PRILOGA

Priloga k Uredbi (ES) št. 440/2008 se spremeni:

vstavijo se poglavja B.53, B.54, B.55, B.56, B.57 in B.58:

„B.53 ŠTUDIJA RAZVOJNE NEVROTOKSIČNOSTI

UVOD

1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) št. 426 (2007). Delovna skupina OECD za strupenost za razmnoževanje in razvoj je junija 1995 v Københavnu obravnavala potrebo po posodobitvi obstoječih smernic za preskušanje OECD za strupenost za razmnoževanje in razvoj ter pripravo novih smernic za končne točke, ki še niso zajete (1). Delovna skupina je priporočila, da bi bilo treba smernico za preskušanje v zvezi z razvojno nevrotoksičnostjo pripraviti na podlagi smernice ameriške agencije EPA, ki je bila tudi že revidirana (2). Junija 1996 je v Københavnu potekalo drugo posvetovalno zasedanje, da bi se sekretariatu predložili napotki za pripravo nove smernice za preskušanje v zvezi s strupenostjo za razvoj, vključno s pomembnimi dejavniki, npr. podrobnostmi o izbiri živalskih vrst, obdobjem odmerjanja, preskusnim obdobjem, končnimi točkami, ki jih je treba oceniti, in merili za vrednotenje rezultatov. Leta 1998 je bila objavljena ameriška smernica za oceno tveganja nevrotoksičnosti (3). Oktobra 2000 sta drug za drugim potekala strokovno posvetovalno zasedanje OECD in delavnica Inštituta za tvegano znanost ILSI, leta 2005 pa je bilo v Tokiu organizirano strokovno posvetovalno zasedanje. Namen teh srečanj je bila obravnava znanstvenih in tehničnih vprašanj, povezanih z obstoječo smernico za preskušanje, priporočila z zasedanj (4) (5) (6) (7) pa so se upoštevala pri pripravi te testne metode. Dodatne informacije o izvedbi, interpretaciji in terminologiji, uporabljeni za to preskusno metodo, so navedene v smernicah OECD št. 43 ‚Reproductive Toxicity Testing and Assessment‘ (8) in št. 20 ‚Neurotoxicity Testing‘ (9).

ZAČETNI PREUDARKI

2. Znano je, da številne kemikalije povzročajo razvojne nevrotoksične učinke pri človeku in drugih vrstah (10) (11) (12) (13). Za oceno in vrednotenje strupenih lastnosti kemikalije je lahko potrebna določitev možnosti za razvojno nevrotoksičnost. Študije razvojne nevrotoksičnosti so namenjene zagotavljanju podatkov o možnih funkcionalnih in morfoloških učinkih na razvijajoči se živčni sistem potomca, ki lahko nastanejo zaradi izpostavljenosti v maternici in zgodnjem življenjskem obdobju, vključno z opredelitvami odziva na odmerek.

3. Študija razvojne nevrotoksičnosti se lahko izvede kot ločena študija, lahko je vključena v študijo strupenosti za razmnoževanje in/ali nevrotoksičnosti pri odraslih (npr. preskusne metode B.34 (14), B.35 (15) in B.43 (16)) ali dodana študiji strupenosti za predrojstveni razvoj (npr. preskusna metoda B.31 (17)). Če je študija razvojne nevrotoksičnosti vključena v drugo študijo ali ji je dodana, je treba ohraniti celovitost obeh vrst študij. Vsi preskusi morajo biti v skladu z veljavno zakonodajo ali vladnimi in institucionalnimi smernicami za uporabo laboratorijskih živali v raziskavi (npr. 18).

4. Preskuševalni laboratorij mora pred začetkom izvajanja študije preučiti vse razpoložljive informacije o preskusni kemikaliji. Takšne informacije vključujejo vrsto in strukturo kemikalije, njene fizikalno-kemijske lastnosti, rezultate katerih koli drugih preskusov strupenosti kemikalije in vitro ali in vivo, toksikološke podatke o strukturno sorodnih kemikalijah in pričakovane uporabe kemikalije. Te informacije so potrebne, da se vsem, ki jih to zadeva, zagotovi, da je preskus pomemben za zaščito zdravja ljudi in da bo v pomoč pri izbiri ustreznega začetnega odmerka.

NAČELO PRESKUSA

5. Preskusna kemikalija se živalim daje med brejostjo in laktacijo. Matere se preskušajo za oceno učinkov na breje in doječe samice, pri čemer se lahko zagotovijo tudi primerjalne informacije (matere v primerjavi s potomci). Potomci se za vrednotenje nevrotoksičnosti naključno izberejo iz legel. Vrednotenje zajema opazovanje makroskopskih nevroloških in vedenjskih sprememb, vključno z oceno telesnega razvoja, vedenjske ontogenije, motorične aktivnosti, motorične in senzorične funkcije, učenja in spominjanja ter vrednotenjem teže možganov in nevropatologije med poporodnim razvojem in odraslo dobo.

6. Če je preskusna metoda izvedena kot ločena študija, se lahko dodatne razpoložljive živali iz vsake skupine uporabijo za posebne nevrovedenjske, nevropatološke, nevrokemične ali elektrofiziološke postopke, ki lahko dopolnijo podatke, dobljene s preiskavami, ki se priporočajo po tej metodi (16) (19) (20) (21). Dopolnilni postopki so lahko posebno koristni, kadar empirična opazovanja, pričakovani učinki ali mehanizem/način delovanja kaže posebno vrsto nevrotoksičnosti. Ti dopolnilni postopki se lahko uporabijo pri materah in mladičih. Uporabijo se lahko tudi postopki ex vivo ali in vitro, če ne spremenijo celovitosti postopkov in vivo.

PRIPRAVE ZA PRESKUS

Izbira živalskih vrst

7. Priporočena preskusna vrsta je podgana; druge vrste se lahko uporabijo, če je primerno. Vendar je treba opozoriti, da so dnevi brejosti in dnevi po rojstvu, navedeni v tej preskusni metodi, značilni za običajno uporabljene seve podgan, pri čemer je treba izbrati primerljive dneve, če se uporabijo druge vrste ali neobičajni sev. Uporabo drugih vrst je treba utemeljiti na podlagi podatkov o strupenosti, farmakokinetičnih podatkov in/ali drugih podatkov. Utemeljitev mora vključevati razpoložljivost poporodnih nevrovedenjskih in nevropatoloških ocen za posamezne vrste. Če že obstaja preskus, ki je povzročil zaskrbljenost, bi bilo treba razmisliti o uporabi vrste/seva, ki je povzročil zaskrbljenost. Zaradi različne učinkovitosti različnih sevov podgan je treba dokazati, da je sev, ki je bil izbran za uporabo, ustrezno ploden in odziven. Dokumentirati je treba zanesljivost in občutljivost drugih vrst za zaznavanje razvojne nevrotoksičnosti.

Nastanitveni in prehranjevalni pogoji

8. Temperatura v prostoru za preskusne živali mora biti 22 ± 3 °C. Čeprav mora biti relativna vlažnost vsaj 30 % in po možnosti ne presega 70 %, razen med čiščenjem prostora, mora biti cilj 50–60 %. Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Ciklus osvetlitve se lahko pred parjenjem in med izvajanjem študije tudi obrne, da se izvede ocena funkcionalnih in vedenjskih končnih točk v obdobju teme (pri rdeči svetlobi), tj. ko so živali običajno aktivne (22). Vse spremembe ciklusa svetlobe in teme morajo vključevati ustrezno aklimatizacijo, da se živalim omogoči prilagoditev na novi ciklus. Za hranjenje se lahko uporablja običajna laboratorijska hrana z neomejeno količino pitne vode. Navedeta se vrsta hrane in vode, obe pa se analizirata za kontaminante.

9. Živali se lahko nastanijo posamično ali dajo v kletke v manjših skupinah istega spola. Parjenje se mora izvajati v kletkah, ki so primerne za ta namen. Po dokazu o kopulaciji ali najpozneje 15. dan brejosti se sparjene živali naselijo v kletke za kotitev ali kletke za matere. Kletke je treba razporediti tako, da so morebitni učinki zaradi njihovega položaja čim manjši. Ko je kotitev blizu, je treba sparjenim samicam zagotoviti ustrezen in določen material za izdelavo gnezda. Dobro znano je, da ima lahko neustrezno ravnanje ali stres med brejostjo neugodne posledice, vključno izgubo zarodka ter spremenjenim razvojem pred rojstvom in po njem. Da bi preprečili predrojstveno izgubo zaradi dejavnikov, ki niso povezani s tretiranjem, je treba z živalmi med brejostjo ravnati previdno ter se izogibati stresu zaradi zunanjih dejavnikov, na primer čezmernega zunanjega hrupa.

Priprava živali

10. Uporabiti je treba zdrave živali, ki so prilagojene na laboratorijske razmere in predhodno niso bile uporabljene za poskuse, razen če je študija vključena v drugo študijo (glej odstavek 3). Opredeliti je treba vrsto, sev, vir, spol, težo in starost preskusnih živali. Vsaki živali se dodeli edinstvena identifikacijska številka, s katero se označi. Živali iz vseh preskusnih skupin morajo imeti čim bolj enako težo in starost ter biti v običajnem razponu vrst in seva iz študije. Za vsako velikost odmerka je treba uporabiti mlade odrasle samice, ki še niso kotile. Sorojenci se ne smejo pariti, kar je treba skrbno zagotoviti. Dan brejosti (DB) 0 je dan, ko se opazi vaginalni čep in/ali seme. Pri nakupu brejih živali pri dobavitelju je treba omogočiti ustrezen čas aklimatizacije (npr. 2–3 dni). Sparjene samice je treba na nepristranski način razdeliti v kontrolne in tretirane skupine ter jih med skupinami čim bolj enakomerno porazdeliti (npr. za zagotovitev enakomerne porazdelitve med skupinami, kot je razdelitev na podlagi telesne teže, se priporoča stratificiran naključni postopek). Samice, ki jih osemeni isti samec, je treba enakomerno razdeliti med skupine.

POSTOPEK

Število in spol živali

11. Vsaka preskusna in kontrolna skupina mora vključevati zadostno število brejih samic, ki bodo izpostavljene preskusni kemikaliji, za zagotovitev, da se skoti ustrezno število potomcev za vrednotenje nevrotoksičnosti. Za vsak odmerek je priporočenih 20 zarodov. Zasnove za odmerjanje v ponovitveni in postopni skupini so dovoljene, če je doseženo skupno število zarodov na skupino in se za ponovitve upoštevajo ustrezni statistični modeli.

12. Na poporodni dan (PPD) 4 ali pred njim (dan kotitve je PPD 0) je treba velikost posameznega zaroda prilagoditi z naključno izločitvijo odvečnih mladičev, da so vsi zarodi enako veliki (23). Velikost zaroda ne sme presegati povprečne velikosti zaroda za uporabljeni sev glodavcev (8–12). V zarodu mora biti čim bolj uravnoteženo število mladih samcev in samic. Selektivno izločanje mladičev, npr. na podlagi telesne teže, ni ustrezno. Po standardizaciji zarodov (izločevanju) in pred nadaljnjim preskušanjem funkcionalnih končnih točk je treba posamezne mladiče, ki so predvideni za preskušanje pred odstranitvijo od sesanja in po njej, označiti z edinstvenimi oznakami s pomočjo katere koli primerne humane metode označevanja mladičev (npr. 24).

Dodelitev živali za funkcionalne in vedenjske preskuse, tehtanje možganov ter nevropatološka vrednotenja

13. Preskusna metoda omogoča različne pristope glede na dodelitev živali, ki so bile izpostavljene in utero in v obdobju laktacije, za funkcionalne in vedenjske preskuse, spolno zrelost, določanje teže možganov ter nevropatološko vrednotenje (25). Drugi preskusi nevrovedenjske funkcije (npr. socialno vedenje), nevrokemije ali nevropatologije se lahko dodajo glede na posamezni primer, če se ne ogrozi celovitost izvirnega preskusa.

14. Iz vsake tretirane skupine se izberejo mladiči, ki se nato dodelijo za oceno končnih točk na PPD 4. Mladiče je treba izbrati tako, da sta oba spola iz vsakega zaroda v vsaki tretirani skupini čim bolj enakomerno zastopana v vseh preskusih. Za preskušanje motorične aktivnosti je treba preskusiti isti par mladega samca in samice pri vseh starostih pred odstranitvijo od sesanja (glej odstavek 35). Pri vseh drugih preskusih se lahko za različne vedenjske preskuse dodelijo isti ali ločeni pari samcev in samic. Za primerjalne preskuse kognitivne funkcije med odstavljenci in odraslimi živalmi bo morda treba dodeliti različne mladiče, da se preprečijo zavajajoči učinki starosti in predhodnega usposabljanja na te meritve (26) (27). Pri odstranitvi od sesanja (PPD 21) se lahko mladiči, ki niso bili izbrani za preskušanje, humano odstranijo. Navesti je treba vsako spremembo razdelitve mladičev. Statistična enota meritve mora biti zarod (ali mati) in ne mladič.

15. Obstaja več načinov za dodelitev mladičev za preglede pred odstranitvijo od sesanja in po njej, kognitivne preskuse, patološke preglede itd. (glej sliko 1 za splošni načrt in Dodatek 1 za primere dodelitve). Priporočena najmanjša števila živali v posamezni tretirani skupini za preglede pred odstranitvijo od sesanja in po njej so naslednja:

Klinična opazovanja in telesna teža Vse živali Podrobna klinična opazovanja 20/spol (1/spol/zarod) Teža možganov (po fiksaciji), PPD 11–22 10/spol (1/zarod) Teža možganov (nefiksirani), ~ PPD 70 10/spol (1/zarod) Nevropatologija (fiksacija s potopitvijo ali perfuzijo), PPD 11–22 10/spol (1/zarod) Nevropatologija (fiksacija s perfuzijo), PPD ~ 70 10/spol (1/zarod) Spolna zrelost 20/spol (1/spol/zarod) Drugi razvojni znaki (neobvezno) Vse živali Vedenjska ontogenija 20/spol (1/spol/zarod) Motorična aktivnost 20/spol (1/spol/zarod) Motorična in senzorična funkcija 20/spol (1/spol/zarod) Učenje in spominjanje 10/spol (1) (1/zarod)

Odmerjanje

16. Uporabiti je treba najmanj tri velikosti odmerkov in hkratni kontrolni vzorec. Velikost odmerkov se razporedi tako, da se učinki strupenosti stopnjujejo. Če največji odmerek ni omejen s fizikalno-kemijskimi ali biološkimi lastnostmi kemikalije, ga je treba izbrati tako, da izzove določene strupene učinke pri materi (npr. klinični znaki, manjše pridobivanje telesne teže (ne več kot 10 %) in/ali dokaz za toksičnost, pri kateri se omeji odmerek, v tarčnem organu). Velik odmerek je z nekaterimi izjemami lahko omejen na 1 000 mg/kg/dan telesne teže. Pričakovana izpostavljenost pri ljudeh lahko na primer kaže na potrebo po uporabi večjega odmerka. Namesto tega se lahko izvedejo pilotne študije ali predhodne študije za ugotavljanje območja, da se določi največji odmerek, ki ga je treba uporabiti in bi moral povzročiti minimalno stopnjo strupenih učinkov pri materi. Če se s standardno študijo strupenosti za razvoj ali pilotno študijo dokaže, da je preskusna kemikalija strupena za razvoj, mora biti največja velikost odmerka največji odmerek, ki ne bo povzročil čezmernih strupenih učinkov pri potomcih ali smrti in utero ali pred rojstvom ali deformnosti, ki lahko prepreči smiselno vrednotenje nevrotoksičnosti. Najmanjša velikost odmerka naj ne bi povzročila dokazov o strupenih učinkih pri materi ali razvoju, vključno z nevrotoksičnostjo. Izbere se padajoče zaporedje velikosti odmerkov, da se pokažejo vsi z odmerkom povezani odzivi in velikost odmerka, pri kateri ni opaženih škodljivih učinkov (NOAEL) ali odmerki blizu meje zaznavnosti, ki omogoča določitev standardnega odmerka. Za padajoče zaporedje velikosti odmerkov so pogosto optimalni dvakratni do štirikratni intervali, pogosto pa je bolje dodati še dodatno četrto skupino odmerkov, kot uporabiti zelo velike intervale (npr. več kot faktor 10) med odmerki.

17. Pri izbiri velikosti odmerkov je treba upoštevati vse obstoječe podatke o strupenosti ter dodatne informacije o presnovi in toksikokinetiki preskusne kemikalije ali sorodnih snovi. Te informacije lahko pomagajo tudi pri dokazovanju ustreznosti režima odmerjanja. Na podlagi izpostavljenosti in farmakokinetičnih informacij (28) (29) je treba pri mladičih razmisliti o uporabi neposrednega odmerjanja. Pred izvajanjem študije neposrednega odmerjanja je treba skrbno obravnavati prednosti in slabosti (30).

18. Skupina za hkratno kontrolo mora biti kontrolna skupina, tretirana z nepravim nadomestkom, ali kontrolna skupina, tretirana z nosilcem, če je ta uporabljen pri dajanju preskusne kemikalije. Vsem živalim je treba običajno dati enako količino preskusne kemikalije ali nosilca na podlagi telesne teže. Če se za lažje odmerjanje uporablja nosilec ali drug aditiv, je treba upoštevati naslednje lastnosti: učinke na absorpcijo, distribucijo, presnovo ali retencijo preskusne kemikalije, učinke na kemijske lastnosti preskusne kemikalije, ki lahko spremenijo njene strupene lastnosti, ter učinke na porabo hrane ali vode ali status prehranjenosti živali. Nosilec ne sme povzročati učinkov, ki bi lahko vplivali na razlago študije, ne sme biti nevrovedenjsko strupen ali imeti učinkov na razmnoževanje ali razvoj. V zvezi z novimi nosilci je treba poleg kontrolne skupine, tretirane z nosilcem, vključiti tudi kontrolno skupino, tretirano z nepravim nadomestkom. Z živalmi v kontrolni(-h) skupini(-ah) se ravna na enak način kot z živalmi v preskusni skupini.

Dajanje odmerkov

19. Preskusno kemikalijo ali nosilec je treba dajati na način, ki je najprimernejši za možno izpostavljenost pri ljudeh, ter na podlagi razpoložljivih podatkov o presnovi in distribuciji pri preskusnih živalih. Način dajanja odmerka je običajno oralen (npr.z gavažo, hrano ali pitno vodo), vendar se lahko glede na lastnosti in pričakovane ali znane načine izpostavljenosti pri ljudeh uporabijo tudi drugi načini (npr. prek kože, z vdihavanjem); dodatna navodila so navedena v Smernici št. 43 (8). Izbrani način dajanja je treba utemeljiti. Preskusno kemikalijo je treba dati vsak dan približno ob istem času.

20. Odmerek za vsako žival mora običajno temeljiti na zadnji posamični določitvi telesne teže. Vendar je potrebna previdnost pri prilagajanju odmerkov v zadnji tretjini brejosti. Če se pri tretiranih materah opazijo čezmerni strupeni učinki, je treba te živali humano usmrtiti.

21. Preskusno kemikalijo ali nosilec je treba sparjenim samicam dajati vsaj vsak dan od dneva ugnezditve (DB 6) do konca laktacije (PPD 21), da so mladiči izpostavljeni preskusni kemikaliji med nevrološkim razvojem pred rojstvom in po njem. Starost, pri kateri se začne odmerjanje, ter trajanje in pogostost odmerjanja se lahko prilagodijo, če dokazi podpirajo zasnovo poskusa, ki je primernejši za izpostavljenost pri ljudeh. Trajanje odmerjanja je treba prilagoditi za druge vrste, da se zagotovi izpostavljenost v vseh zgodnjih fazah razvoja možganov (npr. enakovredno rasti možganov človeka pred rojstvom in takoj po rojstvu). Odmerjanje se lahko začne ob začetku brejosti (DB 0), čeprav je treba upoštevati, da lahko preskusne kemikalije povzročijo izgubo pred ugnezditvijo. Z dajanjem odmerka na DB 6 se prepreči to tveganje, vendar razvojne faze med DB 0 in 6 niso tretirane. Če laboratorij kupi breje živali, začetek odmerjanja na DB 0 ni mogoč, zato je DB 6 primeren čas za začetek. Laboratorij za preskušanje mora režim odmerjanja določiti v skladu z zadevnimi informacijami o učinkih preskusne kemikalije, predhodnimi izkušnjami in logističnimi težavami, kar lahko vključuje podaljšanje odmerjanja tudi na obdobje po odstavitvi od sesanja. Pri živalih, ki niso skotile vseh potomcev, se odmerjanje na dan kotitve ne izvede. Na splošno se pričakuje, da bodo mladiči izpostavljeni prek materinega mleka, vendar je treba v primerih, kjer ni dovolj dokazov za nadaljnjo izpostavljenost potomcev, razmisliti o neposrednem odmerjanju. Dokaz o stalni izpostavljenosti se lahko pridobi npr. na podlagi farmakokinetičnih informacij, strupenosti za potomce ali spremembami biomarkerjev (28).

OPAZOVANJA

Opazovanja pri materah

22. Pri vseh materah je treba vsaj enkrat na dan skrbno opazovati njihovo zdravstveno stanje, vključno z obolevnostjo in smrtnostjo.

23. V obdobjih tretiranja in opazovanja je treba redno izvajati več podrobnih kliničnih opazovanj (vsaj dve v obdobju odmerjanja med brejostjo in dve v obdobju odmerjanja med laktacijo) z vsaj desetimi materami na velikost odmerka. Živali morajo zunaj njihove domače kletke opazovati usposobljeni tehniki, ki niso seznanjeni s tretiranjem živali, in sicer po standardiziranih postopkih, da se čim bolj zmanjšata stres za živali in pristranskost opazovalca ter zagotovi čim bolj konstantna zanesljivost med opazovalci. Kadar je mogoče, je priporočljivo, da opazovanja v okviru posamezne študije opravi isti tehnik.

24. Prisotnost opaženih znakov je treba zabeležiti. Vedno, kadar je to izvedljivo, je treba zabeležiti tudi stopnjo opaženih znakov. Klinična opazovanja morajo obsegati tudi, vendar ne samo, spremembe na koži, kožuhu, očeh, sluznicah, pojav sekrecije ter delovanje avtonomnega živčevja (npr. solzenje, piloerekcija, velikost zenic, nenormalen vzorec dihanja in/ali dihanje skozi usta ter vsi nenavadni znaki pri uriniranju ali izločanju blata).

25. Zapisati je treba tudi vse nenavadne odzive v zvezi s položajem telesa, stopnjo aktivnosti (npr. zmanjšanje ali povečanje raziskovanja standardnega mesta) in koordinacijo gibov. Zabeležiti je treba spremembe v hoji (npr. zibanje, ataksija), drži (npr. grbast hrbet) in reagiranju na ravnanje, nameščanje ali druge okoljske dražljaje, pa tudi navzočnost kloničnih ali toničnih gibov, krčev ali tremorja, stereotipije (npr. čezmerno čiščenje, nenavadni gibi z glavo, ponavljajoče se krožno premikanje), nenormalno vedenje (npr. grizenje ali čezmerno lizanje, samopohaba, zadenjska hoja, oddajanje glasov) ali agresivnost.

26. Zabeležiti je treba znake strupenosti, vključno z dnevom nastopa, časom dneva, stopnjo in trajanjem.

27. Živali je treba v času odmerjanja med študijo stehtati vsaj enkrat na teden, blizu dneva kotitve ali na dan kotitve in na PPD 21 (odstavitev od sesanja). Pri študijah z gavažo je treba matere stehtati vsaj dvakrat na teden. Odmerke je treba ustrezno prilagoditi ob posameznem določanju telesne teže. Porabo hrane je treba meriti vsaj vsak teden med brejostjo in laktacijo. Porabo vode je treba meriti vsaj enkrat na teden, če izpostavljenost poteka prek oskrbe z vodo.

Opazovanja pri potomcih

28. Pri vseh potomcih je treba vsaj enkrat na dan opazovati znake strupenosti ter obolevnost in smrtnost.

29. V obdobjih tretiranja in opazovanja je treba izvesti podrobnejša klinična opazovanja potomcev. Potomce (vsaj enega mladiča/spol/zarod) morajo opazovati usposobljeni tehniki, ki niso seznanjeni s tretiranjem živali, in sicer po standardiziranih postopkih, da se čim bolj zmanjša pristranskost in čim bolj poveča zanesljivost opazovalcev. Kadar je mogoče, je priporočljivo, da opazovanja opravi isti tehnik. V opazovani fazi razvoja je treba ustrezno spremljati vsaj končne točke, opisane v odstavkih 24 in 25.

30. Zabeležiti je treba vse znake strupenosti pri potomcu, vključno z dnevom nastopa, časom dneva, stopnjo in trajanjem.

Telesni in razvojni znaki

31. Spremembe znakov razvoja pred odstavitvijo od sesanja (npr. znotrajmaternično oblikovanje uhlja, odpiranje oči, izraščanje sekalcev) so tesno povezane s telesno težo (30) (31). Telesna teža je lahko najboljši pokazatelj telesnega razvoja. Merjenje razvojnih znakov je zato priporočljivo le, če obstajajo predhodni dokazi, da bodo te končne točke zagotovile dodatne informacije. Časovna razporeditev ocene teh parametrov je navedena v tabeli 1. Glede na pričakovane učinke in rezultate začetnih meritev se lahko priporoča dodajanje časovnih točk ali opravljanje meritev v drugih razvojnih fazah.

32. Pri oceni telesnega razvoja je priporočljivo uporabiti postkoitalno starost namesto postnatalne starosti (33). Če se preskus pri mladičih izvede na dan odstavitve od sesanja, je priporočljivo, da se ta preskus izvede pred dejansko odstavitvijo od sesanja, da se prepreči zavajajoči učinek stresa, povezanega z odstavitvijo od sesanja. Poleg tega se preskusov na mladičih po odstavitvi od sesanja ne sme izvajati dva dni po odstavitvi od sesanja.

Tabela 1

Časovna razporeditev ocene telesnih in razvojnih znakov ter funkcionalnih/vedenjskih končnih točk (2)

Starostna obdobja Končne točke Pred odstavitvijo od sesanja (3) Adolescenca (3) Mladi odrasli (3) Telesni in razvojni znaki Telesna teža in klinična opazovanja vsak teden (4) vsaj vsaka dva tedna vsaj vsaka dva tedna Teža možganov PPD 22 (5) ob koncu Nevropatologija PPD 22 (5) ob koncu Spolna zrelost — kot je ustrezno — Drugi razvojni znaki (6) kot je ustrezno — — Funkcionalne/vedenjske končne točke Vedenjska ontogenija vsaj dve meritvi Motorična aktivnost (vključno s privajanjem) 1–3-krat (7) — enkrat Motorična in senzorična funkcija — enkrat enkrat Učenje in spominjanje — enkrat enkrat

33. Žive mladiče je treba prešteti in določiti njihov spol, npr. z vizualnim pregledom ali meritvijo zadnjično-genitalne razdalje (34) (35), vsakega mladiča iz zaroda pa je treba stehtati pri rojstvu ali kmalu po tem, vsaj enkrat na teden med laktacijo ter vsaj enkrat vsaka dva tedna po njej. Ko se ovrednoti spolna zrelost, je treba ob pojavu odprtja nožnice (36) ali ločitvi prepucija (37) določiti starost in telesno težo vsaj enega samca in ene samice iz zaroda.

Vedenjska ontogenija

34. Ontogenijo izbranih vedenj je treba izmeriti pri vsaj enem mladiču/spol/zarod v ustreznem starostnem obdobju, pri čemer se ob vseh dnevih preskušanja za vsa ocenjena vedenja uporabijo isti mladiči. Dnevi meritve morajo biti v tem obdobju enakomerno razporejeni, da se opredelijo običajne spremembe v ontogeniji tega vedenja ali spremembe v ontogeniji tega vedenja, povezane s tretiranjem (38). Nekateri primeri vedenj, katerih ontogenija se lahko oceni, so: posturalni refleks, negativna geotaksija in motorična aktivnost (38) (39) (40).

Motorična aktivnost

35. Motorično aktivnost je treba spremljati (41) (42) (43) (44) (45) v obdobju pred odstavitvijo od sesanja in v obdobju odraslosti. Za preskušanje v času odstavljanja od sesanja glej odstavek 32. Preskušanje mora biti dovolj dolgo, da se dokaže privajanje netretiranih kontrolnih vzorcev na preskušanje. Za oceno vedenjske ontogenije se zelo priporoča uporaba motorične aktivnosti. Če se preskušanje uporabi kot preskus vedenjske ontogenije, je za vsa preskušanja pred odstavitvijo od sesanja treba uporabiti iste živali. Preskušanje mora biti dovolj pogosto, da se oceni ontogenija privajanja med preskušanjem (44). To lahko pomeni trikrat ali pogosteje pred dnem odstavitve od sesanja in vključno z njim (npr. PPD 13, 17 in 21). Preskušanje istih živali ali živali iz istega zaroda mora potekati tudi v obdobju odraslosti proti koncu študije (npr. PPD 60–70). Po potrebi se lahko opravi preskušanje ob dodatnih dneh. Motorično aktivnost je treba spremljati z aparaturo za avtomatizirano beleženje aktivnosti, ki mora biti zmožna zaznati povečanje in zmanjšanje aktivnosti (npr. osnovna aktivnost, kot jo izmeri naprava, ne sme biti tako nizka, da bi preprečila zaznavanje zmanjšanja, in ne tako visoka, da bi preprečila zaznavanje povečanja aktivnosti). Vsako napravo je treba preskusiti v skladu s standardnimi postopki, da se zagotovi čim bolj zanesljivo delovanje naprav vse dni. Tretirane skupine morajo biti čim bolj uravnoteženo razporejene med napravami. Vsako žival je treba preskusiti ločeno. Tretirane skupine morajo biti uravnoteženo razporejene med čase preskušanja, da se prepreči zavajajoči učinek cirkadianega ritma aktivnosti. Prizadevati si je treba, da so variacije v preskusnih pogojih minimalne in niso sistematično povezane s tretiranjem. Med spremenljivkami, ki lahko vplivajo na različna merila vedenja, vključno z motorično aktivnostjo, so jakost zvoka, velikost in oblika preskusne kletke, temperatura, relativna vlažnost, svetlobni pogoji, vonji, uporaba domače kletke ali nove preskusne kletke in motnje iz okolja.

Motorična in senzorična funkcija

36. Motorično in senzorično funkcijo je treba natančno pregledati vsaj enkrat v obdobju adolescence in enkrat v obdobju odraslosti (npr. PPD 60–70). Za preskušanje v času odstavljanja od sesanja glej odstavek 32. Treba je izvesti ustrezno preskušanje za zagotovitev ustreznega kvantitativnega vzorčenja senzoričnih dražljajev (npr. somatosenzoričnih, vestibularnih) in motoričnih funkcij (npr. moč, koordinacija). Primeri preskusov motorične in senzorične funkcije so refleks zravnave (46), posturalni refleks (47) (48), reakcija na slušni dražljaj (40) (49) (50) (51) (52) (53) (54) in izzvani potenciali (55).

Preskusi učenja in spominjanja

37. Preskus asociativnega učenja in spominjanja je treba izvesti po odstavitvi od sesanja (npr. 25 ± 2 dni) in pri mladih odraslih (PPD 60 in starejših). Za preskušanje v času odstavljanja od sesanja glej odstavek 32. V teh dveh fazah razvoja se lahko uporabijo isti ali ločeni preskusi. Pri izbiri preskusov učenja in spominjanja pri mladičih, ki so prenehali sesati, in odraslih podganah je dovoljena določena prožnost. Vendar morajo biti preskusi načrtovani tako, da izpolnjujejo dve merili. Prvič, učenje je treba oceniti kot spremembo v več ponovitvenih preskušanjih ali sejah učenja ali s preskusi, ki vključujejo eno preskušanje, ob upoštevanju pogoja, ki kontrolira neasociativne učinke izkušenj. Drugič, preskusi morajo poleg izvirnega učenja (priučitev) vključevati določeno mero (kratkoročnega ali dolgoročnega) spomina, vendar te mere spomina ni mogoče sporočiti brez mere priučitve, ki se pridobi z istim preskusom. Če preskusi učenja in spominjanja kažejo učinek preskusne kemikalije, je morda treba razmisliti o dodatnih preskusih, da se ovržejo druge razlage na podlagi sprememb senzoričnih, motivacijskih in/ali motoričnih zmogljivosti. Poleg zgoraj navedenih meril se priporoča, da se preskus učenja in spominjanja izbere na podlagi dokazane občutljivosti na razred preiskovane kemikalije, če so takšne informacije na voljo v virih. Če takšnih informacij ni, primeri preskusov, ki bi lahko izpolnjevali navedeni merili, vključujejo: pasivno izogibanje (43) (56) (57), zapoznelo uskladitev s položajem pri odraslih podganah (58) in mladičih (59), pogojevanje z vonjem (43) (60), Morrisov vodni labirint (61) (62) (63), Bielov ali Cincinnatijev labirint (64) (65), zvezdasti labirint (66), T-labirint (43) ter priučitev in retencijo vedenja, kontroliranega s planiranim potekom (26) (67) (68). Dodatni preskusi so opisani v virih v zvezi z mladiči, ki so prenehali sesati (26) (27), in odraslimi podganami (19) (20).

Posmrtni pregled

38. Matere se lahko evtanazirajo po odstavitvi potomca od sesanja.

39. Nevropatološko vrednotenje potomca se izvede z uporabo tkiv živali, ki so bile humano usmrčene na PPD 22 ali med PPD 11 in PPD 22 ali ob koncu študije. Pri potomcih, usmrčenih na PPD 22, je treba pregledati možganska tkiva, pri živalih, usmrčenih ob koncu, pa je treba pregledati tkiva centralnega živčnega sistema in perifernega živčnega sistema. Živali, usmrčene na PPD 22 ali prej, se lahko fiksirajo s potopitvijo ali perfuzijo. Živali, usmrčene ob koncu študije, se fiksirajo s perfuzijo. Vsi vidiki priprave vzorcev tkiva od perfuzije živali do seciranja vzorcev tkiv, obdelave tkiv in barvanja preparatov morajo upoštevati uravnoteženo zasnovo, tako da vse serije vsebujejo reprezentativne vzorce posamezne skupine odmerka. Dodatne smernice v zvezi z nevropatologijo so navedene v Smernici OECD št. 20 (9), glej tudi (103).

Obdelava vzorcev tkiv

40. Zabeležiti je treba vse makroskopske anomalije, ki so vidne v času obdukcije. Vzorci tkiv morajo predstavljati vse pomembnejše regije živčnega sistema. Vzorce tkiv je treba hraniti v ustreznem fiksativu in jih obdelati v skladu s standardiziranimi objavljenimi histološkimi protokoli (69) (70) (71) (103). Vstavljanje v parafin je sprejemljivo za tkiva centralnega živčnega sistema in perifernega živčnega sistema, uporaba osmija po fiksaciji, skupaj z vstavljanjem v epoksi, pa je lahko ustrezna, če je potrebna večja stopnja ločljivosti (npr. za periferno živčevje, če obstaja sum na periferno nevropatijo, in/ali za morfometrično analizo perifernega živčevja). Možgansko tkivo, zbrano za morfometrično analizo, je treba vstaviti v ustrezen medij pri vseh velikostih odmerka hkrati, da se preprečijo artefakti zaradi krčenja, ki bi lahko bili povezani s podaljšano hrambo v fiksativu (6).

Nevropatološka preiskava

41. Nameni kvalitativnega pregleda so:

(i) opredeliti regije v živčnem sistemu, ki kažejo dokaze nevropatoloških sprememb;

(ii) opredeliti vrste nevropatoloških sprememb, ki so posledica izpostavljenosti preskusni kemikaliji, in

(iii) določiti stopnjo resnosti nevropatoloških sprememb.

Reprezentativne histološke rezine vzorcev tkiv mora mikroskopsko pregledati ustrezno usposobljen patolog, ki poišče dokaze nevropatoloških sprememb. Vsem nevropatološkim spremembam je treba dodeliti subjektivno oceno resnosti. Hematoksilinska in eozinska barvila so lahko ustrezna za oceno rezin možganov živali, ki so bile humano usmrčene na PPD 22 ali prej. Za rezine tkiv centralnega in perifernega živčnega sistema živali, usmrčenih ob koncu študije, pa se priporoča barvanje z mielinskimi barvili (npr. luksol obstojna modra/krezil vijolična) in barvilom na osnovi srebra (npr. Bielschowskyjevo ali Bodianovo barvilo). Glede na strokovno presojo patologa in vrsto opaženih sprememb se lahko tudi druga barvila štejejo kot ustrezna za ugotavljanje in opis posebnih vrst sprememb (npr. glialni fibrilarni kisli protein (GFAP) ali lektinska histokemija za oceno glialnih in mikroglialnih sprememb (72), fluoro-žad za zaznavanje nekroze (73) (74) ali barvila na osnovi srebra za ugotavljanje degeneracij živčevja (75)).

42. Opraviti je treba morfometrično (kvantitativno) vrednotenje, ker lahko ti podatki prispevajo k zaznavanju učinka, povezanega s tretiranjem, in so dragoceni za razlago razlik v teži možganov ali morfologiji, povezanih s tretiranjem (76) (77). Za morfometrično vrednotenje je treba odvzeti in pripraviti vzorec živčnega tkiva. Morfometrična vrednotenja lahko zajemajo npr. linearne ali površinske meritve posebnih možganskih regij (78). Pri linearnih ali površinskih meritvah je treba uporabiti homologne rezine, ki so skrbno izbrane na podlagi zanesljivih mikroskopskih znakov (6). Stereologija se lahko uporabi za opredelitev učinkov, povezanih s tretiranjem, na spremenljivke, kot so volumen ali število celic za posamezne nevroanatomske regije (79) (80) (81) (82) (83) (84).

43. Pregledati je treba, ali so v možganih dokazi za nevropatološke spremembe, povezane s tretiranjem, pri čemer je treba ustrezne vzorce odvzeti iz vseh pomembnih možganskih regij (npr. vohalni bulbus, možganska skorja, hipokamus, bazalni gangliji, talamus, hipotalamus, srednjimi možgani (tektum, tegmentum in možganski pedunkli), most, podaljšana hrbtenjača in mali možgani), da se zagotovi natančen pregled. Pomembno je, da so vse rezine odvzete iz iste ravnine. Pri odraslih živalih, ki so bile humano usmrčene ob koncu študije, je treba odvzeti reprezentativne rezine hrbtenjače in perifernega živčnega sistema. Območja, ki se pregledujejo, morajo vključevati oko z vidnim živcem in mrežnico, hrbtenjačo ob vratnem in ledvenem delu, dorzalna in ventralna vlakna, proksimalni bedrni živec, proksimalni golenični živec (pri kolenu) in veje goleničnega živca v mečni mišici. Rezine hrbtenjače in perifernih živcev morajo vključevati prečne ali diagonalne in vzdolžne rezine.

44. V okviru nevropatološkega vrednotenja je treba poleg celičnih sprememb (npr. vakuolacija, degeneracija in nekroza nevronov) in sprememb tkiva (npr. glioza, infiltracija levkocitov in tvorjenje cist) poiskati morebitne znake razvojnih poškodb živčnega sistema (6) (85) (86) (87) (88) (89). V zvezi s tem je pomembno, da se učinki, povezani s tretiranjem, ločijo od običajnih razvojnih dogodkov, za katere je znano, da se pojavijo v razvojni fazi, ki ustreza času usmrtitve (90). Primeri pomembnih sprememb, ki kažejo na razvojne poškodbe, med drugim vključujejo:

— makroskopske spremembe velikosti ali oblike vohalnega bulbusa, velikih možganov ali malih možganov,

— spremembe relativne velikosti različnih možganskih regij, vključno z zmanjšanjem ali povečanjem velikosti regij zaradi izgube ali obstojnosti običajno prehodnih populacij celic ali projekcij aksonov (npr. zunanja zarodna plast malih možganov, corpus callosum),

— spremembe v množitvi, migraciji in diferenciaciji, kot kažejo območja čezmerne apoptoze ali nekroze, skupin ali razpršenih populacij ektopičnih, dezorientiranih ali deformiranih nevronov, ali spremembe relativne velikosti različnih plasti kortikalnih struktur,

— spremembe vzorcev mielinizacije, vključno s splošnim zmanjšanjem mieliniziranih struktur ali njihovim spremenjenim barvanjem,

— dokaz za hidrocefalus, zlasti povečanje prekatov, stenozo možganskega akvedukta in tanjšanje možganskih polobel.

Analiza odvisnosti med odmerkom in odzivom pri nevropatoloških spremembah

45. Za kvalitativno in kvantitativno nevropatološko analizo se priporoča naslednji postopek s posameznimi koraki. Najprej se rezine iz skupine z velikim odmerkom primerjajo z rezinami iz kontrolne skupine. Če pri živalih iz skupine z velikim odmerkom ni dokazov o nevropatoloških spremembah, nadaljnja analiza ni potrebna. Če v skupini z velikim odmerkom obstajajo dokazi o nevropatoloških spremembah, se pregledajo živali iz skupin s srednjim in nizkim odmerkom. Če se skupina z velikim odmerkom konča zaradi smrti ali druge zavajajoče strupenosti, se za analizo nevropatoloških sprememb uporabijo skupine z velikim in srednjim odmerkom. Če obstajajo znaki nevrotoksičnosti v skupinah z manjšim odmerkom, je treba v teh skupinah opraviti nevropatološko analizo. Če se pri kvalitativnem ali kvantitativnem pregledu ugotovijo nevropatološke spremembe, povezane s tretiranjem, je treba na podlagi vrednotenja vseh živali iz skupin z vsemi odmerki določiti odvisnost pojavnosti od odmerka, pogostost in stopnjo resnosti poškodb ali morfometričnih sprememb. V to vrednotenje je treba vključiti vse regije možganov, v katerih so vidni dokazi nevropatoloških sprememb. Za vsako vrsto poškodbe je treba opisati značilnosti, ki so uporabljene za opredelitev posamezne stopnje resnosti in kažejo lastnosti, na podlagi katerih se stopnje razlikujejo med sabo. Zabeležiti je treba pogostost posamezne vrste poškodb in njihovo stopnjo resnosti ter opraviti statistično analizo, da se ovrednoti vrsta odvisnosti med odmerkom in odzivom. Priporočena je uporaba kodiranih mikroskopskih preparatov (91).

PODATKI IN POROČANJE

Podatki

46. Podatke je treba sporočati ločeno in jih povzeti v obliki tabele, kjer so za vsako preskusno skupino prikazane vrste sprememb ter število mater in potomcev po spolu in zarodu, ki prikazuje posamezno vrsto spremembe. Če je bila izvedena neposredna izpostavljenost potomca po rojstvu, je treba sporočiti način, trajanje in obdobje izpostavljenosti.

Vrednotenje in razlaga rezultatov

47. Študija razvojne nevrtoksičnosti bo zagotovila informacije o učinkih ponavljajoče se izpostavljenosti kemikaliji in utero in v zgodnjem razvoju po rojstvu. Ker je poudarek tako na splošni strupenosti kot na razvojni nevrotoksičnosti končnih točk, rezultati študije omogočajo razlikovanje med učinki na razvoj živčevja, ki se pojavijo v odsotnosti splošne strupenosti pri materi, in učinki, ki so izraženi samo na stopnjah, ki so strupene tudi za mater. Zaradi zapletenih medsebojnih odvisnosti med zasnovo študije, statistično analizo in biološko pomembnostjo podatkov bo ustrezna interpretacija podatkov o razvojni nevrotoksičnosti vključevala strokovno presojo (107) (109). Razlaga rezultatov preskusa mora temeljiti na pristopu tehtnosti dokazov (20) (92) (93) (94). Obravnavati je treba vzorce vedenjskih ali morfoloških ugotovitev, če obstajajo, in dokaze o odzivu na odmerek. V to opredelitev je treba vključiti podatke iz vseh študij, ki zadevajo vrednotenje razvojne nevrotoksičnosti, vključno z epidemiološkimi študijami na ljudeh ali poročili o primerih in eksperimentalnimi študijami na živalih (npr. podatki o toksikonetiki, informacije o aktivnosti strukture in podatke iz drugih študij strupenosti). To vključuje odvisnost med odmerki preskusne kemikalije in prisotnostjo ali odsotnostjo, pojavnostjo in obsegom katerega koli nevrotoksičnega učinka za posamezni spol (20) (95).

48. Vrednotenje podatkov mora vključevati razpravo o biološki pomembnosti in statistični značilnosti. Statistične analize je treba obravnavati kot orodje, ki usmerja razlago podatkov, vendar je ne določa. Odsotnost statistične značilnosti ne sme biti edini razlog za sklep o odsotnosti učinkov, povezanih s tretiranjem, tako kot statistična značilnost ne sme biti edina utemeljitev za sklepno ugotovitev o učinku, povezanem s tretiranjem. Da bi preprečili morebitne lažno negativne ugotovitve in neločljive težave pri ‚dokazovanju negativnega rezultata‘, je treba obravnavati razpoložljive pozitivne podatke in pretekle kontrolne podatke, zlasti če ni učinkov, povezanih s tretiranjem (102) (106). Verjetnost lažno pozitivnih rezultatov je treba obravnavati ob upoštevanju statističnega vrednotenja vseh podatkov (96). Vrednotenje mora vključevati odnos med ugotovljenimi nevropatološkimi in vedenjskimi spremembami, če obstaja.

49. Vse rezultate je treba analizirati z uporabo statističnih modelov, ki ustrezajo zasnovi preskusa (108). Izbiro parametrske ali neparametrske analize je treba utemeljiti z upoštevanjem dejavnikov, kot so vrsta podatkov (pretvorjeni ali ne) in njihova porazdelitev ter relativna zanesljivost izbrane statistične analize. Statistične analize morajo biti izbrane ob upoštevanju namena in zasnove študije, da se čim bolj zmanjšajo napake tipa I (lažno pozitivni rezultati) in tipa II (lažno negativni rezultati) (96) (97) (104) (105). Razvojne študije, v katerih se uporabljajo multiparne vrste in preskuša več mladičev na zarod, morajo v statistični model vključiti zarod, da se preprečijo povečane stopnje napak tipa I (98) (99) (100) (101). Statistična enota meritve mora biti zarod in ne mladič. Preskuse je treba zasnovati tako, da se živali iz istega zaroda ne obravnavajo kot neodvisna opazovanja. Vse končne točke, ki se vedno znova izmerijo pri istem subjektu, je treba analizirati z uporabo statističnih modelov, ki upoštevajo odvisnost navedenih meritev.

Poročilo o preskusu

50. Poročilo o preskusu mora vključevati naslednje informacije:

Preskusna kemikalija:

— agregatno stanje in, če je to ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti,

— identifikacijske podatke, vključno z virom,

— čistost pripravka ter znane in/ali pričakovane nečistote.

Nosilec (po potrebi):

— utemeljitev izbire nosilca, če to ni voda ali fiziološka raztopina.

Preskusne živali:

— uporabljene vrste in seve ter utemeljitev, če to ni podgana,

— dobavitelja preskusnih živali,

— število, začetno starost in spol živali,

— izvor, nastanitvene pogoje, hrano, vodo itd.,

— težo posamezne živali na začetku preskusa.

Preskusni pogoji:

— utemeljitev izbire velikosti odmerkov,

— utemeljitev načina in trajanja odmerjanja,

— specifikacije uporabljenih odmerkov, vključno s podatki o nosilcu, količini in fizični obliki danega materiala,

— podrobne podatke o formulaciji preskusne kemikalije in pripravi hrane, doseženi koncentraciji, stabilnosti in homogenosti pripravka,

— metodo, uporabljeno za edinstveno identifikacijo mater in potomcev,

— podroben opis postopkov randomizacije, uporabljenih za razdelitev mater v tretirane skupine, izbiro mladičev za izločitev in razdelitev mladičev v preskusne skupine,

— podrobne podatke o dajanju preskusne kemikalije,

— če je primerno, pretvorbo koncentracije preskusne kemikalije, vnesene s hrano ali vodo ali vdihavanjem (ppm), v dejanski odmerek (mg/kg telesne teže/dan),

— okoljske pogoje,

— podrobne podatke o kakovosti hrane in vode (npr. voda iz pipe, destilirana voda),

— datum začetka študije in datum konca študije.

Opazovanje in preskusni postopki:

— podroben opis postopkov, uporabljenih za standardizacijo opazovanj in postopkov ter operativne opredelitve za vrednotenje opazovanj,

— seznam vseh uporabljenih preskusnih postopkov in utemeljitev njihove uporabe,

— podrobnosti o uporabljenih vedenjskih/funkcionalnih, patoloških, nevrokemijskih in elektrofizioloških postopkih, vključno z informacijami in podrobnostmi o avtomatiziranih napravah,

— postopke za umerjanje in zagotavljanje enakovrednosti naprav ter uravnoteženje tretiranih skupin v preskusnih postopkih,

— kratko utemeljitev, s katero se pojasnijo odločitve na podlagi strokovne presoje.

Rezultati (posamezni rezultati in povzetek, vključno s srednjo vrednostjo in varianco, če je ustrezno):

— število živali na začetku študije in število na koncu študije,

— število živali in zarodov, uporabljenih za posamezno preskusno metodo,

— identifikacijsko številko posamezne živali in zarod, iz katerega prihaja,

— velikost zaroda in povprečno težo pri rojstvu po spolu,

— telesno težo in podatke o spremembi telesne teže, vključno s terminalno telesno težo matere in potomcev,

— podatke o porabi hrane in, če je ustrezno, podatke o porabi vode (npr. če se preskusna kemikalija daje prek vode),

— podatke o odzivu na strupenost po spolu in velikost odmerka, vključno z znaki strupenost ali smrtnosti, vključno s časom in vzrokom smrti, če je ustrezno,

— vrsto, resnost, trajanje, dan nastopa, čas dneva in nadaljnji potek podrobnih kliničnih opazovanj,

— vrednotenje posameznih razvojnih znakov (teža, spolna zrelost in vedenjska ontogenija) pri posamezni časovni točki opazovanja,

— podroben opis vseh vedenjskih, funkcionalnih, nevropatoloških, nevrokemijskih in elektrofizioloških ugotovitev po spolu, vključno s povečanjem in zmanjšanjem iz kontrolnih skupin,

— izsledke obdukcije,

— teže možganov,

— diagnoze, ki izhajajo iz nevroloških znakov in poškodb, vključno z naravno nastalimi boleznimi ali stanji,

— slike vzorčnih ugotovitev,

— slike majhne povečave za oceno homologije rezin, uporabljenih za morfometrijo,

— podatke o absorpciji in presnovi, vključno z dopolnilnimi podatki iz ločene študije toksikokinetike, če so na voljo,

— statistično obdelavo rezultatov, vključno s statističnimi modeli, uporabljenimi za analizo podatkov, in rezultate, ne glede na to, ali so bili značilni ali ne,

— seznam osebja, ki je sodelovalo pri študiji, vključno s strokovno usposobljenostjo.

Razprava o rezultatih:

— informacije o odzivu na odmerek po spolu in skupini,

— povezanost katerih koli drugih strupenih učinkov s sklepno ugotovitvijo o nevrotoksičnem potencialu preskusne kemikalije po spolu in skupini,

— vpliv katerih koli informacij o toksikokinetiki na sklepne ugotovitve,

— podobnost učinkov na kateri koli znan nevrotoksikant,

— podatke, ki dokazujejo zanesljivost in občutljivost preskusne metode (tj. pozitivne podatke in pretekle kontrolne podatke),

— odvisnosti, če obstajajo, med nevropatološkimi in funkcionalnimi učinki,

— vrednosti brez opaznih škodljivih učinkov (NOAEL) ali standardni odmerek za matere in potomce po spolu in skupini.

Sklepne ugotovitve:

— razprava o celotni razlagi podatkov na podlagi rezultatov, vključno s sklepno ugotovitvijo o tem, ali je preskusna kemikalija povzročila razvojno nevrotoksičnost, in vrednostih brez opaznih škodljivih učinkov.

VIRI

(1) OECD (1995). Draft Report of the OECD Ad Hoc Working Group on Reproduction and Developmental Toxicity. Copenhagen, Denmark, 13–14 June 1995.

(2) US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98-239. Na voljo na: [http://www.epa.gov/opptsfrs/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/].

(3) US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 630/R-95/001F. Na voljo na: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordisplay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].

(4) Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79–91.

(5) Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101–111.

(6) Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Claudio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropathology. Environ. Health Perspect., 109:93–100.

(7) OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., US, 23–25 October 2000.

(8) OECD (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, OECD, Paris. July 2008. Na voljo na: [http://search.oecd.org/officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage=en].

(9) OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OECD, Paris, September 2003. Na voljo na: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html].

(10) Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantitative comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173–292.

(11) Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000) Experimental and Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition, ISBN 0195084772, Oxford University Press, New York.

(12) Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188–197.

(13) Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998) Handbook of Developmental Neurotoxicology, 1 st Edition, ISBN 0126488606, Academic Press, New York.

(14) Poglavje B.34 te priloge, Preskus strupenosti za razmnoževanje na eni generaciji.

(15) Poglavje B.35 te priloge, Študija dvogeneracijske reproduktivne strupenosti.

(16) Poglavje B.43 te priloge, Študija nevrotoksičnosti na glodalcih.

(17) Poglavje B.31 te priloge, Študija strupenosti za predrojstveni razvoj.

(18) Direktiva 2010/63/EU Evropskega parlamenta in Sveta z dne 22. septembra 2010 o zaščiti živali, ki se uporabljajo v znanstvene namene (UL L 276, 20.10.2010, str. 33).

(19) WHO (1986) Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals (Environmental Health Criteria 60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, USA. Na voljo na: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060.htm].

(20) WHO (2001) Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles and Approaches (Environmental Health Criteria 223), World Health Organization Publications, Geneva. Na voljo na: [http://www.intox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].

(21) Chang, L.W., Slikker, W. (1995) Neurotoxicology: Approaches and Methods, 1 st Edition, ISBN 012168055X, Academic Press, New York.

(22) De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxicol. Teratol., 19:499–509.

(23) Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2–6.

(24) Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. Animal Sci., 27:110–112.

(25) Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118–136.

(26) Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979) Ontogeny of Learning and Memory. ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.

(27) Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987) Perinatal Development: A Psychobiological Perspective. Academic Press, Orlando.

(28) Zoetis, T., Walls, I. (2003) Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research. ILSI Press, Washington, DC.

(29) Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87–94.

(30) Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1–4.

(31) ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceuticals for Human Use.

(32) Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical considerations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433–439.

(33) Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449–457.

(34) Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. (1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383–390.

(35) Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350–365.

(36) Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579–586.

(37) Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298–303.

(38) Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489–95.

(39) Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896–920.

(40) Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. In: Handbook of Behavioral Teratology. Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, New York, str. 67–100.

(41) Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53–66.

(42) Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measurement of spontaneous motor activity, Handbook of Psychopharmacology, Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, New York, str. 37–82.

(43) Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neurotoxicity following neonatal exposure to 3,3'-iminodipropionitrile in the rat. Neurotoxicol. Teratol., 15:117–129.

(44) Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247–260.

(45) Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599–609.

(46) Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 19:1997. 405–411.

(47) Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals. Physiol. Behav., 64:661–669.

(48) Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol., 40:589–591.

(49) Davis, M. (1984) The mammalian startle response. In: Neural Mechanisms of Startle Behavior, Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, str. 287–351.

(50) Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107–128.

(51) Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory dysfunction. In Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology, Tilson, H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, str. 181–211.

(52) Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 8:199–211.

(53) Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototoxicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res., 80:25–30.

(54) Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 6:437–445.

(55) Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked potentials into neurotoxicity test schemes. In: Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicity, Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New York. str. 125–145.

(56) Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory deficits in rats following exposure to 3,3'-iminopropionitrile. Toxicol. Appl. Pharmacol., 105:321–332.

(57) Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247–296.

(58) Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 10:237–244.

(59) Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98–105.

(60) Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 17:465–479.

(61) Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47–60.

(62) Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29–69.

(63) D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60–90.

(64) Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235–241.

(65) Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387–399.

(66) Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced microcephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327–332.

(67) Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 71:342–352.

(68) Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338–341.

(69) Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 28: 122–131.

(70) Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994) Laboratory Methods in Histotechnology, American Registry of Pathology, Washington, DC, str. 84–107.

(71) Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002) Theory and Practice of Histological Techniques, 5th edition, Churchill Livingstone, London.

(72) Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evaluation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291–304.

(73) Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123–130.

(74) Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 53:365–372.

(75) De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545–561.

(76) De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Environ. Toxicol. Pharmacol., 19:745–755.

(77) De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for developmental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417–432.

(78) Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 1:129–135.

(79) Howard, C.V., Reed, M.G. (1998) Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy, Springer-Verlag, New York.

(80) Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A practical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305–310.

(81) Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262–268.

(82) Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in disector stereology. J. Neurocytol., 26:707–710.

(83) West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22:51–61.

(84) Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience, 130: 813–831.

(85) Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of growth deficiency in rats exposed in utero to undernutrition, ethanol, or the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113–121.

(86) Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 84:294–298.

(87) Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental neurotoxicology. In: Handbook of Developmental Neurotoxicology, Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, str. 3–41.

(88) Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science, 283:70–74.

(89) Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056–1060.

(90) Friede, R. L. (1989) Developmental Neuropathology. Second edition. Springer-Verlag, Berlin.

(91) House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127–133.

(92) Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401–405.

(93) US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA NCEA-F-0644A.

(94) US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, Federal Register 61(212): 56274–56322.

(95) Danish Environmental Protection Agency (1995) Neurotoxicology. Review of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefoged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.

(96) Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxicology, 5:113–126.

(97) Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 8:21–27.

(98) Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329–335.

(99) Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in teratology studies. Teratology, 12:165–172.

(100) Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 14: 221–228.

(101) Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. (1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587–90.

(102) Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. (2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345–352.

(103) Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an ad hoc working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006) A ‚best practices‘ approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing – for today. Toxicol. Pathol. 34:296–313.

(104) Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205–210.

(105) Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295–301.

(106) Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):266–287.

(107) Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. (2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):288–325.

(108) Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):326–348.

(109) Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints Neurotoxicology and Teratology, 30(4):349–381.

Slika 1

Splošni načrt preskušanja za funkcionalne/vedenjske preskuse, vrednotenje nevropatologije in težo možganov. Ta diagram temelji na opisu iz odstavkov 13–15 (PPD = poporodni dan). Primeri dodelitev živali so navedeni v Dodatku 1.

Dodatek 1 1. Primeri možnih dodelitev so opisani in prikazani v obliki tabele spodaj. Ti primeri so namenjeni prikazu, da je mogoče živali v študiji razdeliti v različne vzorce preskušanja na več različnih načinov. Primer 1 2. Za preskušanje vedenjske ontogenije pred odstavitvijo od sesanja se uporabi ena skupina 20 mladičev/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec in 1 samica na zarod). Od teh živali je 10 mladičev/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec ali 1 samica na zarod) humano usmrčenih na PPD 22. Možgani se odstranijo, stehtajo in obdelajo za histopatološko vrednotenje. Poleg tega se zberejo podatki o teži možganov z uporabo nefiksiranih možganov preostalih 10 samcev in 10 samic na velikost odmerka. 3. Druga skupina 20 živali/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec in 1 samica na zarod) se uporabi za funkcionalne/vedenjske preskuse po odstavitvi od sesanja (podrobna klinična opazovanja, preskušanja motorične aktivnosti, slušnih dražljajev in kognitivne funkcije pri adolescentih) in ocenjevanje starosti ob nastopu spolne zrelosti. Od teh živali se 10 živali/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec ali 1 samica na zarod) anestezira in fiksira s perfuzijo ob koncu študije (približno PPD 70). Po dodatni fiksaciji in situ se možgani odstranijo in obdelajo za nevropatološko vrednotenje. 4. Za preskušanje kognitivne funkcije pri mladih odraslih (npr. PPD 60–70) se uporabi tretja skupina 20 mladičev/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec in 1 samica na zarod). Od tega je 10 živali/spol/skupino (1 samec ali 1 samica na zarod) usmrčenih ob koncu študije, pri čemer se možgani odstranijo in stehtajo. 5. Preostalih 20 živali/spol/skupino se shrani za morebitne dodatne preskuse. Tabela 1 Št. mladičev (8) Št. mladičev, razporejenih za preskus Pregled/preskus m ž 1 5 20 m + 20 ž Vedenjska ontogenija 10 m + 10 ž Teža/nevropatologija/morfometrija možganov na PPD 22 10 m + 10 ž Teža možganov na PPD 22 2 6 20 m + 20 ž Podrobna klinična opazovanja 20 m + 20 ž Motorična aktivnost 20 m + 20 ž Spolna zrelost 20 m + 20 ž Motorična in senzorična funkcija 20 m + 20 ž Učenje in spominjanje (PPD 25) 10 m + 10 ž Teža/nevropatologija/morfometrija možganov mladih odraslih ~ PPD 70 3 7 20 m + 20 ž Učenje in spominjanje (mladi odrasli) 10 m + 10 ž Teža možganov mladih odraslih ~ PPD 70 4 8 — Preostale živali za zamenjave ali dodatne preskuse Primer 2 6. Za preskušanje vedenjske ontogenije pred odstavitvijo od sesanja se uporabi ena skupina 20 mladičev/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec in 1 samica na zarod). Od teh živali je 10 mladičev/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec ali 1 samica na zarod) humano usmrčenih na PPD 11. Možgani se odstranijo, stehtajo in obdelajo za histopatološko vrednotenje. 7. Druga skupina 20 živali/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec in 1 samica na zarod) se uporabi za preglede po odstavitvi od sesanja (podrobna klinična opazovanja, motorična aktivnost, ocena starosti ob nastopu spolne zrelosti ter motorična in senzorična funkcija). Od teh živali se 10 živali/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec ali 1 samica na zarod) anestezira in fiksira s perfuzijo ob koncu študije (približno PPD 70) Po dodatni fiksaciji in situ se možgani odstranijo, stehtajo in obdelajo za nevropatološko vrednotenje. 8. Za preskušanje kognitivne funkcije pri adolescentih in mladih odraslih se uporabi 10 mladičev/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec ali 1 samica na zarod). Za preskuse kognitivne funkcije na PPD 23 in pri mladih odraslih se uporabijo različne živali. Ob koncu se 10 živali/spol/skupino, ki se preskusijo kot odrasli, usmrti, možgani pa se odstranijo in stehtajo. 9. Preostalih 20 živali/spol/skupino, ki niso bile izbrane za preskušanje, se usmrti in izloči ob odstavitvi od sesanja. Tabela 2 Št. mladičev (9) Št. mladičev, dodeljenih za preskus Pregled/preskus m ž 1 5 20 m + 20 ž Vedenjska ontogenija 10 m + 10 ž Teža/nevropatologija/morfometrija možganov na PPD 11 2 6 20 m + 20 ž Podrobna klinična opazovanja 20 m + 20 ž Motorična aktivnost 20 m + 20 ž Spolna zrelost 20 m + 20 ž Motorična in senzorična funkcija 10 m + 10 ž Teža/nevropatologija/morfometrija možganov mladih odraslih ~ PPD 70 3 7 10 m + 10 ž (10) Učenje in spominjanje (PPD 23) 3 7 10 m + 10 ž (10) Učenje in spominjanje (mladi odrasli) Teža možganov mladih odraslih 4 8 — Živali, usmrčene in izločene na PPD 21 Primer 3 10. Za oceno teže možganov in nevropatološko oceno na PPD 11 se uporabi ena skupina 20 mladičev/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec in 1 samica na zarod). Od teh živali je 10 mladičev/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec ali 1 samica na zarod) humano usmrčenih na PPD 11, pri čemer se možgani odstranijo, stehtajo in obdelajo za histopatološko vrednotenje. Poleg tega se zberejo podatki o teži možganov z uporabo nefiksiranih možganov preostalih 10 samcev in 10 samic na velikost odmerka. 11. Druga skupina 20 živali/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec in 1 samica na zarod) se uporabi za vedenjsko ontogenijo (motorična aktivnost), preglede po odstavitvi od sesanja (motorična aktivnost in ocena starosti ob nastopu spolne zrelosti) in preskušanje kognitivne funkcije pri adolescentih. 12. Druga skupina 20 živali/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec in 1 samica na zarod) se uporabi za preskuse motorične in senzorične funkcije (slušni dražljaji) ter podrobna klinična opazovanja. Od teh živali se 10 živali/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec ali 1 samica na zarod) anestezira in fiksira s perfuzijo ob koncu študije (približno PPD 70) Po dodatni fiksaciji in situ se možgani odstranijo, stehtajo in obdelajo za nevropatološko vrednotenje. 13. Druga skupina 20 mladičev/spol/velikost odmerka se uporabi za preskušanje kognitivne funkcije pri mladih odraslih (tj. 1 samec in 1 samica na zarod). Od tega je 10 živali/spol/skupino (tj. 1 samec ali 1 samica na zarod) ob koncu usmrčenih, pri čemer se možgani odstranijo in stehtajo. Tabela 3 Št. mladičev (11) Št. mladičev, razporejenih za preskus Pregled/preskus m ž 1 5 10 m + 10 ž Teža/nevropatologija/morfometrija možganov na PPD 11 10 m + 10 ž Teža možganov na PPD 11 2 6 20 m + 20 ž Vedenjska ontogenija (motorična aktivnost) 20 m + 20 ž Motorična aktivnost 20 m + 20 ž Spolna zrelost 20 m + 20 ž Učenje in spominjanje (PPD 27) 3 7 20 m + 20 ž Zvočni dražljaj (adolescenti in mladi odrasli) 20 m + 20 ž Podrobna klinična opazovanja 10 m + 10 ž Teža/nevropatologija/morfometrija možganov mladih odraslih ~ PPD 70 4 8 20 m + 20 ž Učenje in spominjanje (mladi odrasli) 10 m + 10 ž Teža možganov mladih odraslih

Dodatek 2 Opredelitve Kemikalija: snov ali zmes. Preskusna kemikalija: katera koli snov ali zmes, ki se preskuša s to preskusno metodo.

B.54 UTEROTROPNI BIOLOŠKI PRESKUS NA GLODAVCIH: KRATKOTRAJNI PRESEJALNI PRESKUS ZA ESTROGENE LASTNOSTI

UVOD

1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD št. 440 (2007). OECD je leta 1998 začela z izvajanjem prednostne dejavnosti, da bi pregledala obstoječe in razvila nove smernice za odkrivanje in preskušanje potencialnih povzročiteljev endokrinih motenj (1). Ta dejavnost je med drugim zajemala razvoj smernice za preskušanje za uterotropni biološki preskus na glodavcih. Za uterotropni biološki preskus na glodavcih je bil opravljen obsežen program validacije, med drugim priprava podrobnega referenčnega dokumenta (2) (3) in izvajanje obsežnih študij znotraj laboratorija in med laboratoriji, da bi dokazali ustreznost in ponovljivost biološkega preskusa z močnim referenčnim estrogenom, šibkimi agonisti estrogenskih receptorjev, močnim antagonistom estrogenskih receptorjev in negativno referenčno kemikalijo (4) (5) (6) (7) (8) (9). Ta preskusna metoda B.54 je bila razvita na podlagi izkušenj, pridobljenih med programom validacije preskusa in dobljenih rezultatov z agonisti estrogenov.

2. Uterotropni biološki preskus je kratkotrajni presejalni preskus, ki izvira iz 30. let prejšnjega stoletja (27) (28) in ga je prvi standardiziral strokovni odbor leta 1962 (32) (35). Temelji na povečanju teže maternice ali uterotropnem odzivu (za pregled glej (29)). Vrednoti sposobnost kemikalije, da sproži biološko delovanje, ki je v skladu z agonisti ali antagonisti naravnih estrogenov (npr. 17ß-estradiol), se pa za odkrivanje antagonistov uporablja precej redkeje kot za odkrivanje agonistov. Maternica se na estrogene odziva na dva načina. Prvotni odziv je povečanje teže zaradi prepojenosti z vodo. Temu odzivu sledi povečanje teže zaradi rasti tkiva (30). Odziv maternice pri podganah in miših je kvalitativno primerljiv.

3. Ta biološki preskus služi kot presejalna študija in vivo, njegovo uporabo pa je treba obravnavati v okviru temeljnega okvira za preskušanje in oceno kemikalij, ki povzročajo endokrine motnje, 'OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals' (Dodatek 2). V tem temeljnem okviru je uterotropni biološki preskus na ravni 3 kot preskus in vivo, ki zagotavlja podatke o enem samem endokrinem mehanizmu, tj. estrogenosti.

4. Uterotropni biološki preskus naj bi bil vključen v sistem preskusov in vitro in in vivo, s katerimi bi opredelili kemikalije, ki bi lahko vplivale na endokrini sistem, na podlagi tega pa bi bile opravljene ocene tveganja za zdravje ljudi in okolje. V programu OECD za validacijo so bili za oceno učinkovitosti preskusa za opredelitev estrogenih kemikalij uporabljeni močni in šibki agonisti estrogenov (4) (5) (6) (7) (8). Tako sta bila uspešno dokazana občutljivost postopka preskušanja za agoniste estrogenov in zagotovljena dobra ponovljivost znotraj laboratorija in med laboratoriji.

5. V zvezi z negativnimi kemikalijami je bila v program validacije vključena samo ena 'negativna' referenčna kemikalija, ki je bila kot negativna že potrjena z uterotropnim preskusom ter in vitro preskusi vezave na receptorje in receptorjev, ocenjeni pa so bili tudi dodatni podatki študij, ki niso bili povezani s programom OECD za validacijo in so dodatno podprli specifičnost uterotropnega biološkega preskusa za odkrivanje agonistov estrogenov (16).

ZAČETNI PREUDARKI IN OMEJITVE

6. Agonisti in antagonisti estrogenov delujejo kot ligandi estrogenskih receptorjev α in β in lahko pri receptorjih aktivirajo oziroma zavirajo dejavnost prepisovanja. Zato bi lahko prišlo do škodljivih učinkov za zdravje, vključno z učinki na razmnoževanje in razvoj. Zato je potrebna hitra ocena in vrednotenje kemikalije kot možnega agonista ali antagonista estrogenov. Afiniteta liganda do estrogenskega receptorja ali aktivacije prepisovanja in vitro je samo eden od kazalnikov morebitne nevarnosti. Drugi kazalniki so lahko aktivacija presnove in njena deaktivacija po vstopu v telo, razporeditev v tarčna tkiva in odstranitev iz telesa, vsaj delno pa so odvisni od načina vnosa in preskusne kemikalije. Zato je treba morebitno dejavnost kemikalije pod ustreznimi pogoji proučiti in vivo, razen če so potrebne informacije razvidne že iz lastnosti kemikalije glede absorpcije, porazdelitve, presnove in izločanja. Maternična tkiva se na stimulacijo z estrogeni odzovejo s hitro in bujno rastjo, zlasti pri laboratorijskih glodavcih, pri katerih pojatveni cikel traja približno 4 dni. Glodavci, zlasti podgane, se pogosto uporabljajo tudi v študijah strupenosti za opredelitev nevarnosti. Zato je maternica pri glodavcih ustrezen tarčni organ za presejanje agonistov in antagonistov estrogenov in vivo.

7. Ta preskusna metoda temelji na protokolih iz validacijske študije OECD, ki so se izkazali za zanesljive in ponovljive v študijah znotraj laboratorija in med laboratoriji (5) (7). Trenutno sta na voljo dve metodi, in sicer metoda s sterilizirano odraslo samico in metoda z nezrelo nesterilizirano samico. V programu OECD za validacijo preskusa se je izkazalo, da sta obe metodi primerljivo občutljivi in ponovljivi. Metoda z nezrelo samico je nekoliko manj specifična, ker je os hipotalamus – hipofiza – spolne žleze (os HPG) nedotaknjena, vendar pokriva širše področje preiskave kot metoda s sterilizirano samico, saj se lahko pri prvi metodi žival odzove na kemikalije, ki vplivajo na os HPG in ne samo na estrogenski receptor. Delovanje osi HPG pri podgani se prične pri približno 15 dneh starosti. Pred tem pubertete ni mogoče spodbuditi s tretiranjem, na primer z GnRH. Ko samice prihajajo v puberteto, imajo pred odpiranjem nožnice več tihih ciklov, zaradi katerih sicer ne pride do odpiranja nožnice ali ovulacije, so pa prisotna hormonska nihanja. Če kemikalija os HPG neposredno ali posredno stimulira pred puberteto, pride do zgodnje ovulacije in pospešenega odpiranja nožnice. Do tega ne pride samo zaradi kemikalij, ki delujejo na os HPG; tudi nekatere vrste hrane, ki imajo višje ravni presnovljive energije kot druge, bodo stimulirale rast in spodbudile odpiranje nožnice, čeprav niso estrogenske. Takšne kemikalije ne bi povzročile uterotropnega odziva pri sterilizirani odrasli samici, saj njihova os HPG ne deluje.

8. Zaradi dobrobiti živali je zaželena uporaba metode z nezrelimi podganami, saj tako ni potrebna kirurška predpriprava živali, izogniti pa se je mogoče tudi neuporabi tistih živali, ki kažejo morebitne znake pojatvenega cikla (glej odstavek 30).

9. Do uterotropnega odziva ne pride samo zaradi estrogenosti, tj. do odziva lahko pride tudi zaradi drugih kemikalij, ne samo agonistov ali antagonistov estrogenov. Do stimulativnega odziva lahko na primer pride tudi zaradi relativno velikih odmerkov progesterona, testosterona ali različnih sintetičnih progestinov (30). Vsak odziv je mogoče histološko analizirati za keratinizacijo in kornifikacijo nožnice (30). Ne glede na morebiten izvor odziva naj bi bili na podlagi pozitivnega rezultata uterotropnega biološkega preskusa običajno začeti postopki za nadaljnja pojasnila. Dodatni dokazi o estrogenosti bi bili lahko pridobljeni na podlagi preskusov in vitro, kot so preskusi vezave na estrogenske receptorje in preskusi aktivacije prepisovanja, ali na podlagi drugih preskusov in vivo, kot je preskus na podgani ženskega spola v puberteti.

10. Ob upoštevanju, da uterotropni biološki preskus služi kot presejalna študija in vivo, je bil pristop validacije koristen tako za vprašanja, povezana z dobrobitjo živali, kot za večstopenjsko strategijo preskušanja. Zato je bilo prizadevanje usmerjeno v strogo validacijo ponovljivosti in občutljivosti za estrogenost, kar je najpomembnejše vprašanje pri številnih kemikalijah, medtem ko v razsežnost antiestrogenosti v preskusu ni bilo vloženega veliko truda. Preskušen je bil samo en antiestrogen z močnim delovanjem, saj je število kemikalij z jasnim antiestrogenim profilom (ki ga ne prikrije kakšno estrogeno delovanje) zelo majhno. Zato je ta preskusna metoda namenjena estrogenemu protokolu, protokol, ki v preskusu opisuje antagonistično delovanje, pa je vključen v smernici (37). Ponovljivost in občutljivost preskusa za kemikalije z izključno antiestrogenim delovanjem bo jasneje opredeljena v prihodnosti, ko bo preskusni postopek že nekaj časa v uporabi in bo opredeljenih več kemikalij s tem načinom delovanja.

11. Priznava se, da morajo biti vsi postopki, pri katerih se uporabljajo živali, v skladu z lokalnimi standardi za varstvo živali; opisi oskrbe in ravnanja z živalmi v nadaljevanju so minimalni standardi, nadomestili pa jih bodo lokalni predpisi, kot je Direktiva 2010/63/EU Evropskega parlamenta in Sveta z dne 22. septembra 2010 o zaščiti živali, ki se uporabljajo v znanstvene namene (38). Nadaljnje smernice o humanem ravnanju z živalmi je predložila OECD (25).

12. Kot pri vseh preskusih, pri katerih se uporabljajo žive živali, se je treba pred pričetkom izvajanja preskusa prepričati, da so podatki resnično potrebni. Na primer, dva pogoja, pri katerih so podatki potrebni, sta:

— visok potencial za izpostavljenost (raven 1 temeljnega okvira, Dodatek 2) ali pokazatelji estrogenosti (raven 2), zaradi katerih je potrebno preveriti, ali se lahko takšni učinki pojavijo in vivo,

— učinki, ki kažejo na estrogenost v preskusih in vivo na ravni 4 ali 5, da bi ugotovili, ali so bili učinki povezani z estrogenimi mehanizmi, ki jih ni mogoče pojasniti s preskusom in vitro.

13. Opredelitve, uporabljene v tej preskusni metodi, so navedene v Dodatku 1.

NAČELO PRESKUSA

14. Občutljivost uterotropnega biološkega preskusa je odvisna od sistema preskušanja na živalih, pri katerem os hipotalamus – hipofiza – jajčniki ne deluje, zaradi česar so prisotne nizke endogene koncentracije cirkulirajočega estrogena. Tako se zagotovi nizka osnovna teža maternice in največji možni razpon odziva na prejete estrogene. To zahtevo izpolnjujeta dve na estrogen občutljivi stanji pri glodavcih ženskega spola:

(i) nezrele samice po odstavitvi in pred puberteto ter

(ii) mlade odrasle samice po sterilizaciji, ko je dovolj časa, da se maternična tkiva zmanjšajo.

15. Preskusna kemikalija se vnese dnevno, in sicer oralno z gavažo ali s podkožnim injiciranjem. Stopnjevani odmerki preskusne kemikalije se dajejo vsaj dvema tretiranima skupinama (za navodila glej odstavek 33) preskusnih živali, pri čemer se za vsako skupino uporabi ena velikost odmerka, in sicer v obdobju treh zaporednih dni pri metodi z nesterilizirano nezrelo samico in obdobju najmanj treh zaporednih dni pri metodi s sterilizirano odraslo samico. Približno 24 ur po prejetju zadnjega odmerka se na živalih opravi obdukcija. Pri agonistih estrogenov se na podlagi srednje teže maternice živali v tretiranih skupinah glede na nosilec oceni, ali je prišlo do statistično značilnega povečanja. Statistično značilno povečanje srednje teže maternice živali v preskusni skupini v tem biološkem preskusu pomeni pozitiven odziv.

OPIS METODE

Izbira živalskih vrst

16. Lahko se uporabijo laboratorijski sevi glodavcev, ki se običajno uporabljajo. Med validacijo so bili na primer uporabljeni sevi podgan Sprague-Dawley in Wistar. Sevi z maternicami, za katere je znano ali pa se sumi, da so manj odzivne, se ne smejo uporabiti. Laboratorij bi moral dokazati občutljivost uporabljenega seva v skladu z odstavkoma 26 in 27.

17. V uterotropnem biološkem preskusu se od 30-ih let prejšnjega stoletja običajno uporabljajo podgane in miši. Validacijske študije OECD so bile izvedene samo s podganami na podlagi prepričanja, da sta obe vrsti enakovredni, zato bi morala biti ena vrsta dovolj za globalno validacijo, da bi prihranili sredstva in živali. Podgane so prva izbira pri večini študij strupenosti za razmnoževanje in razvoj. Ker za miši obstaja obsežna zbirka preteklih podatkov, in bi tako razširili področje uporabe uterotropnega biološkega preskusa na glodavcih na uporabo miši kot preskusne vrste, je bila na miših opravljena omejena nadaljevalna validacijska študija (16). V skladu s prvotnim namenom ohranjanja sredstev in živali je bil izbran premostitveni pristop z omejenim številom preskusnih kemikalij in sodelujočih laboratorijev ter brez preskušanja kodiranih vzorcev. Ta premostitvena validacijska študija za uterotropni biološki preskus na steriliziranih mladih odraslih miših dokazuje, da se podatki, pridobljeni s podganami in mišmi, kvalitativno in kvantitativno dobro dopolnjujejo. Če bo po uterotropnem biološkem preskusu morda izvedena dolgotrajna študija, bo tako mogoče v obeh študijah uporabiti živali iste vrste, seva in izvora. Premostitveni pristop je bil uporabljen samo za sterilizirane odrasle miši, poročilo pa ne zagotavlja zanesljivih podatkov za validacijo modela z nezrelimi samicami, zato model z nezrelimi mišmi ne sodi na področje uporabe obstoječe preskusne metode.

18. Zato se lahko v nekaterih primerih namesto podgan uporabijo miši. Uporabo te vrste je treba utemeljiti na podlagi toksikoloških, farmakokinetičnih in/ali drugih meril. Za miši bodo morda potrebne spremembe protokola. Na primer, poraba hrane pri miših glede na telesno težo je večja kot pri podganah, zato mora biti vsebnost fitoestrogena v hrani za miši manjša kot v hrani za podgane (9) (20) (22).

Nastanitveni in prehranjevalni pogoji

19. Vsi postopki morajo biti skladni z vsemi lokalnimi standardi za varstvo živali v laboratorijih. Ti opisi oskrbe in ravnanja z živalmi so minimalni standardi, ki jih bodo nadomestili lokalni predpisi, kot je Direktiva 2010/63/EU Evropskega parlamenta in Sveta z dne 22. septembra 2010 o zaščiti živali, ki se uporabljajo v znanstvene namene (38). Temperatura v prostoru s preskusnimi živalmi naj bo 22 °C (z odstopanjem približno ± 3 °C). Relativna vlažnost naj bo najmanj 30 % in po možnosti naj ne presega 70 %, razen med čiščenjem prostora. Cilj je 50–60-odstotna relativna vlažnost. Osvetlitev naj bo umetna. Dnevno zaporedje osvetlitve naj bo 12 ur svetlobe, 12 ur teme.

20. Laboratorijsko prehrano in pitno vodo je treba priskrbeti ad libitum. Mlade odrasle živali so lahko nastanjene posamično ali pa so v kletke razvrščene v skupine po največ tri živali. Zaradi mladosti nezrelih živali je priporočljiva družabna skupinska nastanitev.

21. Znano je, da visoka vsebnost fitoestrogenov v laboratorijski prehrani povzroči tolikšno povečanje teže maternice pri glodavcih, da to vpliva na uterotropni biološki preskus (13) (14) (15). Pri nezrelih živalih lahko visoka vsebnost fitoestrogenov in presnovljiva energija v laboratorijski prehrani vplivata tudi na pojav zgodnje pubertete. Fitoestrogeni so prisotni v glavnem zaradi vsebnosti izdelkov iz soje in lucerne v laboratorijski prehrani, koncentracija fitoestrogenov v standardni laboratorijski prehrani pa se razlikuje od serije do serije (23). Telesna teža je pomembna spremenljivka, ker je z njo povezana količina zaužite hrane. Zato se lahko dejanski odmerek fitoestrogenov, zaužitih z enako prehrano, razlikuje glede na vrsto in starost (9). Pri nezrelih podganah ženskega spola je lahko poraba hrane glede na telesno težo približno dvakrat večja od porabe hrane pri steriliziranih mladih odraslih samicah. Pri mladih odraslih miših je lahko poraba hrane glede na telesno težo približno štirikrat večja od porabe hrane pri steriliziranih mladih odraslih podganah ženskega spola.

22. Rezultati uterotropnega biološkega preskusa (9) (17) (18) (19) kažejo, da je določena količina fitoestrogenov v prehrani sprejemljiva in ne zmanjša občutljivosti biološkega preskusa. Praviloma naj raven fitoestrogenov v prehrani nezrelih podganah ženskega spola sevov Sprague Dawley in Wistar (6) (9) ne bi presegla 350 μg ekvivalentov genisteina/gram laboratorijske prehrane. Takšna prehrana bi morala biti primerna tudi pri preskušanju na mladih odraslih steriliziranih podganah, ker je poraba hrane glede na telesno težo pri mladih odraslih živalih manjša v primerjavi s porabo hrane pri nezrelih živalih. Če se uporabijo odrasle sterilizirane miši ali podgane, ki so bolj občutljive na fitoestrogen, je treba upoštevati sorazmerno zmanjšanje ravni fitoestrogenov v prehrani (20). Poleg tega lahko zaradi razlik v razpoložljivi presnovni energiji iz različne prehrane pride do časovnega zamika začetka pubertete (21) (22).

23. Pred začetkom študije je treba skrbno izbrati prehrano brez povečane vrednosti fitoestrogenov (za navodila glej (6) (9)) ali presnovljive energije, ki lahko vplivajo na rezultate (15) (17) (19) (22) (36). Zagotavljanje ustreznega delovanja sistema preskušanja, ki ga uporablja laboratorij in je določen v odstavkih 26 in 27, je pomembno za preverjanje obeh dejavnikov. Kot varovalo v skladu z dobro laboratorijsko prakso je treba za vsako serijo prehrane, uporabljene med študijo, opraviti reprezentativno vzorčenje zaradi morebitne analize vsebnosti fitoestrogenov (npr. v primeru visoke kontrolne teže maternice v primerjavi s preteklimi kontrolnimi vzorci ali nezadostnega odziva na referenčni estrogen, 17-alfa-etinilestradiol). Alikvote je treba analizirati v okviru študije ali pa jih zamrzniti pri –20 °C oziroma tako, da se vzorec pred analizo ne razgradi.

24. Nekatere vrste stelje lahko vsebujejo naravno prisotne estrogene ali antiestrogene kemikalije (na primer, znano je, da koruzni storž vpliva na cikličnost pri podganah in očitno deluje antiestrogeno). Izbrana stelja naj bi vsebovala najmanjšo možno koncentracijo fitoestrogenov.

Priprava živali

25. Preskusne živali, ki ne kažejo nobenih znakov bolezni ali fizičnih nepravilnosti, se naključno dodelijo v kontrolne in tretirane skupine. Kletke je treba razporediti tako, da so možni učinki zaradi njihovega položaja čim manjši. Živali je treba označiti z edinstvenimi oznakami. Najbolje je, da so nezrele živali med prilagajanjem do odstavitve v kletkah skupaj z materami ali nadomestnimi materami. Obdobje prilagajanja pred začetkom študije naj bi pri mladih odraslih živalih in nezrelih živalih, ki so prispele skupaj z materami ali nadomestnimi materami, trajalo približno 5 dni. Če so prispele nezrele živali, odstavljene in brez mater, bo morda potrebno krajše obdobje prilagajanja, saj naj bi se dajanje odmerkov pričelo takoj po odstavitvi (glej odstavek 29).

POSTOPEK

Preverjanje strokovnosti laboratorija

26. Za preverjanje strokovnosti laboratorija sta na voljo dve različni možnosti:

— redno preverjanje na podlagi prvotne študije osnovne pozitivne kontrole (glej odstavek 27). Vsaj vsakih 6 mesecev in vedno, ko pride do spremembe, ki bi lahko vplivala na uspešnost preskusa (npr. nova sestava prehrane, menjava osebja, ki opravlja obdukcije, menjava seva živali ali dobavitelja itd.), je treba odzivnost sistema preskušanja (živalski model) preveriti s primernim odmerkom (na podlagi študije osnovne pozitivne kontrole iz poglavja 27) referenčnega estrogena: 17α-etinilestradiol (št. CAS 57-63-6) (EE),

— uporaba sočasnih kontrolnih vzorcev z vključitvijo skupine, ki je prejela ustrezni odmerek referenčnega estrogena, v vsak preskus.

Če se sistem ne odzove v skladu s pričakovanji, je treba pogoje preskusa preveriti in ustrezno spremeniti. Priporoča se, da je odmerek referenčnega estrogena, ki bo uporabljen v obeh primerih, približno ED70 do 80.

27. Študija osnovne pozitivne kontrole – Preden laboratorij prvič izvede študijo v okviru te preskusne metode, je treba dokazati strokovnost laboratorija s preskusom odzivnosti živalskega modela z določitvijo odziva na odmerek referenčnega estrogena: 17α-etinilestradiola (št. CAS 57-63-6) (EE) z najmanj štirimi odmerki. Odziv teže maternice se nato primerja z dobljenimi preteklimi podatki (glej vir (5)). Če študija osnovne pozitivne kontrole ne prinese pričakovanih rezultatov, je treba pogoje preskusa preveriti in spremeniti.

Število in stanje živali

28. Vsaka tretirana in kontrolna skupina mora vključevati vsaj 6 živali (za protokola obeh metod, tj. z nezrelo in sterilizirano odraslo samico).

Starost nezrelih živali

29. Pri uterotropnem biološkem preskusu z nezrelimi živalmi je treba opredeliti dan skotitve. Dajanje odmerkov se mora začeti dovolj zgodaj, da se ob koncu dajanja preskusne kemikalije še ne prične fiziološko naraščanje endogenih estrogenov, povezanih s puberteto. Po drugi strani pa obstajajo dokazi, da so zelo mlade živali morda manj občutljive. Pri opredelitvi optimalne starosti mora vsak laboratorij upoštevati lastne osnovne podatke o zorenju.

Na splošno se lahko dajanje odmerkov podganam prične takoj po zgodnji odstavitvi na 18. poporodni dan (dan skotitve je poporodni dan 0). Dajanje odmerkov podganam naj bi bilo končano 21. poporodni dan, vsekakor pa pred 25. poporodnim dnem, saj se po tej starosti začne delovanje osi hipotalamus – hipofiza – jajčniki, ravni endogenih estrogenov pa lahko začnejo naraščati hkrati s povprečji osnovne teže maternice in povečanjem standardnih odklonov v skupini (2) (3) (10) (11) (12).

Postopek sterilizacije

30. Pri steriliziranih podganah in miših ženskega spola (tretirane in kontrolne skupine) se sterilizacija opravi med 6. in 8. tednom starosti. Pri podganah naj bi od sterilizacije do prvega odmerka preteklo vsaj 14 dni, da se lahko maternica zmanjša na najmanjšo, stabilno osnovno težo. Pri miših naj bi od sterilizacije do prvega odmerka preteklo vsaj 7 dni. Ker za proizvodnjo velike koncentracije cirkulirajočih estrogenov (3) zadošča majhna količina materničnega tkiva, je treba pred uporabo na živalih opraviti preskus z opazovanjem epitelijskih celic, vzetih z brisom nožnice vsaj pet zaporednih dni (npr. pri podganah na 10.–14. dan po sterilizaciji). Če živali kažejo morebitne znake pojatvenega cikla, se jih ne sme uporabiti. Pri obdukciji je treba ostanke jajčnikov pregledati zaradi morebitne prisotnosti tkiva jajčnikov. Če je tkivo prisotno, se živali ne smejo uporabiti pri izračunih (3).

31. Postopek sterilizacije se prične tako, da pravilno anestezirana žival leži na trebuhu. Rez, s katerim se odpre dorzolateralno trebušno steno, naj meri približno 1 cm v dolžino na sredini med zunanjim robom reber in črevničnim grebenom ter nekaj milimetrov lateralno od lateralnega roba ledvene mišice. Jajčnik je treba iz trebušne votline prestaviti na aseptično polje. Jajčnik je treba ločiti pri stiku jajcevoda in maternice. Po potrditvi, da ni prišlo do večje krvavitve, je treba trebušno steno zapreti s šivom, kožo pa speti s sponkami ali zapreti z ustreznim šivom. Mesto ligacije je prikazano na sliki 1. Uporabiti je treba primerne pooperativne analgetike v skladu s priporočili veterinarja, ki ima izkušnje z nego glodavcev.

Telesna teža

32. Pri metodi s sterilizirano odraslo samico telesna teža in teža maternice nista povezani, ker na težo maternice vplivajo hormoni, kot je estrogen, ne pa tudi rastni faktorji, ki vplivajo na velikost telesa. Ravno nasprotno je telesna teža povezana s težo maternice pri modelu z nezrelo samico v času dozorevanja (34). Zato naj bi bilo na začetku študije pri modelu z nezrelo samico nihanje teže uporabljenih živali čim manjše in naj ne bi preseglo ± 20 % srednje teže. To pomeni, da mora rejec standardizirati velikost zaroda in tako zagotoviti, da so potomci različnih mater približno enako hranjeni. Živali je treba razdeliti v skupine (kontrolne in tretirane) v naključnem razponu teže, tako da se povprečna telesna teža vsake skupine statistično ne razlikuje od drugih skupin. Če je mogoče, je treba paziti, da živali iz istega legla niso razporejene v isto tretirano skupino, ne da bi se zaradi tega povečalo število legel, uporabljenih v raziskavi.

Odmerjanje

33. Za ugotavljanje, ali lahko preskusna kemikalija in vivo deluje estrogeno, običajno zadoščajo dve skupini z odmerki in kontrola, zato je zaradi dobrobiti živali zaželen takšen način preskušanja. Če je cilj pridobiti krivuljo odziva na odmerek ali ekstrapolacija na manjše odmerke, so potrebne vsaj 3 skupine odmerkov. Če ni potrebna samo opredelitev estrogenega delovanja, ampak so potrebne tudi druge informacije (na primer ocena moči delovanja), je treba razmisliti o drugačnem režimu odmerjanja. Razen tretiranja s preskusno kemikalijo je treba živali v kontrolni skupini obravnavati enako kot živali v preskusni skupini. Če je pri dajanju preskusne kemikalije uporabljen nosilec, mora kontrolna skupina prejeti enako količino nosilca kot tretirane skupine (ali največjo uporabljeno količino pri preskusnih skupinah, če so količine, ki jih skupine prejmejo, različne).

34. Cilj pri uterotropnem biološkem preskusu je izbrati odmerke, ki zagotavljajo preživetje živali in zanje niso preveč strupeni oziroma jim ne povzročajo prevelike stiske po treh zaporednih dneh dajanja kemikalije, do največjega odmerka 1 000 mg/kg/d. Pri predlaganju in izbiri velikosti vseh odmerkov je treba upoštevati vse obstoječe podatke o strupenosti in (toksiko-)kinetiki, ki so na razpolago za preskusno kemikalijo ali sorodne snovi. Pri največjem odmerku je treba najprej upoštevati informacije o LD50 in/ali akutni strupenosti, da bi se izognili smrti, hudemu trpljenju ali stiski živali (24) (25) (26). Največji odmerek bi moral biti največji tolerančni odmerek (MTD); študija, opravljena z velikostjo odmerka, ki je povzročil pozitiven uterotropni odziv, bi bila prav tako sprejeta. Kot sito so na splošno sprejemljivi veliki intervali med odmerki (npr. polovica logaritemske enote, kar ustreza večanju odmerka za faktor 3,2, ali celo do ene logaritemske enote). Če ustrezni podatki niso na voljo, se lahko opravi študija ugotavljanja območja, s pomočjo katere se določijo odmerki za uporabo.

35. Namesto tega se lahko v primeru, ko je moč estrogenega delovanja agonista mogoče oceniti s podatki in vitro (ali in silico), pri izbiri odmerka upoštevajo ti podatki. Količina preskusne kemikalije, ki bi povzročila uterotropne odzive, enakovredne referenčnemu agonistu (etinilestradiolu), se na primer oceni z njeno relativno in vitro stopnjo učinkovanja glede na etinilestradiol. Največji preskusni odmerek se dobi tako, da se ta enakovredni odmerek pomnoži z ustreznim faktorjem, npr. 10 ali 100.

Preudarki glede ugotavljanja območja

36. Po potrebi se lahko z nekaj živalmi izvede predhodna študija za ugotavljanje območja. S tem v zvezi se lahko uporabi smernica OECD št. 19 (25), ki opredeljuje klinične znake strupenosti ali stiske pri živalih. Če je to v okviru te študije za ugotavljanje območja po treh dneh dajanja odmerkov izvedljivo, se lahko maternice izreže in stehta približno 24 ur po zadnjem odmerku. Ti podatki so nato lahko v pomoč pri zasnovi glavne študije (izbira sprejemljivih največjih in manjših odmerkov ter priporočilo glede števila skup