10.

dodajo se poglavja C.27, C.28, C.29 in C.30: „C.27 PRESKUS STRUPENOSTI S TRZAČAMI V SISTEMU VODE IN USEDLINE Z UPORABO USEDLINE S PRIMEŠANO PRESKUSNO SNOVJO UVOD 1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 218 (2004). Zasnovana je za oceno učinkov daljše izpostavljenosti kemikalijam na ličinke sladkovodne trzače Chironomus sp., ki živijo v usedlinah. Temelji na obstoječih protokolih za preskušanje strupenosti za Chironomus riparius in Chironomus tentans, ki so bili razviti v Evropi (1) (2) (3) in Severni Ameriki (4) (5) (6) (7) (8) ter krožno preskušeni (1) (6) (9). Uporabijo se lahko tudi druge dobro dokumentirane vrste trzače, npr. Chironomus yoshimatsui (10) (11). 2. Scenarij izpostavljenosti, uporabljen v tej preskusni metodi, je primešanje preskusne snovi v usedlino. Izbira ustreznega scenarija izpostavljenosti je odvisna od namena uporabe preskusa. Namen primešanja snovi v usedlino je simulirati nakopičene ravni kemikalij, ki ostajajo v usedlini. Ta sistem izpostavljenosti vključuje primešanje snovi v usedlino v preskusnem sistemu vode in usedline. 3. Snovi, ki jih je treba preskusiti v zvezi z organizmi, živečimi v usedlinah, se običajno v tem delu zelo dolgo obdržijo. Organizmi, živeči v usedlinah, so lahko izpostavljeni na številne načine. Relativni pomen vsakega načina izpostavljenosti in čas, da ta prispeva k skupnim strupenim učinkom, sta odvisna od fizikalno-kemijskih lastnosti zadevne kemikalije. Pri snoveh, ki se močno adsorbirajo (npr. z log Kow > 5), ali snoveh, ki se kovalentno vežejo na usedlino, je lahko zaužitje kontaminirane hrane pomemben način izpostavljenosti. Da ne bi podcenili strupenosti visoko lipofilnih snovi, se lahko predvidi uporaba hrane, dodane usedlini pred uporabo preskusne snovi. Da bi se upoštevali vsi morebitni načini izpostavljenosti, je ta preskusna metoda osredotočena na dolgoročno izpostavljenost. Preskus za C. riparius in C. yoshimatsui traja 20 do 28 dni, za C. tentans pa 28 do 65 dni. Če so za določen namen potrebni kratkoročni podatki, na primer da se raziščejo učinki nestabilne kemikalije, se lahko dodatne ponovitve umaknejo po 10 dneh. 4. Izmerjene končne točke so skupno število preobraženih odraslih osebkov in čas do preobrazbe. Če so potrebni dodatni kratkoročni podatki, je priporočljivo, da se preživetje in rast ličink izmerita šele po 10-dnevnem obdobju, po potrebi z dodatnimi ponovitvami. 5. Priporoča se uporaba formulirane usedline. Ta ima pred naravnimi usedlinami več prednosti: — variabilnost pri poskusih je manjša, saj formulirana usedlina pomeni ponovljivo ‚standardizirano matrico‘, poleg tega ni več treba iskati nekontaminiranih in čistih virov usedlin, — preskusi se lahko začnejo kadar koli, ne da bi se bilo treba ukvarjati s sezonsko variabilnostjo v preskusni usedlini, poleg tega usedline ni treba predhodno obdelati, da bi se odstranila domorodna favna; s formulirano usedlino se tudi znižajo stroški, povezani z zbiranjem zadostne količine usedline na terenu za rutinsko preskušanje, — uporaba formulirane usedline omogoča primerjave strupenosti in ustrezno razvrstitev snovi. 6. Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1. NAČELO PRESKUSA 7. Ličinke trzače prvega stadija so izpostavljene razponu koncentracije preskusne kemikalije v sistemih vode in usedline. Preskusna snov se primeša v usedlino, ličinke prvega stadija pa se nato vnesejo v preskusne čaše, v katerih so bile koncentracije usedline in vode stabilizirane. Hitrost preobrazbe in razvoja trzač se izmeri ob koncu preskusa. Preživetje in teža ličink se lahko izmerita tudi po 10 dneh, če je to potrebno (z dodatnimi ponovitvami, kot je ustrezno). Ti podatki se analizirajo bodisi z regresijskim modelom, da se oceni koncentracija, ki bi povzročila x-odstotno zmanjšanje preobrazbe, ali preživetja, ali rasti ličink (npr. EC15, EC50 itd.), bodisi s preskušanjem statističnih domnev za določitev NOEC/LOEC. Slednje zahteva primerjavo vrednosti učinkov s kontrolnimi vrednostmi, za kar se uporabijo statistični preskusi. INFORMACIJE O PRESKUSNI SNOVI 8. Znani morajo biti vodotopnost preskusne snovi, njen parni tlak, izmerjeni ali izračunani koeficient porazdelitve v usedlini ter stabilnost v vodi in usedlini. Za določitev količine preskusne snovi v vodi nad usedlino, porni vodi in usedlini mora biti na voljo zanesljiva analitska metoda z znano in izpričano natančnostjo ter mejo zaznave. Koristni informaciji sta tudi strukturna formula in čistost preskusne snovi. Prav tako je koristno poznati obnašanje preskusne snovi v okolju (npr. disipacija, abiotska in biotska razgradnja itd.). Dodatne smernice za preskušanje snovi s fizikalno-kemijskimi lastnostmi, zaradi katerih je preskus otežen, so navedene v (12). REFERENČNE KEMIKALIJE 9. Redno se lahko preskušajo referenčne kemikalije, da se tako zagotavlja zanesljivost protokola za preskušanje in preskusnih pogojev. Primeri referenčnih strupenih snovi, ki so bile uspešno uporabljene v krožnih preskusih in potrditvenih raziskavah, so: lindan, trifluralin, pentaklorofenol, kadmijev klorid in kalijev klorid (1) (2) (5) (6) (13). VELJAVNOST PRESKUSA 10. Za veljavnost preskusa morajo biti izpolnjeni naslednji pogoji: — preobrazba v kontrolnih posodah ob koncu preskusa mora biti vsaj 70-odstotna (1) (6), — C. riparius in C. yoshimatsui v kontrolnih posodah se morajo v odrasle osebke preobraziti med 12. in 23. dnem po vnosu v posode; C. tentans potrebujejo 20 do 65 dni, — ob koncu preskusa je treba v vsaki posodi izmeriti pH in koncentracijo raztopljenega kisika. Koncentracija kisika mora biti vsaj 60 % nasičenosti zraka (ASV) pri uporabljeni temperaturi, pH vode nad usedlino pa mora biti v vseh preskusnih posodah med 6 in 9, — temperatura vode se ne sme razlikovati za več kot ± 1,0 °C; temperaturo vode bi bilo mogoče nadzorovati z izotermalnim prostorom; v takem primeru je treba temperaturo v prostoru potrjevati v ustreznih časovnih presledkih. OPIS METODE Preskusne posode 11. Raziskava se izvaja v steklenih 600-mililitrskih čašah z 8-centimetrskim premerom. Primerne so tudi druge posode, vendar morajo zagotavljati primerno globino usedline in vode nad njo. Površina usedline mora biti dovolj velika, da zagotavlja 2 do 3 cm2 na ličinko. Razmerje med debelino usedline in globino vode nad njo mora biti 1 : 4. Preskusne posode in druge naprave, ki bodo prišle v stik s preskusnim sistemom, morajo biti v celoti iz stekla ali drugega kemijsko inertnega materiala (npr. teflona). Izbira vrst 12. Če je mogoče, naj se v preskusu uporabi vrsta Chironomus riparius. Chironomus tentans je prav tako primerna, vendar je z njo težje delati in zahteva daljše preskusno obdobje. Uporabi se lahko tudi Chironomus yohimatsui. Podrobnosti o metodah gojenja za Chironomus riparius so navedene v Dodatku 2. Informacije o pogojih gojenja so na voljo tudi za druge vrste, npr. Chironomus tentans (4) in Chironomus yoshimatsui (11). Identifikacijo vrst je treba potrditi pred preskusom, ni pa to potrebno pred vsakim preskusom, če organizmi prihajajo iz internega gojišča. Usedlina 13. Če je mogoče, je treba uporabiti formulirano usedlino (imenovano tudi rekonstituirana, umetna ali sintetična usedlina). Če se uporabi naravna usedlina, je treba določiti njene lastnosti (vsaj pH in vsebnost organskega ogljika, priporoča se tudi določitev drugih parametrov, kot sta razmerje C/N in granulometrija), poleg tega ne sme biti onesnažena in ne sme vsebovati drugih organizmov, ki bi lahko tekmovali s trzačami ali jih požrli. Prav tako se priporoča, naj se naravna usedlina pred uporabo v preskusu strupenosti s trzačami 7 dni kondicionira v enakih pogojih, kakršni vladajo v poznejšem preskusu. Za uporabo v tem preskusu (1) (15) (16) se priporoča naslednja formulirana usedlina, ki temelji na umetni zemljini, uporabljeni v preskusni metodi C.8 (14): (a) 4–5 % (suhe teže) šote: čim bližje vrednosti pH 5,5 do 6,0; pomembno je uporabiti fino mleto šoto v prahu (velikost delcev ≤ 1 mm), sušeno samo na zraku; (b) 20 % (suhe teže) kaolinske gline (vsebnost kaolinita po možnosti nad 30 %); (c) 75–76 % (suhe teže) kremenovega peska (prevladovati mora fini pesek, pri katerem je več kot 50 % delcev velikih 50 do 200 μm); (d) doda se deionizirana voda, tako da je v končni mešanici vsebnost vlage 30- do 50-odstotna; (e) doda se kemijsko čist kalcijev karbonat (CaCO3), da se pH v končni mešanici usedline uravna na 7,0 ± 0,5. Vsebnost organskega ogljika v končni mešanici mora biti 2 % (± 0,5 %), uravnava pa se z ustreznimi količinami šote in peska v skladu s točkama (a) in (c). 14. Vir šote, kaolinske gline in peska mora biti znan. Preveriti je treba, da sestavine usedline niso kemično onesnažene (npr. da ne vsebujejo težkih kovin, organoklornih spojin, organofosfornih spojin itd.). Primer priprave formulirane usedline je opisan v Dodatku 3. Sprejemljiva je tudi mešanica suhih sestavin, če se dokaže, da se sestavine usedline po dodatku vode nad usedlino ne začnejo ločevati (npr. lebdenje šotnih delcev) in da je šota ali usedlina zadostno kondicionirana. Voda 15. Za preskusno vodo je primerna vsaka voda, ki ustreza kemijskim značilnostim sprejemljive vode za redčenje, ki so navedene v dodatkih 2 in 4. Za gojiščno vodo in preskusno vodo je sprejemljiva vsaka primerna voda, naravna voda (površinska ali podzemna voda), obdelana voda (glej Dodatek 2) ali deklorirana vodovodna voda, če trzače čas gojenja in preskušanja v njej preživijo brez znakov stresa. Na začetku preskusa mora biti pH preskusne vode med 6 in 9, skupna trdota pa ne sme biti višja od 400 mg/l kot CaCO3. Če se domneva, da bo prišlo do interakcije med ioni, ki povzročajo trdoto vode, in preskusno snovjo, je treba uporabiti vodo z manjšo trdoto (v takem primeru se torej ne sme uporabiti medij Elendt M4). Ves čas raziskave je treba uporabljati isto vrsto vode. Lastnosti vode, navedene v Dodatku 4, je treba izmeriti vsaj dvakrat na leto ali kadar se sumi, da so se morda te lastnosti bistveno spremenile. Založne raztopine – usedline s primešano preskusno snovjo 16. Usedline s primešano preskusno snovjo izbrane koncentracije se običajno pripravijo z dodatkom raztopine preskusne snovi neposredno v usedlino. osnovna raztopina preskusne snovi, raztopljene v deionizirani vodi, se zmeša s formulirano usedlino z valjčnim mlinom, mešalnikom za krmo ali ročno. Če je preskusna snov slabo topna v vodi, se lahko raztopi v čim manjši količini ustreznega organskega topila (npr. heksana, acetona ali kloroforma). Ta raztopina se nato zmeša z 10 g finega kremenovega peska za eno preskusno posodo. Topilo je treba pustiti, da izhlapi, in mora biti v celoti odstranjeno iz peska; pesek se nato zmeša z ustrezno količino usedline na preskusno čašo. Za raztapljanje, razpršitev ali emulgiranje preskusne snovi se lahko uporabijo samo tista sredstva, ki hitro izhlapijo. Ne smemo pozabiti, da je treba pri pripravi usedline upoštevati količino peska, prinesenega z mešanico preskusne snovi in peska (tj. usedlino je torej treba pripraviti z manj peska). Paziti je treba, da je preskusna snov, dodana usedlini, v njej temeljito in enakomerno razporejena. Po potrebi se lahko analizirajo podvzorci, da se ugotovi stopnja homogenosti. NAČRT PRESKUSA 17. Načrt preskusa se nanaša na izbiro števila preskusnih koncentracij in razmikov med njimi, število posod za vsako koncentracijo in število ličink na posodo. Opisani so načrti za točkovno oceno EC, oceno NOEC in izvedbo mejnega preskusa. Načrt za regresijsko analizo 18. S koncentracijami, vključenimi v preskus, bi morala biti zajeta efektivna koncentracija (npr. EC15, EC50) in razpon koncentracije, v katerem je zanimiv vpliv preskusne snovi. Na splošno se natančnost in zlasti veljavnost, ki ju je mogoče doseči pri ocenah efektivnih koncentracij (ECx), izboljšata, kadar je efektivna koncentracija v okviru preskušanega razpona koncentracij. Izogibati se je treba ekstrapolaciji veliko pod najnižjo pozitivno koncentracijo ali veliko nad najvišjo koncentracijo. Kot pomoč pri izbiri razpona koncentracij, ki bo uporabljen (glej odstavek 27), se lahko izvede predhodni preskus za ugotavljanje razpona. 19. Če je treba oceniti ECx, je treba preskusiti vsaj 5 koncentracij in izvesti 3 ponovitve za vsako koncentracijo. Vsekakor je priporočljivo uporabiti dovolj preskusnih koncentracij, da se omogoči dobra ocena modela. Faktor med koncentracijami ne sme biti večji od 2 (izjema je dopustna, kadar naklon krivulje odmerek-učinek ni strm). Število ponovitev na posamezno posodo s preskusno snovjo se lahko zmanjša, če se poveča število preskusnih koncentracij z različnimi učinki. Povečanje števila ponovitev ali zmanjšanje velikosti razmikov med preskusnimi koncentracijami običajno vodi do ožjih intervalov zaupanja za preskus. Dodatne ponovitve so potrebne, če se ocenjujeta 10-dnevno preživetje in rast ličink. Načrt za oceno NOEC/LOEC 20. Če je treba oceniti LOEC ali NOEC, bi bilo treba uporabiti pet preskusnih koncentracij in izvesti vsaj štiri ponovitve, faktor med koncentracijami pa ne sme biti večji od 2. Število ponovitev mora zadostovati, da se zagotovi ustrezna statistična vrednost za ugotovitev 20-odstotne razlike v primerjavi s kontrolno enoto pri 5-odstotni stopnji značilnosti (p = 0,05). Pri hitrosti razvoja je običajno ustrezna analiza variance (ANOVA), kot sta Dunnettov preskus in Williamsov preskus (17) (18) (19) (20). Pri koeficientu preobrazbe se lahko uporabijo Cochran-Armitageev preskus, Fisherjev eksaktni preskus (z Bonferronijevim popravkom) ali Mantel-Haenszelov preskus. Mejni preskus 21. Če v predhodnem preskusu za ugotavljanje razpona ni bilo opaženih učinkov, se lahko opravi mejni preskus (ena preskusna koncentracija in kontrolna enota). Namen mejnega preskusa je izvesti preskus pri dovolj visoki koncentraciji, da lahko nosilci odločanja izključijo mogoče strupene učinke preskusne snovi, meja pa je določena pri koncentraciji, za katero ni pričakovati, da bi se pojavila v katerem koli primeru. Priporoča se 1 000 mg/kg (suhe teže). Običajno je potrebnih vsaj šest ponovitev za preskusne in kontrolne posode. Izkazati je treba ustrezno statistično vrednost za ugotovitev 20-odstotne razlike v primerjavi s kontrolno enoto pri 5-odstotni stopnji značilnosti (p = 0,05). Kar zadeva učinek na hitrost razvoja in težo, je t-test primerna statistična metoda, če podatki izpolnjujejo zahteve za ta preskus (normalnost, homogenost varianc). Če te zahteve niso izpolnjene, se lahko uporabi t-preskus za neenake variance ali neparametrični preskus, kot je Wilcoxon-Mann-Whitneyjev preskus. Pri koeficientu preobrazbe je primeren Fisherjev eksaktni preskus. POSTOPEK Pogoji izpostavljenosti Priprava sistema vode in usedline, v katerem je preskusna snov primešana v usedlino 22. Za uporabo preskusne snovi (14) se priporoča postopek primešanja, opisan v preskusni metodi C.8: Strupenost za deževnike. Usedline s primešano preskusno snovjo se vnesejo v posode, nad usedlino pa se doda voda, da nastane volumensko razmerje med usedlino in vodo 1 : 4 (glej odstavka 11 in 15). Plast usedline mora biti debela 1,5 do 3 cm. Da se prepreči ločevanje sestavin usedline in ponovna suspenzija finega materiala med dodajanjem preskusne vode v vodni stolpec, se lahko usedlina med točenjem vode prekrije s plastičnim pokrovom, ki se takoj nato odstrani. Primerna so lahko tudi druga sredstva. 23. Preskusne posode je treba pokriti (npr. s steklenimi ploščami). Po potrebi se med raziskavo voda dotoči do prvotne količine, da se nadomesti izhlapela voda. Za to je treba uporabiti destilirano ali deionizirano vodo, da se prepreči kopičenje soli. Stabilizacija 24. Ko je usedlina s primešano preskusno snovjo in vodo nad njo pripravljena, je zaželeno, da se omogoči porazdelitev preskusne snovi iz vodne faze v usedlino (3) (4) (6) (13). To je po možnosti treba storiti v temperaturnih in prezračevalnih pogojih, ki bodo uporabljeni v preskusu. Ustrezen čas za vzpostavitev ravnotežja je odvisen od usedline in kemikalije, lahko pa traja od več ur do več dni in v redkih primerih do več tednov (4 do 5 tednov). Ker bi bil tako na voljo čas za razgradnjo številnih kemikalij, se na vzpostavitev ravnotežja ne sme čakati, ampak se za to priporoča 48-urno obdobje. Po koncu tega dodatnega obdobja za vzpostavitev ravnotežja je treba izmeriti koncentracijo preskusne snovi v vodi nad usedlino, porni vodi in usedlini vsaj pri najvišji in nižji koncentraciji (glej odstavek 38). Te analitske določitve preskusne snovi omogočajo izračun masne bilance in izražanje rezultatov na podlagi izmerjenih koncentracij. Dodajanje preskusnih organizmov 25. Od 4 do 5 dni pred vnosom preskusnih organizmov v preskusne posode je treba iz gojišč vzeti jajčna legla in jih vstaviti v majhne posode v gojitvenem mediju. Uporabi se lahko starejši medij iz osnovne kulture ali sveže pripravljeni medij. Če se uporabi slednji, je treba v gojitveni medij dodati majhno količino hrane, npr. zelenih alg in/ali nekaj kapljic filtrata suspenzije iz fino mlete ribje hrane v kosmičih (glej Dodatek 2). Uporabiti je treba samo sveže odložena jajčna legla. Običajno se ličinke izležejo nekaj dni po tem, ko so bila jajčeca odložena (2 do 3 dni za Chironomus riparius pri 20 °C ter 1 do 4 dni za Chironomus tentans pri 23 °C in Chironomus yoshimatsui pri 25 °C), rast ličink pa poteka v 4 stadijih, od katerih vsak traja 4 do 8 dni. V preskusu je treba uporabiti ličinke prvega stadija (2 do 3 ali 1 do 4 dni po tem, ko se izležejo). Stadij trzač se lahko po možnosti preveri z merjenjem širine glave (6). 26. 20 ličink prvega stadija se s topo pipeto naključno vnese v vsako preskusno posodo, ki vsebuje usedlino s primešano preskusno snovjo in vodo. Med dodajanjem ličink v preskusne posode je treba ustaviti prezračevanje vode, ki se ne sme izvajati še 24 ur potem, ko so bile ličinke dodane (glej odstavka 25 in 32). Glede na uporabljeni načrt preskusa (glej odstavka 19 in 20) se za točkovno oceno EC uporabi vsaj 60 ličink na koncentracijo, za določitev NOEC pa 80. Preskusne koncentracije 27. Preskus za ugotavljanje razpona je lahko koristen za določitev razpona koncentracij za končni preskus. Za ta namen se uporabi niz široko razmaknjenih koncentracij preskusne snovi. Da se zagotovi enaka gostota površine na trzačo, kot bo uporabljena za končni preskus, se trzače izpostavijo vsaki koncentraciji preskusne snovi za obdobje, ki omogoča oceno ustreznih preskusnih koncentracij, pri čemer ponovitve niso potrebne. 28. Preskusne koncentracije za končni preskus se določijo na podlagi rezultata preskusa za ugotavljanje razpona. Izbrati in uporabiti je treba vsaj pet koncentracij, kot je opisano v odstavkih 18 do 20. Kontrolne enote 29. V preskus je treba vključiti kontrolne posode, v katerih ni preskusne snovi, toda ki vsebujejo usedlino, z ustreznim številom ponovitev (glej odstavka 19 in 20). Če je bilo za aplikacijo preskusne snovi uporabljeno topilo (glej odstavek 16), je treba dodati kontrolno posodo, katere usedlina vsebuje tudi topilo. Preskusni sistem 30. Uporabljajo se statični sistemi. Polstatični ali pretočni sistemi z občasnim ali kontinuiranim obnavljanjem vode nad usedlino se lahko uporabijo v izjemnih primerih, na primer če specifikacije kakovosti vode postanejo neprimerne za preskusni organizem ali vplivajo na kemijsko ravnotežje (npr. ravni raztopljenega kisika se preveč znižajo, koncentracija izločkov se preveč poviša ali minerali iztekajo iz usedline in vplivajo na pH in/ali trdoto vode). Vendar za izboljšanje kakovosti vode nad usedlino običajno zadoščajo in se prednostno uporabljajo druge metode, kot je prezračevanje. Hrana 31. Ličinke je treba hraniti, po možnosti vsak dan ali vsaj trikrat na teden. Za mlade ličinke v prvih desetih dneh ustreza 0,25–0,5 mg (0,35–0,5 mg za C. yoshimatsui) ribje hrane (suspenzija v vodi ali fino mleta hrana, npr. TetraMin ali TetraPhyll; glej podrobnosti v Dodatku 2) na ličinko na dan. Nekoliko več hrane bodo morda potrebovale starejše ličinke: za preostanek preskusa mora zadostovati 0,5–1 mg na ličinko na dan. Obrok hrane je treba zmanjšati v vseh preskusnih in kontrolnih posodah, če se opazi rast glivic ali smrtnost v kontrolnih posodah. Če razvoja glivic ni mogoče ustaviti, je treba preskus ponoviti. Kadar se preskušajo snovi, ki se močno adsorbirajo (npr. z log Kow > 5), ali snovi, ki se kovalentno vežejo na usedlino, se lahko količina hrane, potrebna za zagotovitev preživetja in naravne rasti organizmov, doda formulirani usedlini pred obdobjem stabilizacije. Za to je treba namesto ribje hrane uporabiti rastlinski material, npr. dodatek 0,5 % (suhe teže) fino mletih listov npr. velike koprive (Urtica dioica), bele murve (Morus alba), plazeče detelje (Trifolium repens), špinače (Spinacia oleracea) ali drugega rastlinskega materiala (Cerophyl ali alfa celuloza). Pogoji inkubacije 32. Zagotovi se rahlo prezračevanje vode nad usedlino v preskusnih posodah, po možnosti 24 ur po vnosu ličink, in se izvaja ves čas preskusa (paziti je treba, da koncentracija raztopljenega kisika ne pade pod 60 % ASV). Prezračevanje se zagotavlja prek steklene pasteurjeve pipete, pritrjene 2 do 3 cm nad plastjo usedline (tj. 1 ali nekaj mehurčkov/s). Kadar se preskušajo hlapne kemikalije, je mogoče razmisliti o tem, da se sistem vode in usedline ne bi prezračeval. 33. Preskus se izvaja pri konstantni temperaturi 20 °C (± 2 °C). Za C. tentans in C. yoshimatsui sta priporočeni temperaturi 23 °C oziroma 25 °C (± 2 °C). Uporablja se 16-urno obdobje osvetljenosti, jakost svetlobe pa mora biti 500 do 1 000 lux. Trajanje izpostavljenosti 34. Izpostavljenost se začne z vnosom ličink v posode s primešano preskusno snovjo in kontrolne posode. Najdaljši čas izpostavljenosti za C. riparius in C. yoshimatsui je 28 dni, za C. tentans pa 65 dni. Če se ličinke v odrasle osebke preobrazijo prej, se lahko preskus konča najmanj pet dni po preobrazbi zadnjega odraslega osebka v kontrolni posodi. Opažanja Preobrazba 35. Določita se čas razvoja in skupno število v celoti preobraženih samcev in samic trzače. Samce je mogoče preprosto prepoznati po pahljačastih tipalkah. 36. Preskusne posode je treba opazovati vsaj trikrat na teden, da se ugotovi kakršno koli neobičajno obnašanje (npr. zapuščanje usedline, nenavadno plavanje) v primerjavi s kontrolno posodo. V obdobju pričakovane preobrazbe je potrebno dnevno štetje preobraženih trzač. Spol in število v celoti preobraženih trzač se zapišeta dnevno. Po identifikaciji se trzače odstranijo iz posod. Vsa jajčna legla, odložena pred zaključkom preskusa, je treba evidentirati in nato odstraniti, da se prepreči vnovični vnos ličink v usedlino. Evidentira se tudi število vidnih bub, ki se niso preobrazile. Napotek za spremljanje preobrazbe je v Dodatku 5. Rast in preživetje 37. Če je treba zagotoviti podatke o 10-dnevnem preživetju in rasti ličink, je treba na začetku vključiti dodatne preskusne posode, ki se lahko uporabijo pozneje. Usedlina iz teh dodatnih posod se preseje skozi sito z 250 μm velikimi luknjicami, da se zadržijo ličinke. Merili za pogin sta negibnost ali neodzivnost na mehanske dražljaje. Ličinke, ki ostanejo v usedlini, je prav tako treba šteti za mrtve (ličinke, ki so poginile na začetku preskusa, so morda razgradili mikrobi). Določi se suha teža (brez pepela) preživelih ličink na preskusno posodo in izračuna srednja suha teža posamezne ličinke na posodo. Koristno je določiti, v kateri stadij spadajo preživele ličinke; za to se lahko izmeri širina glave vsakega osebka. Analitske meritve Koncentracija preskusne snovi 38. Pred začetkom preskusa (tj. dodatkom ličink) se za analitsko določitev koncentracije preskusne snovi v usedlini odvzamejo vzorci usedline vsaj iz ene posode na posamezno obdelavo. Priporoča se, da se na začetku in koncu preskusa analizirajo vsaj vzorci vode nad usedlino, porne vode in usedline (glej odstavek 24), in sicer pri najvišji in nižji koncentraciji. Te določitve koncentracije preskusne snovi pokažejo obnašanje/porazdelitev preskusne snovi v sistemu vode in usedline. 39. Kadar se izvajajo vmesne meritve (npr. 7. dan) in če so za analize potrebni veliki vzorci, ki jih ni mogoče vzeti iz preskusnih posod, ne da bi to vplivalo na preskusni sistem, je treba analitske določitve izvesti na vzorcih iz dodatnih preskusnih posod, ki se obdelujejo enako (vključno s prisotnostjo preskusnih organizmov), vendar se za biološka opažanja ne uporabljajo. 40. Za izolacijo intersticijske vode se priporoča 30-minutno centrifugiranje pri npr. 10 000 g in 4 °C. Če pa se za preskusno snov izkaže, da se ne adsorbira na filtre, je lahko sprejemljivo tudi filtriranje. V nekaterih primerih koncentracij v porni vodi zaradi premajhnega vzorca morda ne bo mogoče analizirati. Fizikalno-kemijski parametri 41. Vrednost pH in temperaturo v preskusnih posodah je treba ustrezno meriti (glej odstavek 10). Trdoto in amonij je treba izmeriti v kontrolnih posodah in eni preskusni posodi pri najvišji koncentraciji na začetku in koncu preskusa. PODATKI IN POROČANJE Obdelava rezultatov 42. Namen tega preskusa je določiti učinek preskusne snovi na hitrost razvoja in skupno število v celoti preobraženih samcev in samic trzače oziroma, pri 10-dnevnem preskusu, učinke na preživetje in težo ličink. Če ni znakov o statistično različni občutljivosti spolov, se lahko rezultati za samce in samice za statistične analize združijo. Razlike v občutljivosti med spoloma je mogoče statistično oceniti, na primer s preskusom χ2-r × 2. Po potrebi je treba po 10 dneh določiti preživetje ličink in srednjo suho težo posamezne ličinke na posodo. 43. Če je mogoče, se efektivne koncentracije, ki so izražene in temeljijo na suhi teži, izračunajo na podlagi izmerjenih koncentracij v usedlini na začetku preskusa (glej odstavek 38). 44. Za točkovno oceno EC50 ali druge ECx se lahko statistični podatki po posodah uporabijo kot dejanske ponovitve. Pri izračunu intervala zaupanja za ECx je treba upoštevati variabilnost med posodami ali pa dokazati, da je ta zanemarljiva. Če se model prilega po metodi najmanjših kvadratov, je treba statistične podatke po posameznih posodah transformirati, da se izboljša homogenost variance. Vendar je treba vrednosti ECx izračunati po tem, ko so bili rezultati transformirani nazaj na prvotno vrednost. 45. Kadar je namen statistične analize določiti NOEC/LOEC s preskušanjem domnev, je treba upoštevati variabilnost med posodami, npr. z vgnezdeno ANOVO. Alternativno se lahko uporabijo robustnejši preskusi (21), kadar so običajne predpostavke ANOVE kršene. Koeficient preobrazbe 46. Koeficient preobrazbe da odgovor ‚vse ali nič‘ in se lahko analizira s Cochran-Armitageevim preskusom, uporabljenim regresivno (step-down), kadar se pričakuje monotono razmerje odmerek-učinek in so ti podatki v skladu s tem pričakovanjem. Če niso, se lahko uporabi Fisherjev eksaktni preskus ali Mantel-Haenszelov preskus z Bonferroni-Holmovimi popravljenimi p-vrednostmi. Če se izkaže, da je variabilnost med ponovitvami v okviru iste koncentracije večja, kot bi kazala binomska porazdelitev (pogosto imenovana ‚ekstra-binomska‘ variacija), potem je treba uporabiti robustni Cochran-Armitageev preskus ali Fisherjev eksaktni preskus, kot je predlagano v (21). Vsota preobraženih trzač na posodo ne se določi in deli s številom vnesenih ličink na: pri čemer je: ER = koeficient preobrazbe, ne = število preobraženih trzač na posodo, na = število vnesenih ličink na posodo. 47. Druga možnost, ki je najprimernejša za velike vzorce, kadar obstaja ekstra binomska varianca, je, da se koeficient preobrazbe obravnava kot zvezni odgovor in se uporabijo postopki, kot je Williamsov preskus, kadar se pričakuje monotono razmerje odmerek-učinek in kadar je to v skladu s temi podatki o koeficientu preobrazbe. Dunettov preskus je primeren, kadar monotonost ne drži. Velik vzorec je tu opredeljen kot število preobraženih osebkov in število nepreobraženih osebkov po posameznih ponovitvah (posodah), pri čemer je obojih več kot pet. 48. Za uporabo metod ANOVA je treba vrednosti ER najprej transformirati z arkus sinus-korensko transformacijo ali Freeman-Tukeyevo transformacijo, da se dobi približna normalna porazdelitev in da se variance izenačijo. Cochran-Armitageev preskus, Fisherjev eksaktni preskus (Bonferroni) ali Mantel-Haenszelov preskus se lahko uporabijo, kadar se uporabljajo absolutne pogostosti. Pri arkus sinus-korenski transformaciji se izračuna arkus sinus (sin-1) kvadratnega korena ER. 49. Za koeficiente preobrazbe se vrednosti ECx izračunajo z regresijsko analizo (ali npr. probit (22), logit, Weibull, ustrezno programsko opremo itd.). Če regresijska analiza ni uspešna (npr. kadar sta manj kot dva delna odgovora), se uporabijo druge neparametrične metode, kot sta drseče povprečje ali linearna interpolacija. Hitrost razvoja 50. Srednji čas razvoja pomeni srednji časovni razpon med vnosom ličink (dan 0 preskusa) in preobrazbo poskusne kohorte trzač. (Za izračun dejanskega časa razvoja je treba upoštevati starost ličink ob vnosu.) Hitrost razvoja je obratna času razvoja (enota: 1/dan) in predstavlja tisti delež razvoja ličink, ki se zgodi na dan. Za oceno teh raziskav strupenosti v usedlini je primernejša hitrost razvoja, saj je njena varianca manjša, poleg tega je bolj homogena in bližje normalni porazdelitvi v primerjavi s časom razvoja. Zato so učinkoviti parametrični preskusi primernejši za hitrost razvoja kot za čas razvoja.Če se hitrost razvoja obravnava kot zvezni odgovor, se lahko vrednosti ECx ocenijo z regresijsko analizo (npr. (23), (24)). 51. Za naslednje statistične preskuse se za število trzač, opaženih na dan opazovanja x, domneva, da so se preobrazile na sredini časovnega intervala med dnevom × in dnevom x – 1 (l = dolžina intervala opazovanja, običajno 1 dan). Srednja hitrost razvoja na posodo (x) se izračuna z enačbo: pri čemer je: : srednja hitrost razvoja za posodo, i : indeks intervala opazovanja, m : največje število intervalov opazovanja, : število trzač, preobraženih v intervalu opazovanja i, ne : skupno število preobraženih trzač ob koncu poskusa, (= ) xi : hitrost razvoja trzač, preobraženih v intervalu i. pri čemer je: dayi : dan opazovanja (dnevi od vnosa), li : dolžina intervala opazovanja i (dnevi, običajno 1 dan). Poročilo o preskusu 52. V poročilu o preskusu morajo biti navedene vsaj naslednje informacije: Preskusna snov: — fizikalno stanje, in kjer je ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti (vodotopnost, parni tlak, porazdelitveni koeficient v tleh (ali v usedlini, če je na voljo), stabilnost v vodi itd.), — kemijski identifikacijski podatki (splošno ime, kemijsko ime, strukturna formula, številka CAS itd.), vključno s čistostjo in analitsko metodo za količinsko določanje preskusne snovi. Preskusne vrste: — uporabljene preskusne živali: vrsta, znanstveno ime, vir organizmov in pogoji razmnoževanja, — informacije o ravnanju z jajčnimi legli in ličinkami, — starost preskusnih živali ob vnosu v preskusne posode. Preskusni pogoji: — uporabljena usedlina, tj. naravna ali formulirana, — za naravno usedlino lokacija in opis mesta vzorčenja usedline, vključno, če je mogoče, s preteklim onesnaženjem; značilnosti: pH, vsebnost organskega ogljika, razmerje C/N in granulometrija (če je ustrezno), — priprava formulirane usedline: sestavine in značilnosti (vsebnost organskega ogljika, pH, vlaga itd. na začetku preskusa), — priprava preskusne vode (če se uporablja obdelana voda) in značilnosti (koncentracija kisika, pH, prevodnost, trdota itd. na začetku preskusa), — globina usedline in vode nad njo, — količina vode nad usedlino in porne vode; teža mokre usedline s porno vodo in brez nje, — preskusne posode (material in velikost), — metoda primešanja preskusne snovi v usedlino: uporabljene preskusne koncentracije, število ponovitev in uporaba topila, če je bilo uporabljeno, — faza stabilizacije za vzpostavitev ravnotežja sistema vode in usedline: trajanje in pogoji, — pogoji inkubacije: temperatura, svetlobni ciklus in jakost svetlobe, prezračevanje (pogostost in jakost), — podrobne informacije o hranjenju, vključno z vrsto hrane, pripravo, količino in načinom. Rezultati: — nazivne preskusne koncentracije, izmerjene preskusne koncentracije in rezultati vseh analiz za določitev koncentracije preskusne snovi v preskusni posodi, — kakovost vode v preskusnih posodah, tj. pH, temperatura, raztopljeni kisik, trdota in amonij, — morebitna nadomestitev izhlapele preskusne vode, — število preobraženih samcev in samic trzače na posodo in na dan, — število ličink, ki se niso preobrazile v trzače, na posodo, — srednja suha teža posamezne ličinke na posodo in po stadijih, če je ustrezno, — delež preobrazbe na ponovitev in preskusno koncentracijo (združeni samci in samice trzače), — srednja hitrost razvoja v celoti preobraženih trzač na ponovitev in stopnjo koncentracije (združeni samci in samice trzače), — ocene strupenih končnih točk, npr. ECx (in s tem povezani intervali zaupanja), NOEC in/ali LOEC, ter statistične metode, uporabljene za njihovo določitev, — obravnava rezultatov, vključno z vsemi vplivi na rezultat preskusa, ki izvirajo iz odstopanj od te preskusne metode. VIRI: (1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Uredila M. Streloke in H. Köpp. Berlin 1995. (2) Fleming, R., idr. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Končno poročilo za Evropsko komisijo. Poročilo št.: EC 3738. Avgust 1994. WRc, Združeno kraljestvo. (3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. Z delavnice WOSTA, ki je potekala na Nizozemskem. (4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates, str. 1125–1241. V ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Zvezek 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA. (5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. (6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Druga izdaja. EPA 600/R-99/064. Marec 2000. Sprememba prve izdaje iz junija 1994. (7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. (8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. (9) Milani, D., Day, K. E., McLeay, D. J., in Kirby, R. S. (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Kanada. (10) Sugaya, Y. (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350. (11) Kawai, K. (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47–57. (12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. (13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. (14) Preskusna metoda C.8 iz te priloge, Strupenost za deževnike. (15) Suedel, B. C., in Rodgers, J. H. (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163–1175. (16) Naylor, C., in Rodrigues, C. (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303. (17) Dunnett, C. W. (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096–1121. (18) Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482–491. (19) Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103–117. (20) Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510–531. (21) Rao, J. N. K., in Scott, A. J. (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577–585. (22) Christensen, E. R. (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213–221. (23) Bruce in Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485–1494. (24) Slob, W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298–312. Dodatek 1 OPREDELITEV POJMOV Za to preskusno metodo se uporabljajo naslednje opredelitve pojmov: formulirana usedlina ali rekonstituirana, umetna ali sintetična usedlina je zmes snovi, uporabljenih za posnemanje fizičnih sestavin naravne usedline; voda nad usedlino je voda, ki se nalije nad usedlino v preskusni posodi; intersticijska voda ali porna voda je voda, ki zavzema prostor med delci usedline in zemljine; usedlina s primešano snovjo je usedlina, ki ji je bila dodana preskusna snov; preskusna kemikalija je snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. Dodatek 2 Priporočila za gojenje Chironomus riparius 1. Ličinke Chironomus se lahko gojijo v kristalizirkah ali večjih vsebnikih. Na dno vsebnika se nanese tanka plast finega kremenovega peska (debela približno 5 do 10 mm). Za primeren substrat se je izkazal tudi kieselguhr (npr. Merck, Art 8117) (zadošča tanjša plast, debela samo nekaj mm). Nato se doda primerna voda do globine več cm. Vodo je treba po potrebi dotočiti, da se nadomestijo izgube zaradi izhlapevanja in prepreči izsušitev. Voda se po potrebi lahko zamenja. Zagotoviti je treba rahlo prezračevanje. Posode, v katerih se gojijo ličinke, morajo biti v primerni kletki, ki bo preprečila pobeg odraslih preobraženih osebkov. Kletka mora biti dovolj velika, da lahko preobraženi odrasli osebki rojijo, sicer se lahko zgodi, da ne bo parjenja (najmanjša velikost je približno 30 × 30 × 30 cm). 2. Kletke morajo biti v prostoru s sobno temperaturo ali prostoru s stalnim ozračjem pri 20 ± 2 °C s 16-urnim obdobjem svetlobe (jakost približno 1 000 lux) in 8-urno temo. Po poročilih lahko manj kot 60-odstotna relativna vlažnost zraka ovira razmnoževanje. Voda za redčenje 3. Uporabi se lahko vsaka primerna naravna ali sintetična voda. Običajno se uporabljajo voda iz vodnjaka, deklorirana vodovodna voda in umetni mediji (npr. medij Elendt ‚M4‘ ali ‚M7‘, glej spodaj). Vodo je treba pred uporabo prezračiti. Voda za gojenje se lahko po potrebi obnovi, tako da se uporabljena voda iz gojitvenih posod skrbno pretoči ali izsesa, ne da bi pri tem uničili ovoj ličink. Hranjenje ličink 4. Ličinke Chironomus je treba hraniti s približno 250 mg ribje hrane v kosmičih (TetraMin®, TetraPhyll® ali druga podobna zaščitena znamka ribje hrane) na posodo na dan. Hrana se lahko daje v obliki suhega mletega prahu ali kot suspenzija v vodi: 1,0 g hrane v kosmičih se doda 20 ml vode za redčenje in zmeša, da nastane homogena mešanica. Ta pripravek se lahko daje v količini približno 5 ml na posodo na dan (pred uporabo ga je treba pretresti). Starejše ličinke lahko dobijo več hrane. 5. Hranjenje se prilagaja kakovosti vode. Če gojitveni medij postane ‚moten‘, je treba hranjenje zmanjšati. Dodajanje hrane je treba skrbno spremljati. Premalo hrane bo povzročilo selitev ličink v vodni stolpec, preveč hrane pa povečano mikrobno dejavnost in zmanjšane koncentracije kisika. Oboje lahko privede do počasnejše rasti. 6. Ko se pripravijo nove gojitvene posode, se lahko dodajo tudi celice nekaterih zelenih alg (npr. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris). Hranjenje preobraženih odraslih osebkov 7. Nekateri raziskovalci so predlagali, da se lahko kot hrana za odrasle preobražene osebke uporabi vatna blazinica, namočena v nasičeno raztopino saharoze. Preobrazba 8. Pri 20 ± 2 °C se bo preobrazba v odrasle osebke iz posod za gojenje ličink začela po približno 13 do 15 dneh. Samce je mogoče preprosto prepoznati po pahljačastih tipalkah. Jajčna legla 9. Ko so v kletki za razmnoževanje odrasli osebki, je treba vse posode za gojenje ličink trikrat tedensko preveriti zaradi morebitnih odloženih želatinastih jajčnih legel, ki jih je treba previdno odstraniti. Prenesti jih je treba v majhno posodo, ki vsebuje vzorec vode za razmnoževanje. Jajčna legla se uporabijo za pripravo nove gojitvene posode (npr. 2 do 4 jajčna legla/posodo) ali za preskuse strupenosti. 10. Ličinke prvega stadija bi se morale izleči po 2 ali 3 dneh. Priprava novih gojitvenih posod 11. Ko so gojišča vzpostavljena, bi moralo biti mogoče novo gojitveno posodo za ličinke pripraviti vsak teden ali manj pogosto, odvisno od zahtev preskušanja, stare posode pa odstraniti, ko se ličinke preobrazijo v odrasle osebke. S takim sistemom bo najpreprosteje zagotovljena redna oskrba z odraslimi osebki. Priprava preskusnih raztopin ‚M4‘ in ‚M7‘ 12. Elendt (1990) je opisal medij ‚M4‘. Medij ‚M7‘ se pripravi kot medij ‚M4‘, z izjemo snovi, navedenih v preglednici 1, za katere so koncentracije pri ‚M7‘ štirikrat nižje kot pri ‚M4‘. Publikacija o mediju ‚M7‘ je v pripravi (Elendt, osebno sporočilo). Preskusna raztopina se ne sme pripraviti po Elendt in Bias (1990), saj koncentracije NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 in K2HPO4, navedene za pripravo osnovnih raztopin, niso ustrezne. Priprava medija ‚M7‘ 13. Vsaka osnovna raztopina (I) se pripravi posebej, sestavljena osnovna raztopina (II) pa se pripravi iz teh osnovnih raztopin (I) (glej preglednico 1). V 50 ml sestavljene osnovne raztopine (II), ki ji je dodana količina vsake osnovne raztopine makrohranilnih snovi, navedena v preglednici 2, se dolije deionizirana voda do 1 litra, da se pripravi medij ‚M7‘. Založna raztopina vitaminov se pripravi tako, da se trije vitamini dodajo v deionizirano vodo, kot je navedeno v preglednici 3, 0,1 ml sestavljene osnovne raztopine vitaminov pa se doda končnemu mediju ‚M7‘ malo pred uporabo. (Založna raztopina vitaminov se shranjuje zamrznjena v majhnih alikvotih.) Medij se prezračuje in stabilizira. VIRI: BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Uredila M. Streloke in H. Köpp. Berlin 1995. Preglednica 1 Založne raztopine elementov v sledeh za medija M4 in M7 Založne raztopine (I) Količina (mg) za pripravo 1 litra z deionizirano vodo Za pripravo sestavljene osnovne raztopine (II): zmešajte naslednje količine (ml) osnovnih raztopin (I) in dopolnite do 1 litra z deionizirano vodo Končne koncentracije v preskusnih raztopinah (mg/l) M4 M7 M4 M7 H3BO3 (15) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 MnCl2 · 4 H2O (15) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 LiCl (15) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 RbCl (15) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 SrCl2 · 6 H2O (15) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 NaBr (15) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 Na2MoO4 · 2 H2O (15) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 CuCl2 · 2 H2O (15) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 ZnCl2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 CaCl2 · 6 H2O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na2SeO3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 NH4VO3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 Na2EDTA · 2 H2O (15) (16) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 FeSO4 · 7 H2O (15) (16) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249

Preglednica 2 Založne raztopine makrohranilnih snovi za medija M4 in M7 Količina za pripravo 1 litra z deionizirano vodo (mg) Količina osnovnih raztopin makrohranilnih snovi za pripravo medijev M4 in M7 (ml/l) Končne koncentracije v preskusnih raztopinah M4 in M7 (mg/l) CaCl2 · 2 H2O 293 800 1,0 293,8 MgSO4 · 7 H2O 246 600 0,5 123,3 KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO3 64 800 1,0 64,8 NaSiO3 · 9 H2O 50 000 0,2 10,0 NaNO3 2 740 0,1 0,274 KH2PO4 1 430 0,1 0,143 K2HPO4 1 840 0,1 0,184

Preglednica 3 Založna raztopina vitaminov za medija M4 in M7. Vse tri raztopine vitaminov so združene v eno. Količina za pripravo 1 litra z deionizirano vodo (mg) Količina dodane osnovne raztopine vitaminov za pripravo medijev M4 in M7 (ml/l) Končne koncentracije v preskusnih raztopinah M4 in M7 (mg/l) Tiamin hidroklorid 750 0,1 0,075 Cianokobalamin (B12) 10 0,1 0,0010 Biotin 7,5 0,1 0,00075 VIRI: Elendt, B. P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25–33. Elendt, B. P. in Bias, W.-R. (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157–1167. Dodatek 3 PRIPRAVA FORMULIRANE USEDLINE Sestava usedline Sestava formulirane usedline mora biti naslednja: Sestavina Značilnosti Delež suhe teže usedline v % Šota Šotni mah, čim bližje pH 5,5 do 6,0, brez vidnih ostankov rastlin, fino mlet (velikost delcev ≤ 1 mm) in sušen na zraku. 4–5 Kremenov pesek Velikost zrn: > 50 % delcev mora biti velikih 50–200 μm. 75–76 Kaolinska glina Vsebnost kaolinita ≥ 30 %. 20 Organski ogljik Uravnava se z dodatkom šote in peska. 2 (± 0,5) Kalcijev karbonat CaCO3, zdrobljen v prah, kemijsko čist. 0,05–0,1 Voda Prevodnost ≤ 10 μS/cm. 30–50 Priprava Šota se posuši na zraku in zmelje v fin prah. Pripravi se suspenzija potrebne količine šote v prahu v deionizirani vodi, za kar se uporabi visoko zmogljiva naprava za homogenizacijo. pH te suspenzije se s CaCO3 uravna na 5,5 ± 0,5. Suspenzija se vsaj 2 dneva kondicionira z rahlim mešanjem pri 20 ± 2 °C, da se stabilizira pH in vzpostavi stabilna mikrobna komponenta. Vrednost pH se znova izmeri in mora biti 6,0 ± 0,5. Šotna suspenzija se nato zmeša z drugimi sestavinami (peskom in kaolinsko glino) in deionizirano vodo, da nastane homogena usedlina z vsebnostjo vode v razponu 30 do 50 % suhe teže usedline. pH končne mešanice se znova izmeri in po potrebi uravna na 6,5 do 7,5 s CaCO3. Vzamejo se vzorci usedline, da se določita suha teža in vsebnost organskega ogljika. Priporoča se, da se formulirana usedlina pred uporabo v preskusu strupenosti s trzačami 7 dni kondicionira v enakih pogojih, kakršni vladajo v poznejšem preskusu. Shranjevanje Suhe sestavine za pripravo umetne usedline se lahko shranjujejo v suhem in hladnem prostoru pri sobni temperaturi. Formulirana (mokra) usedlina se pred uporabo v preskusu ne sme shranjevati. Uporabiti jo je treba takoj po 7-dnevnem obdobju kondicioniranja, s katerim se njena priprava konča. VIRI: Poglavje C.8 te priloge. Strupenost za deževnike. Meller, M., Egeler, P., Rombke, J., Schallnass, H., Nagel, R., Streit, B. (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10–20. Dodatek 4 Kemijske lastnosti sprejemljive vode za redčenje Snov Koncentracije Delci < 20 mg/l Celotni organski ogljik < 2 mg/l Neionizirani amoniak < 1 μg /l Trdota kot CaCO3 < 400 mg/l (17) Ostanek klora < 10 μg /l Skupni organofosforni pesticidi < 50 ng/1 Skupni organoklorni pesticidi in poliklorirani bifenili < 50 ng/1 Skupni organski klor < 25 ng/1 Dodatek 5 Napotek za spremljanje preobrazbe ličink trzače Na preskusne čaše se namestijo lovilniki za preobražene osebke. Potrebni so od 20. dne do konca preskusa. Primer lovilnika je narisan spodaj: A: najlonska mrežica B: obrnjen plastični lonček C: poskusna čaša brez ustja D: mrežasti okenci za izmenjavo vode E: voda F: usedlina C.28 PRESKUS STRUPENOSTI S TRZAČAMI V SISTEMU VODE IN USEDLINE Z UPORABO VODE S PRIMEŠANO PRESKUSNO SNOVJO UVOD 1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD TG 219 (2004). Zasnovana je za oceno učinkov daljše izpostavljenosti kemikalijam na ličinke sladkovodne trzače Chironomus sp., ki živijo v usedlinah. Temelji predvsem na smernici BBA, v kateri je scenarij izpostavljenosti uporaba sistema vode in usedline, sestavljenega iz umetne zemljine in vodnega stolpca (1). Upošteva tudi obstoječe protokole za preskušanje strupenosti za Chironomus riparius in Chironomus tentans, ki so bili razviti v Evropi in Severni Ameriki (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) ter krožno preskušeni (1) (6) (9). Uporabijo se lahko tudi druge dobro dokumentirane vrste trzače, npr. Chironomus yoshimatsui (10) (11). 2. Scenarij izpostavljenosti, uporabljen v tej preskusni metodi, je primešanje preskusne snovi v vodo. Izbira ustreznega scenarija izpostavljenosti je odvisna od namena uporabe preskusa. Scenarij izpostavljenosti, ki vključuje primešanje preskusne snovi v vodni stolpec, je namenjen simulaciji pojava zanašanja pesticidov in zajema začetne najvišje koncentracije v porni vodi. Uporaben je tudi za druge vrste izpostavljenosti (vključno z razlitji kemikalij), razen za procese kopičenja, ki trajajo dlje od preskusnega obdobja. 3. Snovi, ki jih je treba preskusiti v zvezi z organizmi, živečimi v usedlinah, se običajno v tem delu zelo dolgo obdržijo. Organizmi, živeči v usedlinah, so lahko izpostavljeni na številne načine. Relativni pomen vsakega načina izpostavljenosti in čas, da ta prispeva k skupnim strupenim učinkom, sta odvisna od fizikalno-kemijskih lastnosti zadevne kemikalije. Pri snoveh, ki se močno adsorbirajo (npr. z log Kow > 5), ali snoveh, ki se kovalentno vežejo na usedlino, je lahko zaužitje kontaminirane hrane pomemben način izpostavljenosti. Da ne bi podcenili strupenosti visoko lipofilnih snovi, se lahko predvidi uporaba hrane, dodane usedlini pred uporabo preskusne snovi. Da bi se upoštevali vsi morebitni načini izpostavljenosti, je ta preskusna metoda osredotočena na dolgoročno izpostavljenost. Preskus za C. riparius in C. yoshimatsui traja 20 do 28 dni, za C. tentans pa 28 do 65 dni. Če so za določen namen potrebni kratkoročni podatki, na primer da se raziščejo učinki nestabilne kemikalije, se lahko dodatne ponovitve umaknejo po 10 dneh. 4. Izmerjene končne točke so skupno število preobraženih odraslih osebkov in čas do preobrazbe. Če so potrebni dodatni kratkoročni podatki, je priporočljivo, da se preživetje in rast ličink izmerita šele po 10-dnevnem obdobju, po potrebi z dodatnimi ponovitvami. 5. Priporoča se uporaba formulirane usedline. Ta ima pred naravnimi usedlinami več prednosti: — variabilnost pri poskusih je manjša, saj formulirana usedlina pomeni ponovljivo ‚standardizirano matrico‘, poleg tega ni več treba iskati nekontaminiranih in čistih virov usedlin, — preskusi se lahko začnejo kadar koli, ne da bi se bilo treba ukvarjati s sezonsko variabilnostjo v preskusni usedlini, poleg tega usedline ni treba predhodno obdelati, da bi se odstranila domorodna favna; s formulirano usedlino se tudi znižajo stroški, povezani z zbiranjem zadostne količine usedline na terenu za rutinsko preskušanje, — uporaba formulirane usedline omogoča primerjave strupenosti in ustrezno razvrstitev snovi: podatki o strupenosti iz preskusov z naravnimi in umetnimi usedlinami so bili primerljivi za več kemikalij (2). 6. Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1. NAČELO PRESKUSA 7. Ličinke trzače prvega stadija so izpostavljene razponu koncentracije preskusne kemikalije v sistemih vode in usedline. Preskus se začne z vnosom ličink prvega stadija v preskusne čaše, ki vsebujejo sistem vode in usedline, nato pa se preskusna snov primeša v vodo. Hitrost preobrazbe in razvoja trzač se izmerita ob koncu preskusa. Preživetje in teža ličink se lahko izmerita tudi po 10 dneh, če je to potrebno (z dodatnimi ponovitvami, kot je ustrezno). Ti podatki se analizirajo bodisi z regresijskim modelom, da se oceni koncentracija, ki bi povzročila x-odstotno zmanjšanje preobrazbe, preživetja ali rasti ličink (npr. EC15, EC50 itd.), bodisi s preskušanjem statističnih domnev za določitev NOEC/LOEC. Slednje zahteva primerjavo vrednosti učinkov s kontrolnimi vrednostmi, za kar se uporabijo statistični preskusi. INFORMACIJE O PRESKUSNI SNOVI 8. Znani morajo biti vodotopnost preskusne snovi, njen parni tlak, izmerjeni ali izračunani koeficient porazdelitve v usedlini ter stabilnost v vodi in usedlini. Za določitev količine preskusne snovi v vodi nad usedlino, porni vodi in usedlini mora biti na voljo zanesljiva analitska metoda z znano in izpričano natančnostjo in mejo zaznave. Med Koristni informaciji sta tudi strukturna formula in čistost preskusne snovi. Prav tako je koristno poznati obnašanje preskusne snovi v okolju (npr. disipacija, abiotska in biotska razgradnja itd.). Dodatne smernice za preskušanje snovi s fizikalno-kemijskimi lastnostmi, zaradi katerih je preskušanje oteženo, so navedene v (12). REFERENČNE KEMIKALIJE 9. Redno se lahko preskušajo referenčne kemikalije, da se tako zagotavlja zanesljivost protokola za preskušanje in preskusnih pogojev. Primeri referenčnih strupenih snovi, ki so bile uspešno uporabljene v krožnih preskusih in potrditvenih raziskavah, so: lindan, trifluralin, pentaklorofenol, kadmijev klorid in kalijev klorid (1) (2) (5) (6) (13). VELJAVNOST PRESKUSA 10. Za veljavnost preskusa morajo biti izpolnjeni naslednji pogoji: — preobrazba v kontrolnih posodah ob koncu preskusa mora biti vsaj 70-odstotna (1) (6), — C. riparius in C. yoshimatsui v kontrolnih posodah se morajo v odrasle osebke preobraziti med 12. in 23. dnem po vnosu v posode; C. tentans potrebujejo 20 do 65 dni, — ob koncu preskusa je treba v vsaki posodi izmeriti pH in koncentracijo raztopljenega kisika. Koncentracija kisika mora biti vsaj 60 % nasičenosti zraka (ASV) pri uporabljeni temperaturi, pH vode nad usedlino pa mora biti v vseh preskusnih posodah med 6 in 9, — temperatura vode se ne sme razlikovati za več kot ± 1,0 °C. Temperaturo vode bi bilo mogoče nadzorovati z izotermalnim prostorom; v takem primeru je treba temperaturo v prostoru potrjevati v ustreznih časovnih presledkih. OPIS METODE Preskusne posode 11. Raziskava se izvaja v steklenih 600-mililitrskih čašah z 8-centimetrskim premerom. Primerne so tudi druge posode, vendar morajo zagotavljati primerno globino usedline in vode nad njo. Površina usedline mora biti dovolj velika, da zagotavlja 2 do 3 cm2 na ličinko. Razmerje med debelino usedline in globino vode nad njo mora biti 1 : 4. Preskusne posode in druge naprave, ki bodo prišle v stik s preskusnim sistemom, morajo biti v celoti iz stekla ali drugega kemijsko inertnega materiala (npr. teflona). Izbira vrst 12. Če je mogoče, naj se v preskusu uporabi vrsta Chironomus riparius. Chironomus tentans je prav tako primerna, vendar je z njo težje delati in zahteva daljše preskusno obdobje. Uporabi se lahko tudi Chironomus yohimatsui. Podrobnosti o metodah gojenja za Chironomus riparius so navedene v Dodatku 2. Informacije o pogojih gojenja so na voljo tudi za druge vrste, npr. Chironomus tentans (4) in Chironomus yoshimatsui (11). Identifikacijo vrst je treba potrditi pred preskusom, ni pa to potrebno pred vsakim preskusom, če organizmi prihajajo iz internega gojišča. Usedlina 13. Če je mogoče, je treba uporabiti formulirano usedlino (imenovano tudi rekonstituirana, umetna ali sintetična usedlina). Če se uporabi naravna usedlina, je treba določiti njene lastnosti (vsaj pH in vsebnost organskega ogljika, priporoča se tudi določitev drugih parametrov, kot sta razmerje C/N in granulometrija), poleg tega ne sme biti onesnažena in ne sme vsebovati drugih organizmov, ki bi lahko tekmovali s trzačami ali jih požrli. Prav tako se priporoča, naj se naravna usedlina pred uporabo v preskusu strupenosti s trzačami 7 dni kondicionira v enakih pogojih, kakršni vladajo v poznejšem preskusu. Za uporabo v tem preskusu (1) (15) (16) se priporoča naslednja formulirana usedlina, ki temelji na umetni zemljini, uporabljeni v preskusni metodi C.8 (14): (a) 4–5 % (suhe teže) šote: čim bližje vrednosti pH 5,5 do 6,0; pomembno je uporabiti fino mleto šoto v prahu (velikost delcev ≤ 1 mm), sušeno samo na zraku; (b) 20 % (suhe teže) kaolinske gline (vsebnost kaolinita po možnosti nad 30 %); (c) 75–76 % (suhe teže) kremenovega peska (prevladovati mora fini pesek, pri katerem je več kot 50 % delcev velikih 50 do 200 μm); (d) doda se deionizirana voda, tako da je v končni mešanici vlaga 30- do 50-odstotna; (e) doda se kemijsko čist kalcijev karbonat (CaCO3), da se pH v končni mešanici usedline uravna na 7,0 ± 0,5; (f) vsebnost organskega ogljika v končni mešanici mora biti 2 % (± 0,5 %), uravnava pa se z ustreznimi količinami šote in peska v skladu s točkama (a) in (c). 14. Vir šote, kaolinske gline in peska mora biti znan. Preveriti je treba, da sestavine usedline niso kemično onesnažene (npr. da ne vsebujejo težkih kovin, organoklornih spojin, organofosfornih spojin itd.). Primer priprave formulirane usedline je opisan v Dodatku 3. Sprejemljiva je tudi mešanica suhih sestavin, če se dokaže, da se sestavine usedline po dodatku vode nad usedlino ne začnejo ločevati (npr. lebdenje šotnih delcev) in da je šota ali usedlina zadostno kondicionirana. Voda 15. Za preskusno vodo je primerna vsaka voda, ki ustreza kemijskim značilnostim sprejemljive vode za redčenje, ki so navedene v dodatkih 2 in 4. Za gojiščno vodo in preskusno vodo je sprejemljiva vsaka primerna voda, naravna voda (površinska ali podzemna voda), obdelana voda (glej Dodatek 2) ali deklorirana vodovodna voda, če trzače čas gojenja in preskušanja v njej preživijo brez znakov stresa. Na začetku preskusa mora biti pH preskusne vode med 6 in 9, skupna trdota pa ne sme biti višja od 400 mg/l kot CaCO3. Če se domneva, da bo prišlo do interakcije med ioni, ki povzročajo trdoto vode, in preskusno snovjo, je treba uporabiti vodo z manjšo trdoto (v takem primeru se torej ne sme uporabiti medij Elendt M4). Ves čas raziskave je treba uporabljati isto vrsto vode. Lastnosti vode, navedene v Dodatku 4, je treba izmeriti vsaj dvakrat na leto ali kadar se sumi, da so se morda te lastnosti bistveno spremenile. Založne raztopine – voda s primešano preskusno snovjo 16. Preskusne koncentracije se izračunajo na podlagi koncentracij v vodnem stolpcu, tj. vodi nad usedlino. Preskusne raztopine izbranih koncentracij se običajno pripravijo z redčenjem osnovne raztopine. Založne raztopine je po možnosti treba pripraviti tako, da se preskusna snov raztopi v preskusnem mediju. V nekaterih primerih bo morda treba uporabiti topila ali disperzijska sredstva, da se pripravi primerno koncentrirana osnovna raztopina. Primerna topila so na primer aceteon, etanol, metanol, etilen glikol monoetil eter, etilen glikol dimetil eter, dimetil formamid in trietilen glikol. Disperzijska sredstva, ki se lahko uporabijo, so Cremaphor RH40, Tween 80, metil celuloza 0,01 % in HCO-40. Koncentracija topila v končnem preskusnem mediju mora biti minimalna (tj. ≤ 0,1 ml/l) in mora biti enaka v vseh posodah s preskusno snovjo. Kadar se uporabi topilo, to ne sme bistveno vplivati na preživetje ličink trzače ali imeti vidnih škodljivih učinkov nanje, kar se pokaže s kontrolno enoto, v kateri je le topilo. Vendar si je treba čim bolj prizadevati, da se taki materiali ne uporabijo. NAČRT PRESKUSA 17. Načrt preskusa se nanaša na izbiro števila preskusnih koncentracij in razmikov med njimi, število posod za vsako koncentracijo in število ličink na posodo. Opisani so načrti za točkovno oceno EC, oceno NOEC in izvedbo mejnega preskusa. Regresijska analiza je primernejša od pristopa s preskušanjem domnev. Načrt preskusa za regresijsko analizo 18. S koncentracijami, vključenimi v preskus, bi morala biti zajeta efektivna koncentracija (npr. EC15, EC50) in razpon koncentracije, v katerem je zanimiv vpliv preskusne snovi. Na splošno se natančnost in zlasti veljavnost, ki ju je mogoče doseči pri ocenah efektivnih koncentracij (ECx), izboljšata, kadar je efektivna koncentracija v okviru preskušanega razpona koncentracij. Izogibati se je treba ekstrapolaciji veliko pod najnižjo pozitivno koncentracijo ali veliko nad najvišjo koncentracijo. Kot pomoč pri izbiri razpona koncentracij, ki bo uporabljen (glej odstavek 27), se lahko izvede predhodni preskus za ugotavljanje razpona. 19. Če je treba oceniti ECx, je treba preskusiti vsaj 5 koncentracij in izvesti 3 ponovitve za vsako koncentracijo. Vsekakor je priporočljivo uporabiti dovolj preskusnih koncentracij, da se omogoči dobra ocena modela. Faktor med koncentracijami ne sme biti večji od 2 (izjema je dopustna, kadar naklon krivulje odmerek-učinek ni strm). Število ponovitev na posamezno posodo s preskusno snovjo se lahko zmanjša, če se poveča število preskusnih koncentracij z različnimi učinki. Povečanje števila ponovitev ali zmanjšanje velikosti razmikov med preskusnimi koncentracijami običajno vodi do ožjih intervalov zaupanja za preskus. Dodatne ponovitve so potrebne, če se ocenjujeta 10-dnevno preživetje in rast ličink. Načrt za oceno NOEC/LOEC 20. Če je treba oceniti LOEC/NOEC, bi bilo treba uporabiti pet preskusnih koncentracij in izvesti vsaj štiri ponovitve, faktor med koncentracijami pa ne sme biti večji od 2. Število ponovitev mora zadostovati, da se zagotovi ustrezna statistična vrednost za ugotovitev 20-odstotne razlike v primerjavi s kontrolno enoto pri 5-odstotni stopnji značilnosti (p = 0,05). Pri hitrosti razvoja je običajno ustrezna analiza variance (ANOVA), kot sta Dunnettov preskus in Williamsov preskus (17) (18) (19) (20). Pri koeficientu preobrazbe se lahko uporabijo Cochran-Armitageev preskus, Fisherjev eksaktni preskus (z Bonferronijevim popravkom) ali Mantel-Haenszelov preskus. Mejni preskus 21. Če v predhodnem preskusu za ugotavljanje razpona ni bilo opaženih učinkov, se lahko opravi mejni preskus (ena preskusna koncentracija in kontrolna enota). Namen mejnega preskusa je pokazati, da je toksična vrednost preskusne snovi večja od preskušene mejne koncentracije. Pri tej preskusni metodi priporočene koncentracije ni mogoče predlagati; to je prepuščeno presoji regulatorjev. Običajno je potrebnih vsaj šest ponovitev za preskusne in kontrolne posode. Izkazati je treba ustrezno statistično vrednost za ugotovitev 20-odstotne razlike v primerjavi s kontrolno enoto pri 5-odstotni stopnji značilnosti (p = 0,05). Kar zadeva učinek na hitrost razvoja in težo, je t-preskus primerna statistična metoda, če podatki izpolnjujejo zahteve tega preskusa (normalnost, homogenost varianc). Če te zahteve niso izpolnjene, se lahko uporabi t-preskus za neenake variance ali neparametrični preskus, kot je Wilcoxon-Mann-Whitneyjev preskus. Pri koeficientu preobrazbe je primeren Fisherjev eksaktni preskus. POSTOPEK Pogoji izpostavljenosti Priprava sistema vode in usedline, v katerem je preskusna snov primešana v vodo 22. V preskusne posode se dodajo ustrezne količine formulirane usedline (glej odstavka 13 in 14 ter Dodatek 3), da nastane plast, debela vsaj 1,5 cm. Doda se voda do globine 6 cm (glej odstavek 15). Razmerje med debelino usedline in globino vode ne sme biti večje od 1 : 4, usedlina pa ne sme biti debelejša od 3 cm. Sistem vode in usedline je treba sedem dni rahlo prezračevati, preden se dodajo preskusni organizmi (glej odstavek 14 in Dodatek 3). Da se prepreči ločevanje sestavin usedline in ponovna suspenzija finega materiala med dodajanjem preskusne vode v vodni stolpec, se lahko usedlina med točenjem vode prekrije s plastičnim pokrovom, ki se takoj nato odstrani. Primerna so lahko tudi druga sredstva. 23. Preskusne posode je treba pokriti (npr. s steklenimi ploščami). Po potrebi se med raziskavo voda dotoči do prvotne količine, da se nadomesti izhlapela voda. Za to je treba uporabiti destilirano ali deionizirano vodo, da se prepreči kopičenje soli. Dodajanje preskusnih organizmov 24. Od 4 do 5 dni pred vnosom preskusnih organizmov v preskusne posode je treba iz gojišč vzeti jajčna legla in jih vstaviti v majhne posode v gojitvenem mediju. Uporabi se lahko starejši medij iz osnovne kulture ali sveže pripravljeni medij. Če se uporabi slednji, je treba v gojitveni medij dodati majhno količino hrane, npr. zelenih alg in/ali nekaj kapljic filtrata suspenzije iz fino mlete ribje hrane v kosmičih (glej Dodatek 2). Uporabiti je treba samo sveže odložena jajčna legla. Običajno se ličinke izležejo nekaj dni po tem, ko so bila jajčeca odložena (2 do 3 dni za Chironomus riparius pri 20 °C ter 1 do 4 dni za Chironomus tentans pri 23 °C in Chironomus yoshimatsui pri 25 °C), rast ličink pa poteka v 4 stadijih, od katerih vsak traja 4 do 8 dni. V preskusu je treba uporabiti ličinke prvega stadija (2 do 3 ali 1 do 4 dni po tem, ko se izležejo). Stadij trzač se lahko po možnosti preveri z merjenjem širine glave (6). 25. 20 ličink prvega stadija se s topo pipeto naključno vnese v vsako preskusno posodo, ki vsebuje usedlino in vodo s primešano preskusno snovjo. Med dodajanjem ličink v preskusne posode je treba ustaviti prezračevanje vode, ki se ne sme izvajati še 24 ur po tem, ko so bile ličinke dodane (glej odstavka 24 in 32). Glede na uporabljeni načrt preskusa (glej odstavka 19 in 20) se za točkovno oceno EC uporabi vsaj 60 ličink na koncentracijo, za določitev NOEC pa 80. 26. 24 ur po vnosu ličink se preskusna snov vmeša v vodni stolpec nad usedlino, znova se zagotovi prezračevanje. Pod površino vodnega stolpca se s pipeto vnesejo majhne količine raztopine preskusne snovi. Vodo nad usedlino je nato treba premešati, pri čemer je treba paziti, da se ne premeša še usedlina. Preskusne koncentracije 27. Preskus za ugotavljanje razpona je lahko koristen za določitev razpona koncentracij za končni preskus. Za ta namen se uporabi niz široko razmaknjenih koncentracij preskusne snovi. Da se zagotovi enaka gostota površine na trzačo, kot bo uporabljena za končni preskus, se trzače izpostavijo vsaki koncentraciji preskusne snovi za obdobje, ki omogoča oceno ustreznih preskusnih koncentracij, pri čemer ponovitve niso potrebne. 28. Preskusne koncentracije za končni preskus se določijo na podlagi rezultata preskusa za ugotavljanje razpona. Izbrati in uporabiti je treba vsaj pet koncentracij, kot je opisano v odstavkih 18 do 20. Kontrolne enote 29. V preskus je treba vključiti kontrolne posode, v katerih ni preskusne snovi, toda ki vsebujejo usedlino, z ustreznim številom ponovitev (glej odstavka 19 in 20). Če je bilo za aplikacijo preskusne snovi uporabljeno topilo (glej odstavek 16), je treba dodati kontrolno posodo, katere usedlina vsebuje tudi topilo. Preskusni sistem 30. Uporabljajo se statični sistemi. Polstatični ali pretočni sistemi z občasnim ali kontinuiranim obnavljanjem vode nad usedlino se lahko uporabijo v izjemnih primerih, na primer če specifikacije kakovosti vode postanejo neprimerne za preskusni organizem ali vplivajo na kemijsko ravnotežje (npr. ravni raztopljenega kisika se preveč znižajo, koncentracija izločkov se preveč poviša ali minerali iztekajo iz usedline in vplivajo na pH in/ali trdoto vode). Vendar za izboljšanje kakovosti vode nad usedlino običajno zadoščajo in se prednostno uporabljajo druge metode, kot je prezračevanje. Hrana 31. Ličinke je treba hraniti, po možnosti vsak dan ali vsaj trikrat na teden. Za mlade ličinke v prvih desetih dneh ustreza 0,25–0,5 mg (0,35–0,5 mg za C. yoshimatsui) ribje hrane (suspenzija v vodi ali fino mleta hrana, npr. TetraMin ali TetraPhyll; glej podrobnosti v Dodatku 2) na ličinko na dan. Nekoliko več hrane bodo morda potrebovale starejše ličinke: za preostanek preskusa mora zadostovati 0,5–1 mg na ličinko na dan. Obrok hrane je treba zmanjšati v vseh preskusnih in kontrolnih posodah, če se opazi rast glivic ali smrtnost v kontrolnih posodah. Če razvoja glivic ni mogoče ustaviti, je treba preskus ponoviti. Kadar se preskušajo snovi, ki se močno adsorbirajo (npr. z log Kow > 5), ali snovi, ki se kovalentno vežejo na usedlino, se lahko količina hrane, potrebna za zagotovitev preživetja in naravne rasti organizmov, doda formulirani usedlini pred obdobjem stabilizacije. Za to je treba namesto ribje hrane uporabiti rastlinski material, npr. dodatek 0,5 % (suhe teže) fino mletih listov npr. velike koprive (Urtica dioica), bele murve (Morus alba), plazeče detelje (Trifolium repens), špinače (Spinacia oleracea) ali drugega rastlinskega materiala (Cerophyl ali alfa celuloza). Pogoji inkubacije 32. Zagotovi se rahlo prezračevanje vode nad usedlino v preskusnih posodah, po možnosti 24 ur po vnosu ličink, in se izvaja ves čas preskusa (paziti je treba, da koncentracija raztopljenega kisika ne pade pod 60 % ASV). Prezračevanje se zagotavlja prek steklene pasteurjeve pipete, pritrjene 2 do 3 cm nad plastjo usedline (tj. 1 ali nekaj mehurčkov/s). Kadar se preskušajo hlapne kemikalije, je mogoče razmisliti o tem, da se sistem vode in usedline ne bi prezračeval. 33. Preskus se izvaja pri konstantni temperaturi 20 °C (± 2 °C). Za C. tentans in C. yoshimatsui sta priporočeni temperaturi 23 °C oziroma 25 °C (± 2 °C). Uporablja se 16-urno obdobje osvetljenosti, jakost svetlobe pa mora biti 500 do 1 000 lux. Trajanje izpostavljenosti 34. Izpostavljenost se začne z vnosom ličink v posode s primešano preskusno snovjo in kontrolne posode. Najdaljši čas izpostavljenosti za C. riparius in C. yoshimatsui je 28 dni, za C. tentans pa 65 dni. Če se ličinke v odrasle osebke preobrazijo prej, se lahko preskus konča najmanj pet dni po preobrazbi zadnjega odraslega osebka v kontrolni posodi. OPAŽANJA Preobrazba 35. Določita se čas razvoja in skupno število v celoti preobraženih samcev in samic trzače. Samce je mogoče preprosto prepoznati po pahljačastih tipalkah. 36. Preskusne posode je treba opazovati vsaj trikrat na teden, da se ugotovi kakršno koli neobičajno obnašanje (npr. zapuščanje usedline, nenavadno plavanje) v primerjavi s kontrolno posodo. V obdobju pričakovane preobrazbe je potrebno dnevno štetje preobraženih trzač. Spol in število v celoti preobraženih trzač se zapišeta dnevno. Po identifikaciji se trzače odstranijo iz posod. Vsa jajčna legla, odložena pred zaključkom preskusa, je treba evidentirati in nato odstraniti, da se prepreči vnovični vnos ličink v usedlino. Evidentira se tudi število vidnih bub, ki se niso preobrazile. Napotek za spremljanje preobrazbe je v Dodatku 5. Rast in preživetje 37. Če je treba zagotoviti podatke o 10-dnevnem preživetju in rasti ličink, je treba na začetku vključiti dodatne preskusne posode, ki se lahko uporabijo pozneje. Usedlina iz teh dodatnih posod se preseje skozi sito z 250 μm velikimi luknjicami, da se zadržijo ličinke. Merili za pogin sta negibnost ali neodzivnost na mehanske dražljaje. Ličinke, ki ostanejo v usedlini, je prav tako treba šteti za mrtve (ličinke, ki so poginile na začetku preskusa, so morda razgradili mikrobi). Določi se suha teža (brez pepela) preživelih ličink na preskusno posodo in izračuna srednja suha teža posamezne ličinke na posodo. Koristno je določiti, v kateri stadij spadajo preživele ličinke; za to se lahko izmeri širina glave vsakega osebka. Analitske meritve Koncentracija preskusne snovi 38. Na začetku (po možnosti 1 uro po vnosu preskusne snovi) in koncu preskusa je treba analizirati vsaj vzorce vode nad usedlino, porne vode in usedline, in sicer pri najvišji in nižji koncentraciji. Te določitve koncentracije preskusne snovi pokažejo obnašanje/porazdelitev preskusne snovi v sistemu vode in usedline. Vzorčenje usedline na začetku preskusa lahko vpliva na preskusni sistem (npr. odstranitev preskusnih ličink), zato je treba za analitske določitve na začetku preskusa in med njim po potrebi uporabiti dodatne preskusne posode (glej odstavek 39). Meritve v usedlini morda ne bodo potrebne, če je bila porazdelitev preskusne snovi med vodo in usedlino jasno določena z raziskavo vode/usedline v primerljivih pogojih (npr. razmerje usedline in vode, vrsta uporabe, vsebnost organskega ogljika v usedlini). 39. Kadar se izvajajo vmesne meritve (npr. sedmi dan) in če so za analize potrebni veliki vzorci, ki jih ni mogoče vzeti iz preskusnih posod, ne da bi to vplivalo na preskusni sistem, je treba analitske določitve izvesti na vzorcih iz dodatnih preskusnih posod, ki se obdelujejo enako (vključno s prisotnostjo preskusnih organizmov), vendar se za biološka opažanja ne uporabljajo. 40. Za izolacijo intersticijske vode se priporoča 30-minutno centrifugiranje pri npr. 10 000 g in 4 °C. Če pa se za preskusno snov izkaže, da se ne adsorbira na filtre, je sprejemljivo tudi filtriranje. V nekaterih primerih morda koncentracij v porni vodi zaradi premajhnega vzorca ne bo mogoče analizirati. Fizikalno-kemijski parametri 41. Vrednost pH, raztopljeni kisik v preskusni vodi in temperaturo preskusnih posod je treba ustrezno meriti (glej odstavek 10). Trdoto in amonij je treba izmeriti v kontrolnih posodah in eni preskusni posodi pri najvišji koncentraciji na začetku in koncu preskusa. PODATKI IN POROČANJE Obdelava rezultatov 42. Namen tega preskusa je določiti učinek preskusne snovi na hitrost razvoja in skupno število v celoti preobraženih samcev in samic trzače oziroma, pri 10-dnevnem preskusu, učinke na preživetje in težo ličink. Če ni znakov o statistično različni občutljivosti spolov, se lahko rezultati za samce in samice za statistične analize združijo. Razlike v občutljivosti med spoloma je mogoče statistično oceniti, na primer s preskusom χ2-r × 2. Po potrebi je treba po 10 dneh določiti preživetje ličink in srednjo suho težo posamezne ličinke na posodo. 43. Če je mogoče, se efektivne koncentracije, izražene kot koncentracije v vodi nad usedlino, izračunajo na podlagi izmerjenih koncentracij na začetku preskusa (glej odstavek 38). 44. Za točkovno oceno EC50 ali druge ECx se lahko statistični podatki po posameznih posodah uporabijo kot dejanske ponovitve. Pri izračunu intervala zaupanja za ECx je treba upoštevati variabilnost med posodami ali pa dokazati, da je ta zanemarljiva. Če se model prilega po metodi najmanjših kvadratov, je treba statistične podatke po posameznih posodah transformirati, da se izboljša homogenost variance. Vendar je treba vrednosti ECx izračunati po tem, ko so bili rezultati transformirani nazaj na prvotno vrednost. 45. Kadar je namen statistične analize določiti NOEC/LOEC s preskušanjem domnev, je treba upoštevati variabilnost med posodami, npr. z vgnezdeno ANOVO. Alternativno se lahko uporabijo robustnejši preskusi (21), kadar so običajne predpostavke ANOVE kršene. Koeficient preobrazbe 46. Koeficient preobrazbe da odgovor ‚vse ali nič‘ in se lahko analizira s Cochran-Armitageevim preskusom, uporabljenim regresivno (step-down), kadar se pričakuje monotono razmerje odmerek-učinek in so ti podatki v skladu s tem pričakovanjem. Če niso, se lahko uporabi Fisherjev eksaktni preskus ali Mantel-Haenszelov preskus z Bonferroni-Holmovimi popravljenimi p-vrednostmi. Če se izkaže, da je variabilnost med ponovitvami v okviru iste koncentracije večja, kot bi kazala binomska porazdelitev (pogosto imenovana ‚ekstra-binomska‘ variacija), potem je treba uporabiti robustni Cochran-Armitageev preskus ali Fisherjev eksaktni preskus, kot je predlagano v (21). 47. Vsota preobraženih trzač na posodo ne se določi in deli s številom vnesenih ličink na: pri čemer je: ER = koeficient preobrazbe, ne = število preobraženih trzač na posodo, na = število vnesenih ličink na posodo. 48. Druga možnost, ki je najprimernejša za velike vzorce, kadar obstaja ekstra binomska varianca, je, da se koeficient preobrazbe obravnava kot zvezni odgovor in se uporabijo postopki, kot je Williamsov preskus, kadar se pričakuje monotono razmerje odmerek-učinek in kadar podatki ER potrjujejo to predpostavko. Dunettov preskus je primeren, kadar monotonost ne drži. Velik vzorec je tu opredeljen kot število preobraženih osebkov in število nepreobraženih osebkov po posameznih ponovitvah (posodah), pri čemer je obojih več kot pet. 49. Za uporabo metod ANOVA je treba vrednosti ER najprej transformirati z arkus sinus-korensko transformacijo ali Freeman-Tukeyevo transformacijo, da se dobi približna normalna porazdelitev in da se variance izenačijo. Cochran-Armitageev preskus, Fisherjev eksaktni preskus (Bonferroni) ali Mantel-Haenszelov preskus se lahko uporabijo, kadar se uporabljajo absolutne pogostosti. Pri arkus sinus-korenski transformaciji se izračuna arkus sinus (sin–1) kvadratnega korena ER. 50. Za koeficiente preobrazbe se vrednosti ECx izračunajo z regresijsko analizo (ali npr. probit (22), logit, Weibull, ustrezno programsko opremo itd.). Če regresijska analiza ni uspešna (npr. kadar sta manj kot dva delna odgovora), se uporabijo druge neparametrične metode, kot sta drseče povprečje ali linearna interpolacija. Hitrost razvoja 51. Srednji čas razvoja pomeni srednji časovni razpon med vnosom ličink (dan 0 preskusa) in preobrazbo poskusne kohorte trzač. (Za izračun dejanskega časa razvoja je treba upoštevati starost ličink ob vnosu.) Hitrost razvoja je obratna času razvoja (enota: 1/dan) in predstavlja tisti delež razvoja ličink, ki se zgodi na dan. Za oceno teh raziskav strupenosti v usedlini je primernejša hitrost razvoja, saj je njena varianca manjša, poleg tega je bolj homogena in bližje normalni porazdelitvi v primerjavi s časom razvoja. Zato so učinkoviti parametrični preskusi primernejši za hitrost razvoja kot za čas razvoja. Če se hitrost razvoja obravnava kot zvezni odgovor, se lahko vrednosti ECx ocenijo z regresijsko analizo (npr. (23) (24)). 52. Za naslednje statistične preskuse se za število trzač, opaženih na dan opazovanja x, domneva, da so se preobrazile na sredini časovnega intervala med dnevom × in dnevom x – 1 (l = dolžina intervala opazovanja, običajno 1 dan). Srednja hitrost razvoja na posodo (x) se izračuna z enačbo: pri čemer je: : srednja hitrost razvoja na posodo, i : indeks intervala opazovanja, m : največje število intervalov opazovanja, : število trzač, preobraženih v intervalu opazovanja i, ne : skupno število preobraženih trzač ob koncu poskusa, (= ) x : hitrost razvoja trzač, preobraženih v intervalu i. pri čemer je: dayi : dan opazovanja (dnevi od vnosa), li : dolžina intervala opazovanja i (dnevi, običajno 1 dan). Poročilo o preskusu 53. V poročilu o preskusu morajo biti vsaj naslednje informacije: Preskusna snov: — fizikalno stanje, in kjer je ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti (vodotopnost, parni tlak, porazdelitveni koeficient v tleh (ali v usedlini, če je na voljo), stabilnost v vodi itd.), — kemijski identifikacijski podatki (splošno ime, kemijsko ime, strukturna formula, številka CAS itd.), vključno s čistostjo in analitsko metodo za količinsko določanje preskusne snovi. Preskusne vrste: — uporabljene preskusne živali: vrsta, znanstveno ime, vir organizmov in pogoji razmnoževanja, — informacije o ravnanju z jajčnimi legli in ličinkami, — starost preskusnih živali ob vnosu v preskusne posode. Preskusni pogoji: — uporabljena usedlina, tj. naravna ali formulirana, — za naravno usedlino lokacija in opis mesta vzorčenja usedline, vključno, če je mogoče, s preteklim onesnaženjem, značilnosti: pH, vsebnost organskega ogljika, razmerje C/N in granulometrija (če je ustrezno), — priprava formulirane usedline: sestavine in značilnosti (vsebnost organskega ogljika, pH, vlaga itd. na začetku preskusa), — priprava preskusne vode (če se uporablja obdelana voda) in značilnosti (koncentracija kisika, pH, prevodnost, trdota itd. na začetku preskusa), — globina usedline in vode nad njo, — količina vode nad usedlino in porne vode; teža mokre usedline s porno vodo in brez nje, — preskusne posode (material in velikost), — način priprave osnovnih raztopin in preskusnih koncentracij, — uporaba preskusne snovi: uporabljene preskusne koncentracije, število ponovitev in uporaba topila, če je bilo uporabljeno, — pogoji inkubacije: temperatura, svetlobni ciklus in jakost svetlobe, prezračevanje (pogostost in jakost), — podrobne informacije o hranjenju, vključno z vrsto hrane, pripravo, količino in načinom. Rezultati: — nazivne preskusne koncentracije, izmerjene preskusne koncentracije in rezultati vseh analiz za določitev koncentracije preskusne snovi v preskusni posodi, — kakovost vode v preskusnih posodah, tj. pH, temperatura, raztopljeni kisik, trdota in amonij, — morebitna nadomestitev izhlapele preskusne vode, — število preobraženih samcev in samic trzače na posodo in na dan, — število ličink, ki se niso preobrazile v trzače, na posodo, — srednja suha teža posamezne ličinke na posodo in po stadijih, če je ustrezno, — delež preobrazbe na ponovitev in preskusno koncentracijo (združeni samci in samice trzače), — srednja hitrost razvoja v celoti preobraženih trzač na ponovitev in stopnjo koncentracije (združeni samci in samice trzače), — ocene strupenih končnih točk, npr. ECx (in s tem povezani intervali zaupanja), NOEC in/ali LOEC, ter statistične metode, uporabljene za njihovo določitev, — obravnava rezultatov, vključno z vsemi vplivi na rezultat preskusa, ki izvirajo iz odstopanj od te preskusne metode. VIRI: (1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Uredila M. Streloke in H. Köpp. Berlin 1995. (2) Fleming, R., idr. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Končno poročilo za Evropsko komisijo. Poročilo št.: EC 3738. Avgust 1994. WRc, Združeno kraljestvo. (3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. Z delavnice WOSTA, ki je potekala na Nizozemskem. (4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. V ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Zvezek 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. (5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. (6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Druga izdaja. EPA 600/R-99/064. Marec 2000. Sprememba prve izdaje iz junija 1994. (7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. (8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. (9) Milani, D., Day, K. E., McLeay, D. J., Kirby, R. S. (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. (10) Sugaya, Y. (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350. (11) Kawai, K. (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47–57. (12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. (13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. (14) Poglavje C.8 te priloge, Strupenost za deževnike. (15) Suedel, B. C., in Rodgers, J. H. (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163–1175. (16) Naylor, C., in Rodrigues, C. (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303. (17) Dunnett, C. W. (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096–1121. (18) Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482–491. (19) Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103–117. (20) Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510–531. (21) Rao, J. N. K., in Scott, A. J. (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577–585. (22) Christensen, E. R. (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213–221. (23) Bruce in Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485–1494. (24) Slob, W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298–312. Dodatek 1 OPREDELITEV POJMOV Za to metodo se uporabljajo naslednje opredelitve pojmov: formulirana usedlina ali rekonstituirana, umetna ali sintetična usedlina je zmes snovi, uporabljenih za posnemanje fizičnih sestavin naravne usedline; voda nad usedlino je voda, ki se nalije nad usedlino v preskusni posodi; intersticijska voda ali porna voda je voda, ki zavzema prostor med delci usedline in zemljine; voda s primešano snovjo je preskusna voda, ki ji je bila dodana preskusna snov; preskusna kemikalija je snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. Dodatek 2 Priporočila za gojenje Chironomus riparius 1. Ličinke Chironomus se lahko gojijo v kristalizirkah ali večjih vsebnikih. Na dno vsebnika se nanese tanka plast finega kremenovega peska (debela približno 5 do 10 mm). Za primeren substrat se je izkazal tudi kieselguhr (npr. Merck, Art 8117) (zadošča tanjša plast, debela samo nekaj mm). Nato se doda primerna voda do globine več cm. Vodo je treba po potrebi dotočiti, da se nadomestijo izgube zaradi izhlapevanja in prepreči izsušitev. Voda se po potrebi lahko zamenja. Zagotoviti je treba rahlo prezračevanje. Posode, v katerih se gojijo ličinke, morajo biti v primerni kletki, ki bo preprečila pobeg odraslih preobraženih osebkov. Kletka mora biti dovolj velika, da lahko preobraženi odrasli osebki rojijo, sicer se lahko zgodi, da ne bo parjenja (najmanjša velikost je približno 30 × 30 × 30 cm). 2. Kletke morajo biti v prostoru s sobno temperaturo ali prostoru s stalnim ozračjem pri 20 ± 2 °C s 16-urnim obdobjem svetlobe (jakost približno 1 000 lux) in 8-urno temo. Po poročilih lahko manj kot 60-odstotna relativna vlažnost zraka ovira razmnoževanje. Voda za redčenje 3. Uporabi se lahko vsaka primerna naravna ali sintetična voda. Običajno se uporabljajo voda iz vodnjaka, deklorirana vodovodna voda in umetni mediji (npr. medij Elendt ‚M4‘ ali ‚M7‘, glej spodaj). Vodo je treba pred uporabo prezračiti. Voda za gojenje se lahko po potrebi obnovi, tako da se uporabljena voda iz gojitvenih posod skrbno pretoči ali izsesa, ne da bi pri tem uničili ovoj ličink. Hranjenje ličink 4. Ličinke Chironomus je treba hraniti s približno 250 mg ribje hrane v kosmičih (TetraMin®, TetraPhyll® ali druga podobna zaščitena znamka ribje hrane) na posodo na dan. Hrana se lahko daje v obliki suhega mletega prahu ali kot suspenzija v vodi: 1,0 g hrane v kosmičih se doda 20 ml vode za redčenje in zmeša, da nastane homogena mešanica. Ta pripravek se lahko daje v količini približno 5 ml na posodo na dan (pred uporabo ga je treba pretresti). Starejše ličinke lahko dobijo več hrane. 5. Hranjenje se prilagaja kakovosti vode. Če gojitveni medij postane ‚moten‘, je treba hranjenje zmanjšati. Dodajanje hrane je treba skrbno spremljati. Premalo hrane bo povzročilo selitev ličink v vodni stolpec, preveč hrane pa povečano mikrobno dejavnost in zmanjšane koncentracije kisika. Oboje lahko privede do počasnejše rasti. 6. Ko se pripravijo nove gojitvene posode, se lahko dodajo tudi celice nekaterih zelenih alg (npr. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris). Hranjenje preobraženih odraslih osebkov 7. Nekateri raziskovalci so predlagali, da se lahko kot hrana za odrasle preobražene osebke uporabi vatna blazinica, namočena v nasičeno raztopino saharoze. Preobrazba 8. Pri 20 ± 2 °C se bo preobrazba v odrasle osebke iz posod za gojenje ličink začela po približno 13 do 15 dneh. Samce je mogoče preprosto prepoznati po pahljačastih tipalkah. Jajčna legla 9. Ko so v kletki za razmnoževanje odrasli osebki, je treba vse posode za gojenje ličink trikrat tedensko preveriti zaradi morebitnih odloženih želatinastih jajčnih legel, ki jih je treba previdno odstraniti. Prenesti jih je treba v majhno posodo, ki vsebuje vzorec vode za razmnoževanje. Jajčna legla se uporabijo za pripravo nove gojitvene posode (npr. 2 do 4 jajčna legla/posodo) ali za preskuse strupenosti. 10. Ličinke prvega stadija bi se morale izleči po 2 ali 3 dneh. Priprava novih gojitvenih posod 11. Ko so gojišča vzpostavljena, bi moralo biti mogoče novo gojitveno posodo za ličinke pripraviti vsak teden ali manj pogosto, odvisno od zahtev preskušanja, stare posode pa odstraniti, ko se ličinke preobrazijo v odrasle osebke. S takim sistemom bo najpreprosteje zagotovljena redna oskrba z odraslimi osebki. Priprava preskusnih raztopin ‚M4‘ in ‚M7‘ 12. Elendt (1990) je opisal medij ‚M4‘. Medij ‚M7‘ se pripravi kot medij ‚M4‘, razen za snovi, navedene v preglednici 1, za katere so koncentracije pri ‚M7‘ štirikrat nižje kot pri ‚M4‘. Publikacija o mediju ‚M7‘ je v pripravi (Elendt, osebno sporočilo). Preskusna raztopina se ne sme pripraviti po Elendt in Bias (1990), saj koncentracije NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 in K2HPO4, navedene za pripravo osnovnih raztopin, niso ustrezne. Priprava medija ‚M7‘ 13. Vsaka osnovna raztopina (I) se pripravi posebej, sestavljena osnovna raztopina (II) pa se pripravi iz teh osnovnih raztopin (I) (glej preglednico 1). V 50 ml sestavljene osnovne raztopine (II), ki ji je dodana količina vsake osnovne raztopine makrohranilnih snovi, navedena v preglednici 2, se dolije do 1 litra deionizirana voda, da se pripravi medij ‚M7‘. Založna raztopina vitaminov se pripravi tako, da se trije vitamini dodajo v deionizirano vodo, kot je navedeno v preglednici 3, 0,1 ml sestavljene osnovne raztopine vitaminov pa se doda končnemu mediju ‚M7‘ malo pred uporabo. (Založna raztopina vitaminov se shranjuje zamrznjena v majhnih alikvotih.) Medij se prezračuje in stabilizira. Preglednica 1 Založne raztopine elementov v sledeh za medija M4 in M7 Založne raztopine (I) Količina (mg) za pripravo 1 litra z deionizirano vodo Za pripravo sestavljene osnovne raztopine (II): zmešajte naslednje količine (ml) osnovnih raztopin (I) in dopolnite do 1 litra z deionizirano vodo Končne koncentracije v preskusnih raztopinah (mg/l) M4 M7 M4 M7 H3BO3 (18) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 MnCl2 · 4 H2O (18) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 LiCl (18) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 RbCl (18) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 SrCl2 · 6 H2O (18) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 NaBr (18) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 Na2MoO4 · 2 H2O (18) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 CuCl2 · 2 H2O (18) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 ZnCl2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 CaCl2 · 6 H2O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na2SeO3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 NH4VO3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 Na2EDTA · 2 H2O (18) (19) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 FeSO4 · 7 H2O (18) (19) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249 Preglednica 2 Založne raztopine makrohranilnih snovi za medija M4 in M7 Količina za pripravo 1 litra z deionizirano vodo (mg) Količina osnovnih raztopin makrohranilnih snovi za pripravo medijev M4 in M7 (ml/l) Končne koncentracije v preskusnih raztopinah M4 in M7 (mg/l) CaCl2 · 2 H2O 293 800 1,0 293,8 MgSO4 · 7 H2O 246 600 0,5 123,3 KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO3 64 800 1,0 64,8 NaSiO3 · 9 H2O 50 000 0,2 10,0 NaNO3 2 740 0,1 0,274 KH2PO4 1 430 0,1 0,143 K2HPO4 1 840 0,1 0,184 Preglednica 3 Založna raztopina vitaminov za medija M4 in M7 Vse tri raztopine vitaminov so združene v eno.

Količina za pripravo 1 litra z deionizirano vodo (mg) Količina dodane osnovne raztopine vitaminov za pripravo medijev M4 in M7 (ml/l) Končne koncentracije v preskusnih raztopinah M4 in M7 (mg/l) Tiamin hidroklorid 750 0,1 0,075 Cianokobalamin (B12) 10 0,1 0,0010 Biotin 7,5 0,1 0,00075 VIRI: BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Uredila M. Streloke in H. Köpp. Berlin 1995. Elendt, B. P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25–33. Elendt, B. P., in Bias, W.-R. (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157–1167. Dodatek 3 PRIPRAVA FORMULIRANE USEDLINE Sestava usedline Sestava formulirane usedline mora biti naslednja: Sestavina Značilnosti Delež suhe teže usedline v % Šota Šotni mah, čim bližje pH 5,5 do 6,0, brez vidnih ostankov rastlin, fino mlet (velikost delcev ≤ 1 mm) in sušen na zraku. 4–5 Kremenov pesek Velikost zrn: > 50 % delcev mora biti velikih 50–200 μm. 75–76 Kaolinska glina Vsebnost kaolinita ≥ 30 %. 20 Organski ogljik Uravnava se z dodatkom šote in peska. 2 (± 0,5) Kalcijev karbonat CaCO3, zdrobljen v prah, kemijsko čist. 0,05–0,1 Voda Prevodnost ≤ 10 μS/cm. 30–50 Priprava Šota se posuši na zraku in zmelje v fin prah. Pripravi se suspenzija potrebne količine šote v prahu v deionizirani vodi, za kar se uporabi visoko zmogljiva naprava za homogenizacijo. pH te suspenzije se s CaCO3 uravna na 5,5 ± 0,5. Suspenzija se vsaj 2 dneva kondicionira z rahlim mešanjem pri 20 ± 2 °C, da se stabilizira pH in vzpostavi stabilna mikrobna komponenta. Vrednost pH se znova izmeri in mora biti 6,0 ± 0,5. Šotna suspenzija se nato zmeša z drugimi sestavinami (peskom in kaolinsko glino) in deionizirano vodo, da nastane homogena usedlina z vsebnostjo vode v razponu 30 do 50 % suhe teže usedline. pH končne mešanice se znova izmeri in po potrebi uravna na 6,5 do 7,5 s CaCO3. Vzamejo se vzorci usedline, da se določita suha teža in vsebnost organskega ogljika. Priporoča se, da se formulirana usedlina pred uporabo v preskusu strupenosti s trzačami 7 dni kondicionira v enakih pogojih, kakršni vladajo v poznejšem preskusu. Shranjevanje Suhe sestavine za pripravo umetne usedline se lahko shranjujejo v suhem in hladnem prostoru pri sobni temperaturi. Formulirana (mokra) usedlina se pred uporabo v preskusu ne sme shranjevati. Uporabiti jo je treba takoj po 7-dnevnem obdobju kondicioniranja, s katerim se njena priprava konča. VIRI: Poglavje C.8 te priloge. Strupenost za deževnike. Meller, M., Egeler, P., Rombke, J., Schallnass, H., Nagel, R., Streit, B. (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10–20. Dodatek 4 Kemijske lastnosti sprejemljive vode za redčenje Snov Koncentracije Delci < 20 mg/l Celotni organski ogljik < 2 mg/l Neionizirani amoniak < 1 μg /l Trdota kot CaCO3 < 400 mg/l (20) Ostanek klora < 10 μg /l Skupni organofosforni pesticidi < 50 ng/1 Skupni organoklorni pesticidi in poliklorirani bifenili < 50 ng/1 Skupni organski klor < 25 ng/1 Dodatek 5 Napotek za spremljanje preobrazbe ličink trzače Na preskusne čaše se namestijo lovilniki za preobražene osebke. Potrebni so od 20. dne do konca preskusa. Primer lovilnika je narisan spodaj: A : najlonska mrežica B : obrnjen plastični lonček C : poskusna čaša brez ustja D : mrežasti okenci za izmenjavo vode E : voda F : usedlina C.29. DOBRA BIORAZGRADLJIVOST – CO2 V ZAPRTIH POSODAH (PRESKUS NADPROSTORA) UVOD 1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 310 (2006). Je presejalna metoda za ocenjevanje dobre biološke razgradljivosti kemikalij in daje podobne informacije kot šest preskusnih metod, opisanih v poglavju C.4, A–F, te priloge. Zato se lahko kemikalija, pri kateri so rezultati te preskusne metode pozitivni, šteje za dobro biološko razgradljivo in zato hitro razgradljivo v okolju. 2. Uveljavljena metoda z ogljikovim dioksidom (CO2) (1), ki temelji na izvirnem Sturmovem preskusu (2) za ocenjevanje biološke razgradljivosti organskih kemikalij z merjenjem ogljikovega dioksida, ki je nastal zaradi mikrobne dejavnosti, je običajno prva izbira za preskušanje slabo topnih in močno adsorptivnih kemikalij. Izbere se tudi za topne (vendar ne hlapne) kemikalije, ker številni menijo, da je nastajanje ogljikovega dioksida edini nedvoumni dokaz mikrobne dejavnosti. Raztopljeni organski ogljik se lahko odstrani s fizikalno-kemijskimi procesi (adsorpcija, izhlapevanje, obarjanje, hidroliza) in mikrobno dejavnostjo, pri številnih nebioloških reakcijah pa se porablja kisik; CO2 redko nastane abiotsko iz organskih kemikalij. Pri izvirnem in prilagojenem Sturmovem preskusu (1) (2) se CO2 odstrani iz tekoče faze v posode za absorpcijo s prepihovanjem (tj. uvajanjem mehurčkov obdelanega zraka za odstranitev CO2 prek tekočega medija), pri Larsonovi različici (3) (4) pa se CO2 prenese iz reakcijske posode v absorberje s spuščanjem zraka brez CO2 skozi nadprostor in dodatno z nenehnim stresanjem preskusne posode. Reaktorska posoda se stresa samo pri prilagojeni Larsonovi različici; v ISO 9439 (5) in izvirni ameriški različici (6), ki oba določata prepihovanje in ne zamenjave v nadprostoru, je mešanje predpisano samo za netopne snovi. Pri drugi uradni metodi Agencije za varstvo okolja Združenih držav (US EPA) (7), ki temelji na Gledhillovi metodi (8), je reakcijska posoda, ki se stresa, zaprta za ozračje, nastali CO2 pa se zbira v notranjem alkalnem lovilniku neposredno iz plinske faze kot pri klasičnih Warburgovih/Barcroftovih respirometrih. 3. Toda pokazalo se je, da se pri uporabi standardnega prilagojenega Sturmovega preskusa pri številnih kemikalijah (9) v mediju nabira anorganski ogljik (IC). Pri razgradnji 20 mg C/l anilina je bila ugotovljena koncentracija IC kar 8 mg/l. Zato zbiranje CO2 v alkalnih lovilnikih ni pravilno pokazalo količine mikrobiološko nastalega CO2 pri vmesnih časih med razgradnjo. Zato pogoja, da je treba za uvrstitev preskusne kemikalije med dobro biološko razgradljive v ‚10-dnevnem obdobju‘ (10 dneh, ki neposredno sledijo dosegu 10-odstotne biološke razgradljivosti) nabrati > 60 % teoretično največje količine nastalega CO2 (ThCO2), ne izpolnjujejo nekatere kemikalije, ki bi se med dobro biološko razgradljive uvrstile ob odstranjevanju raztopljenega organskega ogljika (DOC). 4. Kadar je delež razgradnje manjši, kot je bilo pričakovano, se v preskusni raztopini morda nabira IC. V takem primeru se lahko razgradljivost oceni z drugimi preskusi dobre biološke razgradljivosti. 5. Zaradi drugih pomanjkljivosti Sturmove metodologije (okornost, dolgotrajnost, nagnjenost k eksperimentalnim napakam in neuporabnost za hlapne kemikalije) se je že prej poleg Gledhillove metode iskala tehnika z zaprtimi posodami, in ne s pretokom plina. Boatman idr. (12) so pregledali prejšnje metode in uporabili zaprt sistem z nadprostorom, pri čemer je bil CO2 sproščen v nadprostor ob koncu inkubacije z zakisanjem medija. CO2 se je meril z analizo s plinsko kromatografijo (GC)/IC v samodejno odvzetih vzorcih iz nadprostora, a se pri tem ni upošteval raztopljeni anorganski ogljik (DIC) v tekoči fazi. Poleg tega so bile uporabljene posode zelo majhne (20 ml) in so vsebovale samo 10 ml medija, kar je povzročalo težave, npr. pri dodajanju nujno zelo majhnih količin netopnih preskusnih kemikalij in/ali pa v inokuliranem mediju ni bilo (dovolj) mikroorganizmov, ki so sposobni razgraditi preskusne kemikalije. 6. Te težave so v neodvisnih raziskavah premagali Struijs in Stoltenkamp (13) ter Birch in Fletcher (14), pri čemer so slednja navdihnile njune izkušnje z napravo, ki se uporablja pri preskusu anaerobne biološke razgradnje (15). Pri prvi metodi (13) se CO2 meri v nadprostoru po zakisanju in uravnoteženju, pri drugi (14) pa je bil DIC izmerjen v plinski in tekoči fazi, brez obdelave; več kot 90 % nastalega IC je bilo v tekoči fazi. Obe metodi imata prednosti pred