SL Uradni list Evropske unije L 220/1

UREDBA KOMISIJE (ES) št. 761/2009

z dne 23. julija 2009

o spremembi Uredbe (ES) št. 440/2008 o določitvi testnih metod v skladu z Uredbo (ES) št. 1907/2006 Evropskega parlamenta in Sveta o registraciji, evalvaciji, avtorizaciji in omejevanju kemikalij (REACH) zaradi njene prilagoditve tehničnemu napredku

(Besedilo velja za EGP)

KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE –

ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske skupnosti,

ob upoštevanju Uredbe (ES) št. 1907/2006 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 18. decembra 2006 o registraciji, evalvaciji, avtorizaciji in omejevanju kemikalij (REACH) ter o ustanovitvi Evropske agencije za kemikalije in o spremembi Direktive 1999/45/ES ter o razveljavitvi Uredbe Sveta (EGS) št. 793/93 in Uredbe Komisije (ES) št. 1488/94 ter Direktive Sveta 76/769/EGS in direktiv Komisije 91/155/EGS, 93/67/EGS, 93/105/ES in 2000/21/ES (1), ter zlasti člena 13(3) Uredbe,

ob upoštevanju naslednjega:

(1) Uredba Komisije (ES) št. 440/2008 (2) vsebuje testne metode za ugotavljanje fizikalno-kemijskih lastnosti, toksičnosti in ekotoksičnosti snovi, ki jih je treba uporabiti za namene Uredbe (ES) št. 1907/2006.

(2) Uredbo (ES) št. 440/2008 je treba posodobiti, tako da se spremenijo nekatere testne metode in vključi več novih testnih metod, ki jih je sprejela OECD. Posvetovanja o tem predlogu z zainteresiranimi stranmi so bila opravljena. Navedene spremembe prilagajajo zadevne metode znanstvenemu in tehničnemu napredku.

(3) Spremeniti je treba določbe o parnem tlaku, da bi se vključila nova efuzijska metoda.

(4) Dodati je treba novo metodo merjenja dolžinsko tehtanega geometričnega povprečnega premera vlaken.

(5) Primerno je posodobiti Uredbo (ES) št. 440/2008, tako da se prednostno vključi nova testna metoda dražilnosti kože in vitro in se število živali, uporabljenih za testne namene, zmanjša v skladu z Direktivo Sveta 86/609/EGS z dne 24. novembra 1986 o približevanju zakonov in drugih predpisov držav članic o varstvu živali, ki se uporabljajo za poskusne in druge znanstvene namene (3). Čeprav v OECD razprave o osnutku testne metode in vitro za draženje kože še niso končane, je metodo B 46 v tem izjemnem primeru primerno vključiti v to uredbo. Metodo B 46 je treba posodobiti takoj, ko bo v OECD dosežen dogovor ali ko bodo na voljo dodatne informacije, ki upravičujejo takšno posodobitev.

(6) Spremeniti je treba določbe o preskusu zaviranja rasti alg, da bi se vključile dodatne vrste in izpolnile zahteve glede ocene nevarnosti in razvrstitve kemikalij.

(7) Dodati je treba novo metodo merjenja aerobne mineralizacije v površinskih vodah na podlagi simulacijskega preskusa biorazgradnje in novo metodo ocenjevanja toksičnosti za rod Lemna na podlagi preskusa zaviranja rasti.

(8) Uredbo (ES) št. 440/2008 je zato treba ustrezno spremeniti.

(9) Ukrepi, predvideni s to uredbo, so v skladu z mnenjem odbora, ustanovljenega v skladu s členom 133 Uredbe (ES) št. 1907/2006 –

SPREJELA NASLEDNJO UREDBO:

Člen 1

Priloga k Uredbi (ES) št. 440/2008 se spremeni:

1. del A se spremeni: (a) poglavje A.4 se nadomesti s poglavjem A.4, kot je določeno v Prilogi I k tej uredbi; (b) doda se poglavje A.22, kot je določeno v Prilogi II k tej uredbi;

2. del B se spremeni: doda se poglavje B.46, kot je določeno v Prilogi III k tej uredbi;

3. del C se spremeni: (a) poglavje C.3 se nadomesti s poglavjem C.3, kot je določeno v Prilogi IV k tej uredbi; (b) dodata se poglavji C.25 in C.26, kot sta določeni v prilogah V in VI k tej uredbi.

Člen 2

Ta uredba začne veljati tretji dan po objavi v Uradnem listu Evropske unije.

Ta uredba je v celoti zavezujoča in se neposredno uporablja v vseh državah članicah. V Bruslju, 23. julija 2009 Za Komisijo Stavros DIMAS Član Komisije

(1) UL L 396, 30.12.2006, str. 1.

(2) UL L 142, 31.5.2008, str. 1.

(3) UL L 358, 18.12.1986, str. 1.

Priloga I A.4. PARNI TLAK 1. METODA Ta metoda je enakovredna OECD TG 104 (2004). 1.1 UVOD Ta revidirana različica metode A.4(1) dodatno vključuje efuzijsko metodo: izotermično termogravimetrijo, namenjeno za snovi z zelo nizkimi tlaki (do 10–10 Pa). Odvisno od zahtev postopka, zlasti pri določanju parnega tlaka snovi z nizkim parnim tlakom, se ponovno ocenijo še drugi postopki za uporabo te metode glede na druga območja uporabe. V termodinamičnem ravnotežju je parni tlak čiste snovi odvisen samo od temperature. Temeljna načela so opisana drugje (2)(3). Ni enega samega merilnega postopka, ki bi bil uporaben za celotno območje parnih tlakov od manj kot 10–10 do 105 Pa. Ta metoda vključuje osem metod za merjenje parnega tlaka, ki jih je mogoče uporabiti za različna območja parnih tlakov. Različne metode se primerjajo glede na uporabnost in merilno območje iz tabele 1. Metode se lahko uporabljajo samo za snovi, ki v pogojih preskusa ne razpadejo. Kadar preskusnih metod zaradi tehničnih razlogov ni mogoče uporabiti, se parni tlak lahko tudi oceni, priporočena ocenjevalna metoda je navedena v Dodatku. 1.2 OPREDELITVE IN ENOTE Parni tlak snovi je opredeljen kot tlak nasičene pare nad trdno ali tekočo snovjo. Za tlak je treba uporabljati enoto SI, tj. pascal (Pa). V preteklosti uporabljane enote, skupaj s pretvorbnimi faktorji, so navedene spodaj: 1 torr = 1 mm Hg = 1,333 × 102 Pa 1 atmosfera = 1,013 × 105 Pa 1 bar = 105 Pa Enota SI za temperaturo je kelvin (K). Za pretvorbo stopinj Celzija v kelvine se uporablja naslednja formula: T = t + 273,15 pri čemer je T temperatura v kelvinih ali termodinamična temperatura, t pa temperatura v stopinjah Celzija. Tabela 1 Merilna metoda Snovi Ocena ponovljivosti Ocena obnovljivosti Priporočeno območje v trdnem stanju v tekočem stanju Dinamična metoda nizko tališče Da do 25 % 1 do 5 % do 25 % 1 do 5 % 103 Pa do 2 × 103 Pa 2 × 103 Pa do 105 Pa Statična metoda Da Da 5 do 10 % 5 do 10 % 10 Pa do 105 Pa 10–2 Pa do 105 Pa (1) Izoteniskopska metoda Da Da 5 do 10 % 5 do 10 % 102 Pa do 105 Pa Efuzijska metoda: parnotlačna tehtnica Da Da 5 do 20 % do 50 % 10–3 do 1 Pa Efuzijska metoda: Knudsenova celica Da Da 10 do 30 % — 10–10 do 1 Pa Efuzijska metoda: izotermična termogravimetrija Da Da 5 do 30 % do 50 % 10–10 do 1 Pa Metoda nasičenega plina Da Da 10 do 30 % do 50 % 10–10 do 103 Pa Metoda z rotorjem Da Da 10 do 20 % — 10–4 do 0,5 Pa 1.3 PRINCIP PRESKUSA V splošnem se parni tlak določa pri različnih temperaturah. V omejenem temperaturnem območju je logaritem parnega tlaka čiste snovi linearna funkcija obratne vrednosti termodinamične temperature v skladu s poenostavljeno Clausius-Clapeyronovo enačbo: pri čemer je: p = parni tlak snovi v pascalih ΔHv = izparilna toplota v J mol–1 R = splošna plinska konstanta, 8,314 J mol–1 K–1 T = termodinamična temperatura v K 1.4 REFERENČNE SNOVI Referenčnih snovi ni treba uporabljati. Služijo predvsem za občasno preverjanje učinkovitosti metode, pa tudi za omogočanje primerjave med rezultati različnih metod. 1.5 OPIS METODE 1.5.1 Dinamična metoda (Cottrellova metoda) 1.5.1.1 Princip Parni tlak se določi z merjenjem vrelišča snovi pri različnih točno določenih tlakih med približno 103 in 105 Pa. Ta metoda se priporoča tudi za določitev vrelišča. Za ta namen je uporabna do 600 K. Vrelišča tekočin so na globini 3 do 4 cm zaradi hidrostatičnega tlaka tekočine približno 0,1 °C višja kot na površini. Pri Cottrellovi metodi (4) se termometer namesti v paro nad površino tekočine, vrela tekočina pa se neprestano črpa prek bučke termometra. Bučko prekriva tanka plast tekočine, ki je v ravnotežju s paro pri atmosferskem tlaku. Termometer zato kaže pravo vrelišče, brez napak zaradi prevelikega segrevanja ali hidrostatičnega tlaka. Črpalka, ki jo je prvič uporabil Cottrell, je prikazana na sliki 1. Vrela tekočina je v cevki A. Platinasta žica B, ki je zatesnjena v dno, spodbuja enakomerno vrenje. Stranska cevka C je napeljana v kondenzator, obloga D pa mrzlemu kondenzu preprečuje stik s termometrom E. Ko tekočina v A vre, se mehurčki in tekočina, ki se ujamejo v liju, preko dveh ročic črpalke F razlijejo čez bučko termometra. Slika 1 Slika 2 Cottrellova črpalka (4) A: Termočlen B: Vakuumski pufrski volumen C: Merilnik tlaka D: Vakuum E: Merilna točka F: Grelni element, približno 150 W 1.5.1.2 Aparatura Zelo natančna aparatura, ki uporablja Cottrellov princip, je prikazana na sliki 2. Sestavljena je iz cevke z vrelnim delom v spodnjem delu, hladilnikom v srednjem delu in odtočno cevko ter prirobnico v zgornjem delu. Cottrellova črpalka se namesti v vrelni del, ki se segreva z električnim kartušnim grelnikom. Temperatura se meri s termočlenom v plašču ali uporovnim termometrom, ki se vstavi skozi prirobnico na vrhu. Izhod se poveže s sistemom za urejanje tlaka. Ta je sestavljen iz vakuumske črpalke, pufrskega volumna, manostata za spuščanje dušika za urejanje tlaka in manometra. 1.5.1.3 Postopek Snov se namesti v vrelni del. Pri neuprašenih trdnih snoveh lahko nastanejo težave, ki pa se včasih lahko odpravijo s segrevanjem hladilnega plašča. Aparatura se zatesni pri robnici in snov razplini. Penečih snovi ni mogoče meriti s to metodo. Nato se nastavi najnižji želeni tlak ter vključi gretje. Hkrati se senzor temperature poveže z zapisovalnikom. Ravnotežje je doseženo, ko se pri konstantnem tlaku zabeleži konstantno vrelišče. Preprečiti je treba zlasti sunkovito udarjanje med vrenjem. Poleg tega se mora kondenzacija v hladilniku popolnoma končati. Kadar se določa parni tlak trdnih snovi z nizkim tališčem, je treba paziti, da se hladilnik ne zamaši. Potem ko se zabeleži točka ravnotežja, se nastavi višji tlak. Postopek se nadaljuje na enak način, dokler ni dosežen tlak 105 Pa (skupaj približno 5 do 10 merilnih točk). Za potrditev je treba ponoviti točke ravnotežja pri padajočih tlakih. 1.5.2 Statična metoda 1.5.2.1 Princip Pri statični metodi (5) se parni tlak pri termodinamičnem ravnotežju določi pri navedeni temperaturi. Ta metoda je primerna za snovi ter večkomponentne tekočine in trdne snovi v območju od 10–1 do 105 Pa in, ob zadostni pazljivosti, tudi v območju 1 do 10 Pa. 1.5.2.2 Aparatura Oprema je sestavljena iz kopeli s konstantno temperaturo (z natančnostjo ±0,2 K), posode za vzorec, povezane z vakuumsko cevjo, manometra in sistema za urejanje tlaka. Komora za vzorec (slika 3a) je povezana z vakuumsko cevjo preko ventila in diferencialnega manometra (U-cevke, ki vsebuje ustrezno manometrsko tekočino), ki služi kot ničelni indikator. Za uporabo v diferencialnem manometru so primerni živo srebro, silikoni in ftalati, odvisno od območja tlaka in kemijskih lastnosti preskusne snovi. Zaradi varovanja okolja pa se je treba uporabi živega srebra izogibati, če je to mogoče. Preskusna snov se ne sme vidno topiti v tekočini v U-cevki ali z njo reagirati. Namesto U-cevke se lahko uporabi merilnik tlaka (slika 3b). Za manometer se lahko uporabijo živo srebro za območje od normalnega zračnega tlaka do 102 Pa ter silikonska olja in ftalati pri območju pod 102 Pa do 10 Pa. Obstajajo tudi drugi merilniki tlaka, ki se lahko uporabljajo pod 102 Pa, membranski manometri, ki se lahko segrevajo, pa se lahko uporabljajo tudi pod 10–1 Pa. Temperatura se meri ob zunanji steni posode z vzorcem ali v sami posodi. 1.5.2.3 Postopek S pomočjo aparature, kakor je prikazana na sliki 3a, se U-cevka napolni z izbrano tekočino, ki jo je treba pred odčitavanjem razpliniti pri zvišani temperaturi. V aparaturo se da preskusna snov in razplini pri znižani temperaturi. Pri večkomponentnih vzorcih mora biti temperatura dovolj nizka, da se sestava snovi zagotovo ne spremeni. Vzpostavljanje ravnotežja je mogoče pospešiti z mešanjem. Vzorec se lahko ohladi s tekočim dušikom ali suhim ledom, paziti pa je treba, da zrak ali tekočina v črpalki ne kondenzira. Ob odprtem ventilu nad vzorčno posodo se nekaj minut izsesava zrak. Postopek razplinjevanja se po potrebi večkrat ponovi. Slika 3a Slika 3b Ko se vzorec segreva in je ventil zaprt, parni tlak narašča. To spremeni ravnotežje tekočine v U-cevki. Za izravnavo tega učinka se v aparaturo spusti dušik ali zrak, dokler ni indikator tlaka spet na ničli. Tlak, potreben za to, se lahko odčita z manometra ali zelo preciznega instrumenta. Ta tlak ustreza parnemu tlaku snovi pri tej merilni temperaturi. Pri uporabi aparature, prikazane na sliki 3b, se parni tlak odčita neposredno. Parni tlak se določi pri ustrezno majhnih temperaturnih intervalih (skupaj približno 5 do 10 merilnih točk) do želenega maksimuma. Za preveritev je treba meritve ponoviti pri nizkih temperaturah. Če vrednosti, dobljene pri ponovljenih meritvah, ne sovpadajo z dobljeno krivuljo za naraščajočo temperaturo, je to lahko posledica enega od naslednjih vzrokov: (i) v vzorcu je še vedno zrak (npr. snovi z veliko viskoznostjo) ali snovi z nizkim vreliščem, ki se sprosti(-jo) med segrevanjem; (ii) v proučevanem temperaturnem območju snov kemično reagira (npr. razpada, polimerizira). 1.5.3 Metoda izoteniskopa 1.5.3.1 Princip Izoteniskop (6) temelji na principu statične metode. Ta metoda zajema namestitev vzorca v bučko, v kateri se ohranja konstantna temperatura in ki je povezana z manometrom ter vakuumsko črpalko. Nečistoče, ki so bolj hlapne kot snov, se odstranijo z razplinjevanjem pri znižanem tlaku. Parni tlak vzorca pri izbranih temperaturah se uravnava z znanim tlakom inertnega plina. Izoteniskop je bil razvit za merjenje parnega tlaka določenih tekočih ogljikovodikov, vendar ga je mogoče uporabiti tudi za proučevanje trdnih snovi. Ta metoda običajno ni primerna za večkomponentne sisteme. Pri vzorcih, ki vsebujejo nehlapne nečistoče, lahko rezultati vsebujejo majhne napake. Priporočeno območje je od 102 do 105 Pa. 1.5.3.2 Aparatura Primer merilne naprave je prikazan na sliki 4. Popoln opis je mogoče najti v ASTM D 2879–86 (6). 1.5.3.3 Postopek Pri tekočinah se sama snov uporabi kot tekočina v diferencialnem manometru. V izoteniskop se vlije zadostna količina tekočine, da se napolnita bučka in krajši krak manometrskega dela. Izoteniskop se pritrdi na vakuumski sistem in odzrači, nato pa napolni z dušikom. Odzračevanje in splakovanje sistema se dvakrat ponovi, da se odstrani ves kisik. Napolnjen izoteniskop se postavi v vodoraven položaj, tako da se vzorec razlije v tanko plast v vzorčni bučki in manometrskem delu. Tlak v sistemu se zmanjša na 133 Pa in vzorec se počasi segreva, dokler ravno ne začne vreti (odstranitev raztopljenih plinov). Izoteniskop se nato postavi tako, da se vzorec vrne v bučko in krajši krak manometra ter se oba popolnoma napolnita s tekočino. Vzdržuje se tlak 133 Pa. Podaljšana konica bučke z vzorcem se segreva nad majhnim plamenom, dokler se sproščene pare vzorca toliko ne razširijo, da izpodrinejo del vzorca iz zgornjega dela bučke in kraka manometra, ga potisnejo v manometrski del izoteniskopa, in tako ustvarijo s parami nasičen prostor brez dušika. Izoteniskop se nato postavi v kopel s konstantno temperaturo, tlak dušika pa se naravna tako, da je enak tlaku vzorca. Ob ravnotežju je parni tlak dušika enak parnemu tlaku snovi. Slika 4 Pri trdnih snoveh se odvisno od območja tlaka in temperature uporabljajo manometrske tekočine, kot so silikonske tekočine ali ftalati. Izboklina na daljšem kraku izoteniskopa se napolni z razplinjeno manometrsko tekočino. Potem se preskusna trdna snov da v bučko in razplini pri zvišani temperaturi. Nato se izoteniskop nagne tako, da manometrska tekočina steče v U-cevko. 1.5.4 Efuzijska metoda: parnotlačna tehtnica (7) 1.5.4.1 Princip Vzorec preskusne snovi se segreje v majhni peči in namesti v odzračen stekleni zvon. Peč se pokrije s pokrovom, na katerem so majhne luknje z znanimi premeri. Para snovi, ki uhaja skozi eno izmed lukenj, se usmeri v skodelico zelo natančne tehtnice, ki je tudi zaprta v odzračenem steklenem zvonu. Pri nekaterih različicah je skodelica tehtnice obdana s hladilno posodo, ki zagotavlja odvajanje toplote navzven s termično prevodnostjo, in se ohlaja s sevanjem, zato da uhajajoča para kondenzira na njej. Moment curka pare deluje kot sila na tehtnico. Tlak pare je mogoče izpeljati na dva načina: neposredno od sile na skodelico tehtnice, pa tudi iz hitrosti izparevanja s pomočjo Hertz-Knudsenove enačbe (2): pri čemer je: G = hitrost izhlapevanja (kg s–1 m–2) M = molska masa (g mol–1) T = temperatura (K) R = splošna plinska konstanta (J mol–1 K–1) p = parni tlak (Pa) Priporočeno območje je od 10–3 do 1 Pa. 1.5.4.2 Aparatura Glavni princip aparature je prikazan na sliki 5. Slika 5 A: Osnovna plošča F: Hladilna posoda in hladilna palica B: Inštrument z vrtljivo tuljavo G: Uparjalna peč C: Stekleni zvon H: Dewarjeva posoda s tekočim dušikom D: Tehtnica s skodelico I: Merjenje temperature vzorca E: Naprava za merjenje vakuuma J: Preskusna snov 1.5.5 Efuzijska metoda: Knudsenova celica 1.5.5.1 Princip Ta metoda temelji na oceni mase preskusne snovi, ki v obliki pare zapusti Knudsenovo celico (8) v časovni enoti skozi mikroodprtino v pogojih ultra visokega vakuuma. Masa izhajajoče pare se lahko ugotovi tako, da se bodisi določi izguba mase celice bodisi kondenzira para pri nizki temperaturi in določi količina izhlapele snovi s kromatografsko analizo. Parni tlak se izračuna z uporabo Hertz-Knudsenovega razmerja (glej točko 1.5.4.1) s korekcijskimi faktorji, ki so odvisni od parametrov aparature (9). Priporočeno območje je 10–10 to 1 Pa (10)(11)(12)(13)(14). 1.5.5.2 Aparatura Glavni princip aparature je prikazan na sliki 6. Slika 6 1: Povezava z vakuumom 7: Navojni pokrov 2: Luknje v platinskem uporovnem termometru ali sistemi za merjenje in nadzorovanje temperature 8: Krilne matice 3: Pokrov vakuumske posode 9: Vijaki 4: O-tesnilo 10: Efuzijske celice iz nerjavečega jekla 5: Aluminijasta vakuumska posoda 11: Grelni vložki 6: Naprava za pritrjevanje in odstranjevanje efuzijskih celic 1.5.6 Efuzijska metoda: izotermična termogravimetrija 1.5.6.1 Princip Ta metoda temelji na določitvi pospešenih hitrosti izhlapevanja preskusne snovi pri povišanih temperaturah in zračnem tlaku s postopkom termogravimetrije (10)(15)(16)(17)(18)(19)(20). Hitrosti izhlapevanja vT nastanejo pri izpostavljanju izbrane snovi počasi tekoči atmosferi inertnega plina in spremljanju izgube teže pri opredeljenih izotermičnih temperaturah T v kelvinih v ustreznih časovnih obdobjih. Parni tlaki pT se izračunajo iz vrednosti vT na podlagi linearnega razmerja med logaritmom parnega tlaka in logaritmom hitrosti izhlapevanja. Po potrebi se izvede ekstrapolacija na temperaturi 20 in 25 °C s pomočjo regresijske analize log pT v odvisnosti od 1/T. Ta metoda je primerna za snovi s parnimi tlaki do 10–10 Pa (10–12 mbar) in s čistostjo, ki je kar najbližje 100 %, da ne pride do napačne razlage izmerjenih izgub teže. 1.5.6.2 Aparatura Glavni princip postavitve preskusa je prikazan na sliki 7. Slika 7 Mimo nosilne plošče z vzorcem, obešene na mikrotehtnici v komori s stalno temperaturo, je speljan tok suhega dušikovega plina, ki odnaša uparjene molekule preskusne snovi. Ko plinski tok zapusti komoro, se očisti v napravi za sorpcijo. 1.5.6.3 Postopek Preskusna snov se nanese na površino hrapave steklene plošče v enakomerni plasti. Pri trdnih snoveh se plošča enakomerno zmoči z raztopino snovi v ustreznem topilu in posuši v inertni atmosferi. Za izvedbo meritev se prevlečena plošča obesi v termogravimetrični analizator, nato pa se izguba teže neprekinjeno meri kot funkcija časa. Hitrost izparevanja vT pri dani temperaturi se izračuna iz zmanjšanja mase Δm plošče z vzorcem s pomočjo naslednje enačbe: kjer je F površina prevlečenih preskusnih snovi, običajno površina plošče z vzorcem, t pa je čas, v katerem se je masa zmanjšala za Δm. Parni tlak pT se izračuna na podlagi njegove funkcije hitrosti izparevanja vT: Log pT = C + D log vT kjer sta C in D konstanti, specifični za uporabljeno preskusno postavitev in odvisni od premera merilne komore ter hitrosti pretoka plina. Ti konstanti se določita enkrat, in sicer z merjenjem nabora snovi z znanimi parnimi tlaki in regresijo log pT v odvisnosti od log vT (11)(21)(22). Razmerje med parnim tlakom pT in temperaturo T v kelvinih je podano z Log pT = A + B 1/T kjer sta A in B konstanti, pridobljeni z regresijo log pT v odvisnosti od 1/T. S to enačbo je mogoče z interpolacijo izračunati parni tlak za katero koli drugo temperaturo. 1.5.7 Metoda z nasičenjem plina (23) 1.5.7.1 Princip Inertni plin se pri sobni temperaturi in pri znanem pretoku spelje skozi oziroma čez vzorec preskusne snovi, in sicer dovolj počasi, da se zagotovi nasičenje. Ključnega pomena je, da v plinski fazi nastopi nasičenje. Prenesena snov se ujame, običajno s pomočjo sorbenta, nato se določi njena količina. Za določitev količine snovi, ki jo prenese znana količina nosilnega plina, se namesto lovljenja pare in poznejše analize lahko uporabijo neposredne analitske tehnike, kot je kromatografija. Parni tlak se izračuna ob predpostavki, da se upošteva zakon idealnega plina in da je skupni tlak mešanice plinov enak vsoti tlakov posameznih plinov. Delni tlak preskusne snovi, tj. parni tlak, se izračuna iz znane skupne prostornine plina in iz teže prenesenega materiala. Postopek z nasičenjem plina se lahko uporablja za trdne ali tekoče snovi. Uporabiti ga je mogoče za parne tlake do 10–10 Pa (10)(11)(12)(13)(14). Metoda je najzanesljivejša za parne tlake, nižje od 103 Pa. Pri tlakih nad 103 Pa so parni tlaki običajno precenjeni, najverjetneje zato, ker se tvorijo aerosoli. Ker se meritve parnega tlaka izvajajo pri sobni temperaturi, ni potrebe za ekstrapolacijo podatkov iz visokih temperatur, zato se ekstrapolacija pri visokih temperaturah, ki pogosto povzroča resne napake, ne izvaja. 1.5.7.2 Aparatura Ta postopek zahteva uporabo posode s konstantno temperaturo. Na skici na sliki 8 je prikazana posoda s tremi pripravami za trdne in tremi pripravami za tekoče vzorce, ki omogočajo trojno analizo trdnega ali tekočega vzorca. Natančnost nadzora temperature je na ±0,5 °C ali boljša. Slika 8 Običajno se za inertni nosilni plin uporablja dušik, občasno pa je treba uporabiti tudi kak drug plin (24). Nosilni plin mora biti suh. Tok plina se razdeli na 6 tokov, ki jih nadzirajo igelni ventili (z odprtino približno 0,79 mm), in teče v posodo po 3,8 mm i.d. bakreni cevi. Po izenačitvi temperature plin teče skozi vzorec in sorbentno past, nato pa zapusti posodo. Trdni vzorci se namestijo v 5 mm i.d. stekleno cev med čepe iz steklene volne (glej sliko 9). Na sliki 10 sta prikazana naprava za tekoče vzorce in sorbentni sistem. Najbolj ponovljiva metoda za merjenje parnega tlaka tekočin je, da se tekočina nanese na steklene kroglice ali na inerten sorbent, kot je na primer silicijev oksid, nato pa se naprava napolni s temi kroglicami. Alternativno se lahko nosilni plin spelje mimo hrapavega frita in v obliki mehurčkov skozi steber tekoče preskusne snovi. Slika 9 Slika 10 Sorbentni sistem ima sprednji in pomožni sorbentni del. Pri zelo nizkih parnih tlakih sorbent zadrži le majhne količine, zato lahko adsorpcija na stekleni volni in steklenih ceveh med vzorcem in sorbentom povzroča velike težave. Pasti, ohlajene s trdnim CO2, so še en učinkovit način za zbiranje uparjenega materiala. Ne povzročajo protitlaka na saturacijsko kolono, prav tako pa je mogoče zelo enostavno kvantitativno odstraniti ujeti material. 1.5.7.3 Postopek Pretok iztočnega nosilnega plina se meri pri sobni temperaturi. Pretok se med preskusom pogosto preverja, da se zagotovi pravilna vrednost za skupno prostornino nosilnega plina. Zaželeno je spremljanje ves čas z merilnikom masnega pretoka. Nasičenje plinske faze lahko zahteva dolg čas stika in zato precej nizke hitrosti pretoka plina (25). Ob koncu poskusa se sprednji in pomožni sorbentni del analizirata ločeno. Snov v vsakem delu se desorbira s topilom. Nastali raztopini se kvantitativno analizirata, da se določi teža desorpcije vsakega dela. Izbira analitične metode (prav tako tudi izbira sorbenta in desorbentne raztopine) je odvisna od vrste preskusnega materiala. Učinkovitost desorpcije se določi tako, da se znana količina vzorca injicira na sorbent, desorbira, nato pa analizira preostala količina. Pomembno je, da se preskusi učinkovitost desorpcije pri (ali blizu) koncentraciji vzorca pod preskusnimi pogoji. Da se zagotovi nasičenost nosilnega plina s preskusno snovjo, se uporabijo tri različne hitrosti pretoka plina. Če izračunani parni tlak ne kaže odvisnosti od pretoka, se predpostavlja, da je nasičen. Parni tlak se izračuna po enačbi: pri čemer je: p = parni tlak (Pa) W = masa uparjene preskusne snovi (g) V = volumen nasičenega plina (m3) R = splošna plinska konstanta 8,314 (J mol–1 K–1) T = temperatura (K) M = molska masa preskusne snovi (g mol–1) Izmerjene volumne je treba popraviti glede na razlike v tlaku in temperaturi med merilnikom pretoka in saturatorjem. 1.5.8 Rotorska metoda 1.5.8.1 Princip Pri tej metodi se uporablja merilnik viskoznosti z rotorjem, v katerem je merilni element jeklena kroglica, postavljena v magnetno polje, tako da lebdi, njeno vrtenje pa povzročajo rotirajoča polja tuljave (26)(27)(28). Merjenje hitrosti njenega vrtenja omogočajo sprejemne tuljave. Ko kroglica doseže določeno hitrost vrtenja, običajno približno 400 vrtljajev na sekundo, se ustavi dotok energije in zaradi trenja, ki ga povzroča plin, se vrtenje upočasni. Padec vrtilne hitrosti se meri kot funkcija časa. Parni tlak se izpelje iz padca hitrosti kroglice, ki je posledica tlaka. Priporočeno območje je od 10–4 do 0,5 Pa. 1.5.8.2 Aparatura Shema postavitve preskusa je prikazana na sliki 11. Merilnik se postavi v posodo s konstantno temperaturo, ki se uravnava na 0,1 °C natančno. Posoda z vzorcem se postavi v ločeno posodo, ki se tudi uravnava na 0,1 °C natančno. Vsi ostali deli sestava pa se vzdržujejo pri višji temperaturi, da se prepreči kondenzacija. Celotna aparatura je priključena na visokovakuumski sistem. Slika 11 2. PODATKI IN POROČANJE 2.1 PODATKI Pri kateri koli od navedenih metod je treba parni tlak določiti pri najmanj dveh temperaturah. Za preverjanje linearnosti krivulje parnega tlaka so zaželene najmanj tri temperature v območju od 0 do 50 °C. Pri efuzijski metodi (Knudsenova celica in izotermična termogravimetrija) in metodi z nasičenjem plina se priporoča temperaturno območje od 120 do 150 °C, namesto od 0 do 50 °C. 2.2 POROČANJE V poročilo o preskusu se vključijo naslednje informacije: — uporabljena metoda, — natančna specifikacija snovi (identiteta in nečistoče) in predhodno prečiščevanje, če je bilo opravljeno, — najmanj po dve vrednosti parnega tlaka in temperature, če je mogoče, pa tri ali več, v območju 0 do 50 °C (ali od 120 do 150 °C), — vsaj ena od temperatur mora biti 25 °C ali manj, če je tehnično izvedljivo v skladu z izbrano metodo, — vsi neobdelani podatki, — krivulja log p v odvisnosti od 1/T, — ocenjeni parni tlak pri 20 ali 25 °C. Če pride do prehoda (spremembe stanja, razpada), je treba navesti naslednje podatke: — vrsta spremembe, — temperatura, pri kateri pride do spremembe pri atmosferskem tlaku, — parni tlak pri 10 in 20 °C pod temperaturo prehoda in pri 10 in 20 °C nad to temperaturo (razen če gre za prehod iz trdnega v plinasto agregatno stanje). Navesti je treba vse informacije in opombe, pomembne za razlago rezultatov, zlasti glede nečistot in agregatnega stanja snovi. 3. VIRI (1) Uradni list Evropskih skupnosti, L 383 A, 26–47 (1992). (2) Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, Le Neindre, B., in Vodar, B., Eds., Butterworths, London. (3) Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. Chapter IX, Interscience Publ., New York. (4) Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., Van Nostrand Company, New York. (5) NF T 20–048 AFNOR (September 1985). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within a range from 10–1 to 105 Pa – Static method. (6) ASTM D 2879–86, Standard test method for vapour pressure – temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. (7) NF T 20–047 AFNOR (September 1985). Chemical products for industrial use –Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–3 to 1 Pa – Vapour pressure balance method. (8) Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 593. (9) Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. Thermodynamics 7, 1173. (10) Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest Management Science 56, 521–532. (11) Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition (2000) (12) Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determination of small vapour pressures determination of the vapour pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 22–28. (13) Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 269–278. (14) Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p-dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), 117–122. (15) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science 4 (1973) 137–147. (16) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide Science 5 (1974) 393–400. (17) Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relationship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesticide Science 13 (1982) 161–168. (18) Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 45 (1995) 27–31. (19) Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermogravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction (SPME); Pesticide Science, 53 (1998) 300–310. (20) Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low-Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87(12) (1998) 1512–20. (21) Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range -25 °C to 150 °C. (22) Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 (2002). (23) 40 CFR, 796. (1993). pp 148–153, Office of the Federal Register, Washington DC. (24) Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435. (25) Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375. (26) Messer G., Röhl, P., Grosse G., in Jitschin W. (1987). J. Vac. Sci. Technol. (A), 5(4), 2440. (27) Comsa G., Fremerey J.K., in Lindenau, B. (1980). J. Vac. Sci. Technol. 17(2), 642. (28) Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715. (1) Pri uporabi manometra kapacitivnosti Dodatek Ocenjevalna metoda UVOD Izračunane vrednosti parnega tlaka se lahko uporabijo: — za izbiro primerne preskusne metode, — za pridobitev ocene ali mejne vrednosti v primerih, kadar preskusne metode ni mogoče uporabiti zaradi tehničnih razlogov. OCENJEVALNA METODA Parni tlak tekočin in trdnih snovi se lahko oceni z uporabo prilagojene Watsonove korelacije (a). Edini potrebni s preskusom pridobljeni podatek je normalno vrelišče. Metoda je uporabna za območje tlaka od 105 Pa do 10–5 Pa. Podrobne informacije o metodi so navedene v „Priročniku metod za ocenjevanje kemijskih lastnosti“ (b). Glej tudi OECD Environmental Monograph št. 67 (c). RAČUNSKI POSTOPEK Parni tlak se izračuna na naslednji način: pri čemer je: T = izbrana temperatura Tb = normalno vrelišče Pvp = parni tlak pri temperaturi T ΔHvb = izparilna toplota ΔZb = faktor stisljivosti (ocenjen na 0,97) m = empirični faktor, odvisen od agregatnega stanja pri izbrani temperaturi Nadalje pri čemer je KF empirični faktor, ki upošteva polarnost snovi. V viru (b) so navedeni faktorji KF za več spojin. Precej pogosto so na voljo podatki o vrelišču pri znižanem tlaku. Pri takih primerih se parni tlak izračuna na naslednji način: pri čemer je T1 vrelišče pri znižanem tlaku P1. POROČILO Pri uporabi ocenjevalne metode, poročilo vključuje izčrpno dokumentacijo izračuna. VIRI (a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398. (b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill. (c) OECD Environmental Monograph No.67. Application of Structure-Activity Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Assessment (1993).

PRILOGA II A.22. GEOMETRIJSKI SREDNJI PREMER GLEDE NA DOLŽINO VLAKEN 1. METODA 1.1 UVOD Ta metoda opisuje postopek za merjenje geometrijskega srednjega premera glede na dolžino vlaken (LWGMD – Length Weighted Geometric Mean Diameter) velikih ročno izdelanih mineralnih vlaken (MMMF – Man Made Mineral Fibres). Ker ima LWGMD populacije 95 % verjetnosti, da leži med 95 odstotnimi stopnjami zaupanja (LWGMD ± dve standardni napaki) vzorca, bo dejanska vrednost (preskusna vrednost) nižja od 95 % meje zaupanja vzorca (tj. LWGMD ± dve standardni napaki). Metoda temelji na dopolnitvi (junij 1994) osnutka industrijskega postopka HSE, ki je bil usklajen na sestanku med ECFIA in HSE v Chestru dne 26.9.1993 in razvit za in iz drugega medlaboratorijskega poskusa (1, 2). To merilno metodo se lahko uporablja za označevanje premera vlaken velikih snovi ali proizvodov, ki vsebujejo MMMF, vključno z ognjeodpornimi keramičnimi vlakni (RFC), ročno izdelanimi steklenimi vlakni (MMVF), kristalnimi in polikristalnimi vlakni. Določanje utežnostnega faktorja dolžine je sredstvo za izravnavo učinkov na porazdelitev premera, povzročenega zaradi preloma dolgih vlaken pri vzorčenju ali ravnanju z materialom. Geometrična statistika (geometrično povprečje) se uporablja za merjenje velikosti porazdelitve premera MMMF, ker imajo ti premeri običajno velikost porazdelitve, ki se približuje normalnemu logaritmu. Merjenje dolžine kot tudi premera je obsežno in zahteva veliko časa, vendar, če se meritve izvedejo samo na tistih vlaknih, ki se dotikajo neskončno tanke črte v vidnem polju SEM, potem je verjetnost izbire danega vlakna sorazmerna njegovi dolžini. Ker to določa dolžino pri izračunih utežnostnega faktorja dolžine, je edina zahtevana meritev, meritev premera, tako da je možno LWGMD-2SE izračunati, kot je to opisano. 1.2 DEFINICIJE Delec: Predmet z razmerjem dolžina/širina, ki je manjše od 3:1. Vlakno: Predmet z razmerjem dolžina/širina, ki je manjše od 3:1. 1.3 OBSEG IN OMEJITVE Ta metoda je zasnovana tako, da je možno pogledati porazdelitev premerov, ki imajo mediano premera od 0,5 μm do 6 μm. Večje premere je možno izmeriti, če se uporabijo manjše povečave SEM, vendar je metoda izredno omejena na natančno porazdelitev vlaken, tako da se priporoča uporaba meritev s TEM (prenosni elektronski mikroskop), če je mediana premera pod 0,5 μm. 1.4 NAČELA METODE PRESKUŠANJA Število reprezentančnih vzorcev jeder se vzame iz krpe vlaken ali iz prostih velikih vlaken. Velika vlakna se z uporabo postopka drobljenja skrajšajo po dolžini, reprezentativni podvzorci pa se razpršijo v vodi. Alikvoti se izvlečejo in filtrirajo skozi 0,2 μm velike pore polikarbonskega filtra in se pripravijo za preskušanje s tehniko skeniranja z elektronskim mikroskopom (SEM). Premeri vlaken se merijo pri povečavi zaslona × 10 000 ali večji (1), pri tem pa se uporabi metoda sekanja črte, da je tako dosežena nevtralna ocena mediane premera. Izračuna se spodnjih 95 % intervala zaupanja (na osnovi enostranskega preskusa), tako da je možno dati oceno najnižje vrednosti srednjega geometrijskega premera glede na dolžino vlakna materiala. 1.5 OPIS METODE PRESKUŠANJA 1.5.1 Varnostni/previdnost Do največje možne mere je treba zmanjšati izpostavljenost osebja pred vlakni, ki se uporabljajo v letalstvu, zato je za ravnanje s suhimi vlakni treba uporabljati dimno komoro ali komoro, v katero posegamo z rokavicami. Potrebno je spremljanje občasne izpostavljenosti osebja, da bi se določila učinkovitost kontrolne metode. Pri rokovanju z MMMF je treba nositi rokavice za enkratno uporabo, da se tako zmanjša draženje kože in prepreči navzkrižno onesnaženje. 1.5.2 Aparature/naprave — Stiskalnica in barve (za tlak do 10 MPa), — filtri s kapilarnimi karbonatnimi porami velikosti 0,2 μm (premera 25 mm), — membranski filtri s 5 μm velikimi celuloznimi porami za uporabo pri podpornih filtrih, — aparature za filtriranje stekla (ali sistem za filtriranje odpadkov), ki sprejmejo filtre s premorom 25 mm (npr. Millipore komplet za mikroanalizo stekla, tip št. XX10 025 00), — sveže destilirana voda, ki je bila filtrirana skozi filter z velikostjo por 0,2 μm za odstranjevanje mikroorganizmov, — naprava za pršenje nanosov na zlato ali zlate/paladijeve površine, — skenirni elektronski mikroskop z ločitvijo do 10 nm in s povečavo ×100 000, — razno: lopatice, rezilo skalpela tipa 24, pincete, cevi SEM, karbonsko lepilo ali karbonski lepilni trak, koloidno srebro, — ultrazvočno tipalo ali namizna ultrazvočna kopel, — naprava za jemanje vzorcev jedra ali vrtalnik za pluto za odvzem vzorcev iz MMMF krpe. 1.5.3 Postopek preskusa 1.5.3.1 Vzorčenje Za odvzem vzorcev krp in plošč se uporablja 25 mm naprava za jemanje vzorcev jeder ali vrtalnik za pluto. Vzorce se odvzame enakomerno po vsej dolžini krajše strani krpe ali iz poljubne površine, če so na razpolago daljše strani krpe. Za odvzem naključnih vzorcev prostih vlaken se uporablja ista oprema. Če je le možno, naj se odvzame šest vzorcev, ki odražajo prostorske razlike velikega materiala. Šest vzorcev jeder je treba z 10 MPa zdrobiti v 50 mm kalupu. Material se meša z lopatico in ponovno stisne z 10 MPa. Nato se material odstrani iz kalupa in shrani v zapečateno steklenico. 1.5.3.2 Priprava vzorca Po potrebi se organska veziva lahko odstranijo tako, da se vlakna za ca. 1 uro vstavijo v peč pri 450 °C. Napravite stožčasto obliko in jo razdelite na štiri dele (to je treba narediti v prašni komori). Z lopatico dodajte majhno količino (< 0,5 g) vzorca v 100 ml sveže destilirane vode, ki ste jo predhodno filtrirali skozi membranski filter 0,2 μm (alternativno se lahko uporabijo izviri izjemno čiste vode, če se pokažejo kot zadovoljivi). Temeljito razpršite s pomočjo ultrazvočnega tipala, ki deluje z močjo 100 W in je uglašeno tako, da povzroča kavitacije. (Če tipalo ni na razpolago, uporabite naslednjo metodo: večkrat pretresite in obrnite za 30 s; za nekaj minut izpostavite ultrazvoku v namizni ultrazvočni napravi; nato ponovno pretresite in obrnite za nadaljnjih 30 s). S široko pipeto (zmogljivosti 2–5 ml) takoj po razpršitvi vlakna odstranite večje število alikvotov (npr. tri alikvote po 3, 6 in 10 ml). Vaakumsko filtrirajte vsak alikvot skozi polikarbonski filter 0,2 μm, ki mu pomaga podporni filter MEC s 5 µm porami, in uporablja 25 mm stekleni filtrski lijak z valjastim rezervoarjem. Približno 5 ml filtrirane destilirane vode je treba vliti v lijak in počasi s pipeto nakapati alikvot v vodo, pri tem pa držati vrh pipete pod meniskusom. Pipeto in rezervoar je po kapljanju treba temeljito splahniti, ker tanka vlakna težijo k površini. Skrbno odstranite filter in ga ločite od podpornega filtra, preden ga vstavite v drugo posodo na sušenje. S skalpelom tipa 24 odrežite četrtino ali polovico dela filtra z filtrskimi ostanki in pri tem uporabite sunkovite gibe. Previdno pritrdite odrezani del na trn SEM in pri tem uporabite vložke lepljivega ogljika ali ogljikovo lepilo. Koloidno srebro se nanese na najmanj tri mesta, da se izboljša električni stik na robovih filtra in trna. Ko se lepilo/koloidno srebro posuši, nabrizgajte sloj približno 50 nm zlata ali zlata/paladija na površino ostankov. 1.5.3.3 Umerjanje in delovanje SEM 1.5.3.3.1 Umerjanje Umerjanje SEM je treba preveriti vsaj enkrat tedensko (idealno enkrat na dan) in pri tem uporabiti mrežo za umerjanje. Umerjanje je treba preveriti glede na potrjene standarde in če izmerjena vrednost (SEM) ni v območju ±2 % od potrjene vrednosti, potem je treba umerjanje SEM prilagoditi in ponovno preveriti. SEM mora biti sposoben ločiti vsaj najmanjši viden premer 0,2 µm pri uporabi prave matrike vzorčenja in pri povečavi × 2 000. 1.5.3.3.2 Delovanje SEM naj obratuje pri povečavi 10 000 (2) pod pogoji, ki omogočajo dobro ločljivost s sprejemljivimi slikami pri počasnem skeniranju, npr. 5 s za sliko. Čeprav so delovne zahteve za različne SME lahko različne, je za doseganje najboljše vidljivosti in ločljivosti na splošno treba uporabiti nastavitev za majhno površino fokusa in kratko delovno razdaljo, z relativno nizko atomsko težo materialov in pospeševalnimi napetostmi 5–10 keV. Ker se izvaja linearni prehod, se priporoča uporaba naklona 0o za najmanjše potrebno ponovno fokusiranje ali, če je SEM v evcentričnem stanju, evcentrična delovna razdalja. Če material ne vsebuje vlaken majhnega premera in so premeri vlaken veliki (> 5 μm), se lahko uporabi manjša povečava. 1.5.3.4 Določanje velikosti 1.5.3.4.1 Pregled z nizko povečavo za oceno vzorca Najprej naj se vzorec pregleda z nizko povečavo, da se ugotovi prisotnost kopičenja velikih vlaken in da se oceni gostota vlaken. V primeru prevelikega kopičenja se priporoča priprava novega vzorca. Za statistično točnost je potrebno izmeriti najmanjše število vlaken, visoka gostota vlaken, ki je na videz primerna za pregled praznih polj, pa zahteva veliko časa in ne prispeva k analizi. Če je filter preobremenjen, je težko meriti vsa merljiva vlakna in ker velika vlakna lahko zakrivajo mala, ki potem niso vidna. Nagnjenost k precenjevanju LWGMD je lahko rezultat gostote vlaken nad 150 vlaken/mm pri linearnem prehodu. Na drugi strani pa nizke koncentracije vlaken povečujejo čas analize in je pogosto stroškovno ugodno pripraviti vzorec gostote vlakna blizu najugodnejšega, kot vztrajati z oceno pri filtrih z nizko koncentracijo. Najugodnejša gostota vlaken naj bi dala povprečje o enem ali dveh ocenjevanih vlaknih v vidnih poljih pri povečavi 5 000. Najugodnejša gostota je odvisna od velikost (premera) vlaken, zato mora operater uporabiti nekatere strokovne presoje, da lahko odloči ali je gostota vlaken blizu najugodnejše ali ne. 1.5.3.4.2 Določanje utežnostnega faktorja dolžine za premere vlaken Štejejo se samo vlakna, ki se dotaknejo (ali prečkajo) (neskončno) tanko črto na zaslonu SEM. Zato je na zaslonu narisana vodoravna (ali navpična) črta, ki poteka skozi sredino zaslona. Alternativno je na sredini zaslona postavljena ena sama točka, v eni smeri pa poteka stalno skeniranje filtra. Premer se izmeri in zapiše za vsako vlakno z razmerjem dolžina/širina večjim od 3:1, ki se dotika ali prečka to točko. 1.5.3.4.3 Določanje velikosti vlakna Priporoča se merjenje najmanj 300 vlaken. Vsako vlakno se meri le enkrat v sečišču s črto ali točko, narisano na sliki (ali blizu sečišča, če je rob vlakna nejasen). Pri vlaknih z neenakomernim presekom se uporabi meritev, ki predstavlja povprečje premera vlakna. Paziti je treba pri določanju robov in merjenju najkrajše razdalje med robovi vlakna. Določanje velikosti je možno on-line ali off-line na shranjenih slikah ali fotografijah. Priporoča se uporaba polavtomatskih sistemov za merjenje na slikah, ki nalagajo podatke neposredno v razpredelnice, ker se tako prihrani čas, zmanjša število napak pri prepisovanju, izračuni pa so lahko avtomatizirani. Konci dolgih vlaken naj se preverijo pri majhnih povečavah, da se zagotovi, da se ne zvijajo nazaj v merilno ali vidno polje in so vlakna izmerjena le enkrat. 2. PODATKI 2.1 OBDELAVA REZULTATOV Premeri vlaken po navadi nimajo normalne porazdelitve. Če pa se izvede logaritmična transformacija, je možno dobiti porazdelitev, ki se približuje normalni. Izračunajte aritmetično srednjo vrednost (srednji lnD) in standardno deviacijo (SDlnD) logaritma z osnovo e (lnD) za n premerov vlakna (D). (1) (2) Standardna deviacija se deli s kvadratnim korenom števila meritev (n), da dobimo standardno napako (SElnD). (3) Dvakrat odštejte standardno napako od srednje vrednosti in izračunajte njen eksponent (srednja vrednost minus dve standardni napaki) in tako dobite geometrijsko srednjo vrednost minus dve geometrijski standardni napaki. (4) 3. POROČANJE POROČILO O PRESKUSU) Poročilo o preskusu naj vsebuje vsaj naslednje informacije: — vrednost LWGMD-2SE, — kakršna koli odstopanja, še zlasti tista, ki vplivajo na natančnost in točnost rezultatov z ustreznimi obrazložitvami. 4. VIRI (1) B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. February 1999. (2) G. Burdett in G. Revell. Development of a standard method to measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research and Laboratory Services Division. 1994. (1) Ta vrednost povečave je določena za vlakna s premerom 3 µm, za vlakna s premerom 6 µm pa je primernejša povečava ×5 000. (2) Za vlakna s premerom 3 μm glej prejšnjo opombo.

PRILOGA III B.46 TEST DRAŽENJA KOŽE IN VITRO: TEST Z MODELOM REKONSTRUIRANE ČLOVEŠKE POKOŽNICE 1. METODA 1.1 UVOD Draženje kože pomeni nastanek popravljive poškodbe kože po nanosu testne snovi za čas do 4 ur [kot je opredeljeno v Globalnem usklajenem sistemu za razvrščanje in označevanje kemikalij (GHS) Združenih narodov (ZN)](1). Ta testna metoda zajema postopek in vitro, ki lahko, odvisno od zahtev po podatkih, kot samostojni nadomestni test v okviru testne strategije in na podlagi pristopa določitve zanesljivosti dokazov (weight of evidence approach) omogoči določitev stopnje razdraženosti kože zaradi snovi (2). Ocenjevanje razdraženosti kože se običajno izvaja na laboratorijskih živalih (glej metodo B.4)(3). V skladu s prizadevanji za dobro počutje živali omogoča metoda B.4 določanje jedkosti za kožo/draženja kože z uporabo zaporedne testne strategije, pri čemer se uporabljata validirani metodi in vitro in ex vivo, da se tako preprečijo bolečine in trpljenje živali. Za del zaporedne testne strategije B.4, ki zadeva jedkost, je smiselno uporabiti tri validirane testne metode ali smernice za testiranje in vitro, in sicer B.40, B.40a in TG 435 (4, 5, 6). Ta testna metoda temelji na modelih rekonstruirane človeške pokožnice, ki so v svoji zasnovi (uporaba človeških keratinocitov pokožnice kot vira celic, vzorčnega tkiva in citoarhitekture) zelo podobni biološkim in fiziološkim značilnostim zgornjih delov človeške kože, tj. pokožnice. Postopek, ki je opisan v okviru te testne metode, omogoča ugotavljanje nevarnosti dražilnih snovi v skladu s kategorijo 2 GHS ZN. Ta testna metoda vključuje tudi skupino standardov učinkovitosti za ocenjevanje podobnih in spremenjenih testnih metod za rekonstruirano človeško pokožnico (7). Predvalidacijske, optimizacijske in validacijske študije so dopolnjene z dvema testnima metodama in vitro (8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17), ki sta na tržišču na voljo pod imenoma EpiSkin™ in EpiDerm™ ter pri katerih se uporabljajo modeli rekonstruirane človeške pokožnice. Te reference so temeljile na R 38. Nekateri vidiki ponovnega izračuna za namene GHS so obravnavani v referenci 25. Metode, katerih učinkovitost je enakovredna EpiSkin™ (validirana referenčna metoda 1), se priporočajo kot samostojne nadomestne testne metode za testiranje in vivo na kuncu za razvrščanje dražilnih snovi kategorije 2 GHS. Metode, katerih učinkovitost je enaka EpiDerm™ (validirana referenčna metoda 2), se priporočajo le kot dodatne testne metode ali kot del zaporedne testne strategije pri načinu določitve zanesljivosti dokazov za razvrščanje dražilnih snovi kategorije 2 GHS. Preden se omogoči uporaba predlaganega testa v zvezi z draženjem kože in vitro z rekonstruirano človeško pokožnico za zakonodajne namene, je treba določiti njegovo zanesljivost, ustreznost (natančnost) in omejitve, kar zadeva predlagano uporabo, da se zagotovi njegova primerljivost z validirano referenčno metodo 1 v skladu s standardi učinkovitosti, ki so določeni v tej testni metodi (Dodatek). V skladu z zahtevami v okviru te testne metode sta bili validirani še dve testni metodi in vitro z rekonstruirano človeško pokožnico, pri čemer so njuni rezultati podobni rezultatom validirane referenčne metode 1 (18). To sta spremenjena testna metoda EpiDerm™ (spremenjena referenčna metoda 2) in testna metoda SkinEthic RHE™ (podobna metodi 1). 1.2 OPREDELITEV POJMOV V okviru te testne metode se uporabljajo naslednje opredelitve pojmov: Natančnost: stopnja ujemanja rezultatov testne metode s sprejetimi referenčnimi vrednostmi. To je merilo učinkovitosti testne metode in eden od vidikov ustreznosti. Ta izraz in izraz „skladnost“ se pogosto izmenično uporabljata za pomen deleža ustreznih rezultatov testne metode. Snov kontrolne serije: primerjalna snov, ki na tkivu povzroči srednje močen odziv glede viabilnosti celic. Viabilnost celic: parameter za merjenje celotne dejavnosti celične populacije, npr. zmožnosti celičnih mitohondrijskih dehidrogenaz za redukcijo vitalnega barvila MTT ([3–(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid, Thiazolyl blue;), ki se glede na izmerjeni končni učinek in uporabljeni načrt testa ujema s skupnim številom in/ali viabilnostjo celic. ET50 : čas izpostavljenosti, ki je potreben za zmanjšanje viabilnosti celic za 50 % po nanosu določene stalne koncentracije označevalca, glej tudi IC50. Delež lažno negativnih rezultatov: delež vseh pozitivnih snovi, ki jih testna metoda lažno prikaže kot negativne. To je eden od kazalcev učinkovitosti testne metode. Delež lažno pozitivnih rezultatov: delež vseh negativnih (neaktivnih) snovi, ki jih testna metoda lažno prikaže kot pozitivne. To je eden od kazalnikov učinkovitosti testne metode. Prevelik odmerek: količina na kožo nanesene testne snovi, ki je večja od količine, potrebne za celotno in enakomerno prekrivanje površine kože. GHS (globalno usklajen sistem za razvrščanje in označevanje kemikalij): sistem, v okviru katerega se predlaga razvrščanje snovi in zmesi v skladu s standardiziranimi vrstami in stopnjami fizikalnih nevarnosti, nevarnosti za zdravje in okolje, ter obravnavajo ustrezni elementi obveščanja, kot so piktogrami, opozorilne besede, izjave o nevarnosti, varnostne izjave in varnostni listi, da se sporočijo informacije o negativnih vplivih z namenom zaščite ljudi (vključno z delodajalci, zaposlenimi, prevozniki, potrošniki in reševalci) in okolja (1), je v EU izveden z Uredbo (ES) št. 1272/2008. IC50 : Koncentracija, pri kateri označevalec po določenem času izpostavljenosti zmanjša viabilnost tkiva za 50 % (IC50), glej tudi ET50. Standardi učinkovitosti: standardi, ki temeljijo na validirani referenčni metodi, na podlagi katere se lahko ocenjuje primerljivost predlagane testne metode, ki je referenčni v mehaničnem in funkcijskem smislu podobna. Vključeni so I) nujni elementi testne metode, II) minimalni seznam referenčnih snovi, izbranih iz skupine snovi, ki se uporabljajo za dokazovanje sprejemljive učinkovitosti validirane referenčne metode, in III) primerljive stopnje natančnosti in zanesljivosti, ki temeljijo na rezultatu uporabe validirane referenčne metode, kar mora dokazati predlagana testna metoda pri ocenjevanju ob uporabi najkrajšega možnega seznama referenčnih snovi. Zanesljivost: merila za obseg ponovljivosti opravljanja testne metode v enem ali več laboratorijih v določenem časovnem obdobju, kadar poteka ob upoštevanju istega protokola. Oceni se z izračunom ponovljivosti v enem ali več laboratorijih. Občutljivost: delež vseh pozitivnih/aktivnih snovi, ki se s testom pravilno razvrstijo. To je merilo natančnosti za testno metodo, s katero se dosežejo kategorični rezultati, in je pomemben dejavnik pri ocenjevanju ustreznosti testne metode. Specifičnost: delež vseh negativnih/neaktivnih snovi, ki se pravilno razvrstijo s testom. To je merilo natančnosti za testno metodo, s katero se dosežejo kategorični rezultati, in je pomemben dejavnik pri ocenjevanju ustreznosti testne metode. Draženje kože: draženje kože je nastanek popravljive poškodbe kože po nanosu testne snovi za čas do 4 ur. Razdraženost kože je reakcija, ki je prisotna na posameznih mestih, ni imunogena in se pojavi kmalu po izpostavitvi kože draženju (24). Njena glavna lastnost je popravljiv proces, ki vključuje vnetne reakcije in večino značilnih kliničnih znakov razdraženosti (eritem, edem, srbenje in bolečino), povezanih z vnetnim procesom. 1.3 OBSEG IN OMEJITVE Omejitev testov z rekonstruirano človeško pokožnico v okviru te testne metode je le razvrščanje snovi kot dražil kože v skladu s kategorijo 2 GHS ZN. Ker razvrščanje snovi v neobvezno kategorijo 3, kot je opredeljeno v GHS ZN, ni dovoljeno, ne bo razvrščena nobena od ostalih snovi (v nobeno od kategorij). To testno metodo je treba prilagajati glede na zakonodajne potrebe in možno prihodnjo vključitev novih končnih učinkov, izboljšav ali razvoja novih podobnih testov. Ta testna metoda omogoča ugotavljanje nevarnosti dražilnih snovi iz ene sestavine (19), vendar ne zagotavlja ustreznih informacij o jedkosti za kožo. Plinov in aerosolov ni mogoče testirati, medtem ko zmesi še niso ocenjene v validacijski študiji. 1.4 NAČELO TESTA Testna snov se površinsko nanese na tridimenzionalni model rekonstruirane človeške pokožnice, ki vključuje normalne keratinocite človeške pokožnice, gojene za večplastni, zelo raznolik model človeške pokožnice. Sestavljajo ga organizirane bazalne, spinalne in zrnate plasti ter večplastna rožena plast, ki vključuje medcelične lamelarne maščobne plasti, razporejene v vzorce, ki so podobni strukturi in vivo. Načelo testa z modelom rekonstruirane človeške pokožnice temelji na predpostavki, da lahko dražilne snovi prodrejo v roženo plast z difuzijo in so citotoksične za spodaj ležeče plasti celic. Viabilnost celic se meri s konverzijo dehidrogenaze vitalnega barvila MTT [3–(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid, Thiazolyl blue; številka EINECS 206–069–5, številka CAS 298–93–1] v soli modrega formazana, količina katere se izmeri po ekstrakciji iz tkiv (20). Dražilne snovi so prepoznavne po zmožnosti zmanjšanja viabilnosti celic pod opredeljene vrednosti praga (tj. ≤ 50 %, za dražila kategorije 2 GHS ZN). Snovi, zaradi katerih je viabilnost celic večja od opredeljene vrednosti praga, ne bodo razvrščene (tj. > 50 %, v nobeno kategorijo). Sistemi modela rekonstruirane človeške pokožnice se lahko uporabljajo za testiranje trdnih snovi, tekočih snovi, poltrdnih snovi in voskov. Tekoče snovi so lahko vodne raztopine ali ne, trdne snovi so lahko topne ali netopne v vodi. Če je mogoče, je treba trdne snovi testirati v obliki finega prahu. Ker je bilo z validacijo sistemov za test z modelom rekonstruirane človeške pokožnice skrbno izbranih 58 snovi, ki predstavljajo veliko različnih kemijskih razredov, se pričakuje splošna veljavnost teh metod za kemijske razrede (16). Validacija vključuje 13 dražilnih snovi kategorije 2 po GHS. Opozoriti je treba, da nejedke kisline, baze, soli in druge anorganske snovi niso bile vključene v validacijo in da nekaj znanih razredov organskih dražilnih snovi, kot na primer hidroperoksidi, fenoli in površinsko aktivne snovi, ni bilo vključenih ali pa so bili vključeni le delno. 1.5 DOKAZOVANJE STROKOVNOSTI Pred rutinsko uporabo validirane metode, pri kateri se upošteva ta testna metoda, je možno, da želijo laboratoriji z uporabo desetih snovi, ki so priporočene v tabeli 1, dokazati tehnično strokovnost. V okviru te testne metode ni neobvezne kategorije 3 GHS ZN. Za podobne nove testne metode, ki so razvite v okviru te testne metode ter so strukturno in funkcionalno podobne validiranim referenčnim metodam, ali za spremembe validiranih metod, se morajo pred začetkom uporabe novih testnih metod kot predpisanega testiranja za dokazovanje njihove primerljive zanesljivosti in natančnosti upoštevati standardi učinkovitosti, opisani v Dodatku k tej testni metodi. Tabela 1 Napovedne snovi, ki so podmnožica referenčnih snovi, navedenih v Dodatku Snov Številka CAS Rezultat testa in vivo Agregatno stanje Kategorija GHS naftalen ocetna kislina 86–87–3 0 Tr kat. št. izopropanol 67–63–0 0,3 Te kat. št. metil stearat 112–61–8 1 Tr kat. št. heptil butirat 5870–93–9 1,7 Te neobvezna kat. 3 heksil salicilat 6259–76–3 2 Te neobvezna kat. 3 ciklamen aldehid 103–95–7 2,3 Te kat. 2 1-bromoheksan 111–25–1 2.7 Te kat. 2 butil metakrilat 97–88–1 3 Te kat. 2 1-metil-3-fenil-1-piperazin 5271–27–2 3,3 Tr kat. 2 heptanal 111–71–7 4 Te kat. 2 1.6 OPIS METODE V nadaljevanju so opisani elementi in postopki testa za ocenjevanje razdraženosti kože z modelom rekonstruirane človeške pokožnice. Model rekonstruirane človeške pokožnice se lahko izdela, pripravi ali pridobi na tržišču (npr. EpiSkin™, EpiDerm™ in SkinEthic RHE™). Protokoli standardnih testnih metod za EpiSkin™, EpiDerm™ in SkinEthic RHE™ so na voljo na spletni strani [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu](21, 22, 23). Testiranje se mora izvajati v skladu z naslednjimi zahtevami: 1.6.1 Elementi modela rekonstruirane človeške pokožnice 1.6.1.1 Splošni pogoji modela Za izdelavo epitelija se uporabijo običajni človeški keratinociti. Pod funkcionalno roženo plastjo je več slojev živih epitelijskih celic (bazalna plast, trnasta plast, zrnata plast). Rožena plast mora biti razdeljena na več plasti in vsebovati lipidni profil za močno funkcionalno pregrado za zaustavitev hitre penetracije označevalcev citotoksičnosti, npr. natrijevega dodecil sulfata (SDS) ali Tritona X-100. Funkcija pregrade se lahko oceni z določitvijo koncentracije, pri kateri označevalec po določenem času izpostavljenosti zmanjša viabilnost tkiv za 50 % (IC50), ali z določitvijo časa izpostavljenosti, ki je potreben za zmanjšanje viabilnosti celic za 50 % (ET50) po nanosu določene stalne koncentracije označevalca. Zadrževalne značilnosti modela morajo preprečiti prehod materiala okoli rožene plasti v živo tkivo, kar bi preprečilo učinkovitost modelov za raziskovanje v zvezi z izpostavljenostjo kože. V modelu kože ne sme biti bakterij, virusov, mikoplazme ali plesni. 1.6.1.2 Pogoji za funkcionalen model 1.6.1.2.1 Viabilnost Zaželena analiza za določanje stopnje viabilnosti celic je z MTT (20). Optična gostota izvlečka (topnega) barvila iz negativnega kontrolnega tkiva mora biti vsaj dvajsetkrat večja od optične gostote samega ekstrakcijskega topila. Zabeležiti je treba, da je negativno kontrolno tkivo, kar zadeva celične kulture, med testiranjem stabilno (podobne meritve viabilnosti celic). 1.6.1.2.2 Pregradna funkcija Rožena plast in njena maščobna sestava morata zadostovati za zaustavitev hitre penetracije citotoksičnih označevalcev, npr. SDS ali Triton X-100, kot se ocenjuje z IC50 ali ET50. 1.6.1.2.3 Morfologija Histološki pregled rekonstruirane kože/pokožnice za prikaz strukture človeške kože/pokožnici podobne strukture (vključno z večplastno roženo plastjo) mora opraviti ustrezno usposobljeno osebje. 1.6.1.2.4 Obnovljivost Rezultati metode s posebnim modelom morajo dokazati, da se koža sčasoma obnovi, najbolje z ustrezno (primerjalno) snovjo kontrolne serije (glej Dodatek). 1.6.1.2.5 Nadzor kakovosti modela Vsaka uporabljena serija modela pokožnice mora izpolnjevati opredeljena merila za sprostitev proizvodnje, med katerimi so najpomembnejša merila v zvezi z viabilnostjo celic (odstavek 1.6.1.2.1) in pregradno funkcijo (odstavek 1.6.1.2.2). Razpon sprejemljivosti (zgornja in spodnja meja) za IC50 ali ET50 mora določiti dobavitelj modela kože (ali raziskovalec ob uporabi lastnega modela). Značilnosti pregrade tkiv se morajo preveriti v laboratoriju po prejetju tkiv. Le rezultati, doseženi z ustreznimi tkivi, se štejejo kot zanesljivi za napovedi v zvezi z vplivi za draženje kože. Kot primer so spodaj navedeni razponi za validirane referenčne metode. Tabela 2 Primeri meril za nadzor kakovosti serije Spodnja meja sprejemljivosti Vrednost razpona sprejemljivosti Zgornja meja sprejemljivosti Validirana referenčna metoda 1 (18-urno testiranje z SDS) IC50 = 1,0 mg/ml IC50 = 2,32 mg/ml IC50 = 3,0 mg/ml Validirana referenčna metoda 2 (1-odstotni Triton X100) ET50 = 4,8 hr ET50 = 6,7 hr ET50 = 8,7 hr 1.6.1.3 Nanos testnih in kontrolnih snovi Za vsako testiranje in kontrole je treba uporabiti zadostno število dvojnikov tkiv (vsaj tri dvojnike na vsako ponovitev testa). Za tekoče in trdne snovi je treba uporabiti zadostno količino testne snovi, da se enakomerno prekrije površina kože, pri čemer mora biti odmerek natančno določen (glej 1.2 Opredelitve), tj. najmanj 25 μL/cm2 ali 25 mg/cm2. Da se zagotovi dober stik s kožo, je treba v primeru trdnih snovi površino pokožnice pred nanosom navlažiti z deionizirano ali destilirano vodo. Če je mogoče, je treba trdne snovi testirati v obliki finega prahu. Ob koncu časa izpostavljenosti je treba testno snov skrbno sprati s površine kože z vodnim puferjem ali 0,9-odstotnim NaCl. Glede na uporabljeni model rekonstruirane človeške pokožnice lahko čas izpostavljenosti traja od 15 do 60 minut, inkubacijska temperatura pa meri od 20 do 37 °C. Za podrobnejše informacije glej Standardne operativne postopke za te tri metode (21, 22, 23). Negativna kontrola (NC) in pozitivna kontrola (PC) se morata sočasno uporabiti za vsako študijo, da se dokaže, da so viabilnost celic (negativna kontrola), pregradna funkcija in posledična občutljivost tkiva (pozitivna kontrola) v okviru v preteklosti opredeljenega razpona sprejemljivosti. Predlagana snov za pozitivno kontrolo je 5-odstotni vodni SDS. Predlagani snovi za negativno kontrolo sta voda ali fosfatni pufer s soljo (PBS). 1.6.1.4 Meritve viabilnosti celic Pri postopku testiranja je zelo pomembno, da se meritve viabilnosti celic ne opravljajo takoj po izpostavljenosti testnim snovem, ampak v svežih gojiščih po dovolj dolgi inkubacijski dobi po testiranju izpranih tkiv. Ta čas omogoča izboljšanje stanja, kar zadeva šibke dražilne vplive, in pojav jasnih citotoksičnih vplivov. V fazi optimizacije testa (9, 10, 11, 12, 13) se je kot najugodnejša izkazala 42-urna inkubacijska doba po testiranju, zato se je uporabljala za validacijo referenčnih testnih metod. Analiza konverzije MTT je kvantitativna validirana metoda, ki jo je treba uporabljati za merjenje viabilnosti celic. Ustreza uporabi tridimenzionalne konstrukcije tkiva. Vzorec kože se za 3 ure potopi v ustrezno koncentracijo raztopine MTT (npr. 0,3–1 mg/mL). S topilom (npr. izopropanolom, kislim izopropanolom) se izvleče oborina modrega formazana, potem pa se koncentracija formazana izmeri tako, da se določi OD pri valovni dolžini 570 nm ±30 nm. Optične značilnosti testne snovi ali njenega kemijskega delovanja na MTT lahko zato ovirajo analizo, zaradi česar je lahko ocena viabilnosti celic lažna (ker lahko testna snov prepreči obarvanje ali povzroči, da se razlikuje od običajnega). To se lahko zgodi, če se določena testna snov s splakovanjem ne odstrani s kože v celoti ali če prodre v pokožnico. Če testna snov deluje neposredno na MTT, je običajne barve ali se obarva med testiranjem tkiva, je treba izvesti dodatne kontrole, da se ugotovijo in odpravijo interference testne snovi z merilno tehniko viabilnosti. Za podrobnejši opis načina neposrednega testiranja zmanjšanja MTT glej protokol testne metode za validirane referenčne metode (21, 22, 23). Nespecifična barva zaradi teh interferenc ne sme preseči 30-odstotne negativne kontrole (za popravke). Če je NSC > 30 %, se šteje, da je testna snov neskladna s testom. 1.6.1.5 Merila za sprejemljivost analize Za vsako analizo, pri kateri se uporabljajo ustrezne/veljavne serije (glej odstavek 1.6.1.2.5), morajo negativna kontrolna tkiva izražati optično gostoto, iz katere je razvidna kakovost tkiv, pri katerih so se upoštevale vse zahtevane stopnje in vsi postopki protokola v zvezi z razdraženostjo kože. Vrednosti kontrol optične gostote ne smejo biti nižje kot v preteklosti postavljene nižje meje. Podobno morajo tkiva s PC, tj. 5-odstotnim vodnim SDS, kazati občutljivost tkiv in njihovo sposobnost odzivanja na dražilne snovi v pogojih vsake posamezne analize (na primer viabilnost celic ≤ 40 % za validirano referenčno metodo 1 in ≤ 20 % za validirano referenčno metodo 2). S tem povezane in ustrezne meritve spremenljivosti med dvojniki tkiv je treba opredeliti (npr. v primeru uporabe standardnih odmikov mora biti njihova vrednost ≤ 18 %). 2. PODATKI 2.1 PODATKI Za vsako testiranje je treba podatke o posameznih vzorcih dvojnikov testov (npr. vrednosti optične gostote in podatke o izračunanem deležu viabilnosti celic za vsako testno snov, vključno z razvrščanjem) sporočiti v tabeli, po potrebi vključno s podatki o ponovljenih poskusih. To pomeni, da je treba sporočiti standardni odmik ± za vsak poskus. Za vsako testirano kemikalijo je treba sporočiti opaženo medsebojno vplivanje z reagentom MTT in obarvanimi testnimi snovmi. 2.2 RAZLAGA REZULTATOV Vrednosti OD, pridobljene z vsakim testnim vzorcem, se lahko uporabijo za izračun deleža viabilnosti celic NC, ki je določena na 100 %. Mejna vrednost deleža viabilnosti celic, ki dražilne testne snovi loči od nerazvrščenih, ter statistični postopek(-ki), ki se uporablja(-jo) za ocenjevanje rezultatov ter določanje dražilnih snovi, morata(-jo) biti natančno opredeljena(-i) in zabeležena(-i) ter dokazana(-i) kot ustrezna(-i). Mejne vrednosti za napovedovanje rezultatov v zvezi z razdraženostjo kože, ki zadevajo validirane referenčne metode, so navedene spodaj. Testna snov se v skladu s kategorijo 2 GHS ZN šteje kot dražilna za kožo: (i) če je viabilnost tkiva po izpostavljenosti in inkubaciji po testiranju manjša kot ali enaka (≤) 50 %. Testna snov se šteje kot snov brez kategorije: (ii) če je viabilnost tkiva po izpostavljenosti in inkubaciji večja (>) kot 50 %. 3. POROČANJE 3.1 POROČILO O TESTU Poročilo o testu mora vključevati naslednje informacije: Testne in kontrolne snovi: — kemijsko(-a) ime(-na), npr. IUPAC ali ime CAS in številko CAS, če je znana, — čistost in sestavo snovi (v odstotku(-ih) mase), — fizikalno-kemijske značilnosti, ki so pomembne za izvedbo študije (npr. agregatno stanje, obstojnost in hlapnost, pH, topnost v vodi, če so znane), — obdelava testnih/kontrolnih snovi pred testiranjem, če je to smiselno (npr. segrevanje, mletje), — pogoji skladiščenja. Utemeljitev modela kože in uporabljenega protokola. Testni pogoji: — uporabljeni celični sistem, — podatki o umerjanju za merilno napravo, s katero je bila izmerjena viabilnost celic (npr. spektrofotometer), — popolne informacije za podporo specifičnemu uporabljenemu modelu kože, vključno z njegovo učinkovitostjo. Ti lahko vključujejo, niso pa omejeni na: (i) viabilnost; (ii) pregradno funkcijo; (iii) morfologijo; (iv) ponovljivost in napovedljivost; (v) nadzor kakovosti modela: — podrobnejše informacije o uporabljenem postopku testiranja, — uporabljeni testni odmerki, čas izpostavljenosti in inkubacijska doba po testiranju, — opis vseh sprememb postopka testiranja, — sklicevanje na podatke o modelu, pridobljene v preteklosti. Ti lahko vključujejo, niso pa omejeni na: (i) sprejemljivost podatkov o nadzoru kakovosti s sklicevanjem na podatke o seriji, pridobljene v preteklosti; (ii) sprejemljivost vrednosti pozitivne in negativne kontrole s sklicevanjem na pozitivna ter negativna kontrolna sredstva in razpone, — opis uporabljenih meril za ocenjevanje, vključno z zagovorom izbire mejne(-ih) vrednosti za napovedni model. Rezultati: — evidentiranje podatkov posameznih testnih vzorcev, — opis vseh ostalih opaženih vplivov. Razprava o rezultatih. Sklepi. 4. VIRI (1) United Nations (UN) (2007) Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), druga revidirana izdaja, ZN, New York in Ženeva, 2007. Na voljo na spletni strani: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html. (2) REACH: Guidance on Information Requirements and Chemical Safety Assessment. Na voljo na spletni strani: http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/information_requirements_en.htm?time=1232447649. (3) Test Method B.4, ACUTE TOXICITY; DERMAL IRRITATION/CORROSION. (4) Test Method B.40, IN VITRO SKIN CORROSION: TRANSCUTANEOUS ELECTRICAL RESISTANCE TEST TER. (5) Test Method B.40 a, IN VITRO SKIN CORROSION: HUMAN SKIN MODEL TEST. (6) OECD (2006), Test Guideline 435. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. In Vitro Membrane Barrier Test Method. Prevzeto 19. julija 2006. Na voljo na spletni strani: http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html. (7) ECVAM (2009), Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Na voljo pod Download Study Documents na spletni strani: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. (8) Fentem, J. H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G. R., Harbell, J. W., Heylings, J. R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J. J. M. in Botham, P. (2001), A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in Vitro, 15, 57–93. (9) Portes, P., Grandidier, M. H., Cohen, C. in Roguet, R.(2002), Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study, Toxicology in Vitro, 16, 765–770. (10) Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. in Spielmann, H. (2004), Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests, ALTEX 21, 107–114. (11) Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. in Spielmann H. (2005), The EpiDerm Test Protocol fort the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests – An Assessment of the Performance of the Optimised Test, ATLA 33, 351–367. (12) Cotovio, J., Grandidier, M.–H., Portes, P., Roguet, R. in Rubinsteen, G. (2005), The In Vitro Acute Skin Irritation of Chemicals: Optimisation of the EPISKIN Prediction Model within the Framework of the ECVAM Validation Process, ATLA 33, 329–249. (13) Zuang, V., Balls, M., Botham, P. A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R. D., Elliot, G. R., Fentem, J. H., Heylings, J. R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J. J. M., Wiemann, C. in Worth, A. (2002), Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. ECVAM Skin Irritation Task Force Report 2, ATLA 30,109–129. (14) Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. in Zuang, V. (2007), The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test, ATLA 35, 559–601. (15) Hoffmann, S. (2006), ECVAM Skin Irritation Validation Study Phase II: Analysis of the Primary Endpoint MTT and the Secondary Endpoint IL1-α, str. 135 + priloge. Na voljo pod Download Study Documents na spletni strani: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. (16) Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. in Zuang V. (2007), ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals, ATLA 35, 603–619. (17) Cotovio, J., Grandidier, M–H., Lelièvre, D., Roguet, R., Tinois-Tessonneaud, E., Leclaire, J. (2007), In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy -Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, Special Issue-proceedings from WC6, zvezek 14, 351–358. (18) ESAC statement on updated EpiDerm and similar SkinEthic assays, 5. november 2008. (19) ES (2006). Uredba (ES) št. 1907/2006 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 18. decembra 2006 o registraciji, evalvaciji, avtorizaciji in omejevanju kemikalij (REACH), o ustanovitvi Evropske agencije za kemikalije ter spremembi Direktive 1999/45/ES ter razveljavitvi Uredbe Sveta (EGS) št. 793/93 in Uredbe Komisije (ES) št. 1488/94 ter Direktive Sveta 76/769/EGS in direktiv Komisije 91/155/EGS, 93/67/EGS, 93/105/ES in 2000/21/ES. Uradni list Evropske unije L 396, 30.12.2006, str. 1. OPOCE, Luxembourg. (20) Mosman, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity asssays. Journal of Immunological Methods 65, 55–63. (21) EpiSkin™ SOP, izdaja 1.6 (januar 2005), Validation of the EpiSkin Skin Irritation Test – 42 Hours Assay For The Prediction of Acute Skin Irritation of Chemicals. Na voljo pod Download Study Documents na spletni strani: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. (22) EpiDerm™ SOP, izdaja 5.0 (oktober 2004), Draft Standard Operating Procedure. In Vitro Skin Irritation Test: Human Skin Model. Model: EpiDerm™- 200. Na voljo pod Download Study Documents na spletni strani: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. (23) SkinEthic RHE™ SOP. Kmalu na voljo pod Download Study Documents na spletni strani: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. (24) Harvell, J. D., Lamminstausta, K, Maibach H. I. (1995), Irritant contact dermatitis, v: Guin J. D., Practical Contact Dermatitis, Mc Graw-Hill New York, str. 7–18. (25) Griesinger C, Barroso J & Zuang V: ECVAM background document on the recent adaptations of the ECVAM performance standards for in vitro skin irritation testing in the context of the drafting process of an EU test method and an OECD draft test guideline. Ispra, November 13, 2008. Dodatek Ocena učinkovitosti predlaganega modela rekonstruirane človeške pokožnice in vitro za draženje kože UVOD Postopki, ki so predlagani za uporabo v okviru te testne metode, se morajo oceniti tako, da se določi njihova zanesljivost in natančnost ob uporabi snovi, ki predstavljajo celoten razpon rezultatov testa Draize za draženja kože. Ocena predlaganih testnih metod ob uporabi 20 predlaganih referenčnih snovi (tabela 2) mora pokazati, da so ti postopki prav tako zanesljivi in natančni kot validirana referenčna metoda 1 (tabela 3) (1). Standardi natančnosti in zanesljivosti, ki jih je treba doseči, so navedeni v točkah II in III. Nerazvrščene in razvrščene snovi (kategorija 2 GHS ZN), ki predstavljajo ustrezne kemijske razrede, so vključene tako, da je lahko zanesljivost in učinkovitost (občutljivost, specifičnost, lažna negativna stopnja in lažna pozitivna stopnja ter natančnost) predlagane testne metode primerljive z validirano referenčno metodo 1. Zanesljivost testne metode in njena sposobnost zagotovitve ustrezne določitve dražilnih snovi kategorije 2 GHS ZN morata biti določeni pred začetkom uporabe metode za testiranje novih snovi. STANDARDI UČINKOVITOSTI Standardi učinkovitosti zajemajo naslednje tri elemente: I) nujni elementi testne metode, II) referenčne snovi ter III) opredeljene vrednosti natančnosti in zanesljivosti (2). Ti standardi učinkovitosti temeljijo na standardih učinkovitosti, ki so bili opredeljeni po končani študiji Evropskega centra za validacijo alternativnih metod draženja kože (3). I. Nujni elementi testne metode Splošni pogoji modela Za izdelavo epitelija se uporabijo običajni človeški keratinociti. Pod funkcionalno roženo plastjo je več plasti živih epitelijskih celic (bazalna plast, trnasta plast, zrnata plast). Rožena plast je razdeljena na več plasti in vsebuje lipidni profil za močno funkcionalno pregrado za zaustavitev hitre penetracije označevalcev citotoksičnosti, npr. SDS ali Tritona X-100. Funkcija ovire se lahko oceni z določitvijo koncentracije, pri kateri označevalec po določenem času izpostavljenosti zmanjša viabilnost tkiv za 50 % (IC50), ali z določitvijo časa izpostavljenosti, ki je potreben za zmanjšanje viabilnosti celic za 50 % (ET50) po nanosu označevalca v določeni stalni koncentraciji. Zadrževalne značilnosti modela morajo preprečiti prehod materiala okoli rožene plasti v živo tkivo, kar bi preprečilo učinkovitost modelov za raziskovanje v zvezi z izpostavljenostjo kože. V modelu kože ne sme biti bakterij, virusov, mikoplazme ali plesni. Pogoji za funkcionalen model Viabilnost Zaželena analiza za določanje stopnje viabilnosti celic je z MTT (4). Optična gostota izvlečka (topnega) barvila iz negativnega kontrolnega tkiva mora biti vsaj dvajsetkrat večja od optične gostote samega ekstrakcijskega topila. Zabeležiti je treba, da je tkivo NC, kar zadeva celične kulture, v času testiranja stabilno (podobne meritve viabilnosti celic). Pregradna funkcija Rožena plast in njena maščobna sestava morata zadostovati za zaustavitev hitre penetracije citotoksičnih označevalcev, npr. SDS ali Triton X-100, kot se ocenjuje z IC50 ali ET50. Morfologija Histološki pregled rekonstruirane kože/pokožnice za prikaz strukture človeške kože/pokožnici podobne strukture (vključno z večplastno roženo plastjo) mora opraviti ustrezno usposobljeno osebje. Obnovljivost Rezultati metode s posebnim modelom morajo dokazati, da se koža sčasoma obnovi, najbolje z ustrezno (primerjalno) snovjo kontrolne serije (glej opredelitve v oddelku 1.2). Nadzor kakovosti modela Vsaka uporabljena serija modela pokožnice mora izpolnjevati opredeljena merila za sprostitev trga, med katerimi so najpomembnejša merila za viabilnost in za pregradno funkcijo Razpon sprejemljivosti (zgornja in spodnja meja) za IC50 ali ET50 mora določiti dobavitelj modela kože (ali raziskovalec ob uporabi lastnega modela). Značilnosti pregrade tkiv se morajo preveriti v laboratoriju po prejemu tkiv. Le rezultati, ki se dosežejo z ustreznimi tkivi, se lahko vključijo v zanesljivo napovedovanje vplivov draženja kože. Kot primer so spodaj navedeni razponi za validirane referenčne metode. Tabela 1 Primeri meril za nadzor kakovosti serije Spodnja meja sprejemljivosti Vrednost razpona sprejemljivosti Zgornja meja sprejemljivosti Validirana referenčna metoda 1 (18-urno testiranje z SDS) IC50 = 1,0 mg/ml IC50 = 2,32 mg/ml IC50 = 3,0 mg/ml Validirana referenčna metoda 2 (1-odstoten Triton X100) ET50 = 4,8 hr ET50 = 6,7 hr ET50 = 8,7 hr II. Referenčne snovi Referenčne snovi se uporabljajo za določanje, ali sta zanesljivost in natančnost predlagane nove testne metode rekonstruirane človekove pokožnice in vitro, ki se je izkazala za strukturno in funkcionalno dovolj podobno validiranim referenčnim metodam ali ki predstavlja manjšo spremembo validirane referenčne metode, primerljiva z učinkovitostjo validirane referenčne metode 1 (1). Med 20 referenčnimi snovmi, navedenimi v tabeli 2, so snovi, ki predstavljajo različne kemijske razrede in kemikalije iz kategorije 2 GHS ZN. Snovi s tega seznama vključujejo 10 snovi kategorije 2 GHS ZN, 3 snovi iz kategorije 3 GHS ZN in 7 nerazvrščenih snovi. V okviru te metode se neobvezna kategorija 3 ne upošteva. Te referenčne snovi predstavljajo najmanjše možno število snovi, ki jih je treba uporabiti pri ocenjevanju natančnosti in zanesljivosti predlagane testne metode draženja kože z rekonstruirano človeško pokožnico. Če navedena snov ni na voljo, se lahko uporabijo druge snovi, za katere so na voljo ustrezni referenčni podatki in vivo. Po želji se lahko na najkrajši možni seznam referenčnih snovi dodajo druge snovi, ki predstavljajo druge kemijske razrede in za katere so na voljo ustrezni referenčni podatki in vivo, da se dodatno oceni natančnost predlagane testne metode. Tabela 2 Referenčne snovi za določitev vrednosti natančnosti in zanesljivosti za modele rekonstruirane človeške pokožnice za razdraženost kože Snov (1) Št. CAS Št. EINECS Agregatno stanje Rezultat in vivo Kategorija GHS in vitro Kategorija GHS in vivo 1-bromo-4-klorobutan 6940–78–9 230–089–3 Te 0 kat. 2 kat. št. dietil ftalat 84–66–2 201–550–6 Te 0 kat. št. kat. št. naftalen ocetna kislina 86–87–3 201–705–8 Tr 0 kat. št. kat. št. alil fenoksiacetat 7493–74–5 231–335–2 Te 0,3 kat. št. kat. št. izopropanol 67–63–0 200–661–7 Te 0,3 kat. št. kat. št. 4-metiltiobenzaldehid 3446–89–7 222–365–7 Te 1 kat. 2 kat. št. metil stearat 112–61–8 203–990–4 Tr 1 kat. št. kat. št. heptil butirat 5870–93–9 227–526–5 Te 1,7 kat. št. neobvezna kat. 3 heksil salicilat 6259–76–3 228–408–6 Te 2 kat. št. neobvezna kat. 3 triizobutilfosfat 126–71–6 204–798–3 Te 2 kat. 2 neobvezna kat. 3 1-dekanol 112–30–1 203–956–9 Te 2,3 kat. 2 kat. 2 ciklamen aldehid 103–95–7 203–161–7 Te 2,3 kat. 2 kat. 2 1-bromoheksan 111–25–1 203–850–2 Te 2,7 kat. 2 kat. 2 2-klorometil-3,5-dimetil-4-metoksipiridinhidroklorid 86604–75–3 434–680–9 Tr 2,7 kat. 2 kat. 2 a-terpineol 98–55–5 202–680–6 Te 2,7 kat. 2 kat. 2 di-n-propildisulfid 629–19–6 211–079–8 Te 3 kat. št. kat. 2 butil metakrilat 97–88–1 202–615–1 Te 3 kat. 2 kat. 2 benzenetiol, 5–(1,1-dimetiletil)-2-metil 7340–90–1 438–520–9 Te 3,3 kat. 2 kat. 2 1-metil-3-fenil-1-piperazin 5271–27–2 431–180–2 Tr 3,3 kat. 2 kat. 2 heptanal 111–71–7 203–898–4 Te 4 kat. 2 kat. 2 Snovi iz tabele 2 zagotavljajo reprezentativno razdelitev 58 snovi, uporabljenih v mednarodni študiji Evropskega centra za validacijo alternativnih metod draženja kože (1). Njihov izbor temelji na naslednjih merilih: — snovi so na voljo na tržišču, — predstavljajo celoten niz rezultatov testa Draize za draženje kože (od nerazdražene do zelo razdražene kože), — njihova kemična struktura je natančno opredeljena, — predstavljajo sposobnost ponovljivosti in napovedljivosti validirane metode, kot določa validacijska študija Evropskega centra za validacijo alternativnih metod, — predstavljajo kemijsko delovanje, ki je uporabljeno v validacijskem postopku, — niso povezane z zelo strupenim profilom (npr. rakotvornim ali strupenim za reprodukcijski sistem) ali stroški zaradi prepovedane izpostavljenosti tem kemikalijam. III. Opredeljene vrednosti natančnosti in zanesljivosti Učinkovitost (občutljivost, specifičnost, lažna negativna stopnja in lažna pozitivna stopnja ter natančnost) predlagane testne metode morajo biti primerljive z vrednostmi validirane referenčne metode 1 (tabela 3), kar pomeni, da mora biti občutljivost enaka ali večja (≥) kot 80 %, specifičnost enaka ali večja (≥) kot 70 %, natančnost pa enaka ali večja kot (≥) 75 %. Pri izračunu učinkovitosti je treba upoštevati vse razvrstitve 20 snovi, pridobljene v različnih sodelujočih laboratorijih. Vsi laboratoriji morajo pri razvrščanju vseh snovi upoštevati povprečno vrednost viabilnosti v različnih izvedenih ponovitvah testa (najmanj tri veljavne ponovitve). Tabela 3 Učinkovitost validirane referenčne metode 1 (2) Testna metoda Št. snovi Občutljivost Specifičnost Delež lažno negativnih rezultatov Delež lažno pozitivnih rezultatov Natančnost Validirana referenčna metoda 1 (3) 58 87,2 % (4) 71,1 % (5) 12,8 % 29,9 % 74,7 % Validirana referenčna metoda 1 (3) 20 90 % 73,3 % 10 % 26,7 % 81,7 % Zanesljivost predlagane testne metode mora biti primerljiva z zanesljivostjo validiranih referenčnih metod. Ponovljivost v enem laboratoriju Ocena spremenljivosti v laboratoriju mora kazati skladnost razvrstitev (v kategorijo 2/nobeno kategorijo), ki se doseže z različnimi neodvisnimi ponovitvami testa z 20 referenčnimi snovmi v enem laboratoriju in je enaka ali večja (≥) kot 90 %. Ponovljivost v različnih laboratorijih Ocena ponovljivosti v različnih laboratorijih ni potrebna, če se bo predlagana testna metoda uporabljala le v enem laboratoriju. Za metode, ki se bodo uporabljale v več laboratorijih, mora biti skladnost razvrstitev (v kategorijo 2/v nobeno kategorijo), ki se dosežejo z različnimi neodvisnimi ponovitvami testa z 20 referenčnimi snovmi, najbolje v najmanj treh laboratorijih, enaka ali večja (≥) kot 80 %. VIRI (1) Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. in Zuang, V. (2007), The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, 559–601. (2) OECD (2005), Guidance Document No. 34 on the validation and international acceptance of new or updated test methods for hazard assessment. OECD, Pariz. (3) ECVAM (2007), Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Na voljo pod Download Study Documents na spletni strani: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. Prevzeto 27.10.2008. (4) Mosman, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity asssays, Journal of Immunological Methods 65, 55–63. (5) Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. in Zuang. V (2007), ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals, ATLA 35, 603–619. (1) 20 referenčnih snovi predstavlja reprezentativen izbor 58 snovi, ki so se prvotno uporabljale za validacijo referenčne metode 1 (EpiSkin™). Na voljo je celoten seznam testnih snovi in merila za izbor (5). (2) V tabeli 3 je navedena učinkovitost validirane metode 1 v zvezi z njeno sposobnostjo ustrezne opredelitve dražilnih snovi (kategorija 2 GHS ZN) in nerazvrščenih snovi (ki niso v nobeni kategoriji, vključno z neobvezno kategorijo 3) za 58 in 20 referenčnih snovi (tabela 2). (3) EpiSkin™ (4) Na podlagi 13 dražilnih snovi kategorije 2 po GHS. (5) Na podlagi 45 dražilnih snovi kategorije 3 po GHS ali kemikalij, ki niso v nobeni kategoriji po GHS.

PRILOGA IV C.3. SLADKOVODNE ALGE IN CIANOBAKTERIJE, PRESKUS ZAVIRANJA RASTI 1. METODA Ta metoda je enakovredna OECD TG 201 (2006)(1). 1.1 UVOD Preskusne metode se ob upoštevanju znanstvenega napredka redno spreminjajo in posodabljajo. Preskusno metodo C.3 je bilo treba spremeniti zaradi vključitve dodatnih vrst in izpolnitve zahtev za oceno nevarnosti in razvrstitev kemikalij. Spremembe so bile izvedene na podlagi izčrpnih praktičnih izkušenj, znanstvenega napredka na področju študij toksičnosti za alge in ob široki uporabi ustreznih predpisov od njenega prvotnega sprejetja. 1.2 POMEN IZRAZOV Za namene preskusnih metod se uporabljajo naslednje opredelitve in okrajšave: Biomasa: je suha teža žive snovi prisotne v populaciji, izražena v dani prostornini; npr. mg alg/liter preskusne raztopine. „Biomasa“ je običajno opredeljena kot masa, vendar se v tem preskusu ta beseda uporablja za označevanje mase na prostornino. V tem preskusu se običajno merijo tudi nadomestki za biomaso, kot so npr. število celic, fluorescenca itd., zato se izraz „biomasa“ uporablja tudi za meritve teh nadomestkov. Koeficient variacije: je merilo variabilnosti parametra brez merila, opredeljeno kot razmerje med standardnim odstopanjem in povprečjem. Izraziti ga je mogoče tudi kot odstotno vrednost. Srednji koeficient variacije povprečne specifične stopnje rasti v ponovitvenih kontrolnih kulturah se računa tako, kot sledi: 1. Izračuna se KV v odstotkih povprečne specifične stopnje rasti na dan/po posamičnih delih za vsakokratno ponovitev. 2. Izračuna se srednja vrednost vseh izračunanih vrednosti v točki 1, da se pridobi srednji koeficient variacije specifične stopnje rasti na dan/po posamičnih delih v ponovitvenih kontrolnih kulturah. ECx : je koncentracija preskusne snovi, raztopljene v preskusnem mediju, katere rezultat je x % (npr. 50 %) zmanjšanje rasti preskusnega organizma v ustreznem obdobju izpostavljenosti (navesti v primeru odstopanja od polnega ali običajnega trajanja preskusa). Za nedvoumno označitev vrednosti EC, pridobljene iz stopnje rasti ali prirasta, se uporabljata simbola „ErC“ ali „EyC“. Rastno gojišče: je povsem sintetično gojišče, v katerem rastejo preskusne alge med izpostavljenostjo preskusni snovi. Preskusne snovi se običajno raztopijo v preskusnem mediju. Stopnja rasti (povprečna specifična stopnja rasti): je logaritemsko povečanje biomase v času izpostavljenosti. Koncentracija z najnižjim opaznim učinkom (LOEC): je najnižja preskušena koncentracija, pri kateri se ugotovi statistično pomemben učinek snovi na zmanjšanje rasti (pri p < 0,05) v primerjavi s kontrolnim vzorcem v ustreznem času izpostavljenosti. Vendar pa morajo imeti vse preskusne koncentracije nad LOEC škodljiv učinek, ki je enak ali večji od učinka, opazovanega pri LOEC. Če teh dveh pogojev ni mogoče izpolniti, je treba izčrpno razložiti, na kak način je bila izbrana LOEC (in ne NOEC). Koncentracija brez opaznega učinka (NOEC): je preskusna koncentracija tik pod LOEC. Odvisna spremenljivka: je spremenljivka za ocenitev toksičnosti, izpeljana iz katerih koli izmerjenih parametrov, ki opisujejo biomaso z drugačno računsko metodo. Za to metodo sta stopnja rasti in prirasta odvisni spremenljivki, neposredno izpeljani iz izmerjene biomase ali katerega koli omenjenega nadomestka. Specifična stopnja rasti: je odvisna spremenljivka, opredeljena kot količnik razlike naravnih logaritmov opazovanega parametra (v tej preskusni metodi je to biomasa) in upoštevanega časovnega obdobja. Prirast: je vrednost izmerjene spremenljivke ob koncu obdobja izpostavljenosti manj vrednost izmerjene spremenljivke ob začetku obdobja izpostavljenosti, s katero se izrazi povečanje biomase med preskusom. 1.3 UPORABA PRESKUSA Ta preskusna metoda se najlažje uporabi pri vodotopnih snoveh, za katere je verjetno, da bodo v pogojih preskusa ostale v vodi. Za preskušanje snovi, ki so hlapne, močno adsorptivne, obarvane in slabo topne v vodi, ali snovi, ki lahko vplivajo na razpoložljivost hranilnih snovi ali mineralov v preskusnem mediju, so morda potrebne nekatere prilagoditve opisanega postopka (npr. zaprt sistem ali hlajenje preskusnih posod). Navodila za nekaj primernih prilagoditev so navedena v (2), (3) in (4). 1.4 PRINCIP PRESKUSA Namen tega preskusa je določiti učinke snovi na rast sladkovodnih mikroalg in/ali cianobakterij. Preskusni organizmi v eksponentni fazi rasti se v šaržnih kulturah izpostavijo preskusni snovi ponavadi za 72 ur. Kljub relativno kratkemu trajanju preskusa je mogoče oceniti učinke na več generacijah. Odziv sistema je zmanjšanje rasti pri vrsti kultur alg (preskusnih enot), ki so izpostavljene različnim koncentracijam preskusne snovi. Odziv je ocenjen v odvisnosti od koncentracije izpostavljenosti v primerjavi s povprečno rastjo ponovitvenih, neizpostavljenih kontrolnih kultur. Za popolno izražanje odziva sistema na toksične učinke (optimalna občutljivost) se kulturam za merjenje zmanjšanja specifične stopnje rasti omogoči neomejena eksponentna rast pod zadostnimi prehranskimi pogoji ter stalno svetlobo v zadostnem časovnem obdobju. Rast in zaviranje rasti sta določena z meritvami biomase alg v odvisnosti od časa. Biomasa alg je opredeljena kot suha teža na prostornino, npr. mg alg/liter preskusne raztopine. Vendar je suho težo težko meriti, zato se uporabljajo nadomestni parametri. Od teh nadomestkov se najpogosteje uporablja število celic. Drugi nadomestni parametri vključujejo prostornino celic, fluorescenco, optično gostoto itn. Pretvorni faktor med izmerjenim nadomestnim parametrom in biomaso mora biti znan. Končna točka preskusa je zaviranje rasti, izraženo kot logaritmično povečanje biomase (povprečne specifične stopnje rasti) med obdobjem izpostavljenosti. Iz povprečnih specifičnih stopenj rasti, zabeleženih v vrsti preskusnih raztopin, je koncentracija, ki doseže določeno zaviranje rasti x % (npr. 50 %), določena in izražena kot ErCx (npr. ErC50). Za rabo te metode v zakonodajnem okviru EU bi morali za izračun rezultatov uporabiti povprečno specifično hitrost rasti iz razlogov, opisanih v oddelku 2.2 spodaj. Dodatna odvisna spremenljivka, ki se uporablja za to preskusno metodo, je prirastek, ki je lahko potreben za izpolnitev zakonodajnih zahtev v nekaterih državah. Opredeljen je kot biomasa na koncu obdobja izpostavljenosti manj biomasa na začetku obdobja izpostavljenosti. Iz prirastka, zabeleženega v vrsti preskusnih raztopin, se koncentracija, ki doseže določeno zaviranje prirastka x % (npr. 50 %), izračuna in izrazi kot EyCx (npr. EyC50). Zraven tega je mogoče statistično določiti koncentracijo z najnižjim opaznim učinkom (LOEC) in koncentracijo brez opaznega učinka (NOEC). 1.5 PODATKI O PRESKUSNI SNOVI Podatki o preskusni snovi, ki so lahko uporabni pri vzpostavitvi preskusnih pogojev, vključujejo strukturno formulo, stopnjo čistosti, stabilnost na svetlobi, stabilnost pod pogoji preskusa, lastnosti absorpcije svetlobe, pKa in rezultate raziskav o preoblikovanju, vključno z biološko razgradljivostjo v vodi. Topnost v vodi, porazdelitveni koeficient oktanol/voda (Pov) in parni tlak preskusne snovi morajo biti znani, razpoložljiva pa mora biti tudi validirana metoda za količinsko opredelitev snovi v preskusnih raztopinah skupaj z navedeno rekuperacijo in mejo zaznavnosti. 1.6 REFERENČNA SNOV Referenčna snov/referenčne snovi, kot je na primer 3,5-diklorofenol, ki se uporablja za mednarodni prstanasti preskus (4), se lahko preskusi kot sredstvo preskušanja preskusnega postopka. Kot referenčna snov za zelene alge se prav tako lahko uporabi kalijev dikromat. Referenčno snov je zaželeno preskusiti vsaj dvakrat letno. 1.7 VELJAVNOST PRESKUSA Za veljavnost preskusa morajo biti izpolnjena naslednja izvedbena merila: — Biomasa v kontrolnih kulturah se mora v 72 urah preskusnega obdobja eksponentno povečati za faktor najmanj 16. To ustreza specifični stopnji rasti v 0,92 dneva1. Za najpogosteje uporabljene vrste je stopnja rasti ponavadi bistveno višja (glej Dodatek 1). Merilo ni izpolnjeno, kadar se uporabijo vrste, ki rastejo počasneje od tistih, ki so navedene v Dodatku 1. V tem primeru se mora preskusno obdobje podaljšati, da se zagotovi 16-kratna rast v kontrolnih kulturah, medtem ko mora biti rast eksponentna skozi celotno preskusno obdobje. Preskusno obdobje se lahko skrajša za najmanj 48 ur za ohranitev neomejene eksponentne rasti med preskusom, dokler je dosežen minimalni množitelj 16. — Povprečni koeficient variacije za posamične specifične stopnje rasti (dnevi 0–1, 1–2 in 2–3, za 72-urne preskuse) v kontrolnih kulturah (glej poglavje 1.2 v „koeficient variacije“) ne sme prekoračiti 35 %. Za računanje posamičnih specifičnih stopenj rasti glej drugi odstavek v poglavju 2.2.1. Merilo se uporablja za povprečno vrednost koeficientov variacije, izračunanih za ponovitvene kontrolne kulture. — Koeficient variacije za povprečne specifične stopnje rasti med celotnim preskusnim obdobjem v ponovitvenih kontrolnih kulturah ne sme prekoračiti 7 % v preskusih z zelenimi algami Pseudokirchneriella subcapitata in Desmodesmus subspicatus. Za druge manj pogosto preskušene vrste vrednost ne sme prekoračiti 10 %. 1.8 OPIS METODE 1.8.1 Aparatura Preskusne posode in drugi aparature, ki pridejo v stik s preskusnimi raztopinami, morajo biti v celoti iz stekla ali drugega kemijsko inertnega materiala. Predmete je treba temeljito umiti, da organski ali anorganski onesnaževalci ne ovirajo rasti alg ali sestave preskusnih raztopin. Preskusne posode so ponavadi steklene bučke z dimenzijami, ki dopuščajo zadostno prostornino kulture za meritve med preskusom in zadosten prenos mase CO2 iz ozračja (glej drugi odstavek v poglavju 1.8.9). Količina tekočine mora biti zadostna za analitsko določanje (glej peti odstavek v poglavju 1.8.11). Potrebna je tudi nekatera ali vsa oprema v nadaljevanju: — Inkubator za kultiviranje: priporoča se omara ali soba, v kateri se lahko izbrana temperatura inkubacije vzdržuje na ±2 °C. — Naprave za merjenje svetlobe: treba je poudariti, da bo metoda za merjenje jakosti svetlobe in še zlasti vrsta sprejemnika (odjemnika) vplivala na izmerjeno vrednost. Meritve naj se po možnosti izvajajo z uporabo okroglega (4 π) sprejemnika (ki reagira na neposredno in odbito svetlobo iz vseh kotov nad in pod ravnino meritve) ali sprejemnika 2 π (ki reagira na svetlobo iz vseh kotov nad ravnino meritve). — Aparatura za določanje biomase alg: število celic, ki je najpogosteje uporabljen nadomestni parameter za biomaso alg, se lahko izvede z uporabo elektronskega števca delcev, mikroskopa s števno komoro ali pretočnega citometra. Za merjenje drugih nadomestkov biomase se lahko uporabljajo pretočni citometer, fluorimeter, spektrofotometer ali kolorimeter. Pretvorni faktor, ki povezuje število celic s suho težo, je koristen za preračunavanje. Zaradi zagotovitve uporabnih meritev pri nizkih koncentracijah biomase, ko se uporablja spektrofotometer, je morda treba uporabiti kivete s svetlobno potjo vsaj 4 cm. 1.8.2 Preskusni organizmi Uporabi se lahko nekaj vrst nepritrjenih mikroalg in cianobakterij. Sevi, navedeni v Dodatku 1, so se izkazali kot primerni za uporabo preskusnega postopka, določenega v tej preskusni metodi. Pri uporabi drugih vrst je treba poročati o sevu in/ali izvoru. Treba je potrditi, da se lahko eksponentna rast izbrane preskusne alge ohrani skozi celotno preskusno obdobje pod prevladujočimi pogoji. 1.8.3 Rastno gojišče Priporočata se dve alternativni rastni gojišči; gojišče OECD in gojišče AAP. Sestave teh gojišč so prikazane v Dodatku 2. Začetna pH vrednost ter kapaciteta pufrov (ki ureja porast pH) sta v teh dveh gojiščih različni. Zato so rezultati preskusov lahko različni, odvisno od uporabljenega gojišča, še posebno pri preskušanju ionizirajočih snovi. Morda bo za nekatere namene, npr. pri preskušanju kovin in kelatnih reagentov ali pri preskušanju pri različnih pH vrednostih, treba prilagoditi rastno gojišče. Uporaba prilagojenega gojišča mora biti podrobno opisana in utemeljena (3)(4). 1.8.4 Začetna koncentracija biomase Začetna biomasa v preskusnih kulturah mora biti enaka v vseh preskusnih kulturah in zadostno nizka, da dopušča eksponentno rast skozi celotno inkubacijsko obdobje brez tveganja izčrpanja hranilnih snovi. Začetna biomasa kot suha snov ne sme prekoračiti 0,5 mg/l. Priporočene so naslednje začetne koncentracije celic: Pseudokirchneriella subcapitata: 5 × 103–104 celic/ml Desmodesmus subspicatus 2–5 × 103 celic/ml Navicula pelliculosa 104 celic/ml Anabaena flos-aquae 104 celic/ml Synechococcus leopoliensis 5 × 104–105 celic/ml 1.8.5 Koncentracija preskusne snovi Območje koncentracije, v katerem se lahko pojavijo učinki, je lahko določeno na osnovi rezultatov iz preskusov za ugotavljanje območja. Za zadnji dokončni preskus naj se izbere najmanj pet koncentracij, razvrščenih v geometrijskih vrstah s faktorjem, ki ne presega 3,2. Za preskusno snov, ki kaže ravno krivuljo odziva koncentracije, je lahko določen višji faktor. Serije koncentracij naj po možnosti pokrivajo območje, ki povzroča 5–75-odstotno zaviranje stopnje rasti alg. 1.8.6 Ponovitve in kontrolni vzorci Načrt preskusa mora vključevati tri ponovitve za vsako preskusno koncentracijo. Če ni zahtevana določitev NOEC, se lahko načrt preskusa prilagodi, da se poveča število koncentracij in zmanjša število ponovitev na koncentracijo. Izvedejo se najmanj tri kontrolne ponovitve, v idealnih razmerah pa naj se uporabi dvakratno število ponovitev za vsako preskusno koncentracijo. Za analitsko določanje koncentracij preskusne snovi se lahko pripravi ločena serija preskusnih raztopin (glej četrti in šesti odstavek v poglavju 1.8.11). Kadar se za raztapljanje preskusne snovi uporabi topilo, morajo biti v preskusni načrt vključene dodatne kontrolne kulture, ki vsebujejo topilo pri enaki koncentraciji, kot je bila uporabljena pri preskusnih kulturah. 1.8.7 Priprava kulture inokuluma Kultura inokuluma se pripravi v preskusnem mediju 2–4 dni pred začetkom preskusa zaradi prilagoditve preskusnih alg preskusnim pogojem in zagotovitve, da so alge v eksponentni fazi rasti, ko se uporabijo za inokulacijo preskusnih raztopin. Algalno biomaso je treba prilagoditi, da lahko eksponentna rast do začetka preskusa prevlada v kulturi inokuluma. Kultura inokuluma se inkubira pod enakimi pogoji kot preskusne kulture. V kulturi inokuluma se meri porast biomase, da se zagotovi rast znotraj normalnega obsega za preskusni sev pod pogoji kultiviranja. Primer postopka za kultiviranje alg je opisa