Osma Direktiva Komisije

z dne 15. junija 1978

o uvedbi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme

(78/633/EGS)

KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE

ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske gospodarske skupnosti,

ob upoštevanju Direktive Sveta 70/373/EGS z dne 20. julija 1970 o uvedbi metod vzorčenja in analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme [1], kakor je bila nazadnje spremenjena z Aktom o pristopu, in zlasti člena 2 Direktive,

ker zahteva navedena direktiva, da se uradni nadzor krme izvaja z uporabo metod vzorčenja in analitskih metod Skupnosti za preverjanje izpolnjevanja zahtev, določenih z zakoni in drugimi predpisi v zvezi s kakovostjo in sestavo krme;

ker so direktive Komisije 71/250/EGS z dne 15. junija 1971 [2], 71/393/EGS z dne 18. novembra 1971 [3], 72/199/EGS z dne 27. aprila 1972 [4], 73/46/EGS z dne 5. decembra 1972 [5], 74/203/EGS z dne 25. marca 1974 [6], 75/84/EGS z dne 20. decembra 1974 [7] in 76/372/EGS z dne 1. marca 1976 [8] že določile številne analitske metode Skupnosti; ker je zaradi napredka dela od tedaj priporočljivo sprejeti osmi sklop metod;

ker so ukrepi, predvideni s to direktivo, v skladu z mnenjem Stalnega odbora za krmo,

SPREJELA NASLEDNJO DIREKTIVO:

Člen 1

1. Države članice zahtevajo, da se analiza za uradni nadzor vsebnosti cinkovega bacitracina, flavofosfolipola, železa, bakra, mangana in cinka v krmi opravlja skladno z metodami, opisanimi v Prilogi k tej direktivi.

2. Splošne določbe, navedene v delu 1 "Uvod" Priloge k Prvi direktivi Komisije 71/250/EGS, razen dela, ki obravnava pripravo vzorca za analizo, se uporabljajo za metode, opisane v Prilogi k tej direktivi.

Člen 2

Države članice sprejmejo zakone ali druge predpise, potrebne za uskladitev s to direktivo, do 1. januarja 1979. O tem takoj obvestijo Komisijo.

Člen 3

Ta direktiva je naslovljena na države članice.

V Bruslju, 15. junija 1978

Za Komisijo

Finn Gundelach

Podpredsednik

[1] UL L 170, 3.8.1970, str. 2.

[2] UL L 155, 12.7.1971, str. 13.

[3] UL L 279, 20.12.1971, str. 7.

[4] UL L 123, 29.5.1972, str. 6.

[5] UL L 83, 30.3.1973, str. 21.

[6] UL L 108, 22.4.1974, str. 7.

[7] UL L 32, 5.2.1975, str. 26.

[8] UL L 102, 15.4.1976, str. 8.

--------------------------------------------------

PRILOGA

1. DOLOČANJE CINKOVEGA BACITRACINA Z DIFUZIJO V AGARSKEM GOJIŠČU

1. NAMEN IN PODROČJE UPORABE

S tem postopkom se določa cinkov bacitracin v krmi, koncentratih in premiksih. Spodnja meja za določitev je 5 mg/kg (5 ppm) [1]. Ta postopek se ne uporablja v prisotnosti motečih snovi, zlasti velikih količin bakra in askorbinske kisline.

2. PRINCIP

Vzorec ekstrahiramo pri pH 2 z mešanico metanola, vode in klorovodikove kisline. Vrednost pH v ekstraktu popravimo na 6,5, po potrebi koncentriramo in razredčimo. Njegovo antibiotično delovanje določimo tako, da izmerimo difuzijo cinkovega bacitracina v agarskem gojišču, ki je inokulirano z Micrococcus luteus (Syn. M flavus). Znak difuzije je oblikovanje inhibicijskih con mikroorganizma. Za premer teh con velja, da je premosorazmeren z logaritmom koncentracije antibiotika na obseg uporabljenih koncentracij antibiotika.

3. MIKROORGANIZEM: MICROCOCCUS LUTEUS ATCC 10240

3.1 Vzdrževanje prvotne kulture

Inokuliramo Micrococcus luteus na poševen nanos agarja na gojišču (4.1). Inkubiramo 24 ur pri 30 do 37 °C, shranimo v hladilnik na približno 4 °C in ponovno inokuliramo vsaka dva tedna na poševne nanose agarja.

3.2 Priprava bakterijske suspenzije [2]

Rast pred kratkim pripravljenega agarskega poševnega nanosa (3.1) poberemo z 2 do 3 ml raztopine natrijevega klorida (4.3). To suspenzijo uporabimo za inokulacijo 250 ml gojišča (4.1), shranjenega v Rouxovi bučki, in inkubiramo 18 do 20 ur pri temperaturi 30 do 37 °C. Rast poberemo v 25 ml raztopine natrijevega klorida (4.3) in premešamo. Raztopino razredčimo na eno desetino z raztopino natrijevega klorida (4.3). Prepustnost svetlobe suspenzije mora biti 75-odstotna, izmerjena pri 650 nm in 1-centimetrski debelini plasti pri raztopini natrijevega klorida (4.3).

4. GOJIŠČA IN REAGENTI

4.1 Gojišče [3]

Mesni pepton | 6,0 g |

Tripton | 4,0 g |

Kvasni ekstrakt | 3,0 g |

Mesni ekstrakt | 1,5 g |

Glukoza | 1,0 g |

Agar | 15,0 g |

Voda | 1000 ml |

pH 6,5 do 6,6 (po sterilizaciji) | |

4.2 Preskusno gojišče [4]

Tripton | 1,0 g |

Kvasni ekstrakt | 3,0 g |

Mesni ekstrakt | 1,5 g |

Glukoza | 1,0 g |

Agar | 20,0 g |

Tween | 1 ml |

Voda | 1000 ml |

pH 6,5 (po sterilizaciji) | |

4.3 Raztopina natrijevega klorida 0,8 % (w/v): v vodi raztopimo 8 g natrijevega klorida a.p. in ga razredčimo na 1000 ml; nato steriliziramo.

4.4 Mešanica metanola, čiste vode in klorovodikove kisline a.p. (d: od 1,18 do 1,19): 80/17,5/2,5 (v/v/v).

4.5 Fosfatni pufer, pH 6,5

Kalijev hidrogenfosfat, K2HPO4 a.p. (22,15 g).

Kalijev dihidrogenfosfat, KH2PO4 a.p. (27,85 g).

Voda do 1000 ml.

4.6 Klorovodikova kislina a.p. (d: od 1,18 do 1,19).

4.7 Klorovodikova kislina a.p. (0,1 N).

4.8 Raztopina natrijevega hidroksida 1 N a.p.

4.9 Rdečerjava raztopina bromovega krezola 0,04 % (w/v): 0,1 g rjavordečega bromovega krezola raztopimo v 18,5 ml raztopine natrijevega hidroksida 0,01 N. Dodamo vodo, da se prostornina poveča na 250 ml, in zmešamo.

4.10 Običajna snov: cinkov bacitracin znane dejavnosti (v mednarodnih enotah).

5. STANDARDNE RAZTOPINE

Odmerimo količino običajnega cinkovega bacitracina (4.10), kar ustreza 1050 mednarodnim enotam (glede na navedeno dejavnost). Dodamo 5 ml klorovodikove kisline 0,1 N (4.7) in pustimo 15 minut. Dodamo 30 ml vode, s fosfatnim puferjem pH 6,5 (4.5) (približno 4 ml) naravnamo vrednost pH na 4,5, nato dodamo vodo, da prostornina naraste na 50 ml, in dobro premešamo (1 ml = 21 i. u., mednarodnih enot).

Z zaporednim razredčevanjem s fosfatnim puferjem pH 6,5 (4.5) pripravimo iz te raztopine naslednje raztopine:

S8 | 0,42 | i.u./ml |

S4 | 0,21 | i.u./ml |

S2 | 0,105 | i.u./ml |

S1 | 0,0525 | i.u./ml |

6. PRIPRAVA EKSTRAKTA

6.1 Ekstrakcija

6.1.1 Koncentrati, premiksi in mineralna krma

Odtehtamo od 2,0 do 5,0 g vzorca, dodamo 30 ml mešanice (4.4) in na hitro pretresemo. Preverimo, da je vrednost pH okrog 2. Nato stresamo 10 minut, dodamo 30 ml fosfatnega puferja pH 6,5 (4.5) in stresamo 15 minut. Mešanico razredčimo s fosfatnim puferjem (4.5), da dobimo pričakovano vsebnost cinkovega bacitracina 0,42 i.u./ml (= U8).

6.1.2 Beljakovinski koncentrati

Odmerimo 10,0 g vzorca, dodamo 50 ml mešanice (4.4) in na hitro pretresemo. Preverimo, da je vrednost pH okrog 2. Nato stresamo 10 minut, dodamo 50 ml fosfatnega puferja pH 6,5 (4.5) in stresamo 15 minut. Mešanico razredčimo s fosfatnim puferjem (4.5), da dobimo pričakovano vsebnost cinkovega bacitracina 0,42 i.u./ml (= U8).

6.1.3 Druga krma

Odmerimo 10,0 g vzorca (20,0 g za pričakovano vsebnost cinkovega bacitracina 5 mg/kg), dodamo 25 ml mešanice (4.4) in približno 10 minut homogeniziramo. Dodamo 25 ml fosfatnega puferja pH 6,5 (4.5), stresamo 15 minut in centrifugiramo. Vzamemo 20 ml supernatantne raztopine in z dodajanjem raztopine natrijevega hidroksida 1 N (4.8) naravnamo vrednost pH na 6,5, pri čemer nam kot indikator služi rdečerjava raztopina bromovega krezola (4.9). Pustimo, da v rotacijskem izparilniku mešanica izpari na približno 4 ml pri temperaturi, ki ne presega 35 °C. Mešanico razredčimo z vodo, da dobimo pričakovano vsebnost cinkovega bacitracina 0,42 i.u./ml (= U8).

6.2 Preskusne raztopine

Iz raztopine U8 pripravimo raztopine U4 (pričakovana vsebnost: 0,21 i.u./ml), U2 (pričakovana vsebnost: 0,105 i.u./ml), in U1 (pričakovana vsebnost: 0,0525 i.u./ml), in sicer z zaporednim razredčevanjem (1 + 1) s fosfatnim puferjem (4.5).

7. PRESKUSNI POSTOPEK

7.1 Inokulacija preskusnega gojišča

Preskusno gojišče (4.2) inokuliramo z bakterijsko suspenzijo (3.2) pri približno 50 °C. S predhodnimi preskusi na ploščah s preskusnim gojiščem (4.2) določimo količino bakterijske suspenzije, ki je potrebna, da se pridobi največje in najjasnejše inhibicijske cone z različnimi koncentracijami cinkovega bacitracina.

7.2 Priprava plošč

Difuzija skozi agar se izvaja na ploščah s štirimi koncentracijami običajne raztopine (S8, S4, S2 in S1) in s štirimi koncentracijami preskusne raztopine (U8, U4, U2 in U1) na vsaki od njih. Te štiri koncentracije ekstrakta in običajne raztopine moramo dati na vsako ploščo. V ta namen izberemo plošče, ki so dovolj velike za vsaj osem vdolbin s premerom od 10 do 13 mm, z najmanj 30 mm razdalje med središči, ki jih je treba vdolbsti v agarsko gojišče. Preskus se lahko izvaja na tankih steklenih ploščah, na katerih je obroč iz obdelanega aluminija ali plastike in imajo premer 200 mm, v višino pa merijo 20 mm.

Na plošče nalijmo količino gojišča (4.2), ki je inokuliran skladno s točko 7.1, da dobimo približno 2 mm debelo plast (50 ml za ploščo s premerom 200 mm). Počakamo, da se površina utrdi. Nato izdolbemo vdolbine in vanje vlijemo natanko odmerjeno količino preskusne in običajne raztopine (med 0,10 in 0,15 ml na vdolbino, glede na premer).

Vsako koncentracijo uporabimo najmanj štirikrat, tako da je treba pri vsakem preskusu oceniti 32 inhibicijskih con.

7.3 Inkubacija

Plošče inkubiramo od 16 do 18 ur pri 28 do 30 °C.

8. OVREDNOTENJE

Izmerimo premer inhibicijskih con do 0,1 mm natančno. Zabeležimo srednje vrednosti za vsako koncentracijo na pollogaritmičnem grafu, ki kaže logaritem koncentracij glede na premere inhibicijskih con. Na grafu prikažemo najustreznejše premice, in sicer tako za običajno raztopino kot tudi za ekstrakt, kakor je navedeno v spodnjem primeru.

Z naslednjo enačbo določimo "najboljšo" točko za najnižjo raven običajne raztopine (SL):

SL =

7 S

+ 4 S

+ S

- 2 S

810

Z naslednjo enačbo določimo "najboljšo" točko za najvišjo raven običajne raztopine (SH):

SH =

7 S

+ 4 S

+ S

- 2 S

110

Na podoben način izračunamo "najboljšo" točke za najnižjo (UL) in najvišjo (UH) raven ekstrakta, in sicer tako, da v zgornjih enačbah U1, U2, U4 in U8 nadomestimo s S1, S2, S4 in S8.

Zabeležimo izračunane vrednosti SL in SH na istem grafu in jih povežemo, da dobimo "najboljšo" premico za običajno raztopino. Na podoben način zabeležimo vrednosti UL in UH ter jih povežemo, da dobimo "najboljšo" premico za ekstrakt.

Če ni motečih dejavnikov, bi morale biti črte vzporedne. Iz praktičnih namenov lahko premice štejemo za vzporedne, če med vrednostmi (SH–SL) ter (UH–UL) in njihovimi srednjimi vrednostmi ni več kot 10 % odklona.

Če premice niso vzporedne, lahko izločimo bodisi U1 in S1 ali U8 in S8, z vrednostmi SL, SH, UL in UH pa z alternativnimi enačbami izračunamo alternativne "najustreznejše" premice:

SL =

5 S

+ 2 S

- S

6

SH =

5 S

+ 2 S

- S

6

Podobno velja tudi za UL in UH. Za alternativne najustreznejše premice preverimo vzporednost, kot zgoraj. Če se rezultat izračuna na treh ravneh, je treba to zabeležiti v končnem poročilu.

Ko premice štejemo za vzporedne, izračunamo logaritem relativne dejavnosti (log. A) s pomočjo ene izmed naslednjih formul.

Za štiri vrednosti

log. A =

× 0,602

U

+ U

+ S

+ S

- U

- U

- S

- S

2

Za tri vrednosti

log. A =

× 0,401

U

+ S

- U

- S

1

ali

log. A =

× 0,401

U

+ S

- U

- S

2

Dejanska dejavnost = domnevna dejavnost × relativna dejavnost.

Kadar premic ne štejemo za vzporedne, določitev ponovimo. Če vzporednost še vedno ni dosežena, izračunamo logaritem relativne dejavnosti (log. A) s pomočjo formule (c). Dobljeni rezultat pa je približek, in to moramo navesti v končnem poročilu.

9. PONOVLJIVOST

Razlika med rezultati dveh določitev, ki jih na istem vzorcu izvaja isti analitik, ne sme presegati:

20 % v povezavi z najvišjo vrednostjo za vsebnost bacitracina od 5 do 25 mg/kg;

5 mg/kg v absolutni vrednosti za vsebnosti, višje od 25 in do 50 mg/kg;

10 % v povezavi z najvišjo vrednostjo za vsebnosti nad 50 mg/kg.

2. DOLOČANJE FLAVOFOSFOLIPOLA Z DIFUZIJO NA AGARSKEM GOJIŠČU

1. NAMEN IN PODROČJE UPORABE

S to metodo določamo flavofosfolipol v krmi, koncentratih in premiksih. Spodnja meja določanja je 1 mg/kg (1 ppm).

2. PRINCIP

Vzorec ekstrahiramo z razredčenim metanolom s segrevanjem pod povratnim tokom. Po centrifugiranju ekstrakt prečistimo (po potrebi) z ionskimi izmenjevalci in razredčimo. Njegovo antibiotično aktivnost določimo z merjenjem difuzije flavofosfolipola na agarskem gojišču, nacepljenem s Staphylococcus aureus. Znak difuzije je oblikovanje inhibicijskih con mikroorganizma. Za premer teh con velja, da je premosorazmeren z logaritmom koncentracije antibiotika v območju uporabljenih koncentracij antibiotika.

3. MIKROORGANIZEM: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P

3.1 Vzdrževanje osnovne kulture

Staphylococcus aureus nacepimo na poševen nanos agarja na gojišču (4.1). Inkubiramo 24 ur pri 37 °C, hranimo v hladilniku pri približno 4 °C in vsak mesec precepimo na poševne nanose agarja.

3.2 Priprava bakterijske suspenzije [5]

Dve epruveti osnovne kulture (3.1) precepimo vsak teden. Inkubiramo 24 ur pri 37 °C in hranimo v hladilniku pri približno 4 °C.

24 ur pred preskusom s tem prirastkom nacepimo dve do štiri epruvete s poševnimi nanosi gojišč (4.1). Inkubiramo od 16 do 18 ur pri 37 °C. Pripravimo suspenzijo rasti v raztopini natrijevega klorida (4.3). Prepustnost svetlobe suspenzije mora biti približno 40 %, izmerjena pri 578 nm v 1-centimetrski kiveti proti raztopini natrijevega klorida (4.3).

4. GOJIŠČA IN REAGENTI

4.1 Gojišče [6]

Mesni pepton | 6,0 g |

Tripton | 4,0 g |

Kvasni ekstrakt | 3,0 g |

Mesni ekstrakt | 1,5 g |

Glukoza | 1,0 g |

Agar | 15,0 g |

Voda | 1000 ml |

pH 6,5 (po sterilizaciji) | |

4.2. Preskusno gojišče [7]

4.2.1 Osnovna plast [8]

Mesni pepton | 6,0 g |

Kvasni ekstrakt | 3,0 g |

Mesni ekstrakt | 1,5 g |

Agar | 10,0 g |

Voda | 1000 ml |

pH 6,5 (po sterilizaciji) | |

4.2.2 Zasejalna plast

Kot v točki 4.1, z dodatkom 2,0 g silikonske emulzije proti penjenju [9].

4.3 Raztopina natrijevega klorida 0,4 % (m/v): v vodi raztopimo 4 g natrijevega klorida p.a. in razredčimo do 1000 ml; steriliziramo.

4.4 Metanol, čisti.

4.5 Metanol 50 % (v/v): 500 ml metanola (4.4) razredčimo s 500 ml vode.

4.6. Metanol 80 % (v/v): 800 ml metanola razredčimo (4.4) z 200 ml vode.

4.7 Tris (hidroksimetil) aminometan a.p.

4.8 Metanolan raztopina kalijevega klorida 1,5 % (m/v): 1,5 g kalijevega klorida p.a. raztopimo v 20 ml vode, nato dopolnimo z metanolom do 100 ml (4.4).

4.9 Kationski izmenjevalec: Dowex 50 W 8, 20 do 50 meš, Na oblika (kat. Serva št. 41600) ali enakovreden.

4.10 Anionski izmenjevalec: Dowex 1 2, 20 do 50 meš, Cl oblika (kat. Serva. št 41010) ali enakovreden. Pred uporabo 12 do 14 ur pustimo v 80-odstotnem metanolu (4.6).

4.11 Steklena volna.

4.12 pH indikatorski papir (pH 6,6 do 8,1).

4.13 Askorbinska kislina.

4.14 Standardna substanca: flavofosfolipol znane aktivnosti.

5. OPREMA

5.1 Steklena cev za kromatografijo, notranji premer: 9 mm, dolžina: 150 do 200 mm, opremljena s petelinčkom na zoženem spodnjem delu in brusom (za povezavo s kapalnim lijakom (5.2)) na zgornjem delu.

5.2 Kapalni lijak 250 ml, opremljen s petelinčkom in brusom.

5.3 250-mililitrska erlenmajerica z brusom.

5.4 Povratni hladilnik z brusom.

6. STANDARDNE RAZTOPINE

Točno natehtano količino standardne substance (4.14) raztopimo v 50-odstotnem metanolu (4.5) in razredčimo, da dobimo osnovno raztopino, ki vsebuje 100 μg flavofosfolipola na mililiter. Raztopina je stabilna do dveh mesecev, če jo hranimo v zaprti posodi pri 4 °C.

Z zaporednim razredčevanjem s 50-odstotnim metanolom (4.5) iz te osnovne raztopine pripravimo naslednje raztopine:

S8 | 0,2 | μg/ml |

S4 | 0,1 | μg/ml |

S2 | 0,05 | μg/ml |

S1 | 0,025 | μg/ml |

7. PRIPRAVA EKSTRAKTA

7.1. Ekstrakcija

7.1.1 Koncentrati, premiksi in mineralna krma

Natehtamo od 2,0 do 5,0 g vzorca in dodamo približno 150 mg askorbinske kisline (4.13). V erlenmajerici (5.3) premešamo s 150 ml 50-odstotnega metanola (4.5) in z okoli 400 mg tris(hidroksimetil)aminometana (4.7) naravnamo pH na 8,1 do 8,2. Preverimo pH z indikatorskim papirjem (4.12). Pustimo stati 15 minut, nato s tris(hidroksimetil)aminometanom (4.7) ponovno naravnamo pH na 8,1 do 8,2 in 10 minut vremo pod povratnim hladilnikom (5.4) ter pri tem neprestano mešamo. Mešanico ohladimo in centrifugiramo, nato oddekantiramo ekstrakt.

7.1.2 Druga krma

Natehtamo od 5,0 do 30,0 g količino vzorca, ki vsebuje vsaj 30 μg flavofosfolipola. V erlenmajerici (5.3) premešamo s 150 ml 50-odstotnega metanola (4.5) in naravnamo pH na 8,1 do 8,2 s približno 400 mg tris(hidroksimetil)aminometan (4.7). Preverimo pH z indikatorskim papirjem (4.12). Pustimo stati 15 minut, nato s tris(hidroksimetil)aminometanom (4.7) ponovno naravnamo pH na 8,1 do 8,2 in 10 minut vremo pod povratnim hladilnikom (5.4) ter pri tem neprestano mešamo. Mešanico ohladimo, centrifugiramo in oddekantiramo ekstrakt.

7.2 Čiščenje (ta korak lahko pri koncentratih, premiksih in mineralni krmil izpustimo)

110 ml ekstrakta dodamo 11 g kationskega izmenjalca (4.9), eno minuto vremo pod povratnim hladilnikom (5.4) in neprestano mešamo. Kationski izmenjevalec ločimo s centrifugiranjem ali filtriranjem. 100 ml ekstrakta dodamo 150 ml metanola (4.4) in raztopino hranimo 12 do 15 ur pri temperaturi 4 °C. Na hladnem odfiltriramo kosmiče.

Na dno steklene cevi (5.1) vstavimo zamašek iz steklene volne (4.11), v cev vlijemo 5 ml anionskega izmenjevalca (4.10) in kolono speremo s 100 ml 80-odstotnega metanola (4.6). Z uporabo lijaka (5.2) v kolono prenesemo najmanj 100 ml filtrata, za katerega predvidevamo, da vsebuje 16 μg flavofosfolipola (200 ml za 30-gramski vzorec krme pri 1 ppm). Po potrebi, preden ga vlijemo v kolono, filtrat razredčimo z 80-odstotnim metanolom (4.6), da dobimo pričakovano vsebnost flavofosfolipola 16 μg/100 ml. Hitrost pretoka naravnamo na približno 2 ml/minuto. Eluat zavržemo. Nato speremo kolono s 50 ml 80-odstotnega metanola (4.6) in eluat zavržemo.

Flavofosfolipol eluiramo z metanolno raztopino kalijevega klorida (4.8) s hitrostjo pretoka do približno 2 ml/minuto. 50 ml eluata prenesemo v merilno bučko, dodamo 30 ml vode in premešamo. Ta raztopina bi morala vsebovati 0,2 μg/ml (= U8) flavofosfolipola.

7.3 Preskusne raztopine

Po potrebi (to je, če smo izpustili čiščenje) ekstrakt, dobljen v točki 7.1.1, razredčimo s 50-odstotnim metanolom (4.5), da dobimo pričakovano vsebnost flavofosfolipola 0,2 μg/ml (= U8).

Iz raztopine U8 pripravimo raztopine U4 (pričakovana vsebnost: 0,1 μg/ml), U2 (pričakovana vsebnost: 0,05 μg/ml), in U1 (pričakovana vsebnost: 0,025 μg/ml), in sicer z zaporednim razredčevanjem (1 + 1) s 50-odstotnim metanolom (4.5).

8. PRESKUSNI POSTOPEK

8.1 Nacepljenje preskusnega gojišča

Preskusno gojišče (4.2.2) nacepimo z bakterijsko suspenzijo (3.2) pri približno 50 °C. S predhodnimi preskusi na ploščah s preskusnim gojiščem (4.2.2) določimo količino bakterijske suspenzije, ki je potrebna, da dobimo največje in najjasnejše inhibicijske cone z različnimi koncentracijami flavofosfolipola (približno 30 ml/l).

8.2 Priprava plošč

Difuzijo skozi agar izvajamo na ploščah s štirimi koncentracijami standardnih raztopin (S8, S4, S2 in S1) in s štirimi koncentracijami preskusnih raztopin (U8, U4, U2 in U1) na vsaki izmed njih. Te štiri koncentracije ekstrakta in standardne raztopine moramo nujno dodati na vsako ploščo. Zato izberemo dovolj velike plošče za vsaj osem vdolbin s premerom od 10 do 13 mm, z najmanj 30 mm razdalje med središči, ki jih vdolbemo v agarsko gojišče. Preskus lahko izvajamo na steklenih ploščah, na katere postavimo obroč iz obdelanega aluminija ali plastike in imajo premer 200 mm, v višino pa merijo 20 mm.

Na plošče nalijmo določeno količino gojišča (4.2.1), da dobimo približno 1,5 mm debelo plast (45 ml za ploščo s premerom 200 mm). Ko se vsebina izravna, prelijemo določeno količino gojišča (4.2.2), ki je nacepljeno skladno s točko 8.1, da dobimo približno 1 mm debelo plast (30 ml za ploščo s premerom 200 mm). Počakamo, da se površina ponovno izravna. Nato izdolbemo vdolbine in vanje nanesemo točno odmerjene volumne preskusnih in standardnih raztopin (med 0,10 in 0,15 ml na vdolbino, glede na premer).

Vsako koncentracijo nanesemo najmanj štirikrat, tako da pri vsakem preskusu ovrednotimo 32 inhibicijskih con.

8.3 Inkubacija

Plošče inkubiramo od 16 do 18 ur pri 28 do 30 °C.

9. OVREDNOTENJE

Izmerimo premer inhibicijskih con s točnostjo 0,1 mm. Srednje vrednosti za vsako koncentracijo nanesemo v semilogaritemski diagram, ki prikazuje logaritem koncentracij glede na premer inhibicijskih con. Na diagramu izrišemo premice z najboljšim potekom tako za standardno raztopino kot tudi za ekstrakt, kakor je prikazano spodaj.

Z naslednjo enačbo določimo "najboljšo" točko za najnižjo vsebnost standardne raztopine (SL):

SL =

7 S

+ 4 S

+ S

- 2 S

810

SH =

7 S

+ 4 S

+ S

- 2 S

110

Na podoben način izračunamo "najboljše" točke za najnižjo (UL) in najvišjo (UH) vsebnost ekstrakta, in sicer tako, da v zgornjih enačbah U1, U2, U4 in U8 nadomestimo s S1, S2, S4 in S8.

Izračunane vrednosti SL in SH nanesemo na isti diagram in jih povežemo, da dobimo premico z najboljšim potekom za standardno raztopino. Na podoben način zabeležimo vrednosti UL in UH ter jih povežemo, da dobimo premico z najboljšim potekom za ekstrakt.

Če ni interferenc, bi morale biti premice vzporedne. Za praktične namene lahko premice štejemo za vzporedne, če se vrednosti (SH-SL) ter (UH-UL) ne razlikujejo za več kot 10 % od njihovih srednjih vrednosti.

Če premice niso vzporedne, lahko izločimo bodisi U1 in S1 ali U8 in S8, in SL, SH, UL in UH izračunamo z alternativnimi enačbami, s katerimi dobimo alternativne premice z najboljšim potekom:

SL =

5 S

+ 2 S

- S

6

SH =

5 S

+ 2 S

- S

6

Z najboljšim potekom preverimo vzporednost kot zgoraj. Če rezultat izračunamo iz treh vsebnosti, moramo to navesti v končnem poročilu.

Ko premice štejemo za vzporedne, izračunamo logaritem relativne aktivnosti (log. A) s pomočjo ene izmed naslednjih formul.

Za štiri vrednosti

log. A =

× 0,602

U

+ U

+ S

+ S

- U

- U

- S

- S

2

Za tri vrednosti

log. A =

× 0,401

U

+ S

- U

- S

1

ali

log. A=

× 0,401

U

+ S

- U

- S

2

Dejanska aktivnost = domnevna aktivnost × relativna aktivnost.

Kadar premic ne štejemo za vzporedne, določitev ponovimo. Če vzporednost še vedno ni dosežena, izračunamo logaritem relativne aktivnosti (log. A) s formulo (c). Vendar moramo tako dobljeni rezultat jemati kot približnega, in to moramo navesti v končnem poročilu.

10. PONOVLJIVOST

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki jih na istem vzorcu izvaja isti analitik, ne sme presegati:

0,5 mg/kg v absolutni vrednosti, za vsebnosti flavofosfolipola od 1 do 2 mg/kg;

25 % glede na višjo vrednost, za vsebnosti nad 2 in do 10 mg/kg;

20 % glede na višjo vrednost, za vsebnosti nad 10 in do 25 mg/kg;

5 mg/kg v absolutni vrednosti, za vsebnosti nad 25 in do 50 mg/kg;

10 % glede na višjo vrednost, za vsebnosti nad 50 mg/kg.

3. DOLOČANJE ŽELEZA, BAKRA, MANGANA IN CINKA V SLEDOVIH

1. NAMEN IN PODROČJE UPORABE

S to metodo je mogoče določiti vsebnost železa, bakra, mangana in cinka v sledovih v krmi. Spodnje meje določanja so:

železo (Fe): 20 mg/kg

baker (Cu): 10 mg/kg

mangan (Mn): 20 mg/kg

cink (Zn): 20 mg/kg

2. PRINCIP

Po razkroju morebitnih organskih snovi vzorec raztopimo v klorovodikovi kislini. Po primernem razredčenju določimo železo, baker, mangan in cink z atomsko absorpcijsko spektrometrijo.

3. REAGENTI

Uvodne opombe

Za pripravo reagentov in raztopin za analizo uporabimo vodo brez kationov, ki jih je treba določiti, ki jo pripravimo z dvojnim destiliranjem vode v destilatorju iz borosilikatnega ali kremenovega stekla ali z dvojno ionsko izmenjavo.

Reagenti morajo biti najmanj analitske čistoče (p.a.). Odsotnost elementa, ki ga določamo, preverjamo s slepim preskusom. Po potrebi moramo reagente dodatno prečistiti.

Namesto spodaj opisanih običajnih raztopin lahko uporabimo komercialne standardne raztopine, če so zajamčene in so bile pred uporabo preverjene.

3.1 Klorovodikova kislina p.a. (d: 1,19).

3.2 Klorovodikova kislina p.a. (6 N).

3.3 Klorovodikova kislina p.a. (0,5 N).

3.4 38 do 40-odstotna (v/v) klorovodikova kislina z vsebnostjo železa manj kot 1 mg Fe/liter in z manj kot 10 mg (v obliki sulfata)/liter ostanka po izparevanju.

3.5 Žveplova (VI) kislina p.a. (d: 1,84).

3.6 Vodikov peroksid p.a. (približno 100 volumnov kisika (30 % po masi)).

3.7 Standardna raztopina železa (1000 μg Fe/ml), pripravljena: v 200 ml 6 N klorovodikove kisline (3.2) raztopimo 1 g železne žice p.a., dodamo 16 ml vodikovega peroksida (3.6) in dopolnimo z vodo do litra.

3.7.1 Standardna delovna raztopina železa (100 μg Fe/ml), pripravljena tako, da razredčimo standardno raztopino (3.7) z vodo 1 + 9.

3.8 Standardna raztopina bakra (1000 μg Cu/ml), pripravljena: v 25 ml 6 N klorovodikove kisline (3.2) raztopimo 1 g bakra v prahu (p.a.), dodamo 5 ml vodikovega peroksida (3.6) in dopolnimo z vodo do litra.

3.8.1 Standardna delovna raztopina bakra (10 μg Cu/ml), pripravljena tako, da razredčimo standardno raztopino (3,8) z vodo 1 + 9, nato pa to raztopino ponovno razredčimo z vodo 1 + 9.

3.9 Standardna raztopina mangana (1000 μg Mn/ml), pripravljena: v 25 ml 6 N klorovodikove kisline (3.2) raztopimo 1 g mangana v prahu (p.a.) in dopolnimo z vodo do litra.

3.9.1 Standardna delovna raztopina mangana (10 μg Mn/ml), pripravljena tako, da razredčimo standardno raztopino (3,9) z vodo 1 + 9, nato pa to raztopino ponovno razredčimo z vodo 1 + 9.

3.10 Standardna raztopina cinka (1000 μg Zn/ml), pripravljena: v 25 ml 6 N klorovodikove kisline (3.2) raztopimo 1 g cinka v foliji ali granulah (p.a.) in dopolnimo z vodo do litra.

3.10.1 Standardna delovna raztopina cinka (10 μg Zn/ml), pripravljena tako, da razredčimo standardno raztopino (3.10) z vodo 1 + 9, nato pa to raztopino ponovno razredčimo z vodo 1 + 9.

3.11 Raztopina lantanovega klorida, pripravljena: v 150 ml vode raztopimo 12 g lantanovega klorida, dodamo 100 ml 6 N klorovodikove kisline (3.2) in dopolnimo z vodo do litra.

4. OPREMA

4.1 Žarilna peč z regulacijo temperature in rekorderjem.

4.2 Stekleni deli morajo biti iz odpornega borosilikata in priporočljivo je, da uporabljamo opremo, ki je namenjena izključno določanju elementov v sledovih.

4.3 Žarilni lonček iz platine in (možno) iz kvarca.

4.4 Atomski absorpcijski spektrofotometer, ki ustreza zahtevam metode glede občutljivosti in natančnost zahtevanega območja.

5. POSTOPEK

5.1 Vzorci, ki vsebujejo organske snovi

5.1.1 Upepeljevanje in priprava raztopine za analizo [10]

(i) Natehtamo 5 do 10 g vzorca s točnostjo 0,2 mg in ga prenesemo v žarilni lonček iz kvarca ali platine (4.3) (glej opombo (b)), osušimo v sušilniku pri 105 °C in ga nato postavimo v hladno žarilno peč (4.1). Peč zapremo (glej opombo (c)) in približno 90 minut postopoma višamo temperaturo na 450 do 475 °C. To temperaturo ohranjamo 4 do 16 ur (npr. čez noč), da odstranimo zoglenele snovi, nato pa peč odpremo in ohladimo (glej opombo (d)).

Lonček izperemo s skupno okoli 5 ml klorovodikove kisline (3.1) in to počasi in previdno prelijemo v čašo (lahko pride do burne reakcije zaradi nastanka CO2). Po kapljicah dodajamo klorovodikovo kislino (3.1) in mešamo, dokler penjenje ne poneha. Izparevamo do suhega in pri tem občasno premešamo s stekleno palčko.

Nato dodamo preostanku 15 ml 6 N klorovodikove kisline (3.2) in nato približno 120 ml vode. Premešamo s stekleno palčko, ki jo pustimo v čaši, čašo pa pokrijemo z urnim steklom. Počasi segrejemo do vrenja in pustimo vreti do popolnega raztapljanja pepela. Filtriramo skozi filter, ki ne vsebuje pepela, v 250-mililitrsko merilno bučko. Čašo in filter speremo s 5 ml vroče 6 N klorovodikove kisline (3.2) in dvakrat z vrelo vodo. Merilno bučko napolnimo z vodo do oznake (koncentracija HCl okoli 0,5 N).

(ii) Če je preostanek na filtru videti črn (ogljik), ga ponovno postavimo v peč in ponovno upepelimo pri 450 do 475 °C. Ta upepelitev, ki zahteva le nekaj ur (okoli tri do pet ur), je dokončana, ko je pepel videti bel ali skoraj bel. Preostanek raztopimo v 2 ml klorovodikove kisline (3.1), izparimo do suhega in dodamo 5 ml 6 N klorovodikove kisline (3.2). Segrejemo, filtriramo raztopino v merilno bučko in dopolnimo z vodo do oznake (koncentracija HCl okoli 0,5 N).

Opombe:

(a) Pri določanju elementov v sledovih je pomembno, da smo pozorni na nevarnost kontaminacije, predvsem s cinkom, bakrom in železom. Zato oprema, ki se uporablja pri pripravi vzorcev, ne sme vsebovati teh kovin.

Da bi zmanjšali splošno tveganje kontaminacije, delamo v brezprašnem prostoru s čisto opremo in dobro oprano stekleno posodo. Določanje cinka je posebej občutljivo na več vrst kontaminacije, npr. s stekleno posodo, reagenti, prahom, itd.

(b) Maso vzorca, ki ga bomo upepelili, izračunamo iz približne vsebnosti elementov v sledovih v krmi glede na občutljivost uporabljenega spektrofotometra. Pri nekateri krmi, ki vsebujejo malo prvin v sledovih, bi lahko začeli z vzorcem, težkim 10 do 20 g in razredčenjem končne raztopine le do 100 ml.

(c) Upepeljevanje izvajamo v zaprti peči brez dovajanja zraka ali kisika.

(d) Temperatura na pirometru ne sme preseči 475 °C.

5.1.2 Določanje s spektrofotometrijo

5.1.2.1 Priprava raztopin za umeritev

Za vsakega izmed elementov, ki ga bomo določali, pripravimo iz standardnih delovnih raztopin, navedenih v točkah 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 in 3.10.1, serijo raztopin za umeritev, od katerih ima vsaka koncentracijo HCl okoli 0,5 N in (pri železu, manganu in cinku) koncentracijo lantanovega klorida, ki ustreza 0,1 % La (m/v). Izbrane koncentracije elementov v sledovih se morajo nahajati v območju občutljivosti uporabljenega spektrofotometra. V tabelah spodaj so kot primer navedene sestave tipičnih območij raztopin za umeritev, odvisnih od vrste in občutljivosti spektrofotometra, ki ga uporabljamo, zato bo morda treba izbrati drugačne koncentracije.

Železo

μg Fe/ml | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |

ml standardne delovne raztopine (3.7.1) (1 ml = 100 μg Fe) | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |

+ ml 6 N HCl (3.2) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 |

+ 10 ml raztopine lantanovega klorida (3.11) in do 100 ml dopolnimo z vodo. |

Baker

μg Cu/ml | 0 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 1,0 |

ml delovne standardne raztopine (3.8.1) (1 ml = 10 μg Cu) | 0 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |

+ ml 6 N HCl (3.2) | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 |

Do 100 ml dopolnimo z vodo. |

Mangan

μg Mn/ml | 0 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 1,0 |

ml delovne standardne raztopine (3.9.1) (1 ml = 10 μg Mn) | 0 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |

+ ml 6 N HCl (3.2) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 |

+ 10 ml raztopine lantanovega klorida (3.11) in do 100 ml dopolnimo z vodo. |

Cink

μg Zn/ml | 0 | 0,05 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 |

ml delovne standardne raztopine (3.10.1) (1 ml = 10 μg Zn) | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 |

+ ml 6 N HCl (3.2) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 |

+ 10 ml raztopine lantanovega klorida (3.11) in do 100 ml dopolnimo z vodo. |

5.1.2.2 Priprava raztopine za analizo

Za določanje bakra se lahko raztopina, pripravljena po točki 5.1.1, običajno uporabi direktno. Če je treba koncentracijo prilagoditi območju umeritve, odpipetiramo ustrezen alikvot v 100- mililitrsko merilno bučko in jo dopolnimo do oznake z 0,5 N klorovodikovo kislino (3.3).

Za določanje železa, mangana in cinka odpipetiramo ustrezen alikvot raztopine, pripravljene po točki 5.1.1, v 100-mililitrsko merilno bučko, dodamo 10 ml raztopine lantanovega klorida (3.11) in do oznake dopolnimo z 0,5 N klorovodikovo kislino (3.3) (glej tudi točko 8 "Opomba").

5.1.2.3 Slepi preskus

Slepi preskus vključuje vse predpisane korake postopka, le da izpustimo vzorec.

Umeritvena raztopina "0" se ne sme uporabljati kot slepa.

5.1.2.4 Merjenje atomske absorpcije

Atomsko absorpcijo umeritvenih raztopin in raztopine, ki jo bomo analizirali, izmerimo z uporabo oksidnega plamena zrak-acetilen pri naslednjih valovnih dolžinah:

Fe: 248,3 nm

Cu: 324,8 nm

Mn: 279,5 nm

Zn: 213,8 nm

Vsako merjenje izvedemo štirikrat.

5.2 Mineralna krma

Če vzorec ne vsebuje organskih snovi, je predhodno upepeljevanje nepotrebno. Nadaljujemo drugi odstavek točke 5.1.1 pod (i). Izparevanje s klorovodikovo kislino lahko izpustimo.

6. IZRAČUN REZULTATOV

Iz umeritvene krivulje izračunamo koncentracije elementov v sledovih v analizirani raztopini in izrazimo rezultat v miligramih elementov v sledovih na kilogram vzorca (ppm).

7. PONOVLJIVOST

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določevanj, ki jih na istem vzorcu izvaja isti analitik, ne sme presegati:

- 5 mg/kg, v absolutni vrednosti, za vsebnosti elementov v sledovih do 50 mg/kg;

- 10 % od višjega rezultata za vsebnosti elementov v sledovih od 50 do 100 mg/kg;

- 10 mg/kg, v absolutni vrednosti, za vsebnosti elementov v sledovih od 100 do 200 mg/kg;

- 5 % od višjega rezultata za vsebnosti elementov v sledovih nad 200 mg/kg.

8. OPOMBA

P

· 2, lahko opustimo dodatek raztopine lantanovega klorida (3.11) raztopinam za analizo in umeritev.

[1] 1 mg cinkovega bacitracina ustreza 42 mednarodnim enotam (i.u.).

[2] Uporabimo lahko tudi druge postopke, če je ugotovljeno, da dajejo podobne bakterijske suspenzije.

[3] Uporabimo lahko katero koli običajno gojišče, ki ima podobno sestavo in daje enake rezultate.

[4] Uporabimo lahko katero koli običajno gojišče, ki ima podobno sestavo in daje enake rezultate.

[5] Uporabimo lahko tudi druge postopke, če je ugotovljeno, da dajejo podobne bakterijske suspenzije.

[6] Uporabimo lahko tudi druge postopke, če je ugotovljeno, da dajejo podobne bakterijske suspenzije.

[7] Uporabimo lahko katero koli običajno gojišče, ki ima podobno sestavo in daje enake rezultate.

[8] Uporabimo lahko katero koli običajno gojišče, ki ima podobno sestavo in daje enake rezultate.

[9] Uporabimo lahko tudi druge postopke, če je ugotovljeno, da dajejo podobne bakterijske suspenzije.

[10] Zelena krma (sveža ali posušena) lahko vsebuje velike količine zelenjavnega kremena, ki lahko zadržuje elemente v sledeh in ga je treba odstraniti. Pri vzorcih takšne krme je treba uporabljati naslednji modificirani postopek. Postopek iz točke 5.1.1 pod (i) izvajamo do filtracije. Filtrirni papir, ki vsebuje netopne ostanke, dvakrat speremo z vrelo vodo in ga postavimo v platinast žarilni lonček (4.3). Sežigamo v žarilni peči (4.1) pri temperaturi pod 550 °C, dokler vse ogljikove snovi popolnoma ne izginejo. Ohladimo, dodamo nekaj kapljic vode in nato 10 do 15 ml florovodikove kisline (3.4) in izparevamo do suhega pri temperaturi približno 150 °C. Če je v ostanku še kaj kremena, ga ponovno raztopimo v nekaj mililitrih florovodikove kisline (3.4) in izparevamo, dokler ni suho. Dodamo nekaj kapljic žveplove (VI) kisline (3.5) in segrevamo do prenehanja izhajanja belih par. Ko smo dodali 5 ml 6 N klorovodikove kisline (3.2) in približno 30 ml vode, segrejemo, filtriramo raztopino v 250-mililitrsko merilno bučko in dopolnimo z vodo do oznake (koncentracija HCl približno 0,5 N). Nato nadaljujemo določanje po točki 5.1.3.

--------------------------------------------------