Četrta Direktiva Komisije

z dne 5. decembra 1972

o določitvi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme

(73/46/EGS)

KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE

ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske gospodarske skupnosti,

ob upoštevanju Direktive Sveta z dne 20. julija 1970 [1] o uvedbi metod vzorčenja in analiz Skupnosti za uradni nadzor krme, kakor je bila spremenjena z Direktivo 72/275/EGS z dne 20. julija 1972 [2], in zlasti člena 2 Direktive,

ker navedena direktiva zahteva, da se uradni nadzor krme izvaja z uporabo metod vzorčenja in analiz Skupnosti za namene preverjanja skladnosti z zahtevami, ki izhajajo iz zakonov ali drugih predpisov v zvezi s kakovostjo in sestavo krme;

ker so direktive 71/250/EGS z dne 15. junija 1971 [3], 71/393/EGS z dne 18. novembra 1971 [4] in 72/199/EGS z dne 27. aprila 1972 [5] že določile številne analitske metode Skupnosti; ker je zaradi napredka dela odtlej priporočljivo sprejeti četrti sklop metod;

ker so ukrepi, predvideni s to direktivo, v skladu z mnenjem Upravnega odbora za krmo,

SPREJELA NASLEDNJO DIREKTIVO

Člen 1

Države članice zahtevajo, da se analize za uradni nadzor krme v zvezi z vsebnostjo vlage v živalskih in rastlinskih masteh in oljih ter vsebnostjo magnezija in surovih vlaken v krmi izvajajo v skladu z metodami, opisanimi v Prilogi I k tej direktivi.

Splošne določbe, navedene v delu 1 (Uvod) Priloge k Prvi direktivi Komisije 71/250/EGS z dne 15. junija 1971, se uporabljajo za metode, opisane v Prilogi I k tej direktivi.

Člen 2

Države članice zahtevajo, da se analize za uradni nadzor krme v zvezi z vsebnostjo retinola (vitamina A), tiamina (anevrina, vitamina B1), askorbinske in dehidroaskorbinske kisline (vitamina C) izvajajo v skladu z metodami, opisanimi v Prilogi II k tej direktivi.

Splošne določbe, navedene v delu 1 (Uvod) Priloge k Prvi direktivi Komisije 71/250/EGS z dne 15. junija 1971, z izjemo dela, ki govori o pripravi vzorca za analizo, se uporabljajo za metode, opisane v Prilogi II k tej direktivi.

Člen 3

Države članice sprejmejo zakone in druge predpise, potrebne za uskladitev s to direktivo, najpozneje do 1. januarja 1974. O tem takoj obvestijo Komisijo.

Člen 4

Ta direktiva je naslovljena na države članice.

V Bruslju, 5. decembra 1972

Za Komisijo

Predsednik

S. L. Mansholt

[1] UL št. L 170, 3.8.1970, str. 2.

[2] UL št. L 171, 29.7.1972, str. 39.

[3] UL L 155, 12.7.1971, str. 13.

[4] UL L 279, 20.12.1971, str. 7.

[5] UL L 123, 29.5.1972, str. 6.

--------------------------------------------------

PRILOGA I

1. DOLOČANJE VLAGE V RASTLINSKIH IN ŽIVALSKIH MASTEH IN OLJIH

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določitev vsebnosti vode in hlapnih snovi v živalskih in rastlinskih masteh in oljih.

2. Princip

Vzorec se posuši do konstantne mase pri 103 °C. Izguba mase se določi s tehtanjem.

3. Oprema

3.1 Posoda z ravnim dnom iz materiala, odpornega proti koroziji, s premerom 8 do 9 cm in višino približno 3 cm (tehtič).

3.2 Živosrebrni termometer z ojačeno bučko in podaljškom na zgornjem delu, s skalo od približno 80 °C do najmanj 110 °C in dolžino približno 10 cm.

3.3 Peščena kopel ali električna plošča.

3.4 Eksikator, ki vključuje učinkovito sušilo.

3.5 Analitska tehtnica.

4. Postopek

Natehta se približno 20 g homogeniziranega vzorca s točnostjo mg v suho, stehtano posodo (3.1), v kateri je termometer (3.2). Ob nenehnem mešanju s termometrom se segreva na peščeni kopeli ali na vroči plošči (3.3) tako, da temperatura doseže 90 °C v približno 7 minutah.

Temperatura se zniža in opazuje se pogostost, s katero se mehurčki dvigujejo z dna posode. Temperatura ne sme preseči 105 °C. Nadaljuje se z mešanjem in pri tem drgne dno posode, dokler mehurčki ne prenehajo izhajati.

Da se zagotovi popolna odstranitev vlage, se večkrat segreje na 103 °C ± 2 °C ob ohlajevanju na 93 °C med zaporednimi gretji. Nato se pusti, da se vzorec v eksikatorju (3.4) ohladi na sobno temperaturo, in se stehta. Postopek se ponavlja, dokler izguba mase med dvema zaporednima tehtanjema ni manjša od 2 mg.

Opomba:

Povečanje mase vzorca po ponovljenem segrevanju kaže na oksidacijo maščobe. V tem primeru je treba upoštevati rezultat tehtanja, izvedenega neposredno pred začetkom povečevanja mase.

5. Izračun rezultatov

Odstotni masni delež vlage v vzorcu se izračuna z naslednjo enačbo:

×

100M0

kjer je:

M0 = masa vzorca v gramih;

M1 = masa posode z vsebino pred segrevanjem v gramih;

M2 = masa posode z vsebino po segrevanju v gramih.

Rezultati, nižji od 0,05 %, se navedejo kot "manj kakor 0,05 %".

Ponovljivost

Razlika v vlagi med rezultatoma dveh vzporednih določitev na istem vzorcu ne sme presegati 0,05 % absolutne vrednosti.

2. DOLOČANJE MAGNEZIJA

— z atomsko absorpcijsko spektrofotometrijo –

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določitev količine magnezija v krmi. Posebej je primerna za določanje vsebnosti magnezija, nižjih od 5 %.

2. Princip

Vzorec se upepeli in raztopi v razredčeni klorovodikovi kislini. Če ne vsebuje organskih snovi, se raztopi direktno v razredčeni klorovodikovi kislini. Raztopina se razredči in vsebnost magnezija se določi z atomsko absorpcijsko spektrofotometrijo pri 285,2 nm s primerjavo s standardnimi raztopinami.

3. Reagenti

3.1 Klorovodikova kislina p. a. d: 1,16.

3.2 Koncentrirana klorovodikova kislina p. a. d: 1,19.

3.3 Magnezijev trak ali žica oziroma magnezijev sulfat heptahidrat, osušen na sobni temperaturi.

3.4 2,5-odstotna (m/v) raztopina stroncijeve soli (klorid ali nitrat) stroncij (= 76,08 g SrCl2 × 6 H2O p. a. ali 60,38 g Sr (NO3)2.p. a.).

3.5 Standardna raztopina magnezija: s točnostjo mg se natehta 1 g magnezija (3.3), kateremu je bila predhodno previdno odstranjena oksidna plast, ali ustrezna količina (10,143 g) magnezijevega sulfata heptahidrata (3.3). Prenese se v 1000 — mililitrsko merilno bučko, doda 80 ml klorovodikove kisline (3.1), pusti, da se raztopi, in dopolni z vodo do 1000 ml. 1 ml te raztopine vsebuje 1,000 mg magnezija.

4. Oprema

4.1 Platinski, kvarcni ali porcelanski žarilni lonček.

4.2 Termostatsko regulirana električna žarilna peč.

4.3 Atomski absorpcijski spektrofotometer.

5. Postopek

5.1 Priprava vzorčne raztopine

5.1.1 Krma, sestavljena izključno iz mineralnih snovi

S točnostjo mg se natehta 5 g vzorca v 500-mililitrsko merilno bučko z 250 do 300 ml vode. Doda se 40 ml klorovodikove kisline (3.1), zavre in tekočina pusti rahlo vreti 30 minut. Pusti se, da se ohladi, dopolni z vodo do oznake, premeša in filtrira v suho čašo skozi suh naguban filter. Prvih 30 ml filtrata se zavrže. Če vzorec vsebuje silicijev dioksid, se doda 5 g vzorca z zadostno količino (15-30 ml) klorovodikove kisline (3.2), izpari do suhega na vodni kopeli in postavi za eno uro v sušilnik pri 105 °C. Nadaljuje se, kakor je opisano v tretjem stavku 5.1.2.

5.1.2 Krma, sestavljena pretežno iz mineralnih snovi

S točnostjo mg se natehta 5 g vzorca v lonček in žari pri 550 °C v žarilni peči tako dolgo, da pepel ne vsebuje ogljikovih delcev, ter nato ohladi. Da bi se odstranil silicijev dioksid, se pepelu doda zadostna količina (15-30 ml) klorovodikove kisline (3.2), izpari do suhega na vodni kopeli in postavi za eno uro v sušilnik pri 105 °C. Ostanku se doda 10 ml klorovodikove kisline (3.1) in s toplo vodo prenese v 500-mililitrsko merilno bučko. Pusti se, da se ohladi, in dopolni z vodo do oznake. Premeša se in filtrira v suho čašo skozi suh naguban filter. Prvih 30 ml filtrata se zavrže.

5.1.3 Krma, sestavljena pretežno iz organskih snovi

S točnostjo mg se natehta 5 g vzorca v lonček in žari pri 550 °C v žarilni peči tako dolgo, da pepel ne vsebuje ogljikovih delcev. Da se dobi netopen silicijev dioksid, se pepelu doda 5 ml klorovodikove kisline (3.2), izpari do suhega na vodni kopeli in nato eno uro suši v sušilniku pri 105 °C. Pepelu se doda 5 ml klorovodikove kisline (3.1), se s toplo vodo prenese v 250-mililitrsko merilno bučko, segreje do vrenja, pusti ohladiti in dopolni z vodo do oznake. Premeša se in skozi suh naguban filter se filtrira v suho čašo. Prvih 30 ml filtrata se zavrže.

5.2 Merjenje z atomsko absorpcijo

Z razredčenjem standardne raztopine (3.5) z vodo se pripravi najmanj 5 referenčnih raztopin z naraščajočimi koncentracijami, ki ustrezajo optimalnemu merilnemu območju spektrofotometra. Vsaki raztopini se doda 10 ml raztopine stroncijeve soli (3.4) in dopolni z vodo do 100 ml. Z vodo se razredči alikvot filtrata, dobljenega v 5.1.1, 5.1.2 ali 5.1.3, tako, da se dobi koncentracija magnezija znotraj meja koncentracije referenčnih raztopin. Koncentracija klorovodikove kisline v tej raztopini ne sme preseči 0,4 N. Doda se 10 ml raztopine stroncijeve soli (3.4) in dopolni z vodo do 100 ml. Absorpcija določane raztopine in referenčnih raztopin se meri pri 285,2 nm.

6. Izračun rezultatov

Količina magnezija v vzorcu se izračuna glede na referenčne raztopine. Rezultat se izrazi v odstotnih masnih deležih glede na vzorec.

Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določitev na istem vzorcu ne sme presegati 5 % relativne vrednosti.

3. DOLOČANJE SUROVIH VLAKEN

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določitev količine nemastnih organskih snovi v krmi. To so snovi, ki so netopljive v kislini in alkalnih medijih ter so ponavadi poimenovane surova vlakna.

2. Princip

Vzorec se po potrebi razmasti in zaporedno obdela s specificiranimi koncentracijami vrelih raztopin žveplene kisline in kalijevega hidroksida. Ostanek se loči s filtracijo v prisotnosti azbesta, spere, posuši, stehta in upepeli pri temperaturi 900 °C. Izguba teže pri upepeljevanju ustreza vsebnosti surovih vlaken v preskusnem vzorcu.

3. Reagenti

3.1 Žveplova kislina 0,26 N.

3.2 Obdelan azbest: azbestu tipa, ki se uporablja z Goochevim žarilnim lončkom, se doda približno petkratna teža razredčene klorovodikove kisline (1 del klorovodikove kisline, d: 1,19 + 3 deli vode). Mešanica naj vre približno 45 minut, nato se pusti, da se ohladi, ter filtrira skozi Büchnerjev lijak. Ostanek se najprej spere z vodo, dokler klorovodikova kislina ne izgine iz pralne vode, nato se spere še z acetonom (3.6). Azbest se posuši v sušilni peči in nato upepeljuje 2 uri pri 900 °C. Pusti se, da se ohladi, in shrani v zamašeni bučki. Tako obdelan azbest se lahko uporabi večkrat. Ustrezati mora specifikacijam iz 5 o slepem preskusu.

3.3 Emulzija proti penjenju (npr. silikon).

3.4 Raztopina kalijevega hidroksida 0,23 N.

3.5 Klorovodikova kislina 0,5 N.

3.6 Aceton.

3.7 Dietileter.

4. Oprema

4.1 Čaše z velikostjo najmanj 600 ml z merilnimi oznakami na stopnji 200 ml.

4.2 Porcelanske plošče s premerom približno 80 mm in debele približno 4 mm ter preluknjane s približno 32 luknjami s premerom približno 4 mm.

4.3 Vakuumske buče, zamašene z gumenimi zamaški, s prostornino približno 2 litra z merilnimi oznakami na stopnji 800 ml, opremljene s steklenimi lijaki s premerom 120 mm.

4.4 Filtrirne plošče s premerom približno 40 mm, debele približno 4 mm s poševnimi robovi, tako da se prilegajo lijaku (4.3), preluknjane s približno 16 luknjami s premerom 4 mm in prekrite z žično mrežo, katere očesa merijo približno 1 mm. Tako plošče kakor tudi mreža morajo biti odporne proti kislinam in alkalijam.

4.5 Platinasti ali kremenovi žarilni lončki.

4.6 Termostatsko regulirana električna talilna peč.

4.7 Eksikator.

4.8 Azbestni filter: 2,0 g azbesta (3.2) se raztopi v 100 ml vode.

Filtrira se v vakuumu nad filtrirno ploščo, pokrito z žično mrežo (4.4) in položeno v lijak vakuumske buče (4.3). Filtrat se zbere in še enkrat filtrira skozi isti filter. Filtrat se zavrže.

5. Postopek

S točnostjo mg se v čašo (4.1) natehtata 3 g vzorca in 2 g obdelanega azbesta (3.2), dodata se 200 ml žveplove kisline (3.1) in nekaj kapljic emulzije proti penjenju (3.3). Hitro se zavre in pusti vreti natančno 30 minut. Da bi se ohranila konstantna prostornina, se čaša pokrije s hladilno pripravo, kakor na primer s 500-mililitrsko bučo z okroglim dnom, v kateri kroži hladna voda. Vretje se ustavi tako, da se doda približno 50 ml hladne vode in takoj filtrira v vakuumu skozi azbestni filter, pripravljen, kakor je prikazano v 4.8.

Ostanek se spere s petimi količinami približno 100 ml zelo vroče vode, tako da se dobi končna prostornina 800 ml filtrata. Ostanek se količinsko prenese v čašo (4.1), v kateri je porcelanska plošča (4.2) za reguliranje vrenja. Doda se 200 ml raztopine kalijevega hidroksida (3.4). Hitro se zavre in pusti vreti natančno 30 minut. Doda se približno 50 ml hladne vode in v vakuumu nemudoma filtrira skozi svež azbestni filter, pripravljen, kakor je prikazano v 4.8. Ostanek se nato pere z zelo vročo vodo, dokler ni pralna voda nevtralna (preskus z lakmusovim papirjem), nato še trikrat z acetonom (3.6) (skupaj približno 100 ml acetona).

Ostanek se količinsko prenese v žarilni lonček (4.5), po potrebi se razbije, in posuši na konstantno težo v sušilni peči pri 130 °C.

Ohladi se v eksikatorju (4.7) in hitro stehta.

Žarilni lonček se položi v talilno peč (4.6) in žari 30 minut pri 900 °C. Ohladi se v eksikatorju (4.7) in hitro stehta.

Z istim postopkom se izvede slepi preskus z obdelanim azbestom (3.2), vendar brez vzorca. Izguba teže pri žarjenju 6 g azbesta ne sme presegati 10 mg.

6. Izračun rezultatov

Odstotek surovih vlaken v vzorcu se izrazi z naslednjim razmerjem:

×

1003

kjer je:

a = izguba teže po žarjenju med določitvijo;

b = izguba teže po žarjenju med slepim preskusom.

Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določitev na istem vzorcu ne sme presegati:

0,3 absolutne vrednosti za vsebnosti surovih vlaken, manjše od 10 %;

3 % relativne vrednosti za vsebnosti surovih vlaken, enake ali večje od 10 %.

7. Opombe

7.1 Krmo, ki vsebuje več kakor 10 % olj in masti, je treba pred analizo razmastiti z dietiletrom (3.7). Za razmastitev se preskusni vzorec (3 g, stehtani na najbližji mg) da na azbestni filter (4.8). Trikrat se prekrije s približno 50 ml dietiletra (3.7) in vsakič se previdno filtrira pod vakuumom. Razmaščeni preskusni vzorec in azbest se količinsko preneseta v čašo (4.1) in analiza se nadaljuje, kakor je prikazano v 5.

7.2 Krmo z olji in mastmi, ki jih ni mogoče izločiti neposredno, je treba razmastiti, kakor je opisano v 7.1, in še enkrat razmastiti, potem ko se kislina spere iz ostanka.

Da bi se sprala kislina, je treba ostanek trikrat sprati z acetonom (3.6) (skupaj 100 ml), nato pa še trikrat s 50 ml dietiletra (3.7). Nato se ostanek količinsko premesti v čašo (4.1) in analiza se nadaljuje, kakor je prikazano v drugem odstavku v 5 (obdelava z raztopino kalijevega hidroksida).

7.3 Če je krma bogata s kalcijem (več kakor 2 % kalcija), se preskusni vzorec (3 g, stehtani na najbližji mg) da v čašo (4.1) s 100 ml klorovodikove kisline 0,5 N (3.5) in pusti 5 minut stati na hladnem. Takoj se filtrira in spere s hladno vodo. Kot pripomoček pri filtriranju se uporabi 2,0 g azbesta, namenjenega za vretje z žveplovo kislino. Če se pri filtraciji pojavijo težave, se suspenzija razredči z acetonom (3.6). Nato se nadaljuje, kakor je prikazano v 5.

--------------------------------------------------

PRILOGA II

1. DOLOČANJE RETINOLA (VITAMINA A)

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določitev količine retinola (vitamina A) v krmi, koncentratih in premiksih. Spodnja meja določitve je 10000 IU/kg za visoko pigmentirana živila in 4000 IU/kg za preostala [1]. Proizvodi so razdeljeni v dve skupini glede na domnevno vsebnost retinola:

Skupina A: vsebnost, nižja od 200000 IU/kg;

Skupina B: vsebnost, enaka ali večja od 200000 IU/kg.

2. Princip

Vroč vzorec se hidrolizira z raztopino kalcijevega hidroksida v etanolovem mediju in v prisotnosti antioksidanta ali v dušikovi atmosferi. Mešanica se izloči z 1,2-dikloroetanom. Ekstrakt se izpari do suhega in obdela s petroletrom. Raztopina se kromatografira v koloni aluminijevega oksida (za proizvode iz skupine B je kromatografija potrebna le v nekaterih primerih). Za proizvode iz skupine A se vsebnost retinola določa s spektrofotometrijo pri 610 nm po razvoju barvnega kompleksa po Carr-Priceovi reakciji; za proizvode iz skupine B s spektrofotometrijo v UV-spektru pri 325 nm.

3. Reagenti

(a) uporabljeni za analizo proizvodov skupin A in B

3.1 96-odstotni (v/v) etanol.

3.2 10-odstotna (w/v) raztopina natrijevega askorbata p. a.ali

3.3 Prečiščeni dušik.

3.4 50-odstotna (w/v) raztopina kalijevega hidroksida p. a.

3.5 Raztopina kalijevega hidroksida 1 N p. a.

3.6 Raztopina kalijevega hidroksida 0,5 N p. a.

3.7 1,2-dikloroetan p. a.

3.8 Petroleter, vrelišče: 30-50 °C. Če je treba, se prečisti z naslednjim postopkom: 1000 ml petroletra se zmeša z 20-mililtrskimi odmerki koncentrirane žveplove kisline, dokler kislina ne ostane brezbarvna. Kislina se odstrani in petroleter se zaporedno izpere s po 500 ml vode, dvakrat s po 250 ml 10-odstotne (w/v) raztopine natrijevega hidroksida ter trikrat s po 500 ml vode. Odstrani se vodna plast, petroleter se 1 uro suši nad aktivnim ogljikom in brezvodnim natrijevim sulfatom ter se nato prefiltrira in destilira.

3.9 Aluminijev oksid, standardiziran po Brockmannu: sežiga se 8 ur pri 750 °C, ohladi v eksikatorju in shrani v rjavo steklenico z zamaškom iz brušenega stekla. Pred uporabo v kromatografiji se navlaži, kakor sledi: v rjavo steklenico se dasta 10 g aluminijevega oksida in 0,7 ml vode. Steklenica se zamaši in med nenehnim stresanjem 5 minut segreva v vreli vodni kopeli. Pusti se, da se ohladi. Aktivnost tako pripravljenega aluminija se preveri tako, da se znana količina retinola (3.17) (pribl. 500 IU) podvrže postopkoma 5.3 in 5.4 in preveri rekuperacija.

3.10 Osnovni aluminijev oksid stopnje aktivnosti 1 (Woelm, Merck ali enakovreden).

3.11 Čisti dietileter. Peroksidi in sledi vode se odstranijo s kromatografijo na koloni osnovnega aluminijevega oksida (3.10). (25 g aluminijevega oksida na 250 ml dietiletra).

3.12 Raztopine petroletra (3.8) pri 4-, 8-, 12-, 16- in 20-odstotnem (v/v) dietiletru (3.11).

3.13 0,5-molarna raztopina natrijevega sulfida v 70-odstotnem (v/v) glicerinu, pripravljena iz natrijevega sulfida p. a.

(b) uporabljeni izključno za analizo proizvodov iz skupine A

3.14 Benzen, ki se lahko kristalizira, p. a.

3.15 Kloroform p. a. S kromatografijo na koloni osnovnega aluminijevega oksida (3.10) se odstranijo etanol, fosgen in sledi vode (50 g aluminijevega oksida na 200 ml kloroforma; prvih 50 ml izpirka je priporočljivo kromatografirati še enkrat).

3.16 Carr-Priceov reagent: približno 25 g antimonovega triklorida (shranjenega v eksikatorju) se vmeša v 100 ml kloroforma (3.15), dokler se ne dobi nasičena raztopina. Rahla usedlina antimonovega triklorida je zanemarljiva. Doda se 2 ml anhidrida ocetne kisline p. a. Raztopina se hrani v hladilniku v rjavi steklenici z zamaškom iz brušenega stekla, kjer se lahko pusti več tednov.

3.17 Retinol — standardiziran s spektrofotometrijo.

(c) uporabljen izključno za analizo proizvodov iz skupine B

3.18 Izopropanol za kromatografijo.

4. Oprema

4.1 Vodna kopel.

4.2 Naprava za vakuumsko izhlapevanje z okroglimi bučkami z različnimi prostorninami.

4.3 Steklene kromatografske cevke (dolžine: 300 mm; z notranjim premerom: približno 13 mm).

4.4 Spektrofotometer z 10-milimetrskimi celicami. Za meritve v UV-spektru so potrebne celice iz kremena.

4.5 UV-svetilke, primerne za 365 nm.

5. Postopek

Opomba:

Vsi postopki morajo biti izvedeni brez neposredne svetlobe, če je treba, v opremi iz rjavega stekla.

5.1 Preskusni vzorec

Iz natančno razdeljenega vzorca se vzame preskusni vzorec, ki ustreza predvideni vsebnosti retinola, in sicer:

0,1 — 1,0 g za koncentrate (vsebnosti, večje od 20000 IU/g);

3,0 — 5,0 g za premikse (vsebnosti med 400 in 20000 IU/g);

10 — 20 g za mineralne mešanice;

30 g za proizvode skupine A.

Preskusni vzorec se nemudoma da v 500-mililitrsko bučko z zamaškom iz brušenega stekla.

5.2 Hidroliza in ekstrakcija [2]

Preskusnemu vzorcu se zaporedoma dodajo 40 ml etanola (3.1), 2 ml raztopine natrijevega askorbata (3.2) [3], 10 ml raztopine kalijevega hidroksida (3.4) in 2 ml raztopine natrijevega sulfida (3.13).

V rektifikacijski koloni se segreva 30 minut pri 70 do 80 °C, nato se pusti ohladiti pod vodnim curkom. S pipeto se dodata 50 ml etanola (3.1) in 100 ml 1,2-dikloroetana (3.7). Krepko se pretrese in tekočina, ki plava na površju, se dekantira v dekantirno posodo. V posodo se doda 150 ml raztopine kalijevega hidroksida (3.5), trese 30 sekund in pusti stati, dokler se plasti ne ločita. Dikloretanska plast (spodnja plast) se zbere v dekantirno posodo, doda 40 ml raztopine kalijevega hidroksida (3.6), trese 10 sekund in pusti stati, dokler se plasti ne ločita. Nato se dikloretanska plast zbere v dekantirno posodo in 6–8-krat spere s po 40 ml vode, dokler ne vsebuje več alkalij (preskus s fenolftaleinom). Dikloretanska plast se nato zbere in z uporabo trakov filtrirnega papirja se odstranijo zadnje sledi vode.

V vakuumu in vodni kopeli se alikvoten del raztopine do suhega izhlapeva na temperaturi 40 °C. Ostanek se nemudoma obdela s 5 ml petroletra (3.8).

Proizvodi skupine A se kromatografirajo, kakor je prikazano v 5.3.1.

Za proizvode skupine B se raztopina premesti v 50-mililitrsko merilno bučko, prostornina se dopolni s petroletrom (3.8), zmeša in izmeri se optična gostota, kakor je prikazano v 5.4.2.

5.3 Kromatografija

5.3.1 Proizvodi skupine A

Kromatografska cevka (4.3) se do višine 200 mm napolni z 10 g aluminijevega oksida (3.9), ki je bil predhodno zmešan v gosto suspenzijo s petroletrom (3.8). V cevko se da raztopina, pridobljena po postopku iz 5.2, in nemudoma doda 20 ml petroletra (3.8). Nato se pod tlakom ali delnim vakuumom zaporedoma izpira s po 10 ml raztopine petroletra pri 4-, 8-, 12-, 16- in 20-odstotnem dietiletru (3.12), pri čemer naj bo hitrost pritoka 2 do 3 kapljice na sekundo.

Najprej se izpere karotin [4]. Retinol se ponavadi izpere pri raztopini petroletra pri 20-odstotnem dietiletru (3.12). Izpiranje se spremlja pod UV-svetlobo (kratka osvetlitev kolone z živosrebrno svetilko). Pri tem je fluorescentno območje retinola jasno ločeno od rumenih območij ksantofila, ki mu sledijo. Izpirek, ki vsebuje retinol, se zbere v erlenmajerici.

5.3.2 Proizvodi skupine B

Kromatografijo je treba izvesti le, če meritve optične gostote, dobljene po 5.4.2, ne ustrezajo zahtevam iz te točke.

Če se kromatografija izkaže za potrebno, se v kromatografsko kolono da alikvoten del raztopine v petroletru, pridobljene po postopku iz 5.2, ki vsebuje približno 500 IU retinola, ter se kromatografira, kakor je prikazano v 5.3.1.

5.4 Merjenje optične gostote

5.4.1 Proizvodi skupine A

Pod vakuumom se do suhega evaporira izpirek iz 5.3.1, ki vsebuje retinol, in ostanek se obdela z 2 ml benzena (3.14). Nato se vzame 0,3 ml te raztopine in se doda 3 ml Carr-Priceovega reagenta (3.16). Razvije se modro obarvanje. Optična gostota se izmeri s spektrofotometrom pri 610 nm natančno 30 sekund po začetku reakcije. Vsebnost retinola se določi v povezavi s standardno krivuljo, dobljeno pri raztopinah benzena, ki imajo vse večje koncentracije standardnega retinola, obdelanega s Carr-Priceovim reagentom (2 do 16 IU standardnega retinola (3.17) na 0,3 ml benzena (3.14) + 3 ml Carr-Priceovega reagenta (3.16)). Standardno krivuljo je treba redno in pogosto preverjati s standardno in sveže pripravljeno raztopino Carr-Priceovega reagenta.

5.4.2 Proizvodi skupine B

Za analizo se vzame alikvoten del raztopine v petroletru, pridobljene po postopku iz 5.2, ki vsebuje približno 200 IU retinola. Pod vakuumom se evaporira do suhega in ostanek obdela s 25 ml izopropanola (3.18). Optična gostota se izmeri v spektrofotometru pri 325, 310 in 334 nm. Absorpcijski maksimum se nahaja pri 325 nm. Vsebnost retinola v raztopini se izračuna, kakor sledi:

E325 × 18,30 = IU retinola/ml

Vendar mora biti razmerje optičnih gostot

E310 : E325 in E334 : E325

6 : 7 = 0,857.

Če eno od teh razmerij znatno odstopa od te vrednosti (< 0,830 ali >0,880), je treba pred meritvijo optične gostote izvesti kromatografijo skladno s postopkom iz 5.3.2. Če meritev optične gostote, izvedene po kromatografiji, kaže, da zgoraj omenjena razmerja še vedno znatno odstopajo od vrednosti 0,857 (< 0,830 ali > 0,880), mora biti določitev izvedena skladno s postopkom, navedenim za proizvode skupine A.

6. Izračun rezultatov

Pri izračunu vsebnosti retinola je treba upoštevati težo preskusnega vzorca in raztopin, uporabljenih med analizo. Rezultati se izrazijo v IU retinola na kg krme ali na kg koncentrata ali premiksa.

Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določitev na istem vzorcu ne sme presegati:

- 20 % relativne vrednosti za vsebnosti retinola, nižje od 75000 IU/kg;

- 15000 IU za vsebnosti med 75000 in 150000 IU/kg;

- 10 % relativne vrednosti za vsebnosti med 150000 in 250000 IU/kg;

- 25000 IU za vsebnosti med 25000 in 500000 IU/kg;

- 5 % relativne vrednosti za vsebnosti, večje od 500000 IU/kg.

2. DOLOČANJE TIAMINA (VITAMINA B1, ANEVRINA)

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določitev količine tiamina (anevrina, vitamina B1) v krmi, koncentratih in premiksih. Spodnja meja določitve je 5 ppm.

2. Princip

Vroča raztopina se obdela z razredčeno žveplovo kislino in nato encimsko hidrolizira. Tako pridobljena raztopina je podvržena alkalni oksidaciji. Nastali tiokrom se izloči z izobutanolom in določi se s fluorescenčno spektroskopijo.

3. Reagenti

3.1 100 μg/ml standardne raztopine tiamina: 112,3 mg tiaminovega hidroklorida, predhodno pod vakuumom posušenega na konstantno težo, se raztopi v 1000 ml žveplove kisline 0,2 N (3.2). Raztopino je mogoče v hladnem, temnem prostoru hraniti en mesec.

3.2 Žveplova kislina 0,2 N.

3.3 Čisti natrijev disulfit.

3.4 20-odstotna (w/v) raztopina kalijevega fericianida

3.5 25-odstotna (w/v) raztopina kalijevega hidroksida

3.6 Oksidacijska mešanica: 2 ml raztopine kalijevega fericianida (3.4) se zmeša z 48 ml raztopine kalijevega hidroksida (3.5). Ta mešanica ne drži več kakor 4 ure.

3.7 Izobutanol p. a.

3.8 Raztopina natrijevega acetata 2,5 N.

3.9 Multiencimski preparat, ki vsebuje proteazo, fosfatazo in amilazo (npr. Clarase).

3.10 96-odstotni (v/v) etanol.

4. Oprema

4.1 Vodna kopel.

4.2 Centrifuga (3500 vrt./min) s 30- do 50-mililitrskimi epruvetami z zamaški iz brušenega stekla.

4.3 Fluorescenčni spektrometer.

5. Postopek

5.1 Encimska hidroliza

V vsako od dveh 250-mililitrskih merilnih bučk A in B se da enaka količina fino razdeljenega vzorca, ki vsebuje približno 100 μg tiamina in 125 ml žveplove kisline (3.2). Samo v bučko A se doda tudi 1,0 ml standardne raztopine (3.1) (notranji standard).

Bučki se močno pretreseta, postavita v vodno kopel in ob občasnem tresenju se v njej pustita 15 minut. Ohladi se na približno 45 °C. V obe bučki se dodata 20 ml raztopine natrijevega acetata (3.8) in 0,5 g multiencimskega preparata (3.9) ter se pusti stati 20 minut pri sobni temperaturi. Nato se doda še 20 ml raztopine natrijevega acetata (3.8), do volumna se dolije voda, nato pa homogenizira in filtrira. Potem ko se zavrže prvih 15 ml, se zbereta filtrata A in B. Pripravijo se naslednje raztopine:

5.1.1 Referenčna raztopina T

V centrifugalno epruveto (4.2) se dasta 5 ml filtrata A in približno 10 mg natrijevega disulfita (3.3). Epruveta se za 15 minut potopi v vrelo vodno kopel in nato pusti ohladiti na sobno temperaturo.

5.1.2 Raztopini A (notranji standard) in B (vzorec)

V eno centrifugalno epruveto (4.2) se da 5 ml filtrata A, v drugo 5 ml filtrata B (4.2).

5.2 Oksidacija

Raztopinam T, A in B se doda 5 ml oksidacijske mešanice (3.6) in 1 minuto zatem še 10 ml izobutanola (3.7). Epruvete se zamašijo in krepko pretresajo 5 sekund. Pustijo se stati eno minuto, nato se centrifugirajo, tako da se ločijo plasti. Iz vsake epruvete se 5 ml izobutanola, ki plava na površini, prenese v vsako od 250-mililitrskih merilnih bučk, volumen se dopolni z etanolom (3.10) in homogenizira (= ekstrakti T, A in B).

5.3 Merjenje fluorescence

Meritve se izvedejo pri valovni dolžini, za katero fluorescenčni spektrometer daje optimalni odziv na fluorescenco tiokroma. Vzorec se obseva pri približno 365 nm.

Naprava se umeri na vrednost nič z ekstraktom T, nato se izmerita intenzivnosti fluorescence ekstraktov A in B.

6. Izračun rezultatov

Vsebnost tiamina v vzorcu v mg/kg se izrazi z naslednjim razmerjem: d × b/(a – b) c

c

kjer je:

a = intenzivnost fluorescence ekstrakta A (notranji standard);

b = intenzivnost fluorescence ekstrakta B (vzorec);

c = teža vzorca v g;

d = količina tiamina, dodana preskusnemu vzorcu v μg (notranji standard).

Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določitev na istem vzorcu ne sme presegati:

10 % relativne vrednosti za vsebnosti, manjše od 500 mg/kg, in

5 % relativne vrednosti za vsebnosti, enake ali večje od 500 mg/kg.

3. DOLOČANJE ASKORBINSKE KISLINE IN DEHIDROASKORBINSKE KISLINE (VITAMINA C)

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določitev skupne vsebnosti askorbinske in dehidroaskorbinske kisline (vitamina C) v krmi, koncentratih in premiksih. Spodnja meja določitve je 5 ppm. Proizvodi so razdeljeni v dve skupini glede na domnevno vsebnost vitamina C:

Skupina A: vsebnosti, nižje od 10 g/kg;

Skupina B: vsebnosti, enake ali večje od 10 g/kg.

2. Princip

Vzorec se potopi v razredčeno raztopino metafosforne kisline in ekstrahira s kloroformom. Vodna faza se najprej obdela z raztopino 2,6-diklorofenolindofenola, da se askorbinska kislina pretvori v dehidroaskorbinsko kislino, nato pa še z raztopino 2,4-dinitrofenilhidrazina. Nastali hidrazon se ekstrahira z mešanico etilacetata, ledoceta in acetona. Raztopina se kromatografira na koloni silikagela, izpirek se evaporira do suhega in ostanek se raztopi v razredčeni žveplovi kislini. Optična gostota raztopine se zmeri s spektrofotometrom pri 509 nm.

Za proizvode skupine A je treba izpirek, ki izhaja iz kolonske kromatografije, podvreči še tankoplastni kromatografiji, da se izolira hidrazon.

3. Reagenti

3.1 Standardna 0,05-odstotna raztopina L-askorbinske kisline: 50 mg L-askorbinske kisline p. a. se raztopi v približno 20 ml raztopine metafosforne kisline (3.2) in do 100 ml se dolije voda. Raztopina se pripravi tik pred uporabo.

3.2 10-odstotna (w/v) raztopina metafosforne kisline: po drobljenju v možnarju se v vodi raztopi 200 g metafosforne kisline p. a. in nato se do 2000 ml dolije voda. Hrani se pri temperaturi 4 °C in je stabilna en teden.

3.3 Kloroform p. a.

3.4 0,5-odstotna (w/v) raztopina 2,6-diklorofenolindofenola p. a., ki se pripravi tik pred uporabo.

3.5 Filtrirni pripomoček (S. in S. št. 121 ali enakovreden).

3.6 2-odstotna (w/v) kisla raztopina 2,4-dinitrofenilhidrazina: 2 g 2,4-dinitrofenilhidrazina se raztopi v 100 ml razredčene žveplove kisline (25 ml žveplove kisline p. a., d: 1,84, razredčene tako, da se do 100 ml dolije voda). Na hladnem se raztopina lahko hrani en teden.

3.7 Dušik ali

3.8 ogljikov dioksid.

3.9 Mešanica etilacetata p. a., ledoceta in acetona p. a. v volumskem razmerju: 96/2/2.

3.10 Mešanica diklorometana p. a. in ledoceta v volumskem razmerju: 97/3.

3.11 Silikagel, velikosti delcev: 0,05 do 0,2 mm.

3.12 Silikagel H stopnje Stahl za tankoplastno kromatografijo.

3.13 Razredčena žveplova kislina: v 200 ml merilno bučko se da 105 ml vode in volumen dopolni z žveplovo kislino p. a., d: 1,84.

3.14 Eluacijsko topilo za tankoplastno kromatografijo: 75 ml dietiletra p. a. se zmeša s 25 ml etilacetata p. a. in 4,0 ml 96-odstotne (w/v) ocetne kisline p. a. Po dveh do treh kromatografijah se raztopina pripravi znova.

4. Oprema

4.1 Vodna kopel s termostatom, nastavljenim na 20 °C.

4.2 Centrifuga (3500 vrt./min) s 40- do 50-mililitrskimi epruvetami z zamaški iz brušenega stekla.

4.3 Rotacijski vakuumski izparilnik z 250-mililitrskimi bučkami.

4.4 Steklene kromatografske cevke (dolžine: 100 mm, z notranjim premerom: 20 mm) s kolutom iz žlindre (npr. Allihnove cevke).

4.5 Spektrofotometer ali kolorimeter s filtri z 10-milimetrskimi celicami.

4.6 Aparat za tankoplastno kromatografijo s ploščami iz silikagela (3.12), prevlečenimi do globine od 0,5 do 0,6 mm. (Primerne so vnaprej pripravljene plošče.) Plošče se sušijo 2,5 do 3 ure v sušilni peči pri temperaturi od 120 do 130 °C. Pustijo se ohladiti in nato najmanj 24 ur pred uporabo hranijo v eksikatorju.

4.7 Sušilna peč, nastavljena na 120 do 130 °C.

5. Postopek

5.1 Ekstrakcija

V vsako od dveh 250-mililitrskih merilnih bučk (z zamaški iz brušenega stekla) A in B se da enaka količina fino razdeljenega vzorca, ki vsebuje približno 200 μg vitamina C. Samo v bučko A sedoda 0,4 ml standardne raztopine (3.1) in z rahlim tresenjem premeša (notranji standard).

Pri temperaturi 4 °C se v vsako bučko dasta 30 ml kloroforma (3.3) in 25 ml raztopine metafosforne kisline (3.2). Rahlo se pretreseta in nato pustita stati 10 do 15 minut. Doda se 25 ml vode, bučki se zamašita, močno treseta 10 sekund in pustita stati 10 do 15 minut v vodni kopeli (4.1). Raztopina se nato centrifugira, da se vodna faza loči od kloroformove. Kakor je opisano spodaj, se sočasno izvedejo postopki na vodnem ekstraktu A (notranji standard) in B.

5.2 Oksidacija

S pipeto se 40 ml plavajoče (rahlo meglene) vodne raztopine, pridobljene po postopku iz 5.1, prenese v reakcijsko cevko z zamaškom iz brušenega stekla, doda se 0,5 do 1 ml raztopine 2,6-diklorofenolindofenola (3.4) in premeša. Pojavi se rdeče obarvanje, ki mora ostati najmanj 15 minut. Nato se doda približno 300 mg filtrirnega pripomočka (3.5), pretrese in filtrira skozi suh naguban filter. Ni nujno, da je filtrat čist.

5.3 Reakcija z 2,4-dinitrofenilhidrazinom in ekstrakcijo hidrazona

S pipeto se 10 ml filtrata, dobljenega po postopku iz 5.2, prenese v centrifugirno epruveto (4.2), doda 2 ml raztopine 2,4-dinitrofenilhidrazina (3.6) in premeša. Tok dušika (3.7) ali ogljikovega dioksida (3.8) se hitro spusti v epruveto, zamaši in za približno 15 ur (čez noč) potopi v vodno kopel (4.1).

Nato se dodajo 3 ml vode, 20 ml mešanice etilacetata, ledoceta in acetona (3.9) in približno 800 mg filtrirnega pripomočka (3.5). Epruveta se zamaši, krepko pretresa 30 sekund in centrifugira. 15 ml faze, plavajoče na površini, se da v izparilno bučko in izpareva pod zmanjšanim tlakom v rotacijskem izparilniku (4.3), dokler se ne dobi oljnati ostanek. Ob gretju na 50 °C se ostanek raztopi v 2 ml mešanice dietiletra, ledoceta in acetona (3,9), pusti, da se ohladi, doda 10 ml mešanice diklorometana in ledoceta (3.10) ter premeša.

5.4 Kolonska kromatografija

Kromatografska cevka (4.4) se napolni do 30 ml z mešanico diklorometana in ledoceta (3.10). Ob močnem mešanju se 5 g silikagela (3.11) potopi v 30 ml mešanice diklorometana in ledoceta (3.10) in suspenzija se vlije v cevko. Pusti se stati in nato pri nizkem tlaku stisne pod dušikom (3.7). Raztopina, pridobljena po postopku iz 5.3, se dekantira, bučka se splakne z majhno količino mešanice diklorometana in ledoceta (3.10) in dekantira v cevko. Cevka se nato napolni z mešanico (3.10) in kolona se spere z isto mešanico (3- do 4-krat s po 5 ml), dokler se ne dobi brezbarvni izpirek. Rumeno obarvani del izpirka se zavrže.

Rdečkasto območje na vrhu kolone se izpere z mešanico etilacetata, ledoceta in acetona (3.9), izpirek se zbere in izpareva do suhega.

5.4.1 Za proizvode skupine A (vsebnosti vitamina C so nižje od 10 g/kg) se ostanek raztopi z 2 ml mešanice etilacetata, ledoceta in acetona (3.9) in nemudoma kromatografira na tanki plasti, kakor je prikazano v 5.5.

5.4.2 Za proizvode skupine B (vsebnosti vitamina C so enake ali večje od 10 g/kg) se oljnati ostanek obdela s 4 ml razredčene žveplove kisline (3.13), močno pretrese, da se ostanek popolnoma raztopi, in izmeri se optična gostota, kakor je prikazano v 5.6.

5.5 Tankoplastna kromatografija

Opisane postopke je treba izvesti dvojno, kakor sledi: V tanki liniji se na ploščo (4.6) položi 0,5 ml raztopine, pridobljene po postopku iz 5.4.1. Z eluacijskim topilom (3.14) se razvija najmanj 20 minut v kadi, nasičeni s topilnimi hlapi, dokler ni rožnato obarvano območje hidrazona jasno ločeno. Pusti se, da se posuši na odprtem prostoru. Označi se meja rožnatega območja, to se postrga z lopatico in prah se kvantitativno prenese v kromatografsko cevko (4.4).

Prašek se zaporedoma izpere, enkrat z 2 ml in dvakrat z 1,5 ml mešanice etilacetata, ledoceta in acetona (3.9). Izpirek se zbere v majhno bučko (zadnji del mora biti brezbarven) in izpareva do suhega. Oljnati ostanek se obdela s 4,0 ml razredčene žveplove kisline (3.13), močno pretrese, da se popolnoma raztopi, in izmeri se optična gostota.

5.6 Merjenje optične gostote

Optična gostota se izmeri s spektrofotometrom pri 509 nm 20 do 30 minut potem, ko se je ostanek raztopil v žveplovi kislini. Meritve se izvedejo v primerjavi z razredčeno žveplovo kislino (3.13).

5.7 Slepi preskus

Z istim postopkom se izvede slepi preskus, vendar brez vzorca.

6. Izračun rezultatov

Vsebnost vitamina C v g/kg se poda z naslednjim razmerjem:

× 2

× 10d

kjer je:

a = optična gostota pri slepem preskusu;

b = optična gostota notranje standardne raztopine;

c = optična gostota vzorčne raztopine;

d = teža preskusnega vzorca v gramih.

Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določitev na istem vzorcu ne sme presegati:

10 % relativne vrednosti za vsebnosti vitamina C, manjše od 10 g/kg in

5 % relativne vrednosti za vsebnosti, ki so enake ali večje od 10 g/kg.

[1] 1 IU = 0,3 μg retinola.

[2] Za mlečno krmo in izdelke, ki so nagnjeni k aglomeraciji ali nabrekanju, se količina reagentov, navedenih v prvem in drugem odstavku točke 5.2, podvoji.

[3] Natrijevega askorbata ni treba dodati, če se hidroliza izvaja v dušikovi atmosferi.

[4] Vsebnost karotina se lahko določi z merjenjem optične gostote pri 450 nm;E 1 %1 cm = 2600

--------------------------------------------------