Direktiva Komisije 92/95/EGS

z dne 9. novembra 1992

o spremembi Priloge k Sedmi direktivi 76/372/EGS o določitvi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme

KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE

ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske gospodarske skupnosti,

ob upoštevanju Direktive Sveta 70/373/EGS z dne 20. julija 1970 o uvedbi metod vzorčenja in analiz Skupnosti za uradni nadzor krme [1], kakor je bila nazadnje spremenjena z Aktom o pristopu Španije in Portugalske in zlasti člena 2 Direktive,

ker Sedma direktiva Komisije 76/372/EGS z dne 1. marca 1976 o uvedbi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme [2], kakor je spremenjena z Direktivo 81/680/EGS [3], določa metode, ki naj se uporabljajo za določanje aflatoksina B1;

ker je treba te metode prilagoditi novim znanstvenim in tehničnim dosežkom; ker je zlasti priporočljivo, da je na voljo metoda za nadzor zelo nizkih mejnih vrednosti aflatoksina, določena z Direktivo Sveta 74/63/EGS z dne 17. decembra 1973 o določanju največjih mejnih vrednosti neželenih snovi in proizvodov v prehrani živali [4], kakor je nazadnje spremenjena z Direktivo 91/132/EGS [5];

ker je tudi priporočljivo, da je na voljo metoda za določanje aflatoksina B1 v navzočnosti motečih snovi, kot je citrusova pulpa;

ker so ukrepi iz te direktive v skladu z mnenjem Stalnega odbora za krmo,

SPREJELA NASLEDNJO DIREKTIVO:

Člen 1

Priloga k Direktivi 76/372/EGS se spremeni v skladu s Prilogo k tej direktivi.

Člen 2

Države članice najpozneje do 1. oktobra 1993 sprejmejo zakone in druge predpise, potrebne za uskladitev z določbami te direktive. O tem takoj obvestijo Komisijo.

Države članice se v sprejetih predpisih sklicujejo na to direktivo ali pa sklic nanjo navedejo ob njihovi uradni objavi. Način sklicevanja določijo države članice.

Člen 3

Ta direktiva je naslovljena na države članice.

V Bruslju, 9. novembra 1992

Za Komisijo

Ray Mac Sharry

Član Komisije

[1] UL L 170, 3.8.1970, str. 2.

[2] UL L 102, 15.4.1976, str. 8

[3] UL L 246, 29.8.1981, str. 32.

[4] UL L 38, 11.2.1974, str. 31.

[5] UL L 66, 13.3.1991, str. 16.

--------------------------------------------------

PRILOGA

I. V delu A "Enodimenzionalna tankoplastna kromatografska metoda" se besedilo v točki 1 "Namen in področje uporabe" nadomesti z naslednjim besedilom:

"1. Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje vsebnosti aflatoksina B1 v surovinah in posamičnih krmilih. Ta metoda se ne uporablja kadar je v krmi prisotna citrusova pulpa. Spodnja meja določevanja je 0,01 mg/kg (10 ppb).

Ob prisotnosti motečih snovi je treba ponoviti analizo z uporabo metode B (tekočinska kromatografija visoke ločljivosti)."

II. V delu B "Dvodimenzionalna tankoplastna kromatografska metoda" se besedilo nadomesti z naslednjim:

"B. DOLOČANJE AFLATOKSINA B1 Z METODO TEKOČINSKE KROMATOGRAFIJE VISOKE LOČLJIVOSTI

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje aflatoksina B1 v krmi, vključno s krmo, ki vsebuje citrusovo pulpo. Spodnja meja določevanja je 0,001 mg/kg (1 ppb).

2. Princip

Vzorec ekstrahiramo s kloroformom. Ekstrakt prefiltriramo in alikvotne dele prečistimo v Florisil kartuši in nato v kartuši C18. Končno ločevanje in določanje poteka po postopku tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC) z uporabo kolone C18 z reverzno fazo, čemur sledi postkolonska derivatizacija z jodom in vodo, ter določanje fluorescence.

Opomba:

Mikotoksini so izredno toksične snovi. Ravnanje z njimi se mora opravljati v digestoriju. Kadar so toksini v suhi obliki se morajo sprejeti posebni varstveni ukrepi zaradi njihove elektrostatične narave in tendence, da se razpršijo po delovni površini.

3. Reagenti

3.1 Kloroform, stabiliziran z 0,5 do 1,0 % etanola, glede na maso. Glej točko 10.2.

3.2 Metanol, primeren za metodo HPLC za pripravo 3.6.

3.3 Aceton.

3.4 Acetonitril, primeren za metodo HPLC.

3.5 Topila za razvijanje: Pripravimo jih en dan pred uporabo ali pa zrak v topilih odstranimo ultrazvočno.

3.5.1 Mešanica acetona (3.3) in vode, 98 + 2 (v + v).

3.5.2 Mešanica vode in metanola (3.2), 80 + 20 (v + v).

3.5.3 Mešanica vode in acetona (3.3), 85 + 15 (v + v).

3.6 Mobilna faza za HPLC.

Mešanica vode, metanola (3.2) in acetonitrila (3.4), 130 + 70 + 40 (v + v + v).

Opomba:

Sestavo topila mobilne faze je treba prilagoditi glede na značilnosti uporabljene kolone HPLC.

3.7 Nasičena jodova raztopina: 400 ml vode dodamo 2 g joda. Mešamo vsaj 90 minut in filtriramo skozi membranski filter (4.15). Nasičeno raztopino zavarujemo pred svetlobo, da preprečimo fotokemijsko razgradnjo.

3.8 Celit 545, izpran v kislini, ali enakovreden.

3.9 Florisil kartuša (Waters SEP-PAK) ali enakovredna.

3.10 Kartuša C18 (Waters SEP-PAK) ali enakovredna.

3.11 Inertni plin, npr. dušik.

3.12 Standardna raztopina aflatoksina B1 v kloroformu, koncentracije 10 μg/ml. Koncentracijo raztopine preverimo na naslednji način: določimo absorpcijski spekter raztopine med 330 in 370 nm s pomočjo spektrofotometra (4.23). Izmerimo absorbanco (A) pri največji vrednosti blizu 363 nm. Izračunamo koncentracijo aflatoksina B1 v mikrogramih na mililiter raztopine po enačbi:

Koncentracija (μg/ml) =

= 13,991 × A

3.12.1 Osnovna standardna raztopina aflatoksina B1 v kloroformu.

Prenesemo 2,5 ml standardne raztopine aflatoksina B1 (3.12) v 50-ml merilno bučko in dopolnimo s kloroformom do oznake (3.1). Dobro zaprto raztopino, zavito v aluminijasto folijo, shranimo na hladno (4 °C) v temnem prostoru.

3.13 Raztopine aflatoksina B1 za umeritev po metodi HPCL.

Opomba:

Za pripravo teh raztopin uporabimo stekleno posodo, izprano v kislini (glej 4, Oprema).

3.13.1 Raztopina za umeritev 4ng/ml.

Merilno bučko z osnovno standardno raztopino (3.12.1) segrevamo na sobno temperaturo v aluminijasti foliji (nekaj ur). Prenesemo 400 μl osnovne standardne raztopine (200 ng aflatoksina B1) v 50-ml merilno bučko in raztopino odparimo do suhega pod tokom inertnega plina (3.11).

Dobljen ostanek raztopimo v približno 20-ml mešanice vode/acetona (3.5.3), dopolnimo do oznake z mešanico vode/acetona in dobro premešamo.

3.13.2 Raztopina za umeritev 3 ng/ml.

Kvantitativno prenesemo 7,5 ml raztopine za umeritev (3.13.1) v 10-ml merilno bučko, dopolnimo do oznake z mešanico vode/acetona (3.5.3) in dobro premešamo.

3.13.3 Raztopina za umeritev 2 ng/ml.

Kvantitativno prenesemo 25 ml raztopine za umeritev (3.13.1) v 50-ml merilno bučko, dopolnimo do oznake z mešanico vode/acetona (3.5.3) in dobro premešamo.

Ta raztopina se imenuje tudi referenčni standard, ki se uporablja za ponovno vbrizganje med HPLC (5.5).

3.13.4 Raztopina za umeritev 1 ng/ml.

Kvantitativno prenesemo 2,5 ml raztopine za umeritev (3.13.1) v 10-ml merilno bučko, dopolnimo do oznake z mešanico vode/acetona (3.5.3) in dobro premešamo.

3.14 Ampula, ki vsebuje mešanice aflatoksinov B1, B2, G1 in G2, s koncentracijami približno 1, 0,5, 1 in 0,5 μg/ml v 1 ml kloroforma.

3.14.1 Kromatografska preskusna raztopina.

Vsebino ampule (3.14) prenesemo v epruveto s steklenim zamaškom ali fiolo z navojem. Prenesemo 40 μl te raztopine v epruveto s steklenim zamaškom (izprano v kislini) (4.22). Kloroform odparimo pod tokom inertnega plina (3.11) in ponovno raztopimo v 10 ml mešanice vode/acetona (3.5.3).

3.15 Reagenti za potrditveni preskus (6).

3.15.1 Nasičena raztopina natrijevega klorida.

3.15.2 Natrijev sulfat, brezvoden, v zrnu.

4. Oprema

Opozorilo: Uporaba steklene posode, ki ni izprana v kislini, za vodne raztopine aflatoksina lahko povzroči izgube. Posebno pazljivo je treba ravnati z novo stekleno posodo in stekleno posodo za enkratno uporabo, kot so fiole za samovzorčenje in pasteurjeve pipete. Laboratorijsko stekleno posodo, ki pride v stik z vodno raztopino aflatoksinov, je treba namočiti v razredčeno kislino (npr. žveplena kislina = 2 mol/1) več ur, nato pa izprati z destilirano vodo, da odstranimo sledove kisline (npr. trikrat, preverimo s pH indikatorjem). V praksi je to potrebno narediti za bučko z ovalnim dnom (4.4), merilne bučke, merilne valje, fiole ali epruvete, ki se uporabljajo za raztopine za umeritev in končne ekstrakte (zlasti fiole za samovzorčenje) in pasteurjeve pipete, če se te uporabljajo za prenos raztopin za umeritev ali ekstrakte.

4.1 Naprava za mešanje in mletje.

4.2 Velikost odprtine sita 1,0 mm, (ISO R 565).

4.3 Mehanski stresalnik.

4.4 Rotacijski vakumski izparilnik s 150 do 250-ml bučko z ovalnim dnom.

4.5 Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti, injektor z zanko primeren za vbrizganje 250 ml. Glej navodila proizvajalca za delno ali popolno polnjenje zanke.

4.6 Analitska kolona HPLC: pakiranje 3 μm ali 5 μm C18.

4.7 Nepulzirajoča črpalka za dodajanje jodovega postkolonskega reagenta.

4.8 Valco zero dead volume Tee, nerjavno jeklo (1/16” x 0,75 mm).

4.9 Reakcijska spirala; Teflon ali nerjavno jeklo. Dimenzije 3000 x 0,5 mm do 5000 x 0,5 mm so bile ugotovljene kot ustrezne v kombinaciji s 5-μm ali 3-μm HPLC kolonami.

4.10 Termostatično vzdrževana vodna kopel, nastavljena na 60 °C, pri čemer se lahko temperatura regulira za vsaj 0,1 °C.

4.11 Detektor fluorescence z valovnima dolžinama vzbujanja pri 365 nm in emisije pri 435 nm. (Za filtrirni instrument: valovna dolžina emisije > 400 nm). Ki omogoča detekcijo vsaj 0,05 ng aflatoksina B1. Protipritisk je priporočljiv (npr. restriktor, spirala iz teflona ali nerjavnega jekla, povezana z izhodom iz detektorja), da bi s tem preprečili zračne mehurčke v pretočni celici.

4.12 Tračni zapisovalnik.

4.13 Elektronski integrator (neobvezen).

4.14 Naguban filtrirni papir s premerom: 24 cm, Macherey-Nagel 617 1/4 ali enakovreden.

4.15 Membranski filter z velikostjo por 0,45 μm, Millipore HAWP 04700 ali enakovreden.

4.16 500-ml erlenmajerica s steklenim zamaškom.

4.17 Steklena kolona (notranji premer približno 1 cm, dolžina približno 30 cm), opremljena s konico Luer.

4.18 Luer petelinček, odporen na kloroform (npr. Bio-rad 7328017, Analytichem Al 6078, J.T. Baker 4514 ali enakovreden).

4.19 Brizga, odporna na kemikalije, 10-ml konektor Luer.

4.20 Brizga za HPLC vbrizgavanje 250 μl (glej 4.5).

4.21 100-μl mikro brizga za pripravo raztopin za umeritev (s tehtanjem preverimo, ali je točnost v okviru 2 %).

4.22 10-ml steklenička z zamaškom, kalibrirana.

4.23 Spektrofotometer, primeren za meritve v UV območju spektra.

4.24 Oprema za potrditveni preskus (6).

4.24.1 100-ml lij ločnik, izpran v kislini, s teflonskim petelinčkom.

4.24.2 Grelni blok, 40 to 50 °C.

5. Postopek

5.1 Priprava vzorca.

Vzorec zdrobimo tako, da v celoti preide skozi sito (4.2).

5.2 Preskusni vzorec.

Natehtamo 50 g pripravljenega preskusnega vzorca v erlenmajerico (4.16).

5.3 Ekstrakcija

Preskusnemu vzorcu dodamo 25 g Celita (3.8), 250 ml kloroforma (3.1) in 25 ml vode (5.2). Erlenmajerico zamašimo in stresamo 30 minut z mehanskim stresalnikom (4.3). Filtriramo skozi naguban filter (4.14). Zberemo 50 ml filtrata. Če je potrebno, vzamemo alikvot filtrata in razredčimo do 50 ml s kloroformom, tako da koncentracija aflatoksina B1 ni večja od 4 ng/ml.

5.4 Čiščenje (postopek je treba izvesti brez večjih prekinitev).

Opozorilo:

- Laboratorij, v katerem opravljamo analize, ustrezno zavarujemo pred dnevno svetlobo. To lahko učinkovito opravimo tako, da uporabimo:

(i) folijo, ki absorbira UV, na oknih v kombinaciji z zasenčeno svetlobo (ni neposredne sončne svetlobe);

(ii) zavese ali žaluzije v kombinaciji z umetno svetlobo (sprejemljive so fluorescenčne cevi);

- Raztopine, ki vsebujejo aflatoksin, moramo čim bolj zaščititi pred svetlobo (hranimo jih na temnem, uporabimo aluminijasto folijo).

5.4.1 Čiščenje s Florisil SEP-PAK

5.4.1.1 Priprava sestava kolona-kartuša

Petelinček (4.18) pritrdimo na krajši del kartuše Florisil (3.9) (Glej sliko 1). Kartušo izperemo in odstranimo zrak tako, da vzamemo 10 ml kloroforma (3.1) in hitro pretočimo 8 ml kloroforma prek petelinčka skozi kartušo z uporabo brizge (4.19). Daljši del kartuše pritrdimo na stekleno kolono (4.17) in pretočimo preostala 2 ml kloroforma skozi kartušo v kolono. Petelinček zapremo. Brizgo odstranimo.

5.4.1.2 Čiščenje

V sestav kolona-kartuša dodamo filtrat iz 5.3 in pustimo, da odteče s pomočjo težnosti. Izperemo s 5 ml kloroforma (3.1) in nato z 20 ml metanola (3.2). Eluate zavržemo. Med temi postopki zagotovimo, da se sestav kolona-kartuša ne osuši.

Eluiramo aflatoksin B1 s 40 ml mešanice aceton/voda (3.5.1) in v bučko z ovalnim dnom rotacijskega uparjalnika zberemo ves eluat (4.4). Eluat koncentriramo na rotacijskem uparjalniku pri 40 °C do 50 °C, dokler se aceton ne destilira več. (Opomba: približno 0,5 ml tekočine ostane v bučki. Preskusi so pokazali, da nadaljnje uparjanje ni škodljivo in kadar ostane 0,5 ml tekočine, ni več znatne vsebnosti acetona. Ostanki acetona bi lahko povzročili izgube aflatoksina B1 na kartuši C18). Dodamo 1 ml metanola (3.2), bučko stresemo, da raztopimo aflatoksin B1 na straneh bučke, dodamo 4 ml vode in premešamo. Kartušo odstranimo in zavržemo. Stekleno kolono izperemo z vodo in pripravimo za čiščenje na C18.

5.4.2 Čiščenje C18 SEP-PAK.

5.4.2.1 Priprava sestava kolona-kartuša.

Petelinček pritrdimo (4.18) na krajši del kartuše C18 (3.10) (glej sliko 1). Nastavimo kartušo in odstranimo zrak, tako da hitro pretočimo 10 ml metanola (3.2) prek petelinčka z uporabo brizge (4.19). (Zračni mehurčki v kartuši so vidni kot svetle pike na sicer sivkastem ozadju). Vzamemo 10 ml vode in pretočimo 8 ml skozi kartušo (pri prehodu z metanola na vodo pazimo, da zrak ne pride v kartušo). Daljši del kartuše pritrdimo na stekleno kolono (4.17) in pretočimo preostala 2 ml vode skozi kartušo v kolono. Petelinček zapremo. Brizgo odstranimo.

5.4.2.2 Čiščenje

Ekstrakt, dobljen v 5.4.1.2, kvantitativno prenesemo v stekleno kolono (4.17), pri čemer bučko dvakrat speremo z mešanico 5 ml vode/metanola (3.5.2), pri čemer mešanica odteče s pomočjo težnosti. Med temi postopki zagotovimo, da se sestav kolona-kartuša ne osuši. (Kadar se naredijo zračni mehurčki v zoženem delu blizu kartuše, ustavimo pretok in potolčemo po vrhu steklene kolone, da odstranimo zračne mehurčke. Nato nadaljujemo). Eluiramo s 25 ml mešanice vode/metanola. Eluat zavržemo. Aflatoksin B1 eluiramo s 50 ml mešanice vode/acetona (3.5.3), in v 50-ml merilno bučko zberemo ves eluat. Z vodo dopolnimo do oznake in premešamo: nastalo preskusno raztopino uporabimo za kromatografijo (5.5).

Opozorilo:

Filtracija končnega ekstrakta pred HPLC običajno ni potrebna. Če štejemo za potrebno, ne smemo uporabiti celuloznega filtra, ker lahko povzroči izgubo aflatoksina B1. Sprejemljivi so teflonski filtri.

5.5 Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti

(Za nastavitev opreme glej sliko 2). Potrebno je dovolj časa za pripravo in stabilizacijo instrumentov.

Opomba 1:

Stopnje pretoka za mobilno fazo in za postkolonski reagent so le okvirne. Po možnosti jih prilagodimo glede na značilnosti kolone HPLC.

Opomba 2:

Odziv detektorja na aflatoksin B1 je odvisen od temperature, zato je potrebna kompenzacija odklona (glej sliko 3). Z vbrizganjem določene količine referenčnega standarda aflatoksina B1 (3.13.3) v rednih časovnih razmikih (tj. vsako tretje vbrizganje), lahko korigiramo vrednosti vrha aflatoksina B1 med temi referenčnimi standardi tako, da uporabimo povprečni odziv, če je razlika med odzivi zaporednih referenčnih standardov zelo majhna (< 10 %). Zato je treba opraviti vbrizganje brez prekinitev. Če je potrebna prekinitev, mora biti prvo vbrizganje pred prekinitvijo in prvo vbrizganje po prekinitvi referenčni standard (3.13.3). Ker je umeritvena krivulja linearna in poteka skozi izhodišče, se količine aflatoksina B1 v vzorcih določijo neposredno s sklicevanjem na bližnje standarde.

5.5.1 Nastavitev črpalke HPLC

Črpalko HPLC (4.5) nastavimo na pretok 0,5 ali 0,3 ml/min za 5-μm ali 3-μm kolono HPLC (4.6) z uporabo mobilne faze (3.6).

5.5.2 Nastavitev črpalke za postkolonsko reakcijo

Črpalko nastavimo (4.7) na pretok 0,2 do 0,4 ml/min z jodom nasičene vodne raztopine (3.7). Okvirni napotek: Pretoki približno 0,4 ali 0,2 ml/min so priporočljivi v kombinaciji s pretoki 0,5 oziroma 0,3 ml/min mobilne faze (3.6).

5.5.3 Detektor fluorescence

Detektor fluorescence nastavimo (4.11) na valovno dolžino vzbujanja = 365 nm in emisije = 435 nm (instrument s filtrom: > 400 nm). Atenuator detektorja nastavimo tako, da dosežemo približno 80 % polnega odklona pisala za 1 ng aflatoksina B1.

5.5.4 Injektor

Za vse raztopine vbrizgamo 250 μ1 v skladu z navodili proizvajalca injektorja.

5.5.5 Preverjanje kromatografske separacije

Vbrizgamo kromatografsko preskusno raztopino (3.14.1). Spodnji deli krivulje morajo biti manjši od 5 % vsote zgornjih delov krivulje sosednjih vrhov.

5.5.6 Preverjanje stabilnosti sistema

Pred vsako serijo analiz vbrizgamo referenčni standard (3.13.3), dokler ne dosežemo stabilne površine vrhov (Opomba: Vrhovi aflatoksina B1 med dvema zaporednima vbrizgoma se ne smejo razlikovati za več kot 6 %). Nemudoma nadaljujemo s preverjanjem linearnosti (5.5.7).

5.5.7 Preverjanje linearnosti

Vbrizgamo umeritvene raztopine aflatoksina B1 (3.13.1 do 3.13.4). Pri vsakem tretjem vbrizganju uporabimo referenčni standard (3.13.3) za popravek odklona pri odzivu (Opomba: Odzivi vrhov za ta referenčni standard se ne smejo razlikovati za več kot 10 % v 90 minutah). Popravek odklona je v skladu z enačbo, navedeno v točki 7. Umeritveni graf mora biti linearen in potekati skozi izvor znotraj dvakratne standardne napake ocenjenega Y. Vrednosti se ne smejo razlikovati za več kot 3 % od nazivnih vrednosti. Če so te zahteve izpolnjene, nemudoma nadaljujemo. Če niso izpolnjene, pa težavo ugotovimo in odpravimo, preden nadaljujemo.

5.5.8 Vbrizganje ekstraktov vzorcev

Vbrizgamo očiščene ekstrakte vzorca (5.4.2.2). Po vsakem drugem vbrizganju ekstrakta vzorca ponovimo vbrizganje referenčnega standarda (3.13.3) v skladu z naslednjim nizom: referenčni standard, ekstrakt, ekstrakt, referenčni standard, ekstrakt, ekstrakt, referenčni standard itd.

6. Potrditveni preskus

6.1 Nadaljnja obdelava ekstrakta (5.4.2.2)

Končnemu ekstraktu iz 5.4.2.2. dodamo 5 ml raztopine natrijevega klorida (3.15.1). Ekstrahiramo trikrat z 2 ml kloroforma (3.1) eno minuto v liju ločniku (4.24.1). Kombinirane ekstrakte kloroforma prelijemo čez približno 1 g natrijevega sulfata (3.15.2) v 10-ml epruveto. Uporabimo lahko manjši lij (premer: 4 cm) s koščkom surovega bombaža v vratu lija, ki ga pokriva približno 1 g natrijevega sulfata.

Plast natrijevega sulfata izperemo z nekaj ml kloroforma, ki ga zberemo v isti epruveti. Ekstrakt kloroforma izparimo do suhega v isti epruveti z uporabo grelnega bloka (4.24.2) in ponovno raztopimo v 1 ml kloroforma.

6.2 Priprava derivata in tankoplastna kromatografija:

Glej Prilogo k Direktivi Sveta 76/372/EGS metoda A, točka 5.6.2.

7. Izračun rezultatov

Vsebnost aflatoksina B1(mg/kg) v vzorcu izračunamo s formulo:

vsebnost aflatoksina B1 v

m × V

V

× M ×

VfVc

pri čemer je:

m m =

P

+ P

× 2 r

st

P (vzorec) = površina vrha aflatoksina B1 vzorca

P(st1) = površina vrha aflatoksina B1, ki izhaja iz predhodnega vbrizganja referenčnega standarda (3.13.3)

P(st2) = površina vrha aflatoksina B1, ki izhaja iz naslednjega vbrizganja referenčnega standarda (3.13.3)

r(st) = vbrizgana količina aflatoksina B1 v referenčnem standardu (3.13.3) v ng

Vm = prostornina vbrizganega ekstrakta vzorca v ml

Vext = končna prostornina ekstrakta vzorca v ml, z upoštevanjem opravljene razredčitve (5.3)

M = masa vzorca v g

Vf = prostornina filtrata, prenesenega v kartušo Florisil (5.4.1.2) v ml

Vc = prostornina kloroforma, uporabljenega za ekstrahiranje vzorca v ml

Če upoštevamo postopek v tem protokolu, se formula glasi:

vsebnost aflatoksina B1 v μg/kg = 20 x m.

7.1 Izračun lahko izvedemo tudi z merjenjem vrhov.

8. Ponovljivost:

Glej točko 10.1.

9. Obnovljivost:

Glej točko 10.1

10. Opazovanje

10.1 Natančnost

Rezultati ponovljivosti in obnovljivosti medlaboratorijske študije [1], opravljene na mednarodni ravni za krmne mešanice, so navedeni v Razpredelnici 1. Tu uporabljeni izraz ponovljivost (r) je definiran kot največje razmerje, ki ni signifikantno pri 95 % ravni verjetnosti za primerjavo dveh odčitkov za isti vzorec v istem laboratoriju pod podobnimi pogoji. Izraz obnovljivost (R) je definiran podobno, za primerjavo dveh različnih laboratorijev. V skladu z ISO 3534 — 1977, 2.35 [2] in Odločbo Komisije 89/610/EGS [3] sta r in R navedena v Razpredelnici 1 kot koeficienta variacije.

Razpredelnica 1

Ponovljivost (r) in obnovljivost (R), izraženi kot razmerje in ustrezni koeficienti variacije

(15 laboratorijev)

Raven | r | R | CVr [4] | CVR |

(μg/kg) | | | (%) | (%) |

8 & 14 | 1,4 | 1,7 | 11 | 18 |

"CV 10.2 Stabilizacija kloroforma (3.1)

Adsorpcijske značilnosti kartuše se lahko spremenijo, če se uporabijo drugi stabilizatorji in ne etanol. To je treba preveriti v skladu s točko 10.3, kadar opisani kloroform ni na voljo.

10.3 Točnost

Pravilna uporaba metode se preveri s ponovljenimi merjenji na potrjenih referenčnih materialih. Če slednji niso na voljo, je treba izvajanje metode preveriti s ponovnimi preskusi na ojačanih slepih vzorcih. Odklon srednje vrednosti od dejanske vrednosti, izražene kot odstotek dejanske vrednosti, mora biti v mejah od -20 do + 10 %.

+++++ TIFF +++++

Slika 1: Sestav kolona-kartuša

+++++ TIFF +++++

Slika 2: Shema poteka sistema LC s postkolonsko derivatizacijo z jodom.

+++++ TIFF +++++

Slika 3: Kompenzacija odklona pri odzivu na aflatoksin B1 z vbrizganjem referenčnega standarda (3.13.3) v rednih razmikih"

[1] Egmond, H.P. van, Heisterkamp, S.H. and Paulsch, W.E. (1991). Food Additives and Contaminants 8, 17-29.

[2] ISO 3534-1977.

[3] UL L 351, 2.12.1989, str. 39.

[4] "koeficient variacije

--------------------------------------------------