(6)

Dodajo se naslednja poglavja od C.31 do C.46: „ C.31 PRESKUS KOPENSKIH RASTLIN: PRESKUS VZNIKA IN RASTI SEJANCEV: UVOD 1. Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici za preskušanje OECD (TG) 208 (2006). Preskusne metode se ob upoštevanju znanstvenega napredka in uporabnosti za zakonodajno uporabo redno preverjajo. Ta posodobljena preskusna metoda je zasnovana za ocenjevanje potencialnih učinkov kemikalij na vznik in rast sejancev. Kot taka ne zajema kroničnih učinkov ali učinkov na razmnoževanje (npr. oploditev in razvoj semen, oblikovanje cvetov, zorenje plodov). Treba je upoštevati pogoje izpostavljenosti in lastnosti kemikalije, ki bo preskušena, s čimer se zagotovi uporaba ustreznih preskusnih metod (pri preskušanju kovin/kovinskih spojin je npr. treba upoštevati učinke vrednosti pH in povezanih protiionov) (1). Ta preskusna metoda ni namenjena rastlinam, ki so izpostavljene hlapom kemikalij. To preskusno metodo je mogoče uporabiti pri preskušanju splošnih kemikalij, biocidov in fitofarmacevtskih sredstev (ki so znani tudi kot izdelki za zaščito rastlin ali pesticidi). Razvita je bila na osnovi obstoječih metod (2)(3)(4)(5)(6)(7). Upoštevani so bili tudi drugi viri, ki se nanašajo na preskušanje rastlin (8)(9)(10). Uporabljene opredelitve so navedene v Dodatku 1. NAČELO PRESKUSA 2. Preskus ocenjuje učinke na vznik sejancev in zgodnjo rast višjih rastlin po izpostavljenosti preskusni kemikaliji v tleh (ali drugem primernem matriksu tal). Semena se namestijo v stik s tlemi, tretiranimi s preskusno kemikalijo, po obdobju od 14 do 21 dni po 50-odstotnem vzniku sejancev v kontrolni skupini pa se ocenijo učinki nanje. Merjene končne točke so vizualna ocena vznika sejancev, suha teža poganjkov (alternativno sveža teža poganjkov) in v določenih primerih višina poganjkov ter ocena vidnih škodljivih učinkov na različne dele rastline. Meritve in opažanja se primerjajo s tistimi pri netretiranih kontrolnih rastlinah. 3. Odvisno od pričakovanega načina izpostavljenosti se preskusna kemikalija vnese v tla (ali v morebitni matriks umetnih tal) ali pa se nanese na površino tal; izbere se možnost, ki ustrezno predstavlja potencialni način izpostavljenosti kemikaliji. Vnos v tla se izvede s tretiranjem tal v razsutem stanju. Po nanosu se tla prenesejo v posode, nato pa se vanje posejejo semena dane rastlinske vrste. Nanosi na površino se izvedejo na tleh, prenesenih v posode, v katerih so že posejana semena. Preskusne enote (kontrole ter tretirana tla in semena) se nato namestijo v ustrezne pogoje, ki podpirajo kalitev/rast rastlin. 4. Lahko se izvede preskus za določanje krivulje odmerek-odziv ali pri eni sami koncentraciji/stopnji aplikacije kot mejni preskus v skladu s cilji študije. Če rezultati preskusa z eno samo koncentracijo/stopnjo aplikacije presegajo določeno raven strupenosti (npr. če so opaženi učinki večji od x %), se izvede preskus za določanje območja delovanja, s katerim se določijo zgornje in spodnje meje za strupenost, sledi pa mu preskus z več koncentracijami/stopnjami aplikacije za pridobitev krivulje odmerek-odziv. Uporabi se ustrezna statistična analiza za pridobitev učinkovite koncentracije ECx ali učinkovite stopnje aplikacije ERx (npr. EC25, ER25, EC50, ER50) za najbolj občutljive zadevne parametre. V tem preskusu je mogoče izračunati tudi koncentracijo brez opaznega učinka (NOEC) in najnižjo koncentracijo z opaznim učinkom (LOEC). PODATKI O PRESKUSNI KEMIKALIJI 5. Naslednji podatki so uporabni za ugotavljanje pričakovanega načina izpostavljenosti in pri načrtovanju preskusa: strukturna formula, čistost, topnost v vodi, obstojnost v organskih topilih, porazdelitveni koeficient 1-oktanol/voda, vedenje pri sorpciji v tleh, parni tlak, kemijska stabilnost v vodi in na svetlobi ter biorazgradljivost. VELJAVNOST PRESKUSA 6. Da bi bil preskus veljaven, morajo kontrole izpolnjevati naslednja merila: — vznik sejancev je vsaj 70-odstoten, — sejanci ne kažejo vidnih fitotoksičnih učinkov (npr. kloroze, nekroze, venenja, deformacij listov in stebel), rastline pa izkazujejo le normalno variacijo rasti in morfologije za to določeno vrsto, — srednja stopnja preživetja vzniknjenih kontrolnih sejancev v času trajanja študije je vsaj 90 %, — okoljski pogoji za določeno vrsto so enaki in rastni substrati vsebujejo enako količino matriksa tal, podpornih substratov ali substrata iz istega vira. REFERENČNA KEMIKALIJA 7. Referenčno kemikalijo je v rednih časovnih razmikih mogoče preskusiti, da se preveri, ali se izvedba preskusa ter odziv določenih preskusnih rastlin in preskusni pogoji skozi čas niso znatno spremenili. Namesto tega je mogoče za oceno učinkovitosti preskusnega sistema v določenih laboratorijih uporabiti pretekle meritve biomase ali rasti, kar lahko služi kot interni laboratorijski ukrep kontrole kakovosti. OPIS METODE Naravna tla – umetni substrat 8. Rastline je mogoče gojiti v posodah s peščeno ilovico, ilovnatim peskom ali peščeno glinasto ilovico, ki vsebuje do 1,5 odstotka organskega ogljika (pribl. 3 odstotke organske snovi). Uporabi se lahko tudi komercialna prst za sajenje lončnic ali sintetična mešanica tal, ki vsebuje do 1,5 odstotka organskega ogljika. Če je znano, da ima preskusna kemikalija visoko afiniteto za glino, se glinenih tal ne sme uporabljati. Naravna tla je treba presejati na 2-milimetrske delce, da se homogenizirajo in da se odstranijo grobi delci. Poročati je treba o vrsti in teksturi, odstotku organskega ogljika, vrednosti pH in vsebnosti soli, izmerjeni kot električna prevodnost končnih pripravljenih tal. Tla je treba razvrstiti v skladu s standardnim sistemom za razvrščanje (11). Tla se lahko pasterizirajo ali toplotno obdelajo, da se zmanjša učinek talnih patogenov. 9. Pri naravnih tleh je zaradi spreminjajočih se fizikalnih/kemijskih lastnosti in mikrobnih populacij razlaga rezultatov lahko bolj zapletena. Te spremenljivke spreminjajo sposobnost zadrževanja vlage, sposobnost vezave kemikalije, zračnost ter vsebino hranil in elementov v sledovih. Poleg variacij teh fizikalnih dejavnikov bo obstajala tudi variacija kemijskih lastnosti, kot sta vrednost pH in redoks potencial, ki lahko vpliva na biološko razpoložljivost preskusne kemikalije (12)(13)(14). 10. Umetni substrati se običajno ne uporabljajo za preskušanje fitofarmacevtskih sredstev, lahko pa so uporabni pri preskušanju splošnih kemikalij ali tam, kjer se želi kar najbolj zmanjšati variabilnost naravnih tal in povečati primerljivost rezultatov preskusa. Uporabljeni substrati morajo biti iz inertnih materialov, ki kar najbolj zmanjšajo interakcijo s preskusno kemikalijo ali topilom kot nosilcem ali pa z obema. Ugotovljeno je, da so s kislino opran kremenov pesek, mineralna volna in steklene kroglice (npr. s premerom od 0,35 do 0,85 mm) primerni inertni materiali, ki kar najmanj absorbirajo preskusno kemikalijo (15), kar omogoča, da je kemikalija z vsrkavanjem prek korenin v kar največji meri na voljo sejancu. Med neprimernimi substrati so vermikulit, perlit in drugi zelo absorptivni materiali. Zagotovljene morajo biti hranilne snovi za rast rastlin, ki poskrbijo, da rastline niso v stresu zaradi pomanjkanja hranilnih snovi, to pa je treba, kadar je le mogoče, oceniti s kemijsko analizo ali z vizualno oceno kontrolnih rastlin. Merila za izbiro preskusnih vrst 11. Da izbrana vrsta razvije niz odzivov, mora biti razumno obsežna, npr. glede svoje taksonomske pestrosti v rastlinskem kraljestvu, svoje porazdelitve, pogostnosti, značilnosti življenjskega cikla posamezne vrste in območja pojavljanja v naravi (8)(10)(16)(17)(18)(19)(20). Pri izbiri je treba upoštevati naslednje značilnosti potencialnih preskusnih vrst: — vrste imajo enotna semena, ki so lahko dostopna pri zanesljivih standardnih virih semen ter ki dosegajo skladno, zanesljivo in enakomerno kalivost ter enotno rast sejancev, — rastlino je mogoče preskusiti v laboratoriju ter lahko daje zanesljive in ponovljive rezultate v okviru preskusnih infrastruktur in primerjalno med njimi, — občutljivost preskušane vrste mora biti skladna z odzivi rastlin, odkritih v okolju, ki je izpostavljeno kemikaliji, — vrste so bile do neke mere uporabljene v predhodnih preskusih strupenosti, njihova uporaba, npr. pri bioloških preskusih herbicidov, presejanju za težke kovine, obremenitvenih preskusih za slanost in minerale ali študijah alelopatije, pa kaže občutljivost na mnogo različnih obremenilnih dejavnikov, — vrste so združljive z rastnimi pogoji preskusne metode, — zadoščajo merilom za veljavnost preskusa. Nekatere od preskusnih vrst, ki so bile v preteklosti najbolj uporabljane, so navedene v Dodatku 2, potencialne nekmetijske rastline pa v Dodatku 3. 12. Število vrst, ki bodo preskušene, je odvisno od ustreznih zakonskih zahtev, zato v tej preskusni metodi ni navedeno. Uporaba preskusne kemikalije 13. Kemikalijo je treba nanesti v ustreznem nosilcu (npr. vodi, acetonu, etanolu, polietilen glikolu, gumi arabikumu, pesku). Mogoče je preskusiti tudi zmesi (formulirane produkte ali formulacije), ki vsebujejo aktivne snovi in različne adjuvanse. Vnos v tla/umetni substrat 14. Kemikalije, ki so topne v vodi ali suspendirane v vodi, se lahko dodajo vodi, nato pa se raztopina z ustrezno napravo za mešanje zmeša s tlemi. Ta vrsta preskusa je lahko ustrezna, če izpostavljenost kemikaliji poteka prek tal ali porne vode v tleh in če obstajajo pomisleki glede vsrkavanja prek korenin. Zmogljivost tal za zadrževanje vode zaradi dodajanja preskusne kemikalije ne sme biti presežena. Količina dodane vode mora biti enaka za vsako preskusno koncentracijo, vendar mora biti omejena, da se prepreči zbiranje aglomeratov tal v skupkih. 15. Kemikalije z nizko topnostjo v vodi je treba raztopiti v ustreznem hlapnem topilu (npr. acetonu, etanolu) in zmešati s peskom. Nato se med nenehnim mešanjem peska topilo lahko iz peska odstrani s tokom zraka. Tretirani pesek se zmeša z eksperimentalnimi tlemi. Vzpostavi se drug kontrolni vzorec, ki prejme le pesek in topilo. Vsem stopnjam tretiranja in drugi kontroli so dodane enake količine peska z zmešanim in odstranjenim topilom. Pri trdnih, netopnih preskusnih kemikalijah se suha tla in kemikalija zmešajo v ustrezni napravi za mešanje. Nato se tla dodajo v posode, v katere se takoj posejejo semena. 16. Če se namesto tal uporablja umetni substrat, je mogoče kemikalije, ki so topne v vodi, tik pred začetkom preskusa raztopiti v hranilni raztopini. Kemikalije, ki niso topne v vodi, a jih je mogoče v vodi suspendirati z nosilcem topila, je treba z nosilcem dodati hranilni raztopini. Kemikalije, ki niso topne v vodi in za katere ni na voljo nobenega nestrupenega nosilca, topnega v vodi, je treba raztopiti v ustreznem hlapnem topilu. Raztopina se zmeša s peskom ali steklenimi kroglicami in se namesti v rotavapor ter upari; na pesku oziroma kroglicah ostane enakomerna obloga kemikalije. Pred polnjenjem sadilne posode je treba tehtane deleže kroglic ekstrahirati z istim organskim topilom in preskušeno kemikalijo. Nanos na površino 17. Za nanos preskusne kemikalije se pri fitofarmacevtskih sredstvih pogosto uporablja škropljenje površine tal s preskusno raztopino. Vsa oprema, uporabljena pri izvajanju preskusov, vključno z opremo za pripravo in dodajanje preskusne kemikalije, mora imeti takšni zasnovo in zmogljivost, da je mogoče preskuse, ki vključujejo to opremo, izvesti natančno, pokritost pa bo ponovljiva. Pokritost mora biti enotna prek celotne površine tal. Poskrbeti je treba, da ni možnosti adsorpcije kemikalije v opremo ali reagiranja kemikalije z opremo (npr. s plastičnimi cevmi in z lipofilnimi kemikalijami ali jeklenimi deli in elementi). Preskusna kemikalija se razprši na površino tal s posnemanjem značilnega nanašanja s škropilnico. V splošnem morajo biti količine razpršila v območju, ki se običajno uporablja v kmetijski praksi, o količinah (količini vode itd.) pa je treba poročati. Izbrati je treba tako vrsto šobe, ki bo omogočala enakomerno pokritost površine tal. Če se nanašajo topila in nosilci, je treba pripraviti drugo skupino kontrolnih rastlin, ki prejemajo le topilo/nosilec. To pri fitofarmacevtskih sredstvih, preskušanih v obliki formulacij, ni potrebno. Preverjanje koncentracije/stopnje aplikacije preskusne kemikalije 18. Koncentracije/stopnje aplikacije je treba potrditi z ustreznim analitskim preverjanjem. Pri topnih kemikalijah je mogoče potrditi preverjanje koncentracij/stopenj aplikacije vseh preskusnih kemikalij z analizo preskusne raztopine z najvišjo koncentracijo, uporabljene pri preskusu, z dokumentacijo o naknadni razredčitvi in z uporabo umerjene opreme za nanos (npr. umerjenih steklenih posod za analizo, umerjene opreme za nanos s škropilnikom). Pri netopnih kemikalijah mora biti navedeno preverjanje spojin, poleg tega pa še mase preskusne kemikalije, dodane tlom. Če se zahteva dokazovanje homogenosti, bo morda potrebno analizirati tla. POSTOPEK Načrt preskusa 19. Semena istih vrst se posejejo v posode. Število semen, posejanih v posodo, je odvisno od vrste, velikosti posode in trajanja preskusa. Število rastlin na posodo mora biti takšno, da so v času trajanja preskusa omogočeni primerni rastni pogoji in da se prepreči nagnetenost. Največja gostota rastlin znaša približno 3–10 semen na 100 cm2, odvisno od velikosti semen. Kot primer se za 15-centimetrsko posodo priporočajo od ena do dve sadiki koruze, soje, paradižnika, kumar ali sladkorne pese, tri sadike oljne ogrščice ali graha in od 5 do 10 sadik čebule, pšenice ali drugih sejancev z majhnimi semeni. Število semen in posod za ponovitve (ponovitev je opredeljena kot posoda, zato rastline v isti posodi ne predstavljajo ponovitve) mora biti zadostno za optimalno statistično analizo (21). Treba je opozoriti, da bo variabilnost večja za preskusne vrste, pri katerih je uporabljenih manj večjih semen na posodo (ponovitev), v primerjavi s preskusnimi vrstami, pri katerih je mogoče uporabljati večje število manjših semen na posodo. Ta variabilnost se lahko kar najbolj zmanjša s sejanjem enakega števila semen v vsako posodo. 20. Z uporabo kontrolnih skupin se zagotovi, da so opazni učinki povezani samo z izpostavljenostjo preskusni kemikaliji ali se jih lahko pripiše tej izpostavljenosti. Ustrezna kontrolna skupina mora biti v vseh vidikih identična preskusni skupini, razen glede izpostavljenosti preskusni kemikaliji. V okviru danega preskusa morajo biti vse preskusne rastline, vključno s kontrolnimi, iz istega vira. Za preprečevanje pristranskosti se zahteva naključno dodeljevanje preskusnih in kontrolnih posod. 21. Izogibati se je treba semenom, prevlečenim z insekticidom ali fungicidom (tj. ‚obloženim‘ semenom). Vendar nekateri regulativni organi dovoljujejo uporabo določenih nesistemskih kontaktnih fungicidov (npr. kaptana, tirama) (22). Če obstaja skrb glede patogenov, ki se prenašajo s semeni, se semena lahko za kratek čas namočijo v razredčeno 5-odstotno raztopino hipoklorita, nato pa se dobro sperejo pod tekočo vodo in posušijo. Sanacija z drugimi fitofarmacevtskimi sredstvi ni dovoljena. Preskusni pogoji 22. Preskusni pogoji se morajo približati pogojem, potrebnim za normalno rast preskušenih vrst in sort (v Dodatku 4 so navedeni primeri preskusnih pogojev). Rastline, ki vznikajo, se morajo vzdrževati glede na dobro vrtnarsko prakso v komorah, fitotronih ali rastlinjakih s kontroliranim okoljem. Pri uporabi prostorov, namenjenih za rast, te prakse običajno vključujejo nadzor in ustrezno pogosto (npr. dnevno) beleženje temperature, vlažnosti, koncentracije ogljikovega dioksida, svetlobe (obsevanosti, valovne dolžine, fotosintetsko aktivnega sevanja) in obdobja osvetljenosti, sredstev za zalivanje itd., s čimer se zagotovi zdrava rast, ki se presoja s kontrolnimi rastlinami izbranih vrst. Temperaturo v rastlinjakih je treba nadzirati z zračenjem, ogrevanjem in/ali hladilnimi sistemi. Za preskušanje v rastlinjakih se v splošnem priporočajo naslednji pogoji: — temperatura: 22 °C ± 10 °C, — vlažnost; 70 % ± 25 %, — obdobje osvetljenosti: najmanj 16 ur svetlobe, — obsevanost: 350 ± 50 μE/m2/s. Če obsevanost pade pod 200 μE/m2/s, valovna dolžina pa je 400–700 nm, je potrebna dodatna osvetlitev, razen pri določenih vrstah, ki ne potrebujejo toliko svetlobe. Med trajanjem študije je treba spremljati okoljske pogoje in poročati o njih. Rastline je treba gojiti v neporoznih plastičnih ali glaziranih posodah, pod katere so podstavljeni pladnji ali krožnički. Posode se lahko redno premešča, da je variabilnost pri rasti rastlin (zaradi razlik v preskusnih pogojih v prostorih, namenjenih za rast) čim manjša. Posode morajo biti dovolj velike, da se omogoči normalna rast. 23. Za ohranjanje vitalnosti rastlin se lahko hranilnim snovem v tleh dodajajo dodatki. O potrebah po dodatnih hranilnih snoveh in času njihovega dodajanja je mogoče presoditi z opazovanjem kontrolnih rastlin. Priporočeno je zalivanje preskusnih posod od spodaj (npr. s stenjem iz steklenih vlaken). Vendar je mogoče z začetnim zalivanjem od zgoraj spodbuditi kalivost semen, pri nanosu na površino tal pa takšno zalivanje olajša prehod kemikalije v tla. 24. Specifični rastni pogoji morajo biti ustrezni za preskušane vrste in preiskovano preskusno kemikalijo. Kontrolne in tretirane rastline je treba gojiti v enakih okoljskih pogojih, vendar je treba izvesti ustrezne ukrepe za preprečevanje navzkrižne izpostavljenosti (npr. hlapnim kemikalijam) med različnimi tretiranji in izpostavljenosti kontrolnih rastlin preskusnim kemikalijam. Preskušanje pri eni sami koncentraciji/stopnji aplikacije 25. Za določanje ustrezne koncentracije/stopnje aplikacije kemikalije za izvedbo preskusa z eno samo koncentracijo ali stopnjo (provokacijskega/mejnega preskusa) je treba upoštevati več dejavnikov. Pri splošnih kemikalijah ti dejavniki vključujejo fizikalne/kemijske lastnosti kemikalije. Za fitofarmacevtska sredstva je treba upoštevati fizikalne/kemijske lastnosti in vzorec uporabe preskusne kemikalije, njeno največjo koncentracijo ali stopnjo aplikacije, število aplikacij na sezono in/ali obstojnost preskusne kemikalije. Za ugotavljanje, ali ima splošna kemikalija fitotoksične lastnosti, je lahko primerno preskušanje pri najvišji ravni 1 000 mg/kg suhih tal. Preskus za določanje območja delovanja 26. Po potrebi je mogoče izvesti preskus za določanje območja delovanja, s katerim so pridobljene smernice za koncentracije/stopnje, ki bodo preskušane v dokončni študiji odziva v odvisnosti od odmerka. Pri preskusu za določanje območja delovanja morajo biti med vrednostmi preskusnih koncentracij/stopenj precejšnji razmiki (znašati morajo npr. 0,1, 1,0, 10, 100 in 1 000 mg/kg suhih tal). Koncentracije/stopnje pri fitofarmacevtskih sredstvih lahko temeljijo na največji koncentraciji ali stopnji aplikacije, npr. 1/100, 1/10, 1/1 priporočene največje koncentracije ali stopnje aplikacije. Preskušanje z več koncentracijami/stopnjami aplikacije 27. Namen preskusa z več koncentracijami/stopnjami aplikacije je ugotoviti razmerje med odmerkom in odzivom ter določiti vrednost ECx ali ERx za vznik, biomaso in/ali vizualne učinke v primerjavi z neizpostavljenimi kontrolami, kot zahtevajo regulativni organi. 28. Število in razmiki koncentracij ali stopenj aplikacije morajo biti zadostni, da se ustvari zanesljivo razmerje med odmerkom in odzivom ter regresijska enačba in da se poda ocena vrednosti ECx ali ERx. Izbrane koncentracije/stopnje aplikacije morajo zajemati vrednosti ECx ali ERx, ki se bodo ugotavljale. Če je, na primer, zahtevana vrednost EC50, je zaželeno preskušanje pri stopnjah, ki dosegajo od 20- do 80-odstotni učinek. Priporočeno število preskusnih koncentracij/stopenj aplikacij za doseganje tega je vsaj pet v geometrijski vrsti in še netretirana kontrola, faktor razmika med njimi pa ne sme biti večji kot tri. Za vsako tretirano ali kontrolno skupino mora biti število ponovitev vsaj štiri, skupno število semen pa vsaj 20. Za večjo statistično moč preskusa bo morda potrebnih več ponovitev določenih rastlin s slabo kalivostjo ali spremenljivo rastjo. Če se uporablja več preskusnih koncentracij/stopenj aplikacije, se lahko število ponovitev zmanjša. Če se ocenjuje vrednost NOEC, bo za doseganje želene statistične moči morda potrebnih več ponovitev (23). Opažanja 29. Med obdobjem opazovanja, tj. od 14 do 21 dni po vzniku 50 % kontrolnih rastlin (tudi kontrol s topili, če je to smiselno), se pri rastlinah pogosto (vsaj tedensko in, če je mogoče, dnevno) opazuje, ali je prišlo do vznika, vidnih znakov fitotoksičnosti in umrljivosti. Ob koncu preskusa je treba zabeležiti meritev odstotka vznika in biomase preživelih rastlin ter vidne znake škodljivih učinkov na različne dele rastline. Med slednjimi so anomalije videza vzniknjenih sejancev, zakrnela rast, kloroza, razbarvanje, umrljivost in učinki na razvoj rastline. Končno biomaso je mogoče meriti s končno povprečno suho težo poganjkov preživelih rastlin, s spravilom poganjkov na površini tal in s sušenjem teh poganjkov pri 60 °C do konstantne teže. Namesto tega je končno biomaso mogoče meriti s svežo težo poganjkov. Če tako zahtevajo regulativni organi, je druga končna točka lahko višina poganjka. Za ocenjevanje opaznih strupenih učinkov je treba uporabljati enoten sistem točkovanja za vidne poškodbe. Primeri kvalitativnih in kvantitativnih vizualnih ocen so podani v virih (23)(24). PODATKI IN POROČANJE Statistična analiza Preskus z eno samo koncentracijo/stopnjo 30. Podatke o vsaki rastlinski vrsti je treba analizirati z ustrezno statistično metodo (21). Treba je poročati o ravni učinka pri preskusni koncentraciji/stopnji ali nedoseganju danega učinka pri preskusni koncentraciji/stopnji (npr. o učinku, ki je < x % učinka, opaženega pri koncentraciji ali stopnji y). Preskus z več koncentracijami/stopnjami 31. Z regresijsko enačbo se ugotovi razmerje med odmerkom in odzivom. Uporabljajo se lahko različni modeli: na primer, za oceno vrednosti ECx ali ERx (npr. EC25, ER25, EC50, ER50) in njenih meja zaupanja za vznik v obliki kvantnih podatkov so lahko primerne metode analiza logit in analiza probit, Weibullova metoda, metoda Spearman-Karber, prilagojena metoda Spearman-Karber itd. Za rast sejancev (težo in višino) kot zvezno končno točko je vrednost ECx ali ERx in njene meje zaupanja mogoče oceniti z ustrezno regresijsko analizo (npr. z Bruce-Versteegovo nelinearno regresijsko analizo (25)). Kadar je mogoče, mora biti R2 za najbolj občutljive vrste enak ali večji od 0,7, uporabljene preskusne koncentracije/stopnje pa zajemajo od 20- do 80-odstotne učinke. Če se ocenjuje vrednost NOEC, mora imeti prednost uporaba učinkovitih statističnih preskusov, ki jih je treba izbrati na podlagi porazdelitve podatkov (21)(26). Poročilo o preskusu 32. V poročilu o preskusu morajo biti predstavljeni rezultati študij in podroben opis preskusnih pogojev ter temeljita razprava o rezultatih, analiza podatkov in zaključki, izpeljani iz analize. Treba je podati povzetek v preglednici in izvleček rezultatov. Poročilo mora vključevati naslednje: Preskusna kemikalija: — kemijski identifikacijski podatki, relevantne lastnosti preskušane kemikalije (npr. log Pow, topnost v vodi, parni tlak in informacije o usodi in vedenju v okolju, če so na voljo), — podrobnosti o pripravi preskusne raztopine in preverjanju preskusnih koncentracij, kot je navedeno v odstavku 18. Preskusne vrste: — podrobnosti preskusnega organizma: vrsta/sorta, družine rastlin, znanstvena in splošna imena, kar najpodrobneje opisana vir in zgodovina semena (npr. ime dobavitelja, odstotek kalivosti, velikost semena, številka razreda, serije ali skupine, leto ali rastna sezono pobiranja semena, datum ocene kalivosti), viabilnost itd., — število preskušanih vrst eno- in dvokaličnic, — razlogi za izbiro vrste, — opis shranjevanja, tretiranja in vzdrževanja semena. Preskusni pogoji: — oprema za preskušanje (npr. rastna komora, fitotron in rastlinjak), — opis preskusnega sistema (npr. velikosti in materialov posod ter količine tal), — lastnosti tal (tekstura ali vrsta tal: porazdelitev in razvrstitev delcev tal, fizikalne in kemijske lastnosti, vključno z odstotkom organske snovi, odstotek organskega ogljika in vrednost pH), — priprava tal/substrata (npr. tal, umetnih tal, peska in drugega) pred preskusom, — opis hranilnega gojišča, če je uporabljeno, — nanos kemikalije: opis metode nanosa, opis opreme, stopnje in količine izpostavljenosti, vključno s preverjanjem kemikalije, opis metode umerjanja in opis okoljskih pogojev med nanosom, — rastni pogoji: obsevanost (npr. PAR, fotosintetsko aktivno sevanje), obdobje osvetljenosti, največje/najmanjše temperature, program in metoda zalivanja, gnojenje, — število semen na posodo, število rastlin na odmerek, število ponovitev (posod) na stopnjo izpostavljenosti, — vrsta in število kontrol (negativnih in/ali pozitivnih kontrol, kontrole s topilom, če se uporablja), — trajanje preskusa. Rezultati: — preglednica vseh končnih točk za vsako ponovitev, preskusno koncentracijo/stopnjo in vrsto, — število in odstotek vzniknjenih semen v primerjavi s kontrolami, — meritve biomase (suho težo ali svežo težo poganjkov) rastlin v obliki odstotka kontrol, — višina poganjkov rastlin v obliki odstotka kontrol, če je merjena, — odstotek vidnih poškodb ter kvantitativni in kvalitativni opis vidnih poškodb (kloroza, nekroza, venenje, deformacije listov in stebel, pa tudi morebitna odsotnost učinkov) zaradi preskusne kemikalije v primerjavi s kontrolnimi rastlinami, — opis ocenjevalne lestvice, uporabljene za presojo vidnih poškodb, če obstaja vizualno ocenjevanje, — pri študijah z eno samo stopnjo je treba poročati o odstotku poškodb, — vrednosti ECx ali ERx (npr. EC50, ER50, EC25, ER25) in z njimi povezane meje zaupanja. Če se izvaja regresijska analiza, je treba določiti standardno napako za regresijsko enačbo in standardno napako za ocene posameznih parametrov (npr. naklon, presek), — vrednosti NOEC (in LOEC), če so izračunane, — opis uporabljenih statističnih postopkov in predpostavk, — grafični prikaz teh podatkov in razmerje med odmerkom in odzivom preskušanih vrst. Odstopanja od postopkov, opisanih v tej preskusni metodi, in morebitne nenavadne dogodke med preskusom. LITERATURA (1) Schrader, G., Metge, K., in Bahadir, M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189–193. (2) Mednarodna organizacija za standardizacijo. (1993). ISO 11269-1. Kakovost tal – Določevanje učinka onesnažil na rastlinstvo – 1. del: Metoda merjenja zaviranja rasti korenin. (3) Mednarodna organizacija za standardizacijo. (1995). ISO 11269-2. Kakovost tal – Določevanje učinka onesnažil na rastlinstvo – 2. del: Učinki kemikalij na vznik in rast višjih rastlin. (4) American Standard for Testing Material (ASTM). (2002). E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests. (5) U.S. EPA. (1982). FIFRA, 40CFR, Part 158.540. Subdivision J, Parts 122-1 and 123-1. (6) US EPA. (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines: — 850.4000: Background – Non-target Plant Testing, — 850.4025: Target Area Phytotoxicity, — 850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence), — 850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test, — 850.4225: Seedling Emergence, Tier II, — 850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test. (7) AFNOR, X31-201. (1982). Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1. (1993) Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines. (8) Boutin, C., Freemark, K. E., in Keddy, C. J. (1993). Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Non-target plant testing and evaluation. Technical Report Series, št. 145. Canadian Wildlife Service (Headquarters), Environment Canada, Hull, Québec, Kanada. (9) Forster, R., Heimbach, U., Kula, C., in Zwerger, P. (1997). Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms – A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., št. 48. (10) Hale, B., Hall, J. C., Solomon, K., in Stephenson, G. (1994). A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario, Kanada. (11) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) in Soil Sc. Soc. Amer. Ind. 26:305 (1962). (12) Audus, L. J. (1964). Herbicide behaviour in the soil. V: Audus, L. J., ur. The Physiology and biochemistry of Herbicides, London, New York, Academic Press, NY, poglavje 5, str. 163–206. (13) Beall, M. L., Jr., in Nash, R. G. (1969). Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil, J. Agro. 61:571–575. (14) Beetsman, G. D., Kenney, D. R., in Chesters, G. (1969). Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties, J. Agro. 61:247–250. (15) U.S. Food and Drug Administration (FDA). (1987). Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, 14 str., FDA, Washington, DC. (16) McKelvey, R. A., Wright, J. P., Honegger, J. L., in Warren, L. W. (2002). A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Management Science vol. 58:1161– 1174. (17) Boutin, C.; Elmegaard, N., in Kjær, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology vol. 13(4): 349–369. (18) Boutin, C. in Rogers, C. A. (2000). Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides – An analysis with two databases. Ecotoxicology vol. 9(4):255–271. (19) Boutin, C., in Harper, J. L. (1991). A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9:155–271. (20) Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T. E., Batchelor, S. P., in Maguire, R. J. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Envir. Toxicol. Chem. 19 (10): 2532–2541. (21) OECD (2006). Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment, št. 54, Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz. (22) Hatzios, K. K., in Penner, D. (1985). Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1:1–63. (23) Hamill, P. B., Marriage, P. B., in Friesen, G. (1977). A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Science 25:386–389. (24) Frans, R. E., in Talbert, R. E. (1992). Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. V: B. Truelove (ur.) Research Methods in Weed Science, 2. izdaja. Southern weed Science Society, Auburn, 15–23. (25) Bruce, R. D., in Versteeg, D. J.(1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. Environmental Toxicology and Chemistry 11, 1485– 1492. (26) Poglavje C.33 te priloge: Preskus razmnoževanja deževnikov (Eisenia fetida/Eisenia andrei). Dodatek 1 Opredelitve pojmov Aktivna sestavina (a.i.) (ali aktivna snov (a.s.)) je snov, zasnovana za doseganje določenega biološkega učinka (npr. nadzora nad insekti, preprečevanje bolezni rastlin, zatiranje plevela na tretiranem območju), ki je znana tudi kot aktivna sestavina oziroma snov na tehnični stopnji. Kemikalija pomeni snov ali zmes. Fitofarmacevtska sredstva (sredstva za zaščito pridelka ali rastlin) ali pesticidi so snovi s posebno biološko aktivnostjo, ki se uporabljajo za zaščito pridelka pred škodljivimi organizmi (npr. glivičnimi boleznimi, insekti in kompetitivnimi rastlinami). ECx – koncentracija z x-odstotnim učinkom ali ERx – stopnja z x-odstotnim učinkom je koncentracija ali stopnja, ki povzroči neželeno menjavo ali spremembo odstotka x v končni točki preskusa, merjeni glede na kontrolo (25- oziroma 50-odstotno zmanjšanje vznika, teže poganjkov, končnega števila prisotnih rastlin ali povečanje vidnih poškodb bi predstavljalo vrednost EC25/ER25 oziroma EC50/ER50). Vznik je pojav koleoptila ali kotiledona nad površino tal. Formulacija je komercialno formulirani produkt, ki vsebuje aktivno snov (aktivno sestavino), znan tudi kot končni pripravek (8) ali značilni končni izdelek (TEP (‚typical end-use product‘)). Vrednost LOEC (Lowest Observed Effect Concentration) je najnižja koncentracija preskusne kemikalije, pri kateri je bil opažen učinek. V tem preskusu ima koncentracija, ki ustreza vrednosti LOEC, v danem obdobju izpostavljenosti statistično značilen učinek (p < 0,05) v primerjavi s kontrolo in je višja od vrednosti NOEC. Neciljne rastline: rastline, ki so zunaj ciljnega območja rastlin. Pri fitofarmacevtskih sredstvih to navadno pomeni rastline zunaj tretiranega območja. Vrednost NOEC (No Observed Effect Concentration) je najvišja koncentracija preskusne kemikalije, pri kateri ni bilo opaženega nobenega učinka. V tem preskusu koncentracija, ki ustreza vrednosti NOEC, v danem obdobju izpostavljenosti v primerjavi s kontrolo nima statistično značilnega učinka (p < 0,05). Fitotoksičnost: škodljiva odstopanja (ocenjena z meritvami in vizualno) od normalnega vzorca videza in rasti rastlin kot odziv na dano kemikalijo. Ponovitev je preskusna enota, ki predstavlja kontrolno skupino in/ali tretirano skupino. V teh študijah je posoda opredeljena kot ponovitev. Vizualna ocena: ocena vidnih poškodb na podlagi opazovanja rastlinskega sestoja, vitalnosti, deformacij, kloroze, nekroze in splošnega videza v primerjavi s kontrolo. Preskusna kemikalija: katera koli snov ali zmes, preskušena s to metodo. Dodatek 2 Seznam vrst, uporabljenih pri preskušanju rastlin v preteklosti Družina Vrsta Splošna imena DICOTYLEDONAE (DVOKALIČNICE) Apiaceae (Umbelliferae) (kobulnice) Daucus carota korenje Asteraceae (Compositae) (nebinovke (košarnice)) Helianthus annuus sončnice Asteraceae (Compositae) (nebinovke (košarnice)) Lactuca sativa solata Brassicaceae (Cruciferae) (križnice (kapusnice)) Sinapis alba bela gorjušica Brassicaceae (Cruciferae) (križnice (kapusnice)) Brassica campestris var. chinensis kitajski kapus Brassicaceae (Cruciferae) (križnice (kapusnice)) Brassica napus oljna ogrščica Brassicaceae (Cruciferae) (križnice (kapusnice)) Brassica oleracea var. capitata zelje Brassicaceae (Cruciferae) (križnice (kapusnice)) Brassica rapa strniščna repa Brassicaceae (Cruciferae) (križnice (kapusnice)) Lepidium sativum kreša Brassicaceae (Cruciferae) (križnice (kapusnice)) Raphanus sativus redkev Chenopodiaceae (metlikovke) Beta vulgaris sladkorna pesa Cucurbitaceae (bučevke) Cucumis sativus kumara Fabaceae (Leguminosae) (metuljnice (stročnice)) Glycine max (G. soja) soja Fabaceae (Leguminosae) (metuljnice (stročnice)) Phaseolus aureus mungo fižol Fabaceae (Leguminosae) (metuljnice (stročnice)) Phaseolus vulgaris pritlikavi fižol, stročji fižol, vrtni fižol Fabaceae (Leguminosae) (metuljnice (stročnice)) Pisum sativum grah Fabaceae (Leguminosae) (metuljnice (stročnice)) Trigonella foenum- graecum božja rutica metuljnice (stročnice) (Fabaceae (Leguminosae)) Lotus corniculatus navadna nokota metuljnice (stročnice) (Fabaceae (Leguminosae)) Trifolium pratense črna detelja metuljnice (stročnice) (Fabaceae (Leguminosae)) Vicia sativa grašica Linaceae (lanovke) Linum usitatissimum lan Polygonaceae (dresnovke) Fagopyrum esculentum ajda Solanaceae (razhudnikovke) Solanum lycopersicon paradižnik MONOCOTYLEDONAE (ENOKALIČNICE) Liliaceae (Amarylladaceae) (lilijevke (narcisovke)) Allium cepa čebula Poaceae (Gramineae) (trave) Avena sativa oves Poaceae (Gramineae) (trave) Hordeum vulgare ječmen Poaceae (Gramineae) (trave) Lolium perenne trpežna (angleška) ljuljka Poaceae (Gramineae) (trave) Oryza sativa riž Poaceae (Gramineae) (trave) Secale cereale rž Poaceae (Gramineae) (trave) Sorghum bicolor sirek v zrnju, navadni sirek trave (Poaceae (Gramineae)) Triticum aestivum pšenica Poaceae (Gramineae) (trave) Zea mays koruza Dodatek 3 Seznam potencialnih nekmetijskih rastlin Potencialne rastline za preskušanje strupenosti rastlin OECD. Opomba: V naslednji preglednici so informacije o 52 nekmetijskih vrstah (viri so za vsak vnos navedeni v oklepajih). Navedene hitrosti vznika so vzete iz objavljene literature in služijo le kot splošno vodilo. Posamezne izkušnje se lahko razlikujejo glede na vir semena in druge dejavnike. Botanično ime DRUŽINE vrste (slovensko splošno ime) Življenjska doba (9) in habitat Teža semena (mg) Obdobje osvetljenosti za kalivost ali rast (10) Globina sejanja (mm) (11) Čas do kalitve (dni) (12) Posebna tretiranja (13) Preskus strupenosti (14) Dobavitelji semen (15) Druge reference (16) APIACEAE (KOBULNICE) Torilis japónica (japonska oklobnica) E, D; prizadeta območja, žive meje, pašniki (16, 19) 1,7–1,9 (14, 19) S = T (14) 0 (1, 19) 5 (50 %) (19) hladna stratifikacija (7, 14, 18, 19), morda je potrebno zorenje (19), tema zavira kalivost (1, 19), brez posebnih tretiranj (5) NAKNADNO (5) ASTERACEAE (NEBINOVKE) Bellis perennis (navadna marjetica) T travišča, orna zemljišča, trate (16, 19) 0,09–0,17 (4, 19) S = T (14) 0 (4) 3 (50 %) (19) 11 (100 %) (18) obsevanost ne vpliva na kalivost (18, 19), brez posebnih tretiranj (4, 14) NAKNADNO (4) A, D, F 7 Centaurea cyanus (plavica) E polja, obcestne površine, odprti habitati (16) 4,1–4,9 (4, 14) S = T (14) 0–3 (2, 4, 14) 14–21 (100 %) (14) brez posebnih tretiranj (2, 4) NAKNADNO (2,4) A, D, E, F 7 Centaurea nigra (črni glavinec) T polja, obcestne površine, odprti habitati (16, 19) 2,4–2,6 (14, 19) S = T (14) 0 (19) 3 (50 %) (19) 4 (97 %) (18) morda je potrebno zorenje (18, 19), tema zavira kalivost (19), brez posebnih tretiranj (5, 14, 26) NAKNADNO (5, 22, 26) A Inula helenium veliki oman T vlažna, prizadeta mesta (16) 1–1,3 (4, 14, 29) 0 (4, 29) brez posebnih tretiranj (4) NAKNADNO (4) A, F Leontodon hispidus (navadni otavčič) T polja, obcestne površine, prizadeta območja (16, 19) 0,85–1,2 (14, 19) S = T (14) 0 (19) 4 (50 %) (19) 7 (80 %) (18) tema zavira kalivost (17, 18, 19) brez posebnih tretiranj (5, 23) NAKNADNO (5, 22, 23) Rudbeckia hirta (srhkodlakava rudbekija) D, T prizadeta območja (16) 0,3 (4, 14) S = T (14) 0 (4, 33) < 10 (100 %) (33) brez posebnih tretiranj (4, 14, 33) NAKNADNO (4, 33) C, D, E, F Solidago canadensis kanadska zlata rozga T pašniki, odprta območja (16) 0,06–0,08 (4, 14) S = T (11) 0 (4) 14–21 (11) zmešajte z enakim delom peska in 24 ur namakajte v 500 ppm GA (11), brez posebnih tretiranj (4) NAKNADNO (4) E, F Xanthium pensylvanicum (pensilvanski bodič) E polja, odprti habitati (16) 25–61 (14, 29) 0(1) 5(29) tema lahko zavira kalivost (1), namakajte 12 ur v topli vodi (29) PREDHODNO IN NAKNADNO (31) A Xanthium spinosum (trnati bodič) E odprti habitati (16) 200 (14) S = T (14) S > T (6) 10 (6) opraskanje (14), brez posebnih tretiranj (6) PREDHODNO IN NAKNADNO (6) A Xanthium strumarium (navadni bodič) E polja, odprti habitati (16) 67,4 (14) S = T (14) 10–20 (6, 21) brez posebnih tretiranj (6, 14, 21) PREDHODNO IN NAKNADNO (6, 21, 28, 31) A BRASSICACEAE (KRIŽNICE) Cardamine pratensis (travniška penuša) T polja, obcestne površine, trate (16, 19) 0,6 (14, 19) S = T (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 15 (98 %) (18) tema zavira kalivost (18, 19), brez posebnih tretiranj (5, 14, 22) NAKNADNO (5, 22) F CARYOPHYLLACEAE (KLINČNICE) Lychnis flos-cuculi (kukavičja lučca) T (16) 0,21 (14) S = T (14) < 14 (100 %) (14, 25) morda je potrebno zorenje (18), brez posebnih tretiranj (5, 14, 15, 22–26) NAKNADNO (5, 15, 22–26) F CHENOPODIACEAE (METLIKOVKE) Chenopodium album (bela metlika) E robovi polj, prizadeta območja (16, 19) 0,7–1,5 (14, 19, 34) S = T (14) 0 (1, 19) 2 (50 %) (19) tretiranje se razlikuje glede na barvo semena (19), obdobje mirovanja pri shranjevanju na suhem (19), tema zavira kalivost (1, 18, 19), hladna stratifikacija (18), brez posebnih tretiranj (14, 34) PREDHODNO IN NAKNADNO (28, 31, 34) A 32 CLUSIACEAE (KRČNIČEVKE) Hypericum perforatum (šentjanževka) T polja, orna zemljišča, odprti habitati (16, 19) 0,1–0,23 (14, 19) S = T (14) 0 (1, 19) 3 (19) 11 (90 %) (18) tema zavira kalivost (1, 18, 19), brez posebnih tretiranj (5, 14, 15, 25, 27) NAKNADNO (5, 15, 25, 27) A, E, F CONVOLVULACEAE (SLAKOVKE) Ipomoea hederacea (bršljanasti lepi slak) E obcestne površine, odprti habitati, koruzna polja (16) 28,2 (14) S > T (6, 10) 10–20 (6, 10, 21) 4 (100 %) (10) obsevanost ne vpliva na kalivost (1), brez posebnih tretiranj (6, 21) PREDHODNO IN NAKNADNO (6, 12, 21, 28) A CYPERACEAE (OSTRIČEVKE) Cyperus rotundus (okrogla ostrica) T orne površine, pašniki, obcestne površine (16, 30) 0,2 (14) S = T (14) 0 (1) 10–20 (6, 10) 12 (91 %) (10) tema zavira kalivost (1), brez posebnih tretiranj (6, 10, 14) PREDHODNO IN NAKNADNO (6, 28, 31) B 7 FABACEAE (METULJNICE) Lotus corniculatus (navadna nokota) T travnate površine, obcestne površine, odprti habitati (16, 19) 1–1,67 (14, 19) S = T (14) 1 (50 %) (19) opraskanje (14, 19), obsevanost ne vpliva na kalivost (18, 19) brez posebnih tretiranj (23, 25) NAKNADNO (5, 23, 25) A, D, E, F Senna obtusifolia (topolistna sena) E vlažni gozdovi (16) 23–28 (9) S = T (14) S > T (9) 10–20 (6,9) semena 24 ur namakajte v vodi (9), opraskanje (14), viabilnost semena se razlikuje glede na barvo (1), brez posebnih tretiranj (6) NAKNADNO (6,9) A Sesbania exaltata (konoplja) E aluvialna tla (16) 11–13 (9, 14) S > T (9) 10-20 (9, 21) semena 24 ur namakajte v vodi (9), obsevanost ne vpliva na kalivost (1), brez posebnih tretiranj (21) PREDHODNO IN NAKNADNO (9, 21, 28, 31) A Trifolium pratense (črna detelja) T polja, obcestne površine, orna zemljišča (16, 19) 1,4–1,7 (14, 19) S = T (14) 1 (50 %) (19) opraskanje (14, 18), morda je potrebno zorenje (19), obsevanost ne vpliva na kalivost (1, 19), brez posebnih tretiranj (5) NAKNADNO (5) A, E, F LAMIACEAE (USTNATICE) Leonurus cardiaca (deljenolistna srčnica) T odprta območja (16) 0,75–1,0 (4, 14) S = T (14) 0 (4) brez posebnih tretiranj (4, 14) NAKNADNO (4) F Mentha spicata (klasasta meta) T vlažna območja (16) 2,21 (4) 0 (4) brez posebnih tretiranj (4) NAKNADNO (4) F Nepeta cataria (mačja meta) T prizadeta območja (16) 0,54 (4, 14) S = T (14) 0 (4) brez posebnih tretiranj (2, 4, 14) NAKNADNO (2,4) F Prunella vulgaris (navadna črnoglavka) T orna zemljišča, travnata področja, prizadeta mesta (16, 19) 0,58–1,2 (4, 14, 19) S = T (14) 0 (4, 19) 5 (50 %) (19) 7 (91 %) (18) tema zavira kalivost (18, 19), boljša kalivost z večjimi semeni (1), brez posebnih tretiranj (4, 14, 22) NAKNADNO (4, 22) A, F Stachys officinalis (navadni čistec) T travišča, robovi polj (19) 14–18 (14, 19) S = T (14) 7 (50 %) (19) brez posebnih tretiranj (5, 14, 22) NAKNADNO (5, 22) F MALVACEAE (SLEZENOVKE) Abutilón theophrasti (baržunasti oslezovec) E polja, odprti habitati (16) 8,8 (14) S = T (14) 10–20 (6, 10, 21) 4 (84 %) (10) opraskanje (14), brez posebnih tretiranj (5, 10, 21) PREDHODNO IN NAKNADNO (6, 22, 28, 31) A, F Sida spinosa (bodičasta sida) E polja, obcestne površine (16) 3,8 (14) S = T (14) 10–20 (6, 21) opraskanje (14), obsevanost ne vpliva na kalivost (1), brez posebnih tretiranj (6, 21) PREDHODNO IN NAKNADNO (6, 21, 28, 31) A, F PAPAVERACEAE (MAKOVKE) Papaver rhoeas (poljski mak) E polja, orna zemljišča, prizadeta mesta (16, 19) 0,1–0,3 (4, 14, 19, 29) S = T (14) 0 (4, 29) 4 (50 %) (19) hladna stratifikacija in opraskanje (1, 19, 32), brez posebnih tretiranj (4, 14, 29) NAKNADNO (4) A, D, E, F, G POACEAE (TRAVE) Agrostis tenuis (tankolistna šopulja) trate, pašniki (16) 0,07 (14) S > T (Ю) 20 (10) 10 (62 %) (10) tema zavira kalivost (1, 17–19) brez posebnih tretiranj (10) NAKNADNO (10) A, E Alopecurus myosuroides (njivski lisičji rep) E polja, odprti habitati (16) 0,9–1,6 (29, 34) S = T (14) 2 (29) < 24 (30 %) (34) opraskanje (14), tretiranje s 101 mg/l KNO3 (14), topla stratifikacija (1), tema zavira kalivost (1), brez posebnih tretiranj (34) PREDHODNO IN NAKNADNO (28, 34) A 32 Avena fatua (gluhi oves) E kultivirana območja, odprti habitati (16) 7–37,5 (14, 30) S = T (14) S > T (6) 10–20 (6, 10) 3 (70 %) (18) opraskanje (7, 32), tema zavira kalitev (1), hladna stratifikacija (1, 18), brez posebnih tretiranj (6, 10, 14) PREDHODNO IN NAKNADNO (6, 10, 28, 31) A Bromus tectorum (strešna stoklasa) E polja, obcestne površine, orna zemljišča (16) 0,45–2,28 (14, 29) S = T (14) 3 (29) obdobje zorenja (1, 7, 32), svetloba zavira kalivost (1), brez posebnih tretiranj (14) PREDHODNO IN NAKNADNO (28, 31) A Cynosurus cristatus (navadni pasji rep) T polja, obcestne površine, odprti habitati (16, 19) 0,5–0,7 (14, 19, 29) S = T (14) 0 (29) 3 (50 %) (19) obsevanost ne vpliva na kalivost (19), brez posebnih tretiranj (14, 29) NAKNADNO (5) A Digitaria sanguinalis (krvavordeča srakonja) E polja, trate, odprti habitati (16) 0,52–0,6 (14, 30) S = T (14) 10–20 (21). 7 (75 %) 14 (94 %) (7) opraskanje, hladna stratifikacija in zorenje (1, 7, 14, 32), tretiranje s 101 mg/l KNO3 (14), tema zavira kalivost (1), brez posebnih tretiranj (21) PREDHODNO IN NAKNADNO (18, 25, 31) A Echinochloa crusgalli (navadna kostreba) E (16) 1,5 (14) S = T (14) S > T (3) 10–20 (7, 21) opraskanje (7, 32), obsevanost ne vpliva na kalivost (1), brez posebnih tretiranj (3, 14, 21) PREDHODNO IN NAKNADNO (3, 21, 28, 31) A Elymus canadensis (kanadski bored) T obrežna območja, prizadeta mesta (16) 4–5 (14, 30) S = T (11) 1 (11) 14–28 (11) brez posebnih tretiranj (2, 11) NAKNADNO (2) C, D, E Festuca pratensis (travniška bilnica) T polja, vlažna območja (16, 19) 1,53–2,2 (16, 19) S = T (14) S > T (10) 20 (10) 9 (74 %) (10) 2 (50 %) (19) brez posebnih tretiranj (10, 19) NAKNADNO (10) A 7 Hordeum pusillum (mali ječmen) E pašniki, obcestne površine, odprti habitati (16) 3,28 (14) topla stratifikacija (1), obsevanost ne vpliva na kalivost (1) PREDHODNO (31) 7 Phieum pratense (travniški mačji rep) T pašniki, orna polja, prizadeta mesta (16, 19) 0,45 (14, 19) S > T (10, 14) 0–10 (10, 19) 2 (74 %) (10) 8 (50 %) (19) tema zavira kalivost (19), obsevanost ne vpliva na kalivost (17), brez posebnih tretiranj (10, 14, 17, 19) NAKNADNO (10) A, E POLYGONACEAE (DRESNOVKE) Polygonum convolvulus (navadni slakovec) E odprti habitati, obcestne površine (16) 5–8 (4, 14, 29) S = T (20) 0–2 (4, 29) hladna stratifikacija od 4 do 8 tednov (1, 2, 4, 20, 29), obsevanost ne vpliva na kalivost (1) PREDHODNO IN NAKNADNO (1, 2, 20, 28, 31) A 32 Polygonum lapathifolium (ščavjelistna dresen) E vlažna tla (16) 1,8–2,5 (14). S > T (6) 5 (94 %) (18) obsevanost ne vpliva na kalivost (1), tema zavira kalivost (18), hladna stratifikacija (1), brez posebnih tretiranj (5) PREDHODNO IN NAKNADNO (6) A, E Polygonum pennsylvanicum (pensilvanska dresen) E polja, odprti habitati (16) 3,6–7 (14, 29) 2 (29) hladna stratifikacija 4 tedne pri 0–5 °C (1, 29), tema zavira kalivost (1) PREDHODNO (31) A, E Polygonum periscaria (breskvolistna dresen) E prizadeta območja, orna zemljišča (16, 19) 2,1–2,3 (14, 19) S > T (13) 0 (19) < 14 (13) 2 (50 %) (19) opraskanje, hladna stratifikacija, tretiranje z GA (14), hladna stratifikacija, zorenje (17–19), tema zavira kalivost (19), brez posebnih tretiranj (13) NAKNADNO (13) A 32 Rumex crispus (kodrastolistna kislica) T orna polja, obcestne površine, odprta območja (16, 19) 1,3–1,5 (4, 14, 19) S = T (14, 33) 0 (4, 19, 33) 3 (50 %) (19) 6 (100 %) (33) obsevanost ne vpliva na kalivost (18, 19), morda je potrebno zorenje (18), brez posebnih tretiranj (4, 14, 33) NAKNADNO (4, 33) A, E 32 PRIMULACEAE (JEGLIČEVKE) Anagallis arvensis (navadna kurja češnjica) E orna polja, odprta območja, prizadeta mesta (16, 19) 0,4–0,5 (4, 14, 19) S = T (14) 1 (50 %) (19) hladna stratifikacija, tretiranje z GA (1, 14, 18, 19, 32), za kalivost je potrebna svetloba (1), brez posebnih tretiranj (2, 4) NAKNADNO (2,4) A, F RANUNCULACEAE (ZLATIČEVKE) Ranunculus acris (ripeča zlatica) T orna polja, obcestne površine, odprta območja (16, 19) 1,5–2 (14, 19, 29) S = T (14) 1 (29) 41–56 (19, 29) brez posebnih tretiranj (5, 14, 22, 24–26) NAKNADNO (5, 22, 24–26) 32 ROSACEAE (ROŽNICE) Geum urbanum (navadna sretena) T žive meje, vlažna območja (16, 19) 0,8–1,5 (14, 19) S = T (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 16 (79 %) (18) tema zavira kalivost (18, 19), topla stratifikacija (1), brez posebnih tretiranj (5, 14, 22, 25, 26) NAKNADNO (5, 22, 25, 26) A RUBIACEAE (BROŠČEVKE) Galium aparine (plezajoča lakota) E orna polja, vlažna območja, prizadeta mesta (16, 19) 7–9 (14, 19) S = T (14) 5 (50 %) (19) 6 (100 %) (18) hladna stratifikacija (1, 18, 19), obsevanost ne vpliva na kalivost (18, 19), svetloba zavira kalivost (1), brez posebnih tretiranj (6, 14) PREDHODNO IN NAKNADNO (6, 28) A 32 Galium mollugo (navadna lakota) T žive meje, odprta območja (8) 7 (29) S = T (14) 2 (29) brez posebnih tretiranj (5, 14, 22, 24, 26, 29) NAKNADNO (5, 22, 24, 26) A SCROPHULARIACEAE (ČRNOBINOVKE) Digitalis purpurea (škrlatni naprstec) D, T žive meje, odprta območja (16, 19) 0,1–0,6 (4, 14, 19) S = T (14) 0 (4, 19) 6 (50 %) (19) 8 (99 %) (18) tema zavira kalivost (1,17–19), brez posebnih tretiranj (4, 22–26) NAKNADNO (4, 22–26) D, G, F Veronica persica (perzijski jetičnik) E orna polja, odprta območja, prizadeta mesta (16, 19) 0,5–0,6 (14, 19) S = T (14) 0 (19) 3(19) 5 (96 %) (18) tema zavira kalivost (18, 19), hladna stratifikacija (18), brez posebnih tretiranj (14) PREDHODNO IN NAKNADNO (28) A 32 Navedeni dobavitelji semen ID dobavitelja Informacije o dobavitelju A Herbiseed New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ VELIKA BRITANIJA + 44 1189349464 www.herbiseed.com B Tropilab Inc. 8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771-3948 ZDA +1 7273444050 www.tropilab.com C Pterophylla – Native Plants & Seeds #316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0 KANADA + 1 5195863985 D Applewood Seed Co. 5380 Vivian St., Arvada, CO 80002 ZDA + 1 3034317333 www.applewoodseed.com E Ernst Conservation Seeds 9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335 ZDA +1 8008733321 www.ernstseed.com F Chiltern Seeds Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB VELIKA BRITANIJA +44 1229581137 www.chiltemseeds.co.uk G Thompson & Morgan P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7 KANADA + 1 8002747333 www.thompson-morgan.com NAVEDENI VIRI (1) Baskin, C. C., in Baskin, J. M. (1998). Seeds. Academic Press, Toronto. (2) Blackburn, L. G., in Boutin, C. (2003). Subtle effects of herbicide use in the context of genetically modified crops: a case study with glyphosate (Round-Up®). Ecotoxicology, 12:271–285. (3) Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T., Batchelor, P. S., in Maguire, R. J. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Environmental Toxicology & Chemistry, 19(10):2532–2541. (4) Boutin, C., Elmegaard, N., in Kjaer, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: implications for risk assessment. Ecotoxicology, 13:349–369. (5) Breeze, V., Thomas, G., in Butler, R. (1992). Use of a model and toxicity data to predict the risks to some wild plant species from drift of four herbicides. Annals of Applied Biology, 121:669–677. (6) Brown, R. A., in Farmer, D. (1991). Track-sprayer and glasshouse techniques for terrestrial plant bioassays with pesticides. V: Plants for toxicity assessment: 2. izdaja. ASTM STP 1115, J. W. Gorsuch, W. R. Lower, W. Wang, in M. A. Lewis, ur. American Society for Testing & Materials, Philadelphia. Str. 197–208. (7) Buhler, D. D., in Hoffman, M. L. (1999). Anderson's guide to practical methods of propagating weeds and other plants. Weed Science Society of America, Lawrence, K. (8) Clapham, A. R., Tutin, T. G., in Warburg, E. F. (1981). Excursion flora of the British Isles, 3. izdaja, Cambridge University Press, Cambridge. (9) Clay, P. A., in Griffin, J. L. (2000). Weed seed production and seedling emergence response to late-season glyphosate applications. Weed Science, 48:481–486. (10) Cole, J. F. H., in Canning, L. (1993). Rationale for the choice of species in the regulatory testing of the effects of pesticides on terrestrial non-target plants. BCPC – Weeds. str. 151–156. (11) Fiely, M. (Ernst Conservation Seeds). (2004). Osebna komunikacija. (www.ernstseed.com). (12) Fletcher, J. S., Johnson, F. L., in McFarlane, J. C. (1990). Influence of greenhouse versus field testing and taxonomic differences on plant sensitivity to chemical treatment. Environmental Toxicology & Chemistry, 9:769–776. (13) Fletcher, J. S., Pfleeger, T. G., Ratsch, H. C., in Hayes, R. (1996). Potential impact of low levels of chlorsulfuron and other herbicides on growth and yield of nontarget plants. Environmental Toxicology & Chemistry, 15(7):1189–1196. (14) Flynn, S., Turner, R. M., in Dickie, J. B. (2004). Seed Information Database (release 6.0, okt. 2004) Royal Botanic Gardens, Kew (www.rbgkew.org.uk/data/sid). (15) Franzaring, J., Kempenaar, C., in van der Eerden, L. J. M. (2001). Effects of vapours of chlorpropham and ethofumesate on wild plant species. Environmental Pollution, 114:21–28. (16) Gleason, H. A., in Cronquist, A. (1991). Manual of vascular plants of northeastern United States and adjacent Canada, 2. izdaja. New York Botanical Garden, Bronx, NY. (17) Grime, J. P. (1981). The role of seed dormancy in vegetation dynamics. Annals of Applied Biology, 98:555–558. (18) Grime, J. P., Mason, G., Curtis, A. V., Rodman, J., Band, S. R., Mowforth, M. A. G., Neal, A. M., in Shaw, S. (1981). A comparative study of germination characteristics in a local flora. Journal of Ecology, 69:1017–1059. (19) Grime, J. P., Hodgson, J. G., in Hunt, R. 1988. Comparative plant ecology: a functional approach to common British species. Unwin Hyman Ltd., London. (20) Kjaer, C. (1994). Sublethal effects of chlorsulfuron on black bindweed (Polygonum convolvulus L.). Weed Research, 34, 453–459. (21) Klingaman, T. E., King, C. A., in Oliver, L. R. (1992). Effect of application rate, weed species, and weed stage of growth on imazethapyr activity. Weed Science, 40:227–232. (22) Marrs, R. H., Williams, C. T., Frost, A. J., in Plant, R. A. (1989). Assessment of the effects of herbicide spray drift on a range of plant species of conservation interest. Environmental Pollution, 59:71–86. (23) Marrs, R. H., Frost, A. J., in Plant, R. A. (1991). Effects of herbicide spray drift on selected species of nature conservation interest: the effects of plant age and surrounding vegetation structure. Environmental Pollution, 69:223–235. (24) Marrs, R. H., Frost, A. J., in Plant, R. A. (1991). Effects of mecoprop drift on some plant species of conservation interest when grown in standardized mixtures in microcosms. Environmental Pollution, 73:25–42. (25) Marrs, R. H., Frost, A. J., Plant, R. A., in Lunnis, P. (1993). Determination of buffer zones to protect seedlings of non-target plants from the effects of glyphosate spray drift. Agriculture, Ecosystems, & Environment, 45:283–293. (26) Marrs, R. H., in Frost, A. J. (1997). A microcosm approach to detection of the effects of herbicide spray drift in plant communities. Journal of Environmental Management, 50:369–388. (27) Marshall, E. J. P., in Bernie, J. E. (1985). Herbicide effects on field margin flora. BCPC – Weeds. str. 1021–1028. (28) McKelvey, R. A., Wright, J. P., in Honegger, J. L. (2002). A comparison of crop and non-crop plants as sensitive species for regulatory testing. Pest Management Science, 58:1161–1174. (29) Morton, S. (Herbiseed). (2004). Osebna komunikacija. (http://www.herbiseed.com). (30) USDA, NRCS. 2004. The Plants Database, version 3.5. (http://plants.usda.gov). National Plant Data Centre, Baton Rouge, LA 70874-4490 ZDA. (31) USEPA. (1999). One-Liner Database. [U.S. E.P.A./Office of Pesticide Programs/Environmental Fate and Effects Division/Environmental Epidemiology Branch]. (32) Webster, R. H. (1979). Technical Report No. 56: Growing weeds from seeds and other propagules for experimental purposes. Agricultural Research Council Weed Research Organization, Oxford. (33) White, A. L., in Boutin, C. (National Wildlife Research Centre, Environment Canada). 2004. Osebna komunikacija. (34) Zwerger, P., in Pestemer, W. (2000). Testing the phytotoxic effects of herbicides on higher terrestrial non-target plants using a plant life-cycle test. Z. PflKrankh. PflSchutz, Sonderh., 17:711–718. Dodatek 4 Primeri ustreznih rastnih pogojev za določene vrste kmetijskih rastlin Naslednji pogoji so se izkazali za primerne pri 10 vrstah kmetijskih rastlin in jih je mogoče uporabljati kot vodilo tudi pri preskusih z določenimi drugimi vrstami v rastnih komorah: Koncentracija ogljikovega dioksida: 350 ± 50 ppm. Relativna vlažnost: 70 ± 5 % med obdobji osvetljenosti in 90 ± 5 % med obdobji teme. Temperatura: 25 ± 3 °C podnevi, 20 ± 3 °C ponoči. Obdobje osvetljenosti: 16 ur osvetljenosti/8 ur teme, pri čemer se predpostavlja, da je povprečna valovna dolžina od 400 do 700 nm. Osvetljenost: svetlost 350 ± 50 μE/m2/s, merjeno na vrhu rastlinskega pokrova. Vrste kmetijskih rastlin so: — paradižnik (Solanum lycopersicon), — navadna kumara (Cucumis sativus), — solata (Lactuca sativa), — soja (Glycine max), — glavnato zelje (Brassica oleracea var. capitata), — navadno korenje (Daucus carota), — oves (Avena sativa), — trpežna ljuljka (Lolium perenne), — koruza (Zea mays), — čebula (Allium cepa). C.32. PRESKUS RAZMNOŽEVANJA ENHITREJEV UVOD 1. Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici za preskušanje OECD (TG) 220 (2004). Zasnovana je za uporabo pri ocenjevanju učinkov kemikalij na sposobnost razmnoževanja črva enhitreja, Enchytraeus albidus (Henle, 1873), v tleh. Načeloma temelji na metodi, ki jo je razvila nemška Zvezna agencija za okolje (1) in je bila preskušena s krožnim preskusom (2). Upoštevane so bile tudi druge metode za preskušanje strupenosti kemikalij za enhitreje in deževnike (3)(4)(5)(6)(7)(8). ZAČETNI POMISLEKI 2. V tleh živeči kolobarniki iz rodu Enchytraeus so ekološko pomembna vrsta za ekotoksikološko preskušanje. Čeprav je enhitreje pogosto najti v tleh, ki vsebujejo deževnike, pa drži tudi to, da jih je pogosto veliko tudi v tleh, kjer deževnikov ni. Enhitreje je mogoče uporabljati v laboratorijskih preskusih ter v polterenskih in terenskih študijah. S praktičnega vidika je z mnogimi vrstami enhitrejev enostavno ravnati in jih gojiti, njihov generacijski čas pa je znatno krajši od generacijskega časa pri deževnikih. Zato preskus razmnoževanja z enhitreji traja le od 4 do 6 tednov, z deževniki (Eisenia fetida) pa 8 tednov. 3. Osnovne informacije o ekologiji in ekotoksikologiji enhitrejev v kopenskem okolju je mogoče najti v (9)(10)(11)(12). NAČELO PRESKUSA 4. Odrasli črvi enhitrejev so izpostavljeni več koncentracijam preskusne kemikalije, vmešane v umetna tla. Preskus je mogoče razdeliti v dve fazi: (a) če na voljo ni dovolj informacij, preskus za določanje območja delovanja, v katerem je glavna končna točka smrtnost, ocenjena po dveh tednih izpostavljenosti, ter (b) dokončni preskus razmnoževanja, v katerem se oceni skupno število mladičev, ki jih je ustvaril starš, in preživetje staršev. Dokončni preskus traja šest tednov. Po prvih treh tednih se odrasli črvi odstranijo in zabeležijo se morfološke spremembe. Po dodatnih treh tednih se prešteje število potomcev, izleženih iz kokonov, ki so jih proizvedli starši. Sposobnost razmnoževanja živali, izpostavljenih preskusni kemikaliji, se za določitev (i) koncentracije brez opaznega učinka (NOEC) in/ali (ii) ECx (npr. EC10, EC50) z regresijskim modelom, s katerim se oceni koncentracijo, ki bi povzročila x-odstotno zmanjšanje sposobnosti razmnoževanja, primerja s sposobnostjo razmnoževanja pri kontrolah. Preskusne koncentracije morajo oklepati vrednost ECx (npr. EC10, EC50), tako da vrednost ECx nato izvira iz interpolacije in ne iz ekstrapolacije. PODATKI O PRESKUSNI KEMIKALIJI 5. Po možnosti morajo biti znani topnost v vodi, vrednost log Kow, porazdelitveni koeficient tla/voda (npr. poglavje C.18 ali C.19 te priloge) in parni tlak preskusne kemikalije. Zaželene so dodatne informacije o usodi preskusne kemikalije v tleh, kot so hitrosti fotolize in hidrolize. 6. To preskusno metodo je mogoče uporabiti za vodotopne in nevodotopne kemikalije. Vendar se bodo načini nanosa preskusne kemikalije ustrezno razlikovali. Preskusna metoda se ne sme uporabljati pri hlapnih kemikalijah, tj. kemikalijah, za katere je Henryjeva konstanta ali porazdelitveni koeficient zrak/voda večja od ena, ali pri kemikalijah, pri katerih parni tlak pri 25 °C presega 0,0133 Pa. VELJAVNOST PRESKUSA 7. Da preskus šteje kot veljaven, morajo kontrolni vzorci izpolnjevati naslednja merila: — smrtnost pri odraslih osebkih na koncu preskusa za določanje območja delovanja in po prvih treh tednih po preskusu razmnoževanja ne sme presegati 20 %, — s predpostavko, da je bilo pri pripravi preskusa uporabljenih 10 odraslih osebkov na posodo, mora biti na koncu preskusa povprečno ustvarjenih vsaj 25 mladičev, — koeficient variacije okrog povprečnega števila mladičev ob koncu preskusa razmnoževanja ne sme presegati 50 %. Če preskus ne uspe izpolniti zgoraj naštetih meril za veljavnost, mora biti prekinjen, razen če je mogoče podati utemeljitev za nadaljevanje preskusa. Utemeljitev mora biti vključena v poročilo o preskusu. REFERENČNA KEMIKALIJA 8. Referenčna kemikalija mora biti preskušana v rednih časovnih razmikih ali pa po možnosti vključena v vsak preskus, da se preveri, ali se odziv preskusnih organizmov v času ni pomembneje spremenil. Primerna referenčna kemikalija je karbendazim, za katerega je dokazano, da vpliva na preživetje in razmnoževanje enhitrejev (13)(14), mogoče pa je uporabiti tudi druge kemikalije, katerih podatki o strupenosti so dobro znani. V krožnem preskusu je bila uporabljena formulacija karbendazima, znana pod trgovskim imenom Derosal™, ki jo dobavlja družba AgrEvo Company (iz Frankfurta v Nemčiji) in ki vsebuje 360 g/l (32,18 %) aktivne sestavine (2). Vrednost EC50 za razmnoževanje, določena v krožnem preskusu, je bila v območju 1,2 ± 0,8 mg aktivne sestavine (a.s.)/kg suhe mase (2). Če je v preskusno serijo vključen pozitivni toksikološki standard, se uporablja ena koncentracija, število ponovitev pa mora biti enako kot v kontrolah. Za karbendazim se priporoča preskušanje 1,2 mg a.s./kg suhe teže (preskušane v obliki tekoče formulacije). OPIS PRESKUSA Oprema 9. Preskusne posode morajo biti izdelane iz stekla ali drugega kemijsko inertnega materiala. Primerni so stekleni kozarci (s prostornino npr. od 0,20 do 0,25 litra; premer: ≈ 6 cm). Posode morajo imeti prozorne pokrove (npr. iz stekla ali polietilena), ki so zasnovani tako, da čim bolj zmanjšajo izhlapevanje vode, pri tem pa omogočajo izmenjavo plinov med tlemi in ozračjem. Pokrovi morajo biti prozorni, da je omogočen prenos svetlobe. 10. Zahtevana je običajna laboratorijska oprema, zlasti naslednje: — sušilna omara, — stereomikroskop, — merilnik vrednosti pH in fotometer, — ustrezne natančne tehtnice, — ustrezna oprema za uravnavanje temperature, — ustrezna oprema za uravnavanje vlažnosti (ni nujna, če imajo posode za izpostavljanje pokrove), — inkubator ali majhna soba s klimatsko napravo, — pincete, kljuke ali zanke, — kad za razvijanje fotografij. Priprava umetnih tal 11. V tem preskusu se uporabljajo umetna tla (5)(7) z naslednjo sestavo (na podlagi suhih tež, posušenih na konstantno težo pri 105 °C): — 10 % na zraku posušenega in fino mletega šotnega mahu (sprejemljiva je velikost delcev 2 ± 1 mm); pred uporabo tal, pripravljenih s svežo šaržo šote, v preskusu je priporočljivo preveriti, ali so tla primerna za gojenje črvov, — 20 % kaolinske gline (po možnosti naj bo vsebnost kaolinita nad 30 %), — približno od 0,3 do 1,0 % kalcijevega karbonata (CaCO3, zdrobljenega v prah, analitsko čistega) za doseganje vrednosti pH, ki znaša 6,0 ± 0,5; količina kalcijevega karbonata, ki bo dodana, je lahko odvisna zlasti od kakovosti/značilnosti šote, — približno 70 % na zraku posušenega kremenovega peska (odvisno od potrebne količine CaCO3), v glavnem finega peska z več kot 50 % delcev, ki merijo med 50 in 200 mikroni. Pred uporabo tal v dokončnem preskusu je priporočljivo dokazati primernost umetnih tal za gojenje črvov in izpolnjevanje meril za veljavnost preskusa. Tako preverjanje je posebej priporočljivo za to, da se prepreči ogroženost preskusa, če se vsebnost organskega ogljika v umetnih tleh zniža, npr. z znižanjem vsebnosti mahu na vrednost 4–5 % in ustreznim zvišanjem vsebnosti peska. S takim znižanjem vsebnosti organskega ogljika se lahko zmanjšajo možnosti adsorpcije preskusne kemikalije na tla (organski ogljik), razpoložljivost preskusne kemikalije za črve pa se lahko poveča. Dokazano je, da lahko Enchytraeus albidus izpolnjuje merila za veljavnost v zvezi z razmnoževanjem, če se preskus izvaja z naravnimi tlemi z manjšo vsebnostjo organskega ogljika, npr. 2,7 % (15), (omejene) izkušnje pa kažejo, da je to mogoče doseči tudi pri umetnih tleh s 5 % šote. Opomba: pri uporabi naravnih tal za dodatno preskušanje (na višjih stopnjah) je treba dokazati tudi primernost tal in izpolnjevanje meril za veljavnost preskusa. 12. Suhe sestavine tal se temeljito premešajo (npr. v velikem laboratorijskem mešalniku). To je treba storiti vsaj en teden pred začetkom preskusa. Zmešana tla je treba hraniti dva dneva, da se kislost uravnoteži/stabilizira. Za določanje vrednosti pH zmesi tal in 1 M kalijevega klorida (KCl) ali 0,01 M kalcijevega klorida (CaCl2) se uporablja raztopina v razmerju 1: 5 (glej (16) in Dodatek 3). Če so tla bolj kisla, kot je določeno z zahtevanim območjem (glej odstavek 11), jih je mogoče prilagoditi z dodajanjem ustrezne količine CaCO3. Če so tla preveč alkalna, jih je mogoče prilagoditi z dodajanjem večje količine zmesi, navedene v odstavku 11, vendar brez CaCO3. 13. Največja zmogljivost zadrževanja vode (water holding capacity – WHC) umetnih tal je določena v skladu s postopki, opisanimi v Dodatku 2. Dan ali dva pred začetkom preskusa se suha umetna tla predhodno navlažijo z dodajanjem zadostne količine deionizirane vode, da je pridobljena približno polovica končne vsebnosti vode, kar je od 40 do 60 % največje zmogljivosti zadrževanja vode. Na začetku preskusa so predhodno navlažena tla razdeljena na dele, ki ustrezajo številu preskusnih koncentracij (in referenčnih kemikalij, kadar je primerno) ter kontrol, uporabljenih za preskus. Vsebnost vlage se z dodajanjem raztopine preskusne kemikalije in/ali z dodajanjem destilirane ali deionizirane vode prilagodi na 40–60 % največje zmogljivosti zadrževanja vode (glej odstavke 19–21). Vsebnost vlage se določi na začetku in koncu preskusa (s sušenjem na konstantno težo pri 105 °C) in mora biti v optimalnem območju za preživetje črvov. Vsebnost vlage v tleh je mogoče preveriti z rahlim stiskanjem tal v roki; če je vsebnost vlage pravilna, se morajo med prsti pojaviti majhne kapljice vode. Izbira in priprava preskusnih živali 14. Priporočena preskusna vrsta je Enchytraeus albidus (Henle, 1837) (enhitrej), član družine Enchytraeidae (red Oligochaeta, deblo Annelida). E. albidus je ena od najobsežnejših vrst kolobarnikov iz družine Enchytraeidae, pri kateri so zabeleženi tudi osebki, dolgi do 35 mm (17)(18). Vrsta E. albidus je razširjena po vsem svetu in jo najdemo v morskih, sladkovodnih in kopenskih habitatih, v glavnem v razkrajajočih se organskih snoveh (algah, kompostu), redko pa na travnikih (9). Njena široka ekološka toleranca in nekatere morfološke variacije kažejo na to, da morda obstaja več podvrst. 15. Vrsta E. albidus je na trgu na voljo kot hrana za ribe. Treba je preveriti, ali je kultura kontaminirana z drugimi, običajno manjšimi vrstami (1)(19). V primeru kontaminacije je treba vse črve oprati z vodo v petrijevki. Nato se (s stereomikroskopom) izberejo veliki odrasli osebki E. albidus za pripravo nove kulture in izločitev vseh drugih črvov. Vrsto E. albidus je mogoče enostavno gojiti v mnogih organskih snoveh (glej Dodatek 4). Življenjski cikel vrste E. albidus je kratek, ker zrelost doseže v obdobju med 33 dnevi (pri 18 °C) in 74 dnevi (pri 12 °C) (1). Za preskus se uporabijo le kulture, ki so bile brez težav 5 tednov (v času ene generacije) gojene v laboratoriju. 16. Primerne so tudi druge vrste rodu Enchytraeus, npr. E. buchholzi (Vejdovsky, 1879) ali E. crypticus (Westheide in Graefe, 1992) (glej Dodatek 5). Če se uporabijo druge vrste rodu Enchytraeus, jih je treba jasno identificirati in poročati o razlogih za izbiro. 17. Živali, uporabljene v preskusih, so odrasli črvi. Na področju kliteluma morajo imeti jajčeca (bele pike) in biti morajo približno enake velikosti (dolgi približno 1 cm). Sinhronizacija gojitvene kulture ni potrebna. 18. Če se enhitreji ne gojijo v isti vrsti tal in v pogojih (vključno s hranjenjem), uporabljenih za končni preskus, jih je treba aklimatizirati vsaj 24 ur in do tri dni. Na začetku je treba aklimatizirati število odraslih osebkov, ki je večje od števila, potrebnega za izvedbo preskusa, da je omogočena možnost zavrnitve poškodovanih ali kako drugače neprimernih osebkov. Ob koncu obdobja aklimatizacije se za preskus izberejo samo črvi, ki imajo jajčeca in se ne vedejo nenormalno (npr. ne poskušajo uiti iz tal). Črvi se s pinceto, s kljukami ali z zankami skrbno izberejo in namestijo v petrijevko, v kateri je malo sladke vode. V ta namen je primernejša rekonstituirana sladka voda, kot je predlagano v poglavju C.20 te priloge (Preskus razmnoževanja vrste Daphnia magna), saj deionizirana, demineralizirana ali vodovodna voda lahko črve poškoduje. Črvi se pregledajo pod stereomikroskopom in izločijo se vsi, ki nimajo jajčec. Pazljivo se odstranijo in izločijo vse pršice ali vsi skakači, ki so morda kontaminirali kulture. Zdravi črvi, ki se ne uporabijo za preskus, se vrnejo v založno kulturo. Priprava preskusnih koncentracij Preskusna kemikalija, topna v vodi 19. Raztopina preskusne kemikalije se pripravi v deionizirani vodi v količini, ki zadošča za vse ponovitve ene preskusne koncentracije. Priporočljivo je uporabljati zadostno količino vode, da se doseže zahtevana vsebnost vlage, tj. od 40 do 60 % največje vrednosti WHC (glej odstavek 13). Pred vstavljanjem v preskusno posodo se vsaka raztopina preskusne kemikalije temeljito zmeša z eno šaržo predhodno navlaženih tal. Preskusna kemikalija, ki ni topna v vodi 20. Pri kemikalijah, ki niso topne v vodi, so pa topne v organskih topilih, se lahko preskusna kemikalija raztopi v najmanjši mogoči količini primernega vehikla (npr. acetona). Uporabijo se lahko le hlapna topila. Vehikel se razprši na majhno količino (npr. 2,5 g) finega kremenovega peska ali pa se z njo zmeša. Vehikel se odstrani tako, da vsaj eno uro izhlapeva v digestoriju. Ta zmes kremenovega peska in preskusne kemikalije se doda predhodno navlaženim tlom in po dodajanju ustrezne količine deionizirane vode temeljito zmeša, da se doseže zahtevana vlaga. Končna mešanica se namesti v preskusne posode. 21. Pri kemikalijah, ki so slabo topne v vodi in organskih topilih, se ekvivalent 2,5 g fino mletega kremenovega peska na preskusno posodo zmeša z določeno količino preskusne kemikalije, da nastane želena preskusna koncentracija. Ta zmes kremenovega peska in preskusne kemikalije se doda predhodno navlaženim tlom in po dodajanju ustrezne količine deionizirane vode temeljito zmeša, da se doseže zahtevana vsebnost vlage. Končna mešanica se porazdeli v preskusne posode. Postopek se ponovi za vsako preskusno koncentracijo, pripravi pa se tudi ustrezna kontrola. 22. Kemikalij se običajno ne sme preskušati pri koncentracijah, večjih od 1 000 mg/kg suhe mase tal. Vendar pa je v skladu s cilji določenega preskusa morda potrebno preskušanje pri višjih koncentracijah. IZVEDBA PRESKUSOV Preskusne in kontrolne skupine 23. Za vsako preskusno koncentracijo se količina preskusnih tal, ki ustreza 20 g suhe teže, postavi v preskusno posodo (glej odstavke 19–21). Pripravijo se tudi kontrolni vzorci brez preskusne kemikalije. Vsaki posodi se v skladu s postopki, opisanimi v odstavku 29, doda hrana. V vsako preskusno posodo se naključno razporedi po deset črvov. Črvi se previdno prenesejo v vsako preskusno posodo in na primer s pinceto, kljukami ali zankami namestijo na površino tal. Število ponovitev za preskusne koncentracije in za kontrolne vzorce je odvisno od uporabljenega načrta preskusa (glej odstavek 34). Preskusne posode se naključno namestijo v preskusni inkubator, njihovi položaji pa se naključno menjajo vsak teden. 24. Če se za nanos preskusne kemikalije uporablja vehikel, je treba poleg preskusne serije izvesti še eno kontrolno serijo, ki vsebuje kremenov pesek, na katerega se razprši ali z njim zmeša topilo. Koncentracija topila ali disperzijskega sredstva mora biti enaka tisti v preskusnih posodah s preskusno kemikalijo. Za kemikalije, ki jih je treba dodajanje v skladu s postopki, opisanimi v odstavku 21, se mora izvesti kontrolna serija, ki vsebuje dodaten kremenov pesek (2,5 g na posodo). Preskusni pogoji 25. Preskusna temperatura je 20 ± 2 °C. Za preprečevanje uhajanja črvov iz tal se preskus izvaja v nadzorovanih ciklih svetlobe in teme (po možnosti 16 ur svetlobe in 8 ur teme) pri osvetljenosti od 400 do 800 luksov na območju preskusnih posod. 26. Za preverjanje vlažnosti tal se posode na začetku preskusa in nato enkrat tedensko stehtajo. Izguba mase se nadomesti z dodajanjem ustrezne količine deionizirane vode. Treba je opozoriti, da je mogoče izgubo vode zmanjšati z vzdrževanjem visoke relativne vlažnosti zraka (> 80 %) v preskusnem inkubatorju. 27. Vsebnost vlage in vrednost pH je treba meriti ob začetku in koncu preskusa za določanje območja delovanja in dokončnega preskusa. Meritve je treba opraviti v kontrolnih in tretiranih (z vsemi koncentracijami) vzorcih tal, ki so pripravljeni in vzdrževani na enak način kot preskusne kulture, ne vsebujejo pa črvov. Tem vzorcem tal je treba hrano dodati le v začetku preskusa, da se spodbudi mikrobna dejavnost. Količina dodane hrane mora biti enaka količini hrane, dodani preskusnim kulturam. Tem posodam med preskusom ni treba dodajati dodatne hrane. Hranjenje 28. Uporablja se hrana, ki lahko vzdržuje populacijo enhitrejev. Kot primerna hrana so se izkazali ovseni kosmiči, po možnosti avtoklavirani pred uporabo, da se prepreči kontaminacija z mikrobi (primerno je tudi gretje). 29. Najprej se hrana ponudi tako, da se 50 mg grobo mletih ovsenih kosmičev zmeša s tlemi v vsaki posodi, še preden se vanjo namestijo črvi. Nato pa se hrana dobavlja tedensko, vse do 21. dneva. Hranjenje se 28. dne ne izvede, saj so odrasli osebki na tej stopnji odstranjeni, mladi črvi pa po tem potrebujejo relativno malo dodatne hrane. Hranjenje med preskusom obsega 25 mg grobo mletih ovsenih kosmičev na posodo, ki se previdno namestijo na površino tal, da ne poškodujejo črvov. Za zmanjšanje rasti gliv je treba kosmiče ovsa prekriti z majhno količino tal in jih tako zakopati v tla. Če hrana ostane nepoužita, je treba obrok zmanjšati. Načrt za preskus za določanje območja delovanja 30. Po potrebi se preskus za določanje območja delovanja izvede na primer s petimi koncentracijami preskusnih kemikalij, ki znašajo 0,1, 1,0, 10, 100 in 1 000 mg/kg (suhe teže tal). Zadošča ena ponovitev za vsak tretirani in kontrolni vzorec. 31. Preskus za določanje območja delovanja traja dva tedna. Na koncu preskusa se oceni smrtnost črvov. Črv se zabeleži kot mrtev, če se na sprednjem koncu ne odziva na mehanske dražljaje. Pri odločanju o območju koncentracij za uporabo v dokončnem preskusu so poleg informacij o smrtnosti lahko koristne tudi dodatne informacije. Zato je treba zabeležiti tudi spremembe vedenja odraslih osebkov (npr. nezmožnost kopanja v tla, negibno ležanje ob stekleni steni preskusne posode) in morfologijo (npr. prisotnost odprtih ran) ter morebitno prisotnost mladičev. Slednjo je mogoče določiti z metodo barvanja, opisano v Dodatku 6. 32. Vrednost LC50 je mogoče približno določiti z izračunom geometrijske sredine podatkov o smrtnosti. Pri določanju razpona koncentracij za dokončni preskus se predpostavlja, da so učinki na razmnoževanje nižji od vrednosti LC50 za faktor, ki znaša do 10. Vendar je to razmerje empirično in je v vsakem posameznem primeru lahko drugačno. Dodatna opažanja iz preskusa za določanje območja delovanja, kot je pojav mladičev, lahko pripomorejo k natančnejši določitvi razpona koncentracij preskusne kemikalije, ki bo uporabljen v dokončnem preskusu. 33. Za natančno določitev vrednosti LC50 je priporočljivo izvajanje preskusa z vsaj štirimi ponovitvami vsake od koncentracij preskusne kemikalije in število koncentracij, ki je zadostno, da pri teh koncentracijah povzroči vsaj štiri različne statistično značilne povprečne odzive. Podobno število koncentracij in ponovitev za kontrole se uporablja, kadar je to primerno. Načrt dokončnega preskusa razmnoževanja 34. Na podlagi priporočil, ki izhajajo iz krožnega preskusa, se predlagajo trije načrti (2). — Za določanje vrednosti NOEC je treba preskusiti vsaj pet koncentracij v geometrijski vrsti. Priporočene so štiri ponovitve za vsako preskusno koncentracijo in osem kontrol. Med koncentracijami mora biti razmik, katerega faktor ne sme presegati vrednosti 1,8. — Za določitev vrednosti ECx (npr. EC10, EC50) je treba preskusiti vsaj pet koncentracij, da se lahko ECx določi z interpolacijo in ne z ekstrapolacijo pa morajo koncentracije oklepati vrednost ECx. Priporočene so vsaj štiri ponovitve za vsako preskusno koncentracijo in štiri kontrolne ponovitve. Faktor razmika se lahko spreminja, tj. je v pričakovanem območju učinkov lahko manjši ali enak 1,8, pri višjih in nižjih koncentracijah pa je lahko nad 1,8. — Kombiniran pristop omogoča določitev vrednosti NOEC in ECx. Treba je uporabiti osem koncentracij za tretiranje v geometrijski vrsti. Priporočene so štiri ponovitve za vsako tretiranje in osem kontrol. Med koncentracijami mora biti razmik, katerega faktor ne sme presegati vrednosti 1,8. 35. Treba je uporabiti deset odraslih črvov na preskusno posodo (glej odstavek 23). V preskusno posodo se hrana doda na začetku preskusa in nato enkrat tedensko (glej odstavek 29) do vključno 21. dneva. Na 21. dan se vzorci tal previdno ročno pregledajo; poiščejo in preštejejo se živi odrasli črvi ter zabeležijo spremembe vedenja (npr. nezmožnost kopanja v tla, negibno ležanje ob stekleni steni preskusne posode) in morfologije (npr. odprte rane). Nato se vsi odrasli črvi odstranijo iz preskusnih posod in preskusnih tal. Preskusna tla, ki vsebujejo morebitne ustvarjene kokone, se inkubirajo dodatne tri tedne pri enakih preskusnih pogojih, razen hranjenja, ki poteka le 35. dan (tj. 25 mg grobo mletih ovsenih kosmičev na posodo). 36. Po šestih tednih se preštejejo črvi, ki so se na novo izlegli. Priporočljiva je metoda, ki temelji na barvanju z barvilom bengal rdeče (glej Dodatek 6), čeprav so se kot primerne izkazale tudi druge tehnike ekstrakcije z vlago (ne pa tudi s toploto) in flotacije (glej Dodatek 6) (4)(10)(11)(20). Barvanje z barvilom bengal rdeče je priporočljivo, ker ekstrakcijo iz substrata tal z vlago lahko ovira motnost zaradi delcev suspendirane gline. Mejni preskus 37. Če pri največji koncentraciji v preskusu za določanje območja delovanja (tj. 1 000 mg/kg) ni opaženih učinkov, je mogoče preskus razmnoževanja s koncentracijo 1 000 mg/kg izvesti kot mejni preskus, da se dokaže, da je vrednost NOEC za razmnoževanje večja od te vrednosti. Povzetek in časovni razpored preskusa 38. Faze preskusa je mogoče povzeti na naslednji način: Čas Preskus za določanje območja delovanja Dokončni preskus dan – 7 ali prej — priprava umetnih tal (mešanje suhih sestavin) — priprava umetnih tal (mešanje suhih sestavin) dan – 5 — preverjanje vrednosti pH umetnih tal — merjenje največje vrednosti WHC tal — preverjanje vrednosti pH umetnih tal — merjenje največje vrednosti WHC tal od dne – 5 do dne – 3 — razvrščanje črvov za aklimatizacijo — razvrščanje črvov za aklimatizacijo od dne – 3 do dne 0 — aklimatizacija črvov vsaj 24 ur — aklimatizacija črvov vsaj 24 ur dan – 1 — predhodna navlažitev umetnih tal in razdelitev v šarže — predhodna navlažitev umetnih tal in razdelitev v šarže dan 0 — priprava založnih raztopin — nanos preskusne kemikalije — odtehtanje preskusnega substrata v preskusne posode — primešanje hrane — vnašanje črvov — merjenje vrednosti pH in vsebnosti vlage v tleh — priprava založnih raztopin — nanos preskusne kemikalije — odtehtanje preskusnega substrata v preskusne posode — primešanje hrane — vnašanje črvov — merjenje vrednosti pH in vsebnosti vlage v tleh dan 7 — preverjanje vsebnosti vlage v tleh — preverjanje vsebnosti vlage v tleh — hranjenje dan 14 — določitev smrtnosti odraslih osebkov — ocena števila mladičev — merjenje vrednosti pH in vsebnosti vlage v tleh — preverjanje vsebnosti vlage v tleh — hranjenje dan 21 — opazovanje vedenja odraslih osebkov — odstranjevanje odraslih osebkov — določitev smrtnosti odraslih osebkov — preverjanje vsebnosti vlage v tleh — hranjenje dan 28 — preverjanje vsebnosti vlage v tleh — brez hranjenja dan 35 — preverjanje vsebnosti vlage v tleh — hranjenje dan 42 — štetje mladih črvov — merjenje vrednosti pH in vsebnosti vlage v tleh PODATKI IN POROČANJE Obdelava rezultatov 39. Čeprav je v Dodatku 7 podan pregled, v tej preskusni metodi ni podana nobena dokončna statistična smernica za analizo rezultatov preskusa. 40. V preskusu za določanje območja delovanja je glavna končna točka smrtnost. Vendar je treba zabeležiti tudi spremembe vedenja odraslih osebkov (npr. nezmožnost kopanja v tla, negibno ležanje ob stekleni steni preskusne posode) in morfologije (npr. odprte rane) ter morebitno prisotnost mladičev. Za določanje vrednosti LC50 se običajno uporabi analiza probit (21) ali regresija logit. Vendar pa je mogoče v primerih, pri katerih ta analitska metoda ni primerna (npr. če so na voljo manj kot tri koncentracije z delnimi usmrtitvami), uporabiti alternativne metode. Te metode lahko vključujejo drseča povprečja (22), prilagojeno metodo Spearman-Karber (23) ali enostavno interpolacijo (npr. geometrijsko sredino vrednosti LC0 in LC100, izračunano s kvadratnim korenom zmnožka vrednosti LC0 in LC100). 41. V dokončnem preskusu je končna točka plodnost (tj. število ustvarjenih mladičev). Vendar je treba v končno poročilo, tako kot pri preskusu za določanje območja delovanja, zabeležiti vse druge znake škodljivega delovanja. Za statistično analizo morata biti izračunana aritmetična sredina in standardni odklon za razmnoževanje pri posamezni tretirani skupini in kontroli. 42. Če je izvedena analiza variance, je mogoče standardni odklon, s, in stopinje prostosti, df, nadomestiti z oceno skupne variance, pridobljene z analizo variance (ANOVA) oziroma z njenimi stopinjami prostosti, če varianca ni odvisna od koncentracije. V tem primeru uporabite enosmerne analize variance kontrol in tretiranih skupin. Te vrednosti se navadno izračunajo s komercialno programsko opremo za statistiko, pri čemer so rezultati glede na posodo uporabljeni kot ponovitve. Če se zdi, da je združevanje podatkov za negativne kontrole in kontrole s topilom bolj smiselno od preskušanja glede na enega od njih, jih je treba preskusiti, da se preveri, da med njimi ni značilnih razlik (za ustrezne preskuse glej odstavek 45 in Dodatek 7). 43. Nadaljnje statistično preskušanje in sklepanje je odvisno od tega, ali so vrednosti ponovitev normalno porazdeljene in homogene glede na svojo varianco. Ocena vrednosti NOEC 44. Prednost mora imeti uporaba učinkovitih preskusov. Uporabiti je treba informacije npr. iz predhodnih izkušenj s krožnim preskušanjem ali druge podatke iz preteklih študij o tem, ali so podatki približno normalno porazdeljeni. Homogenost variance (homoskedastičnost) je bolj kritična. Izkušnje kažejo, da varianca pogosto narašča z naraščajočo srednjo vrednostjo. V teh primerih transformacija podatkov lahko privede do homoskedastičnosti. Vendar mora taka transformacija temeljiti na izkušnjah s podatki iz preteklih študij in ne na podatkih, ki se proučujejo. Pri homogenih podatkih je treba izvesti več t-preskusov, kot je Williamsov preskus (α = 0,05, enostranski) (24)(25) ali, v nekaterih primerih, Dunnettov preskus (26)(27). Velja pripomniti, da je treba v primeru neenake ponovitve popraviti vrednosti t iz preglednice tako, kot sta predlagala Dunnett in Williams. Včasih se odzivi zaradi velike variacije ne povečajo/zmanjšajo pravilno. V tem primeru velikega odklona od monotonosti je bolj primeren Dunnettov preskus. Če obstajajo odkloni od homoskedastičnosti, je morda smiselno natančneje proučiti možne učinke na variance, da se ugotovi, ali je mogoče uporabiti t-preskuse brez prevelike izgube učinkovitosti (28). Druga možnost je uporaba večkratnega U-preskusa, npr. Bonferronijevega U-preskusa po Holmu (29), ali – če ti podatki kažejo heteroskedastičnost, sicer pa so skladni z osnovnim monotonim razmerjem odmerek-odziv – drugega neparametričnega preskusa (npr. preskusa po Jonckheere-Terpstraju (30)(31) ali Shirleyjevega preskusa (32)(33)); uporaba takšnega preskusa ima v splošnem prednost pred t-preskusi za neenake variance. (Glej tudi shemo v Dodatku 7.) 45. Če je izveden mejni preskus in so izpolnjeni predpogoji za postopke parametričnih preskusov (normalnost, homogenost), je mogoče uporabiti parni Studentov t-preskus ali, namesto tega, postopek Mann-Whitneyjevega U-preskusa (29). Ocena vrednosti ECx 46. Za izračun katere koli vrednosti ECx se po pridobitvi ustrezne funkcije odmerek-odziv za regresijsko analizo (linearno ali nelinearno) uporabijo srednje vrednosti glede na tretirano skupino. Za rast črvov v obliki zveznega odziva je mogoče vrednosti ECx oceniti z ustrezno regresijsko analizo (35). Med primernimi funkcijami za kvantne podatke (smrtnost/preživetje in število ustvarjenih potomcev) so normalna sigmoidna funkcija in logistične ali Weibullove funkcije, ki vsebujejo od dva do štiri parametre, pri čemer nekatere lahko modelirajo tudi odzive v obliki hormeze. Če je bila funkcija odmerek-odziv prilagojena z linearno regresijsko analizo, je treba v regresijski analizi pred ocenjevanjem vrednosti ECx najti značilni r2 (determinacijski koeficient) in/ali naklon, tako da se v enačbo, podano z regresijsko analizo, vstavi vrednost, ki ustreza x % srednje vrednosti kontrole. V skladu s Fiellerjem (navedeno v Finney (21)) ali z drugimi ustreznimi sodobnimi metodami se izračunajo 95-odstotne meje zaupanja. 47. Namesto tega se odziv lahko modelira kot odstotek ali razmerje parametra modela, ki se razlaga kot srednja vrednost odziva kontrole. V teh primerih je mogoče običajno (logistično, Weibullovo) sigmoidno krivuljo pogosto enostavno prilagoditi rezultatom s postopkom regresije probit (21). V teh primerih je treba utežno funkcijo prilagoditi za odzive metrik, kot je podano v Christensen (36). Če pa je ugotovljena hormeza, mora analizo probit nadomestiti logistična ali Weibullova funkcija s štirimi parametri, prilagojena s postopkom nelinearne regresije (36). Če podatkom ni mogoče prilagoditi primerne funkcije odmerek-odziv, je mogoče za oceno vrednosti ECx in njenih meja zaupanja uporabiti alternativne metode, kot so drseča povprečja po Thompsonu (22) in postopek prilagojene metode Spearman-Karber (23). POROČILO O PRESKUSU 48. Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: Preskusna kemikalija: — fizikalno stanje in, kjer je ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti (npr. topnost v vodi, parni tlak), — kemijski identifikacijski podatki preskusne kemikalije po nomenklaturi IUPAC, številka CAS, serija, skupina, strukturna formula in čistost, — datum izteka roka uporabnosti vzorca. Preskusne vrste: — uporabljene preskusne vrste: vrsta, znanstveno ime, vir organizmov in pogoji gojenja. Preskusni pogoji: — sestavine in priprava umetnih tal, — metoda uporabe preskusne kemikalije, — opis preskusnih pogojev, vključno s temperaturo, vsebnostjo vlage, vrednostjo pH itd., — celoten opis načrta in postopkov poskusa. Rezultati preskusa: — smrtnost pri odraslih črvih po dveh tednih in število mladičev na koncu preskusa za določanje območja delovanja, — smrtnost pri odraslih črvih po treh tednih izpostavljenosti in celoten seznam mladičev na koncu dokončnega preskusa, — morebitni opaženi fizični ali patološki simptomi in spremembe vedenja pri preskusnih organizmih, — vrednosti LC50, NOEC in/ali ECx (npr. EC50, EC10) za razmnoževanje, če je mogoče nekatere od njih uporabiti znotraj intervalov zaupanja, krivulja prilagojenega modela, uporabljena za njegov izračun, ter vse informacije in opažanja, ki pripomorejo k razlagi rezultatov. Odstopanja od postopkov, opisanih v tej preskusni metodi, in morebitni nenavadni dogodki med preskusom. LITERATURA (1) Römbke, J. (1989). Entwicklung eines Reproduktionstests an Bodenorganismen – Enchytraeen. Abschlußbericht des Battelle-Instituts e.V. Frankfurt für das Umweltbundesamt (Berlin), FE-Vorhaben 106 03 051/01. (2) Römbke, J., in Moser, T. (1999). Organisation and Performance of an International Ringtest for the Validation of the Enchytraeid Reproduction Test. UBA-Texte 4/99, 150 + 223 str. (3) Westheide, W., in Bethge-Beilfuss, D. (1991). The sublethal enchytraeid test system: guidelines and some results, V: Modern Ecology: Basic and Applied Aspects. Uredila Esser, G., in Overdieck, D., str. 497–508. Elsevier, Amsterdam. (4) Dirven-Van Breemen, E., Baerselmann, R., in Notenboom, J. (1994). Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Annelida) in Bodemecotoxicologisch Onderzoek. RIVM Rapport, št. 719102025. 46 str. (5) Poglavje C.8 te priloge, Strupenost za deževnike. (6) ISO (Mednarodna organizacija za standardizacijo) (1993). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 1: Determination of acute toxicity using Artificial Soil substrate, št. 11268-1. ISO, Ženeva. (7) ISO (Mednarodna organizacija za standardizacijo) (1996). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2. ISO, Ženeva. (8) Rundgren, S., in A. K. Augustsson (1998). Test on the enchytraeid Cognettia sphagnetorum (Vejdovsky 1877). V: Løkke, H. in C. A. M. Van Gestel, Handbook of soil invertebrate toxicity tests. John Wiley and Sons, Chichester, 73–94. (9) Kasprzak, K. (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23, 217–232. (10) Römbke, J. (1995). Enchytraeen (Oligochaeta) als Bioindikator, UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 7, 246–249. (11) Dunger, W., in Fiedler, H. J. (1997). Methoden der Bodenbiologie. G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York. (12) Didden, W. A. M. (1993). Ecology of terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37, 2–29. (13) Becker, H. (1991). Bodenorganismen – Prüfungskategorien der Forschung. UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 3, 19–24. (14) Römbke, J., in Federschmidt, A. (1995). Effects of the fungicide Carbendazim on Enchytraeidae in laboratory and field tests, Newsletter on Enchytraeidae 4, 79–96. (15) Römbke, J., Riepert, F., in Achazi, R. (2000). Enchytraeen als Testorganismen. V: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden S., Erb R., Dott W., in Eisentraeger A. (ur.). Spektrum Verl., Heidelberg. 59–81. (16) ISO (Mednarodna organizacija za standardizacijo) (1994). Kakovost tal – Določevanje pH, št. 10390. ISO, Ženeva. (17) Bell, A. W. (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902, 1– 13. (18) Nielsen, C. O., in Christensen, B. (1959). The Enchytraeidae, critical revision and taxonomy of European species. Natura Jutlandica 8-9, 1– 160. (19) Bouguenec, V., in Giani, N. (1987). Deux nouvelles especes d'Enchytraeus (Oligochaeta, Enchytraeidae) et rediscription d'E. bigeminus. Remarques sur le genre Enchytraeus. Ann. Limnol. 23, 9–22. (20) Korinkova, J., in Sigmund, J. (1968). The colouring of bottom-fauna samples before sorting, Vestnik Ceskoslovensko Spolecnosti Zoologicke 32, 300–305. (21) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis (3. izdaja), str. 19–76. Cambridge Univ. Press. (22) Finney, D. J. (1978). Statistical Method in Biological Assay. -Charles Griffin & Company Ltd, London. (23) Hamilton, M. A., Russo, R. C., in Thurston, R.V. (1977). Trimmed Spearman-Karber Method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environ. Sci. Technol. 11(7), 714–719; Correction Environ. Sci. Technol. 12(1998), 417. (24) Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103-117. (25) Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, 519-531. (26) Dunnett, C. W. (1955). A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control. Amer. Statist. Ass. J. 50, 1096-1121. (27) Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20, 482-491. (28) Hoeven, N. van der (1998). Power analysis for the NOEC: What is the probability of detecting small toxic effects on three different species using the appropriate standardized test protocols? Ecotoxicology 7: 355–361. (29) Holm, S. (1979). A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand. J. Statist. 6, 65-70. (30) Jonckheere, A. R. (1954). A Distribution-free k-Sample Test Against Ordered Alternatives, Biometrika 41, 133– 145. (31) Terpstra, T. J. (1952). The Asymptotic Normality and Consistency of Kendall's Test Against Trend, When Ties are Present in One Ranking, Indagationes Math. 14, 327–333. (32) Shirley, E. A. (1979). The comparison of treatment to control group means in toxicology studies, Applied Statistics 28, 144– 151. (33) Williams, D. A. (1986). A Note on Shirley's Nonparametric Test for Comparing Several Dose Levels with a Zero-Dose Control, Biometrics 42, 183– 186. (34) Sokal, R. R., in F. J. Rohlf. (1981). Biometry. The Principle and practice of statistics in biological research. 2. izdaja. W. H. Freeman and Company. New York. (35) Christensen, E. R. (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18, 213–221. (36) Van Ewijk, P. H., in Hoekstra, J. A. (1993). Calculation of the EC50 and its confidence interval when sub-toxic stimulus is present. Ecotox, Environ. Safety. 25, 25–32. Dodatek 1 Opredelitve pojmov Za to preskusno metodo se uporabljajo naslednje opredelitve: Kemikalija pomeni snov ali zmes. ECx (učinkovita koncentracija za x-odstotni učinek) je koncentracija, ki na preskusnih organizmih v danem obdobju izpostavljenosti v primerjavi s kontrolno učinkuje x-odstotno. V tem preskusu so učinkovite koncentracije izražene kot masa preskusne kemikalije na suho maso preskusnih tal. LC0 (koncentracija brez smrtnega učinka) je koncentracija preskusne kemikalije, ki v določenem časovnem obdobju ne ubije nobenega od izpostavljenih preskusnih organizmov. V tem preskusu je LC0 izražena kot masa preskusne kemikalije na suho maso preskusnih tal. LC50 (srednja smrtna koncentracija) je koncentracija preskusne kemikalije, ki v določenem časovnem obdobju ubije 50 % izpostavljenih preskusnih organizmov. V tem preskusu je LC50 izražena kot masa preskusne kemikalije na suho maso preskusnih tal. LC100 (popolnoma smrtna koncentracija) je koncentracija preskusne kemikalije, ki v določenem časovnem obdobju ubije 100 % izpostavljenih preskusnih organizmov. V tem preskusu je LC100 izražena kot masa preskusne kemikalije na suho maso preskusnih tal. LOEC (najnižja koncentracija z opaznim učinkom) je najnižja koncentracija preskusne kemikalije, ki ima statistično značilen učinek (p < 0,05). V tem preskusu je vrednost LOEC izražena kot masa preskusne kemikalije na suho maso preskusnih tal. Vse preskusne koncentracije nad vrednostjo LOEC morajo običajno kazati učinek, ki je statistično različen od kontrole. Vsa odstopanja od zgoraj navedenega pri ugotavljanju vrednosti LOEC morajo biti utemeljena v poročilu o preskusu. NOEC (koncentracija brez opaznega učinka) je najvišja koncentracija preskusne kemikalije tik pod vrednostjo LOEC, pri kateri ni opaznega učinka. V tem preskusu koncentracija, ki ustreza vrednosti NOEC, v danem obdobju izpostavljenosti v primerjavi s kontrolo nima statistično značilnega učinka (p < 0,05). Hitrost razmnoževanja je srednja vrednost števila mladih črvov, ki jih ustvari določeno število odraslih osebkov v preskusnem obdobju. Preskusna kemikalija je katera koli snov ali zmes, preskušena s to preskusno metodo. Dodatek 2 Določanje največje zmogljivosti zadrževanja vode Določanje zmogljivosti zadrževanja vode umetnih tal Ugotovljeno je bilo, da je primerna naslednja metoda. Opisana je v Prilogi C standarda ISO DIS 11268-2. S primerno napravo (svedrastim vzorčevalnikom itd.) zberite določeno količino (npr. 5 g) substrata preskusnih tal. Pokrijte dno vzorčevalnika s koščkom filtrirnega papirja in ga po polnjenju z vodo postavite na stojalo v vodno kopel. Vzorčevalnik je treba postopoma potapljati, dokler nivo vode ni nad zgornjim delom tal. Nato ga je treba pustiti v vodi približno tri ure. Ker ni mogoče zadržati vse vode, ki jo absorbirajo talne kapilare, mora biti omogočeno, da se vzorec tal dve uri suši, tako da se vzorčevalnik postavi na ležišče iz zelo mokrega, fino mletega kremenovega peska, ki je nameščen v zaprti posodi (da se ne posuši). Nato je treba vzorec stehtati in pri 105 °C posušiti na konstantno maso. Zmogljivost zadrževanja vode (WHC) je nato mogoče izračunati po naslednjem postopku: pri čemer je: S = z vodo nasičeni substrat + masa vzorčevalnika + masa filtrirnega papirja, T = tara (masa vzorčevalnika + masa filtrirnega papirja), D = suha masa substrata. VIR: ISO (Mednarodna organizacija za standardizacijo) (1996). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, št. 11268-2, ISO, Ženeva. Dodatek 3 Določanje vrednosti ph tal Naslednja metoda za določanje vrednosti pH vzorca tal temelji na opisu v ISO 10390 (Kakovost tal – Določevanje pH). Določena količina tal se pri sobni temperaturi suši vsaj 12 ur. Nato se izdela suspenzija tal (ki vsebuje vsaj 5 gramov tal) v petkratni količini volumna tal z 1 M analitsko čistega kalijevega klorida (KCl) ali 0,01 M raztopine analitsko čistega kalcijevega klorida (CaCl2). Suspenzija se nato pet minut temeljito stresa. Po stresanju se suspenzija vsaj 2 uri in največ 24 ur pusti, da se usede. Vrednost pH tekoče faze se nato meri z merilnikom vrednosti pH, ki je pred vsako meritvijo umerjen z ustreznimi vrstami pufrskih raztopin (npr. pH 4,0 in 7,0). VIR: ISO (Mednarodna organizacija za standardizacijo) (1994). Kakovost tal – Določevanje pH, št. 10390. ISO, Ženeva. Dodatek 4 Pogoji gojenja vrste enchytraeus Enhitreje vrste Enchytraeus albidus (in drugih vrst Enchytraeus) je mogoče gojiti v velikih plastičnih posodah (npr. 30 × 60 × 10 cm), napolnjenih z zmesjo 1: 1 umetnih tal in naravne, nekontaminirane vrtne prsti. Kompostnemu materialu se je treba izogibati, saj lahko vsebuje strupene kemikalije, kot so težke kovine. Pred uporabo je treba iz tal odstraniti favno (npr. z globokim zamrzovanjem). Substrat, ki ga sestavljajo samo umetna tla, je tudi mogoče uporabiti, vendar je lahko hitrost razmnoževanja nižja od tiste pri substratu z mešanimi tlemi. Vrednost pH substrata, uporabljenega za gojenje, mora znašati 6,0 ± 0,5. Kultura se hrani v temi pri temperaturi od 15 do 20 °C ± 2 °C. Izogibati se je treba temperaturam, višjim od 23 °C. Tla je treba ohranjati vlažna, ne pa mokra. Da je vsebnost vlage pravilna, kažejo majhne kapljice vode, ki se pojavijo med prsti ob rahlem stiskanju tal. Treba se je izogibati ustvarjanju anoksičnih pogojev, zato je treba poskrbeti, da pokrovi posod, v katerih so kulture, omogočajo zadostno izmenjavo plinov z ozračjem. Vsak teden je treba tla previdno prekopati, da se pospeši zrače