UREDBA KOMISIJE (ES) št. 273/2008

z dne 5. marca 2008

o določitvi podrobnih pravil za izvajanje Uredbe Sveta (ES) št. 1255/1999 o analitskih metodah in ocenjevanju kakovosti mleka in mlečnih proizvodov

KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE –

ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske skupnosti,

ob upoštevanju Uredbe Sveta (ES) št. 1255/1999 z dne 17. maja 1999 o skupni organizaciji trga mleka in mlečnih izdelkov (1) ter zlasti členov 10 in 15 ter členov 26(3), 29(1) in 31(4) Uredbe,

ob upoštevanju naslednjega:

Uredba Komisije (ES) št. 213/2001 (2) določa podrobna pravila za izvajanje Uredbe Sveta (ES) št. 1255/1999 o analitskih metodah in ocenjevanju kakovosti mleka in mlečnih proizvodov. Ob upoštevanju znanstvenega in tehničnega razvoja so na področju analitske metodologije potrebne bistvene spremembe. Zaradi preglednosti in učinkovitosti ter glede na število in vrsto predlogov sprememb je treba Uredbo (ES) št. 213/2001 razveljaviti in nadomestiti z novo uredbo.

Preveriti je treba, ali se dosledno izpolnjujejo zahteve glede sestave in kakovosti mleka in mlečnih proizvodov, navedene v ureditvah, določenih v Uredbi (ES) št. 1255/1999.

Referenčne metode za tako preverjanje so pogosto metode, ki jih objavijo mednarodne organizacije, kot so Evropski odbor za standardizacijo (CEN), Mednarodna organizacija za mleko (IDF), Mednarodna organizacija za standardizacijo (ISO) in Znanstveno združenje za odličnost analitičnih metod (AOAC International), ki jih tudi redno osvežujejo. V nekaterih primerih je določena referenčna metoda Skupnosti, medtem ko v drugih primerih ni v pravilih Skupnosti opredeljena nobena referenčna metoda. Da bi bilo zagotovljeno enotno izvajanje referenčnih metod, je treba sestaviti seznam referenčnih metod in omogočiti Komisiji, da ga po potrebi prilagodi.

Za nekatere analize trenutno ni nobenih mednarodno validiranih referenčnih metod, zato ni na voljo podatkov o odstopanju rezultatov analiz od laboratorija do laboratorija. Zato je treba na ravni Skupnosti določiti metode, ki so validirane v skladu z mednarodno sprejetimi pravili in se uporabljajo kot referenčne metode.

Uredba Komisije (ES) št. 1898/2005 (3) določa podrobna pravila za izvajanje Uredbe Sveta (ES) št. 1255/1999, kar zadeva ukrepe za prodajo smetane, masla in zgoščenega masla na trgu Skupnosti, in predvideva sledenje smetani, maslu in zgoščenemu maslu v nekaterih okoliščinah, da bi se zagotovila pravilna končna uporaba teh proizvodov. Sledenje je pomembno za pravilno delovanje sistema. Za zagotovitev enakovrednega obravnavanja tistih, ki so vključeni v ta sistem, je treba uvesti enotne metode za določitev nekaterih od teh sledilcev.

V skladu s členom 9 Uredbe (ES) št. 1255/1999 se lahko dodeli pomoč za zasebno skladiščenje sira, izdelanega iz ovčjega mleka. Po členu 31 navedene uredbe se lahko za te proizvode dodeli posebno povračilo. Sir, izdelan iz ovčjega, kozjega in bivoljega mleka ter mešanic ovčjega, kozjega in bivoljega mleka, se lahko uvaža v Skupnost po sporazumih o preferenčnem obravnavanju iz nekaterih tretjih držav. V skladu z zgoraj navedenim so potrebni primerni pregledi za zagotovitev, da v take proizvode ni dodano kravje mleko. Zato je treba na ravni Skupnosti uvesti metodo za ugotavljanje kravjega mleka ne glede na uporabo rutinskih metod, če izpolnjujejo nekatera merila.

V skladu z Uredbo Komisije (EGS) št. 2921/90 z dne 10. oktobra 1990 o pomoči za proizvodnjo kazeina in kazeinatov iz posnetega mleka (4) v proizvodu ne smejo biti prisotne koliformne bakterije. Mednarodno sprejeta referenčna metoda za ugotavljanje koliformnih bakterij v mleku in mlečnih proizvodih je ISO 4831. Referenčna metoda za ugotavljanje koliformnih bakterij na ravni Skupnosti je bila določena na podlagi navedenega standarda.

V skladu z Uredbo (ES) št. 1255/1999 morata maslo in posneto mleko v prahu, namenjena intervenciji, ali posneto mleko v prahu, namenjeno tudi uporabi za živalsko krmo, izpolnjevati nekatere kakovostne zahteve. Določiti je treba referenčne metode, s katerimi se preveri, ali so te zahteve izpolnjene.

Nekatere metode so v tej uredbi prvič predstavljene. Zagotoviti je treba ustrezno obdobje od začetka veljavnosti te uredbe, da se laboratorijem omogoči pravilna uvedba in uporaba teh metod, to pomeni, da imajo po začetku veljavnosti te uredbe na voljo šest mesecev za začetek uporabe teh novih metod. Kadar koli Organizacija za razvoj standardov prenovi in objavi referenčno metodo iz Priloge I, imajo laboratoriji šest mesecev časa za posodobitev analitskih postopkov, da jih uskladijo z novim standardom.

Ukrepi iz te uredbe, so v skladu z mnenjem Upravljalnega odbora za mleko in mlečne proizvode –

SPREJELA NASLEDNJO UREDBO:

POGLAVJE I

SPLOŠNE DOLOČBE

Člen 1

Vsebina urejanja in področje uporabe

1. Ta uredba določa nekatere referenčne metode za kemično, fizikalno in mikrobiološko analizo ter senzorično oceno mleka in mlečnih proizvodov, ki se uporabljajo v skladu z režimi za skupno ureditev trga z mlekom in mlečnimi proizvodi, določenimi v Uredbi (ES) št. 1255/1999, in pravila za uporabo teh metod.

2. Seznam referenčnih metod, primernih za analize, kakor so navedene v odstavku 1, vključuje Priloga I k tej uredbi.

3. Komisija osveži seznam po postopku iz člena 42 Uredbe (ES) št. 1255/1999.

Člen 2

Rutinske metode

Rutinske metode se lahko uporabljajo za analize, ki jih zahtevajo pravila Skupnosti, če so pravilno umerjene in se redno preverjajo glede na referenčne metode. Rezultati se primerjajo ob upoštevanju stalne pristranskosti, ponovljivosti in obnovljivosti.

V primeru odstopanja so odločilni rezultati, dobljeni z referenčno metodo.

Države članice obvestijo Komisijo o uporabi rutinskih metod v analizah iz člena 1.

POGLAVJE II

ANALITSKE METODE

Člen 3

Ocena skladnosti pošiljke s pravno omejitvijo

Priloga II k tej uredbi se uporablja za določanje skladnosti s pravnimi zahtevami glede sestave, razen za analizo sledilcev.

Člen 4

Senzorično ocenjevanje

1. Za senzorično ocenjevanje mleka in mlečnih proizvodov razen masla za javno skladiščenje morajo države članice kot referenčno metodo uporabiti standard IDF 99C:1997 ali druge primerljive metode, o katerih uradno obvestijo Komisijo.

Postopki iz Priloge III se uporabljajo za preverjanje dela ocenjevalcev in zanesljivosti rezultatov senzoričnih analiz.

2. Za maslo za javno skladiščenje se uporabljajo postopki iz Priloge III za preverjanje dela ocenjevalcev in zanesljivosti rezultatov senzoričnih analiz.

Postopek iz Priloge IV se uporabi kot referenčna metoda za senzorično ocenjevanje.

Člen 5

Sledilci

1. Kot referenčna metoda za določanje vsebnosti trigliceridov enantične kisline v maslu, maslenem olju in smetani se uporablja analitska metoda iz Priloge V.

2. Kot referenčna metoda za določanje vsebnosti vanilina v zgoščenem maslu, maslu in smetani se uporablja analitska metoda iz Priloge VI.

3. Kot referenčna metoda za določanje vsebnosti etil estra beta-apo-8’ karotenske kisline v zgoščenem maslu in maslu se uporablja analitska metoda iz Priloge VII.

4. Kot referenčna metoda za določanje vsebnosti β-sitosterola ali stigmasterola v maslu in zgoščenem maslu se uporablja analitska metoda iz Priloge VIII.

5. Sledenje zgoščenemu maslu, maslu in smetani se opravlja v skladu z ustreznimi pravili Skupnosti, če so dobljeni rezultati skladni s specifikacijami iz točk 10 in 11 Priloge V in iz točke 8 prilog VI, VII in VIII.

Člen 6

Ugotavljanje kazeina kravjega mleka

1. Za zagotovitev, da sir, izdelan izključno iz ovčjega, kozjega ali bivoljega mleka ali iz mešanice ovčjega, kozjega in bivoljega mleka, dejansko ne vsebuje kazeina kravjega mleka, se uporablja referenčna analitska metoda iz Priloge IX.

Če je vsebnost kazeina kravjega mleka v analiziranem vzorcu enaka ali višja od vsebnosti v referenčnem vzorcu, ki vsebuje 1 % kravjega mleka, kakor je opisano v Prilogi IX, se šteje, da je kazein kravjega mleka prisoten.

2. Rutinske metode za ugotavljanje kazeina kravjega mleka v siru, kakor je navedeno v odstavku 1, se lahko uporabijo, če:

Če nobena od navedenih zahtev ni izpolnjena, se uporabijo referenčne metode iz Priloge IX.

Člen 7

Ugotavljanje koliformnih bakterij

Ugotavljanje prisotnosti koliformnih bakterij v maslu, posnetem mleku v prahu, kazeinu in kazeinatih se opravlja v skladu z referenčno metodo iz Priloge X.

Člen 8

Določanje vsebnosti laktoze

Vsebnost laktoze v proizvodih, ki spadajo pod oznako KN 2309, se določa v skladu z referenčno metodo iz Priloge XI.

Člen 9

Ugotavljanje siriščne sirotke

1. Siriščna sirotka v posnetem mleku v prahu za javno skladiščenje se ugotavlja v skladu z referenčno metodo iz Priloge XII.

2. Siriščna sirotka v posnetem mleku v prahu in mešanice za živalsko krmo se ugotavljajo v skladu z referenčno metodo iz Priloge XII. Če se ugotovi prisotnost siriščne sirotke, je treba izvajati ukrepe iz Priloge XIII.

Člen 10

Ugotavljanje pinjenca

Pinjenec v posnetem mleku v prahu se določa v skladu z referenčno metodo iz Priloge XIV.

Člen 11

Ugotavljanje antimikrobnih ostankov

Antimikrobni ostanki v posnetem mleku v prahu se ugotavljajo v skladu z referenčno metodo iz Priloge XV.

Člen 12

Določanje vsebnosti posnetega mleka v prahu

Vsebnost posnetega mleka v prahu v krmnih mešanicah se določa v skladu z referenčno metodo iz Priloge XVI.

Člen 13

Ugotavljanje škroba

Škrob v posnetem mleku v prahu, denaturiranem mleku v prahu in krmnih mešanicah se ugotavlja v skladu z referenčno metodo iz Priloge XVII.

Člen 14

Določanje vsebnosti vlage v smetani v prahu

Vsebnosti vlage v smetani v prahu se določa v skladu z referenčno metodo iz Priloge XVIII.

Člen 15

Določanje vsebnosti vlage kislega pinjenca v prahu

Vsebnosti vlage v kislem pinjencu v prahu, namenjenem uporabi v krmi, se določa v skladu z referenčno metodo iz Priloge XIX.

Člen 16

Določanje čistosti mlečne maščobe

Čistost mlečne maščobe se določa v skladu z referenčno metodo iz Priloge XX.

POGLAVJE III

SPLOŠNE IN KONČNE DOLOČBE

Člen 17

Zagotavljanje kakovosti

Analize se opravijo v laboratorijih, ki izvajajo analitski sistem zagotavljanja kakovosti vključno z notranjimi postopki nadzora kakovosti. Neakreditirani laboratoriji vsaj enkrat na leto sodelujejo v shemah preskušanja strokovnosti, pri čemer njihovi rezultati ne smejo odstopati za več kot 2σ R (standardni odklon obnovljivosti referenčne metode) od uradne vrednosti. Na voljo mora biti podroben opis uporabljenega sistema za posvetovanje v laboratoriju.

Laboratoriji, ki so akreditirani v skladu s standardi iz člena 12 Uredbe (ES) št. 882/2004 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 29. aprila 2004 o izvajanju uradnega nadzora, da se zagotovi preverjanje skladnosti z zakonodajo o krmi in živilih ter s pravili o zdravstvenem varstvu živali in zaščiti živali (6), so izključeni iz obveznosti sodelovanja pri preskušanju strokovnosti.

Člen 18

Vzorčenje in nesoglasja glede rezultatov analiz

1. Vzorčenje se izvaja v skladu z ustrezno uredbo za zadevne proizvode. Če ni določb o vzorčenju, se uporablja določba iz standarda ISO 707|IDF 50, mleko in mlečni proizvodi – navodila za vzorčenje.

2. Laboratorijska poročila o rezultatih analiz morajo vsebovati zadostne podatke za oceno rezultatov, ki se opravi v skladu s Prilogo II in Prilogo XXI.

3. Za analize, ki jih predvidevajo pravila Skupnosti, je treba vzeti dvojne vzorce.

4. Kadar se izvajalec ne strinja z rezultati analize, je treba uporabiti postopek iz Priloge XXI.

5. Če lahko proizvajalec v petih dneh po vzorčenju dokaže, da postopek vzorčenja ni potekal pravilno, je treba vzorčenje ponoviti, kadar je mogoče. Če vzorčenja ni mogoče ponoviti, je treba analizirano pošiljko sprejeti.

Člen 19

Prehodno obdobje

Ocenjevanje skladnosti na podlagi Priloge II k tej uredbi se izvede v 12 mesecih po začetku veljavnosti Uredbe. Države članice bodo po potrebi poročale Komisiji takoj, ko se v tem obdobju v zvezi s postopkom statističnega nadzora pojavi večja težava.

Člen 20

Razveljavitve

Uredba (ES) št. 213/2001 se razveljavi.

Sklicevanja na razveljavljene uredbe veljajo kot sklicevanja na to uredbo in se razlagajo v skladu s korelacijsko tabelo v Prilogi XXII.

Člen 21

Začetek veljavnosti

Ta uredba začne veljati tretji dan po objavi v Uradnem listu Evropske unije.

Uporablja se od 31. marca 2008.

(1) UL L 160, 26.6.1999, str. 48. Uredba, kakor je bila nazadnje spremenjena z Uredbo (ES) št. 1152/2007 (UL L 258, 4.10.2007, str. 3). Uredba (ES) št. 1255/1999 bo 1. julija 2008 nadomeščena z Uredbo (ES) št. 1234/2007 (UL L 299, 16.11.2007, str. 1).

(2) UL L 37, 7.2.2001, str. 1.

(3) UL L 308, 25.11.2005, str. 1. Uredba, kakor je bila nazadnje spremenjena z Uredbo (ES) št. 1546/2007 (UL L 337, 21.12.2007, str. 68).

(4) UL L 279, 11.10.1990, str. 22. Uredba, kakor je bila nazadnje spremenjena z Uredbo (ES) št. 1487/2006 (UL L 278, 10.10.2006, str. 8).

(5) UL L 256, 7.9.1987, str. 1. Uredba, kakor je bila nazadnje spremenjena z Uredbo Komisije (ES) št. 1352/2007 (UL L 303, 21.11.2007, str. 3).

(6) UL L 165, 30.4.2004, str. 1.

Mleko in smetana, nezgoščena in brez dodanega sladkorja ali drugih sladil

Najmanj 4 od 5 točk za A, F in C

Seznam okrajšav Min. = najmanj, Maks. = največ, Priloga = priloga k navedeni uredbi, SNF = suha snov brez maščobe, PV = peroksidno število, A = videz, F = aroma, C = konsistenca, TBC = skupno število bakterij, Term. = število termofilnih bakterij, MS = država članica, IDF = International Dairy Federation (Mednarodno združenje za mlekarstvo), ISO = International Standards Organisation (Mednarodna organizacija za standardizacijo), IUPAC = International Union of Pure and Applied Chemistry (Mednarodna zveza za čisto in uporabno kemijo), ADPI = American Dairy Products Institute (Ameriški inštitut za mlečne proizvode), SCM = sladkano zgoščeno mleko, EMC = evaporirano mleko ali smetana.

Če se uporabljajo metode, ki niso določene v tej uredbi, in niso določeni ukrepi za natančnost, je treba izvesti znotrajlaboratorijsko validacijo. V formulah za izračun razširjene negotovosti U je treba ustrezno uporabiti standardni odmik interne ponovljivosti sir in standardni odmik interne obnovljivosti siR namesto σr in σ R .

Preskus je treba, kadar je to primerno, organizirati najmanj enkrat na leto zaradi primerjave rezultatov, ki jih dobijo ocenjevalci iz različnih regij. Če se opazijo pomembne razlike, je treba sprejeti potrebne ukrepe, da se ugotovijo vzroki zanje in dosežejo primerljivi rezultati.

C. PRIMERJAVA REZULTATOV, PRIDOBLJENIH V RAZLIČNIH REGIJAH DRŽAVE ČLANICE IN V RAZLIČNIH DRŽAVAH ČLANICAH

Če se ugotovi, da so posamezni ocenjevalci presegli mejo 1,5 točke za indeks odklona ali ponovljivosti, mora(-jo) strokovnjak(-i) uradnega organa izvesti enega ali več naključnih ponovnih pregledov uspešnosti na vzorcih, ki se bodo ocenjevali v naslednjih nekaj tednih, ali skupaj s temi ocenjevalci izvesti enega ali več „spremljevalnih“ pregledov. Natančno spremljanje je nujno za odločitev, ali naj se te storitve ohranijo. Ugotovitve je treba dokumentirati in shraniti kot dokazila o nadaljnjih ukrepih.

Vodja skupine ocenjevalcev, ki mora biti uradno zaposlen pri pristojnem organu in je lahko član skupine, mora biti na splošno odgovoren za celoten postopek. V ocenjevalni list mora zapisovati posamezne točke za vsako lastnost in potrditi sprejem ali zavrnitev proizvoda.

„Gostota“ je izraz, ki se uporablja za konsistenco proizvoda, ko se zaužije. Ponavadi se povezuje s trdnostjo in mazavostjo ter mora biti enaka v celotnem proizvodu. Tesno je povezana s teksturo in pomeni lastnost proizvoda, da se ne sesede pod lastno težo. Dokazuje jo upor pri rezanju in se lahko meri mehansko ali preveri z jezikom ali prstom.

„Konsistenca“ zajema naslednje značilnosti: gostoto, teksturo in čvrstost. Mazavost se lahko spremlja s fizičnimi sredstvi, če to želi posamezna država članica, da bi izpolnila zahteve stranke. Komisija se lahko odloči, da bo v prihodnje uskladila metodologijo.

Višji ocenjevalci morajo vsako leto sodelovati v več skupinah za ocenjevanje in, kadar je to mogoče, vsaj enkrat na tri mesece.

Vsi ocenjevalci morajo redno sodelovati v skupinah za senzorično ocenjevanje za ohranjanje svoje usposobljenosti. Pogostost bo odvisna od mase in količine masla na enoto časa in je, kadar je to mogoče, vsaj ena skupina za ocenjevanje na mesec.

potrjene reference in primerke, ki lahko ocenjevalcu pomagajo pri opredelitvi posebnih okusov in intenzivnosti okusa v proizvodu.

odkrivanje in prepoznavanje senzoričnih lastnosti in posebnih senzoričnih izrazov,

4.1 Za podrobnosti o splošnih zahtevah in izločilnih preskusih, ki se lahko uporabijo pred uradno zaposlitvijo novega ocenjevalca, glej ISO/DIS 22935–1|IDF 99–1, odstavek 4 (zaposlovanje) in odstavek 5.1.

V prostoru za ocenjevanje ne sme biti tujih vonjev in mora biti enostaven za čiščenje. Stene morajo biti svetle barve in od njih se svetloba ne sme odbijati.

„Strokovni ocenjevalec“ je opredeljen kot oseba z visoko stopnjo senzorične občutljivosti in izkušnjami na področju senzorične metodologije, ki je sposoben doslednega in zanesljivega ocenjevanja različnih proizvodov. Ta tip ocenjevalca ima dober dolgoročni senzorični spomin.

Za nadaljnje informacije glej sedanji mednarodni standard IDF za mleko in mlečne proizvode, IDF 99 – deli 1, 2 in 3 o senzoričnem ocenjevanju.

Tabela 5 prikazuje vrednosti Sr in SR z ustreznimi združenimi vrednostmi ter celotnima parametroma r in R.

Sliki 2 in 3 prikazujeta trend Sr in SR, izračunan za štiri vzorce dveh navedenih sklopov podatkov.

Tabeli 3 in 4 prikazujeta rezultate, ki so nastali le z metodo TG in ustreznimi parametri natančnosti. Sprejemljivost teh parametrov je pogojena s sprejemljivostjo majhnega števila laboratorijev (6).

Tabeli 1 in 2 prikazujeta rezultate vseh laboratorijev in parametrov natančnosti, izračunanih ob sprejemljivem številu (8) laboratorijev, vendar ti žal niso pridobljeni z enako analitsko metodo.

Vzorec D. Dixonov in Grubbsov preskus na ravni 1 in 5 % sta pokazala enega laboratorijskega ubežnika.

Vzorec C. Dixonov in Grubbsov preskus na ravni 1 in 5 % sta pokazala enega laboratorijskega ubežnika.

Vzorec A. Dixonov, Cochranov in Grubbsov preskus na ravni 1 in 5 % so pokazali enega laboratorijskega ubežnika.

Zaradi manj laboratorijev je bil statistični izračun narejen za celoten sklop (sliki 1 in 2) podatkov, vključno z rezultati FAME, in za podatke, dobljene z analizo TG.

Pri četrtem testu primerljivosti so bili obravnavani štirje vzorci (A, B, C, D) in devet laboratorijev je predložilo rezultate (tabele 1–2).

Rezultati sedmih laboratorijev so pokazali, da je metoda FAME povzročila večjo spremenljivost, zato so sklenili, da se uporabi le določitev trienantoata kot triglicerida po postopku količinske opredelitve q za trienantoat z uporabo trikaproata kot internega standarda. Poleg tega je treba analizo trigliceridov izvajati s kapilarno kolono.

Pri drugem testu primerljivosti je sodelovalo deset laboratorijev in uporabljene so bile štiri različne metode:

Vrednosti za mejo ponovljivosti in obnovljivosti sta izraženi pri 95-odstotni stopnji verjetnosti ter mogoče ne bosta ustrezali razponom koncentracij in matricam, ki se od danih razlikujejo.

V točki 12 so navedene podrobnosti medlaboratorijskega preskusa masla na podlagi standardov ISO 5725–1 in ISO 5725–2 glede natančnosti metode.

Za vsak kromatogram vzorcev med STD1 in STD2 izračunajte vsebnost enantične kisline, C (kg/t):

7.2.4 V 10-mililitrsko merilno bučko (5.2) vlijte 1 ml raztopine 7.2.1 in 1 ml raztopine 7.2.2. Do oznake 10 ml dolijte n-heksan (4.1).

7.1.2.5 V 10-mililitrski merilni bučki (5.2) na 1 mg natančno odmerite 1 g ekstrahirane maščobe. Dodajte 1 ml raztopine 7.2.2. Do oznake 10 ml dolijte n-heksan (4.1) in premešajte.

temperatura kolone: začetna temperatura 130 °C se ohranja eno minuto, nato se povečuje po stopnji 20 °C/min do 260 °C ter nato po stopnji 30 °C/min do 360 °C; temperatura 360 °C se ohrani 10 minut

Kolona plinskega kromatografa s stacionarno fazo, ki se je uspešno uporabila za ločevanje trigliceridov (100 % dimetilpolisiloksan ali 5 % fenil- in 95 % metilpolisiloksan). Izberite stacionarno fazo, dolžino kolone (4–15 m), notranji premer (0,22–0,50 mm) in debelino nanosa (0,12 μm ali več) ob upoštevanju laboratorijskih izkušenj in uporabljenega sistema za vbrizgavanje. V vsakem primeru mora izbrana kolona zagotoviti popolno ločevanje vrha topila in trigliceridov kaprojske kisline ter osnovno ločbo med vrhovi trigliceridov kaprojske in enantične kisline. Primeri veljavnih pogojev so navedeni spodaj.

9.4 Pri ustreznih redčenjih standardne raztopine (4.5.2) je treba preveriti linearnost pri prvem izvajanju analize in nato v rednih časovnih presledkih ali po spremembah ali popravilu HPLC-opreme. Vanilin se lahko razgradi v vanilinsko kislino, divanilin in druge spojine z delovanjem lastnih encimov v nepasterizirani smetani ali proizvodih iz nje.

Opomba: Pri analizi vanilina v smetani mora biti koncentracija sledila izražena v mg sledila/kg mlečne maščobe. To se naredi tako, da se C pomnoži s 100/f, kjer je f vsebnost maščobe v smetani, izražena v odstotkih (m/m).

Odpipetirajte 5 ml standardne raztopine vanilina (4.5.2) v 100-mililitrsko merilno bučko. Dodajte 5 ml ekstrakcijske raztopine (4.4) in dopolnite z vodo do oznake. Ta raztopina vsebuje 0,5 μg/ml vanilina.

Preskusnemu deležu vzorca (5.1.1, 5.1.2 ali 5.1.3) dodajte približno 75 ml ekstrakcijske raztopine (4.4), približno 15 minut dobro mešajte ali stresajte, nato dolijte ekstrakcijsko raztopino (4.4). Približno 10 ml tega ekstrakta prenesite v epruveto z zamaškom. Postavite epruveto v zamrzovalnik (3.1) in jo pustite v njem približno 30 minut. Centrifugirajte hladni ekstrakt pet minut pri približno 2 000 vrtljajih na minuto in ga takoj oddekantirajte. Pustite, da se odcejena raztopina ohladi na temperaturo okolice. Odpipetirajte 5 ml oddekantirane raztopine v 100-mililitrsko merilno bučko in dopolnite vodo. Prefiltrirajte alikvot skozi membranski mikrofilter (3.3) z brizgalko (3.2). Filtrat je pripravljen za HPLC-določitev.

Podatki natančnosti so bili določeni s preskusom leta 1995, pri katerem je sodelovalo 11 laboratorijev in 12 sledenih vzorcev (šest slepih vzporednih izvajanj) za maslo in 12 sledenih (šest slepih vzporednih analiz) za zgoščeno maslo.

Odpipetirajte 0, 0,25, 0,5, 0,75 in 1,0 ml standardne raztopine apo-karotenskega estra (4.1.2) v pet 100-mililitrskih merilnih bučk. Dopolnite celotno prostornino s petroletrom (4.2) in zmešajte.

Prenesite alikvot v 1-centimetrsko kiveto in izmerite absorbanco pri 440 nm proti petroletru kot slepemu vzorcu. Določite koncentracijo apo-karotenskega estra v raztopini glede na umeritveno krivuljo (C μ/ml).

Natehtajte na 1 mg natančno približno 1 g zgoščenega masla (ali izločene maslene maščobe (5.1.2)), (M). Količinsko ga prenesite v 20-mililitrsko (V) merilno bučko s petroletrom (4.2), dopolnite do oznake in temeljito premešajte.

Vzorec raztalite v sušilniku pri približno 45 °C in prefiltrirajte reprezentativno količino skozi filter, ki vsebuje približno 10 g brezvodnega natrijevega sulfata (4.3), v okolici, zaščiteni pred močno naravno in umetno svetlobo, in ga hranite pri temperaturi 45 °C. Zberite primerno količino maslene maščobe.

Natehtajte na 1 mg natančno približno 0,100 g suspenzije apo-karotenskega estra (4.1.1) (W), raztopite jo v petroletru (4.2), količinsko jo prenesite v merilno bučko s prostornino 100 ml in jo dopolnite s petroletrom do oznake.

Opomba: Suspenzija apo-karotenskega estra je občutljiva na zrak, toploto in svetlobo. V zaprti prvotni posodi (zaprta pod dušikom) in na hladnem mestu se lahko hrani približno eno leto. Po odprtju je treba vsebino čim prej porabiti.

Segrejte suspenzijo na temperaturi med 45 °C in 50 °C ter homogenizirajte v neodprti prvotni posodi. V merilno bučko (100 ml) natehtajte približno 400 mg, raztopite jo v 20 ml kloroforma (4.4) in prostornino dopolnite s cikloheksanom (4.5). Razredčite 5 ml te raztopine na 100 ml s cikloheksanom (raztopina A). Razredčite 5 ml raztopine A na 100 ml s cikloheksanom. Merite absorbanco pri 447–449 nm (izmeri se največja vrednost proti cikloheksanu kot slepemu vzorcu v 1-centimetrski kiveti).

3.2 Spektrofotometer – primeren za uporabo pri 440 nm (in 447–449 nm) in opremljen s kiveto, dolgo 1 cm

Koncentracija sledila v vzorcu, s katero se doseže najnižji rezultat, se uporabi v zvezi z interpolacijo med 118,5 mg/kg in 82,9 mg/kg ali 120,4 mg/kg in 84,3 mg/kg.

Koncentracija sledila v vzorcu, s katero se doseže najnižji rezultat, se uporabi v zvezi z interpolacijo med 115,8 mg/kg in 80,1 mg/kg ali 117,7 mg/kg in 81,5 mg/kg.

Podatki natančnosti so bili določeni s preskusom leta 1991, pri katerem je sodelovalo devet laboratorijev in šest vzorcev (tri slepa vzporedna izvajanja) za stigmasterol in šest vzorcev (tri slepa vzporedna izvajanja) za sitosterol.

Podatki natančnosti so bili določeni s preskusom leta 1992, pri katerem je sodelovalo osem laboratorijev in šest vzorcev (tri slepa vzporedna izvajanja) za stigmasterol in šest vzorcev (tri slepa vzporedna izvajanja) za sitosterol.

Določite površino vrha sterola (stigmasterola in sitosterola) in vrha betulina v vzorcu ter izračunajte R2:

cepitev vzorca: 10:1 do 50:1; cepitveno razmerje mora biti optimizirano glede na navodila proizvajalca in linearnost odziva detektorja, nato ga je treba potrditi za celotno koncentracijsko območja proučevanja.

5.3.1 Prenesite raztopino etra, ki je ostala v bučki, v 2-mililitrsko reakcijsko stekleničko (3.7) skupaj z 2 ml dietiletra in eter odstranite s tokom dušika. Sperite bučko z dvema dodatnima 2 ml alikvotoma dietiletra, prenesite v stekleničko in vsakič odstranite eter z dušikom.

5.2.3 Čisti sloj etra brez mila spustite skozi stekleno kolono (3.5), ki vsebuje 30 g brezvodnega natrijevega sulfata (4.5). Zberite eter v 250-mililitrsko bučko (3.3). Dodajte vrelni kamenček in izparevajte skoraj do suhega v vodni kopeli ali grelni oblogi, pri tem pa poskrbite, da zberete odpadna topila.

5.2.2 Pri ugotavljanju sitosterola dodajte v bučko 1,0 ml raztopine internega standarda (4.3.1.1), pri ugotavljanju stigmasterola pa 0,4 mg/ml (4.3.1.2). Temeljito premešajte. Vsebino bučke količinsko prenesite v 500-mililitrski lij ločnik (3.2), nato bučko zaporedoma sperite s 50 ml vode in 250 ml dietiletra (4.4). Dve minuti močno stresajte lij ločnik in nato pustite, da se faze ločijo. Odstranite spodnji vodni sloj in s stresanjem sperite sloj etra s štirimi zaporednimi 100 ml alikvoti vode.

V 150-mililitrsko bučko (3.1) na 1 mg natančno natehtajte približno 1 g masla (W2) ali zgoščenega masla (W2). Dodajte 50 ml etanola (4.1) in 10 ml raztopine kalijevega hidroksida (4.2). Namestite povratni hladilnik in segrevajte 30 minut pri približno 75 °C. Odstranite kondenzator in bučko ohladite približno na temperaturo okolice.

5.1.2 Standardna kromatografska raztopina stigmasterola: 1 ml standardne raztopine stigmasterola (4.9.1) prenesite v vsako od dveh reakcijskih stekleničk (3.7) in odstranite dietileter s tokom dušika. Dodajte 1 ml raztopine internega standarda (4.3.1.2) in odstranite dietileter s tokom dušika.

5.1.1 Standardna kromatografska raztopina sitosterola: 1 ml standardne raztopine sitosterola (4.8.1) prenesite v vsako od dveh reakcijskih stekleničk (3.7) in odstranite dietileter s tokom dušika. Dodajte 1 ml raztopine internega standarda (4.3.1.1) in odstranite dietileter s tokom dušika.

Opomba 1: Čistost standardnih materialov, ki se uporabijo za kalibracijo, je treba določiti po postopku normalizacije. Predpostavite, da so vsi steroli, prisotni v vzorcu, prikazani na kromatogramu, celotna površina vrhov pa pomeni 100 % sestavin sterola, in da steroli dajejo enak detektorski odziv. Linearnost sistema je treba potrditi za celotni razpon koncentracij, ki se proučujejo.

4.6 Sililacijski reagent, na primer TRI–SIL (na voljo pri Pierce Chemical Co, kat. št. 49001) ali enakovreden (pomembno: TRI–SIL je vnetljiv, strupen, koroziven in morebiti rakotvoren. Laboratorijsko osebje se mora seznaniti z varnostnimi podatki o TRI-SILU in sprejeti ustrezne varnostne ukrepe).

4.2 Kalijev hidroksid, 60-odstotna raztopina, raztopite 600 g kalijevega hidroksida (najmanj 85 %) v vodi in dopolnite do enega litra z vodo

3.9 Kapilarne kolone iz taljenega kremenovega stekla, v celoti prevlečene z BP1 ali enakovrednim materialom (ali katere koli druge kolone z najmanj enako ločljivostjo) z enakomerno debelino 0,25 μm; v koloni mora biti mogoče ločiti trimetil-silil derivate lanosterola in sitosterola. Primerna je kolona z dolžino 12 m in notranjim premerom 0,2 mm;

Metoda opisuje postopek za količinsko določanje sitosterola ali sigmasterola v maslu in zgoščenem maslu. Za sitosterol se vzame vsota β-sitosterola in 22-dihidro-β-sitosterola, za druge sitosterole se predpostavlja, da so nepomembni.

PRILOGA IX

(Člen 6)

REFERENČNA METODA ZA UGOTAVLJANJE KRAVJEGA MLEKA IN KAZEINATA V SIRIH IZ OVČJEGA, KOZJEGA ALI BIVOLJEGA MLEKA ALI MEŠANIC OVČJEGA, KOZJEGA IN BIVOLJEGA MLEKA

1. NAMEN

Ugotavljanje kravjega mleka in kazeinata v sirih iz ovčjega, kozjega in bivoljega mleka ali mešanic ovčjega, kozjega in bivoljega mleka z izoelektričnim fokusiranjem γ-kazeinov po plazminolizi.

2. PODROČJE UPORABE

Ta metoda je primerna za občutljivo, specifično ugotavljanje surovega in toplotno obdelanega kravjega mleka in kazeinata v svežih in zorenih sirih iz ovčjega, kozjega in bivoljega mleka ter iz mešanic ovčjega, kozjega in bivoljega mleka. Ni pa primerna za ugotavljanje mlečnih ali sirnih ponaredkov s toplotno obdelanimi proteinskimi koncentrati govejega sirila.

3. POSTOPEK

3.1 Izolacija kazeinov iz sira in referenčni standardi

3.2 Raztopitev izoliranih kazeinov in izpostavitev v plazminsko cepitev (EC.3.4.21.7)

3.3 Izoelektrično fokusiranje plazminsko obdelanih kazeinov v prisotnosti sečnine in obarvanje proteinov

3.4 Vrednotenje obarvanih γ3- in γ2-kazeinskih primerkov (dokaz kravjega mleka) s primerjavo primerka, pridobljenega iz vzorca, s primerki, pridobljenimi v istem gelu iz referenčnih standardov, ki vsebujejo 0 % in 1 % kravjega mleka

4. REAGENTI

Razen če ni določeno drugače, je treba uporabiti analitsko čiste kemikalije. Voda mora biti dvakrat destilirana ali enakovredne čistosti.

Opomba: Naslednje podrobnosti veljajo za laboratorijsko pripravljene poliakrilamidne gele v velikosti 265 × 125 × 0,25 mm, ki vsebujejo sečnino. Če so uporabljene druge velikosti in vrste gelov, se lahko pogoji ločitve prilagodijo.

Izoelektrično fokusiranje

4.1 Reagenti za izdelavo poliakrilamidnih gelov z vsebnostjo sečnine

4.1.1 Osnovna gelska raztopina

V vodi raztopite:

4,85 g akrilamida,

0,15 g N, N'-metilen-bis-akrilamida (BIS),

48,05 g sečnine,

15,00 g glicerola (87 % w/w)

in dopolnite do 100 ml ter raztopino shranite v rjavi steklenici v hladilniku.

Opomba: Namesto navedenih določenih količin nevrotoksičnih akrilamidov se lahko uporabi tudi industrijska mešanica akrilamidne/BIS raztopine. Če taka raztopina vsebuje 30 % w/v akrilamida in 0,8 % w/v BIS, je treba namesto navedenih količin za pripravek vzeti 16,2 ml. Rok uporabnosti raztopine je največ 10 dni. Če je njena prevodnost več kot 5 μS, raztopino deionizirajte z mešanjem 2 g amberlita MB-3 30 minut, nato filtrirajte skozi membrano 0,45 μm.

4.1.2 Gelska raztopina

Gelsko raztopino pripravite z mešanjem dodatkov, amfolitov in gelske raztopine iz zaloge (glej 4.1.1).

9,0 ml osnovne gelske raztopine,

24 mg β-alanina,

500 μl amfolita pH 3,5–9,5 (1),

250 μl amfolita pH 5–7 (1),

250 μl amfolita pH 6–8 (1).

Zmešajte gelsko raztopino in jo dve do tri minute razplinjajte v ultrazvočni kopeli ali vakuumu.

Opomba: Gelsko raztopino pripravite, tik preden jo nalijete (glej 6.2).

4.1.3 Katalizatorske raztopine

4.1.3.1 N, N, N' N' – tetrametiletilendiamin (Temed)

4.1.3.2 40 % w/v amonijev persulfat (PER):

Raztopite 800 mg PER v vodi in dopolnite do 2 ml.

Opomba: Vedno uporabite sveže pripravljeno raztopino PER.

4.2 Kontaktna tekočina

Kerozen ali tekoči parafin.

4.3 Anodna raztopina

Raztopite 5,77 g fosforjeve (V) kisline (85 % w/w) v vodi in dopolnite z vodo do 100 ml.

4.4 Katodna raztopina

Raztopite 2,00 g natrijevega hidroksida v vodi in dopolnite z vodo do 100 ml.

Priprava vzorca

4.5 Reagent za izolacijo proteinov

4.5.1 Razredčena ocetna kislina (25,0 ml ledocetne kisline dopolnite z vodo do 100 ml).

4.5.2 Diklorometan

4.5.3 Aceton

4.6 Pufer za raztapljanje proteinov

V vodi raztopite

5,75 g glicerola (87 % w/w),

24,03 g sečnine,

250 mg ditiotreitola

in dopolnite do 50 ml.

Opomba: Hranite v hladilniku; najdaljši rok uporabnosti je en teden.

4.7 Reagenti za plazminsko cepitev kazeinov

4.7.1 Pufer amonijevega hidrogenkarbonata

Titrirajte 0,2 mol/l raztopine amonijevega hidrogenkarbonata (1,58 g/100 ml vode), ki vsebuje 0,05 mol/l etilendiamintetraocetne kisline (EDTA, 1,46 g/100 ml) z 0,2 mol/l raztopine amonijevega karbonata (1,92 g/100 ml vode), ki vsebuje 0,05 mol/l EDTA do pH 8.

4.7.2 Goveji plazmin (EC. 3.4.21.7) z aktivnostjo najmanj 5 U/ml.

4.7.3 Raztopina ε-aminokapronske kisline za inhibiranje encimov.

Raztopite 2,624 g ε-aminokapronske kisline (6-amino-n-heksanojske kisline) v 100 ml 40 % (v/v) etanola.

4.8 Standardi

4.8.1 Certificirani referenčni standardi mešanice sesirjenega posnetega ovčjega in kozjega mleka, ki vsebuje 0 % in 1 % kravjega mleka, so na voljo na Inštitutu za referenčne materiale in meritve Komisije, B-2440 Geel, Belgija.

4.8.2 Priprava laboratorijskih delovnih standardov sesirjenega bivoljega mleka, ki vsebuje 0 % in 1 % kravjega mleka.

Posneto mleko se pripravi z 20-minutnim centrifugiranjem vzorca surovega bivoljega ali kravjega mleka pri 37 °C in 2 500 g. Po hitri ohladitvi epruvete in vsebine na 6 do 8 °C se popolnoma odstrani zgornja plast maščobe. Za pripravo 1 % standarda v litrski čaši k 495 ml posnetega bivoljega mleka dodajte 5 ml posnetega kravjega mleka, nastavite pH na 6,4 z dodajanjem razredčene mlečne kisline (10 % w/v). Nastavite temperaturo na 35 °C in dodajte 100 μl telečjega sirila (aktivnost sirila je 1:10 000, pribl. 3 000 U/ml), mešajte eno minuto in nato pustite eno uro čašo pokrito z aluminijasto folijo pri 35 °C, da se naredi gruda. Ko se je naredila gruda, se celotno sesirjeno mleko posuši z zmrzovanjem (freeze-dry) brez predhodne homogenizacije ali odločitve sirotke. Po tem postopku grudo fino zmeljite, da dobite homogen prah. Za pripravo 0 % standarda uporabite isti postopek z naravnim posnetim bivoljim mlekom. Standarda morate shraniti pri –20 °C.

Opomba: Pred pripravo standardov je priporočljivo, da se preveri čistost bivoljega mleka z izoelektričnim fokusiranjem plazminsko obdelanih kazeinov.

Reagenti za obarvanje proteinov

4.9 Fiksir

Raztopite 150 g trikloroocetne kisline v vodi in dopolnite do 1 000 ml.

4.10 Raztopina za razbarvanje

500 ml metanola in 200 ml ledocetne kisline razredčite z destilirano vodo do 2 000 ml.

Opomba: Vsak dan pripravite svežo raztopino za razbarvanje. Lahko jo pripravite z mešanjem enakih prostornin osnovnih raztopin 50 % (v/v) metanola in 20 % (v/v) ocetne kisline.

4.11 Raztopine za obarvanje

4.11.1 Raztopina za obarvanje (osnovna raztopina 1)

Raztopite 3,0 g Coomassie Brillant Blue G-250 (C.I. 42655) v 1 000 ml 90 % (v/v) metanola z magnetnim mešalnikom (približno 45 minut), filtrirajte skozi dva srednje hitra nagubana filtra.

4.11.2 Raztopina za obarvanje (osnovna raztopina 2)

Raztopite 5,0 g bakrovega sulfata pentahidrata v 1 000 ml 20 % (v/v) ocetne kisline.

4.11.3 Raztopina za obarvanje (delovna raztopina)

Tik pred obarvanjem zmešajte skupaj 125 ml vsake osnovne raztopine (4.11.1, 4.11.2).

Opomba: Raztopino za obarvanje morate pripraviti na dan uporabe.

5. OPREMA

5.1 Steklene ploščice (265 × 125 × 4 mm); valjček iz gume (širine 15 cm); nivelirna miza

5.2 Nosilna folija za gel (265 × 125 mm)

5.3 Pokrivna folija (280 × 125 mm). Na vsak dolgi rob zalepite trak lepilnega traku (280 × 6 × 0,25 mm) (glej sliko 1)

5.4 Elektrofokusirna komora s hladilno ploščo (npr. 265 × 125 mm) in ustrezen vir energije (≥ 2,5 kV) ali avtomatska elektroforezna naprava

5.5 Cirkulacijski kriostat, termostatsko nadzorovan na 12 ± 0,5 °C

5.6 Centrifuga, nastavljiva do 3 000 g

5.7 Elektrodni trakovi (≥ 265 mm dolgi)

5.8 Plastične kapalke za anodne in katodne raztopine

5.9 Trakovi za nanos vzorca (10 × 5 mm, iz viskoze ali nizkoadsorpcijski filtrirni papir)

5.10 Škarje iz nerjavečega jekla, skalpeli in pincete

5.11 Posode iz nerjavečega jekla ali steklene posode za obarvanje in razbarvanje (npr. pladnji za instrumente 280 × 150 mm)

5.12 Prilagodljiv palični homogenizator (premer osi 10 mm), v razponu od 8 000 do 20 000 vrtljajev/minuto

5.13 Magnetni mešalnik.

5.14 Ultrazvočna kopel

5.15 Varilnik folije

5.16 Mikropipete s prostornino 25 μl

5.17 Vakuumski koncentrator ali – zamrzovalni sušilnik

5.18 Termostatsko nadzorovana vodna kopel, prilagodljiva na 35 in 40 ± 1 °C, z mešalnikom

5.19 Denzitometer za odčitavanje pri λ = 634 nm

6. POSTOPEK

6.1 Priprava vzorca

6.1.1 Izolacija kazeinov

Stehtajte količino, enakovredno 5 g suhe mase sira ali referenčnih standardov v 100-mililitrski epruveti za centrifugiranje, dodajte 60 ml destilirane vode in homogenizirajte s paličnim homogenizatorjem (8 000 do 10 000 vrt./min). Nastavite na pH 4,6 z razredčeno ocetno kislino (4.5.1) in centrifugirajte (5 minut, 3 000 g). Odlijte maščobo in sirotko, homogenizirajte ostanek pri 20 000 vrt./min v 40 ml destilirane vode s pH 4,5, dobljenim z razredčeno ocetno kislino (4.5.1); dodajte 20 ml diklorometana (4.5.2), znova homogenizirajte in centrifugirajte (5 minut, 3 000 g). Z lopatico odstranite kazeinsko plast, ki leži med vodno in organsko fazo (glej sliko 2), in odlijte obe fazi. Znova homogenizirajte kazein v 40 ml destilirane vode (glej zgoraj) in 20 ml diklorometana (4.5.2) in centrifugirajte. Nadaljujte postopek (dva- do trikrat), dokler obe ekstrakcijski fazi ne postaneta brezbarvni. Homogenizirajte proteinski preostanek s 50 ml acetona (4.5.3) in filtrirajte prek srednje hitrega nagubanega filtrirnega papirja. Ostanek na filtru vsakič sperite z dvema ločenima 25-mililitrskima odmerkoma acetona in pustite, da se posuši na zraku ali v toku dušika, nato ga v terilnici zdrobite v fin prah.

Opomba: Izoliran suh kazein morate hraniti pri –20 °C.

6.1.2 Plazminsko cepljenje β-kazeinov za okrepitev γ-kazeinov

Disperzirajte 25 mg izoliranih kazeinov (6.1.1) v 0,5 ml pufra amonijevega karbonata (4.7.1) in 20 minut homogenizirajte, npr. z uporabo ultrazvočnega postopka. Ogrejte na 40 °C in dodajte 10 μl plazmina (4.7.2), zmešajte in eno uro inkubirajte pri 40 °C z neprestanim tresenjem. Za inhibicijo encima dodajte 20 μl raztopine ε-aminokapronske kisline (4.7.3), nato dodajte 200 mg sečnine v trdi obliki in 2 ml ditiotreitola.

Opomba: Da bi dobili več simetrije v fokusiranih kazeinskih trakovih, je priporočljivo, da raztopino sušite z zmrzovanjem, potem ko ste dodali ε-aminokapronsko kislino, in nato raztopite preostanek v 0,5 ml pufra za raztapljanje proteinov (4.6).

6.2 Priprava sečnine, ki vsebuje poliakrilamidne gele

Z nekaj kapljicami vode povaljajte nosilno folijo za gel (5.2) po stekleni plošči (5.1), odstranite vso odvečno vodo s papirnato brisačo ali tkanino. Na enak način povaljajte pokrivno folijo (5.3) z distančniki (0,25 mm) po drugi stekleni plošči. Položite ploščo vodoravno na nivelirno mizo.

Dodajte 10 μl Temed-a (4.1.3.1) v pripravljeno in razplinjeno gelsko raztopino (4.1.2), pomešajte in dodajte 10 μl raztopine PER (4.1.3.2), dobro premešajte in takoj enakomerno nalijte na sredino pokrivne folije. En rob nosilne plošče gela (folija naj bo obrnjena navzdol) položite na pokrivno folijo in jo počasi spuščajte, tako da se med folijami naredi film gela in se enakomerno ter brez mehurčkov razširi (slika 3). Pazljivo do konca spustite nosilno ploščo gela s tanko lopatico in nanjo položite še tri steklene plošče, ki bodo namenjene za uteži. Potem ko je polimerizacija končana (po približno 60 minutah), premestite polimerizirani gel na nosilno folijo skupaj s pokrivno folijo, tako da rahlo udarite po steklenih ploščah. Skrbno očistite hrbtno stran nosilne folije ostankov gela in sečnine. Zavarite gelov sendvič v filmski tulec in shranite v hladilnik (največ 6 tednov).

Opomba: Pokrivna folija z distančniki se lahko uporabi znova. Poliakrilamidni gel se lahko razreže v manjše kose, kar je priporočljivo zlasti, kadar je vzorcev malo ali če uporabljate avtomatsko elektroforezno napravo (dva gela, velikost 4,5 × 5 cm).

6.3 Izoelektrično fokusiranje

Nastavite termostat za hlajenje na 12 °C. S kerozinom zbrišite hrbtno stran nosilne folije in kapnite nekaj kapljic kerozina (4.2) na sredo hladilnega bloka. Nato po njem povaljajte gelov sendvič, z nosilno stranjo navzdol, in pazite, da ne nastanejo mehurčki. Obrišite ves odvečni kerozin in odstranite pokrivno folijo. Prepojite elektrodna trakova z elektrodnima raztopinama (4.3, 4.4), odrežite ju v dolžini gela in postavite v pripravljene položaje (razdalja elektrod 9,5 cm).

Pogoji za izoelektrično fokusiranje:

6.3.1 Velikost gela 265 × 125 × 0,25 mm

Korak Čas (min) Napetost: (V) Tok (mA) Moč (W) Volt ure (Vh) 1. Predhodno fokusiranje 30 največ 2 500 največ 15 konstan. 4 pribl. 300 2. Vzorčno fokusiranje (2) 60 največ 2 500 največ 15 konstan. 4 pribl. 1 000 3. Končno fokusiranje 60 največ 2 500 največ 5 največ 20 pribl. 3 000 40 največ 2 500 največ 6 največ 20 pribl. 3 000 30 največ 2 500 največ 7 največ 25 pribl. 3 000

Opomba: Če sta debelina ali širina gela spremenjeni, se morata ustrezno prilagoditi vrednosti za tok in moč (npr. podvojite vrednosti za električni tok in moč, če se uporabi gel 265 × 125 × 0,5 mm).

6.3.2 Primer programa napetosti za avtomatsko elektroforezno napravo (2 gela 5,0 × 4,5 cm), elektrodi brez trakov, ki se neposredno naneseta na gel

Korak Napetost Tok Moč Začasna Volt ure 1. Predhodno fokusiranje 1 000 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 85 Vh 2. Vzorčno fokusiranje 250 V 5,0 mA 2,5 W 8 °C 30 Vh 3. Fokusiranje 1 200 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 80 Vh 4. Fokusiranje 1 500 V 5,0 mA 7,0 W 8 °C 570 Vh

V koraku 2 postavite trak za nanos vzorca na 0 Vh.

V koraku 2 odstranite trak za nanos vzorca pri 30 Vh.

6.4 Proteinsko obarvanje

6.4.1 Proteinsko fiksiranje

Po izključitvi elektrike takoj odstranite elektrodna trakova in dajte gel v posodo za obarvanje/razbarvanje, napolnjeno z 200 ml fiksirja (4.9); pustite 15 minut in neprestano stresajte.

6.4.2 Umivanje in obarvanje gelske plošče

Temeljito odtočite fiksir in dvakrat vsakič po 30 sekund spirajte gelsko ploščo s 100 ml raztopine za razbarvanje (4.10). Odlijte raztopino za razbarvanje in dopolnite posodo z 250 ml raztopine za obarvanje (4.11.3); počakajte 45 minut in z rahlim tresenjem omogočite, da se obarva.

6.4.3 Razbarvanje gelske plošče

Odlijte raztopino za obarvanje, dvakrat sperite gelsko ploščo, pri čemer vsakič uporabite 100 ml raztopine za razbarvanje (4.10), nato 15 minut tresite z 200 ml raztopine za razbarvanje in najmanj dvakrat ali trikrat ponovite korak razbarvanja, dokler ozadje ne postane čisto in brezbarvno. Nato splaknite gelsko ploščo z destilirano vodo (2 × 2 minuti) in sušite na zraku (2 do 3 ure) ali s sušilnikom za lase (10–15 minut).

Opomba 1: Fiksiranje, pomivanje, obarvanje in razbarvanje opravite pri temperaturi 20 °C. Ne uporabljajte visokih temperatur.

Opomba 2: Če raje uporabljate bolj občutljivo obarvanje s srebrom (npr. oprema za obarvanje s srebrom, protein, Pharmacia Biotech, št. kode 17–1150–01), morate plazminsko obdelane kazeinske vzorce razredčiti do 5 mg/ml.

7. OVREDNOTENJE

Ovrednotenje se izvaja s primerjavo proteinskih vzorcev neznanega vzorca z referenčnimi standardi na istem gelu. Ugotavljanje kravjega mleka v sirih iz ovčjega, kozjega in bivoljega mleka in mešanic ovčjega, kozjega in bivoljega mleka se izvaja prek γ3- in γ2-kazeinov, katerih izoelektrične točke so v razponu med pH 6,5 in pH 7,5 (slike 4a, 4b, in 5). Meja zaznavnosti je manj kot 0,5 %.

7.1 Vizualna ocena

Za vizualno ocenitev količine kravjega mleka je priporočljivo, da se koncentracije vzorcev in standardov prilagodijo za pridobitev iste stopnje intenzitete ovčjih, kozjih in/ali bivoljih γ2- in γ3-kazeinov (glej „γ2, E, G, B“ in „γ3, E, G, B“ na slikah 4a, 4b in 5). Po tem se lahko neposredno presodi količina kravjega mleka (manj kot, enako ali več kot 1 %) v neznanem vzorcu s primerjavo intenzitete kravjih γ3- in γ2-kazeinov (glej „γ3 C“ in „γ2 C“ na slikah 4a, 4b in 5) s tistimi, ki imajo od 0 % in 1 % referenčnih standardov (ovca, koza) ali laboratorijskimi vmesnimi standardi (bivol).

7.2 Denzitometrijska ocena

Za določitev razmerja površin pod vrhovi za kravja, ovčja, kozja in/ali bivolja kazeina γ2 in γ3 (glej sliko 5) uporabite denzitometrijo (5.19), če je na voljo. Primerjajte to vrednost z razmerjem površin pod vrhovi γ2- in γ3-kazeinov 1-odstotnega referenčnega standarda (ovca, koza) ali laboratorijskega vmesnega standarda (bivol), analiziranega na istem gelu.

Opomba: Metoda deluje zadovoljivo, če se pokaže jasen pozitiven znak za goveja kazeina γ2 in γ3 v 1-odstotnem referenčnem standardu, vendar ne v 0-odstotnem referenčnem standardu. V nasprotnem primeru optimizirajte postopek tako, da natančno sledite podrobnostim metode.

Vzorec je ocenjen pozitivno, če sta oba goveja kazeina γ2 in γ3 ali ustrezajoče razmerje površin pod vrhovi enako ali večje, kot je stopnja 1-odstotnega referenčnega standarda.

8. VIRI

1. Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A. in Bocca A., „Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins“, Milchwissenschaft 45, 1990, str. 708–711.

2. Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A. in Del Giovine L., „A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting“, Milchwissenschaft 50, 1995, str. 83–85.

3. Krause I., Berner I. in Klostermeyer H., „Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte – and carrier ampholyte/immobilized pH gradient – isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier“, v: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ur.), Bode-Verlag, München, 1989, str. 389–393.

4. Krause Ι., Belitz H.–D. in Kaiser K.–P., „Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen“, Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 1982, str.195–199.

5. Radola, B. J., „Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50–100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films“, Electrophoresis 1, 1980, str. 43–56.

Slika 1

Shematska risba pokrivne folije

Slika 2

Kazeinska plast, ki po centrifugiranju plava med vodno in organsko fazo

Slika 3

Poklopna tehnika za ulivanje zelo tankih poliakrilamidnih gelov

a = lepilni trak na distančniku (0,25 mm); b = pokrivna folija (5.3); c, e = stekleni plošči (5.1); d = gelska raztopina (4.1.2); f = nosilna folija gela

Slika 4a

Izoelektrično fokusiranje plazminsko obdelanih kazeinov iz ovčjega in kozjega sira, ki vsebuje različne količine kravjega mleka

% CM = odstotek kravjega mleka, C = krava, E = ovca, G = koza

Prikazan je zgornji del gela izoelektričnega fokusiranja (IEF)

Slika 4b

Izoelektrično fokusiranje plazminsko obdelanih kazeinov iz sira, narejenega iz mešanic ovčjega, kozjega in bivoljega mleka z vsebnostjo različnih količin kravjega mleka

% CM = odstotek kravjega mleka; 1+ = vzorec vsebuje 1 % kravjega mleka, v sredini sledi pa ima dodano kapljico čistega govejega kazeina. C = krava, E = ovca, G = koza, B = bivol

Prikazana je skupna razdalja separacije za gel IEF.

Slika 5

Superpozicija denzitogramov standardnih vzorcev (SDT) in vzorcev sira, narejenega iz mešanice ovčjega, kozjega in bivoljega mleka po izometričnem fokusiranju

a, b = standardi, ki vsebujejo 0 % in 1 % kravjega mleka; c–g = vzorci sirov, ki vsebujejo 0, 1, 2, 3 in 7 % kravjega mleka. C = krava, E = ovca, G = koza.

Zgornja polovica gela IEF je bila obdelana pri λ = 634 nm.

(1) Izdelka Ampholine® pH 3,5–9,5 (Pharmacia) in Resolyte® pH 5–7 in pH 6–8 (BDH, Merck) sta se pokazala kot posebno primerna za pridobitev potrebnih ločitev γ–kazeinov.

(2) Nanašanje vzorca: po predhodnem fokusiranju (korak 1) s pipeto nakapajte 18 µl vzorca in standardne raztopine na trakove za nanos vzorca (10 × 5 mm), jih položite na gel v razmiku 1 mm drug od drugega in 5 mm podolžno od anode ter rahlo pritisnite. Fokusiranje opravite pod navedenimi pogoji, po 60-minutnem fokusiranju vzorca previdno odstranite trakove za nanos vzorca.