PRILOGA II

PRESKUSNA SHEMA ZA DIAGNOSTICIRANJE, DETEKCIJO IN IDENTIFIKACIJO BAKTERIJE RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

PODROČJE UPORABE PRESKUSNE SHEME

Ta shema opisuje različne postopke, povezane z:

(i) diagnozo rjave gnilobe pri gomoljih krompirja ali bakterijskega venenja pri rastlinah krompirja, paradižnika in nekaterih drugih gostiteljskih rastlinah;

(ii) detekcijo bakterije Ralstonia solanacearum v vzorcih gomoljev krompirja, v sadikah krompirja, paradižnika in drugih gostiteljskih rastlin, vode in zeblje;

(iii) identifikacijo bakterije Ralstonia solanacearum (R. solanacearum).

VSEBINA

Stran Splošna načela 40 ODDELEK I: Uporaba testne sheme 40 1. Shema detekcije za diagnozo rjave gnilobe in bakterijskega venenja (R. solanacearum) pri gomoljih krompirja ter na rastlinah krompirja, paradižnika in drugih gostiteljskih rastlinah s simptomi rjave gnilobe ali bakterijskega venenja 40 2. Shema za detekcijo in identifikacijo bakterije R. solanacearum v vzorcih asimptomatskih gomoljev krompirja 43 3. Shema za detekcijo in identifikacijo bakterije R. solanacearum v vzorcih asimptomatskih rastlin krompirja, paradižnika in drugih gostiteljskih rastlin 46 ODDELEK II: Podrobne metode za detekcijo bakterije R. solanacearum v gomoljih krompirja ter na rastlinah krompirja, paradižnika in drugih gostiteljskih rastlinah s simptomi rjave gnilobe ali bakterijskega venenja 48 1. Simptomi 48 2. Hitri presejalni testi 48 3. Postopek izolacije 49 4. Identifikacijski testi za R. solanacearum 49 ODDELEK III: 1. Podrobne metode za detekcijo in identifikacijo bakterije R. solanacearum v vzorcih asimptomatskih gomoljev krompirja 49 1.1 Priprava vzorcev 49 1.2 Testiranje 51 2. Podrobne metode za detekcijo in identifikacijo bakterije R. solanacearum v vzorcih asimptomatskih rastlin krompirja, paradižnika in drugih rastlin gostiteljic. 51 2.1 Priprava vzorcev 51 2.2 Testiranje 52 ODDELEK IV: 1. Shema za detekcijo in identifikacijo bakterije R. solanacearum v vodi 53 2. Metode za detekcijo in identifikacijo bakterije R. solanacearum v vodi 55 2.1 Priprava vzorcev 55 2.2 Testiranje 55 ODDELEK V: 1. Shema za detekcijo in identifikacijo bakterije R. solanacearum v zemlji 56 2. Metode za detekcijo in identifikacijo bakterije R. solanacearum v zemlji 58 2.1 Priprava vzorcev 58 2.2 Testiranje 58 ODDELEK VI: Optimizirani protokoli za detekcijo in identifikacijo bakterije R. solanacearum 58 A. Diagnostični in detekcijski testi 58 1. Test eksudacije na steblu 58 2. Detekcija zrnc poli-β-hidroksibutirata 58 3. Seroaglutinacijski testi 59 4. Selektivna izolacija 60 4.1 Razmaz na selektivno gojišče 60 4.2 Obogatitveni postopek 60 5. Imunofluorescentni test (Test IF) 61 6. Verižna reakcija s polimerozo (Test PCR) 64 6.1 Metode prečiščevanja DNK 65 (a) Pastrikova metoda (2000) 65 (b) Druge metode 65 6.2 PCR 66 6.3. Analiza produkta PCR 66 7. Fluorescentna in situ hibridizacija (Test FISH) 67 8. Encimskoimunski testi (Testi ELISA) 69 (a) Posredni ELISA 69 (b) DASI (indirektni dvojni sendvič) ELISA 70 9. Biološki test 71 B. Identifikacijski testi 72 1. Hranilni in encimski identifikacijski testi 72 2. IF test 72 3. Test ELISA 73 4. Test PCR 73 5. Test FISH 73 6. Profiliranje maščobnih kislin (FAP) 73 7. Metode opredelitve seva 73 7.1 Določanje biovarja 73 7.2 Iskanje prstnih odtisov genoma 74 7.3 Metode PCR 74 C. Potrditveni test 74 Dodatek 1 Laboratoriji, ki optimirajo in potrjujejo protokole 76 Dodatek 2 Gojišča za izolacijo in gojenje bakterije R. solanacearum 77 Dodatek 3 (A) Komercialno dostopni standardizirani kontrolni material 79 (B) Priprava kontrole 80 Dodatek 4 Pufri za testne postopke 82 Dodatek 5 Ugotavljanje stopnje kontaminacije pri testih IF in FISH 85 Dodatek 6 Potrjeni PCR protokoli in reagenti 86 Dodatek 7 Potrjeni reagenti za test FISH 91 Dodatek 8 Pogoji kulture za paradižnik in jajčevec 93 Bibliografija 94

SPLOŠNA NAČELA

Optimizirani protokoli za različne metode, potrjeni reagenti in podrobnosti za pripravo testnih in kontrolnih materialov so opisani v Prilogah. Seznam laboratorijev, ki so sodelovali pri optimizaciji in potrjevanju protokolov, je v Dodatku 1.

Ker protokoli vključujejo detekcijo karantenskega organizma in bodo vključevali uporabo živih kultur R. solanacearum kot kontrolnih materialov, bo treba postopke izvajati v ustreznih karantenskih pogojih z zadostnimi sredstvi za odstranjevanje odpadkov in pod pogoji ustreznih licenc, ki jih izdajo uradne oblasti za karanteno rastlin.

Parametri testiranja morajo zagotavljati dosledno in ponovljivo detekcijo stopenj R. solanacearum na določenih pragovih za izbrane metode.

Obvezna je natančna priprava pozitivne kontrole.

Testiranje po zahtevanih pragovih pomeni tudi pravilne nastavitve, vzdrževanje in umerjanje opreme, pozorno ravnanje z reagenti in njihovo ohranjanje ter vse ukrepe za preprečevanje kontaminacije med vzorci, npr. ločitev pozitivnih kontrol od testnih vzorcev. Treba je uporabiti standarde zagotavljanja kakovosti, da ne bi prišlo do upravnih in drugih napak, še posebej pri označevanju in dokumentiranju.

Domnevni pojav, kot je navedeno v členu 4(2) Direktive 98/57/ES, implicira pozitivni rezultat v diagnostičnih ali presejalnih testih, opravljenih na vzorcu, kot je prikazano v diagramih poteka spodaj. Pozitivni prvi presejalni test (IF test, PCR/FISH, selektivna izolacija) mora biti potrjen z drugim presejalnim testom, ki temelji na drugačnem biološkem načelu.

Če je prvi presejalni test pozitiven, se domneva kontaminacija z R. solanacearum in je treba opraviti drugi presejalni test. Če je drugi presejalni test pozitiven, je domneva potrjena (domnevni pojav) in nadaljevati je treba s testiranjem po shemi. Če je drugi presejalni test negativen, se vzorec šteje za nekontaminiranega z R. solanacearum.

Potrjena navzočnost, kot je navedeno v členu 5(1) Direktive 98/57/ES, implicira izolacijo in identifikacijo čiste kulture R. solanacearum s potrditvijo patogenosti.

ODDELEK I

UPORABA TESTNE SHEME

1. Shema detekcije za diagnozo rjave gnilobe in bakterijskega venenja (R. solanacearum) pri gomoljih krompirja ter na rastlinah krompirja, paradižnika in drugih gostiteljskih rastlinah s simptomi rjave gnilobe ali bakterijskega venenja.

Testni postopek je namenjen za krompirjeve gomolje in rastline s simptomi, ki so značilni za ali nakazujejo sum na rjavo gnilobo ali žilno venenje. Vključuje hitri presejalni test, izolacijo patogena iz okuženega žilnega tkiva na (selektivnem) gojišču, in v primeru pozitivnega rezultata, identifikacijo kulture kot bakterije R. solanacearum.

2. Shema za detekcijo in identifikacijo bakterije R. solanacearum v vzorcih asimptomatskih gomoljev krompirja

Načelo:

Postopek testiranja je namenjen detekciji latentnih okužb gomoljev krompirja. Pozitivni rezultat vsaj dveh presejalnih testov3, ki sta osnovana na različnih bioloških načelih, mora biti dopolnjen z izolacijo patogena, ki mu v primeru izolacije značilnih kolonij sledi potrditev čiste kulture kot R. solanacearum. Pozitiven rezultat samo enega od presejalnih testov ne zadošča za sum okuženosti vzorca.

Presejalni testi in izolacijski testi morajo dovoljevati detekcijo 103 do 104 celic/ml resuspendirane pelete, vključene kot pozitivne kontrole v vsaki seriji testov.

3. Shema za detekcijo in identifikacijo bakterije R. solanacearum v vzorcih asimptomatskih rastlin krompirja, paradižnika in drugih gostiteljskih rastlin

ODDELEK II

PODROBNE METODE ZA DETEKCIJO BAKTERIJE R. SOLANACEARUM V GOMOLJIH KROMPIRJA TER NA RASTLINAH KROMPIRJA, PARADIŽNIKA IN DRUGIH GOSTITELJSKIH RASTLINAH S SIMPTOMI RJAVE GNILOBE ALI BAKTERIJSKEGA VENENJA

1. Simptomi (glej spletno mesto http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1 Simptomi na krompirju

Rastlina krompirja. Zgodnja stopnja okužbe se kaže kot venenje listov proti vrhu rastline pri visokih dnevnih temperaturah, ponoči pa si rastlina opomore. V zgodnjih stopnjah venenja listi ostanejo zeleni, kasneje pa začnejo rumeneti in razvije se rjava nekroza. Pojavi se tudi epinastija. Venenje enega poganjka ali cele rastline hitro postane nepovratno in se konča s sesedanjem in z odmrtjem rastline. Žilno tkivo prečno prerezanih stebel uvelih rastlin je običajno rjavo, na površini prereza pa je mogoče opaziti ali z lahkoto iztisniti mlečni bakterijski izcedek. Če prerezano steblo postavimo navpično v vodo, iz žilnih snopov pritečejo sluzaste niti.

Gomolj krompirja. Gomolje krompirja je treba prečno prerezati blizu območja stolona ali po dolžini čez stolon. Zgodnja stopnja okužbe se kaže kot steklasto rumeno do svetlo rjavo razbarvanje žilnega obroča, iz katerega se po nekaj minutah spontano pocedi bled, kremast bakterijski izcedek. Pozneje postane razbarvanost žilnega tkiva bolj izrazito rjava, nekroza pa lahko zajame parenhimatično tkivo. V napredovalih stopnjah okužba izbruhne navzven od stolona in očes, iz katerih lahko mezi bakterijski izcedek, na katerega se začnejo lepiti grudice zemlje. Lahko se pojavijo rdečkasto-rjave, nekoliko udrte razpoke na povrhnjici zaradi notranjega odmrtja žilnih tkiv. V napredovalih stopnjah bolezni je značilen sekundarni razvoj glivičnih in bakterijskih mehkih gnilob.

1.2 Simptomi na paradižniku

Rastlina paradižnika. Prvi vidni simptom je uvel videz najmlajših listov. V ugodnih okoljskih pogojih za patogen (temperatura tal okrog 25 °C, nasičenost z vlago) sledita v nekaj dneh epinastija in venenje ene strani ali cele rastline, kar pripelje do njenega popolnega odmrtja. V manj ugodnih pogojih (temperatura tal pod 21 °C) je venenja manj, vendar lahko iz stebla požene večje število adventivnih korenin. Mogoče je opaziti z vodo zasičene proge vzdolž stebla, ki so dokaz nekroze žilnega sistema. Če steblo prečno prerežemo, iz razbarvanega rjavega žilnega tkiva stebla pritečejo kaplje belega ali rumenkastega bakterijskega izcedka.

1.3 Simptomi na drugih gostiteljih

Rastline Solanum dulcumara in S. nigrum. V naravnih pogojih na teh plevelnih gostiteljih simptome venenja redko opazimo, razen če temperatura tal presega 25 °C ali če je raven inokuluma izredno visoka (npr. če S. nigrum raste zraven bolnih rastlin krompirja ali paradižnika). Ko pride do venenja, so simptomi enaki kot pri paradižniku. Rastline S. dulcamara, ki ne venejo in ki rastejo s steblom in koreninami v vodi, lahko v notranjosti razvijejo rahlo rjavo obarvanost žilnih tkiv na prečnem delu dna stebla ali na potopljenem delu stebla. Iz prerezanih žilnih tkiv lahko priteče bakterijski izcedek, oziroma če postavimo prerezano steblo navpično v vodo, nastanejo sluzaste niti, tudi če ni simptomov venenja.

2. Hitri presejalni testi

Hitri presejalni testi pospešijo domnevno diagnozo, vendar niso bistveni. Uporabite enega ali več od spodnjih potrjenih testov:

2.1 Test eksudacije na steblu

(glej oddelek VI.A.1)

2.2 Detekcija zrnc poli-β-hidroksibutirata (PHB)

Značilna zrnca PHB v celicah R. solanacearum postanejo vidna po obarvanju toplotno fiksiranih madežev bakterijskega izcedka iz okuženega tkiva na stekelcu mikroskopa z nilsko modrim A ali sudan črnim (glej oddelek VI.A.2).

2.3 Seroaglutinacijski testi

(glej oddelek VI.A.3)

2.4 Drugi testi

Drugi ustrezni hitri presejalni testi so IF-test (oddelek VI.A.5), test FISH (oddelek VI.A.7), testi ELISA (oddelek VI.A.8) in testi PCR (oddelek VI.A.6).

3. Postopek izolacije

(a) Odvzamemo izcedek ali dele razbarvanega tkiva z žilnega obroča v gomolju krompirja ali z žilnih trakov v steblu rastlin krompirja, paradižnika ali drugih venečih gostiteljskih rastlin. Suspendiramo v majhni količini sterilne destilirane vode ali 50 mM fosfatnega pufra (Dodatek 4) in pustimo 5–10 minut.

(b) Pripravimo niz desetkratnih razredčin suspenzije.

(c) 50-100 µl suspenzije in razredčin prenesemo na splošno hranilno gojišče (NA, YPGA ali SPA, Dodatek 2) in/ali tetrazolno gojišče po Kelmanu (npr. SMSA, glej Dodatek 2). Razmažemo ali načrtamo z ustrezno tehniko razmaza razredčine. Če se zdi uporabno, pripravimo posamezne plošče z razredčeno celično suspenzijo bakterije R. solanacearum biovar 2/biotip 3 za pozitivno kontrolo.

(d) Plošče 2–6 dni inkubiramo pri 28 °C. — Na splošnem hranilnem gojišču virulentni izolati bakterije R. solanacearum tvorijo biserno kremno bele, ploske, nepravilne in tekoče kolonije, ki imajo v sredini pogosto značilne spirale. Nevirulentne oblike bakterije R. solanacearum tvorijo majhne, okrogle, netekoče, maslaste kolonije, ki so povsem smetanaste barve. — Na tetrazolnem gojišču po Kelmanu in SMSA gojiščih so spirale krvavo rdeče. Nevirulentne oblike bakterije R. solanacearum tvorijo majhne, okrogle, netekoče, maslaste kolonije, ki so povsem temno rdeče.

4. Identifikacijski testi za R. solanacearum

Testi za potrjevanje identitete domnevnih izolatov bakterije R. solanacearum so prikazani v oddelku VI.B.

ODDELEK III

1. Podrobne metode za detekcijo in identifikacijo bakterije R. solanacearum v vzorcih asimptomatskih krompirjevih gomoljev

1.1 Priprava vzorcev

Opomba:

— Standardna velikost vzorca je 200 gomoljev na test. Intenzivnejše vzorčenje zahteva več testov na vzorcih te velikosti. Večje število gomoljev v vzorcu bo privedlo do inhibicije in otežilo razlago rezultatov. Postopek pa lahko prikladno uporabite za vzorce z manj kot 200 gomolji, če je na voljo manj gomoljev.

— Potrjevanje vseh metod detekcije, ki so opisane spodaj, temelji na testiranju vzorcev z 200 gomolji.

— Krompirjev izvleček, ki je opisan spodaj, lahko uporabite tudi za detekcijo bakterije krompirjeve obročkaste gnilobe, Clavibacter michiganensis podv. sepedonicus.

Dovoljena je tudi vnaprejšnja obdelava še pred pripravo vzorca.

(a) Vzorec inkubiramo pri 25–30 °C do dva tedna pred testiranjem, da spodbudimo množenje majhnih populacij bakterije R. solanacearum.

(b) Gomolje operemo. Med vsakim vzorcem uporabimo ustrezna razkužila (klorove spojine, kadar izvajamo test PCR, da odstranimo patogeno DNK) in detergente. Gomolje posušimo na zraku. Postopek pranja je še posebej koristen (vendar ni obvezen) za vzorce z odvečno zemljo in če bomo izvajali test PCR ali neposredno izolacijo.

1.1.1 S čistim in sterilnim skalpelom ali nožem za zelenjavo odstranimo povrhnjico gomolja na območju stolona, tako da najprej postanejo vidna žilna tkiva. Previdno izrežemo majhno stožčasto jedro žilnega tkiva na območju stolona. Nežilnega tkiva naj bo čim manj. (glej spletno mesto http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Opomba: Če so v vzorcu (gnijoči) sumljivi gomolji s simptomi rjave gnilobe, jih umaknemo in jih testiramo posebej.

Če med odstranjevanjem jedra stolona opazimo simptome rjave gnilobe, je treba ta gomolj vizualno pregledati in ga odrezati blizu stolona. Vse odrezane gomolje s sumljivimi simptomi je treba vsaj 2 dni hraniti na sobni temperaturi, da omogočimo suberizacijo, in jih hraniti na hladnem (na 4-10 °C) v primernih karantenskih pogojih. Vse gomolje, vključno tiste s sumljivimi simptomi, je treba hraniti v skladu s Prilogo III.

1.1.2 Jedra stolona zberemo v neuporabljene posode, ki jih je mogoče zapreti in/ali hermetično zapreti (če so posode večkrat uporabljene, jih je najprej treba temeljito očistiti in razkužiti s klorovimi spojinami). Zaželeno je, da se stoloni obdelajo takoj. Če to ni možno, jih shranimo v posodo brez dodatka pufra, v hladilniku za največ 72 ur oziroma pri sobni temperaturi ne dlje kot 24 ur.

Jedra stolonov obdelamo po enem od naslednjih postopkov, in sicer bodisi tako, da:

(a) dodamo zadostno količino (pribl. 40 ml) ekstrakcijskega pufra (Dodatek 4) in stresamo na rotacijskem stresalniku (50-100 vrt/min) 4 ure pod temperaturo 24 °C ali 16–24 ur pri temperaturi hladilnika; bodisi

(b) homogeniziramo jedra z zadostno količino (pribl. 40 ml) ekstrakcijskega pufra (Dodatek 4), ali v mešalniku (npr. Waring ali Ultra Thurax), ali pa jih zdrobimo v dobro zaprti maceracijski vrečki za enkratno uporabo (npr. Stomacher ali Bioreba iz močnega politena, 150 mm × 250 mm, sterilizirano z obsevanjem) z gumijastim kladivom oziroma ustreznim drobilnim aparatom (npr. Homex).

Opomba: Če vzorce homogeniziramo z mešalnikom, obstaja veliko tveganje navzkrižne kontaminacije. Z ustreznimi ukrepi se izogibamo nastajanju aerosolov in politju med postopkom ekstrakcije. Poskrbimo, da bodo za vsak vzorec uporabljena sveže sterilizirana rezila mešalnika in posode. Če uporabljamo test PCR, se izogibamo prenosu DNK na posode oziroma drobilni aparat. Če uporabljamo PCR, je priporočljivo vzorce zmečkati v vrečkah za enkratno uporabo in uporabljati cevke za enkratno uporabo.

1.1.3 Odtočimo supernatant. Če je preveč moten, ga razčistimo s počasnim centrifugiranjem (pri največ 180 g 10 minut pri temperaturi 4-10 °C) ali z vakumsko filtracijo (40-100 µm), in operemo filter z dodatnim (~10 ml) ekstrakcijskim pufrom.

1.1.4 Koncentriramo bakterijsko frakcijo s centrifugiranjem pri 7 000 g 15 minut (ali pri 10 000 g 10 minut) pri temperaturi 4-10 °C in zavržemo supernatant, ne da bi premešali peleto.

1.1.5 Peleto resuspendiramo v 1,5 ml peletnega pufra (Dodatek 4). Uporabimo 500 µl za testiranje bakterije R. solanacearum, 500 µl za Clavibacter michiganensis podv. sepedonicus in 500 µl za referenco. Dodamo končni koncentrat 10–25 % (v/v) sterilnega glicerola 500 µl referenčnega alikvota in preostanku testnega alikvota, močno premešamo. Shranimo pri –16 do –24 °C (tedni) ali pri –68 do –86 °C (meseci). Med testiranjem testne alikvote shranimo na 4-10 °C.

Večkratno zamrzovanje in taljenje ni priporočljivo.

Če je potreben transport ekstrakta, poskrbimo za dostavo v hladilni skrinji v 24 do 48 urah.

1.1.6 Obvezno je treba vse pozitivne kontrole in vzorce R. solanacearum obravnavati ločeno, da ne bi prišlo do kontaminacije. To velja za IF stekelca in za vse teste.

1.2 Testiranje

Glej Diagram poteka in opis testov ter optimizirane protokole v ustreznih dodatkih.

Selektivna izolacija (glej oddelek VI.A.4)

IF test (glej oddelek VI.A.5)

Test PCR (glej oddelek VI.A.6)

Test FISH (glej oddelek VI.A.7)

Test ELISA (glej oddelek VI.A.8)

Biološki test (glej oddelek VI.A.9)

2. Podrobne metode za detekcijo in identifikacijo bakterije R. solanacearum v vzorcih asimptomatskih rastlin krompirja, paradižnika in drugih gostiteljskih rastlin

2.1 Priprava vzorcev

Opomba: Za detekcijo latentnih populacij bakterije R. solanacearum priporočamo testiranje kompozitnih vzorcev. Postopek lahko prikladno uporabimo za kompozitne vzorce do 200 delov stebel. Če opravljamo preiskave, morajo temeljiti na statistično reprezentativnem vzorcu populacije rastline, ki jo preučujemo.

2.1.1 Zberemo 1-2 centimetrske dele stebel v zaprti sterilni posodi, skladno s spodnjimi postopki vzorčenja:

Nasad sadik paradižnika: S čistim, razkuženim nožem odstranimo kos dolžine 1 cm z dna vsakega stebla, tik nad zemljo.

Rastline paradižnika na njivi ali v rastlinjaku: S čistim, razkuženim nožem odstranimo poganjek na najnižjem delu z vsake rastline, tako da ga odrežemo tik nad stikom z glavnim steblom. Z vsakega poganjka ob strani odstranimo najnižji kos dolžine 1 cm.

Druge gostiteljice: S čistim, razkuženim nožem ali škarjami za obrezovanje odstranimo kos dolžine 1 cm z dna vsakega stebla, tik nad zemljo. V primeru S. dulcamara in drugih gostiteljskih rastlin, ki rastejo v vodi, odstranimo 1–2 cm dolge dele s stebla pod vodo ali s stolonov s koreninami v vodi.

Ko nabiramo vzorce na določeni lokaciji, je priporočljivo testirati statistično reprezentativen vzorec vsaj 10 rastlin na mesto vzorčenja za vsako potencialno plevelno gostiteljico. Detekcija patogenov je najzanesljivejša pozno spomladi, poleti in jeseni, čeprav je pri zimzeleni rastlini Solanum dulcamara, ki raste v vodnih tokovih, naravne infekcije mogoče odkriti v kateremkoli letnem času. Znane gostiteljice vključujejo krompirjeve samosevce (se ohranijo v tleh), Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium in druge člane družine Solanaceae. Med gostiteljicami so tudi vrste Pelargonium in Portulaca oleracea. Nekatere evropske vrste plevela, ki potencialno lahko gostijo populacije R. solanacearum biovar 2/biotip 3 v koreninah in/ali rizosferah v določenih okoljskih pogojih, so med drugim: Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, vrste rodu Rorippa, vrste rodu Rumex, Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra in Urtica dioica.

Opomba: Na tej stopnji lahko opravimo vizualni pregled za interne simptome (obarvanje žil ali bakterijski izcedek). Dele stebel s simptomi damo na stran in jih testiramo ločeno (glej oddelek II).

2.1.2 Dele stebel na hitro razkužimo z etanolom 70 % in takoj posušimo z vpojnim papirjem. Nato dele stebel obdelamo po enem od naslednjih postopkov, in sicer bodisi tako, da

(a) dele prekrijemo z zadostno količino (pribl. 40 ml) ekstrakcijskega pufra (Dodatek 4) in stresamo na rotacijskem stresalniku (50-100 vrt/min) 4 ure pod temperaturo 24 °C ali 16–24 ur pri temperaturi hladilnika, bodisi tako, da

(b) takoj obdelamo, dele stolčemo v močni maceracijski vrečki (npr. Stomacher ali Bioreba) z ustrezno količino ekstrakcijskega pufra (Dodatek 4) in gumijastim kladivom oziroma ustreznim drobilnim aparatom (npr. Homex). Če to ni mogoče, dele stebel shranimo v hladilniku za največ 72 ur oziroma pri sobni temperaturi ne dlje od 24 ur.

2.1.3 Po 15 minutah usedanja odtočimo supernatant.

2.1.4 Nadaljnje prečiščenje ekstrakta ali koncentrata bakterijske frakcije običajno ni potrebno, lahko pa ga dosežemo s filtriranjem in/ali centrifugacijo, kot je opisano v oddelku III.1.1.3 do 1.1.5.

2.1.5 Razdelimo ekstrakt čistega oziroma koncentriranega vzorca na dva enaka dela. Polovico hranimo pri 4-10 °C med testiranjem, drugo polovico pa shranimo z 10-25 % (v/v) sterilnim glicerolom pri –16 do –24 °C (tedni) oziroma –68 do –86 °C (meseci), če bi bilo potrebno nadaljnje testiranje.

2.2 Testiranje

Glej Diagram poteka in opis testov ter optimizirane protokole v ustreznih dodatkih.

Selektivna izolacija (glej oddelek VI.A.4)

IF test (glej oddelek VI.A.5)

Test PCR (glej oddelek VI.A.6)

Test FISH (glej oddelek VI.A.7)

Test ELISA (glej oddelek VI.A.8)

Biološki test (glej oddelek VI.A.9)

ODDELEK IV

1. Shema za detekcijo in identifikacijo bakterije R. solanacearum v vodi

2. Metode za detekcijo in identifikacijo bakterije R. solanacearum v vodi

Načelo

Potrjena shema detekcije, ki je opisana v tem oddelku, velja za detekcijo patogenov v vzorcih površinske vode, uporabimo pa jo lahko tudi za testiranje vzorcev iztokov pri predelavi krompirja in odplak. Pomembno se je zavedati, da se pričakovana občutljivost detekcije spreminja z medijem. Na občutljivost izolacijskega testa vplivajo populacije tekmujočih saprofitskih bakterij, ki so ponavadi v iztokih pri predelavi krompirja in odplakah veliko večje kot v površinski vodi. Spodnja shema predvideva detekcijo le 103 celic na liter v površinski vodi, občutljivost detekcije v iztokih pri predelavi krompirja in odplakah pa bo verjetno veliko nižja. Zato je priporočljivo testirati iztoke po vsaki vrsti čiščenja (npr. sedimentaciji ali filtriranju), med katerim se zmanjšajo populacije saprofitskih bakterij. Ko ocenjujemo zanesljivost morebitnih dobljenih negativnih rezultatov, je treba upoštevati omejitve pri občutljivosti testne sheme. Ta shema se sicer uspešno uporablja pri pregledovanju in ugotavljanju prisotnosti oziroma odsotnosti patogena v površinski vodi, toda zavedati se je treba njenih omejitev, če jo uporabljamo pri podobnem pregledovanju iztokov ob predelavi krompirja oziroma odplak.

2.1 Priprava vzorcev

Opomba:

— Detekcija bakterij R. solanacearum je najzanesljivejša pozno spomladi, poleti in jeseni, ko temperatura vode preseže 15 °C.

— Zanesljivost detekcije povečamo z večkratnim zbiranjem vzorcev ob različnih časih v zgoraj omenjenem obdobju na določenih točkah za vzorčenje. Tako zmanjšamo učinke podnebne variacije.

— Upoštevamo učinke močnega deževja in geografijo vodnega toka, da ne bi prišlo do velikih razredčenj, ki bi prikrila prisotnost patogena.

— Vzorce površinske vode jemljemo v bližini gostiteljskih rastlin, če so gostitelji na voljo.

2.1.1 Na izbranih točkah za vzorčenje zberemo vodne vzorce, tako da napolnimo sterilne cevke ali stekleničke za enkratno uporabo, če je mogoče, na globini več kot 30 cm in v oddaljenosti največ 2 m od brega. Za iztoke predelave in odplak zberemo vzorce na mestu odtoka odpadne vode. Priporočljiva je velikost vzorca do 500 ml na mesto vzorčenja. Če imamo rajši manjše vzorce, je priporočljivo, da vzamemo vzorce ob vsaj treh različnih časih na vsako mesto vzorčenja, pri čemer naj vsak vzorec vsebuje dva replicirana pod-vzorca z vsaj 30 ml. Za intenzivno pregledovanje izberemo vsaj 3 točke vzorčenja na 3 km vodotoka in obvezno vzamemo vzorce tudi iz pritokov tega vodotoka.

2.1.2 Vzorce prevažamo v hladnem, temnem okolju (4-10 °C) in testiramo v roku 24 ur.

2.1.3 Po potrebi se bakterijska frakcija lahko koncentrira po eni od naslednjih metod:

(a) Centrifugiramo 30-50 ml podvzorcev pri 10 000 g 10 minut (ali 7 000 g 15 minut), najraje pri 4-10 °C, zavržemo supernatant in resuspendiramo peleto v 1 ml peletnega pufra (Dodatek 4).

(b) Filtracija membrane (najmanjša velikost por 0,45 µm), ki ji sledi pranje filtra v 5-10 ml peletnega pufra in ohranitev izpirka. Ta metoda je primerna za večje količine vode z manjšim številom saprofitov.

Koncentriranje običajno ni priporočljivo za vzorce odpadnih voda od predelave krompirja ali kanalizacije, ker večje populacije konkurenčnih saprofitskih bakterij inhibirajo detekcijo bakterije R. solanacearum.

2.2 Testiranje

Glej Diagram poteka in opis testov v ustreznih dodatkih.

ODDELEK V

1. Shema za detekcijo in identifikacijo bakterije R. solanacearum v zemlji

2. Metode za detekcijo in identifikacijo bakterije R. solanacearum v zemlji

Načela

Potrjena shema detekcije, opisana v tem oddelku, velja za detekcijo patogenov v vzorcih zemlje, lahko pa se uporablja tudi za testiranje vzorcev trdnih odpadkov predelave krompirja oziroma komunalne gošče. Zavedati pa se je treba, da te metode niso zadosti občutljive, da bi zagotovile detekcijo majhnih in/ali neenakomerno razpršenih populacij bakterije R. solanacearum, do katerih lahko pride v naravno okuženih vzorcih teh medijev.

Omejitve občutljivosti te testne sheme je treba upoštevati, če ocenjujemo zanesljivost morebitnih dobljenih negativnih rezultatov, pa tudi ko jo uporabljamo pri pregledovanju za ugotavljanje prisotnosti ali odsotnosti patogena v zemlji in goščah. Najzanesljivejši test za prisotnost patogena v poljskih tleh je, da posadimo dovzetno gostiteljico in spremljamo morebitno okužbo, toda celo s to metodo nizke ravni kontaminacije uidejo detekciji.

2.1 Priprava vzorcev

2.1.1 Vzorčenje poljske zemlje mora slediti standardnim načelom za vzorčenje na ogorčice. Zberemo 0,5-1 kg zemlje na vzorec s 60 mest na 0,3 ha na globini 10-20 cm (ali na mreži 7 × 7 metrov). Če sumimo prisotnost patogena, povečamo število mest zbiranja na 120 na 0,3 ha. Pred testiranjem hranimo vzorce na 12-15 °C. Zberemo goščo od predelave krompirja in odplak, tako da zberemo skupno 1 kg z mest, ki predstavljajo skupni volumen gošče, ki jo bomo testirali. Vsak vzorec pred testiranjem dobro premešamo.

2.1.2 Dispergiramo podvzorce 10-25 g zemlje oziroma gošče z rotacijskim stresanjem (250 vrtlj./m) v 60-150 ml ekstrakcijskega pufra (Dodatek 4) do 2 uri. Po potrebi pri disperziji lahko pomaga, če dodamo 0,02 % sterilnega Tween-20 in 10-20 g sterilnega peska.

2.1.3 Suspenzijo med testiranjem hranimo pri 4 °C.

2.2 Testiranje

Glej Diagram poteka in opis testov v ustreznih dodatkih.

ODDELEK VI

OPTIMIZIRANI PROTOKOLI ZA DETEKCIJO IN IDENTIFIKACIJO BAKTERIJE R. SOLANACEARUM

A. DIAGNOSTIČNI IN DETEKCIJSKI TESTI

1. Test eksudacije na steblu

Prisotnost bakterije R. solanacearum v uvelih steblih krompirja, paradižnika in drugih rastlin gostiteljic je mogoče oceniti na podlagi naslednjega preprostega testa domneve: steblo prerežemo tik nad površino tal. Prerezano površino postavimo v epruveto s čisto vodo. Po nekaj minutah lahko opazimo, da iz prerezanih žilnih snopov spontano pritečejo sluzaste niti bakterijskega izcedka.

2. Detekcija zrnc poli-β-hidroksibutirata

1. Pripravimo razmaz bakterijskega izcedka iz okuženega tkiva na objektnem stekelcu ali razmaz 48-urne kulture na YPGA ali SPA (Dodatek 2).

2. Pripravimo razmaze seva biovar 2 bakterije R. solanacearum za pozitivno kontrolo in, če se zdi uporabno, razmaz znanega PHB negativnega seva za negativno kontrolo.

3. Razmaze pustimo, da se posušijo. Spodnjo površino stekelca hitro povlečemo prek plamena, da se razmaz fiksira.

4. Preparat obarvamo ali z nilsko modrim ali s sudan črnim, in opazujemo pod mikroskopom, kot je opisano spodaj:

Test z nilsko modrim:

(a) Fiksiran razmaz zalijemo z 1-odstotno vodno raztopino nilsko modrega A. Inkubiramo 10 minut pri 55 °C.

(b) Odcedimo raztopino barvila. Na hitro speremo pod majhnim curkom vodovodne vode. Odstranimo odvečno vodo z vpojnim papirjem.

(c) Razmaz zalijemo z 8-odstotno vodno raztopino ocetne kisline. Inkubiramo 1 minuto pri sobni temperaturi.

(d) Na hitro speremo pod majhnim curkom vodovodne vode. Odstranimo odvečno vodo z vpojnim papirjem.

(e) Ponovno navlažimo s kapljo vode. Pokrijemo s krovnim stekelcem.

(f) Obarvani razmaz opazujemo pod epifluorescenčnim mikroskopom pri 450 nm v imerzijskem olju pri povečavi 600–1 000. Uporabljamo imerzijski objektiv za olje ali za vodo.

(g) Iščemo svetlo oranžna fluorescenčna zrnca PHB. Opazujemo tudi pri dnevni svetlobi, da se prepričamo, da so zrnca znotraj celic in da je morfologija celic značilna za bakterijo R. solanacearum.

Test s sudan črnim:

(a) Fiksiran razmaz zalijemo z 0,3-odstotno raztopino sudan črnega B v 70-odstotnem etanolu. Inkubiramo 10 minut pri sobni temperaturi.

(b) Odcedimo raztopino barvila. Na hitro speremo pod tekočo vodo. Odstranimo odvečno vodo z vpojnim papirjem.

(c) Razmaz na kratko potopimo v ksilol. Popivnamo z vpojnim papirjem. Pozor: Ksilol je zdravju škodljiv. Upoštevajte varnostne ukrepe in delajte v digestoriju.

(d) Razmaz zalijemo z 0,5-odstotno (w/v) vodno raztopino safranina in pustimo 10 sekund pri sobni temperaturi. Pozor: Safranin je zdravju škodljiv. Upoštevajte varnostne ukrepe in delajte v digestoriju.

(e) Speremo pod majhnim curkom vodovodne vode. Popivnamo z vpojnim papirjem. Pokrijemo s krovnim stekelcem.

(f) Obarvani razmaz opazujemo pod svetlobnim mikroskopom s presevno svetlobo v imerzijskem olju pri povečavi 1 000. Uporabljamo imerzijski objektiv za olje.

(g) Zrnca PHB v celicah bakterije R. solanacearum se obarvajo modro-črno. Celične stene se obarvajo rožnato.

3. Seroaglutinacijski testi

Aglutinacijo celic R. solanacearum v bakterijskem izcedku ali izvlečku simptomatskega tkiva najlažje opazujemo s potrjenimi protitelesi (glej Dodatek 3), označenimi z ustreznimi barvnimi oznakami, kot so npr. rdeče celice Staphylococcus aureus ali obarvani delci lateksa. Če uporabljamo komercialni pribor (glej Dodatek 3), sledimo navodilom proizvajalca. Sicer sledimo naslednjemu postopku:

(a) Zmešamo kapljice suspenzije označenega protitelesa in bakterijskega izcedka (vsak približno 5 µl) na okencih objektnih stekelc z več vdolbinicami.

(b) Pripravimo pozitivno in negativno kontrolo s suspenzijo R. solanacearum biovar 2 in heterolognega seva.

(c) Po rahlem mešanju, ki traja 15 sekund, opazujemo aglutinacijo v pozitivnih vzorcih.

4. Selektivna izolacija

4.1 Razmaz na selektivno gojišče

Opomba: Preden prvič uporabimo to metodo, opravimo predhodne teste za zagotovitev ponovljive detekcije 103 do 104 enot, ki tvorijo kolonije bakterije R. solanacearum na ml, dodane ekstraktom iz vzorcev, ki so bili prej v testih negativni.

Uporabimo primerno potrjeno selektivno gojišče, npr. SMSA (prilagojeno po Elphinstone in sod. 1996, glej Dodatek 2).

Potrebno je pozorno razlikovati med R. solanacearum in drugimi bakterijami, ki so sposobne na tem gojišču razviti kolonije. Kolonije R. solanacearum lahko izkazujejo tudi atipično morfologijo, če so plošče prenaseljene ali če so prisotne antagonistične bakterije. Kjer sumimo na učinke tekmovanja ali antagonizma, moramo vzorec ponovno testirati z drugačnim testom.

Največjo občutljivost detekcije s to metodo lahko pričakujemo, če uporabljamo sveže pripravljene ekstrakte vzorcev. Metoda pa je uporabna tudi za ekstrakte, ki so bili shranjeni pod glicerolom pri –68 do –86 °C.

Za pozitivno kontrolo pripravimo desetkratne razredčine iz suspenzije 106 enot, ki tvorijo kolonije, na ml virulentnega biovarja 2 seva R. solanacearum (npr. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Da ne bi prišlo do kontaminacije, pripravimo pozitivne kontrole povsem ločeno od vzorcev, ki jih nameravamo testirati.

Za vsako novo pripravljeno serijo selektivnega gojišča je treba preveriti, ali je ustrezno za rast patogena, preden ga uporabimo za testiranje rutinskih vzorcev.

Kontrolni material testiramo povsem enako kot vzorce.

4.1.1 Izvedemo ustrezno tehniko redčitvenega razmaza z namenom, da zagotovimo razredčenje morebitnih populacij saprofitskih bakterij, ki tvorijo kolonije, v ozadju. Razmažemo 50-100 µl na ploščo ekstrakta vzorca in vsako razredčino.

4.1.2 Plošče inkubiramo pri 28 °C. Plošče odčitamo po 48 urah in do 6 dni zatem vsak dan. Tipične kolonije R. solanacearum na gojišču SMSA so mlečno bele, ploske, nepravilnih oblik in tekoče, in po treh dneh inkubacije razvijejo rožnato do krvavo rdečo obarvanost v sredini, z notranjimi progami ali spiralami (glej spletno mesto http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Opomba: Na tem gojišču se včasih razvijejo atipične kolonije bakterije R. solanacearum. Te so lahko majhne, okrogle, povsem rdeče barve in netekoče ali samo delno tekoče, zato jih je težko razlikovati od saprofitskih bakterij, ki tvorijo kolonije.

4.1.3 Prečistimo domnevne kolonije R. solanacearum, potem ko smo jih načrtali ali redčitveno razmazali na splošno hranilno gojišče. Tako dobimo izolirane kolonije (glej Dodatek 2).

4.1.4 Kratkoročno shranimo kulture v sterilni vodi (pH 6-8, brez klora) pri sobni temperaturi v temi, dolgoročno pa v primernem kriogenskem zaščitnem sredstvu pri temperaturi –68 do –86 °C ali liofilizirane.

4.1.5 Identificiramo domnevne kulture (glej oddelek VI. B) in opravimo test patogenosti (glej oddelek VI. C).

Interpretacija testa z razmazom na selektivno gojišče

Test z razmazom na selektivno gojišče je negativen, če po šestih dneh ne opazimo nobenih bakterijskih kolonij ali nobenih domnevnih kolonij, značilnih za bakterije R. solanacearum, pod pogojem, da inhibicija s strani kolonij drugih bakterij ni verjetna in da smo pri pozitivni kontroli našli značilne kolonije bakterije R. solanacearum.

Test z razmazom na selektivno gojišče je pozitiven, če izoliramo kolonije, značilne za bakterije R. solanacearum.

4.2 Obogatitveni postopek

Uporabimo potrjeno sredstvo za obogatitev, npr. modificiran bujon Wilbrink (Dodatek 2).

S tem postopkom lahko selektivno povečamo populacijo R. solanacearum v ekstraktih vzorcev in povečamo občutljivost detekcije. Postopek tudi učinkovito razredči inhibitorje reakcije PCR (1:100). Treba pa se je zavedati, da lahko obogatitev R. solanacearum spodleti zaradi tekmovanja in antagonizma saprofitskih organizmov, ki se pogosto hkrati obogatijo. Zato je lahko izolacija R. solanacearum iz obogatenih kultur bujonov težavna. Ker je populacije serološko povezanih saprofitov mogoče povečati, se priporoča tudi uporaba specifičnih monoklonskih protiteles namesto poliklonskih protiteles, če uporabljamo test ELISA.

4.2.1 Za obogatitveni PCR prenesemo 100 µl ekstrakta vzorca v 10 ml obogatitvenega bujona (Dodatek 2), ki smo ga prej alikvotirali v epruvete ali stekleničke brez DNK. Za obogatitveni test ELISA lahko uporabimo večji delež ekstrakta vzorca v bujonu (npr. 100 µl v 1,0 ml obogatitvenega bujona).

4.2.2 Inkubiramo 72 ur pri 27 do 30 °C v stresalni ali statični kulturi, pri čemer so pokrovi rahlo zaprti, da omogočimo zračenje.

4.2.3 Pred uporabo v testu ELISA ali PCR dobro premešamo.

4.2.4 Z obogatenim bujonom ravnamo enako kot z vzorci v zgornjih testih.

Opomba: Če pričakujemo inhibicijo obogatitve R. solanacearum zaradi velikih populacij nekaterih tekmujočih saprofitskih bakterij, bomo boljše rezultate morda dobili, če ekstrakte vzorcev obogatimo pred centrifugiranjem oziroma pred drugimi postopki koncentriranja.

5. IF test

Načelo

Uporaba IF testa kot glavnega presejalnega testa je priporočljiva, ker je dokazano obstojen pri doseganju zahtevanih pragov.

Če IF test uporabljamo kot glavni presejalni test in je odčitek IF pozitiven, je treba kot drugi presejalni test opraviti izolacijski test, test PCR ali FISH. Če IF test uporabljamo kot drugi presejalni test in je odčitek IF pozitiven, je za zaključek analize potrebno nadaljnje testiranje glede na diagram poteka.

Opomba: Uporabimo potrjen vir protiteles za R. solanacearum (glej spletno mesto http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Priporočljivo je, da se titer določi za vsako novo serijo protiteles. Titer je definiran kot najvišja razredčina, pri kateri pride do optimalne reakcije, če testiramo suspenzijo, ki vsebuje 105 do 106 celic na ml homolognega seva bakterije R. solanacearum, z ustrezno razredčino flourescein izotiocianatovega (FITC) konjugata v skladu z navodili proizvajalca. Potrjeni poliklonalni antiserumi so imeli vsi titer IF vsaj 1:2 000. Med testiranjem je treba protitelesa uporabiti z delovno razredčino (razredčinami), ki je blizu ali enaka titru.

Test je treba opraviti na sveže pripravljenih ekstraktih vzorcev. Po potrebi ga je mogoče uspešno opraviti na ekstraktih, shranjenih pri –68 do –86 °C pod glicerolom. Glicerol odstranimo iz vzorca z dodatkom 1 ml peletnega pufra (Dodatek 4), ponovnim 15-minutnim centrifugiranjem pri 7 000 g in resuspendiranjem v enakem volumnu peletnega pufra. To pogosto ni potrebno, še posebej če so vzorci na stekelcih fiksirani s plamenom.

Pripravimo ločena stekelca za pozitivno kontrolo s homolognim sevom ali katerimkoli drugim referenčnim sevom bakterije R. solanacearum, suspendiranim v ekstraktu krompirja, kot je navedeno v Dodatku 3 B, lahko pa tudi v pufru.

Naravno okuženo tkivo (ohranjeno z liofilizacijo ali zamrzovanjem pri –16 do –24 °C) je treba uporabiti, kjer je mogoče, kot podobno kontrolo na istem stekelcu.

Kot negativne kontrole lahko uporabimo alikvote ekstrakta vzorca, ki so bili prej testirani kot negativni za R. solanacearum.

Standardizirani pozitivni in negativni kontrolni materiali, ki so na voljo za uporabo s tem testom, so navedeni v Dodatku 3.

Uporabimo objektna stekelca z več vdolbinicami, po možnosti z 10 okenci po vsaj 6 mm v premeru.

Kontrolni material testiramo povsem enako kot vzorce.

5.1 Testna stekelca pripravimo po enem od naslednjih postopkov:

(i) Za pelete z relativno malo škroba: V prvo okence odpipetiramo standardno količino (za okence s premerom 6 mm ustreza 15 µl –za večja okenca količino povečamo) razredčine 1/100 resuspendirane krompirjeve pelete. Nato odpipetiramo podobno količino nerazredčene pelete (1/1) na preostala okenca v vrstici. Drugo vrstico lahko uporabimo kot ponovitev ali za drugi vzorec, kot je prikazano na sliki 1.

(ii) Za druge pelete: Pripravimo desetkratne razredčine (1/10, 1/100) resuspendirane pelete v peletnem pufru. V eno vrstico okenc odpipetiramo standardno količino (za okence s premerom 6 mm ustreza 15 µl –za večja okenca količino povečamo) resuspendirane pelete in vsake posamezne razredčine. Drugo vrstico lahko uporabimo kot ponovitev ali za drugi vzorec, kot je prikazano na sliki 2.

5.2 Počakamo, da se kapljice posušijo pri sobni temperaturi, ali jih segrejemo do temperature 40-45 °C. Celice bakterij fiksiramo na stekelce bodisi s segrevanjem (15 minut pri 60 °C), plamenom, 95-odstotnim etanolom, ali po specifičnih navodilih dobaviteljev protiteles.

Fiksirana stekelca lahko po potrebi shranimo zamrznjena v sušilni škatli, čim manj časa je potrebno (največ 3 mesece), preden jih spet testiramo.

5.3 Postopek IF

(i) V skladu s pripravo testnih objektnih stekelc v 5.1(i): Pripravimo niz dvakratnih razredčin. Prva vdolbinica mora imeti 1/2 titra (T/2), druge pa 1/4 titra (T/4), 1/2 titra (T/2), titer (T) in dvakratni titer (2T).

(ii) V skladu s pripravo testnih objektnih stekelc v 5.1(ii): Pripravimo delovno razredčino (DR) protitelesa v pufru IF. Delovna razredčina vpliva na specifičnost.

Slika 1. V skladu s pripravo testnih objektnih stekelc v 5.1(i) in 5.3(i)

Razredčine resuspendirane pelete 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Razredčina resuspendirane pelete (T = titer) T/2 T/4 T/2 T 2T  Dvakratne razredčine antiseruma/protiteles Vzorec 1 1 2 3 4 5 Ponovitev vzorca 1 ali vzorec 2 6 7 8 9 10





Slika 2. V skladu s pripravo testnih objektnih stekelc v 5.1(ii) in 5.3(ii)

Delovna razredčina antiseruma/protiteles 1/1 1/10 1/100 prazno prazno  Desetkratna razredčina resuspendirane pelete Vzorec 1 1 2 3 4 5 Ponovitev vzorca 1 ali vzorec 2 6 7 8 9 10

5.3.1 Objektna stekelca razporedimo po vlažnem vpojnem papirju. Testna okenca prekrijemo z razredčino oziroma razredčinami protiteles. Količina protiteles, nanesenih na okenca, mora biti vsaj enaka količini nanesenega ekstrakta.

Temu postopku sledimo, če ni specifičnih navodil dobaviteljev protiteles.

5.3.2 Inkubiramo pokrito na vlažnem papirju 30 minut pri sobni temperaturi (18-25 °C).

5.3.3 S stekelc otresemo kapljice in stekelca previdno speremo s pufrom IF. Za pet minut potopimo v pufru IF-Tween (Dodatek 4) in nato še v pufru IF. Izogibamo se rabi pršil ali prenosu kapljic, kar bi lahko privedlo do navzkrižne kontaminacije. Previdno popivnamo odvečno vlago.

5.3.4 Objektna stekelca razporedimo po vlažnem papirju. Testna okenca prekrijemo z razredčino konjugata FITC, uporabljenega za določitev titra. Količina konjugata, nanesenega na okenca, mora biti enaka količini nanesenih protiteles.

5.3.5 Stekelca inkubiramo pokrita na vlažnem papirju 30 minut pri sobni temperaturi (18-25 °C).

5.3.6 S stekelca otresemo kapljice konjugata. Splaknemo in operemo kot prej (5.3.3).

Previdno odstranimo odvečno vlago.

5.3.7 Na vsako okence odpipetiramo 5–10 µl 0,1 M glicerola s fosfatnim pufrom (Dodatek 4) ali podobnim prekrivnim pufrom proti bledenju in pokrijemo s krovnim stekelcem.

5.4 Branje IF-testa:

5.4.1 Stekelca pregledamo pod epifluorescenčnim mikroskopom s filtri, primernimi za vzbujanje FITC, v imerzijskem olju ali vodi pri povečavi 500–1 000. Okenca pregledamo vzdolž dveh pravokotnih premerov in po obodu. Pri vzorcih, ki ne kažejo nobenih celic ali le malo celic, opazujemo vsaj 40 mikroskopskih polj.

Najprej pregledamo stekelce pozitivne kontrole. Celice morajo biti svetlo fluorescenčne in povsem obarvane pri določenem titru protiteles oziroma delovne razredčine. Če pri obarvanju pride do odstopanj, je treba IF test (oddelek VI.A.5.) ponoviti.

5.4.2 V testnih okencih testnih stekelc iščemo svetle fluorescenčne celice z značilno morfologijo bakterije R. solanacearum (glej spletno mesto http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intenziteta fluorescence mora biti enaka kot pri sevu pozitivne kontrole pri enaki razredčini protiteles. Celice z nepopolnim obarvanjem ali šibko fluorescenco se ne upoštevajo.

Če sumimo kontaminacijo, moramo test ponoviti. Do tega lahko pride, če vsa stekelca v seriji kažejo pozitivne celice zaradi kontaminacije pufra ali če najdemo pozitivne celice (zunaj okenc stekelc) na zgornji plasti stekelca.

5.4.3 S specifičnostjo testa imunofluorescence je povezanih več problemov. V krompirjevih peletah stebelnih delov in stolonov se bodo verjetno pojavile populacije fluorescentnih celic ozadja z atipično morfologijo in navzkrižno reagirajoče saprofitske bakterije, ki so po velikosti in morfologiji podobne bakteriji R. solanacearum.

5.4.4 Upoštevamo samo fluorescentne celice tipične velikosti in morfologije pri titru oziroma delovni razredčini protiteles, kot je opisano v 5.3.

5.4.5 Interpretacija rezultata IF testa:

(i) Če najdemo svetle fluorescentne celice z značilno morfologijo, določimo povprečno število značilnih celic na mikroskopsko polje in izračunamo število značilnih celic na ml resuspendirane pelete (Dodatek 5). Rezultat testa IF je pozitiven pri vzorcih, ki imajo vsaj 5 × 103 značilnih celic na ml resuspendirane pelete. Vzorec velja za potencialno kontaminiranega in potrebni so nadaljnji testi.

(ii) Rezultat IF testa je negativen pri vzorcih z manj kot 5 × 103 celic na ml resuspendirane pelete, in vzorec velja za negativnega. Nadaljnji testi niso potrebni.

6. Testi PCR

Načela

Če test PCR uporabljamo kot glavni presejalni test in je odčitek pozitiven, je treba kot drugi obvezni presejalni test opraviti izolacijski test ali IF test. Če test PCR uporabljamo kot drugi presejalni test in je odčitek pozitiven, je za zaključek diagnoze potrebno nadaljnje testiranje glede na diagram poteka.

Popolno izkoriščanje te metode kot osnovnega presejalnega testa se priporoča samo, če smo pridobili strokovno usposobljenost.

Opomba: Predhodno testiranje s to metodo mora omogočati ponovljivo detekcijo 103 do 104 celic bakterije R. solanacearum na ml, dodanih ekstraktom vzorcev, ki so bili prej testirani kot negativni. Če želimo doseči največjo stopnjo občutljivosti in specifičnosti v vseh laboratorijih, bodo morda potrebni eksperimenti za optimizacijo.

Uporabimo potrjene reagente za PCR in protokole (glej Dodatek 6). Po možnosti izberemo metodo z notranjo kontrolo.

Z ustreznimi previdnostnimi ukrepi se izogibamo kontaminaciji vzorca s ciljno DNK. Test PCR smejo izvajati le izkušeni strokovnjaki v temu namenjenih laboratorijih za molekularno biologijo, da bi zmanjšali možnost kontaminacije s ciljno DNK.

Negativne kontrole (za ekstrakcijo DNK in postopke PCR) je treba vedno obravnavati kot končne vzorce v postopku, ki pokaže, ali je prišlo do prenosa DNK.

V test PCR vključimo naslednje negativne kontrole:

— ekstrakt vzorca, ki je bil predhodno testiran negativno za R. solanacearum,

— pufrske kontrole za ekstrakcijo bakterije in DNK iz vzorca,

— reakcijsko zmes PCR.

Vključimo naslednje pozitivne kontrole:

— alikvote resuspendiranih pelet, ki jim je bila dodana bakterija R. solanacearum (za pripravo glej Dodatek 3B),

— suspenzijo 106 celic na ml bakterije R. solanacearum v vodi iz virulentnega izolata (npr. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; glej Dodatek 3B),

— če je mogoče, pri PCR testu uporabimo tudi DNK, ekstrahirano iz pozitivnih kontrolnih vzorcev.

Da ne bi prišlo do kontaminacije, pripravimo pozitivno kontrolo v okolju, ločenem od vzorcev, ki jih nameravamo testirati.

Ekstrakti vzorcev morajo biti čim bolj očiščeni zemlje. Zato bi bilo v nekaterih primerih morda priporočljivo, da pripravimo ekstrakte iz opranih krompirjev, če nameravamo uporabiti protokole PCR.

Standardizirani pozitivni in negativni kontrolni materiali, ki so na voljo za uporabo s tem testom, so navedeni v Dodatku 3.

6.1 Metode prečiščevanja DNK

Uporabimo vzorce pozitivne in negativne kontrole, kot je opisano zgoraj (glej Dodatek 3).

Kontrolni material testiramo povsem enako kot vzorce.

Za prečiščevanje ciljne DNK iz kompleksnih vzorčnih medijev je na voljo vrsta metod, s katerimi odstranimo inhibitorje za PCR in druge encimske reakcije in koncentriramo ciljno DNK v ekstraktu vzorca. Naslednja metoda je bila optimirana za uporabo z potrjenimi metodami PCR, prikazanimi v Dodatku 6.

(a) Pastrikova metoda (2000)

1. Odpipetiramo 220 µl lizirnega pufra (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) v 1,5 ml Eppendorfovo epruveto.

2. Dodamo 100 µl ekstrakta vzorca in za 10 min postavimo v grelno enoto ali vodno kopel pri 95 °C.

3. Epruveto za 5 min damo na led.

4. Dodamo 80 µl osnovne raztopine lizocima (50 mg lizocima na ml v 10 mM Tris HCl, pH 8,0) in 30 min inkubiramo pri 37 °C.

5. Dodamo 220 µl Easy DNA® raztopine A (Invitrogen), dobro premešamo z vrtinčenjem in inkubiramo 30 min pri 65 °C.

6. Dodamo 100 µl Easy DNA® raztopine B (Invitrogen) in močno vrtinčimo, da oborina v epruveti prosto teče ter da vzorec postane enakomerno viskozen.

7. Dodamo 500 µl kloroforma in vrtinčimo, dokler se viskoznost ne zmanjša in mešanica postane homogena.

8. Centrifugiramo pri 15 000 g 20 min pri 4 °C, da ločimo faze in dosežemo interfazo.

9. Zgornjo fazo prenesemo v svežo Eppendorfovo epruveto.

10. Dodamo 1 ml 100 % etanola (–20 °C), na kratko vrtičimo in za 10 min. inkubiramo na ledu.

11. Centrifugiramo pri 15 000 g 20 min pri 4° C in iz pelete odstranimo etanol.

12. Dodamo 500 µl 80 % etanola (–20 °C) in premešamo, tako da obrnemo epruveto.

13. Centrifugiramo pri 15 000 g 10 min pri 4 °C, shranimo peleto in odstranimo etanol.

14. Peleto pustimo, da se posuši na zraku ali v vakuumski centrifugi.

15. Peleto resuspendiramo v 100 µl sterilne ultra čiste vode in vsaj 20 minut pustimo pri sobni temperaturi.

16. Hranimo pri –20 °C, dokler je potrebno za PCR.

17. Morebitno belo oborino odvrtimo s centrifugiranjem in uporabimo 5 µl supernatanta, ki vsebuje DNK za PCR.

(b) Druge metode

Druge metode za ekstrakcijo DNK, npr. Qiagen DNeasy Plant Kit, lahko uporabimo, če so dokazano enako učinkovite za prečiščevanje DNK iz kontrolnih vzorcev, ki vsebujejo 103 do 104 patogenih celic na ml.

6.2 PCR

6.2.1 Po potrjenih protokolih pripravimo testne in kontrolne matrice za PCR (oddelek VI.A.6). Pripravimo eno desetkratno razredčino vzorčnega ekstrakta DNK (1:10 v ultra čisti vodi).

6.2.2 Ustrezno reakcijsko zmes PCR pripravimo v nekontaminiranem okolju po objavljenih protokolih (Dodatek 6). Kjer je to mogoče, je priporočljivo uporabiti multipli protokol PCR, ki vključuje tudi notranjo kontrolo PCR.

6.2.3 Dodamo 2-5 µl ekstrakta DNK na 25 µl reakcijske zmesi PCR v sterilne epruvete za PCR po protokolih za PCR (glej Dodatek 6).

6.2.4 Vključimo tudi vzorec za negativno kontrolo, ki vsebuje samo reakcijsko zmes PCR, in dodamo isti vir ultra čiste vode, kot smo ga uporabili za zmes PCR pri vzorcu.

6.2.5 Epruvete damo v isti ciklični termostat, ki smo ga uporabili pri predhodnem testiranju, in zaženemo ustrezno optimirani program PCR (Dodatek 6).

6.3 Analiza produkta PCR

6.3.1 Pomnožke PCR odkrijemo z elektroforezo v agaroznem gelu. Vsaj 12 µl pomnožene reakcijske zmesi DNK iz vsakega vzorca, zmešane s 3 µl nanašalnega pufra (Dodatek 6), vlijemo v 2,0 % (w/v) agarozne gele v tris-acetatnem-EDTA (TAE) pufru (Dodatek 6), 5-8 V na cm. Uporabimo ustrezni označevalec DNK, npr. lestvico 100 bp.

6.3.2 Proge DNK razkrijemo tako, da jih 30-60 min barvamo z etidijevim bromidom (0,5 mg na L), pri tem pa upoštevamo ustrezne varnostne ukrepe za ravnanje s to mutageno snovjo.

6.3.3 Obarvani gel opazujemo pod kratkovalovno UV presvetlitvijo (λ = 302 nm) in iščemo pomnožene produkte PCR pričakovane velikosti (Dodatek 6) ter dokumentiramo.

6.3.4 Za vsa nova odkritja/primere preverimo avtentičnost pomnožka PCR, tako da opravimo restrikcijsko encimsko analizo na vzorcu preostale pomnožene DNK: inkubiramo pri optimalni temperaturi in času z ustreznim encimom in pufrom (glej Dodatek 6). Tako kot prej, raztopljene fragmente PCR odkrijemo z elektroforezo v agaroznem gelu in po obarvanju z etidijevim bromidom opazujemo značilni restrikcijski vzorec fragmentov pod UV presvetlitvijo ter primerjamo z raztopljeno in neraztopljeno pozitivno kontrolo.

Interpretacija rezultata testa PCR:

Test PCR je negativen, če za dotični vzorec ne odkrijemo za bakterijo R. solanacearum značilnega pomnožka PCR pričakovane velikosti, vendar ga odkrijemo za vse vzorce pozitivne kontrole (pri multiplem PCR z za rastlino specifičnimi PCR primerji notranje kontrole: z dotičnim vzorcem je treba pomnožiti drugi produkt PCR pričakovane velikosti).

Test PCR je pozitiven, če odkrijemo za bakterijo R. solanacearum značilen pomnožek PCR pričakovane velikosti in restrikcijskega vzorca (če je potrebno), pod pogojem, da ni bil pomnožen iz nobenega od vzorcev negativne kontrole. Zanesljivo potrditev pozitivnega rezultata dobimo tudi, če ponovimo test z drugo množico PCR primerjev (Dodatek 6).

Opomba: Inhibicijo PCR lahko sumimo, če pričakovani pomnožek dobimo iz vzorca pozitivne kontrole, ki vsebuje bakterijo R. solanacearum v vodi, medtem ko iz pozitivnih kontrol z bakterijo R. solanacearum v ekstraktu krompirja dobimo negativne rezultate. Pri multiplih protokolih PCR z notranjo kontrolo PCR je indicirana inhibicija reakcije, če ne dobimo nobenega od obeh pomnožkov.

Kontaminacijo lahko sumimo, če pričakovani pomnožek dobimo iz ene ali več negativnih kontrol.

7. Test FISH

Načelo

Če test FISH uporabljamo kot glavni presejalni test in je odčitek pozitiven, je treba kot drugi obvezni presejalni test opraviti izolacijski test ali IF test. Če test FISH uporabljamo kot drugi presejalni test in je odčitek pozitiven, je za zaključek diagnoze potrebno nadaljnje testiranje glede na diagram poteka.

Opomba: Uporabimo potrjene, za bakterijo R. solanacearum specifične oligo-sonde (glej Dodatek 7). Predhodno testiranje s to metodo mora omogočati ponovljivo detekcijo vsaj 103 do – 104 celic bakterije R. solanacearum na ml dodano ekstraktom vzorcev, ki so bili prej testirani kot negativni.

Spodnji postopek je najbolje opraviti na sve� pripravljenem ekstraktu vzorca, uspešno pa ga lahko opravimo tudi na ekstraktu vzorca, ki je bil shranjen pod glicerolom pri –16 do –24 °C ali –68 do –86 °C.

Kot negativne kontrole uporabimo alikvote ekstrakta vzorca, ki so bili prej testirani kot negativni za R. solanacearum.

Kot pozitivne kontrole pripravimo suspenzije, ki vsebujejo 105 do 106 celic na ml bakterije R. solanacearum biovar 2 (npr. sev NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, glej Dodatek 3) v 0,01 M fosfatnega pufra (PB) iz 3-5 dnevne kulture). Pripravimo ločena stekelca za pozitivno kontrolo s homolognim sevom ali katerimkoli drugim referenčnim sevom bakterije R. solanacearum, suspendiranim v ekstraktu krompirja, kot je navedeno v Dodatku 3B.

Uporaba eubakterijske oligo-sonde FITC omogoča kontrolo procesa hibridizacije, saj bodo obarvane vse eubakterije, ki so navzoče v vzorcu.

Standardizirani pozitivni in negativni kontrolni materiali, ki so na voljo za uporabo s tem testom, so navedeni v Dodatku 3, točka A.

Kontrolni material testiramo povsem enako kot vzorce.

7.1 Fiksiranje ekstrakta krompirja

Spodnji protokol temelji na Wullings in sod. (1998):

7.1.1 Pripravimo fiksirno raztopino (glej Dodatek 7).

7.1.2 Odpipetiramo 100 µl vsakega ekstrakta vzorca v Eppendorfovo epruveto in centrifugiramo 7 min pri 7 000 g.

7.1.3 Odstranimo supernatant in raztopimo peleto v 200 µl preparata za fiksiranje, pripravljenega manj kot 24 ur pred tem. Vrtinčimo in inkubiramo 1 uro v hladilniku.

7.1.4 Centrifugiramo 7 min pri 7 000 g, odstranimo supernatant in resuspendiramo peleto v 75 µl 0,01 M PB (glej Dodatek 7).

7.1.5 V okenca čistega večprekatnega stekelca nanesemo 16 µl fiksiranih suspenzij, kot je prikazano na sliki 7.1. Nanesemo 2 različna vzorca na stekelce, nerazredčena in uporabimo 10 µl za izdelavo razredčine 1:100 (v 0,01 M PB). Preostalo raztopino vzorca (49 µl) lahko shranimo pri –20 °C, potem ko smo dodali 1 količino 96 % etanola. Če je treba test FISH ponoviti, etanol odstranimo s centrifugiranjem in dodamo enako količino 0,01 PB (premešamo z vrtinčenjem).

Slika 7.1 Razporeditev stekelca za FISH

Vzorec 1 Prazno Prazno Prazno Vzorec 2 okence 1 okence 2 okence 3 okence 4 okence 5 Vzorec 1 Prazno Prazno Prazno Vzorec 2 okence 6 okence 7 okence 8 okence 9 okence 10 Krovno stekelce 1 Krovno stekelce 2

7.1.6 Stekelca posušimo na zraku (ali v sušilniku za stekelca pri 37 °C) in jih fiksiramo s plamenom.

Na tej točki je postopek mogoče prekiniti in nadaljevati s hibridizacijo naslednji dan. Stekelca je treba shraniti v suhem okolju brez prahu pri sobni temperaturi.

7.2 Hibridizacija

7.2.1 Celice dehidriramo v stopenjski seriji etanola 50 %, 80 % in 96 %, v vsakem po eno minuto. Stekelca pustimo, da se posušijo v držalu.

7.2.2 Pripravimo vlažno inkubacijsko komoro, tako da pokrijemo dno hermetične škatle z vpojnim ali filtrirnim papirjem, namočenim v 1x hybmix (Dodatek 7). Škatlo vsaj 10 minut predinkubiramo v hibridizacijski pečici pri 45 °C.

7.2.3 Nanesemo 10 μl hibridizacijske raztopine (Dodatek 7) na 8 okenc (okenca 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 in 10; glej sliko 7.1) vsakega stekelca, tako da sredinski okenci (3 in 8) ostaneta prazni.

7.2.4 Prva 4 in zadnja 4 okenca pokrijemo s krovnimi stekelci (24 × 24 mm), ne da bi ujeli zrak. Stekelca postavimo v vnaprej ogreto vlažno komoro in hibridiziramo 5 ur v pečici pri 45 °C v temi.

7.2.5 Pripravimo 3 čaše, ki vsebujejo 1 l Milli Q (molekulske stopnje) vode, 1 l 1x hybmixa (334 ml 3x hybmixa in 666 ml Milli Q vode) in 1 l 1/8x hybmixa (42 ml 3x hybmixa in 958 ml Milli Q vode). Vsako predinkubiramo v vodni kopeli pri 45 °C.

7.2.6 S stekelc odstranimo krovna stekelca in stekelca damo v držalo.

7.2.7 Speremo odvečno sondo, tako da 15 minut inkubiramo v čaši z 1 × hybmix pri 45 °C.

7.2.8 Držalo prestavimo v pralno raztopino 1/8 hybmix in inkubiramo nadaljnjih 15 minut.

7.2.9 Stekelca na hitro potopimo v vodo Milli Q in jih damo na filtrirni papir. Odvečno vlago odstranimo, tako da površino narahlo prekrijemo s filtrirnim papirjem. Na vsako okence odpipetiramo 5-10 μl raztopine prekrivnega pufra proti bledenju (npr. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA ali ekvivalentni) in pokrijemo celo stekelce z velikim krovnim stekelcem (24 × 60 mm).

7.3 Branje testa FISH:

7.3.1 Stekelca takoj opazujemo z mikroskopom, opremljenim za epifluorescenčno mikroskopiranje, pri 630 ali 1 000-kratni povečavi v imerzijskem olju. S filtrom, primernim za fluorescein izotiocianat (FITC), so evbakterijske celice (kar vključuje večino gram negativnih celic) v vzorcu obarvane fluorescentno zeleno. S filtrom za tetrametilrodamin 5-izotiocianat so celice bakterije R. solanacearum, obarvane s Cy3, videti fluorescentno rdeče. Primerjamo morfolocijo celic z morfologijo pozitivnih kontrol. Celice morajo biti svetlo fluorescentne in povsem obarvane. Če pri obarvanju pride do odstopanj, je treba test FISH ponoviti (oddelek VI.A.7.). Okenca pregledamo vzdolž dveh pravokotnih premerov in po obodu. Pri vzorcih, ki ne kažejo nobenih celic ali le malo celic, opazujemo vsaj 40 mikroskopskih polj.

7.3.2 V testnih okencih testnih stekelc iščemo svetle fluorescenčne celice z značilno morfologijo bakterije R. solanacearum (glej spletno mesto http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intenziteta fluorescence mora biti enaka ali večja kot pri sevu pozitivne kontrole. Celice z nepopolnim obarvanjem ali šibko fluorescenco se ne upoštevajo.

7.3.3 Če sumimo kontaminacijo, moramo test ponoviti. Do tega lahko pride, če vsa stekelca v seriji kažejo pozitivne celice zaradi kontaminacije pufra ali če najdemo pozitivne celice (zunaj okenc stekelc) na zgornji plasti stekelca.

7.3.4 S specifičnostjo testa FISH je povezanih več problemov. V krompirjevih peletah stebelnih delov in stolonov se lahko – čeprav veliko redkeje kot pri testu IF – pojavijo populacije fluorescentnih celic ozadja z atipično morfologijo in navzkrižno reagirajoče saprofitske bakterije, ki so po velikosti in morfologiji podobne bakteriji R. solanacearum.

7.3.5 Upoštevamo samo fluorescenčne celice značilne velikosti in morfologije.

7.3.6 Interpretacija rezultata testa FISH:

(i) Veljavne rezultate testa FISH dobimo, če opazimo celice, ki so po velikosti in morfologiji značilne za bakterijo R. solanacearum, in so s filtrom FITC videti fluorescentno svetlo zelene, s filtrom rodaminom pa fluorescentno svetlo rdeče. Opaziti jih moramo v vseh pozitivnih kontrolah in v nobeni od negativnih kontrol. Če najdemo svetle fluorescentne celice z značilno morfologijo, določimo povprečno število značilnih celic na mikroskopsko polje in izračunamo število značilnih celic na ml resuspendirane pelete (Dodatek 4). Vzorci z najmanj 5 × 103 značilnih celic na ml resuspendirane pelete veljajo za potencialno kontaminirane. Potrebni so nadaljnji testi. Vzorci z manj kot 5 × 103 značilnih celic na ml resuspendirane pelete veljajo za negativne.

(ii) Test FISH je negativen, če s filtrom rodaminom ne opazimo fluorescentnih živo rdečih celic z značilno velikostjo in morfologijo bakterije R. solanacearum, pod pogojem, da značilne živo rdeče fluoresecentne celice opazimo v preparatih pozitivne kontrole pri uporabi filtra rodamina.

8. Testi ELISA

Načelo

Test ELISA lahko uporabimo le kot dodatni test poleg testov IF, PCR ali FISH, saj ima ta test dokaj nizko občutljivost. Če uporabimo DAS ELISA, je obvezna obogatitev in uporaba monoklonalnih protiteles (glej spletno mesto http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Obogatitev vzorca pred uporabo testa ELISA je lahko koristna, saj poveča občutljivost testa, vendar lahko spodleti zaradi tekmovanja z drugimi organizmi v vzorcu.

Opomba: Uporabimo potrjen vir protiteles za R. solanacearum (glej spletno mesto http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Priporočljivo je, da se titer določi za vsako novo serijo protiteles. Titer je definiran kot najvišja razredčina, pri kateri pride do optimalne reakcije, če testiramo suspenzijo, ki vsebuje 105 do 106 celic na ml homolognega seva bakterije R. solanacearum, z ustreznimi konjugati sekundarnih protiteles v skladu z navodili proizvajalca. Med testiranjem protitelesa uporabljamo pri delovni razredčini blizu titra ali v vrednosti titra komercialne formulacije.

Titer protiteles določimo na suspenziji 105 do 106 celic na ml homolognega seva bakterije R. solanacearum.

Kot negativno kontrolo vključimo ekstrakt vzorca, ki je bil že testiran kot negativen za R. solanacearum, in suspenzijo ne-navzkrižno reagirajoče bakterije v fosfatnem pufru s soljo (PBS).

Kot pozitivno kontrolo uporabimo alikvote ekstrakta vzorca, ki so bili že testirani kot negativni, pomešane z 103 do 104 celicami na ml bakterije R. solanacearum biovar 2 (npr. sev NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, glej Dodatek 2 A in B). Za primerjavo rezultatov na obeh ploščah uporabimo standardno suspenzijo 105 do 106 celic na ml v PBS bakterije R. solanacearum. Poskrbimo, da so pozitivne kontrole na mikrotitrski ploščici zagotovo ločene od testiranih vzorcev.

Standardizirani pozitivni in negativni kontrolni materiali, ki so na voljo za uporabo s tem testom, so navedeni v Dodatku 3, točka A.

Kontrolni material testiramo povsem enako kot vzorce.

Potrjena sta dva protokola za test ELISA:

(a) Posredni ELISA (Robinson Smith in sod., 1995)

1. Uporabimo 100-200 µl alikvota ekstrakta vzorca. (Segrevanje 4 minute pri 100 °C v vodni kopeli ali grelni enoti lahko v nekaterih primerih zmanjša število nespecifičnih rezultatov).

2. Dodamo enako količino karbonatnega premaznega pufra z dvojno koncentracijo (Dodatek 4) in močno premešamo.

3. V vsako od vsaj dveh vdolbinic na mikrotitrski ploščici odmerimo 100 µl alikvote (npr. Nunc-Polysorp ali ekvivalentni). Inkubiramo eno uro pri 37 °C ali čez noč pri 4 °C.

4. Otresemo ekstrakte iz vdolbinic. Vdolbinice trikrat speremo z raztopino PBS-Tween (Dodatek 4), pri čemer zadnjo izpiralno raztopino pustimo v vdolbinicah vsaj pet minut.

5. Pripravimo ustrezno razredčino protiteles za bakterijo R. solanacearum v blokirnem pufru (Dodatek 4). Za veljavna komercialna protitelesa uporabimo priporočene razredčine (običajno dvakrat bolj koncentrirane kot titer).

6. V vdolbinice nanesemo po 100 µl razredčine in inkubiramo eno uro pri 37 °C.

7. Otresemo raztopino iz vdolbinic. Vdolbinice speremo kakor prej (4).

8. Pripravimo ustrezno razredčino konjugata alkalne fosfataze sekundarnih protiteles v blokirnem pufru. V vdolbinice nanesemo po 100 µl razredčine in inkubiramo eno uro pri 37 °C.

9. Otresemo konjugat protiteles iz vdolbinic. Vdolbinice speremo kakor prej (4).

10. V vsako vdolbinico dodamo 100 µl raztopine substrata alkalne fosfataze (Dodatek 4). Inkubiramo v temnem prostoru pri sobni temperaturi in odčitavamo absorbanco pri 405 nm v rednih presledkih v 90 minutah.

(b) DASI ELISA

1. Pripravimo ustrezno razredčino poliklonalnih imunoglobulinov z delovanjem proti bakteriji R. solanacearum v premaznem pufru pH 9,6 (Dodatek 4). V vsako vdolbinico nanesemo 200 µl. Inkubiramo 4-5 ur pri 37 °C ali 16 ur pri 4 °C.

2. Vdolbinice trikrat izperemo z raztopino PBS-Tween (Dodatek 4). Vsaj v 2 vdolbinici nanesemo 190 µl ekstrakta vzorca. Na vsaki ploščici dodamo tudi pozitivno in negativno kontrolo, vsako v po dve vdolbinici. Inkubiramo 16 ur pri 4 °C.

3. Vdolbinice trikrat izperemo z raztopino PBS-Tween (Dodatek 4).

4. Pripravimo ustrezno razredčino za bakterijo R. solanacearum specifičnih monoklonalnih protiteles v PBS (Dodatek 4), ki vsebuje tudi 0,5 % bovinega seruma albumina (BSA), in dodamo 190 µl v vsako vdolbinico. Inkubiramo 2 uri pri 37 °C.

5. Vdolbinice trikrat izperemo z raztopino PBS-Tween (Dodatek 4).

6. Pripravimo ustrezno razredčino antimišjih imunoglobulinov, konjugiranih z alkalno fosfatazo v PBS. V vsako vdolbinico nanesemo 190 µl. Inkubiramo 2 uri pri 37 °C.

7. Vdolbinice trikrat izperemo z raztopino PBS-Tween (Dodatek 4).

8. Pripravimo raztopino substrata alkalne fosfataze, ki vsebuje 1 mg p-nitrofenil fosfata na ml pufra substrata (Dodatek 4). V vsako vdolbinico nanesemo 200 µl. Inkubiramo v temnem prostoru pri sobni temperaturi in odčitavamo absorbanco pri 405 nm v rednih presledkih v 90 minutah.

Interpretacija rezultatov testa ELISA:

Test ELISA je negativen, če je povprečni odčitek optične gostote (OD) iz ponovitev vzorčnih vdolbinic < 2x vrednost OD v vdolbinici ekstrakta vzorca negativne kontrole, pod pogojem, da so OD pozitivnih kontrol vsi nad 1,0 (po 90 minutah inkubacije s substratom) in so več kot dvakrat večji od OD, ki je bil ugotovljen za negativne ekstrakte vzorca.

Test ELISA je pozitiven, če so povprečni odčitki OD iz ponovitev vzorčnih vdolbinic > 2x vrednosti OD v vdolbinici ekstrakta vzorca negativne kontrole, pod pogojem, da so odčitki OD v vseh vdolbinicah negativne kontrole < 2x vrednosti odčitkov v vdolbinicah pozitivne kontrole.

Negativni odčitki ELISA v vdolbinicah pozitivne kontrole kažejo, da test ni bil opravljen pravilno ali da je bil inhibiran. Pozitivni odčitki ELISA v vdolbinicah negativne kontrole kažejo, da je prišlo do navzkrižne kontaminacije ali nespecifične vezave protiteles.

9. Biološki test

Opomba: Predhodno testiranje s to metodo mora omogočati ponovljivo detekcijo 103 do 104 enot bakterije R. solanacearum, ki tvorijo kolonije, na ml dodano ekstraktom vzorcev, ki so bili prej testirani kot negativni (priprava glej Dodatek 3).

Največjo občutljivost detekcije lahko pričakujemo, če uporabljamo sveže pripravljen ekstrakt vzorca in imamo optimalne pogoje za rast. Metodo pa lahko uspešno uporabimo tudi za ekstrakte, ki so bili shranjeni pod glicerolom pri –68 do –86 °C.

Spodnji protokol temelji na Janse (1988):

9.1 Za vsak vzorec uporabimo 10 testnih rastlin - dovzetnih kultivarjev paradižnika (npr. Moneymaker ali kultivar z ekvivalentno dovzetnostjo, kot določi testni laboratorij) v fazi tretjega pravega lista. Za podrobnosti o kulturah glej Dodatek 8. Uporabimo lahko tudi jajčevce (npr. kultivar Black Beauty ali kultivarje z ekvivalentno dovzetnostjo), uporabimo samo rastline v fazi listov 2–3, vse do popolnega razprostrtja tretjega pravega lista. Simptomi pri jajčevcu so se pokazali kot blažji in se razvijejo počasneje. Kjer je mogoče, je zato priporočljiva uporaba paradižnikovih sadik.

Med testne rastline porazdelimo 100 µl ekstrakta vzorca.

9.2.1 Inokulacija z brizgalko

Inokuliramo v steblo tik nad kličnima listoma z brizgalko, na kateri je nameščena igla (ne manj kot 23G). Vzorec porazdelimo med testne rastline.

9.2.2 Inokulacija v zarezo

Rastlino držimo med dvema prstoma in odpipetiramo kapljico (približno 5-10 µl) suspendirane pelete na steblo med kličnima listoma in prvim listom.

S sterilnim skalpelom naredimo diagonalno zarezo, dolgo približno 1,0 cm in globoko približno 2/3 debeline stebla. Zarežemo ob kapljici pelete.

Zarezo zalepimo s sterilnim vazelinom iz brizge.

9.3 Inokuliramo z isto tehniko, 5 sadik z vodno suspenzijo 105 do 106 celic na ml, pripravljeno iz 48 urne kulture virulentnega biovarja 2 seva bakterije R. solanacearum kot pozitivno kontrolo, in s peletnim pufrom (Dodatek 4) kot negativno kontrolo. Rastline pozitivne in negativne kontrole ločimo od drugih rastlin, da ne bi prišlo do navzkrižne kontaminacije.

9.4 Testne rastline gojimo v karanteni do 4 tedne pri 25-30 °C in v visoki relativni vlažnosti in primerno zalivamo, da ne bi prišlo do zasičenja z vodo oziroma do venenja zaradi pomanjkanja vode. Da ne bi prišlo do kontaminacije, inkubiramo rastline pozitivne in negativne kontrole na jasno ločenih klopeh v rastlinjaku oziroma rastni komori, in če je prostor omejen, zagotovimo strogo ločitev med obravnavanimi primeri. Če morajo biti rastline iz različnih vzorcev inkubirane blizu skupaj, jih ločimo z ustreznimi zasloni. Ko gnojimo, zalivamo, pregledujemo in delamo karkoli drugega, moramo zelo paziti, da ne bi prišlo do navzkrižne kontaminacije. Rastlinjaki in rastne komore morajo biti obvezno brez vseh insektnih zajedalcev, ker ti lahko prenašajo bakterijo z vzorca na vzorec.

Opazujemo, če se pojavijo simptomi venenja, epinastije, kloroze in krnenja.

9.5 Izoliramo od inficiranih rastlin (oddelek II.3) in identificiramo prečiščene kulture domnevne bakterije R. solanacearum (oddelek VI. B).

9.6 Če po 3 tednih ne opazimo simptomov, opravimo test IF/PCR/izolacije na kompozitnem vzorcu delov stebel dolžine 1 cm vsake testne rastline, odvzetih nad mestom inokulacije. Če je test pozitiven, naredimo razmaz razredčine (oddelek 4.1).

9.7 Identificiramo morebitne prečiščene kulture domnevne bakterije R. solanacearum (oddelek VI. B).

Interpretacija rezultatov biološkega testa

Veljavne rezultate biološkega testa dobimo, če rastline pozitivne kontrole izkazujejo značilne simptome, če bakterije iz teh rastlin lahko ponovno izoliramo in na negativnih kontrolah ne odkrijemo simptomov.

Biološki test je negativen, če testne rastline niso okužene z bakterijo R. solanacearum in pod pogojem, da bakterijo R. solanacearum opazimo v pozitivnih kontrolah.

Biološki test je pozitiven, če so testne rastline okužene z bakterijo R. solanacearum.

B. IDENTIFIKACIJSKI TESTI

Čiste kulture domnevnih izolatov bakterije R. solanacearum identificiramo z vsaj dvema od naslednjih testov, ki temeljijo na različnih bioloških načelih.

Za vsak opravljeni test vključimo znane referenčne seve, kjer je to primerno (glej Dodatek 3).

1. Hranilni in encimski identifikacijski testi

Določimo naslednje lastnosti fenotipov, ki so pri R. solanacearum vselej prisotne ali odsotne, v skladu z metodami Lelliott in Stead (1987), Klement in sod. (1990), Schaad (2001)

Test Pričakovani rezultat Fluorescentni pigment – Vključki PHB + Oksidacijski/fermentacijski (O/F) test O+/F- Katalaza + Oksidaza po Kovacsu + Redukcija nitrata + Izraba citrata + Rast pri 40 °C – Rast v 1 % NaCl + Rast v 2 % NaCl – Arginin dihidrolaza – Utekočinjenje želatine – Hidroliza škroba – Hidroliza ezulina – Produkcija levana –

2. IF test

2.1 Pripravimo suspenzijo približno 106 celic na ml v IF pufru (Dodatek 4).

2.2 Pripravimo niz dvakratnih razredčin ustreznega antiseruma (glej spletno mesto http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3 Izvedemo postopek IF (oddelek VI.A.5).

2.4 Test IF je pozitiven, če je IF-titer kulture enakovreden titru pozitivne kontrole.

3. Test ELISA

Opomba: Če delamo le 2 identifikacijska testa, poleg te metode ne smemo uporabiti še enega serološkega testa.

3.1 Pripravimo suspenzijo približno 108 celic na ml v 1X PBS (Dodatek 4).

3.2 Izvedemo ustrezni postopek ELISA z monoklonalnim protitelesom, specifičnim za R. solanacearum.

3.3 Test ELISA je pozitiven, če odčitek ELISA iz kulture doseže vsaj polovico vrednosti odčitka pozitivne kontrole.

4. Testi PCR

4.1 Pripravimo suspenzijo približno 106 celic na ml v sterilni vodi molekulske stopnje.

4.2 Štiri minute segrevamo 100 µl suspenzije celic v zaprtih epruvetah v grelni enoti ali vreli vodni kopeli pri 100 °C. Vzorce nato lahko shranimo pri –16 do –24 °C, dokler jih ne potrebujemo.

4.3 Izvedemo ustrezne postopke PCR, da pomnožimo za bakterijo R. solanacearum specifične pomnožke (npr. Seal in sod. (1993); Pastrik in Maiss (2000); Pastrik in sod. (2002); Boudazin in sod. (1999); Opina in sod. (1997), Weller in sod. (1999).

4.4 Pozitivno identifikacijo R. solanacearum dosežemo, če so pomnožki PCR enake velikosti in imajo enak polimorfizem dolžin restrikcijskih fragmentov kot sev pozitivne kontrole.

5. Test FISH

5.1 Pripravimo suspenzijo približno 106 celic na ml v ultra čisti vodi.

5.2 Opravimo postopek FISH (oddelek VI.A.7) z vsaj dvema oligo-sondama, specifičnima za R. solanacearum (Dodatek 7).

5.3 Pozitiven test FISH dosežemo, če dobimo iste reakcije iz kulture in pozitivne kontrole.

6. Profiliranje maščobnih kislin (FAP)

6.1 Kulturo 48 ur pri 28 °C gojimo na triptikaznem sojinem agarju (Oxoid).

6.2 Izvedemo ustrezen postopek FAP (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3 Test FAP je pozitiven, če je profil domnevne kulture identičen profilu pozitivne kontrole. Prisotnost značilnih maščobnih kislin 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH in 18:1 2OH in odsotnost 16:0 3OH je močan indikator vrste R.

7. Metode opredelitve seva

Za vsak nov primer izolacije R. solanacearum se priporoča opredelitev seva po eni od naslednjih metod.

Za vsak opravljeni test vključimo znane referenčne seve, kjer je to primerno (glej Dodatek 3).

7.1 Določanje biovarja

R. solanacearum se deli na biovarje na podlagi zmožnosti izrabe in/ali oksidacije treh disaharidov in treh heksoznih alkoholov (Hayward, 1964 in Hayward in sod., 1990). Rastna gojišča za test biovarja so opisana v Dodatku 2. Test lahko uspešno izvedemo tako, da inokuliramo gojišče s čistimi kulturami izolatov R. solanacearum in inkubiramo pri 28 °C. Če gojišče razdelimo v sterilne plošče celične kulture s 96 vdolbinicami (200 µl na vdolbinico), je mogoče v 72 urah opaziti spremembo barve z olivno zelene na rumeno, kar kaže na pozitivni rezultat testa.

Biovar 1 2 3 4 5 Izraba: maltoze – + + – + laktoze – + + – + D (+) celobioze – + + – + manitola – – + + + sorbitola – – + + – dulcitola – – + + –

Dodatni testi delijo biovar 2 na podfenotipe.

Biovar 2A (razširjenost po vsem svetu) Biovar 2A (v Čilu in Kolumbiji) Biovar 2T (v tropskih območjih) izraba trehaloze – + + izraba mezo-inozitola + – + izraba D-riboze – – + pektolitična aktivnost (1) nizka nizka visoka

7.2 Iskanje prstnih odtisov genoma

Molekularno razlikovanje sevov v kompleksu bakterije R. solanacearum je mogoče opraviti z več tehnikami, med drugim:

7.2.1 Analiza polimorfizma dolžin restrikcijskih fragmentov (RFLP) (Cook in sod., 1989)

7.2.2 Ponavljajoče zaporedje PCR z uporabo primerjev REP, BOX in ERIC (Louws in sod., 1995; Smith in sod., 1995)

7.2.3 Analiza polimorfizma dolžin pomnoženih fragmentov (AFLP) (Van der Wolf in sod., 1998)

7.3 Metode PCR

Za razločevanje sevov, ki pripadajo delitvi 1 (biovarji 3, 4 ad 5) in delitvi 2 (biovarji 1, 2A in 2T) bakterije R. solanacearum, lahko uporabimo specifične PCR primerje (Pastrik in sod, 2002; glej Dodatek 6), kot je bilo prvotno določeno z analizo RFLP (Cook in sod., 1989) in določanjem zaporedja 16S rDNA (Taghavi in sod., 1996).

C. POTRDITVENI TEST

Test patogenosti je treba opraviti kot zadnjo potrditev diagnoze za R. solanacearum in za ocenitev virulentnosti kultur, identificiranih kot R. solanacearum.

1. Pripravimo inokulum s približno 106 celic na ml iz 24–48-urne kulture izolata, ki ga nameravamo testirati, in ustrezni pozitivni kontrolni sev bakterije R. solanacearum (npr. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; glej Dodatek 3).

2. Inokuliramo 5–10 dovzetnih rastlin paradižnika ali jajčevca, najbolje v fazi tretjega pravega lista (oddelek VI.A.9).

3. Inkubiramo največ dva tedna pri 25–28 °C in visoki relativni vlažnosti ter ustrezno zalivamo, da ne prihaja do zasičenosti z vodo ali pomanjkanja vode. Pri čistih kulturah bi se moralo značilno venenje pojaviti v 14 dneh. Če po tem obdobju niso prisotni simptomi, kulture ni mogoče potrditi kot patogene oblike bakterije R. solanacearum.

4. Opazujemo, če se pojavijo simptomi venenja in/ali epinastije, kloroze in krnenja.