Direktiva Komisije 2000/45/ES

z dne 6. julija 2000

o določitvi analitskih metod Skupnosti za določanje vitamina A, vitamina E in triptofana v krmi

(Besedilo velja za EGP)

KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE –

ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske skupnosti,

ob upoštevanju Direktive Sveta 70/373/EGS z dne 20. julija 1970 o uvedbi metod Skupnosti za vzorčenje in analizo za uradni nadzor krme [1], kakor je bila nazadnje spremenjena z Aktom o pristopu Avstrije, Finske in Švedske [2], in zlasti člena 2 Direktive,

ob upoštevanju naslednjega:

(1) Direktiva 70/373/EGS določa, da mora biti uradni nadzor krme za preverjanje skladnosti z zahtevami, ki izhajajo iz zakonov in drugih predpisov glede njihove kakovosti in sestave, izvajan z uporabo metod Skupnosti za vzorčenje in analizo.

(2) Direktiva Sveta 70/524/EGS z dne 23. novembra 1970 o dodatkih v krmi [3], kakor je bila nazadnje spremenjena z Uredbo Komisije (ES) št. 2439/1999 z dne 17. novembra 1999 [4], določa, da mora biti vsebnost vitamina A in vitamina B navedena na oznakah, če sta ti snovi dodani premiksom in krmi.

(3) Direktiva Sveta 79/373/EGS z dne 2. aprila 1979 o trženju krmnih mešanic [5], kakor je bila nazadnje spremenjena z Direktivo Komisije 2000/16/ES [6], in Direktiva Sveta 93/74/ES z dne 13. septembra 1993 o krmi za posebne prehranske namene [7], kakor je bila nazadnje spremenjena z Direktivo 96/25/ES [8], določata, da morajo biti aminokisline označene na oznakah krme.

(4) Treba je določiti metode Skupnosti za analizo za preverjanje teh snovi.

(5) Ukrepi, predvideni s to direktivo, so v skladu z mnenjem Stalnega odbora za krmo –

SPREJELA NASLEDNJO DIREKTIVO:

Člen 1

Države članice zagotovijo, da se analize, opravljane za uradni nadzor vitamina A, vitamina E in vsebnosti triptofana v krmi in premiksih, izvajajo z uporabo metode, opisane v Prilogi k tej direktivi.

Člen 2

1. Države članice sprejmejo zakone in druge predpise, potrebne za uskladitev s to direktivo, najpozneje do 31. avgusta 2000. O tem takoj obvestijo Komisijo.

Ukrepi se uporabljajo od 1. septembra 2000.

Države članice se v sprejetih ukrepih sklicujejo na to direktivo ali pa sklic nanjo navedejo ob njihovi uradni objavi. Način sklicevanja določijo države članice.

Člen 3

Ta direktiva začne veljati dvajseti dan po objavi v Uradnem listu Evropskih skupnosti.

Člen 4

Ta direktiva je naslovljena na države članice.

V Bruslju, 6. julija 2000

Za Komisijo

David Byrne

Član Komisije

[1] UL L 170, 3.8.1970, str. 2.

[2] UL C 241, 29.8.1994, str. 1.

[3] UL L 270, 14.12.1970, str. 1.

[4] UL L 297, 18.11.1999, str. 8.

[5] UL L 86, 6.4.1979, str. 30.

[6] UL L 105, 3.5.2000, str. 36.

[7] UL L 237, 22.9.1993, str. 23.

[8] UL L 125, 23.5.1996, str. 35.

--------------------------------------------------

PRILOGA

DEL A DOLOČANJE VITAMINA A

1. Namen in področje uporabe

Metoda se uporablja za določanje vitamina A (retinola) v krmi in premiksih. Vitamin A vključuje celoten trans-retinil alkohol in njegove cis izomere, ki se določijo s to metodo. Vsebnost vitamina A je izražena v mednarodnih enotah (IU) na kg. Ena IU ustreza aktivnosti 0,300 μg celotnega trans-vitamin A alkohola ali 0,344 μg acetata celotnega trans-vitamina A ali 0,550 μg palmitata celotnega trans-vitamina A.

Meja določanja je 2000 IU vitamina A/kg.

2. Princip

Vzorec hidroliziramo z raztopino etanolnega kalijevega hidroksida, vitamin A ekstrahiramo v petroleter. Topilo odstranimo z uparevanjem, ostanek raztopimo v metanolu in po potrebi razredčimo do zahtevane koncentracije. Vsebnost vitamina A določimo s plinsko kromatografijo visoke ločljivosti z reverzno fazo (RP–HPLC) z uporabo UV- ali fluorescenčnega detektorja. Kromatografske parametre izberemo tako, da se celoten trans-vitamin A alkohol in njegovi izomeri ne ločijo.

3. Reagenti

3.1. Etanol, σ = 96 %

3.2. Petroleter, vrelišče 40° do 60 °C

3.3. Metanol

3.4. Raztopina kalijevega hidroksida, β = 50 g/100 ml

3.5. Raztopina natrijevega askorbata, β = 10 g/100 ml (glej opažanja 7.7)

3.6. Natrijev sulfid, Na2S. x H2O (x = 7–9)

3.6.1. Raztopina natrijevega sulfida, c = 0,5 mol/l v glicerolu, β = 120 g/l (za x = 9) (glej opažanja 7.8)

3.7. Raztopina fenolftaleina, β = 2 g/100 ml v etanolu (3.1)

3.8. 2-propanol

3.9. Mobilna faza za HPLC: mešanica metanola (3.3) in vode, npr. 980 + 20 (v + v). Točno razmerje bo določeno glede na značilnosti uporabljene kolone.

3.10. Dušik brez kisika

3.11. Acetat celotnega trans-vitamina A, posebne čistosti, certificirane aktivnosti, npr. 2,80 x 10.6 IU/g

3.11.1. Osnovna raztopina acetata celotnega trans-vitamina A: s točnostjo 0,1 mg natehtamo 50 mg acetata vitamina A (3.11) v 100 ml merilno bučko. Raztopimo v 2-propanolu (3.8) in dopolnimo do oznake z istim topilom. Nominalna koncentracija te raztopine je 1400 enot IU vitamina A na ml. Točno vsebnost moramo določiti v skladu s 5.6.3.1.

3.12. Palmitat celotnega trans-vitamina A, posebne čistosti, certificirane aktivnosti, npr. 1,80 x 10.6 IU/g

3.12.1. Osnovna raztopina palmitata celotnega trans-vitamina A: s točnostjo 0,1 mg natehtamo 80 mg palmitata vitamina A (3.12) v 100 ml merilno bučko. Raztopimo v 2-propanolu (3.8) in dopolnimo do oznake z istim topilom. Nominalna koncentracija te raztopine je 1400 enot IU vitamina A na ml. Točno vsebnost maramo določiti v skladu s 5.6.3.2.

3.13. 2,6-Di-tert-butil-4-metilfenol (BHT) (glej opažanja 7.5)

4. Oprema

4.1. Rotacijski vakuumski uparjalnik

4.2. Temna steklovina

4.2.1. Bučke z ravnim dnom ali erlenmajerice, 500 ml, z brusom

4.2.2. Merilne bučke z zamaški iz brušenega stekla z ozkim vratom, 10, 25, 100 in 500 ml

4.2.3. Liji ločniki, konusni, 1000 ml, z zamaški iz brušenega stekla

4.2.4. Hruškaste buče, 250 ml, z brusi

4.3. Allihnov kondenzator, dolžina obroča 300 mm, s spojem iz brušenega stekla, z nastavkom za dovodno cev plina

4.4. Naguban filtrirni papir za ločenje faz, premera 185 mm (npr. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5. Oprema za kromatografijo HPLC s sistemom vbrizgavanja

4.5.1. Kolona za tekočinsko kromatografijo, 250 mm x 4 mm C18, 5 ali 10 μm polnitev, ali enakovredna (kriterij za zmogljivost: samo en vrh za vse izomere retinola pod pogoji kromatografije HPLC)

4.5.2. UV- ali fluorescenčni detektor s spremenljivo nastavitvijo valovne dolžine

4.6. Spektrofotometer z 10 mm kvarcnimi kivetami

4.7. Vodna kopel z magnetnim mešalnikom

4.8. Aparatura za ekstrakcijo (glej sliko 1), sestavljena iz:

4.8.1. Steklenega valja s kapaciteto l litra, opremljenega z vratom iz brušenega stekla in zamaškom

4.8.2. Vložka iz brušenega stekla, opremljenega s stransko ročico in nastavljivo cevjo, ki gre skozi središče. Nastavljiva cev mora imeti spodnji del v obliki črke U in vbrizg na nasprotnem koncu, tako da vrhnja plast tekočine v valju lahko preide v lij ločnik.

5. Postopek

Opomba

Vitamin A je občutljiv na (UV) svetlobo in oksidacijo. Vse operacije moramo izvajati brez svetlobe (z uporabo temne steklovine ali steklene posode, zaščitene z aluminijevo folijo) in kisika (spiranje z dušikom). Med ekstrakcijo je treba zrak nad tekočino zamenjati z dušikom (previsokemu tlaku se izognemo z občasnim popuščanjem zamaška).

5.1. Priprava vzorca

Vzorec zdrobimo tako, da preide skozi 1 mm sito in pri tem pazimo, da se ne razvije toplota. Drobljenje moramo izvesti tik pred tehtanjem in umiljenjem; v nasprotnem primeru lahko nastanejo izgube vitamina A.

5.2. Umiljanje

Odvisno od vsebnosti vitamina A natehtamo s točnostjo 0,01 g 2 g do 25 g vzorca v 500 ml bučko z ravnim dnom ali erlenmajerico (4.2.1). Nato postopoma dodajamo med obračanjem 130 ml etanola (3.1), približno 100 mg BHT (3.13), 2 ml raztopine natrijevega askorbata (3.5) in 2 ml raztopine natrijevega sulfida (3.6). Kondenzator (4.3) spojimo z bučko in potopimo bučko v vodno kopel z magnetnim mešalnikom (4.7). Segrejemo do vrenja in pustimo pod povratnim hladilnikom pet minut. Nato skozi kondenzator dodamo 25 ml raztopine kalijevega hidroksida (3.4) in pustimo pod povratnim hladilnikom nadaljnjih 25 minut, z mešanjem pod rahlim pretokom dušika. Nato kondenzator speremo s približno 20 ml vode in ohladimo vsebino bučke na sobno temperaturo.

5.3. Ekstrakcija

Z dekantiranjem prenesemo umilitveno raztopino kvantitativno v 1000 ml lij ločnik (4.2.3) ali v aparaturo za ekstrakcijo (4.8) tako, da jo speremo s skupno 250 ml vode. Nato bučko za umilitev speremo s 25 ml etanola (3.1) in nato s 100 ml petroletra (3.2) ter raztopine za izpiranje prenesemo v lij ločnik ali v aparaturo za ekstrakcijo. Razmerje vode in etanola v združenih raztopinah bi moralo znašati 2:1. Močno stresamo dve minuti in nato pustimo dve minuti, da se umiri.

5.3.1. Ekstrakcija z lijem ločnikom (4.2.3)

Ko so plasti ločene (glej opombo 7.3), prenesemo plast petroletra v drug lij ločnik (4.2.3). Ekstrakcijo ponovimo dvakrat s 100 ml petroletra (3.2) in dvakrat s 50 ml petroletra (3.2).

Dvakrat speremo združene ekstrakte v liju ločniku med rahlim obračanjem (da preprečimo nastanek emulzij) s 100 ml porcijami vode in nato s ponavljajočim se stresanjem z nadaljnjimi 100 ml porcijami vode, dokler voda ne postane brezbarvna, ko dodamo raztopino fenolftaleina (3.7) (navadno zadostuje štirikratno izpiranje). Filtriramo sprani ekstrakt skozi suh naguban filter za fazno ločevanje (4.4), da odstranimo suspendirano vodo, v 500 ml merilno bučko (4.2.2). Lij ločnik in filter speremo s 50 ml petroletra (3.2), dopolnimo do oznake s petroletrom (3.2) in dobro premešamo.

5.3.2. Ekstrakcija z uporabo aparature za ekstrakcijo

Ko so se plasti ločile (glej opombo 7.3), zamenjamo zamašek steklenega valja (4.8.1) z vložkom iz brušenega stekla (4.8.2) in namestimo spodnji del nastavljive cevi v obliki črke U tik nad raven vmesnika. S tlakom, ki ga tvori dušik v stranski ročici, zgornjo plast petroletra prenesemo v 1000 ml lij ločnik (4.2.3). Dodamo 100 ml petroletra (3.2) v stekleni valj, zamašimo in dobro pretresemo. Počakamo, da se plasti ločijo, in prenesemo zgornjo plast v lij ločnik tako kot prej. Ponovimo postopek ekstrakcije z novimi 100 ml petroletra (3.2), nato dvakrat s 50 ml porcijami petroletra (3.2) in dodamo plasti petroletra v lij ločnik.

Združene ekstrakte petroletra speremo, kakor je opisano pod 5.3.1, in nadaljujemo, kakor je tam opisano.

5.4. Priprava raztopine vzorca za HPCL

Odpipetiramo alikvot raztopine petroletra (iz 5.3.1 ali 5.3.2) v 250 ml hruškasto bučo (4.2.4). Topilo uparimo skoraj do suhega v rotacijskem uparjalniku (4.1) pri znižanem tlaku in temperaturi kopeli, ki ne presega 40 °C. Znova vzpostavimo atmosferski tlak z dovajanjem dušika (3.10) in bučko odstranimo iz rotacijskega uparjalnika. Preostalo topilo odstranimo v toku dušika (3.10) in ostanek takoj raztopimo v znanem volumnu (10–100 ml) metanola (3.3) (koncentracija vitamina A mora biti v območju od 5 IU/ml do 30 IU/ml).

5.5. Določanje s HPLC

Vitamin A ločimo na koloni C18 z reverzno fazo (4.5.1) in koncentracijo izmerimo z UV- detektorjem (325 nm) ali fluorescenčnim detektorjem (vzbujanje: 325 nm, emisija: 475 nm) (4.5.2).

Vbrizgamo alikvot (npr. 20 μl) metanolne raztopine, dobljene v skladu s 5.4, in eluiramo z mobilno fazo (3.9). Izračunamo srednjo vrednost višine (površine) vrhov za več vbrizgov iste raztopine vzorca in srednje vrednosti višin (površin) vrhov za več vbrizgov raztopin za umerjanje (5.6.2).

Pogoji za HPLC

Navedeni pogoji so dani kot vodilo; lahko se uporabijo tudi drugi pogoji, če dajo enakovredne rezultate.

Kolona za tekočinsko kromatografijo (4.5.1) | 250 mm x 4 mm C18, polnitev 5 ali 10 μm ali enakovredna |

Mobilna faza (3.9) | Mešanica metanola (3.3) in vode, npr. 980 + 20 (v + v) |

Hitrost pretoka | 1–2 ml/min |

Detektor (4.5.2) | UV-detektor (325 nm) ali fluorescenčni detektor (vzbujanje: 325 nm/emisija 475 nm) |

5.6. Umeritev

5.6.1. Priprava delovnih standardnih raztopin

Odpipetiramo 20 ml osnovne raztopine acetata vitamina A (3.11.1) ali 20 ml osnovne raztopine palmitata vitamina A (3.12.1) v 500 ml bučko z ravnim dnom ali erlenmajerico (4.2.1) in hidroliziramo, kakor je opisano pod 5.2, vendar brez dodatka BHT. Nato ekstrahiramo s petroetrom (3.2) v skladu s 5.3 in dopolnimo do 500 ml s petroletrom (3.2). 100 ml tega ekstrakta uparimo v rotacijskem uparjalniku (glej 5.4) skoraj do suhega, odstranimo preostalo topilo v toku dušika (3.10) in ponovno raztopimo ostanek v 10,0 ml metanola (3.3). Nominalna koncentracija te raztopine je 560 enot IU vitamina A na ml. Točno vsebnost moramo določiti v skladu s 5.6.3.3. Standardno delovno raztopino moramo sveže pripraviti pred uporabo.

Odpipetiramo 2,0 ml te delovne standardne raztopine v 20 ml merilno bučko, dopolnimo do oznake z metanolom (3.3) in premešamo. Nominalna koncentracija te razredčene delovne standardne raztopine je 56 enot IU vitamina A na ml.

5.6.2. Priprava raztopin za umeritev in umeritvena krivulja

Prenesemo 1,0, 2,0, 5,0 in 10,0 ml razredčene delovne standardne raztopine v serijo 20 ml merilnih bučk, dopolnimo do oznake z metanolom (3.3) in premešamo. Nominalne koncentracije teh raztopin so 2,8, 5,6, 14,0 in 28,0 IU vitamina A na ml.

Večkrat vbrizgamo 20 μl vsake od raztopin za umerjanje in določimo srednjo vrednost višin (površin) vrhov. Iz srednjih vrednosti višin (površin) vrhov pripravimo umeritveno krivuljo ob upoštevanju rezultatov UV-kontrole (5.6.3.3).

5.6.3. UV-standardizacija standardnih raztopin

5.6.3.1. Osnovna raztopina acetata vitamina A

Odpipetiramo 2,0 ml osnovne raztopine acetata vitamina A (3.11.1) v 50 ml merilno bučko (4.2.2) in dopolnimo do oznake z 2-propanolom (3.8). Nominalna koncentracija te raztopine je 56 IU vitamina A na ml. Odpipetiramo 3,0 ml te razredčene raztopine acetata vitamina A v 25 ml merilno bučko in dopolnimo do oznake z 2-propanolom (3.8). Nominalna koncentracija te raztopine je 6,72 IU vitamina A na ml. Izmerimo UV-spekter te raztopine proti 2-propanolu (3.8) v spektrofotometru (4.6) med 300 nm in 400 nm. Maksimum ekstinkcije mora biti med 325 nm in 327 nm.

Izračun vsebnosti vitamina A:

+++++ TIFF +++++

5.6.3.2. Osnovna raztopina palmitata vitamina A

Odpipetiramo 2,0 ml osnovne raztopine palmitata vitamina A (3.12.1) v 50 ml merilno bučko (4.2.2) in dopolnimo do oznake z 2-propanolom (3.8). Nominalna koncentracija te raztopine je 56 IU vitamina A na ml. Odpipetiramo 3,0 ml te razredčene raztopine palmitata vitamina A v 25 ml merilno bučko in dopolnimo do oznake z 2-propanolom (3.8). Nominalna koncentracija te raztopine je 6,72 IU vitamina A na ml. Izmerimo UV-spekter te raztopine proti 2-propanolu (3.8) v spektrofotometru (4.6) med 300 nm in 400 nm. Maksimum ekstinkcije mora biti med 325 nm in 327 nm.

Izračun vsebnosti vitamina A:

+++++ TIFF +++++

5.6.3.3. Delovna standardna raztopina vitamina A

Odpipetiramo 3,0 ml nerazredčene delovne standardne raztopine vitamina A, pripravljene v skladu s 5.6.1, v 50 ml merilno bučko (4.2.2) in dopolnimo do oznake z 2-propanolom (3.8). Odpipetiramo 5,0 ml te raztopine v 25 ml merilno bučko in dopolnimo do oznake z 2-propanolom (3.8). Nominalna koncentracija te raztopine je 6,72 IU vitamina A na ml. Izmerimo UV-spekter te raztopine proti 2-propanolu (3.8) v spektrofotometru (4.6) med 300 nm in 400 nm. Maksimalna ekstinkcija mora biti med 325 nm in 327 nm.

Izračun vsebnosti vitamina A:

+++++ TIFF +++++

6. Izračun rezultatov

Iz srednje vrednosti višin (površin) vrhov vitamina A iz raztopine vzorca določimo koncentracijo raztopine vzorca v IU/ml iz umeritvane krivulje (5.6.2).

Vsebnost vitamina A w v IU/kg v vzorcu je dana z naslednjo formulo:

w =

500 . β . V

. 1000

V

. m

pri čemer je:

β = koncentracija raztopine vzorca vitamina A (5.4) v IU/ml

V1 = volumen raztopine vzorca (5.4) v ml

V2 = volumen alikvota, uporabljenega v 5.4, v ml

m = masa preskusnega vzorca v g

7. Opažanja

7.1. Za vzorce z nizko koncentracijo vitamina A je morda koristno združiti ekstrakte petroletra iz dveh umilitvenih šarž (natehtana množina: 25 g) v eno raztopino vzorca za določanje s HPLC.

7.2. Masa vzorca, ki ga vzamemo za analizo, ne sme vsebovati več kakor 2 g maščobe.

7.3. Če se ločitev faz ne pojavi, dodamo približno 10 ml etanola (3.1) za razbitje emulzije.

7.4. Pri ribjem olju in drugih čistih maščobah se čas umiljenja lahko podaljša na 45–60 minut.

7.5. Namesto BHT se lahko uporabi hidrokinon.

7.6. Z uporabo običajne fazne kolone je možno ločiti izomere retinola.

7.7. Približno 150 mg askorbinske kisline se lahko uporabi namesto raztopine natrijevega askorbata.

7.8. Približno 50 mg EDTA se lahko uporabi namesto raztopine natrijevega sulfida.

8. Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati 15 % glede na višji rezultat.

9. Rezultati medlaboratorijske študije [1]

L : število laboratorijev

n : število posameznih vrednosti

sr : standardni odmik ponovljivosti

sR : standardni odmik obnovljivosti

r : ponovljivost

R : obnovljivost

CVr : koeficient variacije ponovljivosti

CVR : koeficient variacije obnovljivosti

| Premiks | Krmna mešanica | Mineralni koncentrat | Beljakovinska krma | Pujski |

L | 13 | 12 | 13 | 12 | 13 |

n | 48 | 45 | 47 | 46 | 49 |

srednja vr. [IU/kg] | 17,02 x 106 | 1,21 x 106 | 537100 | 151800 | 18070 |

sr [IU/kg] | 0,51 x 106 | 0,039 x 106 | 22080 | 12280 | 682 |

r [IU/kg] | 1,43 x 106 | 0,109 x 106 | 61824 | 34384 | 1910 |

CVr [%] | 3,0 | 3,5 | 4,1 | 8,1 | 3,8 |

sR [IU/kg] | 1,36 | 0,069 x 106 | 46300 | 23060 | 3614 |

R [IU/kg] | 3,81 x 106 | 0,193 x 106 | 129640 | 64568 | 10119 |

CVR [%] | 8,0 | 6,2 | 8,6 | 15 | 20 |

+++++ TIFF +++++

DEL B DOLOČANJE VITAMINA E

1. Namen in področje uporabe

Metoda se uporablja za določanje vitamina E v krmi in premiksih. Vsebnost vitamina E se izrazi v mg DL-α-tokoferol acetata na kg. 1 mg DL-α-tokoferol acetata ustreza 0,91 mg DL-α-tokoferola (vitamina E).

Meja določanja je 2 mg vitamina E/kg.

2. Princip

Vzorec hidroliziramo z raztopino etanolnega kalijevega hidroksida, vitamin E ekstrahiramo v petroleter. Topilo odstranimo z uparevanjem, ostanek raztopimo v metanolu in po potrebi razredčimo do zahtevane koncentracije. Vsebnost vitamina E določimo s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti z reverzno fazo (RP–HPLC) z uporabo UV- ali fluorescenčnega detektorja.

3. Reagenti

3.1. Etanol, σ = 96 %

3.2. Petroleter, vrelišče 40!!! error character !!! Β!!! error character !!! Ί– 60 °C

3.3. Metanol

3.4. Raztopina kalijevega hidroksida, β = 50 g/100 ml

3.5. Raztopina natrijevega askorbata, β = 10 g/100 ml (glej opažanja 7.7)

3.6. Natrijev sulfid, Na2S · x H2O (x = 7–9)

3.6.1. Raztopina natrijevega sulfida, c = 0,5 mol/l v glicerolu, β = 120 g/l (za x = 9) (glej opažanja 7.8)

3.7. Raztopina fenolftaleina, β = 2 g/100 ml v etanolu (3.1)

3.8. Mobilna faza za HPCL: mešanica metanola (3.3) in vode, npr. 980 + 20 (v + v). Točno razmerje bo določeno glede na značilnosti uporabljene kolone.

3.9. Dušik, brez kisika

3.10. Acetat DL-α-tokoferola, posebne čistosti, certificirane aktivnosti

3.10.1. Osnovna raztopina acetata DL-α-tokoferola: natehtamo s točnostjo 0,1 mg 100 mg acetata DL-α-tokoferola (3.10) v 100 ml merilno bučko. Raztopimo v etanolu (3.1) in dopolnimo do oznake z istim topilom. 1 ml te raztopine vsebuje 1mg acetata DL-α-tokoferola. (UV-kontrola, glej 5.6.1.3; stabilizacija, glej opažanja 7.4).

3.11. DL-α-tokoferol, posebne čistosti, certificirane aktivnosti

3.11.1. Natehtamo s točnostjo 0,1 mg 100 mg acetata DL-α-tokoferola (3.10) v 100 ml merilno bučko. Raztopimo v etanolu (3.1) in dopolnimo do oznake z istim topilom. 1 ml te raztopine vsebuje 1mg DL-α-tokoferola. (UV kontrola, glej 5.6.2.3; stabilizacija glej 7.4 opažanja).

3.12. 2,6 Di-tert-butil-4-metilfenol (BHT) (glej 7.5 opažanja)

4. Oprema

4.1. Rotacijski vakuumski uparjalnik

4.2. Temna steklovina

4.2.1. Bučke z ravnim dnom ali erlenmajerice, 500 ml, z brusom

4.2.2. Merilne bučke z zamaški iz brušenega stekla, z ozkim vratom, 10, 25, 100 in 500 ml

4.2.3. Liji ločniki, konusni, 1000 ml, z zamaški iz brušenega stekla

4.2.4. Hruškaste bučke, 250 ml, z zamaški iz brušenega stekla

4.3. Allihnov kondenzator, dolžina obroča 300 mm, s spojem iz brušenega stekla, z nastavkom za dovodno cev plina

4.4. Naguban filtrirni papir za ločevanje faz, premera 185 mm (npr. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5. Oprema za kromatografijo HPLC s sistemom vbrizgavanja

4.5.1. Kolona za tekočinsko kromatografijo, 250 mm x 4 mm C18, 5 ali 10 μm polnitev, ali enakovredna

4.5.2. Fluorescenčni ali UV-detektor, s spremenljivo nastavitvijo valovne dolžine

4.6. Spektrofotometer z 10 mm kvarcnimi kivetami

4.7. Vodna kopel z magnetnim mešalnikom

4.8. Aparatura za ekstrakcijo (glej skico 1), sestavljena iz:

4.8.1. Steklenega valja s kapaciteto l litra, opremljenega z vratom iz brušenega stekla in zamaškom

4.8.2. Vložka iz brušenega stekla, opremljenega s stransko ročico in nastavljivo cevjo, ki gre skozi središče. Nastavljiva cev mora imeti spodnji del v obliki črke U in vbrizg na nasprotnem koncu, tako da vrhnja plast tekočine v valju lahko preide v lij ločnik.

5. Postopek

Opomba

Vitamin E je občutljiv na (UV) svetlobo in oksidacijo. Vse operacije moramo izvajati brez svetlobe (z uporabo temne steklovine ali steklene posode, zaščitene z aluminijevo folijo) in kisika (spiranje z dušikom). Med ekstrakcijo je treba zrak nad tekočino zamenjati z dušikom (previsokemu tlaku se izognemo z občasnim popuščanjem zamaška).

5.1. Priprava vzorca

Vzorec zdrobimo tako, da preide skozi 1 mm sito in pri tem pazimo, da se ne razvije toplota. Drobljenje moramo izvesti tik pred tehtanjem in umiljenjem; v nasprotnem primeru lahko nastanejo izgube vitamina E.

5.2. Umiljanje

Odvisno od vsebnosti vitamina E natehtamo s točnostjo 0,01 g 2 g do 25 g vzorca v 500 ml bučko z ravnim dnom ali erlenmajerico (4.2.1). Nato postopoma dodajamo med obračanjem 130 ml etanola (3.1), približno 100 mg BHT (3.12), 2 ml raztopine natrijevega askorbata (3.5) in 2 ml raztopine natrijevega sulfida (3.6). Kondenzator (4.3) spojimo z bučko in potopimo bučko v vodno kopel z magnetnim mešalnikom (4.7). Segrejemo do vrenja in pustimo pod povratnim hladilnikom 5 minut. Nato skozi kondenzator dodamo 25 ml raztopine kalijevega hidroksida (3.4) in pustimo pod povratnim hladilnikom še 25 minut, z mešanjem pod rahlim pretokom dušika. Nato kondenzator speremo s približno 20 ml vode in ohladimo vsebino bučke na sobno temperaturo.

5.3. Ekstrakcija

Z dekantiranjem prenesemo umilitveno raztopino kvantitativno v 1000 ml lij ločnik (4.2.3) ali v aparaturo za ekstrakcijo (4.8) tako, da jo spiramo s skupno 250 ml vode. Nato bučko za umiljanje speremo s 25 ml etanola (3.1) in 100 ml petroletra (3.2) ter raztopine za izpiranje prenesemo v lij ločnik ali v aparaturo za ekstrakcijo. Razmerje vode in etanola v združenih raztopinah bi moralo znašati 2:1. Močno stresamo dve minuti in nato pustimo dve minuti, da se umiri.

5.3.1. Ekstrakcija z lijem ločnikom (4.2.3)

Ko so plasti ločene (glej opombo 7.3), prenesemo plast petroletra v drug lij ločnik (4.2.3). Ekstrakcijo ponovimo dvakrat s 100 ml petroletra (3.2) in dvakrat s 50 ml petroletra (3.2).

Dvakrat speremo združene ekstrakte v liju ločniku med rahlim obračanjem (da preprečimo nastanek emulzij) s 100 ml porcijama vode in nato s ponavljajočim se stresanjem z nadaljnjimi 100 ml porcijami vode, dokler voda ne postane brezbarvna, ko dodamo raztopino fenolftaleina (3.7) (navadno zadostuje štirikratno izpiranje). Filtriramo sprani ekstrakt skozi suh naguban filter za ločevanje faz (4.4), da odstranimo suspendirano vodo, v 500 ml merilno bučko (4.2.2). Lij ločnik in filter speremo s 50 ml petroletra (3.2), dopolnimo do oznake s petroletrom (3.2) in dobro premešamo.

5.3.2. Ekstrakcija z uporabo aparature za ekstrakcijo (4.8)

Ko so se plasti ločile (glej opombo 7.3), zamenjamo zamašek steklenega valja (4.8.1) z vložkom iz brušenega stekla (4.8.2) in namestimo spodnji del nastavljive cevi v obliki črke U tik nad raven vmesnika. S tlakom, ki ga tvori dušik v stranski ročici, zgornjo plast petroletra prenesemo v 1000 ml lij ločnik (4.2.3). Dodamo 100 ml petroletra (3.2) v stekleni valj, zamašimo in dobro pretresemo. Počakamo, da se plasti ločijo, in prenesemo zgornjo plast v lij ločnik tako kot prej. Ponovimo postopek ekstrakcije z novimi 100 ml petroletra (3.2), nato dvakrat s 50 ml porcijami petroletra (3.2) in dodamo plasti petroletra v lij ločnik.

Združene ekstrakte petroletra speremo, kakor je opisano pod 5.3.1, in nadaljujemo, kakor je tam opisano.

5.4. Priprava raztopine vzorca za HPCL

Odpipetiramo alikvot raztopine petroletra (iz 5.3.1 ali 5.3.2) v 250 ml hruškasto bučko (4.2.4). Topilo uparimo skoraj do suhega v rotacijskem uparjalniku (4.1) pri znižanem tlaku pri temperaturi kopeli, ki ne presega 40 °C. Znova vzpostavimo atmosferski tlak z dovajanjem dušika (3.9) in bučko odstranimo iz rotacijskega uparjalnika. Preostalo topilo odstranimo v toku dušika (3.9) in ostanek takoj raztopimo v znanem volumnu (10–100 ml) metanola (3.3) (koncentracija DL-α-tokoferola mora biti v območju od 5 μg/ml do 30 μg/ml).

5.5. Določanje s HPLC

Vitamin E ločimo na koloni C18 z reverzno fazo (4.5.1), koncentracijo izmerimo s fluorescenčnim detektorjem (vzbujanje: 295 nm, emisija: 330 nm) ali z UV-detektorjem (292 nm) (4.5.2).

Vbrizgamo alikvot (npr. 20 μl) metanolne raztopine, dobljene v skladu s 5.4, in eluiramo z mobilno fazo (3.8). Izračunamo srednje vrednosti višin (površin) vrhov za več vbrizgov iste raztopine vzorca in srednje vrednosti višin (površin) vrhov za več vbrizgov raztopin za umeritev (5.6.2).

Pogoji za HPLC

Navedeni pogoji so dani kot vodilo; lahko se uporabijo tudi drugi pogoji, če dajo enakovredne rezultate.

Kolona za tekočinsko kromatografijo (4.5.1): | 250 mm x 4 mm C18, polnitev 5 ali 10 μm ali enakovredna |

Mobilna faza (3.8): | Mešanica metanola (3.3) in vode, npr. 980 + 20 (v + v) |

Hitrost pretoka: | 1–2 ml/min |

Detektor (4.5.2): | Fluorescenčni detektor (Vzbujanje: 295nm/emisija: 330 nm) ali UV-detektor (292 nm) |

5.6. Umeritev (acetat DL-α-tokoferola ali DL-α-tokoferol)

5.6.1. Standardni acetat DL-α-tokoferola

5.6.1.1. Priprava delovne standardne raztopine

Odpipetiramo 25 ml osnovne raztopine acetata DL-α-tokoferola (3.10.1) v 500 ml bučko z ravnim dnom ali erlenmajerico (4.2.1) in hidroliziramo, kakor je opisano pod 5.2. Nato ekstrahiramo s petroetrom (3.2) v skladu s 5.3 in dopolnimo do 500 ml s petroletrom. 25 ml tega ekstrakta uparimo v rotacijskem uparjalniku (glej 5.4) skoraj do suhega, odstranimo preostalo topilo v toku dušika (3.9) in ponovno raztopimo ostanek v 25,0 ml metanola (3.3). Nominalna koncentracija te raztopine je 45,5 μg DL-α-tokoferola na ml, kar je enakovredno 50 μg acetata DL-α-tokoferola na ml. Standardno delovno raztopino moramo sveže pripraviti pred uporabo.

5.6.1.2. Priprava raztopin za umeritev in umeritvena krivulja

Prenesemo 1,0, 2,0, 4,0 in 10,0 ml delovne standardne raztopine v serijo 20 ml merilnih bučk, dopolnimo do oznake z metanolom (3.3) in premešamo. Nominalne koncentracije teh raztopin so 2,5, 5,0, 10,0 in 25,0 μg/ml acetata DL-α-tokoferola, to je 2,28, 4,55, 9,10 μg/ml in 22,8 μg/ml DL-α-tokoferola.

Večkrat vbrizgamo 20 μl vsake od raztopin za umeritev in določimo srednje vrednosti višin (površin) vrhov. Iz srednjih vrednosti višin (površin) vrhov pripravimo umeritveno krivuljo.

5.6.1.3 UV-standardizacija osnovne raztopine acetata DL-α-tokoferola (3.10.1)

Razredčimo 5,0 ml osnovne raztopine DL-α-tokoferola (3.10.1) na 25,0 ml z etanolom in izmerimo UV-spekter raztopine proti etanolu (3.1) v spektrofotometru (4.6) med 250 nm in 320 nm.

Maksimum absorpcije bi moral biti pri 284 nm:

+++++ TIFF +++++

(= 43,6 pri 284 v etanolu

Pri tem razredčenju bi morali dobiti vrednost ekstinkcije 0,84 do 0,88.

5.6.2. DL-α-tokoferol standard

5.6.2.1. Priprava delovne standardne raztopine

Odpipetiramo 2,0 ml osnovne raztopine DL-α-tokoferola (3.11.1) v 50 ml merilno bučko, raztopimo v metanolu (3.3) in dopolnimo z metanolom do oznake. Nominalna koncentracija te raztopine je 40 μg DL-α-tokoferola na ml oz. 44,0 μg acetata DL-α-tokoferola na ml. Standardno delovno raztopino moramo sveže pripraviti pred uporabo.

5.6.2.2. Priprava raztopin za umeritev in umeritvena krivulja

Prenesemo 1,0, 2,0, 4,0 in 10,0 ml delovne standardne raztopine v serijo 20 ml merilnih bučk, dopolnimo do oznake z metanolom (3.3) in premešamo. Nominalne koncentracije teh raztopin so 2,0, 4,0, 8,0 in 20,0 μg/ml DL-α-tokoferola, to je 2,20, 4,40, 8,97 μg/ml in 22,0 μg/ml acetata DL-α-tokoferola.

Večkrat vbrizgamo 20 μl vsake od raztopin za umerjanje in določimo srednje vrednosti višin (površin) vrhov. Iz srednjih vrednosti višin (površin) vrhov pripravimo umeritveno krivuljo.

5.6.2.3. UV-standardizacija osnovne raztopine DL-α-tokoferola (3.11.1)

Razredčimo 2,0 ml osnovne raztopine DL-α-tokoferola (3.11.1) do 25,0 ml z etanolom in izmerimo UV-spekter te raztopine proti etanolu (3.1) v spektrofotometru (4.6) med 250 nm in 320 nm. Maksimum absorpcije bi moral biti pri 292 nm:

+++++ TIFF +++++

Pri tem razredčenju bi morali dobiti vrednost ekstinkcije 0,6.

6. Izračun rezultatov

Iz srednje vrednosti višine (površine) vrhov vitamina E iz raztopine vzorca določimo koncentracijo raztopine vzorca v μg/ml (izračunane kot acetat DL-α-tokoferola) iz umeritvene krivulje (5.6.1.2 ali 5.6.2.2).

Vsebnost vitamina E w v mg/kg v vzorcu je dana z naslednjo formulo:

+++++ TIFF +++++

pri čemer je:

β = koncentracija vitamina E (5.4) v raztopini vzorca v μg/ml

V1 = volumen raztopine vzorca (5.4) v ml

V2 = volumen alikvota, uporabljenega v 5.4, v ml

m = masa preskusnega vzorca v g

7. Opažanja

7.1. Za vzorce z nizko koncentracijo vitamina E je morda koristno združiti ekstrakte petroletra iz dveh umilitvenih šarž (natehtana množina: 25 g) v eno raztopino vzorca za določanje s HPLC.

7.2. Masa vzorca, ki ga vzamemo za analizo, ne sme biti vsebovati več kakor 2 g maščobe.

7.3. Če se ločitev faz ne pojavi, dodamo približno 10 ml etanola (3.1) za razbitje emulzije.

7.4. Po spektrofotometrični meritvi acetata DL-α-tokoferola ali raztopine DL-α-tokoferola v skladu s 5.6.1.3 ali pa 5.6.2.3 dodamo približno 10 mg BHT (3.12) v raztopino (3.10.1 ali 3.10.2) in hranimo raztopino v hladilniku (rok hranjenja je največ štiri tedne).

7.5. Namesto BHT lahko uporabimo hidrokinon.

7.6. Z uporabo običajne fazne kolone je možno ločiti α-, β-, γ- in δ-tokoferol.

7.7. Približno 150 mg askorbinske kisline se lahko uporabi namesto raztopine natrijevega askorbata.

7.8. Približno 50 mg EDTA se lahko uporabi namesto raztopine natrijevega sulfida.

8. Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati 15 % glede na najvišji rezultat.

9. Rezultati medlaboratorijske študije [2]

L : število laboratorijev

n : število posameznih vrednosti

sr : standardni odmik ponovljivosti

sR : standardni odmik obnovljivosti

r : ponovljivost

R : obnovljivost

CVr : koeficient variacije ponovljivosti

CVR : koeficient variacije obnovljivosti

| Premiks | Krmna mešanica | Mineralni koncentrat | Proteinska krma | Pujski |

L | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |

n | 48 | 48 | 48 | 48 | 48 |

srednja vr. [mg/kg] | 17380 | 1187 | 926 | 315 | 61,3 |

sr [mg/kg] | 384 | 45,3 | 25,2 | 13,0 | 2,3 |

r [mg/kg] | 1075 | 126,8 | 70,6 | 36,4 | 6,4 |

CVr [%] | 2,2 | 3,8 | 2,7 | 4,1 | 3,8 |

sR [mg/kg] | 830 | 65,0 | 55,5 | 18,9 | 7,8 |

R [mg/kg] | 2324 | 182,0 | 155,4 | 52,9 | 21,8 |

CVR [%] | 4,8 | 5,5 | 6,0 | 6,0 | 12,7 |

+++++ TIFF +++++

DEL C DOLOČANJE TRIPTOFANA

1. Namen in področje uporabe

Metoda se uporablja za določanje celotnega in prostega triptofana v krmi in ne razlikuje med oblikama D- in L-.

2. Princip

Za določanje celotnega triptofana vzorec hidroliziramo pod alkalnimi pogoji z nasičeno raztopino barijevega hidroksida in segrevamo do 100 °C 20 ur. Po hidrolizi dodamo notranji standard.

Za določanje prostega triptofana vzorec ekstrahiramo pod rahlo kislimi pogoji v prisotnosti notranjega standarda.

Triptofan in notranji standard v hidrolizatu ali v ekstraktu določimo s HPLC s fluorescenčno detekcijo.

3. Reagenti

3.1. Uporabljati moramo dvakrat destilirano vodo ali vodo enake kakovosti (prevodnost < 10 μS/cm)

3.2. Standardna snov: triptofan (čistota/vsebnost 99 %), osušena v vakuumu nad fosforjevim pentoksidom

3.3. Notranji standard: α-metil-triptofan (čistota/vsebnost 99 %), posušen v vakuumu nad fosforjevim pentoksidom

3.4. Barijev hidroksid oktahidrat (paziti je treba, da Ba(OH)2 !!! error character !!! Β· 8 H2O ni pretirano izpostavljen zraku, da se ne bi tvoril BaCO3, ki bi lahko motil določanje) (glej opažanja 9.3)

3.5. Natrijev hidroksid

3.6. Orto-fosforjeva kislina, w = 85 %

3.7. Klorovodikova kislina, p20 = 1,19 g/ml

3.8. Metanol za HPLC

3.9. Petroleter, vrelišče 40–60 °C

3.10. Raztopina natrijevega hidroksida, c = 1 mol/l:

Raztopimo 40,0 g NaOH (3.5) v vodi in dopolnimo do 1 l z vodo (3.1).

3.11. Klorovodikova kislina, c = 6 mol/l:

492 ml HCl (3.7) dopolnimo do 1 l z vodo.

3.12. Klorovodikova kislina, c = 1 mol/l:

82 ml HCl (3.7) dopolnimo do 1 l z vodo.

3.13. Klorovodikova kislina, c = 0,1 mol/l:

8,2 ml HCl (3.7) dopolnimo do 1 l z vodo.

3.14. Orto-fosforjeva kislina, c = 0,5 mol/l:

34 ml orto-fosforne kisline (3.6) dopolnimo do 1 l z vodo (3.1).

3.15. Koncentrirana raztopina triptofana (3.2), c = 2,50 μmol/ml:

V 500 ml merilni bučki raztopimo 0,2553 g triptofana (3.2) v klorovodikovi kislini (3.13) in dopolnimo do oznake s klorovodikovo kislino (3.13). Hranimo pri – 18 °C največ štiri tedne.

3.16. Koncentrirana raztopina notranjega standarda, c = 2,50 μmol/ml:

V 500 ml merilni bučki raztopimo 0,2728 g α-metil-triptofana (3.3) v klorovodikovi kislini (3.13) in dopolnimo do oznake s klorovodikovo kislino (3.13). Hranimo pri – 18 °C največ štiri tedne.

3.17. Standardna raztopina triptofana in notranjega standarda za umeritev:

Vzamemo 2,00 ml koncentrirane raztopine triptofana (3.15) in 2,00 ml koncentrirane (g α-metil-triptofan) raztopine notranjega standarda (3.16). Razredčimo z vodo (3.1) in metanolom (3.8) na približno enaka volumna in na približno enako koncentracijo metanola (10–30 %) kot pri končnem hidrolizatu.

To raztopino moramo sveže pripraviti pred uporabo.

Med pripravo jo zaščitimo pred neposredno sončno svetlobo.

3.18. Ocetna kislina

3.19. 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanol

3.20. Etanolamin > 98 %

3.21. Raztopina 1 g 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanola (3.19) v 100 ml metanola (3.8)

3.22. Mobilna faza za HPLC: 3,00 g ocetne kisline (3.18) in 900 ml vode (3.1) + 50,0 ml raztopine (3.21) 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanola (3.19) v metanolu (3.8) (1g/100 ml). Naravnamo pH na 5,00 z uporabo etanolamina (3.20). Dopolnimo do 1000 ml z vodo (3.1)

4. Oprema

4.1. HPLC oprema s spektrofluorimetričnim detektorjem

4.2. Kolona za tekočinsko kromatografijo, 125 mm x 4 mm C18, 3 μm polnitev ali enakovredna

4.3. pH-meter

4.4. Bučka iz polipropilena, vsebine 125 ml, s širokim vratom in zamaškom z navojem

4.5. Membranski filter, 0,45 μm

4.6. Avtoklav, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) bara

4.7. Mehanski stresalnik ali magnetno mešalo

4.8. Vorteks mešalnik

5. Postopek

5.1. Priprava vzorca

Vzorec zdrobimo, tako da preide skozi 0,5 mm sito. Vzorce z visoko vlago moramo pred drobljenjem osušiti ali na zraku ali pri temperaturi, ki ne presega 50 °C ali pa osušiti z zmrzovanjem. Vzorce z visoko vsebnostjo maščobe je treba pred drobljenjem ekstrahirati s petroletrom (3.9).

5.2. Določanje prostega triptofana (ekstrakt)

Natehtamo s točnostjo 1 mg primerno množino (1–5 g) pripravljenega vzorca (5.1) v 500 ml erlenmajerico. Dodamo 100,0 ml klorovodikove kisline, c = 0,1 mol/l (3.13) in 5,00 ml koncentrirane raztopine notranjega standarda (3.16). Stresamo ali mešamo 60 minut z mehanskim stresalnikom ali magnetnim mešalom (4.7). Pustimo, da se usedlina usede na dno in odpipetiramo 10,0 ml raztopine nad usedlino v čašo. Dodamo 5 ml ortofosforjeve kisline, c = 0,5 mol/l (3.14). Naravnamo pH na 3,0 z raztopino natrijevega hidroksida, c = 1,0 mol/l (3.10). Dodamo dovolj metanola (3.8), da dobimo v končnem volumnu koncentracijo metanola med 10 in 30 %. Prenesemo v merilno bučko primerne prostornine in razredčimo z vodo na volumen, ki je potreben za kromatografijo (približno enaki volumni kot pri standardni raztopini za umeritev (3.17)).

Pred vbrizganjem na HPLC kolono nekoliko ml raztopine prefiltriramo skozi 0,45 μm membranski filter (4.5). Nadaljujemo kromatografijo v skladu z odstavkom 5.4.

Standardno raztopino in ekstrakte zaščitimo pred neposredno sončno svetlobo. Če ni možno analizirati ekstraktov istega dne, jih lahko hranimo pri 5 °C največ tri dni.

5.3. Določanje celotnega triptofana (hidrolizat)

Natehtamo s točnostjo 0,2 mg od 0,1 do 1 g pripravljenega vzorca (5.1) v bučko iz polipropilena (4.4). Natehtani del vzorca bi moral imeti vsebnost dušika približno 10 mg. Dodamo 8,4 mg barijevega hidroksida oktahidrata (3.4) in 10 ml vode. Mešamo na vorteks mešalniku (4.8) ali z magnetnim mešalom (4.7). S teflonom prevlečeni magnet pustimo v mešanici. Stene posode speremo s 4 ml vode. Zapremo z vijačnim pokrovom in na rahlo zapremo bučko. Prenesemo v avtoklav (4.6) z vrelo vodo in pustimo v pari 30–60 minut. Zapremo avtoklav in avtoklaviramo pri 110 (± 2) °C 20 ur.

Preden odpremo avtoklav, zmanjšamo temperaturo nekoliko pod 100 °C. Da preprečimo kristalizacijo Ba(OH)2. 8 H2O, dodamo topli mešanici 30 ml vode, ki ima sobno temperaturo. Rahlo pretresemo ali mešamo. Dodamo 2,00 ml koncentrirane raztopine notranjega standarda (α-metil-triptofana) (3.16). Posode hladimo na vodni/ledeni kopeli 15 minut.

Nato dodamo 5 ml ortofosforjeve kisline, c = 0,5 mol/l (3.14). Posodo zadržimo v hladilni kopeli in nevtraliziramo s HCl, c = 6 mol/l (3.11) med mešanjem ter s HCl, c = 1 mol/l (3.12) naravnamo pH na 3,0. Dodamo dovolj metanola, da dobimo v končnem volumnu koncentracijo metanola med 10 in 30 %. Prenesemo v merilno bučko primerne prostornine in razredčimo z vodo do volumna, potrebnega za kromatografijo (na primer 100 ml). Dodatek metanola ne sme povzročiti obarjanja.

Pred vbrizganjem na HPLC kolono prefiltriramo nekoliko ml raztopine skozi 0,45 μm membranski filter (4.5). Nadaljujemo kromatografijo v skladu z odstavkom 5.4.

Standardno raztopino in hidrolizate zaščitimo pred neposredno sončno svetlobo. Če ne moremo analizirati hidrolizatov istega dne, jih lahko hranimo pri 5 °C največ tri dni.

5.4. Določanje s HPCL

Navedeni pogoji za izokratsko eluiranje so ponujeni kot vodilo; lahko se uporabijo tudi drugi pogoji, če dajo enakovredne rezultate (glej tudi opažanja 9.1 in 9.2).

Kolona za tekočinsko kromatografijo (4.2.): | 125 mm x 4 mm C18, polnitev 3 μm ali enakovredna |

Temperatura kolone: | sobna temperatura |

Mobilna faza (3.22): | 3,00 g ocetne kisline (3.18) + 900 ml vode (3.1) + 50,0 ml raztopine (3.21) 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanola (3.19) v metanolu (3.8) (1 g/100ml). Naravnamo pH na 5,00 z uporabo etanolamina (3.20). Dopolnimo do 1000 ml z vodo (3.1) |

Hitrost pretoka: | 1 ml/min |

Celoten čas poteka: | približno 34 minut |

Detekcija valovnih dolžin: | vzbujanje 280 nm, emisija 356 nm |

Volumen vbrizga: | 20 μl |

6. Izračun rezultatov

+++++ TIFF +++++

A = površina vrha notranjega standarda, standardna raztopina za umeritev (3.17)

B = površina vrha triptofana, ekstrakt (5.2) ali hidrolizat (5.3)

C = volumen, v ml (2 ml), koncentrirane raztopine triptofana (3.15), dodan raztopini za umeritev (3.17)

D = koncentracija, v μmol/ml (= 2,50), koncentrirane raztopine tritofana (3.15), dodane raztopini za umeritev (3.17)

E = volumen, v ml, koncentrirane raztopine notranjega standarda (3.16), dodan pri ekstrakciji (5.2) (= 5,00 ml) ali hidrolizatu (5.3) (= 2,00 ml)

F = površina vrha notranjega standarda, ekstrakt (5.2) ali hidrolizat (5.3)

G = površina vrha triptofana, standardna raztopina za umeritev (3.17)

H = volumen, v ml (2 ml), koncentrirane raztopine notranjega standarda (3.16), dodan standardni raztopini za umeritev (3.17)

W = masa vzorca v g (korigirana na prvotno maso, če je posušen, in/ali razmaščen)

MW = molekulska masa triptofana (= 204,23)

7. Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati 10 % glede na najvišji rezultat.

8. Rezultati medlaboratorijske študije

Organizirana je bila medlaboratorijska študija Skupnosti (četrta medsebojna primerjava), v kateri so tri vzorce analizirali v do 12 laboratorijih, da bi certificirali metodo glede hidrolize. Vsak vzorec je bil analiziran s petkratno ponovitvijo. Rezultati so v naslednji tabeli:

L : število laboratorijev, ki so dostavili rezultate

n : število posameznih rezultatov po odstranitvi ubežnikov (določenih s Cochran, Dixon testom za ubežnike)

sr : standardni odmik ponovljivosti

sR : standardni odmik obnovljivosti

r : ponovljivost

R : obnovljivost

CVr : koeficient variacije ponovljivosti, %

CVR : koeficient variacije obnovljivosti, %

| Vzorec 1 Krma za prašiče | Vzorec 2 Krma za prašiče z dodatkom L-triptofana | Vzorec 3 Krmni koncentrat za prašiče |

L | 12 | 12 | 12 |

n | 50 | 55 | 50 |

srednja vr. [g/kg] | 2,42 | 3,40 | 4,22 |

sr [g/kg] | 0,05 | 0,05 | 0,08 |

r [g/kg] | 0,14 | 0,14 | 0,22 |

CVr [%] | 1,9 | 1,6 | 1,9 |

sR [g/kg] | 0,15 | 0,20 | 0,09 |

R [g/kg] | 0,42 | 0,56 | 0,25 |

CVR [%] | 6,3 | 6,0 | 2,2 |

Organizirana je bila še ena medlaboratorijska študija Skupnosti (tretja medsebojna primerjava), v kateri so analizirali dva vzorca v do 13 laboratorijih, da bi certificirali metodo glede na ekstrakcijo prostega triptofana. Vsak vzorec je bil analiziran s petkratno ponovitvijo. Rezultati so v naslednji tabeli:

L : število laboratorijev, ki so dostavili rezultate

n : število posameznih rezultatov, dobljenih po odstranitvi ubežnikov (določenih s Cochran, Dixon testom za ubežnike)

sr : standardni odmik ponovljivosti

sR : standardni odmik obnovljivosti

r : ponovljivost

R : obnovljivost

CVr : koeficient variacije ponovljivosti, %

CVR : koeficient variacije obnovljivosti, %

| Vzorec 4 Mešanica pšenice in soje | Vzorec 5 Mešanica pšenice in soje (= vzorec 4) z dodanim triptofanom (0,457 g/kg) |

L | 12 | 12 |

n | 55 | 60 |

srednja vr. [g/kg] | 0,391 | 0,931 |

sr [g/kg] | 0,005 | 0,012 |

r [g/kg] | 0,014 | 0,034 |

CVr [%] | 1,34 | 1,34 |

sR [g/kg] | 0,018 | 0,048 |

R [g/kg] | 0,050 | 0,134 |

CVR [%] | 4,71 | 5,11 |

Organizirana je bila še ena medlaboratorijska študija Skupnosti, v kateri so analizirali štiri vzorce v do sedmih laboratorijih, da bi certificirali triptofan glede hidrolize. Rezultati so v spodnji tabeli. Vsak vzorec je bil analiziran s petkratno ponovitvijo.

L : število laboratorijev, ki so dostavili rezultate

n : število posameznih rezultatov, dobljenih po odstranitvi ubežnikov (določenih s Cochran, Dixon testom za ubežnike)

sr : standardni odmik ponovljivosti

sR : standardni odmik obnovljivosti

r : ponovljivost

R : obnovljivost

CVr : koeficient variacije ponovljivosti, %

CVR : koeficient variacije obnovljivosti, %

| Vzorec 1 Krmna mešanica za prašiče (CRM 117) | Vzorec 2 Ribja moka z nizko vsebnostjo maščobe (CRM 118) | Vzorec 3 Sojina moka (CRM 119) | Vzorec 4 Posneto mleko v prahu (CRM 120) |

L | 7 | 7 | 7 | 7 |

n | 25 | 30 | 30 | 30 |

srednja vr. [g/kg] | 2,064 | 8,801 | 6,882 | 5,236 |

sr [g/kg] | 0,021 | 0,101 | 0,089 | 0,040 |

r [g/kg] | 0,059 | 0,283 | 0,249 | 0,112 |

CVr [%] | 1,04 | 1,15 | 1,30 | 0,76 |

sR [g/kg] | 0,031 | 0,413 | 0,283 | 0,221 |

R [g/kg] | 0,087 | 1,156 | 0,792 | 0,619 |

CVR [%] | 1,48 | 4,69 | 4,11 | 4,22 |

9. Opažanja

9.1. Naslednji posebni kromatografski pogoji lahko izboljšajo ločenje triptofana in α-metil-triptofana.

Izokratsko eluiranje, ki mu sledi stopenjsko čiščenje kolone:

Kolona za tekočinsko kromatografijo: | 125 mm x 4 mm C18, polnitev 3 μm ali enakovredna |

Temperatura kolone: | 32 °C |

Mobilna faza: | A:0,01 mol/l KH2PO4/Metanol, 95 + 5 (V + V) B: Metanol |

Program stopenj | 0 min | 100 % A | 0 % B |

15 min | 100 % A | 0 % B |

17 min | 60 % A | 40 % B |

19 min | 60 % A | 40 % B |

21 min | 100 % A | 0 % B |

33 min | 100 % A | 0 % B |

Hitrost pretoka: | 1,2 ml/min |

Celoten čas poteka: | približno 33 minut |

9.2. Kromatografija se bo spreminjala v skladu z vrsto HPLC in uporabljenim materialom za polnitev kolone. Izbrani sistem mora omogočiti ločenje bazne linije triptofana in notranjega standarda, poleg tega je pomembno, da se produkti razgradnje dobro ločijo od triptofana in notranjega standarda. Izvesti je treba postopek s hidrolizatom brez notranjega standarda z namenom, da se preveri bazna linija standarda glede na nečistote. Pomembno je, da je čas izvedbe dovolj dolg, da se eluirajo produkti razgradnje, sicer lahko zapozneli vrhovi eluiranja motijo nadaljnje kromatografiranje.

V delovnem območju se mora kromatografski sistem odzivati linearno. Linearni odziv je treba izmeriti s konstantno (običajno) koncentracijo notranjega standarda in različnimi koncentracijami triptofana. Zelo važno je, da so velikosti vrhov tako triptofana kot tudi notranjega standarda v linearnem območju HPLC/fluorescenčnega sistema. Če so vrhovi triptofana in/ali notranjega standarda prenizki ali previsoki, je treba analizo ponoviti z drugačno količino vzorca in/ali s spremenjenim končnim volumnom.

9.3. Barijev hidroksid

S staranjem postane barijev hidroksid težje topen. Posledica tega je motna raztopina za določitev HPLC, kar lahko povzroči nizke rezultate za triptofan.

[1] Izvedla delovna skupina za krmo Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

[2] Izvedla delovna skupina za krmo Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

--------------------------------------------------