IZVEDBENI SKLEP KOMISIJE (EU) 2015/1554

z dne 11. septembra 2015

o določitvi pravil za uporabo Direktive 2006/88/ES v zvezi z zahtevami za metode nadzora in diagnostične metode

(notificirano pod dokumentarno številko C(2015) 6188)

(Besedilo velja za EGP)

EVROPSKA KOMISIJA JE –

ob upoštevanju Pogodbe o delovanju Evropske unije,

ob upoštevanju Direktive Sveta 2006/88/ES z dne 24. oktobra 2006 o zahtevah za zdravstveno varstvo živali in proizvodov iz ribogojstva ter o preprečevanju in nadzoru nekaterih bolezni pri vodnih živalih (1) ter zlasti člena 49(3), člena 50(4), člena 57(b) in člena 61(3) Direktive,

ob upoštevanju naslednjega:

Direktiva 2006/88/ES določa najmanjše preventivne ukrepe za nadzor in zgodnje odkrivanje bolezni s seznama iz Priloge IV k navedeni direktivi pri vodnih živalih (v nadaljnjem besedilu: bolezni s seznama) in ukrepe za nadzor, ki se uporabljajo v primeru suma ali izbruha bolezni s seznama. Prav tako določa zahteve za doseganje statusa brez bolezni v državah članicah ali njihovih območjih ali kompartmentih.

Izkoreninjenje bolezni s seznama in doseganje statusa brez bolezni v državi članici, na območju ali v kompartmentu bi moralo temeljiti na enakih načelih in slediti enakemu znanstvenemu pristopu po vsej Uniji. Zato je treba na ravni Unije določiti posebne zahteve za programe izkoreninjenja in nadzora ter metode vzorčenja in diagnostične metode, ki jih države članice uporabljajo za pridobitev statusa brez bolezni za celotno državo članico ali njeno območje ali kompartment.

Laboratorijske preiskave, ki se opravijo v primeru suma ali potrditve prisotnosti bolezni s seznama, bi morale biti enake na ravni Unije ter slediti enakim znanstvenim standardom in protokolom. V skladu z Direktivo 2006/88/ES bi bilo treba vzpostaviti posebne diagnostične metode in postopke, ki se uporabljajo v laboratorijih, ki jih za navedeni namen določi pristojni organ države članice.

Kodeks zdravstvenega varstva vodnih živali, ki ga je sprejela Svetovna organizacija za zdravje živali (OIE) (v nadaljnjem besedilu: Kodeks za vodne živali) določa standarde za izboljšanje zdravja vodnih živali in dobrobiti gojenih rib po vsem svetu, vključno s standardi za varno mednarodno trgovino z vodnimi živalmi in proizvodi iz njih. Številna poglavja Kodeksa za vodne živali določajo priporočila v zvezi z uporabo nekaterih diagnostičnih testov. Takšni testi, ki jih je določila OIE, so opredeljeni v Priročniku OIE diagnostičnih testov za vodne živali (v nadaljnjem besedilu: Priročnik za vodne živali). Za zagotovitev, da so zahteve Unije v zvezi z diagnostiko bolezni vodnih živali v skladu z mednarodnimi standardi, bi morala pravila iz tega sklepa upoštevati standarde in priporočila Kodeksa za vodne živali.

V zvezi s tem je za številne bolezni s seznama v Priročniku za vodne živali navedenih več testov in postopkov, ki se uporabljajo za namene laboratorijskih preiskav. Za poenotenje znanstvene podlage za diagnosticiranje bolezni s seznama na ravni Unije je treba izbrati med diagnostičnimi testi in postopki, ki jih priporoča OIE, in določiti, kateri testi bi morali biti obvezni za namene laboratorijskih preiskav, ko se izvajajo programi nadzora, ter za izključitev suma na bolezen s seznama ali potrditev prisotnosti bolezni s seznama. Medtem ko bodo v nekaterih primerih morali biti na voljo tudi alternativne metode in postopki, bi bilo treba zagotoviti opise in nekatera znanstvena pojasnila, kdaj in kako bi bilo mogoče uporabiti alternativne metode. To je zlasti potrebno za podrobnejše diagnostične postopke.

Za natančne in ponovljive diagnostične rezultate je pomembno, da se uporabljeni podrobni postopki in protokoli potrdijo v skladu z zadevnimi standardi kakovosti iz dela I Priloge VI k Direktivi 2006/88/ES. Za številne diagnostične metode iz tega sklepa je uporaba komercialnih kompletov za testiranje nujen del diagnostičnih protokolov, navedene komplete za testiranje pa so z akreditiranimi testi za zadevne bolezni potrdili referenčni laboratoriji Evropske unije (v nadaljnjem besedilu: EURL). Zaradi pravne varnosti bi bilo treba v tem sklepu navesti sklice na komercialna imena navedenih potrjenih komercialnih kompletov za testiranje.

Odločba Komisije 2001/183/ES (2) določa zahteve za načrte vzorčenja in diagnostične metode za odkrivanje in potrjevanje bolezni s seznama, in sicer za infekciozno hematopoetsko nekrozo in virusno hemoragično septikemijo. Odločba Komisije 2003/466/ES (3) določa zahteve za načrte vzorčenja in diagnostične metode za odkrivanje infekciozne anemije lososa ter merila za določanje območij in ukrepov uradnega nadzora potem, ko se pojavi sum na prisotnost navedene bolezni ali potrdi prisotnost navedene bolezni. Odločba Komisije 2002/878/ES (4) določa zahteve za načrte vzorčenja in diagnostične metode za odkrivanje in potrjevanje bolezni mehkužcev, in sicer bonamioze in marteilioze. Zaradi posodobitve zahtev bi bilo treba navedene odločbe nadomestiti s tem sklepom. Zato bi bilo treba Odločbo 2001/183/ES, Odločbo 2002/878/ES in Odločbo 2003/466/ES razveljaviti.

Ukrepi iz tega sklepa so v skladu z mnenjem Stalnega odbora za rastline, živali, hrano in krmo –

SPREJELA NASLEDNJI SKLEP:

Člen 1

Predmet urejanja

Ta sklep določa pravila o:

Člen 2

Opredelitev pojmov

V tem sklepu se uporabljajo naslednje opredelitve pojmov:

Člen 3

Minimalne zahteve za programe izkoreninjenja in nadzora

Države članice zagotovijo, da so izpolnjena pravila glede programov nadzora in izkoreninjenja, varovalnih pasov, metod vzorčenja in diagnostičnih metod iz Priloge I ter posebnih metod in podrobnih postopkov iz Priloge II v primeru potrditve, umika ali ponovne vzpostavitve statusa brez bolezni v državi članici ali na njenem območju ali v kompartmentu za eno ali več bolezni s seznama.

Člen 4

Minimalne zahteve za diagnostične metode in posebne postopke

Države članice zagotovijo, da se laboratorijske preiskave izvajajo v skladu z metodami obvladovanja iz Priloge I ter posebnimi diagnostičnimi metodami in podrobnimi postopki iz Priloge II, da se potrdi ali izključi prisotnost bolezni s seznama.

Člen 5

Minimalni ukrepi obvladovanja za zadrževanje bolezni s seznama in minimalne zahteve za odpravo ukrepov za zadrževanje v državah članicah, na območjih ali v kompartmentih, ki niso razglašeni za proste bolezni s seznama

Države članice zagotovijo, da se ukrepi obvladovanja in odprava ukrepov za zadrževanje za eno ali več bolezni s seznama v državi članici ali na njenem območju ali v kompartmentu, ki niso razglašeni za proste bolezni s seznama, izvajajo v skladu z minimalnimi ukrepi obvladovanja in minimalnimi zahtevami za odpravo ukrepov za zadrževanje iz Priloge I.

Člen 6

Razveljavitve

Odločbe 2001/183/ES, 2002/878/ES in 2003/466/ES se razveljavijo.

Člen 7

Datum uporabe

Ta sklep se uporablja od 1. aprila 2016.

Člen 8

Naslovniki

Ta sklep je naslovljen na države članice.

(1) UL L 328, 24.11.2006, str. 14.

(2) Odločba Komisije 2001/183/ES z dne 22. februarja 2001 o določitvi načrtov vzorčenja in diagnostičnih metod za odkrivanje in potrjevanje nekaterih bolezni rib in razveljavitvi Odločbe 92/532/EGS (UL L 67, 9.3.2001, str. 65).

(3) Odločba Komisije 2003/466/ES z dne 13. junija 2003 o merilih za določanje območij in ukrepov uradnega nadzora potem, ko se pojavi sum ali potrdi prisotnost infekciozne anemije lososa (ISA) (UL L 156, 25.6.2003, str. 61).

(4) Odločba komisije 2002/878/ES z dne 6. novembra 2002 o pripravi načrtov vzorčenja in diagnostičnih metod za odkrivanje in potrjevanje prisotnosti bolezni mehkužcev bonamioze (Bonamia ostreae) in marteilioze (Marteilia refrigens) (UL L 305, 7.11.2002, str. 57).

(14) Vzorce je treba zbrati in pregledati v okviru dveh enomesečnih testnih obdobjih na leto (in sicer spomladi in jeseni) ali, ko je primerno, v skladu s praktičnimi vidiki.

(12) Vzorce je treba zbrati ter shraniti in pregledati v okviru dveh enomesečnih testnih obdobjih na leto (in sicer spomladi in jeseni) ali, ko je primerno, v skladu s praktičnimi vidiki.

prisotnost WSD se šteje za potrjeno, ko je dvostopenjska PCR, ki ji sledi sekvenciranje, v skladu z natančnimi metodami in postopki iz tega dela 6 Priloge II pozitivna za WSSV in so v izbrani živali gostiteljici prisotni patognomični znaki WSD.

uradna preiskava vključuje vsaj en zdravstveni pregled in eno vzorčenje 10 rakov, ko so opaženi klinični ali post mortem znaki, ki ustrezajo znakom okužbe z WSD, ali 150 rakov, ko klinični ali post mortem znaki niso opaženi. Vzorci se testirajo v skladu z diagnostično metodo iz točke II.2. (dvostopenjska PCR);

V primeru pozitivnega rezultata pri dvostopenjski PCR se rezultat potrdi s sekvenciranjem amplikona pred izvedbo začetnih kontrolnih ukrepov iz člena 28 Direktive 2006/88/ES, če je to možno pod praktičnimi pogoji s prikazom patognomičnih znakov WSD pri navedenih dovzetnih živalih gostiteljicah s histologijo in transmisijsko elektronsko mikroskopijo.

WSD ni bila dokazana v obdobju dveh let po zaključku ukrepov iz odstavkov (a) in (b), poleg tega pa so bili v tem obdobju izključeni sumi v skladu s postopki iz točke II.3.

je bil stalež obnovljen šele, ko so bile vse gojilnice, uradno razglašene za okužene z WSD, izpraznjene, očiščene in razkužene ter je njihova proizvodnja bila prekinjena/so na njih bili izvedeni alternativni ukrepi v skladu s točko (a);

je bil stalež vseh gojilnic, uradno razglašenih za okužene z WSD, in vseh drugih gojilnic, katerih proizvodnja je bila prekinjena/na katerih so bili izvedeni alternativni ukrepi v skladu s točko (a) na vzpostavljenih okuženih in ogroženih območjih, obnovljen z raki, ki izvirajo iz držav članic, območij ali kompartmentov z zdravstvenim statusom kategorije I, II ali III glede WSD;

so izpolnjene zahteve iz točk I.2.2.1(a), (b) in (c). Če prekinitev proizvodnje ni tehnično izvedljiva, se v gojilnicah izvedejo alternativni ukrepi, ki na enak način zagotavljajo izkoreninjenje WSSV iz okolja gojilnice;

Status brez bolezni se ohrani le, dokler so rezultati testiranja vseh vzorcev, testiranih z uporabo diagnostičnih metod in metod vzorčenja iz točke II.2, negativni za WSD, prav tako pa je bil izključen vsak sum na WSD v skladu z uradno preiskavo in diagnostičnimi metodami iz točke II.3.

Navedena mesta vzorčenja se pregledajo in vzorčijo po načelu rotacije 50 % mest vzorčenja vsako leto. Vzorčenje se opravi v skladu s tabelo 6.B iz oddelka II. Vzorci se izberejo, pripravijo in pregledajo v skladu z diagnostičnimi metodami in metodami vzorčenja iz oddelka II, rezultati laboratorijskih preiskav glede povzročitelja WSD pa morajo biti negativni.

Celinski kompartment, ki zajema eno samo gojilnico z zdravstvenim statusom kategorije I glede WSD, katere zdravstveni status glede navedene bolezni s seznama je neodvisen od okoliških naravnih voda v skladu s točko 3 dela II Priloge V k Direktivi 2006/88/ES in katere status kategorije I je bil preklican v skladu s členom 53(3) navedene direktive, lahko ponovno pridobi zdravstveni status kategorije I, takoj ko pristojni organ potrdi, da so izpolnjeni naslednji pogoji:

Stalež se obnovi šele, ko so vse gojilnice, uradno razglašene za okužene z WSD, izpraznjene, očiščene in razkužene ter je njihova proizvodnja prekinjena v skladu s točko I.2.2.1(c);

stalež vseh gojilnic, uradno razglašenih za okužene, in vseh drugih gojilnic s prekinjeno proizvodnjo znotraj vzpostavljenih okuženih in ogroženih območij se obnovi:

Pristojni organ se lahko odloči zahtevati praznjenje, čiščenje, razkuževanje in prekinitev proizvodnje drugih gojilnic znotraj vzpostavljenih okuženih in ogroženih območij. Trajanje navedene prekinitve proizvodnje določi pristojni organ na podlagi ocene tveganja za vsak primer posebej;

zbiranje vzorcev za testiranje 10 rakov, ko so opaženi klinični znaki ali post mortem znaki okužbe z WSD, ali 150 rakov, ko klinični znaki ali post mortem znaki niso opaženi, in

v vseh gojilnicah, kjer se gojijo dovzetne vrste s seznama iz dela II Priloge IV k Direktivi 2006/88/ES ter ki so na okuženem območju in niso uradno razglašene za okužene z WSD, se opravi uradna preiskava, ki zajema vsaj naslednje:

na morskih območjih: ustreza območju prekrivajočih se območij plimovanja in obdaja okuženo območje ali območju, ki obdaja okuženo območje in se nahaja znotraj kroga s polmerom 10 km od središča okuženega območja; ali enakovrednemu območju, določenemu v skladu z ustreznimi hidrodinamičnimi ali epidemiološkimi podatki, ali

Območje z omejitvami mora biti opredeljeno na podlagi vsakega primera posebej, ob upoštevanju dejavnikov, ki vplivajo na tveganja za širjenje WSD na gojene in divje rake, kot so število, stopnja in porazdelitev smrtnosti rakov v gojilnici, okuženih z WSD; oddaljenost od sosednjih gojilnic in gostota sosednjih gojilnic; kontaktne gojilnice; vrste rakov v gojilnicah; načini gojenja, ki se uporabljajo v prizadetih in sosednjih gojilnicah; hidrodinamične razmere in drugi ugotovljeni dejavniki epidemiološkega pomena.

učinkovito so bili izvedeni minimalni kontrolni ukrepi iz oddelka 4 poglavja V Direktive 2006/88/ES, v bližini gojilnic, uradno razglašenih za okužene z WSD, pa je bilo vzpostavljeno območje z omejitvami, ki je določeno v členu 32(b) navedene direktive ter zajema okuženo in ogroženo območje.

Ko je med izvajanjem programa nadzora iz točke (a) potrjena okužba z WSSV v gojilnici, vključeni v navedeni program nadzora, in je bil zato preklican njen zdravstveni status kategorije II, lahko navedena gojilnica takoj ponovno pridobi zdravstveni status kategorije II in nadaljuje z izvajanjem programa nadzora za pridobitev statusa brez bolezni, ne da bi ji bilo treba izvesti program izkoreninjenja, kot je določeno v točki I.2.2., če:

V gojilnicah ali na mestih vzorčenja so bili opravljeni zdravstveni pregledi in vzorčenja za minimalno obdobje dveh zaporednih let, kot je določeno v tabeli 6.A iz oddelka II.

Država članica, območje ali kompartment z zdravstvenim statusom kategorije III glede WSD v skladu z delom B Priloge III k Direktivi 2006/88/ES lahko doseže zdravstveni status kategorije I glede navedene bolezni s seznama, ko vse gojilnice, kjer se gojijo dovzetne vrste s seznama iz dela II Priloge IV k navedeni direktivi, v državi članici, na območju ali v kompartmentu izpolnjujejo zadevne zahteve iz Priloge V k navedeni direktivi ter ko je bil v vseh navedenih gojilnicah in, ko to zahteva drugi odstavek točke 2 dela I Priloge V k Direktivi 2006/88/ES, na mestih vzorčenja pri divjih populacijah, izbranih v skladu z navedeno točko, izveden eden od naslednjih dvoletnih programov nadzora, ki zajema zdravstvene preglede in zbiranje vzorcev za testiranje.

če so med njimi oslabeli ali umirajoči raki, se izberejo predvsem taki raki. Če med njimi ni takih rakov, izbrani raki vključujejo rake različnih velikosti, torej mlade in odrasle, ki spadajo med izbrane dovzetne vrste in so sorazmerno zastopani v vzorcu.

na območjih morskih ekosistemov in ekosistemov rečnega ustja se izbere ena ali več od naslednjih vrst: Carcinus maenas, Cancer pagurus, Eriocheir sinensis, Liocarcinus depurator, Liocarcinus puber, Crangon crangon, Homarus gammarus, vrste kozic Palaemon adspersus ali penaeid, in sicer Penaeus japonicus, Penaeus kerathurus, Penaeus semisulcatus. Če med njimi ni navedenih vrst, mora biti vzorec reprezentativen za druge prisotne dovzetne vrste deseteronožcev. Glede na širok nabor dovzetnih živali gostiteljic se gostiteljice lahko izberejo iz rodov ali družin deseteronožcev, pri katerih je bila dovzetnost dokazana s poskusi ali naravno;

Ko se v skladu z drugim odstavkom točke 2 dela I Priloge V k Direktivi 2006/88/ES zahteva ciljno usmerjen nadzor pri divjih populacijah, se določita število in geografska porazdelitev mest vzorčenja, tako da so države članice, območja ali kompartmenti ustrezno zajeti. Mesta vzorčenja so reprezentativna za različne ekosisteme z divjimi populacijami dovzetnih vrst, in sicer za morske ekosisteme, ekosisteme rečnega ustja ter rečne in jezerske ekosisteme.

če so v proizvodnih enotah oslabeli ali umirajoči raki, se primarno izberejo taki raki. Če med njimi ni takih rakov, izbrani raki vključujejo rake različnih velikosti, torej mlade in odrasle rake, ki spadajo med izbrane dovzetne vrste in so sorazmerno zastopani v vzorcu;

Raki se za laboratorijske preiskave vzorčijo vedno, kadar koli je verjetno, da bo dosežena najvišja letna temperatura vode. Navedena zahteva glede temperature vode se uporablja tudi za zdravstvene preglede, kadar so ti izvedljivi in ustrezni.

I. Zahteve za programe nadzora in izkoreninjenja za pridobitev in ohranitev zdravstvenega statusa brez bolezni glede WSD ter za obvladovanje okužbe z WSSV

prisotnost Bonamia ostreae se šteje za potrjeno, ko je pozitiven rezultat histopatologije, odtisov tkiv ali hibridizacije in situ povezan s pozitivnim rezultatom PCR in dopolnjen s sekvenciranjem v skladu z odobrenimi metodami in postopki iz dela 5 Priloge II;

Diagnostične metode, ki se uporabljajo za pridobitev ali ohranitev statusa brez bolezni glede okužbe z Bonamia ostreae, so histopatologija, odtisi tkiv ali PCR. Pri uporabi teh diagnostičnih metod se upoštevajo ustrezne natančne metode in postopki iz dela 5 Priloge II.

okužba z Bonamia ostreae ni bila potrjena v obdobju dveh let po zaključku ukrepov iz točk (a), (b) in (c), poleg tega pa so bili v tem obdobju izključeni sumi v skladu s postopki iz točke II.3.

stalež je bil obnovljen šele, ko so bile vse gojilnice ali območja gojenja mehkužcev, uradno razglašene za okužene oz. uradno razglašena za okužena, izpraznjene, očiščene in razkužene oz. izpraznjena, očiščena in razkužena ter je bila njihova proizvodnja prekinjena/so na njih bili izvedeni alternativni ukrepi v skladu s točko (a);

stalež vseh gojilnic ali območij gojenja mehkužcev, uradno razglašenih za okužene oz. okužena, in vseh drugih gojilnic ali območij gojenja mehkužcev, katerih proizvodnja je bila prekinjena/na katerih so bili izvedeni alternativni ukrepi v skladu s točko (a), znotraj vzpostavljenih okuženih in ogroženih območij je bil obnovljen z mehkužci, ki izvirajo iz držav članic ali kompartmentov z zdravstvenim statusom kategorije I, II ali III glede okužbe z Bonamia ostreae;

so izpolnjene zahteve iz točk I.2.2(a), (b) in (c). Če prekinitev proizvodnje ni tehnično izvedljiva, se v gojilnicah izvedejo alternativni ukrepi, ki na enak način zagotavljajo izkoreninjenje Bonamia ostreae iz okolja gojilnice;

stalež vseh gojilnic ali območij gojenja mehkužcev, uradno razglašenih za okužene oz. okužena, in vseh drugih gojilnic ali območij gojenja mehkužcev s prekinjeno proizvodnjo znotraj vzpostavljenih okuženih in ogroženih območij se obnovi z mehkužci, ki izvirajo iz držav članic, območij ali kompartmentov z zdravstvenim statusom kategorije I glede okužbe z Bonamia ostreae. Stalež se obnovi šele, ko so vse gojilnice, uradno razglašene za okužene, izpraznjene, očiščene in razkužene ter je njihova proizvodnja prekinjena v skladu s točko I.2.2(c);

Pristojni organ se lahko odloči zahtevati praznjenje, čiščenje, razkuževanje in prekinitev proizvodnje drugih gojilnic ali območij gojenja mehkužcev, kot je primerno, znotraj vzpostavljenih okuženih in ogroženih območij. Trajanje prekinitve proizvodnje določi pristojni organ na podlagi ocene tveganja za vsak primer posebej;

vse gojilnice in območja gojenja mehkužcev, ki so bili razglašeni za okužene z Bonamia ostreae, se izpraznijo, njihova proizvodnja se prekine ter se, če je mogoče, očistijo in razkužijo. Prekinitev proizvodnje traja vsaj šest mesecev.

v vseh gojilnicah in na območjih gojenja mehkužcev, kjer se gojijo dovzetne vrste s seznama iz dela II Priloge IV k Direktivi 2006/88/ES ter ki so na okuženem območju in niso uradno razglašene za okužene z Bonamia ostreae, se opravi uradna preiskava, ki zajema vsaj zbiranje vzorcev 150 mehkužcev dovzetnih vrst za testiranje po začetku obdobja prenosa Bonamia ostreae. Ko obdobje prenosa ni znano, se vzorčenje začne pozimi ali v začetku pomladi;

ogroženo območje se vzpostavi zunaj okuženega območja in ustreza območju, ki obdaja okuženo območje in je določeno v skladu z ustreznimi hidrodinamičnimi ali epidemiološkimi podatki;

Območje z omejitvami se opredeli na podlagi vsakega primera posebej, ob upoštevanju dejavnikov, ki vplivajo na tveganja za širjenje navedene bolezni s seznama, kot so število, stopnja, starost in porazdelitev smrtnosti mehkužcev v gojilnici ali na območju gojenja mehkužcev, ki je okužena oz. okuženo z Bonamia ostreae, vključno z divjimi mehkužci; oddaljenost in gostota sosednjih gojilnic ali območij gojenja mehkužcev, vključno z divjimi mehkužci; bližina obratov za predelavo ter kontaktnih gojilnic ali območij gojenja mehkužcev; vrste, ki so prisotne v gojilnici ali na območju gojenja mehkužcev, zlasti dovzetne vrste in vektorske vrste; načini gojenja, ki se uporabljajo pri prizadetih in sosednjih gojilnicah ali območjih gojenja mehkužcev; hidrodinamične razmere in drugi ugotovljeni dejavniki epidemiološkega pomena.

učinkovito so bili izvedeni minimalni kontrolni ukrepi iz oddelka 3 poglavja V Direktive 2006/88/ES, v bližini gojilnic ali območij gojenja mehkužcev, uradno razglašenih za okužene oz. okužena z Bonamia ostreae, pa je zlasti bilo vzpostavljeno območje z omejitvami, kot je določeno v členu 32(b) navedene direktive ter ki zajema okuženo in ogroženo območje.

v gojilnicah in na območjih gojenja mehkužcev, kjer se gojijo dovzetne vrste s seznama iz dela II Priloge IV k Direktivi 2006/88/ES, so bili opravljeni zdravstveni pregledi in vzorčenja za minimalno obdobje dveh zaporednih let, kot je določeno v tabeli 5.A iz tega dela;

pri vzorčenju na območjih gojenja mehkužcev se v vzorec vključijo mehkužci iz zadostnega števila mest vzorčenja. Glavni dejavniki, ki jih je treba upoštevati pri izbiri navedenih mest vzorčenja, so mesta vzorčenja s predhodnim dokazom Bonamia ostreae, gostota živali, vodni tokovi, prisotnost dovzetnih vrst, prisotnost vektorskih vrst, batimetrija in prakse upravljanja. V vzorčenje se vključijo naravna nahajališča, ki se nahajajo znotraj območja gojenja ali ob njem.

prisotnost Marteilia refringens se šteje za potrjeno, ko je pozitiven rezultat histopatologije, odtisov tkiv ali hibridizacije in situ povezan s pozitivnim rezultatom PCR in dopolnjen s sekvenciranjem;

Diagnostične metode, ki se uporabljajo za pridobitev ali ohranitev statusa brez bolezni glede okužbe z Marteilia refringens po natančnih diagnostičnih metodah in postopkih iz dela 4 Priloge II, so histopatologija, odtisi tkiv ali PCR.

okužba z Marteilia refringens ni bila potrjena v obdobju dveh let po zaključku ukrepov iz točk (a), (b) in (c), poleg tega pa so bili v tem obdobju izključeni sumi v skladu s postopki iz točke II.3.

je bil stalež obnovljen šele, ko so bile vse gojilnice ali vsa območja gojenja mehkužcev, uradno razglašene za okužene oz. razglašena za okužena, izpraznjene, očiščene in razkužene oz. izpraznjena, očiščena in razkužena ter je bila njihova proizvodnja prekinjena ali so na njih bili izvedeni alternativni ukrepi v skladu s točko (a);

je bil stalež vseh gojilnic ali območij gojenja mehkužcev, uradno razglašenih za okužene oz. okužena, in vseh drugih gojilnic ali območij gojenja mehkužcev, katerih proizvodnja je bila prekinjena/na katerih so bili izvedeni alternativni ukrepi v skladu s točko (a), znotraj vzpostavljenih okuženih in ogroženih območij obnovljen z mehkužci, ki izvirajo iz držav članic, območij ali kompartmentov z zdravstvenim statusom kategorije I, II ali III glede okužbe z Marteilia refringens;

so izpolnjene zahteve iz točk I.2.2(a), (b) in (c). Če prekinitev proizvodnje ni tehnično izvedljiva, se v gojilnicah izvedejo alternativni ukrepi, ki na enak način zagotavljajo izkoreninjenje Marteilia refringens iz okolja gojilnice;

Stalež se obnovi šele, ko so vse gojilnice, uradno razglašene za okužene, izpraznjene, očiščene in razkužene ter je njihova proizvodnja prekinjena v skladu s točko I.2.2(c);

stalež vseh gojilnic ali območij gojenja mehkužcev, uradno razglašenih za okužene oz. okužena, in vseh drugih gojilnic ali območij gojenja mehkužcev s prekinjeno proizvodnjo znotraj vzpostavljenih okuženih in ogroženih območij se obnovi z mehkužci, ki izvirajo iz držav članic, območij ali kompartmentov z zdravstvenim statusom kategorije I glede okužbe z Marteilia refringens.

Pristojni organ se lahko odloči zahtevati praznjenje, čiščenje, razkuževanje in prekinitev proizvodnje drugih gojilnic ali območij gojenja mehkužcev, kot je primerno, znotraj vzpostavljenih okuženih in ogroženih območij. Trajanje prekinitve proizvodnje določi pristojni organ na podlagi ocene tveganja za vsak primer posebej;

Ko se izpraznijo vse gojilnice in območja gojenja mehkužcev, ki so uradno razglašeni za okužene, se njihova proizvodnja za vsaj štiri tedne sinhronizirano prekine.

štirinajst mesecev v primeru gojilnic in območij gojenja mehkužcev z neomejenimi povezavami z okoliškimi vodami, če okuženi mehkužci dovzetnih vrst in tisti mehkužci dovzetnih vrst z epidemiološkimi povezavami z okuženo gojilnico ali okuženim območjem gojenja mehkužcev niso bili pobrani ali odstranjeni pred obdobjem leta, ko je prevalenca Marteilia refringens znana kot največja, ali, ko taki podatki niso znani, ko mehkužci dovzetnih vrst niso bili pobrani ali odstranjeni pred obdobjem, ko temperatura vode preseže 17 °C.

dva meseca v primeru gojilnic in območij gojenja mehkužcev z neomejenimi povezavami z okoliškimi vodami, če so bili okuženi mehkužci dovzetnih vrst in tisti mehkužci dovzetnih vrst z epidemiološkimi povezavami z okuženo gojilnico ali okuženim območjem gojenja mehkužcev, pobrani ali odstranjeni pred obdobjem leta, ko je prevalenca Marteilia refringens znana kot največja, ali, ko to obdobje ni znano, pred obdobjem, ko temperatura vode preseže 17 °C;

dva meseca v primeru gojilnic in območij gojenja mehkužcev z omejenimi povezavami z okoliškimi vodami, kot so drstišča in vzgajališča;

vse gojilnice in območja gojenja mehkužcev, ki so bili razglašeni za okužene z Marteilia refringens, se izpraznijo, njihova proizvodnja se prekine ter se, če je mogoče, očistijo in razkužijo.

v vseh gojilnicah in na območjih gojenja mehkužcev, kjer se gojijo dovzetne vrste s seznama iz dela II Priloge IV k Direktivi 2006/88/ES ter ki so na okuženem območju in niso uradno razglašeni za okužene z Marteilia refringens, se opravi uradna preiskava, ki zajema vsaj zbiranje vzorcev 150 mehkužcev za testiranje po začetku obdobja prenosa Marteilia refringens. Ko obdobje prenosa ni znano, se vzorčenje začne v obdobju, ko temperatura vode preseže 17 °C;

ogroženo območje se vzpostavi zunaj okuženega območja in ustreza območju, ki obdaja okuženo območje in je določeno v skladu z ustreznimi hidrodinamičnimi ali epidemiološkimi podatki;

Območje z omejitvami se opredeli na podlagi vsakega primera posebej ob upoštevanju dejavnikov, ki vplivajo na tveganja za širjenje Marteilia refringens, kot so število, starost, stopnja in porazdelitev smrtnosti mehkužcev v gojilnici ali na območju gojenja mehkužcev, ki je okužena oz. okuženo z Marteilia refringens, vključno z divjimi mehkužci; oddaljenost in gostota sosednjih gojilnic ali območij gojenja mehkužcev, vključno z divjimi mehkužci; bližina obratov za predelavo ter kontaktnih gojilnic ali območij gojenja mehkužcev; vrste, zlasti dovzetne vrste in vektorske vrste, v gojilnici ali na območju gojenja mehkužcev; načini gojenja, ki se uporabljajo v prizadetih in sosednjih gojilnicah ter na območjih gojenja mehkužcev; hidrodinamične razmere in drugi ugotovljeni dejavniki epidemiološkega pomena.

učinkovito so bili izvedeni ukrepi, določeni v oddelku 3 poglavja V Direktive 2006/88/ES, v bližini gojilnic ali območij gojenja mehkužcev, uradno razglašenih za okužene z Marteilia refringens, pa je zlasti bilo vzpostavljeno območje z omejitvami, kot je določeno v členu 32(b) Direktive 2006/88/ES ter ki zajema okuženo in ogroženo območje.

v gojilnicah ali na območjih gojenja mehkužcev so bili opravljeni zdravstveni pregledi in vzorčenja za minimalno obdobje dveh zaporednih let, kot je določeno v tabeli 4.A iz oddelka II;

pri vzorčenju na območjih gojenja mehkužcev se mehkužci iz zadostnega števila mest vzorčenj vključijo v vzorčenje tako, da so v vzorcu sorazmerno zastopani vsi deli območja gojenja mehkužcev. Glavni dejavniki, ki jih je treba upoštevati pri izbiri teh mest vzorčenja, so mesta vzorčenja s predhodnim dokazom Marteilia refringens, gostota živali, vodni tokovi, prisotnost dovzetnih vrst, prisotnost vektorskih vrst, batimetrija in prakse upravljanja. V vzorčenje se vključijo naravna nahajališča.

če so v proizvodnih enotah ali na proizvodnem območju školjke rodu Ostrea spp. in Mytilus spp., se vzorčijo enako veliki vzorci obeh rodov. Če je prisoten le eden od obeh rodov, se vzorči navedeni rod. Če ni prisoten niti rod Ostrea niti rod Mytilus, mora biti vzorec reprezentativen za vse druge prisotne dovzetne vrste;

I. Zahteve za programe nadzora in izkoreninjenja za pridobitev in ohranitev zdravstvenega statusa brez bolezni glede okužbe z Marteilia refringens

dokazovanje ISAV z RT-qPCR, vključno s sekvenciranjem gena HE, da se preveri delecija HPR, in dokazovanje ISAV v tkivnih pripravkih s posebnimi protitelesi proti ISAV (in sicer fiksirane rezine z IHC ali odtise tkiv z IFAT)

uradna preiskava, ki vključuje vsaj en zdravstveni pregled in eno vzorčenje 10 umirajočih rib, ko so opaženi klinični znaki ali post mortem znaki, ki ustrezajo znakom bolezni ISA. Če klinični znaki ali post mortem znaki, ki kažejo na bolezen ISA, niso ugotovljeni, zdravstvenemu pregledu sledi ciljno vzorčenje najmanj 30 umirajočih rib ali pred kratkim umrlih rib z normalnim videzom v skladu s točko I.1. Vzorci se testirajo v skladu z diagnostičnimi metodami iz točke (b);

Diagnostična metoda za pridobitev ali ohranitev statusa brez bolezni glede ISA v skladu s točkama I.2 in I.3 je RT-qPCR, ki ji sledi sekvenciranje pozitivnih vzorcev v skladu z natančnimi metodami in postopki, določenimi v delu 3 Priloge II.

imunohistokemija: praledvice in srce, vključno z zaklopkami in bulbus arteriosus;

ISAV z delecijo HPR ni bil potrjen v obdobju dveh let po zaključku ukrepov iz točk (a), (b) in (c), poleg tega pa so bili v tem obdobju izključeni sumi v skladu s postopki iz točke II.3.

je bil stalež obnovljen šele, ko so vse gojilnice, uradno razglašene za okužene, izpraznjene, očiščene in razkužene ter je njihova proizvodnja bila prekinjena/so v njih bili izvedeni alternativni ukrepi v skladu s točko (a).

je bil stalež vseh gojilnic, uradno razglašenih za okužene, in vseh drugih gojilnic, katerih proizvodnja je bila prekinjena ali v katerih so bili izvedeni alternativni ukrepi v skladu s točko (a), na vzpostavljenih okuženih in ogroženih območjih obnovljen z ribami, ki izvirajo iz držav članic, območij ali kompartmentov z zdravstvenim statusom kategorije I, II ali III glede ISA;

so izpolnjene zahteve iz točk I.2.2.1(a), (b) in (c). Če prekinitev proizvodnje ni tehnično izvedljiva, se v gojilnicah izvedejo alternativni ukrepi, ki na enak način zagotavljajo izkoreninjenje ISAV iz okolja gojilnice;

stalež se obnovi šele, ko so vse gojilnice, uradno razglašene za okužene, izpraznjene, očiščene in razkužene ter je njihova proizvodnja prekinjena v skladu s točko I.2.2.1(c);

stalež vseh gojilnic, uradno razglašenih za okužene z ISAV z delecijo HPR ali s potrjeno boleznijo ISA, in vseh drugih gojilnic znotraj vzpostavljenih okuženih in ogroženih območij, katerih proizvodnja je bila prekinjena, se obnovi z ribami, ki izvirajo iz držav članic, območij ali kompartmentov z zdravstvenim statusom kategorije I glede ISA;

Pristojni organ se lahko odloči zahtevati praznjenje, čiščenje, razkuževanje in prekinitev proizvodnje drugih gojilnic znotraj vzpostavljenih okuženih in ogroženih območij. Trajanje prekinitve proizvodnje za navedene gojilnice določi pristojni organ na podlagi ocene tveganja za vsak primer posebej;

vse gojilnice, uradno razglašene za okužene z ISAV z delecijo HPR ali s potrjeno boleznijo ISA, se izpraznijo, očistijo in razkužijo, njihova proizvodnja pa se prekine za vsaj tri mesece. okužena in ogrožena območja se lahko prekličejo, ko se vse gojilnice znotraj okuženega območja izpraznijo, očistijo in razkužijo, sledi pa jim sinhronizirana prekinitev proizvodnje vsaj šest tednov.

v vseh gojilnicah, kjer se gojijo dovzetne vrste s seznama iz dela II Priloge IV k Direktivi 2006/88/ES ter ki so na okuženem območju in niso uradno razglašene za okužene z ISA, se opravi uradna preiskava, ki zajema vsaj naslednje elemente:

na obalnih območjih: ustreza območju prekrivajočih se območij plimovanja in obdaja okuženo območje; ali območju, ki obdaja okuženo območje in se nahaja znotraj kroga s polmerom 10 km od središča okuženega območja; ali enakovrednemu območju, določenemu v skladu z ustreznimi hidrodinamičnimi ali epidemiološkimi podatki, ali

območje z omejitvami mora biti opredeljeno na podlagi vsakega primera posebej, ob upoštevanju dejavnikov, ki vplivajo na tveganja za širjenje ISA na gojene ali divje ribe, kot so število, stopnja in porazdelitev smrtnosti rib v gojilnici, okuženih z ISAV z delecijo HPR ali s potrjeno boleznijo ISA; oddaljenost od sosednjih gojilnic in gostota sosednjih gojilnic; bližina klavnic; kontaktne gojilnice; vrste rib v gojilnicah; načini gojenja, ki se uporabljajo v prizadetih in sosednjih gojilnicah; hidrodinamične razmere in drugi ugotovljeni dejavniki epidemiološkega pomena.

učinkovito so bili izvedeni minimalni kontrolni ukrepi iz oddelka 3 poglavja V Direktive 2006/88/ES, v bližini gojilnic, uradno razglašenih za okužene z ISAV z delecijo HPR ali s potrjeno boleznijo ISA, pa je zlasti bilo vzpostavljeno območje z omejitvami, kot je določeno v členu 32(b) navedene direktive ter ki zajema okuženo in ogroženo območje;

v gojilnicah ali na mestih vzorčenja so bili opravljeni zdravstveni pregledi in vzorčenja za minimalno obdobje dveh zaporednih let, kot je določeno v tabeli 3.A iz oddelka II;

Država članica, območje ali kompartment z zdravstvenim statusom kategorije III v skladu z delom B Priloge III k Direktivi 2006/88/ES glede ISA, lahko doseže zdravstveni status kategorije I glede navedene bolezni s seznama, ko vse gojilnice, kjer se gojijo dovzetne vrste s seznama iz dela II Priloge IV k Direktivi 2006/88/ES, v državi članici, na območju ali v kompartmentu izpolnjujejo zadevne zahteve iz Priloge V k navedeni direktivi ter ko je bil v vseh navedenih gojilnicah in, ko to zahteva drugi odstavek točke 2 dela I Priloge V k Direktivi, na mestih vzorčenja pri divjih populacijah, izbranih v skladu z navedeno točko, izveden naslednji program nadzora:

izbrane ribe vključujejo ribe, zbrane tako, da so v vzorcu sorazmerno zastopani vse proizvodne enote gojilnice, kot so mrežaste kletke, bazeni in ribniki, ter tudi vsi letniki.

Zdravstveni pregledi se izvajajo v vseh proizvodnih enotah, kot so ribniki, bazeni in mrežaste kletke, da se ugotovi prisotnost poginulih ali oslabelih rib ali rib z neobičajnim vedenjem. Zlasti se pregledajo vodni odtoki, kjer se zaradi vodnega toka zbirajo oslabele ribe.

Ko se v skladu z drugim odstavkom točke 2 dela I Priloge V k Direktivi 2006/88/ES zahteva ciljno usmerjen nadzor pri divjih populacijah, se določita število in geografska porazdelitev mest vzorčenja, tako da so države članice, območja ali kompartmenti ustrezno zajeti. Mesta vzorčenja so reprezentativna tudi za različne ekosisteme z dovzetnimi divjimi populacijami.

Ko se zdravstveni pregledi in vzorčenje gojilnic v skladu z drugim odstavkom točke 2 dela I Priloge V k Direktivi 2006/88/ES zahtevajo več kot enkrat na leto, so časovni presledki med zdravstvenimi pregledi ali zbiranjem vzorcev čim daljši.

I. Zahteve za programe nadzora in izkoreninjenja za pridobitev in ohranitev zdravstvenega statusa brez bolezni glede ISA ter za obvladovanje okužbe z ISAV z delecijo HPR

uradna preiskava vključuje vsaj en zdravstveni pregled in eno vzorčenje 10 rib, ko so opaženi klinični znaki ali post mortem znaki, ki ustrezajo znakom okužbe s KHV, ali 30 rib, ko klinični znaki ali post mortem znaki niso opaženi. Vzorci se testirajo z uporabo diagnostične metode iz točke (b) v skladu z natančnimi diagnostičnimi metodami in postopki, določenimi v točki II dela 2 Priloge II;

III.2 Uradna preiskava in diagnostične metode za izključitev in potrditev prisotnosti okužbe s KHV

Tkivni material, ki ga je treba pregledati, so deli škrg in ledvic. Koščki organov največ dveh rib se lahko združijo.

Diagnostična metoda za dosego ali ohranitev statusa brez bolezni glede KHVD je verižna reakcija s polimerazo v realnem času (qPCR) v skladu z natančnimi diagnostičnimi metodami in postopki, kot so določeni v točki II dela 2 Priloge II.

Tkivni material, ki ga je treba pregledati, so deli škrg in ledvic. Koščki organov največ dveh rib se lahko združijo.

II. Diagnostične metode in metode vzorčenja za nadzor za pridobitev in ohranitev statusa brez bolezni glede KHVD

je bil stalež obnovljen šele, ko so bile vse gojilnice, uradno razglašene za okužene, izpraznjene, očiščene in razkužene ter je njihova proizvodnja bila prekinjena/so v njih bili izvedeni alternativni ukrepi v skladu s točko (a).

je bil stalež vseh gojilnic, uradno razglašenih za okužene, in vseh drugih gojilnic, katerih proizvodnja je bila prekinjena/na katerih so bili izvedeni alternativni ukrepi v skladu s točko (a) na vzpostavljenih okuženih in ogroženih območjih, obnovljen z ribami, ki izvirajo iz držav članic, območij ali kompartmentov z zdravstvenim statusom kategorije I, II ali III glede KHVD;

so izpolnjene zahteve iz točk I.2.2.1(a), (b) in (c). Če prekinitev proizvodnje ni tehnično izvedljiva, se v zadevnih gojilnicah izvedejo alternativni ukrepi, ki na enak način zagotavljajo izkoreninjenje KHV iz okolja gojilnice;

Navedena mesta vzorčenja se pregledajo in vzorčijo po načelu rotacije 50 % mest vzorčenja vsako leto. Vzorčenje se opravi v skladu s tabelo 2.C iz oddelka III. Vzorci se izberejo, pripravijo in pregledajo, kot je opisano v oddelku II, rezultati laboratorijskih preiskav pa morajo biti negativni glede prisotnosti povzročitelja KHVD.

Stalež se obnovi šele, ko so vse gojilnice, uradno razglašene za okužene s KHV, izpraznjene, očiščene in razkužene ter je njihova proizvodnja prekinjena v skladu s točko I.2.2.1(c);

stalež vseh gojilnic, uradno razglašenih za okužene s KHV, in vseh drugih gojilnic s prekinjeno proizvodnjo znotraj vzpostavljenih okuženih in ogroženih območij, se obnovi:

Pristojni organ se lahko odloči zahtevati praznjenje, čiščenje, razkuževanje in prekinitev proizvodnje drugih gojilnic znotraj vzpostavljenih okuženih in ogroženih območij. Trajanje prekinitve proizvodnje določi pristojni organ na podlagi ocene tveganja za vsak primer posebej;

vse gojilnice, uradno razglašene za okužene s KHV, se izpraznijo, očistijo in razkužijo, njihova proizvodnja pa se prekine. Prekinitev proizvodnje traja vsaj šest tednov. Ko se izpraznijo vse gojilnice, ki so znotraj istega okuženega območja in so uradno razglašene za okužene, se njihova proizvodnja za vsaj tri tedne sinhronizirano prekine. Ta odstavek se uporablja tudi za nove gojilnice, uradno razglašene za okužene v času izvajanja programa izkoreninjenja.

v vseh gojilnicah, kjer se gojijo dovzetne vrste s seznama iz dela II Priloge IV k Direktivi 2006/88/ES ter ki so na okuženem območju in niso uradno razglašene za okužene s KHV, se opravi uradna preiskava, ki zajema vsaj naslednje elemente:

Območje z omejitvami mora biti opredeljeno na podlagi vsakega primera posebej, ob upoštevanju dejavnikov, ki vplivajo na tveganja za širjenje KHVD na gojene in divje ribe, kot so število, stopnja in porazdelitev smrtnosti rib v gojilnici, okuženih z virusom KHV; oddaljenost od sosednjih gojilnic in gostota sosednjih gojilnic; bližina klavnic; kontaktne gojilnice; vrste rib v gojilnicah; načini gojenja, ki se uporabljajo v prizadetih in sosednjih gojilnicah; hidrodinamične razmere in drugi ugotovljeni dejavniki epidemiološkega pomena.

učinkovito so bili izvedeni minimalni kontrolni ukrepi iz oddelka 4 poglavja V Direktive 2006/88/ES, v bližini gojilnic, uradno razglašenih za okužene s KHV, pa je bilo vzpostavljeno območje z omejitvami, kot je določeno v členu 32(b) navedene direktive ter ki zajema okuženo in ogroženo območje.

če je med izvajanjem štiriletnega programa nadzora iz točke (a) potrjena okužba s KHV v gojilnici, vključeni v navedeni program nadzora, in je bil zato preklican njen zdravstveni status kategorije II, lahko navedena gojilnica takoj ponovno pridobi zdravstveni status kategorije II in nadaljuje z izvajanjem programa nadzora za pridobitev statusa brez bolezni, ne da bi ji bilo treba izvesti program izkoreninjenja, kot je opisan v točki I.2.2., če izpolnjuje naslednje pogoje:

v gojilnicah ali na mestih vzorčenja je bilo treba opraviti zdravstvene preglede in vzorčenja za minimalno obdobje štirih zaporednih let, kot je določeno v tabeli 2.B iz oddelka III.

v gojilnicah ali na mestih vzorčenja je bilo treba opraviti zdravstvene preglede in vzorčenja za minimalno obdobje dveh zaporednih let, kot je določeno v tabeli 2.A iz oddelka III.

država članica, območje ali kompartment z zdravstvenim statusom kategorije III glede KHVD lahko doseže zdravstveni status kategorije I, ko vse gojilnice, kjer se gojijo dovzetne vrste s seznama iz dela II Priloge IV k Direktivi 2006/88/ES, v navedeni državi članici, na območju ali v kompartmentu izpolnjujejo zahteve za status brez bolezni iz Priloge V k navedeni direktivi ter ko je bil v vseh navedenih gojilnicah in, ko to zahteva drugi odstavek točke 2 dela I navedene priloge, na mestih vzorčenja pri divjih populacijah, izbranih v skladu z navedenim delom, izveden eden od naslednjih programov nadzora:

izbrane ribe morajo vključevati ribe, zbrane tako, da so v vzorcu sorazmerno zastopani vsi deli gojilnice in tudi vsi letniki.

Krap Cyprinus carpio in njegovi hibridi, kot je Cyprinus carpio × Carassius auratus, se vzorčijo, ko so prisotni v gojilnici.

V vseh proizvodnih enotah, kot so ribniki in bazeni, je treba opraviti zdravstvene preglede, da se odkrijejo poginule ali oslabele ribe ali ribe z neobičajnim vedenjem.

Kadar koli je to mogoče, se vzorčijo ribe, ki so bile dlje časa izpostavljene temperaturam, ki omogočajo razvoj virusa, in sicer dva do tri tedne pri 15 °C do 26 °C. Lahko pa se sprejme naslednji pristop:

Ciljno usmerjen nadzor temelji na rednem spremljanju območij, na katerih se nahajajo dovzetne vrste. Območja se spremljajo, ko voda doseže temperaturo, ki omogoča razvoj bolezni (> 15 °C), in ne prej kot dva tedna od datuma, ko os bile take temperature dosežene. Vse umrle ribe ali ribe z neobičajnim vedenjem, najdene na območju, se vzorčijo in testirajo.

Ko se v skladu z drugim odstavkom točke 2 dela I Priloge V k Direktivi 2006/88/ES zahteva ciljno usmerjen nadzor pri divjih populacijah, se določita število in geografska porazdelitev mest vzorčenja, tako da so države članice, območja ali kompartmenti ustrezno zajeti. Mesta vzorčenja so reprezentativna tudi za različne ekosisteme z dovzetnimi divjimi populacijami, in sicer za rečne sisteme in jezera.

I. Zahteve za programe nadzora in izkoreninjenja za pridobitev in ohranitev zdravstvenega statusa brez bolezni glede KHVD ter za obvladovanje okužbe s koi herpes virusom (KHV)

prisotnost VHS se šteje za potrjeno, če so rezultati ene ali več od navedenih diagnostičnih metod pozitivni za VHSV. Prisotnost IHN se šteje za potrjeno, če so rezultati ene ali več od navedenih diagnostičnih metod pozitivni za IHNV. Potrditev prvega primera VHS ali IHN v prej neokuženih državah članicah, na območjih ali v kompartmentih temelji na konvencionalni izolaciji virusa v celični kulturi ali RT-qPCR;

druge diagnostične tehnike z dokazano podobno učinkovitostjo, kot so indirektni fluorescenčni test za dokazovanje protiteles (IFAT), encimsko imunski test (ELISA), RT-PCR in imunohistokemija (IHC);

v gojilnici, za katero obstaja sum okužbe, se opravita vsaj en zdravstveni pregled in eno vzorčenje 10 rib, ko so opaženi klinični znaki ali post mortem znaki, ki ustrezajo znakom okužbe z VHS ali IHN ali obema boleznima, ali vsaj 30 rib, ko klinični znaki ali post mortem znaki niso opaženi. Vzorci se testirajo z uporabo ene ali več diagnostičnih metod iz točk (i) in (ii) v skladu z natančnimi diagnostičnimi metodami in postopki, kot so določeni v oddelku II dela 1 Priloge II:

Tkivni material, ki ga je treba pregledati, so vranica, predledvice in bodisi srce bodisi možgani. Pri vzorčenju plemenk se prav tako lahko pregleda ovarialna ali semenska tekočina.

je bil stalež obnovljen šele, ko so bile vse gojilnice, uradno razglašene za okužene, izpraznjene, očiščene in razkužene ter je njihova proizvodnja bila prekinjena/so v njih bili izvedeni alternativni ukrepi v skladu s točko (a).

je bil stalež vseh gojilnic, uradno razglašenih za okužene, in vseh drugih gojilnic, katerih proizvodnja je bila prekinjena/kjer so bili izvedeni alternativni ukrepi v skladu s točko (a), na vzpostavljenih okuženih in ogroženih območjih obnovljen z ribami, ki izvirajo iz držav članic, območij ali kompartmentov z zdravstvenim statusom kategorije I, II ali III glede VHS ali IHN ali obeh bolezni;

so izpolnjene zahteve iz točk I.2.2.1(a), (b) in (c). Če prekinitev proizvodnje ni tehnično izvedljiva, se v zadevnih gojilnicah izvedejo alternativni ukrepi, ki na enak način zagotavljajo izkoreninjenje IHNV ali VHSV ali obeh virusov iz okolja gojilnice;

Status brez bolezni se ohrani le, dokler so rezultati testiranja vseh vzorcev z uporabo diagnostičnih metod iz točke II.2 negativni za VHS ali IHN ali obe navedeni bolezni s seznama in je izključen vsak sum na VHS ali IHN ali obe bolezni v skladu z diagnostičnimi metodami iz točke II.3.

Celinski kompartment, ki zajema eno samo gojilnico, predhodno razglašeno za prosto VHS ali IHN ali obeh navedenih bolezni s seznama, katere zdravstveni status glede navedenih bolezni s seznama je neodvisen od okoliških naravnih voda v skladu s točko 3 dela II Priloge V k Direktivi 2006/88/ES in katere zdravstveni status kategorije I je bil preklican v skladu s členom 53(3) navedene direktive, lahko ponovno pridobi zdravstveni status kategorije I, takoj ko pristojni organ potrdi, da so izpolnjeni naslednji pogoji:

Stalež se obnovi šele, ko so bile vse gojilnice, uradno razglašene za okužene, izpraznjene, očiščene in razkužene ter je bila njihova proizvodnja prekinjena v skladu s točko I.2.2.1(c);

stalež vseh gojilnic, uradno razglašenih za okužene z VHS ali IHN ali obema navedenima boleznima s seznama, in vseh drugih gojilnic s prekinjeno proizvodnjo znotraj vzpostavljenih okuženih in ogroženih območij, kot je navedeno v točki (c), se obnovi z ribami, ki izvirajo iz države članice, območja ali kompartmenta z zdravstvenim statusom brez bolezni (kategorija I) glede VHS ali IHN ali obeh bolezni.

Pristojni organ se lahko odloči zahtevati praznjenje, čiščenje, razkuževanje in prekinitev proizvodnje drugih gojilnic znotraj vzpostavljenih okuženih in ogroženih območij. Trajanje prekinitve proizvodnje za navedene gojilnice določi pristojni organ na podlagi ocene tveganja za vsak primer posebej;

zdravstveni pregled: v tistih gojilnicah, kjer so rezultati testov iz točke (i) negativni; v obdobju, ko je temperatura vode pod 14 °C, se zdravstveni pregledi še naprej izvajajo enkrat na mesec, razen ko so ribniki ali mrežaste kletke prekriti z ledom, dokler se okuženo območje ne prekliče v skladu s točko I.2.2.1(c);

v vseh gojilnicah, kjer se gojijo dovzetne vrste s seznama iz dela II Priloge IV k Direktivi 2006/88/ES ter ki so na okuženem območju in niso uradno razglašene za okužene z VHS ali IHN ali obema boleznima, se opravi uradna preiskava, ki zajema vsaj naslednje elemente:

na obalnih območjih: ustreza območju prekrivajočih se območij plimovanja in obdaja okuženo območje; ali območju, ki obdaja okuženo območje in se nahaja znotraj kroga s polmerom 10 km od središča okuženega območja; ali enakovrednemu območju, določenemu v skladu z ustreznimi hidrodinamičnimi ali epidemiološkimi podatki;

Območje z omejitvami mora biti opredeljeno na podlagi vsakega primera posebej ob upoštevanju dejavnikov, ki vplivajo na tveganja za širjenje bolezni s seznama na gojene in divje ribe, kot so število, stopnja in porazdelitev smrtnosti rib v gojilnici, okuženi z VHS ali IHN ali obema boleznima; oddaljenost od sosednjih gojilnic in gostota sosednjih gojilnic; bližina klavnic; kontaktne gojilnice; vrste rib v gojilnicah; načini gojenja, ki se uporabljajo v prizadetih gojilnicah in sosednjih gojilnicah; hidrodinamične razmere in drugi ugotovljeni dejavniki epidemiološkega pomena.

če se med izvajanjem programa nadzora iz točke (a) potrdi okužba z VHS ali IHN ali obema boleznima v gojilnici, vključeni v navedeni program nadzora, in je bil zato preklican njen zdravstveni status kategorije II, lahko navedena gojilnica takoj ponovno pridobi zdravstveni status kategorije II in nadaljuje z izvajanjem programa nadzora za pridobitev statusa brez bolezni, ne da bi ji bilo treba izvesti program izkoreninjenja, kot je določen v točki I.2.2, če izpolnjuje naslednje pogoje:

v gojilnicah ali na mestih vzorčenja je bilo treba opraviti zdravstvene preglede in vzorčenja za minimalno obdobje štirih zaporednih let, kot je določeno v tabeli 1.B iz oddelka II.

v gojilnicah ali na mestih vzorčenja je bilo treba opraviti zdravstvene preglede in vzorčenja za minimalno obdobje dveh zaporednih let, kot je določeno v tabeli 1.A iz oddelka II.

država članica, območje ali kompartment z zdravstvenim statusom kategorije III, kot je določeno v delu B Priloge III k Direktivi 2006/88/ES, glede VHS ali IHN ali obeh bolezni lahko doseže zdravstveni status kategorije I glede navedenih bolezni s seznama, če vse gojilnice, kjer se gojijo dovzetne vrste s seznama iz dela II Priloge IV k navedeni direktivi, v navedeni državi članici, na območju ali v kompartmentu izpolnjujejo zahteve iz Priloge V k navedeni direktivi ter če je bil v vseh navedenih gojilnicah in, ko to zahteva drugi odstavek točke 2 dela I Priloge V k Direktivi, na mestih vzorčenja pri divjih populacijah, izbranih v skladu z navedenim delom, izveden eden od naslednjih programov nadzora:

izbrane ribe vključujejo ribe, zbrane tako, da so v vzorcu sorazmerno zastopani vsi deli gojilnice in tudi vsi letniki.

če so med njimi šarenke, se za vzorčenje izberejo samo ribe navedene vrste, razen kadar so med njimi druge dovzetne vrste, ki kažejo tipične znake VHS ali IHN; če med njimi ni šarenk, mora biti vzorec reprezentativen za vse druge prisotne dovzetne vrste;

v vseh proizvodnih enotah, kot so ribniki, bazeni in mrežaste kletke, se opravijo zdravstveni pregledi, da se odkrijejo poginule ali oslabele ribe ali ribe z neobičajnim vedenjem. Zlasti se pregledajo vodni odtoki, kjer se zaradi vodnega toka zbirajo oslabele ribe;

ko se v skladu z drugim odstavkom točke 2 dela I Priloge V k Direktivi 2006/88/ES zahteva ciljno usmerjen nadzor pri divjih populacijah, se določita število in geografska porazdelitev mest vzorčenja, tako da so države članice, območja ali kompartmenti ustrezno zajeti. Mesta vzorčenja so reprezentativna za različne ekosisteme z divjimi populacijami dovzetnih vrst;

I.1 Splošne zahteve za zdravstvene preglede in vzorčenje za VHS in IHN:

I. Zahteve za programe nadzora in izkoreninjenja za pridobitev in ohranitev statusa brez bolezni glede VHS in IHN ter ukrepi obvladovanja za navedeni bolezni s seznama

NADZORNE IN KONTROLNE METODE ZA VIRUSNO HEMORAGIČNO SEPTIKEMIJO (VHS) IN INFEKCIOZNO HEMATOPOETSKO NEKROZO (IHN)

„kontaktna gojilnica“ pomeni gojilnico, kjer se gojijo vodne živali ter za katere je na kakršen koli način dokazano ali obstaja močan sum, da so bile kontaminirane z nalezljivimi organi in tkivi iz gojilnice, uradno razglašene za okuženo.

„gojilnica, uradno razglašena za okuženo“ pomeni gojilnico, kjer se gojijo vodne živali in v kateri je pristojni organ v skladu s členom 28(a), členom 29 in členom 57(b) Direktive 2006/88/ES potrdil eno ali več bolezni s seznama.

„celinsko območje“ pomeni točno določeno geografsko območje na celinskem delu ene ali več držav članic s homogenim hidrološkim sistemom, ki zajema dele povodja od izvirov do naravne ali umetne pregrade, ki preprečuje selitev vodnih živali iz spodnjih delov povodja navzgor, celotno povodje od izvirov do izliva ali več povodij, vključno z vsemi izlivi, zaradi epidemiološke povezave med povodji prek izliva;

metode vzorčenja in diagnostične metode, ki se uporabljajo za laboratorijske preiskave v primeru suma in za potrditev prisotnosti neeksotičnih bolezni s seznama v delu II Priloge IV k Direktivi 2006/88/ES (v nadaljnjem besedilu: bolezni s seznama), kot je določeno v členih 28(a) in 57(b) navedene direktive;

zahteve za programe nadzora in izkoreninjenja, kot je določeno v členu 44 Direktive 2006/88/ES, ter metode vzorčenja in diagnostične metode, ki se uporabljajo za razglasitev statusa brez bolezni za države članice ali njena območja ali kompartmente, kot je določeno v poglavju VII navedene direktive;

PRILOGA II

NATANČNE DIAGNOSTIČNE METODE IN POSTOPKI

I. Uvod

Ta priloga določa natančne postopke za diagnostične metode, ki se uporabljajo za laboratorijske preiskave v okviru programov izkoreninjenja in nadzora iz Priloge I k temu sklepu ter za potrditev ali izključitev suma prisotnosti naslednjih neeksotičnih bolezni s seznama iz dela II Priloge IV k Direktivi 2006/88/ES (v nadaljnjem besedilu: bolezni s seznama) v skladu s členom 57(b) navedene direktive:

1. Virusna hemoragična septikemija (VHS) del 1 2. Infekciozna hematopoetska nekroza (IHN) del 1 3. Koi herpes viroza (KHV) del 2 4. Infekciozna anemija lososov (ISA) del 3 5. Okužba z Marteilia refringens del 4 6. Okužba z Bonamia ostreae del 5 7. Bolezen belih pik (WSD) del 6

II. Opredelitev pojmov

V tej prilogi „transportno gojišče“ pomeni gojišče celične kulture z 10-odstotnim telečjim serumom ter 200 IU penicilina, 200 μg streptomicina in 200 μg kanamicina na mililiter ali z drugimi antibiotiki z dokazano učinkovitostjo.

DEL 1

NATANČNE DIAGNOSTIČNE METODE IN POSTOPKI ZA NADZOR IN POTRDITEV IHN IN VHS

I. Diagnostične metode in postopki za nadzor VHS in IHN

Pri vzorčenju in laboratorijskih preiskavah za pridobitev ali ohranitev zdravstvenega statusa brez bolezni glede IHN ali VHS, kot je določeno v oddelku I dela 1 Priloge I, z uporabo diagnostičnih metod iz točk II.1 in II.2 dela 1 navedene priloge se uporabljajo natančne diagnostične metode in postopki iz naslednjih točk od I.1 do I.6.

I.1 Priprava in pošiljanje vzorcev rib

I.1.1 Tkiva za virološko preiskavo na celični kulturi

Preden se deli organov za preiskavo odpošljejo ali prenesejo v laboratorij, se odstranijo iz ribe s sterilnim secirnim orodjem in prenesejo v sterilne plastične epruvete, ki vsebujejo transportno gojišče.

Količina organov in tkiv rib, ustreznih za virološko preiskavo na celični kulturi in RT-qPCR, je odvisna od velikosti rib. Tako so tkiva za vzorčenje lahko celoten zarod z mešičkom (dolžina telesa < 4 cm), notranji organi, vključno z ledvicami (4 cm < dolžina telesa < 6 cm) ali, pri večjih ribah, ledvice, vranica, srce in/ali možgani ter ovarialna tekočina plemenk v času drstenja.

Ovarialna ali semenska tekočina ali kosi organov največ 10 rib se lahko zberejo v eno sterilno epruveto, ki vsebuje najmanj 4 ml transportnega gojišča, in predstavljajo en združen vzorec. Tkivo v vsakem vzorcu tehta najmanj 0,5 grama (g).

Virološka preiskava na celični kulturi se začne čim prej, najpozneje pa v 48 urah po zbiranju vzorcev. V izjemnih primerih se virološka preiskava lahko začne najpozneje v 72 urah po zbiranju organov in tkiv, če je material za preiskavo zaščiten s transportnim gojiščem in je mogoče med transportom izpolniti zahteve glede temperature.

I.1.2 Vzorci za verižno reakcijo s polimerazo z reverzno transkripcijo (RT-PCR ali RT-qPCR)

Vzorci rib se odvzamejo v skladu s postopkom iz točke I.1.1 z uporabo sterilnega instrumenta in prenesejo v sterilne plastične epruvete, ki vsebujejo transportno gojišče. Tkivo 10 rib se lahko zbere v eno epruveto, predstavlja pa en združen vzorec. Če pa je količina inokuluma majhna, se lahko uporabi tkivo do največ petih rib. Druga možnost je, da se vzorci lahko združujejo v RNK stabilizacijskih reagentih, kot je 0,2 g tkiva/ml reagenta v skladu s priporočilom proizvajalcev, čeprav se vsaka riba posamezno predela in se vzorci ne združujejo zaradi majhne količine organov in tkiv, ki se uporablja za ekstrakcijo.

V laboratorij se lahko pošljejo tudi cele ribe.

I.2 Pošiljanje vzorcev za ribe

Epruvete, ki vsebujejo ribja tkiva v transportnem gojišču za gojenje celic ali analizo RT-PCR/RT-qPCR, se dajo v izolirne posode, na primer polistirenske škatle z debelimi stenami, z dovolj ledu ali z alternativnim hladilnim medijem s podobnim učinkom hlajenja za zagotovitev hlajenja vzorcev med transportom v laboratorij. Vendar je treba preprečiti zamrznitev vzorcev. Temperatura vzorca med transportom nikoli ne sme preseči 10 °C, ob njihovem sprejemu pa mora v transportni škatli še vedno ostati led oz. en ali več zamrzovalnih elementov mora biti še vedno delno ali v celoti zamrznjenih.

V laboratorij se lahko pošljejo cele ribe, če je med transportom mogoče izpolniti zahteve glede temperature iz prvega odstavka. Cele ribe se zavijejo v vpojni papir in se nato pošljejo v plastični vrečki. Lahko se pošljejo tudi žive ribe.

I.3 Zbiranje dodatnega diagnostičnega materiala

Če diagnostični laboratorij to odobri, se za dopolnilne preiskave lahko odvzamejo in pripravijo tudi druga ribja tkiva.

I.4 Priprava vzorcev za preiskavo celične kulture in RT-qPCR

I.4.1 Zamrznitev v izjemnih primerih

V primeru praktičnih težav, ki onemogočajo obdelavo vzorcev v 48 urah po odvzemu ribjih tkiv, je sprejemljivo zamrzniti vzorce tkiv v transportnem gojišču pri – 20 °C ali nižji temperaturi in opraviti virološko preiskavo v 14 dneh. Vendar se ribje tkivo zamrzne in odmrzne samo enkrat pred preiskavo. Vodi se evidenca s podrobnostmi o razlogih za vsako zamrznitev vzorcev ribjih tkiv.

I.4.2 Homogenizacija organov

V laboratoriju se ribje tkivo v epruvetah popolnoma homogenizira s stomaherjem, z mešalcem ali s pestilom v terilnici s sterilnim peskom, nato pa suspendira v prvotnem transportnem gojišču.

Če vzorec sestavljajo cele ribe, krajše od 4 cm, se po odstranitvi telesa za zadnjično odprtino sesekljajo s sterilnimi škarjami ali skalpelom. Če vzorec sestavljajo cele ribe z dolžino telesa med 4 in 6 cm, se zberejo notranji organi, vključno z ledvicami. Če vzorec sestavljajo cele ribe, daljše od 6 cm, se zberejo vzorci tkiv, kot je opisano v točki I.1. Vzorci tkiva se sesekljajo s sterilnimi škarjami ali skalpelom ter homogenizirajo, kot je opisano v prvem odstavku te točke, in suspendirajo v transportnem gojišču.

Končno razmerje med tkivnim materialom in transportnim gojiščem se v laboratoriju prilagodi na 1: 10.

I.4.3 Centrifugiranje homogenata

Homogenat se 15 minut centrifugira v hlajeni centrifugi pri temperaturi od 2 °C do 5 °C pri 2 000 do 4 000 × g, supernatant pa se zbere in obdela bodisi štiri ure pri 15 °C bodisi čez noč pri 4 °C do 8 °C z antibiotiki. Če je bil vzorec poslan v transportnem gojišču, se obdelava supernatanta z antibiotiki lahko izpusti.

V primeru praktičnih težav, kot je okvara inkubatorja ali težave s celičnimi kulturami, ki onemogočajo inokulacijo celic v 48 urah po zbiranju vzorcev ribjega tkiva, se supernatant lahko zamrzne pri – 80 °C in virološka preiskava opravi v 14 dneh.

Če se zbrani supernatant v 48 urah po vzorčenju shrani pri – 80 °C, se lahko ponovno uporabi samo enkrat za virološko preiskavo.

Pred inokulacijo celic se supernatant zmeša z enakimi deli ustrezno razredčenih združenih protiserumov proti avtohtonim serotipom virusa nalezljive nekroze trebušne slinavke (IPN) in s tem inkubira najmanj eno uro pri 15 °C ali največ 18 ur pri 4 °C. Titer protiseruma je vsaj 1/2 000 pri nevtralizacijskem testu 50-odstotne redukcije plakov.

Namen obdelave vseh inokulumov s protiserumom proti virusu IPN je preprečiti razvoj citopatskega efekta (CPE) zaradi virusa IPN v inokuliranih celičnih kulturah. To bo skrajšalo virološke preiskave in zmanjšalo število primerov, pri katerih bi bilo treba pojav CPE šteti za morebitno indikacijo VHSV ali IHNV.

Pri vzorcih iz proizvodnih enot, ki se štejejo za proste IPN, se obdelava inokulumov s protiserumom proti virusu IPN lahko izpusti.

I.4.4 Priprava vzorca za programe nadzora, ki temeljijo na RT-PCR in RT-qPCR

Če so bili vzorci zbrani v transportnem gojišču, se izvede postopek iz točk I.4.2 in I.4.3. Po centrifugiranju se zbere supernatant in ekstrahira RNK. Če se dodatne preiskave ne bodo opravljale takoj po centrifugiranju, se vzorci takoj zamrznejo pri – 20 °C ali nižji temperaturi.

Za analizo ribjih tkiv, shranjenih v RNK stabilizacijskem reagentu, se nadaljnji postopki za vzorce, shranjene pri različnih temperaturah, opravijo v naslednjih časovnih okvirih:

vzorci, shranjeni pri 37 °C: v enem dnevu;

vzorci, shranjeni pri 25 °C: v enem tednu;

vzorci, shranjeni pri 4 °C: v enem mesecu;

vzorci, shranjeni pri – 20 °C: ni omejeno

Združeni vzorci v RNK stabilizacijskem reagentu se obdelajo kot posamezni vzorci v RNK stabilizacijskem reagentu. V primeru vzorcev, združenih v RNK stabilizacijskem reagentu, količina vzorca ne presega količine, ki jo priporoča proizvajalec pripomočkov za ekstrakcijo RNK, kot so pripomočki RNeasy Mini Kits (Qiagen) ali podobno. Če se združijo večji vzorci, morajo pripomočki ali metode za ekstrakcijo to tudi odražati.

Vzorci, zbrani v RNK stabilizacijskem reagentu, se ne uporabijo za gojenje celic.

I.4.5 Združevanje vzorcev za RT-qPCR

Ker je občutljivost danih protokolov RT-qPCR podobna ali večja od občutljivosti metod gojenja celic, je sprejemljivo uporabiti supernatant iz homogeniziranega ribjega tkivnega materiala združenih organov največ 10 rib v gojišču celične kulture za PCR. Vendar se vsa ribja tkiva zaradi precej manjšega inokuluma za PCR v primerjavi s tistim za gojenje celic previdno homogenizirajo pred zbiranjem organov in tkiv za ekstrakcijo.

Enako načelo se uporablja tudi, če se vzorci zbirajo v RNK stabilizacijskih reagentih. Vendar je v navedenem primeru pogosto težko zbrati reprezentativne organe in tkiva za do 10 rib v eni epruveti, zato se število rib, ki se lahko združijo, zmanjša na 2 do 5.

I.5 Virološka preiskava na celični kulturi

I.5.1 Celične kulture in gojišča

Celična linija -2 ribjih mladic sončnega ostriža (BF-2) ali celična linija gonade šarenke -2 (RTG-2) ter bodisi Epithelioma papulosum cyprini (EPC) bodisi celice črnoglavega pisanca (FHM) se gojijo pri 20 °C do 30 °C na ustreznem gojišču, in sicer na gojišču Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) ali njegovih modifikacijah z dodatkom 10-odstotnega fetalnega govejega seruma in antibiotikov v standardnih koncentracijah.

Ko se celice gojijo v zaprtih fiolah, se priporoča puferiranje gojišča z bikarbonatom. Gojišče, ki se uporablja za gojenje celic v odprtih enotah, se lahko puferira s tris(hidroksimetil)aminometan-HCl (Tris-HCl) (23 mM) in natrijevim bikarbonatom (6 mM). Vrednost pH mora biti 7,6 ± 0,2.

Celične kulture, ki se uporabijo za inokulacijo z ribjim tkivnim materialom, so mlade, običajno en dan stare monoslojne celične kulture, kadar je to mogoče; vendar se sprejmejo tudi, če so stare od 4 ure do 48 ur. Pri inokulaciji morajo celice rasti aktivno.

I.5.2 Inokulacija celičnih kultur

Z antibiotikom obdelana suspenzija organov se inokulira v celične kulture v dveh razredčitvah, in sicer v primarni razredčitvi in v razredčitvi primarne razredčitve v razmerju 1: 10, tako da sta končni razredčitvi tkivnega materiala v gojišču celične kulture 1: 100 oz. 1: 1 000, da se prepreči homologna interferenca. Vsaj dve celični liniji se inokulirata, kot je navedeno v točki I.5.1. Razmerje med velikostjo inokuluma in količino gojišča celične kulture je približno 1: 10.

Za vsako razredčitev in vsako celično linijo se uporabi najmanj približno 2 cm2 celične površine, ki ustreza eni jamici na pladnju s celičnimi kulturami in s 24 jamicami. Pladnji s celičnimi kulturami se uporabljajo, kadar je to mogoče.

I.5.3 Inkubacija celičnih kultur

Inokulirane celične kulture se inkubirajo od sedem do deset dni pri 15 °C. Če se barva gojišča celične kulture spremeni iz rdeče v rumeno, kar kaže na zakisanje gojišča, se pH prilagodi s sterilno raztopino bikarbonata ali enakovrednih snovi, da se zagotovi dovzetnost celic za okužbo z virusom.

Vsaj vsakih šest mesecev ali v primeru suma zmanjšane dovzetnosti celic se titrirajo zamrznjene zaloge VHSV in IHNV, da se preveri dovzetnost celičnih kultur za okužbo. Postopek iz oddelka III se uporabi, če je to mogoče.

I.5.4 Mikroskopija

Inokulirane celične kulture se redno pregledujejo, in sicer vsaj trikrat na teden, na pojav CPE pri 40- do 150-kratni povečavi. Če se opazi očiten CPE, se takoj začnejo postopki za določitev virusa v skladu s točko I.6.

I.5.5 Subkultivacija

Če se po primarni 7- do 10-dnevni inkubaciji CPE ne razvije, se opravi subkultivacija nove celične kulture z uporabo celične površine, podobne površini pri primarni kulturi.

Alikvoti gojišča (supernatant) iz vseh kultur ali jamic, ki sestavljajo primarno kulturo, se združijo glede na celično linijo od 7 do 10 dni po inokulaciji. Združeni vzorci se nato inokulirajo v homologne celične kulture, nerazredčene in razredčene v razmerju 1: 10 (kar pomeni končni razredčitvi supernatanta 1: 10 oz. 1: 100), kot je opisano v točki I.5.2. Druga možnost je, da se alikvoti 10 % gojišča, ki sestavlja primarno kulturo, inokulirajo neposredno v jamico s svežo celično kulturo (tj. subkultivacija iz jamice v jamico). Pred inokulacijo se lahko izvede predinkubacija razredčitev s protiserumom proti virusu IPN pri ustrezni razredčitvi, kot je opisano v točki I.4.3.

Inokulirane kulture se nato inkubirajo od 7 do 10 dni pri 15 °C ter se pregledajo v skladu s točko I.5.4.

Če se toksični CPE pojavi v prvih treh dneh inkubacije, se v tej fazi opravi subkultivacija, vendar se celice potem inkubirajo sedem dni in se opravi ponovna subkultivacija z nadaljnjo sedemdnevno inkubacijo. Ko se toksični CPE razvije po treh dneh, se celice enkrat presadijo in inkubirajo, da se doseže skupaj 14 dni od primarne inokulacije. V zadnjih sedmih dneh inkubacije se ne smejo pojaviti znaki toksičnosti.

Če se kljub tretiranju z antibiotiki pojavi bakterijska okužba, se pred subkultivacijo opravi centrifugiranje pri 2 000 do 4 000 × g za 15 minut do 30 minut pri 2 °C do 5 °C ali filtriranje supernatanta skozi filter 0,45 μm ali oboje (filter, ki veže beljakovine z nizko molekulsko maso). Poleg tega subkultivacija poteka po enakih postopkih, kot so opisani za toksični CPE v četrtem odstavku te točke.

Če se CPE ne pojavi, se rezultati testov lahko razglasijo za negativne.

I.6 Določanje virusa

Če je bil v celični kulturi opažen CPE, se gojišče (supernatant) zbere in pregleda po enem ali več od naslednjih postopkov, in sicer z encimsko-imunskim testom (ELISA), indirektno imunofluoerscenco (IF), nevtralizacijo, RT-PCR ali RT-qPCR. Če ti testi niso omogočili dokončne določitve virusa v enem tednu, se supernatant pošlje nacionalnemu referenčnemu laboratoriju ali referenčnemu laboratoriju EU za bolezni rib iz Priloge VI k Direktivi 2006/88/ES za takojšnjo določitev.

I.6.1 ELISA

Za določitev izolata virusa se opravi dvojna sendvič ELISA za dokaz protiteles. Mikrotitrske plošče se premažejo s 50 μl/jamico (0,9 pg) dokazano kakovostnih imunoglobulinov (Ig), očiščenih proteina A, iz kunčjega protiseruma proti IHNV ali VSHV, razredčenega v karbonatnem pufru (pH 9,6), ki vsebuje 15 mM natrijevega azida, in inkubiranega od 18 ur do 2 tedna pri 4 °C.

Na mikrotitrski plošči s pripravljenimi razredčitvami se vsak vzorec, ki vsebuje 1-odstotni Triton X-100 in pozitivne kontrole, razredči s pufrsko raztopino (in sicer s fosfatno pufrano slanico (PBS)-T-BSA, 1 % BSA) v 4-kratni razredčitvi, in sicer nerazredčen ter v razmerjih 1: 4, 1: 16, 1: 64. Mikrotitrske plošče ELISA se sperejo v PBS, ki vsebuje 0,05-odstotni Tween-20 (PBS-T), 50 μl vsake razredčitve pa se prenese z mikrotitrske plošče s pripravljenimi razredčitvami na sprano in premazano mikroploščo ELISA.

Mikrotitrske plošče ELISA se nato inkubirajo 30 minut pri 37 °C. Potem se mikrotitrske plošče sperejo in inkubirajo 30 minut pri 37 °C s posebnimi monoklonskimi protitelesi (in sicer MAb IP5B11 za določitev VHSV oz. Hyb 136-3 za določitev IHNV). Na mikrotitrsko ploščo ELISA se prenese 50 μl hrenove peroksidaze (HRP), konjugirane s kunčjimi protimišjimi protitelesi in razredčene v razmerju 1: 1 000 v PBS-T-BSA.

Nazadnje se po ponovnem spiranju razvijejo reakcije z dodajanjem 50 μl/jamico orto-fenilendiamina (OPD). Mikrotitrske plošče ELISA se inkubirajo 20 minut pri sobni temperaturi v temi, reakcija pa se ustavi z dodajanjem 100 μl/jamico 0,5 M H2SO4.

Absorbanca se spremlja pri valovnih dolžinah 492 nm in 620 nm na čitalniku testa ELISA. Vzorci se opredelijo kot pozitivni ali negativni po primerjavi rezultatov testa z vrednostmi absorbance za pozitivne in negativne kontrole. Na splošno se vzorci s kombinirano absorbanco (A) < 0,5 za nerazredčen material štejejo za negativne, vzorci z vrednostmi A med 0,5 in 1,0 se štejejo za sumljive, vzorci z vrednostmi A > 1,0 pa se štejejo za pozitivne.

Namesto testov ELISA iz te točke se lahko uporabijo druge različice testa ELISA z dokazano podobno učinkovitostjo.

I.6.2 Imunofluorescenca – IF

Patogeni VHSV in IHNV s seznama se določajo z okužbo celic na 96-jamični mikrotitrski plošči „Black“, konvencionalnih 24-jamičnih mikrotitrskih ploščah ali pokrivnih stekelcih na 24-jamičnih mikrotitrskih ploščah. Pri določanju IHNV ali VHSV ali obeh virusov z okužbo celic na pokrivnih stekelcih se uporabi naslednji protokol:

(a) pokrivna stekelca se nasadijo s celicami z gostoto, ki vodi do 60- do 90-odstotne konfluence po 24 urah gojenja. Kadar je mogoče, se v ta namen uporabijo celice EPC, ker se na stekleno površino močno prilepijo, vendar se lahko uporabijo tudi druge celične linije, kot so BF-2, RTG-2 ali FHM. 150 μl supernatanta celične kulture v dveh različnih razredčitvah (1: 10 in 1: 1 000) se inokulira v dveh ponovitvah na en dan starih monoslojih in inkubira 24 ur pri 15 °C;

(b) nato se gojišče celične kulture odstrani, okuženi celični monosloji pa se fiksirajo z 0,5 ml ledeno mrzle vodne raztopine acetona (80 % vol:vol). Fiksacija poteka 15 minut v komori za odsesavanje dima pri sobni temperaturi, nato se raztopina acetona odstrani, pokrivna stekelca pa se vsaj 30 minut sušijo na zraku. Na tej stopnji se mikrotitrske plošče bodisi takoj obdelajo bodisi shranijo pri – 20 °C za nadaljnjo uporabo;

(c) specifična monoklonska protitelesa (in sicer MAb IP5B11 za določitev VHSV oz. Hyb 136-3 za določitev IHNV) se razredčijo v 0,01 M PBST, pH 7,2 v razredčitvi, ki jo priporoča proizvajalec monoklonskih protiteles; 50 μl/jamico do 100 μl/jamico se doda fiksiranemu monosloju, mikrotitrske plošče pa se inkubirajo eno uro pri 37 °C v vlažni komori;

(d) pokrivna stekelca se nežno trikrat sperejo s PBS, ki vsebuje 0,05-odstotni Tween-20 (PBS-T), pufer pa mora biti po zadnjem spiranju v celoti odstranjen. Celice se nato inkubirajo eno uro pri 37 °C s protitelesi proti mišjim imunoglobulinom, konjugiranimi s fluorescein izotiocianatom (FITC) ali tetrametilrodamin-5 (in -6) izotiocianatom (TRITC), ki se uporablja kot primarno protitelo, nato se razredčijo v skladu z navodili dobavitelja, ponovno sperejo v PBS-T in posušijo. Obarvane kulture se namestijo na pokrivna stekelca z uporabo solne raztopine glicerola in se pregledajo pod vpadno ultravijolično (UV) svetlobo. Uporabijo se 10 × oz. 12 × okularji in × 25 oz. × 40 objektna leča s številčnimi aperturami > 0,7 oz. > 1,3.

Namesto tega se glede na celične kulture, fiksacijo in protitelesa referenčne kakovosti lahko uporabijo druge tehnike IF z dokazano podobno učinkovitostjo.

I.6.3 Nevtralizacija

Celice iz zbranega supernatanta se odstranijo s centrifugiranjem (od 2 000 × g do 4 000 × g) ali membransko filtracijo (0,45 μm) s filtrom, ki veže beljakovine z nizko molekulsko maso, supernatant pa se razredči v razmerju 1: 100 in 1: 10 000 v gojišču celične kulture.

Alikvoti najmanj dveh razredčitev supernatanta se zmešajo in ločeno inkubirajo 60 minut pri 15 °C z enakimi deli naslednjih reagentov:

(a) serum, ki vsebuje protitelo, specifično za zadevno skupino, proti VHSV pri razredčitvi 1: 50 (vol:vol);

(b) serum, ki vsebuje protitelo, specifično za zadevno skupino, proti IHNV pri razredčitvi 1: 50 (vol:vol);

(c) združeni vzorci protiserumov proti avtohtonim serotipom IPNV pri razredčitvi 1: 50 (vol:vol);

(d) samo gojišče (pozitivna kontrola).

Iz vsake virusne mešanice supernatanta in seruma se inokulirata vsaj dve celični kulturi, vsaka s 50 μl, nato pa inkubirata pri 15 °C. Razvoj CPE se preverja, kot je opisano v točki I.5.4.

Sevi in izolati VHSV, ki pri nevtralizacijskih testih ne reagirajo, se določajo z metodo IF ali ELISA.

Namesto tega se lahko uporabijo drugi nevtralizacijski testi z dokazano podobno učinkovitostjo.

I.6.4 RT-PCR/ RT-qPCR

I.6.4.1 Priprava virusne RNK

Vse delo z RNK se opravlja na ledu z uporabo rokavic.

RNK se ekstrahira z metodo s fenol-kloroformom ali centrifugalnimi kolonami za afiniteto do RNK v skladu z navodili proizvajalca. Lahko se uporabijo komercialno dostopni kompleti za ekstrakcijo RNK, ki bodo zagotovili visoko kakovostno RNK, primerno za uporabo s protokoli RT-PCR, ki so podrobno opisani v spodnjih točkah.

RNK se ponovno suspendira v destilirani RNaz prosti vodi (tj. v vodi, tretirani z 0,1-odstotnim dietil pirokarbonatom) ali ustreznem elucijskem pufru.

I.6.4.2 RT-PCR

Za dokazovanje IHNV se uporabljata naslednja začetna oligonukleotida:

smiselni začetni oligonukleotid 5′-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3′;

protismiselni začetni oligonukleotid 5′-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3′.

Uporabljajo se naslednji cikli (enostopenjska RT-PCR): 1 cikel: 30 minut pri 50 °C; 1 cikel: 2 minuti pri 95 °C; 30 ciklov: 30 sekund pri 95 °C, 30 sekund pri 50 °C, 60 sekund pri 72 °C; 1 cikel: 7 minut pri 72 °C in namakanje pri 4 °C.

Za dokazovanje VHSV se uporabljata naslednja začetna oligonukleotida:

VN For 5′-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3′;

VN Rev 5′-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3′.

Uporabljajo se naslednji cikli (enostopenjska RT-PCR): 30 minut pri 50 °C, 15 minut pri 95 °C, 35 ciklov po 30 sekund pri 94 °C, 30 sekund pri 55 °C in 60 sekund pri 68 °C. Nato se reakcija vzdržuje 7 minut pri 68 °C.

Količina in specifičnost reakcij RT-PCR se ocenjujeta z gelsko elektroforezo v 1,5-odstotnem agaroznem gelu z etidijevim bromidom ter opazujeta z uporabo presvetlitve z UV. Za IHNV je možno opaziti 693 bp PCR amplikon. Za VHSV je velikost 505 bp.

Rezultati PCR se lahko razlikujejo glede na pogoje, pod katerimi se ta test izvaja, in sicer je morda potrebna optimizacija temperaturnih pogojev reakcije pomnoževanja, odvisno od cikličnega termostata v uporabi. Poleg tega lahko pride do lažno pozitivnih rezultatov zaradi lažnega prileganja začetnega oligonukleotida ali laboratorijske kontaminacije. V izogib morebitnih dvomov se vključijo ustrezne pozitivne in negativne kontrole ter sekvenčni amplikoni. Za začetne oligonukleotide za VHSV je potrebna posebna pozornost pri uporabi celic BF-2, saj začetni oligonukletoidi lahko reagirajo z DNK/RNK celične linije z lažno pozitivnimi rezultati podobne velikosti. Pri testiranju supernatanta iz celic BF-2 se sekvencirajo amplificirani odseki z metodo PCR.

I.6.4.3 RT-qPCR za VHSV

Za VHSV se amplifikacija opravi z uporabo naslednjih začetnih oligonukleotidov in sonde:

Smiselni začetni oligonukleotid: 5′-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3′;

Protismiselni začetni oligonukleotid: 5′-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3′,

in sonda: 5′-FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTG-ATC-TTC-TG-BHQ1.

Enostopenjska RT-qPCR:

Negativne kontrole reakcijske mešanice in pozitivne kontrole reakcije se vključijo na vsako serijo mikrotitrskih plošč. Pogoji pomnoževanja: 30 minut pri 50 °C, 15 minut pri 95 °C, 40 ciklov po 15 sekund pri 94 °C, 40 sekund pri 60 °C in 20 sekund pri 72 °C; po potrebi se prilagodi. Namesto tega se lahko uporabijo druge različice testov RT-PCR ali RT-qPCR z dokazano podobno učinkovitostjo.

I.6.4.4 RT-qPCR za IHNV

Za IHNV se amplifikacija opravi z uporabo naslednjih začetnih oligonukleotidov in sonde:

Smiselni začetni oligonukleotid: 5′- AGA-GCC-AAG-GCA-CTG-TGC-G-3′;

Protismiselni začetni oligonukleotid: 5′- TTCTTTGCGGCTTGGTTGA – 3′

in sonda: 5′ 6FAM-TGAGACTGAGCGGGACA-NFQ/MGB.

Dvostopenjska RT-qPCR:

Naslednji test temelji na dvostopenjski amplifikaciji, zato je od ene do druge reakcije potrebna posebna pozornost pri ravnanju z epruvetami, da se prepreči kontaminacija.

Pogoji pomnoževanja (po stopnji RT): 2 minuti pri 50 °C, 10 minut pri 95 °C, čemur sledi 40 ciklov po 15 sekund pri 95 °C in 1 minuto pri 60 °C; po potrebi se prilagodi.

Namesto tega se lahko uporabijo druge različice testov RT-PCR ali RT-qPCR z dokazano podobno učinkovitostjo.

II. Natančne diagnostične metode in postopki za potrditev ali izključitev suma na VHS in IHN ali obe bolezni pri sumih izbruhov

Ko se zahteva laboratorijska preiskava za potrditev ali izključitev prisotnosti IHN ali VHS ali obeh bolezni v skladu s členom 57(b) Direktive 2006/88/ES z uporabo diagnostičnih metod iz točke II.3 dela 1 Priloge I, se uporabijo naslednje natančne diagnostične metode in postopki:

(a) konvencionalna izolacija virusa z naknadno seronevtralizacijo, imunokemijskim ali molekularnim določanjem virusa;

(b) dokazovanje virusa z RT-PCR ali RT-qPCR;

(c) drugi diagnostični postopki, kot so IFAT, ELISA, RT-PCR, IHC.

II.1 Konvencionalna izolacija virusa z naknadnim določanjem virusa

II.1.1 Izbira vzorcev

Za preiskavo se izbere vsaj 10 rib, ki kažejo tipične znake IHN ali VHS.

II.1.2 Priprava in pošiljanje vzorcev iz rib

Priprava in pošiljanje za namene konvencionalne izolacije virusa se izvajata v skladu z metodami in postopki iz točke I.2.

II.1.3 Zbiranje dodatnega diagnostičnega materiala

Dodatni material za namene konvencionalne izolacije virusa se zbira v skladu z metodami in postopki iz točke I.3.

II.1.4 Priprava vzorcev za preiskavo celične kulture

Vzorci za preiskavo celične kulture za namene konvencionalne izolacije virusa se pripravijo v skladu z metodami in postopki iz točke I.4.

II.1.5 Virološka preiskava na celični kulturi

Virološka preiskava za namene konvencionalne izolacije virusa se izvaja v skladu z metodami in postopki iz točke I.5.

II.1.6 Določanje virusa

Za namene konvencionalne izolacije virusa se virus določa v skladu z metodami in postopki iz točke I.6.

II.2 Dokazovanje virusa z RT-qPCR

II.2.1 Izbira vzorcev

Vzorci za namene dokazovanja virusa z RT-qPCR se izberejo v skladu z metodami in postopki iz točke I.1.2.

II.2.2 Priprava in pošiljanje vzorcev iz rib

Priprava in pošiljanje za namene dokazovanja virusa z RT-qPCR se izvajata v skladu z metodami in postopki iz točke I.2.

II.2.3 Zbiranje dodatnega diagnostičnega materiala

Dodatni diagnostični material za namene dokazovanja virusa z RT-qPCR se zbira v skladu z metodami in postopki iz točke I.3.

II.2.4 Priprava vzorcev za RT-qPCR

Vzorci za namene dokazovanja virusa z RT-qPCR se pripravijo v skladu z metodami in postopki iz točke I.6.4.1.

II.2.5 RT-qPCR

Dokazovanje virusa z RT-qPCR poteka v skladu z metodami in postopki iz točk I.6.4.1, I.6.4.3 in I.6.4.4.

II.3 Drugi diagnostični postopki

Supernatant, pripravljen v skladu s točko I.4.3, se lahko testira s postopkom ELISA, indirektnim fluorescenčnim testom za dokazovanje protiteles (IFAT) ali postopkom RT-PCR v skladu s točko I.6.1, I.6.2 oz. I.6.4. Tkivni material se lahko pregleda z drugimi diagnostičnimi postopki, kot sta IFAT na zamrznjenih rezinah in imunohistokemija na tkivnem materialu, fiksiranem v formalinu. Navedeni hitri postopki se v 48 urah po vzorčenju dopolnijo z virološko preiskavo v skladu s točko II(a) ali točko II(b), če:

(a) je rezultat negativen ali

(b) je pozitivni rezultat pridobljen z materialom, ki predstavlja prvi primer IHN ali VHS.

III. Postopek titracije za preverjanje dovzetnosti celičnih kultur za okužbo

Pri titraciji za preverjanje dovzetnosti celičnih kultur za okužbo, kot je navedeno v točki I.5.3, se uporabijo postopki iz naslednjih odstavkov te točke.

Uporabijo se vsaj dva izolata VHSV in en izolat IHNV. Izolati naj predstavljajo večjo skupino virusov v Evropski uniji, in sicer en izolat patogena šarenke v sladki vodi in en morski izolat patogena romba za VHSV ter en sev patogena šarenke iz Evropske unije za IHNV. Uporabijo se dobro opredeljeni izolati iz držav članic. Šarže virusa, namnoženega na celični liniji z nizkim številom pasaž, se razmnožujejo v stekleničkah s celično kulturo na celicah BF-2 ali RTG-2 za VHSV in na celicah EPC ali FHM za IHNV. Uporabi se gojišče celične kulture z vsaj 10-odstotnim serumom. Pri inokulaciji se uporabi nizka multipliciteta okužbe (MOI) (< 1).

Pri skupnem CPE se virus pridobiva s 15-minutnim centrifugiranjem supernatanta celične kulture pri 2 000 × g, filtersko sterilizira skozi 0,45 μm membranski filter in porazdeli v označene krioepruvete. Virus se hrani pri – 80 °C.

En teden po zamrznitvi se tri fiole z reproducirano vsebino vsakega virusa odmrznejo pod mrzlo vodo in titrirajo na svojih ustreznih celičnih linijah. Vsak izolat virusa se odmrzne in titrira vsaj vsakih šest mesecev ali če obstaja sum, da se je dovzetnost celične linije zmanjšala.

Titracijske postopke je treba podrobno opisati, vsakič pa je treba uporabiti enak postopek.

Titracija s končno razredčitvijo zajema vsaj šest replikacij v vsakem koraku redčenja. Titri se primerjajo s predhodno pridobljenimi titri. Če titer katerega koli od treh izolatov virusa v primerjavi z začetnim titrom pade za faktor log 2 ali več, se celična linija ne uporablja več za namene nadzora.

Če se v laboratoriju hranijo različne celične linije, se vsaka linija pregleda ločeno.

Evidenca se hrani vsaj 10 let.

DEL 2

NATANČNE DIAGNOSTIČNE METODE IN POSTOPKI ZA NADZOR IN POTRDITEV BOLEZNI KHV (KHVD)

I. Natančne diagnostične metode in postopki za potrditev prisotnosti ali izključitev suma na KHVD

Ko se zahteva laboratorijska preiskava za namene potrditve prisotnosti ali za izključitev suma na KHVD v skladu s členom 57(b) Direktive 2006/88/ES z uporabo diagnostičnih metod iz oddelka III dela 2 Priloge I, se uporabijo natančne diagnostične metode in postopki iz točk I.1–I.2 tega dela.

I.1 Priprava vzorcev iz rib

Za diagnostične namene se ribe (poslane žive ali usmrčene in pakirane ločeno v zaprtih aseptičnih posodah) ali alternativno zamrznjeni organi ali kosi organov, konzervirani v 80-odstotnem do absolutnem etanolu ali transportnem gojišču za viruse (ki jih je treba obdelati v 48 urah po zbiranju), lahko uporabijo za testiranje s konvencionalnimi metodami na podlagi PCR ali qPCR.

Za dokazovanje KHV se zberejo škrge in ledvice, poleg tega pa se v dodatnem ločenem vzorcu lahko vključijo tudi vranica, možgani in črevesje. V resnejših primerih se tkivni material največ petih rib lahko združi.

Poleg tega se v nekaterih primerih lahko uporabijo vzorci, pri katerih ne žrtvujemo ribe, kot so kri, bris škrg, biopsija škrg in bris sluzi (v primeru suma prisotnosti KHV se lahko uporabljajo zelo dragocene ribe).

I.1.1 Ekstrakcija DNK

DNK se ekstrahira v skladu s standardnimi postopki.

Lahko se uporabijo komercialno dostopni kompleti za ekstrakcijo DNK, ki zagotavljajo visoko kakovostno DNK, primerno za uporabo s protokoli PCR iz točke I.2.

I.2 Dokazovanje in določanje povzročitelja z metodo na podlagi verižne reakcije s polimerazo (PCR)

I.2.1 Test qPCR za dokazovanje KHV

Za dokazovanje KHV s qPCR se uporabljajo naslednji testi qPCR:

Smiselni začetni oligonukleotid (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;

Protismiselni začetni oligonukleotid (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′

in sonda (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.

Pogoji pomnoževanja: en cikel po 15 minut pri 95 °C, čemur sledi 40 ciklov po 15 sekund pri 94 °C in 60 sekund pri 60 °C. Negativne kontrole reakcijske mešanice in pozitivne kontrole reakcije se vključijo na vsako serijo mikrotitrskih plošč. Lahko se uporabijo druge različice testov qPCR z dokazano podobno učinkovitostjo.

I.2.2 Konvencionalni test PCR za dokazovanje KHV

Test, opisan v tej točki, se ciljno uporabi za gen za timidin kinazo virusa KHV. Vendar se namesto tega lahko uporabijo drugi testi PCR z dokazano podobno občutljivostjo in specifičnostjo kot opisani test.

Smiselni začetni oligonukleotid (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTAC GAG-3′

Protismiselni začetni oligonukleotid (KHV-TKr): 5′-CACCCAGTAGATTA TGC-3′

Pogoji pomnoževanja: en cikel po 5 minut pri 95 °C, čemur sledi 35 ciklov po 30 sekund pri 95 °C, 30 sekund pri 52 °C, eno minuto pri 72 °C in en cikel po 10 minut pri 72 °C. Velikost produkta mora biti 409 bp.

Rezultati PCR se lahko razlikujejo glede na pogoje, pod katerimi se ta test izvaja, in sicer je morda potrebna optimizacija temperaturnih pogojev reakcije pomnoževanja, odvisno od cikličnega termostata v uporabi. Poleg tega lahko pride do lažno pozitivnih rezultatov zaradi lažnega prileganja začetnega oligonukleotida ali kontaminacije. Negativne kontrole reakcijske mešanice in pozitivne kontrole reakcije se vključijo na vsako serijo mikrotitrskih plošč. Lahko se uporabijo druge različice testa PCR z dokazano podobno učinkovitostjo.

Prvo dokazovanje na območju se potrdi s sekvenciranjem ali pošlje nacionalnemu referenčnemu laboratoriju ali referenčnemu laboratoriju EU za bolezni rib iz Priloge VI k Direktivi 2006/88/ES za takojšnjo določitev.

II. Natančne diagnostične metode in postopki za nadzor KHVD

Pri vzorčenju in laboratorijskih preiskavah za pridobitev ali ohranitev nekaterih zdravstvenih statusov glede KHVD, kot je določeno v oddelku I dela 2 Priloge I, z uporabo diagnostičnih metod iz oddelkov II ali III dela 2 navedene priloge se uporabljajo natančne diagnostične metode in postopki iz naslednjih točk II.1 in II.2. tega dela.

II.1 Priprava vzorcev iz rib

Če je to mogoče, se vzorčijo ribe, ki so bile dlje časa izpostavljene temperaturam, ki omogočajo razvoj virusa, in sicer dva do tri tedne pri 15 °C do 26 °C. Če je to možno, se vzorci zberejo 24 ur, vendar ne več kot 72 ur po ravnanju z njimi, na primer po lovljenju z mrežo ali transportu, ki lahko ponovno aktivirajo virus v ribah s statusom nosilca, tako da se poveča možnost dokaza KHV.

Za namene nadzora KHVD se ribe lahko pošljejo žive ali usmrčene in pakirane ločeno v zaprtih aseptičnih posodah, alternativno pa se za testiranje z metodami na podlagi PCR lahko uporabijo zamrznjeni organi ali kosi organov, konzervirani v 80- do 100-odstotnem alkoholu ali transportnem gojišču virusov (ki jih je treba obdelati v 48 urah po zbiranju). Za nadzor KHVD se lahko zberejo tkiva škrg in ledvic.

Za namene nadzora KHVD se je treba izogibati združevanju vzorcev, kadar je mogoče. Če je združevanje potrebno, se lahko združi tkivni material največ dveh rib. Večji vzorci se homogenizirajo s pestilom v terilnici ali stomaherjem, podvzorci pa se pridobijo za ekstrakcijo DNK pred zbistritvijo. Namesto tega se podvzorci lahko zberejo iz vsakega tkiva, vključenega v vzorec, in dajo v „epruvete za razgradnjo“.

II.1.1 Ekstrakcija DNK

DNK se ekstrahira v skladu s standardnimi postopki. Lahko se uporabijo komercialno dostopni kompleti za ekstrakcijo DNK, ki zagotavljajo visoko kakovostno DNK, primerno za uporabo s protokoli PCR iz točke II.2.

Sprejemljivo razmerje med tkivom in gojiščem je 1:9 w/v. V teste se vključi 20 mg– 25 mg tkivnega materiala.

II.2 Nadzor KHVD z metodami na podlagi PCR

Za nadzor KHV se uporablja qPCR. Če se na območju, ki predhodno ni bilo potrjeno kot pozitivno, pojavijo pozitivni vzorci, se rezultati testa potrdijo bodisi:

(a) s sekvenciranjem produkta PCR ali produkta ugnezdene PCR iz vzorcev. Pridobljena sekvenca s čistim konsenzusom se ujema s temi referenčnimi sekvencami (vsaj 98 %);

(b) bodisi se vzorci pošljejo v nacionalni referenčni laboratorij za potrditev.

II.2.1 Test qPCR za dokazovanje KHV

Uporablja se test qPCR, opisan v nadaljevanju:

smiselni začetni oligonukleotid (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;

protismiselni začetni oligonukleotid (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′

in sonda (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.

Pogoji pomnoževanja: en cikel po 15 minut pri 95 °C, čemur sledi 50 ciklov po 15 sekund pri 94 °C in 60 sekund pri 60 °C.

Rezultati qPCR se lahko razlikujejo glede na pogoje, pod katerimi se ta test izvaja, in sicer je morda potrebna optimizacija temperaturnih pogojev reakcije pomnoževanja, odvisno od cikličnega termostata v uporabi. Poleg tega lahko pride do lažno pozitivnih rezultatov zaradi lažnega prileganja začetnega oligonukleotida ali laboratorijske kontaminacije. Negativne kontrole reakcijske mešanice in pozitivne kontrole reakcije se vključijo na vsako serijo mikrotitrskih plošč. Lahko se uporabijo druge različice testov qPCR z dokazano podobno učinkovitostjo.

II.2.2 Konvencionalni test PCR za potrditev dokazovanja KHV

Za potrditev prisotnosti okužbe s KHV se uporabi generična ugnezdena PCR, opisana v spodnji tabeli 2.1, ki ji sledi sekvenciranje amplificiranega pridelka.

Tabela 2.1

Začetni oligonukleotidi in pogoji za ugnezdeno PCR za testiranje vseh herpes virusov ciprinidov (CyHV-1, CyHV-2 in CyHV-3)

Ime začetnega oligonukleotida Sekvenca Pogoji pomnoževanja Velikost produkta CyHVpol-forward 5′-CCAGCAACATGTGCGACGG-3′ Prvi krog PCR 1 cikel: 2 minuti pri 95 °C 40 ciklov: 30 sekund pri 95 °C 30 sekund pri 55 °C 45 sekund pri 72 °C 1 cikel: 10 minut pri 72 °C 362 bp CyHVpol-reverse 5′-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3′ CyHVpol-internal forward 5′-CGACGGVGGYATCAGCCC-3′ Drugi krog PCR 1 cikel: 2 minuti pri 95 °C 40 ciklov: 30 sekund pri 95 °C 30 sekund pri 55 °C 45 sekund pri 72 °C 1 cikel: 10 minut pri 72 °C 339 bp CyHVpol-internal reverse 5′-GAGTTGGCGCAYACYTTCATC-3′

Rezultati PCR se lahko razlikujejo glede na pogoje, pod katerimi se ta test izvaja, in sicer je morda potrebna optimizacija temperaturnih pogojev reakcije pomnoževanja, odvisno od cikličnega termostata v uporabi. Poleg tega lahko pride do lažno pozitivnih rezultatov zaradi lažnega prileganja začetnega oligonukleotida ali laboratorijske kontaminacije. Negativne kontrole reakcijske mešanice in pozitivne kontrole reakcije se vključijo na vsako serijo mikrotitrskih plošč. Namesto tega se lahko uporabijo druge različice testa PCR z dokazano podobno učinkovitostjo.

Sekvenciranje se lahko izvede v laboratoriju ali zunanjem specializiranem podjetju za sekvenciranje. Rezultati sekvenciranja se analizirajo s primerjavo sekvenc z znanimi referenčnimi sekvencami KHV (identifikacijska koda GenBank AP008984, DQ657948 in DQ177346). Pridobljena sekvenca s čistim konsenzusom se mora ujemati z navedenimi referenčnimi sekvencami (vsaj 98 %).

DEL 3

NATANČNE DIAGNOSTIČNE METODE IN POSTOPKI ZA NADZOR IN POTRDITEV INFEKCIOZNE ANEMIJE LOSOSOV (ISA)

I. Postopki vzorčenja za nadzor in kontrolo ISA

Pri vzorčenju in laboratorijski preiskavi za namene programov nadzora ali izkoreninjenja iz dela 3 Priloge I ali za potrditev ali izključitev prisotnosti ISA v skladu s členom 57(b) Direktive 2006/88/ES se uporabljajo natančne metode in postopki iz točk I.1, I.2 in I.3 tega oddelka.

I.1 Priprava vzorcev iz rib

Za namene laboratorijskih preiskav na prisotnost ISA se vzorci rib ne združujejo, kadar je to mogoče. Vendar je za namene nadzora za ISA sprejemljiva združitev 2 do 5 rib.

Vzorci za verižno reakcijo s polimerazo z reverzno transkripcijo (RT-PCR) se odvzamejo iz vseh vzorčenih rib. S sterilnim instrumentom se odvzame košček tkiva iz praledvic in prenese v mikrocentrifugirko, ki vsebuje 1 ml raztopine za ohranjanje RNK z dokazano učinkovitostjo. Tkivo največ 5 rib se lahko zbere v eno epruveto, ki vsebuje transportno raztopino, to pa predstavlja en združen vzorec. Teža tkiva v enem vzorcu je 0,5 g. Ko so ribe premajhne za pridobitev vzorca zahtevane teže, se lahko odvzamejo koščki ledvic, srca, vranice, jeter ali piloričnih cekumov (v tem prednostnem vrstnem redu), da dobimo 0,5 g.

Tkivo za histološko preiskavo odvzamemo le iz sveže usmrčenih rib z normalnim videzom, ki kažejo klinične znake bolezni ali za katere so ugotovitve post mortem pregledov v skladu s prisotnostjo ISA. Vzorčijo se vse zunanje ali notranje lezije, v vsakem primeru pa se iz posameznih rib s skalpelom odstranijo vzorci praledvic, srca, jeter, trebušne slinavke, drobovja, škrg in vranice ter prenesejo v 8- do 10-odstotno (vol:vol) pufrano formalin slanico. Razmerje med fiksirno raztopino in tkivom je vsaj 20: 1 za zagotovitev zadovoljive ohranitve tkiv. Za imunohistokemijo (IHC) se odvzamejo vzorci praledvic in srca.

Tkiva za virološko preiskavo na celični kulturi se odvzamejo iz vseh vzorčenih rib. Koščki jeter, predledvic ali praledvic, srca in vranice se odstranijo s sterilnim instrumentom in prenesejo v plastične epruvete, ki vsebujejo 9 ml transportnega gojišča. Tkivo največ petih rib se lahko zbere v eno epruveto, ki vsebuje transportno raztopino, to pa predstavlja en združen vzorec. Teža tkiva v enem vzorcu je 1,0 g ± 0,5 g.

I.2 Pošiljanje vzorcev iz rib

Cele ribe se lahko transportirajo v laboratorij, če so med transportom izpolnjene zahteve glede temperature, kot je opisano v odstavku 3 te točke. Cele ribe se zavijejo v vpojni papir in pošljejo v plastičnih vrečkah, in sicer ohlajene, kot je opisano v navedenem odstavku.

Lahko se pošljejo tudi žive ribe, vendar le pod nadzorom nacionalnega referenčnega laboratorija za bolezni rib in ob upoštevanju dodatnega razkuževanja in vprašanj biološke zaščite pri transportu živih rib.

Vzorci krvi in epruvete, ki vsebujejo ribja tkiva za virološko preiskavo ali analizo RT-PCR, se dajo v izolirne posode, na primer polistirenske škatle z debelimi stenami, z dovolj ledu ali z zamrzovalnimi elementi za zagotovitev hlajenja vzorcev med transportom v laboratorij. Prepreči se zamrzovanje, pri sprejemu pošiljke pa mora v transportnem škatli še vedno ostati led oz. en ali več zamrzovalnih elementov mora biti še vedno delno ali popolnoma zamrznjen. V izjemnih okoliščinah se lahko vzorci za RT-PCR in vzorci za virološke preiskave zamrznejo in transportirajo v laboratorij pri – 20 °C ali manj.

Za analizo tkiv z RT-PCR, ohranjenih v ribonukleinski kislini (RNA)later, se RNK ekstrahira v naslednjih časovnih okvirih, odvisno od temperature shranjevanja vzorcev:

vzorci, shranjeni pri 37 °C: en dan;

vzorci, shranjeni pri 25 °C: en teden;

vzorci, shranjeni pri 4 °C: en mesec;

vzorci, shranjeni pri – 20 °C: neomejeno.

Če se ribja tkiva transportirajo v fiksirni raztopini za histološko preiskavo, se pošljejo v zatesnjenih epruvetah v posodah, odpornih na udarce. Prepreči se zamrznitev navedenih vzorcev.

Virološka preiskava na celični kulturi se začne čim prej, najpozneje pa v 48 urah po zbiranju vzorcev. V izjemnih primerih se virološka preiskava lahko začne najpozneje v 72 urah po zbiranju materiala, če je material, ki naj bi se pregledal, zaščiten s transportnim gojiščem in je mogoče med transportom izpolniti zahteve glede temperature.

I.3 Zbiranje dodatnega diagnostičnega materiala

Na podlagi odobritve diagnostičnega laboratorija se lahko zberejo druga ribja tkiva kot tkiva iz točke I.1 in pripravijo za dodatno preiskavo.

II. Natančne diagnostične metode in postopki za nadzor in potrditev prisotnosti ali izključitev suma na ISA

Pri laboratorijskih preiskavah za namene pridobitve ali ohranitve določenega zdravstvenega statusa glede ISA, kot je določeno v oddelku I dela 3 Priloge I, ali za namene potrditve prisotnosti ali izključitve suma na ISA v skladu s členom 57(b) Direktive 2006/88/ES z diagnostičnimi metodami iz oddelka II dela 3 Priloge I se uporabljajo natančne metode in postopki iz naslednjih točk od II.1 do II.5.

II.1 Pregled vzorcev z RT-PCR

Diagnostična metoda, ki se uporablja za presejalni test za ISAV je RT-qPCR. Rezultati RT-qPCR se lahko razlikujejo glede na pogoje, pod katerimi se test izvaja, zato se v izogib dvomom vključijo ustrezne pozitivne in negativne kontrole ter amplikoni.

II.1.1 Ekstrakcija celotne RNK

Vse delo z RNK se opravlja na ledu z uporabo rokavic.

Celotna RNK se ekstrahira z metodo s fenol-kloroformom ali centrifugalnimi kolonami za afiniteto do RNK v skladu z navodili proizvajalca.

Prečiščena RNK se ponovno suspendira v destilirani RNaz prosti vodi (tj. v vodi, tretirani z 0,1-odstotnim dietil pirokarbonatom).

Koncentracija in čistost ekstrahirane RNK se oceni z merjenjem optične gostote pri 260 nm in 280 nm. Alternativni pristop je vključitev notranjih kontrol, ki so ciljno usmerjene v virusni genom iz točke II.1.3.

II.1.2 RT-PCR za dokazovanje ISAV

Za amplifikacijo genoma ISAV se lahko uporablja več metod RT-PCR. Dvostopenjska RT-PCR se lahko izvede z reakcijama RT in PCR v dveh ločenih epruvetah. Lahko pa se izvede tudi enostopenjska reakcija z dvema reakcijama v eni epruveti. Enostopenjska metoda se uporabi, kadar je to mogoče, ker test z eno epruveto zmanjša tveganje navzkrižne kontaminacije, saj ni potreben prenos vsebine, in ker se šteje za enako občutljivo kot dvostopenjska metoda.

Uporabijo se začetna oligonukleotida in test iz te točke, in sicer par začetnih oligonukleotidov ILA1 ali ILA2, ki sta ciljno usmerjena v segment 8 in ki sta se izkazala za primerna za dokazovanje ISAV pri izbruhih in v ribah nosilkah. Protismiselni začetni oligonukleotid ILA2 ne ustreza izolatom iz Severne Amerike, zato se v teh primerih uporabi alternativni komplet začetnih oligonukleotidov.

Smiselni začetni oligonukleotid (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′;

Protismiselni začetni oligonukleotid (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.

Pogoji pomnoževanja: en cikel po 30 minut pri 50 °C, 1 cikel po 15 minut pri 94 °C, 40 ciklov po 30 sekund pri 94 °C, 30 sekund pri 55 °C, 60 sekund pri 72 °C; en cikel po 5 minut pri 72 °C. Velikost produkta je 155 bp.

Rezultati PCR se lahko razlikujejo glede na pogoje, pod katerimi se ta test izvaja, in sicer je morda potrebna optimizacija temperaturnih pogojev reakcije pomnoževanja, odvisno od cikličnega termostata v uporabi. Poleg tega lahko pride do lažno pozitivnih rezultatov zaradi lažnega prileganja začetnega oligonukleotida ali laboratorijske kontaminacije. Negativne kontrole reakcijske mešanice in pozitivne kontrole reakcije se vključijo na vsako serijo mikrotitrskih plošč. Namesto tega se lahko uporabijo druge različice testa RT-PCR z dokazano podobno učinkovitostjo.

II.1.3 RT-qPCR za dokazovanje ISAV

Uporaba RT-qPCR morda lahko poveča specifičnost in verjetno tudi občutljivost. Ta metoda se lahko izvede hitreje, ker ni potrebna gelska elektroforeza, zmanjšuje pa tveganje navzkrižne kontaminacije, saj je možno oceniti količino virusne genomske RNK v epruveti z vzorcem. Pomanjkljivost testa RT-qPCR je, da pogosto ni mogoče sekvencirati amplificiranih pridelkov. Če pa obstaja dvom o specifičnosti amplificiranega pridelka, je treba za potrditev rezultata izvesti drug specifičen test za ISAV.

Uporabi se test, ki je opisan v tej točki in je ciljno usmerjen v segment 8. Ta test zajema izolate iz Evropske unije, Evropskega združenja za prosto trgovino in Severne Amerike. Enostopenjska metoda se uporabi, kadar je to mogoče, ker test z eno epruveto zmanjša tveganje navzkrižne kontaminacije.

Smiselni začetni oligonukleotid: 5′- CTACACAGCAGGATGCAGATGT -3′;

Protismiselni začetni oligonukleotid: 5′- CAGGATGCCGGAAGTCGAT -3′;

in sonda: 5′-FAM- CATCGTCGCTGCAGTTC – MGBNFQ-3′.

Negativne kontrole reakcijske mešanice in pozitivne kontrole reakcije se vključijo na vsako serijo mikroti