3.

Dodajo se naslednja poglavja: „B.49. PRESKUS MIKRONUKLEUSOV IN VITRO PRI CELICAH SESALCEV UVOD 1. Analiza mikronukleusov in vitro je preskus genotoksičnosti za odkrivanje mikronukleusov v citoplazmi interfaznih celic. Mikronukleusi lahko izvirajo iz acentričnih kromosomskih delcev (tj. brez centromere) ali celih kromosomov, ki med anafazo celične delitve ne morejo potovati na pole. Analiza odkriva delovanje kemikalij, ki povzročajo strukturne in številčne poškodbe kromosomov (klastogene in anevgene snovi in zmesi) (1) (2) v celicah, pri katerih je med izpostavljenostjo preskusni snovi ali po njej prišlo do delitve celic. Ta preskusna metoda omogoča uporabo protokolov z inhibitorjem polimerizacije aktina citohalazina B (citoB). Dodatek citohalazina B pred načrtovano mitozo omogoča določitev in selektivno analizo frekvence mikronukleusov v celicah, v katerih se je zaključila ena mitoza, ker imajo takšne celice dve jedri (3) (4). Ta preskusna metoda omogoča uporabo protokolov brez citokinetskega bloka, če obstajajo dokazi, da je pri analizirani celični populaciji prišlo do mitoze. 2. Ob uporabi analize mikronukleusov in vitro za opredelitev kemikalij (snovi in zmesi), ki spodbujajo nastanek mikronukleusov, se lahko z uporabo citokinetskega bloka, imunokemijskega označevanja kinetohor ali hibridizacije s centromerno/telomerno sondo (fluorescenčna in situ hibridizacija (FISH)) prav tako pridobijo informacije o mehanizmih poškodb kromosomov in nastanka mikronukleusov (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Postopek označevanja in hibridizacije se lahko uporabi v primeru povečanega nastajanja mikronukleusov, ko želi raziskovalec ugotoviti, ali je povečanje nastalo zaradi dogodkov, ki povzročajo strukturne in številčne poškodbe kromosomov (klastogenih in/ali anevgenih dogodkov). 3. Mikronukleusi predstavljajo poškodbo, ki je bila prenesena na hčerinske celice, pri čemer se kromosomske aberacije v metafaznih celicah ne morejo prenesti. Ker se lahko mikronukleusi v interfaznih celicah ocenijo razmeroma objektivno, mora laboratorijsko osebje ugotoviti samo, ali so se celice delile in koliko celic vsebuje mikronukleus. Zato se lahko pripravke določi razmeroma hitro, analiza pa je lahko avtomatizirana. Zaradi tega se lahko pri vsakem tretiranju oceni na tisoče namesto na stotine celic, s čimer se poveča moč analize. Ker lahko mikronukleusi nastanejo zaradi zaostalih kromosomov, obstaja možnost odkritja snovi, ki povzročajo anevploidijo in se pri klasičnih preskusih kromosomskih aberacij, glej npr. Smernico za preskušanje OECD 473 (poglavje B.10 te priloge), težko preučujejo (17). Vendar analiza mikronukleusov in vitro ne omogoča razlikovanja kemikalij, ki povzročajo poliploidijo, od tistih, ki povzročajo klastogenost, brez posebnih tehnik, kot je fluorescenčna in situ hibridizacija (FISH), opisana v odstavku 2. 4. Analiza mikronukleusov in vitro je metoda, pri kateri se običajno uporabljajo gojene človeške celice ali celice glodavcev. Zagotavlja celovito podlago za preiskovanje morebitnih poškodb kromosomov in vitro, saj lahko odkriva snovi, ki povzročajo strukturne in številčne poškodbe kromosomov (anevgene in klastogene). 5. Analiza mikronukleusov in vitro je zanesljiva in učinkovita pri različnih vrstah celic ter ob prisotnosti ali odsotnosti citohalazina B. Na voljo so obširni podatki, ki podpirajo veljavnost analize mikronukleusov in vitro pri različnih celičnih linijah glodavcev (CHO, V79, CHL/IU, in L5178Y) in človeških limfocitih (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Ti vključujejo zlasti mednarodne validacijske študije, ki jih usklajuje Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22), in poročila International Workshop on Genotoxicity Testing (4) (16). Razpoložljivi podatki so bili tudi ponovno ocenjeni v retrospektivni validacijski študiji glede zanesljivosti dokazov, ki jo je izvedel Evropski center za validacijo alternativnih metod (ECVAM) Evropske komisije, Znanstveni svetovalni odbor ECVAM (ESAC) pa je preskusno metodo potrdil kot znanstveno veljavno (32) (33) (34). Opisana je bila uporaba celičnih linij človeških limfoblastov TK6 (35), celic HepG2 (36) (37) in primarnih embrionalnih celic sirijskega hrčka (38), čeprav v validacijskih študijah niso bile uporabljene. OPREDELITVE POJMOV 6. Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1. ZAČETNI PREUDARKI 7. Pri preskusih, izvedenih in vitro, je treba običajno uporabiti zunanji vir aktivacije presnove, razen če so celice glede na snovi, ki se preskušajo, sposobne presnavljanja. Zunanji sistem aktivacije presnove ne posnema pogojev in vivo v celoti. Treba je tudi paziti, da se prepreči nastanek razmer, ki bi vodile do nepravilnih pozitivnih rezultatov, ki ne kažejo prave mutagenosti in so lahko posledica dejavnikov, kot je opazna sprememba pH ali osmolarnosti ali visoka raven citotoksičnosti (39) (40) (41). Če preskusna kemikalija v času dodajanja v medij vpliva na spremembo pH, je treba pH prilagoditi, po možnosti z dodajanjem pufra v založno raztopino, tako da vsi volumni pri vseh preskusnih koncentracijah in za vse kontrole ostanejo enaki. 8. Za analizo nastanka mikronukleusov je bistvenega pomena, da je do mitoze prišlo v tretiranih in netretiranih kulturah. Glede štetja mikronukleusov se največ podatkov pridobi s pomočjo celic, v katerih se je med tretiranjem s preskusno snovjo ali po njej zaključila ena mitoza. NAČELO PRESKUSNE METODE 9. Človeške celične kulture ali celične kulture sesalcev so izpostavljene preskusni snovi z zunanjim virom aktivacije presnove ali brez nje, razen če so uporabljene celice z ustrezno sposobnostjo presnavljanja. V vsak preskus so vključene primerjalne (topilo/nosilec) kemikalije in kemikalije pozitivne kontrole. 10. Med izpostavljenostjo preskusni snovi ali po njej se celice gojijo tako dolgo, dokler zaradi poškodbe kromosoma ali vretena v interfaznih celicah ne pride do nastanka mikronukleusov. Za nastanek anevploidije mora biti med mitozo navadno prisotna preskusna snov. Odvzete in obarvane interfazne celice se analizirajo glede prisotnosti mikronukleusov. Po možnosti se mikronukleuse šteje samo v tistih celicah, v katerih je med izpostavljenostjo preskusni snovi ali v obdobju po izpostavljenosti, če se uporabi, prišlo do mitoze. V kulturah, ki so bile tretirane s citokinetskim blokom, se to doseže s štetjem samo celic z dvema jedroma. Če citokinetski blok ni bil uporabljen, je treba dokazati, da bi pri analiziranih celicah verjetno prišlo do deljenja celic med izpostavljenostjo preskusni snovi ali po njej. Pri vseh protokolih je treba dokazati, da je do množenja celic prišlo v kontrolnih in tretiranih kulturah, v kulturah (ali vzporednih kulturah), pri katerih se štejejo mikronukleusi, pa je treba oceniti obseg citotoksičnosti ali citostaze, ki je nastala zaradi preskusne snovi. OPIS ANALIZE Pripravki 11. Lahko se uporabijo gojeni primarni človeški limfociti periferne krvi (5) (19) (42) (43) in številne celične linije glodavcev, kot so celice CHO, V79, CHL/IU, in L5178Y (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Uporabo drugih celičnih linij in vrst je treba utemeljiti na podlagi njihove dokazane učinkovitosti v analizi, kot je opisano v oddelku Merila za sprejemljivost. Ker pogostost mikronukleusov v ozadju vpliva na občutljivost analize, se priporoča uporaba celičnih vrst z nizko, stabilno pogostostjo nastajanja mikronukleusov v ozadju. 12. Človeški limfociti periferne krvi se pridobijo od mladih (starih približno 18–35 let), zdravih posameznikov, ki ne kadijo in ki v zadnjem času niso bili izpostavljeni genotoksičnim kemikalijam ali sevanju. Če so za uporabo zbrane celice od več kot enega donatorja, je treba določiti število donatorjev. Pogostost mikronukleusov se povečuje z leti, ta trend pa je bolj opazen pri ženskah kot pri moških (44), kar je treba pri upoštevati pri izbiri donorskih celic. Gojišča in pogoji gojenja 13. Pri vzdrževanju kultur se uporabijo ustrezna gojišča za kulture in pogoji inkubacije (posode za kulture, koncentracija CO2, temperatura in vlažnost). Trajne celične linije in sevi se redno preverjajo, ali je v njih modalno kromosomsko število stabilno in ali niso okužene z mikoplazmo; okužene celične linije in sevi naj se ne uporabljajo. Poznati je treba običajni čas celičnega ciklusa za pogoje gojenja, ki se uporabljajo v preskuševalnem laboratoriju. Če se uporablja metoda citokinetskega bloka, mora biti koncentracija citokinetskega inhibitorja prilagojena določeni vrsti celic in dokazano mora biti, da zagotavlja dober izkoristek celic z dvema jedroma za štetje. Priprava kultur 14. Trajne celične linije in sevi: celice se namnožijo iz založnih kultur, nasadijo v gojišče tako na gosto, da kultura ne bo dosegla konfluentne rasti v enojnih plasteh in kulture suspenzije ne bodo dosegle prevelike gostote preden se požanjejo, in se inkubirajo pri 37 °C. 15. Limfociti: celotna kri, tretirana z antikoagulantom (npr. heparinom), ali ločeni limfociti, so gojeni ob prisotnosti mitogena, npr. fitohemaglutinina (PHA) pred izpostavljenostjo preskusni snovi in citohalazinu B. Aktivacija presnove 16. Pri uporabi celic z neustrezno notranjo sposobnostjo presnavljanja je treba uporabiti zunanje presnovne sisteme. Najpogosteje uporabljani sistem je postmitohondrijska frakcija z dodanim kofaktorjem (S9), pripravljena iz jeter glodavcev, ki so bila tretirana s sredstvi za encimsko indukcijo, kot je Aroclor 1254 (45) (46), ali z zmesjo fenobarbitona in β-naftoflavona (46) (47) (48) (49). Slednja kombinacija ni v nasprotju s Stockholmsko konvencijo o obstojnih organskih onesnaževalih (50) in Uredbo (ES) št. 850/2004 o obstojnih organskih onesnaževalih (66), za nastanek oksidaz z mešano funkcijo pa se je v primerjavi s sredstvom Aroclor 1254 izkazala kot enako učinkovita (46) (47) (48) (49). Postmitohondrijska frakcija se običajno uporablja v koncentracijah 1–10 % (v/v) v končnem preskusnem gojišču. Pogoji sistema za aktivacijo presnove so lahko odvisni od skupine preskušane kemikalije in včasih je primerno uporabiti več kot eno koncentracijo S9. 17. Gensko spremenjene celične linije, v katerih se izražajo geni za točno določene aktivirajoče človeške encime ali encime glodavcev, lahko odpravijo potrebo po zunanjem sistemu aktivacije presnove in se lahko uporabijo kot preskusne celice. V takih primerih mora biti izbira uporabljenih celičnih linij znanstveno utemeljena, npr. s pomembnostjo oksidaze z mešano funkcijo za presnovo preskusne snovi (51) in njihovo odzivnostjo na znane snovi, ki povzročajo strukturne in številčne poškodbe kromosomov (anevgene in klastogene) (glej oddelek Merila za sprejemljivost). Priznati je treba, da izražene oksidaze z mešano funkcijo morda ne bodo presnavljale snovi, ki se preskuša; v takem primeru negativni rezultati ne bi pomenili, da preskusna snov ne more spodbuditi nastanka mikronukleusov. Priprava preskusne snovi 18. Trdne kemikalije se pred obdelavo celic raztopijo v ustreznih topilih ali nosilcih, in po potrebi razredčijo. Tekoče kemikalije se lahko dodajo neposredno v preskusni sistem in/ali se pred obdelavo razredčijo. Plinaste ali hlapne kemikalije je treba preskušati z ustrezno spremenjenimi običajnimi protokoli, kot je obdelava v zatesnjenem nosilcu (52) (53). Uporabljajo se sveže pripravljene preskusne snovi, razen če podatki o stabilnosti kažejo, da je shranjevanje sprejemljivo. Preskusni pogoji Topilo/nosilec 19. Topilo/nosilec ne sme reagirati v stiku s preskusno snovjo, prav tako pa mora biti pri uporabljeni koncentraciji združljivo s preživetjem celic ali ohranjanjem delovanja S9. Če se uporabijo manj znana topila/nosilci (npr. voda, gojišče celic, dimetil sulfoksid), morajo njihovo uporabo podpirati podatki, ki kažejo na njihovo združljivost s preskusno snovjo in njihovo pomanjkanje genotoksičnosti. Priporoča se, da je, kadar koli je to mogoče, prva izbira vodno topilo/nosilec. Uporaba citohalazina B kot citokinetskega bloka 20. Eden od najpomembnejših dejavnikov pri učinkovitosti analize mikronukleusov in vitro je zagotavljanje, da je v celicah, ki se bodo štele, med izpostavljenostjo preskusni snovi ali v obdobju inkubacije po izpostavljenosti, če se uporabi, prišlo do mitoze. Citohalazin B je snov, ki se najbolj pogosto uporablja za blokado citokineze, ker povzroča sestavljanje aktina in tako preprečuje ločevanje hčerinskih celic po mitozi, zaradi česar nastanejo celice z dvema jedroma (5) (54) (55). Štetje mikronukleusov je tako lahko omejeno na celice, pri katerih je med obdelavo ali po njej prišlo do mitoze. Učinek preskusne snovi na kinetiko množenja celic se lahko meri istočasno. Citohalazin B se kot citokinetski blok uporablja takrat, kadar se uporabljajo človeški limfociti, ker se trajanje celičnih ciklov razlikuje od kulture do kulture in od donatorja do donatorja, vsi limfociti pa se ne odzivajo na fitohemaglutinin (PHA). Pri preskušanju celičnih linij so bile uporabljene tudi druge metode za ugotavljanje, ali so se štete celice delile; te metode so obravnavane v nadaljevanju (glej odstavek 26). 21. Laboratorij za vsako vrsto celic določi ustrezno koncentracijo citohalazina B, da doseže optimalno pogostost celic z dvema jedroma v kontrolnih kulturah s topilom/nosilcem. Ustrezna koncentracija citohalazina B je običajno med 3 in 6 μg/ml. Merjenje množenja celic in citotoksičnosti ter izbira koncentracij izpostavljenosti 22. Pri določanju najvišje koncentracije preskusne snovi, ki se bo preskušala, se je treba izogibati koncentracijam, pri katerih se lahko pojavijo nepravilni pozitivni odzivi, na primer koncentracijam, pri katerih se pojavijo čezmerna citotoksičnost, obarjanje v gojiščih in opazne spremembe pH ali osmolarnosti (39) (40) (41). 23. Izvedejo se meritve množenja celic, s čimer se zagotovi, da je v tretiranih celicah med analizo prišlo do mitoze in da je obdelava izvedena na ustreznih ravneh citotoksičnosti (glej odstavek 29). Citotoksičnost se določa z aktivacijo presnove in brez nje v celicah, pri katerih je aktivacija presnove potrebna, in sicer z uporabo relativnega povečanja števila celic (relative increase in cell counts, RICC) ali relativne podvojitve populacije (relative population doubling, RPD) (glej Dodatek 2 za formule), razen če se uporabi citohalazin B. Če se uporabi citohalazin B, se lahko citotoksičnost določi z indeksom pomnoževanja (RI) (glej Dodatek 2 za formulo). 24. Obdelava kultur s citohalazinom B in merjenje relativne pogostosti celic z enim, dvema ali več jedri v kulturi zagotavljata natančno metodo za količinsko opredelitev učinka na množenje celic in citotoksično ali citostatično delovanje obdelave (5) ter zagotavljata, da so preštete samo celice, pri katerih je prišlo do delitve med obdelavo ali po njej. 25. V študijah s citohalazinom B se lahko citostaza/citotoksičnost količinsko opredeli s pomočjo indeksa množenja citokinetskega bloka (cytokinesis-block proliferation index, CBPI) (5) (26) (56) ali določi s pomočjo indeksa pomnoževanja iz vsaj 500 celic na kulturo (glej Dodatek 2 za formule). Kadar se za oceno množenja celic uporablja citohalazin B, je treba CBPI ali RI določiti na podlagi vsaj 500 celic na kulturo. Te meritve se lahko poleg drugih uporabijo za oceno citotoksičnosti tako, da se primerjajo vrednosti v tretiranih in kontrolnih kulturah. Z oceno drugih označevalcev citotoksičnosti (npr. konfluentnost, število celic, apoptoza, nekroza, štetje v metafazi) se lahko pridobijo koristne informacije. 26. V študijah brez citohalazina B je treba dokazati, da so se celice, preštete v kulturi, delile med obdelavo s preskusno snovjo ali po njej; v nasprotnem primeru lahko pride do lažnih negativnih odzivov. Metode, ki so bile uporabljene za zagotavljanje, da so deljene celice štete, obsegajo vključitev in naknadno odkrivanje bromdeoksiuridina (BrdU) za določitev celic, ki so se podvojile (57), tvorbo klonov, kadar so celice iz stalnih celičnih linij tretirane in štetein situ na stekelcu mikroskopa (indeks množenja (PI)) (25) (26) (27) (28), oziroma merjenje relativne podvojitve populacije (RPD) ali relativnega povečanja števila celic (RICC) ali druge preverjene metode (16) (56) (58) (59) (glej Dodatek 2 za formule). Z oceno drugih označevalcev citotoksičnosti ali citostaze (npr. konfluentnost, število celic, apoptoza, nekroza, štetje v metafazi) se lahko pridobijo koristne informacije. 27. Ocenijo se vsaj tri koncentracije, ki jih je mogoče analizirati. Da bi to dosegli, bo morda treba poskus izvesti z uporabo večjega števila koncentracij, ki so tesno skupaj, in analizirati tvorbo mikronukleusov v teh koncentracijah, ki zagotavljajo ustrezen razpon citotoksičnosti. Druga strategija je izvedba predhodnega preskusa citotoksičnosti, da se zoži razpon za končni preskus. 28. Najvišja koncentracija naj proizvede 55 ± 5 % citotoksičnost. Višje ravni lahko povzročijo poškodbo kromosomov kot drugotni učinek citotoksičnosti (60). Ko se citotoksičnost pojavi, naj izbrane preskusne koncentracije obsegajo razpon od tiste, ki povzroči 55 ± 5 % citotoksičnost, do tistih, ki povzročijo majhno citotoksičnost ali je sploh ne povzročijo. 29. Če toksičnost ali oborina nista opaženi, mora najvišja preskusna koncentracija ustrezati 0,01 M, 5 mg/ml ali 5 μl/ml, pri čemer se upošteva nižja od obeh vrednosti. Koncentracije, izbrane za analizo, se lahko na splošno razlikujejo za največ 10. Pri preskusnih snoveh, ki kažejo strmo krivuljo odziva na koncentracijo, je morda potrebna manjša razlika med koncentracijami, tako da se štejejo tudi kulture v zmernem in nizkem razponu toksičnosti. 30. Kadar je topnost omejitveni dejavnik, mora biti najvišja koncentracija, če ni omejena s citotoksičnostjo, najnižja koncentracija, pri kateri je v kulturah vidna najmanjša možna oborina, če pri štetju ni nobenih interferenc. Ocena oborine se izvede z metodami, kot je pregled s svetlobnim mikroskopom, s katerim se opazi oborino, ki ostaja ali se pojavi med gojenjem (do konca obdelave). Kontrolni vzorci 31. V vsak poskus se vključijo primerjalni pozitivni kontrolni vzorci in kontrolni vzorci s topilom/nosilcem, ob aktivaciji presnove in brez nje. 32. Pozitivni kontrolni vzorci so potrebni za dokaz sposobnosti uporabljenih celic, protokol preskusa pa za opredelitev snovi, ki povzročajo strukturne in številčne poškodbe kromosomov (anevgene in klastogene) ter potrditev sposobnosti presnavljanja pripravka S9. Pozitivni kontrolni vzorci morajo uporabiti znane povzročitelje tvorbe mikronukleusov pri koncentracijah, pri katerih se pričakuje majhno, vendar ponovljivo povečanje glede na ozadje, ki pokaže občutljivost preskusnega sistema. Koncentracije pozitivne kontrole naj se izberejo tako, da so učinki jasni, vendar ne razkrijejo takoj identitete kodiranih mikroskopskih preparatov. 33. Za prikaz sposobnosti presnavljanja in zmožnosti sistema, da odkriva klastogene, je treba uporabiti klastogen, pri katerem je potrebna aktivacija presnove (npr. ciklofosfamid; benzo[a]piren). Uporabijo se lahko tudi druge ustrezne snovi pozitivne kontrole, če je to utemeljeno. Ker so lahko nekateri pozitivni kontrolni vzorci, ki potrebujejo aktivacijo presnove, v določenih pogojih obdelave ali določenih celičnih linijah aktivni brez zunanje aktivacije presnove, je treba potrebo po aktivaciji presnove in delovanje pripravka S9 preskusiti na izbrani celični liniji in z izbranimi koncentracijami. 34. Trenutno niso znani nobeni anevgeni, ki bi za svojo genotoksično delovanje potrebovali aktivacijo presnove (16). Trenutno uveljavljeni pozitivni kontroli za anevgeno delovanje sta, na primer, kolhicin in vinblastin. Druge kemikalije se lahko uporabijo, če vplivajo na nastanek mikronukleusov izključno ali v glavnem preko anevgenega delovanja. Da bi se izognili uporabi dveh pozitivnih kontrolnih vzorcev (za klastogenost in anevgenost) brez aktivacije presnove, je lahko kontrola anevgenosti pozitivna kontrola brez S9, kontrola klastogenosti pa se lahko uporablja za preskus ustreznosti uporabljenega sistema za aktivacijo presnove. Pozitivno kontrolo za klastogenost in anevgenost je treba uporabiti pri celicah, pri katerih uporaba S9 ni potrebna. Priporočeni pozitivni kontrolni vzorci so navedeni v Dodatku 3. 35. Če so na voljo ustrezne kemikalije, se lahko preuči možnost uporabe pozitivnih kontrol, ki sodijo v isto skupino kemikalij. Vsi uporabljeni pozitivni kontrolni vzorci morajo ustrezati vrsti celic in pogojem aktivacije. 36. Za vsak odvzem se pripravijo kontrolni vzorci, ki jih sestavlja le topilo ali nosilec. Uporabijo se tudi netretirani kontrolni vzorci, razen če objavljeni ali laboratorijski pretekli kontrolni podatki dokazujejo, da izbrano topilo pri uporabljenih koncentracijah ne povzroča genotoksičnih ali škodljivih učinkov. PRESKUSNI POSTOPEK Program tretiranja 37. Da bi bila verjetnost odkritja snovi, ki povzročajo številčne in strukturne poškodbe kromosomov (anevgene in klastogene snovi) ter delujejo v določeni fazi celičnega cikla, čim večja, mora biti s preskusno snovjo tretirano zadostno število celic v vseh fazah njihovih celičnih ciklov. Program tretiranja celičnih linij in primarnih celičnih kultur se lahko zato nekoliko razlikuje od tistega za limfocite, pri katerih je za začetek celičnega cikla potrebna stimulacija z mitogenom, kar je obravnavano v odstavkih 41–43 (16). 38. Teoretični premisleki skupaj z objavljenimi podatki (18) kažejo, da je večina snovi, ki povzročajo številčne in strukturne poškodbe kromosomov (anevgene in klastogene snovi) odkritih s kratkoročnim obdobjem tretiranja, ki traja 3 do 6 ur z dodanim pripravkom S9 ali brez, ki mu sledita odvzem preskusne snovi in obdobje rasti 1,5–2,0 celičnih ciklov (6). Celice se vzorčijo v času, ki je enak približno 1,5–2,0 dolžinama običajnega (tj. netretiranega) celičnega cikla po začetku ali ob koncu tretiranja (glej preglednico 1). Čas vzorčenja ali obnavljanja se lahko podaljša, če je znano ali se sumi, da preskusna snov vpliva na dolžino celičnega cikla (npr. pri preskušanju nukleozidnih analogov). 39. Zaradi morebitne citotoksičnosti pripravkov S9 za kultivirane celice sesalcev se podaljšana izpostavljenost v dolžini 1,5–2,0 običajnih celičnih ciklov uporablja samo, če S9 ni dodan. Pri podaljšanem tretiranju so na voljo možnosti, ki omogočajo tretiranje celic s preskusno kemikalijo z dodanim citohalazinom B ali brez njega. Te možnosti so namenjene primerom, kjer se lahko pojavi zaskrbljenost glede morebitnih interakcij med preskusno snovjo in citohalazinom B. 40. Priporočeni programi tretiranja celic so predstavljeni v preglednici 1. Ti splošni programi tretiranja se lahko prilagodijo glede na stabilnost ali reaktivnost preskusne snovi ali določenih značilnosti rasti uporabljenih celic. Vsa tretiranja se morajo začeti in končati med eksponentno rastjo celic. Ti programi so podrobneje predstavljeni v odstavkih 41–47, ki sledijo. Preglednica 1 Obdobja tretiranja in odvzema celic za analizo mikronukleusov in vitro Limfociti, primarne celice in celične linije, tretirane s citohalazinom B + S9 Obdelava traja 3–6 ur z dodanim S9; odstranita se S9 in obdelovalno gojišče; dodata se sveže gojišče in citohalazin B; celice se odvzamejo po 1,5–2,0 običajnih celičnih ciklih. – S9 kratka izpostavljenost Obdelava traja 3–6 ur; odstrani se obdelovalno gojišče; dodata se sveže gojišče in citohalazin B; celice se odvzamejo po 1,5–2,0 običajnih celičnih ciklih. – S9 daljša izpostavljenost Možnost A: obdelava traja 1,5–2 dolžini običajnega celičnega cikla z dodanim citohalazinom B; celice se odvzamejo ob koncu obdobja izpostavljenosti. Možnost B: obdelava traja 1,5–2,0 običajna celična cikla; odstrani se preskusna snov; dodata se sveže gojišče in citohalazin B; celice se odvzamejo po 1,5–2,0 običajnih celičnih ciklih. Celične linije, tretirane brez citohalazina B (enako kot opisani programi tretiranja, vendar brez dodajanja citohalazina B) Limfociti, primarne celice in celične linije, tretirane s citohalazinom B 41. Pri limfocitih je najučinkovitejši pristop z začetekom izpostavljenosti preskusni snovi 44–48 ur po stimulaciji fitohemaglutinina (PHA), ko ni več sinhronizacije ciklov (5). V prvotni analizi se celice obdelujejo 3 do 6 ur s preskusno snovjo z dodanim S9 ali brez njega. Obdelovalno gojišče se odstrani in nadomesti s svežim gojiščem, ki vsebuje citohalazin B, celice pa se odvzamejo čez 1,5–2,0 dolžini običajnega celičnega cikla. 42. Če sta oba prvotna preskusa pri kratki obdelavi (3–6 ur) negativna ali dvoumna, se izvede nadaljnja obdelava z daljšo izpostavljenostjo brez S9. Na voljo sta dve možnosti obdelave, ki sta enako sprejemljivi. Vendar je za stimuliranje limfocitov, pri katerih se lahko eksponentna rast po 96 urah po stimulaciji zmanjšuje, morda primernejša možnost A. Pri možnosti B celične kulture do končnega časa vzorčenja ne smejo postati strjene. — Možnost A: celice se s preskusno snovjo obdelujejo 1,5–2,0 dolžini običajnih celičnih ciklov in odvzamejo ob koncu obdelave. — Možnost B: celice se s preskusno snovjo obdelujejo 1,5–2,0 dolžini običajnega celičnega cikla. Obdelovalno gojišče se odstrani in nadomesti s svežim gojiščem, celice pa se odvzamejo po dodatnih 1,5–2,0 dolžinah običajnega celičnega cikla. 43. Primarne celice in celične linije se obdelajo na podoben način kot limfociti, vendar stimulacija s PHA 44–48 ur ni potrebna. Celice, ki niso limfociti, morajo biti izpostavljene tako, da so ob končani študiji še vedno v logaritemski fazi rasti. Celične linije, tretirane brez citohalazina B 44. Celice se obdelujejo 3–6 ur z dodanim S9 in brez njega. Obdelovalno gojišče se odstrani in nadomesti s svežim gojiščem, celice pa se odvzamejo čez 1,5–2,0 dolžini običajnega celičnega cikla. 45. Če sta oba prvotna preskusa pri kratki obdelavi (3–6 ur) negativna ali dvoumna, se izvede nadaljnja obdelava z daljšo izpostavljenostjo (brez S9). Na voljo sta dve možnosti obdelave, ki sta enako sprejemljivi: — Možnost A: celice se s preskusno snovjo obdelujejo 1,5–2,0 dolžini običajnega celičnega cikla in odvzamejo ob koncu obdelave. — Možnost B: celice se s preskusno snovjo obdelujejo 1,5–2,0 dolžini običajnega celičnega cikla. Obdelovalno gojišče se odstrani in nadomesti s svežim gojiščem, celice pa se odvzamejo po dodatnih 1,5–2,0 dolžinah običajnega celičnega cikla. 46. V enojnih plasteh so lahko po zaključku 3–6 ur trajajoče obdelave prisotne mitotične celice (so okrogle in se ločujejo od površine). Ker se te mitotične celice zlahka ločijo, se jih lahko ob odstranitvi gojišča s preskusno snovjo izgubi. Pri spiranju kultur se jih odvzame, nato pa vrne v kulture, pri čemer je treba paziti, da se v času odvzema ne izgubijo celice, pri katerih poteka mitoza in pri katerih obstaja tveganje nastanka mikronukleusa. Število kultur 47. Za vsako koncentracijo preskusne snovi ter kulture z nosilcem/topilom in kulture negativne kontrole se uporabita dve vzporedni kulturi. Kadar se na podlagi preteklih podatkov laboratorija lahko dokaže, da so razlike med dvema vzporednima kulturama minimalne, je sprejemljivo, da se uporabi ena kultura. Če se uporabi ena kultura, se priporoča, da se analizira večje število koncentracij. Odvzem celic in priprava mikroskopskih preparatov 48. Vsaka kultura se odvzame in obdela ločeno. Priprava celic lahko vključuje hipotonično obdelavo, vendar to ni potrebno, če se ustrezno širjenje celic doseže tudi drugače. Pri pripravi mikroskopskih preparatov se lahko uporabijo različne tehnike, če se za štetje pridobi pripravke s celicami visoke kakovosti. Zadržati je treba citoplazmo celic, kar omogoči odkrivanje mikronukleusov in (pri metodi s citokinetskim blokom) zanesljivo identifikacijo celic z dvema jedroma. 49. Mikroskopske preparate se lahko obarva z različnimi metodami, kot so Giemsa ali DNA-specifična flourescentna barvila (59). Uporaba DNA-specifičnega barvila (npr. akridin oranž (61) ali Hoechst 33258 plus pyronin-Y (62)) lahko prepreči nastanek nekaterih artefaktov, povezanih z uporabo barvila, ki ni specifično za DNA. Za opredelitev vsebine (kromosom/kromosomski delec) mikronukleusov, če so potrebne mehanske informacije o njihovi tvorbi, se lahko uporabi kinetohorno protitelo, fluorescentna in situ hibridizacija (FISH) s sondami DNA za centromere ali primarno označevanje in situ s premazi, specifičnimi za centromere, skupaj z ustreznim nasprotnim barvanjem DNA (15) (16). Za razlikovanje med snovmi, ki povzročajo strukturne in številčne poškodbe kromosomov (anevgeni in klastogeni), se lahko uporabijo druge metode, če so se izkazale za učinkovite. Analiza 50. Vse preparate se, skupaj z vzorci s topilom/nosilcem in kontrolnimi vzorci, pred mikroskopsko analizo neodvisno kodira. Namesto tega se lahko kodirane vzorce analizira s pomočjo validiranega, avtomatiziranega sistema za pretočno citometrično analizo ali slikovno analizo. 51. Pri kulturah, tretiranih s citohalazinom B, je treba pogostost mikronukleusov analizirati v vsaj 2 000 celicah z dvema jedroma na koncentracijo (vsaj 1 000 celic z dvema jedroma na kulturo; dve kulturi na koncentracijo). Če se uporabi ena kultura, je treba iz te kulture oceniti vsaj 2 000 celic z dvema jedroma na koncentracijo. Če je za štetje pri vsaki koncentraciji uporabljenih precej manj kot 1 000 celic z dvema jedroma na kulturo ali 2 000 celic z dvema jedroma v primeru ene kulture in če ni ugotovljeno znatno povečanje števila mikronukleusov, je treba preskus ponoviti z več celicami ali z manj toksičnimi koncentracijami, kar je primerneje. Paziti je treba, da se ne šteje celic z dvema jedroma, ki so nepravilne oblike ali pri katerih se velikost dveh jeder precej razlikuje; prav tako se celic z dvema jedroma ne sme zamenjevati s slabo razširjenimi celicami z več jedri. Celice, ki imajo več kot dve glavni jedri, se ne analizirajo glede mikronukleusov, saj je lahko izhodiščna pogostost mikronukleusov v teh celicah višja (63) (64). Štetje celic z enim jedrom je sprejemljivo, če je za preskusno snov znano, da vpliva na delovanje citohalazina B. 52. V celičnih linijah, analiziranih brez tretiranja s citohalazinom B, se mikronukleuse šteje v vsaj 2 000 celicah na koncentracijo (vsaj 1 000 celic na kulturo; dve kulturi na koncentracijo). Če se uporabi samo eno kulturo na koncentracijo, se pri tej kulturi oceni vsaj 2 000 celic. 53. Ko je uporabljen citohalazin B, je treba za oceno množenja celic določiti CBPI ali RI (glej Dodatek 2) na podlagi vsaj 500 celic na kulturo. Kadar se tretiranje izvaja brez dodanega citohalazina B, je treba zagotoviti dokaz, da so se štete celice množile, kot je obravnavano v odstavkih 24–27. Merila za sprejemljivost 54. Laboratorij, ki predlaga uporabo analize mikronukleusov in vitro, opisano v tej preskusni metodi, mora z uporabo referenčnih kemikalij iz Dodatka 3 dokazati svojo sposobnost, da zanesljivo in natančno odkrije kemikalije, za katere je znano, da povzročajo številčne in strukturne poškodbe kromosomov (anevgeno in klastogeno delovanje), z aktivacijo presnove in brez nje, pa tudi znane negativne kemikalije. Kot dokaz za zmožnost laboratorija, da pravilno izvede to preskusno metodo, mora laboratorij zagotoviti dokaze, da se je pri celicah, ki se jih šteje glede tvorbe mikronukleusov, zaključila ena delitev jedra, če se preskus izvaja brez uporabe citohalazina B. 55. Kemikalije iz Dodatka 3 se priporoča kot referenčne kemikalije. Lahko se vključi nadomestne ali dodatne kemikalije, če je njihovo delovanje znano, če spodbujajo tvorbo mikronukleusov z enakimi mehanizmi delovanja in če se zanje izkaže, da so pomembne v zvezi s kemikalijami, ki se bodo preskušale z uporabo postopka analize mikronukleusov in vitro. Utemeljitev bi lahko vključevala validacijsko študijo, pri kateri so uporabljene številne različne snovi, oziroma študijo, osredotočeno na ožji spekter, ki temelji na kemijskem razredu preskusne snovi ali mehanizmu škode, ki se preučuje. 56. Kontrolne kulture s topilom/nosilcem in netretirane kulture naj bi dale ponovljivo nizko in dosledno pogostost mikronukleusov (običajno 5–25 mikronukleusov/1 000 celic za vrste celic, opredeljene v odstavku 11). Druge vrste celic imajo lahko različne razpone odzivov, ki jih je treba določiti pri validaciji za uporabo pri analizi mikronukleusov in vitro. Za določitev preteklih kontrolnih razponov je treba uporabiti podatke, pridobljene z negativno kontrolo, kontrolo s topilom in pozitivno kontrolo. Te vrednosti se uporabijo pri odločanju o ustreznosti primerjalne negativne/pozitivne kontrole za poskus. 57. Če so za analizo predlagane manjše spremembe protokola (npr. avtomatizirano štetje namesto ročnih tehnik štetja; uporaba nove vrste celic), se pred sprejetjem spremenjenega protokola za uporabo najprej dokaže učinkovitost spremembe. Dokaz učinkovitosti vključuje dokaz, da se lahko odkrije glavne mehanizme preloma kromosomov in pridobitev ali izgubo ter da se lahko za razred posamezne snovi ali številnih različnih snovi, ki se bodo preskušale, pridobi ustrezne pozitivne in negativne rezultate. PODATKI IN POROČANJE Obdelava rezultatov 58. Če se uporabi tehnika citokinetskega bloka, se pri ocenjevanju nastajanja mikronukleusov uporabi samo pogostost celic z dvema jedroma z mikronukleusi (ne glede na število mikronukleusov na celico). Štetje celic z enim, dvema ali več mikronukleusi bi lahko zagotovilo koristne informacije, vendar ni obvezno. 59. Določiti je treba sočasne meritve citotoksičnosti in/ali citostaze za vse tretirane kulture in kontrolne kulture s topilom/nosilcem (58). Pri uporabi metode citokinetskega bloka je treba za vse tretirane in kontrolne kulture izračunati CBPI ali RI kot merili zakasnitve celičnega cikla. Če citohalazin B ni dodan, se uporabi relativna podvojitev populacije (RPD) ali relativno povečanje števila celic (RICC) ali indeks množenja (glej Dodatek 2). 60. Navedejo se podatki za posamezne kulture. Poleg tega se podatki povzamejo v obliki preglednice. 61. Kemikalije lahko pri analizi mikronukleusov in vitro povzročijo nastanek mikronukleusov zato, ker povzročajo prelom kromosomov, izgubo kromosomov ali pa oboje hkrati. Za ugotovitev, ali je mehanizem za nastajanje mikronukleusov posledica delovanja, ki povzroča strukturne in številčne poškodbe kromosomov (klastogenega in/ali anevgenega delovanja), se lahko izvede nadaljnja analiza z uporabo antikinetohornih protiteles, in situ sond, specifičnih za centromere, ali drugih metod. Vrednotenje in razlaga rezultatov 62. Ni zahteve po potrjevanju jasnega pozitivnega ali negativnega odziva z dodatnimi preskusi. Dvoumni rezultati se lahko pojasnijo z analizo dodatnih 1 000 celic iz vseh kultur, zaradi česar ne pride do izgube slepih vzorcev. Če ta pristop ne pomaga pri spremembi rezultata, je treba izvesti nadaljnje preskušanje. V nadaljnjih poskusih naj se preuči možnost prilagoditve razširjenega ali zožanega razpona preskusnih parametrov, kot je primerno. Preskusni parametri, ki se lahko spremenijo, vključujejo razmik med preskusnimi koncentracijami, časovno razporeditev obdelave in odvzema celic in/ali pogoje za aktivacijo presnove. 63. Pozitivni rezultat se lahko določi na podlagi številnih meril, kot je na primer s koncentracijo povezano povečanje ali statistično značilno povečanje števila celic z mikronukleusi. Najprej naj se preuči biološka pomembnost rezultatov. Upoštevanje tega, ali so dobljene vrednosti v razponu preteklih kontrol ali zunaj njega, lahko zagotovi smernice pri ocenjevanju biološke pomembnosti odziva. Pri vrednotenju rezultatov preskusa se kot pomoč lahko uporabijo ustrezne statistične metode (65). Vendar je treba rezultate statističnega preskušanja oceniti z upoštevanjem odnosa med odmerkom in odzivom. Upoštevati je treba tudi ponovljivost in pretekle podatke. 64. Čeprav bo večina poskusov dala jasne pozitivne ali negativne rezultate, bodo v nekaterih primerih dobljeni podatki preprečili zanesljivo oceno o delovanju preskusne snovi. Ti dvoumni ali dvomljivi odzivi se lahko pojavijo ne glede na število ponovitev poskusa. 65. Pozitivni rezultati analize mikronukleusov in vitro pomenijo, da v kultiviranih celicah sesalcev preskusna snov povzroča prelome ali izgubo kromosomov. Negativni rezultati pomenijo, da preskusna snov pri uporabljenih preskusnih pogojih ne povzroča preloma kromosomov in/ali pridobitve ali izgube v uporabljenih kultiviranih sesalskih celicah. Poročilo o preskusu 66. Poročilu o preskusu vsebuje vsaj naslednje informacije (če so pomembne za izvedbo študije): Preskusna kemikalija: — identifikacijske podatke in registrsko številko Službe za izmenjavo kemijskih izvlečkov ter številko EC, — agregatno stanje in čistost, — fizikalno-kemijske lastnosti, pomembne za izvedbo študije, — reagiranje preskusne kemikalije s topilom/nosilcem ali gojiščem celic; Topilo/nosilec: — utemeljitev izbire topila/nosilca, — topnost in stabilnost preskusne snovi v topilu/nosilcu; Celice: — vrsto in izvor uporabljenih celic, — ustreznost uporabljene vrste celic, — odsotnost mikoplazme, če je to primerno, — informacije o trajanju celičnega cikla, podvojitvenem času ali indeksu množenja, — kadar so uporabljeni limfociti, spol, starost in število donatorjev krvi, če je primerno, — kadar so uporabljeni limfociti, ali je izpostavljena kri v celoti ali ločeni limfociti, — število pasaž, če je primerno, — metode vzdrževanja celičnih kultur, če je primerno, — modalno število kromosomov, — običajno (negativna kontrola) trajanje celičnega cikla; Preskusni pogoji: — identiteto citogenetskega bloka (npr. cytoB), če je uporabljen, njegovo koncentracijo in trajanje izpostavljenosti celic, — razloge za izbiro koncentracij in števila kultur, vključno s podatki o citotoksičnosti in mejah topnosti, če so na voljo, — sestavo gojišč, koncentracijo CO2, če je primerno, — koncentracije preskusne snovi, — koncentracije (in/ali volumen) nosilca in dodane preskusne snovi, — inkubacijsko temperaturo in čas trajanja inkubacije, — trajanje obdelave, — odvzem po obdelavi, — gostoto celic ob nasaditvi, če je primerno, — vrsto in sestavo sistema za aktivacijo presnove, skupaj z merili za sprejemljivost, — kemikalije pozitivne kontrole in negativne kontrole, — metode priprave mikroskopskih preparatov in uporabljene tehnike barvanja, — merila za identifikacijo mikronukleusov, — števila analiziranih celic, — metode merjenja citotoksičnosti, — morebitne dodatne informacije v zvezi s citotoksičnostjo, — merila za določanje študij kot pozitivnih, negativnih ali dvoumnih, — uporabljene metode statistične analize, — metode, kot je uporaba kinetohornega protitelesa, za ugotavljanje, ali mikronukleusi vsebujejo cele kromosome ali le delce kromosomov, če je primerno; Rezultati: — meritev uporabljene citotoksičnosti, npr CBPI ali RI v primeru metode citokinetskega bloka; RICC, RPD ali PI v primerih, ko metode citokinetskega bloka niso uporabljene; druge ugotovitve, če je primerno, npr. konfluentnost celic, apoptozo, nekrozo, štetje v metafazi, pogostost celic z dvema jedroma, — znake obarjanja, — podatke o pH in osmolarnosti obdelovalnega gojišča, če sta bila določena, — opredelitev sprejemljivih celic za analizo, — porazdelitev celic z enim, dvema ali več jedri v primeru uporabe metode citokinetskega bloka, — število celic z mikronukleusum, podanih ločeno za vsako tretirano in kontrolno kulturo, ter po potrebi opredelitev, ali so iz celic z dvema ali enim jedrom, — odvisnost med koncentracijo in odzivom, kadar je mogoče, — kemijske podatke o primerjalni negativni (topilo/nosilec) in pozitivni kontroli (koncentracije in topila), — pretekle kemijske podatke o negativni (topilo/nosilec) in pozitivni kontroli, skupaj z razponi, povprečji in standardnim odstopanjem ter intervalom zaupanja (npr. 95 %), — statistično analizo; p-vrednosti, če obstajajo; Razprava o rezultatih Sklepi VIRI 1. Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Res., 392, 1–4. 2. Parry, J.M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project, Mutation Res., 287, 3–15. 3. Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay, Cytobios., 43, 233–246. 4. Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group, Environ. Mol. Mutagen., 35, 167–172. 5. Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay, Nature Protocols, 2(5), 1084–1104. 6. Fenech, M. and Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation, Mutation Res., 161, 193–198. 7. Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989), Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody, Environ. Mol. Mutagen., 13, 34–43. 8. Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes, Mutation Res., 234, 9–20. 9. Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, 6, 297–302. 10. Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993), The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes, Mutagenesis, 8, 329–334. 11. Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe, Mutation Res., 319, 205–213. 12. Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization, Mutagenesis, 8, 519–525. 13. Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994), Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes, Mutation Res., 322, 9–20. 14. Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996), Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy, Mutation Res., 372, 233–245. 15. Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes, Mutation Res., 372, 211–219. 16. Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Res., 540, 153–163. 17. OECD (1997), In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test, Test Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Na voljo na spletni strani: www.oecd.org/env/testguidelines. 18. Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study, Mutation Res., 607, 13–36. 19. Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes, Mutation Res., 607, 37–60. 20. Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, III. Using CHO cells, Mutation Res., 607, 61–87. 21. Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells, Mutation Res., 607, 88–124. 22. Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, V. Using L5178Y cells, Mutation Res., 607, 125–152. 23. Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience, Mutation Res., 392, 187–208. 24. Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997), Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience, Mutation Res., 392, 45–59. 25. Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and Madle, S. (1998), Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test. Gesellschaft fur Umwelt-Mutations-forschung, Mutation Res., 410, 81–116. 26. Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), Chemically induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three different test approaches, Mutation Res. 439, 183–190. 27. Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. (1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity, Mutation Res. 445, 55–71. 28. von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000), In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells - results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances, Mutation Res., 468, 137–163. 29. Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 517, 123–134. 30. Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and Sofuni, T. (1999), Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU), Mutagenesis, 14, 569–580. 31. Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test, Mutation Res., 607, 1–152. 32. ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 25th meeting, 16-17 November, 2006, na voljo na spletni strani: http://ecvam.jrc.it/index.htm. 33. ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel, na voljo na spletni strani: http://ecvam.jrc.it/index.htm. 34. Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT), Mutagenesis, 23, 271–283. 35. Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and Sofuni, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test, Mutation Res., 347, 105–115. 36. Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells, Mutagenesis, 17, 257–260. 37. Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge, Toxicol., 198, 315–328. 38. Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals, Mutation Res., 392, 61–70. 39. Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, 147–205. 40. Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells, Mutation Res., 268, 297–305. 41. Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789–886. 42. Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in lymphocytes, Mutation Res., 147, 29–36. 43. Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method, Mutation Res., 392, 11–18. 44. Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhalevich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei, Environ. Mol. Mutagen. 37, 31–45. 45. Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella mutagenicity test, Mutation Res., 113, 173–215. 46. Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55–65. 47. Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays. Mutagenesis, 7, 175–177. 48. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, str. 85–88. 49. Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51–59. 50. UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). Na voljo na spletni strani: http://www.pops.int/. 51. Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996), An investigation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells, Mutagenesis, 11, 247–274. 52. Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, v: Tice, R.R., Costa, D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, str. 91–103. 53. Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay, Environ. Mutagenesis 5, 795–801. 54. Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations, Mutation Res., 285, 35–44. 55. Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 521, 103–112. 56. Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to,Report from the in vitro micronucleus assay working group, Mutation Res., 564, 97–100. 57. Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear assay in lymphocytes, Mutation Res., 139, 61–65. 58. Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Res., 655, 1–3. 59. Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. (1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 341, 169–184. 60. Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environ. Molec. Mutagenesis 35, 191–201. 61. Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, 241–247. 62. MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y, Mutation Res., 120, 269–275. 63. Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Res., 120, 241–247. 64. Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 534, 65–75. 65. Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003), In vitro micronucleus test, v: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, str. 463–467. 66. Uredba (ES) št. 850/2004 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 29. aprila 2004 o obstojnih organskih onesnaževalih in spremembi Direktive 79/117/EGS (UL L 229, 30.4.2004, str. 5). Dodatek 1 Opredelitve pojmov Anevgen: snov ali proces, na podlagi katerega pride do anevploidije v celicah ali organizmih zaradi reagiranja z elementi mitotičnega in meotičnega cikla delitve celic (angl. ‚aneugen‘, op. prev.). Anevploidija: odstopanje od normalnega diploidnega (ali haploidnega) števila kromosomov z enim kromosomom ali več kot enim kromosomov, vendar ne s celotno skupino ali skupinami kromosomov (poliploidija). Apoptoza: programirana celična smrt, za katero je značilna vrsta korakov, ki vodijo k razgradnji celic v delce, vezane na membrano, ki se nato odstranijo s fagocitozo ali osipanjem. Množenje celic: povečanje števila celic zaradi mitotične delitve celic. Centromera: mesto na kromosomu, kjer sta spojeni obe kromatidi in na katerem sta na obeh straneh pritrjeni obe kinetohori. Klastogen: snov ali proces, ki v populacijah celic ali organizmih povzroča strukturne poškodbe kromosomov (angl. ‚clastogen‘, op. prev.). Citokineza: proces delitve celic, ki sledi takoj po mitozi in vpliva na oblikovanje dveh hčerinskih celic, ki imata vsaka eno samo jedro. Indeks množenja citokinetskega bloka (CBPI): delež celic, pri katerih se je izvedla druga delitev, v tretirani populaciji glede na netretirano kontrolo (glej Dodatek 2 za formulo). Citostaza: zaviranje rasti celic (glej Dodatek 2 za formulo). Citotoksičnost: škodljivi učinki na celično strukturo ali delovanje, ki na koncu povzročijo smrt celice. Genotoksično: splošni izraz, ki zajema vse poškodbe DNA ali kromosomov, vključno s prelomi, prerazporeditvijo aduktov, mutacijami, aberacijami kromosomov in anevploidijo. Vsi genotoksični učinki ne vplivajo na nastanek mutacij ali trajno poškodbo kromosomov. Interfazne celice: celice, ki niso v fazi mitoze. Kinetohora: struktura s proteinom, ki nastane na centromeri kromosoma in na katero se pripnejo niti delitvenega vretena med delitvijo celice, kar omogoča pravilno gibanje hčerinskih kromosomov proti poloma hčerinskih celic. Mikronukleusi: majhna jedra, poleg glavnega jedra celic in ločena od njega, ki nastanejo med telofazo mitoze ali mejoze iz zaostalih fragmentov kromosomov ali celih kromosomov. Mitoza: delitev celičnega jedra, ki je običajno razdeljena na profazo, prometafazo, metafazo, anafazo in telofazo. Mitotični indeks: razmerje med številom celic v metafazi in skupnim številom celic v opazovani populaciji celic; pokazatelj stopnje množenja celic te populacije. Mutageno: povzroči dedno spremembo zaporedij baznih parov DNA v genih ali strukturi kromosomov (kromosomske aberacije). Nerazdvajanje: par kromatid se ne razdvoji in ustrezno loči v razvijajoče se hčerinske celice, zaradi česar imata hčerinski celici nenormalno število kromosomov. Poliploidija: številčne kromosomske aberacije v celicah ali organizmih, ki ne vplivajo na posamezen kromosom ali kromosome (anevploidija), ampak na vse kromosome. Indeks množenja (PI): metoda za merjenje citotoksičnosti v primerih, ko citohalazin B ni dodan (glej Dodatek 2 za formulo). Relativno povečanje števila celic (RICC): metoda za merjenje citotoksičnosti v primerih, ko citohalazin B ni dodan (glej Dodatek 2 za formulo). Relativna podvojitev populacije (RPD): metoda za merjenje citotoksičnosti v primerih, ko citohalazin B ni dodan (glej Dodatek 2 za formulo). Indeks pomnoževanja (RI): razmerje ciklov celične delitve v tretirani kulturi glede na netretirano kulturo, med obdobjem izpostavljenosti in obnavljanja (glej Dodatek 2 za formulo). Preskusna kemikalija (imenovana tudi preskusna snov): katera koli snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. Dodatek 2 Formule za ocenjevanje citotoksičnosti 1. Ko je uporabljen citohalazin B, ocena citotoksičnosti temelji na indeksu množenja citokinetskega bloka (CBPI) ali indeksu pomnoževanja (RI) (16) (58). CBPI kaže povprečno število celičnih ciklov na celico med obdobjem izpostavljenosti citohalazinu B in se lahko uporabi za izračun množenja celic. RI kaže relativno število jeder v tretiranih kulturah v primerjavi s kontrolnimi kulturami in se lahko uporabi za izračun % citostaze: % citostaze = 100 – 100{(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)} in: T = kultura, tretirana s preskusno kemikalijo C = kontrolna kultura z nosilcem pri čemer je: Tako je CPBI z vrednostjo 1 (vse celice imajo eno jedro) enak 100-odstotni citostazi. Citostaza = 100 – RI T = tretirane kulture C = kontrolne kulture 2. Zato RI s 53 % pomeni, da se je v primerjavi s številom celic, ki so se delile v kontrolni kulturi in oblikovale celice z dvema jedroma in več jedri, v tretirani kulturi delilo samo 53 % tega števila celic, tj. 47-odstotna citostaza. 3. Ko citohalazin B ni uporabljen, se priporoča ocena cititoksičnosti na podlagi relativnega povečanja števila celic (RICC) ali relativne podvojitve populacije (RPD) (58), saj obe metodi upoštevata delež celične populacije, ki se je delil. pri čemer je: podvajanje populacije = [log (število celic po obdelavi ÷ prvotno število celic)] ÷ log 2 4. Zato RICC ali RPD s 53 % kaže na 47-odstotno citotoksičnost/citostazo. 5. Z uporabo indeksa množenja (PI) se lahko citotoksičnost oceni s pomočjo štetja števila klonov, ki jih sestavljajo 1 celica (cl1), 2 celici (cl2), 3 do 4 celice (cl4) in 5 do 8 celic (cl8). 6. PI se kot koristen in zanesljiv parameter citotoksičnosti uporablja tudi za celične linije, kultivirane in situ brez dodanega citohalazina B (25) (26) (27) (28). Dodatek 3 Referenčne kemikalije, priporočene za ocenjevanje učinkovitosti (16) Kategorija Kemikalija št. CAS Št. EC 1. Klastogeni, aktivni brez aktivacije presnove Citozin-arabinozid 147-94-4 205-705-9 Mitomicin C 50-07-7 200-008-6 2. Klastogeni, ki zahtevajo aktivacijo presnove Benzo(a)piren 50-32-8 200-028-5 Ciklofosfamid 50-18-0 200-015-4 3. Anevgeni Kolhicin 64-86-8 200-598-5 Vinblastin 143-67-9 205-606-0 4. Negativne snovi Di(2-etilheksil)ftalat 117-81-7 204-211-0 Nalidinska kislina 389-08-2 206-864-7 Piren 129-00-0 204-927-3 Natrijev klorid 7647-14-5 231-598-3 B.50. PREOBČUTLJIVOST KOŽE: LOKALNA ANALIZA BEZGAVK: DA UVOD 1. Smernice OECD za preskušanje kemikalij in preskusne metode EU se redno preverjajo zaradi znanstvenega napredka, spreminjajočih se zakonodajnih potreb in vprašanj, povezanih z dobrim počutjem živali. Prva preskusna metoda (B.42) za določanje preobčutljivosti kože pri miši, lokalna analiza bezgavk (LLNA; Smernica za preskušanje OECD 429) je bila že preverjena (1). Objavljene so podrobnosti o validaciji LLNA in pregled s tem povezanega dela (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Pri LLNA se za merjenje množenja limfocitov uporablja radioizotopni timidin ali jod, zato je lahko uporaba analize omejena v primerih, kjer je pridobitev, uporaba ali odstranitev radioaktivnosti težavna. LLNA, DA (razvil jo je Daicel Chemical Industries, Ltd) je neradioaktivna različica LLNA, ki količinsko opredeljuje vsebnost adenozin-trifosfata (ATP) s pomočjo bioluminescence kot pokazatelja množenja limfocitov. Preskusno metodo LNNA: DA je validirala in pregledala mednarodna strokovna skupina za ocenjevanje ter jo priporočila kot koristno za opredelitev kemikalij, ki povzročajo preobčutljivost, in kemikalij, ki je ne povzročajo, z nekaterimi omejitvami (10) (11) (12) (13). Ta preskusna metoda je zasnovana za ocenjevanje morebitne preobčutljivosti kože s kemikalijami (snovmi in zmesmi) pri živalih. Poglavje B.6 te priloge in Smernica za preskušanje OECD 406 uporabljata preskuse na morskih prašičkih, predvsem maksimizacijski in Buehlerjev preskus na morskih prašičkih (14). LLNA (poglavje B.42 te priloge; Smernica za preskušanje OECD 429) in dve spremembi, pri katerih se radioaktivnost ne uporablja, analiza LLNA: DA (poglavje B.50 te priloge; Smernica za preskušanje OECD 442 A) in LLNA: BrdU-ELISA (poglavje B.51 te priloge; Smernica za preskušanje OECD 442 B) zaradi manj pogoste in izpopolnjene uporabe živali zagotavljajo prednost v primerjavi s preskusi na morskih prašičkih iz metode B.6 in Smernica za preskušanje OECD 406 (14). 2. Podobno kot LLNA tudi LLNA: DA preučuje indukcijsko fazo preobčutljivosti kože in zagotavlja količinske podatke, ki so primerni za oceno odziva na odmerek. Ker odkriva povzročitelje preobčutljivosti, ne da bi bilo pri tem treba uporabiti radioaktivni označevalec za DNA, se ne pojavljajo vprašanja glede poklicne izpostavljenosti radioaktivnosti in odstranjevanja odpadkov. Zaradi tega bo za odkrivanje povzročiteljev preobčutljivosti morda mogoča pogostejša uporaba miši, zaradi česar bi se lahko še bolj zmanjšala uporaba morskih prašičkov za preskušanje morebitne preobčutljivosti kože (tj. B.6; Smernica za preskušanje OECD 406) (14). OPREDELITVE POJMOV 3. Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1. ZAČETNI POMISLEKI IN OMEJITVE 4. Analiza LLNA: DA je spremenjena metoda LLNA za ugotavljanje morebitne preobčutljivosti kože s kemikalijami, s posebnimi omejitvami. Ni nujno, da to pomeni, da je treba v vseh primerih namesto preskusov na morskih prašičkih in LLNA (tj. B.6; Smernica za preskušanje OECD 406) (14), uporabiti analizo LLNA: DA, temveč da je ta analiza enakovredna in se lahko uporabi kot druga možnost, pri kateri običajno niso več potrebne dodatne potrditve pozitivnih in negativnih rezultatov (10) (11). Preskuševalni laboratorij mora pred začetkom opravljanja študije upoštevati vse razpoložljive informacije o preskusni snovi. Takšne informacije bodo vključevale vrsto in kemijsko sestavo preskusne snovi; njene fizikalno-kemijske lastnosti; rezultate katerih koli drugih preskusov toksičnosti na preskusni snovi, in vitro ali in vivo; in toksikološke podatke o strukturno sorodnih kemikalijah. Te informacije je treba upoštevati, da se določi, ali je metoda LLNA: DA primerna za preskusno snov (glede na nezdružljivost omejenega števila vrst kemikalij z analizo LLNA: DA [glej odstavek 5] in za lažjo izbiro odmerka. 5. Analiza LLNA: DA je metoda in vivo in posledično ne odpravlja uporabe živali pri ocenjevanju delovanj, ki povzročajo alergijsko preobčutljivost ob stiku. Vendar ima možnost, da v primerjavi s preskusi na morskih prašičkih (B.6; Smernica za preskušanje OECD 406) (14) zmanjša število živali, potrebnih v ta namen. Poleg tega nudi analiza LLNA: DA znatno izboljšanje (manj bolečine in trpljenja) načina, kako se živali uporabljajo za preskušanje alergijske preobčutljivosti ob stiku, saj v nasprotju z metodo B.6 in Smernico za preskušanje 406 ne zahteva, da se povzročijo izzvane reakcije prekomerne občutljivosti kože. Kljub prednostim analize LLNA: DA v primerjavi z metodo B.6 in Smernico za preskušanje OECD 406 (14), obstajajo nekatere omejitve, zaradi katerih je lahko nujna uporaba metode B.6 ali Smernice za preskušanje OECD 406 (npr. preskušanje določenih kovin, lažni pozitivni rezultati pri nekaterih dražilnih snoveh za kožo [kot so nekatere vrste površinsko razgradljivih kemikalij] (6) (1 in poglavje B.42 te priloge), topnost preskusne snovi). Poleg tega je zaradi kemijskih razredov ali snovi s funkcionalnimi skupinami, za katere se je izkazalo, da lahko delujejo kot moteči dejavniki (16), lahko potrebna uporaba preskusov na morskih prašičkih (tj. B.6; Smernica za preskušanje OECD 406 (14)). Za omejitve, določene za LLNA (1 in poglavje B.42 te priloge), je bilo priporočeno, da se uporabljajo tudi za analizo LLNA: DA (10). Poleg tega uporaba analize LLNA: DA morda ni primerna za uporabo snovi, ki vplivajo na ravni adenozin-trifosfata (ATP) (npr. snovi, ki delujejo kot inhibitorji ATP), ali snovi, ki vplivajo na natančno merjenje ATP v celicah (npr. prisotnost encimov, ki razgrajujejo ATP, prisotnost zunajcelične ATP v bezgavki). Razen takšnih določenih omejitev bi morala biti analiza LLNA: DA primerna za preskušanje katere koli snovi, razen če so s temi snovmi povezane lastnosti, ki lahko ovirajo natančnost analize LLNA: DA. Poleg tega je treba razmisliti o možnosti mejnih pozitivnih rezultatov v primerih, ko so dobljene vrednosti stimulacijskega indeksa (SI) med 1,8 in 2,5 (glej odstavke 31–32). To temelji na podatkovni zbirki za validacijo s 44 snovmi s stimulacijskim indeksom ≥ 1,8 (glej odstavek 6), pri kateri je analiza LLNA: DA pravilno opredelila vseh 32 povzročiteljev preobčutljivosti pri LLNA, vendar je nepravilno opredelila tri od 12 snovi, ki pri LLNA ne povzročajo preobčutljivosti z vrednostmi stimulacijskega indeksa med 1,8 in 2,5 (tj. mejno pozitivna vrednost) (10). Ker pa je bil za določanje vrednosti stimulacijskega indeksa in izračun predvidljivih lastnosti preskusa uporabljen isti nabor podatkov, so lahko navedeni rezultati pretirana ocena dejanskih predvidljivih lastnosti. NAČELA METODE PRESKUŠANJA 6. Osnovno načelo, na katerem temelji analiza LLNA: DA, je, da povzročitelji preobčutljivosti povzročijo množenje limfocitov v bezgavkah, ki drenirajo območje nanosa preskusne snovi. To množenje je sorazmerno z odmerkom in močjo uporabljenega alergena in je preprosto sredstvo za doseganje količinske izmere preobčutljivosti. Množenje se izmeri s primerjavo povprečnega množenja v vsaki preskusni skupini in povprečnega množenja v kontrolni skupini, tretirani z nosilcem. Določi se razmerje med povprečnim množenjem v vsaki tretirani skupini in povprečnim množenjem v primerjalni kontrolni skupini z nosilcem, ki se imenuje stimulacijski indeks (SI) in mora biti ≥ 1,8, preden je nadaljnje ocenjevanje preskusne snovi kot možnega povzročitelja preobčutljivosti kože utemeljeno. Opisani postopki temeljijo na merjenju vsebnosti ATP z bioluminiscenco (za katero je znano, da se ujema s številom živih celic) (17), ki pokaže povečano število množečih se celic v ušesnih bezgavkah (18) (19). Metoda z bioluminiscenco izkorišča encim luciferaze za kataliziranje nastanka svetlobe iz ATP in luciferin v skladu z naslednjo reakcijo: ATP + Luciferin + O 2 Oxyluciferin + AMP + PPi + CO 2 + Light Oddana osvetljenost je linearno povezana s koncentracijo ATP in se meri z luminometrom. Analiza reakcije med luciferinom in luciferazo je občutljiva metoda za količinsko opredelitev ATP, ki se uporablja na številne načine (20). OPIS ANALIZE Izbira živalskih vrst 7. Izbrana vrsta za ta preskus je miš. Validacijske študije za analizo LLNA: DA so bile izvedene samo s sevom CBA/J, ki je zato priporočeni sev (12) (13). Uporabijo se mlade odrasle mišje samice, ki še niso kotile in niso breje. Na začetku študije morajo biti živali stare 8–12 tednov, odstopanje mase živali pa mora biti čim manjše in ne sme presegati 20 % povprečne mase. Namesto tega se lahko uporabi druge seve in samce, ko je dobljenih dovolj podatkov za prikaz, da ne obstajajo značilne razlike v odzivu pri analizi LLNA: DA glede na sev in/ali spol. Bivalni in prehranjevalni pogoji 8. Miši morajo biti skupinsko nastanjene (21), razen če je zagotovljena ustrezna znanstvena utemeljitev za njihovo ločeno nastanitev. Temperatura v prostoru za poskusne živali mora biti 22 ± 3 °C. Čeprav mora biti relativna vlažnost najmanj 30 % in po možnosti ne sme presegati 70 %, mora biti ciljna vlažnost, razen med čiščenjem prostora, 50 do 60 %. Osvetlitev naj bo umetna, in sicer 12 ur svetlobe, 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporablja konvencionalna laboratorijska prehrana z neomejeno oskrbo s pitno vodo. Priprava živali 9. Živali se naključno izberejo, označijo tako, da je omogočeno posamično prepoznavanje (vendar ne s katero od oblik ušesnih oznak), in zadržijo v kletkah najmanj pet dni pred začetkom dajanja odmerka, da se lahko prilagodijo laboratorijskim razmeram. Pred začetkom tretiranja se vse živali pregledajo, da se zagotovi, da nimajo opaznih kožnih lezij. Priprava preskusnih raztopin 10. Trdne kemikalije se pred nanosom na uho miši raztopijo ali suspendirajo v ustreznih topilih ali nosilcih in po potrebi razredčijo. Tekoče kemikalije se lahko nanesejo nerazredčene ali pa se razredčijo pred dajanjem odmerka. Pri netopnih kemikalijah, kot so tiste, ki se običajno uporabljajo v medicinskih pripomočkih, je treba uporabiti močno povečano ekstrakcijo v ustreznem topilu, da se odkrije vse ekstraktibilne sestavine za preskušanje pred nanosom na uho miši. Preskusne snovi je treba pripravljati dnevno, razen če podatki o stabilnosti kažejo, da je shranjevanje sprejemljivo. Preverjanje zanesljivosti 11. Za prikaz ustrezne učinkovitosti analize se uporabijo kemikalije pozitivne kontrole, ki se odzovejo z ustrezno in ponovljivo občutljivostjo kot preskusna snov, ki povzroča preobčutljivost, za katero je stopnja reakcije natančno opredeljena. Uporaba primerjalne pozitivne kontrole je priporočena, saj pokaže zmožnost laboratorija, da uspešno izvede vsako analizo, ter omogoča ocenjevanje ponovljivosti in primerljivosti v enem ali več laboratorijih. Tudi nekateri regulativni organi zahtevajo uporabo pozitivne kontrole pri vsaki raziskavi, zato se uporabnikom priporoča, da se pred izvedbo analize LLNA: DA posvetujejo s pristojnimi organi. V skladu s tem se priporoča redna uporaba primerjalne pozitivne kontrole, saj tako ni potrebno dodatno preskušanje na živalih za izpolnitev zahtev, ki se lahko pojavijo zaradi uporabe redne pozitivne kontrole (glej odstavek 12). Pozitivna kontrola mora povzročiti pozitiven odziv analize LLNA: DA na raven izpostavljenosti, za katero se pričakuje, da bo dala večji stimulacijski indeks (SI) > 1,8 kot negativna kontrolna skupina. Odmerek pozitivne kontrole je treba izbrati tako, da ne povzroči čezmernega draženja kože ali sistemske toksičnosti in da je indukcija ponovljiva, vendar ne čezmerna (tj. SI > 10 bi se štel za čezmernega) Priporočena pozitivna kontrola je 25-odstotni heksil cimetov aldehid (Služba za izmenjavo kemijskih izvlečkov [CAS] št. 101-86-0) in 25-odstotni evgenol (št. CAS 97-53-0) v acetonu: olivnem olju (4:1, v/v). V nekaterih okoliščinah se lahko ob ustrezni utemeljitvi uporabijo druge pozitivne kontrole, ki izpolnjujejo zgornja merila. 12. Običajno je uporaba pozitivne kontrolne skupine priporočena, lahko pa obstajajo okoliščine, v katerih redno preskušanje (tj. v razmikih ≤ 6 mesecev) pozitivne kontrole morda zadošča za laboratorije, ki redno izvajajo analizo LLNA: DA (tj. izvajajo analizo LLNA: DA vsaj enkrat mesečno) in imajo vzpostavljeno zbirko podatkov o preteklih pozitivnih kontrolah, ki dokazujejo zmožnost laboratorija, da pridobi ponovljive in natančne rezultate s pozitivnimi kontrolami. Ustrezna strokovnost pri izvajanju analize LLNA: DA se lahko uspešno dokaže z dobivanjem doslednih pozitivnih rezultatov s pozitivno kontrolo pri vsaj desetih neodvisnih preskusih, izvedenih v razumnem časovnem obdobju (tj. v manj kot enem letu). 13. Primerjalno pozitivno kontrolno skupino je treba vključiti vedno, kadar pride do postopkovne spremembe pri analizi LLNA: DA (tj. zamenjava usposobljenega osebja, zamenjava materiala za preskusno metodo in/ali reagentov, zamenjava opreme za preskusno metodo, zamenjava vira preskusnih živali), takšne spremembe pa je treba vedno zabeležiti v laboratorijskih poročilih. Pri odločanju o nujnosti vzpostavitve nove zbirke preteklih podatkov za beleženje doslednosti pri rezultatih pozitivne kontrole je treba upoštevati učinek, ki ga imajo te spremembe na ustreznost predhodno vzpostavljene zbirke preteklih podatkov. 14. Raziskovalci se morajo zavedati, da odločitev o izvajanju redne namesto primerjalne pozitivne kontrolne študije vpliva na ustreznost in sprejemljivost negativnih rezultatov študije, pridobljenih brez primerjalne pozitivne kontrole v razmiku med rednimi pozitivnimi kontrolnimi študijami. Na primer, če je rezultat, pridobljen z redno pozitivno kontrolno študijo, lažno negativen, so lahko vprašljivi negativni rezultati preskusne snovi, pridobljeni v času med zadnjo sprejemljivo redno pozitivno kontrolno študijo in nesprejemljivo redno pozitivno kontrolno študijo. Pri odločanju, ali vključiti primerjalne pozitivne kontrole ali izvajati samo redne pozitivne kontrole, je treba skrbno preučiti posledice teh rezultatov. Treba je razmisliti tudi o uporabi manjšega števila živali v primerjalni pozitivni kontrolni skupini, če je to znanstveno utemeljeno in če laboratorij na podlagi preteklih podatkov, značilnih za laboratorij, dokaže, da se lahko uporabi manjše število miši (22). 15. Čeprav je treba pozitivno kontrolo preskusiti v nosilcu, za katerega je znano, da povzroča dosleden odziv (npr. aceton: olivno olje; 4:1, v/v), lahko obstajajo nekatere zakonodajne okoliščine, ko je potrebno tudi preskušanje v nestandardnem nosilcu (klinično/kemično ustrezne sestave) (23). Če se primerjalna pozitivna kontrola preskuša v drugem nosilcu kot preskusna snov, je treba za primerjalno pozitivno kontrolo vključiti ločen kontrolni nosilec. 16. V primerih, kjer se ocenjujejo snovi za poseben kemijski razred ali razpon reakcij, so lahko primerjalne snovi uporabne tudi za dokaz, da preskusna metoda deluje pravilno za odkrivanje morebitne preobčutljivosti kože pri teh vrstah snovi. Ustrezne primerjalne snovi morajo imeti naslednje lastnosti: — strukturno in funkcijsko podobnost z razredom preskusne snovi, ki se preskuša, — znane fizikalno-kemijske lastnosti; — podporne podatke iz analiz LLNA: DA; — podporne podatke od drugih živalskih modelov in/ali ljudi. PRESKUSNI POSTOPEK Število živali in velikost odmerkov 17. Na skupino odmerka se uporabijo najmanj štiri živali z najmanj tremi koncentracijami preskusne snovi, poleg tega pa še primerjalna negativna kontrolna skupina, tretirana zgolj z nosilcem za preskusno snov, in pozitivna kontrola (primerjalna ali izvedena pred kratkim, odvisno od politike laboratorija pri upoštevanju odstavkov 11–15). Treba je razmisliti o preskušanju več odmerkov pozitivne kontrole, zlasti če se pozitivna kontrola preskuša občasno. Živali v kontrolnih skupinah je treba, razen če se ne tretirajo s preskusno snovjo, obravnavati in tretirati na enak način kot živali v tretiranih skupinah. 18. Izbira odmerka in nosilca mora temeljiti na priporočilih iz sklicev (2) in (24). Zaporedni odmerki se običajno izberejo iz ustrezne serije koncentracij, kot so 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % itd. Izbira uporabljene serije koncentracij mora biti ustrezno znanstveno utemeljena. Kadar so na voljo, je treba pri izbiri treh zaporednih koncentracij upoštevati vse obstoječe toksikološke informacije (npr. akutno toksičnost in draženje kože) ter strukturne in fizikalno-kemijske informacije o želeni preskusni snovi (in/ali strukturno povezani snovi), tako da je pri največji koncentraciji izpostavljenost največja, hkrati pa ni sistemske toksičnosti in/ali čezmernega draženja kože (24) (25). Če takšne informacije niso na voljo, je morda najprej potreben predhodni presejalni preskus (glej odstavke 21–24). 19. Nosilec ne sme ovirati rezultatov preskusa ali vplivati nanje, izbere pa se na podlagi povečevanja topnosti, da se med pripravljanjem raztopine/suspenzije, ki je primerna za uporabo preskusne snov, pridobi največjo možno koncentracijo. Priporočljivi nosilci so aceton: olivno olje (4:1, v/v), N,N-dimetilformamid, metil etil keton, propilen glikol in dimetil sulfoksid (6), vendar se lahko uporabljajo tudi drugi, če je zagotovljena ustrezna znanstvena utemeljitev. V nekaterih okoliščinah je morda treba kot dodatno kontrolo uporabiti klinično ustrezno topilo ali trgovsko sestavo, v kateri se trži preskusna snov. Paziti je treba zlasti, da so v nosilni sistem vključene hidrofilne snovi, ki vlažijo kožo in se ne izsušijo takoj, z vključitvijo ustreznih pospeševalcev raztapljanja (npr. 1-odstotnim Pluronic® L92). Zato se je treba izogibati povsem vodenim nosilcem. 20. Obdelava bezgavk posamezne miši omogoča oceno spremenljivosti med posameznimi živalmi ter statistično primerjavo razlik med meritvami preskusne snovi in primerjalne kontrolne skupine z nosilcem (glej odstavek 33). Poleg tega je ocena možnosti zmanjšanja števila miši v pozitivni kontrolni skupini izvedljiva samo, če se zbirajo podatki o posameznih živalih (22). Poleg tega nekateri regulativni organi zahtevajo zbiranje podatkov o posameznih živalih. Redno zbiranje podatkov o posameznih živalih zagotavlja prednosti glede dobrega počutja živali, saj se s tem prepreči dvojno preskušanje, ki bi bilo potrebno, če bi bilo treba rezultate, prvotno zbrane na en način (npr. preko združenih podatkov o živalih) zaradi drugih zahtev regulativnih organov (npr. glede podatkov o posameznih živalih) kasneje ponovno preučiti. Predhodni presejalni preskus 21. Če informacije za določitev največjega odmerka za preskušanje niso na voljo (glej odstavek 18), je treba izvesti predhodni presejalni preskus, da se določi ustrezna velikost odmerka za preskušanje z analizo LLNA: DA. Namen predhodnega presejalnega preskusa je zagotoviti smernice za izbiro največje velikosti odmerka za uporabo v glavni študiji analize LLNA: DA v primerih, ko ni na voljo informacij o koncentraciji, ki povzroči sistemsko toksičnost (glej odstavek 24) in/ali čezmerno draženje kože (glej odstavek 23). Največja velikost odmerka je 100-odstotna preskusna snov za tekočine ali najvišja možna koncentracija za trdne snovi ali suspenzije. 22. Predhodni presejalni preskus se izvede v pogojih, ki so enaki tistim v glavni študiji analize LLNA: DA, s to razliko, da se ne izvede ocena množenja v bezgavkah in da se lahko uporabi manj živali na skupino odmerka. Predlaga se uporaba ene ali dveh živali na skupino odmerka. Vse miši se opazuje dnevno glede kliničnih znakov sistemske toksičnosti ali lokalnega draženja na mestu nanosa. Telesna masa se zabeleži pred preskusom in pred usmrtitvijo (8. dan). Obe ušesi vsake miši se opazuje glede rdečine in oceni s pomočjo preglednice 1 (25). Meritve debeline ušesa se izvedejo z napravo za merjenje debeline (npr. digitalnim mikrometrom ali merilnikom debeline s številčnico) 1. dan (pred odmerkom), 3. dan (približno 48 ur pred prvim odmerkom), 7. dan (24 ur pred usmrtitvijo) in 8. dan. Poleg tega se lahko 8. dan debelino ušesa določi s preluknjanjem ušes za določitev mase, ki se izvede po humani usmrtitvi živali. Znak za čezmerno draženje je rdečina z oceno ≥ 3 in/ali povečana debelina ušesa za ≥ 25 % na kateri koli dan merjenja (26) in (27). Največji odmerek, izbran za glavno študijo analize LLNA: DA, je naslednji nižji odmerek v seriji koncentracij iz predhodnega presejalnega preskusa (glej odstavek 18), ki ne povzroči sistemske toksičnosti in/ali čezmernega draženja kože. Preglednica 1 Ocena rdečine Ugotovitev Ocena Rdečine ni 0 Neznatna rdečina (komajda opazna) 1 Zelo razločna rdečina 2 Zmerna do močna rdečina 3 Močna rdečina (rdečina rdeče pese) in nastanek krast ovirata razvrstitev rdečine 4 23. Poleg 25-odstotnega povečanja debeline ušesa (26) (27), se za opredelitev dražilnih snovi pri LLNA uporablja tudi statistično značilno povečanje debeline ušesa tretirane miši v primerjavi s kontrolno mišjo tako uporablja za opredelitev dražilnih snovi pri lokalni analizi bezgavk (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Ker pa se lahko statistično značilno povečanje pojavi tudi pri debelini ušesa, manjši od 25 %, ni izrecno povezano s čezmernim draženjem (30) (31) (32) (33) (34). 24. Naslednje klinične ugotovitve lahko nakazujejo sistemsko toksičnost (35), kadar se uporabljajo kot del celovite ocene, in zato lahko pokažejo največjo velikost odmerka za uporabo v glavni analizi LLNA: DA: spremembe v delovanju živčnega sistema (npr. piloerekcija, ataksija, tremorji in krči); vedenjske spremembe (npr. agresivnost, spremembe glede nege, opazna sprememba ravni dejavnosti); spremembe dihanja (npr. spremembe frekvence in intenzivnosti dihanja kot so dispneja, zasoplost in hropenje) ter spremembe glede uživanja hrane in vode. Poleg tega je treba pri oceni upoštevati znake letargije in/ali neodzivnosti ter morebitne klinične znake bolečine in trpljenja, ki niso samo blagi ali trenutni, ali zmanjšanje telesne mase za > 5 % od 1. do 8. dne ter smrtnost. Umirajoče živali ali živali, ki kažejo znake hudega in dolgotrajnega trpljenja, se usmrtijo na human način (36). Načrt za poskus glavne študije 25. Načrt za poskus analize je naslednji: — 1. dan: Posamično ugotovljena in zabeležena masa vsake živali in morebitne klinične ugotovitve. Nanos 1-odstotne vodne raztopine natrijevega laurel sulfata (SLS) na vsak uhelj, s pomočjo čopiča, namočenega v raztopino SLS, in premaz celotnega uhlja v štirih do petih potezah. Uro po obdelavi s SLS sledi nanos 25 μl ustrezno razredčene preskusne snovi, samega nosilca ali pozitivne kontrole (primerjalne ali izvedene pred kratkim, odvisno od politike laboratorija pri upoštevanju odstavkov 11–15 na vsak uhelj. — 2., 3. in 7. dan: Ponovi se postopek predhodne obdelave z 1-odstotno vodno raztopino SLS in nanosa preskusne snovi, ki je bil izveden 1. dan. — 4., 5. in 6. dan: Brez tretiranja. — 8. dan: Zabeleži se masa vsake živali in morebitne klinične ugotovitve. Približno 24 do 30 ur po začetku nanašanja 7. dne se živali humano usmrti. Ušesne bezgavke ob vsakem ušesu miši se izrežejo in shranijo v fosfatni pufer s soljo (PBS) za vsako žival Podatki in diagrami o identifikaciji in izrezu bezgavk so na voljo v sklicu (22). Za nadaljnje spremljanje odziva kože v glavni študiji se lahko v študijski protokol vključijo dodatni parametri, kot so ocena rdečine ušesa ali meritve debeline ušesa (pridobljene z merilnikom debeline ali preluknjanjem ušes za določitev mase pri obdukciji). Priprava celičnih suspenzij 26. Enotna celična suspenzija iz celic bilateralno izrezanih bezgavk vsake miši se pripravi tako, da se bezgavke namesti med dve objektni stekelci, ki se ju nežno stisne in tako zdrobi bezgavke. Po potrditvi, da se je tkivo na tanko razširilo, se stekelci povlečeta narazen. Tkivo na obeh stekelcih se suspendira s fosfatnim pufrom s soljo tako, da se vsako stekelce drži pod kotom nad petrijevko in spira s PBS ter istočasno strga tkivo s stekelca. Bezgavke živali v negativni kontroli so majhne, zato je treba biti pazljiv, da ne pride do umetnega vpliva na vrednosti SI. Za spiranje obeh stekelc se uporabi skupno 1 ml PBS. Suspenzija iz celic bezgavk v petrijevki se narahlo zmeša s strgalom za celice. Nato se s mikropipeto zbere 20 μL alikvota suspenzije iz celic bezgavk, pri čemer je treba paziti, da se ne pobere membrana, vidna z očesom, in zmeša z 1,98 ml PBS, s čimer dobimo 2 ml vzorec. Z enakim postopkom se nato pripravi drugi 2 ml vzorec, tako da sta za vsako žival pripravljena dva vzorca. Določitev množenja celic (merjenje vsebnosti adenozin-trifosfata (ATP) pri limfocitih) 27. Povečanje vsebnosti ATP v bezgavkah se meri z metodo luciferina/luciferaze z uporabo kompleta za merjenje ATP, ki meri bioluminiscenco v relativnih luminiscenčnih enotah (RLU). Čas analize od časa usmrtitve živali do merjenja vsebnosti ATP za vsako posamezno žival mora biti enak, in sicer približno 30 minut, ker se vsebnost ATP po usmrtitvi živali postopoma zmanjšuje (12). Zato mora biti serija postopkov od izreza ušesnih bezgavk do merjenja ATP izvedena v 20 minutah z vnaprej določenim časovnim razporedom, ki je enak za vsako žival. Luminiscenca ATP se izmeri v vsakem 2 ml vzorcu, tako da se za vsako žival pridobi dve meritvi ATP. Nato se določi povprečna luminiscenca ATP, ki se uporabi pri nadaljnjih izračunih (glej odstavek 30). OPAZOVANJA Klinična opazovanja 28. Vsako miš je treba vsaj enkrat dnevno natančno opazovati glede kliničnih znakov, lokalnega draženja na mestu nanosa ali sistemske toksičnosti. Vsa opazovanja se sistematično zabeležijo v evidence, ki se vodijo za vsako miš. Načrt spremljanja vključuje merila za hitro identifikacijo miši, ki izražajo sistemsko toksičnost, čezmerno draženje kože ali jedkost za kožo zaradi evtanazije (36). Telesna masa 29. Kot je navedeno v odstavku 25 se telesna masa posameznih živali izmeri na začetku preskusa in ob predvideni humani usmrtitvi. IZRAČUN REZULTATOV 30. Rezultati za vsako tretirano skupino so izraženi kot povprečni stimulacijski indeks (SI). SI se dobi tako, da se povprečno število relativne luminiscenčne enote/miš v vsaki skupini preskusne snovi in v pozitivni kontrolni skupini deli s povprečnim številom relativne luminiscenčne enote/miš za kontrolno skupino s topilom/nosilcem. Povprečni stimulacijski indeks za kontrolne skupine z nosilcem je potem 1. 31. Rezultat se šteje za pozitivnega, če je SI ≥ 1,8 (10). Vendar se lahko pri odločanju, ali je mejni rezultat pozitiven (tj. vrednost SI med 1,8 in 2,5), uporabijo tudi moč odziva na odmerek, statistični pomen ter doslednost odzivov v topilu/nosilcu in pozitivni kontroli (2) (3) (37). 32. Pri mejnem pozitivnem odzivu s SI med 1,8 in 2,5 bodo uporabniki morda za potrditev, da so takšni rezultati pozitivni, poleg vrednostih SI upoštevali tudi moč odziva na odmerek, dokaze o sistemski toksičnosti ali statistični pomen (10). Upoštevati je treba tudi različne lastnosti preskusne snovi, vključno s strukturno podobnostjo z znanimi povzročitelji preobčutljivosti, povzročanjem čezmernega lokalnega draženja kože pri miši ter naravo opaženega odnosa med odmerkom in odzivom. Ti in drugi razlogi so podrobno obdelani drugje (4). 33. Zbiranje podatkov na ravni posamezne miši bo omogočilo statistično analizo prisotnosti in stopnje odnosa med odmerkom in odzivom v podatkih. Morebitna statistična ocena lahko vključuje oceno odnosa med odmerkom in odzivom ter ustrezno prilagojene primerjave preskusnih skupin (npr. skupina, ki je prejela odmerek v parih, proti primerjavam primerjalnih kontrolnih skupin s topilom/nosilcem). Statistična analiza lahko obsega npr. linearno regresijo ali Williamsov preskus za oceno nihanj odziva na odmerek in Dunnettov preskus za primerjave po parih. Pri izbiri ustrezne metode statistične analize se mora raziskovalec zavedati možnih neenakosti varianc in drugih sorodnih problemov, zaradi katerih je lahko nujna pretvorba podatkov ali neparametrska statistična analiza. V vsakem primeru bo moral raziskovalec morda izvesti izračune stimulacijskega indeksa in statistične analize s podatkovnimi točkami (včasih imenovanimi ‚izločitve‘) in brez njih. PODATKI IN POROČANJE Podatki 34. Podatki se povzamejo v obliki preglednice, ki prikazuje vrednosti relativne luminiscenčne enote za posamezno žival, skupinsko povprečje relativne luminiscenčne enote/žival, s tem povezane napake (npr. SD, SEM) in povprečni SI za vsako skupino odmerka v primerjavi s primerjalno kontrolno skupino s topilom/nosilcem. Poročilo o preskusu 35. Poročilo o preskusu vsebuje naslednje informacije: preskusne in kontrolne kemikalije: — identifikacijske podatke (npr. številko CAS in številko EC, če je na voljo; vir; čistost; znane nečistoče, številko serije), — fizikalno stanje in fizikalno-kemijske lastnosti (npr. hlapnost, stabilnost, topnost), — če je zmes, sestavo in relativne odstotke sestavin; topilo/nosilec: — identifikacijske podatke (čistost, po potrebi koncentracijo, uporabljeno količino), — utemeljitev izbire uporabljenega nosilca; preskusne živali: — vir miši seva CBA, — mikrobiološki status živali, če je znan, — število in starost živali, — vir živali, namestitvene pogoje, prehrano, itd.; preskusni pogoji: — vir, številko serije in podatke proizvajalca glede zagotavljanja kakovosti/nadzora kakovosti kompleta za ATP, — podatke o pripravi in uporabi preskusne snovi, — utemeljitev izbire odmerka (vključno z rezultati predhodnega presejalnega preskusa, če je bil izveden), — uporabljene koncentracije nosilca in preskusne snovi in skupno količino uporabljene preskusne snovi, — podatke o kakovosti hrane in vode (vključno z vrsto/virom prehranjevanja, virom vode), — podatke o programih tretiranja in vzorčenja, — metode merjenja toksičnosti, — merila za obravnavanje študij kot pozitivnih ali negativnih, — podrobnosti o morebitnih odstopanjih protokola in pojasnilo, kako odstopanje vpliva na zasnovo študije in njene rezultate; preverjanje zanesljivosti: — povzetek rezultatov zadnjega preverjanja zanesljivosti, vključno z informacijami o uporabljeni preskusni snovi, koncentraciji in nosilcu, — primerjalne in/ali pretekle pozitivne in primerjalne negativne (topilo/nosilec) kontrolne podatke za preskuševalni laboratorij, — če primerjalna pozitivna kontrola ni bila vključena, datum in laboratorijsko poročilo nazadnje izvedene redne pozitivne kontrole in poročilo, ki navaja pretekle pozitivne kontrolne podatke za laboratorij, na podlagi katerih je upravičeno neizvajanje primerjalne pozitivne kontrole; rezultati: — posamezne mase živali na začetku odmerjanja in ob predvideni usmrtitvi; ter povprečno in povezano napako (npr. SD, SEM) za vsako tretirano skupino, — časovni potek začetka toksičnosti in njenih znakov, vključno z morebitnim draženjem kože na mestu dajanja za vsako žival, — čas usmrtitve živali in čas merjenja ATP za vsako žival, — preglednico z vrednostmi relativne luminiscenčne enote in vrednostmi stimulacijskega indeksa za vsako tretirano skupino odmerka, — povprečno in povezano napako (npr. SD, SPM) za relativno luminiscenčno enoto/miš za vsako tretirano skupino, — izračunan SI in ustrezno merilo spremenljivosti, ki upošteva spremenljivost med posameznimi živalmi tako v preskusni snovi kot kontrolnih skupinah, — odnos med odmerkom in odzivom, — po potrebi, statistične analize; razprava o rezultatih: — kratke pripombe o rezultatih, analizo odziva na odmerek in po potrebi statistične analize, s sklepom, ali naj se preskusna snov šteje za povzročitelja preobčutljivosti kože. VIRI 1. OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: http://www.oecd.org/env/testguidelines 2. Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation. Food Chem, Toxicol., 34, 999-1002. 3. Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem, Toxicol., 34, 985–997. 4. Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 36, 327–333. 5. Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employement of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol., 146, 49–59. 6. ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Na voljo na spletni strani: http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf. 7. Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 258–273. 8. Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 274–286. 9. Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process.Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 249–257. 10. ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd., based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH Publication No. 10-7551A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Na voljo na spletni strani: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-DA/TMER.htm. 11. ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated validation status of new versions and applications of the murine local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Na voljo na spletni strani: http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf. 12. Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. and Ito, M. (2008), Characterization and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint.J. Pharmacol. Toxicol. Meth., 58, 1–10. 13. Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. and Yuasa, A. (2008), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph node assay based on adenosine triphosphate measurement. J. Pharmacol. Toxicol. Meth., 58, 11–26. 14. OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Na voljo na spletni strani: http://www.oecd.org/env/testguidelines. 15. Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896–1904. 16. Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90–96. 17. Crouch, S.P., Kozlowski, R., Slater, K.J. and Fletcher J. (1993), The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Meth., 160, 81–88. 18. Ishizaka, A., Tono-oka, T. and Matsumoto, S. (1984), Evaluation of the proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP. J. Immunol. Meth., 72, 127–132. 19. Dexter, S.J., Cámara, M., Davies, M. and Shakesheff, K.M. (2003), Development of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacterial cell number from a mixed population. Biomat., 24, 27–34. 20. Lundin A. (2000), Use of firefly luciferase in ATP-related assays of biomass, enzymes, and metabolites. Meth. Enzymol., 305, 346–370. 21. ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press. 22. ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. Na voljo na spletni strani: http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf. 23. McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71–89. 24. Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13–31. 25. OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Na voljo na spletni strani: http://www.oecd.org/env/testguidelines. 26. Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist, 96, 235. 27. ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Na voljo na spletni strani: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf. 28. Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice. Drug. Chem. Toxicol., 21, 195–206. 29. Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic