ODLOČBA KOMISIJE

z dne 28. februarja 2005

o uvedbi navodil, ki dopolnjujejo Del B Priloge II k Direktivi Sveta 90/219/EGS o uporabi gensko spremenjenih mikroorganizmov v zaprtih sistemih

(notificirana pod dokumentarno številko K(2005) 413)

(Besedilo velja za EGP)

(2005/174/ES)

KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE –

ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske skupnosti,

ob upoštevanju Direktive Sveta 90/219/EGS z dne 23. aprila 1990 o uporabi gensko spremenjenih mikroorganizmov v zaprtih sistemih (1) in zlasti uvodnega odstavka Dela B Priloge II k Direktivi,

po posvetovanju z Evropsko agencijo za varno hrano (2),

ob upoštevanju naslednjega:

Merila, navedena v Delu B Priloge II k Direktivi 90/219/ES, morajo biti izpolnjena, da bi bil gensko spremenjeni organizem (GSM) varen za zdravje ljudi in okolje ter primeren za vključitev v Del C Priloge II k navedeni direktivi.

Ukrepi, predvideni s to odločbo, so v skladu z mnenjem odbora, ustanovljenega v skladu s členom 21 Direktive 90/219/EGS –

SPREJELA NASLEDNJO ODLOČBO:

Člen 1

Navodila, opredeljena v Prilogi k tej odločbi, se uporablja kot dopolnilo k Delu B Priloge II k Direktivi 90/219/EGS.

Člen 2

Ta odločba je naslovljena na države članice.

(1) UL L 117, 8.5.1990, str. 1. Direktiva, kakor je bila nazadnje spremenjena z Uredbo Evropskega parlamenta in Sveta (ES) št. 1882/2003 (UL L 284, 31.10.2003, str. 1).

(2) EFSA Journal [Bilten EFSA] (2003) 18, 1–15.

PRILOGA

Navodila, ki dopolnjujejo Del B Priloge II k Direktivi 90/219/EGS

UVOD

Vrste GSM se lahko vključijo v Prilogo II, Del C, samo, kadar so izpolnjena splošna in posebna merila, opredeljena v Prilogi II, Del B.

Vsi GSM, ki so vključeni v Prilogo IIC, bodo objavljeni v Uradnem listu, skupaj z ustreznimi prepoznavnimi lastnostmi ali referenčnimi viri GSM. Pri obravnavi, ali je posamezna vrsta GSM primerna za vključitev v Prilogo II, Del C, je treba upoštevati vse sestavine in, kadar je to ustrezno, postopek izgradnje GSM. Treba je poudariti, da se bodo ob upoštevanju vseh vidikov samo lastnosti GSM presojale na podlagi meril v Prilogi II, del B. Če bi se za vse sestavine GSM, ki so bile posamično obravnavane, ugotovilo, da so varne, je verjetno, da bi GSM izpolnil merila varnosti. Vendar to ne more biti predpostavka, temveč je treba vse podrobno proučiti.

Če se GSM tvorijo kot vmesni organizmi pri tvorjenju končnega GSM, je treba tudi o teh vmesnih organizmih presojati na podlagi meril v Prilogi II, Del B, za vsako vrsto, ki bo izvzeta, ter tako dejansko omogočiti, da bo izvzetje celotne uporabe v zaprtih sistemih sprejemljivo. Države članice morajo zagotoviti, da naslednje smernice upoštevajo uporabniki, da bi lažje izpolnili ta merila pri pripravi ustrezne dokumentacije za opredelitev varnosti vrst GSM, ki jih je treba vključiti v Del C Priloge II, za zdravje ljudi in okolje, ter pristojni nacionalni organi pri oceni ustreznosti.

Dokumentacija mora vključevati podrobne in utemeljene dokaze, ki državam članicam omogočijo presojo o tem, ali so mnenja o varnosti GSM glede na merila upravičena. V primeru znanstvene negotovosti je treba uporabiti previdnostni pristop in samo, kadar obstajajo prepričljivi dokazi, da so bila merila izpolnjena, se GSM lahko obravnava zaradi možnosti izvzetja.

Po pozitivni oceni glede izpolnjevanja meril mora pristojni nacionalni organ, ki v ta namen prejme dokumentacijo, to poslati Komisiji, ki se mora v zvezi z vključitvijo zadevnega GSM v Prilogo II, Del C, posvetovati z odborom, ustanovljenim v skladu s členom 21 Direktive. Opredelitve uporabljenih izrazov so navedene v Prilogi 1.

1. SPLOŠNA MERILA

1.1 Preverjanje/avtentičnost seva

Identiteta seva mora biti določena in avtentična, vektor/vključek pa mora biti dobro opredeljen glede zgradbe in funkcije, kakor se pojavi v končnem GSM. Podroben predhodni potek seva (vključno s časovnim razvojem genskih sprememb) zagotavlja koristne informacije za oceno varnosti. Treba je razumeti taksonomski odnos do tesno povezanih, poznanih, škodljivih mikroorganizmov, saj to lahko zagotovi informacije o možnih škodljivih lastnostih, ki se običajno sicer ne izrazijo, vendar pa se zaradi genske spremembe lahko izrazijo. Identiteta evkariontskih celic in sistemov tkivne kulture je treba preveriti v skladu z mednarodnimi klasifikacijami (ATCC ali drugimi).

Ustrezno literaturo je treba pregledati, da bi pridobili informacije o predhodnem poteku, varnosti uporabe, taksonomskih podatkih, fenotipskih in genskih označevalcih, npr. „Bergeys Manual of Determinative Bacteriology“, znanstvene članke in revije, informacije komercialnih družb, ki dobavljajo DNK. Koristni podatki se lahko pridobijo tudi iz zbirk kultur in organizacij za zbiranje kultur, kakor sta Svetovna federacija zbirk kultur (World Federation of Culture Collections - WFCC), ki izdaja svetovni seznam zbirk kultur mikroorganizmov, in Evropska organizacija zbirk kultur (European Culture Collections Organisation - ECCO). Pri tem je treba upoštevati tudi večje evropske zbirke kultur, ki vključujejo široke skupine mikroorganizmov. Kadar se pojavi nov izolat ali sev, ki še ni bil podrobno proučen, se je treba morebitnih še neodgovorjenih vprašanj lotiti s testi za potrditev identitete GSM. To se lahko zgodi, kadar se sev GSM zelo razlikuje od svojega(-ih) starševskega(-ih) seva(-ov), na primer, kadar nastane pri zlitju celic ali je posledica več genskih sprememb.

Kadar so potrebni testi za potrditev identitete seva, lahko testi vključujejo morfologijo, obarvanje, elektronsko mikroskopijo, serologijo, prehranske načine, ki temeljijo na uporabi in/ali razgradnji, analizo izoencimov, značilnosti beljakovin in maščobnih kislin, % G+C, zapise DNK/RNK, povečanje zaporedij DNK/RNK glede na takson, uporabo genskih sond, hibridizacijo s sondami DNK, specifičnimi za rRNK, in določitev zaporedja DNK/RNK. Rezultate takih testov je treba dokumentirati.

Za identifikacijo genov v GSM je optimalno stanje takrat, kadar je poznano popolno nukleotidno zaporedje vektorja in vključka. Lahko se opredeli funkcija vsake genske enote. Kadar je to mogoče, morata biti vektor in vključek po velikosti omejena na genska zaporedja, ki so nujna za opravljanje predvidene funkcije. To zmanjša verjetnost vnosa in izražanja kriptičnih funkcij ali pridobitev neželenih lastnosti.

1.2 Dokumentirana in vzpostavljena varnost

Zagotoviti je treba dokumentirane dokaze o varni rabi GSM. Ti lahko vključujejo rezultate testov, ki so bili predhodno opravljeni, podatke iz pregleda literature ali potrjeno evidenco o varnosti uporabe organizma. Poudariti je treba, da ni nujno, da se s predhodnim potekom varne uporabe potrdi varnost, posebno kadar je bil GSM uporabljen pod strogo nadzorovanimi pogoji zaradi varnostnih razlogov.

Dokumentirani dokazi glede potrjene varnosti pri prejemnem ali starševskem sevu bodo temelj za odločitev, ali GSM izpolnjuje to merilo. Vendar lahko GSM vsebuje precejšnje spremembe v primerjavi s starševskim organizmom (starševskimi organizmi), ki lahko vplivajo na varnost, in te je treba raziskati. Zlasti je treba paziti, kadar je bil namen genske spremembe odstraniti škodljivo ali patogeno lastnost pri prejemnem ali starševskem sevu. V takem primeru je treba varnost dokazati z jasnimi in dokumentarnimi dokazili o uspešno odstranjenih škodljivih ali potencialno škodljivih lastnostih. Kadar podatki za določen prejemni ali starševki sev niso na voljo, je možno uporabiti podatke, ki so bili zbrani za to vrsto. Ti podatki, podprti s pregledom literature in taksonomsko raziskavo variacije seva znotraj vrste, lahko zagotovijo dokaze o varnosti zadevnega prejemnega ali starševskega seva.

Kadar podatki, ki bi dokazali varnost, niso dosegljivi, je treba za vzpostavitev varnosti GSM opraviti ustrezne teste.

1.3 Genska stabilnost

Genska sprememba ne sme povečati stabilnosti GSM v primerjavi z nespremenjenim mikroorganizmom v okolju, če bi bila zaradi tega lahko povzročena škoda.

Kadar bi morebitna nestabilnost v genski spremembi lahko škodljivo vplivala na varnost, je treba zagotoviti dokazila o stabilnosti. To zlasti velja v primerih, kadar je v GSM vnesena mutacija za oslabitev, s katero bi zmanjšali škodljive lastnosti.

2. POSEBNA MERILA

2.1 Nepatogenost

GSM ne sme biti zmožen povzročiti bolezen ali škoditi zdravim osebam, rastlinam ali živalim v običajnih pogojih ali zaradi razmeroma predvidljivih dogodkov, kakor so poškodbe z iglo, nenamerno zaužitje, izpostavljenost aerosolu in izpust, ki vodi v izpostavljenost okolja. Kadar obstaja večja verjetnost, da bodo imunokompromitirani posamezniki, izpostavljeni GSM, na primer, kadar naj bi bil GSM uporabljen v kliničnem okviru, je treba pri presoji splošne varnosti navedenega GSM upoštevati možne posledice zaradi take izpostavljenosti.

Pregled literature in osnovne informacije, zbrane zaradi splošnih meril, bi morali zagotoviti večino zahtevanih podatkov. Proučiti je treba podatke o obravnavi in varnosti vrste in tesno povezanih sevov v preteklosti. Prav tako je treba pregledati sezname človeških, živalskih in rastlinskih patogenov.

Evkariontski virusni vektorji, ki jih je treba vključiti v Prilogo IIC, ne smejo imeti škodljivih posledic za zdravje ljudi in okolje. Njihov izvor mora biti znan, kakor tudi mehanizem zmanjševanja in stabilnosti zadevnih lastnosti. Kadar je to izvedljivo, je treba potrditi prisotnost takih lastnosti v virusu pred spremembo in po njej. Kadar se uporabljajo taki vektorji, je treba uporabiti le mutacije z delecijo. Gradniki, ki kot gostitelje uporabljajo vektorje DNK in RNK, pridobljene iz virusov in kultiviranih celic, pri katerih ni infektivnih virusov ali ne morejo biti tvorjeni, so tudi lahko ustrezni.

Nevirulentni sevi priznanih patogenih vrst, kakor je živo cepivo za ljudi in živali, se lahko obravnavajo, kakor da niso verjetni povzročitelji bolezni, in kot taki izpolnjujejo merilo za Prilogo IIB, pod pogojem, da:

1. ima nevirulentni sev potrjeno evidenco o varnosti uporabe brez škodljivih posledic za zdravje ljudi, živali ali rastlin (pregled literature) ali

2. sevu stalno primanjkuje genski material, ki določa virulentnost, ali ima stalne mutacije, za katere je poznano, da zadostno zmanjšajo virulentnost (testi patogenosti, genska preiskava - genske sonde, odkrivanje fagov in plazmidov, določitev restrikcijskih encimov, določitev zaporedij, beljakovinske sonde), in za katere obstajajo utemeljeni dokazi za varnost. Upoštevati je treba tveganje zaustavitve genske delecije ali mutacije zaradi morebitnega vhodnega genskega prenosa.

Za pridobitev zahtevanih podatkov, kadar jih ne pokažeta pregled literature in taksonomska raziskava, je treba opraviti teste patogenosti, ustrezne za obravnavani mikroorganizem. Te teste je treba izvesti na GSM, čeprav so lahko v nekaterih primerih primerni testi na prejemnem ali starševskem sevu. Vendar, kadar se GSM precej razlikuje od svojega starševskega organizma (svojih starševskih organizmov), je treba paziti, da se izognemo napačnim zaključkom glede nepatogenosti.

Primeri prejemnih ali starševskih sevov mikroorganizmov za tvorjenje GSM, za katere lahko velja, da so primerni za vključitev v del C Priloge IIC, vključujejo:

— zadostno oslabljene derivate bakterijskih sevov, kakor sta na primer Escherichia coli K12 in Staphylococcus aureus 83254, katerih rast in preživetje sta odvisna od dodajanja hranilnih snovi, ki niso na voljo pri ljudeh ali v okolju zunaj kulture, kakor sta na primer potrebna diamoniopimelična kislina, avksotrofija timina;

— sistemi evkariontskih celic in tkivne kulture (rastlinskih ali živalskih, vključno s sesalci), ki lahko veljajo za zadostno oslabljene gostitelje. GSM, ki temeljijo na celicah, morajo izpolnjevati druga merila, ki so navedena tukaj (na primer brez škodljivih naključnih povzročiteljev in nemobilni vektorji);

— seve nepatogenih gostiteljev divjega tipa, ki imajo lahko nadvse specializirane okoljske niše, katerih slučajno uhajanje izpod nadzora bi imelo minimalen vpliv na okolje, ali ki so zelo široko razširjeni in neškodljivi, katerih slučajno uhajanje izpod nadzora bi imelo minimalne posledice za zdravje ljudi, živali ali rastlin. Primeri takih gostiteljev vključujejo mlečnokislinske bakterije, rizobakterije, ekstremne termofilne bakterije, bakterije ali glive, ki tvorijo antibiotike. Ti morajo biti mikroorganizmi s potrjeno evidenco o dobro razviti genetiki in molekularnem poznavanju.

Vektor in vključek, ki se pojavita v končnem GSM, ne smeta vsebovati genov, ki izražajo aktivno beljakovino ali transkript (na primer determinante virulentnosti, toksine itd.) na takšni ravni in v takšni obliki, ki bi obogatila GSM s fenotipom, ki bi najverjetneje lahko povzročil bolezen pri ljudeh, živalih in rastlinah ali imel škodljive posledice za okolje.

Treba se je izogniti uporabi vektorja/vključka, ki vsebuje zaporedja s kodo za škodljive lastnosti v nekaterih mikroorganizmih, ki pa GSM ne obogati s fenotipom, ki bi najverjetneje lahko povzročil bolezen pri ljudeh, živalih in rastlinah ali imel škodljive posledice za okolje. Prav tako je treba paziti, da vnesen genski material ne kodira determinante patogenosti, ki je zmožna nadomestiti mutacijo za oslabitev, navzoče v starševskem organizmu.

Fenotip, ki je posledica vektorja, je lahko odvisen od prejemnega ali starševskega organizma; kar velja za določenega gostitelja, se ne sme preprosto predpostaviti, kakor da velja za gradnik, ki se prenese na drugega gostitelja. Oslabljen retrovirusni vektor v bakterijah ali večini celičnih linij bi bil na primer nezmožen tvoriti delce infektivnega virusa. Vendar bi isti vektor v pakiranju celične linije tvoril delce infektivnega virusa in bi lahko odvisno od narave oslabitve in zaporedij vključka GSM obogatil s fenotipom, ki bi najverjetneje lahko povzročil bolezen.

2.1.1 Nestrupenost

Zaradi genske spremembe GSM ne sme tvoriti nepredvidenih toksinov ali povečati strupenost. Primeri mikrobnih toksinov so eksotoksini, endotoksini in mikotoksini. Proučitev prejemnega ali starševskega seva bi v tej točki dala koristne podatke.

Upoštevati je treba, da je treba v primeru, kadar je prejemni ali starševki sev brez toksinov, pozornost usmeriti na vsakršno možnost, da bi vektor/vključek vnesel toksine ali spodbudil/dereprimiral tvorjenje toksinov. Prisotnost toksinov je treba natančno proučiti, čeprav ni nujno, da to izključuje možnost, da bi bili GSM vključeni v Prilogo IIC.

2.1.2 Nealergenost

Medtem ko so vsi mikroorganizmi do neke stopnje potencialno alergeni, so nekatere vrste priznani alergeni, ki so navedeni v Direktivi Sveta 93/88/EGS (1) in Direktivi Komisije 95/30/ES (2) ter njihovih spremembah. Proučiti je treba, ali GSM pripada prav tej skupini alergenov. Alergene sestavine mikroorganizmov lahko vključujejo celične stene, spore, naravne produkte presnove (na primer proteolitične encime) in nekatere antibiotike. Kadar sta vektor in vključek izražena v končnem GSM, genski produkt ne sme vsebovati bioloških dejavnosti, ki bi lahko povzročile tvorjenje pomembnih alergenov. Poudariti je treba, da se tega merila ne sme uporabljati absolutno.

2.2 Odsotnost škodljivih naključnih povzročiteljev

GSM ne sme vsebovati poznanih naključnih povzročiteljev, kakor so mikoplazma, virusi, bakterije, glive, druge rastlinske/živalske celice, simbionte, ki so lahko škodljivi. Metoda, s katero se temu lahko izognemo, je, da pri tvorjenju GSM, uporabimo prejemni ali starševski sev, za katerega je znano, da nima škodljivih naključnih povzročiteljev, vendar se ne sme predpostaviti, da GSM nima naključnih povzročiteljev zato, ker jih ni (niso) imel(-i) njihov(-i) starševski organizem(-i). Med tvorjenjem GSM so bili lahko vneseni novi povzročitelji.

Posebno skrbno je treba določiti, ali kulture živalskih celic vsebujejo potencialno škodljive naključne povzročitelje, kakor je virus limfocitnega koriomeningitisa, ali mikoplazmo, kakor je Mycoplasma pneumoniae. Naključne povzročitelje je težko ugotoviti. Upoštevati je treba vse omejitve učinkovitosti presejanja.

2.3 Prenos genskega materiala

Vneseni genski material v GSM ne sme biti prenosljiv ali mobilen, kadar bi to lahko povzročilo nastanek škodljivega fenotipa v prejemnem mikroorganizmu.

Vektor in vključek ne smeta prenesti nobenih označevalcev odpornosti na GSM, kadar bi odpornost lahko ogrozila terapevtsko zdravljenje. Prisotnost takih označevalcev a priori ne izključuje vključitev GSM v Prilogo IIC, vendar bi dodatno poudarila pomembnost nemobilnosti takih genov.

Kadar je vektor virus, kozmid ali katere koli vrste vektor, pridobljen iz virusov, mora postati tudi nelizogen (na primer brez represorja cI-lambda), kadar se uporablja kakor klonski vektor. Zaradi prisotnosti, na primer prenosljivih zaporedij provirusa ali drugih funkcionalnih prevzemnih zaporedij, ta vključek ne sme biti mobilen.

Nekateri vektorji, ki so vključeni v kromosomu gostitelju, se tudi lahko obravnavajo kakor nemobilni, vendar jih je treba od primera do primera proučiti, zlasti ob upoštevanju mehanizmov, ki bi lahko olajšali mobilnost kromosoma (na primer prisotnost kromosomskega spolnega faktorja) ali prenos do drugih replikonov, ki so lahko prisotni v gostitelju.

2.4 Varnost za okolje v primeru izpusta iz zaprtega sistema

Okoljska škoda bo običajno povzročena le, kadar je GSM obstojen in ima nevarne lastnosti. Pri obravnavi okoljske škode je treba upoštevati različne okoljske pogoje znotraj držav članic in, kadar je to potrebno, je treba razmisliti o načrtu pri skrajnih primerih. Treba je zagotoviti podatke, kadar so dosegljivi, o prejšnjih izpustih (namernih ali drugih) in z njimi povezanih vplivih na okolje.

2.4.1 Preživetje organizma

Pri odločitvi o tem, ali obstaja verjetnost, da bo GSM imel škodljive posledice za okolje, ali rastlinam in živalim povzročil bolezen, je treba razmisliti, ali bodo biološke lastnosti GSM izboljšale, pustile nespremenjene ali zmanjšale sposobnost GSM za preživetje v okolju. Kadar GSM niso biološko sposobni preživetja v okolju, ti mikroorganizmi ne bodo preživeli daljšega obdobja zunaj zaprtega sistema in zato je verjetnost medsebojnega delovanja z okoljem zmanjšana.

Ob proučevanje možnih škodljivih posledic za okolje je treba upoštevati tudi možno obnašanje GSM, ki iz zaprtega sistema pride v prehranske mreže.

2.4.2 Širjenje

Da bi se GSM v okolju naselil, mora biti sposoben preživeti širjenje v ustrezno nišo in se v njej naseliti. Upoštevati je treba metodo širjenja in verjetnost preživetja med širjenjem. Mnogi mikroorganizmi preživijo, kadar se na primer širijo v aerosolu in kapljicah ali prek mrčesa in črvov.

2.4.3 Naselitev organizma v okolju

Naselitev v določenem okolju je odvisna od narave okolja, v katerega je bil GSM izpuščen, in njegove sposobnosti za preživetje prenosa v novo okolje. Možnost naselitve v ustrezni niši se razlikuje glede na velikost populacije, sposobne za preživetje, velikosti niše in pogostosti ustreznih niš za te vrste. Verjetnost bo za vsako vrsto drugačna. Poleg tega bo imela odpornost ali občutljivost na biotske ali nebiotske obremenitve velik vpliv na naselitev GSM v okolju. Daljše obdobje obstojnosti GSM v okolju je povezano z njegovo sposobnostjo za preživetje in prilagoditev okoljskim pogojem ali za začetek konkurenčne stopnje rasti. Na te dejavnike lahko vplivajo genske spremembe in mesto vključevanja. Obstajajo primeri, v katerih ni verjetno, da bi genske spremembe imele takšen vpliv, na primer, kadar:

— genski produkt, ki prispeva k tvorjenju sekundarnega presnovka, ki se tvori na koncu rasti, ne more spodbuditi začetka rasti.

2.4.4 Prenos genskega materiala

Vse več informacij je na voljo o prenosu genskega materiala med mikroorganizmi. Tudi kadar ima GSM zelo omejeno sposobnost za preživetje, bo pomembna odločitev o zmožnosti vnesenega genskega materiala za obstoj v okolju ali za prenos na druge organizme in povzročitev škode. Prenos genskega materiala se je pokazal na primer pri poskusnih pogojih v zemlji (vključno z rizosfero), živalskem črevesju in vodi prek konjugacije, transdukcije ali transformacije.

Možnost prenosa genskega materiala iz GSM z majhno verjetnostjo rasti in omejeno sposobnostjo za preživetje je zelo majhna. Kadar GSM ne nosi samoprenosljivih plazmidov ali transdukcijskih fagov, je aktivni prenos dejansko izključen. Tveganje bi bilo zelo majhno, kadar vektor/vključek ni samoprenosljiv in je malo mobilen.

(1) UL L 268, 29.10.1993, str. 71.

(2) UL L 155, 6.7.1995, str. 41.