„B. 47 TESTNA METODA ZA DOLOČANJE MOTNJAVE IN PREPUSTNOSTI ROŽENICE GOVEDA ZA UGOTAVLJANJE JEDKIH IN ZELO DRAŽILNIH SNOVI ZA OČI (BCOP)

UVOD

Testna metoda za določanje motnjave in prepustnosti roženice goveda (BCOP) je testna metoda in vitro, ki se pod določenimi pogoji in z določenimi omejitvami uporablja za razvrščanje snovi in zmesi med ‚jedke in zelo dražilne za oči‘ (1) (2) (3). Pri tej testni metodi so zelo dražilne snovi tiste snovi, ki povzročajo poškodbe oči, ki se pri zajcu ohranijo najmanj 21 dni po aplikaciji. Čeprav testa in vivo na očeh zajcev ne more nadomestiti popolnoma, se test BCOP priporoča kot del stopenjske testne strategije za regulativno razvrščanje in označevanje za posebna področja uporabe (4)(5). Testne snovi in zmesi (6) se lahko razvrstijo med jedke ali zelo dražilne snovi za oči, ne da bi bilo potrebno opraviti dodatno testiranje na zajcih. Snov z negativnim testnim rezultatom bi bilo treba testirati na zajcih s pomočjo sekvenčne testne strategije, ki je določena v testni smernici OECD 405 (7) (poglavje B. 5 te priloge).

V tej testni metodi so opisani postopki za oceno potencialne jedkosti in močne dražilnosti testne snovi za oči glede na njeno sposobnost, da v izolirani roženici goveda povzroča motnjavo in povečano prepustnost. Toksični učinki na roženico se merijo z: (i) zmanjšanim prenosom svetlobe (motnjava) in (ii) povečanim prehajanjem barvila natrijevega fluoresceina (prepustnost). Oceni motnjave in prepustnosti roženice po aplikaciji testne snovi skupaj pomenita dražilnost in vitro (IVIS), ki se uporablja za razvrstitev testne snovi v različne stopnje draženja.

S testno metodo BCOP so bile testirane tudi dražilne snovi, ki povzročajo poškodbe oči, ki izginejo v manj kot 21 dnevih, in nedražilne snovi. Vendar natančnost in zanesljivost testne metode BCOP pri snoveh iz teh dveh kategorij nista bili ocenjeni formalno.

ZAČETNI POMISLEKI IN OMEJITVE

Ta testna metoda temelji na protokolu testne metode BCOP Medagencijskega usklajevalnega odbora za validacijo alternativnih metod (ICCVAM)(8), ki je bil pripravljen po mednarodni študiji o validaciji (4)(5)(9), pri kateri sta sodelovala Evropski center za validacijo alternativnih metod (ECVAM) in Japonski center za validacijo alternativnih metod (JaCVAM). Protokol temelji na informacijah, ki jih je prispeval Inštitut za raziskave in vitro (IIVS), in protokolu INVITTOX 124 (10), ki se je uporabil pri predvalidacijski študiji o preskusu BCOP, ki je bila opravljena med leti 1997–1998 in ki jo je sponzorirala Evropska skupnost. Oba protokola temeljita na testni metodologiji BCOP, o kateri je prvi poročal Gautheron et al. (11).

Opredeljene omejitve za to testno metodo temeljijo na visokem številu lažno pozitivnih rezultatov za alkohole in ketone ter visokem številu lažno negativnih rezultatov za trdne snovi, zbranih v podatkovni zbirki za validacijo (glej točko 44) (5). Če se snovi iz teh kemijskih in fizikalnih razredov izključijo iz podatkovne zbirke, se natančnost BCOP v sistemih za razvrščanje snovi EU, EPA in GHS bistveno izboljša (5). Pri tem preskusu (tj. za ugotavljanje izključno jedkih in zelo dražilnih snovi za oči) lažno negativni rezultati niso kritični, saj bi se take snovi nato preskušale na zajcih ali, odvisno od regulativnih zahtev, z drugimi ustrezno potrjenimi testi in vitro, pri katerih se uporablja sekvenčna testna strategija, ki temelji na teži dokazov. Poleg tega nekaterih kemijskih ali proizvodnih razredov (npr. zmesi) s trenutno validacijsko podatkovno zbirko ni bilo mogoče ustrezno oceniti. Vendar pa bi lahko preskuševalci to testno metodo uporabili pri vseh vrstah testnega materiala (tudi pri zmeseh), pri čemer bi bil pozitiven rezultat sprejemljiv kot indikator za jedko ali zelo dražilno snov za oči. Pozitivne rezultate, pridobljene z uporabo alkoholov ali ketonov, je treba razlagati previdno, saj obstaja tveganje, da so vanje vključeni tudi lažno pozitivni rezultati.

Pri vseh postopkih na očesih in roženicah goveda je treba upoštevati veljavna pravila in postopke testnega urada o ravnanju z živalskim materialom, kamor spadajo med drugim tudi tkiva in tkivne tekočine. Priporočajo se splošni previdnostni ukrepi za laboratorije (12).

Čeprav testna metoda upošteva nekatere učinke, ocenjene s testno metodo za ugotavljanje dražilnih snovi na očeh zajcev, in do določene mere tudi njihovo resnost, je kljub temu omejena, saj ne upošteva poškodb veznice in šarenice. Čeprav tudi same reverzibilnosti poškodb roženice s preskusom BCOP ni mogoče oceniti, je bilo na podlagi študij na očeh zajcev kljub temu predlagano, da se oceni prvotna globina poškodbe roženice ter tako razlikuje med ireverzibilnimi in reverzibilnimi učinki (13). Treba je tudi opozoriti, da s testno metodo BCOP ni mogoče oceniti potencialne sistemske toksičnosti, povezane z izpostavljenostjo oči.

Trenutno potekajo prizadevanja za nadaljnjo karakterizacijo uporabnosti in omejitev preskusa BCOP za ugotavljanje lažje dražilnih in nedražilnih snovi (glej tudi točko 45). Uporabnikom se priporoča, da organizacijam za validacijo zagotovijo vzorce in/ali podatke za uradno oceno morebitnih prihodnjih uporab testne metode BCOP, vključno za ugotavljanje lažje dražilnih in nedražilnih snovi.

NAČELO TESTA

Testna metoda BCOP je organotipski model, ki zagotavlja kratkoročno ohranjanje običajne fiziološke in biokemijske funkcije roženice goveda in vitro. Pri tej testni metodi se poškodba, ki jo povzroči testna snov, oceni tako, da se spremembe motnjave in prepustnosti roženice merijo kvantitativno z opacitometrom oziroma spektrofotometrom vidne svetlobe. Obe meritvi se uporabita za izračun IVIS, na podlagi katerega se dodeli kategorija nevarnosti dražilnosti in vitro, s pomočjo katere se predvidi potencialni dražilni učinek testne snovi in vivo (glej merila za odločanje).

Pri testni metodi BCOP se uporabljajo izolirane roženice oči sveže zaklanega goveda. Motnjava roženice se meri kvantitativno in ustreza količini svetlobe, ki prodre skozi roženico. Prepustnost se meri kvantitativno in ustreza količini barvila natrijevega fluoresceina, ki prodre skozi celotno debelino roženice in ga zazna medij v zadnjem delu držala. Testne snovi se dodajo v sprednji del držala za roženico in se tako aplicirajo na epitelno površino roženice. Dodatek 3 vsebuje opis in sliko držala, ki se uporablja za BCOP. Držala za roženico ponujajo na trgu različna podjetja, laboratoriji pa jih lahko izdelajo tudi sami.

Izvor in starost oči goveda ter izbor živalskih vrst

Govedo, ki se zakolje v klavnicah, je običajno namenjeno za človeško prehrano ali druge komercialne uporabe. Pri testih BCOP se kot vir roženic uporabljajo samo zdrave živali, primerne za vstop v prehransko verigo. Ker so goveda glede na pasmo, starost in spol različno težka, ni priporočene teže za zakol.

Velikost roženice se lahko pri očeh različno starih živali razlikuje. Roženice z vodoravnim premerom > 30,5 mm in centralno debelino roženice (CCT) ≥ 1 100 μm ima običajno govedo, starejše od osem let, roženice z navpičnim premerom < 28,5 mm in CCT < 900 μm pa običajno govedo, mlajše od pet let (14). Zato se oči goveda, starejšega od 60 mesecev, običajno ne uporabljajo. Oči goveda, mlajšega od 12 mesecev, se običajno prav tako ne uporabljajo, saj še niso popolnoma razvite, debelina in premer roženice pa sta bistveno manjša kot pri očeh starejšega goveda. Kljub temu se lahko uporabljajo roženice mladih živali (tj. starih od šest do 12 mesecev), saj ima njihova uporaba nekatere prednosti, npr. večja razpoložljivost, manjši starostni razpon in manjša nevarnost izpostavljenosti goveji spongiformni encefalopatiji za osebje klavnice (15). Ker bi bilo nadaljnje ocenjevanje učinka, ki ga imata velikost in debelina roženice na odzivnost jedkih in zelo dražilnih snovi za oči, koristno, se uporabnike spodbuja, da sporočijo približno starost in/ali težo živali, katerih roženice so uporabili v študiji.

Odvzem in prevoz oči v laboratorij

Oči je treba dati v dovolj veliko posodo, jih preliti s Hanksovo uravnoteženo raztopino soli (HBSS) in prepeljati v laboratorij tako, da se njihovo stanje čim manj poslabša in/ali da ne pride do bakterijske okužbe. Ker se oči odvzamejo med zakolom, lahko pridejo v stik s krvjo in drugimi biološkimi snovmi, vključno z bakterijami in drugimi mikroorganizmi. Zato mora biti tveganost okužbe čim manjša (tj. posoda, v kateri so oči, se mora hraniti na mokrem ledu, HBSS, ki se uporablja za hrambo oči med prevozom, pa je treba dodati antibiotike [tj. 100 IU/mL penicilina in 100 μg/mL streptomicina]).

Čas med odvzemom oči in uporabo roženic mora biti pri BCOP čim krajši (običajno se odvzamejo in uporabijo isti dan) in ne sme vplivati na zanesljivost testnih rezultatov. Ti temeljijo na merilih za izbor oči ter pozitivnih in negativnih kontrolnih reakcijah. Vsa očesa, uporabljena v preskusu, morajo pripadati isti skupini oči, odvzeti na določen dan.

Merila za izbor oči za uporabo pri testu BCOP

Po prihodu v laboratorij se oči skrbno pregledajo, ali so poškodovane, vključno s povečano motnjavo, praskami in neovaskularizacijo. Uporabljajo se lahko samo roženice nepoškodovanih oči.

Vsaka testna skupina (testna snov, primerjalne negativne in pozitivne kontrole) je sestavljena iz najmanj treh oči. Pri preskusu BCOP je treba za negativno kontrolo uporabiti tri roženice. Ker se roženice odstranijo s celotnega zrkla in pritrdijo v držala za roženice, se lahko zaradi artefaktov, ki nastanejo zaradi prijemanja, vrednosti motnjave in prepustnosti v posameznih primerih spremenijo (tudi pri negativni kontroli). Poleg tega se vrednosti motnjave in prepustnosti roženic z negativno kontrolno reakcijo uporabljajo za korigiranje vrednosti motnjave in preglednosti predmeta testiranja in pozitivnih kontrolnih vzorcev pri izračunih IVIS.

POSTOPEK

Priprava oči

Nepoškodovane roženice se secirajo tako, da se ohrani 2 do 3 mm širok rob beločnice, kar olajša nadaljnje ravnanje, pri čemer je treba paziti, da se epitelij in endotelij roženice ne poškodujeta. Izolirane roženice se pritrdijo v posebej za to izdelana držala, sestavljena iz sprednjega in zadnjega dela držala, na katera je roženica pripeta z epitelno oziroma endotelno stranjo. Oba dela držala se do roba napolnita z ogretim Eaglovim minimalnim osnovnim medijem EMEM (najprej zadnji del držala), pri čemer je treba zagotoviti, da se ne tvorijo mehurčki. Naprava se nato ekvilibrira pri 32 ± 1 °C najmanj eno uro, da se roženice ekvilibrirajo z medijem in da se doseže čim bolj normalna presnova (približna temperatura na površini roženice znaša in vivo 32 °C).

Ker je toplotna kapaciteta vode večja od zraka, zagotavlja voda stabilnejše temperaturne pogoje za inkubacijo. Zato se priporoča, da se držalo za roženico in njegova vsebina hranita v vodni kopeli pri 32 ± 1 °C. Lahko se uporabljajo tudi inkubatorji za vzdrževanje temperature zraka, če zagotavljajo stabilno temperaturo (tj. s predčasnim segrevanjem držal in medijev).

Uporaba testne snovi

Tekočine se testirajo nerazredčene, medtem ko se površinsko aktivne snovi testirajo v 10-odstotni koncentraciji w/v in 0,9-odstotni raztopini natrijevega klorida, destilirani vodi ali drugem topilu, za katerega je dokazano, da nima škodljivih učinkov na testni sistem. Poltrdne snovi, kreme in voski se navadno testirajo kot tekočine. Če se uporabljajo druge koncentracije raztopin, jih je treba ustrezno utemeljiti. Roženice so izpostavljene tekočinam in površinsko aktivnim snovem 10 minut. Če je čas izpostavljenosti drugačen, ga je treba ustrezno znanstveno utemeljiti.

Površinsko neaktivne trdne snovi se navadno testirajo kot 20-odstotne raztopine ali suspenzije v 0,9-odstotni raztopini natrijevega klorida, destilirani vodi ali drugem topilu, za katerega je dokazano, da nima škodljivih učinkov na testni sistem. V določenih okoliščinah in če je znanstveno utemeljeno, se lahko trdne snovi testirajo tudi nerazredčene z neposredno aplikacijo na površino roženice, pri čemer se uporablja odprta metoda (glej točko 29). Roženice so izpostavljene trdnim snovem štiri ure; če je znanstveno utemeljeno, se lahko tako kot pri tekočinah in površinsko aktivnih snoveh čas izpostavljenosti spremeni.

Uporabljajo se lahko različne testne metode, odvisno od fizikalnih in kemijskih lastnosti testne snovi (tj. trdna, tekoča, viskozna ali neviskozna tekočina). Najpomembnejše je zagotoviti, da testna snov dovolj dobro pokriva epitelno površino in da se med spiranjem ustrezno odstrani. Zaprta metoda se navadno uporablja za neviskozne do nekoliko viskozne testne snovi, medtem ko se odprta metoda navadno uporablja za polviskozne in viskozne tekoče testne tekočine in nerazredčene trdne snovi.

Pri odprti metodi se pred testiranjem s sprednjega dela držala odstranita obroček za zapiranje okenca in stekleno okence. Kontrolna ali testna snov (750 μL ali dovolj testne snovi, da je prekrita celotna roženica) se aplicira neposredno na epitelno površino roženice z mikropipeto. Če se testna snov težko pipetira, se lahko za lažje doziranje testno snov nanese s pipeto za neposredno izpodrivanje tlaka. Konica pipete za neposredno izpodrivanje tlaka se vstavi v dozirno konico brizgalke, da se material napolni v konico za izpodrivanje pod tlakom. Če se potisni bat počasi sprošča, se vlečni bat pipete pomakne navzgor. Če se v konici pipete začnejo tvoriti zračni mehurčki, se predmet testiranja odstrani (izvrže) in postopek ponovi, dokler konica ni polna in v njej ni zračnih mehurčkov. Po potrebi se lahko uporabi običajna brizgalka (brez igle), saj omogoča merjenje natančne količine testne snovi in lažjo aplikacijo na epitelno površino roženice. Po doziranju se na sprednji del držala ponovno namesti stekleno okence in tako ponovno ustvari zaprt sistem.

Inkubacija po izpostavljenosti

Po končani inkubaciji, ki sledi izpostavljenosti (pri tekočinah in površinsko aktivnih snoveh), oziroma po koncu štiriurne izpostavljenosti (pri površinsko neaktivnih trdnih snoveh) se zabeležita motnjava in prepustnost vsake roženice. Poleg tega se vsaka roženica pregleda vizualno in zabeležijo vsa pomembnejša opažanja (npr. lupljenje tkiva, prisotnost preostale testne snovi, neenotni vzorci motnjave). Ta opažanja so lahko pomembna, saj se lahko odražajo v odklonih, ki jih izmeri opacitometer.

Kontrolne snovi

Merjene končne točke

Prepustnost je odvisna od količine barvila natrijevega fluoresceina, ki prodre skozi vse celične sloje roženice (tj. od epitelija na zunanji površini roženice do endotelija na notranji površini roženice). V sprednji del držala za roženico, na katerega je pripeta epitelna stran roženice, se doda 1 mL raztopine natrijevega fluoresceina (4 ali 5 mg/mL pri testiranju tekočin in površinsko aktivnih snovi oziroma površinsko neaktivnih snovi), medtem ko se zadnji del držala, na katerega je pripeta endotelna stran roženice, napolni s svežim EMEM. Držalo se nato da v inkubator v vodoravnem položaju za 90 ± 5 minut pri 32 ± 1 °C. Količina natrijevega fluoresceina, ki prodre v zadnji del držala, se meri kvantitativno s pomočjo spektrofotometrije UV/VIS. Spektrofotometrične meritve pri 490 nm se beležijo kot neprekinjeno merjene vrednosti optične gostote (OD490) ali absorbance. Prepustnost fluorosceina se določa z vrednostmi OD490, ki so bile izmerjene s spektrofotometrom vidne svetlobe pri standardni dolžini poti 1 cm.

Namesto spektrofotometra se lahko uporablja tudi čitalec 96-mestnih mikrotiterskih plošč, pod pogojem, da: (i) se lahko določi linearno merilno območje čitalca za določevanje vrednosti fluroesceina OD490 in (ii) če se v 96-mestni mikrotiterski plošči uporablja dovolj veliko vzorcev fluoresceina, da se zagotovijo vrednosti OD490, ki ustrezajo standardni dolžini poti 1 cm (za to so lahko potrebne popolnoma napolnjene posode [navadno 360 μL]).

PODATKI IN POROČANJE

Ocenjevanje podatkov

Po Sini et al. (16) je bila ta formula izpeljana na podlagi laboratorijskih in medlaboratorijskih študij. Podatki, zbrani med multilaboratorijsko študijo za 36 spojin, so bili ocenjeni z multivariantno analizo, s katero se je določila najustreznejša enačba za primerjanje podatkov in vivo ter in vitro. Analizo so opravili znanstveniki dveh različnih podjetij in izpeljali skoraj identični enačbi.

Po korigiranju vrednosti motnjave in povprečne prepustnosti (OD490) za vrednosti ozadja za motnjavo in vrednosti prepustnosti negativne kontrole OD490 se vrednosti povprečne motnjave in prepustnosti OD490 za vsako testno skupino združijo v empirično izpeljani formuli, s katero se izračuna vrednost draženja in vitro (IVIS) za vsako testno skupino, kot sledi:

Merila za odločanje

Snov z IVIS ≥ 55,1 velja za jedko ali zelo dražilno snov. Kot je navedeno pod točko 1, je treba testno snov, ki ni opredeljena kot jedka ali zelo dražilna za oči, zaradi razvrščanja in označevanja dodatno testirati. V primerjavi s podatki testne metode in vivo na očeh zajcev, razvrščenih po sistemih za razvrščanje EPA (1), EU (2) ali GHS (3), je splošna natančnost testne metode BCOP 79-odstotna (113/143) do 81-odstotna (119/147), delež lažno pozitivnih rezultatov 19-odstoten (20/103) do 21-odstoten (22/103) ter delež lažno negativnih rezultatov 16-odstoten (7/43) do 25-odstoten (10/40). Če se iz podatkovne zbirke izključijo snovi določenega kemijskega (npr. alkoholi, ketoni) ali fizikalnega razreda, je natančnost testa BCOP po sistemih za razvrščanje EU, EPA in GHS 87-odstotna (72/83) do 92-odstotna (78/85), delež lažno pozitivnih rezultatov 12-odstoten (7/58) do 16-odstoten (9/56) ter delež lažno negativnih rezultatov 0-odstoten (0/27) do 12-odstoten (3/26).

Tudi če jedke ali zelo dražilne testne snovi za oči ni mogoče razvrstiti, so lahko podatki, pridobljeni z BCOP in testom in vivo na očeh zajcev ali primerno validiranim testom in vitro, koristni za nadaljnje ocenjevanje primernosti in omejitev testne metode BCOP za določanje nejedkih in ne zelo dražilnih snovi (trenutno se pripravljajo smernice za uporabo testnih metod in vitro za ugotavljanje toksičnosti za oči).

Merila za sprejemljivost študije

Test se šteje za sprejemljivega, če je pri pozitivni kontroli vrednost IVIS znotraj dveh standardnih odklonov veljavne povprečne vrednosti iz preteklih testov, ki jo je treba posodobiti najmanj vsake tri mesece oziroma vedno, kadar opravljajo test laboratoriji, ki redko opravljajo teste (tj. manj kot enkrat mesečno). Reakcije negativne kontrole s topilom/vehiklom morajo dati vrednosti motnjave in prepustnosti, ki so manjše od veljavnih zgornjih omejitev vrednosti ozadja za motnjavo in prepustnosti roženic goveda, testiranih z zadevnimi negativnimi kontrolami ali kontrolami s topilom/vehiklom.

Poročilo o testu

tabele s podatki iz posameznih testnih vzorcev (npr. vrednosti motnjave in OD490 ter izračunane vrednosti IVIS za testno snov ter pozitivne, negativne in primerjalne kontrole [če so bile upoštevane], vključno s podatki iz ponovitev poskusa v dvojniku, če so bile opravljene, ter povprečne vrednosti ± standardni odklon pri vsakem poskusu);

podatki o kalibriranju naprav za merjenje motnjave in prepustnosti (npr. opacitometer in spektrofotometer);

postopek za zagotavljanje celovitosti (tj. natančnosti in zanesljivosti) testne metode v daljšem časovnem obdobju (npr. redno testiranje snovi za preverjanje sposobnosti, uporaba podatkov o negativni in pozitivni kontroli iz preteklih testov).

posebne lastnosti živali, katerim so bili odvzete oči, če so znane (tj. starost, spol, teža živali donatorke).

pogoji za hrambo in prevoz oči (tj. dan in čas odvzema oči, čas pred prvim testiranjem, prevozna sredstva in temperaturni pogoji, morebitno uporabljeni antibiotiki);

ime in naslov naročnika, testnega laboratorija in vodje študije;

čistost in sestava snovi ali zmesi (v težnostnih odstotkih), če so te informacije na voljo;

kemijska imena in strukturno ime Službe za izmenjavo kemijskih izvlečkov (CAS), ki jim sledijo druga imena, če so znana;

LITERATURA

U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96-001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.

Regulation (EC) No 1272/2008 of the European Parliament and of the Council of 16 December 2008 on classification, labelling and packaging of substances and mixtures, amending and repealing Directive 67/548/EEC and 1999/45/EC, and amending Regulation (EC) No. 1907/2006. OJ L 353, 31.12.2008, p. 1 .

UN (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Second revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications, 2007.Available:

ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Available:

ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Available:

Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC. OJ L 396, 30.12.2006, p. 1 .

OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Available:

ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Available:

ICCVAM. (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06-4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Available:

INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Permeability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, Italy: European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM).

Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine corneal opacity and permeability test: An in vitro assay of ocular irritancy. Fundam. Appl. Toxicol. 18:442-449.

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Available:

Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.

Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse. Can. J. Zool. 73:2159-2165.

Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on - Part I. The Lancet 349: 636-641.

Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates. Fundam Appl Toxicol 26:20-31.

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Available:

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Na voljo:

Dodatek 1

OPREDELITVE

Natančnost: stopnja ujemanja testnih rezultatov s priznanimi referenčnimi vrednostmi. Je merilo učinkovitosti testne metode in eden od vidikov „ustreznosti“. Ta izraz in izraz „skladnost“ se pogosto izmenično uporabljata in pomenita delež pravilnih rezultatov testne metode.

Primerjalna snov: snov, ki se uporablja kot standard za primerjavo s testno snovjo. Primerjalna snov mora imeti naslednje lastnosti: (i) trajen in zanesljiv vir; (ii) strukturno in funkcijsko podobnost z razredom testiranih snovi; (ii) znane fizikalne/kemijske lastnosti; (iv) spremni podatki o znanih učinkih in (v) znana potenca v razponu želene reakcije.

Roženica: prozoren sprednji del zrkla, ki pokriva šarenico in zenico ter skozi katerega vstopa svetloba.

Motnjava roženice: merjenje stopnje motnjave roženice po izpostavljenosti testni snovi. Povečana motnjava roženice pomeni, da je roženica poškodovana. Motnjava se lahko ocenjuje subjektivno kot pri Dreizovem testu na očeh zajcev ali objektivno z inštrumentom, kot je „opacitometer“.

Prepustnost roženice: kvantitativna vrednost poškodovanega epitelija roženice, izmerjena z določanjem količine barvila natrijevega fluoresceina, ki prodre skozi vse celične plasti roženice.

EPA kategorija 1: jedka snov (ireverzibilno uničenje očesnega tkiva), ki poškoduje ali draži roženico več kot 21 dni (1).

EU kategorija R41: poškodba očesnega tkiva ali resno fizično poslabšanje vida po aplikaciji testne snovi na sprednjo površino očesa, ki po 21 dneh aplikacije ni popolnoma reverzibilna (2).

Delež lažno negativnih rezultatov: delež vseh pozitivnih snovi, ki jih testna metoda prikaže kot lažno negativne. To je eden od kazalnikov učinkovitosti testne metode.

Delež lažno pozitivnih rezultatov: delež vseh negativnih snovi, ki jih testna metoda prikaže kot lažno negativne. To je eden od kazalnikov učinkovitosti testne metode.

GHS (Globalno usklajeni sistem za razvrščanje in označevanje kemikalij): sistem za razvrščanje kemikalij (snovi in zmesi) s pomočjo standardiziranih vrst in stopenj fizikalnih, zdravstvenih in okoljskih nevarnosti ter za označevanje z npr. piktogrami, opozorilnimi besedami, izjavami o nevarnosti, varnostnimi izjavami in varnostnimi listi z namenom razširjanja informacij o škodljivih učinkih kemikalij ter s tem zaščite ljudi (vključno z delodajalci, delavci, prevozniki, potrošniki in reševalci) in okolja (3).

GHS kategorija 1: poškodba očesnega tkiva ali resno fizično poslabšanje vida po aplikaciji testne snovi na sprednjo površino očesa, ki po 21 dneh aplikacije ni popolnoma reverzibilna (3).

Nevarnost: neločljiva lastnost snovi ali stanja, ki lahko ob izpostavljenosti tej snovi škodljivo učinkuje na organizem, sistem ali (pod)populacijo.

Vrednost draženja in vitro (IVIS): empirično izpeljana formula, ki se uporablja pri testu BCOP, pri kateri se povprečne vrednosti motnjave in prepustnosti za vsako testno skupino združijo v eno samo vrednost in vitro za vsako testno skupino. IVIS = povprečna vrednost motnjave + (15 x povprečna vrednost prepustnosti).

Negativna kontrola: netestirani dvojnik, ki vsebuje vse komponente testnega sistema. Ta vzorec se obdela z vzorci, testiranimi s testno snovjo, in drugimi kontrolnimi vzorci, da se ugotovi, ali topilo reagira s testnim sistemom.

Nedražilna snov: snovi, ki niso razvrščene v EPA kategorije I, II ali III; EU kategoriji R41 ali R36 ali GHS kategorije 1, 2A ali 2B dražilnih snovi za oči.

Jedka snovi za oči: (a) snov, ki povzroča ireverzibilno poškodbo očesnega tkiva; (b) snovi, ki so razvrščene v GHS kategorijo 1, EPA kategorijo I ali EU kategorijo R41 dražilnih snovi za oči (1) (2) (3).

Dražilna snov za oči: (a) snov, ki po aplikaciji na sprednjo površino očesa povzroči reverzibilno poškodbo očesa; (b) snovi, ki so razvrščene v EPA kategoriji II ali III, EU kategorijo R36 ali GHS kategoriji 2A ali 2B dražilnih snovi za oči (1) (2) (3).

Zelo dražilna snov za oči: (a) snov, ki po aplikaciji na sprednjo površino očesa povzroči poškodbo tkiva, ki po 21 dneh po aplikaciji ne izgine oziroma resno fizično poslabša vid; (b) snovi, ki so razvrščene v GHS kategorijo 1, EPA kategorijo I ali EU kategorijo R41 dražilnih snovi za oči (1) (2) (3).

Opacitometer: inštrument za merjenje motnjave roženice, ki kvantitativno ocenjuje prenos svetlobe skozi roženico. Navadno ima dva dela, ki imata vsak svoj vir svetlobe in fotocelico. En del se uporablja za testirano roženico, drugi za kalibriranje in nastavitev inštrumenta na vrednost nič. Svetloba halogene svetilke se skozi kontrolni del (prazen del brez okenc ali tekočine) usmeri v fotocelico in primerja s svetlobo, usmerjeno v fotocelico skozi testni del, v katerem je del z roženico. Primerja se razlika v preneseni svetlobi iz fotocelic, na digitalnem ekranu pa se prikaže numerična vrednost motnjave.

Pozitivna kontrola: dvojnik, ki vsebuje vse komponente testnega sistema in se testira s snovjo, za katero je znano, da sproži pozitivno reakcijo. Da se zagotovi, da se odkloni pri reakciji pozitivne kontrole ocenjujejo v daljšem časovnem obdobju, stopnja reakcije ne sme biti prevelika.

Zanesljivost: stopnja reproduktivnosti testne metode v laboratorijih in med njimi v določenem časovnem obdobju pri uporabi istega protokola. Oceni se z izračunom laboratorijske in medlaboratorijske reproduktivnosti in ponovljivosti.

Kontrola s topilom/vehiklom: netestirani vzorec, ki vsebuje vse komponente testnega sistema, vključno s topilom ali vehiklom, ki se obdela z vzorci, testiranimi s testno snovjo, in drugimi kontrolnimi vzorci, da se določi izhodiščna reakcija za vzorce, testirane s testno snovjo in raztopljene v istem topilu ali vehiklu. Pri testiranju s primerjalno negativno kontrolo ta vzorec tudi pokaže, ali topilo oziroma vehikel reagira s testnim sistemom.

Stopenjsko testiranje: stopenjska testna strategija, pri kateri se v posebnem vrstnem redu pregledajo vse informacije o testni snovi, pri čemer se na vsaki stopnji uporabi teža dokazov, da se določi, ali je na voljo dovolj informacij za razvrstitev snovi med nevarne snovi, preden se preide na naslednjo stopnjo. Če se lahko na podlagi razpoložljivih informacij določi potencialno draženje snovi, dodatno testiranje ni potrebno. Če na podlagi razpoložljivih informacij potencialnega draženja testne snovi ni mogoče določiti, se opravi postopno sekvenčno testiranje na živalih, dokler ni mogoča jasna razvrstitev.

Validirana testna metoda: testna metoda, za katero sta bili na podlagi validacijskih študij določeni primernost (vključno z natančnostjo) in zanesljivost za določen namen. Treba je opozoriti, da natančnost in zanesljivost validirane testne metode nista nujno zadostni, da bi bili sprejemljivi za predlagani namen.

Teža dokazov: proces preučevanja prednosti in slabosti različnih informacij z namenom sprejetja zaključka o potencialni nevarnosti snovi in njegovi utemeljitvi.