PRILOGA I

Shema za teste, ki jih je treba opraviti v skladu s členi 3, 4, 5, 7 in 8

1. SPLOŠNA NAČELA O NAVZOČNOSTI ZADEVNEGA ŠKODLJIVEGA ORGANIZMA

1.1 Sum na navzočnost zadevnega škodljivega organizma obstaja, kadar je rezultat prvega testa za ugotavljanje navzočnosti, opravljenega na zadevni rastlini, pozitiven. Pri simptomatičnem rastlinskem materialu je lahko prvi test za odkrivanje selektivna izolacija.

1.2 Navzočnost zadevnega škodljivega organizma se potrdi na simptomatskih vzorcih zadevnih rastlin v naslednjih primerih: (a) kadar je prvi test za odkrivanje selektivna izolacija, pri kateri dobimo kolonije značilne morfologije: pozitivni rezultati se pridobijo pri dveh identifikacijskih testih; (b) kadar prvi test za odkrivanje ni selektivna izolacija: (i) pozitivni rezultati se pridobijo pri dveh identifikacijskih testih po selektivni izolaciji vzorca; (ii) pozitivni rezultati se pridobijo z drugim testom za ugotavljanje navzočnosti, ki ni selektivna izolacija.

1.3 Navzočnost zadevnega škodljivega organizma se potrdi na asimptomatskih vzorcih zadevnih rastlin v naslednjih primerih: (a) kadar je rezultat pri drugem testu za ugotavljanje navzočnosti pozitiven, pod pogojem, da je prvi ali drugi test za ugotavljanje navzočnosti molekularni (na podlagi DNA) test (TaqMan® test PCR v realnem času ali konvencionalni test PCR); (b) za vzorce, odvzete v državi članici ali na območju države članice, kjer pojav zadevnega škodljivega organizma ni znan, in vzorce, ki izvirajo iz druge države članice: če je pozitivni rezultat pri drugem testu za ugotavljanje navzočnosti v skladu s točko (a) in so rezultati pozitivni pri dveh identifikacijskih testih, opravljenih po selektivni izolaciji vzorca.

2. TESTI

2.1 Testi za ugotavljanje navzočnosti

Testi za ugotavljanje navzočnosti so taki, da dosledno ugotovijo vsaj 104 celic/ml resuspendiranega peleta.

Drugi test za odkrivanje temelji na biološki osnovi ali na drugih nukleotidnih regijah, ki so drugačni kot pri prvem testu za ugotavljanje navzočnosti.

Testi za ugotavljanje navzočnosti so naslednji:

(a) imunofluorescenčni testi, kot so opisani v mednarodnih diagnostičnih standardih;

(b) test FISH (van Beuningen et al. (1995) (1)), kot je opisan v mednarodnih diagnostičnih standardih;

(c) izolacija, kot je opisana v mednarodnih diagnostičnih standardih. Uporabi se ena od naslednjih dveh možnosti: (i) neposredna izolacija na polselektivnem (ali neselektivnem) gojišču, kot je opisana v mednarodnih diagnostičnih standardih; (ii) izolacija po obogatitvi z biotestom, kot je opisana v mednarodnih diagnostičnih standardih;

(d) konvencionalni test PCR (Pastrik (2000) (2)), kot je opisan v mednarodnih diagnostičnih standardih;

(e) TaqMan® testi PCR v realnem času z uporabo primerjev in sond: (i) Schaad et al. (1999) (3), kot je opisano v mednarodnih diagnostičnih standardih; (ii) Vreeburg et al. (2018) (4) (t. i. test NYtor), kot je opisano v mednarodnih diagnostičnih standardih; (iii) Gudmestad et al. (2009) s prilagoditvijo Vreeburg et al., (2018)4, kot je opisano v mednarodnih diagnostičnih standardih; (iv) Massart et al. (2014) (5), kot je opisano v mednarodnih diagnostičnih standardih.

2.2 Identifikacijski testi

Identifikacijski testi so naslednji:

(a) imunfluorescenčni test, kot je opisan v mednarodnih diagnostičnih standardih;

(b) konvencionalni test PCR (Pastrik (2000)), kot je opisan v mednarodnih diagnostičnih standardih;

(c) TaqMan® testi PCR v realnem času z uporabo primerjev in sond: (i) Schaad et al. (1999), kot je opisano v mednarodnih diagnostičnih standardih; (ii) Vreeburg et al. (2018) (t. i. test NYtor), kot je opisano v mednarodnih diagnostičnih standardih; (iii) Gudmestad et al. (2009) s prilagoditvijo Vreeburg et al., (2018), kot je opisano v mednarodnih diagnostičnih standardih; (iv) Massart et al. (2014), kot je opisano v mednarodnih diagnostičnih standardih;

(d) določanje črtne kode DNK, kot je opisano v mednarodnih diagnostičnih standardih;

(e) MALDI-TOF MS (Zaluga et al. (2011) (6)), kot je opisano v mednarodnih diagnostičnih standardih.

3. DIAGRAMI POTEKA POSTOPKOV

Diagram poteka št. 1: Diagnostični postopek za navzočnost zadevnega škodljivega organizma v simptomatskih vzorcih zadevne rastline.

a Izolacija se lahko uporabi kot prvi ali drugi test za ugotavljanje navzočnosti. Če obstaja sum na navzočnost zadevnega škodljivega organizma na gojišču, se kolonije očistijo, da se pridobijo čiste kulture, na katerih se opravita dva identifikacijska testa. Za potrditev navzočnosti škodljivega organizma morajo biti rezultati obeh identifikacijskih testov pozitivni.

b Tretji test za odkrivanje temelji na drugi biološki osnovi ali drugih nukleotidnih regijah.

Diagram poteka št. 2: Diagnostični postopek za zadevni škodljivi organizem v asimptomatskih vzorcih zadevne rastline.

a Izolacija se ne uporablja.

b Tretji test za ugotavljanje navzočnosti temelji na drugi biološki osnovi ali drugih nukleotidnih regijah. Izolacija se ne uporablja.

c Za vzorce iz točke 1.3(b) je za potrditev navzočnosti zadevnega škodljivega organizma po drugem pozitivnem testu za ugotavljanje navzočnosti potrebna izolacija zadevnega škodljivega organizma iz vzorca, ki ji sledita dva pozitivna identifikacijska testa.

4. PRIPRAVA VZORCA

4.1 Vzorci asimptomatskih gomoljev

Standardni vzorec vsebuje 200 gomoljev na test. Ustrezen laboratorijski postopek za pripravo ekstrakta iz popkov za določanje škodljivega organizma je opisan v mednarodnih diagnostičnih standardih.

4.2 Vzorci asimptomatskega rastlinskega materiala, razen gomoljev

Ugotavljanje latentnih okužb se izvede na sestavljenih vzorcih delov stebel. Postopek se lahko uporabi za največ 200 delov stebel iz različnih rastlin v enem vzorcu. Ustrezen laboratorijski postopek za dezinfekcijo in obdelavo delov stebel za pridobitev ekstrakta za ugotavljanje zadevnega škodljivega organizma je opisan v mednarodnih diagnostičnih standardih.

4.3 Vzorci simptomatske zadevne rastline

Deli tkiva se aseptično odstranijo z žilnega obroča v gomolju ali z žilnih trakov v steblih zadevnih rastlin, ki kažejo simptome venenja. Ustrezen laboratorijski postopek za obdelavo teh tkiv za pridobitev ekstrakta za ugotavljanje zadevnega škodljivega organizma je podrobno opisan v mednarodnih diagnostičnih standardih.

(1) van Beuningen, A.R., Derks, H., Janse, J.D. (1995). Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in situ hybridization (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Züchtungs Forschung 1, 266–269.

(2) Pastrik, K.H. (2000). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA. European Journal of Plant Pathology, 106, 155–165.

(3) Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A., Knorr, D (1999). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIOPCR and an automated real-time fluorescence detection system. Plant Disease 83, 1095–1100.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach. EPPO Bulletin 48, 86–96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay. European Journal of Plant Pathology 138, 29–37.

(6) Zaluga, J., Heylen, K., Van Hoorde, K., Hoste, B., Vaerenbergh, J., Maes, M., De Vos, P. (2011). GyrB sequence analysis and MALDI-TOF MS as identification tools for plant pathogenic Clavibacter. Systematic and applied microbiology 34, 400–7. 10.1016/j.syapm.2011.05.001.