PRILOGA XX

Metoda za določanje vsebnosti voskov, metilnih estrov maščobnih kislin in etilnih estrov maščobnih kislin s kapilarno plinsko kromatografijo

1. NAMEN

Metoda je namenjena določanju vsebnosti voskov, metilnih estrov maščobnih kislin in etilnih estrov maščobnih kislin v oljčnih oljih. Posamezni voski in alkilni estri se ločijo glede na število atomov ogljika. Metoda se priporoča kot orodje za ločevanje med oljčnim oljem in oljem iz oljčnih tropin ter kot parameter kakovosti za ekstra deviška oljčna olja, s katerim je mogoče ugotavljati neprave mešanice ekstra deviških oljčnih olj z olji slabše kakovosti, torej z deviškimi, lampante ali nekaterimi razdišavljenimi olji.

2. PRINCIP

Olje, ki smo mu dodali ustrezne interne standarde, na z vodo omočenem silikagelu frakcioniramo s kolonsko kromatografijo. Ujamemo eluirano frakcijo najprej pri pogojih preskušanja (katere polarnost je manjša kot pri trigliceridih) in neposredno analiziramo s pomočjo kapilarne plinske kromatografije.

3. APARAT

3.1. Erlenmajerica prostornine 25 ml.

3.2. Steklena kolona za tekočinsko kromatografijo z notranjim premerom 15 mm, dolžine 30 do 40 cm in opremljena z ustreznim ventilom.

3.3. Plinski kromatograf, primeren za uporabo s kapilarno kolono, opremljen z injicirnim sistemom za injiciranje vzorca neposredno v kolono, ki zajema:

3.3.1. Termostatsko kontrolirano peč s programirano temperaturo.

3.3.2. Injicirni sistem za hladno injiciranje neposredno v kolono.

3.3.3. Plamensko ionizacijski detektor in konverter-ojačevalec.

3.3.4. Registrator z integratorjem (opomba 1) za delovanje s pretvornikom z ojačevalnikom (točka 3.3.3), z odzivnim časom, ki ne presega ene sekunde in s spremenljivo hitrostjo papirja.

Opomba 1: Računalniški sistemi se lahko uporabijo tudi, kadar se podatki o plinski kromatografiji vnesejo prek osebnega računalnika.

3.3.5. Kvarčno kapilarno kolono (za analizo voskov ter metilnih in etilnih estrov), dolžine 8–12 m, notranjega premera 0,25–0,32 mm, znotraj prevlečena s tekočo fazo (opomba 2) do enotne debeline 0,10–0,30 μm.

Opomba 2: Za ta namen so na voljo ustrezne tekoče faze za komercialne namene, kakršne so SE52, SE54 in druge.

3.4. Mikrobrizgalka, 10 μl, z utrjeno iglo, za neposredno vbrizganje na začetek kolone.

3.5. Električni vibrator.

3.6. Rotacijski izparilnik.

3.7. Žarilna peč.

3.8. Analitska tehtnica, ki zagotavlja ± 0,1 mg natančnost.

3.9. Običajna laboratorijska steklovina.

4. REAGENTI

4.1. Silikagel, 60–200 μm mesh. Silikagel vsaj 4 ure žarimo v žarilni peči pri 500 °C. Pustimo, da se ohladi, in potem dodamo 2 % vode glede na količino uporabljenega silikagela. Dobro premešamo, da se suspenzija homogenizira, in pred uporabo hranimo vsaj 12 ur v eksikatorju.

4.2. N-heksan, kromatografske stopnje ali stopnje ostanka (čistost se lahko preveri).

OPOZORILO – Hlapi se lahko vnamejo. Ne približujte virom toplote, iskram ali neposrednemu ognju. Prepričajte se, da so steklenice vedno dobro zaprte. Med uporabo zagotovite ustrezno prezračevanje. Preprečiti je treba zbiranje hlapov in odstraniti vsa možna tveganja za izbruh ognja, ki jih povzročajo na primer grelniki ali električni aparati, ki niso proizvedeni iz nevnetljivih materialov. Škodljivi pri vdihavanju, ker lahko poškodujejo živčne celice. Ne vdihavajte hlapov. Če je potrebno, za dihanje uporabite ustrezen pripomoček. Preprečite stik z očmi ali poškodovano kožo.

4.3. Etil eter, kromatografske stopnje.

OPOZORILO – Zelo vnetljiv in zmerno toksičen. Draži kožo. Škodljiv pri vdihavanju. Lahko poškoduje oči. Lahko učinkuje s časovnim zamikom. Formira lahko eksplozivne perokside. Hlapi se lahko vnamejo. Ne približujte virom toplote, iskram ali neposrednemu ognju. Prepričajte se, da so steklenice vedno dobro zaprte. Med uporabo zagotovite ustrezno prezračevanje. Preprečiti je treba zbiranje hlapov in odstraniti vsa možna tveganja za izbruh ognja, ki jih povzročajo na primer grelniki ali električni aparati, ki niso proizvedeni iz nevnetljivih materialov. Ne izparevajte do suhega ali skoraj suhega. Dodajanje vode ali ustreznega reducenta lahko reducira oblikovanje peroksida. Ne pijte. Ne vdihavajte hlapov. Izogibajte se daljšemu ali večkratnemu stiku s kožo.

4.4. N-heptan kromatografske stopnje ali izo-oktan.

OPOZORILO – Vnetljiv. Škodljiv pri vdihavanju. Ne približujte virom toplote, iskram ali neposrednemu ognju. Prepričajte se, da so steklenice vedno dobro zaprte. Med uporabo zagotovite ustrezno prezračevanje. Ne vdihavajte hlapov. Izogibajte se daljšemu ali večkratnemu stiku s kožo.

4.5. Standardna raztopina lauril arahidata (opomba 3) koncentracije 0,05 % (m/V) v heptanu (interni standard za voske).

Opomba 3: Uporabijo se lahko tudi palmitil palmitat, miristil stearat ali arahidil laureat.

4.6. Standardna raztopina metilnega heptadekanoata koncentracije 0,02 % (m/V) v heptanu (interni standard za metilne in etilne estre).

4.7. Sudan 1 (1-fenilazo-2-naftol).

4.8. Nosilni plin: vodik ali helij, čist, plinske kromatografske stopnje.

OPOZORILO

Vodik. Pod pritiskom zelo vnetljiv. Ne približujte virom toplote, iskram, neposrednemu ognju ali električnim aparatom, ki niso proizvedeni iz nevnetljivih materialov. Prepričajte se, da je ventil steklenice zaprt, kadar se vodik ne uporablja. Vedno uporabljajte z reducentom pritiska. Preden odprete ventil steklenice, sprostite napetost vzmeti reducenta. Pri odpiranju ventila ne stojte pred odprtino steklenice. Med uporabo zagotovite ustrezno prezračevanje. Ne pretakajte vodika iz ene steklenice v drugo. V steklenici ne mešajte plina. Prepričajte se, da steklenic ni mogoče prevrniti. Ne hranite jih na svetlobi in ob virih toplote. Hranite jih v okolju, ki je odporno na korozijo. Ne uporabljajte poškodovanih steklenic ali steklenic brez nalepke.

Helij. Stisnjen plin pod visokim pritiskom. Zmanjša količino kisika na voljo za dihanje. Steklenica naj bo zaprta. Med uporabo zagotovite ustrezno prezračevanje. Ne vstopajte v prostore za hranjenje, razen če so ustrezno prezračeni. Vedno uporabljajte z reducentom pritiska. Preden odprete ventil steklenice, sprostite napetost vzmeti reducenta. Ne pretakajte plina iz ene steklenice v drugo. Prepričajte se, da steklenic ni mogoče prevrniti. Pri odpiranju ventila ne stojte pred odprtino steklenice. Ne hranite jih na svetlobi in ob virih toplote. Hranite jih v okolju, ki je odporno na korozijo. Ne uporabljajte poškodovanih steklenic ali steklenic brez nalepke. Ne vdihavajte. Uporabljajte samo za tehnične namene.

4.9. Pomožna plina:

— Vodik, čist, plinske kromatografske stopnje.

— Zrak, čist, plinske kromatografske stopnje.

OPOZORILO

Zrak. Stisnjen plin pod visokim pritiskom. Uporabljajte previdno v prisotnosti vnetljivih snovi, saj je temperatura, potrebna za samovžig večine organskih sestavin zraka pod visokim pritiskom znatno nižja. Prepričajte se, da je ventil steklenice zaprt, kadar se vodik ne uporablja. Vedno uporabljajte reducent pritiska. Preden odprete ventil steklenice, sprostite napetost vzmeti reducenta. Pri odpiranju ventila ne stojte pred odprtino steklenice. Ne pretakajte plina iz ene steklenice v drugo. V steklenici ne mešajte plina. Prepričajte se, da steklenic ni mogoče prevrniti. Ne hranite jih na svetlobi in ob virih toplote. Hranite jih v okolju, ki je odporno na korozijo. Ne uporabljajte poškodovanih steklenic ali steklenic brez nalepke. Zraka za tehnične namene se ne sme uporabljati za vdihavanje ali dihalne naprave.

5. POSTOPEK

5.1. Priprava kromatografske kolone

V n-heksanu (točka 4.2) suspendiramo 15 g silikagela (točka 4.1) in napolnimo kolono (točka 3.2). Počakamo, da se posede. Homogenost posedanja, ki omogoči homogene kromatografske pasove, lahko dosežemo z uporabo električnega vibratorja. Spiramo s 30 ml n-heksana, da odstranimo vse morebitne nečistoče. V 25-ml bučko (točka 3.1) z analitsko tehtnico (točka 3.8) natehtamo natanko 500 mg vzorca in dodamo ustrezno količino internega standarda (točka 4.5), ki je odvisna od pričakovane vsebnosti voskov, npr. pri oljčnem olju dodamo 0,1 mg lauril arahidata, pri olju iz oljčnih tropin 0,25 do 0,50 mg in 0,05 mg metil heptadekanoata pri oljčnih oljih (točka 4.6).

Tako pripravljen vzorec prenesemo v kromatografsko kolono s pomočjo dveh 2-ml odmerkov n-heksana (točka 4.2).

Topilo izpuščamo iz kolone tako dolgo, da doseže 1 mm nad zgornjim robom absorbenta. Nadalje spiramo z n-heksanom/etilnim etrom (99:1) in zberemo 220 ml pri pretoku približno 15 kapljic vsakih 10 sekund. (Ta frakcija vsebuje metilne in etilne estre ter voske). (opomba 4) (opomba 5).

Opomba 4: Vsak dan je treba pripraviti svežo mešanico n-heksana/etilnega etra (99:1).

Opomba 5: Za opazovanje pravilnega eluiranja voskov lahko vzorcu v raztopini dodamo 100 μl 1-odstotnega sudana I v elucijski mešanici. Barvilo ima vmesno retencijo med voski in trigliceridi. Zato je treba elucijo suspendirati, ko obarvanje doseže dno kromatografske kolone, ker so se eluirali vsi voski.

Iz tako dobljene frakcije na rotavaporju odparimo skoraj vse topilo. Preostala 2 ml odstranimo s pomočjo blagega toka dušika. Zbrano frakcijo, ki vsebuje metilne in etilne estre, razredčimo z 2 do 4 ml n-heptana ali izo-oktana.

5.2. Plinsko kromatografska analiza

5.2.1. Postopek

Kolono pritrdimo na plinski kromatograf (točka 3.3), in sicer vstopni del na injektor, izhodnega pa na detektor. Preverimo plinski kromatograf (plinske povezave, pravilno delovanje detektorja in rekorderja itd.).

Če kolono uporabljamo prvič, jo je priporočljivo kondicionirati. Pri majhnem pretoku plina skozi kolono vključimo plinski kromatograf. Postopoma segrevamo, tako da po približno 4 urah dosežemo temperaturo 350 °C.

Pri tej temperaturi kolono kondicioniramo vsaj 2 uri, nato uravnamo instrument v skladu s pogoji delovanja (uravnamo pretok plina, prižgemo plamen, povežemo z elektronskim rekorderjem (točka 3.3.4), naravnamo delovno temperaturo peči, naravnamo detektor itd.). Pri občutljivosti, ki je vsaj dvakrat večja od delovne, posnamemo bazno linijo. Le-ta mora biti linearna, brez vrhov in brez kakršnih koli odstopanj.

Negativno premočrtni odklon kaže na slabo tesnjenje med kolono in instrumentom, pozitiven odklon pa na slabo kondicionirano kolono.

5.2.2. Izbira delovnih pogojev za voske ter metilne in etilne estre (opomba 6).

Splošni delovni pogoji, ki jih je treba upoštevati, so naslednji:

— Temperatura kolone: 20 °C/min 5 °C/min

80 °C najprej (1′) 140 °C 335 °C (20)

— Temperatura detektorja: 350 °C.

— Brizg: 1 μl raztopine (2–4 ml) n-heptana.

— Nosilni plin: helij ali vodik z optimalno linearno hitrostjo izbranega plina (glej Dodatek A).

— Občutljivost instrumenta: primerna za izpolnjevanje zgoraj navedenih pogojev.

Opomba 6: Zaradi visoke končne temperature je pozitivni odklon dovoljen, a ne sme preseči 10 % polne vrednosti skale.

Te pogoje lahko spremenimo, da bi zadostili značilnostim kolone in plinskega kromatografa, ločili vse voske ter metilne in etilne estre maščobnih kislin ter dosegli zadovoljivo najvišjo separacijo (glej slike 2, 3 in 4) in retencijski čas, ki za interni standard lauril arahidata znaša 18 ± 3 minute. Najznačilnejši vrh voskov mora biti najmanj 60 % od spodnjega dela skale, interni standard metilnega heptadekanoata za metilne in etilne estre pa mora doseči polno vrednost skale.

Vrhove integracijskih parametrov moramo določiti na tak način, da bomo dobili pravilno vrednotenje zadevnih površin vrhov.

5.3. Izvedba analize

Z 10-μl mikrobrizgalko vzamemo 10 μl raztopine; bat potegnemo nazaj, da se igla izprazni. Iglo vbodemo v injektor in po eni ali dveh sekundah hitro vbrizgnemo. Iglo po približno petih sekundah nežno izvlečemo.

Kromatogram snemamo, dokler ne eluirajo vsi voski oziroma stigmastadieni, odvisno od frakcije, ki jo analiziramo.

Bazna linija mora ves čas izpolnjevati zahtevane pogoje.

5.4. Identifikacija vrhov

Vrhove identificiramo s pomočjo retencijskih časov s primerjavo med mešanicami voskov z znanimi retencijskimi časi, ki so bili analizirani pri istih pogojih. Alkilni estri se določijo iz mešanic metilnih in etilnih estrov glavnih maščobnih kislin v oljčnih oljih (palmitinskih in oleinskih).

Slika 1 prikazuje kromatogram voskov deviškega oljčnega olja. Sliki 2 in 3 prikazujeta kromatograma dveh ekstra deviških oljčnih olj v prodaji, od katerih eno vsebuje metilne in etilne estre, drugo pa ne. Slika 4 prikazuje kromatogram za ekstra deviško oljčno olje najvišje kakovosti in isto olje, mešano z 20 % razdišavljenega olja.

5.5. Kvantitativna analiza voskov

S pomočjo integratorja določimo površine vrhov alifatskih estrov od C40 do C46 in površino vrhov internega standarda lauril arahidata.

Skupno vsebnost voskov določimo z dodajanjem vsakega voska posebej v mg/kg maščobe, kot sledi:

kjer je:

Ax = površina vrha za posamezni ester z računalniškim preštevanjem; As = površina vrha za interni standard lauril arahidata ester z računalniškim preštevanjem; ms = masa dodanega internega standarda lauril arahidata, v miligramih; m = masa vzorca za določanje, v gramih.

5.5.1. Kvantitativna analiza metilnih in etilnih estrov

S pomočjo integratorja določimo površine vrhov internega standarda metil heptadekanoata, maščobnih kislin metilnih estrov C16 in C18 ter maščobnih kislin etilnih estrov C16 in C18.

Določimo vsebnost vsakega alkilnega estra v mg/kg maščobe, kot sledi

kjer je:

Ax = površina vrha za posamezni ester C16 in C18 z računalniškim preštevanjem; As = površina vrha za interni standard metil heptadekanoata z računalniškim preštevanjem; ms = masa dodanega internega standarda metil heptadekanoata, v miligramih; m = masa vzorca za določanje, v gramih.

6. PODAJANJE REZULTATOV

Podamo vsoto vsebnosti različnih voskov od C40 do C46 (opomba 7) v miligramih na kilogram maščobe.

Podamo vsoto vsebnosti metilnih estrov in etilnih estrov od C16 do C18 ter vsoto obeh skupaj.

Rezultate izrazimo do najbližjega mg/kg.

Opomba 7: Spojine, ki jih je treba količinsko določiti, se nanašajo na vrhove s sodim številom ogljikovih atomov med estri C40 do C46, tako kot je to prikazano na primeru kromatograma voskov oljčnega olja v priloženi sliki. Za namene določanja se v primeru, da je ester C46 razdeljen, priporoča, da se analizira voskova frakcija olja iz oljčnih tropin, pri čemer je vrh C46 razločen, ker je jasno prevladuje.

Podamo razmerje med etilnimi estri in metilnimi estri.

Slika 1

Primer plinskega kromatograma voskove frakcije oljčnega olja (1)

Slika 2

Metilni estri, etilni estri in voski v deviškem oljčnem olju

Slika 3

Metilni estri, etilni estri in voski v ekstra deviškem oljčnem olju

Slika 4

Del kromatograma za ekstra deviško oljčno olje in isto olje, mešano z razdišavljenim oljem