s hrano ali pitno vodo (na podlagi telesne teže), pri katerem so uporabljeni postopki, opisani za to študijo, ne povzroči opaznih toksičnih učinkov in če na podlagi podatkov o strukturno sorodnih snoveh toksičnost ni pričakovana, popolna študija z več velikostmi odmerkov morda ni potrebna. Mejni preskus se uporabi, razen če izpostavljenost človeka nakazuje potrebo po uporabi večjega odmerka. Pri drugih vrstah prejemanja, na primer pri vdihavanju ali dermalni aplikaciji, lahko fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije pogosto določajo največjo dosegljivo izpostavljenost. Dajanje odmerkov 32. Živalim se dajejo odmerki preskusne kemikalije sedem dni na teden. Če se preskusna kemikalija daje z gavažo, jo je treba živali dati v enkratnem odmerku z uporabo želodčne sonde ali primerne intubacijske kanile. Največja količina tekočine, ki se lahko da naenkrat, je odvisna od velikosti preskusne živali. Količina ne sme presegati 1 ml/100 g telesne teže, razen v primeru vodnih raztopin, za katere se lahko uporabi 2 ml/100 g telesne teže. Razen pri dražilnih ali jedkih preskusnih kemikalijah, ki pri večjih koncentracijah navadno povzročijo močnejše učinke, je treba s prilagajanjem koncentracije čim bolj zmanjšati spremenljivost preskusne količine, da se zagotovi stalna količina pri vseh velikostih odmerkov. 33. Pri preskusnih kemikalijah, ki se dajejo s hrano ali pitno vodo, je treba zagotoviti, da količine uporabljene preskusne kemikalije ne vplivajo na normalno prehranjevanje ali vodno ravnotežje. Če se preskusna kemikalija daje s hrano, se lahko uporabi konstantna koncentracija v hrani (ppm) ali pa konstantna velikost odmerka glede na telesno težo živali; uporabljeni način je treba navesti. Če se preskusna kemikalija daje z gavažo, je treba odmerke dajati vsak dan ob približno istem času in jih najmanj enkrat tedensko prilagajati, da se vzdržuje konstantna velikost odmerka glede na telesno težo živali. Če se kombinirana študija izvaja kot predhodna študija za dolgoročno študijo toksičnosti ali popolno študijo toksičnosti za razmnoževanje, je treba v obeh študijah uporabiti podobno hrano. Načrt za poskus 34. Odmerjanje obema spoloma se mora začeti 2 tedna pred parjenjem, potem ko so se živali aklimatizirale vsaj pet dni in ko so bile samice pregledane, ali imajo normalen pojatveni ciklus (v dvotedenskem obdobju pred tretiranjem). Študija mora biti načrtovana tako, da se ocenjevanje pojatvenega ciklusa začne kmalu potem, ko živali dosežejo polno spolno zrelost. To se lahko pri različnih sevih podgan v različnih laboratorijih nekoliko razlikuje, npr. pri podganah seva Sprague Dawley se zgodi pri 10 tednih starosti, pri podganah seva Wistar pa pri približno 12 tednih starosti. Matere s potomci je treba usmrtiti 13. dan po porodu ali kmalu zatem. Da se omogoči postenje mater čez noč pred odvzemom krvi (če je zaželena ta možnost), mater in njihovega potomstva ni treba nujno usmrtiti isti dan. Dan rojstva (tj. ko je končana kotitev) je opredeljen kot poporodni dan 0. Samice, za katere ni dokazov o kopulaciji, se usmrtijo 24–26 dni po zadnjem dnevu obdobja parjenja. Odmerjanje se pri obeh spolih nadaljuje še v obdobju parjenja. Po obdobju parjenja je treba samcem dajati odmerke še vsaj toliko časa, dokler ni doseženo najkrajše skupno obdobje odmerjanja 28 dni. Nato se usmrtijo ali pa se ohranijo pri življenju in se jim še naprej dajejo odmerki za morebitno drugo parjenje, če se šteje za ustrezno. 35. Dnevno dajanje odmerkov starševskim samicam se mora nadaljevati skozi celotno brejost in vsaj do vključno 13. dne po porodu ali dneva pred usmrtitvijo. Pri študijah, pri katerih se preskusna kemikalija prejema z vdihavanjem ali po dermalni poti, se mora odmerjanje nadaljevati vsaj do vključno 19. dne brejosti, pri čemer je treba odmerjanje znova začeti takoj, ko je to mogoče, in najpozneje 4. dan po porodu. 36. Če so vključene živali iz satelitske skupine, predvidene za nadaljnja opazovanja, se ne parijo. Ohraniti jih je treba še vsaj 14 dni po prvi predvideni usmrtitvi mater, in sicer brez kakršnega koli tretiranja, da se zazna zapoznel nastop, obstojnost ali izginotje toksičnih učinkov. 37. Diagram načrta poskusa je prikazan v Dodatku 2. Pojatveni ciklusi 38. Pojatvene cikluse je treba spremljati pred začetkom tretiranja, da se za študijo izberejo samice z rednimi ciklusi (glej odstavek 27). Dnevno je treba spremljati tudi vaginalne brise, in sicer od začetka obdobja tretiranja do dokazov o parjenju. Če obstajajo pomisleki glede učinkov akutnega stresa, zaradi katerega bi se lahko z začetkom odmerjanja spremenili pojatveni ciklusi, lahko laboratoriji preskusne živali izpostavijo za 2 tedna in nato odvzamejo vaginalne brise, da spremljajo pojatveni ciklus vsaj dva tedna v obdobju pred parjenjem, dokler ni dokazov o parjenju. Med jemanjem celic nožnice/materničnega vratu je treba paziti, da ne pride do poškodb sluznice in posledično do psevdogravidnosti (8) (9). Postopek parjenja 39. Običajno je treba pri tej študiji uporabiti parjenje 1: 1 (en samec na eno samico). Izjeme so možne v primeru občasnih poginov samcev. Samica mora biti nastanjena z istim samcem, dokler ni dokazov o kopulaciji ali dokler ne pretečeta dva tedna. Vsako jutro je treba samice pregledati za prisotnost semenčic ali vaginalnega zamaška. Dan brejosti 0 je opredeljen kot dan, na katerega so potrjeni dokazi o parjenju (opažen je vaginalni čep ali semenčice). Če parjenje ni bilo uspešno, se lahko razmisli o ponovnem parjenju samic z dokazanimi samci iste skupine. Velikost legla 40. Četrti dan po skotitvi se lahko velikost posameznega legla prilagodi z naključno izločitvijo odvečnih mladičev, tako da so po možnosti v vsakem leglu štirje ali pet mladičev vsakega spola, odvisno od običajne velikosti legla pri uporabljenem sevu podgan. Dvema od odvečnih mladičev je treba odvzeti vzorce krvi, jih združiti in uporabiti za določitev ravni T4 v serumu. Selektivno izločanje mladičev, npr. na podlagi telesne teže ali zadnjično-genitalne razdalje, ni ustrezno. Kadar zaradi števila mladih samcev in samic ni mogoče, da bi bili v vsakem leglu štirje ali pet mladičev na spol, je sprejemljiva tudi delna prilagoditev (na primer šest samcev in štiri samice). Mladiči se ne izločijo, če velikost legla pade pod ciljno vrednost za izločitev (8 ali 10 mladičev/leglo). Če je nad ciljno vrednostjo za izločitev na voljo samo en mladič, se izloči samo en mladič, ki se mu odvzame vzorec krvi za morebitne ocene T4 v serumu. 41. Če velikost legla ni prilagojena, se 4. dan po porodu usmrtita dva mladiča na leglo, ki se jima odvzamejo vzorci krvi za meritve serumskih koncentracij hormona ščitnice. Če je mogoče, naj bosta dva mladiča na leglo samici, da se mladi samci prihranijo za ocene razvitosti prsnih bradavic, razen če izločitev teh mladičev pomeni, da ni več na voljo samic za oceno ob usmrtitvi. Mladiči se ne izločijo, če velikost legla pade pod ciljno vrednost za izločitev 8 ali 10 mladičev na leglo (odvisno od običajne velikosti legla pri uporabljenem sevu podgan). Če je glede na običajno velikost legla na voljo en sam mladič, se izloči samo en mladič, ki se mu odvzame vzorec krvi za morebitne ocene T4 v serumu. Opažanja 42. Splošna klinična opazovanja je treba opraviti vsaj enkrat na dan, po možnosti vsak dan ob istem času in ob upoštevanju obdobja največje intenzivnosti pričakovanih učinkov po odmerjanju. Evidentirati je treba podatke o zdravstvenem stanju živali. Živali je treba vsaj dvakrat na dan opazovati za odkrivanje obolevnosti in smrtnosti. 43. Enkrat pred prvo izpostavljenostjo (da se omogočijo primerjave na istem osebku) in nato vsaj enkrat na teden je treba opraviti natančna klinična opazovanja vseh starševskih živali. Ta opazovanja je treba opraviti zunaj kletk, v katerih živali bivajo, na standardnem mestu in po možnosti vsak dan ob istem času. Opažanja je treba skrbno dokumentirati, po možnosti s pomočjo točkovanj, ki jih izrecno določi preskuševalni laboratorij. Prizadevati si je treba, da se preskusni pogoji čim manj spreminjajo in da opazovanja po možnosti opravijo opazovalci, ki s tretiranjem niso seznanjeni. Pozornost je med drugim treba nameniti vsem spremembam na koži, kožuhu, očeh in sluznicah, pojavu sekrecije in ekskrecije ter delovanju avtonomnega živčevja (npr. solzenju, piloerekciji, velikosti zenic in nenavadnemu vzorcu dihanja). Prav tako je treba evidentirati spremembe v hoji, drži in odzivu na ravnanje z živalmi, pa tudi prisotnost kloničnih ali toničnih gibov, stereotipij (npr. prekomernega čiščenja, ponavljajočega se vrtenja v krogu), težke ali podaljšane kotitve ali nenormalnega vedenja (npr. samopohabe, vzvratne hoje) (10). 44. Enkrat med študijo je treba pri petih samcih in petih samicah, naključno izbranih iz vsake skupine, oceniti senzorično reaktivnost na različne vrste dražljajev (npr. slušni, vizualni in proprioceptivni dražljaji) (8) (9) (11), moč prijema (12) in motorično aktivnost (13). Nadaljnje podrobnosti glede mogočih postopkov so na voljo v navedenih virih. Uporabiti je mogoče tudi druge postopke, ki v njih niso opisani. Pri samcih je treba ta funkcionalna opazovanja izvesti proti koncu njihovega obdobja odmerjanja, malo pred predvideno usmrtitvijo, vendar pred vzorčenjem krvi za hematološke ali kliničnokemijske preiskave (glej odstavke 53–56, vključno z opombo 1). Samice morajo biti med temi funkcionalnimi preskusi v fiziološko podobnem stanju, po možnosti pa je treba preskuse izvesti enkrat v zadnjem tednu laktacije (npr. LD 6-13), malo pred predvideno usmrtitvijo. Čas ločitve mater od mladičev naj bo čim krajši. 45. Funkcionalna opazovanja, izvedena proti koncu študije, se lahko izpustijo, če je študija izvedena kot predhodna študija za poznejšo (90-dnevno) študijo subkronične toksičnosti ali dolgoročno študijo. V takem primeru je treba funkcionalna opazovanja vključiti v to dopolnilno študijo. Po drugi strani pa lahko podatki o funkcionalnih opazovanjih, pridobljeni v tej študiji s ponavljajočimi se odmerki, pomagajo pri določanju velikosti odmerkov za poznejšo študijo subkronične toksičnosti ali dolgoročno študijo. 46. Izjemoma se lahko funkcionalna opazovanja izpustijo tudi za skupine, ki sicer kažejo znake zastrupitve v tolikšnem obsegu, da bi to močno oviralo izvedbo funkcionalnega preskusa. 47. Evidentirati je treba trajanje brejosti, ki se računa od dneva brejosti 0. Vsako leglo je treba pregledati čim prej po skotitvi, da se ugotovijo število in spol mladičev, mrtvorojenih, živorojenih in spačkov (mladičev, ki so znatno manjši od ustreznih kontrolnih mladičev) ter večje nepravilnosti. 48. Žive mladiče je treba prešteti in določiti njihov spol, legla pa je treba stehtati v 24 urah po kotitvi (dan 0 ali 1. dan po porodu) ter vsaj na 4. in 13. dan po porodu. Poleg opažanj glede staršev (glej odstavka 43 in 44) je treba evidentirati vsako nenavadno vedenje potomcev. 49. Zadnjično-genitalno razdaljo vsakega mladiča je treba izmeriti na isti poporodni dan, in sicer med poporodnim dnem 0 in 4. dnem po porodu. Podatke o telesni teži mladičev je treba zbrati na dan, ko se meri zadnjično-genitalna razdalja, slednjo pa je treba normirati na mero velikosti mladiča, po možnosti kubični koren telesne teže (14). Število prsnih bradavic/areol pri mladih samcih je treba prešteti 12. ali 13. dan po porodu, kot je priporočeno v Smernici OECD 151 (15). Telesna teža in poraba hrane/vode 50. Samce in samice je treba stehtati prvi dan dajanja odmerka, nato pa vsaj enkrat tedensko in ob usmrtitvi. Med brejostjo je treba samice stehtati na dneve 0, 7, 14 in 20 ter v 24 urah po kotitvi (dan 0 ali 1. dan po porodu) in vsaj 4. in 13. dan po porodu. O teh opažanjih je treba posebej poročati za vsako odraslo žival. 51. Porabo hrane je treba v obdobju pred parjenjem, med brejostjo in laktacijo meriti vsaj enkrat na teden. Med parjenjem merjenje porabe hrane ni obvezno. V teh obdobjih je treba meriti tudi porabo vode, če se preskusna kemikalija daje s tem medijem. Hematologija 52. Enkrat med študijo je treba pri petih samcih in petih samicah, naključno izbranih iz vsake skupine, opraviti naslednje hematološke preiskave: hematokrit, koncentracija hemoglobina, število eritrocitov, retikulociti, skupno in diferencialno število levkocitov, število trombocitov ter čas/zmožnost koagulacije. Druge preiskave, ki jih je treba opraviti, če imajo preskusna kemikalija ali njeni domnevni metaboliti oksidativne lastnosti oziroma če obstaja sum, da jih imajo, vključujejo koncentracijo methemoglobina in Heinzeva telesca. 53. Vzorce krvi je treba vzeti na imenovanem mestu. Samice morajo biti med vzorčenjem v fiziološko podobnem stanju. Da se preprečijo praktične težave, povezane z različnim nastopom brejosti, se lahko vzorci krvi samicam odvzamejo ob koncu obdobja pred parjenjem, namesto da se vzorčijo neposredno pred postopkom evtanazije živali ali med njim. Vzorce krvi samcev je treba po možnosti odvzeti neposredno pred postopkom evtanazije živali ali med njim. Druga možnost je, da se samcem kri odvzame tudi ob koncu obdobja pred parjenjem, če je bila za samice izbrana ta časovna točka. 54. Vzorce krvi je treba shraniti v ustreznih pogojih. Klinična biokemija 55. Klinične biokemične določitve za ugotavljanje glavnih toksičnih učinkov v tkivih in zlasti učinkov na ledvice in jetra je treba opraviti na vzorcih krvi, pridobljenih od izbranih petih samcev in petih samic iz vsake skupine. Priporočeno je, da živali pred jemanjem vzorcev krvi čez noč postimo. ( 22 ) Preiskave plazme ali seruma morajo vključevati določanje natrija, kalija, glukoze, skupnega holesterola, sečnine, kreatinina, skupnih proteinov in albumina, najmanj dveh encimov, ki sta kazalnika hepatoceličnih učinkov (kot so alanin-aminotransferaza, aspartat-aminotransferaza in sorbitol-dehidrogenaza), in žolčnih kislin. Meritve dodatnih encimov (jetrnega ali drugega izvora) in bilirubina lahko v nekaterih okoliščinah zagotovijo koristne informacije. 56. Vzorci krvi z določenega mesta se vzamejo po naslednjem razporedu: — vsaj dvema mladičema na leglo 4. dan po porodu, če število mladičev to omogoča (glej odstavka 40 in 41); — vsem materam in vsaj dvema mladičema na leglo ob usmrtitvi 13. dan ter — vsem odraslim samcem ob usmrtitvi. Vsi vzorci krvi se shranijo v ustreznih pogojih. V vzorcih krvi mladičev, starih 13 dni, in odraslih samcev se ocenijo serumske koncentracije hormonov ščitnice (T4). Dodatna ocena T4 v vzorcih krvi mater in mladičev, starih 4 dni, se izvede po potrebi. Po potrebi se lahko izmerijo tudi drugi hormoni. Za analize hormonov ščitnice se lahko kri mladičev združi po leglih. Hormona ščitnice (T4 in TSH) je treba po možnosti meriti ‚skupaj‘. 57. Po želji se lahko v zadnjem tednu študije pri petih naključno izbranih samcih iz vsake skupine opravijo naslednje analize urina, dobljenega z zbiranjem v določenih časovnih obdobjih: videz, količina, osmolalnost ali specifična teža, pH, proteini, glukoza in kri/krvne celice. 58. Poleg tega je treba razmisliti o študijah za preiskovanje serumskih označevalcev splošnih poškodb tkiva. Druge določitve, ki morajo biti izvedene, če obstaja možnost ali sum, da bodo znane lastnosti preskusne kemikalije vplivale na povezane metabolične profile, vključujejo kalcij, fosfat, trigliceride na tešče in glukozo na tešče, posebne hormone, methemoglobin in holinesterazo. Te je treba opredeliti za vsak primer posebej. 59. Na spremenljivost in absolutne koncentracije pri določanju hormonov lahko vplivajo naslednji dejavniki: — čas usmrtitve zaradi spreminjanja koncentracij hormonov preko dneva; — način usmrtitve, da se prepreči nepotreben stres pri živalih, ki lahko vpliva na koncentracije hormonov; — preskusni kompleti, ki se uporabljajo za določanje hormonov in se lahko razlikujejo po standardnih krivuljah. 60. Vzorce plazme, ki so predvideni posebej za določanje hormonov, je treba odvzeti ob primerljivih urah dneva. Številčne vrednosti, pridobljene pri analiziranju koncentracij hormonov, so pri različnih kompletih za analize, ki so na voljo na trgu, različne. 61. Če pretekli izhodiščni podatki niso ustrezni, je treba razmisliti o določitvi hematoloških in kliničnih biokemičnih spremenljivk pred začetkom dajanja odmerkov ali po možnosti pri sklopu živali, ki niso vključene v preskusne skupine. Za samice je treba podatke pridobiti od doječih živali. PATOLOGIJA Makroskopska obdukcija 62. Na vseh odraslih živalih iz študije je treba opraviti popolno in natančno makroskopsko obdukcijo, ki obsega natančen pregled zunanje površine telesa, vseh odprtin, lobanjske, prsne in trebušne votline ter njihove vsebine. Posebno pozornost je treba posvetiti organom reproduktivnega sistema. Evidentirati je treba število ugnezditev. Vaginalne brise je treba pregledati na dan obdukcije, da se ugotovi faza pojatvenega ciklusa in omogoči korelacija s histopatološkimi preiskavami reproduktivnih organov samic. 63. Z mod, nadmodkov ter prostate in semenskih mešičkov s koagulacijskimi žlezami kot celote je treba pri vseh odraslih samcih, kot je ustrezno, odstraniti vsa priraščena tkiva in nato čim prej po disekciji izmeriti njihovo mokro težo, da se ne izsušijo. Poleg tega lahko teža neobveznih organov vključuje sistem mišice levator ani z bulbokavernozno mišico, Cowperjevi žlezi in glavico penisa pri samcih ter oba jajčnika (mokra teža) in maternico (vključno z materničnim vratom) pri samicah; če se navedeno vključi, je treba te teže zbrati čim prej po disekciji. Pri vseh odraslih živalih je treba shraniti jajčnike, moda, nadmodke, pomožne spolne organe in vse organe, na katerih se kažejo makroskopske lezije. 64. Ščitnične žleze vseh odraslih samcev in samic ter enega mladega samca in samice, starih 13 dni, iz vsakega legla je treba shraniti v fiksacijskem sredstvu, ki je najprimernejše za predvidene nadaljnje histopatološke preiskave. Teža ščitnice se lahko določi po fiksaciji. Pri odstranjevanju priraščenih tkiv je prav tako potrebna velika previdnost, opravi pa se lahko šele po fiksaciji, da se preprečijo poškodbe tkiv, ki lahko ogrozijo histopatološko analizo. Vzorce krvi je treba odvzeti na imenovanem mestu neposredno pred postopkom evtanazije živali ali med njim in jih hraniti v ustreznih pogojih (glej odstavek 56). 65. Poleg tega je treba vsaj petim odraslim samcem in samicam, naključno izbranim iz vsake skupine (to ne velja za živali, ki so najdene poginjajoče in/ali so evtanazirane pred koncem študije), z jeter, ledvic, nadledvičnih žlez, priželjca, vranice, možganov in srca, kot je ustrezno, odstraniti vsa priraščena tkiva, nato pa čim prej po disekciji določiti njihovo mokro težo, da se ne izsušijo. Naslednja tkiva je treba shraniti v fiksacijskem sredstvu, ki je najprimernejše za vrsto tkiva in predvideno poznejšo histopatološko preiskavo: vse vidne lezije, možgane (reprezentativne regije, vključno z velikimi in malimi možgani ter mostom), hrbtenjačo, oko, želodec, tanko in debelo črevo (vključno s Peyerjevimi ploščami), jetra, ledvice, nadledvične žleze, vranico, srce, priželjc, sapnik in pljuča (shranijo se tako, da se napihnejo s fiksativom in nato potopijo), spolne žleze (moda in jajčnike), pomožne spolne organe (maternico in vrat, nadmodek, prostato in semenske mešičke s koagulacijskimi žlezami), vagino, sečni mehur, bezgavke (poleg najbližje drenažne bezgavke je treba vzeti še eno bezgavko v skladu z izkušnjami laboratorija (16)), periferni živec (ishiadični ali tibialni), po možnosti v neposredni bližini mišice, skeletno mišico in kost s kostnim mozgom (rezina ali sveže prepariran punktat kostnega mozga). Priporočljivo je, da se moda fiksirajo s potopitvijo v Bouinov ali prilagojen Davidsonov fiksativ (16) (17) (18); fiksacija v formalinu za ta tkiva ni priporočljiva. Tunico albugineo je dovoljeno nežno in plitvo punktirati na obeh polih organa z iglo, da lahko fiksativ hitro prodre v tkivo. Na podlagi kliničnih in drugih izsledkov se lahko pokaže potreba po preiskavah dodatnih tkiv. Poleg tega je treba shraniti vse organe, ki bi lahko bili ciljni organi glede na znane lastnosti preskusne kemikalije. 66. Z naslednjimi tkivi je mogoče pridobiti koristne informacije o endokrinih učinkih: spolnimi žlezami (jajčniki in modi), pomožnimi spolnimi organi (maternico, vključno z materničnim vratom, nadmodkom, semenskimi mešički s koagulacijskimi žlezami ter dorzolateralno in ventralno prostato), vagino, hipofizo, mlečno žlezo samcev in nadledvično žlezo. Spremembe v mlečnih žlezah samcev niso bile zadostno dokumentirane, vendar je lahko ta parameter zelo občutljiv za snovi z estrogenim delovanjem. Opazovanje organov/tkiv, ki niso navedeni v odstavku 65, je neobvezno. 67. Pri poginulih mladičih in mladičih, usmrčenih 13. dan po porodu ali kmalu zatem, je treba skrbno pregledati vsaj zunanjost, da se odkrijejo večje nepravilnosti. Posebno pozornost je treba posvetiti zunanjim reproduktivnim genitalijam, pri katerih je treba pregledati, ali so se pojavili znaki spremenjenega razvoja. Histopatologija 68. V celoti je treba opraviti histopatološke preiskave shranjenih organov in tkiv izbranih živali iz kontrolne skupine in skupine z velikim odmerkom (s posebnim poudarkom na fazah spermatogeneze v spolnih žlezah samcev in histopatologiji intersticijske celične strukture mod). Ščitnične žleze mladičev in preostalih odraslih živali se lahko pregledajo po potrebi. Te preiskave je treba razširiti na živali iz skupin, tretiranih z drugimi odmerjanji, če se v skupini, tretirani z velikim odmerkom, opazijo spremembe, povezane s tretiranjem. Več informacij o disekciji, fiksaciji, sekciji in histopatologiji endokrinih tkiv je na voljo v napotkih za histopatologijo (10). 69. Pregledati je treba vse vidne lezije. Da se lažje pojasnijo vrednosti brez opaznih škodljivih učinkov, je treba pregledati ciljne organe v skupinah z drugimi odmerki, zlasti v skupinah, v katerih naj ne bi bili opaženi škodljivi učinki. 70. Če se uporablja satelitska skupina, je treba opraviti histopatološko preiskavo na tkivih in organih, na katerih so bili opaženi učinki v tretiranih skupinah. PODATKI IN POROČANJE Podatki 71. Podatke je treba navesti za vsako žival posebej. Poleg tega je treba vse podatke povzeti v obliki preglednice, ki za vsako preskusno skupino prikazuje število živali na začetku preskusa, število živali, poginulih med preskusom ali evtanaziranih iz humanih razlogov, čas pogina ali evtanazije, število plodnih živali, število brejih samic, število živali, ki kažejo znake toksičnosti, opis znakov zaznane toksičnosti, vključno s časom začetka, trajanjem in resnostjo morebitnih toksičnih učinkov, vrsto histopatoloških sprememb in vse ustrezne podatke o leglu. Format zbirnega poročila v obliki preglednice, ki se je izkazal kot zelo koristen za oceno učinkov na razmnoževanje/razvoj, je naveden v Dodatku 3. 72. Če je mogoče, je treba številčne rezultate ocenjevati na podlagi primerne in splošno priznane statistične metode. Pri primerjavah učinka vzdolž odmernega območja se je treba izogibati večkratnim preskusom t. Statistične metode je treba izbrati med zasnovo študije. Statistična analiza zadnjično-genitalne razdalje in razvitosti prsnih bradavic mora temeljiti na podatkih za posameznega mladiča, pri čemer se upoštevajo učinki legla. Kadar je ustrezno, je enota analize leglo. Statistična analiza telesne teže mladičev mora temeljiti na podatkih za posameznega mladiča, pri čemer se upošteva velikost legla. Zaradi omejenega obsega študije imajo statistične analize v obliki preskusov ‚pomembnosti‘ omejeno vrednost za številne končne točke, zlasti končne točke razmnoževanja. Nekatere najpogosteje uporabljene metode, zlasti parametrični testi za meritve centralne tendence, niso ustrezne. Če se uporabijo statistične analize, mora biti izbrana metoda ustrezna za porazdelitev preučevane spremenljivke, izbrati pa jo je treba pred začetkom študije. Vrednotenje rezultatov 73. Ugotovitve te toksikološke študije je treba ovrednotiti glede na opažene učinke, obdukcijo in mikroskopske ugotovitve. Vrednotenje vključuje razmerje med odmerkom preskusne kemikalije in navzočnostjo ali odsotnostjo pojava in resnosti anomalij, vključno z makroskopskimi lezijami, ugotovljenimi ciljnimi organi, neplodnostjo, kliničnimi anomalijami, prizadeto zmogljivostjo reproduktivnosti in legla, spremembami telesne mase, učinki na smrtnost in drugimi toksičnimi učinki. 74. Zaradi kratkotrajnega tretiranja samca je treba pri vrednotenju učinkov na razmnoževanje pri samcih histopatologijo mod in nadmodkov obravnavati skupaj s podatki o plodnosti. Kot pomoč pri razlagi študije je lahko koristna tudi uporaba podatkov o kontrolah iz preteklih preskusov glede razmnoževanja/razvoja (npr. za velikost legla, zadnjično-genitalno razdaljo, razvitost prsnih bradavic, ravni T4 v serumu), če so na voljo. 75. Za kontrolo kakovosti se predlagata zbiranje podatkov o kontrolah iz preteklih preskusov in izračun koeficientov variacije za številčne podatke, zlasti za parametre, povezane z zaznavanjem endokrinih motilcev. Ti podatki se lahko uporabijo za primerjave, ko se vrednotijo dejanske študije. Poročilo o preskusu 76. V poročilo o preskusu se vključijo podatki, navedeni v nadaljevanju. Preskusna kemikalija: — vir, številka serije, rok uporabe, če je na voljo; — stabilnost preskusne kemikalije, če je znana. Snov iz ene sestavine: — fizični videz, topnost v vodi in dodatne ustrezne fizikalno-kemijske lastnosti; — kemijski identifikacijski podatki, kot so ime po nomenklaturi IUPAC ali ime CAS, številka CAS, koda po sistemu SMILES ali identifikatorju InChI, strukturna formula, čistost, kemijska identiteta nečistoč, kot je ustrezno in praktično izvedljivo, itd. Snov z več sestavinami, UVCB in zmesi: — čim obsežnejša opredelitev lastnosti s kemijsko identiteto (glej zgoraj), kvantitativnim pojavljanjem in ustreznimi fizikalno-kemijskimi lastnostmi sestavin . Vehikel (po potrebi): — utemeljitev izbire vehikla, če to ni voda. Preskusne živali: — uporabljena vrsta/sev; — število, starost in spol živali; — izvor, nastanitvene razmere, prehrana itd.; — teža posamezne živali na začetku preskusa. — utemeljitev vrste, če to ni podgana. Preskusni pogoji: — utemeljitev izbire velikosti odmerkov; — podrobni podatki o formulaciji preskusne kemikalije in pripravi hrane, doseženi koncentraciji, stabilnosti in homogenosti pripravka; — podrobnosti o dajanju preskusne kemikalije; — preračunavanje koncentracije preskusne kemikalije v hrani ali vodi (ppm) v dejanski odmerek (mg/kg telesne teže/dan), če je ustrezno; — podrobnosti o kakovosti hrane in vode; — podroben opis postopka naključnega izbiranja mladičev za izločitev, če se izločijo. Rezultati: — telesna teža/spremembe telesne teže; — poraba hrane, in če je ustrezno, poraba vode; — podatki o toksičnem odzivu po spolu in odmerku, vključno s plodnostjo, brejostjo in drugimi znaki — toksičnosti; — trajanje brejosti; toksični ali drugi učinki na razmnoževanje, potomce, poporodno rast itd.; — vrsta, resnost in trajanje kliničnih opažanj (s podatki o popravljivosti); — ocene senzorične aktivnosti, moči oprijema in motorične aktivnosti; — hematološki preskusi z ustreznimi referenčnimi vrednostmi; — klinični biokemijski preskusi z ustreznimi referenčnimi vrednostmi; — število odraslih samic z normalnim ali nenormalnim pojatvenim ciklusom in trajanje ciklusa; — število živorojenih in izgub po ugnezditvi; — število mladičev z večjimi vidnimi anomalijami; splošna ocena zunanjih genitalij, število spačkov; — čas pogina med študijo oziroma ali so živali preživele do zaključka študije; — število ugnezditev, velikost legla in teže legla ob evidentiranju; — podatki o telesni teži mladičev; — zadnjično-genitalna razdalja vseh mladičev (in telesna teža na dan meritve zadnjično-genitalne razdalje); — razvitost prsnih bradavic pri mladih samcih; — ravni ščitničnega hormona, mladiči, stari 13 dni, in odrasli samci (ter matere in mladiči, stari 4 dni, če se merijo); — telesna teža ob usmrtitvi in podatki o teži organov za starševske živali; — izsledki obdukcije; — podroben opis ugotovitev histopatoloških preiskav; — podatki o absorpciji (če so na voljo); — statistična obdelava rezultatov, če je to primerno. Obravnava rezultatov. Sklepne ugotovitve. Razlaga rezultatov 77. S študijo bo zagotovljeno vrednotenje toksičnosti za razmnoževanje/razvoj, povezane z dajanjem ponovljenih odmerkov. Zlasti ker je poudarek tako na splošni toksičnosti kot na toksičnosti za razmnoževanje/razvoj končnih točk, rezultati študije omogočajo razlikovanje med učinki na razmnoževanje/razvoj, ki se pojavijo v odsotnosti splošne toksičnosti, in učinki, ki so izraženi samo na stopnjah, ki so toksične tudi za starše (glej odstavke 7–11). Pokazala bi lahko potrebo po dodatnih preiskavah in zagotovila smernice za zasnovo poznejših študij. Za pomoč pri razlagi rezultatov o razmnoževanju in razvoju glej Smernico OECD 43 (19). Smernica OECD 106 o histološkem vrednotenju preskusov endokrinega in razmnoževalnega sistema pri glodavcih (16) zagotavlja informacije o pripravi in ocenjevanju (endokrinih) organov in vaginalnih brisov, ki so lahko koristne za to preskusno metodo. VIRI (1) OECD (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Na voljo na zahtevo pri Organizaciji za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz. (2) OECD (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokio, 27.–29. oktober 1992. Na voljo na zahtevo pri Organizaciji za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz. (3) Mitsumori, K., Kodama, Y., Uchida, O., Takada, K., Saito, M. Naito, K., Tanaka, S., Kurokawa, Y., Usami, M., Kawashima, K., Yasuhara, K., Toyoda, K., Onodera, H., Furukawa, F., Takahashi, M., in Hayashi, Y. (1994). Confirmation Study, Using Nitro-Benzene, of the Combined Repeat Dose and Reproductive/ Developmental Toxicity Test Protocol Proposed by the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). J. Toxicol , Sci., 19, 141–149. (4) Tanaka, S., Kawashima, K., Naito, K., Usami, M., Nakadate, M., Imaida, K., Takahashi, M., Hayashi, Y., Kurokawa, Y., in Tobe, M. (1992). Combined Repeat Dose and Reproductive/Developmental Toxicity Screening Test (OECD): Familiarization Using Cyclophosphamide. Fundam. Appl. Toxicol ., 18, 89–95. (5) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10.–11. marec 1998, na voljo na zahtevo pri Organizaciji za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz. (6) OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (št. 217), Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz. (7) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (št. 19.), Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz. (8) Goldman, J. M., Murr, A. S., Buckalew, A. R., Ferrell, J. M., in Cooper, R. L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research, del B, 80 (2), 84–97. (9) Sadleir, R. M. F. S. (1979). Cycles and Seasons, v: Auston, C. R., in Short, R. V. (ur.). Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York. (10) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria. Environmental Health Criteria Document (št. 60). (11) Moser, V. C., McDaniel, K. M., in Phillips, P. M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol . Appl. Pharmacol ., 108, 267–283. (12) Meyer, O. A., Tilson, H. A., Byrd, W. C., in Riley, M. T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol ., 1, 233–236. (13) Crofton, K. M., Howard, J. L., Moser, V. C., Gill, M. W., Reiter, L. W., Tilson, H. A., MacPhail, R. C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13, 599–609. (14) Gallavan, R. H., Jr., Holson, J. F., Stump, D. G., Knapp, J. F., in Reynolds, V. L. (1999). ‚Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights‘, Reproductive Toxicology, 13: 383–390. (15) OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health, and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (št. 151). Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz. (16) OECD (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (št. 106), Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz. (17) Hess, R. A., in Moore, B. J. (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. V: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin, R. E., in Heindel, J. J. (ur.). Academic Press: San Diego, Kalifornija, str. 52–85. (18) Latendresse, J. R., Warbrittion, A. R, Jonassen, H., in Creasy, D. M. (2002). Fixation of Testes and Eyes Using a Modified Davidson’s Fluid: Comparison with Bouin’s Fluid and Conventional Davidson’s fluid. Toxicol . Pathol . 30, 524–533. (19) OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (št. 43), Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz. (20) OECD (2011). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption (št. 150), Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz. Dodatek 1 OPREDELITVE POJMOV (GLEJ TUDI (20) SMERNICO OECD 150) Androgenost je zmožnost kemikalije, da deluje tako kot naravni androgeni hormon (npr. testosteron) v sesalskem organizmu. Antiandrogenost je zmožnost kemikalije, da zavira delovanje naravnega androgenega hormona (npr. testosterona) v sesalskem organizmu. Antiestrogenost je zmožnost kemikalije, da zavira delovanje naravnega estrogenega hormona (npr. 17 β-estradiola) v sesalskem organizmu. Protiščitnično delovanje je zmožnost kemikalije, da zavira delovanje naravnega ščitničnega hormona (npr. T3) v sesalskem organizmu. Kemikalija je snov ali zmes. Toksičnost za razvoj pojavna oblika toksičnosti za razmnoževanje, ki se pri potomcih kaže kot pred-, ob- in poporodna strukturna ali funkcionalna motnja. Odmerek je količina dane preskusne kemikalije. Izražen je kot masa preskusne kemikalije na enoto telesne teže preskusne živali na dan (npr. mg/kg telesne teže/dan) ali kot konstantna koncentracija v hrani. Odmerjanje je splošen izraz, ki vključuje odmerek ter pogostnost in trajanje dajanja odmerka. Očitna toksičnost je splošen izraz, ki opisuje jasne znake toksičnosti po dajanju preskusne kemikalije. Ti morajo zadostovati za oceno nevarnosti in biti takšni, da bi povečanje danega odmerka najverjetneje povzročilo razvoj resnih znakov toksičnosti in verjetno smrt. Poškodbe plodnosti pomenijo motnje razmnoževalnih funkcij ali zmogljivosti pri samcih ali samicah. Toksičnost pri materi škodljivi učinki na breje samice, ki se pojavijo bodisi specifično (neposredni učinek) bodisi nespecifično (posredni učinek) in so povezani z brejostjo. NOAEL je kratica za raven brez opaženih škodljivih učinkov (no-observed-adverse-effect level). To je največji odmerek, pri katerem ni opaženih škodljivih učinkov zaradi tretiranja. Estrogenost je zmožnost kemikalije, da deluje tako kot naravni estrogeni hormon (npr. 17 β-estradiola) v sesalskem organizmu. Toksičnost za razmnoževanje pomeni škodljive učinke na potomstvo in/ali poškodbe razmnoževalnih funkcij ali zmogljivosti pri samcih in samicah. Preskusna kemikalija je vsaka snov ali zmes, preskušena s to preskusno metodo. Ščitnično delovanje je zmožnost kemikalije, da deluje tako kot naravni ščitnični hormon (npr. T3) v sesalskem organizmu. Validacija je znanstveni postopek, oblikovan za določanje zahtev glede delovanja in omejitev preskusne metode ter za prikaz njene zanesljivosti in ustreznosti za določen namen. Dodatek 2 DIAGRAM NAČRTA POSKUSA Z NAVEDBO NAJDALJŠEGA TRAJANJA ŠTUDIJE NA PODLAGI POLNEGA 14-DNEVNEGA OBDOBJA PARJENJA Dodatek 3 ZBIRNO POROČILO O UČINKIH NA RAZMNOŽEVANJE/RAZVOJ V OBLIKI PREGLEDNICE OPAŽANJA VREDNOSTI Odmerjanje (enote)....... 0 (kontrola) … … … … Začetni pari (N) Ciklus estrusa (vsaj srednja dolžina in pogostnost nerednih ciklusov) Samice, ki kažejo znake kopulacije (N) Samice, ki so dosegle brejost (N) Dnevi spočetja 1–5 (N) Dnevi spočetja 6–... (23) (N) Brejost ≤ 21 dni (N) Brejost = 22 dni (N) Brejost ≥ 23 dni (N) Matere z živimi novorojenimi mladiči (N) Matere z živimi mladiči 4. dan po porodu (N) Ugnezditve/mati (srednja vrednost) Živi mladiči/mati ob rojstvu (srednja vrednost) Živi mladiči/mati 4. dan (srednja vrednost) Razmerje med spoloma (m/ž) ob rojstvu (srednja vrednost) Razmerje med spoloma (m/ž) 4. dan (srednja vrednost) Teža legla ob rojstvu (srednja vrednost) Teža legla 4. dan (srednja vrednost) Teža mladičev ob rojstvu (srednja vrednost) Teža mladičev ob meritvi zadnjično-genitalne razdalje (srednja vrednost pri samcih, srednja vrednost pri samicah) Zadnjično-genitalna razdalja pri mladičih na isti dan po porodu, od rojstva do 4. dne (srednja vrednost pri samcih, srednja vrednost pri samicah, označi dan po porodu) Teža mladičev 4. dan (srednja vrednost) Teža mladičev 13. dan (srednja vrednost) Razvitost prsnih bradavic pri mladih samcih 13. dan (srednja vrednost) MLADIČI Z ANOMALIJAMI Matere z 0 Matere z 1 Matere z ≥ 2 IZGUBA POTOMSTVA Predporodna (ugnezditve minus živorojeni) Samice z 0 Samice z 1 Samice z 2 Samice z ≥ 3 Poporodna (živorojeni minus živi 13. dan po porodu) Samice z 0 Samice z 1 Samice z 2 Samice z ≥ 3 B.65 IN VITRO PRESKUSNA METODA MEMBRANSKE PREGRADE V ZVEZI Z JEDKOSTJO ZA KOŽO UVOD 1. in vitro preskusno metodo membranske pregrade, ki se lahko uporabi za opredelitev jedkih kemikalij. Pri tej preskusni metodi se uporablja umetna membrana, zasnovana tako, da se na jedke kemikalije odzove podobno kot živalska koža in situ . Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici OECD za preskušanje 435 (2015). Jedkost za kožo pomeni nastanek nepopravljive poškodbe kože, ki se kaže kot vidno odmiranje prek povrhnjice v usnjico po nanosu preskusne kemikalije, kot je opredeljeno v globalno usklajenem sistemu Združenih narodov za razvrščanje in označevanje kemikalij (GHS ZN) (1) ter Uredbi (ES) št. 1272/2008 o razvrščanju, označevanju in pakiranju snovi ter zmesi (uredba CLP) ( 24 ) . Ta preskusna metoda, enakovredna posodobljeni Smernici OECD za preskušanje 435, določapreskusno metodo membranske pregrade, ki se lahko uporabi za opredelitev jedkih kemikalij. Pri tej preskusni metodi se uporablja umetna membrana, zasnovana tako, da se na jedke kemikalije odzove podobno kot živalska koža 2. Jedkost za kožo se tradicionalno ocenjuje tako, da se preskusna kemikalija nanese na kožo živih živali, po določenem času pa se oceni obseg poškodb tkiva (2). Poleg te preskusne metode je bilo še več drugih preskusnih metod in vitro sprejetih kot alternative (3) (4) standardnemu postopku in vivo na koži kuncev (poglavje B.4 te priloge, enakovredno Smernici OECD za preskušanje 404), ki se uporablja za opredelitev jedkih kemikalij (2). V večstopenjski strategiji preskušanja in vrednotenja GHS ZN za oceno in razvrstitev jedkosti za kožo ter smernici OECD za celostne pristope k testiranju in ocenjevanju (IATA) v zvezi z draženjem kože/jedkostjo za kožo se priporoča uporaba validiranih in sprejetih preskusnih metod in vitro v okviru modulov 3 in 4 (1) (5). S pristopi IATA se opisuje več modulov, v katerih so zbrani viri informacij in orodja za analizo, ter (i) zagotavljajo smernice o tem, kako obstoječe podatke, pridobljene s preskušanjem, in podatke, ki ne temeljijo na preskušanju, združiti in uporabiti pri ocenjevanju potenciala kemikalij za draženje kože in jedkost za kožo, (ii) predlagan pa je tudi pristop, kadar je potrebno dodatno preskušanje, med drugim kadar so dobljeni negativni rezultati (5). Pri tem modularnem pristopu se lahko pozitivni rezultati iz preskusnih metod in vitro uporabijo za razvrstitev kemikalije kot jedke, ne da bi bilo potrebno preskušanje na živalih, s čimer se zmanjša in izpopolni uporaba živali ter preprečita bolečina in trpljenje, ki ju lahko povzroči uporaba živali za ta namen. 3. Validacijske študije so bile dokončane za model membranske pregrade in vitro , ki je na trgu na voljo kot Corrositex ® (6) (7) (8) ter za podatkovno zbirko 163 snovi in zmesi kaže 79-odstotno splošno točnost pri napovedi jedkosti za kožo (128/163), 85-odstotno splošno točnost pri občutljivosti (76/89) in 70-odstotno splošno točnost pri specifičnosti (52/74) (7). Na podlagi njene priznane veljavnosti se je uporaba te validirane referenčne metode (VRM) priporočala v okviru večstopenjske strategije preskušanja za oceno potenciala nevarnosti kemikalij v zvezi z jedkostjo za kožo (5) (7). Preden se omogoči uporaba modela membranske pregrade in vitro v zvezi z jedkostjo za kožo za regulativne namene, je treba določiti njegovo zanesljivost, ustreznost (točnost) in omejitve, kar zadeva predlagano uporabo, da se zagotovi njegova primerljivost z VRM (9) v skladu s predhodno določenimi standardi izvajanja (10). Medsebojno priznavanje podatkov OECD bo zagotovljeno šele, ko bo predlagana nova ali posodobljena metoda v skladu s standardi izvajanja pregledana in vključena v enakovredno smernico OECD za preskušanje. Trenutno je s Smernico OECD za preskušanje 435 in to preskusno metodo zajeta samo ena metoda in vitro , tj. model Corrositex ® , ki je na voljo na trgu. 4. Druge preskusne metode za preskušanje jedkosti za kožo temeljijo na uporabi rekonstituirane človeške kože (Smernica OECD 431) (3) in izolirane kože podgan (Smernica OECD 430) (4). Ta smernica za preskušanje omogoča tudi razvrstitev jedkih kemikalij v tri podkategorije jedkosti po GHS ZN in tri skupine transportne embalaže ZN v zvezi z nevarnostjo za jedkost. Ta smernica za preskušanje je bila prvotno sprejeta leta 2006, leta 2015 pa je bila posodobljena zaradi sklicevanja na dokument s smernicami IATA in posodobitve seznama snovi za preverjanje usposobljenosti. OPREDELITVE POJMOV 5. Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku. ZAČETNI PREUDARKI IN OMEJITVE 6. in vitro na zdravje (13). Za popolno vrednotenje lokalnih učinkov na kožo po enkratni izpostavljenosti kože je treba uporabiti smernico OECD v zvezi s celostnimi pristopi k testiranju in ocenjevanju (IATA) (5). Preskus, opisan v tej preskusni metodi, omogoča opredelitev jedkih preskusnih kemikalij in njihovo razvrstitev v podkategorije v skladu z GHS ZN/uredbo CLP (preglednica 1). Poleg tega se lahko taka preskusna metoda uporabi za sprejemanje odločitev o jedkosti in nejedkosti določenih razredov kemikalij, npr. organskih in anorganskih kislin, kislinskih derivatov ( 25 ) , in baz za namene preskušanja nekaterih oblik transporta (7)(11)(12). S to preskusno metodo je opisan splošen postopek, podoben validirani referenčni preskusni metodi (7). Čeprav ta preskusna metoda ne zagotavlja ustreznih informacij o dražilnosti za kožo, je treba opozoriti, da se s preskusno metodo B.46 (enakovredno Smernici OECD za preskušanje 439) izrecno obravnava učinek dražilnosti za kožona zdravje (13). Za popolno vrednotenje lokalnih učinkov na kožo po enkratni izpostavljenosti kože je treba uporabiti smernico OECD v zvezi s celostnimi pristopi k testiranju in ocenjevanju (IATA) (5). Preglednica 1 Kategorija in podkategorije snovi, ki so jedke za kožo, po GHS ZN (26) Kategorija jedkih snovi (kategorija 1) (za organe, ki ne uporabljajo podkategorij) Podkategorije potencialnih jedkih snovi (26) (za organe, ki uporabljajo podkategorije, vključno z uredbo CLP) Jedko pri ≥ tretjini živali Izpostavljenost Opažanje Jedka snov Podkategorija jedkih snovi 1A ≤ 3 minute ≤ 1 ura Podkategorija jedkih snovi 1B > 3 minute / ≤ 1 ura ≤ 14 dni Podkategorija jedkih snovi 1C > 1 ura / ≤ 4 ure ≤ 14 dni 7. Validirana referenčna metoda (7) je omejena s tem, da številne nejedke kemikalije in nekatere jedke kemikalije na podlagi rezultatov začetnega preskusa združljivosti morda niso primerne za preskušanje (glej odstavek 13). V vodi raztopljene kemikalije s pH v razponu od 4,5 do 8,5 pogosto niso primerne za preskušanje; vendar 85 % kemikalij, preskušenih v tem razponu pH, pri preskušanju na živalih ni bilo jedkih (7). Metoda membranske pregrade in vitro se lahko uporabi za preskušanje trdnih snovi (topnih ali netopnih v vodi), tekočih snovi (vodnih raztopin ali ne) in emulzij. Vendar preskusnih kemikalij, ki ne povzročijo zaznavne spremembe pri preskusu združljivosti (tj. spremembe barve v sistemu za zaznavanje kemikalij validirane referenčne preskusne metode), ni mogoče preskusiti z metodo membra