Ta dokument je mišljen zgolj kot dokumentacijsko orodje in institucije za njegovo vsebino ne prevzemajo nobene 
odgovornosti  
►B UREDBA KOMISIJE (ES) št. 440/2008  
z dne 30. maja 2008  
o določitvi testnih metod v skladu z Uredbo (ES) št. 1907/2006 Evropskega parlamenta in Sveta o 
registraciji, evalvaciji, avtorizaciji in omejevanju kemikalij (REACH)  
(Besedilo velja za EGP)  
(UL L 142, 31.5.2008, str. 1)  
spremenjena z:  
Uradni list  
št. stran  datum  
►M1 Uredba Komisije (ES) št. 761/2009 z dne 23. julija 2009  L 220  1  24.8.2009  
►M2 Uredba Komisije (EU) št. 1152/2010 z dne 8. decembra 2010  L 324  13  9.12.2010  
►M3 Uredba Komisije (EU) št. 640/2012 z dne 6. julija 2012  L 193  1  20.7.2012  
►M4 Uredba Komisije (EU) št. 260/2014 z dne 24. januarja 2014  L 81  1  19.3.2014  
►M5 Uredba Komisije (EU) št. 900/2014 z dne 15. julija 2014  L 247  1  21.8.2014  2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1
UREDBA KOMISIJE (ES) št. 440/2008  
z dne 30. maja 2008  
o določitvi testnih metod v skladu z Uredbo (ES) št. 1907/2006 
Evropskega parlamenta in Sveta o registraciji, evalvaciji, 
avtorizaciji in omejevanju kemikalij (REACH)  
(Besedilo velja za EGP)  
KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE –  
ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske skupnosti, ob upoštevanju Uredbe (ES) št. 1907/2006 Evropskega parlamenta in 
Sveta z dne 18. decembra 2006 o registraciji, evalvaciji, avtorizaciji in omejevanju kemikalij (REACH), o ustanovitvi Evropske agencije za kemikalije ter spremembi Direktive 1999/45/ES ter razveljavitvi Uredbe Sveta (EGS) št. 793/93 in Uredbe Komisije (ES) št. 1488/94 ter Dire ­
ktive Sveta 76/769/EGS in direktiv Komisije 91/155/EGS, 93/67/EGS, 93/105/ES in 2000/21/ES (
 1 ) ter zlasti člena 13(3) Uredbe, 
ob upoštevanju naslednjega:  
(1) V skladu z Uredbo (ES) št. 1907/2006 je treba testne metode 
sprejeti na ravni Skupnosti za namene testiranja snovi, kadar so takšni testi potrebni za pridobitev informacij o bistvenih lastno ­
stih snovi.
 
(2) Direktiva Sveta 67/548/EGS z dne 27. junija 1967 o približevanju 
zakonov in drugih predpisov v zvezi z razvrš čanjem, pakiranjem 
in označevanjem nevarnih snovi (  2 ) je v Prilogi V dolo čila 
metode za ugotavljanje fizikalno-kemijskih lastnosti, toksi čnosti 
in ekotoksi čnosti snovi in pripravkov. Priloga V Direktive 
67/548/EGS je bila črtana z Direktivo 2006/121/ES Evropskega 
parlamenta in Sveta z u činkom od 1. junija 2008.  
(3) Testne metode iz Priloge V k Direktivi 67/548/EGS je treba 
vključiti v to uredbo.  
(4) Ta uredba ne izklju čuje uporabe drugih testnih metod, če je 
njihova uporaba v skladu s členom 13(3) Uredbe 1907/2006.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 2  
( 1 ) UL L 396, 30.12.2006, str. 1. Popravljena razli čica v UL L 136, 29.5.2007, str. 3. 
( 2 ) UL P 196, 16.8.1967, str. 1. Direktiva, kakor je bila nazadnje spremenjena 
z Direktivo 2006/121/ES Evropskega parlamenta in Sveta (UL L 396, 30.12.2006, str. 850). Popravljena razli čica v UL L 136, 29.5.2007, str. 281.
 (5) Načela nadomestitve, zmanjšanja in izboljšanja uporabe živali 
v postopkih se morajo popolnoma upoštevati pri oblikovanju testnih metod, zlasti če so na voljo ustrezne potrjene metode, ki 
lahko nadomestijo, zmanjšajo ali izboljšajo poskuse na živalih.
 
(6) Določbe te uredbe so v skladu z mnenjem odbora, ustanovljenega 
v skladu s členom 133 Uredbe (ES) št. 1907/2006 –  
SPREJELA NASLEDNJO UREDBO:  
Člen 1  
Testne metode, ki jih je treba uporabiti za namene Uredbe 
1907/2006/ES, so dolo čene v Prilogi k tej uredbi.  
Člen 2  
Komisija bo po potrebi pregledala testne metode iz te uredbe, da se 
nadomestijo, zmanjšajo ali izboljšajo poskusi na vreten čarjih.  
Člen 3  
Vsi sklici na Prilogo V k Direktivi 67/548/EGS se razlagajo kot sklici 
k tej uredbi.  
Člen 4  
Ta uredba za čne veljati dan po objavi v  Uradnem listu Evropske unije . 
Uporablja se od 1. junija 2008.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 3
 
PRILOGA  
DEL A: METODE ZA DOLO ČANJE FIZIKALNO-KEMIJSKIH 
LASTNOSTI  
KAZALO 
A.1 TALIŠ ČE/ZMRZIŠ ČE 
A.2 VRELIŠ ČE 
A.3 RELATIVNA GOSTOTA A.4 PARNI TLAK A.5 POVRŠINSKA NAPETOST 
A.6 TOPNOST V VODI 
A.8 PORAZDELITVENI KOEFICIENT A.9 PLAMENIŠ ČE 
A.10 VNETLJIVOST (TRDNE SNOVI) 
A.11 VNETLJIVOST (PLINI) A.12 VNETLJIVOST (STIK Z VODO) 
A.13 PIROFORNE LASTNOSTI TRDNIH SNOVI IN TEKO ČIN 
A.14 EKSPLOZIVNE LASTNOSTI A.15 TEMPERATURA SAMOVŽIGA (TEKO ČINE IN PLINI) 
A.16 RELATIVNA TEMPERATURA SAMOVŽIGA ZA TRDNE 
SNOVI 
A.17 OKSIDACIJSKE LASTNOSTI (TRDNE SNOVI) 
A.18 POVPRE ČNO ŠTEVILO MOLEKULSKE MASE IN PORAZDE ­
LITEV MOLEKULSKE MASE POLIMEROV . 
A.19 VSEBNOST POLIMEROV NIZKE MOLEKULSKE MASE A.20 OBNAŠANJE RAZTOPINE/IZVLE ČKA POLIMEROV V VODI 
A.21 OKSIDATIVNE LASTNOSTI (TEKO ČE SNOVI) 
A.22. GEOMETRIJSKI SREDNJI PREMER GLEDE NA DOLŽINO 
VLAKEN
 
▼M4 
A.23 PORAZDELITVENI KOEFICIENT (1-OKTANOL/VODA): 
METODA PO ČASNEGA MEŠANJA  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 4
 
A.1 TALIŠ ČE/ZMRZIŠ ČE 
1. METODA  
Večina opisanih metod temelji na smernici za preskušanje OECD(1). 
Temeljna na čela so navedena v virih (2) in (3).  
1.1 UVOD 
Opisane metode in naprave se uporabljajo za dolo čanje tališča snovi 
brez kakršnih koli omejitev glede njihove stopnje čistosti. 
Izbira metode je odvisna od narave preskusne snovi. Tako bo omejit ­
veni dejavnik to, ali je snov lahko, težko ali nemogo če uprašiti. 
Za nekatere snovi je primernejše dolo čanje zmrziš ča ali strdiš ča in 
standardi za te meritve so tudi vklju čeni v to metodo. 
Kadar zaradi posebnih lastnosti snovi ni mogo če ustrezno izmeriti 
nobenega od navedenih parametrov, je morda primerna to čka tečenja.  
1.2 OPREDELITVE IN ENOTE 
Tališče je opredeljeno kot temperatura, pri kateri pride do prehoda iz 
trdnega v teko če agregatno stanje pri atmosferskem tlaku, in je enaka 
zmrzišču. 
Ker fazni prehod številnih snovi poteka v temperaturnem obmo čju, 
se pogosto opiše kot talilno obmo čje. 
Pretvorba enot (K v  o C) 
t = T - 273,15 
t: Celzijeva temperatura, stopinja Celzija (  o C) 
T: termodinami čna temperatura, kelvin (K)  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Referenčnih snovi ni treba uporabiti vsakokrat, ko se preu čuje nova 
snov. Predvsem naj bi se uporabljale za ob časno preverjanje u čin­
kovitosti metode in za omogo čanje primerjave z rezultati drugih 
metod. 
Nekatere snovi za umerjanje so naštete v virih (4).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 5
 
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Določi se temperatura (temperaturno obmo čje) faznega prehoda iz 
trdnega v teko če stanje ali iz teko čega v trdno stanje. To pomeni, da 
se med segrevanjem/hlajenjem vzorca preskusne snovi pri atmosfer ­
skem tlaku dolo čita temperaturi za četne faze taljenja/zmrzovanja in 
končne faze taljenja/zmrzovanja. Opisanih je pet vrst metod, to so 
kapilarna metoda, metode z ogrevalno mizico, metode za dolo čanje 
zmrzišča, metode termi čne analize in metoda za dolo čanje točke 
tečenja (kakor je bila razvita za nafto). 
V nekateri primerih je lahko pripravneje izmeriti zmrziš če namesto 
tališča. 
1.4.1  Kapilarna metoda  
1.4.1.1  Naprave za merjenje tališ ča s tekočinsko kopeljo  
V kapilarno cevko damo majhno koli čino drobno zmlete snovi in jo 
dobro potla čimo. Cevko segrevamo skupaj s termometrom in med 
dejanskim taljenjem prilagodimo naraš čanje temperature na manj kot 
približno 1 K/min. Dolo čimo začetno in kon čno talilno temperaturo.  
1.4.1.2  Naprave za merjenje tališ ča s kovinskim blokom  
Kakor je opisano v 1.4.1.1, le da sta kapilarna cevka in termometer 
postavljena v ogrevan kovinski blok; opazujemo ju lahko skozi luknje v bloku.
 
1.4.1.3  Fotoceli čna detekcija  
Vzorec v kapilarni cevki se avtomati čno segreva v kovinskem valju. 
Skozi luknjo v valju se usmeri žarek svetlobe skozi snov na 
natančno umerjeno fotocelico. Opti čne lastnosti ve čine snovi se 
med taljenjem spremenijo, prej neprozorne postanejo prozorne. Jakost svetlobe, ki doseže fotocelico, naraste in pošlje signal za 
konec digitalnemu indikatorju, ki od čitava temperaturo na platinskem 
uporovnem termometru v grelni komori. Ta metoda ni primerna za nekatere mo čno obarvane snovi.
 
1.4.2  Ogrevalna mizica  
1.4.2.1  Koflerjeva ogrevalna ploš ča 
Za Koflerjevo ogrevalno ploš čo se uporabita dva kosa kovine z 
različno toplotno prevodnostjo, elektri čno ogrevana, s ploš čo, zasno­
vano tako, da je vzdolž nje sprememba temperature skoraj linearna. Temperatura ogrevalne ploš če je lahko od 283 do 573 K in se od čita 
s posebno napravo, ki vklju čuje premi čno kolesce s kazalcem in 
jezičkom, zasnovano za posamezno ploš čo. Za dolo čanje tališča, se 
snov v tanki plasti nanese neposredno na površino ogrevalne ploš če. 
V nekaj sekundah se pojavi ostra razmejitvena črta med teko čo in 
trdno fazo. Temperatura na razmejitveni črti se odčita tako, da se 
nanjo naravna kazalec.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 6
 
1.4.2.2  Talilni mikroskop  
Za določanje tališča z zelo majhnimi koli činami materiala se upora ­
blja več mikroskopskih grelnih mizic. Pri ve čini grelnih mizic se 
temperatura meri z ob čutljivim termo členom, vendar se v časih upora ­
blja tudi živosrebrni termometer. Zna čilna mikroskopska aparatura z 
ogrevalnimi mizicami za dolo čanje tališ ča ima grelno komoro, ki 
vsebuje kovinsko ploš čo, na katero položimo vzorec na objektnem 
stekelcu. Na sredini kovinske ploš če je luknjica, ki omogo ča vstop 
svetlobe s kolektorja mikroskopa. Med uporabo je komora zaprta s 
stekleno ploš čo, ki prepre čuje vdor zraka v obmo čje vzorca. 
Segrevanje vzorca se uravnava z reostatom. Za zelo natan čne meritve 
pri optično anizotropnih snoveh se lahko uporabi polarizirana svetloba.  
1.4.2.3  Metoda z meniskusom  
Ta metoda se uporablja posebej za poliamide. 
Vizualno se dolo či temperatura, pri kateri se premakne meniskus 
silikonskega olja, ki je med ogrevalno mizico in krovnim stekelcem na preskusnem vzorcu poliamida.
 
1.4.3  Metoda za dolo čanje zmrziš ča 
Vzorec se da v posebno epruveto, ta pa v aparaturo za dolo čanje 
zmrzišča. Vzorec se ohlaja in ves čas rahlo meša in v primernih 
intervalih se meri temperatura. Ko je temperatura pri nekaj zapo ­
rednih od čitkih nespremenjena, se ta temperatura (popravljena z 
upoštevanjem napake termometra) zapiše kot zmrziš če. 
Treba je prepre čiti podhladitev, in sicer tako da se vzdržuje ravno ­
težje med trdno in teko čo fazo.  
1.4.4  Termi čna analiza  
1.4.4.1  Diferen čna termična analiza (DTA)  
Pri tej tehniki se beleži razlika v temperaturi snovi in referen čnega 
materiala v odvisnosti od temperature, pri čemer se na snovi in na 
referenčnem materialu izvaja isti nadzorovani temperaturni program. 
Ko gre vzorec skozi fazni prehod, ki vklju čuje spremembo entalpije, 
se ta sprememba pokaže kot endotermni (tališ če) ali eksotermni 
(zmrzišče) odmik od bazne črte zapisa temperature.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 7
 
1.4.4.2  Diferen čna dinami čna kalorimetrija (DSC)  
Pri tej tehniki se beleži razlika v vnosu energije v snov in referen čni 
material v odvisnosti od temperature, pri čemer se na snovi in refe ­
renčnem materialu izvaja isti nadzorovani temperaturni program. Ta 
energija je energija, ki je potrebna za izena čitev temperature snovi in 
referenčnega materiala. Ko gre vzorec skozi fazni prehod, ki vklju ­ 
čuje spremembo entalpije, se ta sprememba pokaže kot endotermni 
(tališče) ali eksotermni (zmrziš če) odmik od bazne črte zapisa toplot ­
nega pretoka.  
1.4.5  To čka tečenja 
Ta metoda je bila razvita za nafto in je primerna za oljaste snovi z 
nizkim tališ čem. 
Po predhodnem segrevanju se vzorec ohlaja s to čno določeno 
hitrostjo in v intervalih 3 K se opazujejo zna čilnosti tečenja. Najnižja 
temperatura, pri kateri se še opazi premikanje snovi, se zapiše kot 
točka tečenja.  
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Uporabnost in to čnost različnih metod, ki se uporabljajo za dolo čanje 
tališča/talilnega obmo čja, sta navedeni v naslednji tabeli:  
TABELA: UPORABNOST METOD  
A. Kapilarne metode  
Merilna metoda Snovi, ki jih je 
mogoče uprašiti Snovi, ki jih ni 
mogoče zlahka 
uprašiti Temperaturno 
območje Ocenjena 
točnost (  1 ) Veljavni standard  
Naprave za 
merjenje tališ ča s 
tekočinsko kopeljo da le za nekatere 273 do 573 K ± 0,3 K JIS K 0064 
Naprave za 
merjenje tališ ča s 
kovinskim blokom da le za nekatere 293 do > 573 K ± 0,5 K ISO 1218(E) 
Fotocelična detek­
cija da za številne z 
uporabo prila ­
goditvenih 
naprav 253 do 573 K ± 0,5 K  
( 1 ) Odvisno od vrste instrumenta in stopnje čistosti snovi.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 8
 
B. Metode z ogrevalnimi mizicami in metode za dolo čanje zmrziš ča 
Merilna metoda Snovi, ki jih je 
mogoče uprašiti Snovi, ki jih ni 
mogoče zlahka 
uprašiti Temperaturno 
območje Ocenjena 
točnost (  1 ) Veljavni standard  
Koflerjeva ogre ­
valna ploš ča da ne 283 do > 573 K ± 1 K ANSI/ASTM D 
3451-76 
Talilni mikroskop da le za nekatere 273 do > 573 K ± 0,5 K DIN 53736 
Metoda z meni ­
skusom ne posebej za 
poliamide 293 do > 573 K ± 0,5 K ISO 1218 (E) 
Metode za dolo ­ 
čanje zmrziš ča da da 223 do 573 K ± 0,5 K npr. BS 4695  
( 1 ) Odvisno od vrste instrumenta in stopnje čistosti snovi.  
C. Termi čna analiza  
Merilna metoda Snovi, ki jih je 
mogoče uprašiti Snovi, ki jih ni 
mogoče zlahka 
uprašiti Temperaturno 
območje Ocenjena 
točnost (  1 ) Veljavni standard  
Diferenčna 
termična analiza da da 173 do 1 273 K do 
600 K ±0,5 K do 
1 273 K ±2,0 K ASTM E 537-76 
Diferenčna dina­
mična kalorime ­
trija da da 173 do 1 273 K Do 
600 K ±0,5 K do 
1 273 K ±2,0 K ASTM E 537-76  
( 1 ) Odvisno od vrste instrumenta in stopnje čistosti snovi.  
D. Točka tečenja  
Merilna metoda Snovi, ki jih je 
mogoče uprašiti Snovi, ki jih ni 
mogoče zlahka 
uprašiti Temperaturno 
območje Ocenjena 
točnost (  1 ) Veljavni standard  
Točka tečenja za nafto in 
oljaste snovi za nafto in 
oljaste snovi 223 do 323 K ±3,0 K ASTM D 97-66  
( 1 ) Odvisno od vrste instrumenta in stopnje čistosti snovi.  
1.6 OPIS METOD 
Postopki skoraj vseh preskusnih metod so opisani v mednarodnih in 
nacionalnih standardih (glej dodatek 1).  
1.6.1  Metode s kapilarno cevko  
Kadar se drobno uprašene snovi po časi segrevajo, se obi čajno poka ­ 
žejo talilne faze s slike 1.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 9
 
Slika 1
  
Pri določanju tališ ča zapišemo temperaturi na za četku taljenja in v 
zadnji fazi.  
1.6.1.1  Naprave za merjenje tališ ča s tekočinsko kopeljo  
Slika 2 prikazuje vrsto standardizirane steklene aparature za merjenje 
tališča (JIS K 0064); vse specifikacije so v milimetrih.  
Slika 2
  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 10
 
Tekočina za kopel:  
Izbrati je treba primerno teko čino. Izbira teko čine je odvisna od 
tališča, ki se dolo ča, npr. teko či parafin za tališ ča do najve č 473 
K, silikonsko olje za tališ ča do najve č 573 K. 
Za tališča, višja od 523 K, se lahko uporabi zmes treh delov 
žveplove kisline in dveh delov kalijevega sulfata (v masnem razmer ­
ju). Pri uporabi take zmesi je treba upoštevati primerne varnostne ukrepe.
 
Termometer:  
Uporabljajo se lahko samo termometri, ki izpolnjujejo zahteve 
naslednjih ali njim enakovrednih standardov: 
ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.  
Postopek:  
Suha snov se na drobno upraši v terilnici in da v na enem koncu 
zataljeno kapilaro, tako da je tesno natla čene snovi v kapilari 
približno 3 mm. Da bo vzorec enakomerno potla čen, je treba kapi ­
laro z višine približno 700 mm spustiti skozi stekleno cevko navpično na urno steklo. 
Napolnjena kapilarna cevka se postavi v kopel, tako da se srednji del 
bučke termometra z živim srebrom dotika kapilarne cevke na delu, 
kjer je vzorec. Obi čajno se kapilarna cevka vstavi v aparaturo pri 
temperaturi približno 10 K pod tališ čem. 
Tekočina kopeli se segreva tako, da temperatura naraš ča približno za 
3 K/min. Teko čino je treba mešati. Pri približno 10 K pod pri čako­
vanim tališ čem se naraš čanje temperature naravna na najve č 1 
K/min.
 
Izračun: 
Tališče izračunamo na naslednji na čin: 
T = T  D + 0,00016 (T  D - T Ě ) n 
pri čemer je: 
T = popravljeno tališ če v K 
T D = odčitana temperatura na termometru D v K 
T E = odčitana temperatura na termometru E v K 
n = število graduacij živosrebrnega stolpca na termometru D na 
delu, ki gleda iz teko čine. 
1.6.1.2  Naprave za merjenje tališ ča s kovinskim blokom  
Aparatura: 
Sestavljajo jo:  
— valjast kovinski blok, katerega zgornji del je votel in predstavlja 
komoro (glej sliko 3), 
— kovinski zamašek z dvema ali ve č luknjami, ki omogo čajo vsta­
vljanje cevk v kovinski blok,  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 11
 
— grelni sistem za kovinski blok, na primer z elektri čnim uporom, 
vgrajenim v blok, 
— reostat za uravnavanje dovoda energije, če se uporabi elektri čno 
gretje, 
— štiri okenca iz stekla, odpornega proti vro čini, v stranskih stenah 
komore, diametralno razporejenih pravokotno drug na drugega. Pred enim od okenc je postavljen okular za opazovanje kapilarne cevke. Ostala tri okenca se uporabljajo za osvetljevanje notra ­
njosti komore z žarnicami,
 
kapilarna cevka iz stekla, odpornega proti vro čini, na enem koncu 
zaprta (glej 1.6.1.1).  
Glej standarde, navedene v 1.6.1.1. Lahko se uporabijo tudi termoe ­
lektrični instrumenti s primerljivo to čnostjo.  
Slika 3
  
1.6.1.3  Fotoceli čna detekcija 
Aparatura in postopek:  
Aparaturo sestavlja kovinska komora z avtomatiziranim grelnim 
sistemom. Tri kapilarne cevke se napolnijo v skladu z 1.6.1.1 in 
postavijo v grelno komoro.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 12
 
Za umerjanje aparature je na voljo ve č linearnih naraš čanj tempera ­
ture in primerno naraš čanje temperature se elektri čno naravna na 
vnaprej dolo čeno konstantno in linearno hitrost naraš čanja. Zapiso ­
valniki kažejo dejansko temperaturo grelne komore in temperaturo snovi v kapilarnih cevkah.
 
1.6.2  Ogrevalne mizice  
1.6.2.1  Koflerjeva ogrevalna ploš ča 
Glej dodatek.  
1.6.2.2  Talilni mikroskop  
Glej dodatek.  
1.6.2.3  Metoda z meniskusom (poliamidi)  
Glej dodatek. 
Hitrost segrevanja v obmo čju tališča mora biti manjša od 1 K/min.  
1.6.3  Metode za dolo čanje zmrziš ča 
Glej dodatek.  
1.6.4  Termi čna analiza  
1.6.4.1  Diferen čna termična analiza  
Glej dodatek.  
1.6.4.2  Diferen čna dinami čna kalorimetrija  
Glej dodatek.  
1.6.5  Delovanje to čke tečenja 
Glej dodatek.  
2. PODATKI  
V nekaterih primerih je potreben popravek termometra.  
3. PORO ČANJE  
V poročilo o preskusu se, če je možno, vklju čijo naslednje informa ­
cije: 
— uporabljena metoda, 
— natančna specifikacija snovi (identiteta in ne čistote) ter pred ­
hodno pre čiščevanje, če je bilo opravljeno, 
— ocena to čnosti. 
Kot tališče se navede srednja vrednost najmanj dveh meritev, ki sta v 
območju predvidene to čnosti (glej tabele).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 13
 
Če je razlika med temperaturo na za četku taljenja in tisto v zadnji 
fazi taljenja znotraj meja to čnosti metode, se kot tališ če navede 
temperatura v zadnji fazi taljenja; sicer pa se navedeta obe tempera ­
turi. 
Če snov razpade ali sublimira, preden se doseže tališ če, se navede 
temperatura, pri kateri so bile opažene te spremembe. 
Navesti je treba vse informacije in opombe, pomembne za razlago 
rezultatov, zlasti glede ne čstot in agregatnega stanja snovi.  
4. VIRI  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the 
Council C(81) 30 final. 
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermody ­
namics, Butterworths, London 1975, vol. II, str. 803–834. 
(3) R. Weissberger éd.: Technique of organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd éd., Interscience Publ., New 
York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII. 
(4) IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference 
materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, str. 505–515.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 14
 
Dodatek  
Dodatne tehni čne podrobnosti se lahko poiš čejo na primer v naslednjih 
standardih.  
1. Kapilarne metode  
1.1 Naprave za merjenje tališ ča s tekočinsko kopeljo 
ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial 
and final melting points and the melting range of organic chemicals 
BS 4634 Method for the determination of 
melting point and/or melting range 
DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles 
von Harzen nach Kapillarverfahren 
JIS K 00-64 Testing methods for melting point of 
chemical products
 
1.2 Naprave za merjenje tališ ča s kovinskim blokom 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen 
Kunststoffen 
ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination 
of „melting point“  
2. Ogrevalne mizice  
2.1 Koflerjeva ogrevalna ploš ča 
ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for 
testing polymeric powder coatings  
2.2 Talilni mikroskop 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen 
Kunststoffen  
2.3 Metoda z meniskusom (poliamidi) 
ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination 
of „melting point“  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 15
 
ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin 
injection moulding and extrusion mate ­
rials 
NF T 51-050 Résines de polyamides. Détermination 
du „point de fusion“ méthode du 
ménisque  
3. Metode za dolo čanje zmrziš ča 
BS 4633 Method for the determination of 
crystallising point 
BS 4695 Method for Determination of Melting 
Point of petroleum wax (Cooling 
Curve) 
DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von 
Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und 
Motorenbenzolen 
ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la 
température de figeage 
DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes 
von Fettsäuren 
NF T 60-114 Point de fusion des paraffines 
NF T 20-051 Méthode de détermination du point de 
cristallisation (point de congélation) 
ISO 1392 Method for the determination of the 
freezing point  
4. Termi čna analiza  
4.1 Diferen čna termična analiza 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by 
methods of differential thermal 
analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 16
 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  
4.2 Difere čna dinami čna kalorimetrija 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by 
methods of differential thermal 
analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  
5. Dolo čanje točke tečenja 
NBN 52014 Echantillonnage et analyse des 
produits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite – Monsterneming en ontleding van 
aardolieproducten: Troebelingspunt en 
vloeipunt 
ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of 
petroleum oils 
ISO 3016 Petroleum oils – Determination of pour 
point
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 17
 
A.2 VRELIŠ ČE 
1. METODA  
Večina opisanih metod temelji na smernici za preskušanje 
OECD (1). Temeljna na čela so navedena v virih (2) in (3).  
1.1 UVOD 
Tukaj opisane metode in naprave se lahko uporabljajo za teko če 
snovi in snovi z nizkim tališ čem, pod pogojem da pri njih ne 
pride do kemi čne reakcije pri temperaturah pod vreliš čem (na primer 
avtooksidacije, prerazporeditve, razgradnje itd.). Te metode se lahko uporabljajo za čiste in ne čiste tekoče snovi. 
Poudarjene so metode s fotoceli čno detekcijo in termi čno analizo, 
ker te metode omogo čajo določanje tališča in vreliš ča. Poleg tega je 
meritve mogo če opraviti avtomatsko. 
„Dinamična metoda“ ima to prednost, da se lahko uporabi tudi za 
določanje parnega tlaka ter da ni treba popravljati vreliš ča glede na 
normalni tlak (101,325 kPa), ker se med merjenjem z manostatom lahko naravna normalni tlak.  
Opombe:  
Vpliv ne čistot na dolo čanje vreliš ča je v veliki meri odvisen od 
narave ne čistote. Kadar so v vzorcu hlapne ne čistote, ki bi lahko 
vplivale na rezultat, se snov lahko pre čisti.
 
1.2 OPREDELITVE IN ENOTE 
Normalno vreliš če je opredeljeno kot temperatura, pri kateri je parni 
tlak tekočine enak 101,325 kPa. 
Če se vreliš če ne meri pri normalnem atmosferskem tlaku, lahko 
odvisnost parnega tlaka od temperature opisemo s Clausius-Clapey ­
ronovo ena čbo: 
log p ¼ Δ H v 
2; 3RT þ konst : 
pri čemer je: 
P = parni tlak snovi v paskalih AH
 V = izparilna toplota v J mol  -1 
R = splošna plinska konstanta = 8,314 J mol  -1 K -1 
T = termodinami čna temperatura v K 
Vrelišče se navede glede na zra čni tlak med meritvijo.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 18
 
Pretvorbe  
Tlak (enote: kPa) 100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa 
(enota „bar“ je še vedno dovoljena, vendar se ne pripo ­
roča) 
133 Pa = 1 mm Hg = 1 tor 
(enoti „mm Hg“ in „tor“ nista dovoljeni) 
1 atm = standardna atmosfera = 101 325 Pa 
(enota „atm“ ni dovoljena). 
Temperatura (enote: K) t = T - 273,15 t: Celzijeva temperatura, stopinja Celzija (
 o C) 
T: termodinami čna temperatura, kelvin (K)  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Referenčnih snovi ni treba uporabiti vsakokrat, ko se preu čuje nova 
snov. Predvsem naj bi se uporabljale za ob časno preverjanje u čin­
kovitosti metode in za omogo čanje primerjave z rezultati drugih 
metod. 
Nekatere snovi za umerjanje so naštete v metodah, navedenih v 
dodatku.  
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Pet metod za dolo čanje vreliš ča (vreliščnega obmo čja) temelji na 
merjenju vreliš ča, dve pa temeljita na termi čni analizi.  
1.4.1  Dolo čanje z uporabo ebulioskopa  
Ebulioskopi so bili prvotno zasnovani za dolo čanje molekulske mase 
glede na naraš čajoče vrelišče, vendar so primerni tudi za natan čno 
merjenje vreliš ča. Zelo preprosta aparatura je opisana v ASTM D 
1120-72 (glej Dodatek). Teko čina se segrejeva v tej aparaturi v 
ravnotežnih pogojih pri atmosferskem tlaku, dokler ne zavre.  
1.4.2  Dinami čna metoda  
Ta metoda vklju čuje merjenje temperature rekondenzacije pare z 
ustreznim termometrom v povratnem toku med vretjem. Tlak se 
pri tej metodi lahko spreminja.  
1.4.3  Destilacijska metoda za vreliš če 
Ta metoda vklju čuje destilacijo teko čine in merjenje temperature 
rekondenzacije pare ter dolo čanje količine destilata.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 19
 
1.4.4  Metoda po Siwoloboffu  
Vzorec se segreva v cevki, potopljeni v teko čino toplotne kopeli. V 
cevko z vzorcem se potopi zataljena kapilara, ki v spodnjem delu vsebuje zra čni mehurček.
 
1.4.5  Fotoceli čna detekcija  
Po Siwoloboffovem principu se izvede avtomatsko fotoelektri čno 
merjenje z uporabo dvigajo čih se mehur čkov. 
1.4.6  Diferen čna termi čna analiza  
Pri tej tehniki se beleži razlika v temperaturi snovi in referen čnega 
materiala v odvisnosti od temperature, pri čemer se na snovi in na 
referenčnem materialu izvaja isti nadzorovani temperaturni program. 
Ko gre vzorec skozi fazni prehod, ki vklju čuje spremembo entalpije, 
se ta sprememba pokaže kot endotermni (vreliš če) odmik od bazne 
črte zapisa temperature.  
1.4.7  Diferen čna dinami čna kalorimetrija  
Pri tej tehniki se beleži razlika v vnosu energije v snov in referen čni 
material v odvisnosti od temperature, pri čemer se na snovi in refe ­
renčnem materialu izvaja isti nadzorovani temperaturni program. Ta 
energija je energija, potrebna za izena čitev temperature snovi in 
referenčnega materiala. Ko gre vzorec skozi fazni prehod, ki vklju ­ 
čuje spremembo entalpije, se ta sprememba pokaže kot endotermni 
(vrelišče) odmik od bazne črte zapisa toplotnega pretoka.  
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Uporabnost in to čnost različnih metod, ki se uporabljajo za dolo čanje 
vrelišča/vreliščnega obmo čja, sta navedeni v tabeli 1.  
Tabela 1  
Primerjava metod  
Merilna metoda Ocenjena to čnost Veljavni standard  
Ebulioskop ± 1,4 K (do373K) (  1 ) ( 2 ) 
± 2,5 K (do 600K) (  1 ) ( 2 ) ASTMD 1120-72 (  1 ) 
Dinamična metoda ± 0,5 K (do 600 K) (  2 ) 
Destilacijski proces (vreliš čno 
območje) ± 0,5 K (do 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 
4591/71 
Po Siwoloboffu ± 2 K (do 600 K) (  2 ) 
Fotocelična detekcija ± 0,3 K (do 373 K) (  2 ) 
Diferenčna termična kalorimetrija ± 0,5 K (do 600 K) 
± 2,0 K (do 1 273 K) ASTM E 537-76 
Diferenčna dinami čna kalorimetrija ± 0,5 K (do 600 K) 
± 2,0 K (do1 1 273 K) ASTM E 537-76  
( 1 ) Ta točnost velja le za enostavne naprave, npr. tisto, opisano v ASTM D 1120-72; lahko se izboljša z bolj preciznimi 
ebulioskopi. 
( 2 ) Velja le za čiste snovi. Uporabo v druga čnih razmerah je treba utemeljiti.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 20
 
1.6 OPIS METOD 
Postopki nekaterih preskusnih metod so opisani v mednarodnih in 
nacionalnih standardih (glej dodatek).  
1.6.1  Ebulioskop  
Glej dodatek.  
1.6.2  Dinamifha metoda  
Glej preskusno metodo A.4 za dolo čanje parnega tlaka. 
Zapišemo temperaturo vreliš ča, ugotovljeno pri tlaku 101,325 kPa.  
1.6.3  Destilacijski proces (vreliš čno obmo čje) 
Glej dodatek.  
1.6.4  Metoda po Swiloboffu  
Vzorec se segreva v aparaturi za dolo čanje tališ ča, v cevki s 
premerom približno 5 mm (slika 1). 
Slika 1 prikazuje vrsto standardizirane aparature za dolo čanje tališča 
in vrelišča (JIS K 0064) (iz stekla, vse specifikacije v milimetrih).  
Slika l
  
Kapilarna cevka (vreliš čna kapilara), stisnjena približno 1 cm nad 
spodnjim delom, se da v cevko za vzorec. Doda se toliko preskusne snovi, da je stisnjeni del kapilare pod površino teko čine. Cevka z 
vzorcem, v kateri je vreliš čna kapilara, se bodisi pritrdi na termo ­
meter z elastiko bodisi fiksira s podporo s strani (glej sliko 2).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 21
 
Slika 2  
Princip po Siwoloboffu  Slika 3  
Prilagojeni princip
  
Tekočina za kopel se izbere glede na vreliš če. Pri temperaturah do 
573 K se lahko uporabi silikonsko olje. Teko či parafin se lahko 
uporabi le do 473 K. Segrevanje teko čine kopeli mora biti sprva 
naravnano tako, da temperatura naraš ča 3 K/min. Teko čino kopeli 
je treba mešati. Pri približno 10 K pod pri čakovanim vreliš čem se 
segrevanje upo časni, tako da temperatura naraš ča manj kot 1 K/min. 
Ko se približujemo vreliš ču, začnejo iz vreliš čne kapilare hitro izha ­
jati mehur čki. 
Vrelišče je temperatura, pri kateri se ob trenutni ohladitvi ustavi 
izhajanje mehur čkov, teko čina v kapilari pa se za čne nenadoma 
dvigati. Ustrezen od čitek s termometra je vreliš če snovi. 
Pri prilagojenem principu (slika 3) se vreliš če določa v tališčni kapi­
lari. Njen konec se raztegne v približno 2 cm dolgo tanko konico (a); 
vanjo se vsesa majhna koli čina vzorca. Odprti konec drobne kapilare 
se zatali, tako da je na koncu ostane zra čni mehurček. Med segreva ­
njem v aparaturi za dolo čanje tališča (b) se zra čni mehurček razširi. 
Vrelišče sovpada s temperaturo, pri kateri zamašek iz snovi doseže 
nivo površine teko čine kopeli (c).  
1.6.5  Fotoceli čna detekcija  
Vzorec se segreva v kapilarni cevki znotraj segrevanega kovinskega 
bloka. 
Skozi ustrezne luknje v bloku se usmeri svetlobni žarek skozi snov 
na natančno umerjeno fotocelico. 
Med naraš čanjem temperature vzorca iz vreliš čne kapilare izhajajo 
posamezni mehur čki. Ko se doseže vreliš če, se koli čina mehur čkov 
zelo pove ča. To povzro či spremembo v jakosti svetlobe, ki jo beleži 
fotocelica, kar da signal za konec indikatorju, ki od čitava tempera ­
turo s platinskega uporovnega termometra znotraj bloka. 
Ta metoda je se posebej uporabna, ker omogo ča določanje vreliš ča 
pri temperaturi, nižji od sobne, vse do 253,15 K (–20  o C) ne da bi 
bilo treba aparaturo kakor koli spreminjati. Instrument moramo le 
položiti v hladno kopel.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 22
 
1.6.6  Termi čna analiza  
1.6.6.1  Diferen čna termična analiza  
Glej dodatek.  
1.6.6.1  Diferen čna dinami čna kalorimetrija  
Glej dodatek.  
2. PODATKI  
Pri majhnih odstopanjih od normalnega tlaka (najve č ± 5 kPa) se 
vrelišča normalizirajo na T  n po naslednji ena čbi Sidneya Younga: 
T n = T + (f  T × Δp) 
pri čemer je: 
Δp = (101,325 – p) [pazi na predznak] 
P = izmerjeni tlak v kPa f
 T = razmerje med spremembo vreliš ča in tlakom v K/kPa 
T = izmerjeno vreliš če v K 
T n = vrelišče, popravljeno na normalni tlak, v K 
V zgoraj navedenih mednarodnih in nacionalnih standardih so korek ­
cijski faktorji za temperature, f  T , in enačbe za njihove približke za 
mnoge snovi. 
Na primer, metoda DIN 53171 navaja naslednje okvirne korekcije za 
topila v barvah:  
Tabela 2  
Temperatura – korekcijski faktorji f  T 
Temperatura T (K) Korekcijski faktor f  T (K/kPa)  
323,15 0,26 
348,15 0,28 373,15 0,31 
398,15 0,33 
423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 23
 
3. PORO ČANJE  
V poročilo o preskusu se, če je možno, vklju čijo naslednje informa ­
cije: 
— uporabljena metoda, — natančna specifikacija snovi (identiteta in ne čistote) in predhodno 
prečiščevanje, če je bilo opravljeno, 
— ocena to čnosti. 
Kot vreliš če se navede srednja vrednost najmanj dveh meritev, ki sta 
v območju predvidene to čnosti (glej tabelo 1). 
Navedejo se izmerjena vreliš ča in njihova srednja vrednost ter tlak(i), 
pri katerih so bile meritve opravljene, v kPa. Tlak naj bo po 
možnosti blizu normalnemu atmosferskemu tlaku. 
Navesti je treba vse informacije in opombe, pomembne za razlago 
rezultatov, zlasti glede ne čistot in agregatnega stanja snovi.
 
4. VIRI  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the 
Council C (81) 30 final. 
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, editions. Experimental ther ­
modynamics, Butterworths, London 1975, Volume II. 
(3) R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical 
methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publications, New York, 1959, volume I, Part I, Chapter VIII.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 24
 
Dodatek  
Dodatne tehni čne podrobnosti se lahko poiš čejo na primer v naslednjih 
standardih:  
1. Ebulioskop  
1.1 Naprave za merjenje tališ ča s tekočinsko kopeljo 
ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of 
engine anti-freezes  
2. Destilacijski proces (vreliš čno obmo čje) 
ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation 
Yield and Distillation Range) 
BS 4349/68 Method for determination of distillation of 
petroleum products 
BS 4591/71 Method for the determination of distilla ­
tion characteristics 
DIN 53171 Losungsmittel fur Anstrichstoffe, Bestim ­
mung des Siedeverlaufes 
NF T 20-608 Distillation:determination du rendement et 
de l'intervalle de distillation  
3. Diferen čna termi čna analiza in diferen čna dinami čna kalorime ­
trija  
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal 
stability of chemicals by methods of diffe ­
rential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to 
thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoana ­
lytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 25
 
A.3 RELATIVNA GOSTOTA  
1. METODA  
Opisane metode temeljijo na smernici za preskušanje OECD (1). 
Temeljna na čela so navedena v viru (2).  
1.1 UVOD 
Opisane metode za dolo čanje relativne gostote se uporabljajo za 
trdne in teko če snovi, brez kakršnih koli omejitev glede njihove 
stopnje čistosti. Razli čne metode, ki se uporabijo, so navedene v 
tabeli 1.  
1.2 OPREDELITVE IN ENOTE 
Relativna gostota, D  4 20 , trdnih snovi ali teko čin je razmerje med 
maso volumna preskusne snovi pri 20  o C in maso enakega volumna 
vode pri 4  o C. Relativna gostota nima enote. 
Gostota snovi, ρ, je količnik njene mase, m, in volumna, V. 
Gostota, ρ, se v enotah SI izrazi v kg/m  3 . 
1.3 REFEREN ČNE SNOVI (1) (3) 
Referenčnih snovi ni treba uporabiti vsakokrat, ko se preu čuje nova 
snov. Predvsem naj bi se uporabljale za ob časno preverjanje u čin­
kovitosti metode in za omogo čanje primerjave z rezultati drugih 
metod.  
1.4 PRINCIP METOD 
Uporabljajo se štiri vrste metod.  
1.4.1  Vzgonske metode  
1.4.1.1  Hidrometer  (za tekoče snovi) 
Dovolj to čno in hitro je gostoto mogo če določiti s plavajo čimi hidro­
metri, ki omogo čajo sklepanje o gostoti teko čine glede na globino 
potopitve z od čitavanjem z graduirane lestvice.  
1.4.1.2  Hidrostatska tehtnica  (za tekoče in trdne snovi) 
Za določitev gostote vzorca se lahko uporabi razlika med njegovo 
maso, izmerjeno na zraku, in tisto, izmerjeno v primerni teko čini 
(npr. vodi). 
V primeru trdnih snovi je izmerjena gostota reprezentativna le za 
uporabljeni vzorec. Pri dolo čanju gostote teko čin, telo z znanim 
volumnom V, najprej stehtamo na zraku, potem pa še v teko čini. 
1.4.1.3  Metoda s potopljenim telesom  (za tekoče snovi) (4) 
Pri tej metodi se gostota teko čine določi iz razlike med rezultati 
tehtanja teko čine pred in po potopitvi telesa z znanim volumnom 
vanjo.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 26
 
1.4.2  Piknometrske metode  
Za trdne snovi ali teko čine se lahko uporabijo piknometri razli čnih 
oblik in znanih volumnov. Gostota se izra čuna iz razlike med maso 
polnega in maso praznega piknometra ter njegovega znanega 
volumna.  
1.4.3  Piknometer s primerjanjem zraka  (za trdne snovi) 
Gostota trdne snovi v kakršni koli obliki se lahko izmeri s piknome ­
trom s primerjanjem plina pri sobni temperaturi. Volumen snovi se izmeri na zraku ali v inertnem plinu v valju s spremenljivim umer ­
jenim volumnom. Za izra čun gostote se po kon čanem merjenju 
volumna opravi ena meritev mase.
 
1.4.4  Oscilacijski denzitometer  (5) (6) (7) 
Gostota teko čine se lahko izmeri z oscilacijskim denzitometrom. 
Mehanski oscilator, oblikovan kot U-cev, naj vibrira s svojo reso ­
nančno frekvenco, ki je odvisna od njegove mase. Ko se doda 
vzorec, se resonan čna frekvenca oscilatorja spremeni. Aparaturo je 
treba umeriti z dvema teko čima snovema, katerih gostoti sta znani. 
Po možnosti se izbereta snovi, katerih gostoti pokrivata merjeno 
območje. 
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Uporabnost razli čnih metod za dolo čanje relativne gostote je nave ­
dena v tabeli.  
1.6 OPIS METOD 
Primeri standardov, ki so vir dodatnih tehni čnih podatkov, so nave ­
deni v dodatku. 
Preskusi morajo biti izvedeni pri 20  o C in vklju čevati najmanj dve 
meritvi.  
2. PODATKI  
Glej standarde.  
3. PORO ČANJE  
V poročilo o preskusu se, če je možno, vklju čijo naslednje informa ­
cije: 
— uporabljena metoda, — natančna specifikacija snovi (identiteta in ne čistote) in predhodno 
prečiščevanje, če je bilo opravljeno. 
Relativna gostota,
 D  20 
4 , se navede, kakor je opredeljeno v 1.2, 
skupaj z agregatnim stanjem merjene snovi. 
Navesti je treba vse informacije in opombe, pomembne za razlago 
rezultatov, zlasti glede ne čistot in agregatnega stanja snovi.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 27
 
Tabela  
Uporabnost metod  
Merilna metoda Gostota Največja možna 
dinamična 
viskoznost Veljavni standardi 
trdna snov teko čina 
1.4.1.1 Hidrometer da 5 Pa s ISO 387, 
ISO 649-2 
NF T 20-050 
1.4.1.2 Hidrostatska tehtnica (a) trdne snovi da ISO 1183 (A) (b) tekočine da 5 Pa s ISO 901 in 758 
1.4.1.3 Metoda s potopljenim 
telesom da 20 Pa s DIN 53217 
1.4.2 Piknometer ISO 3507 
(a) trdne snovi da ISO 1183(B), 
NF T 20-053 
(b) tekočine da 500 Pa s ISO 758 
1.4.3 Piknometer s primerja ­
njem zraka di DIN 55990 Teil 3, 
DIN 53243 
1.4.4 Oscilacijski denzitometer da 5 Pa s
 
4. VIRI  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the 
Council C(81) 30 final. 
(2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Inter ­
science Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1. 
(3) IUPAC, Recommended reference materials for realization of 
physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 
1976, vol. 48, 508. 
(4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte 
von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. II, 427–430. 
(5) Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektro ­
nik, 1970, vol. 19, 297–302. 
(6) Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeu ­
gnissen -Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeu ­
tische Industrie, 1975, vol. 37, 717–726. 
(7) Riemann, J., Der Einsatz der digital en Dichtemessung im 
Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253–255.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 28
 
Dodatek  
Glede dodatnih tehni čnih podrobnosti so lahko v pomo č na primer naslednji 
standardi:  
1. Vzgonske metode  
1.1 Hidrometer 
DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions 
DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, 
adjustment and use 
Part II: Density hydrometers; standardized 
sizes, designation 
Part III: Use and test 
ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrome ­
ters for general purpose 
NF T 20-050 Chemical products for industrial use – 
Determination of density of liquids – 
Areometric method 
DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydro ­
meters  
1.2 Hidrostatska tehtnica  
Za trdne snovi  
ISO 1183 A metode: Methods for determining the 
density and relative density of plastics excluding cellular plastics 
NF T 20-049 Chemical products for industrial use – 
Determination of the density of solids other than powders and cellular products – Hydrostatic balance method 
ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by 
displacement 
DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; deter ­
mination of density
 
Za tekoče snovi  
ISO 901 ISO 758  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 29
 
DIN 51757 Testing of mineral oils and related mate ­
rials; determination of density 
ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 and ASTM D 1481-62 ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method 
BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method
 
1.3 Metoda s potopljenim telesom 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
coating materials; determination of density; immersed body method
 
2. Piknometrske metode  
2.1 Za teko če snovi 
ISO 3507 Pycnometers 
ISO 758 Liquid chemical products; determination 
of density at 20 °C 
DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile 
liquids which are not too viscous) 
DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with 
a kinematic viscosity of less than 100 . 
10 -6 m 2 s -1 at 15 °C) 
DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 
12798) 
DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with 
a kinematic viscosity of less than 100 . 
10 -6 m 2 s -1 at 20 °C, applicable in parti ­
cular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher 
vapour pressure, approximately 1 bar at 
90 °C)
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 30
 
DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids 
of all types which do not have too high a vapour pressure, in particular also for 
paints, varnishes and bitumen) 
DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in 
DIN 12801) 
DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for 
ethanol – water mixture) 
DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer 
and capillary side tube (for liquids which are not too viscous) 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
products; determination of density by pycnometer 
DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and 
related materials; determination of density 
ASTM D 297 Section 15: Rubber products – chemical 
analysis 
ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic 
compounds 
BS 4699 Method for determination of specific 
gravity and density of petroleum products 
(graduated bicapillary pycnometer method) 
BS 5903 Method for determination of relative 
density and density of petroleum products by the capillary – stoppered pycnometer method 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use – 
Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric 
method
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 31
 
2.2 Za trdne snovi 
ISO 1183 Method B: Methods for determining the 
density and relative density of plastics excluding cellular plastics 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use – 
Determination of density of solids in 
powder and liquids – Pyknometric method 
DIN 19683 Determination of the density of soils
 
3. Piknometer s primerjanjem zraka  
DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und 
ähnlichen Beschichrungsstoffen; Pulver ­
lack; Bestimmung der Dichte 
DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; 
Prüfung  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 32
 
A.4 PARNI TLAK  
1. METODA  
Ta metoda je enakovredna OECD TG 104 (2004).  
1.1 UVOD 
Ta revidirana razli čica metode A.4(1) dodatno vklju čuje efuzijsko 
metodo: izotermi čno termogravimetrijo, namenjeno za snovi z zelo 
nizkimi tlaki (do 10  –10 Pa). Odvisno od zahtev postopka, zlasti pri 
določanju parnega tlaka snovi z nizkim parnim tlakom, se ponovno 
ocenijo še drugi postopki za uporabo te metode glede na druga območja uporabe. 
V termodinami čnem ravnotežju je parni tlak čiste snovi odvisen 
samo od temperature. Temeljna na čela so opisana drugje (2)(3). 
Ni enega samega merilnega postopka, ki bi bil uporaben za celotno 
območje parnih tlakov od manj kot 10
 –10 do 10  5 Pa. Ta metoda 
vključuje osem metod za merjenje parnega tlaka, ki jih je mogo če 
uporabiti za razli čna obmo čja parnih tlakov. Razli čne metode se 
primerjajo glede na uporabnost in merilno obmo čje iz tabele 
1. Metode se lahko uporabljajo samo za snovi, ki v pogojih preskusa ne razpadejo. Kadar preskusnih metod zaradi tehni čnih razlogov ni 
mogoče uporabiti, se parni tlak lahko tudi oceni, priporo čena ocenje ­
valna metoda je navedena v Dodatku.
 
1.2 OPREDELITVE IN ENOTE 
Parni tlak snovi je opredeljen kot tlak nasi čene pare nad trdno ali 
tekočo snovjo. 
Za tlak je treba uporabljati enoto SI, tj. pascal (Pa). V preteklosti 
uporabljane enote, skupaj s pretvorbnimi faktorji, so navedene spodaj: 
1 torr (= 1 mm Hg) = 1,333 × 10  2 Pa 
1 atmosfera = 1,013 × 10  5 Pa 
1 bar = 10  5 Pa 
Enota SI za temperaturo je kelvin (K). Za pretvorbo stopinj Celzija 
v kelvine se uporablja naslednja formula: 
T = t + 273,15 
pri čemer je T temperatura v kelvinih ali termodinami čna tempera ­
tura, t pa temperatura v stopinjah Celzija.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 33
 
Tabela 1  
Merilna metoda Snovi Ocena ponovlji ­
vosti Ocena obnovlji ­
vosti Priporočeno obmo čje 
v trdnem stanju v teko čem stanju  
Dinamična metoda nizko tališ če Da do 25 % 
1 do 5 % do 25 % 
1 do 5 % 10 3 Pa 
do 2 × 10  3 Pa 
2 × 10  3 Pa do 
10 5 Pa 
Statična metoda Da Da 5 do 10 % 5 do 10 % 10 Pa do 10  5 Pa 
10 –2 Pa do 
10 5 Pa (  1 ) 
Izoteniskopska 
metoda Da Da 5 do 10 % 5 do 10 % 10  2 Pa do 10  5 Pa 
Efuzijska metoda: 
parnotlačna 
tehtnica Da Da 5 do 20 % do 50 % 10  –3 do 1 Pa 
Efuzijska metoda: 
Knudsenova celica Da Da 10 do 30 % — 10  –10 do 1 Pa 
Efuzijska metoda: 
izotermična termo­
gravimetrija Da Da 5 do 30 % do 50 % 10  –10 do 1 Pa 
Metoda nasi čenega 
plina Da Da 10 do 30 % do 50 % 10  –10 do 10  3 Pa 
Metoda z rotorjem Da Da 10 do 20 % — 10  –4 do 0,5 Pa  
( 1 ) Pri uporabi manometra kapacitivnosti  
1.3 PRINCIP PRESKUSA 
V splošnem se parni tlak dolo ča pri razli čnih temperaturah. 
V omejenem temperaturnem obmo čju je logaritem parnega tlaka 
čiste snovi linearna funkcija obratne vrednosti termodinami čne 
temperature v skladu s poenostavljeno Clausius-Clapeyronovo enačbo: 
log p ¼
 ΔHv 
2; 3RT þ konstana  
pri čemer je: 
p = parni tlak snovi v pascalih 
ΔHv = izparilna toplota v J mol  –1 
R = splošna plinska konstanta, 8,314 J mol  –1 K –1 
T = termodinami čna temperatura v K  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 34
 
1.4 REFEREN ČNE SNOVI 
Referenčnih snovi ni treba uporabljati. Služijo predvsem za ob časno 
preverjanje u činkovitosti metode, pa tudi za omogo čanje primerjave 
med rezultati razli čnih metod.  
1.5 OPIS METODE  
1.5.1  Dinami čna metoda (Cottrellova metoda)  
1.5.1.1  Princip  
Parni tlak se dolo či z merjenjem vreliš ča snovi pri razli čnih točno 
določenih tlakih med približno 10  3 in 10  5 Pa. Ta metoda se pripo ­
roča tudi za dolo čitev vreliš ča. Za ta namen je uporabna do 600 K. 
Vrelišča tekočin so na globini 3 do 4 cm zaradi hidrostati čnega tlaka 
tekočine približno 0,1 °C višja kot na površini. Pri Cottrellovi metodi 
(4) se termometer namesti v paro nad površino teko čine, vrela teko ­ 
čina pa se neprestano črpa prek bu čke termometra. Bu čko prekriva 
tanka plast teko čine, ki je v ravnotežju s paro pri atmosferskem 
tlaku. Termometer zato kaže pravo vreliš če, brez napak zaradi preve ­
likega segrevanja ali hidrostati čnega tlaka. Črpalka, ki jo je prvi č 
uporabil Cottrell, je prikazana na sliki 1. Vrela teko čina je v cevki 
A. Platinasta žica B, ki je zatesnjena v dno, spodbuja enakomerno vrenje. Stranska cevka C je napeljana v kondenzator, obloga D pa mrzlemu kondenzu prepre čuje stik s termometrom E. Ko teko čina 
v A vre, se mehur čki in teko čina, ki se ujamejo v liju, preko dveh 
ročic črpalke F razlijejo čez bučko termometra.  
Slika 1
 Slika 2
  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 35
 
Cottrellova črpalka (4) 
A: Termo člen 
B: Vakuumski pufrski volumen 
C: Merilnik tlaka 
D: Vakuum E: Merilna to čka 
F: Grelni element, približno 150 W
 
1.5.1.2  Aparatura  
Zelo natan čna aparatura, ki uporablja Cottrellov princip, je prikazana 
na sliki 2. Sestavljena je iz cevke z vrelnim delom v spodnjem delu, hladilnikom v srednjem delu in odto čno cevko ter prirobnico 
v zgornjem delu. Cottrellova črpalka se namesti v vrelni del, ki se 
segreva z elektri čnim kartušnim grelnikom. Temperatura se meri 
s termočlenom v plaš ču ali uporovnim termometrom, ki se vstavi 
skozi prirobnico na vrhu. Izhod se poveže s sistemom za urejanje 
tlaka. Ta je sestavljen iz vakuumske črpalke, pufrskega volumna, 
manostata za spuš čanje dušika za urejanje tlaka in manometra.
 
1.5.1.3  Postopek  
Snov se namesti v vrelni del. Pri neuprašenih trdnih snoveh lahko 
nastanejo težave, ki pa se v časih lahko odpravijo s segrevanjem 
hladilnega plaš ča. Aparatura se zatesni pri robnici in snov razplini. 
Penečih snovi ni mogo če meriti s to metodo. 
Nato se nastavi najnižji želeni tlak ter vklju či gretje. Hkrati se senzor 
temperature poveže z zapisovalnikom. 
Ravnotežje je doseženo, ko se pri konstantnem tlaku zabeleži 
konstantno vreliš če. Prepre čiti je treba zlasti sunkovito udarjanje 
med vrenjem. Poleg tega se mora kondenzacija v hladilniku popol ­
noma kon čati. Kadar se dolo ča parni tlak trdnih snovi z nizkim 
tališčem, je treba paziti, da se hladilnik ne zamaši. 
Potem ko se zabeleži to čka ravnotežja, se nastavi višji tlak. Postopek 
se nadaljuje na enak na čin, dokler ni dosežen tlak 10  5 Pa (skupaj 
približno 5 do 10 merilnih to čk). Za potrditev je treba ponoviti to čke 
ravnotežja pri padajo čih tlakih.  
1.5.2  Stati čna metoda  
1.5.2.1  Princip  
Pri statični metodi (5) se parni tlak pri termodinami čnem ravnotežju 
določi pri navedeni temperaturi. Ta metoda je primerna za snovi ter 
večkomponentne teko čine in trdne snovi v obmo čju od 10  –1 do 
10 5 Pa in, ob zadostni pazljivosti, tudi v obmo čju 1 do 10 Pa.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 36
 
1.5.2.2  Aparatura  
Oprema je sestavljena iz kopeli s konstantno temperaturo (z natan ­ 
čnostjo ±0,2 K), posode za vzorec, povezane z vakuumsko cevjo, 
manometra in sistema za urejanje tlaka. Komora za vzorec (slika 3a) 
je povezana z vakuumsko cevjo preko ventila in diferencialnega 
manometra (U-cevke, ki vsebuje ustrezno manometrsko teko čino), 
ki služi kot ni čelni indikator. Za uporabo v diferencialnem mano ­
metru so primerni živo srebro, silikoni in ftalati, odvisno od obmo čja 
tlaka in kemijskih lastnosti preskusne snovi. Zaradi varovanja okolja 
pa se je treba uporabi živega srebra izogibati, če je to mogo če. 
Preskusna snov se ne sme vidno topiti v teko čini v U-cevki ali 
z njo reagirati. Namesto U-cevke se lahko uporabi merilnik tlaka 
(slika 3b). Za manometer se lahko uporabijo živo srebro za obmo čje 
od normalnega zra čnega tlaka do 10  2 Pa ter silikonska olja in ftalati 
pri obmo čju pod 10  2 Pa do 10 Pa. Obstajajo tudi drugi merilniki 
tlaka, ki se lahko uporabljajo pod 10  2 Pa, membranski manometri, ki 
se lahko segrevajo, pa se lahko uporabljajo tudi pod 10  –1 Pa. Tempe ­
ratura se meri ob zunanji steni posode z vzorcem ali v sami posodi.  
1.5.2.3  Postopek  
S pomočjo aparature, kakor je prikazana na sliki 3a, se U-cevka 
napolni z izbrano teko čino, ki jo je treba pred od čitavanjem razpliniti 
pri zvišani temperaturi. V aparaturo se da preskusna snov in razplini pri znižani temperaturi. Pri ve čkomponentnih vzorcih mora biti 
temperatura dovolj nizka, da se sestava snovi zagotovo ne spremeni. 
Vzpostavljanje ravnotežja je mogo če pospešiti z mešanjem. Vzorec 
se lahko ohladi s teko čim dušikom ali suhim ledom, paziti pa je 
treba, da zrak ali teko čina v črpalki ne kondenzira. Ob odprtem 
ventilu nad vzor čno posodo se nekaj minut izsesava zrak. Postopek 
razplinjevanja se po potrebi ve čkrat ponovi.  
Slika 3a
 Slika 3b
  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 37
 
Ko se vzorec segreva in je ventil zaprt, parni tlak naraš ča. To spre ­
meni ravnotežje teko čine v U-cevki. Za izravnavo tega u činka se 
v aparaturo spusti dušik ali zrak, dokler ni indikator tlaka spet na ničli. Tlak, potreben za to, se lahko od čita z manometra ali zelo 
preciznega instrumenta. Ta tlak ustreza parnemu tlaku snovi pri tej 
merilni temperaturi. Pri uporabi aparature, prikazane na sliki 3b, se 
parni tlak od čita neposredno. 
Parni tlak se dolo či pri ustrezno majhnih temperaturnih intervalih 
(skupaj približno 5 do 10 merilnih to čk) do želenega maksimuma. 
Za preveritev je treba meritve ponoviti pri nizkih temperaturah. Če 
vrednosti, dobljene pri ponovljenih meritvah, ne sovpadajo 
z dobljeno krivuljo za naraš čajočo temperaturo, je to lahko posledica 
enega od naslednjih vzrokov: 
(i) v vzorcu je še vedno zrak (npr. snovi z veliko viskoznostjo) ali 
snovi z nizkim vreliš čem, ki se sprosti(-jo) med segrevanjem; 
(ii) v prou čevanem temperaturnem obmo čju snov kemi čno reagira 
(npr. razpada, polimerizira).
 
1.5.3  Metoda izoteniskopa  
1.5.3.1  Princip  
Izoteniskop (6) temelji na principu stati čne metode. Ta metoda 
zajema namestitev vzorca v bu čko, v kateri se ohranja konstantna 
temperatura in ki je povezana z manometrom ter vakuumsko črpalko. 
Nečistoče, ki so bolj hlapne kot snov, se odstranijo z razplinjevanjem 
pri znižanem tlaku. Parni tlak vzorca pri izbranih temperaturah se uravnava z znanim tlakom inertnega plina. Izoteniskop je bil razvit 
za merjenje parnega tlaka dolo čenih teko čih ogljikovodikov, vendar 
ga je mogo če uporabiti tudi za prou čevanje trdnih snovi. Ta metoda 
običajno ni primerna za ve čkomponentne sisteme. Pri vzorcih, ki 
vsebujejo nehlapne ne čistoče, lahko rezultati vsebujejo majhne 
napake. Priporo čeno obmo čje je od 10
 2 do 10  5 Pa. 
1.5.3.2  Aparatura  
Primer merilne naprave je prikazan na sliki 4. Popoln opis je mogo če 
najti v ASTM D 2879–86 (6).  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 38
 
1.5.3.3  Postopek  
Pri tekočinah se sama snov uporabi kot teko čina v diferencialnem 
manometru. V izoteniskop se vlije zadostna koli čina tekočine, da se 
napolnita bu čka in krajši krak manometrskega dela. Izoteniskop se 
pritrdi na vakuumski sistem in odzra či, nato pa napolni z dušikom. 
Odzračevanje in splakovanje sistema se dvakrat ponovi, da se 
odstrani ves kisik. Napolnjen izoteniskop se postavi v vodoraven položaj, tako da se vzorec razlije v tanko plast v vzor čni bučki in 
manometrskem delu. Tlak v sistemu se zmanjša na 133 Pa in vzorec 
se počasi segreva, dokler ravno ne za čne vreti (odstranitev razto ­
pljenih plinov). Izoteniskop se nato postavi tako, da se vzorec vrne v bučko in krajši krak manometra ter se oba popolnoma napolnita 
s tekočino. Vzdržuje se tlak 133 Pa. Podaljšana konica bu čke 
z vzorcem se segreva nad majhnim plamenom, dokler se sproš čene 
pare vzorca toliko ne razširijo, da izpodrinejo del vzorca iz zgornjega dela bučke in kraka manometra, ga potisnejo v manometrski del 
izoteniskopa, in tako ustvarijo s parami nasi čen prostor brez dušika. 
Izoteniskop se nato postavi v kopel s konstantno temperaturo, tlak 
dušika pa se naravna tako, da je enak tlaku vzorca. Ob ravnotežju je parni tlak dušika enak parnemu tlaku snovi.
 
Slika 4
  
Pri trdnih snoveh se odvisno od obmo čja tlaka in temperature upora ­
bljajo manometrske teko čine, kot so silikonske teko čine ali ftalati. 
Izboklina na daljšem kraku izoteniskopa se napolni z razplinjeno manometrsko teko čino. Potem se preskusna trdna snov da v bu čko 
in razplini pri zvišani temperaturi. Nato se izoteniskop nagne tako, 
da manometrska teko čina steče v U-cevko.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 39
 
1.5.4  Efuzijska metoda: parnotla čna tehtnica  (7) 
1.5.4.1  Princip  
Vzorec preskusne snovi se segreje v majhni pe či in namesti 
v odzračen stekleni zvon. Pe č se pokrije s pokrovom, na katerem 
so majhne luknje z znanimi premeri. Para snovi, ki uhaja skozi eno 
izmed lukenj, se usmeri v skodelico zelo natan čne tehtnice, ki je tudi 
zaprta v odzra čenem steklenem zvonu. Pri nekaterih razli čicah je 
skodelica tehtnice obdana s hladilno posodo, ki zagotavlja odvajanje 
toplote navzven s termi čno prevodnostjo, in se ohlaja s sevanjem, 
zato da uhajajo ča para kondenzira na njej. Moment curka pare deluje 
kot sila na tehtnico. Tlak pare je mogo če izpeljati na dva na čina: 
neposredno od sile na skodelico tehtnice, pa tudi iz hitrosti izpare ­
vanja s pomo čjo Hertz-Knudsenove ena čbe (2):  
p ¼ G ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
2πRT Ü 10  3 
M s 
pri čemer je: 
G = hitrost izhlapevanja (kg s  –1 m –2 ) 
M = molska masa (g mol  –1 ) 
T = temperatura (K) R = splošna plinska konstanta (J mol
 –1 K –1 ) 
p = parni tlak (Pa) 
Priporočeno obmo čje je od 10  –3 do 1 Pa.  
1.5.4.2  Aparatura  
Glavni princip aparature je prikazan na sliki 5.  
Slika 5
  
A: Osnovna ploš ča F: Hladilna posoda in hladilna palica 
B: Inštrument z vrtljivo tuljavo G: Uparjalna pe č 
C: Stekleni zvon H: Dewarjeva posoda s teko čim dušikom 
D: Tehtnica s skodelico I: Merjenje temperature vzorca 
E: Naprava za merjenje vakuuma J: Preskusna snov  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 40
 
1.5.5  Efuzijska metoda: Knudsenova celica  
1.5.5.1  Princip  
Ta metoda temelji na oceni mase preskusne snovi, ki v obliki pare 
zapusti Knudsenovo celico (8) v časovni enoti skozi mikroodprtino 
v pogojih ultra visokega vakuuma. Masa izhajajo če pare se lahko 
ugotovi tako, da se bodisi dolo či izguba mase celice bodisi konden ­
zira para pri nizki temperaturi in dolo či količina izhlapele snovi 
s kromatografsko analizo. Parni tlak se izra čuna z uporabo Hertz- 
Knudsenovega razmerja (glej to čko 1.5.4.1) s korekcijskimi faktorji, 
ki so odvisni od parametrov aparature (9). Priporo čeno obmo čje je 
10 –10 to 1 Pa (10)(11)(12)(13)(14).  
1.5.5.2  Aparatura  
Glavni princip aparature je prikazan na sliki 6.  
Slika 6
  
1: Povezava z vakuumom 7: Navojni pokrov 
2: Luknje v platinskem uporovnem termo ­
metru ali sistemi za merjenje in nadzoro ­
vanje temperature 8: Krilne matice 
3: Pokrov vakuumske posode 9: Vijaki 
4: O-tesnilo 10: Efuzijske celice iz nerjave čega jekla 
5: Aluminijasta vakuumska posoda 11: Grelni vložki 
6: Naprava za pritrjevanje in odstranjevanje 
efuzijskih celic  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 41
 
1.5.6  Efuzijska metoda: izotermi čna termogravimetrija  
1.5.6.1  Princip  
Ta metoda temelji na dolo čitvi pospešenih hitrosti izhlapevanja 
preskusne snovi pri povišanih temperaturah in zra čnem tlaku 
s postopkom termogravimetrije (10)(15)(16)(17)(18)(19)(20). Hitrosti 
izhlapevanja v  T nastanejo pri izpostavljanju izbrane snovi po časi 
tekoči atmosferi inertnega plina in spremljanju izgube teže pri opre ­
deljenih izotermi čnih temperaturah T v kelvinih v ustreznih časovnih 
obdobjih. Parni tlaki p  T se izračunajo iz vrednosti v  T na podlagi 
linearnega razmerja med logaritmom parnega tlaka in logaritmom hitrosti izhlapevanja. Po potrebi se izvede ekstrapolacija na tempe ­
raturi 20 in 25 °C s pomo čjo regresijske analize log p
 T v odvisnosti 
od 1/T. Ta metoda je primerna za snovi s parnimi tlaki do 10  –10 Pa 
(10 –12 mbar) in s čistostjo, ki je kar najbližje 100 %, da ne pride do 
napačne razlage izmerjenih izgub teže.  
1.5.6.2  Aparatura  
Glavni princip postavitve preskusa je prikazan na sliki 7.  
Slika 7
  
Mimo nosilne ploš če z vzorcem, obešene na mikrotehtnici v komori 
s stalno temperaturo, je speljan tok suhega dušikovega plina, ki 
odnaša uparjene molekule preskusne snovi. Ko plinski tok zapusti komoro, se o čisti v napravi za sorpcijo.
 
1.5.6.3  Postopek  
Preskusna snov se nanese na površino hrapave steklene ploš če 
v enakomerni plasti. Pri trdnih snoveh se ploš ča enakomerno 
zmoči z raztopino snovi v ustreznem topilu in posuši v inertni atmos ­
feri. Za izvedbo meritev se prevle čena ploš ča obesi 
v termogravimetri čni analizator, nato pa se izguba teže neprekinjeno 
meri kot funkcija časa. ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 42
 
Hitrost izparevanja v  T pri dani temperaturi se izra čuna iz zmanjšanja 
mase Δm plošče z vzorcem s pomo čjo naslednje ena čbe: 
v T ¼ Δm 
F Ö t gcm  –2 h –1 Ê Ì  
kjer je F površina prevle čenih preskusnih snovi, obi čajno površina 
plošče z vzorcem, t pa je čas, v katerem se je masa zmanjšala za Δm. 
Parni tlak p  T se izračuna na podlagi njegove funkcije hitrosti izpa ­
revanja v  T : 
Log p  T = C + D log v  T 
kjer sta C in D konstanti, specifi čni za uporabljeno preskusno 
postavitev in odvisni od premera merilne komore ter hitrosti pretoka plina. Ti konstanti se dolo čita enkrat, in sicer z merjenjem nabora 
snovi z znanimi parnimi tlaki in regresijo log p
 T v odvisnosti od log 
v T (11)(21)(22). 
Razmerje med parnim tlakom p  T in temperaturo T v kelvinih je 
podano z 
Log p  T = A + B 1/T 
kjer sta A in B konstanti, pridobljeni z regresijo log p  T v odvisnosti 
od 1/T. S to ena čbo je mogo če z interpolacijo izra čunati parni tlak za 
katero koli drugo temperaturo.  
1.5.7  Metoda z nasi čenjem plina  (23)  
1.5.7.1  Princip  
Inertni plin se pri sobni temperaturi in pri znanem pretoku spelje 
skozi oziroma čez vzorec preskusne snovi, in sicer dovolj po časi, da 
se zagotovi nasi čenje. Klju čnega pomena je, da v plinski fazi nastopi 
nasičenje. Prenesena snov se ujame, obi čajno s pomo čjo sorbenta, 
nato se dolo či njena koli čina. Za dolo čitev količine snovi, ki jo 
prenese znana koli čina nosilnega plina, se namesto lovljenja pare 
in poznejše analize lahko uporabijo neposredne analitske tehnike, kot je kromatografija. Parni tlak se izra čuna ob predpostavki, da se 
upošteva zakon idealnega plina in da je skupni tlak mešanice plinov 
enak vsoti tlakov posameznih plinov. Delni tlak preskusne snovi, tj. parni tlak, se izra čuna iz znane skupne prostornine plina in iz teže 
prenesenega materiala. 
Postopek z nasi čenjem plina se lahko uporablja za trdne ali teko če 
snovi. Uporabiti ga je mogo če za parne tlake do 10
 –10 Pa (10)(11) ­
(12)(13)(14). Metoda je najzanesljivejša za parne tlake, nižje od 10
 3 Pa. Pri tlakih nad 10  3 Pa so parni tlaki obi čajno precenjeni, 
najverjetneje zato, ker se tvorijo aerosoli. Ker se meritve parnega 
tlaka izvajajo pri sobni temperaturi, ni potrebe za ekstrapolacijo 
podatkov iz visokih temperatur, zato se ekstrapolacija pri visokih temperaturah, ki pogosto povzro ča resne napake, ne izvaja.
 
1.5.7.2  Aparatura  
Ta postopek zahteva uporabo posode s konstantno temperaturo. Na 
skici na sliki 8 je prikazana posoda s tremi pripravami za trdne in tremi pripravami za teko če vzorce, ki omogo čajo trojno analizo 
trdnega ali teko čega vzorca. Natan čnost nadzora temperature je 
na ±0,5 °C ali boljša.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 43
 
Slika 8
  
Običajno se za inertni nosilni plin uporablja dušik, ob časno pa je 
treba uporabiti tudi kak drug plin (24). Nosilni plin mora biti suh. Tok plina se razdeli na 6 tokov, ki jih nadzirajo igelni ventili (z odprtino približno 0,79 mm), in te če v posodo po 3,8 mm i.d. 
bakreni cevi. Po izena čitvi temperature plin te če skozi vzorec in 
sorbentno past, nato pa zapusti posodo. 
Trdni vzorci se namestijo v 5 mm i.d. stekleno cev med čepe iz 
steklene volne (glej sliko 9). Na sliki 10 sta prikazana naprava za 
tekoče vzorce in sorbentni sistem. Najbolj ponovljiva metoda za 
merjenje parnega tlaka teko čin je, da se teko čina nanese na steklene 
kroglice ali na inerten sorbent, kot je na primer silicijev oksid, nato 
pa se naprava napolni s temi kroglicami. Alternativno se lahko 
nosilni plin spelje mimo hrapavega frita in v obliki mehur čkov 
skozi steber teko če preskusne snovi.  
Slika 9
 Slika 10
  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 44
 
Sorbentni sistem ima sprednji in pomožni sorbentni del. Pri zelo 
nizkih parnih tlakih sorbent zadrži le majhne koli čine, zato lahko 
adsorpcija na stekleni volni in steklenih ceveh med vzorcem in sorbentom povzro ča velike težave. 
Pasti, ohlajene s trdnim CO
 2 , so še en u činkovit na čin za zbiranje 
uparjenega materiala. Ne povzro čajo protitlaka na saturacijsko 
kolono, prav tako pa je mogo če zelo enostavno kvantitativno odstra ­
niti ujeti material.  
1.5.7.3  Postopek  
Pretok izto čnega nosilnega plina se meri pri sobni temperaturi. 
Pretok se med preskusom pogosto preverja, da se zagotovi pravilna 
vrednost za skupno prostornino nosilnega plina. Zaželeno je sprem ­
ljanje ves čas z merilnikom masnega pretoka. Nasi čenje plinske faze 
lahko zahteva dolg čas stika in zato precej nizke hitrosti pretoka 
plina (25). 
Ob koncu poskusa se sprednji in pomožni sorbentni del analizirata 
ločeno. Snov v vsakem delu se desorbira s topilom. Nastali raztopini 
se kvantitativno analizirata, da se dolo či teža desorpcije vsakega 
dela. Izbira analiti čne metode (prav tako tudi izbira sorbenta in 
desorbentne raztopine) je odvisna od vrste preskusnega materiala. 
Učinkovitost desorpcije se dolo či tako, da se znana koli čina vzorca 
injicira na sorbent, desorbira, nato pa analizira preostala koli čina. 
Pomembno je, da se preskusi u činkovitost desorpcije pri (ali blizu) 
koncentraciji vzorca pod preskusnimi pogoji. 
Da se zagotovi nasi čenost nosilnega plina s preskusno snovjo, se 
uporabijo tri razli čne hitrosti pretoka plina. Če izračunani parni 
tlak ne kaže odvisnosti od pretoka, se predpostavlja, da je nasi čen. 
Parni tlak se izra čuna po ena čbi: 
p ¼ W 
V Ü RT 
M 
pri čemer je: 
p = parni tlak (Pa) 
W = masa uparjene preskusne snovi (g) 
V = volumen nasi čenega plina (m  3 ) 
R = splošna plinska konstanta 8,314 (J mol  –1 K –1 ) 
T = temperatura (K) M = molska masa preskusne snovi (g mol
 –1 ) 
Izmerjene volumne je treba popraviti glede na razlike v tlaku in 
temperaturi med merilnikom pretoka in saturatorjem.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 45
 
1.5.8  Rotorska metoda  
1.5.8.1  Princip  
Pri tej metodi se uporablja merilnik viskoznosti z rotorjem, 
v katerem je merilni element jeklena kroglica, postavljena v magnetno polje, tako da lebdi, njeno vrtenje pa povzro čajo rotira ­
joča polja tuljave (26)(27)(28). Merjenje hitrosti njenega vrtenja 
omogočajo sprejemne tuljave. Ko kroglica doseže dolo čeno hitrost 
vrtenja, obi čajno približno 400 vrtljajev na sekundo, se ustavi dotok 
energije in zaradi trenja, ki ga povzro ča plin, se vrtenje upo časni. 
Padec vrtilne hitrosti se meri kot funkcija časa. Parni tlak se izpelje 
iz padca hitrosti kroglice, ki je posledica tlaka. Priporo čeno obmo čje 
je od 10
 –4 do 0,5 Pa.  
1.5.8.2  Aparatura  
Shema postavitve preskusa je prikazana na sliki 11. Merilnik se 
postavi v posodo s konstantno temperaturo, ki se uravnava na 0,1 °C natan čno. Posoda z vzorcem se postavi v lo čeno posodo, ki 
se tudi uravnava na 0,1 °C natan čno. Vsi ostali deli sestava pa se 
vzdržujejo pri višji temperaturi, da se prepre či kondenzacija. Celotna 
aparatura je priklju čena na visokovakuumski sistem.
 
Slika 11
  
2. PODATKI IN PORO ČANJE  
2.1 PODATKI 
Pri kateri koli od navedenih metod je treba parni tlak dolo čiti pri 
najmanj dveh temperaturah. Za preverjanje linearnosti krivulje 
parnega tlaka so zaželene najmanj tri temperature v obmo čju od 0 
do 50 °C. Pri efuzijski metodi (Knudsenova celica in izotermi čna 
termogravimetrija) in metodi z nasi čenjem plina se priporo ča tempe­
raturno obmo čje od 120 do 150 °C, namesto od 0 do 50 °C.  
2.2 PORO ČANJE 
V poročilo o preskusu se vklju čijo naslednje informacije: 
— uporabljena metoda,  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 46
 
— natančna specifikacija snovi (identiteta in ne čistoče) in pred ­
hodno pre čiščevanje, če je bilo opravljeno, 
— najmanj po dve vrednosti parnega tlaka in temperature, če je 
mogoče, pa tri ali ve č, v obmo čju 0 do 50 °C (ali od 120 do 
150 °C), 
— vsaj ena od temperatur mora biti 25 °C ali manj, če je tehni čno 
izvedljivo v skladu z izbrano metodo, 
— vsi neobdelani podatki, 
— krivulja log p v odvisnosti od 1/T, 
— ocenjeni parni tlak pri 20 ali 25 °C. 
Če pride do prehoda (spremembe stanja, razpada), je treba navesti 
naslednje podatke: 
— vrsta spremembe, 
— temperatura, pri kateri pride do spremembe pri atmosferskem 
tlaku, 
— parni tlak pri 10 in 20 °C pod temperaturo prehoda in pri 10 in 
20 °C nad to temperaturo (razen če gre za prehod iz trdnega 
v plinasto agregatno stanje). 
Navesti je treba vse informacije in opombe, pomembne za razlago 
rezultatov, zlasti glede ne čistot in agregatnega stanja snovi.  
3. VIRI  
(1) Uradni list Evropskih skupnosti , L 383 A, 26–47 (1992). 
(2) Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, 
Le Neindre, B., in Vodar, B., Eds., Butterworths, London. 
(3) Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, 
Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. Chapter IX, Interscience Publ., New York. 
(4) Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., 
Van Nostrand Company, New York. 
(5) NF T 20–048 AFNOR (September 1985). Chemical products 
for industrial use – Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within a range from 10
 –1 to 10  5 Pa – Static 
method. 
(6) ASTM D 2879–86, Standard test method for vapour pressure – 
temperature relationship and initial decomposition temperature 
of liquids by isoteniscope. 
(7) NF T 20–047 AFNOR (September 1985). Chemical products 
for industrial use –Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within range from 10  –3 to 1 Pa – Vapour pressure 
balance method.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 47
 
(8) Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 593. 
(9) Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. 
Thermodynamics 7, 1173. 
(10) Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, 
D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest Management Science 56, 521–532. 
(11) Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition 
(2000) 
(12) Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determi ­
nation of small vapour pressures determination of the vapour 
pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 
22–28. 
(13) Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 
269–278. 
(14) Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and 
enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p- 
dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), 117–122. 
(15) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science 4 (1973) 137–147. 
(16) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide 
Science 5 (1974) 393–400. 
(17) Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., 
A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients 
Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relationship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesticide Science 13 (1982) 161–168. 
(18) Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for 
Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric 
Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 
45 (1995) 27–31. 
(19) Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., 
Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermo ­
gravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction 
(SPME); Pesticide Science, 53 (1998) 300–310. 
(20) Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric 
Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of 
Low-Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87(12) (1998) 1512–20. 
(21) Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 81th 
ed.(2000), Vapour Pressure in the Range -25 °C to 150 °C. 
(22) Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 
88 (2002). 
(23) 40 CFR, 796. (1993). pp 148–153, Office of the Federal 
Register, Washington DC.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 48
 
(24) Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435. 
(25) Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375. (26) Messer G., Röhl, P., Grosse G., in Jitschin W. (1987). J. Vac. 
Sci. Technol. (A), 5(4), 2440. 
(27) Comsa G., Fremerey J.K., in Lindenau, B. (1980). J. Vac. Sci. 
Technol. 17(2), 642. 
(28) Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 49
 
Dodatek  
Ocenjevalna metoda  
UVOD 
Izračunane vrednosti parnega tlaka se lahko uporabijo: 
— za izbiro primerne preskusne metode, 
— za pridobitev ocene ali mejne vrednosti v primerih, kadar preskusne metode 
ni mogoče uporabiti zaradi tehni čnih razlogov.  
OCENJEVALNA METODA 
Parni tlak teko čin in trdnih snovi se lahko oceni z uporabo prilagojene Watso ­
nove korelacije (a). Edini potrebni s preskusom pridobljeni podatek je normalno vrelišče. Metoda je uporabna za obmo čje tlaka od 10
 5 Pa do 10  –5 Pa. 
Podrobne informacije o metodi so navedene v „Priro čniku metod za ocenjevanje 
kemijskih lastnosti“ (b). Glej tudi OECD Environmental Monograph št. 67 (c).  
RAČUNSKI POSTOPEK 
Parni tlak se izra čuna na naslednji na čin: 
ln P vp ≈ ΔH vb 
ΔZ b RT b 1 – 3 – 2  T 
T b Í Î  m 
T 
T b – 2m 3 – 2  T 
T b Í Î  m – 1 
ln T 
T b 2 
6 6 4 3 
7 7 5 
pri čemer je: 
T = izbrana temperatura 
T b = normalno vreliš če 
P vp = parni tlak pri temperaturi T 
ΔH vb = izparilna toplota 
ΔZ b = faktor stisljivosti (ocenjen na 0,97) 
m = empiri čni faktor, odvisen od agregatnega stanja pri izbrani temperaturi 
Nadalje  
ΔH vb 
T b ¼ K F ð8; 75 þ R ln T b Þ 
pri čemer je K  F empirični faktor, ki upošteva polarnost snovi. V viru (b) so 
navedeni faktorji K  F za več spojin.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 50
 
Precej pogosto so na voljo podatki o vreliš ču pri znižanem tlaku. Pri takih 
primerih se parni tlak izra čuna na naslednji na čin: 
ln P vp ≈ ln P 1 þ ΔH v1 
ΔZ b RT 1 1 – 3 – 2  T 
T 1 Í Î  m T 1 
T – 2m 3 – 2  T 
T 1 Í Î  m – 1 
ln T 
T 1 " #  
pri čemer je T  1 vrelišče pri znižanem tlaku P  1 . 
POROČILO 
Pri uporabi ocenjevalne metode, poro čilo vključuje izčrpno dokumentacijo izra ­ 
čuna. 
VIRI 
(a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398. 
(b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill. 
(c) OECD Environmental Monograph No.67. Application of Structure-Activity 
Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Asses ­
sment (1993).  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 51
 
A.5 POVRŠINSKA NAPETOST  
1. METODA  
Opisane metode temeljijo na smernici za preskušanje OECD (1). 
Temeljna na čela so navedena v viru (2).  
1.1 UVOD 
Opisane metode se uporabljajo za merjenje površinske napetosti 
vodnih raztopin. 
Pred izvajanjem teh preskusov je koristno imeti predhodne informa ­
cije o topnosti snovi v vodi, njeni zgradbi, hidrolitskih lastnostih in kritični koncentraciji za tvorbo micel. 
Metode, ki sledijo, so uporabne za ve čino kemijskih snovi, brez 
kakršnih koli omejitev glede njihove stopnje čistosti. 
Merjenje površinske napetosti z metodo tenziometra z obro čkom je 
omejeno na vodne raztopine z dinami čno viskoznostjo pod približno 
200 mPa s.
 
1.2 OPREDELITVE IN ENOTE 
Prosto površinsko entalpijo na enoto površine imenujemo površinska 
napetost. 
Površinska napetost se navede v: N/m (enota SI) ali 
mN/m (podenota SI) 
1 N/m = 10
 3 din/cm 
1 mN/m = 1 din/cm v zastarelem sistemu cgs  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Referenčnih snovi ni treba uporabiti vsakokrat, ko se preu čuje nova 
snov. Predvsem naj bi se uporabljale za ob časno preverjanje u čin­
kovitosti metode in za omogo čanje primerjave z rezultati drugih 
metod. 
Referenčne snovi, ki zajemajo široko obmo čje površinskih napetosti, 
so navedene v virih 1 in 3.  
1.4 PRINCIP METOD 
Metode temeljijo na merjenju najve čje navpične sile, ki jo je treba 
uporabiti na zanki ali obro čku v stiku s površino preiskovane teko ­ 
čine v merilni posodici, da bi ga lo čili od te površine, ali na ploš čici, 
katere rob se stika s površino, da bi potegnili nastali film navzgor. 
Snovi, ki so topne v vodi vsaj pri koncentraciji 1 mg/l, se preskušajo 
v vodni raztopini pri eni sami koncentraciji.  
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Natančnost teh metod je ve čja, kot je to obi čajno potrebno za 
okoljsko presojo.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 52
 
1.6 OPIS METOD 
Pripravi se raztopina snovi v destilirani vodi. Koncentracija te razto ­
pine mora biti 90 % koncentracije nasi čene raztopine te snovi v vodi; 
kadar ta koncentracija presega 1 g/l, se za preskušanje uporabi 
koncentracija 1 g/l. Snovi, katerih topnost v vodi je manjša od 
1 mg/l, ni treba preskušati.  
1.6.1  Metoda s ploš čico 
Glej ISO 304 in NF T 73-060 (Površinsko aktivne snovi – dolo čanje 
površinske napetosti z dviganjem teko činskih filmov).  
1.6.2  Metoda z zanko  
Glej ISO 304 in NF T 73-060 (Površinsko aktivne snovi – dolo čanje 
površinske napetosti z dviganjem teko činskih filmov).  
1.6.3  Metoda z obro čkom  
Glej ISO 304 in NF T 73-060 (Površinsko aktivne snovi – dolo čanje 
površinske napetosti z dviganjem teko činskih filmov).  
1.6.4  Usklajena metoda OECD z obro čkom  
1.6.4.1  Aparatura  
Za to merjenje so primerni na trgu dostopni tenziometri. Sestavljajo 
jih naslednji deli: 
— premi čna mizica za vzorec, 
— sistem za merjenje sile, 
— merilno telo (obro ček), 
— merilna posoda.  
1.6.4.1.1 P r e m i č n a m i z i c a z a v z o r e c 
Premična mizica za vzorec se uporablja kot podpora za termostati ­
rano merilno posodo, v kateri je preskusna teko čina. Skupaj s 
sistemom za merjenje sile je nameš čena na stojalu.  
1.6.4.1.2 S i s t e m z a m e r j e n j e s i l e 
Sistem za merjenje sile (glej sliko) je nad mizico za vzorec. Napaka 
pri merjenju sile ne sme presegati ± 10  -6 N, kar ustreza meji napake 
±0,1 mg pri dolo čanju mase. Merilna skala na trgu dostopnih tenzio ­
metrov je v ve čini primerov umerjena v mN/m, tako da se lahko 
površinska napetost od čita neposredno v mN/m na 0,1 mN/m to čno. ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 53
 
1.6.4.1.3 M e r i l n o t e l o ( o b r o č e k ) 
Obroček je običajno narejen iz platina-iridijeve žice, debele približno 
0,4 mm, in s povpre čnim obsegom 60 mm. Ži čnati obro ček visi v 
vodoravnem položaju s kovinske zaponke in ži čnatega namestitve ­
nega nosilca, tako da je povezan s sistemom za merjenje sile (glej sliko).
 
Slika  
Merilno telo  
(Vse dimenzije so v milimetrih)
  
1.6.4.1.4 M e r i l n a p o s o d a 
Merilna posoda, v kateri je preskusna raztopina, je termostatirana 
steklena posoda. Zasnovana je tako, da med merjenjem temperatura preskusne raztopine in plinske faze nad njeno površino ostane 
konstantna ter vzorec ne more izhlapeti. Sprejemljive so valjaste 
steklene posode z notranjim premerom najmanj 45 mm.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 54
 
1.6.4.2  Priprava aparature  
1.6.4.2.1 Č i š č e n j e 
Steklene posode se temeljito o čistijo. Če je potrebno, se operejo z 
vročo kromžveplovo kislino in nato z gosto teko čo fosforjevo kislino 
(83 do 98 masnih % H  3 PO 4 ), temeljito sperejo pod teko čo vodo in 
nazadnje še z dvakrat destilirano vodo do nevtralne reakcije, nato se 
posušijoali splaknejo z delom preskusne teko čine. 
Obroček se najprej temeljito splakne z vodo, da se odstranijo vse v 
vodi topne snovi, nato se za kratek čas potopi v kromžveplovo 
kislino, opere v dvakrat destilirani vodi do nevtralne reakcije ter 
na koncu na hitro segreje nad metanolnim plamenom.  
Opomba:  
Nečistote, ki niso topne ali razgradljive v kromžveplovi ali fosforjevi 
kislini, na primer silikoni, se odstranijo z ustreznim organskim topi ­
lom. 
1.6.4.2.2 U m e r j a n j e a p a r a t u r e 
Validacija aparature obsega preverjanje ni čelne točke in njeno narav ­
navo, tako da je omogo čeno zanesljivo od čitavanje z instrumenta v 
mN/m.  
Postavitev:  
Aparatura se izravna, na primer s pomo čjo vodne tehtnice na osnovni 
plošči tenziometra, z nastavitvijo izravnalnih vijakov na osnovni 
plošči. 
Naravnava ni čelne točke: 
Po namestitvi obro čka na aparaturo in pred potopitvijo v teko čino se 
tenziometer naravna na ni člo ter preveri, ali je obro ček vzporeden s 
površino teko čine. V ta namen se površina teko čine lahko uporabi 
kot ogledalo.  
Umeritev:  
Dejansko umerjanje se lahko opravi po enem od dveh postopkov: 
(a) Z uporabo mase: postopek z uporabo jaha čev z znano maso med 
0,1 in 1,0 g, postavljenih na obro ček. Umeritveni faktor Φ a , s 
katerim je treba pomnožiti vse od čitke z instrumenta, se dolo či 
po enačbi (1):  
Φ a ¼ σ r 
σ a (1) 
pri čemer je:  
σ r ¼ mg 
2b (mN/m) 
m = masa jaha ča (g) 
g = gravitacijski pospešek (981 cm s  -2 na morski višini) 
b = povpre čni obseg obro čka (cm) 
σa = odčitek tenziometra po namestitvi jaha ča na obro ček 
(mN/m).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 55
 
(b) Z uporabo vode: postopek z uporabo čiste vode, katere povr ­ 
šinska napetost pri, na primer, 23  o C je 72,3 mN/m. Ta postopek 
je hitrejši od masnega umerjanja, vendar vedno obstaja nevar ­
nost, da je površinska napetost vode napa čna zaradi sledov ones ­
naženja s površinsko aktivnimi snovmi. 
Umeritveni faktor Φ b , s katerim je treba pomnožiti vse od čitke z 
instrumenta, se dolo či po enačbi (2):  
Φ b ¼ σ o 
σ g (2) 
pri čemer je: 
σ o = površinska napetost vode, navedena v literaturi (mN/m) 
σ g = izmerjena površinska napetost vode (mN/m), obe pri isti 
temperaturi.  
1.6.4.3  Priprava vzorcev  
Pripravijo se vodne raztopine preskusnih snovi v potrebnih koncen ­
tracijah in ne smejo vsebovati nobenih neraztopljenih snovi. 
Vzdrževati je treba konstantno temperaturo (±0,5  o C) raztopine. Ker 
se površinska napetost raztopine v merilni posodi spreminja s časom, 
se izvede ve č meritev ob razli čnih časih in izdela krivulja, ki prika ­
zuje površinsko napetost kot funkcijo časa. Ko ni ve č nadaljnjih 
sprememb, je doseženo stanje ravnotežja. 
Onesnaženje z drugimi snovmi v obliki prahu in plinov moti merje ­
nje. Zato se delo izvaja pod zaš čitnim pokrovom.  
1.6.5  Preskusni pogoji  
Merjenje se opravi pri približno 20  o C, ob vzdrževanju konstantne 
temperature ± 0,5  o C. 
1.6.6  Izvedba preskusa  
Merjena raztopina se nalije v dobro o čiščeno merilno posodo, pri 
čemer je treba paziti, da se ne peni, nato se merilna posoda postavi 
na mizico preskusne aparature. Vrh mizice z merilno posodo se 
dviga, dokler se obro ček ne potopi pod površino merjene raztopine. 
Nato se vrh mizice postopoma in enakomerno spuš ča (s hitrostjo 
približno 0,5 cm/min), da bi se obro ček odtrgal od površine, dokler 
se ne doseže najve čja sila. Teko ča plast, ki se drži obro čka, se od 
njega ne sme lo čiti. Po kon čani meritvi se obro ček spet potopi pod 
površino in merjenja ponavljajo, dokler se ne doseže konstantna vrednost površinske napetosti. Za vsako meritev se zapiše čas, ki 
je minil od ulitja teko čine v merilno posodo. Vrednost se od čita 
pri največji sili, potrebni za odtrganje obro čka od površine teko čine.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 56
 
2. PODATKI  
Za izračun površinske napetosti se vrednost, od čitana z aparature v 
mN/m, najprej pomnoži z umeritvenim faktorjem Φ a ali Φ b (odvisno 
od uporabljenega umeritvenega postopka). Dobljena vrednost je le 
približna in jo je treba popraviti. 
Harkins in Jordan (4) sta empiri čno določila korekcijske faktorje za 
vrednosti površinske napetosti, izmerjene z metodo z obro čkom, ki 
so odvisni od dimenzij obro čka, gostote teko čine in njene površinske 
napetosti. 
Ker je postopek dolo čanja korekcijskega faktorja za vsako posa ­
mezno meritev iz Harkinsovih in Jordanovih tabel dolgotrajen, se 
lahko za izra čun površinske napetosti vodnih raztopin uporabi 
poenostavljeni postopek od čitavanja popravljenih vrednosti površin ­
skih napetosti neposredno iz tabele. (Za od čitke med vrednostmi v 
tabeli se uporabi interpolacija.)  
Tabela  
Popravljanje izmerjene površinske napetosti  
Le za vodne raztopine, ρ = 1 g/cm  3 
r = 9,55 mm (povpre čni polmer obro čka) 
r = 0,185 mm (polmer žice obro čka) 
Izmerjena vrednost (mN/m) Popravljena vrednost (mN/m) 
Umeritev z maso (glej 1.6.4.2.2(a)) Umertlev z vodo (glej 1.6.4.2.2(b))  
20 16,9 18,1 
22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 
26 22,4 24,1 
28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 
50 45,3 48,6 
52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 57
 
Izmerjena vrednost (mN/m) Popravljena vrednost (mN/m) 
Umeritev z maso (glej 1.6.4.2.2(a)) Umertlev z vodo (glej 1.6.4.2.2(b))  
58 53,2 57,0 
60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 — 
Ta tabela je bila sestavljena na podlagi Harkins-Jordanovega 
popravka. Podobna je tabeli iz standarda DIN (DIN 53914) za vodo in vodne raztopine (gostota ρ = 1 g/cm
 3 ) in velja za na trgu 
dostopen obro ček z dimenzijami R = 9,55 mm (povpre čni polmer 
obročka) in r = 0,185 mm (polmer žice obro čka). V tabeli so popra ­
vljene vrednosti za meritve površinske napetosti, opravljene po umeritvi z utežmi ali vodo. 
Druga možnost je, da se brez predhodne umeritve površinska nape ­
tost izračuna po naslednji ena čbi:
 
σ ¼ f x F 
4πR 
pri čemer je: 
F = sila, izmerjena z dinamometrom, tik preden film po či 
R = polmer obro čka 
f = korekcijski faktor (1)  
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
V poročilo o preskusu se, če je možno, vklju čijo naslednje informacije: 
— uporabljena metoda, 
— vrsta uporabljene vode ali raztopine, 
— natančna specifikacija snovi (identiteta in ne čistote), 
— rezultati merjenja: površinska napetost (od čitek), tako posamezni 
odčitki kot tudi njihova aritmeti čna sredina in popravljena aritme ­
tična sredina (upoštevajo č faktor opreme in korekcijsko tabelo),  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 58
 
— koncentracija raztopine, 
— temperatura preskusa, — starost uporabljene raztopine; zlasti čas, pretekel od priprave do 
meritve raztopine, 
— opis časovne odvisnosti površinske napetosti po prenosu razto ­
pine v merilno posodo, 
— informacije in opombe, pomembne za razlago rezultatov, zlasti 
glede nečistot in agregatnega stanja snovi.
 
3.2 RAZLAGA REZULTATOV 
Glede na to, da je površinska napetost destilirane vode 72,75 mN/m 
pri 20  o C, je treba snovi, katerih površinska napetost pri pogojih te 
metode je manjša od 60 mN/m, šteti za površinsko aktivne snovi.  
4. VIRI  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the 
Council C(81) 30 final. 
(2) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New 
York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV 
(3) Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511. (4) Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 
52, 1751.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 59
 
A.6 TOPNOST V VODI  
UVOD 
1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 105 
(1995). Je revidirana razli čica prvotne TG 105, ki je bila sprejeta leta 
1981. Med sedanjo razli čico in tisto iz leta 1981 ni vsebinskih razlik, 
temveč je spremenjena predvsem oblika. Revizija je temeljila na preskusni 
metodi EU „Topnost v vodi“ (  1 ). 
ZAČETNI PREUDARKI 
2. Na topnost snovi v vodi lahko znatno vpliva prisotnost ne čistot. S to 
preskusno metodo se dolo ča topnost v vodi za v glavnem čiste snovi, ki 
so stabilne v vodi in niso hlapne. Pred dolo čanjem topnosti v vodi je kori ­
stno imeti nekatere predhodne informacije o preskusni snovi, kot so struk ­
turna formula, parni tlak, disociacijska konstanta in hidroliza v odvisnosti od 
pH. 
3. V tej preskusni metodi sta opisani dve metodi, in sicer metoda z izpiranjem 
kolone in metoda z bu čko, ki se uporabljata za topnost pod 10  –2 g/l oziroma 
nad njo. Opisan je tudi preprost predhodni preskus. Ta omogo ča določitev 
približne koli čine vzorca, ki bo uporabljena v kon čnem preskusu, in časa, 
potrebnega za dosego nasi čenja.  
OPREDELITEV POJMOV IN ENOTE 
4. Topnost snovi v vodi je masna koncentracija nasi čene raztopine te snovi v 
vodi pri dolo čeni temperaturi. 
5. Topnost v vodi je izražena v masi topljenca na volumen raztopine. Enota SI 
je kg/m  3 , lahko pa se uporablja tudi g/l.  
REFEREN ČNE KEMIKALIJE 
6. Pri preiskovanju preskusne snovi ni treba uporabiti referen čnih kemikalij.  
OPIS METOD  
Preskusni pogoji  
7. Preskus se po možnosti opravi pri 20 ± 0,5 °C. Izbrana temperatura mora 
biti konstantna v vseh bistvenih delih opreme.  
Predhodni preskus  
8. Približno 0,1 g vzorca (trdne preskusne snovi je treba uprašiti) v 10-milili ­
trskem merilnem valju s steklenim zamaškom se postopno dodajajo vse 
večje količine vode sobne temperature. Po vsakem dodatku dolo čene koli­ 
čine vode se zmes 10 minut stresa, nato pa se vizualno preveri, ali so v njej 
prisotni neraztopljeni delci vzorca. Če po dodanih 10 ml vode vzorec ali del 
vzorca ostane neraztopljen, se preskus nadaljuje v 100-mililitrskem 
merilnem valju. Približna topnost je navedena v preglednici 1 pod tisto  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 60
 
količino vode, v kateri se je vzorec popolnoma raztopil. Kadar je topnost 
nizka, je lahko za raztopitev preskusne snovi potrebnega veliko časa, poča­
kati pa je treba najmanj 24 ur. Če preskusna snov po 24 urah še vedno ni 
raztopljena, je treba po čakati dlje (do 96 ur) ali jo dodatno razred čiti, da se 
ugotovi, ali je treba uporabiti metodo z izpiranjem kolone ali metodo z 
bučko. 
Preglednica 1  
ml vode za 0,1 g topne snovi 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 
približna topnost v g/l > 1 000 1 000 do 
200 200 do 
100 100 do 
50 50 do 10 10 do 1 < 1  
Metoda z izpiranjem kolone  
Načelo 
9. Ta metoda temelji na izpiranju preskusne snovi z vodo iz mikrokolone, ki je 
napolnjena z inertnim nosilcem, na katerega se predhodno nanese prebitna 
količina preskusne snovi (2). Topnost v vodi se dolo či, ko masna koncen ­
tracija eluata doseže konstantno raven v odvisnosti od časa. 
Aparatura  
10. Aparaturo sestavlja mikrokolona (slika 1), v kateri se ohranja konstantna 
temperatura in ki je povezana bodisi z recirkulacijsko črpalko (slika 2) 
bodisi z nivojsko posodo (slika 3). Mikrokolona vsebuje inertni nosilec, 
katerega uhajanje prepre čuje majhen čep iz steklene volne, ki se uporablja 
tudi za filtracijo delcev. Kot nosilec je mogo če uporabiti steklene kroglice, 
diatomejsko zemljo ali druge inertne materiale. 
11. Mikrokolona na sliki 1 je primerna za postavitev z recirkulacijsko črpalko. 
Ima nadprostor s petkratnim volumnom polnitve (pet volumnov polnitve se na začetku preskusa zavrže) in volumen petih vzorcev (ki se med preskusom 
vzamejo za analizo). Lahko je tudi manjša, če je mogo če v sistem med 
preskusom dodajati vodo za nadomestitev za četnih petih volumnov polnitve, 
ki se zavržejo skupaj z ne čistotami. Kolona je s cevjo iz inertnega materiala 
povezana z recirkulacijsko črpalko z zmogljivostjo približno 25 ml/h. Recir ­
kulacijska črpalka je lahko na primer peristalti čna ali membranska črpalka. 
Paziti je treba, da material cevi ne povzro či onesnaženja in/ali adsorpcije. 
12. Shema postavitve z nivojsko posodo je prikazana na sliki 3. Pri tej posta ­
vitvi je mikrokolona opremljena z enosmernim petelin čkom. Povezavo z 
nivojsko posodo sestavljata spojka iz brušenega stekla in cev iz inertnega 
materiala. Pretok iz nivojske posode mora biti približno 25 ml/h.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 61
 
Slika 1
  
Mere v mm 
A. Priklju ček za spojko iz brušenega stekla 
B. Nadprostor C. Notranjost 5 D. Zunanjost 19 
E. Čep iz steklene volne 
F. Petelin ček
 
Slika 2
  
A. Atmosfersko uravnoteževanje 
B. Merilnik pretoka 
C. Mikrokolona D. Termostatirana cirkulacijska črpalka 
E. Recirkulacijska črpalka 
F. Dvosmerni ventil za vzor čenje
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 62
 
Slika 3
  
A. Nivojska posoda (npr. 2,5-litrska laboratorijska steklenica) 
B. Kolona C. Zbiralnik frakcij D. Termostat E. Teflonska cev F. Spojka iz brušenega stekla G. Dovod vode (med termostatom in kolono, notranji premer: približno 
8 mm) 
13. Približno 600 mg nosilca se prenese v 50-mililitrsko bu čko z okroglim 
dnom. Primerna koli čina preskusne snovi se raztopi v analitsko čistem 
hlapnem topilu, nato pa se ustrezna koli čina te raztopine doda nosilcu. 
Topilo se popolnoma upari, npr. z rotacijskim uparjalnikom, sicer se nosilec 
med izpiranjem ne bo nasitil z vodo zaradi porazdelitve na površini. Nosilec z naneseno preskusno snovjo se dve uri namaka v približno 5 ml vode, nato pa se suspenzija prelije v mikrokolono. Druga možnost je, da se v mikro ­
kolono, napolnjeno z vodo, strese suh nosilec z naneseno preskusno snovjo 
in se nato pusti približno dve uri, da se vzpostavi ravnotežje. 
14. Nanašanje na nosilec lahko povzro či težave, ki lahko privedejo do napa čnih 
rezultatov, npr. če se preskusna snov poseda kot olje. Take težave je treba 
preučiti in o tem poro čati.
 
Postopek z recirkulacijsko črpalko  
15. Tok se požene skozi kolono. Priporo čljivo je, da se uporabi pretok približno 
25 ml/h, ki ustreza 10 volumnom polnitve na uro za opisano kolono. Najmanj prvih pet volumnov polnitve se zavrže, da se odstranijo v vodi 
topne nečistote. Zatem naj črpalka deluje do vzpostavitve ravnotežja, ki je 
opredeljeno s petimi zaporednimi vzorci, katerih koncentracije se med seboj ne razlikujejo za ve č kot ± 30 %. Časovni intervali med temi vzorci morajo 
ustrezati prehodu najmanj deset volumnov polnitve. Glede na uporabljeno 
analitsko metodo je morda priporo čljivo izdelati krivuljo koncentracija- čas, 
ki prikazuje vzpostavitev ravnotežja.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 63
 
Postopek z nivojsko posodo  
16. Zaporedne frakcije eluata se zberejo in analizirajo z izbrano metodo. Za 
določitev topnosti se uporabijo frakcije eluata iz srednjega obmo čja, kjer 
so koncentracije pri najmanj petih zaporednih frakcijah konstantne v 
območju ± 30 %. 
17. Najprimernejši eluent je dvakrat destilirana voda. Uporabi se lahko tudi 
deionizirana voda z upornostjo nad 10 megaomov/cm, in vsebnostjo organ ­
skega ogljika pod 0,01 %. 
18. Pri obeh postopkih se druga meritev opravi pri polovi čnem pretoku prve 
meritve. Če so rezultati obeh meritev skladni, je preskus zadovoljiv. Če je 
pri manjšem pretoku izmerjena topnost ve čja, je treba pretok razpolavljati, 
dokler ni topnost pri dveh zaporednih meritvah enaka. 
19. Pri obeh postopkih je treba s preverjanjem Tyndallovega efekta preveriti, ali 
frakcije vsebujejo koloidne delce. Ob prisotnosti delcev je treba preskus razveljaviti in ga ponoviti, ko se izboljša filtracija v koloni. 
20. Izmeriti je treba pH vsakega vzorca, po možnosti s posebnimi merilnimi 
lističi.
 
Metoda z bu čko 
Načelo 
21. Preskusna snov (trdne snovi je treba uprašiti) se raztopi v vodi pri tempe ­
raturi, ki je nekoliko višja od temperature preskusa. Ko se doseže nasi če­
nost, se zmes ohladi in ohranja na temperaturi preskusa. Meritev se lahko 
izvede tudi neposredno pri temperaturi preskusa, če se z ustreznim vzor če­
njem zagotovi, da je dosežena to čka nasičenja. Nato se z ustrezno analitsko 
metodo (3) dolo či masna koncentracija preskusne snovi v vodni raztopini, ki 
ne sme vsebovati neraztopljenih delcev.  
Aparatura  
22. Potrebna je naslednja oprema: 
— običajna laboratorijska steklovina in instrumentarij, 
— naprava za stresanje ali mešanje raztopin pri nadzorovani konstantni 
temperaturi, 
— če je potrebna za emulzije, centrifuga (po možnosti termostatirana) in 
— analitska oprema.  
Postopek  
23. S predhodnim preskusom se oceni koli čina preskusne snovi, potrebna za 
nasičenje želenega volumna vode. Približno petkratnik te koli čine se zatehta 
v vsako od treh steklenih posod s steklenimi zamaški (npr. centrifugirke, 
bučke). V vsako posodo se doda volumen vode, izbran glede na analitsko 
metodo in obmo čje topnosti. Posode se tesno zamašijo in pretresejo pri 
30 °C. Uporabiti je treba napravo za stresanje ali mešanje, ki lahko deluje pri konstantni temperaturi, npr. napravo za magnetno mešanje v termostati ­
rani vodni kopeli. Po enem dnevu se v eni od posod 24 ur vzpostavlja 
ravnotežje pri temperaturi preskusa, pri čemer se posoda ob časno pretrese.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 64
 
Vsebina posode se pri temperaturi preskusa centrifugira, nato pa se z 
ustrezno analitsko metodo dolo či koncentracija preskusne snovi v bistri 
vodni fazi. S preostalima posodama se ravna podobno po za četnem vzpo ­
stavljanju ravnotežja pri 30 °C, ki traja pri eni dva in pri drugi tri dni. Če se 
izmerjene koncentracije v vsaj zadnjih dveh posodah ne razlikujejo za ve č 
kot 15 %, je preskus zadovoljiv. Če se pri rezultatih, izmerjenih v posodah 
1, 2 in 3, kaže težnja k naraš čanju vrednosti, je treba celoten preskus 
ponoviti z daljšimi časi za vzpostavljanje ravnotežja. 
24. Preskus se lahko opravi tudi brez predhodne inkubacije pri 30 °C. Da se 
oceni hitrost doseganja to čke nasičenja, se vzorci jemljejo, dokler čas 
mešanja ne vpliva ve č na izmerjene koncentracije. 
25. Izmeriti je treba pH vsakega vzorca, po možnosti s posebnimi merilnimi 
lističi. 
Analitsko dolo čanje 
26. Po možnosti se uporabi metoda, specifi čna za posamezno snov, saj lahko 
majhne koli čine topnih ne čistot povzro čijo velike napake pri izmerjeni 
topnosti. Primeri takih metod so: plinska ali teko činska kromatografija, 
titracija, fotometrija, voltametrija.  
PODATKI IN PORO ČANJE  
Podatki  
Metoda z izpiranjem kolone  
27. Za vsako ponovitev je treba izra čunati srednjo vrednost in standardni odklon 
za najmanj pet zaporednih vzorcev, vzetih pri to čki nasičenja. Srednje vred ­
nosti, dobljene pri dveh preskusih z razli čnimi pretoki, se ne smejo razli ­
kovati za ve č kot 30 %.  
Metoda z bu čko 
28. Za vsako od treh bu čk se izračuna povpre čna vrednost rezultatov, ki se ne 
smejo razlikovati za ve č kot 15 %.  
Poročilo o preskusu  
Metoda z izpiranjem kolone  
29. Poro čilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: 
— rezultate predhodnega preskusa, — kemijsko identiteto in ne čistote (predhodno pre čiščevanje, če je bilo 
opravljeno), 
— koncentracije, pretoke in pH za vsak vzorec, 
— srednje vrednosti in standardne odklone za najmanj pet vzorcev, vzetih 
pri točki nasičenja vsake ponovitve, 
— povpre čje najmanj dveh zaporednih ponovitev, 
— temperaturo vode med procesom nasi čenja, 
— analitsko metodo, 
— vrsto nosilca, — nanašanje na nosilec, 
— uporabljeno topilo, 
— dokaze o kakršni koli kemijski nestabilnosti snovi med preskusom, — vse informacije, pomembne za razlago rezultatov, zlasti glede ne čistot in 
agregatnega stanja preskusne snovi.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 65
 
Metoda z bu čko 
30. Poro čilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: 
— rezultate predhodnega preskusa, — kemijsko identiteto in ne čistote (predhodno pre čiščevanje, če je bilo 
opravljeno), 
— posamezne analitske dolo čitve in povpre čje, če je bilo za posamezno 
bučko določenih več vrednosti, 
— pH vsakega vzorca, — povpre čje vrednosti za razli čne bučke, pri katerih so bili rezultati 
skladni, 
— temperaturo preskusa, — analitsko metodo, — dokaze o kakršni koli kemijski nestabilnosti snovi med preskusom, 
— vse informacije, pomembne za razlago rezultatov, zlasti glede ne čistot in 
agregatnega stanja preskusne snovi.
 
VIRI:  
(1) Direktiva Komisije 92/69/EGS z dne 31. julija 1992 o sedemnajsti prilago ­
ditvi tehni čnemu napredku Direktive Sveta 67/548/EGS o približevanju 
zakonov in drugih predpisov v zvezi z razvrš čanjem, pakiranjem in ozna če­
vanjem nevarnih snovi (UL L 383, 29.12.1992, str. 54). 
(2) NF T 20-045 (AFNOR) (september 1985). Chemical products for industrial 
use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solu ­
bility – Column elution method. 
(3) NF T 20-046 (AFNOR) (september 1985). Chemical products for industrial 
use – Determination of water solubility of solids and liquids with high 
solubility – Flask method.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 66
 
A.8 PORAZDELITVENI KOEFICIENT  
1. METODA  
Opisana metoda „stresanja bu čke“ temelji na smernici za preskušanje 
OECD (1).  
1.1 UVOD 
Za izvajanje tega preskusa je koristno imeti predhodne informacije o 
strukturni formuli, disociacijski konstanti, topnosti v vodi, hidrolizi, 
topnosti v n-oktanolu in površinski napetosti snovi. 
Pri snoveh, ki tvorijo ione, je treba meritve opraviti le z njihovo 
neionizirano obliko (prosta kislina ali prosta baza), pridobljeno z uporabo ustreznega pufra s pH, ki je najmanj eno enoto pod (prosta 
kislina) ali nad (prosta baza) pK. 
Ta preskusna metoda vklju čuje dva lo čena postopka: metodo stre ­
sanja bučke in teko činsko kromatografijo visoke lo čljivosti (HPLC). 
Prvi se uporablja, kadar je vrednost log P
 ow (opredelitve glej spodaj) 
v območju od -2 do 4, in drugi, kadar je v obmo čju od 0 do 6. Pred 
izvedbo katerega koli postopka, je treba pridobiti predhodno oceno porazdelitvenega koeficienta. 
Metoda stresanja bu čke se uporablja samo za v glavnem čiste snovi, 
topne v vodi in n-oktanolu. Ni uporabna za površinsko aktivne snovi 
(za katere je treba navesti izra čunano vrednost ali oceno na podlagi 
topnosti v n-oktanolu in topnosti v vodi). 
Metoda HPLC ni uporabna za mo čne kisline in baze, kovinske 
komplekse, površinsko aktivne snovi ali snovi, ki reagirajo z eluen ­
tom. Za te snovi je treba navesti izra čunano vrednost ali oceno na 
podlagi topnosti v n-oktanolu in topnosti v vodi. 
Metoda HPLC je manj ob čutljiva za prisotnost ne čistot v preskusni 
snovi kakor metoda stresanja bu čke. Vendar v nekaterih primerih 
lahko ne čistote otežijo razlago rezultatov, ker postane dolo čitev 
vrha negotova. Za zmesi, ki dajo nedolo čen pas, se navedejo zgornja 
in spodnja meja log P.
 
1.2 OPREDELITVE IN ENOTE 
Porazdelitveni koeficient (P) je torej koli čnik dveh koncentracij in se 
ponavadi navede v obliki logaritma z osnovo 10 (log P).  
p ow ¼ c n Ä Octanol 
c Voda 
Porazdelitveni koeficient (P) je opredeljen kot razmerje ravnotežnih 
koncentracij (c) raztopljene snovi v dvofaznem sistemu, sestavljenem 
iz dveh topil, ki se v glavnem ne mešata. V primeru n-oktanola in 
vode:  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 67
 
1.3 REFEREN ČNE SNOVI  
Metoda stresanja bu čke 
Referenčnih snovi ni treba uporabiti vsakokrat, ko se preu čuje nova 
snov. Predvsem naj bi se uporabljale za ob časno preverjanje u čin­
kovitosti metode in za omogo čanje primerjave z rezultati drugih 
metod.  
Metoda HPLC  
Za določitev soodvisnosti med rezultati meritev s HPLC za snov in 
njeno vrednostjo P, je treba izdelati umeritveno krivuljo log P v odvisnosti od kromatografskih podatkov z uporabo najmanj 6 refe ­
renčnih točk. Uporabnik sam izbere primerne referen čne snovi. 
Kadar je le mogo če, naj ima najmanj ena referen čna snov ve čji in 
ena manjši P
 ow kot preskusna snov. Za vrednosti log P, manjše od 4, 
umeritev lahko temelji na podatkih, dobljenih z metodo stresanja bučke. Za vrednosti log P, ve čje od 4, umeritev lahko temelji na 
validiranih podatkih iz literature, če so skladni z izra čunanimi vred ­
nostmi. Za ve čjo točnost je priporo čljivo izbrati referen čne snovi, ki 
so strukturno sorodne preskusni snovi. 
Na voljo so iz črpni seznami vrednosti log P
 ow za mnoge skupine 
kemikalij (2)(3). Če ni podatkov o porazdelitvenih koeficientih struk ­
turno sorodnih snovi, se lahko uporabi bolj splošna umeritev z 
drugimi referen čnimi snovmi. 
Seznam priporo čenih referen čnih snovi in njihovih vrednosti P  ow je v 
dodatku 2.  
1.4 PRINCIP METODE  
1.4.1  Metoda stresanja bu čke 
Za določitev porazdelitvenega koeficienta je treba vzpostaviti ravno ­
težje med vsemi medsebojno delujo čimi komponentami sistema in 
določiti koncentraciji snovi, raztopljene v dveh fazah. Študija litera ­
ture o tej temi kaže, da se v ta namen lahko uporabi ve č različnih 
tehnik, npr. temeljito mešanje dveh faz, ki mu sledi njuno lo čevanje, 
da se ugotovi ravnotežna koncentracija preiskovane snovi.  
1.4.2  Metoda HPLC  
HPLC se izvaja z analitskimi kolonami, napolnjenimi z na trgu 
dostopno trdno fazo, ki vsebuje dolge verige ogljikovodikov (npr. C
 8 , C 18 ), vezane na silicijev dioksid. Snovi, injicirane v tako kolono, 
potujejo vzdolž nje z razli čnimi hitrostmi, zaradi razli čne stopnje 
porazdelitve med mobilno fazo in stacionarno fazo ogljikovodikov. Zmesi snovi se eluirajo v vrstnem redu po hidrofobnosti, pri čemer 
se prve eluirajo vodotopne snovi in zadnje tiste, topne v olju, soraz ­
merno z njihovim porazdelitvenim koeficientom ogljikovodik/voda. 
To omogo ča določitev razmerja med retenzijskim časom v taki 
koloni (z reverzno fazo) in porazdelitvenim koeficientom n-oktanol/ voda. Porazdelitveni koeficient se dolo či s sklepanjem iz faktorja 
kapacitete k, opisanega z ena čbo: molekula topila, da pride skozi 
kolono (mrtvi čas).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 68
 
k ¼ t R Ä t o 
t o 
pri čemer je t  R = retenzijski čas preskusne snovi in t  o = povpre čni 
čas, ki ga potrebuje molekula topila, da pride skozi kolono (mrtvi 
čas). 
Kvantitativna analiza ni potrebna, treba je dolo čiti le elucijske čase. 
1.5 MERILA KAKOVOSTI  
1.5.1  Ponovljivost  
Metoda stresanja bu čke 
Da se zagotovi to čnost porazdelitvenega koeficienta, je treba izvesti 
po dve vzporedni meritvi pri treh razli čnih preskusnih pogojih, pri 
čemer se lahko spreminjata koli čina navedene snovi in razmerje 
volumnov topil. Dolo čene vrednosti porazdelitvenega koeficienta, 
izražene kot logaritmi z osnovo 10, morajo biti v obmo čju ±0,3 
log enot.  
Metoda HPLC  
Za povečanje zanesljivosti meritve, je treba izvesti dve vzporedni 
določitvi. Vrednosti log P, izpeljane iz posameznih meritev, naj 
bodo v obmo čju ±0,1 enot log.  
1.5.2  Ob čutljivost  
Metoda stresanja bu čke 
Merilno obmo čje metode je dolo čeno z mejo detekcije analitskega 
postopka. Ta bi morala omogo čiti določitev vrednosti log P  ow v 
območju od –2 do 4 (ob časno, kadar so izpolnjeni pogoji, se to 
območje lahko razširi do vrednosti log P  ow 5), kadar koncentracija 
topljenca v nobeni fazi ni ve čja od 0,01 mola na liter.  
Metoda HPLC  
Metoda HPLC omogo ča ocenjevanje porazdelitvenega koeficienta v 
območju log P  ow od 0 do 6. 
Navadno se porazdelitveni koeficient lahko oceni do ± 1 enote log 
vrednosti, dobljene z metodo stresanja bu čke. Značilne soodvisnosti 
so navedene v literaturi (4)(5)(6)(7)(8). Obi čajno se lahko doseže 
večja točnost, kadar korelacijske krivulje temeljijo na strukturno 
sorodnih referen čnih snoveh (9).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 69
 
1.5.3  Specifi čnost 
Metoda stresanja bu čke 
Nernstov porazdelitveni zakon velja samo pri konstantnih tempera ­
turi, tlaku in pH za razred čene raztopine. Nanaša se le na čiste snovi, 
porazdeljene med dve čisti topili. Če se v eni ali obeh fazah isto ­ 
časno pojavi ve č različnih topljencev, lahko to vpliva na rezultate. 
Disociacija ali asociacija raztopljenih molekul lahko povzro či odsto­
panje od Nernstovega porazdelitvenega zakona. Na takšna odsto ­
panja pokaže dejstvo, da postane porazdelitveni koeficient odvisen od koncentracije raztopine. 
Ker ta preskusna metoda zajema ve č ravnotežij, se ne sme upora ­
bljati za snovi, ki jih je mogo če ionizirati, ne da bi se upošteval 
popravek. Pri takšnih snoveh je treba presoditi o uporabi pufrskih raztopin namesto vode; pH pufra se mora najmanj za eno enoto pH 
razlikovati od pKa snovi, pri čemer je treba upoštevati pomen tega 
pH za okolje.
 
1.6 OPIS METODE  
1.6.1  Predhodna ocena porazdelitvenega koeficienta  
Porazdelitveni koeficient se po možnosti oceni z ra čunsko metodo 
(glej dodatek 1) ali, kadar je primerno, iz razmerja topnosti 
preskusne snovi v čistih topilih (10).  
1.6.2  Metoda stresanja bu čke 
1.6.2.1  Priprava  
n-Oktanol: Dolo čitev porazdelitvenega koeficienta je treba opraviti z 
zelo čistimi analitskimi reagenti. 
Voda: treba je uporabiti vodo, destilirano ali dvakrat destilirano v 
stekleni ali kremen čevi aparaturi. Za snovi, ki jih je mogo če ionizi­
rati, se uporabijo pufri, če je to upravi čeno. 
Opomba:  
Ne sme se uporabiti voda, vzeta neposredno iz ionskega izmenje ­
valca.  
1.6.2.1.1 P r e d h o d n o n a s i č e n j e t o p i l 
Preden se dolo či porazdelitveni koeficient, se topili medsebojno nasi ­
tita s stresanjem pri temperaturi preskusa. To se najlaže izvede tako, da se dve veliki standardni steklenici zelo čistega analitskega n- 
oktanola ali vode, v vsaki od katerih je zadostna koli čina drugega 
topila, stresata 24 ur na mehanskem stresalniku, nato se pustita stati 
tako dolgo, da se fazi lo čita in se vzpostavi stanje nasi čenosti.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 70
 
1.6.2.1.2 P r i p r a v a n a p r e s k u s 
Celoten volumen dvofaznega sistema naj bo tolikšen, da skoraj v 
celoti napolni preskusno posodo. To bo pomagalo prepre čiti izgubo 
topila zaradi izhlapevanja. Volumsko razmerje in koli čine snovi, ki 
se bodo uporabili, se dolo čijo glede na: 
— predhodno oceno porazdelitvenega koeficienta (glej zgoraj), 
— najmanjšo koli čino preskusne snovi, potrebno za analitski posto ­
pek, in 
— omejitvijo najve čje koncentracije v kateri koli fazi na 0,01 mola 
na liter. 
Opravijo se trije preskusi. Pri prvem se uporabi izra čunano volumsko 
razmerje n-oktanol/voda; pri drugem se to razmerje deli z dve; pri tretjem pa se pomnoži z dve (npr. 1:1, 1:2, 2:1).
 
1.6.2.1.3 P r e s k u s n a s n o v 
Pripravi se osnovna raztopina v n-oktanolu, predhodno nasi čenem z 
vodo. Preden se ta osnovna raztopina uporabi za dolo čanje porazde ­
litvenega koeficienta, je treba natan čno določiti njeno koncentracijo. 
Ta raztopina se hrani v pogojih, ki zagotavljajo njeno stabilnost.  
1.6.2.2  Preskusni pogoji  
Temperatura preskusa mora biti konstantna (± 1  o C) in v obmo čju 
med 20 in 25  o C. 
1.6.2.3  Merilni postopek  
1.6.2.3.1 V z p o s t a v i t e v p o r a z d e l i t v e n e g a r a v n o t e ž j a 
Za vsakega od preskusnih pogojev je treba pripraviti po dve 
preskusni posodi, ki vsebujeta potrebni, to čno odmerjeni koli čini 
obeh topil ter potrebno koli čino osnovne raztopine. 
Faze n-oktanola se merijo z volumni. Preskusne posode je treba 
bodisi namestiti na ustrezne stresalnike ali jih stresati ro čno. Kadar 
se uporabljajo centrifugirke, je priporo čena metoda hitro obra čanje 
centrifugirke za 180  o okrog njene pre čne osi, tako da se morebitni 
ujeti zrak dvigne skozi obe fazi. Izkušnje so pokazale, da 50 takšnih 
obratov obi čajno zadostuje za vzpostavitev porazdelitvenega ravno ­
težja. Za ve čjo gotovost pa se priporo ča 100 obratov v petih minu ­
tah. 
1.6.2.3.2 L o č i t e v f a z 
Kadar je potrebno, se fazi lo čita s centrifugiranjem. To se opravi z 
laboratorijsko centrifugo, v kateri se vzdržuje sobna temperatura, če 
pa se uporabi centrifuga brez termostata, se centrifugirke pustijo 
najmanj eno uro pred analizo pri temperaturi preskusa, da se vzpo ­
stavi ravnotežje.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 71
 
1.6.2.4  Analiza  
Za določitev porazdelitvenega koeficienta je treba dolo čiti koncen ­
tracijo preskusne snovi v obeh fazah. To se lahko stori tako, da se vzame alikvot vsake izmed dveh faz iz vsake epruvete za vsak 
preskusni pogoj in se analizira po izbranem postopku. Izra čunati je 
treba skupno koli čino snovi v obeh fazah in jo primerjati s prvotno 
vneseno koli čino snovi. 
Vzorec vodne faze je treba odvzeti s postopkom, ki kar se da 
zmanjša tveganje, da bi se v njem pojavile sledi n-oktanola: v ta namen se lahko uporabi steklena brizga z zamenljivo iglo. Brizga se najprej delno napolni z zrakom. Ta zrak se po časi iztiska med poti ­
skanjem igle skozi plast n-oktanola. V brizgo se vsrka primeren 
volumen vodne faze. Brizga se hitro potegne iz raztopine in igla se odstrani. Vsebina brizge se nato lahko uporabi kot vodni vzorec. Koncentracija v obeh lo čenih fazah se po možnosti dolo či z metodo, 
ki je najbolj primerna za posamezno snov. Primeri morebitnih 
ustreznih analitskih metod so: 
— fotometri čne metode, 
— plinska kromatografija, 
— tekočinska kromatografija visoke lo čljivosti.
 
1.6.3  HPLC metoda  
1.6.3.1  Priprava  
Aparatura  
Potrebujemo teko činski kromatograf, opremljen s črpalko s stabilnim 
pretokom in ustreznim detektorjem. Priporo ča se uporaba injektorja z 
injicirnimi zankami. Prisotnost polarnih skupin v stacionarni fazi lahko resno zmanjša u činkovitost kolone HPLC. Zato mora imeti 
stacionarne faze le minimalni odstotek polarnih skupin (11). Lahko 
se uporabijo na trgu dostopna polnila za mikro kolone z reverzno fazo ali že pripravljene kolone. Med injektorskim sistemom in analitsko kolono se lahko namesti predkolona.
 
Mobilna faza  
Topilo za eluiranje se pripravi iz metanola za HPLC in vode za 
HPLC ter pred uporabo razplini. Izvesti je treba izokratsko izpiranje. 
Uporabiti je treba razmerja metanol/voda z deležem vode najmanj 25 %. Obi čajno je zmes metanol/voda v razmerju 3:1 (v/v) zadovo ­
ljiva za eluiranje snovi z log P 6 v eni uri pri pretoku 1 ml/min. Pri 
snoveh z ve čjo vrednostjo log P bo morda treba skrajšati elucijski 
čas (in elucijski čas referen čnih snovi) z zmanjšanjem polarnosti 
mobilne faze ali podaljšanjem kolone. 
Snovi z zelo majhno topnostjo v n-oktanolu dajo pri metodi HPLC 
velikokrat nenormalno majhne vrednosti log P
 ow ; vrhove takih snovi 
včasih spremlja fronta topila. To se verjetno zgodi zato, ker je poraz ­
delitveni proces prepo časen, da bi dosegla ravnotežje v času, ki je 
običajno potreben za lo čitev s HPLC. V takem primeru je lahko 
učinkovit na čin za dosego zanesljive vrednosti zmanjšanje pretoka 
in/ali razmerja metanol/voda.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 72
 
Preskusne in referen čne snovi morajo biti topne v mobilni fazi v 
zadostnih koncentracijah, da je omogo čena njihova detekcija. 
Dodatki v zmesi metanol/voda se lahko uporabijo le izjemoma, saj spremenijo lastnosti kolone. Za kromatograme z dodatki je obvezna uporaba lo čene kolone enake vrste. Če zmes metanol/voda ni 
primerna, se lahko uporabijo druge zmesi organsko topilo/voda, 
npr. etanol/voda ali acetonitril/voda. 
Pri snoveh, ki disociirajo na ione, je pH eluenta zelo pomemben. 
Mora biti v delovnem obmo čju pH kolone, ki je obi čajno med 2 in 
8. Priporo ča se dodajanje pufra. Prepre čiti je treba obarjanje soli in 
razpadanje kolone, ki lahko nastaneta pri nekaterih zmeseh organske faze in pufra. Meritve HPLC s stacionarnimi fazami z osnovo iz 
silicijevega dioksida in pH nad 8 niso priporo čljive, saj uporaba 
alkalne mobilne faze lahko povzro či hitro poslabšanje u činkovitosti 
kolone.
 
Topljenci  
Referenčne snovi morajo biti čim bolj čiste. Snovi, ki se bodo upora ­
bile za preskus ali umerjanje, se po možnosti raztopijo v mobilni 
fazi. 
Preskusni pogoji  
Med merjenjem se temperatura ne sme spreminjati za ve č kot ± 2 K.  
1.6.3.2  Merjenje  
Izračun mrtvega časa t  o 
Mrtvi čas t  o se lahko dolo či z uporabo bodisi homolognih vrst (npr. 
n-alkilmetil-ketoni) bodisi z organskimi spojinami, ki se ne zadržijo v koloni (npr. tiose čnina ali formamid). Za izra čun mrtvega časa t
 o z 
uporabo homolognih vrst se injicira niz najmanj sedmih spojin 
homologne vrste in dolo čijo njihovi retenzijski časi. Izriše se krivulja 
dobljenih retenzijskih časov t  r(nc + 1)  v odvisnosti od t  r(nc) ter določita 
presek, a, in naklon, b, regresijske ena čbe: 
t r(nc+1)  = a + bt  r(nc) 
(n c = število ogljikovih atomov). Mrtvi čas t  o je določen z: 
t o = a/(1 - b)  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 73
 
Umeritvena krivulja  
Naslednji korak je izdelava krivulje vrednosti log k v odvisnosti od 
log P za ustrezne referen čne snovi. V praksi to pomeni, da se hkrati 
injicira 5 do 10 standardnih referen čnih snovi, katerih log P je blizu 
pričakovanega obmo čja, in dolo čijo retenzijski časi, po možnosti na 
integratorju zapisovalniku, povezanem z detektorjem. Izra čunajo se 
ustrezni logaritmi faktorjev kapacitete, log k, in nariše se krivulja log k v odvisnosti od log P, dolo čenega z metodo stresanja bu čke. 
Umerjanje se izvaja redno, najmanj enkrat dnevno, tako da se 
lahko upoštevajo morebitne spremembe v delovanju kolone.
 
Določanje faktorja kapacitete preskusne snovi  
Preskusna snov se injicira v najmanjšo možno koli čino mobilne faze. 
Določi se retenzijski čas (z dvema vzporednima meritvama), ki 
omogoča izračun faktorja kapacitete k. Iz korelacijske krivulje za 
referenčne snovi se lahko interpolira porazdelitveni koeficient 
preskusne snovi. Pri zelo majhnih in zelo velikih porazdelitvenih koeficientih je potrebna ekstrapolacija. V takih primerih je treba še 
posebej upoštevati meje zaupanja regresijske premice.
 
2. PODATKI  
Metoda stresanja bu čke 
Zanesljivost dolo čenih vrednosti P je mogo če preskusiti s primerja ­
njem srednjih vrednosti vzporednih dolo čitev s skupno srednjo vred ­
nostjo.  
3. PORO ČANJE  
V poročilo o preskusu se, če je možno, vklju čijo naslednje informa ­
cije: 
— natančna specifikacija snovi (identiteta in ne čistote), 
— kadar metode niso uporabne (npr. pri površinsko aktivnih 
snoveh), je treba navesti izra čunano vrednost ali oceno na 
podlagi topnosti v n-oktanolu in topnosti v vodi, 
— vse informacije in opombe, pomembne za razlago rezultatov, 
zlasti glede ne čistot in agregatnega stanja snovi.  
Za metodo stresanja bu čke: 
— rezultat predhodne ocene, če je bila opravljena, 
— temperatura dolo čanja, 
— podatki o uporabljenih analitskih postopkih za dolo čanje koncen ­
tracij, 
— čas in hitrost centrifugiranja, če je bilo uporabljeno,  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 74
 
— izmerjene koncentracije v obeh fazah za vsako dolo čitev (to 
pomeni, da bo v poro čilu skupaj 12 koncentracij), 
— masa preskusne snovi, volumen vsake faze, uporabljene v vsaki 
posodi, in izra čunana skupna koli čina preskusne snovi v vsaki 
fazi po vzpostavitvi ravnotežja, 
— izračunane vrednosti porazdelitvenega koeficienta (P) in njihova 
srednja vrednost za vsak sklop preskusnih pogojev ter srednja 
vrednost vseh dolo čitev. Če kar koli kaže na odvisnost porazde ­
litvenega koeficienta od koncentracije, je to treba vklju čiti v 
poročilo, 
— standardna deviacija posameznih vrednosti P od njihove srednje 
vrednosti, 
— srednja vrednost P vseh dolo čitev mora biti izražena tudi z loga ­
ritmom (osnova 10), 
— izračunana teoreti čna vrednost P  ow , če je bila dolo čena, ali če je 
izmerjena vrednost > 10  4 , 
— pH uporabljene vode in vodne faze med preskusom, 
— če se uporabijo pufri, utemeljitev uporabe pufrov namesto vode, 
sestavo, koncentracijo in pH pufrov ter pH vodne faze pred in po preskusu.
 
Za metodo HPLC:  
— rezultat predhodne ocene, če je bila opravljena, 
— preskusna in referen čne snovi ter njihova čistost, 
— temperaturno obmo čje določitev, 
— pH, pri katerem so bile opravljene dolo čitve, 
— podatki o analitski koloni in predkoloni, mobilni fazi ter na činu 
detekcije, 
— podatki o retenziji in vrednosti log P iz literature za referen čne 
snovi, uporabljene za umerjanje, 
— podatki o prilagojeni regresijski premici (log k v odvisnosti od 
log P), 
— podatki o povpre čni retenziji in interpolirana vrednost log P za 
preskusno snov, 
— opis opreme in delovnih pogojev, 
— elucijski diagrami, — količine preskusne in referen čnih snovi, vnesene v kolono, 
— mrtvi čas in kako je bil izmerjen.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 75
 
4. VIRI  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the 
Council C(81) 30 final. 
(2) C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation 
Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979. 
(3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative 
prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) –Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711. 
(4) L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemo ­
sphere, 1980, vol. 80, 683. 
(5) H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, 
vol. 12, 219 (1981). 
(6) B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73. (7) W.E. Hammers  et al. , J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1. 
(8) J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675. (9) S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, 
vol. 15, 787. 
(10) O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der 
Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laborato ­
riumpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stutt ­
gart, 1958, Band I/1, 223–339. 
(11) R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, 
vol. 14, 479. 
(12) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and 
their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. 
(13) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, 
Amsterdam, 1977. 
(14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial 
use – Determination of partition coefficient – Flask shaking method. 
(15) C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 
1459. 
(16) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. 
(17) C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and 
E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207. 
(18) W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Tech ­
nol., 1974, vol. 8, 1113. 
(19) D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 382. (20) J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biolo ­
gische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, 
New York 1979.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 76
 
(21) R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, 
Amsterdam 1984, 
(22) Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New 
York, Base 1, 1978. 
(23) N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. 
Chem., 1976, vol. 19, 615.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 77
 
Dodatek 1  
Računske/ocenjevalne metode  
UVOD  
Splošni uvod v ra čunske metode, podatki in primeri so na voljo v Priro čniku 
metod za ocenjevanje kemijskih lastnosti (a). 
Izračunane vrednosti P  ow se lahko uporabijo: 
— za izbiro primerne preskusne metode (obmo čje metode stresanja bu čke: log 
P ow : –2 do 4, obmo čje HPLC: log P  ow : 0 do 6), 
— za izbiro ustreznih pogojev preskusa (npr. referen čne snovi za postopke 
HPLC, volumsko razmerje n-oktanol/voda za metodo stresanja bu čke), 
— kot notranje laboratorijsko preverjanje za odkrivanje možnih napak preskusa, — za dolo čitev ocene vrednosti P
 ow , kadar preskusnih metod ni mogo če upora­
biti zaradi tehni čnih razlogov.  
OCENJEVALNA METODA  
Predhodna ocena porazdelitvenega koeficienta  
Vrednost porazdelitvenega koeficienta se lahko oceni na podlagi topnosti 
preskusne snovi v čistih topilih:Za to:  
P ocena ¼ nasičenje c  nÄoktanol  
nasičenje c  voda 
RAČUNSKE METODE  
Princip ra čunskih metod  
Vse računske metode temeljijo na formalni fragmentaciji molekule na ustrezne 
podstrukture, za katere so znane zanesljive vrednosti pove čanja log P  ow . Vred­
nost log P  ow cele molekule se nato izra čuna kot vsota ustreznih vrednosti za 
njene fragmente, kateri se prišteje vsota členov korekcije za intramolekularne 
interakcije. 
Na voljo so seznami konstant fragmentov in členov korekcije (b)(c)(d)(e). Neka ­
teri se redno dopolnjujejo (b).  
Merila kakovosti  
Na splošno se zanesljivost ra čunske metode manjša z ve čjo kompleksnostjo 
preučevane snovi. Pri enostavnih molekulah z majhno molsko maso in eno ali 
dvema funkcionalnima skupinama se lahko pri čakuje odstopanje za 0,1 do 0,3 
enote log P  ow med rezultati razli čnih metod fragmentacije in izmerjeno vred ­
nostjo. Pri bolj kompleksnih molekulah je obmo čje napake lahko ve čje. To je 
odvisno od zanesljivosti in razpoložljivosti konstant fragmentov ter od zmožnosti prepoznavanja intramolekularnih interakcij (npr. vodikove vezi) in pravilne uporabe členov korekcije (manj težavno z ra čunalniško programsko opremo 
CLOGP-3) (b). Pri snoveh, ki se lahko ionizirajo, je pomembno, da se pravilno 
upošteva naboj ali stopnja ionizacije.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 78
 
Računski postopki  
Hanschova p-metoda  
Izvirna konstanta hidrofobnih substituentov, π, ki jo je vpeljal Fujira  et al.  (f), je 
opredeljena z: 
π x = log P  ow (PhX) - log P  ow (PhH) 
pri čemer je P  ow (PhX) porazdelitveni koeficient aromatskega derivata in P  ow 
(PhH) porazdelitveni koeficient izhodne spojine 
(npr. π Cl = log P  ow (C 6 H 5 Cl) - log P  ow (C 6 H 6 ) = 2,84 - 2,13 = 0,71). 
Glede na svojo opredelitev je π-metoda uporabna predvsem za aromatsko substi ­
tucijo. Pripravljene so bile tabele π-vrednosti za veliko število substituentov (b) ­
(c)(d). Uporabljajo se za izra čunavanje log P  ow za aromatske molekule ali 
podstrukture.  
Rekkerjeva metoda  
Po Rekkerju (g) se vrednost log P  ow izračuna na naslednji na čin: 
log P  ow ¼ X 
i a i f i þ X 
j ðčleni interakcijeÞ 
kjer f  i predstavlja konstante za razli čne fragmente molekule in a  i pogostnost 
njihovega pojavljanja v preiskovani molekuli. Členi korekcije se lahko izrazijo 
kot skupni zmnožek ene same konstante C  m (tako imenovane „magi čne konstan ­
te“). Konstante fragmentov f  i in C  m so bile dolo čene na podlagi seznama 1 054 
vrednosti P  ow , dobljenih s poskusi (825 spojin), z uporabo multiple regresijske 
analize (c)(h). Členi interakcije se dolo čijo v skladu z dolo čenimi pravili, opisa ­
nimi v literaturi (e)(h)(i).  
Hansch-Leova metoda  
Po Hanschu in Leu (c) se vrednost log P  ow izračuna po ena čbi: 
log P  ow ¼ P 
i a i f i þ P 
j b j F j 
kjer f  i predstavlja konstante razli čnih fragmentov molekule, F  j člene korekcije ter 
a i in b  j ustrezne pogostnosti pojavljanja. Z metodo poskusa in napake ter 
z izpeljavo iz vrednosti P  ow , dobljenih s poskusi, sta bila sestavljena seznam 
vrednosti za atome in skupine ter seznam členov korekcije F  j (tako imenovanih 
„faktorjev“). Členi korekcije so bili razvrš čeni v več različnih razredov (a)(c). 
Upoštevanje vseh pravil in členov korekcije je sorazmerno zapleteno in dolgo ­
trajno. Razviti so bili programski paketi (b).  
Kombinirana metoda  
Izračunavanje log P  ow kompleksnih molekul se lahko znatno izboljša, če se 
molekula razdeli na ve čje podstrukture, za katere so na voljo zanesljive vrednosti 
log P  ow , bodisi iz tabel (b)(c) bodisi iz lastnih meritev. Taki fragmenti (npr. 
heterocikli, antrakinon, azobenzen) se nato lahko kombinirajo s Hanschovimi p-vrednostmi ali Rekkerjevimi ali Leovimi konstantami fragmentov.
 
Opombe  
(i) Računske metode se lahko za delno ali popolnoma ionizirane snovi upora ­
bijo le, kadar je mogo če upoštevati potrebne korekcijske faktorje;  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 79
 
(ii) če se lahko predpostavlja, da so intramolekularne vodikove vezi, je treba 
prišteti ustrezne člene korekcije (pribl. +0,6 do +1,0 enot log P  ow ) (a). Znaki 
prisotnosti takih vezi se lahko pridobijo iz stereo modelov ali spektroskop ­
skih podatkov o molekuli; 
(iii) če je možnih ve č tavtomernih oblik, mora izra čun temeljiti na najbolj 
verjetni obliki; 
(iv) pozorno je treba spremljati spremembe seznamov konstant fragmentov.  
Poročilo 
Kadar se uporabijo ra čunske/ocenjevalne metode, se v poro čilo o preskusu, če je 
možno, vklju čijo naslednje informacije: 
— opis snovi (zmes, ne čistote itd.), 
— znaki kakršne koli možne intramolekularne vodikove vezi, disociacije, naboja 
in vseh drugih neobi čajnih učinkov (npr. tavtomerija), 
— opis ra čunske metode, 
— identifikacija podatkovne baze ali vir, — posebnosti izbire fragmentov, — izčrpno dokumentacijo izra čuna.
 
LITERATURA  
(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983. 
(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, 
USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3). 
(c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in 
Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979. 
(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. 
(e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. – Chill. Ther. 1979, vol. 14, 
479. 
(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175. 
(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry 
Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1. 
(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459. 
(i) R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, 
Symposium Series 255, p. 225.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 80
 
Dodatek 2  
Priporočene referen čne snovi za metodo HPLC  
Št. Referen čna snov log P  ow PKa 
1 2-Butanon 0,3 
2 4-Acetilpiridin 0,5 3 Anilin 0,9 4 Acetanilid 1,0 
5 Benzilakohol 1,1 
6 p-Metoksifenol 1,3 pKa = 10,26 7 Fenoksiocetna kislina 1,4 pKa = 3,12 8 Fenol 1,5 pKa = 9,92 9 2,4-Dinitrofenol 1,5 pKa = 3,96 
10 Benzonitril 1,6 11 Fenilacetonitril 1,6 12 4-Metílbenzil alkohol 1,6 13 Acetofenon 1,7 14 2-Nitrofenol 1,8 pKa = 7,17 
15 3-Nitrobenzojska kislina 1,8 pKa = 3,47 
16 4-Kloroanilin 1,8 pKa = 4,15 17 Nitrobenzen 1,9 18 Cimetov alkohol 1,9 19 Benzojska kislina 1,9 pKa = 4,19 20 p-Krezol 1,9 pKa = 10,17 21 Cinamska kislina 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 22 Anizol 2,1 23 Metilbenzoat 2,1 24 Benzen 2,1 
25 3-Metílbenzojska kislina 2,4 pKa = 4,27 
26 4-Klorofenol 2,4 pKa = 9,1 27 Trikloroetilen 2,4 28 Atrazin 2,6 29 Etillbenzoat 2,6 30 2,6-Diklorobenzonitril 2,6 31 3-Klombenzojska kislina 2,7 pKa = 3,82 32 Toluen 2,7 33 1 -Naftol 2,7 pKa = 9,34 34 2,3-Dichloroaniline 2,8 
35 Chlorobenzene 2,8 
36 Allyl-phenylether 2,9 37 Bromobenzen 3,0
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 81
 
Št. Referen čna snov log P  ow PKa 
38 Etílbenzen 3,2 
39 Benzofenon 3,2 
40 4-Fenilfenol 3,2 pKa = 9,54 
41 Timol 3,3 
42 1,4-Diklorobenzen 3,4 43 Difenilamin 3,4 pKa = 0,79 44 Naftalen 3,6 45 Fenilbenzoat 3,6 46 Izopropilbenzen 3,7 47 2,4.6-Triklorofenol 3,7 pKa = 6 48 Bifenil 4,0 
49 Benzilbenzoat 4,0 
50 2,4-Dinitro-6-.sek-butilfenol 4,1 51 1,2,4-Triklorobenzen 4,2 52 Dodekanojska kislina 4,2 53 Difenileter 4,2 54 n-Butylbenzene 4,5 55 Fenantren 4,5 56 Fluoroanten 4,7 57 Dibenzil 4,8 58 2,6-Difenilpiridin 4,9 59 Trifenilamin 5,7 
60 DDT 6,2 
Druge referen čne snoví za majhne vrednosti log P
 ow 
1 Nikotinska kislina - 0,07  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 82
 
A.9 PLAMENIŠ ČE 
1. METODA  
1.1 UVOD 
Pred izvajanjem tega preskusa je koristno imeti predhodne informa ­
cije o vnetljivosti snovi. Preskusni postopek se lahko uporablja za 
tekoče snovi, katerih hlape je mogo če prižgati z viri vžiga. Preskusne 
metode, naštete v tem besedilu, so zanesljive samo za obmo čja 
plamenišča, navedena pri posameznih metodah. 
Pri izbiri metode je treba upoštevati možnost kemi čnih reakcij med 
snovjo in posodo za vzorec.  
1.2 OPREDELITVE IN ENOTE 
Plamenišče je najnižja temperatura, popravljena glede na tlak 
101,325 kPa, pri kateri teko čina razvije hlape, pri pogojih, oprede ­
ljenih v preskusni metodi, v takšni koli čini, da se v preskusni posodi 
tvori vnetljiva zmes hlapov in zraka. 
Enote:  o C 
t = T – 273,15 
(t v  o C in T v K)  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Referenčnih snovi ni treba uporabiti vsakokrat, ko se preu čuje nova 
snov. Predvsem naj bi se uporabljale za ob časno preverjanje u čin­
kovitosti metode in za omogo čanje primerjave z rezultati drugih 
metod.  
1.4 PRINCIP METODE 
Snov se da v preskusno posodo in segreje ali ohladi do temperature 
preskusa v skladu s postopkom, opisanim v posamezni preskusni 
metodi. S poskušanjem vžiga se ugotavlja, ali vzorec vzplamti pri 
temperaturi preskusa ali ne.  
1.5 MERILA KAKOVOSTI  
1.5.1  Ponovljivost  
Ponovljivost se spreminja glede na obmo čje plameniš ča in upora ­
bljeno preskusno metodo; najve č 2 o C. 
1.5.2  Ob čutljivost  
Občutljivost je odvisna od uporabljene preskusne metode.  
1.5.3  Specifi čnost 
Specifičnost nekaterih preskusnih metod je omejena na dolo čena 
območja plameniš ča in odvisna od podatkov o snovi (npr. velika 
viskoznost).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 83
 
1.6 OPIS METODE  
1.6.1  Priprave  
Vzorec preskusne snovi se vnese v preskusno aparaturo v skladu z 
1.6.3.1 in/ali 1.6.3.2. 
Zaradi varnosti se priporo ča, da se pri energetsko bogatih ali stru ­
penih snoveh uporabi metoda, pri kateri je vzorec majhen, pribl. 2 cm
 3 . 
1.6.2  Preskusni pogoji  
Aparaturo je treba postaviti na mesto, kjer ni prepiha, če je to v 
skladu z varnostjo.  
1.6.3  Izvedba preskusa  
1.6.3.1  Ravnotežna metoda  
Glej ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.  
1.6.3.2.  Neravnotežna metoda  
Aparatura Abel:  
Glej BS 2000 del 170, NF M07-011, NF T66-009.  
Aparatura Abel-Pensky:  
Glej EN 57, DIN 51755 del 1 (za temperature od 5 do 65  o C), DIN 
51755 del 2 (za temperature pod 5  o C), NF M07-036.  
Aparatura Tag:  
Glej ASTM D 56.  
Aparatura Pensky-Martens:  
Glej ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF 
M07-019.  
Opombe:  
Kadar je plameniš če, določeno z neravnotežno metodo iz 1.6.3.2, 
enako 0 ± 2  o C, 21 ± 2  o C ali 55 ± 2  o C, je treba to vrednost 
potrditi z ravnotežno metodo z uporabo iste aparature. 
Za prijavo se lahko uporabijo le metode, s katerimi je mogo če dolo­ 
čiti plameniš če. 
Za dolo čitev plameniš ča viskoznih teko čin (barve, gume in 
podobno), ki vsebujejo topila, se lahko uporabijo samo aparature 
in preskusne metode, primerne za dolo čanje plameniš ča viskoznih 
tekočin. 
Glej ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213, del 1.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 84
 
2. PODATKI  
3. PORO ČANJE  
V poročilo o preskusu se, če je možno, vklju čijo naslednje informa ­
cije: 
— natančna specifikacija snovi (identiteta in ne čistote), 
— navesti je treba uporabljeno metodo in kakršna koli možna odsto ­
panja, 
— rezultati in vse dodatne opombe, ki so pomembne za razlago 
rezultatov.  
4. VIRI  
Jih ni.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 85
 
A.10  VNETLJIVOST (TRDNE SNOVI)  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Pred izvajanjem tega preskusa je koristno imeti predhodne informa ­
cije o morebitnih eksplozivnih lastnostih snovi. 
Ta preskus je treba uporabljati samo za prašnate, granularne ali 
pastozne snovi. 
Šteje se, da so lahko vnetljive samo snovi, katerih hitrost gorenja 
presega neko mejno vrednost, zato da ne bi bile mednje vklju čene 
vse snovi, ki jih je mogo če prižgati, ampak le tiste, ki gorijo hitro, ali 
tiste, katerih na čin gorenja je kakor koli posebej nevaren. 
Posebej je nevarno, če se žarenje širi preko kovinskega prahu, zaradi 
težav pri gašenju. Kovinski prah se šteje za lahko vnetljivega, če 
omogoča razširjenje žarenja po celi masi v dolo čenem času. 
1.2 OPREDELITVE IN ENOTE 
Čas gorenja izražen v sekundah.  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Niso dolo čene. 
1.4 PRINCIP METODE 
Snov se oblikuje v neprekinjen trak ali pas prahu, dolg približno 
250 mm, in opravi se predhodni presejalni preskus, da se ugotovi, 
ali se ob vžigu s plinskim plamenom gorenje širi s plamenom ali 
tlenjem. Če se v dolo čenem času gorenje razširi čez 200 mm pasu, se 
opravi popoln preskus za dolo čanje hitrosti gorenja.  
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Niso navedena.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 86
 
1.6 OPIS METODE  
1.6.1  Predhodni presejalni preskus  
Snov se oblikuje v neprekinjen trak ali pas prahu, približno 250 mm 
dolg, 20 mm širok in 10 mm visok, na negorljivi, neporozni in 
toplotno slabo prevodni osnovni ploš či. K enemu koncu pasu 
prahu se približa vro č plamen plinskega gorilnika (premer najmanj 
5 mm), dokler se prah ne vname ali za najmanj 2 minuti (5 minut pri prahu iz kovin ali kovinskih zlitin). Zapiše se, ali se gorenje razširi 
vzdolž 200 mm pasu v 4 minutah preskusa (ali 40 minutah pri 
kovinskem prahu). Če se snov ne vname in se gorenje v 
4 minutah (ali 40 minutah) trajanja preskusa ne razširi ne s 
plamenom ne s tlenjem vzdolž 200 mm pasu prahu, se šteje, da 
snov ni lahko vnetljiva, in nadaljnje preskušanje ni potrebno. Če 
se gorenje razširi po snovi do 200 mm dolžine pasu prahu v manj kot 4 minutah, ali manj kot 40 minutah pri kovinskem prahu, je treba 
izvesti spodaj opisani postopek (to čka 1.6.2 in naslednje).
 
1.6.2  Preskus hitrosti gorenja  
1.6.2.1  Priprava  
Prašnate ali granularne snovi se narahlo natresejo v kalup, dolg 
250 mm, s trikotnim pre čnim prerezom z notranjo višino 10 mm 
in širino 20 mm. Na obe vzdolžni stranici kalupa je pritrjena 
kovinska ploš ča, kot stranska pregrada, ki sega 2 mm nad gornji 
rob trikotnega pre čnega prereza (slika). Nato se kalup trikrat spusti 
z višine 2 cm na trdo podlago. Če je potrebno, se kalup dopolni. 
Nato se stranski pregradi odstranita in presežek snovi postrga stran. Na vrh kalupa se položi ploš ča iz negorljivega, neporoznega in 
toplotno slabo prevodnega materiala, nato se cela priprava obrne 
za 180
 o in kalup odstrani. 
Pastozne snovi se nanesejo na negorljivo, neporozno in toplotno 
slabo prevodno osnovno ploš čo v obliki 250 mm dolgega valja s 
prečnim prerezom približno 1 cm  2 . 
1.6.2.2  Preskusni pogoji  
V primeru snovi, ob čutljivih na vlago, je treba preskus opraviti čim 
prej po odstranitvi snovi iz vsebnika.  
1.6.2.3  Izvedba preskusa  
Kupček se namesti v digestorij, pre čno na tok zraka. 
Hitrost zraka mora biti zadostna, da dim ne uhaja v laboratorij, in se 
med preskusom ne sme spreminjati. Okrog aparature je treba name ­
stiti zaslon, za zaš čito pred prepihom. 
Z vročim plamenom plinskega gorilnika (s premerom najmanj 5 mm) 
se prižge en konec kup čka. Ko kup ček zgori do dolžine 80 mm, se 
izmeri hitrost gorenja naslednjih 100 mm.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 87
 
Preskus se izvede šestkrat, vsakokrat s čisto, hladno ploš čo, razen če 
se že prej dobi pozitiven rezultat.  
2. PODATKI  
Za vrednotenje sta pomembna čas gorenja iz predhodnega presejal ­
nega preskusa (1.6.1) in najmanjši čas gorenja v do šestih preskusih 
(1.6.2.3).  
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
V poročilo o preskusu se, če je možno, vklju čijo naslednje informa ­
cije: 
— natančna specifikacija snovi (identiteta in ne čistote), 
— opis preskusne snovi, njeno agregatno stanje vklju čno z 
vsebnostjo vlage, 
— rezultati predhodnega presejalnega preskusa in preskusa hitrosti 
gorenja, če je bil opravljen, 
— vse dodatne opombe, pomembne za razlago rezultatov.  
3.2 RAZLAGA REZULTATA 
Prašnate, granularne ali pastozne snovi se štejejo za lahko vnetljive, 
če je čas gorenja v katerem koli od preskusov, opravljenih v skladu s 
preskusnim postopkom, opisanim v 1.6.2, manj kot 45 sekund. Prah kovin ali kovinskih zlitin se šteje za lahko vnetljivega, če ga je 
mogoče prižgati in se plamen ali obmo čje reakcije razširi po 
celotnem vzorcu v 10 minutah ali manj.
 
4. VIRI  
NF T 20-042 (September 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of solids.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 88
 
Dodatek  
Slika  
Kalup in pripomo čki za pripravo kup čka 
(Vse dimenzije so v milimetrih}
  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 89
 
A.11  VNETLJIVOST (PLINI)  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Ta metoda omogo ča ugotavljanje, ali so plini, zmešani z zrakom, pri 
sobni temperaturi (ca. 20  o C) in atmosferskem tlaku vnetljivi, in če 
so, v katerem obmo čju koncentracij. Zmesi preskušanega plina z 
zrakom naraš čajočih koncentracij se izpostavijo elektri čni iskri, 
nato se opazuje, ali pride do vžiga.  
1.2 OPREDELITVE IN ENOTE 
Območje vnetljivosti je obmo čje koncentracije med spodnjo in 
zgornjo mejo eksplozivnosti. Zgornja in spodnja meja eksplozivnosti 
sta tisti meji koncentracije vnetljivega plina v zmesi z zrakom, pri 
katerih se plamen ne širi.  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Niso dolo čene. 
1.4 PRINCIP METODE 
Koncentracija plina v zraku se postopoma zvišuje in zmes se vsako ­
krat izpostavi elektri čni iskri.  
1.5. MERILA KAKOVOSTI 
Niso navedena.  
1.6 OPIS METODE  
1.6.1  Aparatura  
Preskusna posoda je pokon čni stekleni valj z notranjim premerom 
najmanj 50 mm in višino najmanj 300 mm. Vžigalni elektrodi sta med seboj oddaljeni 3 do 5 mm in nameš čeni 60 mm nad dnom 
valja. Valj je opremljen z odprtino za razbremenitev tlaka. Aparaturo 
je treba zaš čiti z zaslonom, da se omeji morebitna škoda zaradi 
eksplozije. 
Kot vir vžiga se uporabi indukcijska iskra, ki traja 0,5 s in jo proiz ­
vede visoko napetostni transformator z izhodno napetostjo od 10 do 15 kV (najve čja vhodna mo č 300 W). Primer primerne aparature je 
opisan v viru (2).
 
1.6.2  Preskusni pogoji  
Preskus je treba izvajati pri sobni temperaturi (ca. 20  o C). ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 90
 
1.6.3  Izvedba preskusa  
Z uporabo dozirne črpalke se v stekleni valj potisne znana koncen ­
tracija plina v zraku. Skozi zmes se pošlje iskra, nato se opazuje, ali se plamen lo či od vira vžiga in neodvisno širi ali ne. Postopoma se 
povečuje koncentracija plina, vsakokrat za 1 volumski %, do pojava 
vžiga, kakor je opisan zgoraj. 
Če kemijska struktura plina kaže, da bi bil lahko nevnetljiv, in se 
lahko izra čuna sestava stehiometri čne zmesi z zrakom, je treba 
preskusiti le zmesi v obmo čju od 10 % pod do 10 % nad stehiome ­
trično sestavo, v intervalih po 1 %.
 
2. PODATKI  
Pojav širjenja plamena je edini relevantni podatek za dolo čitev te 
lastnosti.  
3. PORO ČANJE  
V poročilo o preskusu se, če je možno, vklju čijo naslednje informa ­
cije: 
— natančna specifikacija snovi (identiteta in ne čistote), 
— opis uporabljene aparature skupaj z dimenzijami, 
— temperatura, pri kateri je bil opravljen preskus, 
— preskušene koncentracije in dobljeni rezultati, — rezultat preskusa: nevnetljiv plin ali lahko vnetljiv plin, — če se ugotovi, da je plin nevnetljiv, je treba navesti obmo čje 
koncentracij, v katerem je bil preskušen v intervalih po 1 %, 
— vse informacije in opombe, pomembne za razlago rezultatov.
 
4. VIRI  
(1) NF T 20-041 (September 85). Chemical products for industrial 
use. Determination of the flammability of gases. 
(2) W.Berthold, D.Conrad, T.Grewer, H.Grosse – einer Standard- 
Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen'. Chem.-Ing.- 
Tech. 1984, vol. 56, 2, 126–127. Wortmann, T. Redeker und H. Schacke. 'Entwicklung
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 91
 
A.12  VNETLJIVOST (STIK Z VODO)  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Ta preskusna metoda se lahko uporablja za ugotavljanje, ali se zaradi 
reakcije snovi ob stiku z vodo ali vlažnim zrakom razvije nevarna 
količina plina ali plinov, ki so morda lahko vnetljivi. 
Preskusna metoda se lahko uporablja za trdne in teko če snovi. Ta 
metoda ni primerna za snovi, ki se v stiku z zrakom spontano 
vnamejo.  
1.2 OPREDELITVE IN ENOTE 
Lahko vnetljivo: snovi, ki v stiku z vodo ali vlažnim zrakom razvi ­
jejo nevarne koli čine lahko vnetljivih plinov s hitrostjo najmanj 1 
liter/kg na uro.  
1.3 PRINCIP METODE 
Snov se preskusi v skladu s spodaj opisanim zaporedjem faz; če pri 
kateri koli fazi pride do vžiga, nadaljnje preskušanje ni potrebno. Če 
je znano, da snov z vodo ne reagira burno, se preskušanje za čne s 
fazo 4 (1.3.4).  
1.3.1  Faza 1  
Preskusna snov se da v kadi čko z destilirano vodo pri 20  o C, nato se 
zapiše, ali se razviti plin vname ali ne.  
1.3.2  Faza 2  
Preskusna snov se da na filtrirni papir, ki plava na površini destili ­
rane vode pri 20  o C v posodici, nato se zapiše, ali se razviti plin 
vname ali ne. Edini namen filtrirnega papirja je obdržati snov na 
enem mestu, da se pove ča verjetnost vžiga.  
1.3.3  Faza 3  
Preskusna snov se oblikuje v približno 2 cm visok kup ček s 
premerom približno 3 cm. Na kup ček se kane nekaj kapljic vode, 
nato se zapiše, ali se razviti plin vname ali ne.  
1.3.4  Faza 4  
Preskusna snov se zmeša z destilirano vodo pri 20  o C, nato se sedem 
ur v enournih presledkih meri hitrost razvijanja plina. Če je hitrost 
razvijanja plina po sedmih urah neenakomerna ali naraš čajoča, je 
treba čas merjenja podaljšati na najve č pet dni. Preskus se lahko 
prekine, če hitrost ob katerem koli času preseže 1 liter/kg na uro.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 92
 
1.4 REFEREN ČNE SNOVI 
Niso dolo čene. 
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Niso navedena.  
1.6 OPIS METOD  
1.6.1  Faza 1  
1.6.1.1  Preskusni pogoji  
Preskus se izvaja pri sobni temperaturi (ca. 20  o C). 
1.6.1.2  Izvedba preskusa  
Majhna koli čina (približno 2 mm v premeru) preskusne snovi se da v 
kadičko z destilirano vodo. Zapisati je treba, (i) ali se razvije kakršen 
koli plin in (ii) ali se ta plin vname. Če se plin vname, nadaljnje 
preskušanje snovi ni ve č potrebno, saj se snov obravnava kot 
nevarna.  
1.6.2  Faza 2  
1.6.2.1  Aparatura  
Filtrirni papir se plosko položi na površino destilirane vode v kakršni 
koli ustrezni posodi, npr. izparilnici s premerom 100 mm.  
1.6.2.2  Preskusni pogoji  
Preskus se izvaja pri sobni temperaturi (ca. 20  o C). 
1.6.2.3  Izvedba preskusa  
Majhna koli čina preskusne snovi (približno 2 mm v premeru) se da 
na sredino filtrirnega papirja. Zapisati je treba, (i) ali se razvije 
kakršen koli plin in (ii) ali se ta plin vname. Če se plin vname, 
nadaljnje preskušanje snovi ni ve č potrebno, saj se snov obravnava 
kot nevarna.  
1.6.3  Faza 3  
1.6.3.1  Preskusni pogoji  
Preskus se izvaja pri sobni temperaturi (ca. 20  o C). 
1.6.3.2  Izvedba preskusa  
Preskusna snov se oblikuje v približno 2 cm visok in 3 cm širok 
kupček z jamico na vrhu. V jamico se kane nekaj kapljic vode in 
zapiše, (i) ali se razvije kakršen koli plin in (ii) ali se ta plin vname. 
Če se plin vname, nadaljnje preskušanje snovi ni ve č potrebno, saj se 
snov obravnava kot nevarna.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 93
 
1.6.4  Faza 4  
1.6.4.1  Aparatura  
Aparatura se sestavi, kakor je prikazano na sliki.  
1.6.4.2  Preskusni pogoji  
Preveri se ali posoda s preskusno snovjo vsebuje prah < 500 μm 
(velikost delcev). Če prah predstavlja ve č kot 1 % m/m celotne 
količine ali če je vzorec drobljiv, je treba celotno snov pred presku ­ 
šanjem zmleti v prah, da se upošteva manjšanje velikosti delcev med 
shranjevanjem in uporabo; sicer se snov preskuša takšna, kakršna je bila prejeta. Preskus je treba izvajati pri sobni temperaturi (pribl. 20
 o C) in atmosferskem tlaku.  
1.6.4.3  Izvedba preskusa  
V lij kapalnik aparature se da 10 do 20 ml vode in v erlenmajerico 
10 g snovi. Volumen razvitega plina se lahko izmeri s kakršnimi koli 
primernimi pripomo čki. Odpre se pipica lija, da voda ste če v erlen­
majerico, in sproži štoparica. V obdobju sedmih ur se vsako uro se izmeri razvijanje plina. Če je v tem obdobju razvijanje plina 
neenakomerno ali če ob koncu tega obdobja hitrost razvijanja plina 
narašča, se merjenje nadaljuje do najve č petih dni. Če hitrost razvi ­
janja plina kadar koli med merjenjem preseže 1 liter/kg na uro, se preskus lahko prekine. Ta preskus je treba izvesti trikrat. 
Če kemijska identiteta plina ni znana, je treba plin analizirati. Če plin 
vsebuje lahko vnetljive sestavine in ni znano, ali je celotna zmes 
lahko vnetljiva, je treba pripraviti zmes z enako sestavo in jo presku ­
siti po metodi A.11.
 
2. PODATKI  
Snov se šteje za nevarno, če: 
— v kateri koli fazi preskusnega postopka pride do spontanega 
vžiga, 
ali 
— se razvija vnetljiv plin s hitrostjo ve č kot 1 liter/kg snovi na uro.  
3. PORO ČANJE  
V poročilo o preskusu se, če je možno, vklju čijo naslednje informa ­
cije: 
— natančna specifikacija snovi (identiteta in ne čistote), 
— podrobnosti o kakršni koli predpripravi preskusne snovi,  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 94
 
— rezultati preskusov (faze 1, 2, 3 in 4), 
— kemijska identiteta razvitega plina, — hitrost razvijanja plina, če se izvede faza 4 (1.6.4), 
— kakršne koli dodatne opombe, pomembne za razlago rezultatov.
 
4. VIRI  
(1) Recommendations on the transport of dangerous goods, test and 
criteria, 1990, United Nations, New York. 
(2) NF T 20-040 (September 85). Chemical products for industrial 
use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 95
 
Dodatek  
Slika  
Aparatura
  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 96
 
A.13  PIROFORNE LASTNOSTI TRDNIH SNOVI IN TEKO ČIN 
1. METODA  
1.1 UVOD 
Preskusni postopek se uporablja za trdne ali teko če snovi, ki se že v 
majhnih koli činah spontano vnamejo kmalu zatem, ko pridejo v stik 
z zrakom pri sobni temperaturi (ca. 20  o C). 
V to metodo niso vklju čene snovi, ki morajo biti izpostavljene zraku 
več ur ali dni pri sobni temperaturi ali pri zvišani temperaturi, preden 
se vnamejo.  
1.2 OPREDELITVE IN ENOTE 
Šteje se, da so snovi piroforne, če se vnamejo ali povzro čijo zogle­
nelost pri pogojih, opisanih v 1.6. 
Morda bo treba preskusiti tudi samovnetljivost teko čin po metodi 
A.15 Temperatura samovžiga (teko čine in plini).  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Niso dolo čene. 
1.4 PRINCIP METODE 
Snov, naj bo trdna ali teko ča, se da v inertno posodo in za pet minut 
izpostavi zraku pri sobni temperaturi. Če se teko ča snov ne vname, 
jo absorbiramo na filtrirni papir in za pet minut izpostavimo zraku 
pri sobni temperaturi (pribl. 20  o C). Če se trdna snov ali teko čina 
vname ali če tekočina vžge ali poogleni filtrirni papir, se šteje, da je 
snov piroforna.  
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Ponovljivost: zaradi varnosti zadostuje en sam pozitiven rezultat, da 
se snov šteje za piroforno.  
1.6 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.6.1  Aparatura  
V porcelanski lon ček s premerom približno 10 cm se natrese 
približno 5 mm visok kup ček diatomejske zemlje pri sobni tempe ­
raturi (ca. 20  o C). 
Opomba:  
Diatomejska zemlja ali katera koli druga primerljiva splošno 
dostopna inertna snov se šteje za reprezentativno prst, na katero bi se lahko v primeru nesre če razlila preskusna snov. 
Za preskušanje teko čin, ki se ne vnamejo ob stiku z zrakom, če so v 
stiku z inertnim nosilcem, potrebujemo suh filtrirni papir.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 97
 
1.6.2  Izvedba preskusa  
(a) Prašnate trdne snovi  
Z višine približno 1 m se na negorljivo površino strese 1 do 2 cm  3 
prašnate preskusne snovi in opazuje, ali se snov vname med pada ­
njem ali v petih minutah posedanja. 
Preskus se izvede šestkrat, razen če že prej pride do vžiga.  
(b) Tekočine 
Približno 5 cm  3 preskusne teko čine se vlije v pripravljen porcelanski 
lonček in opazuje, ali se teko čina vname v petih minutah. 
Če v šestih preskusih ne pride do vžiga, se opravijo naslednji 
preskusi: 
Iz brizge se na prepognjen filtrirni papir nanese 0,5 ml preskusne 
snovi in opazuje, ali se filtrirni papir v petih minutah od nanosa 
tekočine vname ali zogleni. Preskus se izvede trikrat, razen če že 
prej pride do vžiga.  
2. PODATKI  
2.1 OBDELAVA REZULTATOV 
Preskus se lahko prekine, takoj ko se v katerem koli od preskusov 
dobi pozitiven rezultat.  
2.2 VREDNOTENJE 
Če se snov vname v petih minutah po dodatku v inertno posodo in 
izpostavitvi zraku ali če tekoča snov povzro či pooglenitev ali vžig 
filtrirnega papirja v petih minutah po dodatku in izpostavitvi zraku, se šteje, da je piroforna.
 
3. PORO ČANJE  
V poročilo o preskusu se, če je možno, vklju čijo naslednje informacije: 
— natančna specifikacija snovi (identiteta in ne čistote), 
— rezultati preskusov, 
— kakršne koli dodatne opombe, pomembne za razlago rezultatov.  
4. VIRI  
(1) NF T 20-039 (September 85). Chemical products for industrial 
use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids. 
(2) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test 
and criteria, 1990, United Nations, New York.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 98
 
A.14  EKSPLOZIVNE LASTNOSTI  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Metoda predstavlja preskusno shemo za ugotavljanje, ali trdna ali 
pastozna snov predstavlja nevarnost eksplozije, ko se izpostavi 
plamenu (toplotna ob čutljivost) ali udarcu ali trenju (ob čutljivost za 
mehanske dražljaje), in ali teko ča snov predstavlja nevarnost eksplo ­
zije, ko se izpostavi plamenu ali udarcu. 
Metoda zajema tri dele: 
(a) preskus toplotne ob čutljivosti (1); 
(b) preskus mehanske ob čutljivosti za udarce (1); 
(c) preskus mehanske ob čutljivosti za trenje (1). 
Metoda daje podatke za oceno verjetnosti povzro čitve eksplozije s 
pomočjo nekaterih obi čajnih dražljajev. Metoda ni namenjena ugota ­
vljanju zmožnosti snovi, da eksplodira v kakršnih koli pogojih. 
Metoda je primerna za ugotavljanje, ali bo snov predstavljala nevar ­
nost eksplozije (toplotna in mehanska ob čutljivost), v pogojih, dolo ­ 
čenih v direktivi. Temelji na številnih vrstah aparatur, ki se splošno 
uporabljajo na mednarodni ravni (1) in obi čajno dajejo uporabne 
rezultate. Priznava se, da metoda ni dokon čna. Lahko se uporabi 
aparatura, ki je druga čna od navedene, pod pogojem da je 
mednarodno priznana in se rezultati lahko zadovoljivo primerjajo z rezultati, dobljenimi z navedeno aparaturo. 
Preskusov ni treba izvesti, kadar je iz razpoložljivih podatkov o 
termodinamiki (toplota proizvajanja, toplota razgrajevanja) in/ali odsotnosti nekaterih reaktivnih skupin (2) v strukturni formuli brez vsakršnega dvoma razvidno, da snov ni zmožna hitre razgradnje s 
proizvodnjo plinov ali sproš čanjem toplote (tj. snov ne predstavlja 
nevarnosti eksplozije). Preskus mehanske ob čutljivosti za trenje pri 
tekočinah ni potreben.
 
1.2 OPREDELITVE IN ENOTE 
Eksplozivno: 
Snovi, ki lahko eksplodirajo ob izpostavitvi plamenu ali so ob čutljive 
za udarce ali trenje v posebni aparaturi (ali so bolj mehansko ob čut­
ljive kakor 1,3-dinitrobenzen v nadomestni aparaturi).  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
1,3-dinitrobenzen, tehni čni, kristalini čen, presejan do velikosti delcev 
do 0,5 mm, za metode udarca in trenja. 
Perhidro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (RDX, heksogen, ciklonit – CAS 
121-82-4), rekristaliziran iz vodnega cikloheksanona, mokro presejan skozi sito z odprtinami 250 μm in zadržan na situ z odprtinami 
150 μm ter posušen pri 103 ± 2
 o C (4 ure) za drugi niz preskusov 
trenja in udarcev.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 99
 
1.4 PRINCIP METODE 
Za določitev varnih pogojev izvedbe treh preskusov ob čutljivosti so 
potrebni predhodni preskusi.  
1.4.1  Preskusi varnosti pri ravnanju s snovjo (3)  
Zaradi varnosti se pred izvedbo glavnih preskusov zelo majhni 
vzorci (ca. 10 mg) snovi segrevajo na odprtem s plamenom plin ­
skega gorilnika ter izpostavijo udarcu v kakršni koli primerni apara ­
turi in trenju z uporabo kladiva in nakovala ali kakršne koli druge torne naprave. Namen preskusa je ugotoviti, ali je snov tako ob čut­
ljiva in eksplozivna, da je treba predpisane preskuse ob čutljivosti, 
zlasti tiste za toplotno ob čutljivost, izvajati še posebej previdno, da 
se izvajalec preskusov ne poškoduje.
 
1.4.2  Toplotna ob čutljivost  
Pri tej metodi se snov segreva v jekleni cevi, zaprti s šobnimi ploš ­ 
čami s spremenljivim premerom odprtine, da se dolo či, ali je 
verjetno, da bo snov eksplodirala pri intenzivni toploti in dolo čeni 
zaprtosti.  
1.4.3  Mehanska ob čutljivost (udarec)  
Pri tej metodi se snov izpostavi udarcu dolo čene mase, spuš čene z 
določene višine.  
1.4.4  Mehanska ob čutljivost (trenje)  
Pri tej metodi se trdna ali pastozna snov izpostavi trenju med stan ­
dardnimi površinami v dolo čenih pogojih obremenitve in relativnega 
gibanja.  
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Niso navedena.  
1.6 OPIS METODE  
1.6.1  Toplotna ob čutljivost (u činek plamena)  
1.6.1.1  Aparatura  
Aparaturo sestavlja jeklena cev za enkratno uporabo s pripravo za 
zapiranje za ve čkratno uporabo (slika 1), nameš čena v grelno in 
zaščitno napravo. Vsaka cev je izdelana z globokim vle čenjem iz 
jeklene plo čevine (glej dodatek), njen notranji premer je 24 mm, 
dolžina 75 mm in debelina stene 0,5 mm. Na odprtem koncu cevi je prirobnica, ki omogo ča zapiranje cevi s šobnim sklopom. Ta sklop 
sestavlja proti tlaku odporna šobna ploš ča z odprtino na sredini, ki je 
trdno pritrjena na cev z dvodelno vija čno zvezo (matica in navojni 
obroč). Matica in navojni obro č sta izdelana iz krom-manganovega 
jekla (glej dodatek), ki ne proizvaja isker do 800
 o C. Šobne ploš če so 
debele 6 mm, izdelane iz jekla, obstojnega na vro čino (glej dodatek), 
in so na voljo z razli čnimi premeri odprtin.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 100
 
1.6.1.2  Preskusni pogoji  
Običajno se snov preskuša takšna, kakršna je bila prejeta, čeprav je v 
nekaterih primerih, npr. pri stisnjenih, litih ali kako druga če konden­
ziranih, morda treba snov pred preskušanjem zdrobiti. 
Pri trdnih snoveh se masa snovi, ki se bo uporabila v vsakem 
preskusu, dolo či z dvostopenjskim predhodnim preskusom. Stehtana 
cev se napolni z 9 cm  3 snovi, nato se snov potla či s pritiskom sile 80 
N po celotnem pre čnem prerezom cevi. Zaradi varnosti, ali kadar se 
stiskanjem lahko spremeni agregatno stanje snovi, se lahko uporabijo drugi postopki polnjenja; npr. če je snov zelo ob čutljiva za trenje, 
stiskanje ni primerno. Če je snov stisljiva, se dodajajo nove koli čine 
snovi z vsakokratnim stiskanjem, dokler ni cev napolnjena do višine 
55 mm od roba. Dolo či se skupna masa, porabljena za napolnitev 
cevi do višine 55 mm od roba, nato se še dvakrat doda enaka količina snovi, ki se vsakokrat potla či s silo 80 N. Zatem se snov 
bodisi doda s stiskanjem bodisi odvzame, kar je potrebno, da se cev 
napolni do višine 15 mm od roba. Nato se izvede drugi predhodni preskus, ki se za čne s stisnjeno koli čino, enako tretjini skupne mase, 
določene pri prvem predhodnem preskusu. Dodata se še dve taki 
količini in potla čita s silo 80 N, nato se z dodajanjem ali odvzema ­
njem snovi prilagodi njen nivo v cevi do višine 15 mm od roba. Pri vseh preskusih se uporabi koli čina trdne snovi, dolo čena v drugem 
predhodnem preskusu; cev se polni v treh korakih, s tremi enako 
velikimi deli, pri čemer se vsak del s potrebno silo stisne do 
volumna 9 cm
 3 . (To se lahko olajša z uporabo distan čnih obročev.) 
Tekočine in geli se nalijejo v cev do višine 60 mm, pri čemer je 
treba pri gelih posebej paziti, da vmes ni praznih prostorov. Na cev 
se od spodaj natakne navojni obro č, vstavi se ustrezna šobna ploš ča, 
nato se nanese nekaj maziva na osnovi molibdenovega disulfida in privije matica. Nujno se je treba prepri čati, da nič snovi ni ujete med 
prirobnico in ploš čo ali v navoju. 
Kot gorivo se uporabi propan iz industrijske jeklenke, opremljene z 
regulatorjem tlaka (60 do 70 mbar), ki se dovaja skozi merilnik in preko razdelilnika enakomerno porazdeli (kar se dolo či z opazova ­
njem plamenov gorilnikov) med štiri gorilnike. Gorilniki so po 
preskusni komori razporejeni, kakor prikazuje slika 1. Skupna poraba vseh štirih gorilnikov je 3,2 litra propana na minuto. Lahko se uporabijo tudi drugi plini in gorilniki, vendar mora biti hitrost segre ­
vanja taka, kot je dolo čena na sliki 3. Pri vseh aparaturah je treba 
periodično preverjati hitrost segrevanja z uporabo cevi, napolnjenih z 
dibutilftalatom, kakor je navedeno na sliki 3.
 
1.6.1.3  Izvedba preskusov  
V vsakem preskusu se cev segreva, dokler je ne raznese vendar ne 
dalj kot 5 minut. Preskus, pri katerem cev razpade na tri ali ve č 
delov, ki so v nekaterih primerih lahko med seboj povezani s tankimi trakovi kovine, kakor je prikazano na sliki 2, se ovrednoti kot preskus, pri katerem je prišlo do eksplozije. Preskus, pri katerem 
cev razpade na manj delov ali sploh ne razpade, se šteje kot preskus, 
ki ne povzro či eksplozije.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 101
 
Najprej se opravi niz treh preskusov z odprtino premera 6,0 mm na 
šobni ploš či, in če pri nobenem ni eksplozije, se izvede drugi niz treh 
preskusov z odprtino premera 2,0 mm na šobni ploš či. Če pri 
nobenem nizu preskusov ne nastane eksplozija, nadaljnje preskušanje ni potrebno.
 
1.6.1.4  Vrednotenje  
Rezultat preskusa je pozitiven, če pri katerem koli od zgoraj nave ­
denih nizov preskusov nastane eksplozija.  
1.6.2  Mehanska ob čutljivost (udarec)  
1.6.2.1  Aparatura (slika 4)  
Bistveni deli zna čilne aparature z udarnim kladivom so blok iz 
jeklene litine z osnovno ploš čo, nakovalo, stebri ček, vodila, udarne 
uteži, sprožilna naprava in priprava za vzorec. Jekleno nakovalo, 100 mm (premer) × 70 mm (višina), je privito na zgornji del jekle ­
nega bloka, 230 mm (dolžina) × 250 mm (širina) × 200 mm (višina), 
z ulito osnovno ploš čo, 450 mm (dolžina) × 450 mm (širina) × 
60 mm (višina). Stebri ček iz brezšivne vle čene jeklene cevi je 
nameščen v držalu, privitem na zadnjo stran jeklenega bloka. Apara ­
tura je s štirimi vijaki pritrjena na masiven cementni blok 60 × 60 × 
60 cm, tako da sta vodilni tirnici to čno navpi čni in udarna utež 
prosto pade. Na voljo za uporabo sta dve uteži, 5 in 10 kg, iz masivnega jekla. Udarna glava vsake uteži je iz utrjenega jekla, 60 
do 63 HRC, in ima premer najmanj 25 mm. 
Vzorec se zapre v udarno pripravo, ki jo sestavljata dva valja iz 
masivnega jekla s skupno osjo, postavljena eden nad drugim, v 
votlem jeklenem valju, ki predstavlja vodilni obro č. Premer masivnih 
jeklenih valjev mora biti 10 (–0,003, –0,005) mm in višina 10 mm, njuna površina mora biti zloš čena, robovi zaobljeni (polmer krivulje 
0,5 mm), njuna trdota pa znašati 58 do 65 HRC. Zunanji premer 
votlega valja mora biti 16 mm, zloš čene izvrtine 10 (+0,005, +0,010) 
mm, višina pa 13 mm. Udarna priprava se sestavi na vmesnem nakovalu (premer 26 mm in višina 26 mm) iz jekla in centrira z 
obročem, ki ima odprtinice za odvajanje hlapov.
 
1.6.2.2  Preskusni pogoji  
Volumen vzorca mora biti 40 mm  3 ali ustrezen za kakršno koli 
nadomestno aparaturo. Trdne snovi se preskušajo v suhem stanju 
in pripravljene na naslednji na čin: 
(a) prašnate snovi se presejejo (sito z odprtinami 0,5 mm); v 
preskusu se uporabi vsa snov, ki se preseje skozi sito; 
(b) stisnjene, ulite ali kako druga če kondenzirane snovi se razbijejo 
na manjše delce in presejejo; v preskusu se uporabi presejana frakcija s premerom 0,5 do 1 mm, ki mora biti reprezentativna za 
izvirno snov. 
Snovi, ki se obi čajno dobavljajo v pastozni obliki, se, kadar je 
mogoče, preskušajo v suhem stanju, v vsakem primeru pa po odstra ­
nitvi čim večje količine redčila. Pri preskušanju teko čih snovi se med 
zgornjim in spodnjim jeklenim valjem pusti razmik 1 mm.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 102
 
1.6.2.3  Izvedba preskusov  
Izvede se niz šestih preskusov s spuš čanjem mase 10 kg z višine 
0,40 m (40 J). Če pri teh šestih preskusih pri 40 J nastane eksplozija, 
je treba izvesti dodaten niz šestih preskusov s spuš čanjem mase 5 kg 
z višine 0,15 m (7,5 J). V drugih napravah se vzorec primerja z 
izbrano referen čno snovjo po uveljavljenem postopku (npr. s tehniko 
dviganja in spuš čanja itd.).  
1.6.2.4  Vrednotenje  
Šteje se, da je rezultat pozitiven, če eksplozija (vzplamenitev in/ali 
pokanje sta enakovredna eksploziji) nastane najmanj enkrat med katerim koli od preskusov s predpisano udarno aparaturo ali če je 
vzorec bolj ob čutljiv kot 1,3-dinitrobenzen ali RDX pri druga čnem 
preskusu z udarcem.
 
1.6.3  Mehanska ob čutljivost (trenje)  
1.6.3.1  Aparatura (slika 5)  
Torna aparatura je sestavljena iz osnovne ploš če iz jeklene litine, na 
katero je postavljena torna naprava. To sestavljata nepremi čni porce­
lanast valj ček in premi čna porcelanasta ploš čica. Porcelanasta 
ploščica je pritrjena na drsnik, ki se premika po dveh vodilih. Drsnik 
je povezan z elektromotorjem preko pomikalnika, ekscentra in ustreznega menjalnika, tako da se porcelanasta ploš čica enkrat 
samkrat premakne naprej in nazaj pod porcelanastim valj čkom za 
10 mm. Porcelanast valj ček se lahko obremeni z npr. 120 ali 360 
newtoni. 
Porcelanaste ploš čice so izdelane iz belega tehni čnega porcelana 
(hrapavost 9 do 32 mm) in imajo dimenzije 25 mm (dolžina) × 25 mm (širina) × 5 mm (višina). Porcelanast valj ček, je prav tako 
narejen iz belega tehni čnega porcelana ter je dolg 15 mm, ima 
premer 10 mm in hrapava zaokrožena konca s polmerom zaokrože ­
nega dela 10 mm.
 
1.6.3.2  Preskusni pogoji  
Volumen vzorca mora biti 10 mm  3 ali ustrezen za kakršno koli 
drugačno aparaturo. 
Trdne snovi se preskušajo v suhem stanju in pripravljene na 
naslednji na čin: 
(a) prašnate snovi se presejejo (sito z odprtinami 0,5 mm); v 
preskusu se uporabi vsa presejana snov; 
(b) stisnjene, ulite ali kako druga če kondenzirane snovi se zdrobijo 
na manjše delce in presejejo; v preskusu se uporabi presejana frakcija s premerom < 0,5 mm. 
Snovi, ki se obi čajno dobavljajo v pastozni obliki, se, kadar je 
mogoče, preskušajo v suhem stanju. Če se snovi ne da posušiti, se 
pasta (po odstranitvi najve čje možne koli čine redčila) preskusi kot 
0,5 mm debel, 2 mm širok in 10 mm dolg film, pripravljen s 
šablono.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 103
 
1.6.3.3  Izvedba preskusov  
Porcelanast valj ček se postavi na vzorec in obremeni. Med izvaja ­
njem preskusa morajo zareze na porcelanasti ploš čici ležati pre čno na 
smer premikanja. Paziti je treba, da valj ček stoji na vzorcu, da je pod 
valjčkom dovolj preskusne snovi in da se ploš čica pravilno premika 
pod valjčkom. Pri pastoznih snoveh se za nanos snovi na ploš čico 
uporabi 0,5 mm debela šablona z odprtino 2 × 10 mm. Porcelanasta ploščica se mora v 0,44 sekundah premakniti 10 mm naprej in nazaj 
pod porcelanastim valj čkom. Vsak del površine ploš čice in valj čka 
se sme uporabiti le enkrat; oba konca vsakega valj čka se uporabita 
za dva preskusa in vsaka površina ploš čice za tri preskuse. 
Izvede se niz šestih preskusov z obremenitvijo 360 N. Če se v teh 
šestih preskusih dobi pozitiven rezultat, je treba izvesti dodaten niz 
šestih preskusov z obremenitvijo 120 N. V drugi aparaturi se vzorec 
primerja z izbrano referen čno snovjo po uveljavljenem postopku 
(npr. s tehniko dviganja in spuš čanja itd.).
 
1.6.3.4  Vrednotenje  
Šteje se, da je rezultat pozitiven, če eksplozija (prasketanje in/ali 
pokanje ali vzplamenitev so enakovredni eksploziji) nastane vsaj 
enkrat med katerim koli od preskusov s predpisano torno aparaturo 
ali če izpolnjuje enakovredna merila pri druga čnem tornem preskusu.  
2. PODATKI  
Načeloma se šteje, da snov predstavlja nevarnost eksplozije v smislu 
te direktive, če preskus toplotne, udarne ali torne ob čutljivosti da 
pozitiven rezultat.  
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
V poročilo o preskusu se, če je možno, vklju čijo naslednje informacije: 
— identiteta, sestava, čistost, vsebnost vlage itd., preskusne snovi, 
— agregatno stanje vzorca in ali je bil zdrobljen, zdrobljen in/ali 
presejan, 
— opažanja med preskusi toplotne ob čutljivosti (npr. masa vzorca, 
število delov itd.), 
— opažanja med preskusi mehanske ob čutljivosti (npr. nastajanje 
velikih koli čin dima ali popoln razpad brez pokanja, plamena, 
isker, prasketanja itd.), 
— rezultati vsake vrste preskusov, — če je bila uporabljena druga čna aparatura, je treba navesti znan ­
stveno utemeljitev ter dokaze o soodvisnosti med rezultati, prid ­
obljenimi s predpisano aparaturo, in tistimi, pridobljenimi z 
enakovredno aparaturo,
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 104
 
— kakršne koli koristne opombe, na primer sklicevanja na preskuse 
s podobnimi proizvodi, ki so lahko pomembne za pravilno 
razlago rezultatov, 
— vse dodatne opombe, pomembne za razlago rezultatov.  
3.2 RAZLAGA IN VREDNOTENJE REZULTATOV 
V poročilu o preskusu je treba navesti tudi kakršne koli rezultate, ki 
se štejejo za lažne, anomalne ali nereprezentativne. Če je treba kate ­
rega od rezultatov zavre či, je treba navesti obrazložitev in rezultate 
kakršnega koli nadomestnega ali dopolnilnega preskušanja. Če se 
anomalnega rezultata ne da obrazložiti, ga je treba sprejeti takšnega, kakršen je, in ga uporabiti za ustrezno razvrstitev snovi.
 
4. VIRI  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests 
and criteria, 1990, United Nations, New York. 
(2) Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th 
edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990. 
(3) Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, 
vol. 3, 6-13 and 30–42. 
(4) NF T 20-038 (September 85). Chemical products for industrial 
use – Determination of explosion risk.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 105
 
Dodatek  
Primer specifikacije materiala za preskus toplotne ob čutljivosti (glej DIN 1623)  
(1) Cev: Specifikacija materiala št. 1.0336.505 g 
(2) Šobna ploš ča: Specifikacija materiala št. 1.4873 
(3) Navojni obro č in matica: Specifikacija materiala št. 1.3817  
Slika 1  
Aparatura za toplotno ob čutljivost  
(vse dimenzije so v milimetrih)
  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 106
 
Slika 2  
Preskus toplotne ob čutljivosti  
(primeri fragmentacije)
  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 107
 
Slika 3  
Umeritev hitrosti segrevanja pri preskusu toplotne ob čutljivosti
  
Krivulja temperatura/ čas, dobljena s segrevanjem dibutilftalata (27 cm  5 ) v zaprti (šobna ploš ča 
1,5 mm) cevi ob pretoku propana 3,2 litra/minuto. Temperatura se meri s termo členom nikelj- 
krom s premerom 1 mm v ovoju iz nerjave čega jekla, nameš čenim centralno, 43 mm pod 
robom cevi. V obmo čju med 135 in 285 °C mora biti hitrost segrevanja med 185 in 215 
K/minuto.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 108
 
Slika 4  
Aparatura za udarni preskus 
(vse dimenzije so v milimetrih)
  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 109
 
Slika 4  
Nadaljevanje
  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 110
 
Slika 5  
Aparatura za ob čutljivost za trenje
  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 111
 
A.15  TEMPERATURA SAMOVŽIGA (TEKO ČINE IN PLINI)  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Eksplozivne snovi in snovi, ki se spontano vnamejo v stiku z zrakom 
pri sobni temperaturi, se ne smejo preskušati s tem preskusom. 
Preskusni postopek se uporablja za pline, teko čine in pare, ki se 
ob prisotnosti zraka lahko vnamejo na vro či površini. 
Temperaturo samovžiga lahko znatno zniža prisotnost katalitskih 
nečistot, material površine ali ve čji volumen preskusne posode.  
1.2 OPREDELITVE IN ENOTE 
Stopnja samovnetljivosti se izraža s temperaturo samovžiga. Tempe ­
ratura samovžiga je najnižja temperatura, pri kateri se preskusna snov vname, če se pomeša z zrakom v pogojih, opredeljenih v 
preskusni metodi.
 
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Referenčne snovi so naštete v standardih (glej 1.6.3). Predvsem naj 
bi se uporabljale za ob časno preverjanje u činkovitosti metode in za 
omogočanje primerjave z rezultati drugih metod.  
1.4 PRINCIP METODE 
S to metodo se dolo ča najnižja temperatura notranje površine 
posode, pri kateri se plin, para ali teko čina, vbrizgana v posodo, 
vname.  
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Ponovljivost se spreminja v skladu z obmo čjem temperatur samo ­
vžiga in uporabljeno preskusno metodo. 
Občutljivost in specifi čnost sta odvisni od uporabljene preskusne 
metode.  
1.6 OPIS METODE  
1.6.1  Aparatura  
Aparatura je opisana v metodi iz 1.6.3.  
1.6.2  Preskusni pogoji  
Preskus na vzorcu preskusne snovi se izvede v skladu z metodo iz 
1.6.3.  
1.6.3  Izvedba preskusa  
Glej IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 112
 
2. PODATKI  
Zapišejo se temperatura preskusa, atmosferski tlak, uporabljena koli ­ 
čina vzorca, čas, ki prete če do samovžiga.  
3. PORO ČANJE  
V poročilo o preskusu se, če je možno, vklju čijo naslednje informa ­
cije: 
— natančna specifikacija snovi (identiteta in ne čistote), 
— uporabljena koli čina vzorca, atmosferski tlak, 
— uporabljena aparatura, — rezultati meritev (temperature preskusa, rezultati v zvezi z 
vžigom, ustrezni časovni zamik), 
— vse dodatne opombe, pomembne za razlago rezultatov.
 
4. VIRI  
Jih ni.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 113
 
A.16  RELATIVNA TEMPERATURA SAMOVŽIGA ZA TRDNE 
SNOVI  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Eksplozivne snovi in snovi, ki se spontano vnamejo v stiku z zrakom 
pri sobni temperaturi, se ne smejo preskušati s tem preskusom. 
Namen tega preskusa je zagotoviti predhodne podatke o samovnet ­
ljivosti trdnih snovi pri povišani temperaturi. 
Če se vročina, ki se razvije ob reagiranju snovi s kisikom ali ekso ­
termni razgradnji, ne porazgubi dovolj hitro po okolici, se bo snov 
samosegrevala in vnela. Samovžig se torej pojavi, kadar se toplota proizvaja hitreje, kot se izgublja. 
Preskusni postopek je koristen kot predhodni presejalni preskus za 
trdne snovi. Zaradi zapletene narave vžiga in izgorevanja trdnih 
snovi je treba temperaturo samovžiga, dolo čeno v skladu s to 
preskusno metodo, uporabljati le za primerjanje.
 
1.2 OPREDELITVE IN ENOTE 
Temperatura samovžiga, dobljena s to metodo, je najnižja tempera ­
tura okolja, izražena v  o C, pri kateri se dolo čen volumen snovi v 
določenih pogojih vname.  
1.3. REFEREN ČNE SNOVI 
Jih ni.  
1.4. PRINCIP METODE 
Določen volumen preskusne snovi se da v pe č pri sobni temperaturi; 
zapisuje se krivulja temperatura/ čas, ki se nanaša na razmere v 
sredini vzorca, medtem ko se temperatura pe či viša do 400  o C, ali 
do tališča, če je to nižje, s hitrostjo 0,5  o C/min. Pri tem preskusu se 
temperatura pe či, pri kateri temperatura vzorca doseže 400  o C s 
samosegrevanjem, imenuje temperatura samovžiga.  
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Jih ni.  
1.6 OPIS METODE  
1.6.1  Aparatura  
1.6.1.1  Peč 
Laboratorijska pe č s temperaturnim programom (volumen približno 2 
litra), opremljena s sistemom za naravno kroženje zraka in protiek ­
splozijsko zaš čito. Da se prepre či nastanek morebitne eksplozije, je 
treba kakršnim koli razgradnim plinom prepre čiti stik z elektri čnimi 
grelnimi elementi.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 114
 
1.6.1.2  Kocka iz ži čnate mreže  
Kos žičnate mreže iz nerjavnega jekla z odprtinami 0,045 mm se 
razreže v skladu z vzorcem na sliki 1. Mreža se pregane in poveže z žico v kocko brez zgornje ploskve.
 
1.6.1.3  Termo člena 
Primerna termo člena.  
1.6.1.4  Zapisovalnik  
Kakršen koli dvokanalni zapisovalnik, umerjen na 0 do 600  o C ali 
ustrezno napetost.  
1.6.2  Preskusni pogoji  
Snovi se preskušajo takšne, kakršne so bile prejete.  
1.6.3  Izvedba preskusa  
Kocka se napolni s preskusno snovjo, nato se narahlo stresa in polni 
s snovjo, dokler ni povsem polna. Kocka se nato obesi na sredino 
peči pri sobni temperaturi. En termo člen se namesti v sredino kocke, 
drugi pa med kocko in steno pe či, da se beleži temperatura pe či. 
Temperatura se viša do 400  o C ali do tališ ča, če je to nižje, s 
hitrostjo 0,5  o C/min in med tem se ves čas zapisujeta temperaturi 
peči in vzorca. 
Ko se snov vname, termo člen v vzorcu pokaže izjemno skokovit 
porast temperature nad temperaturo pe či. 
2. PODATKI  
Za vrednotenje je pomembna temperatura pe či, pri kateri temperatura 
vzorca s samosegrevanjem doseže 400  o C (glej sliko 2).  
3. PORO ČANJE  
V poročilo o preskusu se, če je možno, vklju čijo naslednje informa ­
cije: 
— opis preskusne snovi, — rezultati merjenja, vklju čno s krivuljo temperatura/ čas, 
— vse dodatne opombe, pomembne za razlago rezultatov.
 
4. VIRI  
NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the relative temperature of the spontaneous flam ­
mability of solids.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 115
 
Slika 1  
Vzorec za 20 mm-preskusno kocko
  
Slika 2  
Značilna krivulja temperatura/ čas
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 116
 
A.17  OKSIDACIJSKE LASTNOSTI (TRDNE SNOVI)  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Pred izvajanjem tega preskusa je koristno imeti predhodne informa ­
cije o vseh morebitnih eksplozivnih lastnostih snovi. 
Ta preskus ni uporaben za teko čine, pline, eksplozivne ali lahko 
vnetljive snovi ali organske perokside. 
Preskusa ni treba izvesti, če se na podlagi preu čitve strukturne 
formule brez vsakršnega dvoma ugotovi, da snov ni zmožna ekso ­
termno reagirati z gorljivo snovjo. 
Treba je izvesti predhodni preskus, da se ugotovi, ali so pri izvedbi 
preskusa potrebni posebni varnostni ukrepi.  
1.2 OPREDELITEV IN ENOTE 
Čas gorenja: reakcijski čas v sekundah, v katerem reakcijsko 
območje prepotuje dolo čeno razdaljo vzdolž kup čka, v skladu s 
postopkom iz 1.6. 
Hitrost gorenja: izražena v milimetrih na sekundo. Največja hitrost gorenja: najve čja vrednost izmed hitrosti gorenja, 
dobljenih z zmesmi, ki vsebujejo od 10 do 90 utežnih % oksidanta.
 
1.3 REFEREN ČNA SNOV 
Pri preskusu in predhodnem preskusu se kot referen čna snov upora ­
blja barijev nitrat (analitska čistost). 
Referenčna zmes je zmes barijevega nitrata in uprašene celuloze, 
pripravljena v skladu z 1.6, ki ima najve čjo hitrost gorenja (obi čajno 
zmes s 60 utežnimi % barijevega nitrata).  
1.4 PRINCIP METODE 
Zaradi varnosti se izvede predhodni preskus. Kadar predhodni 
preskus jasno pokaže, da ima preskusna snov oksidacijske lastnosti, 
nadaljnje preskušanje ni potrebno. V nasprotnem primeru je treba s 
snovjo izvesti popoln preskus. 
V popolnem preskusu se pripravijo zmesi iz preskusne snovi in 
določene gorljive snovi v razli čnih razmerjih. Vsaka zmes se nato 
oblikuje kup ček, ki se na enem koncu prižge. Najve čja določena 
hitrost gorenja se primerja z najve čjo hitrostjo gorenja referen čne 
zmesi.  
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Če je treba snov drobiti in mešati, se za to lahko uporabi katera koli 
metoda, pod pogojem da razlika v najve čji hitrosti gorenja v šestih 
ločenih preskusih ne odstopa od aritmeti čne sredine za ve č kakor 10 %.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 117
 
1.6 OPIS METODE  
1.6.1  Priprava  
1.6.1.1  Preskusna snov  
Velikost delcev v vzorcu se zmanjša do < 0,125 mm po naslednjem 
postopku: preskusna snov se preseje, preostala frakcija se zmelje in 
postopek se ponavlja, dokler skozi sito ni presejana vsa preskusna snov. 
Uporabi se lahko katera koli metoda za mletje in presejanje, ki 
ustreza merilom kakovosti. 
Pred pripravo zmesi se snov posuši pri 105
 o C do konstantne mase. 
Če je temperatura razgradnje preskusne snovi nižja od 105  o C, je 
treba snov posušiti pri ustrezni nižji temperaturi.  
1.6.1.2  Gorljiva snov  
Kot gorljiva snov se uporabi uprašena celuloza. Izbrati je treba vrsto 
celuloze, ki se uporablja za tenkoplastno kromatografijo ali kolonsko 
kromatografijo. Izkazalo se je, da je primerna celuloza z ve č kakor 
85 % vlaken z dolžino med 0,020 in 0,075 mm. Celulozni prah se preseje skozi sito z odprtinami velikosti 0,125 mm. V celem preskusu je treba uporabiti celulozo iz iste serije. 
Pred pripravo zmesi se uprašena celuloza posuši pri 105
 o C do 
konstantne mase. 
Če se v predhodnem preskusu uporabi žagovina, se pripravi žagovina 
mehkega lesa, tako da se zbere delež, presejan skozi sito z odprti ­
nami velikosti 1,6 mm, se temeljito premeša in nato štiri ure suši pri 105
 o C v plasti, debeli najve č 25 mm. Žagovina se ohladi in hrani v 
čim bolj polni nepredušno zaprti posodi do uporabe, kar naj bo po 
možnosti v 24 urah po sušenju.  
1.6.1.3  Vir vžiga  
Kot vir vžiga se uporabi vro č plamen plinskega gorilnika (premer 
najmanj 5 mm). Če se uporabi kak drug vir vžiga (npr. pri presku ­ 
šanju v inertni atmosferi), ga je treba opisati v poro čilu in utemeljiti 
njegovo uporabo.  
1.6.2  Izvedba preskusa  
Opomba:  
Zmesi oksidantov in celuloze ali žagovine je treba obravnavati kot 
morebitno eksplozivne in z njimi ravnati z ustrezno previdnostjo.  
1.6.2.1  Predhodni preskus  
Posušena snov se temeljito zmeša s posušeno celulozo ali žagovino v 
razmerju 2 utežna dela preskusne snovi in 1 utežni del celuloze ali žagovine, nato se zmes oblikuje v majhen stož čast kupček z dimen ­
zijami 3,5 cm (premer osnovne ploskve) × 2,5 cm (višina), tako da 
se brez tla čenja napolni stož čast kalup (npr. laboratorijski stekleni lij 
z zamašeno odto čno cevko).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 118
 
Kupček se da na hladno, negorljivo, neporozno in toplotno slabo 
prevodno osnovno ploš čo. Preskus je treba izvesti v digestoriju, 
kakor v 1.6.2.2. 
Z virom vžiga se dotaknemo kup čka. Opazujeta in zapišeta se silo ­
vitost in trajanje nastale reakcije. 
Če je reakcija silovita, se šteje, da je snov oksidativna. 
Kadar koli je rezultat dvomljiv, je treba izvesti spodaj opisani 
popolni preskusni postopek.  
1.6.2.2  Popolni preskus  
Pripravijo se zmesi oksidanta in celuloze, ki vsebujejo od 10 do 90 
utežnih % oksidanta, vsaka za 10 % ve č. Pri mejnih primerih je treba 
uporabiti tudi vmesne koncentracije zmesi oksidanta in celuloze, da se največja hitrost gorenja dolo či natančneje. 
S pomočjo kalupa se oblikuje kup ček. Kalup je narejen iz kovine, 
dolg 250 mm ter ima trikotni pre čni prerez z notranjo višino 10 mm 
in notranjo širino 20 mm. Na obe vzdolžni stranici kalupa je pritrjena kovinska ploš ča, kot stranska pregrada, ki sega 2 mm nad gornji rob 
trikotnega pre čnega prereza (slika). Ta priprava se napolni z zmesjo 
v majhnem presežku. Kalup se enkrat spusti z višine 2 cm na trdno 
podlago, nato se presežek snovi postrga s ploš čico v poševnem 
položaju. Snameta se stranski pregradi, preostali prah pa zgladi z valjčkom. Na vrh kalupa se položi osnovna ploš ča iz negorljivega, 
neporoznega in toplotno slabo prevodnega materiala, nato se cela 
priprava obrne za 180
 o in odstrani kalup. 
Kupček se namesti v digestorij, pre čno na tok zraka. 
Hitrost odvajanja zraka mora biti zadostna, da dim ne uhaja v labo ­
ratorij, in se med preskusom ne sme spreminjati. Okrog aparature je treba namestiti zaslon, za zaš čito pred prepihom. 
Zaradi higroskopi čnosti celuloze in nekaterih preskusnih snovi je 
treba preskus izvesti čim hitreje. 
Prižgemo en konec kup čka, tako da se ga dotaknemo s plamenom. 
Ko reakcijsko obmo čje preide za četno razdaljo 30 mm se meri reak ­
cijski čas prek razdalje 200 mm. 
Preskus se izvede z referen čno snovjo in vsaj po enkrat z vsako od 
zmesi preskusne snovi in celuloze. 
Če je najve čja hitrost gorenja znatno ve čja od hitrosti gorenja refe ­
renčne zmesi, se preskus lahko ustavi; sicer je treba preskus petkrat 
ponoviti z vsako od treh zmesi, pri katerih je bila hitrost gorenja 
največja.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 119
 
Če se sumi, da je rezultat lažno pozitiven, je treba preskus ponoviti z 
inertno snovjo s podobno velikostjo delcev, kakršna je diatomejska 
zemlja, namesto celuloze. Druga možnost je, da se zmes preskusne snovi in celuloze z najve čjo hitrostjo gorenja ponovno preskusi v 
inertni atmosferi (vsebnost kisika < 2 % v/v).
 
2. PODATKI  
Zaradi varnosti se za zna čilno oksidativno lastnost preskusne snovi 
šteje najve čja hitrost gorenja – ne srednja vrednost. 
Za vrednotenje je pomembna najve čja vrednost hitrosti gorenja dane 
zmesi v nizu šestih preskusov. 
Izdela se graf najve čje vrednosti hitrosti gorenja vsake zmesi v 
odvisnosti od koncentracije oksidanta. Iz grafa se dolo či največja 
hitrost gorenja. 
Šest izmerjenih vrednosti hitrosti gorenja v enem nizu preskusov na 
zmesi z najve čjo hitrostjo gorenja se ne sme razlikovati od aritme ­
tične sredine za ve č kot 10 %; sicer je treba izboljšati metodi mletja 
in mešanja. 
Dobljena najve čja hitrost gorenja se primerja z najve čjo hitrostjo 
gorenja referen čne zmesi (glej 1.3). 
Če se preskusi izvajajo v inertni atmosferi, se najve čja hitrost reak ­
cije primerja s hitrostjo reakcije referen čne zmesi v inertni atmosferi.  
3. PORO ČILO 
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
V poročilo o preskusu se, če je možno, vklju čijo naslednje informa ­
cije: 
— identiteta, sestava, čistost, vsebnost vlage itd., preskusne snovi, 
— kakršna koli obdelava vzorca (npr. mletje, sušenje …), 
— v preskusih uporabljeni vir vžiga, 
— rezultati meritev, — način reagiranja (npr. hitro gorenje na površini, gorenje skozi celotno 
maso, kakršne koli informacije o produktih izgorevanja …), 
— vse dodatne opombe, pomembne za razlago rezultatov, vklju čno 
z opisom silovitosti (plamenenje, iskrenje, dimljenje, po časno 
tlenje itd.) in približno trajanje, ugotovljeno v predhodnih varnos ­
tnih/presejalnih preskusih za preskusno in referen čno snov, 
— rezultati preskusov z inertno snovjo, če so bili izvedeni, 
— rezultati preskusov v inertni atmosferi, če so bili izvedeni.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 120
 
3.2 RAZLAGA REZULTATA 
Šteje se, da je snov oksidativna, kadar: 
(a) je v predhodnem preskusu nastala silovita reakcija; 
(b) je v popolnem preskusu najve čja hitrost gorenja preskušenih 
zmesi večja ali enaka najve čji hitrosti referen čne zmesi celuloze 
in barijevega nitrata. 
Da se izognemo lažno pozitivnim rezultatom, je treba pri razlagi 
rezultatov upoštevati tudi rezultate, dobljene pri preskušanju snovi, zmešane z inertnim materialom, in/ali pri preskušanju v inertni 
atmosferi.
 
4. VIRI  
NF T 20-035 (September 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the oxidizing properties of solids.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 121
 
Dodatek  
Slika  
Kalup in pripomo čki za pripravo kup čka 
(Vse dimenzije so v milimetrih)
  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 122
 
A.18  POVPRE ČNO ŠTEVILO MOLEKULSKE MASE IN PORAZDE ­
LITEV MOLEKULSKE MASE POLIMEROV  
1. METODA  
Ta metoda gelske permeacijske kromatografije je posnetek OECD 
smernice 118 (1996). Temeljna na čela in nadaljnje tehni čne infor­
macije so navedene v literaturi 1.  
1.1 UVOD 
Ker so lastnosti polimerov tako raznolike, je nemogo če opisati eno 
samo metodo, s katero bi bili natan čno določeni pogoji za separacijo 
in ocenjevanje, ki bi pokrivali vse možnosti in posebnosti, do katerih 
pride pri separaciji polimerov. Zlasti se gelni permeacijski kromato ­
grafiji (GPC) pogosto ne da podrediti kompleksnih sistemov polime ­
rov. Kadar GPC metode ni mogo če uporabiti, lahko molekulsko 
maso dolo čimo s pomo čjo drugih metod (glej Prilogo). V takšnih 
primerih je treba uporabljeno metodo natan čno obrazložiti in uteme ­
ljiti. 
Opisana metoda temelji na DIN standardu 55672 (1). Ta DIN stan ­
dard vsebuje podrobne informacije o na činu izvajanja poskusov in 
ocenjevanja podatkov. V primeru, da je treba pogoje poskusa spre ­
meniti, je treba takšne spremembe utemeljiti. Lahko uporabimo tudi 
druge standarde, če so v celoti podprti z viri. Opisana metoda upora ­
blja vzorce polistirena znane polidisperznosti za kalibriranje in jo bo mogoče treba spremeniti, da bo ustrezala dolo čenim polimerom, npr. 
v vodi topnim polimerom in razvejanim polimerom z dolgimi veri ­
gami.
 
1.2 DEFINICIJE IN ENOTE 
Povprečno število molekulske mase M  n in povpre čno maso mole ­
kulske mase M  w določimo s pomo čjo naslednjih ena čb: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
kjer je: 
H i stopnja signala detektorja od osnovne črte za retenzijski volumen V  i , 
M i molekulska masa frakcije polimera pri retenzijskem volumnu V  i in 
n število podatkovnih to čk. 
Razpon porazdelitve molekulske mase, ki je mera za disperznost 
sistema, se kaže z razmerjem M  w /M n. ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 123
 
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Ker je GPC relativna metoda, je treba opraviti kalibriranje. Obi čajno 
za to uporabimo ozko porazdeljene, linearno strukturirane vzorce polistirena z znanimi povpre čnimi molekulskimi masami M
 n in M  w 
in znano porazdelitvijo molekulske mase. Kalibracijsko krivuljo 
lahko uporabimo le pri dolo čanju molekulske mase neznanega 
vzorca, če so pogoji za separacijo vzorca in standardov izbrani na 
povsem enak na čin. 
Določeno razmerje med molekulsko maso in volumnom elucije je 
veljavno le pod specifi čnimi pogoji posameznega poskusa. Ti pogoji 
vključujejo predvsem temperaturo, topilo (ali mešanico topila), 
kromatografske pogoje in separacijsko kolono ali sistem kolon. 
Tako dolo čene molekulske mase vzorca so relativne vrednosti in so 
opisane kot „ekvivalentne molekulske mase polistirena“. To pomeni, da se lahko glede na strukturalne in kemi čne razlike med vzorcem in 
standardi molekulske mase bolj ali manj oddaljijo od absolutnih 
vrednosti. Če uporabimo druge standarde, npr. polietilen glikol, 
polietilen oksid, polimetil metakrilat, poliakrilno kislino, je treba za to navesti razloge.
 
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Porazdelitev molekulske mase vzorca in povpre čno molekulsko maso 
(M n , M  w ) lahko dolo čimo z uporabo GPC metode. GPC je poseben 
tip tekočinske kromatografije, kjer vzorec separiramo v skladu s 
hidrodinami čnimi volumni posameznih sestavin (2). 
Separacija se izvede, ko vzorec prete če skozi kolono, napolnjeno s 
poroznim materialom, obi čajno z organskim gelom. Majhne mole ­
kule lahko predrejo skozi pore, ve čje molekule pa se izlo čijo. Pot 
večjih molekul je tako krajša in te so najprej eluirane. Srednje velike 
molekule predrejo skozi nekaj por in so eluirane pozneje. Najmanjše molekule, katerih povpre čen hidrodinami čni premer je manjši od por 
gela, lahko predrejo skozi vse pore. Te so eluirane zadnje. 
V idealnih razmerah na separacijo v celoti vpliva velikost molekul ­
skih vrst, vendar pa se v praksi težko izognemo vsaj nekaterim ovirajočim učinkom absorbcije. Neenakomerna napolnjenost kolon 
in mrtvi volumni lahko razmere poslabšajo (2). 
Ugotavljanje izvedemo, na primer, na osnovi refrakcijskega indeksa 
ali UV absorpcije in dobimo preprosto distribucijsko krivuljo. Da pa bi na krivulji opredelili dejanske vrednosti molekulske mase, moramo kalibrirati kolono, tako da skoznjo prete čejo polimeri z 
znano molekulsko maso in, v idealnem primeru, v glavnem podobno 
strukturo, npr. razli čni standardi polistirena. Rezultat Gaussove 
krivulje, čeprav včasih popa čen z majhnim repom na strani nizke 
molekulske mase, je obi čajno tak, da navpi čna os kaže koli čino, 
izraženo z maso, raznih eluiranih vrst molekulske mase, vodoravna 
os pa logaritem molekulske mase.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 124
 
1.5 KRITERIJI KAKOVOSTI 
Ponovljivost (Relativna standardna deviacija: RSD) volumna elucije 
bi morala prese či 0,3 %. Zahtevana ponovljivost analize mora biti 
zagotovljena s korekcijo prek internega standarda, če je kromatogram 
ocenjen v časovni odvisnosti in če ne ustreza zgoraj navedenem 
kriteriju (1). Polidisperznosti so odvisne od molekulskih mas stan ­
dardov. V primeru standarda polistirena so tipi čne vrednosti nasled ­
nje: 
M p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20 
(M p je mulekulska masa standarda pri maksimumu vrha)  
1.6 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.6.1  Priprava standardnih raztopin polistirena  
Standardi polistirena se raztopijo s previdnim mešanjem v izbranem 
eluatu. Pri pripravi raztopin je treba upoštevati navodila proizvajalca. 
Koncentracije izbranih standardov so odvisne od razli čnih dejavni ­
kov, npr. injekcijski volumen, viskoznost raztopine in ob čutljivost 
analitskega detektorja. Maksimalen injekcijski volumen mora biti 
prilagojen dolžini kolone, da bi se izognili preobremenitvi. Tipi čni 
injekcijski volumni za analiti čne separacije pri uporabi GPC metode 
s kolono 30 cm × 7,8 mm so navadno med 40 in 100 μl. Možni so 
višji volumni, vendar ne smejo presegati 250 μl. Optimalno razmerje 
med injekcijskim volumnom in koncentracijo je treba dolo čiti pred 
dejanskim kalibriranjem kolone.  
1.6.2  Priprava raztopine vzorca  
Načeloma veljajo za pripravo raztopin vzorca enake zahteve. Vzorec 
se raztopi v ustreznem topilu, npr. tetrahidrofuranu (THF), če ga 
previdno pretresemo. V nobenem primeru ga ne smemo raztopiti z 
uporabo ultrazvo čne kopeli. Kadar je potrebno, se raztopina vzorca 
očisti skozi membranski filter z velikostjo por med 0,2 in 2 μm. 
Prisotnost neraztopljenih delcev je treba zabeležiti v zaklju čnem 
poročilu, saj do tega lahko pride zaradi vrst visoke molekulske 
mase. Uporabiti je treba ustrezno metodo za dolo čitev odstotka 
razgrajenih delcev po masi. Raztopine je treba uporabiti v 24 urah.  
1.6.3  Aparat  
— zbiralnik za topilo, 
— digestorij (kjer je primerno), — črpalka,
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 125
 
— blažilec tresljajev (kjer je primerno), 
— injekcijski sistem, 
— kromatografske kolone, 
— detektor, — merilec pretoka (kjer je primerno), — snemalnik in obdelovalec podatkov, — posoda za odpadke. 
Zagotoviti je treba da je sistem GPC inerten v zvezi z uporabljenimi 
topili (npr. z uporabo jeklenih kapilar za topilo THF).
 
1.6.4  Injekcijski sistem in sistem prenosa topila  
Določen volumen raztopine vzorca nanesemo na kolono bodisi z 
avtomatičnim vzor čevalcem bodisi ro čno na natan čno določeno 
mesto. Če pri ročnem nanosu konico brizgalke prehitro umaknemo 
ali pritisnemo, lahko povzro čimo spremembe v ugotovljeni porazde ­
litvi molekulske mase. Sistem prenosa topila mora biti, kolikor je mogoče, brez tresljajev, zato je najbolje, če uporabimo blažilec 
tresljajev. Red stopnje pretoka je 1 ml/min.
 
1.6.5  Kolona  
Polimer je opredeljen z uporabo bodisi preproste kolone bodisi ve č 
zaporedno povezanih kolon, odvisno od vzorca. V prodaji so na voljo številni porozni materiali kolon z opredeljenimi lastnostmi (npr. velikost por, meje izlo čanja). Izbor separacijskega gela ali 
dolžine kolone je odvisen tako od lastnosti vzorca (hidrodinami čni 
volumni, porazdelitev molekulske mase) in specifi čnih pogojev za 
separacijo, kot so topilo, temperatura in pretok (1) (2) (3).
 
1.6.6  Teoreti čni platoji  
Kolona ali kombinacija kolon, uporabljenih za separacijo, mora biti 
opredeljen s številom teoreti čnih platojev. V primeru THF kot elucij ­
skega topila to vsebuje nanos raztopine etil benzena ali drugega 
ustreznega nepolarnega vzorca na kolono znane dolžine. Število teoretičnih platojev dobimo z naslednjo ena čbo: 
N ¼ 5; 54
 Í 
V e 
W 1=2 Î 2 ali N ¼ 16 V e 
W Í Î  2 
kjer je 
N = število teoreti čnih platojev 
V e = elucijski volumen na maksimumu vrha  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 126
 
W = temelj širine vrha 
W 1/2 = širina vrha na polovici višine  
1.6.7  U činkovitost separacije  
Poleg števila teoreti čnih platojev, ki predstavlja koli čino, ki dolo ča 
širino traku, svojo vlogo igra tudi u činkovitost separacije, ki jo 
določa nagib kalibracijske krivulje. U činkovitost separacije kolone 
dobimo iz naslednjega razmerja:  
V e; M x Ä V e;ð10M  x Þ 
prečni prerez kolone ≥ 6; 0 " 
cm 3 
cm 2 # 
kjer je: 
V e, Mx = elucijski volumen za polistiren z molekulsko maso  M x 
V e,(10.Mx  ) = elucijski volumen za polistiren z 10 krat ve čjo mole­
kulsko maso 
Resolucijo sistema obi čajno opredelimo na naslednji na čin: 
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
kjer sta: 
V e1 , V e2 = elucijska volumna dveh standardov polistirena na 
maksimumu vrha 
W 1 , W  2 = širini vrha pri osnovni črti 
M 1 , M  2 = molekulski masi pri maksimumu vrha (naj se razliku ­
jeta s faktorjem 10). 
R-vrednost sistema kolone mora biti ve čja od 1, 7 (4).  
1.6.8  Topila  
Vsa topila morajo biti visoke čistosti (za THF se uporablja čistost 
99,5 %). Zbiralnik za topilo ( če je potreben v inertnem plinskem 
ozračju) mora biti dovolj velik za kalibriranje kolon in nekaj analiz 
vzorca. Topilo je treba razpliniti preden ga s črpalko prenesemo na 
kolono.  
1.6.9  Nadzor temperature  
Temperatura kriti čnih internih sestavin (injekcijski zvitek, kolone, 
detektor in cevovod) mora biti konstantna in v skladu z izbranim 
topilom.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 127
 
1.6.10  Detektor  
Namen detektorja je koli činsko beleženje koncentracije iz kolone 
eluiranega vzorca. Da bi se izognili nepotrebni širitvi vrhov, mora kivetni volumen detektorske celice ostati čim manjši. Razen v 
primeru disperzije svetlobe in detektorjev viskoznosti ne sme prese ­
gati 10 μl. Za detekcijo se navadno uporablja diferencialna refrakto ­
metrija. Vendar pa, če to zahtevajo specifi čne lastnosti vzorca ali 
elucijskega topila, je mogo če uporabiti tudi druge tipe detektorjev, 
npr. UV/VIS, IR, detektorje viskoznosti, itd.
 
2. PODATKI IN PORO ČANJE  
2.1 PODATKI 
Za podrobne ocenjevalne kriterije kot tudi za zahteve, ki se nanašajo 
na zbiranje in obdelavo podatkov, se je treba sklicevati na DIN standard (1). 
Za vsak vzorec je treba opraviti dva samostojna poskusa. Analizirati 
je treba vsakega posebej. 
Za vsako meritev je treba dolo čiti M
 n , M  w , M  w /M n in M  p . Potrebno 
je eksplicitno ozna čiti, da so merjene vrednosti relativne vrednosti, 
ekvivalentne molekulskim masam uporabljenega standarda. 
Po določitvi retenzijskih volumnov ali retenzijskih časov (po 
možnosti popravljenih z uporabo internega standarda), se logaritem 
M p vrednosti (kjer je M  p maskimum vrha kalibracijskega standarda) 
prikažejo ob eni izmed teh koli čin. Najmanj dve kalibracijski to čki 
sta potrebni za dekado molekulske mase, najmanj pet meritvenih točk pa je zahtevanih za celotno krivuljo, ki bi morala pokrivati 
ocenjeno molekulsko maso vzorca. Kon čno točko nizke molekulske 
mase na kalibracijski krivulji dolo ča n-heksil benzen ali katera drug 
ustrezen nepolaren vzorec. Povpre čno število in povpre čno maso 
molekulskih mas navadno dolo čimo s pomo čjo elektronske obdelave 
podatkov, ki temelji na ena čbah iz oddelka 1.2. V primeru ro čne 
digitalizacije, se lahko upošteva ASTM D 3536-91 (3). 
Porazdelitvena krivulja mora biti posredovana v obliki tabele ali 
grafa (diferencialna frekvenca ali odstotek vsot proti logaritmu M). V grafičnem prikazu mora biti normalna širina ene dekade mole ­
kulske mase 4 cm, maksimum vrha pa naj sega približno 8 cm v 
višino. V primeru integralnih porazdelitvenih krivulj mora biti razlika na ordinati med 0 in 100 % približno 10 cm.
 
2.2 PRESKUSNO PORO ČILO 
Preskusno poro čilo mora vsebovati naslednje informacije:  
2.2.1  Preskusna snov  
— razpoložljive informacije o preskusni snovi (identiteta, aditivi, 
nečistote),  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 128
 
— opis obdelave vzorca, ugotovitve, problemi.  
2.2.2  Inštrumenti  
— zbiralnik za eluat, inertni plin, razplinjanje eluata, sestava eluata, 
nečistote, 
— črpalka, blažilec tresljajev, injekcijski sistem, 
— separacijske kolone (proizvajalec, vse informacije o zna čilnostih 
kolon, kot so velikost por, vrsta separacije, material, itd., število, dolžina in zaporedje uporabljenih kolon), 
— število teoreti čnih platojev kolone (ali kombinacije), u činkovitost 
separacije (resolucija sistema), 
— informacije o simetriji vrhov, — temperatura kolone, vrste nadzora temperature, 
— detektor (principi merjenja, tip, volumen kivete), 
— merilec pretoka, če je uporabljen (proizvajalec, principi merje ­
nja), 
— sistem zapisovanja in obdelovanja podatkov (strojna in 
programska oprema).
 
2.2.3  Kalibriranje sistema  
— podroben opis metode, uporabljene za sestavo kalibracijske 
krivulje, 
— informacije o kriterijih kakovosti za to metodo (npr. korelacijski 
koeficient, vsota kvadratov odstopanj, itd.), 
— informacije o vseh ekstrapolacijah, domnevah in približevanjih, 
opravljenih med poskusnim postopkom in ocenitev ter obdelava 
podatkov, 
— vse uporabljene meritve za ustvarjanje kalibracijske krivulje 
morajo biti dokumentirane na tabeli, ki vsebuje naslednje infor ­
macije za vsako kalibracijsko to čko: 
— ime vzorca, — proizvajalec vzorca, — značilne vrednosti standardov M
 p , M  n , M  w in M  w /M n , kot jih 
posreduje proizvajalec, ali kot so izpeljane iz naknadnih meri ­
tev, skupaj s podrobnostmi o metodi dolo čanja, 
— injekcijski volumen in injekcijska koncentracija,  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 129
 
— M  p vrednost, uporabljena za kalibriranje, 
— elucijski volumen ali popravljeni retenzijski čas, izmerjen pri 
maksimumih vrha, 
— M  p , izračunan na maksimumu vrha, 
— odstotek odstopanja od izra čunanega M  p in kalibracijska vred ­
nost.  
2.2.4  Ocenjevanje  
— ocena na časovni podlagi: metode, uporabljene za zagotovitev zahte ­
vane obnovljivosti (metode popravljanja, interni standard, itd.), 
— informacije o tem, ali je ocena izvedena na podlagi elucijskega 
volumna ali retenzijskega časa, 
— informacije o mejah ocenjevanja, če vrh ni analiziran v celoti, 
— opis blažilnih metod, če so uporabljene, 
— postopki priprave in predobdelave vzorca, — prisotnost morebitnih neraztopljenih delcev, — injekcijski volumen ( μl) in injekcijska koncentracija (mg/ μl), 
— ugotovitve, ki kažejo na u činke, ki peljejo k odklonom od ideal ­
nega GPC profila, 
— podroben opis vseh sprememb v preskusnih postopkih, 
— podrobnosti o stopnjah odstopanj, 
— vse druge informacije in ugotovitve, ki so pomembne za razlago 
rezultatov.
 
3. VIRI  
(1) DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. 
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. 
(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography- GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, 
Pennsylvania. 
(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polysty ­
rene by High Performance Size – Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 130
 
Priloga  
Primeri drugih metod za dolo čanje povpre čnega števila molekulske mase 
(Mn) za polimere  
Gelska permeacijska kromatografija (GPC) je priljubljena metoda za dolo čanje 
M n , zlasti kadar je na razpolago niz standardov, katerih struktura je primerljiva 
s strukturo polimera. Vendar pa v primeru, kadar naletimo pri uporabi metode 
GPC na izvedbene težave ali kadar lahko pri čakujemo, da snov ne bo izpolnila 
regularnega M  n kriterija (in ki ga je potrebno potrditi), so na razpolago druge 
metode, kot so:  
1. Uporaba koligativnih lastnosti  
1.1 Ebulioskopija/krioskopija 
vključuje meritev zvišanja vreliš ča (ebulioskopija) ali znižanja 
strdišča (krioskopija) topila ob dodajanju polimera. Metoda se zanaša 
na dejstvo, da je u činek raztopljenega polimera na to čki vrelišča/ 
strdišča tekočine odvisen od molekulske mase polimera (1) (2). 
Nanos: M  n < 20 000. 
1.2 Nižanje pritiska hlapov 
vključuje meritev pritiska hlapov izbrane referen čne tekočine pred in 
po dodajanju znanih koli čin polimera (1) (2). 
Nanos: M  n < 20 000 (teoreti čno; v praksi gre za mejno vrednost). 
1.3 Membranska osmometrija 
se zanaša na osmozo, t.j. naravno nagnjenost raztapljajo čih se mole ­
kul, da predrejo skozi polprepustno membrano iz razred čila 
v koncentrirano raztopino, da bi se doseglo ravnovesje. V preskusu 
je razredčena raztopina na ni čni koncentraciji, medtem ko koncen ­
trirana raztopina vsebuje polimer. U činek prehajanja topila skozi 
membrano povzro ča diferencial pritiska, ki je odvisen od koncen ­
tracije in molekulske mase polimera (1) (3) (4). 
Nanos: M  n med 20 000–200 000. 
1.4 Osmometrija v hlapni fazi 
vključuje primerjavo stopnje hlapenja čistega raztopljenega aerosola 
na najmanj tri aerosole, ki vsebujejo polimer na razli čnih koncen ­
tracijah (1) (5) (6). 
Nanos: M  n < 20 000.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 131
 
2. Analiza kon čnih skupin  
Da bi uporabili to metodo, sta potrebna tako celotna struktura poli ­
mera in narava verige, ki zaklju čuje končne skupine (ta se mora 
razlikovati od glavnega ogrodja po, na primer, NMR ali titriranju/ derivatizaciji). Z dolo čitvijo molekulske koncentracije kon čnih 
skupin, prisotnih na polimeru, lahko pridemo do vrednosti mole ­
kulske mase (7) (8) (9). 
Nanos: M
 n do 50 000 (z naraš čajočo zanesljivostjo).  
3. Literatura  
(1) Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd 
Edn., John Wiley, New York. 
(2) Glover, C.A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. 
Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York. 
(3) ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination 
of Number-Average Molecular Weight of Polymers by 
Membrane Osmometry. American Society for Testing and Mate ­
rials, Philadelphia, Pennsylvania. 
(4) Coll, H. (1989). membrane Osmometry. In: Determination of 
Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 
25–52. 
(5) ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for 
Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania. 
(6) Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: Deter ­
minationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons. 
(7) Schröder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer 
Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich. 
(8) Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 
In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York. 
(9) Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 
2139–2146.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 132
 
A.19  VSEBNOST POLIMEROV NIZKE MOLEKULSKE MASE  
1. METODA  
Ta gelska permeacijska kromatografija metoda je posnetek OECD 
smernice 119 (1996). Temeljna na čela in nadaljnje tehni čne infor­
macije so navedene v literaturi 1.  
1.1 UVOD 
Ker so lastnosti polimerov tako raznolike, je nemogo če opisati eno 
samo metodo, s katero bi bili natan čno določeni pogoji za separacijo 
in ocenjevanje, ki bi pokrivali vse možnosti in posebnosti, do katerih pride pri separaciji polimerov. Zlasti se gelski permeacijski kromato ­
grafiji (GPC) pogosto ne da podrediti kompleksnih sistemov polime ­
rov. Kadar GPC metode ni mogo če uporabiti, lahko molekulsko 
maso dolo čimo s pomo čjo drugih metod (glej Prilogo). V takšnih 
primerih je treba uporabljeno metodo natan čno obrazložiti in uteme ­
ljiti. 
Opisana metoda temelji na DIN standardu 55672 (1). Ta DIN stan ­
dard vsebuje podrobne informacije o na činu izvajanja poskusov in 
ocenjevanja podatkov. V primeru, da je treba pogoje poskusa spre ­
meniti, je treba takšne spremembe utemeljiti. Lahko uporabimo tudi 
druge standarde, če so v celoti podprti z viri. Opisana metoda upora ­
blja vzorce polistirena znane polidisperznosti za kalibriranje in jo bo 
mogoče treba spremeniti, da bo ustrezala dolo čenim polimerom, npr. 
v vodi topnim polimerom in razvejanim polimerom z dolgimi veri ­
gami.
 
1.2 DEFINICIJE IN ENOTE 
Nizka molekulska masa je arbitrarno opredeljena kot molekulska 
masa pod 1 000 daltoni. 
Povprečno število molekulske mase M  n in povpre čno maso mole ­
kulske mase M  w določimo s pomo čjo naslednjih ena čb: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
kjer je 
H I = stopnja signala detektorja od osnovne črte za retenzijski 
volumen V  i 
M i = molekulska masa frakcije polimera pri retenzijskem volumnu 
V i in n število podatkovnih to čk. 
Razpon porazdelitve molekulske mase, ki je mera za disperznost 
sistema, se kaže z razmerjem M  w /M n. ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 133
 
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Ker je GPC relativna metoda, je treba opraviti kalibriranje. Obi čajno 
za to uporabimo ozko porazdeljene, linearno strukturirane vzorce polistirena z znanimi povpre čnimi molekulskimi masami M
 n in M  w 
in znano porazdelitvijo molekulske mase. Kalibracijsko krivuljo 
lahko uporabimo le pri dolo čanju molekulske mase neznanega 
vzorca, če so pogoji za separacijo vzorca in standardov izbrani na 
povsem enak na čin. 
Določeno razmerje med molekulsko maso in volumnom elucije je 
veljavno le pod specifi čnimi pogoji posameznega poskusa. Ti pogoji 
vključujejo predvsem temperaturo, topilo (ali mešanico topila), 
kromatografske pogoje in separacijsko kolono ali sistem kolon. 
Tako dolo čene molekulske mase vzorca so relativne vrednosti in so 
opisane kot „ekvivalentne molekulske mase polistirena“. To pomeni, da se lahko glede na strukturalne in kemi čne razlike med vzorcem in 
standardi molekulske mase bolj ali manj oddaljijo od absolutnih 
vrednosti. Če uporabimo druge standarde, npr. polietilen glikol, 
polietilen oksid, polimetil metakrilat, poliakrilno kislino, je treba za to navesti razloge.
 
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Porazdelitev molekulske mase vzorca in povpre čno molekulsko maso 
(M n , M  w ) lahko dolo čimo z uporabo GPC metode. GPC je poseben 
tip tekočinske kromatografije, kjer vzorec separiramo v skladu s 
hidrodinami čnimi volumni posameznih sestavin (2). 
Separacija se izvede, ko vzorec prete če skozi kolono, napolnjeno s 
poroznim materialom, obi čajno z organskim gelom. Majhne mole ­
kule lahko predrejo skozi pore, ve čje molekule pa se izlo čijo. Pot 
večjih molekul je tako krajša in te so najprej eluirane. Srednje velike 
molekule predrejo skozi nekaj por in so eluirane pozneje. Najmanjše molekule, katerih povpre čen hidrodinami čni premer je manjši od por 
gela, lahko predrejo skozi vse pore. Te so eluirane zadnje. 
V idealnih razmerah na separacijo v celoti vpliva velikost molekul ­
skih vrst, vendar pa se v praksi težko izognemo vsaj nekaterim oviraj očim učinkom absorbcije. Neenakomerna napolnjenost kolon in 
mrtvi volumni lahko razmere poslabšajo (2). 
Ugotavljanje izvedemo, npr., na osnovi refrakcijskega indeksa ali 
UV absorpcije in dobimo preprosto distribucijsko krivuljo. Da pa bi na krivulji opredelili dejanske vrednosti molekulske mase, moramo kalibrirati kolono, tako da skoznjo prete čejo polimeri z 
znano molekulsko maso in, v idealnem primeru, v glavnem podobno 
strukturo, npr. razli čni standardi polistirena. Rezultat Gaussove 
krivulje, čeprav včasih popa čen z majhnim repom na strani nizke 
molekulske mase, je obi čajno tak, da navpi čna os kaže koli čino, 
izraženo z maso, raznih eluiranih vrst molekulske mase, vodoravna 
os pa logaritem molekulske mase.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 134
 
Vsebnost nizke molekulske mase izhaja iz te krivulje. Izra čun je 
lahko točen le, če se vrste z nizko molekulsko maso ekvivalentno 
na osnovi mase odzivajo na polimer kot celota.  
1.5 KRITERIJI KAKOVOSTI 
Ponovljivost (Relativna standardna deviacija: RSD) volumna elucije bi 
morala prese či 0,3 %. Zahtevana ponovljivost analize mora biti zagoto ­
vljena s korekcijo prek internega standarda, če je kromatogram ocenjen 
v časovni odvisnosti in če ne ustreza zgoraj navedenem kriteriju (1). 
Polidisperznosti so odvisne od molekulskih mas standardov. V primeru 
standarda polistirena so tipi čne vrednosti naslednje: 
M p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20 
(M p je molekulska masa standarda pri maksimumu vrha)  
1.6 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.6.1  Priprava standardnih raztopin polistirena  
Standardi polistirena se raztopijo s previdnim mešanjem v izbranem 
eluatu. Pri pripravi raztopin je treba upoštevati navodila proizvajalca. 
Koncentracije izbranih standardov so odvisne od razli čnih dejavni ­
kov, npr. injekcijski volumen, viskoznost raztopine in ob čutljivost 
analitskega detektorja. Maksimalen injekcijski volumen mora biti prilagojen dolžini kolone, da bi se izognili preobremenitvi. Tipi čni 
injekcijski volumni za analiti čne separacije pri uporabi GPC metode 
s kolono 30 cm × 7,8 mm so navadno med 40 in 100 μl. Možni so 
višji volumni, vendar ne smejo presegati 250 μl. Optimalno razmerje 
med injekcijskim volumnom in koncentracijo je treba dolo čiti pred 
dejanskim kalibriranjem kolone.
 
1.6.2  Priprava raztopine vzorca  
Načeloma veljajo za pripravo raztopin vzorca enake zahteve. Vzorec 
se raztopi v ustreznem topilu, npr. tetrahidrofuranu (THF), če ga 
previdno pretresemo. V nobenem primeru ga ne smemo raztopiti z uporabo ultrazvo čne kopeli. Kadar je potrebno, se raztopina vzorca 
očisti skozi membranski filter z velikostjo por med 0,2 in 2 μm. 
Prisotnost neraztopljenih delcev je treba zabeležiti v zaklju čnem 
poročilu, saj do tega lahko pride zaradi vrst visoke molekulske 
mase. Uporabiti je treba ustrezno metodo za dolo čitev odstotka 
razgrajenih delcev po masi. Raztopine je treba uporabiti v 24 urah.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 135
 
1.6.3  Korekcija vsebnosti ne čistot in aditivov  
Ponavadi je nujno opraviti korekcijo vsebnosti vrst z M < 1 000 za 
prispevek prisotnih nepolimerskih specifi čnih sestavin (npr. ne čistote 
in/ali aditivi), razen če je izmerjena vsebnost že < 1 %. To izvedemo 
z direktno analizo polimerske raztopine ali GPC eluata. 
V primerih, kadar je eluat pri prehajanju skozi kolono preve č 
razredčen za nadaljnjo analizo, ga je treba koncentrirati. Mogo če 
bo potrebno izhlapeti eluat do suhega stanja in ga še enkrat raztopiti. 
Koncentriranje eluata se mora izvesti v pogojih, ki zagotavljajo, da 
na eluatu ne pride do nikakršnih sprememb. Tretiranje eluata po opravljeni GPC je odvisno od analiti čne metode, uporabljene za 
kvantitativno dolo čitev.
 
1.6.4  Aparat  
GPC aparat vsebuje naslednje komparente: 
— zbiralnik za topilo, 
— digestorij (kjer je primerno), 
— črpalka, 
— blažilec tresljajev (kjer je primerno), — injekcijski sistem, — kromatografske kolone, — detektor, — merilec pretoka (kjer je primerno), — snemalnik in obdelovalec podatkov, 
— posoda za odpadke. 
Zagotoviti je treba da je sistem GPC inerten v zvezi z uporabljenimi 
topili (npr. z uporabo jeklenih kapilar za topilo THF).
 
1.6.5  Injekcijski sistem in sistem prenosa topila  
Določen volumen raztopine vzorca nanesemo na kolono bodisi z 
avtomatičnim vzor čevalcem bodisi ro čno na natan čno določeno 
mesto. Če pri ročnem nanosu konico brizgalke prehitro umaknemo 
ali pritisnemo, lahko povzro čimo spremembe v ugotovljeni porazde ­
litvi molekulske mase. Sistem prenosa topila mora biti, kolikor je mogoče, brez tresljajev, zato je najbolje, če uporabimo blažilec 
tresljajev. Red stopnje pretoka je 1 ml/min.
 
1.6.6  Kolona  
Polimer je opredeljen z uporabo bodisi preproste kolone bodisi ve č 
zaporedno povezanih kolon, odvisno od vzorca. V prodaji so na 
voljo številni porozni materiali kolon z opredeljenimi lastnostmi (npr. velikost por, meje izlo čanja). Izbor separacijskega gela ali 
dolžine kolone je odvisen tako od lastnosti vzorca (hidrodinami čni 
volumni, porazdelitev molekulske mase) in specifi čnih pogojev za 
separacijo, kot so topilo, temperatura in pretok (1) (2) (3).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 136
 
1.6.7  Teoreti čni platoji  
Kolona ali kombinacija kolon, uporabljenih za separacijo, mora biti 
opredeljen s številom teoreti čnih platojev. V primeru THF kot elucij ­
skega topila to vsebuje nanos raztopine etil benzena ali drugega 
ustreznega nepolarnega vzorca na kolono znane dolžine. Število 
teoretičnih platojev dobimo z naslednjo ena čbo: 
N ¼ 5; 54 Í 
V e 
W 1=2 Î 2 
ali N ¼ 16 V e 
W Í Î  2 
kjer je 
N = število teoreti čnih platojev 
V e = elucijski volumen na maksimumu vrha 
W = temelj širine vrha W
 1/2 = širina vrha na polovici višine  
1.6.8  U činkovitost separacije  
Poleg števila teoreti čnih platojev, ki predstavlja koli čino, ki dolo ča 
širino traku, svojo vlogo igra tudi u činkovitost separacije, ki jo 
določa nagib kalibracijske krivulje. U činkovitost separacije kolone 
dobimo iz naslednjega razmerja:  
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
prečni preres kolone ≥ 6; 0 " 
cm 3 
cm 2 # 
kjer je: 
Ve, Mx = elucijski volumen za polistiren z molekulsko maso  M x 
V e,(10.Mx  ) = elucijski volumen za polistiren z 10 krat ve čjo mole­
kulsko maso 
Resolucijo sistema obi čajno opredelimo na naslednji na čin: 
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
kjer sta: 
Ve1, V  e2 = elucijska volumna dveh standardov polistirena na 
maksimumu vrha 
W 1 , W  2 = širini vrha pri osnovni črti 
M 1 , M  2 = molekulski masi pri maksimumu vrha (naj se razliku ­
jeta s faktorjem 10). 
R-vrednost sistema kolone mora biti ve čja od 1,7 (4).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 137
 
1.6.9  Topila  
Vsa topila morajo biti visoke čistosti (za THF se uporablja čistost 
99,5 %). Zbiralnik za topilo ( če je potreben v inertnem plinskem 
ozračju) mora biti dovolj velik za kalibriranje kolon in nekaj analiz 
vzorca. Topilo je treba razpliniti preden ga s črpalko prenesemo na 
kolono.  
1.6.10  Nadzor temperature  
Temperatura kriti čnih internih sestavin (injekcijski zvitek, kolone, 
detektor in cevovod) mora biti konstantna in v skladu z izbranim topilom.
 
1.6.11  Detektor  
Namen detektorja je koli činsko beleženje koncentracije iz kolone 
eluiranega vzorca. Da bi se izognili nepotrebni širitvi vrhov, mora 
kivetni volumen detektorske celice ostati čim manjši. Razen v 
primeru disperzije svetlobe in detektorjev viskoznosti ne sme prese ­
gati 10 μ l. Za detekcijo se navadno uporablja diferencialna refrak ­
tometrija. Vendar pa, če to zahtevajo specifi čne lastnosti vzorca ali 
elucijskega topila, je mogo če uporabiti tudi druge tipe detektorjev, 
npr. UV/VIS, IR, detektorje viskoznosti, itd.  
2. PODATKI IN PORO ČANJE  
2.1 PODATKI 
Za podrobne ocenjevalne kriterije kot tudi za zahteve, ki se nanašajo 
na zbiranje in obdelavo podatkov, se je treba sklicevati na DIN 
standard (1). 
Za vsak vzorec je treba opraviti dva samostojna poskusa. Analizirati 
je treba vsakega posebej. V vseh primerih je bistveno, da dolo čimo 
tudi podatke iz praznih polj, s katerimi smo ravnali v enakih pogojih 
kot vzorec. 
Potrebno je eksplicitno ozna čiti, da so merjene vrednosti relativne 
vrednosti, ekvivalentne molekulskim masam uporabljenega stan ­
darda. 
Po določitvi retenzijskih volumnov ali retenzijskih časov (po 
možnosti popravljenih z uporabo internega standarda), se logaritem 
M p vrednosti (kjer je M  p maskimum vrha kalibracijskega standarda) 
prikažejo ob eni izmed teh koli čin. Najmanj dve kalibracijski to čki 
sta potrebni za dekado molekulske mase, najmanj pet meritvenih točk pa je zahtevanih za celotno krivuljo, ki bi morala pokrivati 
ocenjeno molekulsko maso vzorca. Kon čno točko nizke molekulske 
mase na kalibracijski krivulji dolo ča n-heksil benzen ali kateri drug 
ustrezen nepolaren vzorec. Povpre čno število in povpre čno maso 
molekulskih mas navadno dolo čimo s pomo čjo elektronske obdelave 
podatkov, ki temelji na ena čbah iz oddelka 1.2. V primeru ro čne 
digitalizacije, se lahko upošteva ASTM D 3536-91 (3).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 138
 
Če na koloni ostane kak netopen polimer, bo njegova molekulska 
masa verjetno višja od mase topne frakcije; v kolikor je ne bi upošte ­
vali, bi to lahko pripeljalo do previsoke ocene vsebnosti nizke mole ­
kulske mase. Smernice za korekcijo vsebnosti nizke molekulske mase za netopen polimer se nahajajo v Prilogi. 
Porazdelitvena krivulja mora biti posredovana v obliki tabele ali 
grafa (diferencialna frekvenca ali odstotek vsot proti logaritmu M). V grafičnem prikazu mora biti normalna širina ene dekade mole ­
kulske mase 4 cm, maksimum vrha pa naj sega približno 8 cm v 
višino. V primeru integralnih porazdelitvenih krivulj mora biti razlika na ordinati med 0 in 100 % približno 10 cm.
 
2.2 PRESKUSNO PORO ČILO 
Preskusno poro čilo mora vsebovati naslednje informacije:  
2.2.1  Preskusna snov  
— razpoložljive informacije o preskusni snovi (identiteta, aditivi, 
nečistote), 
— opis obdelave vzorca, ugotovitve, problemi.  
2.2.2  Inštrumenti  
— zbiralnik za eluat, inertni plin, razplinjanje eluata, sestava eluata, 
nečistote, 
— črpalka, blažilec tresljajev, injekcijski sistem, 
— separacijske kolone (proizvajalec, vse informacije o zna čilnostih 
kolon, kot so velikost por, vrsta separacije, material, itd., število, dolžina in zaporedje uporabljenih kolon), 
— število teoreti čnih platojev kolone (ali kombinacije), u činkovitost 
separacije(resolucija sistema), 
— informacije o simetriji vrhov, 
— temperatura kolone, vrste nadzora temperature, 
— detektor (principi merjenja, tip, volumen kivete), — merilec pretoka, če je uporabljen (proizvajalec, principi merje ­
nja), 
— sistem zapisovanja in obdelovanja podatkov (strojna in 
programska oprema).
 
2.2.3  Kalibriranje sistema  
— podroben opis metode, uporabljene za sestavo kalibracijske 
krivulje,  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 139
 
— informacije o kriterijih kakovosti za to metodo (npr. korelacijski 
koeficient, vsota kvadratov odstopanj, itd.), 
— informacije o vseh ekstrapolacijah, domnevah in približevanjih, 
opravljenih med poskusnim postopkom in ocenitev ter obdelava podatkov, 
— vse uporabljene meritve za ustvarjanje kalibracijske krivulje 
morajo biti dokumentirane na tabeli, ki vsebuje naslednje infor ­
macije za vsako kalibracijsko to čko: 
— ime vzorca, — proizvajalec vzorca, — značilne vrednosti standardov M
 p , M  n , M  w in M  w /M n , kot jih 
posreduje proizvajalec, ali kot so izpeljane iz naknadnih meri ­
tev, skupaj s podrobnostmi o metodi dolo čanja, 
— injekcijski volumen in injekcijska koncentracija, 
— M  p vrednost, uporabljena za kalibriranje, 
— elucijski volumen ali popravljeni retenzijski čas, izmerjen pri 
maksimumih vrha, 
— M  p , izračunan na maksimumu vrha, 
— odstotek odstopanja od izra čunanega M  p in kalibracijska vred ­
nost.  
2.2.4  Informacije o vsebnosti nizke molekulske mase  
— opis uporabljenih metod pri analizi in na čin izvedbe poskusov, 
— informacije o odstotkih vsebnosti vrst nizke molekulske mase 
(w/w), ki se nanaša na celotni vzorec, 
— informacije o ne čistotah, aditivih in drugih nepolimerskih vrstah 
v odstotkih po teži, ki se nanašajo na celoten vzorec.  
2.2.5  Ocenjevanje  
— ocena na časovni podlagi: metode, uporabljene za zagotovitev zahte ­
vane obnovljivosti (metode popravljanja, interni standard, itd.), 
— informacije o tem, ali je ocena izvedena na podlagi elucijskega 
volumna aliretenzijskega časa, 
— informacije o mejah ocenjevanja, če vrh ni analiziran v celoti, 
— opis blažilnih metod, če so uporabljene, 
— postopki priprave in predobdelave vzorca, — prisotnost morebitnih neraztopljenih delcev,
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 140
 
— injekcijski volumen ( μl) in injekcijska koncentracija (mg/ μl), 
— ugotovitve, ki kažejo na u činke, ki peljejo k odklonom od ideal ­
nega GPC profila, 
— podroben opis vseh sprememb v preskusnih postopkih, — podrobnosti o stopnjah odstopanj, — vse druge informacije in ugotovitve, ki so pomembne za inter ­
pretacijo rezultatov.
 
3. LITERATURA  
(1) DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. 
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. 
(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography- 
GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelp ­
hia, Pennsylvania. 
(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Poly ­
styrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 141
 
Priloga  
Smernice za korekcijo vsebnosti nizke molekulske mase pri prisotnosti 
netopnega polimera  
Kadar je v vzorcu prisoten netopen polimer, lahko to povzro či izgubo mase 
v teku GPC analize. Netopen polimer se lahko nepovratno ohrani na koloni ali 
filtru vzorca, medtem ko raztopni delež vzorca predre skozi kolono. V primeru, 
kadar je mogo če porast refrakcijskega indeksa (dn/dc) polimera oceniti ali izme ­
riti, lahko ocenimo maso vzorca, izgubljeno na koloni. V tem primeru, lahko opravimo korekcijo z uporabo zunanjega kalibriranja s standardnimi materiali 
znane koncentracije in dn/dc, da bi kalibrirali odziv refraktometra. 
V naslednjem primeru je uporabljen standard poli(metil metakrilat) (pMMA). 
Pri zunanjem kalibriranju za analizo akrilnih polimerov, z GPC analiziramo 
pMMA standard znane koncentracije v tetrahidrofuranu, dobljene podatke pa uporabimo, da poiš čemo konstanto na refraktometru, v skladu z ena čbo: 
K = R/(C × V × dn/dc) 
kjer je 
K = konstanta refraktometra (v mikrovoltsekundah/ml), R = odziv pMMA standarda (v mikrovoltsekundah), C = koncentracija pMMA standarda (v mg/ml), V = injekcijski volumen (v ml) in dn/dc = porast refrakcijskega indeksa za pMMA v tetrahidrofuranu (v ml/mg) Naslednji podatki so zna čilni za pMMA standard: 
R = 2 937 891 C = 1,07 mg/ml V = 0,1 ml dn/dc = 9 × 10
 -5 ml/mg 
Dobljeno K vrednost 3,05 × 10  11 nato uporabimo za izra čun odziva teoreti čnega 
detektorja, če je 100 % vbrizganega polimera eluirano skozi detektor.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 142
 
A.20  OBNAŠANJE RAZTOPINE IZVLE ČKA POLIMEROV V VODI  
1. METODA  
Opisana metoda je v skladu s revidirano razli čico OECD smernice 120 
(1997). Nadaljnje tehni čne informacije so navedene v literaturi (1).  
1.1 UVOD 
Za določene polimere, kot so emulzijski polimeri, bo mogo če 
potrebno opraviti za četno pripravo, preden se uporabi tukaj podana 
metoda. Metoda se ne uporablja pri teko činskih polimerih in poli ­
merih, ki v preskusnih pogojih reagirajo z vodo. 
Kadar metoda ni izvedljiva ali mogo ča, lahko obnašanje raztopine/ 
izvlečka raziščemo s pomo čjo drugih metod. V takšnih primerih je 
treba uporabljeno metodo natan čno obrazložiti in utemeljiti.  
1.2 REFEREN ČNE SNOVI 
Jih ni.  
1.3 PRINCIPI PRESKUSNE METODE 
Obnašanje raztopine/izvle čka polimerov v vodnem gojiš ču določimo 
z uporabo metode z bu čko (glej A.6 vodna topnost, metoda z 
bučko), upoštevajo č spodaj opisane spremembe.  
1.4 KRITERIJI KAKOVOSTI 
Jih ni.  
1.5 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.5.1  Oprema  
Za metodo je potrebna naslednja oprema: 
— drobilna naprava, npr. mlin ček za proizvajanje delcev znane veli ­
kosti, 
— aparat za tresenje z možnostjo nadzora temperature, — sistem membranskega filtra, 
— ustrezna oprema za analizo, 
— standardizirana sita.
 
1.5.2  Priprava vzorca  
Reprezentativni vzorec je treba najprej z uporabo ustreznih sit zmanj ­ 
šati na velikost delca med 0,125 in 0,25 mm. Mogo če bo potrebno 
hlajenje, da se doseže stabilnost vzorca ali zaradi procesa drobitve. 
Materiali gumijaste narave se lahko na temperaturi teko čega dušika 
zdrobijo (1). 
Če zahtevane frakcije velikosti delca ni mogo če doseči, je treba 
velikost delca zmanjšati, kolikor je mogo če, in poro čati o rezultatu. 
V poročilu je treba ozna čiti, kako smo zdrobljen vzorec hranili pred 
preskusom.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 143
 
1.5.3  Postopek  
Tri vzorce po 10 g preskusne snovi odmerimo v vsako izmed treh 
posod, zaprtih s steklenimi zamaški, in v vsako posodo dodamo 1 000 ml vode. Če se izkaže, da je ravnanje s koli čino 10 g polimera 
neizvedljivo, je treba uporabiti naslednjo najvišjo koli čino, s katero 
je mogoče ravnati, in temu ustrezno prilagoditi koli čino vode. 
Posode tesno zamašimo in jih pretresemo pri 20
 o C. Uporabiti 
moramo napravo za tresenje ali mešanje, ki lahko deluje na stalni temperaturi. Po 24 urah vsebino vsake posamezne posode centrifu ­
giramo ali prefiltriramo, koncentracijo polimera v čisti vodni fazi pa 
določimo z ustrezno analiti čno metodo. Če ustreznih analiti čnih 
metod za vodno fazo ni na voljo, lahko skupno topljivost/izlo čljivost 
ocenimo iz suhe teže prefiltriranega ostanka ali centrifugirane oborine. 
Ponavadi je treba po koli čini razločiti nečistote in aditive na eni 
strani in vrste z nizko molekulsko maso na drugi. V primeru gravi ­
metrične določitve je prav tako pomembno opraviti prazni preskus 
brez uporabe vseh preskusnih snovi, da bi izra čunali ostanke, do 
katerih pride med poskusnim postopkom. 
Obnašanje raztopine/izvle čka polimerov v vodi pri 37
 o C na pH 2 in 
pH 9 lahko dolo čimo na enak na čin, kot je opisano za izvajanje 
eksperimenta pri 20  o C. pH vrednosti se lahko dosežejo z dodaja ­
njem bodisi primernih puferjev ali ustreznih kislin ali baz, kot so hidrokloridna kislina, acetatna kislina, natrij analiti čne stopnje ali 
kalijev hidroksid ali NH
 3 . 
Glede na uporabljeno metodo analize moramo izpeljati enega ali dva 
preskusa. Kadar je za neposredno analizo vodne faze polimerskega 
delca na voljo dovolj specifi čnih metod, bi moral zadostovati en sam 
preskus, kot je opisano zgoraj. Kadar pa takšne metode niso na voljo in je dolo čitev obnašanja raztopine/izvle čka polimera omejena na 
posredno analizo z dolo čanjem zgolj skupne vsebnosti organskega 
karbona (TOC) vodnega izvle čka, je treba opraviti dodaten preskus. 
Ta dodaten preskus je treba opraviti v treh izvedbah in uporabiti 10- krat manjše vzorce polimera in enake koli čine vode, kot je bila 
uporabljena v prvem preskusu.
 
1.5.4  Analiza  
1.5.4.1  Preskus, opravljen z eno velikostjo vzorca  
Metode so lahko na voljo za neposredno analizo sestavin polimera v 
vodni fazi. Po drugi strani je mogo če upoštevati tudi posredno 
analizo raztopljenih/izlo čenih sestavin polimera z dolo čanjem skupne 
vsebnosti topnih delcev in korekcijo za sestavine, ki niso zna čilne za 
polimer. 
Analiza vodne faze za vse polimerske vrste je mogo ča: 
bodisi z dovolj ob čutljivo metodo, npr.: 
— TOC z uporabo persulfata ali digeriranjem dikromata za spro ­
stitev CO  2 , ki mu sledi ocena z IR ali kemi čna analiza,  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 144
 
— atomska absorpcijska spektrometrija (AAS) ali njen emisijski 
ekvivalent induktivno sklopljene plazme (ICP) za polimere, ki 
vsebujejo silikon ali kovino, 
— UV absorpcija ali spektrofluorometrija za akrilne polimere, 
— LC-MS za vzorce z nizko molekulsko maso, 
ali z vakuumskim izhlapevanjem do suhega stanja vodnega ekstrakta 
in spektroskopijo (IR, UV, itd.) ali AAS/ICP analizo ostanka. 
Če analiza vodne faze kot takšne ni izvedljiva, je treba vodni 
izvleček izvleči z organskim topilom, ki ni združljiv z vodo, npr. s 
kloriranim hidrokarbonom. Topilo nato izhlapimo, ostanek pa anali ­
ziramo kot zgoraj, da bi ugotovili njegovo vsebnost v ustreznem 
polimeru. Vsako sestavino v tem ostanku, ki je prepoznana kot ne či­
stota ali aditiv, je treba odšteti, da bi dolo čili stopnjo raztopine/iz ­
vlečka samega polimera. 
Kadar so prisotne relativno velike koli čine takšnih materialov, je 
mogoče ostanek potrebno analizirati, na primer, s teko činsko kroma ­
tografijo visoke lo čljivosti (HPLC) ali plinsko kromatografijo (GC), 
da bi razlo čili nečistote od prisotnega monomera in vrst, ki so iz 
monomera izpeljane, s čimer nato dolo čimo pravo vsebnost teh vrst. 
V nekaterih primerih lahko zadostuje preprosto izhlapevanje organ ­
skega topila do suhega stanja in tehtanje suhega ostanka.  
1.5.4.2  Preskus, opravljen z dvema razli čnima velikostma vzorca  
Vsi vodni izvle čki se analizirajo za TOC. 
Gravimetri čna določitev se izvede na neraztopljenem/neizvle čenem 
delu vzorca. Če po centrifugiranju ali filtriranju vsebnosti vsake 
posode ostanek polimera ostane pritrjen na stene posode, je treba 
posodo sprati s filtratom, dokler z nje ne odstranimo vseh vidnih 
ostankov. Temu sledi ponovno centrifugiranje ali filtriranje filtrata. Ostanke, ki ostanejo na filtru ali v centrifugini cevi posušimo pri 40
 o C v vakuumu in jih stehtamo. S sušenjem nadaljujemo, dokler 
ne dosežemo konstantne teže.  
2. PODATKI  
2.1 PRESKUS, OPRAVLJEN Z ENO VELIKOSTJO VZORCA 
Posamezni rezultati za vsako izmed treh bu čk in povpre čne vrednosti 
je treba podati in izraziti v enotah mase na volumen raztopine (zna ­ 
čilno mg/l) ali mase na maso vzorca polimera (zna čilno mg/g). Poleg 
tega je treba podati tudi izgubo teže vzorca (izra čunano kot teža 
vzorca, deljeno s težo za četnega vzorca). Izra čunati je treba relativne 
standardne deviacije (RDS). Za celotno snov (polimer + bistveni 
aditivi, itd.) in samo za polimere (t.j. po odštetju prispevka takšnih 
aditivov) je treba podati posamezne številke.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 145
 
2.2 PRESKUS, OPRAVLJEN Z DVEMA RAZLI ČNIMA VELIKO ­
STIMA VZORCA 
Posamezne TOC vrednosti vodnih izvle čkov dveh trojnih poskusov 
in povpre čno vrednost za vsak poskus je treba podati izraženo v 
enotah mase na volumen raztopine (zna čilno mgC/l), kakor tudi v 
enotah mase na težo za četnega vzorca (zna čilno mgC/g). 
Če med rezultatom na visokem in nizkem razmerju vzorec/voda ni 
razlike, lahko to pomeni, da so bile vse izlo čljive sestavine zares 
izvlečene. V tem primeru ponavadi direktna analiza ni potrebna. 
Posamezne teže ostankov je treba podati izražene v odstotku za četnih 
tež vzorca. Povpre čne vrednosti je treba izra čunati za vsak poskus. 
Razlike med 100 % in dobljenimi odstotki predstavljajo odstotke topljivega in izlo čljivega materiala v izvirnem vzorcu.
 
3. PORO ČANJE  
3.1 PRESKUSNO PORO ČILO 
Preskusno poro čilo mora vsebovati naslednje informacije:  
3.1.1  Preskusna snov  
— razpoložljive informacije o preskusni snovi (identiteta, aditivi, 
nečistote, vsebnost vrst z nizko molekulsko maso).  
3.1.2  Poskusni pogoji  
— opis uporabljenih postopkov in poskusnih pogojev, 
— opis analiti čnih in detekcijskih metod.  
3.1.3  Rezultati  
— rezultati o topnosti/izlo čljivosti v mg/l; posamezne in povpre čne 
vrednosti za ekstrakcijske preskuse v razli čnih raztopinah, poraz ­
deljenih v vsebnosti polimera in ne čistotah, aditivih, itd. 
— rezultati topnosti/izlo čljivosti v mg/g polimera, 
— TOC vrednosti vodnega ekstrakta, masa vzorca in izra čunani 
odstotki, če so merjeni, 
— pH vsakega posameznega vzorca, — informacije o praznih vrednostih, — kjer je potrebno, napotki o kemi čni nestabilnosti preskusne snovi 
med preskusnim postopkom in analiti čnim procesom, 
— vse informacije, ki so pomembne za interpretacijo rezultatov.
 
4. LITERATURA  
(1) DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen 
für Prüfzwecke.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 146
 
A.21  OKSIDATIVNE LASTNOSTI (TEKO ČE SNOVI)  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Ta metoda preskušanja je namenjena merjenju potenciala teko če 
snovi za pove čanje stopnje gorenja ali intenzivnosti gorenja vnetljive 
snovi ali za tvorbo mešanice z vnetljivo snovjo, ki se sama vname, ko se obe temeljito premešata. Njena podlaga je preskus ZN za oksidativne teko če snovi (1) in mu je enakovredna. Ker je metoda 
A.21 v prvi vrsti namenjena izpolnjevanju zahtev Uredbe 1907/2006, 
je potrebna primerjava le z eno referen čno snovjo. Če je pričakovati, 
da se bodo rezultati preskusov uporabljali za druge namene (
 1 ), bo 
morda potrebno preskušanje in primerjava z dodatnimi referen čnimi 
snovmi. 
Ta preskus je treba opraviti, kadar preverjanje strukturne formule 
nedvomno pokaže, da snov ne more reagirati eksotermi čno z vnet ­
ljivim materialom. 
Pred opravljanjem tega preskusa je koristno imeti predhodne infor ­
macije o možnih eksplozivnih lastnostih snovi. 
Ta preskus se ne uporablja za trdne snovi, pline, eksplozivne ali zelo 
lahko vnetljive snovi, ali organske perokside. 
Tega preskusa ni treba narediti, kadar so rezultati za preskusno snov 
iz preskusa ZN za oksidativne teko če snovi (1) že na voljo.  
1.2 DEFINICIJE IN ENOTE 
Povprečni čas dvigovanja tlaka je povpre čje izmerjenega časa za 
mešanico v preskusu, da bi se zagotovil dvig tlak s 695 kPa na 
2 070 kPa nad zra čnim tlakom.  
1.3 REFEREN ČNA SNOV 
Potrebna je 65 % (m/m) vodna dušikova kislina (analitske stopnje) 
kot referen čna snov (  2 ). ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 147  
( 1 ) Kot na primer v uredbah ZN o prevozu. 
( 2 ) Kislino je treba titrirati pred preskušanjem za potrditev njene koncentracije.
 Če izvajalec preskusa predvideva, da bi se rezultati tega preskusa 
lahko uporabili za druge namene (  1 ), je lahko ustrezno tudi presku ­ 
šanje z dodatnimi referen čnimi snovmi (  2 ). 
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Tekoča snov, ki jo je treba preskusiti, se zmeša v razmerju 1 proti 1 
glede na maso, z vlaknato celulozo in vlije v tla čno posodo. Če med 
mešanjem ali polnjenjem pride do samovžiga, nadaljnje preskušanje ni potrebno. 
Če samovžig ne nastane, se opravi preskus v celoti. Mešanica se 
segreje v tla čni posodi, dolo či se povpre čni čas, potreben za dvig 
tlaka s 690 kPa na 2 070 kPa nad zra čnim tlakom. To se primerja s 
povprečnim časom dviga tlaka za mešanico 1: 1 referen čne snovi/ 
referenčnih snovi in celuloze.
 
1.5 KRITERIJI KAKOVOSTI 
V seriji petih poskusov na eni snovi se rezultati ne smejo razlikovati 
za več kakor 30 % od aritmeti čne sredine. Rezultate, ki se razlikujejo 
za več kakor 30 % od aritmeti čne sredine, je treba zavre či, izboljšati 
postopek mešanja in polnjenja in ponoviti preskušanje.  
1.6 OPIS METODE  
1.6.1  Priprava  
1.6.1.1  Vnetljiva snov  
Posušena vlaknata celuloza z dolžino vlaken med 50 in 250 μm in 
povprečni premerom 25 μm (  3 ) se uporablja kot vnetljivi material. 
Suši se 4 ure do konstantne teže v plasti, ki je debela najve č 25 mm, 
pri 105  o C in se hrani v eksikatorju, s snovjo za sušenje, dokler se ne 
ohladi in dokler ni potrebna za uporabo. Vsebnost vode v posušeni 
celulozi mora biti manjša kakor 0,5 % na suho maso (  4 ). Če je 
potrebno, se mora čas sušenja podaljšati, da bi se to doseglo (  5 ). 
Med preskusom je treba ves čas uporabljati isto šaržo celuloze.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 148  
( 1 ) Kot na primer v uredbah ZN o prevozu. 
( 2 ) Npr.: 50 % (m/v) perklorne kisline in 40 % (m/m) natrijevega klorata se uporabi kot 
referenca 1. 
( 3 ) Npr.: Whatmanov stolpec za kromatografski celulozni prah CF 11, kataložna številka 
4021 050. 
( 4 ) Potrjeno (npr.) s Karl-Fisherjevo titracijo. 
( 5 ) Druga možnost je, da se doseže ta vsebnost vode lahko tudi z (npr.) 24-urnim segreva ­
njem pri 105  o C v brezzra čnem prostoru.
 1.6.1.2  Naprava  
1.6.1.2.1 T l a č n a p o s o d a 
Potrebna je tla čna posoda. Posoda je sestavljena iz cilindri čne 
jeklene tla čne posode, dolžine 89 mm z zunanjim premerom 
60 mm (glej sliko 1). Dve ravni držali se strojno pritrdita na naspro ­
tnih straneh (zmanjšujeta prerez posode na 50 mm), da jo je lažje 
držati pri namestitvi sprožilnega mehanizma in oddušnega ventila. 
Posoda, ki ima izvrtino premera 20 mm, ima na obeh straneh do globine 19 mm vrezane navoje, ki ustrezajo 1' „britanske standardne cevi (BSP) ali metri čno enakovredni cevi. Zra čni ventil v obliki 
stranske ro čice se privije v ukrivljeni sprednji del tla čne posode 
35 mm od enega konca in pod kotom 90
 o glede na strojno obdelani 
ravnini. Za to je izvrtana 12 mm globoka izvrtina z navoji za privi ­
janje 1/2“ BSP (ali metri čno enakovrednega) navoja na koncu 
stranske ro čice. Če je potrebno, pritrdimo za zatesnitev proti uhajanju 
plina inertno tesnilo. Stranska ro čica sega 55 mm za ohišje tla čne 
posode in ima izvrtino 6 mm. Konec stranske ro čice ima izrezane 
navoje za pritrditev naprave za spreminjanje pritiska z opno. Upora ­
bimo lahko katero koli napravo za merjenje tlaka, pod pogojem, da 
nanjo ne vplivajo vro či plini ali razpadli produkti in da se lahko 
odziva na stopnje dviga tlaka 690–2 070 kPa v manj kakor 5 ms. 
Konec tla čne posode, ki je najbolj oddaljen od stranske ro čice, se zapre s 
sprožilnim mehanizmom, ki je opremljen z dvema elektrodama, od 
katerih je ena izolirana od ohišja mehanizma, druga pa ne. Drugi konec tlačne posode je zaprt z okroglo razpo čno ploščo (tlak preboja 
približno 2 200 kPa), ki jo drži na mestu vijak z 20 mm izvrtino. Če je 
potrebno, pritrdimo za zatesnitev proti uhajanju plina inertno tesnilo. 
Podporno podnožje (slika 2) drži sklop v pravilnem položaju med uporabo. Ponavadi se sestoji iz osnovne ploš če iz mehkega jekla veli ­
kosti 235 mm × 184 mm × 6 mm, na katero je pritrjen po dolžini 185 mm 
profil dimenzij kvadrata 70 mm × 70 mm × 4 mm. 
Iz kvadratnega profila se izrežeta po dolžini dve nasprotni stranici, tako 
da nastane nad njima 86 mm dolg podest, ki ima dve nogi z ravnima stranicama. Konca teh ravnih stranic sta odrezana pod kotom 60
 o na 
horizontalno ravnino in privarjena na osnovno ploš čo. Utor, ki je 22 mm 
širok in 46 mm globok, je strojno vrezan v eno stran gornjega konca podlage, da se vanj uleže stranska ro čica, kadar potisnemo sklop s tla čno 
posodo navzdol, najprej konec s sprožilnim mehanizmom, v podpornik 
podesta. Na spodnjo zunanjo prednjo stran kvadratnega profila je 
privarjen kos jekla, širine 30 mm in debeline 6 mm, ki deluje kakor distančnik. Dva 7 mm pal čna vijaka, privita na nasprotni strani, poma ­
gata držati tla čno posodo trdno na mestu. 12 mm široki trakovi iz 6 mm 
debelega jekla, privarjeni na stranske dele, ob robu podlage kvadratnega 
profila, podpirata tla čno posodo s spodnje strani.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 149
 
1.6.1.2.2 S i s t e m v ž i g a 
Sistem vžiga je sestavljen iz 25 cm dolge žice iz niklja in kroma s 
premerom 0,6 mm in uporom 3,85 ohm/m. Žica se zvije s palico 
premera 5 mm v obliko tuljave in se pritrdi na elektrodo sprožilnega mehanizma. Tuljava mora imeti eno od oblik, prikazanih na sliki 3. Razdalja med dnom posode in spodnjim delom tuljave vžiga 
mora znašati 20 mm. Če elektrodi nista nastavljivi, je treba izolirati 
konca žice za vžig med tuljavo in dnom posode s kerami čnim obro­ 
čem. Žico segreva neprekinjeno tokovno napajanje, ki lahko zagotovi 
moč najmanj 10 amperov.
 
1.6.2  Potek preskušanja  ( 1 ) 
Naprava, ki se sestoji iz zra čnega ventila in sistema segrevanja, vendar 
brez nameš čene okrogle razpo čne plošče, je podprta s koncem s 
koncem, kjer je sprožilni mehanizem, obrnjenim navzdol. 2,5 g teko ­ 
čine, ki jo je treba preskusiti, se zmeša z 2,5 g posušene celuloze v 
stekleni čaši in uporabimo stekleno pali čico za mešanje (  2 ). Zaradi 
varnosti je treba mešanje opraviti z varnostnim š čitom med izvajalcem 
preskusa in mešanico. Če se mešanica vname med mešanjem ali 
polnjenjem, nadaljnje preskušanje ni potrebno. Mešanica se dodaja v majhnih odmerkih po kapljicah v tla čno posodo, prepri čati se je treba, 
da se mešanica nabira okoli tuljave vžiga in je z njo v dobrem stiku. 
Pomembno je, da se tuljava ne deformira med postopkom pakiranja, ker lahko to povzro či zmotne rezultate (
 3 ). Namesti se razpo čna plošča 
in tesno privije vijak, ki jo drži na njenem mestu. Napolnjeno posodo 
prenesemo na sprožilno podporno podnožje, z okroglo razpo čno 
ploščo obrnjeno navzgor, nameš čena mora biti v ustrezni oklepni 
dimni omarici ali sprožilni celici. Tokovno napajanje se priklju či na 
zunanje priklju čne letve sprožilnega mehanizma in uporabi mo č 10 A. 
Čas med za četkom mešanje in vklju čitvijo močnostnega napajanja ne 
sme presegati 10 minut. 
Signal, ki ga oddaja zra čni ventil za tlak, se zabeleži z ustreznim 
sistemom, ki omogo ča hkrati vrednotenje in oblikovanje stalnega 
zapisa dobljenega časovnega tla čnega profila (npr. za časen zapiso ­
valnik skupaj z zapisovalnikom grafa). Mešanica se segreva, dokler 
se okrogla razpo čna plošča ne razpo či ali dokler ne mine vsaj 60 s. 
Če razpočna plošča poči, je treba pustiti mešanico, da se ohladi, 
preden se naprava skrbno razstavi in pri tem upoštevati varnostne 
ukrepe zaradi podtlaka, ki lahko nastane. Izvede se 5 poskusov s 
preskusno snovjo in z referen čno snovjo/snovmi. Čas, potreben za 
dvig tlaka s 690 kPa na 2 070 kPa nad zra čni tlak, se zabeleži. 
Izračuna se povpre čni čas dviga tlaka. 
V nekaterih primerih lahko snovi sprožijo dvig tlaka (previsok ali 
prenizek tlak) zaradi kemijskih reakcij, ki niso zna čilne za oksida ­
tivne lastnosti snovi. V takšnih primerih bo morda potrebno preskus ponoviti z inertno snovjo, npr. z diatomejsko zemljo (kieselguhr) namesto celuloze za pojasnitev vrste reakcije.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 150  
( 1 ) Mešanice oksidantov s celulozo je treba obravnavati kot potencialno eksplozivne in z 
njimi ustrezno pravilno ravnati. 
( 2 ) V praksi se to lahko to doseže tako, da se pripravi mešanica 1: 1 teko če snovi, ki jo je 
treba preskusiti, in celuloze v ve čji količini, kot je potrebno za poskus, in prenesti 5 ± 
0,1 g v tla čno posodo. Mešanico je treba za vsak poskus sveže pripraviti. 
( 3 ) Zlasti se je treba izogibati stiku med sosednjimi zavoji tuljave.
 2. PODATKI  
Časi dviga tlaka za preskusno snov in referen čno snov/snovi. Časi 
dviga tlaka za preskuse z inertno snovjo, če se opravljajo.  
2.1 OBRAVNAVANJE REZULTATOV 
Izračunajo se povpre čni časi dviga tlaka za preskusno snov in refe ­
renčno snov/snovi. 
Izračuna se povpre čni čas dviga tlaka za preskuse z inertno snovjo 
(če se opravljajo). 
Nekateri primeri rezultatov so prikazani v Tabeli 1.  
Tabela 1  
Primer rezultatov  ( a ) 
Snov (  b ) Povprečni čas dviga tlaka za mešanico s celulozo 1:1 
(ms) 
Amonijev dikromat, nasi čena vodna raztopina 20 800 
Kalcijev nitrat, nasi čena vodna raztopina 6 700 
Železov nitrat, nasi čena vodna raztopina 4 133 
Litijev perklorat, nasi čena vodna raztopina 1 686 
Magnezijev perklorat, nasi čena vodna raztopina 777 
Nikljev nitrat, nasi čena vodna raztopina 6 250 
Dušikova kislina, 65 % 4 767 (  c ) 
Perklorova kislina, 50 % 121 (  c ) 
Perklorova kislina, 55 % 59 
Kalijev nitrat, 30 % vodna raztopina 26 690 
Srebrov nitrat, nasi čena vodna raztopina (  d ) 
Natrijev klorat, 40 % vodna raztopina 2 555 (  c ) 
Natrijev nitrat, 45 % vodna raztopina 4 133  
Inertna snov  
Vodna celuloza (  d ) 
( a ) Glej sklic (1) za razvrstitev v shemo prevoza ZN. 
( b ) Nasičeno raztopino je treba pripraviti pri 20  o C. 
( c ) Srednja vrednost pri poskusih iz primerjave med laboratoriji. 
( d ) Maksimalni tlak 2 070 kPa ni dosežen.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 151
 
3. PORO ČILO 
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: 
— vrsto, sestavo, čistost, itd. preskušane snovi, 
— koncentracijo preskusne snovi, — postopek sušenja uporabljene celuloze, — vsebnost vode uporabljene celuloze, 
— rezultate meritev, 
— rezultate preskusov z inertno snovjo, če so bili izvedeni, 
— izračunane povpre čne čase dviga tlaka, 
— vsa odstopanja od te metode in razloge zanje, 
— vse dodatne informacije ali pripombe, ki so pomembne za 
razlago rezultatov.
 
3.2 RAZLAGA REZULTATOV (  1 ) 
Rezultati preskusa se ocenijo na podlagi tega; 
(a) ali se mešanica preskušane snovi in celuloze spontano vname in 
(b) primerjave povpre čnega časa, ki je potreben, da tlak naraste s 
690 kPa na 2 070 kPa s povpre čnim časom za referen čno snov/ 
snovi. 
Tekočo snov je treba obravnavati, kot da je oksidant, kadar: 
(a) se mešanica 1:1, glede na maso, snovi in celuloze spontano 
vname, ali 
(b) ima mešanica 1:1, glede na maso, snovi in celuloze, manjši ali 
enak povpre čni čas dviga tlaka, kot je povpre čni čas dviga tlaka 
mešanice 1:1, glede na maso, 65 % (m/m) vodne dušikove kisline in celuloze. 
Da bi se izognili napa čnim pozitivnim rezultatom, je treba po potrebi 
pri razlagi rezultatov upoštevati tudi rezultate, dobljene pri presku ­ 
šanju snovi z inertnim materialom.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 152  
( 1 ) Glej sklic 1 za razlago rezultatov v skladu z zakonodajo ZN o prevozu z uporabo 
različnih referen čnih snovi.
 4. VIRI  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, 
Manual of Tests and Criteria. 3  rd revised edition. UN Publica ­
tion No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: 
Test for oxidizing liquids.  
Slika 1  
Tlačna posoda
  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 153
 
Slika 2  
Podporni podest
  
Slika 3  
Sistem vžiga
  
Opomba:  Uporabi se lahko kateri koli od obeh na črtov. ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 154
 
A.22.  GEOMETRIJSKI SREDNJI PREMER GLEDE NA DOLŽINO 
VLAKEN  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Ta metoda opisuje postopek za merjenje geometrijskega srednjega 
premera glede na dolžino vlaken (LWGMD – Length Weighted 
Geometric Mean Diameter) velikih ro čno izdelanih mineralnih 
vlaken (MMMF – Man Made Mineral Fibres). Ker ima LWGMD populacije 95 % verjetnosti, da leži med 95 odstotnimi stopnjami 
zaupanja (LWGMD ± dve standardni napaki) vzorca, bo dejanska 
vrednost (preskusna vrednost) nižja od 95 % meje zaupanja vzorca (tj. LWGMD ± dve standardni napaki). Metoda temelji na dopolnitvi (junij 1994) osnutka industrijskega postopka HSE, ki je bil usklajen 
na sestanku med ECFIA in HSE v Chestru dne 26.9.1993 in razvit 
za in iz drugega medlaboratorijskega poskusa (1, 2). To merilno metodo se lahko uporablja za ozna čevanje premera vlaken velikih 
snovi ali proizvodov, ki vsebujejo MMMF, vklju čno 
z ognjeodpornimi kerami čnimi vlakni (RFC), ro čno izdelanimi 
steklenimi vlakni (MMVF), kristalnimi in polikristalnimi vlakni. 
Določanje utežnostnega faktorja dolžine je sredstvo za izravnavo 
učinkov na porazdelitev premera, povzro čenega zaradi preloma 
dolgih vlaken pri vzor čenju ali ravnanju z materialom. Geometri čna 
statistika (geometri čno povpre čje) se uporablja za merjenje velikosti 
porazdelitve premera MMMF, ker imajo ti premeri obi čajno velikost 
porazdelitve, ki se približuje normalnemu logaritmu. 
Merjenje dolžine kot tudi premera je obsežno in zahteva veliko časa, 
vendar, če se meritve izvedejo samo na tistih vlaknih, ki se dotikajo 
neskončno tanke črte v vidnem polju SEM, potem je verjetnost izbire 
danega vlakna sorazmerna njegovi dolžini. Ker to dolo ča dolžino pri 
izračunih utežnostnega faktorja dolžine, je edina zahtevana meritev, 
meritev premera, tako da je možno LWGMD-2SE izra čunati, kot je 
to opisano.
 
1.2 DEFINICIJE  
Delec : Predmet z razmerjem dolžina/širina, ki je manjše od 3:1.  
Vlakno : Predmet z razmerjem dolžina/širina, ki je manjše od 3:1.  
1.3 OBSEG IN OMEJITVE 
Ta metoda je zasnovana tako, da je možno pogledati porazdelitev 
premerov, ki imajo mediano premera od 0,5 μm do 6 μm. Večje 
premere je možno izmeriti, če se uporabijo manjše pove čave SEM, 
vendar je metoda izredno omejena na natan čno porazdelitev vlaken, 
tako da se priporo ča uporaba meritev s TEM (prenosni elektronski 
mikroskop), če je mediana premera pod 0,5 μm. ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 155
 
1.4 NA ČELA METODE PRESKUŠANJA 
Število reprezentan čnih vzorcev jeder se vzame iz krpe vlaken ali iz 
prostih velikih vlaken. Velika vlakna se z uporabo postopka drobljenja skrajšajo po dolžini, reprezentativni podvzorci pa se 
razpršijo v vodi. Alikvoti se izvle čejo in filtrirajo skozi 0,2 μm 
velike pore polikarbonskega filtra in se pripravijo za preskušanje s tehniko skeniranja z elektronskim mikroskopom (SEM). Premeri vlaken se merijo pri pove čavi zaslona × 10 000 ali ve čji (
 1 ), pri tem 
pa se uporabi metoda sekanja črte, da je tako dosežena nevtralna 
ocena mediane premera. Izra čuna se spodnjih 95 % intervala 
zaupanja (na osnovi enostranskega preskusa), tako da je možno 
dati oceno najnižje vrednosti srednjega geometrijskega premera 
glede na dolžino vlakna materiala.  
1.5 OPIS METODE PRESKUŠANJA  
1.5.1  Varnostni/previdnost  
Do najve čje možne mere je treba zmanjšati izpostavljenost osebja 
pred vlakni, ki se uporabljajo v letalstvu, zato je za ravnanje s suhimi vlakni treba uporabljati dimno komoro ali komoro, v katero pose ­
gamo z rokavicami. Potrebno je spremljanje ob časne izpostavljenosti 
osebja, da bi se dolo čila učinkovitost kontrolne metode. Pri roko ­
vanju z MMMF je treba nositi rokavice za enkratno uporabo, da se tako zmanjša draženje kože in prepre či navzkrižno onesnaženje.
 
1.5.2  Aparature/naprave  
— Stiskalnica in barve (za tlak do 10 MPa), 
— filtri s kapilarnimi karbonatnimi porami velikosti 0,2 μm (pre­
mera 25 mm), 
— membranski filtri s 5 μm velikimi celuloznimi porami za uporabo 
pri podpornih filtrih, 
— aparature za filtriranje stekla (ali sistem za filtriranje odpadkov), 
ki sprejmejo filtre s premorom 25 mm (npr. Millipore komplet za mikroanalizo stekla, tip št. XX10 025 00), 
— sveže destilirana voda, ki je bila filtrirana skozi filter z velikostjo 
por 0,2 μm za odstranjevanje mikroorganizmov, 
— naprava za pršenje nanosov na zlato ali zlate/paladijeve površine, — skenirni elektronski mikroskop z lo čitvijo do 10 nm in 
s povečavo ×100 000, 
— razno: lopatice, rezilo skalpela tipa 24, pincete, cevi SEM, 
karbonsko lepilo ali karbonski lepilni trak, koloidno srebro, 
— ultrazvo čno tipalo ali namizna ultrazvo čna kopel, 
— naprava za jemanje vzorcev jedra ali vrtalnik za pluto za odvzem 
vzorcev iz MMMF krpe.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 156  
( 1 ) Ta vrednost pove čave je dolo čena za vlakna s premerom 3 μm, za vlakna s premerom 
6 μm pa je primernejša pove čava ×5 000.
 1.5.3  Postopek preskusa  
1.5.3.1  Vzor čenje 
Za odvzem vzorcev krp in ploš č se uporablja 25 mm naprava za 
jemanje vzorcev jeder ali vrtalnik za pluto. Vzorce se odvzame 
enakomerno po vsej dolžini krajše strani krpe ali iz poljubne povr ­ 
šine, če so na razpolago daljše strani krpe. Za odvzem naklju čnih 
vzorcev prostih vlaken se uporablja ista oprema. Če je le možno, naj 
se odvzame šest vzorcev, ki odražajo prostorske razlike velikega 
materiala. 
Šest vzorcev jeder je treba z 10 MPa zdrobiti v 50 mm kalupu. 
Material se meša z lopatico in ponovno stisne z 10 MPa. Nato se material odstrani iz kalupa in shrani v zape čateno steklenico.
 
1.5.3.2  Priprava vzorca  
Po potrebi se organska veziva lahko odstranijo tako, da se vlakna za 
ca. 1 uro vstavijo v pe č pri 450 °C. 
Napravite stož často obliko in jo razdelite na štiri dele (to je treba 
narediti v prašni komori). 
Z lopatico dodajte majhno koli čino (< 0,5 g) vzorca v 100 ml sveže 
destilirane vode, ki ste jo predhodno filtrirali skozi membranski filter 0,2 μm (alternativno se lahko uporabijo izviri izjemno čiste vode, če 
se pokažejo kot zadovoljivi). Temeljito razpršite s pomo čjo ultrazvo ­ 
čnega tipala, ki deluje z mo čjo 100 W in je uglašeno tako, da 
povzroča kavitacije. ( Če tipalo ni na razpolago, uporabite naslednjo 
metodo: ve čkrat pretresite in obrnite za 30 s; za nekaj minut izpo ­
stavite ultrazvoku v namizni ultrazvo čni napravi; nato ponovno 
pretresite in obrnite za nadaljnjih 30 s). 
S široko pipeto (zmogljivosti 2–5 ml) takoj po razpršitvi vlakna 
odstranite ve čje število alikvotov (npr. tri alikvote po 3, 6 in 10 ml). 
Vaakumsko filtrirajte vsak alikvot skozi polikarbonski filter 0,2 μm, 
ki mu pomaga podporni filter MEC s 5 μm porami, in uporablja 
25 mm stekleni filtrski lijak z valjastim rezervoarjem. Približno 5 ml 
filtrirane destilirane vode je treba vliti v lijak in po časi s pipeto 
nakapati alikvot v vodo, pri tem pa držati vrh pipete pod menisku ­
som. Pipeto in rezervoar je po kapljanju treba temeljito splahniti, ker 
tanka vlakna težijo k površini. 
Skrbno odstranite filter in ga lo čite od podpornega filtra, preden ga 
vstavite v drugo posodo na sušenje.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 157
 
S skalpelom tipa 24 odrežite četrtino ali polovico dela filtra 
z filtrskimi ostanki in pri tem uporabite sunkovite gibe. Previdno 
pritrdite odrezani del na trn SEM in pri tem uporabite vložke leplji ­
vega ogljika ali ogljikovo lepilo. Koloidno srebro se nanese na najmanj tri mesta, da se izboljša elektri čni stik na robovih filtra in 
trna. Ko se lepilo/koloidno srebro posuši, nabrizgajte sloj približno 
50 nm zlata ali zlata/paladija na površino ostankov.
 
1.5.3.3  Umerjanje in delovanje SEM  
1.5.3.3.1 U m e r j a n j e 
Umerjanje SEM je treba preveriti vsaj enkrat tedensko (idealno 
enkrat na dan) in pri tem uporabiti mrežo za umerjanje. Umerjanje 
je treba preveriti glede na potrjene standarde in če izmerjena vred ­
nost (SEM) ni v obmo čju ±2 % od potrjene vrednosti, potem je treba 
umerjanje SEM prilagoditi in ponovno preveriti. 
SEM mora biti sposoben lo čiti vsaj najmanjši viden premer 0,2 μm 
pri uporabi prave matrike vzor čenja in pri pove čavi × 2 000.  
1.5.3.3.2 D e l o v a n j e 
SEM naj obratuje pri pove čavi 10 000 (  1 ) pod pogoji, ki omogo čajo 
dobro ločljivost s sprejemljivimi slikami pri po časnem skeniranju, 
npr. 5 s za sliko. Čeprav so delovne zahteve za razli čne SME 
lahko razli čne, je za doseganje najboljše vidljivosti in lo čljivosti na 
splošno treba uporabiti nastavitev za majhno površino fokusa in kratko delovno razdaljo, z relativno nizko atomsko težo materialov in pospeševalnimi napetostmi 5–10 keV. Ker se izvaja 
linearni prehod, se priporo ča uporaba naklona 0
 o za najmanjše 
potrebno ponovno fokusiranje ali, če je SEM v evcentri čnem stanju, 
evcentrična delovna razdalja. Če material ne vsebuje vlaken majh ­
nega premera in so premeri vlaken veliki (> 5 μm), se lahko uporabi 
manjša pove čava. 
1.5.3.4  Dolo čanje velikosti  
1.5.3.4.1 P r e g l e d z n i z k o p o v e č a v o z a o c e n o v z o r c a 
Najprej naj se vzorec pregleda z nizko pove čavo, da se ugotovi prisot ­
nost kopičenja velikih vlaken in da se oceni gostota vlaken. V primeru 
prevelikega kopi čenja se priporo ča priprava novega vzorca. 
Za statisti čno točnost je potrebno izmeriti najmanjše število vlaken, 
visoka gostota vlaken, ki je na videz primerna za pregled praznih polj, pa zahteva veliko časa in ne prispeva k analizi. Če je filter 
preobremenjen, je težko meriti vsa merljiva vlakna in ker velika 
vlakna lahko zakrivajo mala, ki potem niso vidna.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 158  
( 1 ) Za vlakna s premerom 3 μm glej prejšnjo opombo.
 Nagnjenost k precenjevanju LWGMD je lahko rezultat gostote 
vlaken nad 150 vlaken/mm pri linearnem prehodu. Na drugi strani 
pa nizke koncentracije vlaken pove čujejo čas analize in je pogosto 
stroškovno ugodno pripraviti vzorec gostote vlakna blizu najugod ­
nejšega, kot vztrajati z oceno pri filtrih z nizko koncentracijo. Naju ­
godnejša gostota vlaken naj bi dala povpre čje o enem ali dveh 
ocenjevanih vlaknih v vidnih poljih pri pove čavi 5 000. Najugod ­
nejša gostota je odvisna od velikost (premera) vlaken, zato mora operater uporabiti nekatere strokovne presoje, da lahko odlo či ali 
je gostota vlaken blizu najugodnejše ali ne.
 
1.5.3.4.2 D o l o č a n j e u t e ž n o s t n e g a f a k t o r j a d o l ž i n e z a 
p r e m e r e v l a k e n 
Štejejo se samo vlakna, ki se dotaknejo (ali pre čkajo) (neskon čno) 
tanko črto na zaslonu SEM. Zato je na zaslonu narisana vodoravna 
(ali navpi čna) črta, ki poteka skozi sredino zaslona. 
Alternativno je na sredini zaslona postavljena ena sama to čka, v eni 
smeri pa poteka stalno skeniranje filtra. Premer se izmeri in zapiše za 
vsako vlakno z razmerjem dolžina/širina ve čjim od 3:1, ki se dotika 
ali prečka to točko. 
1.5.3.4.3 D o l o č a n j e v e l i k o s t i v l a k n a 
Priporoča se merjenje najmanj 300 vlaken. Vsako vlakno se meri le 
enkrat v se čišču s črto ali točko, narisano na sliki (ali blizu se čišča, 
če je rob vlakna nejasen). Pri vlaknih z neenakomernim presekom se 
uporabi meritev, ki predstavlja povpre čje premera vlakna. Paziti je 
treba pri dolo čanju robov in merjenju najkrajše razdalje med robovi 
vlakna. Dolo čanje velikosti je možno on-line ali off-line na shra ­
njenih slikah ali fotografijah. Priporo ča se uporaba polavtomatskih 
sistemov za merjenje na slikah, ki nalagajo podatke neposredno v razpredelnice, ker se tako prihrani čas, zmanjša število napak pri 
prepisovanju, izra čuni pa so lahko avtomatizirani. 
Konci dolgih vlaken naj se preverijo pri majhnih pove čavah, da se 
zagotovi, da se ne zvijajo nazaj v merilno ali vidno polje in so 
vlakna izmerjena le enkrat.
 
2. PODATKI  
2.1 OBDELAVA REZULTATOV 
Premeri vlaken po navadi nimajo normalne porazdelitve. Če pa se 
izvede logaritmi čna transformacija, je možno dobiti porazdelitev, ki 
se približuje normalni. 
Izračunajte aritmeti čno srednjo vrednost (srednji lnD) in standardno 
deviacijo (SD  lnD ) logaritma z osnovo e (lnD) za n premerov vlakna (D). 
mean lnD ¼ P 
lnD 
n (1) ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 159
 
SD lnD ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
ΣðlnD – mean lnDÞ 2 
n – 1 s 
(2) 
Standardna deviacija se deli s kvadratnim korenom števila meritev 
(n), da dobimo standardno napako (SE  lnD ). 
SE lnD ¼ SD 
ﬃﬃﬃ n p (3) 
Dvakrat odštejte standardno napako od srednje vrednosti in izra ču­
najte njen eksponent (srednja vrednost minus dve standardni 
napaki) in tako dobite geometrijsko srednjo vrednost minus dve 
geometrijski standardni napaki. 
LWGMD – 2SE ¼ e ðmean lnD – 2SE  lnd Þ (4) 
3. PORO ČANJE  
POROČILO O PRESKUSU) 
Poročilo o preskusu naj vsebuje vsaj naslednje informacije: 
— vrednost LWGMD-2SE, — kakršna koli odstopanja, še zlasti tista, ki vplivajo na natan čnost 
in točnost rezultatov z ustreznimi obrazložitvami.
 
4. VIRI  
(1) B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. February 
1999. 
(2) G. Burdett in G. Revell. Development of a standard method to 
measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: 
Results of the Second inter-laboratory exchange. 
IR/L/MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Execu ­
tive. Research and Laboratory Services Division. 1994.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 160
 
A.23  PORAZDELITVENI KOEFICIENT (1-OKTANOL/VODA): 
METODA PO ČASNEGA MEŠANJA  
UVOD 
1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 123 
(2006). Vrednosti porazdelitvenega koeficienta 1-oktanol/voda (P  OW ) do 
log P  OW 8,2 so bile natan čno določene z metodo po časnega mešanja (1). 
Zato gre za primeren preskusni pristop k neposrednemu dolo čanju P  OW zelo 
hidrofobnih snovi. 
2. Preostali metodi za dolo čanje porazdelitvenega koeficienta 1-oktanol/vode 
(P OW ) sta metoda „stresanja bu čke“ (2) in dolo čanje P  OW na podlagi reten ­
cijskega vedenja pri teko činski kromatografiji visoke lo čljivosti (HPLC) z 
reverzno fazo (3). Pri metodi „stresanja bu čke“ so pogosti artefakti zaradi 
prenosa mikrokapljic oktanola v vodno fazo. S pove čevanjem vrednosti P  OW 
prisotnost teh kapljic v vodni fazi vodi do pove čanega precenjevanja 
koncentracije preskusne snovi v vodi. Zato je uporaba te metode omejena na snovi z log P
 OW < 4. Pri drugi metodi se z opiranjem na zanesljive 
podatke iz neposredno dolo čenih vrednosti P  OW umeri razmerje med reten ­
cijskim vedenjem pri HPLC in izmerjenimi vrednostmi P  OW . Na voljo je bil 
tudi osnutek smernice OECD za dolo čanje porazdelitvenih koeficientov 1- 
oktanol/voda za snovi, ki lahko ionizirajo (4), ki pa se ne uporablja ve č. 
3. Ta preskusna metoda je bila razvita na Nizozemskem. Natan čnost metod, 
opisanih v tem dokumentu, je bila validirana in optimizirana v primerjalni 
validacijski študiji, v kateri je sodelovalo 15 laboratorijev (5).  
ZAČETNI PREUDARKI  
Pomen in uporaba  
4. Za inertne organske snovi so bila ugotovljena zelo pomembna razmerja med 
porazdelitvenimi koeficienti 1-oktanol/voda (P  OW ) in njihovo bioakumula ­
cijo v ribah. Poleg tega je bilo dokazano, da je P  OW povezan s strupenostjo 
za ribe, pa tudi s sorpcijo kemikalij na trdne snovi, kot so prsti in usedline. 
Obsežen pregled razmerij je naveden v viru (6). 
5. Ugotovljena so bila najrazli čnejša razmerja med porazdelitvenim koefi ­
cientom 1-oktanol/voda in drugimi lastnostmi snovi, pomembnimi za 
okoljsko toksikologijo in kemijo. Porazdelitveni koeficient 1-oktanol/voda je zato postal klju čni parameter pri ocenjevanju tveganja kemikalij za okolje, 
pa tudi pri napovedovanju vpliva kemikalij v okolju.
 
Področje uporabe  
6. S preskusom s po časnim mešanjem naj bi se zmanjševala tvorba mikroka ­
pljic iz kapljic 1-oktanola v vodni fazi. Posledi čno ne pride do precenjevanja 
vodne koncentracije zaradi molekul preskusne snovi, ki so združene s takimi kapljicami. Zato je metoda po časnega mešanja posebej primerna za ugota ­
vljanje P
 OW za snovi s pri čakovanimi vrednostmi log P  OW 5 in več, za 
katere metoda stresanja bu čke pogosto da napa čne rezultate (2).  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 161
 
OPREDELITEV POJMOV IN ENOTE 
7. Porazdelitveni koeficient snovi med vodo in lipofilnim topilom (1-oktano ­
lom) ozna čuje ravnotežno porazdelitev kemikalije med obema fazama. 
Porazdelitveni koeficient med vodo in 1-oktanolom (P  OW ) je opredeljen 
kot razmerje ravnotežnih koncentracij preskusne snovi v 1-oktanolu, nasi ­ 
čenem z vodo (C  O ), in vodi, nasi čeni z 1-oktanolom (C  W ). 
P OW ¼ C O=C W 
Kot razmerje koncentracij je porazdelitveni koeficient brez razsežnosti. 
Najpogosteje je podan kot desetiški logaritem (log P  OW ). Odvisen je od 
temperature, sporo čeni podatki pa morajo vklju čevati temperaturo merjenja.  
NAČELO METODE 
8. Za dolo čitev porazdelitvenega koeficienta se voda, 1-oktanol in preskusna 
snov medsebojno uravnotežijo pri konstantni temperaturi. Potem se dolo čijo 
koncentracije preskusne snovi v obeh fazah. 
9. Težave pri preskušanju, povezane s tvorbo mikrokapljic med preskusom 
stresanja bu čke, se lahko zmanjšajo z uporabo preskusa s po časnim meša ­
njem, ki je predlagan v tem dokumentu. V njem se voda, 1-oktanol in 
preskusna snov uravnotežijo v termostatiranem mešalnem reaktorju. Izme ­
njava med fazama se pospeši z mešanjem. To povzro či omejeno turbulenco, 
kar pospeši izmenjavo med 1-oktanolom in vodo, ne da bi se pri tem tvorile 
mikrokapljice (1).  
UPORABNOST PRESKUSA 
10. Ker lahko prisotnost snovi, ki niso preskusna snov, vpliva na koeficient 
aktivnosti preskusne snovi, je treba preskusno snov preskušati v čistem 
stanju. Za preskus porazdelitve 1-oktanol/voda je treba uporabiti najvišjo tržno dostopno čistost. 
11. Ta metoda se uporablja za čiste snovi, ki ne disociirajo ali asociirajo in ne 
kažejo bistvene medfazne aktivnosti. Uporablja se lahko za ugotavljanje porazdelitvenega razmerja 1-oktanol/voda takih snovi in zmesi. Kadar se 
metoda uporablja za zmesi, so ugotovljena porazdelitvena razmerja 1-oktanol/ 
voda pogojna ter odvisna od kemijske sestave preskušane zmesi in elektro ­
litske sestave, uporabljene za vodno fazo. Če se izvedejo dodatni koraki, je 
metoda uporabna tudi za spojine, ki disociirajo ali asociirajo (odstavek 12). 
12. Ker porazdelitev 1-oktanol/voda pri snoveh, ki disociirajo – kot so organske 
kisline in fenoli, organske baze ter organokovinske snovi –, vklju čuje več 
ravnotežij v vodi in 1-oktanolu, je porazdelitveno razmerje 1-oktanol/voda pogojna konstanta, ki je mo čno odvisna od elektrolitske sestave (7) (8). Zato 
je treba pri dolo čanju porazdelitvenega razmerja 1-oktanol/voda pri preskusu 
nadzirati vrednost pH in elektrolitsko sestavo ter o njiju poro čati. Pri ocenje ­
vanju teh porazdelitvenih razmerij je potrebna strokovna presoja. Z uporabo vrednosti disociacijskih konstant je treba izbrati ustrezne vrednosti pH, tako 
da se porazdelitveno razmerje dolo či za vsako ionizacijsko stanje. Kadar se 
preskušajo organokovinske spojine, je treba uporabiti nekompleksirajo če 
pufre (8). Ob upoštevanju sedanjega znanja o vodni kemiji (kompleksacijske konstante, disociacijske konstante) je treba preskusne pogoje izbrati tako, da 
se lahko oceni speciacija preskusne snovi v vodni fazi. Ionska mo č mora biti 
v vseh preskusih enaka, kar se doseže z uporabo osnovnega elektrolita.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 162
 
13. Kadar se preskus opravlja za snovi z nizko topnostjo v vodi ali visokim 
P OW , se lahko pojavijo težave, saj koncentracije v vodi postanejo zelo nizke, 
kar oteži njihovo natan čno določanje. Ta preskusna metoda vsebuje napotke, 
kako to težavo odpraviti.  
INFORMACIJE O PRESKUSNI SNOVI 
14. Kemijski reagenti morajo biti analitsko čisti ali še kakovostnejši. Priporo ča 
se uporaba neozna čenih preskusnih snovi z znano kemijsko sestavo in po 
možnosti vsaj 99-odstotno čistostjo ali izotopsko ozna čenih preskusnih 
spojin z znano kemijsko sestavo in radiokemijsko čistostjo. Pri sledilih s 
kratko razpolovno dobo je treba uporabiti popravke razpada. Pri izotopsko 
označenih preskusnih spojinah je treba uporabiti analitsko metodo, speci ­
fično za dano kemikalijo, da se zagotovi, da se izmerjena radioaktivnost 
nanaša neposredno na preskusno snov. 
15. Oceno log P  OW je mogoče dobiti s tržno dostopno programsko opremo za 
ocenjevanje log P  OW ali z uporabo razmerja topnosti v obeh topilih. 
16. Pred izvedbo preskusa s po časnim mešanjem za dolo čitev P  OW morajo biti 
na voljo naslednje informacije o preskusni snovi: 
(a) strukturna formula; 
(b) ustrezne analitske metode za ugotavljanje koncentracije snovi v vodi in 
1-oktanolu; 
(c) disociacijske konstante snovi, ki lahko ionizirajo (Smernica OECD 112 
(9)); 
(d) topnost v vodi (10); 
(e) abiotska hidroliza (11); 
(f) dobra biorazgradljivost (12); 
(g) parni tlak (13).  
OPIS METODE  
Oprema in aparatura  
17. Potrebna je standardna laboratorijska oprema, zlasti: 
— za mešanje vodne faze se uporabljajo magnetna mešala in magnetne 
mešalne palice, prevle čene s teflonom, 
— analitski instrumenti, primerni za ugotavljanje koncentracije preskusne 
snovi pri pri čakovanih koncentracijah, 
— mešalna posoda s pipo pri dnu. Glede na oceno log P  OW in mejo 
zaznavnosti (LOD) preskusne spojine je treba razmisliti o uporabi reak ­
cijske posode, ki ima enako geometrijo in je ve čja od enega litra, da se 
lahko zagotovi zadosten volumen vode za kemijsko ekstrakcijo in analizo. To privede do višjih koncentracij v vodnem ekstraktu in s 
tem do zanesljivejšega analitskega dolo čanja. Dodatek 1 vsebuje 
preglednico, v kateri so navedene ocene najmanjšega potrebnega volumna, LOD spojine, njen ocenjeni log P
 OW in njena topnost v 
vodi. Preglednica temelji na razmerju med log P  OW ter razmerjem 
topnosti v oktanolu in vodi, kot so ga predstavili Pinsuwan idr. (14): 
log P  OW ¼ 0; 88 log SR þ 0; 41 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 163
 
kjer je  
SR ¼ S okt=S w (v molih), 
ter na razmerju, ki ga je podal Lyman (15) za napovedovanje topnosti v 
vodi. Topnosti v vodi, izra čunane z ena čbo, kot je navedena v Dodatku 
1, je treba obravnavati kot prvo oceno. Opozoriti je treba, da lahko 
uporabnik pripravi oceno topnosti v vodi tudi z uporabo katerega koli 
razmerja, za katero se šteje, da bolje predstavlja razmerje med hidrof ­
obnostjo in topnostjo. Priporo ča se na primer, naj se za trdne spojine v 
napovedovanje topnosti vklju či tališče. Če se uporabi spremenjena 
enačba, se je treba prepri čati, da ena čba za izra čun topnosti v oktanolu 
še vedno velja. V Dodatku 2 je prikazana shema mešalne posode s stekleno oblogo, katere prostornina znaša približno en liter. Razmerja med merami posode, prikazane v Dodatku 2, so se izkazala za ugodna in 
jih je treba ohraniti, kadar se uporabi aparatura druge velikosti, 
— bistveno je sredstvo za ohranjanje konstantne temperature med 
preskusom s po časnim mešanjem. 
18. Posode morajo biti izdelane iz inertnega materiala, tako da je adsorpcija na 
površine posode zanemarljiva.
 
Priprava preskusnih raztopin  
19. P  OW je treba dolo čiti z najčistejšim 1-oktanolom, ki je na voljo na trgu 
(vsaj + 99-odstotnim). Priporo ča se prečiščenje 1-oktanola z ekstrakcijo s 
kislino, bazo in vodo ter poznejšim sušenjem. Poleg tega se lahko 1-oktanol 
prečisti z destilacijo. Pre čiščeni 1-oktanol se uporabi za pripravo standardnih 
raztopin preskusnih snovi. Voda, ki bo uporabljena pri dolo čanju P  OW , mora 
biti destilirana v stekleni ali kremen čevi aparaturi ali pridobljena iz pre čiš­ 
čevalnega sistema, lahko pa se uporablja tudi voda HPLC- čistosti. Za desti ­
lirano vodo je potrebno filtriranje skozi filter z velikostjo por 0,22 μm. 
Vključiti je treba slepe vzorce, s čimer se zagotovi, da v koncentriranih 
ekstraktih ni ne čistot, ki lahko interferirajo s preskusno snovjo. Če se upora ­
blja filter iz steklenih vlaken, ga je treba o čistiti s triurnim segrevanjem v 
peči pri 400 °C. 
20. Pred preskusom se topili medsebojno nasitita z uravnoteženjem v dovolj 
veliki posodi. To se doseže tako, da se dvofazni sistem dva dneva po časi 
meša. 
21. Izbrana ustrezna koncentracija preskusne snovi se raztopi v 1-oktanolu (nasi ­ 
čenem z vodo). Porazdelitveni koeficient 1-oktanol/voda je treba dolo čiti v 
razredčenih raztopinah v 1-oktanolu in vodi. Zato koncentracija preskusne 
snovi ne sme presegati 70 % njene topnosti z najve čjo koncentracijo 0,1 M 
v kateri koli fazi (1). V raztopinah z 1-oktanolom, uporabljenih za preskus, ne sme biti suspendirane trdne preskusne snovi. 
22. Ustrezna koli čina preskusne snovi se raztopi v 1-oktanolu (nasi čenem z 
vodo). Če ocena log P
 OW presega vrednost 5, je treba poskrbeti, da v 
raztopinah z 1-oktanolom, uporabljenih za preskus, ni suspendirane trdne preskusne snovi. V ta namen se upošteva postopek za kemikalije z ocenjeno 
vrednostjo log P
 OW > 5: 
— preskusna snov se raztopi v 1-oktanolu (nasi čenem z vodo),  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 164
 
— raztopina se pusti dovolj dolgo, da se suspendirana trdna snov posede. 
Med posedanjem se spremlja koncentracija preskusne snovi, 
— ko izmerjene koncentracije v raztopini z 1-oktanolom dosežejo stabilne 
vrednosti, se osnovna raztopina razred či z ustreznim volumnom 1-okta ­
nola, 
— izmeri se koncentracija razred čene osnovne raztopine. Če je izmerjena 
koncentracija v skladu z razred čitvijo, se lahko razred čena osnovna 
raztopina uporabi v preskusu s po časnim mešanjem.  
Ekstrakcija in analiza vzorcev  
23. Za analizo preskusne snovi je treba uporabiti validirano analitsko metodo. 
Raziskovalci morajo zagotoviti dokaze, da so koncentracije v fazi 1-okta ­
nola, nasi čenega z vodo, in fazi vode, nasi čene z 1-oktanolom, med 
preskusom nad mejo dolo čljivosti uporabljenih analitskih postopkov. V 
primerih, v katerih so potrebne ekstrakcijske metode, je treba analitske izkoristke preskusne snovi iz vodne faze in faze 1-oktanola dolo čiti pred 
preskusom. Analitski signal je treba popraviti za slepe vzorce in paziti, da 
prenos analita iz enega vzorca v drugega ni mogo č. 
24. Pred analizo bosta zaradi dokaj nizkih koncentracij hidrofobnih preskusnih 
snovi v vodni fazi verjetno potrebna ekstrakcija iz vodne faze z organskim 
topilom in predkoncentriranje ekstrakta. Iz istega razloga je treba znižati 
morebitne koncentracije slepih vzorcev. V ta namen je treba uporabiti topila visoke čistosti, po možnosti topila za analizo ostankov. Poleg tega lahko 
navzkrižno kontaminacijo pomaga prepre čiti delo s steklovino, ki se pred ­
hodno skrbno o čisti (npr. s pomivanjem v topilu ali segrevanjem v pe či pri 
zvišani temperaturi). 
25. Ocena log P
 OW se lahko pridobi s programom za ocenjevanje ali s stro ­
kovno presojo. Če je vrednost višja od 6, je treba skrbno spremljati 
popravke za slepe vzorce in prenos analita. Če ocena log P  OW presega 6, 
je obvezna uporaba nadomestnega standarda za popravek izkoristka, da je mogoče doseči visoke faktorje predkoncentracije. Na trgu so na voljo 
številni ra čunalniški programi za ocenjevanje log P
 OW ( 1 ), npr. Clog P 
(16), KOWWIN (17), ProLogP (18) in ACD log P (19). Opisi pristopov 
k ocenjevanju so na voljo v virih (20–22). 
26. Meje dolo čljivosti (LOQ) za ugotavljanje preskusne snovi v 1-oktanolu in 
vodi je treba dolo čiti s sprejetimi metodami. Na čeloma se lahko meja dolo č­
ljivosti metode dolo či kot koncentracija v vodi ali 1-oktanolu, katere 
razmerje med signalom in hrupom znaša 10. Izbrati je treba ustrezno metodo ekstrakcije in predkoncentriranja ter opredeliti analitske izkoristke. Izbere se ustrezen predkoncentracijski faktor, da se pri analitskem dolo čanju dobi 
signal potrebne intenzivnosti.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 165  
( 1 ) Te informacije so navedene samo za usmerjanje uporabnikov. Uporabijo se lahko tudi 
drugi enakovredni ra čunalniški programi, če je mogo če dokazati, da dajejo enake rezul ­
tate.
 27. Na podlagi parametrov analitske metode in pri čakovanih koncentracij se 
določi približna velikost vzorca, ki je potrebna za natan čno določitev 
koncentracije spojine. Izogibati se je treba uporabi vzorcev vode, ki so premajhni za doseganje zadostnega analitskega signala. Prav tako se je treba izogibati prevelikim vzorcem vode, saj sicer lahko ostane premalo 
vode za najmanjše število zahtevanih analiz (n = 5). V Dodatku 1 so 
navedeni minimalni volumni vzorcev v odvisnosti od prostornine posode, LOD preskusne snovi in topnosti preskusne snovi. 
28. Koli činska dolo čitev preskusnih snovi se izvede s primerjavo z umeritve ­
nimi krivuljami zadevne spojine. Koncentracije v analiziranih vzorcih je 
treba razvrstiti glede na koncentracije standardov. 
29. Za preskusne snovi z oceno log P
 OW , višjo od 6, je treba vzorcu vode pred 
ekstrakcijo primešati nadomestni standard, da se ugotovijo izgube, ki se pojavijo med ekstrakcijo in predkoncentriranjem vzorcev vode. Za natan čen 
popravek izkoristka morajo imeti nadomestki lastnosti, ki so zelo podobne 
ali celo enake lastnostim preskusne snovi. Po možnosti se za ta namen 
uporabljajo (stabilni) izotopno ozna čeni analogi preiskovanih snovi (na 
primer devterirani analogi ali analogi, ozna čeni z izotopom
 13 C). Če uporaba 
označenih stabilnih izotopov, tj.  13 C ali  2 H, ni mogo ča, je treba z opiranjem 
na zanesljive podatke v literaturi dokazati, da so fizikalno-kemijske lastnosti 
nadomestka zelo podobne lastnostim preskusne snovi. Med teko činsko-teko ­ 
činsko ekstrakcijo vodne faze se lahko tvorijo emulzije. Njihovo nastajanje 
je mogoče zmanjšati tako, da se doda sol, emulzija pa pusti čez noč miro­
vati. O metodah, ki se uporabijo za ekstrahiranje in predkoncentriranje 
vzorcev, je treba poro čati. 
30. Vzorci, odvzeti iz faze 1-oktanola, se lahko pred analizo po potrebi razred ­ 
čijo z ustreznim topilom. Poleg tega je uporaba nadomestnih standardov za 
popravek izkoristka priporo čljiva za snovi, za katere so se v preskusih 
izkoristka pokazala velika odstopanja (relativni standardni odklon > 10 %). 
31. O podrobnostih analitske metode je treba poro čati. To vklju čuje metodo 
ekstrakcije, predkoncentracijske faktorje in faktorje red čenja, parametre 
instrumentov, postopek umerjanja, umeritveno obmo čje, analitski izkoristek 
preskusne snovi iz vode, dodajanje nadomestnih standardov za popravek 
izkoristka, vrednosti slepih vzorcev, meje zaznavnosti in meje dolo čljivosti.  
Izvedba preskusa  
Optimalna razmerja volumnov 1-oktanol/voda  
32. Pri izbiri volumnov vode in 1-oktanola je treba upoštevati LOQ v 1-okta ­
nolu in vodi, predkoncentracijske faktorje, uporabljene za vzorce vode, 
vzorčene volumne v 1-oktanolu in vodi ter pri čakovane koncentracije. Za 
namene preskusa je treba volumen 1-oktanola v sistemu po časnega mešanja 
izbrati tako, da je plast 1-oktanola dovolj debela (> 0,5 cm), da omogo ča 
vzorčenje faze 1-oktanola brez povzro čanja motenj v njej. 
33. Običajna fazna razmerja, uporabljena za dolo čitve spojin, katerih log P  OW 
znaša 4,5 in ve č, so 20 do 50 ml 1-oktanola in 950 do 980 ml vode v litrski 
posodi.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 166
 
Preskusni pogoji  
34. Med preskusom je reakcijska posoda termostatirana, da se temperaturne 
spremembe zmanjšajo pod 1 °C. Analizo je treba opraviti pri 25 °C. 
35. Preskusni sistem je treba zaš čititi pred dnevno svetlobo, bodisi tako, da se 
preskus izvaja v temnem prostoru, bodisi tako, da se reakcijska posoda 
pokrije z aluminijasto folijo. 
36. Preskus je treba izvajati v brezprašnem okolju (kolikor je to mogo če). 
37. Sistem 1-oktanol-voda se meša, dokler ni doseženo ravnotežje. V pilotnem 
preskusu se dolžina obdobja za vzpostavljanje ravnotežja oceni z izvedbo preskusa s po časnim mešanjem ter rednim vzor čenjem vode in 1-oktanola. 
Intervali vzor čenja morajo znašati najmanj pet ur. 
38. P
 OW je treba vsaki č določiti z vsaj tremi neodvisnimi preskusi s po časnim 
mešanjem.  
Določanje časa do vzpostavitve ravnotežja  
39. Domneva se, da je ravnotežje doseženo, ko regresija razmerja koncentracij 
1-oktanol/voda glede na čas v obdobju štirih časovnih to čk da naklon, ki ne 
odstopa bistveno od ni č pri vrednosti p = 0,05. Najkrajši čas do vzpostavitve 
ravnotežja je en dan pred za četkom vzor čenja. Načeloma se lahko vzor čenje 
snovi, katerih log P  OW je ocenjen na manj kot 5, opravi drugi in tretji dan. 
Pri bolj hidrofobnih spojinah bo morda treba vzpostavljanje ravnotežja podaljšati. Za spojino z log P
 OW 8,23 (dekaklorobifenil) je bilo za uravno ­
teženje potrebnih 144 ur. Ravnotežje se oceni z ve čkratnim vzor čenjem v 
isti posodi.  
Začetek preskusa  
40. Na za četku preskusa se reakcijska posoda napolni z vodo, nasi čeno z 1- 
oktanolom. Dopustiti je treba dovolj časa, da se doseže termostatirana 
temperatura. 
41. Želena koli čina preskusne snovi (raztopljene v zahtevanem volumnu 1-okta ­
nola, nasi čenega z vodo) se pazljivo doda v reakcijsko posodo. To je klju čni 
korak v preskusu, saj se je treba izogniti turbulentnemu mešanju obeh faz. V ta namen je treba fazo 1-oktanola s pipeto po časi dodajati na steno 
preskusne posode blizu vodne površine. Tako bo zadevna faza tekla stekla 
po steni in ustvarila film nad vodno fazo. Vedno se je treba izogibati odlivanju 1-oktanola neposredno v posodo; kapljice 1-oktanola ne smejo padati neposredno v vodo. 
42. Po za četku mešanja je treba njegovo hitrost po časi povečevati. Če mešalnih 
motorjev ni mogo če ustrezno prilagoditi, je treba razmisliti o uporabi trans ­
formatorja. Hitrost mešanja je treba nastaviti tako, da se na prehodu med vodo in 1-oktanolom ustvari vrtinec, globok 0,5 do najve č 2,5 cm. Hitrost 
mešanja je treba zmanjšati, če globina vrtinca preseže 2,5 cm; v nasprotnem 
primeru se lahko iz kapljic 1-oktanola v vodni fazi tvorijo mikrokapljice, kar privede do precenjevanja koncentracije preskusne snovi v vodi. Najve čja 
hitrost mešanja 2,5 cm se priporo ča na podlagi ugotovitev primerjalne vali ­
dacijske študije (5). Je kompromis med hitrim vzpostavljanjem ravnotežja in 
omejevanjem tvorbe mikrokapljic 1-oktanola.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 167
 
Vzorčenje in obdelava vzorcev  
43. Pred vzor čenjem je treba mešalo izklju čiti in po čakati, da se teko čine 
umirijo. Po kon čanem vzor čenju se mešalo po časi znova zažene, kot je 
opisano zgoraj, zatem pa se hitrost mešanja postopno pove čuje. 
44. Vodna faza se vzor či z uporabo petelin čka na dnu reakcijske posode. Mrtvi 
volumen vode, ki ga vsebuje pipica (pri posodi, prikazani v Dodatku 2, je to približno 5 ml), se vedno zavrže. Voda v pipici ni premešana in zato ni 
uravnotežena z glavnino. Volumen vzorcev vode je treba zabeležiti, paziti 
pa je treba, da se pri dolo čanju masne bilance upošteva koli čina preskusne 
snovi v zavrženi vodi. Izgube zaradi izhlapevanja je treba čim bolj zmanj ­ 
šati, tako da se pusti voda mirno te či v lij ločnik, ne da bi prišlo do motenj v 
plasti vode/1-oktanola. 
45. Vzorci 1-oktanola se pridobijo tako, da se s 100-mikrolitrsko stekleno-ko ­
vinsko brizgo iz plasti 1-oktanola odvzame majhen alikvot (približno 100 
μl). Paziti je treba, da se ne povzro čijo motnje na prehodu faz. Volumen 
vzorčene tekočine se zabeleži. Zadoš ča že majhen alikvot, saj bo vzorec 1- 
oktanola razred čen. 
46. Izogibati se je treba nepotrebnim korakom pri prenosu vzorcev. V ta namen 
je treba volumen vzorca dolo čiti gravimetri čno. Pri vzorcih vode se to lahko 
doseže tako, da se vzorec vode zbere v liju lo čniku, ki že vsebuje zahtevani 
volumen topila.
 
PODATKI IN PORO ČANJE 
47. V skladu s to preskusno metodo se P  OW določi tako, da se v enakih pogojih 
opravijo trije preskusi s po časnim mešanjem (tri preskusne enote) s preisko ­
vano spojino. Regresija, ki se uporabi za dokaz doseženega ravnotežja, mora temeljiti na rezultatih vsaj štirih dolo čitev C
 O /C W v zaporednih časovnih 
točkah. S tem se omogo či izračun variance kot merila nezanesljivosti 
povprečne vrednosti, dobljene v vsaki preskusni enoti. 
48. P  OW se lahko ozna čuje z varianco v dobljenih podatkih za vsako preskusno 
enoto. Ta podatek se uporabi za izra čun P  OW kot tehtanega povpre čja 
rezultatov posameznih preskusnih enot. V ta namen se kot utež uporabi obratna vrednost variance rezultatov preskusnih enot. Posledi čno imajo 
podatki z velikim odstopanjem (izraženim kot varianca) in torej manjšo 
zanesljivostjo manjši vpliv na rezultat kot podatki z majhno varianco. 
49. Podobno se izra čuna tehtani standardni odklon. Ta ozna čuje ponovljivost 
merjenja P
 OW . Nizka vrednost tehtanega standardnega odklona kaže, da je 
bilo dolo čanje P  OW v okviru enega laboratorija zelo ponovljivo. Formalna 
statistična obdelava podatkov je opisana v nadaljevanju.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 168
 
Obdelava rezultatov  
Dokaz doseženega ravnotežja  
50. Logaritem razmerja koncentracij preskusne snovi v 1-oktanolu in vodi (log 
(C O /C w )) se izračuna za vsak čas vzorčenja. Doseženo kemijsko ravnotežje 
se dokaže z grafi čnim prikazom tega razmerja glede na čas. Konstantna 
raven v tem grafi čnem prikazu, ki temelji na vsaj štirih zaporednih časovnih 
točkah, kaže, da je bilo ravnotežje doseženo in da je spojina popolnoma 
raztopljena v 1-oktanolu. V nasprotnem primeru je treba preskus nadaljevati, dokler štiri zaporedne časovne to čke ne dajo naklona, ki ne odstopa bistveno 
od nič pri vrednosti p = 0,05, kar kaže, da je log C
 o /C w neodvisen od časa. 
Izračun log P  OW 
51. Vrednost log P  OW preskusne enote se izra čuna kot tehtana povpre čna vred­
nost log C  o /C w za tisti del krivulje log C  o /C w v odvisnosti od časa, za 
katerega je bilo prikazano ravnotežje. Tehtano povpre čje se izra čuna z 
uteževanjem podatkov z obratno vrednostjo variance, tako da je vpliv poda ­
tkov na kon čni rezultat obratno sorazmeren z nezanesljivostjo podatkov.  
Povprečni log P  OW 
52. Povpre čna vrednost log P  OW različnih preskusnih enot se izra čuna kot 
povprečje rezultatov posameznih preskusnih enot, uteženih z njihovimi 
posameznimi variancami. 
Izračun se opravi tako: 
log P  OW ;Av ¼ ðΣw i Ü log P  OW ;i Þ Ü ðΣw i Þ –1 
kjer je 
log P  OW,i = vrednost log P  OW posamezne preskusne enote i; 
log P  OW,Av  = tehtana povpre čna vrednost posameznih dolo čitev log P  OW ; 
w i = statistična utež, dodeljena vrednosti log P  OW preskusne 
enote i. 
Obratna vrednost variance log P  OW,i se uporabi kot w  i 
(w i ¼ varðlogP  OW ;i Þ –1 ). 
53. Napaka povpre čne vrednosti log P  OW se oceni kot ponovljivost log C  o /C w , 
določenega med fazo vzpostavljanja ravnotežja v posameznih preskusnih 
enotah. Izražena je kot tehtani standardni odklon log P  OW,Av  (σ log Pow,Av  ), 
ki je merilo napake, povezane s P  OW,Av  . Tehtani standardni odklon se lahko 
izračuna iz tehtane variance (var  log Pow,Av  ) tako: 
var log Pow ;Av ¼ ðΣw i Ü ðlog P  OW ;i Ä log P  OW ;Av Þ 2 Þ Ü ðΣw i Ü ðn Ä 1ÞÞ –1 
σ log Pow ;Av ¼ ðvar log Pow ;Av Þ 0;5 
Simbol n predstavlja število preskusnih enot.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 169
 
Poročilo o preskusu  
54. Poro čilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije:  
Preskusna snov  
— splošno ime, kemijsko ime, številko CAS, strukturno formulo (v kateri je 
naveden položaj ozna čevalca, kadar je uporabljena izotopsko ozna čena 
snov) in zadevne fizikalno-kemijske lastnosti (glej odstavek 17), 
— čistost (ne čistote) preskusne snovi, 
— čistost ozna čevalca ozna čenih kemikalij in molarno aktivnost (kjer je 
ustrezno), 
— predhodno oceno log P  OW in metodo, uporabljeno za izpeljavo vredno ­
sti. 
Preskusni pogoji  
— datume izvajanja študij, 
— temperaturo med preskusom, 
— volumne 1-oktanola in vode na za četku preskusa, 
— volumne odvzetih vzorcev 1-oktanola in vode, 
— volumne 1-oktanola in vode, ki so preostali v preskusnih posodah, 
— opis uporabljenih preskusnih posod in pogojev mešanja (geometrija 
mešalne palice in preskusne posode, globina vrtinca v mm in, kadar je na voljo, hitrost mešanja), 
— uporabljene analitske metode za dolo čanje preskusne snovi in meje 
določljivosti metod, 
— čase vzorčenja, 
— pH vodne faze in uporabljene pufre, kadar se pH prilagodi za molekule, 
ki lahko ionizirajo, 
— število ponovitev.  
Rezultati  
— ponovljivost in ob čutljivost uporabljenih analitskih metod, 
— ugotovljene koncentracije preskusne snovi v 1-oktanolu in vodi v odvis ­
nosti od časa, 
— prikaz masne bilance, 
— temperaturo in standardni odklon ali temperaturno obmo čje med presku ­
som, 
— regresijo razmerja koncentracij v odvisnosti od časa, 
— povpre čno vrednost log P
 OW,Av  in njeno standardno napako, 
— razpravo in razlago rezultatov,  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 170
 
— primere surovih podatkov reprezentativne analize (vse surove podatke je 
treba shraniti v skladu s standardi dobre laboratorijske prakse), vklju čno 
z izkoristki nadomestkov, številom ravni, uporabljenih v umerjanju (skupaj z merili za korelacijski koeficient umeritvene krivulje), in rezul ­
tate zagotavljanja/nadzora kakovosti (QA/QC), 
— kadar je na voljo, validacijsko poro čilo o postopku analize (ki se navede 
med viri).
 
VIRI:  
(1) De Bruijn, J. H. M., Busser, F., Seinen, W., Hermens, J. (1989). Determi ­
nation of octanol/water partition coefficients with the „slow-stirring“ 
method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499–512. 
(2) Poglavje A.8 te priloge, Porazdelitveni koeficient. 
(3) Poglavje A.8 te priloge, Porazdelitveni koeficient. 
(4) OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 
Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable 
Substances. Pariz. 
(5) Tolls, J. (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring 
Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM 
contract-Nrs 602730 M/602700/01. 
(6) Boethling, R. S., Mackay, D. (ur.) (2000). Handbook of property estimation 
methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, ZDA. 
(7) Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. (1993). Environ ­
mental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY. 
(8) Arnold, C. G., Widenhaupt, A., David, M. M., Müller, S. R., Haderlein, S. 
B., Schwarzenbach, R. P. (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. 
Environ. Sci. Technol. 31: 2596–2602. 
(9) OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Disso ­
ciation Constants in Water. Pariz. 
(10) Poglavje A.6 te priloge, Topnost v vodi. (11) Poglavje C.7 te priloge, Razgradnja – abiotska razgradnja: hidroliza kot 
funkcija pH. 
(12) Poglavje C.4 – deli II–VII (metode A do F) te priloge, Dolo čanje „dobre“ 
biorazgradljivosti. 
(13) Poglavje A.4 te priloge, Parni tlak. 
(14) Pinsuwan, S., Li, A., in Yalkowsky, S. H. (1995). Correlation of octanol/ 
water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623–626. 
(15) Lyman, W. J. (1990). Solubility in water. V: Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman, W. J., Reehl, W. F., Rosenblatt, D. H., (ur.) American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 do 2-52. 
(16) Leo, A., Weininger, D. (1989). Medchem Software Manual. Daylight 
Chemical Information Systems, Irvine, CA. 
(17) Meylan, W. (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y. 
(18) Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budimpešta. 
(19) ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario 
M5H 3V9, Kanada, 2001.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 171
 
(20) Lyman, W. J. (1990). Octanol/water partition coefficient. V: Lyman, W. J., 
Reehl, W. F., Rosenblatt, D. H. (ur.). Handbook of chemical property 
estimation, American Chemical Society, Washington, D.C. 
(21) Rekker, R. F., de Kort, H. M. (1979). The hydrophobic fragmental constant: 
An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479–488. 
(22) Jübermann, O. (1958). Houben-Weyl (ur.), Methoden der Organischen 
Chemie: 386–390.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 172
 
Dodatek 1  
Preglednice za izra čun najmanjših volumnov vode, potrebnih za zazna ­
vanje preskusnih snovi z razli čnimi vrednostmi log P  ow v vodni fazi  
Predpostavke: 
— največji volumen posameznih alikvotov = 10 % skupnega volumna; 5 
alikvotov = 50 % skupnega volumna, 
— koncentracijapreskusnihsnovi  ¼ 0; 7 Ü topnostvkaterikolifazi. V primeru 
nižjih koncentracij so potrebni ve čji volumni, 
— volumen, uporabljen za dolo čitev LOD = 100 ml, 
— log P  OW v odvisnosti od log S  W in log P  OW v odvisnosti od SR (S  OKT /S W ) 
smiselno predstavljata razmerja za preskusne snovi.  
Ocena S  w 
log P  ow enačba log S  w S w (mg/l)  
4 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,496 3,133E+00 
4,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,035 1,084E+00 
5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 0,426 3,750E-01 
5,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 0,887 1,297E-01 
6 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 1,348 4,487E-02 
6,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 1,809 1,552E-02 
7 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 2,270 5,370E-03 
7,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 2,731 1,858E-03 
8 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 3,192 6,427E-04  
Ocena S  okt 
log \;P  ow enačba S  okt (mg/l)  
4 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 41 3,763E+04 
4,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 42 4,816E+04 
5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 43 6,165E+04 
5,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 44 7,890E+04 
6 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 45 1,010E+05 
6,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 46 1,293E+05 
7 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 47 1,654E+05 
7,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 48 2,117E+05 
8 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 49 2,710E+05  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 173
 
Skupna masa 
preskusne snovi 
(mg) masa  okt /masa  voda masa  H2O 
(mg) konc  H2O 
(mg/l) masa  okt 
(mg) konc  okt 
(mg/l)  
1 319 526 2,5017 2,6333 1 317 26 333 
1 686 1 664 1,0127 1,0660 1 685 33 709 2 158 5 263 0,4099 0,4315 2 157 43 149 2 762 16 644 0,1659 0,1747 2 762 55 230 
3 535 52 632 0,0672 0,0707 3 535 70 691 
4 524 1664 36 0,0272 0,0286 4 524 90 480 5 790 5263 16 0,0110 0,0116 5 790 115 807 7 411 1 664 357 0,0045 0,0047 7 411 148 223 9 486 5 263 158 0,0018 0,0019 9 486 189 713
 
Izračun volumnov  
Najmanjši potrebni volumen za fazo H  2 O pri vsaki koncentraciji LOD  
log K  ow LOD (mikrogrami/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 0,04 0,38 3,80 38 380 
4,5 0,09 0,94 9,38 94 938 
5 0,23 2,32 23,18 232 2 318 
5,5 0,57 5,73 57,26 573 5 726 
6 1,41 14,15 141 1 415 14 146 
6,5 3,50 34,95 350 3 495 34 950 
7 8,64 86,35 864 8 635 86 351 
7,5 21,33 213 2 133 21 335 213 346 
8 52,71 527 5 271 52 711 527 111 
Volumen, 
uporabljen za 
LOD (I) 0,1 
Ključ za izračune 
Predstavlja < 10 % skupnega volumna vodne faze, litrska posoda za vzposta ­
vljanje ravnotežja. 
Predstavlja < 10 % skupnega volumna vodne faze, 2-litrska posoda za vzposta ­
vljanje ravnotežja. 
Predstavlja < 10 % skupnega volumna vodne faze, 5-litrska posoda za vzposta ­
vljanje ravnotežja. 
Predstavlja < 10 % skupnega volumna vodne faze, 10-litrska posoda za vzposta ­
vljanje ravnotežja. 
Presega 10 % celo 10-litrske posode za vzpostavljanje ravnotežja.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 174
 
Pregled potrebnih volumnov v odvisnosti od topnosti v vodi in log P  OW 
Najmanjši potrebni volumen za fazo H  2 O pri vsaki koncentraciji LOD (ml)  
log P  ow S w (mg/l) LOD (mikrogrami/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 10 0,01 0,12 1,19 11,90 118,99 
5 0,02 0,24 2,38 23,80 237,97 3 0,04 0,40 3,97 39,66 396,62 1 0,12 1,19 11,90 118,99 1 189,86 
4,5 5 0,02 0,20 2,03 20,34 203,37 
2 0,05 0,51 5,08 50,84 508,42 
1 0,10 1,02 10,17 101,68 1 016,83 
0,5 0,20 2,03 20,34 203,37 2 033,67 
5 1 0,09 0,87 8,69 86,90 869,01 
0,5 0,17 1,74 17,38 173,80 1 738,02 
0,375 0,23 2,32 23,18 231,75 2 317,53 
0,2 0,43 4,35 43,45 434,51 4 345,05 
5,5 0,4 0,19 1,86 18,57 185,68 1 856,79 
0,2 0,37 3,71 37,14 371,36 3 713,59 0,1 0,74 7,43 74,27 742,72 7 427,17 
0,05 1,49 14,85 148,54 1 485,43 14 854,35 
6 0,1 0,63 6,35 63,48 634,80 6 347,95 
0,05 1,27 12,70 126,96 1 269,59 12 695,91 
0,025 2,54 25,39 253,92 2 539,18 25 391,82 
0,0125 5,08 50,78 507,84 5 078,36 50 783,64 
6,5 0,025 2,17 21,70 217,02 2 170,25 21 702,46 
0,0125 4,34 43,40 434,05 4 340,49 43 404,93 
0,006 9,04 90,43 904,27 9 042,69 90 426,93 
0,003 18,09 180,85 1 808,54 18 085,39 180 853,86 
7 0,006 7,73 77,29 772,89 7 728,85 77 288,50 
0,003 15,46 154,58 1 545,77 15 457,70 154 577,01 
0,0015 23,19 231,87 2 318,66 23 186,55 231 865,51 
0,001 46,37 463,73 4 637,31 46 373,10 463 731,03 
7,5 0,002 19,82 198,18 1 981,77 19 817,73 198 177,33 
0,001 39,64 396,35 3 963,55 39 635,47 396 354,66 
0,0005 79,27 792,71 7 927,09 79 270,93 792 709,32
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 175
 
log P  ow S w (mg/l) LOD (mikrogrami/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
0,00025 158,54 1 585,42 15 854,19 158 541,86 1 585 418,63 
8 0,001 33,88 338,77 3 387,68 33 876,77 338 767,72 
0,0005 67,75 677,54 6 775,35 67 753,54 677 535,44 
0,00025 135,51 1 355,07 13 550,71 135 507,09 1 355 070,89 
0,000125 271,01 2 710,14 27 101,42 271 014,18 2 710 141,77 
Volumen, uporabljen za 
LOD (I) 0,1 
Dodatek 2  
Primer preskusne posode s stekleno oblogo za preskus s po časnim 
mešanjem za dolo čanje P  OW
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 176
 
DEL B: METODE ZA DOLO ČANJE TOKSI ČNOSTI IN DRUGIH 
UČINKOV NA ZDRAVJE  
KAZALO 
SPLOŠNI UVOD 
B.1 bis. AKUTNA ORALNA TOKSI ČNOST – POSTOPEK S TO ČNO 
DOLOČENIM ODMERKOM 
B.1 tris. AKUTNA ORALNA TOKSI ČNOST – METODA RAZREDOV 
AKUTNE TOKSI ČNOSTI 
B.2 AKUTNA STRUPENOST PRI VDIHAVANJU B.3 AKUTNA STRUPENOST (V STIKU S KOŽO) B.4 AKUTNA TOKSI ČNOST: DERMALNA DRAŽILNOST/ 
JEDKOST 
B.5 AKUTNA TOKSI ČNOST: O ČESNA DRAŽILNOST/JEDKOST 
B.6 SENZIBILIZACIJA KOŽE B.7 28-DNEVNA ŠTUDIJA ORALNE STRUPENOSTI S PONA ­
VLJAJOČIMI SE ODMERKI NA GLODAVCIH 
B.8 SUBAKUTNA STRUPENOST PRI VDIHAVANJU: 28- 
DNEVNA ŠTUDIJA 
B.9 STRUPENOST (V STIKU S KOŽO) PRI PONAVLJAJO ČEM 
SE ODMERKU (28 DNI) 
B.10 MUTAGENOST – PREIZKUS KROMOSOMSKIH ABERACIJ 
PRI SESALCIH  IN VITRO  
B.11 MUTAGENOST – PRESKUS KROMOSOMSKIH ABERACIJ V 
KOSTNEM MOZGU SESALCEV  IN VIVO  
B.12 MUTAGENOST – PREIZKUS MIKRONUKLEUSOV V 
ERITROCITIH SESALCEV  IN VIVO  
B.13/14 MUTAGENOST: PREIZKUS POVRATNE MUTACIJE PRI 
BAKTERIJAH 
B.15 PRESKUS MUTAGENOSTI IN PRESEJALNA ŠTUDIJA 
RAKOTVORNOSTI GENSKA MUTACIJA –  SACCHARO ­
MYCES CEREVISIAE  
B.16 MITOTI ČNA REKOMBINACIJA –  SACCHAROMYCES CERE ­
VISIAE  
B.17 MUTAGENOST – PREIZKUS GENSKIH MUTACIJ V 
CELICAH SESALCEV  IN VITRO  
B.18 OKVARE IN POPRAVLJANJE DNK – NENA ČRTNA 
SINTEZA DNK – SESALSKE CELICE  IN VITRO  
B.19 PRESKUS IZMENJAVE SESTRSKIH KROMATID  IN VITRO  
B.20 PRESKUS SPOLNO VEZANE RECESIVNE SMRTNOSTI NA  
DROSOPHILA MELANOGASTER
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 177
 
B.21  PRESKUSI CELI ČNE TRANSFORMACIJE SESALSKIH CELIC 
IN VITRO  
B.22 PRESKUS DOMINANTNE SMRTNOSTI NA GLODALCIH 
B.23 PREIZKUS KROMOSOMSKIH ABERACIJ V SPERMATOGO ­
NIJIH SESALCEV 
B.24 PRESKUS POJAVA MADEŽEV NA MIŠIH 
B.25 PRESKUS DEDNE TRANSLOKACIJE NA MIŠIH 
B.26 PRESKUS SUBKRONI ČNE ORALNE TOKSI ČNOSTI 90- 
DNEVNA ŠTUDIJA ORALNE TOKSI ČNOSTI S PONAVLJA ­
JOČIMI SE ODMERKI NA GLODALCIH 
B.27 PRESKUS SUBKRONI ČNE ORALNE TOKSI ČNOSTI 90- 
DNEVNA ŠTUDIJA ORALNE TOKSI ČNOSTI S PONAVLJA ­
JOČMI SE ODMERKI NA NEGLODALCIH 
B.28 ŠTUDIJA SUBKRONI ČNE STRUPENOSTI V STIKU S 
KOŽO90-DNEVNA ŠTUDIJA S PONOVLJENIM DERMALNFM ODMERKOM NA GLODALCIH 
B.29 SUBKRONI ČNA STRUPENOST PRI VDIHAVANJU: 90- 
DNEVNA ŠTUDIJA 
B.30 ŠTUDIJE KRONI ČNE STRUPENOSTI 
B.31 ŠTUDIJA STRUPENOSTI ZA PREDROJSTVENI RAZVOJ 
B.32 ŠTUDIJE RAKOTVORNOSTI 
B.33 KOMBINIRANE ŠTUDIJE KRONI ČNE STRUPENOSTI/ 
RAKOTVORNOSTI 
B.34 PRESKUS STRUPENOSTI ZA RAZMNOŽEVANJE NA ENI 
GENERACIJI 
B.35 ŠTUDIJA DVOGENERACIJSKE REPRODUKTIVNE STRUPE ­
NOSTI 
B.36 TOKSIKOKINETIKA 
B.37 ZAPOZNELA NEVROTOKSI ČNOST ORGANOFOSFORNIH 
SNOVI PO AKUTNI IZPOSTAVLJENOSTI 
B.38 ZAPOZNELA NEVROTOKSI ČNOST ORGANOFOSFORNIH 
SNOVI – 28-DNEVNA ŠTUDIJA S PONAVLJAJO ČIMI SE 
ODMERKI 
B.39 PREIZKUS NENA ČRTNE SINTEZE DNA (UDS) V JETRNIH 
CELICAH SESALCEV  IN VIVO  
B.40 JEDKOST ZA KOŽO  IN VITRO:  PRESKUS TRANSKUTANE 
ELEKTRI ČNE UPORNOSTI (TER) 
B.40 bis. JEDKOST ZA KOŽO  IN VITRO:  PRESKUS Z MODELOM 
ČLOVEŠKE KOŽE
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 178
 
B.41 PRESKUS FOTOTOKSI ČNOSTI 3T3 NRU  IN VITRO  
B.42 PREOB ČUTLJIVOST KOŽE: LOKALNA ANALIZA 
BEZGAVK 
B.43 ŠTUDIJA NEVROTOKSI ČNOSTI NA GLODALCIH 
B.44 ABSORPCIJA SKOZI KOŽO: METODA  IN VIVO  
B.45 ABSORPCIJA SKOZI KOŽO: METODA  IN VITRO  
B.46. PRESKUS DRAŽENJA KOŽE  IN VITRO : PRESKUSNA 
METODA REKONSTRUIRANE ČLOVEŠKE POKOŽNICE 
B.47. TESTNA METODA ZA DOLO ČANJE MOTNJAVE IN 
PREPUSTNOSTI ROŽENICE GOVEDA ZA UGOTAVLJANJE 
JEDKIH IN ZELO DRAŽILNIH SNOVI ZA O ČI (BCOP) 
B.48. TESTNA METODA NA IZOLIRANIH O ČEH PIŠČANCEV ZA 
UGOTAVLJANJE JEDKIH IN ZELO DRAŽILNIH SNOVI ZA 
OČI (ICE) 
B.49. PRESKUS MIKRONUKLEUSOV  IN VITRO  PRI CELICAH 
SESALCEV 
B.50. PREOB ČUTLJIVOST KOŽE: LOKALNA ANALIZA 
BEZGAVK: DA 
B.51. PREOB ČUTLJIVOST KOŽE: LOKALNA ANALIZA 
BEZGAVK: BRDU-ELISA  
▼M4 
B.52 AKUTNA STRUPENOST PRI VDIHAVANJU – METODA 
RAZREDOV AKUTNE STRUPENOSTI  
▼M5 
B.53 ŠTUDIJA RAZVOJNE NEVROTOKSI ČNOSTI 
B.54 UTEROTROPNI BIOLOŠKI PRESKUS NA GLODAVCIH: 
KRATKOTRAJNI PRESEJALNI PRESKUS ZA ESTROGENE 
LASTNOSTI 
B.55 HERSHBERGERJEV BIOLOŠKI PRESKUS NA PODGANAH: 
KRATKOTRAJNI PRESEJALNI PRESKUS 
ZA (ANTI)ANDROGENE LASTNOSTI 
B.56. RAZŠIRJENA ENOGENERACIJSKA ŠTUDIJA STRUPENOSTI 
ZA RAZMNOŽEVANJE 
B.57 PRESKUS STEROIDOGENEZE CELIC H295R 
B.58 PRESKUS GENSKIH MUTACIJ NA SOMATSKIH IN 
KLIČNIH CELICAH GENSKO SPREMENJENIH 
GLODAVCEV  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 179
 
SPLOŠNI UVOD  
A. OPREDELITEV PRESKUSNE SNOVI  
Pred začetkom katere koli študije toksi čnosti je treba poznati sestavo 
preskusne snovi, vklju čno z glavnimi ne čistotami in ustreznimi fizi ­
kalno-kemijskimi lastnostmi, ki vklju čujejo tudi stabilnost. 
Fizikalno-kemijske lastnosti preskusne snovi zagotavljajo pomembne 
informacije za izbiro na čina vnosa, na črtovanje posamezne študije ter 
za rokovanje in skladiš čenje preskusne snovi. 
Pred začetkom študije je treba razviti analiti čno metodo za kvalita ­
tivno in kvantitativno dolo čitev preskusne snovi (vklju čno z glavnimi 
nečistotami, kjer je mogo če) v sredstvu za odmerjanje in biološkem 
materialu. 
Poročilo o preskusu naj vklju čuje vse informacije v zvezi z identi ­
fikacijo, fizikalno-kemijskimi lastnostmi, čistostjo in obnašanjem 
preskusne snovi.  
B. VARSTVO ŽIVALI  
Pri preskušanju toksi čnosti sta bistvenega pomena izvajanje stroge 
kontrole nad okoljskimi razmerami in uporaba primernih tehnik za 
varstvo živali.  
(i) Nastanitveni pogoji  
Okoljske razmere v preskuševalnih živalskih prostorih ali ogradah 
morajo biti primerne za preskusno vrsto. Za podgane, miši in morske 
prašičke so primerne razmere sobna temperatura 22  o C ± 3  o C z 
relativno vlažnostjo od 30 % do 70 %; za kunce naj bi bila tempe ­
ratura 20 ± 3  o C z relativno vlažnostjo od 30 do 70 %. 
Nekatere preskusne tehnike so še posebno ob čutljive za temperaturne 
učinke in v takih primerih so podrobnosti o ustreznih razmerah 
vključene v opis preskusne metode. Pri vseh raziskavah toksi čnih 
učinkov je treba temperaturo in vlažnost spremljati, zabeležiti in 
vključiti v končno poročilo o študiji. 
Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe in 
12 ur teme. Podrobnosti o vzorcu osvetlitve je treba zabeležiti in 
vključiti v končno poročilo o študiji. 
Razen, če metoda dolo ča drugače, se lahko živali nastanijo v kletke 
posamično ali v majhnih skupinah istega spola; pri skupinski nasta ­
nitvi je v kletki lahko najve č pet živali. 
Pomembno je, da je v poro čilih o poskusih na živalih navedena vrsta 
uporabljene nastanitve v kletkah in število nastanjenih živali v vsaki 
kletki med izpostavljenostjo kemikaliji in tudi v vsakem poznejšem 
obdobju opazovanja.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 180
 
(ii) Prehranjevalni pogoji  
Hrana naj izpolnjuje vse prehranjevalne zahteve preskusne živalske 
vrste. Če se preskusne snovi dajejo živalim z njihovo hrano, lahko 
interakcija med snovjo in sestavino hrane zmanjša hranilno vrednost. 
Možnost take reakcije je treba upoštevati pri razlagi rezultatov 
preskusa. Konvencionalna laboratorijska hrana se lahko uporablja z neomejenimi koli činami pitne vode. Na izbiro hrane lahko vpliva 
potreba po zagotovitvi ustrezne primesi preskusne snovi, če se ta 
snov daje s hrano. 
Kontaminanti v hrani, ki lahko vplivajo na toksi čnost, ne smejo biti 
v koncentracijah, ki lahko povzro čijo motnje.
 
C. ALTERNATIVNO PRESKUŠANJE  
Evropska unija je zavezana k spodbujanju razvoja in preverjanja 
alternativnih tehnik, ki lahko zagotavljajo enako raven informacij 
kot trenutni živalski preskusi, vendar uporabljajo manjše število 
živali, povzro čajo manj trpljenja ali se povsem izognejo uporabi 
živali. 
Ko bodo takšne metode na razpolago, se bodo morale upoštevati, 
kjer je mogo če, za opredelitev nevarnosti ter posledi čno razvrstitev 
in označitev glede na njihovo dejansko nevarnost.  
D. OCENJEVANJE IN INTERPRETACIJA  
Ker je treba pri ocenjevanju in interpretaciji preskusov upoštevati 
omejitve, znotraj katerih se lahko rezultati živalskih študij in študij  
in vitro  neposredno ekstrapolirajo na človeka, se lahko dokazi o 
škodljivih u činkih za človeka, če so na razpolago, uporabijo za 
potrditev rezultatov preskusa.  
E. SKLICEVANJE NA LITERATURO  
Večina teh metod je bila razvita v okviru programa OECD – smer ­
nice za preskušanje in jih je treba izvajati v skladu z na čeli dobre 
laboratorijske prakse, da bi bilo kar najbolje zagotovljeno „med ­
sebojno priznavanje podatkov“. 
Dodatne informacije se lahko najdejo v napotilih, navedenih v smer ­
nicah za preskušanje OECD, in drugi ustrezni literaturi.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 181
 
B.1 bis.  AKUTNA ORALNA TOKSI ČNOST – POSTOPEK S TO ČNO 
DOLOČENIM ODMERKOM  
1. METODA  
Ta preskusna metoda ustreza OECD TV 420 (2001)  
1.1 UVOD 
Tradicionalne metode za ocenjevanje akutne toksi čnosti upoštevajo 
pogin živali kot kon čno točko. Leta 1984 je Britansko društvo za 
toksikologijo predlagalo nov pristop k preskušanju akutne toksi čnosti 
na podlagi dajanja serije to čno določenih odmerkov (1). Ta pristop se je 
izognil uporabi pogina živali kot kon čne točke in se namesto tega oprl 
na opazovanje jasnih znakov toksi čnosti na eni seriji velikosti to čno 
določenih odmerkov. Po študijah v Združenem kraljestvu (2) in 
mednarodnih (3) validacijskih študijah  in vivo  se je sprejel postopek 
kot metoda za preskušanje v letu 1992. Kasneje so se statisti čne last­
nosti Postopka s to čnim odmerkom ovrednotile z uporabo matemati ­ 
čnih modelov v seriji študij (4)(5)(6). Tako študije  in vivo  kot študije na 
modelih so pokazale, da je postopek ponovljiv, da se zanj uporablja manj živali in da povzro ča manj trpljenja kakor tradicionalne metode, 
ter da je z njim mogo če razvrstiti snovi na podoben na čin kot z drugimi 
metodami preskušanja akutne toksi čnosti. 
Navodila za izbiro najustreznejše metode preskušanja za dani namen 
se lahko poiš čejo v Dokumentu s smernicami in navodili za presku ­ 
šanje akutne oralne toksi čnosti (7). Ta dokument z navodili vsebuje 
tudi dodatne informacije o izvajanju in razlagi metode preskušanja 
B.1 bis. 
Princip metode je, da se v glavni študiji uporabljajo le zmerno toksi čni 
odmerki in se je treba izogibati dajanju odmerkov, za katere se pri ča­
kuje, da so smrtni. Prav tako se ne sme dajati odmerkov, za katere je 
znano, da povzro čajo vidno bole čino in trpljenje živali zaradi jedkega 
ali močno dražečega delovanja. Umirajo če živali ali živali, ki o čitno 
trpijo ali kažejo znake hudega in dolgotrajnega trpljenja, se usmrtijo na human na čin in se upoštevajo pri razlagi rezultatov preskusa na enak 
način kot živali, ki so poginile med preskusom. Kriterije za sprejem 
odločitve o usmrtitvi umirajo č
ih živali ali živali, ki zelo trpijo, ter 
napotke za prepoznavanje napovedljive ali neizbežne smrti obravnava poseben Dokument s smernicami (8). 
Z metodo pridobimo informacije o nevarnih lastnostih in nam 
omogoča uvrstitev in razvrstitev snovi v skladu z Globalno uskla ­
jenim sistemom (GHS) za razvrš čanje kemikalij, ki povzro čajo 
akutno toksi čnost (9). 
Laboratorij za preskušanje mora upoštevati vse razpoložljive infor ­
macije o preskusni snovi pred opravljanjem študije. Takšne informa ­
cije bodo vklju čevale vrsto in kemijsko sestavo snovi; njene fizi ­
kalno-kemijske lastnosti; rezultate katerih koli drugih preskusov 
toksičnosti na snovi,  in vitro  ali in vivo;  toksikološke podatke o 
strukturno sorodnih snoveh ter pri čakovano uporabo/uporabe snovi. 
Te informacije so potrebne, da vsem, ki jih to zadeva, zagotovijo, da 
je preskus pomemben za zaš čito zdravja ljudi in da bo v pomo č pri 
izbiri ustreznega za četnega odmerka.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 182
 
1.2 DEFINICIJE  
Akutna oralna toksi čnost:  nanaša se na tiste škodljive u činke, ki 
sledijo dajanju enega odmerka snovi ali dajanju ve č odmerkov v 24 
urah.  
Kasnejša smrt:  pomeni, da žival ne pogine ali da ne kaže znakov, 
da bo poginila, v 48 urah, vendar pogine kasneje med 14-dnevnim obdobjem opazovanja.  
Odmerek:  je količina dane preskusne snovi. Odmerek je izražen kot 
masa preskusne snovi na enoto teže preskusne živali (npr. mg/kg).  
Očitna toksi čnost:  je splošen izraz, ki opisuje jasne znake toksi ­ 
čnosti po dajanju preskusne snovi (glej (3) na primer), takšne, da 
se pojavijo pri naslednjem najvišjem to čno določenem odmerku hude 
bolečine in trajne znake hude stiske, stanje umiranja (kriteriji so 
navedeni v Dokumentu s smernicami za humane kon čne točke 
(8)), ali pa, če je mogo če pričakovati smrtnost pri ve čini živali.  
GHS:  Globalno usklajeni sistem razvrš čanja kemijskih snovi in 
mešanic. Skupna aktivnost OECD (zdravje ljudi in okolje), Odbora 
ZN strokovnjakov za prevoz nevarnega blaga (fizikalno-kemijske 
lastnosti) in ILO (poro čanje o nevarnih snovem) in koordinirana 
med organizacijami s Programom za pravilno ravnanje s kemikali ­
jami (IOMC).  
Neizbežna smrt:  ko se pri čakuje umirajo če stanje ali smrt pred 
naslednjim planiranim časom opazovanja. Zna čilni znaki tega stanja 
pri glodalcih lahko vklju čujejo krče, bočni položaj, poležavanje in 
tremor. (Glej Dokument s smernicami z navodili za humane kon čne 
točke (8) za podrobne podatke).  
LD
 50 (srednji smrtni odmerek):  je statisti čno ugotovljen enkraten 
odmerek snovi, za katerega se lahko pri čakuje, da bo povzro čil smrt 
pri 50 odstotkih živali, kadar se jim da po oralni poti. Vrednost LD  50 se 
izrazi z maso preskusne snovi na enoto teže preskusne živali (mg/kg).  
Mejni odmerek:  nanaša se na odmerek na zgornji omejitvi presku ­ 
šanja (2 000 ali 5 000 mg/kg).  
Umirajoče stanje:  stanje umiranja ali nezmožnosti preživeti, kljub 
tretiranju. (Glej Dokument s smernicami humane kon čne točke (8) za 
več podrobnih podatkov).  
Pričakovana smrt:  prisotnost klini čnih znakov, ki kažejo na smrt ob 
znanem času v prihodnosti pred na črtovanim zaklju čkom eksperi ­
menta, na primer: živali niso sposobne dose či vode ali hrane. (Glej 
Dokument s smernicami z navodili za humane kon čne točke (8) za 
več podrobnih podatkov).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 183
 
1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Skupini živali istega spola se dajejo odmerki postopoma, z uporabo 
točno določenih odmerkov 5, 50, 300 in 2 000 mg/kg (izjemoma se 
lahko uporabi dodaten to čno določen odmerek 5 000 mg/kg, glej 
oddelek 1.6.2). Za četna velikost odmerka se izbere na podlagi opazo ­
valne študije kot odmerek, pri katerem se pri čakuje, da se bodo 
pokazali nekateri znaki toksi čnosti, ne da bi povzro čil resne toksi čne 
posledice ali smrtnost. Klini čni znaki in stanja, povezana z bole čino, 
trpljenjem in neizbežno smrtjo, so natan čno napisana v posebnem 
OECD Dokument s smernicami (8). Nadaljnje skupine živali lahko dobivajo višje ali nižje to čno določene odmerke, odvisno od prisot ­
nosti ali odsotnosti znakov toksi čnosti ali smrtnosti. Ta postopek se 
nadaljuje, dokler se ne ugotovi odmerka, ki povzro či očitno toksi ­ 
čnost ali ve č kot eno smrt, ali takrat, ko pri najvišjem odmerku ni 
videti nobenih u činkov, ali kadar nastopijo smrti pri najnižjem 
odmerku.
 
1.4 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.4.1  Izbira živalskih vrst  
Najbolj cenjena vrsta glodalca je podgana, čeprav se lahko uporabijo 
tudi druge vrste glodalcev. Obi čajno se uporabljajo samice (7). To je 
zato, ker v literaturi poro čila o običajnih LD  50 preskusih kažejo, da 
je v občutljivosti med spoloma le malo razlik, vendar so v tistih 
primerih, kjer se razlike opažajo, samice na splošno neznatno bolj 
občutljive (10). Če pa iz poznavanja toksikoloških in toksikokineti ­ 
čnih lastnosti strukturno sorodnih kemikalij izhaja, da je verjetno, da 
so samci bolj ob čutljivi, je treba uporabiti ta spol. Kadar se preskus 
opravlja na samcih, je treba imeti za to ustrezno obrazložitev. 
Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle živali obi čajno uporabljanih 
laboratorijskih sevov. Samice morajo biti nuliparne in ne smejo biti 
breje. Živali morajo biti na za četku odmerjanja stare od 8 do 12 
tednov, njihova teža pa se mora gibati v intervalu ± 20 % povpre čne 
teže katerih koli živali, ki so predhodno prejemale odmerek.  
1.4.2  Pogoji bivanja in hranjenja  
Temperatura eksperimentalnega prostora za živali mora znašati 22  o C 
(± 3  o C). Čeprav mora biti relativna vlažnost najmanj 30 % in po 
možnosti ne sme presegati 70 %, mora biti ciljna vlažnost, razen med čiščenjem prostora, 50 do 60 %. Osvetlitev mora biti umetna, 
v zaporedju 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za hranjenje se lahko 
uporabijo obi čajne predpisane laboratorijske vrste hranjenja z neome ­
jeno koli čino pitne vode. Živali se lahko razporedijo v kletke po 
skupinah glede na odmerek, vendar število živali v vsaki kletki ne 
sme vplivati na neovirano opazovanje vsake živali.
 
1.4.3  Priprava živali  
Živali se izberejo naklju čno, označijo se zato, da je možna indivi ­
dualna identifikacija in se zaprejo v kletke najmanj 5 dni pred 
začetkom odmerjanja, da se lahko prilagodijo laboratorijskim razme ­
ram. ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 184
 
1.4.4  Priprava odmerkov  
Na splošno je treba preskusne snovi dajati v konstantnem volumnu v 
območju odmerkov, ki jih je treba preskusiti s spreminjanjem 
koncentracije odmerjenega pripravka. Kadar je treba preskusiti 
tekoč končni produkt ali mešanico, pa je uporaba nerazred čene 
preskusne snovi, npr. pri konstantni koncentraciji, morda ustreznejša za naknadno oceno tveganja navedene snovi, in jo nekateri regula ­
torni organi zahtevajo. Maksimalni volumen odmerka se v nobenem 
primeru ne sme prese či. Maksimalni volumen teko čine, ki se jo 
lahko da naenkrat, je odvisen od velikosti preskusne živali. Pri glodalcih volumen obi čajno ne bi smel presegati 1 ml/100 g telesne 
teže, pri vodnih raztopinah pa se lahko upošteva 2 ml/100 g telesne 
teže. Glede na formulacijo pripravka za odmerjanje je priporo čena, 
kadar koli je to mogo če, uporaba vodne raztopine/suspenzije/emul ­
zije v olju (npr. v koruznem olju), sledi, po preferen čnem vrstnem 
redu, raztopina/suspenzija/emulzija v olju (npr. koruznem olju) in 
nato po možnosti raztopina v drugih nosilcih. Za nosilce, ki niso voda, je treba poznati toksikološke lastnosti nosilca. Odmerke je treba pripraviti tik pred dajanjem, razen kadar je znana stabilnost 
pripravka za obdobje, v katerem bo uporabljen, in je znano, da je 
sprejemljiva.
 
1.5 POSTOPEK  
1.5.1  Dajanje odmerkov  
Preskusna snov se daje v enem odmerku z gavažo z uporabo 
želodčne sonde ali primerne intubacijske kanile. V neobi čajnih 
razmerah, ko enkraten odmerek ni mogo č, lahko odmerek dajemo 
v manjših frakcijah v obdobju, ki ne presega 24 ur. 
Živali se morajo pred odmerjanjem postiti (npr. podgani je treba 
odtegniti hrano čez noč, vode pa ne; miš ne sme dobiti hrane 3 
do 4 ure prej, vodo pa lahko). Po obdobju postenja je treba živali 
stehtati in jim dati preskusno snov. Po dajanju preskusne snovi se 
lahko odtegne hrana podganam za nadaljnje 3–4 ure ali mišim za 1–2 uri. Kadar se odmerek daje v frakcijah ves čas, je možno, da bo 
potrebno oskrbovati živali s hrano in vodo, odvisno od trajanja 
časovnega obdobja.
 
1.5.2  Opazovalna študija  
Namen opazovalne študije je omogo čanje izbire ustreznega za čet­
nega odmerka za glavno študijo. Preskusna snov se daje posameznim 
živalim v zaporedju v skladu s tabelo poteka v Dodatku 
1. Opazovalna študija se zaklju či, ko se lahko sprejme odlo čitev o 
začetnem odmerku za glavno študijo (ali, če se opazi smrt pri najn ­
ižjem, točno določenem odmerku). 
Začetni odmerek za opazovalno študijo se izbere izmed velikosti 
točno določenega odmerka 5, 50, 300 in 2 000 mg/kg kot odmerek, 
za katerega se pri čakuje, da bo povzro čil očitno toksi čnost na 
podlagi, kadar je to mogo če, dokazov iz podatkov  in vivo  in in 
vitro  za isto kemikalijo in za strukturno sorodne kemikalije. Če 
takšnih informacij ni, bo za četni odmerek 300 mg/kg. 
Med odmerjanjem za vsako žival bo dovoljeno obdobje najmanj 24 
ur. Vse živali je treba opazovati najmanj 14 dni.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 185
 
Izjemoma in le tedaj, kadar je to upravi čeno zaradi posebnih regu ­
latornih potreb, se lahko upošteva dodatna ve čja velikost to čno dolo­ 
čenega odmerka 5 000 mg/kg (glej Dodatek 3). Zaradi skrbi za 
zaščito živali je preskušanje živali v obmo čjih kategorije GHS 5 
(2 000-5 000 mg/kg) nezaželeno in ga je treba upoštevati le, kadar 
obstaja velika verjetnost, da imajo rezultati takšnega preskušanja 
neposreden pomen za zaš čito zdravja ljudi ali živali ali za okolje. 
Kadar žival, preskušana v opazovalni študiji z najnižjo velikostjo 
točno določenega odmerka (5 mg/kg) pogine, je obi čajen postopek 
tak, da se študija zaklju či in snov razvrsti v kategorijo GHS 1 (kot je 
prikazano v Dodatku 1). Če pa je potrebna nadaljnja potrditev 
razvrščanja, se lahko izvede neobvezen nadomestni postopek na 
naslednji na čin. Drugi živali se odmeri 5 mg/kg. Če druga žival 
pogine, se bo kategorija GHS 1 potrdila in študija se bo nemudoma zaključila. Če druga žival preživi, se bo dajal odmerek 5 mg/kg 
največ trem dodatnim živalim. Ker bo nevarnost smrtnosti velika, 
je treba tem živalim dajati odmerek na zaporeden na čin, da se zaš čiti 
zdravje živali. Časovni interval med odmerjanjem vsaki živali bi 
moral biti dovolj dolg, da se ugotovi verjetnost, da bo predhodna žival preživela. Če se zgodi druga smrt, se bo zaporedje odmerjanja 
nemudoma kon čalo in odmerjanja za nadaljnje živali ne bo. Zaradi 
druge smrti (ne glede na število živali, preskušanih v času zaklju čka) 
se uvrsti v izid A (2 smrti ali ve č), upošteva se pravilo o razvrstitvi 
iz Dodatka 2 za 5 mg/kg to čno določenega odmerka (kategorija 1, če 
sta smrti 2 ali če jih je ve č, ali kategorija 2, če je več kot 1 smrt). 
Dodatek 4 poleg tega daje napotke o razvrstitvi v sistem EU, dokler se ne začne izvajati novi GHS sistem.
 
1.5.3  Glavna študija  
1.5.3.1  Število živali in velikosti odmerkov  
Ukrepe, ki jih je treba izvesti po preskušanju z za četno velikostjo 
odmerka, prikazujejo tabele poteka v Dodatku 2. Potreben bo eden od treh ukrepov; ustavitev preskušanja in uvrstitev v ustrezen razred 
razvrstitve nevarnih snovi, preskus z ve čjim točno določenim 
odmerkom ali preskus z manjšim to čno določenim odmerkom. Za 
zaščito živali pa se velikost odmerka, ki je povzro čil smrt v opazo ­
valni študiji, ne bo ponovila v glavni študiji (glej Dodatek 2). 
Izkušnje kažejo, da je najverjetnejši izid z za četno velikostjo 
odmerka tak, da se snov lahko razvrsti in nadaljnje preskušanje ne bo potrebno. 
Običajno se uporabi skupina petih živali istega spola za vsako 
preiskovano velikost odmerka. Med petimi živalmi je ena iz opazo ­
valne študije, ki prejema odmerke izbrane velikosti skupaj s štirimi dodatnimi živalmi (razen, kar ni obi čajno, če velikost odmerka, 
uporabljenega v glavni študiji, ni bila vklju čena v opazovalni študiji). 
Časovni interval med odmerjanjem vsake velikosti je to čno oprede ­
ljen z nastopom, trajanjem in resnostjo toksi čnih znakov. Tretiranje 
živali z naslednjim odmerkom je treba prestaviti na kasneje, dokler 
ni gotovo, da so živali, ki so predhodno dobile odmerek, preživele. Priporočeno je po potrebi obdobje 3 do 4 dni med odmerjanjem 
vsake velikosti odmerka za upoštevanje opazovanja zapoznele toksi ­ 
čnosti. Časovni interval se lahko ustrezno prilagodi, npr. v primeru 
brezuspešnega odziva.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 186
 
Kadar se upošteva zgornji to čno določeni odmerek 5 000 mg/kg, je 
treba izpeljati postopek, opisan v Dodatku 3 (glej tudi oddelek 
1.6.2).  
1.5.3.2  Mejni preskus  
Mejni preskus se uporablja predvsem v primerih, kadar ima izvajalec 
preskusa informacije, ki kažejo, da bo preskusni material verjetno 
netoksičen oziroma bo njegova toksi čnost le nad regulatornimi 
mejnimi odmerki. Informacije o toksi čnosti preskusnega materiala 
se lahko pridobi na podlagi znanja o podobnih preskusnih spojinah ali podobnih preskusnih mešanicah ali produktih, ob upoštevanju 
vrste in odstotka sestavin, za katere je znano, da so toksikološko 
pomembne. V tistih primerih, kjer je le malo ali ni č informacij o 
njegovi toksi čnosti, ali kadar se pri čakuje, da bo preskusni material 
toksičen, je treba opraviti glavni preskus. 
Uporaba obi čajnega postopka, za četni odmerek opazovalne študije 
2 000 mg/kg (ali izjemoma 5 000 mg/kg), čemur sledi odmerjanje 
za naslednje 4 živali s to velikostjo odmerka, se upošteva kot mejni 
preskus za to navodilo.
 
1.6 OPAZOVANJA 
Živali se opazujejo posamezno po odmerjanju najmanj enkrat v prvih 
30 minutah, periodi čno v prvih 24 urah, s posebno pozornostjo v 
prvih 4 urah in nato 14 dni vsak dan, razen kadar jih je treba 
odstraniti iz študije in humano usmrtiti, če je njihovo zdravje ogro ­ 
ženo ali ko so najdene poginule. Trajanja opazovanja ni treba strogo določiti. Opredeliti ga je treba na podlagi toksi čnih reakcij, časa 
nastopa in trajanja obdobja okrevanja ter ga je zato mogo če podalj­ 
šati, kadar je to potrebno. Obdobja, ko se pojavijo znaki toksi čnosti 
in ko izginejo, so pomembna, zlasti če obstaja možnost, da bodo 
toksični znaki zapozneli (11). Vsa opazovanja se sistematsko zabe ­
ležijo, za vsako žival se vodijo posamezne kartoteke. 
Dodatna opazovanja bodo potrebna, če živali še vedno kažejo znake 
toksičnosti. Opazovanja morajo vklju čevati spremembe na koži in 
kožuhu, o čeh in sluznicah, in tudi na dihalih, v obtoku, na avto ­
nomnih in centralnih živ čnih sistemih ter pri somatomotori čnih aktiv­
nostih in vzorcu vedenja. Pozornost je treba posvetiti opazovanjem 
trezorjev, kr čem, slinjenju, driski, otrplosti, spanju in komi. Treba je 
upoštevati principe in kriterije, povzete v Dokumentu s smernicami za humane kon čne točke (8). Živali, najdene v umirajo čem stanju, in 
živali, ki kažejo hudo bole čino in trajne znake resne stiske, je treba 
humano usmrtiti. Kadar se živali usmrtijo iz humanih razlogov ali so 
najdene poginule, je treba čas smrti zabeležiti kar se da natan čno.
 
1.6.1  Telesna teža  
Posamezne teže živali je treba ugotoviti tik pred dajanjem preskusne 
snovi in najmanj enkrat na teden po tem. Treba je izra čunati in 
zabeležiti spremembe teže. Na koncu preskusa se preživele živali 
stehtajo in nato humano usmrtijo.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 187
 
1.6.2  Patologija  
Za vse preskusne živali (vklju čno s tistimi, ki poginejo med presku ­ 
šanjem ali se odstranijo iz študije zaradi ogroženega zdravja živali) je treba opraviti popolno obdukcijo. Vse natan čne patološke spre ­
membe je treba zabeležiti za vsako žival. Mikroskopski pregled 
organov živali, ki so preživele 24 ali ve č ur po začetnem odmerjanju, 
se prav tako lahko upošteva, ker lahko da koristne informacije.
 
2. PODATKI  
Zagotoviti je treba podatke za vsako posamezno žival. Nadalje je 
treba vse podatke prikazati v obliki preglednice, kjer je za vsako preskusno skupino prikazano število uporabljenih živali, število 
živali, ki kažejo znake toksi čnosti, število živali, najdenih poginulih 
med preskusom ali usmr čenih iz humanih razlogov, čas smrti posa ­
meznih živali, opis in časovni potek toksi čnih učinkov in reverzibil ­
nost ter ugotovitve obdukcije.
 
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije, kot je 
primerno: 
Preskusna snov: 
— fizikalno stanje, čistost in, kjer je pomembno, fizikalno-kemijske 
lastnosti (vklju čno z izomernostjo), 
— identifikacijske podatke, vklju čno s številko CAS. 
Nosilec ( če je primerno): 
— utemeljitev izbire nosilca, če to ni voda. 
Preskusne živali: — uporabljena vrsta/sev, — mikrobiološko stanje živali, kadar je znano, — število, starost in spol živali (vklju čno, kjer je primerno, uteme ­
ljitev uporabe samcev namesto samic), 
— vir, pogoji vzdrževanja, vrsta hrane, itd. Pogoji preskusa: — podatki o formulaciji preskusne snovi, vklju čno s podatki o fizi ­
kalni obliki snovi, ki jo dajemo, 
— podatki o formulaciji preskusne snovi, vklju čno z volumni 
odmerjanja in časom odmerjanja, 
— podatki o kakovosti hrane in vode (vklju čno z vrsto hrane/vir, vir 
vode), 
— utemeljitev za izbiro za četnega odmerka.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 188
 
Rezultati: 
— preglednica odzivnih podatkov in velikost odmerka za vsako 
žival (npr. živali, ki kažejo znake toksi čnosti, vklju čno s 
smrtnostjo, vrsto, resnostjo in trajanjem u činkov), 
— preglednica telesne teže in sprememb telesne teže, — teže posameznih živali na dan odmerjanja in v tedenskih inter ­
valih po tem ter čas smrti ali usmrtitve, 
— datum in čas smrti, če nastopi pred na črtovano usmrtitvijo, 
— časovni potek nastopa znakov toksi čnosti in ali so bili reverzi ­
bilni za vsako žival, 
— ugotovitve obdukcije in histopatološke ugotovitve za vsako žival, 
če so na voljo. 
Razprava in razlaga rezultatov. Zaključki.
 
4. LITERATURA  
(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). 
Special report: a new approach to the classification of 
substances and preparations on the basis of their acute toxicity. 
Human Toxicol., 3, 85–92. 
(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. 
(1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human 
Toxicol., 6, 279–291. 
(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, 
P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose proce ­
dure as an alternative to the classical LD
 50 test. Fd. Chem. 
Toxicol. 28, 469–482. 
(4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation 
of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324. 
(5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in 
the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 
315–323. Human Exptl. Toxicol. 
(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Stati ­
stical evaluation of the revised fixed dose procedure.-Hum. Exp. Toxicol., 21, 183–196. 
(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment N. 24. Paris. 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Asses ­
sment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environ ­
mental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assesment N. 19.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 189
 
(9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification 
for Human Health and Environmental Effects of Chemical 
Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/ 
pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no- 
24-no-0,FF.html]. 
(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, 
K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J. A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and- 
Down, Conventional LD
 50 , and Fixed-Dose Acute Toxicity 
Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223–231. 
(11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and 
Eye Irritation . In: Principles and Methods of Toxicology . 3  rd 
Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 190
 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 191
 ▼B 
DODATEK 1  
TABELA POTEKA ZA OPAZOVALNO ŠTUDIJO

2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 192
 ▼B

 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 193
 ▼B 
DODATEK 2  
TABELA POTEKA ZA GLAVNO ŠTUDIJO

2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 194
 ▼B

 
Dodatek 3  
KRITERIJI ZA RAZVRSTITEV PRESKUSNIH SNOVI 
S PRIČAKOVANIMI VREDNOSTMI LD  50 , KI NE PRESEGAJO 2 000 
mg/kg IN JIH NI POTREBNO PRESKUSITI  
Kriteriji za kategorijo 5 nevarnih snovi so namenjeni omogo čanju identifikacije 
preskusnih snovi, katerih nevarnost akutne toksi čnosti je sorazmerno nizka, 
vendar lahko v nekaterih okoliš činah pomenijo nevarnost za ranljivo populacijo. 
Za te snovi se predvideva, da imajo oralni ali kožni LD  50 v območju 2 000-5 000 
mg/kg ali enakovrednih odmerkov za druge poti vnosa. Preskusne snovi bi se lahko uvrstile v kategorijo nevarnih snovi, opredeljeno z: 2 000 mg/kg < LD
 50 < 
5 000 mg/kg (kategorijo 5 v GHS) v naslednjih primerih: 
(a) če so uvrščene v to kategorijo po kateri koli shemi preskušanja Dodatka 2, na 
podlagi pogostnosti smrti; 
(b) če so že na voljo dokazi, ki kažejo na to, da je LD  50 v območju vrednosti 
kategorije 5; ali če druge študije na živalih ali študije toksi čnih učinkov na 
ljudi kažejo na zaskrbljenost zaradi akutnosti za zdravje ljudi; 
(c) z ekstrapolacijo, oceno ali meritvijo podatkov, če uvrstitev v višjo skupino 
nevarnih snovi ni zajam čena, in 
— so na voljo zanesljive informacije, ki kažejo na toksi čne učinke na ljudeh, ali 
— se opazi kakršna koli smrtnost pri preskušanju do vrednosti kategorije 4 
po oralni poti, ali 
— kadar strokovna presoja potrdi pomembne klini čne znake toksi čnosti pri 
preskušanju do vrednosti kategorije 4, z izjemo driske, piloerekcije ali nenormalnega videza, ali 
— kadar se s strokovno presojo potrdi zanesljive informacije, ki kažejo na 
možnost pomembnih akutnih u činkov iz drugih študij na živalih.
 
PRESKUŠANJE Z ODMERKI NAD 2 000 mg/kg  
Izjemoma, in le, kadar to opravi čujejo posebne regulatorne zahteve, se lahko 
upošteva uporaba dodatne ve čje velikosti to čno določenega odmerka 5 000 
mg/kg. Zaradi skrbi za zaš čito zdravja živali je preskušanje živali s 5 000 
mg/kg nezaželeno in bi ga morali upoštevati le, kadar obstaja velika verjetnost, 
da bi rezultati takšnega preskusa imeli neposreden pomen za zaš čito zdravja 
živali ali ljudi (9).  
Opazovalna študija  
Pravila o odlo čitvah, ki veljajo za zaporedni postopek, predstavljena v Dodatku 
1, se razširijo za vklju čitev velikosti odmerka 5 000 mg/kg. Kadar se bo uporabil 
začetni odmerek opazovalne študije 5 000 mg/kg, bo zato izid A (smrt) zahteval 
še preskušanje druge živali pri 2 000 mg/kg; izida B in C (o čitna toksi čnost in 
nobene toksi čnosti) bosta dopuš čala izbiro 5 000 mg/kg kot za četnega odmerka 
za glavno študijo. Če se bo uporabil za četni odmerek, ki bo razli čen od 5 000 
mg/kg, tedaj se bo preskušanje nadaljevalo do 5 000 mg/kg v primeru izidov B ali C pri 2 000 mg/kg; naslednji izid A pri 5 000 mg/kg bo narekoval za četni 
odmerek za glavno študijo 2 000 mg/kg in izida B in C bosta narekovala za četni 
odmerek za glavno študijo 5 000 mg/kg.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 195
 
Glavna študija  
Pravila o odlo čitvah, ki veljajo za zaporedni postopek, predstavljena v Dodatku 
2, se razširijo na vklju čitev velikosti odmerka 5 000 mg/kg. Kadar se bo uporabil 
začetni odmerek glavne študije 5 000 mg/kg, bo zato izid A (> 2 smrt) zahteval 
še preskušanje druge skupine pri 2 000 mg/kg; iz izida B (o čitna toksi čnost in/ali 
≤ 1 smrt) ali C (nobene toksi čnosti) bo sledila neuvrš čenost snovi v skladu 
z GHS. Podobno se bo, če bo odmerek razli čen od 5 000 mg/kg, preskušanje 
nadaljevalo do 5 000 mg/kg v primeru izida C pri 2 000 mg/kg, iz zaporednega izida A pri 5 000 mg/kg bo sledila uvrstitev snovi v kategorijo GHS 5, iz izidov 
B in C pa sledi, da bo snov neuvrš čena.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 196
 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 197
 ▼B 
DODATEK 4  
PRESKUSNA METODA B.l bis  
Napotki za razvrstitev v skladu s shemo EU za obdobje tranzicije do popolne uveljavitve Globalno usklajenega sistema razvrstitv e (GHS) (iz sklica (8))

▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 198
 
B.1 tris.  AKUTNA ORALNA TOKSI ČNOST – METODA RAZREDOV 
AKUTNE TOKSI ČNOSTI  
1. METODA  
Ta preskusna metoda ustreza OECD TG 423 (2001)  
1.1 UVOD 
Metoda razredov akutne toksi čnosti (1), prikazana v tem preskusu, je 
postopen postopek z uporabo treh živali enega spola za vsak korak. 
Odvisno od smrtnosti in/ali umirajo čega stanja živali so lahko 
potrebni 2–4 koraki za omogo čanje presoje o akutni toksi čnosti 
preskusne snovi. Ta postopek je ponovljiv, zanj se uporablja zelo 
malo živali in omogo ča razvrstitev snovi na podoben na čin kot z 
drugimi metodami preskušanja akutne toksi čnosti. Metoda razredov 
akutne toksi čnosti temelji na biometri čnih vrednotenjih (2) (3) (4) (5) 
s točno določenimi odmerki, primerno lo čenimi med seboj, da se 
omogoči uvrščanje snovi za razvrstitev in za ugotavljanje nevarnosti. 
Metoda, kakor je bila prejeta leta 1996, je bila obširno validirana  in 
vivo v primerjavi s podatki za LD  50 , dobljenimi iz literature, tako 
nacionalne (6) kakor tudi mednarodne (7). 
Navodila za izbiro najustreznejše preskusne metode za dani namen se 
lahko poiš čejo v Dokumentu s smernicami za preskušanje akutne 
oralne toksi čnosti (8). Ta dokument s smernicami vsebuje tudi dodatne 
informacije o postopku in razlagi metode preskušanja B.1 tris. 
Preskusnih snovi, v odmerkih, za katere je znano, da povzro čajo 
vidno bole čino in hude motnje pri živalih zaradi jedkega ali izrazito 
dražilnega delovanja, ni treba dajati. Umirajo če živali ali živali, ki 
očitno trpijo ali kažejo znake hudih in trajnih okvar, se usmrti na 
human na čin in se jih upošteva pri razlagi rezultatov preskusa na 
enak način, kot živali, ki so poginile med preskusom. Kriterije za 
sprejem odlo čitve o usmrtitvi umirajo čih živali ali živali, ki zelo 
trpijo, ter napotke za prepoznavanje napovedljive ali neizbežne smrti obravnava poseben Dokument s smernicami (9). 
Metoda uporablja predhodno dolo čene odmerke, rezultati pa omogo čajo 
razvrstitev snovi in uvrstitev v skladu z Globalno usklajenim sistemom 
za razvrščanje kemikalij, ki povzro čajo akutno toksi čnost (10). 
V principu metoda ni namenjena omogo čanju izra čuna točnega 
LD
 50 , vendar upošteva dolo čitev opredeljenih razponov izpostavitve, 
kjer se pri čakuje smrtnost, ker je smrt dela živali še vedno glavna 
končna točka tega preskusa. Ta metoda upošteva dolo čitev vrednosti 
LD 50 le, kadar iz najmanj 2 odmerkov sledi smrtnost, višja kakor 
0 % in nižja kakor 100 %. Uporaba izbire predhodno dolo čenih 
odmerkov, ne glede na preskusno snov, z razvrstitvijo, ki je izrecno 
povezana s številom živali, opazovanih v razli čnih stanjih, izboljšuje 
možnost za doslednost in ponovljivost poro čanja med laboratoriji.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 199
 
Laboratorij preskušanja mora upoštevati vse razpoložljive informa ­
cije o preskusni snovi pred za četkom opravljanja študije. Takšne 
informacije bodo vklju čevale vrsto in kemijsko sestavo snovi; 
njene fizikalno-kemijske lastnosti; rezultat katerih koli drugih preskusov toksi čnosti na snovi,  in vitro  ali in vivo ; toksikološke 
podatke o strukturno sorodnih ter pri čakovano uporabo/uporabe 
snovi. Te informacije so potrebne, da vse, ki jih to zadeva, zagoto ­
vijo, da je preskus pomemben za zaš čito zdravja ljudi in da bo v 
pomoč pri izbiri najustreznejšega za četnega odmerka.
 
1.2 DEFINICIJE  
Akutna oralna toksi čnost:  nanaša se na tiste škodljive u činke, ki se 
pokažejo po dajanju enega odmerka snovi ali ve č odmerkov, danih v 
24 urah.  
Kasnejša smrt:  pomeni, da žival ne pogine ali da ne kaže znakov, 
da bo poginila, v 48 urah, vendar pogine kasneje med 14 dnevnim 
obdobjem opazovanja.  
Odmerek:  je količina dane preskusne snovi. Odmerek je izražen kot 
masa preskusne snovi na enoto teže preskusne živali (npr. mg/kg).  
GHS:  Sistem globalno usklajene razvrstitve za kemijske snovi in meša ­
nice. Skupna aktivnost OECD (zdravje ljudi in okolje), Odbor ZN strokovnjakov za prevoz nevarnega blaga (fizikalno-kemijske lastnosti) 
in ILO (sporo čanje o nevarnosti) ter koordinirana med organizacijami s 
programom za pravilno ravnanje s kemikalijami (IOMC).  
Neizbežna smrt:  ko se pri čakuje umirajo če stanje ali smrt pred 
naslednjim planiranim časom opazovanja. Zna čilni znaki tega stanja 
pri glodalcih lahko vklju čujejo krče, bočni položaj, poležavanje in 
tremor. (Glej Dokument s smernicami z napotki za humane mejne cilje (9) za ve č podrobnih podatkov).  
LD
 50 (srednji smrtni odmerek) : je statisti čno ugotovljen enkraten 
odmerek snovi, za katerega se lahko pri čakuje, da bo povzro čil smrt 
pri 50 odstotkih živali, kadar se jim da oralno. Vrednost LD  50 je izra­ 
žena z maso preskusne snovi na enoto teže preskusne živali (mg/kg).  
Mejni odmerek : nanaša se na odmerek na zgornji omejitvi pri 
preskušanju (2 000 ali 5 000 mg/kg).  
Umirajoče stanje:  stanje umiranja ali nezmožnosti preživeti kljub 
tretiranju. (Glej Dokument s smernicami humane kon čne točke (9) za 
več podrobnih podatkov).  
Pričakovana smrt:  prisotnost klini čnih znakov, ki kažejo na smrt ob 
znanem času v prihodnosti pred na črtovanim zaklju čkom eksperi ­
menta, na primer: nezmožnost živali, da bi dosegle vodo ali hrano. 
(Glej Priro čnik napotki za humane kon čne točke (9) za ve č 
podrobnih podatkov).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 200
 
1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Princip preskusa je tak, da temelji na postopnosti z uporabo mini ­
malnega števila živali za vsak korak, za omogo čanje uvrstitve se 
pridobi dovolj informacij o akutni toksi čnosti preskusne snovi. 
Snov se daje oralno skupini eksperimentalnih v enem od predhodno 
opredeljenih odmerkov. Snov se testira z uporabo postopka po kora ­
kih, za vsak korak se uporabi tri živali istega spola, obi čajno 
ženskega. Prisotnost ali odsotnost smrtnosti živali, povezane s 
spojino, ki so prejemale odmerek na enem koraku, bo dolo čila 
naslednji korak, npr.: 
— nadaljnje preskušanje ni potrebno, 
— odmerjanje za tri dodatne živali, z enakim odmerkom, 
— odmerjanje za tri dodatne živali, z naslednjo ve čjo ali naslednjo 
manjšo velikostjo odmerka. 
Podrobnosti preskusnega postopka so opisane v Dodatku 1. Metoda 
bo omogo čila presojo glede uvrstitve preskusne snovi v enega v 
seriji razredov toksi čnosti, opredeljenih s to čno določenimi smrtnimi 
vrednostmi LD  50 . 
1.4 OPIS METODE  
1.4.1  Izbira živalskih vrst  
Najbolj cenjena vrsta glodalca je podgana, čeprav se lahko uporabijo 
tudi druge vrste glodalcev. Obi čajno se uporabljajo samice (9), to pa 
zato, ker pregledi obi čajnih LD  50 preskusov v literaturi kažejo, da je 
le malo razlik v ob čutljivosti med spoloma, vendar so v tistih prime ­
rih, kjer se opažajo razlike, samice v splošnem neznatno bolj ob čut­
ljive (11). Če pa iz poznavanja toksikoloških in toksikokineti čnih 
lastnosti strukturno sorodnih kemikalij izhaja, da je verjetno, da 
bodo samci bolj ob čutljivi, tedaj je treba uporabiti ta spol. Kadar 
poteka preskušanje na samcih, je treba imeti za to ustrezno obraz ­
ložitev. 
Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle živali obi čajno uporabljanih 
laboratorijskih sevov. Samice morajo biti nuliparne in ne smejo biti breje. Živali morajo biti na za četku odmerjanja stare 8 do 12 tednov, 
njihova teža pa se mora gibati v intervalu ± 20 % povpre čne teže 
katerih koli živali, ki so predhodno prejemale odmerek.
 
1.4.2  Pogoji bivanja in hranjenja  
Temperatura prostora za preskuse z živalmi mora znašati 22  o C (± 
3 o C). Čeprav mora biti relativna vlažnost najmanj 30 % in po 
možnosti ne sme presegati 70 %, mora biti ciljna vlažnost, razen 
med čiščenjem prostora, 50 do 60 %. Osvetlitev mora biti umetna 
v zaporedju 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporabijo obi čajne predpisane laboratorijska vrste hranjenja z neome ­
jeno koli čino pitne vode. Živali se lahko razporedijo v kletke po 
skupinah glede na odmerek, vendar število živali v vsaki kletki ne 
sme vplivati na neovirano opazovanje vsake živali.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 201
 
1.4.3  Priprava živali  
Živali se izberejo naklju čno, označijo se zato, da je možna indivi ­
dualna identifikacija in se zaprejo v kletke najmanj 5 dni pred začetkom odmerjanja, da se lahko prilagodijo laboratorijskim razme ­
ram.
 
1.4.4  Priprava odmerkov  
Na splošno je treba preskusne snovi dajati v konstantnem volumnu v 
razponu odmerkov, ki jih je treba preskusiti s spreminjanjem koncen ­
tracije pripravka odmerjanja. Kadar se namerava preskusiti teko č 
končni produkt ali mešanico, je uporaba nerazred čene preskusne 
snovi, npr. pri konstantni koncentraciji, morda ustreznejša za naknadno oceno tveganja navedene snovi, in jo nekateri regulatorni organi zahtevajo. Maksimalni volumen odmerka se v nobenem 
primeru ne sme prekora čiti. Maksimalni volumen teko čine, ki se jo 
lahko da živali naenkrat, je odvisen od velikosti preskusne živali. Pri glodalcih volumen obi čajno ne sme presegati 1 ml/100g telesne teže, 
pri vodnih raztopinah pa lahko upoštevamo 2 ml/100 g telesne teže. 
Glede na formulacijo preparata odmerjanja je priporo čena uporaba 
vodne raztopine/suspenzije/emulzije, kjer koli je to možno, sledi po preferenčnem vrstnem redu raztopina/suspenzija/emulzija v olju (npr. 
koruzno olje) in nato po možnosti raztopina v drugih nosilcih. Za 
nosilce, ki niso voda, je treba poznati toksikološke lastnosti nosilca. Odmerke je treba pripraviti tik pred dajanjem, razen kadar je znana stabilnost pripravka za obdobje, v katerem bo uporabljen, in je 
znano, da je sprejemljiva.
 
1.5 POSTOPEK  
1.5.1  Dajanje odmerkov  
Preskusna snov se daje v enem odmerku z gavažo z uporabo 
želodčne sonde ali primerne intubacijske kanile. V neobi čajnih 
razmerah, ko enojni odmerek ni mogo č, lahko odmerek dajemo v 
manjših frakcijah v obdobju, ki ne presega 24 ur. 
Živali se morajo pred odmerjanjem postiti (npr. podgani je treba 
odtegniti hrano čez noč, vode pa ne; miš ne sme dobiti hrane 3 
do 4 ure prej, vodo pa lahko). Po obdobju postenja je treba živali 
stehtati in jim dati preskusno snov. Po dajanju preskusne snovi se lahko odtegne hrano podganam za nadaljnje 3–4 ure ali mišim za 1–2 uri. Kadar se odmerek daje v frakcijah ves čas, je možno, da bo 
potrebno oskrbovati živali s hrano in vodo, odvisno od trajanja 
časovnega obdobja.
 
1.5.2  Število živali in velikost odmerkov  
Za vsak korak so potrebne 3 živali. Velikost odmerka, ki ga bo treba 
uporabiti kot za četni odmerek, se izbere izmed štirih stalnih velikosti, 
5, 50, 300 in 2 000 mg/kg telesne teže. Za četna velikost odmerka bi 
morala biti tista, ki bo najverjetneje povzro čila smrtnost nekaterih 
živali odmerjanja. Tabele poteka v Dodatku 1 opisujejo postopek, ki ga je treba izvesti za vsakega od za četnih odmerkov. Dodatek 4 daje 
poleg tega navodila za uvrstitev v sistem EU, dokler se ne bo izvajal 
novi GHS sistem.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 202
 
Kadar je iz razpoložljivih informacije razvidno, da smrtnost pri 
največji velikosti (2 000 mg/kg telesne teže) ni verjetna, je treba 
opraviti mejni preskus. Kadar o snovi, ki jo je treba preskusiti, ni nobenih informacij, je priporo čeno zaradi zdravja živali uporabiti 
začetni odmerek 30 mg/kg telesne teže. 
Časovni interval med skupinami tretiranja je to čno določen z nasto ­
pom, trajanjem in resnostjo toksi čnih znakov. Tretiranje živali z 
naslednjim odmerkom je treba prestaviti na kasnejši čas, dokler ni 
gotovo, da bodo živali, ki so prej prejemale odmerek, preživele. 
Izjemoma, in le kadar to opravi čujejo posebne regulatorne zahteve, 
se lahko upošteva uporaba dodatne ve čje velikosti odmerka 5 000 
mg/kg telesne teže (glej Dodatek 2). Zaradi skrbi za zaš čito zdravja 
živali je preskušanje živali v obmo čjih kategorije GHS 5 
(2 000–5 000 mg/kg) nezaželeno in ga je treba upoštevati le, kadar obstaja velika verjetnost, da bi rezultati takšnega preskusa imeli neposreden pomen za zaš čito zdravja ljudi ali živali ali za okolje.
 
1.5.3  Mejni preskus  
Mejni preskus se uporablja predvsem v primerih, kadar ima izvajalec 
preskusa informacije, ki kažejo, da bo preskusni material verjetno 
netoksičen oziroma bo njegova toksi čnost le nad regulatornimi 
mejnimi odmerki. Informacije o toksi čnosti preskusnega materiala 
se lahko pridobijo na podlagi znanja o podobnih preskusnih spojinah ali podobnih preskusnih mešanicah ali produktih, ob upoštevanju 
vrste in odstotka sestavin, za katere je znano, da so toksikološko 
pomembne. V tistih primerih, kjer je le malo ali ni č informacij o 
njegovi toksi čnosti, ali kadar se pri čakuje, da bo preskusni material 
toksičen, je treba opraviti glavni preskus. 
Mejni preskus z eno velikostjo odmerka 2 000 mg/kg telesne teže se 
lahko opravi s šestimi živalmi (tri živali na en korak). Izjemoma se 
lahko opravi mejni preskus z eno velikostjo odmerka 5 000 mg/kg s tremi živalmi (glej Dodatek 2). Če nastane smrtnost, povezana s 
preskusno snovjo, bo morda potrebno izvesti nadaljnje preskušanje 
z naslednjo nižjo velikostjo.
 
1.6 OPAZOVANJA 
Živali se opazujejo posamezno po odmerjanju najmanj enkrat v prvih 
30 minutah, periodi čno v prvih 24 urah, s posebno pozornostjo v 
prvih 4 urah in nato 14 dni vsak dan, razen kadar jih je treba odstraniti iz študije in humano usmrtiti zaradi ogroženega zdravja ali ko so najdene poginule. Trajanja opazovanja ni treba strogo 
določiti. Opredeliti ga je treba na podlagi toksi čnih reakcij, časa 
nastopa in trajanja okrevanja ter ga je zato mogo če podaljšati, 
kadar je to potrebno. Obdobja, ko se pojavijo znaki toksi čnosti in 
ko izginejo, so pomembna, zlasti če obstaja težnja, da bodo toksi čni 
znaki zapozneli (12). Vsa opazovanja se sistematsko zabeležijo, za 
vsako žival se vodijo posamezne kartoteke.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 203
 
Dodatna opazovanja bodo potrebna, če živali še vedno kažejo znake 
toksičnosti. Opazovanja morajo vklju čevati spremembe na koži in 
kožuhu, o čeh in sluznicah, in tudi na dihalih, v obtoku, na avto ­
nomnih in centralnih živ čnih sistemih ter somatomotori čni aktivnosti 
in vedenjskem vzorcu. Pozornost je treba posvetiti opazovanjem 
tremorjev, kr čem, slinjenju, driski, otrplosti, spanju in komi. Treba 
je upoštevati principe in kriterije, povzete v Dokumentu s smerni ­
cami z napotki za humane kon čne točke (9). Živali, najdene v umira ­
jočem stanju, in živali, ki kažejo hudo bole čino in trajne znake hudih 
okvar, je treba humano usmrtiti. Kadar živali usmrtimo zaradi 
humanih razlogov ali so najdene poginule, je treba čas smrti zabe ­
ležiti kar se da natan čno. 
1.6.1  Telesna teža  
Posamezne teže živali je treba dolo čiti tik pred dajanjem preskusne 
snovi in najmanj enkrat na teden po tem. Treba je izra čunati in 
zabeležiti spremembe teže. Na koncu preskusa se preživele živali 
stehtajo in humano usmrtijo.  
1.6.2  Patologija  
Za vse preskusne živali (vklju čno s tistimi, ki poginejo med 
preskusom ali se odstranijo iz študije zaradi zaš čite zdravja živali) 
je treba opraviti popolno obdukcijo. Vse natan čne patološke spre ­
membe je treba zabeležiti za vsako žival. Mikroskopski pregled organov, ki kažejo resne patološke znake, pri živalih, ki so preživele 
24 ali več ur po za četnem odmerjanju se prav tako lahko upošteva, 
ker lahko da koristne informacije.
 
2. PODATKI  
Zagotoviti je treba podatke za vsako posamezno žival. Nadalje je 
treba vse podatke prikazati v obliki preglednice, kjer je za vsako preskusno skupino prikazano število uporabljenih živali, število živali, ki kažejo znake toksi čnosti, število živali, najdenih poginulih 
med preskusom ali usmr čenih iz humanih razlogov, čas smrti posa ­
meznih živali, opis in časovni potek toksi čnih učinkov in reverzibil ­
nosti ter ugotovitve obdukcije.
 
3. PORO ČANJE  
3.1 Poro čilo o preskusu  
Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije, kot je 
primerno: 
Preskusna snov: — fizikalno stanje, čistost in kjer je pomembno fizikalno-kemijske 
lastnosti (vklju čno z izomerizacijo), 
— identifikacijski podatki, vklju čno s številko CAS. 
Nosilec ( če je primerno): 
— utemeljitev izbire nosilca, če to ni voda. 
Preskusne živali: — uporabljena vrsta/sev,
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 204
 
— mikrobiološko stanje živali, kadar je znano, 
— število, starost in spol živali (vklju čno, kjer je primerno, uteme ­
ljitev za uporabo samcev namesto samic), 
— vir, pogoji vzdrževanja, vrsta hrane, itd. Pogoji preskusa: — podatki o formulaciji preskusne snovi, vklju čno s podatki o fizi ­
kalni obliki snovi, ki se daje, 
— podatki o dajanju preskusne snovi, vklju čno z volumni odmer ­
janja in časom odmerjanja, 
— podatki o kakovosti hrane in vode (vklju čno z vrsto prehranjeva ­
nja/vir, vir vode), 
— utemeljitev za izbiro za četnega odmerka. 
Rezultati: — tabelarni prikaz odzivnih podatkov in velikost odmerka za vsako 
žival (npr. živali, ki kažejo znake toksi čnosti, vklju čno s 
smrtnostjo; vrsto, resnost in trajanje u činkov), 
— tabelarni prikaz telesne teže in sprememb telesne teže, — teže posameznih živali na dan odmerjanja in v tedenskih inter ­
valih po tem ter čas smrti ali usmrtitve, 
— datum in čas smrti, če nastopi pred na črtovano usmrtitvijo, 
— časovni potek nastopa znakov toksi čnosti in ali so bili le–ti 
reverzibilni za vsako žival, 
— ugotovitve obdukcije in histopatološke ugotovitve za vsako žival, 
če so na voljo. 
Razprava in razlaga rezultatov. Zaključki.
 
4. LITERATURA  
(1) Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspec ­
tives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86 
(2) Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). 
Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemi ­
kalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336–341. 
(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. 
(1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559–610 
(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The 
Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734. 
(5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class 
Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129–134 
(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A 
National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method – 
An Alternative to the LD
 50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455–470.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 205
 
(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The 
International Validation Study of the Acute-Toxic-Class 
Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659–670. 
(8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. 
(9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Asses ­
sment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for 
Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environ ­
mental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19. 
(10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemi ­
cals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/ 
oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14- no-24-no-0,FF.html]. 
(11) Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, 
Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and 
Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conven ­
tional LD
 50 , and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. 
Chem. Toxicol 33, 223–231. 
(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity 
and Eye Irritancy.  Principles and Methods of Toxicology . Third 
Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 206
 
Dodatek 1  
POSTOPKI, PO KATERIH SE JE TREBA RAVNATI ZA VSAKEGA OD 
ZAČETNIH ODMERKOV  
SPLOŠNE PRIPOMBE  
Za vsak za četni odmerek prikazujejo ustrezne sheme preskušanja, kakor jih 
vključuje ta dodatek, po katerem se je treba ravnati. 
— Dodatek 1 a: Za četni odmerek 5 mg/kg telesne teže 
— Dodatek 1 b: Za četni odmerek 50 mg/kg telesne teže 
— Dodatek 1 c: Za četni odmerek 300 mg/kg telesne teže 
— Dodatek 1 d: Za četni odmerek 2 000 mg/kg telesne teže 
Odvisno od števila humano usmr čenih živali ali poginulih živali sledi preskusni 
postopek navedenim puš čicam.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 207
 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 208
 ▼B 
Dodatek 1 A  
POSTOPEK PRESKUSA Z ZA ČETNIM ODMERKOM 5 MG/KG TELESNE TEŽE

 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 209
 ▼B 
Dodatek 1 B  
POSTOPEK PRESKUSA Z ZA ČETNIM ODMERKOM 50 MG/KG TELESNE TEŽE

 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 210
 ▼B 
Dodatek 1 C  
POSTOPEK PRESKUSA Z ZA ČETNIM ODMERKOM 300 MG/KG TELESNE TEŽE

 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 211
 ▼B 
Dodatek 1 D  
POSTOPEK PRESKUSA Z ZA ČETNIM ODMERKOM 2 000 MG/KG TELESNE TEŽE

 Dodatek 2  
KRITERIJI ZA RAZVRSTITEV PRESKUSNIH SNOVI 
S PRIČAKOVANIMI VREDNOSTMI LD  50 , KI PRESEGAJO 2 000 
MG/KG, NE DA BI BILO POTREBNO PRESKUŠANJE  
Kriteriji za kategorijo nevarnih snovi 5 so namenjeni omogo čanju identifikacije 
preskusnih snovi, katerih toksi čnost je sorazmerno malo nevarna, vendar lahko 
v točno določenih okoliš činah predstavljajo nevarnost za ranljivo populacijo. Za 
te snovi se predvideva, da imajo oralni ali kožni LD  50 v območju 2 000-5 000 
mg/kg ali enakovrednih odmerkov za druge poti vnosa. Preskusne snovi se lahko 
uvrstijo v kategorijo nevarnih snovi, opredeljeno kot: 2 000 mg/kg < LD  50 < 
5 000 mg/kg (kategorija 5 v GHS) v naslednjih primerih: 
(a) če so uvrš čene v to kategorijo po kateri koli od shem preskušanja iz doda ­
tkov l a–l d na podlagi pogostnosti smrti; 
(b) če so že na voljo dokazi, ki kažejo na to, da je LD  50 v razponu vrednosti 
kategorije 5; ali če druge študije na živalih ali toksi čnih učinkih na ljudi 
kažejo zaskrbljenost zaradi njihove akutnosti; 
(c) z ekstrapolacijo, ocenitvijo ali meritvijo podatkov, če dodelitev višjemu 
razredu nevarnih snovi ni zajam čena, in 
— so na voljo zanesljive informacije, ki kažejo na toksi čne učinke pri ljudeh 
ali 
— se opazi kakršna koli smrtnost pri preskušanju do vrednostmi kategorije 4 
po oralni poti ali 
— kadar strokovna presoja potrdi pomembne klini čne znake toksi čnosti pri 
preskušanju do vrednosti kategorije 4, z izjemo driske, piloerekcije ali nenormalnega videza, ali 
— kadar strokovna presoja potrdi zanesljive informacije, ki kažejo na 
možnost pomembnih akutnih u činkov iz drugih študij na živalih.
 
PRESKUŠANJE Z ODMERKI NAD 2 000 MG/KG  
Zaradi potrebe po zaš čiti zdravja živali je preskušanje živali v razponih kategorije 
5 (2 000 mg/kg) nezaželeno in bi ga morali upoštevati le, kadar obstaja velika 
verjetnost, da bi rezultati takšnega preskušanja imeli neposreden pomen za 
zaščito ljudi ali zdravje živali (10). Nadaljnje preskušanje se ne sme opravljati 
z večjimi velikostmi odmerkov. 
Kadar je potrebno preskušanje odmerka 5 000 mg/kg, je potreben le en korak (to 
pomeni tri živali). Če prve žival odmerjanja pogine, se odmerjanje nadaljuje pri 
2 000 mg/kg v skladu s tabelami poteka iz Dodatka 1. Če prva žival preživi, se 
preskušata nadaljnji dve živali. Če pogine le ena od treh živali, se za vrednost 
LD 50 , da bo presegla 5 000 mg/kg. Če pogineta obe živali, se odmerjanje nada ­
ljuje z 2 000 mg/kg.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 212
 
Dodatek 3  
PRESKUSNA METODA B.1 bis. Napotki za razvrstitev v skladu s shemo EU za prehodno 
obdobje do popolne uveljavitve Globalno usklajenega sistema razvrstitve (GHS) (vzeto iz 
sklica (8))
  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 213
 
▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 214
 
▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 215
 
▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 216
 
B.2 AKUTNA STRUPENOST PRI VDIHAVANJU  
UVOD 
1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD 403 (2009) (1). 
Prvotna Smernica za preskušanje 403 v zvezi z akutno strupenostjo pri vdihavanju (TG 403) je bila sprejeta leta 1981. Ta revidirana preskusna 
metoda B.2 (ki ustreza revidirani TG 403) je bila zasnovana tako, da 
omogoča večjo prožnost, zmanjšuje uporabo živali in izpolnjuje zakonodajne 
potrebe. V revidirani preskusni metodi sta predstavljeni dve vrsti študij: tradicionalni protokol LC
 50 in protokol koncentracija × čas (C × t). Glavni 
značilnosti te preskusne metode sta, da je z njo mogo če dobiti razmerje 
koncentracija-odziv, ki se giblje od nesmrtnih do smrtnih rezultatov, za določitev srednje smrtne koncentracije (LC
 50 ), nesmrtne mejne koncentracije 
(npr. LC  01 ) in naklona, ter opredeliti morebitno ob čutljivost glede na spol. 
Protokol C × t je treba uporabiti v primeru posebne zakonodajne ali znan ­
stvene potrebe po preskušanju živali v ve č časovnih obdobjih, na primer za 
namene na črtovanja odzivanja v nujnih primerih (npr. dolo čanja orientacij ­
skih ravni pri akutni izpostavljenosti (AEGL), smernic za na črtovanje zaš čite 
in reševanja (ERPG) ali vrednosti mejnih ravni pri akutni 
izpostavljenosti (AETL)) ali na črtovanja rabe tal. 
2. Napotke glede izvedbe in razlage študij te preskusne metode je mogo če najti 
v Dokumentu s smernicami za preskušanje akutne strupenosti pri vdihavanju 
(GD 39) (2). 
3. Pojmi, ki se uporabljajo v tej preskusni metodi, so opredeljeni na koncu tega 
poglavja in v GD 39 (2). 
4. Ta preskusna metoda omogo ča opredelitev lastnosti in kvantitativno oceno 
tveganja preskusnih kemikalij ter njihovo razvrš čanje v skladu z Uredbo (ES) 
št. 1272/2008 (3). GD 39 (2) zagotavlja napotke za izbiro primerne metode za preskušanje akutne strupenosti. Kadar so potrebne samo informacije o 
razvrščanju in ozna čevanju, se navadno priporo ča poglavje B.52 te priloge 
(4) (glej GD 39 (2)). Ta preskusna metoda B.2 ni posebej namenjena presku ­ 
šanju posebnih materialov, kot so slabo topni izometri čni ali vlaknati mate ­
riali ali proizvedeni nanomateriali.
 
ZAČETNI PREUDARKI 
5. Da se čim bolj zmanjša uporaba živali, mora preskuševalni laboratorij pred 
razmislekom o preskušanju v skladu s to preskusno metodo preu čiti vse 
razpoložljive informacije o preskusni kemikaliji, vklju čno z obstoje čimi 
študijami (npr. poglavje B.52 te priloge (4)), katerih podatki bi omogo čili 
izognitev dodatnemu preskušanju. Informacije, ki lahko pomagajo pri izbiri 
najprimernejše vrste, seva, spola, na čina izpostavljenosti in ustreznih 
preskusnih koncentracij, vklju čujejo identiteto, kemijsko strukturo in 
fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije; rezultate morebitnih preskusov strupenosti  in vitro  ali in vivo ; pričakovane uporabe in potencial 
za izpostavljenost ljudi; razpoložljive podatke (Q)SAR in toksikološke 
podatke o strukturno sorodnih snoveh (glej GD 39 (2)).
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 217
 
6. Preskušanju jedkih in/ali dražilnih preskusnih kemikalij pri koncentracijah, za 
katere se pri čakuje, da bodo povzro čile hude bole čine in/ali trpljenje, se je 
treba čim bolj izogibati. Jedki/dražilni potencial je treba oceniti s strokovno 
presojo ob uporabi dokazov, kot so izkušnje pri ljudeh in živalih (npr. iz študij s ponavljajo čimi se odmerki, opravljenih pri nejedkih/nedražilnih 
koncentracijah), obstoje či podatki  in vitro  (npr. iz poglavij B.40 (5) in 
B.40 bis (6) te priloge ali iz OECD TG 435 (7)), vrednosti pH, informacije o podobnih snoveh ali kateri koli drugi pomembni podatki, da se raziš če, ali 
je mogoče nadaljnje preskušanje opustiti. Za posebne zakonodajne potrebe 
(npr. pri na črtovanju odzivanja v nujnih primerih) se lahko ta preskusna 
metoda uporabi za izpostavljanje živali tem snovem, ker vodji ali glavnemu raziskovalcu študije zagotavlja nadzor nad izbiro ciljnih koncentracij. Ciljne koncentracije ne smejo povzro čiti resnih dražilnih/jedkih u činkov, morajo pa 
biti zadostne za razširitev krivulje koncentracija-odziv na ravni, ki izpolnjuje 
zakonodajni in znanstveni cilj preskusa. Te koncentracije je treba izbrati za vsak primer posebej in utemeljiti njihovo izbiro (glej GD 39 (2)).
 
NAČELO PRESKUSA 
7. Ta revidirana preskusna metoda B.2 je bila zasnovana za pridobitev zados ­
tnih informacij o akutni strupenosti preskusne kemikalije, da se omogo či 
njena razvrstitev in zagotovijo podatki o smrtnosti (npr. LC  50, LC 01 in 
naklon) za enega ali oba spola – kot je potrebno za kvantitativne ocene 
tveganja. Ta preskusna metoda vklju čuje dve metodi. Prva je tradicionalni 
protokol, pri katerem so skupine živali izpostavljene mejni koncentraciji (mejni preskus) ali seriji koncentracij v postopnem postopku za vnaprej določeno obdobje, obi čajno 4 ure. Za izpolnitev posebnih zakonodajnih 
namenov se lahko uporabijo tudi druga obdobja izpostavljenosti. Druga 
metoda je protokol C × t, pri katerem so skupine živali izpostavljene eni (mejni) koncentraciji ali seriji koncentracij skozi ve č obdobij. 
8. Umirajo če živali ali živali, ki o čitno trpijo bole čine ali kažejo znake hudega 
in trajnega trpljenja, je treba humano usmrtiti ter jih pri razlagi rezultatov preskusa upoštevati enako kot živali, ki so poginile med preskusom. Merila 
za sprejem odlo čitve o usmrtitvi umirajo čih živali ali živali, ki zelo trpijo, in 
napotki za prepoznavanje predvidljive ali neizbežne smrti so obravnavani v Dokumentu s smernicami OECD št. 19 o humanih kon čnih točkah (8).
 
OPIS METODE  
Izbira živalske vrste  
9. Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle živali obi čajno uporabljanih labora ­
torijskih sevov. Najprimernejša vrsta je podgana, uporabo drugih vrst pa je 
treba utemeljiti.  
Priprava živali  
10. Samice še niso smele kotiti in ne smejo biti breje. Na dan izpostavljenosti 
morajo biti živali mladi odrasli primerki, ki so stari 8–12 tednov in tehtajo 
± 20 % srednje teže za posamezni spol vseh predhodno izpostavljenih živali 
iste starosti. Živali se izberejo naklju čno in ozna čijo za posami čno prepo ­
znavanje. Pred za četkom preskusa so najmanj 5 dni v kletkah, da se prila ­
godijo laboratorijskim razmeram. Poleg tega jih je treba pred preskušanjem 
krajše obdobje privajati na preskusno aparaturo, saj se tako zmanjša stres, ki 
ga povzro či uvedba v novo okolje.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 218
 
Oskrba živali  
11. Temperatura v prostoru za oskrbo preskusnih živali mora biti 22 ± 3 °C. 
Relativno vlažnost je treba po možnosti ohranjati v obmo čju 30–70 %, 
čeprav to morda ne bo mogo če, kadar se kot nosilec uporablja voda. Pred 
izpostavljanjem in po njem morajo biti živali v kletkah na splošno združene 
v skupine po spolu in koncentraciji, pri čemer število primerkov na kletko ne 
sme vplivati na neovirano opazovanje posamezne živali ter mora kar najbolj zmanjšati izgube zaradi kanibalizma in spopadov. Kadar bo izpostavljen 
samo nos živali, jih bo morda treba privajati na zadrževalne cevi. Te živalim 
ne smejo povzro čati prevelikega fizi čnega ali toplotnega stresa ali stresa 
zaradi imobilizacije. Omejevanje gibanja lahko vpliva na fiziološke kon čne 
točke, kot sta telesna temperatura (hipertermija) in/ali minutni dihalni volu ­
men. Če so na voljo splošni podatki, ki kažejo, da se takih sprememb ne 
pojavi zelo veliko, predhodno prilagajanje zadrževalnim cevem ni potrebno. Živali, ki se izpostavijo aerosolu s celim telesom, morajo biti med izposta ­
vljenostjo nastanjene posami čno, da preskusnega aerosola ne morejo filtrirati 
preko kožuhov drugih primerkov v kletki. Razen med izpostavljenostjo se lahko uporablja obi čajna in potrjena laboratorijska hrana, ki jo spremlja 
neomejena koli čina pitne vode iz komunalnega omrežja. Osvetlitev mora 
biti umetna z zaporedjem 12 ur svetlobe/12 ur teme.
 
Inhalacijske komore  
12. Pri izbiri inhalacijske komore je treba upoštevati lastnosti preskusne kemika ­
lije in cilj preskusa. Po možnosti se kot na čin izpostavljenosti uporabi izpo ­
stavljenost nosu (imenovana tudi izpostavljenost glave oziroma smr čka). 
Izpostavljenost nosu je navadno najprimernejša za študije teko čih ali trdnih 
aerosolov ter za hlape, ki lahko kondenzirajo v aerosole. Mogo če je, da bo 
posebne cilje študije lažje dose či z izpostavljenostjo celega telesa, vendar je 
treba to utemeljiti v poro čilu o študiji. Kadar se uporablja komora za izposta ­
vljanje celega telesa, skupni volumen preskusnih živali ne sme presegati 5 % prostornine komore, da se zagotovi stabilnost atmosfere. Na čela tehnik izpo ­
stavljanja nosu in celega telesa ter njune prednosti in pomanjkljivosti so 
opisani v GD 39 (2).
 
POGOJI IZPOSTAVLJENOSTI  
Dajanje koncentracij  
13. Izpostavljenost nosu lahko pri podganah traja do 6 ur. Če se uporabljajo miši, 
izpostavljenost nosu navadno ne sme biti daljša od 4 ur. Če so potrebne 
dolgoročnejše študije, je treba to utemeljiti (glej GD 39 (2)). Živali, ki so 
izpostavljene aerosolom v komorah za izpostavljanje celega telesa, morajo 
biti nastanjene posami čno, da se prepre či zaužitje preskusne kemikalije ob 
medsebojnem čiščenju primerkov v kletki. V obdobju izpostavljenosti je 
treba živalim odrekati hrano. Med izpostavljenostjo celega telesa lahko ves 
čas uživajo vodo. 
14. Živali se izpostavijo preskusni kemikaliji v obliki plina, hlapov, aerosola ali 
njihovih zmesi. Agregatno stanje, ki bo preskušeno, je odvisno od 
fizikalno-kemijskih lastnosti preskusne kemikalije, izbrane koncentracije in/ali fizikalne oblike, ki bo najverjetneje prisotna med ravnanjem s preskusno kemikalijo in njeno uporabo. Higroskopne in kemi čno reaktivne 
preskusne kemikalije je treba preskušati v suhem ozra čju. Paziti je treba, da 
ne nastanejo eksplozivne koncentracije.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 219
 
Porazdelitev velikosti delcev  
15. Za vse aerosole in hlape, ki lahko kondenzirajo v aerosole, je treba dolo čiti 
velikost delcev. Da se omogo či izpostavljenost vseh ustreznih predelov dihal, 
so priporo čeni aerosoli, katerih mediana porazdelitvene mase delcev v zraku 
glede na aerodinami čni premer (MMAD) znaša 1–4 μm z geometri čnim 
standardnim odklonom ( σg) 1,5–3,0 (2) (9) (10). Prizadevanje za izpolnitev 
tega standarda naj bo razumno; če ga ni mogo če izpolniti, je treba zagotoviti 
strokovno presojo. Delci kovinskih hlapov so lahko na primer manjši od tega 
standarda, naelektreni delci, vlakna in higroskopne snovi (katerih velikost se 
v vlažnem okolju dihal pove ča) pa presegajo navedene vrednosti.  
Priprava preskusne kemikalije v nosilcu  
16. Za ustvarjanje primerne koncentracije in velikosti delcev preskusne kemika ­
lije v atmosferi se lahko uporabi nosilec. Praviloma je treba prednostno uporabiti vodo. Za snov, ki jo tvorijo delci, se lahko uporabijo mehanski 
postopki, da se doseže zahtevana porazdelitev velikosti delcev, vendar je 
treba paziti, da preskusna kemikalija ne razpade ali se spremeni. Kadar se zdi, da so mehanski postopki spremenili sestavo preskusne kemikalije (npr. ob zelo visokih temperaturah, nastalih zaradi trenja pri pretiranem mletju), je 
treba sestavo te preskusne kemikalije analitsko preveriti. Skrbno je treba 
paziti, da se preskusna kemikalija ne kontaminira. Nekrušljivih granulatov, ki so namenoma formulirani tako, da jih ni mogo če vdihniti, ni treba presku ­ 
šati. Uporabiti je treba preskus drobljivosti, da se dokaže, da pri ravnanju z 
granulatom ne nastajajo delci, ki jih je mogo če vdihniti. Če pri preskusu 
drobljivosti nastanejo snovi, ki jih je mogo če vdihniti, je treba opraviti 
preskus strupenosti pri vdihavanju.
 
Kontrolne živali  
17. Sočasna negativna kontrolna skupina (z zrakom) ni potrebna. Kadar se v 
pomoč pri ustvarjanju preskusne atmosfere uporablja nevodni nosilec, je 
treba kontrolno skupino z nosilcem uporabiti samo, če niso na voljo pretekli 
podatki o strupenosti pri vdihavanju. Če študija strupenosti preskusne kemi ­
kalije, formulirane v nosilcu, ne pokaže strupenosti, iz tega sledi, da nosilec pri preskušeni koncentraciji ni strupen; kontrola z nosilcem torej ni potrebna.
 
SPREMLJANJE POGOJEV IZPOSTAVLJENOSTI  
Pretok zraka v komori  
18. Pretok zraka skozi komoro je treba med vsako izpostavljenostjo skrbno 
nadzorovati, stalno spremljati in zabeležiti najmanj vsako uro. Spremljanje koncentracije (ali stabilnosti) preskusne atmosfere je meritev, ki je nelo čljivo 
povezana z vsemi dinami čnimi parametri in zagotavlja posredno sredstvo za 
nadzor nad vsemi pomembnimi dinami čnimi parametri ustvarjanja atmosfere. 
Pri komorah za izpostavljanje nosu je treba posebno pozornost nameniti preprečevanju ponovnega vdihavanja v primerih, v katerih pretok zraka 
skozi sistem izpostavljanja ni zadosten za zagotovitev dinami čnega toka 
atmosfere s preskusno kemikalijo. Za dokazovanje, da v izbranih pogojih 
postopka ni ponovnega vdihavanja, so na voljo predpisane metodologije (2) (11). Koncentracija kisika mora znašati najmanj 19 %, koncentracija ogljikovega dioksida pa ne sme presegati 1 %. Če obstaja razlog za 
domnevo, da teh standardov ni mogo če izpolniti, je treba koncentraciji kisika 
in ogljikovega dioksida izmeriti.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 220
 
Temperatura in relativna vlažnost v komori  
19. Temperaturo v komori je treba ohranjati pri 22 ± 3 °C. Relativno vlažnost v 
območju dihanja živali je treba pri izpostavljenosti nosu in izpostavljenosti 
celega telesa spremljati ter jo zabeležiti najmanj trikrat, če izpostavljenost 
traja do 4 ure, medtem ko se pri krajših časih izpostavljenosti ta meritev 
zabeleži vsako uro. Relativno vlažnost je treba po možnosti ohranjati v območju 30–70 %, vendar je to lahko bodisi nedosegljivo (npr. pri presku ­ 
šanju zmesi na vodni osnovi) bodisi nemerljivo zaradi interference preskusne 
kemikalije s preskusno metodo.
 
Preskusna kemikalija: nazivna koncentracija  
20. Vedno, kadar je to izvedljivo, je treba izra čunati in zabeležiti nazivno 
koncentracijo v komori za izpostavljanje. Nazivna koncentracija je masa ustvarjene preskusne kemikalije, deljena s skupnim volumnom zraka, ki preide skozi sistem komore. Nazivna koncentracija se ne uporablja za opre ­
deljevanje izpostavljenosti živali, pa č pa pri primerjavi z dejansko koncen ­
tracijo pokaže, kako u činkovito je ustvarjanje preskusnega sistema, in se torej 
lahko uporabi za odkrivanje težav pri tem ustvarjanju.
 
Preskusna kemikalija: dejanska koncentracija  
21. Dejanska koncentracija je koncentracija preskusne kemikalije v obmo čju 
dihanja živali v inhalacijski komori. Meri se s specifi čnimi metodami (npr. 
z neposrednim vzor čenjem, adsorpcijskimi ali kemi čnimi reaktivnimi meto ­
dami in naknadnim analitskim opredeljevanjem) ali nespecifi čnimi metodami, 
kot je gravimetri čna analiza s filtriranjem. Uporaba gravimetri čne analize je 
sprejemljiva samo za enokomponentne prašne aerosole ali aerosole teko čin z 
majhno hlapnostjo ter jo je treba pred študijo podpreti z ustreznimi oprede ­
litvami, specifi čnimi za preskusno kemikalijo. Z gravimetri čno analizo se 
lahko dolo či tudi koncentracija ve čkomponentnega prašnega aerosola, vendar 
so za to potrebni analitski podatki, ki kažejo, da je sestava snovi v zraku podobna za četni snovi. Če te informacije niso na voljo, bo morda treba med 
študijo znova analizirati preskusno kemikalijo (po možnosti takrat, ko lebdi v 
zraku) v rednih intervalih. Za aerosolizirane snovi, ki lahko izhlapijo ali sublimirajo, je treba prikazati, da so bile vse faze zbrane z izbrano metodo. V poročilu o študiji je treba navesti ciljne, nazivne in dejanske koncentracije, 
vendar se v statisti čnih analizah za izra čun vrednosti smrtnih koncentracij 
uporabljajo samo dejanske koncentracije. 
22. Po možnosti je treba uporabiti eno serijo preskusne kemikalije, preskusni 
vzorec pa je treba hraniti v pogojih, v katerih se ohranjajo njegova čistost, 
homogenost in stabilnost. Pred za četkom študije je treba opredeliti lastnosti 
preskusne kemikalije, vklju čno z njeno čistostjo ter, če je to tehni čno izved­
ljivo, identiteto in koli činami ugotovljenih kontaminantov in ne čistot. To se 
lahko med drugim prikaže z naslednjimi podatki: z retencijskim časom in 
relativno površino vrha, molekulsko maso, ugotovljeno na podlagi analiz z 
masno spektroskopijo ali plinsko kromatografijo, ali z drugimi ocenami. Čeprav identiteta preskusnega vzorca ni odgovornost preskuševalnega labo ­
ratorija, je morda smotrno, da ta vsaj delno potrdi naro čnikovo opredelitev 
lastnosti (npr. barvo, agregatno stanje itd.). 
23. Atmosfera v komori za izpostavljanje naj bo konstantna, kolikor je to izved ­
ljivo, ter naj se glede na analitsko metodo spremlja stalno in/ali v rednih intervalih. Kadar se uporablja vzor čenje v intervalih, je treba v štiriurni 
študiji vzorce atmosfere v komori vzeti najmanj dvakrat. Če to zaradi 
omejenih stopenj pretoka zraka ali nizkih koncentracij ni izvedljivo, se 
lahko v celotnem obdobju izpostavljenosti vzame en vzorec. Če se
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 221
 
med posameznimi vzorci pojavijo izrazita nihanja, je treba pri preskušanju 
naslednjih koncentracij uporabiti štiri vzorce na izpostavljenost. Posamezni 
vzorci koncentracije v komori od srednje koncentracije ne smejo odstopati za več kot ± 10 % za pline in hlape oziroma za ve č kot ± 20 % za teko če ali 
trdne aerosole. Izra čunati in zabeležiti je treba čas do vzpostavitve ravnotežja 
v komori (t
 95 ). Čas izpostavljenosti pokriva čas ustvarjanja preskusne kemi ­
kalije, pri tem pa je upoštevan čas, potreben za dosego t  95 . Napotki za 
ocenjevanje t  95 so na voljo v GD 39 (2). 
24. Pri zelo kompleksnih zmeseh, sestavljenih iz plinov/hlapov in aerosolov (npr. 
zgorevalnih atmosfer in preskusnih kemikalij, potiskanih iz namenskih proiz ­
vodov/naprav za posebno uporabo), se lahko v inhalacijski komori vsaka faza 
obnaša druga če, zato je treba za vsako fazo (plin/hlape in aerosol) izbrati 
najmanj eno indikatorsko snov (analit), ki je navadno glavna aktivna snov v zmesi. Kadar je preskusna kemikalija zmes, je treba analitsko koncentracijo navesti za zmes in ne le za aktivno snov ali sestavino (analit). Dodatne 
informacije o dejanskih koncentracijah so na voljo v GD 39 (2).
 
Preskusna kemikalija: porazdelitev velikosti delcev  
25. Porazdelitev velikosti delcev aerosolov je treba med vsako 4-urno izposta ­
vljenostjo dolo čiti vsaj dvakrat s kaskadnim impaktorjem ali nadomestnim 
instrumentom, kot je aerodinami čni merilnik delcev. Če je mogo če prikazati 
enakovrednost rezultatov, dobljenih s kaskadnim impaktorjem in nadomes ­
tnim instrumentom, se lahko nadomestni instrument uporablja skozi celotno študijo. Vzporedno s primarnim instrumentom je treba za potrditev njegove 
učinkovitosti zbiranja uporabljati še drugo napravo, kot je gravimetri čni filter 
ali (plinska) izpiralka. Masna koncentracija, dobljena z analizo velikosti delcev, mora biti v razumnih mejah masne koncentracije, dobljene z analizo s filtriranjem (glej GD 39 (2)). Če je enakovrednost mogo če prikazati zgodaj 
v študiji, se lahko nadaljnje potrditvene meritve opustijo. Zaradi dobrobiti 
živali je treba sprejeti ukrepe, s katerimi se čim bolj zmanjša koli čina 
pomanjkljivih podatkov, zaradi katerih bi bilo treba izpostavljanje ponoviti. Za hlape je treba velikost delcev dolo čiti, če obstaja možnost, da se bodo 
hlapi kondenzirali v aerosol, ali če se v atmosferi s hlapi, v kateri so mogo če 
mešane faze, zaznajo delci (glej odstavek 15).
 
POSTOPEK 
26. V nadaljevanju sta opisani dve vrsti študij: tradicionalni protokol in protokol 
C × t. Oba lahko vklju čujeta opazovalno študijo, glavno študijo in/ali mejni 
preskus (tradicionalni protokol) oziroma preskušanje pri mejni koncentraciji (C × t). Če je znano, da je en spol ob čutljivejši, se lahko vodja študije odlo či 
te študije izvesti samo z njim. Če se z nosom izpostavijo vrste glodavcev, ki 
niso podgane, se lahko najdaljša obdobja izpostavljenosti prilagodijo, da se 
čim bolj zmanjša trpljenje, zna čilno za uporabljeno vrsto. Pred za četkom je 
treba preu čiti vse razpoložljive podatke, da se kar najbolj zmanjša uporaba 
živali. Tako se lahko na primer s podatki, pridobljenimi na podlagi 
poglavja B.52 te priloge (4), odpravi potreba po opazovalni študiji in dokaže 
večja občutljivost enega spola (glej GD 39 (2)).
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 222
 
TRADICIONALNI PROTOKOL  
Splošni preudarki: tradicionalni protokol  
27. Pri tradicionalni študiji se skupine živali za to čno določen čas (običajno 4 
ure) izpostavijo preskusni kemikaliji bodisi v komori za izpostavljanje nosu bodisi v komori za izpostavljanje celega telesa. Živali se izpostavijo bodisi mejni koncentraciji (mejni preskus) bodisi najmanj trem koncentracijam v 
postopnem postopku (glavna študija). Pred glavno študijo se lahko izvede 
opazovalna študija, razen če so že na voljo nekatere informacije o preskusni 
kemikaliji, kot je predhodno izvedena študija B.52 (glej GD 39 (2)).
 
Opazovalna študija: tradicionalni protokol  
28. Opazovalna študija se uporablja za ocenjevanje mo či preskusne kemikalije, 
opredelitev razlik med spoloma glede ob čutljivosti in pomo č pri izbiri 
koncentracij izpostavljenosti za glavno študijo ali mejni preskus. Pri izbiri 
koncentracij za opazovalno študijo je treba uporabiti vse informacije, ki so na 
voljo, vklju čno z razpoložljivimi podatki (Q)SAR in podatki za podobne 
kemikalije. Vsaki koncentraciji se izpostavi najve č tri samce in tri samice 
(3 živali/spol so lahko potrebne, da se ugotovi razlika med spoloma). Opazo ­
valna študija lahko zajema eno samo koncentracijo, po potrebi pa se jih lahko 
preskusi tudi ve č. Opazovalna študija ne sme vklju čevati toliko živali in 
koncentracij, da je podobna glavni študiji. Namesto opazovalne študije se lahko uporabi predhodno izvedena študija B.52 (4) (glej GD 39 (2)).
 
Mejni preskus: tradicionalni protokol  
29. Mejni preskus se uporabi, kadar je znano ali se pri čakuje, da je preskusna 
kemikalija prakti čno nestrupena, tj. da povzro či toksično reakcijo samo nad 
zakonsko predpisano mejno koncentracijo. Pri mejnem preskusu se ena 
skupina treh samcev in treh samic izpostavi preskusni kemikaliji pri mejni koncentraciji. Informacije o strupenosti preskusne kemikalije se lahko prido ­
bijo na podlagi znanja o podobnih preskušenih kemikalijah ob upoštevanju 
identitete in odstotka sestavin, za katere je znano, da so toksikološko 
pomembne. Kadar je informacij o strupenosti preskusne kemikalije malo oziroma jih ni ali kadar se pri čakuje, da je kemikalija strupena, je treba 
opraviti glavni preskus. 
30. Izbira mejnih koncentracij je navadno odvisna od zakonodajnih zahtev. 
Kadar se uporablja Uredba (ES) št. 1272/2008, so mejne koncentracije za 
pline, hlape in aerosole 20 000 ppm, 20 mg/l oziroma 5 mg/l (ali najvišje dosegljive koncentracije) (3). Ustvarjanje mejnih koncentracij nekaterih preskusnih kemikalij, zlasti kemikalij v obliki hlapov in aerosolov, je 
lahko tehni čno zahtevno. Pri preskušanju aerosolov mora biti glavni cilj 
ustvariti delce takšne velikosti, da jih je mogo če vdihniti (MMAD 1–4 μm). 
To je mogo če z večino preskusnih kemikalij pri koncentraciji 2 mg/l. Presku ­ 
šanje aerosolov pri koncentracijah, višjih od 2 mg/l, se lahko izvaja samo, če 
se lahko zagotovi delce takšne velikosti, da jih je mogo če vdihniti (glej GD 
39 (2)). V Uredbi (ES) št. 1272/2008 se zaradi dobrobiti živali (3) presku ­ 
šanje nad mejno koncentracijo odsvetuje. Tako preskušanje se lahko predvidi samo, kadar obstaja velika verjetnost, da bodo rezultati takega preskusa 
neposredno pomembni za varovanje zdravja ljudi (3), poleg tega pa je 
treba to utemeljiti v poro čilu o študiji. V primeru potencialno eksplozivnih 
preskusnih kemikalij je treba paziti, da se ne ustvarijo ugodni pogoji za eksplozijo. Zaradi izogibanja nepotrebni uporabi živali je treba pred mejnim 
preskusom opraviti preskus brez živali in tako zagotoviti, da je v komori 
mogoče doseči pogoje za mejni preskus.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 223
 
31. Če se pri mejni koncentraciji opazi smrtnost ali umiranje, se lahko rezultati 
mejnega preskusa uporabijo kot opazovalna študija za nadaljnje preskušanje 
pri drugih koncentracijah (glej glavno študijo). Kadar zaradi fizikalnih ali kemijskih lastnosti preskusne kemikalije ni mogo če doseči mejne koncen ­
tracije, je treba preskusiti najvišjo dosegljivo koncentracijo. Če ta povzro či 
manj kot 50-odstotno smrtnost, nadaljnje preskušanje ni potrebno. Kadar 
mejne koncentracije ni mogo če doseči, je treba v poro čilu o študiji navesti 
pojasnilo in podporne podatke. Če najvišja dosegljiva koncentracija hlapov 
ne izzove strupenih u činkov, bo morda treba preskusno kemikalijo pripraviti 
v obliki teko čega aerosola.
 
Glavna študija: tradicionalni protokol  
32. Glavna študija se obi čajno opravlja s petimi samci in petimi samicami (ali 
petimi živalmi ob čutljivejšega spola, če je znan) na koncentracijo, pri čemer 
se uporabijo najmanj tri razli čne koncentracije. Za zanesljivo statisti čno 
analizo je treba uporabiti zadostne koncentracije. Časovni interval med skupi ­
nami za izpostavljanje je dolo čen glede na nastop, trajanje in resnost znakov 
zastrupitve. Z izpostavljanjem živali naslednji stopnji koncentracije je treba 
počakati, dokler ni mogo če z razumno gotovostjo sklepati o preživetju pred ­
hodno preskušenih živali. Tako lahko vodja študije prilagodi ciljno koncen ­
tracijo za naslednjo skupino za izpostavljanje. Zaradi odvisnosti od 
kompleksnih tehnologij to pri inhalacijskih študijah morda ni vedno prakti ­ 
čno, zato mora izpostavljanje živali naslednji stopnji koncentracije temeljiti 
na predhodnih izkušnjah in znanstveni presoji. Pri preskušanju zmesi je treba upoštevati GD 39 (2).
 
PROTOKOL KONCENTRACIJA × ČAS (C × T)  
Splošni preudarki: protokol C × t  
33. Postopna študija C × t se lahko obravnava kot alternativa tradicionalnemu 
protokolu, kadar se preskuša strupenost pri vdihavanju (12) (13) (14). Ta pristop omogo ča, da se živali izpostavijo preskusni kemikaliji pri ve č 
koncentracijah in ob razli čnih obdobjih izpostavljenosti. Celotno preskušanje 
se izvaja v komori za izpostavljanje nosu (komore za izpostavljanje celega 
telesa za protokol C × t niso prakti čne). Ta protokol je ponazorjen v 
diagramu poteka v Dodatku 1. Simulacijska analiza je pokazala, da je mogoče s tradicionalnim protokolom in protokolom C × t dobiti zanesljive 
vrednosti LC
 50 , vendar je protokol C × t na splošno boljši pri zagotavljanju 
zanesljivih vrednosti LC  01 in LC  10 (15). 
34. Simulacijska analiza je pokazala, da lahko uporaba dveh živali na interval C 
× t (po ena žival vsakega spola, če se uporabljata oba spola, ali dve živali 
občutljivejšega spola) na splošno zadoš ča, kadar se v glavni študiji presku ­ 
šajo štiri koncentracije in pet obdobij izpostavljenosti. V nekaterih okoli ­ 
ščinah se lahko vodja študije odlo či uporabiti po dve podgani vsakega 
spola na interval C × t (15). Uporaba dveh živali vsakega spola na koncen ­
tracijo in časovno to čko lahko zmanjša izkrivljenost in spremenljivost ocen, 
poveča stopnjo uspešnosti ocenjevanja ter izboljša obseg intervala zaupanja. 
Vendar lahko v primeru nezadostnega ujemanja s podatki za ocenjevanje (ob uporabi ene živali vsakega spola ali dveh živali ob čutljivejšega spola) 
zadošča tudi peta koncentracija izpostavljenosti. Ve č napotkov o številu 
živali in koncentracij, ki jih je treba uporabiti v študiji C × t, je na voljo 
v GD 39 (2).
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 224
 
Opazovalna študija: protokol C × t  
35. Opazovalna študija se uporablja za ocenjevanje mo či preskusne kemikalije in 
pomoč pri izbiri koncentracij izpostavljenosti za glavno študijo. Da se izbere 
primerna za četna koncentracija za glavno študijo in čim bolj zmanjša število 
uporabljenih živali, je lahko potrebna opazovalna študija z do tremi živalmi/ 
spol/koncentracijo (za podrobnosti glej Dodatek III k GD 39 (2)). Za ugota ­
vljanje razlike med spoloma bo morda treba uporabiti tri živali na spol. Te živali je treba izpostaviti za eno samo obdobje, ki navadno traja 240 min. 
Izvedljivost ustvarjanja ustreznih preskusnih atmosfer je treba oceniti med 
predhodnimi tehni čnimi preskusi brez živali. Če so na voljo podatki o 
smrtnosti iz študije B.52 (4), opazovalne študije obi čajno ni treba opraviti. 
Vodja študije mora pri izbiri za četne ciljne koncentracije v študiji B.2 upošte ­
vati vzorce smrtnosti, opažene v kateri koli razpoložljivi študiji B.52 (4) za oba spola in vse preskušene koncentracije (glej GD 39 (2)).
 
Začetna koncentracija: protokol C × t  
36. Začetna koncentracija (izpostavitev I) (Dodatek 1) je bodisi mejna koncen ­
tracija bodisi koncentracija, ki jo vodja študije izbere na podlagi opazovalne študije. Skupine s po 1 živaljo/spol se tej koncentraciji izpostavijo za ve č 
obdobij (v trajanju npr. 15, 30, 60, 120 ali 240 minut), tako da je vseh živali 
skupaj 10 (celotni postopek imenujemo izpostavitev I) (Dodatek 1). 
37. Izbira mejnih koncentracij je navadno odvisna od zakonodajnih zahtev. 
Kadar se uporablja Uredba (ES) št. 1272/2008, so mejne koncentracije za pline, hlape in aerosole 20 000 ppm, 20 mg/l oziroma 5 mg/l (ali najvišje 
dosegljive koncentracije) (3). Ustvarjanje mejnih koncentracij nekaterih 
preskusnih kemikalij, zlasti kemikalij v obliki hlapov in aerosolov, je lahko tehni čno zahtevno. Pri preskušanju aerosolov mora biti cilj ustvariti 
delce takšne velikosti, da jih je mogo če vdihniti (tj. MMAD 1–4 μm), pri 
mejni koncentraciji 2 mg/l. To je mogo če pri večini preskusnih kemikalij. 
Preskušanje aerosolov pri koncentracijah, višjih od 2 mg/l, se lahko izvaja samo, če se lahko zagotovi delce takšne velikosti, da jih je mogo če vdihniti 
(glej GD 39 (2)). V Uredbi (ES) št. 1272/2008 se zaradi dobrobiti živali 
preskušanje nad mejno koncentracijo odsvetuje. Tako preskušanje se lahko predvidi samo, kadar obstaja velika verjetnost, da bodo rezultati takega preskusa neposredno pomembni za varovanje zdravja ljudi (3), poleg tega 
pa je treba to utemeljiti v poro čilu o študiji. V primeru potencialno eksplo ­
zivnih preskusnih kemikalij je treba paziti, da se ne ustvarijo ugodni pogoji za eksplozijo. Zaradi izogibanja nepotrebni uporabi živali je treba pred preskušanjem pri za četni koncentraciji opraviti preskus brez živali in tako 
zagotoviti, da je v komori mogo če doseči pogoje za to koncentracijo. 
38. Če se pri za četni koncentraciji opazi smrtnost ali umiranje, se lahko rezultati, 
dobljeni pri tej koncentraciji, uporabijo kot izhodiš če za nadaljnje presku ­ 
šanje pri drugih koncentracijah (glej glavno študijo). Kadar zaradi fizikalnih ali kemijskih lastnosti preskusne kemikalije ni mogo če doseči mejne koncen ­
tracije, je treba preskusiti najvišjo dosegljivo koncentracijo. Če ta povzro či 
manj kot 50-odstotno smrtnost, nadaljnje preskušanje ni potrebno. Kadar mejne koncentracije ni mogo če doseči, je treba v poro čilu o študiji navesti 
pojasnilo in podporne podatke. Če najvišja dosegljiva koncentracija hlapov 
ne izzove strupenih u činkov, bo morda treba preskusno kemikalijo pripraviti 
v obliki teko čega aerosola.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 225
 
Glavna študija: protokol C × t  
39. Začetna koncentracija (izpostavitev I) (Dodatek 1), preskušena v glavni 
študiji, je bodisi mejna koncentracija bodisi koncentracija, ki jo vodja študije določi na podlagi opazovalne študije. Če je bila med izpostavitvijo I ali po 
njej opažena smrtnost, se minimalna izpostavljenost (C × t), ki povzro či 
smrtnost, upošteva kot smernica za dolo čitev koncentracije in obdobij izpo ­
stavljenosti za izpostavitev II. Vsaka naslednja izpostavitev je odvisna od prejšnje izpostavitve (glej Dodatek 1). 
40. Za številne preskusne kemikalije rezultati, dobljeni pri za četni koncentraciji, 
skupaj s tremi dodatnimi izpostavitvami v okviru drobnejše časovne mreže 
(tj. geometri čne razmaknjenosti obdobij izpostavljenosti, kot jo dolo ča faktor 
med zaporednimi obdobji, obi čajno √2) zadoščajo za dolo čitev razmerja 
smrtnosti C × t (15), čeprav lahko uporaba 5. koncentracije izpostavljenosti 
prinese nekatere koristi (glej Dodatek 1 in GD 39 (2)). Za matemati čno 
obdelavo rezultatov pri protokolu C × t glej Dodatek 1.
 
OPAZOVANJA 
41. Med obdobjem izpostavljenosti je treba živali pogosto klini čno opazovati. Po 
izpostavljenosti je treba klini čna opazovanja izvajati skupno 14 dni, in sicer 
na dan izpostavljenosti najmanj dvakrat ali pogosteje, če to nakazuje odziv 
živali na tretiranje, nato pa najmanj enkrat na dan. Dolžina obdobja opazo ­
vanja ni to čno določena, pač pa jo je treba dolo čiti glede na naravo in čas 
nastopa klini čnih znakov ter dolžino obdobja okrevanja. Časi pojava in izgi ­
notja pokazateljev strupenosti so pomembni, zlasti če se ti znaki nagibajo k 
zapoznelosti. Vsa opažanja se sistemati čno zabeležijo, pri čemer se evidence 
vodijo za vsako žival posebej. Umirajo če živali ter živali, ki kažejo znake 
hude bole čine in/ali trajnega in hudega trpljenja, je treba zaradi njihove 
dobrobiti humano usmrtiti. Pri pregledih za klini čnimi pokazatelji strupenosti 
je treba paziti, da se za četni slab videz in prehodne spremembe v dihanju, ki 
so posledica postopka izpostavljanja, ne zamenjajo za strupenost, povezano s preskusno kemikalijo, ki bi zahtevala pred časno usmrtitev živali. Upoštevati 
je treba na čela in merila, povzeta v Dokumentu s smernicami o humanih 
končnih točkah (GD 19) (7). Kadar se živali usmrtijo iz humanih razlogov ali 
so najdene poginule, je treba čas smrti zabeležiti čim natančneje. 
42. Opazovanja v kletkah morajo vklju čevati spremembe na koži in kožuhu, 
očeh in sluznicah, v dihalih, obto čilih, avtonomnem in osrednjem živ čevju 
ter pri somatomotori čnih aktivnostih in vedenjskih vzorcih. Kadar je to 
mogoče, je treba zabeležiti vsa razlikovanja med lokalnimi in sistemskimi 
učinki. Pozorno je treba opazovati tremorje, kr če, slinjenje, drisko, letargijo, 
spanje in komo. Z merjenjem rektalne temperature se lahko pridobijo podporni dokazi o refleksni bradipneji ali hipo-/hipertermiji, povezani s treti ­
ranjem ali konfinacijo.
 
Telesna teža  
43. Težo posameznih živali je treba zabeležiti enkrat v obdobju prilagajanja na 
okolje, na dan izpostavljenosti pred izpostavljenostjo (dan 0) ter vsaj 1., 3. in 
7. dan (nato pa tedensko), poleg tega pa še ob poginu ali evtanaziji, če ta 
nastopi po 1. dnevu. Telesna teža se priznava kot bistveni kazalnik strupeno ­
sti, tako da je treba živali, pri katerih se v primerjavi z vrednostmi pred 
študijo opazi trajen upad za ≥ 20 %, skrbno spremljati. Preživele živali se 
ob koncu obdobja po izpostavljenosti stehtajo in humano usmrtijo.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 226
 
Patologija  
44. Na vseh preskusnih živalih, vklju čno s tistimi, ki med preskusom poginejo 
ali so evtanazirane in odstranjene iz študije zaradi njihove dobrobiti, je treba opraviti makroskopsko obdukcijo. Če je ni mogo če opraviti takoj po odkritju 
poginule živali, je treba žival ohladiti (ne zamrzniti) na dovolj nizko tempe ­
raturo, da se avtoliza čim bolj zmanjša. Obdukcijo je treba opraviti čim prej, 
navadno v dnevu ali dveh. Za vsako žival je treba zabeležiti vse makro ­
skopske patološke spremembe s posebnim poudarkom na spremembah dihal. 
45. Za razširitev razlagalne vrednosti študije se lahko razmisli o dodatnih samou ­
mevno vklju čenih pregledih, kot sta tehtanje plju č preživelih podgan in/ali 
zagotavljanje dokazov o dražilnosti z mikroskopskim pregledom dihal. Med pregledanimi organi so lahko tudi tisti, ki kažejo makroskopske patološke 
znake pri živalih, ki so preživele 24 ur ali ve č, in organi, za katere je znano 
ali se pri čakuje, da so prizadeti. Mikroskopski pregled celotnih dihal lahko 
zagotovi koristne informacije za preskusne kemikalije, ki reagirajo z vodo, kot so kisline in higroskopne preskusne kemikalije.
 
PODATKI IN PORO ČANJE  
Podatki  
46. Zagotoviti je treba podatke o telesni teži in ugotovitvah obdukcije posa ­
meznih živali. Podatke o klini čnih opažanjih je treba povzeti v preglednicah, 
v katerih se za vsako preskusno skupino navedejo število uporabljenih živali, 
število živali, ki kažejo specifi čne znake zastrupitve, število živali, ki so bile 
najdene poginule med preskusom ali usmr čene iz humanih razlogov, čas 
smrti posameznih živali, opis in časovni potek strupenih u činkov in reverzi ­
bilnosti ter ugotovitve obdukcije.  
Poročilo o preskusu  
47. Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije, kot je primerno:  
Preskusne živali in oskrba  
— opis pogojev v kletkah, vklju čno s številom (ali spremembo števila) živali 
na kletko, nastiljem, temperaturo in relativno vlažnostjo prostora, fotope ­
riodo ter opredelitvijo hrane, 
— uporabljeno vrsta/sev in utemeljitev uporabe vrste, ki ni podgana, — število, starost in spol živali, — metodo randomizacije, — podatke o kakovosti hrane in vode (vklju čno z vrsto/virom hrane in 
virom vode), 
— opis morebitne priprave živali pred preskusom, vklju čno s hrano, karan ­
teno in zdravljenjem.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 227
 
Preskusna kemikalija  
— agregatno stanje, čistost in, če je to ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti 
(vključno z izomerizacijo), 
— identifikacijske podatke in registrsko številko Službe za izmenjavo kemij ­
skih izvle čkov (CAS), če je znana.  
Nosilec  
— utemeljitev uporabe nosilca in utemeljitev izbire nosilca ( če to ni voda), 
— pretekle ali vzporedno pridobljene podatke, ki dokazujejo, da nosilec ne 
vpliva na rezultat študije.  
Inhalacijska komora  
— opis inhalacijske komore, vklju čno z merami in prostornino, 
— izvor in opis opreme, uporabljene za izpostavljanje živali in ustvarjanje 
atmosfere, 
— opremo za merjenje temperature, vlažnosti, velikosti delcev in dejanske 
koncentracije, 
— vir zraka in obdelavo dovajanega/odvajanega zraka ter sistem za klima ­
tiziranje, 
— metode, uporabljene za umerjanje opreme za zagotavljanje homogene 
preskusne atmosfere, 
— razliko v tlaku (pozitivna ali negativna), — izpostavitvene odprtine na komoro (izpostavljanje nosu); položaj živali v 
sistemu (izpostavljanje celega telesa), 
— časovno homogenost/stabilnost preskusne atmosfere, 
— položaj tipal za zaznavanje temperature in vlažnosti ter mesto vzor čenja 
preskusne atmosfere v komori, 
— stopnje pretoka zraka, stopnjo pretoka zraka/izpostavitveno odprtino 
(izpostavljanje nosu) ali število živali/komoro (izpostavljanje celega tele ­
sa), 
— informacije o opremi, uporabljeni za merjenje kisika in ogljikovega diok ­
sida, če se uporablja, 
— čas, potreben za vzpostavitev ravnotežja v inhalacijski komori (t
 95 ), 
— število zamenjav volumna zraka na uro, — merilne naprave ( če se uporabljajo).  
Podatki o izpostavljenosti  
— utemeljitev izbire ciljne koncentracije v glavni študiji, — nazivne koncentracije (skupna masa ustvarjene preskusne kemikalije v 
inhalacijski komori, deljena z volumnom zraka, ki preide skozi komoro), 
— dejanske koncentracije preskusne kemikalije, ki se vzamejo v obmo čju 
dihanja živali, za zmesi, pri katerih nastajajo heterogene fizikalne oblike 
(plini, hlapi, aerosoli), se lahko vsaka analizira lo čeno,
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 228
 
— vse koncentracije v zraku je treba navesti v masnih enotah (npr. mg/l, 
mg/m  3 itd.); v oklepajih se lahko navedejo tudi prostorninske enote (npr. 
ppm, ppb itd.), 
— porazdelitev velikosti delcev, mediano porazdelitvene mase delcev v 
zraku glede na aerodinami čni premer (MMAD) in geometri čni standardni 
odklon (σg), vključno z metodami za njihov izra čun. Poročati je treba o 
posameznih analizah velikosti delcev.  
Preskusni pogoji  
— podatke o pripravi preskusne kemikalije, vklju čno s podrobnostmi o 
postopkih, uporabljenih za zmanjšanje velikosti delcev trdnih snovi ali pripravo raztopin preskusne kemikalije. Kadar obstaja možnost, da so mehanski postopki spremenili sestavo preskusne kemikalije, je treba 
vključiti rezultate analiz za preverjanje sestave te preskusne kemikalije, 
— opis (ki po možnosti vklju čuje diagram) opreme, uporabljene za ustvar ­
janje preskusne atmosfere in izpostavljanje živali preskusni atmosferi, 
— podatke o uporabljeni kemijski analitski metodi in njeni validaciji 
(vključno z rekuperacijo preskusne kemikalije iz nosilca za vzor čenje), 
— utemeljitev dolo čitve preskusnih koncentracij.  
Rezultati  
— preglednice o temperaturi, vlažnosti in pretoku zraka v komori, 
— preglednice s podatki o nazivnih in dejanskih koncentracijah v komori, — preglednice s podatki o velikosti delcev, vklju čno s podatki o analitskem 
vzorčenju, porazdelitvijo velikosti delcev ter izra čuni MMAD in σ
 g , 
— preglednice s podatki o odzivu in koncentracijah za vsako žival (tj. za 
živali, ki kažejo znake zastrupitve, vklju čno s smrtnostjo ter naravo, 
resnostjo, časom nastopa in trajanjem u činkov), 
— telesne teže posameznih živali, izmerjene med študijo; datum in čas smrti, 
če je ta nastopila pred predvideno evtanazijo; časovni potek nastopa 
znakov zastrupitve in ali so bili ti reverzibilni za vsako žival, 
— izsledke obdukcije in histopatološke preiskave za vsako žival, če so na 
voljo, 
— ocene smrtnosti (npr. LC  50 , LD  01 ), vključno s 95-odstotnimi mejami 
zaupanja in naklonom ( če tako dolo ča ocenjevalna metoda), 
— statisti čno povezanost, vklju čno z oceno eksponenta n (protokol C × t). 
Navesti je treba ime uporabljene statisti čne programske opreme.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 229
Razprava in razlaga rezultatov  
— poseben poudarek je treba nameniti opisu metod, uporabljenih za izpol ­
nitev meril te preskusne metode, npr. glede mejne koncentracije ali veli ­
kosti delcev, 
— z vidika splošnih ugotovitev je treba obravnavati možnost vdihavanja 
delcev, zlasti če meril glede velikosti delcev ni bilo mogo če izpolniti, 
— če je bilo treba na podlagi meril iz Dokumenta s smernicami OECD o 
humanih kon čnih točkah (8) humano žrtvovati živali, ki so trpele bole ­ 
čine ali kazale znake hudega in trajnega trpljenja, je treba to pojasniti, 
— če je bilo preskušanje na podlagi poglavja B.52 te priloge (4) prekinjeno 
v korist te preskusne metode B.2, je treba to utemeljiti, 
— v splošno oceno študije je treba vklju čiti doslednost metod, uporabljenih 
za določanje nazivne in dejanske koncentracije, ter razmerje med njima, 
— obravnavati je treba verjetni vzrok smrti in prevladujo či način delovanja 
(sistemski ali lokalni).  
VIRI:  
(1) OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No. 403, OECD, Pariz. Na voljo na: http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines. 
(2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment No. 39, OECD, Pariz. Na voljo na: http://www.oecd.org/env/testgui ­
delines. 
(3) Uredba (ES) št. 1272/2008 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 
16. decembra 2008 o razvrš čanju, ozna čevanju in pakiranju snovi ter zmesi, 
o spremembi in razveljavitvi direktiv 67/548/EGS in 1999/45/ES ter spre ­
membi Uredbe (ES) št. 1907/2006 (UL L 353, 31.12.2008, str. 1). 
(4) Poglavje B.52 te priloge, Akutna strupenost pri vdihavanju – metoda 
razredov akutne strupenosti. 
(5) Poglavje B.40 te priloge, Jedkost za kožo  in vitro : preskus transkutane 
električne upornosti (TER). 
(6) Poglavje B.40 bis te priloge, Jedkost za kožo  in vitro : preskus z modelom 
človeške kože. 
(7) OECD (2005),  In Vitro  Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. 
OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Pariz. Na voljo 
na: http://www.oecd.org/env/testguidelines. 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19, OECD, Pariz. Na voljo na: http:// www.oecd.org/env/testguidelines. 
(9) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321–327. 
(10) Phalen, R. F. (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. 
(2. izdaja) Informa Healthcare, New York.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 230
 
(11) Pauluhn, J. in Thiel, A. (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 
160–167. 
(12) Zwart, J. H. E., Arts, J. M., ten Berge, W. F., Appelman, L. M. (1992). 
Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison 
with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278–290. 
(13) Zwart, J. H. E., Arts, J. M., Klokman-Houweling, E. D., Schoen, E. D. 
(1990). Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105–117. 
(14) Ten Berge, W. F. in Zwart, A. (1989). More Efficient Use of Animals in 
Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65–71. 
(15) OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t 
Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Pariz. Na voljo na: http://www.oecd.org/env/testguidelines. 
(16) Finney, D. J. (1977). Probit Analysis, 3. izdaja, Cambridge University 
Press, London/New York.
 
OPREDELITEV POJMOV  
Preskusna kemikalija:  snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne 
metode.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 231
 
Dodatek 1  
Protokol C × t  
1. Postopna študija koncentracija × čas (C × t) se lahko obravnava kot alter ­
nativa tradicionalnemu protokolu, kadar se preskuša strupenost pri vdiha ­
vanju (12) (13) (14). Po možnosti jo je treba uporabljati ob posebni zako ­
nodajni ali znanstveni potrebi po preskušanju živali v ve č različno dolgih 
časovnih obdobjih, na primer za na črtovanje odzivanja v nujnih primerih ali 
načrtovanje rabe tal. Ta pristop se obi čajno začne s preskušanjem pri mejni 
koncentraciji (izpostavitev I), ko se živali izpostavijo preskusni kemikaliji za pet časovnih obdobij (v trajanju npr. 15, 30, 60, 120 in 240 min), tako da se 
v eni izpostavitvi pridobijo podatki za ve č časovnih obdobij (glej sliko 1). 
Kadar se uporablja Uredba (ES) št. 1272/2008, so mejne koncentracije za pline, hlape in aerosole 20 000 ppm, 20 mg/l oziroma 5 mg/l. Te koncen ­
tracije se smejo prese či samo ob zakonodajni ali znanstveni potrebi po 
preskušanju pri višjih koncentracijah (glej odstavek 37 glavnega dela 
poglavja B.2). 
2. Kadar je informacij o strupenosti preskusne kemikalije malo oziroma jih ni, 
je treba opraviti opazovalno študijo, v kateri se skupine najve č 3 živali na 
spol izpostavijo ciljnim koncentracijam, ki jih dolo či vodja študije, navadno 
za 240 min. 
3. Če se med izpostavitvijo I preskusi mejna koncentracija in se opazi manj kot 
50-odstotna smrtnost, dodatno preskušanje ni potrebno. Če obstaja zakono ­
dajna ali znanstvena potreba po dolo čitvi razmerja koncentracija/ čas/odziv 
pri višjih koncentracijah od opredeljene mejne, je treba naslednjo izposta ­
vitev izvesti pri višji koncentraciji, npr. dvakratniku mejne koncentracije (tj. 
2L na sliki 1). 
4. Če se pri mejni koncentraciji ugotovi strupenost, je potrebno dodatno 
preskušanje (glavna študija). To dodatno izpostavljanje se izvede bodisi 
pri nižjih koncentracijah (na sliki 1: izpostavitve II, III ali IV’) bodisi pri višjih koncentracijah za krajša obdobja (na sliki 1: izpostavitev IV), ki so 
prilagojena in nekoliko manj razmaknjena. 
5. Preskus (za četna in dodatne koncentracije) se opravi z 1 živaljo/spol na 
koncentracijo/ časovno to čko ali 2 živalma ob čutljivejšega spola na koncen ­
tracijo/časovno to čko. V nekaterih okoliš činah se lahko vodja študije odlo či 
uporabiti 2 podgani/spol na koncentracijo/ časovno to čko (ali 4 živali ob čut­
ljivejšega spola na koncentracijo/
časovno to čko) (15). Uporaba 2 živali na 
spol na koncentracijo/ časovno to čko na splošno zmanjša pristranskost in 
spremenljivost ocen, pove ča stopnjo uspešnosti ocenjevanja ter izboljša 
pokritost intervala zaupanja v primerjavi s protokolom, kot je opisan tukaj. Več podrobnosti je na voljo v GD 39 (2). 
6. Po možnosti se vsaka izpostavitev izvede v enem dnevu. Tako se lahko z 
naslednjo izpostavitvijo po čaka, dokler ni mogo če z razumno gotovostjo 
sklepati o preživetju, vodja študije pa lahko prilagodi ciljno koncentracijo 
in obdobja za naslednjo izpostavitev. Vsako izpostavitev je priporo čljivo 
začeti s skupino, ki bo izpostavljena najdlje, npr. s skupino za 240-minutno 
izpostavljanje, tej sledi skupina za 120-minutno izpostavljanje itn. Če na 
primer živali v 240-minutni skupini po 90 minutah umirajo ali kažejo 
resne znake zastrupitve (npr. velike spremembe v vzorcu dihanja, kot je oteženo dihanje), izpostavljanje skupine za 120 minut ne bi bilo smiselno, ker bi bila smrtnost verjetno 100-odstotna. Zato mora vodja študije za 
zadevno koncentracijo izbrati krajša obdobja izpostavljenosti (npr. 90, 65, 
45, 33 in 25 minut).
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 232
 
7. Koncentracijo v komori je treba pogosto meriti, da se dolo či časovno 
tehtana povpre čna koncentracija za vsako obdobje izpostavljenosti. Kadar 
koli je to mogo če, je treba v statisti čni analizi uporabiti čas smrti za vsako 
žival (namesto obdobja izpostavljenosti). 
8. Rezultate prvih štirih izpostavitev je treba preu čiti, da se opredeli poda ­
tkovna vrzel v krivulji koncentracija- čas (glej sliko 1). V primeru nezadost ­
nega ujemanja se lahko izvede dodatna izpostavitev (5. koncentracija). 
Koncentracijo in obdobja izpostavljenosti za 5. izpostavitev je treba izbrati tako, da se zapolni ta vrzel. 
9. Vse izpostavitve (vklju čno s prvo) se uporabijo za izra čun razmerja 
koncentracija- čas-odziv s statisti čno analizo (16). Če je to mogo če, je 
treba za vsak interval C × t uporabiti časovno tehtano povpre čno koncen ­
tracijo in obdobje izpostavljenosti do smrti ( če ta nastopi med izpostavlje ­
nostjo).
 
Slika 1  
Hipotetični prikaz razmerja koncentracija- čas-smrtnost pri podganah
  
Prazni simboli = preživele živali; polni simboli = poginule živali 
Trikotniki = samice; krožci = samci Neprekinjena črta = vrednosti LC
 50 (razpon 7,5–240 min) za samce pri 
n = 1 
Črtkana črta = vrednosti LC  50 (razpon 7,5–240 min) za samice pri n = 1 
Pikčasta črta = hipoteti čne vrednosti LC  50 za samce in samice, če bi veljalo 
n = 2 (12) 
Glosar 
Koncentracija: Čas izpostavljenosti:
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 233
 
10. V nadaljevanju je predstavljen primer postopnega postopka:  
Izpostavitev I – preskušanje pri mejni koncentraciji (glej sliko 1)  
— 1 žival/spol na koncentracijo/ časovno to čko; skupno 10 živali (  a ) 
— Ciljna koncentracija (  b ) = mejna koncentracija. 
— Pet skupin živali se tej ciljni koncentraciji izpostavi za 15, 30, 60, 120 
oziroma 240 minut.  
↓ 
Izpostavitev II  ( c ) – glavna študija  
— 1 žival/spol na koncentracijo/ časovno to čko; skupno 10 živali. 
— Pet skupin živali se izpostavi nižji koncentraciji (  d ) (1/2 L) z malce 
daljšimi obdobji izpostavljenosti (razmaknjenimi glede na faktor √2; 
glej sliko 1).  
↓ 
Izpostavitev III – glavna študija  
— 1 žival/spol na koncentracijo/ časovno to čko; skupno 10 živali. 
— Pet skupin živali se izpostavi nižji koncentraciji (  d ) (1/4 L) z malce 
daljšimi obdobji izpostavljenosti (razmaknjenimi glede na faktor √2; 
glej sliko 1).  
↓ 
Izpostavitev IV’ – glavna študija  
— 1 žival/spol na koncentracijo/ časovno to čko; skupno 10 živali. 
— Pet skupin živali se izpostavi nižji koncentraciji (  d ) (1/8 L) z malce 
daljšimi obdobji izpostavljenosti (razmaknjenimi glede na faktor √2; 
glej sliko 1).  
↓ ali ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 234  
( a ) Če informacije o ob čutljivosti glede na spol niso na voljo, se uporabijo podgane obeh 
spolov, tj. 1 žival/spol na koncentracijo. Na podlagi obstoje čih informacij ali če se med 
to izpostavitvijo izkaže, da je en spol ob čutljivejši, se v nadaljnjem preskušanju uporabi 
10 živali ob čutljivejšega spola (2 živali na koncentracijo/ časovno to čko) pri vsaki 
koncentraciji. 
( b ) Kadar se uporablja Uredba (ES) št. 1272/2008, so mejne koncentracije za pline, hlape in 
aerosole 20 000 ppm, 20 mg/l oziroma 5 mg/l. Nižje za četne koncentracije je treba 
izbrati, če se pričakuje strupenost ali na podlagi rezultatov opazovalne študije. V primeru 
zakonodajnih ali znanstvenih potreb se lahko uporabijo višje koncentracije. 
( c ) Po možnosti je treba z izpostavljanjem živali naslednji ravni koncentracije po čakati, 
dokler ni mogo če z razumno gotovostjo sklepati o preživetju predhodno tretiranih živali. 
Tako lahko vodja študije prilagodi ciljno koncentracijo in obdobja za naslednjo izposta ­
vitev. 
( d ) Minimalni odmerek (koncentracija × čas), ki je povzro čil smrtnost med preskušanjem pri 
začetni koncentraciji (prva izpostavitev), se upošteva kot smernica za dolo čitev naslednje 
kombinacije koncentracije in obdobij izpostavljenosti. Obi čajno se koncentracija prepo ­
lovi (1/2 L), živali pa se izpostavijo v novem časovnem razponu z drobnejšo mrežo, ki 
vključuje geometri čno razporeditev obdobij izpostavljenosti glede na faktor 1,4 ( √2; glej 
vir (11)) okoli časa v skladu z minimalno smrtno velikostjo odmerka ( čas × koncentracija), 
opaženo pri prvi izpostavitvi. Na zgornji sliki (slika 1) je bila smrtnost pri izpostavitvi I 
najprej opažena pri 15 min, zato se obdobja v izpostavitvi II razporedijo okoli 30 min, tako 
da znašajo 15, 21, 30, 42 in 60 min. Po prvih dveh izpostavitvah se mo čno priporo ča, da 
se podatki prikažejo v podobnem diagramu, kot je prikazan na zgornji sliki, ter da se 
preveri, ali ima razmerje med koncentracijo in časom kót 45 stopinj (n = 1) oziroma ali je 
razmerje koncentracija- čas-odziv manj strmo (npr. n = 2) oziroma strmejše (npr. n = 0,8). 
V zadnjih dveh primerih se mo čno priporo ča, naj se naslednje koncentracije in obdobja 
ustrezno prilagodijo.
 Izpostavitev IV – glavna študija  
— 1 žival/spol na koncentracijo/ časovno to čko; skupno 10 živali. 
— Pet skupin živali se izpostavi višji koncentraciji (  e ) (2 L) z malce krajšimi 
obdobji izpostavljenosti (razmaknjenimi glede na faktor √2; glej sliko 1).  
Matemati čna obdelava rezultatov za protokol C × t  
11. Postopek C × t, ki zajema 4 ali 5 koncentracij izpostavljenosti in pet obdobij, 
da 20 oziroma 25 podatkovnih to čk. S temi podatkovnimi to čkami se lahko 
razmerje C × t izra čuna s statisti čno analizo (16):  
Enačba 1 
VerjetnostðPÞ ¼ b 0 þ b 1 ln C þ b 2 ln t 
kjer je C = koncentracija; t = obdobje izpostavljenosti, ali  
Enačba 2 
Odziv ¼ ƒðC n tÞ 
kjer je  n ¼ b 1=b 2: 
Z enačbo 1 se lahko izra čuna vrednost LC  50 za dano časovno obdobje (npr. 4 
ure, 1 uro, 30 minut ali katero koli časovno obdobje v razponu preskuševanih 
časovnih obdobij) z uporabo P = 5 (50-odstotni odziv). Opozoriti je treba, da 
Haberjevo pravilo velja samo, kadar je n = 1. Vrednost LC  01 se lahko 
izračuna z uporabo P = 2,67.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 235  
( e ) V nekaterih primerih je morda treba pove čati koncentracijo (2 L) v novem časovnem 
razponu s še drobnejšo mrežo, ki vklju čuje geometri čno razporeditev obdobij izposta ­
vljenosti glede na faktor 1,4 ( √2) okoli časa v skladu z minimalno smrtno koncentracijo, 
opaženo v prvi izpostavitvi. Po možnosti mora biti najkrajše obdobje izpostavljenosti 
daljše od 5 minut, najdaljše obdobje izpostavljenosti pa ne sme presegati 8 ur.;
 B.3 AKUTNA STRUPENOST (V STIKU S KOŽO)  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Glej Splošni uvod dela B (A).  
1.2 OPREDELITVE 
Glej Splošni uvod dela B (B).  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Jih ni.  
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Preskusna snov se nanese na kožo v stopnjevanih odmerkih ve č 
skupinam poskusnih živali, pri čemer se uporabi en odmerek na 
skupino. Nato se opazujejo u činki in smrtnost. Na živalih, ki med 
preskusom poginejo, se opravi obdukcija, ob koncu preskusa pa tudi na preživelih živalih. 
Živali, ki kažejo hude in dolgotrajne znake stresa in bole čine, bo 
morda treba humano usmrtiti. Odmerjanja preskusnih snovi na na čin, 
za katerega je znano, da povzro ča izrazito bole čino in stres zaradi 
jedkih ali dražilnih lastnosti, ni treba izvesti.
 
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Jih ni.  
1.6 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.6.1  Priprave  
Najmanj pet dni pred za četkom preskusa se živali nastanijo v 
preskusnih kletkah v preskusnih pogojih nastanitve in hranjenja. 
Pred preskusom se zdrave mlade odrasle živali naklju čno izberejo 
in dodelijo tretiranim skupinam. Približno 24 ur pred preskusom je treba živalim s hrbtnega dela trupa s striženjem ali britjem odstraniti dlako. Med striženjem ali britjem dlake je treba paziti, da se koža ne 
odrgne, kar bi lahko spremenilo njeno prepustnost. Za nanos 
preskusne snovi je treba pripraviti najmanj 10 % telesne površine. Pri preskušanju trdnih snovi, ki se po potrebi lahko uprašijo, je treba preskusno snov dovolj navlažiti z vodo ali, kadar je potrebno, 
ustreznim nosilcem, da se zagotovi dober stik s kožo. Pri uporabi 
nosilca je treba upoštevati njegov vpliv na prodiranje preskusne snovi skozi kožo. Teko če preskusne snovi se obi čajno uporabljajo 
nerazredčene.
 
1.6.2  Preskusni pogoji  
1.6.2.1  Poskusne živali  
Uporabi se lahko odrasla podgana ali kunec. Uporabijo se lahko tudi 
druge vrste, vendar je treba njihovo uporabo utemeljiti. Uporabiti je treba splošno uporabljane laboratorijske seve. Ob za četku preskusa 
pri nobenem spolu obmo čje nihanja mase uporabljenih živali ne sme 
presegati ± 20 % ustrezne srednje vrednosti.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 236
 
1.6.2.2  Število in spol  
Na vsako velikost odmerka se uporabi najmanj 5 živali. Vse morajo 
biti istega spola. Če se uporabijo samice, morajo biti nulipare in 
nebreje. Kadar so na voljo informacije, da je eden od spolov izrazito 
občutljivejši, je treba snov odmeriti živalim tega spola.  
Opomba:  Pri preskusih akutne strupenosti na živalih iz sistematskih 
skupin, višjih od glodavcev, je treba razmisliti o uporabi manjšega 
števila živali. Odmerke je treba skrbno izbrati in treba si je čim bolj 
prizadevati, da se ne presežejo zmerno strupeni odmerki. Pri takih preskusih se je treba izogibati dajanju smrtnih odmerkov preskusne snovi.
 
1.6.2.3  Velikost odmerkov  
Teh mora biti dovolj, najmanj tri, in biti morajo v primernih inter ­
valih koncentracij, da pri preskusnih skupinah povzro čijo niz razli ­ 
čnih strupenih u činkov in stopenj umrljivosti. Pri dolo čanju velikosti 
odmerkov je treba upoštevati vse dražilne ali jedke u činke. Podatki 
morajo zadoš čati za izdelavo krivulje odmerek/odziv in, kadar je 
mogoče, omogo čiti sprejemljivo dolo čitev LD  50 . 
1.6.2.4  Mejni preskus  
Lahko se izvede mejni preskus pri eni velikosti odmerka najmanj 
2 000 mg/kg telesne mase na skupini 5 samcev in 5 samic po spodaj opisanem postopku. Če se pojavi smrtnost, povezana s snovjo, bo 
morda potrebna popolna študija.
 
1.6.2.5  Obdobje opazovanja  
Obdobje opazovanja mora trajati najmanj 14 dni. Vendar trajanje 
opazovanja ne sme biti strogo dolo čeno. Dolo čeno mora biti na 
podlagi reakcij na strupenost, hitrosti njihovega pojavljanja in 
dolžine obdobja okrevanja; kadar se zdi potrebno, se lahko podaljša. 
Čas pojava in izginotja znakov strupenosti, njihovo trajanje ter čas 
smrti so pomembni, zlasti če se kaže težnja časovnega zamika smrti.  
1.6.3  Postopek  
Vsaka žival mora biti v svoji kletki. Preskusno snov je treba enako ­
merno nanesti na obmo čje, ki predstavlja približno 10 % skupne 
telesne površine. Pri zelo strupenih snoveh je lahko površina nanosa 
manjša, vendar mora biti čim več površine pokrite s čim tanjšo in 
enakomerno plastjo. 
Snov mora ostati v stiku s kožo celo 24-urno obdobje izpostavljeno ­
sti, kar se zagotovi s poroznim gaznim povojem in nedražilnim 
obližem. Preskusna površina mora biti dodatno ustrezno pokrita, da gazni povoj in preskusna snov ostaneta na istem mestu in se živalim prepreči zaužitje preskusne snovi. Za prepre čitev zaužitja se lahko 
uporabijo pripomo čki za omejevanje gibanja, vendar popolna imobi ­
lizacija ni priporo čena metoda.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 237
 
Ob koncu obdobja izpostavljenosti se ostanek preskusne snovi 
odstrani, kadar je to izvedljivo, z vodo ali kako drugo ustrezno 
metodo čiščenja kože. 
Opazovanja se beležijo sistemati čno in sproti. Za vsako žival je treba 
voditi svojo evidenco. Prvi dan morajo biti opazovanja pogosta. Najmanj enkrat na vsak delavnik je treba izvesti temeljit klini čni 
pregled, druga opazovanja pa se izvajajo vsak dan, z ustreznimi 
ukrepi za zmanjševanje izgube živali v študiji, npr. z obdukcijo ali ohladitvijo poginulih živali in osamitvijo ali žrtvovanjem šibkih ali umirajočih živali. 
Opazovati je treba spremembe na kožuhu, tretirani koži, o čeh in 
sluznici ter tudi v dihalih, obto čilih, avtonomnem in osrednjem 
živčevju, somatomotori čni aktivnosti in vedenjskem vzorcu. S 
posebno pozornostjo je treba opazovati tremor, kr če, slinjenje, 
diarejo, letargijo, spanje in komo. Čas smrti je treba zapisati kolikor 
je mogoče natančno. Na živalih, ki poginejo med preskušanjem, in 
tistih, preživelih ob koncu preskusa, se opravi obdukcija. Zapisati je treba vse makroskopske patološke spremembe. Kadar je tako nave ­
deno, je treba vzeti vzorec tkiva za histopatološko preiskavo.
 
Ocena strupenosti pri drugem spolu  
Po zaklju čku študije na enem spolu, se snov odmeri najmanj eni 
skupini 5 živali drugega spola, da se ugotovi, ali so živali tega 
spola izrazito ob čutljivejše za preskusno snov. V posameznih 
primerih je upravi čena uporaba manjšega števila živali. Kadar so 
na voljo zadovoljive informacije, ki kažejo, da so živali preskuše ­
nega spola izrazito ob čutljivejše, preskušanje živali drugega spola ni 
potrebno.  
2. PODATKI  
Podatke je treba povzeti v tabeli, ki za vsako preskusno skupino 
prikazuje število živali na za četku preskusa, čas smrti posameznih 
živali, število živali, ki kažejo druge znake strupenosti, opis stru ­
penih učinkov in izsledke obdukcije. Maso posameznih živali je 
treba dolo čiti in zapisati tik pred nanašanjem preskusne snovi, 
vsak teden po tem ter ob smrti; spremembe v masi je treba izra čunati 
in zapisati, kadar preskusna žival preživi ve č kakor en dan. Živali, ki 
se humano usmrtijo zaradi s snovjo povezanih stresa in bole čine, se 
zapišejo kot s snovjo povezane smrti. LD  50 je treba dolo čiti s 
pomočjo priznane metode. 
Vrednotenje podatkov mora vklju čevati vrednotenje morebitnih 
razmerij med izpostavljenostjo živali preskusni snovi ter incidenco 
in resnostjo vseh nepravilnosti, vklju čno z vedenjskimi in klini čnimi 
nepravilnostmi, hujšimi poškodbami, spremembami v telesni masi, smrtnostjo in kakršnimi koli drugimi strupenimi u činki.
 
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
V poročilo o preskusu se, če je možno, vklju čijo naslednje informa ­
cije: ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 238
 
— vrsta, sev, vir, okoljski pogoji, prehrana itd., 
— preskusni pogoji (vklju čno z metodo čiščenja kože in vrsto 
povoja: okluzivni ali neokluzivni), 
— velikost odmerkov (z nosilcem, če se uporablja, in koncentraci ­
jami), 
— spol živali, ki so prejele preskusno snov, — tabelarni prikaz podatkov o odzivu po spolu in velikosti odmerka 
(tj. število živali, ki so poginile ali so bile usmr čene med presku ­
som; število živali, ki kažejo znake strupenosti; število izposta ­
vljenih živali), 
— čas smrti po odmerjanju, razlogi in merila za humano usmrtitev 
živali, 
— vsa opažanja, — vrednost LD
 50 za spol, na katerem je bila opravljena popolna 
študija, dolo čena po 14 dneh z navedeno metodo dolo čanja, 
— 95 % interval zaupanja za LD  50 (kadar je to mogo če), 
— krivulja odmerek/smrtnost in naklon, kadar to omogo ča metoda 
določanja, 
— izsledki obdukcije, — kakršni koli izsledki histopatoloških preiskav, — rezultati kakršnih koli preskusov na drugem spolu, — razprava o rezultatih (posebno pozornost je treba posvetiti more ­
bitnemu u činku humanih usmrtitev živali med preskusom na 
izračunano vrednost LD
 50 ), 
— razlaga rezultatov.  
3.2 VREDNOTENJE IN RAZLAGA 
Glej Splošni uvod dela B (D).  
4. VIRI  
Glej Splošni uvod dela B (E).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 239
 
B.4 AKUTNA TOKSI ČNOST: DERMALNA DRAŽILNOST/JEDKOST  
1. METODA  
Ta metoda ustreza OECD TG 404 (2002).  
1.1 UVOD 
Pri pripravi te dopolnjene metode je veljala posebna pozornost 
možnim izboljšavam v zvezi s skrbjo za zdravje živali in vrednotenje vseh obstoje čih informacij o preskusni snovi, da bi se izognili nepo ­
trebnemu preskušanju na laboratorijskih živalih. Ta metoda vklju čuje 
priporočilo, da je treba pred za četkom opravljanja preskusa za dražil ­
nost/jedkost snovi  in vivo  opraviti analizo tehtnosti dokazov na 
podlagi pomembnih obstoje čih podatkov. Kadar ni na voljo dovolj 
podatkov, se lahko pridobijo z uporabo zaporednega preskušanja (1). 
Strategija preskušanja vklju čuje opravljanje validiranih in sprejetih  in 
vitro  preskusov in je podana kot dodatek k tej metodi. Kjer je to 
ustrezno, je poleg tega priporo čena zaporedna aplikacija treh 
preskusnih obližev na živali v za četnem preskusu  in vivo  namesto 
sočasne. 
Za znanstveno zanesljivost in zdravje živali je koristno, da se presku ­ 
šanje  in vivo  ne začne opravljati, dokler se niso ocenili vsi razpolo ­ 
žljivi podatki, pomembni za možno dermalno dražilnost/jedkost 
snovi z analizo tehtnosti dokazov. Takšni podatki bodo vklju čevali 
dokaze obstoje čih študij na ljudeh in/ali laboratorijskih živalih, 
dokaze o dražilnosti/jedkosti ene ali ve č strukturno sorodnih snovi 
ali mešanic takšnih snovi, podatke, ki bodo dokazovali mo čno kislost 
ali alkalnost snovi (2)(3), in rezultate iz validiranih in sprejetih  in 
vitro  ali ex vivo  preskusov (4)(5)(5a). Ta analiza bi morala zmanjšati 
potrebo po  in vivo  preskušanju dermalne jedkosti/dražilnosti snovi, 
za katere obstaja že dovolj dokazov iz drugih študij glede navedenih 
dveh kon čnih točk. 
Bolj upoštevana strategija zaporednega preskušanja, ki vklju čuje 
opravljanje validiranih in sprejetih  in vitro  ali ex vivo  preskusov za 
jedkost/dražilnost, je vklju čena kot dodatek k tej metodi. To strate ­
gijo so razvili in soglasno priporo čili udeleženci OECD delavnice (6) 
in se je sprejela kot priporo čena strategija preskušanja v Globalno 
usklajenem sistemu za razvrstitev kemijskih snovi (GHS) (7). Pripo ­
ročeno se je ravnati po tej strategiji preskušanja pred opravljanjem 
preskušanja  in vivo.  Za nove snovi je priporo čen postopen na čin 
preskušanja za pridobivanje znanstveno zanesljivih podatkov o 
jedkosti/dražilnosti snovi. Za obstoje če snovi, za katere ni dovolj 
podatkov, je treba uporabiti to strategijo za zapolnitev vrzeli manj ­
kajočih podatkov. Uporabo druga čne strategije preskušanja ali 
postopka ali odlo čitev, da se ne bo uporabil na čin preskušanja po 
korakih, je treba upravi čiti. 
Če določitev jedkosti ali dražilnosti ni mogo ča na podlagi analize 
tehtnosti dokazov, skladne s strategijo zaporednega preskušanja, je 
treba upoštevati preskus  in vivo  (glej Dodatek).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 240
 
1.2 DEFINICIJE  
Dermalna dražilnost:  je nastanek reverzibilne poškodbe kože, ki 
sledi uporabi preskusne snovi, trajajo či do 4 ure.  
Dermalna jedkost:  je nastanek ireverzibilne poškodbe kože, in sicer 
vidne nekroze skozi epidermisa in v dermis, ki sledi uporabi 
preskusne snovi, trajajo či do 4 ure. Za jedke reakcije so zna čilni 
čiri, krvavitve, krvave kraste in na koncu štirinajstdnevnih opazovanj 
sprememba barve zaradi pobledele kože, celi predeli plešavosti in 
brazgotine. Treba je upoštevati histopatologijo za vrednotenje 
sumljivih lezij.  
1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Snov, ki jo je treba preskusiti, se nanese na kožo preskusne živali v 
enkratnem odmerku; netretirane površine kože preskusne živali služijo za kontrolo. Stopnja dražilnosti/jedkosti se od čita in zabeleži 
v določenih intervalih in nadalje opiše, da se zagotovi celovito vred ­
notenje reverzibilnosti ali ireverzibilnosti opaženih u činkov. 
Živali, ki kažejo trajne znake hudega trpljenja in/ali bole čine v kateri 
koli fazi preskusa je treba humano usmrtiti in snov skladno s tem 
oceniti. Kriterije za sprejem odlo čitve o humani usmrtitvi umirajo čih 
in hudo trpe čih živali je mogo če najti v sklicu (8).
 
1.4 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.4.1  Priprava za preskus  in vivo  
1.4.1.1  Izbira živalskih vrst  
Kunec beli čnik je najbolj zaželena laboratorijska žival in uporabljajo 
se zdravi mladi odrasli kunci. Za uporabo drugih vrst je potrebna 
obrazložitev.  
1.4.1.2  Priprava živali  
Približno 24 ur pred preskusom je treba odstraniti kožuh s skrbnim 
striženjem na hrbtnem delu trupa živali. Paziti je treba, da se ne odrgne koža in uporabiti le živali z zdravo, nepoškodovano kožo. 
Nekateri kun čji sevi imajo goste zaplate dlak, ki so bolj izrazite v 
nekaterih obdobjih med letom. Takšni predeli goste rasti dlak se ne smejo uporabiti kot preskusni predeli.
 
1.4.1.3  Pogoji bivanja in hranjenja  
Živali morajo imeti vsaka svoj prostor. Temperatura prostora za 
preskuse z živalmi mora znašati za kunce 20  o C (± 3  o C). Čeprav 
mora biti relativna vlažnost najmanj 30 % in po možnosti ne sme 
presegati 70 %, mora biti ciljna vlažnost, razen med čiščenjem 
prostora, 50 do 60 %. Osvetlitev mora biti umetna v zaporedju 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporabijo obi čajne 
predpisane laboratorijske vrste hrane z neomejeno koli čino pitne 
vode.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 241
 
1.4.2  Preskusni postopek  
1.4.2.1  Aplikacija preskusne snovi  
Preskusno snov je treba nanesti na del površine kože (približno 
6 cm) in pokriti z obližem iz gaze, ki se pritrdi z nedražilnim trakom. 
Kadar neposredna aplikacija ni mogo če (npr. teko če snovi ali neka ­
tere kašnate zmesi), je treba preskusno snov najprej nanesti na obliž iz gaze, ki se nato uporabi na koži. Obliž mora biti v ohlapnem stiku s kožo, pritrjen z ustrezno napol zapiralno obvezo med trajanjem 
izpostavitve. Če se preskusna snov nanese na obliž, jo je treba 
pritrditi na kožo na takšen na čin, da je stik dober in snov enako ­
merno razporejena po koži. Treba je prepre čiti živali dostop do 
obliža in zaužitje ali vdihavanje preskusne snovi. 
Tekoče preskusne snovi se navadno uporabljajo nerazred čene. Kadar 
se preskušajo trdne snovi (ki se jih lahko zdrobi, če je to po presoji 
potrebno), je treba preskusno snov navlažiti z zelo majhno koli čino 
vode (ali, kadar je potrebno, z drugim ustreznim nosilcem), ki zado ­
stuje za zagotavljanje dobrega stika s kožo. Kadar se uporabljajo 
drugi nosilci in ne voda, mora biti možen vpliv nosilca na dražilnost 
kože zaradi preskusne snovi minimalen, če sploh kateri. 
Na koncu obdobja izpostavljenosti, ki traja obi čajno 4 ure, je treba 
odstraniti preostalo preskusno snov, kjer je to izvedljivo, z uporabo vode ali ustreznega topila, ne da bi se spremenil obstoje či odziv ali 
integriteta epidermisa.
 
1.4.2.2  Velikost odmerka  
Odmerek 0,5 ml teko če snovi ali 0,5 g trdne snovi ali kašnate zmesi 
se nanese na preskusni predel.  
1.4.2.3  Začetni preskus (dermalni preskus dražilnosti/jedkosti in vivo z 
uporabo ene živali)  
Močno je priporo čeno, da se preskus  in vivo  na začetku izvede z 
uporabo ene živali, zlasti kadar se za snov domneva, da je poten ­
cialno jedka. To je v skladu s strategijo zaporednega preskušanja 
(glej Dodatek 1). 
Kadar se za snov na podlagi analize tehtnosti dokazov presodi, da je 
jedka, ni potrebno nadaljnje preskušanje na živalih. Za ve čino snovi, 
za katere se domneva, da so jedke, nadaljnje preskušanje  in vivo  
običajno ni potrebno. Kadar se kljub temu zdi potrebno zagotoviti 
dodatne podatke zaradi pomanjkljivih dokazov, se lahko izvede 
preskušanje na živalih z uporabo naslednjega pristopa: Na žival se zaporedoma nanesejo do trije preskusni obliži. Prvi obliž se odstrani po treh minutah. Če ni opazna nobena resna reakcija kože, se nanese 
drugi obliž in se odstrani po eni uri. Če kažejo opazovanja v tej fazi, 
da se na human na čin lahko dopusti podaljšanje izpostavljenosti na 
štiri ure, se nanese tretji obliž in se odstrani po štirih urah, odziv pa se razvrsti po stopnjah. 
Če se opazi jedek u činek po kateri koli izmed teh treh zaporednih 
izpostavitev, se preskus nemudoma zaklju či. Če se jedek u činek ne 
opazi po tem, ko se odstrani zadnji obliž, se žival opazuje 14 dni, 
razen kadar se jedkost razvije v zgodnejši časovni to čki.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 242
 
Kadar se ne pri čakuje, da bo preskusna snov povzro čila jedkost, a bi 
lahko bila dražilna, je treba nanesti le en obliž na eno žival za štiri 
ure. 
1.4.2.4  Potrditveni preskus (dermalni preskus dražilnosti in vivo z dodatnimi 
živalmi)  
Če se jedek u činek ne opazi v za četnem preskusu, je treba dražilni 
ali negativni odziv potrditi z uporabo do dveh dodatnih živali, s po enim obližem za vsako, v obdobju izpostavitve štirih ur. Če se v 
začetnem preskusu opazi dražilen u činek, se potrditveni preskus 
lahko naredi na zaporeden na čin ali s so časno izpostavitvijo dveh 
dodatnih živali. Izjemoma, ko se za četni preskus ne izvaja, se lahko 
dve ali tri živali tretira le z enim obližem, ki se odstrani po štirih urah. Kadar se uporabljata dve živali, ni potrebno nadaljnje presku ­ 
šanje, če obe kažeta enak odziv. V nasprotnem primeru se preskusi 
tudi tretja žival. Možno je, da bo treba oceniti dvomljive odzive z uporabo dodatnih živali.
 
1.4.2.5  Obdobje opazovanja  
Obdobje opazovanja mora trajati dovolj dolgo, da se lahko v celoti 
ovrednoti reverzibilnost opaženih u činkov. Preskus je treba zaklju čiti 
ob katerem koli času, kadar kaže žival trajajo če znake hude bole čine 
ali okvar. Za dolo čitev reverzibilnosti u činkov je treba živali opazo ­
vati 14 dni po odstranitvi obližev. Če se opazi reverzibilnost pred 
potekom 14 dni, je treba v tistem času preskus zaklju čiti. 
1.4.2.6  Klini čna opazovanja in razvrstitev reakcij kože v stopnje  
Vse živali je treba pregledati, ali imajo znake rde čine in edemov, ter 
odzive zabeležiti po 60 minutah in nato po 24, 48 in 72 urah po 
odstranitvi obliža. Za za četne preskuse na eni živali se pregleda tudi 
preskusni predel takoj za tem, ko se obliž odstrani. Dermalne reak ­
cije se razvrstijo v stopnje in zabeležijo v skladu s stopnjami iz 
tabele spodaj. Če nastane poškodba kože, ki je ni mogo če opredeliti 
kot dražilnost ali jedkost po 72 urah, bodo morda potrebna opazo ­
vanja do štirinajstega dne za opredelitev reverzibilnosti u činkov. 
Poleg opazovanja dražilnosti je treba v celoti zapisati in zabeležiti 
vse lokalne toksi čne učinke, kakor npr. tanjšanje kože in vse 
sistemske nasprotne u činke (npr. u činke na klini čne znake toksi čnosti 
in telesno težo). Za razjasnitev dvomljivih odzivov je treba opraviti histopatološki pregled. 
Razvrščanje kožnih odzivov je nujno subjektivno. Da bi pospešili 
usklajevanje pri razvrš čanju kožnih odzivov in nudili pomo č presku­ 
ševalnim laboratorijem ter vsem sodelujo čim pri oblikovanju in 
razlagi rezultatov opazovanj, mora biti osebje, ki izvaja ta opazova ­
nja, ustrezno usposobljeno, da obvlada uporabljeni sistem dolo čanja 
stopnje (glej tabelo spodaj). Pri tem bi lahko bil v pomo č ilustriran 
priročnik za dolo čanje stopnje dermalne dražilnosti in drugih 
poškodb (9).
 
2. PODATKI  
2.1 OBDELAVA REZULTATOV 
Rezultati študije se morajo povzeti v obliki preglednice v kon čnem 
poročilu o preskusu in morajo zajemati vse postavke s seznama v 
oddelku 3.1.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 243
 
2.2 VREDNOTENJE REZULTATOV 
Rezultate dermalne dražilnosti je treba vrednotiti v povezavi z vrsto 
in resnostjo lezij ter njihovo reverzibilnostjo ali pomanjkanjem rever ­
zibilnosti. Posamezni rezultati ne predstavljajo absolutnega standarda 
za dražilne lastnosti materiala, ker se vrednotijo tudi drugi u činki 
preskusnega materiala. Namesto tega je treba razumeti posamezne rezultate kot referen čne vrednosti, ki jih je treba ovrednotiti v 
zvezi z vsemi drugimi opazovanji iz študije. Reverzibilnost 
dermalnih lezij je treba upoštevati pri oceni dražilnih odzivov. 
Kadar so odzivi, kakor npr. plešavost, hiperkeratoza, hiperplazija in 
luščenje vidni do konca 14-dnevnega obdobja opazovanja, se 
preskusna snov obravnava kot dražilna.
 
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije, kot je 
primerno: 
Obrazložitev za preskušanje  in vivo : analiza tehtnosti dokazov iz prej 
obstoječih preskusnih podatkov, vklju čno z rezultati strategije zapo ­
rednega preskušanja: 
— opis pomembnih podatkov, ki so na voljo pred preskušanjem, 
— podatki, pridobljeni v vsaki fazi strategije preskušanja, 
— opis opravljenih  in vitro  preskusov, vklju čno s podrobnimi 
podatki o postopkih, rezultati, dobljeni s preskusnimi/referen ­ 
čnimi snovmi, 
— analiza tehtnosti dokazov za opravljanje študije  in vivo . 
Preskusna snov: — identifikacijski podatki (npr. številka CAS; vir, čistost, znane 
nečistoče, številka skupine), 
— fizikalno stanje in fizikalno-kemijske lastnosti (npr.: pH hlapnost, 
topnost, stabilnost), 
— če gre za mešanico, sestava in relativni odstotek sestavin. 
Nosilec: 
— identifikacija, koncentracija (kjer je ustrezno), uporabljeni volu ­
men, 
— obrazložitev upravi čenosti izbire nosilca. 
Preskusne živali: 
— uporabljena vrsta/sev, obrazložitev uporabe živali, če to ni kunec 
beličnik, 
— število živali istega spola, 
— teže posameznih živali na za četku in na zaklju čku preskusa, 
— starost na za četku študije, 
— vir živali, pogoji bivanja, vrsta hranjenja, itd.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 244
 
Pogoji preskusa: 
— tehnika priprave predela za obliž, — podrobni podatki o uporabljenih materialih za obliže in tehnika 
dela z obliži, 
— podrobni podatki o pripravi preskusne snovi, aplikaciji in odstra ­
nitvi. 
Rezultati: 
— preglednica doseženih rezultatov odziva na dražilnost/jedkost za 
vsako žival na vseh izmerjenih časovnih to čkah, 
— opis vseh opaženih lezij, 
— pripovedni opis vrste in stopnje opažene dražilnosti ali jedkosti in 
katere koli histopatološke ugotovitve, 
— opis drugih nasprotnih, lokalnih (npr. tanjšanje kože) in sistem ­
skih učinkov poleg derrmalne dražilnosti in jedkosti. 
Razprava o rezultatih.
 
4. LITERATURA  
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of 
Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. 
ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429. 
(2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro , 2, 19–26. 
(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation 
of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. 
ATLA 26, 709–720. 
(4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, „Skin Irritation“, European 
Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels. 
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on  in vitro  
tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524. 
(5a) Testing Method B.40 Skin Corrosion. 
(6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final 
Report of the OECD Workshop on Harmonization of Valida ­
tion and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test 
Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http:// www.oecd1.org/ehs/test/background.htm). 
(7) OECD (1998) Harmonized Integrated H azard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemi ­
cals Committee and the Working Party on Chemicals, November 
1998 (http://www.oecd1.org/ehs/Class/HCL6.htm).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 245
 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Asses ­
sment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for 
Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Envi ­
ronmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd1.org/ehs/test/mo ­
nos.htm). 
(9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions,  (20T-2004).  United 
States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. 
[Available from OECD Secretariat upon request].
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 246
 
Tabela I  
UVRŠČANJE KOŽNIH REAKCIJ V STOPNJE  
Nastanek rde čine in krast  
Rdečine ni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Neznatna rde čina (komajda opazna) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Zelo razlo čna rdečina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 
Rdečina od zmerne do resne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Resna rde čina (goveja rde čina) in nastanek krast ovirata razvrstitev 
rdečine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  4 
Največ možnih: 4  
Tvorba kožnih oteklin  
Kožnih oteklin ni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Neznatna kožna oteklina (komajda opazna) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Rahla oteklina (robovi predela dobro vidni, ker so izbo čeni) . . . . . . . . . 2 
Zmerna kožna oteklina (izbo čena približno 1 mm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Resna kožna oteklina (izbo čena več kakor 1 mm in razširjena izven 
predela izpostavitve) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 
Največ možnih: 4 
Za razjasnitev dvomljivih odzivov se lahko opravi histopatološki pregled.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 247
 
Dodatek  
Zaporedna strategija preskušanja za dermalno dražilnost in jedkost  
SPLOŠNO  
Za znanstveno zanesljivost in zdravje živali se je pomembno izogniti nepotrebni 
uporabi živali in zmanjšati kakršna koli preskušanja, za katera je verjetno, da 
bodo povzro čila resne odzive pri živalih. Vse informacije o snovi, ki so nanašajo 
na možnost njene kožne jedkosti/dražilnosti, je treba oceniti pred odlo čitvijo 
o preskušanju  in vivo . Mogoče že obstaja dovolj dokazov za razvrstitev 
preskusne snovi glede na njen potencial dermalne jedkosti ali dražilnosti, ne 
da bi bilo treba opraviti preskušanja na laboratorijskih živalih. Analiza tehtnosti 
dokazov in strategija zaporednega preskušanja bosta zato zmanjšali potrebo po preskušanju  in vivo , zlasti če je verjetno, da bo snov povzro čila resne reakcije. 
Priporočeno je, da se analiza tehtnosti dokazov uporabi za ovrednotenje obsto ­
ječih informacij v zvezi s kožno dražilnostjo in jedkostjo snovi za odlo čitev, ali 
je treba opraviti poleg dermalnih študij  in vivo  dodatne študije, ki bi pomagale 
ugotoviti lastnosti takšnega potenciala. Kadar so potrebne nadaljnje študije, je priporočena uporaba strategije zaporednega preskušanja za pridobitev ustreznih 
eksperimentalnih podatkov. Za snovi, ki nimajo anamneze preskušanja, je treba 
uporabiti strategijo preskušanja, da se pridobi potrebni niz podatkov za ovredno ­
tenje njenega potenciala dermalne jedkosti/dražilnosti. Strategija preskušanja, ki je opisana v tem dodatku, se je razvila v OECD delavnici (1) in se je kasneje 
uveljavila in razširila v Usklajeni integrirani sistem razvrstitve snovi, nevarnih za 
zdravje ljudi, in okoljskih u činkov kemijskih snovi, kakor je potrdilo 28. Skupno 
zasedanje Odbora za kemikalije in Delovna skupina za kemikalije novembra 1998 (2). 
Čeprav zaporedno preskušanje ni bistven del metode preskušanja B.4, odraža 
priporočeni pristop za dolo čanje značilnosti kožne dražilnosti/jedkosti. Ta pristop 
predstavlja hkrati najboljši obi čajen postopek in eti čno merilo uspešnosti za 
preskušanje  in vivo  za kožno dražilnost/jedkost. Metoda preskušanja vsebuje 
smernice za opravljanje preskusa  in vivo  in povzema dejavnike, ki jih je treba 
upoštevati pred za četkom takšnega poskusa. Strategija opredeljuje pristop za 
vrednotenje obstoje čih podatkov o lastnostih preskusne snovi glede kožne dražil ­
nosti/jedkosti in stopenjski pristop za pridobivanje ustreznih podatkov o snoveh, 
za katere se dodatne študije potrebujejo ali za katere se študije niso opravile. 
Priporoča tudi opravljanje validiranih in sprejetih preskusov  in vitro  ali ex vivo  za 
kožno jedkost/dražilnost v posebnih okoliš činah.
 
OPIS VREDNOTENJA IN STRATEGIJE PRESKUŠANJA  
Pred začetkom preskusov kot dela strategije zaporednega preskušanja (skica) je 
treba ovrednotiti vse informacije, ki so na voljo, da bi se odlo čili, ali je kožno 
preskušanje  in vivo  potrebno. Čeprav se pomembne informacije lahko pridobijo 
iz ocene posameznih parametrov (npr. najvišji pH), je treba upoštevati obstoje če 
informacije v celoti. Vse pomembne podatke o u činkih zadevne snovi ali analo ­
gnih snovi je treba oceniti pri sprejemanju odlo čitve na podlagi tehtnosti dokazov 
in navesti obrazložitev za to odlo čitev. Glavni poudarek mora biti na obstoje čih 
podatkih o snovi glede ljudi in živali, sledi izid preskušanja  in vitro  ali ex vivo . 
In vivo  študij jedkih snovi se je treba izogibati, kadar koli je to možno. Dejav ­
niki, upoštevani v strategiji preskušanja, vklju čujejo:  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 248
 
Vrednotenje obstoje čih podatkov za ljudi in živali (korak 1).  Najprej je treba 
upoštevati obstoje če podatke o ljudeh, npr. klini čne ali poklicne študije in poro ­ 
čila o primerih, in/ali preskusne podatke za živali (npr. iz ene same ali iz pona ­
vljajočih se študij toksi čnosti z dermalno izpostavitvijo), ker dajejo informacije, 
ki so neposredno povezane z u činki na kožo. Snovi z znano dražilnostjo ali 
jedkostjo in snovi, za katere je nedvomno dokazano, da niso jedke ali dražilne, 
ni treba preskusiti s študijami  in vivo . 
Analiza odnosov med strukturo in aktivnostjo (SAR) (korak 2).  Treba je upošte ­
vati rezultate preskušanj strukturno sorodnih snovi, če so na voljo. Kadar so na 
razpolago zadostni podatki o ljudeh in/ali živalih za strukturno sorodne snovi ali mešanice takšnih snovi, ki kažejo, kakšen je njihov potencial kožne jedkosti/ 
dražilnosti, se lahko domneva, da bo preskusna snov, ki se vrednosti, povzro čila 
enake odzive. V navedenih primerih preskusne snovi morda ne bo treba presku ­
siti. Negativni podatki študij strukturno sorodnih snovi ali mešanic takšnih snovi v skladu s strategijo zaporednega preskušanja niso zadosten dokaz 
o nejedkosti/nedražilnosti snovi. Treba je uporabiti validirane in sprejete SAR 
pristope za identifikacijo dermalne jedkosti kakor tudi potenciala dražilnosti.  
Fizikalno-kemijske lastnosti in kemijske reaktivnosti (korak 3).  Snovi, ki kažejo 
najvišje stopnje pH, kakor npr. ≤ 2,0 in ≥ 11,5, imajo lahko mo čne lokalne u činke. 
Če je najvišja stopnja pH podlaga za identificiranje snovi kot jedke za kožo, tedaj 
se lahko upošteva tudi njena kisla/alkalna rezerva (ali blažilna sposobnost) (3) (4). 
Če blažilna sposobnost nakazuje, da snov morda ni jedka za kožo, tedaj je treba 
opraviti nadaljnje preskušanje za potrditev le-tega, najbolje z uporabo validiranega in sprejetega preskusa  in vitro  ali ex vivo  (glej koraka 5 in 6).  
Dermalna toksi čnost (korak 4).  Če se je kemikalija izkazala za zelo toksi čno po 
dermalni poti, je možno, da dermalna študija dražilnosti/jedkosti  in vivo  ne bo 
izvedljiva, ker bi lahko koli čina preskusne snovi, ki se jo obi čajno uporablja, 
lahko presegala zelo toksi čen odmerek in bi sledil pogin ali hudo trpljenje živali. 
Poleg tega je mogo če, da tedaj, kadar so se že opravile študije dermalne toksi ­ 
čnosti z uporabo kuncev beli čnikov do mejne velikosti odmerka 2 000 mg/kg 
telesne teže ali ve čje, in se ni opazila nikakršna dermalna dražilnost ali jedkost, 
dodatno preskušanje za kožno dražilnost/jedkost ne bo potrebno. Upoštevati je treba številne pomisleke, kadar se vrednoti akutna dermalna toksi čnost 
v predhodno opravljenih študijah. Informacije o dermalnih lezijah so lahko nepo
­
polne. Preskušanje in opazovanja so se morda opravila na vrsti živali, ki ni bila 
kunec, in vrste se lahko zelo razlikujejo glede ob čutljivosti odzivov. Tudi oblika 
preskusne snovi, aplicirana na živali, morda ni bila primerna za ocenitev kožne dražilnosti/jedkosti (npr. razred čitev snovi za preskušanje dermalne toksi čnosti)­
(5). V tistih primerih, v katerih so se opravile skrbno na črtovane študije dermalne 
toksičnosti na kuncih, se negativne ugotovitve kljub temu lahko upoštevajo za 
zadosten dokaz, da snov ni jedka ali dražilna.  
Rezultati in vitro ali ex vivo preskusov (koraka 5 in 6).  Snovi, ki so pokazale 
jedke ali resne dražilne lastnosti v validiranem in sprejetem preskusu  in vitro  ali 
ex vivo  (6) (7), na črtovanem za ocenitev teh posebnih u činkov, ni treba preskusiti 
na živalih. Lahko se domneva, da bodo takšne snovi povzro čile podobne resne 
učinke in vivo .
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 249
 
Preskus in vivo na kuncih (koraka 7 in 8).  Če se sprejme odlo čitev o opravljanju 
preskušanja  in vivo  na podlagi ocene tehtnosti dokazov, se mora za četni preskus 
začeti z uporabo ene živali. Če rezultati tega preskusa pokažejo, da je snov jedka 
za kožo, nadaljnjega preskušanja ni treba opraviti. Če se v za četnem preskusu 
jedki učinek ni opazil, je treba potrditi dražilni ali negativni odziv z uporabo do 
dveh dodatnih živali s 4-urnim trajanjem izpostavljenosti. Če se v za četnem 
preskusu opazi dražilen u činek, se lahko potrditveni preskus izvede na zaporeden 
način, ali pa z izpostavitvijo obeh dodatnih živali isto časno.  
LITERATURA  
(1) OECD (1996). Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD 
Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm). 
(2) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as 
endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/ Class/HCL6.htm). 
(3) Worth, A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., 
Esdaile D.J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, 709–720. 
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988). Classifica ­
tion as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or 
Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxic In Vitro, 2 (1) pp. 
19–26. 
(5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996) Animal, Human, and In Vitro 
Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 1- 
56032-356-6, Chapter 31, 411–436. 
(6) Testing Method B.40. (7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 
2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, 
pp. 483–524.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 250
 
Skica  
STRATEGIJA PRESKUŠANJA IN VREDNOTENJA ZA DERMALNO DRAŽILNOST/JED ­
KOST
  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 251
 
B.5 AKUTNA TOKSI ČNOST: O ČESNA DRAŽILNOST/JEDKOST  
1. METODA  
Ta metoda ustreza OECD TG 405 (2002).  
1.1 UVOD 
Pri pripravi te dopolnjene metode je veljala posebna pozornost 
možnim izboljšavam z vrednotenjem vseh obstoje čih informacij o 
preskusni snovi, da bi se izognili nepotrebnemu preskušanju na labo ­
ratorijskih živalih zaradi skrbi za zdravje živali. Ta metoda vklju čuje 
priporočilo, da je treba pred za četkom opravljanja opisanega 
preskusa  in vivo  za akutno o česno dražilnost/jedkost opraviti analizo 
tehtnosti dokazov (1) na podlagi ustreznih obstoje čih podatkov. 
Kadar ni na voljo dovolj podatkov, je priporo čeno, da se pridobijo 
z uporabo zaporednega preskušanja (2)(3). Strategija preskušanja vključuje opravljanje validiranih in sprejetih  in vitro  preskusov in 
je dana kot dodatek k tej metodi preskušanja. Poleg tega je priporo ­ 
čena uporaba  in vivo  preskusa dermalne dražilnosti/jedkosti, da se 
predvidi o česna jedkost pred upoštevanjem o česnega preskusa  in 
vivo. 
Za znanstveno zanesljivost in zdravje živali je koristno, da se presku ­ 
šanje  in vivo  ne začne opravljati, dokler se niso ocenili vsi razpoložljivi 
podatki, pomembni za možno o česno dražilnost/jedkost snovi z analizo 
tehtnosti dokazov. Takšni podatki bodo vklju čevali dokaze iz obsto ­
ječih študij na ljudeh in/ali laboratorijskih živalih o dražilnosti/jedkosti 
ene ali ve č strukturno sorodnih snovi ali mešanic takšnih snovi, 
podatke, ki bodo dokazovali mo čno kislost ali alkalnost snovi (4)(5), 
in rezultate validiranih in sprejetih  in vitro  ali ex vivo  preskusov za 
kožno jedkost in dražilnost (6)(6a). Mogo če je, da so se te študije 
opravile na podlagi analize tehtnosti dokazov ali pa iz nje sledile. 
Za nekatere snovi lahko takšna analiza nakaže potrebo po  in vivo  
študijah potenciala o česne jedkosti/dražilnosti snovi. V takšnih 
primerih bi bilo bolje pred upoštevanjem uporabe o česnega preskusa  
in vivo  najprej opraviti  in vivo  študijo kožnih u činkih snovi in jih 
oceniti v skladu z metodo preskušanja B.4 (7). Uporaba analize tehtnostnih dokazov in strategija zaporednega preskušanja bi morali 
zmanjšati potrebo po  in vivo  preskušanju za o č
esno jedkost/dražil ­
nost snovi, za katere obstaja že dovolj dokazov iz drugih študij. Če z 
uporabo strategije zaporednega preskušanja ni mogo če določiti 
potenciala o česne jedkosti ali dražilnosti niti po opravljeni  in vivo  
študiji dermalne jedkosti in dražilnosti, se lahko opravi  in vivo  
preskus o česne jedkosti/dražilnosti.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 252
 
Bolj upoštevana strategija zaporednega preskušanja, ki vklju čuje 
opravljanje validiranih  in vitro  ali ex vivo  preskusov za jedkost/dra ­ 
žilnost, je vklju čena v dodatku k tej metodi preskušanja. To strate ­
gijo so razvili in soglasno priporo čili udeleženci OECD delavnice (8) 
in se je sprejela kot priporo čena strategija preskušanja v Globalno 
usklajenem sistemu za razvrstitev kemijskih snovi (GHS) (9). Pripo ­
ročeno se je ravnati po tej strategiji preskušanja pred opravljanjem 
preskušanja  in vivo . Za nove snovi je priporo čen postopen na čin 
preskušanja za pridobivanje znanstveno zanesljivih podatkov o 
jedkosti/dražilnosti snovi. Za obstoje če snovi, za katere ni dovolj 
podatkov o kožni in o česni jedkosti/dražilnosti, je treba uporabiti 
to strategijo za zapolnitev vrzeli manjkajo čih podatkov. Uporabo 
drugačne strategije preskušanja ali postopka ali odlo čitev, da se ne 
bo uporabil na čin postopni preskušanja, je treba obrazložiti.  
1.2 DEFINICIJE  
Očesna dražilnost : je nastanek sprememb na o česu, ki sledijo apli ­
kaciji preskusne snovi na sprednjo površino o česa in ki so v celoti 
reverzibilne v 21 dneh aplikacije.  
Očesna jedkost : je nastanek poškodbe tkiva v o česu ali resnega 
fizičnega poslabšanja vida, ki sledi aplikaciji preskusne snovi na 
sprednjo površino o česa in ki ni v celoti reverzibilna v 21 dneh 
aplikacije.  
1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Snov, ki jo je treba preskusiti, se nanese v enkratnem odmerku na 
eno od očes eksperimentalne živali; netretirano oko služi za kontrolo. 
Stopnja o česne dražilnosti/jedkosti se oceni s seštevanjem lezij na 
očesni veznici, roženici in šarenici, v to čno določenih intervalih. 
Drugi učinki na oko in nasprotni sistemski u činki se prav tako 
opišejo, da se zagotovi celovito vrednotenje u činkov. Študija mora 
trajati dovolj dolgo, da se oceni reverzibilnost ali ireverzibilnost učinkov. 
Živali, ki kažejo trajne znake hudega trpljenja in/ali bole čine v kateri 
koli fazi preskusa, je treba humano usmrtiti in snov skladno s tem oceniti. Kriterije za sprejem odlo čitve o humani usmrtitvi umirajo čih 
in hudo trpe čih živali je mogo če najti v sklicu (10).
 
1.4 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.4.1  Priprava za preskus  in vivo  
1.4.1.1  Izbira živalske vrste  
Kunec beli čnik je najbolj zaželena laboratorijska žival in uporabljajo 
se zdrave mlade odrasle živali. Za uporabo drugih sevov ali vrst je potrebna obrazložitev.
 
1.4.1.2  Priprava živali  
Obe očesi vsake eksperimentalne živali, do nadaljnjega izbrane za 
preskušanje, je treba pregledati v 24 urah, preden se preskušanje 
začne. Živali, ki kažejo o česno dražilnost, o česne napake ali že 
prej nastalo poškodbo roženice, se ne smejo uporabiti.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 253
 
1.4.1.3  Pogoji bivanja in hranjenja  
Živali morajo imeti vsaka svoj prostor. Temperatura prostora za 
preskuse z živalmi mora znašati za kunce 20  o C (± 3  o C). Čeprav 
mora biti relativna vlažnost najmanj 30 % in po možnosti ne sme 
presegati 70 %, mora biti ciljna vlažnost, razen med čiščenjem 
prostora, 50 do 60 %. Osvetlitev mora biti umetna v zaporedju 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporabijo obi čajne 
predpisane laboratorijske vrste hrane z neomejeno koli čino pitne 
vode.
 
1.4.2  Preskusni postopek  
1.4.2.1  Aplikacija preskusne snovi  
Preskusno snov je treba dati v meši ček veznice enega o česa vsake 
živali, potem ko se nežno potegne spodnja veka stran od zrkla. Veke se nato nežno držijo skupaj približno 1 sekundo, da se prepre či 
izguba materiala. Drugo oko, ki ostane netretirano, služi za kontrolo.
 
1.4.2.2  Izpiranje  
Oči preskusnih živali se ne smejo umivati najmanj 24 ur po vkapanju 
preskusne snovi, z izjemo trdnih snovi (glej oddelek 1.4.2.3.2) in v primeru takojšnjih jedkih ali dražilnih u činkov. Po 24 urah se lahko 
uporabi izpiranje, če se meni, da je to ustrezno. 
Uporaba satelitske skupine živali za raziskovanje vpliva izpiranja ni 
priporočena, razen če je znanstveno upravi čena. Če je satelitska 
skupina potrebna, je treba uporabiti dva kunca. Pogoje izpiranja je treba skrbno dokumentirati, npr. čas izpiranja; sestavo in temperaturo 
raztopine za izpiranje; trajanje, volumen in hitrost aplikacije.
 
1.4.2.3  Velikost odmerka  
1.4.2.3.1  Preskušanje teko čih snovi  
Za preskušanje teko čih snovi se uporablja odmerek 0,1 ml. Razpršila 
pod pritiskom se ne smejo uporabljati za vkapanje snovi neposredno 
v oko. Teko če razpršilo je treba iztisniti in zbrati v posodo pred 
vkapanjem 0,1 ml v oko.  
1.4.2.3.2  Preskušanje trdnih snovi  
Pri preskušanju trdnih snovi, kašnatih zmesi in zdrobljenih snovi, 
mora imeti uporabljena koli čina volumen 0,1 ml ali težo, ki ni 
večja kakor 100 mg. Preskusni material je treba zdrobiti v fin 
prah. Volumen trdnega materiala je treba izmeriti po rahlem zgoš če­
vanju, npr. z rahlim potrkavanjem na merilno posodo. Če fiziološki 
mehanizmi niso odstranili iz o česa preskusne živali trdno preskusno 
snov na prvi časovni točki opazovanja eno uro po tretiranju, se lahko 
oko izplakne z raztopino vode in soli ali destilirano vodo.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 254
 
1.4.2.3.3  Preskušanje razpršil  
Priporočeno je, da se vsa uteko činjena razpršila in razpršila pod priti ­
skom zberejo v posodo pred vkapanjem v oko. Izjema so snovi v 
posodah za razpršila pod pritiskom, ki jih ni mogo če zbrati zaradi 
izhlapevanja. V takšnih primerih je treba držati oko odprto in nanesti preskusno snov v oko enostavnim z vbrizgom, ki traja približno eno 
sekundo, z razdalje 10 cm neposredno pred o česom. Ta razdalja se 
lahko spreminja v odvisnosti od pritiska razpršila in njegove vsebine. Paziti je treba, da se oko ne poškoduje zaradi pritiska razpršila. V ustreznih primerih bo mogo če potrebno oceniti potencial za nastanek 
„mehanske“ poškodbe o česa zaradi mo či razpršila. 
Oceno odmerka iz razpršila je mogo če dobiti z naslednjim presku ­
som: snov se razprši na tehtalni papir skozi odprtino velikosti kun č­
jega očesa, ki je nameš čena neposredno pred papir. Porast teže 
papirja se uporabi za približno dolo čitev količine, razpršene v oko. 
Za hlapljive snovi je mogo če odmerek oceniti s tehtanjem v zbirni 
posodi pred in po odstranitvi preskusnega material.
 
1.4.2.4  Začetni preskus (In vivo preskus o česne dražilnosti/jedkosti z 
uporabo ene živali)  
Kot je opredeljeno v strategiji zaporednega preskušanja (glej 
Dodatek 1), je zelo priporo čeno, da se preskus  in vivo  na začetku 
izvede z uporabo ene živali. 
Če rezultati tega preskusa kažejo, da je snov jedka ali resno dražilna 
za oči z uporabo opisanega postopka, se nadaljnje preskušanje za 
očesno dražilnost ne opravi..  
1.4.2.5  Lokalni anestetiki  
Lokalni anestetiki se uporabljajo v odvisnosti od primera. Če analiza 
tehtnosti dokazov kaže, da snov lahko povzro či bolečino, ali če 
začetno preskušanje pokaže, da bo nastala bole ča reakcija, se lokalni 
anestetik lahko uporabi pred vkapanjem preskusne snovi. Vrsto, 
koncentracijo in odmerek lokalnega anestetika je treba skrbno izbrati, 
da se zagotovi, da razlike pri reagiranju na preskusno snov ne bodo posledica njegove uporabe. Na podoben na čin je treba anestezirati 
kontrolno oko.
 
1.4.2.6  Potrditveni preskus (In vivo preskus dražilnosti z dodatnimi živalmi)  
Če se jedek u činek ne opazi v za četnem preskusu, je treba dražilni 
ali negativni odziv potrditi z uporabo do dveh dodatnih živali. Če se 
v začetnem preskusu opazi resen dražilen u činek, ki kaže, da je 
možen mo čan (ireverzibilen) u činek pri potrditvenem preskušanju, 
je priporo čeno, da se potrditveni preskus izvede na zaporeden 
način na eni živali namesto s so časno izpostavitvijo dveh dodatnih 
živali. Če druga žival razkrije jedke ali resne dražilne u činke, se 
preskus ne nadaljuje. Mogo če bodo potrebne dodatne živali za potr ­
ditev šibkih ali zmernih dražilnih odzivov.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 255
 
1.4.2.7  Obdobje opazovanja  
Trajanje obdobja opazovanja mora biti dovolj dolgo, da se lahko v 
celoti ovrednoti obseg in reverzibilnost opaženih u činkov. Preskus je 
treba zaklju čiti ob katerem koli času, kadar kaže žival trajajo če znake 
hude bole čine ali trpljenja (9). Za dolo čitev reverzibilnosti u činkov je 
običajno treba živali opazovati 21 dni po nanašanju preskusne snovi. 
Če se opazi reverzibilnost pred 21 dnem, je treba takrat preskus 
zaključiti. 
1.4.2.7.1  Klinična opazovanja in uvrstitev o česnih reakcij v stopnje  
Oči je treba pregledati po 1, 24, 48 in 72 urah po aplikaciji 
preskusne snovi. Živali se lahko preskušajo le toliko časa, kolikor 
je potrebno za pridobitev dokon čnih informacij. Živali, ki trajno 
kažejo hude bole čine in trpljenje, je treba nemudoma humano 
usmrtiti in v skladu s tem oceniti snov. Usmrtiti je treba živali z naslednjimi o česnimi lezijami po vkapanju: perforacija roženice ali 
značilno gnojenje roženice vklju čno s stafilomom; kri v sprednjem 
delu očesa; stopnja 4 motnosti roženice, ki ne popusti 48 ur; odsot ­
nost svetlobnega refleksa (odziv šarenice stopnje 2), ki traja 72 ur; gnojenje vezni čne vrečke; nekroza vezni čne membrane ali žmurke; 
ali odstopanje. To pa zaradi tega, ker te lezije na splošno niso 
reverzibilne. 
Živali, pri katerih se ne razvijejo o česne lezije, se lahko usmrti ne 
prej kot 3 dni po instilaciji. Živali z blagimi do zmernimi lezijami je treba opazovati dokler lezije ne izginejo ali 21 dni, ko se raziskava zaključi. Opazovanja se izvajajo po 7, 14 in 21 dneh, da se dolo či 
stanje lezij ter njihova reverzibilnost ali ireverzibilnost. 
Pri vsaki preiskavi je treba zabeležiti stopnjo o česne reakcije (vez ­
nice, roženice in šarenice) (tabela 1). Navesti je treba tudi katere koli druge poškodbe o česa (npr. površinski keratitis/panus, obarvanost) 
ali neželene sistemske u činke. 
Za lažji pregled reakcij se lahko uporablja binokularna lupa, ro čni 
oftalmoskop, biomikroskop ali drug ustrezen pripomo ček. Po eviden ­
tiranju rezultatov opazovanja po 24 urah se lahko pregled o či nada­
ljuje s pomo čjo fluoresceina. 
Določanje stopnje o česnih odzivov/reakcij je nujno subjektivno. Da 
bi pospešili usklajevanje pri dolo čanju stopnje o česnih odzivov in 
nudili pomo č preskuševalnim laboratorijem ter vsem sodelujo čim pri 
oblikovanju in razlagi rezultatov opazovanj, mora biti osebje, ki izvaja ta opazovanja, ustrezno usposobljeno, da obvlada uporabljeni sistem dolo čanja stopnje.
 
2. PODATKI  
2.2 VREDNOTENJE REZULTATOV 
Rezultate o česne dražilnosti je treba oceniti v zvezi z vrsto in 
resnostjo lezij ter njihovo reverzibilnostjo ali pomanjkljivostjo rever ­
zibilnosti. Posamezni rezultati ne predstavljajo absolutnega standarda za dražilne lastnosti materiala, ker se ocenjujejo tudi drugi u činki 
preskusnega materiala. Namesto tega je treba obravnavati posamezne 
rezultate kot referen čne vrednosti in so pomembni le, če jih potrjuje 
popoln opis in vrednotenje vseh opazovanj.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 256
 
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: 
Obrazložitev za preskušanje  in vivo : analiza tehtnosti dokazov prej 
obstoječih podatkov, vklju čno z rezultati strategije zaporednega 
preskušanja: 
— opis pomembnih podatkov, ki so na voljo pred preskušanjem, 
— podatki, pridobljeni v vsaki fazi strategije preskušanja, — opis opravljenih  in vitro  preskusov, vklju čno s podrobnimi 
podatki o postopkih, rezultati, dobljenimi s preskusnimi/referen ­ 
čnimi snovmi, 
— opis dražilnih kožnih reakcij  in vivo /opravljena korozijska razi ­
skava vklju čno z dobljenimi rezultati, 
— analiza tehtnosti dokazov za opravljanje študije  in vivo . 
Preskusna snov: — identifikacijski podatki (npr. številka CAS; vir, čistost, znane 
nečistoče, številka skupine), 
— fizikalno stanje in fizikalno-kemijske lastnosti (npr.: pH hlapnost, 
topnost, stabilnost), 
— če gre za mešanico, sestava in relativni odstotek sestavin, 
— če se uporabi lokalni anestetik, identifikacija, čistost, vrsta, 
odmerek in možen medsebojni vpliv s preskusno snovjo. 
Nosilec: — identifikacija, koncentracija (kjer je ustrezno), uporabljeni volu ­
men, 
— obrazložitev upravi čenosti izbire nosilca. 
Preskusne živali: — uporabljena vrsta/sev, obrazložitev za uporabo živali, če to ni 
kunec beli čnik, 
— starost vsake živali na za četku študije, 
— število živali istega spola v preskusni in kontrolni skupini ( če je 
potrebno), 
— teže posameznih živali na za četku in na zaklju čku preskusa, 
— vir, pogoji bivanja, vrsta hrana, itd. Rezultati: 
— opis metode, uporabljene za merjenje rezultatov dražilnosti na 
vsaki časovni to čki opazovanja (npr. poševna ro čna svetilka, 
biomikroskop, fluorescin),
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 257
 
— preglednica s podatki o dražilnem/jedkem odzivu za vsako žival 
na vsaki časovni to čki opazovanja do odstranitve vsake živali iz 
preskusa, 
— narativni opis stopnje in narave opisane dražilnosti ali korozije, — pripovedni opis stopnje in vrste opaženih lezij v o česu (npr. 
vaskularizacije, tvorbe krp, zlepkov, madežev), 
— opis neo česnih lokalnih in sistemskih nasprotnih u činkov in 
histopatoloških ugotovitev, če so. 
Razprava o rezultatih.
 
3.2 RAZLAGA REZULTATOV 
Sklepanje o veljavnosti rezultatov študij o česne dražilnosti na labo ­
ratorijskih živalih za ljudi je veljavno le v omejeni meri. V mnogih primerih je kunec beli čnik bolj ob čutljiv na o česne dražilne snovi ali 
jedke snovi kakor ljudje. 
Pri razlagi podatkov je treba paziti, da se izklju či dražilnost, ki je 
posledica sekundarne infekcije.
 
4. LITERATURA  
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, 
T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. 
ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429. 
(2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., 
Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., 
Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of 
Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159–164. 
(3) Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for 
evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161–177 
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on 
Animals. Toxicol.  In Vitro , 2, 19–26. 
(5) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation 
Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. 
Ocular Toxicol. 12, 227–231. 
(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in 
vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524. 
(6a) Testing Method B.40 Skin Corrosion. 
(7) Testing method B.4. Acute toxicity: dermal irritation/corrosion. 
(8) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final 
Report of the OECD Workshop on Harmonization of Valida ­
tion and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test 
Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http:// 
www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 258
 
(9) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of 
Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemi ­
cals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/ 
HCL6.htm). 
(10) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Asses ­
sment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Expe ­
rimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environ ­
mental Health and Safety Publications. Series on Testing and 
Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 259
 
Tabela I  
RAZVRŠ ČANJE O ČESNIH LEZIJ V STOPNJE  
Roženica  
Motnost: stopnja gostote (od čitati jo je treba na najbolj gostem gostejšem 
predelu) (*) 
Ni gnojenja ali motnosti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Razpršene ali obširne površine motnosti (ki niso rahla motnost obi čaj­
nega leska, delci šarenice jasno vidni) 1 
Prosojna površina razlo čna brez težav; delci šarenice rahlo zatemnjeni 2 
Spodnja površina: delci šarenica se ne razlo čijo; velikost zenice se 
komajda razlo či . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Motna roženica: šarenica se ne razlo či zaradi motnosti . . . . . . . . . . . . . . 4 
Največ možnih: 4 
OPOMBE 
(*) Predel motnosti roženice je treba navesti.  
Šarenica  
Normalna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Opazno poglobljene gube, naval krvi, otekanje, zmerna hiperemija okoli 
roženice; ali injekcija; šarenica reagira na svetlobo (po časna reakcija se 
upošteva kot u činek) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 
1 
Krvavitev, resno propadanje ali odsotnost reakcije na svetlobo . . . . . . . 2 
Največ možnih: 2  
Očesne veznice  
Rdečina (nanaša se na veznice vek in nabrekle veznice, z izjemo roženice in 
šarenice) 
normalna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Nekaj krvnih žil je hiperemi čnih (injicirano) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Razpršena, škrlatna barva; posamezne žile niso zlahka razlo čne . . . . . . 2 
Razširjena goveja rde čina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Največ možnih: 3  
Kemoterapija  
Otekanje (nanaša se na veke in/ali žmurke) 
Normalno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Nekoliko ote čeno nad normalnim . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Očitno otečeno, z delnim zavihanjem vek navzven . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 
Otečeno, z napol zaprtimi vekami . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Otečeno, z ve č kakor napol zaprtimi vekami . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 
Največ možnih: 4  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 260
 
Dodatek  
Zaporedna strategija preskušanja za o česno dražilnost in jedkost  
SPLOŠNO  
Za znanstveno zanesljivost in zdravje živali se je pomembno izogniti nepotrebni 
uporabi živali in zmanjšati kakršna koli preskušanja, za katera je verjetno, da 
bodo povzro čila resne odzive pri živalih. Vse informacije o snovi, ki so nanašajo 
na njeno možno jedkost/dražilnost, je treba oceniti pred odlo čitvijo o preskušanju  
in vivo.  Mogoče že obstaja dovolj dokazov za razvrstitev preskusne snovi glede 
na njen potencial o česne jedkosti ali dražilnosti, ne da bi bilo treba opraviti 
preskušanja na laboratorijskih živalih. Analiza tehtnosti dokazov in strategija 
zaporednega preskušanja bosta zato zmanjšali potrebo po preskušanju  in vivo,  
zlasti če je verjetno, da bo snov povzro čila resne reakcije. 
Priporočeno je, da se analiza tehtnosti dokazov uporabi za vrednotenje obstoje čih 
informacij v zvezi z o česno dražilnostjo in jedkostjo snovi in za odlo čitev, ali je 
treba opraviti poleg o česnih študij  in vivo  dodatne študije, ki bi pomagale opre ­
deliti takšen potencial. Kadar so potrebne nadaljnje študije, je priporo čena 
uporaba strategije zaporednega preskušanja za pridobitev ustreznih eksperimen ­
talnih podatkov. Za snovi, ki nimajo anamneze preskušanja, je treba uporabiti strategijo zaporednega preskušanja, da se pridobijo potrebni podatki za vredno ­
tenje njihovega potenciala o česne jedkosti/dražilnosti. Strategija preskušanja, ki je 
opisana v tem dodatku, se je razvila v OECD delavnici (1). Kasneje se je 
uveljavila in razširila v Usklajeni integrirani sistem razvrstitve nevarnih snovi za zdravje ljudi, in okoljskih u činkov kemijskih snovi, kakor je potrdilo 
28. Skupno zasedanje Odbora za kemikalije in Delovna skupina za kemikalije 
novembra 1998 (2). 
Čeprav zaporedno preskušanje ni bistven del metode preskušanja B.4, prikazuje 
priporočeni pristop za dolo čanje zna čilnosti očesne dražilnosti/jedkosti. Ta 
pristop predstavlja hkrati najboljši obi čajen postopek in eti čno merilo uspešnosti 
za preskušanje  in vivo  za kožno dražilnost/jedkost. Metoda preskušanja vsebuje 
smernice za opravljanje preskusa  in vivo  in povzema dejavnike, ki jih je treba 
upoštevati pred za četkom takšnega preskusa. Strategija zaporednega preskušanja 
opredeljuje pristop tehtnosti dokazov za vrednotenje obstoje čih podatkov 
o lastnostih o česno dražilnih/jedkih snovi in stopenjski pristop za pridobivanje 
pomembnih podatkov o snoveh, za katere se dodatne študije potrebujejo ali za katere se študije niso opravile. Strategija vklju čuje opravljanje validiranih in 
sprejetih preskusov  in vitro  ali ex vivo  in nato opravljanje študij kožne dražilno ­
sti/jedkosti po metodi preskušanja B.4 v posebnih okoliš
činah (3)(4).  
OPIS STRATEGIJE POSTOPNEGA PRESKUŠANJA  
Pred začetkom preskusov kot dela strategije zaporednega preskušanja (Skica) je 
treba ovrednotiti vse informacije, ki so na voljo, da bi se odlo čili, ali je o česno 
preskušanje  in vivo  potrebno. Čeprav se pomembne informacije lahko pridobijo 
iz ocene posameznih parametrov (npr. najvišjega pH), je treba upoštevati obsto ­
ječe informacije v celoti. Vse pomembne podatke o u činkih zadevne snovi ali 
analognih snovi je treba oceniti pri sprejemanju odlo čitve na podlagi tehtnosti 
dokazov in navesti obrazložitev za to odlo čitev. Glavni poudarek mora biti na 
obstoječih podatkih o snovi glede ljudi in živali, sledi izid preskušanja  in vitro  ali 
ex vivo. In vivo  študij jedkih snovi se je treba izogibati, kadar koli je to možno. 
Dejavniki, upoštevani v strategiji preskušanja, vklju čujejo:  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 261
 
Vrednotenje obstoje čih podatkov za ljudi in živali (korak 1).  Najprej je treba 
upoštevati obstoje če podatke o ljudeh, npr. klini čne ali poklicne študije in poro ­ 
čila o primerih, in/ali podatke preskusov na živalih, ker dajejo informacije, ki so 
neposredno povezane z u činki na o či. Snovi z znano jedkostjo ali resno dražil ­
nostjo za o či, se ne smejo vkapati v o či živali, kakor tudi ne snovi, ki kažejo 
jedke ali dražilne u činke na koži; takšne snovi je treba prav tako obravnavati kot 
jedke in/ali dražilne za o či. Snovi, za katere je dovolj dokazov, da niso jedke in 
ne dražilne, iz predhodno opravljenih o česnih študij, prav tako ni treba preskusiti 
z očesnimi študijami  in vivo. 
Analiza odnosov med strukturo in aktivnostjo (SAR) (korak 2).  Treba je upošte ­
vati rezultate preskušanj strukturno sorodnih snovi, če so na voljo. Kadar so na 
razpolago zadostni podatki o ljudeh in/ali živalih za strukturno sorodne snovi ali mešanice takšnih snovi, ki kažejo, kakšen je njihov potencial o česne jedkosti/ 
dražilnosti, se lahko domneva, da bo preskusna snov, ki se vrednoti, povzro čila 
enake odzive. V navedenih primerih preskusne snovi morda ne bo treba presku ­
siti. Negativni podatki študij strukturno sorodnih snovi ali mešanic takšnih snovi v skladu s strategijo zaporednega preskušanja niso zadosten dokaz o nejedkosti/nedražilnosti snovi. Treba je uporabiti validirane in sprejete SAR 
pristope za identifikacijo dermalne jedkosti in potenciala dražilnosti za dermalne 
kakor tudi o česne učinke.  
Fizikalno-kemijske lastnosti in kemijska reaktivnost (korak 3).  Snovi, ki kažejo 
najvišje stopnje pH, kakor npr. < 2,0 in ≥ 11,5, imajo lahko mo čne lokalne 
učinke. Če je najvišja stopnja pH podlaga za identificiranje snovi kot jedke ali 
dražilne za o či, tedaj se lahko upošteva tudi njena kisla/alkalna rezerva (ali 
blažilna sposobnost) (3) (4). Če blažilna sposobnost nakazuje, da snov morda 
ni jedka za kožo, tedaj je treba opraviti nadaljnje preskušanje za potrditev le-tega, najbolje z uporabo validiranega in sprejetega preskusa  in vitro  ali ex vivo  (glej 
oddelek koraka 5 in 6).  
Upoštevanje drugih obstoje čih informacij (korak 4).  V tej fazi je treba oceniti vse 
razpoložljive informacije o sistemski toksi čnosti po dermalni poti. Upoštevati je 
treba tudi akutno dermalno toksi čnost preskusne snovi. Če se je pokazalo, da je 
snov zelo toksi čna po dermalni poti, je morda ne bo treba preskusiti v o č
esu. 
Čeprav ni nujno, da sta akutna dermalna toksi čnost in o česna dražilnost/jedkost 
medsebojno povezani, se lahko domneva, da bo sredstvo, ki je zelo toksi čno po 
dermalni poti, pokazalo tudi visoko toksi čnost, ko se bo vkapalo v oko. Takšne 
podatke je treba upoštevati tudi med korakoma 2 in 3.  
Rezultatov in vitro ali ex vivo preskusov (koraka 5 in 6).  Snovi, ki so pokazale 
jedke ali resne dražilne lastnosti v validiranem in sprejetem preskusu  in vitro  ali 
ex vivo  (6)(7), ki se je validiral in sprejel izrecno za ocenitev jedkosti/dražilnosti 
za oči in kožo, ni treba preskusiti na živalih. Lahko se domneva, da bodo takšne 
snovi povzro čile podobne resne u činke in vivo.  Če niso na voljo validirani in 
sprejeti preskusi  in vitrolex vivo,  se lahko presko čita koraka 5 in 6 in se nadaljuje 
neposredno s korakom 7.  
Ocena in vivo preskusa dermalne dražilnosti ali jedkosti snovi (korak 7).  Če ni 
dovolj dokazov za pripravo zaklju čne analize tehtnosti dokazov za potencial 
očesne dražilnosti/jedkosti snovi na podlagi podatkov iz zgoraj navedenih študij, 
je treba naprej oceniti potencial kožne dražilnosti/jedkosti  in vivo  z uporabo 
metode preskušanja B.4 (4) in spremljajo čega dodatka (9). Če se pokaže, da 
snov povzro ča jedkost ali resno kožno dražilnost, jo je treba obravnavati kot 
jedko očesno dražilno snov, razen če informacije potrjujejo alternativen zaklju ­ 
ček. Tedaj preskusa  in vivo  ne bi bilo potrebno opraviti. Če snov ni jedka ali 
resno dražilna za kožo, je treba opraviti  in vivo  očesni preskus.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 262
 
Preskus in vivo na kuncih (koraka 8 in 9).  Očesno preskušanje  in vivo  je treba 
pričeti z začetnim preskusom z uporabo ene živali. Če rezultati tega preskusa 
pokažejo, da je snov resno dražilna ali jedka za o či, nadaljnjega preskušanja ni 
treba opraviti. Če navedeni preskus ni odkril nobenih jedkih ali resno dražilnih 
učinkov, se opravi potrditveni preskus z dvema dodatnima živalma.  
LITERATURA  
(1) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the 
OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicol ogical Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22- 
24 January 1996 (http://www. oecd. org/ehs/test/background.htm). 
(2) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/ 
Class/HCL6.htm). 
(3) Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating 
Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161-177. 
(4) Testing method B.4. Acute Toxicity: dermal irritation/corrosion. (5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification 
as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alka ­
line Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro,  2, 19–26. 
(6) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solu ­
tions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227–231. 
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM 
international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results 
and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524. 
(8) Testing Method B.40 Skin Corrosion. (9) Annex to Testing method B.4: A Sequential Testing Strategy for Skin Irri ­
tation and Corrosion.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 263
 
Skica  
STRATEGIJA PRESKUŠANJA IN VREDNOTENJA ZA O ČESNO DRAŽILNOST/JED ­
KOST
  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 264
 
▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 265
 
B.6 SENZIBILIZACIJA KOŽE  
1. METODA  
1.1 UVOD  
Opombe:  
Občutljivost preskusov in njihova sposobnost, da odkrijejo morebitne 
senzibilizatorje človeške kože, veljata za pomembni v sistemu razvrš ­ 
čanja toksi čnosti v zvezi z javnim zdravjem. 
Ni ene same preskusne metode, ki bi lahko ustrezno opredelila vse 
snovi s potencialom za senzibilizacijo človeške kože in bila hkrati 
uporabna za vse snovi. 
Pri izbiri preskusa je treba upoštevati dejavnike, kakršne so fizikalne 
lastnosti snovi, vklju čno z njeno sposobnostjo penetracije v kožo. 
Razviti sta bili dve vrsti preskusov na morskih praši čkih: pomožni 
preskusi, pri katerih se alergi čno stanje potencira z raztopitvijo ali 
suspendiranjem preskusne snovi v kompletnem Freundovem adju ­
vantu (KFA), in preskusi, pri katerih se adjuvant ne uporablja. 
Pomožni preskusi so obi čajno natan čnejši pri napovedovanju verjet ­
nega senzibilizacijskega u činka neke snovi na človeško kožo od 
tistih metod, ki ne uporabljajo kompletnega Freundovega adjuvanta, in so zato primernejši. 
Med pomožnimi preskusi se pogosto uporablja maksimizacijski 
preskus na morskih praši čkih (Gpmt). Čeprav se za odkrivanje 
potenciala snovi, da povzro či senzibilizacijo kože, lahko uporabijo 
mnoge druge metode, se Gpmt šteje za najboljši pomožni preskus. 
Za mnoge razrede kemikalij se preskusi, ki ne uporabljajo adjuvanta 
(med katerimi se najve č uporablja Buehlerjev preskus), štejejo za 
manj občutljive. 
V nekaterih primerih lahko obstajajo utemeljeni razlogi za izbiro 
Buehlerjevega preskusa, ki namesto intradermalne injekcije, upora ­
bljene v preskusu maksimizacije na morskih praši čkih, vklju čuje 
lokalno nanašanje. Če se uporabi Buehlerjev preskus, mora biti ta 
izbira znanstveno utemeljena. 
V tej metodi sta opisana maksimizacij ski preskus na morskih 
prašičkih in Buehlerjev preskus. Uporabijo se lahko druge metode, 
če so dobro validirane in znanstveno utemeljene. 
Če je rezultat priznanega predhodnega preskusa pozitiven, se lahko 
preskusna snov šteje za možnega povzro čitelja senzibilizacij e in ni 
potrebna izvedba dodatnega preskusa na morskih praši čkih. Če pa je 
rezultat takšnega preskusa negativen, je treba izvesti preskus na 
morskih praši čkih v skladu s postopkom, opisanim v tej preskusni 
metodi. 
Glej tudi del B splošnega uvoda.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 266
 
1.2 OPREDELITVE POJMOV 
Senzibilizacija kože: (alergijski kontaktni dermatitis) je imunološko 
pogojena kožna reakcija na neko snov. Pri človeku so zna čilne 
reakcije lahko srbenje, eritem, edem, papule, mehurji, gnojni 
mehurčki ali kombinacija teh reakcij. Pri drugih vrstah so reakcije 
lahko razli čne ter sta lahko vidna zgolj eritem in edem. 
Indukcijska izpostavljenost: eksperimentalna izpostavljenost subjekta 
preskusni snovi za povzro čitev hipersenzibilnega stanja. 
Indukcijsko obdobje: najmanj enotedensko obdobje po indukcijski 
izpostavljenosti, v katerem se lahko razvije hipersenzibilno stanje. 
Provokacij ska izpostavljenost: eksperimentalna izpostavljenost pred ­
hodno tretiranega subjekta preskusni snovi, izvedena po indukcij ­
skem obdobju, da bi se ugotovilo, če subjekt reagira hipersenzibilno.  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Vsakih šest mesecev je treba oceniti senzibilnost in zanesljivost 
uporabljene eksperimentalne tehnike z uporabo snovi, za katere se 
ve, da povzro čajo blago do zmerno senzibilizacijo kože. 
Če je preskus pravilno izveden, se lahko v pomožnem preskusu za 
blage/zmerne senzibilizatorje pri čakuje vsaj 30 % reakcija in vsaj 
15 % v neadjuvantnem preskusu. 
Prednostno se uporabljajo naslednje snovi.  
Števila CAS Števila Einecs Imena Einecs Splošna imena  
101-86-0 202-983-3 α-heksilcinamaldehid α -heksilcinamaldehid 
149-30-4 205-736-8 benzotiazol-2-tiol (merkapto ­
benzotiazol) kaptaks 
94-09-7 202-303-5 benzokain nordkain 
Uporabijo se lahko druge kontrolne snovi, ki izpolnjujejo zgoraj 
navedena merila, če to upravi čujejo okoliš čine. 
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Na začetku so preskusne živali izpostavljene preskusni snovi z intra ­
dermalnimi injekcijami in/ali epidermalnim nanosom (indukcijska 
izpostavljenost). Po 10- do 14-dnevnem po čivalnem obdobju (induk ­
cijsko obdobje), v katerem se lahko razvije imunska reakcija, so živali izpostavljene provokacijskemu odmerku. Obseg in stopnja 
kožne reakcije na provokacijsko izpostavljenost pri preskusnih 
živalih se primerja z reakcijo, opaženo pri živalih kontrolne skupine, pri katerih med indukcijo posnemajo tretiranje in ki jih provokacij sko izpostavijo.
 
1.5 OPIS PRESKUSNIH METOD 
Če je odstranitev preskusne snovi nujna, se to doseže z uporabo vode 
ali ustreznega topila, ne da bi se spremenila obstoje ča reakcija ali 
okrnil epidermis.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 267
 
1.5.1  Maksimizacijski preskus na morskih praši čkih (GPMT)  
1.5.1.1 P r i p r a v e 
Zdravi mladi odrasli albino morski praši čki so najmanj 5 dni pred 
preskusom aklimatizirani na razmere v laboratoriju. Pred preskusom 
so živali naklju čno razdeljene v skupine, ki bodo tretirane. Glede na 
preskusno metodo, ki je uporabljena, se dlaka lahko odvzame s striženjem, britjem ali kemi čno depilacijo. Pri tem je treba paziti, 
da koža ostane nepoškodovana. Živali je treba pred za četkom in 
na koncu preskusa stehtati.
 
1.5.1.2 P r e s k u s n i p o g o j i  
1.5.1.2.1 Preskusne živali 
Uporabljajo se albino morski praši čki tistih sevov, ki se obi čajno 
uporabljajo v laboratorijih.  
1.5.1.2.2 Število in spol 
Uporabijo se lahko živali moškega in/ali ženskega spola. Samice 
morskih praši čkov morajo biti nuliparne in ne breje. 
Skupina, ki bo tretirana, mora biti sestavljena iz najmanj 10, 
kontrolna skupina pa iz najmanj 5 živali. Če je prva skupina obse ­
gala manj kakor 20 primerkov in druga manj kakor 10 ter ni mogo če 
sklepati, da je preskusna snov senzibilizator, se mo čno priporo ča 
nadaljnje preskušanje na najmanj 20 preskusnih in 10 kontrolnih 
živali.  
1.5.1.2.3 Velikost odmerkov 
Koncentracija preskusne snovi, uporabljene za vsako indukcijsko 
izpostavljenost, naj bo sistemsko dobro tolerirana in naj ustreza najvišjemu odmerku, ki lahko povzro či blago do zmerno draženje 
kože. Koncentracija, ki se uporabi za provokacijsko izpostavljenost, 
naj ustreza najvišjemu odmerku, ki ne povzro či draženja. Če je 
potrebno, se lahko ustrezne koncentracije dolo čijo s pilotno študijo, 
izvedeno na dveh ali treh živalih. V ta namen je priporo čljiva 
uporaba živali, ki so bile tretirane s kompletnim Freundovim adju ­
vantom (KFA).
 
1.5.1.3 P o s t o p e k  
1.5.1.3.1 Indukcija 
Dan 0 – tretirana skupina 
V ramenske dele, s katerih so bile odstranjene dlake, se vbrizgajo 
trije pari intradermalnih injekcij volumna 0,1 ml, in sicer vsaka injekcija iz para na svoji strani sredinske črte. 
Injekcija 1: zmes 1:1 (v/v) KFA/voda ali fiziološka raztopina Injekcija 2: preskusna snov v ustreznem nosilcu pri izbrani koncen ­
traciji 
Injekcija 3: preskusna snov pri izbrani koncentraciji, formulirana v 
zmesi 1:1 (v/v) KFA/voda ali fiziološka raztopina 
V injekciji 3 so v vodi topne snovi raztopljene v vodni fazi, preden 
se zmešajo s KFA. Lipotopne ali netopne snovi so suspendirane v KFA, preden so kombinirane z vodno fazo. Kon čna koncentracija 
preskusne snovi mora biti enaka tisti, ki je bila uporabljena v 
injekciji 2.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 268
 
Injekciji 1 in 2 se vbrizgata ena poleg druge in čim bliže glavi, 
medtem ko se injekcija 3 vbrizga proti repnemu delu preskusnega 
območja. 
Dan 0 – kontrolna skupina 
Na ista obmo čja kakor pri tretiranih živali se dajo tri serije dveh 
intradermalnih injekcij volumna 0,1 ml. 
Injekcija 1: zmes 1:1 (v/v) KF A/voda ali fiziološka raztopina 
Injekcija 2: nerazred čeno sredstvo 
Injekcija 3: 50 % m/v formulacija nosilca v zmesi 1:1 (v/v) KF 
A/voda ali fiziološka raztopina. 
Dan 5–7 – tretirana skupina in kontrolna skupina 
Približno štiriindvajset ur pred lokalnim indukcijskim nanosom, če 
snov ni senzibilizator kože, je preskusno obmo čje po striženju na 
kratko in/ali britju tretirano z 0,5 ml 10 % natrijevega lauril sulfata v vazelinu zato, da bi bilo povzro čeno lokalno draženje. 
Dan 6–8 – tretirana skupina 
S preskusnega obmo čja se spet odstranijo dlake. Filtrirni papir (2 × 
4 cm), povsem impregniran s preskusno snovjo v ustreznem nosilcu, 
se nanese na preskusno obmo čje in je z okluzivnim povojem v stiku 
s kožo 48 ur. Izbira nosilca mora biti utemeljena. Trde snovi so fino uprašene in inkorporirane v ustrezni nosilec. Če je primerno, se 
tekočine lahko nanesejo nerazred čene. 
Dan 6–8 – kontrolna skupina S preskusnega obmo čja se spet odstranijo dlake. Na preskusno 
območje se podobno nanese zgolj nosilec, ki je z okluzivnim 
povojem v stiku s kožo 48 ur.
 
1.5.1.3.2 Provokacija 
Dan 20–22 – tretirana skupina in kontrolna skupina 
Z bokov tretiranih in kontrolnih živali se odstrani dlaka. Na en bok 
živali se nanese obliž ali gaza, impregnirana s preskusno snovjo in, če je primerno, se tudi na drugi bok lahko nanese obliž ali gaza, 
impregnirana zgolj z nosilcem. Obliži so 24 ur v stiku s kožo z 
okluzivnim povojem.
 
1.5.1.3.3 Opazovanje in ocenjevanje: tretirana skupina in kontrolna skupina 
— približno 21 ur po odstranitvi obliža je treba provokacijsko 
območje očistiti ter ostri či na kratko in/ali obriti in depilirati, 
če je treba, 
— približno 3 ure pozneje (približno 48 ur od za četka provokacij ­
skega nanosa) se opazuje in zabeleži reakcija kože glede na 
ocene, prikazane v dodatku, 
— približno 24 ur po tem opazovanju se opravi in spet zabeleži 
drugo opazovanje (72 ur). 
Spodbuja se hitro čekiranje preskusnih in kontrolnih živali. 
Če je treba pojasniti rezultate, pridobljene v prvi provokaciji, je treba 
preučiti možnost izvedbe druge provokacije (t. j. ponovne provoka ­
cije), če je to primerno z novo kontrolno skupino, približno teden dni 
po prvi provokaciji. Ponovna provokacij a se lahko izvede tudi s 
prvotno kontrolno skupino.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 269
 
Vse kožne reakcije in kakršni koli nenavadni izsledki, vklju čno s 
sistemskimi reakcijami, ki so posledica indukcije in postopkov 
provokacij e, je treba opazovati in zabeležiti v skladu z ocenjevalno lestvico po Magnussonu/Kligmanu (glej dodatek). Za razjasnitev dvomljivih reakcij se lahko izvedejo drugi postopki, npr. histopato ­
loška raziskava ali meritev debeline kožne gube.
 
1.5.2  Buehlerjev preskus  
1.5.2.1 P r i p r a v e 
Zdravi mladi odrasli albino morski praši čki se najmanj 5 dni pred 
preskusom aklimatizirajo na razmere v laboratoriju. Pred preskusom 
so živali naklju čno razdeljene v skupine, ki bodo tretirane. Glede na 
uporabljeno preskusno metodo se dlaka lahko odstrani s striženjem, britjem ali morda s kemi čno depilacijo. Pri tem je treba paziti, da 
koža ostane nepoškodovana. Živali je treba pred za četkom in na 
koncu preskusa stehtati.
 
1.5.2.2 P r e s k u s n i p o g o j i  
1.5.2.2.1 Preskusne živali 
Uporabljajo se albino morski praši čki tistih sevov, ki se obi čajno 
uporabljajo v laboratorijih.  
1.5.2.2.2 Število in spol 
Uporabijo se lahko živali moškega in/ali ženskega spola. Samice 
morskih praši čkov morajo biti nuliparne in ne breje. 
Skupina, ki bo tretirana, mora biti sestavljena iz najmanj 20, 
kontrolna skupina pa iz najmanj 10 živali.  
1.5.2.2.3 Velikost odmerkov 
Koncentracija preskusne snovi, uporabljene za vsako indukcijsko 
izpostavljenost, mora ustrezati najvišjemu odmerku, ki lahko 
povzroči blago, vendar ne čezmerno draženje kože. Koncentracija, 
ki se uporabi za provokacijsko izpostavljenost, mora ustrezati najviš ­
jemu odmerku, ki še ne povzro či draženja. 
Če je potrebno, se lahko ustrezne koncentracije dolo čijo s pilotno 
študijo, ki se opravi na dveh ali treh živalih.Pri preskusnih vodo ­
topnih snoveh je najprimernejše, da se kot nosilec uporabi voda ali 
razredčena nedražilna raztopina surfaktanta. Za druge preskusne 
snovi so primernejše mešanice 80 % etanola in vode za indukcijo, za provokacijo pa aceton.
 
1.5.2.3 P o s t o p e k  
1.5.2.3.1 Indukcija 
Dan 0 – tretirana skupina 
Z enega boka živali se odstrani dlaka (na kratko ostriže). Obliž, ki bo 
uporabljen v preskusu, je treba popolnoma impregnirati s preskusno 
snovjo v ustreznem nosilcu (izbira nosilca mora biti utemeljena; če je 
primerno, se teko čine lahko nanesejo nerazred čene). 
Obliž je treba nanesti na preskusno obmo čje in ga z okluzivnim 
obližem ali gazo ali ustreznim povojem držati v stiku s kožo 6 ur.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 270
 
Obliž mora biti okluziven. Lahko se uporabi okrogla ali štirikotna 
vatna blazinica velikosti približno 4–6 cm  2 . Za zagotovitev okluzije 
je primerna imobilizacija z ustrezno napravo za imobilizacijo. Če se 
uporabi povoj, utegne biti potrebna dodatna izpostavljenost. 
Dan 0 – kontrolna skupina Z enega boka živali je odstranjena dlaka (na kratko ostrižena). Na 
preskusno obmo čje se podobno kakor pri tretirani skupini nanese 
zgolj nosilec. Obliž se nanese na preskusno obmo čje tako, da je 
okluzivni obliž ali gaza ali ustrezen povoj v stiku s kožo 6 ur. Če 
se lahko dokaže, da posnemajo ča kontrolna skupina ni potrebna, se 
lahko uporabi netretirana kontrolna skupina. 
Dan 6-8 in 13–15 – tretirana in kontrolna skupina 
Na dan 6–8 in spet na dan 13–15 se na istem preskusnem obmo čju 
(po potrebi obritem) opravi enak nanos kakor na dan 0.
 
1.5.2.3.2 Provokacija 
Dan 27–29 – tretirana in kontrolna skupina 
Z netretiranega boka tretiranih in kontrolnih živali se odstrani dlaka 
(na kratko ostrižena). Na zadnji del netretiranega boka tretiranih in 
kontrolnih živali se nanese okluzivni obliž ali gaza, vsebujo ča 
ustrezno koli čino preskusne snovi pri najvišji koncentraciji, ki še 
ne povzro ča draženj a. 
Če je primerno, se okluzivni obliž ali gaza, ki vsebuje samo nosilec, 
nanese tudi na sprednji netretirani bok tretiranih in tudi kontrolnih 
živali. Obliže ali gaze je treba z ustreznim povojem držati v stiku s kožo 6 ur.
 
1.5.2.3.3 Opazovanje in ocenjevanje 
— približno 21 ur po odstranitvi obliža je treba s provokacijskega 
območja odstraniti dlako, 
— približno 3 ure pozneje (približno 30 ur po nanosu provokacij 
skega obliža) se opazujejo in zabeležijo reakcije kože glede na ocene, prikazane v dodatku, 
— približno 24 ur po 30-urnem opazovanju (približno 54 ur po 
nanosu provokacijskega obliža) se kožne reakcije spet opazujejo 
in zabeležijo. 
Spodbuja se hitro čekiranje preskusnih in kontrolnih živali. 
Če je treba razjasniti rezultate, pridobljene v prvi provokaciji, je 
treba preu čiti možnost za izvedbo druge provokacije (t. j. ponovne 
provokacije), kjer je primerno, z novo kontrolno skupino, približno 
teden dni po prvi provokaciji. Ponovna provokacij a se lahko izvede 
tudi na prvotni kontrolni skupini.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 271
 
Vse kožne reakcije in kakršne koli nenavadne izsledke, vklju čno s 
sistemskimi reakcijami, ki so posledica indukcije in postopkov 
provokacij e, je treba opazovati in zabeležiti v skladu z ocenjevalno lestvico po Magnussonu/Kligmanu (glej dodatek). Za razjasnitev dvomljivih reakcij se lahko opravijo tudi drugi postopki, npr. histo ­
patološka raziskava ali meritev debeline kožne gube.
 
2. PODATKI (GPMT in Buehlerjev preskus)  
Vse podatke je treba povzeti v obliki tabele, ki za vsako posamezno 
žival prikazuje kožne reakcije pri posameznih opazovanjih.  
3. PORO ČANJE (GPMT in Buehlerjev preskus)  
Če je bila pred preskusom na morskem praši čku opravljena izlo čilna 
analiza, se mora predložiti opis ali napotitev k preskusu (npr. lokalna 
analiza limfnih vozlov (LLNA), preskus otekanja ušesa pri miših (MEST)), vklju čno s podrobnimi podatki o postopku, skupaj z rezul ­
tati, ki so bili pridobljeni s preskusnimi in referen čnimi snovmi.
 
Poročilo o preskusu (GPMT in Buehlerjev preskus)  
Če je mogo če, poročilo o preskusu vklju čuje naslednje informacije: 
Poskusne živali: — sev uporabljenih morskih praši čkov, 
— število, starost in spol živali, — izvor, nastanitveni pogoji, hrana itd., — teža vsake živali na za četku preskusa. 
Preskusni pogoji: — tehnika priprave obmo čja nanosa obliža, 
— podrobnosti o uporabljenih materialih ter tehniki priprave in 
nanosa obliža, 
— rezultat pilotne študije z izsledki o indukcijskih in provokacijskih 
koncentracijah, ki bodo uporabljene v preskusu, 
— podrobnosti o pripravi preskusne snovi, nanosu in odstranitvi, — utemeljitev izbire uporabljenega nosilca, — koncentracije nosilca in preskusne snovi, uporabljene za induk ­
cijsko in provokacijsko izpostavljenost, ter skupna koli čina snovi, 
ki je bila nanesena za indukcijo in provokacijo. 
Rezultati: 
— povzetek rezultatov zadnjega pregleda ob čutljivosti in zaneslji ­
vosti (glej 1.3), vklju čno z informacijami o snovi, koncentraciji 
in uporabljenem nosilcu,
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 272
 
— opazovanja, opravljena na posameznih živalih, vklju čno s 
sistemom ocenjevanja, 
— podroben opis narave in stopnje opaženih u činkov, 
— kakršni koli histopatološki izsledki. Razprava o rezultatih. Zaključki.
 
4. SKLICEVANJE  
Ta metoda je skladna s smernicami za preskušanje OECD 406.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 273
 
Dodatek  
TABELA  
Ocenjevalna lestvica po Magnussonu/Kligmanu za ocenjevanje reakcij pri 
provokacijskem preskusu z obliži  
0 = ni vidnih znakov 1 = diskreten ali neenakomeren eritem 2 = zmeren in zlit eritem 3 = intenziven eritem in oteklina
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 274
 
B.7 28-DNEVNA ŠTUDIJA ORALNE STRUPENOSTI S PONAVLJAJO ČIMI 
SE ODMERKI NA GLODAVCIH  
UVOD 
1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD 407 (2008). 
Prvotna Smernica za preskušanje 407 je bila sprejeta leta 1981. Leta 1995 je 
bila sprejeta revidirana razli čica, da bi se z živalmi, uporabljenimi v študiji, 
pridobile dodatne informacije, zlasti o nevrotoksi čnosti in imunotoksi čnosti. 
2. OECD se je leta 1998 lotila prednostne naloge revidiranja obstoje čih 
smernic za preskušanje ter priprave novih smernic za presejalne preskuse 
in preskušanje potencialnih povzro čiteljev endokrinih motenj (8). Eden od 
elementov te naloge je bil posodobitev obstoje če smernice OECD za „28- 
dnevno študijo oralne strupenosti s ponavljajo čimi se odmerki na glodavcih“ 
(TG 407) s parametri, ki so primerni za odkrivanje endokrinega delovanja 
preskusnih kemikalij. Ta postopek je bil predmet obsežnega mednarodnega 
programa za preskušanje pomena in uporabnosti dodatnih parametrov, u čin­
kovitosti teh parametrov pri kemikalijah z (anti)estrogenim, (anti)andro ­
genim in (proti)š čitničnim delovanjem, ponovljivosti v enem ali ve č labo­
ratorijih ter interference novih parametrov s parametri, zahtevanimi v prejšnji smernici TG 407. Velika koli čina podatkov, ki je bila pri tem prid ­
obljena, je bila zbrana in podrobno ocenjena v iz črpnem poro čilu OECD (9). 
Ta posodobljena preskusna metoda B.7 (ki ustreza smernici TG 407) je plod 
izkušenj in rezultatov, pridobljenih med mednarodnim preskusnim progra ­
mom. Z njo se lahko nekateri z endokrinim sistemom posredovani u činki 
obravnavajo skupaj z drugimi toksikološkimi u činki.
 
ZAČETNI PREUDARKI IN OMEJITVE 
3. Pri ocenjevanju in vrednotenju strupenih lastnosti kemikalije se lahko 
metoda s ponavljanjem odmerkov uporabi za dolo čitev oralne strupenosti, 
potem ko se s preskusi akutne strupenosti že pridobijo za četne informacije o 
strupenosti. Cilj te preskusne metode je preu čiti učinke na zelo razli čne 
možne tar če strupenosti. Z njo se pridobivajo informacije o možnih nevar ­
nostih za zdravje, ki lahko nastanejo pri ponavljajo či se izpostavljenosti v 
razmeroma omejenem obdobju, vklju čno z učinki na živ čni, imunski in 
endokrini sistem. V zvezi s temi kon čnimi točkami bi se s to metodo morale 
identificirati kemikalije, ki imajo nevrotoksi čni potencial, zaradi katerega je 
morda upravi čena dodatna poglobljena raziskava tega vidika, in kemikalije, 
ki vplivajo na fiziologijo š čitnice. Z njo se lahko pridobijo tudi podatki o 
kemikalijah, ki vplivajo na razmnoževalne organe mladih odraslih živali 
moškega in/ali ženskega spola, nakaže pa lahko tudi imunološke u činke. 
4. Rezultate te preskusne metode B.7 je treba uporabiti za opredeljevanje 
nevarnosti in oceno tveganja. Rezultate, ki se dobijo s parametri, poveza ­
nimi z endokrinim sistemom, je treba obravnavati ob upoštevanju doku ­
menta OECD z naslovom „Conceptual Framework for Testing and Asses ­
sment of Endocrine Disrupting Chemicals“ (11). Metoda obsega osnovno študijo strupenosti s ponavljajo čimi se odmerki, ki se lahko uporabi za 
kemikalije, za katere ni upravi čena 90-dnevna študija (npr. če obseg proiz ­
vodnje ne presega dolo čenih mej), ali kot predhodna študija za dolgoro čno 
študijo. Izpostavljenost mora trajati 28 dni.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 275
 
5. Mednarodni program za validacijo parametrov, primernih za morebitno 
odkrivanje endokrinega delovanja preskusne kemikalije, je pokazal, da je 
kakovost podatkov, pridobljenih s to preskusno metodo B.7, precej odvisna od izkušenj preskuševalnega laboratorija. To se nanaša zlasti na histopato ­
loško odkrivanje cikli čnih sprememb pri razmnoževalnih organih samic ali 
določanje teže malih, hormonsko odvisnih organov, ki jih je težko secirati. 
Napotki o histopatologiji so bili pripravljeni (19). Na voljo so na javni spletni strani OECD s smernicami za preskušanje. Njihov namen je poma ­
gati patologom pri preiskavah in pripomo či k pove čanju občutljivosti 
analize. V to preskusno metodo je bilo vklju čenih več parametrov, za katere 
je bilo ugotovljeno, da so kazalniki endokrine strupenosti. Parametri, za katere ni bilo na voljo dovolj podatkov, ki bi dokazovali njihovo uporab ­
nost, ali za katere se je v validacijskem programu izkazalo, da je njihova 
zmožnost odkrivanja povzro čiteljev endokrinih motenj slaba, so predlagani 
kot neobvezne kon čne točke (glej Dodatek 2). 
6. Glede na podatke, pridobljene v validacijskem postopku, je treba poudariti, 
da ta analiza ni dovolj ob čutljiva za identifikacijo vseh snovi z (anti)andro ­
genim ali (anti)estrogenim na činom delovanja (9). Ta preskusna metoda se 
ne izvaja v fazi življenja, ki je najbolj ob čutljiva za endokrine motnje. Kljub 
temu pa so bile pri tej preskusni metodi med validacijskim postopkom identificirane snovi, ki šibko in mo čno vplivajo na delovanje š čitnice, ter 
snovi z mo čnim in zmernim endokrinim delovanjem, ki delujejo prek estro ­
genih ali androgenih receptorjev, v le redkih primerih pa so bile identifici ­
rane snovi z endokrinim delovanjem, ki šibko vplivajo na estrogene ali androgene receptorje. Zato te metode ni mogo če opisati kot presejalno 
analizo za endokrino delovanje. 
7. Neobstoj u činkov, povezanih s temi na čini delovanja, se zato ne sme obrav ­
navati kot dokaz o neobstoju u činkov na endokrini sistem. Kar zadeva z 
endokrinim sistemom posredovane u činke, se snovi torej ne smejo opredeliti 
samo na podlagi rezultatov te preskusne metode, temve č je treba za ozna ­ 
čitev potencialnega endokrinega delovanja uporabiti pristop, ki temelji na 
zanesljivosti dokazov in vklju čuje vse obstoje če podatke o kemikaliji. Zato 
mora sprejetje regulativne odlo čitve o endokrinem delovanju (opredelitev 
snovi) temeljiti na široko zasnovanem pristopu, in ne samo na rezultatih te preskusne metode. 
8. Priznano je, da morajo vsi postopki z živalmi izpolnjevati lokalne standarde, 
ki veljajo za oskrbo živali; spodaj opisana oskrba živali in ravnanje z njimi 
pomenita minimalne standarde izvajanja, nad katerimi prevladajo lokalni predpisi, če so strožji. OECD je dolo čila dodatne napotke o humanem 
ravnanju z živalmi (14). 
9. Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1.
 
NAČELO PRESKUSA 
10. Preskusna kemikalija se dnevno v stopnjevanih odmerkih oralno daje ve č 
skupinam preskusnih živali, in sicer po ena velikost odmerka na skupino v obdobju 28 dni. V obdobju dajanja odmerkov je treba živali vsak dan pozorno opazovati, ali kažejo znake zastrupitve. Na živalih, ki med 
preskusom poginejo ali so evtanazirane, se opravi obdukcija, ob koncu 
preskusa pa se preživele živali evtanazirajo, nato pa se na njih opravi
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 276
 
obdukcija. Z 28-dnevno študijo se pridobijo informacije o u činkih ponavlja ­
joče se oralne izpostavljenosti, poleg tega pa lahko ta študija nakaže potrebo 
po dodatnih dolgoro čnejših študijah. Prav tako lahko pomaga pridobiti infor ­
macije o izbiri koncentracij za dolgoro čnejše študije. S podatki, pridoblje ­
nimi na podlagi preskusne metode, mora biti mogo če opredeliti strupenost 
preskusne kemikalije, nakazati razmerje med odmerkom in odzivom ter 
določiti raven brez opaženih škodljivih u činkov (NOAEL).  
OPIS METODE  
Izbira živalske vrste  
11. Priporo čena vrsta glodavca je podgana, čeprav se lahko uporabijo tudi druge 
vrste glodavcev. Če se parametri, dolo čeni pri tej preskusni metodi B.7, 
preiskujejo na drugi vrsti glodavcev, je treba to podrobno utemeljiti. Čeprav 
je biološko verjetno, da se druge vrste na strupene snovi odzivajo podobno kot podgane, je pri manjših vrstah mogo ča večja spremenljivost zaradi 
tehničnih izzivov pri seciranju manjših organov. V mednarodnem validacij ­
skem programu za odkrivanje povzro čiteljev endokrinih motenj je bila 
podgana edina uporabljena vrsta. Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle živali obi čajno uporabljanih laboratorijskih sevov. Samice še niso smele 
kotiti in ne smejo biti breje. Odmerke je treba za četi dajati čim prej po 
odstavitvi od sesanja, vsekakor pa preden so živali stare 9 tednov. Na začetku študije morajo biti razlike v teži uporabljenih živali čim manjše in 
ne smejo presegati ± 20 % povpre čne teže za vsak spol. Če se študija s 
ponavljajo čimi se oralnimi odmerki izvaja kot predhodna študija dolgoro ­ 
čnejše študije, je zaželeno, da se v obeh študijah uporabijo živali istega seva 
in istega izvora.
 
Nastanitev in hranjenje  
12. Vsi postopki morajo biti v skladu z lokalnimi standardi oskrbe laboratorij ­
skih živali. Temperatura prostora s preskusnimi živalmi mora znašati 22 °C (± 3 °C). Čeprav mora biti relativna vlažnost vsaj 30 % in po možnosti ne 
sme presegati 70 %, razen med čiščenjem prostora, mora biti cilj 50- do 60- 
odstotna vlažnost. Osvetlitev mora biti umetna s fotoperiodo 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporablja obi čajna laboratorijska hrana 
z neomejeno koli čino pitne vode. Na izbiro hrane lahko vpliva potreba po 
zagotovitvi ustrezne primesi preskusne kemikalije, če se daje po tej metodi. 
Živali morajo biti nastanjene v majhnih skupinah istega spola; posami čno so 
lahko nastanjene, če je to znanstveno utemeljeno. Pri skupinski nastanitvi je 
lahko v kletki najve č pet živali. 
13. Hrano je treba redno analizirati, da ne vsebuje kontaminantov. Vzorec hrane 
je treba hraniti, dokler poro čilo ni kon čano.
 
Priprava živali  
14. Zdrave mlade odrasle živali se naklju čno dodelijo kontrolnim in tretiranim 
skupinam. Kletke je treba razporediti tako, da so morebitni u činki zaradi 
položaja kletk čim manjši. Živali se ozna čijo z edinstvenimi oznakami in so 
pred začetkom tretiranja najmanj pet dni v kletkah, da se prilagodijo labo ­
ratorijskim razmeram.  
Priprava odmerkov  
15. Preskusna kemikalija se daje z gavažo ali s hrano ali pitno vodo. Metoda 
oralnega dajanja odmerkov je odvisna od namena študije in fizikalnih/kemij ­
skih/toksikokineti čnih lastnosti preskusne kemikalije.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 277
 
16. Po potrebi se preskusna kemikalija raztopi ali suspendira v ustreznem 
nosilcu. Priporo čljivo je, da se, če je mogo če, najprej preu či možnost 
uporabe vodne raztopine/suspenzije, nato raztopine/suspenzije v olju (npr. koruznem), šele potem pa možnost raztopine v drugih nosilcih. Pri nevodnih nosilcih morajo biti strupene lastnosti nosilca znane. Dolo čiti je treba stabil ­
nost preskusne kemikalije v nosilcu.
 
POSTOPEK  
Število in spol živali  
17. Za vsako velikost odmerka je treba uporabiti vsaj 10 živali (pet samic in pet 
samcev). Če je načrtovana evtanazija med študijo, je treba to število pove ­ 
čati za toliko živali, kolikor se jih namerava evtanazirati pred zaklju čkom 
študije. Razmisliti je treba o dodatni satelitski skupini desetih živali (pet vsakega spola) v kontrolni skupini in skupini, tretirani z najve čjim odmer ­
kom, na katerih bi se vsaj 14 dni po tretiranju opazovalo reverzibilnost, 
obstojnost ali zapoznelost nastopa strupenih u činkov.
 
Odmerjanje  
18. Na splošno je treba uporabiti najmanj tri preskusne skupine in kontrolno 
skupino, če pa se na podlagi ocene drugih podatkov pri odmerku 1 000 
mg/kg telesne teže/dan u činki ne pri čakujejo, se lahko izvede mejni preskus. 
Če ustrezni podatki niso na voljo, se lahko opravi študija za ugotavljanje 
območja (na živalih istega seva in izvora), s pomo čjo katere se dolo čijo 
odmerki, ki bodo uporabljeni. Z živalmi v kontrolni skupini je treba ravnati enako kot z živalmi v preskusni skupini, le da niso deležne tretiranja s 
preskusno kemikalijo. Če se pri dajanju preskusne kemikalije uporablja 
nosilec, mora kontrolna skupina prejeti najve čjo uporabljeno koli čino 
nosilca. 
19. Pri izbiri velikosti odmerkov je treba upoštevati vse podatke o strupenosti in 
(toksiko)kineti čne podatke, ki so na voljo za preskusno kemikalijo ali 
sorodne kemikalije. Izbrati je treba najve čjo velikost odmerka, da se povzro ­ 
čijo strupeni u činki, ne pa tudi smrt ali hudo trpljenje. Nato je treba izbrati 
padajoče zaporedje velikosti odmerkov, da se pokažejo vsi odzivi, ki so 
odvisni od velikosti odmerka, in ugotovi najmanjša velikost odmerka, pri kateri ni opaženih škodljivih u činkov (NOAEL). Za dolo čanje padajo čih 
velikosti odmerkov je velikokrat najbolje uporabiti dva- do štirikratne inter ­
vale, namesto zelo velikih intervalov (npr. ve čjih od desetkratnika) med 
odmerki pa je pogosto primerneje dodati 4. preskusno skupino. 
20. Če se ugotovijo splošna strupenost (npr. zmanjšana telesna teža, u činki na 
jetra, srce, plju ča ali ledvice itd.) ali druge spremembe, ki morda niso 
toksične reakcije (npr. zmanjšan vnos hrane, pove čanje jeter), je potrebna 
previdnost pri razlagi ugotovljenih u činkov na imunske, nevrološke ali 
endokrine ob čutljive kon čne točke.
 
Mejni preskus  
21. Če preskus pri odmerku, velikem najmanj 1 000 mg/kg telesne teže/dan, ali 
pri enakovrednem deležu v hrani ali pitni vodi pri vnosu s hrano ali pitno 
vodo (na podlagi telesne teže), pri katerem so uporabljeni postopki, opisani 
za to študijo, ne povzro či opaznih strupenih u činkov in če na podlagi 
podatkov o strukturno sorodnih kemikalijah strupenost ni pri čakovana, 
popolna študija s tremi velikostmi odmerkov morda ni potrebna. Mejni 
preskus se uporabi, razen če izpostavljenost človeka nakazuje potrebo po 
uporabi ve čjega odmerka.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 278
 
Dajanje odmerkov  
22. Preskusna kemikalija se daje živalim vsak dan 7 dni na teden v obdobju 28 
dni. Če se preskusna kemikalija živalim daje z gavažo, jo je treba dajati v 
enkratnem odmerku z uporabo želod čne cevke ali ustrezne intubacijske 
kanile. Najve čja količina tekočine, ki se lahko da naenkrat, je odvisna od 
velikosti preskusne živali. Koli čina ne sme presegati 1 ml/100 g telesne 
teže, razen pri vodnih raztopinah, pri katerih se lahko uporabi 2 ml/100 g telesne teže. Razen pri dražilnih ali jedkih kemikalijah, ki pri ve čjih koncen ­
tracijah navadno povzro čijo močnejše učinke, je treba s prilagajanjem 
koncentracije čim bolj zmanjšati spremenljivost preskusne koli čine, da se 
zagotovi stalna koli čina pri vseh velikostih odmerkov. 
23. Pri kemikalijah, ki se dajejo s hrano ali pitno vodo, je treba zagotoviti, da 
količine uporabljene preskusne kemikalije ne vplivajo na normalen vnos 
hrane ali porabo vode. Če se preskusna kemikalija daje s hrano, se lahko 
uporabi bodisi konstantna koncentracija v hrani (ppm) bodisi konstantna 
velikost odmerka glede na telesno težo živali; uporabljeni na čin je treba 
navesti. Če se kemikalija daje z gavažo, je treba odmerke dajati vsak dan 
ob približno istem času in jih ustrezno prilagajati, da se vzdržuje konstantna 
velikost odmerka glede na telesno težo živali. Če se študija s ponavljajo čimi 
se odmerki izvaja kot predhodna študija dolgoro čne študije, je treba v obeh 
študijah uporabiti podobno hrano.
 
Opazovanja  
24. Obdobje opazovanja mora trajati 28 dni. Živali iz satelitske skupine, ki so 
bile izbrane za opazovanja po koncu tretiranja, je treba pustiti vsaj 14 dni brez kakršnega koli tretiranja, da se odkrije zapoznel nastop, obstojnost ali izginotje strupenih u činkov. 
25. Splošna klini čna opazovanja je treba opraviti vsaj enkrat na dan, po 
možnosti vsak dan ob istem času in ob upoštevanju obdobja najve čje inten­
zivnosti pri čakovanih u činkov po vnosu odmerka. Podatke o zdravstvenem 
stanju živali je treba zabeležiti. Živali je treba vsaj dvakrat na dan opazovati za odkrivanje obolevnosti in smrtnosti. 
26. Enkrat pred prvo izpostavljenostjo (za omogo čanje primerjav na istem 
osebku) in nato vsaj enkrat na teden je treba opraviti natan čna klinična 
opazovanja vseh živali. Ta opazovanja je treba opraviti zunaj kletk, v katerih živali bivajo, na standardnem mestu in po možnosti vedno ob istem času. 
Opažanja je treba skrbno zabeležiti, po možnosti z uporabo sistemov to čko­
vanja, ki jih izrecno dolo či preskuševalni laboratorij. Prizadevati si je treba, 
da se preskusni pogoji čim manj spreminjajo in da opazovanja po možnosti 
opravijo opazovalci, ki s tretiranjem niso seznanjeni. Pozornost je med 
drugim treba nameniti vsem spremembam na koži, kožuhu, o čeh in sluzni ­
cah, pojavu sekrecije in ekskrecije ter delovanju avtonomnega živ čevja (npr. 
solzenju, piloerekciji, velikosti zenic, nenavadnemu vzorcu dihanja). Prav 
tako je treba zabeležiti spremembe v hoji, drži in odzivu na ravnanje z 
živalmi, pa tudi prisotnost kloni čnih ali toni čnih gibov, stereotipij (npr. 
prekomernega čiščenja, ponavljajo čega se vrtenja v krogu) ali nenormalnega 
vedenja (npr. samopohabe, vzvratne hoje) (2). 
27. V četrtem tednu izpostavljenosti je treba oceniti senzori čne reakcije na 
različne vrste dražljajev (2) (npr. slušne, vidne in proprioceptivne dražljaje) 
(3) (4) (5), mo č oprijema (6) in motori čno aktivnost (7). Nadaljnje podrob ­
nosti glede možnih postopkov so na voljo v navedenih virih. Uporabiti je 
mogoče tudi druge postopke, ki niso opisani v navedenih virih.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 279
 
28. Funkcionalna opazovanja, ki se izvajajo v četrtem tednu izpostavljenosti, se 
lahko izpustijo, če se študija izvaja kot predhodna študija poznejše (90- 
dnevne) študije subkroni čne strupenosti. V takem primeru je treba funkcio ­
nalna opazovanja vklju čiti v to dopolnilno študijo. Po drugi strani pa lahko 
podatki o funkcionalnih opazovanjih, pridobljeni v študiji s ponavljajo čimi 
se odmerki, pomagajo pri dolo čanju velikosti odmerkov za poznejšo študijo 
subkronične strupenosti. 
29. Izjemoma se lahko funkcionalna opazovanja izpustijo tudi za skupine, ki 
sicer kažejo znake zastrupitve v tolikšnem obsegu, da bi to mo čno oviralo 
izvedbo funkcionalnega preskusa. 
30. Pri obdukciji se lahko z vaginalnim brisom dolo či cikel estrusa vseh samic 
(ni obvezno). Ta opazovanja zagotovijo informacije o fazi cikla estrusa ob žrtvovanju in pomagajo pri histološki oceni tkiv, ob čutljivih na estrogen 
(glej napotke o histopatologiji (19)).
 
Telesna teža in poraba hrane/vode  
31. Vse živali je treba stehtati vsaj enkrat na teden. Porabo hrane je treba meriti 
najmanj tedensko. Če se preskusna kemikalija daje s pitno vodo, je treba 
vsaj enkrat na teden izmeriti tudi porabo vode.  
Hematologija  
32. Ob koncu preskusnega obdobja je treba opraviti naslednje hematološke 
preiskave: hematokrit, koncentracija hemoglobina, število eritrocitov, retiku ­
lociti, skupno in diferencialno število levkocitov, število trombocitov ter 
čas/zmožnost koagulacije. Druge preiskave, ki jih je treba opraviti, če 
imajo preskusna kemikalija ali njeni domnevni metaboliti oksidativne last ­
nosti oziroma če obstaja sum, da jih imajo, vklju čujejo koncentracijo methe ­
moglobina in Heinzeva telesca. 
33. Vzorce krvi je treba odvzeti na imenovanem mestu neposredno pred 
postopkom evtanazije živali ali med njim in jih hraniti v ustreznih pogojih. Živali je treba pred evtanazijo čez noč postiti (
 1 ). 
Klinična biokemija  
34. Klini čne biokemi čne preiskave za ugotavljanje glavnih strupenih u činkov na 
tkiva, zlasti na ledvice in jetra, je treba opraviti na vzorcih krvi, ki so bili 
vsem živalim odvzeti neposredno pred postopkom njihove evtanazije ali med njim (razen živalim, ki so bile najdene umirajo če in/ali so bile evtana ­
zirane pred koncem študije). Preiskave plazme ali seruma vklju čujejo dolo ­ 
čanje natrija, kalija, glukoze, skupnega holesterola, se čnine, kreatinina, 
skupnih beljakovin in albumina, najmanj dveh encimov, ki sta kazalnika hepatoceli čnih učinkov (kot so alanin-aminotransferaza, aspartat-aminotrans ­
feraza, alkalna fosfataza, γ-glutamil transpeptidaza in glutamat-dehidrogena ­
za), ter žol čnih kislin. Meritve dodatnih encimov (jetrnega ali drugega 
izvora) in bilirubina lahko v nekaterih okoliš činah zagotovijo koristne infor ­
macije. 
35. Po izbiri se lahko v zadnjem tednu študije izvedejo naslednje analize urina, 
dobljenega z zbiranjem v dolo čenih časovnih obdobjih: videz, koli čina, 
osmolalnost ali specifi čna teža, pH, beljakovine, glukoza in kri/krvne celice.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 280  
( 1 ) Za številne preiskave seruma in plazme, zlasti za dolo čanje glukoze, se priporo ča 
postenje čez noč. Glavni razlog za to je, da bi pove čana spremenljivost, ki bi se zagotovo 
pojavila, če se žival ne bi postila, lahko prikrila manj opazne u činke in otežila razlago. 
Po drugi strani pa lahko postenje čez noč spremeni splošni metabolizem živali in lahko 
zlasti pri študijah prehranjevanja povzro či motnje v dnevni izpostavljenosti preskusni 
kemikaliji. Če se uporabi postenje čez noč, je treba klini čne biokemi čne preiskave izvesti 
po zaklju čku funkcionalnih opazovanj v četrtem tednu študije.
 36. Poleg tega je treba razmisliti o študijah za preiskovanje plazemskih ali 
serumskih ozna čevalcev splošnih poškodb tkiva. Druge preiskave, ki jih je 
treba opraviti, če lahko znane lastnosti preskusne kemikalije vplivajo na 
povezane presnovne profile ali če obstaja sum, da lahko vplivajo nanje, 
vključujejo dolo čanje kalcija, fosfatov, trigliceridov, posebnih hormonov 
in holinesteraze. Te je treba opredeliti pri kemikalijah dolo čenih razredov 
oziroma za vsak primer posebej. 
37. Čeprav v mednarodni oceni z endokrinim sistemom povezanih kon čnih točk 
ni bilo mogo če dokazati nedvomne koristi dolo čanja ščitničnih hormonov 
(T3 in T4) in TSH, je lahko koristno obdržati vzorce plazme ali seruma za merjenje T3, T4 in TSH (ni obvezno), če obstaja znak o u činku na 
hipofizno-š čitnično os. Ti vzorci se lahko hranijo zamrznjeni pri –20 °C. 
Na spremenljivost in absolutne koncentracije pri dolo čanju hormonov lahko 
vplivajo naslednji dejavniki: 
— čas žrtvovanja zaradi spreminjanja koncentracij hormonov preko dneva, 
— način žrtvovanja, da se prepre či nepotreben stres pri živalih, ki lahko 
vpliva na koncentracije hormonov, 
— preskusni kompleti, ki se uporabljajo za dolo čanje hormonov in se lahko 
razlikujejo po standardnih krivuljah. 
Dokončno identifikacijo kemikalij, ki vplivajo na š čitnico, je zanesljiveje 
opraviti s histopatološko analizo kot z ravnmi hormonov. 
38. Vzorce plazme, ki so predvideni posebej za dolo čanje hormonov, je treba 
odvzeti ob primerljivih urah dneva. Priporo čljivo je, da se razmisli o dolo ­ 
čanju ravni T3, T4 in TSH, sproženih s histopatološkimi spremembami 
ščitnice. Števil čne vrednosti, pridobljene pri analiziranju koncentracij 
hormonov, so pri razli čnih kompletih za analize, ki so na voljo na trgu, 
različne. Zato morda ne bo mogo če določiti izvedbenih meril, ki temeljijo na 
enotnih preteklih podatkih. Druga možnost pa je, da si laboratoriji prizade ­
vajo za kontrolne koeficiente variacije, ki so nižji od 25 za T3 in T4 ter nižji 
od 35 za TSH. Vse koncentracije morajo biti zabeležene v ng/ml. 
39. Če pretekli izhodiš
čni podatki niso ustrezni, je treba razmisliti o dolo čitvi 
hematoloških in klini čnih biokemi čnih spremenljivk pred za četkom dajanja 
odmerkov ali po možnosti pri sklopu živali, ki niso vklju čene v preskusne 
skupine.  
PATOLOGIJA  
Makroskopska obdukcija  
40. Na vseh živalih v študiji se opravi popolna in natan čna makroskopska 
obdukcija, ki obsega natan čen pregled zunanje površine telesa, vseh odprtin, 
lobanjske, prsne in trebušne votline ter njihove vsebine. Z  jeter, ledvic,  
nadledvičnih žlez, mod, nadmodka, prostate in semenskih meši čkov s celo ­
tnimi  koagulacijskimi žlezami, priželjca, vranice, možganov in srca vseh 
živali (razen živali, ki so bile najdene umirajo če in/ali so bile evtanazirane 
pred koncem študije) je treba, kot je ustrezno, odstraniti vsa priraš čena tkiva 
in nato izmeriti njihovo mokro težo čim prej po disekciji, da se ne izsušijo. 
Pri prostati in vseh delih, ki spadajo k njej, je potrebna previdnost pri odstranjevanju priraš čenih tkiv, da se ne prebodejo semenski meši čki, ki 
so napolnjeni s teko čino. Lahko pa se semenski meši čki in prostata obrežejo 
in stehtajo po fiksaciji.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 281
 
41. Poleg tega se lahko čim prej po disekciji, da se ne izsušita, stehtata tudi 
naslednji tkivi: oba jaj čnika (mokra teža) in maternica, vklju čno z vratom 
(napotki za odstranitev in pripravo materni čnih tkiv za tehtanje so na voljo v 
OECD TG 440 (18)). 
42. Teža š čitnice (ni obvezno) se lahko dolo či po fiksaciji. Pri odstranjevanju 
priraščenih tkiv je prav tako potrebna velika previdnost, opravi pa se lahko 
šele po fiksaciji, da se prepre čijo poškodbe tkiv, ki lahko ogrozijo histopa ­
tološko analizo. 
43. Naslednja tkiva je treba shraniti v fiksacijskem sredstvu, ki je najprimernejše 
za vrsto tkiva in predvideno poznejšo histopatološko preiskavo (glej 
odstavek 47): vse  vidne lezije, možgane (reprezentativne regije, vklju čno 
z velikimi in malimi možgani ter mostom),  hrbtenja čo, oko, želodec,  
tanko in debelo črevo (vklju čno s Peyerjevimi ploš čami),  jetra, ledvice,  
nadledvične žleze, vranico, srce, priželjc, š čitnico, sapnik in  pljuča (shranijo 
se tako, da se napihnejo s fiksativom in nato potopijo),  spolne žleze (moda 
in jajčnike),  pomožne spolne organe (maternico in vrat, nadmodek, prostato 
in semenske meši čke s koagulacijskimi žlezami),  vagino, se čni mehur,  
bezgavke (poleg najbližje drenažne bezgavke je treba vzeti še eno bezgavko 
v skladu z izkušnjami laboratorija (15)),  periferni živec (ishiadi čni ali tibial ­
ni), po možnosti v neposredni bližini mišice,  skeletno mišico in  kost s  
kostnim mozgom (rezina ali sveže prepariran punktat kostnega mozga). 
Priporočljivo je, da se moda fiksirajo s potopitvijo v Bouinov ali prilagojen 
Davidsonov fiksativ (16) (17).  Tunico albugineo  je treba nežno in plitvo 
punktirati na obeh polih organa z iglo, da lahko fiksativ hitro prodre v tkivo. Na podlagi klini čnih in drugih izsledkov se lahko pokaže potreba po 
preiskavah dodatnih tkiv. Poleg tega je treba shraniti vse organe, ki bi 
lahko bili ciljni organi glede na znane lastnosti preskusne kemikalije. 
44. Z naslednjimi tkivi je mogo če pridobiti koristne informacije o endokrinih 
učinkih: spolnimi žlezami (jaj čniki in modi), pomožnimi spolnimi organi 
(maternico, vklju čno z vratom, nadmodkom, semenskimi meši čki s koagu ­
lacijskimi žlezami ter dorzolateralno in ventralno prostato), vagino, hipofizo, mlečno žlezo samcev, š čitnico in nadledvi čno žlezo. Spremembe v mle čnih 
žlezah samcev niso bile zadostno dokumentirane, vendar je lahko ta para ­
meter zelo ob čutljiv za snovi z estrogenim delovanjem. Opazovanja orga ­
nov/tkiv, ki niso našteti v odstavku 43, niso obvezna (glej Dodatek 2). 
45. Več informacij o disekciji, fiksaciji, sekciji in histopatologiji endokrinih tkiv 
je na voljo v napotkih o histopatologiji (19). 
46. V mednarodnem preskusnem programu je bilo pridobljenih nekaj dokazov, 
da se lahko manj opazni endokrini u činki kemikalij z majhno zmožnostjo za 
vplivanje na homeostazo spolnih hormonov lažje odkrijejo z motnjami sinhronizacije cikla estrusa v razli čnih tkivih kot z o čitnimi histopatološkimi 
spremembami spolnih organov samic. Čeprav ni dokon čnega dokaza o takih 
učinkih, je priporo čljivo, da se dokazi o možni asinhronosti cikla estrusa 
upoštevajo pri razlagi histopatologije jaj čnikov (folikularne celice ter celice 
teke in granuloze), maternice, materni čnega vratu in vagine. V to primerjavo 
se lahko, če se ocenjuje, vklju či tudi faza cikla, ugotovljena z vaginalnimi 
brisi.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 282
 
Histopatologija  
47. Popolno histopatološko preiskavo je treba opraviti na shranjenih organih in 
tkivih vseh živali iz kontrolne skupine ter živali iz skupine, tretirane z velikim odmerkom. Te preiskave je treba razširiti na živali iz skupin, treti ­
ranih z vsemi drugimi odmerki, če se v skupini, tretirani z velikim odmer ­
kom, opazijo spremembe, povezane s tretiranjem. 
48. Pregledati je treba vse vidne lezije. 49. Če se uporablja satelitska skupina, je treba opraviti histopatološko preiskavo 
na tkivih in organih, na katerih so bili opaženi u činki v tretiranih skupinah.
 
PODATKI IN PORO ČANJE  
Podatki  
50. Podatke je treba navesti za vsako žival. Poleg tega je treba vse podatke 
povzeti v preglednicah, v katerih se za vsako preskusno skupino navede število živali na za četku preskusa, število živali, ki so bile med preskusom 
najdene poginule ali so bile evtanazirane iz humanih razlogov, in čas vsake 
smrti ali evtanazije, število živali, ki kažejo znake zastrupitve, opis opaženih 
znakov zastrupitve, vklju čno s časom njihovega nastopa, trajanjem in 
resnostjo vseh strupenih u činkov, število živali, pri katerih so opažene lezije, 
vrste lezij in njihova resnost ter odstotek živali, pri katerih je opažena 
posamezna vrsta lezije. 
51. Če je mogo če, je treba števil čne rezultate ocenjevati na podlagi primerne in 
splošno priznane statisti čne metode. Pri primerjavah u činka vzdolž odmer ­
nega obmo čja se je treba izogibati ve čkratnim preskusom t. Statisti čne 
metode je treba izbrati med zasnovo študije. 
52. Za nadzor kakovosti se predlaga zbiranje preteklih kontrolnih podatkov in 
izračun koeficientov variacije za števil čne podatke, zlasti za parametre, 
povezane z odkrivanjem povzro čiteljev endokrinih motenj. Ti podatki se 
lahko uporabijo za primerjave, ko se ocenjujejo aktualne študije.
 
Poročilo o preskusu  
53. Poro čilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije:  
Preskusna kemikalija  
— agregatno stanje, čistost in fizikalno-kemijske lastnosti, 
— identifikacijske podatke.  
Nosilec (če je ustrezno)  
— utemeljitev izbire nosilca, če to ni voda.  
Preskusne živali  
— uporabljeno vrsta/sev, — število, starost in spol živali, — vir, nastanitvene pogoje, hrano itd., — težo vsake živali na za četku preskusa, 
— utemeljitev vrste, če to ni podgana.  
Preskusni pogoji  
— utemeljitev izbire velikosti odmerkov, — podatke o formulaciji preskusne kemikalije/pripravi hrane, doseženi 
koncentraciji, stabilnosti in homogenosti pripravka,
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 283
 
— podatke o dajanju preskusne kemikalije, 
— preračunavanje koncentracije preskusne kemikalije v hrani ali vodi 
(ppm) v dejanski odmerek (mg/kg telesne teže/dan), če je ustrezno, 
— podatke o kakovosti hrane in vode.  
Neobvezne kon čne točke, ki se preiskujejo  
— seznam neobveznih kon čnih točk, ki se preiskujejo.  
Rezultati  
— telesno težo/spremembe telesne teže, — porabo hrane in, če je ustrezno, porabo vode, 
— podatke o toksi čnih reakcijah glede na spol in velikosti odmerka, 
vključno z znaki zastrupitve, 
— vrsto, resnost in trajanje klini čnih opažanj (ali so reverzibilna ali ne), 
— ocene senzori čne aktivnosti, mo či oprijema in motori čne aktivnosti, 
— hematološke preskuse z ustreznimi referen čnimi vrednostmi, 
— klinične biokemijske preskuse z ustreznimi referen čnimi vrednostmi, 
— telesno težo ob evtanaziji in podatke o teži organov, — izsledke obdukcije, — podroben opis vseh ugotovitev histopatoloških preiskav, — podatke o absorpciji, če so na voljo, 
— statisti čno obdelavo rezultatov, kjer je to primerno.  
Razprava o rezultatih. Sklepi.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 284
 
Dodatek 1  
OPREDELITEV POJMOV 
Androgenost  je zmožnost kemikalije, da deluje tako kot naravni androgeni 
hormon (npr. testosteron) v sesalskem organizmu.  
Antiandrogenost  je zmožnost kemikalije, da zavira delovanje naravnega andro ­
genega hormona (npr. testosterona) v sesalskem organizmu.  
Antiestrogenost  je zmožnost kemikalije, da zavira delovanje naravnega estroge ­
nega hormona (npr. 17 β-estradiola) v sesalskem organizmu.  
Protiščitnično delovanje  je zmožnost kemikalije, da zavira delovanje naravnega 
ščitničnega hormona (npr. T  3 ) v sesalskem organizmu.  
Odmerjanje  je splošni izraz, ki obsega odmerek ter pogostnost in trajanje 
dajanja odmerka.  
Odmerek  je količina dane preskusne kemikalije. Izražen je kot masa preskusne 
kemikalije na enoto telesne teže preskusne živali na dan (npr. mg/kg telesne 
teže/dan) ali kot konstantna koncentracija v hrani.  
Očitna strupenost  je splošni izraz, ki opisuje jasne znake zastrupitve po dajanju 
preskusne kemikalije. Ti morajo zadostovati za oceno nevarnosti in biti takšni, da bi povečanje danega odmerka najverjetneje povzro čilo razvoj resnih znakov 
zastrupitve in verjetno smrt.  
NOAEL  je kratica za raven brez opaženih škodljivih u činkov ( no-observed- 
adverse-effect level ). To je najve čji odmerek, pri katerem ni opaženih škodljivih 
učinkov zaradi tretiranja.  
Estrogenost  je zmožnost kemikalije, da deluje tako kot naravni estrogeni hormon 
(npr. 17 β-estradiola) v sesalskem organizmu.  
Preskusna kemikalija  je vsaka snov ali zmes, preskušana z uporabo te 
preskusne metode.  
Ščitnično delovanje  je zmožnost kemikalije, da deluje tako kot naravni š čitnični 
hormon (npr. T
 3 ) v sesalskem organizmu.  
Validacija  je znanstveni proces, s katerim se dolo čijo delovne zahteve in 
omejitve preskusne metode ter pokažeta njena zanesljivost in ustreznost za dolo ­ 
čeni namen.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 285
 
Dodatek 2  
Končne točke, priporo čene za odkrivanje povzro čiteljev endokrinih motenj v 
tej preskusni metodi B.7  
Obvezne kon čne točke Neobvezne kon čne točke 
Teža 
— moda 
— nadmodek — nadledvi čne žleze 
— prostata in semenski meši čki s 
koagulacijskimi žlezami — jajčniki 
— maternica, vklju čno z vratom 
— ščitnica
 
Histopatologija  
— spolne žleze: 
— moda in — jajčniki 
— pomožni spolni organi: 
— nadmodek 
— prostata in semenski meši čki s 
koagulacijskimi žlezami 
— maternica, vklju čno z vratom 
— nadledvi čne žleze 
— ščitnica 
— vagina — vaginalni brisi 
— mlečne žleze samcev 
— hipofiza
 
Meritve hormonov  
— raven T3 in T4 v obtoku 
— raven TSH v obtoku  
VIRI:  
(1) OECD (Pariz, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the  ad hoc  
Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neuro ­
toxicity. 
(2) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria. Dokument št. 60. 
(3) Tupper, D. E., Wallace R. B. (1980). Utility of the Neurologic Examination 
in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003. 
(4) Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxico ­
logy. J. Toxicol Environ. Health 9: 691–704. 
(5) Moser, V. C., McDaniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat Strain and 
Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283. 
(6) Meyer, O. A., Tilson, H. A., Byrd, W. C., Riley, M. T. (1979). A Method 
for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats 
and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 286
 
(7) Crofton, K. M., Howard, J. L., Moser, V. C., Gill, M. W., Reiter, L. W., 
Tilson, H. A., MacPhail, R. C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor 
Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599–609. 
(8) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10.–11. marec 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5. 
(9) OECD (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: 
Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26. 
(10) OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for 
Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment 
No 21, ENV/JM/MONO(2002)8. 
(11) OECD (2012). Conceptual Framework for Testing and Assessment of 
Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/ 0,3343,fr_2649_37407_2348794_ 1_1_1_37407,00.html. 
(12) OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation 
Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2. 
(13) OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endo ­
crine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3. 
(14) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7. 
(15) Haley, P., Perry, R., Ennulat, D., Frame, S., Johnson, C., Lapointe, J.-M., 
Nyska, A., Snyder, P. W., Walker, D., Walter, G. (2005). STP Position 
Paper: Best Practice Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the 
Immune System. Toxicol Pathol 33: 404–407. 
(16) Hess, R. A., Moore, B. J. (1993). Histological Methods for the Evaluation 
of the Testis. V: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin, R. E., in Heindel, J. J. (ur.). Academic Press: San Diego, Kalifornija, str. 52–85. 
(17) Latendresse, J. R., Warbrittion, A. R., Jonassen, H., Creasy, D. M. (2002). 
Fixation of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524–533. 
(18) OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals N
 o 440: Utero ­
trophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic 
properties. 
(19) OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endo ­
crine and Reproductive Tests in Rodents. ENV/JM/Mono(2009)11.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 287
 
B.8 SUBAKUTNA STRUPENOST PRI VDIHAVANJU: 28-DNEVNA 
ŠTUDIJA  
POVZETEK 
Ta revidirana preskusna metoda B.8 je bila zasnovana za celovito opredelitev 
strupenosti preskusne kemikalije pri vdihavanju po ponavljajo či se izpostavlje ­
nosti v omejenem časovnem obdobju (28 dni) in zagotavljanje podatkov za 
kvantitativne ocene tveganja pri vdihavanju. Skupine najmanj 5 samcev in 5 samic glodavcev se 28 dni po 6 ur na dan izpostavljajo a) trem ali ve č različnim 
koncentracijam preskusne kemikalije, b) filtriranemu zraku (negativna kontrola) 
in/ali c) nosilcu (kontrola z nosilcem). Navadno se živali izpostavljajo 5 dni na teden, dovoljeno pa je tudi izpostavljanje 7 dni na teden. Vedno se preskušajo samci in samice, vendar se lahko izpostavljajo razli čnim koncentracijam, če je 
znano, da je en spol ob čutljivejši na dolo čeno preskusno kemikalijo. Ta metoda 
vodji študije omogo ča prožnost za vklju čitev satelitskih skupin (skupin za rever ­
zibilnost), bronhoalveolarne lavaže (BAL), nevroloških preskusov ter dodatnih kliničnih patoloških in histopatoloških ocen, da se bolje opredeli strupenost 
preskusne kemikalije.
 
UVOD 
1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD 412 (2009). 
Prvotna smernica za preskušanje 412 v zvezi s subakutno strupenostjo pri 
vdihavanju (TG 412) je bila sprejeta leta 1981 (1). Ta preskusna metoda B.8 (ki ustreza revidirani TG 412) je bila posodobljena, da upošteva trenutno stanje v znanosti ter izpolnjuje sedanje in prihodnje zakonodajne 
potrebe. 
2. Ta metoda omogo ča opredeljevanje škodljivih u činkov po ponavljajo či se 
dnevni izpostavljenosti preskusni kemikaliji z vdihavanjem, pri čemer 
preskušanje traja 28 dni. Podatki, pridobljeni z 28-dnevnimi študijami suba ­
kutne strupenosti pri vdihavanju, se lahko uporabljajo za kvantitativne 
ocene tveganja ( če taki študiji ne sledi 90-dnevna študija subkroni čne stru­
penosti pri vdihavanju (poglavje B.29 te priloge)). Ti podatki lahko tudi zagotovijo informacije o izbiri koncentracij za dolgoro čnejše študije, kot je 
90-dnevna študija subkroni čne strupenosti pri vdihavanju. Ta preskusna 
metoda ni posebej namenjena preskušanju nanomaterialov. Pojmi, ki se 
uporabljajo v okviru te preskusne metode, so opredeljeni na koncu tega poglavja in v Dokumentu s smernicami št. 39 (2).
 
ZAČETNI PREUDARKI 
3. Da se pove ča kakovost študije in kar najbolj zmanjša uporaba živali, mora 
preskuševalni laboratorij pred izvedbo študije preu čiti vse razpoložljive 
informacije o preskusni kemikaliji. Informacije, ki pomagajo pri izbiri ustreznih preskusnih koncentracij, lahko vklju čujejo identiteto, kemijsko 
strukturo in fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije; rezultate 
morebitnih preskusov strupenosti  in vitro  ali in vivo ; pričakovane uporabe 
in potencial za izpostavljenost ljudi; razpoložljive podatke (Q)SAR in toksi ­
kološke podatke o strukturno sorodnih kemikalijah ter podatke, pridobljene 
s preskušanjem akutne strupenosti pri vdihavanju. Če se med študijo pri ča­
kuje ali opazi nevrotoksi čnost, se lahko vodja študije odlo či vključiti 
ustrezne ocene, kot sta sklop funkcionalnih opazovanj (FOB) in merjenje motorične aktivnosti. Čeprav je lahko čas izpostavitve odlo čilen za posebne 
preglede, izvajanje teh dodatnih dejavnosti ne sme posegati v osnovno 
zasnovo študije.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 288
 
4. Razred čine jedkih ali dražilnih preskusnih kemikalij se lahko preskušajo pri 
koncentracijah, ki bodo zagotovile želeno stopnjo strupenosti (glej GD 39 
(2)). Pri izpostavljanju živali tem snovem morajo biti ciljne koncentracije dovolj nizke, da ne povzro čijo očitnih bole čin in trpljenja, vendar zadostne 
za razširitev krivulje koncentracija-odziv na ravni, ki izpolnjuje zakonodajni 
in znanstveni cilj preskusa. Te koncentracije je treba izbrati za vsak primer 
posebej, po možnosti na podlagi ustrezno zasnovane študije za ugotavljanje območja, s katero se pridobijo informacije o kriti čnih končnih točkah, 
morebitnem pragu draženja in času nastopa (glej odstavke 11–13). Izbrane 
koncentracije je treba utemeljiti. 
5. Umirajo če živali ali živali, ki o čitno trpijo bole čine ali kažejo znake hudega 
in trajnega trpljenja, je treba humano usmrtiti. Umirajo če živali se upošte ­
vajo enako kot tiste, ki so poginile med preskusom. Merila za sprejetje odločitve o usmrtitvi umirajo čih živali ali živali, ki zelo trpijo, in napotki 
za prepoznavanje predvidljive ali neizbežne smrti so obravnavani v Doku ­
mentu s smernicami OECD o humanih kon čnih točkah (3).
 
OPIS METODE  
Izbira živalske vrste  
6. Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle glodavce obi čajno uporabljanih 
laboratorijskih sevov. Najprimernejša vrsta je podgana. Uporabo drugih 
vrst je treba utemeljiti.  
Priprava živali  
7. Samice še niso smele kotiti in ne smejo biti breje. Na dan randomizacije 
morajo biti živali mladi odrasli primerki, ki so stari 7 do 9 tednov in katerih telesna teža ne odstopa za ve č kot ± 20 % od povpre čne teže za vsak spol. 
Živali se naklju čno izberejo, ozna čijo za posami čno prepoznavanje in so 
pred začetkom preskusa najmanj 5 dni v kletkah, da se prilagodijo labora ­
torijskim razmeram.
 
Oskrba živali  
8. Živali je treba posami čno identificirati, po možnosti s podkožnimi transpon ­
derji, da se olajšajo opazovanja in prepre či zmeda. Temperatura v prostoru 
za oskrbo preskusnih živali mora biti 22 ± 3 °C. Relativno vlažnost je treba 
po možnosti ohranjati v obmo čju 30–70 %, čeprav to morda ne bo mogo če, 
kadar se kot nosilec uporablja voda. Pred izpostavljanjem in po njem morajo biti živali v kletkah na splošno združene v skupine po spolu in koncentraciji, pri čemer število primerkov na kletko ne sme vplivati na 
neovirano opazovanje posamezne živali ter mora kar najbolj zmanjšati 
izgube zaradi kanibalizma in spopadov. Kadar bo izpostavljen samo nos živali, jih bo morda treba privajati na zadrževalne cevi. Te živalim ne smejo povzročati prevelikega fizi čnega ali toplotnega stresa ali stresa zaradi imobi ­
lizacije. Omejevanje gibanja lahko vpliva na fiziološke kon čne točke, kot 
sta telesna temperatura (hipertermija) in/ali minutni dihalni volumen. Če so 
na voljo splošni podatki, ki kažejo, da se takih sprememb ne pojavi zelo veliko, predhodno prilagajanje zadrževalnim cevem ni potrebno. Živali, ki 
se izpostavijo aerosolu s celim telesom, morajo biti med izpostavljenostjo 
nastanjene posami čno, da preskusnega aerosola ne morejo filtrirati preko 
kožuhov drugih primerkov v kletki. Razen med izpostavljenostjo se lahko uporablja obi čajna in potrjena laboratorijska hrana, ki jo spremlja neome ­
jena koli čina pitne vode iz komunalnega omrežja. Osvetlitev mora biti 
umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe/12 ur teme.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 289
 
Inhalacijske komore  
9. Pri izbiri inhalacijske komore je treba upoštevati lastnosti preskusne kemi ­
kalije in cilj preskusa. Po možnosti se kot na čin izpostavljenosti uporabi 
izpostavljenost nosu (imenovana tudi izpostavljenost glave ali smr čka). 
Izpostavljenost nosu je navadno najprimernejša za študije teko čih ali trdnih 
aerosolov ter za hlape, ki lahko kondenzirajo v aerosole. Mogo če je, da bo 
posebne cilje študije lažje dose či z izpostavljenostjo celega telesa, vendar je 
treba to utemeljiti v poro čilu o študiji. Kadar se uporablja komora za izpo ­
stavljenost celega telesa, skupni „volumen“ preskusnih živali ne sme prese ­
gati 5 % prostornine komore, da se zagotovi stabilnost atmosfere. Na čela 
tehnik izpostavljanja nosu in celega telesa ter njune prednosti in pomanj ­
kljivosti so obravnavani v GD 39 (2).  
ŠTUDIJE STRUPENOSTI  
Mejne koncentracije  
10. V nasprotju s študijami akutne strupenosti, za 28-dnevne študije subakutne 
strupenosti pri vdihavanju ni opredeljenih mejnih koncentracij. Pri dolo ­ 
čanju najvišje koncentracije, ki bo preskušena, je treba upoštevati: 1. 
najvišjo dosegljivo koncentracijo, 2. stopnjo izpostavljenosti ljudi „v najslabšem primeru“, 3. potrebo po ohranjanju zadostne oskrbe s kisikom 
in/ali 4. preudarke v zvezi z dobrobitjo živali. Če ni mej, ki temeljijo na 
podatkih, se lahko uporabijo meje za akutno strupenost iz Uredbe (ES) št. 1272/2008 (13) (tj. do najvišje koncentracije 5 mg/l za aerosole, 20 mg/l za hlape in 20 000 ppm za pline) (glej GD 39 (2)). Če je treba pri 
preskušanju plinov ali lahko hlapnih preskusnih kemikalij (npr. hladil) te 
meje prese či, je to treba utemeljiti. Mejna koncentracija mora povzro čiti 
nedvomno strupenost, ne da bi živalim povzro čila nepotreben stres ali vpli ­
vala na njihovo življenjsko dobo (3).
 
Študija za ugotavljanje obmo čja 
11. Pred za četkom glavne študije je morda treba opraviti študijo za ugotavljanje 
območja. Ta je obsežnejša od opazovalne študije, saj ni omejena z izbiro 
koncentracij. Spoznanja, pridobljena v njej, lahko zagotovijo uspešnost glavne študije. S študijo za ugotavljanje obmo čja se lahko na primer zago ­
tovijo tehni čne informacije o analitskih metodah, dolo čanju velikosti delcev 
in odkrivanju mehanizmov strupenosti, klini čni patološki in histopatološki 
podatki ter ocene, kolikšne so lahko koncentracije NOAEL in MTC v glavni študiji. Vodja študije se lahko študijo za ugotavljanje obmo čja odloči 
uporabiti za dolo čitev pragu draženja dihal (npr. s histopatološko preiskavo 
dihal, preskusom plju čne funkcije ali bronhoalveolarno lavažo), zgornje 
koncentracije, ki jo živali prenesejo brez nepotrebnega stresa, in parametrov, s katerimi bo mogo če najbolje opredeliti strupenost preskusne kemikalije. 
12. Študija za ugotavljanje obmo čja lahko zajema eno ali ve č koncentracij. 
Vsaki od njih se izpostavi najve č tri samce in tri samice. Študija za ugota ­
vljanje obmo čja mora trajati vsaj 5 dni in obi čajno najve č 14 dni. V poro ­ 
čilu o študiji je treba utemeljiti izbrane koncentracije za glavno študijo. Cilj 
glavne študije je dokazati razmerje koncentracija-odziv na podlagi pri čako­
vanja o tem, katera bo najob čutljivejša kon čna točka. Nizka koncentracija 
mora biti po možnosti koncentracija brez opaznih škodljivih u činkov, 
medtem ko mora visoka koncentracija povzro čiti nedvomne strupene 
učinke, ne da bi živalim povzro čila nepotrebni stres ali vplivala na njihovo 
življenjsko dobo (3).
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 290
 
13. Pri izbiri koncentracij za študijo za ugotavljanje obmo čja je treba upoštevati 
vse razpoložljive informacije, vklju čno z razmerji struktura-aktivnost in 
podatki o podobnih kemikalijah (glej odstavek 3). S študijo za ugotavljanje območja se lahko potrdijo/zavrnejo pri čakovanja o najob čutljivejših kon čnih 
točkah po mehanisti čnih merilih, npr. o inhibiciji holinesteraze z organo ­
fosfati, nastajanju methemoglobina zaradi eritrocitotoksi čnih snovi, š čitni­ 
čnih hormonih (T
 3 , T 4 ) v primeru tirotoksi čnih snovi ter o beljakovinah, 
LDH ali nevtrofilcih pri bronhoalveolarni lavaži v primeru neškodljivih slabo topnih delcev ali aerosolov, ki dražijo plju ča.
 
Glavna študija  
14. Glavna študija subakutne strupenosti obi čajno zajema tri razli čne koncen ­
tracije ter po potrebi tudi so časno negativno kontrolo (z zrakom) in/ali 
kontrolo z nosilcem (glej odstavek 17). Pri izbiri primernih stopenj izposta ­
vljenosti si je treba pomagati z vsemi razpoložljivimi podatki, vklju čno z 
rezultati študij sistemske strupenosti, presnovo in kinetiko (poseben 
poudarek je treba nameniti izogibanju visokim koncentracijam, ki nasitijo 
kinetične procese). Vsaka preskusna skupina vsebuje najmanj 10 glodavcev 
(5 samcev in 5 samic), ki se 4 tedne po 5 dni na teden 6 ur na dan izpostavljajo preskusni kemikaliji (skupno študija traja 28 dni). Živali se 
lahko izpostavljajo tudi 7 dni na teden (npr. pri preskušanju farmacevtskih 
izdelkov, ki se vdihavajo). Če je znano, da je en spol ob čutljivejši na 
določeno preskusno kemikalijo, se lahko spola izpostavljata razli čnim 
koncentracijam, da se zagotovi optimalen odziv na koncentracijo, kot je 
opisano v odstavku 15. Če se z nosom izpostavijo vrste glodavcev, ki 
niso podgane, se lahko najdaljša obdobja izpostavljenosti prilagodijo, da se kar najbolj zmanjša trpljenje, zna čilno za uporabljeno vrsto. Kadar se 
uporabi obdobje izpostavljenosti, krajše od 6 ur/dan, ali kadar je treba 
opraviti študijo izpostavljenosti celega telesa z dolgimi obdobji (npr. 22 
ur/dan), je treba to utemeljiti (glej GD 39 (2)). V obdobju izpostavljenosti je treba živalim odrekati hrano, razen če je to obdobje daljše od 6 ur. Med 
izpostavljenostjo celega telesa lahko živali ves čas uživajo vodo. 
15. Z izbranimi ciljnimi koncentracijami je treba opredeliti ciljne organe in 
prikazati jasen odziv na koncentracijo: 
— visoka koncentracija mora imeti strupene u činke, vendar ne sme povzro ­ 
čiti dolgotrajnih znakov ali smrtnosti, ki bi prepre čili smiselno oceno, 
— vmesne koncentracije morajo biti razporejene tako, da se doseže stop ­
njevanje med strupenimi u činki nizke in visoke koncentracije, 
— nizka koncentracija mora povzro čiti šibke znake strupenosti oziroma 
takih znakov ne sme povzro čiti.
 
Satelitska študija (študija reverzibilnosti)  
16. Satelitska študija (študija reverzibilnosti) se lahko uporabi za opazovanje 
reverzibilnosti, obstojnosti ali zapoznelega pojava zastrupitve v ustrezno 
dolgem obdobju po tretiranju, ki pa ne sme bili krajše od 14 dni. Satelitske 
skupine (skupine za reverzibilnost) so sestavljene iz petih samcev in petih samic, ki se izpostavijo so časno s preskusnimi živalmi v glavni študiji. 
Skupine za satelitsko študijo (študijo reverzibilnosti) je treba preskusni kemi ­
kaliji izpostaviti pri najvišji koncentraciji, pri čemer se po potrebi uporabi 
sočasna kontrola z zrakom in/ali kontrola z nosilcem (glej odstavek 17).
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 291
 
Kontrolne živali  
17. Z živalmi za so časno negativno kontrolo (z zrakom) je treba ravnati enako 
kot z živalmi v preskusni skupini, le da se namesto preskusni kemikaliji izpostavijo filtriranemu zraku. Kadar se za pomo č pri ustvarjanju preskusne 
atmosfere uporabi voda ali druga snov, je treba v študijo namesto negativne 
kontrolne skupine (z zrakom) vklju čiti kontrolno skupino z nosilcem. Če je 
le mogoče, je treba kot nosilec uporabiti vodo. Kadar se kot nosilec uporabi 
voda, morajo biti kontrolne živali izpostavljene zraku z enako relativno 
vlažnostjo kot pri preskusnih skupinah. Izbira ustreznega nosilca mora 
temeljiti na primerno izvedeni predhodni študiji ali preteklih podatkih. Če 
o strupenosti nosilca ni veliko znanega, se lahko vodja študije odlo či upora­
biti negativno kontrolo (z zrakom) in kontrolo z nosilcem, vendar se to 
močno odsvetuje. Kadar pretekli podatki razkrijejo, da nosilec ni strupen, 
negativna kontrolna skupina (z zrakom) ni potrebna in je treba uporabiti samo kontrolo z nosilcem. Če predhodna študija preskusne kemikalije, 
formulirane v nosilcu, ne pokaže strupenosti, iz tega sledi, da nosilec ni 
strupen pri preskušeni koncentraciji, tako da je treba uporabiti to kontrolo z nosilcem.
 
POGOJI IZPOSTAVLJENOSTI  
Dajanje koncentracij  
18. Živali se izpostavijo preskusni kemikaliji v obliki plina, hlapov, aerosola ali 
njihovih zmesi. Agregatno stanje, ki bo preskušeno, je odvisno od fizikalno-kemijskih lastnosti preskusne kemikalije, izbrane koncentracije 
in/ali fizikalne oblike, ki bo najverjetnejša med ravnanjem s preskusno 
kemikalijo in njeno uporabo. Higroskopne in kemi čno reaktivne preskusne 
kemikalije je treba preskušati v suhem ozra čju. Paziti je treba, da se ne 
ustvarijo eksplozivne koncentracije. Za snov, ki jo tvorijo delci, se lahko 
zaradi zmanjšanja velikosti delcev uporabijo mehanski postopki. Ve č napo­
tkov je na voljo v GD 39 (2).
 
Porazdelitev velikosti delcev  
19. Za vse aerosole in hlape, ki lahko kondenzirajo v aerosole, je treba dolo čiti 
velikost delcev. Da se omogo či izpostavljenost vseh ustreznih predelov 
dihal, so priporo čeni aerosoli, katerih mediana porazdelitvene mase delcev 
v zraku glede na aerodinami čni premer (MMAD) znaša 1–3 μm z geome ­
tričnim standardnim odklonom ( σ g ) 1,5–3,0 (4). Prizadevanje za izpolnitev 
tega standarda naj bo razumno; če ga ni mogo če izpolniti, je treba zagoto ­
viti strokovno presojo. Delci kovinskih hlapov so lahko na primer manjši od 
tega standarda, naelektreni delci in vlakna pa lahko presegajo navedene vrednosti.
 
Priprava preskusne kemikalije v nosilcu  
20. Preskusno kemikalijo je treba po možnosti preskušati brez nosilca. Če je 
uporaba nosilca nujna za ustvarjanje primerne koncentracije in velikosti 
delcev preskusne kemikalije, je treba prednostno uporabiti vodo. Vedno, 
kadar se preskusna kemikalija raztopi v nosilcu, je treba dokazati njeno stabilnost.
 
SPREMLJANJE POGOJEV IZPOSTAVLJENOSTI  
Pretok zraka v komori  
21. Pretok zraka skozi komoro za izpostavljanje je treba med vsako izposta ­
vljenostjo skrbno nadzorovati, stalno spremljati in zabeležiti najmanj vsako uro. Sprotno spremljanje koncentracije (ali časovne stabilnosti) preskusne 
atmosfere je meritev, ki je nelo čljivo povezana z vsemi dinami čnimi para ­
metri in zagotavlja posredno sredstvo za nadzor nad vsemi pomembnimi dinamičnimi parametri vdihavanja. Če se koncentracija spremlja sproti, se 
lahko pogostnost merjenja pretoka zraka zmanjša na eno meritev na izposta ­
vljenost na dan. Pri komorah za izpostavljanje nosu je treba posebno pozor ­
nost nameniti prepre čevanju ponovnega vdihavanja. Koncentracija kisika
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 292
 
mora znašati najmanj 19 %, koncentracija ogljikovega dioksida pa ne sme 
presegati 1 %. Če obstaja razlog za domnevo, da tega standarda ni mogo če 
izpolniti, je treba koncentraciji kisika in ogljikovega dioksida izmeriti. Če 
meritve prvi dan izpostavljenosti pokažejo, da sta ravni teh plinov ustrezni, nadaljnje merjenje ni potrebno.
 
Temperatura in relativna vlažnost v komori  
22. Temperaturo v komori je treba ohranjati pri 22 ± 3 °C. Relativno vlažnost v 
območju dihanja živali je treba pri izpostavljenosti nosu in izpostavljenosti 
celega telesa stalno spremljati ter jo med vsako izpostavljenostjo vsako uro 
zabeležiti, če je to mogo če. Relativno vlažnost je treba po možnosti ohra ­
njati v obmo čju 30–70 %, vendar je to lahko bodisi nedosegljivo (npr. pri 
preskušanju zmesi na vodni osnovi) bodisi nemerljivo zaradi interference 
preskusne kemikalije s preskusno metodo.  
Preskusna kemikalija: nazivna koncentracija  
23. Vedno, kadar je to izvedljivo, je treba izra čunati in zabeležiti nazivno 
koncentracijo v komori za izpostavljanje. Nazivna koncentracija je masa 
ustvarjene preskusne kemikalije, deljena s skupnim volumnom zraka, ki preide skozi sistem inhalacijske komore. Nazivna koncentracija se ne upora ­
blja za opredeljevanje izpostavljenosti živali, pa č pa pri primerjavi z 
dejansko koncentracijo pokaže, kako u činkovito je ustvarjanje preskusnega 
sistema, in se torej lahko uporabi za odkrivanje težav pri ustvarjanju.
 
Preskusna kemikalija: dejanska koncentracija  
24. Dejanska koncentracija je koncentracija preskusne kemikalije, vzor čena v 
območju dihanja živali v inhalacijski komori. Dejanske koncentracije se 
merijo s specifi čnimi metodami (npr. z neposrednim vzor čenjem, adsorpcij ­
skimi ali kemi čnimi reaktivnimi metodami in naknadnim analitskim oprede ­
ljevanjem) ali nespecifi čnimi metodami, kot je gravimetri čna analiza s filtri ­
ranjem. Uporaba gravimetri čne analize je sprejemljiva samo za enokompo ­
nentne prašne aerosole ali aerosole teko čin z majhno hlapnostjo ter jo je 
treba pred študijo podpreti z ustreznimi opredelitvami, specifi čnimi za 
preskusno kemikalijo. Z gravimetri čno analizo se lahko dolo či tudi koncen ­
tracija ve čkomponentnega prašnega aerosola, vendar so za to potrebni 
analitski podatki, ki kažejo, da je sestava snovi v zraku podobna za četni 
snovi. Če te informacije niso na voljo, bo morda treba med študijo znova 
analizirati preskusno kemikalijo (po možnosti takrat, ko lebdi v zraku) v 
rednih intervalih. Za aerosolizirane snovi, ki lahko izhlapijo ali sublimirajo, je treba prikazati, da so bile vse faze zbrane z izbrano metodo. 
25. Po možnosti je treba v celotni študiji uporabljati eno serijo preskusne 
kemikalije, preskusni vzorec pa je treba hraniti v pogojih, v katerih se 
ohranjajo njegova čistost, homogenost in stabilnost. Pred za četkom študije 
je treba opredeliti lastnosti preskusne kemikalije, vklju čno z njeno čistostjo 
ter, če je to tehni čno izvedljivo, identiteto in koli činami ugotovljenih konta ­
minantov in ne čistot. To se lahko med drugim prikaže z naslednjimi 
podatki: z retencijskim časom in relativno površino vrha, molekulsko 
maso, ugotovljeno na podlagi analiz z masno spektroskopijo ali plinsko kromatografijo, ali z drugimi ocenami. Čeprav identiteta preskusnega vzorca 
ni odgovornost preskuševalnega laboratorija, je morda smotrno, da ta vsaj 
delno potrdi naro čnikovo opredelitev lastnosti (npr. barvo, agregatno stanje 
itd.).
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 293
 
26. Atmosfera v komori za izpostavljanje mora biti konstantna, kolikor je to 
izvedljivo. Za dokazovanje stabilnosti pogojev izpostavljenosti se lahko 
uporabi naprava za sprotno spremljanje, kot je aerosolni fotometer za aero ­
sole ali analizator skupnih ogljikovodikov za hlape. Dejansko koncentracijo v komori je treba izmeriti najmanj trikrat vsak dan izpostavljenosti za vsako 
stopnjo izpostavljenosti. Če to zaradi omejenih stopenj pretoka zraka ali 
nizkih koncentracij ni izvedljivo, zadostuje, da se v vsakem obdobju izpo ­
stavljenosti vzame le en vzorec. V tem primeru se vzorec po možnosti zbira prek celotnega obdobja izpostavljenosti. Posamezni vzorci koncentracije v 
komori lahko od srednje koncentracije v komori odstopajo za najve č 
± 10 % za pline in hlape oziroma za najve č ± 20 % za teko če ali trdne 
aerosole. Izra čunati in zabeležiti je treba čas do vzpostavitve ravnotežja v 
komori (t
 95 ). Čas izpostavljenosti pokriva čas ustvarjanja preskusne kemi ­
kalije. Pri tem sta upoštevana čas, potreben za vzpostavitev ravnotežja v 
komori (t  95 ), in čas upadanja. Napotki za ocenjevanje t  95 so na voljo v GD 
39 (2). 
27. Pri zelo kompleksnih zmeseh, sestavljenih iz plinov/hlapov in aerosolov 
(npr. zgorevalnih atmosfer in preskusnih kemikalij, potiskanih iz namenskih proizvodov/naprav za posebno uporabo), se lahko v inhalacijski komori 
vsaka faza obnaša druga če. Zato je treba za vsako fazo (plin/hlape in 
aerosol) izbrati najmanj eno indikatorsko snov (analit), navadno glavno aktivno snov v zmesi. Kadar je preskusna kemikalija zmes, je treba analitsko koncentracijo navesti za celotno zmes in ne le za aktivno sestavino 
ali indikatorsko snov (analit). Dodatne informacije o dejanskih koncentra ­
cijah so na voljo v GD 39 (2).
 
Preskusna kemikalija: porazdelitev velikosti delcev  
28. Porazdelitev velikosti delcev aerosolov je treba dolo čiti najmanj vsak teden 
za vsako koncentracijo s kaskadnim impaktorjem ali nadomestnim instru ­
mentom, kot je aerodinami čni merilnik delcev (APS). Če je mogo če prika­
zati enakovrednost rezultatov, dobljenih s kaskadnim impaktorjem in nado ­
mestnim instrumentom, se lahko nadomestni instrument uporablja skozi 
celotno študijo. 
29. Vzporedno s primarnim instrumentom je treba za potrditev njegove u čin­
kovitosti zbiranja uporabljati še drugo napravo, kot je gravimetri čni filter ali 
(plinska) izpiralka. Masna koncentracija, dobljena z analizo velikosti delcev, mora biti v razumnih mejah masne koncentracije, dobljene z analizo s 
filtriranjem (glej GD 39 (2)). Če je enakovrednost pri vseh preskušenih 
koncentracijah mogo če prikazati zgodaj v študiji, se lahko nadaljnje potr ­
ditvene meritve opustijo. Zaradi dobrobiti živali je treba sprejeti ukrepe, s katerimi se kar najbolj zmanjša koli čina pomanjkljivih podatkov, zaradi 
katerih bi bilo treba študijo ponoviti. 
30. Velikost delcev za hlape je treba dolo čiti, če obstaja možnost, da se bodo 
hlapi kondenzirali v aerosol, ali če se v atmosferi s hlapi, v kateri so 
mogoče mešane faze, zaznajo delci.
 
OPAZOVANJA 
31. Živali je treba klini čno opazovati pred obdobjem izpostavljenosti ter med 
njim in po njem. Pogostejša opazovanja so lahko indicirana glede na odziv 
živali med izpostavljenostjo. Kadar opazovanje živali ovirajo uporaba zadr ­ 
ževalnih cevi za živali, slabo osvetljene komore za izpostavljanje celega telesa ali motne atmosfere, je treba živali pozorno opazovati po izposta ­
vljenosti. Z opazovanji živali, preden so te izpostavljene naslednjega dne, je 
mogoče oceniti reverzibilnost ali okrepitev strupenih u činkov.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 294
 
32. Vsa opažanja se sistemati čno zabeležijo, pri čemer se evidence vodijo za 
vsako žival posebej. Kadar se živali usmrtijo iz humanih razlogov ali so 
najdene poginule, je treba čas smrti navesti čim natančneje. 
33. Opazovanja v kletkah morajo vklju čevati spremembe na koži in kožuhu, 
očeh in sluznicah, v dihalih, obto čilih in živ čevju ter pri somatomotori čnih 
aktivnostih in vedenjskih vzorcih. Pozorno je treba opazovati tremorje, kr če, 
slinjenje, drisko, letargijo, spanje in komo. Z merjenjem rektalne tempera ­
ture se lahko pridobijo podporni dokazi o refleksni bradipneji ali hipo-/hipertermiji, povezani s tretiranjem ali konfinacijo. V protokol študije 
se lahko vklju čijo dodatne ocene, kot so kinetika, biomonitoring, plju čna 
funkcija, retencija slabo topnih snovi, ki se kopi čijo v plju čnem tkivu, in 
vedenjske spremembe.
 
TELESNA TEŽA 
34. Težo posameznih živali je treba zabeležiti malo pred prvo izpostavljenostjo 
(dan 0), zatem pa dvakrat na teden (na primer ob petkih in ponedeljkih, da 
se prikaže okrevanje čez konec tedna, ko se živali ne izpostavljajo, ali na 
podlagi časovnega intervala, da se omogo či ocena sistemske strupenosti) ter 
ob poginu ali evtanaziji. Če v prvih 2 tednih ni u činkov, se lahko do konca 
študije telesna teža meri tedensko. Živali v satelitski skupini (skupini za 
reverzibilnost), če se uporabljajo, je treba tedensko tehtati prek celotnega 
obdobja okrevanja. Ob koncu študije je treba malo pred žrtvovanjem vse živali stehtati, da se omogo či nepristranski izra čun razmerij med težo 
organov in telesno težo.
 
PORABA HRANE IN VODE 
35. Porabo hrane je treba meriti tedensko. Meri se lahko tudi poraba vode.  
KLINIČNA PATOLOGIJA 
36. Klini čne patološke ocene je treba opraviti za vse živali, vklju čno s tistimi v 
kontrolni skupini in satelitski skupini (skupini za reverzibilnost), ko se 
žrtvujejo. Navesti je treba časovni interval med koncem izpostavljenosti 
in odvzemom krvi, zlasti kadar se obravnavana kon čna točka hitro vrne v 
prvotno stanje. Vzor čenje po koncu izpostavljenosti je indicirano za tiste 
parametre, ki imajo kratko plazemsko razpolovno dobo (npr. COHb, CHE 
in MetHb). 
37. V preglednici 1 so našteti klini čni patološki parametri, ki se navadno zahte ­
vajo za vse toksikološke študije. Analiza urina se ne zahteva vedno, vendar se lahko opravi, kadar se zdi koristna na podlagi pri čakovane ali opažene 
strupenosti. Vodja študije se lahko za boljšo opredelitev strupenosti 
preskusne kemikalije odlo či oceniti dodatne parametre (npr. holinesterazo, 
lipide, hormone, kislinsko-bazno ravnovesje, methemoglobin ali Heinzeva telesca, kreatin-kinazo, razmerje med mieloidnimi in eritroidnimi celicami, 
troponine, pline v arterijski krvi, laktat-dehidrogenazo, sorbitol-dehidroge ­
nazo ter γ-glutamiltranspeptidazo).
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 295
 
Preglednica 1  
Standardni klini čni patološki parametri  
Hematologija  
število eritrocitov 
hematokrit koncentracija hemoglobina 
povprečna količina hemoglobina v 
eritrocitih 
povprečni volumen eritrocitov 
povprečna koncentracija hemoglobina 
v eritrocitih 
retikulociti skupno število levkocitov 
diferencialno število levkocitov število trombocitov 
zmožnost koagulacije (izberite 
eno): 
— protrombinski čas 
— čas koagulacije 
— parcialni tromboplastinski čas
 
Klinična kemija  
glukoza (*) 
skupni holesterol 
trigliceridi sečninski dušik v krvi 
skupni bilirubin 
kreatinin 
skupne beljakovine albumin 
globulin alanin-aminotransferaza 
aspartat-aminotransferaza 
alkalna fosfataza kalij natrij 
kalcij 
fosfor klorid
 
Analiza urina (ni obvezno)  
videz (barva in motnost) 
količina 
specifična teža ali osmolalnost 
pH skupne beljakovine 
glukoza kri/krvne celice
 
(*) Ker lahko dolgotrajno obdobje postenja vpliva na meritve glukoze pri tretiranih 
živalih glede na kontrolne živali, mora vodja študije odlo čiti, ali je živali primerno 
postiti. Če se uporabi obdobje postenja, mora to ustrezati uporabljeni živalski 
vrsti; za podgane lahko traja 16 h (postenje čez noč). Določanje glukoze na 
tešče se lahko izvede po postenju čez noč v zadnjem tednu izpostavljenosti ali 
po postenju čez noč pred obdukcijo (v zadnjem primeru skupaj z vsemi drugimi 
kliničnimi patološkimi parametri).  
38. Kadar obstajajo dokazi, da je spodnji predel dihalnih poti (tj. alveole) 
primarno mesto odlaganja in retencije, je lahko bronhoalveolarna 
lavaža (BAL) najprimernejša tehnika za kvantitativno analizo na hipotezi 
temelječih parametrov razmerij med odmerkom in u činkom s poudarkom na 
alveolitisu, vnetju plju č in fosfolipidozi. Tako je mogo če ustrezno preiskati 
spremembe v odzivu na odmerek in časovnem poteku alveolarne okvare. 
Bronhoalveolarni izpirek se lahko uporabi za analizo skupnega in diferen ­
cialnega števila levkocitov, skupnih beljakovin ter laktat-dehidrogenaze. Drugi parametri, ki se lahko obravnavajo, so tisti, ki nakazujejo lizosomske poškodbe, fosfolipidozo, fibrozo in dražilno ali alergijsko vnetje – pri sled ­
njem se lahko vklju či določitev vnetnih citokinov/kemokinov. Meritve BAL 
navadno dopolnjujejo rezultate histopatoloških preiskav, ne morejo pa jih nadomestiti. Napotki o tem, kako opraviti lavažo plju č, so na voljo v GD 
39 (2).
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 296
MAKROSKOPSKA PATOLOGIJA IN TEŽA ORGANOV 
39. Vse preskusne živali, vklju čno s tistimi, ki med preskusom poginejo ali so 
odstranjene iz študije zaradi njihove dobrobiti, je treba popolnoma eksang ­
vinirati (če je to izvedljivo) in na njih opraviti makroskopsko obdukcijo. 
Navesti je treba čas med koncem zadnje izpostavljenosti vsake živali in 
njenim žrtvovanjem. Če obdukcije ni mogo če opraviti nemudoma po 
odkritju poginule živali, jo je treba ohladiti (ne zamrzniti) na dovolj nizko temperaturo, da se avtoliza kar najbolj zmanjša. Obdukcije je treba 
opraviti takoj, ko je mogo če, navadno v dnevu ali dveh. Za vsako žival je 
treba zabeležiti vse makroskopske patološke spremembe s posebnim poudarkom na spremembah dihal. 
40. V preglednici 2 so našteti organi in tkiva, ki jih je treba med makroskopsko 
obdukcijo shraniti v ustreznem mediju za histopatološke preiskave. O shra ­
njevanju organov in tkiv [v oglatih oklepajih] ter vseh drugih organov in tkiv odlo ča vodja študije. Z organov  v krepki pisavi  je treba odstraniti 
priraščena tkiva in navedene organe stehtati čim prej po disekciji, da se 
ne izsušijo. Š čitnico in nadmodek je treba stehtati samo, če je to potrebno, 
ker lahko ostanki obrezovanja otežijo histopatološko oceno. Tkiva in organe je treba takoj po obdukciji in najmanj 24–48 ur (odvisno od uporabljenega fiksativa) pred obrezovanjem fiksirati v 10-odstotnem puferiranem forma ­
linu ali drugem ustreznem fiksativu.
 
Preglednica 2  
Organi in tkiva, ki se shranijo med makroskopsko obdukcijo 
nadledvične žleze  
kostni mozeg (in/ali svež punktat)  
možgani  (vključno z rezinami velikih in 
malih možganov ter podaljšane hrbtenja če/ 
mosta) 
[oči (mrežnica, vidni živec) in veke]  
srce ledvice  
grlo (3 ravni, 1 raven naj vklju čuje spodnji 
del poklopca)  
jetra pljuča (vsi režnji na eni ravni, vklju čno z 
glavnima sapnicama) 
Hilusne bezgavke, zlasti za slabo topne 
preskusne kemikalije, ki jih tvorijo delci. Za 
bolj poglobljene preiskave in/ali študije z 
imunološkim poudarkom se lahko razmisli o dodatnih bezgavkah, npr. iz medplju čnega, 
vratnega/pod čeljustnega in/ali ušesnega 
predela. 
nazofaringealna tkiva (vsaj 4 ravni, 1 raven 
naj vključuje nazofaringealni vod in z nosom 
povezano limfati čno tkivo (NALT)) požiralnik 
[vohalni beti č] 
Jajčniki 
semenski meši čki 
hrbtenjača (vratni, prsni in ledveni del)  
vranica  
želodec  
moda 
priželjc  
ščitnica 
sapnik (vsaj 2 ravni, ki vklju čujeta 1 
vzdolžni prerez skozi karino in 1 pre čni 
prerez) 
[sečni mehur] 
maternica 
vse vidne lezije
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 297
 
41. Plju ča je treba odstraniti nepoškodovana, jih stehtati in napolniti z ustreznim 
fiksativom pri tlaku 20–30 cm vode, da se ohrani njihova struktura (5). 
Rezine je treba zbrati za vse režnje na eni ravni, vklju čno z glavnima 
sapnicama, če pa se opravi lavaža plju č, je treba iz neizpranega režnja 
vzeti rezine na treh ravneh (ki niso zaporedne). 
42. Pregledati je treba najmanj 4 ravni nazofaringealnih tkiv, od katerih mora 
ena vklju čevati nazofaringealni vod (5, 6, 7, 8, 9), da se omogo či ustrezna 
preiskava ploš čatega, prehodnega (neciliarnega respiratornega), respirator ­
nega (ciliarnega respiratornega) in vohalnega epitelija, ter drenažno limfa ­
tično tkivo (NALT; 10, 11). Preiskati je treba tri ravni grla, od katerih mora 
ena vklju čevati spodnji del poklopca (12). Pregledati je treba vsaj dve ravni 
sapnika, kar vklju čuje en vzdolžni prerez skozi karino razcepiš ča glavnih 
sapnic in en pre čni prerez.  
HISTOPATOLOGIJA 
43. Histopatološko oceno vseh organov in tkiv iz preglednice 2 je treba opraviti 
pri kontrolni skupini in skupini, tretirani z visoko koncentracijo, ter pri vseh živalih, ki poginejo ali so žrtvovane med študijo. Posebno pozornost je treba nameniti dihalom, ciljnim organom in vidnim lezijam. Organe in 
tkiva, ki imajo lezije v skupini, tretirani z visoko koncentracijo, je treba 
pregledati v vseh skupinah. Vodja študije se lahko odlo či izvesti histopato ­
loške ocene za dodatne skupine, da se prikaže jasen odziv na koncentracijo. Če se uporablja satelitska skupina (skupina za reverzibilnost), je treba opra ­
viti histopatološko oceno za vsa tkiva in organe, na katerih so bili opaženi 
učinki v tretiranih skupinah. Če se v skupini, izpostavljeni visoki koncen ­
traciji, pojavijo čezmerno število zgodnjih smrti ali druge težave, ki ogro ­ 
žajo pomen podatkov, je treba skupino, tretirano z najbližjo nižjo koncen ­
tracijo, histopatološko pregledati. Makroskopska opažanja in mikroskopske 
ugotovitve je treba poskusiti povezati.
 
PODATKI IN PORO ČANJE  
Podatki  
44. Za posamezne živali je treba navesti podatke o telesni teži, porabi hrane, 
klinični patologiji, makroskopski patologiji, teži organov in histopatologiji. 
Podatke o klini čnih opažanjih je treba povzeti v preglednicah, v katerih se 
za vsako preskusno skupino navedejo število uporabljenih živali, število živali, ki kažejo specifi čne znake zastrupitve, število živali, ki so bile 
najdene poginule med preskusom ali usmr čene iz humanih razlogov, čas 
smrti posameznih živali, opis in časovni potek strupenih u činkov in rever ­
zibilnosti ter ugotovitve obdukcije. Vse rezultate, kvantitativne in naklju čne, 
je treba oceniti z ustrezno statisti čno metodo. Uporabi se lahko katera koli 
splošno priznana statisti čna metoda, izbrati pa jo je treba med zasnovo 
študije.
 
Poročilo o preskusu  
45. Poro čilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije, kot je primerno:  
Preskusne živali in oskrba  
— opis pogojev v kletkah, vklju čno s številom (ali spremembo števila) 
živali na kletko, nastiljem, temperaturo in relativno vlažnostjo prostora, 
fotoperiodo ter opredelitvijo hrane,  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 298
 
— uporabljeno vrsto/sev in utemeljitev uporabe vrste, ki ni podgana. 
Podatki o izvoru in preteklosti se lahko navedejo, če se nanašajo na 
živali, za katere so bili uporabljeni podobni pogoji izpostavljenosti, nastanitveni pogoji in pogoji postenja, 
— število, starost in spol živali, 
— metodo randomizacije, 
— opis morebitne priprave živali pred preskusom, vklju čno s hrano, karan ­
teno in zdravljenjem.  
Preskusna kemikalija  
— agregatno stanje, čistost in, če je to ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti 
(vključno z izomerizacijo), 
— identifikacijske podatke in registrsko številko Službe za izmenjavo 
kemijskih izvle čkov (CAS), če je znana.  
Nosilec  
— utemeljitev uporabe nosilca in utemeljitev izbire nosilca ( če to ni voda), 
— pretekle ali vzporedno pridobljene podatke, ki dokazujejo, da nosilec ne 
vpliva na rezultat študije.  
Inhalacijska komora  
— podroben opis inhalacijske komore, vklju čno s prostornino in diagra ­
mom, 
— izvor in opis opreme, uporabljene za izpostavljanje živali in ustvarjanje 
atmosfere, 
— opremo za merjenje temperature, vlažnosti, velikosti delcev in dejanske 
koncentracije, 
— vir zraka in uporabljeni sistem za klimatiziranje, 
— metode, uporabljene za umerjanje opreme za zagotavljanje homogene 
preskusne atmosfere, 
— razliko v tlaku (pozitivno ali negativno), 
— izpostavitvene odprtine na komoro (izpostavljanje nosu); položaj živali v 
komori (izpostavljanje celega telesa), 
— stabilnost preskusne atmosfere, 
— položaj tipal za zaznavanje temperature in vlažnosti ter mesto vzor čenja 
preskusne atmosfere v komori, 
— obdelavo dovajanega/odvajanega zraka, 
— stopnje pretoka zraka, stopnjo pretoka zraka/izpostavitveno odprtino 
(izpostavljanje nosu) ali število živali/komoro (izpostavljanje celega tele ­
sa), 
— čas, potreben za vzpostavitev ravnotežja v inhalacijski komori (t
 95 ), 
— število zamenjav volumna zraka na uro, 
— merilne naprave ( če se uporabljajo).  
Podatki o izpostavljenosti  
— utemeljitev izbire ciljne koncentracije v glavni študiji,  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 299
 
— nazivne koncentracije (skupna masa ustvarjene preskusne kemikalije v 
inhalacijski komori, deljena z volumnom zraka, ki preide skozi komoro), 
— dejanske koncentracije preskusne kemikalije, ki se vzamejo v obmo čju 
dihanja živali; za zmesi, pri katerih nastajajo heterogene fizikalne oblike (plini, hlapi, aerosoli), se lahko vsaka analizira lo čeno, 
— vse koncentracije v zraku je treba navesti v masnih enotah (mg/l, mg/m
 3 
itd.) in ne v prostorninskih enotah (ppm, ppb itd.), 
— porazdelitev velikosti delcev, mediano porazdelitvene mase delcev v 
zraku glede na aerodinami čni premer (MMAD) in geometri čni stan­
dardni odklon ( σg), vključno z metodami za njihov izra čun. Poročati 
je treba o posameznih analizah velikosti delcev.  
Preskusni pogoji  
— podatke o pripravi preskusne kemikalije, vklju čno s podrobnostmi o 
postopkih, uporabljenih za zmanjšanje velikosti delcev trdnih snovi ali pripravo raztopin preskusne kemikalije, 
— opis (ki po možnosti vklju čuje diagram) opreme, uporabljene za ustvar ­
janje preskusne atmosfere in izpostavljanje živali preskusni atmosferi, 
— podatke o opremi, uporabljeni za spremljanje temperature, vlažnosti in 
pretoka zraka v komori (tj. pripravo umeritvene krivulje), 
— podatke o opremi, uporabljeni za jemanje vzorcev za dolo čanje koncen ­
tracije in porazdelitve velikosti delcev v komori, 
— podatke o uporabljeni kemijski analitski metodi in njeni validaciji 
(vključno z rekuperacijo preskusne kemikalije iz nosilca za vzor čenje), 
— metodo randomizacije pri dodeljevanju živali preskusnim in kontrolnim 
skupinam, 
— podatke o kakovosti hrane in vode (vklju čno z vrsto/virom hrane in 
virom vode), 
— utemeljitev dolo čitve preskusnih koncentracij.  
Rezultati  
— preglednice o temperaturi, vlažnosti in pretoku zraka v komori, — preglednice s podatki o nazivnih in dejanskih koncentracijah v komori, — preglednice s podatki o velikosti delcev, vklju čno s podatki o analitskem 
vzorčenju, porazdelitvijo velikosti delcev ter izra čuni MMAD in σ
 g , 
— preglednice s podatki o odzivu in koncentracijah za vsako žival (tj. za 
živali, ki kažejo znake zastrupitve, vklju čno s smrtnostjo ter naravo, 
resnostjo, časom nastopa in trajanjem u činkov),  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 300
 
— preglednice s težami posameznih živali, 
— preglednice o porabi hrane, 
— preglednice s klini čnimi patološkimi podatki, 
— ugotovitve obdukcije in histopatološke ugotovitve za vsako žival, če so 
na voljo, 
— preglednice z drugimi izmerjenimi parametri.  
Razprava in razlaga rezultatov  
— poseben poudarek je treba nameniti opisu metod, uporabljenih za izpol ­
nitev meril te preskusne metode, npr. glede mejne koncentracije ali velikosti delcev, 
— z vidika splošnih ugotovitev je treba obravnavati možnost vdihavanja 
delcev, zlasti če meril glede velikosti delcev ni bilo mogo če izpolniti, 
— v splošno oceno študije je treba vklju čiti doslednost metod, uporabljenih 
za določanje nazivne in dejanske koncentracije, ter razmerje med njima, 
— obravnavati je treba verjetni vzrok smrti in prevladujo či način delovanja 
(sistemski ali lokalni), 
— če je bilo treba na podlagi meril iz Dokumenta s smernicami OECD o 
humanih kon čnih točkah (3) humano žrtvovati živali, ki so trpele bole ­ 
čine ali kazale znake hudega in trajnega trpljenja, je treba to pojasniti, 
— opredeliti je treba ciljne organe, — določiti je treba vrednosti NOAEL in LOAEL.
 
VIRI:  
(1) OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guide ­
line No 412, Environment Directorate, OECD, Pariz. 
(2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz. 
(3) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariz. 
(4) Whalan, J. E. in Redden, J. C. (1994). Interim Policy for Particle Size and 
Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesti ­
cide Programs, United States Environmental Protection Agency. 
(5) Dungworth, D. L., Tyler, W. S., Plopper, C. E. (1985). Morphological 
Methods for Gross and Microscopic Pathology (poglavje 9). V: Toxicology 
of Inhaled Material, Witschi, H. P. in Brain, J. D. (ur.), Springer Verlag 
Heidelberg, str. 229–258. 
(6) Young, J. T. (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309–312. 
(7) Harkema, J. R. (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in 
laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 
85: 231–238.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 301
 
(8) Woutersen, R. A., Garderen-Hoetmer, A., van Slootweg, P. J., Feron, V. J. 
(1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and 
in humans. V: Waalkes, M. P. in Ward, J. M. (ur.) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215–263. 
(9) Mery, S., Gross, E. A., Joyner, D. R., Godo, M., Morgan, K. T. (1994). 
Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats 
and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353–372. 
(10) Kuper, C. F., Koornstra, P. J., Hameleers, D. M. H., Biewenga, J., Spit, B. 
J., Duijvestijn, A. M., Breda Vriesman van, P. J. C., Sminia, T. (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219–224. 
(11) Kuper, C. F., Arts, J. H. E., Feron, V. J. (2003). Toxicity to nasal-associated 
lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140–141: 281–285. 
(12) Lewis, D. J. (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419–428. 
(13) Uredba (ES) št. 1272/2008 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 
16. decembra 2008 o razvrš čanju, ozna čevanju in pakiranju snovi ter zmesi, 
o spremembi in razveljavitvi direktiv 67/548/EGS in 1999/45/ES ter spre ­
membi Uredbe (ES) št. 1907/2006 (UL L 353, 31.12.2008, str. 1).
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 302
 
Dodatek 1  
OPREDELITEV POJMOV  
Preskusna kemikalija:  snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne 
metode.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 303
 
B.9 STRUPENOST (V STIKU S KOŽO) PRI PONAVLJAJO ČEM SE 
ODMERKU (28 DNI)  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Glej Splošni uvod dela B (A).  
1.2 OPREDELITVE 
Glej Splošni uvod dela B (B).  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Jih ni.  
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Preskusna snov se 28 dni dnevno nanaša na kožo v stopnjevanih 
odmerkih ve č skupinam poskusnih živali, in sicer en odmerek na 
skupino. V obdobju dajanja odmerkov se živali vsakodnevno 
pozorno opazujejo zaradi odkrivanja znakov strupenosti. Na živalih, 
ki med preskusom poginejo, se opravi obdukcija, ob koncu preskusa pa tudi na preživelih živalih.
 
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Jih ni.  
1.6 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.6.1  Priprave  
Najmanj pet dni pred za četkom preskusa se živali nastanijo v 
preskusnih pogojih nastanitve in hranjenja. Pred preskusom se zdrave mlade živali naklju čno izberejo in dodelijo tretiranim in kontrolnim 
skupinam. Tik pred za četkom preskusa se preskusnim živalim ostriže 
dlaka s hrbtnega dela trupa. Dlaka se lahko tudi obrije, vendar je treba to opraviti 24 ur pred preskusom. Striženje ali britje je obi čajno 
treba ponavljati približno v tedenskih intervalih. Med striženjem ali 
britjem je treba paziti, da se koža ne odrgne. Za nanos preskusne 
snovi je treba pripraviti najmanj 10 % telesne površine. Pri dolo čanju 
površine pripravljenega dela in velikosti nanosa je treba upoštevati maso živali. Pri preskušanju trdnih snovi, ki se po potrebi lahko 
uprašijo, je treba preskusno snov dovolj navlažiti z vodo ali, kadar 
je potrebno, ustreznim nosilcem, da se zagotovi dober stik s kožo. Tekoče preskusne snovi se obi čajno uporabljajo nerazred čene. 
Nanosi se opravljajo dnevno, pet do sedem dni na teden.
 
1.6.2  Preskusni pogoji  
1.6.2.1  Poskusne živali  
Uporabijo se lahko odrasle podgane, kunci ali morski praši čki. 
Uporabijo se lahko tudi druge vrste, vendar je treba njihovo uporabo 
utemeljiti.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 304
 
Ob začetku študije obmo čje nihanja mase uporabljenih živali ne sme 
presegati ± 20 % ustrezne srednje vrednosti.  
1.6.2.2  Število in spol  
Za vsako velikost odmerka je treba uporabiti najmanj 10 živali (pet 
samic in pet samcev) z zdravo kožo. Samice morajo biti nulipare in nebreje. Če se načrtujejo žrtvovanja med študijo, je treba število 
povečati za število živali, predvidenih za žrtvovanje pred zaklju čkom 
študije. Poleg tega se lahko satelitska skupina 10 živali (pet živali na spol) 28 dni tretira z velikim odmerkom in se naslednjih 14 dni opazuje za ugotavljanje reverzibilnosti, obstojnosti ali zapoznelega 
pojava strupenih u činkov. Uporabi se tudi satelitska skupina 10 
kontrolnih živali (pet živali na spol).
 
1.6.2.3  Velikost odmerkov  
Potrebne so najmanj tri velikosti odmerkov z eno kontrolo ali, če se 
uporabi nosilec, s kontrolo nosilca. Obdobje izpostavljenosti mora 
trajati najmanj šest ur dnevno. Preskusno snov je treba nanašati vsak 
dan ob istem času, nanose pa je treba v rednih časovnih presledkih 
(enkrat ali dvakrat tedensko) prilagoditi tako, da se vzdržuje konstantna velikost odmerka glede na telesno maso živali. Razen 
tretiranja s preskusno snovjo, je treba z živalmi kontrolne skupine 
ravnati na enak na čin kakor z živalmi preskusne skupine. Če se za 
lažje odmerjanje uporabi nosilec, se živalim skupine za kontrolo 
nosilca odmerki dajejo na enak na čin kakor živalim tretirane skupine 
in prejeti morajo enako koli čino, kakor živali skupine, tretirane z 
največjim odmerkom. Najve čji odmerek naj povzro či strupene 
učinke, vendar ni č ali malo smrtnih primerov. Najmanjši odmerek 
ne sme povzro čiti nobenih znakov strupenosti. Če obstaja uporabna 
ocena izpostavljenosti človeka, jo mora najmanjši odmerek presegati. 
V idealnih razmerah bi vmesna velikost odmerka morala povzro čiti 
minimalne opazne strupene u činke. Če se uporabi ve č kot en vmesni 
odmerek, morajo biti intervali med velikostmi odmerkov taki, da 
povzročijo stopnjevanje strupenih u činkov. V skupinah, tretiranih z 
majhnimi in vmesnimi odmerki, ter v kontrolni skupini mora biti pogostnost smrtnih primerov majhna, da se omogo či smiselno ovred ­
notenje rezultatov. 
Če nanos preskusne snovi povzro či hudo draženje kože, je treba 
koncentracije zmanjšati, zaradi česar se lahko zmanjšajo ali ne poka ­ 
žejo drugi strupeni u činki pri velikih odmerkih. Če se poleg tega 
koža hudo poškoduje, je morda treba prekiniti študijo in za četi novo 
študijo z manjšimi koncentracijami.
 
1.6.2.4  Mejni preskus  
Če pri predhodni študiji z odmerkom 1 000 mg/kg, ali z ve čjim 
odmerkom, ki ustreza možni izpostavljenosti človeka, kadar je ta 
znana, ni opaznih strupenih u činkov, nadaljnje preskušanje morda 
ne bo potrebno.  
1.6.2.5  Obdobje opazovanja  
Poskusne živali je treba dnevno opazovati, ali kažejo znake strupe ­
nosti. Zapisati je treba čas smrti in čas pojava ter izginotja znakov 
strupenosti.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 305
 
1.6.3  Postopek  
Vsaka žival mora biti v svoji kletki. Živali se 28 dni, v idealnih 
razmerah po sedem dni na teden, tretirajo s preskusno snovjo. Živali katere koli satelitske skupine, predvidene za nadaljnja opazovanja, je 
treba pustiti nadaljnjih 14 dni brez tretiranja, da se ugotovi povrat ­
nost ali obstojnost strupenih u činkov. Izpostavljanje mora trajati 
najmanj šest ur dnevno. 
Preskusno snov je treba enakomerno nanesti na obmo čje, ki predsta ­
vlja približno 10 % skupne telesne površine. Pri zelo strupenih snoveh je površina nanosa lahko manjša, vendar mora biti čim več 
površine pokrite s čim tanjšo in enakomerno plastjo. 
Med izpostavljenostjo mora preskusna snov ostati v stiku s kožo, kar se 
zagotovi s poroznim gaznim povojem in nedražilnim obližem. Preskusna površina mora biti dodatno ustrezno pokrita, da gazni 
povoj in preskusna snov ostaneta na istem mestu in se živalim prepre či 
zaužitje preskusne snovi. Za prepre čitev zaužitja se lahko uporabijo 
pripomočki za omejevanje gibanja, vendar popolna imobilizacija ni 
priporočena metoda. Lahko se uporabi tudi zaš čitni ovratnik. 
Ob koncu obdobja izpostavljenosti se ostanek preskusne snovi 
odstrani, kadar je to izvedljivo, z vodo ali kako drugo ustrezno metodo čiščenja kože. 
Vse živali je treba dnevno opazovati in zapisati znake strupenosti, 
vključno s časom njihovega pojava, stopnjo in trajanjem. Opazovati 
je treba spremembe na koži in kožuhu, o čeh in sluznici ter tudi v 
dihalih, obto čilih, avtonomnem in osrednjem živ čevju, somatomoto ­
rični aktivnosti in vedenjskem vzorcu. Tedensko je treba izmeriti 
maso živali. Priporo ča se tudi tedenska meritev porabe hrane. Živali 
je treba redno opazovati, da se prepre či izguba živali zaradi kanibal ­
izma, avtolize tkiv ali napak pri dajanju v kletke. Ob koncu študije 
se na vseh preživelih živalih nesatelitskih tretiranih skupin opravi 
obdukcija. Umirajo če živali in živali v hudem stresu ali s hudimi 
bolečinami se takoj ob odkritju odstranijo iz kletk ter humano 
usmrtijo in obducirajo. 
Ob koncu preskusa se na vseh živalih, vklju čno z živalmi kontrolne 
skupine, opravijo naslednje preiskave: 
1. hematološke preiskave, ki vklju čujejo najmanj dolo čitev hemato ­
krita, koncentracije hemoglobina, števila eritrocitov, skupnega in diferencialnega števila levkocitov in zmožnosti koagulacije; 
2. klinične biokemijske preiskave krvi, ki vklju čujejo dolo čanje 
najmanj enega parametra delovanja jeter in ledvic: serumska alanin-aminotransferaza (prej poznana kot glutamat-piruvat-transa ­
minaza), serumska aspartat-aminotransferaza (prej poznana kot 
glutamat-oksaloacetat-transaminaza), se čninski dušik, albumin, 
kreatinin v krvi, skupni bilirubin in skupne serumske beljakovine. 
Druge dolo čitve, ki so lahko potrebne za izdelavo ustrezne ocene 
strupenosti, vklju čujejo kalcij, fosfor, klorid, natrij, kalij, postno 
glukozo, lipide, hormone, ravnovesje kislina/baza, methemoglobin 
in aktivnost holinesteraze.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 306
 
Kadar je potrebno, se za razširitev raziskave opaženih u činkov lahko 
uporabijo dodatne klini čne biokemijske preiskave.  
1.6.4  Makroskopska obdukcija  
Na vseh živalih iz študije je treba izvesti popolno makroskopsko 
obdukcijo. Najmanj jetra, ledvica, nadledvi čne žleze in moda je 
treba stehtati mokre čim prej po disekciji, da se prepre či njihova 
dehidracija. Organe in tkiva, tj. normalno in tretirano kožo, jetra, ledvica, vranico, moda, nadledvi čne žleze, srce in tar čne organe (to 
je tiste organe, ki kažejo makroskopske poškodbe ali spremembe v 
velikosti), je treba shraniti v ustreznem mediju za morebitno histo ­
patološko preiskavo v prihodnosti.
 
1.6.5  Histopatološka preiskava  
Pri skupini, tretirani z velikim odmerkom, in kontrolni skupini je 
treba opraviti histološko preiskavo na shranjenih organih in tkivih. 
Pri vseh skupinah, tretiranih z manjšimi odmerki, je treba preiskati 
organe in tkiva, ki v skupini z najve čjim odmerkom kažejo 
poškodbe, ki se lahko pripišejo preskusni snovi. Živali satelitske skupine je treba histološko preiskati s posebnim poudarkom na tistih 
organih in tkivih, pri katerih so bili pri drugih tretiranih skupinah 
ugotovljeni strupeni u činki.
 
2. PODATKI  
Podatke je treba povzeti v tabeli, ki za vsako preskusno skupino 
prikazuje število živali na za četku preskusa in število živali, ki 
kažejo posamezno vrsto poškodbe. 
Vse opažene rezultate je treba ovrednotiti z ustrezno statisti čno 
metodo. Uporabi se lahko katera koli priznana statisti čna metoda.  
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
V poročilo o preskusu se, če je možno, vklju čijo naslednje informacije: 
— podatki o živalih (vrsta, sev, vir, okoljski pogoji, prehrana itd.), — preskusni pogoji (vklju čno z vrsto povoja: okluzivni ali neoklu ­
zivni), 
— velikost odmerkov (vklju čno z nosilcem, če je bil uporabljen) in 
koncentracije, 
— velikost odmerka brez u činkov, kadar je možno, 
— podatki o strupenem odzivu po spolu in odmerku, — čas smrti med študijo oziroma ali so živali preživele do zaklju ­ 
čka, 
— strupeni ali drugi u činki, 
— čas odkritja a vsakega nenormalnega znaka in njegov nadaljnji 
razvoj, 
— podatki o hrani in telesni masi, — opravljeni hematološki preskusi in rezultati,
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 307
 
— opravljeni klini čni biokemijski preskusi in rezultati, 
— izsledki obdukcije, — podroben opis vseh histopatoloških izsledkov, 
— statisti čna obdelava rezultatov, kadar je možno, 
— razprava o rezultatih, — razlaga rezultatov.
 
3.2 VREDNOTENJE IN RAZLAGA 
Glej Splošni uvod dela B (D).  
4. VIRI  
Glej Splošni uvod dela B (E).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 308
 
B.10  MUTAGENOST – PREIZKUS KROMOSOMSKIH ABERACIJ 
PRI SESALCIH  IN VITRO  
1. METODA  
Ta metoda ustreza metodi OECD TG 473,  In Vitro  Mammalian 
Chromosome Aberration Test (1997).  
1.1. UVOD 
Namen preizkusa kromosomskih aberacij  in vitro je  določiti snovi, ki 
povzročijo strukturne kromosomske aberacije v kultiviranih sesalskih 
celicah (1) (2) (3). Lo čimo dva tipa strukturnih aberacij, kromo ­
somski tip in kromatidni tip. Ve čina kemičnih mutagenov povzro či 
aberacije kromatidnega tipa, nastopajo pa tudi aberacije kromosom ­
skega tipa. Pove čanje poliploidije lahko pomeni, da kemikalija lahko 
povzroči numerične aberacije. Vendar ta metoda ni namenjena dolo ­ 
čanju numeri čnih aberacij in se navadno ne uporablja v ta namen. 
Kromosomske mutacije in podobni pojavi so vzrok številnih genskih bolezni pri človeku in obstajajo tehtni dokazi, da so kromosomske 
mutacije in podobni pojavi, ki povzro čajo spremembe v onkogenih 
in genih, zaviralcih rasti tumorjev, somatskih celic, povezani z 
nastankom raka pri človeku in poskusnih živalih. 
Pri preizkusu kromosomskih aberacij  in vitro  se lahko uporabijo 
kulture trajnih celi čnih linij, celi čni sevi ali primarne celi čne kulture. 
Uporabljene celice se izberejo na podlagi zmožnosti rasti v kulturi, stabilnosti kariotipa, kromosomskega števila, raznolikosti kromo ­
somov in pogostnosti spontanih kromosomskih aberacij. 
Za preizkuse, opravljene  in vitro,  so navadno potrebni zunanji viri 
aktivacije presnove. Takšen sistem aktivacije presnove ne more povsem posnemati razmer  in vivo  pri sesalcih. Treba je paziti, da 
se prepreči nastanek razmer, ki bi vodile do pozitivnih rezultatov, ki 
ne kažejo prave mutagenosti in so lahko posledica sprememb pH, 
osmolarnosti ali visoke ravni citotoksi čnosti (4) (5). 
Ta preizkus se uporablja za iskanje možnih mutagenov in rakot ­
vornih snovi za sesalce. Mnoge spojine, pri katerih je rezultat tega 
preizkusa pozitiven, so rakotvorne snovi za sesalce; vendar pa sood ­
visnost med tem preizkusom in rakotvornostjo ni popolna. Odvisna je od skupine nevarnosti kemikalije in vedno ve č je dokazov, da 
obstajajo rakotvorne snovi, ki jih ta preizkus ne zazna, ker je videti, 
da delujejo prek drugih mehanizmov in ne z neposrednim poškodo ­
vanjem DNA. 
Glej tudi splošni uvod dela B.
 
1.2 DEFINICIJE  
Aberacija kromatidnega tipa:  strukturna poškodba kromosoma, 
izražena kot prelom posameznih kromatid ali prelom in združitev med kromatidama.  
Aberacija kromosomskega tipa:  strukturna poškodba kromosoma, 
izražena kot prelom ali prelom in združitev obeh kromatid na istem 
mestu.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 309
 
Endoreduplikacija:  proces, pri katerem se jedro po podvojitvi DNA 
v fazi S ne za čne deliti, ampak takoj nastopi druga faza S. Nastanejo 
kromosomi s 4, 8, 16, ... kromatidami.  
Presledek:  akromatska lezija, manjša od širine ene kromatide, ob 
zelo majhni neporavnanosti kromatid.  
Mitotični indeks:  razmerje med številom celic v metafazi in 
skupnim številom celic v opazovani populaciji celic; kazalec stopnje množitve te populacije.  
Numerična aberacija:  število kromosomov, druga čno od normal ­
nega števila, ki je zna čilno za uporabljene celice.  
Poliploidija:  večkratnik haploidnega števila kromosomov (n), razen 
diploidnega števila (tj.  3n, 4n in tako naprej).  
Strukturna aberacija:  sprememba v strukturi kromosoma, ki je 
vidna pri mikroskopskem pregledu metafaze celi čne delitve v obliki 
delecij in fragmentov, transpozicij ali recipro čnih transi okacij.
 
1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Celične kulture se izpostavijo preizkušam snovi ob aktivaciji pres ­
nove in brez nje. Celi čne kulture se v poprej dolo čenih intervalih po 
izpostavitvi preizkušam snovi obdelajo s snovjo za ustavitev meta ­
faze (npr. Colcemidom® ali kolhicinom), se požanjejo in obarvajo, nato se metafazne celice mikroskopsko pregledajo, da se dolo či 
navzočnost kromosomskih aberacij.
 
1.4 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.4.1  Priprave  
1.4.1.1  Celice  
Lahko se uporabijo razli čne celične linije, celi čni sevi ali primarne 
celične kulture, vklju čno s človeškimi celicami (npr. fibroblasti kitaj ­
skega hrčka, limfociti periferne krvi človeka ali drugih sesalcev).  
1.4.1.2  Gojiš če in pogoji kultiviranja  
Pri vzdrževanju kultur naj se uporabijo ustrezna gojiš ča za kulture in 
pogoji inkubacije (posode za kulture, koncentracija CO  2 , temperatura 
in vlažnost). Trajne celi čne linije in sevi se redno preverjajo, ali je v 
njih modalno kromosomsko število stabilno in ali niso okužene z mikoplazmo; okužene celi čne linije in sevi naj se ne uporabljajo. 
Poznati je treba normalni čas celičnega ciklusa in pogoje kultiviranja.
 
1.4.1.3  Priprava kultur  
Trajne celi čne linije in sevi: celice se namnožijo iz založnih kultur, 
nasadijo v gojiš če tako na gosto, da kultura ne bo dosegla konf ­
luentne rasti, preden se požanjejo, in se inkubirajo pri 37  o C. ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 310
 
Limfociti: celotna kri, obdelana z antikoagulantom (npr. heparinom), 
ali ločeni limfociti, dobljeni iz zdravih osebkov, se dodajo v gojiš če, 
ki vsebuje mitogen (npr. fitohemaglutinin), in se inkubirajo pri 37
 o C. 
1.4.1.4  Aktivacija presnove  
Celice naj se izpostavijo preizkušam snovi ob navzo čnosti in ob 
odsotnosti ustreznega sistema za aktivacijo presnove. Najpogosteje 
uporabljani sistem je postmitohondrijska frakcija (S9), pripravljena iz 
jeter glodavcev, ki so bila obdelana s sredstvi za encimsko indukcijo, kakor je Aroclorm 1254 (6) (7) (8) (9), ali z zmesjo fenobarbitona in β – naftoflavona, z dodanimi kofaktorji (10) (11) (12). 
Postmitohondrijska frakcija se navadno uporablja v koncentracijah 1- 
10 % v/v v kon čnem preizkusnem gojiš ču. Pogoji sistema za akti ­
vacijo presnove so lahko odvisni od skupine nevarnosti preizkušane 
kemikalije. V časih je primerno uporabiti ve č kakor eno koncentracijo 
postmitohondrijske frakcije. 
Vrsta razvojnih dosežkov, skupaj s pridobivanjem gensko spreme ­
njenih celi čnih linij, v katerih se izražajo geni za to čno določene 
aktivirajo če encime, lahko daje možnosti za endogeno aktivacijo. 
Izbira uporabljenih celi čnih linij naj bo znanstveno utemeljena 
(npr. s pomembnostjo izoencima citokrom P450 za presnovo preizkušane snovi).
 
1.4.1.5  Preizkušana snov/priprava  
Trdne preizkušane snovi naj se pred obdelavo celic raztopijo ali 
suspendirajo v ustreznih topilih ali nosilcih, in če je to primerno, 
se razredčijo. Tekoče preizkušane snovi se lahko dodajo neposredno 
v preizkusni sistem in/ali pred obdelavo razred čijo. Uporabljajo naj 
se sveže pripravljene preizkušane snovi, razen če podatki o stabil ­
nosti kažejo, da je shranjevanje sprejemljivo.  
1.4.2  Preizkusni pogoji  
1.4.2.1  Topilo/nosilec  
Topilo/nosilec naj ne vzbuja suma, da kemi čno reagira s preizkusno 
snovjo, in naj bo združljivo s preživetjem celic in delovanjem S9. Če 
se uporabijo manj poznana topila/nosilci, naj njihovo vklju čitev 
podpirajo podatki, ki kažejo na njihovo združljivost. Priporo ča se, 
da se, kadar koli je to mogo če, kot prva možnost preu či uporaba 
vodnega topila/nosilca. Kadar se preizkušajo v vodi nestabilne snovi, 
naj se uporabijo brezvodna organska topila. Voda se lahko odstrani z 
molekulskim sitom.  
1.4.2.2  Koncentracije izpostavljenosti  
Med merili, ki jih je treba upoštevati pri dolo čanju najvišje koncen ­
tracije, so citotoksi čnost, topnost v preizkušanem sistemu in spre ­
membe v pH ali osmolarnosti. 
Citotoksičnost naj se dolo či ob aktivaciji presnove in brez nje v 
glavnem poskusu z uporabo ustreznega kazalca celi čne neokrnjenosti 
in rasti, kakor so stopnja konfluentne rasti, število živih celic ali 
mitotični indeks. Lahko je koristno, če se citotoksi čnost in topnost 
določita v poprejšnjem poskusu.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 311
 
Uporabijo naj se vsaj tri koncentracije, ki jih je mogo če analizirati. 
Ob nastopu citotoksi čnosti naj te koncentracije zajamejo obmo čje od 
največje toksičnosti do majhne toksi čnosti ali netoksi čnosti; to bo 
navadno pomenilo, da razlika med koncentracijami ne bo smela biti večja od faktorja med 2 in √10. V času odvzema naj bo pri najvišji 
koncentraciji znatno zmanjšana stopnja konfluentne rasti, število 
celic ali mitoti čni indeks (vsi za ve č kakor 50 %). Mitoti čni indeks 
je le posredno merilo citotoski čnih/citostatskih u činkov in je odvisen 
od časa, ki je pretekel od obdelave. Vendar je mitoti čni indeks 
sprejemljiv za suspenzijske kulture, pri katerih so druge meritve 
toksičnosti lahko težavne in neprakti čne. Informacije o dinamiki 
celičnega ciklusa, kakor je povpre čni generacijski čas (AGT), se 
lahko uporabijo kot dodatne informacije. Vendar je AGT le 
povprečna vrednost, iz katere ni vedno razviden obstoj zapoznelih 
podpopulacij, in celo zelo majhno pove čanje povpre čnega generacij ­
skega časa lahko pomeni znatno zapoznelost optimalnega števila 
aberacij. 
Za sorazmerno necitotoksi čne snovi naj bo najve čja preizkusna 
koncentracija 5 μl/ml, 5 mg/ml oziroma 0,01 M, tista, ki je najnižja. 
Za sorazmerno netopne snovi, ki pri koncentracijah, nižjih od 
netopnih koncentracij, niso toksi čne, naj bo najve čji uporabljeni 
odmerek koncentracija nad mejo topnosti v kon čnem gojiš ču kulture 
ob koncu obdelave. Pri nekaterih primerih (npr. kadar se toksi čnost 
pokaže le pri koncentracijah, višjih od netopne koncentracije) je 
priporočljivo preizkusiti ve č kakor eno koncentracijo z vidno 
oborino. Lahko je koristno oceniti topnost na za četku in na koncu 
obdelave, saj se topnost med izpostavitvijo v preizkusnem sistemu 
lahko spremeni zaradi navzo čnosti celic, seruma S9 itn. Netopnost se 
lahko zazna s prostim o česom. Oborina ne sme vplivati na štetje.  
1.4.2.3  Negativni in pozitivni kontrolni vzorci  
V vsak poskus naj se vklju čijo sočasni pozitivni in negativni (topilo 
ali nosilec) kontrolni vzorci, ob aktivaciji presnove in brez nje. Kadar se uporabi aktivacija presnove, mora biti kemikalija pozitivne kontrole tista, pri kateri je za mutageni odziv potrebna aktivacija. 
V pozitivnih kontrolnih vzorcih naj se uporabi znani klastogen pri 
ravneh izpostavljenosti, pri katerih se pri čakuje ponovljivo in 
zaznavno pove čanje glede na ozadje, ki pokaže ob čutljivost preizkus ­
nega sistema. 
Koncentracije pozitivne kontrole naj se izberejo tako, da so u činki 
jasni, vendar ne razkrijejo takoj identitete kodiranih mikroskopskih 
preparatov. Primeri snovi pozitivne kontrole vklju čujejo:
 
Stanje aktivacije presnove Snov Št. CAS Št. Einecs  
Ni zunanje aktivacije presnove metil metansulfonat 66-27-3 200-625-0 
etil metansulfonat 62-50-0 200-536-7  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 312
 
Stanje aktivacije presnove Snov Št. CAS Št. Einecs  
N-etil-N-nitrozose čnina 759-73-9 212-072-2 
mitomicin C 50-07-7 200-008-6 
4-nitrokinolin-N-oksid 56-57-5 200-281-1 
Zunanja aktivacija presnove benzo[a]piren 50-32-8 200-028-5 
ciklofosfamid 
ciklofosfamid monohidrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Lahko se uporabijo druge ustrezne snovi pozitivne kontrole. Upora ­
bijo naj se kemikalije pozitivne kontrole, ki sodijo v isto skupino 
nevarnosti kakor preizkušana kemikalija, kadar so na voljo. 
Za vsak odvzem naj se pripravijo negativni kontrolni vzorci, ki jih 
sestavlja le topilo ali nosilec v obdelovalnem gojiš ču, obdelani na 
enak način kakor obdelovalne kulture. Uporabijo se tudi neobdelani 
kontrolni vzorci, razen če pretekli kontrolni podatki dokazujejo, da 
izbrano topilo ne povzro ča škodljivih ali mutagenih u činkov.  
1.4.3  Postopek  
1.4.3.1  Obdelava s preizkušano snovjo  
Množeče se celice se obdelajo s preizkušano snovjo ob navzo čnosti 
in ob odsotnosti sistema za aktivacijo presnove. Obdelava limfocitov 
naj se začne približno 48 ur po mitogeni stimulaciji. 
1.4.3.2 Navadno se pri vsaki koncentraciji uporabita dve vzporedni kulturi; 
uporaba dveh vzporednih kultur se mo čno priporo ča pri negativnih/s 
topilom kontrolnih kulturah. Kadar se na podlagi preteklih podatkov lahko dokaže, da so razlike med dvema vzporednima kulturama minimalne (13) (14), je sprejemljivo, da se uporabi ena kultura za 
vsako koncentracijo. 
Plinaste ali hlapne snovi naj se preizkušajo z ustreznimi metodami, 
na primer v zatesnjenih posodah za kulture (15) (16).
 
1.4.3.3  Čas odvzema celic iz kulture  
V prvem poskusu naj se celice za 3-6 ur izpostavijo preizkušam 
snovi, ob aktivaciji presnove in brez nje, in vzor čijo v času približno 
1,5 dolžine normalnega celi čnega ciklusa po za četku obdelave (12). 
Če so pri takšnem protokolu rezultati negativni ob aktivaciji, pa tudi 
brez nje, se opravi dodatni poskus brez aktivacije, pri katerem se 
kultura nenehno obdeluje do vzor čenja v času, enakem približno 1,5 
dolžine normalnega celi čnega ciklusa. Nekatere kemikalije se laže 
zaznajo pri časih obdelave/vzor čenja, ki so daljši od 1,5 dolžine 
ciklusa. Negativne rezultate ob aktivaciji presnove je treba potrditi 
za vsak primer posebej. Kadar se pojmuje, da potrditev negativnih 
rezultatov ni potrebna, naj se to utemelji.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 313
 
1.4.3.4  Priprava kromosomov  
Celične kulture se obdelajo s Colcemidom® ali kolhicinom, navadno 
1-3 ure pred odvzemom celic. Celice se odvzamejo in obdelajo za pripravo kromosomov iz vsake kulture posebej. Priprava kromo ­
somov vklju čuje hipotoni čno obdelavo celic, fiksiranje in barvanje.
 
1.4.3.5  Analiza  
Vsi preparati, skupaj s pozitivnimi in negativnimi kontrolnimi vzorci, 
naj se pred mikroskopsko analizo neodvisno kodirajo. Ker fiksiranje pogosto povzro či pretrganje dela metafaznih celic in izgubo kromo ­
somov, naj bo število centromer v štetih celicah pri vseh vrstah celic 
enako modalnemu številu ± 2. Če je to primerno, naj se na vsako 
koncentracijo in vsak kontrolni vzorec v štetje vklju či vsaj 200 dobro 
vidnih metafaz, ki so enakomerno porazdeljene med vzporedne 
vzorce. To število se lahko zmanjša, kadar se opazi veliko število 
aberacij. 
Čeprav je namen preizkusa zaznati strukturne kromosomske abera ­
cije, je pomembno, da se evidentirata poliploidija in endoreduplika ­
cija, kadar se pokažeta.
 
2. PODATKI  
2.1 OBDELAVA REZULTATOV 
Poskusna enota je celica, zato naj se dolo či odstotek celic z eno ali 
več strukturnimi kromosomskimi aberacijami. Razli čni tipi struk ­
turnih kromosomskih aberacij naj se navedejo skupaj s števili in 
pogostnostjo za poskusne in kontrolne kulture. Presledki se eviden ­
tirajo ločeno in navedejo v poro čilu, vendar se na splošno ne vklju ­ 
čijo v skupno pogostnost aberacij. 
Evidentirajo naj se tudi so časne meritve citotoksi čnosti za vse obde ­
lane in negativne kontrolne kulture v glavnih poskusih aberacij. 
Navedejo se podatki za posamezne kulture. Vsi podatki naj bodo 
povzeti v tabelah. 
Preverjanje jasnega pozitivnega odziva ni potrebno. Dvoumni rezul ­
tati naj se razjasnijo z dodatnimi preizkusi, po možnosti ob prilago ­
jenih poskusnih pogojih. Potrebnost potrditve negativnih rezultatov je obravnavana pod 1.4.3.3. V nadaljnjih poskusih naj se preu či 
možnost prilagoditve preizkusnih parametrov, da se razširi obmo čje 
pogojev analize. Preizkusni parametri, ki bi se lahko prilagodili, vključujejo intervale med koncentracijami in pogoje aktivacije pres ­
nove.
 
2.2 VREDNOTENJE IN INTERPRETACIJA REZULTATOV 
Pozitivni rezultat se lahko dolo či na podlagi številnih meril, kakor je 
na primer s koncentracijo povezano pove čanje ali ponovljivo pove ­ 
čanje števila celic s kromosomskimi aberacijami. Najprej naj se 
preuči biološka pomembnost rezultatov. Pri vrednotenju rezultatov 
preizkusa se kot pomo č lahko uporabijo statisti čne metode (3) 
(13). Statisti čna značilnost naj ne bo edini odlo čilni dejavnik za 
pozitivni odziv.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 314
 
Povečano število poliploidnih celic lahko pomeni, da preizkušana 
snov lahko zavre mitozo in povzro či numerične kromosomske abera ­
cije. Pove čano število celic z endoredupliciranimi kromosomi lahko 
pomeni, da preizkušana snov lahko zavre potek celi čnega ciklusa 
(17) (18). 
Pojmuje se, da preizkušana snov, pri kateri rezultati ne izpolnjujejo 
navedenih meril, ni mutagena v tem sistemu. 
Čeprav bo ve čina poskusov dala jasne pozitivne ali negativne rezul ­
tate, bodo v redkih primerih dobljeni podatki prepre čili zanesljivo 
oceno o delovanju preizkušane snovi. Rezultati lahko ostanejo dvoumni ali dvomljivi ne glede na število ponovitev poskusa. 
Pozitivni rezultati preizkusa kromosomskih aberacij  in vitro  pome­
nijo, da preizkušana snov povzro ča strukturne kromosomske aberacij 
e v kultiviranih somatskih celicah sesalcev. Negativni rezultati pome ­
nijo, da preizkušana snov pri preizkusnih pogojih ne povzro ča 
kromosomskih aberacij v kultiviranih somatskih celicah sesalcev.
 
3. PORO ČANJE  
POROČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preizkusu mora vsebovati naslednje informacije: 
Topilo/nosilec: 
— utemeljitev izbire nosilca, 
— topnost in stabilnost preizkušane snovi v topilu/nosilcu, če sta 
znani. 
Celice: — vrsta in vir celic, — značilnosti kari otipa in ustreznost uporabljene vrste celic, 
— odsotnost mikoplazme, če je to primerno, 
— podatki o dolžini celi čnega ciklusa, 
— spol donorjev krvi, celotna kri ali lo čeni limfociti, uporabljeni 
mitogen, 
— število pasaž, če je to primerno, 
— metode vzdrževanj a celi čne kulture, če j e to primerno, 
— modalno število kromosomov. Preskusni pogoji: — vrsta snovi za ustavitev metafaze, njena koncentracija in čas 
izpostavljenosti celic, 
— razlogi za izbiro koncentracij in števila kultur, vklju čno z npr. 
podatki o citotoksi čnosti in mejah topnosti, če so na voljo, 
— sestava gojiš č, koncentracija CO
 2 , če je to primerno,  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 315
 
— koncentracija preizkušane snovi, 
— volumen dodanega nosilca in preizkušane snovi, — temperatura inkubacije, — čas inkubacije, 
— trajanje obdelave, — gostota celic ob nasaditvi, če je to primerno, 
— vrsta in sestava sistema za aktivacijo presnove, skupaj z merili 
sprejemljivosti, 
— pozitivni in negativni kontrolni vzorci, — metode priprave mikroskopskih preparatov, — merila za štetje aberacij, — število analiziranih metafaz, — metode merjenja toksi čnosti, 
— merila za dolo čitev, ali je študija pozitivna, negativna ali 
dvoumna. 
Rezultati: — znaki toksi čnosti, npr. stopnja konfluentne rasti, podatki o celi ­ 
čnem ciklusu, število celic, mitoti čni indeks, 
— znaki obarjanja, — podatki o pH in osmolarnosti obdelovalnega gojiš ča, če sta bila 
določena, 
— opredelitev aberacij, skupaj s presledki, — število celic s kromosomskimi aberacijami in tip kromosomskih 
aberacij, ki se navedeta posebej za vsako obdelano in kontrolno 
kulturo, 
— spremembe v ploidnosti, če so bile opažene, 
— odvisnost med odmerkom in odzivom, kadar je to mogo če, 
— statisti čne analize, če so bile opravljene, 
— podatki o so časni negativni (topilo/nosilec) in pozitivni kontroli, 
— podatki o pretekli negativni (topilo/nosilec) in pozitivni kontroli, 
z območji, srednjimi vrednostmi in standardnimi odkloni. 
Diskusija rezultatov. Sklepi.
 
4. LITERATURA  
(1) Evans, H.J. (1976). Cytological Methods for Detecting 
Chemical Mutagens. In: Chemical mutagens, Principles and 
Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) 
Plenum Press, New York in London, str. 1–29. 
(2) Ishidate, M. Jr. in Sofumi, T. (1985), The In Vitro Chromo ­
somal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, v: Progress in Mutation Research, 
zv. 5, Ashby, J. idr., (izd.) Elsevier Science Publishers, 
Amsterdam-New York-Oxford, str. 427–432.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 316
 
(3) Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C, Colman, S., 
Brown, B., Cannon, C, Bloom, A. D., Nakamura, F., Ahmed, 
M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G. H., Resnick, M. A., Anderson, G., in Zeiger E. (1978), Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: 
Evaluation of 108 chemicals, Environs, Molec. Mutagen 10 
(suppl. 10), str. 1–175. 
(4) Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., 
Brusick, D., Ashby, J., in Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, str. 147–204. 
(5) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I., in Okumura, K., (1992), 
Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian 
Cells, Mutation Res., 268, str. 297–305. 
(6) Ames, B. N., McCann, J., in Yamasaki, E. (1975), Methods for 
Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ 
Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, str. 347–364. 
(7) Maron, D. M., in Ames, B. N. (1983), Revised Methods for 
the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, str. 173–215. 
(8) Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, 
M., in de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/ 
Carcinogens after Activation in a Mircrosomal System In 
Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimet ­
hylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat- 
Liver Microsomes, Mutation Res., 37, str. 83–90. 
(9) Matsuoka, A., Hayashi, M., in Ishidate, M. Jr. (1979), Chro ­
mosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 
Mix In Vitro, Mutation Res., 66, str. 277–290. 
(10) Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. 
G., Gibson, G. G., Mackay, J. M., in Wolf, R. C. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternative to Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxi ­
city Assays, Mutagenesis, 7, str. 175–177. 
(11) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K., in Sugimura, T. 
(1976), A. Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as 
an Inducer of Metabolic Activation Systems, v: de Serres, F. J. Fouts, J. R. Bend, J. R., in Philpot, R. M. (izd.), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North- 
Holland, str. 85–88. 
(12) Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. L., 
Kirkland, D. J. Morita, T., Mosesso, P., Sofumi, T. (1994), 
Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromo ­
somal Aberrations, Mutation Res., 312, str. 241–261. 
(13) Richardson, C, Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G, 
Chanter, D. O., in Phillips, B. (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays, v: Statistical Evaluation of Muta ­
genicity Test Data, Kirkland, D. J., (cd) Cambridge University 
Press, Cambridge, str. 141–154. 
(14) Soper, K. A., in Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks are 
not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells, Mutation Res., 312, str. 139–149. 
(15) Krahn, D. F., Barsky, F. C, in McCooey, K. T. (1982), CHO/ 
HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, v: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (izd.), 
Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, str. 
91–103.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 317
 
(16) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P., in Brooks, A. L. 
(1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells 
Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Muta ­
gens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, str. 795–801. 
(17) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Res., 
119, str. 403–413. 
(18) Huang, Y., Change, C, in Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin- 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, str. 1362–1364.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 318
 
B.11  MUTAGENOST – PRESKUS KROMOSOMSKIH ABERACIJ V 
KOSTNEM MOZGU SESALCEV  IN VIVO  
1. METODA  
Ta metoda ustreza metodi OECD TG 475, Mammalian Bone 
Marrow Chromosome Aberration Test (1997).  
1.1 UVOD 
Preizkus kromosomskih aberacij  in vivo  pri sesalcih se uporablja za 
odkrivanje strukturnih kromosomskih aberacij, ki jih povzro či 
preizkušana snov v celicah kostnega mozga živali, navadno glodavcev (1) (2) (3) (4). Lo čimo dva tipa strukturnih kromosomskih 
aberacij, kromosomski tip in kromatidni tip. Pove čanje poliploidije 
lahko pomeni, da kemikalija lahko povzro či numerične aberacij e. 
Večina kemičnih mutagenov povzro či aberacij e kromatidnega tipa, 
nastopajo pa tudi aberacij e kromosomskega tipa. Kromosomske 
mutacije in podobni pojavi so vzrok genskih bolezni pri človeku 
in obstajajo tehtni dokazi, da so kromosomske mutacije in podobni pojavi, ki povzro čajo spremembe v onkogenih in genih, zaviralcih 
rasti tumorjev, povezani z rakom pri človeku in v poskusnih siste ­
mih. 
Pri tem preizkusu se redno uporabljajo glodavci. Tar čno tkivo pri tem 
preizkusu je kostni mozeg, ker je zelo vaskularizirano tkivo in vsebuje populacijo celic s hitro menjavo ciklusa, ki se z lahkoto izolirajo in 
obdelajo. Druge vrste in tar čna tkiva niso predmet te metode. 
Ta preizkus kromosomskih aberacij je posebno primeren za ocenje ­
vanje nevarnosti mutagenosti, ker omogo ča upoštevanje dejavnikov 
presnove  in vivo,  farmakokinetike in popravljanja DNA, čeprav so ti 
lahko razli čni pri razli čnih vrstah in tkivih. Preizkus  in vivo  je kori­
sten tudi za nadaljnjo preiskavo mutagenih u činkov, odkritih pri 
preizkusu  in vitro.  
Če obstajajo dokazi, da preizkušana snov ali reaktivni metabolit ne 
bo dosegel tar čnega tkiva, ta preizkus ni primeren. 
Glej tudi splošni uvod dela B.
 
1.2 DEFINICIJE  
Aberacija kromatidnega tipa:  strukturna poškodba kromosoma, 
izražena kot prelom posameznih kromatid ali prelom in združitev 
med kromatidama.  
Aberacija kromosomskega tipa:  strukturna poškodba kromosoma, 
izražena kot prelom ali prelom in združitev pri obeh kromatidah na 
istem mestu.  
Endoreduplikacija:  proces, pri katerem se jedro po podvojitvi DNA 
v fazi S ne za čne deliti, ampak takoj nastopi druga faza S. Nastanejo 
kromosomi s 4, 8, 16, ... kromatidami.  
Presledek:  akromatska lezija, manjša od širine ene kromatide, ob 
zelo majhni neporavnanosti kromatid(-e).  
Numerična aberacija:  število kromosomov, druga čno od normal ­
nega števila, ki je zna čilno za uporabljene celice.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 319
 
Poliploidija:  večkratnik haploidnega števila kromosomov (n), razen 
diploidnega števila (tj.  3n, 4n in tako naprej).  
Strukturna aberacija:  sprememba v strukturi kromosoma, ki je 
vidna pri mikroskopskem pregledu metafaze celi čne delitve v obliki 
delecij in fragmentov, transpozicij ali recipro čnih transi okacij.  
1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Živali se primerno izpostavijo preizkušam snovi in se v primernem 
času po tretiranju žrtvujejo. Pred žrtvovanjem se živali tretirajo s 
sredstvom za ustavitev metafaze (npr. kolhicinom ali Colcemidom®). Nato se pripravijo in obarvajo preparati kromosomov iz celic kost ­
nega mozga in se dolo čijo kromosomske aberacije v metafaznih 
celicah.
 
1.4 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.4.1  Priprave  
1.4.1.1  Izbira živalskih vrst  
Navadno se uporabljajo podgane, miši in kitajski hr čki, lahko pa se 
uporabi katera koli primerna vrsta sesalcev. Uporabijo naj se splošno 
uporabljani laboratorijski sevi mladih zdravih odraslih živali. Ob začetku študije naj bo nihanje teže živali čim manjše in naj ne 
presega ± 20 % srednje vrednosti teže vsakega spola.
 
1.4.1.2  Pogoji bivanja in hranjenja  
Uporabljajo se splošni pogoji iz splošnega uvoda dela B, vendar naj 
bo ciljna vlažnost 50–60 %.  
1.4.1.3  Priprava živali  
Zdrave mlade odrasle živali se naklju čno dodelijo kontrolni in treti ­
rani skupini. Kletke se razporedijo tako, da se čimbolj zmanjšajo 
možni učinki postavitve kletke. Živali se ozna čijo z enkratnimi ozna ­
kami. Živali se vsaj pet dni aklimatizirajo na laboratorijske razmere.  
1.4.1.4  Priprava odmerkov  
Trdne preizkušane snovi naj se pred odmerjanjem živalim raztopijo 
ali suspendirajo v ustreznih topilih ali nosilcih, in če je to primerno, 
se razred čijo. Teko če preizkušane snovi se lahko odmerijo nepo ­
sredno ali pa se pred odmerjanjem razred čijo. Uporabljajo naj se 
sveže pripravljene preizkušane snovi, razen če podatki o stabilnosti 
kažejo, da je shranjevanje sprejemljivo.  
1.4.2  Preizkusni pogoji  
1.4.2.1  Topilo/nosilec  
Topilo/nosilec naj nima toksi čnih učinkov pri uporabljenih odmerkih 
in naj se zanj ne sumi, da kemi čno reagira s preizkusno snovjo. Če 
se uporabijo manj poznana topila/nosilci, naj njihovo vklju čitev 
podpirajo podatki, ki kažejo na njihovo združljivost. Priporo ča se, 
da se, kadar koli je to mogo če, kot prva možnost preu či uporaba 
vodnega topila/nosilca.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 320
 
1.4.2.2  Kontrolni vzorci  
V vsak preizkus naj se vklju čijo sočasni pozitivni in negativni (topi ­
lo/nosilec) kontrolni vzorci za vsak spol. Razen tretiranja s preizkusno snovjo naj se z živalmi v kontrolnih skupinah ravna 
enako kakor s tistimi v tretiranih skupinah. 
Snovi pozitivne kontrole naj pri ravneh izpostavljenosti, pri katerih 
se pričakuje zaznavno pove čanje glede na ozadje, povzro čijo kromo ­
somske aberacije  in vivo.  Odmerki pozitivne kontrole naj se izberejo 
tako, da so u činki jasni, vendar ne razkrijejo takoj identitete kodi ­
ranih mikroskopskih preparatov. Sprejemljivo je, da se snovi pozi ­
tivne kontrole dajejo živalim druga če kakor preizkušana snov in da 
se pri pozitivni kontroli vzor či le enkrat. Lahko se uporabijo kemi ­
kalije pozitivne kontrole, ki sodijo v isti razred kakor preizkušana kemikalija, kadar so na voljo:
 
Snov Št. CAS Št. Einecs  
Etil metansulfonat 62-50-0 200-536-7 
N-etil-N-nitrozose čnina 759-73-9 212-072-2 
Mitomicin C 50-07-7 200-008-6 Ciklofosfamid 
Ciklofosfamid monohidrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Trietilenmelamin 51-18-3 200-083-5 
Negativni kontrolni vzorci, tretirani le s topilom ali nosilcem, 
drugače pa obravnavani enako kakor tretirane skupine, naj se vklju ­ 
čijo v vsako vzor čenje, razen če pretekli kontrolni podatki kažejo na 
sprejemljivo spremenljivost med posameznimi živalmi in pogostnost celic s kromosomskimi aberacijami. Če se pri negativni kontroli 
opravi le eno vzor čenje, je čas prvega vzor čenja najprimernejši. 
Uporabijo naj se tudi netretirani kontrolni vzorci, razen če pretekli 
ali objavljeni kontrolni podatki dokazujejo, da izbrano topilo/nosilec ne povzro ča škodljivih ali mutagenih u činkov.
 
1.5 POSTOPEK  
1.5.1  Število in spol živali  
Vsaka tretirana in kontrolna skupina mora vklju čevati vsaj pet živali 
vsakega spola, ki jih je mogo če analizirati. Če so v času študije na 
voljo podatki študij o isti vrsti in ob uporabi istega na čina izposta ­
vljanja, ki dokazujejo, da med spoloma ni znatnih razlik v toksi čno­
sti, bo zadostovalo preizkušanje na enem spolu. Kadar bi bila izpo ­
stavljenost kemikaliji pri človeku lahko omejena na en spol, na 
primer pri nekaterih farmacevtskih u činkovinah, naj se preizkus 
opravi na živalih ustreznega spola.  
1.5.2  Program tretiranja  
Preizkušane snovi naj se po možnosti dajo z enkratnim vnosom. 
Preizkušane snovi se lahko dajejo tudi v razdeljenem odmerku, to pomeni dva vnosa v istem dnevu, ne ve č kakor nekaj ur narazen, da 
se olajša dajanje velikega volumna materiala. Druga čni režimi 
odmerjanja naj bodo znanstveno utemeljeni.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 321
 
Vzorci naj se vzamejo dvakrat v enem dnevu ob razli čnih časih po 
tretiranju. Pri glodavcih je prvi čas vzorčenja 1,5 dolžine normalnega 
celičnega ciklusa (ki navadno traja 12–18 ur) po tretiranju. Ker čas, 
potreben za sprejem in presnovo preizkušane snovi ter njen u činek 
na dinamiko celi čnega ciklusa, lahko vpliva na optimalni čas za 
zaznavo kromosomskih aberacij, se priporo ča ponovni odvzem 
vzorcev 24 ur po prvem vzor čenju. Če se uporabijo režimi odmerja ­
nja, daljši od enega dneva, naj se vzor či enkrat, 1,5 dolžine normal ­
nega celičnega ciklusa po zadnjem vnosu. 
Pred žrtvovanjem se živalim intraperitonealno injicira ustrezen 
odmerek sredstva za ustavitev metafaze (npr. Colcemida® ali kolhi ­
cina). Živali se vzor čijo v ustreznem časovnem intervalu po tem. Pri 
miših je ta interval približno 3–5 ur; pri kitajskih hr čkih je ta interval 
približno 4–5 ur. Celice se odvzamejo iz kostnega mozga in anali ­
zirajo, da se dolo čijo kromosomske aberacij e.  
1.5.3  Velikost odmerkov  
Če se opravi študija za ugotavljanje obmo čja, ker ni na voljo 
ustreznih podatkov, naj se opravi v istem laboratoriju, na isti vrsti, 
sevu in spolu ter ob enakem režimu tretiranja, kakor bo to upora ­
bljeno v glavni študiji (5). Če toksičnost je, se za prvo vzor čenje 
uporabijo tri velikosti odmerkov. Te velikosti odmerkov naj zajamejo območje od najve čje toksičnosti do majhne toksi čnosti ali netoksi ­ 
čnosti. Pri poznejšem vzor čenju se lahko uporabi le najve čji odme­
rek. Najve čji odmerek je opredeljen kot odmerek, ki povzro či takšne 
znake toksi čnosti, na podlagi katerih je pri čakovati, da bi ve čji 
odmerki pri istem režimu odmerjanja povzro čili smrt. Snovi s speci ­
fičnim biološkim delovanjem pri majhnih netoksi čnih odmerkih (na 
primer hormoni in mitogeni) so lahko izjeme pri merilih za dolo čanje 
odmerka in naj se ovrednotijo za vsak primer posebej. Najve čji 
odmerek se lahko opredeli tudi kot odmerek, ki povzro či nekaj 
znakov toksi čnosti v kostnem mozgu (npr. ve č kakor 50 % zmanj ­ 
šanje mitoti čnega indeksa).
 
1.5.4  Mejni preizkus  
Če preizkus pri eni velikosti odmerka vsaj 2 000 mg/kg telesne teže, 
ki se da v enem vnosu ali v dveh vnosih v istem dnevu, ne povzro či 
nobenih opaznih toksi čnih učinkov in če se na podlagi podatkov o 
strukturno sorodnih snoveh ne pri čakuje, da bo snov genotksi čna, se 
lahko pojmuje, da popolna študija z uporabo treh velikosti odmerkov ni potrebna. Mejni odmerek za dolgotrajnejše študije je 2 000 mg/kg 
telesne teže/dan za tretiranje do 14 dni in 1 000 mg/kg telesne 
teže/dan za tretiranje, daljše od 14 dni. Pri čakovana izpostavljenost 
človeka lahko nakaže potrebo po ve čjih odmerkih pri mejnem 
preizkusu.
 
1.5.5  Dajanje odmerkov  
Navadno se preizkušana snov daje z gavažo po želod čni cevki ali 
ustrezni intubacijski kanili ali z intraperitonealno injekcijo. Sprejem ­
ljivi so tudi drugi na čini izpostavljanja, kadar jih je mogo če uteme­
ljiti. Najve čji volumen teko čine, ki se lahko naenkrat da z gavažo ali 
injekcijo, je odvisen od velikosti preizkušane živali. Volumen naj ne 
presega 2 ml/100 g telesne teže. Uporabo ve čjih volumnov je treba 
utemeljiti. Razen pri draže čih ali jedkih snoveh, ki bodo navadno 
povzročile dražilne u činke pri ve čjih koncentracijah, naj se s prila ­
goditvijo koncentracije čimbolj zmanjša spremenljivost preizkuša ­
nega volumna, tako da se zagotovi stalni volumen pri vseh velikostih 
odmerkov.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 322
 
1.5.6  Priprava kromosomov  
Takoj po žrtvovanju se kostni mozeg odvzame, izpostavi hipotoni čni 
raztopini in fiksira. Celice se nato nanesejo na objektna stekelca in obarvajo.
 
1.5.7  Analiza  
Kot merilo citotoksi čnosti naj se dolo či mitotični indeks v vsaj 1 000 
celicah na žival pri vseh tretiranih živalih (skupaj s pozitivnimi kontrolnimi vzorci) in netretiranih živalih negativne kontrole. 
Analizira naj se vsaj 100 celic za vsako žival. To število se lahko 
zmanjša, kadar se opazi veliko število aberacij. Vsi preparati, skupaj 
s pozitivnimi in negativnimi kontrolnimi vzorci, naj se pred mikro ­
skopsko analizo neodvisno kodirajo. Ker postopki priprave mikro ­
skopskih preparatov pogosto povzro čijo pretrganje dela metafaz in 
izgubo kromosomov, naj bo število centromer v štetih celicah enako 
2 n ± 2.
 
2. PODATKI  
2.1 OBDELAVA REZULTATOV 
Podatki za posamezne živali naj bodo prikazani v tabelah. Poskusna 
enota je žival. Za vsako žival naj se dolo či število štetih celic, število 
aberacij na celico in odstotek celic z eno ali ve č strukturnimi kromo ­
somskimi aberacij ami. Razli čni tipi strukturnih kromosomskih 
aberacij naj se navedejo skupaj s števili in pogostnostjo za tretirane 
in kontrolne skupine. Presledki se evidentirajo lo čeno in navedejo v 
poročilu, vendar se na splošno ne vklju čijo v skupno pogostnost 
aberacij. Če ni dokaza za razliko v odzivu med spoloma, se pri 
statistični analizi lahko združijo podatki za oba spola.  
2.2 VREDNOTENJE IN INTERPRETACIJA REZULTATOV 
Pozitivni rezultat se lahko dolo či na podlagi številnih meril, kakor je 
na primer z odmerkom povezano pove čanje relativnega števila celic 
s kromosomskimi aberacijami ali jasno pove čanje števila celic z 
aberacijami v posamezni tretirani skupini ob posameznem vzor čenju. 
Najprej naj se preu či biološka pomembnost rezultatov. Pri vredno ­
tenju rezultatov preizkusa se kot pomo č lahko uporabijo statisti čne 
metode (6). Statisti čna značilnost naj ne bo edini odlo čilni dejavnik 
za pozitivni odziv. Dvoumni rezultati naj se razjasnijo z dodatnimi preizkusi, po možnosti ob prilagojenih poskusnih pogojih. 
Povečanje poliploidije lahko pomeni, da preizkušana snov lahko 
povzroči numerične kromosomske aberacije. Pove čanje pogostnosti 
endoreduplikacije lahko pomeni, da preizkušana snov lahko zavre potek celi čnega ciklusa (7) (8). 
Pojmuje se, da preizkušana snov, pri kateri rezultati ne izpolnjujejo 
navedenih meril, ni mutagena v tem preizkusu.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 323
 
Čeprav bo ve čina poskusov dala jasne pozitivne ali negativne rezul ­
tate, bodo v redkih primerih dobljeni podatki prepre čili zanesljivo 
oceno o delovanju preizkušane snovi. Rezultati lahko ostanejo dvoumni ali dvomljivi ne glede na število opravljenih poskusov. 
Pozitivni rezultati preizkusa kromosomskih aberacij  in vivo  pome­
nijo, da preizkušana snov povzro ča kromosomske aberacije v 
kostnem mozgu preizkušane vrste. Negativni rezultati pomenijo, da preizkušana snov pri preizkusnih pogojih ne povzro ča kromosomskih 
aberacij v kostnem mozgu preizkušane vrste. 
Obravnava naj se verjetnost, da preizkušana snov ali njeni metaboliti 
dosežejo krvni obtok ali posebej tar čno tkivo (npr. sistemska toksi ­ 
čnost).
 
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preizkusu mora vsebovati naslednje informacije: 
Topilo/nosilec: 
— utemeljitev izbire nosilca, — topnost in stabilnost preizkušane snovi v topilu/nosilcu, če sta 
znani. 
Preizkusne živali: 
— uporabljena vrsta/sev, — število, starost in spol živali, 
— vir, pogoji bivanja, prehrana itn., 
— teža posameznih živali na za četku preizkusa, skupaj z obmo čjem 
telesne teže, srednjo vrednostjo in standardnim odklonom za vsako skupino. 
Preizkusni pogoji: — pozitivni in negativni (nosilec/topilo) kontrolni vzorci, 
— podatki študije za ugotavljanje obmo čja, če je bila opravljena, 
— razlogi za izbiro velikosti odmerka, — podrobnosti o pripravi preizkušane snovi, 
— podrobnosti o dajanju preizkušane snovi, 
— razlogi za na čin dajanja, 
— metode za preverjanje, ali je preizkušana snov dosegla krvni 
obtok ali tar čno tkivo, če je to primerno, 
— način preračunavanja koncentracije preizkušane snovi v hrani/ 
pitni vodi (ppm) v dejanski odmerek (mg/kg telesne teže/dan), 
če je to primerno, 
— podrobnosti o kakovosti hrane in vode, 
— podroben opis programov tretiranja in vzor čenja, 
— metode merjenja toksi čnosti,
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 324
 
— vrsta snovi za ustavitev metafaze, njena koncentracija in čas 
tretiranja, 
— metode priprave mikroskopskih preparatov, 
— merila za štetje aberacij, — število analiziranih celic na žival, — merila za dolo čitev, ali je študija pozitivna, negativna ali 
dvoumna. 
Rezultati: — znaki toksi čnosti, 
— mitoti čni indeks, 
— tip in število aberacij, navedena za vsako žival posebej, — skupno število aberacij na skupino, s srednjimi vrednostmi in 
standardnimi odkloni, 
— število celic z aberacij ami na skupino, s srednjimi vrednostmi in 
standardnimi odkloni, 
— spremembe v ploidnosti, če so bile opažene, 
— odvisnost med odmerkom in odzivom, kadar je to mogo če, 
— statisti čne analize, če so bile opravljene, 
— podatki o so časni negativni kontroli, 
— podatki o pretekli negativni kontroli, z obmo čji, srednjimi vred ­
nostmi in standardnimi odkloni, 
— podatki o so časni pozitivni kontroli. 
Diskusija rezultatov. Sklepi.
 
4. LITERATURA  
(1) Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, v Mutage ­
nicity Testing: a Practical Approach, S. Venitt and J. M. Parry (izd.), IRL Press, Oxford, Washington D. C, str. 275–306. 
(2) Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. 
F., in Shelby, M. (1987), Mammalian In Vivo Cytogenetic 
Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation Res., 189, str. 157–165. 
(3) Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D. G., Boot ­
man, J., in Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetic Assays, 
v: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS 
Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guide ­
lines for Mutagenicity Testing. Poro čilo, del I, pregledan, 
Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port 
Chester, Melbourne, Sydney, str. 115–141. 
(4) Tice, R. R., Hayashi, M., MacGregaro, J. T., Anderson, D., 
Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., 
F. B., Pacchierotti, F., Preston, R. J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S., in Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the in Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal 
Aberration Test, Mutation Res., 312, str. 305–312. 
(5) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, 
J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G, Hodson-Walker, G, Morton, D. B., Kirkland, D. J., in Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society 
Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays, 
Mutagenesis, 7, str. 313–319.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 325
 
(6) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G., in 
Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cyto ­
genetic Assays, v: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Poro čilo, del III. Statistical Evaluation of 
Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland (izd.) Cambridge 
University Press, Cambridge, str. 184–232. 
(7) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation-induced G2 arrest, Mutation Res., 119, str. 403–413. 
(8) Huang, Y., Change, C, in Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin- 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer 
Res., 43, str. 1362–1364.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 326
 
B.12  MUTAGENOST – PREIZKUS MIKRONUKLEUSOV V 
ERITROCITIH SESALCEV  IN VIVO  
1. METODA  
Ta metoda ustreza metodi OECD TG 474, Mammalian Erythrocyte 
Micronucleus Test (1997).  
1.1 UVOD 
Preizkus mikronukleusov  in vivo  pri sesalcih se uporablja za odkri ­
vanje poškodb, ki jih preizkušana snov povzro či na kromosomih ali 
mitotičnem aparatu eritroblastov, z analizo eritrocitov, vzor čenih iz 
kostnega mozga in/ali celic periferne krvi živali, navadno glodavcev. 
Namen preizkusa mikronukleusov je dolo čiti snovi, povzro čiteljice 
citogenetskih poškodb, zaradi katerih nastanejo mikronukleusi, ki vsebujejo zaostale fragmente kromosomov ali cele kromosome. 
Ko se eritroblast iz kostnega mozga razvije v polikromati čni eritrocit, 
se jedro izvrže; kakršen koli mikronukleus, kije nastal, lahko ostane 
v drugače brezjedrni citoplazmi. Vidnost mikronukleusov je v teh 
celicah olajšana, ker nimajo jedra. Pove čanje pogostnosti polikroma ­
tičnih eritrocitov z mikronukleusi pri tretiranih živalih je znak indu ­
ciranih poškodb kromosomov. 
Pri tem preizkusu se redno uporablja kostni mozeg glodavcev, saj v 
tem tkivu nastajajo polikromati čni eritrociti. Dolo čanje nezrelih (poli ­
kromatičnih) eritrocitov z mikronukleusi v periferni krvi je enako 
sprejemljivo pri kateri koli vrsti, pri kateri je bilo dokazano, da 
vranica ni zmožna odstraniti eritrocitov z mikronukleusi, ali ki je 
pokazala dovoljšno ob čutljivost za zaznavanje snovi, povzro čajočih 
strukturne ali numeri čne kromosomske aberacije. Mikronukleusi se 
lahko razlo čijo na podlagi številnih meril. Ta vklju čujejo dolo čanje 
navzočnosti ali odsotnosti kinetohora ali centromerne DNA v mikro ­
nukleusih. Pogostnost nezrelih (polikromati čnih) eritrocitov z mikro ­
nukleusi je glavna kon čna točka. Število zrelih (normokromati čnih) 
eritrocitov, ki vsebujejo mikronukleuse, v periferni krvi med dolo ­ 
čenim številom zrelih eritrocitov se tudi lahko uporabi kot kon čna 
točka preizkusa, kadar se živali tretirajo štiri tedne ali ve č. 
Ta preizkus mikronukleusov  in vivo  pri sesalcih je posebno primeren 
za ocenjevanje nevarnosti mutagenosti, ker omogo ča upoštevanje 
dejavnikov presnove  in vivo,
 farmakokinetike in popravljanja 
DNA, čeprav so ti lahko razli čni pri razli čnih vrstah, tkivih in genet ­
skih končnih točkah. Preizkus  in vivo  je koristen tudi za nadaljnjo 
preiskavo mutagenih u činkov, odkritih v sistemu  in vitro.  
Če obstajajo dokazi, da preizkušana snov ali reaktivni metabolit ne 
bo dosegel tar čnega tkiva, ta preizkus ni primeren. 
Glej tudi splošni uvod dela B.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 327
 
1.2 DEFINICIJE  
Centromera (kinetohor):  del(-i) kromosoma, s katerim(-i) se med 
celično delitvijo povežejo niti delitvenega vretena, kar omogo či 
urejeno gibanje h čerinskih kromosomov proti poloma h čerinskih 
celic.  
Mikronukleusi:  majhna jedra, poleg glavnega jedra celic in lo čena 
od njega, ki nastanejo med telofazo mitoze (mejoze) iz zaostalih fragmentov kromosomov ali celih kromosomov.  
Normokromati čni eritrocit:  zreli eritrocit, ki nima ribosomov in ga 
lahko ločimo od nezrelih, polikromati čnih eritrocitov z barvanjem, 
selektivnim za ribosome.  
Polikromati čni eritrocit:  nezreli eritrocit, v vmesnem stadiju 
razvoja, ki še vedno vsebuje ribosome in ga zato lahko lo čimo od 
zrelih, normokromati čnih eritrocitov z barvanjem, selektivnim za 
ribosome.
 
1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Živali se primerno izpostavijo preizkušam snovi. Če se uporabi 
kostni mozeg, se živali žrtvujejo ob primernih časih po tretiranju, 
nato se odvzame kostni mozeg ter se pripravijo in obarvajo preparati (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Kadar se uporabi periferna kri, se kri odvzame ob primernih časih po tretiranju, nato se pripravijo in obar ­
vajo razmazi krvi (4) (8) (9) (10). Pri študijah s periferno krvjo naj 
med zadnjo izpostavitvijo in odvzemom celic prete če čimmanj časa. 
Preparati se analizirajo, da se dolo či navzočnost mikronukleusov.
 
1.4 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.4.1  Priprave  
1.4.1.1  Izbira živalskih vrst  
Če se uporabi kostni mozeg, se priporo čajo miši ali podgane, lahko 
pa se uporabi katera koli primerna vrsta sesalcev. Kadar se uporabi periferna kri, se priporo čajo miši. Lahko pa se uporabi katera koli 
primerna vrsta sesalcev, pri kateri vranica ne odstrani eritrocitov z 
mikronukleusi ali ki je pokazala dovoljšno ob čutljivost za zaznavanje 
snovi, povzro čajočih strukturne ali numeri čne kromosomske abera ­
cije. Uporabijo naj se splošno uporabljani laboratorijski sevi mladih zdravih živali. Ob za četku študije naj bo nihanje teže živali čim 
manjše in naj ne presega ± 20 % srednje vrednosti teže vsakega 
spola.
 
1.4.1.2  Pogoji bivanja in hranjenja  
Uporabljajo se splošni pogoji iz splošnega uvoda dela B, vendar naj 
bo ciljna vlažnost 50–60 %.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 328
 
1.4.1.3  Priprava živali  
Zdrave mlade odrasle živali se naklju čno dodelijo kontrolni in treti ­
rani skupini. Živali se ozna čijo z enkratnimi oznakami. Živali se vsaj 
pet dni aklimatizirajo na laboratorijske razmere. Kletke se razpore ­
dijo tako, da se čimbolj zmanjšajo možni u činki postavitve kletke.  
1.4.1.4  Priprava odmerkov  
Trdne preizkušane snovi naj se pred odmerjanjem živalim raztopijo 
ali suspendirajo v ustreznih topilih ali nosilcih, in če je to primerno, 
se razred čijo. Teko če preizkušane snovi se lahko odmerijo nepo ­
sredno ali pa se pred odmerjanjem razred čijo. Uporabljajo naj se 
sveže pripravljene preizkušane snovi, razen če podatki o stabilnosti 
kažejo, da je shranjevanje sprejemljivo.  
1.4.2  Preizkusni pogoji  
1.4.2.1  Topilo/nosilec  
Topilo/nosilec naj nima toksi čnih učinkov pri uporabljenih odmerkih 
in naj se zanj ne sumi, da kemi čno reagira s preizkušano snovjo. Če 
se uporabijo manj poznana topila/nosilci, naj njihovo vklju čitev 
podpirajo referen čni podatki, ki kažejo na njihovo združljivost. 
Priporoča se, da je, kadar koli je to mogo če, prva izbira vodno 
topilo/nosilec.  
1.4.2.2  Kontrolni vzorci  
V vsak preizkus naj se vklju čijo sočasni pozitivni in negativni (topi ­
lo/nosilec) kontrolni vzorci za vsak spol. Razen tretiranja s preizku ­ 
šano snovjo naj se z živalmi v kontrolnih skupinah ravna enako 
kakor s tistimi v tretiranih skupinah. 
Snovi pozitivne kontrole naj pri ravneh izpostavljenosti, pri katerih 
se pričakuje zaznavno pove čanje glede na ozadje, povzro čijo 
nastanek mikronukleusov  in vivo.  Odmerki pozitivne kontrole naj 
se izberejo tako, da so u činki jasni, vendar ne razkrijejo takoj iden ­
titete kodiranih mikroskopskih preparatov. Sprejemljivo je, da se 
snovi pozitivne kontrole dajejo živalim druga če kakor preizkušana 
snov in da se pri pozitivni kontroli vzor či le enkrat. Poleg tega se 
lahko uporabijo kemikalije pozitivne kontrole, ki sodijo v isto 
skupino nevarnosti kakor preizkušana kemikalija, kadar so na voljo. 
Primeri snovi pozitivne kontrole vklju čujejo:  
Snov Št. CAS Št. Einecs  
Etil metansulfonat 62-50-0 200-536-7 
N-etil-N-nitrozosecnina 759-73-9 212-072-2 Mitomicin C 50-07-7 200-008-6 Ciklofosfamid 
Ciklofosfamid monohidrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Trietilenmelamin 51-18-3 200-083-5
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 329
 
Negativni kontrolni vzorci, tretirani le s topilom ali nosilcem, 
drugače pa obravnavani enako kakor tretirane skupine, naj se vklju ­ 
čijo v vsako vzor čenje, razen če pretekli kontrolni podatki dokazu ­
jejo sprejemljivo spremenljivost med posameznimi živalmi in pogostnost celic z mikronukleusi. Če se pri negativni kontroli opravi 
le eno vzor čenje, je čas prvega vzor čenja najprimernejši. Uporabijo 
naj se tudi netretirani kontrolni vzorci, razen če pretekli ali objavljeni 
kontrolni podatki dokazujejo, da izbrano topilo/nosilec ne povzro ča 
škodljivih ali mutagenih u činkov. 
Če se uporabi periferna kri, je kot negativni kontrolni vzorec lahko 
sprejemljiv tudi vzorec pred tretiranjem, vendar le pri kratkotrajnih študijah periferne krvi (npr. 1-3 tretiranje(-a)), kadar so dobljeni 
podatki v pri čakovanem obmo čju glede na preteklo kontrolo.
 
1.5 POSTOPEK  
1.5.1  Število in spol živali  
Vsaka tretirana in kontrolna skupina mora vklju čevati vsaj pet živali 
vsakega spola, ki jih je mogo če analizirati (11). Če so v času študije 
na voljo podatki študij o isti vrsti in ob uporabi istega na čina izpo­
stavljanja, ki dokazujejo, da med spoloma ni znatnih razlik v toksi ­ 
čnosti, bo zadostovalo preizkušanje na enem spolu. Kadar bi bila 
lahko izpostavljenost kemikaliji pri človeku omejena na en spol, 
na primer pri nekaterih farmacevtskih u činkovinah, naj se preizkus 
opravi na živalih ustreznega spola.  
1.5.2  Program tretiranja  
Ni mogoče priporočiti nobenega standardnega programa tretiranja (to 
je enega, dveh ali ve č vnosov v 24-urnih intervalih). Vzorci iz 
dolgotrajnih režimov odmerjanja so sprejemljivi, pod pogojem, 
daje bil dokazan pozitivni u činek pri tej študiji ali pri negativni 
študiji, če je bila dokazana toksi čnost ali je bil uporabljen mejni 
odmerek in se je odmerjanje nadaljevalo do vzor čenja. Preizkušane 
snovi se lahko dajejo tudi v razdeljenem odmerku, to pomeni dva vnosa v istem dnevu, ne ve č kakor nekaj ur narazen, da se olajša 
dajanje velikega volumna materiala. 
Preizkus se lahko izvede na dva na čina: 
(a) živali se s snovjo tretirajo enkrat. Vzorci kostnega mozga se 
odvzamejo vsaj dvakrat, vsaj 24 ur po tretiranju in najpozneje 
48 ur po tretiranju, z ustreznimi intervali med vzor čenji. Vzor ­ 
čenje manj kakor 24 ur po tretiranju naj se utemelji. Vzorci 
periferne krvi se odvzamejo vsaj dvakrat, vsaj 36 ur po tretiranju in najpozneje 72 ur po tretiranju, z ustreznimi intervali med 
vzorčenji. Ko se pri posameznem vzor čenju opazi pozitivni 
odziv, dodatno vzor čenje ni potrebno;
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 330
 
(b) če se opravita dva dnevna vnosa ali ve č (npr. dva vnosa ali ve č v 
24-urnih intervalih), se vzorci odvzamejo enkrat med 18. in 24. 
uro po zadnjem vnosu pri kostnem mozgu in enkrat med 36. in 48. uro po zadnjem vnosu pri periferni krvi (12). 
Lahko se vzamejo dodatni vzorci ob drugih časih, kadar je to 
primerno.
 
1.5.3  Velikost odmerkov  
Če se opravi študija za ugotavljanje obmo čja, ker ni na voljo 
ustreznih podatkov, naj se opravi v istem laboratoriju, na isti vrsti, sevu in spolu ob enakem režimu tretiranja, kakor bo to uporabljeno v 
glavni študiji (13). Če toksičnost je, se za prvo vzor čenje uporabijo 
tri velikosti odmerkov. Te velikosti odmerkov naj zajamejo obmo čje 
od največje toksičnosti do majhne toksi čnosti ali netoksi čnosti. Pri 
poznejšem vzor čenju se lahko uporabi le najve čji odmerek. Najve čji 
odmerek je opredeljen kot odmerek, ki povzro či takšne znake toksi ­ 
čnosti, na podlagi katerih je pri čakovati, da bi ve čji odmerki pri 
istem režimu odmerjanja povzro čili smrt. Snovi s specifi čnim biolo ­ 
škim delovanjem pri majhnih netoksi čnih odmerkih (na primer 
hormoni in mitogeni) so lahko izjeme pri merilih za dolo čanje 
odmerka in naj se ovrednotijo za vsak primer posebej. Najve čji 
odmerek se lahko opredeli tudi kot odmerek, ki povzro či nekaj 
znakov toksi čnosti v kostnem mozgu (npr. zmanjšanje deleža 
nezrelih eritrocitov med vsemi eritrociti v kostnem mozgu ali peri ­
ferni krvi).
 
1.5.4  Mejni preizkus  
Če preizkus pri eni velikosti odmerka vsaj 2 000 mg/kg telesne teže, 
ki se da v enem vnosu ali dveh vnosih v istem dnevu, ne povzro či 
nobenih opaznih toksi čnih učinkov in če se na podlagi podatkov o 
strukturno sorodnih snoveh ne pri čakuje, da bo snov genotksi čna, se 
lahko pojmuje, da popolna študija z uporabo treh velikosti odmerkov 
ni potrebna. Mejni odmerek za dolgotrajnejše študije je 2 000 mg/kg telesne teže/dan za tretiranje do 14 dni in 1 000 mg/kg telesne teže/dan za tretiranje, daljše od 14 dni. Pri čakovana izpostavljenost 
človeka lahko nakaže potrebo po ve čjih odmerkih pri mejnem 
preizkusu.
 
1.5.5  Dajanje odmerkov  
Navadno se preizkušana snov daje z gavažo po želod čni cevki ali 
ustrezni intubacijski kanili ali z intraperitonealno injekcijo. Sprejem ­
ljivi so tudi drugi na čini izpostavljanja, kadar se lahko utemeljijo. 
Največji volumen teko čine, ki se lahko naenkrat da z gavažo ali 
injekcijo, je odvisen od velikosti preizkusne živali. Volumen naj 
ne presega 2 ml/100 g telesne teže. Uporabo ve čjih volumnov je 
treba utemeljiti. Razen pri dražilnih ali jedkih snoveh, ki bodo pri večjih koncentracijah navadno povzro čile dražilne u činke, naj se s 
prilagoditvijo koncentracije čimbolj zmanjša spremenljivost preizkus ­
nega volumna, tako da se zagotovi stalni volumen pri vseh velikostih 
odmerkov.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 331
 
1.5.6  Priprava kostnega mozga/krvi  
Celice kostnega mozga se navadno odvzamejo iz stegnenic ali golenic 
takoj po žrtvovanju. Navadno se celice odstranijo iz stegnenic ali gole ­
nic, se preparirajo in obarvajo z uporabo uveljavljenih metod. Periferna 
kri se odvzame iz repne vene ali druge primerne krvne žile. Krvne 
celice se takoj supravitalno obarvajo (8) (9) (10) ali pa se pripravijo razmazi, ki se nato obarvajo. Uporaba DNA-specifi čnega barvila (npr. 
akridin oranž (14) ali Hoechst 33258 plus pyronin-Y (15)) lahko 
prepreči nastanek nekaterih artefaktov, povezanih z uporabo barvila, 
ki ni specifi čno za DNA. Ta prednost ne prepre čuje uporabe splošno 
uporabljenih barvil (npr. Giemsa). Lahko se uporabijo tudi dodatni 
sistemi (npr. celulozne kolone za odstranitev celic z jedri (16)), pod 
pogojem, daje bilo dokazano, da ti sistemi zadovoljivo delujejo pri pripravi mikronukleusov v laboratoriju.
 
1.5.7  Analiza  
Za vsako žival se dolo či delež nezrelih med vsemi (nezrelimi + zrelimi) 
eritrociti, tako da se prešteje skupaj vsaj 200 eritrocitov pri kostnem mozgu in 1 000 eritrocitov pri periferni krvi (17). Vsi preparati, skupaj s pozitivnimi in negativnimi kontrolnimi vzorci, naj se pred mikro ­
skopsko analizo neodvisno kodirajo. V dolo čanje incidence nezrelih 
eritrocitov z mikronukleusi se vklju či vsaj 2 000 nezrelih eritrocitov na 
žival. Dodatne informacije se lahko pridobijo s štetjem zrelih eritro ­
citov z mikronukleusi. Pri analizi mikroskopskih preparatov naj delež 
nezrelih eritrocitov med vsemi eritrociti ne bo manjši od 20 % 
kontrolne vrednosti. Kadar se živali tretirajo nepretrgano štiri tedne ali več, se lahko dolo či tudi incidenca mikronukleusov v vsaj 2 000 
zrelih eritrocitih na žival. Sistemi za avtomatizirano analizo (slikovna 
analiza in preto čna citometri čna analiza celi čnih suspenzij) so sprejem ­
ljiva alternativa ro čnemu dolo čanju, če so ustrezno utemeljeni in vali ­
dirani.
 
2. PODATKI  
2.1 OBDELAVA REZULTATOV 
Podatki za posamezne živali naj bodo prikazani v tabelah. Poskusna 
enota je žival. Za vsako analizirano žival posebej naj se navedejo število štetih nezrelih eritrocitov, število nezrelih eritrocitov z mikro ­
nukleusi in število nezrelih med vsemi eritrociti. Kadar se živali 
tretirajo nepretrgano štiri tedne ali ve č, se navedejo tudi podatki o 
zrelih eritrocitih, če so bili zbrani. Za vsako žival se navede delež 
nezrelih med vsemi eritrociti, in če je to primerno, odstotek eritro ­
citov z mikronukleusi. Če ni dokaza za razliko v odzivu med 
spoloma, se pri statisti čni analizi lahko združijo podatki za oba spola.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 332
 
2.2 VREDNOTENJE IN INTERPRETACIJA REZULTATOV 
Pozitivni rezultat se lahko dolo či na podlagi številnih meril, kakor je 
na primer z odmerkom povezano pove čanje števila celic z mikronu ­
kleusi ali jasno pove čanje števila celic z mikronukleusi v posamezni 
tretirani skupini ob posameznem vzor čenju. Najprej naj se preu či 
biološka pomembnost rezultatov. Pri vrednotenju rezultatov preizkusa se kot pomo č lahko uporabijo statisti čne metode (18) 
(19). Statisti čna značilnost naj ne bo edini odlo čilni dejavnik za 
pozitivni odziv. Dvoumni rezultati naj se razjasnijo z dodatnimi 
preizkusi, po možnosti ob prilagojenih poskusnih pogojih. 
Pojmuje se, da preizkušana snov, pri kateri rezultati ne izpolnjujejo 
navedenih meril, ni mutagena v tem preizkusu. 
Čeprav bo ve čina poskusov dala jasne pozitivne ali negativne rezul ­
tate, bodo v redkih primerih dobljeni podatki prepre čili zanesljivo 
oceno o delovanju preizkušane snovi. Rezultati lahko ostanejo dvoumni ali dvomljivi ne glede na število ponovitev poskusa. 
Pozitivni rezultati preizkusa mikronukleusov pomenijo, da snov 
povzroča nastanek mikronukleusov, ki so posledica poškodb kromo ­
somov ali mitoti čnega aparata v eritroblastih preizkusne vrste. Nega ­
tivni rezultati pomenijo, da preizkušana snov pri preizkusnih pogojih ne povzro ča nastanka mikronukelusov v nezrelih eritrocitih 
preizkusne vrste. 
Obravnava naj se verjetnost, da preizkušana snov ali njeni metaboliti 
dosežejo krvni obtok ali posebej tar čno tkivo (npr. sistemska toksi ­ 
čnost).
 
3. PORO ČANJE  
POROČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preizkusu naj vsebuje naslednje informacije: 
Topilo/nosilec: — utemeljitev izbire nosilca, — topnost in stabilnost preizkušane snovi v topilu/nosilcu, če sta 
znani, 
Preizkusne živali: 
— uporabljena vrsta/sev, — število, starost in spol živali, — vir, pogoji bivanja, prehrana itd., — teža posameznih živali na za četku preizkusa, skupaj z obmo čjem 
telesne teže, srednjo vrednostjo in standardnim odklonom za vsako skupino. 
Preizkusni pogoji: 
— podatki o pozitivnih in negativnih (nosilec/topilo) kontrolnih 
vzorcih, 
— podatki študij e za ugotavljanje obmo čja, če je bila opravljena,
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 333
 
— razlogi za izbiro velikosti odmerka, 
— podrobnosti o pripravi preizkušane snovi, — podrobnosti o dajanju preizkušane snovi, 
— razlogi za na čin dajanja, 
— metode za preverjanje, ali je preizkušana snov dosegla krvni 
obtok ali tar čno tkivo, če je to primerno, 
— način preračunavanja koncentracije preizkušane snovi v hrani/ 
pitni vodi (ppm) v dejanski odmerek (mg/kg telesne teže/dan), 
če je to primerno, 
— podrobnosti o kakovosti hrane in vode, 
— podroben opis programov tretiranja in vzor čenja, 
— metode priprave mikroskopskih preparatov, — metode merjenja toksi čnosti, 
— merila za štetje nezrelih eritrocitov z mikronukleusi, 
— število analiziranih celic na žival, — merila za dolo čitev, ali je študija pozitivna, negativna ali 
dvoumna. 
Rezultati: — znaki toksi čnosti, 
— delež nezrelih eritrocitov med vsemi eritrociti, 
— število nezrelih eritrocitov z mikronukleusi, navedeno za vsako 
žival posebej, 
— srednja vrednost ± standardni odklon nezrelih eritrocitov z mikro ­
nukleusi na skupino, 
— odvisnost med odmerkom in odzivom, kadar je to mogo če, 
— uporabljene statisti čne analize in metode, 
— podatki o so časni in pretekli negativni kontroli, 
— podatki o so časni pozitivni kontroli. 
— Diskusija rezultatov. — Sklepi.
 
4. LITERATURA  
(1) Heddle, J. A. (1973), A Rapid In Vivo Test for Chromosomal 
Damage, Mutation Res., 18, str. 187–190. 
(2) Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, 
str. 9–15. 
(3) Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., 
Mavournin, K., MacGregor, J. G., in Newell, G. W. (1983), 
The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mutation Res. 123, str. 61–118. 
(4) Mavournin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C, Salamone, 
M. F., in Heddle, J. A. (1990), The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A 
report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox 
Program, Mutation Res., 239, str. 29–80.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 334
 
(5) MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N., in Wehr, C. M. 
(1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid 
Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, v: Developments in Science and Practice of Toxicology, izd. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. Miya. 
Elsevier, Amsterdam, str. 555–558. 
(6) MacGregor, J. T., Heddle, J. A. Hite, M., Margolin, G. H., 
Ramel, C, Salamone, M. F., Tice, R. R., in Wild, D. (1987), 
Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189, 
str. 103–112. 
(7) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R., in Shelby, M. 
E. (1990), The in Vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measu ­
rement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol. 14, str. 513–522. 
(8) Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofumi, T., in Ishidate, 
M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral 
Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutation Res., 245, str. 245–249. 
(9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Eryt ­
hrocytes by Acridime Orange Supravital Staining: The 
Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/ JEMMS, MMS, Mutation Res., 278, str. 83–98. 
(10) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis 
Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) 
(1995), Protocol recommended for the short-term mouse perip ­
heral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, str. 53–159. 
(11) Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., 
Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacc ­
hicrotti, F., Romagna, F., Shimada, H. Sutou, S., in Vannier, 
B. (1994), in Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, Mutation Res., 312, str. 293–304. 
(12) Higashikuni, N., in Sutou, S. (1995), An optimal, generalised 
sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse 
peripheral micronucleus test, Mutagenesis, 10, str. 313–319. 
(13) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, 
J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G, Hodson-Walker, G, Morton, D. B., Kirkland, D. J., in Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen 
Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity 
Assays, Mutagenesis, 7, str. 313–319. 
(14) Hayashi, M., Sofumi, T., in Ishidate, M. Jr. (1983), An Appli ­
cation of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micro ­
nucleus Test, Mutation Res., 120, str. 241–247. 
(15) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., in Langlois, R. G. (1983), A 
Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and 
RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyromin Y, Mutation Res., 120, str. 269–275. 
(16) Romagna, F., in Staniforth, C. D. (1989), The automated bone 
marrow micronucleus test, Mutation Res., 213, str. 91–104. 
(17) Gollapudi, B., in McFadden, L. G. (1995), Sample size for the 
estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte 
ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 
347, str. 97–99.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 335
 
(18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, 
D. G., in Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetics Assay, 
v: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests, UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guide ­
lines for Mutagenicity Testing. Poro čilo, del 1, pregledan, 
Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port 
Chester, Melbourne, Sydney, str. 115–141. 
(19) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G E., 
Clare, G., Ferguson R., Richold, M., Papworth, D. G., in Savage, J. R. K. (1989), Staticical Analysis of In Vivo Cyto ­
genetic Assays, in: D. J. Kirkland (izd.), Statistical Evaluation 
of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guide ­
lines for Mutagenicity Testing. Poro čilo, del III, Cambridge 
University Press, Cambridge, New York, Port Chester, 
Melbourne, Sydney, str. 184–232.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 336
 
B.13/14  MUTAGENOST: PREIZKUS POVRATNE MUTACIJE PRI 
BAKTERIJAH  
1. METODA  
Ta metoda ustreza metodi OECD TG 471, Bacterial Reverse Muta ­
tion Test (1997).  
1.1 UVOD 
Pri preizkusu bakterijskih povratnih mutacij se sevi vrst  Salmonella 
typhimurium  in Escherichia coli,  ki potrebujejo aminokisline, upora ­
bljajo za odkrivanje to čkovnih mutacij, ki vklju čujejo substitucijo, 
adicijo ali delecijo enega ali nekaj baznih parov DNA (1) (2) (3). Princip tega preizkusa bakterijskih povratnih mutacij je, da zazna muta ­
cije, ki obrnejo mutacije v preizkusnih sevih in obnovijo funkcionalno 
sposobnost bakterij za sintezo osnovne aminokisline. Povratno muti ­
rane bakterije se zaznajo po sposobnosti rasti v odsotnosti aminoki ­
sline, ki jo starševski preizkusni sev potrebuje. 
Točkovne mutacije so vzrok številnih genskih bolezni pri človeku in 
obstajajo tehtni dokazi, da so to čkovne mutacije onkogenov in 
genov, zaviralcev rasti tumorjev somatskih celic, povezane z 
nastankom tumorjev pri človeku in poskusnih živalih. Preizkus 
bakterijskih povratnih mutacij je hiter, poceni in relativno lahko izvedljiv. Mnogi preizkusni sevi imajo ve č značilnosti, zaradi katerih 
so občutljivejši za zaznavanje mutacij, vklju čno z odzivnimi zapo ­
redji DNA na mestih povratnih mutacij, pove čano prepustnostjo 
celice za velike molekule in odstranitvijo DNA-popravljalnih mehan ­
izmov ali okrepitvijo procesov popravljanja DNA, podvrženega 
napakam. Specifi čnost preizkusnih sevov lahko da koristne informa ­
cije o vrstah mutacij, ki jih povzro čijo genotoksi čne snovi. Na voljo 
je obsežna baza rezultatov za preizkuse bakterijskih povratnih mutacij za številne strukture in razvite so bile dobro uveljavljene 
metodologije za preizkušanje kemikalij z razli čnimi fizikalno-kemij ­
skimi lastnostmi, vklju čno s hlapnimi spojinami. 
Glej tudi splošni uvod dela B.
 
1.2 DEFINICIJE  
Preizkus povratnih mutacij  pri vrsti  Salmonella typhimurium  ali 
Escherichia coli  zazna mutacijo pri sevu, ki potrebuje aminokislino 
(histidin oziroma triptofan), s katero nastane sev, neodvisen od zunanje oskrbe z aminokislino.  
Mutageni substitucije baznih parov  so snovi, ki povzro čijo zame­
njavo baz v DNA. Pri preizkusu povratne mutacije takšna zamenjava lahko nastane na mestu izvirne mutacije ali na drugem mestu bakte ­
rijskega genoma.  
Mutageni premika bralnega okvira  so snovi, ki povzro čijo adicijo 
ali delecijo enega ali ve č baznih parov DNA in tako spremenijo 
bralni okvir RNA.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 337
 
1.3 ZA ČETNI PREUDARKI 
Pri preizkusu bakterijskih povratnih mutacij se uporabljajo proka ­
riontske celice, ki se od sesalskih razlikujejo v lastnostih, kakor so sprejemanje, presnova, kromsomska struktura in procesi popravljanja 
DNA. Za preizkuse, opravljene  in vitro,  so navadno potrebni zunanji 
viri aktivacije presnove. Sistemi aktivacije presnove  in vitro  ne 
morejo povsem posnemati razmer  in vivo  pri sesalcih. Preizkus 
torej ne daje neposrednih informacij o mutagenosti in rakotvornosti 
snovi pri sesalcih. 
Preizkus bakterijskih povratnih mutacij se splošno uporablja kot 
začetno presejanje za odkrivanje genotoksi čnega delovanja in zlasti 
delovanja, ki povzro či točkovne mutacije. Obsežna baza podatkov je 
pokazala, da mnoge kemikalije, ki pri tem preizkusu dajo pozitivni rezultat, kažejo mutageno delovanje tudi pri drugih preizkusih. 
Obstajajo primeri mutagenov, ki jih ta preizkus ne zazna; razlogi 
za te pomanjkljivosti se lahko pripišejo posebni naravi zaznane končne točke, razlikam v aktivaciji presnove ali razlikam v biološki 
razpoložljivosti. Po drugi strani pa lahko dejavniki, ki pove čajo 
občutljivost preizkusa bakterijskih povratnih mutacij, privedejo do 
precenitve mutagenega delovanja. 
Preizkus bakterijskih povratnih mutacij morda ne bo primeren za 
ocenjevanje nekaterih skupin nevarnih kemikalij, na primer mo čno 
baktericidnih spojin (npr. nekaterih antibiotikov) in tistih, za katere se domneva (ali ve), da motijo sistem podvojevanja prav v sesalskih 
celicah (npr. nekateri inhibitorji topoizomeraze in nekateri nukleo ­
zidni analogi). Pri takšnih primerih bi bili lahko bolj primerni preizkusi mutacij pri sesalcih. 
Čeprav so mnoge spojine, pri katerih je rezultat tega preizkusa pozi ­
tiven, rakotvorne snovi za sesalce, soodvisnost ni absolutna. Odvisna je od skupine nevarnosti kemikalije in obstajajo rakotvorne snovi, ki 
jih ta preizkus ne zazna, ker delujejo prek drugih mehanizmov, ki 
niso genotoksi čni, ali mehanizmov, ki jih v bakterijskih celicah ni.
 
1.4 PRINCIP PREIZKUSNE METODE 
Suspenzije bakterijskih celic se izpostavijo preizkušam snovi ob 
navzočnosti in ob odsotnosti zunanjega sistema za aktivacijo pres ­
nove. Pri metodi vklju čitve v ploš čo se te suspenzije zmešajo s 
poltrdim gojiš čem in takoj razlijejo po minimalnem gojiš ču. Pri 
metodi poprejšnje inkubacije se obdelovalna zmes inkubira in nato 
zmeša s poltrdim gojiš čem pred nanosom na minimalno gojiš če. Pri 
obeh tehnikah se po dveh ali treh dneh inkubacije preštejejo kolonije povratnih mutant in primerjajo s številom kolonij spontanih povra ­
tnih mutant na kontrolnih ploš čah s topilom. 
Opisanih je nekaj postopkov za izvedbo preizkusa bakterijskih 
povratnih mutacij. Med splošno uporabljanimi so metoda vklju čitve 
v ploščo (1) (2) (3) (4), metoda poprejšnje inkubacije (2) (3) (5) (6) 
(7) (8), fluktuacijska metoda (9) (10) in suspenzijska metoda (11). 
Opisane so tudi prilagoditve za preizkušanje plinov ali hlapov (12).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 338
 
Postopki, opisani v metodi, veljajo predvsem za metodo vklju čitve v 
ploščo in metodo poprejšnje inkubacije. Obe sta sprejemljivi za 
izvajanje preizkusa ob aktivaciji presnove in brez nje. Nekatere snovi se lahko u činkoviteje zaznajo z metodo poprejšnje inkubacije. 
Te snovi sodijo v skupine nevarnih kemikalij, ki vklju čujejo kratko ­
verižne alifatske nitrozamine, dvovalentne kovine, aldehide, azo 
barvila in diazo spojine, pirolizidinske alkaloide ter alil in nitro spojine (3). Priznano je tudi, da se pri uporabi standardnih postop ­
kov, kakor sta metoda vklju čitve v ploš čo ali metoda poprejšnje 
inkubacije, nekatere skupine mutagenov ne zaznajo vedno. Ti naj 
se obravnavajo kot „posebni primeri“ in mo čno se priporo ča, da se 
za njihovo zaznavanje uporabijo nadomestni postopki. Dolo čijo se 
lahko naslednji „posebni primeri“ (skupaj s primeri postopkov, ki bi 
se lahko uporabili za njihovo zaznavanje): azo barvila in diazo 
spojine (3) (5) (6) (13), plini in hlapne kemikalije (12) (14) (15) (16) ter glikozidi (17) (18). Odstopanje od standardnega postopka je treba znanstveno utemeljiti.
 
1.5 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.5.1  Priprave  
1.5.1.1.  Bakterije  
Sveže kulture bakterij se vzgojijo do pozne logaritemske faze ali 
zgodnje stacionarne faze rasti (približno 109 celic na ml). Kulture 
v pozni stacionarni fazi naj se ne uporabljajo. Kulture, ki se upora ­
bijo v preizkusu, morajo obvezno imeti velik delež živih bakterij. Delež se lahko dokaže na podlagi podatkov o rastnih krivuljah iz 
preteklih kontrol ali pri vsakem preizkusu z dolo čitvijo števila živih 
celic s štetjem na ploš či. 
Priporočena temperatura inkubacije je 37
 o C. 
Uporabi naj se vsaj pet sevov bakterij. Ti naj vklju čujejo štiri seve 
vrste  S. typhimurium  (TA 1535; TA 1537 ali TA97a ali TA97; TA98 
in TA100), za katere je bilo dokazano, da so zanesljivi in dajejo ponovljive rezultate med laboratoriji. Ti štirje sevi vrste  S. typhimu ­
rium  imajo na primarnem mestu povratne mutacije bazne pare GC in 
znana je možnost, da ne zaznajo nekaterih oksidirajo čih mutagenov, 
prečnih povezovalcev in hidrazinov. Takšne snovi lahko zaznajo sevi  
E. coli  WP2 ali  S. typhimurium  TA102 (19), ki imajo na primarnem 
mestu povratne mutacije bazni par AT. Priporo čena kombinacija 
sevov je torej: 
— S. typhimurium  TA1535 in 
— S. typhimurium  TA1537 ali TA97 ali TA97a in 
— S. typhimurium  TA98 in 
— S. typhimurium  TA100 in 
— E. coli  WP2 uvrA, ali  E. coli  WP2 uvrA (pKM101), ali  S. 
typhimurium  TA102. 
Da bi se zaznali pre čno povezovalni mutageni, bi bilo morda bolj 
primerno vklju čiti TA102 ali dodati sev  E. coli,  zmožen popravljanja 
DNA [npr.  E. coli  WP2 ali  E. coli  WP2 (pKM101)].
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 339
 
Uporabljajo naj se uveljavljeni postopki za pripravo založne kulture, 
preverjanje ozna čevalcev in shranjevanje. Potreba po aminokislinah 
za rast naj se dokaže za vsak pripravek zamrznjene založne kulture (histidin za seve  S. typhimurium  in triptofan za seve  E. coli).  
Podobno naj se preverijo druge fenotipske zna čilnosti, namre č: 
navzočnost ali odsotnost R-plazmidov, kadar je to primerno [tj. 
odpornost proti ampicilinu pri sevih TA98, TA100 in TA97a ali TA97, WP2 uvrA in WP2 uvrA (pKM101), in odpornost proti ampicilinu + tetraciklinu pri sevu TA 102G; navzo čnost značilnih 
mutacij (tj. mutacije rfa pri  S. typhimurium  prek občutljivosti za kri 
stal vijoli čno in mutacije uvrA pri  E. coli  ali mutacije uvrB pri  S. 
typhimurium  prek ob čutljivosti za ultravijoli čno svetlobo) (2) (3). 
Število kolonij spontanih povratnih mutant pri sevih naj bo v 
območjih pogostnosti, pri čakovanih glede na pretekle kontrolne 
podatke laboratorija, in po možnosti v obmo čju, navedenem 
v literaturi.
 
1.5.1.2  Gojiš če 
Uporabljata se ustrezno minimalno gojiš če (ki vsebuje npr. mini ­
malno gojiš če E po Vogel-Bonnerju in glukozo) in poltrdo gojiš če, 
ki vsebuje histidin in biotin ali triptofan, da se omogo či nekaj delitev 
celic (1) (2) (9).  
1.5.1.3  Aktivacija presnove  
Bakterije naj se izpostavijo preizkušam snovi ob navzo čnosti in ob 
odsotnosti ustreznega sistema za aktivacijo presnove. Najpogosteje uporabljani sistem je postmitohondrijska frakcija z dodanim kofak ­
torjem (S9), pripravljena iz jeter glodavcev, ki so bila obdelana s 
sredstvi za encimsko indukcijo, kakor je Aroclor 1254 (1) (2), ali z 
zmesjo fenobarbitona in β-naftoflavona (18) (20) (21). Postmitohon ­
drij ska frakcija se navadno uporablja v koncentracijah od 5 do 30 % v/v v zmesi S9. Izbira in stanje sistema za aktivacijo presnove sta 
lahko odvisna od skupine nevarnosti preizkušane kemikalije. V časih 
je primerno uporabiti ve č kakor eno koncentracijo postmitohon ­
drijske frakcije. Pri azo barvilih in diazo spojinah bo morda bolj primerno uporabiti redukcijski sistem aktivacije presnove (6) (13).
 
1.5.1.4  Preizkušana snov/priprava  
Trdne preizkušane snovi naj se pred obdelavo bakterij raztopijo ali 
suspendirajo v ustreznih topilih ali nosilcih, in če je to primerno, se 
razredčijo. Teko če preizkušane snovi se lahko dodajo neposredno v 
preizkusni sistem in/ali se pred obdelavo razred čijo. Uporabljajo naj 
se sveže pripravljene preizkušane snovi, razen če podatki 
o stabilnosti kažejo, da je shranjevanje sprejemljivo. 
Topilo/nosilec naj ne vzbuja suma, da kemi čno reagira s preizkušano 
snovjo, in naj bo združljivo s preživetjem bakterij in delovanjem S9 (22). 
Če se uporabijo manj poznana topila/nosilci, naj njihovo vklju čitev 
podpirajo podatki, ki kažejo na njihovo združljivost. Priporo ča se, da 
se, kadar koli je to mogo če, kot prva možnost preu či uporaba vodnega 
topila/nosilca. Kadar se preizkušajo v vodi nestabilne snovi, naj se 
uporabijo brezvodna organska topila.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 340
 
1.5.2  Preizkusni pogoji  
1.5.2.1  Preizkusni sevi (glej 1.5.1.1)  
1.5.2.2  Koncentracije izpostavljenosti  
Med merili, ki jih je treba upoštevati pri dolo čanju najve čje upora­
bljene koli čine preizkušane snovi, so citotoksi čnost in topnost v 
končni obdelovalni zmesi. 
Lahko je koristno, če se toksi čnost in netopnost dolo čita v poprejš ­
njem poskusu. Citotoksi čnost se lahko zazna prek zmanjšanja števila 
kolonij povratnih mutant, čistine na bakterijskem ozadju ali zmanj ­ 
šanja bakterijskega ozadja ali stopnje preživetja obdelanih kultur. Citotoksičnost snovi se lahko spremeni ob navzo čnosti sistemov za 
aktivacijo presnove. Netopnost naj se oceni kot oborina v kon čni 
zmesi pri dejanskih pogojih preizkusa in naj bo vidna s prostim očesom. 
Priporočena najve čja preizkusna koncentracija za topne necitotok ­
sične snovi je 5 mg/ploš čo ali 5 μl/ploščo. Pri necitotoksi čnih 
snoveh, ki niso topne pri koncentracijah 5 mg/ploš čo ali 5 μl/ploščo, 
naj bo ena ali ve č preizkušenih koncentracij netopnih v kon čni obde­
lovalni zmesi. Preizkušane snovi, ki so citotoksi čne že pri koncen ­
tracijah, manjših od 5 mg/ploš čo ali 5 ul/ploš čo, naj se preizkušajo 
do citotoksi čne koncentracije. Oborina ne sme vplivati na štetje. 
Uporabi naj se vsaj pet razli čnih koncentracij preizkušane snovi, ki 
jih je mogo če analizirati, z intervalom približno pol log (tj. √10) med 
preizkusnimi to čkami pri za četnem poskusu. Primerni so lahko 
manjši intervali, kadar se raziskuje odvisnost med koncentracijo in 
odzivom. Lahko se izvedejo preizkusi s koncentracijami, ve čjimi od 
5 mg/ploš čo ali 5 μl/ploščo, kadar se ocenjujejo snovi, ki vsebujejo 
znatne koli čine potencialno mutagenih ne čistot.  
1.5.2.3  Negativni in pozitivni kontrolni vzorci  
V vsak preizkus naj se vklju čijo sočasni pozitivni in negativni (topilo 
ali nosilec) kontrolni vzorci, specifi čni za sev, ob aktivaciji presnove 
in brez nje. Izberejo naj se koncentracije pozitivne kontrole, ki doka ­
zujejo učinkovito izvedbo vsakega preizkusa. 
Pri preizkusih, pri katerih se uporabi sistem aktivacije presnove, naj 
se referen čna(-e) snov(-i) pozitivne kontrole izbere(-jo) na podlagi 
vrste uporabljenih bakterijskih sevov. 
Naslednje snovi so primeri ustreznih snovi pozitivne kontrole za 
preizkuse z aktivacijo presnove:  
Št. CAS Št. Einecs Snovi  
781-43-1 212-308-4 9,10-dimetilantracen 
57-97-6 200-359-5 7,12-dimetilbenzo(a) antracen 
50-32-8 200-028-5 benzo[a]piren 
613-13-8 210-330-9 2-aminoantracen  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 341
 
Št. CAS Št. Einecs Snovi  
50-18-0 ciklofosfamid 
6055-19-2 200-015-4 ciklofosfamid monohidrat 
Naslednja snov je ustrezna snov pozitivne kontrole za metodo reduk ­
cijske aktivacije presnove:  
Št. CAS Št. Einecs Snovi  
573-58-0 209-358-4 Kongo rde če 
2-aminoantracen naj se ne uporablja kot edini kazalec u činkovitosti 
zmesi S9. Če se uporabi 2-aminoantracen, naj bo tudi za vsako serijo 
S9 značilen mutagen, ki potrebuje aktivacijo presnove z mikrosom ­
skimi encimi, npr. benzo[a]piren, dimetilbenzo antracen. 
Naslednje snovi so primeri snovi pozitivne kontrole za posamezne 
seve, za preizkuse, izvedene brez zunanjega sistema aktivacije pres ­
nove:  
Št. CAS Št. Einecs Snovi Sev  
26628-22-8 247-852-1 natrijev azid TA 1535 in TA 100 
607-57-8 210-138-5 2-nitrofluoren TA 98 
90-45-9 201-995-6 9-aminoakridin TA 1537, TA 97 in TA 97a 
17070-45-0 241-129-4 ICR 191 TA 1537, TA 97 in TA 97a 
80-15-9 201-254-7 kumol hidroperoksid TA 102 
50-07-7 200-008-6 mitomicin C WP2 uvrA in TAl 02 70-25-7 200-730-1 N-metil-N-nitro-N-nitrozogva ­
nidin WP2, WP2uvrA in 
WP2uvrA(pK M101) 
56-57-5 200-281-1 4-nitrokinolin-1-oksid WP2, WP2uvrA in 
WP2uvrA(pK M101) 
3688-53-7 furilfuramid (AF2) sevi s plazmidi 
Lahko se uporabijo druge ustrezne referen čne snovi pozitivne 
kontrole. Uporabijo naj se kemikalije pozitivne kontrole, ki sodijo 
v isto skupino nevarnosti kakor preizkušana kemikalija, kadar so na 
voljo. 
Vključijo naj se negativni kontrolni vzorci, ki jih sestavlja le topilo 
ali nosilec brez preizkušane snovi, obdelani na enak na čin kakor 
obdelovalne skupine. Uporabijo se tudi neobdelani kontrolni vzorci, 
razen če pretekli kontrolni podatki dokazujejo, da izbrano topilo ne 
povzroča škodljivih ali mutagenih u činkov.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 342
 
1.5.3  Postopek  
Pri metodi vklju čitve v ploš čo (1) (2) (3) (4) brez aktivacije presnove 
se navadno 0,05 ml ali 0,1 ml preizkušane raztopine, 0,1 ml sveže bakterijske kulture (ki vsebuje približno 108 živih celic) in 0,5 ml 
sterilnega pufra zmeša z 2,0 ml poltrdega gojiš ča. Pri preizkusu z 
aktivacijo presnove se navadno 0,5 ml zmesi za aktivacijo presnove, ki vsebuje ustrezno koli čino postmitohondrijske frakcije (v obmo čju 
od 5 do 30 % v/v v zmesi za aktivacijo presnove), zmeša s poltrdim 
gojiščem (2,0 ml) skupaj z bakterijami in preizkušano snovjo/razto ­
pino. Vsebina vsake epruvete se premeša in razlije po površini plošče minimalnega gojiš ča. Pred inkubacijo naj se poltrdo gojiš če 
strdi. 
Pri metodi poprejšnje inkubacije (2) (3) (5) (6) se preizkušana snov/ 
raztopina inkubira skupaj s preizkusnim sevom (ki vsebuje približno 
108 živih celic) in sterilnim pufrom ali sistemom za aktivacijo pres ­
nove (0,5 ml), navadno 20 minut ali ve č pri 30–37
 o C, preden se 
zmeša s poltrdim gojiš čem in razlije na površino ploš če minimalnega 
gojišča. Navadno se 0,05 ali 0,1 ml preizkušane snovi/raztopine, 0,1 
ml bakterij in 0,5 ml zmesi S9 ali sterilnega pufra zmeša z 2,0 ml 
poltrdega gojiš ča. Epruvete se med inkubacijo prezra čujejo 
s stresalnikom. 
Za ustrezno oceno nihanja naj se za vsako velikost odmerka upora ­
bijo tri ploš če. Uporaba dveh ploš č je sprejemljiva, kadar je znan ­
stveno utemeljena. Ob časna izguba ploš če ne pomeni nujno neve ­
ljavnega preizkusa. 
Plinaste ali hlapne snovi naj se preizkušajo z ustreznimi metodami, 
na primer v zatesnjenih posodah (12) (14) (15) (16).  
1.5.4  Inkubacija  
Vse plošče posameznega preizkusa naj se inkubirajo 48-72 ur pri 
37 o C. Po inkubaciji se dolo či število kolonij povratnih mutant na 
ploščo. 
2. PODATKI  
2.1 OBDELAVA REZULTATOV 
Podatki se prikažejo kot število kolonij povratnih mutant na ploš čo. 
Navede se tudi število kolonij povratnih mutant na ploš čah negativne 
(kontrolni vzorec s topilom in neobdelani kontrolni vzorec, če se 
uporabi) in pozitivne kontrole. Navedejo se število na posameznih 
ploščah, srednja vrednost števila kolonij povratnih mutant na ploš čo 
in standardni odklon za preizkušano snov ter pozitivne in negativne (neobdelane in/ali s topilom) vzorce. 
Preverjanje jasnega pozitivnega odziva ni potrebno. Dvoumni rezul ­
tati naj se razjasnijo z dodatnimi preizkusi, po možnosti ob prilago ­
jenih poskusnih pogojih. Negativne rezultate je treba potrditi za vsak primer posebej. Kadar se pojmuje, da potrditev negativnih rezultatov 
ni potrebna, naj se to utemelji. V nadaljnjih poskusih naj se preu či 
možnost prilagoditve preizkusnih parametrov, da se razširi obmo čje 
analiziranih pogojev. Preizkusni parametri, ki bi se lahko prilagodili, vključujejo intervale med koncentracijami, metodo obdelave (vklju ­ 
čitev v ploš čo ali poprejšnja inkubacija v suspenziji) in pogoje akti ­
vacije presnove.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 343
 
2.2 VREDNOTENJE IN INTERPRETACIJA REZULTATOV 
Pozitivni rezultat se lahko dolo či na podlagi številnih meril, kakor 
sta na primer s koncentracijo povezano pove čanje v preizkušanem 
območju in/ali ponovljivo pove čanje števila kolonij povratnih mutant 
na ploščo pri eni ali ve č koncentracijah pri vsaj enem sevu s 
sistemom za aktivacijo presnove ali brez njega (23). Najprej naj se preuči biološka pomembnost rezultatov. Pri vrednotenju rezultatov 
preizkusa se kot pomo č lahko uporabijo statisti čne metode (24). 
Vendar pa naj statisti čna značilnost ne bo edini odlo čilni dejavnik 
za pozitivni odziv. 
Pojmuje se, da preizkušana snov, pri kateri rezultati ne izpolnjujejo 
navedenih meril, ni mutagena v tem preizkusu. 
Čeprav bo ve čina poskusov dala jasne pozitivne ali negativne rezul ­
tate, bodo v redkih primerih dobljeni podatki prepre čili zanesljivo 
oceno o delovanju preizkušane snovi. Rezultati lahko ostanejo 
dvoumni ali dvomljivi ne glede na število ponovitev poskusa. 
Pozitivni rezultati preizkusa bakterijskih povratnih mutacij pomenijo, 
da snov povzro ča točkovne mutacije z zamenjavo baz ali premikom 
bralnega okvira v genomu  Salmonella typhimurium  in/ali  Esche­
richia coli.  Negativni rezultati pomenijo, da preizkušana snov pri 
preizkusnih pogojih ni mutagena za preizkusno vrsto.
 
3. PORO ČANJE  
POROČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preizkusu mora vsebovati naslednje informacije: 
Topilo/nosilec: — utemeljitev izbire topila/nosilca, 
— topnost in stabilnost preizkušane snovi v topilu/nosilcu, če sta 
znani. 
Sevi : — uporabljeni sevi, 
— število celic na kulturo, 
— značilnosti seva. 
Preizkusni pogoji: — količina preizkušane snovi na ploš čo (mg/ploš čo ali μl/ploščo), 
skupaj z razlogi za izbiro odmerka in števila ploš č na koncen ­
tracijo, 
— uporabljena gojiš ča, 
— vrsta in sestava sistema za aktivacijo presnove, skupaj z merili 
sprejemljivosti, 
— postopki obdelave. Rezultati : — znaki toksi čnosti, 
— znaki obarjanja, 
— število kolonij na posameznih ploš čah,
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 344
 
— srednja vrednost števila kolonij povratnih mutant na ploš čo in 
standardni odklon, 
— odvisnost med odmerkom in odzivom, kadar je to mogo če, 
— statisti čne analize, če so bile opravljene, 
— podatki o so časni negativni (topilo/nosilec) in pozitivni kontroli, 
z območji, srednjimi vrednostmi in standardnimi odkloni, 
— podatki o pretekli negativni (topilo/nosilec) in pozitivni kontroli, 
z območji, srednjimi vrednostmi in standardnimi odkloni. 
Diskusija rezultatov. 
Sklepi.  
4. LITERATURA  
(1) Ames, B. N., McCann, J., in Yamasaki E. (1975), Methods of 
Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ 
Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 
31, str. 347–364. 
(2) Maron, D. M., in Ames, B. N. (1983), Revised Methods for 
the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, str. 
173–215. 
(3) Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., 
Matsushima, T., Melcion, C, Nohmi, T., Venitt, S., in Zeiger, 
E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial 
Mutation Assays, Mutation Res., 312, str. 217–233. 
(4) Kier, L. D., Brusick D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., 
Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann, J., 
Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T. K., in Ray V. (1986), The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene- 
Tox Program, Mutation Res., 168, str. 69–240. 
(5) Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y. Y., Matsushima, T., Nagao, 
M., Sugimura, T., in Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of 
Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, 
str. 91–96. 
(6) Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, 
A., in Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity 
Microbial Tests, v: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens, izd. Norpoth K. H., in Garner, R. C, Springer, Berlin-Heidelberg-New York, str. 273–285. 
(7) Gatehouse, D. G, Rowland, I. R., Wilcox, P., Callender, R. D., 
in Foster, R. (1980), Bacterial Mutation Assays, v: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS, del 1, pregledan, izd. D. J. 
Kirkland, Cambridge University Press, str. 13–61. 
(8) Aeschacher, H. U., Wolleb, U., in Porchet, L. (1987), Liquid 
Preincubation Mutagenicity Test for Foods, J. Food Safety, 8, 
str. 167–177. 
(9) Green, M. H. L., Muriel, W. J., in Bridges, B. A. (1976), Use 
of a simplified fluctuation test to detect low levels of muta ­
gens, Mutation Res., 38, str. 33–42. 
(10) Hubbard, S. A., Green, M. H. L., Gatehouse, D., in Bridges, J. 
W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, v: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2. izdaja, izd. Kilbey, B. J., 
Legator, M., Nichols, W., in Ramel, C, Elsevier, Amsterdam- 
New York-Oxford, str. 141–161.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 345
 
(11) Thompson, E. D., in Melampy, P. J. (1981), An Examination 
of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with 
Strains of Salmonella typhimurium, Environmental Mutagene ­
sis, 3, str. 453–465. 
(12) Araki, A., Noguchi, T., Kato, F., in Matsushima, T. (1994), 
Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous 
Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 307, str. 335–344. 
(13) Prival, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D., in 
Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzi ­
dine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modi ­
fied Salmonella Assay, Mutation Res., 136, str. 33–47. 
(14) Zeiger, E., Anderson, B. E., Haworth, S., Lawlor, T., in 
Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. Mutagen., 19, str. 2–141. 
(15) Simmon, V., Kauhanen, K., in Tardiff, R. G. (1977), Muta ­
genic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges in F., 
Sobels (izd.) Elsevier, Amsterdam, str. 249–258. 
(16) Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, I. G., in Claxton, L. 
D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmo ­
nella Assay, Environmental Mutagenesis, 9, str. 421–441. 
(17) Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., in 
Sugimura, T. (1979), Mutagenicity of the Naturally Occurring 
Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane 
Conjugates in  Salmonella typhimurium,  Cancer Res., 39, str. 
3780–3782. 
(18) Tamura, G., Gold, C, Ferro-Luzzi, A., in Ames, B. N. (1980), 
Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to 
Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, str. 4961–4965. 
(19) Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J., in Gatehouse, D. G. 
(1990), Comparison of  Salmonella typhimurium  TA 102 with 
Escherichia coli WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, str. 285–291. 
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K., in Sugimura, T. 
(1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, v:  In Vitro  Meta­
bolic Activation in Mutagenesis Testing, izd. F. J. de Serres 
idr. Elsevier, North Holland, str. 85–88. 
(21) Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. 
G., Gibson, G. G., Mackay, J. M., in Wolf, R. C. (1992), 
Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in  in vitro  Genotoxi ­
city Assays, Mutagenesis, 7, str. 175–177. 
(22) Maron, D., Katzenellenbogen, J., in Ames, B. N. (1981), 
Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Micro ­
some Test, Mutation Res., 88, str. 343–350. 
(23) Claxton, L. D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nest ­
mann, E., in Zeiger, E. (1987), Guide for the  Salmonella typhi ­
murium /Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutageni ­
city, Mutation Res., 189, str. 83–91.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 346
 
(24) Mahon, G. A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchel, I., 
Robinson, W. D., in Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data 
from Microbial Colony Assays, v: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, del II. Statistical Evalua ­
tion of Mutagenicity Test Data, izd. Kirkland, D. J., 
Cambridge University Press, str. 28–65.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 347
 
B.15  PRESKUS MUTAGENOSTI IN PRESEJALNA ŠTUDIJA 
RAKOTVORNOSTI GENSKA MUTACIJ A – SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Glej Splošni uvod dela B.  
1.2 OPREDELITEV POJMOV 
Glej Splošni uvod dela B.  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Jih ni.  
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Za merjenje nastanka genskih mutacij, ki jih inducirajo kemijski 
povzročitelji z ali brez metabolne aktivacije, je mogo če uporabiti niz 
haploidnih in diploidnih sevov kvasovke  Saccharomyces cerevisiae.  
Uporabljajo se sistemi napredne mutacije v haploidnih sevih, kot je 
merjenje mutacije rde čih mutant, ki potrebujejo adenin  (ade-1, ade-2),  
v bele mutante, ki potrebujejo dvojni adenin, ter selektivni sistemi, kot je indukcija odpornosti proti kanavaninu in cikloheksimidu. 
Najširše validirani sistem povratne mutacije vklju čuje uporabo 
haploidnega seva XV 185-14C, ki nosi ochre nesmiselne mutacije  
ade 2–1,  org 4–17,  lys 1–1 in  trp 5–48, ki so povratne z mutageni, 
ki povzro čajo zamenjave baz, in inducirajo usmerjene mutacije ali 
ochre supresorske mutacije. XV 185-14C nosi tudi ozna čevalec  his 
1–7, ki je druga če pomenska mutacija, v glavnem povratna z muta ­
cijami na drugem mestu, ter ozna čevalec  hom  3–10, ki je povraten z 
mutageni, ki inducirajo mutacije tipa premik bralnega okvira. 
Pri diploidnih vrstah  S. cerevisisae  je edina široko uporabljana vrsta 
D7, ki je homozigotna za  ilv 1–92.
 
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Jih ni.  
1.6 OPIS PRESKUSNE METODE  
Priprave  
Raztopino preskusnih kemikalij in kontrolo je treba z uporabo ustrez ­
nega nosilca pripraviti tik pred preskusom. Če gre za v vodi netopne 
organske spojine, naj se ne uporabi ve č kot 2 % raztopina v/v 
organskih topil, kot so etanol, aceton ali dimetilsulfoksid (DMSO). 
Končna koncentracija nosilca ne sme bistveno vplivati na sposobnost 
preživetja celic in na zna čilnosti rasti.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 348
 
M e t a b o l n a a k t i v a c i j a 
Celice je treba izpostaviti preskusnim kemikalijam v prisotnosti in v 
odsotnosti ustreznega eksogenega metabolnega aktivacijskega sistema. 
Najpogosteje uporabljeni sistem je s kofaktorjem dopolnjena post- 
mitohondrijalna frakcija iz jeter glodalcev, ki so bila prej tretirana s sredstvi, za encimsko indukcijo. Za metabolno aktivacijo je lahko 
ustrezna tudi uporaba drugih vrst, tkiv, post-mitohondrijalnih frakcij 
ali postopkov.
 
Preskusni pogoji  
P r e s k u s n i s e v i 
V študijah genske mutacije sta najbolj uporabljana haploidni sev XV 
185-14C in diploidni sev D7. Ustrezni so lahko tudi drugi sevi.  
G o j i š č a 
Za določitev preživetja celic in števila mutant se uporabijo ustrezna 
gojišča. 
U p o r a b a n e g a t i v n i h i n p o z i t i v n i h k o n t r o l 
Pozitivno kontrolo, netretirano kontrolo in kontrolo topila je treba 
opraviti hkrati. Za vsak specifi čen mutacijski ciljni u činek je treba 
uporabiti ustrezne kemikalije pozitivne kontrole.  
K o n c e n t r a c i j e i z p o s t a v l j e n o s t i 
Uporabiti je treba najmanj pet ustrezno razporejenih koncentracij 
preskusne snovi. V primeru strupenih snovi pri najvišji koncentraciji preživetje ne sme pasti pod 5 do 10 %. Z relativno vodotopnimi snovmi je treba preskus opravljati do meje njihove topnosti z 
uporabo ustreznih postopkov. Za dobro vodotopne nestrupene 
snovi je treba zgornjo koncentracijo dolo čiti od primera do primera.
 
I n k u b a c i j s k i p o g o j i 
Plošče se inkubirajo štiri do sedem dni pri 28 do 30  o C v temi.  
F r e k v e n c e s p o n t a n i h m u t a c i j 
Uporabljati je treba subkulture s frekvencami spontanih mutacij 
znotraj dovoljenega razpona.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 349
 
Š t e v i l o d v o j n i k o v 
Za analizo prototrofov, ki so nastali z gensko mutacijo, in sposob ­
nosti preživetja celic je treba uporabiti najmanj tri ponovitvene plošče na koncentracijo. V primeru preskusov, pri katerih se upora ­
bljajo ozna čevalci, kot je  hom  3-10 z nizko stopnjo mutacije, je treba 
za pridobitev statisti čno ustreznih podatkov število ploš č povečati.
 
Postopek  
Tretiranje sevov S. cerevisiae se obi čajno izvaja s preskusnim 
postopkom v teko či suspenziji, ki zajema ali celice v stacionarni 
fazi ali rasto če celice. Za četne preskuse je treba opraviti na rasto čih 
celicah: 1 - 5 × 10 celic/ml se izpostavi preskusni kemikaliji najve č 
18 ur pri 28 do 37  o C s tresenjem; če je primerno, se med tretiranjem 
doda ustrezna koli čina metabolnega aktivacij skega sistema. Na 
koncu tretiranja se celice centrifugirajo, sperejo in zasejejo na 
ustrezno gojiš če. Po inkubaciji se ploš če preštejejo za dolo čitev 
preživetja in indukcije genske mutacije. Če je prvi preskus negativen, 
je treba drugi preskus opraviti z uporabo celic v stacionarni fazi. Če 
je prvi preskus pozitiven, se ga potrdi z ustreznim neodvisnim 
preskusom.  
2. PODATKI  
Podatki se povzamejo v obliki tabele, iz katere je razvidno število 
preštetih kolonij, število mutant, preživetje in frekvenco mutant. Vse rezultate je treba potrditi z neodvisnim preskusom. Podatke je treba 
oceniti z uporabo ustreznih statisti čnih metod.
 
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Če je mogo če, se v poro čilo o preskusu glede na tip izvajane študije 
vključijo naslednji podatki: 
— uporabljeni sev, — preskusni pogoji: celice v stacionarni fazi ali rasto če celice, 
sestava gojiš č, inkubacijska temperatura in trajanje, metabolni 
aktivacijski sistem, 
— pogoji tretiranja: stopnje izpostavljenosti, postopek in trajanje 
tretiranja, temperatura tretiranja, pozitivna in negativna kontrola, 
— število preštetih kolonij, število mutant, preživetje in frekvenca 
mutantov, razmerje odmerek/odziv, če je primerno, statisti čna 
ocena podatkov, 
— obravnava rezultatov, — razlaga rezultatov.
 
3.2 OCENA IN RAZLAGA 
Glej Splošni uvod dela B.  
4. VIRI  
Glej Splošni uvod dela B.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 350
 
B.16  MITOTI ČNA REKOMBINACIJA - SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Glej Splošni uvod dela B.  
1.2 OPREDELITEV POJMOV 
Glej Splošni uvod dela B.  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Jih ni.  
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Mitotično rekombinacijo v  Saccharomyces cerevisiae  je mogo če 
zaznati med geni (ali bolj splošno med genom in njegovo centro ­
mero) ali znotraj genov. Prvi primer se imenuje mitoti čni crossing- 
over in ustvarja recipro čne produkte, medtem ko je drugi najpogo ­
steje nerecipro čen in se imenuje konverzija genov. Preskus crossing- 
over se obi čajno opravlja s proizvajanjem recesivnih homozigotnih 
kolonij ali sektorjev, ki nastanejo v heterozigotnem sevu, medtem ko se preskus konverzije genov opravlja s proizvodnjo prototrofnih revertant, ki nastanejo na avksotrofnem heteroalelnem sevu, ki nosi 
dva različna okvarjena alela istega gena. Najpogosteje uporabljani 
sevi za odkrivanje mitoti čne konverzije genov so D
 4 (heteroalelna 
na ade 2  in trp 5), D  7 (heteroralelna na  trp 5), BZ  34 (heteroalelna na  
org 4) in JD1 (hetroalelna na  his 4 in  trp 5). Mitoti čni crossing-over, 
s katerim nastajajo rde či in rožnati homozigotni sektorji, je mogo če 
določiti v D  5 ali na D  7 (ki meri tudi mitoti čno konverzijo genov in 
povratno mutacijo na  ilv 1–92), pri čemer sta oba seva heteroalelna 
za komplementne alele  ade 2.  
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Jih ni.  
1.6 OPIS PRESKUSNE METODE  
Priprave  
Raztopino preskusnih kemikalij ter kontrolo ali referen čne spojine je 
treba z uporabo ustreznega nosilca pripraviti tik pred preskusom. Če 
gre za v vodi netopne organske spojine, naj se ne uporabi ve č kot 
2 % raztopina v/v organskih topil, kot so etanol, aceton ali dimetil ­
sulfoksid (DMSO). Kon čna koncentracija nosilca ne sme bistveno 
vplivati na sposobnost preživetja celic in na zna čilnosti rasti.  
M e t a b o l n a a k t i v a c i j a 
Celice je treba izpostaviti preskusnim kemikalijam v prisotnosti in v 
odsotnosti ustreznega eksogenega metabolnega aktivacijskega 
sistema. Najpogosteje uporabljeni sistem je s kofaktorjem dopolnjena post-mitohondrijalna frakcija iz jeter glodalcev, ki so bila prej treti ­
rana s sredstvi za indukcijo encimov. Za metabolno aktivacijo je 
lahko ustrezna tudi uporaba drugih vrst, tkiv, post-mitohondrijalnih 
frakcij ali postopkov.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 351
 
Preskusni pogoji  
P r e s k u s n i s e v i 
Najpogosteje uporabljani sevi so diploidi D  4 , D  5 , D  7 in 
JD1. Ustrezna je lahko tudi uporaba drugih sevov.  
G o j i š č a 
Za določitev preživetja celic in frekvence mitoti čne rekombinacije se 
uporabijo ustrezna gojiš ča. 
U p o r a b a n e g a t i v n i h i n p o z i t i v n i h k o n t r o l 
Pozitivno kontrolo, netretirano kontrolo in kontrolo topila je treba 
opraviti hkrati. Za vsak specifi čni ciljni u činek rekombinacije je treba 
uporabiti ustrezne kemikalije pozitivne kontrole.  
K o n c e n t r a c i j e i z p o s t a v l j e n o s t i 
Uporabiti je treba najmanj pet ustrezno razporejenih koncentracij 
preskusne snovi. Med dejavniki, ki jih je treba upoštevati, so cito ­
toksičnost in topnost. Najnižja koncentracija ne sme imeti nikakrš ­
nega učinka na sposobnost preživetja celic. V primeru strupenih 
kemikalij preživetje pri najvišji koncentraciji ne sme pasti pod 5 
do 10 %. Z relativno vodotopnimi snovmi je treba preskus opravljati do meje njihove topnosti z uporabo ustreznih postopkov. Za dobro vodotopne nestrupene snovi je treba zgornjo koncentracijo dolo čiti 
od primera do primera. 
Celice se lahko izpostavijo preskusnim kemikalijam ali v njihovi 
stacionarni fazi ali v času rasti za obdobje najve č 18 ur. Za dolga 
obdobja tretiranja pa je treba kulture mikroskopsko pregledati za 
nastanek spor, katerih prisotnost bi razveljavila preskus.
 
I n k u b a c i j s k i p o g o j i 
Plošče se inkubira v temi štiri do sedem dni pri 28 do 30  o C. Plošče, 
uporabljene za analizo rde čih in rožnatih homozigotnih sektorjev, ki 
nastanejo z mitoti čnim crossing-over, je treba hraniti v hladilniku 
(približno 4  o C) za nadaljnji dan ali dva pred štetjem, da se omogo či 
razvoj ustreznih pigmentiranih kolonij.  
F r e k v e n c e s p o n t a n e m i t o t i č n e r e k o m b i n a c i j e 
Uporabiti je treba subkulture s frekvencami spontane mitoti čne 
rekombinacije znotraj dovoljenega normalnega razpona.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 352
 
Š t e v i l o d v o j n i k o v 
Uporabiti je treba najmanj tri ponovitvene ploš če na koncentracijo za 
analizo prototrofov, ki so nastali z mitoti čno konverzijo genov, in 
sposobnosti preživetja celic. V primeru preskusov recesivne homo ­
zigotnosti, ki nastane z mitoti čnim (crossing-over, je treba število 
plošč povečati, da bi se dobilo ustrezno število kolonij.  
Postopki  
Obdelava sevov  S. cerevisiae  se običajno izvaja s preskusnim 
postopkom v teko či suspenziji, ki zajema ali celice v stacionarni 
fazi ali rasto če celice. Za četne preskuse je treba opraviti na rasto čih 
celicah: 1 – 5 × 10  7 celic/ml se izpostavi preskusni kemikaliji najve č 
18 ur pri 28 do 37  o C s tresenjem; če je primerno, se med tretiranjem 
doda ustrezna koli čina metabolnega aktivacijskega sistema. 
Na koncu tretiranja se celice centrifugirajo, sperejo in zasejejo na 
ustrezno gojiš če. Po inkubaciji se ploš če preštejejo za preživetje in 
indukcijo genske mutacije. 
Če je prvi preskus negativen, je treba ob uporabi celic v stacionarni 
fazi opraviti drugi preskus. Če je prvi preskus pozitiven, se ga potrdi 
z ustreznim neodvisnim preskusom.  
2. PODATKI  
Podatki se povzamejo v obliki tabele, iz katere je razvidno število 
preštetih kolonij, število rekombinant, preživetje in frekvenca rekom ­
binant. 
Rezultate je treba potrditi z neodvisnim preskusom. Podatke je treba oceniti z uporabo ustreznih statisti čnih metod.
 
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Če je mogo če, se v poro čilo o preskusu glede na tip izvajane študije 
vključijo naslednji podatki: 
— uporabljeni sevi, 
— preskusni pogoji: celice v stacionarni fazi in rasto če celice, 
sestava gojiš č, inkubacijska temperatura in trajanje, metabolni 
aktivacijski sistem, 
— pogoji tretiranja: stopnje izpostavljenosti, postopek in trajanje 
tretiranja, temperatura tretiranja, pozitivna in negativna kontrola, 
— število preštetih kolonij, število rekombinant, preživetje in 
frekvenca rekombinacije, razmerje odmerek/odziv, če je 
primerno, statisti čna ocena podatkov, 
— obravnava rezultatov, — razlaga rezultatov.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 353
 
3.2 OCENA IN RAZLAGA 
Glej Splošni uvod dela B.  
4. VIRI  
Glej Splošni uvod dela B.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 354
 
B.17  MUTAGENOST – PREIZKUS GENSKIH MUTACIJ V 
CELICAH SESALCEV  IN VITRO  
1. METODA  
Ta metoda ustreza metodi OECD TG 476,  In Vitro  Mammalian Cell 
Gene Mutation Test (1997).  
1.1 UVOD 
Preizkus genskih mutacij v celicah sesalcev  in vitro  se lahko upora ­
blja za odkrivanje genskih mutacij, ki jih povzro čajo kemične snovi. 
Primerne celi čne linije vklju čujejo celice limfoma miši L5178Y, 
linije celic kitajskega hr čka CHO, CHO-AS52 in V79 in človeške 
limfoblaste TK6 (1). V teh celi čnih linijah najpogosteje uporabljane 
genske kon čne točke izmerijo mutacijo na lokusih za timidin-kinazo 
(TK) in hipoksantin-gvanin-fosforibozil-transferazo (HPRT) in na 
transgenu za ksantin-gvanin-fosforibozil-transferazo (XPRT). Preizkusi mutacij TK, HPRT in XPRT zaznajo razli čne vrste genskih 
pojavov. Lokacija TK in XPRT na avtosomih lahko omogo či 
zaznavo genskih pojavov (npr. obsežnih delecij), ki se ne zaznajo 
na lokusu za HPRT na X kromosomih (2) (3) (4) (5) (6). 
Pri preizkusu genskih mutacij v celicah sesalcev  in vitro  se lahko 
uporabijo kulture trajnih celi čnih linij ali celi čnih sevov. Uporabljene 
celice se izberejo na podlagi zmožnosti rasti v kulturi in stabilnosti pogostnosti spontanih mutacij. 
Za preizkuse, opravljene  in vitro,  so navadno potrebni zunanji viri 
aktivacije presnove. Takšen sistem aktivacije presnove ne more povsem posnemati razmer  in vivo  pri sesalcih. Treba je paziti, da 
se prepreči nastanek razmer, ki bi vodile do rezultatov, ne izražajo čih 
prave mutagenosti. Pozitivni rezultati, ki ne izražajo prave mutage ­
nosti, so lahko posledica sprememb pH, osmolarnosti ali visoke ravni citotoksičnosti (7). 
Ta preizkus se uporablja za iskanje možnih mutagenov in rakot ­
vornih snovi za sesalce. Mnoge spojine, pri katerih je rezultat tega 
preizkusa pozitiven, so rakotvorne snovi za sesalce; vendar pa sood ­
visnost med tem preizkusom in rakotvornostjo ni popolna. Odvisna je od skupine nevarnosti kemikalije in vedno ve č je dokazov, da 
obstajajo rakotvorne snovi, ki jih ta preizkus ne zazna, ker, kakor 
kaže, delujejo prek drugih mehanizmov, ki niso genotoksi čni, ali 
mehanizmov, ki jih v sesalskih celicah ni (6). 
Glej tudi splošni uvod dela B.
 
1.2 DEFINICIJE  
Napredna mutacija:  genska mutacija starševskega tipa mutirane 
oblike, ki povzro či spremembo ali izgubo encimskega delovanja 
kodirane beljakovine.  
Mutageni substitucije baznih parov:  snovi, ki povzro čijo zame­
njavo ene ali ve č baznih parov v DNA.  
Mutageni premika bralnega okvira:  snovi, ki povzro čijo adicijo ali 
delecij o enega ali ve č baznih parov v molekuli DNA.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 355
 
Čas izražanja fenotipa:  obdobje, v katerem se nespremenjeni 
genski produkti odstranijo iz na novo mutiranih celic.  
Pogostnost mutant:  število opaženih mutiranih celic, deljeno s 
številom živih celic.  
Relativna skupna rast:  povečanje števila celic v časovnem obdobju 
v primerjavi s kontrolno populacijo celic; izra čunano kot zmnožek 
rasti v suspenziji glede na negativno kontrolo in u činkovitosti kloni ­
ranja glede na negativno kontrolo.  
Relativna rast v suspenziji:  povečanje števila celic v obdobju izra ­ 
žanja glede na negativno kontrolo.  
Sposobnost preživetja:  učinkovitost tvorbe klonov obdelanih celic v 
času nasaditve v selektivnih pogojih po času izražanja.  
Preživetje:  učinkovitost tvorbe klonov obdelanih celic, ko se nasa ­
dijo na ploš čo ob koncu obdelave; preživetje se navadno izraža v 
odvisnosti od preživetja kontrolne populacije celic.  
1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Celice brez timidin-kinaze (TK) so zaradi mutacije TK  +/- -> TK  -/- 
odporne proti citotoksi čnim učinkom pirimidinskega analoga trifluoro ­
timidina (TFT). Celice s timidin-kinazo so ob čutljive za TFT, ki zavira 
celično presnovo in ustavi celi čno delitev. Mutirane celice so tako 
sposobne množitve v navzo čnosti TFT, medtem ko normalne celice, 
ki vsebujejo timidin-kinazo, to niso. Podobno se celice brez HPRT ali 
XPRT selekcionirajo z odpornostjo proti 6-tiogvaninu (TG) ali 8-azog ­
vaninu (AG). Lastnosti preizkušane snovi naj se skrbno preu čijo, če se 
v katerem koli od preizkusov genskih mutacij v celicah sesalcev preizkuša bazni analog ali spojina, sorodna selektivni snovi. Preu či 
naj se na primer vsaka domnevna selektivna toksi čnost preizkušane 
snovi za mutirane in nemutirane celice. Treba je potrditi u činkovitost 
selekcijskega sistema/snovi, kadar se preizkušajo kemikalije, ki so po 
strukturi sorodne selektivni snovi (8). 
Celice v suspenziji ali enoplastni kulturi se za ustrezno časovno 
obdobje izpostavijo preizkušam snovi, ob aktivaciji presnove in 
brez nje, in se kultivirajo na novem gojiš ču, da se dolo či citotoksi ­ 
čnost in se omogo či izražanje fenotipa pred selekcijo mutant (9) (10) 
(11) (12) (13). Citotoksi čnost se navadno dolo či z merjenjem rela ­
tivne učinkovitosti tvorbe klonov (preživetje) ali relativne skupne 
rasti kultur po obdelovanju. Obdelovane kulture se vzdržujejo na 
rastnem gojiš ču dovolj dolgo obdobje, zna čilno za vsak izbran 
lokus in vrsto celic, ki omogo či skoraj optimalno izražanje fenotipa 
induciranih mutacij. Pogostnost mutant se dolo či z nasaditvijo 
znanega števila celic v gojiš če s selektivno snovjo, da se zaznajo 
mutirane celice, in v gojiš če brez selektivne snovi, da se dolo či 
učinkovitost tvorbe klonov (sposobnost preživetja). Po ustrezno 
dolgi inkubaciji se preštejejo kolonije. Pogostnost mutant se izra čuna 
iz števila mutiranih kolonij v selektivnem gojiš ču in iz števila kolonij 
v neselektivnem gojiš ču.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 356
 
1.4 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.4.1  Priprave  
1.4.1.1  Celice  
Na voljo je ve č vrst celic, ki se lahko uporabijo pri tem preizkusu, 
skupaj s subkloni celic L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 ali TK6. Za 
vrsto celic, uporabljeno pri tem preizkusu, naj bodo dokazane ob čut­
ljivost za kemi čne mutagene, velika u činkovitost tvorbe klonov in 
stabilna pogostnost spontanih mutacij. Preveri naj se, ali celice niso 
okužene z mikoplazmo, in če so, naj se ne uporabijo. 
Preizkus naj bo na črtovan tako, da bosta njegova ob čutljivost in mo č 
vnaprej dolo čeni. Število uporabljenih celic, kultur in koncentracij 
preizkušane snovi naj izraža te dolo čene parametre (14). Najmanjše 
število živih celic, ki preživijo obdelovanje in se uporabijo v vsaki 
fazi preizkusa, naj temelji na pogostnosti spontanih mutacij. Splošno vodilo je, da se uporabi število celic, ki je vsaj 10-kratna recipro čna 
vrednost pogostnosti spontanih mutacij. Vendar se priporo ča, da se 
uporabi vsaj 10
 6 celic. Na voljo naj bodo zadovoljivi pretekli podatki 
o uporabljenem celi čnem sistemu, ki kažejo na dosledno u činkovitost 
preizkusa.  
1.4.1.2  Gojiš če in pogoji kultiviranja  
Uporabijo naj se ustrezna gojiš ča za kulture in pogoji inkubacije 
(posode za kulture, temperatura, koncentracija CO  2 in vlažnost). 
Gojišča naj se izberejo glede na selektivne sisteme in vrsto celic, 
ki se uporabijo v preizkusu. Posebej pomembno je, da se izberejo 
takšni pogoji kultiviranja, ki zagotavljajo optimalno rast celic v času 
izražanja in sposobnost tvorjenja kolonij mutiranih, pa tudi nemuti ­
ranih celic.  
1.4.1.3  Priprava kultur  
Celice se namnožijo iz založnih kultur, nasadijo v gojiš če in inku ­
birajo pri 37  o C. Pred uporabo v tem preizkusu bo morda iz kultur 
treba odstraniti že obstoje če mutirane celice.  
1.4.1.4  Aktivacija presnove  
Celice naj se izpostavijo preizkušam snovi ob navzo čnosti in ob 
odsotnosti ustreznega sistema za aktivacijo presnove. Najpogosteje uporabljani sistem je postmitohondrijska frakcija z dodanim kofak ­
torjem (S9), pripravljena iz jeter glodavcev, ki so bila obdelana s 
sredstvi za encimsko indukcijo, kakor je Aroclor 1254 (15) (16) (17) 
(18), ali z zmesjo fenobarbitona in β-naftoflavona (19) (20). 
Postmitohondrijska frakcija se navadno uporablja v koncentracijah 
1–10 % v/v v kon čnem preizkusnem gojiš ču. Izbira in stanje sistema 
za aktivacijo presnove sta lahko odvisna od skupine nevarnosti 
preizkušane kemikalije. V časih je primerno uporabiti ve č kakor 
eno koncentracijo postmitohondrijske frakcije.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 357
 
Vrsta razvojnih dosežkov lahko skupaj s pridobivanjem gensko spre ­
menjenih celi čnih linij, v katerih se izražajo geni za to čno določene 
aktivirajo če encime, daje možnosti za endogeno aktivacijo. Izbira 
uporabljenih celi čnih linij naj bo znanstveno utemeljena (npr. s 
pomembnostjo izoencima citokrom P450 za presnovo preizkušane 
snovi).  
1.4.1.5  Priprava preizkušane snovi  
Trdne preizkušane snovi naj se pred obdelavo celic raztopijo ali 
suspendirajo v ustreznih topilih ali nosilcih, in če je to primerno, 
se razredčijo. Tekoče preizkušane snovi se lahko dodajo neposredno 
v preizkusni sistem in/ali pred obdelavo razred čijo. Uporabljajo naj 
se sveže pripravljene preizkušane snovi, razen če podatki 
o stabilnosti kažejo, da je shranjevanje sprejemljivo.  
1.4.2  Preizkusni pogoji  
1.4.2.1  Topilo/nosilec  
Topilo/nosilec naj ne vzbuja suma, da kemi čno reagira s preizkušano 
snovjo, in naj bo združljivo s preživetjem celic in delovanjem S9. Če 
se uporabijo manj poznana topila/nosilci, naj njihovo vklju čitev 
podpirajo podatki, ki kažejo na njihovo združljivost. Priporo ča se, 
da se, kadar koli je to mogo če, kot prva možnost preu či uporaba 
vodnega topila/nosilca. Kadar se preizkušajo v vodi nestabilne snovi, naj se uporabijo brezvodna organska topila. Voda se lahko odstrani z molekulskim sitom.
 
1.4.2.2  Koncentracije izpostavljenosti  
Med merili, ki jih je treba upoštevati pri dolo čanju najvišje koncen ­
tracije, so citotoksi čnost, topnost v preizkusnem sistemu in spre ­
membe v pH ali osmolarnosti. 
Citotoksičnost naj se dolo či ob aktivaciji presnove in brez nje v 
glavnem poskusu z uporabo ustreznega kazalca celi čne neokrnjenosti 
in rasti, kakor sta relativna u činkovitost tvorbe klonov (preživetje) ali 
relativna skupna rast. Lahko je koristno, če se citotoksi čnost in 
topnost dolo čita v poprejšnjem poskusu. 
Uporabijo naj se vsaj štiri koncentracije, ki jih je mogo če analizirati. 
Pri citotoksi čnosti naj te koncentracije zajemajo obmo čje od najve čje 
toksičnosti do majhne toksi čnosti ali netoksi čnosti; to bo navadno 
pomenilo, da razlika med koncentracijami ne bo smela biti ve čja od 
faktorja med 2 in √10. Če največja koncentracija temelji na citotok ­
sičnosti, naj povzro či približno 10–20 % (vendar ne manj kakor 
10 %) relativno preživetje (relativna u činkovitost tvorbe klonov) ali 
relativno skupno rast. Za sorazmerno necitotoksi čne snovi naj bo 
največja preizkušana koncentracija 5 mg/ml, 5 μl/ml oziroma 0,01 
M, tista, ki je najnižja.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 358
 
Sorazmerno netopne snovi naj se preizkušajo do ali prek meje 
topnosti v pogojih kultiviranja. Netopnost naj se dolo či v končnem 
obdelovalnem gojiš ču, kateremu so izpostavljene celice. Lahko je 
koristno oceniti topnost na za četku in na koncu obdelave, saj se 
topnost med izpostavitvijo v preizkusnem sistemu lahko spremeni 
zaradi navzo čnosti celic, S9, seruma itn. Netopnost se lahko zazna 
s prostim o česom. Oborina ne sme vplivati na štetje.  
1.4.2.3  Kontrolni vzorci  
V vsak poskus naj se vklju čijo sočasni pozitivni in negativni (topilo 
ali nosilec) kontrolni vzorci, ob aktivaciji presnove in brez nje. Kadar se uporabi aktivacija presnove, mora biti kemikalija pozitivne kontrole tista, pri kateri je za mutageni odziv potrebna aktivacija. 
Primeri snovi pozitivne kontrole vklju čujejo:
 
Stanje aktivacije 
presnove Lokus Snov Št. CAS Št. Einecs  
Ni zunanje aktiva ­
cije presnove HPRT etil metansulfonat 62-50-0 200-536-7 
N-etil-N-nitrozose čnina 759-73-9 212-072-2 
TK (majhne 
in velike 
kolonije) metil metansulfonat 66-27-3 200-625-0 
XPRT etil metansulfonat 62-50-0 200-536-7 
N-etil-N-nitrozose čnina 759-73-9 212-072-2 
Zunanja aktivacija 
presnove HPRT 3-metilholantren 56-49-5 200-276-4 
N-dimetil nitrozamin 62-75-9 200-549-8 
7,12-dimetilbenzoantracen 57-97-6 200-359-5 
TK (majhne 
in velike 
kolonije) ciklofosfamid 50-18-0 200-015-4 
ciklofosfamidmonohidrat 6055-19-2 Benzo[a]piren 50-32-8 200-028-5 
3-metilholantren 56-49-5 200-276-5 
XPRT N-dimetil nitrozamin(pri velikih 
koncentracijah S-9) 62-75-9 200-549-8 
Benzo[a]piren 50-32-8 200-028-5 
Lahko se uporabijo druge ustrezne referen čne snovi pozitivne 
kontrole, npr. če ima laboratorij bazo preteklih podatkov za 5- 
bromo 2'-dioksiuridin (št. CAS 59-14-3, št. Einecs 200-415-9), se lahko uporabi tudi ta referen čna snov. Uporabijo naj se kemikalije 
pozitivne kontrole, ki sodijo v isto skupino nevarnosti kakor preizku ­ 
šana kemikalija, kadar so na voljo.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 359
 
Vključijo naj se negativni kontrolni vzorci, ki jih sestavlja le topilo 
ali nosilec v obdelovalnem gojiš ču, obdelani enako kakor obdelo ­
vane skupine. Uporabijo se tudi neobdelani kontrolni vzorci, razen če 
pretekli kontrolni podatki dokazujejo, da izbrano topilo ne povzro ča 
škodljivih ali mutagenih u činkov.  
1.4.3  Postopek  
1.4.3.1  Obdelava s preizkušano snovjo  
Množeče se celice naj se izpostavijo preizkušam snovi ob aktivaciji 
presnove in brez nje. Čas izpostavljenosti naj bo ustrezno dolg 
(navadno zadostuje 3-6 ur). Čas izpostavljenosti lahko traja en 
celični ciklus ali ve č. 
Pri vsaki preizkušeni koncentraciji se lahko obdelata dve vzporedni 
kulturi ali le ena. Kadar se uporabi le ena kultura, naj se pove ča 
število koncentracij, da se zagotovi zadostno število kultur za analizo (npr. vsaj osem koncentracij, ki jih je mogo če analizirati). Uporabita 
naj se dve vzporedni kulturi negativne (topilo) kontrole. 
Plinaste ali hlapne snovi naj se preizkušajo z ustreznimi metodami, 
na primer v zatesnjenih posodah za kulture (21) (22).
 
1.4.3.2  Merjenje preživetja, sposobnosti preživetja in pogostnosti mutant  
Ob koncu izpostavljenosti se celice sperejo in kultivirajo, da se 
določi preživetje in omogo či izražanje fenotipa mutant. Merjenje 
citotoksičnosti z dolo čanjem relativne u činkovitosti tvorbe klonov 
(preživetje) ali relativne skupne rasti kultur se navadno za čne po 
obdelovanju. 
Vsak lokus potrebuje dolo čen najmanjši čas za skoraj optimalno 
izrazitev fenotipa na novo induciranih mutacij (HPRT in XPRT potrebujeta vsaj 6-8 dni, TK pa vsaj 2 dni). Celice naj se gojijo na gojišču s selektivno(-imi) snovjo(-mi) in na gojiš ču brez takšnih 
snovi, da se dolo čita število mutant in u činkovitost tvorbe klonov. 
Merjenje sposobnosti preživetja (ki se uporabi za izra čun pogostnosti 
mutant) se za čne ob koncu časa izražanja z nasaditvijo v nesele ­
ktivno gojiš če. 
Če da preizkušana snov pri preizkusu L5178Y TK
 +/- pozitiven rezul ­
tat, naj se pri vsaj eni od preizkusnih kultur (najve čja pozitivna 
koncentracija) ter pri negativnih in pozitivnih kontrolnih vzorcih 
kolonije razvrstijo po velikosti. Če da preizkušana snov pri preizkusu 
L5178Y TK  +/- negativen rezultat, naj se kolonije razvrstijo po veli ­
kosti pri negativnih in pozitivnih kontrolnih vzorcih. Razvrstitev 
kolonij po velikosti se lahko izvede tudi pri študijah, pri katerih se 
uporabi TK6TK  +/- . ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 360
 
2. PODATKI  
2.1 OBDELAVA REZULTATOV 
Podatki naj vklju čujejo citotoksi čnost in sposobnost preživetja, 
število kolonij in pogostnost mutant za obdelane in kontrolne 
kulture. Pri pozitivnem odzivu pri preizkusu L5178Y TK  +/- se kolo­
nije štejejo z upoštevanjem merila velikih in majhnih kolonij pri vsaj eni od koncentracij preizkušane snovi (najve čja pozitivna koncentra ­
cija) ter pri negativni in pozitivni kontroli. Molekularne in citoge ­
netske lastnosti mutant z velikimi in majhnimi kolonijami so bile 
podrobno raziskane (23) (24). Pri preizkusu TK
 +/- se kolonije štejejo 
z upoštevanjem merila kolonij z normalno rastjo (velike) in po časno 
rastjo (majhne) (25). Mutirane celice z najobsežnejšimi genskimi 
poškodbami imajo daljši podvojitveni čas in zato sestavljajo majhne 
kolonije. Obseg poškodb se giblje od izgube celega gena do kromo ­
somskih aberacij, vidnih pri kari otipu. Nastanek mutant z majhnimi 
kolonijami se povezuje s kemikalijami, ki povzro čajo obsežne 
kromosomske aberacije (26). Manj resno prizadete mutirane celice rastejo s podobno hitrostjo kakor starševske celice in sestavljajo velike kolonije. 
Navede naj se preživetje (relativna uspešnost tvorbe klonov) ali 
relativna skupna rast. Pogostnost mutant naj se izrazi kot število 
mutiranih celic na število preživelih celic. 
Navedejo se podatki za posamezne kulture. Vsi podatki naj bodo 
povzeti v tabelah. 
Preverjanje jasnega pozitivnega odziva ni potrebno. Dvoumni rezul ­
tati naj se razjasnijo z dodatnimi preizkusi, po možnosti ob prilago ­
jenih poskusnih pogojih. Negativne rezultate je treba potrditi za vsak 
primer posebej. Kadar se pojmuje, da potrditev negativnih rezultatov 
ni potrebna, naj se to utemelji. Pri dvoumnih ali negativnih rezultatih naj se v nadaljnjih poskusih preu či možnost prilagoditve preizkusnih 
parametrov, da se razširi obmo čje analiziranih pogojev. Preizkusni 
parametri, ki bi se lahko prilagodili, vklju čujejo intervale med 
koncentracijami in pogoje aktivacije presnove.
 
2.2 VREDNOTENJE IN INTERPRETACIJA REZULTATOV 
Pozitivni rezultat se lahko dolo či na podlagi številnih meril, kakor je 
na primer s koncentracijo povezano pove čanje ali ponovljivo pove ­ 
čanje pogostnosti mutant. Najprej naj se preu či biološka pomembnost 
rezultatov. Pri vrednotenju rezultatov preizkusa se kot pomo č lahko 
uporabijo statisti čne metode. Statisti čna značilnost naj ne bo edini 
odločilni dejavnik za pozitivni odziv. 
Pojmuje se, da preizkušana snov, pri kateri rezultati ne izpolnjujejo 
navedenih meril, ni mutagena v tem sistemu.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 361
 
Čeprav bo ve čina študij dala jasne pozitivne ali negativne rezultate, 
bodo v redkih primerih dobljeni podatki prepre čili zanesljivo oceno o 
delovanju preizkušane snovi. Rezultati lahko ostanejo dvoumni ali dvomljivi ne glede na število ponovitev poskusa. 
Pozitivni rezultati preizkusa genskih mutacij v celicah sesalcev  in 
vitro  pomenijo, da preizkušana snov povzro ča genske mutacije v 
uporabljenih kultiviranih sesalskih celicah. Ponovljiv rezultat pri koncentraciji s pozitivnim odzivom je najbolj pomemben. Negativni rezultati pomenijo, da preizkušana snov pri preizkusnih pogojih ne 
povzroča genskih mutacij v uporabljenih kultiviranih sesalskih celi ­
cah.
 
3. PORO ČANJE  
POROČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preizkusu mora vsebovati naslednje informacije: 
Topilo/nosilec: — utemeljitev izbire nosilca/topila; — topnost in stabilnost preizkušane snovi v topilu/nosilcu, če sta 
znani. 
Celice: — vrsta in vir celic, — število celi čnih kultur, 
— število pasaž celic, če je to primerno, 
— metode vzdrževanja celi čne kulture, če je to primerno, 
— odsotnost mikoplazme. Preizkusni pogoji: — razlogi za izbiro koncentracij in števila kultur, tudi npr. podatki o 
citotoksičnosti in mejah topnosti, če so na voljo, 
— sestava gojiš č, koncentracija CO
 2 , 
— koncentracija preizkušane snovi, — volumen dodanega nosilca in preizkušane snovi, 
— temperatura inkubacije, 
— čas inkubacije, 
— trajanje obdelave, — gostota celic med obdelavo, — vrsta in sestava sistema za aktivacijo presnove, skupaj z merili 
sprejemljivosti, 
— pozitivni in negativni kontrolni vzorci,
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 362
 
— dolžina časa izražanja (skupaj s številom nasajenih celic ter 
programom kultiviranja na novem gojiš ču in dodajanja hranil, 
če je to primerno), 
— selektivne snovi, — merila za dolo čitev, ali je preizkus pozitiven, negativen ali dvou ­
men, 
— uporabljene metode za dolo čanje števila živih in mutiranih celic, 
— opredelitev, katera velikost in tip kolonij se upoštevata (vklju čno 
z merili za „majhne“ in „velike“ kolonije, če je to primerno). 
Rezultati: — znaki toksi čnosti, 
— znaki obarjanja, 
— podatki o pH in osmolarnosti med izpostavljenostjo preizkusni 
snovi, če sta bila dolo čena, 
— velikost kolonij, če je dolo čena, vsaj za negativne in pozitivne 
kontrolne vzorce, 
— usposobljenost laboratorija za zaznavanje mutant z majhnimi 
kolonijami pri sistemu L5178Y TK
 +/- , kadar je to primerno, 
— odvisnost med odmerkom in odzivom, kadar je to mogo če, 
— statisti čne analize, če so bile opravljene, 
— podatki o so časni negativni (topilo/nosilec) in pozitivni kontroli, 
— podatki o pretekli negativni (topilo/nosilec) in pozitivni kontroli, 
z območji, srednjimi vrednostmi in standardnimi odkloni, 
— pogostnost mutant. 
Diskusija rezultatov. 
Sklepi.  
4. LITERATURA  
(1) Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindall, 
K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell 
Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. 
(2) Chu, E. H. Y., in Mailing H. V. (1968), Mammalian Cell 
Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations 
in Chinese Hamster Cells  In Vitro , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 
61, str. 1306–1312. 
(3) Liber, H. L., in Thilly, W. G. (1982), Mutation Assay at the 
Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, 
Mutation Res. 94, str. 467–485. 
(4) Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, 
K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse 
Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagenesis, 4, str. 
394–403.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 363
 
(5) Aaron, C.S. and Stankowski, Jr.L.F. (1989). Comparison of the 
AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six 
Drug Candidates. Mutation Res., 223, str. 121–128. 
(6) Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M., Nishi, Y., 
Stankowski, Jr.L.F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group 
Report. Report of the International Workshop on Standardisa ­
tion of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, str. 235–239. 
(7) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M., 
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991). Genotoxicity 
Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, str. 147–204. 
(8) Clive, D., McCuen, R., Spector, J.F.S., Piper, C. and Mavour ­
nin, K.H. (1983). Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in 
Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 115, str. 225–251. 
(9) Li, A.P., Gupta, R.S., Heflich, R.H. and Wasson, J.S. (1988). 
A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypo ­
xanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Deter ­
mine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox 
Program. Mutation Res., 196, str. 17–36. 
(10) Li, A.P., Carver, J.H., Choy, W.N., Hsie, A.W., Gupta, R.S., 
Loveday, K.S., O'Neill, J.P., Riddle, J.C., Stankowski, L.F. Jr. and Yang, L.L. (1987). A Guide for the Performance of the 
Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phospho ­
ribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, str. 135–141. 
(11) Liber, H.L., Yandell, D.W and Little, J.B. (1989). A Compa ­
rison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in 
Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are 
Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, str. 9–17. 
(12) Stankowski, L.F. Jr., Tindall, K.R. and Hsie, A.W. (1986). 
Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulpho ­
nate -and ICR 191- Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate -and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, str. 133–147. 
(13) Turner, N.T., Batson, A.G. and Clive, D. (1984). Procedures 
for the L5178Y/TK
 +/- – TK  +/- Mouse Lymphoma Cell Muta ­
genicity Assay. In: Kilbey, B.J. et al (eds.) Handbook of Muta ­
genicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New 
York, str. 239–268. 
(14) Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M., Green, M.H.L., Cole, 
J., McGregor, D.B. and Asquith, J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: 
Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, 
D.J., Ed., Cambridge University Press, str. 66–101. 
(15) Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, 
N. and Mazzaccaro, A. (1977). Induction of 6-Thioguanine- 
Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse- 
Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, str. 365–373. 
(16) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ 
Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 
str. 347–364.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 364
 
(17) Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G. and 
Brown M.M.M. (1979). Validation and Characterization of 
the L5178Y/TK  +/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System. 
Mutat. Res., 59, str. 61–108. 
(18) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the 
Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, str. 
173–215. 
(19) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., 
Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alterna ­
tives to Aroclor 1254 – Induced S9 in  In Vitro  Genotoxicity 
Assays. Mutagenesis, 7, str. 175–177. 
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Clive, K. and Sugimura, T. 
(1976). A Safe Substitute Mavournin, Polychlorinated Biphe ­
nyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In:  In 
Vitro  Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, 
F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. 225-251. Philpot, R.M. (eds), 
Elsevier, North-Holland, str. 85–88. 
(21) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/ 
HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Ti če, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). 
Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, 
str. 91–103. 
(22) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). 
Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on 
Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the 
CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, str. 795–801. 
(23) Applegate, M.L., Cell/Hypoxanthine-Guanine M.M., Broder, 
C.B., Burrell, A. and Hozier, J.C. (1990). Molecular Dissection 
of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in 
Mouse Lymphoma Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, str. 51–55. 
(24) Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C, Howard, B.E., Batson, 
A.G., Turner, N.T. and Sawyer, J. (1985). Analysis of Trifluo ­
rothymidine-Resistant (TFT
 1 ) Mutants of L5178Y/TK  +/- Mouse 
Lymphoma Cells. Mutation Res., 151, str. 161–174. 
(25) Yandell, D.W., Dryja, T.P. and Little, J.B. (1990). ICR 
Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous 
Autosomal 191-Induced in Human Cells. Mutation Res., 229, 
str. 89–102. 
(26) Moore, M.M. and Doerr, C.L. (1990). Comparison of Chro ­
mosome Aberration Frequency L5178Y/TK  +/- Small-Colony 
TK +/- Mutant Frequency in L5178Y/TK  +/- -3.7.2C Mouse 
Lymphoma Cells. Mutagenesis, 5, str. 609–614.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 365
 
B.18  OKVARE IN POPRAVLJANJE DNK – NENA ČRTNA SINTEZA 
DNK – SESALSKE CELICE  IN VITRO  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Glej Splošni uvod dela B.  
1.2 OPREDELITEV POJMOV 
Glej Splošni uvod dela B.  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Jih ni.  
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Preskus nena črtne sinteze DNK meri repaturno sintezo DNK po 
izrezu in odstranitvi dela DNK, ki vsebuje mesto okvare, ki so jo 
inducirali kemijski in fizikalni povzro čitelji. Preskus temelji na vklju ­ 
čitvi timidina, ozna čenega s tritijem (  3 H-TdR), v DNK sesalskih 
celic, ki niso v fazi S celi čnega ciklusa. Sprejem H-TdR se lahko 
določi z avtoradiografijo ali teko činskim scintilacijskim štetjem 
(LSC) DNK iz tretiranih celic. Sesalske celice v kulturi, razen če 
se ne uporabljeni primarnih podganjih hepatocitov, se tretirajo s preskusnim sredstvom z ali brez eksogenega metabolnega aktivacij ­
skega sistema. Nena črtno sintezo DNK je mogo če meriti tudi v  in 
vivo sistemih.
 
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Jih ni.  
1.6 OPIS PRESKUSNE METODE  
Priprave  
Preskusne kemikalije in kontrolne ali referen čne snovi je treba 
pripraviti na rastnem gojiš ču ali pa raztopiti ali suspendirati v 
ustreznih nosilcih ter nato še nadalje razred čiti v rastnem gojiš ču 
za uporabo v preskusu. Kon čna koncentracija nosilca naj ne vpliva 
na sposobnost preživetja celic. 
V preskusu je mogo če uporabiti primarne kulture podganjih hepato ­
citov, človeške limfocite ali stabilizirane celi čne linije (npr. človeške 
diploidne fibroblaste). 
Celice je treba izpostaviti preskusni kemikaliji v prisotnosti in v 
odsotnosti ustreznega metabolnega aktivacij skega sistema.  
Preskusni pogoji  
Š t e v i l o k u l t u r 
Za vsako preskusno to čko sta potrebni najmanj dve celi čni kulturi za 
avtoradiografijo in šest kultur (ali manj, če je to znanstveno uteme ­
ljeno) za dolo čitev nena črtne sinteze DNK s teko činskim scintilacij ­
skim štetjem.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 366
 
U p o r a b a n e g a t i v n i h i n p o z i t i v n i h k o n t r o l 
V vsak preskus je treba hkrati vklju čiti pozitivne in negativne (netre ­
tirane in/ali kontrole nosilca) kontrole z in brez metabolne aktivacije. 
Primeri pozitivnih kontrol za preskus podganjih hepatocitov vklju ču­
jejo 7,12- dimetil benzantracen (7,12-DMBA) ali 2-acetilaminof ­
luoren (2-AAF). V primeru stabiliziranih celi čnih linij je 4-nitroki ­
nolin-N-oksid (4-NQO) primer pozitivne kontrole za avtoradiografski preskus in preskus teko činskega scintilacijskega štetja, ki sta opra ­
vljena brez metabolne aktivacije; N-dimetil nitrosamin je primer 
spojine pozitivne kontrole kadar se uporabi metabolni aktivacijski 
sistem.
 
K o n c e n t r a c i j e i z p o s t a v l j e n o s t i 
Uporabiti je treba ve č koncentracij preskusne snovi v obmo čju, 
ustreznem za opredelitev odziva. Najvišja koncentracija mora sprožiti 
nekaj citotoksi čnih učinkov. Snovi, relativno netopne v vodi, je treba 
preskušati do meje njihove topnosti. Za dobro vodotopne nestrupene snovi je treba zgornjo koncentracijo preskusne kemikalije dolo čiti od 
primera do primera.
 
C e l i c e 
Za vzdrževanju kultur je treba uporabiti ustrezno rastno gojiš če, CO  2 
koncentracijo, temperaturo in vlažnost. Stabilizirane celi čne linije je 
treba redno preverjati za okužbo z mikoplazmo.  
M e t a b o l n a a k t i v a c i j a 
Sistem metabolne aktivacij e se s kulturami primarnih hepatocitov ne 
uporablja. Stabilizirane celi čne linije in limfociti se izpostavijo 
preskusni snovi v prisotnosti in v odsotnosti ustreznega metabolnega aktivacij skega sistema.
 
Postopek  
P r i p r a v a k u l t u r 
Stabilizirane celi čne linije se pridobijo iz založnih kultur (npr. s 
tripsinizacijo ali z otresanjem), nacepljenih v posodah za kulture v 
primerni gostoti in inkubiranih pri 37  o C. 
Kratkotrajne kulture podganjih hepatocitov se dolo čijo tako, da se 
sveže ločenim hepatocitom v ustreznem gojiš ču omogo či pritrditev 
na rastno podlago. 
Kulture človeških limfocitov se pripravijo z uporabo ustreznih 
tehnik.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 367
 
T r e t i r a n j e k u l t u r s p r e s k u s n o s n o v j o  
Primarni podganji hepatociti  
Sveže izolirane podganje hepatocite se primerno dolgo tretira s 
preskusno snovjo na gojiš ču, ki vsebuje  3 H-TdR. Na koncu obdobja 
tretiranja je treba celice odstraniti z gojiš ča, in ji nato sprati, fiksirati 
in posušiti. Stekelca je treba potopiti v avtoradiografsko emulzijo 
(kot alternativo se lahko uporabi tudi odstranjevalni film), izpostaviti, razviti, obarvati in prešteti.
 
Stabilizirane celi čne linije in limfociti  
Avtoradiografske tehnike: celi čne kulture se ustrezno dolgo izposta ­
vijo preskusni snovi, čemur sledi tretiranje s  3 H-TdR. Čas določa 
narava snovi, aktivnost metabolnih sistemov in tip celic. Da bi odkrili vrhunec nena črtne sinteze DNK, je treba
 3 H-TdR dodati 
bodisi isto časno s preskusno snovjo bodisi nekaj minut po izposta ­
vljenosti preskusni snovi. Na izbiro med tema dvema postopkoma bodo vplivale možne interakcije med preskusno snovjo in
 3 H-TdR. 
Da bi lo čili med nena črtno sintezo DNK in semikonzervativnim 
podvajanjem DNK je mogo če slednje inhibirati, na primer, z uporabo 
gojišča brez arginina, nizke vsebnosti seruma ali hidroksiuree na 
gojišču. 
Meritve nena črtne sinteze DNK s teko činskim scintilacijskim štet ­
jem: Pred tretiranjem s preskusno snovjo je treba vstop celic v fazo S 
blokirati, kot je opisano zgoraj; celice je nato treba izpostaviti 
preskusni kemikaliji, kot je opisano v primeru avtoradiografije. Na koncu inkubacijskega obdobja je treba DNK ekstrahirati iz celic in določiti celotno vsebino DNK ter obseg vklju čitve
 3 H-TdR. 
Treba je upoštevati, da je pri uporabi človeških limfocitov v zgoraj 
navedenih tehnikah prepre čevanje semikonzervativega podvajanja 
DNK v nestimuliranih kulturah nepotrebno.  
Analiza  
A v t o r a d i o g r a f s k e d o l o č i t v e  
Pri določanju nena črtne sinteze DNK v celicah v kulturi se jedra faze 
S ne štejejo. Prešteti je treba najmanj 50 celic na koncentracijo. Stekelca je treba kodirati pred štetjem. Na vsakem stekelcu je treba prešteti ve č široko lo čenih poljubnih polj. Koli čino vključenega
 
3 H-TdR v citoplazmi je treba dolo čiti s preštevanjem treh podro čij 
velikosti jedra v citoplazmi vsake preštete celice.  
D o l o č i t v e s t e k o č i n s k i m s c i n t i l a c i j s k i m š t e t j e m 
Pri določanju nena črtne sinteze DNK s teko činskim scintilacijskim 
štetjem je treba pri vsaki koncentraciji in v kontrolah uporabiti 
ustrezno število kultur.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 368
 
Vse rezultate je treba potrditi v neodvisnem preskusu.  
2. PODATKI  
Podatki se povzamejo v obliki tabele.  
2.1 AVTORADIOGRAFSKE DOLO ČITVE 
Obseg vklju čitve  3 H-TdR v citoplazmi in število zrnc, najdenih na 
celičnem jedru, je treba zabeležiti posebej. 
Za opis porazdelitve obsega vklju čitve  3 H-TdR v citoplazmi in 
število zrnc na jedro se lahko uporabi sredina, mediana in modus.  
2.2 DOLO ČITVE S TEKO ČINSKIM SCINTILACIJSKIM ŠTETJEM 
Za namen dolo čitev s teko činskim scintilacijskim štetjem je treba 
vključitev  3 H-TdR prikazati kot dpm/ μg DNK. Srednja vrednost 
dpm/μg DNK s standardno deviacijo se lahko uporabi za opis poraz ­
delitve vklju čitve. 
Podatke je treba oceniti z uporabo ustreznih statisti čnih metod.  
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Če je mogo če, se v poro čilo o preskusu glede na tip izvajane študije 
vključijo naslednji podatki: 
— uporabljene celice, gostoto in število pasaž v času obdelave, 
število celi čnih kultur, 
— uporabljene metode za vzdrževanje celi čnih kultur, vklju čno z 
gojiščem, temperaturo in koncentracijo CO  2 , 
— preskusna snov, nosilec, koncentracije in utemeljitev izbora 
koncentracij, uporabljenih v preskusu, 
— podrobnosti o metabolnem aktivacijskem sistemu, 
— program tretiranja, 
— pozitivne in negativne kontrole, — uporabljena avtoradiografska tehnika, — uporabljeni postopki za blokiranje vstopa celic v fazo S, 
— uporabljeni postopki za ekstrakcijo DNK in dolo čanje celotne 
vsebine DNK pri dolo čitvah s teko činskim scintilacijskim štet ­
jem, 
— razmerje odmerek/odziv, kadar je to mogo če, 
— statisti čna ocena, 
— obravnava rezultatov, — razlaga rezultatov.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 369
 
3.2 OCENA IN RAZLAGA 
Glej Splošni uvod dela B.  
4. VIRI  
Glej Splošni uvod dela B.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 370
 
B.19  PRESKUS IZMENJAVE SESTRSKIH KROMATID  IN VITRO  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Glej Splošni uvod dela B.  
1.2 OPREDELITEV POJMOV 
Glej Splošni uvod dela B.  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Jih ni.  
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Preskus izmenjave sestrskih kromatid (SCE) je kratkotrajni preskus 
za odkrivanje recipro čnih izmenjav DNK med sestrskima kromati ­
dama kromosoma, ki se podvaja. Izmenjava sestrskih kromatid pred ­
stavlja izmenjavo produktov podvajanja DNK na na videz homolo ­
gnih lokusih. Proces izmenjave predvidoma zajema razpad in ponovno združitev DNK, čeprav je malo poznanega o njegovi mole ­
kularni osnovi. Za odkrivanje izmenjav sestrskih kromatid je 
potrebnih nekaj na činov diferencialnega ozna čevanja sestrskih 
kromatid, to pa se lahko doseže z vklju čitvijo bromdeoksiuridina 
(BrdU) v kromosomsko DNK za dva celi čna cikla. 
Sesalske celice  in vitro  se izpostavijo preskusni kemikaliji z ali brez 
sesalskega eksogenega metabolnega aktivacijskega sistema, če je to 
primerno, in se jih goji skozi dva cikla podvajanja na gojiš ču, ki 
vsebuje BrdU. Po obdelavi z inhibitorjem delitvenega vretena (npr. s kolhicinom), da bi se celice akumulirale v metafazi mitoze (C-meta ­
faza), se celice spravijo in opravijo kromosomske priprave.
 
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Jih ni.  
1.6 OPIS PRESKUSNE METODE  
Priprave  
— V preskusu je mogo če uporabiti primarne kulture, ( človeške 
limfocite) ali stabilizirane celi čne linije (npr. celice jaj čnikov 
kitajskega hr čka). Celične linije je treba preveriti za okužbo z  
mikoplazmo . 
— Uporabiti je treba ustrezno gojiš če in inkubacijske pogoje (npr. 
temperatura, posode za gojitev, koncentracija CO  2 in vlažnost). 
— Preskusne snovi se lahko pripravijo na gojiš ču ali raztopijo ali 
suspendira v ustreznih nosilcih pred tretiranjem celic. Kon čna 
koncentracija nosilca v gojitvenem sistemu ne sme bistveno vpli ­
vati na sposobnost preživetja celic ali stopnjo rasti, vplive na 
frekvenco izmenjav sestrskih kromatid pa je treba spremljati z 
uporabo kontrole s topilom.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 371
 
— Celice je treba izpostaviti preskusni snovi v prisotnosti in v 
odsotnosti sesalskega metabolnega aktivacijskega sistema. 
Kadar pa so uporabljeni tipi celic z endogeno metabolno aktiva ­
cijo, morata stopnja in narava aktivnosti ustrezati kemijskemu razredu, ki se preskuša.
 
Preskusni pogoji  
Š t e v i l o k u l t u r 
Za vsako preskusno to čko je potrebno uporabiti najmanj en dvojnik 
kultur.  
U p o r a b a n e g a t i v n i h i n p o z i t i v n i h k o n t r o l 
V vsak preskus je treba vklju čiti pozitivne kontrole z uporabo nepo ­
sredno delujo če spojine in spojine, ki zahteva aktivacijo presnove; 
uporabiti je treba tudi kontrolo nosilca. 
Primeri snovi, ki jih je mogo če uporabiti kot pozitivne kontrole, so 
naslednji: 
— neposredno delujo če spojine: 
— etilmetansulfonat, 
— posredno delujo če spojine: 
— ciklofosfamid. 
Kadar je primerno, se lahko vklju či dodatna pozitivna kontrola 
enakega kemijskega razreda, kot je preskušana kemikalija.  
K o n c e n t r a c i j e i z p o s t a v l j e n o s t i 
Uporabiti je treba najmanj tri ustrezno razporejene koncentracije 
preskusne snovi. Najvišja koncentracija mora povzro čiti opazne stru ­
pene učinke, vendar mora še vedno omogo čati ustrezno podvajanje 
celic. Snovi, relativno netopne v vodi, je treba preskušati do meje 
njihove topnosti z uporabo ustreznih postopkov. Za dobro vodotopne 
nestrupene snovi je treba zgornjo koncentracijo preskusne snovi določiti od primera do primera.
 
Postopek  
P r i p r a v a k u l t u r 
Stabilizirane celi čne linije se pridobijo iz založnih kultur (npr. s 
tripsinizacijo ali z otresanjem), nacepljenih v gojitvenih posodah v 
primerni gostoti in inkubiranih pri 37  o C. V primeru enoplastnih 
kultur je treba število celic na gojitveno posodo prilagoditi tako, da kulture v času spravila niso konfluentne za dosti ve č kot 50 %. 
Uporabijo pa se lahko tudi celice v suspenzijski kulturi. Kulture 
človeških limfocitov se z uporabo ustreznih tehnik pridobijo iz hepa ­
rinizirane krvi in inkubirajo pri 37
 o C. ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 372
 
T r e t i r a n j e 
Celice v eksponentni fazi rasti se ustrezno dolgo izpostavijo 
preskusni snovi; v ve čini primerov je u činkovito že ena do dve 
uri, vendar pa se lahko v nekaterih primerih čas obdelave podaljša 
do dveh zaklju čenih celi čnih ciklov. Celice, ki nimajo zadostne 
endogene metabolne aktivacije, je treba izpostaviti preskusni snovi 
v prisotnosti in odsotnosti ustreznega sistema metabolne aktivacije. Na koncu obdobja izpostavljenosti se s celic spere preskusna snov in celice se gojijo skozi dva cikla podvajanja v prisotnosti BrdU. Lahko 
pa se uporabi tudi drugi postopek, v katerem se celice isto časno 
izpostavljajo preskusni kemikaliji in BrdU za celoten čas gojitve 
dveh celi čnih ciklov. 
Kulture človeških limfocitov se tretirajo v semisinhronih pogojih. 
Celice se analizirajo v njihovi drugi delitvi po tretiranju, s čimer se 
zagotovi, da so bile najob čutljivejše faze celi čnega ciklusa izposta ­
vljene kemikaliji. Vse kulture, ki jim je dodan BrdU, se obdelajo v 
temi ali pri zasen čeni razbeljeni svetlobi žarnic do spravila celic, da 
bi se kolikor je mogo če zmanjšala fotoliza DNK, ki vsebuje BrdU.
 
S p r a v i l o c e l i c 
Celične kulture se obdelajo z inhibitorjem delitvenega vretena (npr. s 
kolhicinom) eno do štiri ure pred spravilom. Vsaka kultura se za pripravo kromosomov spravi in predela posebej.
 
P r i p r a v a i n o b a r v a n j e k r o m o s o m o v 
Pripravki kromosomov se pridobijo s standardnimi citogenetskimi 
tehnikami. Obarvanje stekelc, za prikaz izmenjav sestrskih kromatid, je mogoče opraviti z ve č tehnikami (npr. fluorescenca plus Giemsa 
metoda).
 
A n a l i z a 
Število analiziranih celic naj temelji na spontani frekvenci izmenjave 
sestrskih kromatid v kontroli. Obi čajno se za izmenjavo sestrskih 
kromatid analizira najmanj 25 dobro razvitih metafaz na kulturo. Stekelca se kodirajo pred analizo. Pri človeških limfocitih se anali ­
zirajo le metafaze, ki vsebujejo 46 centromerov. Pri stabiliziranih 
celičnih linija se analizirajo le metafaze, ki vsebujejo ± 2 centromera 
modalnega števila. Navesti je treba ali je centrom eri čna zamenjava 
oznake zabeležena kot izmenjava sestrskih kromatid. Rezultate je 
treba potrditi z neodvisnim preskusom.
 
2. PODATKI  
Podatki se povzamejo v obliki tabele. Za vsako obdelano in 
kontrolno kulturo posebej je treba navesti število izmenjav sestrskih kromatid za vsako metafazo in število sestrskih kromatid na 
kromosom za vsako metafazo. 
Podatke je treba oceniti z uporabo ustreznih statisti čnih metod.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 373
 
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Če je mogo če, se v poro čilo o preskusu glede na tip izvajane študije 
vključijo naslednji podatki: 
— uporabljene celice, metode vzdrževanja celi čne kulture, 
— preskusni pogoji: sestava gojiš ča, koncentracija CO  2 , koncentra ­
cija preskusne snovi, uporabljen nosilec, inkubacijska tempera ­
tura, čas tretiranja, uporabljen inhibitor delitvenega vretena, 
njegova koncentracija in trajanje tretiranja z njim, tip uporablje ­
nega sesalskega aktivacijskega metabolnega sistema, pozitivne in 
negativne kontrole, 
— število celi čnih kultur na preskusno to čko, 
— podrobnosti uporabljene tehnike za pripravo stekelc, — število analiziranih metafaz (podatki, podani za vsako kulturo 
posebej), 
— srednje število izmenjave med sestrskimi kromatidami na celico 
in na kromosom (podatki, podani za vsako kulturo posebej), 
— merila za štetje izmenjav sestrskih kromatid, — utemeljitev izbora odmerka, — razmerje odmerek-odziv, če je to primerno, 
— statisti čna ocena, 
— obravnava rezultatov, — razlaga rezultatov.
 
3.2 OCENA IN RAZLAGA 
Glej Splošni uvod dela B.  
4. VIRI  
Glej Splošni uvod dela B.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 374
 
B.20  PRESKUS SPOLNO VEZANE RECESIVNE SMRTNOSTI NA  
DROSOPHILA MELANOGASTER  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Glej Splošni uvod dela B.  
1.2 OPREDELITEV POJMOV 
Glej Splošni uvod dela B.  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Jih ni.  
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Preskus spolno vezane recesivne smrtnosti (SLRL) z uporabo  
Drosophile melanogaster  odkriva pojavnost mutacij, in sicer to čka­
stih mutacij in majhnih delecij, v zarodni liniji žuželke. Ta preskus je 
preskus napredne mutacije, ki je sposoben odkriti mutacije na približno 800 lokusih kromosoma X; to predstavlja približno 80 % vseh lokusov kromosoma X. Kromosom X predstavlja približno eno 
petino celotnega haploidnega genoma. 
Mutacije v kromosomu X  Drosophile melanogaster  se fenotipi čno 
izražajo na samcih, ki nosijo mutantni gen. Kadar je mutacija v hemizigotnih pogojih letalna, se na njeno prisotnost sklepa iz odsot ­
nosti enega razreda zaroda samcev od dveh, ki jih obi čajno proiz ­
vede heterozigotna samica. Preskus spolno vezane recesivne smrtnosti izkoriš ča ta dejstva s pomo čjo posebej ozna čenih in razpo ­
rejenih kromosomov.
 
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Jih ni.  
1.6 OPIS PRESKUSNE METODE  
Priprave  
Z a l o g e 
Uporabijo se lahko samci natan čno opredeljenih zalog divjega tipa in 
samice zaloge seva Muller-5. Lahko pa se uporabijo tudi zaloge samic, ki so primerno ozna čene z večkrat invertiranim kromosomom X.
 
P r e s k u s n a s n o v 
Preskusne snovi je treba raztopiti v vodi. V vodi netopne snovi, se 
lahko raztopijo ali suspendirajo v ustreznih nosilcih (npr. mešanica etanola in Tween-60 ali 80), nato pa pred dajanjem razred čijo v vodi 
ali raztopini soli. Za nosilec naj se ne uporablja dimetilsulfoksid 
(DMSO).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 375
 
Š t e v i l o ž i v a l i 
Preskus je treba zasnovati z vnaprej dolo čeno občutljivostjo in 
močjo. Frekvenca spontanih mutacij, opažena v ustrezni kontroli, 
bo vplivala na število tretiranih kromosomov, ki morajo biti analizi ­
rani. 
N a č i n d a j a n j a 
Izpostavljenost je lahko oralna, z injekcijo ali pa se živali izpostavijo 
plinom ali hlapom. Hranjenje s preskusno snovjo se lahko opravi z raztopino sladkorja. Kadar je potrebno, se lahko snovi raztopijo v 0,7 % raztopini NaCl in vbrizgnejo v prsni koš ali trebuh.
 
U p o r a b a n e g a t i v n i h i n p o z i t i v n i h k o n t r o l 
Vključiti je treba negativne (nosilec) in pozitivne kontrole. Če pa so 
na razpolago ustrezni laboratorijski pretekli kontrolni podatki, sočasne kontrole niso potrebne.
 
S t o p n j e i z p o s t a v l j e n o s t i 
Uporabiti je treba tri stopnje izpostavljenosti. Za predhodno oceno se 
lahko uporabi ena stopnja izpostavljenosti preskusni snovi, ki je bodisi maksimalna tolerirana koncentracija ali ki kaže nekaj znakov strupenosti. V primeru nestrupenih snovi je treba uporabiti izposta ­
vljenost maksimalnim izvedljivim koncentracijam.
 
P o s t o p e k 
Samci divjega tipa (stari tri do pet dni) se tretirajo s preskusno 
snovjo in parijo posamezno s presežnim številom samic, ki se še 
niso parile, iz zaloge Muller-5 ali iz druge zaloge, ustrezno ozna čene 
(z večkrat invertiranim kromosomom X). Samice se vsake dva do tri 
dni zamenjajo s takimi, ki se še niso parile, da se pokrije celoten cikel zarodnih celic. Na zarodu teh samic se zabeležijo letalni u činki, 
ki ustrezajo u činkom na zrelo spermo, spermatide srednje in zadnje 
faze, zgodnje spermatide, spermatocite in spermatogonije v času 
tretiranja. 
Heterozigotnim samicam F
 1 iz zgoraj navedenih križanj se omogo či 
posamezno parjenje (tj. ena samica na fiolo) s svojimi brati. V 
generaciji F  2 se pri vsaki kontroli zabeleži odsotnost samcev divjega 
tipa. Če se izkaže, da je kultura nastala iz samice F  1 , ki v staršev ­
skem kromosomu X nosi letalni gen (tj. ne opazi se samcev z treti ­
ranim kromosomom), je treba potomke te samice z enakim geno ­
tipom preskušati, da bi se ugotovilo, ali se smrtnost ponovi v 
naslednji generaciji.  
2. PODATKI  
Podatki se povzamejo v obliki tabele, da se pokaže število presku ­ 
šanih kromosomov X, število neplodnih samcev in število letalnih kromosomov pri vsaki koncentraciji izpostavljenosti in za vsako obdobje parjenja vsakega posameznega tretiranega samca. Navesti 
je treba število skupin razli čnih velikosti na vsakega samca. Nave ­
dene rezultate je treba potrditi v posebnem preskusu.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 376
 
Pri oceni preskusov spolno vezane recesivne smrtnosti je treba 
uporabiti ustrezne statisti čne metode. Treba je upoštevati in z 
ustrezno statisti čno metodo oceniti kopi čenje recesivnih letalnih 
genov, ki izhajajo od enega samca.  
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Če je mogo če, se v poro čilo o preskusu glede na tip izvajane študije 
vključijo naslednji podatki: 
— zaloga: zaloge Drosophila ali uporabljeni sevi, starost žuželk, 
število tretiranih samcev, število sterilnih samcev, število stabili ­
ziranih F  2 kultur, število F  2 kultur brez potomcev, število kromo ­
somov, ki nosijo letalni gen, opaženo v vsaki fazi zarodne celice, 
— merila dolo čanja velikosti tretiranih skupin, 
— preskusni pogoji: podroben opis programa tretiranja in vzor čenja, 
stopnje izpostavljenosti, podatki o strupenosti, negativne (topilo) in pozitivne kontrole, če je to primerno, 
— merila za štetje letalnih mutacij,, — razmerje izpostavljenost/u činek, kjer je mogo če, 
— ocena podatkov, — obravnava rezultatov, — razlaga rezultatov.
 
3.2 OCENA IN RAZLAGA 
Glej Splošni uvod dela B.  
4. VIRI  
Glej Splošni uvod dela B.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 377
 
B.21  PRESKUSI CELI ČNE TRANSFORMACIJE SESALSKIH CELIC  
IN VITRO  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Glej Splošni uvod dela B.  
1.2 OPREDELITEV POJMOV 
Glej Splošni uvod dela B.  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Jih ni.  
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Za odkrivanje fenotipskih sprememb  in vitro,  ki jih inducirajo 
kemijske snovi, povezane z maligno transformacijo  in vivo,  se 
lahko uporabijo sistemi sesalskih celi čnih kultur. Med splošno upora ­
bljane celice spadajo C3H10T  1/2 , 3T3, SHE in podgane Fischer, 
preskusi pa temeljijo na spremembah v celi čni morfologiji, obliko ­
vanju žariš č ali spremembah na izgubi pritrjevalne odvisnosti celic v 
poltrdnem agarju. Obstajajo tudi redkeje uporabljani sistemi, ki 
odkrivajo fiziološke ali morfološke spremembe v celicah po izposta ­
vljenosti rakotvornim kemikalijam. Niti eden od ciljnih u činkov 
preskusa  in vitro  nima dolo čene mehanisti čne povezave z rakom. 
Nekateri preskusni sistemi lahko odkrijejo promotorje tumorjev. 
Citotoksičnost se lahko dolo či z merjenjem u činka preskusnega 
materiala na sposobnosti tvorbe kolonij (u činkovitost kloniranja) ali 
na stopnje rasti kultur. Namen merjenja citotoksi čosti je ugotoviti, ali 
je bila izpostavljenost preskusni kemikaliji toksikološko relevantna, 
ni pa mogo če z njim izra čunati frekvenco transformacije v vseh 
preskusih, saj lahko nekateri vsebujejo podaljšano inkubacijo in/ali ponovni razmaz na ploš če.
 
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Jih ni.  
1.6 OPIS PRESKUSNE METODE  
Priprave  
C e l i c e 
Odvisno od uporabljanega preskusa transformacije je na voljo niz 
celičnih linij ali primarnih celic. Raziskovalec mora zagotoviti, da 
celice v opravljanem preskusu kažejo ustrezno fenotipsko spre ­
membo po izpostavljenosti znanim rakotvornim snovem in da sta 
veljavnost in zanesljivost preskusa, ki se ga opravlja v raziskoval ­ 
čevem laboratoriju, dokazljivi in dokumentirani.  
G o j i š č e 
Uporabiti je treba gojiš ča in preskusne pogoje, ki ustrezajo izvaja ­
nemu preskusu transformacije.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 378
 
P r e s k u s n a s n o v 
Preskusne snovi se lahko pripravijo v gojiš ču ali raztopijo ali suspen ­
dirajo v ustreznih nosilcih tik pred tretiranjem celic. Kon čna koncen ­
tracija nosilca v gojitvenem sistemu ne sme vplivati na sposobnost preživetja celic, stopnjo rasti ali pojav transformacije.
 
M e t a b o l n a a k t i v a c i j a 
Celice je treba izpostaviti preskusni snovi v prisotnosti in v odsot ­
nosti ustreznega metabolnega aktivacijskega sistema. Kadar pa so 
uporabljeni tipi celic z endogeno metabolno aktivacijo, se je treba prepričati, da narava aktivnosti ustreza kemijskemu razredu, ki se 
preskuša.
 
Preskusni pogoji  
U p o r a b a n e g a t i v n i h i n p o z i t i v n i h k o n t r o l 
V vsak preskus je treba vklju čiti pozitivne kontrole z uporabo nepo ­
sredno delujo če spojine ter spojine, ki zahteva metabolno aktivacijo; 
uporabiti je treba tudi negativno kontrolo (nosilec). 
Primeri snovi, ki jih je mogo če uporabiti kot pozitivne kontrole, so 
naslednji: 
— Neposredno delujo če kemikalije: 
— etilmetansulfonat, 
— β-propiolakton. 
— Spojine, ki zahtevajo aktivacijo presnove: 
— 2-acetilaminofluoren, 
— 4-dimetil aminoazobenzen, 
— 7,12-dimetilbenzantracen. 
Kadar je primerno, je treba vklju čiti dodatno pozitivno kontrolno 
enakega kemijskega razreda, kot je preskušana spojina.  
K o n c e n t r a c i j e i z p o s t a v l j e n o s t i 
Uporabiti je treba nekaj koncentracij preskusne snovi. Te koncen ­
tracije morajo povzro čiti s koncentracijo povezane u činke strupeno ­
sti, pri čemer najvišja koncentracija povzro ča nizko stopnjo prežive ­
tja, preživetje v najnižji koncentraciji pa mora biti približno enako kot v negativni kontroli. Snovi, relativno netopne v vodi, je treba preskušati do meje njihove topnosti z uporabo ustreznih postopkov. 
Za dobro vodotopne nestrupene snovi je treba zgornjo koncentracijo 
preskusne snovi dolo čiti od primera do primera.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 379
 
Postopek  
Celice je treba izpostaviti za ustrezno obdobje, odvisno od upora ­
bljenega preskusnega sistema, to pa lahko pri podaljšani izpostavlje ­
nosti vklju čuje ponovno dajanje odmerka ob spremembi gojiš ča (in, 
če je potrebno, sveže mešanice za metabolno aktivacijo). Celice, ki 
nimajo zadostne endogene metabolne aktivacije, je treba izpostaviti 
preskusni snovi v prisotnosti in odsotnosti ustreznega metabolnega aktivacijskega sistema. Na koncu obdobja izpostavljenosti se s celic spere preskusna snov in celice se gojijo v pogojih, ki ustrezajo 
spremljanemu transformiranega fenotipa ter pojavnosti nekatere 
transformacije. Vsi rezultati se potrdijo v neodvisnem preskusu.
 
2. PODATKI  
Podatki se povzamejo v obliki tabele, ti pa so lahko zelo razli čni, 
odvisno od uporabljenega preskusa, npr. število kolonij ali žariš č na 
ploščo, pozitivne ploš če ali število transformiranih celic. Kadar je 
primerno, je treba preživetje izraziti kot odstotek kontrolne stopnje in 
frekvence transformacij izražene s številom transformantov na število preživelih celic. Podatke je treba oceniti z uporabo ustreznih stati ­
stičnih metod.
 
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Če je mogo če, se v poro čilo o preskusu glede na tip izvajane študije 
vključijo naslednji podatki: 
— uporabljen tip celic, število celi čnih kultur, metode vzdrževanja 
celičnih kultur, 
— preskusni pogoji: koncentracija preskusne snovi, uporabljen nosi ­
lec, inkubacijski čas, trajanje in frekvenca tretiranja, gostota celic 
v času tretiranja, tip uporabljenega eksogenega metabolnega akti ­
vacijskega sistema, pozitivne in negativne kontrole, dolo čitev 
spremljanega fenotipa, uporabljen selektivni sistem ( če je primer ­
no), utemeljitev izbora odmerka, 
— metoda preštevanja živih in transformiranih celic, 
— statisti čna ocena, 
— obravnava rezultatov, — razlaga rezultatov.
 
3.2 OCENA IN RAZLAGA 
Glej Splošni uvod dela B.  
4. VIRI  
Glej Splošni uvod dela B.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 380
 
B.22  PRESKUS DOMINANTNE SMRTNOSTI NA GLODALCIH  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Glej Splošni uvod dela B.  
1.2 OPREDELITEV POJMOV 
Glej Splošni uvod dela B.  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Jih ni.  
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Učinki dominantne smrtnosti povzro čajo embrionalno ali fetalno 
smrt. Indukcija dominantno letalnih genov zaradi izpostavljenosti kemijski snovi kaže, da snov deluje na zarodno tkivo preskusnih 
vrst. Na splošno velja, da so dominantni letalni geni posledica 
kromosomske okvare (strukturne in numeri čne anomalije). Če gre 
za tretiranje samic, so lahko embrionalne smrti tudi posledica stru ­
penih učinkov. 
Na splošno se samci izpostavijo preskusni spojini in parijo z netre ­
tiranimi samicami, ki se še niso parile. Preskušajo se lahko razli čni 
stadiji zarodnih celic lo čeno, z zaporednimi intervali parjenja. Porast 
števila mrtvih ugnezditev na samico v tretirani skupini nad številom 
mrtvih ugnezditev na samico v kontrolni skupini kaže na izgubo po ugnezditvi. Izguba pred ugnezditvijo se lahko oceni na podlagi števil corpora lutea ali s primerjavo skupnega števila ugnezditev na samico 
v preskusni in kontrolni skupini. Skupen dominantni letalni u činek je 
vsota izgub pred in po ugnezditvi. Izra čun skupnega dominantnega 
smrtnega u činka temelji na primerjavi živih ugnezditev na samico v 
preskusni skupini z živimi ugnezditvami na samico v kontrolni 
skupini. Zmanjšanje števila ugnezditev v dolo čenih presledkih je 
lahko rezultat uni čenja celic (npr. spermatocit in/ali spermatogoni ­
jev).
 
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Jih ni.  
1.6 OPIS PRESKUSNE METODE  
Priprave  
Kadar je mogo če, je treba preskusne snovi raztopiti ali suspendirati v 
izotonični raztopini soli. Kemikalije, netopne v vodi, se lahko razto ­
pijo ali suspendirajo v ustreznem nosilcu. Uporabljeni nosilec ne sme 
interferirati s preskusno kemikalijo niti povzro čati strupenih u činkov. 
Uporabiti je treba sveže pripravljene preskusne kemikalije.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 381
 
Preskusni pogoji  
N a č i n d a j a n j a 
Preskusna spojina se na splošno da le enkrat. Na podlagi toksikolo ­ 
ških podatkov je mogo če uporabiti tudi ponavljajo či program tretira ­
nja. Običajna načina dajanja sta oralna intubacija ali intraperitonealna 
injekcija. Ustrezni so tudi drugi na čini dajanja.  
P r e s k u s n e ž i v a l i 
Kot preskusne vrste se priporo čajo podgane ali miši. Naklju čno se 
izberejo zdrave in spolno popolnoma zrele živali in se razporedijo v preskusne in kontrolne skupine.
 
Š t e v i l o i n s p o l 
Uporabiti je treba ustrezno število tretiranih samcev, da se lahko 
upošteva spontano spremembo ocenjevane biološke lastnosti. Izbrano število naj temelji na vnaprej dolo čeni občutljivosti zaznavanja in 
vrednosti zna čilnosti. Na primer, v tipi čnem preskusu bi moralo 
biti število samcev zadosti veliko, da omogo či od 30 do 50 brejih 
samic na interval parjenja.
 
U p o r a b a n e g a t i v n i h i n p o z i t i v n i h k o n t r o l 
Na splošno je treba v vsak preskus vklju čiti sočasne pozitivne in 
negativne (nosilec) kontrole. Kadar so na voljo sprejemljivi rezultati pozitivne kontrole iz preskusov, ki so bili pred kratkim izvajani v istem laboratoriju, jih je mogo če uporabiti namesto so časne pozitivne 
kontrole. Snovi pozitivne kontrole je treba uporabiti v ustrezno 
nizkem odmerku (npr. MMS, intraperitonealno, pri 10 mg/kilogram), da bi se dokazala ob čutljivost preskusa.
 
V e l i k o s t i o d m e r k a 
Običajno se uporabijo tri velikosti odmerka. Odmerek visoke veli ­
kosti mora povzro čiti znake strupenosti ali zmanjšano plodnost pri 
tretiranih živalih. V nekaterih primerih lahko zadostuje že en sam visok odmerek.
 
M e j n i p r e s k u s 
Nestrupene snovi je treba preskusiti s 5 g/kilogram pri enem samem 
odmerku ali z 1 g/kilogram/dan pri ponovljenih odmerkih.  
Postopek  
Na voljo je nekaj programov tretiranja. Preskusna snov se najpogo ­
steje daje samo enkrat. Uporabijo se lahko tudi drugi programi treti ­
ranja. 
Posamezni samci se parijo zaporedno z eno ali dvema netretiranima 
samicama, ki se še nista parili, v ustreznih časovnih presledkih po 
tretiranju. Samice je treba pustiti s samci za čas najmanj enega 
pojatvenega cikla ali dokler se ne zgodi parjenje, kar se ugotovi 
ob prisotnosti semen čec v vagini ali ob prisotnosti vaginalnega 
zamaška.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 382
 
Število parjenj po tretiranju je dolo čeno s programom tretiranja, 
zagotoviti pa je treba, da se vse faze zarodnih celic po tretiranju 
vzorčijo. 
Samice se žrtvujejo v drugi polovici brejosti, vsebina maternice pa se 
pregleda, da bi se dolo čilo število mrtvih in živih ugnezditev. Lahko 
se pregledajo tudi jaj čniki, da bi se dolo čilo število  corpora lutea . 
2. PODATKI  
Podatki se povzamejo v obliki tabele, da bi se prikazalo število 
samcev, število brejih samic in število nebrejih samic. Navesti je 
treba posamezne rezultate vsakega parjenja, vklju čno z identiteto 
vsakega samca in samice. Za vsako samico je treba zabeležiti teden parjenja, velikost odmerka, ki so ga sprejeli samci, pogostost 
živih ugnezditev in mrtve ugnezditve. 
Izračun skupnega dominantnega smrtnega u činka temelji na primer ­
javi živih ugnezditev na samico v preskusni skupini z živimi ugnez ­
ditvami na samico v kontrolni skupini. Analizira se razmerje med 
mrtvimi in živimi ugnezditvami iz tretirane skupine v primerjavi z enakim razmerjem iz kontrolne skupine, da bi se prikazala izguba po ugnezditvi. 
Iz tabel mora biti razvidno, ali podatki navedeni kot zgodnje in 
pozne smrti. Če je ocenjena izguba pred ugnezditvijo, je treba 
navesti tudi to. Izgubo pred ugnezditvijo je mogo če izračunati kot 
razliko med številom corpora lutea in številom ugnezditev ali kot zmanjšanje povpre čnega števila ugnezditev na maternico v primer ­
javi s parjenji v kontrolah. 
Podatki se ocenijo z ustreznimi statisti čnimi metodami.
 
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Če je mogo če, se v poro čilo o preskusu vklju čijo naslednji podatki: 
— vrsta, sev, starost in masa uporabljenih živali, število živali 
vsakega spola v preskusni in kontrolni skupini, 
— preskusna snov, nosilec, preskusne velikosti odmerka in uteme ­
ljitev izbora odmerka, negativne in pozitivne kontrole, podatki o 
strupenosti, 
— program dajanja in tretiranja, 
— program parjenja, 
— uporabljena metoda za dolo čitev, ali je prišlo do parjenja, 
— čas žrtvovanja, 
— merila za preštevanj e dominantnih letalnih genov, 
— razmerje odmerek/odziv, če je primerno,  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 383
 
— statisti čna ocena, 
— obravnava rezultatov, — razlaga rezultatov.
 
3.2 OCENA IN RAZLAGA 
Glej Splošni uvod dela B.  
4. VIRI  
Glej Splošni uvod dela B.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 384
 
B.23  PREIZKUS KROMOSOMSKIH ABERACIJ V 
SPERMATOGONIJIH SESALCEV  
1. METODA  
Ta metoda ustreza metodi OECD TG 483, Mammalian Spermatogo ­
nial Chromosome Aberration Test (1997).  
1.1 UVOD 
Namen preizkusa kromosomskih aberacij v sesalskih spermatogonijih  
in vivo  je določiti snovi, ki povzro čijo strukturne kromosomske 
aberacije v spermatogonijih sesalcev (1) (2) (3) (4) (5). Lo čimo 
dva tipa strukturnih aberacij, kromosomski tip in kromatidni tip. 
Večina kemičnih mutagenov povzro či aberacije kromatidnega tipa, 
nastopajo pa tudi aberacije kromosomskega tipa. Ta metoda ni name ­
njena dolo čanju numeri čnih aberacij in se navadno ne uporablja v ta 
namen. Kromosomske mutacije in podobni pojavi so vzrok številnih 
genskih bolezni pri človeku. 
S tem preizkusom se dolo čajo kromosomski pojavi v spermatogo ­
nijih in zato se pri čakuje, da preizkus napove povzro čitev dednih 
mutacij v kli čnih celicah. 
Pri tem preizkusu se redno uporabljajo glodavci. Ta citogenetski 
preizkus  in vivo  zazna kromosomske aberacije pri mitozi spermato ­
gonijev. Druge tar čne celice niso predmet te metode. 
Da se zaznajo aberacije kromatidnega tipa v spermatogonijih, naj se 
pregleda prva mitotska delitev celic po obdelavi, preden se lezije 
izgubijo v naslednjih celi čnih delitvah. Dodatne informacije o obde ­
lanih spermatogonijih se lahko pridobijo z analizo aberacij kromo ­
somskega tipa pri mejotskih kromosomih v diakinezi-metafazi I, ko 
obdelane celice postanejo spermatociti. 
Ta preizkus  in vivo  je namenjen ugotavljanju, ali so mutageni somat ­
skih celic aktivni tudi v kli čnih celicah. Poleg tega je ta preizkus na 
spermatogonijih primeren za ocenjevanje nevarnosti mutagenosti, ker omogoča upoštevanje dejavnikov presnove  in vivo,  farmakokinetike 
in popravljanja DNA. 
V modu so številne generacije spermatogonijev, ki so razli čno občut­
ljive za kemi čno obdelavo. Zaznane aberacije tako pomenijo skupni 
odziv obdelanih populacij spermatogonijev, pri čemer prevladujejo 
številnejši diferencirani spermatogoniji. Zaradi fizi čne in fiziološke 
prepreke Sertolijevih celic in prepreke med krvjo in modom so različne generacije spermatogonijev lahko izpostavljene krvnemu 
obtoku ali pa ne, odvisno od njihovega položaja v modu. 
Če obstajajo dokazi, da preizkušana snov ali reaktivni metabolit ne 
bo dosegel tar čnega tkiva, ta preizkus ni primeren. 
Glej tudi splošni uvod dela B.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 385
 
1.2 DEFINICIJE  
Aberacija kromatidnega tipa:  strukturna poškodba kromosoma, 
izražena kot prelom posameznih kromatid ali prelom in združitev med kromatidama.  
Aberacija kromosomskega tipa:  strukturna poškodba kromosoma, 
izražena kot prelom ali prelom in združitev obeh kromatid na istem 
mestu.  
Presledek:  akromatska lezija, manjša od širine ene kromatide, ob 
zelo majhni neporavnanosti kromatid.  
Numerična aberacija:  število kromosomov, druga čno od normal ­
nega števila, ki je zna čilno za uporabljene živali.  
Poliploidija:  večkratnik haploidnega števila kromosomov (n), razen 
diploidnega števila (tj.  3n, 4n in tako naprej).  
Strukturna aberacija:  sprememba v strukturi kromosoma, ki je 
vidna pri mikroskopskem pregledu metafaze celi čne delitve v obliki 
delecij, transpozicij ali recipro čnih translokacij.
 
1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Živali se primerno izpostavijo preizkušam snovi in se v primernem 
času po tretiranju žrtvujejo. Pred žrtvovanjem se živali tretirajo s 
snovjo za ustavitev metafaze (npr. kolhicinom, Colcemidom®). Nato se pripravijo in obarvajo preparati kromosomov iz kli čnih 
celic ter dolo čijo kromosomske aberacije v metafaznih celicah.
 
1.4 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.4.1  Priprave  
1.4.1.1  Izbira živalskih vrst  
Navadno se uporabljajo samci kitajskega hr čka in miši. Lahko pa se 
uporabijo tudi samci drugih ustreznih vrst sesalcev. Uporabijo naj se splošno uporabljani laboratorijski sevi mladih zdravih odraslih živali. Ob začetku študije naj bo nihanje teže živali čim manjše in naj ne 
presega ± 20 % srednje vrednosti teže.
 
1.4.1.2  Pogoji bivanja in hranjenja  
Uporabljajo se splošni pogoji iz splošnega uvoda dela B, vendar naj 
bo ciljna vlažnost 50–60 %.  
1.4.1.3  Priprava živali  
Zdravi mladi odrasli samci se naklju čno dodelijo kontrolni in treti ­
rani skupini. Kletke se razporedijo tako, da se čimbolj zmanjšajo 
možni učinki postavitve kletke. Živali se ozna čijo z enkratnimi ozna ­
kami. Živali se pred za četkom študije vsaj pet dni aklimatizirajo na 
laboratorijske razmere.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 386
 
1.4.1.4  Priprava odmerkov  
Trdne preizkušane snovi naj se pred odmerjanjem živalim raztopijo 
ali suspendirajo v ustreznih topilih ali nosilcih, in če je to primerno, 
se razred čijo. Teko če preizkušane snovi se lahko odmerijo nepo ­
sredno ali pa se pred odmerjanjem razred čijo. Uporabljajo naj se 
sveže pripravljene preizkušane snovi, razen če podatki o stabilnosti 
kažejo, da je shranjevanje sprejemljivo.  
1.4.2  Preizkusni pogoji  
1.4.2.1  Topilo/nosilec  
Topilo/nosilec naj nima toksi čnih učinkov pri uporabljenih odmerkih 
in naj se zanj ne sumi, da kemi čno reagira s preizkušano snovjo. Če 
se uporabijo manj poznana topila/nosilci, naj njihovo vklju čitev 
podpirajo podatki, ki kažejo na njihovo združljivost. Priporo ča se, 
da se, kadar koli je to mogo če, kot prva možnost preu či uporaba 
vodnega topila/nosilca.  
1.4.2.2  Kontrolni vzorci  
V vsak preizkus naj se vklju čijo sočasni pozitivni in negativni (topi ­
lo/nosilec) kontrolni vzorci. Razen tretiranja s preizkušano snovjo naj 
se z živalmi v kontrolnih skupinah ravna enako kakor s tistimi v tretiranih skupinah. 
Snovi pozitivne kontrole naj pri ravneh izpostavljenosti, pri katerih 
se pričakuje zaznavno pove čanje glede na ozadje, povzro čijo struk­
turne kromosomske aberacije v spermatogonijih  in vivo.  
Odmerki pozitivne kontrole naj se izberejo tako, da so u činki jasni, 
vendar ne razkrijejo takoj identitete kodiranih mikroskopskih prepa ­
ratov. Sprejemljivo je, da se snovi pozitivne kontrole dajejo živalim drugače kakor preizkušana snov in da se pri pozitivni kontroli vzor či 
le enkrat. Poleg tega se lahko uporabijo kemikalije pozitivne 
kontrole, ki sodijo v isto skupino nevarnosti kakor preizkušana kemi ­
kalija, kadar so na voljo. Primeri snovi pozitivne kontrole vklju ču­
jejo:
 
Snov Št. CAS Št. Einecs  
Ciklofosfamid 
Ciklofosfamid monohidrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Cikloheksilamin 108-91-8 203-629-0 
Mitomicin C 50-07-7 200-008-6 
Monomerni akrilamid 79-06-1 201-173-7 
Trietilenmelamin 51-18-3 200-083-5 
Negativni kontrolni vzorci, tretirani le s topilom ali nosilcem, 
drugače pa obravnavani enako kakor tretirane skupine, naj se vklju ­ 
čijo v vsako vzor čenje, razen če pretekli kontrolni podatki dokazu ­
jejo sprejemljivo spremenljivost med posameznimi živalmi in pogostnost celic s kromosomskimi aberacijami. Uporabijo naj se tudi netretirani kontrolni vzorci, razen če pretekli ali objavljeni 
kontrolni podatki dokazujejo, da izbrano topilo/nosilec ne povzro ča 
škodljivih ali mutagenih u činkov.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 387
 
1.5 POSTOPEK  
1.5.1  Število živali  
Vsaka tretirana in kontrolna skupina mora vklju čevati vsaj pet 
samcev, ki jih je mogo če analizirati.  
1.5.2  Program tretiranja  
Preizkušane snovi se po možnosti dajo enkrat ali dvakrat (tj. kot en 
vnos ali kot dva vnosa). Preizkušane snovi se lahko dajo tudi v razdeljenem odmerku, tj. dva vnosa v istem dnevu, ne ve č kakor 
nekaj ur narazen, da se olajša dajanje velikega volumna materiala. 
Drugačni režimi odmerjanja naj bodo znanstveno utemeljeni. 
Pri skupini z najve čjim odmerkom se vzorci vzamejo dvakrat po 
tretiranju. Ker preizkušana snov lahko vpliva na dinamiko celi čnega 
ciklusa, se vzorci vzamejo enkrat zgodaj, približno 24 ur po tretira ­
nju, in drugi č pozno, približno 48 ur po tretiranju. Pri drugih 
odmerkih naj se vzorci vzamejo 24 ur ali 1,5 dolžine celi čnega 
ciklusa po tretiranju, razen če je znano, da so drugi časi vzorčenja 
primernejši za zaznavanje u činkov (6). 
Lahko se vzamejo dodatni vzorci ob drugih časih. Na primer pri 
kemikalijah, ki bi lahko povzro čile zaostajanje kromosomov ali 
učinke, neodvisne od faze S, bi bilo lahko primerno vzor čiti bolj 
zgodaj (1). 
Ustreznost programa ponovljenega tretiranja je treba dolo čiti za vsak 
primer posebej. Po ponovljenem programu tretiranja naj se živali 
žrtvujejo 24 ur (1,5 dolžine celi čnega ciklusa) po zadnjem vnosu. 
Lahko se vzamejo dodatni vzorci ob drugih časih, kadar je to 
primerno. 
Pred žrtvovanjem se živalim intraperitonealno injicira ustrezen 
odmerek snovi za ustavitev metafaze (npr. Colcemida® ali kolhici ­
na). Živali se vzor čijo v ustreznem časovnem intervalu po tem. Pri 
miših je ta interval približno 3–5 ur, pri kitajskih hr čkih pa približno 
4–5 ur.
 
1.5.3  Velikost odmerkov  
Če se opravi študija za ugotavljanje obmo čja, ker ni na voljo 
ustreznih podatkov, naj se opravi v istem laboratoriju, na isti vrsti in sevu ter ob enakem režimu tretiranja, kakor bo to uporabljeno v glavni študiji (7). Pri toksi čnosti se za prvo vzor čenje uporabijo tri 
velikosti odmerkov. Te velikosti odmerkov naj zajamejo obmo čje od 
največje toksičnosti do majhne toksi čnosti ali netoksi čnosti. Pri 
poznejšem vzor čenju se lahko uporabi le najve čji odmerek. Najve čji 
odmerek je odmerek, ki povzro či takšne znake toksi čnosti, da se 
pričakuje, da bi ve čji odmerki pri istem režimu odmerjanja povzro čili 
smrt.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 388
 
Snovi s specifi čnim biološkim delovanjem pri majhnih netoksi čnih 
odmerkih (kakor so hormoni in mitogeni) so lahko izjeme pri merilih 
za določanje odmerka in naj se ovrednotijo za vsak primer posebej. 
Največji odmerek se lahko opredeli tudi kot odmerek, ki povzro či 
nekaj znakov toksi čnosti v spermatogonijih (npr. zmanjšanje 
razmerja med mitozami spermatogonijev v prvi in drugi mejotski 
metafazi; zmanjšanje naj ne bi preseglo 50 %).  
1.5.4  Mejni preizkus  
Če preizkus pri eni velikosti odmerka vsaj 2 000 mg/kg telesne teže/ 
dan, ki se da v enem vnosu ali v dveh vnosih v istem dnevu, ne 
povzroči nobenih opaznih toksi čnih učinkov in če se na podlagi 
podatkov o strukturno sorodnih snoveh ne pri čakuje, da bo snov 
genotoksi čna, se lahko pojmuje, da popolna študija z uporabo treh 
velikosti odmerkov ni potrebna. Pri čakovana izpostavljenost človeka 
lahko nakaže potrebo po ve čjih odmerkih pri mejnem preizkusu.  
1.5.5  Dajanje odmerkov  
Navadno se preizkušana snov daje z gavažo po želod čni cevki ali 
ustrezni intubacijski kanili ali z intraperitonealno injekcijo. Sprejem ­
ljivi so tudi drugi na čini izpostavljanja, kadar se lahko utemeljijo. 
Največji volumen teko čine, ki se lahko naenkrat da z gavažo ali 
injekcijo, je odvisen od velikosti preizkusne živali. Volumen naj 
ne presega 2 ml/100 g telesne teže. Uporabo ve čjih volumnov je 
treba utemeljiti. Razen pri dražilnih ali jedkih snoveh, ki bodo navadno povzro čile dražilne u činke pri ve čjih koncentracijah, naj 
se s prilagoditvijo koncentracije čimbolj zmanjša spremenljivost 
preizkusnega volumna, tako da se zagotovi stalni volumen pri vseh velikostih odmerkov.
 
1.5.6  Priprava kromosomov  
Takoj po žrtvovanju se iz enega ali obeh mod pridobijo celi čne 
suspenzije, se izpostavijo hipotoni čni raztopini in fiksirajo. Celice 
se nato nanesejo na objektna stekelca in obarvajo.  
1.5.7  Analiza  
Pri vsaki živali naj se analizira vsaj 100 dobro vidnih metafaz (tj. 
najmanj 500 metafaz na skupino). To število se lahko zmanjša, kadar 
se opazi veliko število aberacij. Vsi preparati, skupaj s pozitivnimi in 
negativnimi kontrolnimi vzorci, naj se pred mikroskopsko analizo neodvisno kodirajo. Ker fiksiranje pogosto povzro či pretrganje dela 
metafaz in izgubo kromosomov, naj bo število centromer v štetih 
celicah enako 2n ± 2.
 
2. PODATKI  
2.1 OBDELAVA REZULTATOV 
Podatki za posamezne živali naj bodo prikazani v tabeli. Poskusna 
enota je žival. Za vsako žival naj se dolo či število celic s struktur ­
nimi kromosomskimi aberacij ami in število kromosomskih aberacij na celico. Razli čni tipi strukturnih kromosomskih aberacij naj se 
navedejo s svojimi števili in pogostnostjo za tretirane in kontrolne 
skupine. Presledki se evidentirajo lo čeno in navedejo v poro čilu, 
vendar se na splošno ne vklju čijo v skupno pogostnost aberacij.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 389
 
Če se opazujeta mitoza, pa tudi mejoza, naj se dolo či razmerje med 
mitozami spermatogonijev v prvi in drugi mejotski metafazi kot 
merilo citotoksi čnosti za vse tretirane živali in živali negativne 
kontrole v celem vzorcu 100 dele čih se celic na žival, da se ugoto ­
vijo možni citotoksi čni učinki. Če se opazuje le mitoza, naj se dolo či 
mitotični indeks v vsaj 1 000 celicah za vsako žival.  
2.2 VREDNOTENJE IN INTERPRETACIJA REZULTATOV 
Pozitivni rezultat se lahko dolo či na podlagi številnih meril, kakor je 
na primer z odmerkom povezano pove čanje relativnega števila celic 
s kromosomskimi aberacijami ali jasno pove čanje števila celic z 
aberacijami v posamezni tretirani skupini ob posameznem vzor čenju. 
Najprej naj se preu či biološka pomembnost rezultatov. Pri vredno ­
tenju rezultatov preizkusa se kot pomo č lahko uporabijo statisti čne 
metode (8). Statisti čna značilnost naj ne bo edini odlo čilni dejavnik 
za pozitivni odziv. Dvoumni rezultati naj se razjasnijo z dodatnimi 
preizkusi, po možnosti ob prilagojenih poskusnih pogojih. 
Pojmuje se, da preizkušana snov, pri kateri rezultati ne izpolnjujejo 
navedenih meril, ni mutagena v tem preizkusu. 
Čeprav bo ve čina poskusov dala jasne pozitivne ali negativne rezul ­
tate, bodo v redkih primerih dobljeni podatki prepre čili zanesljivo 
oceno o delovanju preizkušane snovi. Rezultati lahko ostanejo dvoumni ali dvomljivi ne glede na število ponovitev poskusa. 
Pozitivni rezultati preizkusa kromosomskih aberacij v spermatogo ­
nijih in vivo  pomenijo, da preizkušana snov povzro ča strukturne 
kromosomske aberacij e v kli čnih celicah preizkusne vrste. Negativni 
rezultati pomenijo, da preizkušana snov pri preizkusnih pogojih ne 
povzroča kromosomskih aberacij v kli čnih celicah preizkusne vrste. 
Obravnava naj se verjetnost, da preizkušana snov ali njeni metaboliti 
dosežejo tar čno tkivo.
 
3. PORO ČANJE  
POROČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preizkusu mora vsebovati naslednje informacije: 
Topilo/nosilec: 
— utemeljitev izbire nosilca, 
— topnost in stabilnost preizkušane snovi v topilu/nosilcu, če sta 
znani. 
Preizkusne živali: 
— uporabljena vrsta/sev, 
— število in spol živali, 
— vir, pogoji bivanja, prehrana itn., 
— teža posameznih živali na za četku preizkusa, skupaj z obmo čjem 
telesne teže, srednjo vrednostjo in standardnim odklonom za 
vsako skupino.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 390
 
Preizkusni pogoji: 
— podatki študije za ugotavljanje obmo čja, če je bila opravljena, 
— razlogi za izbiro velikosti odmerka, 
— razlogi za na čin dajanja, 
— podrobnosti o pripravi preizkušane snovi, — podrobnosti o dajanju preizkušane snovi, — razlogi za čas žrtvovanja, 
— način preračunavanja koncentracije preizkušane snovi v hrani/ 
pitni vodi (ppm) v dejanski odmerek (mg/kg telesne teže/dan), 
če je to primerno, 
— podrobnosti o kakovosti hrane in vode, — podroben opis programov tretiranja in vzor čenja, 
— metode merjenja toksi čnosti, 
— vrsta snovi za ustavitev metafaze, njena koncentracija in čas 
tretiranja, 
— metode priprave mikroskopskih preparatov, — merila za štetje aberacij, — število analiziranih celic na žival, 
— merila za dolo čitev, ali je študija pozitivna, negativna ali 
dvoumna. 
Rezultati: — znaki toksi čnosti, 
— mitoti čni indeks, 
— razmerje med mitozami spermatogonijev v prvi in drugi mejotski 
metafazi, 
— tip in število aberacij, navedena za vsako žival posebej, — skupno število aberacij na skupino, — število celic z aberacijami na skupino, — odvisnost med odmerkom in odzivom, če je to mogo če, 
— statisti čne analize, če so bile opravljene, 
— podatki o so časni negativni kontroli, 
— podatki o pretekli negativni kontroli, z obmo čji, srednjimi vred ­
nostmi in standardnimi odkloni, 
— podatki o so časni pozitivni kontroli, 
— spremembe v ploidnosti, če so bile opažene. 
Diskusija rezultatov. Sklepi.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 391
 
4. LITERATURA  
(1) Adler, I.D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermato ­
gonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Speci ­
fications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, 
Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C, 
Lambert, B. and Magnusson, J. (Eds.) Liss, New York, str. 477–484. 
(2) Adler, ID., (1984). Cytogenetic tests in Mammals. In: Mutage ­
nicity Testing: a Practical Approach. Ed. S. Venitt and J.M. 
Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, str. 275–306. 
(3) Evans, E.P., Breckon, G. and Ford, C.E., (1964). An Air-Drying 
Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cyto ­
genetics and Cell Genetics, 3, str. 289–294. 
(4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and 
Henderson, L. (1990).  In Vivo  Cytogenetic Assays, In: D.J. 
Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recom ­
mended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for 
Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge Univer ­
sity Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, str. 115–141. 
(5) Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978). A New Method for 
Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. 
Mutation Res., 52, str. 207–209. 
(6) Adler, ID., Shelby M.D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., 
Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. 
Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ 
Cell Tests. Mutation Res., 312, str. 313–318. 
(7) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., 
Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G, Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of British 
Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society 
Working group: Dose setting in  In Vivo  Mutagenicity Assays. 
Mutagenesis, 7, str. 313–319. 
(8) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and 
Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of  In Vivo  Cytoge­
netic Assays In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, report, Part III. Cambridge University 
Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 
str. 184–232.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 392
 
B.24  PRESKUS POJAVA MADEŽEV NA MIŠIH  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Glej Splošni uvod dela E.  
1.2 OPREDELITEV POJMOV 
Glej Splošni uvod dela E.  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Jih ni.  
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
To je preskus  in vivo  na miših, pri katerem se kemikalijam izposta ­
vijo razvijajo či embrii. Ciljne celice v razvijajo čih embriih so melan ­
oblasti, ciljni geni pa so tisti, ki nadzorujejo pigmentacijo dlak krzna. 
Razvijajo či se embrii so heterozigotni za številne navedene gene za 
obarvanje krzna. Posledica mutacije v dominantnem alelu tega gena v melanoblastu ali izgube tega alela (zaradi razli čnih genetskih vzro ­
kov) se odraža v izražanju recesivnega fenotipa v njegovih celicah 
potomkah, ki predstavlja madež spremenjene barve na krznu miši. 
Določi se število zaroda z navedenimi madeži, mutacijami, njihova 
pogostost pa se primerja s pogostostjo teh madežev med potomci, ki nastanejo iz embriov, tretiranih samo s topilom. Preskus pojava 
madežev pri miših odkriva predvidene somatske mutacije v fetalnih 
celicah.
 
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Jih ni.  
1.6 OPIS PRESKUSNE METODE  
Priprave  
Preskusne snovi se, kadar je mogo če, raztopijo ali suspendirajo v 
izotonični raztopini soli. Kemikalije, netopne v vodi, se raztopijo ali 
suspendirajo v ustreznih nosilcih. Uporabljeni nosilec ne sme inter ­
ferirati s preskusno kemikalijo niti povzro čati strupenih u činkov. 
Uporabiti je treba sveže pripravljene preskusne kemikalije.  
P r e s k u s n e ž i v a l i 
Miši seva T (nonagouti, a/a; chincilla, pink eye, c  ch p/c ch p; brown, 
b/b; dilute, short ear, d se/d se; piebald spotting, s/s) se parijo ali s 
sevom HT (pallid, nonagouti, brachypody, pa a bp/pa a bp; leaden fuzzy, ln fz/ln fz; pearl pe/pe), ali s C57 BL (nonagouti, a/a). Lahko se izvajajo tudi druga ustrezna križanja, kot med NMRI (nonagouti, 
a/a; albino, c/c) in DBA (nonagouti, a/a; brown, b/b; dilute d/d), pod 
pogojem, da proizvedejo potomce nonagouti.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 393
 
Š t e v i l o i n s p o l 
Tretira se zadostno število brejih samic, da bi se ustvarilo ustrezno 
število preživelega zaroda pri vsaki uporabljeni velikosti odmerka. Ustrezno velikost vzorca dolo ča število madežev, opaženih na treti ­
rani miši, in lestvica kontrolnih podatkov. Negativni rezultat je spre ­
jemljiv le, če se doseže najmanj 300 potomcev samic, tretiranih z 
najvišjo velikostjo odmerka.
 
U p o r a b a n e g a t i v n i h i n p o z i t i v n i h k o n t r o l 
Na razpolago morajo biti so časni kontrolni podatki za miši, ki so bile 
tretirane samo z nosilcem (negativne kontrole). Da bi se pove čala 
občutljivost preskusa, se lahko uporabijo tudi pretekli kontrolni 
podatki iz istega laboratorija, pod pogojem da so le-ti homogeni. 
Če se ne odkrije mutagenosti preskusne kemikalije, naj bi bili na 
voljo podatki pozitivne kontrole, ki so bili pred kratkim pridobljeni v istem laboratoriju pri tretiranju s kemikalijo, za katero je poznano, da v tem preskusu pokaže mutagenost.
 
N a č i n d a j a n j a 
Običajna načina dajanja sta oralna intubacija ali intraperitonealna 
injekcija, ki se jo da brejim samicam. Kadar je ustrezno, se lahko 
uporabi tretiranje z inhalacijo ali kak drug na čin dajanja.  
V e l i k o s t i o d m e r k a 
Uporabita se najmanj dve velikosti odmerka, vklju čno z eno, ki kaže 
znake strupenosti ali zmanjšano velikost zaroda. V primeru nestru ­
penih kemikalij je treba živali izpostaviti maksimalni izvedljivi veli ­
kosti odmerka.  
Postopek  
Običajno se živali tretirajo enkrat na osmi, deveti ali deseti dan 
brejosti, pri čemer je prvi dan tisti, ko se prvi č opazi vaginalni 
zamašek. Ti dnevi se ujemajo s 7,25, 8,25 in 9,25 dneva po spo četju. 
V teh dneh se lahko živali tretirajo tudi zaporedno.  
A n a l i z a 
Med tretjim in četrtim tednom po skotitvi se potomci kodirajo in 
preštejejo se madeži. Lo čimo tri razrede madežev: 
(a) beli madeži v razmaku do 5 mm od srednje trebušne linije, ki so 
domnevno rezultat uni čenja celic (WMVS); 
(b) rumeni, agouti madeži okrog seskov, genitalij, vratu, pazdušnega 
in dimeljskega podro čja in sredi čela, ki so domnevno rezultat 
napačne diferenciacije (MDS); in 
(c) pigmentirani in beli madeži, naklju čno razporejeni po krznu, ki 
so domnevno rezultat somatskih mutacij (RS).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 394
 
Določijo se vsi trije razredi, vendar je le zadnji, RS, genetsko 
pomemben. Težave razlo čevanja med MDS in RS se lahko razrešijo 
s fluoroscentnim mikroskopiranjem vzor čnih dlak. 
Upoštevati je treba o čitne vidne morfološke abnormalnosti potom ­
cev. 
2. PODATKI  
Podatki se predstavijo kot skupno število preštetih potomcev in 
število potomcev z enim ali ve č madeži, ki so domnevno rezultat 
somatskih mutacij. Podatki tretirane skupine in negativne kontrole se 
primerjajo z ustreznimi metodami. Podatki se navedejo tudi po posa ­
meznem zarodu.  
3. PORO ČILO 
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Če je mogo če, se v poro čilo o preskusu vklju čijo naslednji podatki: 
— sevi, uporabljeni pri križanju, — število brejih samic v preskusnih in kontrolnih skupinah, 
— povpre čna velikost zaroda v preskusnih in kontrolnih skupinah 
ob skotitvi in pri odstavitvi od sesanja, 
— velikost(i) odmerka preskusne kemikalije, — uporabljeno topilo, — dan brejosti, ko je bilo opravljeno tretiranje, — način tretiranja, 
— skupno število preštetih potomcev in število potomcev z WMVS, 
MDS in RS v preskusnih in kontrolnih skupinah, 
— vidne morfološke abnormalnosti, — razmerje odmerek/odziv pri RS, kadar je mogo če, 
— statisti čna ocena, 
— obravnava rezultatov, — razlaga rezultatov.
 
3.2 OCENA IN RAZLAGA 
Glej Splošni uvod dela B.  
4. VIRI  
Glej Splošni uvod dela B.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 395
 
B.25  PRESKUS DEDNE TRANSLOKACIJE NA MIŠIH  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Glej Splošni uvod dela B.  
1.2 OPREDELITEV POJMOV 
Glej Splošni uvod dela B.  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Jih ni.  
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Preskus dedne translokacije na miših odkriva strukturalne in nume ­
rične kromosomske spremembe v zarodnih sesalskih celicah, prid ­
obljenih pri potomcih prve generacije. Tipi odkritih kromosomskih sprememb so recipro čne translokacije in, če so vklju čeni tudi 
potomci samic, izguba kromosoma X. Nosilci translokacij in samice 
tipa XO kažejo zmanjšano plodnost, kar se uporabi za izbor potomcev F
 1 za citogenetsko analizo. Popolno sterilnost povzro čijo 
nekateri tipi translokacij (avtosom X in tip c-t). Translokacije se 
citogenetsko opazujejo v mejoti čnih celicah v diakinezi-metafazi I 
posameznih samcev, bodisi samcev F  1 ali zaroda samcev samic F  1 . 
Samice tipa XO se citogenetsko prepozna po prisotnosti samo 39 
kromosomov v mitozi kostnega mozga.  
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Jih ni.  
1.6 OPIS PRESKUSNE METODE  
Priprave  
Preskusne kemikalije se raztopijo v izotoni čni raztopini soli. Če so 
netopne, se raztopijo ali suspendirajo v ustreznem nosilcu. Upora ­
bljajo se sveže pripravljene raztopine preskusne spojine. Če je za 
lažje dajanje odmerkov uporabljen nosilec, le-ta ne sme vplivati na 
preskusno kemikalijo ali povzro čati strupenih u činkov.  
N a č i n d a j a n j a 
Načina dajanja sta obi čajno oralna intubacija in intraperitonealna 
injekcija. Ustrezni so lahko tudi drugi na čini dajanja.  
P r e s k u s n e ž i v a l i 
Zaradi lažjega vzrejnega in citološkega preverjanja se navedeni 
preskusi opravljajo na miših. Ne zahteva se nikakršen poseben 
mišji sev. Vendar pa mora biti povpre čna velikost zaroda seva 
večja od osem in relativno konstantna. 
Uporabijo se zdrave, spolno zrele živali.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 396
 
Š t e v i l o ž i v a l i 
Število potrebnih živali je odvisno od frekvence spontane transloka ­
cije in minimalne stopnje indukcije, ki je potrebna za pozitiven rezultat. 
Preskus se obi čajno opravlja z analizami potomcev samcev F
 1 . 
Preskus je treba opraviti na najmanj 500 potomcih samcih F  1 na 
skupino odmerka. Če se vklju čijo potomci samice F  1 , je zahtevanih 
300 samcev in 300 samic.  
U p o r a b a n e g a t i v n i h i n p o z i t i v n i h k o n t r o l 
Na voljo naj bi bili ustrezni kontrolni podatki, izpeljani iz so časnih 
in preteklih kontrol. Kadar so na voljo sprejemljivi rezultati pozitivne kontrole iz preskusov, ki so bili pred kratkim izvajani v istem labo ­
ratoriju, se ti rezultati lahko uporabijo namesto teko če pozitivne 
kontrole.
 
V e l i k o s t i o d m e r k a 
Preskuša se ena velikost odmerka, ponavadi je to najvišji odmerek, 
povezan s povzro čitvijo minimalnih strupenih u činkov, vendar brez 
vpliva na razmnoževalno vedenje ali preživetje. Da bi se dolo čilo 
razmerje odmerek/odziv, sta zahtevana še dva dodatna nižja odmerka. V primeru nestrupenih kemikalij je treba živali izpostaviti maksimalni izvedljivi velikosti odmerka.
 
Postopek  
T r e t i r a n j e i n p a r j e n j e 
Na voljo sta dva programa tretiranja. Najpogosteje se uporablja 
enkratno dajanje preskusne snovi. Preskusna snov se lahko daje 
tudi sedem dni na teden, in sicer 35 dni. Število parjenj po tretiranju je določeno s programom tretiranja, zagotoviti pa je treba, da se 
vzorčijo vse faze obdelanih zarodnih celic. Po obdobju parjenja se 
samice posamezno razvrstijo po kletkah. Ko samica skoti mladi če, se 
zabeleži datum, velikost zaroda in spol potomcev. Vsi moški potomci se odstavijo od sesanja, ženske potomke pa se izlo čijo, 
razen če se ne vklju čijo v preskus.
 
P r e s k u s t r a n s l o k a c i j s k e h e t e r o z i g o t n o s t i 
Uporabljata se ena od dveh možnih metod: 
— preskus plodnosti potomcev F  1 in nadaljnje preverjanje možnih 
nosilcev translokacij s citogenetsko analizo, 
— citogenetska analiza vseh potomcev samcev F  1 brez vnaprejšnje 
selekcije s preskusom plodnosti. 
(a) Preskus plodnosti 
Zmanjšano plodnost posameznih živali F  1 je mogoče ugotoviti na 
podlagi opazovanja velikosti zaroda in/ali analize vsebine mater ­
nice samic. 
Za uporabljeni mišji sev morajo biti dolo čena merila dolo čanja 
normalne in zmanjšane plodnosti.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 397
 
Opazovanja velikosti zaroda: samci F  1 , ki bodo preskušani, so 
posamezno razporejeni po kletkah s samicami bodisi iz istega 
preskusa ali iz kolonije. Kletke se dnevno pregledujejo od 18. dne po parjenju. Ob skotitvi se zabeležita velikost zaroda in spol potomcev F
 2 , nakar se zarodi izlo čijo. Če se opravlja preskus na 
potomcih samicah F  1 , se potomce F  2 iz majhnih zarodov ohrani 
za nadaljnje preskuse. Samice, ki so nosilke translokacij, se preverijo s citogenetsko analizo translokacije pri katerem koli izmed njihovih moških mladi čev. Samice tipa X0 se prepoznajo 
po tem, da se razmerje spolov samci-samice med njihovimi 
potomci spremeni iz 1:1 na 1:2. V naslednjem postopku se normalne živali F
 1 izločijo iz nadaljnjih preskusov, če prvi 
zarod F  2 doseže ali preseže vnaprej dolo čeno normalno vrednost, 
sicer se opazuje drugi ali tretji zarod F  2 . 
Živali F  1 , ki jih po opazovanju najmanj treh zarodov F  2 ni 
mogoče razvrstiti kot normalne, se nadaljnje preskušajo z analizo 
vsebine maternice samic, ki so se parile, ali pa se takoj podvržejo citogenetski analizi. 
Analiza vsebine maternice: Zmanjšanje velikosti zaroda nosilcev 
translokacij je posledica embrionalne smrti, tako da visoko 
število mrtvih ugnezditev kaže na prisotnost translokacij e pri 
preskusni. Vsakega izmed samcev F
 1 , na katerih se bo opravljal 
preskus, se pari z dvema do tremi samicami. Spo četje se ugotovi 
tako, da se vsak dan zjutraj samice pregledajo za vaginalne 
zamaške. 14 do 16 dni pozneje se samice žrtvujejo in zabeležijo 
se žive in mrtve ugnezditve v njihovih maternicah. 
(b) Citogenetska analiza 
Testisi se pripravijo s tehniko sušenja na zraku. Nosilci translo ­
kacij se prepoznajo po prisotnosti multivalentnih konfiguracij v diakinezi metafaze I v primarnih spermatocitah. Zahtevani dokaz, 
da je žival, na kateri se opravlja preskus, nosilec translokacij e, 
dobimo z opazovanjem najmanj dveh celic z multivalentno asociacijo. 
Če ni bila opravljena nikakršna vzrejna selekcija, se na vseh 
samcih F
 1 opravi citogenetski pregled. Pod mikroskopom je 
treba prešteti najmanj 25 celic diakineze-metafaze I na samca. 
Pregled mitoti čnih metafaz v spermatogonijih kostnega mozga je 
potreben pri samcih F  1 z majhnimi testisi in mejoti čno členitvijo 
pred diakinezo ali na samicah za katere se sumi, da so tipa XO. 
Prisotnost nenavadno dolgega in/ali kratkega kromosoma v vsaki 
izmed 10 celic je dokaz posebne sterilne translokacij e pri samcih (c-t tip). Nekaj translokacij avtosoma X, ki povzro čajo sterilnost 
samcev, se lahko prepozna le z analizo proganja mitoti čnih 
kromosomov. Prisotnost 39 kromosomov v vseh 10 mitozah je 
dokaz stanja XO pri samici.
 
2. PODATKI  
Podatki se povzamejo v obliki tabele. 
Navede se srednja velikost zaroda in razmerje med spoloma iz 
parjenj staršev ob rojstvu in odstavitvi od sesanja za vsak interval 
parjenja.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 398
 
Za oceno plodnosti živali F  1 se prikaže srednja vrednost velikost 
zaroda vseh normalnih parjenj ter posamezne velikosti zarodov 
nosilcev translokacij F  1 . Za analizo vsebine maternice se navede 
povprečno število živih in mrtvih vsadkov pri normalnih parjenjih 
ter posamezna števila živih in mrtvih vsadkov za vsako parjenje 
nosilcev translokacij F  1 . 
Za citogenetsko analizo diakineze-metafaze I se pri vsakem nosilcu 
translokacij navede število tipov multivalentne konfiguracije in skupno število celic. 
V primeru posameznih sterilnih živali F
 1 se navede skupno število 
parjenj in trajanje obdobja parjenja. Podajo se teže testisov in 
podrobnosti citogenetske analize. 
V primeru samic tipa X0 se navedena srednja velikost zaroda, 
razmerje po spolu med potomci F  1 in rezultate citogenetske analize. 
Kadar se možni nosilci translokacij vnaprej izberejo s preskusi plod ­
nosti, je treba v tabele vklju čiti podatke o tem, od teh je bilo potr ­
jenih za translokacij ske heterozigote. 
Poročajo se podatki iz preskusov z negativno in pozitivno kontrolo.  
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Če je mogo če, se v poro čilo o preskusu vklju čijo naslednji podatki: 
— sev miši, starost živali, masa tretiranih živali, — število starševskih živali vsakega spola v preskusni in kontrolni 
skupini, 
— preskusni pogoji, podroben opis tretiranja, velikosti odmerka, 
topila, program parjenja, 
— število in spol potomcev na samico, število in spol potomcev, 
vzrejenih za analizo translokacije, 
— čas in merila analize translokacije, 
— število in podroben opis nosilcev translokacij, vklju čno z vzrej ­
nimi podatki in podatki o vsebini maternice, če je primerno; 
— citogenetski postopki in podrobnosti mikroskopske analize, po 
možnosti s slikami, 
— statisti čna ocena, 
— obravnava rezultatov, — razlaga rezultatov.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 399
 
3.2 OCENA IN RAZLAGA 
Glej Splošni uvod dela B.  
4. VIRI  
Glej Splošni uvod dela B.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 400
 
B.26  PRESKUS SUBKRONI ČNE ORALNE TOKSI ČNOSTI 90-DNEVNA 
ŠTUDIJA ORALNE TOKSI ČNOSTI S PONAVLJAJO ČIMI SE 
ODMERKI NA GLODALCIH  
1. METODA  
Ta metoda za preskus subkroni čne oralne toksi čnosti ustreza metodi 
OECD TG 408 (1998).  
1.1 UVOD 
Pri ocenjevanju in vrednotenju strupenih lastnosti kemikalije se lahko 
določi subkroni čna oralna toksi čnost z uporabo ponavljajo čega 
odmerjanja, potem ko so že bile pridobljene za četne informacije o 
toksičnosti s preskusi akutne toksi čnosti ali 28-dnevnimi preskusi 
toksičnosti s ponavljajo čimi se odmerki. Ta 90-dnevna študija daje 
informacije o možnih nevarnostih za zdravje, za katere je verjetno, 
da se pojavijo pri ponavljajo či se izpostavljenosti v daljšem 
časovnem obdobju, vklju čno z razvojem od odstavitve dale č v 
odraslo dobo. Študija daje informacije o glavnih toksi čnih učinkih, 
nakaže ciljne organe in možnost kopi čenja ter lahko omogo či oceno 
ravni izpostavljenosti brez opaznih škodljivih u činkov (NOAEL), ki 
ga je mogo če uporabiti za izbiro velikosti odmerkov pri študijah 
kronične toksičnosti in dolo čanju varnostnih meril za izpostavljenost 
človeka. 
Metoda namenja dodatno pozornost nevrološkim ciljnim u činkom ter 
pokaže možne u činke na imunski in reproduktivni sistem. Poudar ­
jena je tudi potreba po skrbnem klini čnem opazovanju živali, da se 
pridobi kar najve č informacij. Študija bi morala omogo čiti identifi ­
kacijo kemikalij s potencialnimi nevrotoksi čnimi in imunološkimi 
učinki ter u činki na reproduktivne organe, kar bi morebiti terjalo 
nadaljnje poglobljene raziskave. 
Glej tudi Splošni uvod Del B.  
1.2 OPREDELITEV POJMOV  
Odmerek:  je količina dane preskusne snovi. Odmerek je izražen kot 
masa (g, mg), kot masa preskusne snovi na enoto teže preskusne živali (npr. mg/kg) ali kot konstantna koncentracija v hrani (ppm).  
Odmerjanje:  je splošni izraz, ki obsega odmerek ter pogostnost in 
trajanje dajanja odmerka.  
NOAEL:  je kratica za odmerek brez opaznih škodljivih u činkov 
(No Observed Adverse Effect Level) in je najve čji odmerek, pri 
katerem ne opazimo nobenega škodljivega u činka, povezanega z 
tretiranjem.
 
1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Preskusna snov se 90 dni dnevo oralno daje v stopnjevanih odmerkih 
več skupinam poskusnih živali, in sicer ena velikost odmerka na 
skupino. V času dajanja odmerkov je treba živali pozorno opazovati 
ali kažejo znake toksi čnosti. Na živalih, ki med preskusom poginejo 
ali so usmr čene, se izvede obdukcija, na koncu preskusa pa se usmrti 
tudi preživele živali in tudi na njih izvede obdukcija.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 401
 
1.4 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.4.1  Priprava živali  
Uporabiti je treba zdrave živali, ki so se najmanj pet dni prilagajale 
na laboratorijske razmere in ki predhodno niso bile uporabljene za 
poskuse. Poznati je treba vrsto, sev, vir, spol, težo in/ali starost 
poskusnih živali. Živali se naklju čno dodelijo kontrolni in tretirani 
skupini. Kletke je treba razporediti tako, da so možni u činki zaradi 
pozicije kletk čim manjši. Vsaki živali se dodeli posebna identifika ­
cijska številka.  
1.4.2  Priprava odmerkov  
Preskusna snov se daje z gavažo, s hrano ali s pitno vodo. Metoda 
oralnega dajanja odmerkov je odvisna od namena študije in od fizi ­
kalnih/kemijskih lastnosti preskusnega materiala. 
Po potrebi se preskusna snov raztopi ali suspendira v primernem 
nosilcu. Priporo čljivo je, da se, kadar koli je mogo če, najprej 
razmisli o uporabi vodne raztopine/suspenzije, potem o raztopini/ emulziji v olju (npr. koruzno olje), nato pa šele o možni raztopini 
v drugih nosilcih. V primeru nosilcev, ki niso voda, je treba poznati 
toksične lastnosti takega nosilca. Dolo čiti je treba stabilnost 
preskusne snovi pri pogojih dajanja.
 
1.4.3  Preskusni pogoji  
1.4.3.1  Poskusne živali  
Priporočena vrsta je podgana, vendar se lahko uporabijo tudi druge 
vrste glodalcev, npr. miš. Uporabiti je treba laboratorijske seve 
mladih zdravih odraslih živali, ki se obi čajno uporabljajo. Samice 
morajo biti nuliparne in ne smejo biti breje. Z odmerjanjem je treba začeti čim prej po odstavitvi, v vsakem primeru pa preden 
živali dosežejo starost devetih tednov. Na za četku študije morajo 
biti razlike v teži posameznih živali čim manjše in ne smejo prese ­
gati ± 20 % povpre čne teže za vsak spol. Če se študija izvaja kot 
predhodna študija za dolgotrajno študijo kroni čne toksičnosti, je 
treba v obeh študijah uporabiti živali istega seva in vira.
 
1.4.3.2  Število in spol  
Za vsako velikost odmerka je treba uporabiti najmanj 20 živali (10 
samic in 10 samcev). Če so načrtovane usmrtitve med potekom 
študije, je treba število pove čati za število živali, predvidenih za 
usmrtitev pred zaklju čkom študije. Na podlagi že poznanih lastnosti 
kemikalije ali bližjih analogov je treba razmisliti o vklju čitvi satelitne 
skupine desetih živali (pet na spol) v kontrolno skupino in skupino z največjim odmerkom, za opazovanje reverzibilnosti ali obstojnosti 
morebitnih toksi čnih učinkov po tretiranju. Trajanje tega opazoval ­
nega obdobja po tretiranju se dolo či glede na opažene u činke.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 402
 
1.4.3.3  Velikost odmerkov  
Uporabiti je treba najmanj tri velikosti odmerkov in kontrolo, razen 
če se izvaja mejni preskus (glej 1.4.3.4). Velikosti odmerkov se 
lahko dolo čijo na podlagi rezultatov študij s ponavljajo čimi se 
odmerki ali študij za ugotavljanje obmo čja odmerkov, pri tem pa 
morajo biti upoštevani vsi obstoje či toksikološki in toksikokineti čni 
podatki, ki so na voljo v zvezi s preskusno snovjo ali sorodnimi materiali. Razen kadar zaradi fizikalno-kemijskih lastnosti ali biolo ­ 
ških učinkov preskusne snovi to ni mogo če, je treba najvišjo velikost 
odmerka izbrati z namenom, da se povzro či toksičnost, vendar pa ne 
smrt ali hudo trpljenje. Upadajo če zaporedje velikosti odmerkov je 
treba izbrati z namenom, da se pokažejo vse od odmerka odvisne 
reakcije, in je odmerek brez opaznih škodljivih u činkov (NOAEL) 
najnižji izbrani velikosti odmerka. Za upadajo če zaporedje velikosti 
odmerkov so pogosto optimalni dvakratni do štirikratni intervali, 
pogosto pa je bolje dodati še dodatno četrto preskusno skupino, 
kakor uporabiti zelo velike intervale (npr. ve č kot faktor okrog 
6–10) med odmerki. 
Kontrolna skupina je netretirana skupina ali kontrolna skupina, treti ­
rana le z nosilcem, če je pri dajanju preskusne snovi ta uporabljen. 
Razen kar zadeva tretiranje s preskusno snovjo, morajo biti živali v kontrolni skupini obravnavane enako kakor živali v preskusni 
skupini. Če je uporabljen nosilec, mora kontrolna skupina prejeti 
volumen nosilca, enak najve čjemu uporabljenemu volumnu. Če se 
preskusna snov daje s hrano in se s tem povzro či zmanjšan vnos 
hrane, lahko uporabimo po parih hranjeno kontrolno skupino, da se 
razloči zmanjšan vnos hrane zaradi okusa ali toksikoloških spre ­
memb v preskusnem modelu. 
Ustrezno je treba upoštevati naslednje lastnosti nosilca in drugih 
aditivov: u činke na absorpcijo, distribucijo, presnovo ali retencijo 
preskusne snovi; u činke na kemijske lastnosti preskusne snovi, ki 
lahko spremenijo njene toksi čne lastnosti; ter u činke na porabo 
hrane ali vode ali prehranjenost živali.
 
1.4.3.4  Mejni preskus  
Če preskus pri eni velikosti odmerka, enakovredni najmanj 1 000 
mg/kg telesne teže/dan, pri katerem so uporabljeni postopki, opisani za to študijo, ne da opaznih škodljivih u činkov, in če toksičnost ni 
pričakovana glede na podatke o strukturno sorodnih snoveh, potem 
popolna študija z uporabo treh velikosti odmerkov morda ne bo 
potrebna. Mejni preskus se lahko uporabi za vse primere razen, kadar učinki izpostavljenosti pri človeku kažejo na potrebo po 
uporabi ve čje velikosti odmerka.
 
1.5 POSTOPEK  
1.5.1  Dajanje odmerkov  
Živali dobivajo preskusno snov dnevno sedem dni na teden v 
obdobju 90 dni. Vsako odstopanje od tega režima odmerjanja, npr. pet dni na teden, je treba utemeljiti. Če se preskusna snov daje z 
gavažo, jo je treba živali dati v enkratnem odmerku z uporabo 
želodčne sonde ali primerne intubacijske kanile. Maksimalni 
volumen teko čine, ki jo je mogo če dati naenkrat, je odvisen od 
velikosti poskusne živali. Volumen ne sme prese či 1 ml/100 g 
telesne teže, razen v primeru vodnih raztopin, kjer je dovoljeno 
uporabiti 2 ml/100 g telesne teže. Razen pri draže čih ali jedkih 
snoveh, ki bodo pri višjih koncentracijah obi čajno povzro čile 
močnejše učinke, je treba variabilnost preskusnega volumna s prila ­
gajanjem koncentracije obdržati na kar najnižji ravni, zato da bi 
zagotovili konstantni volumen pri vseh odmerkih.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 403
 
Pri snoveh, ki se dajejo s hrano ali pitno vodo, je treba zagotoviti, da 
količine uporabljene preskusne snovi ne vplivajo na obi čajno raven 
vnosa hrane ali porabe vode. Kadar se preskusna snov daje s hrano, se lahko uporabi bodisi konstantna koncentracija v hrani (ppm) bodisi konstantna velikost odmerka glede na telesno težo živali; 
treba je navesti uporabljeni na čin. Če snov dajemo z gavažo, je 
treba odmerke dati vsak dan približno ob istem času in jih ustrezno 
prilagoditi, da se vzdržuje konstantna velikosti odmerka glede na telesno težo živali. Če se 90-dnevna študija izvaja kot predhodna 
študija za dolgotrajno študijo kroni čne toksičnosti, je treba v obeh 
študijah uporabiti podobno hrano.
 
1.5.2  Opazovanja  
Obdobje opazovanja mora trajati najmanj 90 dni. Živali v satelitni 
skupini, ki so predvidene za naknadna opazovanja, morajo primerno 
časovno obdobje ostati netretirane, zato da bi lahko ugotovili, ali so 
toksični učinki obstojni ali reverzibilni. 
Splošna klini čna opazovanja je treba opraviti najmanj enkrat na dan, 
najbolje vsak dan ob istem času, pri čemer se upošteva vrhunec 
pričakovanih u činkov po odmerjanju. Klini čno stanje živali je treba 
dokumentirati. Najmanj dvakrat dnevno, obi čajno na za četku in na 
koncu vsakega dne, je treba živali pregledati, da se odkrijejo znaki obolevnosti in smrtnosti. 
Najmanj enkrat pred prvo izpostavljenostjo (zaradi primerjav na istem 
osebku) in enkrat na teden po tem je treba opraviti natan čna klinična 
opazovanja vseh živali. Ta opazovanja je treba opraviti zunaj doma če 
kletke, najbolje na standardnem mestu in vsakokrat ob podobnem času. Opažanja je treba skrbno dokumentirati, najbolje s pomo čjo 
točkovanj, ki jih laboratorij, ki preskus opravlja, natan čno definira. 
Prizadevati si je treba, da so variacije v pogojih opazovanja mini ­
malne. Opaženi znaki morajo vklju čevati, vendar ne smejo biti 
omejeni le na, spremembe na koži, kožuhu, o čeh, sluznicah, pojav 
sekrecije in ekskrecije ter delovanje avtonomnega živ čevja (npr. lakri ­
macija, piloerekcija, velikost zenic, nenormalno dihanje). Dokumenti ­
rati je treba tudi spremembe v hoji, drži in reagiranju na ravnanje z živalmi, pa tudi prisotnost kloni čnih in toni čnih gibov, stereotipov 
(npr. prekomerno čiščenje, ponavljajo ča se krožna premikanja) ali 
nenormalno vedenje (npr. samomali čenje, zadenjska hoja) (1). 
Oftalmološko preiskavo z uporabo oftalmoskopa ali ustrezne enako ­
vredne opreme je treba izvesti pred dajanjem preskusne snovi in na 
koncu študije, najbolje na vseh živalih, vendar vsaj v skupini z velikim odmerkom in v kontrolni skupini. Če se odkrijejo spre ­
membe na o čeh, je treba preiskati celo skupino. 
Proti koncu obdobja izpostavljenosti, v nobenem primeru pa ne prej kot 
v11. tednu, je treba oceniti senzori čne reakcije na razne dražljaje (1) 
(npr. akusti čne, vizualne in proprioceptivne dražljaje) (2), (3), (4), mo č 
oprijema (5) in motori
čne aktivnosti (6). Nadaljnje podrobnosti glede 
možnih postopkov so podane v navedeni literaturi. Uporabiti je možno tudi druge postopke, ki so opisani drugod. 
Opazovanja drugih funkcij proti koncu študije se lahko opustijo, če 
so podatki o funkcionalnih opazovanjih znani že iz drugih študij, v 
dnevnih klini čnih opazovanjih pa niso bile odkrite nobene funkcio ­
nalne pomanjkljivosti.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 404
 
V izjemnih primerih se opazovanja drugih funkcij lahko opustijo tudi 
pri skupinah, v katerih so se znaki toksi čnosti pokazali v tolikšnem 
obsegu, da bi znatno vplivali na rezultate funkcionalnega preskusa.  
1.5.2.1  Telesna teža in poraba hrane/vode  
Vse živali je treba stehtati najmanj enkrat na teden. Meritve porabe 
hrane je treba opraviti najmanj tedensko. Če se preskusna snov daje 
s pitno vodo, je treba najmanj tedensko izmeriti tudi porabo vode. Poraba vode se lahko upošteva tudi pri študijah odmerjanja s hrano 
ali z gavažo, pri katerih se vedenje glede pitja lahko spremeni.
 
1.5.2.2  Hematologija in klini čna biokemija  
Vzorce krvi je treba vzeti na imenovanem mestu in jih hraniti, če je 
to potrebno, v ustreznih pogojih. Na koncu preskusnega obdobja se 
vzorci odvzamejo tik pred usmrtitvijo ali med samim postopkom usmrtitve živali. 
Na koncu preskusnega obdobja in pri morebitnih vmesnih odvzemih 
vzorcev krvi je treba izvesti naslednje hematološke teste: hematokrit, 
koncentracijo hemoglobina, število eritrocitov, skupna in diferen ­
cialna krvna slika, število trombocitov in meritev časa/potenciala 
koagulacije krvi. 
Klinične biokemi čne določitve za ugotavljanje glavnih toksi čnih 
učinkov v tkivih in zlasti u činkov na ledvica in jetra, je treba opraviti 
na vzorcih krvi, pridobljenih od vsake živali tik pred usmrtitvijo ali 
med samim postopkom usmrtitve (to ne velja za živali, ki so najdene 
poginjajo če in/ali poginule med postopkom). Podobno kot pri hema ­
toloških preiskavah se vmesno vzor čenje lahko opravi tudi za 
klinične biokemi čne preskuse. Priporo čeno je, da živali pred jema ­
njem vzorcev krvi čez noč postimo (
 1 ). Določitve v plazmi ali 
serumu morajo vklju čevati natrij, kalij, glukozo, skupni holesterol, 
sečnino, sečninski dušik v krvi, kreatinin, skupne beljakovine in 
albumin ter ve č kot dva encima, ki kažeta na hepatocelularne u činke 
(kot so alanin-aminotransferaza, aspartat-aminotransferaza, alkalna 
fosfataza, gamaglutamil-transpeptidaza, in sorbitol-dehidrogenaza). Vključiti je možno tudi meritve dodatnih encimov (jetrnih ali 
drugega izvora) in žol čnih kislin, ki lahko v nekaterih okoliš činah 
dajo koristne informacije. 
Po izbiri se lahko v zadnjem tednu študije opravijo analize urina, 
dobljenega z zbiranjem v dolo čenih časovnih obdobjih: videz, volu ­
men, osmolalnost ali specifi čna teža, pH, beljakovine, glukoza in 
kri/krvne celice. 
Poleg tega bi bilo treba razmisliti o preiskavi splošnih serumskih 
markerjev poškodb tkiva. Kadar znane lastnosti preskusne snovi 
lahko vplivajo na ustrezne sorodne presnovne profile ali kadar se pričakujejo takšni vplivi, je treba dolo čiti kalcij, fosfor, vrednost 
trigliceridov na teš če, specifične hormone, methemoglobin in holine ­
sterazo. Te parametre je treba dolo čiti pri kemikalijah dolo čenih 
razredov oziroma odvisno od primera.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 405  
( 1 ) Za več meritev v serumu in plazmi, zlasti pa za glukozo, je priporo čeno, da se živali čez 
noč postijo. Glavni razlog za to je, da bi pove čana variabilnost, ki bi bila neizogibno 
posledica nepoštenja, prikrila šibkejše u činke in otežila interpretacijo. Po drugi strani pa 
poštenje čez noč lahko vpliva na splošno presnovo živali in zlasti v študijah prehranje ­
vanja zmoti dnevno izpostavljenost preskusni snovi. Če se uporabi poštenje čez noč, je 
treba klini čne biokemi čne analize izvesti po opravljenih funkcionalnih opazovanjih v 
okviru študije.
 V glavnem mora biti pristop fleksibilen, odvisno od vrste in od 
opaženega in/ali pri čakovanega u činka dane snovi. 
Če predhodni podatki o normalnih vrednostih niso primerni, je treba 
razmisliti o dolo čitvi hematoloških in klini čnih biokemi čnih parame ­
trov pred odmerjanjem preskusne snovi; praviloma ni priporo čeno, 
da se ti podatki dolo čijo pred tretiranjem (7).  
1.5.2.3  Obdukcija  
Na vseh živalih iz študije je treba opraviti popolno in natan čno 
obdukcijo, ki obsega natan čno preiskavo zunanje površine telesa, 
vseh odprtin, lobanjske, prsne in trebušne votline ter njihove vsebine. Z jeter, ledvic, nadledvi čnih žlez, mod, obmodka, maternice, jaj čni­
kov, priželjca, vranice, možganov in srca vseh živali (to ne velja za 
živali, ki so najdene poginjajo če in/ali usmr čene med postopkom) je 
treba, kot je ustrezno, odstraniti vsa priraš čena tkiva, nato pa, čim 
prej po disekciji, dolo čiti njihovo mokro težo, zato da se prepre či 
sušenje. 
Naslednja tkiva je treba shraniti v sredstvu, ki je najprimernejše za 
vrsto tkiva in za predvidene nadaljnje histopatološke preiskave: vse 
makroskopske lezije, možgane (reprezentativna podro čja, ki vklju ču­
jejo velike možgane, male možgane in možgansko deblo/pons), hrbtenjačo (s treh predelov: vratnega, srednjega prsnega in ledvene ­
ga), hipofizo, š čitnico, obš čitnico, priželjc, požiralnik, slinavke, želo ­
dec, tanko in debelo črevo (vklju čno s Peyerjivimi poloji), jetra, 
trebušno slinavko, ledvica, nadledvi čni žlezi, vranico, srce, sapnik 
in pljuča (vpihnjena s fiksativom, nato vstavljena v ustrezno razto ­
pino), aorto, spolne žleze, maternico, akcesorne spolne organe, mlečne žleze samic, prostato, se čni mehur, žol čnik (miš), bezgavke 
(najbolje eno bezgavko, ki zajema predel poti odmerjanja, in drugo 
bezgavko oddaljeno od tega predela, zato da so vklju čeni tudi 
sistemski u činki), periferni živec (bedrni ali goleni čni) najbolje v 
neposredni bližini mišice, rezino kostnega mozga (in/ali sveži aspirat kostnega mozga), kožo in o či (če so bile med oftalmološkimi 
preiskavami ugotovljene spremembe). Klini čne in druge ugotovitve 
lahko pokažejo, da bo treba pregledati dodatna tkiva. Shraniti je treba tudi vse organe, za katere je na podlagi znanih lastnosti preskusne snovi verjetno, da bi lahko bili ciljni organi.
 
1.5.2.4  Histopatologija  
V celoti je treba opraviti histopatološke preiskave shranjenih organov 
in tkiv vseh živali iz kontrolne skupine in skupine z velikim odmer ­
kom. Če so v skupini z velikim odmerkom opažene spremembe, 
povezane s tretiranjem, je treba te preiskave razširiti tudi na skupine vseh drugih odmerkov. 
Preiskati je treba vse makroskopske lezije. Če je uporabljena satelitna skupina, je treba histopatološke preiskave 
opraviti na tkivih in organih, na katerih so bili pri tretiranih skupinah 
vidni učinki.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 406
 
2. PODATKI IN PORO ČANJE  
2.1 PODATKI 
Predložiti je treba podatke za vsako posamezno žival. Nadalje je 
treba vse podatke prikazati v obliki preglednice, iz katere so za 
vsako preskusno skupino razvidni naslednji podatki: število živali 
na začetku preskusa in število živali, med preskusom najdenih 
mrtvih ali usmr čenih iz humanih razlogov, nato čas smrti oziroma 
humane usmrtitve, število živali, ki kažejo znake toksi čnosti, opis 
opaženih znakov toksi čnosti, vklju čno s časom, ko so toksi čni učinki 
prvikrat nastopili, njihovim trajanjem in jakostjo, število živali s poškodbami, vrsto poškodb in odstotek živali z vsako posamezno 
vrsto poškodbe. 
Če je mogo če, je treba numeri čne podatke ovrednotiti s primerno 
splošno sprejeto statisti čno metodo. Statisti čne metode in podatke, ki 
se analizirajo, je treba dolo čiti pri načrtovanju študije.
 
2.2 PORO ČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije:  
2.2.1  Preskusna snov:  
— fizikalno stanje, čistost in fizikalno-kemijske lastnosti, 
— identifikacijski podatki, 
— nosilec (po potrebi): utemeljitev izbire nosilca, če to ni voda.  
2.2.2  Vrsta poskusnih živali:  
— uporabljena vrsta in sev, 
— število, starost in spol živali, — izvor, pogoji vzdrževanja, hrana ipd., — teža posameznih živali na za četku preskusa.
 
2.2.3  Preskusni pogoji:  
— utemeljitev izbire velikosti odmerka, 
— podatki o formulaciji preskusne snovi/priprave hrane, dosežena 
koncentracija, stabilnost in homogenost pripravka, 
— podatki o dajanju preskusne snovi, 
— dejanski odmerki (mg/kg telesne teže/dan) in po potrebi faktor za 
preračunavanje koncentracije preskusne snovi v hrani/pitni vodi 
(ppm) v dejanski odmerek, 
— podatki o kakovosti hrane in vode.  
2.2.4  Rezultati:  
— telesna teža in spremembe v telesni teži, 
— po potrebi podatki o porabi hrane in vode, 
— podatki o toksi čnem učinkovanju glede na spol in velikost 
odmerka, vklju čno z znaki toksi čnosti,  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 407
 
— vrsta, resnost in trajanje klini čnih opažanj (ali so reverzibilna ali ne), 
— rezultati oftalmoloških preiskav, — ocena senzori čne aktivnosti, mo či oprijema in motori čne aktiv­
nosti (kadar so na voljo), 
— hematološki testi z ustreznimi normalnimi vrednostmi, — klinični biokemi čni preskusi z ustreznimi normalnimi vrednostmi, 
— terminalna teža telesa, teže organov in razmerje teža organa/teža 
telesa, 
— ugotovitve obdukcije, — natančen opis vseh histopatoloških ugotovitev, 
— podatki o absorpciji, če so na voljo, 
— statisti čna obdelava rezultatov, po potrebi. 
Razprava o rezultatih. Zaključki.
 
3. LITERATURA  
(1) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of 
Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environ ­
mental Health Criteria Document No. 60. 
(2) Tupper, D.E., Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurologic 
Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999–1003. 
(3) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial 
Toxicology. J.Toxicol. Environ. Health, 9, 691–704. 
(4) Moser, V.C., Mc Daniel, K.M., Phillips, P.M. (1991). Rat Strain 
and Stock Comparisons Using a Functional Observational 
Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. 
Appl. Pharmacol., 108, 267–283. 
(5) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T. (1979). A 
Method for the Routine Assesment of Fore- and Hind- limb grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., I, 233- 
236. 
(6) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter 
L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 
599–609. 
(7) Weingand K., Brown G., Hall R.  et al.  (1996). „Harmonisation 
of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies“, Fundam. & Appl. Toxicol., 29, 198–201.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 408
 
B.27  PRESKUS SUBKRONI ČNE ORALNE TOKSI ČNOSTI 90-DNEVNA 
ŠTUDIJA ORALNE TOKSI ČNOSTI S PONAVLJAJO ČMI SE 
ODMERKI NA NEGLODALCIH  
1. METODA  
Ta metoda za preskus subkroni čne oralne toksi čnosti ustreza metodi 
OECD TG 409 (1998).  
1.1 UVOD 
Pri ocenjevanju in vrednotenju toksi čnih lastnosti kemikalije se lahko 
določi subkroni čna toksičnost z uporabo ponavljajo čega odmerjanja, 
potem ko so že bile pridobljene za četne informacije o toksi čnosti s 
preskusi akutne toksi čnosti ali 28-dnevnimi preskusi toksi čnosti pri 
ponavljajo čih se odmerkih. Ta 90-dnevna študija daje informacije o 
možnih nevarnostih za zdravje, za katere je verjetno, da se pojavijo 
pri ponavljani izpostavljenosti v obdobju naglega razvoja do mlade odrasle dobe. Študija daje informacije o glavnih toksi čnih učinkih, 
pokaže ciljne organe in možnosti kopi čenja ter lahko omogo či oceno 
ravni izpostavljenosti brez opaznih škodljivih u činkov, ki jo je 
mogoče uporabiti za izbiro velikosti odmerka pri preiskavah kroni čne 
toksičnosti in za dolo čitev varnostnih meril za izpostavljenost 
človeka. 
Preskusna metoda omogo ča ugotavljanje škodljivih u činkov izposta ­
vljenosti kemikalijam pri neglodalcih in se lahko uporablja le v naslednjih primerih: 
— kadar u činki, ugotovljeni v drugih študijah, nakazujejo potrebo 
po razjasnitvi/karakterizaciji pri drugi, neglodalski vrsti, ali 
— kadar toksikokineti čne študije kažejo na to, da je uporaba dolo ­ 
čene vrste neglodalcev najbolj primerna izbira laboratorijske 
živali ali 
— kadar drugi posebni razlogi upravi čujejo uporabo neglodalske 
vrste. 
Glej tudi Splošni uvod Del B.
 
1.2 OPREDELITEV POJMOV  
Odmerek:  je količina dajane preskusne snovi. Odmerek je izražen 
kot masa (g, mg), kot masa preskusne snovi na enoto teže poskusne živali (npr. mg/kg) ali kot konstantna koncentracija v hrani (ppm).  
Odmerjanje:  je splošni izraz, ki obsega odmerek, njegovo pogost ­
nost in trajanje dajanja odmerka.  
NOAEL:  je kratica za odmerek brez opaznih škodljivih u činkov 
(No Observed Adverse Effect Level) in je najve čji odmerek, pri 
katerem ne opazimo nobenega škodljivega u činka, povezanega z 
tretiranjem.
 
1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Preskusna snov se v obdobju 90 dni dnevno oralno daje v stopnje ­
vanih odmerkih ve č skupinam poskusnih živali, in sicer ena velikost 
odmerka na skupino. V času dajanja snovi natan čno opazujemo, ali 
živali kažejo znake toksi čnosti. Na živalih, ki med preskusom pogi ­
nejo ali so usmr čene, se izvede obdukcija, na koncu preskusa pa se 
usmrtijo tudi preživele živali in tudi na njih se izvede obdukcija.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 409
 
1.4 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.4.1  Izbira živalskih vrst  
Neglodalska vrsta, ki se obi čajno uporablja, je pes, ki mora biti 
določene pasme; pogosto se uporablja angleški brak. Uporabijo se 
lahko tudi druge vrste, denimo svinja ali pritlikava svinja. Uporaba 
primatov se ne priporo ča in njihovo uporabo je treba upravi čiti. 
Uporabiti je treba mlade, zdrave živali, v primeru psa je najbolje, da se odmerjanje za čne pri 4–6 mesecih, nikakor pa ne pozneje kot 
pri 9 mesecih starosti. Kadar se študija izvaja kot predhodna študija 
za dolgotrajno študijo kroni čne toksičnosti, je treba v obeh študijah 
uporabiti isto vrsto/pasmo.
 
1.4.2  Priprava živali  
Uporabiti je treba zdrave mlade živali, ki so se prilagodile na labo ­
ratorijske razmere in ki predhodno niso bile uporabljene za poskuse. Trajanje aklimatizacije je odvisno od izbrane poskusne vrste in njenega vira. Priporo ča se najmanj pet dni za pse ali svinje, gojene 
za ta namen v doma čem laboratoriju, in najmanj dva tedna za iste 
živali, če so pridobljene iz zunanjega vira. Poznati je treba vrsto, sev, 
vir, spol, težo in/ali starost poskusnih živali. Živali je treba naklju čno 
dodeliti kontrolni in tretirani skupini. Kletke je treba razporediti tako, 
da so možni u činki zaradi pozicije kletk čim manjši. Vsaki živali je 
treba dodeliti enkratno identifikacijsko številko.
 
1.4.3  Priprava odmerkov  
Preskusna snov se lahko daje s hrano, pitno vodo, gavažo ali kapsu ­
lami. Metoda oralnega dajanja je odvisna od namena študije in od 
fizikalno-kemijskih lastnosti preskusnega materiala. 
Po potrebi se preskusna snov raztopi ali suspendira v primernem 
nosilcu. Priporo čljivo je, da se, kadar koli je mogo če, najprej 
razmisli o uporabi vodne raztopine/suspenzije, potem o raztopini/ emulziji v olju (npr. koruzno olje), nato pa šele o možni raztopini v drugih nosilcih. V primeru nosilcev, ki niso voda, je treba poznati 
toksične lastnosti takega nosilca. Dolo čiti je treba stabilnost 
preskusne snovi v pogojih dajanja.
 
1.5 POSTOPEK  
1.5.1  Število in spol živali  
Za vsako velikost odmerka je treba uporabiti najmanj osem živali 
(štiri samice in štiri samce). Če so načrtovane usmrtitve med 
potekom študije, je treba število pove čati za število živali, pred ­
videnih za usmrtitev pred zaklju čkom študije. Število živali na 
koncu študije mora biti primerno za smiselno ovrednotenje toksi čnih 
učinkov. Na podlagi že poznanih lastnosti snovi ali bližjih analogov 
je treba razmisliti o vklju čitvi satelitne skupine osmih živali (štiri na 
spol) v kontrolno skupino in skupino z najve čjim odmerkom, za 
opazovanje reverzibilnosti ali perzistence morebitnih toksi čnih 
učinkov po tretiranju. Trajanje tega opazovalnega obdobja po treti ­
ranju se dolo či glede na opažene u činke. ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 410
 
1.5.2  Odmerjanje  
Uporabiti je treba najmanj tri velikosti odmerkov in isto časno 
kontrolo, razen če se izvaja mejni preskus (glej 1.5.3). Velikosti 
odmerkov se lahko dolo čijo na podlagi rezultatov študij s ponavlja ­
jočim odmerjanjem ali študij za ugotavljanje obmo čja odmerkov, pri 
tem pa morajo biti upoštevani vsi obstoje či toksikološki in toksiko ­
kinetični podatki, ki so na voljo v zvezi s preskusno snovjo ali 
sorodnimi materiali. Razen kadar zaradi fizikalno-kemijskih lastnosti 
ali bioloških u činkov preskusne snovi to ni mogo če, je treba najvišjo 
velikost odmerka izbrati z namenom, da se povzro či toksičnost, ne 
pa smrt ali hudo trpljenje. Upadajo če zaporedje velikosti odmerkov 
je treba izbrati z namenom, da se pokažejo vse od odmerka odvisne 
reakcije, in je velikost odmerka brez opaznih škodljivih u činkov 
(NOAEL) najnižja izbrana velikost odmerka. Za dolo čanje upadajo ­ 
čega zaporedja velikosti odmerkov so pogosto najprimernejši 
dvakratni do štirikratni intervali, ve činoma pa je bolje dodati 
dodatno, četrto preskusno skupino, kakor uporabiti zelo velike inter ­
vale (npr. ve č kot faktor okrog 6–10) med odmerki. 
Kontrolna skupina je netretirana skupina ali skupina, tretirana z 
nosilcem, če je pri dajanju preskusne snovi ta uporabljen. Razen 
kar zadeva tretiranje s preskusno snovjo, morajo biti živali v 
kontrolni skupini obravnavane enako kakor živali v preskusni 
skupini. Če je uporabljen nosilec, mora kontrolna skupina prejeti 
volumen nosilca, enak najve čjemu uporabljenemu volumnu. Če se 
preskusna snov daje s hrano in se s tem povzro či zmanjšan vnos 
hrane, lahko uporabimo po parih hranjeno kontrolno skupino, da se 
razloči zmanjšan vnos hrane zaradi okusa ali toksikoloških spre ­
memb v preskusnem modelu. 
Ustrezno je treba upoštevati naslednje lastnosti nosilca in drugih 
dodatkov: u činke na absorpcijo, distribucijo, presnovo ali retencijo 
preskusne snovi; u činke na kemijske lastnosti preskusne snovi, ki 
lahko spremenijo njene toksi čne lastnosti; ter u činke na porabo 
hrane ali vode ali prehranjenost živali.  
1.5.3  Mejni preskus  
Če preskus pri eni velikosti odmerka, enakovredni najmanj 1 000 
mg/kg telesne teže/dan, pri katerem so uporabljeni postopki, opisani za to študijo, ne da opaznih škodljivih u činkov in če toksičnost ni 
pričakovana glede na podatke o strukturno sorodnih snoveh, potem 
popolna študija z uporabo treh velikosti odmerkov morda ne bo potrebna. Mejni preskus se lahko uporabi v vseh primerih razen, kadar učinki izpostavljenosti pri človeku kažejo na potrebo po 
uporabi višje velikosti odmerka.
 
1.5.4  Dajanje odmerkov  
Živali dobivajo preskusno snov dnevno sedem dni na teden v 
obdobju 90 dni. Vsako odstopanje od tega režima odmerjanja, npr. 
pet dni na teden, je treba utemeljiti. Če se preskusna snov daje z 
gavažo, jo je treba živali dati v enkratnem odmerku z uporabo želodčne sonde ali primerne intubacijske kanile. Najve čji volumen 
tekočine, ki jo je mogo če dati naenkrat, je odvisen od velikosti 
poskusne živali. Volumen naj bo čim manjši. Razen pri draže čih 
ali jedkih snoveh, ki bodo pri višjih koncentracijah obi čajno povzro ­ 
čile močnejše učinke, je treba variabilnost preskusnega volumna s 
prilagajanjem koncentracije obdržati na kar najnižji ravni, zato da bi 
zagotovili konstantni volumen pri vseh odmerkih.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 411
 
Pri snoveh, ki se dajejo s hrano ali pitno vodo, je nujno zagotoviti, 
da količine uporabljene preskusne snovi ne vplivajo na obi čajno 
raven vnosa hrane ali porabe vode. Kadar se preskusna snov daje s hrano, se lahko uporabi bodisi konstantna koncentracija v hrani (ppm) bodisi konstantna velikost odmerka glede na telesno težo; 
treba je navesti uporabljeni na čin. Če snov dajemo z gavažo ali 
kapsulo, je treba odmerke dati vsak dan približno ob istem času in 
jih ustrezno prilagoditi, da se vzdržuje konstantna velikost odmerka glede na telesno težo živali. Če se 90-dnevna študija izvaja kot 
predhodna študija za dolgotrajno študijo kroni čne toksičnosti, je 
treba v obeh študijah uporabiti podobno hrano.
 
1.5.5  Opazovanja  
Opazovano obdobje mora trajati najmanj 90 dni. Živali v satelitni 
skupini, ki so predvidene za naknadna opazovanja, se za primerno 
časovno obdobje ne tretira, zato da bi lahko ugotovili, ali so toksi čni 
učinki obstojni ali reverzibilni. 
Splošna klini čna opazovanja je treba opraviti najmanj enkrat na dan, 
najbolje vsak dan ob istem času, pri čemer se upošteva vrhunec 
pričakovanih u činkov po odmerjanju. Klini čno stanje živali je treba 
dokumentirati. Najmanj dvakrat dnevno, obi čajno na za četku in na 
koncu vsakega dne, je treba živali pregledati, da se odkrijejo znaki obolevnosti in smrtnosti. 
Najmanj enkrat pred prvo izpostavljenostjo (zaradi primerjav na 
istem osebku) in enkrat na teden po tem je treba opraviti natan čna 
klinična opazovanja vseh živali. Ta opazovanja je treba, če je 
mogoče, opraviti zunaj doma če kletke, na standardnem mestu in 
vsakokrat ob podobnem času. Prizadevati si je treba, da so variacije 
v pogojih opazovanja minimalne. Znake toksi čnosti je treba skrbno 
dokumentirati, vklju čno s časom, ko so nastopili, njihovo jakostjo in 
trajanjem. Opazovanja morajo obsegati, vendar ne smejo biti 
omejena na, spremembe na koži, kožuhu, o čeh, sluznicah, pojav 
sekrecije in ekskrecije ter delovanje avtonomnega živ čevja (npr. 
lakrimacija, piloerekcija, velikost zenic, nenormalno dihanje). Doku ­
mentirati je treba tudi spremembe v hoji, drži in odzivu na ravnanje z 
živalmi, pa tudi prisotnost zgibkov, stereotipnega vedenja (npr. 
prekomerno čiščenje, ponavljajo ča se krožna premikanja) ali vsako 
nenormalno vedenje. 
Oftalmološko preiskavo z uporabo oftalmoskopa ali ustrezne enako ­
vredne opreme je treba izvesti pred dajanjem preskusne snovi in na koncu študije, najbolje na vseh živalih, vendar vsaj v skupini z 
velikim odmerkom in v kontrolni skupini. Če se odkrijejo spre ­
membe na o čeh, povezane z tretiranjem, je treba preiskati celo 
skupino.
 
1.5.5.1  Telesna teža in poraba hrane/vode  
Vse živali je treba stehtati najmanj enkrat na teden. Meritve porabe 
hrane je treba opraviti vsaj tedensko. Če se preskusna snov daje s 
pitno vodo, je treba najmanj enkrat tedensko izmeriti tudi porabo vode. Poraba vode se lahko upošteva tudi pri študijah odmerjanja 
s hrano ali z gavažo, pri katerih se vedenje glede pitja lahko spre ­
meni.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 412
 
1.5.5.2  Hematologija in klini čna biokemija  
Vzorce krvi je treba vzeti na imenovanem mestu in hraniti, kadar je 
primerno, v ustreznih pogojih. Na koncu preskusnega obdobja se vzorci odvzamejo tik pred usmrtitvijo ali med samim postopkom 
usmrtitve živali. 
Na začetku študije, nato bodisi v mese čnih intervalih bodisi na sredi 
preskusnega obdobja in na koncu preskusnega obdobja je treba opra ­
viti hematološke preiskave, vklju čujoč krvno sliko levkocitov, število 
trombocitov in meritev časa/potenciala koagulacije krvi, protrom ­
binski čas ali tromboplastinski čas. 
Klinične biokemi čne določitve za ugotavljanje glavnih toksi čnih 
učinkov v tkivih, zlasti u činkov na ledvica in jetra, je treba opraviti 
na vzorcih krvi, pridobljenih od vseh živali na za četku študije, nato 
bodisi v mese čnih intervalih bodisi na sredi preskusnega obdobja in 
na koncu preskusnega obdobja. Testna podro čja, o katerih je treba 
razmisliti, so elektrolitsko ravnotežje, presnova ogljikovodikov ter 
delovanje jeter in ledvic. Na izbor dolo čenih testov bodo vplivala 
opažanja glede na čina delovanja preskusne snovi. Pred odvzemom 
krvi je treba živali postiti za obdobje, primerno za posamezno vrsto. Predlagane dolo čitve vklju čujejo kalcij, fosfor, klorid, natrij, kalij, 
glukozo na teš če, alanin-aminotransferazo, aspartat-aminotransferazo, 
ornitin-dekarboksilazo, gamaglutamil-transpeptidazo, se čninski dušik, 
albumin, kreatinin v krvi, skupni bilirubin in skupne serumske belja ­
kovine. 
Urinsko analizo je treba opraviti vsaj na za četku študije, nato na 
sredi preskusnega obdobja in še na koncu preskusnega obdobja, in 
sicer na urinu, ki je zbran v dolo čenih časovnih obdobjih. Meritve 
pri urinski analizi naj vklju čujejo videz, volumen, osmolalnost ali 
specifično težo, pH, beljakovine, glukozo in kri/krvne celice. Če je 
treba preiskavo opaženih u činkov razširiti, se lahko uporabijo 
dodatni parametri. 
Poleg tega bi bilo treba razmisliti o preiskavi splošnih markerjev 
poškodb tkiva. Za ustrezno toksikološko ovrednotenje bo morebiti 
treba dolo čiti tudi lipide, hormone, razmerje kisline/baze, methemo ­
globin in inhibicijo holinesteraze. Če je treba opazovanje opaženih 
učinkov razširiti, se lahko opravijo dodatne klini čne biokemijske 
analize. Te je treba dolo čiti pri kemikalijah dolo čenih razredov 
oziroma odvisno od primera. 
V glavnem mora biti pristop fleksibilen, odvisno od vrste in od 
opaženega in/ali pri čakovanega u činka dane snovi.  
1.5.5.3  Obdukcija  
Na vseh živalih iz študije je treba opraviti popolno in natan čno 
obdukcijo, ki obsega skrbno preiskavo zunanje površine telesa, vseh odprtin, lobanjske, prsne in trebušne votline ter njihove vsebine. 
Z jeter z žol čnikom, ledvic, nadledvi čnih žlez, mod, obmodka, jaj č­
nikov, maternice, š čitnice (z obš čitnicami), priželjca, vranice, 
možganov in srca vseh živali (to ne velja za živali, ki so najdene poginjajo če in/ali usmr čene med postopkom) je treba ustrezno o čistiti 
vsa priraš čena tkiva, nato pa dolo čiti njihovo mokro težo, čim prej 
po disekciji, zato da se prepre či sušenje.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 413
 
Naslednja tkiva je treba shraniti v sredstvu, ki je najprimernejše za 
vrsto tkiva in za predvidene nadaljnje histopatološke preiskave: vse 
makroskopske poškodbe, možgane (reprezentativna podro čja, ki 
vključujejo velike možgane, male možgane in možgansko deblo/ 
pons), hrbtenja čo (s treh predelov: vratnega, srednjega prsnega in 
ledvenega), hipofizo, o či, ščitnico, obš čitnico, priželjc, požiralnik, 
slinavke, želodec, tanko in debelo črevo (vklju čno s Peyerjivimi 
poloji), jetra, žol čnik, trebušno slinavko, ledvica, nadledvi čni žlezi, 
vranico, srce, sapnik in plju ča, aorto, spolne žleze, maternico, 
pomožne spolne organe, mle čne žleze samic, prostato, se čni mehur, 
bezgavke (priporo čljivo, eno bezgavko, ki zajema predel poti odmer ­
janja preskusne snovi, in drugo bezgavko oddaljeno od tega predela, zato da so vklju čeni tudi sistemski u činki), periferni živec (ishiadi čni 
ali tibialni) najbolje v neposredni bližini mišice, rezino kostnega 
mozga (in/ali sveži aspirat kostnega mozga) in kožo. Klini čne in 
druge ugotovitve lahko pokažejo, da bo treba pregledati dodatna tkiva. Shraniti je treba tudi vse organe, za katere je na podlagi znanih 
lastnosti preskusne snovi verjetno, da so ciljni organi.
 
1.5.5.4  Histopatologija  
V celoti je treba opraviti histopatološke preiskave shranjenih organov 
in tkiv vsaj pri vseh živalih iz kontrolne skupine in skupine z 
velikim odmerkom. Če so v skupini z velikim odmerkom opažene 
spremembe, povezane s tretiranjem, je treba te preiskave razširiti tudi na skupine vseh drugih odmerkov. 
Preiskati je treba vse makroskopske poškodbe. Če je uporabljena satelitna skupina, je treba histopatološke preiskave 
opraviti na tkivih in organih, na katerih so bili vidni u činki v treti ­
ranih skupinah.
 
2. PODATKI IN PORO ČANJE  
2.1 PODATKI 
Predložiti je treba podatke za vsako posamezno žival. Nadalje je 
treba vse podatke prikazati v obliki preglednice, iz katere so za vsako preskusno skupino razvidni naslednji podatki: število živali 
na začetku preskusa in število živali, med preskusom najdenih 
mrtvih ali usmr čenih iz humanih razlogov, čas smrti oziroma 
usmrtitve iz humanih razlogov, število živali, ki kažejo znake toksi ­ 
čnosti, opis opaženih znakov toksi čnosti, vklju čno s časom, ko so 
toksični učinki prvikrat nastopili, njihovim trajanjem in jakostjo, 
število živali s poškodbami, vrsta poškodb in odstotek živali z vsako posamezno vrsto poškodbe. 
Če je mogo če, je treba numeri čne podatke ovrednotiti s primerno 
splošno sprejeto statisti čno metodo. Statisti čne metode in podatke, ki 
se analizirajo, je treba dolo čiti pri načrtovanju študije.
 
2.2 PORO ČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije:  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 414
 
2.2.1  Preskusna snov:  
— fizikalno stanje, čistost in fizikalno-kemijske lastnosti, 
— identifikacijski podatki, — nosilec (po potrebi): utemeljitev izbire nosilca, če to ni voda.
 
2.2.2  Vrsta poskusnih živali:  
— uporabljena vrsta in sev, 
— število, starost in spol živali, — vir, pogoji vzdrževanja, hrana ipd., — teža posameznih živali na za četku preskusa.
 
2.2.3  Pogoji preskusa:  
— utemeljitev izbire velikosti odmerka, 
— podatki o formulaciji preskusne snovi/priprave hrane, dosežena 
koncentracija, stabilnost in homogenost pripravka, 
— podatki o dajanju preskusne snovi, — dejanski odmerki (mg/kg telesne teže/dan) in po potrebi faktor za 
preračunavanje koncentracije preskusne snovi v hrani/pitni vodi 
(ppm) v dejanski odmerek, 
— podatki o kakovosti hrane in vode.
 
2.2.4  Rezultati:  
— telesna teža/spremembe v telesni teži, 
— po potrebi podatki o porabi hrane in porabi vode, 
— podatki o toksi čnem učinkovanju glede na spol in velikost 
odmerka, vklju čno z znaki toksi čnosti, 
— vrsta, resnost in trajanje klini čnih opažanj (ali so reverzibilna ali 
ne), 
— oftalmološka preiskava, — hematološki testi z ustreznimi normalnimi vrednostmi, — klinični biokemi čni preskusi z ustreznimi normalnimi vrednostmi, 
— terminalna teža telesa, teže organov in razmerje med težo organa 
in telesno težo, 
— ugotovitve obdukcije, — natančen opis vseh histopatoloških ugotovitev, 
— podatki o absorpciji, če so na voljo, 
— statisti čna obdelava rezultatov, po potrebi. 
Razprava o rezultatih. Zaključki.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 415
 
B.28  ŠTUDIJA SUBKRONI ČNE STRUPENOSTI V STIKU S KOŽO 
90-DNEVNA ŠTUDIJA S PONOVLJENIM DERMALNIM 
ODMERKOM NA GLODALCIH  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Glej Splošni uvod dela B.  
1.2 OPREDELITEV POJMOV 
Glej Splošni uvod dela B.  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Jih ni.  
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Preskusna snov se daje dnevno na kožo v graduiranih odmerkih 
nekaj skupinam preskusnih živali, po en odmerek na skupino v 
obdobju 90 dni. V obdobju dajanja se živali opazujejo dnevno, da 
bi se odkrilo znake strupenosti. Na živalih, ki med preskusom pogi ­
nejo, se opravi nekropsija, po zaklju čku preskusa pa se nekropsija 
opravi tudi na preživelih živalih.  
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Jih ni.  
1.6 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.6.1  P r i p r a v e  
Živali se vzdržujejo v preskusnih nastanitvenih in prehranjevalnih 
pogojih najmanj pet dni pred preskusom. Pred preskusom se naključno izberejo zdrave mlade živali in se razporedijo v preskusne 
ter kontrolne skupine. Pred samim preskusom se na hrbtnem predelu 
telesa preskusnih živali ostriže krzno. Lahko se ga obrije, vendar je treba to opraviti približno 24 ur pred preskusom. Živalim je obi čajno 
treba krzno ponovno ostri či ali obriti približno v tedenskih časovnih 
presledkih. Med striženjem ali britjem krzna je treba paziti, da se ne 
odrgne kožo. Za nanos preskusne snovi je treba o čistiti najmanj 
10 % telesne površine. Pri odlo čitvi o podro čju, ki ga je treba 
očistiti, in velikosti pokrivala, je treba upoštevati maso živali. Pri 
preskušanju trdnih snovi, ki jih je, kadar je primerno, mogo če upra­ 
šiti, je treba preskusno snov dovolj navlažiti z vodo ali, kadar je potrebno, ustreznim nosilcem, da se zagotovi dober stik s kožo. 
Tekoče preskusne snovi se ponavadi uporabljajo nerazred čene. 
Snovi se nanaša vsak dan pet do sedem dni na teden.
 
1.6.2  Preskusni pogoji  
1.6.2.1 P r e s k u s n e ž i v a l i 
Uporabijo se odrasla podgana, kunec ali morski praši ček. Mogo če je 
uporabiti tudi druge vrste, vendar je njihovo uporabo treba utemeljiti. Na začetku preskusa nihanje v teži ne sme presegati ± 20 % srednje 
vrednosti. Kadar se subkroni čna dermalna študija izvaja kot pred ­
hodnica dolgodobne študije, je treba v obeh študijah uporabiti isto 
vrsto in sev.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 416
 
1.6.2.2 Š t e v i l o i n s p o l 
Za vsako velikost odmerka je treba uporabiti najmanj 20 živali (10 
samic in 10 samcev) z zdravo kožo. Samice naj bodo nuliparne in nebreje. Če so načrtovana vmesna žrtvovanja, je treba število pove ­ 
čati za število živali, ki naj bi bile žrtvovane še pred zaklju čkom 
študije. Poleg tega se lahko satelitsko skupino 20 živali (10 živali na spol) tretira z odmerkom visoke velikosti 90 dni in na njih v 28 dneh po tretiranju opazuje povratnost, obstojnost ali zapozneli pojav stru ­
penih učinkov.
 
1.6.2.3 V e l i k o s t i o d m e r k a 
Zahtevane so najmanj tri velikosti odmerka s kontrolno skupino ali 
kontrolno skupino nosilca, v kolikor je uporabljen nosilec. Čas izpo­
stavljenosti naj traja najmanj šest ur na dan. Preskusno snov je treba 
nanesti vsak dan približno ob enakem času, količino nanesene snovi 
pa prilagajati v časovnih presledkih (tedensko ali dvotedensko), da se 
ohrani konstantna velikost odmerka glede na telesno maso živali. 
Razen tretiranja s preskusno snovjo je treba z živalmi v kontrolni 
skupini ravnati na popolnoma enak na čin kot z živalmi iz preskusne 
skupine. Kadar se za lažje dajanje odmerkov uporabi nosilec, ga je treba na kontrolni skupini odmeriti na enak na čin kot na preskusnih 
skupinah, odmerek nosilca pa naj bo enak, kot pri preskusni skupini 
z najvišjo velikostjo odmerka. Najvišja velikost odmerka bi morala povzročiti strupene u činke, vendar sme povzro čiti malo oziroma 
nobenega smrtnega primera. Najnižja velikost odmerka ne sme 
povzročiti nikakršnih znakov strupenosti. Kadar je na razpolago 
uporabna ocena izpostavljenost človeka, mora najnižja velikost to 
presegati. V najboljšem primeru mora srednja velikost odmerka povzročiti minimalne opazne strupene u činke. Če je uporabljena 
več kot ena srednja velikost odmerka, je treba te velikosti razporediti 
tako, da dobimo stopnjevanje strupenih u činkov. Za pomenljivo 
oceno rezultatov mora biti pojav smrtnih primerov v skupinah z nizkim in srednjim odmerkom ter v kontrolnih skupinah nizek. 
Če nanos preskusne snovi povzro či hudo vnetje kože, je treba 
koncentracijo zmanjšati, kar ima lahko za posledico zmanjšanje ali odsotnost strupenih u činkov pri visoki velikosti odmerka. Če je koža 
hudo poškodovana, bo morda treba zaklju čiti študijo in za četi novo 
študijo z nižjimi koncentracijami.
 
1.6.3 M e j n i p r e s k u s 
Če predhodna študija pri velikosti odmerka 1 000 mg/kilogram, ali 
pri višji velikosti odmerka, povezani z možno izpostavljenostjo 
človeka, kadar je ta poznana, ne pokaže nikakršnih znakov strupenih 
učinkov, nadaljnji preskusi verjetno ne bodo potrebni.  
1.6.4 Č a s o p a z o v a n j a 
Preskusne živali je treba dnevno opazovati, da bi se odkrili znaki 
strupenosti. Zabeležiti je treba čas smrti in čas, ko se znaki strupe ­
nosti pojavijo in izginejo.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 417
 
1.6.5 P o s t o p e k 
Živali je treba hraniti v kletkah vsako posebej. Najprimerneje je, da 
se živalim odmerek preskusne snovi daje sedem dni na teden, v obdobju 90 dni. 
Živali iz katere koli satelitske skupine, za katero so na črtovana 
nadaljnja opazovanja, je treba ohranjati še nadaljnjih 28 dni brez tretiranja, da bi se odkrilo okrevanje ali obstojnost strupenih u činkov. 
Čas izpostavljenosti naj bo šest ur na dan. 
Preskusno snov je treba nanesti enakomerno na obmo čje, ki znaša 
približno 10 % celotne telesne površine. V primeru zelo strupene 
snovi je lahko površina pokritosti manjša, vendar mora kljub temu 
biti v celoti pokrita s čim tanjšo in čim bolj enakomerno plastjo. 
V času izpostavljenosti se preskusna snov ohranja v stiku s kožo s 
porozno obvezo iz gaze in lepilnim trakom, ki ne draži kože. 
Preskusno obmo čje je treba še dodatno pokriti na primeren na čin, 
da se obvezo iz gaze in preskusno snov obdrži na mestu ter zagotovi, da živali ne morejo zaužiti preskusne snovi. Za prepre čitev zaužitja 
preskusne snovi je mogo če uporabiti opremo, ki omejuje gibanje 
živali, vendar pa popolna imobilizacija ni priporo čljiva metoda. 
Na koncu obdobja izpostavljenosti se, kjer je mogo če, odstrani 
ostanke preskusne snovi z vodo ali s kakšno drugo ustrezno metodo 
čiščenja kože. 
Vse živali je treba dnevno opazovati in beležiti znake strupenosti 
vključno s časom njihovega nastopa, stopnjo in trajanjem. Opazo ­
vanje v kletkah naj vklju čuje opazovanje sprememb na koži in 
krznu, v o čeh in sluznicah ter v dihalnem in krvožilnem sistemu, 
avtonomnem in osrednjem živ čnem sistemu, somatomotori čni aktiv­
nosti ter vedenjskem vzorcu. Tedensko je treba meriti porabo hrane 
in živali vsak teden stehtati. Redno opazovanje živali je potrebno, da 
se zagotovi, da med preskusom ne pride do izgube živali zaradi kanibalizma, avtolize tkiv ali napa čne postavitve. Na koncu preskus ­
nega obdobja se na vseh preživelih živalih iz nesatelitske preskusne 
skupine opravi nekropsija. Umirajo če živali je treba odstraniti in 
opraviti nekropsijo takoj, ko je to opaženo. 
Naslednji pregledi se obi čajno opravijo na vseh živalih, vklju čno s 
kontrolnimi skupinami: 
(a) Oftalmološki pregled z uporabo oftalmoskopa ali podobne 
ustrezne opreme je treba opraviti pred dajanjem preskusne 
snovi in ob zaklju čku študije, po možnosti na vseh živalih, 
najmanj pa na skupinah z visokim odmerkom in kontrolnih skupinah. Če se odkrijejo spremembe v o čeh, je treba pregledati 
vse živali. 
(b) Hematološko preiskavo, vklju čno s hematokritom, koncentracijo 
hemoglobina, številom eritrocitov, skupnim in diferencialnim številom levkocitov ter merjenjem zmožnosti koagulacije, kot je čas koagulacije, protrombinski 
čas, tromboplastinski čas ali 
število trombocitov, je treba opraviti na koncu preskusnega 
obdobja.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 418
 
(c) Klinično biokemijsko dolo čitev na krvi je treba izvesti na koncu 
preskusnega obdobja. Preskusna podro čja, ki štejejo za ustrezna 
vsem študijam, so ravnovesje elektrolitov, presnova ogljikovih hidratov, delovanje jeter in ledvic. Izbor dolo čenih preskusov bo 
odvisen od opazovanj na čina delovanja snovi. Predlagane dolo ­ 
čitve so meritve kalcija, fosforja, klora, natrija, kalija, glukoze na 
tešče (z obdobjem teš čosti, ustreznim za posamezno vrsto), 
serumske glutaminske piruvi čne transaminaze (
 1 ), serumske 
glutaminske oksaloacetat transaminaze (  2 ), ornitin-dekarboksi ­
laze, gama-glutamil-transpeptidaze, se čnine, albumina, kreatinina 
v krvi, skupnega bilirubina in skupnih serumskih proteinov. Druge dolo čitve, ki bi lahko bile potrebne za ustrezno oceno 
strupenosti vklju čujejo analize lipidov, hormonov, kislinsko- 
bazično ravnovesje, methemoglobina in aktivnost holinesteraze. 
Po potrebi je mogo če opraviti dodatne klini čno biokemijske 
preiskave, da bi se razširilo raziskavo opaženih u činkov. 
(d) Analize urina ni treba opravljati rutinsko, ampak samo takrat, 
kadar gre za indikacije, ki temeljijo na pri čakovani ali opaženi 
strupenosti. 
Če so predhodni podatki normalnih vrednosti neustrezni, je treba 
pozornost usmeriti na hematološke in klini čno biokemijske parametre 
pred začetkom dajanja odmerkov.
 
1.6.6 M a k r o s k o p s k a n e k r o p s i j a 
Na vseh živalih je treba opraviti temeljito makroskopsko nekropsijo, 
ki vključujejo pregled zunanje površine telesa, vseh telesnih odprtin 
ter lobanjske, prsne in trebušne votline ter njihove vsebine. Jetra, ledvice, nadledvi čne žleze in moda je treba čim prej po seciranju, 
še vlažne, stehtati, da se izognemo izsušitvi. Naslednje organe in 
tkiva je treba shraniti v ustreznem mediju za morebitne nadaljnje histopatološke preiskave: vse vidne lezije, možgane – vklju čno z 
deli podaljšane hrbtenja če/mosta, skorjo malih možganov in 
možgansko skorjo, hipofizo, š čitnico/obš čitnico in tkivo priželjca, 
(sapnik), plju ča, srce, aorto, žleze slinavke, jetra, vranico, ledvice, 
nadledvične žleze, trebušno slinavko, spolne žleze, maternico, 
pomožne spolne organe, žol čnik (če je prisoten), požiralnik, želodec, 
dvanajsternik, zgornje tanko črevo, spodnje tanko črevo, slepo črevo, 
debelo črevo, danko, se čni mehur, reprezentativni limfni vozel, 
(mlečno žlezo samic), (stegensko miši čevje), periferni živec, (o či), 
(prsnico s kostnim mozgom), (stegnenica, vklju čno s površino skle ­
pa), (hrbtenja čo na treh ravneh – vratni, prsni in ledveni) in (eksor ­
bitalne žlezne solznice). Tkiva, navedena v oklepajih, je treba pregle ­
dati le, če kažejo znake strupenosti ali če gre za indikacijo, da so to 
ciljni organi.
 
1.6.7 H i s t o p a t o l o š k a p r e i s k a v a 
(a) Popolno histopatološko preiskavo je treba opraviti na normalni in 
tretirani koži ter organih in tkivih živali v kontrolni skupini in 
skupini z visokim odmerkom. 
(b) Pregledati je treba vse vidne lezije.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 419  
( 1 ) Danes poznana kot serumska alanin aminotransferaza. 
( 2 ) Danes poznana kot serumska aspartat aminotransferaza
 (c) Pregledati je treba ciljne organe v skupinah z drugimi odmerki. 
(d) Kadar so uporabljene podgane, je treba na plju čih živali iz 
skupin z nižjimi in srednje velikimi odmerki opraviti histopato ­
loško preiskavo, da bi se odkrili znaki okužbe, saj se tako lahko 
ustrezno oceni zdravstveno stanje živali. Nadaljnje histopatološke 
preiskave na živalih v teh skupinah verjetno ne bodo potrebne na rutinski osnovi, vedno pa se morajo opraviti na organih, ki poka ­ 
žejo znake lezij v skupini z visokim odmerkom. 
(e) Kadar je uporabljena satelitska skupina, je treba opraviti histo ­
patološko preiskavo na tkivih in organih, na katerih so v preskusnih skupinah opazni u činki.
 
2. PODATKI  
Podatki se povzamejo v obliki tabele, iz katere je za vsako preskusno 
skupino razvidno število živali na za četku preskusa, število živali, pri 
katerih so opažene lezije, tipe lezij, in odstotek živali, ki kažejo 
določen tip lezije. Rezultate je treba oceniti z ustrezno statisti čno 
metodo. Uporabiti je mogo če katero koli priznano statisti čno metodo.  
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Če je mogo če, se v poro čilo o preskusu vklju čijo naslednji podatki: 
— vrsta, sev, vir, okoljski pogoji, hrana, 
— preskusni pogoji, 
— velikosti odmerka (vklju čno z nosilcem, če je ta uporabljen) in 
koncentracije, 
— podatki o odzivu strupenosti po spolu in odmerku, 
— če je možno, velikost odmerka, pri kateri ni opaženega u činka, 
— čas smrti med študijo ali preživetje živali do zaklju čka, 
— opis strupenih ali drugih u činkov, 
— čas opazovanja vsakega znaka abnormalnosti in njegov nadaljnji 
potek, 
— podatki o hrani in telesni masi, 
— oftalmološke ugotovitve, — opravljeni hematološki preskusi in vsi rezultati, 
— opravljeni klini čni biokemijski preskusi in vsi rezultati (vklju čno 
z rezultati vsake analize urina), 
— ugotovitve nekropsije,
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 420
 
— podroben opis vseh histopatoloških ugotovitev, 
— statisti čna obdelava rezultatov, kadar je to mogo če, 
— obravnava rezultatov, 
— razlaga rezultatov.  
3.2 OCENA IN RAZLAGA 
Glej Splošni uvod dela B.  
4. VIRI  
Glej Splošni uvod dela B.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 421
 
B.29  SUBKRONI ČNA STRUPENOST PRI VDIHAVANJU: 90-DNEVNA 
ŠTUDIJA  
POVZETEK 
Ta revidirana preskusna metoda B.29 je bila zasnovana za celovito opredelitev 
strupenosti preskusne kemikalije pri vdihavanju v subkroni čnem obdobju (90 dni) 
in zagotavljanje podatkov za kvantitativne ocene tveganja pri vdihavanju. 
Skupine 10 samcev in 10 samic glodavcev se 90 dni (13 tednov) po 6 ur na dan izpostavljajo a) trem ali ve č različnim koncentracijam preskusne kemikalije, 
b) filtriranemu zraku (negativna kontrola) in/ali c) nosilcu (kontrola z nosilcem). 
Navadno se živali izpostavljajo 5 dni na teden, dovoljeno pa je tudi izposta ­
vljanje 7 dni na teden. Vedno se preskušajo samci in samice, vendar se lahko izpostavljajo razli čnim koncentracijam, če je znano, da je en spol ob čutljivejši za 
določeno preskusno kemikalijo. Ta metoda vodji študije omogo ča prožnost za 
vključitev satelitskih skupin (skupin za reverzibilnost), vmesnih žrtvovanj, bron ­
hoalveolarne lavaže (BAL), nevroloških preskusov ter dodatnih klini čnih patolo ­ 
ških in histopatoloških ocen, da se bolje opredeli strupenost preskusne kemika ­
lije.
 
UVOD 
1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD 413 (2009). 
Prvotna smernica za preskušanje 413 v zvezi s subkroni čno strupenostjo pri 
vdihavanju (TG 413) je bila sprejeta leta 1981 (1). Ta preskusna metoda B.29 (ki ustreza revidirani TG 413 (2009)) je bila posodobljena, da upošteva 
trenutno stanje v znanosti ter izpolnjuje sedanje in prihodnje zakonodajne 
potrebe. 
2. Študije subkroni čne strupenosti pri vdihavanju se uporabljajo predvsem za 
določanje zakonsko predpisanih koncentracij za ocenjevanje tveganj za 
delavce v delovnem okolju. Uporabljajo se tudi za ocenjevanje tveganj za ljudi v njihovem bivalnem okolju in med prevozom ter okoljskih tveganj. Ta 
metoda omogo ča opredelitev škodljivih u činkov po ponavljajo či se dnevni 
izpostavljenosti preskusni kemikaliji z vdihavanjem, pri čemer preskušanje 
traja 90 dni (približno 10 % življenjske dobe podgane). Podatki, pridobljeni s študijami subkroni čne strupenosti pri vdihavanju se lahko uporabijo za 
kvantitativne ocene tveganja in izbiro koncentracij za študije kroni čne stru­
penosti. Ta preskusna metoda ni posebej namenjena preskušanju nanomate ­
rialov. Pojmi, ki se uporabljajo v okviru te preskusne metode, so opredeljeni na koncu tega poglavja in v Dokumentu s smernicami (GD) št. 39 (2).
 
ZAČETNI PREUDARKI 
3. Da se pove ča kakovost študije in kar najbolj zmanjša uporaba živali, mora 
preskuševalni laboratorij pred izvedbo študije preu čiti vse razpoložljive 
informacije o preskusni kemikaliji. Informacije, ki pomagajo pri izbiri ustreznih preskusnih koncentracij, lahko vklju čujejo identiteto, kemijsko 
strukturo in fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije; rezultate 
morebitnih preskusov strupenosti  in vitro  ali in vivo ; pričakovane uporabe 
in potencial za izpostavljenost ljudi; razpoložljive podatke (Q)SAR in toksi ­
kološke podatke o strukturno sorodnih kemikalijah ter podatke, pridobljene 
z drugimi študijami s ponavljajo čo se izpostavljenostjo. Če se med študijo 
pričakuje ali opazi nevrotoksi čnost, se lahko vodja študije odlo či vključiti 
ustrezne ocene, kot sta sklop funkcionalnih opazovanj (FOB) in merjenje motorične aktivnosti. Čeprav je lahko čas izpostavitve odlo čilen za posebne 
preglede, izvajanje teh dodatnih dejavnosti ne sme posegati v osnovno 
zasnovo študije.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 422
 
4. Razred čine jedkih ali dražilnih preskusnih kemikalij se lahko preskušajo pri 
koncentracijah, ki bodo zagotovile želeno stopnjo strupenosti. Ve č infor­
macij je na voljo v GD 39 (2). Pri izpostavljanju živali tem snovem morajo biti ciljne koncentracije dovolj nizke, da ne povzro čijo očitnih bole čin in 
trpljenja, vendar zadostne za razširitev krivulje koncentracija-odziv na ravni, 
ki izpolnjuje zakonodajni in znanstveni cilj preskusa. Te koncentracije je 
treba izbrati za vsak primer posebej, po možnosti na podlagi ustrezno zasno ­
vane študije za ugotavljanje obmo čja, s katero se pridobijo informacije o 
kritičnih končnih točkah, morebitnem pragu draženja in času nastopa (glej 
odstavke 11–13). Izbrane koncentracije je treba utemeljiti. 
5. Umirajo če živali ali živali, ki o čitno trpijo bole čine ali kažejo znake hudega 
in trajnega trpljenja, je treba humano usmrtiti. Umirajo če živali se upošte ­
vajo enako kot tiste, ki so poginile med preskusom. Merila za sprejetje odločitve o usmrtitvi umirajo čih živali ali živali, ki zelo trpijo, in napotki 
za prepoznavanje predvidljive ali neizbežne smrti so obravnavani v Doku ­
mentu s smernicami OECD o humanih kon čnih točkah (3).
 
OPIS METODE  
Izbira živalske vrste  
6. Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle glodavce obi čajno uporabljanih 
laboratorijskih sevov. Najprimernejša vrsta je podgana, uporabo drugih 
vrst je treba utemeljiti.  
Priprava živali  
7. Samice še niso smele kotiti in ne smejo biti breje. Na dan randomizacije 
morajo biti živali mladi odrasli primerki, ki so stari 7 do 9 tednov. Njihova telesna teža ne sme odstopati za ve č kot ± 20 % od povpre čne teže za vsak 
spol. Živali se naklju čno izberejo, ozna čijo za posami čno prepoznavanje in 
so pred za četkom preskusa najmanj 5 dni v kletkah, da se prilagodijo 
laboratorijskim razmeram.
 
Oskrba živali  
8. Živali je treba posami čno identificirati, po možnosti s podkožnimi transpon ­
derji, da se olajšajo opazovanja in prepre či zmeda. Temperatura v prostoru 
za oskrbo preskusnih živali mora biti 22 ± 3 °C. Relativno vlažnost je treba 
po možnosti ohranjati v obmo čju 30–70 %, čeprav to morda ne bo mogo če, 
kadar se kot nosilec uporablja voda. Pred izpostavljanjem in po njem morajo biti živali v kletkah na splošno združene v skupine po spolu in koncentraciji, pri čemer število primerkov na kletko ne sme vplivati na neovirano opazo ­
vanje posamezne živali ter mora kar najbolj zmanjšati izgube zaradi kanibal ­
izma in spopadov. Kadar bo izpostavljen samo nos živali, jih bo morda treba privajati na zadrževalne cevi. Te živalim ne smejo povzro čati prevelikega 
fizičnega ali toplotnega stresa ali stresa zaradi imobilizacije. Omejevanje 
gibanja lahko vpliva na fiziološke kon čne točke, kot sta telesna temperatura 
(hipertermija) in/ali minutni dihalni volumen. Če so na voljo splošni 
podatki, ki kažejo, da se takih sprememb ne pojavi zelo veliko, predhodno prilagajanje zadrževalnim cevem ni potrebno. Živali, ki se izpostavijo aero ­
solu s celim telesom, morajo biti med izpostavljenostjo nastanjene posami ­ 
čno, da preskusnega aerosola ne morejo filtrirati preko kožuhov drugih 
primerkov v kletki. Razen med izpostavljenostjo se lahko uporablja obi čajna 
in potrjena laboratorijska hrana, ki jo spremlja neomejena koli čina pitne 
vode iz komunalnega omrežja. Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je 
zaporedje 12 ur svetlobe/12 ur teme.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 423
 
Inhalacijske komore  
9. Pri izbiri inhalacijske komore je treba upoštevati lastnosti preskusne kemi ­
kalije in cilj preskusa. Po možnosti se kot na čin izpostavljenosti uporabi 
izpostavljenost nosu (imenovana tudi izpostavljenost glave ali smr čka). Izpo­
stavljenost nosu je navadno najprimernejša za študije teko čih ali trdnih 
aerosolov ter za hlape, ki lahko kondenzirajo v aerosole. Mogo če je, da 
bo posebne cilje študije lažje dose či z izpostavljenostjo celega telesa, vendar 
je treba to utemeljiti v poro čilu o študiji. Kadar se uporablja komora za 
izpostavljenost celega telesa, skupni volumen preskusnih živali ne sme 
presegati 5 % prostornine komore, da se zagotovi stabilnost atmosfere. Načela tehnik izpostavljanja nosu in celega telesa ter njune prednosti in 
pomanjkljivosti so obravnavani v GD 39 (2).
 
ŠTUDIJE STRUPENOSTI  
Mejne koncentracije  
10. V nasprotju s študijami akutne strupenosti, za študije subkroni čne strupe ­
nosti pri vdihavanju ni opredeljenih mejnih koncentracij. Pri dolo čanju 
najvišje koncentracije, ki bo preskušena, je treba upoštevati: 1. najvišjo dosegljivo koncentracijo, 2. stopnjo izpostavljenosti ljudi „v najslabšem primeru“, 3. dobrobitjo živali. Če ni mej, ki temeljijo na podatkih, se 
lahko uporabijo meje za akutno strupenost iz Uredbe (ES) št. 1272/2008 
(13) (tj. do najvišje koncentracije 5 mg/l za aerosole, 20 mg/l za hlape in 20 000 ppm za pline) (glej GD 39 (2)). Če je treba pri preskušanju plinov ali 
lahko hlapnih preskusnih kemikalij (npr. hladil) te meje prese či, je to treba 
utemeljiti. Mejna koncentracija mora povzro čiti nedvomno strupenost, ne da 
bi živalim povzro čila nepotrebni stres ali vplivala na njihovo življenjsko 
dobo (3).
 
Študija za ugotavljanje obmo čja 
11. Pred za četkom glavne študije je navadno treba opraviti študijo za ugota ­
vljanje obmo čja. Ta je obsežnejša od opazovalne študije, saj ni omejena z 
izbiro koncentracij. Spoznanja, pridobljena v njej, lahko zagotovijo uspeš ­
nost glavne študije. S študijo za ugotavljanje obmo čja se lahko na primer 
zagotovijo tehni čne informacije o analitskih metodah, dolo čanju velikosti 
delcev in odkrivanju mehanizmov strupenosti, klini čni patološki in histopa ­
tološki podatki ter ocene, kolikšne so lahko koncentracije NOAEL in MTC v glavni študiji. Vodja študije se lahko študijo za ugotavljanje obmo čja 
odloči uporabiti za dolo čitev pragu draženja dihal (npr. s histopatološko 
preiskavo dihal, preskusom plju čne funkcije ali bronhoalveolarno lavažo), 
zgornje koncentracije, ki jo živali prenesejo brez nepotrebnega stresa, in parametrov, s katerimi bo mogo če najbolje opredeliti strupenost preskusne 
kemikalije. 
12. Študija za ugotavljanje obmo čja lahko zajema eno ali ve č koncentracij. 
Glede na izbrane kon čne točke je treba vsaki koncentraciji izpostaviti tri 
do šest samcev in tri do šest samic. Študija za ugotavljanje obmo čja mora 
trajati vsaj 5 dni in navadno najve č 28 dni. V poro čilu o študiji je treba 
utemeljiti izbrane koncentracije za glavno študijo. Cilj glavne študije je 
dokazati razmerje koncentracija-odziv na podlagi pri čakovanja o tem, katera 
bo najobčutljivejša kon čna točka. Nizka koncentracija mora biti po možnosti 
koncentracija brez opaznih škodljivih u činkov, medtem ko mora visoka 
koncentracija povzro čiti nedvomno strupenost, ne da bi živalim povzro čila 
nepotrebni stres ali vplivala na njihovo življenjsko dobo (3).
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 424
 
13. Pri izbiri koncentracij za študijo za ugotavljanje obmo čja je treba upoštevati 
vse razpoložljive informacije, vklju čno z razmerji struktura-aktivnost in 
podatki o podobnih kemikalijah (glej odstavek 3). S študijo za ugotavljanje območja se lahko potrdijo/zavrnejo pri čakovanja o najob čutljivejših kon čnih 
točkah po mehanisti čnih merilih, npr. o inhibiciji holinesteraze z organofos ­
fati, nastajanju methemoglobina zaradi eritrocitotoksi čnih snovi, š čitničnih 
hormonih (T
 3 , T 4 ) v primeru tirotoksi čnih snovi ter o beljakovinah, LDH ali 
nevtrofilcih pri bronhoalveolarni lavaži v primeru neškodljivih slabo topnih delcev ali aerosolov, ki dražijo plju ča.
 
Glavna študija  
14. Glavna študija subkroni čne strupenosti obi čajno zajema tri razli čne koncen ­
tracije ter po potrebi tudi so časno negativno kontrolo (z zrakom) in/ali 
kontrolo z nosilcem (glej odstavek 18). Pri izbiri primernih stopenj izposta ­
vljenosti si je treba pomagati z vsemi razpoložljivimi podatki, vklju čno z 
rezultati študij sistemske strupenosti, presnovo in kinetiko (poseben 
poudarek je treba nameniti izogibanju visokim koncentracijam, ki nasitijo 
kinetične procese). Vsaka preskusna skupina vsebuje 10 samcev in 10 samic 
glodavcev, ki se 13 tednov (skupno študija traja vsaj 90 dni) po 5 dni na teden 6 ur na dan izpostavljajo preskusni kemikaliji. Živali se lahko izposta ­
vljajo tudi 7 dni na teden (npr. pri preskušanju farmacevtskih izdelkov, ki se 
vdihavajo). Če je znano, da je en spol ob čutljivejši na dolo čeno preskusno 
kemikalijo, se lahko spola izpostavljata razli čnim koncentracijam, da se 
zagotovi optimalen odziv na koncentracijo, kot je opisano v odstavku 15. 
Če se z nosom izpostavijo vrste glodavcev, ki niso podgane, se lahko 
najdaljša obdobja izpostavljenosti prilagodijo, da se kar najbolj zmanjša trpljenje, zna čilno za uporabljeno vrsto. Kadar se uporabi obdobje izposta ­
vljenosti, krajše od 6 ur/dan, ali kadar je treba opraviti študijo izpostavlje ­
nosti celega telesa z dolgimi obdobji (npr. 22 ur/dan), je treba to utemeljiti 
(glej GD 39 (2)). V obdobju izpostavljenosti je treba živalim odrekati hrano, razen če je to obdobje daljše od 6 ur. Med izpostavljenostjo celega telesa 
lahko živali ves čas uživajo vodo. 
15. Z izbranimi ciljnimi koncentracijami je treba opredeliti ciljne organe in 
prikazati jasen odziv na koncentracijo: 
— visoka koncentracija mora imeti strupene u činke, vendar ne sme povzro ­ 
čiti dolgotrajnih znakov ali smrtnosti, ki bi prepre čili smiselno oceno, 
— vmesne koncentracije morajo biti razporejene tako, da se doseže stop ­
njevanje med strupenimi u činki nizke in visoke koncentracije, 
— nizka koncentracija mora povzro čiti šibke znake strupenosti oziroma 
takih znakov ne sme povzro čiti.
 
Vmesna žrtvovanja  
16. Če se načrtujejo vmesna žrtvovanja, je treba število živali pri vsaki stopnji 
izpostavljenosti pove čati za toliko, kolikor se jih namerava žrtvovati pred 
zaključkom študije. Uporabo vmesnih žrtvovanj je treba utemeljiti in žrtvo ­
vane živali ustrezno upoštevati v statisti čnih analizah.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 425
 
Satelitska študija (študija reverzibilnosti)  
17. Satelitska študija (študija reverzibilnosti) se lahko uporabi za opazovanje 
reverzibilnosti, obstojnosti ali zapoznelega nastopa zastrupitve v ustrezno dolgem obdobju po tretiranju, ki pa ne sme bili krajše od 14 dni. Satelitske 
skupine (skupine za reverzibilnost) so sestavljene iz 10 samcev in 10 samic, 
ki se izpostavijo so časno s preskusnimi živalmi v glavni študiji. Skupine za 
satelitsko študijo (študijo reverzibilnosti) je treba preskusni kemikaliji izpo ­
staviti pri najvišji koncentraciji, pri čemer se po potrebi uporabi so časna 
kontrola z zrakom in/ali kontrola z nosilcem (glej odstavek 18).
 
Kontrolne živali  
18. Z živalmi za so časno negativno kontrolo (z zrakom) je treba ravnati enako 
kot z živalmi v preskusni skupini, le da se namesto preskusni kemikaliji izpostavijo filtriranemu zraku. Kadar se za pomo č pri ustvarjanju preskusne 
atmosfere uporabi voda ali druga snov, je treba v študijo namesto negativne 
kontrolne skupine (z zrakom) vklju čiti kontrolno skupino z nosilcem. Če je 
le mogoče, je treba kot nosilec uporabiti vodo. Kadar se kot nosilec uporabi 
voda, morajo biti kontrolne živali izpostavljene zraku z enako relativno 
vlažnostjo kot pri preskusnih skupinah. Izbira ustreznega nosilca mora teme ­
ljiti na primerno izvedeni predhodni študiji ali preteklih podatkih. Če o 
strupenosti nosilca ni veliko znanega, se lahko vodja študije odlo či uporabiti 
negativno kontrolo (z zrakom) in kontrolo z nosilcem, vendar se to mo čno 
odsvetuje. Kadar pretekli podatki razkrijejo, da nosilec ni strupen, negativna kontrolna skupina (z zrakom) ni potrebna in je treba uporabiti samo kontrolo z nosilcem. Če predhodna študija preskusne kemikalije, formulirane v 
nosilcu, ne pokaže strupenosti, iz tega sledi, da nosilec ni strupen pri presku ­ 
šeni koncentraciji, tako da je treba uporabiti to kontrolo z nosilcem.
 
POGOJI IZPOSTAVLJENOSTI  
Dajanje koncentracij  
19. Živali se izpostavijo preskusni kemikaliji v obliki plina, hlapov, aerosola ali 
njihovih zmesi. Agregatno stanje, ki bo preskušeno, je odvisno od fizikalno-kemijskih lastnosti preskusne kemikalije, izbranih koncentracij in/ali fizikalne oblike, ki bo najverjetnejša med ravnanjem s preskusno 
kemikalijo in njeno uporabo. Higroskopne in kemi čno reaktivne preskusne 
kemikalije je treba preskušati v suhem ozra čju. Paziti je treba, da se ne 
ustvarijo eksplozivne koncentracije. Za snovi, ki jih tvorijo delci, se lahko zaradi zmanjšanja velikosti delcev uporabijo mehanski postopki. Ve č napo­
tkov je na voljo v GD 39 (2).
 
Porazdelitev velikosti delcev  
20. Za vse aerosole in hlape, ki lahko kondenzirajo v aerosole, je treba dolo čiti 
velikost delcev. Da se omogo či izpostavljenost vseh ustreznih predelov 
dihal, so priporo čeni aerosoli, katerih mediana porazdelitvene mase delcev 
v zraku glede na aerodinami čni premer (MMAD) znaša 1–3 μm z geome ­
tričnim standardnim odklonom ( σ g ) 1,5–3,0 (4). Prizadevanje za izpolnitev 
tega standarda naj bo razumno; če ga ni mogo če izpolniti, je treba zagotoviti 
strokovno presojo. Delci kovinskih hlapov so na primer manjši od tega 
standarda, naelektreni delci in vlakna pa lahko presegajo navedene vredno ­
sti. ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 426
 
Priprava preskusne kemikalije v nosilcu  
21. Preskusno kemikalijo je treba po možnosti preskušati brez nosilca. Če je 
uporaba nosilca nujna za ustvarjanje primerne koncentracije in velikosti delcev preskusne kemikalije, je treba prednostno uporabiti vodo. Vedno, 
kadar se preskusna kemikalija raztopi v nosilcu, je treba dokazati njeno 
stabilnost.
 
SPREMLJANJE POGOJEV IZPOSTAVLJENOSTI  
Pretok zraka v komori  
22. Pretok zraka skozi komoro za izpostavljanje je treba med vsako izposta ­
vljenostjo skrbno nadzorovati, stalno spremljati in zabeležiti najmanj vsako 
uro. Sprotno spremljanje koncentracije (ali časovne stabilnosti) preskusne 
atmosfere je meritev, ki je nelo čljivo povezana z vsemi dinami čnimi para ­
metri in zagotavlja posredno sredstvo za nadzor nad vsemi pomembnimi dinamičnimi parametri vdihavanja. Če se koncentracija spremlja sproti, se 
lahko pogostnost merjenja pretoka zraka zmanjša na eno meritev na izposta ­
vljenost na dan. Pri komorah za izpostavljanje nosu je treba posebno pozor ­
nost nameniti prepre čevanju ponovnega vdihavanja. Koncentracija kisika 
mora znašati najmanj 19 %, koncentracija ogljikovega dioksida pa ne sme 
presegati 1 %. Če obstaja razlog za domnevo, da tega standarda ni mogo če 
izpolniti, je treba koncentraciji kisika in ogljikovega dioksida izmeriti. Če 
meritve prvi dan izpostavljenosti pokažejo, da sta ravni teh plinov ustrezni, 
nadaljnje merjenje ni potrebno.
 
Temperatura in relativna vlažnost v komori  
23. Temperaturo v komori je treba ohranjati pri 22 ± 3 °C. Relativno vlažnost v 
območju dihanja živali je treba pri izpostavljenosti nosu in izpostavljenosti 
celega telesa stalno spremljati ter jo med vsako izpostavljenostjo vsako uro 
zabeležiti, kadar je to mogo če. Relativno vlažnost je treba po možnosti 
ohranjati v obmo čju 30–70 %, vendar je to lahko bodisi nedosegljivo 
(npr. pri preskušanju zmesi na vodni osnovi) bodisi neizmerljivo zaradi 
interference preskusne kemikalije s preskusno metodo.  
Preskusna kemikalija: nazivna koncentracija  
24. Vedno, kadar je to izvedljivo, je treba izra čunati in zabeležiti nazivno 
koncentracijo v komori za izpostavljanje. Nazivna koncentracija je masa 
ustvarjene preskusne kemikalije, deljena s skupnim volumnom zraka, ki 
preide skozi sistem inhalacijske komore. Nazivna koncentracija se ne upora ­
blja za opredeljevanje izpostavljenosti živali, pa č pa pri primerjavi z 
dejansko koncentracijo nakaže, kako u činkovito je ustvarjanje preskusnega 
sistema, in se torej lahko uporabi za odkrivanje težav pri ustvarjanju.  
Preskusna kemikalija: dejanska koncentracija  
25. Dejanska koncentracija je koncentracija preskusne kemikalije, vzor čena v 
območju dihanja živali v inhalacijski komori. Dejanske koncentracije se 
merijo s specifi čnimi metodami (npr. z neposrednim vzor čenjem, adsorpcij ­
skimi ali kemi čnimi reaktivnimi metodami in naknadnim analitskim oprede ­
ljevanjem) ali nespecifi čnimi metodami, kot je gravimetri čna analiza s filtri ­
ranjem. Uporaba gravimetri čne analize je sprejemljiva samo za enokompo ­
nentne prašne aerosole ali aerosole teko čin z majhno hlapnostjo ter jo je 
treba pred študijo podpreti z ustreznimi opredelitvami, specifi čnimi ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 427
 
za preskusno kemikalijo. Z gravimetri čno analizo se lahko dolo či tudi 
koncentracija ve čkomponentnega prašnega aerosola, vendar so za to 
potrebni analitski podatki, ki kažejo, da je sestava snovi v zraku podobna začetni snovi. Če te informacije niso na voljo, bo morda treba med študijo 
znova analizirati preskusno kemikalijo (po možnosti takrat, ko lebdi v zraku) 
v rednih intervalih. Za aerosolizirane snovi, ki lahko izhlapijo ali sublimi ­
rajo, je treba prikazati, da so bile vse faze zbrane z izbrano metodo. 
26. Po možnosti je treba v celotni študiji uporabljati eno serijo preskusne kemi ­
kalije, preskusni vzorec pa je treba hraniti v pogojih, v katerih se ohranjajo njegova čistost, homogenost in stabilnost. Pred za četkom študije je treba 
opredeliti lastnosti preskusne kemikalije, vklju čno z njeno čistostjo ter, če 
je to tehni čno izvedljivo, identiteto in koli činami ugotovljenih kontami ­
nantov in ne čistot. To se lahko med drugim prikaže z naslednjimi podatki: 
z retencijskim časom in relativno površino vrha, molekulsko maso, ugoto ­
vljeno na podlagi analiz z masno spektroskopijo ali plinsko kromatografijo, 
ali z drugimi ocenami. Čeprav identiteta preskusnega vzorca ni odgovornost 
preskuševalnega laboratorija, je morda smotrno, da ta vsaj v omejenem obsegu potrdi naro čnikovo opredelitev lastnosti (npr. barvo, agregatno stanje 
itd.). 
27. Atmosfera v komori za izpostavljanje mora biti konstantna, kolikor je to 
izvedljivo. Za dokazovanje stabilnosti pogojev izpostavljenosti se lahko uporabi naprava za sprotno spremljanje, kot je aerosolni fotometer za aero ­
sole ali analizator skupnih ogljikovodikov za hlape. Dejansko koncentracijo 
v komori je treba izmeriti najmanj trikrat vsak dan izpostavljenosti za vsako 
stopnjo izpostavljenosti. Če to zaradi omejenih stopenj pretoka zraka ali 
nizkih koncentracij ni izvedljivo, zadostuje, da se v vsakem obdobju izpo ­
stavljenosti vzame le en vzorec. V tem primeru se vzorec po možnosti zbira 
prek celotnega obdobja izpostavljenosti. Posamezni vzorci koncentracije v 
komori lahko od srednje koncentracije v komori odstopajo za najve č ± 10 % 
za pline in hlape oziroma za najve č ± 20 % za teko če ali trdne aerosole. 
Izračunati in zabeležiti je treba čas do vzpostavitve ravnotežja v komori 
(t
 95 ). Čas izpostavljenosti pokriva čas ustvarjanja preskusne kemikalije. Pri 
tem sta upoštevana čas, potreben za vzpostavitev ravnotežja v komori (t  95 ), 
in čas padanja. Napotki za ocenjevanje t  95 so na voljo v GD 39 (2). 
28. Pri zelo kompleksnih zmeseh, sestavljenih iz plinov/hlapov in aerosolov 
(npr. zgorevalnih atmosfer in preskusnih kemikalij, potiskanih iz namenskih 
proizvodov/naprav za posebno uporabo), se lahko v inhalacijski komori 
vsaka faza obnaša druga če. Zato je treba za vsako fazo (plin/hlape in aero ­
sol) izbrati najmanj eno indikatorsko snov (analit), po navadi glavno aktivno sestavino v zmesi. Kadar je preskusna kemikalija zmes, je treba analitsko 
koncentracijo navesti za celotno zmes in ne le za aktivno sestavino ali 
indikatorsko snov (analit). Dodatne informacije o dejanskih koncentracijah so na voljo v GD 39 (2).
 
Preskusna kemikalija: porazdelitev velikosti delcev  
29. Porazdelitev velikosti delcev aerosolov je treba dolo čiti najmanj vsak teden 
za vsako koncentracijo s kaskadnim impaktorjem ali nadomestnim instru ­
mentom, kot je aerodinami čni merilnik delcev (APS). Če je mogo če prika­
zati enakovrednost rezultatov, dobljenih s kaskadnim impaktorjem in nado ­
mestnim instrumentom, se lahko nadomestni instrument uporablja skozi 
celotno študijo.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 428
 
30. Vzporedno s primarnim instrumentom je treba za potrditev njegove u činko­
vitosti zbiranja uporabljati še drugo napravo, kot je gravimetri čni filter ali 
(plinska) izpiralka. Masna koncentracija, dobljena z analizo velikosti delcev, mora biti v razumnih mejah masne koncentracije, dobljene z analizo s filtriranjem (glej GD 39 (2)). Če je enakovrednost pri vseh preskušenih 
koncentracijah mogo če prikazati zgodaj v študiji, se lahko nadaljnje potrdit ­
vene meritve opustijo. Zaradi dobrobiti živali je treba sprejeti ukrepe, s katerimi se kar najbolj zmanjša koli čina pomanjkljivih podatkov, zaradi 
katerih bi bilo treba študijo ponoviti. 
31. Velikost delcev za hlape je treba dolo čiti, če je mogo če, da se bodo hlapi 
kondenzirali v aerosol, ali če se v atmosferi s hlapi, v kateri so mogo če 
mešane faze, zaznajo delci.
 
OPAZOVANJA 
32. Živali je treba klini čno opazovati pred obdobjem izpostavljenosti ter med 
njim in po njem. Pogostejša opazovanja so lahko indicirana glede na odziv 
živali med izpostavljenostjo. Kadar opazovanje živali ovirajo uporaba zadr ­ 
ževalnih cevi za živali, slabo osvetljene komore za izpostavljanje celega telesa ali motne atmosfere, je treba živali pozorno opazovati po izpostavlje ­
nosti. Z opazovanji živali, preden so te izpostavljene naslednjega dne, je 
mogoče oceniti reverzibilnost ali okrepitev strupenih u činkov. 
33. Vsa opažanja se sistemati čno zabeležijo, pri čemer se evidence vodijo za 
vsako žival posebej. Kadar se živali usmrtijo iz humanih razlogov ali so najdene poginule, je treba čas smrti navesti čim natančneje. 
34. Opazovanja v kletkah morajo vklju čevati spremembe na koži in kožuhu, 
očeh in sluznicah, v dihalih, obto čilih in živ čevju ter pri somatomotori čnih 
aktivnostih in vedenjskih vzorcih. Pozorno je treba opazovati tremorje, kr če, 
slinjenje, drisko, letargijo, spanje in komo. Z merjenjem rektalne tempera ­
ture se lahko pridobijo podporni dokazi o refleksni bradipneji ali 
hipo-/hipertermiji, povezani s tretiranjem ali konfinacijo. V protokol študije 
se lahko vklju čijo dodatne ocene, kot so kinetika, biomonitoring, plju čna 
funkcija, zadrževanje slabo topnih snovi, ki se kopi čijo v plju čnem tkivu, in 
vedenjske spremembe.
 
TELESNA TEŽA 
35. Težo posameznih živali je treba zabeležiti malo pred prvo izpostavljenostjo 
(dan 0), zatem pa dvakrat na teden (na primer ob petkih in ponedeljkih, da 
se prikaže okrevanje čez konec tedna, ko se živali ne izpostavljajo, ali na 
podlagi časovnega intervala, da se omogo či ocena sistemske strupenosti) ter 
ob poginu ali evtanaziji. Če v prvih 4 tednih ni u činkov, se lahko do konca 
študije telesna teža meri tedensko. Živali v satelitski skupini (skupini za 
reverzibilnost), če se uporabljajo, je treba tedensko tehtati prek celotnega 
obdobja okrevanja. Ob koncu študije je treba malo pred žrtvovanjem vse živali stehtati, da se omogo či nepristranski izra čun razmerij med težo 
organov in telesno težo.
 
PORABA HRANE IN VODE 
36. Porabo hrane je treba meriti tedensko. Meri se lahko tudi poraba vode.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 429
 
KLINIČNA PATOLOGIJA 
37. Klini čne patološke ocene je treba opraviti za vse živali, vklju čno s tistimi v 
kontrolnih skupinah in satelitski skupini (skupini za reverzibilnost), ko se žrtvujejo. Navesti je treba časovni interval med koncem izpostavljenosti in 
jemanjem krvi, zlasti kadar se obravnavana kon čna točka hitro vrne v 
prvotno stanje. Vzor čenje po koncu izpostavljenosti je indicirano za tiste 
parametre, ki imajo kratko plazemsko razpolovno dobo (npr. COHb, CHE in MetHb). 
38. V preglednici 1 so našteti klini čni patološki parametri, ki se navadno zahte ­
vajo za vse toksikološke študije. Analiza urina se ne zahteva redno, vendar 
se lahko opravi, kadar se zdi koristna na podlagi pri čakovane ali opažene 
strupenosti. Vodja študije se lahko za boljšo opredelitev strupenosti preskusne kemikalije odlo či oceniti dodatne parametre (npr. holinesterazo, 
lipide, hormone, kislinsko-bazno ravnovesje, methemoglobin ali Heinzeva 
telesca, kreatin-kinazo, razmerje med mieloidnimi in eritroidnimi celicami, troponine, pline v arterijski krvi, laktat-dehidrogenazo, sorbital-dehidrogenazo ter γ-glutamiltranspeptidazo).
 
Preglednica 1  
Standardni klini čni patološki parametri  
Hematologija  
število eritrocitov 
hematokrit 
koncentracija hemoglobina 
povprečna količina hemoglobina v 
eritrocitih 
povprečni volumen eritrocitov 
povprečna koncentracija hemoglobina 
v eritrocitih 
retikulociti skupno število levkocitov 
diferencialno število levkocitov 
število trombocitov 
zmožnost koagulacije (izberite 
eno): 
— protrombinski čas 
— čas koagulacije 
— parcialni tromboplastinski čas 
Klinična kemija  
glukoza (*) 
skupni holesterol trigliceridi 
sečninski dušik v krvi 
skupni bilirubin kreatinin skupne beljakovine 
albumin 
globulin alanin-aminotransferaza 
aspartat-aminotransferaza alkalna fosfataza 
kalij 
natrij kalcij fosfor 
klorid
 
Analiza urina (ni obvezno)  
videz (barva in motnost) 
količina 
specifična teža ali osmolalnost 
pH skupne beljakovine 
glukoza 
kri/krvne celice  
(*) Ker lahko dolgotrajno obdobje postenja vpliva na meritve glukoze pri tretiranih 
živalih glede na kontrolne živali, mora vodja študije odlo čiti, ali je živali primerno 
postiti. Če se uporabi obdobje postenja, mora to ustrezati uporabljeni živalski 
vrsti; za podgane lahko traja 16 h (postenje čez noč). Določanje glukoze na 
tešče se lahko izvede po postenju čez noč v zadnjem tednu izpostavljenosti ali 
po postenju čez noč pred obdukcijo (v zadnjem primeru skupaj z vsemi drugimi 
kliničnimi patološkimi parametri).  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 430
 
39. Kadar obstajajo dokazi, da je spodnji del dihalnih poti (tj. alveole) primarno 
mesto odlaganja in retencije, je lahko bronhoalveolarna lavaža (BAL) najpri ­
mernejša tehnika za kvantitativno analizo na hipotezi temelje čih parametrov 
razmerij med odmerkom in u činkom s poudarkom na alveolitisu, vnetju 
pljuč in fosfolipidozi. Tako je mogo če ustrezno preiskati spremembe v 
odzivu na odmerek in časovnem poteku alveolarne okvare. Bronhoalveolarni 
izpirek se lahko uporabi za analizo skupnega in diferencialnega števila levkocitov, skupnih beljakovin ter laktat-dehidrogenaze. Drugi parametri, ki se lahko obravnavajo, so tisti, ki nakazujejo lizosomske poškodbe, fosfo ­
lipidozo, fibrozo in dražilno ali alergijsko vnetje – pri slednjem se lahko 
vključi določitev vnetnih citokinov/kemokinov. Meritve BAL navadno 
dopolnjujejo rezultate histopatoloških preiskav, ne morejo pa jih nadome ­
stiti. Napotki o tem, kako opraviti lavažo plju č, so na voljo v GD 39 (2).
 
OFTALMOLOŠKE PREISKAVE 
40. Z oftalmoskopom ali enakovredno napravo je treba opraviti oftalmološke 
preiskave o česnega ozadja, opti čnih medijev, šarenice in veznice, in sicer 
pred dajanjem preskusne kemikalije na vseh živalih ter ob prenehanju treti ­
ranja na vseh skupinah, tretiranih z visoko koncentracijo, in kontrolnih skupinah. Če se v o čeh zaznajo spremembe, je treba pregledati tudi vse 
živali iz drugih skupin, vklju čno s satelitsko skupino (skupino za reverzi ­
bilnost).
 
MAKROSKOPSKA PATOLOGIJA IN TEŽA ORGANOV 
41. Vse preskusne živali, vklju čno s tistimi, ki med preskusom poginejo ali so 
odstranjene iz študije zaradi njihove dobrobiti, je treba popolnoma eksang ­
vinirati (če je to izvedljivo) in na njih opraviti makroskopsko obdukcijo. 
Navesti je treba čas med koncem zadnje izpostavljenosti vsake živali in 
njenim žrtvovanjem. Če obdukcije ni mogo če opraviti nemudoma po 
odkritju poginule živali, jo je treba ohladiti (ne zamrzniti) na dovolj nizko 
temperaturo, da se avtoliza kar najbolj zmanjša. Obdukcije je treba opraviti takoj, ko je mogo če, navadno v dnevu ali dveh. Za vsako žival je treba 
zabeležiti vse makroskopske patološke spremembe s posebnim poudarkom 
na spremembah dihal. 
42. V preglednici 2 so našteti organi in tkiva, ki jih je treba med makroskopsko 
obdukcijo shraniti v ustreznem mediju za histopatološke preiskave. O shra ­
njevanju organov in tkiv [v oglatih oklepajih] ter vseh drugih organov in tkiv odlo ča vodja študije. Z organov  v krepki pisavi  je treba odstraniti 
priraščena tkiva in navedene organe stehtati čim prej po disekciji, da se 
ne izsušijo. Š čitnico in nadmodek je treba stehtati samo, če je to potrebno, 
ker lahko ostanki obrezovanja ogrozijo histopatološko oceno. Tkiva in organe je treba takoj po obdukciji in najmanj 24–48 ur (odvisno od upora ­
bljenega fiksativa) pred obrezovanjem fiksirati v 10-odstotnem puferiranem 
formalinu ali drugem ustreznem fiksativu.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 431
 
Preglednica 2  
Organi in tkiva, ki se shranijo med makroskopsko obdukcijo 
nadledvične žleze  
aorta kostni mozeg (in/ali svež punktat)  
možgani  (vključno z rezinami velikih in 
malih možganov ter podaljšane hrbtenja če/ 
mosta) 
slepo črevo 
debelo črevo 
dvanajsternik  
[nadmodek]  
[oči (mrežnica, vidni živec) in veke] 
stegnenica in kolenski sklep žolčnik (če je) 
[Harderjeve žleze]  
srce 
vito črevo 
tešče črevo 
ledvice  
[solzne žleze (zunaj o česne votline)] 
grlo (3 ravni, vklju čno s spodnjim delom 
poklopca)  
jetra pljuča (vsi režnji na eni ravni, vklju čno z 
glavnima sapnicama) 
Hilusne bezgavke, zlasti za slabo topne 
preskusne kemikalije, ki jih tvorijo delci. Za 
bolj poglobljene preiskave in/ali študije z 
imunološkim poudarkom se lahko razmisli o dodatnih bezgavkah, npr. iz medplju čnega, 
vratnega/pod čeljustnega in/ali ušesnega 
predela. 
bezgavke (oddaljene od vstopnega mesta) mlečna žleza (sami čina) 
mišica (stegenska) 
nazofaringealna tkiva (vsaj 4 ravni, 1 raven 
naj vključuje nazofaringealni vod in z nosom 
povezano limfati čno tkivo (NALT)) požiralnik 
[vohalni beti č] 
jajčniki 
trebušna slinavka 
obščitnice 
periferni živec (ishiadi
čni ali tibialni, po 
možnosti v bližini mišice) 
hipofiza 
prostata rektum 
žleze slinavke 
semenski meši čki 
koža 
hrbtenjača (vratni, prsni in ledveni del)  
vranica  
prsnica želodec 
zobje  
moda priželjc 
ščitnica  
[jezik] sapnik (vsaj 2 ravni, ki vklju čujeta 1 
vzdolžni prerez skozi karino in 1 pre čni 
prerez) 
[sečevod] 
[sečnica] 
sečni mehur  
maternica  
ciljni organi 
vse vidne lezije in skupki tkiv
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 432
 
43. Pljuča je treba odstraniti nepoškodovana, jih stehtati in napolniti z ustreznim 
fiksativom pri tlaku 20–30 cm vode, da se ohrani njihova struktura (5). 
Rezine je treba zbrati za vse režnje na eni ravni, vklju čno z glavnima 
sapnicama, če pa se opravi lavaža plju č, je treba iz neizpranega režnja 
vzeti rezine na treh ravneh (ki niso zaporedne). 
44. Pregledati je treba najmanj 4 ravni nazofaringealnih tkiv, od katerih mora 
ena vklju čevati nazofaringealni vod (5) (6) (7) (8) (9), da se omogo či 
ustrezna preiskava ploš čatega, prehodnega (neciliarnega respiratornega), 
respiratornega (ciliarnega respiratornega) in vohalnega epitelija, ter drenažno limfatično tkivo (NALT) (10) (11). Preiskati je treba tri ravni grla, od 
katerih mora ena vklju čevati spodnji del poklopca (12). Pregledati je treba 
vsaj dve ravni sapnika, kar vklju čuje en vzdolžni prerez skozi karino razce ­
pišča glavnih sapnic in en pre čni prerez.
 
HISTOPATOLOGIJA 
45. Histopatološko oceno vseh organov in tkiv iz preglednice 2 je treba opraviti 
pri kontrolni skupini in skupini, tretirani z visoko koncentracijo, ter pri vseh živalih, ki poginejo ali so žrtvovane med študijo. Posebno pozornost je treba nameniti dihalom, ciljnim organom in vidnim lezijam. Organe in tkiva, ki 
imajo lezije v skupini, tretirani z visoko koncentracijo, je treba pregledati v 
vseh skupinah. Vodja študije se lahko odlo či izvesti histopatološke ocene za 
dodatne skupine, da se prikaže jasen odziv na koncentracijo. Če se uporablja 
satelitska skupina (skupina za reverzibilnost), je treba opraviti histopatološko 
oceno za vsa tkiva in organe, na katerih so bili opaženi u činki v tretiranih 
skupinah. Če se v skupini, izpostavljeni visoki koncentraciji, pojavijo 
čezmerno število zgodnjih smrti ali druge težave, ki ogrožajo pomen poda ­
tkov, je treba skupino, tretirano z najbližjo nižjo koncentracijo, histopato ­
loško pregledati. Makroskopska opažanja in mikroskopske ugotovitve je 
treba poskusiti povezati.
 
PODATKI IN PORO ČANJE  
Podatki  
46. Za posamezne živali je treba navesti podatke o telesni teži, porabi hrane, 
klinični patologiji, makroskopski patologiji, teži organov in histopatologiji. 
Podatke o klini čnih opažanjih je treba povzeti v preglednicah, v katerih se 
za vsako preskusno skupino navedejo število uporabljenih živali, število živali, ki kažejo specifi čne znake zastrupitve, število živali, ki so bile 
najdene poginule med preskusom ali usmr čene iz humanih razlogov, čas 
smrti posameznih živali, opis in časovni potek strupenih u činkov in rever ­
zibilnosti ter ugotovitve obdukcije. Vse rezultate, kvantitativne in naklju čne, 
je treba oceniti z ustrezno statisti čno metodo. Uporabi se lahko katera koli 
splošno priznana statisti čna metoda, izbrati pa jo je treba med zasnovo 
študije.
 
Poročilo o preskusu  
47. Poro čilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije, kot je primerno:  
Preskusne živali in oskrba  
— opis pogojev v kletkah, vklju čno s številom (ali spremembo števila) 
živali na kletko, nastiljem, temperaturo in relativno vlažnostjo prostora, 
fotoperiodo ter opredelitvijo hrane,  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 433
 
— uporabljeno vrsto/sev in utemeljitev uporabe vrste, ki ni podgana. 
Podatki o izvoru in preteklosti se lahko navedejo, če se nanašajo na 
živali, za katere so bili uporabljeni podobni pogoji izpostavljenosti, nastanitveni pogoji in pogoji postenja, 
— število, starost in spol živali, 
— metodo randomizacije, 
— opis morebitne priprave živali pred preskusom, vklju čno s hrano, karan ­
teno in zdravljenjem.  
Preskusna kemikalija  
— agregatno stanje, čistost in, če je to ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti 
(vključno z izomerizacijo), 
— identifikacijske podatke in registrsko številko Službe za izmenjavo 
kemijskih izvle čkov (CAS), če je znana.  
Nosilec  
— utemeljitev uporabe nosilca in utemeljitev izbire nosilca ( če to ni voda), 
— pretekle ali vzporedno pridobljene podatke, ki dokazujejo, da nosilec ne 
vpliva na rezultat študije.  
Inhalacijska komora  
— podroben opis inhalacijske komore, vklju čno s prostornino in diagra ­
mom, 
— izvor in opis opreme, uporabljene za izpostavljanje živali in ustvarjanje 
atmosfere, 
— opremo za merjenje temperature, vlažnosti, velikosti delcev in dejanske 
koncentracije, 
— vir zraka in uporabljeni sistem za klimatiziranje, 
— metode, uporabljene za umerjanje opreme za zagotavljanje homogene 
preskusne atmosfere, 
— razliko v tlaku (pozitivno ali negativno), 
— izpostavitvene odprtine na komoro (izpostavljanje nosu); položaj živali v 
komori (izpostavljanje celega telesa), 
— stabilnost preskusne atmosfere, 
— položaj tipal za zaznavanje temperature in vlažnosti ter mesto vzor čenja 
preskusne atmosfere v komori, 
— obdelavo dovajanega/odvajanega zraka, 
— stopnje pretoka zraka, stopnjo pretoka zraka/izpostavitveno odprtino 
(izpostavljanje nosu) ali število živali/komoro (izpostavljanje celega tele ­
sa), 
— čas, potreben za vzpostavitev ravnotežja v inhalacijski komori (t
 95 ), 
— število zamenjav volumnov zraka na uro, 
— merilne naprave ( če se uporabljajo).  
Podatki o izpostavljenosti  
— utemeljitev izbire ciljne koncentracije v glavni študiji,  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 434
 
— nazivne koncentracije (skupna masa ustvarjene preskusne kemikalije v 
inhalacijski komori, deljena z volumnom zraka, ki preide skozi komoro), 
— dejanske koncentracije preskusne kemikalije, ki se vzamejo v obmo čju 
dihanja živali; za zmesi, pri katerih nastajajo heterogene fizikalne oblike (plini, hlapi, aerosoli), se lahko vsaka analizira lo čeno, 
— vse koncentracije v zraku je treba navesti v masnih enotah (mg/l, mg/m
 3 
itd.), in ne v prostorninskih enotah (ppm, ppb itd.), 
— porazdelitev velikosti delcev, mediano porazdelitvene mase delcev v 
zraku glede na aerodinami čni premer (MMAD) in geometri čni stan­
dardni odklon ( σg), vključno z metodami za njihov izra čun. Poročati 
je treba o posameznih analizah velikosti delcev.  
Preskusni pogoji  
— podatke o pripravi preskusne kemikalije, vklju čno s podrobnostmi o 
postopkih, uporabljenih za zmanjšanje velikosti delcev trdnih snovi ali pripravo raztopin preskusne kemikalije, 
— opis (ki po možnosti vklju čuje diagram) opreme, uporabljene za ustvar ­
janje preskusne atmosfere in izpostavljanje živali preskusni atmosferi, 
— podatke o opremi, uporabljeni za spremljanje temperature, vlažnosti in 
pretoka zraka v komori (tj. pripravo umeritvene krivulje), 
— podatke o opremi, uporabljeni za jemanje vzorcev za dolo čanje koncen ­
tracije in porazdelitve velikosti delcev v komori, 
— podatke o uporabljeni kemijski analitski metodi in njeni validaciji 
(vključno z rekuperacijo preskusne kemikalije iz nosilca za vzor čenje), 
— metodo randomizacije pri dodeljevanju živali preskusnim in kontrolnim 
skupinam, 
— podatke o kakovosti hrane in vode (vklju čno z vrsto/virom hrane in 
virom vode), 
— utemeljitev dolo čitve preskusnih koncentracij.  
Rezultati  
— preglednice o temperaturi, vlažnosti in pretoku zraka v komori, — preglednice s podatki o nazivnih in dejanskih koncentracijah v komori, — preglednice s podatki o velikosti delcev, vklju čno s podatki o analitskem 
vzorčenju, porazdelitvijo velikosti delcev ter izra čuni MMAD in σ
 g , 
— preglednice s podatki o odzivu in koncentracijo za vsako žival (tj. za 
živali, ki kažejo znake zastrupitve, vklju čno s smrtnostjo ter naravo, 
resnostjo, časom nastopa in trajanjem u činkov),  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 435
 
— preglednice o teži posameznih živali, 
— preglednice o porabi hrane, 
— preglednice s klini čnimi patološkimi podatki, 
— ugotovitve obdukcije in histopatološke ugotovitve za vsako žival, če so 
na voljo.  
Razprava in razlaga rezultatov  
— poseben poudarek je treba nameniti opisu metod, uporabljenih za izpol ­
nitev meril te preskusne metode, npr. glede mejne koncentracije ali velikosti delcev, 
— z vidika splošnih ugotovitev je treba obravnavati možnost vdihavanja 
delcev, zlasti če meril glede velikosti delcev ni bilo mogo če izpolniti, 
— v splošno oceno študije je treba vklju čiti doslednost metod, uporabljenih 
za določanje nazivne in dejanske koncentracije, ter razmerje med njima, 
— obravnavati je treba verjetni vzrok smrti in prevladujo či način delovanja 
(sistemski ali lokalni), 
— če je bilo treba na podlagi meril iz Dokumenta s smernicami OECD o 
humanih kon čnih točkah (3) humano žrtvovati živali, ki so trpele bole ­ 
čine ali kazale znake hudega in trajnega trpljenja, je treba to pojasniti, 
— opredeliti je treba ciljne organe, 
— določiti je treba vrednosti NOAEL in LOAEL.
 
VIRI:  
(1) OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guide ­
line No 413, Environment Directorate, OECD, Pariz. 
(2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz. 
(3) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariz. 
(4) Whalan, J. E. in Redden, J. C. (1994). Interim Policy for Particle Size and 
Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesti ­
cide Programs, United States Environmental Protection Agency. 
(5) Dungworth, D. L., Tyler, W. S., Plopper, C. E. (1985). Morphological 
Methods for Gross and Microscopic Pathology (poglavje 9). V: Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H. P. in Brain, J. D. (ur.), Springer Verlag Heidelberg, str. 229–258. 
(6) Young, J. T. (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309–312. 
(7) Harkema, J. R. (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in 
laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 
85: 231–238.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 436
 
(8) Woutersen, R. A., Garderen-Hoetmer, A., van Slootweg, P. J., Feron, V. J. 
(1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and 
in humans. V: Waalkes, M. P. in Ward, J. M. (ur.) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215–263. 
(9) Mery, S., Gross, E. A., Joyner, D. R., Godo, M., Morgan, K. T. (1994). 
Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats 
and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353–372. 
(10) Kuper, C. F., Koornstra, P. J., Hameleers, D. M. H., Biewenga, J., Spit, B. 
J., Duijvestijn, A. M., Breda Vriesman van, P. J. C., Sminia, T. (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219–224. 
(11) Kuper, C. F., Arts, J. H. E., Feron, V. J. (2003). Toxicity to nasal-associated 
lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140–141: 281–285. 
(12) Lewis, D. J. (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419–428. 
(13) Uredba (ES) št. 1272/2008 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 
16. decembra 2008 o razvrš čanju, ozna čevanju in pakiranju snovi ter zmesi, 
o spremembi in razveljavitvi direktiv 67/548/EGS in 1999/45/ES ter spre ­
membi Uredbe (ES) št. 1907/2006 (UL L 353, 31.12.2008, str. 1).
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 437
 
Dodatek 1  
OPREDELITEV POJMOV  
Preskusna kemikalija:  snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne 
metode.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 438
 
B.30  ŠTUDIJE KRONI ČNE STRUPENOSTI  
UVOD 
1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 452 
(2009). Prvotna TG 452 je bila sprejeta leta 1981. Priprava te revidirane 
preskusne metode B.30 je bila ocenjena kot nujna zaradi upoštevanja nedav ­
nega razvoja na podro čju dobrobiti živali in zakonodajnih zahtev (1) (2) (3) 
(4). Ta preskusna metoda B.30 je bila posodobljena vzporedno z revizijama poglavja B.32 te priloge z naslovom „Študije rakotvornosti“ in 
poglavja B.33 te priloge z naslovom „Kombinirane študije kroni čne strupe ­
nosti/rakotvornosti“, da bi se z uporabo živali v študiji pridobile dodatne informacije in da bi se zagotovilo ve č podatkov o izbiri odmerkov. Ta 
preskusna metoda je zasnovana za preskušanje zelo razli čnih kemikalij, 
vključno s pesticidi in industrijskimi kemikalijami. 
2. Večina študij kroni čne strupenosti se opravi na glodavcih, zato je ta 
preskusna metoda namenjena zlasti uporabi v študijah, opravljenih na teh 
živalskih vrstah. Če bi bilo take študije treba izvesti na vrstah, ki niso 
glodavci, se lahko z ustreznimi prilagoditvami prav tako uporabijo na čela 
in postopki, opisani v tej metodi, ter na čela in postopki iz poglavja B.27 te 
priloge z naslovom „90-dnevna študija oralne toksi čnosti s ponavljajo čimi se 
odmerki na neglodavcih“ (5), kot je navedeno v Dokumentu s smernicami OECD št. 116 o zasnovi in izvajanju študij kroni čne strupenosti in rakot ­
vornosti (6). 
3. Glavni trije na čini dajanja, ki se uporabljajo v študijah kroni čne strupenosti, 
so oralni, dermalni in inhalacijski. Izbira na čina dajanja je odvisna od fizi ­
kalnih in kemijskih lastnosti preskusne kemikalije ter prevladujo čega načina 
izpostavljenosti ljudi. Dodatne informacije o izbiri na čina izpostavljenosti so 
na voljo v Dokumentu s smernicami OECD št. 116 (6). 
4. Ta preskusna metoda je osredoto čena na oralno izpostavljenost, ki se v 
študijah kroni čne strupenosti uporablja najpogosteje. Dolgoro čne študije 
kronične strupenosti, ki vklju čujejo dermalno ali inhalacijsko izpostavlje ­
nost, so lahko prav tako potrebne za oceno tveganja za zdravje ljudi in/ali 
na podlagi nekaterih zakonodajnih ureditev, vendar pa sta oba navedena načina izpostavljenosti tehni čno precej zapletena. Take študije je treba 
zasnovati za vsak primer posebej, je pa mogo če preskusno metodo za 
ocenjevanje in vrednotenje kroni čne strupenosti z oralnim na činom dajanja, 
opisano v tem dokumentu, uporabiti kot osnovo za protokol za inhalacijske in/ali dermalne študije, kar zadeva priporo čila glede obdobij tretiranja, klini ­ 
čnih in patoloških parametrov itd. Za inhalacijski (6) (7) in dermalni na
čin 
dajanja (6) preskusnih kemikalij so na voljo napotki OECD. Pri zasnovi 
dolgoročnejših študij z inhalacijsko izpostavljenostjo je treba podrobno 
preučiti predvsem poglavji B.8 (8) in B.29 te priloge (9) ter Dokument s 
smernicami OECD o preskušanju akutne strupenosti pri vdihavanju (7). V 
primeru preskušanja z dermalnim na činom dajanja je treba upoštevati 
poglavje B.9 te priloge (10).  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 439
 
5. S študijo kroni čne strupenosti se pridobivajo informacije o možnih nevarno ­
stih za zdravje, ki se lahko pojavijo ob ponavljajo či se izpostavljenosti prek 
znatnega dela življenjske dobe uporabljene vrste. Z njo se pridobijo infor ­
macije o strupenih u činkih preskusne kemikalije ter nakažejo ciljni organi in 
možnost kopi čenja. Poleg tega se lahko s študijo oceni vrednost brez opaže ­
nega škodljivega u činka, ki se lahko uporabi za dolo čitev varnostnih meril 
za izpostavljenost ljudi. Poudarjena je tudi potreba po skrbnem klini čnem 
opazovanju živali, da se pridobi kar najve č informacij. 
6. Cilji študij, na katere se nanaša ta preskusna metoda, vklju čujejo: 
— opredelitev kroni čne strupenosti preskusne kemikalije, 
— opredelitev ciljnih organov, 
— opredelitev razmerja med odmerkom in odzivom, 
— opredelitev vrednosti brez opaženega škodljivega u činka (NOAEL) ali 
izhodiščne točke za dolo čitev primerjalnega odmerka ( benchmark dose  – 
BMD), 
— napoved u činkov kroni čne strupenosti pri stopnjah izpostavljenosti ljudi, 
— zagotovitev podatkov za preskušanje hipotez glede na čina delovanja (6).  
ZAČETNI PREUDARKI 
7. Pri ocenjevanju in vrednotenju toksikoloških lastnosti preskusne kemikalije 
mora preskuševalni laboratorij pred izvedbo študije preu čiti vse razpoložljive 
informacije o preskusni kemikaliji, da se zasnova študije osredoto či na 
učinkovitejše preskušanje potenciala kroni čne strupenosti in da se kar 
najbolj zmanjša uporaba živali. Informacije, ki pomagajo pri zasnovi študije, 
vključujejo identiteto, kemijsko strukturo in fizikalno-kemijske lastnosti 
preskusne kemikalije; vse informacije o na činu delovanja; rezultate morebi ­
tnih preskusov strupenosti  in vitro  ali in vivo ; pričakovane uporabe in 
potencial za izpostavljenost ljudi; razpoložljive podatke (Q)SAR in toksiko ­
loške podatke o strukturno sorodnih snoveh; razpoložljive toksikokineti čne 
podatke (podatke o kinetiki pri enkratnem odmerku in tudi pri ponavljajo čih 
se odmerkih, če so na voljo) ter podatke, pridobljene z drugimi študijami s 
ponavljajo čo se izpostavljenostjo. Kroni čno strupenost je treba ugotavljati 
šele po pridobitvi za četnih informacij o strupenosti na podlagi 28- in/ali 90- 
dnevnega preskusa strupenosti s ponavljajo čimi se odmerki. V okviru 
splošne ocene potencialnih škodljivih u činkov dolo čene preskusne kemika ­
lije na zdravje je treba razmisliti o postopnem pristopu k preskušanju 
kronične strupenosti (11) (12) (13) (14). 
8. Pred za četkom študije je treba dolo čiti najprimernejše statisti čne metode za 
analizo rezultatov ob upoštevanju zasnove in ciljev preskusa. Med vidiki, ki jih je treba preu čiti, je tudi vprašanje, ali bi morala statistika vklju čevati 
prilagoditev glede na preživetje in analizo v primeru pred časnega prenehanja 
tretiranja ene ali ve č skupin. Napotki o primernih statisti čnih analizah in 
ključne reference mednarodno priznanih statisti čnih metod so na voljo v 
Dokumentu s smernicami št. 116 (6) ter v Dokumentu s smernicami 
št. 35 o analizi in ocenjevanju študij kroni čne strupenosti in rakotvornosti 
(15).
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 440
 
9. Pri izvajanju študije kroni čne strupenosti je treba vedno upoštevati vodilna 
načela in preudarke, opisane v Dokumentu s smernicami OECD št. 19 o 
prepoznavanju, ocenjevanju in uporabi klini čnih znakov kot humanih 
končnih točk za preskusne živali pri oceni varnosti (16), zlasti odstavek 
62 navedenega dokumenta. V tem odstavku je navedeno: „ Pri študijah, ki 
vključujejo ponavljajo če se odmerke, je treba sprejeti premišljeno odlo čitev, 
ali naj se žival humano usmrti ali ne, če kaže klini čne znake, ki se stop ­
njujejo in vodijo v dodatno poslabšanje njenega stanja. Ta odlo čitev mora 
vključevati razmislek o vrednosti informacij, ki bodo pridobljene z ohranit ­
vijo zadevne živali v študiji glede na njeno splošno stanje. Če se sprejme 
odločitev, da se žival ohrani v preskusu, je treba po potrebi pove čati 
pogostnost opazovanj. Obstaja tudi možnost, da se brez ogrožanja namena preskusa za časno prekine dajanje odmerkov, če bi to ublažilo bole čine ali 
trpljenje, ali da se zmanjša preskusni odmerek. “ 
10. Podrobni napotki in razprava o na čelih izbire odmerkov za študije kroni čne 
strupenosti in rakotvornosti so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (6) ter v dveh publikacijah, ki ju je pripravil International Life Sciences Institute (17) (18). Osrednja strategija izbire odmerkov je odvisna od glav ­
nega cilja ali ciljev študije (odstavek 6). Pri izbiri ustreznih velikosti 
odmerkov je treba najti ravnotežje med spremljanjem nevarnosti na eni ter opredeljevanjem u činkov majhnih odmerkov in njihovim pomenom na drugi 
strani. To je zlasti pomembno, kadar bo izvedena kombinirana študija 
kronične strupenosti in rakotvornosti (poglavje B.33 te priloge) (odstavek 
11). 
11. Razmisliti je treba o možnosti, da se namesto lo čene izvedbe študije 
kronične strupenosti (ta preskusna metoda B.30) in študije rakotvornosti 
(poglavje B.32 te priloge) izvede kombinirana študija kroni čne strupenosti 
in rakotvornosti (poglavje B.33 te priloge). S kombiniranim preskusom se v 
primerjavi z izvedbo dveh lo čenih študij zagotovi ve čja učinkovitost v 
smislu časa in stroškov, ne da bi bila pri tem ogrožena kakovost podatkov 
v fazi v zvezi s kroni čno strupenostjo ali v fazi v zvezi z rakotvornostjo. 
Vendar je treba pri izvajanju kombinirane študije kroni čne strupenosti in 
rakotvornosti (poglavje B.33 te priloge) skrbno upoštevati na čela izbire 
odmerkov (odstavki 9 in 20–25), poleg tega pa se tudi priznava, da se na podlagi nekaterih zakonodajnih okvirov lahko zahteva lo č
ena izvedba študij. 
12. Pojmi, ki se uporabljajo v okviru te preskusne metode, so opredeljeni na 
koncu tega poglavja in v Dokumentu s smernicami št. 116 (6).  
NAČELO PRESKUSA 
13. Preskusna kemikalija se dnevno v stopnjevanih odmerkih daje ve č skupinam 
preskusnih živali, pri čemer preskus navadno traja 12 mesecev, čeprav se 
lahko glede na zakonodajne zahteve izberejo tudi daljša ali krajša obdobja (glej odstavek 33). Izbrano obdobje mora biti dovolj dolgo, da se lahko pokažejo u činki kumulativne strupenosti, ne pa tudi zavajajo či učinki spre­
memb, povezanih s staranjem. Odstopanja od 12-mese čnega obdobja izpo ­
stavljenosti je treba utemeljiti, zlasti krajša obdobja. Preskusna kemikalija se navadno daje oralno, čeprav je lahko primerno tudi preskušanje z inhalacij ­
skim ali dermalnim na činom dajanja. Zasnova študije lahko vklju čuje tudi 
eno ali ve č vmesnih usmrtitev, npr. pri 3 ali 6 mesecih, zaradi česar se lahko 
vključijo dodatne skupine živali (glej odstavek 19). V obdobju dajanja 
odmerkov je treba pozorno opazovati, ali živali kažejo znake zastrupitve. Na živalih, ki med preskusom poginejo ali so usmr čene, se opravi obduk ­
cija, ob koncu preskusa pa se tudi preživele živali usmrtijo in se na njih 
opravi obdukcija.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 441
 
OPIS METODE  
Izbira živalske vrste  
14. Ta preskusna metoda je namenjena predvsem ocenjevanju in vrednotenju 
kronične strupenosti na glodavcih (glej odstavek 2), čeprav se priznava, da 
se lahko z nekaterimi zakonodajnimi ureditvami zahtevajo podobne študije na vrstah, ki niso glodavci. Izbiro živalske vrste je treba utemeljiti. Kadar se 
zahtevajo študije kroni čne strupenosti na vrstah, ki niso glodavci, morata 
zasnova in izvajanje takih študij morata temeljiti na na čelih, opisanih v tej 
preskusni metodi, ter na tistih iz poglavja B.27 te priloge z naslovom „90- dnevna študija oralne toksi čnosti s ponavljajo čimi se odmerki na neglodav ­
cih“ (5). Dodatne informacije o izbiri živalske vrste in seva so na voljo v 
Dokumentu s smernicami št. 116 (6). 
15. V tej preskusni metodi je priporo čena vrsta podgana, uporabijo pa se lahko 
tudi druge vrste glodavcev, npr. miš. Podgane in miši so najprimernejši preskusni modeli zaradi njihove razmeroma kratke življenjske dobe, razšir ­
jene uporabe v farmakoloških in toksikoloških študijah, ob čutljivosti za 
indukcijo tumorjev ter razpoložljivosti dovolj opredeljenih sevov. Zaradi 
teh lastnosti je na voljo veliko informacij o njihovi fiziologiji in patologiji. Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle živali obi čajno uporabljanih labo ­
ratorijskih sevov. V študiji kroni čne strupenosti je treba uporabiti isti sev in 
izvor živali kot v predhodnih krajših študijah strupenosti. Samice še niso 
smele kotiti in ne smejo biti breje.
 
Nastanitveni in prehranjevalni pogoji  
16. Živali se lahko nastanijo posami čno ali dajo v kletke v manjših skupinah 
istega spola; posami čna nastanitev se lahko predvidi samo, če je znanstveno 
utemeljena (19) (20) (21). Kletke je treba razporediti tako, da so morebitni 
učinki zaradi njihovega položaja čim manjši. Temperatura v prostoru s 
preskusnimi živalmi mora biti 22 °C (± 3 °C). Čeprav mora biti relativna 
vlažnost vsaj 30-odstotna in po možnosti ne sme presegati 70 %, razen med 
čiščenjem prostora, mora biti cilj 50- do 60-odstotna vlažnost. Osvetlitev 
mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za 
hranjenje se lahko uporablja obi čajna laboratorijska hrana z neomejeno 
količino pitne vode. Hrana mora zadovoljevati vse prehranske potrebe 
preskušane živalske vrste, vsebnost kontaminantov, med drugim ostankov 
pesticidov, obstojnih organskih onesnaževal, fitoestrogenov, težkih kovin in mikotoksinov, ki lahko vplivajo na rezultat preskusa, pa mora biti čim 
manjša. Redno je treba pripravljati analitske informacije o ravneh kontami ­
nantov v hranilih in hrani, vsaj na za četku študije in kadar se zamenja serija 
uporabljane kemikalije, ter jih vklju čiti v končno poročilo. Prav tako je treba 
zagotoviti analitske informacije o pitni vodi, uporabljeni v študiji. Kadar se preskusna kemikalija daje s hrano, lahko na izbiro hrane vpliva potreba po 
zagotovitvi ustrezne primesi preskusne kemikalije in zadovoljevanju 
prehranskih potreb živali.
 
Priprava živali  
17. Uporabiti je treba zdrave živali, ki so se najmanj 7 dni prilagajale labora ­
torijskim razmeram in še niso bile vklju čene v preskusne postopke. V 
primeru glodavcev je treba odmerke za četi dajati čim prej po odstavitvi 
od sesanja in prilagajanju na okolje, po možnosti preden so živali stare 8 tednov. Opredeliti je treba vrsto, sev, izvor, spol, težo in starost preskusnih živali. Ob za četku študije morajo biti razlike v teži uporabljenih živali za 
vsak spol čim manjše, njihova teža pa ne sme odstopati za ve č kot ± 20 % 
od povpre čne teže vseh živali v študiji glede na spol. Živali se naklju čno
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 442
 
dodelijo kontrolnim in tretiranim skupinam. Po randomizaciji med skupi ­
nami v okviru vsakega spola ne sme biti ve čjih razlik v povpre čni telesni 
teži. Če obstajajo statisti čno pomembne razlike, je treba fazo randomizacije 
ponoviti, če je to mogo če. Vsaki živali je treba dodeliti edinstveno identi ­
fikacijsko številko in jo trajno ozna čiti s to številko s tetovažo, vsaditvijo 
mikročipa ali drugo ustrezno metodo.  
POSTOPEK  
Število in spol živali  
18. Uporabiti je treba oba spola. Število živali mora biti zadostno, da je ob 
koncu študije v vsaki skupini dovolj živali za temeljito biološko in stati ­
stično ocenjevanje. Pri glodavcih je treba obi čajno uporabiti najmanj 20 
živali na spol za vsako velikost odmerka, medtem ko se pri vrstah, ki 
niso glodavci, priporo čajo najmanj 4 živali na spol na skupino. V študijah, 
ki vključujejo miši, so lahko potrebne dodatne živali v vsaki odmerni 
skupini, da je mogo če opraviti vse zahtevane hematološke preiskave.  
Uporaba vmesnih usmrtitev, satelitskih skupin in opozorilnih živali  
19. Če je to znanstveno utemeljeno, se lahko v študiji predvidijo vmesne 
usmrtitve (vsaj 10 živali/spol/skupino), npr. pri 6 mesecih, da se zagotovijo 
informacije o napredovanju toksikoloških sprememb in mehanisti čne infor­
macije. Kadar so take informacije že na voljo iz prejšnjih študij strupenosti s ponavljajo čimi se odmerki v zvezi z zadevno preskusno kemikalijo, vmesne 
usmrtitve morda niso znanstveno utemeljene. Vklju čijo se lahko tudi sate ­
litske skupine za spremljanje reverzibilnosti morebitnih toksikoloških spre ­
memb, ki jih povzro či preiskovana preskusna kemikalija; te preiskave so 
navadno omejene na najve čji odmerek v študiji in kontrolo. Poleg tega se 
lahko po potrebi predvidi dodatna skupina opozorilnih živali (navadno 5 
živali na spol) za spremljanje patološkega stanja med študijo (22). Če se 
načrtujejo vmesne usmrtitve ali vklju čitev satelitskih ali opozorilnih skupin, 
je treba število živali v zasnovi študije pove čati za toliko, kolikor se jih 
namerava usmrtiti pred zaklju čkom študije. Za te živali so obi čajno potrebna 
enaka opazovanja kot za živali v fazi študije v zvezi s kroni čno strupenostjo, 
vključno s telesno težo, porabo hrane/vode, hematološkimi in klini čnimi 
biokemičnimi meritvami ter patološkimi preiskavami, čeprav se lahko pred ­
vidi tudi (za skupine za vmesno usmrtitev), da se meritve omejijo na speci ­
fična ključna merila, kot sta nevrotoksi čnost ali imunotoksi čnost.
 
Odmerne skupine in odmerjanje  
20. Napotki glede vseh vidikov izbire odmerkov in razporeditve njihovih veli ­
kosti so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (6). Uporabiti je treba 
najmanj tri velikosti odmerkov in so časno kontrolo, razen če se opravi mejni 
preskus (glej odstavek 27). Velikosti odmerkov navadno temeljijo na rezul ­
tatih kratkoro čnejših študij s ponavljajo čimi se odmerki ali študij za ugota ­
vljanje obmo čja, pri njihovem dolo čanju pa je treba upoštevati vse obstoje če 
toksikološke in toksikokineti čne podatke, ki so na voljo za preskusno kemi ­
kalijo ali sorodne snovi.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 443
 
21. Razen kadar zaradi fizikalno-kemijskih lastnosti ali bioloških u činkov 
preskusne kemikalije to ni mogo če, je navadno treba najve čjo velikost 
odmerka izbrati za opredelitev glavnih ciljnih organov in strupenih u činkov, 
pri čemer se je treba izogibati povzro čanju trpljenja, hude zastrupitve, 
obolevnosti ali smrti. Ob upoštevanju dejavnikov, navedenih v odstavku 
22 spodaj, je treba najve čji odmerek izbrati tako, da se izzovejo znaki 
strupenosti, na primer upo časnitev pridobivanja telesne teže (približno 10- 
odstotna). 
22. Vendar se lahko glede na cilje študije (glej odstavek 6) izbere tudi najve čji 
odmerek, manjši od odmerka, ki povzro ča znake zastrupitve, npr. če 
odmerek izzove škodljiv u činek, ki vzbuja zaskrbljenost, ne vpliva pa 
bistveno na življenjsko dobo ali telesno težo. Najve čji odmerek ne sme 
presegati 1 000 mg/kg telesne teže/dan (mejni odmerek, glej odstavek 27). 
23. Velikosti odmerkov in razporeditev med njimi se lahko izberejo za dolo ­ 
čanje odziva v odvisnosti od odmerka in vrednosti NOAEL ali drugega 
želenega izida študije, npr. BMD (glej odstavek 25) pri najmanjšem odmerku. Dejavniki, ki jih je treba upoštevati pri dolo čitvi manjših odmer ­
kov, vklju čujejo pričakovani naklon krivulje odmerek-odziv, odmerke, pri 
katerih se lahko pojavijo pomembne spremembe v presnovi ali na činu stru­
penega delovanja, velikost, pri kateri se pri čakuje prag, ali velikost, pri 
kateri se pri čakuje izhodiš čna točka za ekstrapolacijo majhnih odmerkov. 
24. Izbrana razporeditev velikosti odmerkov je odvisna od lastnosti preskusne 
kemikalije in je v tej preskusni metodi ni mogo če predpisati, vendar dva- do 
štirikratni intervali velikokrat zagotovijo visoko u činkovitost preskusa, kadar 
se uporabijo za dolo čitev padajo čih velikosti odmerkov, namesto uporabe 
zelo velikih intervalov (npr. ve čjih od faktorja približno 6–10) med odmerki 
pa je pogosto primerneje dodati četrto preskusno skupino. Na splošno se je 
treba izogibati uporabi faktorjev, ve čjih od 10, če se uporabijo, pa je to treba 
utemeljiti. 
25. Kot je nadalje navedeno v Dokumentu s smernicami št. 116 (6), je treba pri 
izbiri odmerkov upoštevati: 
— znane ali domnevne nelinearnosti ali to čke pregiba na krivulji 
odmerek-odziv, 
— toksikokinetiko in odmerna obmo čja, v katerih se pojavljajo ali ne poja
­
vljajo presnovna indukcija, nasi čenje ali nelinearnost med zunanjimi in 
notranjimi odmerki, 
— prekurzorske lezije, ozna čevalce učinka ali kazalnike delovanja klju čnih 
temeljnih bioloških procesov, 
— ključne (ali domnevne) vidike na čina delovanja, kot so odmerki, pri 
katerih se za čne pojavljati citotoksi čnost, so ravni hormonov motene, 
homeostati čni mehanizmi preobremenjeni itd., 
— predele krivulje odmerek-odziv, pri katerih je potrebna posebno zane ­
sljiva ocena, npr. v obmo čju pričakovanega BMD ali predvidenega 
praga, 
— preudarke v zvezi s pri čakovanimi stopnjami izpostavljenosti ljudi.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 444
 
26. Kontrolna skupina je netretirana skupina ali kontrolna skupina z nosilcem, 
če se pri dajanju preskusne kemikalije uporablja nosilec. Z živalmi v 
kontrolni skupini je treba ravnati enako kot z živalmi v preskusni skupini, le da se ne tretirajo s preskusno kemikalijo. Če se uporablja nosilec, mora 
kontrolna skupina prejeti najve čjo količino nosilca, ki je bila uporabljena 
med odmernimi skupinami. Če se preskusna snov daje s hrano in se s tem 
zaradi njene manjše okusnosti povzro či bistveno zmanjšanje vnosa hrane, je 
lahko koristna dodatna, po parih hranjena kontrolna skupina, ki se uporablja kot primernejša kontrola. 
27. Če je mogo če na podlagi informacij iz predhodnih študij predvideti, da 
preskus pri eni velikosti odmerka, enakovredni najmanj 1 000 mg/kg telesne teže/dan, pri katerem so uporabljeni postopki, opisani za to študijo, verjetno 
ne bo povzro čil škodljivih u činkov, in če glede na podatke o strukturno 
sorodnih kemikalijah strupenost ni pri čakovana, popolna študija s tremi 
velikostmi odmerkov morda ne bo potrebna. Lahko se uporabi meja 1 000 mg/kg telesne teže/dan, razen če izpostavljenost ljudi nakazuje potrebo po 
večjem odmerku.
 
Priprava odmerkov in dajanje preskusne kemikalije  
28. Preskusna kemikalija se obi čajno daje oralno, s hrano ali pitno vodo 
oziroma z gavažo. Dodatne informacije o na činih in metodah dajanja so 
na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (6). Na čin in metoda dajanja 
sta odvisna od namena študije, fizikalnih/kemijskih lastnosti preskusne kemikalije, njene biološke dostopnosti ter prevladujo čega načina in metode 
izpostavljenosti ljudi. Izbrani na čin in metodo dajanja je treba utemeljiti. 
Zaradi dobrobiti živali je treba oralno gavažo praviloma izbrati samo pri 
tistih snoveh, pri katerih sta ta na čin in metoda dajanja razumno reprezen ­
tativna za potencialno izpostavljenost ljudi (npr. pri farmacevtskih izdelkih). Prehranske in okoljske kemikalije, vklju čno s pesticidi, se navadno dajejo s 
hrano ali pitno vodo. V nekaterih scenarijih, npr. pri izpostavljenosti na 
delovnem mestu, pa so lahko primernejši drugi na čini dajanja. 
29. Po potrebi se preskusna kemikalija raztopi ali suspendira v ustreznem 
nosilcu. Upoštevati je treba naslednje lastnosti nosilca in drugih aditivov, kot je ustrezno: u činke na absorpcijo, porazdelitev, presnovo ali retencijo 
preskusne kemikalije, u činke na kemijske lastnosti preskusne kemikalije, ki 
lahko spremenijo njene strupene lastnosti, ter u činke na porabo hrane ali 
vode ali na prehranjenost živali. Priporo čljivo je, da se, če je mogo če, 
najprej preu či možnost uporabe vodne raztopine/suspenzije, nato raztopine/ 
emulzije v olju (npr. koruznem), šele potem pa možnost raztopine v drugih 
nosilcih. Pri nevodnih nosilcih morajo biti strupene lastnosti nosilca znane. 
Na voljo morajo biti informacije o stabilnosti preskusne kemikalije in homo ­
genosti raztopin ali hrane, ki se bodo uporabljale v preskusu (kot je ustre ­
zno), v pogojih dajanja (npr. s hrano). 
30. Pri kemikalijah, ki se dajejo s hrano ali pitno vodo, je treba zagotoviti, da 
količine uporabljene preskusne kemikalije ne vplivajo na normalno prehra ­
njevanje ali vodno ravnotežje. Pri dolgoro čnih študijah strupenosti, pri 
katerih se uporablja dajanje s hrano, koncentracija preskusne kemikalije v 
hrani praviloma ne sme presegati zgornje meje 5 % vse hrane, da se prepre ­ 
čijo prehranska neravnovesja. Če se preskusna kemikalija daje s hrano, se 
lahko uporabi bodisi konstantna koncentracija v hrani (mg/kg hrane ali ppm) 
bodisi konstantna velikost odmerka glede na telesno težo živali (mg/kg 
telesne teže), ki se izra čuna vsak teden. Uporabljeni na čin je treba navesti.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 445
 
31. V primeru oralnega dajanja živali dobijo odmerek preskusne kemikalije vsak 
dan (sedem dni na teden), preskusno obdobje pa navadno traja 12 mesecev 
(glej tudi odstavek 33), čeprav so lahko glede na zakonodajne zahteve 
potrebna tudi daljša obdobja. Vsak druga čen režim odmerjanja, npr. pet 
dni na teden, je treba utemeljiti. V primeru dermalnega dajanja so živali s 
preskusno kemikalijo navadno tretirane vsaj 6 ur na dan 7 dni na teden, kot 
je navedeno v poglavju B.9 te priloge (10), prek obdobja 12 mesecev. Inhalacijska izpostavljenost se izvaja 6 ur na dan 7 dni na teden, uporabiti pa je mogo če tudi izpostavljenost 5 dni na teden, če je utemeljena. Obdobje 
izpostavljenosti praviloma traja 12 mesecev. Če se z nosom izpostavijo vrste 
glodavcev, ki niso podgane, se lahko najdaljši časi izpostavljenosti prilago ­
dijo, da se kar najbolj zmanjša trpljenje, zna čilno za uporabljeno vrsto. 
Obdobja izpostavljenosti, krajša od 6 ur na dan, je treba utemeljiti. Glej 
tudi poglavje B.8 te priloge (8). 
32. Če se preskusna kemikalija živalim daje z gavažo, je treba pri tem upora ­
bljati želod čno cevko ali ustrezno intubacijsko kanilo, postopek pa opravljati 
vsak dan ob podobnem času. Običajno živali dobijo enkraten odmerek 
enkrat na dan, če pa je kemikalija na primer lokalni dražljivec, se lahko 
dnevno odmerjena koli čina ohranja tudi z dajanjem polovi čnih odmerkov 
(dvakrat na dan). Najve čja količina tekočine, ki se lahko da naenkrat, je 
odvisna od velikosti preskusne živali. To koli čino je treba ohranjati tako 
majhno, kot je prakti čno, praviloma pa pri glodavcih ne sme prese či 1 
ml/100 g telesne teže (22). Spremenljivost preskusne koli čine je treba kar 
najbolj zmanjšati s prilagajanjem koncentracije, da se zagotovi konstantna količina pri vseh velikostih odmerkov. Izjema so potencialno jedke ali 
dražilne kemikalije, ki jih je treba razred čiti, da se prepre čijo resni lokalni 
učinki. Preskušanju pri koncentracijah, pri katerih obstaja verjetnost jedkosti 
ali dražilnosti za prebavni trakt, se je treba izogibati.
 
Trajanje študije  
33. Čeprav je ta preskusna metoda primarno zasnovana kot 12-mese čna študija 
kronične strupenosti, je zasnovana tako, da se lahko uporablja tudi za krat ­
koročnejše (npr. 6- ali 9-mese čne) ali dolgoro čnejše (npr. 18- ali 24-mese ­ 
čne) študije, glede na zahteve konkretnih zakonodajnih ureditev ali za 
posebne mehanisti čne namene. Odstopanja od 12-mese čnega obdobja izpo ­
stavljenosti je treba utemeljiti, zlasti krajša obdobja. Satelitske skupine, vključene za spremljanje reverzibilnosti toksikoloških sprememb, ki jih 
povzroči preiskovana preskusna kemikalija, se s preskusno kemikalijo ne 
tretirajo najmanj 4 tedne in najve č eno tretjino celotnega trajanja študije po 
koncu izpostavljenosti. Ve č napotkov, vklju čno s preudarki o preživetju v 
študiji, je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (6).
 
OPAZOVANJA 
34. Vse živali je treba pregledovati za odkrivanje obolevnosti ali smrtnosti, 
običajno na za četku in koncu vsakega dne, vklju čno s konci tedna in praz ­
niki. Splošna klini čna opazovanja je treba opraviti vsaj enkrat na dan, po 
možnosti vsak dan ob istem času in ob upoštevanju obdobja najve čje inten­
zivnosti pri čakovanih u činkov po vnosu odmerka, če gre za dajanje z 
gavažo.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 446
 
35. Podrobna klini čna opazovanja je treba opraviti na vseh živalih vsaj enkrat 
pred prvo izpostavljenostjo (za omogo čanje primerjav na istem osebku), ob 
koncu prvega tedna študije, zatem pa mese čno. Protokol za opazovanja je 
treba dolo čiti tako, da so razlike med posameznimi opazovalci čim manjše 
in neodvisne od preskusne skupine. Ta opazovanja je treba opraviti zunaj 
kletk, v katerih živali bivajo, po možnosti na standardnem mestu in vedno 
ob istem času. Opažanja je treba skrbno zabeležiti, po možnosti z uporabo 
sistemov to čkovanja, ki jih izrecno dolo či preskuševalni laboratorij. Priza ­
devati si je treba, da se pogoji opazovanja čim manj spreminjajo. Pozornost 
je med drugim treba nameniti vsem spremembam na koži, kožuhu, o čeh in 
sluznicah, pojavu sekrecije in ekskrecije ter delovanju avtonomnega živ čevja 
(npr. solzenju, piloerekciji, velikosti zenic in nenavadnemu vzorcu dihanja). Prav tako je treba zabeležiti spremembe v hoji, drži in odzivu na ravnanje z 
živalmi, pa tudi prisotnost kloni čnih ali toni čnih gibov, stereotipij (npr. 
prekomernega čiščenja, ponavljajo čega se vrtenja v krogu) ali nenormalnega 
vedenja (npr. samopohabe, vzvratne hoje) (24). 
36. Na vseh živalih je treba pred prvim dajanjem preskusne kemikalije z oftal ­
moskopom ali drugo primerno opremo opraviti oftalmološko preiskavo. Ob koncu študije je treba to preiskavo po možnosti opraviti na vseh živalih, 
vsekakor pa vsaj pri skupini, tretirani z velikim odmerkom, in kontrolni 
skupini. Če se v o čeh zaznajo spremembe, povezane s tretiranjem, je 
treba pregledati vse živali. Če strukturna analiza ali druge informacije kažejo 
na strupenost za o či, je treba pogostnost preiskav o či povečati. 
37. Za kemikalije, v zvezi s katerimi je predhodni 28- in/ali 90-dnevni preskus 
strupenosti s ponavljajo čimi se odmerki nakazal potencial za povzro čanje 
nevrotoksi čnih učinkov, se lahko po izbiri ocenijo senzori čne reakcije na 
različne vrste dražljajev (24) (npr. slušne, vidne in proprioceptivne dražljaje) 
(25) (26) (27), mo č oprijema (28) ter motori čna aktivnost (29), in sicer pred 
začetkom študije ter vsake 3 mesece po za četku študije do 12. meseca in 
vključno z njim, pa tudi ob koncu študije ( če je daljša od 12 mesecev). 
Nadaljnje podrobnosti glede možnih postopkov so na voljo v navedenih virih. Uporabiti je mogo č
e tudi druge postopke, ki v njih niso opisani. 
38. Za kemikalije, v zvezi s katerimi je predhodni 28- in/ali 90-dnevni preskus 
strupenosti s ponavljajo čimi se odmerki nakazal potencial za povzro čanje 
imunotoksi čnih učinkov, se lahko nadaljnje preiskave te kon čne točke po 
izbiri opravijo ob koncu študije.  
Telesna teža, poraba hrane/vode in izkoristek hrane  
39. Vse živali je treba stehtati na za četku tretiranja, vsaj enkrat na teden prvih 
13 tednov, zatem pa najmanj enkrat na mesec. Meritve porabe in izkoristka 
hrane je treba prvih 13 tednov opravljati vsaj enkrat na teden, nato pa najmanj enkrat na mesec. Kadar se kemikalija daje s pitno vodo, je treba porabo vode prvih 13 tednov meriti vsaj enkrat na teden, zatem pa najmanj 
enkrat na mesec. O meritvah porabe vode je treba razmisliti tudi pri študijah, 
pri katerih se spremenijo vzorci pitja.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 447
 
Hematologija in klini čna biokemija  
40. V študijah z glodavci je treba hematološke preiskave opravljati na vsaj 10 
samcih in 10 samicah na skupino, in sicer pri 3, 6 in 12 mesecih, pa tudi ob koncu študije ( če je daljša od 12 mesecev), pri čemer je treba za te preiskave 
v vsej študiji uporabljati iste živali. Pri miših so lahko za izvedbo vseh 
zahtevanih hematoloških preiskav potrebne satelitske živali (glej odstavek 18). V študijah na vrstah, ki niso glodavci, se vzorci jemljejo manjšemu številu živali (npr. 4 živalim na spol na skupino v študijah s psi) ob vmesnih 
vzorčenjih in ob koncu študije, kot je opisano za glodavce. Meritve pri 3 
mesecih, pa naj gre za študije z glodavci ali vrstami, ki niso glodavci, ni treba opraviti, če v predhodni 90-dnevni študiji, izvedeni s primerljivimi 
velikostmi odmerkov, niso bili opaženi u činki na hematološke parametre. 
Vzorce krvi je treba odvzeti na imenovanem mestu, na primer s punkcijo srca ali iz retroorbitalnega sinusa, medtem ko je žival v anesteziji. 
41. Preiskati je treba naslednji seznam parametrov (30): skupno in diferencialno 
število levkocitov, število eritrocitov, število trombocitov, koncentracijo 
hemoglobina, hematokrit (volumen stisnjenih eritrocitov), povpre čni 
volumen eritrocitov (MCV), povpre čno koli čino hemoglobina v 
eritrocitih (MCH), povpre čno koncentracijo hemoglobina v 
eritrocitih (MCHC), protrombinski čas in aktivirani parcialni trombopla ­
stinski čas. Glede na strupenost preskusne kemikalije se lahko, kot je 
primerno, merijo tudi drugi hematološki parametri, kot so Heinzeva telesca ali druge netipi čne morfološke oblike eritrocitov ali methemoglobin. Na 
splošno je treba sprejeti prožni pristop glede na opažene in/ali pri čakovane 
učinke dane preskusne kemikalije. Če preskusna kemikalija u činkuje na 
krvotvorni sistem, sta lahko indicirana tudi meritev števila retikulocitov in citološka preiskava kostnega mozga, čeprav teh ni treba izvajati redno. 
42. Klini čne biokemi čne preiskave za ugotavljanje glavnih strupenih u činkov na 
tkiva ter zlasti ledvice in jetra je treba opravljati na vzorcih krvi, odvzetih 
najmanj 10 samcem in 10 samicam na skupino v istih časovnih intervalih, 
kot so dolo čeni za hematološke preiskave, ter pri tem prek celotne študije 
uporabljati iste živali. Pri miših so lahko za izvedbo vseh zahtevanih klini ­ 
čnih biokemi čnih preiskav potrebne satelitske živali. V študijah na vrstah, ki 
niso glodavci, se vzorci jemljejo manjšemu številu živali (npr. 4 živalim na 
spol na skupino v študijah s psi) ob vmesnih vzor čenjih in ob koncu študije, 
kot je opisano za glodavce. Meritev pri 3 mesecih, pa naj gre za študije z glodavci ali vrstami, ki niso glodavci, ni treba opraviti, če v predhodni 90- 
dnevni študiji, izvedeni s primerljivimi velikostmi odmerkov, niso bili 
opaženi u činki na klini čne biokemi čne parametre. Pred odvzemom vzorcev 
krvi je priporo čljivo živali čez noč
 postiti (kar pa ne velja za miši). Preiskati 
je treba naslednji seznam parametrov (30): glukozo, se čnino (sečninski 
dušik), kreatinin, skupne beljakovine, albumin, kalcij, natrij, kalij, skupni 
holesterol, najmanj dva ustrezna preskusa za hepatocelularno oceno (alanin- aminotransferaza, aspartat-aminotransferaza, glutamat-dehidrogenaza, skupne žolčne kisline) (31) in najmanj dva ustrezna preskusa za hepatobiliarno 
oceno (alkalna fosfataza, γ-glutamil transferaza, 5’-nukleotidaza, skupni bili ­
rubin, skupne žol čne kisline) (31). Glede na strupenost preskusne kemikalije 
se lahko, kot je primerno, merijo tudi drugi klini čni kemični parametri, kot 
so vrednost trigliceridov na teš če, specifi čni hormoni in holinesteraza. Na 
splošno je potreben prožni pristop glede na opažene in/ali pri čakovane 
učinke dane preskusne kemikalije.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 448
 
43. Analize urina je treba opraviti na najmanj 10 samcih in 10 samicah na 
skupino na vzorcih, zbranih v istih časovnih intervalih kot pri hematoloških 
in kliničnih kemičnih preiskavah. Meritev pri 3 mesecih ni treba opraviti, če 
v predhodni 90-dnevni študiji, izvedeni s primerljivimi velikostmi odmer ­
kov, niso bili opaženi u činki pri analizi urina. V strokovno priporo čilo glede 
kliničnih patoloških študij (30) je bil vklju čen naslednji seznam parametrov: 
videz, koli čina, osmolalnost ali specifi čna teža, pH, skupne beljakovine in 
glukoza. Druge dolo čitve vklju čujejo keton, urobilinogen, bilirubin in 
okultno kri. Če je treba preiskavo opaženih u činkov razširiti, se lahko 
uporabijo dodatni parametri. 
44. Na splošno se šteje, da je treba izhodiš čne hematološke in klini čne bioke­
mične spremenljivke dolo čiti pred tretiranjem v študijah s psi, ne pa tudi v 
študijah z glodavci (30). Če pa so pretekli izhodiš čni podatki (glej odstavek 
50) nezadostni, je treba razmisliti o pripravi takih podatkov.  
Patologija  
Makroskopska obdukcija  
45. Praviloma se na vseh živalih v študiji opravi popolna in natan čna makro ­
skopska obdukcija, ki obsega natan čen pregled zunanje površine telesa, vseh 
odprtin, lobanjske, prsne in trebušne votline ter njihove vsebine. Lahko pa 
se tudi predvidi (za skupine za vmesno usmrtitev ali satelitske skupine), da se meritve omejijo na specifi čna ključna merila, kot sta nevrotoksi čnost ali 
imunotoksi čnost (glej odstavek 19). Obdukcija in poznejši postopki, opisani 
v naslednjih odstavkih, pri teh živalih niso potrebni. Za opozorilne živali je 
lahko obdukcija potrebna v posameznih primerih, o čemer odlo ča vodja 
študije. 
46. Stehtati je treba organe vseh živali, razen tistih, ki se izklju čijo na podlagi 
zadnjega dela odstavka 45. Z nadledvi čnih žlez, možganov, nadmodka, srca, 
ledvic, jeter, jaj čnikov, vranice, mod, š čitnice (stehtane po fiksaciji skupaj z 
obščitnicami) in maternice vseh živali (razen živali, ki so bile najdene 
umirajoče in/ali so bile usmr čene med študijo) je treba, kot je ustrezno, 
odstraniti vsa priraš čena tkiva in nato izmeriti njihovo mokro težo čim 
prej po disekciji, da se ne izsušijo. V študijah z mišmi tehtanje nadledvi čnih 
žlez ni obvezno. 
47. Naslednja tkiva je treba shraniti v fiksacijskem sredstvu, ki je najprimernejše 
za vrsto tkiva in predvideno poznejšo histopatološko preiskavo (32) (tkiva v 
oglatih oklepajih niso obvezna): 
vse vidne lezije srce trebušna slinavka želodec (predželodec, žlezni 
želodec) 
nadledvična žleza vito črevo obš čitnica [zobje] 
aorta teš če črevo periferni živec modo 
možgani (vklju čno z rezi ­
nami velikih in malih 
možganov ter podaljšane hrbtenjače/mosta) ledvica hipofiza priželjc 
slepo črevo solzna žleza (zunaj 
očesne votline) prostata š čitnica 
maternični vrat jetra rektum [jezik]
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 449
 
koagulacijska žleza plju ča žleza slinavka sapnik 
debelo črevo bezgavke (povrhnje in 
globoke) semenski meši ček se čni mehur 
dvanajsternik mle čna žleza (obvezna 
za samice, in če jo je 
mogoče secirati s 
prostim o česom, za 
samce) skeletna mišica maternica (vklju čno z mater ­
ničnim vratom) 
nadmodek [zgornja dihala, vklju čno 
z nosom, nosnimi školj ­
kami in obnosnimi votli ­
nami] koža [se čevod] 
oko (vklju čno z mrežnico) požiralnik hrbtenja ča (na treh 
ravneh: vratni, prsni in ledveni) [sečnica] 
[stegnenica s sklepom] [vohalni beti č] vranica vagina 
žolčnik (pri vrstah, ki niso 
podgane) jajčnik [prsnica] rezina in/ali svež punktat 
kostnega mozga 
Harderjeva žleza 
Pri parnih organih, npr. ledvicah ali nadledvi čnih žlezah, je treba shraniti 
oba organa. Na podlagi klini čnih in drugih izsledkov se lahko pokaže 
potreba po preiskavah dodatnih tkiv. Poleg tega je treba shraniti vse organe, 
ki bi lahko bili ciljni organi glede na znane lastnosti preskusne kemikalije. V študijah z dermalnim na činom dajanja je treba shraniti iste organe, kot so 
določeni na seznamu za oralni na čin, bistveno pa je posebno vzor čenje in 
shranjevanje kože z mesta nanosa. V inhalacijskih študijah je treba v zvezi s 
seznamom shranjenih in pregledanih tkiv dihal slediti priporo čilom iz 
poglavij B.8 (8) in B.29 te priloge (9). Za druge organe/tkiva (in poleg posebej shranjenih tkiv dihal) je treba preu čiti seznam organov, dolo čen 
za oralni na čin dajanja.
 
Histopatologija  
48. Na voljo so napotki o najboljših praksah pri izvajanju toksikoloških patolo ­ 
ških študij (32). Histopatološke preiskave morajo obsegati vsaj: 
— vsa tkiva živali iz skupine, tretirane z velikim odmerkom, in kontrolne 
skupine, 
— vsa tkiva živali, ki so poginile ali bile usmr čene med študijo, 
— vsa tkiva, ki kažejo makroskopske abnormalnosti, 
— ciljna tkiva ali tkiva, pri katerih so bile v skupini, tretirani z velikim 
odmerkom, opažene s tretiranjem povezane spremembe, vseh živali iz 
vseh drugih odmernih skupin, 
— pri parnih organih, npr. ledvicah ali nadledvi čnih žlezah, je treba pregle ­
dati oba organa.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 450
 
PODATKI IN PORO ČANJE  
Podatki  
49. Navesti je treba podatke za posamezne živali in za vse ocenjevane parame ­
tre. Poleg tega je treba vse podatke povzeti v preglednicah, v katerih se za vsako preskusno skupino navede število živali na za četku preskusa, število 
živali, ki so bile med preskusom najdene poginule ali so bile usmr čene iz 
humanih razlogov, in čas vsake smrti ali humane usmrtitve, število živali, ki 
kažejo znake zastrupitve, opis opaženih znakov zastrupitve, vklju čno s 
časom njihovega nastopa, trajanjem in resnostjo vseh strupenih u činkov, 
ter število živali, pri katerih so opažene lezije, vrste lezij in odstotek živali, 
pri katerih je opažena posamezna vrsta lezije. V preglednicah s povzetimi 
podatki je treba navesti srednje vrednosti in standardne odklone (za preskusne podatke, ki se nenehno zbirajo) za živali, pri katerih so opaženi strupeni u činki ali lezije, ter razvrstitev lezij. 
50. Pretekli kontrolni podatki so lahko dragoceni za razlago rezultatov študije, 
npr. kadar obstajajo znaki, da podatki, zagotovljeni s so časnimi kontrolami, 
bistveno odstopajo od nedavnih podatkov, pridobljenih na kontrolnih živalih iz istega preskuševalnega laboratorija/kolonije. Če se ocenjujejo pretekli 
kontrolni podatki, morajo izhajati iz istega laboratorija ter se nanašati na 
živali iste starosti in seva, poleg tega pa morajo biti pridobljeni v petih letih 
pred zadevno študijo. 
51. Če je ustrezno, je treba števil čne rezultate ocenjevati na podlagi primerne in 
splošno priznane statisti čne metode. Statisti čne metode in podatke, ki bodo 
analizirani, je treba izbrati pri zasnovi študije (odstavek 8). V izbiri je treba predvideti prilagoditve glede na preživetje, če so potrebne.
 
Poročilo o preskusu  
52. Poro čilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije:  
Preskusna kemikalija  
— agregatno stanje, čistost in fizikalno-kemijske lastnosti, 
— identifikacijske podatke, 
— izvor kemikalije, — številko serije, — potrdilo o kemijski analizi.  
Nosilec (če je ustrezno)  
— utemeljitev izbire nosilca ( če to ni voda).  
Preskusne živali  
— uporabljeno vrsta/sev in utemeljitev izbire, — število, starost in spol živali ob za četku preskusa,
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 451
 
— izvor, nastanitvene pogoje, hrano itd., 
— težo vsake živali ob za četku preskusa.  
Preskusni pogoji  
— utemeljitev na čina dajanja in izbire odmerkov, 
— če je ustrezno, uporabljene statisti čne metode za analizo podatkov, 
— podatke o formulaciji preskusne kemikalije/pripravi hrane, 
— analitske podatke o doseženi koncentraciji, stabilnosti in homogenosti 
pripravka, 
— način dajanja in podatke o dajanju preskusne kemikalije, 
— za inhalacijske študije informacijo, ali je bila uporabljena izpostavljenost 
nosu ali izpostavljenost celega telesa, 
— dejanske odmerke (mg/kg telesne teže/dan) in faktor za pretvorbo 
koncentracije preskusne snovi v hrani/pitni vodi (mg/kg ali ppm) v dejanski odmerek, če je ustrezno, 
— podatke o kakovosti hrane in vode.  
Rezultati (predstaviti je treba povzete podatke v preglednicah in podatke za 
posamezne živali)  
— podatke o preživetju, 
— telesno težo/spremembe telesne teže, 
— porabo hrane, izra čune izkoristka hrane, če so bili narejeni, in porabo 
vode, če je ustrezno, 
— podatke o toksi čni reakciji glede na spol in velikost odmerka, vklju čno z 
znaki zastrupitve, 
— vrsto, pogostnost (in če se ocenjuje, resnost) in trajanje klini čnih opažanj 
(prehodnih ali trajnih), 
— oftalmološko preiskavo, 
— hematološke preskuse, 
— klinične biokemi čne preskuse, 
— analize urina, 
— rezultat morebitnih preiskav nevrotoksi čnosti ali imunotoksi čnosti, 
— terminalno telesno težo, — težo organov (in razmerja med težami organov, če je ustrezno), 
— izsledke obdukcije, 
— podroben opis ugotovitev vseh s tretiranjem povezanih histopatoloških 
preiskav, 
— podatke o absorpciji, če so na voljo.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 452
 
Statistična obdelava rezultatov, če je ustrezno 
Razprava o rezultatih  
— razmerja med odmerkom in odzivom, — preučitev vseh informacij o na činu delovanja, 
— razpravo o morebitnih pristopih modeliranja, 
— določitev BMD, NOAEL ali LOAEL, 
— pretekle kontrolne podatke, 
— pomembnost za ljudi.  
Sklepi.
 
VIRI:  
(1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rim, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Pariz. 
(2) Combes, R. D., Gaunt, I., Balls, M. (2004). A Scientific and Animal 
Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the 
Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163–208. 
(3) Barlow, S. M., Greig, J. B., Bridges, J. W., idr. (2002). Hazard identifica ­
tion by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145–191. 
(4) Chhabra, R. S., Bucher, J. R., Wolfe, M., Portier, C. (2003). Toxicity 
characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445. 
(5) Poglavje B.27 te priloge, Preskus subkroni čne oralne toksi čnosti: 90-dnevna 
študija oralne toksi čnosti s ponavljajo čimi se odmerki na neglodalcih. 
(6) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 
and 453 – druga izdaja. Series on Testing and Assessment No. 116, na 
voljo na javni spletni strani OECD o smernicah za preskušanje na naslovu www.oecd.org/env/testguidelines. 
(7) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz. 
(8) Poglavje B.8 te priloge, Subakutna strupenost pri vdihavanju: 28-dnevna 
študija. 
(9) Poglavje B.29 te priloge, Subkroni čna strupenost pri vdihavanju: 90-dnevna 
študija. 
(10) Poglavje B.9 te priloge, Strupenost (v stiku s kožo) pri ponavljajo čem se 
odmerku (28 dni). 
(11) Carmichael, N. G., Barton, H. A., Boobis, A. R., idr. (2006). Agricultural 
Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization 
of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1–7. 
(12) Barton, H. A., Pastoor, T. P., Baetcke, T., idr. (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9–35. 
(13) Doe, J. E., Boobis, A. R., Blacker, A., idr. (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. 
Critical Reviews in Toxicology 36: 37–68.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 453
 
(14) Cooper, R. L., Lamb, J. S., Barlow, S. M., idr. (2006). A Tiered Approach 
to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical 
Reviews in Toxicology 36: 69–98. 
(15) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment 
No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, 
OECD, Pariz. 
(16) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariz. 
(17) Rhomberg, L. R., Baetcke, K., Blancato, J., Bus, J., Cohen, S., Conolly, R., 
Dixit, R., Doe, J., Ekelman, K., Fenner-Crisp, P., Harvey, P., Hattis, D., Jacobs, A., Jacobson-Kram, D., Lewandowski, T., Liteplo, R., Pelkonen, O., 
Rice, J., Somers, D., Turturro, A., West, W., Olin, S. (2007). Issues in the 
Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729– 837. 
(18) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran, J. A. (ur.). ILSI Press, Washington, DC. 
(19) Direktiva 2010/63/EU Evropskega parlamenta in Sveta z dne 22. septembra 
2010 o zaš čiti živali, ki se uporabljajo v znanstvene namene (UL L 276, 
20.10.2010, str. 33). 
(20) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86–23. Washington D.C., US. Dept. of 
Health and Human Services. 
(21) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of 
Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3- 
906255-04-2. 
(22) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals 
in various housing systems. 
(23) Diehl, K.-H., Hull, R., Morton, D., Pfister, R., Rabemampianina, Y., Smith, 
D., Vidal, J.-M., van de Vorstenbosch, C. 2001. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology 21: 15–23. 
(24) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60. 
(25) Tupper, D. E., Wallace, R. B. (1980). Utility of the Neurologic Examination 
in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003. 
(26) Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxico ­
logy. J. Toxicol. Environ. Health 9: 691–704. 
(27) Moser, V. C., McDaniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat Strain and 
Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283. 
(28) Meyer, O. A., Tilson, H. A., Byrd, W. C., Riley, M. T. (1979). A Method 
for the Routine Assessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats 
and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236. 
(29) Crofton, K. M., Howard, J. L., Moser, V. C., Gill, M. W., Reiter, L. W., 
Tilson, H. A., MacPhail, R. C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor 
Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. 
Neurotoxicol. Teratol. 13: 599–609.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 454
 
(30) Weingand, K., Brown, G., Hall, R., idr. (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & 
Appl. Toxicol. 29: 198–201. 
(31) (Osnutek) dokumenta agencije EMEA z naslovom „Non-clinical guideline 
on drug-induced hepatotoxicity“ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/ a50115/2006). 
(32) Crissman, J. W., Goodman, D. G., Hildebrandt, P. K., idr. (2004). Best 
Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 
32: 126–131.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 455
 
Dodatek 1  
OPREDELITEV POJMOV  
Preskusna kemikalija:  snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne 
metode.;  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 456
 
B.31  ŠTUDIJA STRUPENOSTI ZA PREDROJSTVENI RAZVOJ  
1. METODA  
Ta metoda ustreza metodi OECD TG 414 (2001).  
1.1 UVOD 
Metoda za preskušanje strupenosti za razvoj je namenjena zagota ­
vljanju splošnih informacij o u činkih predrojstvene izpostavljenosti 
breje preskusne živali in razvijajo čih se organizmov v maternici; to 
lahko vklju čuje oceno vplivov matere, pa tudi smrti, strukturnih 
anomalij ali spremenjene rasti zarodka. Funkcionalne pomanjkljivo ­
sti, čeprav pomemben del razvoja, niso sestavni del te preskusne 
metode. Lahko se preizkusijo v posebni študiji ali kot dodatek k 
tej študiji z uporabo preskusne metode za razvojno nevrotoksi čnost. 
Za informacije o preskušanju funkcionalnih pomanjkljivosti in drugih poporodnih u činkov preskusne metode se lahko na primeren na čin 
uporabi študija dvogeneracijske reproduktivne strupenosti ali študija 
razvojne nevrotoksi čnosti. 
Pri tej preskusni metodi je lahko v posameznih primerih potrebna 
posebna prilagoditev na podlagi posebnega poznavanja npr. fizi ­
kalno-kemijskih ali toksikoloških lastnosti preskusne snovi. Taka 
prilagoditev je sprejemljiva, kadar prepri čljivi znanstveni podatki 
kažejo, da bo prilagoditev omogo čila bolj informativen preskus. V 
takem primeru je treba znanstvene podatke natan čno dokumentirati v 
poročilu o študiji.
 
1.2 DEFINICIJE  
Razvojna toksikologija:  preučevanje škodljivih u činkov na razvoj 
organizma, ki so lahko posledica izpostavljenosti pred spo četjem, 
med razvojem pred rojstvom ali po rojstvu do spolne zrelosti. Glavne pojavne oblike strupenosti za razvoj vklju čujejo 1. smrt organizma, 
2. strukturno anomalijo, 3. spremenjeno rast in 4. funkcionalno 
pomanjkljivost. Razvojno toksikologijo so v preteklosti pogosto 
imenovali teratologija.  
Škodljivi u činek:  vsako odstopanje od normalnega, povezano s treti ­
ranjem, ki zmanjšuje sposobnost organizma za preživetje, razmnože ­
vanje ali prilagoditev okolju. V razvojni toksikologiji v njenem 
najširšem pomenu vklju čuje vsak u činek, ki moti normalen razvoj 
zarodka pred rojstvom in po njem.  
Spremenjena rast:  sprememba mase ali velikosti organa ali telesa 
potomca.  
Spremembe (nepravilnosti):  strukturne spremembe v razvoju, ki 
vključujejo deformnosti in odstopanja (28).  
Deformnost/ve čja anomalija:  strukturna sprememba, ki naj bi bila 
za žival škodljiva (lahko tudi smrtna) in je navadno redka.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 457
 
Odstopanje/manjša anomalija:  strukturna sprememba, ki naj bi 
imela malo ali ni č škodljivega u činka na žival; lahko je prehodna 
in lahko se razmeroma pogosto pojavlja v kontrolni populaciji.  
Zarodek:  vsota izpeljank oplojenega jaj čeca v kateri koli stopnji 
razvoja od oploditve do rojstva, vklju čno z embrionalnimi membra ­
nami ter embriom ali fetusom.  
Vgnezditev (nidacija):  pritrditev blastociste v epitelno materni čno 
sluznico, vklju čno s prediranjem skozi materni čni epitelij in vsadit ­
vijo v endometrij.  
Embrio:  zgodnja ali razvojna stopnja katerega koli organizma, zlasti 
razvojni produkt oplojenega jaj čeca od takrat, ko se pojavi vzdolžna 
os, do takrat, ko nastanejo vse glavne strukture.  
Embriotoksi čnost:  škodljivo za normalno strukturo, razvoj, rast 
in/ali sposobnost za preživetje embria.  
Fetus:  nerojeni potomec v postembrionalnem obdobju.  
Fetalna toksi čnost:  škodljivo za normalno strukturo, razvoj, rast 
in/ali preživetje fetusa.  
Splav:  predčasna izločitev produktov spo četja iz maternice: embria 
ali fetusa, nezmožnega preživetja.  
Resorpcija:  zarodek, ki naknadno po vgnezditvi v maternici odmre 
in se resorbira.  
Zgodnja resorpcija:  dokaz o vgnezditvi brez prepoznavnega 
embria/fetusa.  
Pozna resorpcija:  mrtvi embrio ali fetus z 
zunanjimi degenerativnimi spremembami.  
NOAEL:  kratica za vrednost brez opaznih škodljivih u činkov 
(No Observed Adverse Effect Level) in je najve čji odmerek ali 
stopnja izpostavljenosti, pri kateri ne opazimo nobenega škodljivega 
učinka, povezanega s tretiranjem.  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Jih ni.  
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Navadno se preskusna snov daje brejim živalim najmanj od vgnez ­
ditve do enega dne pred dnevom predvidene usmrtitve, ki naj bo čim 
bliže normalnemu dnevu kotitve brez tveganja izgube podatkov, ki izhajajo iz pred časne kotitve. Preskusna metoda ni namenjena samo 
preučevanju obdobja organogeneze (npr. od 5 do 15 dne pri glodalcu 
in od 6 do 18 dne pri kuncu), temve č tudi učinkov pred vgnezditvijo, 
kadar je primerno, v vsem obdobju brej osti do dneva pred carskim rezom. Malo pred carskim rezom se samice usmrtijo, preu či se 
maternična vsebina, fetusi pa se ocenijo glede na zunanje vidne 
nepravilnosti in spremembe mehkega tkiva in okostja.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 458
 
1.5 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.5.1  Izbira živalskih vrst  
Priporoča se, da se preskušanje izvaja na najustreznejših vrstah in da 
se uporabijo laboratorijske vrste in sevi, ki se navadno uporabljajo 
pri preskušanju strupenosti za predrojstveni razvoj. Priporo čena 
glodalska vrsta je podgana in priporo čena neglodalska vrsta je kunec. 
Če se uporabi druga vrsta, je treba to utemeljiti.  
1.5.2  Nastanitvene in prehranjevalne razmere  
Temperatura v prostoru s poskusnimi živalmi naj bo 22  o C (± 3  o ) za 
glodalce in 18  o C (± 3+) za kunce. Čeprav naj bi bila relativna 
vlažnost najmanj 30 % in je zaželeno, da ne presega 70 %, razen v času čiščenja prostora, je cilj 50–60 %. Osvetlitev naj bo umetna, 
zaporedje 12 ur svetlobe, 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporablja 
konvencionalna laboratorijska prehrana z neomejeno oskrbo s pitno vodo. 
Parjenje naj se izvaja v kletkah, ki so primerne za ta namen. Čeprav 
je priporo čljiva individualna namestitev živali, ki se parijo, je spre ­
jemljiva tudi skupinska namestitev v manjšem številu.
 
1.5.3  Priprava živali  
Uporabiti je treba zdrave živali, ki so se najmanj pet dni prilagajale 
na laboratorijske razmere in predhodno niso bile uporabljene za 
poskuse. Poznati je treba vrsto, sev, vir, spol, maso in/ali starost poskusnih živali. Živali v vseh preskusnih skupinah naj bodo čim 
enotnejše po masi in starosti. Za vsako velikost odmerka je treba 
uporabiti mlade odrasle samice, ki še niso kotile. Samice naj se 
parijo s samci iste vrste in seva, izogibati se je treba parjenju soro ­
jencev. Pri glodalcih je dan brejosti 0 tisti dan, ko se opazi vaginalni čep in/ali seme; pri kuncih je dan 0 navadno dan koitusa ali umetne 
osemenitve, če se uporabi ta tehnika. Sparjene samice se na nepri ­
stranski na čin dodelijo v kontrolno in tretirano skupino. Kletke je 
treba razporediti tako, da so možni u činki zaradi pozicije kletk čim 
manjši. Vsaki živali se dodeli enotna identifikacijska številka. Spar ­
jene samice se na nepristranski na čin dodelijo v kontrolno in treti ­
rano skupino in če se samice parijo v serijah, se živali iz vsake serije 
enakomerno porazdelijo v skupini. Podobno se samice, ki jih osemeni isti samec, enakomerno porazdelijo v obe skupini.
 
1.6 POSTOPEK  
1.6.1  Število in spol živali  
Vsaka preskusna in kontrolna skupina naj vklju čuje zadostno število 
samic, tako da bo za obdukcijo približno 20 ženskih živali z vgnez ­
ditvijo. Skupine z manj kakor 16 živali z vgnezditvijo so lahko 
neustrezne. Ni nujno, da smrtnost mater ogrozi študijo, pod pogojem, 
da ni večja od približno 10 %.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 459
 
1.6.2  Priprava odmerkov  
Če se za olajšanje odmerjanja uporablja nosilec ali drug aditiv, je 
treba upoštevati naslednje lastnosti: u činke na absorpcijo, distribu ­
cijo, presnovo in retencijo ali ekskrecijo preskusne snovi; u činke na 
kemijske lastnosti preskusne snovi, ki lahko spremenijo njene 
toksične lastnosti; ter u činke na porabo hrane ali vode ali na prehra ­
njenost živali. Nosilec ne sme biti toksi čen za razvoj in ne sme 
učinkovati na reprodukcijo.  
1.6.3  Odmerjanje  
Normalno se preskusna snov daje vsak dan od vgnezditve (npr. od 5. 
dne po parjenju) do dneva pred predvidenim carskim rezom. Če 
predhodne študije, ki so na voljo, ne navajajo visoke možnosti za 
izgubo pred vgnezditvijo, se lahko tretiranje podaljša, tako da vklju ­ 
čuje celotno obdobje brej osti, od parjenja do dneva pred predvideno 
usmrtitvijo. Dobro je znano, da se lahko neprimerno ravnanje ali 
stres med nose čnostjo kon čata s predrojstveno izgubo. Da bi zava ­
rovali predrojstveno izgubo pred dejavniki, ki niso povezani s treti ­
ranjem, se je treba izogibati nepotrebnemu pretovarjanju brejih živali, pa tudi stresu zaradi zunanjih dejavnikov, na primer hrupa. 
Uporabiti je treba najmanj tri velikosti odmerkov in hkratno 
kontrolo. Zdrave živali se na nepristranski na čin dodelijo v kontrolno 
in tretirano skupino. Velikost odmerkov se razporedi tako, da se 
toksični učinki stopnjujejo. Razen kadar to zaradi fizikalno-kemijske 
narave ali bioloških lastnosti preskusne snovi ni mogo če, je treba 
najvišjo vrednost odmerka izbrati tako, da povzro či nekaj toksi čnosti 
za razvoj in/ali pri materi (klini čni znaki ali zmanjšanje telesne 
mase), vendar ne smrt ali hudo trpljenje. Najmanj ena vmesna veli ­
kost odmerka mora povzro čiti minimalno opazne toksi čne učinke. 
Najmanjša velikost odmerka ne sme povzro čiti nobenega dokaza 
toksičnosti niti za razvoj niti pri materi. Padajo če zaporedje velikosti 
odmerkov je treba izbrati tako, da se pokažejo vse reakcije, ki so odvisne od odmerka, in vrednost brez opaznih škodljivih u činkov 
(NOAEL). Za padajo če zaporedje velikosti odmerkov so pogosto 
optimalni dvakratni do štirikratni intervali, pogosto pa je bolje dodati 
še dodatno četrto preskusno skupino, kakor uporabiti zelo velike 
intervale med odmerki (npr. ve č kakor faktor 10). Čeprav je cilj 
ugotoviti vrednost brez opaznih škodljivih u činkov pri materi, so 
lahko sprejemljive tudi študije, ki ne dokažejo take vrednosti (1). 
Vrednosti odmerkov je treba izbirati ob upoštevanju vseh obstoje čih 
podatkov o strupenosti, pa tudi dodatnih informacij o presnovi in 
toksikokinetiki preskusne snovi ali sorodnih materialov. Te informa ­
cije pomagajo tudi pri dokazovanju ustreznosti režima odmerjanja. 
Uporabiti je treba hkratno kontrolno skupino. Ta skupina je 
kontrolna skupina, tretirana z nepravim nadomestkom ali kontrolna skupina, tretirana le z nosilcem, če je ta uporabljen pri dajanju 
preskusne snovi. Vsem skupinam se daje enaka koli čina bodisi 
preskusne snovi ali nosilca. Živali v kontrolni (h) skupini(ah) se obravnavajo na enak na čin kakor živali v preskusni skupini. 
Kontrolne skupine, tretirane z nosilcem, morajo prejeti koli čino 
nosilca, enako najve čji uporabljeni koli čini (kakor v najnižji tretirani 
skupini).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 460
 
1.6.4  Mejni preskus  
Če preskus pri eni velikosti odmerka najmanj 1 000 mg/kg telesne 
mase/dan z oralnim dajanjem, pri katerem se uporabijo postopki, opisani za to študijo, ne povzro či opazne toksi čnosti pri nobeni 
breji živali ali njenih potomcih in če se glede na obstoje če podatke 
(npr. o strukturno in/ali presnovno sorodnih zmeseh) ne pri čakuje 
učinka, potem se šteje, da ni potrebna popolna študija z uporabo 
treh velikosti odmerkov. Pri čakovana človekova izpostavljenost 
lahko narekuje potrebo, da se v mejnem preskusu uporabi ve čji 
oralni odmerek. Pri drugih vrstah dajanja, na primer pri vdihavanju ali dermalni aplikaciji, lahko fizikalno-kemijske lastnosti preskusne 
snovi pogosto dolo čajo in omejujejo najve čjo dosegljivo raven izpo ­
stavljenosti (na primer dermalna aplikacija ne bi smela povzro čati 
hude lokalne toksi čnosti).
 
1.6.5  Dajanje odmerkov  
Preskusna snov ali nosilec se navadno daje oralno z intubacijo. Če se 
uporabi drug na čin dajanja odmerkov, mora izvajalec preskusa zago ­
toviti utemeljitev in razlog za svojo izbiro, lahko pa so potrebne 
ustrezne spremembe (2)(3)(4). Preskusno snov je treba dati vsak 
dan približno ob istem času. 
Odmerek za posamezno žival navadno temelji na zadnji posami čni 
določitvi telesne mase. Vendar je potrebna previdnost pri prilaga ­
janju odmerka v zadnjem trimestni brejosti. Pri izbiri odmerka je treba uporabiti obstoje če podatke, da bi prepre čili čezmerno toksi ­ 
čnost pri materi. Če se pri tretiranih materah opazi čezmerna toksi ­ 
čnost, je treba te živali humano usmrtiti. Če več živali kaže znake 
čezmerne toksi čnosti, je treba razmisliti o prekinitvi te skupine 
odmerka. Če se snov daje z gavažo, jo je treba dati živali po 
možnosti v enkratnem odmerku z uporabo želod čne sonde ali 
primerne intubacijske kanile. Maksimalna koli čina tekočine, ki jo 
je mogoče dati naenkrat, je odvisna od velikosti poskusne živali. 
Količina ne sme presegati 1 ml/100 g telesne mase, razen v primeru 
vodnih raztopin, kjer je dovoljeno uporabiti 2 ml/100 g telesne mase. 
Če se kot nosilec uporablja koruzno olje, koli čina ne sme presegati 
0,4 ml/100 g telesne mase. Variabilnost preskusne koli čine je treba s 
prilagajanjem koncentracije obdržati na kar najnižji ravni, da se 
zagotovi konstantna koli čina pri vseh odmerkih.
 
1.6.6  Opazovanje mater  
Klinična opazovanja je treba opraviti in dokumentirati najmanj 
enkrat na dan, najbolje vsak dan ob istem času, pri čemer se 
upošteva vrhunec pri čakovanih u činkov po odmerjanju. Stanje živali 
je treba dokumentirati, vklju čno s smrtnostjo, odmiranjem, pomemb ­
nimi vedenjskimi spremembami in vsemi znaki o čitne toksi čnosti.  
1.6.7  Telesna masa in poraba hrane  
Živali je treba stehtati na dan brejosti 0 ali najpozneje tretji dan 
brejosti, če je živali, ki so se parile, dostavil zunanji rejec, nato na 
prvi dan odmerjanja, najmanj vsake 3 dni v obdobju odmerjanja in 
na dan predvidene usmrtitve.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 461
 
Porabo hrane je treba zabeležiti vsake tri dni, na isti dan kot se 
določa telesna masa.  
1.6.8  Postmortalni pregled  
Samice je treba usmrtiti en dan pred pri čakovano kotitvijo. Samice, 
ki kažejo znake splava ali pred časne kotitve pred predvideno usmrtit ­
vijo, je treba usmrtiti in opraviti temeljit makroskopski pregled. 
Ob koncu študije ali ob smrti med študijo se makroskopsko pregle ­
dajo kakršne koli strukturne anomalije ali patološke spremembe pri materi. Ocenitev matere med carskim rezom in poznejše analize 
fetusa naj se izvajajo po možnosti brez poznavanja tretirane skupine, 
da je pristranskost čim manjša.
 
1.6.9  Pregled materni čne vsebine  
Takoj po koncu študije ali čim prej po smrti se maternice odstranijo 
in ugotovi status nose čnosti živali. Maternice, ki niso videti 
gravidne, se še dodatno pregledajo (npr. z barvanjem z amonijevim sulfidom pri glodalcih in barvanjem po Salewskem ali ustrezno alter ­
nativno metodo pri kuncih), da se potrdi nenose či status (5). 
Gravidne maternice z materni čnim vratom je treba stehtati. Masa 
gravidnih maternic se ne sme pridobiti od živali, za katere je ugoto ­
vljeno, da so med študijo poginile. 
Pri brejih živalih se dolo či število rumenih telesc. 
Maternično vsebino je treba pregledati glede na število embrionalnih 
ali fetalnih smrti in fetusov, ki so sposobni preživetja. Opisati je 
treba stopnjo resorpcije, da bi ocenili relativni čas smrti zarodka 
(glej oddelek 1.2).
 
1.6.10  Pregled fetusov  
Za vsak fetus je treba dolo čiti spol in telesno maso. 
Pri vsakem fetusu je treba pregledati zunanje spremembe (6). 
Pregledajo se spremembe skeleta in mehkega tkiva pri fetusih (npr. 
odstopanja in deformnosti ali nepravilnosti) (7) (8) (9) (10) (11) (12) 
(13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24). Katego ­
rizacija fetalnih sprememb je zaželena, vendar ne nujna. Kadar se 
opravi kategorizacija, je treba jasno navesti merila za dolo čitev vsake 
kategorije. Posebno pozornost je treba posvetiti reproduktivnemu traktu, ki ga je treba pregledati, če ima znake spremenjenega razvoja. 
Pri glodalcih je treba pripraviti približno polovico vsakega zaroda in 
pregledati skeletne spremembe. Druga polovica se pripravi in pregleda glede sprememb mehkega tkiva s sprejetimi ali ustreznimi 
metodami serijskega razreza ali s tehnikami natan čne osnovne razte ­
lesbe.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 462
 
Pri neglodalcih, npr. kuncih, se pri vseh fetusih pregledajo spre ­
membe mehkega tkiva in skeleta. Pri telesih teh fetusov se spre ­
membe mehkega tkiva ocenijo z natan čno raztelesbo, ki lahko vklju ­ 
čuje postopke za dodatno oceno notranje strukture srca (25). Glave 
polovice fetusov, ki so pregledani na ta na čin, se odstranijo in obde ­
lajo za oceno sprememb mehkega tkiva (tudi o či, možganov, nosnih 
prehodov in jezika) z uporabo standardnih metod serijskega razreza (26) ali enako ob čutljivih metod. Telesa teh fetusov in preostalih 
nedotaknjenih fetusov se obdelajo in pregledajo glede skeletnih spre ­
memb z enakimi metodami, kakor so opisane za glodalce.
 
2. PODATKI  
2.1 OBDELAVA REZULTATOV 
Podatki se sporo čajo posami čno za matere in njihove potomce in se 
povzamejo v obliki tabele, ki prikazuje za vsako preskusno skupino in vsako generacijo število živali na za četku preskusa, število živali, 
najdenih mrtvih ali usmr čenih iz humanih razlogov med preskusom, 
čas katere koli smrti ali humane usmrtitve, število brejih samic, 
število živali, ki kažejo znake toksi čnosti, opis znakov zaznane toksi ­ 
čnosti, vklju čno s časom začetka, trajanja in resnosti katerih koli 
toksičnih učinkov, vrsto embrionalnih/fetalnih opažanj o vseh 
ustreznih podatkih o zarodu. 
Numerični rezultati se ocenijo z ustrezno statisti čno metodo z 
uporabo zaroda kot enote za podatkovno analizo. Uporabi se splošno 
sprejeta statisti čna metoda, statisti čne metode je treba dolo čiti pri 
načrtovanju študije in jih utemeljiti. Sporo čajo se tudi podatki o 
živalih, ki ne preživijo do predvidene usmrtitve. Ti podatki se lahko po potrebi vklju čijo v skupinske podatke. Ustreznost podatkov, 
dobljenih o teh živalih in vklju čitev ali izklju čitev iz katerih koli 
skupinskih podatkov, je treba utemeljiti ali presoditi na individualni podlagi.
 
2.2 VREDNOTENJE REZULTATOV 
Ugotovitve študije strupenosti za predrojstveni razvoj je treba ovred ­
notiti glede na opažene u činke. Vrednotenje vsebuje naslednje infor ­
macije: 
— rezultate preskusa pri materi in embriu/fetusu, vklju čno z ovred ­
notenjem razmerja ali njegove odsotnosti med izpostavljenostjo živali preskusni snovi in pojavom ter resnostjo vseh ugotovitev, 
— merila, uporabljena za kategorizacijo zunanjih sprememb fetusa 
ter sprememb mehkega tkiva in skeleta, če je bila kategorizacija 
opravljena,
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 463
 
— kadar je primerno, pretekle kontrolne podatke za izboljšanje 
razlage rezultatov študije, 
— številke, uporabljene pri izra čunu vseh odstotkov ali kazalnikov, 
— ustrezne statisti čne analize ugotovitev študije, če je to primerno, 
ki naj vklju čujejo dovolj informacij o metodi analize, tako da 
lahko neodvisni ocenjevalec/statistik ponovno ovrednoti in obnovi analizo, 
Pri kateri koli študiji, ki dokaže odsotnost katerega koli toksi čnega 
učinka, je treba razmisliti o nadaljnjih raziskavah za dolo čitev 
absorpcije in biološke razpoložljivosti preskusne snovi.
 
2.3 RAZLAGA REZULTATOV 
Študija strupenosti za predrojstveni razvoj zagotovi informacije o 
učinkih ponovne izpostavljenosti tej snovi med brej ostjo na matere 
in razvoj njihovih potomcev v maternici. Rezultate študije je treba 
razlagati skupaj z ugotovitvami subkroni čnih, reprodukcijskih, toksi ­
kokinetičnih in drugih študij. Ker je poudarek tako na splošni toksi ­ 
čnosti v smislu toksi čnosti pri materi kot na ciljnih u činkih strupe ­
nosti za razvoj, rezultati študije do dolo čene mere omogo čajo razli­
kovanje med razvojnimi u činki, ki se pojavijo v odsotnosti splošne 
toksičnosti in u činki, ki so doseženi samo na stopnjah, ki so strupene 
tudi za mater (27).  
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje posebne informacije: 
Preskusna snov: 
— fizikalno stanje in, kjer je to ustrezno, fizikalno-kemijske lastno ­
sti, 
— identifikacijo, vklju čno s številko po CAS, če je znana/dolo čena, 
— čistost. 
Nosilec (po potrebi): 
— utemeljitev izbire nosilca, če to ni voda. 
Preskusne živali: — uporabljeno vrsto in sev, 
— število in starost živali, 
— izvor, nastanitvene razmere, hrano ipd., 
— maso posameznih živali na za četku preskusa. 
Preskusni pogoji: — utemeljitev izbire velikosti odmerka, 
— podatke o sestavi preskusne snovi/pripravi hrane, doseženi 
koncentraciji, stabilnosti in homogenosti pripravka,
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 464
 
— podatke o dajanju preskusne snovi, 
— preračunavanje koncentracije preskusne snovi v hrani/pitni vodi 
(ppm) v dejanski odmerek (mg/kg telesne mase/dan), če je 
primerno, 
— okoljske razmere, 
— podatke o kakovosti hrane in vode. 
Rezultati: 
Podatki o toksi čnem učinkovanju pri materi po odmerku, ki vklju ­ 
čujejo, vendar niso omejeni na: 
— število živali na za četku preskusa, število preživelih živalih, 
število brejih in število živali, ki splavijo ali kotijo pred časno, 
— dan smrti med študijo ali če živali preživijo do konca, 
— podatki o živalih, ki ne preživijo do predvidene usmrtitve, se 
sporočijo, vendar se ne vklju čijo v medskupinske statisti čne 
primerjave, 
— dan opazovanj a vsakega nenormalnega klini čnega znaka in 
poznejšega poteka, 
— telesno maso, spremembo telesne mase in maso gravidne mater ­
nice, vklju čno, po izbiri, s spremembo telesne mase popravljeno 
za maso gravidne maternice, 
— porabo hrane in porabo vode, če je izmerjena, 
— ugotovitve obdukcije, vklju čno z maso maternice, 
— treba je poro čati o vrednostih brez opaznih škodljivih u činkov pri 
materi in o razvojnih u činkih. 
Ciljni učinki za razvoj po odmerku na zarod z vsadki, ki vklju čujejo: 
— število rumenih telesc, 
— število vgnezditev, število in odstotek živih in mrtvih fetusov in 
resorpcij, 
— število in odstotek izgub pred vgnezditvijo in po njej. 
Ciljni učinki za razvoj po odmerku na zarod z živimi fetusi, ki 
vključujejo: 
— število in odstotek živih potomcev, 
— razmerje spolov, 
— fetalna telesna masa, če je mogo če po spolu in skupno, 
— zunanje deformnosti in deformnosti mehkega tkiva in skeleta ter 
druge ustrezne spremembe, 
— merila za kategorizacijo, če je primerno,  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 465
 
— skupno število in odstotek fetusov in zaroda z zunanjo spre ­
membo, spremembo mehkega tkiva ali skeleta, pa tudi vrste in 
pojavnost posameznih nepravilnosti in druge ustrezne spre ­
membe. 
Razprava o rezultatih. Zaključki.
 
4. LITERATURA  
(1) Kavlock R.J. et al. (1996) A Simulation Study of the Influence 
of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for 
Developmental Toxicity.  Risk Analysis  16; 399–410. 
(2) Kimmel, C.A. and Francis, E.Z. (1990) Proceedings of the 
Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal Developmental Toxicity Studies.  Fundamental and Applied 
Toxicology  14; 386-398. 
(3) Wong, B.A., et al. (1997) Developing Specialized Inhalation 
Exposure Systems to Address Toxicological Problems.  CIIT 
Activities  17; 1–8. 
(4) US Environmental Protection Agency (1985) Subpart E- 
Specific Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350: Inhalation Developmental Toxicity Study. 
(5) Salewski, E. (1964) Faerbermethode zum Makroskopischen 
Nachweis von Implantations Stellen am Uterusder Ratte.  
Naunyn-Schmeidebergs Archiv für Pharmakologie undExperi ­
mentelle  Pathologie 247:367. 
(6) Edwards, J. A. (1968) The external Development of the Rabbit 
and Rat Embryo. In  Advances in Teratology.  D.H.M. Woolam 
(ed.) Vol. 3. Academic Press, NY. 
(7) Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage and Bone 
in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S.  
Congenital Anomalies  16, 171–173. 
(8) Igarashi, E. et al. (1992) Frequency Of Spontaneous Axial 
Skeletal Variations Detected by the Double Staining Techni ­
quefor Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses.  
Congenital Anomalies  32, 381-391. 
(9) Kimmel, C.A. et al. (1993) Skeletal Development Following 
Heat Exposure in the Rat.  Teratology  47, 229-242. 
(10) Marr, M.C. et al. (1988) Comparison of Single and Double 
Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects 
of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats.  Teratology  37, 476. 
(11) Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969) A Rapid Method for 
Detecting Malformations in Rat Foetuses.  Journal of Morpho ­
logy 127:291-306. 
(12) Fritz, H. (1974) Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative 
of Foetal Maturity.  Teratology  11, 313–320. 
(13) Gibson, J.P. et al. (1966) Use of the Rabbit in Teratogenicity 
Studies.  Toxicology and Applied Pharmacology  9, 398–408. 
(14) Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973) Skeletal Deviation in 
Rats: Malformations or Variations?  Teratology  8, 309–316. 
(15) Marr, M.C. et al. (1992) Developmental Stages of the CD 
(Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Maternal Exposure to 
Ethylene Glycol.  Teratology  46, 169–181.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 466
 
(16) Monie, I.W. et al. (1965) Dissection Procedures for Rat 
Foetuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and 
Histological Study of Viscera.  Supplement to Teratology 
Workshop Manual,  pp. 163–173. 
(17) Spark, C. and Dawson, A.B. (1928) The Order and Time of 
appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind 
Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the 
Possible Influence of the Sex Factor.  American Journal of 
Anatomy  41, 411–445. 
(18) Staples, R.E. and Schnell, V.L. (1964) Refinements in Rapid 
Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for 
Fetal Bone.  Stain Technology  39, 61–63. 
(19) Strong, R.M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification 
of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) Skeleton.  American Journal of Anatomy  36, 313–355. 
(20) Stuckhardt, J.L. and Poppe, S.M. (1984) Fresh Visceral Exami ­
nation of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogenicity 
Testing.  Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis  4, 
181–188. 
(21) Walker, D.G. and Wirtschafter, Z.T. (1957)  The Genesis of the 
Rat Skeleton.  Thomas, Springfield, IL. 
(22) Wilson, J.G. (1965) Embryological Considerations in Terato ­
logy. In  Teratology: Principles and Techniques,  Wilson J.G. 
and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, pp 251–277. 
(23) Wilson, J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977)  Handbook of 
Teratology,  Vol. 4. Plenum, NY. 
(24) Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Tech ­
niques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity.  Acta Vet. 
Acad. Sci. Hung.  28, 233–239. 
(25) Staples, R.E. (1974) Detection of visceral Alterations in 
Mammalian Foetuses.  Teratology  9, 37–38. 
(26) Van Julsingha, E.B. and C.G. Bennett (1977) A Dissecting 
Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In:  Methods in Prenatal Toxicology  Neubert, D., 
Merker, H.J. and Kwasigroch, T.E. (eds.). University of 
Chicago, Chicago, IL, pp. 126–144. 
(27) US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for 
Developmental Toxicity Risk Assessment.  Federal Register  
56, 63798–63826. 
(28) Wise, D.L. et al. (1997) Terminology of Developmental 
Abnormalities in Common Laboratory Mammals (Version 1) 
Teratology 55, 249–292.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 467
 
B.32  ŠTUDIJE RAKOTVORNOSTI  
UVOD 
1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 451 
(2009). Prvotna TG 451 v zvezi s študijami rakotvornosti je bila sprejeta leta 1981. Priprava te revidirane preskusne metode B.32 je bila ocenjena kot 
nujna zaradi upoštevanja nedavnega razvoja na podro čju dobrobiti živali in 
zakonodajnih zahtev (2) (3) (4) (5) (6). Ta preskusna metoda B.32 je bila posodobljena vzporedno z revizijama poglavja B.30 te priloge z naslovom „Študije kroni čne strupenosti“ in poglavja B.33 te priloge z naslovom 
„Kombinirane študije kroni čne strupenosti/rakotvornosti“, da bi se z uporabo 
živali v študiji pridobile dodatne informacije in da bi se zagotovilo ve č 
podatkov o izbiri odmerkov. Ta preskusna metoda B.32 je zasnovana za preskušanje zelo razli čnih kemikalij, vklju čno s pesticidi in industrijskimi 
kemikalijami. Vendar je treba opozoriti, da so lahko nekatere podrobnosti in 
zahteve za farmacevtske izdelke druga čne (glej Smernico Mednarodne 
konference o usklajevanju (ICH) S1B o preskušanju rakotvornosti farma ­
cevtskih izdelkov). 
2. Večina študij rakotvornosti se opravi na glodavcih, zato je ta preskusna 
metoda namenjena zlasti uporabi v študijah, opravljenih na teh živalskih vrstah. Če bi bilo take študije treba izvesti na vrstah, ki niso glodavci, se 
lahko z ustreznimi prilagoditvami prav tako uporabijo na čela in postopki, 
opisani v tej preskusni metodi, ter na čela in postopki iz poglavja B.27 te 
priloge z naslovom „90-dnevna študija oralne toksi čnosti s ponavljajo čimi se 
odmerki na neglodavcih“ (6). Ve č napotkov je na voljo v Dokumentu s 
smernicami OECD št. 116 o zasnovi in izvajanju študij kroni čne strupenosti 
in rakotvornosti (7). 
3. Glavni trije na čini dajanja, ki se uporabljajo v študijah rakotvornosti, so 
oralni, dermalni in inhalacijski. Izbira na čina dajanja je odvisna od fizikalnih 
in kemijskih lastnosti preskusne kemikalije ter prevladujo čega načina izpo­
stavljenosti ljudi. Dodatne informacije o izbiri na čina izpostavljenosti so na 
voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). 
4. Ta preskusna metoda je osredoto čena na oralno izpostavljenost, ki se v 
študijah rakotvornosti uporablja najpogosteje. Študije rakotvornosti, ki vklju ­ 
čujejo dermalno ali inhalacijsko izpostavljenost, so lahko prav tako potrebne 
za oceno tveganja za zdravje ljudi in/ali na podlagi nekaterih zakonodajnih ureditev, vendar pa sta oba navedena na čina izpostavljenosti tehni čno precej 
zapletena. Take študije je treba zasnovati za vsak primer posebej, je pa 
mogoče preskusno metodo za ocenjevanje in vrednotenje rakotvornosti z 
oralnim na činom dajanja, opisano v tem dokumentu, uporabiti kot osnovo 
za protokol za inhalacijske in/ali dermalne študije, kar zadeva priporo čila 
glede obdobij tretiranja, klini čnih in patoloških parametrov itd. Za dermalni 
(7) in inhalacijski na čin dajanja (7) (8) preskusnih kemikalij so na voljo 
napotki OECD. Pri zasnovi dolgoro čnejših študij z inhalacijsko izpostavlje ­
nostjo je treba podrobno preu čiti poglavji B.8 (9) in B.29 te priloge (10) ter 
Dokument s smernicami OECD o preskušanju akutne strupenosti pri vdiha ­
vanju (8). V primeru preskušanja z dermalnim na činom dajanja je treba 
upoštevati poglavje B.9 te priloge (11).  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 468
 
5. S študijo rakotvornosti se pridobivajo informacije o možnih nevarnostih za 
zdravje, ki se lahko pojavijo ob ponavljajo či se izpostavljenosti v obdobju, 
ki obsega najve č celotno življenjsko dobo uporabljene vrste. Z njo se prido ­
bijo informacije o strupenih u činkih preskusne kemikalije, vklju čno s poten ­
cialno rakotvornostjo, lahko pa se nakažejo tudi ciljni organi in možnost 
kopičenja. S študijo se lahko oceni vrednost brez opaženega škodljivega 
učinka za strupene u činke in – v primeru rakotvornih snovi, ki niso geno ­
toksične – za tumorske odzive, ki se lahko uporabi za dolo čitev varnostnih 
meril za izpostavljenost ljudi. Poudarjena je tudi potreba po skrbnem klini ­ 
čnem opazovanju živali, da se pridobi kar najve č informacij. 
6. Cilji študij rakotvornosti, na katere se nanaša ta preskusna metoda, vklju ­ 
čujejo: 
— opredelitev rakotvornih lastnosti preskusne kemikalije, ki v primerjavi s 
sočasnimi kontrolnimi skupinami privedejo do pove čane pojavnosti 
novotvorb, pove čanega deleža malignih novotvorb ali skrajšanja časa 
do pojava novotvorb, 
— opredelitev ciljnih organov rakotvornosti, 
— opredelitev časa do pojava novotvorb, 
— opredelitev razmerja med odmerkom in odzivom za tumorje, 
— opredelitev vrednosti brez opaženega škodljivega u činka (NOAEL) ali 
izhodiščne točke za dolo čitev primerjalnega odmerka ( benchmark dose  – 
BMD), 
— ekstrapolacijo rakotvornih u činkov na stopnje izpostavljenosti ljudi pri 
majhnih odmerkih, 
— zagotovitev podatkov za preskušanje hipotez glede na čina delovanja (2) 
(7) (12) (13) (14) (15).  
ZAČETNI PREUDARKI 
7. Pri ocenjevanju in vrednotenju potencialne rakotvornosti preskusne kemika ­
lije mora preskuševalni laboratorij pred izvedbo študije preu čiti vse razpolo ­ 
žljive informacije o preskusni kemikaliji, da se zasnova študije osredoto či na 
učinkovitejše preskušanje rakotvornega potenciala in da se kar najbolj 
zmanjša uporaba živali. Informacije o na činu delovanja domnevne rakot ­
vorne snovi in upoštevanje njenega na čina delovanja (2) (7) (12) (13) 
(14) (15) so posebej pomembni, saj se lahko optimalna zasnova študije razlikuje glede na to, ali je preskusna kemikalija znana ali domnevna geno ­
toksična rakotvorna snov. Ve č napotkov o preudarkih v zvezi z na činom 
delovanja je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). 
8. Informacije, ki pomagajo pri zasnovi študije, vklju čujejo identiteto, kemijsko 
strukturo in fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije; rezultate 
morebitnih preskusov strupenosti  in vitro  ali in vivo , vključno s preskusi 
genotoksi čnosti; pri čakovane uporabe in potencial za izpostavljenost ljudi; 
razpoložljive podatke (Q)SAR, podatke o mutagenosti/genotoksi čnosti in 
rakotvornosti ter druge toksikološke podatke o strukturno sorodnih snoveh; 
razpoložljive toksikokineti čne podatke (podatke o kinetiki pri enkratnem 
odmerku in tudi pri ponavljajo čih se odmerkih, če so na voljo) ter
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 469
 
podatke, pridobljene z drugimi študijami s ponavljajo čo se izpostavljenostjo. 
Rakotvornost je treba ocenjevati šele po pridobitvi za četnih informacij o 
strupenosti na podlagi 28-dnevnega in/ali 90-dnevnega preskusa strupenosti s ponavljajo čimi se odmerki. Koristne informacije se lahko zagotovijo tudi s 
kratkoročnimi preskusi iniciacije/spodbujanja razvoja raka. V okviru splošne 
ocene potencialnih škodljivih u činkov dolo čene preskusne kemikalije na 
zdravje je treba razmisliti o postopnem pristopu k preskušanju rakotvornosti (16) (17) (18) (19). 
9. Pred za četkom študije je treba dolo čiti najprimernejše statisti čne metode za 
analizo rezultatov ob upoštevanju zasnove in ciljev preskusa. Med vidiki, o katerih je treba razmisliti, je tudi vprašanje, ali bi morala statistika vklju če­
vati prilagoditev glede na preživetje, analizo kumulativnih tveganj tumorjev 
glede na trajanje preživetja, analizo časa do pojava tumorjev in analizo v 
primeru pred časnega prenehanja tretiranja ene ali ve č skupin. Napotki o 
primernih statisti čnih analizah in klju čne reference mednarodno priznanih 
statističnih metod so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7) ter 
v Dokumentu s smernicami št. 35 o analizi in ocenjevanju študij kroni čne 
strupenosti in rakotvornosti (20). 
10. Pri izvajanju študije rakotvornosti je treba vedno upoštevati vodilna na čela 
in preudarke, opisane v Dokumentu s smernicami OECD št. 19 o prepo ­
znavanju, ocenjevanju in uporabi klini čnih znakov kot humanih kon čnih 
točk za preskusne živali v oceni varnosti (21), zlasti odstavek 62 navede ­
nega dokumenta. V tem odstavku je navedeno: „ Pri študijah, ki vklju čujejo 
ponavljajo če se odmerke, je treba sprejeti premišljeno odlo čitev, ali naj se 
žival humano usmrti ali ne, če kaže klini čne znake, ki se stopnjujejo in 
vodijo v dodatno poslabšanje njenega stanja. Ta odlo čitev mora vklju čevati 
razmislek o vrednosti informacij, ki bodo pridobljene z ohranitvijo zadevne 
živali v študiji glede na njeno splošno stanje. Če se sprejme odlo čitev, da se 
žival ohrani v preskusu, je treba po potrebi pove čati pogostnost opazovanj. 
Obstaja tudi možnost, da se brez ogrožanja namena preskusa za časno 
prekine dajanje odmerkov, če bi to ublažilo bole čine ali trpljenje, ali da 
se zmanjša preskusni odmerek. “ 
11. Podrobni napotki in razprava o na čelih izbire odmerkov za študije kroni čne 
strupenosti in rakotvornosti so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7) ter v dveh publikacijah, ki ju je pripravil International Life Sciences Institute (22) (23). Osrednja strategija izbire odmerkov je odvisna od glav ­
nega cilja ali ciljev študije (odstavek 6). Pri izbiri ustreznih velikosti 
odmerkov je treba najti ravnotežje med spremljanjem nevarnosti na eni ter opredeljevanjem u činkov majhnih odmerkov in njihovim pomenom na drugi 
strani. To je zlasti pomembno, kadar bo izvedena kombinirana študija 
kronične strupenosti in rakotvornosti (poglavje B.33 te priloge) (odstavek 12). 
12. Razmisliti je treba o možnosti, da se namesto lo čene izvedbe študije 
kronične strupenosti (poglavje B.30 te priloge) in študije rakotvornosti (ta 
preskusna metoda B.32) izvede kombinirana študija kroni čne strupenosti in 
rakotvornosti (poglavje B.33 te priloge). S kombiniranim preskusom se v primerjavi z izvedbo dveh lo čenih študij zagotovi ve čja učinkovitost v 
smislu časa in stroškov, ne da bi bila pri tem ogrožena kakovost podatkov 
v fazi v zvezi s kroni čno strupenostjo ali fazi v zvezi z rakotvornostjo. 
Vendar je treba pri izvajanju kombinirane študije kroni čne strupenosti in 
rakotvornosti (poglavje B.33 te priloge) skrbno upoštevati na čela izbire 
odmerkov (odstavki 11 in 22–25), poleg tega pa se tudi priznava, da se 
na podlagi nekaterih zakonodajnih okvirov lahko zahteva lo čena izvedba 
študij.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 470
 
13. Pojmi, ki se uporabljajo v okviru te preskusne metode, so opredeljeni na 
koncu tega poglavja in v Dokumentu s smernicami št. 116 (7).  
NAČELO PRESKUSA 
14. Preskusna kemikalija se dnevno v stopnjevanih odmerkih daje ve č skupinam 
preskusnih živali, pri čemer preskus traja ve čino njihove življenjske dobe, 
način dajanja pa je navadno oralni. Primerno je lahko tudi preskušanje z 
inhalacijskim ali dermalnim na činom dajanja. Živali je treba pozorno opazo ­
vati, da se odkrijejo znaki strupenosti in nastanek neoplasti čnih lezij. Na 
živalih, ki med preskusom poginejo ali so usmr čene, se opravi obdukcija, ob 
koncu preskusa pa se tudi preživele živali usmrtijo in se na njih opravi 
obdukcija.  
OPIS METODE  
Izbira živalske vrste  
15. Ta preskusna metoda je namenjena predvsem ocenjevanju in vrednotenju 
rakotvornosti pri glodavcih (odstavek 2). O uporabi vrst, ki niso glodavci, se lahko razmisli, kadar razpoložljivi podatki kažejo, da so ustreznejše za 
napovedovanje u činkov na zdravje ljudi. Izbiro živalske vrste je treba 
utemeljiti. Priporo čena vrsta glodavca je podgana, uporabijo pa se lahko 
tudi druge vrste glodavcev, npr. miš. Čeprav je uporabnost miši pri presku ­ 
šanju rakotvornosti lahko omejena (24) (25) (26), se lahko z nekaterimi 
veljavnimi zakonodajnimi ureditvami še vedno zahteva preskušanje rakot ­
vornosti na miših, razen če se ugotovi, da taka študija z znanstvenega vidika 
ni nujna. Podgane in miši so najprimernejši preskusni modeli zaradi njihove razmeroma kratke življenjske dobe, razširjene uporabe v farmakoloških in 
toksikoloških študijah, ob čutljivosti za indukcijo tumorjev ter razpoložlji ­
vosti dovolj opredeljenih sevov. Zaradi teh lastnosti je na voljo veliko informacij o njihovi fiziologiji in patologiji. Dodatne informacije o izbiri živalske vrste in seva so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). 
16. Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle živali obi čajno uporabljanih labo ­
ratorijskih sevov. Po možnosti je treba v študiji rakotvornosti uporabiti isti 
sev in izvor živali kot v predhodnih krajših študijah strupenosti, čeprav je 
treba – če je znano, da se pri živalih zadevnega seva in izvora pojavljajo 
težave pri doseganju obi čajno sprejetih meril preživetja za dolgoro čne 
študije (glej Dokument s smernicami št. 116 (7)) – razmisliti o uporabi 
seva živali, katerega stopnja preživetja je sprejemljiva za dolgoro čno študijo. 
Samice še niso smele kotiti in ne smejo biti breje.
 
Nastanitev in hranjenje  
17. Živali se lahko nastanijo posami čno ali dajo v kletke v manjših skupinah 
istega spola; posami čna nastanitev se lahko predvidi samo, če je znanstveno 
utemeljena (27) (28) (29). Kletke je treba razporediti tako, da so morebitni učinki zaradi njihovega položaja čim manjši. Temperatura prostora s 
preskusnimi živalmi mora znašati 22 °C (± 3 °C). Čeprav mora biti relativna 
vlažnost vsaj 30 % in po možnosti ne sme presegati 70 %, razen med 
čiščenjem prostora, mora biti cilj 50- do 60-odstotna vlažnost. Osvetlitev 
mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za 
hranjenje se lahko uporablja obi čajna laboratorijska hrana z neomejeno 
količino pitne vode. Hrana mora zadovoljevati vse prehranske potrebe 
preskušane živalske vrste, vsebnost kontaminantov, med drugim ostankov
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 471
 
pesticidov, obstojnih organskih onesnaževal, fitoestrogenov, težkih kovin in 
mikotoksinov, ki lahko vplivajo na rezultat preskusa, pa mora biti čim 
manjša. Redno je treba pripravljati analitske informacije o ravneh kontami ­
nantov v hranilih in hrani, vsaj na za četku študije in kadar se zamenja serija 
uporabljane kemikalije, ter jih vklju čiti v končno poročilo. Prav tako je treba 
zagotoviti analitske informacije o pitni vodi, uporabljeni v študiji. Kadar se 
preskusna kemikalija daje s hrano, lahko na izbiro hrane vpliva potreba po zagotovitvi ustrezne primesi preskusne kemikalije in zadovoljevanju prehranskih potreb živali.
 
Priprava živali  
18. Uporabiti je treba zdrave živali, ki so se najmanj 7 dni prilagajale labora ­
torijskim razmeram in še niso bile vklju čene v preskusne postopke. V 
primeru glodavcev je treba odmerke za četi dajati čim prej po odstavitvi 
od sesanja in prilagajanju na okolje, po možnosti preden so živali stare 8 
tednov. Opredeliti je treba vrsto, sev, izvor, spol, težo in starost preskusnih živali. Ob za četku študije morajo biti razlike v teži uporabljenih živali za 
vsak spol čim manjše, njihova teža pa ne sme odstopati za ve č kot ± 20 % 
od povpre čne teže vseh živali v študiji glede na spol. Živali se naklju čno 
dodelijo kontrolnim in tretiranim skupinam. Po randomizaciji med skupi ­
nami v okviru vsakega spola ne sme biti ve čjih razlik v povpre čni telesni 
teži. Če obstajajo statisti čno pomembne razlike, je treba fazo randomizacije 
ponoviti, če je to mogo če. Vsaki živali je treba dodeliti edinstveno identi ­
fikacijsko številko in jo trajno ozna čiti s to številko s tetovažo, vsaditvijo 
mikročipa ali drugo ustrezno metodo.
 
POSTOPEK  
Število in spol živali  
19. Uporabiti je treba oba spola. Živali mora biti dovolj za temeljito biološko in 
statistično ocenjevanje. Zato mora vsaka odmerna skupina in so časna 
kontrolna skupina vsebovati najmanj 50 živali vsakega spola. Glede na namen študije je mogo če povečati statisti čno moč ključnih ocen z neenakim 
dodeljevanjem živali razli čnim odmernim skupinam, tako da je v skupinah, 
tretiranih z majhnimi odmerki, ve č kot 50 živali, npr. za ocenjevanje rakot ­
vornega potenciala pri majhnih odmerkih. Vendar se je treba zavedati, da je ob zmernem pove čanju velikosti skupine pove čanje statisti čne moči študije 
razmeroma majhno. Ve č informacij o statisti čni zasnovi študije in izbiri 
velikosti odmerkov za čim obsežnejše pove čanje statisti čne moči je na 
voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7).
 
Uporaba vmesnih usmrtitev in satelitskih (opozorilnih) skupin  
20. Če je to znanstveno utemeljeno, se lahko v študiji predvidijo vmesne usmrti ­
tve, npr. pri 12 mesecih, da se zagotovijo informacije o napredovanju neoplastičnih sprememb in mehanisti čne informacije. Kadar so take infor ­
macije že na voljo iz prejšnjih študij strupenosti s ponavljajo čimi se odmerki 
v zvezi z zadevno preskusno kemikalijo, vmesne usmrtitve morda niso znanstveno utemeljene. Če se v zasnovo študije vklju čijo vmesne usmrtitve, 
število živali v vsaki odmerni skupini, za katere se na črtuje vmesna usmrti ­
tev, navadno znaša 10 živali na spol, skupno število živali v zasnovi študije 
pa je treba pove čati za toliko, kolikor se jih namerava usmrtiti pred 
zaključkom študije. Poleg tega se lahko po potrebi predvidi dodatna skupina 
opozorilnih živali (obi čajno 5 živali vsakega spola) za spremljanje patolo ­ 
škega stanja med študijo (30). Ve č napotkov je na voljo v Dokumentu s 
smernicami št. 116 (7).
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 472
 
Odmerne skupine in odmerjanje  
21. Napotki glede vseh vidikov izbire odmerkov in razporeditve njihovih veli ­
kosti so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). Uporabiti je treba najmanj tri velikosti odmerkov in so časno kontrolo. Velikosti odmerkov 
navadno temeljijo na rezultatih kratkoro čnejših študij s ponavljajo čimi se 
odmerki ali študij za ugotavljanje obmo čja, pri njihovem dolo čanju pa je 
treba upoštevati vse obstoje če toksikološke in toksikokineti čne podatke, ki 
so na voljo za preskusno kemikalijo ali sorodne snovi. 
22. Razen kadar zaradi fizikalno-kemijskih lastnosti ali bioloških u činkov 
preskusne kemikalije to ni mogo če, je treba najve čjo velikost odmerka 
izbrati za opredelitev glavnih ciljnih organov in strupenih u činkov, pri 
čemer se je treba izogibati povzro čanju trpljenja, hude zastrupitve, obolev ­
nosti ali smrti. Ob upoštevanju dejavnikov, navedenih v odstavku 23 spodaj, je treba najve čji odmerek praviloma izbrati tako, da se izzovejo znaki stru ­
penosti, na primer upo časnitev pridobivanja telesne teže (približno 10- 
odstotna). Vendar se lahko glede na cilje študije (glej odstavek 6) izbere tudi najve čji odmerek, manjši od odmerka, ki povzro ča znake strupenosti, 
npr. če odmerek izzove škodljiv u činek, ki vzbuja zaskrbljenost, ne vpliva 
pa bistveno na življenjsko dobo ali telesno težo. 
23. Velikosti odmerkov in razporeditev med njimi se lahko izberejo za dolo ­ 
čanje odziva v odvisnosti od odmerka in – glede na na čin delovanja 
preskusne kemikalije – vrednosti NOAEL ali drugega želenega rezultata 
študije, npr. BMD (glej odstavek 25) pri najmanjšem odmerku. Dejavniki, ki jih je treba upoštevati pri dolo čitvi manjših odmerkov, vklju čujejo priča­
kovani naklon krivulje odmerek-odziv, odmerke, pri katerih se lahko poja ­
vijo pomembne spremembe v presnovi ali na činu strupenega delovanja, 
velikost, pri kateri se pri čakuje prag, ali velikost, pri kateri se pri čakuje 
izhodiščna točka za ekstrapolacijo majhnih odmerkov. 
24. Izbrana razporeditev velikosti odmerkov je odvisna od lastnosti preskusne 
kemikalije in je v tej preskusni metodi ni mogo če predpisati, vendar dva- do 
štirikratni intervali velikokrat zagotovijo visoko u činkovitost preskusa pri 
določanju padajo čih velikosti odmerkov, namesto uporabe zelo velikih inter
­
valov (npr. ve čjih od faktorja približno 6–10) med odmerki pa je pogosto 
primerneje dodati četrto preskusno skupino. Na splošno se je treba izogibati 
uporabi faktorjev, ve čjih od 10, če se uporabijo, pa je to treba utemeljiti. 
25. Kot je nadalje opisano v Dokumentu s smernicami št. 116 (7), je treba pri 
izbiri odmerkov upoštevati: 
— znane ali domnevne nelinearnosti ali to čke pregiba na krivulji 
odmerek-odziv, 
— toksikokinetiko in odmerna obmo čja, v katerih se pojavljajo ali ne poja ­
vljajo presnovna indukcija, nasi čenje ali nelinearnost med zunanjimi in 
notranjimi odmerki, 
— prekurzorske lezije, ozna čevalce učinka ali kazalnike delovanja klju čnih 
temeljnih bioloških procesov, 
— ključne (ali domnevne) vidike na čina delovanja, kot so odmerki, pri 
katerih se za čne pojavljati citotoksi čnost, so ravni hormonov motene, 
homeostati čni mehanizmi preobremenjeni itd.,  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 473
 
— predele krivulje odmerek-odziv, v katerih je potrebna posebno zanesljiva 
ocena, npr. v obmo čju pričakovanega BMD ali predvidenega praga, 
— preudarke v zvezi s pri čakovanimi stopnjami izpostavljenosti ljudi. 
26. Kontrolna skupina je netretirana skupina ali kontrolna skupina z nosilcem, 
če se pri dajanju preskusne kemikalije uporablja nosilec. Z živalmi v 
kontrolni skupini je treba ravnati enako kot z živalmi v preskusnih skupinah, le da se ne tretirajo s preskusno kemikalijo. Če se uporablja nosilec, mora 
kontrolna skupina prejeti najve čjo količino nosilca, ki je bila uporabljena 
med odmernimi skupinami. Če se preskusna snov daje s hrano in se s tem 
zaradi njene manjše okusnosti povzro či bistveno zmanjšanje vnosa hrane, je 
lahko koristna dodatna, po parih hranjena kontrolna skupina, ki se uporablja 
kot primernejša kontrola.
 
Priprava odmerkov in dajanje preskusne kemikalije  
27. Preskusna kemikalija se obi čajno daje oralno, s hrano ali pitno vodo 
oziroma z gavažo. Dodatne informacije o na činih in metodah dajanja so 
na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). Na čin in metoda dajanja 
sta odvisna od namena študije, fizikalno-kemijskih lastnosti preskusne kemi ­
kalije, njene biološke dostopnosti ter prevladujo čega načina in metode izpo ­
stavljenosti ljudi. Izbrani na čin in metodo dajanja je treba utemeljiti. Zaradi 
dobrobiti živali je treba oralno gavažo praviloma izbrati samo pri tistih snoveh, pri katerih sta ta na čin in metoda dajanja razumno reprezentativna 
za potencialno izpostavljenost ljudi (npr. pri farmacevtskih izdelkih). 
Prehranske in okoljske kemikalije, vklju čno s pesticidi, se navadno dajejo 
s hrano ali pitno vodo. Pri nekaterih scenarijih, npr. izpostavljenosti na delovnem mestu, pa so lahko primernejši drugi na čini dajanja. 
28. Po potrebi se preskusna kemikalija raztopi ali suspendira v ustreznem 
nosilcu. Upoštevati je treba naslednje lastnosti nosilca in drugih aditivov, 
kot je ustrezno: u činke na absorpcijo, porazdelitev, presnovo ali retencijo 
preskusne kemikalije, u činke na kemijske lastnosti preskusne kemikalije, ki 
lahko spremenijo njene strupene lastnosti, ter u činke na porabo hrane ali 
vode ali na prehranjenost živali. Priporo čljivo je, da se, če je mogo če, 
najprej preu či možnost uporabe vodne raztopine/suspenzije, nato raztopine/ 
emulzije v olju (npr. koruznem), šele potem pa možnost raztopine v drugih nosilcih. Pri nevodnih nosilcih morajo biti strupene lastnosti nosilca znane. Na voljo morajo biti informacije o stabilnosti preskusne kemikalije in homo ­
genosti raztopin ali hrane, ki se bodo uporabljale v preskusu (kot je ustre ­
zno), v pogojih dajanja (npr. s hrano). 
29. Pri kemikalijah, ki se dajejo s hrano ali pitno vodo, je treba zagotoviti, da 
količine uporabljene preskusne kemikalije ne vplivajo na normalno prehra ­
njevanje ali vodno ravnotežje. Pri dolgoro čnih študijah strupenosti, pri 
katerih se uporablja dajanje s hrano, koncentracija preskusne kemikalije v 
hrani praviloma ne sme presegati zgornje meje 5 % vse hrane, da se prepre ­ 
čijo prehranska neravnovesja. Če se preskusna kemikalija daje s hrano, se 
lahko uporabi bodisi konstantna koncentracija v hrani (mg/kg hrane ali ppm) 
bodisi konstantna velikost odmerka glede na telesno težo živali (mg/kg 
telesne teže), ki se izra čuna vsak teden. Uporabljeni na čin je treba navesti.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 474
 
30. V primeru oralnega dajanja živali dobivajo odmerek preskusne kemikalije 
vsak dan (sedem dni na teden), preskusno obdobje pa pri glodavcih navadno 
traja 24 mesecev (glej tudi odstavek 32). Vsak druga čen režim odmerjanja, 
npr. pet dni na teden, je treba utemeljiti. V primeru dermalnega dajanja so živali s preskusno kemikalijo navadno tretirane vsaj 6 ur na dan 7 dni na 
teden, kot je navedeno v poglavju B.9 te priloge (11), prek obdobja 24 
mesecev. Inhalacijska izpostavljenost se izvaja 6 ur na dan 7 dni na teden, uporabiti pa je mogo če tudi izpostavljenost 5 dni na teden, če je utemeljena. 
Obdobje izpostavljenosti praviloma traja 24 mesecev. Če se z nosom izpo ­
stavijo vrste glodavcev, ki niso podgane, se lahko najdaljša obdobja izposta ­
vljenosti prilagodijo, da se kar najbolj zmanjša trpljenje, zna čilno za upora ­
bljeno vrsto. Obdobja izpostavljenosti, krajša od 6 ur na dan, je treba utemeljiti. Glej tudi poglavje B.8 te priloge (9). 
31. Če se preskusna kemikalija živalim daje z gavažo, je treba pri tem upora ­
bljati želod čno cevko ali ustrezno intubacijsko kanilo, postopek pa opravljati 
vsak dan ob podobnem času. Običajno živali dobijo enkraten odmerek 
enkrat na dan, če pa je kemikalija na primer lokalni dražljivec, se lahko 
dnevno odmerjena koli čina ohranja tudi z dajanjem polovi čnih odmerkov 
(dvakrat na dan). Najve čja količina tekočine, ki se lahko da naenkrat, je 
odvisna od velikosti preskusne živali. To koli čino je treba ohranjati tako 
majhno, kot je prakti čno, praviloma pa pri glodavcih ne sme prese či 1 
ml/100 g telesne teže (31). Spremenljivost preskusne koli čine je treba kar 
najbolj zmanjšati s prilagajanjem koncentracije, da se zagotovi konstantna 
količina pri vseh velikostih odmerkov. Izjema so potencialno jedke ali 
dražilne kemikalije, ki jih je treba razred čiti, da se prepre čijo resni lokalni 
učinki. Preskušanju pri koncentracijah, pri katerih obstaja verjetnost jedkosti 
ali dražilnosti za prebavni trakt, se je treba izogibati.
 
Trajanje študije  
32. Študija pri glodavcih navadno traja 24 mesecev, kar ustreza ve čini normalne 
življenjske dobe živali, ki bodo uporabljene. Glede na življenjsko dobo in 
sev živalske vrste v študiji se lahko uporabijo tudi krajša ali daljša obdobja 
študije, vendar je treba to utemeljiti. Za nekatere seve miši, npr. AKR/J, C3H/J ali C57BL/6J, je lahko primernejše 18-mese čno obdobje. V nadalje ­
vanju je nekaj napotkov o trajanju in zaklju čku študije ter preživetju; ve č 
napotkov, vklju čno s preudarki o sprejemljivosti negativnih rezultatov 
študije rakotvornosti glede na preživetje v študiji, je na voljo v Dokumentu s smernicami OECD št. 116 o zasnovi in izvajanju študij kroni čne strupe ­
nosti in rakotvornosti (7). 
— Kadar število preživelih živali v skupinah, tretiranih z manjšimi odmerki, 
ali kontrolni skupini pade pod 25 %, je treba razmisliti o zaklju čku 
študije. 
— Kadar zaradi strupenosti prezgodaj poginejo samo živali v skupini, treti ­
rani z velikim odmerkom, to ne sme biti razlog za zaklju ček študije. 
— Preživetje je treba obravnavati lo čeno za vsak spol. 
— Študija se ne sme podaljševati prek to čke, ko razpoložljivi podatki iz 
študije ne zadoš čajo več za statisti čno veljavno oceno.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 475
 
OPAZOVANJA 
33. Vse živali je treba pregledovati za odkrivanje obolevnosti ali smrtnosti, 
običajno na za četku in koncu vsakega dne, vklju čno s konci tedna in praz ­
niki. Poleg tega je treba živali pregledati enkrat na dan za odkrivanje 
konkretnih toksikološko pomembnih znakov, ob upoštevanju obdobja 
največje intenzivnosti pri čakovanih u činkov po vnosu odmerka, če gre za 
dajanje z gavažo. Posebno pozornost je treba nameniti nastanku tumorjev ter zabeležiti čas nastopa, mesto, mere, videz in progresijo vsakega makro ­
skopsko vidnega ali otipljivega tumorja.
 
Telesna teža, poraba hrane/vode in izkoristek hrane  
34. Vse živali je treba stehtati na za četku tretiranja, vsaj enkrat na teden prvih 
13 tednov, zatem pa najmanj enkrat na mesec. Meritve porabe in izkoristka hrane je treba prvih 13 tednov opravljati vsaj enkrat na teden, nato pa 
najmanj enkrat na mesec. Kadar se preskusna kemikalija daje s pitno 
vodo, je treba porabo vode prvih 13 tednov meriti vsaj enkrat na teden, zatem pa najmanj enkrat na mesec. O meritvah porabe vode je treba razmi ­
sliti tudi pri študijah, pri katerih se spremenijo vzorci pitja.
 
Hematološke, klini čne biokemi čne in druge meritve  
35. Da bi se s študijo pridobilo kar najve č informacij, zlasti kar zadeva razmi ­
sleke o na činu delovanja, se lahko jemljejo vzorci krvi za hematološke in 
klinične biokemi čne preiskave, o čemer odlo či vodja študije. Primerna je 
lahko tudi analiza urina. Ve č napotkov o vrednosti jemanja takih vzorcev v 
okviru študije rakotvornosti je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 
(7). Če se štejeta za primerna, se lahko odvzem vzorcev krvi za hematološke 
in klinične kemične preiskave ter analiza urina opravita kot del vmesne 
usmrtitve (odstavek 20) ter ob zaklju čku študije na najmanj 10 živalih na 
spol na skupino. Vzorce krvi je treba odvzeti na imenovanem mestu, na 
primer s punkcijo srca ali iz retroorbitalnega sinusa, medtem ko je žival v 
anesteziji, in jih shraniti, če je ustrezno, v primernih pogojih. Za pregled se 
lahko pripravijo tudi krvni razmazi, zlasti če kaže, da je ciljni organ kostni 
mozeg, čeprav so bili izraženi dvomi o vrednosti takega pregleda za ocenje ­
vanje rakotvornega/onkogenega potenciala (32).  
PATOLOGIJA  
Makroskopska obdukcija  
36. Na vseh živalih v študiji, razen na opozorilnih (glej odstavek 20) in drugih 
satelitskih živalih, se opravi popolna in natan čna makroskopska obdukcija, 
ki obsega natan čen pregled zunanje površine telesa, vseh odprtin, lobanjske, 
prsne in trebušne votline ter njihove vsebine. Za opozorilne in druge sate ­
litske živali je lahko obdukcija potrebna v posameznih primerih, o čemer 
odloča vodja študije. Tehtanje organov navadno ni del študije rakotvornosti, 
saj je zaradi sprememb, povezanih s staranjem, v poznejših fazah pa zaradi nastanka tumorjev, lahko motena koristnost podatkov o teži organov. So pa lahko ti podatki odlo čilni za oceno zanesljivosti dokazov in zlasti za 
preudarke v zvezi z na činom delovanja. Če je teža organov del satelitske 
študije, jo je treba izmeriti najpozneje 1 leto po za četku študije.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 476
 
37. Naslednja tkiva je treba shraniti v fiksacijskem sredstvu, ki je najprimernejše 
za vrsto tkiva in predvideno poznejšo histopatološko preiskavo (33) (tkiva v 
oglatih oklepajih niso obvezna): 
vse vidne lezije srce trebušna slinavka želodec (predželodec, žlezni 
želodec) 
nadledvična žleza vito črevo obš čitnica [zobje] 
aorta teš če črevo periferni živec modo 
možgani (vklju čno z rezi ­
nami velikih in malih možganov ter podaljšane hrbtenjače/mosta) ledvica hipofiza priželjc 
slepo črevo solzna žleza (zunaj 
očesne votline) prostata š čitnica 
maternični vrat jetra rektum [jezik] 
koagulacijska žleza plju ča žleza slinavka sapnik 
debelo črevo bezgavke (povrhnje in 
globoke) semenski meši ček se čni mehur 
dvanajsternik mle čna žleza (obvezna 
za samice, in če jo je 
mogoče secirati s 
prostim o česom, za 
samce) skeletna mišica maternica (vklju čno z 
vratom) 
nadmodek [zgornja dihala, vklju čno 
z nosom, nosnimi školj ­
kami in obnosnimi votli ­
nami] koža [se čevod] 
oko (vklju čno z mrežnico) požiralnik hrbtenja ča (na treh 
ravneh: vratni, prsni in 
ledveni) [sečnica] 
[stegnenica s sklepom] [vohalni beti č] vranica vagina 
žolčnik (pri vrstah, ki niso 
podgane) jajčnik [prsnica] rezina in/ali svež punktat 
kostnega mozga 
Harderjeva žleza 
Pri parnih organih, npr. ledvicah ali nadledvi
čnih žlezah, je treba shraniti 
oba organa. Na podlagi klini čnih in drugih izsledkov se lahko pokaže 
potreba po preiskavah dodatnih tkiv. Poleg tega je treba shraniti vse organe, ki bi lahko bili ciljni organi glede na znane lastnosti preskusne kemikalije. V študijah z dermalnim na činom dajanja je treba shraniti iste organe, kot so 
določeni na seznamu za oralni na čin, bistveno pa je posebno vzor čenje in 
shranjevanje kože z mesta nanosa. V inhalacijskih študijah je treba v zvezi s seznamom shranjenih in pregledanih tkiv dihal slediti priporo čilom iz 
poglavij B.8 in B.29 te priloge. Za druge organe/tkiva (in poleg posebej 
shranjenih tkiv dihal) je treba preu čiti seznam organov, dolo čen za oralni 
način dajanja.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 477
 
Histopatologija  
38. Na voljo so napotki o najboljših praksah pri izvajanju toksikoloških patolo ­ 
ških študij (33). Pregledati je treba vsaj naslednja tkiva: 
— vsa tkiva živali iz skupine, tretirane z velikim odmerkom, in kontrolne 
skupine, 
— vsa tkiva živali, ki so poginile ali bile usmr čene med študijo, 
— vsa tkiva, ki kažejo makroskopske abnormalnosti, vklju čno s tumorji, 
— kadar so bile v skupini, tretirani z velikim odmerkom, opažene s tretira ­
njem povezane histopatološke spremembe, je treba pregledati ista tkiva vseh živali iz vseh drugih odmernih skupin, 
— pri parnih organih, npr. ledvicah ali nadledvi čnih žlezah, je treba pregle ­
dati oba organa.
 
PODATKI IN PORO ČANJE  
Podatki  
39. Navesti je treba podatke za posamezne živali za vse ocenjevane parametre. 
Poleg tega je treba vse podatke povzeti v preglednicah, v katerih se za vsako 
preskusno skupino navede število živali na za četku preskusa, število živali, 
ki so bile med preskusom najdene poginule ali so bile usmr čene iz humanih 
razlogov, in čas vsake smrti ali humane usmrtitve, število živali, ki kažejo 
znake zastrupitve, opis opaženih znakov zastrupitve, vklju čno s časom 
njihovega nastopa, trajanjem in resnostjo vseh strupenih u činkov, ter število 
živali, pri katerih so opažene lezije, vrste lezij in odstotek živali, pri katerih je opažena posamezna vrsta lezije. V preglednicah s povzetimi podatki je 
treba navesti srednje vrednosti in standardne odklone (za preskusne podatke, 
ki se nenehno zbirajo) za živali, pri katerih so opaženi strupeni u činki ali 
lezije, ter razvrstitev lezij. 
40. Pretekli kontrolni podatki so lahko dragoceni za razlago rezultatov študije, 
npr. kadar obstajajo znaki, da podatki, zagotovljeni s so časnimi kontrolami, 
bistveno odstopajo od nedavnih podatkov, pridobljenih na kontrolnih živalih iz istega preskuševalnega laboratorija/kolonije. Če se ocenjujejo pretekli 
kontrolni podatki, morajo izhajati iz istega laboratorija ter se nanašati na 
živali iste starosti in seva, poleg tega pa morajo biti pridobljeni v petih letih 
pred zadevno študijo. 
41. Če je ustrezno, je treba števil čne rezultate ocenjevati na podlagi primerne in 
splošno priznane statisti čne metode. Statisti čne metode in podatke, ki bodo 
analizirani, je treba izbrati pri zasnovi študije (odstavek 9). V izbiri je treba 
predvideti prilagoditve glede na preživetje, če so potrebne.
 
Poročilo o preskusu  
42. Poro čilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije:  
Preskusna kemikalija  
— agregatno stanje, čistost in fizikalno-kemijske lastnosti, 
— identifikacijske podatke,  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 478
 
— izvor kemikalije, 
— številko serije, — potrdilo o kemijski analizi.  
Nosilec (če je ustrezno)  
— utemeljitev izbire nosilca ( če to ni voda).  
Preskusne živali  
— uporabljeno vrsto/sev in utemeljitev izbire, — število, starost in spol živali na za četku preskusa, 
— izvor, nastanitvene pogoje, hrano itd., — težo vsake živali ob za četku preskusa.  
Preskusni pogoji  
— utemeljitev na čina dajanja in izbire odmerkov, 
— če je ustrezno, uporabljene statisti čne metode za analizo podatkov, 
— podatke o formulaciji preskusne kemikalije/pripravi hrane, — analitske podatke o doseženi koncentraciji, stabilnosti in homogenosti 
pripravka, 
— način dajanja in podatke o dajanju preskusne kemikalije, 
— za inhalacijske študije informacijo, ali je bila uporabljena izpostavljenost 
nosu ali izpostavljenost celega telesa, 
— dejanske odmerke (mg/kg telesne teže/dan) in faktor za pretvorbo 
koncentracije preskusne snovi v hrani/pitni vodi (mg/kg ali ppm) v 
dejanski odmerek, če je ustrezno, 
— podatke o kakovosti hrane in vode.  
Rezultati (predstaviti je treba povzete podatke v preglednicah in podatke za 
posamezne živali) 
Splošno  
— podatke o preživetju, — telesno težo/spremembe telesne teže, — porabo hrane, izra čune izkoristka hrane, če so bili narejeni, in porabo 
vode, če je ustrezno, 
— toksikokineti čne podatke ( če so na voljo), 
— oftalmoskopiranje ( če so podatki na voljo), 
— hematologijo ( če so podatki na voljo), 
— klinično kemijo ( če so podatki na voljo).
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 479
 
Klinični izsledki  
— znake zastrupitve, — pojavnost (in resnost, če se ocenjuje) vseh abnormalnosti, 
— vrsto, resnost in trajanje klini čnih opažanj (prehodnih ali trajnih).  
Obdukcijski podatki  
— terminalno telesno težo, 
— težo organov in razmerja med težami organov, če je ustrezno, 
— izsledke obdukcije; pojavnost in resnost abnormalnosti.  
Histopatologija  
— neneoplasti čne ugotovitve histopatoloških preiskav, 
— neoplasti čne ugotovitve histopatoloških preiskav, 
— povezanost makroskopskih in mikroskopskih ugotovitev, 
— podroben opis vseh s tretiranjem povezanih ugotovitev histopatoloških 
preiskav, vklju čno z razvrstitvami resnosti, 
— navedbo morebitnih medsebojnih strokovnih pregledov mikroskopskih 
preparatov.  
Statistična obdelava rezultatov, če je ustrezno 
Razprava o rezultatih  
— razpravo o pristopih modeliranja, 
— razmerja med odmerkom in odzivom, 
— pretekle kontrolne podatke, — preučitev vseh informacij o na činu delovanja, 
— določitev BMD, NOAEL ali LOAEL, 
— pomembnost za ljudi.  
Sklepi.
 
VIRI:  
(1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rim, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Pariz. 
(2) EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency, Washington, DC. 
(3) Combes, R. D., Gaunt, I., Balls, M. (2004). A Scientific and Animal 
Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. 
ATLA 32: 163–208. 
(4) Barlow, S. M., Greig, J. B., Bridges, J. W., idr. (2002). Hazard identifica ­
tion by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 
145–191. 
(5) Chhabra, R. S., Bucher, J. R., Wolfe, M., Portier, C. (2003). Toxicity 
characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology 
Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 480
 
(6) Poglavje B.27 te priloge, Preskus subkroni čne oralne toksi čnosti: 90-dnevna 
študija oralne toksi čnosti s ponavljajo čimi se odmerki na neglodalcih. 
(7) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 
and 453 – druga izdaja. Series on Testing and Assessment No. 116, na 
voljo na javni spletni strani OECD o smernicah za preskušanje na naslovu www.oecd.org/env/testguidelines. 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz. 
(9) Poglavje B.8 te priloge, Subakutna strupenost pri vdihavanju: 28-dnevna 
študija. 
(10) Poglavje B.29 te priloge, Subkroni čna strupenost pri vdihavanju: 90-dnevna 
študija. 
(11) Poglavje B.9 te priloge, Strupenost (v stiku s kožo) pri ponavljajo čem se 
odmerku (28 dni). 
(12) Boobis, A. R., Cohen, S. M., Dellarco, V., McGregor, D., Meek, M. E., 
Vickers, C., Willcocks, D., Farland, W. (2006). IPCS Framework for analy ­
zing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in 
Toxicol, 36: 793–801. 
(13) Cohen, S. M., Meek, M. E., Klaunig, J. E., Patton, D. E., in Fenner-Crisp, 
P. A. (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes 
of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33: 581–589. 
(14) Holsapple, M. P., Pitot, H. C., Cohen, S. N., Boobis, A. R., Klaunig, J. E., 
Pastoor, T., Dellarco, V. L., Dragan, Y. P. (2006). Mode of Action in 
Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89: 51–56. 
(15) Meek, E. M., Bucher, J. R., Cohen, S. M., Dellarco, V., Hill, R. N., 
Lehman-McKemmon, L. D., Longfellow, D. G., Pastoor, T., Seed, J., Patton, D. E. (2003). A Framework for Human Relevance analysis of 
Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33: 
591–653. 
(16) Carmichael, N. G., Barton, H. A., Boobis, A. R., idr. (2006). Agricultural 
Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization 
of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1–7. 
(17) Barton, H. A., Pastoor, T. P., Baetcke, T., idr. (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9–35. 
(18) Doe, J. E., Boobis, A. R., Blacker, A., idr. (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37–68. 
(19) Cooper, R. L., Lamb, J. S., Barlow, S. M., idr. (2006). A Tiered Approach 
to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69–98. 
(20) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, 
OECD, Pariz. 
(21) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Pariz.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 481
 
(22) Rhomberg, L. R., Baetcke, K., Blancato, J., Bus, J., Cohen, S., Conolly, R., 
Dixit, R., Doe, J., Ekelman, K., Fenner-Crisp, P., Harvey, P., Hattis, D., 
Jacobs, A., Jacobson-Kram, D., Lewandowski, T., Liteplo, R., Pelkonen, O., Rice, J., Somers, D., Turturro, A., West, W., Olin, S. (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies 
in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 
729–837. 
(23) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran, J. A. (ur.). ILSI Press, Washington, DC. 
(24) Griffiths, S. A., Parkinson, C., McAuslane, J. A. N., in Lumley, C. E. 
(1994). The utility of the second rodent species in the carcinogenicity 
testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1): 214. 
(25) Usui, T., Griffiths, S. A., in Lumley, C. E. (1996). The utility of the mouse 
for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. V: 
D’Arcy POF & Harron DWG (ur.). Proceedings of the Third International 
Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. str. 279–284. 
(26) Carmichael, N. G., Enzmann, H., Pate, I., Waechter, F. (1997). The Signi ­
ficance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Asses ­
sment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing 
by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105: 1196–1203. 
(27) Direktiva 2010/63/EU Evropskega parlamenta in Sveta z dne 22. septembra 
2010 o zaš čiti živali, ki se uporabljajo v znanstvene namene (UL L 276, 
20.10.2010, str. 33). 
(28) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86–23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services. 
(29) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of 
Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3- 
906255-04-2. 
(30) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals 
in various housing systems. 
(31) Diehl, K.-H., Hull, R., Morton, D., Pfister, R., Rabemampianina, Y., Smith, 
D., Vidal, J.-M., van de Vorstenbosch, C. 2001. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21: 15–23. 
(32) Weingand, K., idr. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology 
Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198–201. 
(33) Crissman, J., Goodman, D., Hildebrandt, P., idr. (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126–131.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 482
 
Dodatek 1  
OPREDELITEV POJMOV  
Preskusna kemikalija:  snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne 
metode.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 483
 
B.33  KOMBINIRANE ŠTUDIJE KRONI ČNE 
STRUPENOSTI/RAKOTVORNOSTI  
UVOD 
1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 453 
(2009). Prvotna TG 453 je bila sprejeta leta 1981. Priprava te posodobljene 
preskusne metode B.33 je bila ocenjena kot nujna zaradi upoštevanja nedav ­
nega razvoja na podro čju dobrobiti živali in zakonodajnih zahtev (1) (2) (3) 
(4) (5). Ta preskusna metoda B.33 je bila posodobljena vzporedno z revi ­
zijama poglavja B.32 te priloge z naslovom „Študije rakotvornosti“ in 
poglavja B.30 te priloge z naslovom „Študije kroni čne strupenosti“, da bi 
se z uporabo živali v študiji pridobile dodatne informacije in da bi se zagotovilo ve č podatkov o izbiri odmerkov. Ta preskusna metoda je zasno ­
vana za preskušanje zelo razli čnih kemikalij, vklju čno s pesticidi in indu ­
strijskimi kemikalijami. Vendar je treba opozoriti, da so lahko nekatere podrobnosti in zahteve za farmacevtske izdelke druga čne (glej Smernico 
Mednarodne konference o usklajevanju (ICH) S1B o preskušanju rakotvor ­
nosti farmacevtskih izdelkov). 
2. Večina študij kroni čne strupenosti in rakotvornosti se opravi na glodavcih, 
zato je ta preskusna metoda namenjena zlasti uporabi v študijah, opravljenih na teh živalskih vrstah. Če bi bilo take študije treba izvesti na vrstah, ki niso 
glodavci, se lahko z ustreznimi prilagoditvami prav tako uporabijo na čela in 
postopki, opisani v tej metodi, ter na čela in postopki iz poglavja B.27 te 
priloge z naslovom „90-dnevna študija oralne toksi čnosti s ponavljajo čimi se 
odmerki na neglodavcih“ (6), kot je navedeno v Dokumentu s smernicami OECD št. 116 o zasnovi in izvajanju študij kroni čne strupenosti in rakot ­
vornosti (7). 
3. Glavni trije na čini dajanja, ki se uporabljajo v študijah kroni čne strupenosti/ 
rakotvornosti, so oralni, dermalni in inhalacijski. Izbira na čina dajanja je 
odvisna od fizikalnih in kemijskih lastnosti preskusne kemikalije ter prev ­
ladujočega načina izpostavljenosti ljudi. Dodatne informacije o izbiri na čina 
izpostavljenosti so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). 
4. Ta preskusna metoda je osredoto čena na oralno izpostavljenost, ki se v 
študijah kroni čne strupenosti in rakotvornosti uporablja najpogosteje. Dolgo ­
ročne študije, ki vklju čujejo dermalno ali inhalacijsko izpostavljenost, so 
lahko prav tako lahko potrebne za oceno tveganja za zdravje ljudi in/ali 
na podlagi nekaterih zakonodajnih ureditev, vendar pa sta oba navedena načina izpostavljenosti tehni čno precej zapletena. Take študije je treba 
zasnovati za vsak primer posebej, je pa mogo če preskusno metodo za 
ocenjevanje in vrednotenje kroni čne strupenosti in rakotvornosti z oralnim 
načinom dajanja, opisano v tem dokumentu, uporabiti kot osnovo za 
protokol za inhalacijske in/ali dermalne študije, kar zadeva priporo
čila 
glede obdobij tretiranja, klini čnih in patoloških parametrov itd. Za inhala ­
cijski (7) (8) in dermalni na čin dajanja (7) preskusnih kemikalij so na voljo 
napotki OECD. Pri zasnovi dolgoro čnejših študij z inhalacijsko izpostavlje ­
nostjo je treba podrobno preu čiti poglavji B.8 (9) in B.29 te priloge (10) ter 
Dokument s smernicami OECD o preskušanju akutne strupenosti pri vdiha ­
vanju (8). V primeru preskušanja z dermalnim na činom dajanja je treba 
upoštevati poglavje B.9 te priloge (11).  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 484
 
5. S kombinirano študijo kroni čne strupenosti/rakotvornosti se pridobivajo 
informacije o možnih nevarnostih za zdravje, ki se lahko pojavijo ob pona ­
vljajoči se izpostavljenosti v obdobju, ki obsega najve č celotno življenjsko 
dobo uporabljene vrste. Z njo se pridobijo informacije o strupenih u činkih 
preskusne kemikalije, vklju čno s potencialno rakotvornostjo, nakažejo se 
ciljni organi in možnost kopi čenja. S študijo se lahko oceni vrednost brez 
opaženega škodljivega u činka za strupene u činke in – v primeru rakotvornih 
snovi, ki niso genotoksi čne – za tumorske odzive, ki se lahko uporabi za 
določitev varnostnih meril za izpostavljenost ljudi. Poudarjena je tudi 
potreba po skrbnem klini čnem opazovanju živali, da se pridobi kar najve č 
informacij. 
6. Cilji študij kroni čne strupenosti/rakotvornosti, na katere se nanaša ta 
preskusna metoda, vklju čujejo: 
— opredelitev rakotvornih lastnosti preskusne kemikalije, ki v primerjavi s 
sočasnimi kontrolnimi skupinami privedejo do pove čane pojavnosti 
novotvorb, pove čanega deleža malignih novotvorb ali skrajšanja časa 
do pojava novotvorb, 
— opredelitev časa do pojava novotvorb, 
— opredelitev kroni čne strupenosti preskusne kemikalije, 
— opredelitev ciljnih organov kroni čne strupenosti in rakotvornosti, 
— opredelitev razmerja med odmerkom in odzivom, — opredelitev vrednosti brez opaženega škodljivega u činka (NOAEL) ali 
izhodiščne točke za dolo čitev primerjalnega odmerka ( benchmark dose  – 
BMD), 
— ekstrapolacijo rakotvornih u činkov na stopnje izpostavljenosti ljudi pri 
majhnih odmerkih, 
— napoved u činkov kroni čne strupenosti pri stopnjah izpostavljenosti ljudi, 
— zagotovitev podatkov za preskušanje hipotez glede na čina delovanja (2) 
(7) (12) (13) (14) (15).
 
ZAČETNI PREUDARKI 
7. Pri ocenjevanju in vrednotenju potencialne rakotvornosti in kroni čne strupe­
nosti preskusne kemikalije mora preskuševalni laboratorij pred izvedbo 
študije preu čiti vse razpoložljive informacije o preskusni kemikaliji, da se 
zasnova študije osredoto či na učinkovitejše preskušanje toksikoloških last ­
nosti te kemikalije in da se kar najbolj zmanjša uporaba živali. Informacije o 
načinu delovanja domnevne rakotvorne snovi in upoštevanje njenega na čina 
delovanja (2) (7) (12) (13) (14) (15) so posebej pomembni, saj se lahko optimalna zasnova študije razlikuje glede na to, ali je preskusna kemikalija znana ali domnevna genotoksi čna rakotvorna snov. Ve č napotkov o 
preudarkih v zvezi z na činom delovanja je na voljo v Dokumentu s smer ­
nicami št. 116 (7). 
8. Informacije, ki pomagajo pri zasnovi študije, vklju čujejo identiteto, kemijsko 
strukturo in fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije; vse informa ­
cije o načinu delovanja; rezultate morebitnih preskusov strupenosti  in vitro  
ali in vivo , vključno s preskusi genotoksi čnosti; pri čakovane uporabe in 
potencial za izpostavljenost ljudi; razpoložljive podatke (Q)SAR, podatke o mutagenosti/genotoksi čnosti in rakotvornosti ter druge toksikološke 
podatke o strukturno sorodnih snoveh; razpoložljive toksikokineti čne 
podatke (podatke o kinetiki pri enkratnem odmerku in tudi pri ponavljajo čih 
se odmerkih, če so na voljo) ter podatke, pridobljene z drugimi študijami
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 485
 
s ponavljajo čo se izpostavljenostjo. Kroni čno strupenost/rakotvornost je 
treba ugotavljati šele po pridobitvi za četnih informacij o strupenosti na 
podlagi 28-dnevnega in/ali 90-dnevnega preskusa strupenosti s ponavljajo ­ 
čimi se odmerki. Koristne informacije se lahko zagotovijo tudi s kratkoro ­ 
čnimi preskusi iniciacije/spodbujanja razvoja raka. V okviru splošne ocene 
potencialnih škodljivih u činkov dolo čene preskusne kemikalije na zdravje je 
treba razmisliti o postopnem pristopu k preskušanju rakotvornosti (16) (17) (18) (19). 
9. Pred za četkom študije je treba dolo čiti najprimernejše statisti čne metode za 
analizo rezultatov ob upoštevanju zasnove in ciljev preskusa. Med vidiki, ki jih je treba preu čiti, je tudi vprašanje, ali bi morala statistika vklju čevati 
prilagoditev glede na preživetje, analizo kumulativnih tveganj tumorjev 
glede na trajanje preživetja, analizo časa do pojava tumorjev in analizo v 
primeru pred časnega prenehanja tretiranja ene ali ve č skupin. Napotki o 
primernih statisti čnih analizah in klju čne reference mednarodno priznanih 
statističnih metod so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7) ter 
v Dokumentu s smernicami št. 35 o analizi in ocenjevanju študij kroni čne 
strupenosti in rakotvornosti (20). 
10. Pri izvajanju študije rakotvornosti je treba vedno upoštevati vodilna na čela 
in preudarke, opisane v Dokumentu s smernicami OECD o prepoznavanju, ocenjevanju in uporabi klini čnih znakov kot humanih kon čnih točk za 
preskusne živali v oceni varnosti (21), zlasti odstavek 62 navedenega doku ­
menta. V tem odstavku je navedeno: „ Pri študijah, ki vklju čujejo ponavlja ­
joče se odmerke, je treba sprejeti premišljeno odlo čitev, ali naj se žival 
humano usmrti ali ne, če kaže klini čne znake, ki se stopnjujejo in vodijo 
v dodatno poslabšanje njenega stanja. Ta odlo čitev mora vklju čevati razmi ­
slek o vrednosti informacij, ki bodo pridobljene z ohranitvijo zadevne živali 
v študiji glede na njeno splošno stanje. Če se sprejme odlo čitev, da se žival 
ohrani v preskusu, je treba po potrebi pove čati pogostnost opazovanj. 
Obstaja tudi možnost, da se brez ogrožanja namena preskusa za č
asno 
prekine dajanje odmerkov, če bi to ublažilo bole čine ali trpljenje, ali da 
se zmanjša preskusni odmerek. “ 
11. Podrobni napotki in razprava o na čelih izbire odmerkov za študije kroni čne 
strupenosti in rakotvornosti so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7) ter v dveh publikacijah, ki ju je pripravil International Life Sciences Institute (22) (23). Osrednja strategija izbire odmerkov je odvisna od glav ­
nega cilja ali ciljev študije (odstavek 6). Pri izbiri ustreznih velikosti 
odmerkov je treba najti ravnotežje med spremljanjem nevarnosti na eni strani ter opredeljevanjem u činkov majhnih odmerkov in njihovim 
pomenom na drugi. To je zlasti pomembno v primeru te kombinirane študije 
kronične strupenosti in rakotvornosti. 
12. Razmisliti je treba o možnosti, da se namesto lo čene izvedbe študije 
kronične strupenosti (poglavje B.30 te priloge) in študije rakotvornosti 
(poglavje B.32 te priloge) izvede ta kombinirana študija kroni čne strupenosti 
in rakotvornosti. S kombiniranim preskusom se v primerjavi z izvedbo dveh ločenih študij zagotovi ve čja učinkovitost v smislu časa in stroškov ter se 
nekoliko zmanjša uporaba živali, ne da bi bila pri tem ogrožena kakovost 
podatkov v fazi v zvezi s kroni čno strupenostjo ali fazi v zvezi z rakotvor ­
nostjo. Vendar je treba pri izvajanju kombinirane študije kroni čne strupe ­
nosti in rakotvornosti skrbno upoštevati na čela izbire odmerkov (odstavki 11 
in 22–26), poleg tega pa se tudi priznava, da se na podlagi nekaterih zako ­
nodajnih okvirov lahko zahteva lo čena izvedba študij. Ve č napotkov o tem, 
kako zasnovati kombinirano študijo kroni čne strupenosti in rakotvornosti, da 
bo mogoče z njo kar najbolj zmanjšati število uporabljenih živali in racio ­
nalizirati razli čne preskusne postopke, je na voljo v Dokumentu s smerni ­
cami št. 116 (7).
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 486
 
13. Pojmi, ki se uporabljajo v okviru te preskusne metode, so opredeljeni na 
koncu tega poglavja in v Dokumentu s smernicami št. 116 (7).  
NAČELO PRESKUSA 
14. Študija je zasnovana z dvema vzporednima fazama – fazo v zvezi s 
kronično strupenostjo in fazo v zvezi z rakotvornostjo (glede trajanja glej 
odstavek 34 oziroma odstavek 35). Preskusna kemikalija se navadno daje 
oralno, čeprav je lahko primerno tudi preskušanje z inhalacijskim ali 
dermalnim na činom dajanja. V fazi v zvezi s kroni čno strupenostjo se 
preskusna kemikalija dnevno v stopnjevanih odmerkih daje ve č skupinam 
preskusnih živali, in sicer ena velikost odmerka na skupino, pri čemer 
preskus obi čajno traja 12 mesecev, čeprav se lahko glede na zakonodajne 
zahteve izberejo tudi daljša ali krajša obdobja (glej odstavek 34). Izbrano obdobje mora biti dovolj dolgo, da se lahko pokažejo morebitni u činki 
kumulativne strupenosti, ne pa tudi zavajajo či učinki sprememb, povezanih 
s staranjem. Zasnova študije lahko vklju čuje tudi eno ali ve č vmesnih 
usmrtitev, npr. pri 3 ali 6 mesecih, zaradi česar se lahko vklju čijo dodatne 
skupine živali (glej odstavek 20). V fazi v zvezi z rakotvornostjo se 
preskusna kemikalija dnevno daje ve č skupinam preskusnih živali, pri 
čemer preskus traja ve čino njihove življenjske dobe. Živali je treba v 
obeh fazah skrbno opazovati, da se odkrijejo znaki strupenosti in nastanek neoplastičnih lezij. Na živalih, ki med preskusom poginejo ali so usmr čene, 
se opravi obdukcija, ob koncu preskusa pa se tudi preživele živali usmrtijo 
in se na njih opravi obdukcija.
 
OPIS METODE  
Izbira živalske vrste  
15. Ta preskusna metoda je namenjena predvsem ocenjevanju in vrednotenju 
kronične strupenosti in rakotvornosti pri glodavcih (odstavek 2). O uporabi 
vrst, ki niso glodavci, se lahko razmisli, kadar razpoložljivi podatki kažejo, 
da so ustreznejše za napovedovanje u činkov na zdravje ljudi. Izbiro živalske 
vrste je treba utemeljiti. Priporo čena vrsta glodavca je podgana, čeprav se 
lahko uporabijo tudi druge vrste glodavcev, npr. miš. Čeprav je uporabnost 
miši pri preskušanju rakotvornosti lahko omejena (24) (25) (26), se lahko z nekaterimi veljavnimi zakonodajnimi ureditvami še vedno zahteva presku ­ 
šanje rakotvornosti na miših, razen če se ugotovi, da taka študija z znan ­
stvenega vidika ni nujna. Podgane in miši so najprimernejši preskusni 
modeli zaradi njihove razmeroma kratke življenjske dobe, razširjene uporabe v farmakoloških in toksikoloških študijah, ob čutljivosti za indukcijo 
tumorjev ter razpoložljivosti dovolj opredeljenih sevov. Zaradi teh lastnosti 
je na voljo veliko informacij o njihovi fiziologiji in patologiji. Kadar se 
zahtevajo študije kroni čne strupenosti/rakotvornosti na vrstah, ki niso 
glodavci, morata zasnova in izvajanje takih študij temeljiti na na čelih, 
opisanih v tej preskusni metodi, ter na na čelih iz poglavja B.27 te priloge 
z naslovom „90-dnevna študija oralne toksi čnosti s ponavljajo čimi se 
odmerki na neglodalcih“ (6). Dodatne informacije o izbiri živalske vrste in seva so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). 
16. Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle živali obi čajno uporabljanih labo ­
ratorijskih sevov. Po možnosti je treba v kombinirani študiji kroni čne stru­
penosti/rakotvornosti uporabiti isti sev in izvor živali kot v predhodnih 
krajših študijah strupenosti, čeprav je treba – če je znano, da se pri živalih 
zadevnega seva in izvora pojavljajo težave pri doseganju obi čajno sprejetih 
meril preživetja za dolgoro čne študije (glej Dokument s smernicami št. 116 
(7)) – razmisliti o uporabi seva živali, katerega stopnja preživetja je sprejem ­
ljiva za dolgoro čno študijo. Samice še niso smele kotiti in ne smejo biti 
breje.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 487
 
Nastanitveni in prehranjevalni pogoji  
17. Živali se lahko nastanijo posami čno ali dajo v kletke v manjših skupinah 
istega spola; posami čna nastanitev se lahko predvidi samo, če je znanstveno 
utemeljena (27) (28) (29). Kletke je treba razporediti tako, da so morebitni 
učinki zaradi njihovega položaja čim manjši. Temperatura prostora s 
preskusnimi živalmi mora znašati 22 °C (± 3 °C). Čeprav mora biti relativna 
vlažnost vsaj 30 % in po možnosti ne sme presegati 70 %, razen med čiščenjem prostora, mora biti cilj 50- do 60-odstotna vlažnost. Osvetlitev 
mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za 
hranjenje se lahko uporablja obi čajna laboratorijska hrana z neomejeno 
količino pitne vode. Hrana mora zadovoljevati vse prehranske potrebe 
preskušane živalske vrste, vsebnost kontaminantov, med drugim ostankov 
pesticidov, obstojnih organskih onesnaževal, fitoestrogenov, težkih kovin in mikotoksinov, ki lahko vplivajo na rezultat preskusa, pa mora biti čim 
manjša. Redno je treba pripravljati analitske informacije o ravneh kontami ­
nantov v hranilih in hrani, vsaj na za četku študije in kadar se zamenja serija 
uporabljane kemikalije, ter jih vklju čiti v končno poročilo. Prav tako je treba 
zagotoviti analitske informacije o pitni vodi, uporabljeni v študiji. Kadar se preskusna kemikalija daje s hrano, lahko na izbiro hrane vpliva potreba po 
zagotovitvi ustrezne primesi preskusne kemikalije in zadovoljevanju 
prehranskih potreb živali.
 
Priprava živali  
18. Uporabiti je treba zdrave živali, ki so se najmanj 7 dni prilagajale labora ­
torijskim razmeram in še niso bile vklju čene v preskusne postopke. V 
primeru glodavcev je treba odmerke za četi dajati čim prej po odstavitvi 
od sesanja in prilagajanju na okolje, po možnosti preden so živali stare 8 tednov. Opredeliti je treba vrsto, sev, izvor, spol, težo in starost preskusnih živali. Ob za četku študije morajo biti razlike v teži uporabljenih živali za 
vsak spol čim manjše, njihova teža pa ne sme odstopati za ve č kot ± 20 % 
od povpre čne teže vseh živali v študiji glede na spol. Živali se naklju čno 
dodelijo kontrolnim in tretiranim skupinam. Po randomizaciji med skupi ­
nami v okviru vsakega spola ne sme biti ve čjih razlik v povpre čni telesni 
teži. Če obstajajo statisti čno pomembne razlike, je treba fazo randomizacije 
ponoviti, če je to mogo če. Vsaki živali je treba dodeliti edinstveno identi ­
fikacijsko številko in jo trajno ozna čiti s to številko s tetovažo, vsaditvijo 
mikročipa ali drugo ustrezno metodo.
 
POSTOPEK  
Število in spol živali  
19. Uporabiti je treba oba spola. Živali mora biti dovolj za temeljito biološko in 
statistično ocenjevanje. Pri glodavcih mora zato vsaka odmerna skupina (kot 
je navedeno v odstavku 22) in so časna kontrolna skupina, namenjena fazi 
študije v zvezi z rakotvornostjo, vsebovati najmanj 50 živali vsakega spola. Glede na namen študije je mogo če povečati statisti čno moč ključnih ocen z 
neenakim dodeljevanjem živali razli čnim odmernim skupinam, tako da je v 
skupinah, tretiranih z majhnimi odmerki, ve č kot 50 živali, npr. za ocenje ­
vanje rakotvornega potenciala pri majhnih odmerkih. Vendar se je treba zavedati, da je ob zmernem pove čanju velikosti skupine pove čanje stati ­
stične moči študije razmeroma majhno. Vsaka odmerna skupina (kot je 
navedeno v odstavku 22) in so časna kontrolna skupina, namenjena fazi
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 488
 
študije v zvezi s kroni čno strupenostjo, mora v primeru glodavcev vsebovati 
najmanj 10 živali vsakega spola. Opozoriti je treba, da je to število manjše 
kot v študiji kroni čne strupenosti (poglavje B.30 te priloge). Vendar bo 
razlaga podatkov, pridobljenih z manjšim številom živali na skupino v fazi te kombinirane študije v zvezi s kroni čno strupenostjo, podkrepljena s 
podatki, pridobljenimi z ve čjim številom živali v fazi študije v zvezi z 
rakotvornostjo. V študijah, ki vklju čujejo miši, bodo v vsaki odmerni 
skupini za fazo v zvezi s kroni čno strupenostjo morda potrebne dodatne 
živali, da bo mogo če opraviti vse zahtevane hematološke preiskave. Ve č 
informacij o statisti čni zasnovi študije in izbiri velikosti odmerkov za čim 
obsežnejše pove čanje statisti čne moči je na voljo v Dokumentu s smerni ­
cami št. 116 (7).
 
Uporaba vmesnih usmrtitev, satelitske skupine in opozorilnih živali  
20. Če je to znanstveno utemeljeno, se lahko v študiji predvidijo vmesne usmrti ­
tve, npr. pri 6 mesecih za fazo v zvezi s kroni čno strupenostjo, da se 
zagotovijo informacije o napredovanju ne-neoplasti čnih sprememb in meha ­
nistične informacije. Kadar so take informacije že na voljo iz prejšnjih študij 
strupenosti s ponavljajo čimi se odmerki v zvezi z zadevno preskusno kemi ­
kalijo, vmesne usmrtitve morda niso znanstveno utemeljene. Z živalmi, 
uporabljenimi v fazi študije v zvezi s kroni čno strupenostjo, ki obi čajno 
traja 12 mesecev (odstavek 34), se pridobijo podatki v zvezi z vmesnimi usmrtitvami za fazo študije v zvezi z rakotvornostjo, s čimer se zmanjša 
skupno število uporabljenih živali. V fazo študije v zvezi s kroni čno stru­
penostjo se lahko vklju čijo tudi satelitske skupine za spremljanje reverzibil ­
nosti morebitnih toksikoloških sprememb, ki jih povzro či preiskovana 
preskusna kemikalija. Te preiskave so lahko omejene na najve čji odmerek 
v študiji in kontrolo. Po potrebi se lahko predvidi dodatna skupina opozo ­
rilnih živali (navadno 5 živali na spol) za spremljanje patološkega stanja 
med študijo (30). Ve č napotkov o tem, kako zasnovati študijo, da se vklju ­ 
čijo vmesne usmrtitve ter satelitske in opozorilne živali, hkrati pa kar najbolj 
zmanjša skupno število uporabljenih živali, je na voljo v Dokumentu s 
smernicami št. 116 (7). 
21. Če se v zasnovo študije vklju čijo satelitske živali in/ali vmesne usmrtitve, 
število živali v vsaki odmerni skupini, vklju čenih v ta namen, navadno 
znaša 10 živali na spol, skupno število živali v zasnovi študije pa je treba 
povečati za toliko, kolikor se jih namerava usmrtiti pred zaklju čkom študije. 
Za živali za vmesno usmrtitev in satelitske živali so obi čajno potrebna enaka 
opazovanja kot za živali v fazi glavne študije v zvezi s kroni čno strupe ­
nostjo, vklju čno s telesno težo, porabo hrane/vode, hematološkimi in klini ­ 
čnimi biokemi čnimi meritvami ter patološkimi preiskavami, čeprav se lahko 
predvidi tudi (pri skupinah za vmesno usmrtitev), da se meritve omejijo na specifična ključna merila, kot sta nevrotoksi čnost ali imunotoksi čnost.
 
Odmerne skupine in odmerjanje  
22. Napotki glede vseh vidikov izbire odmerkov in razporeditve njihovih veli ­
kosti so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). Za fazo v zvezi s 
kronično strupenostjo in fazo v zvezi z rakotvornostjo je treba uporabiti 
najmanj tri velikosti odmerkov in so časno kontrolo. Velikosti odmerkov 
navadno temeljijo na rezultatih kratkoro čnejših študij s ponavljajo čimi se 
odmerki ali študij za ugotavljanje obmo čja, pri njihovem dolo čanju pa je 
treba upoštevati vse obstoje če toksikološke in toksikokineti čne podatke, ki 
so na voljo za preskusno kemikalijo ali sorodne snovi.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 489
 
23. Za fazo študije v zvezi s kroni čno strupenostjo se lahko oceni, da celotna 
študija s tremi velikostmi odmerkov ni potrebna, če je mogo če predvideti, da 
preskus pri eni velikosti odmerka, enakovredni najmanj 1 000 mg/kg telesne teže/dan, verjetno ne bo povzro čil škodljivih u činkov. To predvidevanje 
mora temeljiti na informacijah iz predhodnih študij in preudarku, da na 
podlagi podatkov o strukturno sorodnih kemikalijah strupenost ni pri čako­
vana. Lahko se uporabi meja 1 000 mg/kg telesne teže/dan, razen če izpo­
stavljenost ljudi nakazuje potrebo po uporabi ve čjega odmerka. 
24. Razen kadar zaradi fizikalno-kemijskih lastnosti ali bioloških u činkov 
preskusne kemikalije to ni mogo če, je treba najve čjo velikost odmerka 
izbrati za opredelitev glavnih ciljnih organov in strupenih u činkov, pri 
čemer se je treba izogibati povzro čanju trpljenja, hude zastrupitve, obolev ­
nosti ali smrti. Najve čjo velikost odmerka je praviloma treba izbrati tako, da 
se izzovejo znaki strupenosti, na primer upo časnitev pridobivanja telesne 
teže (približno 10-odstotna). Vendar se lahko glede na cilje študije (glej odstavek 6) izbere tudi najve čji odmerek, manjši od odmerka, ki povzro ča 
znake strupenosti, npr. če odmerek izzove škodljiv u činek, ki vzbuja zaskr ­
bljenost, ne vpliva pa bistveno na življenjsko dobo ali telesno težo. 
25. Velikosti odmerkov in razporeditev med njimi se lahko izberejo za dolo ­ 
čanje odziva v odvisnosti od odmerka in – glede na na čin delovanja 
preskusne kemikalije – vrednosti NOAEL ali drugega želenega rezultata 
študije, npr. BMD (glej odstavek 27). Dejavniki, ki jih je treba upoštevati pri določitvi manjših odmerkov, vklju čujejo pričakovani naklon krivulje 
odmerek-odziv, odmerke, pri katerih se lahko pojavijo pomembne spre ­
membe v presnovi ali na činu strupenega delovanja, velikost, pri kateri se 
pričakuje prag, ali velikost, pri kateri se pri čakuje izhodiš čna točka za 
ekstrapolacijo majhnih odmerkov. Glavni cilj kombinirane študije rakotvor ­
nosti/kroni čne strupenosti je pridobiti informacije za oceno tveganja za 
rakotvornost, informacije o kroni čni strupenosti pa so navadno podrejen 
cilj. To je treba upoštevati pri izbiri velikosti odmerkov in razporeditve med njimi za študijo. 
26. Izbrana razporeditev velikosti odmerkov je odvisna od ciljev študije in 
lastnosti preskusne kemikalije ter je v tej preskusni metodi ni mogo č
e 
natančno predpisati, vendar dva- do štirikratni intervali velikokrat zagotovijo 
visoko učinkovitost preskusa pri dolo čanju padajo čih velikosti odmerkov, 
namesto uporabe zelo velikih intervalov (npr. ve čjih od faktorja približno 
6–10) med odmerki pa je pogosto primerneje dodati četrto preskusno 
skupino. Na splošno se je treba izogibati uporabi faktorjev, ve čjih od 10, 
če se uporabijo, pa je to treba utemeljiti. 
27. Kot je nadalje opisano v Dokumentu s smernicami št. 116 (7), je treba pri 
izbiri odmerkov upoštevati: 
— znane ali domnevne nelinearnosti ali to čke pregiba na krivulji 
odmerek-odziv, 
— toksikokinetiko in odmerna obmo čja, v katerih se pojavljajo ali ne poja ­
vljajo presnovna indukcija, nasi čenje ali nelinearnost med zunanjimi in 
notranjimi odmerki, 
— prekurzorske lezije, ozna čevalce učinka ali kazalnike delovanja klju čnih 
temeljnih bioloških procesov,  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 490
 
— ključne (ali domnevne) vidike na čina delovanja, kot so odmerki, pri 
katerih se za čne pojavljati citotoksi čnost, so ravni hormonov motene, 
homeostati čni mehanizmi preobremenjeni itd., 
— predele krivulje odmerek-odziv, v katerih je potrebna posebno zanesljiva 
ocena, npr. v obmo čju pričakovanega BMD ali predvidenega praga, 
— preudarke v zvezi s pri čakovanimi stopnjami izpostavljenosti ljudi, zlasti 
pri izbiri srednjih in majhnih odmerkov. 
28. Kontrolna skupina je netretirana skupina ali kontrolna skupina z nosilcem, 
če se pri dajanju preskusne kemikalije uporablja nosilec. Z živalmi v 
kontrolni skupini je treba ravnati enako kot z živalmi v preskusnih skupinah, 
le da se ne tretirajo s preskusno kemikalijo. Če se uporablja nosilec, mora 
kontrolna skupina prejeti najve čjo količino nosilca, ki je bila uporabljena 
med odmernimi skupinami. Če se preskusna snov daje s hrano in se s tem 
zaradi njene manjše okusnosti povzro či bistveno zmanjšanje vnosa hrane, je 
lahko koristna dodatna, po parih hranjena kontrolna skupina, ki se uporablja kot primernejša kontrola.
 
Priprava odmerkov in dajanje preskusne kemikalije  
29. Preskusna kemikalija se obi čajno daje oralno, s hrano ali pitno vodo 
oziroma z gavažo. Dodatne informacije o na činih in metodah dajanja so 
na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). Na čin in metoda dajanja 
sta odvisna od namena študije, fizikalnih/kemijskih lastnosti preskusne kemikalije, njene biološke dostopnosti ter prevladujo čega načina in metode 
izpostavljenosti ljudi. Izbrani na čin in metodo dajanja je treba utemeljiti. 
Zaradi dobrobiti živali je treba oralno gavažo praviloma izbrati samo pri 
tistih snoveh, pri katerih sta ta na čin in metoda dajanja razumno reprezen ­
tativna za potencialno izpostavljenost ljudi (npr. pri farmacevtskih izdelkih). Prehranske in okoljske kemikalije, vklju čno s pesticidi, se navadno dajejo s 
hrano ali pitno vodo. Pri nekaterih scenarijih, npr. izpostavljenosti na 
delovnem mestu, pa so lahko primernejši drugi na čini dajanja. 
30. Po potrebi se preskusna kemikalija raztopi ali suspendira v ustreznem 
nosilcu. Upoštevati je treba naslednje lastnosti nosilca in drugih aditivov, 
kot je ustrezno: u činke na absorpcijo, porazdelitev, presnovo ali retencijo 
preskusne kemikalije, u činke na kemijske lastnosti preskusne kemikalije, ki 
lahko spremenijo njene strupene lastnosti, ter u činke na porabo hrane ali 
vode ali na prehranjenost živali. Priporo čljivo je, da se, če je mogo če, 
najprej preu či možnost uporabe vodne raztopine/suspenzije, nato raztopine/ 
emulzije v olju (npr. koruznem), šele potem pa možnost raztopine v drugih nosilcih. Pri nevodnih nosilcih morajo biti strupene lastnosti nosilca znane. Na voljo morajo biti informacije o stabilnosti preskusne kemikalije in homo ­
genosti raztopin ali hrane (kot je ustrezno), v pogojih dajanja (npr. s hrano). 
31. Pri kemikalijah, ki se dajejo s hrano ali pitno vodo, je treba zagotoviti, da 
količine uporabljene preskusne kemikalije ne vplivajo na normalno prehra ­
njevanje ali vodno ravnotežje. Pri dolgoro čnih študijah strupenosti, pri 
katerih se uporablja dajanje s hrano, koncentracija preskusne kemikalije v 
hrani praviloma ne sme presegati zgornje meje 5 % vse hrane, da se prepre ­ 
čijo prehranska neravnovesja. Če se preskusna kemikalija daje s hrano, se 
lahko uporabi bodisi konstantna koncentracija v hrani (mg/kg hrane ali ppm) 
bodisi konstantna velikost odmerka glede na telesno težo živali (mg/kg 
telesne teže), ki se izra čuna vsak teden. Uporabljeni na čin je treba navesti.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 491
 
32. V primeru oralnega dajanja živali dobivajo odmerek preskusne kemikalije 
vsak dan (sedem dni na teden), preskusno obdobje pa traja 12 mesecev (faza 
v zvezi s kroni čno strupenostjo) ali 24 mesecev (faza v zvezi z rakotvor ­
nostjo) – glej tudi odstavka 33 in 34. Vsak druga čen režim odmerjanja, npr. 
pet dni na teden, je treba utemeljiti. V primeru dermalnega dajanja so živali 
s preskusno kemikalijo navadno tretirane vsaj 6 ur na dan 7 dni na teden, 
kot je navedeno v poglavju B.9 te priloge (11), prek obdobja 12 mesecev (faza v zvezi s kroni čno strupenostjo) ali 24 mesecev (faza v zvezi z rakot ­
vornostjo). Inhalacijska izpostavljenost se izvaja 6 ur na dan 7 dni na teden, 
uporabiti pa je mogo če tudi izpostavljenost 5 dni na teden, če je utemeljena. 
Obdobje izpostavljenosti praviloma traja 12 mesecev (faza v zvezi s kronično strupenostjo) ali 24 mesecev (faza v zvezi z rakotvornostjo). Če 
se z nosom izpostavijo vrste glodavcev, ki niso podgane, se lahko najdaljša 
obdobja izpostavljenosti prilagodijo, da se kar najbolj zmanjša trpljenje, 
značilno za uporabljeno vrsto. Obdobja izpostavljenosti, krajša od 6 ur na 
dan, je treba utemeljiti. Glej tudi poglavje B.8 te priloge (9). 
33. Če se preskusna kemikalija živalim daje z gavažo, je treba pri tem upora ­
bljati želod čno cevko ali ustrezno intubacijsko kanilo, postopek pa opravljati 
vsak dan ob podobnem času. Običajno živali dobijo enkraten odmerek 
enkrat na dan, če pa je kemikalija na primer lokalni dražljivec, se lahko 
dnevno odmerjena koli čina ohranja tudi z dajanjem polovi čnih odmerkov 
(dvakrat na dan). Najve čja količina tekočine, ki se lahko da naenkrat, je 
odvisna od velikosti preskusne živali. To koli čino je treba ohranjati tako 
majhno, kot je prakti čno, praviloma pa pri glodavcih ne sme prese či 1 
ml/100 g telesne teže (31). Spremenljivost preskusne koli čine je treba kar 
najbolj zmanjšati s prilagajanjem koncentracije, da se zagotovi konstantna 
količina pri vseh velikostih odmerkov. Izjema so potencialno jedke ali 
dražilne kemikalije, ki jih je treba razred čiti, da se prepre čijo resni lokalni 
učinki. Preskušanju pri koncentracijah, pri katerih obstaja verjetnost jedkosti 
ali dražilnosti za prebavni trakt, se je treba izogibati.
 
Trajanje študije  
34. Obdobje odmerjanja in faza te študije v zvezi s kroni čno strupenostjo 
običajno trajata 12 mesecev, je pa ta zasnova študije taka, da se lahko 
uporablja tudi za kratkoro čnejše (npr. 6- ali 9-mese čne) ali dolgoro čnejše 
(npr. 18- ali 24-mese čne) študije, glede na zahteve konkretnih zakonodajnih 
ureditev ali za posebne mehanisti čne namene. Odstopanja od 12-mese čnega 
obdobja izpostavljenosti je treba utemeljiti, zlasti krajša obdobja. Vse 
odmerne skupine, dodeljene tej fazi, se ob dolo čenem času prenehajo treti ­
rati, da se ocenijo kroni čna strupenost in ne-neoplasti čne patološke spre ­
membe. Satelitske skupine, vklju čene za spremljanje reverzibilnosti toksiko ­
loških sprememb, ki jih povzro či preiskovana preskusna kemikalija, se s 
preskusno kemikalijo ne tretirajo najmanj 4 tedne in najve č eno tretjino 
celotnega trajanja študije po koncu izpostavljenosti. 
35. Faza te študije v zvezi z rakotvornostjo pri glodavcih obi čajno traja 24 
mesecev in ustreza ve čini normalne življenjske dobe živali, ki bodo upora ­
bljene. Glede na življenjsko dobo in sev živalske vrste v študiji se lahko 
uporabijo tudi krajša ali daljša obdobja študije, vendar je treba to utemeljiti. 
Za nekatere seve miši, npr. AKR/J, C3H/J ali C57BL/6J, je lahko primer ­
nejše 18-mese čno obdobje. V nadaljevanju je nekaj napotkov o trajanju in 
zaključku študije ter preživetju; ve č napotkov, vklju čno s preudarki o spre ­
jemljivosti sprejemljivosti negativnih rezultatov študije rakotvornosti glede 
na preživetje v študiji, je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7).  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 492
 
— Kadar število preživelih živali v skupinah, tretiranih z manjšimi odmerki, 
ali kontrolni skupini pade pod 25 %, je treba razmisliti o zaklju čku 
študije. 
— Kadar zaradi strupenosti prezgodaj poginejo samo živali v skupini, treti ­
rani z velikim odmerkom, to ne sme biti razlog za zaklju ček študije. 
— Preživetje je treba obravnavati lo čeno za vsak spol. 
— Študija se ne sme podaljševati prek to čke, ko razpoložljivi podatki iz 
študije ne zadoš čajo več za statisti čno veljavno oceno.  
OPAZOVANJA (FAZA V ZVEZI S KRONI ČNO STRUPENOSTJO) 
36. Vse živali je treba pregledovati za odkrivanje obolevnosti ali smrtnosti, 
običajno na za četku in koncu vsakega dne, vklju čno s konci tedna in praz ­
niki. Splošna klini čna opazovanja je treba opraviti vsaj enkrat na dan, po 
možnosti vsak dan ob istem času in ob upoštevanju obdobja najve čje inten­
zivnosti pri čakovanih u činkov po vnosu odmerka, če gre za dajanje z 
gavažo. 
37. Podrobna klini čna opazovanja je treba opraviti na vseh živalih vsaj enkrat 
pred prvo izpostavljenostjo (za omogo čanje primerjav na istem osebku), ob 
koncu prvega tedna študije, zatem pa mese čno. Protokol za opazovanja je 
treba dolo čiti tako, da so razlike med posameznimi opazovalci čim manjše 
in neodvisne od preskusne skupine. Ta opazovanja je treba opraviti zunaj 
kletk, v katerih bivajo živali, po možnosti na standardnem mestu in vedno ob istem času. Opažanja je treba skrbno zabeležiti, po možnosti s sistemi 
točkovanja, ki jih izrecno dolo či preskuševalni laboratorij. Prizadevati si je 
treba, da se pogoji opazovanja čim manj spreminjajo. Pozornost je med 
drugim treba nameniti vsem spremembam na koži, kožuhu, o čeh in sluzni ­
cah, pojavu sekrecije in ekskrecije ter delovanju avtonomnega živ čevja (npr. 
solzenju, piloerekciji, velikosti zenic, nenavadnemu vzorcu dihanja). Prav 
tako je treba zabeležiti spremembe v hoji, drži in odzivu na ravnanje z 
živalmi, pa tudi prisotnost kloni čnih ali toni čnih gibov, stereotipij (npr. 
prekomernega čiščenja, ponavljajo čega se vrtenja v krogu) ali nenormalnega 
vedenja (npr. samopohabe, vzvratne hoje) (32). 
38. Na vseh živalih je treba pred prvim dajanjem preskusne kemikalije z oftal ­
moskopom ali drugo primerno opremo opraviti oftalmološko preiskavo. Ob 
koncu študije je treba to preiskavo po možnosti opraviti na vseh živalih, vsekakor pa vsaj pri skupini, tretirani z velikim odmerkom, in kontrolni skupini. Če se v o čeh zaznajo spremembe, povezane s tretiranjem, je 
treba pregledati vse živali. Če strukturna analiza ali druge informacije kažejo 
na strupenost za o či, je treba pogostnost preiskav o či povečati. 
39. Za kemikalije, v zvezi s katerimi je predhodni 28- in/ali 90-dnevni preskus 
strupenosti s ponavljajo čimi se odmerki nakazal potencial za povzro č
anje 
nevrotoksi čnih učinkov, se lahko po izbiri ocenijo senzori čne reakcije na 
različne vrste dražljajev (32) (npr. slušne, vidne in proprioceptivne dražljaje) 
(33) (34) (35), mo č oprijema (36) ter motori čna aktivnost (37), in sicer pred 
začetkom študije ter vsake 3 mesece po za četku študije do 12. meseca in 
vključno z njim, pa tudi ob koncu študije ( če je daljša od 12 mesecev). 
Nadaljnje podrobnosti glede mogo čih postopkov so na voljo v navedenih 
virih. Uporabiti je mogo če tudi druge postopke, ki v njih niso opisani.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 493
 
40. Za kemikalije, v zvezi s katerimi je predhodni 28- in/ali 90-dnevni preskus 
strupenosti s ponavljajo čimi se odmerki nakazal potencial za povzro čanje 
imunotoksi čnih učinkov, se lahko nadaljnje preiskave te kon čne točke po 
izbiri opravijo ob koncu študije.  
Telesna teža, poraba hrane/vode in izkoristek hrane  
41. Vse živali je treba stehtati na za četku tretiranja, vsaj enkrat na teden prvih 
13 tednov, zatem pa najmanj enkrat na mesec. Meritve porabe in izkoristka 
hrane je treba prvih 13 tednov opravljati vsaj enkrat na teden, nato pa najmanj enkrat na mesec. Kadar se preskusna kemikalija daje s pitno vodo, je treba porabo vode prvih 13 tednov meriti vsaj enkrat na teden, 
zatem pa najmanj enkrat na mesec. O meritvah porabe vode je treba razmi ­
sliti tudi pri študijah, pri katerih se spremenijo vzorci pitja.
 
Hematologija in klini čna biokemija  
42. V študijah z glodavci je treba hematološke preiskave opravljati na vseh 
živalih v študiji (10 samcih in 10 samicah na skupino), in sicer pri 3, 6 
in 12 mesecih, pa tudi ob koncu študije ( če je daljša od 12 mesecev). Pri 
miših so lahko za izvedbo vseh zahtevanih hematoloških preiskav potrebne satelitske živali (glej odstavek 19). V študijah na vrstah, ki niso glodavci, se 
vzorci jemljejo manjšemu številu živali (npr. 4 živalim na spol na skupino v 
študijah s psi) ob vmesnih vzor čenjih in ob koncu študije, kot je opisano za 
glodavce. Meritev pri 3 mesecih, pa naj gre za študije z glodavci ali vrstami, ki niso glodavci, ni treba opraviti, če v predhodni 90-dnevni študiji, izvedeni 
s primerljivimi velikostmi odmerkov, niso bili opaženi u činki na hemato ­
loške parametre. Vzorce krvi je treba odvzeti na imenovanem mestu, na primer s punkcijo srca ali iz retroorbitalnega sinusa, medtem ko je žival v anesteziji. 
43. Preiskati je treba naslednji seznam parametrov (38): skupno in diferencialno 
število levkocitov, število eritrocitov, število trombocitov, koncentracijo hemoglobina, hematokrit (volumen stisnjenih eritrocitov), povpre čni 
volumen eritrocitov (MCV), povpre čno koli čino hemoglobina v 
eritrocitih (MCH), povpre čno koncentracijo hemoglobina v 
eritrocitih (MCHC), protrombinski čas in aktivirani parcialni trombopla ­
stinski čas. Glede na strupenost preskusne kemikalije se lahko, kot je 
primerno, merijo tudi drugi hematološki parametri, kot so Heinzeva telesca ali druge netipi čne morfološke oblike eritrocitov ali methemoglobin. Na 
splošno je treba sprejeti prožni pristop glede na opažene in/ali pri čakovane 
učinke dane preskusne kemikalije. Če preskusna kemikalija u činkuje na 
krvotvorni sistem, sta lahko indicirana tudi meritev števila retikulocitov in citološka preiskava kostnega mozga, čeprav teh ni treba izvajati redno. 
44. Klini čne biokemi čne preiskave za ugotavljanje glavnih strupenih u činkov na 
tkiva ter zlasti ledvice in jetra je treba opravljati na vzorcih krvi, odvzetih vsem živalim v študiji (10 samcem in 10 samicam na skupino) v istih časovnih intervalih, kot so dolo čeni za hematološke preiskave. Pri miših 
so lahko za izvedbo vseh zahtevanih klini čnih biokemi čnih preiskav 
potrebne satelitske živali. V študijah na vrstah, ki niso glodavci, se vzorci jemljejo manjšemu številu živali (npr. 4 živalim na spol na skupino v študijah s psi) ob vmesnih vzor čenjih in ob koncu študije, kot je opisano 
za glodavce. Meritev pri 3 mesecih, pa naj gre za študije z glodavci ali 
vrstami, ki niso glodavci, ni treba opraviti, če v predhodni 90-dnevni študiji,
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 494
 
izvedeni s primerljivimi velikostmi odmerkov, niso bili opaženi u činki na 
klinične biokemi čne parametre. Pred odvzemom vzorcev krvi je priporo č­
ljivo živali čez noč postiti (kar pa ne velja za miši) (  1 ). Preiskati je treba 
naslednji seznam parametrov (38): glukozo, se čnino (sečninski dušik), krea ­
tinin, skupne beljakovine, albumin, kalcij, natrij, kalij, skupni holesterol, 
najmanj dva ustrezna preskusa za hepatocelularno oceno (alanin-aminotrans ­
feraza, aspartat-aminotransferaza, glutamat-dehidrogenaza, skupne žol čne 
kisline) (39) in najmanj dva ustrezna preskusa za hepatobiliarno oceno (alkalna fosfataza, γ-glutamil transferaza, 5’-nukleotidaza, skupni bilirubin, 
skupne žol čne kisline) (39). Glede na strupenost preskusne kemikalije se 
lahko, kot je primerno, merijo tudi drugi klini čni kemični parametri, kot so 
vrednost trigliceridov na teš če, specifi čni hormoni in holinesteraza. Na 
splošno je potreben prožni pristop glede na opažene in/ali pri čakovane 
učinke dane preskusne kemikalije. 
45. Analize urina je treba opravljati na vseh živalih v študiji (10 samcih in 10 
samicah na skupino) na vzorcih, zbranih v istih časovnih intervalih kot pri 
hematoloških in klini čnih kemi čnih preiskavah. Meritev pri 3 mesecih ni 
treba opraviti, če v predhodni 90-dnevni študiji, izvedeni s primerljivimi 
velikostmi odmerkov, niso bili opaženi u činki pri analizi urina. V strokovno 
priporočilo glede klini čnih patoloških študij (38) je bil vklju čen naslednji 
seznam parametrov: videz, koli čina, osmolalnost ali specifi čna teža, pH, 
skupne beljakovine in glukoza. Druge dolo čitve vklju čujejo keton, urobili ­
nogen, bilirubin in okultno kri. Če je treba preiskavo opaženih u činkov 
razširiti, se lahko uporabijo dodatni parametri. 
46. Na splošno se šteje, da je v študijah s psi pred tretiranjem treba dolo čiti 
izhodiščne hematološke in klini čne biokemi čne spremenljivke, v študijah z 
glodavci pa to ni potrebno (38). Če pa so pretekli izhodiš čni podatki (glej 
odstavek 58) nezadostni, je treba razmisliti o pripravi takih podatkov.
 
PATOLOGIJA  
Makroskopska obdukcija  
47. Praviloma se na vseh živalih v študiji opravi popolna in natan čna makro ­
skopska obdukcija, ki obsega natan čen pregled zunanje površine telesa, vseh 
odprtin, lobanjske, prsne in trebušne votline ter njihove vsebine. Lahko pa se tudi predvidi (za skupine za vmesno usmrtitev ali satelitske skupine), da se meritve omejijo na specifi čna ključna merila, kot sta nevrotoksi čnost ali 
imunotoksi čnost (glej odstavek 21). Obdukcija in poznejši postopki, opisani 
v naslednjih odstavkih, pri teh živalih niso potrebni. Za opozorilne živali je lahko obdukcija potrebna v posameznih primerih, o čemer odlo ča vodja 
študije.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 495  
( 1 ) Za številne preiskave seruma in plazme, zlasti za dolo čanje glukoze, se priporo ča 
postenje čez noč. Glavni razlog za to je, da bi pove čana spremenljivost, ki bi se zagotovo 
pojavila, če se žival ne bi postila, lahko prikrila manj opazne u činke in otežila razlago. 
Vendar je treba opozoriti, da lahko postenje čez noč spremeni splošni metabolizem živali 
in lahko zlasti pri študijah prehranjevanja povzro či motnje v dnevni izpostavljenosti 
preskusni kemikaliji. Vse živali je treba ocenjevati v enakem fiziološkem stanju, zato 
se podrobne ali nevrološke ocene po možnosti izvedejo drug dan kot jemanje vzorcev za 
klinične biokemi čne preiskave.
 48. Stehtati je treba organe vseh živalih, razen tistih, ki se izklju čijo na podlagi 
zadnjega dela odstavka 47. Z nadledvi čnih žlez, možganov, nadmodka, srca, 
ledvic, jeter, jaj čnikov, vranice, mod, š čitnice (stehtane po fiksaciji skupaj z 
obščitnicami) in maternice vseh živali (razen živali, ki so bile najdene 
umirajoče in/ali so bile usmr čene med študijo) je treba, kot je ustrezno, 
odstraniti vsa priraš čena tkiva in nato izmeriti njihovo mokro težo čim 
prej po disekciji, da se ne izsušijo. 
49. Naslednja tkiva je treba shraniti v fiksacijskem sredstvu, ki je najprimernejše 
za vrsto tkiva in predvideno poznejšo histopatološko preiskavo (40) (tkiva v 
oglatih oklepajih niso obvezna): 
vse vidne lezije srce trebušna slinavka želodec (predželodec, žlezni 
želodec) 
nadledvična žleza vito črevo obš čitnica [zobje] 
aorta teš če črevo periferni živec modo 
možgani (vklju čno z rezi ­
nami velikih in malih 
možganov ter podaljšane 
hrbtenjače/mosta) ledvica hipofiza priželjc 
slepo črevo solzna žleza (zunaj 
očesne votline) prostata š čitnica 
maternični vrat jetra rektum [jezik] 
koagulacijska žleza plju ča žleza slinavka sapnik 
debelo črevo bezgavke (povrhnje in 
globoke) semenski meši ček se čni mehur 
dvanajsternik mle čna žleza (obvezna 
za samice, in če jo je 
mogoče secirati s 
prostim o česom, za 
samce) skeletna mišica maternica (vklju čno z 
vratom) 
nadmodek [zgornja dihala, vklju čno 
z nosom, nosnimi školj ­
kami in obnosnimi votli ­
nami] koža [se čevod] 
oko (vklju čno z mrežnico) požiralnik hrbtenja ča (na treh 
ravneh: vratni, prsni in ledveni) [sečnica] 
[stegnenica s sklepom] [vohalni beti č] vranica vagina 
žolčnik (pri vrstah, ki niso 
podgane) jajčnik [prsnica] rezina in/ali svež punktat 
kostnega mozga 
Harderjeva žleza
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 496
 
Pri parnih organih, npr. ledvicah ali nadledvi čnih žlezah, je treba shraniti 
oba organa. Na podlagi klini čnih in drugih izsledkov se lahko pokaže 
potreba po preiskavah dodatnih tkiv. Poleg tega je treba shraniti vse organe, ki bi lahko bili ciljni organi glede na znane lastnosti preskusne kemikalije. V študijah z dermalnim na činom dajanja je treba pregledati iste organe, kot so 
določeni na seznamu za oralni na čin, potrebno pa je posebno vzor čenje in 
shranjevanje kože z mesta nanosa. V inhalacijskih študijah je treba v zvezi s seznamom shranjenih in pregledanih tkiv dihal slediti priporo čilom iz 
poglavij B.8 (9) in B.29 te priloge (10). Za druge organe/tkiva (in poleg 
posebej shranjenih tkiv dihal) je treba preu čiti seznam organov, dolo čen za 
oralni način dajanja.
 
Histopatologija  
50. Na voljo so napotki o najboljših praksah pri izvajanju toksikoloških patolo ­ 
ških študij (40). Histopatološke preiskave morajo obsegati vsaj: 
— vsa tkiva živali iz skupine, tretirane z velikim odmerkom, in kontrolne 
skupine, 
— vsa tkiva živali, ki so poginile ali bile usmr čene med študijo, 
— vsa tkiva, ki kažejo makroskopske abnormalnosti, — ciljna tkiva ali tkiva, pri katerih so bile v skupini, tretirani z velikim 
odmerkom, opažene s tretiranjem povezane spremembe, vseh živali iz 
vseh drugih odmernih skupin, 
— pri parnih organih, npr. ledvicah ali nadledvi čnih žlezah, je treba pregle ­
dati oba organa.
 
OPAZOVANJA (FAZA V ZVEZI Z RAKOTVORNOSTJO) 
51. Vse živali je treba pregledovati za odkrivanje obolevnosti ali smrtnosti, 
običajno na za četku in koncu vsakega dne, vklju čno s konci tedna in praz ­
niki. Poleg tega je treba živali pregledati enkrat na dan za odkrivanje konkretnih toksikološko pomembnih znakov. Pri študijah, v katerih se 
uporabi gavaža, je treba živali pregledati takoj po vnosu odmerka. Posebno 
pozornost je treba nameniti nastanku tumorjev ter zabeležiti čas nastopa, 
mesto, mere, videz in progresijo vsakega makroskopsko vidnega ali otiplji ­
vega tumorja. 
52. Vse živali je treba stehtati na za četku tretiranja, vsaj enkrat na teden prvih 
13 tednov, zatem pa najmanj enkrat na mesec. Meritve porabe in izkoristka 
hrane je treba prvih 13 tednov opravljati vsaj enkrat na teden, nato pa najmanj enkrat na mesec. Kadar se preskusna kemikalija daje s pitno vodo, je treba porabo vode prvih 13 tednov meriti vsaj enkrat na teden, 
zatem pa najmanj enkrat na mesec. O meritvah porabe vode je treba razmi ­
sliti tudi pri študijah, pri katerih se spremenijo vzorci pitja.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 497
 
Hematološke, klini čne biokemi čne in druge meritve  
53. Da bi se s študijo pridobilo kar najve č informacij, zlasti kar zadeva razmi ­
sleke o na činu delovanja, se lahko jemljejo vzorci krvi za hematološke in 
klinične biokemi čne preiskave, čeprav o tem odlo ča vodja študije. Primerna 
je lahko tudi analiza urina. Informacije o teh parametrih se zagotovijo s 
podatki, ki so bili pridobljeni z živalmi, uporabljenimi v fazi študije v zvezi s kroni čno strupenostjo, ki obi čajno traja 12 mesecev (odstavek 34). 
Več napotkov o vrednosti jemanja takih vzorcev v okviru študije rakotvor ­
nosti je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). Če se odvzamejo 
vzorci krvi, je treba to storiti ob koncu preskusnega obdobja, tik pred postopkom usmrtitve živali ali v okviru tega postopka. Odvzeti jih je 
treba na imenovanem mestu, na primer s punkcijo srca ali iz retroorbitalnega 
sinusa, medtem ko je žival v anesteziji. Za pregled se lahko pripravijo tudi krvni razmazi, zlasti če kaže, da je ciljni organ kostni mozeg, čeprav so bili 
izraženi dvomi o vrednosti takega pregleda krvnih razmazov v fazi v zvezi z 
rakotvornostjo za ocenjevanje rakotvornega/onkogenega potenciala (38).
 
PATOLOGIJA  
Makroskopska obdukcija  
54. Na vseh živalih v študiji, razen na opozorilnih in drugih satelitskih živalih 
(glej odstavek 20), se opravi popolna in natan čna makroskopska obdukcija, 
ki obsega natan čen pregled zunanje površine telesa, vseh odprtin, lobanjske, 
prsne in trebušne votline ter njihove vsebine. Za opozorilne in druge sate ­
litske živali je lahko obdukcija potrebna v posameznih primerih, o čemer 
odloča vodja študije. Tehtanje organov navadno ni del študije rakotvornosti, 
saj je zaradi sprememb, povezanih s staranjem, v poznejših fazah pa zaradi nastanka tumorjev, lahko motena koristnost podatkov o teži organov. So pa lahko ti podatki odlo čilni za oceno zanesljivosti dokazov in zlasti za 
preudarke v zvezi z na činom delovanja. Če je teža organov del satelitske 
študije, jo je treba izmeriti najpozneje eno leto po za četku študije. 
55. Naslednja tkiva je treba shraniti v fiksacijskem sredstvu, ki je najprimernejše 
za vrsto tkiva in predvideno poznejšo histopatološko preiskavo (40) (tkiva v 
oglatih oklepajih niso obvezna): 
vse vidne lezije srce trebušna slinavka želodec (predželodec, žlezni 
želodec) 
nadledvična žleza vito črevo obš čitnica [zobje] 
aorta teš če črevo periferni živec modo 
možgani (vklju čno z rezi ­
nami velikih in malih možganov ter podaljšane 
hrbtenjače/mosta) ledvica hipofiza priželjc 
slepo črevo solzna žleza (zunaj 
očesne votline) prostata š čitnica 
maternični vrat jetra danka [jezik] 
koagulacijska žleza plju ča žleza slinavka sapnik 
debelo črevo bezgavke (povrhnje in 
globoke) semenski meši ček se čni mehur
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 498
 
dvanajsternik mle čna žleza (obvezna 
za samice, in če jo je 
mogoče secirati s 
prostim o česom, za 
samce) skeletna mišica maternica (vklju čno z 
vratom) 
nadmodek [zgornja dihala, vklju čno 
z nosom, nosnimi školj ­
kami in obnosnimi votli ­
nami] koža [se čevod] 
oko (vklju čno z mrežnico) požiralnik hrbtenja ča (na treh 
ravneh: vratni, prsni in 
ledveni) [sečnica] 
[stegnenica s sklepom] [vohalni beti č] vranica vagina 
žolčnik (pri vrstah, ki niso 
podgane) jajčnik [prsnica] rezina in/ali svež punktat 
kostnega mozga 
Harderjeva žleza 
Pri parnih organih, npr. ledvicah ali nadledvi čnih žlezah, je treba shraniti 
oba organa. Na podlagi klini čnih in drugih izsledkov se lahko pokaže 
potreba po preiskavah dodatnih tkiv. Poleg tega je treba shraniti vse organe, ki bi lahko bili ciljni organi glede na znane lastnosti preskusne kemikalije. V študijah z dermalnim na činom dajanja je treba pregledati iste organe, kot so 
določeni na seznamu za oralni na čin, potrebno pa je posebno vzor čenje in 
shranjevanje kože z mesta nanosa. V inhalacijskih študijah je treba v zvezi s seznamom shranjenih in pregledanih tkiv dihal slediti priporo čilom iz 
poglavij B.8 (8) in B.29 te priloge (9). Za druge organe/tkiva (in poleg 
posebej shranjenih tkiv dihal) je treba preu čiti seznam organov, dolo čen 
za oralni na čin dajanja.
 
Histopatologija  
56. Na voljo so napotki o najboljših praksah pri izvajanju toksikoloških patolo ­ 
ških študij (40). Pregledati je treba vsaj naslednja tkiva: 
— vsa tkiva živali iz skupine, tretirane z velikim odmerkom, in kontrolne 
skupine, 
— vsa tkiva živali, ki so poginile ali bile usmr čene med študijo, 
— vsa tkiva, ki kažejo makroskopske abnormalnosti, vklju čno s tumorji, 
— kadar so bile v skupini, tretirani z velikim odmerkom, opažene s tretira ­
njem povezane histopatološke spremembe, je treba pregledati ista tkiva vseh živali iz vseh drugih odmernih skupin, 
— pri parnih organih, npr. ledvicah ali nadledvi čnih žlezah, je treba pregle ­
dati oba organa.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 499
 
PODATKI IN PORO ČANJE (FAZA V ZVEZI Z RAKOTVORNOSTJO IN 
FAZA V ZVEZI S KRONI ČNO STRUPENOSTJO)  
Podatki  
57. Navesti je treba podatke za posamezne živali za vse ocenjevane parametre. 
Poleg tega je treba vse podatke povzeti v preglednicah, v katerih se za vsako preskusno skupino navede število živali na za četku preskusa, število živali, 
ki so bile med preskusom najdene poginule ali so bile usmr čene iz humanih 
razlogov, in čas vsake smrti ali humane usmrtitve, število živali, ki kažejo 
znake strupenosti, opis opaženih znakov zastrupitve, vklju čno s časom 
njihovega nastopa, trajanjem in resnostjo vseh strupenih u činkov, ter število 
živali, pri katerih so opažene lezije, vrste lezij in odstotek živali, pri katerih 
je opažena posamezna vrsta lezije. V preglednicah s povzetimi podatki je treba navesti srednje vrednosti in standardne odklone (za preskusne podatke, ki se nenehno zbirajo) za živali, pri katerih so opaženi strupeni u činki ali 
lezije, ter razvrstitev lezij. 
58. Pretekli kontrolni podatki so lahko dragoceni za razlago rezultatov študije, 
npr. kadar obstajajo znaki, da podatki, zagotovljeni s so časnimi kontrolami, 
bistveno odstopajo od nedavnih podatkov, pridobljenih na kontrolnih živalih iz istega preskuševalnega laboratorija/kolonije. Če se ocenjujejo pretekli 
kontrolni podatki, morajo izhajati iz istega laboratorija, se nanašati na živali 
iste starosti in seva, poleg tega pa morajo biti pridobljeni v petih letih pred 
zadevno študijo. 
59. Če je ustrezno, je treba števil čne rezultate ocenjevati na podlagi primerne in 
splošno priznane statisti čne metode. Statisti čne metode in podatke, ki bodo 
analizirani, je treba izbrati pri zasnovi študije (odstavek 9). V izbiri je treba predvideti prilagoditve glede na preživetje, če so potrebne. 
60. Poro čilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije:  
Preskusna kemikalija  
— agregatno stanje, čistost in fizikalno-kemijske lastnosti, 
— identifikacijske podatke, 
— izvor kemikalije, 
— številko serije, — potrdilo o kemijski analizi.  
Nosilec (če je ustrezno)  
— utemeljitev izbire nosilca ( če to ni voda).  
Preskusne živali  
— uporabljeno vrsto/sev in utemeljitev izbire, 
— število, starost in spol živali na za četku preskusa, 
— izvor, nastanitvene pogoje, hrano itd., 
— težo vsake živali ob za četku preskusa.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 500
 
Preskusni pogoji  
— utemeljitev na čina dajanja in izbire odmerkov, 
— če je ustrezno, uporabljene statisti čne metode za analizo podatkov, 
— podatke o formulaciji preskusne kemikalije/pripravi hrane, 
— analitske podatke o doseženi koncentraciji, stabilnosti in homogenosti 
pripravka, 
— način dajanja in podatke o dajanju preskusne kemikalije, 
— za inhalacijske študije informacijo, ali je bila uporabljena izpostavljenost 
nosu ali izpostavljenost celega telesa, 
— dejanske odmerke (mg/kg telesne teže/dan) in faktor za pretvorbo 
koncentracije preskusne snovi v hrani/pitni vodi (mg/kg ali ppm) v dejanski odmerek, če je primerno, 
— podatke o kakovosti hrane in vode.  
Rezultati (predstaviti je treba povzete podatke v preglednicah in podatke za 
posamezne živali) 
Splošno  
— podatke o preživetju, — telesno težo/spremembe telesne teže, — porabo hrane, izra čune izkoristka hrane, če so bili narejeni, in porabo 
vode, če je ustrezno, 
— toksikokineti čne podatke, če so na voljo, 
— oftalmoskopiranje ( če so podatki na voljo), 
— hematologijo ( če so podatki na voljo), 
— klinično kemijo ( če so podatki na voljo).  
Klinični izsledki  
— znake zastrupitve, — pojavnost (in resnost, če se ocenjuje) vseh abnormalnosti, 
— vrsto, resnost in trajanje klini čnih opažanj (prehodnih ali trajnih).  
Obdukcijski podatki  
— terminalno telesno težo, — težo organov in razmerja med težami organov, če je ustrezno, 
— izsledke obdukcije; pojavnost in resnost abnormalnosti.  
Histopatologija  
— neneoplasti čne ugotovitve histopatoloških preiskav, 
— neoplasti čne ugotovitve histopatoloških preiskav,
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 501
 
— povezanost makroskopskih in mikroskopskih ugotovitev, 
— podroben opis vseh s tretiranjem povezanih ugotovitev histopatoloških 
preiskav, vklju čno z razvrstitvami resnosti, 
— navedbo morebitnih medsebojnih strokovnih pregledov mikroskopskih 
preparatov.  
Statistična obdelava rezultatov, če je ustrezno 
Razprava o rezultatih  
— razpravo o pristopih modeliranja, 
— razmerja med odmerkom in odzivom, — pretekle kontrolne podatke, 
— preučitev vseh informacij o na činu delovanja, 
— določitev BMD, NOAEL ali LOAEL, 
— pomembnost za ljudi.  
Sklepi.
 
VIRI:  
(1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rim, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Pariz. 
(2) EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency, Washington, DC. 
(3) Combes, R. D., Gaunt, I., Balls, M. (2004). A Scientific and Animal 
Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the 
Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. 
ATLA 32: 163–208. 
(4) Barlow, S. M., Greig, J. B., Bridges, J. W., idr. (2002). Hazard identifica ­
tion by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145–191. 
(5) Chhabra, R. S., Bucher, J. R., Wolfe, M., Portier, C. (2003). Toxicity 
characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445. 
(6) Poglavje B.27 te priloge, Preskus subkroni čne oralne toksi čnosti: 90-dnevna 
študija oralne toksi čnosti s ponavljajo čimi se odmerki na neglodalcih. 
(7) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 – druga izdaja. Series on Testing and Assessment No. 116, na 
voljo na javni spletni strani OECD o smernicah za preskušanje na naslovu 
www.oecd.org/env/testguidelines. 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz. 
(9) Poglavje B.8 te priloge, Subakutna strupenost pri vdihavanju: 28-dnevna 
študija. 
(10) Poglavje B.29 te priloge, Subkroni čna strupenost pri vdihavanju: 90-dnevna 
študija. 
(11) Poglavje B.9 te priloge, Strupenost (v stiku s kožo) pri ponavljajo čem se 
odmerku (28 dni).
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 502
 
(12) Boobis, A. R., Cohen, S. M., Dellarco, V., McGregor, D., Meek, M. E., 
Vickers, C., Willcocks, D., Farland, W. (2006). IPCS Framework for analy ­
zing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36: 793–801. 
(13) Cohen, S. M., Meek, M. E., Klaunig, J. E., Patton, D. E., Fenner-Crisp, P. 
A. (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33: 581–589. 
(14) Holsapple, M. P., Pitot, H. C., Cohen, S. N., Boobis, A. R., Klaunig, J. E., 
Pastoor, T., Dellarco, V. L., Dragan, Y. P. (2006). Mode of Action in 
Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 
89: 51–56. 
(15) Meek, E. M., Bucher, J. R., Cohen, S. M., Dellarco, V., Hill, R. N., 
Lehman-McKemmon, L. D., Longfellow, D. G., Pastoor, T., Seed, J., Patton, D. E. (2003). A Framework for Human Relevance analysis of 
Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33: 
591–653. 
(16) Carmichael, N. G., Barton, H. A., Boobis, A. R., idr. (2006). Agricultural 
Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Crit. Rev. Toxicol. 36, 1–7. 
(17) Barton, H. A., Pastoor, T. P., Baetcke, T., idr. (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. 
Crit. Rev. Toxicol. 36: 9–35. 
(18) Doe, J. E., Boobis, A. R., Blacker, A., idr. (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 37–68. 
(19) Cooper, R. L., Lamb, J. S., Barlow, S. M., idr. (2006). A Tiered Approach 
to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 69–98. 
(20) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment 
No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, 
OECD, Pariz. 
(21) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Pariz. 
(22) Rhomberg, L. R., Baetcke, K., Blancato, J., Bus, J., Cohen, S., Conolly, R., 
Dixit, R., Doe, J., Ekelman, K., Fenner-Crisp, P., Harvey, P., Hattis, D., 
Jacobs, A., Jacobson-Kram, D., Lewandowski, T., Liteplo, R., Pelkonen, O., Rice, J., Somers, D., Turturro, A., West, W., Olin, S. (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies 
in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 
729–837. 
(23) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran, J. A. (ur.). ILSI Press, Washington, DC. 
(24) Griffiths, S. A., Parkinson, C., McAuslane, J. A. N., in Lumley, C. E. 
(1994). The utility of the second rodent species in the carcinogenicity 
testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1): 214. 
(25) Usui, T., Griffiths, S. A., in Lumley, C. E. (1996). The utility of the mouse 
for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. V: 
D’Arcy POF & Harron DWG (ur.). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. str. 279–284. 
(26) Carmichael, N. G., Enzmann, H., Pate, I., Waechter, F. (1997). The Signi ­
ficance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Asses ­
sment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing 
by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105: 1196–1203.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 503
 
(27) Direktiva 2010/63/EU Evropskega parlamenta in Sveta z dne 22. septembra 
2010 o zaš čiti živali, ki se uporabljajo v znanstvene namene (UL L 276, 
20.10.2010, str. 33). 
(28) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services. 
(29) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, december, 1989). Publication on the Planning and Struc ­
ture of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-06-9. 
(30) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals 
in various housing systems. 
(31) Diehl, K.-H., Hull, R., Morton, D., Pfister, R., Rabemampianina, Y., Smith, 
D., Vidal, J.-M., van de Vorstenbosch, C. 2001. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology, 21: 15–23. 
(32) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60. 
(33) Tupper, D. E., Wallace, R. B. (1980). Utility of the Neurologic Examination 
in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003. 
(34) Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxico ­
logy. J. Toxicol. Environ. Health 9: 691–704. 
(35) Moser, V. C., McDaniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat Strain and 
Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline 
Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283. 
(36) Meyer, O. A., Tilson, H. A., Byrd, W. C., Riley, M. T. (1979). A Method 
for the Routine Assessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236. 
(37) Crofton, K. M., Howard, J. L., Moser, V. C., Gill, M. W., Reiter, L. W., 
Tilson, H. A., MacPhail, R. C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor 
Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599–609. 
(38) Weingand, K., Brown, G., Hall, R., idr. (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & 
Appl. Toxicol. 29: 198–201. 
(39) (Osnutek) dokumenta agencije EMEA z naslovom „Non-clinical guideline 
on drug-induced hepatotoxicity“ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/ a50115/2006). 
(40) Crissman, J. W., Goodman, D. G., Hildebrandt, P. K., idr. (2004). Best 
Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 
32: 126–131.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 504
 
Dodatek 1  
OPREDELITEV POJMOV  
Preskusna kemikalija:  snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne 
metode.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 505
 
B.34  PRESKUS STRUPENOSTI ZA RAZMNOŽEVANJE NA ENI 
GENERACIJI  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Glej Splošni uvod dela B.  
1.2 OPREDELITEV POJMOV 
Glej Splošni uvod dela B.  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Jih ni.  
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Preskusna snov se daje dnevno, v graduiranih odmerkih, nekaj 
skupinam samcev in samic. Samcem je treba dajati odmerke med 
rastjo in tekom najmanj enega zaklju čenega cikla spermatogeneze 
(približno 56 dni pri miših in 70 dni pri podganah), da bi preskusna 
snov lahko povzro čila škodljive u činke na spermatogenezo. 
Samicam iz starševske generacije (P) je treba odmerke dajati tekom 
najmanj dveh zaklju čenih pojatvenih ciklusov, da bi preskusna snov 
lahko povzro čila škodljive u činke na pojatev. Živali se potem parijo. 
Preskusna snov se daje obema spoloma v času parjenja, pozneje pa 
samo še samicam v času brej osti in dokler traja dojenje. Za dajanje 
z inhalacijo je treba metodo prilagoditi.  
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Jih ni.  
1.6 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.6.1  P r i p r a v e  
Pred preskusom se naklju čno izberejo zdrave mlade živali in se 
razporedijo v preskusne ter kontrolne skupine. Živali se vzdržujejo v preskusnih nastanitvenih in prehranjevalnih pogojih najmanj pet 
dni pred preskusom. Preskusno snov je priporo čljivo dajati s hrano 
ali v pitni vodi. Sprejemljivi so tudi drugi na čini dajanja. Vsem 
živalim je treba dajati odmerke z enako metodo v ustreznem preskusnem obdobju. Če se za lažje dajanje odmerkov uporabi 
nosilec ali drugi dodatki, se je treba prepri čati, da le-ti ne povzro čajo 
strupenih u činkov. Odmerke je treba dajati sedem dni na teden.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 506
 
1.6.2 P r e s k u s n e ž i v a l i  
Izbor vrst 
Priporočeni vrsti sta miš in podgana. Uporabiti je treba zdrave živali, 
ki niso bile izpostavljene predhodnim preskusnim postopkom. Sevi z nizko plodnostjo naj se ne uporabljajo. Preskusne živali je treba 
opredeliti po vrsti, sevu, spolu, teži in/ali starosti. 
Za ustrezno oceno plodnosti je treba preu čiti samce in samice. Vse 
preskusne in kontrolne živali je treba odstaviti od sesanja pred začetkom dajanja odmerkov.
 
Število in spol 
Vsaka preskusna in kontrolna skupina naj ima zadostno število 
živali, da bo pri ali tik pred rokom skotitve vsebovala okrog 20 brejih samic. 
Cilj je ustvariti zadosti primerov brej osti in mladi čev, s čimer se 
zagotovi pomenljiva ocena zmožnosti u činkovanja snovi na plodnost, 
brej ost in materinsko vedenje v starševski P generaciji živali, ter na 
sesanje, rast in razvoj mladi čev F1 od zaploditve do odstavitve od 
sesanja.
 
1.6.3 P r e s k u s n i p o g o j i 
Hrano in vodo je treba priskrbeti ad libitum. Ko se bliža kotitev, je 
treba breje samice razvrstiti po materinskih kletkah ali kletkah za 
kotitev posamezno ter priskrbeti material za izdelavo gnezda.  
1.6.3.1 V e l i k o s t i o d m e r k a 
Uporabiti je treba najmanj tri preskusne in eno kontrolno skupino. 
Če je pri dajanju preskusne snovi uporabljen nosilec, naj bi kontrolna 
skupina prejela nosilec v najve čji uporabljeni velikosti. Če preskusna 
snov povzro či manjši vnos ali izkoristek hrane, potem bi bila lahko 
potrebna uporaba paralelne kontrolne skupine za hrano. V najboljšem 
primeru najvišja velikost odmerka, razen če je ne omejujejo fizikal ­
ne/kemijske lastnosti ali biološki u činki preskusne snovi, povzro či 
strupenost, vendar ne smrtnosti, pri starševskih (P) živalih. Srednja 
velikost ali velikosti odmerka naj povzro čijo minimalne strupene 
učinke, ki se jih lahko pripiše preskusni snovi, nizek odmerek pa 
ne bi sme povzro čiti nikakršnih vidnih škodljivih u činkov na starših 
ali potomcih. Kadar se odmerek posameznim živalim daje z gavažo 
ali s kapsulo, ga je treba odmeriti na podlagi telesne mase posa ­
mezne živali in tedensko prilagajati spremembam telesne mase. Pri samicah v času brej osti lahko odmerki temeljijo na telesni masi na 
dan brej osti 0 ali 6, če je tako želeno.
 
1.6.3.2 M e j n i p r e s k u s 
V primeru snovi nizke strupenosti, kadar velikost odmerka najmanj 
1 000 mg/kilogram ne povzro či nikakršnih znakov motenja razmno ­ 
ževanja, študije pri drugih velikostih odmerka verjetno ne bodo potrebne. Če predhodna študija pri visoki velikosti odmerka z 
jasnimi znaki maternalne strupenosti ne pokaže nikakršnih škodljivih 
učinkov na plodnost, študije pri drugih velikosti odmerka verjetno ne 
bodo potrebne.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 507
 
1.6.3.3  Izvajanje preskusa  
Č a s o v n i r a z p o r e d p r e s k u s a 
Vsakodnevno dajanje odmerkov starševskim (P) samcem naj se za čne 
pri starosti okrog pet do devet tednov, potem ko so že najmanj pet dni odstavljeni od sesanja in prilagojeni preskusnim pogojem. Pri 
podganah se dajanje odmerkov nadaljuje 10 tednov pred obdobjem 
parjenja (osem tednov pri miših). Samce je treba usmrtiti in pregledati ali na koncu obdobja parjenja ali pa se lahko ohranijo na preskusni hrani za morebitno produkcijo drugega zaroda in se usmrtijo in pregle ­
dajo enkrat pred koncem študije. Pri starševskih (P) samicah se dajanje 
odmerkov za čne najmanj po petih dneh prilagajanja preskusnim 
pogojem in se nadaljuje najmanj dva tedna pred parjenjem. Vsako ­
dnevno dajanje odmerkov starševskim samicam naj se nadaljuje še 
skozi tritedensko obdobje parjenja, brej osti in vse do odstavitve od 
sesanja mladi čev F1. Upoštevati je treba spremembe časovnega 
razporeda dajanja odmerkov, utemeljenega na drugih razpoložljivih informacijah o preskusni snovi, kot je indukcija metabolizma ali 
bioakumulacije.
 
P o s t o p e k p a r j e n j a 
Pri preskusih strupenosti za razmnoževanje je mogo če uporabiti 
parjenje v razmerju ali 1:1 (en samec na eno samico) ali 1:2 (en 
samec na dve samici). 
Pri parjenju 1:1 se samica nastani z istim samcem vse do spo četja ali 
dokler ne pote čejo trije tedni. Vsako jutro se samice pregledajo za 
prisotnost semen čec ali vaginalnih zamaškov. Dan 0 brejosti je dan, 
ko se odkrije vaginalni zamašek ali semen čeca. 
Tiste pare, ki se ne uspejo spariti, je treba preu čiti, da bi se dolo čil 
vzrok navidezne neplodnosti. 
To lahko zajema postopke, kot so omogo čanje dodatnih priložnosti 
za parjenje z drugimi dokazanimi o četi samci ali materami samicami, 
mikroskopski pregledi razmnoževalnih organov in pregled pojatve ­
nega ciklusa ali spermatogeneze.  
V e l i k o s t i z a r o d a 
Živalim, ki jim je dan odmerek med študijo plodnosti, se omogo či, 
da skotijo na normalen na čin in vzredijo svoje mladi če do odstavitve 
od sesanja brez standardiziranja zarodov. 
Kjer se opravi standardizirane zaroda, se predlaga naslednji posto ­
pek. V času od prvega do četrtega dne po skotitvi se lahko velikost 
vsakega zaroda prilagodi z izlo čitvijo odve čnih mladi čev, da bi se 
dobilo, če je to mogo če, štiri samce in štiri samice na zarod. 
Kadar število mladih samcev in samic ne omogo ča, da bi jih v 
vsakem zarodu bilo po štiri na spol, je sprejemljiva tudi delna prila ­
goditev (na primer, pet samcev in tri samice). Prilagoditve se ne 
uporabljajo za primer zarodov z manj kot osmimi mladi či. ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 508
 
1.6.4 O p a z o v a n j a 
Tekom celotnega preskusnega obdobja je treba žival opazovati 
najmanj enkrat dnevno. Ustrezne vedenjske spremembe, znake težke ali podaljšane kotitve in vse znake strupenosti, vklju čno s 
smrtnostjo, je treba zabeležiti. V obdobju pred in med parjenjem je 
treba vsak dan meriti porabo hrane. Po kotitvi in v času dojenja je 
treba merjenje porabe hrane (hkrati z merjenjem porabe vode, kadar se preskusna snov daje s pitno vodo) meriti na isti dan, kot se tehta 
zarod. Starševske samce in samice je treba stehtati prvi dan dajanja 
odmerka, potem pa enkrat tedensko. O navedenih opazovanjih je treba poro čati za vsako odraslo žival posebej. 
Trajanje brej osti je treba ra čunati od dneva 0 brej osti. Vsak zarod je 
treba pregledati čim prej po skotitvi, da bi se dolo čilo število in spol 
mladičev, mrtvorojene in živorojene živali ter prisotnost vidnih 
anomalij. 
Mrtve mladi če in mladi če, žrtvovane na četrti dan, je treba shraniti in 
preučiti glede možnih okvar. Žive mladi če je treba prešteti in zarode 
stehtati na jutro po skotitvi, četrti in sedmi dan ter potem še enkrat 
tedensko do zaklju čka študije, ko je treba živali stehtati posamezno. 
Zabeležiti je treba fizi čne in vedenjske abnormalnosti, opažene na 
materah samicah ali mladi čih.
 
1.6.5 P a t o l o g i j a  
1.6.5.1 N e k r o p s i j a 
Ob žrtvovanju ali smrti med študijo je treba na živalih iz starševske 
generacije opraviti makroskopski pregled, da bi se odkrile vse struk ­
turalne abnormalnosti ali patološke spremembe, pri čemer se 
posebno pozornost posveti na razmnoževalnemu sistemu. Mrtve ali 
umirajoče mladiče je treba pregledati, da bi se odkrile okvare.  
1.6.5.2 H i s t o p a t o l o g i j a 
Jajčnike, maternico, materni čni vrat, vagino, moda, obmodke, seme ­
njake, prostato, sprednji reženj prostate, hipofizo in ciljne organe 
vseh starševskih živali je treba shraniti za mikroskopski pregled. V 
primeru, da ti organi niso bili pregledani v drugih študijah z ve čkra­
tnimi odmerki, jih je treba, kadar je to izvedljivo, mikroskopsko pregledati na vseh živalih iz skupine z visokim odmerkom in 
kontrolne skupine ter na živalih, ki so umrle med študijo. 
Organe, ki na navedenih živalih pokažejo abnormalnosti, je treba 
potem pregledati še na vseh ostalih starševskih živalih. V teh primerih je treba opraviti mikroskopski pregled vseh tkiv, ki kažejo vidne patološke spremembe. Kot je bilo predlagano v okviru 
postopkov parjenja, se mikroskopskemu pregledu lahko izpostavijo 
razmnoževalni organi živali, pri katerih se sumi neplodnost.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 509
 
2. PODATKI  
Podatki se povzamejo v obliki tabele, iz katere je za vsako preskusno 
skupino razvidno število živali na za četku preskusa, število plodnih 
samcev, število brejih samic, tipe sprememb in odstotek živali, ki 
kažejo dolo čen tip spremembe. 
Kadar je to mogo če, je treba numeri čne rezultate oceniti z ustrezno 
statistično metodo. Uporabiti je mogo če katero koli priznano stati ­
stično metodo.  
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Če je mogo če, se v poro čilo o preskusu vklju čijo naslednji podatki: 
— uporabljena vrsta/sev, — podatki o odzivu strupenosti po spolu in odmerku, vklju čno z 
rodnostjo, brej ostjo in sposobnostjo preživetja, 
— čas smrti med študijo ali preživetje živali do na črtovanega žrtvo ­
vanja ali do zaklju čka študije, 
— tabela, na kateri so prikazane teže vsakega zaroda, povpre čne 
teže mladi čev ter posamezne teže mladi čev na zaklju čku, 
— strupeni ali drugi u činki na razmnoževanje, mladi če in poporodni 
rasti, 
— dan opazovanja vsakega znaka abnormalnosti in njegov nadaljnji 
potek, 
— podatki o telesni masi starševskih živali, 
— ugotovitve nekropsije, 
— podroben opis vseh mikroskopskih ugotovitev, — statisti čna obdelava rezultatov, kadar je to mogo če, 
— obravnava rezultatov, — razlaga rezultatov.
 
3.2 OCENA IN RAZLAGA 
Glej Splošni uvod dela B.  
4. VIRI  
Glej Splošni uvod dela B.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 510
 
B.35  ŠTUDIJA DVOGENERACIJSKE REPRODUKTIVNE STRUPE ­
NOSTI  
1. METODA  
Ta metoda ustreza metodi OECD TG 416 (2001).  
1.1 UVOD 
Ta metoda za preskušanje dvogeneracijske reprodukcije je name ­
njena zagotavljanju splošnih informacij o u činkih preskusne snovi 
na celovitost in zmogljivost moških in ženskih reproduktivnih siste ­
mov, vklju čno s funkcijo spolnih žlez, ciklom estrusa, obnašanjem 
pri parjenju, spo četjem, brej ostjo, kotitvijo, laktacijo in odstavlja ­
njem, ter na rast in razvoj potomcev. Študija lahko zagotovi tudi 
informacije o u činkih preskusne snovi na neonatalno obolevnost, 
smrtnost in predhodne podatke o strupenosti za razvoj pred rojstvom in po njem ter služi kot vodnik za nadaljnje preskuse. Poleg preu če­
vanja rasti in razvoja generacije F1 je ta preskusna metoda name ­
njena tudi ocenjevanju celovitosti in zmogljivosti moških in ženskih reproduktivnih sistemov ter rasti in razvoja generacije F2. Za nadaljnje informacije o strupenosti za razvoj in funkcionalnih 
pomanjkljivostih se lahko bodisi vklju či dodatne študijske segmente 
v ta protokol s primerno uporabo metod za strupenost za razvoj in/ali razvojno nevrotoksi čnost bodisi se te ciljne u činke preu či v posebnih 
študijah z uporabo ustreznih preskusnih metod.
 
1.2 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Preskusna snov se daje v stopnjevanih odmerkih ve č skupinam samcev 
in samic. Samci generacije P morajo dobivati odmerek med rastjo in še 
najmanj en celotni spermatogenetski cikel (približno 56 dni pri miši in 70 
dni pri podgani), da bi se pokazali kakršni koli škodljivi u činki na 
spermatogenezo. U činki na seme se dolo čijo s številnimi parametri 
semena (npr. morfologijo in gibljivostjo semena) in s pripravo tkiva in 
podrobno histopatologijo. Če so na voljo podatki o spermatogenezi iz 
prejšnjih študij s ponavljajo čimi odmerki z dovolj dolgim trajanjem, npr. 
iz 90-dnevne študije, ni nujno, da se v vrednotenje vklju čijo samci 
generacije P. Vsekakor pa je priporo čljivo, da se shranijo vzorci ali 
digitalni posnetki semena generacije P, da se omogo či poznejše vredno ­
tenje. Samice generacije P morajo dobivati odmerek med rastjo in še nekaj celotnih ciklov estrusa, da bi odkrili kakršne koli škodljive u činke 
preskusne snovi na normalen cikel estrusa. Preskusna snov se daje 
staršem (P) med njihovim parjenjem, med posledi čno brej ostjo in 
med odstavljanjem njihovih potomcev F1. Med odstavljanjem se nada ­
ljuje z dajanjem snovi potomcem F1 med njihovo rastjo do odraslosti, parjenja in ustvarjenja generacije F2, dokler se ne odstavi generacija F2. 
Na vseh živalih se izvajajo klini čna opazovanja in patološki pregledi 
glede znakov strupenosti s posebnim poudarkom na u činke na celo ­
vitost in zmogljivost moških in ženskih reproduktivnih sistemov in 
na rast in razvoj potomcev.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 511
 
1.3 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.3.1  Izbira živalskih vrst  
Priporočena vrsta za preskušanje je podgana. Če se uporabijo druge 
vrste, je treba to utemeljiti in potrebne so ustrezne spremembe. Sevi 
z nizko plodnostjo ali dobro znano visoko pojavnostjo razvojnih 
napak se ne smejo uporabljati. Na za četku študije morajo biti razlike 
v masi posameznih živali čim manjše in ne smejo presegati ± 20 % 
povprečne mase za vsak spol.  
1.3.2  Nastanitvene in prehranjevalne razmere  
Temperatura v prostoru s poskusnimi živalmi naj bo 22  o C (± 30 C). 
Čeprav naj bi bila relativna vlažnost najmanj 30 % in je zaželeno, da 
ne presega 70 %, razen v času čiščenja prostora, je cilj 50-60 %. 
Osvetlitev naj bo umetna, zaporedje 12 ur svetlobe, 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporablja konvencionalna laboratorijska prehrana z neomejeno oskrbo s pitno vodo. Na izbiro prehrane lahko vpliva 
potreba po zagotovitvi ustrezne primesi preskusne snovi, kadar se 
daje po tej metodi. 
Živali se lahko namestijo posami čno ali dajo v kletke v manjših 
skupinah istega spola. Parjenje naj se izvaja v kletkah, ki so primerne za ta namen. Po dokazu o kopulaciji se sparjene samice 
posamično naselijo v kletke za kotitev ali kletke za matere. Sparjene 
podgane so lahko tudi v manjših skupinah in se lo čijo en dan ali dva 
pred kotitvijo. Ko je kotitev blizu, se sparjenim živalim zagotovi ustrezen in dolo čen material za izdelavo gnezda.
 
1.3.3  Priprava živali  
Uporabiti je treba zdrave mlade živali, ki so se najmanj pet dni 
prilagajale na laboratorijske razmere in predhodno niso bile upora ­
bljene za poskuse. Poznati je treba vrsto, sev, vir, spol, maso in/ali 
starost poskusnih živali. Znana morajo biti sorodstvena razmerja med živalmi, tako da se je mogo če izogniti parjenju med sorojenci. Živali 
se naključno dodelijo v kontrolno in tretirano skupino (priporo čljiva 
je plastitev po telesni masi). Kletke je treba razporediti tako, da so 
možni učinki zaradi pozicije kletk čim manjši. Vsaki živali se dodeli 
enotna identifikacijska številka. Pri generaciji P je to treba narediti, preden se za čne odmerjanje. Pri generaciji F1 se to naredi ob odsta ­
vljanju živali, izbranih za parjenje. Za vse izbrane živali F1 je treba 
voditi evidenco z navedbo o poreklu zaroda. Poleg tega je priporo č­
ljiva posami čna identifikacija mladi čev čim prej po rojstvu, če se 
načrtuje posami čno tehtanje mladi čev ali kakršne koli funkcionalne 
preskuse. 
Starši (P) so na za četku odmerjanja stari približno 5 do 9 tednov. 
Živali v vseh preskusnih skupinah naj bodo čim enotnejše po masi in 
starosti.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 512
 
1.4 POSTOPEK  
1.4.1  Število in spol živali  
Vsaka preskusna in kontrolna skupina mora vsebovati zadostno 
število živali, da nastane po možnosti najmanj 20 brejih samic, ki 
kotijo ali so blizu kotitve. Pri snoveh, ki povzro čajo nezaželene 
učinke, povezane s tretiranjem (npr. sterilnost, čezmerna toksi čnost 
pri velikem odmerku), to ni mogo če. Cilj je dobiti dovolj brejih 
samic, da je zagotovljeno smiselno ovrednotenje potenciala snovi 
za vplivanje na plodnost, brej ost in materinsko obnašanje ter sesa ­
nje, rast in razvoj potomcev F1 od spo četja do zrelosti in razvoj 
njihovih potomcev (F2) do odstavitve. Če zaželeno število brejih 
živali (to je 20) ni doseženo, študija s tem torej ni nujno ovržena 
in je potrebno vrednotenje vsakega primera posebej.  
1.4.2  Priprava odmerkov  
Priporoča se, da se preskusna snov daje oralno (s hrano, pitno vodo 
ali gavažo), razen če se šteje drug na čin dajanja (npr. dermalno ali z 
vdihavanjem) za primernejšega. 
Po potrebi se preskusna snov raztopi ali suspendira v primernem 
nosilcu. Priporo čljivo je, da se, kadar koli je mogo če, najprej 
razmisli o uporabi vodne raztopine/suspenzije, potem o raztopini/ emulziji v olju (npr. koruzno olje), šele nato o možni raztopini v 
drugih nosilcih. V primeru nosilcev, ki niso voda, je treba poznati 
toksične lastnosti takega nosilca. Dolo čiti je treba stabilnost 
preskusne snovi v nosilcu.
 
1.4.3  Odmerjanje  
Uporabijo se najmanj tri velikosti odmerkov in hkratna kontrola. Razen 
kadar zaradi fizikalno-kemijskih lastnosti ali bioloških u činkov 
preskusne snovi to ni mogo če, je treba najvišjo velikost odmerka izbrati 
z namenom, da se povzro či toksičnost, vendar ne smrt ali hudo trplje ­
nje. V primeru nepri čakovane smrtnosti, so študije s stopnjo smrtnosti, 
manjšo od približno 10 odstotkov pri starših (P), navadno še vedno 
sprejemljive. Padajo če zaporedje velikosti odmerkov je treba izbrati 
tako, da se pokažejo vse reakcije, ki so odvisne od odmerka, in vred ­
nost brez opaznih škodljivih u činkov (NOAEL). Za padajo če zaporedje 
velikosti odmerkov so pogosto optimalni dvakratni do štirikratni inter ­
vali, pogosto pa je bolje dodati še dodatno četrto preskusno skupino, 
kakor uporabiti zelo velike intervale med odmerki (npr. ve č kot faktor 
10). Pri študijah odmerjanja s hrano interval odmerka ne bi smel biti 
večji od trikratnega. Vrednosti odmerkov je treba izbirati ob upošte ­
vanju vseh obstoje čih podatkov o strupenosti, zlasti rezultate iz študij s 
ponavljajo čimi odmerki. Upoštevajo se tudi vse razpoložljive informa ­
cije o presnovi in kinetiki preskusne zmesi ali sorodnih materialov. Te 
informacije poleg tega pomagajo tudi pri dokazovanju ustreznosti 
režima odmerjanja.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 513
 
Kontrolna skupina je netretirana skupina ali kontrolna skupina, treti ­
rana samo z nosilcem, če je ta uporabljen pri dajanju preskusne 
snovi. Razen pri tretiranju s preskusno snovjo, morajo biti živali v kontrolni skupini obravnavane enako kakor živali v preskusni skupini. Če je uporabljen nosilec, mora kontrolna skupina prejeti 
količino nosilca, enako najve čji uporabljeni koli čini. Če se preskusna 
snov daje s hrano in povzro ča zmanjšan vnos ali izkoristek hrane, 
potem je morda potrebna uporaba po parih hranjene kontrolne skupine. Namesto hkratne po parih hranjene kontrolne skupine se 
lahko uporabijo podatki iz nadzorovanih študij, namenjenih ovred ­
notenju u činkov zmanjšane porabe hrane na reproduktivne parame ­
tre. 
Upoštevati je treba naslednje lastnosti nosilca in drugih aditivov: 
učinke na absorpcijo, distribucijo, presnovo ali retencijo preskusne 
snovi; učinke na kemijske lastnosti preskusne snovi, ki lahko spre ­
menijo njene toksi čne lastnosti; ter u činke na porabo hrane ali vode 
ali status prehranjenosti živali.
 
1.4.4  Mejni preskus  
Če oralna študija pri eni velikosti odmerka najmanj 1 000 mg/kg 
telesne mase/dan ali enakovreden odstotek hrane ali pitne vode pri 
dajanju hrane ali pitne vode, pri kateri se uporabijo postopki, opisani za to študijo, ne povzro či opaznih toksi čnih učinkov ne pri starših ne 
pri njihovih potomcih in se glede na podatke o strukturno in/ali 
presnovno sorodnih zmeseh ne pri čakuje učinka, potem se šteje, da 
ni potrebna popolna študija z uporabo ve č velikosti odmerkov. Mejni 
preskus se lahko uporabi za vse primere, razen kadar človekova 
izpostavljenost kaže na potrebo po uporabi ve čje velikosti odmerka. 
Pri drugih vrstah dajanja, na primer pri vdihavanju ali dermalni aplikaciji, lahko fizikalno-kemijske lastnosti preskusne snovi, na primer topnost, pogosto dolo čajo in omejujejo najve čjo dosegljivo 
raven izpostavljenosti.
 
1.4.5  Dajanje odmerkov  
Živali naj dobivajo preskusno snov 7 dni na teden. Zaželena je 
oralna pot dajanja (prehrana, pitna voda ali gavaža). Če se uporabi 
drug način dajanja, je treba to utemeljiti in lahko so potrebne 
ustrezne spremembe. V ustreznem preskusnem obdobju vse živali 
dobivajo odmerke po enaki metodi. Kadar se preskusna snov daje 
z gavažo, je treba to storiti z uporabo želod čne sonde. Koli čina 
tekočine, ki se da naenkrat, ne sme presegati 1 ml/100 g telesne 
mase (pri koruznem olju najve č 0,4 ml/100 g telesne mase), razen 
v primeru vodnih raztopin, kjer se sme uporabiti 2 ml/100 g telesne 
mase. Razen pri draže čih ali jedkih snoveh, ki pri višjih koncentra ­
cijah navadno povzro čajo močnejše učinke, je treba variabilnost 
preskusne koli čine s prilagajanjem koncentracije obdržati na kar 
najnižji ravni, zato da bi zagotovili konstantno koli čino pri vseh 
odmerkih. Pri študijah z gavažo mladi či navadno dobivajo preskusno 
snov samo posredno skozi mleko, dokler se zanje po odstavitvi ne začne neposredno dajanje odmerkov. Pri študijah s prehrano ali pitno 
vodo dobijo mladi či dodatno preskusno snov neposredno, ko za čnejo 
v zadnjem tednu laktacijskega obdobja sami jesti.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 514
 
Pri snoveh, ki se dajejo s hrano ali pitno vodo, je treba zagotoviti, da 
količine uporabljene preskusne snovi ne vplivajo na obi čajno raven 
vnosa hrane ali porabe vode. Kadar se preskusna snov daje s hrano, se lahko uporabi bodisi konstantna koncentracija v hrani (ppm) bodisi konstantna velikost odmerka glede na telesno maso živali; 
treba je navesti uporabljeni na čin. Če dajemo snov z gavažo, je 
treba odmerke dati vsak dan približno ob istem času in jih najmanj 
enkrat tedensko prilagoditi, da se vzdržuje konstantna velikost odmerka glede na telesno maso živali. Pri prilagajanju odmerka 
gavaže, ki temelji na masi, je treba upoštevati informacije o poraz ­
delitvi posteljice.
 
1.4.6  Na črti za poskuse  
Dnevno dajanje odmerkov starševskim (P) samcem in samicam se 
začne, ko so stari 5 do 9 tednov. Dnevno dajanje odmerkov samcem 
in samicam F1 se za čne ob odstavitvi; treba pa je upoštevati, da se 
lahko v primeru dajanja preskusne snovi s hrano ali pitno vodo začne neposredna izpostavljenost mladi čev F1 preskusni snovi že v 
laktacijskem obdobju. Pri obeh spolih (P in F1) se odmerjanje nada ­
ljuje najmanj 10 tednov pred obdobjem parjenja. Odmerjanje se 
nadaljuje pri obeh spolih še 2 tedna v obdobju parjenja. Samce je treba humano usmrtiti in preu čiti, ko niso ve č potrebni za ocenje ­
vanje reproduktivnih u činkov. Pri starševskih (P) samicah se mora 
odmerjanje nadaljevati skozi ves čas brej osti in do odstavljanja 
potomcev F1. Upoštevati je treba spremembe na črta odmerjanja, ki 
temeljijo na razpoložljivih informacijah o preskusni snovi, vklju čno z 
obstoječimi podatki o toksi čnosti, nastajanju presnove ali bioakumu ­
laciji. Odmerek za vsako žival navadno temelji na zadnji posami čni 
določitvi telesne mase. Vendar je potrebna previdnost pri prilaga ­
janju odmerka v zadnjem trimestni brej osti. 
Tretiranje samcev in samic P in F1 se nadaljuje do konca. Vse 
odrasle samce in samice P in F1 je treba humano usmrtiti, ko niso več potrebni za ocenjevanje reproduktivnih u činkov. Potomci F1, ki 
niso izbrani za parjenje, in vsi potomci F2 se humano usmrtijo po 
odstavitvi.
 
1.4.7  Postopek parjenja  
1.4.7.1  Parjenje staršev (P)  
Pri vsakem parjenju se vsaka samica da skupaj z enim samcem z 
enako velikostjo odmerka (parjenje 1: 1), dokler ne pride do kopu ­
lacije ali dokler ne mineta 2 tedna. Samice se vsak dan pregledajo 
glede navzo čnosti semena ali vaginalnega čepa. Dan brej osti 0 je 
opredeljen kot dan, ko je najden vaginalni čep ali seme. V primeru, 
da parjenje ni uspešno, se lahko razmisli o ponovnem parjenju samic 
z dokazanimi samci iste skupine. Sparjeni pari morajo biti jasno 
navedeni v podatkih. Parjenju sorojencev se je treba izogibati.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 515
 
1.4.7.2  Parjenje F1  
Pri parjenju potomcev F1, je treba iz vsakega zaroda po odstavitvi 
izbrati najmanj enega samca in eno samico za parjenje z drugimi mladiči z enako velikostjo odmerka, vendar iz drugega zaroda, za 
ustvarjenje generacije F2. Izbira mladi čev iz vsakega zaroda mora 
biti naklju čna, brez zna čilnih opaznih razlik v telesni masi ali videzu 
med vrstniki iz zaroda. V primeru, da so opažene te razlike, je treba izbrati najboljše predstavnike iz vsakega zaroda. Prakti čno je to 
najbolje storiti glede na telesno maso, lahko pa je primernejše na 
podlagi videza. Potomci F1 se ne bi smeli pariti, dokler ne dosežejo polne spolne zrelosti. 
Pari brez potomcev se morajo ovrednotiti, da se dolo či pravi vzrok 
neplodnosti. To lahko vklju čuje postopke, kot so dodatne možnosti 
za parjenje z drugimi dokazanimi o četi ali materami, mikroskopski 
pregled reproduktivnih organov in pregled ciklov estrusa ali sperma ­
togeneze.
 
1.4.7.3  Drugo parjenje  
V nekaterih primerih, na primer pri spremembah velikosti zaroda, 
povezanih s tretiranjem, ali pri opaženem dvoumnem u činku pri 
prvem parjenju, je priporo čljivo, da se odrasli P ali F1 ponovno 
parijo, da bi ustvarili drugi zarod. Priporo čeno je, da se ponovno 
parijo samice ali samci, ki niso ustvarili zaroda z dokazanimi 
plemenskimi živalmi nasprotnega spola. Če se zdi, da je pri kateri 
koli generaciji potrebno ustvariti drugi zarod, je treba živali ponovno pariti približno en teden po odstavitvi zadnjega zaroda.
 
1.4.7.4  Velikost zaroda  
Živalim se dovoli, da normalno skotijo in redijo svoje potomce do 
odstavitve. Standardizacija velikosti zaroda ni obvezna. Kadar se 
standardizacija opravi, se metoda podrobno opiše.  
1.5 OPAZOVANJA  
1.5.1  Klini čna opazovanja  
Splošno klini čno opazovanje je treba opraviti vsak dan in v primeru 
dajanja odmerkov z gavažo je treba upoštevati vrhunec pri čakovanih 
učinkov po odmerjanju. Zabeležiti je treba vedenjske spremembe, 
znake težke ali podaljšane kotitve in vse znake toksi čnosti. Dodatni, 
podrobnejši pregled vsake živali se izvede najmanj enkrat tedensko in se lahko primerno opravi takrat, ko se žival tehta. Dvakrat 
dnevno, ob koncu tedna pa enkrat dnevno, je treba vse živali opazo ­
vati glede obolevnosti in smrtnosti.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 516
 
1.5.2  Telesna masa in poraba hrane/vode pri starših  
Starši (P in F1) se stehtajo prvi dan dajanja odmerkov in potem 
najmanj enkrat tedensko. Starševske samice (P in F1) se med brejostjo stehtajo najmanj na 0., 7., 14. in 20. ali 21. dan ter med 
laktacijo na iste dneve, kot je tehtanje zaroda, in na dan, ko so živali 
usmrčene. O teh opazovanjih je treba poro čati posami čno za vsako 
odraslo žival. Med obdobjem pred parjenjem in med brejostjo se poraba hrane meri najmanj tedensko. Poraba vode se meri najmanj 
tedensko, če se preskusna snov daje z vodo.
 
1.5.3  Cikel estrusa  
Dolžina in normalnost cikla estrusa se pri samicah P in F1 ovred ­
notita z vaginalnim brisom pred parjenjem in po izbiri med parje ­
njem, dokler ni najden dokaz o parjenju. Med jemanjem vaginalnih/ vratnih celic je treba paziti, da ne pride do poškodb sluznice in 
pozneje do nastanka psevdogravidnosti (1).
 
1.5.4  Parametri semena  
Pri vseh samcih P in F1 se na koncu zabeleži teža moda in obmodka 
in po en organ od vsakega shrani za histopatološki pregled (glej oddelek 1.5.7, 1.5.8.1). Za podskupino najmanj desetih samcev iz vsake skupine samcev P in F1 je treba preostala moda in obmodke 
uporabiti za štetje semen čic, odpornih na homogenizacijo, ali zalog 
semena v repu obmodka. Pri tej isti podskupini samcev je treba zbrati seme iz repov obmodkov ali semenovodov za ovrednotenje gibljivosti in morfologije semena. Če se opazujejo u činki, povezani s 
tretiranjem, ali kadar je v drugih študijah dokaz za možne u činke na 
spermatogenezo, se ovrednotenje semena izvede pri vseh samcih v vsaki skupini odmerka; druga če se lahko štetje omeji na kontrolne 
samce in samce P in F1 z velikim odmerkom. 
Prešteti je treba tudi celotno število semen čic iz moda, ki so odporne 
na homogenizacijo, in seme iz repa obmodka (2) (3). Na zaloge 
semena v repu se lahko sklepa po koncentraciji in koli čini semena 
v suspenziji, ki se uporabi za dokon čanje kakovostnih vrednotenj, in 
števila semena, dobljenega z naknadnim mletjem in/ali homogenizi ­
ranjem preostalega tkiva repa obmodka. Štetje je treba izvesti na 
izbrani podskupini samcev iz vseh skupin odmerkov takoj po usmrtitvi živali, razen če so narejeni video ali digitalni posnetki ali 
če se primerki zamrznejo in analizirajo pozneje. V teh primerih se 
lahko najprej analizirajo kontrole in skupina z velikim odmerkom. 
Če niso vidni nobeni u činki, povezani s tretiranjem (npr. u činki na 
število semen čic, gibljivost ali morfologijo), drugih skupin odmerkov 
ni treba analizirati. Kadar se u činki, povezani s tretiranjem, opazijo 
v skupini z velikim odmerkom, je treba ovrednotiti tudi skupine z 
manjšim odmerkom.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 517
 
Gibljivost semena v obmodku (ali semenovodu) je treba ovrednotiti 
ali posneti na video takoj po usmrtitvi. Seme je treba ohraniti s čim 
manjšimi poškodbami in razred čiti za analizo gibljivosti s sprejem ­
ljivimi metodami (4). Odstotek progresivno gibljivega semena je treba dolo čiti bodisi subjektivno ali objektivno. Kadar se opravi 
analiza gibanja s pomo čjo računalnika (5) (6) (7) (8) (9) (10), izpe ­
ljava progresivne gibljivosti temelji na uporabniško dolo čenih 
pragovih za povpre čno hitrost ali na linearnem indeksu. Če se v 
času obdukcije vzorci posnamejo na videotrak (11) ali se druga če 
zabeležijo slike, se lahko pozneje analizirajo le samci P in F1 iz 
kontrolne skupine in skupine z velikim odmerkom, razen če so 
opazni učinki, povezani s tretiranjem, v tem primeru je treba ovred ­
notiti tudi skupine z manjšim odmerkom. Če ni video ali digitalne 
slike, se morajo ob obdukciji analizirati vsi vzorci iz vseh tretiranih 
skupin. 
Treba je opraviti morfološko ovrednotenje semena iz obmodka (ali 
semenovoda). Seme (najmanj 200 na vzorec) je treba preu čiti kot 
fiksirane, mokre preparate (12) in ga razvrstiti bodisi v normalno ali nenormalno. Primeri morfoloških anomalij semena vklju čujejo spoji ­
tev, ločene glavice ter glavice in/ali repke nepravilnih oblik. Ovred ­
notenje je treba izvesti na izbrani podskupini samcev v vseh 
skupinah odmerkov bodisi takoj po usmrtitvi živali ali pozneje na podlagi video ali digitalnih posnetkov. Tudi brisi se, potem ko so 
fiksirani, lahko preu čujejo pozneje. V teh primerih se lahko najprej 
analizirajo kontrole in skupina z velikim odmerkom. Če niso vidni 
nobeni učinki (npr. u činki na morfologijo semena), drugih skupin 
odmerkov ni treba analizirati. Kadar se u činki, povezani s tretira ­
njem, opazijo v skupini z velikim odmerkom, je treba ovrednotiti 
tudi skupine z manjšim odmerkom. 
Če so bili zgornji parametri za ovrednotenje semena že preu čeni v 
študiji sistemske toksi čnosti, ki je trajala vsaj 90 dni, jih ni treba 
ponoviti v dvogeneracijski študiji. Vsekakor pa je priporo čljivo, da 
se shranijo vzorci ali digitalni posnetki semena generacije P, da se omogoči poznejše vrednotenje, če bi bilo potrebno.
 
1.5.5  Potomci  
Vsak zarod je treba preu čiti čim prej po skotitvi (laktacijski dan 0) in 
ugotoviti število in spol mladi čev, mrtvorojenih, živorojenih, in 
navzočnost večjih nepravilnosti. Mladi če, ki so mrtvi na dan 0, je 
najbolje, če se ne macerirajo, preu čiti glede možnih napak in vzroka 
smrti in konzervirati. Žive mladi če je treba prešteti in posami čno 
stehtati ob skotitvi (laktacijski dan 0) ali na dan 1 in pozneje na dneve rednega tehtanja, npr. na 4., 7., 14. in 21. dan laktacije. Treba 
je evidentirati telesne ali vedenjske anomalije, ki se opazijo pri 
materah ali njihovih potomcih.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 518
 
Telesni razvoj potomcev je treba zabeležiti v glavnem po prirastu 
telesne mase. Drugi telesni parametri (npr. o česne in ušesne odprtine, 
izbijanje zob, rast las) lahko dajo dodatne informacije, a ti podatki se raje ovrednotijo v kontekstu podatkov o spolni zrelosti (npr. starost in telesna masa ob vaginalni odprtini ali lo čitvi prepucija na glavici 
penisa) (13). Funkcionalne preiskave (npr. motori čne dejavnosti, 
senzorne funkcije, refleksna ontogenija) potomcev F1 pred in/ali po odstavitvi, zlasti tiste, ki se nanašajo na spolno zrelost, so pripo ­
ročljive, če take preiskave niso vklju čene v posebne študije. Starost 
vaginalne odprtine in lo čitve prepucija je treba dolo čiti pri odsta ­
vljenih mladi čih F1, izbranih za parjenje. Zadnji čno-genitalno 
razdaljo pri mladi čih F2 je treba izmeriti na poporodni dan 0, če 
jo sprožijo spremembe v razmerju spolov pri F1 ali časovna uskla ­
ditev spolne zrelosti. 
Funkcionalna opazovanja se lahko opustijo pri skupinah, ki sicer 
jasno kažejo znake škodljivih u činkov (npr. znatno zmanjšanje prido ­
bivanja telesne mase itd.). Če se opravljajo funkcionalne preiskave, 
naj se ne delajo na mladi čih, ki so izbrani za parjenje.
 
1.5.6  Obdukcija  
Na koncu študije ali ob smrti med študijo se makroskopsko pregle ­
dajo vsi starši (P in F1), vsi mladi či z zunanjimi anomalijami ali 
kliničnimi znaki, pa tudi po en naklju čno izbran mladi č vsakega 
spola in zaroda iz obeh generacij F1 in F2 glede kakršnih koli strukturnih anomalij ali patoloških sprememb. Posebno pozornost 
je treba posvetiti organom reproduktivnega sistema. Mladi če, ki so 
humano usmr čeni v razmerah poginjanja, in mrtve mladi če je treba, 
če se ne macerirajo, preu čiti glede možnih napak in/ali vzroka smrti 
in konzervirati. 
Maternice vseh samic, ki so prvi č kotile, se pregledajo na na čin, ki 
ne škoduje histopatološkemu ovrednotenju, glede navzo čnosti in 
števila vgnezditev.
 
1.5.7  Masa organov  
Na koncu se dolo či telesna masa in masa naslednjih organov vseh 
staršev P in F1 (parni organi se stehtajo posami čno): 
— maternice, jaj čnikov, 
— mod, obmodkov (v celoti in repa), — prostate, 
— semenskih meši čkov s koagulacijskimi žlezami in njihovimi teko ­ 
činami ter prostato (kot ena enota), 
— možganov, jeter, ledvic, vranice, hipofize, š čitnice in nadledvi ­ 
čnih žlez ter znanih ciljnih organov. 
Končno telesno maso je treba dolo čiti za mladi če F1 in F2, ki so 
izbrani za obdukcijo. Stehtajo se naslednji organi po enega naklju čno 
izbranega mladi ča vsakega spola in zaroda (glej oddelek 1.5.6): 
možgani, vranica in priželjc.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 519
 
Rezultate obdukcije in tehtanja organov je treba oceniti v smislu 
ugotovitev iz drugih študij s ponavljajo čimi odmerki, kadar je to 
izvedljivo.  
1.5.8  Histopatologija  
1.5.8.1  Starši  
Naslednji organi in tkiva staršev (P in F1) ali njihovi reprezentativni 
vzorci se fiksirajo in shranijo v primernem mediju za histopatološki 
pregled. 
— nožnica, maternica z vratom in jaj čniki (shranjeni v ustreznem 
fiksativu), 
— eno modo (konzervirano v Bouinovem ali primerljivem fiksati ­
vu), en obmodek, semenski meši čki, prostata in koagulacijska 
žleza, 
— predhodno dolo čen(i) ciljni organ(i) vseh staršev P in F1, 
izbranih za parjenje. 
Celotna histopatologija zgoraj naštetih konzerviranih organov in tkiv 
se izvede za vse živali z velikim odmerkom in za vse kontrolne 
živali P in F1, izbrane za parjenje. Pregled jaj čnikov živali P ni 
obvezen. Organi, pri katerih je opaziti spremembe, povezane s treti ­
ranjen, je treba pregledati tudi v skupinah z majhnim in srednjim odmerkom, da se lažje pojasni vrednost brez opaznih škodljivih 
učinkov. Poleg tega se histopatološko ovrednotijo reproduktivni 
organi živali z majhnim in srednjim odmerkom, za katere se domneva zmanjšana plodnost, npr. pri tistih, ki se niso mogli spariti, 
spočeti, zaploditi ali skotiti zdravih potomcev, ali pri katerih so 
prizadeti cikli čnost estrusa ali število, gibljivost ali morfologija 
semena. Pregledajo se vse makroskopske lezije, na primer atrofija ali tumorji. 
Treba je izvesti podroben histopatološki pregled mod (npr. z uporabo 
Bouinovega fiksativa, vstavljanja v parafin in pre čnih prerezov debe ­
line 4–5 um), da bi ugotovili u činke, povezane s tretiranjem, kot so 
zastale semen čice, manjkajo če plasti ali vrste kli čnih celic, celice 
velikanke z ve č jedri ali uhajanje spermatogenih celic v svetlino 
(14). Pregled nepoškodovanega obmodka mora vklju čevati glavo, 
telo in rep, ki se lahko opravi z ocenjevanjem podolžnega prereza. 
Obmodek je treba oceniti glede prenikanja belih krvni čk, spremembe 
prevladujo če vrste celic, vrst okvarjenih celic in fagocitoze semena. 
Za preučitev moških reproduktivnih organov se lahko uporabita PAS 
in barvanje s hematoksilinom. 
Postlaktacijski jaj čnik bi moral vsebovati za četne in rasto če folikle, 
pa tudi veliko rumenih telesc iz laktacije. Histopatološki pregled bi moral odkriti kakovostno izgubljanje populacije za četnih foliklov. 
Količinsko vrednotenje za četnih foliklov je treba izvesti za samice 
F1; število živali, izbira prereza jaj čnika in velikost vzorca prereza 
morajo biti statisti čno ustrezni za uporabljeni postopek ocenjevanja. 
Pregled mora vklju čevati štetje števila za četnih foliklov, ki se lahko 
kombinirajo z majhnimi rasto čimi folikli, za primerjavo tretiranih in 
kontrolnih jaj čnikov (15) (16) (17) (18) (19).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 520
 
1.5.8.2  Odstavljeni mladi či 
Pretežno nenormalno tkivo in ciljni organi vseh mladi čev z zuna ­
njimi anomalijami ali klini čnimi znaki, pa tudi po en naklju čno 
izbran mladi č vsakega spola in zaroda iz obeh generacij F1 in F2, 
ki niso bili izbrani za parjenje, se fiksirajo in shranijo v primernem 
mediju za histopatološki pregled. Izvede se celotni histopatološki opis zna čilnosti konzerviranih tkiv s posebnim poudarkom na 
organih reproduktivnega sistema.
 
2. PODATKI  
2.1 OBDELAVA REZULTATOV 
Podatki se sporo čajo posami čno in se povzamejo v obliki tabele, ki 
prikazuje za vsako preskusno skupino in vsako generacijo število 
živali na za četku preskusa, število živali, najdenih mrtvih ali 
usmrčenih iz humanih razlogov med preskusom, čas katere koli 
smrti ali humane usmrtitve, število plodnih živali, število brejih 
samic, število živali, ki kažejo znake toksi čnosti, opis znakov 
zaznane toksi čnosti, vklju čno s časom začetka, trajanja in resnosti 
katerih koli toksi čnih učinkov, vrsto opažanj o starših in potomcih, 
vrstah histopatoloških sprememb in vseh ustreznih podatkov o 
zarodu. 
Številčni rezultati se morajo oceniti z ustrezno splošno sprejeto stati ­
stično metodo; statisti čne metode je treba dolo čiti pri na črtovanju 
študije in jih utemeljiti. Za analiziranje podatkov so lahko koristni statistični modeli odziva v odvisnosti od odmerka. Poro čilo mora 
vključevati dovolj informacij o metodi analize in uporabljenem ra ču­
nalniškem programu, tako da lahko neodvisni ocenjevalec/statistik ponovno ovrednoti in obnovi analizo.
 
2.2 VREDNOTENJE REZULTATOV 
Ugotovitve te študije dvogeneracijske reproduktivne strupenosti je 
treba ovrednotiti glede na opažene u činke, vklju čno z obdukcijo in 
mikroskopskimi ugotovitvami. Vrednotenje vklju čuje razmerje ali 
njegovo odsotnost med odmerkom preskusne snovi in navzo čnostjo 
ali odsotnostjo pojava in resnosti anomalij, vklju čno 
z makroskopskimi lezijami, ugotovljenimi ciljnimi organi, prizadeto plodnostjo, klini čnimi anomalijami, prizadeto zmogljivost reprodu ­
ktivnosti in zaroda, spremembe telesne mase, u činke na smrtnost 
in druge strupene u činke. Pri vrednotenju rezultatov preskusa je 
treba upoštevati fizikalno-kemijske lastnosti preskusne snovi in toksi ­
kokinetične podatke, če so na voljo. 
Pravilno izveden preskus reproduktivne strupenosti mora dati zado ­
voljivo oceno vrednosti brez u činka in razumevanje škodljivih 
učinkov na reprodukcijo, kotitev, laktacijo, poporodni razvoj 
vključno z rastjo in spolnim razvojem.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 521
 
2.3 RAZLAGA REZULTATOV 
Študija dvogeneracijske reproduktivne strupenosti zagotovi informa ­
cije o učinkih ponovne izpostavljenosti snovi v vseh fazah reprodu ­
ktivnega cikla. Študija zagotovi zlasti informacije o reproduktivnih 
parametrih in o razvoju, rasti, dozorevanju in preživetju potomcev. 
Rezultate študije je treba razlagati skupaj z ugotovitvami sub kronične študije, študije predroj stvenega razvoja, toksikokineti čne 
ter drugih razpoložljivih študij. Rezultati te študije se lahko uporabijo 
pri ocenjevanju potrebe po nadaljnjem preskušanju kemikalije. 
Ekstrapolacija rezultatov študije na človeka je veljavna le do 
omejene stopnje. Rezultati so najuporabnejši za zagotovitev infor ­
macij o vrednostih brez u činka in dovoljeni človekovi izpostavlje ­
nosti (20) (21) (22) (23).
 
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: 
Preskusna snov: 
— fizikalno stanje in ustrezne fizikalno-kemijske lastnosti, 
— identifikacijske podatke, 
— čistost. 
Nosilec (po potrebi): 
— utemeljitev izbire nosilca, če to ni voda. 
Preskusne živali: 
— uporabljeno vrsto/sev, 
— število, starost in spol živali, 
— izvor, nastanitvene razmere, hrano, material za izdelavo gnezda 
itd., 
— maso posameznih živali na za četku preskusa. 
Preskusni pogoji: 
— utemeljitev izbire velikosti odmerka, 
— podatke o sestavi preskusne snovi/pripravi hrane, doseženi 
koncentraciji, 
— stabilnost in homogenost pripravka, 
— podatke o dajanju preskusne snovi, 
— preračunavanje koncentracije preskusne snovi v hrani/pitni vodi 
(ppm) v dejanski odmerek (mg/kg telesne mase/dan), če je 
primerno, 
— podatke o kakovosti hrane in vode.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 522
 
Rezultati: 
— porabo hrane in porabo vode, če je na voljo, izkoristek hrane 
(prirast telesne mase na gram porabljene hrane) in porabo preskusnega materiala za živali P in F1, razen za obdobje sobi ­
vanja in najmanj za zadnjo tretjino laktacije, 
— podatke o absorpciji ( če so na voljo), 
— podatke o telesni masi za živali P in F1, ki so izbrane za parje ­
nje, 
— podatke o masi zaroda in mladi čev, 
— telesno maso ob usmrtitvi in podatke o absolutni in relativni 
telesni masi organov za starše, 
— vrsto, resnost in trajanje klini čnih opažanj (ali so reverzibilna ali 
ne), 
— čas smrti med študijo in, če živali preživijo, do konca, 
— podatke o toksi čnem učinkovanju glede na spol in odmerek, 
vključno z znaki parjenja, plodnostjo, brej ostjo, skotitvijo, 
sposobnostjo za preživetje in laktacijo; poro čilo mora navajati 
številke, uporabljene pri izra čunu teh kazalnikov, 
— toksične ali druge u činke na reprodukcijo, potomce, poporodno 
rast itd., 
— ugotovitve obdukcije, 
— natančen opis vseh histopatoloških ugotovitev, 
— število samic P in F1 z normalnim ciklom in dolžino cikla, — skupno število semena v repu obmodka, odstotek progresivno 
gibljivega semena, odstotek morfološko normalnega semena in 
odstotek semena z vsako ugotovljeno anomalijo, 
— čas za parjenje, vklju čno s številom dni pred parjenjem, 
— dolžino brejosti, 
— število vgnezditev, rumenih telesc, velikost zaroda, — število živorojenih in izgub po vgnezditvi, — število mladi čev z večjimi vidnimi anomalijami, če je treba poro ­ 
čati o številu spa čkov, 
— podatke o telesnih znakih pri mladi čih in drugih poporodnih 
razvojnih podatkih; ovrednotene telesne znake je treba utemeljiti, 
— podatke o opazovanju funkcij pri mladi čih in odraslih, kot je 
primerno, 
— statisti čno obdelavo rezultatov, po potrebi.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 523
 
Razprava o rezultatih. 
Zaključki, tudi vrednosti brez opaznih škodljivih u činkov pri materah 
in potomcih.  
4. LITERATURA  
(1) Sadleir, R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, In:  Reproduction 
in Mammals:  I. Germ Cells and Fertilization, C.R. Auston and 
R.V. Short (eds.), Cambridge, New York. 
(2) Gray, L.E. et al., (1989). A Dose-Response Analysis of Metho ­
xychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat.  Fundamental and Applied Toxicology  12: 
92–108. 
(3) Robb, G.W. et al., (1978). Daily Sperm Production and Epidi ­
dymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats.  Journal of 
Reproduction and Fertility  54: 103–107. 
(4) Klinefelter, G.R. et al., (1991). The Method of Sperm Collec ­
tion Significantly Influences Sperm Motion Parameters Follo ­
wing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat.  
Reproductive Toxicology  5: 39–44 
(5) Seed, J. et al. (1996). Methods for Assessing Sperm Motility, 
Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report.  Reproductive Toxicology  10(3): 237–244. 
(6) Chapin, R.E. et al., (1992).Methods for Assessing Rat Sperm 
Motility.  Reproductive Toxicology  6: 267-273 
(7) Klinefelter, G.R. et al., (1992). Direct Effects of Ethane Dimet ­
hanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  In 
Vitro  Demonstration.  Journal of Andrology  13: 409–421. 
(8) Slott, V.L. et al., (1991). Rat Sperm Motility Analysis: Metho ­
dologic Considerations.  Reproductive Toxicology  5: 449–458. 
(9) Slott, V.L. and Perreault, S.D., (1993). Computer-Assisted 
Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. In:  Methods in Toxico ­
logy,  Part A., Academic, Orlando, Florida. pp. 319–333. 
(10) Toth, G.P. et al. (1989). The Automated Analysis of Rat Sperm 
Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations. Journal of Andro ­
logy 10: 401–415. 
(11) Working, P.K. and M. Hurtt, (1987). Computerized Videomi ­
crographic Analysis of Rat Sperm Motility. Journal of Andro ­
logy 8: 330–337. 
(12) Linder, R.E. et al., (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the 
Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Toxicology 6: 491–505. 
(13) Korenbrot, C.C. et al., (1977). Preputial Separation as an 
External Sign of Pubertal Development in the Male Rat. Biolo ­
gical Reproduction 17: 298–303. 
(14) Russell, L.D. et al., (1990). Histological and Histopathological 
Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, Florida. 
(15) Heindel, J.J. and R.E. Chapin, (eds.) (1993). Part B. Female 
Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, 
Orlando, Florida. 
(16) Heindel, J.J. et al., (1989) Histological Assessment of Ovarian 
Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. In: Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, New York, pp. 421–426. 
(17) Manson, J.M. and Y.J. Kang, (1989). Test Methods for Asses ­
sing Female Reproductive and Developmental Toxicology. In: 
Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), 
Raven, New York.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 524
 
(18) Smith, B.J. et al,. (1991). Comparison of Random and Serial 
Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive 
Toxicology 5: 379–383. 
(19) Heindel, J.J. (1999). Oocyte Quantitation and Ovarian Histo ­
logy. In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. Daston,. 
and C.A. Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, DC. 
(20) Thomas, J. A. (1991). Toxic Responses of the Reproductive 
System. In: Casarett and Doull's Toxicology, M.O. Amdur, J. Doull, and CD. Klaassen (eds.), Pergamon, New York. 
(21) Zenick, H. and E.D. Clegg, (1989). Assessment of Male Repro ­
ductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. In: Principles 
and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven Press, New York. 
(22) Palmer, A.K. (1981). In: Developmental Toxicology, Kimmel, 
C.A. and J. Buelke-Sam (eds.), Raven Press, New York. 
(23) Palmer, A.K. (1978). In Handbook of Teratology, Vol. 4, J.G. 
Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum Press, New York.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 525
 
B.36  TOKSIKOKINETIKA  
UVOD 
1. Ta preskusna metoda ustreza OECD TG 417 (2010). Študije, s katerimi se 
preučuje toksikokinetika (TK) preskusne kemikalije, se izvajajo za prido ­
bitev zadostnih informacij o njeni absorpciji, porazdelitvi, biotransformaciji 
(tj. presnovi) in izlo čanju, za pomo č pri povezovanju koncentracije ali 
odmerka z opaženo strupenostjo ter za razumevanje mehanizma strupenosti te kemikalije. TK lahko pomaga razumeti toksikološke študije z dokazova ­
njem, da so preskusne živali sistemsko izpostavljene preskusni kemikaliji, in 
razkrivanjem, kateri deli kemikalije krožijo (izhodiš čna kemikalija/metabo ­
liti). Osnovni toksikokineti čni parametri, dolo čeni v teh študijah, zagota ­
vljajo tudi informacije o potencialu za kopi čenje preskusne kemikalije v 
tkivih in/ali organih ter potencialu za indukcijo biotransformacije, ki je 
posledica izpostavljenosti preskusni kemikaliji. 
2. Toksikokineti čni podatki lahko pomagajo oceniti, ali so podatki o strupe ­
nosti za živali ustrezni in uporabni za ekstrapolacijo v oceno nevarnosti in/ali tveganja za ljudi. Poleg tega se lahko s toksikokineti čnimi študijami 
pridobijo koristne informacije za dolo čanje velikosti odmerkov pri toksiko ­
loških študijah (linearna/nelinearna kinetika) ter za ugotavljanje u činkov 
načina dajanja, biološke dostopnosti in vidikov, povezanih z zasnovo 
študije. Nekatere vrste toksikokineti čnih podatkov je mogo če uporabiti pri 
zasnovi toksikokineti čnih modelov, temelje čih na fiziologiji (PBTK). 
3. Podatki o metabolitih/toksikokineti čni podatki imajo pomembne uporabe, 
kot je nakazovanje morebitnih strupenosti in na činov delovanja ter njihove 
povezanosti z velikostjo odmerka in na činom izpostavljenosti. Poleg tega se 
lahko s podatki o presnovi pridobijo informacije, ki so uporabne pri ocenje ­
vanju toksikološkega pomena izpostavljenosti eksogeno ustvarjenim meta ­
bolitom preskusne kemikalije. 
4. Ustrezni toksikokineti čni podatki lahko pomagajo dodatno podkrepiti spre ­
jemljivost in uporabnost kvantitativnih razmerij med strukturo in aktivnostjo ter pristopov navzkrižnega branja ali združevanja v skupine pri ocenjevanju 
varnosti kemikalij. Poleg tega se lahko kineti čni podatki uporabljajo tudi za 
ocenjevanje toksikološkega pomena drugih študij (npr.  in vivo /in vitro ). 
5. Če niso navedeni drugi na čini dajanja (glej zlasti odstavke 74–78), se ta 
preskusna metoda uporablja za oralno dajanje preskusne kemikalije.
 
ZAČETNI PREUDARKI 
6. Zakonodajni sistemi imajo za razli čne razrede kemikalij (npr. pesticide, 
biocide, industrijske kemikalije) razli čne zahteve in potrebe glede merjenja 
končnih točk in parametrov, povezanih s toksikokinetiko. V nasprotju z 
večino preskusnih metod je v tej preskusni metodi opisano toksikokineti čno 
preskušanje, ki vklju čuje več meritev in kon čnih točk. V prihodnosti bo 
morda pripravljenih ve č novih preskusnih metod in/ali dokumentov s smer ­
nicami, v katerih bo podrobneje opisana vsaka kon čna točka posebej. V 
primeru te preskusne metode je odlo čitev o tem, kateri preskusi ali ocene 
se izvedejo, odvisna od zahtev in/ali potreb posameznega zakonodajnega 
sistema.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 526
 
7. Za ocenjevanje toksikokineti čnega vedenja preskusne kemikalije za zakono ­
dajne namene se lahko izvedejo številne študije. Vendar glede na posebne 
zakonodajne potrebe ali okoliš čine za ocenjevanje preskusne kemikalije vse 
morda niso potrebne. Pri zasnovi toksikokineti čnih študij sta potrebna prož ­
nost in upoštevanje lastnosti preiskovane preskusne kemikalije. V časih je 
morda treba preiskati samo dolo čen sklop vprašanj, da se odpravijo pomi ­
sleki glede nevarnosti in tveganj, povezani s preskusno kemikalijo. V neka ­
terih okoliš činah se lahko toksikokineti čni podatki zbirajo v okviru ocenje ­
vanja v drugih toksikoloških študijah. Spet v drugih primerih so lahko – 
odvisno od zakonodajnih potreb in/ali če se pri ocenjevanju preskusne 
kemikalije pojavijo nova vprašanja – potrebne dodatne in/ali obsežnejše toksikokineti čne študije. 
8. Da se pove ča kakovost študije in v izogib nepotrebni uporabi živali mora 
preskuševalni laboratorij pred izvedbo študije preu čiti vse razpoložljive 
informacije o preskusni kemikaliji ter zadevnih metabolitih in analogih. To lahko vklju čuje podatke iz drugih ustreznih preskusnih metod (študij  
in vivo , študij  in vitro  in/ali ocen  in silico ). Za načrtovanje študije in razlago 
rezultatov so lahko koristne fizikalno-kemijske lastnosti, kot so porazdelit ­
veni koeficient oktanol/voda (izražen kot log P
 OW ), pKa, topnost v vodi, 
parni tlak in molekulska masa kemikalije. Te lastnosti se lahko ugotovijo z ustreznimi metodami, opisanimi v zadevnih preskusnih metodah.
 
OMEJITVE 
9. Ta preskusna metoda ni zasnovana za obravnavanje posebnih okoliš čin, kot 
so breje ali doje če živali in zarod, ali ocenjevanje morebitnih ostankov v 
izpostavljenih živalih, ki so namenjene proizvodnji hrane. Vendar pa lahko 
podatki, pridobljeni s študijo B.36, zagotovijo splošne osnovne informacije, ki se uporabijo za usmerjanje zasnove posebnih študij za take preiskave. Ta 
preskusna metoda ni namenjena preskušanju nanomaterialov. Kot je nave ­
deno v poro čilu o predhodnem pregledu smernic za preskušanje OECD, 
namenjenemu oceni njihove uporabnosti za nanomateriale, se TG 417 (ki ustreza tej preskusni metodi B.36) za nanomateriale ne sme uporabljati (1).
 
OPREDELITEV POJMOV 
10. Pojmi, ki se uporabljajo v tej preskusni metodi, so opredeljeni v Dodatku.  
PREUDARKI V ZVEZI Z DOBROBITJO ŽIVALI 
11. Napotki o humanem ravnanju z živalmi so na voljo v Dokumentu s smer ­
nicami OECD (GD) 19 (2). Priporo ča se, naj se GD 19 uporablja za vse 
študije  in vivo  ter in vitro , opisane v tej preskusni metodi.  
OPIS METOD  
Pilotne študije  
12. Uporaba pilotnih študij se priporo ča in spodbuja za izbiro preskusnih para ­
metrov toksikoloških študij (npr. presnove, masne bilance, analitskih postop ­
kov, odmernega obmo čja, izdihovanja CO  2 itd.). Za opredelitev nekaterih od 
teh parametrov uporaba izotopsko ozna čenih kemikalij morda ni potrebna.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 527
 
Izbira živali  
Vrsta  
13. Živalska vrsta (in sev) v toksikokineti čnem preskušanju mora biti po 
možnosti ista, kot se uporablja v drugih toksikoloških študijah, izvedenih s preiskovano preskusno kemikalijo. Praviloma je treba uporabiti podgano, saj se v toksikoloških študijah obširno uporablja. Uporaba drugih ali doda ­
tnih vrst je lahko upravi čena, če je iz pomembnih toksikoloških študij 
razvidna precejšnja strupenost za te vrste ali če se pokaže, da je strupenost/ 
toksikokinetika pri njih bolj relevantna za ugotavljanje strupenosti/toksiko ­
kinetike pri ljudeh. Izbiro živalske vrste in njenega seva je treba utemeljiti. 
14. Če ni navedeno druga če, se pri tej preskusni metodi kot preskusna vrsta 
uporablja podgana. Za uporabo drugih preskusnih vrst morda je treba neka ­
tere elemente metode morda treba prilagoditi.
 
Starost in sev  
15. Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle živali (v času odmerjanja navadno 
stare 6–12 tednov) (glej tudi odstavka 13 in 14). Uporabo živali, ki niso mladi odrasli osebki, je treba utemeljiti. Na za četku študije morajo biti vse 
živali podobne starosti. Teža posameznih živali ne sme odstopati za ve č kot 
± 20 % od povpre čne teže v preskusni skupini. Po možnosti je treba upora ­
biti isti sev, ki je bil uporabljen pri pripravi toksikološke zbirke podatkov za preskusno kemikalijo.
 
Število in spol živali  
16. Za vsak preskušeni odmerek je treba uporabiti najmanj štiri živali enega 
spola. Spol uporabljenih živali je treba utemeljiti. O uporabi obeh spolov 
(štirih samcev in štirih samic) je treba razmisliti, če obstajajo dokazi o 
pomembnih razlikah v strupenosti glede na spol.  
Nastanitveni in prehranjevalni pogoji  
17. V splošnem morajo biti živali v preskusnem obdobju nastanjene posami čno. 
Skupinska nastanitev je lahko utemeljena v posebnih okoliš činah. Osvetlitev 
mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe in 12 ur teme. 
Temperatura v prostoru s preskusnimi živalmi mora znašati 22 °C (± 3 °C), relativna vlažnost pa 30–70 %. Za hranjenje se lahko uporablja obi čajna 
laboratorijska hrana z neomejeno koli čino pitne vode.
 
Preskusna kemikalija  
18. Za vse vidike študije v zvezi z masno bilanco in identifikacijo metabolitov 
je treba uporabljati preskusno kemikalijo, ki je ozna čena z izotopom  14 C. Če 
pa se lahko dokaže, da: 
— je mogo če masno bilanco primerno oceniti in metabolite ustrezno iden ­
tificirati z neozna čeno preskusno kemikalijo, 
— sta analitska specifi čnost in ob čutljivost metode ob uporabi neradioa ­
ktivne preskusne kemikalije enaki tistima, ki bi se lahko zagotovili z 
izotopsko ozna čeno preskusno kemikalijo, ali ve čji od njiju,  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 528
 
izotopsko ozna čene preskusne kemikalije ni treba uporabiti. Poleg tega se 
lahko uporabijo tudi drugi radioaktivni in stabilni izotopi, zlasti če je 
zadevni element razlog za strupenost ali je udeležen v strupenem delu preskusne kemikalije. Če je mogo če, mora biti radioaktivni ozna čevalec v 
osrednjem delu molekule, ki je presnovno stabilen (ni izmenljiv, se ne izlo či 
s presnovo kot CO
 2 in ne postane del skupin z enim ogljikovim atomom v 
organizmu). Za spremljanje presnovne poti preskusne kemikalije je lahko potrebno ozna čevanje ve č mest ali specifi čnih regij molekule. 
19. Izotopsko ozna čene preskusne kemikalije in tiste, ki niso izotopsko ozna ­ 
čene, je treba analizirati z ustreznimi metodami za ugotavljanje čistosti in 
identitete. Radiokemijska čistost radioaktivne preskusne kemikalije mora biti 
najvišja dosegljiva za dano preskusno kemikalijo (po možnosti mora biti 
višja od 95 %), razumno pa si je treba tudi prizadevati za identifikacijo nečistot z vsaj 2-odstotnim deležem. Poro čati je treba o čistosti ter identiteti 
in deležu vseh ne čistot, ki so bile identificirane. V posameznih zakonodajnih 
ureditvah so lahko zagotovljeni dodatni napotki v pomo č pri opredeljevanju 
in določanju preskusnih kemikalij, sestavljenih iz zmesi, ter metode za 
določanje čistosti.
 
Izbira odmerkov  
Pilotna študija  
20. Navadno za pilotno študijo zadoš ča enkraten oralni odmerek. Ta ne sme biti 
strupen, mora pa biti dovolj velik za identifikacijo metabolitov v izlo čkih 
(in, če je primerno, plazmi) in izpolnitev opredeljenega namena pilotne 
študije, kot je navedeno v odstavku 12 te preskusne metode.  
Glavne študije  
21. Za glavne študije sta priporo čljiva najmanj dva odmerka, saj lahko informa ­
cije, zbrane na podlagi vsaj dveh odmernih skupin, pomagajo pri dolo čitvi 
odmerkov v drugih študijah strupenosti in pri ocenjevanju odziva v odvis ­
nosti od odmerka v že razpoložljivih preskusih strupenosti. 
22. Kadar se data dva odmerka, morata biti oba dovolj velika, da je mogo če 
identificirati metabolite v izlo čkih (in če je primerno, plazmi). Pri izbiri 
odmerkov je treba upoštevati informacije iz razpoložljivih podatkov o stru ­
penosti. Če te niso na voljo (npr. iz študij akutne oralne strupenosti, v 
katerih se preiskujejo klini čni znaki strupenosti, ali iz študij strupenosti s 
ponavljajo čimi se odmerki), se lahko za ve čji odmerek predvidi vrednost, ki 
je nižja od ocene LD  50 (za oralni in dermalni na čin dajanja) ali LC  50 (za 
inhalacijski na čin dajanja) ali od nižje vrednosti ocene obmo čja akutne 
strupenosti. Ve čji odmerek mora biti eden od ve čkratnikov manjšega 
odmerka. 
23. Če se preiskuje samo ena velikost odmerka, mora biti ta po možnosti dovolj 
velik, da je mogo če identificirati metabolite v izlo čkih (in, če je primerno, 
plazmi), vendar ne sme povzro čiti očitne strupenosti. Nevklju čitev druge 
velikosti odmerka je treba utemeljiti. 
24. Če je treba ugotoviti u činek odmerka na kineti čne procese, dva odmerka 
morda ne bosta zadoš čala, vsaj en odmerek pa mora biti dovolj velik, da se 
ti procesi nasitijo. Če obmo čje pod krivuljo plazemska 
koncentracija- čas (AUC) med dvema velikostma odmerkov, ki se upora ­
bljata v glavni študiji, ni linearna, je to dober znak, da se nekje med 
obema velikostma odmerkov pojavlja nasi čenost enega ali ve č kinetičnih 
procesov.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 529
 
25. Za preskusne kemikalije z nizko strupenostjo je treba uporabiti najve čji 
odmerek 1 000 mg/kg telesne teže (pri oralnem in dermalnem dajanju; če 
je način dajanja inhalacijski, so napotki v poglavju B.2 te priloge, obi čajno 
pa ta odmerek ne presega 2 mg/l). V skladu z zakonodajnimi potrebami je lahko zaradi lastnosti, specifi čne za obravnavano kemikalijo, potreben ve čji 
odmerek. Izbiro odmerkov je treba vedno utemeljiti. 
26. Podatki o toksikokinetiki in porazdelitvi v tkivih, pridobljeni z enkratnim 
odmerkom, lahko zadoš čajo za dolo čitev potenciala za kopi čenje in/ali 
obstojnost. Vendar je v nekaterih okoliš činah lahko potrebno dajanje s 
ponavljajo čimi se odmerki, (i) da se celoviteje obravnavajo potencial za 
kopičenje in/ali obstojnost ali spremembe v TK (npr. indukcija in inhibicija 
encimov) ali (ii) če se to zahteva v veljavni zakonodajni ureditvi. Čeprav v 
študijah s ponavljajo čimi se odmerki obi čajno zadoš ča dajanje ponavljajo čih 
se majhnih odmerkov, je v nekaterih okoliš činah lahko potrebno tudi dajanje 
ponavljajo čih se velikih odmerkov (glej tudi odstavek 57).
 
Dajanje preskusne kemikalije  
27. Preskusno kemikalijo je treba raztopiti ali homogeno suspendirati v enakem 
nosilcu, kot se uporablja v drugih študijah strupenosti z oralno gavažo, 
izvedenih z zadevno preskusno kemikalijo, če so take informacije o nosilcu 
na voljo. Izbiro nosilca je treba utemeljiti. Nosilec in velikost odmerkov je treba predvideti v zasnovi študije. Obi čajna metoda dajanja je z gavažo, 
vendar je lahko v dolo čenih okoliš činah primernejše dajanje z želatinastimi 
kapsulami ali v prehranskih mešanicah (v obeh primerih je treba navesti 
utemeljitev). Potrditi je treba dejanski odmerek, dan vsaki živali. 
28. Najve čja količina tekočine, ki bo dana naenkrat z oralno gavažo, je odvisna 
od velikosti preskusnih živali, vrste nosilca za odmerke in tega, ali se živalim pred dajanjem preskusne kemikalije hrana odreka ali ne. Hranjenje 
ali omejevanje hrane pred dajanjem odmerkov je treba utemeljiti. Praviloma 
je treba koli čino ohranjati tako majhno, kot je prakti čno, kar velja tako za 
vodne kot nevodne nosilce. Velikosti odmerkov pri glodavcih navadno ne smejo presegati 10 ml/kg telesne teže. Koli čine nosilcev, ki se uporabijo za 
bolj lipofilne preskusne kemikalije, se lahko za čnejo pri 4 ml/kg telesne 
teže. Za ponavljajo če se odmerjanje, pri katerem je dnevno postenje 
kontraindicirano, je treba predvideti manjše velikosti odmerkov (npr. 2–4 ml/kg telesne teže). Kadar je mogo če, je treba razmisliti o uporabi koli čin 
odmerkov, ki so v skladu s tistimi, ki so bili uporabljeni v drugih študijah z 
oralno gavažo v zvezi s preskusno kemikalijo. 
29. Intravenozno (IV) dajanje preskusne kemikalije in merjenje njene prisotnosti 
v krvi in/ali izlo čkih se lahko uporabita za ugotavljanje biološke dostopnosti 
ali relativne oralne absorpcije. V IV-študiji se z uporabo ustreznega nosilca da enkraten odmerek preskusne kemikalije (ki je navadno enak manjšemu 
oralnemu odmerku, ne sme pa ga presegati – glej odstavke o izbiri odmer ­
kov). To snov je treba dati v ustrezni koli čini (npr. 1 ml/kg telesne teže) na 
izbranem mestu dajanja najmanj štirim živalim primernega spola (uporabita se lahko oba spola, če je to upravi čeno – glej odstavek 16). Za IV-dajanje 
preskusne kemikalije je potreben popolnoma raztopljen ali suspendiran 
pripravek z odmerkom. Nosilec za IV-dajanje ne sme vplivati na celovitost
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 530
 
ali pretok krvi. Če se preskusna kemikalija daje z infuzijo, je treba o hitrosti 
infuzije poro čati in jo uskladiti za vse živali, če se uporablja infuzijska 
črpalka. Kadar se izvede kanilacija jugularne vene (za dajanje preskusne 
kemikalije in/ali odvzem krvi) ali se za dajanje uporabi stegenska arterija, je treba uporabiti anestezijo. O vrsti anestezije je treba skrbno razmisliti, saj 
lahko vpliva na toksikokinetiko. Preden se živalim da preskusna kemikalija 
z nosilcem, jim je treba omogo čiti, da si dovolj opomorejo. 
30. Za nekatere preskusne kemikalije se glede na njihove fizikalno-kemijske 
lastnosti in pri čakovano uporabo ali izpostavljenost ljudi lahko uporabijo 
drugi načini dajanja, npr. dermalni in inhalacijski (glej odstavke 74–78).
 
Meritve  
Masna bilanca  
31. Masna bilanca se dolo či s seštetjem deleža danega (radioaktivnega) 
odmerka, ki se izlo či v urinu, iztrebkih in izdihanem zraku, ter deleža, 
prisotnega v tkivih, preostanku trupa in teko čini od izpiranja kletke (glej 
odstavek 46). Na splošno se šteje, da ustrezna skupna rekuperacija znaša > 90 % dane preskusne kemikalije (radioaktivnosti).
 
Absorpcija  
32. Začetno oceno absorpcije je mogo če dobiti z izklju čitvijo deleža odmerka v 
prebavnem traktu in/ali iztrebkih iz dolo čanja masne bilance. Za izra čun 
deleža absorpcije glej odstavek 33. Za preiskovanje izlo čkov glej odstavke 
44–49. Če natančnega obsega absorpcije po oralnem dajanju odmerka ni 
mogoče ugotoviti iz študij masne bilance (npr. kadar je v iztrebkih ve č kot 
20 % danega odmerka), so morda potrebne dodatne preiskave. Te študije lahko zajemajo bodisi (1) oralno dajanje preskusne kemikalije in merjenje 
njene prisotnosti v žol ču bodisi (2) oralno in IV-dajanje preskusne kemika ­
lije ter merjenje njene neto koli čine v urinu, izdihanem zraku in trupu za 
vsakega od obeh na činov dajanja. V kateri koli od obeh zasnov študij se 
merjenje radioaktivnosti uporabi kot nadomestna metoda za analizo, speci ­
fično za kemikalijo, preskusne kemikalije in metabolitov. 
33. Če se izvaja študija žol čnega izlo čanja, se navadno uporabi oralni na čin 
dajanja. V tej študiji je treba izvesti kanilacijo žol čnih vodov pri najmanj 
štirih živalih ustreznega spola (ali obeh spolov, če je to upravi čeno) in jim 
dati enkratni odmerek preskusne kemikalije. Po dajanju preskusne kemika ­
lije je treba izlo čanje radioaktivnosti/preskusne kemikalije v žol ču spremljati 
tako dolgo, kolikor je potrebno za oceno deleža danega odmerka, ki se izlo či 
na ta način, s tem podatkom pa se lahko neposredno izra čuna obseg oralne 
absorpcije, in sicer z ena čbo: 
deležabsorpcije ¼ ðkoličinavžolču þ urinu þ izdihanemzraku 
þtrupubrezkoli činevprebavnemtraktu Þ=
danakoličina Ü 100 
34. Pri nekaterih razredih preskusnih kemikalij se lahko pojavi neposredna 
sekrecija absorbiranega odmerka skozi črevesne sluznice. V takih primerih 
se šteje, da merjenje deleža odmerka v iztrebkih po oralnem dajanju pri 
podgani, pri kateri je bila izvedena kanilacija žol čnega voda, ni reprezenta ­
tivno za neabsorbirani odmerek. Če se zdi, da se pojavlja sekrecija v čreve­
sju, je priporo čljivo, da delež absorbiranega odmerka temelji na absorpciji, 
izračunani s primerjavo med izlo čanjem po oralnem in izlo čanjem po 
IV-dajanju (nedotaknjena podgana ali podgana, na kateri je bila izvedena kanilacija žol čnega voda) (glej odstavek 35). Kadar se šteje, da je potrebna 
količinska opredelitev sekrecije v črevesju, je priporo čljivo tudi izmeriti 
izločanje po IV-dajanju odmerka pri podgani, na kateri je bila izvedena 
kanilacija žol čnega voda.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 531
 
Biološka dostopnost  
35. Biološka dostopnost se lahko dolo či na podlagi plazemske/krvne kinetike 
skupine, tretirane z oralnim dajanjem, in skupine, tretirane z IV-dajanjem, kot je opisano v odstavkih 50–52, s posebno kemijsko analizo preskusne 
kemikalije in/ali zadevnih metabolitov, tako da izotopsko ozna čena 
preskusna kemikalija ni potrebna. Nato se izra čuna biološka 
dostopnost (F) preskusne kemikalije ali zadevnih metabolitov, in sicer z enačbo: 
F ¼ ðAUC
 exp=AUC  IV Þ Ü ðodmerek  IV=odmerek  exp Þ; 
pri čemer je AUC obmo čje pod krivuljo plazemska koncentracija- čas, exp 
pa način dajanja pri preskusu (oralni, dermalni ali inhalacijski). 
36. Pri ocenjevanju tveganja sistemskih u činkov je uporaba biološke dostopnosti 
strupene sestavine navadno ustreznejša od uporabe deleža absorpcije, če se 
sistemske koncentracije iz študij na živalih primerjajo s podobnimi podatki o 
biomonitoringu, pridobljenimi s študijami izpostavljenosti delavcev. Okoli ­ 
ščine pa lahko postanejo bolj zapletene, če so odmerki v nelinearnem 
območju, zato je pomembno, da se s toksikokineti čnim presejalnim 
preskusom dolo čijo odmerki v linearnem obmo čju. 
Porazdelitev v tkivih  
37. Poznavanje porazdelitve preskusne kemikalije in/ali njenih metabolitov v 
tkivih je pomembno za opredelitev ciljnih tkiv, razumevanje osnovnih mehanizmov strupenosti ter pridobivanje informacij o potencialu za kopi ­ 
čenje in obstojnost preskusne kemikalije in metabolitov. Delež celotnega 
(radioaktivnega) odmerka v tkivih in preostanku trupa je treba izmeriti 
vsaj ob koncu preskusa z izlo čanjem (npr. navadno do 7 dni po odmerku 
ali prej, odvisno od posebnega obnašanja preskusne kemikalije). Če se ob 
koncu študije v tkivih preskusne kemikalije ne odkrije (npr. ker se je zaradi 
kratke razpolovne dobe izlo čila pred koncem študije), je treba paziti, da se 
podatki ne razlagajo napa čno. V takem primeru je treba preiskavo porazde ­
litve v tkivih opraviti v času najvišje plazemske/krvne koncentracije (T
 max ) 
ali najvišje stopnje izlo čanja preskusne kemikalije (in/ali metabolitov) z 
urinom, kot je ustrezno (glej odstavek 38). Poleg tega je morda treba 
tkiva zbirati tudi v dodatnih časovnih to čkah, in sicer za ugotavljanje poraz ­
delitve preskusne kemikalije in/ali njenih metabolitov v tkivih, ocenjevanje 
odvisnosti od časa (po potrebi), v pomo č pri določanju masne bilance in/ali 
če to zahteva pristojni organ. Tkiva, ki jih je treba zbrati, so med drugim 
jetra, maš čoba, prebavni trakt, ledvice, vranica, polna kri, preostanek trupa, 
tkiva ciljnih organov in vsa druga tkiva (npr. š čitnica, eritrociti, razmnože ­
valni organi, koža, oko (zlasti pri pigmentiranih živalih)), ki so lahko 
pomembna pri toksikološki oceni preskusne kemikalije. Razmisliti je treba o analiziranju dodatnih tkiv, zbranih v istih časovnih to čkah, da se živali kar 
najbolj izkoristijo ter če se v študijah subkroni čne ali kroni čne strupenosti 
opazi strupenost za ciljni organ. Poro čati je treba tudi o koncentraciji 
(radioaktivnega) ostanka in razmerjih tkivo-plazma (kri). 
38. Mogo če je tudi, da je treba porazdelitev v tkivih oceniti še v dodatnih 
časovnih to čkah, na primer ob najvišji koncentraciji v plazmi/krvi (npr. 
T
 max ) ali najvišji stopnji izlo čanja z urinom, dolo čenih na podlagi ustreznih 
preskusih plazemske/krvne kinetike ali preskusih z izlo čanjem, ali pa da to 
zahteva pristojni organ. Te informacije so lahko koristne za razumevanje strupenosti ter potenciala za kopi čenje in obstojnost preskusne kemikalije in 
metabolitov. Izbiro vzorca je treba utemeljiti; vzorci za analizo so navadno 
enaki zgoraj navedenim (glej odstavek 37).
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 532
 
39. Za študije porazdelitve v tkivih je koli čino radioaktivnosti mogo če določiti z 
disekcijo organov, homogenizacijo, sežigom in/ali solubilizacijo, čemur sledi 
tekočinsko scintilacijsko štetje (LSC) zajetih ostankov. Nekatere tehnike, ki 
so trenutno na razli čnih stopnjah razvoja, npr. kvantitativna avtoradiografija 
celega telesa in receptorska mikroskopska avtoradiografija, se lahko izkažejo 
kot koristne pri dolo čanju porazdelitve preskusne kemikalije v organih in/ali 
tkivih (3) (4). 
40. Pri na činih izpostavljenosti, ki niso oralni, je treba zbrati in analizirati 
specifična tkiva, kot so plju ča pri inhalacijskih študijah in koža pri 
dermalnih študijah. Glej odstavke 74–78.  
Presnova  
41. Izločke (in po potrebi plazmo) je treba zbrati, da se identificirajo nespreme ­
njena preskusna kemikalija in metaboliti ter dolo čijo njihove koli čine, kot je 
opisano v odstavkih 44–49. Sprejemljivo je združevanje izlo čkov, da se 
olajša identifikacija metabolitov v dolo čeni odmerni skupini. Priporo čljivo 
je določiti profile metabolitov iz vsakega časovnega obdobja. Če to zaradi 
pomanjkanja vzorcev in/ali radioaktivnosti ni mogo če, je sprejemljivo zdru ­ 
ževanje urina in iztrebkov, zbranih v razli čnih časovnih to čkah, vendar 
morajo ti biti od živali istega spola in iz iste odmerne skupine. Za analizi ­
ranje urina, iztrebkov, izdihane radioaktivnosti tretiranih živali in po potrebi 
žolča je treba uporabiti ustrezne kvalitativne in kvantitativne metode. 
42. Razumno si je treba prizadevati, da se identificirajo vsi metaboliti z vsaj 5- 
odstotnim deležem danega odmerka in pripravi shema presnove za 
preskusno kemikalijo. Identificirati je treba preskusne kemikalije, za katere 
je bilo pri analizi izlo čkov ugotovljeno, da obsegajo 5 % danega odmerka 
ali več. Identifikacija pomeni to čno določanje strukture sestavin. Navadno se 
izvede z dodatno kromatografijo metabolita z znanimi standardi z dvema 
različnima sistemoma ali tehnikami, ki omogo čajo pozitivno strukturno iden ­
tifikacijo, kot so masna spektrometrija, jedrska magnetna resonanca (NMR) itd. Pri dodatni kromatografiji kromatografske tehnike, pri katerih se upora ­
blja ista stacionarna faza z dvema razli čnima topilnima sistemoma, niso 
ustrezne za potrjevanje identitete metabolita, ki temelji na dveh metodah, 
saj metodi nista neodvisni. Za identifikacijo z dodatno kromatografijo je treba uporabiti dva razli čna in analitsko neodvisna sistema, kot sta tankopla ­
stna kromatografija (TLC) z reverzno in normalno fazo ter teko činska 
kromatografija visoke lo čljivosti (HPLC). Če je kromatografsko lo čevanje 
ustrezne kakovosti, dodatno potrjevanje s spektroskopskimi metodami ni potrebno. Nedvoumna identifikacija pa je mogo ča tudi z metodami, s kate ­
rimi se pridobivajo strukturne informacije, kot so: teko činska kromatografija 
z masno spektrometrija (LC-MS) ali teko činska kromatografija s tandemsko 
masno spektrometrijo (LC-MS/MS), plinska kromatografija z masno spek ­
trometrijo (GC-MS) in spektroskopija z jedrsko magnetno resonanco. 
43. Če metabolitov z vsaj 5-odstotnim deležem danega odmerka ni mogo
če 
identificirati, je treba v kon čnem poro čilu to utemeljiti/pojasniti. Morda je 
ustrezno identificirati metabolite, ki predstavljajo manj kot 5 % danega odmerka, da se izboljša razumevanje presnovne poti za oceno nevarnosti in/ali tveganja preskusne kemikalije. Če je to mogo če, je treba navesti 
potrditev strukture. Za to je morda treba dolo čiti profile metabolitov v 
plazmi, krvi ali drugih tkivih.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 533
 
Izločanje 
44. Stopnjo in obseg izlo čanja danega odmerka je treba dolo čiti tako, da se 
izmeri delež (radioaktivnega) odmerka, pridobljen iz urina, iztrebkov in izdihanega zraka. Ti podatki pomagajo tudi pri dolo čanju masne bilance. 
Količine preskusne kemikalije (radioaktivnosti), izlo čene z urinom, iztrebki 
in izdihanim zrakom, je treba dolo čati v ustreznih časovnih intervalih (glej 
odstavke 47–49). Preskusi s ponavljajo čimi se odmerki morajo biti ustrezno 
zasnovani, da je mogo če zbirati podatke o izlo čanju za izpolnitev ciljev iz 
odstavka 26. S tem se omogo či primerjave s preskusi z enkratnim odmer ­
kom. 
45. Če pilotna študija pokaže, da v izdihanem zraku ni pomembne koli čine 
preskusne kemikalije (radioaktivnosti) (v skladu z odstavkom 49), v kon čni 
študiji izdihanega zraka ni treba zbirati. 
46. Za zbiranje izlo čkov (urina, iztrebkov in izdihanega zraka) se vsaka žival 
namesti v lo čeno enoto za preiskave presnove. Ob koncu vsakega obdobja 
zbiranja (glej odstavke 47–49) je treba te enote sprati z ustreznim topilom (ta postopek se imenuje „izpiranje kletke“), da se zagotovi kar najve čja 
rekuperacija preskusne kemikalije (radioaktivnosti). Izlo čki se nehajo zbirati 
po 7 dneh ali po tem, ko je bilo pridobljenih vsaj 90 % danega odmerka, kar od tega je prej. 
47. Skupne koli čine preskusne kemikalije (radioaktivnosti) v urinu je treba prvi 
dan zbiranja dolo čati vsaj dvakrat, od tega enkrat 24 ur po odmerku, nato pa 
enkrat na dan do konca študije. Priporo čljivo je, da se za prvi dan izbereta 
več kot dve časovni to čki vzorčenja (npr. 6, 12 in 24 ur po odmerku). 
Rezultate pilotnih študij je treba analizirati, da se pridobijo informacije o drugih ali dodatnih časovnih to čkah zbiranja. Razpored zbiranja je treba 
utemeljiti. 
48. Skupne koli čine preskusne kemikalije (radioaktivnosti) v iztrebkih je treba 
ugotavljati dnevno, prvi č 24 ur po dajanju odmerka, do konca študije, razen 
če pilotne študije kažejo, da so za zbiranje potrebne druge ali dodatne 
časovne to čke. Druga čne razporede zbiranja je treba utemeljiti. 
49. Zbiranje izdihanega CO
 2 in drugih hlapnih snovi se lahko v dolo čenem 
preskusu v študiji prekine, ko se v 24-urnem obdobju zbiranja izdihanega zraka v njem ugotovi manj kot 1 % danega odmerka.
 
Študije časovnega poteka  
Plazemska/krvna kinetika  
50. Namen teh študij je oceniti osnovne toksikokineti čne parametre (npr. C  max , 
T max , razpolovno dobo (t  1/2 ), AUC) preskusne kemikalije. Opravijo se lahko 
pri enem odmerku, navadno pa pri dveh ali ve č odmerkih. Odmerek je treba 
določiti glede na vrsto preskusa in/ali vidik, obravnavan v študiji. Kineti čni 
podatki so lahko potrebni za reševanje vprašanj, kot je biološka dostopnost 
preskusne kemikalije, in/ali za pojasnitev u činka odmerka na iz čistek (npr. 
ali je nasi čenost izčistka odvisna od odmerka). 
51. Za te študije je treba uporabiti najmanj štiri živali istega spola na odmerno 
skupino. Spol uporabljenih živali je treba utemeljiti. O uporabi obeh spolov 
(štirih samcev in štirih samic) je treba razmisliti, če obstajajo dokazi o 
pomembnih razlikah v strupenosti glede na spol.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 534
 
52. Potem ko se živalim da preskusna kemikalija (izotopsko ozna čena), je treba 
vsaki živali v ustreznih časovnih to čkah z ustrezno metodo odvzeti vzorce 
krvi. Velikost in število vzorcev krvi, ki se lahko odvzamejo eni živali, sta lahko omejena zaradi možnih u činkov večkratnega jemanja vzorcev na zdra ­
vje/fiziologijo živali in/ali ob čutljivosti analitske metode. Vzorce je treba 
analizirati za vsako posamezno žival. V nekaterih primerih (npr. pri oprede ­
ljevanju lastnosti metabolitov) je mogo če treba združiti vzorce ve č živali. 
Združene vzorce je treba jasno identificirati, združitev pa utemeljiti. Če se 
uporabi izotopsko ozna čena preskusna kemikalija, je morda ustrezno anali ­
zirati skupno prisotnost radioaktivnosti. V tem primeru je treba skupno 
radioaktivnost analizirati v polni krvi in plazmi ali plazmi in rde čih krvni­ 
čkah, da se lahko izra čuna razmerje kri-plazma. V drugih primerih so morda 
potrebne bolj specifi čne preiskave, za katere je treba identificirati izhodiš čno 
spojino in/ali metabolite, ali ocena vezave na beljakovine.
 
Kinetika drugih tkiv  
53. Namen teh študij je pridobiti informacije o časovnem poteku ter z dolo čit­
vijo količine preskusne kemikalije v razli čnih tkivih ugotoviti parametre, kot 
so način strupenega delovanja, kopi čenje v organizmih in biološka obstoj ­
nost. Izbira tkiv in število časovnih to čk, ki bodo ocenjene, so odvisni od 
obravnavanega vidika in toksikološke zbirke podatkov za preskusno kemi ­
kalijo. Pri zasnovi teh kineti čnih študij na drugih tkivih je treba upoštevati 
informacije, zbrane v skladu z odstavki 37–40. Pri njih se lahko uporabijo 
enkratni odmerki ali ponavljajo či se odmerki. Uporabljeni pristop je treba 
natančno utemeljiti. 
54. Razlogi za izvajanje kineti čnih študij na drugih tkivih so lahko: 
— dokazana podaljšana razpolovna doba v krvi, kar kaže na možnost kopi ­ 
čenja preskusne kemikalije v razli čnih tkivih, ali 
— želja ugotoviti, ali je bila v dolo čenih tkivih dosežena stabilna raven 
koncentracije (na primer pri študijah s ponavljajo čimi se odmerki je 
bila morda raven dinami čnega ravnotežja preskusne kemikalije v krvi 
očitno dosežena, vseeno pa se želi preveriti, da je bila dosežena tudi v 
ciljnih tkivih). 
55. Pri teh vrstah študij časovnega poteka je treba ustrezni oralni odmerek 
preskusne kemikalije dati vsaj štirim živalim na odmerek in časovno to čko, 
nato pa je treba spremljati časovni potek porazdelitve v izbranih tkivih. 
Uporabijo se lahko živali samo enega spola, razen če je ugotovljeno, da 
je strupenost odvisna od spola. Od obravnavanega vidika je odvisno tudi, ali 
se analizirajo celotna radioaktivnost ali izhodiš čna kemikalija in/ali metabo ­
liti. Porazdelitev v tkivih je treba oceniti z ustreznimi tehnikami.  
Indukcija/inhibicija encimov  
56. V enem ali ve č naslednjih primerih so lahko potrebne študije možnih 
učinkov indukcije/inhibicije encimov ali biotransformacije preu čevane 
preskusne kemikalije: 
1. razpoložljivi dokazi kažejo povezavo med biotransformacijo preskusne 
kemikalije in pove čano strupenostjo; 
2. razpoložljivi podatki o strupenosti kažejo nelinearno razmerje med 
odmerkom in presnovo;  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 535
 
3. rezultati študij za identifikacijo metabolitov kažejo obstoj potencialno 
strupenega metabolita, ki je morda rezultat encimske poti, ki jo je 
povzročila preskusna kemikalija; 
4. pri pojasnjevanju u činkov, za katere se domneva povezava s pojavom 
indukcije encimov; 
5. če se pri preskusih  in vitro  ali in vivo  na različnih vrstah ali v razli čnih 
pogojih ugotovijo za strupenost pomembne spremembe presnovnega profila preskusne kemikalije, je morda potrebna opredelitev lastnosti 
udeleženih encimov (npr. encimi faze I, kot so izoencimi od citokroma 
P450 odvisnega monooksigenaznega sistema, encimi faze II, kot so izoencimi sulfotransferaze ali uridin difosfat glukuronozil transferaze. ali kateri koli drugi pomembni encimi). Te informacije se lahko upora ­
bijo za oceno primernosti ekstrapolacij ene živalske vrste na drugo. 
57. Za ocenjevanje sprememb v toksikokinetiki, povezanih s preskusno kemi ­
kalijo, je treba uporabiti primerne protokole študij, ki so ustrezno validirani in utemeljeni. Zasnove študij lahko na primer obsegajo ponavljajo če se 
odmerke neozna čene preskusne kemikalije, čemur 14. dan sledi enkraten 
izotopsko ozna čen odmerek, ali ponavljajo če se odmerke izotopsko ozna ­ 
čene preskusne kemikalije in vzor čenje na 1., 7. in 14. dan za dolo čitev 
presnovnih profilov. S ponavljajo čimi se odmerki izotopsko ozna čene 
preskusne kemikalije se lahko pridobijo tudi informacije o kopi čenju v 
organizmih (glej odstavek 26).
 
DODATNI PRISTOPI 
58. Z dodatnimi pristopi poleg preskusov  in vivo , opisanih v tej preskusni 
metodi, se lahko pridobijo koristne informacije o absorpciji, porazdelitvi, 
presnovi ali izlo čanju preskusne kemikalije pri nekaterih vrstah.  
Uporaba informacij iz preskusov  in vitro  
59. S študijami  in vitro , v katerih so uporabljeni ustrezni preskusni sistemi, je 
mogoče dobiti odgovore na ve č vprašanj o presnovi preskusne kemikalije. 
Za preučevanje mogo čih metabolitov se lahko uporabijo sveže izolirani ali 
kultivirani hepatociti in podceli čne frakcije (npr. mikrosomi in citosolska 
frakcija ali frakcija S9) iz jeter. Za oceno tveganja je lahko zanimiva lokalna 
presnova v ciljnem organu, npr. plju čih. Za te namene so lahko koristne 
mikrosomske frakcije ciljnih tkiv. Študije z mikrosomi so lahko koristne za obravnavanje morebitnih razlik med spoloma in glede na fazo življenja ter 
za opredelitev encimskih parametrov (K
 m in V  max ), ki so lahko v pomo č pri 
ocenjevanju odvisnosti presnove od odmerka v povezavi s stopnjami izpo ­
stavljenosti. Poleg tega so lahko mikrosomi v pomo č pri identifikaciji 
posebnih mikrosomskih encimov, ki sodelujejo pri presnovi preskusne kemi ­
kalije, kar je lahko pomembno pri ekstrapolaciji ene živalske vrste na drugo 
(glej tudi odstavek 56). Prav tako se lahko preu či potencial za indukcijo 
biotransformacije, in sicer s podceli čnimi frakcijami (npr. mikrosomi in 
citosoli) iz jeter živali, predhodno tretiranih s preiskovano preskusno kemi ­
kalijo,  in vitro  v študijah indukcije hepatocitov, ali na podlagi dolo čenih 
celičnih linij, v katerih so izraženi ustrezni encimi. V nekaterih okoliš činah 
in ustreznih pogojih se lahko za dolo čanje možnih razlik pri biotransforma ­
ciji med vrstami predvidi uporaba podceli čnih frakcij iz človeških tkiv. 
Rezultati iz preiskav  in vitro  se lahko uporabijo tudi pri izdelavi modelov 
PBTK (5).  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 536
 
60. S študijami dermalne absorpcije  in vitro  se lahko pridobijo dodatne infor ­
macije za opredelitev absorpcije (6). 
61. Primarne celi čne kulture iz jetrnih celic in rezin svežega tkiva se lahko 
uporabijo za obravnavo podobnih vprašanj kot pri jetrnih mikrosomih. V 
nekaterih primerih je mogo če na konkretna vprašanja odgovoriti s celi čnimi 
linijami z opredeljenimi izraženimi ustreznimi encimi ali spremenjenimi celičnimi linijami. V nekaterih primerih je lahko koristno preu čevati inhibi ­
cijo in indukcijo posebnih izoencimov citokroma P450 (npr. CYP1A1, 2E1, 
1A2 in drugih) in/ali encimov faze II z izhodiš čno spojino v okviru študij  in 
vitro . Pridobljene informacije so lahko koristne za spojine s podobno struk ­
turo.
 
Uporaba toksikokineti čnih podatkov iz študij strupenosti kot dodatnih 
informacij  
62. Analiza vzorcev krvi, tkiva in/ali izlo čkov, pridobljenih med izvajanjem 
drugih študij strupenosti, lahko zagotovi podatke o biološki dostopnosti, 
spremembah plazemske koncentracije v odvisnosti od časa (AUC, C  max ), 
potencialu za kopi čenje v organizmih, stopnjah iz čistkov ter spremembah v 
presnovi in kinetiki glede na spol ali fazo življenja. 
63. Zasnova študije se lahko prilagodi, da se poiš čejo odgovori na vprašanja v 
zvezi z: nasi čenostjo absorpcije, potmi biotransformacije ali izlo čanja pri 
večjih odmerkih; delovanjem novih presnovnih poti pri ve čjih odmerkih 
in omejenostjo strupenih metabolitov na ve čje odmerke. 
64. Drugi vidiki ocene nevarnosti bi lahko bili na primer: 
— s starostjo povezana ob čutljivost zaradi razlik v stanju krvno-možganske 
pregrade, ledvic in/ali zmožnosti razstrupljanja, 
— občutljivost podpopulacij zaradi razlik v zmožnostih biotransformacije 
ali drugih toksikokineti čnih razlik, 
— stopnja izpostavljenosti fetusa pri transplacentarnem prenosu kemikalij 
ali novorojene živali prek laktacije.  
Uporaba toksikokineti čnega modeliranja  
65. Toksikokineti čni modeli lahko prispevajo k razli čnim vidikom ocenjevanja 
nevarnosti in tveganja, na primer pri napovedovanju sistemske izpostavlje ­
nosti in odmerka za notranje tkivo. Poleg tega se lahko z njimi obravnavajo 
konkretna vprašanja o na činu delovanja, lahko pa so tudi osnova za ekstra ­
polacijo na druge vrste, na čine izpostavljenosti in vzorce dajanja odmerkov 
ter ocenjevanje tveganja za ljudi. Podatki, koristni za izdelavo modelov 
PBTK za preskusno kemikalijo za dano vrsto, vklju čujejo 1. porazdelitvene 
koeficiente, 2. biokemi čne konstante in fiziološke parametre, 3. parametre 
absorpcije pri razli čnih načinih izpostavljenosti in 4. kineti čne podatke  in 
vivo za ovrednotenje modela (npr. parametri iz čistkov za ustrezne poti izlo ­ 
čanja (> 10 %), K  m in V  max za presnovo). Preskusne podatke, uporabljene 
pri izdelavi modela, je treba pridobiti z znanstveno utemeljenimi metodami, rezultate modela pa validirati. Parametri, specifi čni za preskusno kemikalijo 
in vrsto, kot so stopnje absorpcije, porazdelitev med krvjo in tkivom ter 
konstante hitrosti presnove, se pogosto dolo čajo, da bi se olajšala izdelava 
nerazdelčnih modelov ali modelov, ki temeljijo na fiziologiji (7).
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 537
 
PODATKI IN PORO ČANJE 
66. Priporo čljivo je, da poro čilo o študiji vsebuje kazalo.  
Osrednji del poro čila 
67. V osrednjem delu poro čila morajo biti predstavljene informacije, ki jih 
obsega ta preskusna metoda. Raz členjeno mora biti na oddelke in odstavke, 
kot je navedeno v nadaljevanju.  
Povzetek  
68. Ta oddelek poro čila o študiji mora vsebovati povzetek zasnove študije in 
opis uporabljenih metod. V njem morajo biti poudarjene klju čne ugotovitve 
v zvezi z masno bilanco, lastnostmi in pomembnostjo metabolitov, ostanki tkiv, stopnjo iz čistkov, potencialom za kopi čenje v organizmih, razlikami 
glede na spol itd. Povzetek mora biti dovolj podroben, da omogo ča oceno 
ugotovitev.
 
Uvod  
69. Ta del poro čila mora vsebovati cilje študije, razloge zanjo, njeno zasnovo ter 
ustrezne vire in pretekle podatke o podro čju. 
Materiali in metode  
70. V tem oddelku poro čila morajo biti podrobno navedene vse ustrezne infor ­
macije, vklju čno z naslednjimi: 
(a) Preskusna kemikalija 
V tem pododdelku je treba identificirati preskusno kemikalijo in navesti: 
kemijsko ime, molekulsko strukturo, kvalitativno in kvantitativno opre ­
delitev kemijske sestave, kemijsko čistost ter po možnosti vrsto in koli ­ 
čino nečistot. Vklju čiti je treba tudi informacije o fizikalnih/kemijskih 
lastnostih, vklju čno z agregatnim stanjem, barvo, bruto koeficientom 
topnosti in/ali porazdelitvenim koeficientom, stabilnostjo in po potrebi jedkostjo. Če je ustrezno, je treba navesti informacije o izomerih. Če je 
preskusna kemikalija izotopsko ozna čena, je treba v ta poddel vklju čiti 
naslednje informacije: vrsto radionuklida, položaj oznake, specifi čno 
aktivnost in radiokemijsko čistost. 
Opisati je trebe vse nosilce, red čila, snovi za upo časnitev sedimentacije 
v suspenziji, emulgatorje ali druge snovi, uporabljene pri dajanju preskusne kemikalije. 
(b) Preskusne živali 
V tem pododdelku je treba navesti informacije o preskusnih živalih, 
vključno z izbranimi vrstami in razlogi za njihovo uporabo, sevom in 
starostjo ob za četku študije, spolom in telesno težo, zdravstvenim 
stanjem in oskrbo živali. 
(c) Metode 
V tem poddelu je treba navesti podrobne informacije o zasnovi študije 
in uporabljeni metodologiji. Vsebovati mora naslednje informacije: 
1. utemeljitev spremembe na čina izpostavljenosti in pogojev izposta ­
vljenosti, če je ustrezno;
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 538
 
2. utemeljitev izbranih velikosti odmerkov; 
3. opis pilotnih študij, uporabljenih za preskusno zasnovo nadaljnjih 
študij, če je ustrezno. Predložiti je treba podporne podatke pilotne 
študije; 
4. opis priprave raztopin za odmerjanje z navedbo vrste topila ali 
nosilca, če je bil uporabljen; 
5. število tretiranih skupin in število živali na skupino; 
6. velikosti in koli čino odmerkov (in specifi čna aktivnost odmerka, če 
se uporabi radioaktivnost); 
7. načine in metode dajanja odmerkov; 
8. pogostnost dajanja odmerkov; 9. obdobje postenja ( če se uporabi); 
10. skupno radioaktivnost na žival; 
11. opis ravnanja z živalmi; 
12. opis jemanja vzorcev in ravnanja z njimi; 
13. analitske metode, uporabljene za lo čevanje, dolo čanje količine in 
identifikacijo metabolitov; 
14. mejo zaznavnosti za uporabljene metode; 15. druge uporabljene preskusne meritve in postopke (vklju čno z vali ­
dacijo metod za analizo metabolitov). 
(d) Statisti čna analiza 
Če se za analizo ugotovitev študije uporabi statisti čna analiza, je treba 
vključiti zadostne informacije o metodi analize in uporabljenem ra ču­
nalniškem programu, da lahko neodvisni ocenjevalec/statistik analizo znova oceni in ponovi. 
Če se uporabijo študije sistemskega modeliranja, kot je PBTK, je treba v 
predstavitev modelov vklju čiti popoln opis modela, da se lahko izvedeta 
neodvisna ponovitev in validacija modela (glej odstavek 65 in Dodatek: 
opredelitev pojmov).
 
Rezultati  
71. Vse podatke je treba povzeti in predstaviti v preglednicah z ustrezno stati ­
stično oceno ter jih opisati v tem delu. Podatke, pridobljene pri merjenju 
radioaktivnosti, je treba povzeti in predstaviti, kot je ustrezno za študijo, 
navadno v ekvivalentih mikrogramov ali miligramov na maso vzorca, lahko 
pa se uporabijo tudi druge enote. Ta del mora vklju čevati grafi čne ponazo ­
ritve ugotovitev, izvode reprezentativnih kromatografskih in spektrometri ­ 
čnih podatkov, identifikacijo/koli činsko opredelitev metabolitov in pred ­
lagane presnovne poti, vklju čno z molekulsko strukturo metabolitov. 
Poleg tega je treba po potrebi v ta del vklju čiti naslednje informacije: 
1. količino in delež rekuperacije radioaktivnosti v urinu, iztrebkih, izdi ­
hanem zraku ter v urinu in iztrebkih ob izpiranju kletk; 
— pri dermalnih študijah je treba vklju čiti tudi podatke o rekuperaciji 
preskusne kemikalije iz tretirane kože in ob umivanju kože, ostanku radioaktivnosti na aparaturi, ki pokriva kožo, in v enoti za preiskave 
presnove ter rezultate študije z umivanjem kože. Za ve č podrobnosti 
glej odstavke 74–77,
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 539
 
— pri inhalacijskih študijah je treba vklju čiti tudi podatke o rekuperaciji 
preskusne kemikalije iz plju č in nosnih tkiv (8). Za ve č podrobnosti 
glej odstavek 78; 
2. porazdelitev v tkivih, izraženo kot delež danega odmerka in koncentracija 
(ekvivalenti mikrogramov na gram tkiva), in razmerja tkivo-kri ali tkivo-plazma; 
3. materialno bilanco, izdelano na podlagi vsake študije, ki vklju čuje 
analizo telesnih tkiv in izlo čkov; 
4. plazemske koncentracije in toksikokineti čne parametre (biološka dostop ­
nost, AUC, Cmax, Tmax, iz čistek, razpolovna doba) po tem, ko je bil 
dan odmerek preskusne kemikalije v skladu z ustreznimi na čini izposta ­
vljenosti; 
5. stopnjo in obseg absorpcije preskusne kemikalije po tem, ko je bil dan 
odmerek v skladu z ustreznimi na čini izpostavljenosti; 
6. količine preskusne kemikalije in metabolitov (izražene kot delež danega 
odmerka), zbranih v izlo čkih; 
7. sklicevanje na podatke iz dodatka, ki vsebujejo podatke o posamezni 
živali za vse kon čne točke meritev (npr. dajanje odmerka, delež rekupe ­
racije, koncentracije, toksikokineti čni parametri itd.); 
8. grafično predstavitev predlaganih presnovnih poti in molekulskih struktur 
metabolitov.
 
Razprava in sklepi  
72. Avtorji morajo v tem oddelku: 
1. na podlagi rezultatov v zvezi s presnovo in izlo čanjem preskusne kemi ­
kalije predlagati presnovno pot; 
2. preučiti morebitne razlike glede na vrsto in spol v zvezi z izlo čanjem 
in/ali biotransformacijo preskusne kemikalije; 
3. v preglednici predstaviti in preu čiti identifikacijo in pomembnost meta ­
bolitov, stopnje iz čistkov, potencial za kopi čenje v organizmih, ravni 
ostankov tkiv izhodiš čne snovi in/ali metabolitov ter morebitne od 
odmerka odvisne spremembe toksikokineti čnih parametrov, kot je ustre ­
zno; 
4. v ta del vklju čiti vse ustrezne toksikokineti čne podatke, pridobljene med 
izvajanjem študij strupenosti; 
5. oblikovati jedrnat sklep, ki ga je mogo če podpreti z ugotovitvami študije; 
6. (po potrebi ali kot je ustrezno) dodati oddelke. 
73. Za vklju čitev podpornih bibliografskih informacij, preglednic, grafi čnih 
predstavitev, dodatkov itd. je treba uporabiti dodatne oddelke.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 540
 
DRUGI NA ČINI IZPOSTAVLJENOSTI  
Dermalni na čin 
Dermalno tretiranje  
74. Ta oddelek vsebuje posebne informacije o preiskovanju toksikokinetike 
preskusne kemikalije pri dermalnem na činu dajanja. Ve č o dermalni absorp ­
ciji je na voljo v poglavju B.44 te priloge (Absorpcija skozi kožo: metoda  in 
vivo (9)). Za druge kon čne točke, kot sta porazdelitev in presnova, se lahko 
uporabi ta preskusna metoda B.36. Za dermalno tretiranje je treba uporabiti 
eno ali ve č velikosti odmerkov preskusne kemikalije. Preskusna kemikalija 
(npr. čista, razred čena ali formulirana snov, ki vsebuje preskusno kemikalijo 
in se nanese na kožo) mora biti enaka (ali realisti čen nadomestek) tisti, ki so 
ji lahko izpostavljeni ljudje ali druge potencialne ciljne vrste. Velikosti 
odmerkov je treba dolo čiti v skladu z odstavki 20–26 te preskusne metode. 
Med dejavniki, ki bi jih bilo mogo če upoštevati pri izbiri dermalnega 
odmerka, so pri čakovana izpostavljenost človeka in/ali odmerki, pri katerih 
je bila v drugih študijah dermalne strupenosti ugotovljenost strupenost. 
Dermalne odmerke je treba po potrebi raztopiti v ustreznem nosilcu in 
nanesti v koli čini, ustrezni za nanos odmerka. Tik pred za četkom preskusa 
je treba preskusnim živalim ostri či dlako s hrbtnega dela trupa. Dlaka se 
lahko tudi obrije, vendar je treba to opraviti približno 24 ur pred preskusom. 
Med striženjem ali britjem dlake je treba paziti, da se koža ne odrgne, kar bi 
lahko spremenilo njeno prepustnost. Za nanos preskusne kemikalije je treba ostriči oziroma obriti približno 10 % površine telesa. Pri zelo strupenih 
kemikalijah je lahko površina pokritosti manjša od 10 %, vendar mora 
biti s tanko in enakomerno plastjo pokrite čim več površine. Površina treti ­
ranja mora biti enaka v vseh preskusnih skupinah z dermalnim tretiranjem. Površine, ki se tretirajo, je treba pokriti z ustrezno zaš čito, ki bo ostala na 
mestu. Živali morajo biti nastanjene posami čno. 
75. Študijo z umivanjem kože je treba opraviti, da se oceni, koliko nanesenega 
odmerka preskusne kemikalije se lahko odstrani s kože z umivanjem treti ­
rane kožne površine z blagim milom in vodo. Ta študija je lahko tudi v 
pomoč pri določanju masne bilance pri dermalnem na činu dajanja preskusne 
kemikalije. Pri tej študiji z umivanjem kože je treba na dve živali nanesti enkraten odmerek preskusne kemikalije. Velikost odmerka se izbere v skladu z odstavkom 23 te preskusne metode (glej tudi odstavek 76 o trajanju 
stika s kožo). Dolo čiti je treba, koliko preskusne kemikalije se pridobi iz 
vode z milom, s katero se je umivala koža, da se oceni u činkovitost njenega 
odstranjevanja z umivanjem. 
76. Preskusno kemikalijo je treba nanesti na kožo in jo na njej pustiti vsaj 6 ur, 
razen če to ni mogo če zaradi jedkosti. Ko se zaš čita odstrani, je treba 
tretirano površino umiti v skladu s postopkom, opisanim v študiji z umiva ­
njem kože (glej odstavek 75). Zaš č
ito in vodo z milom, s katero je bila 
umita koža, je treba analizirati, da se ugotovi prisotnost ostankov preskusne 
kemikalije. Ob koncu študij je treba vsako žival humano usmrtiti v skladu z virom (2), tretirano kožo pa odstraniti. Ustrezen del tretirane kože je treba analizirati, da se dolo čijo ostanki preskusne kemikalije (radioaktivnosti). 
77. Za toksikokineti čno oceno farmacevtskih izdelkov so v skladu z ustrezno 
zakonodajno ureditvijo morda potrebni druga čni postopki.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 541
 
Inhalacijski na čin 
78. Uporabiti je treba eno samo koncentracijo preskusne kemikalije (ali po 
potrebi ve č). Koncentracije je treba dolo čiti v skladu z odstavki 20–26 te 
preskusne metode. Tretiranje z vdihavanjem je treba izvajati z aparaturo z 
nosnim stožcem ali aparaturo za izpostavljanje glave, da se prepre či absorp­
cija prek drugih na činov izpostavljenosti (8). Če se uporabijo drugi pogoji 
izpostavljenosti z vdihavanjem, je treba to izbiro utemeljiti in dokumentirati. Trajanje izpostavljenosti z vdihavanjem je treba opredeliti; navadno traja 
4–6 ur.
 
VIRI:  
(1) OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their 
Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manu ­
factured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Pariz. 
(2) OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of 
Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in 
Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series 
on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Pariz. 
(3) Solon, E. G., Kraus, L. (2002). Quantitative whole-body autoradiography in 
the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and 
regulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73–81. 
(4) Stumpf, W. E. (2005). Drug localization and targeting with receptor micros ­
copic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25–40. 
(5) Loizou, G., Spendiff, M., Barton, H. A., Bessems, J., Bois, F. Y., d’Yvoire, 
M. B., Buist. H., Clewell, H. J. 3., Meek, B., Gundert-Remy, U., Goerlitz, 
G., Schmitt, W. (2008). Development of good modelling practice for 
physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400–411. 
(6) Poglavje B.45 te priloge, Absorpcija skozi kožo: metoda  in vitro . 
(7) IPCS (2010). Characterization and application of 
Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS 
Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organiza ­
tion, International Programme on Chemical Safety. 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, 
OECD, Pariz. 
(9) Poglavje B.44 te priloge, Absorpcija skozi kožo: metoda  in vivo . 
(10) Barton, H. A., idr. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, 
Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9–35. 
(11) Gibaldi, M., in Perrier, D., (1982), Pharmacokinetics, 2. izdaja, Marcel 
Dekker, Inc., New York.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 542
 
Dodatek  
OPREDELITEV POJMOV  
Absorpcija : procesi sprejemanja kemikalij v tkiva ali skozi tkiva. Nanaša se na 
izhodiščno spojino in vse njene metabolite. Ne sme se mešati z „biološko dostop ­
nostjo“.  
Kopičenje v organizmih  (bioakumulacija): pove čanje količine preskusne kemi ­
kalije skozi čas v tkivih (navadno maš čobnih tkivih po ponavljajo či se izposta ­
vljenosti); če je stopnja vnosa preskusne kemikalije v telo višja od stopnje 
njenega izlo čanja, se preskusna kemikalija kopi či v organizmu in lahko doseže 
strupene koncentracije.  
ADME : kratica za „absorpcija, porazdelitev, presnova in izlo čanje“.  
AUC : (območje pod krivuljo plazemska koncentracija- čas): obmo čje pod 
krivuljo na grafi čnem prikazu, ki predstavlja koncentracijo preskusne kemikalije 
v plazmi v odvisnosti od časa. Predstavlja skupno koli čino preskusne kemikalije, 
ki jo telo absorbira v vnaprej dolo čenem obdobju. V linearnih pogojih je AUC 
(od časa nič do neskon čnosti) sorazmerna s skupno koli čino preskusne kemika ­
lije, ki jo telo absorbira, ne glede na stopnjo absorpcije.  
Avtoradiografija : (avtoradiografija celega telesa): pri tej tehniki, s katero se 
kvalitativno in/ali kvantitativno dolo ča mesto radioaktivne preskusne kemikalije 
v tkivu, se uporablja rentgensko slikanje, v zadnjem času pa tudi digitalno 
slikanje s fosforno ploš čo, pri čemer se slika oddano sevanje v notranjosti pred ­
meta študije, s tem pa izotopsko ozna čene molekule ali njihovi deli postanejo 
vidni. Kvantitativna avtoradiografija celega telesa ima lahko v primerjavi z disek ­
cijo organov nekatere prednosti pri ocenjevanju porazdelitve preskusne kemika ­
lije, skupne rekuperacije in lo čljivosti radioaktivne snovi v tkivih. Ena od 
pomembnih prednosti je na primer, da se lahko ta tehnika pri modelu s pigmen ­
tiranimi živalmi uporabi za oceno morebitne asociacije preskusne kemikalije z 
melaninom, ki lahko veže nekatere molekule. Čeprav lahko z njo dobimo kori ­
stne preglede veznih mest z visoko zmogljivostjo in nizko afiniteto na ravni celega telesa, je lahko omejena pri prepoznavanju konkretnih ciljnih mest, kot 
so receptorska vezna mesta, kjer sta za zaznavanje potrebni razmeroma visoka 
ločljivost in velika ob čutljivost. Če se uporabi avtoradiografija, je treba preskuse 
za določanje masne bilance dane spojine opraviti na skupini ali v študiji, lo čeni 
od preskusa dolo čanja porazdelitve v tkivu, pri katerih se vsi izlo čki (ki lahko 
vključujejo tudi izdihan zrak) in celotni trupi homogenizirajo in analizirajo s 
tekočinskim scintilacijskim štetjem.  
Žolčno izločanje: izločanje prek žol čnih vodov.  
Bioakumulacija : glej „kopi čenje v organizmih“.  
Biološka dostopnost : del danega odmerka, ki doseže sistemski obtok ali je na 
voljo na mestu fiziološke aktivnosti. Navadno se biološka dostopnost preskusne 
kemikalije nanaša na izhodiš čno spojino, lahko pa tudi na njene metabolite. Pri 
tem se upošteva samo ena kemijska oblika.  Opomba : biološka dostopnost in 
absorpcija nista sopomenki. Razlika med, na primer, oralno absorpcijo (tj. prisot ­
nost v črevesni steni in portalnem obtoku) in biološko dostopnostjo (tj. prisotnost 
v sistemskem krvnem obtoku in tkivih) lahko med drugim izhaja iz kemijske 
razgradnje, ki je posledica presnove v črevesni steni, ali prenosa odtoka nazaj v 
črevesno svetlino, ali predsistemske presnove v jetrih (10). Biološka dostopnost 
strupene sestavine (izhodiš čne spojine ali metabolita) je bistveni parameter pri 
oceni tveganja za ljudi (ekstrapolacija velikega na majhen odmerek, ekstrapola ­
cija na druge na čine dajanja), da se iz zunanjega NOAEL ali BMD (uporabljeni 
odmerek) izpelje notranja vrednost. Za u činke na jetra po oralnem dajanju 
zadošča oralna absorpcija. Za vse u činke, razen u činkov na vstopnem mestu, 
pa je biološka dostopnost v primerjavi z absorpcijo navadno zanesljivejši para ­
meter za nadaljnjo uporabo v oceni tveganja.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 543
 
Biološka obstojnost : glej „obstojnost“.  
Biotransformacija : (navadno encimska) kemi čna pretvorba preiskovane 
preskusne kemikalije v telesu v drugo kemikalijo. Sopomenka za „presnovo“.  
C max : bodisi najvišja (plazemska/serumska) koncentracija v krvi po dajanju 
odmerka bodisi najve čje izločanje (v urinu ali iztrebkih) po dajanju odmerka.  
Stopnja iz čistka : kvantitativno merilo stopnje odstranjevanja preskusne kemika ­
lije iz krvi, plazme ali dolo čenih tkiv na enoto časa. 
Razdelek : strukturni ali biokemi čni del (ali enota) telesa, tkiva ali celice, ki je 
ločen od preostanka.  
Načini razstrupljanja : vrsta korakov, ki vodi do odstranitve strupenih kemikalij 
iz telesa, bodisi s presnovno spremembo bodisi z izlo čanjem.  
Porazdelitev : razpršenost preskusne kemikalije in njenih derivatov po organ ­
izmu.  
Encimi/izoencimi : beljakovine, ki pospešujejo kemi čne reakcije. Izoencimi so 
encimi, ki pospešujejo podobne kemi čne reakcije, vendar imajo druga čno zapo­
redje aminokislin.  
Encimski parametri : K  m : Michaelisova konstanta in V  max : največja hitrost.  
Izločanje: procesi, s katerimi se dana preskusna kemikalija in/ali njeni metaboliti 
odstranijo iz telesa.  
Eksogeno : izvirajo če ali ustvarjeno zunaj organizma ali sistema.  
Ekstrapolacija : sklepanje o eni ali ve č neznanih vrednostih na podlagi tega, kar 
je znano ali opaženo.  
Razpolovna doba (t  1/2 ): čas, ki je potreben, da se koncentracija preskusne 
kemikalije v razdelku zmanjša za polovico. Navadno se nanaša na plazemsko koncentracijo ali koli čino preskusne kemikalije v celem telesu.  
Indukcija/indukcija encimov : sinteza encimov kot odziv na okoljski dražljaj ali 
induktor.  
Linearnost/linearna kinetika : pri kinetiki je proces linearen, ko so vse stopnje 
prenosa med razdelki sorazmerne s prisotnimi koli činami ali koncentracijami, tj. 
proces prvega reda. Koli čine izčistkov in porazdelitev so zato konstantne, kar 
velja tudi za razpolovne dobe. Dosežena koncentracija je sorazmerna z velikostjo 
odmerka (izpostavljenostjo), kopi čenje pa je lažje napovedati. Ali gre za linear ­
nost ali nelinearnost, se lahko oceni s primerjanjem ustreznih parametrov, npr. AUC, po razli čnih odmerkih ali po enkratni in ponavljajo či se izpostavljenosti. 
Če se ne ugotovi odvisnost od velikosti odmerka, je to lahko znak nasi čenosti 
encimov, ki sodelujejo pri presnovi spojine, pove čanje AUC po ponavljajo či se 
izpostavljenosti v primerjavi z enkratno izpostavljenostjo je lahko znak inhibicije presnove, zmanjšanje AUC pa znak indukcije presnove (glej tudi vir (11)).  
Masna bilanca : količinska razlika med preskusno kemikalijo, ki vstopa v 
sistem, in preskusno kemikalijo, ki zapuš ča sistem.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 544
 
Materialna bilanca : glej „masna bilanca“.  
Mehanizem (na čin) strupenosti/mehanizem (na čin) delovanja : mehanizem 
delovanja se nanaša na konkretno biokemi čno interakcijo, s katero preskusna 
kemikalija povzro či učinek. Način delovanja se nanaša na splošnejše poti, ki 
vodijo k strupenosti preskusne kemikalije.  
Presnova : sopomenka za „biotransformacijo“.  
Metaboliti : produkti presnove ali presnovnih procesov.  
Oralna absorpcija : delež odmerka preskusne kemikalije, ki se absorbira z mesta 
dajanja (npr. iz prebavnega trakta). Ta klju čni parameter se lahko uporabi za 
razumevanje dela dane preskusne kemikalije, ki doseže portalno veno, nato pa 
jetra.  
Porazdelitveni koeficient : imenovan tudi distribucijski koeficient; merilo 
različne topnosti kemikalije v dveh topilih.  
Najvišja (plazemska/serumska) raven v krvi : najvišja (plazemska/serumska) 
koncentracija v krvi po dajanju odmerka (glej tudi „C  max “). 
Obstojnost (biološka obstojnost) : dolgoro čna prisotnost kemikalije (v biolo ­ 
škem sistemu) zaradi odpornosti na razgradnjo/izlo čanje.  
Navzkrižno branje : informacije o kon čnih točkah za eno ali ve č kemikalij se 
uporabijo za napovedovanje kon čne točke za ciljno kemikalijo.  
Receptorska mikroskopska avtoradiografija  (ali receptorska mikroavtoradio ­
grafija): ta tehnika se lahko uporabi za preiskovanje ksenobioti čne interakcije s 
konkretnimi tkivnimi mesti ali celi čnimi populacijami, na primer pri študijah 
receptorske vezave ali posebnega na čina delovanja, pri katerih sta lahko potrebni 
visoka lo čljivost in velika ob čutljivost, ki pa morda nista mogo či z drugimi 
tehnikami, kakršna je na primer avtoradiografija celega telesa.  
Način dajanja  (oralni, IV, dermalni, inhalacijski itd.): nanaša se na na čin, kako 
se kemikalije vnašajo v telo (npr. oralno z gavažo, oralno s hrano, dermalno, z vdihavanjem, intravenozno itd.).  
Nasičenost : stanje, pri katerem eden ali ve č kinetičnih procesov (npr. absorpcija, 
presnova ali čiščenje) poteka najintenzivneje (procesi so „nasi čeni“).  
Občutljivost : zmožnost metode ali instrumenta, da razlikuje med meritvenimi 
odzivi, ki predstavljajo razli čne stopnje preiskovane spremenljivke.  
(Plazemska) raven dinami čnega ravnotežja v krvi : neravnotežno stanje 
odprtega sistema, v katerem vse sile, ki delujejo na sistem, natan čno izenačujejo 
nasprotne sile, tako da koncentracije vseh sestavnih delov ostajajo nespreme ­
njene, čeprav snov te če skozi sistem.  
Sistemsko modeliranje  (na fiziologiji temelje če toksikokineti
čno, na farmakoki ­
netiki temelje če, na fiziologiji temelje če farmakokineti čno, na biologiji temelje če 
itd.): abstraktni model, ki uporablja matemati čni jezik za opisovanje vedenja 
sistema.  
Ciljno tkivo : tkivo, v katerem se kaže glavni škodljivi u činek strupene snovi.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 545
 
Preskusna kemikalija : kemikalija ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne 
metode.  
Porazdelitev v tkivih : reverzibilno gibanje preskusne kemikalije z enega mesta 
v telesu na drugo. Porazdelitev v tkivih se lahko preiskuje z disekcijo organov, homogenizacijo, sežigom in teko činskim scintilacijskim štetjem ali s kvalitativno 
in/ali kvantitativno avtoradiografijo celega telesa. Prva metoda je primerna za 
pridobivanje podatkov o koncentraciji in deležu rekuperacije iz tkiv in 
preostankov trupov istih živali, vendar ima lahko nezadostno lo čljivost za vsa 
tkiva in morda ne zagotavlja najboljše možne ravni skupne rekuperacije (< 90 %). Za opredelitev druge metode glej zgoraj.  
T
 max : čas, potreben za dosego C  max . 
Toksikokinetika  (farmakokinetika): podro čje, ki preu čuje absorpcijo, porazdeli ­
tev, presnovo in izlo čanje kemikalij skozi čas. 
Validacija modelov : postopek ocenjevanja, ali model ustrezno in dosledno 
opisuje vse razpoložljive toksikokineti čne podatke. Modeli se lahko ocenjujejo 
s statistično in vizualno primerjavo napovedi modela s preskusnimi vrednostmi 
glede na skupno neodvisno spremenljivko (npr. čas). Obseg ocene mora biti 
utemeljen glede na predvideno uporabo modela.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 546
 
B.37  ZAPOZNELA NEVROTOKSI ČNOST ORGANOFOSFORNIH 
SNOVI PO AKUTNI IZPOSTAVLJENOSTI  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Pri ocenjevanju in vrednotenju toksi čnih učinkov snovi je 
pomembno upoštevati potencial nekaterih razredov snovi, da povzro ­ 
čijo posebne vrste nevrotoksi čnosti, ki se morda ne bi odkrile v 
drugih študijah toksi čnosti. Nekatere organofosforne snovi, za katere 
je bilo ugotovljeno, da povzro čajo zapoznelo nevrotoksi čnost, bi 
morale biti predmet takšnega ocenjevanja. 
Izločilne študije  in vitro  bi se lahko uporabile pri dolo čanju tistih 
snovi, ki lahko povzro čijo zapoznelo polinevropatijo; vendar nega ­
tivni izsledki študij  in vitro  ne zagotavljajo dokazov, da preskusna 
snov ni nevrotoksikant. 
Glej del B splošnega uvoda.  
1.2 OPREDELITEV POJMOV 
Organofosforne snovi vklju čujejo nenabite organofosforne estre, tioe ­
stre ali anhidride organofosfornih, organofosfoni čnih ali organofos ­
foramidnih kislin ali sorodnih fosforotiotskih, fosfonotiotskih ali fosforotioamidnih kislin ali druge snovi, ki lahko povzro čijo zapoz ­
nelo nevrotoksi čnost, ki je v časih opažena v tem razredu snovi. 
Zapoznela nevrotoksi čnost je sindrom, povezan z dolgotrajnim 
zapoznelim nastopom ataksije, distalnimi aksonopatijami hrbtenja če 
in perifernega živ čevja ter z inhibicijo in staranjem nevropatske 
ciljne esteraze (NTE) v živ čnem tkivu.
 
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Referenčna snov se lahko preskuša na pozitivni kontrolni skupini kot 
dokaz, da se tudi v preskusnih laboratorijskih okoliš činah odziv 
preskušane vrste ni bistveno spremenil. 
Primer široko uporabljenega nevrotoksikanta je tri-o-tolil fosfat (CAS 
78-30-8, Einecs 201-103-5, nomenklatura CAS: tris(2-metilfenil)ester 
fosforjeve kisline), znan tudi kot tris-o-krezilfosfat.  
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Preskusna snov se daje oralno in z enkratnim odmerkom doma čim 
kokošim, ki so bile zaš čitene pred akutnimi holinergi čnimi učinki, če 
je to primerno. Živali se opazujejo 21 dni za morebitne vedenjske 
nepravilnosti, ataksijo in paralizo. Navadno se od 24 do 48 ur po 
vnosu odmerka izvedejo biokemi čne analize, zlasti inhibicija nevro ­
patske ciljne erastaze (NTE), na naklju čno izbranih kokoših iz vsake 
skupine. Enaindvajset dni po izpostavljenosti se usmrtijo druge 
kokoši in se izvede histopatološka preiskava izbranega živ čnega 
tkiva.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 547
 
1.5 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.5.1  Priprave  
Zdrave, mlade, odrasle kokoši, ki ne kažejo znakov virusnih obolenj, 
niso tretirane s snovmi, ki bi vplivala na rezultat preskusa, in ki ne 
kažejo znakov nenavadnega obnašanja, je treba naklju čno razvrstiti v 
skupino, ki bo tretirana, in v kontrolno skupino ter jih aklimatizirati na laboratorijske razmere najmanj 5 dni pred za četkom študije. 
Treba je uporabiti kletke ali ograde, ki so dovolj velike, da omogo ­ 
čajo prosto gibanje kokoši in olajšajo opazovanje obnašanja živali. 
Običajno se preskusna snov vnaša po oralni poti z gastri čno sondo, 
želatinastimi kapsulami ali primerljivo metodo. Teko čine se lahko 
vnašajo nerazred čene ali raztopljene v ustreznem nosilcu, kakršno 
je na primer koruzno olje; če je mogo če, je treba trdne snovi razto ­
piti, ker se utegne zgoditi, da se veliki odmerki v želatinastih kapsulah ne absorbirajo u činkovito. Pri nevodnih nosilcih je treba 
poznati njihove toksi čne značilnosti ali jih v nasprotnem dolo čiti 
pred začetkom preskusa.
 
1.5.2  Preskusni pogoji  
1.5.2.1  Poskusne živali  
Priporoča se uporaba mladih odraslih doma čih kokoši nesnic  {Gallus 
gallus domesticus),  ki so stare od 8 do 12 mesecev. Uporabiti je 
treba kokoši pasem standardne velikosti in sevov, obi čajno vzrejene 
v okoliščinah, ki kokošim dovoljujejo svobodno gibanje.  
1.5.2.2  Število in spol  
Poleg skupine, ki bo tretirana, je treba uporabiti kontrolno skupino, 
ki ji je vnesen zgolj nosilec, in tudi pozitivno kontrolno skupino. Kontrolno skupino, ki ji je vnesen zgolj nosilec, je treba tretirati 
enako kakor skupino, ki bo tretirana, razen da se živalim ne da 
preskusna snov. 
Vsaka skupina ptic mora biti sestavljena iz zadosti kokoši, tako da se 
lahko usmrti najmanj šest ptic za biokemi čne analize (tri na vsakega 
od obeh časovnih terminov opazovanja) in da lahko šest primerkov 
preživi 21-dnevno obdobje opazovanja za patološke preiskave. 
Pozitivna kontrolna skupina se lahko preskuša hkrati, lahko pa je 
tudi nedavno preskušena kontrolna skupina. Sestavljena naj bo iz 
vsaj šestih kokoši, tretiranih z znanim zapoznelim nevrotoksikantom, 
od katerih so tri namenjene za biokemi čne analize in tri za patološke 
preiskave. Priporo ča se redno dopolnjevanje predhodnih podatkov. 
Nove pozitivne kontrolne podatke je treba razviti vsakokrat, ko labo ­
ratorij, ki izvaja preskuse, spremeni katerega od bistvenih elementov 
preskusa (npr. sev, vrsta krme, nastanitvene razmere).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 548
 
1.5.2.3  Velikosti odmerkov  
Za določitev velikosti odmerka, ki se bo uporabil v glavni študiji, je 
treba izvesti predhodno študijo z ustreznim številom kokoši in skupin velikosti odmerkov. V tej predhodni študiji, namenjeni dolo čitvi 
primernega odmerka za glavno študijo, se praviloma pri čakuje 
nekaj smrtnosti. Da bi se izognili smrti zaradi akutnih holinergi čnih 
učinkov, se lahko uporabi atropin ali kakšno drugo zaš čitno sredstvo, 
za katero je znano, da ne moti zapoznelih nevrotoksi čnih odzivov. 
Za določitev najve čjega nesmrtonosnega odmerka preskusne snovi so 
na voljo številne metode (glej metodo B.1 bis). Pri izbiri odmerka so lahko v veliko pomo č podatki iz predhodnih študij na kokoših ali 
druge toksikološke informacije. 
Odmerek preskusne snovi v glavni študiji naj bo čim večji, pri čemer 
je treba upoštevati rezultate predhodne študije za izbiro odmerka in najvišji mejni odmerek 2 000 mg/kg telesne teže. Ne glede na število 
smrtnih primerov, ki se lahko pojavijo, pa naj bi preživelo zadosti 
živali za izvedbo biokemi čnih analiz (šest) in histoloških preiskav 
(šest) do 21. dneva preskusa. Za prepre čitev smrti zaradi akutnih 
holinergičnih učinkov je treba uporabiti atropin ali kakšno drugo 
zaščitno sredstvo, ki ne moti zapoznelih nevrotoksi čnih odzivov.
 
1.5.2.4  Mejni preskus  
Če preskus, izveden v skladu z opisanimi postopki za to študijo in 
pri stopnji odmerka, ki znaša najmanj 2 000 mg/kg telesne teže/dan, ne povzro či nobenih o čitnih toksi čnih učinkov in če podatki o struk ­
turno sorodnih snoveh ne kažejo na pojav toksi čnosti, študije z 
uporabo ve čjega odmerka ni treba izvesti. Mejni preskus se ne 
uporabi samo, če človeška izpostavljenost kaže na potrebo po 
uporabi ve čjega odmerka.
 
1.5.2.5  Obdobje opazovanja  
Obdobje opazovanja traja 21 dni.  
1.5.3  Postopek  
Potem ko se živalim da zaš čitno sredstvo za prepre čevanje smrti 
zaradi akutnih holinergi čnih učinkov, se preskusna snov vnese v 
enkratnem odmerku.  
1.5.3.1 Splošno opazovanje 
Opazovanje je treba za četi takoj po izpostavitvi. Vse kokoši je treba 
večkrat na dan natan čno opazovati prva 2 dni preskusa in nato 
najmanj enkrat na dan v obdobju 21 dni ali do njihove predvidene 
usmrtitve. Zabeležiti je treba vse znake toksi čnosti, vklju čno s časom 
nastopa, vrsto, resnostjo in trajanjem vedenjskih nepravilnosti. Za ataksijo je treba uporabiti stopenjsko ocenjevalno lestvico, sesta ­
vljeno iz najmanj štirih stopenj, zabeležiti pa je treba tudi primere 
paralize. Najmanj dvakrat na teden je treba kokoši, ki so bile izbrane 
za patološka opazovanja, izpustiti iz kletk in jih pripraviti k prisilni motorični dejavnosti, kakršno je denimo plezanje po lestvi, da bi bilo 
olajšano opazovanje minimalnih toksi čnih učinkov. Umirajo če živali 
ali živali, ki kažejo znake hudega trpljenja in hude bole čine, je treba 
odstraniti, humano usmrtiti in opraviti nekropsijo.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 549
 
1.5.3.2 Telesna teža 
Vse živali je treba stehtati neposredno pred dajanjem preskusne 
snovi in nato najmanj enkrat na teden.  
1.5.3.3 Biokemija 
V nekaj dneh po vnosu odmerka je treba usmrtiti šest naklju čno 
izbranih kokoši iz vsake tretirane skupine in kontrolne skupine, ki 
ji je vnesen zgolj nosilec, ter tri kokoši iz pozitivne kontrolne 
skupine ( če je ta skupina preskušena hkrati), možgane in ledveno 
hrbtenjačo pa je treba pripraviti in analizirati za dolo čitev morebitne 
inhibicije nevropatske ciljne erastaze. Poleg tega je lahko za dolo ­ 
čitev inhibicije nevropatske ciljne erastaze koristno pripraviti in 
analizirati ishiati čno živčno tkivo. Obi čajno se usmrtijo po tri ptice 
iz kontrolne skupine in vsake tretirane skupine po 24 urah in tri po 48 urah, medtem ko se tri kokoši iz pozitivnih kontrolnih skupin 
usmrtijo po 24 urah. Če opazovanja klini čnih znakov intoksikacije 
(ki se lahko oceni z opazovanjem časa nastopa holinergi čnih znakov) 
kažejo, da bo odstranitev toksi čnega sredstva potekala zelo po časi, 
utegne biti primernejše, da se odvzame tkivo pri treh pticah v obeh 
terminih v obdobju od 24 ur in do najpozneje 72 ur po vnosu odmerka. 
Na teh vzorcih se po potrebi lahko opravijo analize acetilholineste ­
raze (AChE). Vendar se  in vivo  lahko AchE spontano reaktivira, kar 
lahko vodi k podcenjevanju zmožnosti neke snovi kot inhibitorja 
AChE.
 
1.5.3.4 Makroskopska nekropsija 
Makroskopska nekropsija vseh živali (usmr čenih po na črtu in ubitih 
zaradi umiranja) naj vklju čuje opazovanje videza možganov in hrbte ­
njače. 
1.5.3.5 Histopatološka preiskava 
Živčno tkivo živali, preživelih obdobje opazovanja, in ki ni bilo 
uporabljeno za biokemi čne študije, se uporabi za mikroskopske 
preiskave. Tkivo je treba fiksirati  in situ  z uporabo tehnik škropitve. 
Opravi se odvzem tkiva na malih možganih (srednja longitudinalna stopnja), podaljšani hrbtenja či, hrbtenja či in perifernem živ čevju. 
Vzorce hrbtenja če je treba odvzeti z zgornjega vratnega predela, 
srednjega prsnega in ledveno-križnega predela. Odvzamejo se tudi vzorci distalnega dela tibialnega živca in njegovih vej v smeri dvoglave me čne mišice in shiati čnega živca. Vzorce tkiva je treba 
obarvati z ustreznimi mielinskimi in specifi čnimi aksonskimi barvili.
 
2. PODATKI  
Če so rezultati na kon čnih točkah, izbranih v tej metodi (biokemija, 
histopatologija in opazovanje obnašanja), negativni, dodatno presku ­ 
šanje zapoznele nevrotoksi čnosti navadno ni potrebno. Dvoumni in 
nedokončni rezultati za te kon čne točke lahko zahtevajo dodatno 
ocenjevanje. 
Priskrbeti je treba podatke za vsako posamezno žival. Poleg tega je 
treba vse podatke povzeti v obliki tabele, ki za vsako preskusno skupino prikazuje število živali na za četku preskusa, število živali, 
ki kažejo poškodbe, vedenjske spremembe in biokemi čne učinke, 
vrste in resnost teh poškodb ali u činkov in odstotek živali, ki jih 
je prizadela posamezna vrsta in resnost poškodbe ali u činka.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 550
 
Izsledke te študije je treba ocenjevati glede na pojav, resnost in 
korelacije vedenjskih, biokemi čnih in histopatoloških u činkov ter 
katerih koli drugih opaženih u činkov v tretiranih in kontrolnih skupi ­
nah. 
Številčne rezultate je treba ocenjevati na podlagi primernih in 
splošno priznanih statisti čnih metod. Uporabljene statisti čne metode 
je treba izbrati pri izdelavi študije.  
3. PORO ČANJE  
POROČILO O PRESKUSU 
Če je mogo če, poročilo o preskusu vklju čuje naslednje informacije: 
Poskusne živali: 
— uporabljen sev, 
— število in starost živali, — izvor, nastanitveni pogoji, itd., — teža vsake živali na za četku preskusa. 
Preskusni pogoji: — podrobni podatki o pripravi preskusne snovi, stabilnosti in homo ­
genosti, kjer je primerno, 
— utemeljitev izbire uporabljenega nosilca, — podrobni podatki o dajanju preskusne snovi, 
— podrobni podatki o kvaliteti hrane in vode, 
— utemeljitev izbire odmerka, — opis danih odmerkov, vklju čno s podrobnimi podatki o nosilcu in 
volumnu ter fizikalni obliki dane snovi, 
— vrsta zaš čitnega sredstva in podrobni podatki o njegovem vnosu. 
Rezultati: — podatki o telesni teži, — podatki o toksi čnem odzivu glede na skupino, vklju čno s 
smrtnostjo, 
— narava, resnost in trajanje klini čnih opazovanj (reverzibilnih ali 
nereverzibilnih), 
— natančen opis biokemi čnih metod in njihovih izsledkov, 
— izsledki nekropsije, — podroben opis vseh histopatoloških izsledkov, — statisti čna obdelava rezultatov, kjer je primerno. 
Razprava o rezultatih. Zaključki.
 
4. SKLICEVANJA  
Ta metoda je skladna s smernicami za preskušanje OECD TG 418.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 551
 
B.38  ZAPOZNELA NEVROTOKSI ČNOST ORGANOFOSFORNIH 
SNOVI – 28-DNEVNA ŠTUDIJA S PONAVLJAJO ČIMI SE 
ODMERKI  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Pri ocenjevanju in vrednotenju toksi čnih učinkov snovi je 
pomembno upoštevati potencial dolo čenih razredov snovi, da 
povzročijo posebne vrste nevrotoksi čnosti, ki se morda ne odkrijejo 
v drugih študijah toksi čnosti. Nekatere organofosforne snovi, za 
katere je bilo opaženo, da povzro čajo zapoznelo nevrotoksi čnost, 
bi morale biti predmet takšnega ocenjevanja. 
Izločilne študije  in vitro  bi se lahko uporabile za dolo čanje tistih 
snovi, ki lahko povzro čijo zapoznelo polinevropatijo; vendar nega ­
tivni izsledki študij  in vitro  ne zagotavljajo dokazov, da preskusna 
snov ni nevrotoksikant. 
Ta 28-dnevni preskus zapoznele nevrotoksi čnosti daje informacije o 
morebitnih nevarnostih za zdravje, ki jih lahko povzro či ponovna 
izpostavljenost v dolo čenem obdobju. Prav tako bo zagotovil infor ­
macije o odzivu na odmerke in omogo čil oceno stopnje koncentracije 
brez opaznih negativnih vplivov (NOAEL), ki se lahko uporablja za določitev meril o varnosti za izpostavljenost. 
Glej del B splošnega uvoda.
 
1.2 OPREDELITEV POJMOV 
Organofosforne snovi vklju čujejo nenabite organofosforne estre, tioe ­
stre ali anhidride organofosfornih, organofosfoni čnih ali organofos ­
foramidnih kislin ali sorodnih fosforotiotskih, fosfonotiotskih ali fosforotioamidskih kislin ali druge snovi, ki lahko povzro čijo zapoz­
nelo nevrotoksi čnost, ki se v časih zasledi v tem razredu snovi. 
Zapoznela nevrotoksi čnost je sindrom, povezan z dolgotrajnim 
zapoznelim nastopom ataksije, distalnimi aksonopatijami hrbtenja če 
in perifernega živ čevja ter z inhibicijo in staranjem nevropatske 
ciljne esteraze (NTE) v živ čnem tkivu.
 
1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Dnevni odmerki preskusne snovi se doma čim kokošim dajejo oralno 
28 dni. Živali je treba najmanj enkrat na dan opazovati zaradi more ­
bitnih vedenjskih nepravilnosti, ataksije in paralize do štirinajstega 
dneva po vnosu zadnjega odmerka. Navadno se od 24 do 48 ur po 
vnosu zadnjega odmerka opravijo biokemi čne analize, zlasti inhibi ­
cije nevropatske ciljne esteraze (NTE), na naklju čno izbranih 
kokoših iz vsake skupine. Dva tedna po vnosu zadnjega odmerka 
se usmrtijo druge kokoši in izvede se histopatološka preiskava izbra ­
nega živčnega tkiva.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 552
 
1.4 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.4.1  Priprave  
Zdrave, mlade, odrasle kokoši, ki ne kažejo znakov virusnih obolenj, 
niso tretirane s snovmi, ki bi vplivala na rezultat preskusa, in ki ne 
kažejo znakov nenavadnega obnašanja, je treba naklju čno razvrstiti v 
skupino, ki bo tretirana, in kontrolno skupino ter jih aklimatizirati na laboratorijske razmere najmanj 5 dni pred za četkom študije. 
Uporabiti je treba kletke ali ograde, ki so dovolj velike, da omogo ­ 
čajo prosto gibanje kokoši in olajšajo opazovanje obnašanja živali. 
Običajno je treba odmerek dajati oralno vsak dan in sedem dni na 
teden, po možnosti z gastri čno sondo ali želatinastimi kapsulami. 
Tekočine se lahko vnašajo nerazred čene ali raztopljene v ustreznem 
nosilcu, kakršno je na primer koruzno olje; če je mogo če, je treba 
trdne snovi raztopiti, ker se utegne zgoditi, da se veliki odmerki v želatinastih kapsulah ne absorbirajo u činkovito. Pri nevodnih nosilcih 
je treba poznati njihove toksi čne značilnosti ali jih v nasprotnem 
določiti pred za četkom preskusa.
 
1.4.2  Preskusni pogoji  
1.4.2.1  Poskusne živali  
Priporoča se uporaba mladih odraslih doma čih kokoši nesnic (Gallus 
gallus domesticus), ki so stare od 8 do 12 mesecev. Uporabiti je treba kokoši pasem standardne velikosti in sevov, obi čajno vzrejene 
v okoliščinah, ki kokošim dovoljujejo svobodno gibanje.
 
1.4.2.2  Število in spol  
Običajno je treba uporabiti najmanj tri skupine za tretiranje in eno 
kontrolno skupino. Slednjo skupino je treba tretirati enako kakor 
skupino za tretiranje, razen da se živalim ne da preskusna snov. 
Vsaka skupina ptic naj bo sestavljena iz zadosti kokoši, da se lahko 
najmanj šest ptic usmrti za biokemi čne analize (tri na vsakega od 
obeh časovnih terminov opazovanja) in da lahko šest ptic preživi 14- 
dnevno obdobje opazovanja za patološke preiskave.  
1.4.2.3  Velikost odmerkov  
Pri izbiri velikosti odmerkov je treba upoštevati tri rezultate preskusa 
zapoznele nevrotoksi čnosti po akutni izpostavljenosti in vse druge 
obstoječe podatke o toksi čnosti ali toksikokinetiki za preskusno 
zmes. Izbrati je treba najve čji odmerek, ki bi povzro čil toksične 
učinke, po možnosti zapoznelo nevrotoksi čnost, ne pa smrti ali 
hudega trpljenja. Nato je treba izbrati padajo če zaporedje velikosti 
odmerkov, da se dokažeta vsak odziv, ki je pogojen z odmerkom, in 
koncentracija brez opaznih negativnih vplivov pri najmanjšem 
odmerku.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 553
 
1.4.2.4  Mejni preskus  
Če preskus z velikostjo odmerka, ki znaša najmanj 1 000 mg/kg 
telesne teže/dan, z uporabo predpisanih postopkov za to študijo ne povzroči nobenih opaznih toksi čnih učinkov in če podatki o struk ­
turno sorodnih snoveh ne kažejo na pojav toksi čnosti, študije z 
uporabo višjega odmerka ni treba izvesti. Mejni preskus se ne uporabi samo, če izpostavljenost človeka kaže na potrebo po uporabi 
večjega odmerka.
 
1.4.2.5  Obdobje opazovanja  
Vse živali je treba med obdobjem izpostavljenosti in 14 dni po njem 
opazovati najmanj enkrat na dan, razen če je bila predvidena nekrop ­
sija. 
1.4.3  Postopek  
Živalim se dajejo odmerki preskusne snovi sedem dni na teden v 
obdobju 28 dni.  
1.4.3.1  Splošna opazovanja  
Opazovanja je treba za četi, takoj ko se lotimo tretiranja. Vse kokoši 
je treba najmanj enkrat na dan natan čno opazovati vseh 28 dni 
tretiranja in naslednjih 14 dni ali do predvidene usmrtitve. Zabeležiti 
je treba vse znake toksi čnosti, vklju čno s časom nastopa, vrsto, 
resnostjo in trajanjem. Opazovanja naj med drugim vklju čujejo 
vedenjske nepravilnosti. Ataksijo je treba meriti z vrstilno ocenje ­
valno lestvico, sestavljeno iz najmanj štirih stopenj, zabeležiti pa je treba tudi primere paralize. Najmanj dvakrat na teden je treba kokoši izpustiti iz kletk in jih pripraviti k prisilni motori čni dejavnosti, 
kakršno je denimo plezanje po lestvi, da bi bilo olajšano opazovanje 
minimalnih toksi čnih učinkov. Umirajo če živali ali živali, ki kažejo 
znake hudega trpljenja ali hude bole čine, je treba odstraniti, humano 
usmrtiti in opraviti nekropsijo.
 
1.4.3.2  Telesna teža  
Vse kokoši je treba neposredno pred prvim dajanjem preskusne 
snovi in nato najmanj enkrat na teden stehtati.  
1.4.3.3  Biokemija  
V nekaj dneh po vnosu zadnjega odmerka je treba usmrtiti šest 
naključno izbranih kokoši iz tretirane in iz kontrolne skupine, možgane 
in ledveno hrbtenja čo pa je treba pripraviti in analizirati za dolo čitev 
morebitne inhibicije nevropatske ciljne esteraze (NTE). Poleg tega je za 
določitev inhibicije nevropatske ciljne esteraze lahko koristno pripra ­
viti in analizirati ishiati čno živčno tkivo. Navadno se po 24 urah 
usmrtijo po tri ptice iz kontrolne in iz vsake tretirane skupine ter tri 
živali 48 ur po vnosu zadnjega odmerka. Če podatki iz študije akutne 
izpostavljenosti ali drugih študij (npr. toksikokinetika) kažejo, da je bolj priporo čljiv drug čas usmrtitve po zadnjem vnosu odmerka, je 
treba uporabiti ta čas in razloge za tako ravnanje utemeljiti. 
Na teh vzorcih se po potrebi lahko izvedejo analize acetilholineste ­
raze (AChE). Vendar se AChE  in vivo  lahko spontano reaktivira, kar 
lahko vodi k podcenjevanju u činkovitosti neke snovi kot inhibitorja 
AChE.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 554
 
1.4.3.4  Makroskopska nekropsija  
Makroskopska nekropsija vseh živali (tistih, ki so usmr čene po 
programu, in tistih, ki so usmr čene, ko že umirajo) naj vklju čuje 
opazovanje videza možganov in hrbtenja če. 
1.4.3.5  Histopatološka preiskava  
Živčno tkivo živali, preživelih obdobje opazovanja, ki ni bilo upora ­
bljeno za biokemijske študije, je treba uporabiti za mikroskopske preiskave. Tkivo je treba fiksirati  in situ  z uporabo tehnik škropitve. 
Odvzem tkiva se opravi na malih možganih (srednja longitudinalna 
stopnja), podaljšani hrbtenja či, hrbtenja či in perifernem živ čevju. 
Vzorce hrbtenja če je treba odvzeti z zgornjega vratnega predela, 
srednjega prsnega in ledveno-križnega predela. Odvzamejo se tudi vzorci distalnega dela tibialnega živca in njegovih vej v smeri 
dvoglave me čne mišice ter ishiati čnega živca. Vzorce tkiva je treba 
obarvati z ustreznimi mielinskimi in aksonskimi barvili. Mikro ­
skopsko preiskavo je na za četku treba opraviti na shranjenem tkivu 
vseh živali kontrolne skupine in skupine, tretirane z velikim odmer ­
kom. Če v slednji skupini obstajajo dokazi o u činkih, je treba izvesti 
tudi mikroskopsko preiskavo tkiv kokoši iz skupin s srednjim in nizkim odmerkom.
 
2. PODATKI  
Če so rezultati na kon čnih točkah, izbranih v tej metodi (biokemija, 
histopatologija in opazovanje obnašanja), negativni, dodatno presku ­ 
šanje zapoznele nevrotoksi čnosti navadno ni potrebno. Dvoumni in 
nedokončni rezultati za te kon čne točke lahko zahtevajo nadaljnje 
ocenjevanje. 
Priskrbeti je treba podatke za vsako posamezno žival. Poleg tega je 
treba vse podatke povzeti v obliki tabele, ki za vsako preskusno skupino prikazuje število živali na za četku preskusa, število živali, 
ki kažejo poškodbe, vedenjske spremembe in biokemi čne učinke, 
vrste in resnost teh poškodb ali u činkov ter odstotek živali, ki jih 
je prizadela posamezna vrsta in resnost poškodbe ali u činka. 
Izsledke te študije je treba ocenjevati glede na pojav, resnost in 
korelacije vedenjskih, biokemi čnih in histopatoloških u činkov ter 
katerih koli drugih opaženih u činkov v vsaki tretirani in kontrolni 
skupini. 
Številčne rezultate je treba ocenjevati na podlagi primernih in 
splošno priznanih statisti čnih metod. Uporabljene statisti čne metode 
je treba izbrati pri izdelavi študije.
 
3. PORO ČANJE  
POROČILO O PRESKUSU 
Če je mogo če, poročilo o preskusu vklju čuje naslednje informacije: 
Preskusne živali: 
— uporabljeni sev, — število in starost živali, 
— izvor, nastanitvene razmere itd., 
— teža vsake živali na za četku preskusa.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 555
 
Preskusni pogoji: 
— podrobni podatki o pripravi preskusne snovi, stabilnosti in homo ­
genosti, kjer je primerno, 
— utemeljitev izbire uporabljenega nosilca, — podrobni podatki o dajanju preskusne snovi, — podrobni podatki o kvaliteti hrane in vode, — utemeljitev izbire odmerka, — opis danih odmerkov, vklju čno s podrobnimi podatki o nosilcu in 
volumnu ter fizikalni obliki dane snovi, 
— če so biokemijske analize izvedene ob druga čnem času, kakršen 
je bil predviden (24 in 48 ur), utemeljitev takšne izbire. 
Rezultati: — podatki o telesni teži, — podatki o toksi čnem odzivu glede na velikost odmerka, vklju čno 
s smrtnostjo, 
— stopnja koncentracije brez opaznih negativnih vplivov, — narava, resnost in trajanje klini čnih opazovanj (reverzibilnih ali 
nereverzibilnih), 
— natančen opis biokemi čnih metod in njihovih izsledkov, 
— izsledki nekropsije, — podroben opis vseh histopatoloških izsledkov, — statisti čna obdelava rezultatov, kjer je primerno. 
Razprava o rezultatih. Zaključki.
 
4. SKLICEVANJE  
Ta metoda je skladna s smernicami za preskušanje OECD TG 419.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 556
 
B.39  PREIZKUS NENA ČRTNE SINTEZE DNA (UDS) V JETRNIH 
CELICAH SESALCEV  IN VIVO  
1. METODA  
Ta metoda ustreza metodi OECD TG 486, Unscheduled DNA Synt ­
hesis (UDS) Test with Mammalian Liver Cells  In Vivo  (1997).  
1.1 UVOD 
Namen preizkusa nena črtne sinteze DNA (UDS) v jetrnih celicah 
sesalcev  in vivo  je določiti preizkušane snovi, ki sprožijo popra ­
vljanje DNA v jetrnih celicah tretiranih živali (1), (2), (3), (4). 
Ta preizkus  in vivo  je metoda za preiskovanje genotoksi čnih učinkov 
kemikalij na jetra. Izmerjena kon čna točka kaže na poškodbe in 
posledično popravljanje DNA v jetrnih celicah. Jetra so navadno 
glavno podro čje presnove absorbiranih spojin. Zato so primerno 
mesto za merjenje poškodb DNA  in vivo.  
Če obstajajo dokazi, da preizkušana snov ne bo dosegla tar čnega 
tkiva, ta preizkus ni primeren. 
Končna točka preizkusa nena črtne sinteze DNA (UDS) se meri z 
določanjem sprejema ozna čenih nukleozidov v celicah, v katerih 
ne poteka na črtna (faza S) sinteza DNA. Najpogosteje uporabljena 
tehnika je avtoradiografsko dolo čanje sprejema timidina, ozna čenega 
s tritijem (  3 H-TdR). Za preizkuse UDS  in vivo  se po možnosti upora ­
bljajo jetra podgan. Namesto jeter se lahko uporabijo druga tkiva, vendar ta niso predmet te metode. 
Zaznavanje odziva UDS je odvisno od števila baz DNA, ki se izre ­ 
žejo in zamenjajo na mestu poškodbe. Zato je preizkus UDS posebej koristen za zaznavanje „popravljanja dolgih delov“ (20 do 30 baz), 
ki ga povzro či snov. „Popravljanje kratkih delov“ (ena do tri baze) se 
zazna z mnogo manjšo ob čutljivostjo. Poleg tega mutageni pojavi 
lahko nastanejo zaradi nepopravljanja, napa čnega popravljanja ali 
napačnega podvojevanja lezij DNA. Velikost odziva UDS ne da 
nobenih podatkov o to čnosti popravljanja. Možno je tudi, da 
mutagen reagira z DNA, a se poškodbe DNA ne popravijo s popra ­
vljanjem z izrezovanjem. Pomanjkanje specifi čnih informacij o muta ­
genem delovanju pri preizkusu UDS se nadomesti s potencialno 
občutljivostjo te kon čne točke, ker se meri v celotnem genomu. 
Glej tudi splošni uvod dela B.
 
1.2 DEFINICIJE  
Celice v popravljanju:  neto število jedrnih zrnc (NNG), ve čje od 
vnaprej dolo čene vrednosti, utemeljene v laboratoriju, ki opravlja 
preizkus.  
Neto število jedrnih zrnc (NNG):  kvantitativno merilo za UDS aktiv ­
nost v celici pri avtoradiografskih preizkusih UDS, ki se izra čuna tako, 
da se povpre čno število citoplazemskih zrnc v jedru enakovrednih 
območjih citoplazme (CG) odšteje od števila jedrnih zrnc (NG): 
NNG = NG – CG. Število NNG se izra čuna za posamezne celice in 
nato združi za celice v kulturi, v vzporednih kulturah itn.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 557
 
Nenačrtna sinteza DNA (UDS):  popravljalna sinteza DNA po 
izrezu in odstranitvi dela DNA, na katerem je poškodba, ki jo 
povzročijo kemične snovi ali fizikalni dejavniki.  
1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Preizkus UDS v jetrnih celicah sesalcev  in vivo  kaže na popravljalno 
sintezo DNA po izrezu in odstranitvi dela DNA, na katerem je 
poškodba, ki jo povzro čijo kemične snovi ali fizikalni dejavniki. 
Preizkus navadno temelji na vklju čitvi 3 H-TdR v DNA jetrnih celic, 
v katerih je majhna pogostnost celic v fazi S celi čnega ciklusa. 
Sprejem  3 H-TdR se navadno dolo či z avtoradiografijo, ker ta tehnika 
ni tako dovzetna za motnje, ki jih povzro čajo celice v fazi S, kakor 
je to na primer metoda teko činske scintilacije.  
1.4 OPIS METODE  
1.4.1  Priprave  
1.4.1.1  Izbira živalskih vrst  
Navadno se uporabljajo podgane, lahko pa se uporabi katera koli 
primerna vrsta sesalcev. Uporabijo naj se splošno uporabljani labo ­
ratorijski sevi mladih zdravih odraslih živali. Ob za četku študije naj 
bo nihanje teže živali čim manjše in naj ne presega ± 20 % srednje 
vrednosti teže za vsak spol.  
1.4.1.2  Pogoji bivanja in hranjenja  
Uporabljajo se splošni pogoji iz splošnega uvoda dela B, vendar naj 
bo ciljna vlažnost 50 do 60 %.  
1.4.1.3  Priprava živali  
Zdrave mlade odrasle živali se naklju čno dodelijo kontrolni in treti ­
rani skupini. Kletke se razporedijo tako, da se čimbolj zmanjšajo 
možni učinki postavitve kletke. Živali se ozna čijo z enkratnimi ozna ­
kami in se pustijo v kletkah vsaj pet dni pred za četkom študije, da se 
aklimatizirajo na laboratorijske razmere.  
1.4.1.4  Preizkušana snov/priprava  
Trdne preizkušane snovi naj se pred odmerjanjem živalim raztopijo 
ali suspendirajo v ustreznih topilih ali nosilcih, in če je to primerno, 
se razred čijo. Teko če preizkušane snovi se lahko odmerijo nepo ­
sredno ali pa se pred odmerjanjem razred čijo. Uporabljajo naj se 
sveže pripravljene preizkušane snovi, razen če podatki o stabilnosti 
kažejo, da je shranjevanje sprejemljivo.  
1.4.2  Preizkusni pogoji  
1.4.2.1  Topilo/nosilec  
Topilo/nosilec naj nima toksi čnih učinkov pri uporabljenih odmerkih 
in naj se zanj ne sumi, da kemi čno reagira s preizkušano snovjo. Če 
se uporabijo manj poznana topila/nosilci, naj njihovo vklju čitev 
podpirajo podatki, ki kažejo na njihovo združljivost. Priporo ča se, 
da se, kadar koli je to mogo če, kot prva možnost preu či uporaba 
vodnega topila/nosilca.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 558
 
1.4.2.2  Kontrolni vzorci  
V vsak samostojno izveden del preizkusa naj se vklju čijo sočasni 
pozitivni in negativni (topilo/nosilec) kontrolni vzorci. Razen treti ­
ranja s preizkušano snovjo naj se z živalmi v kontrolni skupini ravna 
enako kakor s tistimi v tretiranih skupinah. 
Snovi pozitivne kontrole naj bodo snovi, za katere se ve, da povzro ­ 
čijo UDS, če se dajejo pri ravneh izpostavljenosti, pri katerih se 
pričakuje zaznavno pove čanje glede na ozadje. Snovi pozitivne 
kontrole, pri katerih je potrebna aktivacija presnove, naj se upora ­
bljajo v odmerkih, ki povzro čijo zmeren odziv (4). Odmerki naj se 
izberejo tako, da so u činki jasni, vendar ne razkrijejo takoj identitete 
kodiranih mikroskopskih preparatov. Primeri snovi pozitivne kontrole vklju čujejo:
 
Čas vzorčenja Snov Št. CAS Št. Einecs  
Zgodnja vzor čenja (2 do 4 ure) N-dimetilnitrozamin 62-75-9 200-249-8 
Pozna vzor čenja (12 do 16 ur) N-2-fluorenilacetamid (2-AAF) 53-96-3 200-188-6 
Lahko se uporabijo druge ustrezne snovi pozitivne kontrole. Spre ­
jemljivo je, da se snovi pozitivne kontrole dajejo živalim druga če 
kakor preizkušana snov.  
1.5 POSTOPEK  
1.5.1  Število in spol živali  
Uporabi naj se zadostno število živali, da se upošteva naravno 
biološko nihanje odziva na preizkus. V vsaki skupini naj bodo vsaj tri živali, ki jih je mogo če analizirati. Če že obstaja obsežna 
baza preteklih podatkov, sta za so časne negativne in pozitivne 
kontrolne skupine potrebni le ena ali dve živali. 
Če so v času študije na voljo podatki študij o isti vrsti in ob uporabi 
istega na čina izpostavljanja, ki dokazujejo, da med spoloma ni 
znatnih razlik v toksi čnosti, bo zadostovalo preizkušanje na enem 
spolu, po možnosti na samcih. Kadar bi bila lahko izpostavljenost kemikaliji pri človeku omejena na en spol, na primer pri nekaterih 
farmacevtskih u činkovinah, naj se preizkus opravi na živalih ustrez ­
nega spola.
 
1.5.2  Program tretiranja  
Preizkušane snovi se navadno dajejo z enkratnim vnosom.  
1.5.3  Velikost odmerkov  
Navadno se uporabljata vsaj dve velikosti odmerkov. Najve čji 
odmerek je odmerek, ki povzro či takšne znake toksi čnosti, da se 
pričakuje, da bi ve čji odmerki pri istem režimu odmerjanja povzro čili 
smrt. V splošnem naj bo manjši odmerek 50 do 25 % ve čjega 
odmerka.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 559
 
Snovi s specifi čnim biološkim delovanjem pri majhnih netoksi čnih 
odmerkih (na primer hormoni in mitogeni) so lahko izjeme pri 
merilih za dolo čanje odmerka in naj se ovrednotijo za vsak primer 
posebej. Če se opravi študija za ugotavljanje obmo čja, ker ni na 
voljo ustreznih podatkov, naj se opravi v istem laboratoriju, na isti 
vrsti, sevu in spolu ter ob enakem režimu tretiranja, kakor bo to 
uporabljeno v glavni študiji. 
Največji odmerek se lahko opredeli tudi kot odmerek, ki povzro či 
nekaj znakov toksi čnosti v jetrih (npr. piknoti čna jedra).  
1.5.4  Mejni preizkus  
Če preizkus pri eni velikosti odmerka vsaj 2 000 mg/kg telesne teže, 
ki se da v enem vnosu ali v dveh vnosih v istem dnevu, ne povzro či 
nobenih opaznih toksi čnih učinkov in če se na podlagi podatkov o 
strukturno sorodnih snoveh ne pri čakuje, da bo snov genotoksi čna, 
popolna študija morda ne bo potrebna. Pri čakovana izpostavljenost 
človeka lahko nakaže potrebo po ve čjih odmerkih pri mejnem 
preizkusu.  
1.5.5  Dajanje odmerkov  
Navadno se preizkušana snov da z gavažo po želod čni cevki ali 
ustrezni intubacijski kanili. Sprejemljivi so tudi drugi na čini izposta ­
vljanja, kadar se lahko utemeljijo. Vendar intraperitonealni na čin ni 
priporočljiv, ker jetra lahko izpostavi preizkušam snovi neposredno 
in ne prek krvožilnega sistema. Najve čji volumen teko čine, ki se 
lahko naenkrat da z gavažo ali injekcijo, je odvisen od velikosti 
preizkusne živali. Volumen naj ne presega 2 ml/100 g telesne teže. 
Uporabo ve čjih volumnov je treba utemeljiti. Razen pri dražilnih ali 
jedkih snoveh, ki bodo navadno povzro čile dražilne u činke pri ve čjih 
koncentracijah, naj se s prilagoditvijo koncentracije čimbolj zmanjša 
spremenljivost preizkusnega volumna, tako da se zagotovi stalni volumen pri vseh velikostih odmerkov.
 
1.5.6  Priprava jetrnih celic  
Jetrne celice tretiranih živali se navadno pripravijo 12 do 16 ur po 
odmerjanju. Navadno je potrebno dodatno, zgodnejše vzor čenje 
(ponavadi dve do štiri ure po tretiranju), razen če se po 12 do 16 
urah pokaže jasen pozitivni odziv. Lahko se vzor či tudi ob drugih 
časih, kadar je to utemeljeno s podatki o toksikokinetiki. 
Navadno se pripravijo kratkotrajne kulture jetrnih celic sesalcev, tako 
da se jetra perfundirajo  in situ  s kolagenazo in se sveže odcepljenim 
jetrnim celicam omogo či, da se pritrdijo na ustrezno podlago. Jetrne 
celice živali negativne kontrole naj imajo sposobnost preživetja (5) 
vsaj 50 %.  
1.5.7  Dolo čanje UDS  
Sveže izolirane sesalske jetrne celice se primerno dolgo, na primer tri 
do osem ur, inkubirajo, navadno v gojiš ču, ki vsebuje  3 H-TdR. Po 
končani inkubaciji se gojiš če odstrani s celic, ki se nato lahko inku ­
birajo v gojiš ču s presežkom neozna čenega timidina, da se zmanjša 
nevgrajena radioaktivnost (cold chase). Celice se nato sperejo, fiksi ­
rajo in posušijo. Pri daljši inkubaciji „cold chase“ morda ne bo potreben. Mikroskopski preparati se pomo čijo v avtoradiografsko 
emulzijo, se izpostavijo v temi (npr. hranijo se v hladilniku 7 do 
14 dni), se razvijejo in pobarvajo, nato se preštejejo izpostavljena 
srebrna zrnca. Za vsako žival se pripravijo dva do trije preparati.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 560
 
1.5.8  Analiza  
Mikroskopski preparati naj vsebujejo dovolj celic z normalno morfo ­
logijo, da je omogo čeno smiselno ocenjevanje UDS. Preparati se 
mikroskopsko pregledajo, da se poiš čejo znaki o čitne citotoksi čnosti 
(npr. piknoza, zmanjšana raven radioaktivnih ozna čevalcev). 
Mikroskopski preparati naj se kodirajo pred štetjem zrnc. Navadno se 
v štetje vklju či 100 celic za vsako žival z vsaj dveh preparatov; štetje 
manj kakor 100 celic/žival naj bo utemeljeno. Število zrnc se ne določa za jedra v fazi S, lahko pa se evidentira delež celic v fazi S. 
Količina
 3 H-TdR, vgrajenega v jedra in citoplazmo morfološko 
normalnih celic, kar dokazuje nalaganje srebrnih zrnc, naj se dolo či 
z ustreznimi metodami.  
2. PODATKI  
2.1 OBDELAVA REZULTATOV 
Navedejo se podatki za posamezne mikroskopske preparate in živali. 
Poleg tega naj bodo vsi podatki povzeti v tabeli. Izra čuna naj se neto 
število jedrnih zrnc (NNG) za vsako celico, vsako žival ter vsak odmerek in čas, tako da se od števila NG odšteje število CG. Če 
se preštevajo „celice v popravljanju“, naj bodo merila za dolo čanje 
„celic v popravljanju“ utemeljena in zasnovana na podatkih pretekle ali sočasne negativne kontrole. Numeri čni rezultati se lahko ovred ­
notijo s statisti čnimi metodami. Če se uporabijo statisti čni testi, naj 
se izberejo in utemeljijo pred za četkom študije.
 
2.2 VREDNOTENJE IN INTERPRETACIJA REZULTATOV 
Primeri meril za pozitivne/negativne odzive vklju čujejo: 
pozitivne (i) vrednosti NNG, ve čje od poprej dolo čenega 
praga, ki je utemeljen na podlagi preteklih podatkov laboratorija; 
ali (ii) vrednosti NNG, znatno ve čje kakor pri 
sočasni kontroli; 
negativne (i) vrednosti NNG, v obmo čju preteklega kontrol ­
nega praga ali pod njim; 
ali (ii) vrednosti NNG, ne znatno ve čje kakor pri 
sočasni kontroli.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 561
 
Prouči naj se biološka pomembnost rezultatov: to pomeni, naj se 
upoštevajo parametri, kakor so razlike med živalmi, odvisnost med 
odmerkom in odzivom ter citotoksi čnost. Pri vrednotenju rezultatov 
preizkusa se kot pomo č lahko uporabijo statisti čne metode. Vendar 
pa naj statisti čna značilnost ne bo edini odlo čilni dejavnik za pozi ­
tivni odziv. 
Čeprav bo ve čina poskusov dala jasne pozitivne ali negativne rezul ­
tate, bodo v redkih primerih dobljeni podatki prepre čili zanesljivo 
oceno o delovanju preizkušane snovi. Rezultati lahko ostanejo dvoumni ali dvomljivi ne glede na število ponovitev poskusa. 
Pozitivni rezultat preizkusa UDS z jetrnimi celicami sesalcev  in vivo  
pomeni, da preizkušana snov povzro ča poškodbe DNA v jetrnih 
celicah sesalcev  in vivo,  ki se lahko popravijo z nena črtno sintezo 
DNA  in vitro.  Negativni rezultat pomeni, da preizkušana snov pri 
preizkusnih pogojih ne povzro ča poškodb DNA, ki se lahko zaznajo 
s tem preizkusom. 
Obravnava naj se verjetnost, da preizkušana snov doseže krvni obtok 
ali posebej tar čno tkivo (npr. sistemska toksi čnost).
 
3. PORO ČANJE  
POROČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preizkusu mora vsebovati naslednje informacije: 
Topilo/nosilec: 
— utemeljitev izbire nosilca, 
— topnost in stabilnost preizkušane snovi v topilu/nosilcu, če sta 
znani. 
Preskusne živali: — uporabljena vrsta/sev, — število, starost in spol živali, 
— vir, pogoji bivanja, prehrana itn., 
— teža posameznih živali na za četku preizkusa, skupaj z obmo čjem 
telesne teže, srednjo vrednostjo in standardnim odklonom za vsako skupino. 
Preskusni pogoji : 
— pozitivni in negativni (nosilec/topilo) kontrolni vzorci, 
— podatki študije za ugotavljanje obmo čja, če j e bila opravljena, 
— razlogi za izbiro velikosti odmerka, — podrobnosti o pripravi preizkušane snovi, — podrobnosti o dajanju preizkušane snovi, — razlogi za na čin dajanja, 
— metode za preverjanje, ali je preizkušana snov dosegla krvni 
obtok ali tar čno tkivo, če je to primerno,
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 562
 
— način preračunavanja koncentracije preizkušane snovi v hrani/ 
pitni vodi (ppm) v dejanski odmerek (mg/kg telesne teže/dan), 
če je to primerno, 
— podrobnosti o kakovosti hrane in vode, 
— podroben opis programov tretiranja in vzor čenja, 
— metode merjenja toksi čnosti, 
— metoda priprave in kultiviranja jetrnih celic, 
— uporabljena avtoradiografska tehnika, — število pripravljenih mikroskopskih preparatov in število celic, 
upoštevanih pri štetju, 
— merila vrednotenja, 
— merila za dolo čitev, ali je študija pozitivna, negativna ali 
dvoumna, 
Rezultati: 
— srednja vrednost števila jedrnih zrnc, števila citoplazemskih zrnc 
in neto števila jedrnih zrnc za posamezne mikroskopske prepa ­
rate, živali in skupine, 
— odvisnost med odmerkom in odzivom, če je na voljo, 
— statisti čna ocena, če je na voljo, 
— znaki toksi čnosti, 
— podatki o so časni negativni (topilo/nosilec) in pozitivni kontroli, 
— podatki o pretekli negativni (topilo/nosilec) in pozitivni kontroli, 
z območji, srednjimi vrednostmi in standardnimi odkloni, 
— število „celic v popravljanju“, če je bilo dolo čeno, 
— število celic v fazi S, če je bilo dolo čeno, 
— sposobnost preživetja celic. 
Diskusija rezultatov. 
Sklepi.
 
4. LITERATURA  
(1) Ashby, J., Lefevre, P.A., Burlinson, B. and Penman, M.G. 
(1985). An Assessment of the  In Vivo  Rat Hepatocyte DNA 
Repair Assay. Mutation Res., 156, str. 1–18. 
(2) Butterworth, B.E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., 
Mirsalis, J., Probst, G. and Williams, G. (1987). A Protocol 
and Guide for the  In Vivo  Rat Hepatocyte DNA-Repair Assay. 
Mutation Res. 189, str. 123–133. 
(3) Kennelly, J.C., Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P.A., Burlinson, 
B., Benford, D.J., Dean, S.W. and Mitchell, I. de G. (1993). In 
Vivo Rat Liver UDS Assay. In: Kirkland D.J. and Fox M., 
(Eds) Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Recom ­
mended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part II revised. Cambridge 
University Press, Cambridge, New York, Port Chester, 
Melbourne, Sydney, str. 52–77.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 563
 
(4) Madle, S., Dean, S.W., Andrae, U., Brambilla, G., Burlinson, 
B., Doolittle, D.J., Furihata, C., Hertner, T., McQueen, C.A. and 
Mori, H. (1993). Recommendations for the Performance of UDS Tests  In Vitro  and  In Vivo . Mutation Res., 312, str. 263–285. 
(5) Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl, 
C. (1993). Assessment of the Relation Between the Initial Viabi ­
lity and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocytes 
Used for the  In Vivo/In Vitro  DNA Repair Assay (UDS). Muta ­
tion Res., 291, str. 21–27. 
(6) Mirsalis, J.C., Tyson, C.K. and Butterworth, B.E. (1982). Detec ­
tion of Genotoxic Carcinogens in the  In Vivo/In Vitro  Hepato­
cyte DNA Repair Assay. Environ. Mutagen, 4, str. 553–562.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 564
 
B.40  JEDKOSTZAKOŽO IN VITRO : PRESKUS TRANSKUTANE 
ELEKTRI ČNE UPORNOSTI (TER)  
1. METODA  
Ta preskusna metoda je enakovredna OECD TG 430 (2004).  
1.1 UVOD 
Jedkost za kožo pomeni nastanek nepovratnih poškodb kožnega 
tkiva po nanosu preskušanega materiala [po definiciji iz Globally Harmonised System for the Classification and Labelling of Chemical 
Substances and Mixtures (GHS)] (1). Ta metoda dolo ča postopek, s 
katerim se ocena jedkosti ne opravlja na živih živalih. 
Ocena jedkosti za kožo se je obi čajno opravljala na laboratorijskih 
živalih (2). Zadržki v zvezi z bole činami in trpljenjem živali, ki je 
povezano s tem postopkom, je bilo upoštevano v reviziji preskusne metode B.4, ki omogo ča določevanje jedkosti za kožo z alternativ ­
nimi metodami  in vitro,  pri čemer se prepre čita bolečina in trpljenje. 
Prvi korak k dolo čitvi alternativnih preskusov, ki bi se lahko upora ­
bili za preskušanje jedkosti za kožo v regulativne namene, so bile predvalidacijske študije (3). Za temi je bila opravljena uradna vali ­
dacijska študija metod  in vitro  za oceno jedkosti za kožo (4) (5) (6) 
(7) (8). Na podlagi izidov teh študij in druge objavljene literature je bilo izdelano priporo čilo, da se lahko naslednja preskusa uporabita 
za oceno jedkosti za kožo  in vivo  (9) (10) (11): preskus z modelom 
človeške kože (glej preskusno metodo B.40bis) in preskus transku ­
tane elektri čne upornosti (ta metoda). 
V validacijski študiji in drugih objavljenih študijah so ugotovili, da lahko 
preskus transkutane elektri čne upornosti (TER) pri podganah (12) (13) 
zanesljivo razlikuje med znanimi snovmi, ki so jedke za kožo, in znanimi 
snovmi, ki niso jedke (5) (9). 
Preskus opisan v tej metodi omogo ča identifikacijo jedkih kemijskih 
snovi in mešanic. Omogo ča tudi identifikacijo nejedkih snovi in meša ­
nic, če je podprta z dokazi in ob uporabi drugih obstoje čih podatkov 
(npr. pH, razmerja struktura-aktivnost, podatki o ljudeh in/ali živalih) (1) (2) (11) (14). Ne daje pa podatkov o draženju kože niti ne omogo ča 
nadaljnje kategorizacije jedkih snovi, kot je to dovoljeno v Globally 
Harmonised Classification System (GHS) (1). 
Za popolno vrednotenje lokalnih u činkov na kožo po enkratni izpo ­
stavljenosti se priporo ča upoštevanje na črtovanja zaporednega 
preskušanja, ki je priloženo Preskusni metodi B.4 (2) in na voljo v Globally Harmonised System (1). To na črtovanje preskušanja vklju ­ 
čuje opravljanje preskusov jedkosti za kožo  in vitro  (kakor je 
opisano v tej metodi) in preskusov draženja kože  in vitro  pred 
preskušanjem na živih živalih.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 565
 
1.2 OPREDELITEV POJMOV  
Jedkost za kožo  in vivo:  je nastanek nepovratnih poškodb kože: 
zlasti, vidne nekroze skozi pokožnico in v usnjico v štirih urah po nanosu preskusne snovi. Reakcije na jedkost se razvrstijo na ulcera ­
cije, krvavitve, krvave kraste in po 14-dnevnem opazovanju, ko se 
zaradi luš čenja kože izgubi obarvanost, na obmo čja alopecije in 
brazgotine. Dvomljive lezije je treba preiskati histopatološko.  
Transkutana elektri čna upornost (TER):  merilo elektri čne impe­
dance kože, ki je izražena kot upornost v kiloohmih. Preprosta in robustna metoda za ocenjevanje pregradne funkcije z beleženjem prehoda ionov preko kože z aparaturo z Wheatstonovim mosti čem.
 
1.3 REFEREN ČNE SPOJINE  
Tabela 1  
Referenčne kemikalije  
Ime Št. Einecs Št. CAS  
1,2-Diaminopropan 201-155-9 78-90-0 Mo čno jedko 
Akrilna kislina 201-177-9 79-10-7 Mo čno jedko 
2-terc-Butilfenol 201-807-2 88-18-6 Jedko 
Kalijev hidroksid (10-odstoten) 215-181-3 1310-58-3 Jedko 
Žveplova kislina (10-odstotna) 231-639-5 7664-93-9 Jedko 
Oktanojska kislina (kaprilska 
kislina) 204-677-5 124-07-02 Jedko 
4-Amino-1,2,4-triazol 209-533-5 584-13-4 Ni jedko 
Evgenol 202-589-1 97-53-0 Ni jedko 
Fenetil bromid 203-130-8 103-63-9 Ni jedko Tetrakloroetilen 204-825-9 27-18-4 Ni jedko 
Izostearinska kislina 250-178-0 30399-84-9 Ni jedko 
4-(Metiltio)-benzaldehid 222-365-7 3446-89-7 Ni jedko 
Večina navedenih kemikalij je vzetih s seznama kemikalij izbranih 
za mednarodno validacijsko študijo ECVAM (4). Izbira v tej študiji 
je temeljila na naslednjih kriterijih: 
(i) enako število jedkih in nejedkih snovi;
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 566
 
(ii) komercialno dostopne snovi, ki pokrivajo ve čino pomembnih 
kemijskih skupin; 
(iii) vklju čitev močno jedkih in manj jedkih snovi, da se omogo či 
razlikovanje na podlagi stopnje jedkosti; 
(iv) izbira kemikalij, s katerimi je mogo če v laboratoriju ravnati, ne 
da bi nastopile druge hude nevarnosti z izjemo jedkosti.  
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Preskušani material se nanese za najve č 24 ur na epidermalne povr ­ 
šine kožnih ploš čic v preskusnem sistemu z dvema komorama, v 
katerem kožne ploš čice ločujejo komori. Kožne ploš čice se odvza ­
mejo s humano usmr čenih podgan, starih 28–30 dni. Jedki materiali 
se identificirajo glede na zmožnost zmanjšati celovitost in pregradno 
funkcijo rožene plasti pokožnice, ki se meri kot znižanje TER pod raven praga (12). Za TER pri podganah je bil na podlagi obsežnih podatkov za širok obseg kemikalij izbran prag 5 k Ω, kjer je bila 
velika ve čina vrednosti precej nad pragom (pogosto > 10 k Ω) ali 
precej pod njim (pogosto < 3 k Ω) (12). Na splošno materiali, ki niso 
jedki za živali, ampak so dražilni ali nedražilni, ne znižujejo TER pod ta prag. Prav tako lahko uporaba drugih kožnih pripravkov ali 
druge opreme spremeni vrednost praga, kar zahteva dodatne validacije. 
V preskusni postopek je vklju čena stopnja vezave barvila za potrje ­
vanje pozitivnih rezultatov preskusa TER, kadar so vrednosti okoli 5 
kΩ. V stopnji vezave barvila se ugotovi, ali je pove čanje ionske 
prepustnosti posledica fizi čnega uničenja rožene plasti pokožnice. 
Metoda TER je na podganji koži pokazala, da lahko pri kuncih 
napove jedkost  in vivo,  določeno s preskusno metodo B.4 (2). 
Treba je pripomniti, da je preskus  in vivo  na kuncih v primerjavi s 
preskusom na koš čku človeške kože zelo konzervativen glede 
jedkosti za kožo in draženja kože (15).
 
1.5 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.5.1  Živali  
Podgane so bile izbrane, ker je bila ob čutljivost kože podgan za 
kemikalije v tem preskusu predhodno dokazana (10). Zagotoviti je treba, da so meši čki dlak v dormantni fazi, preden se za čne rast 
odraslih dlak, pri čemer sta zlasti pomembna starost (ob odvzemu 
kože) in linija podgane.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 567
 
Dlaka na hrbtu in bokih mladih približno 22 dni starih samcev ali 
samic (Wistar ali podobne linije podgan) se previdno odstrani z 
majhnimi škarjami. Nato se živali s pazljivim brisanjem umijejo, ostrižena površina pa se potopi v antibioti čno raztopino (ki denimo 
vsebuje streptomicin, penicilin, kloramfenikol in amfotericin v 
koncentracijah, ki u činkovito prepre čujejo rast bakterij). Živali se z 
antibiotično raztopino ponovno umijejo tretji ali četrti dan po prvem 
umivanju, uporabijo pa se v 3 dneh po drugem umivanju, ko rožena plast okreva po odstranitvi dlak.
 
1.5.2  Priprava kožnih ploš čic 
Živali se humano usmrtijo, ko so stare 28-30 dni; ta starost je klju ­ 
čna. Z vsake posamezne živali se nato odstrani hrbtno bo čna koža in 
z nje previdno odluš či vsa odve čna podkožna maš čoba. Nato se 
izrežejo kožne ploš čice v premeru približno 20 mm. Koža se lahko 
shrani pred uporabo ploš čic, kadar se dokaže, da so podatki pozi ­
tivnih in negativnih kontrol enaki kot pri sveži koži. 
Vsaka kožna ploš čica se namesti čez konec cevi iz PTFE (polite ­
trafluoroetilena), pri čemer se mora površina pokožnice dotikati cevi. 
Čez konec cevi se tesno namesti gumijast obro č, s katerim se koža 
pričvrsti, nato se obreže odve čno tkivo. Mere cevi in obro ča so 
prikazane na sliki 2. Gumijasti obro č se nato z naravnim vazelinom 
pazljivo pri tesni na konec PTFE-cevi. Cev se z vzmetno sponko 
namesti v receptorsko komoro, ki vsebuje raztopino MgSO  4 
(154 mM) (slika 1). Kožne ploš čice morajo biti popolnoma poto ­
pljene v raztopino MgSO  4 . Iz kože ene podgane je mogo če pridobiti 
od 10 do 15 kožnih ploš čic. 
Na dveh kožnih ploš čicah iz kože vsake živali se pred za četkom 
preskušanja za namene kontrole kakovosti izmeri elektri čna upor­
nost. Ploš čice se lahko uporabijo v preskusu, če je upornost obeh 
ploščic večja od 10 k Ω. Če je upornost manjša od 10 k Ω, je treba 
preostale ploš čice, pripravljene iz iste kože, zavre či. 
1.5.3  Nanos preskušanih in kontrolnih snovi  
V vsaki študiji je treba uporabiti isto časne pozitivne in negativne 
kontrole, da se zagotovi ustreznost izvedbe modela poskusa. Upora ­
bijo se lahko le kožne ploš čice ene živali. Predlagana snov za pozi ­
tivno kontrolo je 10-molarna klorovodikova kislina, za negativno kontrolo pa destilirana voda. 
Tekoče preskušane snovi (150 μL) se nanesejo enakomerno na povr ­ 
šino pokožnice v cevi. Pri preskušanju trdnega materiala se na kožno 
ploščico enakomerno nanese dovolj trdne snovi, da se zagotovi, da je 
prekrita celotna površina pokožnice. Nato se na trdno snov doda deionizirana voda (150 μL), cevka pa se rahlo pretrese. Za najve čji 
stik s kožo bo morda treba trdno snov segrevati do 30
 o C, da se 
preskušana snov stali ali zmeh ča, ali zmleti, da nastane granulat ali 
prašek.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 568
 
Za vsako preskušano snov in kontrolno snov se uporabijo tri kožne 
ploščice. Preskušana snov se odstrani tako, da se toliko časa spira s 
curkom teko če vode, ki ima do 30  o C, dokler ni ve č mogoče odstra­
niti materiala.  
1.5.4  Meritve TER  
Impedanca kože se izmeri kot TER z Wheatstonovim mosti čem 
nizke napetosti in izmeni čnega toka (13). Splošne specifikacije za 
mostič so: delovna napetost 1-3 volte, izmeni čni tok 50–1 000 Hz v 
obliki sinusa ali pravokotnika in merilno obmo čje najmanj 0,1–30 
kΩ. Merilni mosti č v validacijski študiji je meril induktivnost do 
2 000 H, kapacitivnost do 2 000 μF in upornost do 2 M Ω pri 
frekvencah 100 Hz ali 1 kHz v zaporednih ali vzporednih meritvah. V preskusu jedkosti TER se meritve beležijo v obliki upornosti pri 
frekvenci 100 Hz in z zaporednimi vrednostmi. Pred merjenjem elek ­
trične upornosti se površinska napetost kože zmanjša, tako da se doda 
zadostna koli čina 70-odstotnega etanola, da prekrije pokožnico. Po 
nekaj sekundah se etanol odstrani iz cevi, tkivo pa se nato navlaži s 
3 mL raztopine MgSO
 4 (154 mM). Za merjenje upornosti v k Ω/kožno 
ploščico se elektrode merilnega mosti ča namestijo na vsako stran kožne 
ploščice (slika 1). Mere elektrod in dolžina elektrode pod krokodilsko 
sponko so navedene na sliki 2. Sponka notranje (debele) elektrode med 
merjenjem upornosti leži na vrhu PTFE-cevi, s čimer se zagotovi, da je 
v raztopino MgSO  4 ves čas potopljena enaka dolžina elektrode. 
Zunanja elektroda je v receptorski komori, in sicer se dotika njenega dna. Razdalja med vzmetno sponko in dnom PTFE-cevi je konstantna 
(slika 2), saj ta razdalja vpliva na dobljeno vrednost upornosti. Zato 
mora biti razdalja med notranjo elektrodo in kožno ploš čico konstantna 
in minimalna (1–2 mm). 
Če je izmerjeni upor ve čji od 20 k Ω, je to morda posledica tega, da 
ostanki preskušane snovi prekrivajo površino pokožnice kožne ploščice. Za odstranitev te plasti se lahko na primer za čepi PTFE-cev 
z orokavi čenim palcem in jo stresa približno 10 sekund; raztopina 
MgSO
 4 se zavrže, merjenje upornosti pa se ponovi s svežim MgSO  4 . 
Lastnosti in mere preskusne naprave in uporabljenega poskusnega 
postopka lahko vplivajo na pridobljene vrednosti TER. Prag za 
jedkost 5 k Ω je bil ugotovljen na podlagi podatkov, pridobljenih s 
posebnimi napravami in postopki, opisanimi v tej metodi. Če se 
preskusni pogoji bistveno spremenijo ali če se uporabi druga čna 
aparatura, lahko veljajo druga čni pragovi in kontrolne vrednosti. 
Zaradi tega je treba metodologijo in prag upornosti obvezno umerjati s preskušanjem vrste referen čnih standardov, ki se izberejo izmed 
kemikalij, uporabljenih v validacijski študiji (4) (5), ali iz skupin 
kemikalij, ki so podobne preskušani. Nabor primernih referen čnih 
kemikalij je prikazan v tabeli 1.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 569
 
1.5.5  Metode vezave barvila  
Izpostavljenost dolo čenim nejedkim materialom lahko povzro či 
zmanjšanje upornosti pod prag 5 k Ω, pri čemer je omogo čen prehod 
ionov skozi roženo plast in zmanjšanje elektri čne upornosti (5). Npr. 
nevtralne organske snovi in kemikalije, ki so površinsko aktivne 
(med drugim detergenti, emulgatorji in druge površinsko aktivne snovi) lahko odstranjujejo kožne lipide in povzro čijo večjo prepust ­
nost ionov. Zato je treba pri vrednostih TER za preskušano snov pod 
ali okoli 5 k Ω in brez vidnih poškodb opraviti oceno penetracije 
barvila na kontrolnih in obdelovanih tkivih, da se ugotovi, ali so vrednosti TER posledica pove čane prepustnosti kože ali jedkosti za 
kožo (3) (5). V slednjem primeru barvilo sulforodamin B poruši 
roženo plast, ki po nanosu na površino kože hitro penetrira in obarva pod njim leže če tkivo. To specifi čno barvilo je odporno proti širo ­
kemu razponu kemikalij in nanj ne vpliva ekstrakcijski postopek, 
opisan spodaj.
 
1.5.5.1  Nanos in odstranitev barvila sulforodamin B  
Po oceni TER se magnezijev sulfat odstrani iz cevi, kožo pa je treba 
natančno pregledati za vidne poškodbe. Če ni očitnih večjih 
poškodb, se na površino pokožnice vsake kožne ploš čice za 2 uri 
nanese 150 μl 10-odstotne (m/V) raztopine barvila sulforodamin B 
(Acid Red 52; C.I. 45100; št. Einecs 222-529-8; št. CAS 3520-42-1) v destilirani vodi. Te kožne ploš čice se nato približno 10 sekund 
spirajo s teko čo vodo pri najve č sobni temperaturi, da se odstrani 
morebitno odve čno/nevezano barvilo. Vsaka kožna ploš čica se 
pazljivo odstrani iz PTFE-cevi in se prenese v vialo (npr. 20-milili ­
trsko stekleni čko za scintilacijsko teko čino), ki vsebuje deionizirano 
vodo (8 mL). Viale se 5 minut rahlo stresajo, da se odstrani preostalo 
odvečno nevezano barvilo. Postopek izpiranja se ponovi, nato pa se 
kožne ploš čice odstranijo in prenesejo v viale, ki vsebujejo 5 mL 30- 
odstotnega (m/V) natrijevega dodecil sulfata (SDS) v destilirani vodi 
in se v inkubatorju čez noč shranijo pri 60
 o C. 
Po inkubaciji se vse kožne ploš čice odstranijo in zavržejo, preostala 
raztopina pa se 8 minut centrifugira pri 21  o C (relativna centrifugalna 
sila ~ 175 × g). Vzorec supernatanta v koli čini 1 mL se nato razred či 
v razmerju 1 proti 5 (V/V) (tj. 1 mL + 4 mL) s 30-odstotnim SDS (m/V) v destilirani vodi. Opti čna gostota (OD) raztopine se meri pri 
565 nm.
 
1.5.5.2  Izra čun vsebnosti barvila  
Vsebnost barvila sulforodamin B v ploš čici se izra čuna iz vrednosti 
OD (koeficient molarne ekstinkcije barvila sulforodamin B pri 565 nm = 8,7 × 10; molekulska masa = 580). Vsebnost barvila se 
določi za vsako kožno ploš čico s pomo čjo ustrezne umeritvene 
krivulje, nato pa se izra čuna srednja vrednost vsebnosti barvila za 
ponovitve.
 
2. PODATKI  
Vrednosti upornosti (k Ω) in, kadar je primerno, vrednosti vsebnosti 
barvila (μg/ploščico) za preskušano snov skupaj s podatki pozitivnih 
in negativnih kontrol, je treba prikazati v obliki razpredelnice (posa ­
mezni podatki preskušanja in srednje vrednosti ± standardni odklon), 
vključno s podatki ponovitev/ponovljenih poskusov, srednjimi vred ­
nostmi in posameznimi vrednostmi.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 570
 
2.1 RAZLAGA REZULTATOV 
Povprečni rezultati TER se sprejmejo pod pogojem, da so vrednosti 
istočasne pozitivne in negativne kontrole v mejah sprejemljivosti za 
to metodo v preskusnem laboratoriju. Meje sprejemljivosti za meto ­
dologijo in aparaturo, opisani zgoraj, so prikazane v naslednji tabeli:  
Kontrola Snov Mejni upor 
(kΩ) 
Pozitivna 10M klorovodikova kislina 0,5–1,0 
Negativna Destilirana voda 10–25 
Povprečni rezultati vezanja barvila se sprejmejo pod pogojem, da so 
vrednosti isto časne kontrole v mejah sprejemljivosti za metodo. 
Predlagane sprejemljive meje vsebnosti barvila za kontrolne snovi 
za opisano metodologijo in napravo so naslednje:  
Kontrola Snov Meje vsebnosti 
barvila (μg/ 
košček) 
Pozitivna 10 M klorovodikova kislina 40–100 
Negativna Destilirana voda 15–35 
Preskušana snov se šteje kot nejedka za kožo: 
(i) če je srednja vrednost TER, dobljena za preskušano snov, ve čja 
od 5 kΩ ali 
(ii) če je srednja vrednost TER manjša ali enaka kot 5 k Ω in 
— na kožni ploš čici ni vidnih poškodb in 
— je srednja vrednost vsebnosti barvila v kožni ploš čici veliko 
manjša od isto časno dolo čene srednje vrednosti vsebnosti 
barvila v kožni ploš čici iz pozitivne kontrol 10-molarno HCl. 
Preskušana snov se šteje kot jedka za kožo: 
(i) če je srednja vrednost TER manjša ali enaka kot 5 k Ω in je 
kožna ploš č vidno poškodovana ali 
(ii) če je srednja vrednost TER manjša ali enaka kot 5 k Ω in 
— na kožni ploš čici ni vidnih poškodb, vendar 
— je srednja vrednost vsebnosti barvila v kožni ploš čici večja ali 
enaka isto časno dolo čeni srednji vrednosti vsebnosti barvila v 
kožni ploš čici iz pozitivne kontrole z 10-molarno HCl.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 571
 
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: 
Preskušane in kontrolne snovi: 
— kemijsko(-a) ime(-na), npr. IUPAC, ime CAS in številko CAS, 
če je znana, 
— čistost in sestavo snovi ali pripravka (v utežnih odstotnih vredno ­
stih) in agregatno stanje, 
— fizikalno-kemijske lastnosti pomembne za izvedbo študije, npr. 
agregatno stanje, pH, stabilnost, topnost v vodi, 
— obdelava preskušanih/kontrolnih snovi pred preskušanjem, če je 
smiselno (npr. segrevanje, mletje), 
— stabilnost, če je znana. 
Preskusne živali: — uporabljena linija in spol, 
— starost živali, ko so bile uporabljene kot donorke, 
— vir, pogoji nastanitve, prehrana itd., — podrobnosti o pripravi kože. 
Preskusni pogoji: 
— umeritvene krivulje za preskusne aparature, — umeritvene krivulje za izvedbo preskusa vezave barvila, — podrobni podatki o preskusnem postopku uporabljenem za 
meritve TER, 
— podrobni podatki o preskusnem postopku uporabljenem za oceno 
vezave barvila; če je primerno, 
— opis vseh sprememb preskusnih postopkov, 
— opis uporabljenih kriterijev ocenjevanja. 
Rezultati: — podatki iz poskusa TER in vezave barvila ( če je smiselno) za 
posamezno žival in posamezne vzorce kože v obliki razpredel ­
nice, 
— opis vseh opaženih u činkov. 
Razprava o rezultatih. 
Sklepi.
 
4. LITERATURA  
(1) OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for 
Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Asses ­
sment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http:// 
www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm- 
mono(2001)6.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 572
 
(2) Preskusna metoda B.4. Akutna toksi čnost: draženje kože/jed ­
kost. 
(3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, 
M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. 
(1995). A prevalidation study on  in vitro  skin corrosivity 
testing. The report and recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, 219–255. 
(4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international vali ­
dation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 1. Selection 
and distribution of the test chemicals. Toxic. in Vitro 12, 471- 
482. 
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhütter, H.-G., and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxic. in Vitro 12, 483–524. 
(6) OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on 
Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alter ­
native Toxicological Test Methods, 62 pp. 
(7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem. J.H., Bruner. L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder. R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski. D., 
Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the 
validation of toxicity test procedures. The report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129–147. 
(8) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regu ­
latory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publi ­
cation No. 97-3981. National Institute of Environmental Health 
Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf 
(9) ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275- 
280. 
(10) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of EpiDerm
 TM , EPISKIN  TM (EPI-200), and the Rat Skin 
Transcutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro 
test methods for assessing dermal corrosivity potential of 
chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental 
Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf . 
(11) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The 
In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st 
–2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 
27
 th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request 
from the Secretariat 
(12) Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A., and Rhodes, C. (1986). An  
in vitro  skin corrosivity test -modificationsand validation. Fd. 
Chem. Toxicol. 24, 507–512.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 573
 
(13) Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, 
D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J., and Gardner, 
J. (1992). The skin corrosivity test  in vitro:  results of an inter ­
laboratory trial. Toxic. in Vitro 6, 191–194. 
(14) Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the 
Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 
26: 709–720. 
(15) Basketter, D.A., Chamberlain, M., Griffiths, H.A., Rowson, 
M., Whittle, E., York, M. (1997). The classification of skin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35, 845–852. 
(16) Oliver G.J.A, Pemberton M.A and Rhodes C. (1988). An In 
Vitro model for identifying skin-corrosive chemicals. I. Initial Validation. Toxic. in Vitro. 2, 7–17.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 574
 
Slika 1  
Aparatura za preskus TER s podganjo kožo
  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 575
 
Slika 2  
Mere uporabljenih cevi iz politetrafluoroetilena (PTFE), receptorskih cevi in 
elektrod
  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 576
 
Ključni dejavniki zgoraj prikazane aparature:  
— notranji premer PTFE-cevi, — dolžina elektrod relativno na PTFE-cev in receptorsko cev, tako 
ta se kožna ploš čica ne dotika elektrod in da je v stiku z razto ­
pino MgSCO
 4 standardna dolžina elektrode, 
— višina raztopine MgSCO  4 v receptorski cevki mora biti relativna 
na gladino raztopine v PTFE-cevi, kakor je prikazano v sliki 1, 
— kožna ploš čica mora biti v PTFE-cev fiksirana zadostno, da je 
upor elektri čnega toka resni čno merilo lastnosti kože.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 577
 
B.40 BIS.  JEDKOST ZA KOŽO  IN VITRO:  PRESKUS Z MODELOM 
ČLOVEŠKE KOŽE  
1. METODA  
Ta preskusna metoda je enakovredna OECD TG 431 (2004).  
1.1 UVOD 
Jedkost za kožo pomeni nastanek nepovratnih poškodb kožnega 
tkiva po nanosu preskušanega materiala [po definiciji iz Globally 
Harmonised System for the Classification and Labelling of Chemical 
Substances and Mixtures (GHS)] (1). V tej preskusni metodi se ocena jedkosti ne opravlja na živih živalih ali živalskem tkivu. 
Ocena jedkosti za kožo se je obi čajno opravljala na laboratorijskih 
živalih (2). Zadržki v zvezi z bole činami in trpljenjem živali, ki je 
povezano s tem postopkom, je bila upoštevana v reviziji preskusne 
metode B.4, ki omogo ča določevanje jedkosti za kožo z alternativ ­
nimi metodami  in vitro,  pri čemer se prepre či bolečina in trpljenje 
živali. 
V tej preskusni metodi se ocena jedkosti ne opravlja na živih živalih 
ali živalskem tkivu. Za temi je bila opravljena uradna validacijska študija metod  in vitro  za oceno jedkosti za kožo (4) (5) (6) (7) (8). 
Na podlagi izidov teh študij in druge objavljene literature (9) je bilo 
izdano priporo čilo, da se lahko naslednja preskusa uporabita za 
oceno jedkosti za kožo  in vivo  (10) (11) (12) (13): preskus z 
modelom človeške kože (glej metodo) in preskus transkutane elek ­
trične upornosti (preskusna metoda B.40). 
V validacijskih študijah so ugotovili, da lahko preskus z modelom 
človeške kože (3) (4) (5) (9) zanesljivo razlikuje med znanimi 
snovmi, ki so jedke za kožo, in znanimi snovmi, ki niso jedke. S 
protokolom preskusa je mogo če pridobiti podatke o tem, ali je 
preskusna snov mo čno ali šibko jedka za kožo. 
Preskus, opisan v tej metodi, omogo ča identifikacijo jedkih kemij ­
skih snovi in mešanic. Omogo ča tudi identifikacijo nejedkih snovi in 
mešanic, če je podprta z dokazi in ob uporabi drugih obstoje čih 
podatkov (npr. pH, razmerja struktura-aktivnost, podatki o ljudeh 
in/ali živalih) (1) (2) (13) (14). Obi čajno pa ne daje zadostnih poda ­
tkov o draženju kože niti ne omogo ča nadaljnje kategorizacije jedkih 
snovi, kakor je to dovoljeno v Globally Harmonised Classification 
System (GHS) (1). 
Za popolno vrednotenje lokalnih u činkov na kožo po enkratni izpo ­
stavljenosti se priporo ča upoštevanje na črtovanja zaporednega 
preskušanja, ki je priloženo preskusni metodi B.4 (2) in na voljo v Globally Harmonised System (GHS) (1). To na črtovanje preskušanja 
vključuje opravljanje preskusov jedkosti za kožo  in vitro  (kakor je 
opisano v tej metodi) in preskusov draženja kože pred preskušanjem 
na živih živalih.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 578
 
1.2 OPREDELITEV POJMOV  
Jedkost za kožo  in vivo : je nastanek nepovratnih poškodb kože: 
zlasti, vidne nekroze skozi pokožnico in v usnjico v štirih urah po nanosu preskusne snovi. Reakcije na jedkost se razvrstijo na ulcera ­
cije, krvavitve, krvave kraste in po 14-dnevnem opazovanju, ko se 
zaradi luš čenja kože izgubi obarvanost, na obmo čja alopecije in 
brazgotine. Dvomljive lezije je treba preiskati histopatološko.  
Viabilnost celic:  parameter za merjenje celotne dejavnosti populacije 
celic (npr. zmožnost celi čnih mitohondrijskih dehidrogenaz za reduk ­
cijo vitalnega barvila MTT), ki se glede na merjeni ciljni u činek in 
uporabljeni na črt preskusa ujema s skupnim številom in/ali vital ­
nostjo celic.
 
1.3 REFEREN ČNE SPOJINE  
Tabela 1  
Referenčne kemikalije  
Ime Št. Einecs Št. CAS  
1,2-Diaminopropan 201-155-9 78-90-0 Mo čno jedko 
Akrilna kislina 201-177-9 79-10-7 Mo čno jedko 
2-terc-Butilfenol 201-807-2 88-18-6 Jedko Kalijev hidroksid (10-odstoten) 215-181-3 1310-58-3 Jedko Zveplova kislina (10-odstotna) 231-639-5 7664-93-9 Jedko Oktanojska (kaprilska kislina) 204-677-5 124-07-02 Jedko 4-Amino-1,2,4-triazol 209-533-5 584-13-4 Ni jedko Evgenol 202-589-1 97-53-0 Ni jedko Fenetil bromid 203-130-8 103-63-9 Ni jedko Tetrakloroetilen 204-825-9 27-18-4 Ni jedko Izostearinska kislina 250-178-0 30399-84-9 Ni jedko 4-(Metiltio)-benzaldehid 222-365-7 3446-89-7 Ni jedko 
Večina navedenih kemikalij je vzetih s seznama kemikalij izbranih 
za mednarodno validacijsko študijo ECVAM (4). Izbira v tej študiji je temeljila na naslednjih kriterijih: 
(i) enako število jedkih in nejedkih snovi; 
(ii) komercialno dostopne snovi, ki pokrivajo ve čino pomembnih 
kemijskih skupin; 
(iii) vklju čitev močno jedkih in manj jedkih snovi, da se omogo či 
razlikovanje na podlagi stopnje jedkosti;
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 579
 
(iv) izbira kemikalij, s katerimi je mogo če v laboratoriju ravnati, ne 
da bi nastopile druge hude nevarnosti z izjemo jedkosti.  
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Preskušani material se površinsko nanese na tridimenzionalni model 
človeške kože, ki obsega najmanj rekonstruirano pokožnico s funk ­
cionalno roženo plastjo. Jedki materiali se identificirajo glede na 
zmožnost, da se po dolo čenem času izpostavljenosti zmanjšajo 
sposobnost celic [ki se dolo či npr. z uporabo preskusa redukcije 
MTT (15)] pod opredeljeno raven praga. Na čelo preskusa modela 
človeške kože temelji na hipotezi, da jedke kemikalije lahko prodrejo 
v roženo plast z difuzijo ali erozijo in so citotoksi čne za spodaj 
ležeče sloje celic.  
1.4.1  Postopek  
1.4.1.1  Modeli človeške kože  
Modeli človeške kože se lahko pripravijo ali pridobijo komercialno 
(npr. modela EpiDerm™ in EPISKIN™) (16) (17) (18) (19) ali pa jih razvije ali pripravi preskusni laboratorij (20) (21). Razumljivo je, da se pri uporabi človeške kože upoštevajo nacionalna in 
mednarodna eti čna načela in okoliš čine. Vse nove modele je treba 
validirati (najmanj v obsegu, opisanem v 1.4.1.1.2). Modeli človeške 
kože za uporabo v tem preskusu morajo izpolnjevati naslednje zahteve:
 
1.4.1.1.1 P o g o j i s p l o š n e g a m o d e l a : 
Za pripravo epitelija se morajo uporabiti človeški keratinociti. Pod 
funkcionalno roženo plastjo je ve č slojev živih epitelijskih celic. 
Model kože ima lahko tudi sloj strome. Rožena plast mora biti večslojna z ustreznim profilom lipidov, da opravlja funkcijo pregrade 
z robustnostjo, da je odporna proti hitri penetraciji ozna čevalcev 
citotoksičnosti. Zadrževalne lastnosti modela morajo prepre čiti 
prehod materiala okoli rožene plasti v živo tkivo. Prehod preskušane kemikalije okoli rožene plasti povzro či slabo modeliranje izpostavlje ­
nosti kože. V modelu kože ne sme biti bakterij (vklju čno z miko ­
plazmami) ali plesni.
 
1.4.1.1.2 P o g o j i f u n k c i j s k e g a m o d e l a : 
Obseg viabilnosti se ponavadi števil čno vrednoti z uporabo MTT ali 
drugih s presnovo pretvorjenih vitalnih barvil. V teh primerih mora biti 
optična gostota (OD) barvila iz negativnega kontrolnega tkiva najmanj 
20-krat ve čja od OD ekstrakcijskega topila [za pregled glej (22)]. Nega ­
tivno kontrolno tkivo mora biti obstojno v kulturi (dajati podobne 
meritve viabilnosti) v času trajanja preskusa. Rožena plast mora biti 
dovolj robustna, da je odporna proti hitri penetraciji ozna čevalcev 
citotoksičnosti (npr. l-odstotnega Tritona X-100). Ta lastnost se 
lahko oceni s časom izpostavljanja, ki je potreben, da se zmanjša 
viabilnost celic za 50 % (ET  50 ) (npr. za modela EpiDerm™ in 
EPISKIN™ je to > 2 uri). Tkivo mora omogo čati ponovljivost rezul ­
tatov tudi po dolo čenem časovnem obdobju in po možnosti v razli čnih 
laboratorijih. Poleg tega mora biti tkivo primerno za uporabo v 
izbranem preskusnem protokolu za napovedovanje jedkosti referen čnih 
kemikalij (glej tabelo 1).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 580
 
1.4.1.2  Nanos preskušanih in kontrolnih snovi  
Za vsako obdelavo ( čas izpostavljenosti), vklju čno s kontrolami, se 
izvedeta dve ponovitvi s tkivom. Pri teko čih materialih je treba 
nanesti dovolj preskušane snovi, da se enakomerno prekrije površina 
kože: uporabiti je treba najmanj 25 μL/cm2. Pri trdnih materialih je 
treba nanesti dovolj preskušane snovi, da je koža enakomerno prekrita, nato pa je treba snov navlažiti z deionizirano ali destilirano vodo, da se zagotovi dober stik s kožo. Kadar je primerno, je treba 
trdne snovi pred nanosom zmleti v prašek. Metoda nanosa mora biti 
primerna preskušani snovi (glej npr. referenco 5). Ob koncu časa 
izpostavljenosti je treba preskušani material skrbno sprati s površine 
kože z ustreznim pufrom ali 0,9-odstotno raztopino NaCl. 
V vsaki študiji je treba uporabiti isto časne pozitivne in negativne 
kontrole, da se zagotovi ustreznost izvedbe modela poskusa. Pred ­
lagana snov za pozitivno kontrolo je ledocetna kislina ali 8-normalni 
KOH. Predlagana snov za negativno kontrolo je 0,9-odstotni NaCl 
ali voda.
 
1.4.1.3  Meritve viabilnosti celic  
Za merjenje viabilnosti celic je možno uporabiti samo kvantitativne, 
validirane metode. Meritve viabilnosti morajo biti združljive z 
uporabo tridimenzionalne konstrukcije tkiva. Nespecifi čna vezava 
barvil ne sme vplivati na meritev viabilnosti. Zato niso primerna barvila, ki se vežejo na beljakovine, in barvila, ki se presnovno ne pretvarjajo (npr. nevtralno rde če). Najpogosteje uporabljen preskus je 
redukcija MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev 
bromid, Thiazolyl blue: št. Einecs 206-069-5, št. CAS 298-93-1)], za katerega je dokazano, da daje natan čne in ponovljive rezultate (5), 
vendar se lahko uporabijo tudi druga barvila. Vzorec kože se za 3 
ure potopi v raztopino MTT v ustrezni koncentraciji (npr. 
0,3–1 mg/mL) pri ustrezni inkubacijski temperaturi. Oborina modrega formazana se nato ekstrahira s topilom (izopropanol), 
nato pa se koncentracija formazana izmeri z dolo čitvijo OD pri 
valovni dolžini od 540 od 595 nm. 
Kemična reakcija preskušanega materiala z vitalnim barvilom lahko 
posnema presnovo celice, kar povzro či lažne ocene viabilnosti. Ta 
pojav so ugotovili v primerih, ko preskusni material ni bil s spira ­
njem popolnoma odstranjen s kože (9). Če preskusni material nepo ­
sredno deluje na vitalno barvilo, je treba uporabiti dodatne kontrole za odkrivanje in odpravljanje motenj preskusne snovi pri meritvah 
viabilnosti (9)(23).
 
2. PODATKI  
Podatki o vrednosti OD in izra čunanih odstotnih vrednostih viabil ­
nosti celic za preskušano snov, pozitivne in negativne kontrole, vključno s podatki o ponovitvah/ponovljenih poskusih (kolikor je 
smiselno), srednjih vrednostih in posameznih vrednostih, je treba 
za vsako tkivo prikazati v obliki razpredelnice.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 581
 
2.1 RAZLAGA REZULTATOV 
Vrednosti OD, pridobljene za vsak preskušani vzorec, se lahko 
uporabijo za izra čun odstotnega deleža viabilnosti celic v primerjavi 
z negativno kontrolo, katere viabilnost je arbitrarno postavljena na 
100 %. Mejna vrednost odstotnega deleža viabilnosti celic, ki se 
uporablja za razlikovanje med jedkimi in nejedkimi preskušanimi materiali (ali za razlikovanje razli čnih razredov jedkosti), ali stati ­
stični postopki za vrednotenje rezultatov in identifikacijo jedkih 
materialov morajo biti natan čno opredeljeni in zabeleženi, njihova 
ustreznost pa mora biti potrjena. Ponavadi se te vrednosti dolo čijo 
med optimizacijo preskusa, preskusijo v predvalidacijski fazi in potr ­
dijo v validacijski študiji. Primer je napovedovanje jedkosti v 
modelu EpiDerm™ je (9): 
Preskušana snov se šteje kot jedka za kožo: 
(i) če je viabilnost po 3 minutah izpostavljenosti manjša od 50 % ali 
(ii) če je viabilnost po 3 minutah izpostavljenosti ve čja ali enaka kot 
50 % in je viabilnost po 1 uri izpostavljenosti manjša od 15 %. 
Preskušana snov se šteje kot nejedka za kožo: (i) če je viabilnost po 3 minutah izpostavljenosti ve čja ali enaka 
50 % in je viabilnost po 1 uri izpostavljenosti ve čja ali enaka 
15 %.
 
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: 
Preskušana in kontrolna snov: — kemijsko(-a) ime(-na), npr. IUPAC, ime CAS in številko CAS, 
če je znana, 
— čistost in sestavo snovi ali pripravka (v utežnih odstotnih vredno ­
stih), 
— fizikalno-kemijske lastnosti pomembne za izvedbo študije, npr. 
agregatno stanje, pH, stabilnost, topnost v vodi, 
— obdelava preskušanih/kontrolnih snovi pred preskušanjem, če je 
smiselno (npr. segrevanje, mletje), 
— stabilnost, če je znana. 
Utemeljitev modela kože in uporabljenega protokola. Preskusni pogoji: — uporabljeni celi čni sistem, 
— podatki o umerjanju za merilno napravo, s katero se je merila 
viabilnost celic (npr. spektrofotometer),
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 582
 
— popolni podatki za podporo specifi čnemu uporabljenemu modelu 
kože, vklju čno z njegovo veljavnostjo, 
— podrobni podatki o preskusnem postopku, — uporabljeni preskusni odmerki, 
— opis vseh modifikacij preskusnih postopkov, 
— sklicevanje na histori čne podatke o modelu, 
— opis uporabljenih kriterijev ocenjevanja. 
Rezultati: 
— podatki iz posameznih preskusnih vzorcev v preglednici, — opis drugih opaženih u činkov. 
Razprava o rezultatih. 
Sklep.
 
4. LITERATURA  
(1) OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for 
Human Health and Environmental Hazards of Chemical 
Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Asses ­
sment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http:// www.olis. oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono 
(2001)6. 
(2) Preskusna metoda B.4. Akutna toksi čnost: draženje kože/jed ­
kost. 
(3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. 
(1995). A prevalidation study on  in vitro  skin corrosivity 
testing. The report recommendations of EC VAM Workshop 6 ATLA 23, 219–255. 
(4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998). The EC VAM international 
validation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 
1. Selection and distribution of the test chemicals. Toxic. In Vitro 12, 471–482. 
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxic. In Vitro 12, 483–524. 
(6) OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on 
Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alter ­
native Toxicological Test Methods, 62 pp. 
(7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem, J.H., Bruner, L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder, R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., 
Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski, D., 
Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the validation of toxicity test procedures. Test report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129–147. 
(8) ICC VAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regu ­
latory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publi ­
cation No. 97-3981. National Institute of Environmental Health 
Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 583
 
(9) Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C, Spielmann, H., Uphill, P., 
Wilkins, S., McPherson, J.P., Wiemann, C, Kaufmann, T., 
Remmele, M. and Holzhutter, H.G. (2000). The ECVAM prevalidation study on the use of EpiDerm for skin Corrosivity testing. ATLA 28, pp. 371–401. 
(10) ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275–280. 
(11) ECVAM (2000). ECVAM News & Views. ATLA 28, 365–67. (12) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation 
of EpiDerm™, EPISKIN™ (EPI-200), and the Rat Skin Trans ­
cutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemi ­
cals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology 
Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf 
(13) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The 
In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st 
- 2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 
27
 th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request 
from the Secretariat 
(14) Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the 
Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26: 709–720. 
(15) 15 Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular 
growth and survival: application to proliferation and cytotoxi ­
city asssays. J.Immunol. Meth. 65, 55–63. 
(16) Cannon, C.L., Neal, P.J., Southee, J.A., Kubilus, J., and Klaus ­
ner, M., 1994. New epidermal model for dermal irritancy 
testing. Toxic. In Vitro 8, 889–891. 
(17) Ponec, M., Boelsma, E., Weerheim, A., Mulder, A., Boutwstra, 
J., and Mommaas, M., 2000. Lipid and ultrastructural charac ­
terization of reconstructed skin models. International Journal of Pharmaceutics. 203, 211–225. 
(18) Tinois E, Gaetani Q, Gayraud B, Dupont D, Rougier A, Poura ­
dier DX (1994). The Episkin model: Successful reconstruction of human epidermis in vitro. In In vitro Skin Toxicology. Edited by A Rougier, AM Goldberg and HI Maibach: 133–140 
(19) Tinois E, Tiollier J, Gaucherand M, Dumas H, Tardy M, 
Thivolet J (1991). In vitro and post -transplantation differen ­
tiation of human keratinocytes grown on the human type IV collagen film of a bilayered dermal substitute. Experimental 
Cell Research 193: 310–319 
(20) Parentau, N.L., Bilbo, P., Molte, C.J., Mason, V.S., and 
Rosenberg, H. (1992). The organotypic culture of human 
skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. 
Cytotechnology 9, 163–171. 
(21) Wilkins, L.M., Watson, S.R., Prosky, S.J., Meunier, ST., 
Parentau, N.L. (1994). Development of a bilayered living 
skin construct for clinical applications. Biotechnology and 
Bioengineering 43/8, 747–756.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 584
 
(22) Marshall, N.J., Goodwin, C.J., Holt, S.J. (1995). A critical asses ­
sment of the use of microculture tetrazolium assays to measure 
cell growth and function. Growth Regulation 5, 69–84. 
(23) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesne', C, Elliot, G.R., Harbell, 
J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Rouget, R., and van de Sandt, J.J.M., and Botham, P.A. (2001). A prevalidation study on  in 
vitro  tests for acute skin irritation: results and evaluation by the 
Management Team. Toxic. In Vitro 15, 57–93.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 585
 
B.41  PRESKUS FOTOTOKSI ČNOSTI 3T3 NRU IN  VITRO  
1. METODA  
Ta preskusna metoda je enakovredna OECD TG 432 (2004).  
1.1 UVOD 
Fototoksi čnost je opredeljena kot toksi čna reakcija snovi, nanesene 
na telo, ki se sproži ali bolj izrazi (razvidno pri manjših odmerkih) 
po naknadni izpostavljenosti svetlobi, ali se sproži z obsevanjem kože po sistemskem dajanju kemikalije. 
S preskusom fototoksi čnosti 3T3 NRU  in vitro  se ugotavlja fototok ­
sični potencial preskušane snovi, ki ga izzove vzbujena kemikalija 
po izpostavljenosti svetlobi. V preskusu se dolo ča fotocitotoksi čnost 
na podlagi relativnega zmanjšanja viabilnosti celic izpostavljenih 
kemikaliji v prisotnosti in odsotnosti svetlobe. Snovi, ki jih dolo čimo 
s tem preskusom, so najverjetneje fototoksi čne in vivo  po sistemskem 
dajanju in porazdelitvi po koži ali po površinskem nanosu na kožo. 
Za več vrst kemikalij je bilo ugotovljeno, da sprožajo fototoksi čne 
učinke (1) (2) (3) (4). Njihova edina skupna lastnost je sposobnost, 
da v obmo čju sončne svetlobe absorbirajo svetlobno energijo. Po 
prvem zakonu fotokemije (Grotthaus-Draperjev zakon) zahteva foto ­
reakcija zadostno absorpcijo svetlobnih kvantov. Še preden se za čne 
razmišljati o biološkem preskušanju je zato po Smernici za presku ­ 
šanje OECD 101 pri preskušani kemikaliji treba dolo čiti absorpcijski 
spekter UV/vidne svetlobe.. Predlagano je bilo, da kemikalija zelo verjetno ni fotoreaktivna, če je koeficient molarne ekstinkcije/absorp ­
cije manjši od 10 litrov × mol
 -1 × cm  -1 . Te kemikalije ni treba 
preskušati niti v preskusu fototoksi čnosti 3T3 NRU  in vitro  niti v 
katerem koli drugem biološkem preskusu škodljivih fotokemijskih učinkov (1)(5). Glej tudi Dodatek 1. 
Zanesljivost in pomen preskusa fototoksi čnosti 3T3 NRU  in vitro  sta 
bila nedavno ovrednotena (6) (7) (8) (9). Dokazali so, da preskus fototoksičnosti 3T3 NRU  in vitro  napoveduje akutne fototoksi čne 
učinke pri živalih in ljudeh  in vivo.  Preskus ni namenjen napovedo ­
vanju drugih škodljivih u činkov, ki lahko nastanejo zaradi kombini ­
ranega delovanja kemikalije in svetlobe, npr. ne obravnava fotoge ­
notoksičnosti, fotoalergenosti ali fotorakotvornosti niti ne omogo ča 
ocenjevanja fototoksi čnega potenciala. Prav tako preskus ni bil 
zasnovan za obravnavanje posrednih mehanizmov fototoksi čnosti, 
učinkov presnovkov preskušane snovi ali u činkov zmesi. 
Medtem ko je uporaba presnovnih sistemov splošna zahteva za vse 
preskuse  in vitro  za napovedovanje genotoksi čnega in karcinogenega 
potenciala, so se doslej v primeru fototoksikologije pojavili le redki primeri, kjer je potrebna presnovna transformacija, da bi kemikalija učinkovala kot fototoksin  in vivo  ali in vitro.  Zaradi tega ni niti 
potrebno niti znanstveno upravi čeno, da se pri čujoči preskus opravi 
s sistemom za aktivacijo presnove.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 586
 
1.2 OPREDELITEV POJMOV  
Obsevanje:  intenziteta ultravijoli čne (UV) ali vidne svetlobe, ki 
doseže površino, merjena v W/m ali mW/cm  2 . 
Odmerek svetlobe:  količina (= intenziteta x čas) ultravijoli čnega 
(UV) ali vidnega sevanja, ki doseže površino, izražena v joulih (= 
W x s) na enoto površine, npr. J/m ali J/cm  2 . 
Valovni pasovi UV-svetlobe:  oznake, ki jih priporo ča CIE (Com ­
mission Internationale de L'Eclairage), so: UVA (315–400 nm), 
UVB (280–315 nm) in UVC (100–280 nm). Uporabljajo se tudi druge oznake; lo čnica med UVB in UVA je pogosto pri 320 nm, 
UVA pa se lahko razdeli v UV-A1 in UV-A2, pri čemer je lo čnica 
pri približno 340 nm.  
Viabilnost celic:  parameter za merjenje celotne dejavnosti populacije 
celic (npr. sprejemanje vitalnega barvila nevtralno rde če v celične 
lizosome), ki se glede na merjeni ciljni u činek in uporabljeni na črt 
preskusa ujema s skupnim številom in/ali vitalnostjo celic.  
Relativna viabilnost celic:  viabilnost celic, izražena glede na 
kontrole s topilom (negativne kontrole), ki potekajo ves čas preskus ­
nega postopka (bodisi +Irr bodisi -Irr), vendar se ne obdelajo s 
preskušano kemikalijo.  
PIF (faktor fotoiritacije):  faktor, pridobljen s primerjanjem dveh 
enako učinkovitih citotoksi čnih koncentracij (IC50) preskušane 
kemikalije, dobljenih v odsotnosti (- Irr) in v prisotnosti (+ Irr) necitotoksi čnega obsevanja z UV A/vi dno svetlobo.  
IC
 50 : koncentracija preskušane kemikalije, pri kateri se viabilnost 
celic zmanjša za 50 %.  
MPE (srednji fotou činek):  meritev, izpeljana iz matemati čne 
analize celotne oblike krivulj reakcije na dve koncentraciji, prid ­
obljenih v odsotnosti (-Irr) in v prisotnosti (+Irr) necitotoksi čnega 
obsevanja z U V A/vi dno svetlobo.  
Fototoksi čnost:  akutna toksi čna reakcija, ki nastane po prvotni izpo ­
stavljenosti kože nekaterim kemikalijam in naknadni izpostavljenosti svetlobi, ali se podobno sproži z obsevanjem kože po sistemskem dajanju kemikalije.
 
1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Preskus fototoksi čnosti 3T3 NRU  in vitro  temelji na primerjavi cito ­
toksičnosti kemikalije, kadar se preskuša v prisotnosti in v odsotnosti 
izpostavljenosti necitotoksi čnemu odmerku simulirane son čne svet­
lobe. Citotoksi čnost se v tem preskusu izraža kot od koncentracije 
odvisno zmanjšanje sprejemanja vitalnega barvila nevtralno rde če 24 
ur po obdelovanju s preskušano kemikalijo in obsevanju (10). NR je šibko kationsko barvilo, ki zlahka prehaja celi čne membrane neod ­
visno od difuzije in se znotraj celi čno kopiči v lizosomih. Spre ­
membe površine ob čutljive membrane lizosomov povzro čijo krhkost 
lizosomov in druge spremembe, ki postopno postanejo nepovratne. Te spremembe izzovejo u činki ksenobiotikov in posledica je zmanj ­ 
šano sprejemanje NR. Zato je mogo če razlikovati med viabilnimi, 
poškodovanimi in odmrlimi celicami, kar je osnova preskusa.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 587
 
Celice Balb/c 3T3 se kultivirajo 24 ur, da se oblikujejo enoslojne 
celične plasti. Dve 96-kanalni ploš či na eno preskušano kemikalijo 
se nato eno uro predinkubirata z osmimi razli čnimi koncentracijami 
preskušane snovi. Nato se ena od obeh ploš č izpostavi najve čjemu 
necitotoksi čnemu odmerku obsevanja, medtem ko druga ploš ča 
ostane v temi. Na obeh ploš čah se nato gojiš če za obdelovanje 
nadomesti z umetnim gojiš čem, po nadaljnjih 24 urah inkubacije 
pa se viabilnost celic dolo ča s sprejemanjem nevtralno rde čega. 
Viabilnost celic, izražena kot odstotek neobdelanih kontrol s topilom, 
se izračuna za vsako preskusno koncentracijo. Za napoved fototoksi ­ 
čnega potenciala se reakcije na koncentracije, pridobljene v prisot ­
nosti in v odsotnosti obsevanja, med seboj primerjajo, obi čajno na 
ravni IC  50 , tj. pri koncentraciji, ki viabilnost celic v primerjavi z 
neobdelanimi kontrolami zmanjša za 50 %.  
1.4 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.4.1  Priprave  
1.4.1.1  Celice  
V validacijski študiji je bila uporabljena stalna celi čna linija mišjih 
fibroblastov, Balb/c 3T3, klon 31, bodisi iz zbirke American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, ZDA, bodisi iz zbirke 
European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, 
Združeno Kraljestvo, zato je priporo čljivo, da jo pridobite iz uvelja ­
vljene zbirke celic. Z istim preskusnim postopkom je mogo če 
uspešno uporabiti tudi druge celice ali celi čne linije, če so pogoji 
gojenja prilagojeni specifi čnim potrebam celic, vendar pa je treba 
dokazati enakovrednost. 
Celice je treba redno preverjati glede odsotnosti kontaminacije z 
mikoplazmami, uporabiti pa se smejo le, če jih v celicah ni (11). 
Pomembno je, da se ob čutljivost celic za UV redno preverja v skladu 
s postopkom kontrole kakovosti, opisanim v tej metodi. Ker se občutljivost celic za UVA lahko pove ča s številom pasaž, je treba 
uporabiti celice Balb/c 3T3 z najmanjšim možnim številom pasaž, po 
možnosti nižjim od 100. (Glej oddelek 1.4.2.2.2 in Dodatek 2).
 
1.4.1.2  Gojiš ča in pogoji gojenja  
Tako za rutinske pasaže celic kot med samim preskusnim postopkom 
je treba uporabiti ustrezna gojiš ča kuture in ustrezne inkubacijske 
pogoje, npr. za celice Balb/c 3T3 so to DMEM (Eaglovo gojiš če 
modificirano po Dulbeccu) z dodatkom 10-odstotnega seruma novo ­
rojenih telet, 4 mM glutamina, penicilina (100 R7) in streptomicina 
(100 μg/mL) ter odvisno od pufira inkubacija v vlažnem ozra čju pri 
37 o C v 5–7,5 % CO  2 (glej oddelek 1.4.1.4, drugi odstavek). Pri tem 
je še zlasti pomembno, da pogoji ravnanja s celi čno kulturo zagota ­
vljajo čas za celi čni cikel v okviru obi čajnih histori čnih meja, ki 
veljajo za uporabljene celice ali celi čne linije.  
1.4.1.3  Priprava kultur  
Celice iz zamrznjenih založnih kultur se v umetno gojiš če zasejejo v 
ustrezni gostoti in se ponovno kultivirajo vsaj enkrat, preden se 
uporabijo v preskusu fototoksi čnosti 3T3 NRU  in vitro.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 588
 
Celice za preskus fototoksi čnosti se v umetno gojiš če zasejejo v 
takšni gostoti, da kulture do konca preskusa ne postanejo strnjene, 
tj. ko se 48 ur po zasejanju celic dolo ča viabilnost celic. Za celice 
Balb/c 3T3, ki se kultivirajo v 96-kanalnih ploš čah, se priporo ča 
zasejanje z gostoto celic 1 × 10  4 celic na kanal. 
Za vsako preskušano kemikalijo se celice enako zasejejo v dve 
ločeni 96-kanalni ploš či, ki gresta nato hkrati čez celotni preskusni 
postopek pod enakimi pogoji gojenja, razen časovnega obdobja, v 
katerem se ena ploš ča obseva (+ Irr), druga pa ostane v temi (- Irr).  
1.4.1.4  Priprava preskušane snovi  
Preskušane snovi je treba sveže pripraviti tik pred uporabo, razen če 
podatki potrjujejo njihovo stabilnost med hranjenjem. Priporo čljivo 
je, da se vsi postopki s kemikalijo in za četno obdelovanje celic 
izvajajo v pogojih svetlobe, ki prepre čijo fotoaktivacijo ali 
razgradnjo preskušane snovi pred obsevanjem. 
Preskušane kemikalije je treba raztopiti v pufrskih raztopinah soli, 
npr. Earlovi uravnoteženi raztopini soli (EBSS) ali drugi fiziološko uravnoteženi pufrski raztopini, v katerih zato, da med obsevanjem ne 
pride do interference, ne sme biti beljakovinskih sestavin in sestavin, 
ki absorbirajo svetlobo (npr. pH-indikatorskih barv in vitaminov). Ker so celice med obsevanjem približno 50 minut izven inkubatorja s CO
 2 , je treba izvesti ustrezne ukrepe za prepre čitev alkalinizacije. 
Če se uporabljajo šibki pufri, kot je EBSS, se lahko to doseže z 
inkubiranjem celic v 7,5 % CO  2 . Če se celice inkubirajo samo v 5 % 
CO 2 , je treba izbrati mo čnejši pufer. 
Preskušane kemikalije z omejeno topnostjo v vodi je treba raztopiti v 
ustreznem topilu. Če se uporabi topilo, mora imeti stalni volumen v 
vseh kulturah, tj. v negativnih kontrolah (s topilom) in v vseh koncentracijah preskušane kemikalije, in mora biti v vseh koncen ­
tracijah necitotoksi čno. Koncentracije preskušane kemikalije je treba 
izbrati tako, da ne nastajajo oborine ali motne raztopine. 
Priporočeni topili sta dimetilsulfoksid (DMSO) in etanol (EtOH). 
Primerna so lahko tudi druga topila z nizko citotoksi čnostjo. Pred 
uporabo je treba pri vseh drugih topilih skrbno preveriti specifi čne 
lastnosti, npr. reagiranje s preskušano kemikalijo, izni čenje fototok ­
sičnega učinka, lovljenje radikalov in/ali stabilnost kemikalije v 
topilu. 
Za boljšo topnost se lahko uporabi vrtin čno mešanje in/ali uporaba 
ultrazvoka in/ali segrevanje na ustrezno temperaturo, razen če to 
vpliva na stabilnost preskušane kemikalije.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 589
 
1.4.1.5  Pogoji obsevanja  
1.4.1.5.1 V i r s v e t l o b e 
Izbira primernega vira svetlobe in ustreznega filtra je klju čni 
dejavnik pri preskušanju fototoksi čnosti. UVA in vidna obmo čja so 
navadno povezana s pojavom fototoksi čnih reakcij  in vivo  (3) (12), 
medtem ko je UVB na splošno manj pomemben in mo čno citotok ­
sičen, saj svojo citotoksi čnost med 313 in 280 nm poviša tiso čkrat 
(13). Merila za izbiro ustreznega vira svetlobe morajo vklju čevati 
bistveno zahtevo, da vir svetlobe oddaja valovne dolžine, ki jih preskušana kemikalija absorbira (absorpcijski spekter), ter da mora 
odmerek svetlobe (ki ga je mogo če doseči v razumnem času izposta ­
vljenosti) zadostovati za odkrivanje znanih fotocitotoksi čnih kemika ­
lij. Nadalje uporabljene valovne dolžine in odmerki ne smejo po nepotrebnem škodovati preskusnemu sistemu, npr. oddajanje toplote 
(infrardeče območje). 
Simulacija son čne svetlobe s solarnimi simulatorji velja za optimalni 
umetni vir svetlobe. Porazdelitev obsevalne mo či filtriranega solar ­
nega simulatorja mora biti podobna son čni svetlobi na odprtem, ki je 
prikazana v (14). V solarnih simulatorjih se uporabljajo tako kseno ­
nove oblo čne svetilke kakor (dopirane) živosrebrove kovinske halo ­
genidne oblo čne svetilke (15). Slednje imajo prednost, da oddajajo 
manj toplote in da so cenejše, vendar je ujemanje s son čno svetlobo 
manj popolno kot pri ksenonovih oblo čnih svetilkah. Ker vsi solarni 
simulatorji oddajajo precejšnje koli čine UVB, jih je treba ustrezno 
filtrirati, da se oslabijo mo čno citotoksi čne valovne dolžine UVB. 
Ker vsi plasti čni materiali, iz katerih so izdelane posode za gojenje 
celic, vsebujejo UV stabilizatorje, je treba spekter meriti skozi pokrov enake vrste 96-kanalne ploš če, kot se uporabi v preskusu. 
Ne glede na uporabljene ukrepe za oslabitev posameznih delov 
spektra s filtracijo ali z nenamernimi filtracij skimi u činki opreme 
spekter, zabeležen pod temi filtri, ne sme odstopati od standardizi ­
rane sončne svetlobe na odprtem (14). Primer spektralne razdelitve 
obsevanja filtriranega solarnega simulatorja, uporabljenega v valida ­
cijski študiji preskusa fototoksi čnosti 3T3 NRU
 in vitro,  je bil obja ­
vljen v (8) (16). Glej tudi sliko 1 v Dodatku 2.  
1.4.1.5.2 D o z i m e t r i j a 
Pred vsakim preskusom fototoksi čnosti je treba redno preverjati 
intenzivnost svetlobe (obsevanja), in sicer z uporabo primernega 
širokospektralnega UV-metra. Intenzivnost je treba meriti skozi 
pokrov enake vrste 96-kanalne ploš če, kot se uporabi v preskusu. 
UV-meter je treba predhodno kalibrirati za vir svetlobe. Preveriti je treba delovanje UV-metra in v ta namen se priporo ča uporaba 
drugega, referen čnega UV-metra iste vrste in iste kalibracije. Idealno 
je treba pri ve čjih intervalih uporabiti spektroradiometer, da se meri 
spektralno sevanje filtriranega vira svetlobe in preveri kalibracija širokospektralnega UV-metra. 
Ugotovljeno je bilo, da odmerek v višini 5 J/cm (izmerjen v obmo čju 
UVA) ni citotoksi čen za celice Balb/c 3T3 in da je dovolj mo čan, da 
vzbudi kemikalije, da povzro čijo fototoksi čne reakcije, (6)(17); za 5 
J/cm v časovnem obdobju 50 min, je bilo obsevanje prilagojeno na 
1,7mW/cm2. Glej sliko 2 v Dodatku 2. Če se uporabi druga celi čna 
linija ali druga čen vir svetlobe, je morda potrebna kalibracija 
odmerka obsevanja, da se izbere odmerek, ki ni škodljiv za celice 
in zadosti mo čen za zaznavanje standardnih fototoksinov. Čas izpo­
stavljenosti svetlobi se izra čuna takole:
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 590
 
tðminÞ ¼ odmerek obsevanja  ðJ=cm 2 Þ Ü 1000 
sevanje ðmW =cm 2 Þ Ü 60 t(min) = (1J = 1 Ws)  
1.4.2  Preskusni pogoji  
1.4.2.1  Koncentracije preskušane snovi  
Razpon koncentracij kemikalije, ki se preskuša v prisotnosti (+ Irr) 
in v odsotnosti (- Irr) svetlobe, je treba ustrezno dolo čiti v pred ­
hodnih poskusih za ugotavljanje razpona odmerka. Morda je uporabno dolo čiti topnost na za četku in po 60 minutah (oziroma 
uporabljenem trajanju obdelovanja), saj se lahko topnost spreminja 
s časom in med izpostavljenostjo. Da se prepre či toksičnost zaradi 
nepravilnih pogojev gojenja ali zelo kislih oziroma alkalnih kemika ­
lij, mora biti pH celi čnih kultur z dodano preskušano kemikalijo v 
mejah 6,5–7,8. 
Najvišja koncentracija preskušane snovi mora biti v fizioloških 
pogojih preskusa, npr. prepre čiti je treba osmotske in pH strese. 
Odvisno od preskušane kemikalije je morda treba razmisliti o drugih 
fizikalno-kemij skih lastnostih, ki omejujejo najvišjo koncentracijo v 
preskusu. Pri relativno netopnih snoveh, ki niso toksi čne pri koncen ­
tracijah do nasi čenja, je treba preskušati najvišjo dosegljivo koncen ­
tracijo. Na splošno je treba prepre čiti obarjanje preskušane kemika ­
lije v kateri koli preskusni koncentraciji. Maksimalna koncentracija 
preskušane snovi ne sme prese či 1 000 μg/mL; osmolarnost ne sme 
preseči 10 mmol. Uporabiti je treba geometri čna zaporedja koncen ­
tracij po osem koncentracij preskušane snovi s konstantnim 
faktorjem razred čevanja (glej oddelek 2.1, drugi odstavek). 
Če obstajajo podatki (iz poskusa za ugotavljanje razpona), da presku ­ 
šana kemikalija ni citotoksi čna do mejne koncentracije v temnem 
poskusu (- Irr), vendar je zelo citotoksi čna pri obsevanju (+ Irr), 
se bodo razponi koncentracij, namenjeni preskus (+ Irr) morda 
morali razlikovati od koncentracij za preskus (- Irr), da bo izpolnjena zahteva glede ustrezne kakovosti podatkov.
 
1.4.2.2  Kontrole  
1.4.2.2.1 O b č u t l j i v o s t c e l i c z a o b s e v a n j e , u g o t a v l j a n j e 
h i s t o r i č n i h p o d a t k o v : 
Pri celicah je treba redno (približno vsako peto pasažo) preverjati 
občutljivost za vir svetlobe z ocenjevanjem njihove viabilnosti po 
izpostavitvi pove čuj očim odmerkom obsevanja. V tej oceni je treba 
uporabiti ve č odmerkov obsevanja, vklju čno z ravnmi, ki so znatno 
večje od ravni, uporabljenih v preskusu fototoksi čnosti 3T3 NRU. Te 
odmerke je najlažje števil čno ovrednotiti z merjenjem UV-obmo čja 
vira svetlobe. Celice se zasejejo z gostoto, ki se uporablja pri 
preskusu fototoksi čnosti 3T3 NRU  in vitro  in so obsevane naslednji 
dan. Po enem dnevu se dolo či viabilnost celic na podlagi spreje ­
manja nevtralno rde čega. Nato je treba dokazati, da je bil ugotovljeni 
največji necitotoksi čni odmerek (npr. v validacijski študiji je bil 5 
J/cm [UVA]) zadosten za pravilno razvrstitev referen čnih kemikalij 
(tabela 1).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 591
 
1.4.2.2.2 O b č u t l j i v o s t z a s e v a n j e , p r e v e r j a n j e t r e n u t n e g a 
p r e s k u s a : 
Preskus izpolnjuje merila kakovosti, če je viabilnost obsevanih nega ­
tivnih kontrol/kontrol s topilom ve čja od 80 % viabilnosti neobse ­
vanih negativnih kontrol/kontrol s topilom.  
1.4.2.2.3 V i a b i l n o s t k o n t r o l s t o p i l o m : 
Absolutna opti čna gostota (OD  540 NRU  ), merjena v ekstraktu 
nevtralno rde čega iz kontrol s topilom, pokaže, ali je 1 × 10  4 celic, 
zasejanih v vsak posamezni kanal, v dveh dneh preskusa zraslo z običajno hitrostjo podvajanja. Preskus izpolnjuje merila sprejemljivo ­
sti, če je srednja vrednost OD
 540 NRU  neobdelanih kontrol > 0,4 (tj. 
približno dvajsetkratnik odzadnje absorbance topila).  
1.4.2.2.4 P o z i t i v n a k o n t r o l a : 
Skupaj z vsakim preskusom fototoksi čnosti 3T3 NRU  in vitro  se 
obenem preskuša tudi znana fototoksi čna kemikalija. Priporo ča se 
klorpromazin (CPZ). Za CPZ, ki se je preskušal s standardnim proto ­
kolom v preskusu fototoksi čnosti 3T3 NRU  in vitro,  so bila oprede ­
ljena naslednja merila sprejemljivosti: obsevani CPZ (+ Irr): IC  50 = 
0,1 do 2,0 μg/mL, neobsevani CPZ (Irr): IC  50 = 7,0 do 90,0 μg/mL. 
Faktor fotoiritacije (PIF) mora biti > 6. Spremljati je treba histori čne 
rezultate pozitivne kontrole. 
Namesto klorpromazina se lahko kot hkratna pozitivna kontrola 
uporabijo tudi druge fototoksi čne kemikalije, ki ustrezajo vrsti kemi ­
kalije, ki se vrednoti, ali njenim zna čilnostim glede topnosti.  
1.4.3  Preskusni postopek (6) (7) (8) (16) (17):  
1.4.3.1  Prvi dan:  
Odmeriti 100 μL umetnega gojiš ča v stranske kanale ene 96-kanalne 
mikrotitrske ploš če (= slepi vzorci). V preostale kanale razdeliti 100 
μL celične suspenzije z 1 × 10  5 celicami/mL (= 1 × 10  4 celic/kanal). 
Za vsako zaporedje koncentracij posamezne preskušane snovi in za 
kontrolo s topilom ter pozitivno kontrolo je treba pripraviti dve plošči. 
Celice inkubirati 24 ur (glej oddelek 1.4.1.2), dokler ne oblikujejo na 
pol strnjene enoslojne plasti. S takšnim inkubacijskim časom se 
zagotovijo okrevanje celic, pritrjevanje in eksponentna rast.
 
1.4.3.2  Drugi dan:  
Po inkubaciji odcediti umetno gojiš če s celic in jih dvakrat previdno 
sprati s 150 μL pufrske raztopine, ki se je uporabila za inkubacijo. 
Dodati 100 μL pufra, ki vsebuje ustrezno koncentracijo preskušane 
kemikalije ali topila (kontrola s topilom). Uporabiti 8 razli čnih 
koncentracij preskušane kemikalije. Celice s preskušano kemikalijo 
v temi inkubirati 60 minut (glej oddelek 1.4.1.2 in 1.4.1.4, drugi odstavek). 
Izmed obeh ploš č, ki so bile pripravljene za vsako zaporedje koncen ­
tracije preskušane snovi in kontrole, se naklju čno izbere ena za 
določevanje citotoksi čnosti (- Irr) (tj. kontrolna ploš ča) in ena za 
določevanje fotocitotoksi čnosti (+ Irr) (tj. obdelovalna ploš ča).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 592
 
Za izvedbo +Irr izpostavljanja celice pri sobni temperaturi obsevati 
50 minut prek pokrova 96-kanalne ploš če z najve čjim necitotoksi ­ 
čnim odmerkom sevanja (glej tudi Dodatek 2). Neobsevane ploš če (- 
Irr) zadržati pri sobni temperaturi 50 minut v temni škatli (= trajanje izpostavljenosti svetlobi). 
Odcediti preskusno raztopino in dvakrat previdno sprati s 150 μL 
pufrske raztopine, ki se je uporabila za inkubacijo in ki ne vsebuje 
preskušanega materiala. Zamenjati pufer z umetnim gojiš čem in 
inkubirati (glej oddelek 1.4.1.2) čez noč (18–22 ur).
 
1.4.3.3  Tretji dan:  
1.4.3.3.1 M i k r o s k o p s k o v r e d n o t e n j e 
Celice je treba preu čiti za rast, morfologijo in neokrnjenost enoslojne 
plasti pod fazno-kontrastnim mikroskopom. Zabeležiti je treba spre ­
membe celi čne morfologije in u činke na rast celic.  
1.4.3.3.2 P r e s k u s s p r e j e m a n j a n e v t r a l n o r d e č e g a 
Celice sprati s 150 μL predhodno segretega pufra. Raztopino za 
spiranje odstraniti z rahlim stresanjem. Dodati 100 μL nevtralno 
rdečega (NR) v koncentraciji 50 μg/mL (3-amino-7-dimetilamino-2- 
metilfenazin hidroklorid, številka Einecs 209-035-8; številka CAS 553-24-2; C.I. 50040) v gojiš ču brez seruma (16) in 3 ure inkubirati, 
kakor je opisano v odstavku 1.4.1.2. Po inkubaciji odstraniti gojiš če 
z NR in celice sprati s 150 μL pufra. Odliti in odstraniti odve čni 
pufer s pivnanjem ali centrifugiranjem. 
Dodati natan čno 150 μL raztopine za desorpcijo NR (sveže pripra ­
vljeno zmes 49 delov vode + 50 delov etanola + 1 del ocetne kisline). 
Deset minut nežno stresati mikrotitrsko ploš čo na stresalniku za 
mikrotitrske ploš če, dokler se NR ne ekstrahira iz celic in tvori 
homogeno raztopino. 
Optično gostoto ekstrakta NR izmeriti pri 540 nm v spektrofotome ­
tru, slepe vzorce uporabiti kot referenco. Podatke shraniti v ustreznem elektronskem datote čnem formatu za naknadno analizo.
 
2. PODATKI  
2.1 KAKOVOST IN KOLI ČINA PODATKOV 
Podatki iz preskusa naj omogo čajo smiselno analizo povezave 
koncentracija-reakcija, pridobljene v prisotnosti in v odsotnosti obse ­
vanja, in, če je možno, koncentracije preskušane kemikalije, pri 
kateri se je viabilnost celic zmanjšala za 50 % (IC50). Če se ugotovi 
citotoksičnost, je treba tako razpon koncentracij kakor razmak med 
posameznimi koncentracijami izbrati tako, da je poskusne podatke 
mogoče prikazati v obliki krivulje. 
Pri jasno pozitivnih in jasno negativnih rezultatih (glej oddelek 2.3, 
prvi odstavek) je dovolj glavni poskus, podprt z enim ali ve č pred­
hodnimi poskusi za ugotavljanje razpona.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 593
 
Dvoumne, mejne ali nejasne rezultate je treba pojasniti z dodatnim 
preskušanjem (glej tudi oddelek 2.4, drugi odstavek). V teh primerih 
je treba preu čiti spremembo pogojev preskusa. Pogoji preskusa, ki se 
lahko spremenijo, so med drugim obmo čje ali razmak koncentracij, 
trajanje predinkubacije in trajanje izpostavljenosti obsevanju. Za 
kemikalije, ki so v vodi nestabilne, je lahko ustrezen krajši čas 
izpostavljanja.  
2.2 OCENA REZULTATOV 
Za vrednotenje podatkov se lahko izra čunata faktor fotoiritacije (PIF) 
in srednji fotou činek (MPE). 
Za izračun mer fotocitotoksi čnosti (glej spodaj) je treba dolo čiti 
ustrezno neprekinjeno krivuljo koncentracija-reakcija (model), ki se 
približa naboru diskretnih vrednosti koncentracije-reakcije. Prirejanje krivulje podatkom se obi čajno opravi z metodo nelinearne regresije 
(18). Za vrednotenje vpliva variabilnosti podatkov na prirejeno 
krivuljo se priporo ča postopek bootstrap. 
Faktor fotoiritacije (PIF) se izra čuna po naslednji ena čbi:
 
PIF ¼ IC 50 ðÄIrrÞ 
IC 50 ðþIrrÞ 
Če IC  50 v prisotnosti ali odsotnosti svetlobe ni mogo če izračunati, se 
PIF za preskušani material ne da dolo čiti. Srednji fotou činek (MPE) 
temelji na primerjavi celotnih krivulj koncentracija-reakcija (19). 
Opredeljen je kot tehtano povpre čje preko reprezentativnega nabora 
vrednosti fotou činka.  
MPE ¼ Σ 
i ¼ 1 n 
w i PE c i 
Σ 
i ¼ 1 n 
w i 
Fotoučinek PEc pri kateri koli koncentraciji C je definiran kot 
zmnožek u činka reakcije REc in u činka odmerka DEc, tj. PEc = 
REc × DEc. U činek reakcije REc je razlika med reakcijama, zabe ­
leženima v odsotnosti in prisotnosti svetlobe, tj. REc = Rc (- Irr) – 
Rc (+ Irr). U činek odmerka se izra čuna po naslednji ena čbi: 
DE  c ¼ Æ Æ Æ Æ C=C ä Ä 1 
C=C ä þ 1 Æ Æ Æ Æ 
pri čemer je C* enakovredna koncentracija, tj. koncentracija, pri 
kateri je reakcija + Irr enakovredna reakciji - Irr s koncentracijo C. 
Če C* ni možno dolo čiti, ker so vrednosti reakcij krivulje +Irr 
sistematično višje ali nižje od Rc(- Irr), se u činek odmerka dolo či 
na 1. Utežni faktorji wi so dolo čeni z najvišjo vrednostjo reakcije, tj. 
wi = MAX {Ri (+ Irr), Ri (- Irr)}. Koncentracijska mreža C; se 
izbere tako, da enako število to čk pade v vsak koncentracijski inter ­
val, ki je definiran s koncentracijami, uporabljenimi v preskusu. Izračun MPE je omejen na najvišjo vrednost koncentracije, pri kateri 
vsaj ena od krivulj kaže vrednost reakcije najmanj 10 %. Če je ta 
najvišja koncentracija višja od najvišje koncentracije, uporabljene v poskusu + Irr, se preostanek krivulje + Irr dolo či na vrednost reakcije 
„0“. Kemikalija se uvrsti med fototoksi čne snovi, glede na to, ali je 
vrednost MPE ve čja od ustrezno izbrane vrednosti praga (MPEc = 
0,15) ali ne.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 594
 
Programska oprema za izra čun PIF in MPE je na voljo na (20).  
2.3 RAZLAGA REZULTATOV 
Na podlagi validacijske študije (8) preskušana snov s PIF < 2 ali 
MPE < 0,1 napoveduje: „brez fototoksi čnosti“. PIF > 2 in < 5 ali 
MPE > 0,1 in < 0,15 napoveduje: „verjetna fototoksi čnost“; in PIF > 
5 ali MPE > 0,15 napoveduje: „fototoksi čnost“. 
V vsakem laboratoriju, kjer se uvaja ta preskus, je treba pred presku ­ 
šanjem preskušanih snovi za fototoksi čno vrednotenje preskusiti refe ­
renčne materiale, navedene v tabeli 1. Vrednosti PIF ali MPE morajo 
biti blizu vrednostim iz tabele 1.  
Tabela 1  
Kemijsko ime St Einecs St CAS PIF MPE Absorpcij ska 
konica Topilo (  1 ) 
Amiodaron HCl 243-293-2 [19774-82-4] > 3,25 0,27–0,54 242 nm 
300 nm 
(plato) etanol 
Kloropromazin 
HCl 200-701-3 [69-09-0] >14,4 0,33–0,63 309 nm etanol 
Norfloksacin 274-614-4 [70458-96-7] > 71,6 0,34–0,90 316 nm acetonitril 
Antracen 204-371-1 [120-12-7] > 18,5 0,19–0,81 356 nm acetonitril 
Protoporfirin 
IX, dinatrijev 256-815-9 [50865-01-5] > 45,3 0,54–0,74 402 nm etanol 
L-Histidin [7006-35-1] brez PIF 0,05–0,10 211 nm voda 
Heksaklorofen 200-733-8 [70-30-4] 1,1–1,7 0,00–0,05 299 nm 
317 nm 
(plato) etanol 
Natrijev lavril 
sulfat 205-788-1 [151-21-3] 1,0–1,9 0,00–0,05 brez absorp ­
cije voda  
( 1 ) Topilo za merjenje absorpcije.  
2.4 RAZLAGA PODATKOV 
Če so fototoksi čni učinki opaženi le pri najvišji preskusni koncen ­
traciji (zlasti pri vodotopnih preskušanih kemikalijah), je morda potreben nadaljnji razmislek o oceni nevarnosti. Ta lahko zajema podatke o kožni absorpciji in akumulaciji kemikalije v koži in/ali 
podatke drugih preskusov, denimo pri preskusu kemikalije z 
modelom živalske ali človeške kože ali modeli kože  in vitro.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 595
 
Če pa toksi čnost ni bila ugotovljena (+ Irr in - Irr) in če je topnost v 
vodi omejila preskusne koncentracije, je združljivost preskušane 
snovi s preskusom vprašljiva, tako da je treba razmisliti o potrje ­
valnem preskusu, npr. z drugim modelom.  
3. PORO ČANJE  
POROČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preskusu mora vsebovati vsaj naslednje informacije: 
Preskusna snov: 
— identifikacijski podatki, skupna generi čna imena in IUPAC ter št. 
CAS, če so znana, 
— agregatno stanje in čistost, 
— fizikalno-kemijske lastnosti, pomembne za izvedbo študije, 
— absorpcijski spekter UV/vidna svetloba 
— stabilnost in fotostabilnost, če sta znani. 
Topilo: 
— utemeljitev izbire topila, 
— topnost preskušane kemikalije v topilu, 
— odstotek topila v obdelovalnem gojiš ču. 
Celice: 
— vrsta in izvor celic, 
— odsotnost mikoplazem, 
— število celi čnih pasaž, če je znano, 
— občutljivost celic za sevanje, dolo čena z obsevalno opremo, ki se 
uporablja pri preskusu fototoksi čnosti 3T3 NRU  in vitro.  
Preskusni pogoji (1);  inkubacijapred obdelavo in po njej:  
— vrsta in sestava umetnega gojiš ča, 
— pogoji inkubacije (koncentracija CO  2 ; temperatura; vlažnost), 
— trajanje inkubacije (predhodna obdelava, naknadna obdelava). 
Preskusni pogoji (2);  obdelava s kemikalijo:  
— utemeljitev izbire koncentracij preskušane kemikalije, upora ­
bljenih v prisotnosti in v odsotnosti obsevanja, 
— pri omejeni topnosti preskušane kemikalije in odsotnosti citotok ­
sičnosti: utemeljitev najvišje preskušane koncentracije, 
— vrsta in sestava obdelovalnega gojiš ča (pufrska raztopina soli), 
— trajanje kemi čnega obdelovanja. 
Preskusni pogoji (3);  obsevanje:  
— utemeljitev izbora uporabljenega vira svetlobe,  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 596
 
— izdelovalec in vrsta vira svetlobe ter radiometra, 
— spektralne zna čilnosti sevanja vira svetlobe, 
— značilnosti prepuš čanja in absorpcije uporabljenega(-ih) filtra(-ov), 
— značilnosti radio etra in podatki o njegovi kalibraciji, 
— oddaljenost vira svetlobe od preskusnega sistema, — UVA-obsevanje s te razdalje, izraženo v mW/cm
 2 , 
— trajanje izpostavljenosti UV/vidni svetlobi, 
— odmerek UVA (obsevanje × čas), izražen v J/cm  2 , 
— temperatura celi čnih kultur med obsevanjem in celi čnih kultur, ki 
so bile isto časno v temi. 
Preskusni pogoji (4);  Preskus viabilnosti z nevtralno rde čim: 
— sestava gojiš ča za obdelovanje z nevtralno rde čim, 
— trajanje inkubacij e nevtralno rde čega, 
— pogoji inkubacije (koncentracija CO  2 ; temperatura; vlažnost), 
— pogoji ekstrakcije nevtralno rde čega (ekstrakcijsko sredstvo, 
trajanje), 
— valovna dolžina, uporabljena za spektrofotometri čno merjenje 
optične gostote nevtralno rde čega, 
— druga valovna dolžina (referenca), če je bila uporabljena, 
— vsebina spektrofotometri čnega slepega vzorca, če je bil upora ­
bljen. 
Rezultati: 
— viabilnost celic, pridobljena pri vsaki posamezni koncentraciji 
preskušane kemikalije, izražena kot odstotek viabilnosti 
povprečne vrednosti hkratnih kontrol s topilom, 
— krivulje koncentracija-reakcija (koncentracija preskušane kemika ­
lije proti relativni viabilnosti celic), pridobljene v hkratnih 
poskusih + Irr in - Irr, 
— analiza krivulj koncentracij a-reakcij a: če je mogo če, navedba/ 
izračun IC  50 (+ Irr) in IC  50 (- Irr), 
— primerjava dveh krivulj koncentracij a-reakcij a, pridobljenih v 
prisotnosti in odsotnosti obsevanja, in sicer bodisi z izra čunom 
faktorja fotoiritacije (PIF) ali z izra čunom srednjega fotou činka 
(MPE), 
— merila za sprejemljivost preskusa; hkratna kontrola s topilom, 
— absolutna viabilnost (opti čna gostota ekstrakta nevtralno rde čega) 
obsevanih in neobsevanih celic, 
— histori čni podatki o negativnih kontrolah in kontrolah s topilom, 
srednje vrednosti in standardni odkloni, 
— merila za sprejemljivost preskusa; hkratna pozitivna kontrola,  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 597
 
— IC  50 (+ Irr) in IC  50 (- Irr) ter PIF/MPE kemikalije za pozitivno 
kontrolo, 
— histori čni podatki o kemikaliji za pozitivno kontrolo: IC  50 (+ Irr) 
and IC  50 (- Irr) ter PIF/MPE; srednje vrednosti in standardni 
odkloni. 
Razprava o rezultatih. 
Sklepi.  
4. LITERATURA  
1. Lovell W.W. (1993). A scheme for  in vitro  screening of 
substances for photoallergenic potential. Toxic. In Vitro 7: 
95–102. 
2. Santamaria, L. and Prino, G. (1972). List of the photodynamic 
substances. In „Research Progress in Organic, Biological and 
Medicinal Chemistry“ Vol. 3 part 1. North Holland Publishing 
Co. Amsterdam, p XI–XXXV. 
3. Spielmann, H., Lovell, W.W., Holzle, E., Johnson, B.E., 
Maurer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O., and 
Sladowski, D. (1994).  In vitro  phototoxicity testing: The report 
and recommendations of ECVAM Workshop 2. ATLA, 22. 314–348. 
4. Spikes, J.D. (1989). Photosensitization. In „The science of 
Photobiology“ Edited by K.C. Smith. Plenum Press, New 
York. 2nd edition, p 79–110. 
5. OECD (1997) Environmental Health and Safety Publications, 
Series on Testing and Assessment No.7 „Guidance Document 
On Direct Phototransformation Of Chemicals In Water“ Envi ­
ronment Directorate, OECD, Paris. 
6. Spielmann, H., Balls, M., Doring, B., Holzhiitter, H.G., 
Kalweit, S., Klecak, G., L'Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, 
W.W., Maurer, T., Moldenhauer. F. Moore. L., Pape, W., Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W., and Willshaw, A. (1994). EEC/COLIPA project on  in vitro  photo­
toxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell 
phototoxicity assay. Toxic. In Vitro 8, 793–796. 
7. Anon (1998). Statement on the scientific validity of the 3T3 
NRU PT test (an  in vitro  test for phototoxicity), European 
Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA, 26, 7–8. 
8. Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., Pechovitch, 
G De Silva, O., Holzhutter, H.G., Clothier, R., Desolle, P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Pfannen ­
becker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, 
W., and Brantom, P. (1998). The international EU/COLIPA  In 
vitro  phototoxicity validation study: results of phase II (blind 
trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test. Toxic. In Vitro 
12, 305–327. 
9. OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In 
Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test Guideline Proposal, Berlin, 
30th – 31th October 2001, Secretariat's Final Summary Report, 
15
 th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request 
from the Secretariat. 
10. Borenfreund, E., and Puerner, J.A. (1985). Toxicity determina ­
tion in vitro  by morphological alterations and neutral red 
absorption. Toxicology Lett., 24, 119–124. 
11. Hay, R.J. (1988) The seed stock concept and quality control for 
cell lines. Analytical Biochemistry 171, 225–237.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 598
 
12. Lambert L.A, Warner W.G., and Kornhauser A. (1996) Animal 
models for phototoxicity testing. In „Dermatotoxicology“, 
edited by F.N. Marzulli and H.I. Maibach. Taylor & Francis, Washington DC. 5th Edition, p 515–530. 
13. Tyrrell R.M., Pidoux M (1987) Action spectra for human skin 
cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultra ­
violet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on 
epidermal keratinocytes. Cancer Res., 47, 1825–1829. 
14. ISO 10977. (1993). Photography – Processed photographic 
colour films and paper prints – Methods for measuring image stability. 
15. Sunscreen Testing (UV.B) TECHNICALREPORT, CIE, Inter ­
national Commission on Illumnation, Publication No. 90, Vienna, 1993, ISBN 3 900 734 275 
16. ZEBET/ECVAM/COLIPA – Standard Operating Procedure:  In 
Vitro  3T3 NRU Phototoxicity Test. Final Version, 7 September, 
1998. 18 pgs. 
17. Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., De Silva, 
O., Holzhutter, H.G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., and Pfannenbecker, U. (1998) A study on UV filter chemicals 
from Annex VII of the European Union  Directive 76/768/EEC,  
in the  in vitro  3T3 NRU phototoxicity test. ATLA 26, 679-708. 
18. Holzhutter, H.G., and Quedenau, J. (1995) Mathematical mode ­
ling of cellular responses to external signals. J. Biol. Systems 3, 127–138. 
19. Holzhiitter, H.G. (1997). A general measure of in  vitro  photo­
toxicity derived from pairs of dose-response curves and its use 
for predicting the in  vivo  phototoxicity of chemicals. ATLA, 25, 
445–462. 
20. http://www.oecd.org/document/55/0,2340,en_2649_34377_ 
2349687_l_l_l_l,00. html
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 599
 
Dodatek 1  
Vloga 3T3 NRU PT v postopnem pristopu k preskušanju fototoksi čnosti kemikalij
  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 600
 
Dodatek 2  
Slika 1  
Spektralna porazdelitev mo či pri filtriranem solarnem simulatorju
  
(glej oddelek 1.4.1.5, drugi odstavek) 
V sliki 1 je prikazan primer sprejemljive spektralna porazdelitev obsevanja pri filtriranem solarnem 
simulatorju. Uporabljena je bila dopirana kovinska halogenidna svetilka, kakor v preskusu 3T3 NRU PT (6) (8) (17). Prikazan je u činek dveh razli čnih filtrov in u činka dodatnega filtriranja 
pokrova 96-kanalne ploš če za celične kulture. Filter H2 se je uporabil le v preskusnih sistemih, 
ki lahko prenašajo ve čje količine UVB (preskus z modelom kože in preskus fotohemolize eritro ­
citov). Pri 3T3 NRU-PT je bil uporabljen filter H1. V sliki je prikazano, da se u činek dodatnega 
filtriranja pokrova ploš če pojavlja predvsem v obmo čju UVB, pri čemer v obsevalnem spektru 
ostaja dovolj UVB zavzbujanje kemikalij, ki se obi čajno absorbirajo v obmo čje UVB, npr. amio ­
daron (glej tabelo 1).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 601
 
Slika 2  
Občutljivost celic Balb/c 3T3 za sevanje (izmerjeno v obmo čju UVA)  
Viabilnost celic ( % sprejemanja nevtralno rde čega pri kontrolah v temi)
  
(glej oddelek 1.4.1.5.2, drugi odstavek; 1.4.2.2.1, 1.4.2.2.2) 
Občutljivost celic Balb/c 3T3 za obsevanje z uporabljenim solarnim simulatorjem v validacijskem 
preskušanju preskusa fototoksi čnosti 3T3 NRU, izmerjena v obmo čju UVA. V sliki so prikazani 
rezultati sedmih razli čnih laboratorijev v predvalidacijski študiji (1). Krivulji z odprtimi to čkami 
izvirajo iz starejših celic (ve čje število pasaž), ki so jih morale zamenjati nove zaloge celic, katerih 
rezultati so prikazane s krivuljami s krepkimi to čkami, ki predstavljajo sprejemljivo toleranco na 
obsevanje. 
Iz teh podatkov je pridobljen najve čji necitotoksi čni odmerek obsevanja 5 J/cm  2 (navpična črtkana 
črta). Vodoravna črtkana črta prikazuje najve čji sprejemljiv u činek obsevanja, ki je opisan 
v odstavku 1.4.2.2.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 602
 
B.42.  PREOB ČUTLJIVOST KOŽE: LOKALNA ANALIZA BEZGAVK  
UVOD 
1. Smernice OECD za preskušanje kemikalij in preskusne metode EU, ki 
temeljijo na teh smernicah, se redno preverjajo zaradi znanstvenega 
napredka, spreminjajo čih se zakonodajnih potreb in vprašanj, povezanih 
z dobrim po čutjem živali. Prvotna preskusna metoda za dolo čanje 
preobčutljivosti kože pri miših, lokalna analiza bezgavk (LLNA; Smernica 
za preskušanje OECD 429; poglavje B.42 te priloge) je bila sprejeta že 
prej (1). Objavljene so podrobnosti o validaciji LLNA in pregled s tem 
povezanega dela (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). Posodobljena LLNA temelji na oceni izkušenj in znanstvenih podatkih (12). To je druga preskusna metoda, zasnovana za ocenjevanje morebitne preob čutljivosti 
kože s kemikalijami (snovmi in zmesmi) pri živalih. Druga preskusna 
metoda (tj. Smernica za preskušanje OECD 406; poglavje B.6 te priloge) pa uporablja preskuse na morskih praši čkih, predvsem maksimizacijski in 
Buehlerjev preskus na morskih praši čkih (13). LLNA zagotavlja prednosti 
v primerjavi z metodo B.6 in Smernico za preskušanje OECD 406 (13) glede dobrega po čutja živali. Ta posodobljena preskusna metoda za LLNA 
vključuje skupino standardov u činkovitosti (Dodatek 1), ki se lahko upora ­
bijo za oceno statusa validacije novih in/ali spremenjenih preskusnih 
metod, ki so v fukcijskem in mehani čnem smislu podobne LLNA, v 
skladu z na čeli smernic OECD št. 34 (14). 
2. LLNA preu čuje indukcijsko fazo preob čutljivosti kože in zagotavlja koli ­ 
činske podatke, ki so primerni za oceno odziva na odmerek. Treba je 
opozoriti, da so blagi/zmerni povzro čitelji preob čutljivosti, ki se priporo ­ 
čajo kot ustrezne kemikalije pozitivne kontrole za preskusne metode z 
morskimi praši čki (tj. B.6; Smernica za preskušanje OECD 406), (13) 
primerni tudi za uporabo pri LLNA (6) (8) (15). Pristop omejene LLNA 
(rLLNA), pri katerem bi se lahko uporabilo do 40 % manj živali, je prav tako opisan kot možnost v tej preskusni metodi (16) (17) (18). rLLNA se lahko uporabi, kadar obstaja zakonodajna potreba po potrditvi negativne 
napovedi o morebitni preob čutljivosti kože, če so izpolnjene vse druge 
specifikacije protokola LLNA, kot je opisano v tej preskusni metodi. Napoved negativnega rezultata bi morala temeljiti na vseh razpoložljivih informacijah, kot je opisano v odstavku 4. Pred uporabo rLLNA je treba 
zagotoviti jasne obrazložitve in znanstvene utemeljitve za njeno uporabo. 
Če je z rLLNA proti pri čakovanjem pridobljen pozitiven ali dvoumen 
rezultat, je morda potrebno dodatno preskušanje za razlago ali pojasnitev izidov. rLLNA se ne sme uporabljati za ugotavljanje nevarnosti preskusnih 
snovi, ki povzro čajo preob čutljivost kože, kadar so potrebne informacije o 
odzivu na odmerek, kot npr. podrazvrsititev za Uredbo (ES) št. 1272/2008 Evropskega parlamenta in Sveta o razvrš čanju, ozna čevanju in pakiranju 
snovi ter zmesi in Globalno usklajen sistem za razvrš čanje in ozna čevanje 
kemikalij Združenih narodov.
 
OPREDELITVE POJMOV 
3. Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 2.  
IZHODIŠ ČA IN OMEJITVE 
4. LLNA je nadomestna metoda za ugotavljanje morebitne preob čutljivosti 
kože s kemikalijami. To ne pomeni nujno, da je treba v vseh primerih 
namesto preskusov na morskih praši čkih uporabiti LLNA (tj. B.6; Smer ­
nica za preskušanje OECD 406) (13), temve č da je ta analiza enako dobra 
in se lahko uporabi kot druga možnost, pri kateri navadno niso ve č 
potrebne dodatne potrditve pozitivnih in negativnih rezultatov. Preskuše ­
valni laboratorij mora pred za četkom študije preu čiti vse razpoložljive  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 603
 
informacije o preskusni snovi. Takšne informacije bodo vklju čevale vrsto 
in kemijsko sestavo preskusne snovi; njene fizikalno-kemijske lastnosti; 
rezultate katerih koli drugih preskusov toksi čnosti na preskusni snovi,  in 
vitro  ali in vivo ; in toksikološke podatke o strukturno sorodnih kemikali ­
jah. Te informacije je treba preu čiti, da se dolo či, ali je LLNA primerna za 
snov (glede na nezdružljivost omejenega števila vrst kemikalij pri LLNA – 
glej odstavek 5), in za lažjo izbiro odmerka. 
5. LLNA je metoda  in vivo  in posledi čno ne odpravlja uporabe živali pri 
ocenjevanju delovanja, ki povzro čajo alergijsko preob čutljivost ob stiku. 
Vendar ima možnost, da zmanjša število živali, potrebnih v ta namen. Še več, LLNA ponuja znatno izboljšanje (manj bole čine in trpljenja) na čina, 
kako se živali uporabljajo za preskušanje alergijske preob čutljivosti ob 
stiku. LLNA temelji na upoštevanju imunoloških primerov, ki jih spodbu ­
dijo kemikalije med indukcijsko fazo preob čutljivosti. V nasprotju s 
preskusi na morskih praši čkih (tj. B.6; Smernica za preskušanje OECD 
(406) (13) LLNA ne zahteva, da se povzro čijo izzvane reakcije preko ­
merne ob čutljivosti kože. Poleg tega LLNA ne zahteva uporabe pomož ­
nega preskusa (13) kot pri maksimizacijskem preskusu na morskih 
prašičkih S tem LLNA zmanjšuje bole čino in trpljenje živali. Kljub pred ­
nostim LLNA v primerjavi z metodo B.6 in Smernico za preskušanje OECD 406 je treba upoštevati, da obstajajo nekatere omejitve, zaradi katerih je lahko nujna uporaba metode B.6 ali Smernice za preskušanje 
OECD 406 (13) ( npr. lažni negativni izidi pri LLNA pri nekaterih kovi ­
nah, lažni pozitivni izidi pri nekaterih dražilnih snoveh za kožo [kot so nekatere vrste površinsko razgradljivih kemikalij] (19) (20), ali topnost preskusne snovi). Poleg tega je zaradi kemijskih razredov ali snovi s 
funkcionalnimi skupinami, za katere se je izkazalo, da lahko delujejo 
kot moteči dejavniki (21) lahko potrebna uporaba preskusov na morskih 
prašičkih (tj . B.6; Smernica za preskušanje OECD 406) (13). Na podlagi 
omejene podatkovne zbirke za validacijo, ki je obsegala zlasti pesticidne 
pripravke, je bolj verjetno, da bo za te vrste snovi pozitiven rezultat 
prinesla LLNA kot pa preskus na morskih praši čkih (22). Vendar pa bi 
se lahko pri preskušanju pripravkov preu čila tudi možnost vklju čitve 
podobnih snovi z znanimi rezultati kot primerjalnih snovi, s čimer bi se 
dokazalo, da LLNA deluje pravilno (glej odstavek 16). Razen takšnih 
opredeljenih omejitev bi morala biti LLNA primerna za preskušanje katere koli snovi, razen če so s temi snovmi povezane lastnosti, ki lahko ovirajo 
natančnost LLNA.
 
NAČELO PRESKUSA 
6. Osnovno na čelo, na katerem temelji LLNA, je, da povzro čitelji preob čut­
ljivosti povzro čijo množenje limfocitov v bezgavkah, ki drenirajo obmo čje 
nanosa preskusne snovi. To množenje je sorazmerno z odmerkom in močjo uporabljenega alergena in je preprosto sredstvo za pridobitev koli ­ 
činske izmere preob čutljivosti. Množenje se izmeri s primerjavo povpre ­ 
čnega množenja v vsaki preskusni skupini in povpre čnega množenja v 
kontrolni skupini, tretirani z nosilcem. Preden se utemelji razvrstitev preskusne snovi kot možnega povzro čitelja preob čutljivosti kože, se dolo či 
razmerje med povpre čnim množenjem v vsaki tretirani skupini in povpre ­ 
čnim množenjem v primerjalni kontrolni skupini z nosilcem, ki se imenuje 
stimulacijski indeks (SI) in mora biti ≥ 3. Tukaj opisani postopki temeljijo 
na uporabi  in vivo  radioaktivnih oznak za merjenje pove čanega števila 
množečih se celic v ušesnih bezgavkah. Za oceno števila množe čih se 
celic se lahko uporabijo tudi druge kon čne točke, če so zahteve standardov 
učinkovitosti v celoti izpolnjene (Dodatek 1).
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 604
 
OPIS ANALIZE  
Izbira živalskih vrst  
7. Izbrana vrsta za ta preskus je miš. Uporabijo se mlade odrasle mišje 
samice seva CBA/Ca ali CBA/J, ki še niso kotile in niso breje. Na za četku 
študije morajo biti živali stare 8–12 tednov, odstopanje mase živali pa mora biti čim manjše in ne sme presegati 20 % povpre čne mase. Namesto 
tega se lahko uporabijo drugi sevi in samci, če je pridobljenih dovolj 
podatkov za dokaz, da ne obstajajo zna čilne razlike v odzivu pri LLNA 
glede na sev in/ali spol.
 
Bivalni in prehranjevalni pogoji  
8. Miši morajo biti skupinsko nastanjene (23), razen če je zagotovljena 
ustrezna znanstvena utemeljitev za njihovo lo čeno nastanitev. Temperatura 
v prostoru za poskusne živali mora biti 22 ± 3 °C. Čeprav mora biti 
relativna vlažnost najmanj 30 % in po možnosti ne sme, razen med čišče­
njem prostora, presegati 70 %, mora biti ciljna vlažnost, 50–60 %. Osvet ­
litev mora biti umetna, in sicer 12 ur svetlobe, 12 ur teme. Za hranjenje se 
lahko uporablja obi čajna laboratorijska prehrana z neomejeno oskrbo s 
pitno vodo.  
Priprava živali  
9. Živali se naklju čno izberejo, ozna čijo tako, da je omogo čeno posami čno 
prepoznavanje (vendar ne s katero od oblik ušesnih oznak), in zadržijo v kletkah najmanj pet dni pred za četkom dajanja odmerka, da se lahko 
prilagodijo laboratorijskim razmeram. Pred za četkom tretiranja se vse 
živali pregledajo, da se zagotovi, da nimajo opaznih kožnih lezij.
 
Priprava preskusnih raztopin  
10. Trdne kemikalije se pred nanosom na uho miši raztopijo ali suspendirajo v 
ustreznih topilih ali nosilcih in po potrebi razred čijo. Tekoče kemikalije se 
lahko nanesejo nerazred čene ali pa se razred čijo pred dajanjem odmerka 
Pri netopnih kemikalijah, kot so tiste, ki se obi čajno uporabljajo v medi ­
cinskih pripomo čkih, je treba uporabiti mo čno povečano ekstrakcijo v 
ustreznem topilu, da se odkrijejo vse ekstraktibilne sestavine za presku ­ 
šanje pred nanosom na uho miši. Preskusne snovi je treba pripravljati 
dnevno, razen če podatki o stabilnosti kažejo, da je shranjevanje sprejem ­
ljivo.  
Preverjanje zanesljivosti  
11. Za prikaz ustrezne u činkovitosti analize se uporabijo kemikalije pozitivne 
kontrole, ki se odzovejo z ustrezno in ponovljivo ob čutljivostjo kot 
preskusna snov, ki povzro ča preobčutljivost, za katero je stopnja reakcije 
natančno opredeljena. Uporaba primerjalne pozitivne kontrole je priporo ­ 
čena, saj pokaže zmožnost laboratorija, da uspešno izvede vsako analizo, 
ter omogo ča ocenjevanje ponovljivosti in primerljivosti v enem ali ve č 
laboratorijih. Tudi nekateri regulativni organi zahtevajo uporabo pozitivne kontrole pri vsaki raziskavi, zato se uporabnikom priporo ča, da se pred 
izvedbo LLNA posvetujejo s pristojnimi organi. V skladu s tem se pripo ­
roča redna uporaba primerjalne pozitivne kontrole, saj tako ni potrebno 
dodatno preskušanje na živalih za izpolnitev zahtev, ki se lahko pojavijo zaradi uporabe redne pozitivne kontrole (glej odstavek 12). Pozitivna kontrola mora povzro čiti pozitiven odziv LLNA na raven izpostavljenosti, 
za katero se pri čakuje, da bo dala ve čji stimulacijski indeks (SI) > 3 kot 
negativna kontrolna skupina. Odmerek pozitivne kontrole je treba izbrati
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 605
 
tako, da ne povzro či čezmernega draženja kože ali sistemske toksi čnosti in 
da je indukcija ponovljiva, vendar ne čezmerna (tj. SI > 20 bi bil čezme­
ren) Priporo čena pozitivna kontrola je 25-odstotni heksil cimetov aldehid 
(Služba za izmenjavo kemijskih izvle čkov [CAS] št. 101-86-0) v acetonu: 
olivno olje (4:1, v/v) in 5-odstotni merkaptobenzotiazol (št. CAS 149-30-4) v  
N,N-dimetilformamidu (glej Dodatek 1, preglednica 1). V nekaterih 
okoliščinah se lahko ob ustrezni utemeljitvi uporabijo druge pozitivne 
kontrole, ki izpolnjujejo zgornja merila. 
12. Obi čajno je uporaba primerjalne pozitivne kontrolne skupine priporo čena, 
lahko pa obstajajo okoliš čine, v katerih redno preskušanje (tj. v razmikih ≤ 
6 mesecev) pozitivne kontrole morda zadoš ča za laboratorije, ki redno 
izvajajo LLNA (tj. izvajajo LLNA vsaj enkrat mese čno) in imajo vzpo ­
stavljene zbirke podatkov o preteklih pozitivnih kontrolah, ki dokazujejo 
zmožnost laboratorija, da pridobi ponovljive in natan čne rezultate s pozi ­
tivnimi kontrolami. Ustrezna strokovnost pri izvajanju LLNA se lahko uspešno dokaže z dobivanjem doslednih pozitivnih rezultatov pri pozitivni kontroli pri vsaj desetih neodvisnih preskusih, izvedenih v razumnem 
časovnem obdobju (tj. v manj kot enem letu). 
13. Primerjalno pozitivno kontrolno skupino je treba vklju čiti vedno, kadar 
pride do postopkovne spremembe pri LLNA (tj. zamenjava usposobljenega 
osebja, zamenjava materiala za preskusno metodo in/ali reagentov, zame ­
njava opreme za preskusno metodo, zamenjava vira preskusnih živali), takšne spremembe pa je treba vedno zabeležiti v laboratorijskih poro čilih. 
Pri odločanju o nujnosti vzpostavitve nove zbirke preteklih podatkov za 
beleženje doslednosti pri rezultatih pozitivne kontrole je treba upoštevati 
učinek, ki ga imajo te spremembe na ustreznost predhodno vzpostavljene 
zbirke preteklih podatkov. 
14. Raziskovalci se morajo zavedati, da odlo čitev o izvajanju redne namesto 
primerjalne pozitivne kontrolne študije vpliva na ustreznost in sprejemlji ­
vost negativnih rezultatov študije, pridobljenih brez primerjalne pozitivne kontrole v razmiku med rednimi pozitivnimi kontrolnimi študijami. Na 
primer, če je rezultat, pridobljen z redno pozitivno kontrolno študijo, 
lažno negativen, so lahko vprašljivi negativni rezultati preskusne snovi, pridobljeni v času med zadnjo sprejemljivo redno pozitivno kontrolno 
študijo in nesprejemljivo redno pozitivno kontrolno študijo. Pri odlo čanju, 
ali vključiti primerjalne pozitivne kontrole ali izvajati samo redne pozi ­
tivne kontrole, je treba skrbno preu čiti posledice teh rezultatov. Treba je 
razmisliti tudi o uporabi manjšega števila živali v primerjalni pozitivni kontrolni skupini, če je to znanstveno utemeljeno in če laboratorij na 
podlagi preteklih podatkov, zna čilnih za laboratorij, dokaže, da se lahko 
uporabi manjše število miši (12). 
15. Čeprav je treba pozitivno kontrolo preskusiti v nosilcu, za katerega je 
znano, da povzro ča dosleden odziv (npr. aceton: olivno olje; 4:1, v/v), 
lahko obstajajo nekatere zakonodajne okoliš čine, ko je potrebno tudi 
preskušanje v nestandardnem nosilcu (klini čno/kemično ustrezne sestave) 
(24). Če se primerjalna pozitivna kontrola preskuša v drugem nosilcu kot 
preskusna snov, je treba za primerjalno pozitivno kontrolo vklju čiti ločen 
kontrolni nosilec. 
16. V primerih, kjer se ocenjujejo preskusne snovi za poseben kemijski razred 
ali razpon reakcij, so lahko primerjalne snovi uporabne tudi za dokaz, da 
preskusna metoda deluje pravilno za odkrivanje morebitne preob čutljivosti 
kože pri teh vrstah preskusnih snovi. Ustrezne primerjalne snovi morajo imeti naslednje lastnosti: 
— strukturno in funkcijsko podobnost z razredom preskusne snovi, ki se 
preskuša, 
— znane fizikalne/kemijske lastnosti, 
— podporne podatke iz LLNA, 
— podporne podatke od drugih živalskih modelov in/ali ljudi.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 606
 
PRESKUSNI POSTOPEK  
Število živali in velikost odmerkov  
17. Na skupino odmerka se uporabijo najmanj štiri živali z najmanj tremi 
koncentracijami preskusne snovi, poleg tega pa še primerjalna negativna 
kontrolna skupina, tretirana zgolj z nosilcem za preskusno snov, in pozi ­
tivna kontrola (primerjalna ali izvedena pred kratkim, odvisno od politike 
laboratorija pri upoštevanju odstavkov 11–15). Treba je razmisliti o 
preskušanju ve č odmerkov pozitivne kontrole, zlasti če se pozitivna 
kontrola preskuša ob časno. Živali v kontrolnih skupinah je treba, razen 
če se ne tretirajo s preskusno snovjo, obravnavati in tretirati na enak na čin 
kot živali v tretiranih skupinah. 
18. Izbira odmerka in nosilca mora temeljiti na priporo čilih iz sklica (3) in (5). 
Zaporedni odmerki se obi čajno izberejo iz ustrezne serije koncentracij, kot 
so 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % itd. Izbira upora ­
bljene serije koncentracij mora biti ustrezno znanstveno utemeljena. Kadar 
so na voljo, je treba pri izbiri treh zaporednih koncentracij upoštevati vse 
obstoječe toksikološke informacije (npr. akutno toksi čnost in draženje 
kože) ter strukturne in fizikalno-kemijske informacije o želeni preskusni snovi (in/ali strukturno povezani snovi), tako da je pri najve čji koncen ­
traciji izpostavljenost najve čja, hkrati pa ni sistemske toksi čnosti in/ali 
čezmernega draženja kože (3) (25). Če takšne informacije niso na voljo, 
je morda najprej potreben predhodni presejalni preskus (glej odstavke 21–24). 
19. Nosilec ne sme ovirati rezultatov preskusa ali vplivati nanje, izbere pa se 
na podlagi pove čevanja topnosti, da se med pripravljanjem raztopine/su ­
spenzije, ki je primerna za uporabo preskusne snov, pridobi najve čjo 
možno koncentracijo. Priporo čljivi nosilci so aceton: olivno olje (4:1, 
v/v), N,N -dimetilformamid, metil etil keton, propilen glikol in dimetil 
sulfoksid (19), vendar se lahko uporabljajo tudi drugi, če je zagotovljena 
ustrezna znanstvena utemeljitev. V nekaterih okoliš činah je morda treba 
kot dodatno kontrolo uporabiti klini čno ustrezno topilo ali trgovsko 
sestavo, v kateri se trži preskusna snov. Paziti je treba zlasti, da so v 
nosilni sistem vklju čene hidrofilne preskusne snovi, ki vlažijo kožo in se 
ne izsušijo takoj, z vklju čitvijo ustreznih pospeševalcev raztapljanja (npr. 
1-odstotnim Pluronic® L92). Zato se je treba izogibati povsem vodnim nosilcem. 
20. Obdelava bezgavk posamezne miši omogo ča oceno spremenljivosti med 
posameznimi živalmi ter statisti čno primerjavo razlik med meritvami 
preskusne snovi in primerjalne kontrolne skupine z nosilcem (glej odstavek 35). Poleg tega je ocena možnosti zmanjšanja števila miši v pozitivni kontrolni skupini izvedljiva samo, če se zbirajo podatki o posa ­
meznih živalih (12) spodaj. Poleg tega nekateri regulativni organi zahte ­
vajo zbiranje podatkov o posameznih živalih. Kljub temu lahko nekateri regulativni organi skupne podatke o živalih štejejo za sprejemljive; v takih 
primerih imajo lahko uporabniki možnost, da zbirajo podatke o posa ­
meznih živalih ali skupne podatke.
 
Predhodni presejalni preskus  
21. Če informacije za dolo čitev najve čjega odmerka za preskušanje niso na 
voljo (glej odstavek 18 zgoraj), je treba izvesti predhodni presejalni preskus, da se dolo či ustrezna velikost odmerka za preskušanje z LLNA. 
Namen predhodnega presejalnega preskusa je zagotoviti smernice za izbiro 
največje velikosti odmerka za uporabo v glavni študiji LLNA v primerih, 
ko niso na voljo informacije o koncentraciji, ki povzro či sistemsko toksi ­ 
čnost (glej odstavek 24) in/ali čezmerno draženje kože (glej odstavek 23). 
Največja velikost odmerka je 100-odstotna preskusna snov za teko čine ali 
najvišja možna koncentracija za trdne snovi ali suspenzije.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 607
 
22. Predhodni presejalni preskus se izvede v pogojih, ki so enaki tistim v 
glavni študiji LLNA, s to razliko, da se ne izvede ocena množenja v 
bezgavkah in da se lahko uporabi manj živali na skupino odmerka. Pred ­
laga se uporaba ene ali dveh živali na skupino odmerka. Vse miši se opazuje dnevno glede klini čnih znakov sistemske toksi čnosti ali lokalnega 
draženja na mestu nanosa. Telesna masa se zabeleži pred preskusom in 
pred usmrtitvijo (6. dan). Obe ušesi vsake miši se opazuje glede rde čine in 
oceni s pomo čjo preglednice 1 (25). Meritve debeline ušesa se izvedejo z 
napravo za merjenje debeline (npr. digitalnim mikrometrom ali merilnikom 
debeline s števil čnico) 1. dan (pred odmerkom), 3. dan (približno 48 ur 
pred prvim odmerkom) in 6. dan. Poleg tega se lahko 6. dan debelino ušesa dolo či s preluknjanjem ušes za dolo čitev mase, ki se izvede po 
humani usmrtitvi živali. Znak za čezmerno draženje kože je rde čina z 
oceno ≥ 3 in/ali pove čana debelina ušesa za ≥ 25 % na kateri koli dan 
merjenja (26) (27). Najve čji odmerek, izbran za glavno študijo LLNA, je 
naslednji nižji odmerek v seriji koncentracij iz predhodnega presejalnega preskusa (glej odstavek 18), ki ne povzro či sistemske toksi čnosti in/ali 
čezmernega draženja kože.
 
Preglednica 1  
Ocena rde čine 
Ugotovitev Ocena  
Rdečine ni 0 
Neznatna rde čina (komajda opazna) 1 
Zelo razlo čna rdečina 2 
Zmerna do mo čna rdečina 3 
Močna rdečina (rdečina rdeče pese) in nastanek krast ovirata 
razvrstitev rde čine 4 
23. Poleg 25-odstotnega pove čanja debeline ušesa (26) (27) se za opredelitev 
dražilnih snovi pri LLNA uporablja tudi statisti čno značilno pove čanje 
debeline ušesa tretirane miši v primerjavi s kontrolno mišjo (28) (29) 
(30) (31) (32) (33) (34). Ker pa se lahko statisti čno značilno pove čanje 
pojavi tudi pri debelini ušesa, manjši od 25 %, ni izrecno povezano s čezmernim draženjem (30) (32) (33) (34). 
24. Naslednje klini čne ugotovitve lahko nakazujejo sistemsko toksi čnost (35) 
(36), kadar se uporabljajo kot del celovite ocene, in zato lahko pokažejo največjo velikost odmerka za uporabo v glavni LLNA: spremembe v 
delovanju živ čnega sistema (npr. piloerekcija, ataksija, tremorji in kr či); 
vedenjske spremembe (npr. agresivnost, spremembe glede nege, opazna sprememba stopnje aktivnosti); spremembe dihanja (npr. spremembe frekvence in intenzivnosti dihanja, kot so dispneja, zasoplost in hropenje) 
ter spremembe glede uživanja hrane in vode. Poleg tega je treba pri oceni 
upoštevati znake letargije in/ali neodzivnosti ter morebitne klini čne znake 
bolečine in trpljenja, ki niso samo blagi ali trenutni, ali zmanjšanje telesne 
mase za > 5 % od 1. do 6. dne ter smrtnost. Umirajo če živali ali živali, ki 
očitno trpijo ali kažejo znake hudega in dolgotrajnega trpljenja, se usmrtijo 
na human na čin (37).
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 608
 
Načrt za poskus glavne študije  
25. Na črt za poskus analize je naslednji: 
— 1. dan: Posami čno ugotovljena in zabeležena masa vsake živali in 
morebitne klini čne ugotovitve. Nanos 25 μl ustrezno razred čene 
preskusne snovi, samega nosilca ali pozitivne kontrole (primerjalne ali izvedene pred kratkim, odvisno od politike laboratorija pri upošte ­
vanju odstavkov 11–15). 
— 2. in 3. dan: Ponovi se postopek nanosa, ki je bil izveden 1. dan. 
— 4. in 5. dan: Brez tretiranja. — 6. dan: Zabeleži se masa vsake živali. Vsem poskusnim in kontrolnim 
mišim se v repno žilo vbrizga 250 μl sterilnega fosfatnega pufra s 
soljo (PBS), ki vsebuje 20 μCi (7,4 × 10
 5 Bq) tritiranega (  3 H)-metil 
timidina. Lahko pa se vsem mišim v repno veno vbrizga 250 μL PBS, 
ki vsebuje 2 μCi (7,4 × 10  4 Bq)  125 I-jododeoksiuridina in 10  –5 M 
fluorodeoksiuridina. Pet (5) ur kasneje so živali humano usmr čene. 
Ušesne bezgavke ob vsakem ušesu miši se izrežejo in shranijo v 
PBS za vsako žival (pristop po posamezni živali); lahko pa se 
bezgavke iz vsakega ušesa izrežejo in shranijo v PBS za vsako treti ­
rano skupino (zbirni pristop za tretirane skupine). Podatki in diagrami o identifikaciji in izrezu bezgavk so na voljo v sklicu (12). Za 
nadaljnje spremljanje lokalnega odziva kože v glavni študiji se lahko 
v protokol študije vklju čijo dodatni parametri, kot so ocena rde čine 
ušesa ali meritve debeline ušesa (pridobljene z merilnikom debeline ali preluknjanjem ušes za dolo čitev mase pri obdukciji).
 
Priprava celi čnih suspenzij  
26. Enotna celi čna suspenzija iz celic izrezanih bezgavk, bodisi bilateralno iz 
posameznih živali bodisi zbirno iz tretiranih skupin, se pripravi z blago mehanično disagregacijo skozi ži čno mrežo iz nerjavnega jekla z velikostjo 
odprtin 200 mikronov ali drugo uveljavljeno tehniko za pripravo enotne 
celične suspenzije. Celice iz bezgavk se dvakrat izperejo s presežkom 
fosfatnega pufra s soljo in DNA se 18 ur obarja s 5-odstotno triklorocetno kislino pri 4 °C (3). Peleti se ponovno suspendirajo v 1 ml triklorocetne kisline in prenesejo v scintilacijske stekleni čke, ki vsebujejo 10 ml scin ­
tilacijske teko čine, za štetje 3H, ali pa prenesejo neposredno v epruvete za 
gama štetje za 1
 25 I. 
Določitev množenja celic (vklju čena radioaktivnost)  
27. Vklju čitev 3H-metil timidina se izmeri z β-scintilacijskim štetjem razgra ­
denj na minuto (DPM). Vklju čitev 1  25 I-jododeoksiuridina se izmeri s 
štetjem 1  25 I in se prav tako izrazi kot DPM. Odvisno od uporabljenega 
pristopa se vklju čitev izrazi kot DPM/miš (posami čni pristop) ali DPM/ 
tretirano skupino (zbirni pristop za tretirane skupine).  
Omejena LLNA  
28. V dolo čenih primerih, ko obstaja zakonodajna potreba po potrditvi nega ­
tivne napovedi preob čutljivosti kože, se lahko uporabi neobvezni protokol 
rLLNA (16) (17) (18) z manjšim številom živali, če so izpolnjene vse 
druge specifikacije protokola rLLNA v tej preskusni metodi. Pred uporabo rLLNA je treba zagotoviti jasne obrazložitve in znanstvene utemeljitve za 
njeno uporabo. Če je pridobljen pozitiven ali dvoumen rezultat, je morda 
potrebno dodatno preskušanje za razlago ali pojasnitev izida.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 609
 
29. Edina razlika med protokoli preskusne metode LLNA in rLLNA je manjše 
število skupin odmerka, zaradi česar rLLNA ne zagotavlja informacij o 
odzivu na odmerek. Zato se, kadar so potrebne informacije o odzivu na odmerek, rLLNA ne uporablja. Tako kot pri LLNA z ve č odmerki mora 
biti koncentracija preskusne snovi, ki se ocenjuje pri rLLNA, najvišja 
koncentracija, ki pri miši ne povzro či očitne sistemske toksi čnosti in/ali 
čezmernega draženja kože (glej odstavek 18).
 
OPAZOVANJA  
Klinična opazovanja  
30. Vsako miš je treba vsaj enkrat dnevno natan čno opazovati glede klini čnih 
znakov, lokalnega draženja na mestu nanosa ali sistemske toksi čnosti. Vsa 
opazovanja se sistemati čno zabeležijo v evidence, ki se vodijo za vsako 
miš. Načrti spremljanja morajo vklju čevati merila za hitro identifikacijo 
miši, ki izražajo sistemsko toksi čnost, čezmerno draženje kože ali jedkost 
za kožo zaradi evtanazije (37).  
Telesna masa  
31. Kot je navedeno v odstavku 25, se telesna masa posameznih živali izmeri 
na začetku preskusa in ob predvideni humani usmrtitvi.  
IZRAČUN REZULTATOV 
32. Rezultati za vsako tretirano skupino so izraženi kot stimulacijski 
indeks (SI). Kadar se uporabi pristop po posamezni živali, se SI dobi tako, da se povpre čno število razgradenj na minuto/miš v vsaki skupini 
preskusne snovi in v pozitivni kontrolni skupini deli s povpre čnim 
številom razgradenj na minuto/miš za kontrolno skupino s topilom/nosil ­
cem. Povpre čni SI za kontrolne skupine z nosilcem je potem 1. Kadar se 
uporabi zbirni pristop za tretirane skupine, se SI dobi tako, da se zbirna 
radioaktivna vklju čitev za vsako tretirano skupino z vklju čitvijo zbirne 
kontrolne skupine deli z nosilcem, kar da povpre čni SI. 
33. Pri postopku odlo čanja se rezultat šteje za pozitivnega, ko je SI ≥ 3. 
Vendar se lahko pri odlo čanju, ali je mejni rezultat pozitiven, uporabijo 
tudi moč odziva na odmerek, statisti čni pomen ter doslednost odzivov v 
topilu/nosilcu in pozitivni kontroli (4) (5) (6). 
34. Če je treba razjasniti dobljene rezultate, je treba upoštevati razli čne last­
nosti preskusne snovi, tudi strukturno podobnost z znanimi povzro čitelji 
preobčutljivosti, če povzroča čezmerno lokalno draženje kože pri miši, in 
naravo opaženega odnosa med odmerkom in odzivom. Ti in drugi razlogi so podrobno obravnavani drugje (7). 
35. Zbiranje podatkov o radioaktivnosti na ravni posamezne miši bo omogo ­ 
čilo statisti čno analizo prisotnosti in stopnje odnosa med odmerkom in 
odzivom v podatkih. Morebitna statisti čna ocena lahko vklju čuje oceno 
odnosa med odmerkom in odzivom ter ustrezno prilagojene primerjave 
preskusnih skupin (npr. skupina, ki je prejela odmerek v parih, proti 
primerjavam primerjalnih kontrolnih skupin z nosilcem). Statisti čna analiza 
lahko obsega npr. linearno regresijo ali Williamsov preskus za oceno nihanj odziva na odmerek in Dunnettov preskus za primerjave po parih. 
Pri izbiri ustrezne metode statisti čne analize se mora raziskovalec zavedati 
možnih neenakosti varianc in drugih sorodnih problemov, zaradi katerih je lahko nujna pretvorba podatkov ali neparametrska statisti čna analiza. V 
vsakem primeru bo moral raziskovalec morda izvesti izra čune SI ter stati ­
stične analize s podatkovnimi to čkami (včasih imenovanimi „izlo čitve“) in 
brez njih.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 610
 
PODATKI IN PORO ČANJE  
Podatki  
36. Podatki se povzamejo v obliki preglednice. Pri uporabi pristopa po posa ­
mezni živali se prikažejo vrednosti DPM za posamezno žival, skupinsko 
povprečje DPM/žival, s tem povezane napake (npr. SD, SEM) in 
povprečni SI za vsako skupino odmerka v primerjavi s primerjalno 
kontrolno skupino z nosilcem. Pri uporabi zbirnega pristopa za tretirane 
skupine se prikažeta povpre čna/srednja DPM in povpre čni SI za vsako 
skupino odmerka v primerjavi s primerjalno kontrolno skupino z nosilcem.  
Poročilo o preskusu  
37. Poro čilo o preskusu vsebuje naslednje informacije: 
preskušane in kontrolne snovi: 
— identifikacijske podatke (npr. številko CAS in številko EC, če je na 
voljo; vir; čistost; znane ne čistoče, številko serije), 
— fizikalno stanje in fizikalno-kemijske lastnosti (npr. hlapnost, stabil ­
nost, topnost), 
— če je zmes, sestavo in relativne odstotke sestavin; 
topilo/nosilec: — identifikacijske podatke ( čistost, po potrebi koncentracijo, uporabljeno 
količino), 
— utemeljitev izbire uporabljenega nosilca; preskusne živali: — vir miši seva CBA, — mikrobiološki status živali, če je znan, 
— število in starost živali, — vir živali, namestitvene pogoje, prehrano, itd.; preskusni pogoji: — podatke o pripravi in uporabi preskusne snovi, 
— utemeljitev izbire odmerka (vklju čno z rezultati predhodnega presejal ­
nega preskusa, če je bil izveden), 
— uporabljene koncentracije nosilca in preskusne snovi ter skupno koli ­ 
čino uporabljene preskusne snovi, 
— podatke o kakovosti hrane in vode (vklju čno z vrsto/virom prehranje ­
vanja, virom vode), 
— podatke o programih tretiranja in vzor čenja, 
— metode merjenja toksi čnosti, 
— merila za obravnavanje študij kot pozitivnih ali negativnih, — podrobnosti o morebitnih odstopanjih protokola in pojasnilo, kako 
odstopanje vpliva na zasnovo študije in njene rezultate; 
preverjanje zanesljivosti: — povzetek rezultatov zadnjega preverjanja zanesljivosti, vklju čno z 
informacijami o uporabljeni preskusni snovi, koncentraciji in nosilcu, 
— primerjalne in/ali pretekle pozitivne in primerjalne negativne (topilo/ 
nosilec) kontrolne podatke za preskuševalni laboratorij,
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 611
 
— če primerjalna pozitivna kontrola ni bila vklju čena, datum in laborato ­
rijsko poro čilo nazadnje izvedene redne pozitivne kontrole in poro čilo, 
ki navaja pretekle pozitivne kontrolne podatke za laboratorij, na podlagi katerih je upravi čeno neizvajanje primerjalne pozitivne 
kontrole; 
rezultati: — posamezne mase živali na za četku odmerjanja in ob predvideni usmrti ­
tvi; ter povpre čno in povezano napako (npr. SD, SEM) za vsako 
tretirano skupino, 
— časovni potek za četka toksi čnosti in njenih znakov, vklju čno z more ­
bitnim draženjem kože na mestu nanosa za vsako žival, 
— preglednico z vrednostmi DPM za vsako posamezno miš (pristop po 
posamezni živali) ali povpre čnimi/srednjimi (zbirni pristop za tretirane 
skupine) vrednostmi DPM in vrednostmi SI za vsako tretirano skupino, 
— povpre čno in povezano napako (npr. SD, SPM) za DPM/miš za vsako 
tretirano skupino in rezultate analize izlo čitev za vsako tretirano 
skupino pri uporabi pristopa po posamezni živali, 
— izračunan SI in ustrezno merilo spremenljivosti, ki pri uporabi pristopa 
po posamezni živali upošteva spremenljivost med posameznimi živalmi tako v preskusni snovi kot kontrolnih skupinah, 
— odnos med odmerkom in odzivom, — po potrebi, statisti čne analize; 
razprava o rezultatih: — kratke pripombe o rezultatih, analizo odziva na odmerek in po potrebi 
statistične analize, s sklepom, ali naj se preskusna snov šteje za 
povzročitelja preob čutljivosti kože.
 
VIRI 
1. OECD (2002), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD Guide ­
line for the Testing of Chemicals No 429, Paris. Na voljo na spletni strani: http://www.oecd.org/env/testguidelines. 
2. Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992), The murine local lymph node assay; 
collaborative studies and new directions: A commentary, Food Chem. Toxi ­
col., 30, 165–169. 
3. Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications, Toxicol., 93, 13–31. 
4. Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, 
D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments 
using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise, J. Toxicol. 
Environ. Health, 53 563–79. 
5. Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation, Food Chem. Toxicol., 34, 999–1002. 
6. Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests, Food Chem. Toxicol., 34, 985–997. 
7. Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests, Food Chem. 
Toxicol., 36, 327–33.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 612
 
8. Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncer ­
tainty margins, Toxicol., 146, 49–59. 
9. Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. 
Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34: 258–273. 
10. Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34, 274–286. 
11. Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34: 249–257. 
12. ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle 
Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Na voljo na spletni strani: http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/ LLNAPerfStds.pdf. 
13. OECD (1992), Skin Sensitisation. OECD Guideline for Testing of Chemicals 
No 406, OECD, Paris. Na voljo na spletni strani: http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines. 
14. OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Envi ­
ronment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment 
No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Na voljo na spletni strani: http://www.oecd.org/env/testguidelines. 
15. Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kimber, 
I. (1998), Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl 
cinnamic aldehyde, J. Appl. Toxicol., 18, 281–284. 
16. Kimber, I., Dearman, R.J., Betts, C.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, 
P.S., Patlewicz, G.Y. and Basketter, D.A. (2006), The local lymph node 
assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal require ­
ments? Contact Dermatitis, 54, 181–185. 
17. ESAC (2007), Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay 
(rLLNA), European Commission Directorate General, Joint Research Centre, 
Institute for Health and Consumer Protection, European Centre for the 
Validation of Alternative Methods, April 2007. Na voljo na spletni strani: http://ecvam.jrc.it/ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf. 
18. ICCVAM (2009), The Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. The 
Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test Method 
Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products, NIH Publication Number 09-6439, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. 
Na voljo na spletni strani: http://iccvam.niehs.nih.gov/. 
19. ICCVAM (1999), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method for 
Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the 
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative 
Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication No. 99-4494, Research Triangle Park, NC: National Institute 
of Environmental Health Sciences. Na voljo na spletni strani: 
http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 613
 
20. Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT), Food Chem. Toxicol., 46, 1896–1904. 
21. Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, 
C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), 
Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensi ­
tisation datasets: implications for REACH, Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90–96. 
22. ICCVAM (2009), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of 
the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication Number 10-7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of 
Environmental Health Sciences, na voljo na spletni strani: http://iccvam. 
niehs.nih.gov/. 
23. ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the 
Care and Use of Laboratory Animals, 7th ed. Washington, DC: National Academies Press. 
24. McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH, Toxicol., 238, 71–89. 
25. OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No. 404, Paris, France. Na voljo na spletni strani: 
http://www.oecd.org/document/40/ 
0,3343,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html . 
26. Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances, Toxicologist, 96, 235. 
27. ICCVAM (2009), Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Na voljo na spletni strani: 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf. 
28. Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice, Drug. Chem. Toxicol., 21, 195–206. 
29. Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the 
differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions, Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83–94. 
30. Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals, Toxicol. Meth., 8, 245–256. 
31. Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods, Drug. Chem. Toxicol., 22, 491–506. 
32. Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, 
H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60–68. 
33. Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728. 
34. Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract, Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028. 
35. OECD (1987), Acute Dermal Toxicity, OECD Guideline for Testing of 
Chemicals No 402, Paris, France. Na voljo na spletni strani: 
http://www.oecd.org/env/testguidelines.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 614
 
36. ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In 
Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, na voljo na spletni strani: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ 
acutetox/Tox_workshop.htm. 
37. OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Na 
voljo na spletni strani: http://www.oecd.org/env/testguidelines.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 615
 
Dodatek 1  
Standardi u činkovitosti za ocenjevanje predlaganih podobnih ali 
prilagojenih preskusnih metod LLNA za preob čutljivost kože  
UVOD 
1. Namen standardov u činkovitosti je posredovati podlago, na kateri se lahko za 
nove preskusne metode, lastniške (tj. avtorske, zaš čitene z blagovno znamko, 
registrirane) in nelastniške, ugotovi, da so ustrezno natan čne in zanesljive za 
določene namene preskušanja. Ti standardi u činkovitosti, ki temeljijo na vali ­
diranih in uveljavljenih preskusnih metodah, se lahko uporabijo za oceno 
zanesljivosti in natan čnosti drugih podobnih metod (ki se pogovorno imenu ­
jejo „podobni“ preskusi), ki temeljijo na podobnih znanstvenih na čelih in 
merijo ali napovedujejo isti biološki ali toksi čni učinek (14). 
2. Spremenjene metode (tj. predlagane morebitne izboljšave odobrene 
preskusne metode) je treba pred sprejetjem oceniti, da se ugotovita u činek 
predlaganih sprememb na u činkovitost preskusa in obseg, v katerem takšne 
spremembe vplivajo na informacije, ki so na voljo za druge elemente postopka validacije. Odvisno od števila in narave predlaganih sprememb, dobljenih podatkov in podporne dokumentacije za te spremembe se zanje 
izvede enak postopek validacije, kot je predpisan za nov preskus ali, po 
potrebi, omejena ocena zanesljivosti in ustreznosti z uveljavljenimi standardi učinkovitosti (14). 
3. Podobne ali spremenjene metode, ki so predlagane za uporabo v okviru te 
preskusne metode, je treba oceniti ter dolo čiti njihovo zanesljivost in natan ­ 
čnost z uporabo kemikalij, ki predstavljajo celoten razpon ocen LLNA. Da 
bi se izognili neupravi čeni uporabi živali, se priporo ča, da se razvijalci 
modelov pred za četkom izvajanja validacijskih študij v skladu s standardi 
učinkovitosti in smernicami iz te preskusne metode posvetujejo z ustreznimi 
organi. 
4. Ti standardi u činkovitosti temeljijo na ameriških ICCVAM, evropskih 
ECVAM in japonskih JaCVAM usklajenih standardih u činkovitosti (12) 
za ocenjevanje veljavnosti podobnih ali spremenjenih razli čic LLNA. Stan ­
dardi učinkovitosti obsegajo bistvene elemente preskusne metode, priporo ­ 
čene referen čne kemikalije ter standarde za natan čnost in zanesljivost, ki jih 
mora predlagana metoda dose či ali prese či.
 
I. Bistveni elementi preskusne metode  
5. Za zagotovitev, da je podobna ali spremenjena metoda LLNA v funkcijskem 
in mehani čnem smislu podobna LLNA in meri isti biološki u činek, morajo 
biti v protokol preskusne metode vklju čeni naslednji elementi: 
— preskusna snov se površinsko nanese na obe ušesi miši, 
— množenje limfocitov se izmeri v bezgavkah, ki drenirajo obmo čje nanosa 
preskusne snovi, 
— množenje limfocitov se izmeri med indukcijsko fazo preob čutljivosti 
kože,  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 616
 
— pri preskusnih snoveh je najve čji izbran odmerek najvišja koncentracija, 
ki pri miši ne povzro či sistemske toksi čnosti in/ali čezmernega draženja 
kože; pri pozitivnih referen čnih kemikalijah je najve čji odmerek vsaj 
tako velik kot vrednosti ocenjene koncentracije, potrebne za stimula ­
cijski indeks 3 (vrednosti EC3) ustreznih referen čnih kemikalij (glej 
preglednico 1) pri LLNA, ne da bi pri miši povzro čil sistemsko toksi ­ 
čnost in/ali čezmerno draženje kože, 
— v vsako študijo je treba vklju čiti primerjalno kontrolno skupino z nosil ­
cem, po potrebi pa se uporabi tudi primerjalna pozitivna kontrola, 
— na skupino odmerka se uporabijo najmanj štiri živali, — zberejo se podatki o posamezni živali ali skupni podatki o živalih. Če katero od teh meril ni izpolnjeno, standardov u činkovitosti ni mogo če 
uporabiti za validacijo podobne ali spremenjene metode.
 
II. Najkrajši možni seznam referen čnih kemikalij  
6. Usklajeni ameriški ICCVAM, evropski ECVAM in japonski JaCVAM stan ­
dardi učinkovitosti (12) dolo čajo najkrajši možni seznam 18 referen čnih 
kemikalij, ki jih je treba uporabiti, in štiri druge referen čne kemikalije (tj. 
snovi, ki so pri LLNA dale lažne pozitivne ali lažne negativne rezultate v 
primerjavi z rezultati pri človeku in morskih praši čkih (B.6, ali Smernica za 
preskušanje OECD 406) (13) in so zato lahko enako ali bolj u činkovite od 
LLNA), vklju čene v standarde u činkovitosti za LLNA. Merila za izbor za 
opredelitev teh kemikalij so bila: 
— seznam referen čnih kemikalij predstavlja vrste snovi, ki se obi čajno 
preskušajo glede morebitnega povzro čanja preob čutljivosti kože, in 
razpon odzivov, ki jih LLNA lahko meri ali napove; 
— kemična struktura snovi je natan čno opredeljena; 
— za vsako snov so na voljo podatki LLNA iz preskusov na morskih 
prašičkih (tj. B.6; Smernica za preskušanje OECD 406) (13) in (kadar 
je mogoče) ljudeh; in 
— snovi so dostopne pri tržnih virih. Priporočene referen čne kemikalije so navedene v preglednici 1. Študije, ki 
uporabljajo predlagane referen čne kemikalije, morajo biti ocenjene v 
nosilcu, s katerim so navedene v preglednici 1. V primerih, ko navedena 
snov ni na voljo, se lahko z ustrezno utemeljitvijo uporabijo druge snovi, ki izpolnjujejo navedena merila za izbor.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 617
 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 618
 ▼M3 
Preglednica 1  
Priporočene referen čne kemikalije za standarde u činkovitosti za LLNA  
Številka Kemikalije (  1 ) Št. CAS Oblika Nos (  2 ) EC3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5 x–2,0 x 
EC3 Dejanski 
razpon EC3 LLNA v 
primerjavi z 
MP LLNA v 
primerjavi s 
človekom  
1 5-kloro-2-metil-4-izotiazolin-3-on (CMI) in 
2-metil-4-izotiazolin-3-on (MI) (  5 ) 26172-55-4/2682-20-4 tek. DMF 0,009 1 0,0045– 
0,018 NI +/+ +/+ 
2 DNCB 97-00-7 trd. AOO 0,049 15 0,025– 
0,099 0,02– 
0,094 +/+ +/+ 
3 4-fenilendiamin 106-50-3 trd. AOO 0,11 6 0,055– 
0,22 0,07–0,16 +/+ +/+ 
4 kobaltov klorid 7646-79-9 trd. DMSO 0,6 2 0,3–1,2 0,4–0,8 +/+ +/+ 
5 izoevgenol 97-54-1 tek. AOO 1,5 47 0,77–3,1 0,5–3,3 +/+ +/+ 6 2-merkaptobenzotiazol 149-30-4 trd. DMF 1,7 1 0,85–3,4 NI +/+ +/+ 
7 citral 5392-40-5 tek. AOO 9,2 6 4,6–18,3 5,1–13 +/+ +/+ 
8 HCA 101-86-0 tek. AOO 9,7 21 4,8–19,5 4,4–14,7 +/+ +/+ 
9 evgenol 97-53-0 tek. AOO 10,1 11 5,05–20,2 4,9–15 +/+ +/+ 
10 fenil benzoat 93-99-2 trd. AOO 13,6 3 6,8–27,2 1,2–20 +/+ +/+ 11 cimetov alkohol 104-54-1 trd. AOO 21 1 10,5–42 NI +/+ +/+ 
12 imidazolidinil urea 39236-46-9 trd. DMF 24 1 12–48 NI +/+ +/+ 
13 metil metakrilat 80-62-6 tek. AOO 90 1 45–100 NI +/+ +/+ 
14 klorobenzen 108-90-7 tek. AOO 25 1 n.r. n.r. –/– –/ (*) 
15 izopropanol 67-63-0 tek. AOO 50 1 n.r. n.r. –/– –/+
 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 619
 ▼M3 
Številka Kemikalije (  1 ) Št. CAS Oblika Nos (  2 ) EC3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5 x–2,0 x 
EC3 Dejanski 
razpon EC3 LLNA v 
primerjavi z 
MP LLNA v 
primerjavi s 
človekom  
16 mle čna kislina 50-21-5 tek. DMSO 25 1 n.r. n.r. –/– –/ (*) 
17 metil salicilat 119-36-8 tek. AOO 20 9 n.r. n.r. –/– –/– 18 salicilna kislina 69-72-7 trd. AOO 25 1 n.r. n.r. –/– –/– 
Druge snovi za prikaz izboljšane u činkovitosti glede na LLNA 
19 natrijev lavrilsulfat 151-21-3 trd. DMF 8,1 5 4,05–16,2 1,5–17,1 +/– +/– 20 etilen glikol dimetakrilat 97-90-5 tek. MEK 28 1 14–56 NI +/– +/+ 
21 ksilen 1330-20-7 tek. AOO 95,8 1 47,9–100 NI +/ (**) +/– 
22 nikljev diklorid 7718-54-9 trd. DMSO 5 2 n.r. n.r. –/+ –/+
 
Kratice: AOO = aceton olivno olje (4:1, v/v); št. CAS = številka Službe za izmenjavo kemijskih izvle čkov; DMF =  N,N -dimetilformamid; DMSO = dimetil sulfoksid; DNCB = 2,4-dinitroklorobenzen; EC3 = ocenjena 
koncentracija, potrebna za stimulacijski indeks 3; MP = rezultat preskusa na morskih praši čkih (tj. B. 6 ali Smernica za preskušanje OECD 406) (13); HCA = heksil cimetov aldehid; LLNA = rezultat lokalne analize bezgavk  pri 
glodavcih ( tj. B. 42 ali Smernica za preskušanje OECD 429) (1); MEK = metil etil keton; NI = ni izra čunano, ker so bili podatki pridobljeni z eno samo študijo; n.r = ni relevantno, ker je stimulacijski indeks < 3; trd. = trdna 
snov; Nos = nosilec preskusa. 
(*) Predvideva se, da pri ljudeh ni povzro čitelj preob čutljivosti, ker niso bili najdeni nobeni rezultati klini čnih epikutanih testov, zato ni vklju čen v komplet za epikutano testiranje kot alergen, in najdenega ni bilo nobenega 
poročila o primeru preob čutljivosti pri človeku. 
(**) Podatki o MP niso na voljo. 
( 1 ) Kemikalije je treba pripravljati dnevno, razen če podatki o stabilnosti kažejo, da je shranjevanje sprejemljivo. 
( 2 ) Zaradi morebitnega vpliva razli čnih nosilcev na u činkovitost LLNA je treba uporabljati priporo čen nosilec za vsako referen čno kemikalijo (24) (32). 
( 3 ) Povpre čna vrednost v primerih, ko je bila na voljo ve č kot ena vrednost EC3. Pri negativnih snoveh (tj. s stimulacijskim indeksom < 3) je navedena najvišja preskušena koncentracija.  
( 4 ) Število študij LLNA, s katerimi so bili pridobljeni podatki. 
( 5 ) Na tržiš ču na voljo pod imenom Kathon CG (št. CAS 55965-84-9), ki je zmes CMI in MI v razmerju 3:1. Relativne koncentracije vsake sestav ine so od 1,1 % do 1,25 % (CMI) in od 0,3 % do 0,45 % (MI). Neaktivne 
sestavine so magnezijeve soli (21,5 % do 24 %) in bakrov nitrat (0,15 % do 0,17 %), s preostalo sestavo 74 % do 77 % vode. Kath on CG je dostopen preko podjetij Sigma-Aldrich in Rohm and Haas (zdaj Dow Chemical 
Corporation).
 III. Opredeljeni standardi zanesljivosti in natan čnosti  
7. Natan čnost podobne ali spremenjene metode LLNA mora pri ocenjevanju z 
uporabo 18 referen čnih kemikalij, ki jih je treba uporabiti, dosegati ali 
presegati natan čnost standardov u činkovitosti za LLNA. Rezultat nove ali 
spremenjene metode mora biti pravilna razvrstitev na podlagi odlo čitve „da/ 
ne“. Vendar pa nova ali spremenjena metoda morda ne bo pravilno 
razvrstila vseh 18 referen čnih kemikalij, ki jih je treba uporabiti. Če je, 
na primer, eden od šibkih povzro čiteljev preob čutljivosti napa čno razvrš čen, 
se lahko za dokaz enake u činkovitosti upoštevajo utemeljitev za napa čno 
razvrstitev in ustrezni podatki (npr. rezultati preskusa, ki zagotavljajo 
pravilno razvrstitev drugih snovi s fizikalnimi in kemijskimi lastnostmi ter 
lastnostmi, ki povzro čajo preob čutljivost, podobnimi lastnostim napa čno 
razvrščene referen čne kemikalije). V takih okoliš činah se status validacije 
novih in spremenjenih preskusnih metod za LLNA oceni za vsak primer 
posebej.  
Ponovljivost v laboratoriju  
8. Za ugotavljanje ponovljivosti v laboratoriju se nova ali prilagojena metoda 
LLNA oceni z uporabo snovi, ki povzro ča preobčutljivost in je natan čno 
opredeljena v LLNA. Zato standardi u činkovitosti za LLNA temeljijo na 
spremenljivosti rezultatov ponovljenih preskusov s heksil cimetovim 
aldehidom (HCA). Za oceno zanesljivosti v laboratoriju je treba vrednosti ocenjenega praga koncentracije (ECt) za HCA pridobiti ob štirih razli čnih 
priložnostih, med preskusi pa mora biti vsaj en teden razmaka. Sprejemljivo 
ponovljivost v laboratoriju kaže zmožnost laboratorija, da pri vsakem 
preskusu s HCA pridobi vrednosti ECt med 5 % in 20 %, kar predstavlja razpon od 0,5 do 2,0-krat povpre čne ocenjene koncentracije, potrebne za 
stimulacijski indeks 3 (EC3), dolo čene za HCA (10 %) pri LLNA (glej 
preglednico 1).
 
Ponovljivost v laboratorijih  
9. Ponovljivost nove ali prilagojene metode LLNA v laboratorijih se oceni z 
uporabo dveh snovi, ki povzro čata preob čutljivost in sta natan čno oprede ­
ljeni v LLNA. Standardi u činkovitosti za LLNA temeljijo na spremenljivosti 
rezultatov preskusov s HCA in 2,4-dinitroklorobenzenom (DNCB) v razli ­ 
čnih laboratorijih. Vrednosti ECt je treba pridobiti neodvisno in z eno samo 
študijo, izvedeno v vsaj treh lo čenih laboratorijih. Za prikaz sprejemljive 
ponovljivosti v laboratorijih mora vsak laboratorij pridobiti vrednosti ECt od 
5 % do 20 % za HCA in od 0,025 % do 0,1 % za DNCB, kar predstavlja 
razpon od 0,5 do 2,0-krat povpre čne koncentracije EC3, dolo čene za HCA 
(10 %) oziroma DNCB (0,05 %), pri LLNA (glej preglednico 1).  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 620
Dodatek 2  
Opredelitve pojmov  
Natančnost: stopnja ujemanja rezultatov preskusne metode z uveljavljenimi refe ­
renčnimi vrednostmi. To je merilo u činkovitosti preskusne metode in eden od 
vidikov ustreznosti. Ta izraz in izraz „skladnost“ se pogosto izmeni čno upora­
bljata za pomen deleža ustreznih rezultatov preskusne metode (14). 
Primerjalna snov: snov, ki povzro ča preobčutljivost ali je ne povzro ča in se 
uporablja kot standard za primerjavo s preskusno snovjo. Primerjalna snov mora imeti naslednje lastnosti: (i) trajen in zanesljiv vir; (ii) strukturno in funk ­
cijsko podobnost z razredom preskušanih snovi; (iii) znane fizikalno-kemijske 
lastnosti; (iv) podporne podatke o znanih u činkih in (v) znano u činkovitost v 
razponu želene reakcije. 
Ocenjen prag koncentracije (ECt): ocenjena koncentracija preskusne snovi, 
potrebne za stimulacijski indeks, ki kaže na pozitiven rezultat. 
Ocenjena koncentracija tri (EC3): ocenjena koncentracija preskusne snovi, 
potrebne za stimulacijski indeks tri. 
Lažno negativna snov: preskusna snov, ki je s preskusno metodo nepravilno 
opredeljena kot negativna ali neaktivna, čeprav je dejansko pozitivna ali aktivna. 
Lažno pozitivna snov: preskusna snov, ki je s preskusom nepravilno opredeljena 
kot pozitivna ali aktivna, čeprav je dejansko negativna ali neaktivna. 
Nevarnost: možnost škodljivega u činka na zdravje ali okolje. Do škodljivega 
učinka pride, če je raven izpostavljenosti dovolj visoka. 
Ponovljivost v laboratorijih: merjenje obsega, v katerem lahko razli čni kvalifici ­
rani laboratoriji, ki uporabljajo isti protokol in preskušajo iste preskusne snovi, 
pridejo do kvalitativno in kvantitativno podobnih rezultatov. Ponovljivost v labo ­
ratorijih se ugotovi med postopki pred validacijo in med validacijo ter kaže, v kakšnem obsegu se lahko preskus uspešno uporablja v ve č laboratorijih; imenuje 
se tudi ponovljivost v razli čnih laboratorijih (14). 
Ponovljivost v laboratoriju: dolo čitev, obsega, v katerem lahko kvalificirane 
osebe v istem laboratoriju uspešno ponovijo rezultate z uporabo dolo čenega 
protokola v razli čnem času. Imenuje se tudi ponovljivost znotraj laboratorija (14). 
Podobni preskus: pogovorni izraz za preskusno metodo, ki je strukturno in 
funkcijsko podobna potrjeni in uveljavljeni referen čni preskusni metodi. Takšna 
preskusna metoda je primerna za naknadno validacijo. Uporablja se izmeni čno s 
podobno preskusno metodo (14). 
Izločitev: izlo čitev je ugotovitev, ki se izrazito razlikuje od drugih vrednosti v 
naključnem vzorcu populacije. 
Standardi u činkovitosti: standardi, ki temeljijo na validirani preskusni metodi, na 
podlagi katere se lahko ocenjuje primerljivost predlagane preskusne metode, ki je v mehani čnem in funkcijskem smislu podobna. Obsegajo: i) nujne elemente 
preskusne metode, ii) najkrajši možni seznam referen č
nih kemikalij, izbranih iz 
skupine kemikalij, ki se uporabljajo za dokazovanje sprejemljive u činkovitosti 
validirane preskusne metode, in iii) podobne stopnje natan čnosti in zanesljivosti, 
ki temeljijo na rezultatu uporabe validirane preskusne metode, kar mora pri 
ocenjevanju dokazati predlagana preskusna metoda ob uporabi najkrajšega 
možnega seznama referen čnih kemikalij (14). 
Lastniška preskusna metoda: preskusna metoda, pri kateri sta proizvodnja in 
distribucija omejeni s patenti, avtorskimi pravicami, blagovnimi znamkami itd.  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 621
 
Zagotavljanje kakovosti: postopek upravljanja, pri katerem posamezniki, neod ­
visni od oseb, ki so izvajale preskuse, ocenijo izpolnjevanje laboratorijskih stan ­
dardov za preskušanje, zahtev in postopkov vodenja evidenc ter natan čnosti 
prenosa podatkov. 
Referenčne kemikalije: kemikalije, izbrane za uporabo v postopku validacije, za 
katere so odzivi referen čnega preskusnega sistema ali želenih vrst  in vitro  ali in 
vivo že znani. Te kemikalije morajo biti reprezentativne za razrede kemikalij, za 
katere naj bi se uporabila preskusna metoda, predstavljati pa morajo celoten razpon odzivov, ki se jih lahko pri čakuje od kemikalij, za katere bo morda 
uporabljena, od mo čnega, do šibkega, do negativnega. Za razli čne faze validacije 
in različne preskusne metode ter preskusne uporabe so lahko potrebne razli čne 
skupine referen čnih kemikalij (14). 
Ustreznost: opis odnosa med preskusom in želenim u činkom ter njegovim 
pomenom in uporabnostjo za dolo čen namen. Pomeni stopnjo, do katere preskus 
pravilno izmeri ali napove želeni biološki u činek. Ustreznost vklju čuje upošte ­
vanje natan čnosti (skladnosti) preskusne metode (14). 
Zanesljivost: stopnja ponovljivosti preskusne metode v laboratorijih in med njimi 
v določenem časovnem obdobju pri uporabi istega protokola. Oceni se z izra ­ 
čunom ponovljivosti v enem ali ve č laboratorijih (14). 
Preobčutljivost kože: imunološki proces, ki se pojavi, ko je ob čutljiv posameznik 
lokalno izpostavljen kemi čnemu alergenu, ki na koži sproži imunski odziv in 
lahko povzro či razvoj preob čutljivosti ob stiku. 
Stimulacijski indeks (SI): vrednost, izra čunana za oceno morebitne preob čutlji­
vosti kože, ki jo lahko povzro či preskusna snov; je razmerje med množenjem v 
tretiranih skupinah in množenjem v primerjalni kontrolni skupini z nosilcem. 
Preskusna snov (imenovana tudi preskusna kemikalija): katera koli snov ali 
zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. 
Validirana preskusna metoda: preskusna metoda, za katero sta bili na podlagi 
validacijskih študij dolo čeni ustreznost (vklju čno z natan čnostjo) in zanesljivost 
za določen namen. Treba je opozoriti, da natan čnost in zanesljivost validirane 
preskusne metode nista nujno zadostni, da bi bili sprejemljivi za predlagani 
namen (14).  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 622
 
B.43  ŠTUDIJA NEVROTOKSI ČNOSTI NA GLODALCIH  
1. METODA  
Ta metoda ustreza metodi OECD TG 424 (1997). 
Ta preskusna metoda je namenjena pridobivanju informacij, ki so 
potrebne za potrditev ali nadaljnjo opredelitev potencialne nevrotok ­
sičnosti kemikalij na odraslih živalih. Lahko se jo kombinira z obsto ­
ječimi preskusnimi metodami za študije strupenosti s ponavljajo čimi 
odmerki ali pa se jo izvaja kot posebno študijo. Priporo čljivo je, da 
se v pomo č pri načrtovanju študij, ki temeljijo na tej preskusni 
metodi, uporabijo napotki OECD o strategijah in metodah presku ­ 
šanja nevrotoksi čnosti (1). To je še posebej pomembno, kadar se 
razmišlja o spremembah postopkov opazovanja in preskušanja, ki se priporo čajo za rutinsko uporabo te metode. Napotki so bili pripra ­
vljeni za olajšanje izbire drugih preskusnih postopkov za uporabo v 
posebnih okoliš činah. 
Vrednotenje razvojne nevrotoksi čnosti ni predmet te metode.
 
1.1 UVOD 
Pri ocenjevanju in vrednotenju strupenih lastnosti kemikalij je 
pomembno, da se upošteva potencial za nevrotoksi čne učinke. Že 
preskusna metoda za sistemsko toksi čnost s ponavljajo čimi odmerki 
vključuje opazovanja, ki iš čejo potencialno nevrotoksi čnost. Ta 
preskusna metoda se lahko uporabi za na črtovanje študije za prido ­
bitev nadaljnjih informacij ali potrditev informacij o nevrotoksi čnih 
učinkih, ki jih pokažejo študije sistemske toksi čnosti s ponavljajo ­ 
čimi odmerki. Vendar lahko upoštevanje potencialne nevrotoksi ­ 
čnosti nekaterih razredov kemikalij pokaže, da bi jih lahko primer ­
neje ocenili z uporabo te metode brez predhodnih navedb o poten ­
cialni nevrotoksi čnosti iz študij sistemske toksi čnosti s ponavljajo ­ 
čimi odmerki. Taki razlogi vklju čujejo na primer: 
— opazovanje nevroloških znakov ali nevropatoloških lezij v 
študijah toksi čnosti, ki niso študije sistemske toksi čnosti s pona ­
vljajočimi odmerki, ali 
— strukturno podobnost ali druge informacije o povezavah z 
znanimi nevrotoksikanti. 
Poleg tega lahko obstajajo še drugi primeri, ko je primerna uporaba 
te preskusne metode; za nadaljnje podrobnosti glej (1). 
Ta metoda je oblikovana tako, da se lahko prilagodi in v primeru 
posebnih potreb potrdi posebna histopatološka in vedenjska nevro ­
toksičnost kemikalij, pa tudi da se zagotovi ozna čitev in koli činska 
opredelitev nevrotoksi čnih odzivov.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 623
 
V preteklosti je bila nevrotoksi čnost izena čena z nevropatijo, ki 
vključuje nevropatološke lezije ali nevrološke motnje, kot so božjast, 
paraliza ali tremor. Čeprav je nevropatija pomembna pojavna oblika 
nevrotoksi čnosti, je danes jasno, da obstajajo številni drugi znaki 
toksičnosti živ čnega sistema (npr. izguba motori čne koordinacije, 
senzorične pomanjkljivosti, u čne in spominske motnje), ki se ne 
odražajo v nevropatiji ali drugih vrstah študij. 
Ta preskusna metoda za nevrotoksi čnost je namenjena odkrivanju 
glavnih nevrovedenj skih in nevropatoloških u činkov na odraslih 
glodalcih. Čeprav lahko vedenjski u činki tudi v odsotnosti morfolo ­ 
ških sprememb odražajo škodljiv vpliv na organizem, niso vse vedenjske spremembe zna čilne za živ čni sistem. Zato je treba vse 
opažene spremembe ovrednotiti skupaj s soodvisnimi histopatolo ­ 
škimi, hematološkimi ali biokemi čnimi podatki, pa tudi s podatki o 
drugih vrstah sistemske toksi čnosti. Preskušanje, ki se v tej metodi 
zahteva za zagotavljanje ozna čitve in koli činske opredelitve nevro ­
toksičnih odzivov, vklju čuje posebne histopatološke in vedenjske 
postopke, ki se lahko nadalje podprejo z elektrofiziološkimi in/ali 
biokemičnimi raziskavami (1) (2) (3) (4). 
Nevrotoksikanti lahko delujejo na številne cilje v živ čnem sistemu in 
z različnimi mehanizmi. Ker ni ene same vrste preskusov, s katerimi 
bi se lahko temeljito ovrednotilo nevrotoksi čen potencial vseh snovi, 
je lahko potrebno izkoristiti druge  in vivo  ali in vitro  preskuse, 
značilne za vrsto opazovane ali pri čakovane nevrotoksi čnosti. 
Ta preskusna metoda se lahko uporablja tudi skupaj z navodili v 
napotkih OECD o strategijah in metodah preskušanja nevrotoksi ­ 
čnosti (1) za na črtovanje študij, ki so namenjene nadaljnji ozna čitvi 
ali povečanju občutljivosti koli činske opredelitve odziva na odmerek 
po vrstnem redu ali boljši oceni vrednosti brez opaznih škodljivih učinkov ali utemeljitvi znanih ali domnevnih nevarnosti kemikalije. 
Na primer, študije se lahko namenijo ugotavljanju in vrednotenju 
nevrotoksi čnega(-ih) mehanizma(-ov) ali dopolnitvi podatkov, ki so 
že na voljo iz uporabe osnovnih nevrovedenj skih in nevropatoloških postopkov opazovanja. Takim študijam ni treba ponoviti podatkov, ki bi jih dobili z uporabo standardnih postopkov, ki jih priporo ča ta 
metoda, če so taki podatki že na voljo in ne štejejo za potrebne pri 
razlagi rezultatov študije. 
Ta študija nevrotoksi čnosti, če se uporablja samostojno ali v kombi ­
naciji, zagotavlja informacije, s katerimi se lahko: 
— ugotovi, ali je živ čni sistem trajno ali reverzibilno prizadet zaradi 
preskušane kemikalije, 
— prispeva k ozna čitvi sprememb živ čnega sistema, povezanih z 
izpostavljenostjo kemikaliji, in razumevanjem osnovnega mehan ­
izma,
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 624
 
— določi odnose med odzivom na odmerek in časovnim odzivom, 
da bi ocenili vrednost brez opaznih škodljivih u činkov (ki se 
lahko uporablja za ugotavljanje varnostnih meril za kemikalijo). 
Ta preskusna metoda uporablja oralno dajanje preskusne snovi. Drugi 
načini dajanja (npr. dermalno ali z vdihavanjem) so lahko primernejši 
in lahko zahtevajo spremembo priporo čenih postopkov. Razlogi za 
izbiro načina dajanja so odvisni od profila človekove izpostavljenosti 
in razpoložljivih toksikoloških ali kineti čnih informacij.  
1.2 OPREDELITVE POJMOV  
Škodljivi u činek:  je odstopanje od normalnega, povezano s tretira ­
njem, ki zmanjšuje sposobnost organizma za preživetje, razmnože ­
vanje ali prilagoditev okolju.  
Odmerek:  je količina dane preskusne snovi. Odmerek je izražen kot 
masa (g, mg), kot masa preskusne snovi na enoto mase preskusne živali (npr. mg/kg) ali kot konstanta koncentracije v hrani (ppm).  
Odmerjanje:  je splošen izraz, ki vklju čuje odmerek ter pogostost in 
trajanje dajanja odmerka.  
Nevrotoksi čnost:  je škodljiva sprememba strukture ali funkcije 
živčnega sistema, ki je posledica izpostavljenosti kemi čnemu, biolo ­ 
škemu ali fizi čnemu sredstvu.  
Nevrotoksikant:  je vsako kemi čno, biološko ali fizi čno sredstvo, ki 
ima potencial, da povzro ča nevrotoksi čnost.  
NOAEL:  je kratica za vrednost brez opaznih škodljivih u činkov 
(No Observed Adverse Effect Level) in je najve čji odmerek, pri 
katerem ne opazimo nobenega škodljivega u činka, povezanega s 
tretiranjem.
 
1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Preskusna kemikalija se daje oralno v vrsti odmerkov ve č skupinam 
laboratorijskih glodalcev. Navadno se zahtevajo ponavljajo či 
odmerki in režim odmerjanja je lahko 28 dni, subkroni čen (90 dni) 
ali kroničen (1 leto ali dlje). Postopki, navedeni v tej preskusni 
metodi, se lahko uporabljajo tudi za študijo akutne nevrotoksi čnosti. 
Živali se preskušajo, da bi omogo čili odkrivanje ali ozna čitev 
vedenjskih in/ali nevroloških anomalij. V vsakem obdobju opazo ­
vanja se ocenjuje vrsta vedenjskih oblik, ki jih lahko prizadenejo 
nevrotoksikanti. Na koncu preskusa se podskupina živali vsakega 
spola iz vsake skupine perfundira  in situ  in pripravijo ter preu čijo 
se prerezi možganov, hrbtenja če in perifernih živcev. 
Kadar se študija opravi kot samostojna študija za ugotavljanje nevro ­
toksičnosti ali za ozna čitev nevrotoksi čnih učinkov, se lahko živali iz 
vsake skupine, ki niso uporabljene za perfuzijo in naknadno histo ­
patologijo (glej Tabelo 1), uporabijo za posebne nevrovedenj ske, nevropatološke, nevrokemi čne ali elektrofiziološke postopke, ki 
lahko dopolnijo podatke, dobljene s standardnimi preiskavami, ki 
se zahtevajo po tej metodi (1). Ti dopolnilni postopki so lahko še 
posebno koristni, kadar empiri čna opazovanja ali pri čakovani u činki 
kažejo posebno vrsto ali cilj nevrotoksi čnosti kemikalije. Preostale 
živali pa se lahko uporabijo za vrednotenja, kakor so tista, ki se 
zahtevajo v preskusnih metodah za študije toksi čnosti s ponavljajo ­ 
čimi odmerki na glodalcih.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 625
 
Kadar se postopki te preskusne metode kombinirajo s postopki 
drugih preskusnih metod, je potrebno zadostno število živali, da se 
izpolnijo zahteve obeh študij glede opazovanja.  
1.4 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.4.1  Izbira živalskih vrst  
Priporočena glodalska vrsta je podgana, čeprav se lahko ob uteme ­
ljitvi uporabi druga glodalska vrsta. Uporabijo se laboratorijski sevi 
mladih odraslih živali, ki se splošno uporabljajo. Samice morajo biti nuliparne in ne smejo biti breje. Dajanje odmerkov se mora normalno za četi čim prej po odstavitvi, po možnosti najpozneje 
takrat, ko so živali stare šest tednov in v vsakem primeru preden 
so živali stare devet tednov. Kadar pa se ta študija kombinira z drugimi študijami, je morda treba to starost prilagoditi. Razlike v masi posameznih živali na za četku študije ne smejo presegati ± 
20 % povpre čne mase za vsak spol. Če se kratkotrajna študija s 
ponavljajo čimi odmerki izvaja kot predhodna študija za dolgotrajno 
študijo, je treba v obeh študijah uporabiti živali istega seva in vira.
 
1.4.2  Nastanitvene in prehranjevalne razmere  
Temperatura v prostoru s poskusnimi živalmi naj bo 22  o C (± 3  o C). 
Čeprav naj bi bila relativna vlažnost najmanj 30 % in je zaželeno, da 
ne presega 70 %, razen v času čiščenja prostora, je cilj 50–60 %. 
Osvetlitev naj bo umetna, zaporedje 12 ur svetlobe, 12 ur teme. Glasnega ponavljajo čega hrupa naj bo čim manj. Za hranjenje se 
lahko uporablja konvencionalna laboratorijska prehrana z neomejeno 
oskrbo s pitno vodo. Na izbiro prehrane lahko vpliva potreba po zagotovitvi ustrezne primesi preskusne snovi, kadar se daje po tej metodi. Živali se lahko namestijo posami čno ali dajo v kletke v 
manjših skupinah istega spola.
 
1.4.3  Priprava živali  
Zdrave mlade živali se naklju čno dodelijo v tretirano in kontrolno 
skupino. Kletke je treba razporediti tako, da so možni u činki zaradi 
pozicije kletk čim manjši. Živali se na enoten na čin identificirajo in 
zadržijo v kletkah (5) dni pred za četkom študije, da se prilagodijo na 
laboratorijske razmere.  
1.4.4  Na čin dajanja in priprava odmerkov  
Ta preskusna metoda se posebej ukvarja z oralnim dajanjem 
preskusne snovi. Oralno dajanje je lahko z gavažo, hrano, pitno vodo ali kapsulami. Drugi na čini dajanja (npr. dermalno ali z vdiha ­
vanjem) so lahko primernejši in lahko zahtevajo spremembo pripo ­
ročenih postopkov. Razlogi za izbiro na čina dajanja so odvisni od 
profila človekove izpostavljenosti in razpoložljivih toksikoloških ali 
kinetičnih informacij. Treba je navesti utemeljitev za izbiro na čina 
dajanja, pa tudi posledi čne spremembe postopkov te preskusne 
metode.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 626
 
Po potrebi se lahko preskusna snov raztopi ali suspendira v 
primernem nosilcu. Priporo čljivo je, da se najprej razmisli o uporabi 
vodne raztopine/suspenzije, potem o raztopini/suspenziji v olju (npr. koruznem olju) in šele nato o možni raztopini/suspenziji v drugih nosilcih. Strupene lastnosti nosilca morajo biti znane. Poleg tega je 
treba upoštevati naslednje lastnosti nosilca: u činke nosilca na absorp ­
cijo, distribucijo, presnovo ali retencijo preskusne snovi, ki lahko spremenijo njene toksi čne lastnosti; ter u činke na porabo hrane ali 
vode ali status prehranjenosti živali.
 
1.5 POSTOPKI  
1.5.1  Število in spol živali  
Kadar se študija opravi kot posebna študija, je treba uporabiti 
najmanj 20 živali (10 samic in 10 samcev) v vsaki skupini odmerka in v kontrolni skupini za vrednotenje podrobnih klini čnih in funk ­
cionalnih opazovanj. Najmanj pet samcev in pet samic, izbranih 
izmed teh 10 samcev in 10 samic, je treba perfundirati  in situ  in 
uporabiti za podrobno nevrohistopatologijo na koncu študije. V primerih, ko se glede nevrotoksi čnih učinkov opazuje le omejeno 
število živali v dani skupini odmerka, je treba upoštevati vklju čitev 
teh živali med živali, izbrane za perfuzijo. Kadar se študija izvede v kombinaciji s študijo toksi čnosti s ponavljajo čimi odmerki, je treba 
uporabiti zadostno število živali, da so izpolnjeni cilji obeh študij. 
Najmanjše število živali na skupino za razli čne kombinacije študij je 
podano v Tabeli 1. Če se načrtujejo vmesne usmrtitve ali obnovit ­
vene skupine za opazovanje reverzibilnosti, obstojnosti ali zapozne ­
lega nastopa toksi čnih učinkov po tretiranju ali če se razmišlja o 
dopolnilnih opazovanjih, je treba število živali pove čati, da se zago ­
tovi, da je na voljo število živali, ki je potrebno za opazovanje in histopatologijo.
 
1.5.2  Tretirane in kontrolne skupine  
Na splošno se uporabijo najmanj tri skupine odmerkov in kontrolna 
skupina, a če se po oceni drugih podatkov ne pri čakuje nobenih 
učinkov pri ponavljajo čem odmerku 1 000 mg/kg telesne mase/dan, 
se lahko izvede mejni preskus. Če ni na voljo primernih podatkov, se 
lahko izvede študija za ugotavljanje obmo čja odmerkov, da pomaga 
določiti odmerke, ki se naj uporabijo. Razen pri tretiranju s 
preskusno snovjo, morajo biti živali v kontrolni skupini obravnavane enako kakor živali v preskusni skupini. Če je pri dajanju preskusne 
snovi uporabljen nosilec, mora kontrolna skupina prejeti koli čino 
nosilca, enako najve čji uporabljeni koli čini.
 
1.5.3  Preverjanje zanesljivosti  
Laboratorij, ki izvaja študijo, mora predložiti podatke, ki dokazujejo 
njegovo sposobnost za izvedbo študije in ob čutljivost uporabljenih 
postopkov. Ti podatki morajo zagotoviti dokaz o sposobnosti odkri ­
vanja in po potrebi koli činske opredelitve sprememb razli čnih ciljnih 
učinkov, ki se priporo čajo za opazovanje, na primer avtonomnih 
znakov, senzori čnih reakcij, mo či nožnega oprijema in motori čne 
aktivnosti. Informacije o kemikalijah, ki povzro čajo različne vrste 
nevrotoksi čnih odzivov in bi se lahko uporabljaje kot snovi pozitivne 
kontrole, so v sklicih od 2 do 9. Pretekli podatki se lahko uporabijo, 
če ostanejo bistveni vidiki poskusnih postopkov enaki. Priporo ča se 
občasno posodabljanje preteklih podatkov. Kadar izvajalski labora ­
torij spremeni kak bistven element pri izvajanju preskusa ali postop ­
kov, je treba razviti nove podatke, ki izkazujejo nadaljnjo ob čutlji­
vost postopkov.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 627
 
1.5.4  Izbira odmerkov  
Velikosti odmerkov se izberejo ob upoštevanju vsake predhodno 
opažene toksi čnosti in kineti čnih podatkov, ki so na voljo za 
preskusne zmesi ali sorodne materiale. Najve čjo velikost odmerka 
je treba izbrati s ciljem povzro čitve nevrotoksi čnih učinkov ali jasnih 
sistemskih toksi čnih učinkov. Padajo če zaporedje velikosti odmerkov 
je treba potem izbrati tako, da se pokažejo vse reakcije, ki so odvisne od odmerka, in vrednost brez opaznih škodljivih u činkov (NOAEL) 
pri najnižji velikosti odmerka. Na čeloma je treba velikosti odmerkov 
določiti tako, da se lahko primarni toksi čni učinki na živ čni sistem 
ločijo od učinkov, ki so povezani s sistemsko toksi čnostjo. Dvakratni 
do trikratni intervali so pogosto najprimernejši, ve činoma pa je bolje 
dodati dodatno, četrto preskusno skupino, kakor uporabiti zelo velike 
intervale med odmerki (npr. ve č kakor faktor 10). Kadar obstaja 
primerna ocena človekove izpostavljenosti, je treba upoštevati 
tudi to.
 
1.5.5  Mejni preskus  
Če študija pri eni velikosti odmerka najmanj 1 000 mg/kg telesne 
mase/dan, pri katerem so uporabljeni postopki, opisani za to študijo, 
ne da opaznih nevrotoksi čnih učinkov, in če toksičnost ni pri čako­
vana glede na podatke o strukturno sorodnih zmeseh, potem popolna študija z uporabo treh velikosti odmerkov morda ne bo potrebna. Pričakovana človekova izpostavljenost lahko narekuje potrebo, da 
se v mejnem preskusu uporabi ve čji oralni odmerek. Pri drugih 
vrstah dajanja, na primer pri vdihavanju ali dermalni aplikaciji, lahko fizikalno-kemijske lastnosti preskusne snovi pogosto dolo čajo 
največjo dosegljivo raven izpostavljenosti. Za izvedbo akutne oralne 
študije mora biti odmerek za mejni preskus najmanj 2 000 mg/kg.
 
1.5.6  Dajanje odmerkov  
Živali dobivajo odmerek preskusne snovi dnevno, sedem dni v 
tednu, najmanj 28 dni; uporabo petdnevnega režima odmerjanja ali 
krajše obdobje izpostavljenosti je treba utemeljiti. Če se preskusna 
snov daje z gavažo, jo je treba dati v enkratnem odmerku z uporabo želodčne sonde ali primerne intubacijske kanile. Maksimalna koli čina 
tekočine, ki jo je mogo če dati naenkrat, je odvisna od velikosti 
poskusnih živali. Koli čina ne sme presegati 1 ml/100 g telesne 
mase. Vendar se lahko v primeru vodnih raztopin upošteva uporaba do 2 ml/100 g telesne mase. Razen pri draže čih ali jedkih snoveh, ki 
pri višjih koncentracijah navadno povzro čajo močnejše učinke, je 
treba variabilnost preskusnega volumna s prilagajanjem koncentracije obdržati na kar najnižji ravni, zato da bi zagotovili konstantno koli ­ 
čino pri vseh odmerkih. 
Pri snoveh, ki se dajejo s hrano ali pitno vodo, je treba zagotoviti, da 
količine uporabljene preskusne snovi ne vplivajo na obi čajno raven 
vnosa hrane ali porabe vode. Kadar se preskusna snov daje s hrano, 
se lahko uporabi bodisi konstantna koncentracija v hrani (ppm) 
bodisi konstantna velikost odmerka glede na telesno maso živali; treba je navesti uporabljeni na čin. Če snov dajemo z gavažo, je 
treba odmerke dati vsak dan približno ob istem času in jih ustrezno 
prilagoditi, da se vzdržuje konstantna velikost odmerka glede na 
telesno maso živali. Če se študija s ponavljajo čimi odmerki izvaja 
kot predhodna študija za dolgotrajno študijo, je treba v obeh študijah uporabiti podobno hrano. Pri akutnih študijah se lahko odmerek, če 
posamezni odmerek ni mogo č, daje v manjših delih v obdobju, ki ne 
presega 24 ur.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 628
 
1.6 OPAZOVANJE  
1.6.1  Pogostost opazovanj in preskusov  
Pri študijah s ponavljajo čimi odmerki se obdobje opazovanja 
prekriva z obdobjem dajanja odmerka. Pri akutnih študijah je treba 
opazovati 14-dnevno obdobje po tretiranju. Pri živalih v satelitskih skupinah, ki ostanejo v obdobju po tretiranju neizpostavljene, opazo ­
vanja zajemajo tudi to obdobje. 
Opazovanja se opravijo dovolj pogosto, da je čim večja možnost za 
odkritje vedenjskih in/ali nevroloških anomalij. Opazovanja je 
najbolje opraviti vsak dan ob istem času, pri čemer se upošteva 
vrhunec pri čakovanih u činkov po odmerjanju. Pogostost klini čnih 
opazovanj in funkcionalnih preskusov je povzeta v Tabeli 2. Če 
kinetični ali drugi podatki, ki so dobljeni iz prejšnjih študij, kažejo 
na potrebo po uporabi drugih časov za opazovanja, preskuse ali 
obdobja po opazovanju, je treba sprejeti druga čen razpored, da bi 
dobili čim več informacij. Spremembe programa je treba utemeljiti.
 
1.6.1.1  Opazovanja splošnega zdravstvenega stanja in smrtnosti/obolevnosti  
Vse živali je treba najmanj enkrat dnevno natan čno opazovati glede 
zdravstvenega stanja, najmanj dvakrat dnevno pa tudi glede obolev ­
nosti in smrtnosti.  
1.6.1.2  Podrobna klini čna opazovanja  
Podrobna klini čna opazovanja se na vseh živalih, ki so izbrane v ta 
namen (glej Tabelo 1), opravijo enkrat pred prvo izpostavljenostjo 
(zaradi primerjav na istem osebku) in potem v razli čnih presledkih, 
odvisno od trajanja študije (glej Tabelo 2). Podrobna klini čna opazo­
vanja satelitskih obnovitvenih skupin je treba opraviti na koncu obnovitvenega obdobja. Podrobna klini čna opazovanja je treba opra ­
viti zunaj doma če kletke na standardnem mestu. Opažanja je treba 
skrbno dokumentirati s pomo čjo meril in to čkovanj za vsako meritev 
pri opazovanju. Laboratorij, ki opravlja preskus, mora jasno oprede ­
liti merila ali lestvice. Prizadevati si je treba, da so odstopanja od 
pogojev preskušanja čim manjša (ne sistemati čno povezana s tretira ­
njem) in da opazovanja izvajajo usposobljeni opazovalci, ki ne poznajo dejanskega tretiranja. 
Priporočljivo je, da se opazovanja izvajajo na strukturiran na čin, kjer 
se dobro opredeljena merila (vklju čno z opredelitvijo normalnega 
„območja“) uporabljajo sistemati čno za vsako žival v vsakem opazo ­
valnem času. „Normalno obmo čje“ mora biti ustrezno dokumenti ­
rano. Vse opažene znake je treba zabeležiti. Vedno, kadar je to 
izvedljivo, se zabeleži tudi velikost opaženih znakov. Klini čna 
opazovanja morajo obsegati tudi, vendar ne samo, spremembe na koži, kožuhu, o čeh, sluznicah, pojav sekrecije in ekskrecije ter delo ­
vanje avtonomnega živ čevja (npr. lakrimacija, piloerekcija, velikost 
zenic, nenormalen vzorec dihanja in/ali dihanje skozi usta, vsi nena ­
vadni znaki uriniranja in izlo čanja blata ali razbarvan urin).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 629
 
Zapisati je treba tudi vse nenavadne odzive v zvezi s položajem 
telesa, stopnjo aktivnosti (npr. zmanjšanje ali pove čanje raziskovanja 
standardnega mesta) in koordinacijo gibov. Zabeležiti je treba spre ­
membe v hoji (npr. zibanje, ataksija), drži (npr. grbast hrbet) in reagiranju na ravnanje, nameš čanje ali druge okoljske dražljaje, pa 
tudi navzo čnost kloni čnih ali toni čnih gibov, kr čev ali tremorja, 
stereotipe (npr. prekomernega čiščenja, nenavadnih gibov z glavo, 
ponavljajo čega se krožnega premikanja) ali nenormalno vedenje (npr. 
grizenje ali čezmerno lizanje, samomali čenje, zadenjsko hojo, odda ­
janje zvokov) ali agresivnost.
 
1.6.1.3  Funkcionalni preskusi  
Podobno kakor podrobna klini čna opazovanja je treba tudi funkcio ­
nalne preskuse izvesti enkrat pred izpostavljenostjo in potem pogosto 
pri vseh živalih, izbranih v ta namen (glej Tabelo 1). Tudi pogostost funkcionalnega preskušanja je odvisna od trajanje študije (glej Tabelo 2). Poleg obdobij opazovanja iz Tabele 2 je treba tudi funk ­
cionalna opazovanja o satelitskih obnovitvenih skupinah opraviti čim 
bliže kon čni usmrtitvi. Funkcionalni preskusi vklju čujejo senzori čne 
reakcije na razli čne dražljaje [npr. akusti čne, vizualne in propriocep ­
tivne dražljaje (5) (6) (7)], oceno mo či nožnega oprijema (8) in 
oceno motori čne aktivnosti (9). Motori čno aktivnost je treba izmeriti 
z avtomatiziranim sredstvom, ki lahko odkrije oboje, zmanjšanje in povečanje aktivnosti. Če se uporabi drug opredeljen sistem, mora biti 
količinski in z dokazano ob čutljivostjo in zanesljivostjo. Vsako sred ­
stvo mora biti preskušeno, da je zagotovljena zanesljivost v času in 
skladnost med sredstvi. Nadaljnje podrobnosti glede možnih postopkov so podane v navedeni literaturi. Če ni podatkov (npr. o 
strukturni aktivnosti, epidemioloških podatkov, drugih toksikoloških 
študij) za navedbo potencialnih nevrotoksi čnih učinkov, je treba 
razmisliti o vklju čitvi bolj specializiranih preskusov za podrobnejšo 
preučitev možnih u činkov senzori čne in motori čne funkcije ali 
učenja in spominjanja. Ve č informacij o bolj specializiranih 
preskusih in njihovi uporabi je navedenih v (1). 
Izjemoma se lahko živali, ki kažejo znake toksi čnosti v takem 
obsegu, da bi znatno vplivali na funkcionalni preskus, izpustijo pri 
tem preskusu. Izlo čitev živali iz funkcionalnega preskusa je treba 
utemeljiti.
 
1.6.2  Telesna masa in poraba hrane/vode  
Pri študijah, ki trajajo do 90 dni, je treba vse živali stehtati najmanj 
enkrat na teden in meriti porabo hrane (porabo vode, kadar se preskusna snov daje v tem mediju) najmanj tedensko. Pri dolgo ­
trajnih študijah je treba prvih 13 tednov vse živali stehtati najmanj 
enkrat na teden in potem najmanj enkrat na 4 tedne. Meritve porabe hrane (porabe vode, kadar se preskusna snov daje v tem mediju) je treba v prvih 13 tednih opravljati najmanj tedensko in potem v 
približno trimese čnih presledkih, razen če zdravstveno stanje ali spre ­
membe telesne mase narekujejo druga če.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 630
 
1.6.3  Oftalmologija  
Pri študijah, ki trajajo dlje kakor 28 dni, je treba oftalmološko 
preiskavo z uporabo oftalmoskopa ali ustreznega enakovrednega instrumenta izvesti pred dajanjem preskusne snovi in na koncu 
študije, najbolje na vseh živalih, vendar vsaj v skupini živali z 
velikim odmerkom in v kontrolni skupini. Če se odkrijejo spre ­
membe na o čeh ali če klinični znaki narekujejo tako potrebo, je 
treba preiskati vse živali. Pri dolgotrajnih študijah je treba oftalmo ­
loško preiskavo izvesti tudi po 13 tednih. Oftalmoloških preiskav ni 
treba izvajati, če so ti podatki že na voljo iz drugih študij s 
podobnim trajanjem in podobno velikostjo odmerkov.
 
1.6.4  Hematologija in klini čna biokemija  
Kadar se študija nevrotoksi čnosti izvaja v kombinaciji s študijo 
sistemske toksi čnosti s ponavljajo čimi odmerki, je treba opraviti 
hematološke preiskave in klini čne biokemi čne določitve, kakor je 
določeno v metodi za študije sistemske toksi čnosti. Zbiranje vzorcev 
je treba izvajati na tak na čin, da so potencialni u činki na nevrove ­
denje čim manjši.  
1.6.5  Histopatologija  
Nevropatološke preglede je treba na črtovati tako, da dopolnjujejo in 
razširijo opazovanja, opravljena med fazo študije  in vivo.  Tkiva 
najmanj 5 živali na spol in skupino (glej Tabelo 1 in naslednji 
odstavek) se fiksirajo  in situ  z uporabo splošno priznanih tehnik 
perfuzije in fiksacije (glej sklic 3, poglavje 5 in sklic 4, poglavje 50). Zabeležijo se vse ve čje opazne spremembe. Kadar se študija 
opravlja kot samostojna študija presejanja nevrotoksi čnosti ali za 
označitev nevrotoksi čnih učinkov, se lahko preostale živali uporabijo 
za posebne nevrovedenjske (10) (11), nevropatološke (10) (11) (12) (13), nevrokemi čne (10) (11) (14) (15) ali elektrofiziološke (10) (11) 
(16) (17) postopke, ki lahko dopolnijo tukaj opisane postopke in 
preiskave ali pove čajo število histopatološko preu čevanih osebkov. 
Ti dopolnilni postopki so lahko še posebno koristni, kadar empiri čna 
opazovanja ali pri čakovani u činki kažejo posebno vrsto ali cilj 
nevrotoksi čnosti (2) (3). Preostale živali pa se lahko uporabijo tudi 
za rutinska patološka vrednotenja, opisana v metodi za študije s ponavljajo čimi odmerki. 
Vse vzorce tkiva, vstavljene v parafin, je treba barvati po splošnem 
postopku, na primer s hematoksilinom in eozinom (H&E), in izvesti mikroskopski pregled. Če se opazijo ali domnevajo znaki periferne 
nevropatije, je treba preiskati v plastiko vstavljene vzorce perifernega 
živčnega tkiva. Klini čni znaki lahko nakazujejo tudi dodatna mesta 
za preiskavo ali uporabo posebnih postopkov barvanja. Napotki o dodatnih mestih za preiskavo so v (3) (4). V pomo č pri dokazovanju 
posebnih vrst patoloških sprememb so lahko tudi ustrezne posebne 
barve (18).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 631
 
Reprezentativne prereze osrednjega in perifernega živ čnega sistema 
je treba histološko pregledati (glej sklic 3, poglavje 5 in sklic 4, 
poglavje 50). Pregledana obmo čja navadno vklju čujejo: velike 
možgane, osrednji del možganov (limbi čni sistem), skupaj s 
prerezom hipokampusa, medmožgane, male možgane, pons, medulo 
oblongato, oko z vidnim živcem in mrežnico, hrbtenja čo ob vratnem 
in ledvenem delu, spinalne ganglije, dorzalna in ventralna vlakna, proksimalni bedrni živec, proksimalni goleni čni živec (pri kolenu) in 
veje goleni čnega živca v me čni mišici. Rezine hrbtenja če in peri ­
fernih živcev vklju čujejo prečne ali diagonalne in vzdolžne prereze. 
Pozornost je treba posvetiti ožilju živ čnega sistema. Pregledati je 
treba tudi vzorec skeletne mišice, zlasti me čne mišice. Posebno 
pozornost je treba posvetiti mestom s celi čno in vlaknasto strukturo 
in vzorcu v osrednjem in perifernem živ čnem sistemu, za katere je 
znano, da jih nevrotoksikanti posebno prizadenejo. 
Napotki o nevropatoloških spremembah, ki so tipi čna posledica izpo ­
stavljenosti toksi čnim snovem, so v sklicih (3)(4). Priporo ča se 
postopna preu čitev vzorcev, pri kateri se s kontrolno skupino najprej 
primerjajo prerezi iz skupine z velikim odmerkom. Če se v vzorcih 
iz teh skupin ne opazi nobene nevropatološke spremembe, nadaljnja 
analiza ni potrebna. Če se v skupini z velikim odmerkom opazijo 
nevropatološke spremembe, je treba potem zaporedno preu čiti in 
označiti vzorce iz vseh potencialno prizadetih tkiv iz skupin s sred ­
njim in majhnim odmerkom. 
Če se pri pregledu kakovosti najde kakršen koli dokaz o nevropato ­
loških spremembah, potem je treba drugi pregled opraviti na vseh 
območjih živčnega sistema, ki kaže te spremembe. Prereze iz vseh 
skupin odmerkov iz vsakega potencialno prizadetega obmo čja je 
treba ozna čiti in preu čiti naključno, brez poznavanja oznake. Pogo ­
stost in resnost vsake lezije je treba zabeležiti. Ko so ocenjena vsa 
območja iz vseh skupin odmerkov, se lahko oznaka raz členi in 
opravi statisti č
na analiza za ovrednotenje odnosov med odmerkom 
in odzivom. Opisati je treba primere razli čnih stopenj resnosti za 
vsako lezijo. 
Nevropatološke ugotovitve je treba ovrednotiti v smislu vedenjskih 
opazovanj in meritev, pa tudi drugih podatkov iz prejšnjih in 
sočasnih študij sistemske toksi čnosti preskusne snovi.  
2. PODATKI  
2.1 OBDELAVA REZULTATOV 
Predložiti je treba podatke za vsako posamezno žival. Nadalje je 
treba vse podatke prikazati v obliki tabele, iz katere so za vsako preskusno ali kontrolno skupino razvidni naslednji podatki: število 
živali na za četku preskusa in število živali, med preskusom najdenih 
mrtvih ali usmr čenih iz humanih razlogov, nato čas smrti oziroma 
humane usmrtitve, število živali, ki kažejo znake toksi čnosti, opis 
opaženih znakov toksi čnosti, vklju čno s časom, ko so toksi čni učinki 
prvikrat nastopili, njihovim trajanjem, vrsto in jakostjo, število živali 
s poškodbami, vklju čno z vrsto in resnostjo poškodb.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 632
 
2.2 VREDNOTENJE IN RAZLAGA REZULTATOV 
Ugotovitve študije je treba ovrednotiti glede na pojavnost, resnost in 
soodvisnost nevrovedenj skih in nevropatoloških u činkov (vklju čeni 
so nevrokemij ski ali elektrofiziološki u činki, pa tudi dopolnilne 
preiskave) ter drugih opaženih škodljivih u činkov. Če je mogo če, 
je treba numeri čne podatke ovrednotiti s primerno splošno sprejeto 
statistično metodo. Statisti čne metode se izberejo med na črtovanjem 
študije.  
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: 
Preskusna snov: — fizikalno stanje (vklju čno z izomerizmom, čistostjo in fizikalno- 
kemijskimi lastnostmi), 
— identifikacijske podatke. Nosilec (po potrebi): — utemeljitev izbire nosilca. Preskusne živali: — uporabljeno vrsto/sev, — število, starost in spol živali, — izvor, nastanitvene razmere, prilagoditev, hrano ipd., — maso posameznih živali na za četku preskusa. 
Preskusni pogoji: — podatke o sestavi preskusne snovi/pripravi hrane, doseženi 
koncentraciji, stabilnosti in homogenosti pripravka: 
— specifikacijo uporabljenih odmerkov, vklju čno s podatki o 
nosilcu, koli čini in fizi čni obliki danega materiala, 
— podatke o dajanju preskusne snovi, — utemeljitev izbire velikosti odmerkov, — utemeljitev na čina in trajanja izpostavljenosti, 
— preračunavanje koncentracije preskusne snovi v hrani/pitni vodi 
(ppm) v dejanski odmerek (mg/kg telesne mase/dan), če je 
primerno, 
— podatke o kakovosti hrane in vode. Opazovanje in preskusni postopki: — podatke o dodelitvi živali iz vsake skupine v perfuzij ske podsku ­
pine, 
— podatke o sistemih to čkovanja, vklju čno z merili in to čkovalnimi 
lestvicami za vsako meritev v podrobnih klini čnih opazovanjih,
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 633
 
— podatke o funkcionalnih preskusih za sensori čne reakcije na 
različne dražljaje (npr. akusti čne, vizualne in proprioceptivne); 
za ocenjevanje mo či nožnega oprijema; za ocenjevanje motori čne 
aktivnosti (vklju čno s podatki o avtomatiziranih sredstvih za 
odkrivanje aktivnosti); in drugih uporabljenih postopkih, 
— podatke o oftalmoloških preiskavah in, če je primerno, hematolo ­ 
ških preiskavah in klini čnih biokemijskih preskusih z ustreznimi 
normalnimi vrednostmi, 
— podatke za posebne nevrovedenjske, nevropatološke, nevroke ­
mične ali elektrofiziološke postopke. 
Rezultati: — telesno maso/spremembe telesne mase, vklju čno s telesno maso 
ob usmrtitvi, 
— porabo hrane in porabo vode, kar je primerno, — podatke o toksi čnem učinkovanju glede na spol in velikost 
odmerka, vklju čno z znaki toksi čnosti, 
— vrsto, resnost in trajanje ( čas začetka in poznejši potek) 
podrobnih klini čnih opazovanj (ali so reverzibilna ali ne), 
— natančen opis vseh rezultatov funkcionalnega preskusa, 
— ugotovitve obdukcije, 
— podroben opis vseh nevrovedenjskih, nevropatoloških in nevro ­
kemijskih ali elektrofizioloških ugotovitev, če so na voljo, 
— podatke o absorpciji in presnovi, če so na voljo, 
— statisti čno obdelavo rezultatov, po potrebi. 
Razprava o rezultatih: — informacije o odzivu na odmerek, 
— odnos katerih koli drugih toksi čnih učinkov do zaklju čka o 
nevrotoksi čnem potencialu preskusne kemikalije, 
— vrednost brez opaznih škodljivih u činkov. 
Zaključki: 
— zaželena je posebna izjava o celotni nevrotoksi čnosti preskusne 
kemikalije.
 
4. LITERATURA  
(1) OECD Giudance Document on Neurotoxicity Testing Strate ­
gies and Test Methods. OECD, Paris. V pripravi. 
(2) Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study, 
OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. V pripravi. 
(3) World Health Organization (WHO) (1986). Environmental 
Health Criteria document 60: Principles and Methods for the 
Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to Chemicals. 
(4) Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. (1980). Experimental and 
Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, P.S. and Schaumburg, 
H.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/London.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 634
 
(5) Tupper, D.E. and Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neuro ­
logical Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 
999–1003. 
(6) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Indu ­
strial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691–704. 
(7) Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M. (1991). Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observa ­
tional Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. 
Appl. Pharmacol., 108, 267–283. 
(8) Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T. 
(1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and 
Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxi ­
col., I, 233–236. 
(9) Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, 
L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for 
Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 
599–609. 
(10) Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds. (1992). Neurotoxicology 
Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York. 
(11) Chang, L.W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. 
Marcel Dekker, New York. 
(12) Broxup, B. (1991). Neuopathology as a screen for Neurotoxi ­
city Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, 689–695. 
(13) Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C. 
(1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydro ­
xyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 
18, 343–352. 
(14) O'Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as 
Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 10, 445–452. 
(15) O'Callaghan J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute Exposure of 
the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Then, 244, 368–378. 
(16) Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G. (1982). Elec ­
trophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous 
System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, pp 299–335. 
(17) Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Methods in neuro ­
toxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxico ­
logy. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams 
and Wilkins Co.,. Baltimore/London, pp. 726–742. 
(18) Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and Pratice of 
Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological Tech ­
niques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Living ­
stone.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 635
 
Tabela 1  
Najmanjše število živali, ki so potrebne na skupino, kadar se študija nevrotoksi čnosti izvaja posebej ali v 
kombinaciji s študijami  
ŠTUDIJA NEVROTOKSI ČNOSTI, IZVEDENA KOT: 
Posebna študija Kombinirana študija z 
28-dnevno študijo Kombinirana študija z 
90-dnevno študijo Kombinirana študija s 
študijo kroni čne 
toksičnosti 
Skupno število živali na 
skupino 10 samcev in 10 
samic 10 samcev in 10 
samic 15 samcev in 15 
samic 25 samcev in 25 
samic 
Število živali, izbranih za 
funkcionalno preskušanje, vključno s podrobnimi 
kliničnimi opazovanji 10 samcev in 10 
samic 10 samcev in 10 
samic 10 samcev in 10 
samic 10 samcev in 10 
samic 
Število živali, izbranih za 
perfuzijo  in situ  in nevrohi ­
stopatologijo 5 samcev in 5 
samic 5 samcev in 5 
samic 5 samcev in 5 
samic 5 samcev in 5 samic 
Število živali, izbranih za 
opazovanja toksi čnosti s 
ponavljajo čimi odmerki/ 
subkronično/kronično, 
hematologijo, klini čno 
biokemijo, histopatologijo itd., kakor je navedeno v zadevnih  Smernicah  5 samcev in 5 
samic 10 samcev † in 10 
samic † 20 samcev † in 20 
samic † 
Po potrebi dopolnilna 
opazovanja 5 samcev in 5 
samic
 
† Vklju čuje pet živali, izbranih za funkcionalno preskušanje in podrobna klini čna opazovanja kot del študije nevrotoksi čnosti. ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 636
 
Tabela 2  
Pogostost klini čnih opazovanj in funkcionalnih preskusov  
Vrsta opazovanja Trajanje študije 
Akutno 28 dni 90 dni Kroni čno 
Pri vseh živalih Splošno zdrav ­
stveno stanje dnevno dnevno dnevno dnevno 
Smrtnost/obolev ­
nost dvakrat dnevno dvakrat dnevno dvakrat dnevno dvakrat dnevno 
Pri živalih, izbranih 
za funkcionalna opaz ovanja Podrobna 
klinična opazo­
vanja — pred prvo 
izpostavlje ­
nostjo 
— v 8 urah po 
odmerjanju 
v pričako­
vanem času 
vrhunca 
učinka 
— 7. in 14. dan 
po odmer ­
janju — pred prvo 
izpostavlje ­
nostjo 
— potem enkrat 
tedensko — pred prvo 
izpostavlje ­
nostjo 
— enkrat v 
prvem ali 
drugem tednu izpo ­
stavljenosti 
— potem 
mesečno — pred prvo 
izpostavlje ­
nostjo 
— enkrat na 
koncu prvega 
meseca izpo ­
stavljenosti 
— potem vsake 
tri mesece 
Funkcionalni 
preskusi — pred prvo 
izpostavlje ­
nostjo 
— v 8 urah po 
odmerjanju 
v pričako­
vanem času 
vrhunca učinka 
— 7. in 14. dan 
po odmer ­
janju — pred prvo 
izpostavlje ­
nostjo 
— v četrtem 
tednu treti ­
ranja č
im 
bliže koncu obdobja izpostavlje ­
nosti — pred prvo 
izpostavlje ­
nostjo 
— enkrat v 
prvem ali 
drugem 
tednu izpo ­
stavljenosti 
— potem 
mesečno — pred prvo 
izpostavlje ­
nostjo 
— enkrat na 
koncu prvega 
meseca izpo ­
stavljenosti 
— potem vsake 
tri mesece
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 637
 
B.44  ABSORPCIJA SKOZI KOŽO: METODA  IN VIVO  
1. METODA  
Ta preskusna metoda je enakovredna OECD TG 427 (2004).  
1.1 UVOD 
Izpostavljenost številnim kemikalijam se v glavnem dogaja skozi 
kožo, medtem ko se pri ve čini toksikoloških študij, opravljenih na 
živalih v laboratoriju kemikalije dajejo oralno. Študija perkutane absorpcije  in vivo,  določena v teh smernicah vzpostavlja povezavo, 
potrebno za ekstrapoliranje iz oralnih študij, pri ocenah varnosti po 
izpostavljenosti kože. 
Snov mora preiti veliko celi čnih plasti kože, preden lahko pride do 
obtoka. Plast, ki dolo ča stopnjo za ve čino snovi, je  stratum corneum  
(rožena plast), sestavljena iz mrtvih celic. Prepustnost skozi kožo je odvisna tako od lipofilnosti kemikalije in debeline zunanje plasti epidermisa, kakor tudi od dejavnikov, kot je molekulska masa in 
koncentracija snovi. V splošnem je koža podgan in kuncev bolj 
prepustna od človeške kože, prepustnost kože morskih praši čkov in 
opic pa je bolj podobna prepustnosti človeške kože. 
Metode za merjenje absorpcije skozi kožo so razdeljene v dve kate ­
goriji:  in vivo  ter in vitro.  Po metodi  in vivo  lahko pridobimo dobre 
informacije o absorpciji skozi kožo za razli čne laboratorijske vrste. V 
zadnjem času so se bolj razvile metode  in vitro.  Pri le-teh se upora ­
blja prenos čez celotno ali delno debelino živalske ali človeške kože 
v posodo s teko čino. Metoda  in vitro je  opisana posebej v lo čeni 
preskusni metodi (1). Priporo čljivo je, da se preverijo Napotki 
OECD za izvajanje študij o absorpciji skozi kožo (2) kot pomo č 
pri izbiri najbolj ustrezne metode v dani situaciji, saj vsebujejo ve č 
podrobnosti o ustreznosti tako  in vivo,  kakor tudi  in vitro  metode. 
Metoda  in vivo,  ki je tu opisana, omogo ča določanje penetracije 
preskusne snovi skozi kožo v sistemski prostor. Ta tehnika se upora ­
blja že mnogo let (3) (4) (5) (6) (7). Čeprav so študije perkutane 
absorpcije  in vitro  v številnih primerih lahko ustrezne, pa v dolo ­ 
čenih situacijah le študija  in vivo  lahko da potrebne podatke. 
Prednosti metode  in vivo  so, da uporablja fiziološko in presnovno 
nedotaknjen sistem, uporablja vrste, ki so skupne številnim toksiko ­
loškim študijam in se lahko spreminja za uporabo pri drugih vrstah. Slabo stran pa predstavljajo uporaba živih živali, potreba po mate ­
rialu, ozna čenem z radioaktivnim izotopom za omogo čanje zane ­
sljivih rezultatov, težave pri dolo čanju faze zgodnje absorpcije ter 
razlike v prepustnosti kože zaželenih vrst (podgane) in človeške 
kože. Živalska koža je v splošnem bolj prepustna in zato se lahko 
prekutana absorpcija pri človeku preceni (6) (8) (9). Kavsti čne/koro­
zivne snovi se na živih živalih ne preskušajo.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 638
 
1.2 OPREDELITEV POJMOV  
Neabsorbirani odmerek:  pomeni odmerek, izpran s površine kože 
po izpostavljenosti in vsak odmerek, prisoten na neokluzivni ovoj ­
nici, vklju čno z vsakim odmerkom, ki bo izhlapel iz kože med 
izpostavljenostjo. 
Absorbirani odmerek  (in vivo):  je odmerek, prisoten v urinu, 
ostankih izpiranja kletke, iztrebkih, izdihanem zraku ( če se meri), 
krvi, tkivih ( če se odvzemajo) in preostalem trupu po odstranitvi 
mesta kože za nanos.  
Absorpcijski odmerek:  pomeni odmerek, prisoten na ali v koži po 
izpiranju.  
1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Preskusna snov, ki naj bo ozna čena z radioaktivnim izotopom, se 
nanese na pobrito kožo živali v eni ali ve č ustreznih velikostih 
odmerka v obliki reprezentan čnega pripravka v uporabi. Preskusni 
pripravek se pusti v stiku s kožo dolo čeno časovno obdobje pod 
ustrezno ovojnico (neokluzivno, polokluzivno ali okluzivno) zaradi preprečitve zaužitja preskusnega pripravka. Ob koncu obdobja izpo ­
stavljenosti se ovojnica odstrani in koža se o čisti z ustreznim 
čistilnim sredstvom, ovojnica ter čistilna sredstva se shranijo za 
analizo, uporabi pa se sveža ovojnica. Živali so nastanjene v posa ­
meznih presnovnih kletkah pred, med in po obdobju izpostavljenosti, 
iztrebki in izdihani zrak v tem obdobju pa se zberejo za analizo. 
Zbiranje izdihanega zraka se lahko opusti, če je dovolj podatkov, da 
se ustvarja malo ali ni č hlapnih radioaktivnih metabolitov. V vsako 
študijo je obi čajno vklju čenih več skupin živali, ki bodo izposta ­
vljene preskusnemu pripravku. Na koncu obdobja izpostavljenosti 
se eno skupino usmrti. Druge skupine se zatem usmrtijo v rednih časovni razmikih (2). Ob koncu obdobja vzor čenja se preostale živali 
usmrtijo, odvzame se kri za analizo, prostor nanosa se odstrani za 
analizo, trupi pa se analizirajo zaradi morebitnih neiztrebljenih snovi. 
Vzorci se preskusijo z ustreznimi sredstvi in oceni se stopnja preku ­
tane absorpcije (6) (8) (9).
 
1.4 OPIS METODE  
1.4.1  Izbira živalskih vrst  
Najbolj pogosto uporabljene vrste so podgane, lahko pa se upora ­
bljajo tudi linije brez dlak in vrste, katerih stopnje absorpcije skozi 
kožo so bolj podobne človeškim (3) (6) (7) (8) (9). Uporabljajo se 
mlade, odrasle, zdrave živali enega spola (privzet je moški spol) in linij, ki se obi čajno uporabljajo v laboratorijih. Ob za četku študije 
teža uporabljenih živali ne sme odstopati za ve č kot ± 20 % od 
povprečne teže. Primerne so, na primer, podgane moškega spola s 
težo 200 g–250 g, zlasti v zgornji polovici tega obsega.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 639
 
1.4.2  Število in spol živali  
Skupina vsaj štirih živali enega spola se uporabi za vsak preskusni 
pripravek in vsak na črtovan čas usmrtitve. Skupine živali se usmrtijo 
v različnih časovnih razmikih, najprej na primer ob koncu obdobja 
izpostavljenosti (tipi čno 6 ali 24 ur) in nato naslednje (npr. po 48 in 
72 urah). Če obstajajo podatki, ki kažejo na bistvene razlike v 
dermalni toksi čnosti med moškim in ženskim spolom, se izbere 
bolj občutljiv spol. Če takih podatkov ni, se lahko uporablja kateri 
koli spol.  
1.4.3  Pogoji nastanitve in hranjenja  
Temperatura v prostoru za poskuse na živalih naj bo 22  o C(± 3  o C). 
Čeprav naj bi bila relativna vlažnost vsaj 30 % in naj po možnosti ne 
bi presegala 70 %, razen med čiščenjem prostora, bi cilj moral biti 
50–60 %. Osvetlitev naj bo umetna, in sicer 12 ur svetlobe, 12 ur 
teme. Za hranjenje se lahko uporablja obi čajna laboratorijska hrana, 
ki naj bo prosto na voljo, skupaj z neomejeno koli čino pitne vode. 
Med študijo in po možnosti tudi med aklimatizacijo so živali nameš ­ 
čene v presnovnih kletkah posami čno. Ker bi razlitje hrane in vode 
ogrozilo rezultate, je treba verjetnost takih dogodkov čim bolj zmanj ­ 
šati. 
1.4.4  Priprava živali  
Živali se ozna čijo zaradi posamezne identifikacije in zadržujejo v 
kletkah vsaj pet dni pred za četkom študije zaradi aklimatizacije na 
laboratorijske pogoje. 
Po preteku obdobja aklimatizacije in približno 24 ur pred odmerja ­
njem se vsaka žival obrije na ramenskem predelu in hrbtu. Prepust ­
nost je pri poškodovani druga čna kot pri nedotaknjeni, zato je treba 
paziti, da se koža ne odrgne. Po opravljenem britju in približno 24 ur pred nanosom preskusne snovi na kožo (glej oddelek 1.4.7) je treba površino kože o čistiti z acetonom, da se odstrani maš čoba. Dodatno 
umivanje z milom in vodo ni priporo čljivo, saj lahko vsak ostanek 
mila pospeši absorpcijo preskusne snovi. Površina mora biti dovolj velika, da omogo či zanesljive izra čune absorbirane koli čine 
preskusne kemikalije na cm kože, po možnosti vsaj 10 cm . Taka 
površina je možna pri podganah s telesno težo 200-250 g. Po 
pripravi se živali vrnejo v presnovne kletke.
 
1.4.5  Preskusna snov  
Preskusna snov je snov, katere penetracijske zna čilnosti se preu ču­
jejo. V idealnem primeru naj bi bila preskusna snov ozna čena z 
radioaktivnim izotopom.  
1.4.6  Preskusni pripravek  
Pripravek preskusne snovi (npr. čist, razred čen ali sestavljen mate ­
rial, ki vsebuje preskusno kemikalijo, ki se nanese na kožo) naj bo 
enak (ali realisti čen nadomestek) tistemu, kateremu so izpostavljeni 
ljudje ali druge možne ciljne vrste. Vsako odstopanje od pripravka, ki se uporablja v praksi, mora biti utemeljeno. Po potrebi se preskusna snov raztopi ali razred či v primernem nosilcu. Če je 
nosilec kaj drugega kot voda, morajo biti znane absorpcijske last ­
nosti in možno medsebojno vplivanje s preskusno snovjo.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 640
 
1.4.7  Nanos na kožo  
Na površini kože se dolo či mesto nanosa dolo čene površine. Znana 
količina preskusnega pripravka se nato enakomerno nanese na povr ­ 
šino. Ta koli čina mora obi čajno oponašati možno človeško izposta ­
vljenost, tipi čno 1–5 mg/cm  2 za trdne snovi ali do 10 μl/cm za 
tekočine. Vse druge koli čine morajo biti utemeljene s pri čakovanimi 
pogoji uporabe, cilji preu čevanja ali fizi čnimi lastnostmi preskusnega 
pripravka. Po nanosu je treba živali prepre čiti negovanje tretiranega 
mesta. Primer tipi čne naprave je prikazan na Sliki 1. Obi čajno se 
mesto nanosa zaš čiti z neokluzivno ovojnico (npr. prepustno 
najlonsko gazo). Pri neprekinjenem nanašanju pa je potrebna okluzija 
na mestu nanosa. V primeru, da izhlapevanje polhlapnih preskusnih 
snovi zmanjša stopnjo izkoristka preskusne snovi do nesprejemljive mere (glej tudi oddelek 1.4.10, prvi odstavek), je treba ujeti izhlapelo snov v ogleni filter, ki pokriva napravo za nanos (glej Sliko 1). 
Pomembno je, da naprava ne poškoduje kože ali absorbira preskus ­
nega pripravka ali reagira z njim. Živali se vrnejo v posamezne presnovne kletke, da se zberejo iztrebki.
 
1.4.8  Trajanje izpostavljenosti in jemanje vzorcev  
Trajanje izpostavljenosti je časovni razmik med nanosom in odstra ­
nitvijo preskusnega pripravka z izpiranjem kože. Uporablja naj se ustrezno obdobje izpostavljenosti (tipi čno 6 ali 24 ur) na podlagi 
pričakovanega trajanja izpostavljenosti človeka. Po preteku obdobja 
izpostavljenosti se živali zadržijo v presnovnih kletkah do na črtovane 
usmrtitve. Živali je treba opazovati zaradi znakov toksi čnosti/nenor ­
malnih reakcij v rednih časovnih razmikih med celotnim trajanjem 
študije. Ob koncu obdobja izpostavljenosti je treba pregledati obde ­
lano kožo zaradi vidnih znakov razdraženosti. 
Presnovne kletke morajo omogo čati ločeno zbiranje urina in 
iztrebkov med celo študijo. Omogo čati morajo tudi zbiranje
 14 C- 
ogljikovega dioksida in hlapnih  14 C-ogljikovih spojin, ki se analizi ­
rajo, če so prisotne v ve čji količini (> 5 %). Urin, iztrebke in ujete 
tekočine (npr.  14 C-ogljikov dioksid in hlapne  14 C-spojine) je treba 
zbirati lo čeno za vsako skupino ob vsakem času vzorčenja. Če 
obstaja dovolj podatkov, da se ustvarja malo ali ni č hlapnih radioa ­
ktivnih metabolitov, se lahko uporabljajo odprte kletke. 
Iztrebki se zbirajo med obdobjem izpostavljenosti, do 24 ur po 
prvem stiku s kožo in nato dnevno do konca poskusa. Medtem ko so trije časovni razmiki za zbiranje iztrebkov obi čajno dovolj, pa 
lahko, glede na predviden namen preskusnega pripravka ali obstoje če 
kinetične podatke, pridejo v poštev tudi bolj ustrezni ali dodatni 
trenutki za študijo. 
Ob koncu obdobja izpostavljenosti se z vsake živali odstrani zaš čitna 
naprava in lo čeno shrani za analizo. Obdelano kožo vseh živali je 
treba vsaj trikrat izprati s čistilnim sredstvom z ustreznimi brisi. 
Paziti je treba, da se ne okužijo drugi deli telesa. Uporabi naj se 
čistilno sredstvo, ki je tipi čno za obi čajno telesno higieno, npr. 
milnica. Na koncu se kožo osuši. Vse brise in kar se izpere je treba shraniti za analizo. Za zaš čito obdelanega mesta tistih živali, 
ki sestavljajo skupine za kasnejše časovne to čke, je treba pred 
njihovo vrnitvijo v posamezne kletke uporabiti svežo ovojnico.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 641
 
1.4.9  Zaklju čni postopki  
Za vsako skupino je treba posamezne živali usmrtiti ob dolo čenem 
času in zbrati kri za analizo. Zaš čitno napravo ali ovojnico je treba 
odstraniti za analizo. Kožo z mesta nanosa in podobne površine, na 
katero ni bil nanesen odmerek, vendar je bila pobrita, je treba odstra ­
niti z vsake živali za lo čeno analizo. Mesto nanosa se lahko frak ­
cionira, da se lo či stratum corneum  od podleže čega epidermisa 
zaradi zagotavljanja ve č podatkov o stanju preskusne kemikalije. 
Ugotavljanje tega stanja v času po obdobju izpostavljenosti bi 
moralo pokazati usodo vseh preskusnih kemikalij v  stratum 
corneum.  Zaradi omogo čanja frakcioniranja kože (po kon čnem izpi­
ranju kože in usmrtitvi živali) se odstrani vsaka zaš čitna ovojnica. 
Mesto nanosa na kožo in še krožni predel okoli njega se izreže s podgane in pripne na desko. Kos lepilnega traku se rahlo pritisne na površino kože in odstrani skupaj z delom  stratum corneum.  To se 
nadaljuje, dokler se trak ve č ne prilepi na površino kože, ko je 
odstranjen ves  stratum corneum.  Za vsako žival se trakovi lahko 
kombinirajo v eni posodi, v katero se doda sredstvo za razgradnjo tkiv, da raztopi  stratum corneum.  Vsa morebitna ciljna tkiva se lahko 
odstranijo za lo čeno merjenje, preden se opravi analiza absorbiranega 
odmerka v preostanku trupa. Trupe posameznih živali je treba shra ­
niti za analizo. Ponavadi zadostuje analiza celotne vsebine. Ciljni organi se lahko odstranijo za lo čeno analizo ( če to nakazujejo 
druge študije). Urin v mehurju ob dolo čeni usmrtitvi se doda prejšnji 
količini urina. Po odvzemu iztrebkov iz presnovnih kletk ob času, 
določenem za usmrtitev, je treba kletke in lovilne posode izprati z 
ustreznim topilom. Prav tako je treba analizirati drugo morebitno 
kontaminirano opremo.
 
1.4.10  Analiza  
Pri vseh študijah je treba dose či zadosten izkoristek (tj. povpre čje 
100 ± 10 % > radioaktivnosti). Izkoristke izven tega obsega je treba utemeljiti. Koli čino uporabljenega odmerka v vsakem vzorcu je treba 
analizirati po ustrezno potrjenih postopkih. 
Statistični podatki morajo vklju čevati dolo čeno mero odstopanj za 
ponovitve vsakega nanosa.
 
2. PODATKI  
Za vsako žival je treba ob vsakem času vzorčenja za preskusno 
kemikalijo in/ali metabolite opraviti naslednje meritve. Poleg posa ­
meznih podatkov je treba poro čati o povpre čju podatkov, urejenih v 
skupine po času vzorčenja. 
— količina, povezana z zaš čitnimi napravami, 
— količina, ki se odstrani s kože, 
— količina v/na koži, ki je ni mogo če izprati s kože,  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 642
 
— količina v vzorcu krvi, 
— količina v iztrebkih in izdihanem zraku ( če je ustrezno), 
— količina, ki ostane v trupu in organih, odstranjenih za lo čeno 
analizo. 
Količina preskusne snovi in/ali metabolitov v iztrebkih, izdihanem 
zraku, krvi in v trupu omogo ča določanje celotne absorbirane koli ­ 
čine v vsaki časovni točki. Izračuna se lahko tudi koli čina preskusne 
kemikalije, absorbirane na cm kože, izpostavljene preskusni snovi v 
obdobju izpostavljenosti.  
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preskusu mora vsebovati zahteve, dolo čene v protokolu, 
vključno z utemeljitvijo uporabljenega sistema preskusa, ter tudi 
naslednje: 
Preskusna snov: — identifikacijski podatki [npr. številka CAS, če je na voljo; vir; 
čistost (radiokemijska čistost); znane ne čistoče; serijska številka] 
— agregatno stanje, fizikalno-kemijske lastnosti (npr. pH, hlapnost, 
topnost, stabilnost, molekulska masa in log Pow). 
Preskusni pripravek: 
— pripravek in utemeljenost uporabe, 
— podrobnosti preskusnega pripravka, koli čina nanosa, dosežena 
koncentracija, nosilec, stabilnost in homogenost. 
Preskusna žival: — uporabljena vrsta/linija, 
— število, starost in spol živali, 
— vir živali, namestitveni pogoji, prehrana, itd., — teže posameznih živali ob za četku preskusa. 
Preskusni pogoji: 
— podrobnosti uporabe preskusnega pripravka (mesto nanosa, 
preskusne metode, zaprtost/nezaprtost, prostornina, ekstrakcija, 
zaznavnost), 
— podrobnosti kakovosti hrane in vode. 
Rezultati: 
— kakršni koli znaki toksi čnosti, 
— tabelirani absorpcijski podatki (izraženi kot hitrost, koli čina in 
odstotek),
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 643
 
— celotni izkoristek poskusa, 
— razlaga rezultatov, primerjava z razpoložljivimi podatki o absorp ­
ciji skozi kožo preskusne spojine. 
Razprava o rezultatih. Sklepi.
 
4. LITERATURA  
(1) Preskusna metoda B.45. Absorpcija skozi kožo: Metoda  in vitro.  
(2) OECD (2002). Napotki za izvajanje študij o absorpciji skozi 
kožo. OECD, Pariz. 
(3) ECETOC (1993) Perkutana absorpcija. Evropski center za 
ekotoksikologijo in toksikologijo kemikalij, Monografija št. 20. 
(4) Zendzian RP (1989) Skin Penetration Method suggested for 
Environmental Protection Agency Requirements.  J. Am. Coll. 
Toxicol.  8(5), 829–835. 
(5) Kemppainen BW, Reifenrath WG (1990) Methods for skin 
absorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA. 
(6) EPA (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles and 
Applications. Exposure Assessment Group, Office of Health 
and Environmental Assessment. 
(7) EPA (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, 
Dermal Penetration. Office of Prevention, Pedsticides and Toxic 
Substances. 
(8) Bronaugh RL, Wester RC, Bucks D, Maibach HI and Sarason R 
(1990)  In vivo  percutaneous absorption of fragrance ingredients 
in reshus monkeys and humans.  Fd. Chem. Toxic.  28, 369–373. 
(9) Feldman RJ and Maibach HI (1970) Absorption of some 
organic compounds through the skin in man.  J. Invest Dermatol.  
54, 399-404.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 644
 
Slika 1  
Primer oblike zna čilne naprave, ki se uporablja za dolo čanje in zaš čito 
dermalnega mesta nanosa med  in vivo  študijami perkutane absorpcije
  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 645
 
B.45  ABSORPCIJA SKOZI KOŽO: METODA  IN VITRO  
1. METODA  
Ta preskusna metoda je enakovredna OECD TG 428 (2004).  
1.1 UVOD 
Ta metoda je bila oblikovana za zagotavljanje informacij o absorpciji 
preskusne snovi, nanesene na izrezano kožo. Lahko se kombinira z 
metodo za absorpcijo skozi kožo: metodo  in vivo  (1), ali pa se opravi 
ločeno. Priporo čljivo je, da se preverijo Napotki OECD za izvajanje 
študij o absorpciji skozi kožo (2), kot pomo č pri oblikovanju študij, 
ki temeljijo na tej metodi. Napotki so bili pripravljeni, da bi omogo ­ 
čili izbiro ustreznih  in vitro  postopkov za uporabo v posebnih okoli ­ 
ščinah, zaradi zagotavljanja zanesljivosti rezultatov, pridobljenih s to 
metodo. 
Metode za merjenje absorpcije skozi kožo in dermalne dostave so 
razdeljene v dve kategoriji:  in vivo  ter in vitro.  Metode absorpcije 
skozi kožo  in vivo  so zelo uveljavljene in zagotavljajo farmakokine ­
tične informacije pri številnih živalskih vrstah. Metoda  in vivo  je 
opisana posebej v drugi preskusni metodi (1). Metode  in vitro  se 
tudi že dolgo uporabljajo za merjenje absorpcije skozi kožo. Čeprav 
formalne validacijske študije metod  in vitro,  ki so zajete v to 
preskusno metodo, niso bile opravljene, so se strokovnjaki OECD 
leta 1999 dogovorili, da je v podporo metodi  in vitro  (3) ovredno ­
tenih dovolj podatkov. Dodatni podrobni podatki, ki krepijo to podporo, vklju čno s pomembnim številom neposrednih primerjav 
med metodama  in vitro  ter in vivo,  so zagotovljeni v Napotkih (2). 
Ta tema je obravnavana v številnih monografijah, ki tudi navajajo 
podrobno ozadje uporabe metode  in vitro  (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) 
(11) (12). Z metodami  in vitro  se meri difuzija kemikalij v kožo in 
po koži v posodo s teko čino, uporablja pa se lahko neaktivna koža 
za merjenje samo difuzije, ali sveža, presnovno aktivna koža za 
istočasno merjenje difuzije in kožne presnove. Take metode so 
postale posebno uporabne kot sito za primerjanje dostave kemikalij iz različnih pripravkov v in skozi kožo, lahko pa so tudi uporabni 
modeli za ocenjevanje absorpcije skozi kožo pri človeku. 
Metode  in vitro  ni mogoče uporabljati za vsa stanja in razrede kemi ­
kalij. Preskusno metodo  in vitro je  mogoče uporabljati za za četno 
kakovostno presojo penetracije skozi kožo. V dolo čenih primerih je 
treba to metodo dopolniti s podatki iz metode  in vivo.  Za nadaljnjo 
razčlenitev stanj, v katerih bi bila metoda  in vitro  ustrezna, je treba 
preveriti napotke (2). Dodatne podrobne informacije v podporo odlo ­ 
čitvi so na voljo v (3). 
Ta metoda predstavlja splošna na čela merjenja dermalne absorpcije 
in dostave preskusne snovi pri uporabi izrezane kože. Uporablja se lahko koža ve č vrst sesalcev, vklju čno s človekom. Zna čilnosti 
prepustnosti kože se po odstranitvi s teles ohranjajo, ker je glavna 
difuzij ska pregrada neaktivna  stratum corneum;  aktivni prenos 
kemikalij skozi kožo ni identificiran. Pokazalo se je, da ima koža zmožnost presnavljanja nekaterih kemikalij med perkutano absorp ­
cijo (6), vendar ta postopek ne omejuje hitrosti dejansko absorbira ­
nega odmerka, čeprav lahko vpliva na naravo snovi, ki vstopa v 
krvni obtok.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 646
 
1.2 OPREDELITEV POJMOV  
Neabsorbirani odmerek:  pomeni odmerek, izpran s površine kože 
po izpostavljenosti in vsak odmerek, prisoten na neokluzivni ovoj ­
nici, vklju čno z vsakim odmerkom, ki bo izhlapel iz kože med 
izpostavljenostjo.  
Absorbirani odmerek  (in vitro):  masa preskusne snovi, ki pride do 
receptorske teko čine ali obtoka v sistemu v dolo čenem časovnem 
obdobju.  
Absorpcijski odmerek  (in vitro):  pomeni odmerek, prisoten na ali v 
koži po izpiranju.  
1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Preskusno snov, ki je lahko ozna čena z radioaktivnim izotopom, se 
nanese na površino vzorca kože, ki lo čuje dve komori difuzijske 
celice. Kemikalija dolo čen čas in pod dolo čenimi pogoji ostane na 
koži, preden se odstrani po ustreznem postopku čiščenja. Recep ­
torska teko čina se v časovnih to čkah vzorči med celotnim poskusom 
in analizirajo se preskusne kemikalije in/ali metaboliti. 
Če se uporabljajo presnovno aktivni sistemi, se z ustreznimi meto ­
dami lahko analizirajo metaboliti preskusnih kemikalij. Na koncu 
poskusa se v celoti oceni razdelitev preskusnih kemikalij in njihovih metabolitov, kadar je ustrezno. 
Absorpcija preskusne snovi se meri v dolo čenem časovnem obdobju 
pri ustreznih pogojih, ki so opisani v tej metodi in v napotkih (2), z 
analizo receptorske teko čine in obdelane kože. Za preskusno snov, ki 
ostane v koži, se šteje, da je absorbirana, razen če je mogo če poka­
zati, da se absorpcija lahko dolo či le iz vrednosti receptorske teko ­ 
čine. Analiza drugih elementov (snovi, izprane s kože, ki ostane v 
plasteh kože) omogo ča dodatno ovrednotenje podatkov, vklju čno s 
celotno razpoložljivostjo preskusne snovi in odstotkom izkoristka. 
Za prikaz uspešnosti in zanesljivosti preskusnega sistema v izva ­
jalnem laboratoriju, bi morali biti rezultati za ustrezne referen čne 
kemikalije na voljo in v skladu z objavljeno literaturo za uporabljeno metodo. To zahtevo je mogo če izpolniti s testiranjem ustrezne refe ­
renčne snovi (po možnosti z lipofilnostjo, ki je blizu preskusni snovi) 
hkrati s preskusno snovjo ali z zagotavljanjem dovolj preteklih poda ­
tkov za številne referen čne snovi z razli čno lipofilnostjo (npr. kofein, 
benzojska kislina in testosteron).
 
1.4 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.4.1  Difuzijska celica  
Difuzijska celica je sestavljena iz donorske in receptorske komore, 
med katere se namesti koža (tipi čni primer je prikazan na Sliki 1). 
Celica mora zagotoviti dobro zaš čito okoli kože, omogo čiti 
enostavno vzor čenje in dobro mešanje receptorske raztopine v 
stiku s spodnjo stranjo kože ter dober temperaturni nadzor celice 
in njene vsebine. Sprejemljive so stati čne in preto čne difuzijske 
celice. Obi čajno na donorskih komorah med izpostavljenostjo 
končnemu odmerku preskusnega pripravka ni okluzije. Pri nepreki ­
njenem nanašanju in pri dolo čenih potekih pri kon čnih odmerkih pa 
je okluzija na na donorskih komorah lahko potrebna.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 647
 
1.4.2  Receptorska teko čina 
Uporaba fiziološko prevodne receptorske teko čine je bolj zaželena, 
čeprav se lahko uporabljajo tudi druge, če so utemeljene. Dana mora 
biti natan čna sestava receptorske teko čine. Zagotovljena mora biti 
zadostna topnost preskusne kemikalije v receptorski teko čini, tako 
da ne deluje kot pregrada za absorpcijo. Poleg tega receptorska tekočina ne sme vplivati na neopore čnost kožnega pripravka. V 
pretočnem sistemu hitrost pretoka ne sme ovirati difuzije preskusne 
snovi v receptorsko teko čino. V sistemu stati čne celice je treba 
tekočino neprestano mešati in redno jemati vzorce. Če se preu čuje 
presnova, mora receptorska teko čina podpirati aktivnost kože med 
celotnim poskusom.
 
1.4.3  Kožni pripravki  
Uporablja se lahko človeška ali živalska koža.. Razumljivo je, da se 
pri uporabi človeške kože upoštevajo nacionalna in mednarodna 
etična načela in okoliš čine. Čeprav je bolj zaželena aktivna koža, 
se lahko uporablja tudi neaktivna koža, če je mogo če dokazati 
njeno neopore čnost. Sprejemljive so bodisi epidermalne membrane 
(encimsko, toplotno ali kemijsko lo čene) ali koža z razcepljeno debe ­
lino (tipi čno debela 200-400 μm), pripravljena z dermatomom. 
Lahko se uporablja koža s celotno debelino, vendar se je treba izogibati prekomerni debelini (ca. > 1 mm), razen če je izrecno 
potrebna za dolo čanje preskusnih kemikalij v plasteh kože. Izbira 
vrst, anatomsko mesto in tehnika pripravljanja morajo biti uteme ­
ljeni. Potrebni so sprejemljivi podatki iz najmanj štirih ponovitev na preskusni pripravek.
 
1.4.4  Neopore čnost kožnega pripravka  
Bistveno je, da je koža pravilno pripravljena. Neustrezno ravnanje 
lahko poškoduje  stratum corneum,  zato je treba preveriti neopore ­ 
čnost pripravljene kože. Kadar se preiskuje presnova kože, je treba 
sveže izrezano kožo uporabiti čim hitreje in pod pogoji, ki podpirajo 
presnovno dejavnost. Na splošno naj bo sveže izrezana koža upora ­
bljena v 24 urah, sprejemljivo obdobje skladiš čenja pa je lahko 
različno glede na encimski sistem presnavljanja in temperature skla ­
diščenja (13). Če so kožni pripravki pred uporabo skladiš čeni, je 
treba podati dokaze, ki izkazujejo ohranjanje pregradne funkcije.  
1.4.5  Preskusna snov  
Preskusna snov je snov, katere penetracijske zna čilnosti se preu ču­
jejo. V idealnem primeru naj bi bila preskusna snov ozna čena z 
radioaktivnim izotopom.  
1.4.6  Preskusni pripravek  
Pripravek preskusne snovi (npr. čist, razred čen ali sestavljen mate ­
rial, ki vsebuje preskusno snov, ki se nanese na kožo) naj bo enak (ali realisti čen nadomestek) tistemu, kateremu so izpostavljeni ljudje 
ali druge možne ciljne vrste. Vsako odstopanje od pripravka, ki se 
uporablja v praksi, mora biti utemeljeno.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 648
 
1.4.7  Koncentracije in izdelave pripravkov preskusnih snovi  
Običajno se uporablja ve č kot ena koncentracija preskusne snovi, da 
zajema zgornjo možno izpostavljenost človeka. Enako je treba 
upoštevati razpon preskušanja zna čilnih pripravkov.  
1.4.8  Nanos na kožo  
Pod normalnimi pogoji izpostavljenosti človeka kemikalijam gre 
ponavadi za kon čne odmerke. Zato je treba uporabiti nanos, ki 
oponaša izpostavljenost človeka, obi čajno 1-5 mg/cm  2 kože za 
trdne snovi in do 10 μl/cm  2 za tekočine. Količina mora biti uteme ­
ljena s pri čakovanimi pogoji uporabe, cilji preu čevanja ali fizi čnimi 
lastnostmi preskusnega pripravka. Nanosi na površino kože so lahko, na primer, neprekinjeni, če se nanašajo veliki volumni na enoto 
površine.
 
1.4.9  Temperatura  
Na pasivno difuzijo kemikalij (in zato njihovo absorpcijo skozi kožo) 
vpliva temperatura. Difuzijsko komoro in kožo je treba ohranjati pri 
konstantni temperaturi, ki je blizu normalni temperature kože, to je 
32 – 1  o C. Različne oblike celic zahtevajo razli čne temperature 
vodne kopeli ali toplotnih blokov, da se zagotavlja fiziološka norma receptorja/kože. Vlažnost naj bo po možnosti od 30 do 70 %.
 
1.4.10  Trajanje izpostavljenosti in jemanje vzorcev  
Koža je lahko izpostavljena preskusnemu pripravku med celotnim 
poskusom ali krajši čas (tj., zaradi oponašanja dolo čene vrste izpo ­
stavljenosti človeka). S kože je treba z ustreznim čistilnim sredstvom 
izprati odve čni preskusni pripravek in preostanek zbrati za analizo. 
Postopek odstranjevanja preskusnega pripravka je odvisen od pogoja pričakovane uporabe in ga je treba utemeljiti. Obi čajno se zahteva 
obdobje vzor čenja 24 ur za omogo čanje zadostne karakterizacije 
absorpcijskega profila. Ker se neopore čnost kože lahko za čne slab­ 
šati po 24 urah, čas vzorčenja običajno ne sme presegati 24 ur. Za 
preskusne snovi, ki hitro prodrejo v kožo, to ni potrebno, za preskusne snovi, ki prodirajo po časi, pa je lahko potreben daljši 
čas. Pogostost vzor čenja receptorske teko čine mora omogo čati 
grafično predstavitev absorpcijskega profila preskusne snovi.
 
1.4.11  Zaklju čni postopki  
Vse elemente sistema preskusa je treba analizirati in dolo čiti izkori­
stek. To obsega donorsko komoro, izpiranje površine kože, kožni 
pripravek in receptorsko komoro/komoro s teko čino. V nekaterih 
primerih se koža lahko frakcionira na izpostavljeno površino kože in površino kože pod celi čnim robom ter na  stratum corneum,  
epidermis in dermis fractions za lo čeno analizo.
 
1.4.12  Analiza  
Pri vseh študijah je treba dose či zadosten izkoristek (cilj bi moral biti 
povprečje 100 – +/-10 % radioaktivnosti in vsaka odstopanja morajo 
biti utemeljena). Koli čino preskusne snovi v receptorski teko čini, 
kožni pripravek, izpiranja s površine kože in kar se izpere z apara ­
ture je treba z ustrezno tehniko analizirati.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 649
 
2. PODATKI  
Predstaviti je treba analizo receptorske teko čine, distribucijo kemi ­
kalij preskusne snovi v sistemu preskusa in absorpcijski profil glede na čas. Kadar se uporabljajo pogoji izpostavljenosti kon čnemu 
odmerku, je treba izra čunati koli čino, izprano s kože, koli čino, pove ­
zano s kožo (in v razli čnih plasteh kože, če se analizira) in koli čino, 
prisotno v receptorski teko čini (stopnjo in koli čino ali odstotek nane ­
senega odmerka). V časih je absorpcija skozi kožo lahko izražena le s 
podatki o receptorski teko čini. Če pa preskusna snov ostane v koži 
ob koncu študije, jo je treba vklju čiti v skupno absorbirano koli čino 
(glej odstavek 66 glede na (3)). V pogojih neprekinjene izpostavlje ­
nosti odmerku lahko podatki omogo čajo izračun prepustnostne 
konstante (Kp). V teh pogojih delež absorpcije ni pomemben.
 
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preskusu mora vsebovati zahteve, dolo čene v protokolu, 
vključno z utemeljitvijo uporabljenega sistema preskusa, ter tudi 
naslednje: 
Preskusna snov: — agregatno stanje, fizikalno-kemijske lastnosti (vsaj molekulska 
masa in log Pow), čistost (radiokemijska čistost), 
— identifikacijski podatki (npr. serijska številka), — topnost v receptorski teko čini. 
Preskusni pripravek: — pripravek in utemeljenost uporabe, 
— homogenost. 
Preskusni pogoji: — viri in mesto kože, metoda priprave, pogoji shranjevanja pred 
uporabo, vsa predhodna obdelava ( čiščenje, zdravljenje z antibio ­
tiki, itd.), merjenja neopore čnosti kože, presnovni status, uteme ­
ljitev uporabe, 
— oblika celice, sestava receptorske teko čine, pretok receptorske 
tekočine, ali časi in postopki vzor čenja, 
— podrobnosti nanosa preskusnega pripravka in koli činska oprede ­
litev nanesenega odmerka, 
— trajanje izpostavljenosti, — podrobnosti odstranitve preskusnega pripravka s kože, npr. izpi ­
ranje kože, 
— podrobnosti analize kože in vse tehnike frakcioniranja, upora ­
bljene za prikaz porazdelitve kože,
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 650
 
— postopki čiščenja celice in opreme, 
— preskusna metoda, tehnike ekstrakcije, meje zaznavnosti in vali ­
dacija analiti čne metode. 
Rezultati: 
— celotni izkoristek poskusa (naneseni odmerek = izpiranja s 
kože + koža + receptorska teko čina + izpiranja s celice), 
— tabeliranje posameznih celi čnih izkoristkov v vsakem prostoru, 
— absorpcijski profil, 
— tabelirani absorpcijski podatki (izraženi kot hitrost, koli čina in 
odstotek). 
Razprava o rezultatih. 
Sklepi.  
4. LITERATURA  
(1) Preskusna metoda B.44. Absorpcija skozi kožo: Metoda  in 
vivo.  
(2) OECD (2002). Napotki za izvajanje študij o absorpciji skozi 
kožo. OECD, Pariz. 
(3) OECD (2000). Poro čilo s sestanka Razširjenega pripravljalnega 
odbora OECD za preskušanje perkutane absorpcije, Priloga 1 k ENV/JM/TG(2000)5. OECD, Pariz. 
(4) Kemppainen BW and Reifenrath WG. (1990). Methods for 
skin absorption. CRC Press, Boca Raton. 
(5) Bronaugh RL and Collier, SW. (1991). Protocol for  In vitro  
Percutaneous Absorption Studies, in  In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Applications,  RL 
Bronaugh and HI Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, pp. 237-241. 
(6) Bronaugh RL and Maibach HI. (1991).  In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Applications.  CRC 
Press, Boca Raton. 
(7) Evropski center za ekotoksikologijo in toksikologijo kemikalij 
(1993). Monografija št.. 20, Perkutana absorpcija, ECETOC, 
Brussels. 
(8) Diembeck W, Beck H, Benech-Kieffer F, Courtellemont P, 
Dupuis J, Lovell W, Paye M, Spengler J, Steiling W (1999). 
Test Guidelines for In  Vitro  Assessment of Dermal Absorption 
and Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingredients, Fd Chem Tox, 37, 191-205. 
(9) Recommended Protocol for  In vitro  Percutaneous Absorption 
Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, No. 65. 
(10) Howes D, Guy R, Hadgraft J, Heylings JR  et a\.  (1996). 
Methods for assessing Percutaneous absorption. ECVAM 
Workshop Report ATLA 24, 81 R10.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 651
 
(11) Schaefer H and Redelmeier TE. (1996). Skin barrier: principles 
of percutaneous absorption. Karger, Basel. 
(12) Roberts MS and Walters KA. (1998). Dermal absorption and 
toxicity assessment. Marcel Dekker, New York. 
(13) Jewell, C, Heylings, JR., Clowes, HM. And Williams, FM. 
(2000). Percutaneous absorption and metabolism of dinitroch ­
lorobenzene in vitro. Arch Toxicol 74: 356-365.  
Slika 1  
Primer zna čilne oblike stati čne difuzijske celice za študije perkutane absorpcije  in vitro
  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 652
 
B.46.  PRESKUS DRAŽENJA KOŽE  IN VITRO : PRESKUSNA METODA 
REKONSTRUIRANE ČLOVEŠKE POKOŽNICE  
UVOD 
1. Draženje kože pomeni nastanek popravljive poškodbe kože po nanosu 
preskusne snovi za najve č 4 ure [kot je dolo čeno v Globalnem usklajenem 
sistemu za razvrš čanje in ozna čevanje kemikalij (GHS) Združenih 
narodov (ZN) ter Uredbi (ES) št. 1272/2008 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 16. decembra 2008 o razvrš čanju, ozna čevanju in pakiranju 
snovi in zmesi (1) (3)]. Ta preskusna metoda zajema postopek  in vitro , ki 
se lahko uporablja za ugotavljanje nevarnosti dražilnih kemikalij (snovi in zmesi) v skladu s kategorijo 2 standardov po GHS ZN in uredbo CLP EU (1) (2) (3). V EU in drugih regijah, ki niso sprejele neobvezne kategorije 3 
po GHS ZN (blage dražilne snovi), se lahko ta preskusna metoda uporabi 
tudi za opredelitev nerazvrš čenih kemikalij, tj. „Brez kategorije“ po GHS 
ZN in CLP EU (1) (3). Ta preskusna metoda se lahko uporabi za dolo čitev 
razdraženosti kože zaradi kemikalije kot samostojni nadomestni preskus za 
preskušanje draženja kože  in vivo  v okviru strategije stopenjskega presku ­ 
šanja (4 in poglavje B.4 te priloge). 
2. Ocenjevanje razdraženosti kože se obi čajno izvaja na laboratorijskih živalih 
[Smernica za preskušanje OECD 404; poglavje B.4 v tej prilogi] (4). V 
skladu s prizadevanji za dobro po čutje živali je bila metoda B.4 leta 2004 
pregledana in omogo ča določitev jedkosti za kožo/draženja kože z uporabo 
strategije stopenjskega preskušanja, pri čemer se uporabljata validirani 
metodi  in vitro  ali ex vivo , da se tako prepre čijo bolečine in trpljenje živali. 
Tri validirane preskusne metode  in vitro  so bile sprejete kot smernice za 
preskušanje OECD 430, 431 in 435 (5) (6) (7) in dve od njih kot poglavji B.40 in B.40a te priloge, ki se uporabljajo za del strategije stopenjskega 
preskušanja B.4 ali Smernice za preskušanje OECD 404 (4), ki se nanaša 
na jedkost. 
3. Ta preskusna metoda obravnava kon čni učinek draženja kože na zdravje 
ljudi. Temelji na rekonstruirani človeški pokožnici, ki je v svoji zasnovi 
(uporaba netransformiranih človeških keratinocitov pokožnice kot vira celic, 
vzorčnega tkiva in citoarhitekture) zelo podobna biološkim in fiziološkim 
značilnostim zgornjih delov človeške kože, tj. pokožnice. Ta preskusna 
metoda vklju čuje tudi skupino standardov u činkovitosti (Dodatek 2) za 
ocenjevanje podobnih in spremenjenih preskusnih metod za rekonstruirano človeško pokožnico, ki jih je razvil evropski ECVAM (8), v skladu z na čeli 
smernice OECD št. 34 (9). 
4. Ta preskusna metoda se upošteva pri treh validiranih metodah. Predvali ­
dacijske, optimizacijske in validacijske študije so dopolnjene s preskusno metodo  in vitro  (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20), pri 
kateri se uporabljajo modeli rekonstruirane 
človeške pokožnice, na tržiš ču 
pa je na voljo pod imenom EpiSkin  TM (validirana referen čna metoda – 
VRM). Dve drugi metodi  in vitro  za preskušanje draženja kože na rekon ­
struirani človeški pokožnici, ki sta na voljo na tržiš ču, sta v skladu z 
validacijo na podlagi standardov u činkovitosti pokazali podobne rezultate 
kot validirana referen čna metoda (21). To sta metodi EpiDerm  TM SIT 
(EPI-200) in SkinEthic  TM RHE (22).  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 653
 
5. Preden se lahko predlagana podobna ali spremenjena  in vitro  metoda 
rekonstruirane človeške pokožnice, razen validirane referen čne metode, 
metode EpiDerm  TM SIT (EPI-200) ali metode SkinEthic  TM RHE, uporabi 
v zakonodajne namene, je treba ugotoviti njeno zanesljivost, ustreznost (natančnost) in omejitve glede njene namenjene uporabe ter tako zagoto ­
viti, da se jo lahko šteje za podobno validirani referen čni metodi v skladu 
s standardi u činkovitosti iz te preskusne metode (Dodatek 2). Poleg tega se 
priporoča, da se pred razvojem in validiranjem podobne ali spremenjene 
metode rekonstruirane človeške pokožnice  in vitro  ter njeno predložitvijo 
za sprejetje v zakonodajo preu či obrazložitveni referen čni dokument 
OECD o preskušanju draženja kože  in vitro  (23)
 
OPREDELITVE POJMOV 
6. Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1.  
ZAČETNI POMISLEKI IN OMEJITVE 
7. Omejitev preskusne metode, kot je pokazala validacijska študija (16), je, 
da ne omogo ča uvrstitve kemikalij v neobvezno kategorijo 3 po GHS ZN 
(blage dražilne snovi) (1). Kadar se uporablja kot delni nadomestni preskus, se morda zahteva nadaljnje  preskušanje in vivo  za nadaljnjo 
karakterizacijo dražilnosti (4 in poglavje B.4 te priloge). Upošteva se, da 
se pri uporabi človeške kože upoštevajo nacionalna in mednarodna eti čna 
načela in okoliš čine. 
8. Ta preskusna metoda obravnava element draženja kože  in vitro  strategije 
stopenjskega preskušanja metode B.4 (Smernica za preskušanje OECD 
404) o jedkosti/draženju za kožo (4). Ta preskusna metoda sicer ne zago ­
tavlja ustreznih informacij o jedkosti za kožo, vendar je treba spomniti, da metoda B.40a (Smernica za preskušanje OECD 431) o jedkosti za kožo temelji na istem sistemu rekonstruirane človeške pokožnice, uporablja pa 
drug protokol (poglavje B.40a). Ta metoda temelji na modelih rekonstrui ­
rane človeške pokožnice, ki uporabljajo človeške keratinocite in tako pred ­
stavljajo  in vitro  ciljni organ želene vrste. Poleg tega neposredno vklju čuje 
prvo stopnjo kaskadne reakcije vnetja/mehanizma delovanja (poškodba 
celic in poškodba tkiva, posledica pa je lokalizirana poškodba), do katere 
pride med draženjem  in vivo . V postopku validacije, na katerem temelji ta 
preskusna metoda, so bile preskušene številne kemikalije, empiri čna zbirka 
podatkov validacijske študije pa skupno obsega 58 kemikalij (16)(18)(23). 
To velja za trdne snovi, teko če snovi, poltrdne snovi in voske. Teko če 
snovi so lahko vodne raztopine ali ne, trdne snovi so lahko topne ali netopne v vodi. Če je mogo če, je treba trdne snovi pred uporabo zmleti 
v fin prah; druga predhodna obdelava vzorca ni potrebna. Plini in aerosoli 
še niso bili ocenjeni v validacijski študiji (24). Čeprav se lahko preskusijo 
z uporabo tehnologije rekonstruirane človeške pokožnice, veljavna 
preskusna metoda ne dovoljuje preskušanje plinov in aerosolov. Opozoriti je treba tudi, da lahko mo čno obarvane kemikalije vplivajo na merjenje 
sposobnosti preživetja celic, zato je treba za popravke uporabiti prilagojene 
kontrole (glej odstavke 24–26). 
9. Kadar je razvrstitev nedvoumna, bi moralo za preskusno kemikalijo zadoš ­ 
čati eno samo preskušanje, sestavljeno iz treh dvojnikov tkiv. V primeru 
mejnih rezultatov, kot so neskladne ponovne meritve in/ali povpre čni 
odstotek sposobnosti preživetja, enak 50 ± 5 %, je treba preu čiti možnost 
izvedbe drugega preskušanja in nato še tretjega, če so rezultati prvih dveh 
preskušanj neskladni.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 654
 
NAČELO PRESKUSNE METODE 
10. Preskusna kemikalija se površinsko nanese na tridimenzionalni model 
rekonstruirane človeške pokožnice, ki vklju čuje netransformirane keratino ­
cite človeške pokožnice, gojene za ve čplastni, zelo raznolik model 
človeške pokožnice. Sestavljajo ga organizirane bazalne, spinalne in zrnate 
plasti ter ve čplastna rožena plast, ki vklju čuje medceli čne lamelarne maš č­
obne plasti, ki predstavljajo glavne razrede maš čob in so podobni strukturi  
in vivo . 
11. S kemikalijami izzvano draženje kože, ki se pokaže v obliki rde čine in 
otekline, je rezultat kaskadnih reakcij, ki se za čnejo s prodiranjem v 
roženo plast in poškodbo spodaj leže čih plasti keratinocitov. Odmirajo či 
keratinociti sprostijo posrednike, ti pa sprožijo kaskadne reakcije vnetja, ki 
deluje na celice v usnjici, zlasti na celice strome in endotelne celice. 
Zaradi razširitve in pove čane prepustnosti endotelnih celic nastaneta 
opazna rde čina in oteklina (24). Metode na podlagi rekonstruirane 
človeške pokožnice merijo za četne dogodke v kaskadni reakciji. 
12. Sposobnost preživetja celic v modelih rekonstruirane človeške pokožnice 
se meri z encimsko pretvorbo vitalnega barvila MTT [3-(4,5-dimetiltiazol- 2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid, Thiazolyl blue; številka CAS 298–93- 
1] v soli modrega formazana, katere koli čina se izmeri po ekstrakciji iz 
tkiv (25). Dražilne kemikalije se prepozna zaradi zmožnosti zmanjšanja sposobnosti preživetja celic pod opredeljene vrednosti praga (tj. ≤ 50 %, za 
kategorijo 2 po GHS ZN/CLP EU). Odvisno od zakonodajnega okvira, v 
katerem se uporabljajo rezultati te preskusne metode, se lahko kemikalije, 
ki vplivajo na sposobnost preživetja celic nad opredeljeno vrednostjo praga, štejejo za nedražilne snovi (tj. > 50 %, brez kategorije).
 
DOKAZOVANJE STROKOVNOSTI 
13. Pred redno uporabo katere koli od treh validiranih metod, pri kateri se 
upošteva ta preskusna metoda, morajo laboratoriji dokazati tehni čno stro­
kovnost z uporabo desetih referen čnih kemikalij, navedenih v preglednici 
1. Za podobne metode, ki so razvite v okviru te preskusne metode, ali za spremembe katere od treh validiranih metod morajo biti pred za četkom 
uporabe metode kot predpisanega preskušanja izpolnjene zahteve glede 
standardov u činkovitosti, opisanih v Dodatku 2 te preskusne metode. 
14. V okviru dokazovanja strokovnosti se priporo ča, da uporabnik po prejetju 
preveri pregrado tkiv, kakor to dolo ča proizvajalec modela rekonstruirane 
človeške pokožnice. To je zlasti pomembno, če tkiva potujejo na dolge 
razdalje/dalj časa. Potem ko je metoda uspešno vzpostavljena in je doka ­
zana strokovnost glede njene uporabe, redno preverjanje tkiv ni ve č potre­
bno. Vendar se priporo ča, da se ob redni uporabi metode še naprej ocenju ­
jejo značilnosti pregrade tkiv v rednih časovnih razmikih.
 
Preglednica 1  
Referenčne kemikalije  ( 1 ) 
Kemikalija Št. CAS Rezultat preskusa  
in vivo  ( 2 ) Agregatno stanje Kategorija po GHS 
ZN/CLP EU  
Naftalen ocetna kislina 86-87-3 0 trdno brez kategorije 
Izopropanol 67-63-0 0,3 teko če brez kategorije  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 655
 
Kemikalija Št. CAS Rezultat preskusa  
in vivo  ( 2 ) Agregatno stanje Kategorija po GHS 
ZN/CLP EU  
Metil stearat 112-61-8 1 trdno brez kategorije 
Heptil butirat 5870-93-9 1,7 teko če brez kategorije  
(neobvezna 
kat. 3 ) ( 3 ), ( 4 ) 
Heksil salicilat 6259-76-3 2 teko če brez kategorije  
(neobvezna 
kat. 3 ) ( 3 ), ( 4 ) 
Ciklamen aldehid 103-95-7 2,3 teko če kat. 2 
1-bromoheksan 111-25-1 2,7 teko če kat. 2 
Kalijev hidroksid (5-odstotni vodni) 1310-58-3 3 teko če kat. 2 
1-metil-3-fenil-1-piperazin 5271-27-2 3,3 trdno kat. 2 
Heptanal 111-71-7 3,4 teko če kat. 2  
( 1 ) Te referen čne kemikalije so podmnožica referen čnih kemikalj, uporabljenih v validacijski študiji. 
( 2 ) Rezultat  in vivo  v skladu z metodo B.4 in Smernico za preskušanje OECD 404 (4). 
( 3 ) V okviru te preskusne metode se neobvezna kategorija 3 po GHS ZN (blage dražilne snovi) (1) šteje kot „Brez kategorije“. 
( 4 ) Neobvezna kategorija 3 po UN GHS se v okviru CLP EU ne uporablja.  
POSTOPEK 
15. V nadaljevanju so opisani elementi in postopki za ocenjevanje razdraže ­
nosti kože z metodo rekonstruirane človeške pokožnice. Model rekonstrui ­
rane človeške pokožnice mora biti rekonstruiran in je lahko pripravljen v 
podjetju ali kupljen na tržiš ču. Za EpiSkin  TM , EpiDerm  TM SIT (EPI-200) 
in SkinEthic  TM RHE so na voljo standardni operativni postopki (SOP) 
(26)(27)(28). Preskušanje se mora izvajati v skladu z naslednjimi zahte ­
vami:  
Elementi preskusne metode rekonstruirane človeške pokožnice  
Splošni pogoji  
16. Za rekonstrukcijo epitelija se uporabijo netransformirani človeški keratino ­
citi. Pod funkcionalno roženo plastjo je ve č slojev živih epitelijskih celic 
(bazalna plast, trnasta plast, zrnata plast). Rožena plast mora biti razdeljena na več plasti in vsebovati lipidni profil za mo čno funkcionalno pregrado za 
zaustavitev hitre penetracije ozna čevalcev citotoksi čnosti, npr. natrijevega 
dodecil sulfata (SDS) ali Tritona X-100. Funkcija pregrade mora biti 
dokazana in se lahko oceni z dolo čitvijo koncentracije, pri kateri ozna če­
valec po dolo čenem času izpostavljenosti zmanjša sposobnost preživetja 
tkiv za 50 % (IC
 50 ), ali z dolo čitvijo časa izpostavljenosti, ki je potreben 
za zmanjšanje sposobnosti preživetja celic za 50 % (ET  50 ) po nanosu 
določene stalne koncentracije ozna čevalca. Zadrževalne zna čilnosti modela 
rekonstruirane človeške pokožnice morajo prepre čiti prehod materiala 
okoli rožene plasti v živo tkivo, kar bi prepre čilo učinkovitost modelov 
za raziskovanje v zvezi z izpostavljenostjo kože. V modelu rekonstruirane 
človeške pokožnice ne sme biti bakterij, virusov, mikoplazme ali plesni.  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 656
 
Pogoji za funkcionalnost  
Sposobnost preživetja 
17. Analiza, uporabljena za dolo čanje stopnje sposobnosti preživetja celic je 
analiza z MTT (25). Uporabniki modela rekonstruirane človeške pokožnice 
morajo zagotoviti, da vsaka serija modela rekonstruirane človeške pokož ­
nice izpolnjuje merila, dolo čena za negativno kontrolo. Opti čna 
gostota (OD) izvle čka ekstrakcijskega topila mora biti dovolj majhna, tj. 
OD < 0,1. Razpon sprejemljivosti (zgornjo in spodnjo mejo) za negativne 
kontrolne vrednosti opti čne gostote (v pogojih za preskusno metodo 
draženja kože) dolo či razvijalec/dobavitelj modela rekonstruirane človeške 
pokožnice, razponi sprejemljivosti za tri validirane metode pa so podani v 
preglednici 2. Zabeležiti je treba, da je negativno kontrolno tkivo, kar 
zadeva celi čne kulture, med preskušanjem stabilno (meritve sposobnosti 
preživetja celic so podobne).  
Preglednica 2  
Razpon sprejemljivosti za negativne kontrolne vrednosti opti čne gostote  
Spodnja meja sprejemljivosti Zgornja meja sprejemljivosti  
EpiSkin  TM (SM) ≥ 0,6 ≤ 1,5 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) ≥ 1,0 ≤ 2,5 
SkinEthic  TM RHE ≥ 1,2 ≤ 2,5 
Pregradna funkcija 
18. Rožena plast in njena maš čobna sestava morata zadostovati za zaustavitev 
hitre penetracije citotoksi čnih označevalcev, npr. SDS ali Triton X-100, 
kot se ocenjuje z IC  50 ali ET  50 (preglednica 3).  
Morfologija 
19. Opravljen mora biti histološki pregled modela rekonstruirane človeške 
pokožnice za prikaz strukture, podobne človeški pokožnici (vklju čno z 
večplastno roženo plastjo).  
Ponovljivost 
20. Rezultati kemikalije pozitivne kontrole in negativnih kontrol preskusne 
metode morajo dokazati ponovljivost.  
Nadzor kakovosti 
21. Razvijalec/dobavitelj modela rekonstruirane človeške pokožnice mora 
zagotoviti in dokazati, da vsaka serija modela rekonstruirane človeške 
pokožnice izpolnjuje opredeljena merila za sprostitev proizvodnje, med 
katerimi so najpomembnejša merila za  sposobnost preživetja  (odstavek 
17), pregradno funkcijo  (odstavek 18) in  morfologijo  (odstavek 19). Te 
podatke je treba zagotoviti uporabnikom metode, da lahko te informacije 
vključijo v poro čilo. Razpon sprejemljivosti (zgornja in spodnja meja) za 
IC 50 ali ET  50 mora dolo čiti dobavitelj modela rekonstruirane človeške 
pokožnice (ali raziskovalec ob uporabi lastnega modela). Le rezultati, doseženi z ustreznimi tkivi, se štejejo kot zanesljivi za napovedi v zvezi 
z razvrstitvijo draženja kože. Kot primer so v preglednici 3 navedeni 
razponi sprejemljivosti za tri validirane metode.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 657
 
Preglednica 3  
Primeri meril za nadzor kakovosti serije  
Spodnja meja sprejemljivosti Zgornja meja sprejemljivosti  
EpiSkin  TM (SM) 
(18-urno preskušanje s SDS) (26) IC 50 = 1,0 mg/ml IC  50 = 3,0 mg/ml 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) 
(1-odstotni Triton X-100) (27) ET 50 = 4,8 h ET  50 = 8,7 h 
SkinEthic  TM RHE 
(1-odstotni Triton X-100) (28) ET 50 = 4,0 h ET  50 = 9,0 h  
Nanos preskusnih in kontrolnih kemikalij  
22. Za vsako preskusno kemikalijo in kontrole v vsaki ponovitvi je treba 
uporabiti vsaj tri dvojnike. Za teko če in trdne snovi je treba uporabiti 
zadostno koli čino preskusne kemikalije, da se enakomerno prekrije povr ­ 
šina pokožnice, pri čemer mora biti odmerek natan čno določen, tj. najmanj 
25 μL/cm  2 ali 25 mg/cm  2. Za boljši stik med preskusno kemikalijo in 
površino pokožnice je treba v primeru trdnih snovi površino pokožnice 
pred nanosom navlažiti z deionizirano ali destilirano vodo. Če je mogo če, 
je treba trdne snovi preskušati v obliki finega prahu. Ob koncu časa 
izpostavljenosti je treba preskusno kemikalijo skrbno sprati s površine 
pokožnice z vodnim pufrom ali 0,9-odstotnim NaCl. Glede na uporabljeni 
model rekonstruirane človeške pokožnice lahko čas izpostavljenosti traja 
od 15 do 60 minut, inkubacijska temperatura pa je od 20 do 37 °C. Ta obdobja izpostavljenosti in temperature se optimizirajo za vsako metodo 
rekonstruirane človeške pokožnice in predstavljajo razli čne vsebovane last ­
nosti metod; za podrobnosti glej Standardne operativne postopke za te metode (26) (27) (28). 
23. Negativno kontrolo (NC) in pozitivno kontrolo (PC) je treba uporabiti 
istočasno za vsako ponovitev, da se dokaže, da so sposobnost preživetja 
celic (z negativno kontrolo), pregradna funkcija in posledi čna občutljivost 
tkiva (s pozitivno kontrolo) v okviru v preteklosti opredeljenega razpona sprejemljivosti. Predlagana snov za pozitivno kontrolo je 5-odstotni vodni SDS. Predlagani kemikaliji za negativno kontrolo sta voda ali fosfatni 
pufer s soljo (PBS).
 
Meritve sposobnosti preživetja celic  
24. Pri postopku preskušanja je zelo pomembno, da se meritve sposobnosti 
preživetja celic ne opravljajo takoj po izpostavljenosti preskusnim kemi ­
kalijam, ampak v svežih gojiš čih po dovolj dolgi inkubacijski dobi po 
preskušanju izpranih tkiv. Ta čas omogo ča izboljšanje stanja, kar zadeva 
šibke citotoksi čne vplive, in pojav jasnih citotoksi čnih vplivov. V fazi 
optimizacije preskusa (11) (12) (13) (14) (15) se je za optimalno izkazala 42-urna inkubacijska doba po preskušanju. 
25. Analiza MTT je validirana kvantitativna metoda, ki jo je treba v okviru te 
preskusne metode uporabljati za merjenje sposobnosti preživetja celic. 
Ustreza uporabi tridimenzionalne konstrukcije tkiva. Vzorec tkiva se za 3 ure potopi v ustrezno koncentracijo raztopine MTT (npr. 0,3 -1 mg/ml). S topilom (npr. izopropanolom, kislim izopropanolom) se izvle če oborina 
modrega formazana, potem pa se koncentracija formazana izmeri tako, da 
se določi OD pri valovni dolžini 570 nm ± 30 nm.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 658
 
26. Opti čne značilnosti preskusne kemikalije ali njenega kemijskega delovanja 
na MTT lahko zato ovirajo analizo, zaradi česar je lahko ocena sposob ­
nosti preživetja celic lažna (ker lahko preskusna kemikalija prepre či obar­
vanje ali povzro či, da se razlikuje od obi čajnega). To se lahko zgodi, če se 
določena preskusna kemikalija s splakovanjem ne odstrani s kože v celoti 
ali če prodre v pokožnico. Če preskusna kemikalija deluje neposredno na 
MTT (snov, ki neposredno zmanjša MTT), je obi čajne barve ali se obarva 
med testiranjem tkiva, je treba izvesti dodatne kontrole, da se ugotovi in odpravi interference preskusne kemikalije s tehniko za merjenje sposob ­
nosti preživetja. Za podrobnejši opis na čina glede popravka neposrednega 
zmanjšanja MTT in vpliva obarvanih snovi glej Standardne operativne postopke za te tri validirane referen čne metode (26) (27) (28).
 
Merila za sprejemljivost  
27. Za vsako metodo, pri kateri se uporabljajo veljavne serije rekonstruirane 
človeške pokožnice (glej odstavek 21), morajo negativna kontrolna tkiva 
izražati opti čno gostoto, iz katere je razvidna kakovost tkiv, pri katerih so 
se upoštevale zahtevane stopnje in vsi postopki protokola. Vrednosti kontrol 
optične gostote ne smejo biti nižje od v preteklosti postavljenih mej. Podobno 
morajo tkiva s pozitivno kontrolo, tj. 5-odstotnim vodnim SDS, kazati sposobnost tkiv, da se odzovejo na dražilne snovi v pogojih preskusne 
metode (26) (27) (28). S tem povezane in ustrezne meritve spremenljivosti 
med dvojniki tkiv je treba opredeliti (npr. v primeru uporabe standardnih odmikov mora biti njihova vrednost v okviru enostranskega 95-odstotnega 
intervala tolerance, izra čunanega na podlagi preteklih podatkov; pri validi ­
rani referen čni metodi je standardni odmik < 18 %).
 
Razlaga rezultatov in napovedni model  
28. Vrednosti opti čne gostote, pridobljene z vsako preskusno kemikalijo, se 
lahko uporabijo za izra čun deleža za preživetje sposobnih celic negativne 
kontrole, ki mora biti 100 %. Mejna vrednost deleža za preživetje sposobnih celic, ki dražilne preskusne kemikalije lo či od nerazvrš čenih, 
in statistični postopki, ki se uporabljajo za ocenjevanje rezultatov ter dolo ­ 
čanje dražilnih kemikalij, morajo biti natan čno opredeljeni in zabeleženi 
ter dokazani kot ustrezni. Mejne vrednosti za napoved draženja so podane v nadaljevanju: 
— Preskusna kemikalija se v skladu s kategorijo 2 po GHS ZN/CLP EU 
šteje kot dražilna za kožo, če je sposobnost preživetja tkiva po izposta ­
vljenosti in inkubaciji po preskušanju manjša od ali enaka ( ≤) 50 %. 
— Odvisno od zakonodajnega okvira, v katerem se uporabljajo rezultati te 
preskusne metode, se preskusna kemikalija v skladu z oznako „brez kate ­
gorije“ po GHS ZN/CLP EU šteje kot snov, ki ne draži kože, če je sposob ­
nost preživetja tkiva po izpostavljenosti in inkubaciji ve čja (>) od 50 %.
 
PODATKI IN PORO ČANJE  
Podatki  
29. Za vsako preskušanje je treba podatke o posameznih dvojnikih tkiv (npr. 
vrednosti opti čne gostote in podatke o izra čunanem deležu za preživetje 
sposobnih celic za vsako preskusno kemikalijo, vklju čno z razvrš čanjem) 
sporočiti v obliki preglednice, po potrebi vklju čno s podatki o ponovljenih 
preskusih. To pomeni, da je treba sporo čiti standardni odmik ± za vsako 
preskušanje. Za vsako preskušano kemikalijo je treba sporo čiti opaženo 
medsebojno vplivanje z reagentom MTT in obarvanimi preskusnimi kemi ­
kalijami.  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 659
 
Poročilo o preskusu  
30. Poro čilo o preskusu vsebuje naslednje informacije: 
Preskušane in kontrolne kemikalije: 
— kemijska imena, kot so ime in številka CAS, ime in številka EC, če je 
znana, 
— čistost in sestava kemikalije (v odstotkih mase), 
— fizikalno-kemijske zna čilnosti, ki so pomembne za izvedbo študije 
(npr. agregatno stanje, obstojnost, hlapnost, pH, topnost v vodi, če 
so znane), 
— obdelava preskušanih/kontrolnih snovi pred preskušanjem, če je 
smiselno (npr. segrevanje, mletje), 
— pogoji skladiš čenja; 
Utemeljitev uporabljenega modela rekonstruirane človeške pokožnice in 
protokola 
Preskusni pogoji: — uporabljeni sistem celic, — popolne informacije za podporo specifi čnemu uporabljenemu modelu 
rekonstruirane človeške pokožnice, vklju čno z njegovo u činkovitostjo. 
To lahko vklju čuje, vendar ni omejeno na: 
(i) sposobnost preživetja; 
(ii) pregradno funkcijo; 
(iii) morfologijo; 
(iv) ponovljivost in napovedljivost; 
(v) nadzor kakovosti modela, 
— podrobni podatki o preskusnem postopku, — uporabljeni preskusni odmerki, čas izpostavljenosti in inkubacijska 
doba po preskušanju, 
— opis vseh sprememb postopka preskušanja, — sklicevanje na podatke o modelu, pridobljene v preteklosti. To lahko 
vključuje, vendar ni omejeno na: 
(i) sprejemljivost podatkov o nadzoru kakovosti s sklicevanjem na 
podatke o seriji, pridobljene v preteklosti; 
(ii) sprejemljivost vrednosti pozitivne in negativne kontrole s skliceva ­
njem na sredstva in razpone pozitivne in negativne kontrole, 
— opis uporabljenih meril za ocenjevanje, vklju čno z zagovorom izbire 
mejnih vrednosti za napovedni model, 
— sklicevanje na podatke, pridobljene v preteklosti;
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 660
 
Rezultati: 
— evidentiranje podatkov posameznih preskusnih kemikalij za vsak 
preskus in vsako ponovljeno meritev, 
— navedba kontrol, uporabljenih za snovi, ki neposredno zmanjšajo MTT, 
in/ali obarvane preskusne kemikalije, 
— opis drugih opaženih u činkov; 
Razprava o rezultatih 
Sklep  
VIRI 
1. UN (2009), United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS), Third revised edition, UN New York and 
Geneva. Na voljo na spletni strani: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ 
ghs/ghs_rev03/03files_e.html. 
2. EC-ECVAM (2009), Statement on the „Performance under UN GHS of three  
in vitro  assays for skin irritation testing and the adaptation of the Reference 
Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin irritation 
Performance Standards“, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC30), 9 April 2009. Na voljo na spletni strani: http://ec ­
vam.jrc.ec.europa.eu. 
3. Uredba (ES) št. 1272/2008 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 
16. decembra 2008 o razvrš čanju, ozna čevanju in pakiranju snovi ter zmesi, 
o spremembi in razveljavitvi direktiv 67/548/EGS in 1999/45/ES ter spre ­
membi Uredbe (ES) št. 1907/2006. UL L 353, 31. 12. 2008, str. 1. 
4. OECD (2004), Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the 
Testing of Chemicals No. 404, OECD, Paris. Na voljo na spletni strani: 
http://www.oecd.org/env/testguidelines. 
5. OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical 
Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 430, 
OECD, Paris. Na voljo na spletni strani: http://www.oecd.org/env/testguide ­
lines. 
6. OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD 
Guideline for the Testing of Chemicals No. 431, OECD, Paris. Na voljo na 
spletni strani: http://www.oecd.org/env/testguidelines. 
7. OECD (2006),  In Vitro  Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, 
OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Na voljo na spletni strani: http://www.oecd.org/env/testguidelines. 
8. EC-ECVAM (2009), Performance Standards for  in vitro  skin irritation test 
methods based on Reconstructed human Epidermis (RhE)? Na voljo na spletni strani: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 
9. OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, 
OECD Series on Testing and Assessment No. 34, OECD, Paris. Na voljo na spletni strani: http://www.oecd.org/env/testguidelines. 
10. Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, 
J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J. M. and Botham, P. (2001), A 
prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, Results and 
evaluation by the Management Team, Toxicol. in Vitro 15, 57–93. 
11. Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. and Roguet, R. (2002), Refinement 
of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemi ­
cals: follow-up to the ECVAM prevalidation study, Toxicol. in Vitro 16, 
765–770.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 661
 
12. Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. 
and Spielmann, H. (2004), Optimisation of the EpiDerm test protocol for the 
upcoming ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests, ALTEX 
21, 107–114. 
13. Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, 
D. and Spielmann, H. (2005), The EpiDerm test protocol for the upcoming 
ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests – An assessment of 
the performance of the optimised test, ATLA 33, 351–367. 
14. Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. and Rubinsteen, G. 
(2005), The  in vitro  acute skin irritation of chemicals: optimisation of the 
EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation process, ATLA 33, 329–349. 
15. Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., 
Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, 
R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. and Worth, A. (2002), Follow-up to the ECVAM prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, 
The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irrita ­
tion Task Force report 2, ATLA 30, 109–129. 
16. Spielmann, H., mailto:Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., 
Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., 
Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM 
international validation study on  in vitro  tests for acute skin irritation: Report 
on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity function test, ATLA 35, 559–601. 
17. Hoffmann, S. (2006), ECVAM skin irritation validation study phase II: 
Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1- α. 
Na voljo na spletni strani: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 
18. Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. and 
Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on  in vitro  
tests for acute skin irritation: selection of test chemicals, ATLA 35, 603–619. 
19. Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., 
Tinois-Tessonneaud, E. and Leclaire, J. (2007),  In vitro  acute skin irritancy 
of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy - Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, 14, 351–358. 
20. EC-ECVAM (2007), Statement on the validity of  in vitro  tests for skin 
irritation, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC26), 27 April 2007. Na voljo na spletni strani: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 
21. EC-ECVAM (2007), Performance Standards for applying human skin 
models to  in vitro  skin irritation testing. Na voljo na spletni strani: http:// 
ecvam.jrc.ec.europa.eu. 
22. EC-ECVAM (2008), Statement on the scientific validity of  in vitro  tests for 
skin irritation testing, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee 
(ESAC29), 5 November 2008. Na voljo na spletni strani: http://ec ­
vam.jrc.ec.europa.eu. 
23. OECD (2010), Explanatory background document to the OECD draft Test 
Guideline on  in vitro  skin irritation testing. OECD Series on Testing and 
Assessment, No. 137, OECD, Paris. Na voljo na spletni strani: http:// 
www.oecd.org/document/24/ 0,3746,en_2649_34377_47858904_1_1_1_1,00.html . 
24. Welss, T., Basketter, D.A. and Schröder, K.R. (2004),  In vitro  skin irritation: 
fact and future. State of the art review of mechanisms and models, Toxicol. 
in Vitro 18, 231–243.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 662
 
25. Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and survi ­
val: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods 
65, 55–63. 
26. EpiSkin  TM SOP, Version 1.8 (February 2009), ECVAM Skin Irritation Vali ­
dation Study: Validation of the EpiSkin  TM test method 15 min - 42 hours for 
the prediction of acute skin irritation of chemicals. Na voljo na spletni strani: 
http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 
27. EpiDerm  TM SOP, Version 7.0 (Revised March 2009), Protocol for:  In vitro  
EpiDerm  TM skin irritation test (EPI-200-SIT), For use with MatTek Corpo ­
ration’s reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). Na voljo na spletni strani: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 
28. SkinEthic
 TM RHE SOP, Version 2.0 (February 2009), SkinEthic skin irrita ­
tion test-42bis test method for the prediction of acute skin irritation of chemicals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. Na voljo na spletni strani: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 
29. Harvell, J.D., Lamminstausta, K., and Maibach, H.I. (1995), Irritant contact 
dermatitis, In: Practical Contact Dermatitis, str. 7–18, (Ed. Guin J. D.). Mc 
Graw-Hill, New York. 
30. Direktiva Komisije 2001/59/ES z dne 6. avgusta 2001 o 28. prilagoditvi 
tehničnemu napredku Direktive Sveta 67/548/EGS o približevanju zakonov 
in drugih predpisov v zvezi z razvrš čanjem, pakiranjem in ozna čevanjem 
nevarnih snovi (UL L 225, 21.8.2001, str. 1). 
31. Basketter, D.A., York, M., McFadden, J.P. and Robinson, M.K. (2004), 
Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. Contact Dermatitis 51, 1–4. 
32. Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, H., 
Marriott, M. and Kandarova, H. (2007), Comparison of human skin irritation 
and photo-irritation patch test data with cellular  in vitro  assays and animal  in 
vivo data, ALTEX, 14, 359–365. 
33. Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, 
M. and Kandárová, H. (2010), Comparison of human skin irritation patch 
test data with  in vitro  skin irritation assays and animal data, Contact Derma ­
titis, 62, 109–116.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 663
 
Dodatek 1  
Opredelitve pojmov  
Natančnost: stopnja ujemanja rezultatov preskusne metode z uveljavljenimi refe ­
renčnimi vrednostmi. To je merilo u činkovitosti preskusne metode in eden od 
vidikov ustreznosti. Ta izraz in izraz „skladnost“ se pogosto izmeni čno upora­
bljata za poimenovanje deleža ustreznih rezultatov preskusne metode (9). 
Sposobnost preživetja celic: parameter za merjenje celotne dejavnosti celi čne 
populacije, npr. zmožnosti celi čnih mitohondrijskih dehidrogenaz za redukcijo 
vitalnega barvila MTT ([3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid], Thiazolyl blue), ki se glede na izmerjeni kon čni učinek in uporabljeni na črt 
preskusa ujema s skupnim številom in/ali sposobnostjo preživetja živih celic. 
Skladnost: je merjenje u činkovitosti preskusne metode pri preskusnih metodah, s 
katerimi se dosežejo kategori čni rezultati, in eden od vidikov ustreznosti. Izraz se 
izmenično uporablja z natan čnostjo in je opredeljen kot delež vseh preskušanih 
kemikalij, ki so pravilno razvrš čene kot pozitivne ali negativne. (9). 
ET
 50 : lahko se oceni z dolo čanjem časa izpostavljenosti, ki je potreben za zmanj ­ 
šanje sposobnosti preživetja celic za 50 % po nanosu dolo čene stalne koncen ­
tracije ozna čevalca, glej tudi IC  50 . 
EU CLP (Uredba (ES) št. 1272/2008 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 
16. decembra 2008 o razvrš čanju, ozna čevanju in pakiranju snovi ter zmesi): v 
Evropski uniji izvaja globalno usklajen sistem za razvrš čanje in ozna čevanje 
kemikalij (snovi in zmesi) Združenih narodov (3). 
GHS (globalno usklajen sistem za razvrš čanje in ozna čevanje kemikalij) Zdru ­ 
ženih narodov (ZN)): sistem za razvrš čanje kemikalij (snovi in zmesi) s pomo čjo 
standardiziranih vrst in stopenj fizikalnih, zdravstvenih in okoljskih nevarnosti ter 
za označevanje z npr. piktogrami, opozorilnimi besedami, izjavami o nevarnosti, 
varnostnimi izjavami in varnostnimi listi z namenom razširjanja informacij o škodljivih u činkih kemikalij ter s tem zaš čite ljudi (vklju čno z delodajalci, 
delavci, prevozniki, potrošniki in reševalci) in okolja (1). 
IC
 50 : lahko se oceni z dolo čanjem koncentracije, pri kateri ozna čevalec po dolo ­ 
čenem času izpostavljenosti zmanjša sposobnosti preživetja tkiva za 50 % (IC  50 ), 
glej tudi ET  50 . 
Prevelik odmerek: koli čina na pokožnico nanesene preskusne kemikalije, ki je 
večja od koli čine, potrebne za celotno in enakomerno prekrivanje površine 
pokožnice. 
Podobni preskus: pogovorni izraz za preskusno metodo, ki je strukturno in 
funkcijsko podobna potrjeni in uveljavljeni referen čni preskusni metodi. Takšna 
preskusna metoda je primerna za naknadno validacijo. Uporablja se izmeni čno s 
podobno preskusno metodo (9). 
Standardi u činkovitosti: standardi, ki temeljijo na validirani referen čni metodi, na 
podlagi katere se lahko ocenjuje primerljivost predlagane preskusne metode, ki je v funkcijskem in mehani čnem smislu podobna referen čni. Obsegajo: i) nujne 
elemente preskusne metode, ii) najkrajši možni seznam referen čnih kemikalij, 
izbranih iz skupine kemikalij, ki se uporabljajo za dokazovanje sprejemljive učinkovitosti validirane preskusne metode, ter iii) podobne stopnje natan čnosti 
in zanesljivosti, ki temeljijo na rezultatih validirane preskusne metode, kar mora 
dokazati predlagana preskusna metoda pri ocenjevanju ob uporabi najkrajšega 
možnega seznama referen čnih kemikalij (9).
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 664
 
Referenčne kemikalije: kemikalije, izbrane za uporabo v postopku validacije, za 
katere so odzivi referen čnega preskusnega sistema ali želenih vrst  in vitro  ali in 
vivo že znani. Te kemikalije morajo biti reprezentativne za razrede kemikalij, za 
katere naj bi se uporabila preskusna metoda, predstavljati pa morajo celoten razpon odzivov, ki se jih lahko pri čakuje od kemikalij, za katere bo morda 
uporabljena, od mo čnega, do šibkega, do negativnega. Za razli čne faze validacije 
in različne preskusne metode ter preskusne uporabe so lahko potrebne razli čne 
skupine referen čnih kemikalij (9). 
Ustreznost: opis odnosa med preskusom in želenim u činkom ter njegovim 
pomenom in uporabnostjo za dolo čen namen. Pomeni stopnjo, do katere preskus 
pravilno izmeri ali napove želeni biološki u činek. Ustreznost vklju čuje upošte ­
vanje natan čnosti (skladnosti) preskusne metode (9). 
Zanesljivost: stopnja reproduktivnosti preskusne metode v laboratorijih in med 
njimi v dolo čenem časovnem obdobju pri uporabi istega protokola. Oceni se z 
izračunom ponovljivosti v enem ali ve č laboratorijih (9). 
Nadomestni preskus: preskus, ki bo nadomestil preskus v redni uporabi in ki je 
uveljavljen za ugotavljanje nevarnosti in/ali oceno tveganja ter za katerega je bilo ugotovljeno, da v primerjavi z uveljavljenim preskusom v vseh mogo čih okoli­ 
ščinah preskušanja in za vse mogo če preskusne kemikalije zagotavlja enakovredno 
ali izboljšano varstvo zdravja ljudi ali živali ali okolja, kot se uporablja (9). 
Občutljivost: delež vseh pozitivnih/aktivnih preskusnih kemikalij, ki se s 
preskusom pravilno razvrstijo. To je merilo natan čnosti za preskusno metodo, s 
katero se dosežejo kategori čni rezultati, in je pomemben dejavnik pri ocenjevanju 
ustreznosti preskusne metode (9). 
Draženje kože: draženje kože je nastanek popravljive poškodbe kože po nanosu 
preskusne snovi za najve č 4 ure. Razdraženost kože je reakcija, ki je prisotna na 
posameznih mestih, ni imunogena in se pojavi kmalu po izpostavitvi kože draženju (29). Njena glavna lastnost je popravljiva narava, ki vklju čuje vnetne 
reakcije in ve čino značilnih klini čnih znakov razdraženosti (rde čino, oteklino, 
srbenje in bole čino), povezanih z vnetnim procesom. 
Specifičnost: delež vseh negativnih/neaktivnih preskusnih kemikalij, ki se s 
preskusom pravilno razvrstijo. To je merilo natan čnosti za preskusno metodo, s 
katero se dosežejo kategori čni rezultati, in je pomemben dejavnik pri ocenjevanju 
ustreznosti preskusne metode. (9). 
Strategija stopenjskega preskušanja: preskušanje, pri katerem se preskusne 
metode uporabljajo v zaporedju; o preskusnih metodah, izbranih v vsaki naslednji stopnji, se odlo ča na podlagi rezultatov na prejšnji stopnji preskušanja (9). 
Preskusna kemikalija (imenovana tudi preskusna snov): katera koli snov ali 
zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 665
 
Dodatek 2  
Standardi u činkovitosti za oceno predlaganih podobnih ali spremenjenih 
metod rekonstruirane človeške pokožnice  in vitro  za draženje kože  
UVOD 
1. Namen standardov u činkovitosti je posredovati podlago, na kateri se lahko za 
nove metode, lastniške (tj. avtorske, zaš čitene z blagovno znamko, registri ­
rane) in nelastniške, ugotovi, da so ustrezno natan čne in zanesljive za dolo ­ 
čene namene preskušanja. Ti standardi u činkovitosti, ki temeljijo na validi ­
ranih in uveljavljenih preskusnih metodah, se lahko uporabijo za oceno zane ­
sljivosti in natan čnosti drugih podobnih metod (ki se pogovorno imenujejo 
„podobni“ preskusi), ki temeljijo na podobnih znanstvenih na čelih in merijo 
ali napovedujejo isti biološki ali toksi čni učinek (9). 
2. Spremenjene metode (tj. predlagane morebitne izboljšave odobrene 
preskusne metode) je treba pred sprejetjem oceniti, da se ugotovita u činek 
predlaganih sprememb na u činkovitost preskusa in obseg, v katerem 
takšne spremembe vplivajo na informacije, ki so na voljo za druge 
elemente postopka validacije. Odvisno od števila in narave predlaganih 
sprememb, dobljenih podatkov in podporne dokumentacije za te spre ­
membe se zanje izvede enak postopek validacije, kot je predpisan za nov preskus ali, po potrebi, omejena ocena zanesljivosti in ustreznosti z 
uveljavljenimi standardi u činkovitosti (9). 
3. Podobne ali spremenjene metode katere koli od treh validiranih metod 
[EpiSkin™ (validirana referen čna metoda – VRM), EpiDerm™ SIT 
(EPI-200) in SkinEthic™ RHE], ki so predlagane za uporabo v okviru te preskusne metode, je treba oceniti ter dolo čiti njihovo zanesljivost in 
natančnost z uporabo kemikalij, ki predstavljajo celoten razpon rezultatov 
preskusa Draize za draženje kože. Pri ocenjevanju z uporabo 20 priporo ­ 
čenih referen čnih kemikalij standardov u činkovitosti (preglednica 1) 
morajo biti predlagane podobne ali spremenjene metode tako zanesljive 
in natančne kot validirana referen čna metoda (preglednica 2) (2) (16). 
Vrednosti natan čnosti in zanesljivosti, ki morajo biti dosežene, so nave ­
dene v odstavkih 8 do 12 tega dodatka. Vklju čene so nerazvrš čene (brez 
kategorije po GHS ZN/CLP EU) in razvrš čene (kategorija 2 po GHS 
ZN/CLP EU) (1) kemikalije, ki predstavljajo razli čne kemijske razrede, 
da se lahko zanesljivost in natan čnost (občutljivost, specifi čnost in splošna 
natančnost) predlagane metode primerjata z zanesljivostjo in natan čnostjo 
validirane referen č
ne metode. Pred uporabo metode za preskušanje novih 
preskusnih kemikalij je treba dolo čiti zanesljivost metode, njeno zmožnost, 
da pravilno opredeli dražilne kemikalije kategorije 2 po GHS ZN/CLP EU, in, odvisno od zakonodajnega okvira, za katerega se pridobivajo podatki, 
tudi njeno zmožnost, da pravilno opredeli kemikalije brez kategorije po 
GHS ZN/CLP EU. 
4. Ti standardi u činkovitosti temeljijo na standardih u činkovitosti evropskega 
ECVAM (8) in so posodobljeni v skladu s sistemi po GHS ZN/CLP EU za razvrščanje in ozna čevanje (1) (3). Prvotni standardi u činkovitosti so bili 
opredeljeni po kon čani validacijski študiji (21) in so temeljili na sistemu 
razvrščanja EU, kot ga dolo ča Direktiva Komisije 2001/59/ES z dne 
6. avgusta 2001 o 28. prilagoditvi tehni čnemu napredku Direktive Sveta 
67/548/EGS o približevanju zakonov in drugih predpisov v zvezi z razvrš ­ 
čanjem, pakiranjem in ozna čevanjem nevarnih snovi (
 1 ). Zaradi sprejetja  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 666  
( 1 ) UL L 225, 21.8.2001, str. 1.
 sistema po GHS ZN za razvrš čanje in ozna čevanje v EU (CLP EU) (3), do 
katerega je prišlo med zaklju čkom validacijske študije in dokon čanjem te 
preskusne metode, so bili standardi u činkovitosti posodobljeni (8). Poso ­
dobitev se nanaša v glavnem na spremembe (i) sklopa referen čnih kemi­
kalij standardov u činkovitosti ter (ii) opredeljenih vrednosti zanesljivosti in 
natančnosti (2) (23).  
STANDARDI U ČINKOVITOSTI ZA PRESKUSNE METODE REKONSTRUI ­
RANE ČLOVEŠKE POKOŽNICE  IN VITRO  ZA DRAŽENJE KOŽE 
5. Standardi u činkovitosti zajemajo naslednje tri elemente (9): 
I. Nujne elemente preskusne metode 
II. Najkrajši možni seznam referen čnih kemikalij 
III. Opredeljene vrednosti natan čnosti in zanesljivosti  
I. Nujni elementi preskusne metode  
6. Vklju čujejo bistvene strukturne, funkcionalne in postopkovne elemente 
validirane metode, ki morajo biti vklju čeni v protokol predlagane, v funk ­
cijskem in mehani čnem smislu podobne ali spremenjene metode. Ti 
elementi vklju čujejo edinstvene zna čilnosti metode, pomembne podrob ­
nosti o postopku in ukrepe za nadzor kakovosti. Izpolnjevanje teh 
bistvenih elementov preskusne metode pomaga pri zagotavljanju, da podobna ali spremenjena metoda temelji na enakih konceptih kot ustrezna validirana referen čna metoda (9). Bistveni elementi preskusne metode so 
podrobneje opisani v odstavkih 16 do 21 preskusne metode, pri presku ­ 
šanju pa je treba upoštevati naslednje: 
— splošne pogoje (odstavek 16) in — funkcionalne pogoje, ki obsegajo: 
— sposobnost preživetja (odstavek 17), 
— pregradno funkcijo (odstavek 18), — morfologijo (odstavek 19), 
— ponovljivost (odstavek 20), in 
— nadzor kakovosti (odstavek 21).
 
II. Najkrajši možni seznam referen čnih kemikalij  
7. Referen čne kemikalije se uporabljajo za ugotavljanje, ali sta zanesljivost in 
natančnost predlagane podobne ali spremenjene metode, ki se je izkazala 
za strukturno in funkcionalno dovolj podobno validirani referen čni metodi 
ali ki predstavlja manjšo spremembo ene od validiranih referen čnih metod, 
primerljivi z u činkovitostjo validirane referen čne metode 1 ali boljši kot 
VRM (2) (8) (16) (23). Med 20 priporo čenimi referen čnimi kemikalijami, 
navedenimi v preglednici 1, so kemikalije, ki predstavljajo razli čne 
kemijske razrede (tj. kategorije kemikalij na podlagi funkcionalnih skupin) in so reprezentativne za celoten razpon rezultatov preskusa Draize za 
draženje kože (od nerazdražene do zelo razdražene kože). Kemikalije, 
vključene v seznam, obsegajo 10 kemikalij kategorije 2 po GHS ZN/CLP 
EU in 10 nerazvrš čenih kemikalij, od katerih so 3 kemikalije iz neobvezne 
kategorije 3 po GHS ZN. V okviru te preskusne metode se neobvezna 
kategorija 3 šteje kot „Brez kategorije“. Kemikalije iz preglednice 1 so 
glede na kemijsko delovanje in agregatno stanje izbrane iz kemikalij, uporabljenih v fazi optimizacije, ki je sledila predvalidaciji, in v valida ­
cijski študiji validirane referen čne metode (14) (18). Te referen čne kemi­
kalije predstavljajo najmanjše možno število snovi, ki jih je treba uporabiti 
pri ocenjevanju natan čnosti in zanesljivosti predlagane podobne ali
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 667
 
spremenjene metode, vendar se ne smejo uporabljati za razvoj novih 
metod. Če navedena snov ni na voljo, se lahko uporabijo druge snovi, 
za katere so na voljo ustrezni referen čni podatki  in vivo , zlasti iz kemikalij, 
uporabljenih v fazi optimizacije, ki je sledila predvalidaciji, in v valida ­
cijski študiji validirane referen čne metode. Po želji se lahko na najkrajši 
možni seznam referen čnih kemikalij dodajo druge kemikalije, ki predsta ­
vljajo druge kemijske razrede in za katere so na voljo ustrezni referen čni 
podatki  in vivo , da se dodatno oceni natan čnost predlagane metode.  
Preglednica 1  
Najkrajši možni seznam referen čnih kemikalij za dolo čitev vrednosti natan čnosti in zanesljivosti za metode 
rekonstruirane človeške pokožnice za razdraženost kože  ( 1 ) 
Kemikalija Številka CAS Agregatno stanje Rezultat preskusa  
in vivo  VRM  in vitro  
kat. GHS ZN/CLP EU  in 
vivo kat. 
1-bromo-4-kloropropan 6940-78-9 teko če 0 kat. 2 brez kategorije 
Dietil ftalat 84-66-2 teko če 0 brez katego ­
rije brez kategorije 
Naftalen ocetna kislina 86-87-3 trdno 0 brez katego ­
rije brez kategorije 
Alil fenoksiacetat 7493-74-5 teko če 0,3 brez katego ­
rije brez kategorije 
Izopropanol 67-63-0 teko če 0,3 brez katego ­
rije brez kategorije 
4-metiltio-benzaldehid 3446-89-7 teko če 1 kat. 2 brez kategorije 
Metil stearat 112-61-8 trdno 1 brez katego ­
rije brez kategorije 
Heptil butirat 5870-93-9 teko če 1,7 brez katego ­
rije brez kategorije 
Heksil salicilat 6259-76-3 teko če 2 brez katego ­
rije brez kategorije 
Cinnamaldehid 104-55-2 teko če 2 kat. 2 brez kategorije 
(neobvezna 
kat.3) ( 3 ) 
1-dekanol  ( 2 ) 112-30-1 teko če 2,3 kat. 2 kat. 2  
Ciklamen aldehid 103-95-7 teko če 2,3 kat. 2 kat. 2 
1-bromoheksan 111-25-1 teko če 2,7 kat. 2 kat. 2 
2-klorometil-3,5-dimetil-4- 
metoksipiridinhidroklorid 86604-75-3 trdno 2,7 kat. 2 kat. 2  
Di-n-propildisulfid  ( 2 ) 629-19-6 teko če 3 brez 
kategorije kat. 2  
Kalijev hidroksid (5-odstotni 
vodni) 1310-58-3 teko če 3 kat. 2 kat. 2 
Benzenetiol, 5–(1,1-dimetile ­
til)-2-metil 7340-90-1 teko če 3,3 kat. 2 kat. 2 
1-metil-3-fenil-1-piperazin 5271-27-2 trdno 3,3 kat. 2 kat. 2  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 668
 
Kemikalija Številka CAS Agregatno stanje Rezultat preskusa  
in vivo  VRM  in vitro  
kat. GHS ZN/CLP EU  in 
vivo kat. 
Heptanal 111-71-7 teko če 3,4 kat. 2 kat. 2 
Tetrakloroetilen 127-18-4 teko če 4 kat. 2 kat. 2  
( 1 ) Izbor kemikalij temelji na naslednjih merilih: (i) kemikalije so na voljo na tržiš ču, (ii), predstavljajo celoten niz rezultatov preskusa 
Draize za draženje kože (od nerazdražene do zelo razdražene kože), (iii) njihova kemi čna struktura je natan čno opredeljena, (iv) 
predstavljajo kemijsko delovanje, ki je uporabljeno v validacijskem postopku, in (v), niso povezane z zelo strupenim profilom ( npr. 
rakotvornim ali strupenim za reprodukcijski sistem) ali stroški zaradi prepovedane izpostavljenosti tem kemikalijam. 
( 2 ) Kemikalije, ki so dražilne za kunce, vendar obstajajo zanesljivi dokazi, da niso dražilne za ljudi (31) (32) (33). 
( 3 ) Po GHS ZN, ne po CLP EU.  
III. Opredeljene vrednosti natan čnosti in zanesljivosti  
8. Za namene dolo čanja zanesljivosti in ustreznosti predlaganih podobnih ali 
spremenjenih metod, ki se bodo uporabljale v ve č laboratorijih, je treba 
vseh 20 referen čnih kemikalij iz preglednice 1 preskusiti v vsaj treh labo ­
ratorijih. Če se bo predlagana metoda uporabljala v samo enem laborato ­
riju, preskušanje v ve č laboratorij za validacijo ne bo potrebno. Vendar pa 
je bistveno, da takšne validacijske študije v skladu z mednarodnimi smer ­
nicami neodvisno ocenijo mednarodno priznani organi za validacijo (9). V 
vsakem laboratoriju mora biti preskušanih vseh 20 kemikalij v treh neod ­
visnih ponovitvah, izvedenih z razli čnimi serijami tkiv in v intervalih, med 
katerimi je preteklo dovolj časa. Vsako ponovitev morajo sestavljati vsaj 
trije sočasno preskušani dvojniki tkiv za vsako vklju čeno preskusno kemi ­
kalijo, negativno kontrolo in pozitivno kontrolo. 
9. Vrednosti zanesljivosti in natan čnosti predlagane metode je treba izra čunati 
ob upoštevanju vseh štirih meril, navedenih v nadaljevanju, s čimer se 
zagotovi, da so vrednosti zanesljivosti in ustreznosti izra čunane na vnaprej 
določen in dosleden na čin: 
1. za izra čun spremenljivosti in napovedljivosti (natan čnosti) metode v 
laboratoriju in med laboratoriji se upoštevajo samo podatki ponovitev 
v celoti izvedenih zaporedij ponovitev; 
2. vsak sodelujo č laboratorij mora pri dokon čnem razvrš čanju vsake refe ­
renčne kemikalije upoštevati povpre čno vrednost sposobnosti preživetja 
iz različnih izvedenih ponovitev preskusa v celoti izvedenega zaporedja 
ponovitev; 
3. pri izra čunu spremenljivosti metode med laboratoriji se upoštevajo 
samo podatki, pridobljeni za kemikalije, za katere so bila zaporedja 
ponovitev v celoti izvedena v vseh sodelujo čih laboratorijih; 
4. izračun vrednosti natan čnosti se izvede na podlagi napovedi posamez ­
nega laboratorija, ki so jih razli čni sodelujo či laboratoriji pridobili za 20 
referenčnih kemikalij. 
V skladu s tem  zaporedje ponovitev  sestavljajo tri neodvisne ponovitve, 
ki jih izvede en laboratorij za eno preskusno kemikalijo.  V celoti izvedeno 
zaporedje ponovitev  je zaporedje ponovitev, ki jih izvede en laboratorij 
za eno preskusno kemikalijo, pri čemer so veljavne vse tri ponovitve. To 
pomeni, da ena sama neveljavna ponovitev razveljavi celotno zaporedje 
ponovitev, sestavljeno iz treh ponovitev.  
Ponovljivost v laboratoriju  
10. Ocena ponovljivosti v laboratoriju mora kazati skladnost razvrstitev (v 
kategorijo 2/brez kategorije po GHS ZN/CLP EU), ki se doseže z razli ­ 
čnimi neodvisnimi ponovitvami preskusa z 20 referen čnimi kemikalijami v 
enem laboratoriju in je enaka ali ve čja (≥) od 90 %.  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 669
 
Ponovljivost v razli čnih laboratorijih  
11. Ocena ponovljivosti v razli čnih laboratorijih ni potrebna, če se bo pred ­
lagana preskusna metoda uporabljala le v enem laboratoriju. Za metode, ki 
se bodo uporabljale v ve č laboratorijih, mora biti skladnost razvrstitev (v 
kategorijo 2/brez kategorije po GHS ZN/CLP EU), ki se dosežejo z razli ­ 
čnimi neodvisnimi ponovitvami preskusa z 20 referen čnimi kemikalijami, 
najbolje v najmanj treh laboratorijih, enaka ali ve čja (≥) od 80 %.  
Napovedljivost (natan čnost)  
12. Natan čnost (občutljivost, specifi čnost in splošna natan čnost) predlagane 
podobne ali spremenjene metode mora biti primerljiva z natan čnostjo 
validirane referen čne metode, ob upoštevanju dodatnih informacij, pove ­
zanih z ustreznostjo pri želenih vrstah (preglednica 2). Ob čutljivost mora 
biti enaka ali ve čja (≥) od 80 % (2) (8) (23). Nadaljnja posebna omejitev 
se nanaša na ob čutljivost predlagane metode  in vitro , saj lahko samo dve 
kemikaliji kategorije 2  in vivo , 1-dekanol  in di-n-propildisulfid , več kot en 
sodelujoči laboratorij napa čno razvrsti kot brez kategorije. Specifi čnost 
mora biti enaka ali ve čja (≥) od 70 % (2) (8) (23). Glede specifi čnosti 
predlaganih metod  in vitro  ni nobenih drugih omejitev, tj. kateri koli 
sodelujoči laboratorij lahko napa čno razvrsti katero koli kemikalijo brez 
kategorije  in vivo , če je končna specifi čnost preskusne metode v sprejem ­
ljivem razponu. Splošna natan čnost mora biti enaka ali ve čja (≥) od 75 % 
(2) (8) (23). Čeprav je ob čutljivost validirane referen čne metode, izra ču­
nane za 20 referen čnih kemikalij iz preglednice 1, enaka 90 %, je oprede ­
ljena najnižja možna vrednost ob čutljivosti za katero koli podobno ali 
spremenjeno metodo, ki se šteje za veljavno, dolo čena na 80 %, saj je 
za obe kemikaliji, 1 -dekanol  (mejna kemikalija) in  di-n-propildisulfid  
(lažna negativna validirane referen čne metode), znano, da pri ljudeh ne 
povzročata draženja (31) (32) (33), čeprav sta bili pri preskusu s kunci 
opredeljeni kot dražilni snovi. Ker modeli rekonstruirane človeške pokož ­
nice temeljijo na celicah človeškega izvora, lahko te kemikalije napovedo 
kot snovi, ki ne dražijo (brez kategorije po GHS ZN/CLP EU).  
Preglednica 2  
Zahtevane vrednosti napovedljivosti za ob čutljivost, specifi čnost in splošno natan čnost katere 
koli podobne ali spremenjene metode, ki se šteje za veljavno  
Občutljivost Specifi čnost Splošna natan čnost 
≥ 80 % ≥ 70 % ≥ 75 %  
Merila za sprejemljivost študije  
13. Lahko se zgodi, da eden ali ve č preskusov v zvezi z eno preskusno 
kemikalijo ali ve č preskusnimi kemikalijami ne izpolnjuje meril za spre ­
jemljivost preskusa za preskusne in kontrolne kemikalije ali pa ni sprejem ­
ljiv zaradi drugih razlogov. Za dopolnitev manjkajo čih podatkov je za 
vsako preskusno kemikalijo dopustna izvedba najve č dveh dodatnih 
preskusov („ponovno preskušanje“). Natan čneje, ker je treba v primeru 
ponovnega preskušanja primerjalno preskusiti tudi pozitivno in negativno kontrolo, sta lahko za vsako preskusno kemikalijo izvedeni najve č dve 
dodatni ponovitvi. 
14. Obstaja verjetnost, da vsak sodelujo či laboratorij za vsako referen čno 
kemikalijo tudi po ponovnem preskušanju ne bo dobil vsaj treh veljavnih ponovitev, zahtevanih za vsako preskušano kemikalijo, zaradi česar bo 
podatkovna matrika nepopolna. Da se zbirka podatkov štela za popolno, 
je treba v takih primerih izpolniti naslednja tri merila: 
1. pri vseh 20 referen čnih kemikalijah mora biti vsaj eno zaporedje pono ­
vitev izvedeno v celoti;
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 670
 
2. v vsakem od vsaj treh sodelujo čih laboratorijev mora biti v celoti 
izvedenih vsaj 85 % zaporedij ponovitev (za 20 kemikalij; tj. v enem 
laboratoriju so dovoljena 3 neveljavna zaporedja ponovitev); 
3. v celoti izvedenih mora biti vsaj 90 % vseh zaporedij ponovitev iz vsaj 
treh laboratorijev (za 20 kemikalij, preskušanih v treh laboratorijih, tj. skupno je dovoljenih 6 neveljavnih zaporedij ponovitev).
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 671
 
B. 47  TESTNA METODA ZA DOLO ČANJE MOTNJAVE IN PREPUST ­
NOSTI ROŽENICE GOVEDA ZA UGOTAVLJANJE JEDKIH IN 
ZELO DRAŽILNIH SNOVI ZA O ČI (BCOP)  
UVOD 
1. Testna metoda za dolo čanje motnjave in prepustnosti roženice 
goveda (BCOP) je testna metoda  in vitro , ki se pod dolo čenimi pogoji in 
z določenimi omejitvami uporablja za razvrš čanje snovi in zmesi med „jedke 
in zelo dražilne za o či“ (1) (2) (3). Pri tej testni metodi so zelo dražilne 
snovi tiste snovi, ki povzro čajo poškodbe o či, ki se pri zajcu ohranijo 
najmanj 21 dni po aplikaciji. Čeprav testa  in vivo  na očeh zajcev ne more 
nadomestiti popolnoma, se test BCOP priporo ča kot del stopenjske testne 
strategije za regulativno razvrš čanje in ozna čevanje za posebna podro čja 
uporabe (4)(5). Testne snovi in zmesi (6) se lahko razvrstijo med jedke ali zelo dražilne snovi za o či, ne da bi bilo potrebno opraviti dodatno 
testiranje na zajcih. Snov z negativnim testnim rezultatom bi bilo treba 
testirati na zajcih s pomo čjo sekven čne testne strategije, ki je dolo čena v 
testni smernici OECD 405 (7) (poglavje B. 5 te priloge). 
2. V tej testni metodi so opisani postopki za oceno potencialne jedkosti in 
močne dražilnosti testne snovi za o či glede na njeno sposobnost, da v 
izolirani roženici goveda povzro ča motnjavo in pove čano prepustnost. 
Toksični učinki na roženico se merijo z: (i) zmanjšanim prenosom svetlobe 
(motnjava) in (ii) pove čanim prehajanjem barvila natrijevega fluoresceina 
(prepustnost). Oceni motnjave in prepustnosti roženice po aplikaciji testne snovi skupaj pomenita dražilnost  in vitro  (IVIS), ki se uporablja za 
razvrstitev testne snovi v razli čne stopnje draženja. 
3. S testno metodo BCOP so bile testirane tudi dražilne snovi, ki povzro čajo 
poškodbe o či, ki izginejo v manj kot 21 dnevih, in nedražilne snovi. Vendar 
natančnost in zanesljivost testne metode BCOP pri snoveh iz teh dveh 
kategorij nista bili ocenjeni formalno. 
4. Opredelitve so navedene v dodatku I.
 
ZAČETNI POMISLEKI IN OMEJITVE 
5. Ta testna metoda temelji na protokolu testne metode BCOP Medagencij ­
skega usklajevalnega odbora za validacijo alternativnih 
metod (ICCVAM)(8), ki je bil pripravljen po mednarodni študiji o validaciji (4)(5)(9), pri kateri sta sodelovala Evropski center za validacijo alternativnih metod (ECVAM) in Japonski center za validacijo alternativnih metod (JaC ­
VAM). Protokol temelji na informacijah, ki jih je prispeval Inštitut za razi ­
skave in vitro (IIVS), in protokolu INVITTOX 124 (10), ki se je uporabil pri predvalidacijski študiji o preskusu BCOP, ki je bila opravljena med leti 1997–1998 in ki jo je sponzorirala Evropska skupnost. Oba protokola teme ­
ljita na testni metodologiji BCOP, o kateri je prvi poro čal Gautheron  et al.  
(11).
 ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 672
 
6. Opredeljene omejitve za to testno metodo temeljijo na visokem številu lažno 
pozitivnih rezultatov za alkohole in ketone ter visokem številu lažno nega ­
tivnih rezultatov za trdne snovi, zbranih v podatkovni zbirki za validacijo (glej točko 44) (5). Če se snovi iz teh kemijskih in fizikalnih razredov 
izključijo iz podatkovne zbirke, se natan čnost BCOP v sistemih za razvrš ­ 
čanje snovi EU, EPA in GHS bistveno izboljša (5). Pri tem preskusu (tj. za 
ugotavljanje izklju čno jedkih in zelo dražilnih snovi za o či) lažno negativni 
rezultati niso kriti čni, saj bi se take snovi nato preskušale na zajcih ali, 
odvisno od regulativnih zahtev, z drugimi ustrezno potrjenimi testi  in vitro , 
pri katerih se uporablja sekven čna testna strategija, ki temelji na teži doka ­
zov. Poleg tega nekaterih kemijskih ali proizvodnih razredov (npr. zmesi) s trenutno validacijsko podatkovno zbirko ni bilo mogo če ustrezno oceniti. 
Vendar pa bi lahko preskuševalci to testno metodo uporabili pri vseh vrstah 
testnega materiala (tudi pri zmeseh), pri čemer bi bil pozitiven rezultat 
sprejemljiv kot indikator za jedko ali zelo dražilno snov za o či. Pozitivne 
rezultate, pridobljene z uporabo alkoholov ali ketonov, je treba razlagati previdno, saj obstaja tveganje, da so vanje vklju čeni tudi lažno pozitivni 
rezultati. 
7. Pri vseh postopkih na o česih in roženicah goveda je treba upoštevati 
veljavna pravila in postopke testnega urada o ravnanju z živalskim materia ­
lom, kamor spadajo med drugim tudi tkiva in tkivne teko čine. Priporo čajo 
se splošni previdnostni ukrepi za laboratorije (12). 
8. Čeprav testna metoda upošteva nekatere u činke, ocenjene s testno metodo za 
ugotavljanje dražilnih snovi na o čeh zajcev, in do dolo čene mere tudi 
njihovo resnost, je kljub temu omejena, saj ne upošteva poškodb veznice in šarenice. Čeprav tudi same reverzibilnosti poškodb roženice s preskusom 
BCOP ni mogo če oceniti, je bilo na podlagi študij na o čeh zajcev kljub 
temu predlagano, da se oceni prvotna globina poškodbe roženice ter tako razlikuje med ireverzibilnimi in reverzibilnimi u činki (13). Treba je tudi 
opozoriti, da s testno metodo BCOP ni mogo če oceniti potencialne 
sistemske toksi čnosti, povezane z izpostavljenostjo o či. 
9. Trenutno potekajo prizadevanja za nadaljnjo karakterizacijo uporabnosti in 
omejitev preskusa BCOP za ugotavljanje lažje dražilnih in nedražilnih snovi (glej tudi to čko 45). Uporabnikom se priporo ča, da organizacijam za vali ­
dacijo zagotovijo vzorce in/ali podatke za uradno oceno morebitnih prihod ­
njih uporab testne metode BCOP, vklju čno za ugotavljanje lažje dražilnih in 
nedražilnih snovi. 
10. Laboratoriji, ki ta preskus opravljajo prvi
č, morajo uporabiti kemikalije za 
preverjanje usposobljenosti iz dodatka 2. Te kemikalije uporabijo, da doka ­ 
žejo, da so tehni čno sposobni izvajati testno metodo BCOP, preden podatke 
o testu BCOP predložijo za regulativno razvrstitev nevarnosti.  
NAČELO TESTA 
11. Testna metoda BCOP je organotipski model, ki zagotavlja kratkoro čno 
ohranjanje obi čajne fiziološke in biokemijske funkcije roženice goveda  in 
vitro . Pri tej testni metodi se poškodba, ki jo povzro či testna snov, oceni 
tako, da se spremembe motnjave in prepustnosti roženice merijo kvantita ­
tivno z opacitometrom oziroma spektrofotometrom vidne svetlobe. Obe meritvi se uporabita za izra čun IVIS, na podlagi katerega se dodeli katego ­
rija nevarnosti dražilnosti  in vitro , s pomočjo katere se predvidi potencialni 
dražilni u činek testne snovi  in vivo  (glej merila za odlo čanje).
 ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 673
 
12. Pri testni metodi BCOP se uporabljajo izolirane roženice o či sveže zakla ­
nega goveda. Motnjava roženice se meri kvantitativno in ustreza koli čini 
svetlobe, ki prodre skozi roženico. Prepustnost se meri kvantitativno in ustreza koli čini barvila natrijevega fluoresceina, ki prodre skozi celotno 
debelino roženice in ga zazna medij v zadnjem delu držala. Testne snovi 
se dodajo v sprednji del držala za roženico in se tako aplicirajo na epitelno 
površino roženice. Dodatek 3 vsebuje opis in sliko držala, ki se uporablja za BCOP. Držala za roženico ponujajo na trgu razli čna podjetja, laboratoriji pa 
jih lahko izdelajo tudi sami.
 
Izvor in starost o či goveda ter izbor živalskih vrst  
13. Govedo, ki se zakolje v klavnicah, je obi čajno namenjeno za človeško 
prehrano ali druge komercialne uporabe. Pri testih BCOP se kot vir roženic 
uporabljajo samo zdrave živali, primerne za vstop v prehransko verigo. Ker so goveda glede na pasmo, starost in spol razli čno težka, ni priporo čene teže 
za zakol. 
14. Velikost roženice se lahko pri o čeh različno starih živali razlikuje. Roženice 
z vodoravnim premerom > 30,5 mm in centralno debelino roženice (CCT) 
≥ 1 100 μm ima obi čajno govedo, starejše od osem let, roženice z navpi čnim 
premerom < 28,5 mm in CCT < 900 μm pa običajno govedo, mlajše od pet 
let (14). Zato se o či goveda, starejšega od 60 mesecev, obi čajno ne upora ­
bljajo. O či goveda, mlajšega od 12 mesecev, se obi čajno prav tako ne 
uporabljajo, saj še niso popolnoma razvite, debelina in premer roženice pa sta bistveno manjša kot pri o čeh starejšega goveda. Kljub temu se lahko 
uporabljajo roženice mladih živali (tj. starih od šest do 12 mesecev), saj ima 
njihova uporaba nekatere prednosti, npr. ve čja razpoložljivost, manjši staro ­
stni razpon in manjša nevarnost izpostavljenosti goveji spongiformni ence ­
falopatiji za osebje klavnice (15). Ker bi bilo nadaljnje ocenjevanje u činka, 
ki ga imata velikost in debelina roženice na odzivnost jedkih in zelo 
dražilnih snovi za o či, koristno, se uporabnike spodbuja, da sporo čijo 
približno starost in/ali težo živali, katerih roženice so uporabili v študiji.
 
Odvzem in prevoz o či v laboratorij  
15. Oči odvzame osebje klavnice. Da bi čim bolj zmanjšali mehanske in druge 
vrste poškodb o či, jih morajo odvzeti takoj po zakolu. Da o či ne bi bile 
izpostavljene potencialno dražilnim snovem, osebje klavnice pri spiranju 
glav živali ne sme uporabljati detergentov. 
16. Oči je treba dati v dovolj veliko posodo, jih preliti s Hanksovo uravnoteženo 
raztopino soli (HBSS) in prepeljati v laboratorij tako, da se njihovo stanje čim manj poslabša in/ali da ne pride do bakterijske okužbe. Ker se o či 
odvzamejo med zakolom, lahko pridejo v stik s krvjo in drugimi biološkimi 
snovmi, vklju čno z bakterijami in drugimi mikroorganizmi. Zato mora biti 
tveganost okužbe čim manjša (tj. posoda, v kateri so o či, se mora hraniti na 
mokrem ledu, HBSS, ki se uporablja za hrambo o či med prevozom, pa je 
treba dodati antibiotike [tj. 100 IU/mL penicilina in 100 μg/mL streptomi ­
cina]).
 ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 674
 
17. Čas med odvzemom o či in uporabo roženic mora biti pri BCOP čim krajši 
(običajno se odvzamejo in uporabijo isti dan) in ne sme vplivati na zane ­
sljivost testnih rezultatov. Ti temeljijo na merilih za izbor o či ter pozitivnih 
in negativnih kontrolnih reakcijah. Vsa o česa, uporabljena v preskusu, 
morajo pripadati isti skupini o či, odvzeti na dolo čen dan.  
Merila za izbor o či za uporabo pri testu BCOP  
18. Po prihodu v laboratorij se o či skrbno pregledajo, ali so poškodovane, 
vključno s pove čano motnjavo, praskami in neovaskularizacijo. Uporabljajo 
se lahko samo roženice nepoškodovanih o či. 
19. Kakovost vsake roženice se oceni tudi v poznejši fazi preskusa. Roženice z 
motnjavo ve č kot sedem enot motnjave (OPOMBA: opacitometer je treba 
kalibrirati v skladu s standardi za dolo čevanje enot motnjave, glej dodatek 
3) je treba po enournem kalibriranju izlo čiti. 
20. Vsaka testna skupina (testna snov, primerjalne negativne in pozitivne 
kontrole) je sestavljena iz najmanj treh o či. Pri preskusu BCOP je treba 
za negativno kontrolo uporabiti tri roženice. Ker se roženice odstranijo s celotnega zrkla in pritrdijo v držala za roženice, se lahko zaradi artefaktov, 
ki nastanejo zaradi prijemanja, vrednosti motnjave in prepustnosti v posa ­
meznih primerih spremenijo (tudi pri negativni kontroli). Poleg tega se vrednosti motnjave in prepustnosti roženic z negativno kontrolno reakcijo uporabljajo za korigiranje vrednosti motnjave in preglednosti predmeta testi ­
ranja in pozitivnih kontrolnih vzorcev pri izra čunih IVIS.
 
POSTOPEK  
Priprava o či 
21. Nepoškodovane roženice se secirajo tako, da se ohrani 2 do 3 mm širok rob 
beločnice, kar olajša nadaljnje ravnanje, pri čemer je treba paziti, da se 
epitelij in endotelij roženice ne poškodujeta. Izolirane roženice se pritrdijo v posebej za to izdelana držala, sestavljena iz sprednjega in zadnjega dela 
držala, na katera je roženica pripeta z epitelno oziroma endotelno stranjo. 
Oba dela držala se do roba napolnita z ogretim Eaglovim minimalnim osnovnim medijem EMEM (najprej zadnji del držala), pri čemer je treba 
zagotoviti, da se ne tvorijo mehur čki. Naprava se nato ekvilibrira pri 
32 ± 1 °C najmanj eno uro, da se roženice ekvilibrirajo z medijem in da 
se doseže čim bolj normalna presnova (približna temperatura na površini 
roženice znaša  in vivo  32 °C). 
22. Po ekvilibriranju se v oba dela držala doda svež, ogret medij EMEM, za 
vsako roženico pa se zabeležijo izhodiš čne vrednosti motnjave. Roženice z 
makroskopskimi poškodbami tkiva (npr. praskami, pigmentacijo, neovasku ­
larizacijo) ali motnjavo, ve čjo od sedem enot, se zavržejo. Nato se izra čuna 
povprečna motnjava vseh ekvilibriranih roženic. Za negativno kontrolo (ali 
kontrolo s topilom) se izberejo najmanj tri roženice, katerih motnjava je 
blizu povpre čni motnjavi vseh roženic. Preostale roženice se nato razdelijo 
na skupino za nadaljnje testiranje in skupino za pozitivne kontrole.
 ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 675
 
23. Ker je toplotna kapaciteta vode ve čja od zraka, zagotavlja voda stabilnejše 
temperaturne pogoje za inkubacijo. Zato se priporo ča, da se držalo za rože ­
nico in njegova vsebina hranita v vodni kopeli pri 32 ± 1 °C. Lahko se uporabljajo tudi inkubatorji za vzdrževanje temperature zraka, če zagota­
vljajo stabilno temperaturo (tj. s pred časnim segrevanjem držal in medijev).
 
Uporaba testne snovi  
24. Vodita se dva razli čna testna protokola - eden za teko čine in površinsko 
aktivne snovi (trdne snovi ali teko čine) ter eden za površinsko neaktivne 
snovi (trdne snovi). 
25. Teko čine se testirajo nerazred čene, medtem ko se površinsko aktivne snovi 
testirajo v 10-odstotni koncentraciji w/v in 0,9-odstotni raztopini natrijevega 
klorida, destilirani vodi ali drugem topilu, za katerega je dokazano, da nima škodljivih u činkov na testni sistem. Poltrdne snovi, kreme in voski se 
navadno testirajo kot teko čine. Če se uporabljajo druge koncentracije razto ­
pin, jih je treba ustrezno utemeljiti. Roženice so izpostavljene teko činam in 
površinsko aktivnim snovem 10 minut. Če je čas izpostavljenosti druga čen, 
ga je treba ustrezno znanstveno utemeljiti. 
26. Površinsko neaktivne trdne snovi se navadno testirajo kot 20-odstotne razto ­
pine ali suspenzije v 0,9-odstotni raztopini natrijevega klorida, destilirani vodi ali drugem topilu, za katerega je dokazano, da nima škodljivih u činkov 
na testni sistem. V dolo čenih okoliš činah in če je znanstveno utemeljeno, se 
lahko trdne snovi testirajo tudi nerazred čene z neposredno aplikacijo na 
površino roženice, pri čemer se uporablja odprta metoda (glej to čko 29). 
Roženice so izpostavljene trdnim snovem štiri ure; če je znanstveno uteme ­
ljeno, se lahko tako kot pri teko činah in površinsko aktivnih snoveh čas 
izpostavljenosti spremeni. 
27. Uporabljajo se lahko razli čne testne metode, odvisno od fizikalnih in kemij ­
skih lastnosti testne snovi (tj. trdna, teko ča, viskozna ali neviskozna teko ­ 
čina). Najpomembnejše je zagotoviti, da testna snov dovolj dobro pokriva 
epitelno površino in da se med spiranjem ustrezno odstrani. Zaprta metoda 
se navadno uporablja za neviskozne do nekoliko viskozne testne snovi, 
medtem ko se odprta metoda navadno uporablja za polviskozne in viskozne tekoče testne teko čine in nerazred čene trdne snovi. 
28. Pri zaprti metodi se prek dozirnih odprtin na zgornji površini v sprednji del 
držala doda toliko testne snovi (750 μL), da ta prekrije epitelno stran rože ­
nice, odprtine pa se nato za čas izpostavljenosti zatesnijo s tesnilnimi čepki. 
Treba je zagotoviti, da je vsaka roženica testni snovi izpostavljena dovolj 
dolgo. 
29. Pri odprti metodi se pred testiranjem s sprednjega dela držala odstranita 
obroček za zapiranje okenca in stekleno okence. Kontrolna ali testna snov 
(750 μL ali dovolj testne snovi, da je prekrita celotna roženica) se aplicira 
neposredno na epitelno površino roženice z mikropipeto. Če se testna snov 
težko pipetira, se lahko za lažje doziranje testno snov nanese s pipeto za 
neposredno izpodrivanje tlaka. Konica pipete za neposredno izpodrivanje 
tlaka se vstavi v dozirno konico brizgalke, da se material napolni v konico za izpodrivanje pod tlakom. Če se potisni bat po časi sprošča, se vlečni bat 
pipete pomakne navzgor. Če se v konici pipete za čnejo tvoriti zra čni 
mehurčki, se predmet testiranja odstrani (izvrže) in postopek ponovi, dokler 
konica ni polna in v njej ni zra čnih mehur čkov. Po potrebi se lahko uporabi 
običajna brizgalka (brez igle), saj omogo ča merjenje natan čne količine testne 
snovi in lažjo aplikacijo na epitelno površino roženice. Po doziranju se na 
sprednji del držala ponovno namesti stekleno okence in tako ponovno 
ustvari zaprt sistem.
 ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 676
 
Inkubacija po izpostavljenosti  
30. Po izpostavljenosti se testna snov, snov za negativno kontrolo ali snov za 
pozitivno kontrolo odstrani iz sprednjega dela držala, epitelij pa se najmanj 
trikrat (oziroma dokler testna snov ni ve č vidna) spere z EMEM (ki vsebuje 
fenol rdeče). Za spiranje se uporablja medij, ki vsebuje fenol rde če, saj se 
lahko s spreminjanjem barv v fenol rde čem nadzoruje, ali je bilo spiranje 
kislih ali alkalnih materialov u činkovito. Če je fenol rde če še vedno obar ­
vano (rumeno ali vijoli často) ali če je testna snov še vedno vidna, se rože ­
nice sperejo ve č kot trikrat. Ko v mediju ni ve č testne snovi, se roženice še 
zadnjič sperejo z EMEM (brez fenol rde čega). EMEM (brez fenol rde čega) 
se uporabi pri zadnjem spiranju, da se zagotovi, da je bilo fenol rde če 
odstranjeno iz sprednjega dela držala pred merjenjem motnjave. Nato se sprednji del držala ponovno napolni s svežim EMEM brez fenol rde čega. 
31. Pri teko činah ali površinsko aktivnih snoveh se roženice po spiranju dajo v 
inkubator še za dve dodatni uri pri 32 ± 1 °C. V dolo čenih okoliš činah je po 
izpostavljenosti koristna tudi daljša inkubacija, vendar je to odvisno od 
vsakega posameznega primera. Roženice, ki se testirajo s trdnimi snovmi, 
se po štirih urah izpostavljenosti temeljito sperejo, vendar pri njih nadaljnja inkubacija ni potrebna. 
32. Po kon čani inkubaciji, ki sledi izpostavljenosti (pri teko činah in površinsko 
aktivnih snoveh), oziroma po koncu štiriurne izpostavljenosti (pri površinsko neaktivnih trdnih snoveh) se zabeležita motnjava in prepustnost vsake rože ­
nice. Poleg tega se vsaka roženica pregleda vizualno in zabeležijo vsa 
pomembnejša opažanja (npr. lupljenje tkiva, prisotnost preostale testne 
snovi, neenotni vzorci motnjave). Ta opažanja so lahko pomembna, saj se lahko odražajo v odklonih, ki jih izmeri opacitometer.
 
Kontrolne snovi  
33. Vsak poskus vklju čuje primerjalno negativno kontrolo ali kontrolo s topi ­
lom/vehiklom ter pozitivno kontrolo. 
34. Pri testiranju 100-odstotne teko če snovi se v testno metodo BCOP vklju či 
primerjalna negativna kontrola (npr. 0,9-odstotna raztopina natrijevega klorida ali destilirane vode), da se ugotovijo nespecifi čne spremembe test ­
nega sistema in zagotovijo izhodiš čne vrednosti za kon čne točke preskusa. 
Ta kontrola tudi zagotavlja, da preskusni pogoji ne povzro čajo dražilnih 
reakcij. 
35. Pri testiranju razred čene tekočine, površinsko aktivne ali trdne snovi se v 
testno metodo BCOP vklju či primerjalna kontrolna skupina s topilom/vehi ­
klom, da se ugotovijo nespecifi čne spremembe testnega sistema in zagoto ­
vijo izhodiš čne vrednosti za kon čne točke preskusa. Uporablja se lahko 
samo topilo/vehikel, za katerega je dokazano, da nima škodljivih u činkov 
na testni sistem. 
36. Pri vsakem poskusu se kot primerjalna pozitivna kontrola vklju či tudi znana 
dražilna snov za o či, da se zagotovi, da se sproži želena reakcija. Ker se pri 
tej testni metodi preskus BCOP uporablja za ugotavljanje jedkih ali zelo dražilnih snovi za o či, mora biti referen čna snov pri pozitivni kontroli snov, 
ki pri tej testni metodi povzro či močno reakcijo. Da se zagotovi, da se 
odkloni pri reakcijah pozitivne kontrole ocenjujejo v daljšem obdobju, 
stopnja dražilnega u činka ne sme biti prevelika. 
37. Primera pozitivnih kontrol za teko če testne snovi sta dimetilformamid ali 1- 
odstoten natrijev hidroksid. Primer pozitivne kontrole za trdno testno snov je 
20-odstoten w/v imidazol v 0,9-odstotni raztopini natrijevega klorida.
 ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 677
 
38. Primerjalne snovi so primerne za ocenjevanje potencialnih dražilnih u čin­
kov, ki jih imajo neznane kemikalije dolo čenega kemijskega ali proizvod ­
nega razreda na o či, ali za ocenjevanje relativnega potencialnega draženja 
dražilne snovi za oko v dolo čenem razponu dražilnih reakcij.  
Merjene kon čne točke 
39. Motnjava je odvisna od koli čine svetlobe, ki prodre skozi roženico. 
Motnjava roženice se meri kvantitativno s pomo čjo opacitometra, pri 
čemer se meri neprekinjeno. 
40. Prepustnost je odvisna od koli čine barvila natrijevega fluoresceina, ki prodre 
skozi vse celi čne sloje roženice (tj. od epitelija na zunanji površini roženice 
do endotelija na notranji površini roženice). V sprednji del držala za rože ­
nico, na katerega je pripeta epitelna stran roženice, se doda 1 mL raztopine natrijevega fluoresceina (4 ali 5 mg/mL pri testiranju teko čin in površinsko 
aktivnih snovi oziroma površinsko neaktivnih snovi), medtem ko se zadnji 
del držala, na katerega je pripeta endotelna stran roženice, napolni s svežim 
EMEM. Držalo se nato da v inkubator v vodoravnem položaju za 90 ± 5 minut pri 32 ± 1 °C. Koli čina natrijevega fluoresceina, ki prodre v zadnji del 
držala, se meri kvantitativno s pomo čjo spektrofotometrije UV/VIS. Spek ­
trofotometri čne meritve pri 490 nm se beležijo kot neprekinjeno merjene 
vrednosti opti čne gostote (OD
 490 ) ali absorbance. Prepustnost fluorosceina 
se določa z vrednostmi OD  490 , ki so bile izmerjene s spektrofotometrom 
vidne svetlobe pri standardni dolžini poti 1 cm. 
41. Namesto spektrofotometra se lahko uporablja tudi čitalec 96-mestnih mikro ­
titerskih ploš č, pod pogojem, da: (i) se lahko dolo či linearno merilno 
območje čitalca za dolo čevanje vrednosti fluroesceina OD  490 in (ii) če se 
v 96-mestni mikrotiterski ploš či uporablja dovolj veliko vzorcev fluores ­
ceina, da se zagotovijo vrednosti OD  490 , ki ustrezajo standardni dolžini 
poti 1 cm (za to so lahko potrebne popolnoma napolnjene posode [navadno 360 μL]).
 
PODATKI IN PORO ČANJE  
Ocenjevanje podatkov  
42. Po korigiranju vrednosti motnjave in povpre čne prepustnosti (OD  490 ) za 
vrednosti ozadja za motnjavo in vrednosti prepustnosti negativne kontrole 
OD  490 se vrednosti povpre čne motnjave in prepustnosti OD  490 za vsako 
testno skupino združijo v empiri čno izpeljani formuli, s katero se izra čuna 
vrednost draženja  in vitro  (IVIS) za vsako testno skupino, kot sledi: 
IVIS = povpre čna vrednost motnjave + (15 × povpre čna vrednost prepust ­
nosti OD  490 ) 
Po Sini et al.  (16) je bila ta formula izpeljana na podlagi laboratorijskih in 
medlaboratorijskih študij. Podatki, zbrani med multilaboratorijsko študijo za 
36 spojin, so bili ocenjeni z multivariantno analizo, s katero se je dolo čila 
najustreznejša ena čba za primerjanje podatkov  in vivo  ter in vitro . Analizo 
so opravili znanstveniki dveh razli čnih podjetij in izpeljali skoraj identi čni 
enačbi. 
43. Vrednosti motnjave in prepustnosti je treba oceniti tudi neodvisno, da se 
ugotovi, ali testna snov skozi eno od dveh kon čnih točk učinkuje jedko ali 
zelo dražilno (glej merila za odlo čanje).  ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 678
 
Merila za odlo čanje 
44. Snov z IVIS ≥ 55,1 velja za jedko ali zelo dražilno snov. Kot je navedeno 
pod točko 1, je treba testno snov, ki ni opredeljena kot jedka ali zelo 
dražilna za o či, zaradi razvrš čanja in ozna čevanja dodatno testirati. V 
primerjavi s podatki testne metode  in vivo  na očeh zajcev, razvrš čenih po 
sistemih za razvrš čanje EPA (1), EU (2) ali GHS (3), je splošna natan čnost 
testne metode BCOP 79-odstotna (113/143) do 81-odstotna (119/147), delež 
lažno pozitivnih rezultatov 19-odstoten (20/103) do 21-odstoten (22/103) ter delež lažno negativnih rezultatov 16-odstoten (7/43) do 25-odstoten (10/40). Če se iz podatkovne zbirke izklju čijo snovi dolo čenega kemijskega (npr. 
alkoholi, ketoni) ali fizikalnega razreda, je natan čnost testa BCOP po 
sistemih za razvrš čanje EU, EPA in GHS 87-odstotna (72/83) do 92- 
odstotna (78/85), delež lažno pozitivnih rezultatov 12-odstoten (7/58) do 16-odstoten (9/56) ter delež lažno negativnih rezultatov 0-odstoten (0/27) 
do 12-odstoten (3/26). 
45. Tudi če jedke ali zelo dražilne testne snovi za o či ni mogo če razvrstiti, so 
lahko podatki, pridobljeni z BCOP in testom  in vivo  na očeh zajcev ali 
primerno validiranim testom  in vitro , koristni za nadaljnje ocenjevanje 
primernosti in omejitev testne metode BCOP za dolo čanje nejedkih in ne 
zelo dražilnih snovi (trenutno se pripravljajo smernice za uporabo testnih 
metod  in vitro  za ugotavljanje toksi čnosti za o či).
 
Merila za sprejemljivost študije  
46. Test se šteje za sprejemljivega, če je pri pozitivni kontroli vrednost IVIS 
znotraj dveh standardnih odklonov veljavne povpre čne vrednosti iz preteklih 
testov, ki jo je treba posodobiti najmanj vsake tri mesece oziroma vedno, kadar opravljajo test laboratoriji, ki redko opravljajo teste (tj. manj kot enkrat mese čno). Reakcije negativne kontrole s topilom/vehiklom morajo 
dati vrednosti motnjave in prepustnosti, ki so manjše od veljavnih zgornjih 
omejitev vrednosti ozadja za motnjavo in prepustnosti roženic goveda, testi ­
ranih z zadevnimi negativnimi kontrolami ali kontrolami s topilom/vehi ­
klom.
 
Poročilo o testu  
47. V poro čilu o testu je treba navesti naslednje informacije ( če so pomembne 
za izvedbo študije):  
testne in kontrolne snovi  
kemijska imena in strukturno ime Službe za izmenjavo kemijskih 
izvlečkov (CAS), ki jim sledijo druga imena, če so znana; 
registrska številka CAS (RN), če je znana; 
čistost in sestava snovi ali zmesi (v težnostnih odstotkih), če so te informa ­
cije na voljo; 
fizikalno-kemijske lastnosti, pomembne za izvedbo študije, npr. fizikalno 
stanje, hlapnost, pH vrednost, stabilnost, kemijski razred, topnost v vodi; 
obdelava testnih/kontrolnih snovi pred testiranjem, če je pomembna (npr. 
segrevanje, mletje); 
stabilnost, če je znana.  ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 679
 
podatki o naro čniku in testnem laboratoriju  
ime in naslov naro čnika, testnega laboratorija in vodje študije; 
podatki o viru o či (tj. obrat, v katerem so bili odvzeti); 
pogoji za hrambo in prevoz o či (tj. dan in čas odvzema o či, čas pred prvim 
testiranjem, prevozna sredstva in temperaturni pogoji, morebitno uporabljeni 
antibiotiki); 
posebne lastnosti živali, katerim so bili odvzete o či, če so znane (tj. starost, 
spol, teža živali donatorke).  
utemeljitev testne metode in uporabljenega protokola  
celovitost testne metode  
postopek za zagotavljanje celovitosti (tj. natan čnosti in zanesljivosti) testne 
metode v daljšem časovnem obdobju (npr. redno testiranje snovi za prever ­
janje sposobnosti, uporaba podatkov o negativni in pozitivni kontroli iz preteklih testov).
 
merila za sprejemljivost testa  
sprejemljiva primerjalna pozitivna in negativna kontrola na podlagi poda ­
tkov iz preteklih testov; 
sprejemljiva primerjalna pozitivna in negativna kontrola na podlagi poda ­
tkov iz preteklih testov.  
testni pogoji  
opis uporabljenega testnega sistema; 
vrsta uporabljenega držala za roženico; 
podatki o kalibriranju naprav za merjenje motnjave in prepustnosti (npr. 
opacitometer in spektrofotometer); 
podatki o uporabljenih roženicah goveda, vklju čno z izjavami o njihovi 
kakovosti; 
podrobnosti o uporabljenem testnem postopku; 
uporabljene koncentracije testne snovi; 
opis vseh sprememb testnega postopka; 
sklic na modelne podatke iz preteklih testov (tj. negativna in pozitivna 
kontrola, snovi za preverjanje sposobnosti, primerjalne snovi); 
opis uporabljenih meril za ocenjevanje.  
rezultati  
tabele s podatki iz posameznih testnih vzorcev (npr. vrednosti motnjave in 
OD  490 ter izračunane vrednosti IVIS za testno snov ter pozitivne, negativne 
in primerjalne kontrole [ če so bile upoštevane], vklju čno s podatki iz pono ­
vitev poskusa v dvojniku, če so bile opravljene, ter povpre čne vrednosti ± 
standardni odklon pri vsakem poskusu); 
opis drugih opaženih u činkov;  
razprava o rezultatih  
sklepne ugotovitve.  
LITERATURA 
(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96- 
001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.  ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 680
 
(2) Regulation (EC) No 1272/2008 of the European Parliament and of 
the Council of 16 December 2008 on classification, labelling and 
packaging of substances and mixtures, amending and repealing Direc ­
tive 67/548/EEC and 1999/45/EC, and amending Regulation (EC) No. 1907/2006. OJ L 353, 31.12.2008, p. 1. 
(3) UN (2007). Globally Harmonized System of Classification and 
Labelling of Chemicals (GHS). Second revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications, 2007.Available: 
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02fi ­
les_e.html] 
(4) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retro ­
spective study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to 
identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Available: 
[http://ecvam.jrc.it/index.htm] 
(5) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. 
Available: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm] 
(6) Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of 
the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 
1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 
and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC. OJ L 396, 30.12.2006, p. 1. 
(7) OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Available: 
[http://www.oecd.org/document/40/ 
0,2340,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.htm l] 
(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Proto ­
col. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of 
Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. 
Available: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm] 
(9) ICCVAM. (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Identi ­
fying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity 
and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06-4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Available: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ 
ocu_brd_ice.htm] 
(10) INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and 
Permeability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, 
Italy: European Centre for the Validation of Alternative 
Methods (ECVAM).
 ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 681
 
(11) Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine 
corneal opacity and permeability test: An  in vitro  assay of ocular 
irritancy.  Fundam. Appl. Toxicol.  18:442-449. 
(12) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Health ­
care Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guide ­
line for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious 
Agents in Healthcare Settings. Available: 
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf]. 
(13) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays.  Reg. Tox. 
Pharmacol.  36:106-117. 
(14) Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and 
morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse.  
Can. J. Zool.  73:2159-2165. 
(15) Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on - Part I. The 
Lancet 349: 636-641. 
(16) Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, 
E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates.  Fundam Appl 
Toxicol  26:20-31. 
(17) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In 
Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Available: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ 
ocu_brd_bcop.htm] 
(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In 
Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Na voljo: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ 
ocu_brd_bcop.htm]
 ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 682
 
Dodatek 1  
OPREDELITVE  
Natančnost:  stopnja ujemanja testnih rezultatov s priznanimi referen čnimi vred ­
nostmi. Je merilo u činkovitosti testne metode in eden od vidikov „ustreznosti“. 
Ta izraz in izraz „skladnost“ se pogosto izmeni čno uporabljata in pomenita delež 
pravilnih rezultatov testne metode.  
Primerjalna snov:  snov, ki se uporablja kot standard za primerjavo s testno 
snovjo. Primerjalna snov mora imeti naslednje lastnosti: (i) trajen in zanesljiv 
vir; (ii) strukturno in funkcijsko podobnost z razredom testiranih snovi; (ii) znane 
fizikalne/kemijske lastnosti; (iv) spremni podatki o znanih u činkih in (v) znana 
potenca v razponu želene reakcije.  
Roženica:  prozoren sprednji del zrkla, ki pokriva šarenico in zenico ter skozi 
katerega vstopa svetloba.  
Motnjava roženice:  merjenje stopnje motnjave roženice po izpostavljenosti 
testni snovi. Pove čana motnjava roženice pomeni, da je roženica poškodovana. 
Motnjava se lahko ocenjuje subjektivno kot pri Dreizovem testu na o čeh zajcev 
ali objektivno z inštrumentom, kot je „opacitometer“.  
Prepustnost roženice:  kvantitativna vrednost poškodovanega epitelija roženice, 
izmerjena z dolo čanjem koli čine barvila natrijevega fluoresceina, ki prodre skozi 
vse celične plasti roženice.  
EPA kategorija 1:  jedka snov (ireverzibilno uni čenje očesnega tkiva), ki poško ­
duje ali draži roženico ve č kot 21 dni (1).  
EU kategorija R41:  poškodba o česnega tkiva ali resno fizi čno poslabšanje vida 
po aplikaciji testne snovi na sprednjo površino o česa, ki po 21 dneh aplikacije ni 
popolnoma reverzibilna (2).  
Delež lažno negativnih rezultatov:  delež vseh pozitivnih snovi, ki jih testna 
metoda prikaže kot lažno negativne. To je eden od kazalnikov u činkovitosti 
testne metode.  
Delež lažno pozitivnih rezultatov:  delež vseh negativnih snovi, ki jih testna 
metoda prikaže kot lažno negativne. To je eden od kazalnikov u činkovitosti 
testne metode.  
GHS (Globalno usklajeni sistem za razvrš čanje in ozna čevanje kemikalij):  
sistem za razvrš čanje kemikalij (snovi in zmesi) s pomo čjo standardiziranih vrst 
in stopenj fizikalnih, zdravstvenih in okoljskih nevarnosti ter za ozna čevanje z 
npr. piktogrami, opozorilnimi besedami, izjavami o nevarnosti, varnostnimi izja ­
vami in varnostnimi listi z namenom razširjanja informacij o škodljivih u činkih 
kemikalij ter s tem zaš čite ljudi (vklju čno z delodajalci, delavci, prevozniki, 
potrošniki in reševalci) in okolja (3).  ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 683
 
GHS kategorija 1:  poškodba o česnega tkiva ali resno fizi čno poslabšanje vida 
po aplikaciji testne snovi na sprednjo površino o česa, ki po 21 dneh aplikacije ni 
popolnoma reverzibilna (3).  
Nevarnost:  neločljiva lastnost snovi ali stanja, ki lahko ob izpostavljenosti tej 
snovi škodljivo u činkuje na organizem, sistem ali (pod)populacijo.  
Vrednost draženja  in vitro  (IVIS):  empirično izpeljana formula, ki se uporablja 
pri testu BCOP, pri kateri se povpre čne vrednosti motnjave in prepustnosti za 
vsako testno skupino združijo v eno samo vrednost  in vitro  za vsako testno 
skupino. IVIS = povpre čna vrednost motnjave + (15 x povpre čna vrednost 
prepustnosti).  
Negativna kontrola:  netestirani dvojnik, ki vsebuje vse komponente testnega 
sistema. Ta vzorec se obdela z vzorci, testiranimi s testno snovjo, in drugimi kontrolnimi vzorci, da se ugotovi, ali topilo reagira s testnim sistemom.  
Nedražilna snov:  snovi, ki niso razvrš čene v EPA kategorije I, II ali III; EU 
kategoriji R41 ali R36 ali GHS kategorije 1, 2A ali 2B dražilnih snovi za o či. 
Jedka snovi za o či: (a) snov, ki povzro ča ireverzibilno poškodbo o česnega 
tkiva; (b) snovi, ki so razvrš čene v GHS kategorijo 1, EPA kategorijo I ali 
EU kategorijo R41 dražilnih snovi za o či (1) (2) (3).  
Dražilna snov za o či: (a) snov, ki po aplikaciji na sprednjo površino o česa 
povzroči reverzibilno poškodbo o česa; (b) snovi, ki so razvrš čene v EPA kate ­
goriji II ali III, EU kategorijo R36 ali GHS kategoriji 2A ali 2B dražilnih snovi za oči (1) (2) (3).  
Zelo dražilna snov za o či: (a) snov, ki po aplikaciji na sprednjo površino o česa 
povzroči poškodbo tkiva, ki po 21 dneh po aplikaciji ne izgine oziroma resno 
fizično poslabša vid; (b) snovi, ki so razvrš čene v GHS kategorijo 1, EPA 
kategorijo I ali EU kategorijo R41 dražilnih snovi za o či (1) (2) (3).
 
Opacitometer:  inštrument za merjenje motnjave roženice, ki kvantitativno 
ocenjuje prenos svetlobe skozi roženico. Navadno ima dva dela, ki imata vsak svoj vir svetlobe in fotocelico. En del se uporablja za testirano roženico, drugi za 
kalibriranje in nastavitev inštrumenta na vrednost ni č. Svetloba halogene svetilke 
se skozi kontrolni del (prazen del brez okenc ali teko čine) usmeri v fotocelico in 
primerja s svetlobo, usmerjeno v fotocelico skozi testni del, v katerem je del z roženico. Primerja se razlika v preneseni svetlobi iz fotocelic, na digitalnem 
ekranu pa se prikaže numeri čna vrednost motnjave.  
Pozitivna kontrola:  dvojnik, ki vsebuje vse komponente testnega sistema in se 
testira s snovjo, za katero je znano, da sproži pozitivno reakcijo. Da se zagotovi, 
da se odkloni pri reakciji pozitivne kontrole ocenjujejo v daljšem časovnem 
obdobju, stopnja reakcije ne sme biti prevelika.
 ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 684
 
Zanesljivost:  stopnja reproduktivnosti testne metode v laboratorijih in med njimi 
v določenem časovnem obdobju pri uporabi istega protokola. Oceni se z izra ­ 
čunom laboratorijske in medlaboratorijske reproduktivnosti in ponovljivosti.  
Kontrola s topilom/vehiklom:  netestirani vzorec, ki vsebuje vse komponente 
testnega sistema, vklju čno s topilom ali vehiklom, ki se obdela z vzorci, testira ­
nimi s testno snovjo, in drugimi kontrolnimi vzorci, da se dolo či izhodiščna 
reakcija za vzorce, testirane s testno snovjo in raztopljene v istem topilu ali vehiklu. Pri testiranju s primerjalno negativno kontrolo ta vzorec tudi pokaže, ali topilo oziroma vehikel reagira s testnim sistemom.  
Stopenjsko testiranje:  stopenjska testna strategija, pri kateri se v posebnem 
vrstnem redu pregledajo vse informacije o testni snovi, pri čemer se na vsaki 
stopnji uporabi teža dokazov, da se dolo či, ali je na voljo dovolj informacij za 
razvrstitev snovi med nevarne snovi, preden se preide na naslednjo stopnjo. Če se 
lahko na podlagi razpoložljivih informacij dolo či potencialno draženje snovi, 
dodatno testiranje ni potrebno. Če na podlagi razpoložljivih informacij potencial ­
nega draženja testne snovi ni mogo če določiti, se opravi postopno sekven čno 
testiranje na živalih, dokler ni mogo ča jasna razvrstitev.  
Validirana testna metoda:  testna metoda, za katero sta bili na podlagi validacij ­
skih študij dolo čeni primernost (vklju čno z natan čnostjo) in zanesljivost za 
določen namen. Treba je opozoriti, da natan čnost in zanesljivost validirane testne 
metode nista nujno zadostni, da bi bili sprejemljivi za predlagani namen.  
Teža dokazov:  proces preu čevanja prednosti in slabosti razli čnih informacij z 
namenom sprejetja zaklju čka o potencialni nevarnosti snovi in njegovi utemeljitvi.
 ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 685
 
Dodatek 2  
Snovi za preverjanje usposobljenosti za testno metodo BCOP  
Preden lahko za čnejo laboratoriji redno uporabljati testno metodo, ki izpolnjuje 
zahteve te testne metode, morajo dokazati tehni čno usposobljenost tako, da deset 
priporočenih snovi iz tabele 1 pravilno razvrstijo glede na njihov dražilni u činek 
na oči. Te snovi so bile izbrane, ker predstavljajo razpon reakcij lokalnega 
draženja/razjedanja o česa, ki temelji na rezultatih testa  in vivo  na očeh zajcev 
(TG 405) (tj. kategorije 1, 2A, 2B ali snovi, ki niso razvrš čene in ozna čene v 
skladu z UN GHS (3) (7)). Vendar se lahko zaradi validirane primernosti teh preskusov (tj. izklju čno za dolo čevanje jedkih in zelo dražilnih snovi za o či) 
usposobljenost dokaže samo z dvema testnima rezultatoma, na podlagi katerih 
je mogoča razvrstitev (jedka/zelo dražilna snov ali nejedka/nedražilna snov). 
Druga merila za izbor snovi so bila, da so te dostopne na trgu, da so na voljo visokokakovostni referen čni podatki  in vivo  in visokokakovostni podatki, prid ­
obljeni z dvema metodama  in vitro , za kateri se pripravljajo smernice. Zaradi 
tega so bile dražilne snovi izbrane iz priporo čenega seznama ICCVAM, ki 
vsebuje 122 referen čnih snovi za validacijo testnih metod  in vitro  za ugotavljanje 
toksičnosti za o či (glej dodatek H: ICCVAM - Priporo čene referen čne snovi) (5). 
Referenčni podatki so zbrani v dokumentih ICCVAM o pregledu ozadja testne 
metode BCOP in testne metode ICE na izoliranih o čeh piščancev (17) (18).
 
Tabela 1  
Priporočene snovi za ugotavljanje tehni čne usposobljenosti za BCOP  
Snov Št. CAS Kemijski (  1 ) razred Fizikalna 
oblika Razvrstitev  in 
vivo ( 2 ) Razvrstitev  in vitro  ( 3 ) 
benzalkonijev 
klorid (5 %) 8001-54-5 onijska spojina teko ča kategorija 1 jedka/zelo dražilna snov 
klorheksidin 55-56-1 amin, amidin trdna kategorija 1 jedka/zelo dražilna snov 
dibenzoil-L-vinska 
kislina 2743-38-6 karboksilna 
kislina, ester trdna kategorija 1 jedka/zelo dražilna snov 
imidazol 288-32-4 heterocikli čna 
spojina trdna kategorija 1 jedka/zelo dražilna snov 
trikloroocetna 
kislina (30 %) 76-03-9 karboksilna 
kislina tekoča kategorija 1 jedka/zelo dražilna snov 
2,6-diklorobenzoil 
klorid 4659-45-4 kislinski halid teko ča kategorija 
2A nejedka/lažje dražilna snov 
etil-2-metil acetoa ­
cetat 609-14-3 keton, ester teko ča kategorija 
2B nejedka/lažje dražilna snov 
amonijev nitrat 6484-52-2 anorganska sol trdna kategorija 
2A nejedka/lažje dražilna snov  ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 686
 
Snov Št. CAS Kemijski (  1 ) razred Fizikalna 
oblika Razvrstitev  in 
vivo ( 2 ) Razvrstitev  in vitro  ( 3 ) 
glicerol 56-81-5 alkohol teko ča ni oznake nejedka/lažje dražilna snov 
n-heksan 110-54-3 ogljikovodik 
(acikličen) tekoča ni oznake nejedka/lažje dražilna snov  
Kratice: št. CAS = registrska številka Službe za izmenjavo kemijskih izvle čkov (CAS) 
( 1 ) Kemijski razredi so bili dodeljeni za vsako testno snov s standardnim sistemom za razvrš čanje, ki temelji na sistemu MeSH (na 
voljo na http//www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) Na podlagi rezultatov, pridobljenih s testom  in vivo  na očeh zajcev (OECD TG 405), in ob upoštevanju UN GHS (3)(7). 
( 3 ) Na podlagi rezultatov BCOP in ICE.  ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 687
 
Dodatek 3  
DRŽALO ZA ROŽENICO ZA DOLO ČANJE BCOP 
1. Držala za roženico za BCOP so narejena iz intertnega materiala (npr. poli ­
propilena). Sestavljena so iz dveh polovic (sprednjega in zadnjega dela) in 
dveh podobnih cilindri čnih notranjih posodic. Prostornina vsake posodice je 
5 mL in se kon ča s steklenim okencem, skozi katerega se beležijo vrednosti 
motnjave. Premer notranjih posodic je 1,7 cm, globina pa 2,2 cm (  1 ). 
Tesnilni obro ček na zadnjem delu držala prepre čuje uhajanje. Roženice se 
z endotelno stranjo navzdol položijo na tesnilni obro ček zadnjega dela 
držala, sprednji del držala pa se položi na epitelno stran roženice. Oba 
dela držala sta pritrjena s tremi vijaki iz nerjave čega materiala na zunanjih 
robovih vsakega dela. Na koncu vsakega dela držala je stekleno okence, ki se lahko odstrani za lažji dostop do roženice. Med steklenim okencem in delom držala je tesnilni obro ček, ki prepre čuje uhajanje. Skozi luknjici na 
vrhu vsakega dela držala se vnašajo in odstranjujejo medij in testne snovi. 
Med testiranjem in inkubacijo sta oba dela držala zaprta z gumijastimi čepki.
 
Glosar  
Glass disc: steklena ploš čica 
PTFE-O-ring: tesnilni obro ček PTFE 
Refill: odprtina za polnjenje 
Hanger: povezovalni element 
Cap: čepek 
Nut: varovalni obro ček 
O-ring: tesnilni obro ček 
Posterior compartment: zadnji del držala Anterior compartment: sprednji del držala Fixing screws: pritrdilni vijaki
 ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 688  
( 1 ) Navedene dimenzije se nanašajo na drž ala za roženico, ki se uporabljajo pri kravah, 
starih od 12 do 60 mesecev. Za uporabo pri živalih, starih od šest do 12 mesecev, bi 
moralo biti držalo zasnovano tako, da bi bila prostornina vsakega dela 4 mL, premer 
obeh notranjih delov 1,5 cm in njuna globina 2,2 cm. Pri vsakem novo zasnovanem 
držalu za roženico je pomembno, da je razmerje med izpostavljeno površino roženice in 
prostornino zadnjega dela enako razmerju pri obi čajnih držalih za roženico. Tako se 
zagotovi, da se pravilno dolo čijo vrednosti prepustnosti za izra čun IVIS s predlagano 
formulo.
 OPACITOMETER 
2. Opacitometer je naprava, ki meri prenos svetlobe. Svetloba halogene 
svetilke se skozi kontrolni del (prazen del brez okenc ali teko čine) usmeri 
v fotocelico in primerja s svetlobo, usmerjeno v fotocelico skozi testni del, v katerem je del z roženico. Nato se primerja razlika v svetlobi, ki se prenese iz fotocelic, na digitalnem ekranu pa se prikaže numeri čna vrednost 
motnjave. Enote motnjave so že dolo čene. 
3. Opacitometer naj bi prek izmerjenih vrednosti motnjave zagotovil linearno 
reakcijo, ki ustreza mejnim vrednostim, ki se uporabljajo v razli čnih 
sistemih za razvrš čanje, opisanih v modelu za prognosticiranje (tj. do 
mejne vrednosti, ki dolo ča jedkost/mo čno dražilnost). Da bodo izmerjene 
vrednosti do 75–80 enot motnjave linearne in natan čne, je treba opacito ­
meter kalibrirati s kalibratorji. Kalibratorji (neprepustne poliesterske folije) se namestijo v kalibracijski del (del za roženico, zasnovan posebej za kali ­
bratorje) in beležijo na opacitometru. Kalibracijski del je zasnovan tako, da 
je oddaljenost kalibratorjev med svetlobo in fotocelico približno enaka kot 
oddaljenost roženic med merjenjem prepustnosti. Opacitometer se najprej kalibrira na 0 enot motnjave, pri čemer se uporablja kalibracijski del brez 
kalibratorja. Nato se tri razli čni kalibratorji en za drugim namestijo v kali ­
bracijski del ter se meri prepustnost. Kalibratorji 1, 2 in 3 naj bi zagotovili vrednosti prepustnosti, ki ustrezajo vnaprej dolo čenim vrednostim 75, 150 
oziroma 225 enot motnjave ± 5 %.
 ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 689
 
B. 48  TESTNA METODA NA IZOLIRANIH O ČEH PIŠČANCEV ZA 
UGOTAVLJANJE JEDKIH IN ZELO DRAŽILNIH SNOVI ZA 
OČI (ICE)  
UVOD 
1. Testna metoda na izoliranih o čeh piščancev (ICE) je testna metoda  in vitro , ki 
se pod dolo čenimi pogoji in z dolo čenimi omejitvami uporablja za razvrš čanje 
snovi in zmesi med „jedke in zelo dražilne za o či“ (1) (2) (3). V tej testni 
metodi so zelo dražilne snovi tiste snovi, ki povzro čajo poškodbe o či, ki se pri 
zajcu ohranijo najmanj 21 dni po aplikaciji. Čeprav testa  in vivo  na očeh zajcev 
ne more nadomestiti popolnoma, se test ICE priporo ča kot del stopenjske 
testne strategije za regulativno razvrš čanje in ozna čevanje za posebna podro čja 
uporabe (4) (5). Testne snovi in zmesi (6), ki v tem preskusu dajo pozitiven 
rezultat, se lahko razvrstijo med jedke ali zelo dražilne snovi za o či, ne da bi 
bilo potrebno opraviti dodatno testiranje na zajcih. Snov z negativnim rezul ­
tatom testa bi bilo treba testirati na zajcih s pomo čjo sekven čne testne strate ­
gije, ki je dolo čena v preskusni smernici OECD 405 (7) (poglavje B. 5 te 
priloge). 
2. V tej testni metodi so opisani postopki za oceno potencialne jedkosti in 
močne dražilnosti testne snovi za o či glede na njeno sposobnost, da v 
izoliranem o česu piščanca povzro ča toksičnost. Toksi čni učinki na roženico 
se merijo z: (i) kvalitativnim ocenjevanjem motnjave, (ii) kvalitativnim 
ocenjevanjem poškodbe epitelija po aplikaciji fluoresceina (zadrževanje fluoresceina), (iii) kvantitativnim ocenjevanjem pove čane debeline (nabre ­
klosti) in (iv) kvantitativnim ocenjevanjem makroskopske morfološke 
poškodbe na površini. Motnjava roženice, nabreklost in ocenjevanje 
poškodb po izpostavljenosti testni snovi se najprej ocenijo posami čno in 
nato združijo, da se lahko dolo či stopnja dražilnosti o česa. 
3. S testno metodo ICE so bile testirane tudi dražilne snovi, ki povzro čajo 
poškodbe o či, ki izginejo v manj kot 21 dneh, in nedražilne snovi. Vendar 
natančnost in zanesljivost testne metode ICE pri snoveh iz teh dveh kate ­
gorij nista bili ocenjeni formalno. 
4. Opredelitve so navedene v dodatku 1.  
ZAČETNI POMISLEKI IN OMEJITVE 
5. Ta testna metoda temelji na protokolu (8) testne metode ICE Medagencij ­
skega usklajevalnega odbora za validacijo alternativnih metod (ICCVAM), 
ki je bil pripravljen po mednarodni študiji o validaciji (4)(5)(9), pri kateri so 
sodelovali Evropski center za validacijo alternativnih metod (ECVAM), Japonski center za validacijo alternativnih metod (JaCVAM) ter Oddelek za toksikologijo in uporabno farmakologijo nizozemskega Inštituta za razi ­
skave TNO. Protokol temelji na informacijah iz objavljenih protokolov ter 
protokolu, ki ga uporablja TNO (10) (11) (12) (13) (14).
 ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 690
 
6. Opredeljene omejitve za to testno metodo temeljijo na visokem številu lažno 
pozitivnih rezultatov za alkohole ter visokem številu lažno negativnih rezul ­
tatov za trdne in površinsko aktivne snovi (glej to čko 47) (4). Če se snovi iz teh 
kemijskih in fizikalnih razredov izklju čijo iz podatkovne zbirke, se natan čnost 
ICE v sistemih za razvrš čanje EU, EPA in GHS bistveno izboljša (4). Pri tem 
preskusu (tj. za ugotavljanje izklju čno jedkih in zelo dražilnih snovi za o či) 
lažno negativni rezultati niso kriti čni, saj bi se take snovi nato preskušale na 
zajcih ali, odvisno od regulativnih zahtev, z drugimi ustrezno potrjenimi testi  in 
vitro , pri katerih se uporablja sekven čna testna strategija, ki temelji na teži 
dokazov. Poleg tega nekaterih kemijskih ali proizvodnih razredov (npr. zmesi) 
s trenutno validacijsko podatkovno zbirko ni bilo mogo če ustrezno oceniti. 
Vendar pa bi lahko preskuševalci to testno metodo uporabili pri vseh vrstah testnega materiala (tudi pri zmeseh), pri čemer bi bil pozitiven rezultat spre ­
jemljiv kot indikator za jedko ali zelo dražilno snov za o či. Pozitivne rezultate, 
pridobljene z uporabo alkoholov, je treba razlagati previdno, saj obstaja tvega ­
nje, da so vanje vklju čeni tudi lažno pozitivni rezultati 
7. Pri vseh postopkih na o česih piščancev je treba upoštevati veljavna pravila 
in postopke testnega urada o ravnanju s človeškim ali živalskim materialom, 
kamor spadajo med drugim tudi tkiva in tkivne teko čine. Priporo čajo se 
splošni previdnostni ukrepi za laboratorije (15). 
8. Čeprav testna metoda upošteva nekatere u činke na o česa, ocenjene s testno 
metodo za ugotavljanje dražilnih snovi na o čeh zajcev, in do dolo čene mere 
tudi njihovo resnost, je kljub temu omejena, saj ne upošteva poškodb 
veznice in šarenice. Čeprav tudi same reverzibilnosti poškodb roženice s 
testom ICE ni mogo če oceniti, je bilo na podlagi študij na o čeh zajcev kljub 
temu predlagano, da se oceni prvotna globina poškodbe roženice ter tako 
razlikuje med ireverzibilnimi in reverzibilnimi u činki (16). Treba je tudi 
opozoriti, da s testno metodo ICE ni mogo če oceniti potencialne sistemske 
toksičnosti, povezane z izpostavljenostjo o či. 
9. Trenutno potekajo prizadevanja za nadaljnjo karakterizacijo uporabnosti in 
omejitev testne metode ICE za ugotavljanje lažje dražilnih in nedražilnih 
snovi (glej tudi to čko 48). Uporabnikom se priporo ča, da organizacijam za 
validacijo zagotovijo vzorce in/ali podatke za uradno oceno morebitnih 
prihodnjih uporab testne metode ICE, vklju čno za ugotavljanje lažje 
dražilnih ali nedražilnih snovi za o či. 
10. Laboratoriji, ki ta preskus opravljajo prvi č, morajo uporabiti kemikalije za 
preverjanje usposobljenosti iz dodatka 2. Te kemikalije uporabijo, da doka ­ 
žejo, da so tehni čno sposobni izvajati testno metodo ICE, preden podatke o 
testu ICE predložijo za regulativno razvrstitev nevarnosti.  
NAČELO TESTA 
11. Testna metoda ICE je organotipski model, ki zagotavlja kratkoro čno ohra­
njanje piš čančjega očesa v  in vitro . Pri tej testni metodi se poškodba, ki jo 
povzroči testna snov, oceni tako, da se dolo čijo nabreklost roženice, njena 
prepustnost in zadrževanje fluorosceina. Medtem ko se zadnja parametra 
ocenjujeta kvalitativno, je treba nabreklost roženice oceniti kvantitativno. 
Vsaka meritev se pretvori v kvantitativen rezultat, ki se uporabi za izra čun 
splošnega indeksa dražilnosti, ali pa se ji dodeli kvalitativna kategorija, ki se uporablja za razred jedkosti in mo čne dražilnosti za o či in vitro . Oba rezul ­
tata se lahko nato uporabita za predvidevanje jedkosti in mo čne dražilnosti 
testne snovi za o či in vivo  (glej merila za odlo čanje).
 ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 691
 
Izvor in starost o či piščancev  
12. Za ta preskus se obi čajno uporabljajo o či piščancev, ki so bili zaklani v 
klavnicah in namenjeni za človeško prehrano, kar pomeni, da poskusne 
živali niso potrebne. Uporabljajo se samo o či zdravih živali, primernih za 
vstop v prehransko verigo 
13. Čeprav kontrolirana študija za ocenjevanje najprimernejše starosti piš čancev 
ni bila opravljena, se pri tej testni metodi uporabljajo mladi piš čanci, ki so 
bili zaklani v klavnicah (tj. piš čanci, stari približno sedem tednov in težki od 
1,5–2,5 kg).  
Odvzem in prevoz o či v laboratorij  
14. Glave se odstranijo neposredno po omamljanju piš čancev, obi čajno z elek ­
tričnim šokom, in po izkrvavitvi zaradi prereza vratu. Piš čanci se morajo 
nahajati v bližini laboratorija, tako da se njihove glave iz klavnice v labo ­
ratorij pripeljejo dovolj hitro, da se njihovo stanje čim manj poslabša in/ali 
da ne pride do bakterijske okužbe. Čas med odvzemom o či in uporabo glav 
piščancev mora biti pri testni metodi ICE čim krajši (navadno dve uri) in ne 
sme vplivati na zanesljivost rezultatov preskusa. Ti temeljijo na merilih za 
izbor oči ter pozitivnih in negativnih kontrolnih reakcijah. Vsa o česa, upora ­
bljena v preskusu, morajo pripadati isti skupini o či, odvzeti na dolo čen dan. 
15. Ker se o česa secirajo v laboratoriju, se intaktne glave iz klavnice v labora ­
torij prepeljejo na sobni temperaturi v plasti čnih posodah in navlažene s 
krpami, napojenimi z izotoni čno fiziološko raztopino.  
Merila za izbor o či za test ICE  
16. Oči z močno izhodiš čno obarvanostjo s fluoresceinom (tj. > 0,5) ali motno 
roženico (tj. > 0,5) po izolaciji se zavržejo. 
17. Vsaka testna skupina in primerjalna pozitivna kontrola sta sestavljeni iz 
najmanj treh o či. Za negativno kontrolo ali kontrolo s topilom ( če se 
namesto fiziološke raztopine uporablja drugo topilo) se uporabi najmanj 
eno oko.  
POSTOPEK  
Priprava o či 
18. Skrbno se odstranijo veke, pri čemer je treba paziti, da se roženica ne 
poškoduje. Celovitost roženice se hitro oceni tako, da se na njeno površino za nekaj sekund aplicira kapljica 2-odstotnega (w/v) natrijevega fluores ­
ceina, površina pa se nato spere z izotoni čno fiziološko raztopino. O či, ki 
jim je bil dodan fluorescein, se nato osvetlijo s špranjsko svetilko, da se roženica ne bi poškodovala (tj. zadrževanje fluoresceina in motnjava rože ­
nice ≤ 0,5). 
19. Če je oko nepoškodovano, se izreže iz lobanje, pri čemer je treba paziti, da 
se roženica ne poškoduje. Zrklo se potegne iz o česne votline potegne tako, 
da se žmurka zagrabi s kirurškimi prijemalkami, o česne mišice pa se prere ­ 
žejo z ukrivljenimi škarjami s topo konico. Tako se prepre či, da bi se 
roženica zaradi prevelikega tlaka poškodovala (tj. artefakti zaradi stisnjenja). 
20. Ko se oko odstrani iz o česne votline, se ga mora še vedno držati viden del 
vidnega živca. Po odstranitvi iz o česne votline se oko položi na vpojno 
podlago, nato pa se odrežeta žmurka in preostalo vezno tkivo.
 ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 692
 
21. Izolirano oko se pritrdi v prijemalko iz nerjave čega materiala, pri čemer 
mora biti roženica v vodoravnem položaju. Prijemalka se nato prenese v 
komoro naprave za superfuzijo (16). Prijemalke je treba v napravi za super ­
fuzijo namestiti tako, da je celotna roženica pokrita z izotoni čno fiziološko 
raztopino. Temperatura v komorah naprave za superfuzijo mora znašati 
32 ± 1,5 °C. Dodatek 3 vsebuje diagram obi čajne naprave za superfuzijo 
z očesnimi prijemalkami, ki je na voljo na trgu, laboratoriji pa jo lahko 
izdelajo tudi sami. Naprava se lahko prilagodi potrebam posameznega labo ­
ratorija (tj. za sprejem razli čnega števila o či). 
22. V napravi za superfuzijo se o či še enkrat pregledajo s špranjsko svetilko, da se 
zagotovi, da se med seciranjem niso poškodovale. Pri tem se z nastavkom za 
merjenje globine na špranjski svetilki na apeksu roženice izmeri tudi debelina roženice. O či z (i) vrednostjo zadržanega fluoresceina > 0,5; (ii) motnjavo 
roženice > 0,5; ali (iii) dodatnimi znaki poškodb je treba zamenjati. Za o či, 
ki se na podlagi teh meril ne zavržejo, velja, da se kljub temu zavržejo, če 
debelina roženice za ve č kot 10 % odstopa od povpre čne vrednosti vseh o či. 
Uporabniki morajo upoštevati, da lahko špranjske svetilke pri razli čnih širinah 
špranje za debelino roženice dajo razli čne merilne vrednosti. Širino špranje je 
treba nastaviti na 0,095 mm. 
23. Po pregledu in izlo čitvi se oči dajo v inkubator za približno 45 do 60 minut, 
da se pred doziranjem ekvilibrirajo s testnim sistemom. Po ekvilibriranju se kot izhodiš čna vrednost za debelino in motnjavo roženice zabeleži ni čna 
vrednost (tj. čas = 0). Vrednost fluoresceina, dolo čena pri seciranju, se 
uporabi kot izhodiš čna vrednost za kon čno točko.
 
Uporaba testne snovi  
24. Po meritvi z ni čnimi referen čnimi vrednostmi se oko (in držalo) odvzame iz 
naprave za superfuzijo in da v vodoravni položaj, nato pa se na roženico 
aplicira testna snov. 
25. Teko če testne snovi se obi čajno testirajo nerazred čene, lahko pa se po 
potrebi tudi razred čijo (tj. kot del koncepta študije). Najpogosteje se kot 
topilo pri razred čenih snoveh uporablja fiziološka raztopina. Pod kontrol ­
nimi pogoji se lahko uporabljajo tudi druga topila, vendar je treba dokazati, 
da so primerna. 
26. Teko če testne snovi se aplicirajo na roženico tako, da je s testno snovjo 
enakomerno pokrita celotna površina roženice; standardna prostornina je 
0,03 mL. 
27. Če je mogo če, je treba trdne testne snovi čim bolj zdrobiti v terilnici s 
pestilom ali primerljivim orodjem za trenje. Prašek se aplicira na roženico tako, da je njena površina enakomerno pokrita s testno snovjo; standardna 
količina je 0,03 g. 
28. Testna snov (teko ča ali trdna) se pusti u činkovati 10 sekund, nato pa se 
spere z očesa s fiziološko raztopino (približno 20 mL) pri sobni temperaturi. 
Oko (in držalo) se nato ponovno da v napravo za superfuzijo v prvotnem pokončnem položaju.
 
Kontrolne snovi  
29. Vsak poskus vklju čuje primerjalno negativno kontrolo ali kontrolo s topi ­
lom/vehiklom ter pozitivne kontrole.  ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 693
 
30. Pri testiranju 100-odstotnih teko čin ali trdnih snovi se kot primerjalna nega ­
tivna kontrola pri testni metodi ICE uporablja fiziološka raztopina, da se 
ugotovijo nespecifi čne spremembe testnega sistema in da preskusni pogoji 
ne povzro čajo neustreznih dražilnih reakcij. 
31. Pri testiranju razred čenih teko čin se v testno metodo vklju či primerjalna 
kontrolna skupina s topilom/vehiklom, da se ugotovijo nespecifi čne spre­
membe testnega sistema in da preskusni pogoji ne povzro čajo dražilnih 
reakcij. Kot je navedeno v to čki 25, se lahko uporablja samo topilo/vehikel, 
za katerega je dokazano, da nima škodljivih u činkov na testni sistem. 
32. Pri vsakem poskusu se kot primerjalna pozitivna kontrola vklju či tudi znana 
dražilna snov za o či, da se zagotovi, da se sproži želena reakcija. Ker se pri 
tej testni metodi preskus ICE uporablja za ugotavljanje jedkih ali zelo 
dražilnih snovi, mora biti referen čna snov pri pozitivni kontroli snov, ki 
pri tej testni metodi povzro či močno reakcijo. Da se zagotovi, da se odkloni 
pri reakciji pozitivne kontrole ocenjujejo v daljšem časovnem obdobju, 
stopnja mo čne reakcije ne sme biti prevelika. Za pozitivno kontrolo je 
treba zbrati dovolj podatkov o  in vitro , da se lahko izra čuna statisti čno 
določen sprejemljiv razpon pozitivne kontrole. Če za dolo čeno pozitivno 
kontrolo ni na voljo ustreznih podatkov o testni metodi ICE iz preteklosti, je treba opraviti študije, v katerih se bodo ti podatki zbrali. 
33. Primera pozitivnih kontrol za teko če testne snovi sta 10-odstotna ocetna 
kislina ali 5-odstoten benzalkonijev klorid, primera pozitivnih kontrol za 
trdne testne snovi pa natrijev hidroksid in imidazol. 
34. Primerjalne snovi so primerne za ocenjevanje potencialnih dražilnih u čin­
kov, ki jih imajo neznane kemikalije dolo čenega kemijskega ali proizvod ­
nega razreda na o či, ali za ocenjevanje relativnega potencialnega draženja 
dražilne snovi za oko v dolo čenem razponu dražilnih u činkov.
 
Merjene kon čne točke 
35. Testirane roženice se ocenijo pred testiranjem in nato 30, 75, 120, 180 in 
240 minut (± 5 minut) po spiranju, ki se opravi po testiranju. Ti časovni 
intervali omogo čajo ustrezno število meritev med štiriurnim testiranjem in 
zagotavljajo dovolj časa, da se o či med posameznimi meritvami ustrezno 
pregledajo. 
36. Končne točke, ki se ocenijo, so motnjava roženice, nabreklost, zadrževanje 
fluoresceina in morfološki u činki (tj. luknji čast ali odstopljen epitelij). Vse 
končne točke razen zadrževanja fluoresceina (ki se dolo či pred testiranjem in 
30 minut po izpostavljenosti testni snovi) se dolo čijo pri vsakem navedenem 
časovnem intervalu. 
37. Priporo ča se, da se motnjava roženice, zadrževanje fluoresceina, morfološki 
učinki in morebitni histopatološki izvidi fotografirajo. 
38. Po štiriurnem pregledu je treba o či hraniti v ustrezni fiksirni raztopini (tj. v 
nevtralnem formalinskem pufru), da se lahko po potrebi opravi histopato ­
loški pregled.  ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 694
 
39. Nabreklost roženice se dolo či na podlagi debelin roženice, izmerjenih z 
optičnim pahimetrom na špranjski svetilki. Izrazi se v odstotkih in izra čuna 
na podlagi izmerjenih debelin roženic s pomo čjo naslednje formule:  
8 
> > > : debelina roženica v času t Ä debelina roženice v času t ¼ 0 
debelina roženice v času t ¼ 0 9 
> > > ; Ü 100 
40. Povpre čna nabreklost roženice vseh testnih o či, izražena v odstotkih, se 
izračuna v vseh časovnih intervalih. Na podlagi najvišje povpre čne vrednosti 
nabreklosti roženice, ki je bila zabeležena v vseh časovnih intervalih, se za 
vsako testno snov dolo či skupna vrednost posamezne kategorije. 
41. Pri izra čunu motnjave roženice se upošteva površina najbolj motne roženice. 
Povprečna motnjava roženice vseh testnih o či se izračuna v vseh časovnih 
intervalih. Na podlagi najvišje povpre čne vrednosti motnjave roženice, ki je 
bila zabeležena v vseh časovnih obdobjih, se za vsako testno snov dolo či 
skupna vrednost za posamezno kategorijo (tabela 1).  
Tabela 1  
Motnjava roženice  
Vrednost Opažanja  
0 roženica ni motna 
0,5 roženica zelo malo motna 1 neostra in razpršena obmo čja, deli šarenice dobro vidni 
2 obmo čje, ki prepuš ča svetlobo, dobro razpoznavno deli šarenice slabše vidni 
3 zelo motna roženica; deli šarenice niso vidni; velikost zenice komaj razpoznavna 
4 popolnoma motna roženica; šarenica ni vidna 
42. Povpre čna vrednost zadržanega fluoresceina se pri vseh testnih o čeh izra­ 
čuna samo za 30-minutno časovno obdobje in se za vsako testno snov 
dodeli kot skupna vrednost za posamezno kategorijo (tabela 2).
 
Tabela 2  
Zadrževanje fluoresceina  
Vrednost Opažanja  
0 brez zadržanega fluoresceina 
0,5 zelo malo zadržanega fluoresceina v posameznih celicah 1 posamezne celice z nekaj fluoresceina, razdrobljene na testiranem podro čju 
roženice 
2 to čkaste ali zlite celice z veliko fluoresceina 
3 velika zlita podro čja roženice, v katerih se zadržuje fluorescein
 ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 695
 
43. Morfološki u činki vklju čujejo „luknji časte“ epitelne celice roženice, „odsto ­
pljeni“ epitelij, „kosmato“ roženi čno površino in „prilepljeno“ testno snov 
na roženico. Ta opažanja so lahko razli čno resna in se lahko pojavijo isto ­ 
časno. Uvrš čanje teh opažanj poteka subjektivno glede na razlago razisko ­
valca.  
PODATKI IN PORO ČANJE  
Ocenjevanje podatkov  
44. Rezultate za motnjavo in nabreklost roženice ter zadrževanje fluoresceina je 
treba oceniti lo čeno, da se ustvari razred ICE za vsako kon čno točko. 
Razredi ICE za vsako kon čno točko se nato združijo, da se vsaka testna 
snov lahko razvrsti v razred dražilnosti.  
Merila za odlo čanje 
45. Po oceni vsake kon čne točke se na podlagi vnaprej dolo čenega razpona 
dodelijo razredi ICE. Debelina roženice (tabela 3), motnjava roženice (tabela 4) in zadrževanje fluoresceina (tabela 5) se razlagajo s pomo čjo štirih 
razredov ICE po naslednjih lestvicah:
 
Tabela 3  
Merila ICE za razvrstitev glede na debelino roženice  
Povprečna nabreklost roženice (%) (*) Razred ICE  
0 do 5 I 
> 5 do 12 II 
> 12 do 18 (> 75 min po aplikaciji) II 
> 12 do 18 ( ≤ 75 min po aplikaciji) III 
> 18 do 26 III > 26 do 32 (> 75 min po aplikaciji) III > 26 to 32 ( ≤ 75 min po aplikaciji) IV 
> 32 IV
 
(*) Vrednosti za nabreklost roženice so veljavne samo, če se merijo s špranjsko svetilko tipa Haag-Streit 
BP900 z napravo za merjenje globine št. I in nastavljeno širino špranje 9½, tj. 0,095 mm. Uporabniki morajo upoštevati, da lahko špranjske svetilke pri razli čnih širinah špranje dajo razli čne merilne vrednosti 
za debelino roženice.
 
Tabela 4  
Merila ICE za razvrstitev motnjave roženice  
Povprečna najvišja vrednost motnjave (*) Razred ICE  
0,0–0,5 I 
0,6–1,5 II 1,6–2,5 III 2,6–4,0 IV
 
(*) Glej tabelo 1.  ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 696
 
Tabela 5  
Merila ICE za razvrstitev glede na povpre čno vrednost zadržanega fluoresceina  
Povprečna vrednost zadržanega fluoresceina po 30 
minutah po aplikaciji (*) Razred ICE  
0,0–0,5 I 
0,6–1,5 II 1,6–2,5 III 2,6–3,0 IV
 
(*) Glej tabelo 2.  
46. Splošni razred testne snovi za dražilnost  in vitro  se določi tako, da se za 
razrede dražilnosti, ki ustrezajo ugotovljenim kategorijam za nabreklost in 
motnjavo roženice ter zadrževanje fluoresceina, uporabi formula iz tabele 6.  
Tabela 6  
Splošna razvrstitev za dražilnost  in vitro  
Razvrstitev Kombinacije treh kon čnih točk 
jedka/zelo dražilna snov 3 × IV 
2 × IV, 1 × III 2 × IV, 1 × II (*) 
2 × IV, 1 × I (*) 
motnjava roženice ≥ 3 pri 30 min (pri najmanj 2 
očeh) 
motnjava roženice 4 pri vsakem časovnem inter ­
valu (pri najmanj 2 o čeh) 
močno odstopljen epitelij (pri najmanj enem 
očesu)
 
(*) manj pogoste kombinacije  
47. Kot je navedeno v prvem odstavku, je treba testno snov, ki ni opredeljena 
kot jedka ali zelo dražilna za o či, zaradi razvrš čanja in ozna čevanja dodatno 
testirati. V primerjavi s podatki testne metode  in vivo  na očeh zajcev za 
določanje jedkih ali zelo dražilnih snovi za o či, razvrščenih po EPA (1), EU 
(2) ali GHS (3), je splošna natan čnost testne metode ICE 83-odstotna 
(120/144) do 87-odstotna (134/154), delež lažno pozitivnih rezultatov 6- odstoten (7/122) do 8-odstoten (9/116) ter delež lažno negativnih rezultatov 41-odstoten (13/32) do 50-odstoten (15/30). Če se iz podatkovne zbirke 
izključijo snovi nekaterih kemijskih (npr. alkoholi, ketoni) ali fizikalnih 
razredov (npr. trdne snovi), je natan čnost testa ICE po sistemih za razvrš ­ 
čanje EU, EPA in GHS 91-odstotna (75/82) do 92-odstotna (69/75), delež 
lažno pozitivnih rezultatov 5-odstoten (4/73) do 6-odstoten (4/70) ter delež 
lažno negativnih rezultatov 29-odstoten (2/7) do 33-odstoten (3/9) (4). 
48. Tudi če jedke ali zelo dražilne testne snovi za o či ni mogo če razvrstiti, so 
lahko podatki, pridobljeni s ICE in testom  in vivo  na očeh zajcev ali 
primerno validiranim testom  in vitro , koristni za nadaljnje ocenjevanje 
primernosti in omejitev testne metode ICE za dolo čanje nejedkih in ne 
zelo dražilnih snovi (smernice za uporabo testnih metod  in vitro  za ugota ­
vljanje toksi čnosti za o či se pripravljajo).
 ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 697
 
Merila za sprejemljivost študije  
49. Test se šteje za sprejemljivega, če dajo primerjalne negativne kontrole s 
vehiklom/topilom in primerjalne pozitivne kontrole za dražilnost vrednosti, 
ki spadajo v razrede nedražilnih snovi oziroma razrede zelo dražilnih/jedkih snovi.
 
Poročilo o testu  
50. V poro čilu o testu je treba navesti naslednje informacije ( če so pomembne 
za izvedbo študije):  
testne in kontrolne snovi  
kemijska imena in strukturno ime Službe za izmenjavo kemijskih 
izvlečkov (CAS), ki jim sledijo druga imena, če so znana; 
registrska številka CAS (RN), če je znana; 
čistost in sestava snovi ali zmesi (v težnostnih odstotkih), če so te informa ­
cije na voljo; 
fizikalno-kemijske lastnosti, pomembne za izvedbo študije, npr. fizikalno 
stanje, pH vrednost, stabilnost, kemijski razred, topnost v vodi; 
obdelava testnih/kontrolnih snovi pred testiranjem, če je pomembna (npr. 
segrevanje, mletje); 
stabilnost, če je znana.  
podatki o naro čniku in testnem laboratoriju  
ime in naslov naro čnika, testnega laboratorija in vodje študije; 
podatki o viru o či (tj. obrat, v katerem so bili odvzeti); 
pogoji za hrambo in prevoz o či (tj. dan in čas odvzema o či, čas pred prvim 
testiranjem, prevozna sredstva in temperaturni pogoji, morebitno uporabljeni antibiotiki); 
posebne lastnosti živali, katerim so bili odvzete o či, če so znane (tj. starost, 
spol, teža živali donatorke).
 
utemeljitev testne metode in uporabljenega protokola  
celovitost testne metode  
postopek za zagotavljanje celovitosti (tj. natan čnosti in zanesljivosti) testne 
metode v daljšem časovnem obdobju (npr. redno testiranje snovi za ugota ­
vljanje sposobnosti, uporaba podatkov o negativni in pozitivni kontroli iz 
preteklih testov).  
merila za sprejemljivost testa  
sprejemljiva primerjalna pozitivna in negativna kontrola na podlagi poda ­
tkov iz preteklih testov.  
testni pogoji  
opis uporabljenega testnega sistema; 
vrsta uporabljene špranjske svetilke (tj. model); nastavitve inštrumentov za uporabljeno špranjsko svetilko; 
podatki o uporabljenih o čeh piščancev, vklju čno z izjavami o njihovi kako ­
vosti;
 ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 698
 
podrobnosti o uporabljenem testnem postopku; 
uporabljene koncentracije testne snovi; 
opis vseh sprememb testnega postopka; 
sklic na podatke o modelu iz preteklih testov (tj. negativna in pozitivna 
kontrola, snovi za preverjanje sposobnosti; ugotavljanje sposobnosti, primer ­
jalne snovi); 
opis uporabljenih meril za ocenjevanje.  
rezultati  
opis drugih opaženih u činkov; 
po potrebi slike o či; 
razprava o rezultatih  
sklepne ugotovitve  
LITERATURA 
(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96- 
001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency. 
(2) Regulation (EC) No 1272/2008 of the European Parliament and of the 
Council of 16 December 2008 on classification, labelling and packa ­
ging of substances and mixtures, amending and repealing Directive 67/548/EEC and 1999/45/EC, and amending Regulation (EC) No. 
1907/2006. OJ L 353, 31.12.2008, 1. 
(3) United nations (UN) (2007). Globally Harmonized System of Classi ­
fication and Labelling of Chemicals (GHS), Second revised edition, UN New York and Geneva, 2007. Available at: 
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02fi ­
les_e.html] 
(4) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro Ocular 
Toxicity  Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation 
of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology 
Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Available: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm] 
(5) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospec ­
tive study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to identify 
potential ocular corrosives and severe eye irritants. Available: 
[http://ecvam.jrc.it/index.htm]. 
(6) Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the 
Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, 
Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission 
Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC 
and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC. OJ L 396, 30.12.2006, p.1. 
(7) OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Available: 
[http://www.oecd.org/document/40/0, 2340, en_2649_34377 
_37051368_1_1_1_1,00.html]
 ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 699
 
(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended ICE Test Method Proto ­
col. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology 
Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Available: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm] 
(9) ICCVAM. (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: 
National Toxicology Program. Available: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ 
ocu_brd_ice.htm] 
(10) Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enuc ­
leated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits.  Fd. Chem. Toxicol.  31:69- 
76. 
(11) INVITTOX (1994). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET). 
Available: 
[http://ecvam.jrc.it/index.htm]. 
(12) Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The 
EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test.  Toxicol. In Vitro  9:871-929. 
(13) Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A 
practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion 
potential of test materials.  Food Chem. Toxicol . 34:291-296. 
(14) Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). 
IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/pre ­
diction of ocular irritation.  Food Chem. Toxicol.  35:23-37. 
(15) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Health ­
care Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guide ­
line for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Available: 
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf]. 
(16) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays.  Reg. Tox. 
Pharmacol.  36:106-117. 
(17) Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The  in vitro  
assessment of severe irritants.  Fd. Cosmet.- Toxicol. - 19, 471-480.
 ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 700
 
(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  In 
Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irri ­
tants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Available: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ 
ocu_brd_bcop.htm] 
(19) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  In 
Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irri ­
tantsIsolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Na voljo: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ 
ocu_brd_bcop.htm]
 ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 701
 
Dodatek 1  
OPREDELITVE  
Natančnost:  stopnja ujemanja rezultatov testne metode s sprejetimi referen čnimi 
vrednostmi. Je merilo u činkovitosti testne metode in eden od vidikov „ustrezno ­
sti“. Ta izraz in izraz „skladnost“ se pogosto izmeni čno uporabljata in pomenita 
delež ustreznih rezultatov testne metode.  
Primerjalna snov:  snov, ki se uporablja kot standard za primerjavo s testno 
snovjo. Primerjalna snov mora imeti naslednje lastnosti: (i) trajen in zanesljiv 
vir; (ii) strukturno in funkcijsko podobnost z razredom testiranih snovi; (ii) znane 
fizikalne/kemijske lastnosti; (iv) spremni podatki o znanih u činkih in (v) znana 
potenca v razponu želene reakcije.  
Roženica:  prozoren sprednji del zrkla, ki pokriva šarenico in zenico ter skozi 
katerega vstopa svetloba.  
Motnjava roženice:  merjenje stopnje motnjave roženice po izpostavljenosti 
testni snovi. Pove čana motnjava roženice pomeni, da je roženica poškodovana.  
Nabreklost roženice:  objektivno merjenje pri testu ICE, da se dolo či občutlji­
vost roženice po aplikaciji testne snovi. Izrazi se v odstotkih in izra čuna na 
podlagi izhodiš čnih (vrednosti pred aplikacijo) izmerjenih vrednosti debelin rože ­
nice in debelin, zabeleženih v testu ICE v rednih časovnih intervalih po aplikaciji 
testnega materiala. Stopnja nabreklosti roženice je indikator za poškodbo rože ­
nice.  
EPA kategorija 1:  jedka snov (ireverzibilno uni čenje očesnega tkiva), ki priza ­
dene ali draži roženico ve č kot 21 dni (1).  
EU kategorija R41:  poškodba o česnega tkiva ali resno fizi čno poslabšanje vida 
po aplikaciji testne snovi na sprednjo površino o česa, ki po 21 dneh aplikacije ni 
popolnoma reverzibilna (2).  
Delež lažno negativnih rezultatov:  delež vseh pozitivnih snovi, ki jih testna 
metoda prikaže kot lažno negativne. To je eden od kazalnikov u činkovitosti 
testne metode.  
Delež lažno pozitivnih rezultatov:  delež vseh negativnih snovi, ki jih testna 
metoda prikaže kot lažno pozitivne. To je eden od kazalnikov u činkovitosti testne 
metode.  
Zadrževanje fluoresceina:  subjektivno merjenje pri testu ICE, s katerim se 
določi obseg zadržanega natrijevega fluoresceina v celicah epitelija po aplikaciji 
testne snovi. Obseg zadržanega fluoresceina je indikator za poškodbo roženi ­ 
čnega epitelija.  
GHS (Globalno usklajeni sistem za razvrš čanje in ozna čevanje kemikalij):  
sistem za razvrš čanje kemikalij (snovi in zmesi) s pomo čjo standardiziranih vrst 
in stopenj fizikalnih, zdravstvenih in okoljskih nevarnosti ter za ozna čevanje z 
npr. piktogrami, opozorilnimi besedami, izjavami o nevarnosti, varnostnimi izja ­
vami in varnostnimi listi z namenom razširjanja informacij o škodljivih u činkih 
kemikalij ter s tem zaš čite ljudi (vklju čno z delodajalci, delavci, prevozniki, 
potrošniki in reševalci) in okolja (3).  ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 702
 
GHS kategorija 1:  poškodba o česnega tkiva ali resno fizi čno poslabšanje vida 
po aplikaciji testne snovi na sprednjo površino o česa, ki po 21 dneh aplikacije ni 
popolnoma reverzibilna (3).  
Nevarnost:  neločljiva lastnost snovi ali stanja, ki lahko ob izpostavljenosti tej 
snovi škodljivo u činkuje na organizem, sistem ali (pod)populacijo.  
Negativna kontrola:  netestirani dvojnik, ki vsebuje vse komponente testnega 
sistema. Ta vzorec se obdela z vzorci, testiranimi s testno snovjo, ali drugimi 
kontrolnimi vzorci, da se ugotovi, ali topilo reagira s testnim sistemom.  
Nedražilna snov:  snovi, ki niso razvrš čene v EPA kategorije I, II ali III; EU 
kategoriji R41 ali R36; ali GHS kategorije 1, 2A ali 2B dražilnih snovi za o či. 
Jedka snovi za o či: (a) snov, ki povzro ča ireverzibilno poškodbo o česnega 
tkiva; (b) snovi, ki so razvrš čene v GHS kategorijo 1, EPA kategorijo I ali 
EU kategorijo R41 dražilnih snovi za o či (1) (2) (3).  
Dražilna snov za o či: (a) snov, ki po aplikaciji na sprednjo površino o česa 
povzroča reverzibilno poškodbo o česa; (b) snovi, ki niso razvrš čene v EPA 
kategorije I, II ali III; EU kategorija R36: ali GHS kategorijo 1, 2A ali 2B 
dražilnih snovi za o či. 
Zelo dražilna snov za o či: (a) snov, ki po aplikaciji na sprednjo površino o česa 
povzroči poškodbo tkiva, ki po 21 dneh po aplikaciji ne izgine oziroma resno 
fizično poslabša vid; (b) snovi, ki so razvrš čene v GHS kategorijo 1, EPA 
kategorijo I ali EU kategorijo R41 dražilnih snovi za o či (1) (2) (3).  
Pozitivna kontrola:  dvojnik, ki vsebuje vse komponente testnega sistema in se 
testira s snovjo, za katero je znano, da reagira pozitivno. Da se zagotovi, da se odkloni pri reakciji pozitivne kontrole ocenjujejo v daljšem časovnem obdobju, 
stopnja mo čne reakcije ne sme biti prevelika.  
Zanesljivost:  stopnja reproduktivnosti testne metode v laboratorijih in med njimi 
v določenem časovnem obdobju pri uporabi istega protokola. Oceni se z izra ­
 
čunom laboratorijske in medlaboratorijske reproduktivnosti in ponovljivosti.  
Špranjska svetilka:  inštrument, ki se uporablja za direktno preiskavo o česa in ki 
skupaj z binokularnim mikroskopom tvori stereomikroskop s pokon čno sliko. Pri 
testni metodi ICE se ta inštrument uporablja za vpogled v sprednje strukture očesa piščanca ter za objektivno merjenje debeline roženice z nastavkom za 
merjenje globine.  
Kontrola s topilom/vehiklom:  netestirani vzorec, ki vsebuje vse komponente 
testnega sistema, vklju čno s topilom ali vehiklom, ki se obdela s kontrolnimi 
vzorci, testiranimi s testno snovjo, in drugimi kontrolnimi vzorci, da se dolo či 
izhodiščna reakcija za vzorce, testirane s testno snovjo in raztopljene v istem 
topilu ali vehiklu. Pri testiranju s primerjalno negativno kontrolo ta vzorec tudi 
pokaže, ali topilo oziroma vehikel reagira s testnim sistemom.
 ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 703
 
Stopenjsko testiranje:  stopenjska testna strategija, pri kateri se v posebnem 
vrstnem redu pregledajo vse informacije o testni snovi, pri čemer se na vsaki 
stopnji uporabi teža dokazov, da se dolo či, ali je na voljo dovolj informacij za 
razvrstitev snovi med nevarne snovi, preden se preide na naslednjo stopnjo. Če se 
lahko na podlagi razpoložljivih informacij dolo či potencialno draženje snovi, 
dodatno testiranje ni potrebno. Če na podlagi razpoložljivih informacij potencial ­
nega draženja testne snovi ni mogo če določiti, se opravi postopno sekven čno 
testiranje na živalih, dokler ni mogo ča jasna razvrstitev.  
Validirana testna metoda:  testna metoda, za katero sta bili na podlagi validacij ­
skih študij dolo čeni primernost (vklju čno z natan čnostjo) in zanesljivost za 
določen namen. Treba je opozoriti, da natan čnost in zanesljivost validirane testne 
metode nista nujno zadostni, da bi bili sprejemljivi za predlagani namen.  
Teža dokazov:  proces preu čevanja prednosti in slabosti razli čnih informacij z 
namenom sprejetja zaklju čka o potencialni nevarnosti snovi in njegovi utemeljitvi.  ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 704
 
Dodatek 2  
KEMIKALIJE ZA PREVERJANJE SPOSOBNOSTI PRI TESTNI METODI ICE 
Preden lahko za čnejo laboratoriji redno uporabljati testno metodo, ki izpolnjuje 
zahteve te testne metode, morajo dokazati tehni čno usposobljenost tako, da deset 
priporočenih snovi iz tabele 1 pravilno razvrstijo glede na njihov dražilni u činek na 
oči. Te snovi so bile izbrane, ker predstavljajo razpon reakcij lokalnega draženja/ 
razjedanja o česa, ki temelji na rezultatih testa  in vivo  na očeh zajcev (TG 405) 
(kategorije 1, 2A, 2B ali snovi, ki niso razvrš čene in ozna čene v skladu z UN 
GHS (3) (7). Vendar se lahko zaradi validirane primernosti teh poskusov (tj. 
izključno za dolo čevanje jedkih in zelo dražilnih snovi za o či) usposobljenost 
dokaže samo z dvema testnima rezultatoma, na podlagi katerih je mogo ča 
razvrstitev (jedka/zelo dražilna snov ali nejedka/nedražilna snov). Druga merila za izbor snovi so bila, da so te dostopne na trgu, da so na voljo visokokakovostni 
referenčni podatki  in vivo  in visokokakovostni podatki, pridobljeni z dvema meto ­
dama  in vitro , za kateri se pripravljajo smernice. Zaradi tega so bile dražilne snovi 
izbrane iz priporo čenega seznama ICCVAM, ki vsebuje 122 referen čnih snovi za 
validacijo testnih metod  in vitro  za ugotavljanje toksi čnosti za o či (glej dodatek H: 
Referenčni podatki so zbrani v dokumentih ICCVAM o pregledu ozadja testne 
metode BCOP in testne metode ICE na izoliranih o čeh piščancev (18) (19).
 
Tabela 1  
Priporočene snovi za ugotavljanje tehni čne usposobljenosti za ICE  
Kemikalija Št. CAS Kemijski razred (  1 ) Fizikalna oblika Razvrstitev  in 
vivo ( 2 ) Razvrstitev  in vitro  ( 3 ) 
benzalkonijev klorid 
(5 %) 8001-54-5 onijska spojina teko ča kategorija 1 jedka/zelo dražilna 
snov 
klorheksidin 55-56-1 amin, amidin trdna kategorija 1 jedka/zelo dražilna 
snov 
dibenzoil-L-vinska 
kislina 2743-38-6 karboksilna 
kislina, ester trdna kategorija 1 jedka/zelo dražilna 
snov 
imidazol 288-32-4 heterocikli čna 
spojina trdna kategorija 1 jedka/zelo dražilna 
snov 
trikloroocetna kislina 
(30 %) 76-03-9 karboksilna 
kislina tekoča kategorija 1 jedka/zelo dražilna 
snov 
2,6-diklorobenzoil 
klorid 4659-45-4 kislinski halid teko ča kategorija 2A nejedka/lažje dražilna 
snov 
etil-2-metil acetoa ­
cetat 609-14-3 keton, ester teko ča kategorija 2B nejedka/lažje dražilna 
snov 
amonijev nitrat 6484-52-2 anorganska sol trdna kategorija 2A nejedka/lažje dražilna 
snov ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 705
 
Kemikalija Št. CAS Kemijski razred (  1 ) Fizikalna oblika Razvrstitev  in 
vivo ( 2 ) Razvrstitev  in vitro  ( 3 ) 
glicerol 56-81-5 alkohol teko ča ni oznake nejedka/lažje dražilna 
snov 
n-heksan 110-54-3 ogljikovodik 
(acikličen) tekoča ni oznake nejedka/lažje dražilna 
snov  
Kratice: št. CAS = registrska številka Službe za izmenjavo kemijskih izvle čkov (CAS). 
( 1 ) Kemijski razredi so bili dodeljeni za vsako testno snov s standardnim sistemom za razvrš čanje, ki temelji na sistemu MeSH (na 
voljo na http//www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) Na podlagi rezultatov, pridobljenih s testom in vivo na o čeh zajcev (OECD TG 405), in ob upoštevanju UN GHS (3)(7). 
( 3 ) Na podlagi rezultatov BCOP in ICE.  ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 706
 
Dodatek 3  
Diagrami naprave za superfuzijo in prijemalk za o či pri ICE  
(za dodaten generi čen opis naprave za superfuzijo in prijemalke za o či glej 
Burton et al. (17))
  ▼M2 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 707
 
B.49.  PRESKUS MIKRONUKLEUSOV  IN VITRO  PRI CELICAH 
SESALCEV  
UVOD 
1. Analiza mikronukleusov  in vitro  je preskus genotoksi čnosti za odkrivanje 
mikronukleusov v citoplazmi interfaznih celic. Mikronukleusi lahko izvirajo 
iz acentri čnih kromosomskih delcev (tj. brez centromere) ali celih kromoso ­
mov, ki med anafazo celi čne delitve ne morejo potovati na pole. Analiza 
odkriva delovanje kemikalij, ki povzro čajo strukturne in števil čne poškodbe 
kromosomov (klastogene in anevgene snovi in zmesi) (1) (2) v celicah, pri 
katerih je med izpostavljenostjo preskusni snovi ali po njej prišlo do delitve celic. Ta preskusna metoda omogo ča uporabo protokolov z inhibitorjem 
polimerizacije aktina citohalazina B (citoB). Dodatek citohalazina B pred 
načrtovano mitozo omogo ča določitev in selektivno analizo frekvence 
mikronukleusov v celicah, v katerih se je zaklju čila ena mitoza, ker imajo 
takšne celice dve jedri (3) (4). Ta preskusna metoda omogo ča uporabo 
protokolov brez citokinetskega bloka, če obstajajo dokazi, da je pri analizi ­
rani celični populaciji prišlo do mitoze. 
2. Ob uporabi analize mikronukleusov  in vitro  za opredelitev kemikalij (snovi 
in zmesi), ki spodbujajo nastanek mikronukleusov, se lahko z uporabo citokinetskega bloka, imunokemijskega ozna čevanja kinetohor ali hibridiza ­
cije s centromerno/telomerno sondo (fluorescen čna in situ  
hibridizacija (FISH)) prav tako pridobijo informacije o mehanizmih poškodb 
kromosomov in nastanka mikronukleusov (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Postopek ozna čevanja in hibridizacije se lahko uporabi v 
primeru pove čanega nastajanja mikronukleusov, ko želi raziskovalec ugoto ­
viti, ali je pove čanje nastalo zaradi dogodkov, ki povzro čajo strukturne in 
številčne poškodbe kromosomov (klastogenih in/ali anevgenih dogodkov). 
3. Mikronukleusi predstavljajo poškodbo, ki je bila prenesena na h čerinske 
celice, pri čemer se kromosomske aberacije v metafaznih celicah ne morejo 
prenesti. Ker se lahko mikronukleusi v interfaznih celicah ocenijo razme ­
roma objektivno, mora laboratorijsko osebje ugotoviti samo, ali so se celice 
delile in koliko celic vsebuje mikronukleus. Zato se lahko pripravke dolo či 
razmeroma hitro, analiza pa je lahko avtomatizirana. Zaradi tega se lahko pri vsakem tretiranju oceni na tiso če namesto na stotine celic, s čimer se pove ča 
moč analize. Ker lahko mikronukleusi nastanejo zaradi zaostalih kromoso ­
mov, obstaja možnost odkritja snovi, ki povzro čajo anevploidijo in se pri 
klasič
nih preskusih kromosomskih aberacij, glej npr. Smernico za presku ­ 
šanje OECD 473 (poglavje B.10 te priloge), težko preu čujejo (17). Vendar 
analiza mikronukleusov  in vitro  ne omogo ča razlikovanja kemikalij, ki 
povzročajo poliploidijo, od tistih, ki povzro čajo klastogenost, brez posebnih 
tehnik, kot je fluorescen čna in situ  hibridizacija (FISH), opisana v 
odstavku 2. 
4. Analiza mikronukleusov  in vitro  je metoda, pri kateri se obi čajno upora ­
bljajo gojene človeške celice ali celice glodavcev. Zagotavlja celovito 
podlago za preiskovanje morebitnih poškodb kromosomov  in vitro , saj 
lahko odkriva snovi, ki povzro čajo strukturne in števil čne poškodbe kromo ­
somov (anevgene in klastogene). 
5. Analiza mikronukleusov  in vitro  je zanesljiva in u činkovita pri razli čnih 
vrstah celic ter ob prisotnosti ali odsotnosti citohalazina B. Na voljo so obširni podatki, ki podpirajo veljavnost analize mikronukleusov  in vitro  
pri različnih celičnih linijah glodavcev (CHO, V79, CHL/IU, in L5178Y) 
in človeških limfocitih (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) 
(29) (30) (31). Ti vklju čujejo zlasti mednarodne validacijske študije, ki jih 
usklajuje Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22), in poro čila International Workshop on Genotoxicity Testing (4) 
(16). Razpoložljivi podatki so bili tudi ponovno ocenjeni v retrospektivni 
validacijski študiji glede zanesljivosti dokazov, ki jo je izvedel
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 708
 
Evropski center za validacijo alternativnih metod (ECVAM) Evropske komi ­
sije, Znanstveni svetovalni odbor ECVAM (ESAC) pa je preskusno metodo 
potrdil kot znanstveno veljavno (32) (33) (34). Opisana je bila uporaba celičnih linij človeških limfoblastov TK6 (35), celic HepG2 (36) (37) in 
primarnih embrionalnih celic sirijskega hr čka (38), čeprav v validacijskih 
študijah niso bile uporabljene.
 
OPREDELITVE POJMOV 
6. Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1.  
ZAČETNI PREUDARKI 
7. Pri preskusih, izvedenih  in vitro , je treba obi čajno uporabiti zunanji vir 
aktivacije presnove, razen če so celice glede na snovi, ki se preskušajo, 
sposobne presnavljanja. Zunanji sistem aktivacije presnove ne posnema pogojev  in vivo  v celoti. Treba je tudi paziti, da se prepre či nastanek razmer, 
ki bi vodile do nepravilnih pozitivnih rezultatov, ki ne kažejo prave muta ­
genosti in so lahko posledica dejavnikov, kot je opazna sprememba pH ali osmolarnosti ali visoka raven citotoksi čnosti (39) (40) (41). Če preskusna 
kemikalija v času dodajanja v medij vpliva na spremembo pH, je treba pH 
prilagoditi, po možnosti z dodajanjem pufra v založno raztopino, tako da vsi 
volumni pri vseh preskusnih koncentracijah in za vse kontrole ostanejo enaki. 
8. Za analizo nastanka mikronukleusov je bistvenega pomena, da je do mitoze 
prišlo v tretiranih in netretiranih kulturah. Glede štetja mikronukleusov se največ podatkov pridobi s pomo čjo celic, v katerih se je med tretiranjem s 
preskusno snovjo ali po njej zaklju čila ena mitoza.
 
NAČELO PRESKUSNE METODE 
9. Človeške celi čne kulture ali celi čne kulture sesalcev so izpostavljene 
preskusni snovi z zunanjim virom aktivacije presnove ali brez nje, razen če so uporabljene celice z ustrezno sposobnostjo presnavljanja. V vsak 
preskus so vklju čene primerjalne (topilo/nosilec) kemikalije in kemikalije 
pozitivne kontrole. 
10. Med izpostavljenostjo preskusni snovi ali po njej se celice gojijo tako dolgo, 
dokler zaradi poškodbe kromosoma ali vretena v interfaznih celicah ne pride 
do nastanka mikronukleusov. Za nastanek anevploidije mora biti med mitozo navadno prisotna preskusna snov. Odvzete in obarvane interfazne celice se analizirajo glede prisotnosti mikronukleusov. Po možnosti se 
mikronukleuse šteje samo v tistih celicah, v katerih je med izpostavljenostjo 
preskusni snovi ali v obdobju po izpostavljenosti, če se uporabi, prišlo do 
mitoze. V kulturah, ki so bile tretirane s citokinetskim blokom, se to doseže s štetjem samo celic z dvema jedroma. Če citokinetski blok ni bil upora ­
bljen, je treba dokazati, da bi pri analiziranih celicah verjetno prišlo do 
deljenja celic med izpostavljenostjo preskusni snovi ali po njej. Pri vseh protokolih je treba dokazati, da je do množenja celic prišlo v kontrolnih in tretiranih kulturah, v kulturah (ali vzporednih kulturah), pri katerih se štejejo 
mikronukleusi, pa je treba oceniti obseg citotoksi čnosti ali citostaze, ki je 
nastala zaradi preskusne snovi.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 709
 
OPIS ANALIZE  
Pripravki  
11. Lahko se uporabijo gojeni primarni človeški limfociti periferne krvi (5) (19) 
(42) (43) in številne celi čne linije glodavcev, kot so celice CHO, V79, 
CHL/IU, in L5178Y (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Uporabo drugih celi čnih linij in vrst je treba utemeljiti na podlagi njihove 
dokazane u činkovitosti v analizi, kot je opisano v oddelku Merila za spre ­
jemljivost. Ker pogostost mikronukleusov v ozadju vpliva na ob čutljivost 
analize, se priporo ča uporaba celi čnih vrst z nizko, stabilno pogostostjo 
nastajanja mikronukleusov v ozadju. 
12. Človeški limfociti periferne krvi se pridobijo od mladih (starih približno 
18–35 let), zdravih posameznikov, ki ne kadijo in ki v zadnjem času niso 
bili izpostavljeni genotoksi čnim kemikalijam ali sevanju. Če so za uporabo 
zbrane celice od ve č kot enega donatorja, je treba dolo čiti število donatorjev. 
Pogostost mikronukleusov se pove čuje z leti, ta trend pa je bolj opazen pri 
ženskah kot pri moških (44), kar je treba pri upoštevati pri izbiri donorskih 
celic.
 
Gojišča in pogoji gojenja 
13. Pri vzdrževanju kultur se uporabijo ustrezna gojiš ča za kulture in pogoji 
inkubacije (posode za kulture, koncentracija CO  2 , temperatura in vlažnost). 
Trajne celi čne linije in sevi se redno preverjajo, ali je v njih modalno 
kromosomsko število stabilno in ali niso okužene z mikoplazmo; okužene 
celične linije in sevi naj se ne uporabljajo. Poznati je treba obi čajni čas 
celičnega ciklusa za pogoje gojenja, ki se uporabljajo v preskuševalnem 
laboratoriju. Če se uporablja metoda citokinetskega bloka, mora biti koncen ­
tracija citokinetskega inhibitorja prilagojena dolo čeni vrsti celic in dokazano 
mora biti, da zagotavlja dober izkoristek celic z dvema jedroma za štetje.  
Priprava kultur 
14. Trajne celi čne linije in sevi: celice se namnožijo iz založnih kultur, nasadijo 
v gojišče tako na gosto, da kultura ne bo dosegla konfluentne rasti v enojnih 
plasteh in kulture suspenzije ne bodo dosegle prevelike gostote preden se 
požanjejo, in se inkubirajo pri 37 °C. 
15. Limfociti: celotna kri, tretirana z antikoagulantom (npr. heparinom), ali 
ločeni limfociti, so gojeni ob prisotnosti mitogena, npr. 
fitohemaglutinina (PHA) pred izpostavljenostjo preskusni snovi in citohala ­
zinu B.  
Aktivacija presnove 
16. Pri uporabi celic z neustrezno notranjo sposobnostjo presnavljanja je treba 
uporabiti zunanje presnovne sisteme. Najpogosteje uporabljani sistem je postmitohondrijska frakcija z dodanim kofaktorjem (S9), pripravljena iz jeter glodavcev, ki so bila tretirana s sredstvi za encimsko indukcijo, kot 
je Aroclor 1254 (45) (46), ali z zmesjo fenobarbitona in β-naftoflavona (46) 
(47) (48) (49). Slednja kombinacija ni v nasprotju s Stockholmsko konven ­
cijo o obstojnih organskih onesnaževalih (50) in Uredbo (ES) št. 850/2004 o obstojnih organskih onesnaževalih (66), za nastanek oksidaz z mešano funk ­
cijo pa se je v primerjavi s sredstvom Aroclor 1254 izkazala kot enako 
učinkovita (46) (47) (48) (49). Postmitohondrijska frakcija se obi čajno 
uporablja v koncentracijah 1–10 % (v/v) v kon čnem preskusnem gojiš ču. 
Pogoji sistema za aktivacijo presnove so lahko odvisni od skupine presku ­ 
šane kemikalije in v časih je primerno uporabiti ve č kot eno koncentracijo 
S9.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 710
 
17. Gensko spremenjene celi čne linije, v katerih se izražajo geni za to čno dolo­ 
čene aktivirajo če človeške encime ali encime glodavcev, lahko odpravijo 
potrebo po zunanjem sistemu aktivacije presnove in se lahko uporabijo kot preskusne celice. V takih primerih mora biti izbira uporabljenih celi čnih 
linij znanstveno utemeljena, npr. s pomembnostjo oksidaze z mešano funk ­
cijo za presnovo preskusne snovi (51) in njihovo odzivnostjo na znane snovi, 
ki povzro čajo strukturne in števil čne poškodbe kromosomov (anevgene in 
klastogene) (glej oddelek Merila za sprejemljivost). Priznati je treba, da izra ­ 
žene oksidaze z mešano funkcijo morda ne bodo presnavljale snovi, ki se 
preskuša; v takem primeru negativni rezultati ne bi pomenili, da preskusna 
snov ne more spodbuditi nastanka mikronukleusov.
 
Priprava preskusne snovi 
18. Trdne kemikalije se pred obdelavo celic raztopijo v ustreznih topilih ali 
nosilcih, in po potrebi razred čijo. Tekoče kemikalije se lahko dodajo nepo ­
sredno v preskusni sistem in/ali se pred obdelavo razred čijo. Plinaste ali 
hlapne kemikalije je treba preskušati z ustrezno spremenjenimi obi čajnimi 
protokoli, kot je obdelava v zatesnjenem nosilcu (52) (53). Uporabljajo se 
sveže pripravljene preskusne snovi, razen če podatki o stabilnosti kažejo, da 
je shranjevanje sprejemljivo.  
Preskusni pogoji  
Topilo/nosilec 
19. Topilo/nosilec ne sme reagirati v stiku s preskusno snovjo, prav tako pa 
mora biti pri uporabljeni koncentraciji združljivo s preživetjem celic ali 
ohranjanjem delovanja S9. Če se uporabijo manj znana topila/nosilci (npr. 
voda, gojiš če celic, dimetil sulfoksid), morajo njihovo uporabo podpirati 
podatki, ki kažejo na njihovo združljivost s preskusno snovjo in njihovo 
pomanjkanje genotoksi čnosti. Priporo ča se, da je, kadar koli je to mogo če, 
prva izbira vodno topilo/nosilec.  
Uporaba citohalazina B kot citokinetskega bloka 
20. Eden od najpomembnejših dejavnikov pri u činkovitosti analize mikronu ­
kleusov  in vitro  je zagotavljanje, da je v celicah, ki se bodo štele, med 
izpostavljenostjo preskusni snovi ali v obdobju inkubacije po izpostavljeno ­
sti, če se uporabi, prišlo do mitoze. Citohalazin B je snov, ki se najbolj 
pogosto uporablja za blokado citokineze, ker povzro ča sestavljanje aktina in 
tako prepre čuje ločevanje hčerinskih celic po mitozi, zaradi česar nastanejo 
celice z dvema jedroma (5) (54) (55). Štetje mikronukleusov je tako lahko omejeno na celice, pri katerih je med obdelavo ali po njej prišlo do mitoze. Učinek preskusne snovi na kinetiko množenja celic se lahko meri isto časno. 
Citohalazin B se kot citokinetski blok uporablja takrat, kadar se uporabljajo 
človeški limfociti, ker se trajanje celi čnih ciklov razlikuje od kulture do 
kulture in od donatorja do donatorja, vsi limfociti pa se ne odzivajo na fitohemaglutinin (PHA). Pri preskušanju celi čnih linij so bile uporabljene 
tudi druge metode za ugotavljanje, ali so se štete celice delile; te metode so 
obravnavane v nadaljevanju (glej odstavek 26). 
21. Laboratorij za vsako vrsto celic dolo či ustrezno koncentracijo citohalazina 
B, da doseže optimalno pogostost celic z dvema jedroma v kontrolnih 
kulturah s topilom/nosilcem. Ustrezna koncentracija citohalazina B je 
običajno med 3 in 6 μg/ml.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 711
 
Merjenje množenja celic in citotoksi čnosti ter izbira koncentracij izposta ­
vljenosti 
22. Pri dolo čanju najvišje koncentracije preskusne snovi, ki se bo preskušala, se 
je treba izogibati koncentracijam, pri katerih se lahko pojavijo nepravilni pozitivni odzivi, na primer koncentracijam, pri katerih se pojavijo čezmerna 
citotoksičnost, obarjanje v gojiš čih in opazne spremembe pH ali osmolar ­
nosti (39) (40) (41). 
23. Izvedejo se meritve množenja celic, s čimer se zagotovi, da je v tretiranih 
celicah med analizo prišlo do mitoze in da je obdelava izvedena na ustreznih 
ravneh citotoksi čnosti (glej odstavek 29). Citotoksi čnost se dolo ča z aktiva ­
cijo presnove in brez nje v celicah, pri katerih je aktivacija presnove potrebna, in sicer z uporabo relativnega pove čanja števila celic (relative 
increase in cell counts, RICC) ali relativne podvojitve populacije (relative 
population doubling, RPD) (glej Dodatek 2 za formule), razen če se uporabi 
citohalazin B. Če se uporabi citohalazin B, se lahko citotoksi čnost dolo či z 
indeksom pomnoževanja (RI) (glej Dodatek 2 za formulo). 
24. Obdelava kultur s citohalazinom B in merjenje relativne pogostosti celic z 
enim, dvema ali ve č jedri v kulturi zagotavljata natan čno metodo za koli ­ 
činsko opredelitev u činka na množenje celic in citotoksi čno ali citostati čno 
delovanje obdelave (5) ter zagotavljata, da so preštete samo celice, pri 
katerih je prišlo do delitve med obdelavo ali po njej. 
25. V študijah s citohalazinom B se lahko citostaza/citotoksi čnost koli činsko 
opredeli s pomo čjo indeksa množenja citokinetskega bloka (cytokinesis- 
block proliferation index, CBPI) (5) (26) (56) ali dolo či s pomočjo indeksa 
pomnoževanja iz vsaj 500 celic na kulturo (glej Dodatek 2 za formule). Kadar se za oceno množenja celic uporablja citohalazin B, je treba CBPI ali RI dolo čiti na podlagi vsaj 500 celic na kulturo. Te meritve se lahko 
poleg drugih uporabijo za oceno citotoksi čnosti tako, da se primerjajo vred ­
nosti v tretiranih in kontrolnih kulturah. Z oceno drugih ozna čevalcev cito ­
toksičnosti (npr. konfluentnost, število celic, apoptoza, nekroza, štetje v 
metafazi) se lahko pridobijo koristne informacije. 
26. V študijah brez citohalazina B je treba dokazati, da so se celice, preštete v 
kulturi, delile med obdelavo s preskusno snovjo ali po njej; v nasprotnem primeru lahko pride do lažnih negativnih odzivov. Metode, ki so bile upora ­
bljene za zagotavljanje, da so deljene celice štete, obsegajo vklju čitev in 
naknadno odkrivanje bromdeoksiuridina (BrdU) za dolo čitev celic, ki so se 
podvojile (57), tvorbo klonov, kadar so celice iz stalnih celi čnih linij treti ­
rane in štete in situ  na stekelcu mikroskopa (indeks množenja (PI)) (25) (26) 
(27) (28), oziroma merjenje relativne podvojitve populacije (RPD) ali rela ­
tivnega pove čanja števila celic (RICC) ali druge preverjene metode (16) (56) 
(58) (59) (glej Dodatek 2 za formule). Z oceno drugih ozna čevalcev cito ­
toksičnosti ali citostaze (npr. konfluentnost, število celic, apoptoza, nekroza, 
štetje v metafazi) se lahko pridobijo koristne informacije. 
27. Ocenijo se vsaj tri koncentracije, ki jih je mogo če analizirati. Da bi to 
dosegli, bo morda treba poskus izvesti z uporabo ve čjega števila koncen ­
tracij, ki so tesno skupaj, in analizirati tvorbo mikronukleusov v teh koncen ­
tracijah, ki zagotavljajo ustrezen razpon citotoksi čnosti. Druga strategija je 
izvedba predhodnega preskusa citotoksi čnosti, da se zoži razpon za kon čni 
preskus. 
28. Najvišja koncentracija naj proizvede 55 ± 5 % citotoksi čnost. Višje ravni 
lahko povzro čijo poškodbo kromosomov kot drugotni u činek citotoksi čnosti 
(60). Ko se citotoksi čnost pojavi, naj izbrane preskusne koncentracije obse ­
gajo razpon od tiste, ki povzro či 55 ± 5 % citotoksi čnost, do tistih, ki 
povzročijo majhno citotoksi čnost ali je sploh ne povzro čijo. ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 712
 
29. Če toksičnost ali oborina nista opaženi, mora najvišja preskusna koncentra ­
cija ustrezati 0,01 M, 5 mg/ml ali 5 μl/ml, pri čemer se upošteva nižja od 
obeh vrednosti. Koncentracije, izbrane za analizo, se lahko na splošno razli ­
kujejo za najve č 10. Pri preskusnih snoveh, ki kažejo strmo krivuljo odziva 
na koncentracijo, je morda potrebna manjša razlika med koncentracijami, 
tako da se štejejo tudi kulture v zmernem in nizkem razponu toksi čnosti. 
30. Kadar je topnost omejitveni dejavnik, mora biti najvišja koncentracija, če ni 
omejena s citotoksi čnostjo, najnižja koncentracija, pri kateri je v kulturah 
vidna najmanjša možna oborina, če pri štetju ni nobenih interferenc. Ocena 
oborine se izvede z metodami, kot je pregled s svetlobnim mikroskopom, s 
katerim se opazi oborino, ki ostaja ali se pojavi med gojenjem (do konca 
obdelave).  
Kontrolni vzorci 
31. V vsak poskus se vklju čijo primerjalni pozitivni kontrolni vzorci in 
kontrolni vzorci s topilom/nosilcem, ob aktivaciji presnove in brez nje. 
32. Pozitivni kontrolni vzorci so potrebni za dokaz sposobnosti uporabljenih 
celic, protokol preskusa pa za opredelitev snovi, ki povzro čajo strukturne 
in številčne poškodbe kromosomov (anevgene in klastogene) ter potrditev 
sposobnosti presnavljanja pripravka S9. Pozitivni kontrolni vzorci morajo 
uporabiti znane povzro čitelje tvorbe mikronukleusov pri koncentracijah, pri 
katerih se pri čakuje majhno, vendar ponovljivo pove čanje glede na ozadje, 
ki pokaže ob čutljivost preskusnega sistema. Koncentracije pozitivne kontrole 
naj se izberejo tako, da so u činki jasni, vendar ne razkrijejo takoj identitete 
kodiranih mikroskopskih preparatov. 
33. Za prikaz sposobnosti presnavljanja in zmožnosti sistema, da odkriva klasto ­
gene, je treba uporabiti klastogen, pri katerem je potrebna aktivacija pres ­
nove (npr. ciklofosfamid; benzo[a]piren). Uporabijo se lahko tudi druge 
ustrezne snovi pozitivne kontrole, če je to utemeljeno. Ker so lahko nekateri 
pozitivni kontrolni vzorci, ki potrebujejo aktivacijo presnove, v dolo čenih 
pogojih obdelave ali dolo čenih celičnih linijah aktivni brez zunanje aktiva ­
cije presnove, je treba potrebo po aktivaciji presnove in delovanje pripravka 
S9 preskusiti na izbrani celi čni liniji in z izbranimi koncentracijami. 
34. Trenutno niso znani nobeni anevgeni, ki bi za svojo genotoksi čno delovanje 
potrebovali aktivacijo presnove (16). Trenutno uveljavljeni pozitivni kontroli za anevgeno delovanje sta, na primer, kolhicin in vinblastin. Druge kemi ­
kalije se lahko uporabijo, če vplivajo na nastanek mikronukleusov izklju čno 
ali v glavnem preko anevgenega delovanja. Da bi se izognili uporabi dveh pozitivnih kontrolnih vzorcev (za klastogenost in anevgenost) brez aktivacije presnove, je lahko kontrola anevgenosti pozitivna kontrola brez S9, kontrola 
klastogenosti pa se lahko uporablja za preskus ustreznosti uporabljenega 
sistema za aktivacijo presnove. Pozitivno kontrolo za klastogenost in anev ­
genost je treba uporabiti pri celicah, pri katerih uporaba S9 ni potrebna. Priporočeni pozitivni kontrolni vzorci so navedeni v Dodatku 3. 
35. Če so na voljo ustrezne kemikalije, se lahko preu či možnost uporabe pozitivnih 
kontrol, ki sodijo v isto skupino kemikalij. Vsi uporabljeni pozitivni kontrolni 
vzorci morajo ustrezati vrsti celic in pogojem aktivacije.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 713
 
36. Za vsak odvzem se pripravijo kontrolni vzorci, ki jih sestavlja le topilo ali 
nosilec. Uporabijo se tudi netretirani kontrolni vzorci, razen če objavljeni ali 
laboratorijski pretekli kontrolni podatki dokazujejo, da izbrano topilo pri uporabljenih koncentracijah ne povzro ča genotoksi čnih ali škodljivih u čin­
kov.
 
PRESKUSNI POSTOPEK  
Program tretiranja  
37. Da bi bila verjetnost odkritja snovi, ki povzro čajo števil čne in strukturne 
poškodbe kromosomov (anevgene in klastogene snovi) ter delujejo v dolo ­ 
čeni fazi celi čnega cikla, čim večja, mora biti s preskusno snovjo tretirano 
zadostno število celic v vseh fazah njihovih celi čnih ciklov. Program treti ­
ranja celi čnih linij in primarnih celi čnih kultur se lahko zato nekoliko razli ­
kuje od tistega za limfocite, pri katerih je za za četek celičnega cikla 
potrebna stimulacija z mitogenom, kar je obravnavano v odstavkih 41–43 (16). 
38. Teoreti čni premisleki skupaj z objavljenimi podatki (18) kažejo, da je ve čina 
snovi, ki povzro čajo števil čne in strukturne poškodbe kromosomov (anev ­
gene in klastogene snovi) odkritih s kratkoro čnim obdobjem tretiranja, ki 
traja 3 do 6 ur z dodanim pripravkom S9 ali brez, ki mu sledita odvzem 
preskusne snovi in obdobje rasti 1,5–2,0 celi čnih ciklov (6). Celice se 
vzorčijo v času, ki je enak približno 1,5–2,0 dolžinama obi čajnega (tj. 
netretiranega) celi čnega cikla po za četku ali ob koncu tretiranja (glej 
preglednico 1). Čas vzorčenja ali obnavljanja se lahko podaljša, če je 
znano ali se sumi, da preskusna snov vpliva na dolžino celi čnega cikla 
(npr. pri preskušanju nukleozidnih analogov). 
39. Zaradi morebitne citotoksi čnosti pripravkov S9 za kultivirane celice sesalcev 
se podaljšana izpostavljenost v dolžini 1,5–2,0 obi čajnih celi čnih ciklov 
uporablja samo, če S9 ni dodan. Pri podaljšanem tretiranju so na voljo 
možnosti, ki omogo čajo tretiranje celic s preskusno kemikalijo z dodanim 
citohalazinom B ali brez njega. Te možnosti so namenjene primerom, kjer se lahko pojavi zaskrbljenost glede morebitnih interakcij med preskusno snovjo 
in citohalazinom B. 
40. Priporo čeni programi tretiranja celic so predstavljeni v preglednici 1. Ti 
splošni programi tretiranja se lahko prilagodijo glede na stabilnost ali 
reaktivnost preskusne snovi ali dolo čenih značilnosti rasti uporabljenih celic. 
Vsa tretiranja se morajo za četi in kon čati med eksponentno rastjo celic. Ti 
programi so podrobneje predstavljeni v odstavkih 41–47, ki sledijo.  
Preglednica 1  
Obdobja tretiranja in odvzema celic za analizo mikronukleusov  in vitro  
Limfociti, primarne celice in celi čne linije, 
tretirane s citohalazinom B + S9 Obdelava traja 3–6 ur z dodanim S9; 
odstranita se S9 in obdelovalno gojiš če; 
dodata se sveže gojiš če in citohalazin B; 
celice se odvzamejo po 1,5–2,0 obi čajnih celi ­ 
čnih ciklih. 
– S9 
kratka izpostavljenost Obdelava traja 3–6 ur; 
odstrani se obdelovalno gojiš če; 
dodata se sveže gojiš če in citohalazin B; 
celice se odvzamejo po 1,5–2,0 obi čajnih celi ­ 
čnih ciklih.  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 714
 
– S9 
daljša izpostavljenost  Možnost A:  obdelava traja 1,5–2 dolžini obi čaj­
nega celi čnega cikla z dodanim citohalazinom 
B; 
celice se odvzamejo ob koncu obdobja izposta ­
vljenosti.  
Možnost B:  obdelava traja 1,5–2,0 obi čajna 
celična cikla; 
odstrani se preskusna snov; dodata se sveže gojiš če in citohalazin B; 
celice se odvzamejo po 1,5–2,0 obi čajnih celi ­ 
čnih ciklih. 
Celične linije, tretirane brez citohalazina B 
(enako kot opisani programi tretiranja, vendar brez dodajanja citohalazina B)
 
Limfociti, primarne celice in celi čne linije, tretirane s citohalazinom B  
41. Pri limfocitih je naju činkovitejši pristop z za četekom izpostavljenosti 
preskusni snovi 44–48 ur po stimulaciji fitohemaglutinina (PHA), ko ni več sinhronizacije ciklov (5). V prvotni analizi se celice obdelujejo 3 do 
6 ur s preskusno snovjo z dodanim S9 ali brez njega. Obdelovalno gojiš če 
se odstrani in nadomesti s svežim gojiš čem, ki vsebuje citohalazin B, celice 
pa se odvzamejo čez 1,5–2,0 dolžini obi čajnega celi čnega cikla. 
42. Če sta oba prvotna preskusa pri kratki obdelavi (3–6 ur) negativna ali 
dvoumna, se izvede nadaljnja obdelava z daljšo izpostavljenostjo brez S9. 
Na voljo sta dve možnosti obdelave, ki sta enako sprejemljivi. Vendar je za 
stimuliranje limfocitov, pri katerih se lahko eksponentna rast po 96 urah po stimulaciji zmanjšuje, morda primernejša možnost A. Pri možnosti B celi čne 
kulture do kon čnega časa vzorčenja ne smejo postati strjene. 
— Možnost A: celice se s preskusno snovjo obdelujejo 1,5–2,0 dolžini 
običajnih celi čnih ciklov in odvzamejo ob koncu obdelave. 
— Možnost B: celice se s preskusno snovjo obdelujejo 1,5–2,0 dolžini 
običajnega celi čnega cikla. Obdelovalno gojiš če se odstrani in nadomesti 
s svežim gojiš čem, celice pa se odvzamejo po dodatnih 1,5–2,0 dolžinah 
običajnega celi čnega cikla. 
43. Primarne celice in celi čne linije se obdelajo na podoben na čin kot limfociti, 
vendar stimulacija s PHA 44–48 ur ni potrebna. Celice, ki niso limfociti, morajo biti izpostavljene tako, da so ob kon čani študiji še vedno v logari ­
temski fazi rasti.
 
Celične linije, tretirane brez citohalazina B  
44. Celice se obdelujejo 3–6 ur z dodanim S9 in brez njega. Obdelovalno 
gojišče se odstrani in nadomesti s svežim gojiš čem, celice pa se odvzamejo 
čez 1,5–2,0 dolžini obi čajnega celi čnega cikla.  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 715
 
45. Če sta oba prvotna preskusa pri kratki obdelavi (3–6 ur) negativna ali 
dvoumna, se izvede nadaljnja obdelava z daljšo izpostavljenostjo (brez 
S9). Na voljo sta dve možnosti obdelave, ki sta enako sprejemljivi: 
— Možnost A: celice se s preskusno snovjo obdelujejo 1,5–2,0 dolžini 
običajnega celi čnega cikla in odvzamejo ob koncu obdelave. 
— Možnost B: celice se s preskusno snovjo obdelujejo 1,5–2,0 dolžini 
običajnega celi čnega cikla. Obdelovalno gojiš če se odstrani in nadomesti 
s svežim gojiš čem, celice pa se odvzamejo po dodatnih 1,5–2,0 dolžinah 
običajnega celi čnega cikla. 
46. V enojnih plasteh so lahko po zaklju čku 3–6 ur trajajo če obdelave prisotne 
mitotične celice (so okrogle in se lo čujejo od površine). Ker se te mitoti čne 
celice zlahka lo čijo, se jih lahko ob odstranitvi gojiš ča s preskusno snovjo 
izgubi. Pri spiranju kultur se jih odvzame, nato pa vrne v kulture, pri čemer 
je treba paziti, da se v času odvzema ne izgubijo celice, pri katerih poteka 
mitoza in pri katerih obstaja tveganje nastanka mikronukleusa.  
Število kultur  
47. Za vsako koncentracijo preskusne snovi ter kulture z nosilcem/topilom in 
kulture negativne kontrole se uporabita dve vzporedni kulturi. Kadar se na 
podlagi preteklih podatkov laboratorija lahko dokaže, da so razlike med 
dvema vzporednima kulturama minimalne, je sprejemljivo, da se uporabi ena kultura. Če se uporabi ena kultura, se priporo ča, da se analizira ve čje 
število koncentracij.
 
Odvzem celic in priprava mikroskopskih preparatov  
48. Vsaka kultura se odvzame in obdela lo čeno. Priprava celic lahko vklju čuje 
hipotonično obdelavo, vendar to ni potrebno, če se ustrezno širjenje celic 
doseže tudi druga če. Pri pripravi mikroskopskih preparatov se lahko upora ­
bijo razli čne tehnike, če se za štetje pridobi pripravke s celicami visoke 
kakovosti. Zadržati je treba citoplazmo celic, kar omogo či odkrivanje mikro ­
nukleusov in (pri metodi s citokinetskim blokom) zanesljivo identifikacijo celic z dvema jedroma. 
49. Mikroskopske preparate se lahko obarva z razli čnimi metodami, kot so 
Giemsa ali DNA-specifi čna flourescentna barvila (59). Uporaba 
DNA-specifi čnega barvila (npr. akridin oranž (61) ali Hoechst 33258 plus 
pyronin-Y (62)) lahko prepre či nastanek nekaterih artefaktov, povezanih z 
uporabo barvila, ki ni specifi čno za DNA. Za opredelitev vsebine (kromo ­
som/kromosomski delec) mikronukleusov, če so potrebne mehanske infor ­
macije o njihovi tvorbi, se lahko uporabi kinetohorno protitelo, fluores ­
centna  in situ  hibridizacija (FISH) s sondami DNA za centromere ali 
primarno ozna čevanje  in situ  s premazi, specifi čnimi za centromere, skupaj 
z ustreznim nasprotnim barvanjem DNA (15) (16). Za razlikovanje med 
snovmi, ki povzro čajo strukturne in števil čne poškodbe kromosomov (anev ­
geni in klastogeni), se lahko uporabijo druge metode, če so se izkazale za 
učinkovite.
 
Analiza  
50. Vse preparate se, skupaj z vzorci s topilom/nosilcem in kontrolnimi vzorci, 
pred mikroskopsko analizo neodvisno kodira. Namesto tega se lahko kodi ­
rane vzorce analizira s pomo čjo validiranega, avtomatiziranega sistema za 
pretočno citometri čno analizo ali slikovno analizo.  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 716
 
51. Pri kulturah, tretiranih s citohalazinom B, je treba pogostost mikronukleusov 
analizirati v vsaj 2 000 celicah z dvema jedroma na koncentracijo (vsaj 
1 000 celic z dvema jedroma na kulturo; dve kulturi na koncentracijo). Če 
se uporabi ena kultura, je treba iz te kulture oceniti vsaj 2 000 celic z dvema jedroma na koncentracijo. Če je za štetje pri vsaki koncentraciji uporabljenih 
precej manj kot 1 000 celic z dvema jedroma na kulturo ali 2 000 celic z 
dvema jedroma v primeru ene kulture in če ni ugotovljeno znatno pove čanje 
števila mikronukleusov, je treba preskus ponoviti z ve č celicami ali z manj 
toksičnimi koncentracijami, kar je primerneje. Paziti je treba, da se ne šteje 
celic z dvema jedroma, ki so nepravilne oblike ali pri katerih se velikost 
dveh jeder precej razlikuje; prav tako se celic z dvema jedroma ne sme zamenjevati s slabo razširjenimi celicami z ve č jedri. Celice, ki imajo ve č 
kot dve glavni jedri, se ne analizirajo glede mikronukleusov, saj je lahko 
izhodiščna pogostost mikronukleusov v teh celicah višja (63) (64). Štetje 
celic z enim jedrom je sprejemljivo, če je za preskusno snov znano, da 
vpliva na delovanje citohalazina B. 
52. V celi čnih linijah, analiziranih brez tretiranja s citohalazinom B, se mikro ­
nukleuse šteje v vsaj 2 000 celicah na koncentracijo (vsaj 1 000 celic na 
kulturo; dve kulturi na koncentracijo). Če se uporabi samo eno kulturo na 
koncentracijo, se pri tej kulturi oceni vsaj 2 000 celic. 
53. Ko je uporabljen citohalazin B, je treba za oceno množenja celic dolo čiti 
CBPI ali RI (glej Dodatek 2) na podlagi vsaj 500 celic na kulturo. Kadar se 
tretiranje izvaja brez dodanega citohalazina B, je treba zagotoviti dokaz, da so se štete celice množile, kot je obravnavano v odstavkih 24–27.
 
Merila za sprejemljivost  
54. Laboratorij, ki predlaga uporabo analize mikronukleusov  in vitro , opisano v tej 
preskusni metodi, mora z uporabo referen čnih kemikalij iz Dodatka 3 dokazati 
svojo sposobnost, da zanesljivo in natan čno odkrije kemikalije, za katere je 
znano, da povzro čajo števil čne in strukturne poškodbe kromosomov (anev ­
geno in klastogeno delovanje), z aktivacijo presnove in brez nje, pa tudi znane 
negativne kemikalije. Kot dokaz za zmožnost laboratorija, da pravilno izvede to preskusno metodo, mora laboratorij zagotoviti dokaze, da se je pri celicah, ki se jih šteje glede tvorbe mikronukleusov, zaklju čila ena delitev jedra, če se 
preskus izvaja brez uporabe citohalazina B. 
55. Kemikalije iz Dodatka 3 se priporo ča kot referen čne kemikalije. Lahko se 
vključi nadomestne ali dodatne kemikalije, če je njihovo delovanje znano, če 
spodbujajo tvorbo mikronukleusov z enakimi mehanizmi delovanja in če se 
zanje izkaže, da so pomembne v zvezi s kemikalijami, ki se bodo preskušale 
z uporabo postopka analize mikronukleusov  in vitro . Utemeljitev bi lahko 
vključevala validacijsko študijo, pri kateri so uporabljene številne razli čne 
snovi, oziroma študijo, osredoto čeno na ožji spekter, ki temelji na kemij ­
skem razredu preskusne snovi ali mehanizmu škode, ki se preu čuje. 
56. Kontrolne kulture s topilom/nosilcem in netretirane kulture naj bi dale pono ­
vljivo nizko in dosledno pogostost mikronukleusov (obi čajno 5–25 mikro ­
nukleusov/1 000 celic za vrste celic, opredeljene v odstavku 11). Druge 
vrste celic imajo lahko razli čne razpone odzivov, ki jih je treba dolo čiti 
pri validaciji za uporabo pri analizi mikronukleusov  in vitro . Za dolo čitev 
preteklih kontrolnih razponov je treba uporabiti podatke, pridobljene z nega ­
tivno kontrolo, kontrolo s topilom in pozitivno kontrolo. Te vrednosti se 
uporabijo pri odlo čanju o ustreznosti primerjalne negativne/pozitivne 
kontrole za poskus.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 717
 
57. Če so za analizo predlagane manjše spremembe protokola (npr. avtomatizi ­
rano štetje namesto ro čnih tehnik štetja; uporaba nove vrste celic), se pred 
sprejetjem spremenjenega protokola za uporabo najprej dokaže u činkovitost 
spremembe. Dokaz u činkovitosti vklju čuje dokaz, da se lahko odkrije glavne 
mehanizme preloma kromosomov in pridobitev ali izgubo ter da se lahko za 
razred posamezne snovi ali številnih razli čnih snovi, ki se bodo preskušale, 
pridobi ustrezne pozitivne in negativne rezultate.  
PODATKI IN PORO ČANJE  
Obdelava rezultatov  
58. Če se uporabi tehnika citokinetskega bloka, se pri ocenjevanju nastajanja 
mikronukleusov uporabi samo pogostost celic z dvema jedroma z mikronu ­
kleusi (ne glede na število mikronukleusov na celico). Štetje celic z enim, 
dvema ali ve č mikronukleusi bi lahko zagotovilo koristne informacije, 
vendar ni obvezno. 
59. Dolo čiti je treba so časne meritve citotoksi čnosti in/ali citostaze za vse treti ­
rane kulture in kontrolne kulture s topilom/nosilcem (58). Pri uporabi metode citokinetskega bloka je treba za vse tretirane in kontrolne kulture izračunati CBPI ali RI kot merili zakasnitve celi čnega cikla. Če citohalazin 
B ni dodan, se uporabi relativna podvojitev populacije (RPD) ali relativno 
povečanje števila celic (RICC) ali indeks množenja (glej Dodatek 2). 
60. Navedejo se podatki za posamezne kulture. Poleg tega se podatki povzamejo 
v obliki preglednice. 
61. Kemikalije lahko pri analizi mikronukleusov in vitro povzro čijo nastanek 
mikronukleusov zato, ker povzro čajo prelom kromosomov, izgubo kromo ­
somov ali pa oboje hkrati. Za ugotovitev, ali je mehanizem za nastajanje mikronukleusov posledica delovanja, ki povzro ča strukturne in števil čne 
poškodbe kromosomov (klastogenega in/ali anevgenega delovanja), se 
lahko izvede nadaljnja analiza z uporabo antikinetohornih protiteles,  in 
situ sond, specifi čnih za centromere, ali drugih metod.
 
Vrednotenje in razlaga rezultatov  
62. Ni zahteve po potrjevanju jasnega pozitivnega ali negativnega odziva z 
dodatnimi preskusi. Dvoumni rezultati se lahko pojasnijo z analizo dodatnih 
1 000 celic iz vseh kultur, zaradi česar ne pride do izgube slepih vzorcev. 
Če ta pristop ne pomaga pri spremembi rezultata, je treba izvesti nadaljnje 
preskušanje. V nadaljnjih poskusih naj se preu či možnost prilagoditve razšir ­
jenega ali zožanega razpona preskusnih parametrov, kot je primerno. 
Preskusni parametri, ki se lahko spremenijo, vklju čujejo razmik med 
preskusnimi koncentracijami, časovno razporeditev obdelave in odvzema 
celic in/ali pogoje za aktivacijo presnove. 
63. Pozitivni rezultat se lahko dolo či na podlagi številnih meril, kot je na primer 
s koncentracijo povezano pove čanje ali statisti čno značilno pove čanje števila 
celic z mikronukleusi. Najprej naj se preu či biološka pomembnost rezulta ­
tov. Upoštevanje tega, ali so dobljene vrednosti v razponu preteklih kontrol 
ali zunaj njega, lahko zagotovi smernice pri ocenjevanju biološke pomemb ­
nosti odziva. Pri vrednotenju rezultatov preskusa se kot pomo č lahko upora ­
bijo ustrezne statisti čne metode (65). Vendar je treba rezultate statisti čnega 
preskušanja oceniti z upoštevanjem odnosa med odmerkom in odzivom. 
Upoštevati je treba tudi ponovljivost in pretekle podatke.  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 718
 
64. Čeprav bo ve čina poskusov dala jasne pozitivne ali negativne rezultate, 
bodo v nekaterih primerih dobljeni podatki prepre čili zanesljivo oceno o 
delovanju preskusne snovi. Ti dvoumni ali dvomljivi odzivi se lahko poja ­
vijo ne glede na število ponovitev poskusa. 
65. Pozitivni rezultati analize mikronukleusov  in vitro  pomenijo, da v kultivi ­
ranih celicah sesalcev preskusna snov povzro ča prelome ali izgubo kromo ­
somov . Negativni rezultati pomenijo, da preskusna snov pri uporabljenih 
preskusnih pogojih ne povzro ča preloma kromosomov in/ali pridobitve ali 
izgube v uporabljenih kultiviranih sesalskih celicah.  
Poročilo o preskusu  
66. Poro čilu o preskusu vsebuje vsaj naslednje informacije ( če so pomembne za 
izvedbo študije):  
Preskusna kemikalija:  
— identifikacijske podatke in registrsko številko Službe za izmenjavo 
kemijskih izvle čkov ter številko EC, 
— agregatno stanje in čistost, 
— fizikalno-kemijske lastnosti, pomembne za izvedbo študije, — reagiranje preskusne kemikalije s topilom/nosilcem ali gojiš čem celic;  
Topilo/nosilec:  
— utemeljitev izbire topila/nosilca, 
— topnost in stabilnost preskusne snovi v topilu/nosilcu;  
Celice:  
— vrsto in izvor uporabljenih celic, 
— ustreznost uporabljene vrste celic, 
— odsotnost mikoplazme, če je to primerno, 
— informacije o trajanju celi čnega cikla, podvojitvenem času ali indeksu 
množenja, 
— kadar so uporabljeni limfociti, spol, starost in število donatorjev krvi, če 
je primerno, 
— kadar so uporabljeni limfociti, ali je izpostavljena kri v celoti ali lo čeni 
limfociti, 
— število pasaž, če je primerno, 
— metode vzdrževanja celi čnih kultur, če je primerno, 
— modalno število kromosomov, 
— običajno (negativna kontrola) trajanje celi čnega cikla;  
Preskusni pogoji:  
— identiteto citogenetskega bloka (npr. cytoB), če je uporabljen, njegovo 
koncentracijo in trajanje izpostavljenosti celic, 
— razloge za izbiro koncentracij in števila kultur, vklju čno s podatki o 
citotoksičnosti in mejah topnosti, če so na voljo, 
— sestavo gojiš č, koncentracijo CO
 2 , če je primerno, 
— koncentracije preskusne snovi,  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 719
 
— koncentracije (in/ali volumen) nosilca in dodane preskusne snovi, 
— inkubacijsko temperaturo in čas trajanja inkubacije, 
— trajanje obdelave, 
— odvzem po obdelavi, 
— gostoto celic ob nasaditvi, če je primerno, 
— vrsto in sestavo sistema za aktivacijo presnove, skupaj z merili za spre ­
jemljivost, 
— kemikalije pozitivne kontrole in negativne kontrole, 
— metode priprave mikroskopskih preparatov in uporabljene tehnike barva ­
nja, 
— merila za identifikacijo mikronukleusov, — števila analiziranih celic, 
— metode merjenja citotoksi čnosti, 
— morebitne dodatne informacije v zvezi s citotoksi čnostjo, 
— merila za dolo čanje študij kot pozitivnih, negativnih ali dvoumnih, 
— uporabljene metode statisti čne analize, 
— metode, kot je uporaba kinetohornega protitelesa, za ugotavljanje, ali 
mikronukleusi vsebujejo cele kromosome ali le delce kromosomov, če 
je primerno;  
Rezultati:  
— meritev uporabljene citotoksi čnosti, npr CBPI ali RI v primeru metode 
citokinetskega bloka; RICC, RPD ali PI v primerih, ko metode citokinet ­
skega bloka niso uporabljene; druge ugotovitve, če je primerno, npr. 
konfluentnost celic, apoptozo, nekrozo, štetje v metafazi, pogostost 
celic z dvema jedroma, 
— znake obarjanja, 
— podatke o pH in osmolarnosti obdelovalnega gojiš ča, če sta bila dolo ­ 
čena, 
— opredelitev sprejemljivih celic za analizo, — porazdelitev celic z enim, dvema ali ve č jedri v primeru uporabe metode 
citokinetskega bloka, 
— število celic z mikronukleusum, podanih lo čeno za vsako tretirano in 
kontrolno kulturo, ter po potrebi opredelitev, ali so iz celic z dvema ali enim jedrom, 
— odvisnost med koncentracijo in odzivom, kadar je mogo če, 
— kemijske podatke o primerjalni negativni (topilo/nosilec) in pozitivni 
kontroli (koncentracije in topila), 
— pretekle kemijske podatke o negativni (topilo/nosilec) in pozitivni 
kontroli, skupaj z razponi, povpre čji in standardnim odstopanjem ter 
intervalom zaupanja (npr. 95 %), 
— statisti čno analizo; p-vrednosti, če obstajajo;  
Razprava o rezultatih 
Sklepi
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 720
 
VIRI 
1. Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test.  
Mutation Res. , 392, 1–4. 
2. Parry, J.M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the aneu ­
genic potential of environmental chemicals: the European Community aneu ­
ploidy project,  Mutation Res. , 287, 3–15. 
3. Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in the 
micronucleus assay,  Cytobios. , 43, 233–246. 
4. Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the  In Vitro  Micronucleus 
Assay Working Group,  Environ. Mol. Mutagen ., 35, 167–172. 
5. Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay,  Nature 
Protocols, 2  (5), 1084–1104. 
6. Fenech, M. and Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus 
method in human lymphocytes: effect of  in-vivo  ageing and low dose 
X-irradiation,  Mutation Res. , 161, 193–198. 
7. Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989), Identification of 
aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody,  Environ. Mol. Mutagen. , 13, 34–43. 
8. Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and 
aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence  in- 
situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes,  Mutation Res. , 
234, 9–20. 
9. Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991), Clas ­
sification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to  in situ  hybridization with biotinylated 
gamma satellite DNA,  Mutagenesis , 6, 297–302. 
10. Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993), The use of fluores ­
cence  in-situ  hybridisation for the detection of aneugens in 
cytokinesis-blocked mouse splenocytes,  Mutagenesis , 8, 329–334. 
11. Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cytogenetic 
damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and 
micronucleus analysis by fluorescence  in situ  hybridization with a centro ­
meric probe,  Mutation Res. , 319, 205–213. 
12. Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chro ­
mosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by anti ­
kinetochore staining and  in situ  hybridization,  Mutagenesis , 8, 519–525. 
13. Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994), Detection of hyper ­
diploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes follo ­
wing exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor 
fluorescence  in situ  hybridization with DNA probes,  Mutation Res. , 322, 
9–20. 
14. Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996), Fluo ­
rescence  in situ  hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric 
probes: a sensitive method to detect aneuploidy,  Mutation Res. , 372, 
233–245. 
15. Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of 
chromosome segregation by means of fluorescence  in situ  hybridization: 
application to cytokinesis-blocked human lymphocytes,  Mutation Res. , 372, 
211–219. 
16. Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der 
Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the  in vitro  micronucleus 
assay working group.  Mutation Res. , 540, 153–163.  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 721
 
17. OECD (1997),  In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test , Test 
Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, 
Paris. Na voljo na spletni strani: www.oecd.org/env/testguidelines. 
18. Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. 
and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on  in vitro  
micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study,  
Mutation Res. , 607, 13–36. 
19. Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, 
R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test. II. 
Using human lymphocytes,  Mutation Res. , 607, 37–60. 
20. Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., 
Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, 
D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in 
vitro  micronucleus test, III. Using CHO cells,  Mutation Res. , 607, 61–87. 
21. Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobayashi, 
K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and 
Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  
micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells,  Mutation Res. , 607, 88–124. 
22. Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., 
Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), 
SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test, V. 
Using L5178Y cells,  Mutation Res. , 607, 125–152. 
23. Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data 
on in vitro  MNT and  in vitro  CA: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 
187–208. 
24. Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997), 
Comparative evaluation of the  in vitro  micronucleus test and the  in vitro  
chromosome aberration test: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 
45–59. 
25. Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and 
Madle, S. (1998), Evaluation of the  in vitro  micronucleus test as an alterna ­
tive to the  in vitro  chromosomal aberration assay: position of the GUM 
Working Group on the  in vitro  micronucleus test. Gesellschaft fur 
Umwelt-Mutations-forschung,  Mutation Res. , 410, 81–116. 
26. Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), Chemically 
induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three different 
test approaches,  Mutation Res.  439, 183–190. 
27. Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. 
(1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 
cells to detect drug-induced photogenotoxicity,  Mutation Res.  445, 55–71. 
28. von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., 
Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000),  In vitro  micronucleus assay with Chinese hamster V79 
cells - results of a collaborative study with  in situ  exposure to 26 chemical 
substances,  Mutation Res ., 468, 137–163. 
29. Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  in 
vitro
 micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity,  Mutation 
Res., 517, 123–134. 
30. Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., 
Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and 
Sofuni, T. (1999), Validation study of the  in vitro  micronucleus test in a 
Chinese hamster lung cell line (CHL/IU),  Mutagenesis , 14, 569–580.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 722
 
31. Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International colla ­
borative study on  in vitro  micronucleus test,  Mutation Res. , 607, 1–152. 
32. ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of 
Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on 
the scientific validity of the  in vitro  micronucleus test as an alternative to the  
in vitro  chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 25  th 
meeting, 16-17 November, 2006, na voljo na spletni strani: http://ecvam.jrc.it/ 
index.htm. 
33. ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer 
Review, Retrospective Validation of the  In Vitro  Micronucleus Test, 
Summary and Conclusions of the Peer Review Panel, na voljo na spletni 
strani: http://ecvam.jrc.it/index.htm. 
34. Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, 
van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of  
in vitro  Micronucleus Test (MNT),  Mutagenesis , 23, 271–283. 
35. Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and Sofuni, 
T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the  in vitro  micronucleus test,  Mutation Res. , 
347, 105–115. 
36. Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and 
Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B
 1 is genotoxic in human derived hepa ­
toma (HepG2) cells,  Mutagenesis , 17, 257–260. 
37. Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., 
Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge,  Toxicol. , 198, 315–328. 
38. Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., 
Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian 
hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation 
assay for National Toxicology Program test chemicals,  Mutation Res. , 392, 
61–70. 
39. Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., 
Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under 
extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9,  Mutation 
Res., 257, 147–205. 
40. Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity of 
low pH to various cultured mammalian cells,  Mutation Res. , 268, 297–305. 
41. Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced 
by low pH treatment conditions and increased ion concentrations,  Environ. 
Mutagen ., 8, 789–886. 
42. Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in lymp ­
hocytes,  Mutation Res. , 147, 29–36. 
43. Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood 
micronucleus method,  Mutation Res. , 392, 11–18. 
44. Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., 
Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhale ­
vich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, M.R., 
Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman Micro ­
Nucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of 
laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of 
micronuclei,  Environ. Mol. Mutagen.  37, 31–45.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 723
 
45. Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella 
mutagenicity test,  Mutation Res. , 113, 173–215. 
46. Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980), Differential 
effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver,  J. Environ. Pathol. Toxicol. , 4, 
55–65. 
47. Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., 
Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in  in-vitro  genotoxicity assays.  Mutagenesis , 7, 175–177. 
48. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe 
substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activa ­
tion Systems,  In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. 
(eds),  In Vitro  Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, 
North-Holland, str. 85–88. 
49. Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996), Human liver 
S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison 
with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9,  
Environ. Mol. Mutagen. , 28, 51–59. 
50. UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, 
United Nations Environment Programme (UNEP). Na voljo na spletni strani: 
http://www.pops.int/. 
51. Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996), An investiga ­
tion into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells,  Mutagenesis , 11, 
247–274. 
52. Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Muta ­
tion Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids,  v: Tice, R.R., Costa, 
D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New 
York, Plenum, str. 91–103. 
53. Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation of 
an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay,  Environ. Mutagenesis  
5, 795–801. 
54. Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed 
description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations,  Mutation Res. , 285, 35–44. 
55. Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  in 
vitro  micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals 
with different mechanisms of action and different levels of activity,  Mutation 
Res., 521, 103–112. 
56. Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., 
Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to,Re ­
port from the  in vitro  micronucleus assay working group,  Mutation Res. , 
564, 97–100. 
57. Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear 
assay in lymphocytes,  Mutation Res. , 139, 61–65. 
58. Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison 
of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the  in vitro  
micronucleus test. I. Theoretical aspects,  Mutation Res. , 655, 1–3. 
59. Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. 
(1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures,  Mutation Res. , 341, 
169–184. 
60. Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations  in vitro : 
Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the 
aberration assay, Environ. Molec.  Mutagenesis  35, 191–201.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 724
 
61. Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of 
Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test,  Mutation 
Res., 120, 241–247. 
62. MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple 
Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y,  Mutation Res. , 120, 269–275. 
63. Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of 
acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test,  Mutation 
Res., 120, 241–247. 
64. Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and 
Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria 
for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lympho ­
cyte cultures,  Mutation Res. , 534, 65–75. 
65. Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003),  In vitro  micronucleus 
test, v: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. 
Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, str. 463–467. 
66. Uredba (ES) št. 850/2004 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 29. aprila 
2004 o obstojnih organskih onesnaževalih in spremembi Direktive 79/117/EGS (UL L 229, 30.4.2004, str. 5).
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 725
 
Dodatek 1  
Opredelitve pojmov  
Anevgen:  snov ali proces, na podlagi katerega pride do anevploidije v celicah ali 
organizmih zaradi reagiranja z elementi mitoti čnega in meoti čnega cikla delitve 
celic (angl. „aneugen“, op. prev.).  
Anevploidija:  odstopanje od normalnega diploidnega (ali haploidnega) števila 
kromosomov z enim kromosomom ali ve č kot enim kromosomov, vendar ne s 
celotno skupino ali skupinami kromosomov (poliploidija).  
Apoptoza:  programirana celi čna smrt, za katero je zna čilna vrsta korakov, ki 
vodijo k razgradnji celic v delce, vezane na membrano, ki se nato odstranijo s fagocitozo ali osipanjem.  
Množenje celic:  povečanje števila celic zaradi mitoti čne delitve celic.  
Centromera:  mesto na kromosomu, kjer sta spojeni obe kromatidi in na katerem 
sta na obeh straneh pritrjeni obe kinetohori.  
Klastogen:  snov ali proces, ki v populacijah celic ali organizmih povzro ča struk­
turne poškodbe kromosomov (angl. „clastogen“, op. prev.).  
Citokineza:  proces delitve celic, ki sledi takoj po mitozi in vpliva na oblikovanje 
dveh hčerinskih celic, ki imata vsaka eno samo jedro.  
Indeks množenja citokinetskega bloka (CBPI):  delež celic, pri katerih se je 
izvedla druga delitev, v tretirani populaciji glede na netretirano kontrolo (glej 
Dodatek 2 za formulo).  
Citostaza:  zaviranje rasti celic (glej Dodatek 2 za formulo).  
Citotoksičnost:  škodljivi u činki na celi čno strukturo ali delovanje, ki na koncu 
povzročijo smrt celice.  
Genotoksi čno: splošni izraz, ki zajema vse poškodbe DNA ali kromosomov, 
vključno s prelomi, prerazporeditvijo aduktov, mutacijami, aberacijami kromo ­
somov in anevploidijo. Vsi genotoksi čni učinki ne vplivajo na nastanek mutacij 
ali trajno poškodbo kromosomov.  
Interfazne celice:  celice, ki niso v fazi mitoze.  
Kinetohora:  struktura s proteinom, ki nastane na centromeri kromosoma in na 
katero se pripnejo niti delitvenega vretena med delitvijo celice, kar omogo ča 
pravilno gibanje h čerinskih kromosomov proti poloma h čerinskih celic.  
Mikronukleusi:
 majhna jedra, poleg glavnega jedra celic in lo čena od njega, ki 
nastanejo med telofazo mitoze ali mejoze iz zaostalih fragmentov kromosomov 
ali celih kromosomov.  
Mitoza:  delitev celi čnega jedra, ki je obi čajno razdeljena na profazo, prometa ­
fazo, metafazo, anafazo in telofazo.  
Mitotični indeks:  razmerje med številom celic v metafazi in skupnim številom 
celic v opazovani populaciji celic; pokazatelj stopnje množenja celic te popula ­
cije. 
Mutageno:  povzroči dedno spremembo zaporedij baznih parov DNA v genih ali 
strukturi kromosomov (kromosomske aberacije).  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 726
 
Nerazdvajanje:  par kromatid se ne razdvoji in ustrezno lo či v razvijajo če se 
hčerinske celice, zaradi česar imata h čerinski celici nenormalno število kromo ­
somov.  
Poliploidija:  številčne kromosomske aberacije v celicah ali organizmih, ki ne 
vplivajo na posamezen kromosom ali kromosome (anevploidija), ampak na vse kromosome.  
Indeks množenja (PI):  metoda za merjenje citotoksi čnosti v primerih, ko citoha ­
lazin B ni dodan (glej Dodatek 2 za formulo).  
Relativno pove čanje števila celic (RICC):  metoda za merjenje citotoksi čnosti v 
primerih, ko citohalazin B ni dodan (glej Dodatek 2 za formulo).  
Relativna podvojitev populacije (RPD):  metoda za merjenje citotoksi čnosti v 
primerih, ko citohalazin B ni dodan (glej Dodatek 2 za formulo).  
Indeks pomnoževanja (RI):  razmerje ciklov celi čne delitve v tretirani kulturi 
glede na netretirano kulturo, med obdobjem izpostavljenosti in obnavljanja 
(glej Dodatek 2 za formulo).  
Preskusna kemikalija (imenovana tudi preskusna snov):  katera koli snov ali 
zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 727
 
Dodatek 2  
Formule za ocenjevanje citotoksi čnosti  
1. Ko je uporabljen citohalazin B , ocena citotoksi čnosti temelji na indeksu 
množenja citokinetskega bloka (CBPI) ali indeksu pomnoževanja (RI) (16) (58). 
CBPI kaže povpre čno število celi čnih ciklov na celico med obdobjem izposta ­
vljenosti citohalazinu B in se lahko uporabi za izra čun množenja celic. RI kaže 
relativno število jeder v tretiranih kulturah v primerjavi s kontrolnimi kulturami 
in se lahko uporabi za izra čun % citostaze: 
% citostaze = 100 – 100{(CBPI  T – 1) ÷ (CBPI  C – 1)} 
in: 
T = kultura, tretirana s preskusno kemikalijo C = kontrolna kultura z nosilcem 
pri čemer je: 
CBPI ¼
 ððšt: celic z enim jedrom Þ þ ð2 Ü št: celic z dvema jedroma Þ þ ð3 Ü št: celic z enim jedrom ÞÞ 
ðskupno število celic Þ 
Tako je CPBI z vrednostjo 1 (vse celice imajo eno jedro) enak 100-odstotni 
citostazi. 
Citostaza = 100 – RI 
RI ¼ ððšt: celic z dvema jedroma Þ þ ð2 Ü št: celic z ve č jedriÞÞ ö ðskupno število celic Þ T 
ððšt: celic z dvema jedroma Þ þ ð2 Ü št: celic z ve č jedriÞÞ ö ðskupno število celic Þ C Ü 100 
T = tretirane kulture 
C = kontrolne kulture 
2. Zato RI s 53 % pomeni, da se je v primerjavi s številom celic, ki so se 
delile v kontrolni kulturi in oblikovale celice z dvema jedroma in ve č jedri, v 
tretirani kulturi delilo samo 53 % tega števila celic, tj. 47-odstotna citostaza. 
3. Ko citohalazin B ni uporabljen , se priporo ča ocena cititoksi čnosti na 
podlagi relativnega pove čanja števila celic (RICC) ali relativne podvojitve 
populacije (RPD) (58), saj obe metodi upoštevata delež celi čne populacije, ki 
se je delil. 
RICC ¼ ðpovečanje števila celic v tretiranih kulturah  ðkončno – začetnoÞÞ 
ðpovečanje števila celic v kontrolnih kulturah  ðkončno – začetnoÞÞ Ü 100 
RPD ¼ ðšt: podvajanj populacije v tretiranih kulturah Þ 
ðšt: podvajanj populacije v kontrolnih kulturah Þ Ü 100 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 728
 
pri čemer je: 
podvajanje populacije = [log (število celic po obdelavi ÷ prvotno število celic)] ÷ 
log 2 
4. Zato RICC ali RPD s 53 % kaže na 47-odstotno citotoksi čnost/citostazo. 
5. Z uporabo indeksa množenja (PI) se lahko citotoksi čnost oceni s pomo čjo 
štetja števila klonov, ki jih sestavljajo 1 celica (cl1), 2 celici (cl2), 3 do 4 celice (cl4) in 5 do 8 celic (cl8). 
PI ¼
 ðð1 Ü cl1Þ þ ð2 Ü cl2Þ þ ð3 Ü cl4Þ þ ð4 Ü cl8ÞÞ 
ðcl1 þ cl2 þ cl4 þ cl8Þ 
6. PI se kot koristen in zanesljiv parameter citotoksi čnosti uporablja tudi za 
celične linije, kultivirane  in situ  brez dodanega citohalazina B (25) (26) (27) (28).  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 729
 
Dodatek 3  
Referenčne kemikalije, priporo čene za ocenjevanje u činkovitosti  ( 1 ) 
Kategorija Kemikalija št. CAS Št. EC  
1. Klastogeni, aktivni brez aktivacije presnove 
Citozin-arabinozid 147-94-4 205-705-9 Mitomicin C 50-07-7 200-008-6 
2. Klastogeni, ki zahtevajo aktivacijo presnove 
Benzo(a)piren 50-32-8 200-028-5 
Ciklofosfamid 50-18-0 200-015-4 
3. Anevgeni 
Kolhicin 64-86-8 200-598-5 Vinblastin 143-67-9 205-606-0 
4. Negativne snovi 
Di(2-etilheksil)ftalat 117-81-7 204-211-0 
Nalidinska kislina 389-08-2 206-864-7 Piren 129-00-0 204-927-3 Natrijev klorid 7647-14-5 231-598-3
 
( 1 ) Referen čne kemikalije so kemikalije, priporo čene za uporabo. Nadomestne ali dodatne kemikalije se lahko dodajo na seznam 
referenčnih kemikalij, če je njihovo delovanje znano, če spodbujajo tvorbo mikronukleusov z enakimi mehanizmi delovanja in če se 
zanje izkaže, da so pomembne v zvezi s kemikalijami, ki se bodo preskušale z uporabo postopka analize mikronukleusov  in vitro . 
Odvisno od namena bi lahko utemeljitev obsegala validacijsko študijo, pri kateri so uporabljene številne razli čne snovi, oziroma 
študijo, osredoto čeno na ožji spekter, ki temelji na kemijskem razredu preskusne snovi ali mehanizmu škode, ki se ga preu čuje. ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 730
 
B.50.  PREOB ČUTLJIVOST KOŽE: LOKALNA ANALIZA BEZGAVK: DA  
UVOD 
1. Smernice OECD za preskušanje kemikalij in preskusne metode EU se redno 
preverjajo zaradi znanstvenega napredka, spreminjajo čih se zakonodajnih 
potreb in vprašanj, povezanih z dobrim po čutjem živali. Prva preskusna 
metoda (B.42) za dolo čanje preob čutljivosti kože pri miši, lokalna analiza 
bezgavk (LLNA; Smernica za preskušanje OECD 429) je bila že preverjena 
(1). Objavljene so podrobnosti o validaciji LLNA in pregled s tem poveza ­
nega dela (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Pri LLNA se za merjenje množenja limfocitov uporablja radioizotopni timidin ali jod, zato je lahko uporaba 
analize omejena v primerih, kjer je pridobitev, uporaba ali odstranitev 
radioaktivnosti težavna. LLNA, DA (razvil jo je Daicel Chemical Industries, Ltd) je neradioaktivna razli čica LLNA, ki koli činsko opredeljuje vsebnost 
adenozin-trifosfata (ATP) s pomo čjo bioluminescence kot pokazatelja 
množenja limfocitov. Preskusno metodo LNNA: DA je validirala in pregle ­
dala mednarodna strokovna skupina za ocenjevanje ter jo priporo čila kot 
koristno za opredelitev kemikalij, ki povzro čajo preob čutljivost, in kemika ­
lij, ki je ne povzro čajo, z nekaterimi omejitvami (10) (11) (12) (13). Ta 
preskusna metoda je zasnovana za ocenjevanje morebitne preob čutljivosti 
kože s kemikalijami (snovmi in zmesmi) pri živalih. Poglavje B.6 te priloge in Smernica za preskušanje OECD 406 uporabljata preskuse na morskih prašičkih, predvsem maksimizacijski in Buehlerjev preskus na morskih 
prašičkih (14). LLNA (poglavje B.42 te priloge; Smernica za preskušanje 
OECD 429) in dve spremembi, pri katerih se radioaktivnost ne uporablja, analiza LLNA: DA (poglavje B.50 te priloge; Smernica za preskušanje OECD 442 A) in LLNA: BrdU-ELISA (poglavje B.51 te priloge; Smernica 
za preskušanje OECD 442 B) zaradi manj pogoste in izpopolnjene uporabe 
živali zagotavljajo prednost v primerjavi s preskusi na morskih praši čkih iz 
metode B.6 in Smernica za preskušanje OECD 406 (14). 
2. Podobno kot LLNA tudi LLNA: DA preu čuje indukcijsko fazo preob čut­
ljivosti kože in zagotavlja koli činske podatke, ki so primerni za oceno 
odziva na odmerek. Ker odkriva povzro čitelje preob čutljivosti, ne da bi 
bilo pri tem treba uporabiti radioaktivni ozna čevalec za DNA, se ne poja ­
vljajo vprašanja glede poklicne izpostavljenosti radioaktivnosti in odstranje ­
vanja odpadkov. Zaradi tega bo za odkrivanje povzro čiteljev preob čutljivosti 
morda mogo ča pogostejša uporaba miši, zaradi česar bi se lahko še bolj 
zmanjšala uporaba morskih praši čkov za preskušanje morebitne preob čut­
ljivosti kože (tj. B.6; Smernica za preskušanje OECD 406) (14).
 
OPREDELITVE POJMOV 
3. Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1.  
ZAČETNI POMISLEKI IN OMEJITVE 
4. Analiza LLNA: DA je spremenjena metoda LLNA za ugotavljanje more ­
bitne preob čutljivosti kože s kemikalijami, s posebnimi omejitvami. Ni 
nujno, da to pomeni, da je treba v vseh primerih namesto preskusov na 
morskih praši čkih in LLNA (tj. B.6; Smernica za preskušanje OECD 406) 
(14), uporabiti analizo LLNA: DA, temve č da je ta analiza enakovredna in 
se lahko uporabi kot druga možnost, pri kateri obi čajno niso ve č potrebne 
dodatne potrditve pozitivnih in negativnih rezultatov (10) (11). Preskuše ­
valni laboratorij mora pred za četkom opravljanja študije upoštevati vse 
razpoložljive informacije o preskusni snovi. Takšne informacije bodo  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 731
 
vključevale vrsto in kemijsko sestavo preskusne snovi; njene 
fizikalno-kemijske lastnosti; rezultate katerih koli drugih preskusov toksi ­ 
čnosti na preskusni snovi,  in vitro  ali in vivo ; in toksikološke podatke o 
strukturno sorodnih kemikalijah. Te informacije je treba upoštevati, da se določi, ali je metoda LLNA: DA primerna za preskusno snov (glede na 
nezdružljivost omejenega števila vrst kemikalij z analizo LLNA: DA [glej 
odstavek 5] in za lažjo izbiro odmerka. 
5. Analiza LLNA: DA je metoda  in vivo  in posledi čno ne odpravlja uporabe 
živali pri ocenjevanju delovanj, ki povzro čajo alergijsko preob čutljivost ob 
stiku. Vendar ima možnost, da v primerjavi s preskusi na morskih praši čkih 
(B.6; Smernica za preskušanje OECD 406) (14) zmanjša število živali, potrebnih v ta namen. Poleg tega nudi analiza LLNA: DA znatno izboljšanje (manj bole čine in trpljenja) na čina, kako se živali uporabljajo za preskušanje 
alergijske preob čutljivosti ob stiku, saj v nasprotju z metodo B.6 in Smer ­
nico za preskušanje 406 ne zahteva, da se povzro čijo izzvane reakcije 
prekomerne ob čutljivosti kože. Kljub prednostim analize LLNA: DA v 
primerjavi z metodo B.6 in Smernico za preskušanje OECD 406 (14), 
obstajajo nekatere omejitve, zaradi katerih je lahko nujna uporaba metode 
B.6 ali Smernice za preskušanje OECD 406 (npr. preskušanje dolo čenih 
kovin, lažni pozitivni rezultati pri nekaterih dražilnih snoveh za kožo [kot 
so nekatere vrste površinsko razgradljivih kemikalij] (6) (1 in poglavje B.42 
te priloge), topnost preskusne snovi). Poleg tega je zaradi kemijskih razredov ali snovi s funkcionalnimi skupinami, za katere se je izkazalo, da lahko delujejo kot mote či dejavniki (16), lahko potrebna uporaba 
preskusov na morskih praši čkih (tj. B.6; Smernica za preskušanje OECD 
406 (14)). Za omejitve, dolo čene za LLNA (1 in poglavje B.42 te priloge), 
je bilo priporo čeno, da se uporabljajo tudi za analizo LLNA: DA (10). Poleg 
tega uporaba analize LLNA: DA morda ni primerna za uporabo snovi, ki 
vplivajo na ravni adenozin-trifosfata (ATP) (npr. snovi, ki delujejo kot 
inhibitorji ATP), ali snovi, ki vplivajo na natan čno merjenje ATP v celicah 
(npr. prisotnost encimov, ki razgrajujejo ATP, prisotnost zunajceli čne ATP v 
bezgavki). Razen takšnih dolo čenih omejitev bi morala biti analiza LLNA: 
DA primerna za preskušanje katere koli snovi, razen če so s temi snovmi 
povezane lastnosti, ki lahko ovirajo natan čnost analize LLNA: DA. Poleg 
tega je treba razmisliti o možnosti mejnih pozitivnih rezultatov v primerih, ko so dobljene vrednosti stimulacijskega indeksa (SI) med 1,8 in 2,5 (glej 
odstavke 31–32). To temelji na podatkovni zbirki za validacijo s 44 snovmi 
s stimulacijskim indeksom ≥ 1,8 (glej odstavek 6), pri kateri je analiza 
LLNA: DA pravilno opredelila vseh 32 povzro čiteljev preob čutljivosti pri 
LLNA, vendar je nepravilno opredelila tri od 12 snovi, ki pri LLNA ne 
povzročajo preob čutljivosti z vrednostmi stimulacijskega indeksa med 1,8 in 
2,5 (tj. mejno pozitivna vrednost) (10). Ker pa je bil za dolo čanje vrednosti 
stimulacijskega indeksa in izra čun predvidljivih lastnosti preskusa upora ­
bljen isti nabor podatkov, so lahko navedeni rezultati pretirana ocena dejan ­
skih predvidljivih lastnosti.  
NAČELA METODE PRESKUŠANJA 
6. Osnovno na čelo, na katerem temelji analiza LLNA: DA, je, da povzro čitelji 
preobčutljivosti povzro čijo množenje limfocitov v bezgavkah, ki drenirajo 
območje nanosa preskusne snovi. To množenje je sorazmerno z odmerkom 
in močjo uporabljenega alergena in je preprosto sredstvo za doseganje koli ­ 
činske izmere preob čutljivosti. Množenje se izmeri s primerjavo povpre ­ 
čnega množenja v vsaki preskusni skupini in povpre čnega množenja v 
kontrolni skupini, tretirani z nosilcem. Dolo či se razmerje med povpre čnim 
množenjem v vsaki tretirani skupini in povpre čnim množenjem v primerjalni 
kontrolni skupini z nosilcem, ki se imenuje stimulacijski indeks (SI) in mora biti ≥ 1,8, preden je nadaljnje ocenjevanje preskusne snovi kot možnega 
povzročitelja preob čutljivosti kože utemeljeno. Opisani postopki temeljijo na 
merjenju vsebnosti ATP z bioluminiscenco (za katero je znano, da se ujema
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 732
 
s številom živih celic) (17), ki pokaže pove čano število množe čih se celic v 
ušesnih bezgavkah (18) (19). Metoda z bioluminiscenco izkoriš ča encim 
luciferaze za kataliziranje nastanka svetlobe iz ATP in luciferin v skladu z naslednjo reakcijo:  
ATP + Luciferin  + O
 2
 Oxyluciferin  + AMP  + PP  i + CO  2 
+ Light  
Oddana osvetljenost je linearno povezana s koncentracijo ATP in se meri z 
luminometrom. Analiza reakcije med luciferinom in luciferazo je ob čutljiva 
metoda za koli činsko opredelitev ATP, ki se uporablja na številne na čine 
(20).  
OPIS ANALIZE  
Izbira živalskih vrst  
7. Izbrana vrsta za ta preskus je miš. Validacijske študije za analizo LLNA: 
DA so bile izvedene samo s sevom CBA/J, ki je zato priporo čeni sev (12) 
(13). Uporabijo se mlade odrasle mišje samice, ki še niso kotile in niso breje. Na za četku študije morajo biti živali stare 8–12 tednov, odstopanje 
mase živali pa mora biti čim manjše in ne sme presegati 20 % povpre čne 
mase. Namesto tega se lahko uporabi druge seve in samce, ko je dobljenih 
dovolj podatkov za prikaz, da ne obstajajo zna čilne razlike v odzivu pri 
analizi LLNA: DA glede na sev in/ali spol.
 
Bivalni in prehranjevalni pogoji  
8. Miši morajo biti skupinsko nastanjene (21), razen če je zagotovljena 
ustrezna znanstvena utemeljitev za njihovo lo čeno nastanitev. Temperatura 
v prostoru za poskusne živali mora biti 22 ± 3 °C. Čeprav mora biti 
relativna vlažnost najmanj 30 % in po možnosti ne sme presegati 70 %, mora biti ciljna vlažnost, razen med čiščenjem prostora, 50 do 60 %. Osvet ­
litev naj bo umetna, in sicer 12 ur svetlobe, 12 ur teme. Za hranjenje se 
lahko uporablja konvencionalna laboratorijska prehrana z neomejeno oskrbo 
s pitno vodo.
 
Priprava živali  
9. Živali se naklju čno izberejo, ozna čijo tako, da je omogo čeno posami čno 
prepoznavanje (vendar ne s katero od oblik ušesnih oznak), in zadržijo v 
kletkah najmanj pet dni pred za četkom dajanja odmerka, da se lahko prila ­
godijo laboratorijskim razmeram. Pred za četkom tretiranja se vse živali 
pregledajo, da se zagotovi, da nimajo opaznih kožnih lezij.  
Priprava preskusnih raztopin  
10. Trdne kemikalije se pred nanosom na uho miši raztopijo ali suspendirajo v 
ustreznih topilih ali nosilcih in po potrebi razred čijo. Teko če kemikalije se 
lahko nanesejo nerazred čene ali pa se razred čijo pred dajanjem odmerka. Pri 
netopnih kemikalijah, kot so tiste, ki se obi čajno uporabljajo v medicinskih 
pripomočkih, je treba uporabiti mo čno povečano ekstrakcijo v ustreznem 
topilu, da se odkrije vse ekstraktibilne sestavine za preskušanje pred 
nanosom na uho miši. Preskusne snovi je treba pripravljati dnevno, razen 
če podatki o stabilnosti kažejo, da je shranjevanje sprejemljivo.  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 733
 
Preverjanje zanesljivosti  
11. Za prikaz ustrezne u činkovitosti analize se uporabijo kemikalije pozitivne 
kontrole, ki se odzovejo z ustrezno in ponovljivo ob čutljivostjo kot 
preskusna snov, ki povzro ča preobčutljivost, za katero je stopnja reakcije 
natančno opredeljena. Uporaba primerjalne pozitivne kontrole je priporo ­ 
čena, saj pokaže zmožnost laboratorija, da uspešno izvede vsako analizo, 
ter omogo ča ocenjevanje ponovljivosti in primerljivosti v enem ali ve č 
laboratorijih. Tudi nekateri regulativni organi zahtevajo uporabo pozitivne kontrole pri vsaki raziskavi, zato se uporabnikom priporo ča, da se pred 
izvedbo analize LLNA: DA posvetujejo s pristojnimi organi. V skladu s 
tem se priporo ča redna uporaba primerjalne pozitivne kontrole, saj tako ni 
potrebno dodatno preskušanje na živalih za izpolnitev zahtev, ki se lahko pojavijo zaradi uporabe redne pozitivne kontrole (glej odstavek 12). Pozi ­
tivna kontrola mora povzro čiti pozitiven odziv analize LLNA: DA na raven 
izpostavljenosti, za katero se pri čakuje, da bo dala ve čji stimulacijski 
indeks (SI) > 1,8 kot negativna kontrolna skupina. Odmerek pozitivne kontrole je treba izbrati tako, da ne povzro či čezmernega draženja kože 
ali sistemske toksi čnosti in da je indukcija ponovljiva, vendar ne čezmerna 
(tj. SI > 10 bi se štel za čezmernega) Priporo čena pozitivna kontrola je 25- 
odstotni heksil cimetov aldehid (Služba za izmenjavo kemijskih izvle čkov 
[CAS] št. 101-86-0) in 25-odstotni evgenol (št. CAS 97-53-0) v acetonu: olivnem olju (4:1, v/v). V nekaterih okoliš činah se lahko ob ustrezni uteme ­
ljitvi uporabijo druge pozitivne kontrole, ki izpolnjujejo zgornja merila. 
12. Običajno je uporaba pozitivne kontrolne skupine priporo čena, lahko pa 
obstajajo okoliš čine, v katerih redno preskušanje (tj. v razmikih ≤ 6 mese­
cev) pozitivne kontrole morda zadoš ča za laboratorije, ki redno izvajajo 
analizo LLNA: DA (tj. izvajajo analizo LLNA: DA vsaj enkrat mese čno) 
in imajo vzpostavljeno zbirko podatkov o preteklih pozitivnih kontrolah, ki 
dokazujejo zmožnost laboratorija, da pridobi ponovljive in natan čne rezul­
tate s pozitivnimi kontrolami. Ustrezna strokovnost pri izvajanju analize LLNA: DA se lahko uspešno dokaže z dobivanjem doslednih pozitivnih 
rezultatov s pozitivno kontrolo pri vsaj desetih neodvisnih preskusih, izve ­
denih v razumnem časovnem obdobju (tj. v manj kot enem letu). 
13. Primerjalno pozitivno kontrolno skupino je treba vklju čiti vedno, kadar pride 
do postopkovne spremembe pri analizi LLNA: DA (tj. zamenjava usposo ­
bljenega osebja, zamenjava materiala za preskusno metodo in/ali reagentov, 
zamenjava opreme za preskusno metodo, zamenjava vira preskusnih živali), 
takšne spremembe pa je treba vedno zabeležiti v laboratorijskih poro čilih. 
Pri odločanju o nujnosti vzpostavitve nove zbirke preteklih podatkov za 
beleženje doslednosti pri rezultatih pozitivne kontrole je treba upoštevati 
učinek, ki ga imajo te spremembe na ustreznost predhodno vzpostavljene 
zbirke preteklih podatkov. 
14. Raziskovalci se morajo zavedati, da odlo čitev o izvajanju redne namesto 
primerjalne pozitivne kontrolne študije vpliva na ustreznost in sprejemljivost negativnih rezultatov študije, pridobljenih brez primerjalne pozitivne kontrole v razmiku med rednimi pozitivnimi kontrolnimi študijami. Na 
primer, če je rezultat, pridobljen z redno pozitivno kontrolno študijo, 
lažno negativen, so lahko vprašljivi negativni rezultati preskusne snovi, pridobljeni v času med zadnjo sprejemljivo redno pozitivno kontrolno 
študijo in nesprejemljivo redno pozitivno kontrolno študijo. Pri odlo čanju, 
ali vključiti primerjalne pozitivne kontrole ali izvajati samo redne pozitivne 
kontrole, je treba skrbno preu čiti posledice teh rezultatov. Treba je razmisliti 
tudi o uporabi manjšega števila živali v primerjalni pozitivni kontrolni skupini, če je to znanstveno utemeljeno in če laboratorij na podlagi preteklih 
podatkov, zna čilnih za laboratorij, dokaže, da se lahko uporabi manjše 
število miši (22).
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 734
 
15. Čeprav je treba pozitivno kontrolo preskusiti v nosilcu, za katerega je znano, 
da povzro ča dosleden odziv (npr. aceton: olivno olje; 4:1, v/v), lahko obsta ­
jajo nekatere zakonodajne okoliš čine, ko je potrebno tudi preskušanje v 
nestandardnem nosilcu (klini čno/kemično ustrezne sestave) (23). Če se 
primerjalna pozitivna kontrola preskuša v drugem nosilcu kot preskusna 
snov, je treba za primerjalno pozitivno kontrolo vklju čiti ločen kontrolni 
nosilec. 
16. V primerih, kjer se ocenjujejo snovi za poseben kemijski razred ali razpon 
reakcij, so lahko primerjalne snovi uporabne tudi za dokaz, da preskusna metoda deluje pravilno za odkrivanje morebitne preob čutljivosti kože pri teh 
vrstah snovi. Ustrezne primerjalne snovi morajo imeti naslednje lastnosti: 
— strukturno in funkcijsko podobnost z razredom preskusne snovi, ki se 
preskuša, 
— znane fizikalno-kemijske lastnosti; 
— podporne podatke iz analiz LLNA: DA; 
— podporne podatke od drugih živalskih modelov in/ali ljudi.
 
PRESKUSNI POSTOPEK  
Število živali in velikost odmerkov  
17. Na skupino odmerka se uporabijo najmanj štiri živali z najmanj tremi 
koncentracijami preskusne snovi, poleg tega pa še primerjalna negativna 
kontrolna skupina, tretirana zgolj z nosilcem za preskusno snov, in pozitivna 
kontrola (primerjalna ali izvedena pred kratkim, odvisno od politike labora ­
torija pri upoštevanju odstavkov 11–15). Treba je razmisliti o preskušanju več odmerkov pozitivne kontrole, zlasti če se pozitivna kontrola preskuša 
občasno. Živali v kontrolnih skupinah je treba, razen če se ne tretirajo s 
preskusno snovjo, obravnavati in tretirati na enak na čin kot živali v treti ­
ranih skupinah. 
18. Izbira odmerka in nosilca mora temeljiti na priporo čilih iz sklicev (2) in 
(24). Zaporedni odmerki se obi čajno izberejo iz ustrezne serije koncentracij, 
kot so 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % itd. Izbira upora ­
bljene serije koncentracij mora biti ustrezno znanstveno utemeljena. Kadar so na voljo, je treba pri izbiri treh zaporednih koncentracij upoštevati vse 
obstoječe toksikološke informacije (npr. akutno toksi čnost in draženje kože) 
ter strukturne in fizikalno-kemijske informacije o želeni preskusni snovi (in/ali strukturno povezani snovi), tako da je pri najve čji koncentraciji izpo ­
stavljenost najve čja, hkrati pa ni sistemske toksi čnosti in/ali čezmernega 
draženja kože (24) (25). Če takšne informacije niso na voljo, je morda 
najprej potreben predhodni presejalni preskus (glej odstavke 21–24). 
19. Nosilec ne sme ovirati rezultatov preskusa ali vplivati nanje, izbere pa se na 
podlagi pove čevanja topnosti, da se med pripravljanjem raztopine/suspen ­
zije, ki je primerna za uporabo preskusne snov, pridobi najve čjo možno 
koncentracijo. Priporo čljivi nosilci so aceton: olivno olje (4:1, v/v), N,N- 
dimetilformamid, metil etil keton, propilen glikol in dimetil sulfoksid (6), vendar se lahko uporabljajo tudi drugi, če je zagotovljena ustrezna znan ­
stvena utemeljitev. V nekaterih okoliš činah je morda treba kot dodatno 
kontrolo uporabiti klini čno ustrezno topilo ali trgovsko sestavo, v kateri 
se trži preskusna snov. Paziti je treba zlasti, da so v nosilni sistem vklju čene 
hidrofilne snovi, ki vlažijo kožo in se ne izsušijo takoj, z vklju čitvijo 
ustreznih pospeševalcev raztapljanja (npr. 1-odstotnim Pluronic® L92). 
Zato se je treba izogibati povsem vodenim nosilcem.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 735
 
20. Obdelava bezgavk posamezne miši omogo ča oceno spremenljivosti med 
posameznimi živalmi ter statisti čno primerjavo razlik med meritvami 
preskusne snovi in primerjalne kontrolne skupine z nosilcem (glej odstavek 33). Poleg tega je ocena možnosti zmanjšanja števila miši v pozitivni kontrolni skupini izvedljiva samo, če se zbirajo podatki o posameznih 
živalih (22). Poleg tega nekateri regulativni organi zahtevajo zbiranje poda ­
tkov o posameznih živalih. Redno zbiranje podatkov o posameznih živalih zagotavlja prednosti glede dobrega po čutja živali, saj se s tem prepre či 
dvojno preskušanje, ki bi bilo potrebno, če bi bilo treba rezultate, prvotno 
zbrane na en na čin (npr. preko združenih podatkov o živalih) zaradi drugih 
zahtev regulativnih organov (npr. glede podatkov o posameznih živalih) kasneje ponovno preu čiti.
 
Predhodni presejalni preskus  
21. Če informacije za dolo čitev najve čjega odmerka za preskušanje niso na 
voljo (glej odstavek 18), je treba izvesti predhodni presejalni preskus, da 
se določi ustrezna velikost odmerka za preskušanje z analizo LLNA: DA. 
Namen predhodnega presejalnega preskusa je zagotoviti smernice za izbiro največje velikosti odmerka za uporabo v glavni študiji analize LLNA: DA v 
primerih, ko ni na voljo informacij o koncentraciji, ki povzro či sistemsko 
toksičnost (glej odstavek 24) in/ali čezmerno draženje kože (glej odstavek 
23). Najve čja velikost odmerka je 100-odstotna preskusna snov za teko čine 
ali najvišja možna koncentracija za trdne snovi ali suspenzije. 
22. Predhodni presejalni preskus se izvede v pogojih, ki so enaki tistim v glavni 
študiji analize LLNA: DA, s to razliko, da se ne izvede ocena množenja v bezgavkah in da se lahko uporabi manj živali na skupino odmerka. Predlaga 
se uporaba ene ali dveh živali na skupino odmerka. Vse miši se opazuje 
dnevno glede klini čnih znakov sistemske toksi čnosti ali lokalnega draženja 
na mestu nanosa. Telesna masa se zabeleži pred preskusom in pred usmrtit ­
vijo (8. dan). Obe ušesi vsake miši se opazuje glede rde čine in oceni s 
pomočjo preglednice 1 (25). Meritve debeline ušesa se izvedejo z napravo 
za merjenje debeline (npr. digitalnim mikrometrom ali merilnikom debeline s številčnico) 1. dan (pred odmerkom), 3. dan (približno 48 ur pred prvim 
odmerkom), 7. dan (24 ur pred usmrtitvijo) in 8. dan. Poleg tega se lahko 8. 
dan debelino ušesa dolo či s preluknjanjem ušes za dolo čitev mase, ki se 
izvede po humani usmrtitvi živali. Znak za čezmerno draženje je rde čina z 
oceno ≥ 3 in/ali pove čana debelina ušesa za ≥ 25 % na kateri koli dan 
merjenja (26) in (27). Najve čji odmerek, izbran za glavno študijo analize 
LLNA: DA, je naslednji nižji odmerek v seriji koncentracij iz predhodnega 
presejalnega preskusa (glej odstavek 18), ki ne povzro či sistemske toksi ­ 
čnosti in/ali čezmernega draženja kože.
 
Preglednica 1  
Ocena rde čine 
Ugotovitev Ocena  
Rdečine ni 0 
Neznatna rde čina (komajda opazna) 1 
Zelo razlo čna rdečina 2  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 736
 
Ugotovitev Ocena  
Zmerna do mo čna rdečina 3 
Močna rdečina (rdečina rdeče pese) in nastanek krast ovirata razvrstitev 
rdečine 4 
23. Poleg 25-odstotnega pove čanja debeline ušesa (26) (27), se za opredelitev 
dražilnih snovi pri LLNA uporablja tudi statisti čno značilno pove čanje debe ­
line ušesa tretirane miši v primerjavi s kontrolno mišjo tako uporablja za opredelitev dražilnih snovi pri lokalni analizi bezgavk (28) (29) (30) (31) 
(32) (33) (34). Ker pa se lahko statisti čno značilno pove čanje pojavi tudi pri 
debelini ušesa, manjši od 25 %, ni izrecno povezano s čezmernim draženjem 
(30) (31) (32) (33) (34). 
24. Naslednje klini čne ugotovitve lahko nakazujejo sistemsko toksi čnost (35), 
kadar se uporabljajo kot del celovite ocene, in zato lahko pokažejo najve čjo 
velikost odmerka za uporabo v glavni analizi LLNA: DA: spremembe v delovanju živ čnega sistema (npr. piloerekcija, ataksija, tremorji in kr či); 
vedenjske spremembe (npr. agresivnost, spremembe glede nege, opazna 
sprememba ravni dejavnosti); spremembe dihanja (npr. spremembe 
frekvence in intenzivnosti dihanja kot so dispneja, zasoplost in hropenje) ter spremembe glede uživanja hrane in vode. Poleg tega je treba pri oceni upoštevati znake letargije in/ali neodzivnosti ter morebitne klini čne znake 
bolečine in trpljenja, ki niso samo blagi ali trenutni, ali zmanjšanje telesne 
mase za > 5 % od 1. do 8. dne ter smrtnost. Umirajo če živali ali živali, ki 
kažejo znake hudega in dolgotrajnega trpljenja, se usmrtijo na human na čin 
(36).
 
Načrt za poskus glavne študije  
25. Načrt za poskus analize je naslednji: 
— 1. dan:  Posamično ugotovljena in zabeležena masa vsake živali in 
morebitne klini čne ugotovitve. Nanos 1-odstotne vodne raztopine natri ­
jevega laurel sulfata (SLS) na vsak uhelj, s pomo čjo čopiča, namočenega 
v raztopino SLS, in premaz celotnega uhlja v štirih do petih potezah. Uro po obdelavi s SLS sledi nanos 25 μl ustrezno razred čene preskusne 
snovi, samega nosilca ali pozitivne kontrole (primerjalne ali izvedene 
pred kratkim, odvisno od politike laboratorija pri upoštevanju odstavkov 
11–15 na vsak uhelj. 
— 2., 3. in 7. dan:  Ponovi se postopek predhodne obdelave z 1-odstotno 
vodno raztopino SLS in nanosa preskusne snovi, ki je bil izveden 1. dan. 
— 4., 5. in 6. dan:  Brez tretiranja. 
— 8. dan:  Zabeleži se masa vsake živali in morebitne klini čne ugotovitve. 
Približno 24 do 30 ur po za četku nanašanja 7. dne se živali humano 
usmrti. Ušesne bezgavke ob vsakem ušesu miši se izrežejo in shranijo v 
fosfatni pufer s soljo (PBS) za vsako žival Podatki in diagrami o iden ­
tifikaciji in izrezu bezgavk so na voljo v sklicu (22). Za nadaljnje spremljanje odziva kože v glavni študiji se lahko v študijski protokol vključijo dodatni parametri, kot so ocena rde čine ušesa ali meritve debe ­
line ušesa (pridobljene z merilnikom debeline ali preluknjanjem ušes za 
določitev mase pri obdukciji).
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 737
 
Priprava celi čnih suspenzij  
26. Enotna celi čna suspenzija iz celic bilateralno izrezanih bezgavk vsake miši 
se pripravi tako, da se bezgavke namesti med dve objektni stekelci, ki se ju 
nežno stisne in tako zdrobi bezgavke. Po potrditvi, da se je tkivo na tanko razširilo, se stekelci povle četa narazen. Tkivo na obeh stekelcih se suspen ­
dira s fosfatnim pufrom s soljo tako, da se vsako stekelce drži pod kotom 
nad petrijevko in spira s PBS ter isto časno strga tkivo s stekelca. Bezgavke 
živali v negativni kontroli so majhne, zato je treba biti pazljiv, da ne pride do umetnega vpliva na vrednosti SI. Za spiranje obeh stekelc se uporabi skupno 1 ml PBS. Suspenzija iz celic bezgavk v petrijevki se narahlo zmeša 
s strgalom za celice. Nato se s mikropipeto zbere 20 μL alikvota suspenzije 
iz celic bezgavk, pri čemer je treba paziti, da se ne pobere membrana, vidna 
z očesom, in zmeša z 1,98 ml PBS, s čimer dobimo 2 ml vzorec. Z enakim 
postopkom se nato pripravi drugi 2 ml vzorec, tako da sta za vsako žival 
pripravljena dva vzorca.
 
Določitev množenja celic (merjenje vsebnosti adenozin-trifosfata (ATP) pri 
limfocitih)  
27. Pove čanje vsebnosti ATP v bezgavkah se meri z metodo luciferina/lucife ­
raze z uporabo kompleta za merjenje ATP, ki meri bioluminiscenco v rela ­
tivnih luminiscen čnih enotah (RLU). Čas analize od časa usmrtitve živali do 
merjenja vsebnosti ATP za vsako posamezno žival mora biti enak, in sicer 
približno 30 minut, ker se vsebnost ATP po usmrtitvi živali postopoma 
zmanjšuje (12). Zato mora biti serija postopkov od izreza ušesnih bezgavk do merjenja ATP izvedena v 20 minutah z vnaprej dolo čenim časovnim 
razporedom, ki je enak za vsako žival. Luminiscenca ATP se izmeri v 
vsakem 2 ml vzorcu, tako da se za vsako žival pridobi dve meritvi ATP. 
Nato se dolo či povprečna luminiscenca ATP, ki se uporabi pri nadaljnjih 
izračunih (glej odstavek 30).
 
OPAZOVANJA  
Klinična opazovanja  
28. Vsako miš je treba vsaj enkrat dnevno natan čno opazovati glede klini čnih 
znakov, lokalnega draženja na mestu nanosa ali sistemske toksi čnosti. Vsa 
opazovanja se sistemati čno zabeležijo v evidence, ki se vodijo za vsako miš. 
Načrt spremljanja vklju čuje merila za hitro identifikacijo miši, ki izražajo 
sistemsko toksi čnost, čezmerno draženje kože ali jedkost za kožo zaradi 
evtanazije (36).  
Telesna masa  
29. Kot je navedeno v odstavku 25 se telesna masa posameznih živali izmeri na 
začetku preskusa in ob predvideni humani usmrtitvi.  
IZRAČUN REZULTATOV 
30. Rezultati za vsako tretirano skupino so izraženi kot povpre čni stimulacijski 
indeks (SI). SI se dobi tako, da se povpre čno število relativne luminiscen čne 
enote/miš v vsaki skupini preskusne snovi in v pozitivni kontrolni skupini deli s povpre čnim številom relativne luminiscen čne enote/miš za kontrolno 
skupino s topilom/nosilcem. Povpre čni stimulacijski indeks za kontrolne 
skupine z nosilcem je potem 1.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 738
 
31. Rezultat se šteje za pozitivnega, če je SI ≥ 1,8 (10). Vendar se lahko pri 
odločanju, ali je mejni rezultat pozitiven (tj. vrednost SI med 1,8 in 2,5), 
uporabijo tudi mo č odziva na odmerek, statisti čni pomen ter doslednost 
odzivov v topilu/nosilcu in pozitivni kontroli (2) (3) (37). 
32. Pri mejnem pozitivnem odzivu s SI med 1,8 in 2,5 bodo uporabniki morda 
za potrditev, da so takšni rezultati pozitivni, poleg vrednostih SI upoštevali 
tudi moč odziva na odmerek, dokaze o sistemski toksi čnosti ali statisti čni 
pomen (10). Upoštevati je treba tudi razli čne lastnosti preskusne snovi, 
vključno s strukturno podobnostjo z znanimi povzro čitelji preob čutljivosti, 
povzročanjem čezmernega lokalnega draženja kože pri miši ter naravo 
opaženega odnosa med odmerkom in odzivom. Ti in drugi razlogi so podrobno obdelani drugje (4). 
33. Zbiranje podatkov na ravni posamezne miši bo omogo čilo statisti čno analizo 
prisotnosti in stopnje odnosa med odmerkom in odzivom v podatkih. More ­
bitna statisti čna ocena lahko vklju čuje oceno odnosa med odmerkom in 
odzivom ter ustrezno prilagojene primerjave preskusnih skupin (npr. skupina, ki je prejela odmerek v parih, proti primerjavam primerjalnih 
kontrolnih skupin s topilom/nosilcem). Statisti čna analiza lahko obsega 
npr. linearno regresijo ali Williamsov preskus za oceno nihanj odziva na odmerek in Dunnettov preskus za primerjave po parih. Pri izbiri ustrezne metode statisti čne analize se mora raziskovalec zavedati možnih neenakosti 
varianc in drugih sorodnih problemov, zaradi katerih je lahko nujna pret ­
vorba podatkov ali neparametrska statisti čna analiza. V vsakem primeru bo 
moral raziskovalec morda izvesti izra čune stimulacijskega indeksa in stati ­
stične analize s podatkovnimi to čkami (včasih imenovanimi „izlo čitve“) in 
brez njih.
 
PODATKI IN PORO ČANJE  
Podatki  
34. Podatki se povzamejo v obliki preglednice, ki prikazuje vrednosti relativne 
luminiscen čne enote za posamezno žival, skupinsko povpre čje relativne 
luminiscen čne enote/žival, s tem povezane napake (npr. SD, SEM) in 
povprečni SI za vsako skupino odmerka v primerjavi s primerjalno 
kontrolno skupino s topilom/nosilcem.  
Poročilo o preskusu  
35. Poro čilo o preskusu vsebuje naslednje informacije: 
preskusne in kontrolne kemikalije: 
— identifikacijske podatke (npr. številko CAS in številko EC, če je na 
voljo; vir; čistost; znane ne čistoče, številko serije), 
— fizikalno stanje in fizikalno-kemijske lastnosti (npr. hlapnost, stabilnost, 
topnost), 
— če je zmes, sestavo in relativne odstotke sestavin; 
topilo/nosilec: — identifikacijske podatke ( čistost, po potrebi koncentracijo, uporabljeno 
količino), 
— utemeljitev izbire uporabljenega nosilca;
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 739
 
preskusne živali: 
— vir miši seva CBA, — mikrobiološki status živali, če je znan, 
— število in starost živali, — vir živali, namestitvene pogoje, prehrano, itd.; preskusni pogoji: — vir, številko serije in podatke proizvajalca glede zagotavljanja kakovosti/ 
nadzora kakovosti kompleta za ATP, 
— podatke o pripravi in uporabi preskusne snovi, — utemeljitev izbire odmerka (vklju čno z rezultati predhodnega presejal ­
nega preskusa, če je bil izveden), 
— uporabljene koncentracije nosilca in preskusne snovi in skupno koli čino 
uporabljene preskusne snovi, 
— podatke o kakovosti hrane in vode (vklju čno z vrsto/virom prehranjeva ­
nja, virom vode), 
— podatke o programih tretiranja in vzor čenja, 
— metode merjenja toksi čnosti, 
— merila za obravnavanje študij kot pozitivnih ali negativnih, — podrobnosti o morebitnih odstopanjih protokola in pojasnilo, kako odsto ­
panje vpliva na zasnovo študije in njene rezultate; 
preverjanje zanesljivosti: — povzetek rezultatov zadnjega preverjanja zanesljivosti, vklju čno z infor ­
macijami o uporabljeni preskusni snovi, koncentraciji in nosilcu, 
— primerjalne in/ali pretekle pozitivne in primerjalne negativne (topilo/no ­
silec) kontrolne podatke za preskuševalni laboratorij, 
— če primerjalna pozitivna kontrola ni bila vklju čena, datum in laborato ­
rijsko poro čilo nazadnje izvedene redne pozitivne kontrole in poro čilo, 
ki navaja pretekle pozitivne kontrolne podatke za laboratorij, na podlagi 
katerih je upravi čeno neizvajanje primerjalne pozitivne kontrole; 
rezultati: — posamezne mase živali na za četku odmerjanja in ob predvideni usmrti ­
tvi; ter povpre čno in povezano napako (npr. SD, SEM) za vsako treti ­
rano skupino, 
— časovni potek za četka toksi čnosti in njenih znakov, vklju čno z morebi ­
tnim draženjem kože na mestu dajanja za vsako žival, 
— čas usmrtitve živali in čas merjenja ATP za vsako žival, 
— preglednico z vrednostmi relativne luminiscen čne enote in vrednostmi 
stimulacijskega indeksa za vsako tretirano skupino odmerka, 
— povpre čno in povezano napako (npr. SD, SPM) za relativno luminis ­
cenčno enoto/miš za vsako tretirano skupino,
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 740
 
— izračunan SI in ustrezno merilo spremenljivosti, ki upošteva spremen ­
ljivost med posameznimi živalmi tako v preskusni snovi kot kontrolnih 
skupinah, 
— odnos med odmerkom in odzivom, — po potrebi, statisti čne analize; 
razprava o rezultatih: — kratke pripombe o rezultatih, analizo odziva na odmerek in po potrebi 
statistične analize, s sklepom, ali naj se preskusna snov šteje za povzro ­ 
čitelja preob čutljivosti kože.
 
VIRI 
1. OECD (2010),  Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay , Test Guideline 
No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available 
at: http://www.oecd.org/env/testguidelines 
2. Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation.  Food Chem, Toxicol ., 34, 999-1002. 
3. Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests.  Food Chem, Toxicol ., 34, 985–997. 
4. Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests.  Food Chem. 
Toxicol. , 36, 327–333. 
5. Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: 
employement of a regression method that includes determination of uncer ­
tainty margins.  Toxicol ., 146, 49–59. 
6. ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the 
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative 
Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publi ­
cation No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Na voljo na spletni strani: 
http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf. 
7. Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel.  Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 258–273. 
8. Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency 
center for the evaluation of alternative toxicological methods.  Reg. Toxicol. 
Pharmacol. 34 , 274–286. 
9. Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process. Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 249–257. 
10. ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive 
local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd., based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH Publication No. 10- 7551A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental 
Health Sciences. Na voljo na spletni strani: http://iccvam.niehs.nih.gov/ 
methods/immunotox/llna-DA/TMER.htm.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 741
 
11. ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated 
validation status of new versions and applications of the murine local lymph 
node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Na voljo na spletni strani: 
http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf. 
12. Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. and Ito, M. (2008), Characterization 
and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint. J. Pharmacol. Toxicol. Meth. , 58, 1–10. 
13. Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, 
T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, 
T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. and Yuasa, A. (2008), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph node assay 
based on adenosine triphosphate measurement.  J. Pharmacol. Toxicol. Meth. , 
58, 11–26. 
14. OECD (1992),  Skin Sensitisation , Test Guideline No. 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals, OECD, Paris. Na voljo na spletni strani: 
http://www.oecd.org/env/testguidelines. 
15. Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as 
assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig 
maximization test (GPMT).  Food Chem. Toxicol ., 46, 1896–1904. 
16. Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, 
C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), 
Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensi ­
tisation datasets: implications for REACH.  Reg. Toxicol. Pharmacol ., 55, 
90–96. 
17. Crouch, S.P., Kozlowski, R., Slater, K.J. and Fletcher J. (1993), The use of 
ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.  
J. Immunol. Meth ., 160, 81–88. 
18. Ishizaka, A., Tono-oka, T. and Matsumoto, S. (1984), Evaluation of the 
proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP.  J. Immunol. Meth ., 72, 127–132. 
19. Dexter, S.J., Cámara, M., Davies, M. and Shakesheff, K.M. (2003), Deve ­
lopment of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacterial cell number from a mixed population.  Biomat. , 24, 27–34. 
20. Lundin A. (2000), Use of firefly luciferase in ATP-related assays of biomass, 
enzymes, and metabolites.  Meth. Enzymol ., 305, 346–370. 
21. ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the 
Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press. 
22. ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle 
Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. Na voljo na spletni strani: http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/ LLNAPerfStds.pdf. 
23. McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH.  Toxicol ., 238, 71–89. 
24. Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications.  Toxicol ., 93, 13–31. 
25. OECD (2002),  Acute Dermal Irritation/Corrosion , Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Na voljo na spletni 
strani: http://www.oecd.org/env/testguidelines.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 742
 
26. Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and 
false positive substances.  Toxicologist , 96, 235. 
27. ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National 
Institute of Environmental Health Sciences. Na voljo na spletni strani: 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf. 
28. Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice.  Drug. Chem. Toxicol ., 21, 195–206. 
29. Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions.  
Toxicol. Appl. Pharmacol. , 153, 83–94. 
30. Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals.  Toxicol. Meth. , 8, 245–256. 
31. Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods.  Drug Chem. Toxicol ., 22, 491–506. 
32. Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, 
H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol ., 212, 60–68. 
33. Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol ., 79, 721–728. 
34. Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract.  Environ. Health Perspect ., 115, 
1023–1028. 
35. ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In 
Vitro  Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. 
Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Na voljo na spletni strani: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ 
acutetox/Tox_workshop.htm. 
36. OECD (2000),  Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation , Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Na 
voljo na spletni strani: http://www.oecd.org/env/testguidelines. 
37. Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, 
D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments 
using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise.  J. Toxicol. 
Environ. Health, 53563 –79. 
38. OECD (2005),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , Envi­
ronment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment 
No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Na voljo na spletni strani: http://www.oecd.org/env/testguidelines.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 743
 
Dodatek 1  
OPREDELITVE POJMOV 
Natančnost: stopnja ujemanja rezultatov preskusne metode z uveljavljenimi refe ­
renčnimi vrednostmi. To je merilo u činkovitosti preskusne metode in eden od 
vidikov ustreznosti. Ta izraz in izraz „skladnost“ se pogosto izmeni čno upora­
bljata za pomen deleža ustreznih rezultatov preskusne metode (38). 
Primerjalna snov: snov, ki povzro ča preobčutljivost ali je ne povzro ča in se 
uporablja kot standard za primerjavo s preskusno snovjo. Primerjalna snov 
mora imeti naslednje lastnosti: (i) trajen in zanesljiv vir; (ii) strukturno in funk ­
cijsko podobnost z razredom preskušanih snovi; (iii) znane fizikalno-kemijske lastnosti; (iv) podporne podatke o znanih u činkih in (v) znano u činkovitost v 
razponu želene reakcije. 
Lažno negativna snov: snov, ki je s preskusno metodo nepravilno opredeljena 
kot negativna ali neaktivna, čeprav je dejansko pozitivna ali aktivna. 
Lažno pozitivna snov: snov, ki je s preskusom nepravilno opredeljena kot pozi ­
tivna ali aktivna, čeprav je dejansko negativna ali neaktivna. 
Nevarnost: možnost škodljivega u činka na zdravje ali okolje. Do škodljivega 
učinka pride, če je raven izpostavljenosti dovolj velika. 
Ponovljivost v laboratorijih: merjenje obsega, v katerem lahko razli čni kvalifici ­
rani laboratoriji, ki uporabljajo isti protokol in preskušajo iste preskusne snovi, pridejo do kvalitativno in kvantitativno podobnih rezultatov. Ponovljivost v labo ­
ratorijih se ugotovi med postopki pred validacijo in med validacijo ter kaže, v 
kakšnem obsegu se lahko preskus uspešno uporablja v ve č laboratorijih; imenuje 
se tudi ponovljivost v razli čnih laboratorijih (38). 
Ponovljivost v laboratoriju: dolo čitev obsega, v katerem lahko kvalificirane 
osebe v istem laboratoriju uspešno ponovijo rezultate z uporabo dolo čenega 
protokola v razli čnem času. Imenuje se tudi ponovljivost znotraj laboratorija (38). 
Izločitev: izlo čitev je ugotovitev, ki se izrazito razlikuje od drugih vrednosti v 
naključnem vzorcu populacije. 
Zagotavljanje kakovosti: postopek upravljanja, pri katerem posamezniki, neod ­
visni od oseb, ki so izvajale preskuse, ocenijo izpolnjevanje laboratorijskih stan ­
dardov za preskušanje, zahtev in postopkov vodenja evidenc ter natan čnosti 
prenosa podatkov. 
Zanesljivost: stopnja ponovljivosti preskusne metode v laboratorijih in med njimi 
v določenem časovnem obdobju pri uporabi istega protokola. Oceni se z izra ­ 
čunom ponovljivosti v enem ali ve č laboratorijih (38). 
Preobčutljivost kože: imunološki proces, ki se pojavi, ko je ob čutljiv posameznik 
lokalno izpostavljen kemi čnemu alergenu, ki na koži sproži imunski odziv in 
lahko povzro či razvoj preob čutljivosti ob stiku. 
Stimulacijski indeks (SI): vrednost, izra čunana za oceno morebitne preob čutlji­
vosti kože, ki jo lahko povzro či preskusna snov; je razmerje med množenjem v 
tretiranih skupinah in množenjem v primerjalni kontrolni skupini z nosilcem. 
Preskusna snov (imenovana tudi preskusna kemikalija): katera koli snov ali 
zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode.  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 744
 
B.51.  PREOB ČUTLJIVOST KOŽE: LOKALNA ANALIZA BEZGAVK: 
BRDU-ELISA  
UVOD 
1. Smernice OECD za preskušanje kemikalij in preskusne metode EU se redno 
preverjajo zaradi znanstvenega napredka, spreminjajo čih se zakonodajnih 
potreb in vprašanj, povezanih z dobrim po čutjem živali. Prva preskusna 
metoda (B.42) za dolo čanje preob čutljivosti kože pri miši, lokalna analiza 
bezgavk (LLNA; Smernica za preskušanje OECD 429) je bila že preverjena (1 in poglavje B.42 te Priloge). Objavljene so podrobnosti o validaciji LLNA in pregled s tem povezanega dela (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). 
Pri LLNA se za merjenje množenja limfocitov uporablja radioizotopni 
timidin ali jod, zato je lahko uporaba analize omejena v primerih, kjer je pridobitev, uporaba ali odstranitev radioaktivnosti težavna. LLNA: BrdU-ELISA [encimsko-imunski test, v nadaljnjem besedilu: analiza 
LLNA: BrdU-ELISA] je neradioaktivna razli čica LLNA, pri kateri se upora ­
blja radioaktivno neozna čen 5-bromo 2-deoksiuridin (BrdU) (Služba za 
izmenjavo kemijskih izvle čkov [CAS] št. 59-14-3) v preskusnem sistemu, 
ki temelji na encimsko-imunskem testu za merjenje množenja limfocitov. 
Analizo LLNA: BrdU-ELISA je validirala in pregledala mednarodna neod ­
visna strokovna skupina za ocenjevanje ter jo priporo čila kot koristno za 
opredelitev kemikalij, ki povzro čajo preob čutljivost, in kemikalij, ki je ne 
povzročajo, z nekaterimi omejitvami (10) (11) (12). Ta preskusna metoda je 
zasnovana za ocenjevanje morebitne preob čutljivosti kože s kemikalijami 
(snovmi in zmesmi) pri živalih. Poglavje B.6 te priloge in Smernica za preskušanje OECD 406 uporabljata preskuse na morskih praši čkih, pred ­
vsem maksimizacijski in Buehlerjev preskus na morskih praši čkih (13). 
LLNA (poglavje B.42 te priloge; Smernica za preskušanje OECD 429) in 
dve spremembi, pri katerih se radioaktivnost ne uporablja, analiza LLNA: BrdU-ELISA (poglavje B.51 te priloge; Smernica za preskušanje OECD 442 B) in analiza LLNA: DA (poglavje B.50 te priloge; Smernica za preskušanje 
OECD 442 A) zaradi manj pogoste in izpopolnjene uporabe živali zagota ­
vljajo prednost v primerjavi s preskusi na morskih praši čkih iz metode B.6 
in Smernice za preskušanje OECD 406 (13). 
2. Podobno kot LLNA tudi analiza LLNA: BrdU-ELISA preu čuje indukcijsko 
fazo preob čutljivosti kože in zagotavlja koli činske podatke, ki so primerni za 
oceno odziva na odmerek. Ker odkriva povzro čitelje preob čutljivosti, ne da bi 
bilo pri tem treba uporabiti radioaktivni ozna čevalec za DNA, se ne pojavljajo 
vprašanja glede poklicne izpostavljenosti radioaktivnosti in odstranjevanja odpadkov. Zaradi tega bo za odkrivanje povzro čiteljev preob čutljivosti 
morda mogo ča pogostejša uporaba miši, zaradi česar bi se lahko še bolj zmanj ­ 
šala uporaba morskih praši čkov za preskušanje morebitne preob čutljivosti 
kože (tj. B.6; Smernica za preskušanje OECD 406) (13).
 
OPREDELITVE POJMOV 
3. Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1.  
ZAČETNI POMISLEKI IN OMEJITVE 
4. Analiza LLNA: BrdU-ELISA je spremenjena metoda LLNA za ugotavljanje 
morebitne preob čutljivosti kože s kemikalijami, s posebnimi omejitvami. Ni 
nujno, da to pomeni, da je treba v vseh primerih namesto preskusov na 
morskih praši čkih ali LLNA (tj. B.6; Smernica za preskušanje OECD 406) 
(13) uporabiti analizo LLNA: BrdU-ELISA, temve č da je ta analiza enako ­
vredna in se lahko uporabi kot druga možnost, pri kateri obi čajno niso ve č 
potrebne dodatne potrditve pozitivnih in negativnih rezultatov (10) (11). 
Preskuševalni laboratorij mora pred za četkom opravljanja študije upoštevati 
vse razpoložljive informacije o preskusni snovi. Takšne informacije bodo  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 745
 
vključevale vrsto in kemijsko sestavo preskusne snovi; njene 
fizikalno-kemijske lastnosti; rezultate katerih koli drugih preskusov toksi ­ 
čnosti na preskusni snovi,  in vitro  ali in vivo ; in toksikološke podatke o 
strukturno sorodnih kemikalijah. Te informacije je treba upoštevati, da se določi, ali je metoda LLNA: BrdU-ELISA primerna za preskusno snov 
(glede na nezdružljivost omejenega števila vrst kemikalij z analizo LLNA: 
BrdU-ELISA [glej odstavek 5]) in za lažjo izbiro odmerka. 
5. Analiza LLNA: BrdU-ELISA je metoda  in vivo  in posledi čno ne odpravlja 
uporabe živali pri ocenjevanju delovanj, ki povzro čajo alergijsko preob čut­
ljivost ob stiku. Vendar ima možnost, da v primerjavi s preskusi na morskih 
prašičkih (B.6; Smernica za preskušanje OECD 406) (13), zmanjša število 
živali, potrebnih v ta namen. Poleg tega nudi analiza LLNA: BrdU-ELISA znatno izboljšanje na čina, kako se živali uporabljajo za preskušanje aler ­
gijske preob čutljivosti ob stiku, saj v nasprotju z metodo B.6 in Smernico za 
preskušanje OECD 406 ne zahteva, da se povzro čijo izzvane reakcije preko ­
merne ob čutljivosti kože. Poleg tega analiza LLNA: BrdU-ELISA za razliko 
od maksimizacijskega preskusa na morskih praši čkih ne zahteva uporabe 
pomožnega preskusa (poglavje B.6 te priloge, 13). S tem analiza LLNA: 
BrdU-ELISA zmanjšuje trpljenje živali. Kljub prednostim analize LLNA: 
BrdU-ELISA v primerjavi z metodo B.6 in Smernico za preskušanje OECD 406 (13) obstajajo nekatere omejitve, zaradi katerih je lahko nujna uporaba metode B.6 ali Smernice za preskušanje OECD 406 (npr. presku ­ 
šanje dolo čenih kovin, lažni pozitivni izidi pri nekaterih dražilnih snoveh za 
kožo [kot so nekatere vrste površinsko razgradljivih kemikalij] (6) (1 in poglavje B.42 te priloge), topnost preskusne snovi). Poleg tega je zaradi kemijskih razredov ali snovi s funkcionalnimi skupinami, za katere se je 
izkazalo, da lahko delujejo kot mote či dejavniki (15), lahko potrebna 
uporaba preskusov na morskih praši čkih (tj. B.6; Smernica za preskušanje 
OECD 406 (13)). Za omejitve, dolo čene za LLNA (1 in poglavje B.42 te 
priloge), je bilo priporo čeno, da se uporabljajo tudi za analizo LLNA: 
BrdU-ELISA (10). Razen takšnih dolo čenih omejitev bi morala biti analiza 
LLNA: BrdU-ELISA primerna za preskušanje katerih koli kemikalij, razen če so s temi kemikalijami povezane lastnosti, ki lahko ovirajo natan čnost 
analize LLNA: BrdU-ELISA. Poleg tega je treba razmisliti o možnosti 
mejnih pozitivnih rezultatov v primerih, ko so dobljene vrednosti stimulacij ­
skega indeksa (SI) med 1,6 in 1,9 (glej odstavke 31–32). To temelji na podatkovni zbirki za validacijo s 43 snovmi s stimulacijskim indeksom ≥ 
1,6 (glej odstavek 6), pri kateri je analiza LLNA: BrdU-ELISA pravilno 
opredelila vseh 32 povzro čiteljev preob čutljivosti pri LLNA, vendar je 
nepravilno opredelila dve od 11 snovi, ki pri LLNA ne povzro čajo preob čut­
ljivosti z vrednostmi stimulacijskega indeksa med 1,6 in 1,9 (tj. mejno pozitivna vrednost) (10). Ker pa je bil za dolo čanje vrednosti stimulacij ­
skega indeksa in izra
čun predvidljivih lastnosti preskusa uporabljen isti 
nabor podatkov, so lahko navedeni rezultati pretirana ocena dejanskih pred ­
vidljivih lastnosti.  
NAČELA METODE PRESKUŠANJA 
6. Osnovno na čelo, na katerem temelji analiza LLNA: BrdU-ELISA, je, da 
povzročitelji preob čutljivosti povzro čijo množenje limfocitov v bezgavkah, 
ki drenirajo obmo čje nanosa preskusne snovi. To množenje je sorazmerno z 
odmerkom in mo čjo uporabljenega alergena in je preprosto sredstvo za 
doseganje koli činske izmere preob čutljivosti. Množenje se izmeri s primer ­
javo povpre čnega množenja v vsaki preskusni skupini in povpre čnega 
množenja v kontrolni skupini, tretirani z nosilcem. Dolo či se razmerje 
med povpre čnim množenjem v vsaki tretirani skupini in povpre čnim množe ­
njem v primerjalni kontrolni skupini z nosilcem, ki se imenuje stimulacijski 
indeks (SI) in mora biti ≥ 1,6, preden je nadaljnje ocenjevanje preskusne 
snovi kot možnega povzro čitelja preob čutljivosti kože utemeljeno. Opisani  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 746
 
postopki temeljijo na merjenju vsebnosti BrdU, ki kaže pove čano število 
množečih se celic v ušesnih bezgavkah. BrdU je analog timidina in se v 
množeče se celice DNA vklju či na podoben na čin. Vključitev BrdU se meri 
z encimsko-imunskim testom, ki uporablja protitelo, specifi čno za BrdU, ki 
je označeno tudi s peroksidazo. Ko se doda substrat, peroksidaza reagira s 
substratom in nastane obarvan produkt, ki je koli činsko opredeljen pri dolo ­ 
čeni absorbanci z uporabo čitalca mikrotiterskih ploš č. 
OPIS ANALIZE  
Izbira živalskih vrst  
7. Izbrana vrsta za ta preskus je miš. Validacijske študije za analizo LLNA: 
BrdU-ELISA so bile izvedene samo s sevom CBA/JN, ki je zato priporo čeni 
sev (10) (12). Uporabijo se mlade odrasle mišje samice, ki še niso kotile in niso breje. Na za četku študije morajo biti živali stare 8–12 tednov, odsto ­
panje mase živali pa mora biti čim manjše in ne sme presegati 20 % 
povprečne mase. Namesto tega se lahko uporabi druge seve in samce, ko 
je dobljenih dovolj podatkov za prikaz, da ne obstajajo zna čilne razlike v 
odzivu pri analizi LLNA: BrdU-ELISA.
 
Bivalni in prehranjevalni pogoji  
8. Miši morajo biti skupinsko nastanjene (16), razen če je zagotovljena 
ustrezna znanstvena utemeljitev za njihovo lo čeno nastanitev. Temperatura 
v prostoru za poskusne živali mora biti 22 ± 3 °C. Čeprav mora biti 
relativna vlažnost najmanj 30 % in po možnosti ne sme presegati 70 %, 
mora biti ciljna vlažnost, razen med čiščenjem prostora, 50 do 60 %. Osvet ­
litev naj bo umetna, in sicer 12 ur svetlobe, 12 ur teme. Za hranjenje se 
lahko uporablja konvencionalna laboratorijska prehrana z neomejeno oskrbo 
s pitno vodo.  
Priprava živali  
9. Živali se naklju čno izberejo, ozna čijo tako, da je omogo čeno posami čno 
prepoznavanje (vendar ne s katero od oblik ušesnih oznak), in zadržijo v 
kletkah najmanj pet dni pred za četkom dajanja odmerka, da se lahko prila ­
godijo laboratorijskim razmeram. Pred za četkom tretiranja se vse živali 
pregledajo, da se zagotovi, da nimajo opaznih kožnih lezij.  
Priprava preskusnih raztopin  
10. Trdne kemikalije se pred nanosom na uho miši raztopijo ali suspendirajo v 
ustreznih topilih ali nosilcih in po potrebi razred čijo. Teko če kemikalije se 
lahko nanesejo nerazred čene ali pa se razred čijo pred dajanjem odmerka. Pri 
netopnih kemikalijah, kot so tiste, ki se obi čajno uporabljajo v medicinskih 
pripomočkih, je treba uporabiti mo čno povečano ekstrakcijo v ustreznem 
topilu, da se odkrije vse ekstraktibilne sestavine za preskušanje pred 
nanosom na uho miši. Preskusne snovi je treba pripravljati dnevno, razen 
če podatki o stabilnosti kažejo, da je shranjevanje sprejemljivo.  
Preverjanje zanesljivosti  
11. Za prikaz ustrezne u činkovitosti analize se uporabijo kemikalije pozitivne 
kontrole, ki se odzovejo z ustrezno in ponovljivo ob čutljivostjo kot 
preskusna snov, ki povzro ča preobčutljivost, za katero je stopnja reakcije 
natančno opredeljena. Uporaba primerjalne pozitivne kontrole je priporo ­ 
čena, saj pokaže zmožnost laboratorija, da uspešno izvede vsako analizo, 
ter omogo ča ocenjevanje ponovljivosti in primerljivosti v enem ali ve č 
laboratorijih. Tudi nekateri regulativni organi zahtevajo uporabo pozitivne  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 747
 
kontrole pri vsaki raziskavi, zato se uporabnikom priporo ča, da se pred 
izvedbo analize LLNA: BrdU-ELISA posvetujejo s pristojnimi organi. V 
skladu s tem se priporo ča redna uporaba primerjalne pozitivne kontrole, 
saj tako ni potrebno dodatno preskušanje na živalih za izpolnitev zahtev, ki se lahko pojavijo zaradi uporabe redne pozitivne kontrole (glej odstavek 
12). Pozitivna kontrola mora povzro čiti pozitiven odziv analize LLNA: 
BrdU-ELISA na raven izpostavljenosti, za katero se pri čakuje, da bo dala 
večji stimulacijski indeks SI ≥ 1,6 kot negativna kontrolna skupina. 
Odmerek pozitivne kontrole je treba izbrati tako, da ne povzro či čezmernega 
draženja kože ali sistemske toksi čnosti in da je indukcija ponovljiva, vendar 
ne čezmerna (tj. SI > 14 bi se štel za čezmernega). Priporo čena pozitivna 
kontrola je 25-odstotni heksil cimetov aldehid (CAS št. 101-86-0) in 25- odstotni evgenol (št. CAS 97-53-0) v acetonu: olivnem olju (4:1, v/v). V 
nekaterih okoliš činah se lahko ob ustrezni utemeljitvi uporabijo druge pozi ­
tivne kontrole, ki izpolnjujejo zgornja merila. 
12. Običajno je uporaba pozitivne kontrolne skupine priporo čena, lahko pa 
obstajajo okoliš čine, v katerih redno preskušanje (tj. v razmikih ≤ 6 mese­
cev) pozitivne kontrole morda zadoš ča za laboratorije, ki redno izvajajo 
analizo LLNA: BrdU-ELISA (tj. izvajajo analizo LLNA: BrdU-ELISA 
vsaj enkrat mese čno) in imajo vzpostavljeno zbirko preteklih podatkov o 
pozitivnih kontrolah, ki dokazuje zmožnost laboratorija, da pridobi pono ­
vljive in natan čne rezultate s pozitivnimi kontrolami. Ustrezna strokovnost 
pri izvajanju analize LLNA: BrdU-ELISA se lahko uspešno dokaže z dobi ­
vanjem doslednih pozitivnih rezultatov s pozitivno kontrolo pri vsaj desetih 
neodvisnih preskusih, izvedenih v razumnem časovnem obdobju (tj. v manj 
kot enem letu). 
13. Primerjalno pozitivno kontrolno skupino je treba vklju čiti vedno, kadar pride 
do postopkovne spremembe pri analizi LLNA: BrdU-ELISA (npr. zame ­
njava usposobljenega osebja, zamenjava materiala za preskusno metodo 
in/ali reagentov, zamenjava opreme za preskusno metodo, zamenjava vira 
preskusnih živali), takšne spremembe pa je treba vedno zabeležiti v labora ­
torijskih poro čilih. Pri odlo čanju o nujnosti vzpostavitve nove zbirke prete ­
klih podatkov za beleženje doslednosti pri rezultatih pozitivne kontrole je 
treba upoštevati u činek, ki ga imajo te spremembe na ustreznost predhodno 
vzpostavljene zbirke preteklih podatkov. 
14. Raziskovalci se morajo zavedati, da odlo čitev o izvajanju redne namesto 
primerjalne pozitivne kontrolne študije vpliva na ustreznost in sprejemljivost 
negativnih rezultatov študije, pridobljenih brez primerjalne pozitivne kontrole v razmiku med rednimi pozitivnimi kontrolnimi študijami. Na primer, če je rezultat, pridobljen z redno pozitivno kontrolno študijo, 
lažno negativen, so lahko vprašljivi negativni rezultati preskusne snovi, 
pridobljeni v č
asu med zadnjo sprejemljivo redno pozitivno kontrolno 
študijo in nesprejemljivo redno pozitivno kontrolno študijo. Pri odlo čanju, 
ali vključiti primerjalne pozitivne kontrole ali izvajati samo redne pozitivne 
kontrole, je treba skrbno preu čiti posledice teh rezultatov. Treba je razmisliti 
tudi o uporabi manjšega števila živali v primerjalni pozitivni kontrolni skupini, če je to znanstveno utemeljeno in če laboratorij na podlagi preteklih 
podatkov, zna čilnih za laboratorij, dokaže, da se lahko uporabi manjše 
število miši (17). 
15. Čeprav je treba pozitivno kontrolo preskusiti v nosilcu, za katerega je znano, 
da povzro ča dosleden odziv (npr. aceton: olivno olje; 4:1, v/v), lahko obsta ­
jajo nekatere zakonodajne okoliš čine, ko je potrebno tudi preskušanje v 
nestandardnem nosilcu (klini čno/kemično ustrezne sestave) (18). Če se 
primerjalna pozitivna kontrola preskuša v drugem nosilcu kot preskusna 
snov, je treba za primerjalno pozitivno kontrolo vklju čiti ločen kontrolni 
nosilec.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 748
 
16. V primerih, kjer se ocenjujejo preskusne snovi za poseben kemijski razred 
ali razpon reakcij, so lahko primerjalne snovi uporabne tudi za dokaz, da 
preskusna metoda deluje pravilno za odkrivanje morebitne preob čutljivosti 
kože pri teh vrstah preskusnih snovi. Ustrezne primerjalne snovi morajo imeti naslednje lastnosti: 
— strukturno in funkcijsko podobnost z razredom preskusne snovi, ki se 
preskuša, 
— znane fizikalno-kemijske lastnosti, — podporne podatke iz analiz LLNA: BrdU-ELISA, — podporne podatke od drugih živalskih modelov in/ali ljudi.
 
PRESKUSNI POSTOPEK  
Število živali in velikost odmerkov  
17. Na skupino odmerka se uporabijo najmanj štiri živali z najmanj tremi 
koncentracijami preskusne snovi, poleg tega pa še primerjalna negativna kontrolna skupina, tretirana zgolj z nosilcem za preskusno snov, in pozitivna 
kontrolna skupina (primerjalna ali izvedena pred kratkim, odvisno od poli ­
tike laboratorija pri upoštevanju odstavkov 11–15). Treba je razmisliti o preskušanju ve č odmerkov pozitivne kontrole, zlasti če se pozitivna kontrola 
preskuša ob časno. Živali v kontrolnih skupinah je treba, razen če se ne 
tretirajo s preskusno snovjo, obravnavati in tretirati na enak na čin kot živali 
v tretiranih skupinah. 
18. Izbira odmerka in nosilca mora temeljiti na priporo čilih iz sklicev (2) in 
(19). Zaporedni odmerki se obi čajno izberejo iz ustrezne serije koncentracij, 
kot so 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % itd. Izbira upora ­
bljene serije koncentracij mora biti ustrezno znanstveno utemeljena. Kadar 
so na voljo, je treba pri izbiri treh zaporednih koncentracij upoštevati vse 
obstoječe toksikološke informacije (npr. akutno toksi čnost in draženje kože) 
ter strukturne in fizikalno-kemijske informacije o želeni preskusni snovi (in/ali strukturno povezani snovi), tako da je pri najve čji koncentraciji izpo ­
stavljenost najve čja, hkrati pa ni sistemske toksi čnosti in/ali čezmernega 
draženja kože (19) (20 in poglavje B.4 te Priloge). Če takšne informacije 
niso na voljo, je morda najprej potreben predhodni presejalni preskus (glej odstavke 21–24). 
19. Nosilec ne sme ovirati rezultatov preskusa ali vplivati nanje, izbere pa se na 
podlagi pove čevanja topnosti, da se med pripravljanjem raztopine/suspen ­
zije, ki je primerna za uporabo preskusne snov, pridobi najve čjo možno 
koncentracijo. Priporo čljivi nosilci so aceton: olivno olje (4:1, v/v),  N,N - 
dimetilformamid, metil etil keton, propilen glikol in dimetil sulfoksid (6), vendar se lahko uporabljajo tudi drugi, če je zagotovljena ustrezna znan ­
stvena utemeljitev. V nekaterih okoliš činah je morda treba kot dodatno 
kontrolo uporabiti klini čno ustrezno topilo ali trgovsko sestavo, v kateri 
se trži preskusna snov. Paziti je treba zlasti, da so v nosilni sistem vklju čene 
hidrofilne preskusne snovi, ki vlažijo kožo in se ne izsušijo takoj, z vklju ­ 
čitvijo ustreznih pospeševalcev raztapljanja (npr. 1-odstotnim Pluronic® 
L92). Zato se je treba izogibati povsem vodenim nosilcem.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 749
 
20. Obdelava bezgavk posamezne miši omogo ča oceno spremenljivosti med 
posameznimi živalmi in statisti čno primerjavo razlik med meritvami 
preskusne snovi in primerjalne kontrolne skupine z nosilcem (glej odstavek 33). Poleg tega je ocena možnosti glede zmanjšanja števila miši v pozitivni kontrolni skupini izvedljiva samo, če se zbira podatke o posameznih živalih 
(17). Poleg tega nekateri regulativni organi zahtevajo zbiranje podatkov o 
posameznih živalih. Redno zbiranje podatkov o posameznih živalih zagota ­
vlja prednosti glede dobrega po čutja živali, saj se s tem prepre či dvojno 
preskušanje, ki bi bilo potrebno, če bi bilo treba rezultate, prvotno zbrane na 
en način (npr. preko združenih podatkov o živalih) zaradi drugih zahtev 
regulativnih organov (npr. glede podatkov o posameznih živalih) kasneje ponovno preu čiti.
 
Predhodni presejalni preskus  
21. Če informacije za dolo čitev najve čjega odmerka za preskušanje niso na 
voljo (glej odstavek 18), je treba izvesti predhodni presejalni preskus, da se določi ustrezna velikost odmerka za preskušanje z analizo LLNA: 
BrdU-ELISA. Namen predhodnega presejalnega preskusa je zagotoviti smer ­
nice za izbiro najve čje velikosti odmerka za uporabo v glavni študiji analize 
LLNA: BrdU-ELISA v primerih, ko ni na voljo informacij o koncentraciji, ki povzro či sistemsko toksi čnost (glej odstavek 24) in/ali čezmerno draženje 
kože (glej odstavek 23). Najve čja velikost odmerka je 100-odstotna koncen ­
tracija preskusne snovi za teko čine ali najvišja možna koncentracija za trdne 
snovi ali suspenzije. 
22. Predhodni presejalni preskus se izvede v pogojih, ki so enaki tistim v glavni 
študiji analize LLNA: BrdU-ELISA, s to razliko, da se ne izvede ocena 
množenja v bezgavkah in da se lahko uporabi manj živali na skupino odmerka. Predlaga se uporaba ene ali dveh živali na skupino odmerka. Vse miši se opazuje dnevno glede klini čnih znakov sistemske toksi čnosti 
ali lokalnega draženja na mestu nanosa. Telesna masa se zabeleži pred 
preskusom in pred usmrtitvijo (6. dan). Obe ušesi vsake miši se opazuje glede rde čine in oceni s pomo čjo preglednice 1 (20 in poglavje B.4 te 
priloge). Meritve debeline ušesa se izvedejo z napravo za merjenje debeline 
(npr. digitalnim mikrometrom ali merilnikom debeline s števil čnico) 1. dan 
(pred odmerkom), 3. dan (približno 48 ur pred prvim odmerkom) in 6. dan. Poleg tega se lahko 6. dan debelino ušesa dolo či s preluknjanjem ušes za 
določitev mase, ki se izvede po humani usmrtitvi živali. Znak za čezmerno 
draženje je rde čina z oceno ≥ 3 in/ali pove čana debelina ušesa za ≥ 25 % na 
kateri koli dan merjenja (21) (22). Najve čji odmerek, izbran za glavno 
študijo analize LLNA: BrdU-ELISA, je naslednji nižji odmerek v seriji koncentracij iz predhodnega presejalnega preskusa (glej odstavek 18), ki 
ne povzro či sistemske toksi čnosti in/ali čezmernega draženja kože.
 
Preglednica 1  
Ocena rde čine 
Ugotovitev Ocena  
Rdečine ni 0 
Neznatna rde čina (komajda opazna) 1 
Zelo razlo čna rdečina 2  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 750
 
Ugotovitev Ocena  
Zmerna do mo čna rdečina 3 
Močna rdečina (rdečina rdeče pese) in nastanek krast ovirata 
razvrstitev rde čine 4 
23. Poleg 25-odstotnega pove čanja debeline ušesa (21) (22) se za opredelitev 
dražilnih snovi pri LLNA uporablja tudi statisti čno značilno pove čanje debe ­
line ušesa tretirane miši v primerjavi s kontrolno mišjo (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28). Ker pa se lahko statisti čno značilno pove čanje pojavi tudi pri 
debelini ušesa, manjši od 25 %, ni izrecno povezano s čezmernim draženjem 
(25) (26) (27) (28) (29). 
24. Naslednje klini čne ugotovitve lahko nakazujejo sistemsko toksi čnost (30), 
kadar se uporabljajo kot del celovite ocene, in zato lahko pokažejo najve čjo 
velikost odmerka za uporabo v glavni analizi LLNA: BrdU-ELISA: spre ­
membe v delovanju živ čnega sistema (npr. piloerekcija, ataksija, tremorji in 
krči); vedenjske spremembe (npr. agresivnost, spremembe glede nege, opazna 
sprememba stopnje aktivnosti); spremembe dihanja (npr. spremembe frekvence in intenzivnosti dihanja, kot so dispneja, zasoplost in hropenje) in spremembe glede uživanja hrane in vode. Poleg tega je treba pri oceni upošte ­
vati znake letargije in/ali neodzivnosti ter morebitne klini čne znake bole čine in 
trpljenja, ki niso samo blagi ali trenutni, ali zmanjšanje telesne mase za > 5 % od 1. do 6. dne ter smrtnost. Umirajo če živali ali živali, ki kažejo znake hudega 
in dolgotrajnega trpljenja, se usmrtijo na human na čin (31).
 
Načrt za poskus glavne študije  
25. Načrt za poskus analize je naslednji: 
— 1. dan:  Posamično ugotovljena in zabeležena masa vsake živali in 
morebitne klini čne ugotovitve. Nanos 25 μl ustrezno razred čene 
preskusne snovi, samega nosilca ali pozitivne kontrole (primerjalne ali izvedena pred kratkim, odvisno od politike laboratorija pri upoštevanju odstavkov 11–15) na vsak uhelj. 
— 2. in 3. dan:  Ponovi se postopek nanosa, ki je bil izveden 1. dan. 
— 4. dan:  Brez tretiranja. 
— 5. dan:  Intraperitonealno vbrizganje 0,5 ml (5 mg/miš) raztopine BrdU 
(10 mg/ml). 
— 6. dan:  Zabeleži se masa vsake živali in morebitne klini čne ugotovitve. 
Približno 24 ur po vbrizgani BrdU se živali humano usmrti. Ušesne bezgavke ob vsakem ušesu miši se izrežejo in shranijo v fosfatni 
pufer s soljo (PBS) za vsako žival Podatki in diagrami o identifikaciji 
in izrezu bezgavk so na voljo v sklicu (17). Za nadaljnje spremljanje odziva kože v glavni študiji se lahko v študijski protokol vklju čijo 
dodatni parametri, kot so ocena rde čine ušesa ali meritve debeline 
ušesa (pridobljene z merilnikom debeline ali preluknjanjem ušes za 
določitev mase pri obdukciji).
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 751
 
Priprava celi čnih suspenzij  
26. Enotna celi čna suspenzija iz celic bilateralno izrezanih bezgavk vsake miši 
se pripravi z blago mehani čno disagregacijo skozi ži čno mrežo iz nerjavnega 
jekla z velikostjo odprtin 200 mikronov ali drugo uveljavljeno tehniko za pripravo enotne celi čne suspenzije (npr. uporabo plasti čnega pestila za 
enkratno uporabo za drobljenje bezgavk, ki mu sledi prehajanje skozi 
mrežo iz najlona z velikostjo odprtin 70 mikronov). Postopek priprave 
suspenzije iz celic bezgavk je pri tej analizi bistvenega pomena, zato mora vsak izvajalec predhodno pridobiti te spretnosti. Bezgavke živali v negativni kontroli so majhne, zato je treba biti pazljiv, da ne pride do 
umetnega vpliva na vrednosti SI. V vsakem primeru je treba ciljni volumen 
suspenzije iz celic bezgavk prilagoditi dolo čenemu optimiziranemu volumnu 
(približno 15 ml). Optimiziran volumen temelji na doseganju povpre čne 
absorbance negativne kontrolne skupine v razponu 0,1–0,2.
 
Določitev množenja celic (merjenje vsebnosti bromdeoksiuridina (BrdU) v 
DNA limfocitov)  
27. BrdU se meri z encimsko-imunskim testom z uporabo tržnega kompleta (npr. 
Roche Applied Science, Mannheim, Nem čija, št. v katalogu 11 647 229 001). 
Na kratko, v vdolbinice treh mikroploš č z ravnim dnom se doda 100 μL 
suspenzije iz celic bezgavk. Po fiksaciji in denaturaciji celic iz bezgavk se v 
vsako vdolbinico doda anti-BrdU protitelo in omogo či, da pride do reakcije. 
Nato se anti-BrdU protitelo odstrani s spiranjem, doda se raztopina substrata in omogoči se, da nastane kromogen. Nato se izmeri absorbanca pri 370 nm z 
referenčno valovno dolžino 492 nm. V vseh primerih morajo biti preskusni 
pogoji analize optimizirani (glej odstavek 26).
 
OPAZOVANJA  
Klinična opazovanja  
28. Vsako miš je treba vsaj enkrat dnevno natan čno opazovati glede klini čnih 
znakov, lokalnega draženja na mestu nanosa ali sistemske toksi čnosti. Vsa 
opazovanja se sistemati čno zabeležijo v evidence, ki se vodijo za vsako miš. 
Načrt spremljanja vklju čuje merila za hitro identifikacijo miši, ki izražajo 
sistemsko toksi čnost, čezmerno draženje kože ali jedkost za kožo zaradi 
evtanazije (31).  
Telesna masa  
29. Kot je navedeno v odstavku 25, se telesna masa posameznih živali izmeri na 
začetku preskusa in ob predvideni humani usmrtitvi.  
IZRAČUN REZULTATOV 
30. Rezultati za vsako tretirano skupino so izraženi kot povpre čni stimulacijski 
indeks (SI). SI se dobi tako, da se povpre čni indeks ozna čevanja za 
BrdU/miš v vsaki skupini preskusne snovi in v pozitivni kontrolni skupini deli s povpre čnim indeksom ozna čevanja za BrdU za kontrolno skupino s 
topilom/nosilcem. Povpre čni stimulacijski indeks za kontrolne skupine z 
nosilcem je potem 1. 
Indeks ozna čevanja za BrdU je opredeljen kot: 
indeks ozna čevanja za BrdU = (ABS
 em – ABS blank  em ) – (ABS  ref – ABS 
blank  ref ) 
pri čemer je em = valovna dolžina emisije in ref = referen čna valovna 
dolžina.  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 752
 
31. Rezultat se šteje za pozitivnega, če je SI ≥ 1,6 (10). Vendar se lahko pri 
odločanju, ali je mejni rezultat pozitiven (tj. vrednost SI med 1,6 in 1,9), 
uporabijo tudi mo č odziva na odmerek, statisti čni pomen ter doslednost 
odzivov v topilu/nosilcu in pozitivni kontroli (3) (6) (32). 
32. Pri mejnem pozitivnem odzivu s SI med 1,6 in 1,9 bodo uporabniki morda 
za potrditev, da so takšni rezultati pozitivni, poleg vrednosti SI upoštevali 
tudi moč odziva na odmerek, dokaze o sistemski toksi čnosti ali statisti čni 
pomen (10). Upoštevati je treba tudi razli čne lastnosti preskusne snovi, 
vključno s strukturno podobnostjo z znanimi povzro čitelji preob čutljivosti, 
povzročanjem čezmernega lokalnega draženja kože pri miši ter naravo 
opaženega odnosa med odmerkom in odzivom. Ti in drugi razlogi so podrobno obdelani drugje (4). 
33. Zbiranje podatkov na ravni posamezne miši bo omogo čilo statisti čno analizo 
prisotnosti in stopnje odnosa med odmerkom in odzivom v podatkih. More ­
bitna statisti čna ocena lahko vklju čuje oceno odnosa med odmerkom in 
odzivom ter ustrezno prilagojene primerjave preskusnih skupin (npr. skupina, ki je prejela odmerek v parih, proti primerjavam primerjalnih 
kontrolnih skupin s topilom/nosilcem). Statisti čna analiza lahko obsega 
npr. linearno regresijo ali Williamsov preskus za oceno nihanj odziva na odmerek in Dunnettov preskus za primerjave po parih. Pri izbiri ustrezne metode statisti čne analize se mora raziskovalec zavedati možnih neenakosti 
varianc in drugih sorodnih problemov, zaradi katerih je lahko nujna pret ­
vorba podatkov ali neparametrska statisti čna analiza. V vsakem primeru bo 
moral raziskovalec morda izvesti izra čune stimulacijskega indeksa in stati ­
stične analize s podatkovnimi to čkami (včasih imenovanimi „izlo čitve“) in 
brez njih.
 
PODATKI IN PORO ČANJE  
Podatki  
34. Podatki se povzamejo v obliki preglednice, ki prikazuje vrednosti indeksa 
označevanja za BrdU, skupinsko povpre čje indeksa ozna čevanja za BrdU/ 
žival, s tem povezane napake (npr. SD, SEM) in povpre čni SI za vsako 
skupino odmerka v primerjavi s primerjalno kontrolno skupino s topilom/ nosilcem.
 
Poročilo o preskusu  
35. Poro čilo o preskusu vsebuje naslednje informacije: 
preskusne in kontrolne kemikalije: 
— identifikacijske podatke (npr. številko CAS in številko EC, če je na 
voljo; vir; čistost; znane ne čistoče, številko serije), 
— fizikalno stanje in fizikalno-kemijske lastnosti (npr. hlapnost, stabilnost, 
topnost), 
— če je zmes, sestavo in relativne odstotke sestavin; 
topilo/nosilec: — identifikacijske podatke ( čistost, po potrebi koncentracijo, uporabljeno 
količino), 
— utemeljitev izbire uporabljenega nosilca;
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 753
 
preskusne živali: 
— vir miši seva CBA, 
— mikrobiološki status živali, če je znan, 
— število in starost živali, 
— število, starost in spol živali; 
preskusni pogoji: 
— vir, številko serije in podatke proizvajalca glede zagotavljanja kakovosti/ 
nadzora kakovosti (ob čutljivost na protitelesa in specifi čnost ter mejo 
zaznavnosti) kompleta za encimsko-imunski test, 
— podatke o pripravi in uporabi preskusne snovi, 
— utemeljitev izbire odmerka (vklju čno z rezultati predhodnega presejal ­
nega preskusa, če je bil izveden), 
— uporabljene koncentracije nosilca in preskusne snovi in skupno koli čino 
uporabljene preskusne snovi, 
— podatke o kakovosti hrane in vode (vklju čno z vrsto/virom prehranjeva ­
nja, virom vode), 
— podatke o programih tretiranja in vzor čenja, 
— metode merjenja toksi čnosti, 
— merila za obravnavanje študij kot pozitivnih ali negativnih, 
— podrobnosti o morebitnih odstopanjih protokola in pojasnilo, kako odsto ­
panje vpliva na zasnovo študije in njene rezultate; 
preverjanje zanesljivosti: 
— povzetek rezultatov zadnjega preverjanja zanesljivosti, vklju čno z infor ­
macijami o uporabljeni preskusni snovi, koncentraciji in nosilcu, 
— primerjalne in/ali pretekle pozitivne in primerjalne negativne (topilo/no ­
silec) kontrolne podatke za preskuševalni laboratorij, 
— če primerjalna pozitivna kontrola ni bila vklju čena, datum in laborato ­
rijsko poro čilo nazadnje izvedene redne pozitivne kontrole in poro čilo, 
ki navaja pretekle pozitivne kontrolne podatke za laboratorij, na podlagi 
katerih je upravi čeno neizvajanje primerjalne pozitivne kontrole; 
rezultati: 
— posamezne mase živali na za četku odmerjanja in ob predvideni humani 
usmrtitvi; ter povpre čno in povezano napako (npr. SD, SEM) za vsako 
tretirano skupino, 
— časovni potek za četka toksi čnosti in njenih znakov, vklju čno z morebi ­
tnim draženjem kože na mestu dajanja za vsako žival, 
— preglednico s kazalniki ozna čevanja za BrdU za vsako posamezno miš 
in vrednosti SI za vsako tretirano skupino, 
— povpre čno in povezano napako (npr. SD, SPM) za indeks ozna čevanja 
za BrdU/miš za vsako tretirano skupino,  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 754
 
— izračunan SI in ustrezno merilo spremenljivosti, ki upošteva spremen ­
ljivost med posameznimi živalmi tako v preskusni snovi kot kontrolnih 
skupinah, 
— odnos med odmerkom in odzivom, — po potrebi, statisti čne analize; 
razprava o rezultatih: — kratke pripombe o rezultatih, analizo odziva na odmerek in po potrebi 
statistične analize, s sklepom, ali naj se preskusna snov šteje za povzro ­ 
čitelja preob čutljivosti kože.
 
VIRI 
1. OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline 
No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Na voljo na spletni strani: http://www.oecd.org/env/testguidelines. 
2. Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation. Food Chem. Toxicol., 34, 999–1002. 
3. Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 34, 985–997. 
4. Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. 
Toxicol., 36, 327–33. 
5. Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employement of a regression method that includes determination of uncer ­
tainty margins. Toxicol., 146, 49–59. 
6. ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative 
Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the 
Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publi ­
cation No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Na voljo na spletni strani: http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf. 
7. Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 258–273. 
8. Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 274–286. 
9. Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 249–257. 
10. ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive 
local lymph node assay: BrdU-ELISA Test Method Protocol (LLNA: BrdU-ELISA). NIH Publication No. 10-7552A/B. Research Triangle Park, 
NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Na voljo na spletni 
strani: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/TMER.htm.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 755
 
11. (11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: 
Updated validation status of new versions and applications of the murine 
local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact derma ­
titis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Na voljo na spletni strani: 
http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf. 
12. Takeyoshi, M., Iida, K., Shiraishi, K. and Hoshuyama, S. (2005), Novel 
approach for classifying chemicals according to skin sensitising potency by non-radioisotopic modification of the local lymph node assay. J. Appl. Toxicol., 25, 129–134. 
13. OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals, OECD, Paris. Na voljo na spletni strani: 
http://www.oecd.org/env/testguidelines. 
14. Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as 
assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896–1904. 
15. Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, 
C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), 
Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensi ­
tisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90–96. 
16. ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the 
Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National 
Academies Press. 
17. ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay. NIH Publication Number 09-7357. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Na voljo na 
spletni strani: http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/ 
LLNAPerfStds.pdf. 
18. McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71–89. 
19. Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13–31. 
20. OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Na voljo na spletni strani: http://www.oecd.org/env/testguidelines. 
21. Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and 
false positive substances. Toxicologist, 96, 235. 
22. ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National 
Institute of Environmental Health Sciences. Na voljo na spletni strani: 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf. 
23. Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in 
female B6C3F1 mice. Drug Chem. Toxicol., 21, 195–206. 
24. Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83–94. 
25. Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245–256.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 756
 
26. Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods. Drug. Chem. Toxicol., 22, 491–506. 
27. Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, 
H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter- laboratory validation of alternative endpoints 
of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60–68. 
28. Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721–728. 
29. Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 
1023–1028. 
30. ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In 
Vitro  Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. 
Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Na voljo na spletni strani: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ 
acutetox/Tox_workshop.htm. 
31. OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in 
Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Na voljo na spletni strani: http://www.oecd.org/env/testguidelines. 
32. Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, 
D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. 
(1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments 
using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ.l Health, 53, 563–79. 
33. OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Envi ­
ronment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment 
No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Na voljo na spletni strani: http://www.oecd.org/env/testguidelines.
 ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 757
 
Dodatek 1  
OPREDELITVE POJMOV  
Natančnost:  stopnja ujemanja rezultatov preskusne metode z uveljavljenimi refe ­
renčnimi vrednostmi. To je merilo u činkovitosti preskusne metode in eden od 
vidikov ustreznosti. Ta izraz in izraz „skladnost“ se pogosto izmeni čno upora­
bljata za pomen deleža ustreznih rezultatov preskusne metode (33).  
Primerjalna snov:  snov, ki povzro ča preobčutljivost ali je ne povzro ča in se 
uporablja kot standard za primerjavo s preskusno snovjo. Primerjalna snov mora imeti naslednje lastnosti: (i) trajen in zanesljiv vir; (ii) strukturno in funk ­
cijsko podobnost z razredom preskušanih snovi; (iii) znane fizikalno-kemijske 
lastnosti; (iv) podporne podatke o znanih u činkih in (v) znano u činkovitost v 
razponu želene reakcije.  
Lažno negativna snov:  preskusna snov, ki je s preskusno metodo nepravilno opre ­
deljena kot negativna ali neaktivna, čeprav je dejansko pozitivna ali aktivna (33).  
Lažno pozitivna snov:  preskusna snov, ki je s preskusom nepravilno opredeljena 
kot pozitivna ali aktivna, čeprav je dejansko negativna ali neaktivna (33).  
Nevarnost:  možnost škodljivega u činka na zdravje ali okolje. Do škodljivega 
učinka pride, če je raven izpostavljenosti dovolj visoka.  
Ponovljivost v laboratorijih:  merjenje obsega, v katerem lahko razli čni kvalifi ­
cirani laboratoriji, ki uporabljajo isti protokol in preskušajo iste preskusne snovi, 
pridejo do kvalitativno in kvantitativno podobnih rezultatov. Ponovljivost v labo ­
ratorijih se ugotovi med postopki pred validacijo in med validacijo ter kaže, v kakšnem obsegu se lahko preskus uspešno uporablja v ve č laboratorijih; imenuje 
se tudi ponovljivost v razli čnih laboratorijih (33).  
Ponovljivost v laboratoriju:  določitev, obsega, v katerem lahko kvalificirane 
osebe v istem laboratoriju uspešno ponovijo rezultate z uporabo dolo čenega 
protokola v razli čnem času. Imenuje se tudi ponovljivost znotraj laboratorija (33).  
Izločitev: izločitev je ugotovitev, ki se izrazito razlikuje od drugih vrednosti v 
naključnem vzorcu populacije.  
Zagotavljanje kakovosti:  postopek upravljanja, pri katerem posamezniki, neod ­
visni od oseb, ki so izvajale preskuse, ocenijo izpolnjevanje laboratorijskih stan ­
dardov za preskušanje, zahtev in postopkov vodenja evidenc ter natan čnosti 
prenosa podatkov.  
Zanesljivost:  stopnja ponovljivosti preskusne metode v laboratorijih in med njimi 
v določenem časovnem obdobju pri uporabi istega protokola. Oceni se z izra ­ 
čunom ponovljivosti v enem ali ve č laboratorijih (33).  
Preobčutljivost kože:  imunološki proces, ki se pojavi, ko je ob čutljiv posameznik 
lokalno izpostavljen kemi čnemu alergenu, ki na koži sproži imunski odziv in 
lahko povzro či razvoj preob čutljivosti ob stiku.  
Stimulacijski indeks (SI):  vrednost, izra čunana za oceno morebitne preob čutlji­
vosti kože, ki jo lahko povzro či preskusna snov; je razmerje med množenjem v 
tretiranih skupinah in množenjem v primerjalni kontrolni skupini z nosilcem.  
Preskusna snov (imenovana tudi preskusna kemikalija):  katera koli snov ali 
zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode.  ▼M3 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 758
 
B.52  AKUTNA STRUPENOST PRI VDIHAVANJU – METODA 
RAZREDOV AKUTNE STRUPENOSTI  
UVOD 
1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 436 
(2009). Prvotna TG 403 v zvezi z akutno strupenostjo pri vdihavanju je 
bila sprejeta leta 1981 in je bila odtlej revidirana (glej poglavje B.2 te 
priloge (1)). Priprava metode razredov akutne strupenosti (ATC) pri vdiha ­
vanju (2) (3) (4) je bila ocenjena kot ustrezna po sprejetju revidirane oralne metode ATC (poglavje B.1 tris te priloge) (5). Retrospektivna ocena u čin­
kovitosti preskusne metode ATC za akutno strupenost pri vdihavanju je 
pokazala, da je primerna za namene razvrš čanja in ozna čevanja (6). 
Preskusna metoda ATC pri vdihavanju bo omogo čila uporabo zaporednih 
faz točno določenih ciljnih koncentracij za zagotovitev razvrstitve strupe ­
nosti preskusne kemikalije. Kot klju čna končna točka se uporablja smrtnost, 
vendar je treba živali, ki doživljajo hude bole čine ali muke oziroma ki trpijo 
ali katerih smrt je neizbežna, humano usmrtiti, da se njihovo trpljenje čim 
bolj zmanjša. Napotki o humanih kon čnih točkah so na voljo v Dokumentu 
s smernicami OECD št. 19 (7). 
2. Napotki glede izvedbe in razlage te preskusne metode so na voljo v Doku ­
mentu s smernicami št. 39 za preskušanje akutne strupenosti pri vdihavanju (GD 39) (8). 
3. Pojmi, ki se uporabljajo v okviru te preskusne metode, so opredeljeni v 
Dodatku 1 in v GD 39 (8). 
4. S to preskusno metodo se pridobivajo informacije o nevarnih lastnostih in 
omogoča razvrstitev preskusne kemikalije v skladu z Uredbo (ES) 
št. 1272/2008 za razvrš čanje kemikalij, ki povzro čajo akutno strupenost 
(9). Če so potrebne ocenjene vrednosti LC
 50 ali analize odziva na koncen ­
tracijo, je primerno uporabiti preskusno metodo iz poglavja B.2 te priloge (1). Več napotkov o izbiri preskusne metode je na voljo v GD 39 (8). Ta 
preskusna metoda ni posebej namenjena preskušanju posebnih materialov, 
kot so slabo topni izometri čni ali vlaknati materiali ali proizvedeni nanoma ­
teriali.
 
ZAČETNI PREUDARKI 
5. Da se uporaba živali kar najbolj zmanjša, mora preskuševalni laboratorij 
pred razmislekom o preskušanju v skladu s to preskusno metodo preu čiti 
vse razpoložljive informacije o preskusni kemikaliji, vklju čno z obstoje čimi 
študijami, katerih podatki bi omogo čili izognitev dodatnemu preskušanju. 
Informacije, ki lahko pomagajo pri izbiri najprimernejše vrste, seva, spola, načina izpostavljenosti in ustreznih preskusnih koncentracij, vklju čujejo 
identiteto, kemijsko strukturo in fizikalno-kemijske lastnosti preskusne 
kemikalije; rezultate morebitnih preskusov strupenosti  in vitro  ali in vivo ; 
pričakovane uporabe in potencial za izpostavljenost ljudi; razpoložljive 
podatke (Q)SAR in toksikološke podatke o strukturno sorodnih kemikalijah. 
S to preskusno metodo se ne smejo preskušati koncentracije, za katere se 
pričakuje, da bodo zaradi jedkega (
 1 ) ali izrazito dražilnega delovanja 
povzročile hude bole čine in trpljenje (glej GD 39 (8)).  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 759  
( 1 ) Ocena jedkosti lahko temelji na strokovni presoji, v kateri se uporabijo dokazi, kot so: 
izkušnje pri ljudeh in živalih, obstoje či podatki ( in vitro ), npr. poglavji B.40 (10) ali B.40 
bis te priloge (11) ali Smernica za preskušanje OECD št. 435 (12), vrednosti pH, 
informacije o podobnih kemikalijah ali drugi ustrezni podatki.
 NAČELO PRESKUSA 
6. Preskus temelji na na čelu, da se s postopnim postopkom med 4-urno izpo ­
stavljenostjo pridobi dovolj informacij o akutni strupenosti pri vdihavanju preskusne kemikalije, da je mogo če to kemikalijo razvrstiti. Za izpolnitev 
posebnih zakonodajnih namenov se lahko uporabijo tudi druga obdobja 
izpostavljenosti. V vseh to čno določenih fazah koncentracij se preskusijo 
po 3 živali vsakega spola. Glede na smrtnost in/ali umirajo če stanje živali 
lahko za presojo akutne strupenosti preskusne kemikalije zadoš čata 2 fazi. 
Če se zagotovijo dokazi, da je en spol ob čutljivejši od drugega, se lahko 
preskus nadaljuje samo z ob čutljivejšim spolom. Od rezultata predhodne 
faze je odvisna naslednja faza, na primer: 
(a) nadaljnje preskušanje ni potrebno; 
(b) preskušanje s tremi živalmi na spol ali 
(c) preskušanje s 6 živalmi izklju čno občutljivejšega spola, tj. morajo ocene 
spodnje meje razreda strupenosti temeljiti na 6 živalih na skupino za 
preskusno koncentracijo, ne glede na spol. 
7. Umirajo če živali ali živali, ki o čitno trpijo bole čine ali kažejo znake hudega 
in trajnega trpljenja, je treba humano usmrtiti ter jih pri razlagi rezultatov preskusa upoštevati enako kot živali, ki so poginile med preskusom. Merila za sprejetje odlo čitve o usmrtitvi umirajo čih živali ali živali, ki zelo trpijo, in 
napotki za prepoznavanje predvidljive ali neizbežne smrti so obravnavani v 
Dokumentu s smernicami št. 19 o humanih kon čnih točkah (7).
 
OPIS METODE  
Izbira živalske vrste  
8. Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle živali obi čajno uporabljanih labo ­
ratorijskih sevov. Najprimernejša vrsta je podgana, uporabo drugih vrst pa je 
treba utemeljiti.  
Priprava živali  
9. Samice še niso smele kotiti in ne smejo biti breje. Na dan izpostavljenosti 
morajo biti živali mladi odrasli primerki, ki so stari 8 do 12 tednov, njihova teža pa ne sme odstopati za ve č kot ± 20 % od povpre čne teže za vsak spol 
vseh predhodno izpostavljenih živali pri isti starosti. Živali se naklju čno 
izberejo in ozna čijo za posami čno prepoznavanje. Pred za četkom preskusa 
so najmanj 5 dni v kletkah, da se prilagodijo laboratorijskim razmeram. 
Poleg tega jih je treba pred preskušanjem krajše obdobje privajati na 
preskusno aparaturo, saj se tako zmanjša stres, ki ga povzro či uvedba v 
novo okolje.
 
Oskrba živali  
10. Temperatura v prostoru za oskrbo preskusnih živali mora biti 22 ± 3 °C. 
Relativno vlažnost je treba po možnosti ohranjati v obmo čju 30–70 %, 
čeprav to morda ne bo mogo če, kadar se kot nosilec uporablja voda. Pred 
izpostavljanjem in po njem morajo biti živali v kletkah na splošno združene v skupine po spolu in koncentraciji, pri čemer število primerkov na kletko 
ne sme vplivati na neovirano opazovanje posamezne živali ter mora kar 
najbolj zmanjšati izgube zaradi kanibalizma in spopadov. Kadar bo izposta ­
vljen samo nos živali, jih bo morda treba privajati na zadrževalne cevi. Te živalim ne smejo povzro čati prevelikega fizi čnega ali toplotnega stresa ali 
stresa zaradi imobilizacije. Omejevanje gibanja lahko vpliva na fiziološke 
končne točke, kot sta telesna temperatura (hipertermija) in/ali minutni
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 760
 
dihalni volumen. Če so na voljo splošni podatki, ki kažejo, da se takih 
sprememb ne pojavi zelo veliko, predhodno prilagajanje zadrževalnim 
cevem ni potrebno. Živali, ki se izpostavijo aerosolu s celim telesom, morajo biti med izpostavljenostjo nastanjene posami čno, da preskusnega 
aerosola ne morejo filtrirati preko kožuhov drugih primerkov v kletki. 
Razen med izpostavljenostjo se lahko uporablja obi čajna in potrjena labo ­
ratorijska hrana, ki jo spremlja neomejena koli čina pitne vode iz komunal ­
nega omrežja. Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur 
svetlobe/12 ur teme.
 
Inhalacijske komore  
11. Pri izbiri inhalacijske komore je treba upoštevati lastnosti preskusne kemi ­
kalije in cilj preskusa. Po možnosti se kot na čin izpostavljenosti uporabi 
izpostavljenost nosu (imenovana tudi izpostavljenost glave ali smr čka). Izpo­
stavljenost nosu je navadno najprimernejša za študije teko čih ali trdnih 
aerosolov ter za hlape, ki lahko kondenzirajo v aerosole. Mogo če je, da 
bo posebne cilje študije lažje dose či z izpostavljenostjo celega telesa, vendar 
je treba to utemeljiti v poro čilu o študiji. Kadar se uporablja komora za 
izpostavljenost celega telesa, skupni volumen preskusnih živali ne sme presegati 5 % prostornine komore, da se zagotovi stabilnost atmosfere. 
Načela tehnik izpostavljanja nosu in celega telesa ter njune posamezne 
prednosti in pomanjkljivosti so opisani v GD 39 (8).
 
POGOJI IZPOSTAVLJENOSTI  
Dajanje koncentracij  
12. Priporo ča se, da se dolo či štiriurna izpostavljenost, pri čemer ta čas ne 
vključuje časa za vzpostavljanje ravnotežja. Za izpolnitev posebnih zahtev 
je lahko potrebno druga čno obdobje, vendar je treba to utemeljiti v poro čilu 
o študiji (glej GD 39 (8)). Živali, ki so izpostavljene v komorah za izposta ­
vljanje celega telesa, morajo biti nastanjene posami čno, da se prepre či 
zaužitje preskusne kemikalije ob medsebojnem čiščenju primerkov v kletki. 
V obdobju izpostavljenosti je treba živalim odrekati hrano. Med izposta ­
vljenostjo celega telesa lahko ves čas uživajo vodo. 
13. Živali se izpostavijo preskusni kemikaliji v obliki plina, hlapov, aerosola ali 
njihovih zmesi. Agregatno stanje, ki bo preskušeno, je odvisno od 
fizikalno-kemijskih lastnosti preskusne kemikalije, izbrane koncentracije 
in/ali fizikalne oblike, ki bo najverjetneje prisotna med ravnanjem s preskusno kemikalijo in njeno uporabo. Higroskopne in kemi čno reaktivne 
preskusne kemikalije je treba preskušati v suhem ozra čju. Paziti je treba, da 
se ne ustvarijo eksplozivne koncentracije.
 
Porazdelitev velikosti delcev  
14. Za vse aerosole in hlape, ki lahko kondenzirajo v aerosole, je treba dolo čiti 
velikost delcev. Da se omogo či izpostavljenost vseh ustreznih predelov 
dihal, so priporo čeni aerosoli, katerih mediana porazdelitvene mase delcev 
v zraku glede na aerodinami čni premer (MMAD) znaša 1–4 μm z geome ­
tričnim standardnim odklonom ( σ g ) 1,5–3,0 (8) (13) (14). Prizadevanje za 
izpolnitev tega standarda naj bo razumno; če ga ni mogo če izpolniti, je treba 
zagotoviti strokovno presojo. Delci kovinskih hlapov so lahko na primer manjši od tega standarda, naelektreni delci, vlakna in higroskopne snovi 
(katerih velikost se v vlažnem okolju dihal pove ča) pa lahko presegajo 
navedene vrednosti.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 761
 
Priprava preskusne kemikalije v nosilcu  
15. Za ustvarjanje primerne koncentracije in velikosti delcev preskusne kemika ­
lije v atmosferi se lahko uporabi nosilec. Praviloma je treba prednostno uporabiti vodo. Za snov, ki jo tvorijo delci, se lahko uporabijo mehanski 
postopki, da se doseže zahtevana porazdelitev velikosti delcev, vendar je 
treba paziti, da preskusna kemikalija ne razpade ali se spremeni. Kadar se zdi, da so mehanski postopki spremenili sestavo preskusne kemikalije (npr. ob zelo visoki temperaturi, nastali zaradi trenja pri pretiranem mletju), je 
treba sestavo te preskusne kemikalije analitsko preveriti. Skrbno je treba 
paziti, da se preskusna kemikalija ne onesnaži. Nekrušljivih granulatov, ki so namenoma formulirani tako, da jih ni mogo če vdihniti, ni treba presku ­ 
šati. Uporabiti je treba preskus drobljivosti, da se dokaže, da pri ravnanju z 
granulatom ne nastajajo delci, ki jih je mogo če vdihniti. Če v preskusu 
drobljivosti nastanejo snovi, ki jih je mogo če vdihniti, je treba opraviti 
preskus strupenosti pri vdihavanju.
 
Kontrolne živali  
16. Sočasna negativna kontrolna skupina (z zrakom) ni potrebna. Kadar se v 
pomoč pri ustvarjanju preskusne atmosfere uporablja nevodni nosilec, je 
treba kontrolno skupino z nosilcem uporabiti samo, če niso na voljo pretekli 
podatki o strupenosti pri vdihavanju. Če študija strupenosti preskusne kemi ­
kalije, formulirane v nosilcu, ne pokaže strupenosti, iz tega sledi, da nosilec pri preskušeni koncentraciji ni strupen; kontrola z nosilcem torej ni 
potrebna.
 
SPREMLJANJE POGOJEV IZPOSTAVLJENOSTI  
Pretok zraka v komori  
17. Pretok zraka skozi komoro je treba med vsako izpostavljenostjo skrbno 
nadzorovati, stalno spremljati in zabeležiti najmanj vsako uro. Spremljanje 
koncentracije (ali stabilnosti) preskusne atmosfere je meritev, ki je nelo čljivo 
povezana z vsemi dinami čnimi parametri in zagotavlja posredno sredstvo za 
nadzor nad vsemi pomembnimi dinami čnimi parametri ustvarjanja atmos ­
fere. Pri komorah za izpostavljanje nosu je treba posebno pozornost name ­
niti prepre čevanju ponovnega vdihavanja v primerih, v katerih pretok zraka 
skozi sistem izpostavljanja ni zadosten za zagotovitev dinami čnega toka 
atmosfere s preskusno kemikalijo. Za dokazovanje, da v izbranih pogojih postopka ne prihaja do ponovnega vdihavanja, so na voljo predpisane meto ­
dologije (8) (15). Koncentracija kisika mora znašati najmanj 19 %, koncen ­
tracija ogljikovega dioksida pa ne sme presegati 1 %. Če obstajajo razlogi 
za mnenje, da teh standardov ni mogo če izpolniti, je treba koncentraciji 
kisika in ogljikovega dioksida izmeriti.
 
Temperatura in relativna vlažnost v komori  
18. Temperaturo v komori je treba ohranjati pri 22 ± 3 °C. Relativno vlažnost v 
območju dihanja živali je treba pri izpostavljenosti nosu in izpostavljenosti 
celega telesa spremljati ter jo zabeležiti najmanj trikrat, če izpostavljenost 
traja do 4 ure, medtem ko se pri krajših časih izpostavljenosti ta meritev 
zabeleži vsako uro. Relativno vlažnost je treba po možnosti ohranjati v območju 30–70 %, vendar je to lahko bodisi nedosegljivo (npr. pri presku ­ 
šanju zmesi na vodni osnovi) bodisi neizmerljivo zaradi interference 
preskusne kemikalije s preskusno metodo.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 762
 
Preskusna kemikalija: nazivna koncentracija  
19. Vedno, kadar je to izvedljivo, je treba izra čunati in zabeležiti nazivno 
koncentracijo v komori za izpostavljanje. Nazivna koncentracija je masa ustvarjene preskusne kemikalije, deljena s skupnim volumnom zraka, ki 
preide skozi sistem komore. Nazivna koncentracija se ne uporablja za opre ­
deljevanje izpostavljenosti živali, pa č pa pri primerjavi z dejansko koncen ­
tracijo pokaže, kako u činkovito je ustvarjanje preskusnega sistema, in se 
torej lahko uporabi za odkrivanje težav pri tem ustvarjanju.
 
Preskusna kemikalija: dejanska koncentracija  
20. Dejanska koncentracija je koncentracija preskusne kemikalije v obmo čju 
dihanja živali v inhalacijski komori. Meri se s specifi čnimi metodami 
(npr. z neposrednim vzor čenjem, adsorpcijskimi ali kemi čnimi reaktivnimi 
metodami in naknadnim analitskim opredeljevanjem) ali nespecifi čnimi 
metodami, kot je gravimetri čna analiza s filtriranjem. Uporaba gravimetri čne 
analize je sprejemljiva samo za enokomponentne prašne aerosole ali aero ­
sole teko čin z majhno hlapnostjo ter jo je treba pred študijo podpreti z 
ustreznimi opredelitvami, specifi čnimi za preskusno kemikalijo. Z gravime ­
trično analizo se lahko dolo či tudi koncentracija ve čkomponentnega praš ­
nega aerosola, vendar so za to potrebni analitski podatki, ki kažejo, da je 
sestava snovi v zraku podobna za četni snovi. Če te informacije niso na 
voljo, bo morda treba med študijo znova analizirati preskusno kemikalijo (po možnosti takrat, ko lebdi v zraku) v rednih intervalih. Za aerosolizirane snovi, ki lahko izhlapijo ali sublimirajo, je treba prikazati, da so bile vse 
faze zbrane z izbrano metodo. V poro čilu o študiji je treba navesti ciljne, 
nazivne in dejanske koncentracije, vendar se v statisti čnih analizah za 
izračun vrednosti smrtnih koncentracij uporabljajo samo dejanske koncen ­
tracije. 
21. Po možnosti je treba uporabiti eno serijo preskusne kemikalije, preskusni 
vzorec pa je treba hraniti v pogojih, v katerih se ohranjajo njegova čistost, 
homogenost in stabilnost. Pred za četkom študije je treba opredeliti lastnosti 
preskusne kemikalije, vklju čno z njeno čistostjo ter, če je to tehni čno izved­
ljivo, identiteto in koli činami ugotovljenih kontaminantov in ne čistot. To se 
lahko med drugim prikaže z naslednjimi podatki: z retencijskim časom in 
relativno površino vrha, molekulsko maso, ugotovljeno na podlagi analiz z masno spektroskopijo ali plinsko kromatografijo, ali z drugimi ocenami. Čeprav identiteta preskusnega vzorca ni odgovornost preskuševalnega labo ­
ratorija, je morda smotrno, da ta vsaj deloma potrdi naro čnikovo opredelitev 
lastnosti (npr. barvo, agregatno stanje itd.). 
22. Atmosfera v komori za izpostavljanje naj bo konstantna, kolikor je to izved ­
ljivo, ter naj se glede na analitsko metodo spremlja stalno in/ali v rednih intervalih. Kadar se uporablja vzor čenje v intervalih, je treba v štiriurni 
študiji vzorce atmosfere v komori vzeti najmanj dvakrat. Če to zaradi 
omejenih stopenj pretoka zraka ali nizkih koncentracij ni izvedljivo, se 
lahko v celotnem obdobju izpostavljenosti vzame en vzorec. Če se med 
posameznimi vzorci pojavijo izrazita nihanja, je treba pri preskušanju 
naslednjih koncentracij uporabiti štiri vzorce na izpostavljenost. Posamezni 
vzorci koncentracije v komori od srednje koncentracije ne smejo odstopati 
za več kot ± 10 % za pline in hlape oziroma za ve č kot ± 20 % za teko če ali 
trdne aerosole. Izra čunati in zabeležiti je treba čas do vzpostavitve ravno ­
težja v komori (t  95 ). Čas izpostavljenosti pokriva čas ustvarjanja preskusne 
kemikalije, pri tem pa je upoštevan čas, potreben za dosego t  95 . Napotki za 
ocenjevanje t  95 so na voljo v GD 39 (8).  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 763
 
23. Pri zelo kompleksnih zmeseh, sestavljenih iz hlapov/plinov in aerosolov 
(npr. zgorevalnih atmosfer in preskusnih kemikalij, potiskanih iz namenskih 
proizvodov/naprav za posebno uporabo), se lahko v inhalacijski komori vsaka faza obnaša druga če, zato je treba za vsako fazo (hlape/plin in aero ­
sol) izbrati najmanj eno indikatorsko snov (analit), ki je navadno glavna 
aktivna snov v zmesi. Kadar je preskusna kemikalija zmes, je treba analitsko 
koncentracijo navesti za celotno zmes in ne le za aktivno snov ali sestavino (analit). Dodatne informacije o dejanskih koncentracijah so na voljo v GD 39 (8).
 
Preskusna kemikalija: porazdelitev velikosti delcev  
24. Porazdelitev velikosti delcev aerosolov je treba med vsako 4-urno izposta ­
vljenostjo dolo čiti vsaj dvakrat s kaskadnim impaktorjem ali nadomestnim 
instrumentom, kot je aerodinami čni merilnik delcev. Če je mogo če prikazati 
enakovrednost rezultatov, dobljenih s kaskadnim impaktorjem in nadomes ­
tnim instrumentom, se lahko nadomestni instrument uporablja skozi celotno študijo. Vzporedno s primarnim instrumentom je treba za potrditev njegove 
učinkovitosti zbiranja uporabljati še drugo napravo, kot je gravimetri čni 
filter ali (plinska) izpiralka. Masna koncentracija, dobljena z analizo veli ­
kosti delcev, mora biti v razumnih mejah masne koncentracije, dobljene z analizo s filtriranjem (glej GD 39 (8)). Če je enakovrednost mogo če prika­
zati zgodaj v študiji, se lahko nadaljnje potrditvene meritve opustijo. Zaradi 
dobrobiti živali je treba sprejeti ukrepe, da se čim bolj zmanjša koli čina 
pomanjkljivih podatkov, zaradi katerih bi bilo treba izpostavljanje ponoviti. Za hlape je treba velikost delcev dolo čiti, če obstaja možnost, da se bodo 
hlapi kondenzirali v aerosol, ali če se v atmosferi s hlapi, v kateri so mogo če 
mešane faze, zaznajo delci (glej odstavek 14).
 
POSTOPEK  
Glavni preskus  
25. V vsaki fazi se uporabijo tri živali na spol ali šest živali ob čutljivejšega 
spola. Če se z nosom izpostavijo vrste glodavcev, ki niso podgane, se lahko 
najdaljša obdobja izpostavljenosti prilagodijo, da se kar najbolj zmanjša trpljenje, zna čilno za uporabljeno vrsto. Koncentracija, ki bo uporabljena 
kot začetni odmerek, se izbere med štirimi to čno določenimi koncentraci ­
jami, začetna koncentracija pa mora biti tista, ki bo najverjetneje povzro čila 
zastrupitev pri nekaterih od živali, ki bodo prejele odmerek. Sheme presku ­ 
šanja za pline, hlape in aerosole (vklju čene v dodatke 2–4) ponazarjajo 
preskušanje z mejnimi vrednostmi kategorij 1–4 iz Uredbe (ES) 
št. 1272/2008 (9) za pline (100, 500, 2500, 20000 ppm/4 h) (Dodatek 2), hlape (0,5, 2, 10, 20 mg/l/4 h) (Dodatek 3) in aerosole (0,05, 0,5, 1, 5 mg/l/4 h) (Dodatek 4). Kategorija 5, ki se v navedeni uredbi ne izvaja, se 
nanaša na koncentracije nad zadevnimi mejnimi koncentracijami. Za vsako 
začetno koncentracijo se uporablja zadevna shema preskušanja. Glede na 
število humano usmr čenih ali poginulih živali se v preskusnem postopku 
sledi prikazanim puš čicam, dokler ni mogo ča razvrstitev v kategorijo. 
26. Časovni interval med skupinami za izpostavljanje je dolo čen glede na 
nastop, trajanje in resnost strupenih znakov. Z izpostavljanjem živali 
naslednji stopnji koncentracije je treba po čakati, dokler ni mogo če z 
razumno gotovostjo sklepati o preživetju predhodno preskušenih živali. Med izpostavljanji naslednji stopnji koncentracije je priporo čljivo počakati 
tri ali štiri dni, da se omogo či opazovanje zapoznele strupenosti. Časovni 
interval se lahko ustrezno prilagodi, npr. pri neopredeljivih odzivih.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 764
 
Mejni preskus  
27. Mejni preskus se uporabi, kadar je znano ali se pri čakuje, da je preskusna 
kemikalija prakti čno nestrupena, tj. da povzro či toksično reakcijo samo nad 
zakonsko predpisano mejno koncentracijo. Informacije o strupenosti 
preskusne kemikalije se lahko pridobijo na podlagi znanja o podobnih 
preskušenih snoveh ali podobnih zmeseh ob upoštevanju identitete in odstotka sestavin, za katere je znano, da so toksikološko pomembne. Kadar je informacij o strupenosti preskusne kemikalije malo oziroma jih 
ni ali kadar se pri čakuje, da je strupena, je treba opraviti glavni preskus 
(več napotkov je na voljo v GD 39 (8)). 
28. Z obi čajnim postopkom se tri živali na spol ali šest živali ob čutljivejšega 
spola izpostavi koncentraciji 20000 ppm za pline, 20 mg/l za hlape oziroma 
5 mg/l za prah/meglice ( če so te koncentracije dosegljive), kar se uporabi 
kot mejni preskus za to preskusno metodo. Pri preskušanju aerosolov mora biti glavni cilj ustvariti delce takšne velikosti, da jih je mogo če vdihniti (tj. 
MMAD 1–4 μm). To je mogo če z večino preskusnih kemikalij pri koncen ­
traciji 2 mg/l. Preskušanje aerosolov pri koncentracijah, višjih od 2 mg/l, se lahko izvaja samo, če se lahko zagotovi delce takšne velikosti, da jih je 
mogoče vdihniti (glej GD 39 (8)). V skladu z globalno usklajenim sistemom 
za razvrš čanje in ozna čevanje kemikalij (GHS) (16) se zaradi dobrobiti 
živali preskušanje nad mejno koncentracijo odsvetuje. Preskušanje v kate ­
goriji 5 v skladu z GHS (16), ki se v Uredbi (ES) št. 1272/2008 (9) ne izvaja, se sme predvideti samo, kadar obstaja velika verjetnost, da bodo 
rezultati takega preskusa neposredno pomembni za varovanje zdravja ljudi, 
poleg tega pa je treba to utemeljiti v poro čilu o študiji. V primeru poten ­
cialno eksplozivnih preskusnih kemikalij je treba paziti, da se ne ustvarijo ugodni pogoji za eksplozijo. Zaradi izogibanja nepotrebni uporabi živali je 
treba pred mejnim preskusom opraviti preskus brez živali in tako zagotoviti, 
da je v komori mogo če doseči pogoje za mejni preskus.
 
OPAZOVANJA 
29. Med obdobjem izpostavljenosti je treba živali pogosto klini čno opazovati. 
Po izpostavljenosti je treba klini čna opazovanja izvajati skupno 14 dni, in 
sicer na dan izpostavljenosti najmanj dvakrat ali pogosteje, če to nakazuje 
odziv živali na tretiranje, nato pa najmanj enkrat na dan. Dolžina obdobja 
opazovanja ni to čno določena, pač pa jo je treba dolo čiti glede na naravo in 
čas nastopa klini čnih znakov ter dolžino obdobja okrevanja. Časi pojava in 
izginotja pokazateljev strupenosti so pomembni, zlasti če se ti znaki nagi ­
bajo k zapoznelosti. Vsa opažanja se sistemati čno zabeležijo, pri čemer se 
evidence vodijo za vsako žival posebej. Umirajo če živali ter živali, ki kažejo 
znake hude bole čine in/ali trajnega in hudega trpljenja, je treba zaradi 
njihove dobrobiti humano usmrtiti. Pri pregledih za klini čnimi pokazatelji 
strupenosti je treba paziti, da se za četni slab videz in prehodne spremembe v 
dihanju, ki so posledica postopka izpostavljanja, ne zamenjajo za u činke, 
povezane s tretiranjem. Upoštevati je treba na čela in merila, povzeta v 
Dokumentu s smernicami o humanih kon čnih točkah (7). Kadar se živali 
usmrtijo iz humanih razlogov ali so najdene poginule, je treba čas smrti 
zabeležiti čim natančneje. ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 765
 
30. Opazovanja v kletkah morajo vklju čevati spremembe na koži in kožuhu, 
očeh in sluznicah, v dihalih, obto čilih, avtonomnem in osrednjem živ čevju 
ter pri somatomotori čnih aktivnostih in vedenjskih vzorcih. Kadar je to 
mogoče, je treba zabeležiti vsa razlikovanja med lokalnimi in sistemskimi 
učinki. Pozorno je treba opazovati tremorje, kr če, slinjenje, drisko, letargijo, 
spanje in komo. Z merjenjem rektalne temperature se lahko pridobijo 
podporni dokazi o refleksni bradipneji ali hipo-/hipertermiji, povezani s tretiranjem ali konfinacijo.
 
Telesna teža  
31. Težo posameznih živali je treba zabeležiti enkrat v obdobju prilagajanja na 
okolje, na dan izpostavljenosti pred izpostavljenostjo (dan 0) ter vsaj 1., 3. in 7. dan (nato pa tedensko), poleg tega pa še ob poginu ali evtanaziji, če ta 
nastopi po 1. dnevu. Telesna teža se priznava kot bistveni kazalnik strupe ­
nosti, tako da je treba živali, pri katerih se v primerjavi z vrednostmi pred 
študijo opazi trajen upad za ≥ 20 %, skrbno spremljati. Preživele živali se ob 
koncu obdobja po izpostavljenosti stehtajo in humano usmrtijo.
 
Patologija  
32. Na vseh preskusnih živalih, vklju čno s tistimi, ki med preskusom poginejo 
ali so evtanazirane in odstranjene iz študije zaradi njihove dobrobiti, je treba opraviti makroskopsko obdukcijo. Če je ni mogo če opraviti takoj po odkritju 
poginule živali, je treba žival ohladiti (ne zamrzniti) na dovolj nizko tempe ­
raturo, da se avtoliza čim bolj zmanjša. Obdukcijo je treba opraviti čim prej, 
navadno v dnevu ali dveh. Za vsako žival je treba zabeležiti vse makro ­
skopske patološke spremembe s posebnim poudarkom na spremembah dihal. 
33. Za razširitev razlagalne vrednosti študije se lahko razmisli o dodatnih 
samoumevno vklju čenih pregledih, kot sta tehtanje plju č preživelih podgan 
in/ali zagotavljanje dokazov o dražilnosti z mikroskopskim pregledom dihal. Med pregledanimi organi so lahko tudi tisti, ki kažejo makroskopske pato ­
loške znake pri živalih, ki so preživele 24 ur ali ve č, in organi, za katere je 
znano ali se pri čakuje, da so prizadeti. Mikroskopski pregled celotnih dihal 
lahko zagotovi koristne informacije za preskusne kemikalije, ki reagirajo z vodo, kot so kisline in higroskopne preskusne kemikalije.
 
PODATKI IN PORO ČANJE  
Podatki  
34. Zagotoviti je treba podatke o telesni teži in ugotovitvah obdukcije posa ­
meznih živali. Podatke o klini čnih opazovanjih je treba povzeti v pregled ­
nicah, v katerih se za vsako preskusno skupino navedejo število upora ­
bljenih živali, število živali, ki kažejo specifi čne znake zastrupitve, število 
živali, ki so bile najdene poginule med preskusom ali usmr čene iz humanih 
razlogov, čas smrti posameznih živali, opis in časovni potek strupenih 
učinkov in reverzibilnosti ter ugotovitve obdukcije.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 766
 
Poročilo o preskusu  
35. Poro čilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije, kot je primerno:  
Preskusne živali in oskrba  
— opis pogojev v kletkah, vklju čno s številom (ali spremembo števila) 
živali na kletko, nastiljem, temperaturo prostora in relativno vlažnostjo, fotoperiodo ter opredelitvijo hrane, 
— uporabljeno vrsto/sev in utemeljitev uporabe vrste, ki ni podgana, 
— število, starost in spol živali, 
— metodo randomizacije, 
— podatke o kakovosti hrane in vode (vklju čno z vrsto/virom hrane in 
virom vode), 
— opis morebitne priprave živali pred preskusom, vklju čno s hrano, karan ­
teno in zdravljenjem.  
Preskusna kemikalija  
— agregatno stanje, čistost in, če je to ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti 
(vključno z izomerizacijo), 
— identifikacijske podatke in registrsko številko Službe za izmenjavo 
kemijskih izvle čkov (CAS), če je znana.  
Nosilec  
— utemeljitev uporabe nosilca in utemeljitev izbire nosilca ( če to ni voda), 
— pretekle ali teko če podatke, ki dokazujejo, da nosilec ne vpliva na 
rezultat študije.  
Inhalacijska komora  
— opis inhalacijske komore, vklju čno z merami in prostornino, 
— izvor in opis opreme, uporabljene za izpostavljanje živali in ustvarjanje 
atmosfere, 
— opremo za merjenje temperature, vlažnosti, velikosti delcev in dejanske 
koncentracije, 
— vir zraka, obdelavo dovajanega/odvajanega zraka in sistem za klimatizi ­
ranje, 
— metode, uporabljene za umerjanje opreme za zagotavljanje homogene 
preskusne atmosfere, 
— razliko v tlaku (pozitivna ali negativna), 
— izpostavitvene odprtine na komoro (izpostavljanje nosu); položaj živali v 
sistemu (izpostavljanje celega telesa), 
— časovno homogenost/stabilnost preskusne atmosfere, 
— položaj tipal za zaznavanje temperature in vlažnosti ter mesto vzor čenja 
preskusne atmosfere v komori, 
— stopnje pretoka zraka, stopnjo pretoka zraka/izpostavitveno odprtino 
(izpostavljanje nosu) ali število živali/komoro (izpostavljanje celega tele ­
sa), 
— informacije o opremi, uporabljeni za merjenje kisika in ogljikovega 
dioksida, če je ustrezno,
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 767
 
— čas, potreben za vzpostavitev ravnotežja v inhalacijski komori (t  95 ), 
— število zamenjav volumnov zraka na uro, — merilne naprave ( če je ustrezno).  
Podatki o izpostavljenosti  
— utemeljitev izbire ciljne koncentracije v glavni študiji, — nazivne koncentracije (skupna masa ustvarjene preskusne kemikalije v 
inhalacijski komori, deljena z volumnom zraka, ki preide skozi komoro), 
— dejanske koncentracije preskusne kemikalije, ki se vzamejo v obmo čju 
dihanja živali; za preskusne zmesi, pri katerih nastajajo heterogene fizi ­
kalne oblike (plini, hlapi, aerosoli), se lahko vsaka analizira lo čeno, 
— vse koncentracije v zraku je treba navesti v masnih enotah (npr. mg/l, 
mg/m
 3 itd.); v oklepajih se lahko navedejo tudi prostorninske enote (npr. 
ppm, ppb), 
— porazdelitev velikosti delcev, mediano porazdelitvene mase delcev v 
zraku glede na aerodinami čni premer (MMAD) in geometri čni stan­
dardni odklon ( σg), vključno z metodami za njihov izra čun. Poročati 
je treba o posameznih analizah velikosti delcev.  
Preskusni pogoji  
— podatke o pripravi preskusne kemikalije, vklju čno s podrobnostmi o 
postopkih, uporabljenih za zmanjšanje velikosti delcev trdnih snovi ali pripravo raztopin preskusne kemikalije. Kadar obstaja možnost, da so mehanski postopki spremenili sestavo preskusne kemikalije, je treba 
vključiti rezultate analiz za preverjanje sestave te preskusne kemikalije, 
— opis (ki po možnosti vklju čuje diagram) opreme, uporabljene za ustvar ­
janje preskusne atmosfere in izpostavljanje živali preskusni atmosferi, 
— podatke o uporabljeni kemijski analitski metodi in njeni validaciji 
(vključno z rekuperacijo preskusne kemikalije iz nosilca za vzor čenje), 
— utemeljitev dolo čitve preskusnih koncentracij.  
Rezultati  
— preglednice o temperaturi, vlažnosti in pretoku zraka v komori, — preglednice s podatki o nazivnih in dejanskih koncentracijah, 
— preglednice s podatki o velikosti delcev, vklju čno s podatki o analitskem 
vzorčenju, porazdelitvijo velikosti delcev ter izra čuni MMAD in σ
 g , 
— preglednice s podatki o odzivu in koncentracijah za vsako žival (tj. za 
živali, ki kažejo znake strupenosti, vklju čno s smrtnostjo ter naravo, 
resnostjo in trajanjem u činkov), 
— telesne teže posameznih živali, izmerjene med študijo, datum in čas 
smrti, če je ta nastopila pred predvideno evtanazijo; časovni potek 
nastopa znakov zastrupitve in ali so bili ti reverzibilni za vsako žival,  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 768
 
— izsledke obdukcije in histopatološke preiskave za vsako žival, če so na 
voljo, 
— razvrstitev kategorij po Uredbi (ES) št. 1272/2008 in mejno vrednost 
LC 50 . 
Razprava in razlaga rezultatov  
— poseben poudarek je treba nameniti opisu metod, uporabljenih za izpol ­
nitev meril te preskusne metode, npr. glede mejne koncentracije ali velikosti delcev, 
— z vidika splošnih ugotovitev je treba obravnavati možnost vdihavanja 
delcev, zlasti če meril glede velikosti delcev ni bilo mogo če izpolniti, 
— v splošno oceno študije je treba vklju čiti doslednost metod, uporabljenih 
za določanje nazivne in dejanske koncentracije, ter razmerje med njima, 
— obravnavati je treba verjetni vzrok smrti in prevladujo či način delovanja 
(sistemski ali lokalni), 
— če je bilo treba na podlagi meril iz Dokumenta s smernicami OECD o 
humanih kon čnih točkah (7) humano žrtvovati živali, ki so trpele bole ­ 
čine ali kazale znake hudega in trajnega trpljenja, je treba to pojasniti.
 
VIRI:  
(1) Poglavje B.2 te priloge, Akutna strupenost pri vdihavanju. 
(2) Holzhütter, H.-G., Genschow, E., Diener, W., in Schlede, E. (2003). Dermal 
and Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biome ­
tric Evaluations for the Globally Harmonized Classification System. Arch. Toxicol. 77: 243–254. 
(3) Diener, W., Kayser, D., in Schlede, E. (1997). The Inhalation Acute-Toxic- 
Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations. Arch. Toxicol. 
71: 537–549. 
(4) Diener, W., in Schlede, E. (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives 
to LD/LC
 50 Tests. ALTEX 1: 129–134. 
(5) Poglavje B.1 tris te priloge, Akutna oralna toksi čnost – metoda razredov 
akutne toksi čnosti. 
(6) OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the 
Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation 
Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 105, OECD, Pariz. Na voljo na: http://www.oecd.org/ env/testguidelines. 
(7) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19. Na voljo na: http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines. 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment No. 39, OECD, Pariz. Na voljo na: http://www.oecd.org/env/testgui ­
delines. 
(9) Uredba (ES) št. 1272/2008 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 
16. decembra 2008 o razvrš čanju, ozna čevanju in pakiranju snovi ter zmesi, 
o spremembi in razveljavitvi direktiv 67/548/EGS in 1999/45/ES ter spre ­
membi Uredbe (ES) št. 1907/2006 (UL L 353, 31.12.2008, str. 1).
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 769
 
(10) Poglavje B.40 te priloge, Jedkost za kožo  in vitro : preskus transkutane 
električne upornosti (TER). 
(11) Poglavje B.40 bis te priloge, Jedkost za kožo  in vitro : preskus z modelom 
človeške kože. 
(12) OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. 
OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Pariz. Na voljo na: http://www.oecd.org/env/testguidelines. 
(13) Phalen, R. F. (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2. 
izdaja) Informa Healthcare, New York. 
(14) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321–327. 
(15) Pauluhn, J., in Thiel, A. (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 
160–167. 
(16) OZN (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, OZN New York in 
Ženeva. Na voljo na: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_wel ­
come_e.html.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 770
 
Dodatek 1  
OPREDELITEV POJMOV  
Preskusna kemikalija:  snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne 
metode.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 771
 
Dodatek 2  
Postopek, ki ga je treba upoštevati pri vsaki za četni koncentraciji za 
pline (ppM/4 H)  
Splošne opombe (  1 ) 
Za vsako za četno koncentracijo je v zadevnih shemah preskušanja, vklju čenih v 
ta dodatek, prikazan postopek, ki ga je treba upoštevati. 
Dodatek 2a: za četna koncentracija je 100 ppm 
Dodatek 2b: za četna koncentracija je 500 ppm 
Dodatek 2c: za četna koncentracija je 2500 ppm 
Dodatek 2d: za četna koncentracija je 20000 ppm 
Glede na število humano usmr čenih ali poginulih živali se v preskusnem 
postopku sledi prikazanim puš čicam.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 772  
( 1 ) Spodnje preglednice vsebujejo sklicevanja na globalno usklajeni sistem za razvrš čanje in 
označevanje kemikalij (GHS). V EU se enakovreden sistem izvaja z Uredbo (ES) 
št. 1272/2008. V primeru akutne strupenosti pri vdihavanju se z Uredbo (ES) 
št. 1272/2008 (9) ne izvaja kategorija 5.
 Dodatek 2a  
Akutna strupenost pri vdihavanju:  
preskusni postopek z za četno koncentracijo 100 ppm/4 h za pline
  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 773
 
Dodatek 2b  
Akutna strupenost pri vdihavanju:  
preskusni postopek z za četno koncentracijo 500 ppm/4 h za pline
  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 774
 
Dodatek 2c  
Akutna strupenost pri vdihavanju:  
preskusni postopek z za četno koncentracijo 2500 ppm/4 h za pline
  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 775
 
Dodatek 2d  
Akutna strupenost pri vdihavanju:  
preskusni postopek z za četno koncentracijo 20000 ppm/4 h za pline
  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 776
 
Dodatek 3  
Postopek, ki ga je treba upoštevati pri vsaki za četni koncentraciji za 
hlape (mg/L/4 H)  
Splošne opombe (  1 ) 
Za vsako za četno koncentracijo je v zadevnih shemah preskušanja, vklju čenih v 
ta dodatek, prikazan postopek, ki ga je treba upoštevati. 
Dodatek 3a: za četna koncentracija je 0,5 mg/l 
Dodatek 3b: za četna koncentracija je 2,0 mg/l 
Dodatek 3c: za četna koncentracija je 10 mg/l 
Dodatek 3d: za četna koncentracija je 20 mg/l 
Glede na število humano usmr čenih ali poginulih živali se v preskusnem 
postopku sledi prikazanim puš čicam.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 777  
( 1 ) Spodnje preglednice vsebujejo sklicevanja na globalno usklajeni sistem za razvrš čanje in 
označevanje kemikalij (GHS). V EU se enakovreden sistem izvaja z Uredbo (ES) 
št. 1272/2008. V primeru akutne strupenosti pri vdihavanju se z Uredbo (ES) 
št. 1272/2008 (9) ne izvaja kategorija 5.
 Dodatek 3a  
Akutna strupenost pri vdihavanju:  
preskusni postopek z za četno koncentracijo 0,5 mg/L/4 h za hlape
  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 778
 
Dodatek 3b  
Akutna strupenost pri vdihavanju:  
preskusni postopek z za četno koncentracijo 2 mg/L/4 h za hlape
  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 779
 
Dodatek 3c  
Akutna strupenost pri vdihavanju:  
preskusni postopek z za četno koncentraci jo 10 mg/L/4 h za hlape
  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 780
 
Dodatek 3d  
Akutna strupenost pri vdihavanju:  
preskusni postopek z za četno koncentracijo 20 mg/L/4 h za hlape
  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 781
 
Dodatek 4  
Postopek, ki ga je treba upoštevati pri vsaki za četni koncentraciji za 
aerosole (mg/L/4 H)  
Splošne opombe  ( 1 ) 
Za vsako za četno koncentracijo je v zadevnih shemah preskušanja, vklju čenih v 
ta dodatek, prikazan postopek, ki ga je treba upoštevati. 
Dodatek 4a: za četna koncentracija je 0,05 mg/l 
Dodatek 4b: za četna koncentracija je 0,5 mg/l 
Dodatek 4c: za četna koncentracija je 1 mg/l 
Dodatek 4d: za četna koncentracija je 5 mg/l 
Glede na število humano usmr čenih ali poginulih živali se v preskusnem 
postopku sledi prikazanim puš čicam.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 782  
( 1 ) Spodnje preglednice vsebujejo sklicevanja na globalno usklajeni sistem za razvrš čanje in 
označevanje kemikalij (GHS). V EU se enakovreden sistem izvaja z Uredbo (ES) 
št. 1272/2008. V primeru akutne strupenosti pri vdihavanju se z Uredbo (ES) 
št. 1272/2008 (9) ne izvaja kategorija 5.
 Dodatek 4a  
Akutna strupenost pri vdihavanju:  
preskusni postopek z za četno koncentraci jo 0,05 mg/L/4 h za aerosole
  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 783
 
Dodatek 4b  
Akutna strupenost privdihavanju:  
preskusni postopek z za četno koncentracijo 0,5 mg/L/4 h za aerosole
  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 784
 
Dodatek 4c  
Akutna strupenost pri vdihavanju:  
preskusni postopek z za četno koncentracijo 1 mg/L/4 h za aerosole
  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 785
 
Dodatek 4d  
Akutna strupenost pri vdihavanju:  
preskusni postopek z za četno koncentracijo 5 mg/L/4 h za aerosole
  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 786
 
B.53  ŠTUDIJA RAZVOJNE NEVROTOKSI ČNOSTI  
UVOD 
1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) št. 426 
(2007). Delovna skupina OECD za strupenost za razmnoževanje in razvoj je 
junija 1995 v Københavnu obravnavala potrebo po posodobitvi obstoje čih 
smernic za preskušanje OECD za strupenost za razmnoževanje in razvoj ter pripravo novih smernic za kon čne točke, ki še niso zajete (1). Delovna 
skupina je priporo čila, da bi bilo treba smernico za preskušanje v zvezi z 
razvojno nevrotoksi čnostjo pripraviti na podlagi smernice ameriške agencije 
EPA, ki je bila tudi že revidirana (2). Junija 1996 je v Københavnu pote ­
kalo drugo posvetovalno zasedanje, da bi se sekretariatu predložili napotki za pripravo nove smernice za preskušanje v zvezi s strupenostjo za razvoj, 
vključno s pomembnimi dejavniki, npr. podrobnostmi o izbiri živalskih vrst, 
obdobjem odmerjanja, preskusnim obdobjem, kon čnimi točkami, ki jih je 
treba oceniti, in merili za vrednotenje rezultatov. Leta 1998 je bila obja ­
vljena ameriška smernica za oceno tveganja nevrotoksi čnosti (3). Oktobra 
2000 sta drug za drugim potekala strokovno posvetovalno zasedanje OECD 
in delavnica Inštituta za tvegano znanost ILSI, leta 2005 pa je bilo v Tokiu organizirano strokovno posvetovalno zasedanje. Namen teh sre čanj je bila 
obravnava znanstvenih in tehni čnih vprašanj, povezanih z obstoje čo smer­
nico za preskušanje, priporo čila z zasedanj (4) (5) (6) (7) pa so se upošte ­
vala pri pripravi te testne metode. Dodatne informacije o izvedbi, interpre ­
taciji in terminologiji, uporabljeni za to preskusno metodo, so navedene v smernicah OECD št. 43 ‘Reproductive Toxicity Testing and Assessment’ 
(8) in št. 20 ‘Neurotoxicity Testing’ (9).
 
ZAČETNI PREUDARKI 
2. Znano je, da številne kemikalije povzro čajo razvojne nevrotoksi čne učinke 
pri človeku in drugih vrstah (10) (11) (12) (13). Za oceno in vrednotenje 
strupenih lastnosti kemikalije je lahko potrebna dolo čitev možnosti za 
razvojno nevrotoksi čnost. Študije razvojne nevrotoksi čnosti so namenjene 
zagotavljanju podatkov o možnih funkcionalnih in morfoloških u činkih na 
razvijajoči se živčni sistem potomca, ki lahko nastanejo zaradi izpostavlje ­
nosti v maternici in zgodnjem življenjskem obdobju, vklju čno z opredelit ­
vami odziva na odmerek. 
3. Študija razvojne nevrotoksi čnosti se lahko izvede kot lo čena študija, lahko 
je vključena v študijo strupenosti za razmnoževanje in/ali nevrotoksi čnosti 
pri odraslih (npr. preskusne metode B.34 (14), B.35 (15) in B.43 (16)) ali 
dodana študiji strupenosti za predrojstveni razvoj (npr. preskusna metoda 
B.31 (17)). Če je študija razvojne nevrotoksi čnosti vklju čena v drugo 
študijo ali ji je dodana, je treba ohraniti celovitost obeh vrst študij. Vsi 
preskusi morajo biti v skladu z veljavno zakonodajo ali vladnimi in insti ­
tucionalnimi smernicami za uporabo laboratorijskih živali v raziskavi (npr. 18). 
4. Preskuševalni laboratorij mora pred za četkom izvajanja študije preu čiti vse 
razpoložljive informacije o preskusni kemikaliji. Takšne informacije vklju ­ 
čujejo vrsto in strukturo kemikalije, njene fizikalno-kemijske lastnosti, 
rezultate katerih koli drugih preskusov strupenosti kemikalije  in vitro  ali 
in vivo , toksikološke podatke o strukturno sorodnih kemikalijah in pri čako­
vane uporabe kemikalije. Te informacije so potrebne, da se vsem, ki jih to 
zadeva, zagotovi, da je preskus pomemben za zaš čito zdravja ljudi in da bo 
v pomoč pri izbiri ustreznega za četnega odmerka.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 787
 
NAČELO PRESKUSA 
5. Preskusna kemikalija se živalim daje med brejostjo in laktacijo. Matere se 
preskušajo za oceno u činkov na breje in doje če samice, pri čemer se lahko 
zagotovijo tudi primerjalne informacije (matere v primerjavi s potomci). Potomci se za vrednotenje nevrotoksi čnosti naklju čno izberejo iz legel. 
Vrednotenje zajema opazovanje makroskopskih nevroloških in vedenjskih 
sprememb, vklju čno z oceno telesnega razvoja, vedenjske ontogenije, moto ­
rične aktivnosti, motori čne in senzori čne funkcije, u čenja in spominjanja ter 
vrednotenjem teže možganov in nevropatologije med poporodnim razvojem in odraslo dobo. 
6. Če je preskusna metoda izvedena kot lo čena študija, se lahko dodatne 
razpoložljive živali iz vsake skupine uporabijo za posebne nevrovedenjske, nevropatološke, nevrokemi čne ali elektrofiziološke postopke, ki lahko 
dopolnijo podatke, dobljene s preiskavami, ki se priporo čajo po tej metodi 
(16) (19) (20) (21). Dopolnilni postopki so lahko posebno koristni, kadar 
empirična opazovanja, pri čakovani u činki ali mehanizem/na čin delovanja 
kaže posebno vrsto nevrotoksi čnosti. Ti dopolnilni postopki se lahko upora ­
bijo pri materah in mladi čih. Uporabijo se lahko tudi postopki  ex vivo  ali in 
vitro , če ne spremenijo celovitosti postopkov  in vivo .
 
PRIPRAVE ZA PRESKUS  
Izbira živalskih vrst  
7. Priporo čena preskusna vrsta je podgana; druge vrste se lahko uporabijo, če 
je primerno. Vendar je treba opozoriti, da so dnevi brejosti in dnevi po 
rojstvu, navedeni v tej preskusni metodi, zna čilni za obi čajno uporabljene 
seve podgan, pri čemer je treba izbrati primerljive dneve, če se uporabijo 
druge vrste ali neobi čajni sev. Uporabo drugih vrst je treba utemeljiti na 
podlagi podatkov o strupenosti, farmakokineti čnih podatkov in/ali drugih 
podatkov. Utemeljitev mora vklju čevati razpoložljivost poporodnih nevro ­
vedenjskih in nevropatoloških ocen za posamezne vrste. Če že obstaja 
preskus, ki je povzro čil zaskrbljenost, bi bilo treba razmisliti o uporabi 
vrste/seva, ki je povzro čil zaskrbljenost. Zaradi razli čne učinkovitosti razli ­ 
čnih sevov podgan je treba dokazati, da je sev, ki je bil izbran za uporabo, 
ustrezno ploden in odziven. Dokumentirati je treba zanesljivost in ob čut­
ljivost drugih vrst za zaznavanje razvojne nevrotoksi čnosti.  
Nastanitveni in prehranjevalni pogoji  
8. Temperatura v prostoru za preskusne živali mora biti 22 ± 3 °C. Čeprav 
mora biti relativna vlažnost vsaj 30 % in po možnosti ne presega 70 %, 
razen med čiščenjem prostora, mora biti cilj 50–60 %. Osvetlitev mora biti 
umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Ciklus osvet ­
litve se lahko pred parjenjem in med izvajanjem študije tudi obrne, da se 
izvede ocena funkcionalnih in vedenjskih kon čnih točk v obdobju teme (pri 
rdeči svetlobi), tj. ko so živali obi čajno aktivne (22). Vse spremembe 
ciklusa svetlobe in teme morajo vklju čevati ustrezno aklimatizacijo, da se 
živalim omogo či prilagoditev na novi ciklus. Za hranjenje se lahko upora ­
blja običajna laboratorijska hrana z neomejeno koli čino pitne vode. Nave ­
deta se vrsta hrane in vode, obe pa se analizirata za kontaminante.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 788
 
9. Živali se lahko nastanijo posami čno ali dajo v kletke v manjših skupinah 
istega spola. Parjenje se mora izvajati v kletkah, ki so primerne za ta 
namen. Po dokazu o kopulaciji ali najpozneje 15. dan brejosti se sparjene živali naselijo v kletke za kotitev ali kletke za matere. Kletke je treba razporediti tako, da so morebitni u činki zaradi njihovega položaja čim 
manjši. Ko je kotitev blizu, je treba sparjenim samicam zagotoviti ustrezen 
in določen material za izdelavo gnezda. Dobro znano je, da ima lahko 
neustrezno ravnanje ali stres med brejostjo neugodne posledice, vklju čno 
izgubo zarodka ter spremenjenim razvojem pred rojstvom in po njem. Da bi 
preprečili predrojstveno izgubo zaradi dejavnikov, ki niso povezani s treti ­
ranjem, je treba z živalmi med brejostjo ravnati previdno ter se izogibati stresu zaradi zunanjih dejavnikov, na primer čezmernega zunanjega hrupa.
 
Priprava živali  
10. Uporabiti je treba zdrave živali, ki so prilagojene na laboratorijske razmere 
in predhodno niso bile uporabljene za poskuse, razen če je študija vklju čena 
v drugo študijo (glej odstavek 3). Opredeliti je treba vrsto, sev, vir, spol, 
težo in starost preskusnih živali. Vsaki živali se dodeli edinstvena identifi ­
kacijska številka, s katero se ozna či. Živali iz vseh preskusnih skupin 
morajo imeti čim bolj enako težo in starost ter biti v obi čajnem razponu 
vrst in seva iz študije. Za vsako velikost odmerka je treba uporabiti mlade 
odrasle samice, ki še niso kotile. Sorojenci se ne smejo pariti, kar je treba 
skrbno zagotoviti. Dan brejosti (DB) 0 je dan, ko se opazi vaginalni čep 
in/ali seme. Pri nakupu brejih živali pri dobavitelju je treba omogo čiti 
ustrezen čas aklimatizacije (npr. 2–3 dni). Sparjene samice je treba na 
nepristranski na čin razdeliti v kontrolne in tretirane skupine ter jih med 
skupinami čim bolj enakomerno porazdeliti (npr. za zagotovitev enako ­
merne porazdelitve med skupinami, kot je razdelitev na podlagi telesne teže, se priporo ča stratificiran naklju čni postopek). Samice, ki jih osemeni 
isti samec, je treba enakomerno razdeliti med skupine.
 
POSTOPEK  
Število in spol živali  
11. Vsaka preskusna in kontrolna skupina mora vklju čevati zadostno število 
brejih samic, ki bodo izpostavljene preskusni kemikaliji, za zagotovitev, 
da se skoti ustrezno število potomcev za vrednotenje nevrotoksi čnosti. Za 
vsak odmerek je priporo čenih 20 zarodov. Zasnove za odmerjanje v pono ­
vitveni in postopni skupini so dovoljene, če je doseženo skupno število 
zarodov na skupino in se za ponovitve upoštevajo ustrezni statisti čni 
modeli. 
12. Na poporodni dan (PPD) 4 ali pred njim (dan kotitve je PPD 0) je treba 
velikost posameznega zaroda prilagoditi z naklju čno izločitvijo odve čnih 
mladičev, da so vsi zarodi enako veliki (23). Velikost zaroda ne sme prese ­
gati povpre čne velikosti zaroda za uporabljeni sev glodavcev (8–12). V 
zarodu mora biti čim bolj uravnoteženo število mladih samcev in samic. 
Selektivno izlo čanje mladi čev, npr. na podlagi telesne teže, ni ustrezno. Po 
standardizaciji zarodov (izlo čevanju) in pred nadaljnjim preskušanjem funk ­
cionalnih kon čnih točk je treba posamezne mladi če, ki so predvideni za 
preskušanje pred odstranitvijo od sesanja in po njej, ozna čiti z edinstvenimi 
oznakami s pomo čjo katere koli primerne humane metode ozna čevanja 
mladičev (npr. 24).  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 789
 
Dodelitev živali za funkcionalne in vedenjske preskuse, tehtanje 
možganov ter nevropatološka vrednotenja  
13. Preskusna metoda omogo ča različne pristope glede na dodelitev živali, ki so 
bile izpostavljene  in utero  in v obdobju laktacije, za funkcionalne in 
vedenjske preskuse, spolno zrelost, dolo čanje teže možganov ter nevropa ­
tološko vrednotenje (25). Drugi preskusi nevrovedenjske funkcije (npr. 
socialno vedenje), nevrokemije ali nevropatologije se lahko dodajo glede 
na posamezni primer, če se ne ogrozi celovitost izvirnega preskusa. 
14. Iz vsake tretirane skupine se izberejo mladi či, ki se nato dodelijo za oceno 
končnih točk na PPD 4. Mladi če je treba izbrati tako, da sta oba spola iz 
vsakega zaroda v vsaki tretirani skupini čim bolj enakomerno zastopana v 
vseh preskusih. Za preskušanje motori čne aktivnosti je treba preskusiti isti 
par mladega samca in samice pri vseh starostih pred odstranitvijo od sesanja 
(glej odstavek 35). Pri vseh drugih preskusih se lahko za razli čne vedenjske 
preskuse dodelijo isti ali lo čeni pari samcev in samic. Za primerjalne 
preskuse kognitivne funkcije med odstavljenci in odraslimi živalmi bo morda treba dodeliti razli čne mladiče, da se prepre čijo zavajajo či učinki 
starosti in predhodnega usposabljanja na te meritve (26) (27). Pri odstranitvi 
od sesanja (PPD 21) se lahko mladi či, ki niso bili izbrani za preskušanje, 
humano odstranijo. Navesti je treba vsako spremembo razdelitve mladi čev. 
Statistična enota meritve mora biti zarod (ali mati) in ne mladi č. 
15. Obstaja ve č načinov za dodelitev mladi čev za preglede pred odstranitvijo od 
sesanja in po njej, kognitivne preskuse, patološke preglede itd. (glej sliko 1 za splošni na črt in Dodatek 1 za primere dodelitve). Priporo čena najmanjša 
števila živali v posamezni tretirani skupini za preglede pred odstranitvijo od 
sesanja in po njej so naslednja: 
Klinična opazovanja in telesna teža Vse živali 
Podrobna klini čna opazovanja 20/spol (1/spol/zarod) 
Teža možganov (po fiksaciji), PPD 11–22 10/spol (1/zarod) Teža možganov (nefiksirani), ~ PPD 70 10/spol (1/zarod) Nevropatologija (fiksacija s potopitvijo ali 
perfuzijo), PPD 11–22 10/spol (1/zarod) 
Nevropatologija (fiksacija s perfuzijo), PPD 
~ 70 10/spol (1/zarod) 
Spolna zrelost 20/spol (1/spol/zarod) 
Drugi razvojni znaki (neobvezno) Vse živali Vedenjska ontogenija 20/spol (1/spol/zarod) Motorična aktivnost 20/spol (1/spol/zarod) 
Motorična in senzori č
na funkcija 20/spol (1/spol/zarod) 
Učenje in spominjanje 10/spol (  a ) (1/zarod)  
( a ) Glede na ob čutljivost preskusov kognitivne funkcije je treba razmisliti o preiskavi 
večjega števila živali, npr. najve č 1 samca in 1 samice na zarod (za dodelitev 
živali glej Dodatek 1) (nadaljnja navodila glede velikosti vzorca so navedena v 
Smernici OECD št. 43 (8)).  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 790
 
Odmerjanje  
16. Uporabiti je treba najmanj tri velikosti odmerkov in hkratni kontrolni 
vzorec. Velikost odmerkov se razporedi tako, da se u činki strupenosti stop ­
njujejo. Če največji odmerek ni omejen s fizikalno-kemijskimi ali biolo ­ 
škimi lastnostmi kemikalije, ga je treba izbrati tako, da izzove dolo čene 
strupene u činke pri materi (npr. klini čni znaki, manjše pridobivanje telesne 
teže (ne ve č kot 10 %) in/ali dokaz za toksi čnost, pri kateri se omeji 
odmerek, v tar čnem organu). Velik odmerek je z nekaterimi izjemami 
lahko omejen na 1000 mg/kg/dan telesne teže. Pri čakovana izpostavljenost 
pri ljudeh lahko na primer kaže na potrebo po uporabi ve čjega odmerka. 
Namesto tega se lahko izvedejo pilotne študije ali predhodne študije za 
ugotavljanje obmo čja, da se dolo či največji odmerek, ki ga je treba upora ­
biti in bi moral povzro čiti minimalno stopnjo strupenih u činkov pri materi. 
Če se s standardno študijo strupenosti za razvoj ali pilotno študijo dokaže, 
da je preskusna kemikalija strupena za razvoj, mora biti najve čja velikost 
odmerka najve čji odmerek, ki ne bo povzro čil čezmernih strupenih u činkov 
pri potomcih ali smrti  in utero  ali pred rojstvom ali deformnosti, ki lahko 
prepreči smiselno vrednotenje nevrotoksi čnosti. Najmanjša velikost 
odmerka naj ne bi povzro čila dokazov o strupenih u činkih pri materi ali 
razvoju, vklju čno z nevrotoksi čnostjo. Izbere se padajo če zaporedje veli ­
kosti odmerkov, da se pokažejo vsi z odmerkom povezani odzivi in velikost odmerka, pri kateri ni opaženih škodljivih u činkov (NOAEL) ali odmerki 
blizu meje zaznavnosti, ki omogo ča določitev standardnega odmerka. Za 
padajoče zaporedje velikosti odmerkov so pogosto optimalni dvakratni do 
štirikratni intervali, pogosto pa je bolje dodati še dodatno četrto skupino 
odmerkov, kot uporabiti zelo velike intervale (npr. ve
č kot faktor 10) med 
odmerki. 
17. Pri izbiri velikosti odmerkov je treba upoštevati vse obstoje če podatke o 
strupenosti ter dodatne informacije o presnovi in toksikokinetiki preskusne kemikalije ali sorodnih snovi. Te informacije lahko pomagajo tudi pri doka ­
zovanju ustreznosti režima odmerjanja. Na podlagi izpostavljenosti in 
farmakokineti čnih informacij (28) (29) je treba pri mladi čih razmisliti o 
uporabi neposrednega odmerjanja. Pred izvajanjem študije neposrednega odmerjanja je treba skrbno obravnavati prednosti in slabosti (30). 
18. Skupina za hkratno kontrolo mora biti kontrolna skupina, tretirana z 
nepravim nadomestkom, ali kontrolna skupina, tretirana z nosilcem, če je 
ta uporabljen pri dajanju preskusne kemikalije. Vsem živalim je treba običajno dati enako koli čino preskusne kemikalije ali nosilca na podlagi 
telesne teže. Če se za lažje odmerjanje uporablja nosilec ali drug aditiv, je 
treba upoštevati naslednje lastnosti: u činke na absorpcijo, distribucijo, pres ­
novo ali retencijo preskusne kemikalije, u činke na kemijske lastnosti 
preskusne kemikalije, ki lahko spremenijo njene strupene lastnosti, ter učinke na porabo hrane ali vode ali status prehranjenosti živali. Nosilec 
ne sme povzro čati učinkov, ki bi lahko vplivali na razlago študije, ne 
sme biti nevrovedenjsko strupen ali imeti u činkov na razmnoževanje ali 
razvoj. V zvezi z novimi nosilci je treba poleg kontrolne skupine, tretirane z nosilcem, vklju čiti tudi kontrolno skupino, tretirano z nepravim nadomest ­
kom. Z živalmi v kontrolni(-h) skupini(-ah) se ravna na enak na čin kot z 
živalmi v preskusni skupini.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 791
 
Dajanje odmerkov  
19. Preskusno kemikalijo ali nosilec je treba dajati na na čin, ki je najprimernejši 
za možno izpostavljenost pri ljudeh, ter na podlagi razpoložljivih podatkov 
o presnovi in distribuciji pri preskusnih živalih. Na čin dajanja odmerka je 
običajno oralen (npr.z gavažo, hrano ali pitno vodo), vendar se lahko glede 
na lastnosti in pri čakovane ali znane na čine izpostavljenosti pri ljudeh 
uporabijo tudi drugi na čini (npr. prek kože, z vdihavanjem); dodatna navo ­
dila so navedena v Smernici št. 43 (8). Izbrani na čin dajanja je treba 
utemeljiti. Preskusno kemikalijo je treba dati vsak dan približno ob istem času. 
20. Odmerek za vsako žival mora obi čajno temeljiti na zadnji posami čni dolo­ 
čitvi telesne teže. Vendar je potrebna previdnost pri prilagajanju odmerkov 
v zadnji tretjini brejosti. Če se pri tretiranih materah opazijo čezmerni 
strupeni u činki, je treba te živali humano usmrtiti. 
21. Preskusno kemikalijo ali nosilec je treba sparjenim samicam dajati vsaj vsak 
dan od dneva ugnezditve (DB 6) do konca laktacije (PPD 21), da so mladi či 
izpostavljeni preskusni kemikaliji med nevrološkim razvojem pred rojstvom 
in po njem. Starost, pri kateri se za čne odmerjanje, ter trajanje in pogostost 
odmerjanja se lahko prilagodijo, če dokazi podpirajo zasnovo poskusa, ki je 
primernejši za izpostavljenost pri ljudeh. Trajanje odmerjanja je treba prila ­
goditi za druge vrste, da se zagotovi izpostavljenost v vseh zgodnjih fazah 
razvoja možganov (npr. enakovredno rasti možganov človeka pred rojstvom 
in takoj po rojstvu). Odmerjanje se lahko za čne ob začetku brejosti (DB 0), 
čeprav je treba upoštevati, da lahko preskusne kemikalije povzro čijo izgubo 
pred ugnezditvijo. Z dajanjem odmerka na DB 6 se prepre či to tveganje, 
vendar razvojne faze med DB 0 in 6 niso tretirane. Če laboratorij kupi breje 
živali, začetek odmerjanja na DB 0 ni mogo č, zato je DB 6 primeren čas za 
začetek. Laboratorij za preskušanje mora režim odmerjanja dolo čiti v skladu 
z zadevnimi informacijami o u činkih preskusne kemikalije, predhodnimi 
izkušnjami in logisti čnimi težavami, kar lahko vklju čuje podaljšanje odmer ­
janja tudi na obdobje po odstavitvi od sesanja. Pri živalih, ki niso skotile vseh potomcev, se odmerjanje na dan kotitve ne izvede. Na splošno se 
pričakuje, da bodo mladi
či izpostavljeni prek materinega mleka, vendar je 
treba v primerih, kjer ni dovolj dokazov za nadaljnjo izpostavljenost potom ­
cev, razmisliti o neposrednem odmerjanju. Dokaz o stalni izpostavljenosti se lahko pridobi npr. na podlagi farmakokineti čnih informacij, strupenosti za 
potomce ali spremembami biomarkerjev (28).
 
OPAZOVANJA  
Opazovanja pri materah  
22. Pri vseh materah je treba vsaj enkrat na dan skrbno opazovati njihovo 
zdravstveno stanje, vklju čno z obolevnostjo in smrtnostjo. 
23. V obdobjih tretiranja in opazovanja je treba redno izvajati ve č podrobnih 
kliničnih opazovanj (vsaj dve v obdobju odmerjanja med brejostjo in dve v 
obdobju odmerjanja med laktacijo) z vsaj desetimi materami na velikost 
odmerka. Živali morajo zunaj njihove doma če kletke opazovati usposobljeni 
tehniki, ki niso seznanjeni s tretiranjem živali, in sicer po standardiziranih postopkih, da se čim bolj zmanjšata stres za živali in pristranskost opazo ­
valca ter zagotovi čim bolj konstantna zanesljivost med opazovalci. Kadar 
je mogoče, je priporo čljivo, da opazovanja v okviru posamezne študije 
opravi isti tehnik.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 792
 
24. Prisotnost opaženih znakov je treba zabeležiti. Vedno, kadar je to izved ­
ljivo, je treba zabeležiti tudi stopnjo opaženih znakov. Klini čna opazovanja 
morajo obsegati tudi, vendar ne samo, spremembe na koži, kožuhu, o čeh, 
sluznicah, pojav sekrecije ter delovanje avtonomnega živ čevja (npr. solze ­
nje, piloerekcija, velikost zenic, nenormalen vzorec dihanja in/ali dihanje 
skozi usta ter vsi nenavadni znaki pri uriniranju ali izlo čanju blata). 
25. Zapisati je treba tudi vse nenavadne odzive v zvezi s položajem telesa, 
stopnjo aktivnosti (npr. zmanjšanje ali pove čanje raziskovanja standardnega 
mesta) in koordinacijo gibov. Zabeležiti je treba spremembe v hoji (npr. 
zibanje, ataksija), drži (npr. grbast hrbet) in reagiranju na ravnanje, nameš ­ 
čanje ali druge okoljske dražljaje, pa tudi navzo čnost kloni čnih ali toni čnih 
gibov, kr čev ali tremorja, stereotipije (npr. čezmerno čiščenje, nenavadni 
gibi z glavo, ponavljajo če se krožno premikanje), nenormalno vedenje (npr. 
grizenje ali čezmerno lizanje, samopohaba, zadenjska hoja, oddajanje 
glasov) ali agresivnost. 
26. Zabeležiti je treba znake strupenosti, vklju čno z dnevom nastopa, časom 
dneva, stopnjo in trajanjem. 
27. Živali je treba v času odmerjanja med študijo stehtati vsaj enkrat na teden, 
blizu dneva kotitve ali na dan kotitve in na PPD 21 (odstavitev od sesanja). 
Pri študijah z gavažo je treba matere stehtati vsaj dvakrat na teden. Odmerke je treba ustrezno prilagoditi ob posameznem dolo čanju telesne 
teže. Porabo hrane je treba meriti vsaj vsak teden med brejostjo in laktacijo. 
Porabo vode je treba meriti vsaj enkrat na teden, če izpostavljenost poteka 
prek oskrbe z vodo.
 
Opazovanja pri potomcih  
28. Pri vseh potomcih je treba vsaj enkrat na dan opazovati znake strupenosti 
ter obolevnost in smrtnost. 
29. V obdobjih tretiranja in opazovanja je treba izvesti podrobnejša klini čna 
opazovanja potomcev. Potomce (vsaj enega mladi ča/spol/zarod) morajo 
opazovati usposobljeni tehniki, ki niso seznanjeni s tretiranjem živali, in 
sicer po standardiziranih postopkih, da se čim bolj zmanjša pristranskost in 
čim bolj pove ča zanesljivost opazovalcev. Kadar je mogo če, je priporo č­
ljivo, da opazovanja opravi isti tehnik. V opazovani fazi razvoja je treba 
ustrezno spremljati vsaj kon čne točke, opisane v odstavkih 24 in 25. 
30. Zabeležiti je treba vse znake strupenosti pri potomcu, vklju čno z dnevom 
nastopa, časom dneva, stopnjo in trajanjem.  
Telesni in razvojni znaki  
31. Spremembe znakov razvoja pred odstavitvijo od sesanja (npr. znotrajmater ­
nično oblikovanje uhlja, odpiranje o či, izraščanje sekalcev) so tesno pove ­
zane s telesno težo (30) (31). Telesna teža je lahko najboljši pokazatelj 
telesnega razvoja. Merjenje razvojnih znakov je zato priporo čljivo le, če 
obstajajo predhodni dokazi, da bodo te kon čne točke zagotovile dodatne 
informacije. Časovna razporeditev ocene teh parametrov je navedena v 
tabeli 1. Glede na pri čakovane u činke in rezultate za četnih meritev se 
lahko priporo ča dodajanje časovnih to čk ali opravljanje meritev v drugih 
razvojnih fazah.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 793
 
32. Pri oceni telesnega razvoja je priporo čljivo uporabiti postkoitalno starost 
namesto postnatalne starosti (33). Če se preskus pri mladi čih izvede na 
dan odstavitve od sesanja, je priporo čljivo, da se ta preskus izvede pred 
dejansko odstavitvijo od sesanja, da se prepre či zavajajo či učinek stresa, 
povezanega z odstavitvijo od sesanja. Poleg tega se preskusov na mladi čih 
po odstavitvi od sesanja ne sme izvajati dva dni po odstavitvi od sesanja.  
Tabela 1  
Časovna razporeditev ocene telesnih in razvojnih znakov ter funkcionalnih/vedenjskih 
končnih točk ( a ) 
Starostna 
obdobja 
Končne točke Pred odstavitvijo od 
sesanja (  b ) Adolescenca (  b ) Mladi odrasli (  b ) 
Telesni in razvojni znaki  
Telesna teža in 
klinična opazovanja vsak teden (  c ) vsaj vsaka dva 
tedna vsaj vsaka dva tedna 
Teža možganov PPD 22 (  d ) ob koncu 
Nevropatologija PPD 22 (  d ) ob koncu 
Spolna zrelost — kot je ustrezno — Drugi razvojni znaki (
 e ) kot je ustrezno — —  
Funkcionalne/vedenjske kon čne točke 
Vedenjska ontogenija vsaj dve meritvi Motorična aktivnost 
(vključno s privaja ­
njem) 1–3-krat (
 f ) — enkrat 
Motorična in senzo ­
rična funkcija — enkrat enkrat 
Učenje in spominjanje — enkrat enkrat  
( a ) V tej tabeli je predstavljeno najmanjše število meritev, ki jih je treba izvesti. Glede na pri čakovane 
učinke in rezultate za četnih meritev se lahko priporo ča dodajanje dodatnih časovnih to čk (npr. stare 
živali) ali opravljanje meritev v drugih razvojnih fazah. 
( b ) Priporo ča se, da se preskusi na mladi čih ne izvajajo dva dni po odstavitvi od sesanja (glej odstavek 32). 
Priporočeni starosti za preskuse v adolescenci sta: u čenje in spominjanje = PPD 25 ± 2; motori čna in 
senzorična funkcija = PPD 25 ± 2. Priporo čena starost za preskuse na mladih odraslih je PPD 60–70. 
( c ) Telesno težo je treba v primeru neposrednega odmerjanja izmeriti vsaj dvakrat na teden, da se odmerki 
prilagodijo v času hitrega pridobivanja telesne teže. 
( d ) Teža možganov in nevropatologija se lahko ocenita prej (npr. na PPD 11), če je primerno (glej odstavek 
39). 
( e ) Druge razvojne znake, poleg telesne teže (npr. odpiranje o či), je treba zabeležiti, kadar je primerno (glej 
odstavek 31). 
( f ) Glej odstavek 35.  
33. Žive mladi če je treba prešteti in dolo čiti njihov spol, npr. z vizualnim 
pregledom ali meritvijo zadnji čno-genitalne razdalje (34) (35), vsakega 
mladiča iz zaroda pa je treba stehtati pri rojstvu ali kmalu po tem, vsaj 
enkrat na teden med laktacijo ter vsaj enkrat vsaka dva tedna po njej. Ko se ovrednoti spolna zrelost, je treba ob pojavu odprtja nožnice (36) ali lo čitvi 
prepucija (37) dolo čiti starost in telesno težo vsaj enega samca in ene 
samice iz zaroda.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 794
 
Vedenjska ontogenija  
34. Ontogenijo izbranih vedenj je treba izmeriti pri vsaj enem mladi ču/spol/ 
zarod v ustreznem starostnem obdobju, pri čemer se ob vseh dnevih presku ­ 
šanja za vsa ocenjena vedenja uporabijo isti mladi či. Dnevi meritve morajo 
biti v tem obdobju enakomerno razporejeni, da se opredelijo obi čajne spre­
membe v ontogeniji tega vedenja ali spremembe v ontogeniji tega vedenja, 
povezane s tretiranjem (38). Nekateri primeri vedenj, katerih ontogenija se 
lahko oceni, so: posturalni refleks, negativna geotaksija in motori čna aktiv­
nost (38) (39) (40).  
Motorična aktivnost  
35. Motori čno aktivnost je treba spremljati (41) (42) (43) (44) (45) v obdobju 
pred odstavitvijo od sesanja in v obdobju odraslosti. Za preskušanje v času 
odstavljanja od sesanja glej odstavek 32. Preskušanje mora biti dovolj dolgo, da se dokaže privajanje netretiranih kontrolnih vzorcev na preskuša ­
nje. Za oceno vedenjske ontogenije se zelo priporo ča uporaba motori čne 
aktivnosti. Če se preskušanje uporabi kot preskus vedenjske ontogenije, je 
za vsa preskušanja pred odstavitvijo od sesanja treba uporabiti iste živali. 
Preskušanje mora biti dovolj pogosto, da se oceni ontogenija privajanja med 
preskušanjem (44). To lahko pomeni trikrat ali pogosteje pred dnem odsta ­
vitve od sesanja in vklju čno z njim (npr. PPD 13, 17 in 21). Preskušanje 
istih živali ali živali iz istega zaroda mora potekati tudi v obdobju odraslosti 
proti koncu študije (npr. PPD 60–70). Po potrebi se lahko opravi presku ­ 
šanje ob dodatnih dneh. Motori čno aktivnost je treba spremljati z aparaturo 
za avtomatizirano beleženje aktivnosti, ki mora biti zmožna zaznati pove ­ 
čanje in zmanjšanje aktivnosti (npr. osnovna aktivnost, kot jo izmeri 
naprava, ne sme biti tako nizka, da bi prepre čila zaznavanje zmanjšanja, 
in ne tako visoka, da bi prepre čila zaznavanje pove čanja aktivnosti). Vsako 
napravo je treba preskusiti v skladu s standardnimi postopki, da se zagotovi čim bolj zanesljivo delovanje naprav vse dni. Tretirane skupine morajo biti 
čim bolj uravnoteženo razporejene med napravami. Vsako žival je treba 
preskusiti lo čeno. Tretirane skupine morajo biti uravnoteženo razporejene 
med čase preskušanja, da se prepre či zavajajo či učinek cirkadianega ritma 
aktivnosti. Prizadevati si je treba, da so variacije v preskusnih pogojih 
minimalne in niso sistemati čno povezane s tretiranjem. Med spremenljiv ­
kami, ki lahko vplivajo na razli čna merila vedenja, vklju čno z motori čno 
aktivnostjo, so jakost zvoka, velikost in oblika preskusne kletke, tempera ­
tura, relativna vlažnost, svetlobni pogoji, vonji, uporaba doma če kletke ali 
nove preskusne kletke in motnje iz okolja.
 
Motorična in senzori čna funkcija  
36. Motori čno in senzori čno funkcijo je treba natan čno pregledati vsaj enkrat v 
obdobju adolescence in enkrat v obdobju odraslosti (npr. PPD 60–70). Za 
preskušanje v času odstavljanja od sesanja glej odstavek 32. Treba je izvesti 
ustrezno preskušanje za zagotovitev ustreznega kvantitativnega vzor čenja 
senzoričnih dražljajev (npr. somatosenzori čnih, vestibularnih) in motori čnih 
funkcij (npr. mo č, koordinacija). Primeri preskusov motori čne in senzori čne 
funkcije so refleks zravnave (46), posturalni refleks (47) (48), reakcija na 
slušni dražljaj (40) (49) (50) (51) (52) (53) (54) in izzvani potenciali (55).  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 795
 
Preskusi u čenja in spominjanja  
37. Preskus asociativnega u čenja in spominjanja je treba izvesti po odstavitvi od 
sesanja (npr. 25 ± 2 dni) in pri mladih odraslih (PPD 60 in starejših). Za 
preskušanje v času odstavljanja od sesanja glej odstavek 32. V teh dveh 
fazah razvoja se lahko uporabijo isti ali lo čeni preskusi. Pri izbiri preskusov 
učenja in spominjanja pri mladi čih, ki so prenehali sesati, in odraslih 
podganah je dovoljena dolo čena prožnost. Vendar morajo biti preskusi 
načrtovani tako, da izpolnjujejo dve merili. Prvi č, učenje je treba oceniti 
kot spremembo v ve č ponovitvenih preskušanjih ali sejah u čenja ali s 
preskusi, ki vklju čujejo eno preskušanje, ob upoštevanju pogoja, ki kontro ­
lira neasociativne u činke izkušenj. Drugi č, preskusi morajo poleg izvirnega 
učenja (priu čitev) vklju čevati dolo čeno mero (kratkoro čnega ali dolgoro ­ 
čnega) spomina, vendar te mere spomina ni mogo če sporočiti brez mere 
priučitve, ki se pridobi z istim preskusom. Če preskusi u čenja in spomi ­
njanja kažejo u činek preskusne kemikalije, je morda treba razmisliti o 
dodatnih preskusih, da se ovržejo druge razlage na podlagi sprememb senzoričnih, motivacijskih in/ali motori čnih zmogljivosti. Poleg zgoraj nave ­
denih meril se priporo ča, da se preskus u čenja in spominjanja izbere na 
podlagi dokazane ob čutljivosti na razred preiskovane kemikalije, če so 
takšne informacije na voljo v virih. Če takšnih informacij ni, primeri 
preskusov, ki bi lahko izpolnjevali navedeni merili, vklju čujejo: pasivno 
izogibanje (43) (56) (57), zapoznelo uskladitev s položajem pri odraslih 
podganah (58) in mladi čih (59), pogojevanje z vonjem (43) (60), Morrisov 
vodni labirint (61) (62) (63), Bielov ali Cincinnatijev labirint (64) (65), 
zvezdasti labirint (66), T-labirint (43) ter priu čitev in retencijo vedenja, 
kontroliranega s planiranim potekom (26) (67) (68). Dodatni preskusi so 
opisani v virih v zvezi z mladi či, ki so prenehali sesati (26) (27), in odra ­
slimi podganami (19) (20).  
Posmrtni pregled  
38. Matere se lahko evtanazirajo po odstavitvi potomca od sesanja. 
39. Nevropatološko vrednotenje potomca se izvede z uporabo tkiv živali, ki so 
bile humano usmr čene na PPD 22 ali med PPD 11 in PPD 22 ali ob koncu 
študije. Pri potomcih, usmr čenih na PPD 22, je treba pregledati možganska 
tkiva, pri živalih, usmr čenih ob koncu, pa je treba pregledati tkiva central ­
nega živčnega sistema in perifernega živ čnega sistema. Živali, usmr čene na 
PPD 22 ali prej, se lahko fiksirajo s potopitvijo ali perfuzijo. Živali, 
usmrčene ob koncu študije, se fiksirajo s perfuzijo. Vsi vidiki priprave 
vzorcev tkiva od perfuzije živali do seciranja vzorcev tkiv, obdelave tkiv in barvanja preparatov morajo upoštevati uravnoteženo zasnovo, tako da vse 
serije vsebujejo reprezentativne vzorce posamezne skupine odmerka. 
Dodatne smernice v zvezi z nevropatologijo so navedene v Smernici OECD št. 20 (9), glej tudi (103).
 
Obdelava vzorcev tkiv  
40. Zabeležiti je treba vse makroskopske anomalije, ki so vidne v času obduk ­
cije. Vzorci tkiv morajo predstavljati vse pomembnejše regije živ čnega 
sistema. Vzorce tkiv je treba hraniti v ustreznem fiksativu in jih obdelati v skladu s standardiziranimi objavljenimi histološkimi protokoli (69) (70) (71) (103). Vstavljanje v parafin je sprejemljivo za tkiva centralnega 
živčnega sistema in perifernega živ čnega sistema, uporaba osmija po fiksa ­
ciji, skupaj z vstavljanjem v epoksi, pa je lahko ustrezna, če je potrebna
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 796
 
večja stopnja lo čljivosti (npr. za periferno živ čevje, če obstaja sum na 
periferno nevropatijo, in/ali za morfometri čno analizo perifernega živ čevja). 
Možgansko tkivo, zbrano za morfometri čno analizo, je treba vstaviti v 
ustrezen medij pri vseh velikostih odmerka hkrati, da se prepre čijo artefakti 
zaradi krčenja, ki bi lahko bili povezani s podaljšano hrambo v fiksativu (6).  
Nevropatološka preiskava  
41. Nameni kvalitativnega pregleda so: 
(i) opredeliti regije v živ čnem sistemu, ki kažejo dokaze nevropatoloških 
sprememb; 
(ii) opredeliti vrste nevropatoloških sprememb, ki so posledica izpostavlje ­
nosti preskusni kemikaliji, in 
(iii) dolo čiti stopnjo resnosti nevropatoloških sprememb. 
Reprezentativne histološke rezine vzorcev tkiv mora mikroskopsko pregle ­
dati ustrezno usposobljen patolog, ki poiš če dokaze nevropatoloških spre ­
memb. Vsem nevropatološkim spremembam je treba dodeliti subjektivno oceno resnosti. Hematoksilinska in eozinska barvila so lahko ustrezna za oceno rezin možganov živali, ki so bile humano usmr čene na PPD 22 ali 
prej. Za rezine tkiv centralnega in perifernega živ čnega sistema živali, 
usmrčenih ob koncu študije, pa se priporo ča barvanje z mielinskimi barvili 
(npr. luksol obstojna modra/krezil vijoli čna) in barvilom na osnovi srebra 
(npr. Bielschowskyjevo ali Bodianovo barvilo). Glede na strokovno presojo 
patologa in vrsto opaženih sprememb se lahko tudi druga barvila štejejo kot 
ustrezna za ugotavljanje in opis posebnih vrst sprememb (npr. glialni fibri ­
larni kisli protein (GFAP) ali lektinska histokemija za oceno glialnih in mikroglialnih sprememb (72), fluoro-žad za zaznavanje nekroze (73) (74) 
ali barvila na osnovi srebra za ugotavljanje degeneracij živ čevja (75)). 
42. Opraviti je treba morfometri čno (kvantitativno) vrednotenje, ker lahko ti 
podatki prispevajo k zaznavanju u činka, povezanega s tretiranjem, in so 
dragoceni za razlago razlik v teži možganov ali morfologiji, povezanih s tretiranjem (76) (77). Za morfometri čno vrednotenje je treba odvzeti in 
pripraviti vzorec živ čnega tkiva. Morfometri čna vrednotenja lahko zajemajo 
npr. linearne ali površinske meritve posebnih možganskih regij (78). Pri 
linearnih ali površinskih meritvah je treba uporabiti homologne rezine, ki so skrbno izbrane na podlagi zanesljivih mikroskopskih znakov (6). Stereo ­
logija se lahko uporabi za opredelitev u činkov, povezanih s tretiranjem, na 
spremenljivke, kot so volumen ali število celic za posamezne nevroana ­
tomske regije (79) (80) (81) (82) (83) (84). 
43. Pregledati je treba, ali so v možganih dokazi za nevropatološke spremembe, 
povezane s tretiranjem, pri čemer je treba ustrezne vzorce odvzeti iz vseh 
pomembnih možganskih regij (npr. vohalni bulbus, možganska skorja, hipo ­
kamus, bazalni gangliji, talamus, hipotalamus, srednjimi možgani (tektum, 
tegmentum in možganski pedunkli), most, podaljšana hrbtenja ča in mali 
možgani), da se zagotovi natan čen pregled. Pomembno je, da so vse rezine 
odvzete iz iste ravnine. Pri odraslih živalih, ki so bile humano usmr čene ob 
koncu študije, je treba odvzeti reprezentativne rezine hrbtenja če in perifer ­
nega živčnega sistema. Obmo čja, ki se pregledujejo, morajo vklju čevati oko 
z vidnim živcem in mrežnico, hrbtenja čo ob vratnem in ledvenem delu, 
dorzalna in ventralna vlakna, proksimalni bedrni živec, proksimalni gole ­
nični živec (pri kolenu) in veje goleni č
nega živca v me čni mišici. Rezine 
hrbtenjače in perifernih živcev morajo vklju čevati prečne ali diagonalne in 
vzdolžne rezine.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 797
 
44. V okviru nevropatološkega vrednotenja je treba poleg celi čnih sprememb 
(npr. vakuolacija, degeneracija in nekroza nevronov) in sprememb tkiva 
(npr. glioza, infiltracija levkocitov in tvorjenje cist) poiskati morebitne znake razvojnih poškodb živ čnega sistema (6) (85) (86) (87) (88) (89). V 
zvezi s tem je pomembno, da se u činki, povezani s tretiranjem, lo čijo od 
običajnih razvojnih dogodkov, za katere je znano, da se pojavijo v razvojni 
fazi, ki ustreza času usmrtitve (90). Primeri pomembnih sprememb, ki 
kažejo na razvojne poškodbe, med drugim vklju čujejo: 
— makroskopske spremembe velikosti ali oblike vohalnega bulbusa, 
velikih možganov ali malih možganov, 
— spremembe relativne velikosti razli čnih možganskih regij, vklju čno z 
zmanjšanjem ali pove čanjem velikosti regij zaradi izgube ali obstojnosti 
običajno prehodnih populacij celic ali projekcij aksonov (npr. zunanja 
zarodna plast malih možganov, corpus callosum), 
— spremembe v množitvi, migraciji in diferenciaciji, kot kažejo obmo čja 
čezmerne apoptoze ali nekroze, skupin ali razpršenih populacij ektopi ­ 
čnih, dezorientiranih ali deformiranih nevronov, ali spremembe relativne 
velikosti razli čnih plasti kortikalnih struktur, 
— spremembe vzorcev mielinizacije, vklju čno s splošnim zmanjšanjem 
mieliniziranih struktur ali njihovim spremenjenim barvanjem, 
— dokaz za hidrocefalus, zlasti pove čanje prekatov, stenozo možganskega 
akvedukta in tanjšanje možganskih polobel.
 
Analiza odvisnosti med odmerkom in odzivom pri nevropatoloških 
spremembah  
45. Za kvalitativno in kvantitativno nevropatološko analizo se priporo ča 
naslednji postopek s posameznimi koraki. Najprej se rezine iz skupine z 
velikim odmerkom primerjajo z rezinami iz kontrolne skupine. Če pri 
živalih iz skupine z velikim odmerkom ni dokazov o nevropatoloških spre ­
membah, nadaljnja analiza ni potrebna. Če v skupini z velikim odmerkom 
obstajajo dokazi o nevropatoloških spremembah, se pregledajo živali iz 
skupin s srednjim in nizkim odmerkom. Če se skupina z velikim odmerkom 
konča zaradi smrti ali druge zavajajo če strupenosti, se za analizo nevropa ­
toloških sprememb uporabijo skupine z velikim in srednjim odmerkom. Če 
obstajajo znaki nevrotoksi čnosti v skupinah z manjšim odmerkom, je treba 
v teh skupinah opraviti nevropatološko analizo. Če se pri kvalitativnem ali 
kvantitativnem pregledu ugotovijo nevropatološke spremembe, povezane s tretiranjem, je treba na podlagi vrednotenja vseh živali iz skupin z vsemi 
odmerki dolo čiti odvisnost pojavnosti od odmerka, pogostost in stopnjo 
resnosti poškodb ali morfometri čnih sprememb. V to vrednotenje je treba 
vključiti vse regije možganov, v katerih so vidni dokazi nevropatoloških 
sprememb. Za vsako vrsto poškodbe je treba opisati zna čilnosti, ki so 
uporabljene za opredelitev posamezne stopnje resnosti in kažejo lastnosti, 
na podlagi katerih se stopnje razlikujejo med sabo. Zabeležiti je treba pogostost posamezne vrste poškodb in njihovo stopnjo resnosti ter opraviti statistično analizo, da se ovrednoti vrsta odvisnosti med odmerkom in 
odzivom. Priporo čena je uporaba kodiranih mikroskopskih preparatov (91).
 
PODATKI IN PORO ČANJE  
Podatki  
46. Podatke je treba sporo čati ločeno in jih povzeti v obliki tabele, kjer so za 
vsako preskusno skupino prikazane vrste sprememb ter število mater in potomcev po spolu in zarodu, ki prikazuje posamezno vrsto spremembe. 
Če je bila izvedena neposredna izpostavljenost potomca po rojstvu, je treba 
sporočiti način, trajanje in obdobje izpostavljenosti.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 798
 
Vrednotenje in razlaga rezultatov  
47. Študija razvojne nevrtoksi čnosti bo zagotovila informacije o u činkih pona ­
vljajoče se izpostavljenosti kemikaliji  in utero  in v zgodnjem razvoju po 
rojstvu. Ker je poudarek tako na splošni strupenosti kot na razvojni nevro ­
toksičnosti kon čnih točk, rezultati študije omogo čajo razlikovanje med 
učinki na razvoj živ čevja, ki se pojavijo v odsotnosti splošne strupenosti 
pri materi, in u činki, ki so izraženi samo na stopnjah, ki so strupene tudi za 
mater. Zaradi zapletenih medsebojnih odvisnosti med zasnovo študije, stati ­
stično analizo in biološko pomembnostjo podatkov bo ustrezna interpreta ­
cija podatkov o razvojni nevrotoksi čnosti vklju čevala strokovno presojo 
(107) (109). Razlaga rezultatov preskusa mora temeljiti na pristopu tehtnosti 
dokazov (20) (92) (93) (94). Obravnavati je treba vzorce vedenjskih ali morfoloških ugotovitev, če obstajajo, in dokaze o odzivu na odmerek. V 
to opredelitev je treba vklju čiti podatke iz vseh študij, ki zadevajo vredno ­
tenje razvojne nevrotoksi čnosti, vklju čno z epidemiološkimi študijami na 
ljudeh ali poro čili o primerih in eksperimentalnimi študijami na živalih 
(npr. podatki o toksikonetiki, informacije o aktivnosti strukture in podatke iz drugih študij strupenosti). To vklju čuje odvisnost med odmerki preskusne 
kemikalije in prisotnostjo ali odsotnostjo, pojavnostjo in obsegom katerega 
koli nevrotoksi čnega učinka za posamezni spol (20) (95). 
48. Vrednotenje podatkov mora vklju čevati razpravo o biološki pomembnosti in 
statistični značilnosti. Statisti čne analize je treba obravnavati kot orodje, ki 
usmerja razlago podatkov, vendar je ne dolo ča. Odsotnost statisti čne značil­
nosti ne sme biti edini razlog za sklep o odsotnosti u činkov, povezanih s 
tretiranjem, tako kot statisti čna značilnost ne sme biti edina utemeljitev za 
sklepno ugotovitev o u činku, povezanem s tretiranjem. Da bi prepre čili 
morebitne lažno negativne ugotovitve in nelo
čljive težave pri „dokazovanju 
negativnega rezultata“, je treba obravnavati razpoložljive pozitivne podatke in pretekle kontrolne podatke, zlasti če ni učinkov, povezanih s tretiranjem 
(102) (106). Verjetnost lažno pozitivnih rezultatov je treba obravnavati ob 
upoštevanju statisti čnega vrednotenja vseh podatkov (96). Vrednotenje mora 
vključevati odnos med ugotovljenimi nevropatološkimi in vedenjskimi spre ­
membami, če obstaja. 
49. Vse rezultate je treba analizirati z uporabo statisti čnih modelov, ki ustrezajo 
zasnovi preskusa (108). Izbiro parametrske ali neparametrske analize je treba utemeljiti z upoštevanjem dejavnikov, kot so vrsta podatkov (pretvor ­
jeni ali ne) in njihova porazdelitev ter relativna zanesljivost izbrane stati ­
stične analize. Statisti čne analize morajo biti izbrane ob upoštevanju namena 
in zasnove študije, da se čim bolj zmanjšajo napake tipa I (lažno pozitivni 
rezultati) in tipa II (lažno negativni rezultati) (96) (97) (104) (105). 
Razvojne študije, v katerih se uporabljajo multiparne vrste in preskuša 
več mladičev na zarod, morajo v statisti čni model vklju čiti zarod, da se 
preprečijo povečane stopnje napak tipa I (98) (99) (100) (101). Statisti čna 
enota meritve mora biti zarod in ne mladi č. Preskuse je treba zasnovati tako, 
da se živali iz istega zaroda ne obravnavajo kot neodvisna opazovanja. Vse 
končne točke, ki se vedno znova izmerijo pri istem subjektu, je treba 
analizirati z uporabo statisti čnih modelov, ki upoštevajo odvisnost nave ­
denih meritev.
 
Poročilo o preskusu  
50. Poro čilo o preskusu mora vklju čevati naslednje informacije:  
Preskusna kemikalija:  
— agregatno stanje in, če je to ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti, 
— identifikacijske podatke, vklju čno z virom,  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 799
 
— čistost pripravka ter znane in/ali pri čakovane ne čistote.  
Nosilec (po potrebi):  
— utemeljitev izbire nosilca, če to ni voda ali fiziološka raztopina.  
Preskusne živali:  
— uporabljene vrste in seve ter utemeljitev, če to ni podgana, 
— dobavitelja preskusnih živali, — število, za četno starost in spol živali, 
— izvor, nastanitvene pogoje, hrano, vodo itd., 
— težo posamezne živali na za četku preskusa.
 
Preskusni pogoji:  
— utemeljitev izbire velikosti odmerkov, 
— utemeljitev na čina in trajanja odmerjanja, 
— specifikacije uporabljenih odmerkov, vklju čno s podatki o nosilcu, koli ­ 
čini in fizi čni obliki danega materiala, 
— podrobne podatke o formulaciji preskusne kemikalije in pripravi hrane, 
doseženi koncentraciji, stabilnosti in homogenosti pripravka, 
— metodo, uporabljeno za edinstveno identifikacijo mater in potomcev, — podroben opis postopkov randomizacije, uporabljenih za razdelitev 
mater v tretirane skupine, izbiro mladi čev za izlo čitev in razdelitev 
mladičev v preskusne skupine, 
— podrobne podatke o dajanju preskusne kemikalije, — če je primerno, pretvorbo koncentracije preskusne kemikalije, vnesene s 
hrano ali vodo ali vdihavanjem (ppm), v dejanski odmerek (mg/kg 
telesne teže/dan), 
— okoljske pogoje, — podrobne podatke o kakovosti hrane in vode (npr. voda iz pipe, desti ­
lirana voda), 
— datum za četka študije in datum konca študije.
 
Opazovanje in preskusni postopki:  
— podroben opis postopkov, uporabljenih za standardizacijo opazovanj in 
postopkov ter operativne opredelitve za vrednotenje opazovanj, 
— seznam vseh uporabljenih preskusnih postopkov in utemeljitev njihove 
uporabe, 
— podrobnosti o uporabljenih vedenjskih/funkcionalnih, patoloških, nevro ­
kemijskih in elektrofizioloških postopkih, vklju čno z informacijami in 
podrobnostmi o avtomatiziranih napravah, 
— postopke za umerjanje in zagotavljanje enakovrednosti naprav ter urav ­
noteženje tretiranih skupin v preskusnih postopkih, 
— kratko utemeljitev, s katero se pojasnijo odlo čitve na podlagi strokovne 
presoje.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 800
 
Rezultati (posamezni rezultati in povzetek, vklju čno s srednjo vrednostjo in 
varianco, če je ustrezno):  
— število živali na za četku študije in število na koncu študije, 
— število živali in zarodov, uporabljenih za posamezno preskusno metodo, — identifikacijsko številko posamezne živali in zarod, iz katerega prihaja, 
— velikost zaroda in povpre čno težo pri rojstvu po spolu, 
— telesno težo in podatke o spremembi telesne teže, vklju čno s terminalno 
telesno težo matere in potomcev, 
— podatke o porabi hrane in, če je ustrezno, podatke o porabi vode (npr. 
če se preskusna kemikalija daje prek vode), 
— podatke o odzivu na strupenost po spolu in velikost odmerka, vklju čno 
z znaki strupenost ali smrtnosti, vklju čno s časom in vzrokom smrti, če 
je ustrezno, 
— vrsto, resnost, trajanje, dan nastopa, čas dneva in nadaljnji potek 
podrobnih klini čnih opazovanj, 
— vrednotenje posameznih razvojnih znakov (teža, spolna zrelost in 
vedenjska ontogenija) pri posamezni časovni to čki opazovanja, 
— podroben opis vseh vedenjskih, funkcionalnih, nevropatoloških, nevro ­
kemijskih in elektrofizioloških ugotovitev po spolu, vklju čno s pove ča­
njem in zmanjšanjem iz kontrolnih skupin, 
— izsledke obdukcije, 
— teže možganov, 
— diagnoze, ki izhajajo iz nevroloških znakov in poškodb, vklju čno z 
naravno nastalimi boleznimi ali stanji, 
— slike vzor čnih ugotovitev, 
— slike majhne pove čave za oceno homologije rezin, uporabljenih za 
morfometrijo, 
— podatke o absorpciji in presnovi, vklju čno z dopolnilnimi podatki iz 
ločene študije toksikokinetike, če so na voljo, 
— statisti čno obdelavo rezultatov, vklju čno s statisti čnimi modeli, upora ­
bljenimi za analizo podatkov, in rezultate, ne glede na to, ali so bili 
značilni ali ne, 
— seznam osebja, ki je sodelovalo pri študiji, vklju čno s strokovno 
usposobljenostjo.
 
Razprava o rezultatih:  
— informacije o odzivu na odmerek po spolu in skupini, 
— povezanost katerih koli drugih strupenih u činkov s sklepno ugotovitvijo 
o nevrotoksi čnem potencialu preskusne kemikalije po spolu in skupini, 
— vpliv katerih koli informacij o toksikokinetiki na sklepne ugotovitve, 
— podobnost u činkov na kateri koli znan nevrotoksikant,  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 801
 
— podatke, ki dokazujejo zanesljivost in ob čutljivost preskusne metode (tj. 
pozitivne podatke in pretekle kontrolne podatke), 
— odvisnosti, če obstajajo, med nevropatološkimi in funkcionalnimi u činki, 
— vrednosti brez opaznih škodljivih u činkov (NOAEL) ali standardni 
odmerek za matere in potomce po spolu in skupini.  
Sklepne ugotovitve:  
— razprava o celotni razlagi podatkov na podlagi rezultatov, vklju čno s 
sklepno ugotovitvijo o tem, ali je preskusna kemikalija povzro čila 
razvojno nevrotoksi čnost, in vrednostih brez opaznih škodljivih u činkov.  
VIRI  
(1) OECD (1995). Draft Report of the OECD  Ad Hoc  Working Group on 
Reproduction and Developmental Toxicity. Copenhagen, Denmark, 
13–14 June 1995. 
(2) US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects 
Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. 
US EPA 712-C-98-239. Na voljo na: [http://www.epa.gov/opptsfrs/ 
OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/]. 
(3) US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 
630/R-95/001F. Na voljo na: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordi ­
splay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479]. 
(4) Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., 
Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize deve ­
lopmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral 
effects. Environ. Health Perspect., 109:79–91. 
(5) Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., 
Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental 
neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and 
pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101–111. 
(6) Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Clau ­
dio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize develop ­
mental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropatho ­
logy. Environ. Health Perspect., 109:93–100. 
(7) OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on 
Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., US, 
23–25 October 2000. 
(8) OECD (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, 
OECD, Paris. July 2008. Na voljo na: [http://search.oecd.org/officialdocu ­
ments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mo ­
no(2008)16&doclanguage=en]. 
(9) OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity 
Testing. Environment Directorate, OECD, Paris, September 2003. Na voljo na: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_ 1_1_1_1,00.html]. 
(10) Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantita ­
tive comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173–292. 
(11) Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000)  Experimental and 
Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition,  ISBN 0195084772, Oxford Univer ­
sity Press, New York.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 802
 
(12) Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental 
factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. 
Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188–197. 
(13) Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998)  Handbook of Developmental Neuroto ­
xicology , 1 st Edition , ISBN 0126488606, Academic Press, New York. 
(14) Poglavje B.34 te priloge, Preskus strupenosti za razmnoževanje na eni 
generaciji. 
(15) Poglavje B.35 te priloge, Študija dvogeneracijske reproduktivne 
strupenosti. 
(16) Poglavje B.43 te priloge, Študija nevrotoksi čnosti na glodalcih. 
(17) Poglavje B.31 te priloge, Študija strupenosti za predrojstveni razvoj. 
(18) Direktiva 2010/63/EU Evropskega parlamenta in Sveta z dne 
22. septembra 2010 o zaš čiti živali, ki se uporabljajo v znanstvene namene 
(UL L 276, 20.10.2010, str. 33). 
(19) WHO (1986)  Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals  (Environmental Health Criteria 
60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, USA. Na voljo na: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ 
ehc060.htm]. 
(20) WHO (2001)  Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles 
and Approaches  (Environmental Health Criteria 223), World Health Orga ­
nization Publications, Geneva. Na voljo na: [http://www.intox.org/data ­
bank/documents/supplem/supp/ehc223.htm]. 
(21) Chang, L.W., Slikker, W. (1995)  Neurotoxicology: Approaches and 
Methods , 1
 st Edition , ISBN 012168055X, Academic Press, New York. 
(22) De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on 
neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxi ­
col. Teratol., 19:499–509. 
(23) Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent 
litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2–6. 
(24) Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. 
Animal Sci., 27:110–112. 
(25) Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a 
primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118–136. 
(26) Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979)  Ontogeny of Learning and Memory . 
ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey. 
(27) Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987)  Peri­
natal Development: A Psychobiological Perspective.  Academic Press, 
Orlando. 
(28) Zoetis, T., Walls, I. (2003)  Principles and Practices for Direct Dosing of 
Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research . ILSI Press, 
Washington, DC. 
(29) Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning 
rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI 
expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87–94. 
(30) Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to 
improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1–4. 
(31) ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to 
Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceu ­
ticals for Human Use. 
(32) Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in 
existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical consi ­
derations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433–439.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 803
 
(33) Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal 
age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter 
gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449–457. 
(34) Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. 
(1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital 
distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383–390. 
(35) Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., 
Parks, L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and 
DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350–365. 
(36) Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., 
Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579–586. 
(37) Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separa ­
tion as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298–303. 
(38) Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal 
period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489–95. 
(39) Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in 
the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896–920. 
(40) Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. In:  Handbook of 
Behavioral Teratology.  Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, 
New York, str. 67–100. 
(41) Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods 
with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53–66. 
(42) Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measu ­
rement of spontaneous motor activity,  Handbook of Psychopharmacology , 
Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, 
New York, str. 37–82. 
(43) Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neuroto ­
xicity following neonatal exposure to 3,3'-iminodipropionitrile in the rat. 
Neurotoxicol. Teratol., 15:117–129. 
(44) Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor 
activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247–260. 
(45) Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., 
Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of 
motor activity experiments: Implications for neurotoxicological asses ­
sments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599–609. 
(46) Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) 
Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neuroto ­
xicol. Teratol., 19:1997. 405–411. 
(47) Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for 
measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals. 
Physiol. Behav., 64:661–669. 
(48) Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective 
method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. 
Appl. Pharmacol., 40:589–591. 
(49) Davis, M. (1984) The mammalian startle response. In:  Neural Mechanisms 
of Startle Behavior , Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, str. 
287–351. 
(50) Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 
59:107–128. 
(51) Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory 
dysfunction. In  Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology , 
Tilson, H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, str. 181–211.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 804
 
(52) Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function 
using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 
8:199–211. 
(53) Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototoxi ­
city in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res., 80:25–30. 
(54) Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory 
processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 
6:437–445. 
(55) Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked 
potentials into neurotoxicity test schemes. In:  Target Organ Toxicology 
Series: Neurotoxicity , Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New 
York. str. 125–145. 
(56) Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory 
deficits in rats following exposure to 3,3'-iminopropionitrile. Toxicol. Appl. Pharmacol., 105:321–332. 
(57) Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter 
involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247–296. 
(58) Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior 
and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 
10:237–244. 
(59) Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working 
memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98–105. 
(60) Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor 
paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 
17:465–479. 
(61) Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying 
spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47–60. 
(62) Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water 
maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29–69. 
(63) D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze 
in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60–90. 
(64) Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance 
in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235–241. 
(65) Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction 
after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387–399. 
(66) Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and 
Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced micro ­
cephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327–332. 
(67) Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity 
of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 
71:342–352. 
(68) Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term 
memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol ., 36:338–341. 
(69) Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A 
technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 
28: 122–131. 
(70) Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994)  Laboratory 
Methods in Histotechnology , American Registry of Pathology, Washing ­
ton, DC, str. 84–107. 
(71) Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002)  Theory and Practice of Histological 
Techniques , 5
 th edition, Churchill Livingstone, London.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 805
 
(72) Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evalua ­
tion of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and 
microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291–304. 
(73) Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer 
for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123–130. 
(74) Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) 
Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 
53:365–372. 
(75) De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) 
Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545–561. 
(76) De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, 
J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., 
Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Envi ­
ron. Toxicol. Pharmacol., 19:745–755. 
(77) De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., 
Otto, M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gunder ­
sen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain 
after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for develop ­
mental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417–432. 
(78) Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference 
with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 1:129–135. 
(79) Howard, C.V., Reed, M.G. (1998)  Unbiased Stereology: 
Three-Dimensional Measurement in Microscopy , Springer-Verlag, New 
York. 
(80) Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A prac ­
tical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305–310. 
(81) Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total 
numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an 
unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262–268. 
(82) Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in 
disector stereology. J. Neurocytol., 26:707–710. 
(83) West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of 
neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22:51–61. 
(84) Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. 
Neuroscience, 130: 813–831. 
(85) Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of 
growth deficiency in rats exposed  in utero  to undernutrition, ethanol, or 
the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113–121. 
(86) Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/ 
ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 
84:294–298. 
(87) Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental 
neurotoxicology. In:  Handbook of Developmental Neurotoxicology , Slik­
ker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, str. 3–41. 
(88) Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, K., 
Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade of 
NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. 
Science, 283:70–74.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 806
 
(89) Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., 
Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, 
K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056–1060. 
(90) Friede, R. L. (1989)  Developmental Neuropathology . Second edition. 
Springer-Verlag, Berlin. 
(91) House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison 
of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127–133. 
(92) Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure 
standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401–405. 
(93) US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA 
NCEA-F-0644A. 
(94) US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, 
Federal Register 61(212): 56274–56322. 
(95) Danish Environmental Protection Agency (1995)  Neurotoxicology.  Review 
of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefo ­
ged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P. 
(96) Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for 
appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxico ­
logy, 5:113–126. 
(97) Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special 
emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 
8:21–27. 
(98) Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental 
studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329–335. 
(99) Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in 
teratology studies. Teratology, 12:165–172. 
(100) Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of 
prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 
14: 221–228. 
(101) Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. 
(1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587–90. 
(102) Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. 
(2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345–352. 
(103) Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an  ad hoc  
working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006) A ‘best practices’ approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing – for today. Toxicol. Pathol. 
34:296–313. 
(104) Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures 
analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205–210. 
(105) Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical 
certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295–301. 
(106) Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, 
S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints.  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):266–287. 
(107) Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. 
(2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute 
expert working group on neurodevelopmental endpoints.  Neurotoxicology 
and Teratology,  30(4):288–325.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 807
 
(108) Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, 
W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental 
neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints.  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):326–348. 
(109) Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and 
Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental 
neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):349–381.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 808
 
Slika 1  
Splošni na črt preskušanja za funkcionalne/vedenjske preskuse, vrednotenje nevropatologije in 
težo možganov. Ta diagram temelji na opisu iz odstavkov 13–15 (PPD = poporodni dan). 
Primeri dodelitev živali so navedeni v Dodatku 1.
  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 809
 
Dodatek 1  
1. Primeri možnih dodelitev so opisani in prikazani v obliki tabele spodaj. Ti 
primeri so namenjeni prikazu, da je mogo če živali v študiji razdeliti v 
različne vzorce preskušanja na ve č različnih načinov.  
Primer 1  
2. Za preskušanje vedenjske ontogenije pred odstavitvijo od sesanja se uporabi 
ena skupina 20 mladi čev/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec in 1 samica na 
zarod). Od teh živali je 10 mladi čev/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec ali 1 
samica na zarod) humano usmr čenih na PPD 22. Možgani se odstranijo, 
stehtajo in obdelajo za histopatološko vrednotenje. Poleg tega se zberejo podatki o teži možganov z uporabo nefiksiranih možganov preostalih 10 samcev in 10 samic na velikost odmerka. 
3. Druga skupina 20 živali/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec in 1 samica na 
zarod) se uporabi za funkcionalne/vedenjske preskuse po odstavitvi od 
sesanja (podrobna klini čna opazovanja, preskušanja motori čne aktivnosti, 
slušnih dražljajev in kognitivne funkcije pri adolescentih) in ocenjevanje starosti ob nastopu spolne zrelosti. Od teh živali se 10 živali/spol/velikost 
odmerka (tj. 1 samec ali 1 samica na zarod) anestezira in fiksira s perfuzijo 
ob koncu študije (približno PPD 70). Po dodatni fiksaciji  in situ  se možgani 
odstranijo in obdelajo za nevropatološko vrednotenje. 
4. Za preskušanje kognitivne funkcije pri mladih odraslih (npr. PPD 60–70) se 
uporabi tretja skupina 20 mladi čev/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec in 1 
samica na zarod). Od tega je 10 živali/spol/skupino (1 samec ali 1 samica 
na zarod) usmr čenih ob koncu študije, pri čemer se možgani odstranijo in 
stehtajo. 
5. Preostalih 20 živali/spol/skupino se shrani za morebitne dodatne preskuse.
 
Tabela 1  
Št. mladi čev (  a ) Št. mladi čev, razporejenih 
za preskus Pregled/preskus 
m ž  
1 5 20 m + 20 ž Vedenjska ontogenija 
10 m + 10 ž Teža/nevropatologija/morfome ­
trija možganov na PPD 22 
10 m + 10 ž Teža možganov na PPD 22 
2 6 20 m + 20 ž Podrobna klini čna opazovanja 
20 m + 20 ž Motori čna aktivnost 
20 m + 20 ž Spolna zrelost 20 m + 20 ž Motori čna in senzori čna funk­
cija 
20 m + 20 ž U čenje in spominjanje (PPD 25) 
10 m + 10 ž Teža/nevropatologija/morfome ­
trija možganov mladih odraslih 
~ PPD 70
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 810
 
Št. mladi čev (  a ) 
Št. mladi čev, razporejenih 
za preskus Pregled/preskus 
m ž  
3 7 20 m + 20 ž U čenje in spominjanje (mladi 
odrasli) 
10 m + 10 ž Teža možganov mladih odraslih 
~ PPD 70 
4 8 — Preostale živali za zamenjave ali 
dodatne preskuse  
( a ) V tem primeru se zarodi zmanjšajo na 4 samce in 4 samice, pri čemer se mladi 
samci ozna čijo s številkami od 1 do 4, mlade samice pa s številkami od 5 do 8.  
Primer 2  
6. Za preskušanje vedenjske ontogenije pred odstavitvijo od sesanja se uporabi 
ena skupina 20 mladi čev/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec in 1 samica na 
zarod). Od teh živali je 10 mladi čev/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec ali 1 
samica na zarod) humano usmr čenih na PPD 11. Možgani se odstranijo, 
stehtajo in obdelajo za histopatološko vrednotenje. 
7. Druga skupina 20 živali/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec in 1 samica na 
zarod) se uporabi za preglede po odstavitvi od sesanja (podrobna klini čna 
opazovanja, motori čna aktivnost, ocena starosti ob nastopu spolne zrelosti 
ter motori čna in senzori čna funkcija). Od teh živali se 10 živali/spol/velikost 
odmerka (tj. 1 samec ali 1 samica na zarod) anestezira in fiksira s perfuzijo ob koncu študije (približno PPD 70) Po dodatni fiksaciji  in situ  se možgani 
odstranijo, stehtajo in obdelajo za nevropatološko vrednotenje. 
8. Za preskušanje kognitivne funkcije pri adolescentih in mladih odraslih se 
uporabi 10 mladi čev/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec ali 1 samica na 
zarod). Za preskuse kognitivne funkcije na PPD 23 in pri mladih odraslih 
se uporabijo razli čne živali. Ob koncu se 10 živali/spol/skupino, ki se 
preskusijo kot odrasli, usmrti, možgani pa se odstranijo in stehtajo. 
9. Preostalih 20 živali/spol/skupino, ki niso bile izbrane za preskušanje, se 
usmrti in izlo či ob odstavitvi od sesanja.
 
Tabela 2  
Št. mladi čev (  a ) Št. mladi čev, dodeljenih 
za preskus Pregled/preskus 
m ž  
1 5 20 m + 20 ž Vedenjska ontogenija 
10 m + 10 ž Teža/nevropatologija/morfome ­
trija možganov na PPD 11 
2 6 20 m + 20 ž Podrobna klini čna opazovanja 
20 m + 20 ž Motori čna aktivnost 
20 m + 20 ž Spolna zrelost 
20 m + 20 ž Motori čna in senzori čna funk­
cija 
10 m + 10 ž Teža/nevropatologija/morfome ­
trija možganov mladih odraslih 
~ PPD 70  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 811
 
Št. mladi čev (  a ) 
Št. mladi čev, dodeljenih 
za preskus Pregled/preskus 
m ž  
3 7 10 m + 10 ž (  a ) Učenje in spominjanje (PPD 23) 
3 7 10 m + 10 ž (  b ) Učenje in spominjanje (mladi 
odrasli) 
Teža možganov mladih odraslih 
4 8 — Živali, usmr čene in izlo čene na 
PPD 21  
( a ) V tem primeru se zarodi zmanjšajo na 4 samce in 4 samice, pri čemer se mladi 
samci ozna čijo s številkami od 1 do 4, mlade samice pa s številkami od 5 do 8. 
( b ) Za kognitivne preskuse na PPD 23 in pri mladih odraslih se uporabijo razli čne 
živali (npr. sodi/lihi zarodi od skupaj 20).  
Primer 3  
10. Za oceno teže možganov in nevropatološko oceno na PPD 11 se uporabi 
ena skupina 20 mladi čev/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec in 1 samica na 
zarod). Od teh živali je 10 mladi čev/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec ali 1 
samica na zarod) humano usmr čenih na PPD 11, pri čemer se možgani 
odstranijo, stehtajo in obdelajo za histopatološko vrednotenje. Poleg tega se zberejo podatki o teži možganov z uporabo nefiksiranih možganov 
preostalih 10 samcev in 10 samic na velikost odmerka. 
11. Druga skupina 20 živali/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec in 1 samica na 
zarod) se uporabi za vedenjsko ontogenijo (motori čna aktivnost), preglede 
po odstavitvi od sesanja (motori čna aktivnost in ocena starosti ob nastopu 
spolne zrelosti) in preskušanje kognitivne funkcije pri adolescentih. 
12. Druga skupina 20 živali/spol/velikost odmerka (tj. 1 samec in 1 samica na 
zarod) se uporabi za preskuse motori čne in senzori čne funkcije (slušni 
dražljaji) ter podrobna klini čna opazovanja. Od teh živali se 10 živali/spol/ 
velikost odmerka (tj. 1 samec ali 1 samica na zarod) anestezira in fiksira s 
perfuzijo ob koncu študije (približno PPD 70) Po dodatni fiksaciji  in situ  se 
možgani odstranijo, stehtajo in obdelajo za nevropatološko vrednotenje. 
13. Druga skupina 20 mladi čev/spol/velikost odmerka se uporabi za preskušanje 
kognitivne funkcije pri mladih odraslih (tj. 1 samec in 1 samica na zarod). 
Od tega je 10 živali/spol/skupino (tj. 1 samec ali 1 samica na zarod) ob koncu usmr čenih, pri čemer se možgani odstranijo in stehtajo.
 
Tabela 3  
Št. mladi čev (  a ) Št. mladi čev, razporejenih 
za preskus Pregled/preskus 
m ž  
1 5 10 m + 10 ž Teža/nevropatologija/morfome ­
trija možganov na PPD 11 
10 m + 10 ž Teža možganov na PPD 11 
2 6 20 m + 20 ž Vedenjska ontogenija (moto ­
rična aktivnost) 
20 m + 20 ž Motori čna aktivnost 
20 m + 20 ž Spolna zrelost 
20 m + 20 ž U čenje in spominjanje (PPD 27)  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 812
 
Št. mladi čev (  a ) 
Št. mladi čev, razporejenih 
za preskus Pregled/preskus 
m ž  
3 7 20 m + 20 ž Zvo čni dražljaj (adolescenti in 
mladi odrasli) 
20 m + 20 ž Podrobna klini čna opazovanja 
10 m + 10 ž Teža/nevropatologija/morfome ­
trija možganov mladih odraslih ~ PPD 70 
4 8 20 m + 20 ž U čenje in spominjanje (mladi 
odrasli) 
10 m + 10 ž Teža možganov mladih odraslih
 
( a ) V tem primeru se zarodi zmanjšajo na 4 samce in 4 samice, pri čemer se mladi 
samci ozna čijo s številkami od 1 do 4, mlade samice pa s številkami od 5 do 8.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 813
 
Dodatek 2  
Opredelitve  
Kemikalija: snov ali zmes. 
Preskusna kemikalija: katera koli snov ali zmes, ki se preskuša s to preskusno 
metodo.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 814
 
B.54  UTEROTROPNI BIOLOŠKI PRESKUS NA GLODAVCIH: 
KRATKOTRAJNI PRESEJALNI PRESKUS ZA ESTROGENE 
LASTNOSTI  
UVOD 
1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD št. 440 (2007). 
OECD je leta 1998 za čela z izvajanjem prednostne dejavnosti, da bi pregle ­
dala obstoje če in razvila nove smernice za odkrivanje in preskušanje poten ­
cialnih povzro čiteljev endokrinih motenj (1). Ta dejavnost je med drugim 
zajemala razvoj smernice za preskušanje za uterotropni biološki preskus na glodavcih. Za uterotropni biološki preskus na glodavcih je bil opravljen obsežen program validacije, med drugim priprava podrobnega referen čnega 
dokumenta (2) (3) in izvajanje obsežnih študij znotraj laboratorija in med 
laboratoriji, da bi dokazali ustreznost in ponovljivost biološkega preskusa z močnim referen čnim estrogenom, šibkimi agonisti estrogenskih receptorjev, 
močnim antagonistom estrogenskih receptorjev in negativno referen čno 
kemikalijo (4) (5) (6) (7) (8) (9). Ta preskusna metoda B.54 je bila razvita 
na podlagi izkušenj, pridobljenih med programom validacije preskusa in dobljenih rezultatov z agonisti estrogenov. 
2. Uterotropni biološki preskus je kratkotrajni presejalni preskus, ki izvira iz 
30. let prejšnjega stoletja (27) (28) in ga je prvi standardiziral strokovni 
odbor leta 1962 (32) (35). Temelji na pove čanju teže maternice ali utero ­
tropnem odzivu (za pregled glej (29)). Vrednoti sposobnost kemikalije, da sproži biološko delovanje, ki je v skladu z agonisti ali antagonisti naravnih 
estrogenov (npr. 17ß-estradiol), se pa za odkrivanje antagonistov uporablja 
precej redkeje kot za odkrivanje agonistov. Maternica se na estrogene odziva na dva na čina. Prvotni odziv je pove čanje teže zaradi prepojenosti 
z vodo. Temu odzivu sledi pove čanje teže zaradi rasti tkiva (30). Odziv 
maternice pri podganah in miših je kvalitativno primerljiv. 
3. Ta biološki preskus služi kot presejalna študija  in vivo , njegovo uporabo pa 
je treba obravnavati v okviru temeljnega okvira za preskušanje in oceno kemikalij, ki povzro čajo endokrine motnje, 'OECD Conceptual Framework 
for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals' 
(Dodatek 2). V tem temeljnem okviru je uterotropni biološki preskus na ravni 3 kot preskus  in vivo,  ki zagotavlja podatke o enem samem endo ­
krinem mehanizmu, tj. estrogenosti. 
4. Uterotropni biološki preskus naj bi bil vklju čen v sistem preskusov  in vitro  
in in vivo , s katerimi bi opredelili kemikalije, ki bi lahko vplivale na 
endokrini sistem, na podlagi tega pa bi bile opravljene ocene tveganja za zdravje ljudi in okolje. V programu OECD za validacijo so bili za oceno 
učinkovitosti preskusa za opredelitev estrogenih kemikalij uporabljeni 
močni in šibki agonisti estrogenov (4) (5) (6) (7) (8). Tako sta bila uspešno 
dokazana ob čutljivost postopka preskušanja za agoniste estrogenov in zago ­
tovljena dobra ponovljivost znotraj laboratorija in med laboratoriji. 
5. V zvezi z negativnimi kemikalijami je bila v program validacije vklju čena 
samo ena 'negativna' referen čna kemikalija, ki je bila kot negativna že 
potrjena z uterotropnim preskusom ter  in vitro  preskusi vezave na receptorje 
in receptorjev, ocenjeni pa so bili tudi dodatni podatki študij, ki niso bili povezani s programom OECD za validacijo in so dodatno podprli specifi ­ 
čnost uterotropnega biološkega preskusa za odkrivanje agonistov estrogenov 
(16).
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 815
 
ZAČETNI PREUDARKI IN OMEJITVE 
6. Agonisti in antagonisti estrogenov delujejo kot ligandi estrogenskih recep ­
torjev α in β in lahko pri receptorjih aktivirajo oziroma zavirajo dejavnost 
prepisovanja. Zato bi lahko prišlo do škodljivih u činkov za zdravje, 
vključno z učinki na razmnoževanje in razvoj. Zato je potrebna hitra 
ocena in vrednotenje kemikalije kot možnega agonista ali antagonista estro ­
genov. Afiniteta liganda do estrogenskega receptorja ali aktivacije prepiso ­
vanja  in vitro  je samo eden od kazalnikov morebitne nevarnosti. Drugi 
kazalniki so lahko aktivacija presnove in njena deaktivacija po vstopu v telo, razporeditev v tar čna tkiva in odstranitev iz telesa, vsaj delno pa so 
odvisni od na čina vnosa in preskusne kemikalije. Zato je treba morebitno 
dejavnost kemikalije pod ustreznimi pogoji prou čiti in vivo , razen če so 
potrebne informacije razvidne že iz lastnosti kemikalije glede absorpcije, porazdelitve, presnove in izlo čanja. Materni čna tkiva se na stimulacijo z 
estrogeni odzovejo s hitro in bujno rastjo, zlasti pri laboratorijskih glodav ­
cih, pri katerih pojatveni cikel traja približno 4 dni. Glodavci, zlasti podgane, se pogosto uporabljajo tudi v študijah strupenosti za opredelitev nevarnosti. Zato je maternica pri glodavcih ustrezen tar čni organ za prese ­
janje agonistov in antagonistov estrogenov  in vivo . 
7. Ta preskusna metoda temelji na protokolih iz validacijske študije OECD, ki 
so se izkazali za zanesljive in ponovljive v študijah znotraj laboratorija in med laboratoriji (5) (7). Trenutno sta na voljo dve metodi, in sicer metoda s 
sterilizirano odraslo samico in metoda z nezrelo nesterilizirano samico. V 
programu OECD za validacijo preskusa se je izkazalo, da sta obe metodi primerljivo ob čutljivi in ponovljivi. Metoda z nezrelo samico je nekoliko 
manj specifi čna, ker je os hipotalamus – hipofiza – spolne žleze (os HPG) 
nedotaknjena, vendar pokriva širše podro čje preiskave kot metoda s sterili ­
zirano samico, saj se lahko pri prvi metodi žival odzove na kemikalije, ki vplivajo na os HPG in ne samo na estrogenski receptor. Delovanje osi HPG pri podgani se pri čne pri približno 15 dneh starosti. Pred tem pubertete ni 
mogoče spodbuditi s tretiranjem, na primer z GnRH. Ko samice prihajajo v 
puberteto, imajo pred odpiranjem nožnice ve č tihih ciklov, zaradi katerih 
sicer ne pride do odpiranja nožnice ali ovulacije, so pa prisotna hormonska nihanja. Če kemikalija os HPG neposredno ali posredno stimulira pred 
puberteto, pride do zgodnje ovulacije in pospešenega odpiranja nožnice. 
Do tega ne pride samo zaradi kemikalij, ki delujejo na os HPG; tudi nekatere vrste hrane, ki imajo višje ravni presnovljive energije kot druge, bodo stimulirale rast in spodbudile odpiranje nožnice, čeprav niso estrogen ­
ske. Takšne kemikalije ne bi povzro čile uterotropnega odziva pri sterilizi ­
rani odrasli samici, saj njihova os HPG ne deluje. 
8. Zaradi dobrobiti živali je zaželena uporaba metode z nezrelimi podganami, 
saj tako ni potrebna kirurška predpriprava živali, izogniti pa se je mogo če 
tudi neuporabi tistih živali, ki kažejo morebitne znake pojatvenega cikla 
(glej odstavek 30).
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 816
 
9. Do uterotropnega odziva ne pride samo zaradi estrogenosti, tj. do odziva 
lahko pride tudi zaradi drugih kemikalij, ne samo agonistov ali antagonistov 
estrogenov. Do stimulativnega odziva lahko na primer pride tudi zaradi relativno velikih odmerkov progesterona, testosterona ali razli čnih sinteti ­ 
čnih progestinov (30). Vsak odziv je mogo če histološko analizirati za kera ­
tinizacijo in kornifikacijo nožnice (30). Ne glede na morebiten izvor odziva 
naj bi bili na podlagi pozitivnega rezultata uterotropnega biološkega preskusa obi čajno začeti postopki za nadaljnja pojasnila. Dodatni dokazi 
o estrogenosti bi bili lahko pridobljeni na podlagi preskusov  in vitro , kot 
so preskusi vezave na estrogenske receptorje in preskusi aktivacije prepiso ­
vanja, ali na podlagi drugih preskusov  in vivo,  kot je preskus na podgani 
ženskega spola v puberteti. 
10. Ob upoštevanju, da uterotropni biološki preskus služi kot presejalna študija  
in vivo , je bil pristop validacije koristen tako za vprašanja, povezana z 
dobrobitjo živali, kot za ve čstopenjsko strategijo preskušanja. Zato je bilo 
prizadevanje usmerjeno v strogo validacijo ponovljivosti in ob čutljivosti za 
estrogenost, kar je najpomembnejše vprašanje pri številnih kemikalijah, 
medtem ko v razsežnost antiestrogenosti v preskusu ni bilo vloženega veliko truda. Preskušen je bil samo en antiestrogen z mo čnim delovanjem, 
saj je število kemikalij z jasnim antiestrogenim profilom (ki ga ne prikrije 
kakšno estrogeno delovanje) zelo majhno. Zato je ta preskusna metoda 
namenjena estrogenemu protokolu, protokol, ki v preskusu opisuje antago ­
nistično delovanje, pa je vklju čen v smernici (37). Ponovljivost in ob čut­
ljivost preskusa za kemikalije z izklju čno antiestrogenim delovanjem bo 
jasneje opredeljena v prihodnosti, ko bo preskusni postopek že nekaj časa 
v uporabi in bo opredeljenih ve č kemikalij s tem na činom delovanja. 
11. Priznava se, da morajo biti vsi postopki, pri katerih se uporabljajo živali, v 
skladu z lokalnimi standardi za varstvo živali; opisi oskrbe in ravnanja z živalmi v nadaljevanju so minimalni standardi, nadomestili pa jih bodo lokalni predpisi, kot je Direktiva 2010/63/EU Evropskega parlamenta in 
Sveta z dne 22. septembra 2010 o zaš čiti živali, ki se uporabljajo v znan ­
stvene namene (38). Nadaljnje smernice o humanem ravnanju z živalmi je predložila OECD (25). 
12. Kot pri vseh preskusih, pri katerih se uporabljajo žive živali, se je treba 
pred pričetkom izvajanja preskusa prepri čati, da so podatki resni čno 
potrebni. Na primer, dva pogoja, pri katerih so podatki potrebni, sta: 
— visok potencial za izpostavljenost (raven 1 temeljnega okvira, Dodatek 
2) ali pokazatelji estrogenosti (raven 2), zaradi katerih je potrebno preveriti, ali se lahko takšni u činki pojavijo  in vivo , 
— učinki, ki kažejo na estrogenost v preskusih  in vivo  na ravni 4 ali 5, da 
bi ugotovili, ali so bili u činki povezani z estrogenimi mehanizmi, ki jih 
ni mogoče pojasniti s preskusom  in vitro . 
13. Opredelitve, uporabljene v tej preskusni metodi, so navedene v Dodatku 1.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 817
 
NAČELO PRESKUSA 
14. Občutljivost uterotropnega biološkega preskusa je odvisna od sistema 
preskušanja na živalih, pri katerem os hipotalamus – hipofiza – jaj čniki 
ne deluje, zaradi česar so prisotne nizke endogene koncentracije cirkulira ­
jočega estrogena. Tako se zagotovi nizka osnovna teža maternice in najve čji 
možni razpon odziva na prejete estrogene. To zahtevo izpolnjujeta dve na 
estrogen ob čutljivi stanji pri glodavcih ženskega spola: 
(i) nezrele samice po odstavitvi in pred puberteto ter 
(ii) mlade odrasle samice po sterilizaciji, ko je dovolj časa, da se mater ­
nična tkiva zmanjšajo. 
15. Preskusna kemikalija se vnese dnevno, in sicer oralno z gavažo ali s 
podkožnim injiciranjem. Stopnjevani odmerki preskusne kemikalije se dajejo vsaj dvema tretiranima skupinama (za navodila glej odstavek 33) 
preskusnih živali, pri čemer se za vsako skupino uporabi ena velikost 
odmerka, in sicer v obdobju treh zaporednih dni pri metodi z nesterilizirano nezrelo samico in obdobju najmanj treh zaporednih dni pri metodi s steri ­
lizirano odraslo samico. Približno 24 ur po prejetju zadnjega odmerka se na 
živalih opravi obdukcija. Pri agonistih estrogenov se na podlagi srednje teže 
maternice živali v tretiranih skupinah glede na nosilec oceni, ali je prišlo do statistično značilnega pove čanja. Statisti čno značilno pove čanje srednje teže 
maternice živali v preskusni skupini v tem biološkem preskusu pomeni 
pozitiven odziv.
 
OPIS METODE  
Izbira živalskih vrst  
16. Lahko se uporabijo laboratorijski sevi glodavcev, ki se obi čajno uporabljajo. 
Med validacijo so bili na primer uporabljeni sevi podgan Sprague-Dawley in Wistar. Sevi z maternicami, za katere je znano ali pa se sumi, da so manj 
odzivne, se ne smejo uporabiti. Laboratorij bi moral dokazati ob čutljivost 
uporabljenega seva v skladu z odstavkoma 26 in 27. 
17. V uterotropnem biološkem preskusu se od 30-ih let prejšnjega stoletja 
običajno uporabljajo podgane in miši. Validacijske študije OECD so bile 
izvedene samo s podganami na podlagi prepri čanja, da sta obe vrsti enako ­
vredni, zato bi morala biti ena vrsta dovolj za globalno validacijo, da bi 
prihranili sredstva in živali. Podgane so prva izbira pri ve čini študij strupe ­
nosti za razmnoževanje in razvoj. Ker za miši obstaja obsežna zbirka prete ­
klih podatkov, in bi tako razširili podro čje uporabe uterotropnega biolo ­ 
škega preskusa na glodavcih na uporabo miši kot preskusne vrste, je bila 
na miših opravljena omejena nadaljevalna validacijska študija (16). V skladu s prvotnim namenom ohranjanja sredstev in živali je bil izbran premostitveni pristop z omejenim številom preskusnih kemikalij in sodelu ­
jočih laboratorijev ter brez preskušanja kodiranih vzorcev. Ta premostitvena 
validacijska študija za uterotropni biološki preskus na steriliziranih mladih odraslih miših dokazuje, da se podatki, pridobljeni s podganami in mišmi, kvalitativno in kvantitativno dobro dopolnjujejo. Če bo po uterotropnem 
biološkem preskusu morda izvedena dolgotrajna študija, bo tako mogo če 
v obeh študijah uporabiti živali iste vrste, seva in izvora. Premostitveni pristop je bil uporabljen samo za sterilizirane odrasle miši, poro čilo pa ne 
zagotavlja zanesljivih podatkov za validacijo modela z nezrelimi samicami, 
zato model z nezrelimi mišmi ne sodi na podro čje uporabe obstoje če 
preskusne metode.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 818
 
18. Zato se lahko v nekaterih primerih namesto podgan uporabijo miši. 
Uporabo te vrste je treba utemeljiti na podlagi toksikoloških, farmakokine ­
tičnih in/ali drugih meril. Za miši bodo morda potrebne spremembe proto ­
kola. Na primer, poraba hrane pri miših glede na telesno težo je ve čja kot 
pri podganah, zato mora biti vsebnost fitoestrogena v hrani za miši manjša 
kot v hrani za podgane (9) (20) (22).  
Nastanitveni in prehranjevalni pogoji  
19. Vsi postopki morajo biti skladni z vsemi lokalnimi standardi za varstvo 
živali v laboratorijih. Ti opisi oskrbe in ravnanja z živalmi so minimalni 
standardi, ki jih bodo nadomestili lokalni predpisi, kot je Direktiva 2010/63/EU Evropskega parlamenta in Sveta z dne 22. septembra 2010 o zaščiti živali, ki se uporabljajo v znanstvene namene (38). Temperatura v 
prostoru s preskusnimi živalmi naj bo 22 °C (z odstopanjem približno 
± 3 °C). Relativna vlažnost naj bo najmanj 30 % in po možnosti naj ne presega 70 %, razen med čiščenjem prostora. Cilj je 50–60-odstotna rela ­
tivna vlažnost. Osvetlitev naj bo umetna. Dnevno zaporedje osvetlitve naj 
bo 12 ur svetlobe, 12 ur teme. 
20. Laboratorijsko prehrano in pitno vodo je treba priskrbeti  ad libitum . Mlade 
odrasle živali so lahko nastanjene posami čno ali pa so v kletke razvrš čene v 
skupine po najve č tri živali. Zaradi mladosti nezrelih živali je priporo čljiva 
družabna skupinska nastanitev. 
21. Znano je, da visoka vsebnost fitoestrogenov v laboratorijski prehrani 
povzroči tolikšno pove čanje teže maternice pri glodavcih, da to vpliva na 
uterotropni biološki preskus (13) (14) (15). Pri nezrelih živalih lahko visoka vsebnost fitoestrogenov in presnovljiva energija v laboratorijski prehrani 
vplivata tudi na pojav zgodnje pubertete. Fitoestrogeni so prisotni v 
glavnem zaradi vsebnosti izdelkov iz soje in lucerne v laboratorijski prehrani, koncentracija fitoestrogenov v standardni laboratorijski prehrani pa se razlikuje od serije do serije (23). Telesna teža je pomembna spremen ­
ljivka, ker je z njo povezana koli čina zaužite hrane. Zato se lahko dejanski 
odmerek fitoestrogenov, zaužitih z enako prehrano, razlikuje glede na vrsto in starost (9). Pri nezrelih podganah ženskega spola je lahko poraba hrane glede na telesno težo približno dvakrat ve čja od porabe hrane pri sterilizi ­
ranih mladih odraslih samicah. Pri mladih odraslih miših je lahko poraba 
hrane glede na telesno težo približno štirikrat ve čja od porabe hrane pri 
steriliziranih mladih odraslih podganah ženskega spola. 
22. Rezultati uterotropnega biološkega preskusa (9) (17) (18) (19) kažejo, da je 
določena količina fitoestrogenov v prehrani sprejemljiva in ne zmanjša 
občutljivosti biološkega preskusa. Praviloma naj raven fitoestrogenov v 
prehrani nezrelih podganah ženskega spola sevov Sprague Dawley in Wistar 
(6) (9) ne bi presegla 350 μg ekvivalentov genisteina/gram laboratorijske 
prehrane. Takšna prehrana bi morala biti primerna tudi pri preskušanju na mladih odraslih steriliziranih podganah, ker je poraba hrane glede na telesno 
težo pri mladih odraslih živalih manjša v primerjavi s porabo hrane pri 
nezrelih živalih. Če se uporabijo odrasle sterilizirane miši ali podgane, ki 
so bolj ob čutljive na fitoestrogen, je treba upoštevati sorazmerno zmanjšanje 
ravni fitoestrogenov v prehrani (20). Poleg tega lahko zaradi razlik v razpo ­
ložljivi presnovni energiji iz razli čne prehrane pride do časovnega zamika 
začetka pubertete (21) (22).
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 819
 
23. Pred za četkom študije je treba skrbno izbrati prehrano brez pove čane vred­
nosti fitoestrogenov (za navodila glej (6) (9)) ali presnovljive energije, ki 
lahko vplivajo na rezultate (15) (17) (19) (22) (36). Zagotavljanje ustrez ­
nega delovanja sistema preskušanja, ki ga uporablja laboratorij in je dolo čen 
v odstavkih 26 in 27, je pomembno za preverjanje obeh dejavnikov. Kot 
varovalo v skladu z dobro laboratorijsko prakso je treba za vsako serijo 
prehrane, uporabljene med študijo, opraviti reprezentativno vzor čenje zaradi 
morebitne analize vsebnosti fitoestrogenov (npr. v primeru visoke kontrolne teže maternice v primerjavi s preteklimi kontrolnimi vzorci ali nezadostnega 
odziva na referen čni estrogen, 17-alfa-etinilestradiol). Alikvote je treba 
analizirati v okviru študije ali pa jih zamrzniti pri –20 °C oziroma tako, da se vzorec pred analizo ne razgradi. 
24. Nekatere vrste stelje lahko vsebujejo naravno prisotne estrogene ali antie ­
strogene kemikalije (na primer, znano je, da koruzni storž vpliva na cikli ­ 
čnost pri podganah in o čitno deluje antiestrogeno). Izbrana stelja naj bi 
vsebovala najmanjšo možno koncentracijo fitoestrogenov.
 
Priprava živali  
25. Preskusne živali, ki ne kažejo nobenih znakov bolezni ali fizi čnih nepravil ­
nosti, se naklju čno dodelijo v kontrolne in tretirane skupine. Kletke je treba 
razporediti tako, da so možni u činki zaradi njihovega položaja čim manjši. 
Živali je treba ozna čiti z edinstvenimi oznakami. Najbolje je, da so nezrele 
živali med prilagajanjem do odstavitve v kletkah skupaj z materami ali nadomestnimi materami. Obdobje prilagajanja pred za četkom študije naj 
bi pri mladih odraslih živalih in nezrelih živalih, ki so prispele skupaj z 
materami ali nadomestnimi materami, trajalo približno 5 dni. Če so prispele 
nezrele živali, odstavljene in brez mater, bo morda potrebno krajše obdobje prilagajanja, saj naj bi se dajanje odmerkov pri čelo takoj po odstavitvi (glej 
odstavek 29).
 
POSTOPEK  
Preverjanje strokovnosti laboratorija  
26. Za preverjanje strokovnosti laboratorija sta na voljo dve razli čni možnosti: 
— redno preverjanje na podlagi prvotne študije osnovne pozitivne kontrole 
(glej odstavek 27). Vsaj vsakih 6 mesecev in vedno, ko pride do spre ­
membe, ki bi lahko vplivala na uspešnost preskusa (npr. nova sestava prehrane, menjava osebja, ki opravlja obdukcije, menjava seva živali ali 
dobavitelja itd.), je treba odzivnost sistema preskušanja (živalski model) 
preveriti s primernim odmerkom (na podlagi študije osnovne pozitivne kontrole iz poglavja 27) referen čnega estrogena: 17 α-etinilestradiol 
(št. CAS 57-63-6) (EE), 
— uporaba so časnih kontrolnih vzorcev z vklju čitvijo skupine, ki je prejela 
ustrezni odmerek referen čnega estrogena, v vsak preskus. 
Če se sistem ne odzove v skladu s pri čakovanji, je treba pogoje preskusa 
preveriti in ustrezno spremeniti. Priporo ča se, da je odmerek referen čnega 
estrogena, ki bo uporabljen v obeh primerih, približno ED70 do 80.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 820
 
27. Študija osnovne pozitivne kontrole  – Preden laboratorij prvi č izvede 
študijo v okviru te preskusne metode, je treba dokazati strokovnost labora ­
torija s preskusom odzivnosti živalskega modela z dolo čitvijo odziva na 
odmerek referen čnega estrogena: 17 α-etinilestradiola (št. CAS 57-63- 
6) (EE) z najmanj štirimi odmerki. Odziv teže maternice se nato primerja 
z dobljenimi preteklimi podatki (glej vir (5)). Če študija osnovne pozitivne 
kontrole ne prinese pri čakovanih rezultatov, je treba pogoje preskusa preve ­
riti in spremeniti.  
Število in stanje živali  
28. Vsaka tretirana in kontrolna skupina mora vklju čevati vsaj 6 živali (za 
protokola obeh metod, tj. z nezrelo in sterilizirano odraslo samico).  
Starost nezrelih živali  
29. Pri uterotropnem biološkem preskusu z nezrelimi živalmi je treba opredeliti 
dan skotitve. Dajanje odmerkov se mora za četi dovolj zgodaj, da se ob 
koncu dajanja preskusne kemikalije še ne pri čne fiziološko naraš čanje endo ­
genih estrogenov, povezanih s puberteto. Po drugi strani pa obstajajo dokazi, da so zelo mlade živali morda manj ob čutljive. Pri opredelitvi 
optimalne starosti mora vsak laboratorij upoštevati lastne osnovne podatke 
o zorenju. 
Na splošno se lahko dajanje odmerkov podganam pri čne takoj po zgodnji 
odstavitvi na 18. poporodni dan (dan skotitve je poporodni dan 0). Dajanje odmerkov podganam naj bi bilo kon čano 21. poporodni dan, vsekakor pa 
pred 25. poporodnim dnem, saj se po tej starosti za čne delovanje osi hipo ­
talamus – hipofiza – jaj čniki, ravni endogenih estrogenov pa lahko za čnejo 
naraščati hkrati s povpre čji osnovne teže maternice in pove čanjem stan ­
dardnih odklonov v skupini (2) (3) (10) (11) (12).
 
Postopek sterilizacije  
30. Pri steriliziranih podganah in miših ženskega spola (tretirane in kontrolne 
skupine) se sterilizacija opravi med 6. in 8. tednom starosti. Pri podganah 
naj bi od sterilizacije do prvega odmerka preteklo vsaj 14 dni, da se lahko 
maternica zmanjša na najmanjšo, stabilno osnovno težo. Pri miših naj bi od sterilizacije do prvega odmerka preteklo vsaj 7 dni. Ker za proizvodnjo velike koncentracije cirkulirajo čih estrogenov (3) zadoš ča majhna koli čina 
materničnega tkiva, je treba pred uporabo na živalih opraviti preskus z 
opazovanjem epitelijskih celic, vzetih z brisom nožnice vsaj pet zaporednih dni (npr. pri podganah na 10.–14. dan po sterilizaciji). Če živali kažejo 
morebitne znake pojatvenega cikla, se jih ne sme uporabiti. Pri obdukciji 
je treba ostanke jaj čnikov pregledati zaradi morebitne prisotnosti tkiva jaj č­
nikov. Če je tkivo prisotno, se živali ne smejo uporabiti pri izra čunih (3). 
31. Postopek sterilizacije se pri čne tako, da pravilno anestezirana žival leži na 
trebuhu. Rez, s katerim se odpre dorzolateralno trebušno steno, naj meri približno 1 cm v dolžino na sredini med zunanjim robom reber in črevni­ 
čnim grebenom ter nekaj milimetrov lateralno od lateralnega roba ledvene 
mišice. Jaj čnik je treba iz trebušne votline prestaviti na asepti čno polje. 
Jajčnik je treba lo čiti pri stiku jajcevoda in maternice. Po potrditvi, da ni 
prišlo do ve čje krvavitve, je treba trebušno steno zapreti s šivom, kožo pa 
speti s sponkami ali zapreti z ustreznim šivom. Mesto ligacije je prikazano 
na sliki 1. Uporabiti je treba primerne pooperativne analgetike v skladu s 
priporočili veterinarja, ki ima izkušnje z nego glodavcev.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 821
 
Telesna teža  
32. Pri metodi s sterilizirano odraslo samico telesna teža in teža maternice nista 
povezani, ker na težo maternice vplivajo hormoni, kot je estrogen, ne pa 
tudi rastni faktorji, ki vplivajo na velikost telesa. Ravno nasprotno je telesna teža povezana s težo maternice pri modelu z nezrelo samico v času dozo­
revanja (34). Zato naj bi bilo na za četku študije pri modelu z nezrelo samico 
nihanje teže uporabljenih živali čim manjše in naj ne bi preseglo ± 20 % 
srednje teže. To pomeni, da mora rejec standardizirati velikost zaroda in tako zagotoviti, da so potomci razli čnih mater približno enako hranjeni. 
Živali je treba razdeliti v skupine (kontrolne in tretirane) v naklju čnem 
razponu teže, tako da se povpre čna telesna teža vsake skupine statisti čno 
ne razlikuje od drugih skupin. Če je mogo če, je treba paziti, da živali iz 
istega legla niso razporejene v isto tretirano skupino, ne da bi se zaradi tega povečalo število legel, uporabljenih v raziskavi.
 
Odmerjanje  
33. Za ugotavljanje, ali lahko preskusna kemikalija  in vivo  deluje estrogeno, 
običajno zadoš čajo dve skupini z odmerki in kontrola, zato je zaradi dobro ­
biti živali zaželen takšen na čin preskušanja. Če je cilj pridobiti krivuljo 
odziva na odmerek ali ekstrapolacija na manjše odmerke, so potrebne vsaj 3 skupine odmerkov. Če ni potrebna samo opredelitev estrogenega 
delovanja, ampak so potrebne tudi druge informacije (na primer ocena 
moči delovanja), je treba razmisliti o druga čnem režimu odmerjanja. 
Razen tretiranja s preskusno kemikalijo je treba živali v kontrolni skupini obravnavati enako kot živali v preskusni skupini. Če je pri dajanju 
preskusne kemikalije uporabljen nosilec, mora kontrolna skupina prejeti 
enako koli čino nosilca kot tretirane skupine (ali najve čjo uporabljeno koli ­ 
čino pri preskusnih skupinah, če so količine, ki jih skupine prejmejo, razli ­ 
čne). 
34. Cilj pri uterotropnem biološkem preskusu je izbrati odmerke, ki zagotavljajo 
preživetje živali in zanje niso preve č strupeni oziroma jim ne povzro čajo 
prevelike stiske po treh zaporednih dneh dajanja kemikalije, do najve čjega 
odmerka 1000 mg/kg/d. Pri predlaganju in izbiri velikosti vseh odmerkov je treba upoštevati vse obstoje če podatke o strupenosti in (toksiko-)kinetiki, ki 
so na razpolago za preskusno kemikalijo ali sorodne snovi. Pri najve čjem 
odmerku je treba najprej upoštevati informacije o LD50 in/ali akutni stru ­
penosti, da bi se izognili smrti, hudemu trpljenju ali stiski živali (24) (25) (26). Najve čji odmerek bi moral biti najve čji toleran čni odmerek (MTD); 
študija, opravljena z velikostjo odmerka, ki je povzro čil pozitiven utero ­
tropni odziv, bi bila prav tako sprejeta. Kot sito so na splošno sprejemljivi 
veliki intervali med odmerki (npr. polovica logaritemske enote, kar ustreza večanju odmerka za faktor 3,2, ali celo do ene logaritemske enote). Če 
ustrezni podatki niso na voljo, se lahko opravi študija ugotavljanja obmo čja, 
s pomočjo katere se dolo čijo odmerki za uporabo. 
35. Namesto tega se lahko v primeru, ko je mo č estrogenega delovanja agonista 
mogoče oceniti s podatki  in vitro  (ali in silico ), pri izbiri odmerka upošte ­
vajo ti podatki. Koli
čina preskusne kemikalije, ki bi povzro čila uterotropne 
odzive, enakovredne referen čnemu agonistu (etinilestradiolu), se na primer 
oceni z njeno relativno  in vitro  stopnjo u činkovanja glede na etinilestradiol. 
Največji preskusni odmerek se dobi tako, da se ta enakovredni odmerek 
pomnoži z ustreznim faktorjem, npr. 10 ali 100.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 822
 
Preudarki glede ugotavljanja obmo čja 
36. Po potrebi se lahko z nekaj živalmi izvede predhodna študija za ugota ­
vljanje obmo čja. S tem v zvezi se lahko uporabi smernica OECD št. 19 
(25), ki opredeljuje klini čne znake strupenosti ali stiske pri živalih. Če je to 
v okviru te študije za ugotavljanje obmo čja po treh dneh dajanja odmerkov 
izvedljivo, se lahko maternice izreže in stehta približno 24 ur po zadnjem 
odmerku. Ti podatki so nato lahko v pomo č pri zasnovi glavne študije 
(izbira sprejemljivih najve čjih in manjših odmerkov ter priporo čilo glede 
števila skupin z odmerki).  
Dajanje odmerkov  
37. Preskusna kemikalija se daje oralno z gavažo ali s podkožnim injiciranjem. 
Pri izbiri na čina dajanja je treba upoštevati vprašanja, povezana z dobrobitjo 
živali in toksikološke vidike, kot so relevantnost za na čin izpostavljenosti 
kemikaliji pri ljudeh (npr. na podlagi dajanja oralno z gavažo se modelira 
izpostavljenost prek zaužitja, na podlagi podkožnega injiciranja se modelira 
izpostavljenost prek vdihavanja ali adsorpcije skozi kožo), fizikalne/ke ­
mijske lastnosti preskusne kemikalije in zlasti obstoje či toksikološki podatki 
ter podatki o presnovi in kinetiki (npr. potreba po izogibanju presnovi 
prvega prehoda, boljša u činkovitost dolo čenega načina izpostavljenosti). 
38. Priporo ča se, da se, kadar koli je to mogo če, najprej prou či uporaba vodne 
raztopine/suspenzije. Ker je ve čina estrogenih ligandov ali njihovih meta ­
boličnih prekurzorjev hidrofobnih, se obi čajno uporablja raztopina/suspen ­
zija v olju (npr. koruznem, arašidovem, sezamovem ali olj čnem olju). Ker 
imajo ta olja razli čno vsebnost kalorij in maš čob, lahko nosilec vpliva na 
skupni vnos presnovljive energije, zaradi česar bi morda lahko spremenil 
izmerjene kon čne točke, kot je teža maternice, zlasti pri metodi z nezrelo 
samico (33). Zato je treba pred za četkom študije za vsak nosilec, ki bo 
uporabljen, za primerjavo uporabiti kontrolne vzorce brez nosilcev. Preskusne kemikalije se lahko raztopijo v najmanjši koli čini 95-odstotnega 
etanola ali drugega primernega topila, na kon čno delovno koncentracijo pa 
razredčijo v preskusnem nosilcu. Strupene lastnosti topila morajo biti znane 
in preskušene v lo čeni kontrolni skupini, pri kateri je uporabljeno samo 
topilo. Če je preskusna kemikalija stabilna, se lahko raztapljanje preskusne 
kemikalije pospeši s previdnim segrevanjem in mo čnim mehanskim delova ­
njem. Dolo čiti je treba stabilnost preskusne kemikalije v nosilcu. Če je 
preskusna kemikalija ves čas trajanja študije stabilna, se lahko pripravi 
samo začetni alikvot preskusne kemikalije, nato pa se dnevno pripravljajo 
določene razred čine odmerkov. 
39. Čas odmerjanja je odvisen od uporabljenega modela (glej odstavek 29 za 
model z nezrelo samico in odstavek 30 za sterilizirano odraslo samico). Nezrele podgane ženskega spola prejemajo preskusno kemikalijo dnevno tri zaporedne dni. Pri steriliziranih podganah ženskega spola se prav tako 
priporo
ča tridnevno odmerjanje, vendar je sprejemljiva tudi daljša izposta ­
vljenost, ki lahko izboljša odkrivanje kemikalij s šibko aktivnostjo. Pri sterilizirani miši ženskega spola bi moralo pri mo čnih agonistih estrogenov 
zadoščati tridnevno dajanje odmerka, saj podaljšanje na najve č sedem dni 
ne prinaša nobenih prednosti, vendar pa v validacijski študiji (16) ta pove ­
zava za šibke estrogene ni bila preverjena, zato bi bilo treba pri sterilizirani odrasli samici odmerjanje podaljšati na najve č 7 zaporednih dni.Odmerek je 
treba dati vsak dan približno ob istem času. Po potrebi jih je treba prilago ­
diti, da bi ohranili konstantno velikost odmerka glede na telesno težo živali 
(npr. mg preskusne kemikalije na kg telesne teže na dan). Variabilnost preskusnega volumna na podlagi telesne teže je treba s prilagajanjem koncentracije raztopine za odmerjanje obdržati na kar najnižji ravni, da bi 
zagotovili konstantno koli čino na podlagi telesne teže pri vseh odmerkih in 
vseh načinih dajanja.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 823
 
40. Če se preskusna kemikalija daje z gavažo, jo je treba živali dati v 
enkratnem dnevnem odmerku z uporabo želod čne sonde ali primerne intu ­
bacijske kanile. Najve čja količina tekočine, ki se lahko da naenkrat, je 
odvisna od velikosti preskusne živali. Upoštevati je treba lokalne standarde za varstvo živali, koli čina pa ne sme prese či 5 ml/kg telesne teže, razen pri 
vodnih raztopinah, pri katerih se lahko uporabi 10 ml/kg telesne teže. 
41. Če se preskusna kemikalija daje s podkožnim injiciranjem, se daje v 
enkratnem dnevnem odmerku. Odmerki se dajejo na dorzoskapularnem in/ali ledvenem delu s sterilno iglo (npr. velikosti 23 ali 25) in brizgo 
tuberkulinko. Mesto injiciranja se lahko obrije. Morebitne izgube, uhajanje 
snovi na mestu injiciranja ali nepopoln vnos odmerka je treba zabeležiti. Skupna koli čina odmerka na podgano na dan ne sme prese či 5 ml/kg 
telesne teže, razdeljenih na dve mesti injiciranja, razen pri vodnih raztopi ­
nah, pri katerih se lahko uporabi 10 ml/kg telesne teže.
 
Opazovanja  
Splošna in klini čna opazovanja  
42. Splošna klini čna opazovanja je treba opraviti vsaj enkrat dnevno in pogo ­
steje, če se kažejo znaki strupenosti. Opazovanja je najbolje opraviti vsak 
dan ob istih časih ob upoštevanju vrhunca pri čakovanih u činkov po odmer ­
janju. Vse živali je treba opazovati za dolo čitev smrtnosti, obolevnosti in 
splošnih klini čnih znakov, kot so spremembe vedenja, spremembe na koži, 
dlaki, očeh in sluznicah, pojav sekrecije in ekskrecije ter delovanje avto ­
nomnega živ čevja (npr. solzenje, piloerekcija, velikost zenic, nenavaden 
vzorec dihanja).  
Telesna teža in poraba hrane  
43. Vse živali je treba stehtati dnevno na 0,1 g natan čno, in sicer tik pred 
začetkom tretiranja, tj. ko se živali dodeli v skupine. Izmeri se lahko tudi 
količina hrane, ki jo živali porabijo med obdobjem tretiranja, in sicer za 
vsako posamezno kletko s tehtanjem hranilnic. Rezultati glede porabe hrane se izrazijo v gramih na podgano na dan.
 
Seciranje in merjenje teže maternice  
44. Podgane so humano usmr čene 24 ur po prejetem zadnjem odmerku. Zaželen 
je naključni vrstni red obdukcije po skupinah, da ne bi prišlo do napredo ­
vanja neposredno po skupinah odmerkov, kar bi lahko v manjši meri vpli ­
valo na podatke. Cilj biološkega preskusa je merjenje teže mokre in osušene maternice. V mokri teži je zajeta maternica s teko činami v lumnu. Osušena 
teža se izmeri po odstranitvi teko čin v lumnu maternice. 
45. Pred seciranjem je treba pri nezrelih živalih preveriti odpiranje nožnice. 
Postopek seciranja se za čne s prerezom trebušne stene pri sramni čni zrasti. 
Nato je treba rog maternice in jaj čnike, če so prisotni, lo čiti od dorzalne 
trebušne stene. Se čni mehur in uretri je treba odstraniti z ventralne in 
lateralne strani maternice in nožnice. Brazgotinasto zarastlino med rektumom in nožnico je treba lo čiti tako, da je viden stik nožni čnega 
ustja in presredka. Maternico in nožnico se od telesa lo či s prerezom 
nožnične stene tik nad stikom s presredkom, kot je prikazano na sliki 2. 
Maternico je treba od telesne stene lo čiti s previdnim prerezom mezenterija
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 824
 
maternice od to čke pritrditve po celotni dorzolateralni dolžini vsakega roga 
maternice. Po odstranitvi maternice iz telesa je treba biti dovolj hiter, da ne 
pride do izsušitve tkiv. Izguba teže zaradi izsušitve je pomembnejša pri majhnih tkivih, kot je maternica (23). Če so jajčniki prisotni, jih je treba 
ločiti pri jajcevodu in paziti, da ne pride do izgube teko čine iz lumna roga 
maternice. Če je bila žival sterilizirana, je treba ostanke jaj čnikov pregledati 
zaradi morebitne prisotnosti tkiva jaj čnikov. Odstraniti je treba odve čno 
maščobo in vezno tkivo. Nožnico je treba od maternice lo čiti tik pod 
materničnim vratom, tako da vrat ostane pritrjen na maternico, kot je prika ­
zano na sliki 2. 
46. Maternice je treba posami čno prenesti v edinstveno ozna čeno in stehtano 
posodo (npr. petrijevko ali plasti čno posodo za tehtanje), pri čemer je treba 
še vedno paziti, da pred tehtanjem ne pride do izsušitve (npr. v posodo se lahko na primer odloži filtrirni papir, rahlo navlažen z raztopino vode in soli). Maternico s teko čino v lumnu se stehta na 0,1 mg natan čno (mokra 
teža maternice). 
47. Vsako posamezno maternico je treba nato posami čno obdelati in odstraniti 
tekočino iz lumna. Oba roga maternice se vzdolžno prebodeta ali prerežeta. 
Maternica se odloži na rahlo navlažen filtrirni papir (npr. Whatman št. 3) in nežno stisne z drugim kosom rahlo navlaženega filtrirnega papirja, da se 
popolnoma odstrani teko čina iz lumna. Maternica brez teko čine iz lumna se 
stehta na 0,1 mg natan čno (osušena teža maternice). 
48. S podatki o teži maternice ob usmrtitvi se je mogo če prepričati, da primerna 
starost nezrele nesterilizirane podgane ni bila presežena, vendar so glede tega odlo čilni pretekli podatki o sevu podgan, ki ga je uporabil laboratorij 
(glej odstavek 56 za razlago rezultatov).
 
Neobvezne preiskave  
49. Po tehtanju se lahko maternica fiksira v 10-odstotnem nevtralnem formalin ­
skem pufru in se po barvanju s hematoksilinom in eozinom histopatološko 
pregleda. Skladno s tem se lahko pregleda tudi nožnica (glej odstavek 9). 
Poleg tega se lahko za kvantitativno primerjavo opravi tudi morfometri čno 
merjenje povrhnjice endometrija.  
PODATKI IN PORO ČANJE  
Podatki  
50. Podatki študije morajo obsegati: 
— število posameznih živali na za četku preskusa, 
— število in identiteto živali, najdenih poginulih med preskusom ali 
usmrčenih iz humanih razlogov ter datum in čas pogina ali humane 
usmrtitve, 
— število in identiteto živali, ki kažejo znake strupenosti in opis znakov 
zaznane strupenosti, vklju čno s časom začetka, trajanja in resnosti more ­
bitnih strupenih u činkov, in 
— število in identiteto živali, pri katerih so vidne poškodbe, ter opis vrste 
poškodb.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 825
 
51. Zabeležiti je treba podatke za posamezne živali, in sicer njihovo telesno 
težo, mokro težo maternice ter osušeno težo maternice. Za ugotavljanje, ali 
se je zaradi odmerjanja preskusne kemikalije teža maternice statisti čno 
značilno pove čala (p < 0,05), je treba uporabiti enostranske statisti čne 
analize za agoniste. Izvesti je treba ustrezne statisti čne analize za ugota ­
vljanje sprememb v osušeni in mokri teži maternice zaradi prejemanja 
odmerkov. Podatki se lahko na primer ovrednotijo z analizo kovariance (ANCOVA), pri čemer je telesna teža pri obdukciji kovariat. 
Pred analizo podatkov se lahko za podatke o maternici izvede logaritemska 
pretvorba podatkov za stabilizacijo varianc. Dunnettov in Hsujev preskus 
sta primerna za primerjave po parih vsake skupine, ki je prejela odmerek, s kontrolnimi vzorci, ki so prejemali le nosilec, in izra čun intervalov zaupa ­
nja. Grafi studentiziranih ostankov se lahko uporabijo za odkrivanje more ­
bitnih osamelcev in oceno homogenosti varianc. Ti postopki so bili upora ­
bljeni v programu OECD za validacijo z metodo PROC GLM v sistemu za statistično analizo (SAS Institute, Cary, Severna Karolina, ZDA), razli čica 8 
(6) (7). 
52. Kon čno poročilo mora vklju čevati naslednje podatke:
 
Preskuševalni laboratorij:  
— pristojno osebje in njihove pristojnosti v zvezi s študijo, 
— podatke preskusa osnovne pozitivne kontrole in periodi čne podatke o 
pozitivni kontroli (glej odstavka 26 in 27).  
Preskusna kemikalija:  
— opredelitev preskusnih kemikalij, 
— agregatno stanje in, če je to ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti, 
— metodo in pogostost priprave razred čin, 
— morebitne podatke o stabilnosti, 
— morebitne analize raztopin za odmerjanje.  
Nosilec:  
— opredelitev nosilca (stanje, dobavitelj in št. serije), 
— utemeljitev izbire nosilca ( če ta ni voda).  
Preskusne živali:  
— vrsto in sev ter utemeljitev izbire, 
— dobavitelja in dolo čeni objekt dobavitelja, 
— starost ob dobavi z datumom kotitve, 
— pri nezrelih živalih podatek, ali so prispele skupaj z materami ali nado ­
mestnimi materami, in datum odstavitve, 
— podrobnosti postopka prilagajanja živali, 
— število živali na posamezno kletko, 
— podrobnosti in metodo edinstvenih oznak živali in skupin.  
Preskusni pogoji:  
— podrobnosti postopka randomizacije (tj. uporabljenega postopka), 
— utemeljitev izbire odmerka,  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 826
 
— podrobne podatke o formulaciji preskusne kemikalije, njeni doseženi 
koncentraciji, stabilnosti in homogenosti, 
— podrobne podatke o dajanju preskusne kemikalije in utemeljitev izbire 
načina izpostavljenosti, 
— prehrano (ime, vrsto, dobavitelja, vsebino in, če so znane, ravni fitoe ­
strogenov), 
— izvor vode (npr. voda iz pipe ali filtrirana voda) in njena dobava (pre ­
takanje iz velike posode, v steklenicah itd.), 
— steljo (ime, vrsto, dobavitelja, vsebino), 
— evidenco o pogojih v kletkah, intervalih osvetlitve, sobni temperaturi in 
vlažnosti, čiščenju prostora, 
— podroben opis postopka obdukcije in tehtanja maternice, 
— opis statisti čnih podatkov.  
Rezultati:  
Za posamezne živali:  
— vse dnevne telesne teže posameznih živali (od dodelitve v skupine do 
obdukcije) (na 0,1 g natan čno), 
— starost vsake posamezne živali (v dneh, pri čemer je dan skotitve dan 0) 
ob pričetku dajanja preskusne kemikalije, 
— datum in čas dajanja vsakega odmerka, 
— izračunani volumen in dan odmerek ter opažanja glede morebitne izgube 
odmerka med dajanjem odmerka ali po njem, 
— dnevno evidenco stanja živali, vklju čno z zadevnimi simptomi in opaža ­
nji, 
— domnevni vzrok pogina ( če je žival med študijo najdena umirajo ča ali 
poginula), 
— datum in čas humane usmrtitve z navedbo časa, preteklega od zadnjega 
odmerka, 
— mokro težo maternice (na 0,1 mg natan čno) ter morebitna opažanja 
glede izgube teko čine iz lumna med seciranjem in pripravo na tehtanje, 
— osušeno težo maternice (na 0,1 mg natan čno). 
Za vsako skupino živali:  
— srednje dnevne telesne teže (na 0,1 g natan čno) in standardne odklone 
(od dodelitve v skupine do obdukcije), 
— srednje mokre teže maternic in povpre čne osušene teže maternic (na 0,1 
mg natan čno) in standardne odklone, 
— če je izmerjena, dnevno porabo hrane (izra čunano kot grami porabljene 
hrane na žival),  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 827
— rezultate statisti čnih analiz, ki primerjajo mokre in osušene teže maternic 
tretiranih skupin glede na enake meritve v kontrolnih skupinah z 
nosilcem, 
— rezultate statisti čnih analiz, ki primerjajo skupno telesno težo in prid ­
obljeno težo tretiranih skupin glede na enake meritve v kontrolnih 
skupinah z nosilcem. 
53. Povzetek pomembnih smernic preskusne metode  
Podgana Miš  
Živali  
Sev Obi čajno uporabljeni laboratorijski sevi glodavcev 
Število živali Najmanj 6 živali na skupino odmerka Število skupin Najmanj 2 preskusni skupini (za navodila glej odstavek 33) in 
negativna kontrolna skupina 
Za navodila glede pozitivnih kontrolnih skupin glej odstavka 26 
in 27  
Nastanitveni in prehranjevalni pogoji  
T° v prostoru z živalmi 22 °C ± 3 °C 
Relativna vlažnost 50–60 % in ne manj kot 30 % ali ve č kot 70 % 
Dnevno zaporedje osvet ­
litve 12 ur svetlobe, 12 ur teme 
Prehrana in pitna voda Ad libitum 
Nastanitev Posami čno ali v skupinah po najve č tri živali (pri nezrelih 
živalih se priporo ča družabna skupinska nastanitev) 
Prehrana in stelja Za prehrano in steljo priporo čena nizka raven fitoestrogenov  
Protokol  
Metoda Metoda z nezrelo nesterilizi ­
rano samico (zaželena) 
Metoda s sterilizirano odraslo 
samico Metoda s sterilizirano odraslo 
samico 
Starost nezrelih živali ob 
odmerjanju Ne prej kot 18. poporodni dan. 
Dajanje odmerkov je treba 
zaključiti pred 25. poporodnim 
dnem. V okviru podro čja uporabe 
obstoječe preskusne metode ni 
relevantna. 
Starost ob sterilizaciji Med 6. in 8. tednom starosti 
Starost steriliziranih živali 
ob odmerjanju Od sterilizacije do prvega dne 
dajanja odmerka bi moralo 
preteči vsaj 14 dni. Od sterilizacije do prvega dne 
dajanja odmerka bi moralo 
preteči vsaj 7 dni. 
Telesna teža Nihanje telesne teže naj bo čim manjše in naj ne preseže ± 20 % 
srednje teže.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 828
 
Podgana Miš  
Odmerjanje  
Način dajanja Oralno z gavažo ali s podkožnim injiciranjem 
Pogostost dajanja Enkratni dnevni odmerek 
Prostorninski delež za 
gavažo in injiciranje ≤ 5 ml/kg telesne teže (ali do najve č 10 ml/kg telesne teže pri 
vodnih raztopinah) (na dveh mestih injiciranja pri dajanju podkožno) 
Trajanje odmerjanja 3 zaporedne dni pri modelu z 
nezrelo samico 
Najmanj 3 zaporedne dni pri 
modelu s sterilizirano odraslo 
samico 7 zaporednih dni pri modelu s 
sterilizirano odraslo samico 
Čas obdukcije Približno 24 ur po zadnjem odmerku  
Rezultati  
Pozitiven odziv Statisti čno značilno pove čanje povpre čne teže maternice (mokre 
in/ali osušene) 
Referenčni estrogen 17 α-etinilestradiol
 
SMERNICE ZA RAZLAGO IN PRIZNAVANJE REZULTATOV 
54. Na splošno se lahko preskus za estrogenost šteje za pozitivnega, če vsaj pri 
največjem odmerku pride do statisti čno značilnega pove čanja teže maternice 
(p < 0,05) v primerjavi s kontrolno skupino, pri kateri je uporabljeno le 
topilo. Pozitiven rezultat je nadalje podprt s prikazom biološko verjetnega 
razmerja med odmerkom in stopnjo odziva ob upoštevanju, da lahko estro ­
gene in antiestrogene dejavnosti preskusne kemikalije, ki se prekrivajo, vplivajo na obliko krivulje odziva na odmerek. 
55. Da bi bila mogo ča smiselna razlaga podatkov, je treba paziti, da se ne 
preseže najve čji toleran čni odmerek. Zmanjšanje telesne teže, klini čne 
znake in druge ugotovitve je treba temeljito ovrednotiti. 
56. Pomemben dejavnik za priznavanje podatkov, zbranih z uterotropnim biolo ­ 
škim preskusom, so teže maternic živali v kontrolni skupini z nosilcem. 
Visoke kontrolne vrednosti lahko ogrozijo odzivnost biološkega preskusa in 
zmožnost odkrivanja zelo šibkih agonistov estrogenov. Na podlagi pregleda literature in podatkov, zbranih med validacijo uterotropnega biološkega preskusa, je mogo če ugotoviti, da se visoke povpre čne kontrolne vrednosti 
lahko pojavijo tudi spontano, zlasti pri nezrelih živalih (2) (3) (6) (9). Ker je 
teža maternice pri nezrelih podganah odvisna od številnih spremenljivk, kot so sev ali telesna teža, zgornje meje za težo maternice ni mogo če določiti. 
Načeloma velja, da je treba rezultate obravnavati kot sumljive, če so teže 
osušenih maternic pri nezrelih podganah iz kontrolne skupine med 40 in 45 
mg, zaradi tež maternic nad 45 mg pa bo morda treba ponoviti preskus. Vendar je treba takšne primere obravnavati posami čno (3) (6) (8). Pri 
preskušanju na odraslih podganah po nepopolni sterilizaciji ostane prisotno 
tkivo jajčnikov, ki lahko proizvaja endogeni estrogen in zavira zmanjše ­
vanje teže maternice.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 829
 
57. Da bi bili rezultati sprejemljivi, mora osušena kontrolna teža maternice 
tehtati manj kot 0,09 % telesne teže pri nezrelih podganah ženskega spola 
in manj kot 0,04 % pri steriliziranih mladih odraslih samicah (glej tabelo 31 (2)). Če so kontrolne teže maternic ve čje, je treba prou čiti različne dejav­
nike, tudi starost živali, fitoestrogene v prehrani in druge, negativen rezultat 
preskusa (ni pokazateljev estrogenega delovanja) pa je treba uporabljati 
previdno. 
58. Pretekli podatki kontrolnih skupin z nosilcem naj bodo shranjeni v labora ­
toriju. Pretekli podatki za odzive na pozitivne referen čne estrogene, kot je 
17α-etinilestradiol, naj bodo prav tako shranjeni v laboratoriju. Laboratoriji 
lahko preskušajo tudi odziv na znane šibke agoniste estrogenov. Zaradi zagotavljanja, da se z metodami laboratorija pridobi zadostna ob čutljivost, 
se lahko vsi ti podatki primerjajo z razpoložljivimi podatki (2) (3) (4) (5) 
(6) (7) (8). 
59. V validacijski študiji OECD se je pri mokrih težah maternic pojavljala ve čja 
variabilnost kot pri osušenih težah maternic (6) (7). Vendar pa bi zna čilen 
odziv v kateri koli od obeh meritev pomenil, da je preskusna kemikalija 
pozitivna za estrogeno delovanje. 
60. Do uterotropnega odziva ne pride samo zaradi estrogenov, vendar je treba 
pozitiven rezultat uterotropnega biološkega preskusa na splošno razlagati 
kot dokaz za estrogeni potencial  in vivo  in na njegovi podlagi obi čajno 
začeti postopke za nadaljnja pojasnila (glej odstavek 9 in temeljni okvir 
‘OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endo ­
crine Disrupting Chemicals’, Priloga 2).
 
Slika 1  
Shema s prikazom kirurške odstranitve jaj čnikov
  
Postopek se pri čne s prerezom dorzolateralne trebušne stene na sredini med 
zunanjim robom reber in črevničnim grebenom ter nekaj milimetrov late ­
ralno od lateralnega roba ledvene mišice. V trebušni votlini je treba poiskati jajčnike. Jajčnike je nato treba na asepti čnem polju fizi čno odstraniti iz 
trebušne votline, za omejitev krvavitve namestiti ligaturo med jaj čnik in 
maternico ter jaj čnik odstraniti z rezom pri stiku jajcevoda in obeh rogov 
maternice. Po potrditvi, da ni prišlo do ve čje krvavitve, je treba trebušno 
steno zapreti s šivom, kožo pa speti s sponkami ali zapreti s šivom. Pred 
uporabo je treba živalim dati vsaj 14 dni, da si opomorejo in da se teža 
maternice zmanjša.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 830
 
Slika 2  
Odstranitev in priprava materni čnih tkiv za merjenje teže
  
Postopek se za čne s prerezom trebušne stene pri sramni čni zrasti. Nato je treba 
oba jajčnika, če sta prisotna, in rog maternice lo čiti od dorzalne trebušne stene. 
Sečni mehur in uretri je treba odstraniti z ventralne in lateralne strani maternice 
in nožnice. Brazgotinasto zarastlino med rektumom in nožnico je treba lo čiti 
tako, da je viden stik nožni čnega ustja in presredka. Maternico in nožnico se 
od telesa lo či s prerezom nožni čne stene tik nad stikom s presredkom, kot je 
prikazano na sliki. Maternico je treba od telesne stene lo čiti s previdnim 
prerezom mezenterija maternice od to čke pritrditve po celotni dorzolateralni 
dolžini vsakega roga maternice. Po odstranitvi iz telesa je treba odstraniti odvečno maščobo in vezno tkivo. Če so jajčniki prisotni, jih je treba lo čiti pri 
jajcevodu in paziti, da ne pride do izgube teko čine iz lumna roga maternice. Če 
je bila žival sterilizirana, je treba ostanke jaj čnikov pregledati zaradi morebitne 
prisotnosti tkiva jaj čnikov. Nožnico je treba od maternice lo čiti tik pod materni ­ 
čnim vratom, tako da vrat ostane pritrjen na maternico, kot je prikazano na sliki. 
Maternica se nato lahko stehta.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 831
 
Dodatek 1  
OPREDELITEV POJMOV: 
Antiestrogenost  je zmožnost kemikalije, da v organizmu sesalca zavre delovanje 
estradiola 17ß.  
Kemikalija  je snov ali zmes.  
Datum skotitve  je poporodni dan 0.  
Odmerjanje  je splošen izraz, ki vklju čuje odmerek ter pogostost in trajanje 
dajanja odmerka.  
Odmerek  je količina dane preskusne kemikalije. Pri uterotropnem biološkem 
preskusu je odmerek izražen kot teža preskusne kemikalije na enoto telesne 
teže preskusne živali na dan (npr. mg/kg telesne teže/dan).  
Največji toleran čni odmerek (MTD)  je najve čja količina kemikalije, ki po 
vstopu v telo ne ubije preskusnih živali (ozna čen z LD  0 ) (IUPAC, 1993).  
Estrogenost  je zmožnost kemikalije, da v organizmu sesalca deluje kot estradiol 
17ß. 
Poporodni dan N  je N-ti dan življenja po dnevu skotitve.  
Občutljivost  je delež vseh pozitivnih/aktivnih preskusnih kemikalij, ki se s 
preskusom pravilno razvrstijo. To je merilo natan čnosti za preskusno metodo, s 
katero se dosežejo kategori čni rezultati, in je pomemben dejavnik pri ocenjevanju 
ustreznosti preskusne metode.  
Specifičnost je delež vseh negativnih/neaktivnih preskusnih kemikalij, ki se s 
preskusom pravilno razvrstijo. To je merilo natan čnosti za preskusno metodo, s 
katero se dosežejo kategori čni rezultati, in je pomemben dejavnik pri ocenjevanju 
ustreznosti preskusne metode.  
Preskusna kemikalija  pomeni vsako snov ali zmes, preskušeno s to preskusno 
metodo.  
Uterotropni  je izraz, ki se uporablja za opis pozitivnega vpliva na rast materni ­ 
čnih tkiv.  
Validacija  je znanstveni postopek, oblikovan za dolo čanje zahtev glede delo ­
vanja in omejitev preskusne metode ter za prikaz njene zanesljivosti in ustrez ­
nosti za dolo čen namen.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 832
 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 833
 ▼M5 
Dodatek 2
  
VMG mamm: Skupina za upravljanje validacije na podro čju preskusov na sesalcih in njihovega ocenjevanja.
 OPOMBE K OKVIRU:  
Opomba 1:  Vstop na vseh ravneh in izstop z vseh ravni je mogo č in odvisen 
od obstoje čih potreb po informacijah za namene ocene nevarnosti 
in tveganja.  
Opomba 2:  Na ravni 5 bi moral ekotoksikološki vidik vklju čevati kon čne 
točke, ki kažejo na mehanizme škodljivih u činkov in morebitno 
škodo za populacijo.  
Opomba 3:  Če večmodalni model zajema ve č preskusov ene kon čne točke, ta 
model zamenja uporabo teh preskusov ene kon čne točke. 
Opomba 4:  Kemikalije je treba ocenjevati vsako posebej in pri tem upoštevati 
razpoložljive informacije ter funkcijo ravni okvira.  
Opomba 5:  V času nastanka tega dokumenta okvir še ni izpopolnjen. Na 
ravneh 3, 4 in 5 vklju čuje preskuse, ki so na voljo ali pa še v 
postopku validacije. Slednji so vklju čeni začasno. Ko bodo razviti 
in validirani, bodo uradno dodani v okvir.  
Opomba 6:  Za raven 5 se ne sme šteti, da vklju čuje samo kon čne preskuse. 
Preskusi, vklju čeni na tej ravni, prispevajo k splošni oceni nevar ­
nosti in tveganja.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 834
 
VIRI  
(1) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10  th –11  th March 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5. 
(2) OECD (2003). Detailed Background Review of the Uterotrophic Bioassay: 
Summary of the Available Literature in Support of the Project of the OECD Task Force on Endocrine Disrupters Testing and 
Assessment (EDTA) to Standardise and Validate the Uterotrophic Bioas ­
say. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 38. ENV/JM/MONO(2003)1. 
(3) Owens J.W., Ashby J. (2002). Critical Review and Evaluation of the 
Uterotrophic Bioassay for the Identification of Possible Estrogen Agonists 
and Antagonists: In Support of the Validation of the OECD Uterotrophic Protocols for the Laboratory Rodent. Crit. Rev. Toxicol. 32:445–520. 
(4) OECD (2006). OECD Report of the Initial Work Towards the Validation 
of the Rodent Uterotrophic Assay – Phase 1. OECD Environmental Health 
and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 65. ENV/ JM/MONO(2006)33. 
(5) Kanno, J., Onyon L., Haseman J., Fenner-Crisp P., Ashby J., Owens W. 
(2001). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay to 
screen compounds for in vivo estrogenic responses: Phase 1. Environ 
Health Perspect. 109:785–94. 
(6) OECD (2006). OECD Report of the Validation of the Rodent Uterotrophic 
Bioassay: Phase 2 – Testing of Potent and Weak Oestrogen Agonists by 
Multiple Laboratories. OECD Environmental Health and Safety Publica ­
tion Series on Testing and Assessment No. 66. ENV/JM/MONO(2006)34. 
(7) Kanno J., Onyon L., Peddada S., Ashby J., Jacob E., Owens W. (2003). 
The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two – Dose Response Studies. Environ. Health Persp. 111:1530–1549 
(8) Kanno J., Onyon L., Peddada S., Ashby J., Jacob E., Owens W. (2003). 
The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two – Coded Single Dose Studies. Environ. Health Persp. 111:1550–1558. 
(9) Owens W., Ashby J., Odum J., Onyon L. (2003). The OECD program to 
validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two – Dietary phytoestrogen 
analyses. Environ. Health Persp. 111:1559–1567. 
(10) Ogasawara Y., Okamoto S., Kitamura Y., Matsumoto K. (1983). Prolife ­
rative pattern of uterine cells from birth to adulthood in intact, neonatally castrated, and/or adrenalectomized mice assayed by incorporation of 
[I
 125 ]iododeoxyuridine. Endocrinology 113:582–587. 
(11) Branham W.S., Sheehan D.M., Zehr D.R., Ridlon E., Nelson C.J. (1985). 
The postnatal ontogeny of rat uterine glands and age-related effects of 17β-estradiol. Endocrinology 117:2229–2237. 
(12) Schlumpf M., Berger L., Cotton B., Conscience-Egli M., Durrer S., 
Fleischmann I., Haller V., Maerkel K., Lichtensteiger W. (2001). Estrogen 
active UV screens. SÖFW-J. 127:10–15. 
(13) Zarrow M.X., Lazo-Wasem E.A., Shoger R.L. (1953). Estrogenic activity 
in a commercial animal ration. Science 118:650–651. 
(14) Drane H.M., Patterson D.S.P., Roberts B.A., Saba N. (1975). The chance 
discovery of oestrogenic activity in laboratory rat cake. Fd. Cosmet. Toxi ­
col. 13:425–427. 
(15) Boettger-Tong H, Murphy L, Chiappetta C, Kirkland JL, Goodwin B, 
Adlercreutz H, Stancel GM, Makela S. (1998). A case of a laboratory animal feed with high estrogenic activity and its impact on  in vivo  
responses to exogenously administered estrogens. Environ. Health Perspec. 
106:369–373.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 835
 
(16) OECD (2007). Additional data supporting the Test Guideline on the Utero ­
trophic Bioassay in rodents. OECD Environmental Health and Safety 
Publication Series on Testing and Assessment No. 67. 
(17) Degen G.H., Janning P., Diel P., Bolt H.M. (2002). Estrogenic isoflavones 
in rodent diets. Toxicol. Lett. 128:145–157. 
(18) Wade M.G., Lee A., McMahon A., Cooke G., Curran I. (2003). The 
influence of dietary isoflavone on the uterotrophic response in juvenile rats. Food Chem. Toxicol. 41:1517–1525. 
(19) Yamasaki K., Sawaki M., Noda S., Wada T., Hara T., Takatsuki M. 
(2002). Immature uterotrophic assay of estrogenic compounds in rats 
given different phytoestrogen content diets and the ovarian changes in 
the immature rat uterotrophic of estrogenic compounds with ICI 182,780 or antide. Arch. Toxicol. 76:613–620. 
(20) Thigpen J.E., Haseman J.K., Saunders H.E., Setchell K.D.R., Grant M.F., 
Forsythe D. (2003). Dietary phytoestrogens accelerate the time of vaginal 
opening in immature CD-1 mice. Comp. Med. 53:477–485. 
(21) Ashby J., Tinwell H., Odum J., Kimber I., Brooks A.N., Pate I., Boyle 
C.C. (2000). Diet and the aetiology of temporal advances in human and 
rodent sexual development. J. Appl. Toxicol. 20:343–347. 
(22) Thigpen J.E., Lockear J., Haseman J., Saunders H.E., Caviness G, Grant 
M.F., Forsythe D.B. (2002). Dietary factors affecting uterine weights of immature CD-1 mice used in uterotrophic bioassays. Cancer Detect. Prev. 
26:381–393. 
(23) Thigpen J.E., Li L.-A., Richter C.B., Lebetkin E.H., Jameson C.W. (1987). 
The mouse bioassay for the detection of estrogenic activity in rodent diets: 
I. A standardized method for conducting the mouse bioassay. Lab. Anim. Sci. 37:596–601. 
(24) OECD (2008). Acute oral toxicity – up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425. 
(25) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7. 
(26) OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. ENV/JM/MONO(2001)4. 
(27) Bulbring, E., and Burn, J.H. (1935). The estimation of oestrin and of male 
hormone in oily solution. J. Physiol. 85: 320–333. 
(28) Dorfman, R.I., Gallagher, T.F. and Koch, F.C (1936). The nature of the 
estrogenic substance in human male urine and bull testis. Endocrinology 
19: 33–41. 
(29) Reel, J.R., Lamb IV, J.C. and Neal, B.H. (1996). Survey and assessment 
of mammalian estrogen biological assays for hazard characterization. Fundam. Appl. Toxicol. 34: 288–305. 
(30) Jones, R.C. and Edgren, R.A. (1973). The effects of various steroid on the 
vaginal histology in the rat. Fertil. Steril. 24: 284–291. 
(31) OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development 
– Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Paris. 
(32) Dorfman R.I. (1962). Methods in Hormone Research, Vol. II, Part IV: 
Standard Methods Adopted by Official Organization. New York, 
Academic Press. 
(33) Thigpen J. E. et al. (2004). Selecting the appropriate rodent diet for endo ­
crine disruptor research and testing studies. ILAR J 45(4): 401–416.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 836
 
(34) Gray L.E. and Ostby J. (1998). Effects of pesticides and toxic substances 
on behavioral and morphological reproductive development: endocrine 
versus non-endocrine mechanism. Toxicol Ind Health. 14 (1–2): 159–184. 
(35) Booth A.N., Bickoff E.M. and Kohler G.O. (1960). Estrogen-like activity 
in vegetable oils and mill by-products. Science 131:1807–1808. 
(36) Kato H, Iwata T, Katsu Y, Watanabe H, Ohta Y, Iguchi T (2004). Evalua ­
tion of estrogenic activity in diets for experimental animals using in vitro 
assay. J. Agric Food Chem. 52, 1410–1414. 
(37) OECD (2007). Guidance Document on the Uterotrophic Bioassay Proce ­
dure to Test for Antioestrogenicity. Series on Testing and Assessment. No. 71. 
(38) Direktiva 2010/63/EU Evropskega parlamenta in Sveta z dne 
22. septembra 2010 o zaš čiti živali, ki se uporabljajo v znanstvene namene 
(UL L 276, 20.10.2010, str. 33).
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 837
 
B.55  HERSHBERGERJEV BIOLOŠKI PRESKUS NA PODGANAH: 
KRATKOTRAJNI PRESEJALNI PRESKUS ZA (ANTI)ANDRO ­
GENE LASTNOSTI  
UVOD 
1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD št. 441 (2009). 
OECD je leta 1998 za čela z izvajanjem prednostne dejavnosti, da bi pregle ­
dala obstoje če in razvila nove smernice za odkrivanje in preskušanje poten ­
cialnih povzro čiteljev endokrinih motenj (1). Ta dejavnost je med drugim 
zajemala razvoj smernic za preskušanje za Hershbergerjev biološki preskus na podganah. Farmacevtska industrija je ta preskus uporabljala ve č deset­
letij, prvi č pa ga je leta 1962 standardiziral uradni strokovni odbor kot 
presejalni preskus za androgene kemikalije (2). V obdobju 2001–2007 je 
bil za Hershbergerjev biološki preskus na podganah opravljen obsežen program validacije, med drugim priprava dokumenta o pregledu ozadja metode (23) in dokumenta z zbirko podrobnih metod (3), razvoj priro čnika 
za seciranje (21) in izvajanje obsežnih študij znotraj laboratorija in med 
laboratoriji, da bi dokazali zanesljivost in ponovljivost biološkega preskusa. V teh validacijskih študijah so bili uporabljeni mo čan referen čni androgen 
(testosteron propionat (TP)), dva mo čna sinteti čna androgena (trenbolon 
acetat in metil testosteron), mo čan antiandrogen farmacevtski proizvod (flu ­
tamid), mo čan zaviralec sinteze (finasterid) naravnega androgena (dihidrote ­
stosteron – DHT), ve č šibko antiandrogenih pesticidov (linuron, vinklozolin, 
procimidon, p,p' DDE), mo čan zaviralec 5 α-reduktaze (finasterid) in dve 
znani negativni kemikaliji (dinitrofenol in nonilfenol) (4) (5) (6) (7) (8). Ta preskusna metoda je bila razvita na podlagi dolgoletnih izkušenj z biološkim preskusom ter izkušenj, pridobljenih med validacijo programa 
preskusa in dobljenih rezultatov. 
2. Hershbergerjev biološki preskus je kratkotrajna presejalna študija  in vivo , 
pri kateri se uporabljajo pomožna tkiva moškega reproduktivnega trakta. 
Izvajanje preskusa se je za čelo v 30. letih prejšnjega stoletja, v 40. letih 
prejšnjega stoletja pa so bile vanj vklju čene tudi mišice v moškem reprodu ­
ktivnem traktu, ki so odzivne na androgene (2) (9–15). V 60. letih prejš ­
njega stoletja je bilo s standardizirano razli čico protokola (2) (14) ocenjenih 
več kot 700 možnih androgenov in v tem obdobju je uporaba preskusa za 
androgene in antiandrogene veljala za standardno metodo (2) (15). Ta biološki preskus temelji na spremembi teže petih od androgenov odvisnih 
tkiv pri kastrirani podgani moškega spola v obdobju okrog pubertete. 
Ocenjuje sposobnost kemikalije, da sproži biološko delovanje, ki je tipi čno 
povezano z agonisti ali antagonisti androgenov oziroma zaviralci 5 α-reduk­
taze. Pet od androgenov odvisnih tar čnih tkiv, ki so vklju čena v to 
preskusno metodo, je: ventralna prostata (VP), semenski meši ček (SM) 
(skupaj s teko činami in koagulacijskimi žlezami), mišica levator ani z 
bulbokavernozno mišico (LABC), Cowperjevi žlezi (COW) in glavica penisa (GP). Pri kastrirani podgani moškega spola v obdobju okrog puber ­
tete se teh pet tkiv na androgene odzove s pove čanjem absolutne teže. Ko 
so ta tkiva stimulirana k pove čanju teže z dajanjem mo
čnega referen čnega 
androgena, se vseh pet tkiv na antiandrogene odzove z zmanjšanjem abso ­
lutne teže. Primarni model za Hershbergerjev biološki preskus je kirurško 
kastriran samec v obdobju okrog pubertete, kar je bilo validirano v fazi 1, 2 
in 3 programa validacije Hershbergerjevega preskusa. 
3. Hershbergerjev biološki preskus služi kot mehanisti čna presejalna študija  in 
vivo za agoniste androgenov, antagoniste androgenov in zaviralce 5 α-reduk­
taze, njegovo uporabo pa je treba obravnavati v okviru temeljnega okvira OECD za preskušanje in oceno povzro čiteljev endokrinih motenj, 'OECD 
Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine 
Disrupting Chemicals' (Dodatek 2). V tem temeljnem okviru je Hershber ­
gerjev biološki preskus na ravni 3 kot preskus  in vivo,  ki zagotavlja podatke
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 838
 
o enem samem endokrinem mehanizmu, tj. (anti)androgenosti. Vklju čen naj 
bi bil v sistem preskusov  in vitro  in in vivo , s katerimi bi opredelili kemi ­
kalije, ki bi lahko vplivale na endokrini sistem, na podlagi tega pa bi bile opravljene ocene nevarnosti in tveganja za zdravje ljudi in okolje. 
4. Zaradi prizadevanj za dobrobit živali v zvezi s postopkom kastracije je bil 
kot alternativni model za Hershbergerjev biološki preskus uporabljen neka ­
striran stimuliran odstavljen samec, da bi se izognili kastraciji. Preskusna 
metoda s stimuliranim odstavljenim mladi čem je bila validirana (24), v 
validacijskih študijah pa Hershbergerjev biološki test z odstavljenim mladičem pri preskušenih odmerkih ni dosledno odkrival u činkov šibkih 
antiandrogenov na težo organov, odvisnih od androgenov. Zato v to 
preskusno metodo ni bil vklju čen. Ker pa lahko uporaba te metode pripo ­
more k dobrobiti živali in zagotovi informacije o drugih na činih delovanja, 
je vključena v Smernico OECD št. 115 (25).
 
ZAČETNI PREUDARKI IN OMEJITVE 
5. Agonisti in antagonisti androgenov delujejo kot ligandi androgenskega 
receptorja in lahko aktivirajo oziroma zavirajo gensko prepisovanje, ki ga 
receptor nadzira. Poleg tega nekatere kemikalije zavirajo pretvorbo testo ­
sterona v mo čnejši naravni androgen dihidrotestosteron v nekaterih tar čnih 
tkivih androgenov (zaviralci 5 α-reduktaze). Zaradi takšnih kemikalij bi 
lahko prišlo do škodljivih u činkov za zdravje, vklju čno z učinki na razmno ­ 
ževanje in razvoj. Zato obstaja regulativna potreba po hitri oceni in vred ­
notenju kemikalije kot možnega agonista ali antagonista androgenov ali 
zaviralca 5 α-reduktaze. Afiniteta liganda do androgenskega receptorja, ki 
jo izmeri vezavni receptor ali aktivacije prepisovanja markerskih genov  in 
vitro,  ni edini kazalnik morebitne nevarnosti. Drugi kazalniki vklju čujejo 
aktivacijo presnove in njeno deaktivacijo po vstopu v telo, razporeditev 
kemikalij v tar čna tkiva in odstranitev iz telesa. Zato je treba morebitno 
dejavnost kemikalije pregledati  in vivo  pod ustreznimi pogoji in izposta ­
vljenostjo. Vrednotenje  in vivo  je manj kriti čno, če so znane lastnosti kemi ­
kalije glede absorpcije, porazdelitve, presnove in izlo čanja. Od androgenov 
odvisna tkiva se na stimulacijo z androgeni odzovejo s hitro in bujno rastjo, 
zlasti pri kastriranih podganah moškega spola v obdobju okrog pubertete. Glodavci, zlasti podgane, se pogosto uporabljajo tudi v študijah strupenosti za opredelitev nevarnosti. Zato je razli čica preskusa s kastrirano podgano 
moškega spola v obdobju okrog pubertete, pri kateri se uporabi pet tar čnih 
tkiv, primerna za iskanje agonistov androgenov, antagonistov androgenov in zaviralcev 5 α-reduktaze  in vivo.  
6. Ta preskusna metoda temelji na protokolih iz validacijske študije OECD, ki 
so se izkazali za zanesljive in ponovljive v študijah znotraj laboratorija in 
med laboratoriji (4) (5) (6) (7) (8). V tej preskusni metodi sta predstavljena 
postopka z androgenom in antiandrogenom. 
7. Čeprav je bilo nekaj razlik v odmerku testosteron propionata, ki so ga 
različni laboratoriji v programu OECD za validacijo Hershbergerjevega 
biološkega preskusa uporabili za odkrivanje antiandrogenov (0,2 proti 0,4 
mg/kg/d, podkožno injiciranje), med tema dvema razli čicama protokola ni 
bilo velike razlike glede zmožnosti zaznavanja šibkega ali mo čnega antian ­
drogenega delovanja. Jasno je, da odmerek testosteron propionata ne sme biti tako velik, da bi blokiral u činke šibkih antagonistov androgenskega 
receptorja (AR) ali tako majhen, da bi se androgena tkiva odzvala z majhno 
rastjo tudi brez so časne uporabe antiandrogena.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 839
 
8. Posamezna od androgenov odvisna tkiva ne rastejo samo zaradi androge ­
nov, tj. na težo nekaterih tkiv lahko vplivajo tudi druge kemikalije, ne samo 
agonisti androgenov. Vendar rast ve č tkiv hkrati dokazuje mehanizem, bolj 
značilen za androgene. Veliki odmerki mo čnih estrogenov lahko na primer 
vplivajo na pove čanje teže semenskih meši čkov, druga od androgenov 
odvisna tkiva v preskusu pa se ne odzovejo na podoben na čin. Antiandro ­
gene kemikalije lahko delujejo kot antagonisti androgenskega receptorja ali zaviralci 5 α-reduktaze. Zaviralci 5 α-reduktaze imajo razli čne učinke, ker je 
pretvorba v mo čnejši dihidrotestosteron razli čna od tkiva do tkiva. Antian ­
drogeni, ki zavirajo 5 α-reduktazo, na primer finasterid, imajo v primerjavi z 
močnim antagonistom AR, kot je flutamid, izrazitejše u činke na ventralno 
prostato kot na druga tkiva. Ta razlika med odzivi tkiv se lahko uporabi za razlikovanje med na činom delovanja, pogojenim z androgenskim receptor ­
jem, in na činom delovanja, pogojenim s 5 α-reduktazo. Poleg tega je andro ­
genski receptor evolucijsko povezan z receptorjem za druge steroidne hormone, nekateri drugi hormoni pa lahko pri velikih, suprafizioloških odmerkih vežejo in zavirajo u činke testosteron propionata, ki pospešujejo 
rast (13). Verjetno je tudi, da bi lahko pove čana presnova steroidov in 
posledično znižanje serumskega testosterona vplivalo na manjšo rast od 
androgenov odvisnih tkiv. Zato je treba pozitiven rezultat Hershbergerje ­
vega biološkega preskusa obi čajno oceniti na podlagi analize, ki temelji na 
pristopu tehtnosti dokazov, vklju čno s preskusi  in vitro , kot so preskusi 
vezave na androgenske in estrogenske receptorje (AR in ER) ter ustreznimi preskusi aktivacije prepisovanja, ali na podlagi drugih preskusov  in vivo , ki 
proučujejo podobna tar čna tkiva androgenov, kot so preskus na samcu v 
puberteti, 15-dnevni preskus na nekastriranem odraslem samcu ali 28- 
dnevne oziroma 90-dnevne študije s ponavljajo čimi se odmerki. 
9. Izkušnje kažejo, da so ksenobioti čni antiandrogeni pogostejši od ksenobio ­
tičnih androgenov. Zato se pri čakuje, da se bo Hershbergerjev biološki 
preskus najpogosteje uporabljal za odkrivanje antiandrogenov. Postopek 
preskušanja za androgene pa bi bilo mogo če priporo čiti za steroidne ali 
steroidom podobne kemikalije oziroma kemikalije, pri katerih pokazatelj 
morebitnih androgenih u činkov izhaja iz metod na ravni 1 ali 2 temeljnega 
okvira (Dodatek 2). Podobno lahko pri preskusih na ravni 5 opazimo prisot ­
nost škodljivih u činkov, povezanih z (anti)androgenimi profili, zaradi česar 
je treba oceniti, ali kemikalija deluje z endokrinim na činom delovanja. 
10. Priznava se, da morajo biti vsi postopki, pri katerih se uporabljajo živali, v 
skladu z lokalnimi standardi za varstvo živali; opisi oskrbe in ravnanja z 
živalmi v nadaljevanju so minimalni standardi, nadomestili pa jih bodo 
lokalni predpisi, kot je Direktiva 2010/63/EU Evropskega parlamenta in Sveta z dne 22. septembra 2010 o zaš čiti živali, ki se uporabljajo v znan ­
stvene namene (26). Nadaljnje smernice o humanem ravnanju z živalmi je 
predložila OECD (17). 
11. Kot pri vsakem biološkem preskusu, pri katerem se uporabljajo preskusne 
živali, je treba skrbno pretehtati nujnost izvedbe te študije. Razloga za takšno odlo čitev sta lahko dva: 
— visok potencial za izpostavljenost (raven 1 temeljnega okvira) ali poka ­
zatelji (anti)androgenosti v preskusih  in vitro  (raven 2), ki utemeljujejo 
preiskave glede tega, ali se lahko takšni u činki pojavijo  in vivo , 
— učinki, tipično povezani z (anti)androgenostjo v preskusih  in vivo  na 
ravni 4 ali 5, ki utemeljujejo preiskave dolo čenega na čina delovanja, 
npr. za ugotavljanje, ali so se u činki pojavili zaradi (anti)androgenega 
mehanizma.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 840
 
12. Opredelitve, uporabljene v tej preskusni metodi, so navedene v Dodatku 1.  
NAČELO PRESKUSA 
13. Hershbergerjev biološki preskus svojo ob čutljivost doseže z uporabo 
samcev z minimalno endogeno tvorbo androgenov. Uporabijo se kastrirani samci, če je po kastraciji dovoljenega dovolj časa, da se tar čna tkiva zmanj ­ 
šajo na minimalno in enotno osnovno težo. Pri odkrivanju morebitne andro ­
gene dejavnosti so zato prisotne nizke endogene koncentracije cirkulirajo čih 
androgenov, os hipotalamus – hipofiza – spolne žleze tega u činka ne more 
izravnati prek povratnih mehanizmov, zmožnost odziva tkiva se pove ča na 
največjo možno raven, za četna variabilnost teže tkiva pa se zmanjša na kar 
najnižjo raven. Pri odkrivanju morebitne antiandrogene dejavnosti je enako ­
mernejše pridobivanje teže tkiva mogo če s stimulacijo tkiv z referen čnim 
androgenom. Zato je za izvajanje Hershbergerjevega biološkega preskusa 
potrebnih samo 6 živali na vsako skupino odmerka, pri drugih preskusih z 
nekastriranimi samci v puberteti ali odraslimi samci pa se priporo ča uporaba 
15 samcev na vsako skupino odmerka. 
14. Kastracijo podgan moškega spola v obdobju okrog pubertete je treba opra ­
viti na primeren na čin z uporabo odobrenih anestetikov in asepti čno 
tehniko. Prvih nekaj dni po operaciji je treba dajati analgetike, da bi odpra ­
vili nelagodje po operaciji. Kastracija pove ča natančnost preskusa pri odkri ­
vanju šibkih androgenov in antiandrogenov, saj odstrani kompenzacijske 
endokrine povratne mehanizme, ki so prisotni pri nekastrirani živali in lahko oslabijo u činke danih androgenov in antiandrogenov, pa tudi veliko 
variabilnost koncentracij serumskega testosterona med osebki. Zato je zaradi 
kastracije potrebno manjše število živali za iskanje teh endokrinih 
dejavnosti. 
15. Pri odkrivanju morebitne androgene dejavnosti se preskusna kemikalija 10 
zaporednih dni dnevno daje oralno z gavažo ali s podkožno injekcijo. 
Preskusne kemikalije se dajejo vsaj dvema tretiranima skupinama 
preskusnih živali, pri čemer se za vsako skupino uporabi ena velikost 
odmerka. Približno 24 ur po prejetju zadnjega odmerka se na živalih opravi obdukcija. Če se je v primerjavi s kontrolno skupino z nosilcem teža dveh 
ali več tarčnih organov živali v skupinah, ki so prejele preskusno kemika ­
lijo, statisti čno značilno pove čala, to pomeni, da je preskusna kemikalija 
pozitivna na morebitno androgeno dejavnost (glej odstavek 60). Androgeni, kot je trenbolon, ki jih ni mogo če 5α-reducirati, imajo izrazitejše u činke na 
LABC in GP kot testosteron propionat, vendar bi se morala pove čati teža 
vseh tkiv. 
16. Pri odkrivanju morebitne antiandrogene dejavnosti se preskusna kemikalija 
10 zaporednih dni dnevno daje oralno z gavažo ali s podkožno injekcijo 
skupaj z dnevnimi odmerki testosteron propionata (0,2 ali 0,4 mg/kg/d) s podkožno injekcijo. V programu validacije je bilo ugotovljeno, da se lahko uporabi 0,2 ali 0,4 mg/kg/d testosteron propionata, saj sta oba odmerka 
učinkovita pri zaznavanju antiandrogenov, zato je treba za uporabo v 
preskusu izbrati le enega od odmerkov. Stopnjevani odmerki preskusne kemikalije se dajejo vsaj trem tretiranim skupinam preskusnih živali, pri čemer se za vsako skupino uporabi ena velikost odmerka. Približno 24 ur 
po prejetju zadnjega odmerka se na živalih opravi obdukcija. Če se je v 
primerjavi s kontrolno skupino, ki je prejela samo testosteron propionat, teža dveh ali ve č tarčnih organov živali v skupinah, ki so prejele preskusno 
kemikalijo in testosteron propionat, statisti čno značilno zmanjšala, to 
pomeni, da je preskusna kemikalija pozitivna na morebitno antiandrogeno 
dejavnost (glej odstavek 61).
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 841
 
OPIS METODE  
Izbira vrste in seva  
17. V Hershbergerjevem biološkem preskusu se od 30. let prejšnjega stoletja 
običajno uporabljajo podgane. Čeprav je biološko možno, da bi bil odziv 
pri podganah in miših podoben, so na podlagi 70-letnih izkušenj s podga ­
nami za Hershbergerjev biološki preskus primernejše podgane. Če bo po 
Hershbergerjevem biološkem preskusu morda izvedena dolgotrajna ve čge­
neracijska študija, bo tako mogo če v obeh študijah uporabiti živali iste 
vrste, seva in izvora. 
18. Ta protokol laboratorijem omogo ča, da izberejo sev podgane za uporabo v 
preskusu; na splošno naj bi bil isti, kot ga je sodelujo či laboratorij že 
uporabljal. Lahko se uporabijo obi čajno uporabljeni laboratorijski sevi 
podgan; ne sme se uporabiti sevov, ki dozorijo precej pozneje kot pri starosti 42 dni, ker zaradi kastracije teh samcev pri starosti 42 dni morda 
ne bi bilo mogo če merjenje teže glavice penisa, kar se lahko opravi šele, ko 
se kožica lo či od spolnega uda. Zato se sevi podgan Fisher 344 ne bi smeli 
uporabiti, razen izjemoma. Spolni razvoj seva podgan Fisher 344 poteka 
drugače kot pri drugih, obi čajno uporabljenih sevih, kot sta seva Sprague 
Dawley ali Wistar (16). Če bi bil uporabljen takšen sev, bi moral laboratorij 
podgane kastrirati, ko bi bile malo starejše, in dokazati ob čutljivost upora ­
bljenega seva. Laboratorij mora jasno utemeljiti izbiro seva podgan. Če bo 
po presejalni študiji izvedena študija s ponavljajo čim se odmerkom po 
oralni poti, študija razmnoževanja in razvoja ali dolgoro čna študija, je 
najbolje, da se v vseh študijah uporabijo živali istega seva in istega izvora.
 
Nastanitveni in prehranjevalni pogoji  
19. Vsi postopki morajo biti skladni z vsemi lokalnimi standardi za varstvo 
živali v laboratorijih. Ti opisi oskrbe in ravnanja z živalmi so minimalni standardi, ki jih bodo nadomestili strožji lokalni predpisi, kot je Direktiva 2010/63/EU Evropskega parlamenta in Sveta z dne 22. septembra 2010 o 
zaščiti živali, ki se uporabljajo v znanstvene namene (26). Temperatura v 
prostoru s preskusnimi živalmi naj bo 22 °C (z odstopanjem približno ± 3 °C). Relativna vlažnost naj bo najmanj 30 % in po možnosti naj ne presega 70 %, razen med čiščenjem prostora. Cilj je 50–60-odstotna rela ­
tivna vlažnost. Osvetlitev naj bo umetna. Dnevno zaporedje osvetlitve naj 
bo 12 ur svetlobe, 12 ur teme. 
20. Ker so živali mlade in so podgane družabne živali, je zaželeno, da so 
nastanjene skupinsko in ne posami čno. Z nastanitvijo dveh ali treh živali 
v vsako kletko živali ne bodo prenatrpane in pod s tem povezanim stresom, ki bi lahko vplival na hormonsko uravnavanje razvoja tkiv pomožnih spolnih organov. Kletke je treba temeljito o čistiti, da se odstranijo morebitni 
kontaminanti, in jih razporediti tako, da so možni u činki zaradi njihovega 
položaja čim manjši. Kletke primerne velikosti (~ 2000 kvadratnih centime ­
trov) bodo prepre čile prenatrpanost. 
21. Živali je treba s humano metodo edinstveno ozna čiti (npr. z ušesno znamko 
ali oznako). Metodo identifikacije je treba zabeležiti.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 842
 
22. Laboratorijsko prehrano in pitno vodo je treba priskrbeti  ad libitum . Labo­
ratoriji, ki izvajajo Hershbergerjev biološki preskus, bi morali uporabljati 
laboratorijsko prehrano, ki jo obi čajno uporabljajo pri preskušanju kemika ­
lij. V validacijski študiji biološkega preskusa niso bili opaženi nobeni u činki 
ali variabilnost, ki bi jih lahko pripisali prehrani. Prehrano, ki se uporablja, 
je treba zabeležiti, vzorec laboratorijske prehrane pa shraniti za morebitno 
prihodnjo analizo.  
Merila uspešnosti za težo od androgenov odvisnih organov  
23. Med validacijsko študijo ni bilo nobenih dokazov, da zmanjšanje telesne 
teže vpliva na pove čanje ali zmanjšanje teže tkiva pri tar čnih tkivih (tj. 
tistih, ki jih je treba v tej študiji stehtati). 
24. Med razli čnimi sevi podgan, uspešno uporabljenimi v programu validacije, 
je teža od androgenov odvisnih organov ve čja pri težjih sevih podgan kot 
pri lažjih sevih. Zato merila uspešnosti Hershbergerjevega biološkega preskusa ne vklju čujejo absolutne pri čakovane teže organov za pozitivne 
in negativne kontrolne vzorce. 
25. Ker je koeficient variacije za tkivo obratno sorazmeren s statisti čno značil­
nostjo, merila uspešnosti za Hershbergerjev biološki preskus temeljijo na 
najvišjih vrednostih koeficienta variacije za vsako tkivo (tabela 1). Koefi ­
cienti variacije se izpeljejo iz validacijskih študij OECD. Če so rezultati 
negativni, morajo laboratoriji preveriti koeficiente variacije iz kontrolne 
skupine in skupine, tretirane z velikim odmerkom, da bi ugotovili, ali so 
bila presežena merila uspešnosti za najve čji koeficient variacije. 
26. Študijo je treba ponoviti, ko: 1) trije ali ve č od desetih možnih posameznih 
koeficientov variacije v kontrolni skupini in skupini, tretirani z velikim odmerkom, presežejo najvišje vrednosti, ki so za študije agonistov in anta ­
gonistov dolo čene v tabeli 1, in 2) sta bili vsaj dve tar čni tkivi mejno 
zanemarljivi, tj. so bile vrednosti ρ med 0,05 in 0,10.
 
Tabela 1  
Najvišji dovoljeni koeficienti variacij, dolo čeni za tar čna tkiva pomožnih 
spolnih organov za kastriran model v validacijski študiji OECD  ( 1 ) 
Tkivo Antiandrogeni u činki Androgeni u činki 
Semenska meši čka 40 % 40 % 
Ventralna prostata 40 % 45 % 
LABC 20 % 30 % 
Cowperjevi žlezi 35 % 55 % 
Glavica penisa 17 % 22 %  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 843  
( 1 ) Mejni koeficient variacij za zadevno tkivo je bil dolo čen s pomo čjo grafa vrednosti 
koeficienta variacij – zaporedno podanih od najnižje do najvišje – za vse srednje vred ­
nosti iz vseh preskusov v validaciji z dolo čenim modelom (z agonistom ali antagoni ­
stom). Mejna vrednost koeficienta variacij je bila od čitana s to čke, pri kateri so vmesna 
povečanja do naslednjega najvišjega koeficienta variacij v seriji precej ve čja kot prejšnjih 
nekaj koeficientov variacij – 'to čka preloma'. Opozoriti je treba, da so bile s to analizo 
sicer opredeljene relativno zanesljive 'to čke preloma' za preskus z antagonistom, vendar 
so krivulje koeficienta variacij za preskus z agonistom pokazale bolj enakomerno pove ­ 
čanje, zaradi česar je opredelitev mejne vrednosti koeficienta variacij s to metodo do 
neke mere arbitrarna.
 POSTOPEK  
Skladnost z zakonodajo in verifikacija laboratorija  
27. V nasprotju z uterotropnim preskusom (poglavje B.54 te priloge) dokazo ­
vanje usposobljenosti laboratorija pred za četkom študije pri Hershberger ­
jevem biološkem preskusu ni potrebno, ker so pri tem preskusu hkratni pozitivni (testosteron propionat in flutamid) in negativni kontrolni vzorci sestavni del preskusa.
 
Število in stanje živali  
28. Vsaka tretirana in kontrolna skupina mora vklju čevati vsaj 6 živali. To velja 
tako za androgeni kot tudi za antiandrogeni protokol.  
Kastracija  
29. Več dni po prejemu živali naj bi potekalo za četno obdobje prilagajanja, s 
čemer se zagotovi, da so živali zdrave in se razvijajo. Ker pri živalih, ki so 
bile kastrirane pred 42. dnem starosti ali 42. poporodnim dnem, morda ne 
bo prišlo do lo čevanja prepucija, bi morale biti živali kastrirane na 42. 
poporodni dan ali pozneje, ne pa prej. Živali se kastrirajo pod anestezijo tako, da se zareže v modnik in odstranijo obe modi ter obmodki z ligacijo 
žil in semenovoda. Po potrditvi, da ni nobene krvavitve, je treba modnik 
zapreti s šivom ali sponkami. V prvih nekaj dneh po operaciji naj bi živali prejemale analgetike, da bi ublažili nelagodje po operaciji. Če se pri doba ­
vitelju nabavijo kastrirane živali, mora dobavitelj zagotoviti starost živali in 
stopnjo spolne zrelosti.
 
Prilagajanje po kastraciji  
30. Prilagajanje živali na laboratorijske pogoje mora potekati še vsaj 7 dni po 
kastraciji, da se zmanjša teža tar čnih tkiv. Živali je treba opazovati dnevno, 
vsako žival, ki kaže znake bolezni ali telesne anomalije, pa je treba odstra ­
niti. Tretiranje z za četkom dajanja odmerkov (v študiji) se lahko pri čne že 
49. poporodni dan, vendar ne pozneje kot 60. poporodni dan. Starost ob obdukciji ne bi smela prese či 70. poporodnega dneva. Ta prožnost labora ­
toriju omogo ča, da učinkovito sestavi razpored preskusov.
 
Telesna teža in randomizacija skupine  
31. Zaradi razli čne telesne teže posameznih živali se znotraj skupine in med 
skupinami živali teža organov razlikuje. S pove čanjem variabilnosti teže 
tkiv se pove ča koeficient variacij in zmanjša statisti čna vrednost preskusa 
(včasih imenovana tudi ob čutljivost preskusa). Zato je treba nihanja telesne 
teže eksperimentalno in statisti čno uravnavati. 
32. V eksperimentalno uravnavanje sodi zagotavljanje majhnih nihanj v telesni 
teži znotraj skupin študije in med njimi. Treba se je izogniti uporabi nena ­
vadno majhnih ali velikih živali ter se jih ne sme uvrstiti v kohorto študije. 
Na začetku študije naj nihanje teže uporabljenih živali ne preseže ± 20 % 
srednje teže (npr. 175 g ± 35 g za kastrirane podgane v obdobju okrog pubertete). Živali je treba dodeliti v skupine (kontrolne in tretirane) v naključnem razponu teže, tako da se povpre čna telesna teža vsake skupine 
statistično ne razlikuje od drugih skupin. Uporabljeni postopek randomiza ­
cije sklopov je treba zabeležiti.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 844
 
33. Ker lahko strupenost zmanjša telesno težo tretiranih skupin v primerjavi s 
telesno težo kontrolne skupine, se lahko kot so časna spremenljivka uporabi 
telesna teža na prvi dan prejemanja kemikalije in ne telesna teža ob obdukciji.
 
Odmerjanje  
34. Da bi ugotovili, ali lahko preskusna kemikalija  in vivo  deluje androgeno, 
običajno zadoš čajo dve skupini odmerkov preskusne kemikalije ter pozi ­
tivna kontrolna skupina in skupina z nosilcem (negativna kontrolna skupina) 
(glej odstavek 43), zato je takšen na čin preskušanja zaželen zaradi dobrobiti 
živali. Če je cilj pridobiti krivuljo odziva na odmerek ali ekstrapolacija na 
manjše odmerke, so potrebne vsaj 3 skupine odmerkov. Če ni potrebna 
samo opredelitev androgenega delovanja, ampak so potrebne tudi druge 
informacije (na primer ocena mo či delovanja), je treba razmisliti o druga ­ 
čnem režimu odmerjanja. Za preskušanje za antiandrogene se preskusna 
kemikalija daje skupaj z referen čnim agonistom androgenov. Uporabijo se 
vsaj 3 preskusne skupine z razli čnimi odmerki preskusne kemikalije ter 
pozitivna in negativna kontrolna skupina (glej odstavek 44). Razen tretiranja s preskusno kemikalijo je treba živali v kontrolni skupini obravnavati enako kot živali v preskusni skupini. Če je pri dajanju preskusne kemikalije upora ­
bljen nosilec, mora kontrolna skupina prejeti koli čino nosilca, enako 
največji uporabljeni koli čini pri preskusnih skupinah. 
35. Pri predlaganju in izbiri velikosti vseh odmerkov je treba upoštevati vse 
obstoječe podatke o strupenosti in (toksiko-)kinetiki, ki so na razpolago za 
preskusno kemikalijo ali sorodne snovi. Pri najve čjem odmerku je treba 
najprej upoštevati informacije o LD
 50 in/ali akutni strupenosti, da bi se 
izognili smrti, hudemu trpljenju ali stiski živali (17) (18) (19) (20), pa tudi informacije, ki so na voljo o odmerkih, uporabljenih v študijah kroni ­ 
čnosti in subkroni čnosti. Na splošno se zaradi najve čjega odmerka kon čna 
telesna teža živali ne sme zmanjšati za ve č kot 10 % kontrolne teže. 
Največji odmerek je lahko 1) najve čji odmerek, ki zagotavlja preživetje 
živali in za živali ni preve č strupen oziroma jim ne povzro ča velike stiske 
po 10 zaporednih dneh dajanja odmerka do najve čjega odmerka 1000 
mg/kg/dan (glej odstavek 36), ali 2) odmerek, ki povzro či (anti)androgene 
učinke, pri čemer se izbere manjši izmed njiju. Kot sito so sprejemljivi 
veliki intervali med odmerki, npr. polovica logaritemske enote (kar ustreza 
večanju odmerka za faktor 3,2) ali celo ena logaritemska enota. Če ustrezni 
podatki niso na voljo, se lahko opravi študija ugotavljanja obmo čja (glej 
odstavek 37), s pomo čjo katere se dolo čijo odmerki za uporabo.
 
Mejna velikost odmerka  
36. Če preskus, izveden v skladu z opisanimi postopki za to študijo in pri 
mejnem odmerku 1000 mg/kg telesne teže/dan in manjšim odmerkom, ne 
doseže statisti čno značilne spremembe v teži razmnoževalnih organov, se 
dodatne velikosti odmerkov morda ne štejejo za potrebne. Mejni odmerek se ne uporabi samo, če podatki o izpostavljenosti pri ljudeh kažejo na 
potrebo po uporabi ve čjega odmerka.
 
Preudarki glede ugotavljanja obmo čja 
37. Po potrebi se lahko z nekaj živalmi izvede predhodna študija za ugota ­
vljanje obmo čja za izbiro primernih skupin odmerkov (z uporabo metod 
za preskušanje akutne strupenosti (poglavji B.1 bis in B.1 tris te priloge (27), Smernica za preskušanje OECD št. 425 (19))). Cilj pri Hershberger ­
jevem biološkem preskusu je izbrati odmerke, ki zagotavljajo preživetje 
živali in zanje niso preve č strupeni oziroma jim ne povzro čajo prevelike 
stiske po desetih zaporednih dneh dajanja kemikalije do mejnega odmerka
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 845
 
1000 mg/kg/dan, kot je navedeno v odstavkih 35 in 36. S tem v zvezi se 
lahko uporabijo smernice OECD (17), v katerih so opredeljeni klini čni 
znaki, ki kažejo na strupenost za živali ali njihovo stisko. Če je to v okviru 
te študije za ugotavljanje obmo čja po desetih dneh dajanja odmerkov izved ­
ljivo, se lahko tar čna tkiva izreže in stehta približno 24 ur po zadnjem 
danem odmerku. Ti podatki se nato lahko uporabijo kot pomo č pri izbiri 
odmerkov v glavni študiji.  
Referenčne kemikalije in nosilec  
38. Referen čni agonist androgenov naj bi bil testosteron propionat (TP), 
št. CAS 57-82-5. Referen čni odmerek TP je lahko 0,2 mg/kg telesne 
teže/dan ali 0,4 mg/kg telesne teže/dan. Referen čni antagonist androgenov 
naj bi bil flutamid (FT), št. CAS 1311-84-7. Referen čni odmerek FT naj bi 
bil 3 mg/kg telesne teže/dan, FT pa je treba dati skupaj z referen čnim 
odmerkom TP. 
39. Priporo ča se, da se, kadar koli je to mogo če, najprej prou či uporaba vodne 
raztopine/suspenzije. Ker so številni ligandi androgenov ali njihovi metabo ­
lični prekurzorji hidrofobni, se obi čajno uporablja raztopina/suspenzija v 
olju (npr. koruznem, arašidovem, sezamovem ali olj čnem olju). Preskusne 
kemikalije se lahko raztopijo v najmanjši koli čini 95-odstotnega etanola ali 
drugega primernega topila, na kon čno delovno koncentracijo pa razred čijo v 
preskusnem nosilcu. Strupene lastnosti topila bi morale biti znane in presku ­ 
šene v lo čeni kontrolni skupini, pri kateri je uporabljeno samo topilo. Če je 
preskusna kemikalija stabilna, se lahko raztapljanje preskusne kemikalije pospeši s previdnim segrevanjem in mo čnim mehanskim delovanjem. Dolo ­ 
čiti je treba stabilnost preskusne kemikalije v nosilcu. Če je preskusna 
kemikalija ves čas trajanja študije stabilna, se lahko pripravi samo za četni 
alikvot preskusne kemikalije, nato pa se dnevno pripravljajo dolo čene 
razredčine odmerkov, pri čemer je treba paziti, da ne pride do kontaminacije 
in kvarjenja vzorcev.
 
Dajanje odmerkov  
40. TP je treba dati s podkožnim injiciranjem, FT pa oralno z gavažo. 
41. Preskusno kemikalijo se daje oralno z gavažo ali s podkožnim injiciranjem. 
Pri izbiri na čina dajanja je treba upoštevati vprašanja, povezana z dobrobitjo 
živali in fizikalne/kemijske lastnosti preskusne kemikalije. Poleg tega je treba upoštevati toksikološke vidike, kot je na čin izpostavljenosti kemikaliji 
pri ljudeh (npr. na podlagi dajanja oralno z gavažo se modelira izposta ­
vljenost prek zaužitja, na podlagi podkožnega injiciranja se modelira izpo ­
stavljenost prek vdihavanja ali adsorpcije skozi kožo) in obstoje če toksiko ­
loške podatke ter o presnovi in kinetiki (npr. potreba po izogibanju presnovi 
prvega prehoda, boljša u činkovitost dolo čenega na čina izpostavljenosti) 
pred začetkom obsežnega, dolgotrajnega preskušanja, če se pozitivni rezul ­
tati dobijo z injiciranjem. 
42. Živali naj bi odmerek prejemale na enak na čin in v enakem časovnem 
zaporedju deset zaporednih dni v približno 24-urnih intervalih. Velikost 
odmerka je treba dnevno prilagajati glede na hkratno dnevno merjenje telesne teže. Koli čina odmerka in čas vnosa naj se zabeležita vsak dan 
izpostavljenosti. Da bi bila mogo ča smiselna razlaga podatkov, je treba 
paziti, da se ne preseže najve čji odmerek iz odstavka 35. Zmanjšanje telesne 
teže, klini čne znake in druge ugotovitve je treba temeljito ovrednotiti. Pri
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 846
 
dajanju oralno z gavažo se uporabi želod čna sonda ali primerna intubacijska 
kanila. Najve čja količina tekočine, ki se jo lahko da naenkrat, je odvisna od 
velikosti preskusne živali. Upoštevati je treba lokalne standarde za varstvo živali, koli čina pa ne sme prese či 5 ml/kg telesne teže, razen pri vodnih 
raztopinah, pri katerih se lahko uporabi 10 ml/kg telesne teže. Pri 
podkožnem injiciranju se odmerki dajejo na dorzoskapularnem in/ali 
ledvenem delu s sterilno iglo (npr. velikosti 23 ali 25) in brizgo tuberku ­
linko. Mesto injiciranja se lahko obrije. Morebitne izgube, uhajanje snovi na mestu injiciranja ali nepopoln vnos odmerka je treba zabeležiti. Skupna 
količina odmerka na podgano na dan ne sme prese či 0,5 ml/kg telesne teže.
 
Posebni postopki za agoniste androgenov  
43. Za preskus za agoniste androgenov je nosilec negativna kontrola, skupina, 
ki prejema TP, pa pozitivna kontrola. Biološka dejavnost, ki je skladna z agonisti androgenov, se preskuša z dajanjem izbranih odmerkov preskusne 
kemikalije tretiranim skupinam 10 dni zapored. Teža tkiv petih pomožnih 
spolnih organov živali v skupinah, ki so prejele preskusno kemikalijo, se primerja s skupino za nosilec, da bi se ugotovila statisti čno značilna pove ­ 
čanja teže.
 
Posebni postopki za antagoniste androgenov in zaviralce 5 α-reduktaze  
44. Za preskus za antagoniste androgenov in zaviralce 5 α-reduktaze je skupina, 
ki prejema TP, negativna kontrola, skupina, ki hkrati prejema referen čna 
odmerka TP in FT, pa pozitivna kontrola. Biološka dejavnost, ki je skladna 
z antagonisti androgenov in zaviralci 5 α-reduktaze, se preskuša z dajanjem 
referenčnega odmerka TP in dajanjem preskusne kemikalije 10 dni zapored. 
Teža tkiv petih pomožnih spolnih organov živali v skupinah, ki so prejele preskusno kemikalijo in TP, se primerja z referen čno skupino, ki je prejela 
samo TP, da bi se ugotovila statisti čno značilna zmanjšanja teže.
 
OPAZOVANJA  
Klinična opazovanja  
45. Splošna klini čna opazovanja je treba opraviti vsaj enkrat dnevno in pogo ­
steje, če se kažejo znaki strupenosti. Opazovanja je najbolje opraviti vsak 
dan ob istih časih ob upoštevanju vrhunca pri čakovanih u činkov po odmer ­
janju. Vse živali je treba opazovati za dolo čitev smrtnosti, obolevnosti in 
splošnih klini čnih znakov, kot so spremembe vedenja, spremembe na koži, 
dlaki, očeh in sluznicah, pojav sekrecije in ekskrecije ter delovanje avto ­
nomnega živ čevja (npr. solzenje, piloerekcija, velikost zenic, nenavaden 
vzorec dihanja). 
46. Živali, ki so najdene poginule, je treba odstraniti in uni čiti brez nadaljnje 
analize podatkov. Smrtnost živali pred obdukcijo in morebitne o čitne 
razloge za smrtnost je treba vklju čiti v evidenco študije. Umirajo če živali 
je treba humano usmrtiti. Umirajo če in posledi čno usmrčene živali ter 
očitne razloge za obolevnost je treba vklju čiti v evidenco študije.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 847
 
Telesna teža in poraba hrane  
47. Vse živali je treba stehtati dnevno na 0,1 g natan čno, in sicer tik pred 
začetkom tretiranja, tj. ko so živali razdeljene v skupine. Izmeri se lahko 
tudi količina hrane, ki jo živali porabijo med obdobjem tretiranja, in sicer za 
vsako posamezno kletko s tehtanjem hranilnic. Rezultati glede porabe hrane se izrazijo v gramih na podgano na dan.
 
Seciranje in merjenje teže tkiv in organov  
48. Približno 24 ur po zadnjem odmerku preskusne kemikalije je treba podgane 
usmrtiti in opraviti izkrvavitev v skladu z obi čajnimi postopki zadevnega 
laboratorija ter opraviti obdukcijo. Metodo humane usmrtitve je treba zabe ­
ležiti v laboratorijskem poro čilu. 
49. Zaželen je naklju čni vrstni red obdukcije po skupinah, da ne bi prišlo do 
napredovanja neposredno po skupinah odmerkov, kar bi lahko vplivalo na podatke. Vse ugotovitve pri obdukciji, tj. patološke spremembe/vidne 
poškodbe, je treba zabeležiti in o njih poro čati. 
50. Pet od androgenov odvisnih tkiv (VP, SV, LABC, COW, GP) je treba 
stehtati. Ta tkiva je treba izrezati, previdno odstraniti priraš čena tkiva in 
maščobo ter dolo čiti njihovo svežo (nefiksirano) težo. Z vsakim tkivom je 
treba ravnati zelo skrbno, da ne bi prišlo do izgube teko čin in izsušitve, 
zaradi česar bi lahko prišlo do precejšnjih napak in variabilnosti, saj bi se 
zabeležene teže zmanjšale. Ve č tkiv je lahko zelo majhnih ali jih je težko 
secirati, zaradi česar bo prišlo do variabilnosti. Zato je pomembno, da 
osebe, ki secirajo tkiva pomožnih spolnih organov, poznajo standardne 
postopke seciranja za ta tkiva. Priro čnik s standardnim operativnim 
postopkom za seciranje je na voljo na spletni strani OECD (21). S skrbnim usposabljanjem v skladu s priro čnikom s standardnim operativnim 
postopkom se bo zmanjšal morebitni vir variacij v študiji. Zaželeno je, da 
je za seciranje zadevnega tkiva zadolžen isti obducent, saj tako ne pride do 
razlik med posamezniki pri obdelavi tkiva. Če to ni mogo če, bi morala biti 
obdukcija zasnovana tako, da vsak obducent secira zadevno tkivo iz vseh tretiranih skupin, namesto da en posameznik secira vsa tkiva kontrolne 
skupine, nekdo drug pa je zadolžen za tretirane skupine. Vsako tkivo 
pomožnega spolnega organa je treba stehtati brez pivnanja na 0,1 mg natančno in zabeležiti težo za vsako žival. 
51. Več tkiv je lahko zelo majhnih ali pa jih je težko secirati, zaradi česar bo 
prišlo do variabilnosti. Iz preteklega dela je razvidna vrsta koeficientov variacij, za katere se zdi, da se razlikujejo glede na strokovnost laboratorija. 
V nekaj primerih so bile v dolo čenem laboratoriju ugotovljene velike 
razlike v absolutni teži tkiv, kot sta ventralna prostata in Cowperjevi žlezi. 
52. Lahko se opravijo tudi meritve jeter, obeh ledvic in obeh nadledvi čnih žlez. 
S teh tkiv je prav tako treba odstraniti odve čno priraščeno vezivno tkivo in 
maščobo. Jetra je treba stehtati in težo zabeležiti na 0,1 g natan čno, prav 
tako je treba stehtati obe ledvici in nadledvi čni žlezi ter težo zabeležiti na 
0,1 mg natan čno. Jetra, ledvici in nadledvi čni žlezi so organi, na katere 
vplivajo androgeni, in dobri pokazatelji sistemske strupenosti.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 848
 
53. Lahko se opravijo tudi meritve serumskega luteinizirajo čega hormona (LH), 
hormona, ki spodbuja rast foliklov (FSH), in testosterona (T). Koncentracije 
serumskega testosterona so koristne pri ugotavljanju, ali preskusna kemika ­
lija povzro ča presnovo testosterona v jetrih in tako znižuje koncentracije v 
serumu. Brez podatkov o testosteronu bi se lahko zdelo, da je do tega 
učinka prišlo zaradi antiandrogenega mehanizma. Koncentracije LH zagota ­
vljajo informacije glede zmožnosti antiandrogena, da zmanjša težo organov in vpliva na funkcijo hipotalamusa in hipofize, ki lahko v dolgotrajnih študijah povzro či tumorje na modih. Hormon FSH je pomemben hormon 
za spermatogenezo. Lahko se opravijo tudi meritve T4 in T3 v serumu, ki 
bi zagotovile koristne dodatne informacije o zmožnosti za porušenje hormonskega ravnovesja š čitnice. Če se bodo opravile meritve hormonov, 
je treba pred obdukcijo podgane omamiti in vzeti kri s punkcijo srca, 
metodo anestezije pa je treba skrbno izbrati, da ne bi vplivala na meritve 
hormonov. Metodo priprave seruma, vir radioimunskega preskusa ali druge komplete za merjenje, analiti čne postopke in rezultate je treba zabeležiti. 
Koncentracije LH je treba zabeležiti kot ng na ml seruma in testosteron je 
treba prav tako zabeležiti kot ng na ml seruma. 
54. Seciranje tkiv je opisano v nadaljevanju s podrobnim priro čnikom za seci ­
ranje s fotografijami, ki so bile kot dodatno gradivo objavljene v okviru 
programa validacije (21). Na spletni strani korejske uprave za hrano in 
zdravila je na voljo tudi posnetek seciranja (22). 
— Žival je obrnjena z ventralno površino navzgor; preveriti je treba, ali se 
je kožica penisa lo čila od glavice. Če sta ločeni, je treba umakniti 
kožico in odstraniti glavico penisa, jo stehtati (na 0,1 mg natan čno) in 
težo zabeležiti. 
— Kožo na trebuhu in trebušno steno je treba prerezati, s čemer se razkri ­
jejo notranji organi. Če se bodo opravile meritve neobveznih organov, je 
treba odstraniti jetra in jih stehtati na 0,1 g natan čno, odstraniti želodec 
in črevesje, odstraniti obe ledvici in nadledvi čni žlezi ter jih stehtati na 
0,1 mg natan čno. S tem postopkom se razkrije mehur in za čne seciranje 
tarčnih moških pomožnih organov. 
— Za seciranje ventralne prostate (VP) je treba mehur s prerezom veznega 
tkiva po sredini lo čiti od plasti ventralnih mišic. Mehur je treba premak ­
niti anteriorno proti semenskim meši čkom, da se razkrijeta levi in desni 
reženj ventralne prostate (prekrita s plastjo maš čobe). Z desnega in 
levega režnja VP je treba previdno odstraniti maš čobo. Desni reženj 
VP je treba previdno odmakniti od se čnice ter lo čiti reženj in se čnico. 
Med držanjem desnega režnja VP je treba nežno odmakniti levi reženj VP in ga izrezati; režnja je treba stehtati na 0,1 mg natan čno in težo 
zabeležiti. 
— Za seciranje semenskih meši čkov in koagulacijskih žlez je treba 
kavdalno premakniti mehur, s čemer se razkrijejo semenovod, desni in 
levi reženj semenskih meši čkov in koagulacijske žleze (SVCG). Treba 
je prepre čiti uhajanje teko čine, in sicer tako, da se s sponko spne 
spodnji del SVCG, kjer se stikata semenovod in se čnica. SVCG je 
treba previdno izrezati, s sponko še vedno na mestu odstraniti maš čobo 
in priraščena tkiva, nato pa ju položiti v tarirano posodo za tehtanje, 
odstraniti sponko, stehtati organe na 0,1 mg natan čno in težo zabeležiti.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 849
 
— Za seciranje mišice levator ani z bulbokavernozno mišico (LABC) je 
treba razkriti mišice in koren penisa. Mišice LA so ovite okrog debelega 
črevesa, sprednje mišice LA in BC pa so pritrjene na čebulček penisa. 
Odstraniti je treba kožo in adneks s perianalnega obmo čja, ki potekata 
od korena penisa do sprednjega dela anusa. Postopoma je treba odstra ­
niti mišice BC od čebulčka in tkiv. Debelo črevo je treba prerezati na 
pol, nato pa se lahko v celoti izrežejo mišice LABC in odstranijo. Z mišic LABC je treba odstraniti maš čobo in priraš čena tkiva, nato pa 
mišice stehtati na 0,1 mg natan čno in težo zabeležiti. 
— Ko so mišice LABC odstranjene, sta vidni okrogli Cowperjevi ali 
bulbouretralni žlezi (COW) pri spodnjem delu in nekoliko dorzalno 
od čebulčka. Pri izrezu je potrebna previdnost, da se ne poškoduje 
tanka kapsula, zaradi česar bi iztekala teko čina. Cowperjevi žlezi je 
treba stehtati na 0,1 mg natan čno in težo zabeležiti. 
— Zabeležiti je treba tudi izgubo teko čine iz katere koli žleze med obduk ­
cijo in seciranjem. 
55. Če je za oceno vsake kemikalije potrebna obdukcija ve čjega števila živali, 
kot je smiselno za en dan, se lahko za četek študije razporedi na dva zapo ­
redna dneva, kar pomeni, da bo obdukcija in s tem povezano delo razpo ­
rejeno na dva dneva. V tem primeru je treba uporabiti polovico živali vsake od tretiranih skupin na dan. 
56. Po obdukciji je treba trupla uni čiti na primeren na čin.
 
POROČANJE  
Podatki  
57. Podatki se sporo čajo posami čno (tj. telesna teža, teža tkiva pomožnih 
spolnih organov, neobvezne meritve ter drugi odzivi in opažanja) in za 
vsako skupino živali (srednji in standardni odkloni vseh meritev). Podatki se povzamejo v obliki tabele. Podatki prikazujejo število živali na za četku 
preskusa, število živali, najdenih poginulih ali najdenih, ko kažejo znake 
strupenosti med preskusom, opis znakov zaznane strupenosti, vklju čno s 
časom njenega za četka, trajanja in resnosti. 
58. Kon čno poročilo mora vklju čevati naslednje podatke:
 
Preskuševalni laboratorij:  
— naziv laboratorija, kraj, 
— vodjo študije in drugo osebje ter njegove pristojnosti v zvezi s študijo, — datume za četka in konca študije, tj. prvi dan dajanja preskusne kemika ­
lije oziroma zadnji dan obdukcije.
 
Preskusna kemikalija:  
— izvor, številko serije, vrsto, čistoto, polni naslov dobavitelja in oprede ­
litev preskusnih kemikalij, 
— agregatno stanje in, če je to ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti, 
— pogoje shranjevanja, metodo in pogostost priprave razred čin, 
— morebitne podatke o stabilnosti, — morebitne analize raztopin/suspenzij za odmerjanje.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 850
 
Nosilec:  
— opredelitev nosilca (vrsta, dobavitelj in št. serije), 
— utemeljitev izbire nosilca ( če ta ni voda).  
Preskusne živali in postopki reje živali:  
— uporabljeno vrsto/sev in utemeljitev izbire, 
— izvor ali dobavitelja živali, vklju čno s polnim naslovom, 
— število in starost dobavljenih živali, 
— pogoje nastanitve (temperaturo, osvetlitev itd.), 
— prehrano (ime, vrsto, dobavitelja, št. serije, vsebino in, če so znane, 
ravni fitoestrogenov), 
— steljo (ime, vrsto, dobavitelja, vsebino), 
— pogoje v kletkah in število živali na posamezno kletko.  
Preskusni pogoji:  
— starost ob kastraciji in trajanje prilagajanja po kastraciji, 
— teže posameznih živali ob za četku študije (na 0,1 g natan čno), 
— postopek randomizacije in evidenco dodelitve v skupine z nosilcem, 
referenčne skupine, skupine, ki so prejele preskusno kemikalijo, in 
kletke, 
— srednji in standardni odklon telesne teže za vsako skupino za vsak dan 
tehtanja v času trajanja študije, 
— utemeljitev izbire odmerka, 
— način dajanja preskusne kemikalije in utemeljitev izbire na čina 
izpostavljenosti, 
— če je bil opravljen preskus za antiandrogenost, tretiranje s TP (odmerek 
in količino), 
— tretiranje s preskusno kemikalijo (odmerek in koli čina), 
— čas odmerjanja, 
— postopke obdukcije, vklju čno z na čini izkrvavitve in morebitne 
anestezije, 
— če so bile opravljene analize seruma, podrobnosti metode. Če je bil na 
primer uporabljen radioimunski preskus (RIA), je treba sporo čiti izvor 
kompletov za izvedbo preskusa, datum poteka kompleta, postopek scin ­
tilacijskega štetja in standardiziranje.  
Rezultati:  
— dnevna opazovanja za vsako žival med dajanjem odmerkov, vklju čno s: 
— telesno težo (na 0,1 g natan čno), 
— kliničnimi znaki ( če se pojavijo), 
— morebitnimi meritvami ali opombami o porabi hrane, 
— opazovanja pri obdukciji za vsako žival, vklju čno z:  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 851
 
— datumom obdukcije, 
— skupino tretiranja živali, — identifikacijsko oznako živali, 
— obducentom, 
— časom dneva, ko sta bili opravljeni obdukcija in seciranje, 
— starostjo živali, — končno telesno težo pri obdukciji in zabeleženo morebitno statisti čno 
značilno pove čanje ali zmanjšanje, 
— vrstnim redom izkrvavitve živali in seciranja pri obdukciji, 
— težo petih tar čnih od androgenov odvisnih tkiv: 
— ventralne prostate (na 0,1 mg natan čno), 
— semenskih meši čkov in koagulacijskih žlez, skupaj s teko čino (obeh, na 
0,1 mg natan čno), 
— sistema mišice levator ani z bulbokavernozno mišico (na 0,1 mg natan ­ 
čno), 
— Cowperjevih žlez (sveža teža – obeh, na 0,1 mg natan čno), 
— glavice penisa (sveža teža, na 0,1 mg natan čno), 
— morebitno težo neobveznih tkiv: 
— jeter (na 0,1 g natan čno), 
— ledvic (obeh, na 0,1 mg natan čno), 
— nadledvi čnih žlez (obeh, na 0,1 mg natan čno), 
— splošne pripombe in komentarje, 
— morebitne analize serumskih hormonov: 
— serum LH (ni obvezno – ng na ml seruma) in 
— serum T (ni obvezno – ng na ml seruma) 
— splošne pripombe in komentarje.
 
Povzetek podatkov  
Podatke je treba prikazati v obliki tabele, v kateri so navedeni podatki o 
velikosti vzorca za vsako skupino, srednje vrednosti in standardna napaka 
povprečnega ali standardnega odklona. Tabele bi morale vsebovati telesno 
težo živali pri obdukciji, spremembe telesne teže od za četka odmerjanja do 
obdukcije, težo tkiv tar čnih pomožnih spolnih organov in težo neobveznih 
tkiv. 
Razprava o rezultatih  
Analiza rezultatov  
59. Telesno težo in težo organov ob obdukciji je treba statisti čno analizirati za 
lastnosti, kot je homogenost varianc, za analizo pa po potrebi ustrezno 
pretvoriti podatke. Tretirane skupine je treba primerjati s kontrolno skupino 
s tehnikami, kot je ANOVA, ki ji sledi primerjava po parih (npr. Dunnettov enostranski preskus) in merilo za statisti čno razliko, npr. p ≤ 0,05. Skupine 
s statistično značilnostjo je treba identificirati. Vendar se je treba 'relativni 
teži' organov izogibati zaradi neveljavnih statisti čnih predpostavk, na katerih 
temelji ta obdelava podatkov.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 852
 
60. Za agonizem androgenov mora biti kontrola preskusna skupina, tretirana 
samo z nosilcem. Zaradi zna čilnosti delovanja preskusne kemikalije se 
lahko tkiva razli čno relativno odzivajo; na primer trenbolon, ki ga ni 
mogoče 5 alfa-reducirati, ima izrazitejše u činke na LABC in GP kot testo ­
steron propionat. Statisti čno značilno pove čanje (p ≤ 0,05) teže dveh ali ve č 
tarčnih od androgenov odvisnih tkiv (VP, LABC, GP, CG in SVCG) se 
šteje za pozitiven rezultat na agoniste androgenov, dolo čena stopnja pove ­ 
čane rasti pa bi se morala pojaviti pri vseh tar čnih tkivih. Skupna ocena 
odzivov vseh tkiv pomožnih spolnih organov je mogo ča z uporabo ustrezne 
multivariantne analize podatkov. Tako bi se lahko analiza izboljšala, zlasti v 
primerih, ko se statisti čno značilen odziv pojavi samo pri enem tkivu. 
61. Za agonizem androgenov mora biti kontrola preskusna skupina, tretirana z 
referenčnim androgenom (samo s testosteron propionatom). Zaradi zna čil­
nosti delovanja preskusne kemikalije se lahko tkiva razli čno relativno odzi ­
vajo; na primer zaviralci 5 α-reduktaze imajo v primerjavi z mo čnimi anta ­
gonisti AR, kot je flutamid, izrazitejše u činke na ventralno prostato kot na 
druga tkiva. Statisti čno značilno zmanjšanje (p ≤ 0,05) teže dveh ali ve č 
tarčnih od androgenov odvisnih tkiv (VP, LABC, GP, CG in SVCG) v 
primerjavi s tretiranjem samo s testosteron propionatom se šteje za pozitiven rezultat na antagoniste androgenov, dolo čena stopnja zmanjšanja rasti pa bi 
se morala pojaviti pri vseh tar čnih tkivih. Skupna ocena odzivov vseh tkiv 
pomožnih spolnih organov je mogo ča z uporabo ustrezne multivariantne 
analize podatkov. Tako bi se lahko analiza izboljšala, zlasti v primerih, ko se statisti čno značilen odziv pojavi samo pri enem tkivu. 
62. Podatke je treba prikazati v obliki tabele, v kateri so navedeni srednja 
vrednost, standardna napaka srednje vrednosti (sprejemljiv bi bil tudi stan ­
dardni odklon) in podatki o velikosti vzorca za vsako skupino. Vklju čene bi 
morale biti tudi tabele s podatki za posamezne živali. Preveriti je treba 
posamič
ne vrednosti, srednjo vrednost, standardno napako (standardni 
odklon) in vrednosti koeficienta variacij za kontrolne podatke, da bi ugoto ­
vili, ali izpolnjujejo sprejemljiva merila za skladnost s pri čakovanimi prete ­
klimi vrednostmi. S pomo čjo koeficientov variacij, ki presegajo vrednosti 
koeficientov variacij iz tabele 1 (glej odstavka 25 in 26) za težo vsakega 
organa, je treba ugotoviti, ali je prišlo do napake pri beleženju ali vnašanju podatkov oziroma ali laboratorij še ne obvlada popolnoma natan čnega seci ­
ranja od androgenov odvisnih tkiv in je potrebno nadaljnje usposabljanje/ 
praksa. Na splošno so koeficienti variacij (standardni odklon deljen s 
povprečno težo organa) ponovljivi med laboratoriji in študijami. Predsta ­
vljeni morajo biti vsaj podatki za ventralno prostato, semenski meši ček, 
mišico levator ani z bulbokavernozno mišico, Cowperjevi žlezi, glavico 
penisa in jetra ter podatki o teži organov in spremembi telesne teže od 
začetka odmerjanja do obdukcije. Podatki so lahko predstavljeni tudi po 
prilagoditvi kovariance za telesno težo, vendar ne namesto predstavitve neprilagojenih podatkov. Poleg tega je treba v primeru, da do lo čitve prepu ­
cija ne pride v nobeni od skupin, pojavnost lo čitve prepucija zabeležiti in s 
Fisherjevim natan čnim preskusom statisti čno primerjati s kontrolno skupino.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 853
 
63. Ko se s pomo čjo originalnih obrazcev preverja to čnost podatkov, vnesenih 
v računalnik, je treba vrednosti teže organov, ki niso biološko verjetne ali 
pa se od povpre čij te tretirane skupine razlikujejo za ve č kot tri standardne 
odklone, natan čno preveriti in po potrebi zavre či kot napake pri beleženju. 
64. Primerjava rezultatov študije z vrednostmi koeficientov variacije OECD (v 
tabeli 1) je pogosto pomemben korak pri razlagi glede veljavnosti rezultatov 
študije. Pretekli podatki kontrolnih skupin z nosilcem naj bodo shranjeni v 
laboratoriju. Pretekli podatki o odzivih na pozitivne referen čne kemikalije, 
kot sta testosteron propionat in flutamid, naj bodo prav tako shranjeni v laboratoriju. Laboratoriji lahko tudi redno preskušajo odziv na znane šibke 
agoniste in antagoniste androgenov ter te podatke hranijo. Zaradi zagota ­
vljanja, da se z metodami laboratorija dobi ustrezno statisti čno natančnost in 
moč, se lahko ti podatki primerjajo z razpoložljivimi podatki OECD.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 854
 
Dodatek 1  
OPREDELITEV POJMOV: 
Androgen  je izraz, ki se uporablja za opis pozitivnega vpliva na rast od andro ­
genov odvisnih tkiv.  
Antiandrogen  je zmožnost kemikalije, da v organizmu sesalca zavre delovanje 
testosteron propionata.  
Kemikalija  je snov ali zmes.  
Datum skotitve  je poporodni dan 0.  
Odmerek  je količina dane preskusne kemikalije. Pri Hershbergerjevem biolo ­ 
škem preskusu je odmerek izražen kot teža preskusne kemikalije na enoto telesne 
teže preskusne živali na dan (npr. mg/kg telesne teže/dan).  
Odmerjanje  je splošen izraz, ki vklju čuje odmerek ter pogostost in trajanje 
dajanja odmerka.  
Umirajoč je izraz, ki se uporablja za opis umirajo če živali, tj. živali, ki je blizu 
smrti.  
Poporodni dan N  je N-ti dan življenja po dnevu skotitve.  
Občutljivost  je zmožnost preskusne metode, da pravilno identificira kemikalije, 
ki imajo lastnost, zaradi katere so preskušane.  
Specifičnost je zmožnost preskusne metode, da pravilno identificira kemikalije, 
ki nimajo lastnosti, zaradi katere so preskušane.  
Preskusna kemikalija  pomeni vsako snov ali zmes, preskušeno s to preskusno 
metodo.  
Validacija  je znanstven postopek, oblikovan za dolo čanje zahtev glede delovanja 
in omejitev preskusne metode ter za prikaz njene zanesljivosti in ustreznosti za določen namen.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 855
 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 856
 ▼M5 
Dodatek 2
  
VMG mamm: Skupina za upravljanje validacije na podro čju preskusov na sesalcih in njihovega ocenjevanja.
 OPOMBE K OKVIRU:  
Opomba 1:  Vstop na vseh ravneh in izstop z vseh ravni je mogo č in odvisen 
od obstoje čih potreb po informacijah zaradi ocene nevarnosti in 
tveganja.  
Opomba 2:  Na ravni 5 bi moral ekotoksikološki vidik vklju čevati kon čne 
točke, ki kažejo na mehanizme škodljivih u činkov in morebitno 
škodo za populacijo.  
Opomba 3:  Če večmodalni model zajema ve č preskusov ene kon čne točke, ta 
model zamenja uporabo teh preskusov ene kon čne točke. 
Opomba 4:  Kemikalije je treba ocenjevati vsako posebej in pri tem upoštevati 
razpoložljive informacije ter funkcijo ravni okvira.  
Opomba 5:  V času nastanka tega dokumenta okvir še ni izpopolnjen. Na 
ravneh 3, 4 in 5 vklju čuje preskuse, ki so na voljo ali pa še v 
postopku validacije. Slednji so vklju čeni začasno. Ko bodo razviti 
in validirani, bodo uradno dodani v okvir.  
Opomba 6:  Za raven 5 se ne sme šteti, da vklju čuje samo kon čne preskuse. 
Preskusi, vklju čeni na tej ravni, prispevajo k splošni oceni nevar ­
nosti in tveganja.  
VIRI  
(1) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th–11th March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5. 
(2) Dorfman R.I. (1962). Standard methods adopted by official organization. 
Academic Press, NY. 
(3) Gray L.E. Jr., Furr J. and Ostby J.S. (2005). Hershberger assay to inve ­
stigate the effects of endocrine disrupting compounds with androgenic and antiandrogenic activity in castrate-immature male rats. In:  Current Proto ­
cols in Toxicology  16.9.1–16.9.15. J Wiley and Sons Inc. 
(4) OECD (2006). Final OECD report of the initial work towards the valida ­
tion of the rat Hershberger assay. Phase 1. Androgenic response to testo ­
sterone propionate and anti-androgenic effects of flutamide. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N
 o 62. 
ENV/JM/MONO(2006)30. 
(5) OECD (2008). Report of the OECD Validation of the Rat Hershberger 
Bioassay: Phase 2: Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and a 5α-Reductase Inhibitor in Dose Response Studies by Multiple Labo ­
ratories. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing 
and Assessment N
 o 86. ENV/JM/MONO(2008)3. 
(6) OECD (2007). Report of the Validation of the Rat Hershberger Assay: 
Phase 3: Coded Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and Negative Reference Chemicals by Multiple Laboratories. Surgical Castrate 
Model Protocol. Environmental Health and Safety, Monograph Series on 
Testing and Assessment N
 o 73. ENV/JM/MONO(2007)20. 
(7) Owens, W., Zeiger E., Walker M., Ashby J., Onyon L., Gray, Jr., L.E. 
(2006). The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 
1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized 
protocol. Env. Health Persp. 114:1265–1269.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 857
 
(8) Owens W., Gray L.E., Zeiger E., Walker M., Yamasaki K., Ashby J., 
Jacob E. (2007). The OECD program to validate the rat Hershberger 
bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses: phase 2 dose-response studies. Environ Health Perspect. 115(5):671–8. 
(9) Korenchevsky V. (1932). The assay of testicular hormone preparations. 
Biochem J 26:413–422. 
(10) Korenchevsky V., Dennison M., Schalit R. (1932). The response of 
castrated male rats to the injection of the testicular hormone. Biochem J 
26:1306–1314. 
(11) Eisenberg E., Gordan G.S. (1950). The levator ani muscle of the rat as an 
index of myotrophic activity of steroidal hormones. J Pharmacol Exp Therap 99:38–44. 
(12) Eisenberg E., Gordan G.S., Elliott H.W. (1949). Testosterone and tissue 
respiration of the castrate male rat with a possible test for mytrophic 
activity. Endocrinology 45:113–119. 
(13) Hershberger L., Shipley E., Meyer R. (1953). Myotrophic activity of 19- 
nortestosterone and other steroids determined by modified levator ani muscle method. Proc Soc Exp Biol Med 83:175–180. 
(14) Hilgar A.G., Vollmer E.P. (1964). Endocrine bioassay data: Androgenic 
and myogenic. Washington DC: United States Public Health Service. 
(15) Dorfman R.I. (1969). Androgens and anabolic agents. In: Methods in 
Hormone Research, volume IIA. (Dorfman RI, ed.) New York:Academic 
Press, 151–220. 
(16) Massaro E.J. (2002). Handbook of Neurotoxicology, volume I. New York: 
Humana Press, p. 38. 
(17) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7. 
(18) OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development 
– Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Paris. 
(19) OECD (2008). Acute oral toxicity – up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425. 
(20) OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. ENV/JM/MONO(2001)4. 
(21) Supplemental materials for Owens et al. (2006). The OECD programme to 
validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo 
androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol. Env. Health Persp. 114:1265-1269. See, section II, The dissection guidance provided 
to the laboratories: http://www.ehponline.org/docs/2006/8751/suppl.pdf. 
(22) Korea Food and Drug Administration. Visual reference guide on Hersh ­
berger assay procedure, including a dissection video. http:// 
rndmoa.kfda.go.kr/endocrine/reference/education_fr.html. 
(23) OECD (2008). Background Review Document on the Rodent Hershberger 
Bioassay. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 90. ENV/JM/MONO(2008)17. 
(24) OECD (2008). Draft Validation report of the Intact, Stimulated, Weanling 
Male Rat Version of the Hershberger Bioassay. 
(25) OECD (2009). Guidance Document on the Weanling Hershberger 
Bioassay in rats: A shortterm screening assay for (anti)androgenic proper ­
ties. Series on Testing and Assessment, Number 115.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 858
 
(26) Direktiva 2010/63/EU Evropskega parlamenta in Sveta z dne 
22. Septembra 2010 o zaš čiti živali, ki se uporabljajo v znanstvene namene 
(UL L 276, 20.10.2010, str. 33). 
(27) Naslednja poglavja te priloge: 
B.1 bis, Akutna oralna toksi čnost – postopek s to čno določenim 
odmerkom. 
B.1 tris, Akutna oralna toksi čnost – metoda razredov akutne toksi čnosti.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 859
 
B.56  RAZŠIRJENA ENOGENERACIJSKA ŠTUDIJA STRUPENOSTI ZA 
RAZMNOŽEVANJE  
UVOD 
1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD št. 443 (2012). 
Temelji na predlogu tehni čnega odbora za oceno varnosti kemikalij 
v kmetijstvu (ACSA) Inštituta za zdravstvene in okoljske vede (HESI) Mednarodnega inštituta za znanost o življenju (ILSI) za razširjeno enoge ­
neracijsko študijo strupenosti za razmnoževanje v življenjskem obdobju 
potomcev prve generacije (F
 1 ), kakor je objavljen v Cooper et al., 2006 
(1). Narejene so bile številne izboljšave na črta študije in dodana so bila 
pojasnila, da bi zagotovili prožnost in poudarili pomen izhajanja iz obsto ­
ječega znanja in ugotovitev ob opazovanju živih živali, ki se uporabijo za 
usmerjanje in prilagajanje preskušanja. Ta preskusna metoda obsega podroben opis izvajanja razširjene enogeneracijske študije strupenosti za razmnoževanje. Preskusna metoda opisuje tri kohorte živali F
 1 : 
Kohorta 1: oceni kon čne točke razmnoževanja/razvoja; ta kohorta bo 
morda razširjena na generacijo F  2 . 
Kohorta 2: oceni morebiten u činek izpostavljenosti kemikaliji na živ čni 
sistem v razvoju. 
Kohorta 3: oceni morebiten u činek izpostavljenosti kemikaliji na imunski 
sistem v razvoju. 
2. Odlo čitev glede ocenjevanja druge generacije in opustitve kohorte za 
razvojno nevrotoksi čnost in/ali kohorte za razvojno imunotoksi čnost bi 
morala temeljiti na obstoje čem znanju o kemikaliji, ki se vrednoti, in 
potrebah razli čnih regulativnih organov. Namen te preskusne metode je 
zagotoviti podrobnosti o izvajanju študije in na činih vrednotenja vsake od 
kohort. 
3. Postopek za odlo čitev o notranjih sprožilcih za produkcijo druge generacije 
je opisan v Smernici OECD št. 117 (39) za regulativne organe, ki upora ­
bljajo notranje sprožilce.  
ZAČETNI PREUDARKI IN CILJI 
4. Glavni cilj razširjene enogeneracijske študije o strupenosti za razmnože ­
vanje je vrednotenje dolo čenih življenjskih obdobij, ki niso zajeta v drugih 
vrstah študij strupenosti in preskušanje za u činke, ki bi lahko bili posledica 
izpostavljenosti kemikalijam v pred- in poporodnem obdobju. Pri kon čnih 
točkah razmnoževanja se priporo ča, da se najprej, in ko je to mogo če, za 
odkrivanje u činkov na ženske in moške razmnoževalne organe uporabijo 
informacije iz študij s ponavljajo čimi se odmerki (vklju čno s presejalnimi 
študijami za strupenost za razmnoževanje, npr. Smernica za preskušanje 
OECD št. 422 (32)), ali kratkotrajnih presejalnih študij za povzro čitelje 
endokrinih motenj (npr. uterotropni preskus – preskusna metoda B.54 (36), in Hershbergerjev preskus – preskusna metoda B.55 (37)). Mednje lahko sodijo spermatogeneza (histopatologija mod) pri samcih ter pojatveni 
cikli, štetje foliklov/zorenje oocitov in celovitost jaj čnikov (histopatologija) 
pri samicah. Razširjena enogeneracijska študija strupenosti za razmnože ­
vanje služi kot preskus za kon čne točke razmnoževanja, pri katerih so 
potrebni interakcija samcev in samic, samice z zarodkom in samice s 
potomci ter generacija F
 1 do obdobja po spolni zrelosti (glej Smernico 
OECD št. 151, ki podpira to preskusno metodo (40)).  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 860
 
5. Preskusna metoda je zasnovana tako, da zagotavlja vrednotenje pred- in 
poporodnih u činkov kemikalij na razvoj, pa tudi temeljito vrednotenje 
sistemske strupenosti pri brejih in doje čih samicah ter mladih in odraslih 
potomcih. S podrobnim prou čevanjem klju čnih končnih točk razvoja, kot so 
sposobnost potomcev za preživetje, zdravje in razvojni status ob rojstvu ter 
fizični in funkcionalni razvoj do odraslosti, naj bi se opredelili dolo čeni 
tarčni organi pri potomcih. Poleg tega bo študija zagotovila in/ali potrdila 
informacije o u činkih preskusne kemikalije na celovitost in zmogljivost 
moških in ženskih razmnoževalnih sistemov. Še posebej, vendar ne izklju ­ 
čno, so obravnavani naslednji parametri: funkcija spolnih žlez, pojatveni 
cikel, zorenje semena v obmodku, vedenje pri parjenju, spo četje, brejost, 
kotitev in laktacija. Poleg tega bodo informacije, pridobljene na podlagi ocen razvojne nevrotoksi čnosti in/ali razvojne imunotoksi čnosti, opredelile 
morebitne u činke v teh sistemih. Podatki, pridobljeni s temi preskusi, bi 
morali omogo čiti dolo čanje vrednosti brez opaznih škodljivih 
učinkov (NOAEL), najnižjih vrednosti z opaženim škodljivim 
učinkom (LOAEL) in/ali primerjalnih odmerkov za razli čne končne točke 
in/ali biti uporabljeni za opredelitev u činkov, ugotovljenih v prejšnjih 
študijah s ponavljajo čim se odmerkom, in/ali služiti kot smernica za 
nadaljnje preskušanje. 
6. Shema protokola je predstavljena na sliki 1. Preskusna kemikalija se daje 
neprekinjeno v stopnjevanih odmerkih ve č skupinam spolno zrelih samcev 
in samic. Ta generacija staršev (P) prejema odmerke v dolo čenem obdobju 
pred parjenjem (obdobje je dolo čeno na podlagi razpoložljivih informacij za 
preskusno kemikalijo, vendar mora trajati vsaj dva tedna) in v dvoteden ­
skem obdobju parjenja. Starševski (P) samci nadalje prejemajo odmerke vsaj do odstavitve potomcev F
 1 . Odmerke naj bi prejemali vsaj 10 tednov. 
Če je treba pojasniti u činke na razmnoževanje, lahko odmerke prejemajo 
tudi dalj časa. Tretiranje starševskih (P) samic se nadaljuje med brejostjo in 
laktacijo do usmrtitve po odstavitvi njihovih potomcev (tj. 8–10 tednov tretiranja). Potomci F
 1 so s preskusno kemikalijo nadalje tretirani od odsta ­
vitve do odraslosti. Če se ocenjuje druga generacija (glej Smernico OECD 
št. 117 (39)), se potomce F  1 še naprej tretira do odstavitve potomcev F  2 ali 
zaključka študije. 
7. Na vseh živalih se izvajajo klini čna opazovanja in patološki pregledi za 
znake strupenosti s posebnim poudarkom na celovitosti in zmogljivosti moških in ženskih razmnoževalnih sistemov ter na zdravju, rasti, razvoju 
in delovanju potomcev. Ob odstavitvi so izbrani potomci razdeljeni v dolo ­ 
čene podskupine (kohorte 1–3, glej odstavka 33 in 34 ter sliko 1) zaradi 
nadaljnjih preiskav, vklju čno s spolno zrelostjo, celovitostjo in delovanjem 
razmnoževalnega organa, vedenjskimi in nevrološkimi kon čnimi točkami ter 
delovanjem imunskega sistema. 
8. Pri izvajanju študije je treba upoštevati vodilna na čela in premisleke iz 
smernice OECD št. 19 o prepoznavanju, oceni in uporabi klini čnih znakov 
kot humanih kon čnih točk za preskusne živali, ki se uporabljajo pri ocenah 
varnosti (34).
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 861
 
9. Ko bo na voljo dovolj študij za ugotavljanje u činka tega novega na črta 
študije, bo opravljen pregled preskusne metode, ki bo ob upoštevanju prid ­
obljenih izkušenj po potrebi spremenjena.  
Slika 1  
Shema razširjene enogeneracijske študije strupenosti za razmnoževanje
  
OPIS METODE/PRIPRAVE NA PRESKUS  
Živali  
Izbira živalske vrste in seva  
10. Vrsto za preskus strupenosti za razmnoževanje je treba skrbno izbrati ob 
upoštevanju vseh razpoložljivih informacij. Zaradi obsega osnovnih poda ­
tkov in primerljivosti s splošnimi preskusi strupenosti je priporo čena vrsta 
običajno podgana; merila in priporo čila v tej preskusni metodi se nanašajo 
na to vrsto. Če se uporabi druga vrsta, je treba izbiro utemeljiti in ustrezno 
spremeniti protokol. Sevi z nizko plodnostjo ali dobro znano visoko pojav ­
nostjo spontanih razvojnih napak se ne smejo uporabljati.  
Starost, telesna teža in merila za vklju čitev 
11. Uporabijo se zdravi starši, na katerih se še niso izvajali preskusni postopki. 
Proučiti je treba samce in samice; uporabijo se samice, ki še niso kotile in 
ki niso breje. Starši (P) naj bodo spolno zreli, ob za četku odmerjanja naj 
imajo podobno težo (v okviru spola), ob parjenju naj bodo približno enako stari (približno 90 dni) in naj bodo reprezentativni za vrsto in sev, upora ­
bljena v študiji. Živali naj se prilagajajo vsaj 5 dni po prihodu. Živali se 
naključno dodelijo v kontrolne in tretirane skupine tako, da bodo povpre čne 
telesne teže med skupinami primerljive (tj. ± 20 % srednje vrednosti).
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 862
 
Nastanitveni in prehranjevalni pogoji  
12. Temperatura v prostoru s preskusnimi živalmi naj bo 22 °C (± 3 °C). 
Relativna vlažnost naj bo med 30 in 70 %, pri čemer je najprimernejše 
območje med 50 in 60 %. Umetna osvetlitev naj bo nastavljena na 12 ur 
svetlobe, 12 ur teme. Uporablja se lahko obi čajna laboratorijska prehrana z 
neomejeno koli čino pitne vode. Posebno pozornost je treba nameniti 
vsebnosti fitoestrogenov v prehrani, saj lahko njihova visoka raven vpliva na nekatere kon čne točke razmnoževanja. Priporo ča se uporaba standardi ­
zirane prehrane z odprto formulo, v kateri so bile v skladu s priporo čili 
zmanjšane koli čine estrogenih kemikalij (2) (30). Na izbiro prehrane lahko 
vpliva potreba po zagotovitvi ustrezne primesi preskusne kemikalije, kadar 
se daje po tej metodi. Preveriti je treba vsebnost, homogenost in stabilnost 
preskusne kemikalije v prehrani. Hrano in pitno vodo je treba redno anali ­
zirati za kontaminante. Vzorce vsake serije prehrane, uporabljene med študijo, je treba shraniti pod ustreznimi pogoji (npr. zamrznjene pri – 20 
°C) do zaklju čka poročila, če bi bilo treba na podlagi rezultatov opraviti 
nadaljnjo analizo sestavin prehrane. 
13. Živali je treba v kletke namestiti v manjših skupinah istega spola in iz iste 
tretirane skupine. Zaradi izogibanja poškodbam (npr. samcev po obdobju 
parjenja) se lahko namestijo tudi posami čno. Parjenje naj se izvaja v klet ­
kah, ki so primerne za ta namen. Po dokazu o kopulaciji se domnevno breje samice namestijo lo čeno v kletke za kotitev ali kletke za matere, kjer imajo 
na voljo ustrezen in dolo čen material za izdelavo gnezda. Legla so nasta ­
njena s svojimi materami do odstavitve. Živali F
 1 naj bi bile od odstavitve 
do usmrtitve nameš čene v majhnih skupinah istega spola in tretirane 
skupine. Če je to znanstveno upravi čeno, so lahko živali nameš čene posa­
mično. Raven fitoestrogenov v izbrani stelji naj bo kar najmanjša.  
Število in identifikacija živali  
14. Običajno naj bi bilo v vsaki preskusni in kontrolni skupini zadostno število 
sparjenih parov, da je za vsako skupino odmerka brejih vsaj 20 samic. Cilj je dovolj brejih samic, da je zagotovljeno smiselno ovrednotenje potenciala snovi za vplivanje na plodnost, brejost in materinsko obnašanje 
starševske (P) generacije ter rast in razvoj potomcev F
 1 od spočetja do 
zrelosti. Če zaželeno število brejih živali ni doseženo, študija s tem torej 
ni nujno ovržena in je potrebno vrednotenje vsakega primera posebej ob upoštevanju morebitne vzro čne povezave s preskusno kemikalijo. 
15. Pred za četkom odmerjanja se vsaki starševski (P) živali dodeli edinstvena 
identifikacijska številka. Če je iz preteklih podatkov laboratorija razvidno, 
da velik delež samic morda ne bo imel rednih (4- ali 5-dnevnih) pojatvenih ciklov, se priporo ča ocena pojatvenih ciklov pred pri četkom tretiranja. 
Skupina se lahko tudi pove ča in se tako zagotovi, da bo imelo ob za četku 
tretiranja v vsaki skupini vsaj 20 samic redne (4- ali 5-dnevne) pojatvene cikle. Vsi potomci F
 1 se označijo z edinstvenimi oznakami, ko so novoro ­
jene živali prvi č pregledane na poporodni dan 0 ali 1. poporodni dan. Ves 
čas trajanja študije je treba voditi evidenco z navedbo o poreklu zaroda za 
vse živali F  1 in, kadar je primerno, živali F  2 . ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 863
 
Preskusna kemikalija  
Razpoložljive informacije o preskusni kemikaliji  
16. Pregled obstoje čih informacij je pomemben zaradi odlo čitev o načinu daja­
nja, izbiri nosilca, izbiri vrste živali, izbiri odmerkov in morebitnih spre ­
membah urnika odmerjanja. Zato je treba pri na črtovanju razširjene enoge ­
neracijske študije strupenosti za razmnoževanje upoštevati vse ustrezne razpoložljive informacije o preskusni kemikaliji, tj. fizikalno-kemijske last ­
nosti, toksikokinetiko (vklju čno s presnovo, zna čilno za vrsto), toksikodi ­
namične lastnosti, razmerja med strukturo in aktivnostjo, presnovne procese  
in vitro , rezultate predhodnih študij strupenosti in zadevne informacije o 
strukturnih analogih. Predhodne informacije o absorpciji, porazdelitvi, pres ­
novi in izlo čanju ter bioakumulaciji je mogo če pridobiti na podlagi 
kemijske sestave, fizikalno-kemijskih podatkov, obsega študij vezave na 
plazemske beljakovine ali toksikokineti čnih študij, rezultati študij strupe ­
nosti pa zagotavljajo dodatne informacije, npr. o vrednosti brez opaznih škodljivih u činkov (NOAEL), presnovi ali nastajanju presnove.
 
Upoštevanje podatkov o toksikokinetiki  
17. Čeprav niso zahtevani, so podatki o toksikokinetiki iz predhodno izvedenih 
študij za ugotavljanje obmo čja ali drugih študij izredno koristni pri na črto­
vanju študije, izbiri velikosti odmerkov in razlagi rezultatov. Zlasti koristni so podatki, ki: 1) preverjajo izpostavljenost razvijajo čih se zarodkov in 
mladičev preskusni kemikaliji (ali ustreznim metabolitom), 2) zagotavljajo 
oceno notranje dozimetrije in 3) ocenijo možnost nasi čenosti kineti čnega 
procesa, odvisne od odmerka. Če so na voljo, je treba upoštevati tudi 
dodatne podatke o toksikokinetiki, kot so profili presnovkov, časovni poteki 
koncentracije itd. Dodatne podatke o toksikokinetiki je mogo če zbrati tudi 
med glavno študijo, če to ne moti zbiranja in razlage kon čnih točk glavne 
študije. 
Na splošno je pri na črtovanju razširjene enogeneracijske študije strupenosti 
za razmnoževanje koristen naslednji podatkovni niz o toksikokinetiki: 
— pozna brejost (npr. 20. dan brejosti) – kri matere in kri zarodka, 
— sredina obdobja laktacije (10. poporodni dan) – kri matere, kri mladi ča 
in/ali mleko, 
— zgodnje obdobje po odstavitvi (npr. 28. poporodni dan) – vzorci krvi 
odstavljenih živali. 
Pri določanju dolo čenih analitov (npr. mati čne kemikalije in/ali metabolitov) 
in sheme vzor čenja je potrebna prožnost. Število in čas odvzema vzorcev na 
določeni dan vzor čenja sta na primer odvisna od na čina izpostavljenosti in 
predhodnega poznavanja toksikokineti čnih lastnosti pri nebrejih živalih. Pri 
študijah o prehrani zadoš ča vzorčenje ob enem samem doslednem času vsak 
dan vzorčenja, pri odmerjanju z gavažo pa bo morda potrebno vzor čenje 
tudi ob drugih časih, da bi dobili boljšo oceno obmo čja notranjih odmerkov. 
Ni pa potrebno pripraviti celotnega časovnega poteka koncentracije na 
kateri koli dan vzor čenja. Po potrebi se lahko za analizo zarodkov in novo ­
rojenih živali podatke o krvi združi po spolu znotraj legel.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 864
 
Način dajanja kemikalije  
18. Pri izbiri na čina dajanja je treba upoštevati na čine, ki so najpomembnejši za 
izpostavljenost pri ljudeh. Čeprav je protokol zasnovan za dajanje preskusne 
kemikalije s hrano, ga je mogo če spremeniti za dajanje na druge na čine 
(pitna voda, gavaža, vdihavanje, skozi kožo), odvisno od lastnosti kemika ­
lije in potrebnih informacij.  
Izbira nosilca  
19. Po potrebi se preskusna kemikalija raztopi ali suspendira v ustreznem 
nosilcu. Priporo ča se, da se, kadar koli je to mogo če, najprej razmisli o 
uporabi vodne raztopine/suspenzije, nato pa raztopine/suspenzije v olju (npr. koruznem). V primeru nosilcev, ki niso voda, je treba poznati toksi čne 
lastnosti takega nosilca. Uporabi nosilcev z morebitno intrinzi čno strupe ­
nostjo se je treba izogibati (npr. acetonu, dimetilsulfoksidu). Dolo čiti je 
treba stabilnost preskusne kemikalije v nosilcu. Če se za lažje odmerjanje 
uporabi nosilec ali drug dodatek, je treba upoštevati naslednje lastnosti: učinke na absorpcijo, porazdelitev, presnovo ali zadrževanje preskusne 
kemikalije; u činke na kemijske lastnosti preskusne kemikalije, ki bi lahko 
spremenili njene strupene lastnosti; in u činke na porabo vode ali hrane 
oziroma prehranjenost živali.
 
Izbira odmerka  
20. Običajno naj bi študija obsegala vsaj tri velikosti odmerkov in hkratno 
kontrolo. Pri izbiri ustreznih velikosti odmerkov bi moral raziskovalec 
upoštevati vse razpoložljive informacije, vklju čno z informacijami o odmer ­
janju iz prejšnjih študij, podatke o toksikokinetiki pri brejih in nebrejih samicah, obseg prenosa z dojenjem ter ocene izpostavljenosti pri ljudeh. 
Če so na voljo podatki o toksikokinetiki, ki kažejo na od odmerka odvisno 
nasičenost toksikokineti čnih procesov, se je treba izogniti velikim odmer ­
kom, ki o čitno kažejo nasi čenost, seveda če naj bi bila izpostavljenost pri 
ljudeh precej pod to čko nasičenosti. V takih primerih naj bi bil najve čji 
odmerek na prevojni to čki za prehod na nelinearne toksikokineti čne last­
nosti ali tik nad njo. 
21. Če ustreznih podatkov o toksikokinetiki ni na voljo, naj bi velikosti 
odmerkov temeljile na u činkih strupenosti, razen kadar zaradi fizikalne/ke ­
mijske narave preskusne kemikalije to ni mogo če. Če velikosti odmerkov 
temeljijo na strupenosti, je treba najve čji odmerek izbrati z namenom, da se 
povzroči določena stopnja sistemske strupenosti, vendar ne smrti ali hudega 
trpljenja živali. 
22. Padajo če zaporedje velikosti odmerkov je treba izbrati tako, da se pokažejo 
vse od odmerka odvisne reakcije in dolo či vrednost brez opaženih škod ­
ljivih učinkov (NOAEL) ali odmerke blizu meje zaznavnosti, na podlagi 
katerih bi bilo mogo če določiti primerjalni odmerek za najob čutljivejše 
končne točke. Da ne bi bilo prevelikega razpona med NOAEL in LOAEL, 
so pogosto optimalni dvakratni do štirikratni intervali. Pogosto je bolje 
dodati četrto preskusno skupino, kot uporabiti zelo velike intervale med 
odmerki (npr. ve č kot faktor 10). 
23. Razen tretiranja s preskusno kemikalijo se z živalmi v kontrolni skupini 
ravna enako kot z živalmi v preskusni skupini. Ta skupina je kontrolna skupina, ki ni tretirana ali je tretirana z nepravim nadomestkom, ali kontrolna skupina, tretirana le z nosilcem, če je ta uporabljen pri dajanju 
preskusne kemikalije. Če je uporabljen nosilec, mora kontrolna skupina 
prejeti koli čino nosilca, enako najve
čji uporabljeni koli čini. ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 865
 
Mejni preskus  
24. Če pri odmerku najmanj 1000 mg/kg telesne teže/dan ni dokazov o strupe ­
nosti pri študijah s ponavljajo čimi se odmerki ali se ne pri čakuje strupenosti 
glede na podatke o strukturno in/ali presnovno sorodnih kemikalijah, ki 
kažejo na podobnost presnovnih lastnosti  in vivo /in vitro , se šteje, da študija 
z uporabo ve č različnih velikosti odmerkov ni potrebna. V takih primerih se 
lahko razširjena enogeneracijska študija strupenosti za razmnoževanje izvede s kontrolno skupino in enim odmerkom najmanj 1000 mg/kg telesne 
teže/dan. Če se pri tej velikosti odmerka pojavijo dokazi o strupenosti za 
razmnoževanje in razvoj, bodo potrebne nadaljnje študije z manjšimi odmerki za opredelitev NOAEL. Ti preudarki o mejnem preskusu veljajo 
samo v primeru, ko na podlagi izpostavljenosti pri ljudeh ni razvidna 
potreba po ve čjem odmerku.
 
POSTOPKI  
Izpostavljenost potomcev  
25. Priporo čen način dajanja je izpostavljenost s prehrano. Če se izvajajo študije 
dajanja z gavažo, je treba opozoriti, da mladi či preskusno kemikalijo 
običajno prejemajo posredno prek mleka, dokler se po odstavitvi ne pri čne 
neposredno odmerjanje . Pri študijah s prehrano ali pitno vodo dobijo 
mladiči preskusno kemikalijo tudi neposredno, ko se za čnejo v zadnjem 
tednu obdobja dojenja samostojno prehranjevati. Če se v mleko izlo ča 
premalo preskusne kemikalije in če ni dokazov o neprekinjeni izpostavlje ­
nosti potomcev, je treba razmisliti o spremembi na črta študije. V tem 
primeru je treba prou čiti možnost neposrednega odmerjanja mladi čem 
med dojenjem na podlagi razpoložljivih informacij o toksikokinetiki, stru ­
penosti za potomce ali spremembi biomarkerjev (3) (4). Pred pri četkom 
neposrednega odmerjanja doje čim se mladi čem je treba skrbno pretehtati 
prednosti in slabosti (5).  
Urnik odmerjanja in dajanje odmerkov  
26. Informacije o pojatvenem ciklu, histopatoloških preiskavah ženskega in 
moškega reproduktivnega trakta in/ali analizi semena iz mod/obmodka so 
morda na voljo iz prejšnjih ustrezno dolgih študij strupenosti s ponavlja ­
jočim se odmerkom. Trajanje tretiranja pred parjenjem v razširjeni enoge ­
neracijski študiji strupenosti za razmnoževanje je torej usmerjeno v odkri ­
vanje učinkov na spremembe delovanja, ki bi lahko motile vedenje pri 
parjenju in oploditev. Tretiranje pred parjenjem mora trajati dovolj dolgo, da se dosežejo stabilni pogoji izpostavljenosti pri starševskih (P) samcih in samicah. V ve čini primerov za oba spola zadoš ča dvotedensko tretiranje 
pred parjenjem. Pri samicah so v tem času zajeti 3–4 popolni pojatveni 
cikli, kar bi moralo zadoš čati za odkrivanje morebitnih škodljivih u činkov 
na cikličnost. Pri samcih je to obdobje enakovredno obdobju, potrebnemu 
za prehod zore čih semenčic v obmodkih, in bi moralo zadoš čati za odkri ­
vanje učinkov na seme po fazi proizvodnje v modih (med zadnjimi fazami 
sprostitve spermatidov v obmodek in zorenjem semena v obmodku) pri parjenju. Ob usmrtitvi, ko sta na črtovani histopatologija mod in obmodka 
ter analiza parametrov semena, so starševski (P) samci in samci F
 1 izposta­
vljeni vsaj en celotni proces spermatogeneze ((6) (7) (8) (9) in Smernica 
OECD št. 151 (40)).  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 866
 
27. Scenarije izpostavljenosti samcev pred parjenjem je mogo če spremeniti, če 
so bili v prejšnjih študijah jasno ugotovljeni strupenost za moda (oslabitev 
spermatogeneze) ali u činki na celovitost in delovanje semena. Podobno je 
lahko pri samicah zaradi znanih u činkov preskusne kemikalije na pojatveni 
cikel in s tem na spolno dojemljivost utemeljena uporaba druga čnih scena ­
rijev izpostavljenosti pred parjenjem. V posebnih primerih je lahko sprejem ­
ljivo, da se tretiranje starševskih (P) samic pri čne šele po brisu, pozitivnem 
na seme (glej Smernico OECD št. 151 (40)). 
28. Po pri četku obdobja odmerjanja pred parjenjem je treba živali s preskusno 
kemikalijo tretirati neprekinjeno 7 dni na teden do obdukcije. Vse živali dobivajo odmerke po enaki metodi. Odmerjanje naj se nadaljuje med dvote ­
denskim obdobjem parjenja in pri starševskih (P) samicah med brejostjo in 
laktacijo do dneva usmrtitve po odstavitvi. Samce je treba tretirati enako do usmrtitve ob odstavitvi živali F
 1 . Pri obdukciji je treba dati prednost sami ­
cam, na katerih je treba opraviti obdukcijo na isti/podoben dan laktacije. 
Obdukcija samcev lahko poteka ve č dni, odvisno od zmogljivosti laborato ­
rija. Če se neposredno odmerjanje ni pri čelo že med dojenjem, se mora 
neposredno odmerjanje samcem in samicam F  1 pričeti ob odstavitvi in 
nadaljevati do na črtovane obdukcije, odvisno od kohorte. 
29. Pri kemikalijah, ki se dajejo s hrano ali pitno vodo, je nujno zagotoviti, da 
količine uporabljene preskusne kemikalije ne vplivajo na obi čajno raven 
vnosa hrane ali porabe vode. Kadar se preskusna kemikalija daje s hrano, se lahko uporabi konstantna koncentracija v hrani (ppm) ali pa konstantna velikost odmerka glede na telesno težo živali; uporabljeno metodo je treba 
določiti. 
30. Pri kemikalijah, ki se dajejo z gavažo, naj koli čina enega danega odmerka 
tekočine običajno ne bi presegla 1 ml/100 g telesne teže (0,4 ml/100 g 
telesne teže je najve čja dovoljena koli čina za olje, npr. koruzno olje). 
Razen pri draže čih ali jedkih kemikalijah, ki pri višjih koncentracijah 
navadno povzro čajo močnejše učinke, je treba variabilnost preskusne koli ­ 
čine s prilagajanjem koncentracije obdržati na kar najnižji ravni, da bi 
zagotovili konstantno koli čino pri vseh odmerkih. Odmerek je treba dati 
vsak dan približno ob istem času. Odmerek za posamezno žival je navadno 
izbran na podlagi nazadnje dolo čene telesne teže živali, prilagodi pa se ga 
vsaj enkrat tedensko za odrasle samce in odrasle nebreje samice ter vsaka dva dni za breje samice in živali F
 1 pred odstavitvijo in dva tedna po 
odstavitvi. Če podatki o toksikokinetiki kažejo na prenos preskusne kemi ­
kalije prek posteljice v majhnih koli činah, bo morda treba v zadnjem tednu 
brejosti prilagoditi odmerek z gavažo, da mati ne bi prejela preve č strupe­
nega odmerka. Na dan kotitve se samice ne smejo tretirati z gavažo ali na kakšen drugi na čin odmerjanja, pri katerem je treba ravnati z živaljo; bolje 
je, da samice na ta dan ne prejmejo preskusne kemikalije, kot da se zmoti 
postopek kotitve.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 867
 
Parjenje  
31. Vsaka starševska (P) samica se namesti skupaj z naklju čno izbranim, nepo ­
vezanim samcem, ki prejema enako velikost odmerka (parjenje 1:1), dokler 
ne pride do kopulacije ali dokler ne mineta 2 tedna. Če ni dovolj samcev, 
na primer zaradi pogina samcev pred parjenjem, se lahko samci, ki so se že parili, sparijo (1:1) z drugimi samicami, tako da so vse samice sparjene. 
Dan 0 brejosti je opredeljen kot dan, na katerega so potrjeni dokazi o 
parjenju (je opažen vaginalni čep ali seme). Živali je treba lo čiti takoj, ko 
so najdeni dokazi o kopulaciji. Če po dveh tednih ni prišlo do parjenja, je 
treba živali lo čiti brez nadaljnje priložnosti za parjenje. Sparjeni pari morajo 
biti jasno ozna čeni v podatkih.
 
Velikost legla  
32. Četrti dan po skotitvi se lahko velikost vsakega legla prilagodi z naklju čno 
izločitvijo odve čnih mladi čev, da bi se dobilo, če je to mogo če, pet samcev 
in pet samic na leglo. Selektivna izlo čitev mladi čev, npr. na podlagi telesne 
teže, ni primerna. Kadar zaradi števila mladih samcev in samic ni mogo če, 
da bi jih bilo v vsakem zarodu po pet na spol, je sprejemljiva tudi delna 
prilagoditev (na primer, šest samcev in štiri samice).  
Izbor mladi čev za študije po odstavitvi (glej sliko 1)  
33. Ob odstavitvi (okrog 21. poporodnega dne) se iz vseh razpoložljivih legel 
do 20 mladi čev na vsako skupino odmerka in kontrolno skupino izbere za 
nadaljnje preiskave in vzdržuje do spolne zrelosti (razen če je preskušanje 
potrebno prej). Mladi či se izberejo naklju čno, vključiti pa se ne smejo o čitni 
spački (živali s telesno težo, ki je ve č kot dva standardna odklona manjša 
od povpre čne telesne teže mladi čev iz zadevnega legla), saj najverjetneje ne 
bodo reprezentativni za tretirano skupino. 
21. poporodni dan so izbrani mladi či F 1 naključno razporejeni v eno od treh 
kohort živali, kot sledi: 
Kohorta 1 (1A in 1B) = Preskušanje strupenosti za razmnoževanje/razvoj Kohorta 2 (2A in 2B) = Preskušanje razvojne nevrotoksi čnosti 
Kohorta 3 = Preskušanje razvojne imunotoksi čnosti 
Kohorta 1A: En samec in ena samica/leglo/skupino (20/spol/skupino): 
prednostni izbor za prvotno oceno u činkov na razmnoževalne sisteme in 
učinkov splošne strupenosti. 
Kohorta 1B: En samec in ena samica/leglo/skupino (20/spol/skupino): 
prednostni izbor za nadaljnjo oceno sposobnosti razmnoževanja s parjenjem 
živali F
 1 , ko se ocenjuje (glej Smernico OECD št. 117 (39)), in za prido ­
bivanje dodatnih histopatoloških podatkov v primeru domnevno strupenih snovi za razmnoževanje ali domnevnih povzro čiteljev endokrinih motenj 
oziroma v primeru, ko so rezultati iz kohorte 1A dvoumni. 
Kohorta 2A: skupno 20 mladi čev na skupino (10 samcev in 10 samic na 
skupino; en samec ali ena samica na leglo), dodeljenih za preskušanje za 
nevrološko-vedenjske motnje, ki mu sledi nevrohistopatološka ocena kot odraslih. 
Kohorta 2B: skupno 20 mladi čev na skupino (10 samcev in 10 samic na 
skupino; en samec ali ena samica na leglo), dodeljenih za nevrohistopato ­
loško oceno ob odstavitvi (21. ali 22. poporodni dan). Če živali ni dovolj, je 
treba dati prednost dodelitvi živali kohorti 2A.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 868
 
Kohorta 3: skupno 20 mladi čev na skupino (10 samcev in 10 samic na 
skupino; en na leglo, če je mogo če). Morda bodo potrebni dodatni mladi či 
iz kontrolne skupine, ki bodo živali pozitivne kontrole v preskusu protite ­
lesnega odziva na osnovi T-celic (TDAR) na 56. poporodni dan ± 3 dnevi. 
34. Če v leglu ni dovolj mladi čev za vse kohorte, ima prednost kohorta 1, saj jo 
je mogoče razširiti na produkcijo generacije F  2 . V primeru posebnih okoli ­ 
ščin, npr. če je kemikalija domnevno strupena za živ čevje, imunski sistem 
ali razmnoževanje, se lahko kateri koli kohorti dodelijo dodatni mladi či. Ti 
mladiči se lahko uporabijo za preiskave ob razli čnih časovnih to čkah ali za 
ocenjevanje dodatnih kon čnih točk. Na mladi čih, ki niso dodeljeni v 
kohorte, se bodo opravile klini čne biokemijske preiskave (odstavek 55) in 
opravljena bo makroskopska obdukcija (odstavek 68).  
Drugo parjenje starševskih (P) živali  
35. Za starševske (P) živali drugo parjenje obi čajno ni priporo čeno, saj se zaradi 
tega izgubijo pomembne informacije o številu vgnezditev (in s tem podatki o izgubah po vgnezditvi in ob kotitvi) za prvo leglo. Potreba po preverjanju ali pojasnjevanju u činka pri izpostavljenih samicah bi bila bolje izpolnjena z 
razširitvijo študije na parjenje generacije F
 1 . Vendar pa drugo parjenje 
starševskih (P) samcev z netretiranimi samicami vedno predstavlja možnost, da se razjasnijo dvoumni rezultati ali nadalje opredelijo u činki na plodnost, 
ugotovljeni pri prvem parjenju.
 
OPAZOVANJA ŽIVIH ŽIVALI  
Klinična opazovanja  
36. Pri starševskih (P) živalih in izbranih živalih F  1 se splošno klini čno opazo ­
vanje opravi enkrat dnevno. V primeru odmerjanja z gavažo je treba 
klinična opazovanja izvesti pred odmerjanjem in po njem (za morebitne 
znake strupenosti, povezane z najvišjo koncentracijo plazme). Zabeležijo se bistvene vedenjske spremembe, znaki težke ali podaljšane kotitve in 
vsi znaki strupenosti. Dvakrat dnevno, ob koncu tedna pa enkrat dnevno, 
je treba vse živali opazovati za ugotavljanje hude strupenosti, obolevnosti in smrtnosti. 
37. Poleg tega se podrobnejši pregled vseh starševskih (P) živali in živali F
 1 (po 
odstavitvi) izvede enkrat tedensko in se lahko primerno opravi takrat, ko se žival tehta, zaradi česar se zmanjša stres ob ravnanju z njo. Opazovanja je 
treba skrbno izvajati in beležiti z uporabo sistemov ocenjevanja, ki jih 
določi preskuševalni laboratorij. Prizadevati si je treba, da so variacije v 
preskusnih pogojih čim manjše. Pozornost je med drugim treba posvetiti 
vsem spremembam na koži, dlaki, o čeh in sluznicah, pojavu sekrecije in 
ekskrecije ter delovanju avtonomnega živ čevja (npr. solzenje, piloerekcija, 
velikost zenic, nenormalen vzorec dihanja). Prav tako je treba zabeležiti spremembe vedenja, drže in odzivanja na ravnanje, pa tudi navzo čnost 
kloničnih ali toni čnih gibov, stereotipije (npr. čezmerno čiščenje, nenehno 
vrtenje v krogih) ali nenormalnega vedenja (npr. samopohaba, zadenjska 
hoja).
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 869
 
Telesna teža in poraba hrane/vode  
38. Starševske (P) živali se stehtajo prvi dan dajanja odmerkov in potem 
najmanj enkrat tedensko. Poleg tega se starševske (P) samice med laktacijo 
tehtajo na iste dneve, kot poteka tehtanje mladi čev iz njihovega zaroda (glej 
odstavek 44). Vse živali F  1 se stehtajo posami čno ob odstavitvi (21. popo ­
rodni dan) in potem najmanj enkrat tedensko. Telesna teža se zabeleži tudi 
na dan nastopa pubertete (kon čano ločevanje prepucija ali pojav odprtja 
nožnice). Vse živali se stehtajo ob usmrtitvi. 
39. Med študijo se poraba hrane in vode (v primeru dajanja preskusne kemi ­
kalije z vodo) beleži vsaj enkrat tedensko na iste dneve kot telesna teža 
živali (razen med obdobjem sobivanja). Poraba hrane vsake kletke živali F  1 
se beleži tedensko, za čne pa se z dodelitvijo zadevni kohorti.  
Pojatveni cikli  
40. Predhodne informacije o u činkih na pojatveni cikel, povezanih s preskusno 
kemikalijo, so morda na voljo že iz prejšnjih študij strupenosti s ponavlja ­
jočim se odmerkom in se lahko uporabijo pri na črtovanju protokola za 
določeno preskusno kemikalijo za razširjeno enogeneracijsko študijo stru ­
penosti za razmnoževanje. Obi čajno se ocenjevanje pojatvene cikli čnosti (s 
citologijo nožnice) za čne hkrati s tretiranjem in nadaljuje do potrditve o 
parjenju ali konca dvotedenskega obdobja parjenja. Če so bili pri samicah 
opravljeni presejalni preskusi glede normalnosti pojatvenih ciklov pred treti ­
ranjem, je nadaljevanje jemanja brisa nožnice koristno tudi po za četku 
tretiranja; če pa obstajajo pomisleki glede splošnih u činkov ob za četku 
tretiranja (na primer izrazito zmanjšana poraba hrane na za četku), se 
lahko živalim omogo či največ dvotedensko obdobje prilagajanja na treti ­
ranje pred za četkom dvotedenskega obdobja jemanja brisov, ki mu sledi 
parjenje. Če se s tem obdobje tretiranja samic podaljša (tj. na štiritedensko 
tretiranje pred parjenjem), bi bilo morda treba nabaviti mlajše živali in 
podaljšati obdobje tretiranja samcev pred parjenjem. Med jemanjem celic nožnice/materni čnega vratu je treba paziti, da ne pride do poškodb sluznice 
in posledi čno do namišljene brejosti (10) (11). 
41. Za vse samice F
 1 v kohorti 1A je brise nožnice treba pregledovati dnevno, 
po pojavu odprtja nožnice do prvega brisa s poroženelimi celicami, da bi določili časovni interval med tema dvema dogodkoma. Pojatvene cikle vseh 
samic F
 1 v kohorti 1A je prav tako treba spremljati dva tedna, s pri četkom 
okoli 75. poporodnega dne. Če bo potrebno parjenje generacije F  1, je treba 
citologijo nožnice v kohorti 1B spremljati od časa parjenja do odkritja 
dokazov o parjenju.  
Parjenje in brejost  
42. Poleg standardnih kon čnih točk (npr. telesna teža, poraba hrane, klini čna 
opazovanja vklju čno s preverjanjem smrtnosti/obolevnosti) je treba zabele ­ 
žiti datume parjenja, datum oploditve in datum kotitve ter izra čunati pred ­
koitalni interval (od parjenja do oploditve) in trajanje brejosti (od oploditve do kotitve). V času pričakovane kotitve je treba starševske (P) samice 
skrbno pregledati za morebitne znake distocije. Morebitne nepravilnosti 
pri gnezdenju ali dojenju je treba zabeležiti.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 870
 
43. Dan kotitve je dan laktacije 0 za mater in poporodni dan 0 za potomce. 
Namesto tega lahko vse primerjave temeljijo tudi na postkoitalnem obdobju, 
da ne bi prišlo do zamenjave podatkov o poporodnem razvoju zaradi razlik v času trajanja brejosti; treba pa je zabeležiti tudi čas kotitve. To je 
pomembno zlasti, kadar preskusna kemikalija vpliva na trajanje brejosti.
 
Parametri pri potomcih  
44. Vsak zarod je treba prou čiti čim prej po skotitvi (poporodni dan 0 ali 1. 
poporodni dan) ter ugotoviti število in spol mladi čev, število mrtvorojenih 
in živorojenih živali ter navzo čnost večjih nepravilnosti (navzven vidne 
nepravilnosti, vklju čno z razcepljenim nebom, podkožne krvavitve, neobi ­ 
čajna barva ali struktura kože, prisotnost popkovine, pomanjkanje mleka v 
želodcu, prisotnost suhih izlo čkov). Poleg tega mora biti v okviru prve 
klinične preiskave novorojenih živali opravljena kvalitativna ocena telesne 
temperature, aktivnosti in odzivanja na ravnanje. Mladi če, ki so najdeni 
mrtvi na poporodni dan 0 ali pozneje, je treba prou čiti glede možnih 
okvar in vzroka smrti. Žive mladi če je treba prešteti in posami čno stehtati 
na poporodni dan 0 ali 1. poporodni dan ter redno tehtati pozneje, npr. vsaj 
na 4., 7., 14. in 21. poporodni dan. Primerno starosti živali je treba klini čne 
preglede ponoviti ob tehtanju potomcev oziroma pogosteje, če so bile ob 
kotitvi podane ugotovitve v zvezi s posameznimi primeri. Opaženi znaki 
lahko vklju čujejo, niso pa omejeni na zunanje nepravilnosti, spremembe na 
koži, dlaki, o čeh in sluznicah, pojav sekrecije in ekskrecije ter delovanje 
avtonomnega živ čevja. Prav tako je treba zabeležiti spremembe vedenja, 
drže in odzivanja na ravnanje, pa tudi pojav kloni čnih ali toni čnih gibov, 
stereotipije ali nenormalnega vedenja. 
45. Zadnji čno-genitalno razdaljo vsakega mladi ča je treba izmeriti vsaj enkrat 
med poporodnim dnem 0 in 4. poporodnim dnem. Podatke o telesni teži mladičev je treba zbrati na dan, ko se meri zadnji čno-genitalna razdalja, 
slednjo pa je treba normirati na mero velikosti mladi ča, po možnosti kubi čni 
koren telesne teže (12). Mladi če moškega spola je treba za prisotnost 
bradavic in bradavi čnih kolobarjev pregledati na 12. ali 13. poporodni dan. 
46. Vsi izbrani mladi či F
 1 se dnevno pregledajo za lo čitev prepucija od glavice 
penisa pri samcih oziroma pojav odprtja nožnice pri samicah, in sicer pred pričakovanim dnem teh kon čnih točk, da se ugotovi, ali do spolne zrelosti 
prihaja zgodaj. Morebitne nepravilnosti genitalnih organov, kot so trajni 
vaginalni filament, hipospadija ali razcepljen penis, je treba zabeležiti. 
Spolna zrelost živali F
 1 se primerja s fizi čnim razvojem z dolo čitvijo 
starosti in telesne teže ob lo čitvi prepucija od glavice spolnega uda pri 
samcih oziroma pojavu vaginalne odprtine pri samicah (13).  
Ocena morebitne razvojne nevrotoksi čnosti (kohorti 2A in 2B)  
47. Za oceno nevrotoksi čnosti je treba uporabiti deset samcev in deset samic 
kohorte 2A ter deset samcev in deset samic kohorte 2B (za vsako kohorto: 
1 samec ali 1 samica na leglo; iz vsakega legla je naklju čno izbran vsaj 1 
mladič). Pri vsaki živali kohorte 2A se opravi ocena slušnega dražljaja, 
sklop funkcionalnih opazovanj, ocena motori čne aktivnosti (glej odstavke 
48–50) in nevropatološka ocena (glej odstavka 74–75). Prizadevati si je 
treba, da so variacije pri vseh preskusnih pogojih čim manjše in niso siste ­
matično povezane s tretiranjem. Med spremenljivkami, ki lahko vplivajo na  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 871
 
vedenje, so jakost zvoka (npr. ob časni hrup), temperatura, vlaga, osvetlitev, 
vonji, čas dneva in motnje iz okolja. Rezultate preskusov nevrotoksi čnosti 
je treba razlagati v povezavi z ustreznimi referen čnimi razponi preteklih 
kontrol. Živali kohorte 2B je treba uporabiti za nevropatološko oceno 21. ali 22. poporodni dan (glej odstavka 74–75). 
48. Preskus slušnega dražljaja se opravi 24. poporodni dan (± 1 dan) z živalmi 
v kohorti 2A. Izvajanje preskušanja na dan preskušanja mora biti uravno ­
teženo po tretiranih in kontrolnih skupinah. Vsako preskušanje je sesta ­
vljeno iz 50 preskusov. Pri izvajanju preskusa slušnih dražljajev je treba določiti srednjo amplitudo odziva pri vsakem sklopu po 10 preskusov (5 
sklopov po 10 preskusov), pri čemer morajo biti preskusni pogoji optimi ­
zirani za habituacijo znotraj preskušanja. Ti postopki morajo biti v skladu s preskusno metodo B.53 (35). 
49. Ob primernem času med 63. in 75. poporodnim dnem se pri živalih iz 
kohorte 2A opravi sklop funkcionalnih opazovanj in avtomatizirani preskus 
motorične aktivnosti. Ti postopki morajo biti v skladu s preskusnima meto ­
dama B.43 (33) in B.53 (35). Sklop funkcionalnih opazovanj vklju čuje 
temeljit opis videza, vedenja in funkcionalne neokrnjenosti subjekta. To se oceni z opazovanjem v doma či kletki, po prenosu na standardno mesto 
(na terenu), kjer se žival prosto giblje, in z gibalnimi preskusi. Preskušanje 
naj se izvaja od najmanj do najbolj interaktivnega. Seznam meril je naveden v Dodatku 1. Vse živali morajo skrbno opazovati usposobljeni opazovalci, ki niso seznanjeni s tretiranjem živali, in sicer po standardiziranih postop ­
kih, s katerimi se zmanjša variabilnost opazovalca. Če je to mogo če, naj 
živali v zadevnem preskusu vrednoti isti opazovalec. Če to ni mogo če, je 
potreben dokaz o enaki zanesljivosti opazovalcev. Za vsak parameter v sklopu vedenjskega preskušanja je treba uporabiti izrecne operativno opre ­
deljene lestvice in merila za to čkovanje. Če je mogo če, je treba razviti 
objektivna kvantitativna merila za opazovane kon čne točke, ki vklju čujejo 
subjektivno razvrš čanje. Za motori čno aktivnost se vsaka žival preskuša 
posamično. Preskušanje mora biti dovolj dolgo, da se za kontrolne vzorce 
dokaže habituacija znotraj preskušanja. Motori čno aktivnost je treba sprem ­
ljati z avtomatizirano napravo za beleženje aktivnosti, ki lahko odkrije tako zmanjšanje kot tudi pove čanje aktivnosti, (tj. osnovna aktivnost, kot jo 
izmeri naprava, ne sme biti tako nizka, da ni mogo če zaznati zmanjšanja, 
in ne tako visoka, da ni mogo če zaznati pove čanja aktivnosti). Vsako 
napravo je treba preskusiti s standardnimi postopki, da je zagotovljeno čim bolj zanesljivo delovanje naprav vse dni. Preskušanje tretiranih skupin 
mora biti v najve čji možni meri uravnoteženo med napravami. Tretirane 
skupine morajo biti uravnoteženo razporejene po časih preskušanja, da se 
prepre
či zavajajo či učinek cirkadianega ritma aktivnosti. 
50. Če so v skladu z obstoje čimi informacijami potrebni drugi funkcionalni 
preskusi (npr. senzori čni, socialni, kognitivni), jih je treba vklju čiti, ne da 
bi bila pri tem ogrožena celovitost drugih vrednotenj v okviru študije. Če se 
ti preskusi izvajajo na istih živalih kot standardno preskušanje slušnega 
dražljaja, sklop funkcionalnih opazovanj in preskušanje motori čne aktivno ­
sti, je treba pripraviti časovni razpored razli čnih preskusov, da bi bila celo ­
vitost teh preskusov čim manj ogrožena. Dopolnilni postopki so lahko 
posebno koristni, kadar empiri čna opazovanja, pri čakovani u činki ali meha ­
nizem/način delovanja kažejo posebno vrsto nevrotoksi čnosti.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 872
 
Ocena morebitne razvojne nevrotoksi čnosti (kohorta 3)  
51. Na 56. poporodni dan (± 3 dni) je treba 10 samcev in 10 samic iz kohorte 3 
iz vsake tretirane skupine (1 samec ali 1 samica na leglo; iz vsakega legla je 
naključno izbran vsaj 1 mladi č) uporabiti v preskusu protitelesnega odziva 
na osnovi T-celic (TDAR), tj. primarni odziv protitelesa razreda IgM na antigen na osnovi T-celic, kot so SRBC (ov čje rdeče krvničke) ali KLH 
(hemocianin iz morskega polža), v skladu z veljavnimi postopki preskušanja 
imunotoksi čnosti (14) (15). Odziv je mogo če ovrednotiti s štetjem celic, ki 
delajo plake (celice PFC), v vranici, ali dolo čanjem titra protitelesa IgM, 
značilnega za SRBC ali KLH, v serumu s preskusom ELISA ob vrhuncu 
odziva. Vrhunec odziva je obi čajno štiri (odziv celic PFC) ali pet (preskus 
ELISA) dni po intravenozni imunizaciji. Če se primarni odziv protiteles 
preskuša s štetjem celic, ki delajo plake, ni treba vseh podskupin živali vrednotiti na isti dan, pod pogojem, da: so imunizacija in usmrtitev 
podskupin na črtovani tako, da se celice PFC prešteje ob vrhuncu odziva; 
je v podskupinah enako število potomcev moškega in ženskega spola iz vseh skupin z odmerkom, vklju čno s kontrolnimi skupinami; in so podsku ­
pine vrednotene približno ob isti poporodni starosti. Izpostavljenost 
preskusni kemikaliji se nadaljuje do dneva pred odvzemom vranic za 
preskus odziva celic PFC ali seruma za preskus ELISA.
 
Nadaljnja ocena morebitne strupenosti za razmnoževanje (kohorta 1B)  
52. Živali iz kohorte 1B se lahko po potrebi tretirajo še po 90. poporodnem 
dnevu in parijo za produkcijo generacije F  2 . Samce in samice iz iste skupine 
z odmerkom je treba namestiti skupaj (pri tem se je treba izogibati parjenju 
med sorojenci) do najve č dva tedna, ki se za čneta na 90. poporodni dan ali 
pozneje, vendar ne pozneje od 120. poporodnega dne. Postopki morajo biti podobni kot pri starševskih (P) živalih. Glede na tehtnost dokazov pa se 
legla morda lahko usmrtijo na 4. poporodni dan, namesto da bi se jih 
spremljalo do odstavitve ali še dlje.
 
OPAZOVANJA OB USMRTITVI  
Klinična biokemija/hematologija  
53. Pri starševskih (P) živalih je treba spremljati sistemske u činke. Ob usmrtitvi 
se desetim naklju čno izbranim starševskim (P) samcem in samicam na 
skupino z odmerkom, ki so se postili, vzamejo vzorci krvi z dolo čenega 
mesta, ki se nato shranijo pod ustreznimi pogoji in na katerih se opravijo delne ali popolne hematološke preiskave, klini čne biokemijske preiskave, 
preskusa za T4 in TSH ali drugi pregledi na podlagi profila znanih u činkov 
preskusne kemikalije (glej Smernico OECD št. 151 (40)). Pregledati je treba 
naslednje hematološke parametre: hematokrit, koncentracijo hemoglobina, število eritrocitov, skupno število levkocitov in diferencialno sliko levkoci ­
tov, število trombocitov in čas/potencial koagulacije krvi. Preiskave plazme 
ali seruma morajo vklju čevati: glukozo, skupni holesterol, se čnino, kreati ­
nin, skupne beljakovine, albumin in najmanj dva encima, ki sta kazalnika hepatoceli čnih učinkov (kot so alanin-aminotransferaza, aspartat-aminotrans ­
feraza, alkalna fosfataza, gamaglutamil transpeptidaza in sorbitol dehidro ­
genaza). Meritve dodatnih encimov in žol čnih kislin lahko v časih dajo kori ­
stne informacije. Poleg tega se lahko vsem živalim tudi odvzame kri in se
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 873
 
shrani za morebitno poznejšo analizo, da se razjasnijo dvoumni u činki ali 
zberejo podatki o notranji izpostavljenosti. Če drugo parjenje starševskih (P) 
živali ni na črtovano, se vzorci krvi zberejo tik pred postopkom ob na črto­
vani usmrtitvi ali v sklopu le-tega. Če se živali ne usmrtijo, se vzorce krvi 
odvzame nekaj dni pred drugim parjenjem živali. Razen če je na podlagi 
obstoječih podatkov iz študij s ponavljajo čim se odmerkom razvidno, da 
preskusna kemikalija ne vpliva na parameter, je treba pred usmrtitvijo opraviti analizo urina in ovrednotiti naslednje parametre: videz, koli čino, 
osmolalnost ali specifi čno težo, pH, beljakovine, glukozo, kri in krvne 
celice ter celi čni drobir. Odvzame se lahko tudi urin za spremljanje ekskre ­
cije preskusne kemikalije in/ali metabolitov. 
54. Pri živalih F
 1 je treba spremljati tudi sistemske u činke. Ob usmrtitvi se 
desetim naklju čno izbranim samcem in samicam iz kohorte 1A na skupino 
z odmerkom, ki so se postili, vzamejo vzorci krvi z dolo čenega mesta, ki se 
nato shranijo pod ustreznimi pogoji in na katerih se opravijo standardne klinične biokemijske preiskave, vklju čno z oceno serumske koncentracije 
hormonov š čitnice (T4 in TSH), hematološke preiskave (skupno število in 
diferencialna slika levkocitov ter število eritrocitov) in analiza urina. 
55. Na 4. poporodni dan se odve čne mladiče makroskopsko obducira in upošte ­
vajo se meritve serumske koncentracije hormona š čitnice (T4). Po potrebi se 
zarodu odvzame kri novorojenih mladi čev (4. poporodni dan) za bioke ­
mično analizo/analizo hormonov š čitnice. Za analizo T4 in TSH se kri 
odvzame tudi odstavljenim mladi čem, ki se jih makroskopsko obducira na 
22. poporodni dan (mladi či F
 1 , ki niso izbrani za kohorte).  
Parametri semena  
56. Parametre semena se meri pri vseh samcih generacije P, razen če obstajajo 
podatki, ki dokazujejo, da so v 90-dnevni študiji parametri semena nespre ­
menjeni. Pregled parametrov semena se opravi pri vseh samcih iz kohorte 1A. 
57. Ob usmrtitvi se pri vseh starševskih (P) samcih in samcih F
 1 (kohorta 1A) 
zabeleži teža moda in obmodka. Vsaj eno modo in en obmodek se shrani za histopatološki pregled. Drugi obmodek se uporabi za štetje zalog semena v 
repu obmodka (16) (17). Poleg tega se odvzame seme iz repov obmodkov 
(ali semenovodov) z metodami, pri katerih so poškodbe za ovrednotenje gibljivosti in morfologije semena kar najmanjše (18). 
58. Gibljivost semena je treba ovrednotiti takoj po usmrtitvi ali zabeležiti za 
poznejšo analizo. Odstotek progresivno gibljivega semena je treba subje ­
ktivno ali objektivno dolo čiti z analizo gibanja s pomo čjo računalnika (19) 
(20) (21) (22) (23) (24). Za morfološko ovrednotenje semena je treba vzorce semena iz obmodka (ali semenovoda) prou čiti kot fiksirane ali mokre prepa ­
rate (25) in najmanj 200 semen čic na vzorec razvrstiti kot normalne (glavica 
in srednji del/repek so videti normalno) ali nenormalne. Primeri morfoloških anomalij semena vklju čujejo spojitev, lo čene glavice ter glavice in/ali repke 
nepravilnih oblik (26). Glavice nepravilne oblike ali velike glavice lahko 
kažejo na okvare pri sprostitvi spermatidov v obmodek. 
59. Če se ob obdukciji zamrznejo vzorci semena, fiksirajo brisi in posnamejo 
posnetki za analizo gibljivosti semena (27), se lahko naknadno analizirajo le samci iz kontrolne skupine in skupin z velikim odmerkom. Če so opazni 
učinki, povezani s tretiranjem, je treba ovrednotiti tudi skupine z manjšim 
odmerkom.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 874
 
Makroskopska obdukcija  
60. Ob usmrtitvi ali prezgodnji smrti se vse starševske (P) živali in živali F  1 
makroskopsko obducirajo in makroskopsko pregledajo za odkrivanje 
kakršnih koli strukturnih anomalij ali patoloških sprememb. Posebno pozor ­
nost je treba posvetiti organom razmnoževalnega sistema. Mladi če, ki so 
humano usmr čeni med poginjanjem, in mrtve mladi če je treba zabeležiti in, 
če se ne macerirajo, prou čiti glede možnih okvar in/ali vzroka smrti ter 
konzervirati. 
61. Pri odraslih starševskih (P) samicah in samicah F  1 se na dan obdukcije 
pregleda bris nožnice, da se ugotovi faza pojatvenega cikla in omogo či 
korelacija s histopatološkimi preiskavami razmnoževalnih organov. Mater ­
nice vseh starševskih (P) samic (in po potrebi samic F  1 ) se pregledajo glede 
navzočnosti in števila vgnezditev na na čin, ki nima negativnega vpliva na 
histopatološko ovrednotenje.  
Teža organov in shranjevanje tkiv – odrasle starševske (P) živali in 
odrasle živali F  1 
62. Po usmrtitvi se čim prej po seciranju, da ne pride do izsušitve, dolo čita 
telesna teža in mokra teža v nadaljevanju navedenih organov vseh 
starševskih (P) živali in odraslih živali F  1 iz zadevnih kohort (kakor je 
navedeno v nadaljevanju). Ti organi se nato shranijo pod ustreznimi pogoji. Če ni navedeno druga če, se lahko parni organi stehtajo posami čno ali 
skupaj, v skladu z obi čajno prakso zadevnega laboratorija. 
— Maternica (z jajcevodoma in materni čnim vratom), jaj čniki. 
— Moda, obmodki (v celoti in repi za vzorce za štetje semena). 
— Prostata (dorzolateralni in ventralni del skupaj). Pri odstranitvi sklopa 
prostate je treba paziti, da se ne predreta semenska meši čka, ki sta polna 
tekočine. V primeru u činka na skupno težo prostate, povezanega s 
tretiranjem, je treba po fiksaciji previdno secirati dorzolateralni in ventralni segment in ju lo čeno stehtati. 
— Semenska meši čka s koagulacijskimi žlezami in njihovimi teko činami 
(kot ena enota). 
— Možgani, jetra, ledvice, srce, vranica, priželjc, hipofiza, š čitnica (po 
fiksaciji), nadledvi čni žlezi in znani tar čni organi ali tkiva. 
63. Poleg navedenih organov je treba pod ustreznimi pogoji shraniti vzorce 
perifernega živca, mišice, hrbtenja če, očesa z vidnim živcem, prebavnega 
trakta, sečnega mehurja, plju č, sapnika (s pritrjeno š čitnico in obš čitnicami), 
kostnega mozga, semenovoda (pri samcih), mle čnih žlez (pri samcih in 
samicah) in nožnice. 
64. Pri živalih kohorte 1A se vsi organi stehtajo in shranijo za histopatološke 
preiskave. 
65. Pri preiskavi pred- in poporodno povzro čenih imunotoksi čnih učinkov se 
pri 10 samcih in 10 samicah iz kohorte 1A iz vsake tretirane skupine (1 samec ali 1 samica na leglo; iz vsakega legla je naklju čno izbran vsaj 1 
mladič) ob usmrtitvi opravi naslednje: 
— tehtanje bezgavk, ki so blizu predela poti izpostavljenosti, in tistih, ki so 
od njega oddaljene (poleg tehtanja nadledvi čnih žlez, priželjca in 
vranice, ki je bilo pri vseh živalih iz kohorte 1A že opravljeno),
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 875
 
— analiza podskupin limfocitov v vranici (limfocitov T s površinskim 
označevalcem CD4+ in CD8+, limfocitov B in naravnih celic ubijalk) 
v eni polovici vranice, druga polovica se shrani za histopatološko ovrednotenje. 
Z analizo podskupin limfocitov v vranici pri neimuniziranih živalih (kohorta 
1A) se bo ugotovilo, ali je izpostavljenost povezana s spremembo imuno ­
loške razporeditve celic 'pomagalk' (CD4+), citotoksi čnih (CD8+) limfo ­
citov iz priželjca ali naravnih celic ubijalk (hiter odziv na neoplasti čne 
celice in patogene). 
66. Pri živalih iz kohorte 1B se stehtajo in do vklapljanja v blok obdelajo 
naslednji organi in tkiva: 
— nožnica (nestehtana), — maternica z materni čnim vratom, 
— jajčniki, 
— moda (vsaj eno), 
— obmodki, 
— semenski meši čki in koagulacijske žleze, 
— prostata, — hipofiza, — opredeljeni tar čni organi. 
Histopatološke preiskave pri kohorti 1B se izvedejo, če so rezultati iz 
kohorte 1A dvoumni, ali v primeru domnevnih strupenih snovi za razmno ­ 
ževanje ali domnevnih povzro čiteljev endokrinih motenj. 
67. Kohorti 2A in 2B: Preskušanje razvojne nevrotoksi čnosti (21. ali 22. popo ­
rodni dan in odrasli potomci). Živali iz kohorte 2A je treba po vedenjskem 
preskušanju usmrtiti, zabeležiti težo možganov in izvesti popolne nevrohi ­
stopatološke preiskave zaradi ocene nevrotoksi čnosti. Živali iz kohorte 2B 
se usmrtijo 21. ali 22. poporodni dan, zabeleži se teža možganov in izvede 
mikroskopski pregled možganov za oceno nevrotoksi čnosti. Fiksiranje s 
perfuzijo je zahtevano pri živalih iz kohorte 2A in neobvezno pri živalih iz kohorte 2B, kot to dolo ča preskusna metoda B.53 (35).
 
Teža organov in shranjevanje tkiv – odstavljeni mladi či F 1 
68. Mladi či, ki niso izbrani za kohorte, vklju čno s spački, so po odstavitvi, na 
22. poporodni dan, usmr čeni, razen če so na podlagi rezultatov potrebne 
nadaljnje preiskave živih živali. Na usmr čenih mladi čih se izvede makro ­
skopska obdukcija in ocenijo razmnoževalni organi, kakor je opisano v odstavkih 62 in 63. Pri najve č 10 mladi čih na spol na skupino iz čim 
več zarodov je treba stehtati možgane, vranico in priželjc ter jih shraniti 
pod ustreznimi pogoji. Poleg tega se lahko tkiva mle čnih žlez teh mladi čev 
moškega in ženskega spola shranijo za nadaljnjo mikroskopsko analizo (
 1 ) 
(glej Smernico OECD št. 151 (40)). Ve čje nepravilnosti in tar čna tkiva je 
treba shraniti za morebiten histološki pregled.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 876  
( 1 ) Raziskave so pokazale, da je mle čna žleza, zlasti v zgodnji fazi svojega razvoja, ob čut­
ljiva kon čna točka za estrogensko delovanje. Priporo ča se, da se pri validaciji v to 
metodo vklju čijo končne točke v zvezi z mle čnimi žlezami obeh spolov.
 Histopatologija – starševske (P) živali  
69. Popolni histopatološki pregled iz odstavkov 62 in 63 se opravi za vse 
starševske (P) živali iz skupin z velikim odmerkom in kontrolnih skupin. 
Organe, pri katerih so vidne spremembe zaradi tretiranja, je prav tako treba pregledati pri vseh živalih iz skupin z manjšimi odmerki za pomo č pri 
določanju NOAEL. Poleg tega se histopatološko ovrednotijo razmnoževalni 
organi vseh živali, za katere se domneva zmanjšana plodnost, npr. pri tistih, 
ki se niso mogli spariti, spo četi, zaploditi ali skotiti zdravih potomcev, ali 
pri katerih so bili prizadeti cikli čnost pojatev ali število, gibljivost ali 
morfologija semena, in vse makroskopske poškodbe.
 
Histopatologija – živali F  1 
Živali iz kohorte 1  
70. Popolni histopatološki pregled iz odstavkov 62 in 63 se opravi za vse 
odrasle živali iz skupin z velikim odmerkom in kontrolnih skupin iz kohorte 1A. Iz vsakega legla se uporabi vsaj 1 mladi č vsakega spola. Vse makro ­
skopske poškodbe ter organe in tkiva, pri katerih so vidne spremembe 
zaradi tretiranja, je treba pregledati tudi pri vseh živalih iz skupin z manj ­ 
šimi odmerki za pomo č pri dolo čanju NOAEL. Za vrednotenje pred- in 
poporodno povzro čenih učinkov na limfoidne organe je treba poleg histo ­
patološkega vrednotenja priželjca, vranice in nadledvi čnih žlez, ki se opravi 
pri vseh živalih iz kohorte 1A, pri 10 samcih in 10 samicah iz kohorte 1A 
opraviti tudi histopatološko vrednotenje na odvzetih bezgavkah in kostnem mozgu. 
71. Pri razmnoževalnih in endokrinih tkivih vseh živali iz kohorte 1B, obde ­
lanih do vklapljanja v blok v skladu z odstavkom 66, je treba v primeru domnevnih strupenih snovi za razmnoževanje ali domnevnih povzro čiteljev 
endokrinih motenj opraviti histopatološke preglede. Živali iz kohorte 1B se 
histološko pregledajo tudi v primeru, da so rezultati iz kohorte 1A dvoumni. 
72. Jajčniki odraslih samic bi morali vsebovati za četne in rasto če folikle, pa tudi 
rumena telesca; histopatološki pregled bi zato moral biti namenjen koli čin­
skemu vrednotenju za četnih in majhnih rasto čih foliklov ter rumenih telesc 
pri samicah F
 1 ; število živali, izbira rezine jaj čnika in velikost vzorca rezine 
morajo biti statisti čno ustrezni za uporabljeni postopek vrednotenja. Štetje 
foliklov se lahko najprej izvede na živalih iz kontrolnih skupin in skupin z 
velikim odmerkom, v primeru škodljivih u činkov pri slednjih pa je treba 
proučiti tudi nižje odmerke. Pregled mora vklju čevati štetje števila za četnih 
foliklov, ki se lahko kombinirajo z majhnimi rasto čimi folikli, za primerjavo 
tretiranih in kontrolnih jaj čnikov (glej Smernico OECD št. 151) (40)). 
Oceno rumenih telesc je treba izvesti vzporedno s preskušanjem cikli čnosti 
pojatev, tako da se lahko faza cikla upošteva pri vrednotenju. Preveriti je treba, ali so se jajcevod, maternica in nožnica ustrezno razvili. 
73. Pri samcih F
 1 se izvedejo podrobni histopatološki pregledi mod, da bi se 
ugotovili u činki na diferenciacijo in razvoj mod ter na spermatogenezo, 
povezani s tretiranjem (38). Če je mogo če, je treba pregledati rezine mrežja 
mod. Preveriti je treba, ali so se glava, telo in rep obmodkov in semenovod 
ustrezno razvili, pa tudi parametre za te organe, zahtevane za starševske (P) 
samce.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 877
 
Živali iz kohorte 2  
74. Za vse skupine z velikimi odmerki in kontrolne skupine živali iz kohorte 
2A se po kon čanem preskušanju za nevrološko-vedenjske motnje (po 75. 
poporodnem dnevu, vendar ne po 90. poporodnem dnevu) opravijo nevrohi ­
stopatološki pregledi pri obeh spolih. Histopatološki pregled možganov se 
pri vseh skupinah z velikimi odmerki in kontrolnih skupinah živali kohorte 2B pri obeh spolih opravi na 21. ali 22. poporodni dan. Organe ali tkiva, pri katerih so vidne spremembe zaradi tretiranja, je prav tako treba pregledati 
pri vseh živalih iz skupin z manjšimi odmerki za pomo č pri dolo čanju 
NOAEL. Pri živalih iz kohort 2A in 2B se pregleda ve č rezin možganov, 
pri čemer se pregledajo vohalni bulbus, možganska skorja, hipokampus, 
bazalni gangliji, talamus, hipotalamus, srednji možgani (tectum, tegmentum 
in možganski pedunkli), možgansko deblo in mali možgani. Samo pri živalih iz kohorte 2A se pregledajo o či (mrežnica in vidni živec) ter vzorci 
perifernega živca, mišice in hrbtenja če. Vsi nevrohistološki postopki morajo 
biti v skladu s preskusno metodo B.53 (35). 
75. Morfometri čna (kvantitativna) vrednotenja je treba opraviti na reprezenta ­
tivnih obmo čjih možganov (homolognih rezinah, skrbno izbranih na podlagi 
zanesljivih mikroskopskih znakov) in lahko vklju čujejo linearne in/ali povr ­ 
šinske meritve dolo čenih predelov možganov. Da bi se izbrala najbolj 
homologna in reprezentativna rezina za dolo čen predel možganov, ki se 
bo vrednotil, je treba vzeti vsaj tri zaporedne rezine pri vsakem znaku (ravni). Nevropatolog bi moral ustrezno presoditi, ali so rezine, pripravljene 
za meritev, homologne z drugimi v vzorcu in torej primerne za uporabo, ker 
se lahko zlasti linearne meritve spreminjajo na relativno kratki razdalji (28). Nehomologne rezine se ne smejo uporabiti. Cilj je vzor čenje vseh živali, ki 
so za to namenjene (10/spol/velikost odmerka), vendar lahko zadoš ča tudi 
manjše število živali. Vzorci, manjši od 6 živali/spol/velikost odmerka, na 
splošno ne zadoš čajo za namene te preskusne metode. S stereologijo se 
lahko opredelijo s tretiranjem povezani u činki na parametre, kot je koli čina 
ali število celic za dolo čene nevroanatomske predele. Vsi vidiki priprave 
vzorcev tkiva, od fiksacije tkiva do seciranja vzorcev tkiva, obdelave tkiva 
in barvanja preparatov, bi morali biti na črtovani uravnoteženo, tako da 
vsaka serija vsebuje reprezentativne vzorce vsake skupine z odmerkom. Pri uporabi morfometri čne ali stereološke analize je treba možgansko 
tkivo vstaviti v ustrezen medij pri vseh velikostih odmerka hkrati, da se 
ne bi pojavili artefakti zaradi skr čenja, povezani z dolgotrajno hrambo v 
fiksativu.
 
POROČANJE  
Podatki  
76. Podatki se sporo čajo posami čno in se povzamejo v obliki tabele. Kadar je 
to mogoče, se za vsako skupino in vsako generacijo sporo čijo naslednji 
podatki: število živali na za četku preskusa, število živali, najdenih poginulih 
ali usmrčenih iz humanih razlogov med preskusom, čas katere koli smrti ali 
humane usmrtitve, število plodnih živali, število brejih samic, število samic, ki so skotile zarod, in število živali, ki kažejo znake strupenosti. Sporo čiti je 
treba opis strupenosti, vklju čno s časom njenega za četka, trajanja in 
resnosti. 
77. Števil čni rezultati se morajo oceniti z ustrezno in sprejeto statisti čno 
metodo. Statisti čne metode je treba dolo čiti pri načrtovanju študije; ustrezno 
morajo obravnavati nenormalne podatke (npr. podatke štetja), okrnjene 
podatke (npr. omejen čas opazovanja), odvisnost (npr. u činki na zarod in 
ponovljeni ukrepi) in neenake variance. Posplošeni linearni mešani modeli
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 878
 
in modeli odziva na odmerek obsegajo obsežen sklop analiti čnih orodij, ki 
so morda primerni za podatke, pridobljene na podlagi te preskusne metode. 
Poročilo mora vklju čevati dovolj informacij o metodi analize in upora ­
bljenem ra čunalniškem programu, tako da lahko neodvisni ocenjevalec/stati ­
stik ovrednoti/ponovno ovrednoti analizo.  
Vrednotenje rezultatov  
78. Ugotovitve je treba ovrednotiti glede na opažene u činke, vklju čno z obduk ­
cijo in mikroskopskimi ugotovitvami. Vrednotenje vklju čuje razmerje ali 
odsotnost razmerja med odmerkom ter navzo čnostjo, pojavom in resnostjo 
anomalij, vklju čno z makroskopskimi poškodbami. Oceniti je treba tudi 
tarčne organe, plodnost, klini čne anomalije, zmogljivost razmnoževanja in 
produkcije zaroda, spremembe telesne teže, u činke na smrtnost ter druge 
strupene u činke in u činke na razvoj. Posebno pozornost je treba nameniti 
spremembam, omejenim na en spol. Pri vrednotenju rezultatov je treba 
upoštevati fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije in, če so na 
voljo, podatke o toksikokinetiki, vklju čno s prenosom prek posteljice in 
izločanjem mleka.  
Poročilo o preskusu  
79. Poro čilo o preskusu naj vsebuje naslednje informacije, pridobljene s to 
študijo s pomo čjo starševskih (P) živali, živali F  1 in živali F  2 (kot je 
ustrezno):  
Preskusna kemikalija:  
— vse zadevne razpoložljive informacije o kemikaliji, toksikokineti čnih in 
toksikodinami čnih lastnostih preskusne kemikalije, 
— identifikacijske podatke, — čistoto.
 
Nosilec (po potrebi):  
— utemeljitev izbire nosilca, če ta ni voda.  
Preskusne živali:  
— uporabljeno vrsto/sev, 
— število, starost in spol živali, 
— izvor, pogoje nastanitve, hrano, material za izdelavo gnezda itd., 
— težo posameznih živali na za četku preskusa, 
— podatke o vaginalnem brisu za starševske (P) samice pred pri četkom 
tretiranja ( če so bili podatki takrat zbrani), 
— evidenco parjenja starševske (P) generacije z navedbo samca in samice, 
ki sta se parila, in uspešnost parjenja, 
— evidenco o leglu izvora za odrasle živali generacije F  1 . 
Preskusni pogoji:  
— utemeljitev izbire velikosti odmerka, 
— podatke o sestavi preskusne kemikalije/pripravi hrane, doseženih 
koncentracijah,  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 879
 
— stabilnost in homogenost pripravka v nosilcu (npr. prehrani, pitni vodi), 
v krvi in/ali mleku pod pogoji uporabe in hrambe med uporabami, 
— podrobne podatke o dajanju preskusne kemikalije, 
— pretvorbo koncentracije preskusne kemikalije v hrani/pitni vodi (ppm) v 
dejanski odmerek (mg/kg telesne teže/dan), če je primerno, 
— podrobne podatke o kakovosti hrane in vode (vklju čno s podatki o 
sestavi prehrane, če so na voljo), 
— podroben opis postopkov randomizacije za izbiro mladi čev za izlo čitev 
in dodelitev mladi čev v preskusne skupine, 
— okoljske pogoje, 
— seznam osebja, ki je sodelovalo v študiji, vklju čno s strokovno 
usposobljenostjo.  
Rezultati (povzetek in posami čni podatki po spolu in odmerku):  
— porabo hrane in porabo vode, če je na voljo, izkoristek hrane (prirast 
telesne teže na gram zaužite hrane, razen za obdobje sobivanja in med laktacijo) in porabo preskusne kemikalije (za dajanje s hrano/pitno vodo) za starševske (P) živali in živali F
 1 , 
— podatke o absorpciji ( če so na voljo), 
— podatke o telesni teži za starševske (P) živali, 
— podatke o telesni teži za izbrane živali F  1 po odstavitvi, 
— čas smrti med študijo oziroma ali podatek o tem, da so živali preživele 
do zaklju čka, 
— vrsto, resnost in trajanje klini čnih opažanj (s podatki o reverzibilnosti), 
— podatke hematoloških preskusov, analize urina in podatke meritev na 
področju klinične kemije, vklju čno s TSH in T4, 
— fenotipsko analizo vrani čnih celic (celic T, B, NK), 
— celularnosti kostnega mozga, 
— podatke o odzivu na strupenost, — število starševskih (P) samic in samic F
 1 z normalnim ali nenormalnim 
pojatvenim ciklom in trajanje cikla, 
— čas do parjenja (predkoitalni interval, število dni med parjenjem in 
oploditvijo), 
— strupene ali druge u činke na razmnoževanje, vklju čno s številom in 
odstotkom živali, ki so se sparile, bile breje, so skotile in dosegle 
laktacijo, odstotkom samcev, ki so oplodili samico, in samic z znaki 
distocije/podaljšano ali zahtevno kotitvijo, 
— trajanje brejosti in, če so podatki na voljo, kotitve, 
— število vgnezditev, velikost zaroda in odstotek mladi čev moškega spola, 
— število in odstotek izgub po vgnezditvi, živorojenih in mrtvorojenih 
živali,  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 880
 
— podatke o teži zaroda in posameznih mladi čev (samcev, samic in obeh 
spolov), število spa čkov, če je ugotovljeno, 
— število mladi čev z večjimi vidnimi anomalijami, 
— strupene ali druge u činke na potomce, poporodno rast, sposobnost preži ­
vetja itd., 
— podatke o fizi čnih znakih pri mladi čih in druge podatke o poporodnem 
razvoju, 
— podatke o spolnem zorenju živali F  1 , 
— podatke o opazovanju funkcij pri mladi čih in odraslih, kot je primerno, 
— telesno težo ob usmrtitvi in podatke o absolutni in relativni teži organov 
za starševske (P) živali in odrasle živali F  1 , 
— ugotovitve obdukcije, 
— natančen opis vseh histopatoloških ugotovitev, 
— skupno število semena v repu obmodka, odstotek progresivno gibljivega 
semena, odstotek morfološko normalnega semena in odstotek semena z ugotovljeno posamezno anomalijo za starševske (P) samce in odrasle 
samce F
 1 , 
— število in faze zrelosti foliklov v jaj čnikih starševskih (P) samic in samic 
F 1, če je primerno, 
— število rumenih telesc v jaj čnikih samic F  1 , 
— statisti čno obdelavo rezultatov, če je to primerno.  
Parametri kohorte 2:  
— podroben opis postopkov za standardiziranje opažanj in postopkov ter 
operativne opredelitve za ocenjevanje opažanj, 
— seznam vseh uporabljenih preskusnih postopkov in utemeljitev njihove 
uporabe, 
— podrobnosti o uporabljenih vedenjskih/funkcionalnih, nevropatoloških in 
morfometri čnih postopkih, vklju čno z informacijami in podrobnostmi o 
avtomatiziranih napravah, 
— postopke za umerjanje in zagotavljanje enakovrednosti naprav ter urav ­
noteženje tretiranih skupin v preskusnih postopkih, 
— kratko utemeljitev, s katero se pojasnijo odlo čitve na podlagi strokovne 
presoje, 
— podrobnosti o vseh vedenjskih/funkcionalnih, nevropatoloških in morfo ­
metričnih ugotovitvah po spolu in skupini z odmerkom, vklju čno s 
povečanji in zmanjšanji iz kontrolnih skupin, 
— težo možganov, — morebitne diagnoze na podlagi nevroloških znakov in poškodb, 
vključno z naravnimi pojavi bolezni ali stanj, 
— slike vzor čnih ugotovitev, 
— slike majhne pove čave za ocenjevanje homologije rezin, uporabljenih za 
morfologijo,
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 881
 
— statisti čno obdelavo rezultatov, vklju čno s statisti čnimi modeli, upora ­
bljenimi za analizo podatkov, in rezultate, ne glede na to, ali so bili 
značilni ali ne, 
— odnos katerih koli drugih strupenih u činkov do sklepne ugotovitve o 
nevrotoksi čnem potencialu preskusne kemikalije, po spolu in skupini z 
odmerkom, 
— vpliv katerih koli informacij o toksikokinetiki na sklepne ugotovitve, 
— podatke, ki podpirajo zanesljivost in ob čutljivost preskusne metode (tj. 
podatke o pozitivni kontroli in pretekle kontrolne podatke), 
— odnose, če obstajajo, med nevropatološkimi in funkcionalnimi u činki, 
— NOAEL ali primerjalni odmerek za matere in potomce, po spolu in 
skupini z odmerkom, 
— razpravo o celotni razlagi podatkov na podlagi rezultatov, vklju čno s 
sklepno ugotovitvijo o tem, ali je kemikalija povzro čila razvojno nevro ­
toksičnost, in NOAEL.  
Parametri kohorte 3:  
— titre serumskih protiteles IgM (senzibilizacija na SRBC ali KHL) ali 
vraničnih enot IgM PFC (senzibilizacija na SRBC), 
— izvajanje metode TDAR morajo v okviru procesa optimizacije potrditi 
laboratorij, ki prvi č izvaja preskus, in redno (npr. letno) vsi laboratoriji, 
— razpravo o celotni razlagi podatkov na podlagi rezultatov, vklju čno s 
sklepno ugotovitvijo o tem, ali je kemikalija povzro čila razvojno imuno ­
toksičnost, in NOAEL.  
Razprava o rezultatih  
Sklepne ugotovitve, tudi vrednosti brez opaznih škodljivih u činkov pri 
starših in potomcih  
Zagotoviti je treba tudi vse informacije, ki niso bile pridobljene med študijo, 
ampak so uporabne za razlago rezultatov (npr. podobnost u činkov z u činki 
znanih nevrotoksinov).  
Razlaga rezultatov  
80. Razširjena enogeneracijska študija strupenosti za razmnoževanje po potrebi 
zagotavlja informacije o u činkih ponovne izpostavljenosti kemikaliji med 
vsemi fazami reprodukcijskega cikla. Študija zlasti zagotavlja informacije o 
razmnoževalnem sistemu ter o kon čnih točkah razvoja, rasti, preživetja in 
delovanja potomcev do 90. poporodnega dne. 
81. Pri razlagi rezultatov je treba upoštevati vse razpoložljive informacije o 
kemikaliji, vklju čno s fizikalno-kemijskimi, toksikokineti čnimi in toksiko ­
dinamičnimi lastnostmi, razpoložljive zadevne informacije o strukturnih 
analogih in rezultate iz predhodno izvedenih študij strupenosti s preskusno kemikalijo (npr. akutno strupenost, strupenost po ponovnih aplikacijah, 
mehanisti čne študije ter študije za ocenjevanje znatnih kvalitativnih in kvan ­
titativnih razlik med vrstami med presnovnimi lastnostmi  in vivo /in vitro ). 
Rezultate makroskopske obdukcije in tehtanja organov je treba oceniti v smislu ugotovitev iz drugih študij s ponavljajo čimi se odmerki, kadar je to 
izvedljivo. Zmanjšano rast potomcev je mogo če obravnavati v zvezi z 
učinkom preskusne kemikalije na sestavo mleka (29).
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 882
 
Kohorta 2 (razvojna nevrotoksi čnost)  
82. Rezultate nevrovedenjske in nevropatološke analize je treba razlagati v 
okviru vseh ugotovitev z analizo, ki temelji na tehtnosti dokazov, in stro ­
kovno presojo. Potrebna je razprava o vzorcih vedenjskih ali morfoloških ugotovitev, če so prisotni, in dokazih odziva na odmerek. V to opredelitev 
je treba vklju čiti vrednotenje razvojne nevrotoksi čnosti, vklju čno z epide ­
miološkimi študijami na ljudeh ali poro čili o primerih, in eksperimentalne 
študije na živalih (npr. podatki o toksikokinetiki, informacije o razmerju med strukturo in aktivnostjo, podatki iz drugih študij strupenosti). V vred ­
notenje podatkov je treba vklju čiti razpravo o biološki in statisti čni značil­
nosti. Vrednotenje naj vklju čuje odnos med ugotovljenimi nevropatološkimi 
in vedenjskimi spremembami, če obstaja. Za navodila o razlagi rezultatov o 
razvojni nevrotoksi čnosti glej preskusno metodo B.53 (35) in Tyl et al., 
2008 (31).
 
Kohorta 3 (razvojna imunotoksi čnost)  
83. V okviru vseh ugotovitev je treba ovrednotiti zaviranje ali krepitev imun ­
skega sistema, kakor je ocenjena s TDAR (protitelesni odziv na osnovi T-celic). Pomembnost rezultata odziva protiteles, odvisnega od celic T, 
lahko podprejo drugi u činki na imunološko povezane kazalnike (npr. celu ­
larnost kostnega mozga, teža in histopatološke preiskave limfoidnih tkiv, razporeditev podskupin limfocitov). U činki, ugotovljeni na podlagi odziva 
protiteles, odvisnega od celic T, morda ne bodo tako pomembni v primeru 
drugih ugotovljenih strupenosti pri nizkih koncentracijah izpostavljenosti. 
84. Za pomo č pri razlagi rezultatov o razmnoževanju in nevrotoksi čnosti glej 
Smernico OECD št. 43 (26).
 
VIRI  
(1) Cooper, R.L., J.C. Lamb, S.M. Barlow, K. Bentley, A.M. Brady, N. Doerr, 
D.L. Eisenbrandt, P.A. Fenner-Crisp, R.N. Hines, L.F.H. Irvine, C.A. Kimmel, H. Koeter, A.A. Li, S.L. Makris, L.P. Sheets, G.J.A. Speijers 
and K.E. Whitby (2006), 'A Tiered Approach to Life Stages Testing for 
Agricultural Chemical Safety Assessment',  Critical Reviews in Toxicology , 
36, 69–98. 
(2) Thigpen, J.E., K.D.R. Setchell, K.B. Ahlmark, J. Locklear, T. Spahr, G.F. 
Leviness, M.F. Goelz, J.K. Haseman, R.R. Newbold, and D.B. Forsythe (1999), ‘Phytoestrogen Content of Purified Open and Closed Formula Laboratory Animal Diets’,  Lab. Anim. Sci. , 49, 530–536. 
(3) Zoetis, T. and I. Walls (2003), Principles and Practices for Direct Dosing 
of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research, ILSI Press, Washington, DC. 
(4) Moser, V.C., I. Walls and T. Zoetis (2005), ‘Direct Dosing of Preweaning 
Rodents in Toxicity Testing and Research: Deliberations of an ILSI RSI Expert Working Group’, International Journal of Toxicology, 24, 87–94. 
(5) Conolly, R.B., B.D. Beck, and J.I. Goodman (1999), ‘Stimulating 
Research to Improve the Scientific Basis of Risk Assessment’,  Toxicolo ­
gical Sciences , 49, 1–4. 
(6) Ulbrich, B. and A.K. Palmer (1995), ‘Detection of Effects on Male Repro ­
duction – a Literature Survey’,  Journal of the American College of Toxi ­
cologists , 14, 293–327. 
(7) Mangelsdorf, I., J. Buschmann and B. Orthen (2003), ‘Some Aspects 
Relating to the Evaluation of the Effects of Chemicals on Male Fertility’,  
Regulatory Toxicology and Pharmacology , 37, 356–369.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 883
 
(8) Sakai, T., M. Takahashi, K. Mitsumori, K. Yasuhara, K. Kawashima, H. 
Mayahara and Y. Ohno (2000). ‘Collaborative work to evaluate toxicity on 
male reproductive organs by repeated dose studies in rats – overview of the studies’,  Journal of Toxicological Sciences , 25, 1–21. 
(9) Creasy, D.M. (2003), ‘Evaluation of Testicular Toxicology: A Synopsis 
and Discussion of the Recommendations Proposed by the Society of Toxi ­
cologic Pathology’,  Birth Defects Research , Part B, 68, 408–415. 
(10) Goldman, J.M., A.S. Murr, A.R. Buckalew, J.M. Ferrell and R.L. Cooper 
(2007), ‘The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology 
and its Utility in Toxicological Studies’,  Birth Defects Research , Part B, 
80 (2), 84–97. 
(11) Sadleir, R.M.F.S. (1979), ‘Cycles and Seasons’, in C.R. Auston and R.V. 
Short (eds.),  Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization , 
Cambridge, New York. 
(12) Gallavan, R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. 
Reynolds (1999), ‘Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations 
in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights’,  Reproductive Toxicology,  13: 383–390. 
(13) Korenbrot, C.C., I.T. Huhtaniemi and R.I. Weiner (1977), ‘Preputial Sepa ­
ration as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat’,  
Biological Reproduction , 17, 298–303. 
(14) Ladics, G.S. (2007), ‘Use of SRBC Antibody Responses for Immunotoxi ­
city Testing’,  Methods , 41, 9–19. 
(15) Gore, E.R., J. Gower, E. Kurali, J.L. Sui, J. Bynum, D. Ennulat and D.J. 
Herzyk (2004), ‘Primary Antibody Response to Keyhole Limpet Hemo ­
cyanin in Rat as a Model for Immunotoxicity Evaluation’,  Toxicology , 
197, 23–35. 
(16) Gray, L.E., J. Ostby, J. Ferrell, G. Rehnberg, R. Linder, R. Cooper, J. 
Goldman, V. Slott and J. Laskey (1989), ‘A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and 
Function in the Rat’,  Fundamental and Applied Toxicology , 12, 92–108. 
(17) Robb, G.W., R.P. Amann and G.J. Killian (1978), ‘Daily Sperm Produc ­
tion and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats’,  Journal 
of Reproduction and Fertility ,54, 103–107. 
(18) Klinefelter, G.R., L.E. Jr Gray and J.D. Suarez (1991), 'The Method of 
Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Follo ­
wing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat'.  Reproductive 
Toxicology ,5, 39–44. 
(19) Seed, J., R.E. Chapin, E.D. Clegg., L.A. Dostal, R.H. Foote, M.E. Hurtt, 
G.R. Klinefelter, S.L. Makris, S.D. Perreault, S. Schrader, D. Seyler, R. 
Sprando, K.A. Treinen, D.N. Veeramachaneni and L.D. Wise (1996), 
‘Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report’,  Reproductive Toxicology , 10, 
237–244. 
(20) Chapin, R.E., R.S. Filler, D. Gulati, J.J. Heindel, D.F. Katz, C.A. Mebus, 
F. Obasaju, S.D. Perreault, S.R. Russell and S. Schrader (1992), ‘Methods for Assessing Rat Sperm Motility’,  Reproductive Toxicology , 6, 267–273. 
(21) Klinefelter, G.R., N.L. Roberts and J.D. Suarez (1992), ‘Direct Effects of 
Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  In 
Vitro  Demonstration’,  Journal of Andrology , 13, 409–421. 
(22) Slott, V.L., J.D. Suarez and S.D. Perreault (1991), ‘Rat Sperm Motility 
Analysis: Methodologic Considerations’,  Reproductive Toxicology , 5, 
449–458.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 884
 
(23) Slott, V.L., and S.D. Perreault (1993), ‘Computer-Assisted Sperm Analysis 
of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility 
Analyzer’,  Methods in Toxicology, Part A , Academic, Orlando, Florida, 
str. 319–333. 
(24) Toth, G.P., J.A. Stober, E.J. Read, H. Zenick and M.K. Smith (1989), ‘The 
Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epich ­
lorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations’,  
Journal of Andrology , 10, 401–415. 
(25) Linder, R.E., L.F. Strader, V.L. Slott and J.D. Suarez (1992), ‘Endpoints 
of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen 
Reproductive Toxicants’,  Reproductive Toxicology , 6, 491–505. 
(26) OECD (2008),  Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity 
Testing and Assessment , Series on Testing and Assessment, No. 43, ENV/ 
JM/MONO(2008)16, OECD, Paris. 
(27) Working, P.K., M. Hurtt (1987), ‘Computerized Videomicrographic 
Analysis of Rat Sperm Motility’,  Journal of Andrology , 8, 330–337. 
(28) Bolin, B., R. Garman, K. Jensen, G. Krinke, B. Stuart, and an ad Hoc 
Working Group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee (2006), ‘A “Best Practices” Approach to Neuropathologic Assessment in Developmental Neurotoxicity Testing – for Today’,  Toxicological Patho ­
logy, 34, 296–313. 
(29) Stütz, N., B. Bongiovanni, M. Rassetto, A. Ferri, A.M. Evangelista de 
Duffard, and R. Duffard (2006), ‘Detection of 2,4-dichlorophenoxyacetic 
Acid in Rat Milk of Dams Exposed During Lactation and Milk Analysis of their Major Components’,  Food Chemicals Toxicology , 44, 8–16. 
(30) Thigpen, J.E., K.D.R. Setchell, J.K. Haseman, H.E. Saunders, G.F. Cavi ­
ness, G.E. Kissling, M.G. Grant and D.B. Forsythe (2007), ‘Variations in Phytoestrogen Content between Different Mill Dates of the Same Diet 
Produces Significant Differences in the Time of Vaginal Opening in 
CD-1 Mice and F344 Rats but not in CD Sprague Dawley Rats’,  Envi­
ronmental health perspectives,  115(12), 1717–1726. 
(31) Tyl, R.W., K. Crofton, A. Moretto, V. Moser, L.P. Sheets and T.J. 
Sobotka (2008), ‘Identification and Interpretation of Developmental Neurotoxicity Effects: a Report from the ILSI Research Foundation/Risk 
Science Institute Expert Working Group on Neurodevelopmental 
Endpoints’,  Neurotoxicology and Teratology , 30: 349–381. 
(32) OECD (1996), Combined Repeated Dose Toxicity Study with the Repro ­
duction/Developmental Toxicity Screening Test, OECD Guideline for Testing of Chemicals, No. 422, OECD, Paris. 
(33) Poglavje B.43 te priloge, Študija nevrotoksi čnosti na glodalcih. 
(34) OECD (2000), Guidance Document on the recognition, assessment, and 
use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluations, Series on Testing and Assessment, No. 19, ENV/JM/ MONO(2000)7, OECD, Paris. 
(35) Poglavje B.53 te priloge, Študija razvojne nevrotoksi čnosti. 
(36) Poglavje B.54 te priloge, Uterotropni biološki preskus na glodavcih: krat ­
kotrajni presejalni preskus za estrogene lastnosti. 
(37) Poglavje B.55 te priloge, Hershbergerjev biološki preskus na podganah: 
kratkotrajni presejalni preskus za (anti)androgene lastnosti.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 885
 
(38) OECD (2009), Guidance Document for Histologic Evalution of Endocrine 
and Reproductive Test in Rodents, Series on Testing and Assessment, No. 
106, OECD, Paris. 
(39) OECD (2011), Guidance Document on the Current Implementation of 
Internal Triggers in the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study in the United States and Canada, Series on Testing and Assessment, 
No. 117, ENV/JM/MONO(2011)21, OECD, Paris. 
(40) OECD (2013), Guidance Document supporting TG 443: Extended One 
Generation Reproductive Toxicity Study, Series on Testing and Asses ­
sment, No. 151, OECD, Paris.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 886
 
Dodatek 1  
Meritve in opazovanja, vklju čena v sklop funkcionalnih opazovanj (kohorta 2A)  
Domača kletka in na terenu Gibalne Fiziološke  
Drža Enostaven prenos Temperatura 
Neprostovoljni kloni čni in toni čni Enostavno ravnanje Telesna teža 
Zaprtost o česne veke Tonus mišic Odziv zenic 
Piloerekcija Odziv na pristop Velikost zenic Slinjenje Odziv na dotik Solzenje Odziv na slušni dražljaj Oddajanje glasov Odziv na stiskanje repa Dvigovanje Posturalni odziv 
Anomalije pri hoji Razširjenost prstov pri 
pristanku 
Vzburjenost Mo č oprijema s prednjimi 
okončinami 
Stereotipije Mo č oprijema z zadnjimi 
okončinami 
Nenormalno vedenje 
Madeži 
Anomalije pri dihanju
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 887
 
Dodatek 2  
OPREDELITVE:  
Kemikalija : snov ali zmes.  
Preskusna kemikalija : vsaka snov ali zmes, ki se preskuša s to preskusno 
metodo.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 888
 
B.57  PRESKUS STEROIDOGENEZE CELIC H295R  
UVOD 
1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) št. 456 
(2011). OECD je leta 1998 za čela z izvajanjem prednostne dejavnosti, da bi 
pregledala obstoje če in razvila nove smernice za odkrivanje in preskušanje 
kemikalij, ki bi lahko povzro čale endokrine motnje. Temeljni okvir OECD 
iz leta 2002 za preskušanje in oceno povzro čiteljev endokrinih motenj 
(OECD Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine 
Disrupting Chemicals), zajema pet ravni, pri čemer vsaka raven ustreza 
posamezni stopnji biološke kompleksnosti (1). Za preskus steroidogeneze celic H295R  in vitro  (H295R), opisan v okviru te preskusne metode, se 
uporablja adenokarcinomska celi čna linija človeka (celice NCI-H295R), pri 
čemer preskus predstavlja raven 2 'preskusa  in vitro  za zagotavljanje meha ­
nističnih podatkov', ki se uporablja za namene presejanja in prednostnega 
razvrščanja. Priprava in standardizacija preskusa kot presejalnega preskusa 
za odkrivanje kemi čnih učinkov na steroidogenezo, zlasti proizvajanje 17 β- 
estradiola (E2) in testosterona (T), sta bili izvedeni v postopku, ki ga sesta ­
vlja več korakov. Preskus celic H295R je bil optimiziran in validiran (2) (3) 
(4) (5). 
2. Cilj preskusa steroidogeneze celic H295R je zaznati kemikalije, ki vplivajo 
na proizvajanje E2 in T. Namen preskusa celic H295R je identificirati ksenobiotike, katerih ciljna obmo čja so endogene komponente, ki zajemajo 
znotrajceli čne biokemijske poti, ki se za čnejo z zaporedjem reakcij od hole ­
sterola do proizvajanja E2 in/ali T. Preskus celic H295R ni namenjen iden ­
tifikaciji kemikalij, ki vplivajo na steroidogenezo zaradi u činkov na os 
hipotalamus – hipofiza – spolne žleze (HPG). Cilj preskusa je zagotoviti 
odgovor DA/NE na vprašanje o možnosti, da bi kemikalija povzro čila ali 
zavirala proizvodnjo T in E2, vendar je mogo če v nekaterih primerih dobiti 
tudi kvantitativne rezultate (glej odstavka 53 in 54). Rezultati preskusa so izraženi kot relativne spremembe v proizvodnji hormonov v primerjavi s 
kontrolnimi vzorci s topilom (KVT). Namen preskusa ni zagotoviti 
posebnih mehanisti čnih informacij glede interakcije preskusne kemikalije 
z endokrinim sistemom. V raziskavi je bila uporabljena celi čna linija za 
opredelitev u činkov na posebne encime in vmesne hormone, kot je proge ­
steron (2). 
3. Opredelitve in kratice, uporabljene v okviru te preskusne metode, so 
opisane v Dodatku. Podroben protokol, vklju čno z navodili za pripravo 
raztopin, gojenje celic in izvajanje razli čnih vidikov preskusa, je na voljo 
v dodatkih I–III k dokumentu OECD 'Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production' (4).
 
ZAČETNI PREUDARKI IN OMEJITVE 
4. V biosintezo spolnih steroidnih hormonov je vklju čenih pet razli čnih enci­
mov, ki katalizirajo šest razli čnih reakcij. Encimska pretvorba holesterola v 
pregnenolon z encimom za cepitev stranske verige holesterola (CYP11A) iz 
družine citokromov P450 (CYP) predstavlja prvi korak v zaporedju bioke ­
mijskih reakcij, ki se kon čajo s sintezo steroidnih kon čnih proizvodov. 
Glede na vrstni red naslednjih dveh reakcij se steroidogenska pot razdeli 
na dve poti, in sicer Δ 5 -hidroksisteroidno pot in Δ 4 -ketosteroidno pot, ki se 
končata s proizvodnjo androstendiona (slika 1). 
5. Androstendion se pretvori v testosteron (T) s pomo čjo 17β-hidroksisteroidne 
dehidrogenaze (17 β-HSD). Testosteron je tako vmesni kot kon čni 
hormonski produkt. Pri moškem se lahko T pretvori v 
dihidrotestosteron (DHT) s 5 α-reduktazo, ki se nahaja v celi čnih membra ­
nah, jedrni ovojnici in endoplazmatskem retikulumu tar čnih tkiv androge ­
nega delovanja, kot so prostata in semenski meši čki. DHT je kot androgen 
znatno mo čnejši kot T in se prav tako šteje za kon čni hormon. Pri preskusu 
celic H295R se DHT ne meri (glej odstavek 10).  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 889
 
6. Encim na steroidogenski poti, ki pretvori androgene kemikalije v estrogene 
kemikalije, je aromataza (CYP19). CYP19 pretvori T v 17 β-estradiol (E2) 
in androstendion v estron. E2 in T se štejeta za kon čna hormona steroido ­
genske poti. 
7. Specifi čnost aktivnosti liaze CYP17 se med vrstami razlikuje pri vmesnih 
substratih. Pri človeku daje encim prednost substratom Δ 5 -hidroksisteroidne 
poti (pregnenolon), pri podgani pa imajo prednost substrati Δ 4 -ketosteroidne 
poti (progesteron) (19). S takšno razliko aktivnosti liaze CYP17 se lahko razložijo nekatere razlike v odzivu na kemikalije, ki spreminjajo steroido ­
genezo  in vivo  in so odvisne od vrst (6). Dokazano je, da celice H295 
najbolj to čno odražajo izražanje adrenalnih encimov in vzorec proizvajanja 
steroidov pri odraslem človeku (20), vendar je znano, da izražajo encime 
tako za Δ
 5 -hidroksisteroidne kot tudi za Δ 4 -ketosteroidne poti za sintezo 
androgenov (7) (11) (13) (15).  
Slika 1  
Steroidogenska pot v celicah H295R
  
Opomba:  
Encimi so v leže čem tisku, hormoni so v odebeljenem tisku, puš čice pa 
označujejo smer sinteze. Sivo ozadje ozna čuje kortikosteroidne poti/pro ­
dukte. Poti spolnih steroidov/produktov so obkroženi. CYP = citokrom 
P450; HSD = hidroksisteroidna dehidrogenaza; DHEA = 
dehidroepiandrosteron. 
8. Človeška adenokarcinomska celi čna linija H295R je uporaben model  in 
vitro  za preiskovanje u činkov na sintezo steroidnih hormonov (2) (7) (8) 
(9) (10). V celi čni liniji H295R se izražajo geni, ki kodirajo vse klju čne 
encime za zgoraj navedeno steroidogenezo (11) (15) (slika 1). To je edin ­
stvena lastnost, ker je izražanje teh genov  in vivo  specifično za tkiva in 
razvojno fazo, pri čemer se obi čajno v enem tkivu ali eni razvojni fazi ne 
izražajo vsi geni, ki sodelujejo pri steroidogenezi (2). Celice H295R imajo fiziološke zna čilnosti consko nediferenciranih človeških fetalnih celic 
nadledvičnice (11). Celice predstavljajo edinstven sistem  in vitro , ker so 
sposobne proizvesti vse steroidne hormone, ki se nahajajo v skorji nadled ­
vične žleze in spolnih žlezah, kar omogo ča preskušanje u činkov na sintezo 
kortikosteroidov in proizvajanje spolnih steroidnih hormonov, kot so andro ­
geni in estrogeni, čeprav je bil preskus validiran le za zaznavanje T in E2. 
Spremembe, ki jih preskusni sistem zabeleži v obliki spremembe proiz ­
vodnje T in E2, so lahko rezultat številnih razli čnih interakcij preskusnih
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 890
 
kemikalij s steroidogenimi funkcijami, ki se izražajo s celicami H295R. 
Vključujejo modulacijo izražanja, sintezo ali funkcijo encimov, ki sodelu ­
jejo pri proizvajanju, pretvorbi ali odstranitvi steroidnih hormonov (12) (13) (14). Zaviranje proizvajanja hormonov je lahko posledica neposredne konkuren čne vezave z encimom na poti, vpliva na kofaktorje, kot sta 
NADPH (nikotinamid adenin dinukleotid fosfat) in cAMP (cikli čni 
adenozin monofosfat), in/ali pove čanja steroidne presnove ali supresije izra ­ 
žanja genov nekaterih encimov na poti steroidogeneze. Medtem ko je lahko zaviranje funkcija neposrednih ali posrednih postopkov pri proizvajanju 
hormonov, je indukcija obi čajno posredna, na primer z vplivanjem na 
kofaktorja, kot sta NADPH in cAMP (kot v primeru forskolina), zmanjša ­
njem steroidne presnove (13) in/ali pove čanjem izražanja genov za sintezo 
steroidov. 
9. Preskus celic H295R ima ve č prednosti: 
— omogo ča zaznavanje tako pove čanja kot tudi zmanjšanja proizvajanja T 
in E2, 
— omogo ča neposredno oceno možnih u činkov kemikalije na sposobnost 
preživetja celic/citotoksi čnost. To je pomembna lastnost, saj omogo ča 
razlikovanje med u činki, ki so posledica citotoksi čnosti, in u činki, ki so 
posledica neposredne interakcije kemikalij s steroidogenimi potmi, kar 
pri sistemih izse čkov tkiv, ki zajemajo ve č vrst celic razli čnih občut­
ljivosti in funkcionalnosti, ni mogo če, 
— ne zahteva se uporaba živali, 
— celična linija H295R je na voljo na tržiš ču. 
10. Glavne omejitve preskusa so naslednje: 
— njegova presnovna zmogljivost ni znana, vendar je verjetno zelo 
omejena, zato bodo kemikalije, ki morajo biti presnovno aktivirane, v tem preskusu verjetno spregledane, 
— ker celice H295R izhajajo iz tkiva nadledvi čne žleze, vsebujejo encime, 
ki so sposobni proizvodnje glukokortikoidov in mineralokortikoidov ter 
spolnih hormonov, zato bi lahko u činki na proizvajanje glukokorti ­
koidov in mineralokortikoidov vplivali na ravni T in E2, opažene v preskusu, 
— ker se v njem ne meri DHT, se ne pri čakuje zaznavanje kemikalij, ki 
zavirajo 5 α-reduktazo, pri čemer se lahko v tem primeru uporabi Hersh ­
bergerjev preskus (16), 
— preskus celic H295R ne bo zaznal kemikalij, ki vplivajo na steroidoge ­
nezo prek vpliva na os hipotalamus – hipofiza – spolne žleze (HPG), 
ker se to lahko prou čuje le pri nepoškodovanih živalih.
 
NAČELO PRESKUSA 
11. Cilj tega preskusa je zaznavanje kemikalij, ki vplivajo na proizvajanje E2 in 
T. T je tudi posrednik na poti proizvajanja E2. V preskusu se lahko zaznajo 
kemikalije, ki obi čajno zavirajo ali sprožijo encime poti steroidogeneze.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 891
 
12. Preskus se obi čajno opravi pod standardnimi pogoji za celi čne kulture na 
plošči s 24 jamicami za gojenje kulture. Za izvajanje preskusa se lahko 
uporabijo tudi ploš če drugih velikosti, vendar je treba nasaditvene in 
preskusne pogoje ustrezno prilagoditi, da se ohrani upoštevanje meril uspeš ­
nosti. 
13. Po 24-urni aklimatizaciji na ploš čah z več jamicami so celice 48 ur izposta ­
vljene sedmim koncentracijam preskusne kemikalije v vsaj treh ponovitvah. 
Topilo ter znan zaviralec in povzro čitelj proizvajanja hormonov se v nespre ­
menljivi koncentraciji preskusita kot negativni in pozitivni kontrolni vzorec. Ob koncu obdobja izpostavljenosti se iz vseh jamic odstrani gojiš če. 
Sposobnost preživetja celic v posamezni jamici se analizira takoj po odstra ­
nitvi gojiš ča. Koncentracije hormonov v gojiš ču se lahko izmerijo z 
uporabo razli čnih metod, vklju čno s kompleti za hormonske meritve, ki 
so na voljo na tržiš ču, in/ali instrumentalnimi tehnikami, kot je teko činska 
kromatografija z masno spektrometrijo (LC-MS). Podatki so izraženi kot 
razmerje spremembe glede na kontrolni vzorec s topilom in najnižjo koncentracijo z opaženim u činkom (LOEC). Če je preskus negativen, se 
največja preskušena koncentracija sporo či kot koncentracija brez opaznega 
učinka (NOEC). Sklepne ugotovitve glede sposobnosti kemikalije, da vpliva 
na steroidogenezo, morajo temeljiti na vsaj dveh neodvisnih ponovitvah preskusa. Prvi potek preskusa lahko deluje kot ponovitev za ugotavljanje območja, pri čemer se koncentracije za drugo ali tretjo ponovitev po potrebi 
naknadno prilagodijo, če nastanejo težave v zvezi s topnostjo ali citotoksi ­ 
čnostjo ali če se zdi, da je kemikalija aktivna na robu obmo čja preskušane 
koncentracije.
 
POSTOPEK V ZVEZI S KULTURAMI  
Celična linija  
14. Celice NCI-H295R na tržiš ču zagotavlja American Type Culture 
Collections (ATCC) po podpisu sporazuma o prenosu materiala (  1 ). 
Uvod  
15. Zaradi sprememb zmogljivosti celic za proizvajanje E2 s staranjem/ve ča­
njem pasaž (2) je treba celice pred uporabo gojiti v skladu s posebnim 
protokolom, pri čemer je treba zabeležiti število pasaž od odtajanja celic 
ter število pasaž, pri katerem so bile celice zamrznjene in shranjene v teko či 
dušik. Prvo število ozna čuje dejansko število pasaž celic, drugo število pa 
število pasaž, pri katerem so bile celice zamrznjene in shranjene. Celice, ki 
so bile zamrznjene po peti pasaži in odtajane ter so se nato trikrat delile (4 
pasaže, pri čemer se sveže odtajane celice štejejo kot pasaža 1) po 
ponovnem gojenju, bi bile na primer ozna čene s pasažo 4,5. Primer ozna ­ 
čevanja s številkami je naveden v Dodatku 1 k validacijskemu poro čilu (4). 
16. Založno gojiš če se uporablja kot osnova za obogatena gojiš ča ali gojiš ča za 
zamrzovanje. Obogateno gojiš če je potreben sestavni del gojenja celic. 
Gojišče za zamrzovanje je posebej zasnovano tako, da omogo ča zamrzo ­
vanje celic za dolgoro čno shranjevanje brez posledic. V Nu-serumu (ali 
primerljivem serumu z enakimi lastnostmi, ki dokazano zagotavlja podatke, 
ki izpolnjujejo zahteve glede izvedbe preskusa in kontrole kakovosti), ki je sestavina obogatenega gojiš ča, je treba analizirati za osnovne koncentracije 
T in E2. Priprava teh raztopin je opisana v Dodatku II k validacijskemu 
poročilu (4).
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 892  
( 1 ) ATCC CRL-2128; ATCC, Manassas, VA, ZDA [http://www.lgcstandards-atcc.org/].
 17. Po iniciaciji celi čne kulture H295R iz izvirne serije ATCC morajo celice 
rasti pet pasaž (tj. se celice delijo štirikrat). Celice pete pasaže se nato 
zamrznejo v teko čem dušiku za shranjevanje. Pred zamrzovanjem celic se 
vzorec prejšnjih celic četrte pasaže preskusi na ploš či za kontrolo kakovosti 
(glej odstavka 36 in 37), da se preveri, ali osnovno proizvajanje hormonov 
in odziv na pozitivne kontrolne kemikalije izpolnjujeta merila za kontrolo 
kakovosti preskusa iz tabele 5. 
18. Celice H295R je treba gojiti, zamrzniti in shraniti v teko čem dušiku, da se 
zagotovi stalna razpoložljivost celic ustrezne pasaže/starosti za gojenje in 
uporabo. Najve čje število pasaž po dodajanju nove (  1 ) ali zamrznjene (  2 ) 
serije celic v kulturo, ki je sprejemljiva za uporabo v preskusu celic H295R, ne sme biti ve čje od 10. Sprejemljive pasaže za kulture celic iz serije, ki je 
bila zamrznjena pri pasaži 5, so na primer med 4,5 in 10,5. Za celice, ki se 
gojijo iz teh zamrznjenih serij, je treba upoštevati postopek iz odstavka 19. 
Te celice je treba gojiti vsaj štiri (4) dodatne pasaže (pasaža 4,5), preden se uporabijo pri preskušanju.
 
Začetne celice iz zamrznjene zaloge  
19. Postopek za za četek gojenja celic iz zamrznjene zaloge je treba uporabiti, če 
se nova serija celic odstrani iz hrambe v teko čem dušiku za namen gojenja 
in preskušanja. Podrobnosti o tem postopku so navedene v Dodatku III k 
validacijskemu poro čilu (4). Celice se odstranijo iz hrambe v teko čem 
dušiku, hitro odtajajo, vstavijo v obogateno gojiš če v centrifugirki, centri ­
fugirajo pri sobni temperaturi, ponovno suspendirajo v obogatenem gojiš ču 
in prestavijo v bu čke. Gojiš če je treba naslednji dan zamenjati. Celice 
H295R se gojijo v inkubatorju pri 37 °C s 5 % CO  2 v atmosferi z zrakom, 
pri čemer se gojiš če obnovi dvakrat do trikrat na teden. Ko so celice 
približno 85–90-odstotno konfluentne, jih je treba deliti. Delitev celic je potrebna, da se zagotovijo zdrave celice, ki rastejo in se ohranijo za opra ­
vljanje bioloških preskusov. Celice se trikrat sperejo s fosfatnim pufrom s 
soljo (PBS, brez Ca
 2+ Mg 2+ ) in odstranijo iz bu čk z dodajanjem ustreznega 
encima za lo čevanje, npr. tripsina, v PBS (brez Ca  2+ Mg 2+ ). Takoj ko se 
celice ločijo od bu čke, je treba delovanje encima ustaviti z dodajanjem 
obogatenega gojiš ča v razmerju trikratnika volumna, uporabljenega za treti ­
ranje z encimom. Celice se prestavijo v centrifugirko, centrifugirajo pri sobni temperaturi, supernatant se odstrani, peleti celic pa se ponovno suspendirajo v obogatenem gojiš ču. Ustrezna koli čina raztopine s celicami 
se da v novo bu čko. Količino raztopine s celicami je treba prilagoditi tako, 
da so celice konfluentne v 5–7 dneh. Priporo čeno razmerje subkultivacije je 
od 1:3 do 1:4. Ploš čo je treba skrbno ozna čiti. Celice so zdaj pripravljene za 
uporabo v preskusu, odve čne celice pa je treba zamrzniti v teko čem dušiku, 
kot je opisano v odstavku 20.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 893  
( 1 ) „Nova serija“ pomeni svežo serijo celic, prejetih od dobavitelja ATCC. 
( 2 ) „Zamrznjena serija“ pomeni celice, ki so že bile gojene in nato zamrznjene v laborato ­
riju, ki ni laboratorij dobavitelja ATCC.
 Zamrzovanje celic H295R (priprava celic za shranjevanje v teko čem 
dušiku)  
20. Pri pripravi celic H295R za zamrzovanje je treba upoštevati zgoraj opisani 
postopek delitve celic do faze ponovnega suspendiranja peletov celic na dnu centrifugirke. V tem primeru se peleti celic ponovno suspendirajo v gojiš ču 
za zamrzovanje. Raztopina se prenese v ustrezno ozna čeno kriovialo, ki se 
zamrzne pri – 80
 o C za 24 ur in se nato prestavi v teko či dušik za shra ­
njevanje. Podrobnosti o tem postopku so navedene v Dodatku III k valida ­
cijskemu poro čilu (4).  
Nasaditev in predhodna inkubacija celic za preskušanje  
21. Število ploš č s 24 jamicami, pripravljenih, kot je opisano v odstavku 19, ki 
bo potrebno, je odvisno od števila kemikalij, ki jih je treba preskusiti, in konfluentnosti celic v posodah za gojenje. Ena bu čka (75 cm
 2 ) s celicami, 
ki so 80–90-odstotno konfluentne, bo na splošno zagotovila dovolj celic za 
1–1,5 ploš če (s 24 jamicami) s ciljno gostoto od 200000 do 300000 celic na 
mililiter gojiš ča, zaradi česar bo konfluentnost v jamicah po 24 urah 50–60- 
odstotna (slika 2). To je tipi čna optimalna gostota celic za proizvajanje 
hormonov v preskusu. Pri ve čjih gostotah se vzorci proizvajanja T in E2 
spremenijo. Priporo čljivo je, da se pred prvim izvajanjem preskusa presku ­
sijo različne gostote zasejanja med 200000 in 300000 celicami na ml, za 
nadaljnje preskuse pa izbere gostota, ki po 24 urah povzro či 50–60-odstotno 
konfluentnost v jamicah.  
Slika 2  
Mikrofotografija celic H295R pri gostoti zasejanja 50 % v ploš či s 24 jamicami za 
gojenje kulture po 24 urah, posneta na robu jamice (A) in sredi jamice (B)
  
22. Gojiš če se s pipeto nakapa iz bu čke, celice pa se trikrat sperejo s sterilnim 
PBS (brez Ca  2+ Mg 2+ ). Za ločitev celic od bu čke se doda raztopina z encimi 
(v PBS). Po ustrezno dolgem lo čevanju celic je treba delovanje encima 
ustaviti z dodajanjem obogatenega gojiš ča v razmerju trikratnika volumna, 
uporabljenega za tretiranje z encimom. Celice se prestavijo v centrifugirko, 
centrifugirajo pri sobni temperaturi, supernatant se odstrani, peleti celic pa  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 894
 
se ponovno suspendirajo v obogatenem gojiš ču. Gostota celic se izra čuna na 
primer s hemocitometrom ali števcem celic. Raztopino s celicami je treba 
razredčiti do želene gostote za nasaditev in skrbno premešati, da se zagotovi 
homogena gostota celic. Celice je treba nasaditi z 1 ml raztopine s celicami na jamico, ploš če in jamice pa ozna čiti. Zasejane ploš če se 24 ur inkubirajo 
pri 37 °C in 5 % CO
 2 v atmosferi z zrakom, da se omogo či pritrditev celic 
na jamice.  
ZAHTEVE GLEDE KONTROLE KAKOVOSTI 
23. Klju čno je, da se med odmerjanjem v jamice dajo natan čne količine 
raztopin in vzorcev, ker te koli čine določajo koncentracije, uporabljene v 
izračunih rezultatov preskusov. 
24. Pred iniciacijo celi čne kulture in nadaljnjimi preskušanji mora vsak labora ­
torij dokazati ob čutljivost svojega sistema za merjenje hormonov (odstavki 
29–31). 
25. Če je treba uporabiti preskuse meritev hormonov na podlagi protiteles, je 
treba pred za četkom preskušanja analizirati možen vpliv kemikalij, ki se 
bodo preskušale, na sistem za merjenje, ki se uporablja za koli činsko opre ­
delitev T in E2, kot je opisano v odstavku 32. 
26. Priporo čeno topilo za preskus je DMSO. Če se uporabi drugo topilo, je 
treba dolo čiti naslednje: 
— topnost preskusne kemikalije, forskolina in prokloraza v topilu ter — citotoksi čnost kot funkcijo koncentracije topila. 
Priporoča se, da najve čja dovoljena koncentracija topila ne presega deset ­
kratnika razred čine najmanj citotoksi čne koncentracije topila. 
27. Pred prvim izvajanjem preskušanja mora laboratorij opraviti zahtevani 
preskus, kot je opisan v odstavkih 33–35, s katerim dokaže, da je sposoben ohraniti in dose či ustrezno celi čno kulturo ter preskusne pogoje, ki so 
potrebni za preskušanja kemikalij. 
28. Ob za četku preskušanja z novo serijo je treba pred uporabo nove serije celic 
opraviti preskus s kontrolno ploš čo, da se ovrednoti delovanje celic, kot je 
opisano v odstavkih 36 in 37.
 
Učinkovitost sistema za merjenje hormonov  
Občutljivost metode, to čnost, natan čnost in navzkrižna reaktivnost z matriko 
vzorčenja 
29. Vsak laboratorij lahko za analizo proizvajanja T in E2 v celicah H295R 
uporabi sistem za merjenje hormonov po svoji izbiri, pod pogojem, da 
izpolnjuje merila uspešnosti, vklju čno z mejo dolo čljivosti. Meji sta 
običajno 100 pg/ml za T in 10 pg/ml za E2 ter temeljita na osnovnih ravneh 
hormonov, opaženih v validacijskih študijah. Vendar so lahko glede na 
osnovne ravni hormonov, dosežene v zadevnem laboratoriju, ustrezne 
višje ali nižje ravni. Pred za četkom ploš če za kontrolo kakovosti in potekov 
preskusov mora laboratorij dokazati, da je s preskusom hormonov, ki se bo uporabil, koncentracije hormonov v obogatenem gojiš ču mogoče izmeriti z 
ustrezno to čnostjo in natan čnostjo, da so izpolnjena merila za kontrolo 
kakovosti iz tabel 1 in 5, in sicer z analizo obogatenega gojiš ča s prime ­ 
šanim hormonom kot interno kontrolo. Obogatenemu gojiš ču se dodajo vsaj 
tri koncentracije vsakega hormona (npr. 100, 500 in 2500 pg/ml T, 10, 50 
in 250 pg/ml E2 ali pa se lahko za najmanjše primešane koncentracije za T 
in E2 uporabijo in analizirajo najmanjše možne koncentracije na podlagi
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 895
 
mej zaznavnosti za izbrani sistem za merjene hormonov). Izmerjene 
koncentracije hormonov neekstrahiranih vzorcev morajo biti znotraj 30 % 
nominalnih koncentracij, razlika med ponovnimi meritvami istega vzorca pa ne sme presegati 25 % (glej tudi tabelo 8 za dodatna merila kontrole kako ­
vosti). Če so ta merila kontrole kakovosti izpolnjena, se šteje, da je izbrani 
preskus meritve hormonov dovolj to čen in natan čen ter ne reagira navz ­
križno s sestavinami v gojiš ču (matrika vzorca) tako, da bi se lahko pri ča­
koval znaten vpliv na rezultat preskusa. V tem primeru ekstrakcija vzorcev pred merjenjem hormonov ni potrebna. 
30. Če merila kakovosti iz tabel 1 in 8 niso izpolnjena, lahko pride do znatnih 
vplivov matrike in je treba izvesti preskus z ekstrahiranim primešanim 
gojiščem. Primer postopka ekstrakcije je opisan v Dodatku II k validacij ­
skemu poro čilu (4). Meritve koncentracij hormonov v ekstrahiranih vzorcih 
je treba trikrat ponoviti (
 1 ). Če je mogo če dokazati, da sestavine gojiš ča po 
ekstrakciji ne vplivajo na metodo zaznavanja hormonov, kot je opredeljeno 
z merili kontrole kakovosti, je treba vse nadaljnje preskuse izvesti z uporabo ekstrahiranih vzorcev. Če po ekstrakciji meril kontrole kakovosti 
ni mogoče izpolniti, uporabljeni sistem za merjenje hormonov ni primeren 
za namen preskusa steroidogeneze celic H295R in je treba uporabiti drugo 
metodo za zaznavanje hormonov.
 
Umeritvena krivulja  
31. Koncentracije hormonov v kontrolnih vzorcih s topilom (KVT) morajo biti 
znotraj linearnega dela umeritvene krivulje. Najbolje je, da so vrednosti kontrolnih vzorcev s topilom blizu sredine linearnega dela, da se omogo či 
merjenje povzro čanja in zaviranja sinteze hormonov. Ustrezno se izberejo 
razredčine gojišča (ali ekstraktov), ki jih je treba izmeriti. Linearno pove ­
zavo je treba dolo čiti z ustreznim statisti čnim pristopom.
 
Preskus vpliva kemikalij  
32. Če se bodo za merjenje hormonov uporabljali preskusi na podlagi protiteles, 
kot so encimskoimunski preskusi (ELISA) in radioimunski preskusi (RIA), 
je treba za vsako kemikalijo preskusiti možen vpliv na sistem za merjenje hormonov, ki se bo uporabil, preden se za čne dejansko preskušanje kemi ­
kalij (Dodatek III k validacijskemu poro čilu (4)), ker lahko nekatere kemi ­
kalije vplivajo na te preskuse (17). Če se z analizo hormonov ugotovi 
prisotnost vpliva, ki je enak ali ve čji od 20 % osnovne proizvodnje 
hormonov T in/ali E2, je treba opraviti preskus vpliva kemikalij na preskus
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 896  
( 1 ) Opomba:  Če je potrebna ekstrakcija, se za posamezen ekstrakt opravijo tri ponovne 
meritve. Vsak vzorec se ekstrahira samo enkrat.
 hormonov (kot je opisan v oddelku 5.0 Dodatka III k validacijskemu poro ­ 
čilu (4)) pri vseh razred činah kemijskih založnih raztopin, da se opredeli 
odmerek, pri katerem se pojavi znaten ( ≥ 20 %) vpliv. Če je vpliv manjši 
od 30 %, se rezultati lahko popravijo za vpliv. Če vpliv preseže 30 %, so 
podatki neveljavni, pri čemer je treba podatke pri teh koncentracijah 
zavreči. Če se znaten vpliv preskusne kemikalije na sistem za merjenje 
hormonov pojavi pri ve č kot eni necitotoksi čni koncentraciji, je treba upora ­
biti drug sistem za merjenje hormonov. Da se prepre či vpliv zaradi konta ­
minacije s kemikalijami, se priporo ča, da se hormoni iz gojiš ča ekstrahirajo 
z ustreznim topilom, pri čemer so možne metode navedene v validacijskem 
poročilu (4).  
Tabela 1  
Merila uspešnosti za sisteme za merjenje hormonov  
Parameter Merilo  
Občutljivost metode merjenja Meja dolo čljivosti (LOQ) 
T: 100 pg/ml; E2: 10 pg/ml (  a ) 
Učinkovitost ekstrakcije hormonov 
(samo, kadar je ekstrakcija 
potrebna) Povprečne stopnje izkoristka (na 
podlagi treh ponovitev meritev) 
primešanih koli čin hormonov od 
dodane koli čine ne smejo odstopati 
za več kot 30 %. 
Vpliv kemikalij (samo za sisteme 
na podlagi protiteles) Znatna (≥ 30 % osnovne proizvodnje 
zadevnega hormona) navzkrižna reaktivnost s hormoni, ki jih proizve ­
dejo celice, se ne sme pojaviti (
 b ) ( c ). 
( a ) Opomba:  Meje meritve metode temeljijo na vrednostih osnovne proizvodnje 
hormonov iz tabele 5 in u činkovitosti. Če se lahko doseže ve čje osnovno proiz ­
vajanje hormonov, je lahko meja višja. 
( b ) Nekatera protitelesa za T in E2 so lahko pri ve čjih deležih navzkrižno reaktivna z 
androstendionom in estronom. V takih primerih ni mogo če točno določiti učinkov 
na 17β-HSD. Vendar lahko podatki kljub temu zagotavljajo uporabne informacije 
o učinkih na proizvajanje estrogena ali androgena na splošno. V takih primerih je 
treba podatke izraziti kot odzive androgena/estrogena in ne kot E2 in T. 
( c ) Ti vklju čujejo: holesterol, pregnenolon, progesteron, 11-deoksikortikosteron, korti ­
kosteron, aldosteron, 17 α-pregnenolon,17 α-progesteron, deoksikortizol, kortizol, 
DHEA, androstendion, estron.  
Preskus usposobljenosti laboratorija  
33. Pred preskušanjem neznanih kemikalij je treba s preskusom usposobljenosti 
laboratorija dokazati, da je laboratorij usposobljen za doseganje in ohranitev ustrezne celi čne kulture ter preskusnih pogojev, ki so potrebni za uspešno 
izvedbo preskusa. Ker je uspešnost preskusa neposredno povezana z 
osebjem laboratorija, ki opravlja preskus, je treba te postopke delno pono ­
viti, če se osebje v laboratoriju zamenja. 
34. Ta preskus usposobljenosti bo izveden pod enakimi pogoji, kot so navedeni 
v odstavkih 38 do 40, z izpostavitvijo celic 7 naraš čajočim koncentracijam 
močnih, zmernih in šibkih povzro čiteljev in zaviralcev ter negativni kemi ­
kaliji (glej tabelo 2). Kemikalije, ki jih je treba preskusiti, vklju čujejo zlasti 
močnega povzro čitelja forskolin (št. CAS 66575-29-9), mo čnega zaviralca
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 897
 
prokloraz (št. CAS 67747-09-5), zmernega povzro čitelja atrazin (št. CAS 
1912-24-9), zmernega zaviralca aminoglutetimid (št. CAS 125-84-8), 
šibkega povzro čitelja (proizvajanje E2) in šibkega zaviralca (proizvajanje 
T) bisfenol A (št. CAS 80-05-7) ter negativno kemikalijo humani horionski gonadotropin (HCG) (št. CAS 9002-61-3), kot je navedeno v tabeli 2. Za 
vse kemikalije se vodijo lo čene plošče, kot je prikazano v tabeli 6. Vsak 
dnevni preskus s kemikalijami za preskušanje usposobljenosti mora vklju ­ 
čevati eno ploš čo za kontrolo kakovosti (tabela 4, odstavka 36–37).
 
Tabela 2  
Kemikalije za preverjanje usposobljenosti in koncentracije 
izpostavljenosti  
Kemikalija za preskušanje 
usposobljenosti Preskusne koncentracije ( μM) 
Prokloraz 0 (  a ), 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 
Forskolin 0 (  a ), 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 
Atrazin 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
Aminoglutetimid 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
Bisfenol A 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
HCG 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100  
( a ) Kontrolni vzorec (0) s topilom (DMSO), 1 μl DMSO/jamico.  
Izpostavljenost celic H295R kemikalijam za preskus usposobljenosti se 
izvede v ploš čah s 24 jamicami med preskusom usposobljenosti laboratorija. 
Vsi odmerki preskusne kemikalije se odmerjajo v μM. Odmerki se dajejo v 
DMSO pri 0,1 % m/m na jamico. Vse preskusne koncentracije je treba 
preskusiti v treh ponovitvah (tabela 6). Za vsako kemikalijo se vodijo 
ločene plošče. Vsak dnevni preskus vklju čuje eno ploš čo za kontrolo 
kakovosti. 
35. Analize sposobnosti preživetja celic in hormonov je treba izvesti, kot je 
določeno v odstavkih 42 do 46. Mejno vrednost (najnižja koncentracija z 
opaženim u činkom, LOEC) in odlo čitev o razvrstitvi je treba sporo čiti in 
primerjati z vrednostmi v tabeli 3. Podatki se štejejo za sprejemljive, če 
izpolnjujejo najnižjo koncentracijo z opaženim u činkom in odlo čitev o 
razvrstitvi iz tabele 3.  
Tabela 3  
Mejne vrednosti (LOEC) in odlo čitev o razvrstitvi kemikalij za preskušanje 
usposobljenosti  
Št. CAS LOEC (μM) Odlo čitev o razvrstitvi 
T E2 T E2  
Prokloraz 67747-09-5 ≤ 0,1 ≤ 1,0 + (  a ) (zaviranje) + (zaviranje) 
Forskolin 66575-29-9 ≤ 10 ≤ 0,1 + (povzro čanje) + (povzro čanje) 
Atrazin 1912-24-9 ≤ 100 ≤ 10 + (povzro čanje) + (povzro čanje) 
Aminoglutetimid 125-84-8 ≤ 100 ≤ 100 + (zaviranje) + (zaviranje)  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 898
 
Št. CAS LOEC (μM) Odlo čitev o razvrstitvi 
T E2 T E2  
Bisfenol A 80-05-7 ≤ 10 ≤ 10 + (zaviranje) + (povzro čanje) 
HCG 9002-61-3 n. r. n. r. Negativno Negativno  
( a ) + : pozitivno. 
N. r.: ni relevantno, ker ne sme biti sprememb po izpostavljenosti necitotoksi čnim koncentracijam nega ­
tivnega kontrolnega vzorca.  
Plošča za kontrolo kakovosti  
36. Ploš ča za kontrolo kakovosti se uporablja za preverjanje delovanja celic 
H295R pod normalnimi pogoji za kulture ter za vzpostavitev zbirke prete ­
klih podatkov za koncentracije hormonov v kontrolnih vzorcih s topilom, pozitivnih in negativnih kontrolnih vzorcih ter za druge meritve kontrole kakovosti v daljšem obdobju. 
— Delovanje celic H295R je treba oceniti s ploš čo za preverjanje kakovosti 
za vsako novo serijo ATCC ali po prvi uporabi predhodno zamrznjene 
zaloge celic, razen če je bil preskus usposobljenosti laboratorija 
(odstavki 32–34) opravljen s to serijo celic. 
— Plošča za kontrolo kakovosti zagotavlja popolno oceno preskusnih 
pogojev (npr. sposobnost preživetja celic, kontrolni vzorci s topilom, negativnih in pozitivnih kontrolnih vzorcev ter spremenljivost v 
preskusih in med njimi) pri preskušanju kemikalij in bi morala biti 
del vsake ponovitve preskusa. 
37. Preskus kontrole kakovosti se izvede na ploš či s 24 jamicami, pri čemer se 
upoštevajo enaki postopki inkubacije, odmerjanja, sposobnosti preživetja celice/citotoksi čnosti, ekstrakcije hormonov in analize hormonov, kot so 
opisani v odstavkih 38 do 46 za preskušanje kemikalij. Ploš ča za kontrolo 
kakovosti zajema slepe vzorce, kontrolne vzorce s topili ter dve koncen ­
traciji znanega povzro čitelja (forskolin, 1, 10 μM) in zaviralca (prokloraz, 
0,1, 1 μM) sinteze E2 in T. Poleg tega se v izbranih jamicah uporabi MeOH 
kot pozitivni kontrolni vzorec za preskus sposobnosti preživetja/citotoksi ­ 
čnost. Podroben opis razporeditve ploš če je naveden v tabeli 4. Merila, ki 
jih mora ploš ča za kontrolo kakovosti izpolnjevati, so navedena v tabeli 5. 
Najmanjša osnovna proizvodnja hormonov za T in E2 mora biti izpolnjena 
tako v kontrolnem vzorcu s topilom kot v praznih jamicah.
 
Tabela 4  
Razporeditev ploš če za kontrolo kakovosti za preskušanje delovanja neizpostavljenih 
celic H295R ter celic, izpostavljenih znanim zaviralcem (PRO = prokloraz) in spodbujevalcem (FOR = forskolin) proizvajanja E2 in T. Po koncu preskusa 
izpostavljenosti in odstranitvi gojiš ča se vsem jamicam z MeOH doda 70-odstotna 
raztopina metanola, ki deluje kot pozitivni kontrolni vzorec za citotoksi čnost (glej 
preskus citotoksi čnosti v Dodatku III k validacijskemu poro čilu (4))
 
1 2 3 4 5 6  
A Prazno (  a ) Prazno (  a ) Prazno (  a ) Prazno (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) Prazno (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) Prazno (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) 
B DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 899
 
1 2 3 4 5 6  
C FOR 1 
μM FOR 1 
μM FOR 1 
μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM 
D FOR 10 
μM FOR 10 
μM FOR 10 
μM PRO 1 μM PRO 1 μM PRO 1 μM 
( a ) Celice v praznih jamicah prejmejo le gojiš če (tj. nič topila). 
( b ) Metanol (MeOH) se doda po koncu izpostavljenosti in ko je gojiš če odstranjeno iz teh jamic. 
( c ) Kontrolni vzorec s topilom DMSO (1 μl/jamico).  
Tabela 5  
Merila uspešnosti za ploš čo za kontrolo kakovosti  
T E2  
Osnovna proizvodnja 
hormona v kontrolnem vzorcu s topilom (KVT) ≥ 5-kratnik meje 
določljivosti ≥ 2,5-kratnik meje 
določljivosti 
Povzročanje (10 μM 
forskolina) ≥ 1,5-kratnik KVT ≥ 7,5-kratnik KVT 
Zaviranje (1 μM proklo ­
raza) ≤ 0,5-kratnik KVT ≤ 0,5-kratnik KVT
 
POSTOPEK KEMI ČNE IZPOSTAVLJENOSTI 
38. Predhodno inkubirane celice se odstranijo iz inkubatorja (odstavek 21) in 
preverijo pod mikroskopom, da se zagotovi, da so pred odmerjanjem v 
dobrem stanju (pritrditev, morfologija). 
39. Celice se postavijo v biološko varno omaro, obogateno gojiš če pa se 
odstrani in nadomesti z novim obogatenim gojiš čem (1 ml/jamico). Pripo ­
ročeno topilo za to metodo je DMSO. Če obstajajo razlogi za uporabo 
drugega topila, se to znanstveno utemelji. Celice so izpostavljene preskusni 
kemikaliji z dodajanjem 1 μl ustrezne založne raztopine v DMSO (glej 
Dodatek II k validacijskemu poro čilu (4)) na 1 ml obogatenega gojiš ča 
(prostornina jamice). Tako je kon čna koncentracija v jamicah 0,1 % 
DMSO. Za zagotovitev ustreznega mešanja se na splošno priporo ča, da 
se ustrezna založna raztopina preskusne kemikalije v DMSO zmeša z 
obogatenim gojiš čem za pridobitev želene kon čne koncentracije posamez ­
nega odmerka, zmesi pa doda posamezni jamici takoj po odstranitvi starega gojišča. Če se uporabi ta možnost, mora koncentracija DMSO (0,1 %) ostati 
enaka v vseh jamicah. V jamicah, ki vsebujejo najvišji koncentraciji, se s 
stereomikroskopom vizualno oceni nastajanje oborine ali motnosti, ki kaže nepopolno topnost preskusne kemikalije. Če se opazita taki stanji (motnost, 
nastajanje oborine), se pregledajo tudi jamice, ki vsebujejo naslednje nižje 
koncentracije (in tako naprej), pri čemer se jamice, ki se niso v celoti 
spremenile v raztopino, izklju čijo iz nadaljnjega vrednotenja in analize. 
Plošča se za 48 ur vrne v inkubator pri 37 °C in 5 % CO
 2 v atmosferi z 
zrakom. Razporeditev ploš če s preskusno kemikalijo je prikazana v tabeli 6. 
Zaloge 1–7 kažejo razporeditev naraš čajočih odmerkov preskusne 
kemikalije.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 900
 
Tabela 6  
Shema odmerjanja za izpostavljenost celic H295R preskusnim kemikalijam v ploš či s 24 
jamicami  
1 2 3 4 5 6  
A DMSO DMSO DMSO Zaloga 4 Zaloga 4 Zaloga 4 
B Zaloga 1 Zaloga 1 Zaloga 1 Zaloga 5 Zaloga 5 Zaloga 5 
C Zaloga 2 Zaloga 2 Zaloga 2 Zaloga 6 Zaloga 6 Zaloga 6 
D Zaloga 3 Zaloga 3 Zaloga 3 Zaloga 7 Zaloga 7 Zaloga 7 
40. Po 48 urah se izpostavljene ploš če odstranijo iz inkubatorja, pri čemer se v 
vsaki jamici pod mikroskopom preverijo stanje celic (pritrditev, morfologija, 
stopnja konfluence) in znaki citotoksi čnosti. Gojiš če iz vsake jamice se 
razdeli na dva enaka dela (po približno 490 μl) ter prenese v dve lo čeni 
in ustrezno ozna čeni viali (tj. en alikvot za zagotovitev rezervnega vzorca za 
vsako jamico). Da se prepre či izsušitev celic, se gojiš če odstrani iz ene 
vrstice ali stolpca naenkrat in nadomesti z gojiš čem za preskus sposobnosti 
preživetja/citotoksi čnosti celice. Če se sposobnost preživetja/citotoksi čnost 
celice ne izmeri takoj, se v vsako jamico doda 200 μl PBS s Ca  2+ in Mg  2+ . 
Gojišča se zamrznejo pri – 80 °C do nadaljnje obdelave za analizo koncen ­
tracij hormonov (glej odstavke 44–46). Čeprav sta T in E2 v gojiš ču pri – 
80 °C na splošno stabilna vsaj 3 mesece, je treba v vsakem laboratoriju dokumentirati stabilnost hormonov med shranjevanjem. 
41. Takoj po odstranitvi gojiš ča se za vsako izpostavljeno ploš čo določi sposob­
nost preživetja/citotoksi čnost celic.
 
Določanje sposobnosti preživetja celice  
42. Za dolo čanje možnega vpliva preskusne kemikalije na sposobnost preživetja 
celice se lahko uporabi preskus sposobnosti preživetja/citotoksi čnosti celice 
po izbiri. Preskus mora zagotoviti dejansko meritev odstotka celic, 
sposobnih preživetja, v jamici, ali dokazati, da je neposredno primerljiva 
s preskusom Live/Dead® (njegovo linearno funkcijo) (glej Dodatek III k validacijskemu poro čilu (4)). Drugi preskus, ki dokazano deluje enako 
dobro, je preskus MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolijev 
bromid] (18). Ocena sposobnosti preživetja celic z uporabo zgornje metode 
je relativna meritev, ki ne kaže nujno linearnih povezav z absolutnim številom celic v jamici. Zato mora analitik izvesti vzporedno subjektivno vizualno oceno vsake jamice, pri čemer je treba posneti digitalne fotografije 
kontrolnih vzorcev s topilom ter vzeti dve najve čji necitotoksi čni koncen ­
traciji in ju arhivirati, da se omogo či poznejša ocena dejanske gostote celic, 
če je to potrebno. Če se na podlagi vizualnega pregleda ali preskusa sposob ­
nosti preživetja/citotoksi čnosti zdi, da se je število celic pove čalo, je treba to 
domnevno pove čanje preveriti. Če se pove čanje števila celic potrdi, je treba 
to navesti v poro čilu o preskusu. Sposobnost preživetja celic bo izražena 
glede na povpre čni odziv v kontrolnih vzorcih s topilom, ki se šteje kot 
100-odstotna sposobnost preživetja celic, in se izra čuna, kot je ustrezno za 
uporabljeni preskus sposobnosti preživetja/citotoksi čnosti celic. Za preskus 
MTT se lahko uporabi naslednja formula:
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 901
 
% celic, sposobnih preživetja  = (odziv v jamici – povpre čni odziv v 
jamicah, obdelanih z MeOH [= 100-odstotna smrtnost]) ÷ (povpre čni 
odziv v jamicah preskusnih vzorcev s topilom – povpre čni odziv v jamicah, 
obdelanih z MeOH [= 100-odstotna smrtnost]). 
43. Jamice s sposobnostjo preživetja, manjšo od 80 % glede na povpre čno 
sposobnost preživetja v kontrolnih vzorcih s topilom (= 100-odstotno preži ­
vetje), se ne smejo vklju čiti v analizo kon čnih podatkov. Zaviranje steroi ­
dogeneze, ki se pojavi ob prisotnosti skoraj 20-odstotne citotoksi čnosti, je 
treba skrbno ovrednotiti za zagotovitev, da citotoksi čnost ni vzrok za 
zaviranje.  
Analiza hormonov  
44. Vsak laboratorij lahko za analizo T in E2 uporabi sistem za merjenje 
hormonov po izbiri. Za pripravo razred čin se lahko uporabijo rezervni 
alikvoti gojiš ča iz posamezne tretirane skupine, da se koncentracija uskladi 
z linearnim delom umeritvene krivulje. Kot je navedeno v odstavku 29, 
mora vsak laboratorij dokazati skladnost svojega sistema za merjenje hormonov (npr. ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) z merili kontrole kako ­
vosti, tako da pred izvedbo kontrole kakovosti ali preskušanja kemikalij 
analizira gojiš če s primešanim hormonom interne kontrole. Za zagotovitev, 
da deli preskusnega sistema ne vplivajo na meritev hormonov, bo hormone morda treba pred njihovim merjenjem ekstrahirati iz gojiš ča (glej odstavek 
30 za pogoje, pod katerimi se ekstrakcija zahteva, in pogoje, pod katerimi 
se ne zahteva). Priporo ča se izvedba ekstrakcije na podlagi postopkov iz 
Dodatka III k validacijskemu poro čilu (4). 
45. Če se za meritev proizvajanja hormonov uporablja komplet za preskušanje, 
ki je na voljo na tržiš ču, je treba analizo hormonov izvesti, kot je dolo čeno 
v navodilih, ki jih je kompletu za preskušanje priložil proizvajalec. Ve čina 
proizvajalcev uporablja edinstven postopek za izvedbo analize hormonov. Razredčine vzorcev je treba prilagoditi tako, da bodo pri čakovane koncen ­
tracije hormonov v kontrolnih vzorcih s topilom na sredini linearnega 
razpona umeritvene krivulje posameznega preskusa (Dodatek III k validacij ­
skemu poro čilu (4)). Vrednosti zunaj linearnega dela umeritvene krivulje je 
treba zavre či. 
46. Kon čne koncentracije hormonov se izra čunajo, kot sledi: 
Primer: 
Ekstrahirano: 450 μl gojišča 
Obdelano v: 250 μl pufra za preskus 
Razredčina pri preskusu: 1:10 (za uskladitev vzorca z linearnim 
razponom umeritvene krivulje) 
Koncentracija hormonov pri 
preskusu: 150 pg/ml (že prilagojeno koncentraciji 
na ml preskušenega vzorca) 
Izkoristek: 89 % 
Končna koncentracija hormonov 
= (Koncentracija hormonov (na ml) ÷ 
izkoristek) (faktor razred čenja) 
Končna koncentracija hormonov 
= (150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 
10 = 936,3 pg/ml
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 902
 
Izbira preskusnih koncentracij  
47. Izvesti je treba vsaj dva neodvisna poteka preskusa. Če predhodne infor ­
macije, kot so informacije o mejah topnosti ali citotoksi čnosti, ne zagota ­
vljajo podlage za izbiro preskusnih koncentracij, se priporo ča, da se 
preskusne koncentracije za prvi potek preskusa razporedijo v intervalih log
 10 , pri čemer je najve čja koncentracija 10  -3 M. Če je kemikalija topna 
in ni citotoksi čna pri nobeni preskušeni koncentraciji ter je bil prvi potek 
preskusa negativen pri vseh koncentracijah, je treba to potrditi še z enim potekom preskusa z uporabo enakih pogojev kot pri prvem poteku preskusa (tabela 7). Če so rezultati prvega poteka preskusa  dvoumni  (tj. je faktor 
spremembe statisti čno značilen pri kontrolnem vzorcu z raztopino pri samo 
eni koncentraciji) ali pozitivni (tj. je faktor spremembe pri dveh ali ve č 
sosednjih koncentracijah statisti čno značilen), je treba preskus ponoviti, 
kot je navedeno v tabeli 7, z izboljšanjem izbranih preskusnih koncentracij. 
Preskusne koncentracije v drugem in tretjem poteku preskusa ( če je 
primerno) je treba prilagoditi na podlagi rezultatov oklepajo čih koncentracij 
iz prvega poteka preskusa, ki so sprožile u činek, z uporabo razporejanja 
koncentracij na podlagi 1/2-logaritma (npr. če so koncentracije 0,001, 0,01, 
0,1, 1, 10, 100 in 1000 μM iz prvega poteka preskusa povzro čile sproženje 
pri 1 in 10 μM, morajo biti koncentracije, preskušene v drugem poteku 
preskusa, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 in 100 μM), razen če je treba za doseganje 
najnižje koncentracije z opaženim u činkom uporabiti nižje koncentracije. V 
slednjem primeru je treba v drugem poteku preskusa z 1/2-logaritemsko 
skalo preskusiti vsaj pet koncentracij pod najnižjo koncentracijo, preskušeno pri prvem poteku preskusa. Če drugi potek preskusa ne potrdi prvega 
poteka (tj. se statisti čna značilnost ne pojavi pri predhodno pozitivno 
preskušeni koncentraciji ± 1 pove čanje koncentracije), je treba izvesti tretji 
preskus z uporabo izvirnih preskusnih pogojev. Dvoumni rezultati prvega poteka preskusa se štejejo za negativne, če opaženega u činka ni mogo če 
potrditi v nobenem od naslednjih dveh potekov preskusa. Dvoumni rezultati 
se štejejo za pozitiven odziv (u činek), če je mogo če odziv potrditi pri vsaj 
še enem poteku preskusa v okviru pove čanja koncentracije za ± 1 (glej 
oddelek 55 za postopek razlage podatkov).
 
Tabela 7  
Matrika odlo čanja za možne scenarije rezultatov  
Potek preskusa 1 Potek preskusa 2 Potek preskusa 3 Odlo čitev 
Scenarij Odlo čitev Scenarij Odlo čitev Scenarij Pozitivno Negativno  
Negativno Potrditev (  a ) Negativno Konec X 
Negativno Potrditev (  a ) Pozitivno Izboljšanje (  b ) Nega ­
tivno X 
Dvoumno (  c ) Izboljšanje (  b ) Negativno Potrditev (  a ) Nega ­
tivno X 
Dvoumno (  c ) Izboljšanje (  b ) Negativno Potrditev (  a ) Pozitivno X 
Dvoumno (  c ) Izboljšanje (  b ) Pozitivno X 
Pozitivno Izboljšanje (  b ) Negativno Potrditev (  a ) Pozitivno X  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 903
 
Potek preskusa 1 Potek preskusa 2 Potek preskusa 3 Odlo čitev 
Scenarij Odlo čitev Scenarij Odlo čitev Scenarij Pozitivno Negativno  
Negativno Potrditev (  a ) Pozitivno Izboljšanje (  b ) Pozitivno X 
Pozitivno Izboljšanje (  b ) Pozitivno Konec X  
( a ) Potrditev prejšnjega poteka preskusa z uporabo enake zasnove preskusa. 
( b ) Ponovitev preskusa pri razporeditvi koncentracij z 1/2-logaritmom (omejitev koncentracij, ki so se v predhodnem preskusu 
izkazale za znatno razli čne). 
( c ) Razmerje spremembe pri eni koncentraciji se statisti čno znatno razlikuje od kontrolnega vzorca z raztopino.  
Kontrola kakovosti preskusne ploš če 
48. Poleg izpolnjevanja meril kontrole kakovosti ploš č je treba izpolniti tudi 
druga merila kakovosti iz tabele 8, ki se nanašajo na sprejemljive variacije med podvojenimi jamicami, podvojenimi preskusi, linearnostjo in ob čutlji­
vostjo sistemov za merjenje hormonov, variabilnost med podvojenimi merit ­
vami hormonov istega vzorca in odstotkom izkoristka hormonskih dodatkov po ekstrakciji gojiš ča (če je primerno; glej odstavek 30 o zahtevah glede 
ekstrakcije). Podatki morajo biti razvrš čeni v sprejemljiva obmo čja, oprede ­
ljena za posamezne parametre, da se upoštevajo pri nadaljnjem vrednotenju. 
Če ta merila niso izpolnjenja, mora biti v razpredelnici navedeno, da 
zadevni vzorec ni izpolnjeval meril kontrole kakovosti in da ga je treba ponovno analizirati ali izlo čiti iz sklopa podatkov.
 
Tabela 8  
Sprejemljiva obmo čja in/ali variacije (%) za parametre preskusne ploš če za preskus celic 
H295R  
(LOQ: meja dolo čljivosti sistema za meritev hormonov. KV: Koeficient variacije; KVT: 
kontrolni vzorec s topilom; DPM: razgradnje na minuto)  
Primerjava med T E2  
Osnovna proizvodnja 
hormonov v KVT Razmerje spremembe, 
večje od LOQ ≥ 5-kratna ≥ 2,5-kratna 
Preskusi izpostavljenosti – 
v okviru KV ploš če za 
KVT (podvojene jamice) Absolutne koncentracije ≤ 30 % ≤ 30 % 
Preskusi izpostavljenosti – 
med KV ploš če za KVT 
(podvojeni preskusi) Faktor spremembe ≤ 30 % ≤ 30 % 
Sistem merjenja hormonov 
– občutljivost Zaznavno razmerje 
zmanjšanja glede na KVT ≥ 5-kratno ≥ 2,5-kratno 
Sistem merjenja hormonov 
– KV podvojene meritve za KVT (
 a ) Absolutne koncentracije ≤ 25 % ≤ 25 % 
Ekstrakcija iz gojiš ča – 
izkoristek notranjega stan ­
darda 3H ( če je primerno) DPM ≥ 65 % nominalno  
( a ) Nanaša se na ponovljene meritve istega vzorca.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 904
 
ANALIZA PODATKOV IN PORO ČANJE  
Analiza podatkov  
49. Za vrednotenje relativnega pove čanja/zmanjšanja kemijsko spremenjenega 
proizvajanja hormonov je treba rezultate normalizirati na srednjo vrednost 
kontrolnega vzorca s topilom vseh preskusnih ploš č in rezultate izraziti kot 
spremembe glede na kontrolne vzorce s topilom na posamezni preskusni plošči. Vse podatke je treba izraziti kot srednjo vrednost ± 1 standardni 
odklon. 
50. V analizo podatkov je treba vklju čiti le podatke o hormonih iz jamic, kjer je 
bila citotoksi čnost manjša od 20 %. Relativne spremembe je treba izra ču­
nati, kot sledi:  
relativna sprememba  = (koncentracija hormonov v posamezni jamici) ÷ 
(srednja koncentracija hormonov v vseh jamicah s kontrolnim vzorcem s 
topilom). 
51. Če se na podlagi vizualnega pregleda jamice ali preskusa sposobnosti preži ­
vetja/citotoksi čnosti iz odstavka 42 zdi, da se je število celic pove čalo, je 
treba to domnevno pove čanje preveriti. Če se pove čanje števila celic potrdi, 
je treba to navesti v poro čilu o preskusu. 
52. Pred izvedbo statisti čne analize je treba opraviti vrednotenje predpostavke 
normalnosti in homogenosti variance. Normalnost je treba ovrednotiti z uporabo standardnih verjetnostnih grafikonov ali drugih ustreznih statisti ­ 
čnih metod (npr. Shapiro-Wilkov preskus). Če podatki (razmerja sprememb) 
niso normalno porazdeljeni, jih je treba poskusiti približati normalni poraz ­
delitvi s pretvorbo. Če so podatki normalno porazdeljeni ali so blizu 
normalne porazdelitve, je treba razlike med skupinami koncentracij kemi ­
kalije in kontrolnim vzorcem s topilom analizirati z uporabo parametri čnega 
preskusa (npr. Dunnettov preskus), pri čemer je  koncentracija  neodvisna,  
odziv  (faktor spremembe) pa odvisna spremenljivka. Če so podatki 
normalno porazdeljeni, je treba uporabiti neparametri čni preskus (npr. 
Kruskal-Wallisov preskus, Steelov preskus). Razlike se štejejo za zna čilne, 
kadar je  p ≤ 0,05. Statisti čna vrednotenja se opravijo na podlagi povpre čnih 
vrednosti posamezne jamice, ki predstavlja neodvisne podatkovne to čke s 
podvojitvami. Pri čakuje se, da zaradi velikega razmika med odmerki v 
prvem poteku preskusa (skala log
 10 ) v veliko primerih ne bo mogo če opisati 
jasne odvisnosti med koncentracijo in odzivom, kjer bosta dva najve čja 
odmerka na linearnem delu sigmoidne krivulje. Zato se za prvi potek preskusa ali kateri koli drug sklop podatkov, pri katerem se pojavi to stanje 
(npr. kadar ni mogo če oceniti najve čje učinkovitosti), uporabi statistika s 
stalno spremenljivko tipa I, opisana zgoraj. 
53. Če na linearnem delu krivulje ležita ve č kot dve podatkovni to čki in kadar 
je mogoče izračunati najve čje učinkovitosti, kot je predvideno za nekatere 
od drugih potekov preskusa, ki se izvedejo z uporabo pollogaritemske 
razporeditve koncentracij izpostavljenosti, je treba za izra čun učinkovitih 
koncentracij (npr. EC50 in EC20) uporabiti verjetnostni, logaritemski ali drug ustrezen regresijski model. 
54. Rezultate je treba predstaviti v grafi čni (palični grafikon, ki predstavlja 
srednjo vrednost +/– 1 standardni odklon) in tabelarni (najnižja koncentra ­
cija z opaženim u činkom/koncentracija brez opaznega u činka, smer u činka 
in moč največjega odziva, ki je del dela podatkov o odvisnosti med 
odmerkom in odzivom) obliki (za primer glej sliko 3). Ocena podatkov se šteje za veljavno le, če je temeljila na vsaj dveh neodvisno izvedenih 
potekih preskusa. Preskus ali potek preskusa se šteje za neodvisen, če je bil 
izveden na drug dan z uporabo novega kompleta raztopin in kontrolnih vzorcev. Obseg koncentracij, uporabljen v drugem in tretjem poteku preskusa ( če je potrebno), se lahko prilagodi na podlagi rezultatov prvega 
poteka preskusa, da se bolje opredeli obmo čje odziva na odmerek, ki 
vsebuje najnižjo koncentracijo z opaženim u činkom (glej odstavek 47).
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 905
 
Slika 3  
Primer predstavitve in vrednotenja podatkov, pridobljenih med izvajanjem preskusa celic 
H295R, v grafi čni in tabelarni obliki  
(Zvezdice ozna čujejo statisti čno značilne razlike kontrolnega vzorca s topilom ( p < 0,05). LOEC: 
najnižja koncentracija z opaženim u činkom; najve čja sprememba: najve čja moč odziva, opažena pri 
kateri koli koncentraciji, v primerjavi s povpre čnim odzivom kontrolnega vzorca s topilom (= 1))
  
Kemikalija LOEC Najve čja sprememba  
Forskolin 0,01 0,15-kratna 
Letrozol 0,001 29-kratna  
Postopek razlage podatkov  
55. Preskusna kemikalija se oceni za pozitivno, če se razmerje indukcije stati ­
stično razlikuje ( p ≤ 0,05) od kontrolnega vzorca s topilom v dveh sosed ­
njih koncentracijah v vsaj dveh neposredno opravljenih potekih preskusa (tabela 7). Preskusa kemikalija se oceni za negativno na podlagi dveh 
neodvisnih negativnih potekov preskusa ali v treh potekih preskusa, ki 
zajemata dva negativna poteka preskusa in en dvoumen ali pozitiven potek preskusa. Če podatki, pridobljeni v treh neodvisnih preskusih, ne 
izpolnjujejo meril za odlo čitev iz tabele 7, rezultatov preskusa ni mogo če 
interpretirati. Rezultati pri koncentracijah, ki presegajo meje topnosti, ali pri 
citotoksičnih koncentracijah ne smejo biti vklju čeni v razlago rezultatov.
 
Poročilo o preskusu  
56. Poro čilo o preskusu mora vklju čevati naslednje informacije:  
Preskuševalni laboratorij:  
— ime in kraj laboratorija, 
— vodjo študije ter drugo osebje in njihove pristojnosti v zvezi s študijo, 
— datum za četka študije in datum konca študije.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 906
 
Preskusna kemikalija, reagenti in kontrolni vzorci:  
— identiteto (ime, št. CAS, kot je ustrezno), vir, številko lota/serije, čistoto, 
dobavitelja ter opredelitev preskusne kemikalije, reagentov in kontrolnih 
vzorcev, 
— agregatno stanje in ustrezne fizikalno-kemijske lastnosti preskusne 
kemikalije, 
— pogoje shranjevanja ter metodo in pogostost priprave preskusnih kemi ­
kalij, reagentov in kontrolnih vzorcev, 
— stabilnost preskusne kemikalije.  
Celice:  
— vir in vrsto celic, 
— število celi čnih pasaž (identifikator celi čne pasaže) celic, uporabljenih v 
preskusu, 
— opis postopkov za ohranitev celi čnih kultur.  
Zahteve pred preskušanjem ( če je ustrezno):  
— opis in rezultate preskusa vpliva kemikalij na preskus hormonov, 
— opis in rezultate meritev u činkovitosti ekstrakcije hormonov, 
— umeritvene in umeritvene krivulje za vse analiti čne preskuse, ki jih je 
treba izvesti, 
— meje zaznavnosti za izbrane analiti čne preskuse.  
Preskusni pogoji:  
— sestavo gojiš ča, 
— koncentracijo preskusne kemikalije, — gostoto celic (ocenjena ali izmerjena koncentracija celic po 24 urah in 
48 urah), 
— topnost preskusne kemikalije (meja topnosti, če je dolo čena), 
— čas in pogoje inkubacije.
 
Rezultati preskusa:  
— neobdelane podatke za vse jamice za kontrolne vzorce in preskusne 
kemikalije – vsako podvojeno meritev v obliki izvirnih podatkov, prid ­
obljenih z instrumentom, uporabljenim za meritev proizvajanja hormonov (npr. opti čna gostota, enote fluorescence, razgradnja na 
minuto itd.), 
— validacijo normalnosti ali razlago pretvorbe podatkov, — srednjo vrednost odzivov ± 1 standardni odklon za vsako izmerjeno 
jamico, 
— podatke o citotoksi čnosti (preskusne koncentracije, ki so povzro čile 
citotoksičnost), 
— potrditev, da so bile zahteve glede kontrole kakovosti izpolnjene,
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 907
 
— relativno spremembo v primerjavi s kontrolnim vzorcem s topilom, s 
popravkom za citotoksi čnost, 
— palični grafikon, ki kaže relativno spremembo (razmerje spremembe) pri 
posamezni koncentraciji, standardni odklon in statisti čno značilnost, kot 
je navedeno v odstavkih 49–54.  
Razlaga podatkov:  
— uporabo postopka za razlago podatkov za rezultate in razpravo o 
ugotovitvah.  
Razprava:  
— ali v študiji obstajajo znaki za možnost, da bi lahko na podatke o T/E2 
vplivali posredni u činki na glukokortikoidne in mineralokortikoidne 
poti?  
Sklepne ugotovitve  
VIRI  
(1) OECD (2002), OECD Conceptual Framework for the Testing and Asses ­
sment of Endocrine Disrupting Chemicals, v Dodatku 2 k poglavju B.54 te 
priloge. 
(2) Hecker, M., Newsted, J.L., Murphy, M.B., Higley, E.B., Jones, P.D., Wu, 
R. and Giesy, J.P. (2006), Human adrenocarcinoma (H295R) cells for 
rapid in vitro determination of effects on steroidogenesis: Hormone production,  Toxicol. Appl. Pharmacol.,  217, 114–124. 
(3) Hecker, M., Hollert, H., Cooper, R., Vinggaard, A.-M., Akahori, Y., 
Murphy, M., Nellemann, C., Higley, E., Newsted, J., Wu, R., Lam, P., 
Laskey, J., Buckalew, A., Grund, S., Nakai, M., Timm, G., and Giesy, 
J. P. (2007), The OECD validation program of the H295R steroidgenesis assay for the identification of in vitro inhibitors or inducers of testosterone and estradiol production, Phase 2: inter laboratory pre-validation studies.  
Env. Sci. Pollut. Res ., 14, 23–30. 
(4) OECD (2010),  Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis 
Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production , 
OECD Series of Testing and Assessment No. 132, ENV/JM/MO ­
NO(2010)31, Paris. Na voljo na [http://www.oecd.org/document/30/ 0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1 _1,00.html]. 
(5) OECD (2010),  Peer Review Report of the H295R Cell-Based Assay for 
Steroidogenesis,  OECD Series of Testing and Assessment No. 133, ENV/ 
JM/MONO(2010)32, Paris. Na voljo na: [http://www.oecd.org/document/ 
30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1_1, 00.html]. 
(6) Battelle (2005), Detailed Review Paper on Steroidogenesis. Na voljo na: 
[http://www.epa.gov/endo/pubs/edmvs/steroidogenesis_drp_fi ­
nal_3_29_05.pdf]. 
(7) Hilscherova, K., Jones, P. D., Gracia, T., Newsted, J. L., Zhang, X., 
Sanderson, J. T., Yu, R. M. K., Wu, R. S. S. and Giesy, J. P. (2004), Assessment of the Effects of Chemicals on the Expression of Ten Steroi ­
dogenic Genes in the H295R Cell Line Using Real-Time PCR,  Toxicol. 
Sci., 81, 78–89. 
(8) Sanderson, J. T., Boerma, J., Lansbergen, G. and Van den Berg, M. 
(2002), Induction and inhibition of aromatase (CYP19) activity by various classes of pesticides in H295R human adrenocortical carcinoma cells,  
Toxicol. Appl. Pharmacol.,  182, 44–54. 
(9) Breen, M.S., Breen, M., Terasaki, N., Yamazaki, M. and Conolly, R.B. 
(2010), Computational model of steroidogenesis in human H295R cells to 
predict biochemical response to endocrine-active chemicals: Model deve ­
lopment for metyrapone,  Environ. Health Perspect.,  118: 265–272.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 908
 
(10) Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), 
Assessment of chemical effects on aromatase activity using the H295R cell 
line, Environ. Sci. Poll. Res.,  17:1137–1148. 
(11) Gazdar, A. F., Oie, H. K., Shackleton, C. H., Chen, T. R., Triche, T. J., 
Myers, C. E., Chrousos, G. P., Brennan, M. F., Stein, C. A. and La Rocca, R. V. (1990), Establishment and characterization of a human adrenocor ­
tical carcinoma cell line that expresses Multiple pathways of steroid 
biosynthesis,  Cancer Res.,  50, 5488–5496. 
(12) He, Y.H., Wiseman, S.B., Zhang, X.W., Hecker, M., Jones, P.D., El-Din, 
M.G., Martin, J.W. and Giesy, J.P. (2010), Ozonation attenuates the steroi ­
dogenic disruptive effects of sediment free oil sands process water in the 
H295R cell line,  Chemosphere,  80:578–584. 
(13) Zhang, X.W., Yu, R.M.K., Jones, P.D., Lam, G.K.W., Newsted, J.L., 
Gracia, T., Hecker, M., Hilscherova, K., Sanderson, J.T., Wu, R.S.S. and Giesy, J.P. (2005), Quantitative RT-PCR methods for evaluating 
toxicant-induced effects on steroidogenesis using the H295R cell line,  
Environ. Sci. Technol.,  39:2777–2785. 
(14) Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), 
Differential assessment of chemical effects on aromatase activity, and E2 and T production using the H295R cell line,  Environ. Sci. Pol. Res.,  
17:1137–1148. 
(15) Rainey, W. E., Bird, I. M., Sawetawan, C., Hanley, N. A., Mccarthy, J. L., 
Mcgee, E. A., Wester, R. and Mason, J. I. (1993), Regulation of human adrenal carcinoma cell (NCI-H295) production of C19 steroids,  J. Clin. 
Endocrinol. Metab.,  77, 731–737. 
(16) Poglavje B.55 te priloge: Hershbergerjev biološki preskus na podganah: 
kratkotrajni presejalni preskus za (anti)androgene lastnosti. 
(17) Shapiro, R., and Page, L.B. (1976), Interference by 2,3-dimercapto-1- 
propanol (BAL) in angiotensin I radioimmunoassay,  J. Lab. Clin. Med.,  
2, 222–231. 
(18) Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for growth and survival: 
application to proliferation and cytotoxicity assays,  J. Immunol. Methods.,  
65, 55–63. 
(19) Brock, B.J., Waterman, M.R. (1999). Biochemical differences between rat 
and human cytochrome P450c17 support the different steroidogenic needs 
of these two species, Biochemistry. 38:1598–1606. 
(20) Oskarsson, A., Ulleras, E., Plant, K., Hinson, J. Goldfarb, P.S., (2006), 
Steroidogenic gene expression in H295R cells and the human adrenal gland: adrenotoxic effects of lindane in vitro, J. Appl. Toxicol., 
26:484–492.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 909
Dodatek  
OPREDELITEV POJMOV:  
Konfluentnost  se nanaša na pokritje ali množitev, ki je celicam dovoljena v 
gojišču kulture ali čez njega.  
Kemikalija  pomeni snov ali zmes.  
KV pomeni koeficient variacije in je opredeljen kot razmerje med standardnim 
odklonom porazdelitve in njegovo aritmeti čno sredino.  
CYP  pomeni citokrom P450 mono-oksigenaze, družino genov in encimov, ki jih 
proizvajajo, ki sodelujejo pri katalizi razli čnih biokemijskih reakcij, vklju čno s 
sintezo in presnovo steroidnih hormonov.  
DPM  pomeni število razgradenj na minuto. To je število atomov v dani koli čini 
radioaktivne snovi, za katero se zazna, da razpade v eni minuti.  
E2 je 17β-estradiol, tj. najpomembnejši estrogen v sistemih sesalcev. 
Celice  H295R  so človeške adenokarcinomske celice, ki imajo fiziološke lastnosti 
consko nediferenciranih človeških fetalnih celic nadledvi čnice in izražajo vse 
encime steroidogenezne poti. Zagotavlja jih ATCC.  
Gojišče za zamrzovanje  se uporablja za zamrzovanje in shranjevanje zamrz ­
njenih celic. Zajema založno gojiš če ter BD Nu-Serum in dimetilsulfoksid.  
Linearni razpon  je razpon v okviru umeritvene krivulje za sistem meritve 
hormonov, kjer so rezultati sorazmerni s koncentracijo analita, prisotnega v 
vzorcu.  
LOQ  je kratica za 'mejo dolo čljivosti' in je najmanjša koli čina kemikalije, ki jo je 
mogoče razločiti od odsotnosti kemikalije (slepa vrednost) v dani meji zaupanja. 
Za namen te metode mejo dolo čljivosti obi čajno opredeli proizvajalec preskusnih 
sistemov, če ni dolo čeno druga če. 
LOEC  je najnižja koncentracija z opaženim u činkom, tj. najmanjša raven 
koncentracije, pri kateri se odziv pri preskusu statisti čno razlikuje od odziva 
kontrolnega vzorca s topilom.  
NOEC  je koncentracija brez opaznega u činka, ki je najvišja preskušena koncen ­
tracija, če pri preskusu ni pozitivnega odziva.  
Pasaža  je število delitev celic po iniciaciji kulture iz zamrznjene zaloge. Za četna 
pasaža, ki se je za čela iz zamrznjene zaloge, ima številko ena (1). Celice, ki so se 
delile enkrat, so ozna čene kot pasaža 2 itd.  
PBS je Dulbeccov fosfatni pufer s soljo.  
Kontrola kakovosti , okrajšano QC, pomeni ukrepe, ki so potrebni za zagoto ­
vitev veljavnih podatkov.  
Plošča za kontrolo kakovosti  je plošča s 24 jamicami, ki vsebuje dve koncen ­
traciji pozitivnih in negativnih kontrolnih vzorcev za spremljanje uspešnosti nove serije celic ali zagotavljanje pozitivnih kontrolnih vzorcev za preskušanje 
kemikalij.  
Ponovitev  je neodvisen preskus z novim kompletom raztopin in kontrolnih 
vzorcev.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 910
 
Založno gojiš če je osnova za pripravo drugih reagentov. Sestavljen je iz zmesi 
Dulbeccovega gojiš ča Modified Eagle in Hamove zmesi hranil F-12 
(DMEM/F12) v razmerju 1:1 v 15 mM pufra HEPES brez fenol rde čega ali 
natrijevega bikarbonata. Natrijev bikarbonat se doda kot pufer; glej Dodatek II k validacijskemu poro čilu (4).  
Obogateno gojiš če zajema založno gojiš če ter BD Nu-Serum in visokokakovo ­
stno zmes ITS+; glej Dodatek II k validacijskemu poro čilu (4).  
Steroidogeneza  je pot sinteze, ki vodi od holesterola do razli čnih steroidnih 
hormonov. Ve č vmesnih produktov na poti sinteze steroidov, kot sta progesteron 
in testosteron, je pomembnih hormonov samih po sebi, vendar delujejo tudi kot predhodne sestavine za hormone nižje na poti sinteze.  
T pomeni testosteron, enega od dveh najpomembnejših androgenov v sistemu 
sesalcev.  
Preskusna kemikalija  je katera koli snov ali zmes, ki se preskuša s to preskusno 
metodo.  
Preskusna ploš ča je plošča, na kateri so celice H295R izpostavljene preskusnim 
kemikalijam. Preskusne ploš če vsebujejo kontrolni vzorec s topilom in preskusno 
kemikalijo v sedmih stopnjah koncentracije v treh ponovitvah.  
Tripsin 1X  je razred čena raztopina encima tripsina, tj. serinska proteaza trebušne 
slinavke, ki se uporablja za odstopitev celic s ploš če za gojenje; glej Dodatek III 
k validacijskemu poro čilu (4).
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 911
 
B.58  PRESKUS GENSKIH MUTACIJ NA SOMATSKIH IN KLI ČNIH 
CELICAH GENSKO SPREMENJENIH GLODAVCEV  
UVOD 
1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD št. 488 (2013). 
Na voljo so preskusne metode EU za številne preskuse mutacij  in vitro , ki 
lahko odkrijejo kromosomske in/ali genske mutacije. Obstajajo tudi preskusne metode za kon čne točke in vivo  (tj. kromosomske aberacije in 
nenačrtna sinteza DNA); vendar pa te metode ne merijo genskih mutacij. 
Preskusi mutacij pri gensko spremenjenih glodavcih (TGR) izpolnjujejo potrebo po prakti čnih in splošno razširjenih preskusih genskih mutacij  in 
vivo. 
2. Preskusi mutacij pri gensko spremenjenih glodavcih so bili obsežno pregle ­
dani (24) (33). Uporabljajo se gensko spremenjene podgane in miši z večkratnimi kopijami v kromosome vklju čenih prenosljivih vektorjev na 
osnovi plazmida ali faga. Transgeni vsebujejo poro čevalske gene za odkri ­
vanje razli čnih vrst mutacij, ki so jih preskusne kemikalije povzro čile in 
vivo. 
3. Mutacije pri glodavcih se ocenijo s pridobitvijo transgena in analizo feno ­
tipa poročevalskega gena v bakterijskem gostitelju, ki nima poro čevalskega 
gena. Preskusi genskih mutacij pri gensko spremenjenih glodavcih merijo mutacije, povzro čene pri genetsko nevtralnih genih, pridobljenih iz prak ­
tično katerega koli tkiva glodavca. Ti preskusi zato zaobidejo številne 
omejitve, povezane s prou čevanjem genskih mutacij v endogenih genih  in 
vivo (npr. omejeno število tkiv, primernih za analizo, negativna/pozitivna 
selekcija za mutacije). 
4. Iz dokazov je razvidno, da se transgeni na mutagene odzivajo podobno kot 
endogeni geni, zlasti glede substitucije baznih parov, premikov bralnega okvira ter majhnih delecij in insercij (24). 
5. Pri International Workshops on Genotoxicity Testing (mednarodna delav ­
nica o preskušanju genotoksi čnosti, IWGT) so odobrili vklju čitev preskusov 
genskih mutacij pri gensko spremenjenih glodavcih za odkrivanje genskih mutacij  in vivo  in priporo čili protokol za njihovo izvajanje (15) (29). Ta 
preskusna metoda temelji na teh priporo čilih. Za nadaljnjo analizo, ki 
podpira uporabo tega protokola, glej (16). 
6. Pričakuje se, da bo v prihodnosti preskus genskih mutacij pri gensko spre ­
menjenih glodavcih mogo če združiti s študijo strupenosti s ponavljajo čim se 
odmerkom (poglavje B.7 te priloge). Potrebni so podatki, ki bi zagotovili, 
da krajše, enodnevno obdobje med koncem obdobja odmerjanja in vzor če­
njem iz študije strupenosti s ponavljajo čim se odmerkom, ki pri preskusih 
genskih mutacij pri gensko spremenjenih glodavcih traja 3 dni, ne vpliva na 
občutljivost preskusa genskih mutacij pri gensko spremenjenih glodavcih. 
Potrebni so tudi podatki, ki kažejo, da uporaba seva gensko spremenjenih 
glodavcev namesto obi čajnih sevov glodavcev ne vpliva na uspešnost 
preskusa s ponavljajo čim se odmerkom. Ko bodo ti podatki na voljo, bo 
ta preskusna metoda posodobljena. 
7. Opredelitve klju čnih pojmov so navedene v Dodatku.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 912
 
ZAČETNI PREUDARKI 
8. Preskusi genskih mutacij pri gensko spremenjenih glodavcih, za katere je na 
voljo dovolj podatkov, ki podpirajo njihovo uporabo v tej preskusni metodi, 
so: miš z bakteriofagom z genom  lacZ  (Muta™Mouse); miš s plazmidom z 
genom  lacZ ; miš in podgana, ki sta  gpt in Spi  – negativni; miš in podgana z 
genom  lacI  (Big Blue®) pod standardnimi pogoji. Poleg tega se lahko 
preskus pozitivne selekcije gena  cII uporabi za vrednotenje mutacij v 
modelih Big Blue® in Muta™Mouse. Mutageneza pri modelih TGR se običajno oceni kot pogostnost mutantov; če je potrebno, pa se lahko 
dodatne informacije pridobi z molekularno analizo mutacij (glej odstavek 
24). 
9. Ti preskusi genskih mutacij  in vivo  pri glodavcih so posebno primerni za 
ocenjevanje nevarnosti mutagenosti, ker so odzivi preskusov odvisni od presnove  in vivo,  farmakokinetike in popravljanja DNA, čeprav so ti 
lahko razli čni pri razli čnih vrstah, tkivih in vrstah poškodb DNA. Preskus  
in vivo  za genske mutacije je koristen tudi za nadaljnjo preiskavo mutagenih 
učinkov, odkritih pri sistemu  in vitro,  in za spremljanje rezultatov preskusov 
z uporabo drugih kon čnih točk in vivo  (24). Poleg tega, da je vzro čno 
povezana z nastankom raka, je genska mutacija pomembna kon čna točka 
za napoved nerakastih bolezni na podlagi mutacij pri somatskih tkivih (12) 
(13) in bolezni, ki se prenašajo prek zarodne linije. 
10. Če obstajajo dokazi, da preskusna kemikalija ali zadevni metabolit ne bosta 
dosegla interesnih tkiv, izvajanje preskusa genskih mutacij pri gensko spre ­
menjenih glodavcih ni primerno.
 
NAČELO PRESKUSNE METODE 
11. V preskusih, opisanih v odstavku 8, je tar čni gen po izvoru bakterijski ali 
bakteriofag, iz genomske DNA glodavcev pa se pridobi z vklju čitvijo trans ­
gena v prenosljivi vektor na osnovi bakteriofaga λ ali plazmida. Pri 
postopku je potrebna ekstrakcija genomske DNA iz interesnega tkiva 
glodavcev, obdelava genomske DNA  in vitro  (tj. pakiranje vektorjev λ ali 
ligacija in elektroporacija plazmidov za pridobitev prenosljivega vektorja), in posledi čno odkritje mutacij v bakterijskih gostiteljih pod ustreznimi 
pogoji. V preskusih se uporabljajo nevtralni transgeni, ki se zlahka pridobijo 
iz večine tkiv. 
12. Osnovni preskus genskih mutacij pri gensko spremenjenih glodavcih obsega 
tretiranje glodavca v dolo čenem obdobju. Kemikalije se lahko dajejo na 
kateri koli primerni na čin, vključno z vsaditvijo (npr. preskušanje medicin ­
skih pripomo čkov). Celotno obdobje, v katerem žival prejema odmerek, se 
imenuje obdobje odmerjanja. Odmerjanju obi čajno sledi obdobje pred 
usmrtitvijo, med katerim žival ne prejema kemikalije in med katerim se nepopravljene poškodbe DNA ustalijo kot stabilne mutacije. V virih se to obdobje razli čno imenuje sprememba, ustalitev ali izražanje; ob koncu tega 
obdobja sledi vzor čenje (15) (29). Po usmrtitvi živali se genomski DNA 
izolira iz interesnih tkiv in pre čisti.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 913
 
13. Podatki za eno samo tkivo na žival iz ve č pakiranj/ligacij se ponavadi 
združijo in pogostnost mutantov se obi čajno ovrednoti z uporabo skupno 
med 10  5 in 10  7 enot, ki delajo plake ali kolonije. Pri uporabi metod s 
pozitivno selekcijo se skupno število enot, ki tvorijo plake, dolo či z ločenim 
sklopom neselektivnih ploš č. 
14. Metode s pozitivno selekcijo so se razvile zaradi poenostavitve odkrivanja 
mutacij pri genu  gpt (gpt delta miš in podgana , gpt  – fenotip (20) (22) (28)) 
in genu  lacZ  (Muta™Mouse ali miš s plazmidom z genom  lacZ  (3) (10) 
(11) (30)); genske mutacije  lacI  v živalih Big Blue® se odkrivajo z nesele ­
ktivno metodo, ki mutante opredeli s proizvajanjem obarvanih (modrih) plakov. Metodologija pozitivne selekcije je v uporabi tudi za odkrivanje točkovnih mutacij v genu  cII prenosljivega vektorja na osnovi bakteriofaga 
λ [miš ali podgana Big Blue® in miš Muta™Mouse (17)] in delecijske 
mutacije v λ rdečih in gam  genih (selekcija Spi
 – v miši in podgani z 
genom  gpt (21) (22) (28)). Pogostnost mutantovse izra čuna tako, da se 
število plakov/plazmidov z mutacijami v transgenu deli s skupnim številom 
plakov/plazmidov, pridobljenih iz istega vzorca DNA. Sporo čeni parameter 
pri preskusih genskih mutacij pri gensko spremenjenih glodavcih je pogost ­
nost mutantov. Poleg tega je pogostnost mutantov mogo če določiti kot del 
celic, ki prenašajo neodvisne mutacije; pri tem izra čunu je potreben 
popravek za klonalno ekspanzijoz dolo čanjem zaporedja pridobljenih 
mutantov (24). 
15. Mutacije v preskusih to čkovnih mutacij v genih  lacI, lacZ, cII  in gpt so v 
glavnem sestavljene iz mutacij substitucij baznih parov, premikov bralnega 
okvira ter majhnih insercij/delecij. Sorazmerni delež teh vrst mutacij med spontanimi mutacijami je podoben kot pri tistem v endogenem genu  Hprt.  
Obsežne delecije je mogo če zaznati samo v preskusih s selekcijo Spi
 – in 
plazmidom  lacZ  (24). Interesne mutacije so mutacije  in vivo  v miši ali 
podgani. Mutacije  in vitro  in ex vivo , ki se lahko pojavijo med pridobiva ­
njem, podvajanjem ali popravilom fagov/plazmidov, so relativno redke, v nekaterih sistemih pa jih lahko bakterijski gostitelj/sistem pozitivne selekcije 
posebej identificira ali izklju či.
 
OPIS PRESKUSNE METODE  
Priprava  
Izbira živalskih vrst  
16. Na voljo so številni modeli za odkrivanje genskih mutacij v gensko spre ­
menjeni miši, njihova uporaba pa je bolj razširjena od modelov z gensko 
spremenjeno podgano. Če je podgana o čitno primernejši model od miši 
(npr. pri preiskovanju mehanizma karcinogeneze za tumor, ki se pojavi samo pri podganah, za povezavo s študijami strupenosti pri podganah, ali če je presnova podgane bolj reprezentativna za človeško presnovo), je treba 
razmisliti o uporabi modelov z gensko spremenjeno podgano.
 
Nastanitveni in prehranjevalni pogoji  
17. Temperatura v prostoru s preskusnimi živalmi naj bo 22 °C (± 3 °C). 
Čeprav naj bi bila relativna vlažnost vsaj 30 % in naj po možnosti ne bi 
presegala 70 %, razen v času čiščenja prostora, bi cilj moral biti ohranjanje 
50–60-odstotne relativne vlažnosti. Osvetlitev naj bo umetna, pri čemer je 
zaporedje 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporablja  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 914
 
konvencionalna laboratorijska prehrana z neomejeno oskrbo s pitno vodo. 
Na izbiro prehrane lahko vpliva potreba po zagotovitvi ustrezne primesi 
preskusne kemikalije, kadar se daje na ta na čin. Če agresivno vedenje ni 
pričakovano, je treba živali namestiti v majhnih skupinah (po najve č pet 
živali) istega spola. Če je to znanstveno upravi čeno, so lahko živali nameš ­ 
čene posami čno. 
Priprava živali  
18. Zdrave mlade spolno zrele odrasle živali (ob za četku tretiranja stare 8–12 
tednov) se naklju čno razdelijo v kontrolne in tretirane skupine. Živali se 
označijo z edinstvenimi oznakami. Živali se vsaj pet dni prilagajajo na 
laboratorijske razmere. Kletke je treba razporediti tako, da so možni u činki 
zaradi njihovega položaja čim manjši. Ob za četku študije naj bo razlika med 
težami živali čim manjša in naj ne presega ± 20 % srednje vrednosti teže 
vsakega spola.  
Priprava odmerkov  
19. Trdne preskusne kemikalije naj se pred odmerjanjem živalim raztopijo ali 
suspendirajo v ustreznih topilih ali nosilcih ali primešajo prehrani ali pitni 
vodi. Teko če preskusne kemikalije se lahko odmerijo neposredno ali pa se 
pred odmerjanjem razred čijo. Pri izpostavljenosti z vdihavanjem se lahko 
preskusne kemikalije dajejo v obliki plina, pare ali trdnega/teko čega aero­
sola, odvisno od njihovih fizikalno-kemijskih lastnosti. Uporabljajo naj se 
sveže pripravljene preskusne kemikalije, razen če podatki o stabilnosti 
kažejo, da je shranjevanje sprejemljivo.  
Preskusni pogoji  
Topilo/nosilec  
20. Topilo/nosilec pri uporabljenih koli činah odmerkov naj nima strupenih 
učinkov in naj se zanj ne sumi, da kemi čno reagira s preskusno kemikalijo. 
Če se uporabijo manj poznana topila/nosilci, naj bo njihova uporaba podprta 
z referenčni podatki, ki kažejo na njihovo združljivost. Priporo ča se, da se, 
kadar koli je to mogo če, najprej razmisli o uporabi vodnega topila/nosilca.  
Pozitivni kontrolni vzorci  
21. Običajno je treba hkrati uporabiti živali pozitivne kontrole. Laboratoriji, ki 
so dokazali usposobljenost (glej odstavek 23) in redno izvajajo te preskuse, lahko za potrditev uspešnosti metode v vsako študijo vklju čijo DNA treti ­
ranih živali iz prejšnjih pozitivnih kontrol. DNA iz prejšnjih preskusov je 
treba pridobiti iz istih vrst in interesnih tkiv ter primerno shraniti (glej odstavek 36). Pri uporabi hkratnih pozitivnih kontrolnih vzorcev ni treba, da se odmerjajo na enak na čin kot preskusna kemikalija, vendar pa mora 
zanje biti znano, da povzro čajo mutacije v vsaj enem interesnem tkivu za 
preskusno kemikalijo. Odmerke kemikalije pozitivne kontrole je treba izbrati tako, da bodo sprožili blage ali zmerne u činke, na podlagi katerih 
bo mogo če kritično oceniti uspešnost in ob čutljivost preskusa. Primeri 
kemikalij pozitivne kontrole in nekatera njihova tar čna tkiva so navedeni 
v tabeli 1.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 915
 
Tabela 1  
Primeri kemikalij pozitivne kontrole in nekatera njihova tar čna tkiva  
Kemikalije pozitivne kontrole 
in njihove št. CAS Ime EINECS in št. EINECS Zna čilnosti Tarčno tkivo mutacije 
Podgana Miš  
N-etil-N-nitrozose čnina 
[št. CAS 759-73-9] N-etil-N-nitrozose čnina 
[212-072-2] Neposredno 
delujoč mutagen Jetra, plju ča Kostni mozeg, 
debelo črevo, epitelij 
debelega črevesa, 
črevesje, jetra, 
pljuča, vranica, 
ledvice, granulozne celice v jaj čnikih, 
moške kli čne celice 
Etil karbamat (uretan) 
[št. CAS 51-79-6] Uretan 
[200-123-1] Mutagen, potrebna 
je presnova, a ima 
samo blage u činke Kostni mozeg, pred ­ 
želodec, tanko 
črevo, jetra, plju ča, 
vranica 
2,4-diaminotoluen 
[št. CAS 95-80-7] 4-metil-m-fenilendiamin 
[202-453-1] Mutagen, potrebna 
je presnova, pozi ­
tiven je tudi v 
preskusu s Spi
 – Jetra Jetra 
Benzo[a]piren 
[št. CAS 50-32-8] Benzo[def]krizen 
[200-028-5] Mutagen, potrebna 
je presnova Jetra, 
omentum Kostni mozeg, prsi, 
debelo črevo, pred ­ 
želodec, žlezni želo ­
dec, srce, jetra, 
pljuča, moške kli čne 
celice  
Negativni kontrolni vzorci  
22. Negativne kontrolne vzorce, tretirane samo s topilom ali nosilcem, druga če 
pa tretirane enako kot tretirane skupine, je treba vklju čiti v vsako vzor čenje. 
Če pretekli ali objavljeni podatki ne dokazujejo, da izbrano topilo/nosilec ne 
povzroča nobenih škodljivih ali mutagenih u činkov, se v vsako vzor čenje 
vključijo neobdelani kontrolni vzorci, da se dokaže sprejemljivost kontrole 
nosilca.  
Preverjanje strokovnosti laboratorija  
23. Usposobljenost za izvajanje teh preskusov se dokaže s prikazom zmožnosti 
ponovitve pri čakovanih rezultatov iz objavljenih podatkov (24) za: 1) 
pogostnost mutacij s kemikalijami pozitivne kontrole (vklju čno z blagimi 
odzivi), kot so kemikalije iz tabele 1, nemutageni in kontrole nosilca, in 2) pridobivanje transgena iz genomskega DNA (npr. u činkovitost pakiranja).
 
Določanje zaporedja mutantov  
24. Za regulativno uporabo dolo čanje zaporedja DNA mutantov ni potrebno, 
zlasti če je dobljen jasen pozitiven ali negativen rezultat. Podatki o dolo ­ 
čanju zaporedja pa so lahko koristni pri pojavu visoke interindividualne 
variacije. V teh primerih se lahko dolo čanje zaporedja uporabi za izklju čitev 
pojava velikega števila mutantov (t. i. jackpots) ali klonov z opredelitvijo edinstvenih mutantov v dolo čenem tkivu. Dolo čanje zaporedja približno 10 
mutantov na tkivo na žival bi moralo zadoš čati za preprosto ugotavljanje, 
ali klonski mutanti prispevajo k pogostnosti mutantov; za matemati čno 
popravo pogostnosti mutantov za klonskost bo morda potrebnih tudi do
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 916
 
25 mutantov. Dolo čanje zaporedja mutantov bo morda potrebno tudi pri 
manjšem pove čanju pogostnosti mutantov (tj. ki komaj presežejo vrednosti 
v neobdelanih kontrolnih vzorcih). Razlike v spektru mutantov med kolo ­
nijami mutantov v tretiranih in netretiranih živalih bodo morda podprle mutageni u činek (29). Spektri mutantov so lahko koristni tudi za razvoj 
mehanisti čnih hipotez. Ko naj bi bilo dolo čanje zaporedja vklju čeno v 
protokol študije, je treba biti posebej pazljiv pri na črtovanju takšnih študij, 
zlasti glede števila mutantov z dolo čenim zaporedjem na vzorec, da se 
doseže ustrezna mo č glede na uporabljen statisti čni model (glej odstavek 
43).
 
POSTOPEK  
Število in spol živali  
25. Vnaprej dolo čeno število živali na skupino mora biti tolikšno, da se zago ­
tovi statisti čna moč, potrebna za odkrivanje vsaj podvajanja pogostnosti 
mutantov. Skupine naj bodo sestavljene iz vsaj pet živali; če je statisti čna 
moč premajhna, je treba pove čati število živali po potrebi. Obi čajno se 
uporabijo živali moškega spola. V nekaterih primerih bi bilo morda presku ­ 
šanje samo samic upravi čeno; na primer pri preskušanju zdravil, ki jih 
tipično uporabljajo ženske, ali raziskovanju presnove, zna čilne za ženske. 
Če so med spoloma glede strupenosti ali presnove velike razlike, bo 
potrebno preskušanje na samcih in samicah.  
Obdobje odmerjanja  
26. Na podlagi ugotovitev, da se mutacije kopi čijo z vsakim tretiranjem, je 
potreben režim s ponavljajo čimi se odmerki, in sicer dnevnim tretiranjem 
prek 28 dni. Na splošno naj bi bilo to dovolj časa, da šibki mutageni 
nakopičijo dovolj mutacij, izpostavljenost pa dovolj dolga, da je mogo če 
odkriti mutacije v po časi množe čih se organih. Za nekatera vrednotenja so 
morda primerni tudi drugi režimi tretiranja, te druge razporede dajanja 
odmerkov pa je treba znanstveno upravi čiti v protokolu. Tretiranje mora 
trajati vsaj toliko časa, kolikor je potrebnega za popolno indukcijo vseh 
zadevnih presnovnih encimov, pri krajših tretiranjih pa bo morda potrebno 
večkratno vzor čenje, ki je primerno za organe z razli čnimi stopnjami 
namnoževanja. V vsakem primeru je treba pri utemeljitvi protokola upora ­
biti vse razpoložljive informacije (npr. o splošni strupenosti ali presnovi in farmakokinetiki), zlasti pri odstopanju od navedenih standardnih priporo čil. 
Sicer lahko tretiranje, daljše od 8 tednov pove ča občutljivost, vendar ga je 
treba jasno razložiti in utemeljiti, saj lahko dolgo tretiranje povzro či navi­
dezno pove čanje pogostnosti mutantov zaradi klonalne ekspanzije (29).
 
Velikost odmerkov  
27. Velikosti odmerkov naj temeljijo na rezultatih študije za ugotavljanje 
območja za merjenje splošne strupenosti, ki je bila opravljena z enakim 
načinom izpostavljenosti, ali pa na rezultatih že obstoje čih študij subakutne 
strupenosti. Za dolo čanje obmo čij odmerkov se lahko uporabijo gensko 
nespremenjene živali istega seva glodavcev. Da bi se dobile informacije o 
odzivu na odmerek, je treba v glavnem preskusu v celotno študijo vklju čiti 
negativno kontrolno skupino (glej odstavek 22) in najmanj tri ustrezno  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 917
 
razporejene velikosti odmerka, razen če se uporabi mejni odmerek (glej 
odstavek 28). Najve čji odmerek bi moral biti najve čji toleran čni 
odmerek (MTD). Najve čji toleran čni odmerek je odmerek, ki povzro či 
takšne znake strupenosti, da se pri čakuje, da bi ve čji odmerki pri istem 
režimu odmerjanja povzro čili smrt. Snovi s specifi čnim biološkim delova ­
njem pri majhnih, nestrupenih odmerkih (kakor so hormoni in mitogeni) in 
kemikalije, ki kažejo nasi čenost toksokineti čnih lastnosti, so lahko izjeme 
pri merilih za dolo čanje odmerka in naj se ovrednotijo za vsak primer 
posebej. Uporabljene velikosti odmerkov naj zajemajo obmo čje od najve čje 
strupenosti do majhne strupenosti ali nestrupenosti.  
Mejni preskus  
28. Če preskusi za ugotavljanje obmo čja odmerkov ali obstoje či podatki pove ­
zanih sevov glodavcev kažejo, da režim tretiranja z najmanj mejnim 
odmerkom (glej v nadaljevanju) ne povzro či nobenih opaznih u činkov stru ­
penosti in če se na podlagi podatkov o strukturno sorodnih snoveh ne 
pričakuje, da bo snov genotoksi čna, se lahko pojmuje, da popolna študija 
z uporabo treh velikosti odmerkov ni potrebna Pri 28-dnevnem obdobju 
odmerjanja (tj. 28 dnevnih tretiranj) je mejni odmerek 1000/mg/kg telesne teže/dan. Pri najve č 14-dnevnem obdobju odmerjanja je mejni odmerek 
2000 mg/kg telesne teže/dan (razporede odmerjanja, ki se razlikujejo od 
28 dnevnih tretiranj, je treba znanstveno utemeljiti v protokolu; glej 
odstavek 26).
 
Dajanje odmerkov  
29. Navadno se preskusna kemikalija daje z gavažo po želod čni cevki ali 
ustrezni intubacijski kanili. Na splošno je treba pri na črtovanju študije 
upoštevati predviden na čin izpostavljenosti pri ljudeh. Zato so sprejemljivi 
tudi drugi na čini izpostavljanja (pitna voda, podkožno, intravenozno, 
lokalno, vdihavanje, intratrahealno, s prehrano ali vsadkom), kadar se 
lahko utemeljijo. Dajanje z intraperitonealno injekcijo ni priporo čeno, saj 
ni fiziološko pomemben na čin izpostavljenosti pri ljudeh. Najve čja količina 
tekočine, ki se lahko naenkrat da z gavažo ali injekcijo, je odvisna od 
velikosti preskusne živali. Koli čina ne sme presegati 2 ml/100 g telesne 
teže. Uporabo ve čjih količin je treba utemeljiti. Razen pri draže čih ali 
jedkih kemikalijah, ki pri višjih koncentracijah navadno povzro čajo 
močnejše učinke, je treba variabilnost preskusne koli čine s prilagajanjem 
koncentracije obdržati na kar najnižji ravni, da bi zagotovili konstantno 
količino pri vseh odmerkih.  
Vzorčenje 
Somatske celice  
30. Vzor čenje je pomembna spremenljivka, ker je dolo čeno z obdobjem, 
potrebnim za ustalitev mutacije. To obdobje je odvisno od tkiva in je o čitno 
povezano z obnavljanjem populacije celic, pri čemer se kostni mozeg in 
črevesje hitro odzivata, jetra pa precej po časneje. Ustrezen kompromis za 
merjenje pogostnosti mutantov v hitro in po časi se množe čih tkivih je 28 
zaporednih dni tretiranja (kot je navedeno v odstavku 26) in vzor čenje tri 
dni po zadnjem tretiranju; mogo če pa je, da v takih pogojih v po časi se 
množečih tkivih ne bo prišlo do najve čje pogostnosti mutantov. Če so 
počasi množe ča se tkiva še posebej pomembna, bo morda primernejše 
poznejše obdobje vzor čenja 28 dni po 28 dneh dajanja odmerkov (16) 
(29). V takih primerih bi poznejše vzor čenje zamenjalo tridnevno vzor čenje, 
za kar bi bila potrebna znanstvena utemeljitev.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 918
 
Klične celice  
31. Preskusi pri gensko spremenjenih glodavcih so primerni za študijo povzro ­ 
čanja mutacije genov v moških kli čnih celicah (7) (8) (27), pri kateri sta čas 
in kinetika spermatogeneze dobro opredeljeni (27). Ker je število jaj čnih 
celic, ki so na voljo za analizo, nizko celo po superovulaciji in zaradi 
dejstva, da v oocitih sinteza DNA ne poteka, za dolo čanje mutacij v ženskih 
kličnih celicah ni mogo če uporabiti transgenskih preskusov (31). 
32. Časi vzorčenja moških kli čnih celic morajo biti izbrani tako, da so vzor čene 
različne vrste izpostavljenih celic v razli čnih fazah razvoja kli čne celice in 
da je bila tar čna faza vzor čenja dovolj izpostavljena. Obdobje, v katerem 
klične celice napredujejo od zarodnih celic iz spermatogonijev do zrele 
sperme, ki doseže semenovode/repe obmodkov, traja ~ 49 dni pri miši 
(36) in ~ 70 dni pri podgani (34) (35). Po 28-dnevnem izpostavljanju, ki 
mu sledi tridnevno vzor čenje, bo seme, odvzeto iz semenovodov/repov 
obmodkov (7) (8), predstavljalo populacijo celic, izpostavljenih med približno zadnjo polovico spermatogeneze, ki obsega mejoti čno in postme ­
jotično obdobje, ne pa tudi obdobja spermatogonijev ali zarodnih celic. Da 
bi bile celice v semenovodih/repih obmodkov, ki so bile zarodne celice spermatogonijev v obdobju izpostavljenosti, ustrezno vzor čene, je po 
končanem tretiranju potrebno dodatno vzor čenje vsaj 7 tednov (pri miši) 
ali 10 tednov (pri podgani). 
33. Celice, pridobljene iz semenskih cevk po režimu 28 dni + 3 dnevi, pred ­
stavljajo mešano populacijo, obogateno za vse faze kli čnih celic v razvoju 
(7) (8). Ocena faz, v katerih so povzro čene mutacije kli čne celice, z vzor ­ 
čenjem teh celic za odkrivanje genske mutacije ni tako natan čna kot z 
vzorčenjem semen čic iz semenovodov/repov obmodkov (ker se iz cevk 
odvzamejo vzorci številnih razli čnih celic in bo nekaj somatskih celic to 
populacijo celic kontaminiralo). Vendar pa so z vzor čenjem iz semenskih 
cevk in semen čic iz semenovodov/repov obmodkov po režimu vzor
čenja 
samo 28 dni + 3 dnevi v dolo čeni meri zajete celice, izpostavljene v ve čini 
razvojnih faz kli čne celice, kar je lahko koristno za odkrivanje nekaterih 
mutagenov kli čnih celic.  
Opazovanja  
34. Splošna klini čna opazovanja je treba opraviti vsaj enkrat na dan, po 
možnosti vsak dan ob istem času in ob upoštevanju obdobja najve čje 
intenzivnosti pri čakovanih u činkov po vnosu odmerka. Zabeležiti je treba 
podatke o zdravstvenem stanju živali. Živali je treba vsaj dvakrat na dan 
opazovati za dolo čitev obolevnosti in smrtnosti. Vse živali je treba stehtati 
vsaj enkrat tedensko in ob usmrtitvi. Meritve porabe hrane je treba opraviti vsaj tedensko. Če se preskusna kemikalija daje s pitno vodo, je treba 
izmeriti porabo vode pri vsaki menjavi vode in vsaj tedensko. Živali, ki 
kažejo nesmrtonosne znake čezmerne strupenosti, je treba usmrtiti pred 
koncem preskusnega obdobja (23).
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 919
 
Odvzem tkiv  
35. Odvzem tkiv je treba jasno utemeljiti. Ker je povzro čanje mutacij mogo če 
proučevati v skoraj vsakem tkivu, je treba tkiva, ki bodo odvzeta, izbrati na 
podlagi razlogov za izvajanje študije in obstoje čih podatkih o mutagenosti, 
rakotvornosti ali strupenosti za preskuševano kemikalijo. Pomembni dejav ­
niki, ki jih je treba upoštevati, so na čin dajanja (na podlagi verjetnih 
načinov izpostavljenosti pri ljudeh), predvidena razporeditev tkiv in možni 
mehanizem delovanja. Če ni nobenih osnovnih informacij, je treba odvzeti 
več morebitnih interesnih somatskih tkiv. Ta tkiva naj bi predstavljala hitro 
množeča se in po časi množe ča se tkiva ter tkiva, ki so mesto kontakta. 
Poleg tega je treba odvzeti semen čice iz semenovodov/repov obmodkov in 
klične celice v razvoju iz semenskih cevk (kakor je opisano v odstavkih 32 
in 33) ter jih shraniti za primer, če bo v prihodnosti potrebna analiza 
mutagenosti kli čnih celic. Pridobiti je treba podatke o teži organov, pri 
večjih organih pa je treba odvzeti isto obmo čje pri vseh živalih.  
Shranjevanje tkiv in DNA  
36. Tkiva (ali homogenate tkiv) je treba shraniti pri najmanj – 70 °C, za izola ­
cijo DNA pa jih je treba uporabiti v 5 letih. Izolirano DNA, shranjeno v 
hladilniku v primernem pufru pri 4 °C, je treba za analizo mutacij uporabiti v 1 letu.
 
Izbor tkiv za analizo mutantov  
37. Izbira tkiva mora temeljiti na preudarkih, kot so: 1) na čin dajanja ali mesto 
prvega kontakta (npr. žlezni želodec pri dajanju oralno, plju ča pri dajanju z 
vdihavanjem ali koža pri lokalnem nanašanju); in 2) farmakokineti čni para­
metri iz študij splošne strupenosti, ki kažejo na razporeditev, zadrževanje ali kopičenje v tkivih, ali tar čnih organih za strupenost. Če se izvajajo študije 
za nadaljnje spremljanje študij rakotvornosti, je treba upoštevati tar čna tkiva 
rakotvornosti. Izbira tkiv za analizo naj bi kar najbolj pripomogla k odkri ­
vanju kemikalij, ki so neposredno delujo či mutageni  in vitro , hitro metabo ­
lizirane, zelo reaktivne ali pa se slabo absorbirajo, ali pa kemikalij, pri katerih se tar čno tkivo dolo či z načinom dajanja (6). 
38. Če ni nobenih osnovnih informacij, je treba ob upoštevanju mesta kontakta 
zaradi na čina dajanja za mutagenost ovrednotiti jetra in vsaj eno hitro se 
množeče tkivo (npr. žlezni želodec, kostni mozeg). V ve čini primerov je 
mogoče navedene zahteve izpolniti z analizo dveh skrbno izbranih tkiv, v 
nekaterih primerih pa bodo potrebna vsaj tri tkiva. Če obstajajo razlogi za 
posebno zaskrbljenost glede u činkov kli čnih celic, vklju čno s pozitivnimi 
odzivi v somatskih celicah, je treba tkiva kli čnih celic ovrednotiti za 
mutacije.
 
Merilne metode  
39. Za priporo čene gensko spremenjene modele so na voljo standardne labora ­
torijske ali objavljene metode za odkrivanje mutantov: lambda bakteriofag in plazmid  lacZ  (30); miš  lacI  (2) (18); miš delta  gpt (22); podgana delta  
gpt (28);  cII (17). Prilagoditve je treba utemeljiti in ustrezno dokumentirati. 
Podatki iz ve č poskusov pakiranja se lahko združijo in uporabijo za dose ­
ganje zadostnega števila plakov ali kolonij. Če je za dosego ustreznega 
števila plakov potrebnih veliko reakcij pakiranja, to lahko kaže na slabo kakovost DNA. V takih primerih je treba podatke obravnavati previdno, saj 
so morda niso zanesljivi. Optimalno skupno število plakov ali kolonij na 
vzorec DNA dolo ča statistična verjetnost odkrivanja zadostnega števila
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 920
 
mutantov pri dolo čeni spontani pogostnosti mutantov. Na splošno je 
potrebnih najmanj 125000 do 300000 plakov, če je spontana pogostnost 
mutantov v višini 3 × 10  -5 (15). Pri preskusu Big Blue®  lacI  je treba 
dokazati, da je mogo če z vklju čitvijo ustreznih barvnih kontrol hkrati z 
vsakim nanosom odkriti celotno obmo čje barvnih fenotipov mutantov. 
Tkiva in vzorce (elemente) slednjih je treba obdelati in analizirati z razde ­
litvijo v bloke, pri čemer se elementi iz kontrolne skupine z nosilcem/topi ­
lom, pozitivne kontrolne skupine ( če se uporablja) ali DNA pozitivnega 
kontrolnega vzorca ( če je primerno) in vsake tretirane skupine obdelajo 
skupaj.  
PODATKI IN PORO ČANJE  
Obdelava rezultatov  
40. Podatki za posamezne živali naj bodo prikazani v tabelah. Preskusna enota 
je žival. Poro čilo naj vsebuje skupno število enot, ki delajo plake ali kolo ­
nije, število mutantov in pogostnost mutantov za vsako tkivo vsake živali. 
Če izvedemo ve č reakcij pakiranja/sproš čanja fagov, je treba sporo čiti 
število reakcij na posamezni vzorec DNA. Sicer je treba shraniti podatke za vsako posamezno reakcijo, vendar je treba sporo čiti samo skupno število 
enot, ki delajo plake ali kolonije. Sporo čiti je treba podatke o strupenosti in 
kliničnih znakih v skladu z odstavkom 34. Morebitne rezultate dolo čanja 
zaporedja je treba predstaviti za vsak analizirani mutant in izra čune pogost ­
nosti mutantov prikazati za vsako žival in tkivo.
 
Statistično vrednotenje in razlaga rezultatov  
41. Za dolo čitev pozitivnega rezultata obstaja ve č meril, na primer pove čanje 
pogostnosti mutantov, povezano z odmerkom, ali o čitno pove čanje pogost ­
nosti mutantov v skupini z enim odmerkom v primerjavi s kontrolno 
skupino s topilom/nosilcem. Da bi dobili dovolj podatkov za analizo odziva 
na odmerek, je treba analizirati vsaj tri tretirane skupine. Najprej naj se prouči biološka pomembnost rezultatov, pri vrednotenju rezultatov preskusa 
pa se kot pomo č lahko uporabijo ustrezne statisti čne metode (4) (14) (15) 
(25) (26). V uporabljenih statisti čnih preskusih naj bo preskusna enota žival. 
42. Preskusno kemikalijo, pri kateri rezultati ne izpolnjujejo navedenih meril v 
katerem od tkiv, je treba v tem preskusu šteti za nemutageno. Za biološko 
pomembnost negativnega rezultata je treba potrditi izpostavljenost tkiva. 
43. Za analize dolo čanja zaporedja DNA so za pomo č pri razlagi rezultatov na 
voljo številni statisti čni pristopi (1) (5) (9) (19). 
44. Upoštevanje tega, ali so dobljene vrednosti v razponu preteklih kontrol ali 
zunaj njega, lahko zagotovi smernice pri ocenjevanju biološke pomembnosti 
odziva (32).
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 921
 
Poročilo o preskusu  
45. Poro čilo o preskusu mora vklju čevati naslednje podatke:  
Preskusna kemikalija:  
— identifikacijske podatke in št. CAS, če je znana, 
— izvor, številko serije, če je na voljo, 
— agregatno stanje in čistoto, 
— fizikalno-kemijske lastnosti, pomembne za izvedbo študije, — stabilnost preskusne kemikalije, če je znana.
 
Topilo/nosilec:  
— utemeljitev izbire uporabljenega nosilca, 
— topnost in stabilnost preskusne kemikalije v topilu/nosilcu, če sta znani, 
— pripravo pripravkov hrane in pitne vode ali pripravkov za vdihavanje, 
— analiti čne ugotovitve o pripravkih (npr. stabilnost, homogenost, nomi ­
nalne koncentracije).  
Preskusne živali:  
— uporabljeno vrsto/sev in utemeljitev izbire, 
— število, starost in spol živali, — izvor, nastanitvene razmere, hrano itd., 
— težo posameznih živali na za četku preizkusa, skupaj z obmo čjem, 
srednjo vrednostjo in standardnim odklonom telesne teže za vsako 
skupino.
 
Preskusni pogoji:  
— podatke o pozitivnih in negativnih (nosilec/topilo) kontrolnih vzorcih, 
— podatke iz študije za ugotavljanje obmo čja, 
— utemeljitev izbire velikosti odmerka, — podrobnosti o pripravi preskusne kemikalije, 
— podrobne podatke o dajanju preskusne kemikalije, 
— utemeljitev na čina dajanja, 
— metode za merjenje strupenosti za živali, vklju čno s histopatološko ali 
hematološko analizo, če sta bili uporabljeni, ter pogostost opazovanja 
živali in tehtanja, 
— v primeru negativnih rezultatov metode za preverjanje, ali je preskusna 
kemikalija dosegla tar čno tkivo ali krvni obtok,
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 922
 
— dejanski odmerek (mg/kg telesne teže/dan), prera čunan na podlagi 
koncentracije preskusne kemikalije v hrani/pitni vodi (ppm) in porabe, 
če je primerno, 
— podrobne podatke o kakovosti hrane in vode, 
— podroben opis razporedov tretiranj in vzor čenj ter utemeljitev izbir, 
— metode usmrtitve, 
— postopke za izolacijo in hrambo tkiv, 
— metode za izolacijo genomske DNA pri glodavcih, reševanje transgena 
iz genomske DNA in prenos transgene DNA v bakterijskega gostitelja, 
— izvor in številko serij za vse celice, komplete in reagente (kjer je primer ­
no), 
— metode za štetje mutantov, 
— metode za molekularno analizo mutantov in uporabo pri popravi za 
klonskost in/ali izra čun pogostnosti mutantov, če je primerno.  
Rezultati:  
— stanje živali pred preskusnim obdobjem in med njim, vklju čno z znaki 
strupenosti, 
— telesno težo in težo organov ob usmrtitvi, 
— za vsako tkivo/žival število mutantov, število ovrednotenih plakov ali 
kolonij, pogostnost mutantov, 
— za vsako skupino tkiv/živali število reakcij v obliki pakiranj na posa ­
mezni vzorec DNA, skupno število mutantov, povpre čno pogostnost 
mutantov, standardni odklon, 
— odvisnost med odmerkom in odzivom, kadar je to mogo če, 
— za vsako tkivo/žival število neodvisnih mutantov in povpre čno pogost ­
nost mutantov, če je bila izvedena molekularna analiza mutantov, 
— podatke o hkratni in pretekli negativni kontroli z obmo čji, povpre čji in 
standardnimi odkloni, 
— podatke o hkratni pozitivni kontroli (ali nehkratni pozitivni kontroli za 
DNA), 
— analiti čne ugotovitve, če so na voljo (npr. koncentracija DNA pri paki ­
ranju, podatki o dolo čanju zaporedja DNA), 
— uporabljene statisti čne analize in metode.  
Razprava o rezultatih  
Sklepna ugotovitev  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 923
 
VIRI  
(1) Adams,  W.T. and T.R.  Skopek  (1987), ‘Statistical  Test  for the Comparison 
of Samples from Mutational Spectra’,  J. Mol. Biol ., 194: 391–396. 
(2) Bielas, J.H. (2002), ‘A more Efficient Big Blue® Protocol Improves 
Transgene Rescue and Accuracy in an Adduct and Mutation Measure ­
ment’,  Mutation Res. , 518: 107–112. 
(3) Boerrigter, M.E., M.E. Dollé, H.-J. Martus, J.A. Gossen and J. Vijg 
(1995), ‘Plasmid-based Transgenic Mouse Model for Studying  in vivo  
Mutations’  Nature , 377(6550): 657–659. 
(4) Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1995), ‘Statistical Design and Analysis of 
Mutation Studies in Transgenic Mice’  , Environ. Mol. Mutagen , 25(3): 
246–255. 
(5) Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1996), ‘Mutational Spectra in Transgenic 
Animal Research: Data Analysis and Study Design Based upon the Mutant or Mutation Frequency’,  Environ. Mol. Mutagen,  28: 405–413. 
(6) Dean, S.W., T.M. Brooks, B. Burlinson, J. Mirsalis, B. Myhr, L. Recio 
and V. Thybaud (1999), ‘Transgenic Mouse Mutation Assay Systems can 
Play an important Role in Regulatory Mutagenicity Testing  in vivo  for the 
Detection of Site-of-contact Mutagens’,  Mutagenesis , 14(1): 141–151. 
(7) Douglas, G.R., J. Jiao, J.D. Gingerich, J.A. Gossen and L.M. Soper(1995), 
‘Temporal and Molecular Characteristics of Mutations Induced by Ethyl ­
nitrosourea in Germ Cells Isolated from Seminiferous Tubules and in Spermatozoa of  lacZ  Transgenic Mice’,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 92: 
7485–7489. 
(8) Douglas, G.R ., J.D. Gingerich, L.M. Soper and J. Jiao (1997), ‘Toward an 
Understanding of the Use of Transgenic Mice for the Detection of Gene Mutations in Germ Cells’,  Mutation Res. , 388(2-3): 197–212. 
(9) Dunson, D.B. and K.R. Tindall (2000), ‘Bayesian Analysis of Mutational 
Spectra’,  Genetics , 156: 1411–1418. 
(10) Gossen, J.A., W.J. de Leeuw, C.H. Tan, E.C. Zwarthoff, F. Berends, P.H. 
Lohman, D.L. Knook and J. Vijg (1989), ‘Efficient Rescue of Integrated Shuttle Vectors from Transgenic Mice: a Model for Studying Mutations  in 
vivo’, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86(20): 7971–7975. 
(11) Gossen, J.A. and J. Vijg (1993), ‘A Selective System for lacZ-Phage using 
a Galactose-sensitive  E. coli  Host’,  Biotechniques , 14(3): 326, 330. 
(12) Erikson, R.P. (2003), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer’,  Mutation Res. , 543: 125–136. 
(13) Erikson, R.P. (2010), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer: an Update’,  Mutation Res. , 705: 96–106. 
(14) Fung, K.Y., G.R. Douglas and D. Krewski (1998), ‘Statistical Analysis of  
lacZ Mutant Frequency Data from Muta™Mouse Mutagenicity Assays’,  
Mutagenesis , 13(3): 249–255. 
(15) Heddle, J.A ., S. Dean, T. Nohmi, M. Boerrigter, D. Casciano, G.R. 
Douglas, B.W. Glickman, N.J. Gorelick, J.C. Mirsalis, H.-J Martus, T.R. Skopek, V. Thybaud, K.R.Tindall and N. Yajima (2000), ‘In vivo Trans ­
genic Mutation Assays’,  Environ. Mol. Mutagen ., 35: 253–259. 
(16) Heddle, J.A., H.-J. Martus and G.R. Douglas (2003), ‘Treatment and 
Sampling Protocols for Transgenic Mutation Assays’,  Environ. Mol. Muta ­
gen.
, 41: 1–6.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 924
 
(17) Jakubczak, J.L., G. Merlino, J.E. French, W.J. Muller, B. Paul, S. Adhya 
and S. Garges (1996), ‘Analysis of Genetic Instability during Mammary 
Tumor Progression using a novel Selection-based Assay for  in vivo  Muta­
tions in a Bacteriophage λ Transgene Target’,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 
93(17): 9073–9078. 
(18) Kohler, S.W., G.S. Provost, P.L. Kretz, A. Fieck, J.A. Sorge and J.M. 
Short (1990), ‘The Use of Transgenic Mice for Short-term, in vivo Muta ­
genicity Testing’, Genet. Anal. Tech. Appl., 7(8): 212–218. 
(19) Lewis P.D., B. Manshian, M.N. Routledge, G.B. Scott and P.A. Burns 
(2008), ‘Comparison of Induced and Cancer-associated Mutational Spectra 
using Multivariate Data Analysis’, Carcinogenesis, 29(4): 772–778. 
(20) Nohmi, T., M. Katoh, H. Suzuki, M. Matsui, M. Yamada, M. Watanabe, 
M. Suzuki, N. Horiya, O. Ueda, T. Shibuya, H. Ikeda and T. Sofuni 
(1996), ‘A new Transgenic Mouse Mutagenesis Test System using Spi  – 
and 6-thioguanine Selections’, Environ. Mol. Mutagen., 28(4): 465–470. 
(21) Nohmi, T., M. Suzuki, K. Masumura, M. Yamada, K. Matsui, O. Ueda, H. 
Suzuki, M. Katoh, H. Ikeda and T. Sofuni (1999), ‘Spi  – Selection: an 
Efficient Method to Detect γ-ray-induced Deletions in Transgenic Mice’,  
Environ. Mol. Mutagen ., 34(1): 9–15. 
(22) Nohmi, T., T. Suzuki and K.I. Masumura (2000), 'Recent Advances in the 
Protocols of Transgenic Mouse Mutation Assays',  Mutation Res. , 
455(1–2): 191–215. 
(23) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, N  o 19, 
ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. 
(24) OECD (2009), Detailed Review Paper on Transgenic Rodent Mutation 
Assays, Series on Testing and Assessment, N  o 103, ENV/JM/MO ­
NO(2009)7, OECD, Paris. 
(25) Piegorsch, W.W., B.H. Margolin, M.D. Shelby, A. Johnson, J.E. French, 
R.W. Tennant and K.R. Tindall (1995), 'Study Design and Sample Sizes 
for a lacI Transgenic Mouse Mutation Assay', Environ. Mol. Mutagen., 
25(3): 231–245. 
(26) Piegorsch, W.W., A.C. Lockhart, G.J. Carr, B.H. Margolin, T. Brooks, ... 
G.R. Douglas, U.M. Liegibel, T. Suzuki, V. Thybaud, J.H. van Delft and 
N.J. Gorelick (1997), ‘Sources of Variability in Data from a Positive Selection lacZ Transgenic Mouse Mutation Assay: an Interlaboratory Study’, Mutation. Res., 388(2–3): 249–289. 
(27) Singer, T.M., I.B. Lambert, A. Williams, G.R. Douglas and C.L. Yauk 
(2006), ‘Detection of Induced Male Germline Mutation: Correlations and 
Comparisons between Traditional Germline Mutation Assays, Transgenic 
Rodent Assays and Expanded Simple Tandem Repeat Instability Assays’, Mutation. Res., 598: 164–193. 
(28) Toyoda-Hokaiwado, N., T. Inoue, K. Masumura, H. Hayashi, Y. Kawa ­
mura, Y. Kurata, M. Takamune, M. Yamada, H. Sanada, T. Umemura, A. Nishikawa and T. Nohmi (2010), 'Integration of in vivo Genotoxicity and 
Short-term Carcinogenicity Assays using F344 gpt delta Transgenic Rats: 
in vivo Mutagenicity of 2,4-diaminotoluene and 2,6-diaminotoluene Struc ­
tural Isomers', Toxicol. Sci., 114(1): 71–78. 
(29) Thybaud, V., S. Dean, T. Nohmi, J. de Boer, G.R. Douglas, B.W. Glick ­
man, N.J. Gorelick, J.A. Heddle, R.H. Heflich, I. Lambert, H.-J. Martus, J.C. Mirsalis, T. Suzuki and N. Yajima (2003), ‘ In vivo  Transgenic Muta ­
tion Assays’,  Mutation Res ., 540: 141–151. 
(30) Vijg, J. and G.R. Douglas (1996), 'Bacteriophage λ and Plasmid  lacZ  
Transgenic Mice for studying Mutations  in vivo ' in: G. Pfeifer (ed.),  Tech­
nologies for Detection of DNA Damage and Mutations, Part II,  Plenum 
Press, New York, NY, USA, str. 391–410.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 925
 
(31) Yauk, C.L., J.D. Gingerich, L. Soper, A. MacMahon, W.G. Foster and 
G.R. Douglas (2005), ‘A  lacZ  Transgenic Mouse Assay for the Detection 
of Mutations in Follicular Granulosa Cells’,  Mutation Res ., 578(1–2): 
117–123. 
(32) Hayashi, M., K. Dearfield, P. Kasper, D. Lovell, H.-J. Martus, V. Thybaud 
(2011), ‘Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control 
Data’, Mutation Res., doi:10.1016/j.mrgentox.2010.09.007. 
(33) OECD (2011), Retrospective Performance Assessment of OECD Test 
Guideline on Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays, Series on Testing and Assessment, N
 o 145, ENV/JM/MO ­
NO(2011)20, OECD, Paris. 
(34) Clermont, Y. (1972), ‘Kinetics of spermatogenesis in mammals seminife ­
rous epithelium cycle and spermatogonial renewal’. Physiol. Rev. 52: 198–236. 
(35) Robaire, B., Hinton, B.T., and Oregbin-Crist, M.-C. (2006), ‘The Epidi ­
dymis’, in Neil, J.D., Pfaff, D.W., Chalis, J.R.G., de Kretser, D.M., 
Richards, J.S., and P. M, Wassarman (eds.), Physiology of Reproduction, 
Elsevier, the Netherlands, str. 1071–1148. 
(36) Russell, L.B. (2004), ‘Effects of male germ-cell stage on the frequency, 
nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse’, 
Genetica, 122: 25–36.
 ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 926
 
Dodatek  
OPREDELITEV POJMOV:  
Obdobje odmerjanja : celotno obdobje, v katerem žival prejema odmerek.  
Substitucija baznih parov : vrsta mutacije, ki povzro či zamenjavo enega 
samega nukleotidnega baznega para v DNA z drugim nukleotidnim baznim parom DNA.  
Kapsida : proteinski plaš č, ki ovija virusni delec.  
Kemikalija : snov ali zmes.  
Klonalna ekspanzija : nastanek številnih celic iz ene same (mutirane) celice.  
Enote, ki delajo kolonije : merilo števila bakterij, sposobnih za razmnoževanje.  
Konkatemer : dolga neprekinjena biomolekula, ki jo sestavlja ve č enakih kopij, 
povezanih v serijo.  
Kohezivni konec : odsek enoverižne DNA z 12 nukleotidi, ki je na obeh koncih 
dvovijačnega genoma bakteriofaga lambda.  
Delecija : mutacija, pri kateri genom izgubi enega ali ve č (zaporednih) 
nukleotidov.  
Elektroporacija : uporaba elektri čnih impulzov za pove čanje prepustnosti celi ­ 
čnih membran.  
Endogeni gen : gen, ki izvira iz genoma.  
Povečana binomska porazdelitev : večja variabilnost pri ponovitvi ocene deleža 
populacije, kot bi bila pri čakovana, če bi imela populacija binomsko porazdelitev.  
Premik bralnega okvira : genetska mutacija, ki jo povzro čijo insercije ali dele ­
cije števila nukleotidov, ki ni enakomerno deljivo s tri v zaporedju DNA, ki kodira za proteine/peptide.  
Insercija : v zaporedje DNA je dodan najmanj en nukleotidni bazni par.  
Jackpot : veliko število mutantov, ki s klonalno ekspanzijo nastanejo iz ene 
same mutacije.  
Obsežne delecije : delecije v DNA, ki obsegajo ve č kot nekaj kilobaz (u činko­
vito se jih odkriva v preskusih s selekcijo Spi
 – in plazmidom lacZ).  
Ligacija : kovalentno povezovanje dveh koncev molekul DNA z ligazo DNA.  
Mitogen : kemikalija, ki celico spodbudi k celi čni delitvi, sproži mitozo (tj. 
celično delitev).  
Nevtralni gen : gen, na katerega ne vplivajo pozitivni ali negativni selektivni 
pritiski.  
Pakiranje : sinteza infektivnih bakteriofagnih delcev od priprave kapside bakte ­
riofaga in proteinov repa in konkatemer molekul DNA bakteriofaga. Obi čajno se 
uporablja za pakiranje DNA, klonirano na vektor lambda (lo čeno s kohezivnimi 
konci) v infekciozne delce lambde.  
Učinkovitost pakiranja : učinkovitost, s katero so pakirani bakteriofagi integri ­
rani v bakteriji gostiteljici.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 927
 
Enote, ki delajo plake : merilo števila bakteriofagov, sposobnih za razmnoževa ­
nje. 
Točkovna mutacija : splošni izraz za mutacijo, ki vpliva le na majhno zaporedje 
DNA, vklju čno z majhnimi insercijami, delecijami in zamenjavami baznih parov.  
Pozitivna selekcija : metoda, ki preživetje omogo či samo mutantom.  
Poročevalski gen : gen, pri katerem se hitro odkrije mutirani genski produkt.  
Vzorčenje: konec obdobja, pred usmrtitvijo, med katerim žival ne prejema 
kemikalije in med katerim se nepopravljene poškodbe DNA fiksirajo v stabilne 
mutacije.  
Vektor za prenos : vektor, ki je zgrajen tako, da se lahko razširi v dveh razli ­ 
čnih vrstah gostiteljev; zato je mogo če DNA, vstavljeno v prenosljivi vektor, 
preskušati ali jo obravnavati v dveh razli čnih vrstah celic ali dveh razli čnih 
organizmih.  
Preskusna kemikalija : vsaka snov ali zmes, preskušana s to preskusno metodo.  
Transgensko : iz, se nanaša na ali pa je organizem, pri katerem je prišlo do 
spremembe genoma zaradi prenosa gena ali genov iz druge vrste.  ▼M5 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 928
 
KAZALO  
DEL C: METODE ZA DOLO ČANJE STRUPENOSTI ZA OKOLJE 
C.1 AKUTNA STRUPENOST ZA RIBE 
C.2 PRESKUS AKUTNE IMOBILIZACIJE VODNIH BOLH  
(DAPHNIA  SP.) 
C.3 SLADKOVODNE ALGE IN CIANOBAKTERIJE, PRESKUS 
ZAVIRANJA RASTI 
C.4 DOLO ČANJE „DOBRE“ BIORAZGRADLJIVOSTI 
DEL I SPLOŠNO 
DEL II PRESKUS UPADANJA DOC (METODA C.4-A) 
DEL III PRILAGOJENI PRESEJALNI PRESKUS OECD (METODA C.4-B) 
DEL IV PRESKUS RAZVIJANJA CO  2 (METODA C.4-C) 
DEL V PRESKUS MANOMETRI ČNE RESPIROMETRIJE (METODA 
C.4-D) 
DEL VI PRESKUS Z ZAPRTO STEKLENICO (METODA C.4-E) 
DEL VII PRESKUS M.I.T.I. (METODA C.4-F) 
C.5 RAZGRADNJA – BIOKEMIJSKA POTREBA PO KISIKU 
C.6 RAZGRADNJA – KEMIJSKA POTREBA PO KISIKU 
C.7 RAZGRADNJA – ABIOTSKA RAZGRADNJA: HIDROLIZA 
KOT FUNKCIJA pH 
C.8 STRUPENOST ZA DEŽEVNIKE 
C.9 BIORAZGRADNJA – ZAHN-WELLENSEV PRESKUS 
C.1O SIMULACIJSKI PRESKUS ZA AEROBNO ČIŠČENJE 
ODPADNE VODE: C.10-A: ENOTE Z AKTIVNIM BLATOM – C.10-B: BIOFILMI 
C.11 BIORAZGRADNJA– PRESKUS ZAVIRANJA DIHANJA 
AKTIVNEGA BLATA 
C.12 BIORAZGRADNJA – SPREMENJENI SCAS PRESKUS 
C.13 BIOKONCENTRACIJA: PRETO ČNI PRESKUS NA RIBAH 
C.14 PRESKUS RASTI RIBJIH MLADIC 
C.15 RIBE, PRESKUS KRATKOTRAJNE TOKSI ČNOSTI NA 
EMBRIIH IN MLADICAH S HRANILNIM MEŠI ČKOM 
C.16 ČEBELE DELAVKE – PRESKUS AKUTNE ORALNE TOKSI ­ 
ČNOSTI 
C.17 ČEBELE DELAVKE – PRESKUS AKUTNE KONTAKTNE 
TOKSIČNOSTI 
C.18 ADSORPCIJA/DESORPCIJA Z UPORABO METODE 
ŠARŽNIH PRESKUSOV RAVNOTEŽJA
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 929
 
C.19 OCENJEVANJE ADSORPCIJSKEGA KOEFICIENTA ( K OC ) 
TAL IN ODPADNEGA BLATA (BLATA IZ ČISTILNIH 
NAPRAV) S TEKO ČINSKO KROMATOGRAFIJO VISOKE 
LOČLJIVOSTI (HPLC) 
C.20 PRESKUS RAZMNOŽEVANJA VRSTE  DAPHNIA MAGNA  
C.21 TALNI MIKROORGANIZMI: PRESKUS TRANSFORMACIJE 
DUŠIKA 
C.22 TALNI MIKROORGANIZMI: PRESKUS TRANSFORMACIJE 
OGLJIKA 
C.23 AEROBNA IN ANAEROBNA TRANSFORMACIJA V TLEH C.24 AEROBNA IN ANAEROBNA TRANSFORMACIJA 
V SISTEMIH VODNIH USEDLIN 
C.25. AEROBNA MINERALIZACIJA V POVRŠINSKI VODI – 
SIMULACIJSKI PRESKUS BIORAZGRADNJE 
C.26.  LEMNA  SP. GROWTH INHIBITION TEST
 
▼M4 
C.27. PRESKUS STRUPENOSTI S TRZA ČAMI V SISTEMU VODE 
IN USEDLINE Z UPORABO USEDLINE S PRIMEŠANO 
PRESKUSNO SNOVJO 
C.28. PRESKUS STRUPENOSTI S TRZA ČAMI V SISTEMU VODE 
IN USEDLINE Z UPORABO VODE S PRIMEŠANO 
PRESKUSNO SNOVJO 
C.29. DOBRA BIORAZGRADLJIVOST – CO  2 V ZAPRTIH 
POSODAH (PRESKUS NADPROSTORA) 
C.30. BIOAKUMULACIJA V KOPENSKIH MALOŠ ČETINCIH  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 930
 
C.1 AKUTNA STRUPENOST ZA RIBE  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Namen tega preskusa je dolo čiti akutno smrtno strupenost snovi za 
ribe v sladki vodi. Za pomo č pri izbiranju najbolj primerne 
preskusne metode (stati čna, polstati čna ali preto čna), da se zagoto ­
vijo zadovoljivo konstantne koncentracije preskusne snovi v času 
preskusa, je zaželeno, da je na voljo čim več informacij o topnosti 
v vodi, parnem tlaku, kemi čni stabilnosti, disociacijski konstanti in 
biorazgradljivosti snovi. 
Pri načrtovanju preskusa in pri razlagi rezultatov je treba upoštevati 
tudi dodatne informacije (na primer strukturno formulo, stopnjo 
čistosti, vrsto in odstotek bistvenih ne čistot, prisotnost in koli čino 
dodatkov ter porazdelitveni koeficient n-oktanol/voda).  
1.2 OPREDELITVE IN ENOTE 
Akutna strupenost je zaznaven škodljiv u činek, ki ga v kratkem času 
(nekaj dneh) v organizmu povzro či izpostavljenost snovi. V tem 
preskusu je akutna strupenost izražena kot srednja smrtna koncen ­
tracija (LC  50 ), to je koncentracija v vodi, ki povzro či pogin 50 % rib 
v preskusni skupini med neprekinjeno izpostavljenostjo, katere trajanje mora biti navedeno. 
Vse koncentracije preskusne snovi so navedene v masi na volumen 
(miligramih na liter). Lahko se izrazijo tudi v masi na maso (mg · kg
 -1 ). 
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Za dokazovanje, da se odziv preskusne vrste v laboratorijskih 
preskusnih pogojih ni bistveno spremenil, se lahko preskusi refe ­
renčna snov. 
Za ta preskus ni dolo čena nobena referen čna snov.  
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Lahko se izvede mejni preskus s 100 mg na liter, v dokaz, da je 
LC 50 večji od te koncentracije. 
Ribe se za 96 ur izpostavijo preskusni snovi, dodani vodi, v nizu 
koncentracij. Smrtni primeri se zapišejo v najmanj 24-urnih interva ­
lih, in kadar je mogo če, se za vsak čas opazovanja izra čunajo 
koncentracije, pri katerih pogine 50 % rib (LC  50 ). 
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Merila kakovosti se uporabljajo za mejni preskus in za popolni 
preskus. 
Ob koncu preskusa smrtnost v kontrolnih vzorcih ne sme biti ve čja 
od 10 % (oziroma ene ribe, če se uporabi manj kot deset rib). 
Ves čas preskusa mora biti koncentracija raztopljenega kisika ve č kot 
60 % nasi čenosti zraka.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 931
 
Ves čas preskusa se koncentracije preskusne snovi vzdržujejo 
v območju 80 % za četnih koncentracij. 
Pri snoveh, ki se lahko topijo v preskusnem mediju in dajejo stabilne 
raztopine, t.j. snovi, ki ne bodo znatno hlapele, se razgradile, hidro ­
lizirale ali adsorbirale, se šteje, da je za četna koncentracija enako ­
vredna nazivni koncentraciji. Priložijo se dokazi, da so se koncen ­
tracije vzdrževale ves čas preskusa in so bila izpolnjena merila kako ­
vosti. 
Pri snoveh, ki: 
(i) so slabo topne v preskusnem mediju ali 
(ii) so zmožne tvoriti stabilne emulzije ali disperzije ali 
(iii) v vodnih raztopinah niso stabilne, 
se šteje, da je za četna koncentracija koncentracija, izmerjena 
v raztopini (ali, če to tehni čno ni izvedljivo, v vodnem stolpcu) na 
začetku preskusa. Koncentracija se dolo či po vzpostavitvi ravnotežja, 
vendar pred vnosom preskusnih rib. 
V vsakem od teh primerov, je treba opraviti dodatne meritve med 
preskusom, da se potrdijo dejanske koncentracije izpostavljenosti ali izpolnitev meril kakovosti. 
Vrednost pH se ne sme spreminjati za ve č kot 1 enoto.
 
1.6 OPIS PRESKUSNE METODE 
Uporabijo se lahko tri vrste postopkov:  
Statični preskus:  
Preskus strupenosti, pri katerem ni pretoka preskusne raztopine. 
(Raztopine ostanejo nespremenjene ves čas preskusa.)  
Polstatični preskus:  
Preskus, pri katerem ni pretoka preskusne raztopine, se pa preskusna 
raztopina v rednih časovnih presledkih (npr. 24 ur) v celoti obnovi.  
Pretočni preskus:  
Preskus strupenosti, pri katerem se voda v preskusnih komorah 
neprestano obnavlja, pri čemer se preskusna snov prenaša z vodo, 
uporabljeno za obnavljanje preskusnega medija.  
1.6.1  Reagenti  
1.6.1.1  Raztopine preskusnih snovi  
Osnovne raztopine potrebnih koncentracij se pripravijo z raztopitvijo 
snovi v deionizirani vodi ali vodi v skladu s to čko 1.6.1.2. 
Izbrane preskusne koncentracije se pripravijo z red čenjem osnovne 
raztopine. Če se preskušajo velike koncentracije, se snov lahko 
raztopi neposredno v vodi za red čenje. ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 932
 
Običajno je treba snovi preskusiti le do meje topnosti. Pri nekaterih 
snoveh (npr. snoveh, ki so slabo topne v vodi ali imajo visok P  ow , ali 
tistih, ki v vodi tvorijo stabilne disperzije in ne pravih raztopin) je sprejemljivo izvesti preskus pri koncentraciji nad mejo topnosti, da se zagotovi doseganje najve čje topne/stabilne koncentracije. 
Pomembno pa je, da ta koncentracija ne bo motila preskusnega 
sistema (npr. tvorba filma na vodni površini, ki prepre či obnavljanje 
kisika v vodi itd.). 
Pri pripravi osnovnih raztopin snovi, ki so slabo topne v vodi, ali za 
lažje dispergiranje teh snovi v preskusnem mediju se lahko uporabi 
ultrazvočno dispergiranje, organska topila, emulgatorji ali disper ­
zijska sredstva. Kadar se uporabijo take pomožne snovi, morajo preskusne raztopine vseh koncentracij vsebovati enako koli čino 
pomožne snovi in dodatno kontrolno skupino rib je treba izpostaviti 
enaki koncentraciji pomožne snovi, kakor je uporabljena 
v preskusnih skupinah. Koncentracija takih pomožnih snovi mora biti čim manjša in v nobenem primeru ne sme prese či 100 mg na 
liter preskusnega medija. 
Preskus je treba opraviti brez uravnavanja pH. Če obstajajo dokazi 
o izraziti spremembi pH, se priporo ča, da se preskus ponovi 
z uravnanim pH in rezultati vklju čijo v poro čilo. V tem primeru je 
treba pH vrednost osnovne raztopine uravnati na pH vrednost vode 
za redčenje, razen če obstajajo posebni razlogi, da se to ne stori. V ta 
namen je najbolje uporabiti HCl in NaOH. To uravnavanje pH je treba opraviti tako, da se koncentracija preskusne snovi v osnovni raztopini bistveno ne spremeni. Če uravnava povzro či kemijsko reak ­
cijo ali obarjanje preskusne snovi, je treba o tem poro čati.
 
1.6.1.2  Voda za vzdrževanje in razred čenje 
Uporabi se lahko pitna voda (ki ni onesnažena s potencialno zdravju 
škodljivimi koncentracijami klora, težkih kovin ali drugih snovi), kakovostna naravna voda ali obdelana voda (glej Dodatek 1). Pripo ­
roča se uporaba vode s skupno trdoto med 50 in 250 mg na liter (kot 
CaCO
 3 ) in pH vrednostjo 6,0 do 8,5.  
1.6.2  Aparatura  
Vse aparature morajo biti izdelane iz kemijsko inertnih materialov. 
— sistem za avtomatsko red čenje (za preto čni preskus), 
— oksimeter, — oprema za dolo čanje trdote vode, 
— ustrezna aparatura za uravnavanje temperature, — pH-meter.
 
1.6.3  Preskusne ribe  
Ribe morajo biti zdrave in brez o čitnih nepravilnosti.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 933
 
Uporabljeno vrsto je treba izbrati na podlagi prakti čnih meril, kot so 
njihova razpoložljivost celo leto, lahko vzdrževanje, pripravnost za 
preskušanje, relativna ob čutljivost za kemikalije in kakršni koli 
ekonomski, biološki ali ekološki dejavniki, ki so lahko pomembni. Pri izbiri vrste rib je treba upoštevati tudi potrebo po primerljivosti 
dobljenih podatkov in obstoje če mednarodne uskladitve (vir 1). 
Seznam ribjih vrst, ki se priporo čajo za ta preskus, je v Dodatku 2; 
najbolj primerni vrsti sta cebrica in šarenka.
 
1.6.3.1  Vzdrževanje  
Ribe naj po možnosti izvirajo iz ene same jate rib s podobno dolžino 
in starostjo. Ribe je treba vzdrževati najmanj 12 dni v naslednjih 
pogojih:  
obremenitev:  
ustrezna sistemu (kroženje ali pretok) in vrsti rib,  
voda:  
glej 1.6.1.2,  
svetloba:  
12 do 16 ur osvetljevanja dnevno,  
koncentracija raztopljenega kisika:  
najmanj 80 % nasi čenosti zraka,  
hranjenje:  
trikrat tedensko ali vsak dan, 24 ur pred za četkom preskusa pa se 
hranjenje ustavi.  
1.6.3.2  Smrtnost  
Po 48-urnem obdobju prilagajanja se zapišejo smrtni primeri in 
uporabijo naslednja merila: 
— več kot 10 % populacije v sedmih dneh: 
celotna serija se zavrne, 
— med 5 in 10 % populacije: 
obdobje vzdrževanja se podaljša za sedem dni. 
Če ne pride do novih smrtnih primerov, je serija sprejemljiva, 
v nasprotnem primeru jo je treba zavrniti, 
— manj kot 5 % populacije: 
serija se sprejme.  
1.6.4  Prilagajanje  
Najmanj sedem dni pred uporabo morajo biti vse ribe izpostavljene 
vodi z enako kakovostjo in temperaturo, kakor se bo uporabila 
v preskusu.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 934
 
1.6.5  Preskusni postopek  
Pred dokon čnim preskusom se lahko opravi preskus za ugotavljanje 
območja, namenjen pridobivanju informacij o obmo čju koncentracij, 
ki se bodo uporabile v glavnem preskusu. 
Poleg preskusnega niza se izvede ena kontrola brez preskusne snovi 
in, če je potrebno, tudi ena kontrola s pomožno snovjo. 
Glede na fizikalne in kemijske lastnosti preskusne snovi je treba 
izbrati ustrezno metodo preskusa, stati čno, polstati čno ali preto čno, 
tako da so izpolnjena merila kakovosti. 
Ribe se izpostavijo snovi na spodaj opisani na čin: 
— trajanje: 96 ur, — število živali: najmanj 7 na koncentracijo, — bazeni: s primernim volumnom glede na priporo čeno obremenitev, 
— obremenitev: za stati čne in polstati čne preskuse je najve čja pripo­
ročena obremenitev 1 g na liter; pri preto čnih sistemih je spre ­
jemljiva tudi ve čja obremenitev, 
— preskusna koncentracija: najmanj 5 koncentracij, ki se med seboj 
razlikujejo za konstantni faktor najve č 2,2 in so kolikor je 
mogoče porazdeljene prek obmo čja od 0 do 100-odstotne 
smrtnosti, 
— voda: glej 1.6.1.2, — svetloba: 12 do 16 ur osvetljevanja dnevno, — temperatura: primerna za vrsto (Dodatek 2), vendar v mejah ± 
1
 o C pri vsakem preskusu, 
— koncentracija raztopljenega kisika: najmanj 60 % nasi čenosti 
zraka pri izbrani temperaturi, 
— hranjenje: ga ni. Ribe se pregledajo po prvih 2 do 4 urah in nato v najmanj 24-urnih 
intervalih. Ribe se štejejo za mrtve, če dotik dela med predrepno in 
repno plavutjo ne povzro či nobene reakcije in niso opazni dihalni 
gibi. Mrtve ribe se odstranijo takoj, ko so opažene, in zapišejo se smrtni primeri. Zapišejo se vse opazne nepravilnosti (npr. izguba 
ravnotežja, spremembe v na činu plavanja, dihanju, pigmentaciji itd.). 
Dnevno je treba meriti pH, raztopljeni kisik in temperaturo.
 
Mejni preskus  
Z uporabo postopkov, opisanih v tej preskusni metodi, se lahko 
izvede mejni preskus pri 100 mg na liter, v dokaz, da je LC  50 
večji od te koncentracije. 
Če ima snov take lastnosti, da koncentracije 100 mg na liter ni 
mogoče doseči, se mejni preskus izvede s koncentracijo, enako 
topnosti snovi (ali najve čji koncentraciji, pri kateri še nastane 
stabilna disperzija) v uporabljenem mediju (glej tudi to čko 1.6.1.1).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 935
 
Mejni preskus je treba izvesti s 7 do 10 ribami, z enakim številom 
v kontrolni(-h) skupini(-ah). (Po binomski teoriji velja, da je pri 10 
uporabljenih ribah in smrtnosti 0 verjetnost, da je LC  50 večji od 
koncentracije, uporabljene v mejnem preskusu, enaka 99,9 %. Pri 7, 8, ali 9 ribah odsotnost smrtnosti pomeni najmanj 99-odstotno 
verjetnost, da je LC
 50 večji od uporabljene koncentracije.) 
Če se pojavijo smrtni primeri, je treba izvesti popolno študijo. Če se 
opazijo subletalni u činki, jih je treba navesti v poro čilu. 
2. PODATKI IN OCENA  
Za vsako obdobje, ko so bila zapisana opažanja (24, 48, 72 in 96 ur), 
se na logaritemsko-verjetnostnem papirju izdela graf odstotka smrtnosti za vsako priporo čeno obdobje izpostavljanja v odvisnosti 
od koncentracije. 
Kadar je mogo če in za vsak čas opazovanja, je treba po standardnih 
postopkih oceniti LC
 50 in meje zaupanja (p = 0,05); te vrednosti je 
treba zaokrožiti na eno ali najve č dve značilni mesti (primeri zaokro ­ 
žitve na dve mesti: 170 za 173,5; 0,13 za 0,127; 1,2 za 1,21). 
Kadar je naklon krivulje koncentracija/odstotek odziva preve č strm 
za izračun LC  50 , zadostuje grafi čna ocena te vrednosti. 
Kadar dve zaporedni koncentraciji pri faktorju 2,2 povzro čita samo 0 
in 100 % smrtnost, ti dve vrednosti zadostujeta za prikaz obmo čja, 
v katerem je LC  50 . 
Če se opazi, da ni mogo če ohraniti stabilnosti ali homogenosti 
preskusne snovi, je treba to navesti v poro čilu in upoštevati pri 
razlagi rezultatov.  
3. PORO ČANJE  
V poročilo o preskusu se, če je možno, vklju čijo naslednje informa ­
cije: 
— informacije o preskusnih ribah (znanstveno ime, sev, dobavitelj, 
vse predhodne obdelave, velikost in število, uporabljena za vsako 
preskusno koncentracijo), 
— vir in glavne kemijske lastnosti vode za red čenje (pH, trdota, 
temperatura), 
— v primeru snovi, slabo topnih v vodi, metoda priprave osnovne in 
preskusnih raztopin, 
— koncentracija vseh pomožnih snovi, 
— seznam uporabljenih koncentracij in vse razpoložljive informacije 
o stabilnosti preskusne snovi v preskusni raztopini pri upora ­
bljenih koncentracijah, 
— če se opravijo kemijske analize, uporabljene metode in dobljeni 
rezultati, 
— rezultati mejnega preskusa, če je bil opravljen, 
— razlogi za izbiro uporabljenega preskusnega postopka in podatki 
o njem (npr. stati čen, polstati čen, stopnja odmerjanja, pretok, 
morebitno prezra čevanje, obremenitev z ribami itd.),  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 936
 
— opis preskusne opreme, 
— režim osvetljevanja, 
— koncentracija raztopljenega kisika, pH vrednost in temperatura 
preskusnih raztopin vsakih 24 ur, 
— dokazi, da so bila izpolnjena merila kakovosti, 
— tabela, ki prikazuje skupno smrtnost pri vsaki koncentraciji in pri 
kontroli (ali kontroli s pomožno snovjo, če je potrebno) ob 
vsakem priporo čenem času opazovanja, 
— graf koncentracija/odstotek odziva ob koncu preskusa, — če je mogo če, vrednosti LC
 50 za vsak priporo čeni čas opazovanja 
(s 95-odstotnimi mejami zaupanja), 
— uporabljeni statisti čni postopki za dolo čanje vrednosti LC  50 , 
— dobljeni rezultati, če se uporabi referen čna snov, 
— največja preskusna koncentracija, ki v času preskusa ne povzro či 
smrti, 
— najmanjša preskusna koncentracija, ki v času preskusa povzro či 
100-odstotno smrtnost.  
4. VIRI  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the 
Council C(81) 30 final and updates. 
(2) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to  
Brachydanio rerio –  Static and Flow Through methods – NFT 
90-303 June 1985. 
(3) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to  
Salmo gairdneri –  Static and Flow – Through methods – NFT 
90-305 June 1985. 
(4) ISO 7346/1,/2 and/3 -Water Quality -Determination of the 
acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish  (Brac­
hydanio rerio  Hamilton-Buchanan -Teleostei, Cyprinidae). Part 
1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow- through method. 
(5) Eidgenossisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien 
fur Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmet ­
hoden – Part II 1974. 
(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (11) und 1 
(15). 
(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish. 
(8) NEN 6506- Water -Bepaling van de akute toxiciteit met behulp 
van Poecilia reticulata,  1980. 
(9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxicity 
tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The 
Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Orga ­
nisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975. 
(10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring 
and support laboratory, Office of Research and Development, 
EPA-600/4-78-012, January 1978.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 937
 
(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, 
Part IV, 16 March 1979. 
(12) Standard methods for the examination of water and wastewa ­
ter, fourteen edition, APHA-AWW A-WPCF, 1975. 
(13) Commission of the European Communities, Inter-laboratory 
test programme concerning the study of the ecotoxicityof a chemical substance with respect to the fish. EEC Study 
D.8368, 22 March 1979. 
(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten 
Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Okotoxikologie, Grund ­
lagen fur die okotoxikologische Bewertung von Umweltchemi ­
kalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986. 
(15) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F., A simplified method for 
evaluating dose effects experiments, J. Pharm, tExp. Therap., 1949, vol. 96, 99. 
(16) Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, 
Weycombe, U.K., 1978. 
(17) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. 
Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821. 
(18) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II 
Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, 
vol. 4, 3-32. 
(19) Stephan, C.E. Methods for calculating an LC
 50 . In Aquatic 
Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, 
ASTM STP 634, 1977, 65-84. 
(20) Stephan, C.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, 
R.W. A computer program for calculating an LC
 50 . US EPA.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 938
 
Dodatek 1  
Obdelana voda  
Primer ustrezne vode za red čenje 
Vse kemikalije morajo biti analitsko čiste. 
Voda mora biti destilirana voda dobre kakovosti ali deionizirana voda 
s prevodnostjo pod 5 μScm  -1 . 
Aparatura za destilacijo vode ne sme vsebovati bakrenih delov.  
Osnovne raztopine  
CaCl  2 . 2H  2 O (kalcijev klorid dihidrat): 
Raztopimo v vodi in dopolnimo do 1 litra. 11,76 g 
MgSO  4 . 7H  2 O (magnezijev sulfat heptahidrat): 
Raztopimo v vodi in dopolnimo do 1 litra. 4,93 g 
NaHCO  3 (natrijev hydrogen karbonat): 
Raztopimo v vodi in dopolnimo do 1 litra. 2,59 g 
KCI (kalijev klorid): 
Raztopimo v vodi in dopolnimo do 1 litra. 0,23 g  
Obdelana voda za red čenje 
Zmešamo po 25 ml vsake od štirih osnovnih raztopin in dopolnimo z vodo do 1 
litra. 
Prezračujemo, dokler koncentracija raztopljenega kisika ni enaka nasi čenosti 
zraka. 
Vrednost pH mora biti 7,8 ± 0,2. 
Če je potrebno, pH uravnavamo z NaOH (natrijevem hidroksidu) ali HCl (klo ­
rovodikovo kislino). 
Tako pripravljeno vodo za red čenje pustimo približno 12 ur in je ne smemo ve č 
zračiti. 
Vsota ionov Ca in Mg v tej raztopini je 2,5 mmol na liter. Razmerje ionov Ca in 
Mg je 4:1 ter Na in K 10:1. Skupna alkalnost te raztopine je 0,8 mmol na liter. 
Nobeno odstopanje v pripravi vode za red čenje ne sme spremeniti sestave ali 
lastnosti vode.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 939
 
Dodatek 2  
Priporočene ribje vrste za preskušanje  
Priporočena vrsta Priporočeno 
območje 
temperature 
preskusa (  o C) Priporočena 
skupna dolžina 
preskusne živali 
(cm) 
Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae) 
(Hamilton–Buchanan), navadna cebrica  20 do 24 3,0 ± 0,5  
Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)  
(Rafinesque), črnoglavi pisanec 20 do 24 5,0 ± 2,5  
Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Linneaus 1758), krap 20 do 24 6,0 ± 2,0  
Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae)  
Cyprinodontidae (Tomminck and Schlege 1850), medaka 20 do 24 3,0 ± 1,0  
Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)  
(Peters 1859), gupi 20 do 24 3,0 ± 1,0  
Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarc ­
hidae)  (Rafinesque Linneaus 1758), son čni 
ostriž 20 do 24 5,0 ± 2,0  
Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmoni ­
dae) (Walbaum 1988), amerikanka 12 do 17 6,0 ± 2,0  
Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae)  (Lin­
neaus 1758), jez 20 do 24 6,0 ± 2,0
 
Zbiranje  
Zgoraj navedene ribe se z lahkoto gojijo in/ali so ob če na voljo celo leto. Lahko 
se razmnožujejo in gojijo bodisi v ribogojnicah bodisi v laboratoriju v pogojih, kjer se nadzorujejo bolezni in zajedavci, tako da bodo preskusne živali zdrave in znanega porekla. Te ribe so na voljo v številnih delih sveta.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 940
 
Dodatek 3  
Primer krivulje smrtnosti v odvisnosti od koncentracije  
Primer dolo čanja LC  50 z uporabo logaritemskega-verjetnostnega papirja
  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 941
 
C.2 PRESKUS AKUTNE IMOBILIZACIJE VODNIH BOLH  
(DAPHNIA  SP.)  
1. METODA  
Ta preskusna metoda akutne imobilizacije je enakovredna OECD TG 
202 (2004).  
1.1 UVOD 
Ta metoda opisuje preskus akutne toksi čnosti za dolo čanje učinkov 
kemikalij na vodne bolhe. Kolikor je možno, so bile uporabljene obstoječe preskusne metode (1) (2) (3).
 
1.2 OPREDELITVE POJMOV 
V zvezi s to metodo se uporabljajo naslednje opredelitve:  
EC 50 : je koncentracija, za katero se oceni, da imobilizira 50 % 
vodnih bolh v navedenem obdobju izpostavljenosti. Če se uporabi 
druga opredelitev pojma, je treba to navesti skupaj z virom.  
Imobilizacija:  Živali, ki niso zmožne plavati v 15 sekundah po 
rahlem stresanju preskusne posode, se štejejo za imobilne ( čeprav 
lahko še vedno premikajo svoje tipalke).  
1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Mlade vodne bolhe, ki niso starejše od 24 ur ob za četku preskusa, se 
za 48 ur izpostavijo preskusni snovi v nizu koncentracij. Imobiliza ­
cija se ugotavlja po 24 urah in 48 urah ter primerja s kontrolnimi vrednostmi. Rezultati se analizirajo, da se izra čuna EC
 50 po 48 
h (glej oddelek 1.2 za opredelitve). Dolo čevanje EC  50 po 24 h je 
izbirno.  
1.4 PODATKI O PRESKUSNI SNOVI 
Treba je poznati topnost v vodi in parni tlak. na voljo mora biti 
zanesljiva analitska metoda za števil čno vrednotenje snovi 
v preskusni raztopini z znanim analitskim izkoristkom in mejo 
zaznavnosti (LOD). Uporabni podatki so strukturna formula, čistost 
snovi, stabilnost v vodi ali na svetlobi, P  ow in rezultati preskusa za 
dobro biorazgradljivost (glej metodo C.4). 
Opomba: Navodila za preskušanje snovi, ki jih je težko preskušati 
zaradi fizikalno-kemijskih lastnosti, so na voljo v (4).  
1.5 REFEREN ČNE SNOVI 
S preskušanjem referen čne snovi za EC  50 se zagotavlja zanesljivost 
preskusnih pogojev. Za ta namen se priporo čajo strupene snovi, ki se 
uporabljajo v mednarodnih preskusih primerljivosti (1) (5) (  1 ). 
Preskus(-e) z referen čno snovjo je najboljše opraviti vsak mesec in 
najmanj dvakrat letno.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 942  
( 1 ) Rezultati teh medlaboratorijskih preskusov in Tehni čni popravek ISO 6341 so za kalijev 
dikromat (K  2 Cr 2 O 7 ) pokazali EC  50 – 24 h v obmo čju 0,6 mg/l do 1,7 mg/l.
 1.6 MERILA KAKOVOSTI 
Za veljavnost preskusa veljajo naslednja merila izvedbe: 
— v kontrolah, vklju čno s kontrolo, ki vsebuje sredstvo za razta ­
pljanje, ne sme biti imobiliziranih ve č kot 10 % vodnih bolh, 
— koncentracija raztopljenega kisika na koncu preskusa mora biti > 
3 mg/l v kontrolni in preskusni posodi. 
Opomba: V zvezi s prvim merilom ne sme ve č kot 10 % kontrolnih 
vodnih bolh kazati znakov imobilizacije ali drugih znakov bolezni ali stresa, npr. razbarvanja, neobi čajnega vedenja, kot je ujetost na povr ­ 
šini vode.
 
1.7 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.7.1  Oprema  
Preskusne posode in druge aparature, ki bodo prišle v stik 
s preskusnimi raztopinami, so v celoti steklene ali iz drugega 
kemijsko inertnega materiala: Preskusne posode so obi čajno steklene 
epruvete ali čaše; pred vsako uporabo jih je treba o čistiti 
s standardnimi laboratorijskimi postopki. Preskusne posode so 
narahlo pokrite, da se prepre čita izguba vode zaradi izhlapevanja 
in vnos prahu v raztopine. Hlapne snovi je treba preskušati v zaprtih do vrha napolnjenih posodah, ki so dovolj velike, da kisik ne postane omejujo č dejavnik ali da ga je premalo (glej 
oddelek 1.6 in prvi odstavek oddelka 1.8.3) 
Poleg navedenega je potrebna naslednja oprema ali samo del: oksi ­
meter (z mikroelektrodo ali drugo ustrezno opremo za merjenje raztopljenega kisika v majhnih vzorcih); pH-meter; ustrezna apara ­
tura za uravnavanje temperature; oprema za dolo čanje koncentracije 
skupnega organskega ogljika (TOC); oprema za dolo čanje kemijske 
potrebe po kisiku (KPK); oprema za dolo čanje trdote vode itn.
 
1.7.2  Preskusni organizem  
Prednost ima vrsta  Daphnia magna Straus,  lahko pa se v tem 
preskusu uporabi tudi druga vrsta (npr.  Daphniapulex).  Preskusne 
živali morajo biti na za četku preskusa stare manj kot 24 ur; za 
zmanjšanje variabilnosti se mo čno priporo ča, da niso potomci iz 
prvega legla. Izvirati morajo iz zdrave populacije (t.j. ne kažejo 
znakov stresa, kot so visoka smrtnost, navzo čnost samcev in ephi ­
pije, zakasnitev prvega legla, razbarvane živali itn.). Vsi organizmi, uporabljeni v posameznem preskusu, morajo izvirati iz kultur iz iste populacije vodnih bolh. Zarodne živali je treba držati v razmerah 
(svetloba, temperatura, medij), ki so podobni tistim iz preskusa. Če 
se medij za vodne bolhe v preskusu razlikuje od medija za rutinsko gojenje vodnih bolh, je pred preskusom dobro opraviti aklimatiza ­
cijo. V tem primeru je treba mladi če vodnih bolh pustiti v vodi za 
redčenje pri preskusni temperaturi najmanj 48 ur pred za četkom 
preskusa.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 943
 
1.7.3  Gojiš čna voda in voda za red čenje 
Za gojiščno vodo in vodo za red čenje je sprejemljiva naravna voda 
(površinska ali podzemna voda), obdelana voda ali deklorirana vodo ­
vodna voda, če vodne bolhe v njej preživijo trajanje gojitve, aklima ­
tizacije in preskušanja brez znakov stresa. Vsaka voda, ki ustreza 
kemijskim zna čilnostim sprejemljive vode za red čenje, ki so nave ­
dene v Dodatku 1, je primerna za preskusno vodo. Voda mora biti ves čas trajanja preskusa konstantne kakovosti. Obdelana voda se 
lahko pripravi z dodajanjem specifi čnih količin reagentov priznane 
analitske čistosti deionizirani ali destilirani vodi. Primeri obdelane 
vode so prikazani v (1) (6) in Dodatku 2. Upoštevati je treba, da 
se pri preskušanju snovi, ki vsebujejo kovine, izogibamo medijem, ki 
vsebujejo znana kelatorska sredstva, kot sta medija M4 in M7 iz Dodatka 2. Vrednost pH mora biti v obmo čju 6 do 9. Za  Daphnia 
Magna  se priporo ča uporaba vode s trdoto med 140 in 250 mg/l (kot 
CaCO
 3 ), za druge vrste vodnih bolh pa so primernejše vode 
z manjšo trdoto. Vodo za red čenje lahko pred uporabo v preskusu 
prezračujemo, da koncentracija raztopljenega kisika doseže nasi če­
nost. 
Če uporabimo naravno vodo, moramo parametre kakovosti izmeriti 
najmanj dvakrat letno ali ko posumimo, da so se te zna čilnosti 
bistveno spremenile (glej prejšnji odstavek in Dodatek 1). Opraviti 
je treba tudi meritve težkih kovin (npr. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni). Če 
uporabimo deklorirano vodovodno vodo, je zaželeno dnevno anali ­
ziranje vsebnosti klora. Če je voda za red čenje površinskega ali 
podzemnega izvora, moramo izmeriti prevodnost in skupni organski 
ogljik (TOC) ali kemijsko potrebo po kisiku (KPK).  
1.7.4  Preskusne raztopine  
Preskusne raztopine izbranih koncentracij se ponavadi pripravijo 
z redčenjem osnovne raztopine. Osnovne raztopine se po možnosti 
pripravijo z raztapljanjem preskusne snovi v vodi za red čenje. 
Kolikor je možno, se je treba izogniti uporabi topil, emulgatorjev 
ali disperzijskih sredstev. Vendar je uporaba teh spojin v nekaterih primerih neizogibna, da pripravimo ustrezno koncentrirano osnovno raztopino. Navodila za primerna topila, emulgatorje in disperzij ska 
sredstva so v (4). V vsakem primeru preskusna snov v preskusni 
raztopini ne sme prese či meje topnosti v vodi za red čenje. 
Preskus je treba opraviti brez uravnavanja pH. Če pH ne ostane 
v območju 6–9, se lahko opravi drugi preskus z uravnanjem pH 
osnovne raztopine na pH vode za red čenje pred dodatkom preskusne 
snovi. To uravnavanje pH je treba opraviti tako, da se koncentracija v osnovni raztopini ne spremeni bistveno in da se ne povzro či 
nobena kemijska reakcija ali obarjanje preskusne snovi. Najboljše 
je uporabiti HCl in NaOH.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 944
 
1.8 POSTOPEK  
1.8.1  Pogoji izpostavitve  
1.8.1.1  Preskusne in kontrolne skupine  
Preskusne posode napolnimo z ustreznimi koli činami vode za 
redčenje in raztopinami preskusne snovi. Razmerje zrak/voda 
v posodi mora biti enako v preskusni in kontrolni skupini. Vodne bolhe nato vnesemo v preskusne posode. Za vsako preskusno koncentracijo in za kontrole je treba uporabiti najmanj 20 živali, 
po možnosti razdeljene na štiri skupine po pet živali. Uporabiti je 
treba najmanj 2 ml preskusne raztopine na žival (t.j. koli čino 10 ml 
za pet vodnih bolh v preskusni posodi). Če koncentracija preskusa ni 
stabilna, se preskus lahko opravi s polstati čnim obnavljanjem ali 
pretočnim sistemom. 
Poleg tretiranega niza se izvede kontrolni niz z vodo za red čenje in 
če je ustrezno tudi kontrolni niz, ki vsebuje sredstvo za raztapljanje.
 
1.8.1.2  Preskusne koncentracije  
Razen če so na voljo podatki o toksi čnosti preskusne snovi, se lahko 
opravi preskus za ugotavljanje obmo čja, namenjen dolo čanju 
območja koncentracij za dokon čni preskus. V ta namen se vodne 
bolhe izpostavijo nizu s širokimi intervali koncentracij preskusne 
snovi. Pet vodnih bolh je treba izpostaviti vsaki preskusni koncen ­
traciji 48 ur ali manj. Ponovitve niso obvezne. Obdobje izpostavitve se lahko skrajša (npr. 24 ur ali manj), če je možno pridobiti 
v krajšem času podatke, primerne namenu preskusa za ugotavljanje 
območja. 
Uporabiti je treba najmanj pet preskusnih koncentracij. Urediti jih je 
treba v geometrijski vrsti z geometrijskim razmerjem, ki po možnosti 
ne presega 2,2. Če se uporabi manj kot pet koncentracij, je treba to 
utemeljiti. Najvišja preskušena koncentracija po možnosti povzro či 
100-odstotno imobilizacijo, najnižja preskušena koncentracija pa 
nobenih opaznih u činkov.
 
1.8.1.3  Pogoji inkubacije  
Temperatura mora biti v obmo čju od 18  o C do 22  o C, vendar 
konstantna v mejah ± 1  o C pri vsakem preskusu. Priporo čljiv je 
ciklus 16 ur svetlobe in 8 ur teme. Popolna tema je tudi sprejemljiva, 
zlasti če so preskusne snovi na svetlobi nestabilne. 
Preskusne posode se ne smejo prezra čevati med preskusom. Preskus 
se opravi brez uravnavanja pH. Med preskusom se vodne bolhe ne 
smejo hraniti.  
1.8.1.4  Trajanje  
Preskus traja 48 ur.  
1.8.2  Pripombe  
V vsaki preskusni posodi se ugotovijo imobilizirane vodne bolhe 24 
in 48 ur po za četku preskusa, (glej oddelek 1.2 za opredelitve). Poleg 
imobiliziranosti se navede tudi vsako neobi čajno vedenje ali neobi ­ 
čajni videz.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 945
 
1.8.3  Analitske meritve  
Raztopljeni kisik in pH se izmerita na za četku in koncu preskusa 
v kontroli(ah) in najvišji koncentraciji preskusne snovi. Koncentra ­
cija raztopljenega kisika v kontrolah mora biti skladna s merilom 
veljavnosti (glej oddelek 1.6). Vrednost pH v posameznem preskusu 
običajno ne sme variirati za ve č kot 1,5 enote. Temperatura se 
običajno meri v kontrolnih posodah ali v zraku prostora in se po 
možnosti neprekinjeno zapisuje med preskusom ali vsaj na za četku 
in koncu preskusa. 
Koncentracije preskusne snovi je treba izmeriti najmanj v najvišji in 
najnižji preskusni koncentraciji na za četku in koncu preskusa (4). 
Priporoča se, da rezultati temeljijo na izmerjenih koncentracijah. 
Če pa so na voljo dokazi, da so se koncentracije preskusne snovi 
zadovoljivo zadrževale v obmo čju ± 20 % nominalne ali izmerjene 
začetne koncentracije ves čas preskusa, lahko rezultati temeljijo na 
nominalnih ali izmerjenih za četnih vrednostih.  
1.9 MEJNI PRESKUS 
Z uporabo postopkov, opisanih v tej metodi, se lahko izvede mejni 
preskus s 100 mg/l preskusne snovi ali do meje topnosti v preskusnem mediju (pri čemer se uporabi nižja od obeh vrednosti) 
za dokaz, da je EC
 50 večji od te koncentracije. Mejni preskus je 
treba izvesti z 20 vodnimi bolhami (po možnosti razdeljenimi 
v štiri skupine po pet) in enakim številom v kontrolni(-h) skupini(- ah). Če se pojavi imobilizacija, je treba izvesti popolno študijo. 
Zapisati je treba vsako ugotovljeno neobi čajno vedenje.
 
2. PODATKI  
Podatke je treba povzeti v preglednici, ki za vsako tretirano skupino 
in kontrolo prikazuje število uporabljenih vodnih bolh in imobiliza ­
cijo pri vsakem opazovanju. Prikaže se odstotek imobiliziranih 
vodnih bolh po 24 urah in 48 urah glede na preskusne koncentracije. Podatki se analizirajo z ustreznimi statisti čnimi metodami (npr. 
verjetnostna analiza itn.), da se izra čunajo naklon krivulj in EC
 50 
z 9-odstotnimi mejami zaupanja (p = 0,05) (7) (8). 
Kadar standardne metode izra čuna EC  50 niso primerne za pridobljene 
podatke, se za približek EC  50 uporabita najvišja koncentracija, ki ni 
povzročila imobilizacije, in najnižja koncentracija, ki je povzro čila 
100-odstotno imobilizacijo (pri čemer je EC  50 geometrijska sredina 
teh dveh koncentracij).  
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje podatke: 
Preskusna snov: — fizikalno stanje in pomembne fizikalno-kemijske lastnosti,
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 946
 
— kemijski identifikacijski podatki, vklju čno s čistostjo. 
Preskusna vrsta: 
— izvor in vrsta vodnih bolh  (Daphnia),  izvorni dobavitelj ( če je 
znan) in uporabljeni pogoji gojenja (vklju čno z izvorom, vrsto in 
količino hrane, pogostnostjo hranjenja). 
Preskusni pogoji: 
— opis preskusnih posod: vrsta posod, koli čina raztopine, število 
vodnih bolh na preskusno posodo, število preskusnih posod (ponovitev) na koncentracijo, 
— metode priprave osnovnih in preskusnih raztopin, vklju čno 
z uporabo kakršnih koli topil ali disperzivnih sredstev, upora ­
bljene koncentracije, 
— podrobnosti o vodi za red čenje: izvor in kakovostne zna čilnosti 
vode (pH, trdota, razmerje Ca/Mg, razmerje Na/K, alkalnost, prevodnost itn); sestava obdelane vode, če je bila uporabljena, 
— pogoji inkubacije: temperatura, intenzivnost in periodi čnost svet­
lobe, raztopljeni kisik, pH itn. 
Rezultati: 
— število in odstotek vodnih bolh, ki so bile imobilizirane ali so 
kazale kakršne koli škodljive u činke (vklju čno z neobi čajnim 
vedenjem) v kontrolnih skupinah in vsaki tretirani skupini 
v vsakem obdobju opazovanja in opis narave opaženih u činkov, 
— rezultat in datum opravljenega preskusa z referen čno snovjo, če 
sta na voljo, 
— nominalne preskusne koncentracije in rezultati vseh analiz za 
določevanje koncentracije preskusne snovi v preskusnih posodah; 
navesti je treba tudi analitski izkoristek metode in mejo zaznav ­
nosti, 
— vse fizikalno-kemijske meritve temperature, pH in koncentracije 
raztopljenega kisika med preskusom, 
— EC
 50 po 48 h za imobilizacijo z intervali zaupanja in grafi prire ­
jenih modelov, ki so bili uporabljeni pri izra čunu teh vrednosti, 
nakloni krivulj odmerek-odziv in njihova standardna napaka; 
statistični postopki, uporabljeni za dolo čevanje EC  50 (te podatke 
je treba navesti tudi za imobilizacijo po 24 h, če je bila izmer ­
jena), 
— obrazložitev vsakega odstopanja od preskusne metode in more ­
bitni vpliv odstopanja na rezultate preskusa.  
4. VIRI  
(1) ISO 6341. (1996). Water quality – Determination of the inhibi ­
tion of the mobility of  Daphnia magna  Straus (Cladocera, 
Crustacea) – Acute toxicity test. Third edition, 1996. 
(2) EPA OPPTS 850.1010. (1996). Ecological Effects Test Guide ­
lines – Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test, Freshwater 
Daphnids.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 947
 
(3) Environment Canada. (1996) Biological test method. Acute 
Lethality Test Using  Daphnia  spp. EPS 
1/RM/11. Environment Canada, Ottawa, Ontario, Canada. 
(4) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publication. Series on Testing and Assessment. No. 
23. Paris 2000. 
(5) Commission of the European Communities. Study D8369. 
(1979). Inter-laboratory Test Programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to  Daph­
nia. 
(6) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 211:  
Daphnia magna  Reproduction Test, adopted September 1998. 
(7) Stephan C.E. (1977). Methods for calculating an LC
 50 . In 
Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). ASTM STP 634 – American 
Society for Testing and Materials. Str. 65-84 
(8) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 3
 rd 
ed. London. Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 948
 
DODATEK 1  
NEKATERE KEMIJSKE LASTNOSTI SPREJEMLJIVE VODE ZA 
REDČENJE  
Snov Koncentracija  
Snov v delcih < 20 mg/l 
Skupni organski ogljik < 2 mg/l 
Neionizirani amoniak < 1 μg/l 
Rezidualni klor < 10 μg/l 
Skupni organofosforni pesticidi < 50 ng/l Skupni organoklorovi pesticidi s polikloriranimi bifenili < 50 ng/l Skupni organski klor < 25 ng/l
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 949
 
DODATEK 2  
PRIMERI PRIMERNE OBDELANE PRESKUSNE VODE  
Preskusna voda ISO (1)  
Osnovne raztopine (ena snov) Za pripravo obdelane vode se 
doda naslednje koli čine 
osnovnih raztopin v 1 litru 
vode (*) Snov Količina dodana v 1 liter 
vode (*)  
Kalcijev klorid 
CaCl  2 , 2H  2 O 11,76 g 25 ml 
Magnezijev sulfat 
MgSO  4 , 7H  2 O 4,93 g 25 ml 
Natrijev hidrogenkarbonat 
NaHCO  3 2,59 g 25 ml 
Kalijev klorid 
KCl 0,23 g 25 ml  
(*) Voda primerne čistosti, npr. deionizirana, destilirana ali pridobljena z vzvratno osmozo, 
ki ne presega 10 μS.cm  -1 . 
Medija Elendt M7 in M4  
Aklimatizacija na medija Elendt M4 in M7  
Nekateri laboratoriji so imeli težave pri neposrednem prenosu vodnih bolh 
v medija M4 in M7. Vendar so težavo z dolo čenim uspehom rešili s postopno 
aklimatizacijo, t.j. prenašanjem iz lastnega medija v 30-odsotni medij Elendt, nato v 60-odstotni in nato v 100-odstotni medij Elendt. Aklimatizacijsko obdobje 
lahko traja do enega meseca.
 
Priprava  
Elementi v sledeh  
Ločene osnovne raztopine (I) posameznih elementov v sledeh se najprej pripravijo 
z vodo primerne čistosti, npr. deionizirano, destilirano ali pridobljeno z vzvratno 
osmozo. Iz teh razli čnih osnovnih raztopin (I) se pripravi druga osnovna raztopina 
(II), ki vsebuje vse elemente v sledeh (kombinirana raztopina), t.j.:  
Osnovna(-e) 
raztopina(-e) I (ena snov) Količina, dodana vodi 
(mg/l) Koncentracija (glede na 
medij M4) Za pripravo kombinirane osnovne raztopine II se 
doda naslednje koli čine osnovne raztopine I vodi 
(ml/l) 
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190 20000-kratna 1,0 0,25 
MnCl  2 .4H  2 O 7 210 20000-kratna 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20000-kratna 1,0 0,25  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 950
 
Osnovna(-e) 
raztopina(-e) I (ena snov) Količina, dodana vodi 
(mg/l) Koncentracija (glede na 
medij M4) Za pripravo kombinirane osnovne raztopine II se 
doda naslednje koli čine osnovne raztopine I vodi 
(ml/l) 
M4 M7  
RbCl 1 420 20000-kratna 1,0 0,25 
SrCl  2 .6H  2 O 3 040 20000-kratna 1,0 0,25 
NaBr 320 20000-kratna 1,0 0,25 
Na 2 MoO  4 .2H  2 O 1 230 20000-kratna 1,0 0,25 
CuCl  2 .2H  2 O 335 20000-kratna 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20000-kratna 1,0 1,0 
CoCl  2 .6H  2 O 200 20000-kratna 1,0 1,0 
KI 65 20000-kratna 1,0 1,0 Na
 2 SeO  3 43,8 20000-kratna 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20000-kratna 1,0 1,0 
Na 2 EDTA.2H  2 O 5 000 2000-kratna — — 
FeSO  4 .7H  2 O 1 991 2000-kratna — — 
Raztopini Na  2 EDTA in FeSO  4 se pripravita lo čeno, zlijeta skupaj in nato nemu ­
doma avtoklavirata. 
Pri tem nastane: 
Raztopina 2 l Fe-EDTA 1000-kratna 20,0 5,0  
Medija M4 in M7  
Medija M4 in M7 se pripravita iz osnovne raztopine II, makrohranil in vitaminov 
po naslednjem postopku:  
Količina, dodana vodi 
(mg/l) Koncentracija (glede na 
medij M4) Količina osnovne raztopine II, dodana za prip 
ravo medija (ml/l) 
M4 M7  
Osnovna raztopina II 
(kombinirani elementi v sledeh) 20-kratna 50 50 
Osnovne raztopine makro ­
hranil (ena snov) 
CaCl
 2 · 2H  2 0 29 3800 1000-kratna 1,0 1,0 
MgSO  4 · 7H  2 O 24 6600 2000-kratna 0,5 0,5 
KCl 5 8000 10000-kratna 0,1 0,1 NaHCO
 3 6 4800 1000-kratna 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 · 9H  2 O 5 0000 5000-kratna 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10000-kratna 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10000-kratna 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10000-kratna 0,1 0,1  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 951
 
Količina, dodana vodi 
(mg/l) Koncentracija (glede na 
medij M4) Količina osnovne raztopine II, dodana za prip 
ravo medija (ml/l) 
M4 M7  
Kombinirana osnova vita ­
minov — 10000-kratna 0,1 0,1 
Kombinirano osnovno raztopino vitaminov pripravimo z dodatkom treh vitaminov 
v 1 liter vode, kakor je prikazano spodaj: 
Tiamin hidroklorid 750 10000-kratna 
Cianokobalamin (B  12 ) 10 10000-kratna 
Biotin 7,5 10000-kratna 
Kombinirano osnovno raztopino vitaminov hranimo zamrznjeno v majhnih 
alikvotih. Vitamini se dodajo medijem neposredno pred uporabo. 
Opomba: Da prepre čimo obarjanje soli pri pripravi popolnega medija, doda ­
jamo alikvote osnovnih raztopin v približno 500–800 ml deionizi ­
rane vode, ki jo dopolnimo do 1 litra. 
Opomba: Prvi opis medija M4 je objavljen v Elendt, B. P. (1990). Selenium 
deficiency in Crustacea; an ultrastructual approach to antennal 
damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25-33.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 952
 
C.3 SLADKOVODNE ALGE IN CIANOBAKTERIJE, PRESKUS 
ZAVIRANJA RASTI  
1. METODA  
Ta metoda je enakovredna OECD TG 201 (2006)(1).  
1.1 UVOD 
Preskusne metode se ob upoštevanju znanstvenega napredka redno 
spreminjajo in posodabljajo. Preskusno metodo C.3 je bilo treba spremeniti zaradi vklju čitve dodatnih vrst in izpolnitve zahtev za 
oceno nevarnosti in razvrstitev kemikalij. Spremembe so bile izve ­
dene na podlagi iz črpnih prakti čnih izkušenj, znanstvenega napredka 
na področju študij toksi čnosti za alge in ob široki uporabi ustreznih 
predpisov od njenega prvotnega sprejetja.
 
1.2 POMEN IZRAZOV 
Za namene preskusnih metod se uporabljajo naslednje opredelitve in 
okrajšave:  
Biomasa : je suha teža žive snovi prisotne v populaciji, izražena 
v dani prostornini; npr. mg alg/liter preskusne raztopine. „Biomasa“ 
je običajno opredeljena kot masa, vendar se v tem preskusu ta 
beseda uporablja za ozna čevanje mase na prostornino. V tem 
preskusu se obi čajno merijo tudi nadomestki za biomaso, kot so 
npr. število celic, fluorescenca itd., zato se izraz „biomasa“ uporablja 
tudi za meritve teh nadomestkov.  
Koeficient variacije : je merilo variabilnosti parametra brez merila, 
opredeljeno kot razmerje med standardnim odstopanjem in povpre č­
jem. Izraziti ga je mogo če tudi kot odstotno vrednost. Srednji koefi ­
cient variacije povpre čne specifi čne stopnje rasti v ponovitvenih 
kontrolnih kulturah se ra čuna tako, kot sledi: 
1. Izračuna se KV v odstotkih povpre čne specifi čne stopnje rasti na 
dan/po posami čnih delih za vsakokratno ponovitev. 
2. Izračuna se srednja vrednost vseh izra čunanih vrednosti v to čki 1, 
da se pridobi srednji koeficient variacije specifi čne stopnje rasti 
na dan/po posami čnih delih v ponovitvenih kontrolnih kulturah.  
EC x : je koncentracija preskusne snovi, raztopljene v preskusnem 
mediju, katere rezultat je x % (npr. 50 %) zmanjšanje rasti preskus ­
nega organizma v ustreznem obdobju izpostavljenosti (navesti 
v primeru odstopanja od polnega ali obi čajnega trajanja preskusa). 
Za nedvoumno ozna čitev vrednosti EC, pridobljene iz stopnje 
rasti ali prirasta, se uporabljata simbola „E  r C“ ali „E  y C“. 
Rastno gojiš če: je povsem sinteti čno gojišče, v katerem rastejo 
preskusne alge med izpostavljenostjo preskusni snovi. Preskusne snovi se obi čajno raztopijo v preskusnem mediju.  
Stopnja rasti  (povprečna specifi čna stopnja rasti ): je logaritemsko 
povečanje biomase v času izpostavljenosti.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 953
 
Koncentracija z najnižjim opaznim u činkom (LOEC) : je najnižja 
preskušena koncentracija, pri kateri se ugotovi statisti čno pomemben 
učinek snovi na zmanjšanje rasti (pri p < 0,05) v primerjavi 
s kontrolnim vzorcem v ustreznem času izpostavljenosti. Vendar 
pa morajo imeti vse preskusne koncentracije nad LOEC škodljiv 
učinek, ki je enak ali ve čji od učinka, opazovanega pri LOEC. Če 
teh dveh pogojev ni mogo če izpolniti, je treba iz črpno razložiti, na 
kak način je bila izbrana LOEC (in ne NOEC).  
Koncentracija brez opaznega u činka (NOEC) : je preskusna 
koncentracija tik pod LOEC.  
Odvisna spremenljivka : je spremenljivka za ocenitev toksi čnosti, 
izpeljana iz katerih koli izmerjenih parametrov, ki opisujejo biomaso 
z drugačno računsko metodo. Za to metodo sta stopnja rasti in 
prirasta odvisni spremenljivki, neposredno izpeljani iz izmerjene biomase ali katerega koli omenjenega nadomestka.  
Specifična stopnja rasti : je odvisna spremenljivka, opredeljena kot 
količnik razlike naravnih logaritmov opazovanega parametra (v tej 
preskusni metodi je to biomasa) in upoštevanega časovnega obdobja.  
Prirast : je vrednost izmerjene spremenljivke ob koncu obdobja izpo ­
stavljenosti manj vrednost izmerjene spremenljivke ob za četku 
obdobja izpostavljenosti, s katero se izrazi pove čanje biomase med 
preskusom.
 
1.3 UPORABA PRESKUSA 
Ta preskusna metoda se najlažje uporabi pri vodotopnih snoveh, za 
katere je verjetno, da bodo v pogojih preskusa ostale v vodi. Za 
preskušanje snovi, ki so hlapne, mo čno adsorptivne, obarvane in 
slabo topne v vodi, ali snovi, ki lahko vplivajo na razpoložljivost hranilnih snovi ali mineralov v preskusnem mediju, so morda potrebne nekatere prilagoditve opisanega postopka (npr. zaprt sistem 
ali hlajenje preskusnih posod). Navodila za nekaj primernih prilago ­
ditev so navedena v (2), (3) in (4).
 
1.4 PRINCIP PRESKUSA 
Namen tega preskusa je dolo čiti učinke snovi na rast sladkovodnih 
mikroalg in/ali cianobakterij. Preskusni organizmi v eksponentni fazi 
rasti se v šaržnih kulturah izpostavijo preskusni snovi ponavadi za 72 ur. Kljub relativno kratkemu trajanju preskusa je mogo če oceniti 
učinke na ve č generacijah. 
Odziv sistema je zmanjšanje rasti pri vrsti kultur alg (preskusnih 
enot), ki so izpostavljene razli čnim koncentracijam preskusne snovi. 
Odziv je ocenjen v odvisnosti od koncentracije izpostavljenosti 
v primerjavi s povpre čno rastjo ponovitvenih, neizpostavljenih 
kontrolnih kultur. Za popolno izražanje odziva sistema na toksi čne 
učinke (optimalna ob čutljivost) se kulturam za merjenje zmanjšanja 
specifične stopnje rasti omogo či neomejena eksponentna rast pod 
zadostnimi prehranskimi pogoji ter stalno svetlobo v zadostnem 
časovnem obdobju.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 954
 
Rast in zaviranje rasti sta dolo čena z meritvami biomase alg 
v odvisnosti od časa. Biomasa alg je opredeljena kot suha teža na 
prostornino, npr. mg alg/liter preskusne raztopine. Vendar je suho težo težko meriti, zato se uporabljajo nadomestni parametri. Od teh nadomestkov se najpogosteje uporablja število celic. Drugi nadome ­
stni parametri vklju čujejo prostornino celic, fluorescenco, opti čno 
gostoto itn. Pretvorni faktor med izmerjenim nadomestnim parame ­
trom in biomaso mora biti znan. 
Končna točka preskusa je zaviranje rasti, izraženo kot logaritmi čno 
povečanje biomase (povpre čne specifi čne stopnje rasti) med 
obdobjem izpostavljenosti. Iz povpre čnih specifi čnih stopenj rasti, 
zabeleženih v vrsti preskusnih raztopin, je koncentracija, ki doseže 
določeno zaviranje rasti x % (npr. 50 %), dolo čena in izražena kot 
E
 r C x (npr. E  r C 50 ). 
Za rabo te metode v zakonodajnem okviru EU bi morali za izra čun 
rezultatov uporabiti povpre čno specifi čno hitrost rasti iz razlogov, 
opisanih v oddelku 2.2 spodaj. Dodatna odvisna spremenljivka, ki 
se uporablja za to preskusno metodo, je prirastek, ki je lahko potreben za izpolnitev zakonodajnih zahtev v nekaterih državah. 
Opredeljen je kot biomasa na koncu obdobja izpostavljenosti manj 
biomasa na za četku obdobja izpostavljenosti. Iz prirastka, zabeleže ­
nega v vrsti preskusnih raztopin, se koncentracija, ki doseže dolo ­ 
čeno zaviranje prirastka x % (npr. 50 %), izra čuna in izrazi kot E
 y C x 
(npr. E  y C 50 ). 
Zraven tega je mogo če statistično določiti koncentracijo z najnižjim 
opaznim u činkom (LOEC) in koncentracijo brez opaznega u činka 
(NOEC).  
1.5 PODATKI O PRESKUSNI SNOVI 
Podatki o preskusni snovi, ki so lahko uporabni pri vzpostavitvi 
preskusnih pogojev, vklju čujejo strukturno formulo, stopnjo čistosti, 
stabilnost na svetlobi, stabilnost pod pogoji preskusa, lastnosti 
absorpcije svetlobe, pKa in rezultate raziskav o preoblikovanju, 
vključno z biološko razgradljivostjo v vodi. 
Topnost v vodi, porazdelitveni koeficient oktanol/voda (P  ov ) in parni 
tlak preskusne snovi morajo biti znani, razpoložljiva pa mora biti 
tudi validirana metoda za koli činsko opredelitev snovi v preskusnih 
raztopinah skupaj z navedeno rekuperacijo in mejo zaznavnosti.  
1.6 REFEREN ČNA SNOV 
Referenčna snov/referen čne snovi, kot je na primer 3,5-diklorofenol, 
ki se uporablja za mednarodni prstanasti preskus (4), se lahko 
preskusi kot sredstvo preskušanja preskusnega postopka. Kot refe ­
renčna snov za zelene alge se prav tako lahko uporabi kalijev dikro ­
mat. Referen čno snov je zaželeno preskusiti vsaj dvakrat letno.  
1.7 VELJAVNOST PRESKUSA 
Za veljavnost preskusa morajo biti izpolnjena naslednja izvedbena 
merila:  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 955
 
— Biomasa v kontrolnih kulturah se mora v 72 urah preskusnega 
obdobja eksponentno pove čati za faktor najmanj 16. To ustreza 
specifični stopnji rasti v 0,92 dneva  1 . Za najpogosteje upora ­
bljene vrste je stopnja rasti ponavadi bistveno višja (glej Dodatek 1). Merilo ni izpolnjeno, kadar se uporabijo vrste, ki rastejo 
počasneje od tistih, ki so navedene v Dodatku 1. V tem primeru 
se mora preskusno obdobje podaljšati, da se zagotovi 16-kratna rast v kontrolnih kulturah, medtem ko mora biti rast eksponentna skozi celotno preskusno obdobje. Preskusno obdobje se lahko 
skrajša za najmanj 48 ur za ohranitev neomejene eksponentne 
rasti med preskusom, dokler je dosežen minimalni množitelj 16. 
— Povpre čni koeficient variacije za posami čne specifi čne stopnje 
rasti (dnevi 0–1, 1–2 in 2–3, za 72-urne preskuse) v kontrolnih kulturah (glej poglavje 1.2 v „koeficient variacije“) ne sme prekoračiti 35 %. Za ra čunanje posami čnih specifi čnih stopenj 
rasti glej drugi odstavek v poglavju 2.2.1. Merilo se uporablja 
za povpre čno vrednost koeficientov variacije, izra čunanih za 
ponovitvene kontrolne kulture. 
— Koeficient variacije za povpre čne specifi čne stopnje rasti med 
celotnim preskusnim obdobjem v ponovitvenih kontrolnih 
kulturah ne sme prekora čiti 7 % v preskusih z zelenimi algami  
Pseudokirchneriella subcapitata  in Desmodesmus subspicatus . 
Za druge manj pogosto preskušene vrste vrednost ne sme preko ­
račiti 10 %.
 
1.8 OPIS METODE  
1.8.1  Aparatura  
Preskusne posode in drugi aparature, ki pridejo v stik s preskusnimi 
raztopinami, morajo biti v celoti iz stekla ali drugega kemijsko 
inertnega materiala. Predmete je treba temeljito umiti, da organski ali anorganski onesnaževalci ne ovirajo rasti alg ali sestave 
preskusnih raztopin. 
Preskusne posode so ponavadi steklene bu čke z dimenzijami, ki 
dopuščajo zadostno prostornino kulture za meritve med preskusom 
in zadosten prenos mase CO
 2 iz ozračja (glej drugi odstavek 
v poglavju 1.8.9). Koli čina tekočine mora biti zadostna za analitsko 
določanje (glej peti odstavek v poglavju 1.8.11). 
Potrebna je tudi nekatera ali vsa oprema v nadaljevanju: — Inkubator za kultiviranje: priporo ča se omara ali soba, v kateri se 
lahko izbrana temperatura inkubacije vzdržuje na ±2 °C. 
— Naprave za merjenje svetlobe: treba je poudariti, da bo metoda za 
merjenje jakosti svetlobe in še zlasti vrsta sprejemnika (odjem ­
nika) vplivala na izmerjeno vrednost. Meritve naj se po možnosti izvajajo z uporabo okroglega (4 π) sprejemnika (ki reagira na 
neposredno in odbito svetlobo iz vseh kotov nad in pod ravnino 
meritve) ali sprejemnika 2 π (ki reagira na svetlobo iz vseh kotov 
nad ravnino meritve).
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 956
 
— Aparatura za dolo čanje biomase alg: število celic, ki je najpogo ­
steje uporabljen nadomestni parameter za biomaso alg, se lahko 
izvede z uporabo elektronskega števca delcev, mikroskopa s števno komoro ali preto čnega citometra. Za merjenje drugih 
nadomestkov biomase se lahko uporabljajo preto čni citometer, 
fluorimeter, spektrofotometer ali kolorimeter. Pretvorni faktor, 
ki povezuje število celic s suho težo, je koristen za prera čunava­
nje. Zaradi zagotovitve uporabnih meritev pri nizkih koncentra ­
cijah biomase, ko se uporablja spektrofotometer, je morda treba 
uporabiti kivete s svetlobno potjo vsaj 4 cm.
 
1.8.2  Preskusni organizmi  
Uporabi se lahko nekaj vrst nepritrjenih mikroalg in cianobakterij. 
Sevi, navedeni v Dodatku 1, so se izkazali kot primerni za uporabo 
preskusnega postopka, dolo čenega v tej preskusni metodi. 
Pri uporabi drugih vrst je treba poro čati o sevu in/ali izvoru. Treba je 
potrditi, da se lahko eksponentna rast izbrane preskusne alge ohrani 
skozi celotno preskusno obdobje pod prevladujo čimi pogoji.  
1.8.3  Rastno gojiš če 
Priporočata se dve alternativni rastni gojiš či; gojišče OECD in 
gojišče AAP. Sestave teh gojiš č so prikazane v Dodatku 
2. Začetna pH vrednost ter kapaciteta pufrov (ki ureja porast pH) 
sta v teh dveh gojiš čih različni. Zato so rezultati preskusov lahko 
različni, odvisno od uporabljenega gojiš ča, še posebno pri presku ­ 
šanju ionizirajo čih snovi. 
Morda bo za nekatere namene, npr. pri preskušanju kovin in kelatnih 
reagentov ali pri preskušanju pri razli čnih pH vrednostih, treba prila ­
goditi rastno gojiš če. Uporaba prilagojenega gojiš ča mora biti 
podrobno opisana in utemeljena (3)(4).  
1.8.4  Za četna koncentracija biomase  
Začetna biomasa v preskusnih kulturah mora biti enaka v vseh 
preskusnih kulturah in zadostno nizka, da dopuš ča eksponentno 
rast skozi celotno inkubacijsko obdobje brez tveganja iz črpanja 
hranilnih snovi. Za četna biomasa kot suha snov ne sme prekora čiti 
0,5 mg/l. Priporo čene so naslednje za četne koncentracije celic:  
Pseudokirchneriella subcapitata:  5 × 10  3 –10  4 celic/ml  
Desmodesmus subspicatus  2–5 × 10  3 celic/ml  
Navicula pelliculosa  10  4 celic/ml  
Anabaena flos-aquae  10  4 celic/ml  
Synechococcus leopoliensis  5 × 10  4 –10  5 celic/ml  
1.8.5  Koncentracija preskusne snovi  
Območje koncentracije, v katerem se lahko pojavijo u činki, je lahko 
določeno na osnovi rezultatov iz preskusov za ugotavljanje obmo čja. 
Za zadnji dokon čni preskus naj se izbere najmanj pet koncentracij, 
razvrščenih v geometrijskih vrstah s faktorjem, ki ne presega 3,2. Za 
preskusno snov, ki kaže ravno krivuljo odziva koncentracije, je lahko 
določen višji faktor. Serije koncentracij naj po možnosti pokrivajo 
območje, ki povzro ča 5–75-odstotno zaviranje stopnje rasti alg.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 957
 
1.8.6  Ponovitve in kontrolni vzorci  
Načrt preskusa mora vklju čevati tri ponovitve za vsako preskusno 
koncentracijo. Če ni zahtevana dolo čitev NOEC, se lahko na črt 
preskusa prilagodi, da se pove ča število koncentracij in zmanjša 
število ponovitev na koncentracijo. Izvedejo se najmanj tri kontrolne 
ponovitve, v idealnih razmerah pa naj se uporabi dvakratno število ponovitev za vsako preskusno koncentracijo. 
Za analitsko dolo čanje koncentracij preskusne snovi se lahko 
pripravi lo čena serija preskusnih raztopin (glej četrti in šesti odstavek 
v poglavju 1.8.11). 
Kadar se za raztapljanje preskusne snovi uporabi topilo, morajo biti 
v preskusni na črt vključene dodatne kontrolne kulture, ki vsebujejo 
topilo pri enaki koncentraciji, kot je bila uporabljena pri preskusnih kulturah.
 
1.8.7  Priprava kulture inokuluma  
Kultura inokuluma se pripravi v preskusnem mediju 2–4 dni pred 
začetkom preskusa zaradi prilagoditve preskusnih alg preskusnim 
pogojem in zagotovitve, da so alge v eksponentni fazi rasti, ko se 
uporabijo za inokulacijo preskusnih raztopin. Algalno biomaso je 
treba prilagoditi, da lahko eksponentna rast do za četka preskusa 
prevlada v kulturi inokuluma. Kultura inokuluma se inkubira pod enakimi pogoji kot preskusne kulture. V kulturi inokuluma se meri 
porast biomase, da se zagotovi rast znotraj normalnega obsega za 
preskusni sev pod pogoji kultiviranja. Primer postopka za kultivi ­
ranje alg je opisan v Dodatku 3. Da ne pride do sinhrone delitve celic med preskusom, se lahko zahteva še drugi ukrep razmnože ­
vanja kulture inokuluma.
 
1.8.8  Priprava preskusne raztopine  
Vse preskusne raztopine morajo vsebovati enake koncentracije 
rastnih gojiš č in začetno biomaso preskusnih alg. Preskusne razto ­
pine izbranih koncentracij se ponavadi pripravijo z mešanjem 
osnovne raztopine preskusne snovi z rastnim gojiš čem in kulturo 
inokuluma. Osnovne raztopine se ponavadi pripravijo tako, da se snov raztopi v preskusnem mediju. 
Topila, npr. aceton, t-butil alkohol in dimetilformamid, se lahko 
uporabljajo kot nosilci za dodajanje snovi z nizko topnostjo v vodi preskusnemu mediju (2)(3). Koncentracija topila naj ne prekora či 
100 μl/l in enaka koncentracija topila naj bo dodana vsem kulturam 
(tudi kontrolnim) v seriji preskusov.
 
1.8.9  Inkubacija  
Preskusne posode se zaprejo z zamaški, ki prepuš čajo zrak. Posode 
se pretresejo in postavijo v inkubator za kultiviranje. Med preskusom je potrebno imeti alge v suspenziji in omogo čiti prenos CO
 2 . V ta 
namen je potrebno nenehno tresenje ali mešanje. Kulture naj se 
ohranjajo pri temperaturi obsega 21 do 24 °C, kontrolirani pri ±2 °C. Za vrste, razen naštetih v Dodatku 1, npr. tropske vrste, so lahko primerne višje temperature, pod pogojem, da so lahko izpol ­
njena merila za veljavnost. Priporo čeno je, da se bu čke v inkubatorju 
naključno razporedi in dnevno prestavlja.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 958
 
Vrednost pH kontrolnega medija naj se med preskusom ne pove ča za 
več kot 1,5. Za kovine in spojine, ki delno ionizirajo pri pH okrog 
preskusne pH, je morda treba omejiti premik (drift) pH, da se zago ­
tovijo ponovljivi in natan čni rezultati. Premik za < 0,5 pH enot je 
tehnično izvedljiv in se lahko doseže tako, da se v preskusni razto ­
pini zagotovi primerna stopnja prenosa mase CO  2 iz okoliškega 
zraka, npr. s pove čanjem stopnje tresenja. Druga možnost je zmanj ­ 
šanje potrebe po CO  2 z zmanjšanjem za četne biomase ali skrajša ­
njem trajanja preskusa. 
Površina, na kateri so kulture inkubirane, naj prejema stalno, enotno 
fluorescentno osvetljenost, npr. „hladno belo“ svetlobo ali „dnevno svetlobo“. Sevi alg in cianobakterij se razlikujejo glede svojih zahtev po svetlobi. Izbrana jakost svetlobe naj ustreza uporabljenemu 
preskusnemu organizmu. Za priporo čene vrst zelenih alg se na 
stopnji preskusnih raztopin izbere jakost svetlobe od 60 do 120 μE·m
 –2 ·s –1 , kadar se meri v fotosinteti čno učinkovitem obsegu 
valovne dolžine 400–700 nm z uporabo primernega sprejemnika. 
Nekatere vrste, zlasti  Anabaena flos-aquae , dobro rastejo pri nižjih 
jakostih svetlobe in se pri visokih jakostih lahko poškodujejo. Za takšne vrste naj bo izbrana povpre čna jakost svetlobe v obsegu 
40–60 μE·m
 –2 ·s –1 . (Pri merilnikih svetlobe, umerjenih v luksih, 
enakovredno obmo čje 4440–8880 lux za hladno belo svetlobo 
približno ustreza priporo čeni jakosti svetlobe 60–120 μE·m  –2 ·s –1 .) 
Jakost svetlobe v inkubacijskem obmo čju ne odstopa od povpre čne 
jakosti svetlobe za ve č kot ±15 %.  
1.8.10  Trajanje preskusa  
Preskus ponavadi traja 72 ur. Preskus lahko traja tudi ve č ali manj 
časa, pod pogojem da so izpolnjena vsa merila za veljavnost, nave ­
dena v poglavju 1.7.  
1.8.11  Merjenje in analitsko dolo čanje 
Biomasa alg v vsaki bu čki se med preskusnim obdobjem dolo ča 
najmanj enkrat dnevno. Če se merjenje izvaja na majhnih koli činah, 
vzetih iz preskusne raztopine s pipeto, je treba te ohranjati nespre ­
menjene. 
Merjenje biomase se izvaja z ro čnim štetjem celic s pomo čjo mikro­
skopa ali z elektronskim števcem delcev (s štetjem celic in/ali biovo ­
lumnom). Alternativne tehnike, npr. preto čna citometrija, klorofilna 
fluorescenca  in vitro  ali in vivo  (6)(7) ali opti čna gostota, se lahko 
uporabljajo pod pogojem, da je mogo če v obmo čju biomase 
v preskusu ugotoviti zadovoljivo povezavo z biomaso. 
Vrednost pH raztopin se izmeri na za četku in koncu preskusa. 
Če je na voljo analitski postopek za dolo čanje preskusne snovi 
v uporabljenem obmo čju koncentracije, je treba preskusne raztopine 
analizirati, da se preverijo za četne koncentracije in vzdrževanje 
koncentracij izpostavljenosti med preskusom.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 959
 
Analiza koncentracije preskusne snovi na za četku in koncu preskusa 
nizke in visoke preskusne koncentracije in koncentracija okrog pri ča­
kovane EC  50 sta lahko zadostni, kadar je verjetno, da se bodo 
koncentracije izpostavljenosti med preskusom razlikovale za manj kot 20 % od nominalnih vrednosti. Analiza vseh preskusnih koncen ­
tracij na za četku in koncu preskusa se priporo ča, kadar je malo 
verjetno, da bodo koncentracije ostale znotraj 80–120 % nominalne vrednosti. Za hlapne, neobstojne ali mo čno adsorptivne preskusne 
snovi se priporo ča dodatno vzor čenje za analizo v 24-urnih intervalih 
med obdobjem izpostavljenosti, da se bolje dolo čijo izgube 
preskusne snovi. Za te snovi so potrebne posebne ponovitve. V vseh primerih je treba izvesti dolo čanje koncentracije preskusne 
snovi samo na eni ponovitveni posodi pri vsaki preskusni koncen ­
traciji (ali na vsebnostih posod, zbranih s ponovitvijo). 
Preskusni medij, pripravljen posebej za analizo koncentracij izposta ­
vljenosti med preskusom, naj se obravnavajo enako kot tisti, upora ­
bljeni za preskušanje; npr. naj se inokulirajo z algami in inkubirajo 
pod enakimi pogoji. Če se zahteva analiza raztopljene koncentracije 
preskusne snovi, je morda treba lo čiti alge od medija. Najboljše je, 
da se ločitev izvede s centrifugiranjem z nizkim pospeškom g, ki 
zadošča, da se alge usedejo. 
Če obstajajo dokazi, da se je koncentracija preskušane snovi zado ­
voljivo ohranila znotraj ±20 % nominalne ali izmerjene za četne 
koncentracije skozi celoten preskus, se analiza rezultatov lahko utemelji na nominalnih ali izmerjenih za četnih vrednostih. Če je 
odstopanje od nominalne ali izmerjene za četne koncentracije ve čje 
od ±20 %, se analiza rezultatov utemelji na geometrijski povpre čni 
koncentraciji med izpostavljenostjo ali na modelih, ki opisujejo upad koncentracije preskusne snovi (3)(8). 
Preskus zaviranja rasti alge je bolj dinami čen preskusni sistem od 
večine drugih kratkoro čnih preskusov toksi čnosti za vodno okolje. 
Posledično je morda težko dolo čiti dejanske koncentracije izposta ­
vljenosti, še posebno za adsorptivne snovi, preskušene pri nizkih 
koncentracijah. Izginevanje snovi iz raztopine z adsorpcijo 
v naraščajočo biomaso alg v takih primerih ne pomeni, da se je 
snov izgubila iz preskusnega sistema. Ko je rezultat preskusa anali ­
ziran, je treba preveriti preveriti, ali upadanje v koncentraciji 
preskusne snovi med preskusom spremlja upadanje v zaviranju rasti. 
Če je tako, se lahko preu či uporaba primernega modela, ki opisuje 
upadanje koncentracije v preskusni snovi (8). Če ne, je morda 
primerno utemeljiti analizo rezultatov na za četnih (nominalnih ali 
izmerjenih) koncentracijah.
 
1.8.12  Druga opazovanja  
Izvesti je treba mikroskopsko opazovanje, da se preveri normalna in 
zdrava navzo čnost kulture inokuluma in opazuje vsako nenormalno 
pojavljanje alg (ki ga lahko povzro či izpostavljenost preskusni snovi) 
na koncu preskusa.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 960
 
1.8.13  Mejni preskus  
V nekaterih okoliš činah, npr. kadar predhodni preskus pokaže, da 
preskusna snov nima toksi čnih učinkov pri koncentracijah do 
100 mg·l  –1 ali do svoje meje topnosti v preskusnem mediju (karkoli 
je nižje), se lahko izvede mejni preskus, ki vklju čuje primerjavo 
odzivov v kontrolni skupini in eni tretirani skupini (100 mg·l  –1 ali 
koncentracija, ki je enaka meji topnosti). Zelo se priporo ča, da je 
mejni preskus podprt z analizo koncentracije izpostavljenosti. Za 
mejni preskus se uporabljajo vsi prej opisani preskusni pogoji in 
merila za veljavnost, razen da je število tretiranih ponovitev najmanj šest. Odvisne spremenljivke v kontrolni in tretirani skupini se lahko 
analizirajo z uporabo statisti čnega testa za primerjavo na činov, npr. 
s študentskim t-preskusom. Če so variance obeh skupin neenake, je 
treba izvesti t-preskus, prilagojen za neenake variance.
 
1.8.14  Sprememba za mo čno barvane snovi  
Obsevanje (jakost svetlobe) bi moralo biti na zgornjem koncu 
območja predvidenega s to preskusno metodo: 120 μE m-2 s-1 ali 
več. 
Svetlobna pot bi morala biti zmanjšana z zmanjšanjem koli čine 
preskusnih raztopin (v obmo čje od 5 do 25 ml). 
Primerno mešanje (na primer z zmernim stresanjem) bi moralo biti 
zagotovljeno za ve čjo pogostost izpostavitve alge ve čjim obsevanjem 
na površini kulture.  
2. PODATKI  
2.1 IZRIS RASTNIH KRIVULJ 
Biomasa v preskusnih posodah je lahko izražena v enotah nadomest ­
nega parametra, uporabljenega za merjenje (npr. število celic, fluo ­
rescenca). 
V tabeli se predstavi ocenjena koncentracijo biomase v preskusnih 
kulturah in kontrolnih skupinah skupaj s koncentracijami preskus ­
nega materiala in časom meritev, zabeleženim z lo čljivostjo vsaj 
celih ur, da se izdela izris rastnih krivulj. Na tej stopnji so lahko uporabne tako logaritmi čne kot linearne lestvice, vendar so logarit ­
mične lestvice obvezne in na splošno podajo boljšo predstavitev 
variacij od rastnega vzorca med preskusnim obdobjem. Eksponentna 
rast pri izrisu na logaritmi čni lestvici kaže ravno črto in naklonjenost 
črte (nagib) prikazuje specifi čno stopnjo rasti. 
Z uporabo izrisov se preveri, ali kontrolne kulture skozi celotni 
preskus rastejo eksponentno glede na pri čakovano stopnjo. Zaradi 
možnih napak se preverijo vse podatkovne to čke in videz grafov 
ter neobdelani podatki in postopki. Zlasti se preverijo vse poda ­
tkovne to čke, za katere se zdi, da odstopajo zaradi sistemati čne 
napake. Če je mogo če postopkovne napake o čitno prepoznati in/ali 
so zelo verjetne, se specifi čna podatkovna to čka označi kot izlo čena 
in se ne vklju či v kasnejšo statisti čno analizo. (Koncentracija alg ni č 
v eni od dveh ali treh ponovitvenih posod lahko pokaže, da posoda 
ni bila pravilno inokulirana ali da je bila neprimerno o čiščena.) 
Razlogi za zavrnitev podatkovnih to čk kot izlo čenih morajo biti 
jasno navedeni v poro čilu o preskusu. Veljavni razlogi so samo 
(redko) postopkovne napake in ne le slaba natan čnost. Statisti čni 
postopki za prepoznavanje izlo čitve imajo za to vrsto problema 
omejeno uporabnost in ne morejo nadomestiti strokovne presoje. Izločitve (ozna čene kot take) naj se po možnosti ohranijo med poda ­
tkovnimi to čkami, ki so prikazane v katerikoli grafi č
ni ali tabelarni 
predstavitvi podatkov.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 961
 
2.2 ODVISNA SPREMENLJIVKA 
Namen preskusa je dolo čiti učinke preskusne snovi na rast alg. Ta 
preskusna metoda opisuje dve odvisni spremenljivki, ker imajo države članice razli čne preference in zakonodajne potrebe. Da bi 
bili preskusni rezultati sprejemljivi v vseh državah članicah, se 
morajo rezultati ovrednotiti z uporabo obeh odvisnih spremenljivk (a) in (b), ki sta: 
(a) povpre čna specifi čna stopnja rasti: ta odvisna spremenljivka se 
preračuna na osnovi logaritmi čnega naraš čanja biomase med 
preskusnim obdobjem, ki je dnevno izražen; 
(b) prirast: ta odvisna spremenljivka je biomasa na koncu preskusa 
manj začetna biomasa. 
Za rabo te metode v zakonodajnem okviru EU bi morali za izra čun 
rezultatov uporabiti povpre čno specifi čno hitrost rasti iz razlogov, ki 
so opisani spodaj. Treba je opozoriti, da toksi čne vrednosti, prera ­ 
čunane z uporabo teh dveh odvisnih spremenljivk, niso primerljive, 
in ta razlika mora biti priznana pri uporabi rezultatov preskusa. 
Vrednosti EC
 x , ki temeljijo na povpre čni specifi čni stopnji rasti 
(E r C x ), bodo na splošno višje kot rezultati, ki temeljijo na prirastu 
(E y C x ), če se zaradi matemati čne osnove zadevnih pristopov upošte ­
vajo preskusni pogoji te preskusne metode. To se ne razlaga kot 
razlika v ob čutljivosti med obema odvisnima spremenljivkama, 
preprosto zato ker so vrednosti matemati čno različne. Koncept 
povprečne specifi čne stopnje rasti temelji na splošnem eksponentnem 
rastnem vzorcu alg v neomejenih kulturah, kjer je toksi čnost 
ocenjena na osnovi u činkov na stopnjo rasti in ni odvisna od abso ­
lutne vrednosti specifi čne kontrolne stopnje rasti, naklona krivulje 
koncentracija-odziv ali trajanja preskusa. Nasprotno so rezultati, ki temeljijo na odvisni spremenljivki prirasta, odvisni od vseh teh 
drugih spremenljivk. E
 y C x je odvisna od specifi čne stopnje rasti 
vrst alg, uporabljenih v vsakem preskusu, in od maksimalne speci ­
fične stopnje rasti, ki je lahko razli čna glede na vrsto in celo glede 
na seve alg. Ta odvisna spremenljivka se ne uporablja za primerjanje 
občutljivosti na toksi čne snovi med vrstami alg ali celo razli čnimi 
sevi. Medtem ko ima uporaba povpre čne specifi čne stopnje rasti 
v znanosti prednost pri ocenjevanju toksi čnosti, pa so v to preskusno 
metodo vklju čene tudi ocene toksi čnosti, ki temeljijo na prirastu, da 
se zadovolji trenutnim pravnim predpisom v nekaterih državah.  
2.2.1  Povpre čna stopnja rasti  
Povprečna specifi čna stopnja rasti za dolo čeno obdobje se izra čuna 
kot logaritmi čno povečanje biomase za vsako posamezno posodo 
kontrolnih in tretiranih skupin iz ena čbe: 
μ i-j ¼ lnX j – lnX i 
t j – t i ðdan  –1 Þ 
kjer je: 
μ i–j : povpre čna specifi čna stopnja rasti od časa i do j; 
X i : biomasa v času i; 
X j : biomasa v času j.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 962
 
Srednja vrednost stopnje rasti skupaj z ocenami razhajanj se izra čuna 
za vsako tretirano skupino in kontrolno skupino.. 
Povprečna specifi čna stopnja rasti se izra čuna za celotno preskusno 
obdobje (ponavadi dnevi 0–3) z uporabo nominalno inokulirane 
biomase kot za četne vrednosti raje kot izmerjene za četne vrednosti, 
saj je v tem primeru dosežena ve čja natančnost. Če oprema za 
merjenje biomase dopuš ča zadovoljivo natan čno določanje nizke 
biomase inokuluma (npr. preto čni citometer), potem se lahko uporabi 
začetna izmerjena koncentracija biomase. Prav tako se ocenijo posa ­
mične stopnje rasti, izra čunane kot specifi čne stopnje rasti za vsak 
dan med potekom preskusa (dnevi 0–1, 1–2 in 2–3) in pregleda se, 
ali kontrolna stopnja rasti ostaja konstantna (glej merila za veljav ­
nost, poglavje 1.7). Znatno nižja specifi čna stopnja rasti prvega dne 
od celotne povpre čne specifi čne stopnje rasti lahko nakazuje fazo 
prilagajanja. Medtem ko je lahko faza prilagajanja v kontrolnih 
skupinah s pravilnim razmnoževanjem predkultur zmanjšana in prak ­
tično izničena, lahko faza prilagajanja v izpostavljenih kulturah naka ­
zuje obnovitev po za četnem toksi čnem stresu ali zmanjšani izposta ­
vljenosti zaradi izgube preskusne snovi (vklju čno s sorpcijo na 
biomaso alg) po za četni izpostavljenosti. Zaradi tega se lahko 
oceni posami čna stopnja rasti, da se ocenijo u činki preskusne snovi, 
ki se pojavi med obdobjem izpostavljenosti. Bistvene razlike med posamično stopnjo rasti in povpre čno stopnjo rasti nakazujejo odklon 
od konstantne eksponentne rasti in da je zagotovljena natan čna 
preiskava rastnih krivulj. 
Odstotek zaviranja stopnje rasti za vsako tretirano ponovitev se izra ­ 
čuna po ena čbi:
 
%I r ¼ μ C – μ T 
μ C Ü 100  
kjer je: 
%I r : odstotek zaviranja v povpre čni specifi čni stopnji rasti 
μ C : srednja vrednost za povpre čno specifi čno stopnjo rasti ( μ) 
v kontrolni skupini; 
μ T : povpre čna specifi čna stopnja rasti za tretirano ponovitev. 
Če se za pripravo preskusnih raztopin uporabijo topila, naj se pri 
izračunu odstotka zaviranja raje kot kontrole brez topil uporabi 
kontrole topil.  
2.2.2  Prirast  
Prirast se ra čuna kot biomasa ob koncu preskusa manj za četna 
biomasa za vsako posodo kontrolnega in tretiranega vzorca. Za vsako preskusno koncentracijo in kontrolni vzorec se izra čuna 
srednja vrednost prirasta z ocenjeno varianco. Odstotek zaviranja 
v prirastu (% I
 y ) se lahko izra čuna za vsako tretirano ponovitev po 
enačbi: 
%I y ¼ ðY C – Y T Þ 
Y C Ü 100  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 963
 
kjer je: 
% I  y : odstotek zaviranja prirasta 
Y C : srednja vrednost prirasta v kontrolni skupini 
Y T : vrednost prirasta za tretirano ponovitev.  
2.3 IZRIS KRIVULJE ODZIVA KONCENTRACIJE 
Izriše se odstotek zaviranja glede na logaritem koncentracije 
preskusne snovi in se natan čno pregleda izris, pri čemer se ne 
upošteva vsaka takšna podatkovna to čka, ki je bila izlo čena v prvi 
fazi. Skozi podatkovne to čke se potegne ravna črta, in sicer ro čno ali 
z računalniško interpolacijo, da se dobi prvi vtis o razmerju odziv- 
koncentracija, nato se nadaljuje z bolj podrobno metodo, po 
možnosti z ra čunalniško statisti čno metodo. Odvisno od predvidene 
uporabe podatkov, kvalitete (natan čnosti) in koli čine podatkov, kot 
tudi razpoložljivosti orodij za analizo podatkov, se lahko odlo či (in 
včasih povsem upravi čeno), da se ustavi analiza podatkov na tej 
stopnji in se preprosto prebere klju čne vrednosti EC  50 in EC  10 (in/ali 
EC 20 ) iz ročno narisane krivulje (glej tudi spodnje poglavje 
o spodbujevalnih u činkih). Utemeljeni razlogi za neuporabo stati ­
stične metode lahko vklju čujejo: 
— Podatki niso primerni za ra čunalniške metode, saj le-te ne izde ­
lajo nobenih bolj zanesljivih rezultatov, kot jih lahko pridobi strokovna presoja – nekateri ra čunalniški programi v takšnih 
situacijah celo ne morejo izdelati zanesljive rešitve (ponovitve 
se ne združujejo itd.). 
— Spodbujevalni odzivi rasti se z uporabo razpoložljivih ra čunalni­ 
ških programov ne morejo ustrezno obravnavati (glej spodaj).
 
2.4 STATISTI ČNI POSTOPKI 
Cilj je pridobiti kvantitativno razmerje koncentracija-odziv z uporabo 
regresijske analize. Lahko se uporabi tehtana linearna regresija, po 
tem ko se izvede linearizacijska pretvorba podatkov o odzivu – na 
primer v verjetnostnih ali logaritmi čnih ali Weibullovih enotah (9), 
vendar so nelinearni regresijski postopki prednostne metode, ki bolje obravnavajo neizogibne podatkovne nepravilnosti in odklone od 
enakomerne porazdelitve. Če se te nepravilnosti približujejo ni čel­
nemu ali popolnemu zaviranju, se lahko pove čajo s pretvorbo in 
ovirajo analizo (9). Upoštevati je treba, da so standardne metode za analizo, ki uporabljajo verjetnostne, logaritmi čne ali Weibullove 
pretvorbe, namenjene za uporabo na kvantiziranih podatkih (npr. 
umrljivost ali preživetje), in morajo biti ustrezno prirejene zaradi upoštevanja podatkov o rasti ali o biomasi. Posebni postopki za določanje vrednosti EC
 x iz stalnih podatkov so navedeni v (10), 
(11) in (12). Uporaba nelinearne regresijske analize je podrobneje 
opisana v Dodatku 4.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 964
 
Za vsako odvisno spremenljivko, ki se analizira, se za izra čun 
ocenjenih vrednosti pri vrednostih EC  x uporabi razmerje koncentra ­
cija-odziv. Kadar je to mogo če, se dolo čijo 95 % meje zaupanja za 
vsako oceno. Ujemanje podatkov o odzivu z regresijskim modelom naj se oceni grafi čno ali statisti čno. Regresijska analiza se izvede 
z uporabo posami čnih ponovitvenih odzivov in ne srednjih vrednosti 
tretiranih skupin. Če pa je nelinearno prilagajanje krivulj težko ali 
zaradi preve č razpršenih podatkov ne uspe, se težava lahko prepre či 
z izvedbo regresije na skupinskih srednjih vrednostih kot prakti čni 
način zmanjševanja vpliva pri čakovanih izlo čitev. Uporaba te 
možnosti naj se navede v poro čilu kot odklon od normalnega 
postopka, ker ujemanje krivulje s posami čnimi ponovitvami ni dalo 
dobrih rezultatov. 
Ocene EC
 50 in meje zaupanja se prav tako lahko pridobi z uporabo 
linearne interpolacije z metodo vezanja (13), če so razpoložljivi 
regresijski modeli/metode za podatke neustrezni. 
Za ocenjevanje LOEC in zato tudi NOEC ter za u činke preskusne 
snovi na stopnjo rasti je potrebno primerjati srednje vrednosti treti ­
ranih skupin z uporabo tehnik analize variance (ANOVA). Srednja 
vrednost vsake koncentracije se nato primerja s srednjo vrednostjo 
kontrolnih skupin z uporabo primerne multiple primerjave ali preskusne metode trenda. Uporabna sta lahko Dunnettov ali Williamsov preskus (14)(15)(16)(17)(18). Potrebno je oceniti, ali 
predpostavka o homogenosti variance ANOVA drži. Ta ocena se 
lahko izvede grafi čno ali s formalnim preskusom (18). Primerna 
preskusa sta Levenejev in Bartlettov. Neizpolnjevanje predpostavke o homogenosti varianc se lahko v časih popravi z logaritmi čno pret­
vorbo podatkov. Če je heterogenost variance velika in je s pretvorbo 
ni mogoče popraviti, se obravnava analiza z metodami kot so Jonck ­
heerevi step-down preskusi trenda. Dodatna navodila o dolo čanju 
NOEC so navedena v (12). 
Nedavni znanstveni razvoj je privedel do priporo čila o opustitvi 
koncepta NOEC in nadomestitve le-tega z regresijo, ki temelji na ocenjenih vrednostih EC
 x . Za ta preskus alg ni bila dolo čena 
primerna vrednost x. Primerno je obmo čje 10 do 20 % (odvisno 
od izbrane odvisne spremenljivke) in po možnosti naj se poro ča 
tako o EC  10 kot tudi o EC  20 . 
2.5 SPODBUJANJE RASTI 
Pri nizkih koncentracijah je v časih opaženo spodbujanje rasti (nega ­
tivno zaviranje). To je lahko posledica hormeze („spodbujanje toksi ­ 
čnosti“) ali dodajanja spodbujevalnih rastnih faktorjev s preskusnim 
materialom minimalnemu uporabljenemu mediju. Upoštevati je treba, 
da dodajanje anorganskih hranil naj ne bi imelo nobenih neposrednih 
učinkov, saj naj bi preskusni medij ohranjal presežek hranil skozi 
celoten preskus. Nizek odmerek spodbujanja se ponavadi ne upošteva pri ra čunanju EC
 50 , razen če je zelo velik. Če pa je zelo 
velik ali če se izračuna vrednost EC  x za nizek x, so potrebni posebni 
postopki. Brisanju spodbujevalnih odzivov iz analize podatkov se je treba izogibati, če je mogo če, in če razpoložljiva programska oprema 
za prilagajanje krivulje ne more sprejeti manjših spodbujanj, se lahko 
uporabi linearna interpolacija z metodo vezanja. Če je spodbujanje 
zelo veliko, naj se obravnava model hormeze (19).
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 965
 
2.6 NETOKSI ČNO ZAVIRANJE RASTI 
Preskusni materiali, ki absorbirajo svetlobo, lahko povzro čijo zmanj ­ 
šanje stopnje rasti, ker sen čenje zmanjša koli čino razpoložljive svet ­
lobe. Takšne fizikalne u činke je treba s prilagoditvijo preskusnih 
pogojev lo čiti od toksi čnih učinkov in o njih lo čeno poročati. Navo ­
dila so navedena v (2) in (3).  
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preskusu mora vsebovati: 
Preskusno snov: — fizične značilnosti in fizikalno kemijske lastnosti, vklju čno 
z mejo topnosti v vodi, 
— kemijske identifikacijske podatke, vklju čno s čistostjo. 
Preskusne vrste: 
— sev, dobavitelja ali vir in uporabljene pogoje gojenja. 
Preskusne pogoje: 
— podatke o za četku preskusa in njegovo trajanje, 
— opis na črta preskusa: preskusne posode, volumne kultur, gostoto 
biomase na za četku preskusa, 
— sestavo medija, 
— preskusne koncentracije in ponovitve (npr. število ponovitev, 
število uporabljenih preskusnih koncentracij in geometrijskih naraščanj), 
— opis priprave preskusnih raztopin, vklju čno z uporabo topil itd., 
— inkubator za kultiviranje, — jakost in kvaliteto svetlobe (vir, homogenost), 
— temperaturo, 
— preskušene koncentracije: nominalne preskusne koncentracije in 
vsake rezultate analiz, da se dolo či koncentracija preskusne snovi 
v preskusnih posodah Poro ča naj se o rekuperaciji metode in 
meji količinske dolo čitve v preskusni matrici, 
— vse odklone od te preskusne metode, 
— metodo za dolo čanje biomase in dokaze o korelaciji med izmer ­
jenim parametrom in suho težo. 
Rezultate: 
— pH vrednosti na za četku in koncu preskusa za vsa tretiranja, 
— biomaso za vsako bu čko pri vsaki to čki meritve in metodo za 
merjenje biomase,
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 966
 
— rastne krivulje (izris biomase glede na čas), 
— izračunane odvisne spremenljivke za vsako tretirano ponovitev, 
s srednjimi vrednostmi in koeficienti variacij za ponovitve, 
— grafično predstavitev razmerja koncentracija/u činek, 
— ocene toksi čnosti za odvisne spremenljivke, npr. EC  50 , EC  10 , 
EC 20 in pripadajo če intervale zaupanja. Če sta izra čunani, 
LOEC in NOEC in statisti čne metode, uporabljene za njuno 
določitev, 
— če je bila uporabljena ANOVA, velikost u činka, ki je bil opažen 
(npr. najmanj pomembna razlika), 
— vsako spodbujanje rasti, ki se je pokazalo pri katerem koli treti ­
ranju, 
— vse druge opažene u činke, npr. morfološke spremembe alg, 
— razpravo o rezultatih, vklju čno z vsakim vplivom na izid 
preskusa, ki izhaja iz odklonov od preskusne metode.  
4. VIRI  
(1) OECD TG 201 (2006). Freshwater Alga and Cyanobacteria, 
Growth Inhibition Test. 
(2) ISO 1998: Water quality – Guidance for algal growth inhibition 
tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water. ISO/DIS 14442. 
(3) OECD 2000: Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing 
of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, št. 23. 
(4) ISO 1998: Water quality – Sampling – Part 16: General 
Guidance for Biotesting. ISO 5667–16. 
(5) ISO 1993: Water quality – Algal growth inhibition test. ISO 
8692. 
(6) Mayer, P., Cuhel, R. in Nyholm, N. (1997). A simple in vitro 
fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525–2531. 
(7) Slovacey, R.E. in Hanna, P.J. In vivo fluorescence determina ­
tions of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceano ­
graphy 22,5 (1977), str. 919–925. 
(8) Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. in Batley, G.E. 
(2003) Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem 22, 2073–2079. 
(9) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 
19, 713–718.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 967
 
(10) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. in Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity 
tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157–167. 
(11) Bruce, R.D. in Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for 
modelling continuous toxicity data. Env. Toxicol. Chem. 11:1485–1494. 
(12) OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data. 
(13) Norberg-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Asses ­
sment Center Technical Report 05–88. USEPA, Duluth, MN. 
(14) Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc. 50: 1096–1121. 
(15) Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics 20: 482–491. 
(16) Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27: 103–117. 
(17) Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28: 510–531. 
(18) Draper, N.R. in Smith, H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition. Wiley, New York. 
(19) Brain P. in Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93–96.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 968
 
Dodatek 1  
Sevi, dokazano primerni za preskušanje  
Zelene alge  
— Pseudokirchneriella subcapitata , (prej poznana kot  Selenastrum capricornu ­
tum), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG 
— Desmodesmus subspicatus  (prej poznana kot  Scenedesmus subspicatus ) 86.81 
SAG  
Kremenaste alge  
— Navicula pelliculosa , UTEX 664  
Cianobakterije  
— Anabaena flos-aquae , UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A 
— Synechococcus leopoliensis , UTEX 625, CCAP 1405/1  
Viri sevov  
Priporočeni sevi so na voljo v kulturah z eno samo vrsto alg v naslednjih zbirkah 
(po abecednem vrstnem redu): 
ATCC: American Type Culture Collection 
10801 University Boulevard Manassas, Virginia 20110–2209 USA 
CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa 
Institute of Freshwater Ecology, Windermere Laboratory Far Sawrey, Amblerside 
Cumbria 
LA22 0LP UK 
SAG: Sammlung von Algenkulturen 
Albrecht-von-Haller-Institut 
Universität Göttingen Nikolausberger Weg 18 37073 Göttingen 
GERMANY 
UTEX Culture Collection of Algae 
Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology School of Biological Sciences the University of Texas at Austin 
Austin, Texas 78712 
USA
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 969
 
Videz in zna čilnosti priporo čenih vrst  
P. subcapitata D. subspicatus N. pelliculosa A. flos-aquae S. leopoliensis  
Videz upognjene, 
zvite posa ­
mezne celice ovalne, 
v glavnem 
posamezne celice paličice verige ovalnih 
celic paličice 
Velikost (L ș × șW) μm 8–14 × 2–3 7–15 × 3–12 7,1 × 3,7 4,5 × 3 6 × 1 
Volumen celice ( μm
 3 /celico) 40–60 (  1 ) 60–80 (  1 ) 40–50 (  1 ) 30–40 (  1 ) 2,5 (  2 ) 
Suha teža celice (mg/celico) 2–3 × 10  –8 3–4 × 10  –8 3–4 × 10  –8 1–2 × 10  –8 2–3 × 10  –9 
Stopnja rasti (  3 ) (dan  –1 ) 1,5–1,7 1,2–1,5 1,4 1,1–1,4 2,0–2,4  
( 1 ) Izmerjeno z elektronskim števcem delcev 
( 2 ) Izračunano iz velikosti 
( 3 ) Najpogosteje opazovana stopnja rasti v gojiš ču OECD pri jakosti svetlobe približno μE·m  –2 ·s –1 in 21 °C  
Posebna priporo čila o kultiviranju in ravnanju s priporo čenimi preskusnimi 
vrstami  
Pseudokirchneriella subcapitata in Desmodesmus subspicatus  
Te zelene alge se na splošno lahko vzdržuje v razli čnih gojiščih kultur. Podatki 
o primernih gojiš čih so na voljo v zbirkah kultur. Celice so ponavadi samotarske, 
meritve celi čne gostote pa se lahko izvedejo na enostaven na čin z uporabo elek ­
tronskega merilca delcev ali mikroskopa.  
Anabaena flos-aquae  
Za gojenje osnovne kulture se lahko uporabijo razli čna rastna gojiš ča. Zelo 
pomembno je, da se šaržni kulturi ne dopusti, da gre preko logaritemske faze 
rasti, kadar se obnavlja, saj je na tej stopnji obnova težka.  
Anabaena flos-aquae  razvije skupke ugnezdenih verig celic. Velikost teh 
skupkov je glede na pogoje kultiviranja lahko razli čna. Te skupke je pri štetju 
s pomočjo mikroskopa ali ob uporabi elektronskega števca delcev za dolo čanje 
biomase morda treba lo čiti. 
Za ločevanje verig se lahko uporabi ultrazvo čno razbijanje podvzorcev, da se 
zmanjša variabilnost štetja. Daljše ultrazvo čno razbijanje od priporo čenega za 
ločevanje verig v krajše dolžine lahko uni či celice. Jakost in trajanje ultrazvo ­ 
čnega razbijanja morata biti enaka za vse tretirane skupine. 
Na hemocitometru se prešteje dovolj polj (najmanj 400 celic), da se nadomesti 
variabilnost. To bo izboljšalo zanesljivost mikroskopskega dolo čanja gostote. 
Elektronski števec delcev se lahko uporabi za dolo čanje celotnega volumna celic 
alg Anabaena  po ločevanju celi čnih verig z natan čnim ultrazvo čnim razbijanjem. 
Energijo ultrazvo čnega razbijanja je treba prilagoditi, da se prepre či razkroj celic. 
Da se zagotovi dobro premešano in homogeno suspenzijo alg, ki se uporabi za 
inokulacijo preskusnih posod, se uporabi mešalnik vortex ali podobna primerna 
metoda.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 970
 
Preskusne posode naj se postavijo na krožno in recipro čno stresalno mizo pri 
približno 150 obratih na minuto. Alternativno se lahko uporabi prekinjeno 
tresenje za zmanjšanje težnje  Anabaene  po oblikovanju grud. Če se grude poja ­
vijo, je treba paziti, da se doseže reprezentativne vzorce za merjenje biomase. Za razdrobitev grud je lahko pred vzor čenjem potrebno mo čno tresenje.
 
Synechococcus leopoliensis  
Za gojenje osnovne kulture se lahko uporabijo razli čna rastna gojiš ča. Podatki 
o primernih gojiš čih so na voljo v zbirkah kultur.  
Synechococcus leopoliensis  raste kot samotarske celice v obliki pali čic. Celice so 
zelo majhne, kar otežuje uporabo mikroskopskega štetja za merjenje biomase. 
Uporabni so elektronski števci delcev, opremljeni za štetje delcev do najmanjše velikosti približno 1 μm. Primerne so tudi  in vitro  fluorometri čne meritve.
 
Navicula pelliculosa  
Za gojenje osnovne kulture se lahko uporabijo razli čna rastna gojiš ča. Podatki 
o primernih gojiš čih so na voljo v zbirkah kultur. Pomembno si je zapomniti, da 
je v gojiš ču zahtevan silikat.  
Navicula pelliculosa  lahko pod dolo čenimi rastnimi pogoji oblikuje skupke. 
Celice alg se zaradi proizvajanja lipidov v časih kopi čijo na površinski prevleki. 
V teh okoliš činah je potrebno zagotoviti posebne ukrepe, ko se vzame podvzorce 
za določanje biomase, da se pridobi reprezentativne vzorce. Morda je lahko 
potrebno mo čno stresanje, npr. z uporabo mešalnika vortex.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 971
 
Dodatek 2  
Rastno gojiš če 
Uporabiti se sme eno od naslednjih dveh rastnih gojiš č: 
Gojišče OECD: Originalno gojiš če OECD TG 201, tudi v skladu z ISO 8692 
US. EPA gojiš če AAP tudi v skladu z ASTM. 
Pri pripravi teh gojiš č naj se uporabi reagentne ali analitsko čiste kemikalije in 
deionizirana voda.  
Sestava gojiš ča AAP (US. EPA) in gojiš ča OECD TG 201  
Sestavina EPA OECD 
mg/l mM mg/l mM  
NaHCO  3 15,0 0,179 50,0 0,595 
NaNO  3 25,5 0,300 
NH  4 Cl 15,0 0,280 
MgCl  2 ·6(H  2 O) 12,16 0,0598 12,0 0,0590 
CaCl  2 ·2(H  2 O) 4,41 0,0300 18,0 0,122 
MgSO  4 ·7(H  2 O) 14,6 0,0592 15,0 0,0609 
K 2 HPO  4 1,044 0,00599 
KH  2 PO 4 1,60 0,00919 
FeCl  3 ·6(H  2 O) 0,160 0,000591 0,0640 0,000237 
Na 2 EDTA·2(H  2 O) 0,300 0,000806 0,100 0,000269 (*) 
H 3 BO 3 0,186 0,00300 0,185 0,00299 
MnCl  2 ·4(H  2 O) 0,415 0,00201 0,415 0,00210 
ZnCl  2 0,00327 0,000024 0,00300 0,0000220 
CoCl  2 ·6(H  2 O) 0,00143 0,000006 0,00150 0,00000630 
Na 2 MoO  4 ·2(H  2 O) 0,00726 0,000030 0,00700 0,0000289 
CuCl  2 .2(H  2 O) 0,000012 0,00000007 0,00001 0,00000006 
pH 7,5 8,1  
(*) Molarno razmerje EDTA in železa neznatno presega enoto. To prepre čuje usedline železa in isto časno 
zmanjšuje kelacijo ionov težkih kovin.  
V preskusu s kremenasto algo  Navicula pelliculosa  morata biti obe gojiš či dopol­
njeni z Na  2 SiO  3 ·9H  2 0, da se pridobi koncentracija 1,4 mg Si/l. 
PH gojiš ča se pridobi z ravnovesjem med karbonatnim sistemom gojiš ča in 
parcialnim tlakom CO  2 v atmosferskem zraku. Približno razmerje med pH pri 
25 °C in koncentracijo molarnega bikarbonata je: 
pH eq = 11,30 + log [HCO  3 ] ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 972
 
S 15 mg NaHCO  3 /l, pH  eq = 7,5 (gojiš če U.S. EPA in s 50 mg NaHCO  3 /l, 
pH eq = 8,1 (gojiš če OECD).  
Elementna sestava v preskusnih gojiš čih 
Element EPA OECD 
mg/l mg/l  
C 2,144 7,148 
N 4,202 3,927 
P 0,186 0,285 
K 0,469 0,459 
Na 11,044 13,704 
Ca 1,202 4,905 
Mg 2,909 2,913 
Fe 0,033 0,017 
Mn 0,115 0,115  
Priprava gojiš ča OECD  
Hranilo Koncentracija v osnovni raztopini 
Osnovna raztopina 1: makrohranilne snovi  
NH  4 Cl 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 
MgSO  4 ·7H  2 O 
KH  2 PO 4 1,5 g·l  –1 
1,2 g·l  –1 
1,8 g·l  –1 
1,5 g·l  –1 
0,16 g·l  –1 
Osnovna raztopina 2: železo  
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 64 mg·l  –1 
100 mg·l  –1 
Osnovna raztopina 3: elementi v sledovih  
H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 185 mg·l  –1 
415 mg·l  –1 
3 mg·l  –1 
1,5 mg·l  –1 
0,01 mg·l  –1 
7 mg·l  –1 
Osnovna raztopina 4: bikarbonat  
NaHCO  3 50 g·l  –1 
Na 2 SiO  3 ·9H  2 0 
Osnovne raztopine se sterilizira z membransko filtracijo (s povpre čnim premerom 
por 0,2 μm) ali avtoklaviranjem (120 °C, 15 min). Raztopine se shrani v temnem 
prostoru pri 4 °C. 
Raztopin 2 in 4 se ne avtoklavira, temve č le sterilizira z membransko filtracijo.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 973
 
Rastno gojiš če se pripravi z dodajanjem primerne koli čine raztopin 1–4 vodi. 
K 500 ml sterilizirane vode se doda:. — 10 ml osnovne raztopine 1 — 1 ml osnovne raztopine 2 — 1 ml osnovne raztopine 3 — 1 ml osnovne raztopine 4 Do 1 000 ml se dopolni s sterilizirano vodo. 
Za vzpostavljanje ravnovesja gojiš ča z atmosferskim CO
 2 se dopusti dovolj časa; 
če je potrebno, s pomo čjo prepihovanja sterilnega filtriranega zraka za nekaj ur.  
Priprava gojiš ča AAP  
A1.1 Po 1 ml vsake osnovne raztopine A1.2.1–A1.2.7 se dolije v približno 
900 ml deionizirane ali destilirane vode, nato se raztopina razred či na 1 
liter. 
A1.2 Makrohranilne osnovne raztopine se pridobijo z raztapljanjem spodaj 
navedenih snovi v 500 ml deionizirane ali destilirane vode. Reagenti 
A1.2.1, A1.2.2, A1.2.3, in A1.2.4 se lahko združijo v eno osnovno raztopino. 
A1.2.1  NaNO
 3 – 12,750 g. 
A1.2.2  MgCl  2 · 6H 2 O – 6,082 g. 
A1.2.3  CaCl  2 · 2H 2 O – 2,205 g. 
A1.2.4  Mikrohranilna osnovna raztopina  – (glej A1.3). 
A1.2.5  MgSO  4 ·7H  2 O – 7,350 g. 
A1.2.6  K  2 HPO  4 – 0,522 g. 
A1.2.7  NaHCO  3 – 7,500 g. 
A1.2.8  Na  2 SiO  3 ·9H  2 O – glej opombo A1.1. 
Opomba A1.1 – Uporablja se samo za preskusne vrste kremenastih alg. 
Doda se lahko neposredno (202,4 mg) ali z dodajanjem osnovne razto ­
pine do kon čne koncentracije 20 mg/l Si v gojiš ču. 
A1.3 Mikrohranilna osnovna raztopina se pridobi z raztapljanjem spodaj 
navedenih snovi v 500 ml deionozirane ali destilirane vode. 
A1.3.1  H  3 BO 3 – 92,760 mg. 
A1.3.2  MnCl  2 ·4H  2 O – 207,690 mg. 
A1.3.3  ZnCl  2 – 1,635 mg. 
A1.3.4  FeCl  3 ·6H  2 O – 79,880 mg. 
A1.3.5  CoCl  2 ·6H  2 O – 0,714 mg. 
A1.3.6  Na  2 MoO  4 ·2H  2 O – 3,630 mg. 
A1.3.7  CuCl  2 ·2H  2 O – 0,006 mg. 
A1.3.8  Na  2 EDTA·2H  2 O – 150,000 mg. 
[dinatrijev (etilendinitrilo) tetraacetat].  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 974
 
A1.3.9  Na  2 SeO  4 ·5H  2 O – 0,005 mg. Glej opombo A1.2. 
Opomba A1.2 – Uporablja se samo za gojiš ča za osnovne raztopine 
vrst kremenastih alg. 
A1.4 pH se uravna na 7,5 ± 0,1 z 0,1  N ali 1,0  N NaOH ali HCl. 
A1.5 Gojiš če se filtrira v sterilni vsebnik skozi 0,22- μm membranski filter, 
če se uporabi števec delcev, ali skozi 0,45- μm filter, če se števec delcev 
ne uporabi. 
A1.6 Gojiš če se do uporabe shrani v temnem prostoru pri temperaturi 
približno 4 °C.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 975
 
Dodatek 3  
Primer postopka kultiviranja alg  
Splošne opombe  
Namen kultiviranja po naslednjem postopku je pridobiti kulture alg za preskuse 
toksičnosti. 
Uporabiti je treba primerne metode, s katerimi se zagotovi, da se kulture alg ne 
okužijo z bakterijami. Lahko so zaželene akseni čne kulture, vsekakor pa se 
morajo uvesti in uporabiti kulture z eno samo vrsto alg. 
Vse postopke je treba izvesti v sterilnih pogojih, da se prepre či okužba 
z bakterijami in drugimi algami.  
Oprema in materiali  
Glej v Preskusni metodi: Aparatura.  
Postopki za pridobivanje kultur alg  
Priprava hranilnih raztopin (gojiš če): 
Vse hranilne soli gojiš ča se pripravi kot koncentrirane osnovne raztopine ter 
hrani v temnem in hladnem prostoru. Te raztopine se sterilizirajo s filtracijo ali 
avtoklaviranjem. 
Gojišče se pripravi z dodajanjem pravilne koli čine osnovne raztopine sterilni 
destilirani vodi, pri čemer se pazi, da ne pride do okužbe. Za trdno gojiš če se 
doda 0,8 % agarja.  
Osnovna kultura:  
Osnovne kulture so majhne kulture alg, ki se redno prenašajo v sveža gojiš ča in 
se uporabljajo kot za četni preskusni material. Če se kulture ne uporabljajo redno, 
se nanesejo na poševna agarska gojiš ča v epruvetah. Nato se najmanj enkrat na 
dva meseca prenesejo na sveže gojiš če. 
Osnovne kulture se gojijo v erlenmajericah z ustreznim gojiš čem (volumen 
približno 100 ml). Kadar se alge inkubirajo pri 20 °C ob stalni osvetlitvi, jih je treba na sveže gojiš če prenesti enkrat na teden. 
Med prenosom se del „stare“ kulture s sterilno pipeto prenese v erlenmajerico 
s svežim gojiš čem, tako da je pri hitro rasto či vrsti za četna koncentracija 
približno 100-krat manjša, kakor v stari kulturi. 
Stopnja rasti vrste se lahko dolo či iz rastne krivulje. Če je ta znana, se lahko 
oceni gostota, pri kateri je treba kulturo prenesti v novo gojiš če. To je treba 
storiti, preden kultura doseže fazo odmiranja.
 
Predkultura:  
Predkultura je namenjena pridobivanju koli čine alg, primerne za inokulacijo 
preskusnih kultur. Predkultura se inkubira v pogojih preskusa in uporabi, ko je 
še v eksponentni fazi rasti, obi čajno po 2–4 dneh inkubacije. Kulture alg, ki 
vsebujejo deformirane ali nenormalne celice, je treba zavre či. ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 976
 
Dodatek 4  
Analiza podatkov pri nelinearni regresiji  
Splošni premisleki  
Odziv v preskusih alg in drugih mikrobioloških rastnih preskusih – rast biomase 
je po naravi stalna ali metri čna spremenljivka – stopnja postopka, če se uporabi 
stopnja rasti, in njen integral v času, če je izbrana biomasa. Obe sta v povezavi 
z ustreznim povpre čnim odzivom ponovitvenih neizpostavljenih kontrolnih 
skupin in kažeta najve čji odziv pri uvedenih pogojih – s svetlobo in temperaturo 
kot osnovnima dolo čevalnima dejavnikoma v preskusu alg. Sistem je porazdeljen 
ali homogen in biomasa se lahko šteje za kontinuum brez ozira na posamezne 
celice. Porazdelitev variance vrste odziva za takšen sistem se nanaša izklju čno na 
eksperimentalne dejavnike (opisane zna čilno z logaritmi čno normalno ali 
normalno porazdelitvijo napake). To je v nasprotju s tipi čnimi biološkimi odzivi 
s kvantiziranimi podatki, pri katerih se pogosto pri čakuje, da bo toleranca 
(tipično binominalno porazdeljena) posameznih organizmov prevladujo ča kompo­
nenta variance. Odzivi kontrole so ni č ali raven naravnega ozadja. 
V enostavnih razmerah se normiran ali relativni odziv, r, monotono zmanjša od 1 
(ničelno zaviranje) do 0 (100-odstotno zaviranje). Zapomniti si je treba, da vse 
odzive spremlja napaka, tako da se lahko navidezno negativna zaviranja izra čuna 
samo kot rezultat naklju čne napake.  
Regresijska analiza  
Modeli  
Regresijska analiza je namenjena kvantitativnemu opisovanju krivulje koncentra ­
cija-odziv v obliki matemati čne regresijske funkcije Y = f (C) ali bolj pogoste 
F (Z), kjer je Z = log C. Če se jo uporabi inverzno, potem C = f  –1 (Y) dopuš ča 
izračun številk EC  x , vključno z EC  50 , EC  10 in EC  20 , in njihovimi 95 % mejami 
zaupanja. Za ve č preprostih matemati čnih funkcijskih oblik se je izkazalo, da 
uspešno opisujejo razmerja koncentracija-odziv, ki nastanejo v preskusih zavi ­
ranja rasti alg. Funkcije na primer vklju čujejo logisti čno enačbo, nesimetri čno 
Weibullovo ena čbo in funkcijo logaritemsko normalne porazdelitve, ki so vse 
sigmoidne krivulje, ki se asimptoti čno približujejo ena za C → 0 in nič za 
C → neskončno. 
Uporaba stalnih funkcijskih modelov praga (npr. Kooijmanov model za „zavi ­
ranje rasti populacije“ Kooijman et al. 1996) je nedavno predlagana ali alterna ­
tivna asimptoti čnim modelom. Ta model ne pri čakuje učinkov pri koncentracijah 
pod dolo čenim pragom, EC0+, ki je ocenjen z ekstrapolacijo razmerja odziv- 
koncentracija pri preseku osi koncentracije z uporabo enostavne zvezne funkcije, 
ki je v za četni točki nediferenciabilna. 
Zapomniti si je treba, da je analiza lahko enostavno zmanjšanje vsot preostalih 
kvadratov (pri čakovana konstantna varianca) ali ovrednotenih kvadratov, če se 
heterogenost variance izravna.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 977
 
Postopek  
Ta postopek se izvede takole: izberemo ustrezno funkcijsko ena čbo, Y = f (C), in 
jo z nelinearno regresijo prilagodimo podatkom. Raje kot srednje vrednosti pono ­
vitev uporabimo meritve iz vsake posamezne bu čke, da zberemo toliko podatkov, 
kot je le mogo če. Če je na drugi strani varianca visoka, prakti čne izkušnje kažejo, 
da lahko srednje vrednosti ponovitev zagotavljajo bolj robustno matemati čno 
oceno, na katero manj vplivajo naklju čne napake v podatkih, kot pa pri vsaki 
ohranjeni posamezni podatkovni to čki. 
Izrišemo prilagojeno krivuljo in izmerjene podatke ter raziš čemo, ali je krivulja 
ustrezno prilagojena. Analiza ostankov je lahko za ta namen še posebej koristno orodje. Če izbrano funkcijsko razmerje, ki naj ustreza odzivu pri posameznih 
koncentracijah, ne odraža celotne krivulje ali njenega pomembnega dela, na 
primer odziva pri nizkih koncentracijah, izberemo drugo možnost prilagajanja 
krivulje – npr. nesimetri čno krivuljo, kot je Weibullova funkcija, namesto sime ­
trične. Negativna zaviranja rasti lahko povzro čajo težave, na primer pri logarit ­
mično normalni porazdelitveni funkciji, ki prav tako zahteva alternativno regre ­
sijsko funkcijo. Takšnim negativnim vrednostim ni priporo čeno dodeliti ni čelne 
ali majhne pozitivne vrednosti, ker to izkrivi porazdelitve napak. Lahko je primerno narediti lo čene prilagoditve krivulj na delih krivulje, kot je nizki 
delež zaviranja rasti, da se oceni številke EC
 low x . Iz prilagojene ena čbe (z „inverzno 
oceno“, C = f  –1 (Y), izračunamo karakteristi čne ocenjene vrednosti EC  x , in poročamo 
najmanj o ocenah EC  50 in eni ali dveh ocenah EC  low x . Izkušnje prakti čnega presku ­ 
šanja so pokazale, da natan čnost preskusov alg ponavadi dopuš ča sprejemljivo 
natančno ovrednotenje pri 10 % stopnji zaviranja rasti, če so podatkovne to čke 
zadovoljive – razen če se pri nizkih koncentracijah kot mote č dejavnik pojavi spod ­
bujanje rasti. Natan čnost ocene EC  20 je pogosto znatno boljša kot ocena EC  10 , ker je 
EC 20 ponavadi na približno linearnem delu osrednje krivulje odziva koncentracije. 
Včasih je EC  10 težko razložiti zaradi spodbujanja rasti. Zato je, medtem ko je EC  10 
ponavadi dosežena z zadostno natan čnostjo, priporo čeno tudi stalno poro čanje 
o EC  20 . 
Utežni dejavniki  
Eksperimentalna varianca pogosto ni konstantna in zna čilno vsebuje sorazmerno 
komponento, zato je bolj primerna rutinsko izvedena tehtana regresija. Utežni 
dejavniki za takšno analizo se ponavadi predpostavljajo kot obratno sorazmerni 
varianci. 
W i = 1/Var(r  i ) 
Veliko regresijskih programov dopuš ča možnost analize tehtane regresije 
z utežnimi dejavniki, ki so navedeni v tabeli. Ustrezno naj se utežni dejavniki 
normalizirajo tako, da se jih pomnoži z n/ ∑ w i (n je število podatkovnih to čk), 
tako da je njihova vsota enaka ena.  
Normalizacijski odzivi  
Normaliziranje s povpre čnim odzivom kontrole povzro ča nekatere temeljne 
probleme in prinaša precej zapleteno strukturo variance. Z deljenjem odzivov 
s povprečnim odzivom kontrole za pridobitev deleža zaviranja rasti predstavimo 
dodatno napako, ki jo povzro či napaka pri srednji vrednosti kontrole. Razen če je 
napaka zanemarljivo majhna, morajo biti utežni dejavniki v regresiji in meje zaupanja popravljeni za kovarianco s kontrolo (17). Treba si je zapomniti, da 
je velika natan čnost pri ocenjenem povpre čnem odzivu kontrole pomembna, da 
se lahko zmanjša celotna varianca za relativni odziv. Ta varianca je:
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 978
 
(spodnji indeks i se nanaša na stopnjo koncentracije i in spodnji indeks 0 na 
kontrole) 
Y i = relativni odziv = r  i /r 0 = 1 – I = f (C  i ) 
z varianco: 
Var (Y  i ) = Var (r  i /r 0 ) e ¼ (∂Y i / ∂ r i ) 2 ·Var(r  i ) + (∂ Y i / ∂ r 0 ) 2 ·Var (r  0 ) 
in ker je 
(∂ Y i / ∂ r i ) = 1/r  0 in (∂ Y i / ∂ r 0 ) = r  i /r 0 2 
z normalno porazdeljenimi podatki ter m  i in m  0 ponovitvami: 
Var(r  i ) = σ 2 /m i 
celotna varianca relativnega odziva, Y  i postane: 
Var(Y  i ) = σ 2 /(r 0 2 m i ) + r  i 2 · σ 2 /r 0 4 m 0 
Napaka srednje vrednosti kontrole je obratno sorazmerna s kvadratnim korenom 
števila povpre čnih kontrolnih ponovitev, in se v časih lahko dolo či, da se vklju či 
podatke preteklih študij in tako zelo zmanjša napake. Alternativni postopek ni 
normaliziranje podatkov in prilagajanje absolutnih odzivov, vklju čno s podatki 
odziva kontrole, temve č predstavitev vrednosti odziva kontrole kot dodatnega 
parametra, ki ga je treba prilagoditi z nelinearno regresijo. Ta metoda potrebuje 
z običajno 2-parametrsko regresijsko ena čbo prilagajanje 3 parametrov in zato 
zahteva ve č podatkovnih to čk kot nelinearna regresija na podatkih, ki so norma ­
lizirani z uporabo vnaprej dolo čenega odziva kontrole.  
Obratni intervali zaupanja  
Izračun intervalov zaupanja nelinearne regresije z obratno oceno je bolj zapleten 
in v navadnih statisti čnih računalniških programskih paketih ni razpoložljiva 
standardna možnost. Približne meje zaupanja se lahko pridobijo s standardnimi programi nelinearne regresije s ponovno parameterizacijo (Bruce in Versteeg, 
1992), ki vklju čuje predelavo matemati čne enačbe z želenimi ocenjenimi vred ­
nostmi, npr. EC
 10 in EC  50 kot parametri, ki se jih mora oceniti. Naj bo funkcija 
I = f (α, β, koncentracija) in izkoristimo razmerja definicij f ( α, β, EC  10 ) = 0,1 in 
f (α, β, EC  50 ) = 0,5, da nadomestimo f ( α, β, koncentracija) z enakovredno 
funkcijo g (EC  10 , EC  50 , koncentracija. 
Bolj neposredni izra čun (Andersen et al, 1998) se izvede tako, da obdržimo 
izvirno ena čbo in uporabimo Taylorjev raztezek pri srednjih vrednostih za r  i in r  0 
Nedavno so postale priljubljene metode vezanja. Take metode uporabljajo izmer ­
jene podatke in naklju čno število pogostnega ponovnega vzor čenja, ki ga usmerja 
generator, da se oceni empiri čna porazdelitev variance.  
Viri 
Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentra ­
tions in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625–1632. 
Bruce, R.D. in Versteeg, D.J.(1992) A Statistical Procedure for Modelling Conti ­
nuous Ecotoxicity Data. Env. Toxicol. Chem.11, 1485–1494. 
Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. 
(1998): Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405–420.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 979
 
C.4 DOLO ČANJE „DOBRE“ BIORAZGRADLJIVOSTI  
Del I  SPLOŠNO  
I.1 UVOD 
Opisanih je šest preskusnih metod, ki omogo čajo presejalno presku ­ 
šanje snovi glede lahke biorazgradljivosti v aerobnem vodnem 
mediju: 
(a) Upadanje raztopljenega organskega ogljika (DOC) (Metoda C.4-A) 
(b) Prilagojeno presejanje OECD – upadanje DOC (Metoda C.4-B) 
(c) Razvijanje ogljikovega dioksida (CO  2 ) (prilagojeni Sturmov 
preskus) (Metoda C.4-C) 
(d) Manometri čna respirometrija (Metoda C.4-D) 
(e) Zaprta steklenica (Metoda C.4-E) 
(f) MITI (Ministry of International Trade and Industry – Japonska) 
(Metoda C.4-F) 
Splošne in skupne opombe za vseh šest preskusov so navedene 
v delu I metode. Posebnosti za posamezne metode so navedene 
v delih II do VII. Dodatki vsebujejo opredelitve, ena čbe in navodila. 
Medlaboratorijska primerjava, ki jo je OECD izvedel leta 1988, je 
pokazala, da metode dajejo dosledne rezultate. Vendar je glede na 
fizikalne lastnosti preskusne snovi lahko bolj primerna ena ali druga 
od metod.  
I.2 IZBIRA USTREZNE METODE 
Za izbiro najprimernejše metode so potrebne informacije o topnosti, 
parnem tlaku in adsorpcijskih lastnostih snovi. Za izra čun teoreti čnih 
vrednosti in/ali preverjanje izmerjenih vrednosti parametrov, npr. 
TPK, TCO  2 , DOC, TOC, KPK (glej dodatka 1 in 2) je treba poznati 
kemično strukturo ali formulo. 
Preskusne snovi, topne v vodi do najmanj 100 mg/l, se lahko presku ­
sijo z vsemi metodami, pod pogojem da so nehlapne in neadsorpti ­
vne. Za tiste snovi, ki so slabo topne v vodi, hlapne ali adsorptivne, 
so primerne metode navedene v tabeli 1. Na čini ravnanja s snovmi, 
ki so slabo topne v vodi, in hlapnimi snovmi so opisani v Dodatku 3. Zmerno hlapne snovi se lahko preskušajo po metodi upadanja DOC, če je v preskusnih posodah (ki morajo biti ustrezno zaprte) 
dovolj prostora za plin. V tem primeru je treba izvesti abiotsko 
kontrolo, da se upoštevajo vse fizikalne izgube.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 980
 
Tabela 1  
Uporabnost preskusnih metod  
Preskus Analitska metoda Primernost za snovi, ki so: 
slabo topne hlapne adsorptivne  
Upadanje DOC Raztopljeni organski ogljik — — +/- 
Prilagoj. metoda OECD 
upadanja DOC Raztopljeni organski ogljik — — +/- 
Razvijanje CO  2 Respirometrija: razvijanje 
CO 2 + — + 
Manometri čna respirometrija Manometri čna respirome ­
trija: poraba kisika + +/- + 
Zaprta steklenica Respirometrija: raztopljeni 
kisik +/- + + 
MITI Respirometrija: poraba 
kisika + +/- + 
Za razlago dobljenih rezultatov so potrebne informacije o čistoti ali 
relativnih deležih glavnih sestavin preskusne snovi, zlasti kadar so rezultati nizki ali mejni. 
Informacije o strupenosti preskusne snovi za bakterije (Dodatek 5) so 
lahko uporabne za izbiro primernih preskusnih koncentracij in so lahko bistvene za pravilno razlago nizkih vrednosti biorazgradljivo ­
sti.
 
I.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Za preverjanje postopka se preskusijo referen čne snovi, ki izpolnju ­
jejo merila za dobro biorazgradljivost, s postavitvijo primerne stekle ­
nice vzporedno z navadnimi preskusnimi vzorci. 
Primerne snovi so anilin (sveže destiliran), natrijev acetat in natrijev 
benzoat. Te referen čne snovi se pri teh metodah vse razgradijo, tudi 
kadar se namerno ne doda noben inokulum. 
Predlagano je bilo, da se poiš če taka referen čna snov, ki je dobro 
biorazgradljiva, vendar potrebuje dodan inokulum. Predlagan je bil kalijev hidorgen fosfat, vendar je treba pridobiti ve č podatkov za to 
snov, preden se lahko sprejme kot referen čna snov. 
Pri respirometri čnih preskusih lahko snovi, ki vsebujejo dušik, vpli ­
vajo na sprejem kisika zaradi nitrifikacije (glej dodatka 2 in 5).
 
I.4 PRINCIP PRESKUSNIH METOD 
Raztopina ali suspenzija preskusne snovi v mineralnem mediju se 
inokulira in inkubira v aerobnih pogojih v temi ali razpršeni svetlobi. Količina DOC v preskusni raztopini, ki izvira iz inokuluma, mora 
biti čim manjša glede na koli čino DOC, ki izvira iz preskusne snovi. 
Endogena aktivnost inokuluma se preverja z vzporednim slepim preskusom z inokulumom in brez preskusne snovi, čeprav se endo ­
gena aktivnost celic v prisotnosti snovi ne bo povsem skladala s tisto 
v kontrolnem vzorcu. Za preverjanje postopkov pa se vzporedno 
izvede preskus samo z referen čno snovjo.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 981
 
Na splošno se razgradnja spremlja z dolo čanjem parametrov, kot so 
DOC, CO  2 , proizvodnja in sprejem kisika, meritve pa se izvajajo 
dovolj pogosto, da je omogo čena določitev začetka in konca bioraz ­
gradnje. Pri avtomatskih respirometrih je merjenje neprekinjeno. DOC se v časih meri poleg še enega parametra, vendar navadno le 
na začetku in na koncu preskusa. Specifi čne kemijske analize se 
lahko uporabijo za dolo čanje primarne razgradnje preskusne snovi 
in koncentracije kakršnega koli vmesnega proizvoda (obvezno pri preskusu MITI). 
Navadno preskus traja 28 dni. Lahko pa se zaklju či pred 28. dnem, 
t.j. takoj, ko krivulja biorazgradnje doseže konstantno vrednost pri 
najmanj treh dolo čitvah. Preskus se lahko tudi podaljša preko 28 dni, 
kadar krivulja kaže, da se je biorazgradnja za čela, vendar 28. dan še 
ni dosegla konstantne vrednosti.
 
I.5 MERILA KAKOVOSTI  
I.5.1 Obnovljivosti  
Zaradi narave biorazgradnje in mešanih populacij bakterij, ki se 
uporabijo kot inokulum, je treba izvesti najmanj dve vzporedni dolo ­ 
čitvi. 
Splošna izkušnja je, da ve čja kot je koncentracija mikroorganizmov, 
dodanih preskusnemu mediju, manjše bodo razlike med ponovitvami. 
Testi primerljivosti so tudi pokazali, da so razlike med rezultati 
različnih laboratorijev lahko velike, vendar so pri dobro biorazgrad ­
ljivih snoveh rezultati obi čajno kar skladni.  
I.5.2 Veljavnost preskusa  
Preskus se šteje za veljavnega, če je razlika med skrajnimi ponovit ­
venimi vrednostmi odstranitve preskusne snovi bodisi ob konstantni vrednosti bodisi na koncu preskusa bodisi ob koncu 10-dnevnega okna manj kot 20 % in če je odstotek razgradnje referen čne snovi 
dosegel raven za dobro biorazgradljivost v 14 dneh. Če kateri koli od 
teh pogojev ni izpolnjen, je treba preskus ponoviti. Zaradi strogosti teh metod, nizke vrednosti ne pomenijo nujno, da preskusna snov ni biorazgradljiva v okoljskih pogojih, temve č kažejo na to, da bodo za 
določitev biorazgradljivosti potrebne dodatne raziskave. 
Če je bila v preskusu strupenosti, ki je vseboval preskusno in refe ­
renčno snov, razgradnja v 14 dneh manj kot 35 % (glede na DOC) 
ali manj kot 25 % (glede na TPK ali TCO
 2 ), se lahko predpostavlja, 
da je preskusna snov inhibitorna (glej tudi Dodatek 4). Preskusni niz je treba ponoviti, če je mogo če z manjšo koncentracijo preskusne 
snovi in/ali ve čjo koncentracijo inokuluma, vendar ne nad 30 mg 
trdnih delcev/liter.
 
I.6 SPLOŠNI POSTOPKI IN PRIPRAVE 
Splošni pogoji za preskuse so povzeti v tabeli 2. Aparatura in drugi 
preskusni pogoji, ki se nanašajo posebej na posamezne preskuse so 
opisani pod naslovi posameznih preskusov.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 982
 
Tabela 2  
Preskusni pogoji  
Preskus Upadanje DOC Razvijanje CO  2 Manometri čna 
respirometrija Prilagojen 
presejalni 
preskus OECD Zaprta stekle ­
nica MITI (I)  
Koncentracija 
preskusne 
snovi kot 
mg/l 100 2–10 100 
mg DOC/l 10–40 10–20 10–40 
mg ThOD/l 50–100 5–10 
Koncentracija 
inokuluma (v celicah/ln 
pribiližno) ≤ 30 mg/l SS 
ali ≤ 100 ml odtoka/l 
(10
 7 –10  8 ) 0,5 ml 
sekundar­
nega odtoka 
(10 5 ) ≤ 5 ml 
odtoka/l 
(10 4 –10  6 ) 30 mg/l SS 
(10 7 –10  8 ) 
Koncentracija 
elementov v mineralnem mediju 
(v mg/l) 
P 116 11,6 29 N 1,3 0,13 1,3 
Na 86 8,6 17,2 
K 122 12,2 36,5 Mg 2,2 2,2 6,6 Ca 9,9 9,9 29,7 Fe 0,05–0,1 0,05–0,1 0,15 
pH 7,4±0,2 
po možnosti 7,0 Po možno ­
sti7,0 
Temperatuura 22 ± 2
 o C 25 ± 1  o C 
DOC = raztopljeni organski ogljik ThoD = teoreti čna poraba 
kisika SS = neraztopljene trdne 
snovi  
I.6.1 Voda za red čenje 
Uporabi se deionizirana ali destilirana voda brez inhibitornih koncen ­
tracij strupenih snovi (npr. ionov Cu  ++ ). Ne sme vsebovati ve č kot 
10 % organskega ogljika, vnesenega s preskusno snovjo. Velika 
čistost preskusne vode je nujna za odpravo visokih vrednosti slepih 
vzorcev. Okužba lahko nastane zaradi vsebovanih ne čistot in tudi 
zaradi ionsko-izmenjevalnih smol in liziranega materiala iz bakterij 
in alg. Za vsak niz preskusov je treba uporabiti eno samo serijo 
vode, predhodno preverjeno z analizo DOC. Tako preverjanje ni potrebno pri preskusu z zaprto steklenico, vendar mora biti poraba kisika vode majhna.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 983
 
I.6.2 Osnovne raztopine mineralnih sestavin  
Za pripravo preskusnih raztopin se pripravijo osnovne raztopine 
mineralnih sestavin ustreznih koncentracij. Za metodo upadanja DOC, prilagojeni sejalni preskus OECD, preskus razvijanja CO
 2 , 
manometri čno respirometrijo in preskus z zaprto steklenico se 
lahko uporabijo naslednje osnovne raztopine (z razli čnimi faktorji 
redčenja). 
Faktorji red čenja in, za preskus MITI, posebna priprava mineralnega 
medija so navedeni pod naslovi posameznih preskusov.  
Osnovne raztopine:  
Pripravimo naslednje osnovne raztopine iz analitsko čistih reagentov. 
(a) Monokalijev dihidrogen ortofosfat, KH  2 PO 4 8,50 g 
Dikalijev monohidrogen ortofosfat, K  2 HPO  4 21,75 g 
Dinatrijev monohidrogen ortofosfat dihidrat, 
Na 2 HPO  4 . 2 H  2 O 33,40 g 
Amonijev klorid, NH  4 Cl 0,50 g 
Raztopimo v vodi in dopolnimo do 1 litra. pH 
raztopine mora biti 7,4. 
(b) Kalcijev klorid, brezvodni, CaCl  2 27,50 g 
ali kalcijev klorid dihidrat, CaCl  2 , 2 H  2 O 36,40 g 
Raztopimo v vodi in dopolnimo do 1 litra. 
(c) Magnezijev sulfat heptahidrat, MgSO  4 . 7 H  2 O 22,50 g 
Raztopimo v vodi in dopolnimo do 1 litra 
(d) Železov(III) klorid heksahidrat, FeCl  3 . 6 H  2 O 0,25 g 
Raztopimo v vodi in dopolnimo do 1 litra.  
Opomba:  Da nam te raztopine ne bo treba pripraviti tik pred 
uporabo, ji dodamo kapljico koncentrirane HCl ali 0,4 g natrijeve soli etilendiamintetraocetne kisline (EDTA) na liter.
 
I.6.3 Osnovne raztopine snovi  
Kadar topnost presega 1 g/l, raztopimo 1–10 g, kakor je primerno, 
preskusne ali referen čne snovi v deionizirani vodi in dopolnimo do 1 
litra. V nasprotnem primeru pripravimo osnovne raztopine v mineralnem mediju ali snov dodamo neposredno v mineralni medij. Ravnanje z manj topnimi snovmi je opisano v Dodatku 3, 
vendar se za preskus MITI (metoda C.4-F) ne smejo uporabiti ne 
topila ne emulgatorji.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 984
 
I.6.4 Inokulumi  
Inokulum se lahko pridobi iz razli čnih virov: aktivno blato, komu ­
nalne odplake (neklorirane), površinske vode in prsti ali njihove zmesi. Kadar se za preskuse upadanja DOC, razvijanja CO
 2 in mano­
metrične respirometrije uporabi aktivno blato, mora biti odvzeto iz 
čistilne naprave ali laboratorijske enote, ki prejema predvsem gospo ­
dinjske odplake. Ugotovljeno je bilo, da inokulumi iz drugih virov dajo bolj razpršene rezultate. Za prilagojeni presejalni preskus OECD 
in preskus z zaprto steklenico je potreben bolj razred čen inokulum 
brez kosmov in najprimernejši vir je sekundarni odtok iz čistilne 
naprave za gospodinjske odplake ali laboratorijske enote. Inokulum 
za preskus MITI se pridobi iz zmesi virov in je opisan pod naslovom 
za ta preskus.
 
I.6.4.1  Inokulum iz aktivnega blata  
Zberemo svež vzorec aktivnega blata iz prezra čevalnega bazena 
čistilne naprave ali laboratorijske enote, ki čisti predvsem gospo ­
dinjske odplake. Odstranimo grobe delce, če je potrebno 
s filtriranjem skozi fino sito, in nato vzdržujemo blato aerobno. 
Druga možnost je, da ga po odstranitvi grobih delcev pustimo, da se 
posede ali ga centrifugiramo (npr. 10 min pri 1 100 g). Supernatant zavržemo. Blato lahko speremo v mineralnem mediju. Koncentrirano blato suspendiramo v mineralnem mediju, tako da bo koncentracija 
neraztopljenih trdnih snovi 3–5 g/l, in prezra čujemo do uporabe. 
Blato je treba odvzeti iz pravilno delujo če konvencionalne čistilne 
naprave. Če je bilo blato odvzeto iz čistilne naprave z visoko stopnjo 
čiščenja ali če se domneva da vsebuje inhibitorje, ga je treba sprati. 
Resuspendirano blato po temeljitem mešanju pustimo, da se posede, ali ga centrifugiramo, zavržemo supernatant in sprano blato ponovno suspendiramo v dodatnem volumnu mineralnega medija. Postopek 
ponavljamo, dokler ne menimo, da je blato brez presežnega substrata 
ali inhibitorjev. 
Tik pred uporabo popolnoma resuspendiranega blata ali neobdela ­
nega blata odvzamemo vzorec za dolo čitev suhe mase neraztopljenih 
trdnih snovi. 
Dodatna možnost je, da aktivno blato homogeniziramo 
(3–5 g neraztopljenih trdnih snovi/l). Blato obdelujemo z mehanskim mešalnikom 2 minuti pri srednji hitrosti. Zmešano blato naj se poseda 30 minut, če je potrebno tudi dlje, nato odlijemo 
tekočino, ki jo uporabimo kot inokulum v koncentraciji 
10 ml/l mineralnega medija.
 
I.6.4.2  Drugi viri inokuluma  
Lahko se pridobi iz sekundarnega odtoka iz čistilne naprave ali 
laboratorijske enote, ki prejema predvsem gospodinjske odplake. 
Zberemo svež vzorec in ga med prevozom vzdržujemo v aerobnem stanju. Pustimo, da se poseda 1 uro, ali ga filtriramo skozi grobi filtrirni papir in supernatant oziroma filtrat vzdržujemo 
v aerobnem stanju do uporabe. Na liter medija se lahko uporabi do 
100 ml takega inokuluma.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 985
 
Še en vir inokuluma je površinska voda. V tem primeru odvzamemo 
vzorec ustrezne površinske vode, npr. reke, jezera, in ga vzdržujemo 
v aerobnem stanju do uporabe. Če je potrebno inokulum koncentri ­
ramo s filtriranjem ali centrifugiranjem.  
I.6.5 Aklimatizacija inokulumov  
Inokulumi se lahko predhodno aklimatizirajo na preskusne pogoje, 
ne smejo pa se prilagoditi na preskusno snov. Aklimatizacija vklju ­ 
čuje prezra čevanje aktivnega blata v mineralnem mediju ali sekun ­
darnega odtoka 5–7 dni pri temperaturi preskusa. Aklimatizacija 
včasih izboljša natan čnost preskusnih metod, tako da zniža vrednosti 
slepih vzorcev. Pri MITI aklimatizacija inokuluma ni potrebna.  
I.6.6 Abiotski kontrolni vzorci  
Kadar je potrebno, preverimo ali pride do abiotske razgradnje 
preskusne snovi, tako da dolo čimo odstranitev DOC, sprejem kisika 
ali razvijanje ogljikovega dioksida v sterilnih kontrolnih vzorcih brez inokuluma. Steriliziramo s filtriranjem skozi membranski filter (0,2–0,45 mikrometrov) ali z dodatkom ustrezne strupene snovi 
v ustrezni koncentraciji. Če uporabimo membranski filter, vzorce 
odvzamemo asepti čno, da ohranimo sterilnost. Če adsorpcija 
preskusne snovi ni bila izklju čena že prej, morajo preskusi, ki merijo 
biorazgradnjo kot odstranitev DOC, zlasti tisti z inokulumom iz 
aktivnega blata, vklju čevati abiotski kontrolni vzorec, ki je inokuliran 
in zastrupljen.
 
I.6.7 Število steklenic  
Število steklenic v zna čilnem preskusu je navedeno pod naslovom za 
posamezni preskus. 
Lahko se uporabijo naslednje vrste vzorcev: 
— Preskusna suspenzija: vsebuje preskusno snov in inokulum 
— Slepi vzorec z inokulumom: vsebuje le inokulum 
— Vzorec za kontrolo postopka: vsebuje referen čno snov in 
inokulum 
— Abiotski sterilni kontrolni vzorec: sterilen, vsebuje preskusno 
snov (glej I.6.6) 
— Vzorec za kontrolo adsorpcije: vsebuje preskusno snov, 
inokulum in sterilizacijsko sredstvo 
— Vzorec za kontrolo strupenosti: vsebuje preskusno snov, refe ­
renčno snov in inokulum 
Določanje v preskusni suspenziji in slepem vzorcu z inokulumom 
mora obvezno potekati vzporedno. Priporo čljivo je, da se tudi dolo ­ 
čanje v drugih vzorcih izvaja vzporedno. 
To sicer ni vedno možno. Zagotovimo, da je dovolj vzorcev ali 
odčitkov za oceno odstotka odstranitve v 10-dnevnem oknu.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 986
 
I.7 PODATKI IN OCENA 
Pri izračunavanju odstotka razgradnje, D  t , se uporabijo srednje vred ­
nosti podvojenih meritev parametra v preskusnih posodah in slepem vzorcu z inokulumom. Ena čbe so navedene v spodnjih oddelkih za 
posamezne preskuse. Grafi čno se prikaže potek razgradnje in ozna či 
10-dnevno okno. Izra čunata se odstotek odstranitve ob koncu 10- 
dnevnega okna in vrednost ob konstantni koncentraciji ali ob koncu preskusa, kar je primerno, in navedeta v poro čilu. 
Pri respirometri čnih preskusih lahko snovi, ki vsebujejo dušik, vpli ­
vajo na sprejem kisika zaradi nitrifikacije (glej dodatka 2 in 5).
 
I.7.1 Razgradnja merjena z dolo čanjem DOC  
Odstotek razgradnje, D  t , ob vsakem vzor čenju se izra čuna posebej za 
steklenice, ki vsebujejo preskusno snov, z uporabo srednjih vrednosti ponovljenih meritev DOC, da se lahko oceni veljavnost preskusa 
(glej I.5.2). Izra čuna se po naslednji ena čbi:
 
D t ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C b0 Î 
Ü 100 
pri čemer je: 
D t = % razgradnje ob času t, 
C 0 = srednja za četna koncentracija DOC v inokuliranem mediju, 
ki vsebuje preskusno snov (mg DOC/l), 
C t = srednja koncentracija DOC v inokuliranem mediju, ki 
vsebuje preskusno snov, ob času t (mg DOC/l), 
C b0 = srednja za četna koncentracija DOC v slepem inokuliranem 
mineralnem mediju (mg DOC/l), 
C bt = srednja koncentracija DOC v slepem inokuliranem mine ­
ralnem mediju ob času t (mg DOC/l). 
Vse koncentracije se izmerijo s preskusi.  
I.7.2 Razgradnja, merjena s specifi čno analizo  
Kadar so na voljo specifi čni analitski podatki, se primarna bioraz ­
gradnja izra čuna po:  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
pri čemer je: 
D t = % razgradnje ob času t, obi čajno 28 dni, 
S a = količina ostanka preskusne snovi v inokuliranem mediju ob 
koncu preskusa (mg), 
S b = količina ostanka preskusne snovi v slepem vzorcu 
z vodo/medijem, kateremu je bila dodana le preskusna 
snov (mg).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 987
 
I.7.3 Abiotska razgradnja  
Kadar se uporabi abiotski sterilni kontrolni vzorec, se izra čuna 
odstotek abiotske razgradnje po ena čbi: 
% abiotske razgradnje  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
pri čemer je: 
C S(o) = koncentracija DOC v sterilnem kontrolnem vzorcu ob 
dnevu 0 
C s(t) = koncentracija DOC v sterilnem kontrolnem vzorcu ob 
dnevu t  
I.8 PORO ČANJE 
Poročilo o preskusu, če je možno, vsebuje naslednje podatke: 
— preskusna in referen čna snov ter njuna čistota, 
— preskusni pogoji, — inokulum: vrsta in mesto(-a) vzor čenja, koncentracija in kakršna 
koli aklimatizacija, 
— delež in vrsta industrijskih odpadkov, prisotnih v odplaki, če sta 
znana, 
— trajanje preskusa in temperatura, — pri slabo topnih preskusnih snoveh, uporabljena obdelava, — uporabljena preskusna metoda; treba je navesti znanstvene 
razloge in obrazložitev za vsako spremembo v postopku, 
— podatkovni list, — vsi opaženi pojavi zaviranja, — vsaka opažena abiotska razgradnja, — specifi čni kemijski analitski podatki, če so na voljo, 
— analitski podatki o vmesnih proizvodih, če so na voljo, 
— graf odstotka razgradnje v odvisnosti od časa za preskusno in 
referenčno snov; jasno je treba ozna čiti fazo prilagajanja, fazo 
razgradnje, 10-dnevno okno in naklon (Dodatek 1). Če preskus 
izpolnjuje merila za veljavnost, se lahko za graf uporabijo srednje 
vrednosti odstotka razgradnje v steklenicah s preskusno snovjo. 
— odstotek odstranitve po 10-dnevnem oknu in ob doseženi 
konstantni koncentraciji ali ob koncu preskusa.
 
Del II  PRESKUS UPADANJA DOC  (Metoda C.4-A)  
II. PRINCIP METODE 
Izmerjeni volumen inokuliranega mineralnega medija, ki vsebuje 
znano koncentracijo preskusne snovi (10–40 mg DOC/l) kot edinega 
vira organskega ogljika, se prezra čuje v temi ali na razpršeni svetlobi 
pri 22 ± 2  o C. ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 988
 
Razgradnja se spremlja 28 dni prek analize DOC v pogostih presled ­
kih. Stopnja biorazgradnje se izra čuna tako, da se koncentracija 
odstranjenega DOC (popravljena glede na slepi vzorec z inokulumom) izrazi kot odstotek koncentracije na za četku 
preskusa. Stopnja primarne biorazgradnje se lahko izra čuna tudi iz 
dopolnilne kemijske analize, izvedene na za četku in na koncu inku ­
bacije.
 
II.2 OPIS METODE  
II.2.1  Aparatura  
(a) erlenmajerice, npr. 250 ml do 2 l, odvisno od volumna, potreb ­
nega za analizo DOC; 
(b) stresalnik, primeren za erlenmajerice, bodisi z avtomatskim urav ­
navanjem temperature bodisi v prostoru s konstantno tempera ­
turo in dovolj mo čan, da vzdržuje aerobne pogoje v vseh erlen ­
majericah; 
(c) filtrirna naprava z ustreznimi membranskimi filtri; 
(d) analizator DOC; 
(e) aparatura za dolo čanje raztopljenega kisika; 
(f) centrifuga.  
II.2.2  Priprava mineralnega medija  
Pripravo osnovnih raztopin glej v I.6.2. 
Zmešamo 10 ml raztopine (a) in 800 ml vode za red čenje, dodamo 
po 1 ml raztopin (b) do (d) in dopolnimo z vodo za red čenje do 11.  
II.2.3  Priprava in aklimatizacija inokuluma  
Inokulum se lahko pridobi iz razli čnih virov: aktivnega blata, komu ­
nalnih odplak, površinskih vod, prsti ali zmesi teh virov. 
Glej I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 in I.6.5.  
II.2.4  Priprava steklenic  
Kot primer, v 2l erlenmajerice damo po 800 ml mineralnega medija 
in v posamezne erlenmajerice dodamo ustrezno koli čino osnovne 
raztopine preskusne ali referen čne snovi, da bo koncentracija snovi 
enakovredna 10–40 mg DOC/l. Preverimo pH vrednost in jo po potrebi uravnamo na 7,4. Erlenmajerice inokuliramo z aktivnim 
blatom ali inokulumom iz kakega drugega vira (glej I.6.4), tako da 
bo končna koncentracija neraztopljenih trdnih snovi najve č 
30 mg/l. Pripravimo tudi kontrolne vzorce z inokulumom v mineralnem mediju brez preskusne ali referen čne snovi. 
Če je potrebno, uporabimo eno posodo za preverjanje morebitnega 
inhibitornega u činka preskusne snovi, tako da inokuliramo raztopino, 
ki vsebuje primerljivi koncentraciji preskusne in referen čne snovi 
v mineralnem mediju. 
Če je potrebno pripravimo tudi sterilni vzorec za preverjanje, ali se 
preskusna snov razgrajuje abiotsko, tako da uporabimo neinokulirano 
raztopino snovi (glej I.6.6).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 989
 
Če sumimo, da se preskusna snov znatno adsorbira na steklo, blato 
itd., s predhodnim preskusom dolo čimo verjetno stopnjo adsorpcije 
in s tem primernost preskusa za snov (glej tabelo 1). Pripravimo erlenmajerico s preskusno snovjo, inokulumom in sterilizacijskim sredstvom. 
Vse erlenmajerice dopolnimo z mineralnim medijem do 1 l, preme ­ 
šamo in iz vsake erlenmajerice vzamemo vzorec za dolo čitev začetne 
koncentracije DOC (glej Dodatek 2.4). Odprtine erlenmajeric pokri ­
jemo, npr. z aluminijasto folijo, tako da je omogo čena prosta izme ­
njava zraka med erlenmajerico in ozra čjem. Erlenmajerice postavimo 
v stresalnik in tako za čnemo preskus.
 
II.2.5  Število steklenic v zna čilnem preskusu  
Steklenici 1 in 2: Preskusna suspenzija 
Steklenici 3 in 4: Slepi vzorec z inokulumom 
Steklenica 5: Vzorec za kontrolo postopka 
po možnosti in kadar je potrebno: 
Steklenica 6: Abiotski sterilni kontrolni vzorec Steklenica 7: Vzorec za kontrolo adsorpcije 
Steklenica 8: Vzorec za kontrolo strupenosti 
Glej tudi I.6.7.
 
II.2.6  Izvedba preskusa  
Ves čas preskusa v znanih časovnih intervalih dolo čamo koncentra ­
cijo DOC v vsaki steklenici v podvojenih meritvah, in sicer dovolj pogosto, da lahko dolo čimo začetek 10-dnevnega okna in odstotek 
odstranitve na koncu 10-dnevnega okna. Odvzamemo le najmanjši 
volumen preskusne suspenzije, potreben za vsako dolo čitev. 
Če je potrebno, pred vzor čenjem nadomestimo izgube zaradi izhla ­
pevanja, tako da dodamo ustrezno koli čino vode za red čenje (I.6.1). 
Pred odvzemom vzorca medij temeljito premešamo in zagotovimo, 
da se material, prilepljen na steno posode, raztopi ali suspendira. 
Vzorce takoj po odvzemu membransko filtriramo ali centrifugiramo (glej Dodatek 2.4). Filtrirane ali centrifugirane vzorce analiziramo 
isti dan ali pa jih shranimo pri temperaturi 2–4
 o C za najve č 48 ur 
ali pod –18  o C za daljše obdobje.  
II.3 PODATKI IN PORO ČANJE  
II.3.1  Obdelava rezultatov  
Izračunamo odstotek razgradnje ob času t iz I.7.1 (Dolo čanje DOC) 
in, neobvezno, iz I.7.2 (specifi čna analiza). 
Vse rezultate zapišemo na predvidene podatkovne liste.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 990
 
II.3.2  Veljavnost rezultatov  
Glej I.5.2.  
II.3.3  Poro čanje 
Glej I.8.  
II.4 PODATKOVNI LIST 
V nadaljevanju je predstavljen primer podatkovnega lista.  
PRESKUS UPADANJA DOC 
1. LABORATORIJ  
2. DATUM ZA ČETKA PRESKUSA  
3. PRESKUSNA SNOV  
Ime: 
Koncentracija osnovne raztopine: ... mg/l kot snov Začetna koncentracija v mediju, to: ... mg/l kot snov
 
4. INOKULUM  
Vir: 
Obdelava: Aklimatizacija, če je bila opravljena: 
Koncentracija neraztopljenih trdnih snovi v reakcijski zmesi: ... 
mg/l
 
5. DOLO ČITVE OGLJIKA  
Analizator ogljika:  
Št. steklenice DOC po n dneh (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Preskusna snov in 
inokulum 
1 a 1 
A 2 
a, srednja vrednost 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, srednja vrednost 
C b(t) ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 991
 
Št. steklenice DOC po n dneh (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Slepi vzorec 
z inokulumom in brez preskusne snovi 3 C
 1 
C 2 
c, srednja vrednost 
C c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, srednja vrednost 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. VREDNOTENJE NEOBDELANIH PODATKOV  
Št. steklenice % razgradnje po n dneh 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Srednja 
vrednost (  1 ) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
( 1 ) Če je med D  1 in D  2 velika razlika, se srednja vrednost ne izra čuna. 
Opomba: za referen čno snov in vzorce za kontrolo strupenosti se 
lahko uporabi podobna oblika  
7. ABIOTSKA KONTROLA  (neobvezno)  
Čas (dnevi) 
0 t  
Konc. DOC (mg/l) v sterilnih kontrolnih 
vzorcih C s(o) C s(t) 
% abiotske razgradnje  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
8. SPECIFI ČNA KEMI ČNA ANALIZA  (neobvezno)  
Količina ostanka preskusne snovi 
ob koncu preskusa (mg/l) % primarne razgradnje  
Sterilni kontrolni vzorec S  b ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 992
 
Količina ostanka preskusne snovi 
ob koncu preskusa (mg/l) % primarne razgradnje  
Inokulirani preskusni medij S  a S b Ä S a 
S b Ü 100 
Del III  PRILAGOJENI PRESEJALNI PRESKUS OECD  
(Metoda C.4-B)  
III.1 PRINCIP METODE 
Izmerjeni volumen mineralnega medija, ki vsebuje znano koncentra ­
cijo preskusne snovi (10–40 mg DOC/l) kot edinega vira organskega 
ogljika, se inokulira z 0,5 ml odtoka na liter medija. Zmes se prezra ­ 
čuje v temi ali na razpršeni svetlobi pri 22 ± 2  o C. 
Razgradnja se spremlja 28 dni prek analize DOC v pogostih presled ­
kih. Stopnja biorazgradnje se izra čuna tako, da se koncentracija 
odstranjenega DOC (popravljena glede na slepi vzorec 
z inokulumom) izrazi kot odstotek koncentracije na za četku 
preskusa. Stopnja primarne biorazgradnje se lahko izra čuna tudi iz 
dopolnilne kemijske analize, izvedene na za četku in na koncu inku ­
bacije.  
III.2 OPIS METODE  
III.2.1 Aparatura 
(a) Erlenmajerice, npr. 250 ml do 2 l, odvisno od volumna, potreb ­
nega za analizo DOC; 
(b) stresalnik – primeren za erlenmajerice, bodisi z avtomatskim 
uravnavanjem temperature bodisi v prostoru s konstantno tempe ­
raturo in dovolj mo čan, da vzdržuje aerobne pogoje v vseh erlen ­
majericah; 
(c) filtrirna naprava z ustreznimi membranskimi filtri; 
(d) analizator DOC; 
(e) aparatura za dolo čanje raztopljenega kisika; 
(f) centrifuga.  
III.2.2  Priprava mineralnega medija  
Pripravo osnovnih raztopin glej v I.6.2. 
Zmešamo 10 ml raztopine (a) in 800 ml vode za red čenje, dodamo 
po 1 ml raztopin (b) do (d) in dopolnimo z vodo za red čenje do 1 
litra. 
Pri tej metodi se za inokulum uporabi le 0,5 ml odtoka/liter, zato bo 
medij morda treba okrepiti z elementi v sledeh in rastnimi faktorji. 
To se stori tako, da se na liter kon čnega medija doda po 1 ml vsake 
od naslednjih raztopin:  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 993
 
Raztopine elementov v sledeh: 
Manganov sulfat tetrahidrat, MnSO  4 .4H  2 O 39,9 mg 
Borova kislina, H  3 BO 3 57,2 mg 
Cinkov sulfat heptahidrat, ZnSO  4 .7H  2 O 42,8 mg 
Amonijev heptamolibdat (NH  4 ) 6 Mo 7 O 2 4 34,7 mg 
Fe-helat (FeCl  3 etilendiamin-tetra-ocetna kislina) 100,0 mg 
Raztopimo v vodi za red čenje in dopolnimo z vodo za 
redčenje do 1 000 ml. 
Raztopina vitaminov Kvasni ekstrakt 15,0 mg 
Kvasni ekstrakt raztopimo v 100 vode. Steriliziramo s filtriranjem 
skozi 0,2-mikronsko membrano ali pripravimo sveže.
 
III.2.3  Priprava in aklimatizacija inokuluma  
Inokulum se lahko pridobi iz sekundarnega odtoka iz čistilne naprave 
ali laboratorijske enote, ki prejema predvsem gospodinjske odplake. Glej I.6.4.2 in I.6.5. 
Uporabi se 0,5 ml na liter mineralnega medija.
 
III.2.4  Priprava steklenic  
Kot primer, v 2-litrske erlenmajerice damo po 800 ml mineralnega 
medija in v posamezne erlenmajerice dodamo ustrezno koli čino 
osnovne raztopine preskusne ali referen čne snovi, da bo koncentra ­
cija snovi enakovredna 10–40 mg DOC/liter. Preverimo pH vrednost in jo po potrebi uravnamo na 7,4. Erlenmajerice inokuliramo s komunalno odplako v koncentraciji 0,5 ml/liter (glej I.6.4.2). 
Pripravimo tudi kontrolne vzorce z inokulumom v mineralnem 
mediju brez preskusne ali referen čne snovi. 
Če je potrebno, uporabimo eno posodo za preverjanje morebitnega 
inhibitornega u činka preskusne snovi, tako da inokuliramo raztopino, 
ki vsebuje primerljivi koncentraciji preskusne in referen čne snovi 
v mineralnem mediju. 
Če je potrebno pripravimo tudi sterilni vzorec za preverjanje, ali se 
preskusna snov razgrajuje abiotsko, tako da uporabimo neinokulirano raztopino snovi (glej I.6.6). 
Če sumimo, da se preskusna snov znatno adsorbira na steklo, blato 
itd., s predhodnim preskusom dolo čimo verjetno stopnjo adsorpcije 
in s tem primernost preskusa za snov (glej tabelo 1). Pripravimo 
erlenmajerico s preskusno snovjo, inokulumom in sterilizacijskim sredstvom. 
Vse erlenmajerice dopolnimo z mineralnim medijem do 1 litra, 
premešamo in iz vsake erlenmajerice vzamemo vzorec za dolo čitev 
začetne koncentracije DOC (glej Dodatek 2.4). Odprtine erlenmajeric 
pokrijemo, npr. z aluminijasto folijo, tako da je omogo čena prosta 
izmenjava zraka med erlenmajerico in ozra čjem. Erlenmajerice posta ­
vimo v stresalnik in tako za čnemo preskus.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 994
 
III.2.5  Število steklenic v zna čilnem preskusu  
Steklenici 1 in 2: Preskusna suspenzija 
Steklenici 3 in 4: Slepi vzorec z inokulumom Steklenica 5: Vzorec za kontrolo postopka ter po možnosti in kadar je potrebno: Steklenica 6: Abiotski sterilni kontrolni vzorec Steklenica 7: Vzorec za kontrolo adsorpcije Steklenica 8: Vzorec za kontrolo strupenosti 
Glej tudi 1.6.7.
 
III.2.6  Izvedba preskusa  
Ves čas preskusa v znanih časovnih intervalih dolo čamo koncentra ­
cijo DOC v vsaki steklenici v podvojenih meritvah, in sicer dovolj 
pogosto, da lahko dolo čimo začetek 10-dnevnega okna in odstotek 
odstranitve na koncu 10-dnevnega okna. Odvzamemo le najmanjši volumen preskusne suspenzije, potreben za vsako dolo čitev. 
Če je potrebno, pred vzor čenjem nadomestimo izgube zaradi izhla ­
pevanja, tako da dodamo ustrezno koli čino vode za red čenje (I.6.1). 
Pred odvzemom vzorca medij temeljito premešamo in zagotovimo, 
da se material, prilepljen na steno posode, raztopi ali suspendira. Vzorce takoj po odvzemu membransko filtriramo ali centrifugiramo (glej Dodatek 2.4). Filtrirane ali centrifugirane vzorce analiziramo 
isti dan ali pa jih shranimo pri temperaturi 2–4
 o C za najve č 48 ur 
ali pod –18  o C za daljše obdobje.  
III.3 PODATKI IN PORO ČANJE  
III.3.1  Obdelava rezultatov  
Izračunamo odstotek razgradnje ob času t iz I.7.1 (Dolo čanje DOC) 
in, neobvezno, iz I.7.2 (specifi čna analiza). 
Vse rezultate zapišemo na predvidene podatkovne liste.  
III.3.2 Veljavnost rezultatov 
Glej I.5.2.  
III.3.3 Poro čanje 
Glej I.8.  
III.4 PODATKOVNI LIST 
V nadaljevanju je predstavljen primer podatkovnega lista.  
PRILAGOJENI PRESEJALNI PRESKUS OECD 
1. LABORATORIJ  
2. DATUM ZA ČETKA PRESKUSA  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 995
 
3. PRESKUSNA SNOV  
Ime: 
Koncentracija osnovne raztopine: ... mg/l kot snov 
Začetna koncentracija v mediju, to: ... mg/l kot snov  
4. INOKULUM  
Vir: 
Obdelava: 
Aklimatizacija, če je bila opravljena: 
Koncentracija neraztopljenih trdnih snovi v reakcijski zmesi: ... 
mg/l 
5. DOLO ČITVE OGLJIKA  
Analizator ogljika:  
Št. steklenice DOC po n dneh (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Preskusna snov in 
inokulum 
1 a 1 
a 2 
a, srednja vrednost 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, srednja vrednost 
C b(t) 
Slepi vzorec 
z inokulumom in brez preskusne 
snovi 3 C
 1 
C 2 
c, srednja vrednost 
C c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, srednja vrednost 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. VREDNOTENJE NEOBDELANIH PODATKOV  
Št. steklenice % razgradnje po n dneh 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 996
 
Št. steklenice % razgradnje po n dneh 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Srednja 
vrednost (  1 ) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
( 1 ) Če je med D  1 in D  2 velika razlika, se srednja vrednost ne izra čuna. 
Opomba:  za referen čno snov in vzorce za kontrolo strupensosti se 
lahko uporabi podobna oblika.  
7. ABIOTSKA KONTROLA  (neobvezno)  
Čas (dnevi) 
0 t  
Konc. DOC (mg/l) v sterilnih kontrolnih 
vzorcih C S(o) C s(t) 
% abiotske razgradnje  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
8. SPECIFI ČNA KEMIJSKA ANALIZA  (neobvezno)  
Kakiāna ostarika preskusne snovi 
ob koncu preskusa % primarne razgradnje  
Sterilni kontrolni vzorec S  b 
Inokulirani preskusni modij S  a S b Ä S a 
S b Ü 100 
Del IV  PRESKUS RAZVIJANJA CO  2 (Metoda C.4-C)  
IV.1 PRINCIP METODE 
Izmerjeni volumen inokuliranega mineralnega medija, ki vsebuje 
znano koncentracijo preskusne snovi (10–20 mg DOC ali 
TOC/l) kot edinega vira organskega ogljika, se prezra čuje 
z uvajanjem zraka brez ogljikovega dioksida z nadzorovano hitrostjo v temi ali na razpršeni svetlobi. Razgradnja se spremlja 28 dni z določanjem proizvedenega ogljikovega dioksida, ki se ujame 
v barijev ali natrijev hidroksid in izmeri s titracijo preostalega 
hidroksida ali kot anorganski ogljik. Koli čina ogljikovega dioksida, 
proizvedenega iz preskusne snovi (popravljena glede na slepi vzorec z inokulumom), se izrazi kot odstotek TCO
 2 . Stopnja biorazgradnje 
se lahko izra čuna tudi iz dopolnilne analize DOC, izvedene na 
začetku in na koncu inkubacije.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 997
 
IV.2 OPIS METODE  
IV.2.1  Aparatura  
(a) Buče, 2–5 litrov, vsaka opremljena s prezra čevalno cevjo, ki 
sega skoraj do dna bu čke, in odvodno odprtino; 
(b) magnetna mešala, kadar se preskušajo slabo topne snovi; 
(c) steklenice za absorpcijo plina; 
(d) naprava za uravnavanje in merjenje zra čnega pretoka; 
(e) aparatura za izpiranje ogljikovega dioksida, za pripravo zraka 
brez ogljikovega dioksida; lahko pa se uporabi zmes kisika 
brez CO  2 in dušika brez CO  2 iz plinskih jeklenk v pravem 
razmerju (20 % O  2 in 80 % N  2 ); 
(f) naprava za dolo čanje ogljikovega dioksida, bodisi titrimetri čno 
ali s kako obliko analizatorja anorganskega ogljika; 
(g) naprava za membransko filtracijo (neobvezno); 
(h) analizator DOC (neobvezno).  
IV.2.2  Priprava mineralnega medija  
Pripravo osnovnih raztopin glej v I.6.2. 
Zmešamo 10 ml raztopine (a) in 800 ml vode za red čenje, dodamo 
po 1 ml raztopin (b) do (d) in dopolnimo z vodo za red čenje do 1 l.  
IV.2.3  Priprava in aklimatizacija inokuluma  
Inokulum se lahko pridobi iz razli čnih virov: aktivnega blata, komu ­
nalnih odplak, površinskih vod, prsti ali zmesi teh virov. 
Glej I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 in I.6.5.  
IV.2.4  Priprava steklenic  
Naslednji volumni in mase se na primer nanašajo na 5-litrske stekle ­
nice, ki vsebujejo 3 l suspenzije. Če se uporabijo manjši volumni, je 
treba vrednosti ustrezno spremeniti, vendar hkrati zagotoviti to čno 
merjenje nastalega ogljikovega dioksida. 
V vsako 5-litrsko steklenico damo 2 400 ml mineralnega medija. 
Dodamo ustrezen volumen pripravljenega aktivnega blata (glej 
I.6.4.1 in I.6.5), da bo v kon čnih 3 l inokulirane zmesi koncentracija 
neraztopljenih trdnih snovi najve č 30 mg/l. Druga možnost je, da 
pripravljeno blato najprej razred čimo z mineralnim medijem, da 
dobimo suspenzijo 500–1 000 mg/l, nato dodamo ustrezen alikvot 
vsebini 5-litrske steklenice, da dobimo koncentracijo 30 mg/l; ta način zagotavlja ve čjo natančnost. Lahko se uporabijo drugi viri 
inokuluma (glej I.6.4.2). 
Te inokulirane zmesi čez noč prezračujemo z zrakom brez CO
 2 , da 
iz sistema izperemo ogljikov dioksid.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 998
 
V vzporedne steklenice dodamo lo čeno preskusno snov in referen čno 
snov, kot znani volumen osnovnih raztopin, tako da bo dobljena 
koncentracija DOC ali TOC, ki ga prispeva dodana snov, 10 do 20 mg/l; za kontrolo inokuluma v nekaj steklenic ne dodamo snovi. Slabo topne preskusne snovi dodamo neposredno v steklenice, na 
podlagi mase ali volumna, ali ravnamo z njimi, kakor je opisano 
v Dodatku 3. 
Če je potrebno, uporabimo eno steklenico za preverjanje morebitnega 
inhibitornega u činka preskusne snovi, tako da vanjo damo preskusno 
in referen čno snov v koncentracijah, enakih koncentracijam v drugih 
steklenicah. 
Če je potrebno pripravimo tudi sterilni vzorec za preverjanje, ali se 
preskusna snov razgrajuje abiotsko, tako da uporabimo neinokulirano raztopino snovi (glej I.6.6). Steriliziramo z dodatkom strupene snovi v primerni koncentraciji. 
Suspenzije v vseh erlenmajericah dopolnimo do 3 l z mineralnim 
medijem, predhodno prezra čevanim z zrakom brez CO
 2 . Po izbiri 
lahko vzamemo vzorce za analizo DOC (glej Dodatek 2.4) in/ali specifično analizo. Na odvodne odprtine erlenmajeric priklju čimo 
absorpcijske steklenice. 
Če uporabimo barijev hidroksid, na vsako 5-litrsko erlenmajerico 
zaporedno priklju čimo po tri absorpcijske steklenice s po 100 ml 
0,0125 M raztopine barijevega hidroksida. V raztopini ne sme biti oborjenega sulfata in karbonata in tik pred uporabo je treba dolo čiti 
njeno koncentracijo. Če uporabimo natrijev hidroksid, priklju čimo 
dva lovilnika, drugega za potrditev, da se je v prvem absorbiral ves ogljikov dioksid. Primerne so absorpcijske steklenice, opremljene z zapirali za serumske steklenice. V vsako steklenico dodamo 200 ml 
0,05 M natrijevega hidroksida, kar je dovolj za absorpcijo celotne 
količine ogljikovega dioksida, ki se razvije pri popolni razgradnji 
preskusne snovi. Raztopina natrijevega hidroksida vsebuje sledi karbonatov, tudi ko je sveže pripravljena; to se popravi 
z odštetjem koli čine ogljika v slepem vzorcu.
 
IV.2.5  Število steklenic v zna čilnem preskusu  
Steklenici 1 in 2: Preskusna suspenzija 
Steklenici 3 in 4: Slepi vzorec z inokulumom Steklenica 5: Vzorec za kontrolo postopka ter po možnosti in kadar je potrebno: Steklenica 6: Abiotski sterilni kontrolni vzorec Steklenica 7: Vzorec za kontrolo strupenosti Glej tudi I.6.7.
 
IV.2.6  Izvedba preskusa  
Preskus pri čnemo s črpanjem zraka brez CO  2 skozi suspenzije 
s hitrostjo 30–100 ml/min. Periodi čno odvzamemo vzorce absorbenta 
ogljikovega dioksida za analizo vsebnosti CO  2 . Prvih deset dni je 
priporočljivo analize izvesti vsak drugi ali tretji dan, nato pa vsak 
peti dan do 28. dne, da se lahko dolo či 10-dnevno okno.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 999
 
Osemindvajseti dan odvzamemo vzorce (neobvezno) za DOC in/ali 
specifično analizo, izmerimo pH suspenzij in dodamo po 1 ml 
koncentrirane klorovodikove kisline v vsako steklenico; steklenice čez noč prezračujemo, da iz preskusnih suspenzij izženemo ves 
ogljikov dioksid. Devetindvajseti dan izvedemo zadnjo analizo razvi ­
tega ogljikovega dioksida. 
Ob dnevih, ko merimo CO
 2 , odklopimo steklenici najbližji absorber 
z barijevim hidroksidom in raztopino hidroksida titriramo z 0,05 
M HCl ob fenolftaleinu kot indikatorju. Preostale absorberje presta ­
vimo za eno mesto bliže steklenici, na konec verige pa priklju čimo 
nov absorber s 100 ml svežega 0,0125 M barijevega hidroksida. 
Titriramo po potrebi, na primer, ko opazimo znatno obarjanje 
v prvem lovilniku in preden se obarjanje za čne v drugem, ali 
najmanj enkrat na teden. Kadar kot absorbent uporabimo natrijev 
hidroksid, z brizgo odvzamemo majhen vzorec (odvisno od lastnosti 
uporabljenega analizatorja ogljika) raztopine natrijevega hidroksida iz absorberja, ki je najbliže steklenici. Vzorec injiciramo v IC-del analizatorja ogljika za neposredno analizo razvitega ogljikovega 
dioksida. 
Vsebino drugega lovilnika analiziramo šele ob koncu preskusa, da 
upoštevamo popravke zaradi morebitnega prehajanja ogljikovega 
dioksida naprej.
 
IV.3 PODATKI IN PORO ČANJE  
IV.3.1  Obdelava rezultatov  
Količina v absorberju ujetega CO  2 , določena s titracijo, se izra čuna po: 
mgCO  2 = (100 × C  B – 0,5 × V x C  A ) × 44 
pri čemer je: 
V = volumen HCl, porabljen za titracijo 100 ml absorbenta (ml), C
 B = koncentracija raztopine barijevega hidroksida (M), 
C A = koncentracija raztopina klorovodikove kisline (M), 
če je C  B enak 0,0125 M in C  A enak 0,05 M, se za titracijo 100 ml 
barijevega hidroksida porabi 50 ml, je masa CO  2 : 
0; 05 
2 Ü 44 Ü ml HCI porabljeni pri titraciji  ¼ 1; 1 Ü ml HCI  
V tem primeru je torej faktor za pretvorbo pri titraciji porabljene HCl 
v mg CO  2 enak 1,1. 
Iz ustreznih vrednosti, dobljenih pri titraciji, izra čunamo maso CO  2 , 
proizvedenega samo iz inokuluma ter iz inokuluma in preskusne 
snovi; razlika je masa CO  2 , proizvedenega iz preskusne snovi. 
Če na primer pri vzorcu z inokulumom porabimo za titracijo 
48 ml ter pri vzorcu z inokulumom in preskusno snovjo 45 ml, 
CO 2 iz inokuluma = 1,1 × (50 - 48) = 2,2 mg  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1000
 
CO 2 iz inokuluma in preskusne snovi skupaj = 1,1 × (50 - 45) = 5,5 mg 
torej je masa CO  2 , proizvedenega iz preskusne snovi, enaka 3,3 mg. 
Odstotek biorazgradnje se izra čuna po ena čbi: 
% razgradnje ¼ mg proizvedenega CO  2 Ü 100 
TCO  2 Ü mg dodane preskusne snovi  
ali 
% razgradnje ¼ mg proizvedenega CO  2 Ü 100 
mg Tv preskusu dodanega TCO  Ü 3; 67 
pri čemer je 3,67 faktor pretvorbe (44/12) ogljika v ogljikov dioksid. 
Odstotek razgradnje po vsakem časovnem intervalu dolo čimo tako, 
da seštejemo odstotke TCO  2 , izračunane za vsak dan do dneva meri ­
tve. 
Pri absorberjih z natrijevim hidroksidom, koli čino proizvedenega 
ogljikovega dioksida, izraženega kot anorganski ogljik IC (mg), izra ­ 
čunamo tako, da koncentracijo IC v absorbentu pomnožimo 
z volumnom absorbenta. 
Odstotek razgradnje izra čunamo po ena čbi: 
% TCO  2 ¼ mg IC v preskusni steklenici – mg IC v slepem vzorcu 
MG TOC dodanega kot preskusna snov  Ü 100 
Odstranitev DOC (neobvezno) izra čunamo, kakor je opisano 
v I.7. Te in vse druge rezultate zapišemo na predvidene podatkovne 
liste.  
IV.3.2  Veljavnost rezultatov  
Vsebnost IC v suspenziji preskusne snovi v mineralnem mediju mora 
biti na za četku preskusa manj kot 5 % TC in skupni CO  2 , razvit 
v slepem vzorcu z inokulumom, na koncu preskusa ne sme prese či 
40 mg/l medija. Če dobljene vrednosti presežejo 70 mg CO  2 /liter, je 
treba kriti čno preveriti podatke in tehniko preskušanja. 
Glej tudi I.5.2.  
IV.3.3  Poro čanje 
Glej I.8.  
IV.4 PODATKOVNI LIST 
V nadaljevanju je predstavljen primer podatkovnega lista.  
PRESKUS RAZVIJANJA OGLJIKOVEGA DIOKSIDA 
1. LABORATORIJ  
2. DATUM ZA ČETKA PRESKUSA  
3. PRESKUSNA SNOV  
Ime: 
Koncentracija osnovne raztopine: ... mg/l kot snov  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1001
 
Začetna konc. v mediju: ... mg/l kot snov 
Skupni C, dodan v steklenico: ... mg C 
TCO  2 : ... mg CO  2 
4. INOKULUM  
Vir: 
Obdelava: 
Aklimatizacija, če je bila opravljena: 
Koncentracija neraztopljenih trdnih snovi v reakcijski zmesi: 
mg/liter 
5. PROIZVODNJA OGLJIKOVEGA DIOKSIDA IN 
RAZGRADLJIVOST  
Metoda Ba(OH)/NaOH/drugo  
Čas 
(dan) Nastali CO  2 preskusni 
vzorec 
(mg) Nastali CO  2 slepi 
vzorec 
(mg) Nastali CO  2 kumula­
tivni (mg) 
(preskusni minus slepi 
vzorec, srednja vred ­
nost) TCO  2 
cumulative  CO  2 
TCO  2 Ü 100 
1 
2 srednja 
vrednost 3 
4 srednja 
vrednost 1 2 1 2 srednja 
vrednost  
0 
n 1 
n 2 
n 3 
28 
Opomba: za referen čno snov in vzorce za kontrolo strupenosti se 
lahko uporabi podobna oblika.  
6. ANALIZA OGLIJIKA  (neobvezno) 
Analizator ogljika:  
Čas (dan) Slepi vzorec mg/l Preskusna snov mg/l  
0 C  b(o) C o 
28 (  1 ) C  b(t) C t 
( 1 ) ali ob koncu inkubacije.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1002
 
% odstranjenega DOC  ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bðtÞ 
1 Ä C t Ä C bðoÞ Î 
Ü 100 
7. ABIOTSKA RAZGRADNJA  (neobvezno) 
% abiotske razgradnje  ¼ CO  2 proizveden v sterilni steklenici po 28 dneh  ðmgÞ 
TCO  2 ðmgÞ Ü 100 
Del V  PRESKUS MANOMETRI ČNE RESPIROMETRIJE  
(Metoda C.4-D)  
V.1 PRINCIP METODE 
Izmerjeni volumen inokuliranega mineralnega medija, ki vsebuje 
znano koncentracijo preskusne snovi (100 mg preskusne snovi/l, da dobimo najmanj 50–100 mg TPK/l) kot edinega vira 
organskega ogljika, se do 28 dni meša v zaprti steklenici pri 
konstantni temperaturi (± 1
 o C ali manj). Poraba kisika se dolo či 
bodisi z merjenjem koli čine kisika (elektrolitsko proizvedenega), 
potrebne za ohranjanje konstantnega volumna plina 
v respirometrski steklenici, bodisi iz spremembe volumna ali tlaka 
(ali kombinacije obeh) v aparaturi. Razviti ogljikov dioksid se absor ­
bira v raztopini kalijevega hidroksida ali drugega ustreznega absor ­
benta. Koli čina kisika, ki jo porabi preskusna snov (popravljena 
glede na sprejem pri slepem vzorcu z inokulumom, preskušenem 
vzporedno) se izrazi kot odstotek TPK ali KPK. Po izbiri se lahko izračunata primarna biorazgradnja iz dopolnilne specifi čne analize, 
opravljene na za četku in na koncu inkubacije, ter popolna bioraz ­
gradnja z analizo DOC.
 
V.2 OPIS METODE  
V.2.1  Aparatura  
(a) ustrezni respirometer; 
(b) termostat, ki vzdržuje konstantno temperaturo do ± 1  o C ali bolj 
natančno; 
(c) naprava za membransko filtracijo (neobvezno); 
(d) analizator ogljika (neobvezno).  
V.2.2  Priprava mineralnega medija  
Pripravo osnovnih raztopin glej v I.6.2. 
Zmešamo 10 ml raztopine (a) in 800 ml vode za red čenje, dodamo 
po 1 ml raztopin (b) do (d) in dopolnimo z vodo za red čenje do 1 
litra. 
V.2.3  Priprava in aklimatizacija inokuluma  
Inokulum se lahko pridobi iz razli čnih virov: aktivnega blata, komu ­
nalnih odplak, površinskih vod in prsti ali zmesi teh virov. 
Glej I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 in I.6.5.  
V.2.4  Priprava steklenic  
Iz osnovnih raztopin pripravimo lo čene serije raztopin preskusne in 
referenčne snovi v mineralnem mediju, ki ustrezajo koncentraciji 
100 mg snovi/l (da dobimo najmanj 50–100 mg TPK/l).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1003
 
TPK izra čunamo na podlagi tvorbe amonijevih soli, razen če priča­
kujemo nitrifikacijo, takrat mora izra čun temeljiti na tvorbi nitrata 
(glej Dodatek 2.2). 
Določimo pH vrednost in jo po potrebi uravnamo na 7,4±0,2. 
Slabo topne snovi se dodajo pozneje (glej spodaj). 
Če bomo dolo čali strupenost preskusne snovi, pripravimo dodatno 
raztopino v mineralnem mediju, ki vsebuje preskusno in referen čno 
snov v istih koncentracijah, kakor posamezne raztopine. 
Če potrebujemo meritev fizikalno-kemijskega sprejema kisika, 
pripravimo raztopino preskusne snovi, navadno v koncentraciji 
100 mg TPK/l, ki jo steriliziramo z dodatkom ustrezne strupene snovi (glej I.6.6). 
V steklenice, najmanj po dve za vsako vrsto vzorca, damo potrebne 
volumne raztopin preskusne in referen čne snovi. Pripravimo dodatne 
steklenice z le mineralnim medijem (za kontrolo inokuluma) ter, če 
je potrebno, z zmesjo raztopin preskusne in referen čne snovi in 
s sterilno raztopino. 
Če je preskusna snov slabo topna, jo dodamo v tej fazi, neposredno 
v steklenico, na podlagi mase ali volumna, ali ravnamo z njo, kakor je opisano v Dodatku 3. V razdelke CO
 2 -absorberja damo kalijev 
hidroksid, tablete zmesi natrijevega ali kalijevega hidroksida in kalci ­
jevega oksida ali kak drug absorbent.  
V.2.5  Število steklenic v zna čilnem preskusu  
Steklenici 1 in 2: Preskusna suspenzija 
Steklenici 3 in 4: Slepi vzorec z inokulumom Steklenica 5: Vzorec za kontrolo postopka po možnosti in kadar je potrebno: 
Steklenica 6: Sterilni kontrolni vzorec 
Steklenica 7: Vzorec za kontrolo strupenosti Glej tudi I.6.7.
 
V.2.6  Izvedba preskusa  
Počakamo, da steklenice dosežejo želeno temperaturo, in ustrezne 
steklenice inokuliramo s pripravljenim aktivnim blatom ali inoku ­
lumom iz drugega vira, tako da bo koncentracija neraztopljenih trdnih snovi najve č 30 mg/l. Sestavimo aparaturo, vklopimo mešal ­
nik, preverimo nepredušnost in za čnemo meriti sprejem kisika. 
Običajno nam ni treba storiti ni č drugega, kot opraviti potrebne 
odčitke in dnevno preverjati, ali se vzdržujeta prava temperatura in 
ustrezno mešanje. 
Sprejem kisika izra čunamo iz vrednosti, od čitanih v rednih in pogo ­
stih intervalih po metodah, ki jih navaja proizvajalec opreme. Ob koncu inkubacije, navadno po 28 dneh, izmerimo pH vsebine stekle ­
nic, zlasti če je sprejem kisika manjši ali ve čji od ThODNH
 4 (za 
snovi, ki vsebujejo dušik).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1004
 
Če je potrebno, iz respirometrskih steklenic na za četku in na koncu 
odvzamemo vzorce za analizo DOC ali specifi čno kemijsko analizo 
(glej Dodatek 2.4). Ob prvem odvzemu zagotovimo, da je volumen preostale preskusne suspenzije v steklenici znan. Kadar kisik spre ­
jema preskusna snov, ki vsebuje dušik, dolo čimo pove čanje koncen ­
tracije nitrita in nitrata v 28 dneh ter izra čunamo popravek za kisik, 
porabljen pri nitrifikaciji (Dodatek 5).
 
V.3 PODATKI IN PORO ČANJE  
V.3.1  Obdelava rezultatov  
Količino kisika (mg), ki ga sprejme preskusna snov po dolo čenem 
času (popravljeno glede na sprejem v slepem vzorcu za kontrolo 
inokuluma v istem času), delimo z uporabljeno maso preskusne 
snovi. Tako dobimo BPK, izražen v mg kisika/mg preskusne snovi, to je 
BPK ¼
 ðmg sprejetega O  2 pri preskusni snovi – mg sprejetega O  2 pri slepem vzorcuÞ 
ðmg preskusne snovi v steklenici Þ 
= mg O  2 na mg preskusne snovi. 
odstotek razgradnje izra čunamo po ena čbi: 
% biorazgradnje ¼ % TPK ¼ BPKðmg O  2=mg snoviÞ 
TPKðmg O  2 snoviÞ Ü 100 
ali po ena čbi 
% KPK ¼ BPKðmg O  2=mg snoviÞ 
KPKðmg O  2 snoviÞ Ü 100 
Opozoriti je treba, da ti dve metodi ne dasta nujno enakega rezultata; 
priporočena je uporaba prve metode. 
Pri snoveh, ki vsebujejo dušik, uporabimo ustrezni TPK (NH  4 ali 
N0 3 ), glede na to kaj vemo ali pri čakujemo glede nitrifikacije 
(Dodatek 2.2). Če pride do nitrifikacije, ki pa je nepopolna, izra ču­
namo popravek za kisik, porabljen pri nitrifikaciji, iz sprememb 
v koncentraciji nitrita in nitrata (Dodatek 5). 
Kadar dolo čimo organski ogljik in/ali izvedemo specifi čno kemično 
analizo, odstotek razgradnje izra čunamo, kakor je opisano v I.7. 
Vse rezultate zapišemo na priložene podatkovne liste.  
V.3.2  Veljavnost rezultatov  
Sprejem kisika v slepem vzorcu z inokulumom je navadno 
20–30 mg O  2 /l in ne sme biti ve čji od 60 mg/l v 28 dneh. Pri 
vrednostih nad 60 mg/l je treba kriti čno preveriti podatke in tehniko 
preskušanja. Če je pH vrednost izven obmo čja 6–8,5 in poraba kisika 
pri preskusni snovi pod 60 %, je treba preskus ponoviti z manjšo 
koncentracijo preskusne snovi. 
Glej tudi I.5.2.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1005
 
V.3.3  Poro čanje 
Glej I.8.  
V.4 PODATKOVNI LIST  
V nadaljevanju je predstavljen primer podatkovnega lista.  
PRESKUS MANOMETRI ČNE RESPIROMETRIJE 
1. LABORATORIJ  
2. DATUM ZA ČETKA PRESKUSA  
3. PRESKUSNA SNOV  
Ime: 
Koncentracija osnovne raztopine: ... mg/liter 
Začetna koncentracija v mediju, C  o : ... mg/liter 
Volumen v preskusni steklenici (V): ... ml 
TPK ali KPK: ... mg O  2 /mg preskusne snovi (NH  4 or NO  3 ) 
4. INOKULUM  
Vir: 
Obdelava: 
Aklimatizacija, če je bila opravljena: 
Koncentracija neraztopljenih trdnih snovi v reakcijski zmesi: ... 
mg/l 
5. SPREJEM KISIKA: BIORAZGRADLJIVOST  
Čas (dan) 
0 7 14 21 28  
Spr. O  2 (mg) 
preskusna snov 1 
2 
a, srednja 
vrednost 
Spr. O  2 (mg) 
slepi vzorec 3 
4 
b, srednja 
vrednost 
Popravljeni 
BPK (mg) (a 1 – b  m ) 
(a 2 – b  m ) 
BPK na mg 
preskusne snovi
 ða 1 Ä bÞ 
C o V 
ða 2 Ä bÞ 
C o V ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1006
 
Čas (dan) 
0 7 14 21 28  
% razgradnje  
BOD 
ThOD Ü 100 D 1 (a 1 ) 
D 2 (a 2 ) 
srednja 
vrednost (  1 ) 
V = volumen medija v preskusni steklenici. 
( 1 ) Če je med D  1 in D  2 velika razlika, se srednja vrednost ne izra čuna. 
Opomba:  za referen čno snov in vzorce za kontrolo strapenosti se 
lahko uporabi podobna oblika.  
6. POPRAVEK ZA NITRIFIKACIJO  (glej Prilogo V)  
Päev 0 28 Erinevus  
(i) Koncentracija nitrata (mg N/l), (N) 
(ii) Ekvivalent kisika (4,57 × N × V) (mg) — — (iii) Koncentracija nitrita (mg N/l) (N) (iv) Ekvivalent kisika (3,43 × N × V) (mg) — — (ii + iv) Skupni ekvivalent kisika — —
 
7. ANALIZA OGLJIKA  (neobvezno) 
Analizator ogljika:  
Čas (dan) Slepi vzorec (mg/l) Preskusna snov mg/l  
0 (C  blo ) (C  o ) 
28 (  1 ) (C  blt ) (C  t ) 
( 1 ) ali ob koncu inkubacije.  
% odstranjenega DOC  ¼ Í 
1 Ä C t Ä C blt 
C o Ä C blo Î 
Ü 100 
8. SPECIFI ČNA ANALIZA  (neobvezno) 
S b = Koncentracija v fizikalno-kemijskem (sterilnem) 
kontrolnem vzorcu po 28 dneh 
S a = Koncentracija v inokulirani steklenici po 28 dneh,  
% biorazgradnje ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
9. ABIOTSKA RAZGRADNJA  (neobvezno) 
a = poraba kisika v sterilnih steklenicah po 28 dneh,  
poraba kisika na mg preskusne snovi  ¼ a 
C o V ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1007
 
(glej oddelka 1 in 3)  
% abiotske razgradnje  ¼ a Ü 100 
C o V Ü ThOD  
Del VI  PRESKUS Z ZAPRTO STEKLENICO  (METODA 
C.4-E)  
VI.1 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Raztopina preskusne snovi v mineralnem mediju, obi čajno 
2–5 mg/l, se inokulira z relativno majhnim številom mikroorgan ­
izmov iz mešane populacije in hrani v do vrha napolnjenih zaprtih 
steklenicah v temi pri konstantni temperaturi. Razgradnja se spremlja 28 dni prek analize raztopljenega kisika. Koli čina kisika, ki jo porabi 
preskusna snov (popravljena glede na sprejem pri slepem vzorcu 
z inokulumom, preskušenem vzporedno), se izrazi kot odstotek 
TPK ali KPK.
 
VI.2 OPIS METODE  
VI.2.1  Aparatura  
(a) BPK-steklenice s steklenimi zamaški, npr. 250–300 ml; 
(b) vodna kopel ali inkubator, za hranjenje steklenic pri konstantni 
temperaturi (± 1  o C ali bolj natan čno) in brez svetlobe; 
(c) velike steklenice (2–5 litrov) za pripravo medijev in polnjenje 
BPK-steklenic; 
(d) kisikova elektroda in merilnik ali oprema in reagenti za titracijo 
po Winklerju.  
VI.2.2  Priprava mineralnega medija  
Pripravo osnovnih raztopin glej v I.6.2. 
Zmešamo po 1 ml raztopin (a) do (d) in dopolnimo do 1 litra z vodo 
za redčenje.  
VI.2.3  Priprava inokuluma  
Inokulum se navadno pridobi iz sekundarnega odtoka iz čistilne 
naprave ali laboratorijske enote, ki prejema predvsem gospodinjske odplake. Drugi vir inokuluma je površinska voda. Navadno upora ­
bimo od ene kapljice (0,05 ml) do 5 ml filtrata na liter medija; morda 
bo treba s poskusi ugotoviti najprimernejši volumen za dolo čen 
odtok (glej I.6.4.2 in I.6.5).
 
VI.2.4  Priprava steklenic  
Mineralni medij mo čno prezra čujemo najmanj 20 minut. Vsak niz 
preskusov izvedemo z mineralnim medijem iz iste serije. Na splošno 
je medij pripravljen za uporabo po 20 h pri temperaturi preskusa. Za namene kontrole dolo čimo koncentracijo raztopljenega kisika; vred ­
nost mora biti približno 9 mg/l pri 20
 o C. Vse postopke prenašanja in 
polnjenja z medijem, nasi čenim z zrakom, opravimo tako, da v njem 
ne nastajajo mehur čki, na primer z uporabo sifonov.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1008
 
Pripravimo vzporedne skupine BPK-steklenic za dolo čanje preskusne 
in referen čne snovi v so časnih preskusnih nizih. Pripravimo zadostno 
število BPK-steklenic, vklju čno s slepimi vzorci z inokulumom, da 
omogočimo podvojene meritve porabe kisika v želenih časovnih 
intervalih, npr. po 0, 7, 14, 21 in 28 dneh. Lahko bo potrebnih 
več steklenic, da se omogo či določitev 10-dnevnega okna. 
V velike steklenice damo popolnoma prezra čen mineralni medij, tako 
da so napolnjene do približno ene tretjine. Nato v posamezne stekle ­
nice dodamo dovolj osnovne raztopine preskusne snovi ali refe ­
renčne snovi, da je kon čna koncentracija snovi najve č 
10 mg/l. V dodatno steklenico za slepi vzorec z medijem ne dodamo 
nobene snovi. 
Da je zagotovljeno, da aktivnost inokuluma ni omejena, koncentra ­
cija raztopljenega kisika v BPK-steklenicah ne sme pasti pod 0,5 
mg/l. To omejuje koncentracijo preskusne snovi na približno 
2 mg/l. Pri slabo razgradljivih snoveh in tistih z majhnim TPK, lahko uporabimo tudi 5–10 mg/l. V nekaterih primerih je priporo č­
ljivo izvesti vzporedna niza z dvema razli čnima koncentracijama 
preskusne snovi, na primer z 2 in s 5 mg/l. Navadno TPK izra ču­
namo na podlagi tvorbe amonijevih soli, če pa pričakujemo ali vemo, 
da bo potekala nitrifikacija, ga izra čunamo na podlagi tvorbe nitrata 
(ThOD
 NO3 : glej Dodatek 2.2). Če je nitrifikacija nepopolna, vendar 
se pojavi, izra čunamo popravke glede na spremembe v koncentraciji 
nitrita in nitrata, dolo čene z analizo (glej Dodatek 5). 
Če bomo preu čevali strupenost preskusne snovi (na primer, kadar je 
bila predhodno dolo čena nizka vrednost biorazgradljivosti), potrebu ­
jemo dodaten niz steklenic. 
Pripravimo še eno veliko steklenico, ki vsebuje prezra čen mineralni 
medij (do približno ene tretjine volumna) ter preskusno in referen čno 
snov v kon čnih koncentracijah, enakih tistim v drugih velikih stekle ­
nicah. 
Raztopine v velikih steklenicah inokuliramo s sekundarnim odtokom 
(ena kapljica ali približno 0,05 ml do 5 ml na liter) ali drugim virom, 
kot je re čna voda (glej I.6.4.2). Nato raztopine dopolnimo do 
volumna s prezra čenim mineralnim medijem, preko cevi, ki sega 
do dna steklenice, da dosežemo ustrezno mešanje.  
VI.2.5  Število steklenic v zna čilnem preskusu  
V značilnem preskusu se uporabijo naslednje steklenice: 
— najmanj 10 steklenic, ki vsebujejo preskusno snov in inokulum 
(preskusna suspenzija), 
— najmanj 10 steklenic, ki vsebujejo le inokulum (slepi vzorec 
z inokulumom), 
— najmanj 10 steklenic, ki vsebujejo referen čno snov in inokulum 
(kontrola postopka),  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1009
 
— in, kadar je potrebno, 6 steklenic, ki vsebujejo preskusno snov, 
referenčno snov in inokulum (kontrola strupenosti). Da pa bi 
zagotovo omogo čili določitev 10-dnevnega okna, bi potrebovali 
še enkrat toliko steklenic.  
VI.2.6 Izvedba preskusa 
Vsako pripravljeno raztopino s cevjo, ki sega v spodnjo četrtino 
velike steklenice (ne do dna), takoj prenesemo v BPK-steklenice 
ustrezne skupine, tako da so vse BPK-steklenice napolnjene do vrha. Rahlo potrkamo po steklenici, da odstranimo vse zra čne 
mehurčke. V steklenicah za čas nič takoj dolo čimo raztopljeni 
kisik z metodo po Winklerju ali z elektrodo. Vsebina steklenic se 
lahko shrani za poznejšo analizo po Winklerju, tako da se ji doda manganov(II) sulfat in natrijev hidroksid (prvi reagent po Winklerju). Steklenice, ki vsebujejo kisik, fiksiran kot rjavi manganov(III) 
hidroksid, previdno zapremo in shranimo v temi pri 10–20
 o C za 
največ 24 ur, preden nadaljujemo s postopkom po Winklerju. 
Preostale steklenice zamašimo, pri čemer zagotovimo, da v njih ni 
zračnih mehur čkov, in jih inkubiramo pri 20  o C v temi. Vsak niz 
mora spremljati popoln vzporedni niz za dolo čanje slepega inokuli ­
ranega medija. V ustreznih časovnih intervalih (najmanj tedensko) 28 
dnevne inkubacije odvzamemo vzorce iz najmanj po dveh vzpo ­
rednih steklenic na niz za dolo čitev raztopljenega kisika. 
Tedenski vzorci bi morali omogo čiti oceno odstotka odstranitve 
v 14-dnevnem oknu, vzor čenje na 3–4 dni pa bi moralo omogo čiti 
določitev 10-dnevnega okna, za kar je potrebnih približno dvakrat 
toliko steklenic. 
Pri snoveh, ki vsebujejo dušik, je treba izra čunati popravke za 
porabo kisika pri nitrifikaciji. V ta namen za dolo čitev koncentracije 
raztopljenega kisika uporabimo metodo s kisikovo elektrodo in nato 
iz BPK-steklenice odvzamemo vzorec za dolo čitev nitrita in nitrata. 
Iz povečanja koncentracije nitrita in nitrata izra čunamo porabljeni 
kisik (glej Dodatek 5).  
VI.3 PODATKI IN PORO ČANJE  
VI.3.1  Obdelava rezultatov  
Najprej izra čunamo BPK po vsakem časovnem intervalu, tako da 
porabo kisika (mg O  2 /l) v slepem vzorcu z inokulumom odštejemo 
od tiste v vzorcu s preskusno snovjo. Tako popravljeno porabo 
delimo s koncentracijo (mg/l) preskusne snovi, da dobimo specifi čni 
BPK, izražen kot mg kisika na mg preskusne snovi. Izra čunamo 
odstotek biorazgradljivosti, tako da specifi čni BPK delimo 
s specifičnim TPK (izra čunanim v skladu z Dodatkom 2.2) ali 
KPK (dolo čenim z analizo, glej Dodatek 2.3), tako je: 
BOD ¼ ðmg sprejetega O  2 pri preskusni snovi – mg sprejetega O  2 pri slepem vzorcuÞ 
ðmg preskusne snovi v steklenici Þ ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1010
 
= mg O  2 na mg preskusne snovi  
% razgradnje ¼ BPK ðmg O  2=mg preskusne snovil Þ 
TPKðmg O  2=mg preskusne snovil Þ Ü 100 
ali 
% razgradnje ¼ BPK ðmg O  2=mg preskusne snovil Þ 
KPKðmg O  2=mg preskusne snovil Þ Ü 100 
Opozoriti je treba, da ti dve metodi ne dasta nujno enakega rezultata; 
priporočena je uporaba prve metode. 
Pri snoveh, ki vsebujejo dušik, uporabimo ustrezni TPK (NH  4 ali 
NO  3 ), glede na to kaj vemo ali pri čakujemo glede nitrifikacije 
(Dodatek 2.2). Če pride do nitrifikacije, ki pa je nepopolna, izra ču­
namo popravek za kisik, porabljen pri nitrifikaciji, iz sprememb 
v koncentraciji nitrita in nitrata (Dodatek 5).  
VI.3.2  Veljavnost rezultatov  
Poraba kisika v slepem vzorcu z inokulumom po 28 dneh ne sme 
preseči 1,5 mg raztopljenega kisika/l. Pri višjih vrednostih je treba 
preveriti preskusne tehnike. Koncentracija preostalega kisika v preskusnih steklenicah nikoli ne sme pasti pod 0,5 mg/l. Tako 
nizka raven kisika je primerna le, če se taka raven lahko to čno določi 
z uporabljeno metodo za dolo čanje raztopljenega kisika. 
Glej tudi I.5.2.
 
VI.3.3  Poro čanje 
Glej I.8.  
VI.4 PODATKOVNI LIST 
V nadaljevanju je predstavljen primer podatkovnega lista.  
PRESKUS Z ZAPRTO STEKLENICO 
1. LABORATORIJ  
2. DATUM ZA ČETKA PRESKUSA  
3. PRESKUSNA SNOV  
Ime: 
Koncentracija osnovne raztopine: ... mg/liter Začetna koncentracija v steklenici: ... mg/liter 
TPK ali KPK: ... mg O
 2 /mg preskusne snovi  
4. INOKULUM  
Vir: 
Obdelava:  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1011
 
Aklimatizacija, če je bila opravljena: 
Koncentracija v reakcijski zmesi: ... mg/liter  
5. DOLO ČANJE DO  
Metoda: Winkler/elektroda  
Analize steklenic  
Čas inkubacije (d) DO (mg/l) 
0 n  1 n 2 
Slepi vzorec (brez 
snovi) 1 C  1 
2 C  2 
Srednja vrednost 
m b ¼ C 1 þ C 2 
2 
Preskusna snov 1 a  1 
2 a  2 
Srednja vrednost 
m t ¼ a 1 þ a 2 
2 
Opomba: Za referen čno snov in vzarec za kontrolo strapenosti se 
lahko uporabi podobna oblika.  
6. POPRAVEK ZA NITRIFIKACIJO  (glej Prilogo V)  
Čas inkubacije (d) 0 n  1 n 2 n 3 
(i) Koncentracija nitrata (mg N/l) 
(ii) Sprememba Koncentracije nitrata (mg N/l) — (iii) Ekvivalent kisika (mg/l) — (iv) Koncentracija nitrita (mg N/l) (v) Sprememba koncentracije nitrita (mg N/l) — (vi) Ekvivalent kisika (mg/l) — (iii + vi) Skupni ekvivlent kisika (mg/l) —
 
7. PORABA DO: % RAZGRADNJE  
Poraba po n dneh (mg/l) 
n 1 n 2 n 3 
STEKLENICA 1: (m  to – m  tx ) – (m  bo – m  bx ) 
STEKLENICA 2: (m  to – m  tx ) – (m  bo – m  bx ) ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1012
 
Poraba po n dneh (mg/l) 
n 1 n 2 n 3 
STEKLENICA 1: 
% D  1 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
Konc : preskusne snovi Ü TPK snovi 
STEKLENICA 2: 
% D  2 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
Konc : preskusne snovi Ü TPK snovi 
strednja vrednost % D (  1 ) = D 1 þ D 2 
2 
( 1 ) Srednje vrednosti ne ra čunamo, če je razlika med ponovitvama zelo velika.  
mt 0 = vrednost v preskusni steklenici ob času 0 
mt x = vrednost v preskusni steklenici ob času x 
m bo = srednja vrednost slepega vzorca ob času 0 
m bx = srednja vrednost slepega vzorca ob času x 
Upoštevamo tudi popravek za nitrifikacijo iz (iii) + (vi) v oddelku 6.  
8. PORABA DO V SLEPEM VZORCU  
Poraba kisika v slepem vzorcu: (m  b0 – m  b28 ) mg/l. Ta poraba je 
pomembna za veljavnost preskusa. Mora biti manj kot 1,5 mg/l.  
DEL VII  PRESKUS M.I.T.I.  (MetodA C.4-F)  
VII.1 PRINCIP METODE 
V obdobju 28 dni se avtomatsko meri sprejem kisika v raztopini ali 
suspenziji preskusne snovi v mineralnem mediju, inokulirani 
s posebej gojenimi, neprilagojenimi mikroorganizmi, med stalnim 
mešanjem v zatemnjenem, zaprtem respirometru pri 25 ± 1  o C. 
Razviti ogljikov dioksid se absorbira v zmesi natrijevega in kalcije ­
vega hidroksida. Biorazgradljivost se izrazi kot odstotek sprejema 
kisika (popravljenega glede na sprejem v slepem vzorcu) glede na teoretični sprejem (TPK). Lahko se izra čuna tudi odstotek primarne 
biorazgradnje iz dopolnilne specifi čne kemične analize, opravljene na 
začetku in na koncu inkubacije, ter, neobvezno, z analizo DOC.
 
VII.2 OPIS METODE  
VII.2.1  Aparatura  
(a) avtomatski elektrolitski BPK-meter ali respirometer, navadno 
opremljen s šestimi 300 ml-steklenicami s posodicami za CO  2 - 
absorbent;  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1013
 
(b) prostor s konstantno temperaturo in/ali vodna kopel 
s temperaturo 25  o C ± 1  o C ali bolj natan čno; 
(c) naprava za membransko filtracijo (neobvezno); 
(d) analizator ogljika (neobvezno).  
VII.2.2  Priprava mineralnega medija  
Pripravimo naslednje osnovne raztopine iz analitsko čistih reagentov 
in vode (I.6.1): 
(a) Monokalijev dihidrogen ortofosfat, KH  2 PO 4 8,50 g 
Dikalijev monohidrogen ortofosfat, K  2 HPO  4 21,75 g 
Dinatrijev monohidrogen ortofosfat dodekahidrat 
Na 2 HPO  4 12 H  2 O 44,60 g 
Amonijev klorid, NH  4 Cl 1,70 g 
Raztopimo v vodi in dopolnimo do 1 litra. 
pH vrednost raztopine mora biti 7,2. 
(b) Magnezijev sulfat heptahidrat, MgSO  4 7 H  2 O 22,50 g 
Raztopimo v vodi in dopolnimo do 1 litra. 
(c) Kalcijev klorid, brezvodni, CaCl  2 27,50 g 
Raztopimo v vodi in dopolnimo do 1 litra. 
(d) Železov (III) klorid heksahidrat, FeCl  3 6 H  2 O 0,25 g 
Raztopimo v vodi in dopolnimo do 1 litra. 
Zmešamo po 3 ml raztopine (a), (b), (c) in (d) in dopolnimo do 1 litra.  
VII.2.3  Priprava inokuluma  
Zberemo sveže vzorce na najmanj desetih mestih, v glavnem na 
območjih, kjer se uporabljajo in odvajajo razli čne kemikalije. Na 
mestih kot so čistilne naprave za komunalno ali industrijsko odpadno 
vodo, reke, jezera, morja, zberemo 1-litrske vzorce blata, površinske 
prsti, vode itd. in jih dobro zmešamo skupaj. Odstranimo plavajo če 
delce in pustimo nekaj časa stati, nato uravnamo pH supernatanta na 
7 ± 1 z natrijevim hidroksidom ali fosforno kislino. 
Z ustreznim volumnom filtriranega supernatanta napolnimo posode 
za obdelavo aktivnega blata po sistemu polni-prazni in teko čino 
prezračujemo približno 23 1/2 h. Trideset minut po ustavitvi prezra ­ 
čevanja zavržemo približno eno tretjino celotnega volumna 
supernatanta ter preostanku dodamo enak volumen raztopine (pH 7), ki vsebuje po 0,1 % glukoze, peptona in monokalijevega orto ­
fosfata, in nadaljujemo s prezra čevanjem. Postopek ponovimo enkrat 
na dan. Enoto za blato je treba upravljati v skladu z dobro prakso: tekočina mora biti bistra, vzdrževati je treba konstantno temperaturo 
25 ± 2
 o C, pH mora biti 7 ± 1, blato se mora dobro posedati, 
prezračevanje mora biti zadostno, da je zmes ves čas aerobna, 
prisotne morajo biti praživali in najmanj vsake tri mesece je treba z referenčno snovjo preveriti aktivnost blata. Blata ne smemo upora ­
biti dokler ne prete če najmanj en mesec obdelave in ne po ve č kot 
štirih mesecih. Nato v rednih časovnih presledkih, enkrat na tri 
mesece, zbiramo vzorce na najmanj 10 mestih.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1014
 
Za vzdrževanje enake aktivnosti svežega in starega blata zmešamo 
filtrirani supernatant obdelovanega aktivnega blata z enakim 
volumnom filtriranega supernatanta sveže zbrane mešanice iz desetih virov ter nastalo zmes kultiviramo po zgornjem postopku. Blato za inokulum odvzamemo 18–24 h po polnjenju enote.
 
VII.2.4  Priprava steklenic  
Pripravimo naslednjih šest steklenic: 
Št. 1: 100 mg/l preskusne snovi v vodi za red čenje 
Št. 2, 3 in 4: 100 mg/l preskusne snovi v mineralnem mediju 
Št. 5: 100 mg/l referen čne snovi (npr. anilin) v mineralnem mediju 
Št. 6: samo mineralni medij 
Slabo topne snovi dodamo neposredno na podlagi mase ali volumna 
ali z njimi ravnamo, kakor je opisano v Dodatku 3, ne smemo pa 
uporabiti ne topil ne emulgatorjev. V vse steklenice damo CO  2 - 
absorbent v za to namenjene posodice. V steklenicah št. 2, 3 in 4 uravnamo pH na 7,0.
 
VII.2.5  Izvedba preskusa  
Steklenice št. 2, 3 in 4 (preskusne suspenzije), št. 5 (kontrola aktiv ­
nosti) in št. 6 (slepi vzorec z inokulumom) inokuliramo z majhno 
količino inokuluma, tako da bo koncentracija neraztopljenih trdnih 
snovi 30 mg/l. V steklenico št. 1, ki je namenjena abiotski kontroli, ne damo inokuluma. Sestavimo aparaturo, preverimo nepredušnost, 
vklopimo mešalnike in za čnemo meriti sprejem kisika v temi. 
Dnevno preverjamo temperaturo, mešalnik in kulometri čni zapiso ­
valnik sprejema kisika ter zapišemo vse spremembe barve vsebine 
steklenic. Z ustrezno metodo, na primer s šestmestnim grafi čnim 
zapisovalnikom, ki izriše krivuljo BPK, neposredno od čitavamo 
sprejem kisika v šestih steklenicah. Ob koncu inkubacije, navadno 28 dni, izmerimo pH vsebine steklenic ter dolo čimo koncentracijo 
ostanka preskusne snovi in kakršnega koli vmesnega produkta in, pri 
vodotopnih snoveh, koncentracijo DOC (Dodatek 2.4). Pri hlapnih snoveh moramo biti posebej previdni. Če pričakujemo nitrifikacijo, 
po možnosti dolo čimo koncentracijo nitrata in nitrita.
 
VII.3 PODATKI IN PORO ČANJE  
VII.3.1  Obdelava rezultatov  
Količino kisika (mg), ki ga sprejme preskusna snov po dolo čenem 
času, popravljeno glede na sprejem v slepem vzorcu za kontrolo 
inokuluma v istem času, delimo z uporabljeno maso preskusne snovi. 
Tako dobimo BPK, izražen v mg kisika/mg preskusne snovi, to je:  
BPK ¼ ðmg sprejetega O  2 pri preskusni snovi  Ä mg sprejetega O  2 pri slepem vzorcu Þ 
ðmg preskusne snovi v steklenici Þ 
= mg O  2 na mg preskusne snovi  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1015
 
Odstotek biorazgradnje se izra čuna po ena čbi: 
% biorazgradnje ¼ % TPK ¼ BPK ðmg O  2=mg snoviÞ 
TPK ðmg O  2=mg snoviÞ Ü 100 
Pri zmeseh izra čunamo TPK iz elementarne analize, kakor pri 
enostavnih spojinah. Uporabimo ustrezni TPK (TPK  NH4 ali 
TPK  NO3 ), glede na to ali nitrifikacije ni ali je popolna (Dodatek 
2.2). Če pa pride do nitrifikacije, vendar je nepopolna, izra čunamo 
popravek za kisik, porabljen pri nitrifikaciji, iz sprememb v koncentraciji nitrita in nitrata (Dodatek 5). 
Odstotek primarne biorazgradnje izra čunamo iz izgube specifi čne 
(izhodne) snovi (glej 1.7.2).
 
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
Če je v steklenici št. 1, namenjeni merjenju fizikalno-kemijske 
odstranitve, prišlo do izgube preskusne snovi, to navedemo 
v poročilu in uporabimo koncentracijo preskusne snovi (S  b ) po 28 
dneh v tej steklenici za izra čun odstotka biorazgradnje. 
Kadar dolo čamo DOC (neobvezno), izra čunamo odstotek popolne 
biorazgradnje po ena čbi: 
D t ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C bo Î 
Ü 100 
kakor je opisano v to čki I.7.1. Če je v steklenici št. 1, namenjeni 
merjenju fizikalno-kemijske odstranitve, prišlo do izgube DOC, uporabimo koncentracijo DOC v tej steklenici za izra čun odstotka 
biorazgradnje. 
Vse rezultate zapišemo na priložene podatkovne liste.
 
VII.3.2  Veljavnost rezultatov  
Sprejem kisika v slepem vzorcu z inokulumom je navadno 
20–30 mg O  2 /l in ne sme biti ve čji od 60 mg/l v 28 dneh. Pri 
vrednostih nad 60 mg/l je treba kriti čno preveriti podatke in tehniko 
preskušanja. Če je pH vrednost izven obmo čja 6–8,5 in poraba kisika 
pri preskusni snovi pod 60 %, je treba preskus ponoviti z manjšo 
koncentracijo preskusne snovi. 
Glej tudi 1.5.2. Če odstotek razgradnje anilina, izra čunan iz porabe kisika, ne 
preseže 40 % po 7 dneh in 65 % po 14 dneh, se preskus šteje za 
neveljavnega.
 
VII.3.3  Poro čanje 
Glej 1.8.  
VII.4 PODATKOVNI LIST 
V nadaljevanju je predstavljen primer podatkovnega lista.  
PRESKUS M.I.T.I. (I) 
1. LABORATORIJ  
2. DATUM ZA ČETKA PRESKUSA  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1016
 
3. PRESKUSNA SNOV  
Ime: 
Koncentracija osnovne raztopine: ... mg/l kot snov Začetna koncentracija v mediju, C
 o : ... mg/l kot snov 
Volumen reakcijske zmesi, V: .. ml TPK: ... mg O
 2 /l 
4. INOKULUM  
Mesta vzor čenja blata: 
1) … 6) … 
2) … 7) … 3) … 8) … 
4) … 9) … 
5) … 10) … 
Koncentracija neraztopljenih trdnih snovi v aktivnem blatu po 
aklimatizaciji s sinteti čnim blatom = ... mg/l 
Volumen aktivnega blata na liter kon čnega medija = ... ml 
Koncentracija blata v kon čnem mediju = ... mg/l
 
5. SPREJEM KISIKA: BIORAZGRADLJIVOST  
Vrsta uporabljenega respirometra:  
Čas (dan) 
0 7 14 21 28  
Spr. O  2 (mg) 
preskusna snov a 1 
a 2 
a 3 
Spr. O  2 (mg) slepi 
vzorec b 
Popravljeni spr. 
O 2 (mg) (a 1 – b) 
(a 2 – b  1 ) 
(a 3 – b  1 ) 
BPK na mg 
preskusne snovi ða Ä bÞ 
C o V Steklenica 1 
Steklenica 2 Steklenica 3 
% razgradnje
 
BOD 
ThOD Ü 100 1 
2 3 
srednja 
vrednost (
 1 ) 
( 1 ) Srednje vrednosti ne ra čunamo, če je razlika med panovitvanna zelo velika.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1017
 
Opomba: Za referen čno, snov se lahko uporabi padobna oblika.  
6. ANALIZA OGLIJIKA  (neobvezno) : 
Analizator ogljika:  
Steklenica DOC % odstranjenega 
DOC Srednja vrednost 
Izmerjeni Popravljeni  
Voda + preskusna snov a — — 
Blato + preskusna snov b  1 b 1 – c 
Blato + preskusna snov b  2 b 2 – c 
Blato + preskusna snov b  3 b 3 – c 
Slepi kontrolni vzorec c — — —  
% odstranjenega DOC :  a Ä ðb Ä cÞ 
a Ü 100 
7. PODATKI SPECIFI ČNE KEMI ČNE ANALIZE  
Kabčina ostamka preskusne snovi ob 
koncu preskusa % razgradnje  
Slepi preskus z vodo S  b 
Inokulirani medij S a1 
S a2 
S a3 
% razgradnje ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
Izračunamo % razgradnje za steklenice a  1 , a 2 , a 3 . 
8. OPOMBE  
Priložiti je treba krivuljo BPK v odvisnosti od časa, če je na 
voljo.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1018
 
DODATEK 1  
OKRAJŠAVE IN OPREDELITEV POJMOV  
DO: Raztopljeni kisik (mg/l) je koncentracija kisika, raztopljenega v vodnem 
vzorcu (dissolved oxygen). 
BPK: Biokemijska potreba po kisiku (g) je koli čina kisika, ki ga porabijo 
mikroorganizmi pri presnavljanju preskusne snovi; izražena tudi v g sprejetega kisika na g preskusne snovi. (Glej metodo C.5). 
KPK: Kemijska potreba po kisiku (g) je koli čina kisika, porabljenega pri 
oksidaciji preskusne snovi z vro čim, kislim dikromatom; predstavlja 
mero koli čine prisotne oksidirajo če snovi; izražena tudi 
v g porabljenega kisika na g preskusne snovi. (Glej metodo C.6). 
DOC: Raztopljeni organski ogljik (dissolved organic carbon) je organski 
ogljik, ki je prisoten v raztopini ali gre skozi 0,45-mikrometrski filter 
ali ostane v supernatantu po 15-minutnem centrifugiranju pri 
40 000 m.s
 -2 (±4 000 g). 
TPK: Teoreti čna potreba po kisiku (mg) je skupna koli čina kisika, potrebna 
za popolno oksidacijo snovi; izra čuna se iz molekulske formule (glej 
Dodatek 2.2) in se izrazi tudi v mg kisika, potrebnega za mg preskusne snovi. 
TCO
 2 : Teoreti čni ogljikov dioksid (mg) je koli čina ogljikovega dioksida, izra ­ 
čunana iz znane ali izmerjene vsebnosti ogljika v preskusni snovi, ki se 
proizvede ob popolni mineralizaciji snovi; izražena tudi v mg ogljiko ­
vega dioksida, razvitega na mg preskusne snovi. 
TOC: Skupni organski ogljik vzorca je vsota organskega ogljika v raztopini in 
suspenziji (total organic carbon). 
IC: Anorganski ogljik (inorganic carbon). TC: Skupni ogljik je vsota organskega in anorganskega ogljika v vzorcu 
(total carbon).
 
Primarna biorazgradnja:  
je sprememba kemi čne strukture snovi, ki jo povzro či biološko delovanje, zaradi 
česar snov zgubi posebne lastnosti.  
Popolna biorazgradnja (aerobna):  
je raven biorazgradnje, ki se doseže, ko mikroorganizmi povsem porabijo 
preskusno snov, pri čemer nastane ogljikov dioksid, voda, mineralne soli in 
nove mikrobne celi čne sestavine (biomasa).  
Dobro biorazgradljivo:  
je arbitrarna razvrstitev snovi, ki so prestale nekatere specifi čne presejalne 
preskuse za popolno biorazgradljivost; ker so ti preskusi dovolj strogi, se pred ­
postavlja, da se bodo take snovi v vodnem okolju in aerobnih pogojih hitro in 
povsem biorazgradile.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1019
 
Inherentno biorazgradljivo:  
razvrstitev snovi, za katere obstajajo nedvoumni dokazi o biorazgradljivosti (pri ­
marni ali popolni) iz katerega koli priznanega preskusa biorazgradljivosti.  
Možnost čiščenja:  
je voljnost snovi za odstranitev med biološkim čiščenjem odpadnih vod, ne da bi 
to škodovalo normalnemu delovanju čistilnih procesov. Na splošno se dobro 
biorazgradljive snovi lahko čistijo, ne pa tudi vse inherentno biorazgradljive 
snovi. Lahko delujejo tudi abiotski procesi.  
Čas prilagajanja (lag faza):  
je pri preskusu upadanja čas, ki prete če od inokulacije do razgradnje najmanj 
10 %. Čas prilagajanja je pogosto zelo spremenljiv in slabo obnovljiv.  
Čas razgradnje:  
je čas od konca časa prilagajanja do trenutka, ko se doseže 90 % najve čje ravni 
razgradnje.  
10-dnevno okno:  
je obdobje 10 dni, ki se za čne takoj, ko se doseže 10-odstotna razgradnja.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1020
 
DODATEK 2  
IZRAČUN IN DOLO ČITEV PRIMERNIH ZBIRNIH PARAMETROV  
Odvisno od izbrane metode bodo potrebni nekateri zbirni parametri. 
V naslednjem oddelku je opisana izpeljava teh vrednosti. Uporaba teh parametrov je opisana v posameznih metodah.
 
1. Vsebnost ogljika  
Vsebnost ogljika se izra čuna iz znane ali z elementarno analizo dolo čene 
elementarne sestave preskusne snovi.  
2. Teoreti čna potreba po kisiku (TPK)  
Teoretična potreba po kisiku (TPK) se lahko izra čuna, če je znana ali je 
bila z elementarno analizo dolo čena elementarna sestava. Za spojino: 
C c H h Cl cl N n Na na O o P p S s 
brez nitrifikacije je 
ThOD  NH4 ¼ 16 ½2 c þ 1=2ðh Ä cl Ä 3 nÞ þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
MW mg=mg 
ali z nitrifikacijo 
ThOD  NO3 ¼ 16 ½2 c þ 1=2ðh Ä clÞ þ 5=2 n þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
MW mg=mg 
3. Kemijska potreba po kisiku (KPK)  
Kemijska potreba po kisiku (KPK) se dolo či po metodi C.6.  
4. Raztopljeni organski ogljik (DOC)  
Raztopljeni organski ogljik (DOC) je po opredelitvi organski ogljik katere 
koli snovi ali zmesi v vodi, ki gre skozi 0,45-mikrometrski filter. 
Iz preskusnih posod vzamemo vzorce in jih takoj filtriramo v filtrirni 
napravi z uporabo ustreznega membranskega filtra. Prvih 20 ml (kadar 
uporabimo majhen filter, se ta koli čina lahko zmanjša) filtrata zavržemo. 
Za analizo ogljika obdržimo 10–20 ml, kadar injiciramo, lahko tudi manj (volumen odvisen od koli čine, potrebne za analizator ogljika). Koncentra ­
cija DOC se dolo či z analizatorjem organskega ogljika, ki lahko to čno 
izmeri koncentracijo ogljika, enakovredno ali manjšo od 10 % za četne 
koncentracije DOC v preskusu. 
Filtrirane vzorce, ki jih ne moremo analizirati isti dan, lahko konzerviramo 
tako, da jih shranimo v hladilniku pri temperaturi 2–4
 o C za 48 h ali pod 
–18  o C za dlje časa. 
Opombe:  
Membranski filtri so pogosto impregnirani s površinsko aktivnimi snovmi, 
da postanejo hidrofilni. Tak filter lahko vsebuje ve č mg topnega organ ­
skega ogljika, ki moti dolo čanje biorazgradljivosti. Površinsko aktivne 
snovi in druge topne organske spojine se s filtrov odstranijo tako, da se filtri trikrat po eno uro kuhajo v vreli deionizirani vodi. Filtri se nato lahko shranijo v vodi za en teden. Če se uporabijo filtrirni vložki za enkratno 
uporabo, je treba vsako serijo preveriti, ali ne sproš ča topnega organskega 
ogljika.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1021
 
Odvisno od vrste membranskega filtra se lahko nanj adsorbira preskusna 
snov. Zato je priporo čljivo zagotoviti, da se preskusna snov ne zadrži na 
filtru. 
Namesto filtracije se za dolo čanje razlike med TOC in DOC uporabi 15- 
minutno centrifugiranje pri 40 000 m sec  -2 (4 000 g). Metoda ni zanesljiva 
pri začetni koncentraciji < 10 mg DOC/l, saj se bodisi ne odstranijo vse 
bakterije bodisi se ogljik kot del bakterijske plazme ponovno raztopi.  
LITERATURA  
— (1) Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th 
ed, Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen Demand, 
1965, str. 65. 
— (2) Wagner, R., Von Wasser, 1976, vol. 46,139. — (3) DIN-Entwurf 38409 Teil 41 Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, 
Abwasser- und Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs- und Stoffkenngrö βen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauerstoff ­
bedarfs (CSB) (H 41), Normenausschu β Wasserwesen (NAW) in DIN 
Deutsches Institut für Normung e. V. 
— (4) Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphere, 1984, vol 13 (1), 169.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1022
 
DODATEK 3  
VREDNOTENJE BIORAZGRADLJIVOSTI SLABO TOPNIH SNOVI  
Pri preskusih biorazgradljivosti s slabo topnimi snovmi, je treba posebno pozor ­
nost posvetiti naslednjim vidikom. 
Homogene teko čine bodo redko povzro čale težave pri vzor čenju, trdne materiale 
pa je priporo čljivo homogenizirati z ustreznimi sredstvi, da se prepre čijo napake 
zaradi nehomogenosti. Posebej previdni moramo biti, kadar potrebujemo repre ­
zentativne vzorce nekaj miligramov zmesi snovi ali snovi z veliko vsebnostjo nečistot. 
Lahko se uporabijo razli čni načini mešanja med preskusom. Biti moramo 
previdni, da mešanje ravno zadostuje za dispergiranje snovi, ne povzro či pa 
pregrevanja, prekomernega penjenja in prekomernih strižnih sil. 
Lahko se uporabi emulgator, ki daje stabilne disperzije snovi. Ne sme biti strupen 
za bakterije in ne sme se biorazgraditi ali povzro čiti penjenja v pogojih preskusa. 
Za topila veljajo enaka merila, kakor za emulgatorje. Ni priporo čljivo uporabljati trdnih nosilcev za trdne preskusne snovi, so pa lahko 
primerni za oljaste snovi. 
Kadar se uporabijo pomožne snovi, kot so emulgatorji, topila in nosilci, je treba 
izvesti preskus na slepem vzorcu, ki vsebuje pomožno snov. 
Za preučevanje biorazgradljivosti slabo topnih snovi se lahko uporabi kateri koli 
od treh respirometri čnih preskusov: CO
 2 , BPK, MITI.  
LITERATURA  
— de Morsier, A. et al., Biodegradation tests for poorly soluble compounds. 
Chemosphere, 1987, vol. 16, 833. 
— Gerike, P., The Biodegradability testing of poorly water soluble compounds. 
Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1023
 
DODATEK 4  
VREDNOTENJE BIORAZGRADLJIVOSTI SNOVI, ZA KATERE SE 
SUMI, DA SO STRUPENE ZA INOKULUM  
Kadar se na snovi opravi preskus dobre biorazgradljivosti in je videti, da snov ni 
biorazgradljiva, se priporo ča naslednji postopek, če je treba razlikovati med 
inhibicijo in inertnostjo (Reynolds et al., 1987). 
Za preskuse strupenosti in biorazgradljivosti je treba uporabiti podobne ali enake 
inokulume. 
Za oceno strupenosti snovi, preu čevanih v preskusih biorazgradljivosti, se zdi 
primerno uporabiti eno od metod inhibicije stopnje respiracije blata (preskus inhibicije respiracije aktivnega blata – Direktiva 88/302/EGS), BPK in/ali 
metod inhibicije rasti oziroma kombinacijo teh metod. 
Če je treba prepre čiti inhibicijo zaradi strupenosti, je priporo čljivo pri presku ­ 
šanju dobre biorazgradljivosti uporabiti koncentracije preskusne snovi, ki so manjše od 1/10 vrednosti EC
 50 (ali manjše od vrednosti EC  20 ), dobljenih pri 
preskušanju strupenosti. Snovi z vrednostjo EC  50 nad 300 mg/l, verjetno ne 
bodo imele strupenega u činka pri preskušanju dobre biorazgradljivosti. 
Vrednosti EC  50 , manjše od 20 mg/l, bodo verjetno predstavljale resen problem 
pri nadaljnjem preskušanju. Treba je uporabiti majhne koncentracije preskusne snovi ter posledi čno uporabiti strog in ob čutljiv preskus z zaprto steklenico ali 
material, ozna čen s
 14 C. Po drugi strani lahko aklimatiziran inokulum omogo či 
uporabo ve čjih koncentracij preskusne snovi. Vendar se v tem drugem primeru 
izgubi specifi čno merilo preskusa dobre biorazgradljivosti.  
LITERATURA  
(1) Reynolds, L. et al., Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for 
biodegradability. Chemosphere, 1987, vol. 16, 2259.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1024
 
DODATEK 5  
POPRAVEK SPREJEMA KISIKA ZARADI VPLIVA NITRIFIKACIJE  
Napake zaradi neupoštevanja nitrifikacije pri dolo čanju biorazgradljivosti 
z merjenjem sprejema kisika so pri preskusnih snoveh, ki ne vsebujejo N, zanemarljive (najve č 5 %), tudi če se oksidacija amonijskega dušika kdaj 
pa kdaj pojavlja v preskusnih posodah in tistih s slepim vzorcem. Lahko pa 
nastanejo resne napake, kadar preskusna snov vsebuje N. 
Če je prišlo do nitrifikacije, ki pa ni popolna, se opaženi sprejem kisika 
v reakcijski zmesi lahko popravi za koli čino kisika, porabljenega za oksidacijo 
amoniaka do nitrita in nitrata, če se dolo čijo spremembe koncentracije nitrita in 
nitrata med inkubacijo, z upoštevanjem naslednjih ena čb: 
2 NH
 4 Cl + 3O  2 = 2 HNO  2 + 2 HCI + 2 H  2 O (1) 
2 HNO  2 + O  2 = 2 HNO  3 (2) 
Torej: 2 NH
 4 Cl + 4 O  2 = 2 HNO  3 + 2 HCl + 2 H  2 O (3) 
Po enačbi (1) je koli čina kisika, ki jo 28 g dušika v amonijevem kloridu (NH  4 Cl) 
porabi pri oksidaciji do nitrita, enaka 96 g, faktor je torej 3,43 (96/28). Po ena čbi 
(3) pa je koli čina kisika, ki jo porabi 28 g dušika pri oksidaciji do nitrata, enaka 
128 g, kar pomeni faktor 4,57 (128/28). 
Ker sta reakciji zaporedni, saj potekata v lo čenih in razli čnih bakterijskih vrstah, 
se koncentracija nitrita lahko pove ča ali zmanjša; v drugem primeru se bo proiz ­
vedla ekvivalentna koncentracija nitrata. Koli čina kisika, porabljenega pri tvorbi 
nitrata, je torej 4,57 pomnoženo s pove čanjem koncentracije nitrata, medtem ko 
je količina kisika, povezana z nastajanjem nitrita, enaka 3,43 pomnoženo 
s povečanjem koncentracije nitrita oziroma pri zmanjšanju koncentracije nitrita 
je izguba kisika enaka -3,43 pomnoženo s zmanjšanjem koncentracije. 
To je: 
O 2 , porabljen pri tvorbi nitrata = 4,57 × pove čanje koncentracije 
nitrata (4) 
in 
O 2 , porabljen pri tvorbi nitrita = 3,43 × pove čanje koncentracije 
nitrita (5) 
in 
O 2 , izgubljen pri izginjanju nitrita = -3,43 × zmanjšanje koncen ­
tracije nitrata (6) 
Tako da je 
sprejem O  2 zaradi nitrifikacije = ±3,43 × sprememba konc. 
nitrita +4,57 × pove čanje (7) konc. nitrata (7) 
in 
O 2 sprejem zaradi oksidacije C = celotni opaženi sprejem – 
sprejem zaradi nitrifikacije (8) 
Če se dolo či le skupni oksidirani N, se lahko za prvi približek šteje, da je 
sprejem kisika zaradi nitrifikacije enak 4,57 × pove čanje oksidiranega N. 
Popravljena vrednost porabe kisika zaradi oksidacije C se primerja s TPK NH  3 , 
kakor se izra čuna v Dodatku 2.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1025
 
C.5 RAZGRADNJA – BIOKEMIJSKA POTREBA PO KISIKU  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Namen te metode je izmeriti biokemijsko potrebo po kisiku (BPK) 
trdnih ali teko čih organskih snovi. 
Podatki, pridobljeni s tem preskusom, se nanašajo na vodotopne 
snovi; lahko pa se, vsaj na čeloma, preskušajo tudi hlapne snovi in 
tiste, slabo topne v vodi. 
Ta metoda se uporablja samo za tiste organske preskusne snovi, ki 
ne zavirajo bakterij pri koncentraciji, uporabljeni pri preskusu. Če 
preskusna snov ni topna pri preskusni koncentraciji, bodo morda 
potrebni posebni ukrepi, kot je uporaba ultrazvo čnega dispergiranja, 
da se doseže dobra disperzija preskusne snovi. 
Podatki o strupenosti snovi so lahko uporabni za razlago nizkih 
rezultatov in za izbiro primernih preskusnih koncentracij.  
1.2 OPREDELITVE IN ENOTE 
BPK je opredeljen kot masa raztopljenega kisika, potrebna za bioke ­
mijsko oksidacijo dolo čenega volumna raztopine snovi pod predpisa ­
nimi pogoji. 
Rezultati se izrazijo v gramih BPK na gram preskusne snovi.  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Zaželena je uporaba ustrezne referen čne snovi za preverjanje aktiv ­
nosti inokuluma.  
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Vnaprej dolo čena količina snovi, raztopljene ali dispergirane v dobro 
prezračenem primernem mediju, se inokulira z mikroorganizmi in 
inkubira v temi pri konstantni dolo čeni temperaturi okolja. 
BPK se dolo či iz razlike v vsebnosti raztopljenega kisika na za četku 
in na koncu preskusa. Preskus mora trajati najmanj pet dni in najve č 
28 dni. 
Vzporedno je treba opraviti slepi preskus z vzorcem brez preskusne 
snovi.  
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Določitev BPK se ne šteje za veljavno dolo čitev biorazgradljivosti 
snovi. Ta preskus se lahko upošteva le kot presejalni preskus.  
1.6 OPIS POSKUSNE METODE 
Pripravi se predhodna raztopina ali disperzija snovi, tako da se dobi 
koncentracija BPK, ki je združljiva z uporabljeno metodo. Nato se 
določi BPK po kateri koli ustrezni nacionalni ali mednarodni stan ­
dardizirani metodi.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1026
 
2. PODATKI IN OCENA  
BPK v predhodni raztopini se izra čuna po izbrani normirani metodi 
in pretvori v grame BPK na gram preskusne snovi.  
3. PORO ČANJE  
Navede se uporabljena metoda. 
Biokemijska potreba po kisiku mora biti srednja vrednost najmanj 
treh veljavnih meritev. 
Poročati je treba o vseh informacijah in opombah, pomembnih za 
razlago rezultatov, zlasti glede ne čistot, agregatnega stanja, strupenih 
učinkov in notranje sestave snovi, ki bi lahko vplivale na rezultate. 
Poročati je treba o uporabi dodatka za zaviranje biološke nitrifika ­
cije. 
4. VIRI  
Seznam standardiziranih metod, na primer: 
(1) NF T 90 – 103: Determination of the biochemical oxygen 
demand. 
(2) NBN 407: Biochemical oxygen demand. (3) NEN 3235 5.4: Bepaling van het biochemish zuurstofverbruik 
(BZV). 
(4) The determination of biochemical oxygen demand, Methods for 
the examination of water and associated materials, HMSO, 
London. 
(5) ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after 
n days.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1027
 
C.6 RAZGRADNJA – KEMIJSKA POTREBA PO KISIKU  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Namen te metode je izmeriti kemijsko potrebo po kisiku (KPK) 
trdnih ali teko čih organskih snovi na standardni na čin, pod dolo če­
nimi laboratorijskimi pogoji. 
Za izvedbo tega preskusa in razlago dobljenih rezultatov bodo 
uporabne informacije o formuli snovi (npr. halogenidi, železove soli organskih spojin, organoklorove spojine).
 
1.2 OPREDELITVE IN ENOTE 
Kemijska potreba po kisiku je mera oksidacije snovi, izražena kot 
količina kisika ekvivalentna koli čini oksidacijskega reagenta, ki jo 
porabi snov pod dolo čenimi laboratorijskimi pogoji. 
Rezultat se izrazi v gramih KPK na gram preskusne snovi.  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Referenčnih snovi ni treba uporabiti vsakokrat, ko se preu čuje nova 
snov. Predvsem naj bi se uporabljale za ob časno umerjanje metode 
in za omogo čanje primerjave rezultatov pri uporabi druge metode.  
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Vnaprej dolo čena količina snovi, raztopljene ali dispergirane v vodi, 
se dve uri oksidira s kalijevim dikromatom v mediju s koncentrirano 
žveplovo kislino in s srebrovim sulfatom kot katalizatorjem pod 
povratnim hladilnikom. Ostanek dikromata se dolo či s titracijo 
s standardiziranim železo-amonijevim sulfatom. 
Pri snoveh, ki vsebujejo klor, se doda živosrebrov sulfat (  1 ) da se 
zmanjšanja motnja zaradi klorida.  
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Zaradi arbitrarnega na čina določanja je KPK „indikator oksidacije“ 
in se kot tak uporablja kot prakti čni način merjenja organskih snovi. 
Klorid lahko moti ta preskus; dolo čanje KPK lahko motijo tudi 
anorganski reducenti ali oksidanti. 
Nekatere cikli čne spojine in mnoge hlapne spojine (npr. nižje maš č­
obne kisline) se pri tem preskusu ne oksidirajo popolnoma.  
1.6 OPIS PRESKUSNE METODE 
Pripravi se predhodna raztopina ali disperzija snovi, tako da se dobi 
KPK med 250 in 600 mg na liter.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1028  
( 1 ) Po uporabi je treba raztopine, ki vsebujejo živosrebrove soli, primerno obdelati, da se 
prepreči sproščanje živega srebra v okolje.
 Opombe:  
Pri snoveh, ki so slabo topne ali se jih ne da dispergirati, se lahko 
zatehta koli čina fino uprašene snovi ali teko če snovi, ki ustreza 
približno 5 mg KPK, in se da v preskusno aparaturo z vodo. 
Pogosto, zlasti pri slabo topnih snoveh, je kemijsko potrebo po 
kisiku (KPK) bolj primerno dolo čiti po razli čici metode, 
t.j. v zaprtem sistemu z napravo za izravnavo tlaka 
(H. Kelkenberg, 1975). S to prilagojeno metodo se pogosto lahko 
uspešno kvantitativno dolo čijo snovi, ki se s konvencionalno metodo 
le stežka dolo čijo – npr. ocetna kislina. Vendar je v primeru piridina 
tudi ta metoda neuspešna. Če se koncentracija kalijevega dikromata, 
predpisana v viru (1), pove ča na 0,25 N (0,0416 M), se lažje nepo ­
sredno zatehta 5–10 mg snovi, kar je bistveno za dolo čanje KPK 
slabo topnih snovi (vir (2)). 
V drugih primerih se nato dolo či KPK po kateri koli ustrezni nacio ­
nalni ali mednarodni standardizirani metodi.  
2. PODATKI IN OCENA  
KPK v preskusni bu čki se izra čuna po izbrani normirani metodi in 
pretvori v grame KPK na gram preskusne snovi.  
3. PORO ČANJE  
Treba je navesti uporabljeno referen čno metodo. 
Kemijska potreba po kisiku mora biti srednja vrednost najmanj treh 
meritev. Poro čati je treba o vseh informacijah in opombah, 
pomembnih za razlago rezultatov, zlasti glede ne čistot, agregatnega 
stanja in notranjih lastnosti snovi ( če so znane), ki bi lahko vplivale 
na rezultate. 
Treba je poro čati o uporabi živosrebrovega sulfata za zmanjšanje 
motnje zaradi klorida.  
4. VIRI  
(1) Kelkenberg, H.,Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, 
vol. 8, 146. 
(2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169. 
Seznam standardiziranih metod, na primer: 
NBN T 91–201 Determination of the chemical oxygen 
demand. 
ISBN O 11 7512494 Chemical oxygen demand (dichromate 
value) of polluted and waste waters. 
NF T 90–101 Determination of the chemical oxygen demand. DS 217 = water analysis Determination of the chemical 
oxygen demand. 
DIN 38409-H-41 Determination of the chemical oxygen 
demand (COD) within the range above 15 mg per litre. 
NEN 3235 5.3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik. 
ISO 6060 Water quality: chemical oxygen demand dichro ­
mate methods.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1029
 
C.7 RAZGRADNJA – ABIOTSKA RAZGRADNJA: HIDROLIZA KOT 
FUNKCIJA pH  
1. METODA  
Ta preskusna metoda je enakovredna OECD TG 111 (2004).  
1.1 UVOD 
Kemikalije lahko vstopijo v površinske vode z neposrednim vnosom, 
razpršenjem, razlitjem, odtekanjem, odlaganjem odpadkov, odpad ­
nimi vodami iz industrije, gospodinjstev in kmetijstva ter odlaganjem 
iz atmosfere. V teh vodah se lahko pretvorijo s kemijskimi (npr. 
hidrolizo, oksidacijo), fotokemijskimi in/ali mikrobnimi procesi. V tej smernici je opisana laboratorijska preskusna metoda za dolo ­ 
čevanje abiotskih hidrolitskih pretvorb kemikalij v vodnih sistemih 
pri vrednostih pH, ki so v tem okolju obi čajne (pH 4–9). Ta smer ­
nica temelji na obstoje čih smernicah (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). 
S poskusi se dolo či (i) hitrost hidrolize preskusne snovi kot funkcijo 
pH ter (ii) identiteta ali narava in stopnje nastajanja ali razpada 
produktov hidrolize, ki so jim lahko izpostavljeni organizmi. Te študije so lahko potrebne za kemikalije, ki se neposredno vnašajo v vode, ali kemikalije, za katere je verjetno, da lahko vstopijo 
v okolje po drugih poteh, ki so opisane zgoraj.
 
1.2 OPREDELITVE IN ENOTE 
Glej Dodatek 2.  
1.3 UPORABA METODE 
Metoda je splošno uporabna za kemijske snovi (ozna čene ali neozna ­ 
čene), za katere je na voljo analitska metoda z zadostno natan čnostjo 
in občutljivostjo. Uporabna je za rahlo hlapne in nehlapne spojine, ki 
so zadostno topne v vodi. Preskus se ne uporablja za kemikalije, ki 
so zelo hlapne iz vode (npr. fumigante, organska topila) in jih ni 
mogoče zadržati v raztopini v poskusnih pogojih tega preskusa. 
Preskus je težko izvesti s snovmi, ki so slabo topne v vodi (8).  
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Sterilne vodne pufrske raztopine z razli čnimi vrednostmi pH (pH 4, 
7 in 9) se obdelajo s preskusno snovjo in inkubirajo v temi 
v nadzorovanih laboratorijskih pogojih (pri konstantnih temperatu ­
rah). Po ustreznih časovnih intervalih se na pufrskih raztopinah 
izvede analiza za preskusno snov in produkte hidrolize. Če je 
preskusna snov ozna čena (npr. s  14 C), je lažje dolo čiti masno ravno ­
vesje. 
Ta preskusna metoda je zasnovana kot stopenjski pristop, ki je 
prikazan in razložen v Dodatku 1. Rezultat vsake stopnje sproži 
naslednjo stopnjo.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1030
 
1.5 PODATKI O PRESKUSNI SNOVI 
Za določevanje hitrosti hidrolize se lahko uporabijo neozna čena ali 
označena preskusna snov. Ozna čene snovi je na splošno bolje upora ­
biti za preu čevanje poti hidrolize in za dolo čevanje ravnovesja mase, 
vendar v posebnih primerih ozna čevanje ni absolutno potrebno. 
Priporočljivo je ozna čevanje s  14 C, vendar se lahko uporabljajo 
tudi drugi izotopi, npr.  13 C, 15 N, 3 H. Če je možno, se ozna či(-jo) 
najbolj stabilen(-lni) del(-i) molekule. Če npr. preskusna snov 
vsebuje en obro č, je treba ozna čiti ta obro č; če preskusna snov 
vsebuje dva ali ve č obročev, pa se lahko opravijo lo čene študije 
za ugotavljanje usode vsakega ozna čenega obro ča in za pridobivanje 
ustreznih podatkov o tvorbi produktov hidrolize. Čistost preskusne 
snovi mora biti najmanj 95 %. 
Pred izvedbo preskusa hidrolize morajo biti na voljo naslednji 
podatki o preskusni snovi: 
(a) topnost v vodi [Preskusna metoda A.6]; 
(b) topnost v organskih topilih; 
(c) parni tlak [Preskusna metoda A.4] in/ali konstanta Henryjevega 
zakona; 
(d) porazdelitveni koeficient n-oktanol/voda [Preskusna metoda A.8]; 
(e) konstanta disociacije (pKa) [Smernica OECD 112] (9); 
(f) hitrost neposredne in posredne fototransformacij e v vodi, kadar 
j e primerno. 
Na voljo morajo biti analitske metode za števil čno vrednotenje 
preskusne snovi ter če je ustrezno za identifikacijo in števil čno vred­
notenje produktov hidrolize v vodnih raztopinah (glej tudi oddelek 1.7.2).
 
1.6 REFEREN ČNE SNOVI 
Po možnosti je treba uporabiti referen čne snovi za identifikacijo in 
številčno vrednotenje produktov hidrolize s spektroskopskimi in 
kromatografskimi metodami ali drugimi ustrezno ob čutljivimi meto ­
dami.  
1.7 MERILA KAKOVOSTI  
1.7.1  Analitski izkoristek  
Analiza najmanj dvojnika pufrskih raztopin ali njihovih ekstraktov 
neposredno po dodatku preskusne snovi ponuja prve kazalce pono ­
vljivosti analitske metode in enakomernosti uporabe postopka za 
preskusno snov. Izra čun analitskih izkoristkov v kasnejših stopnjah 
poskusov omogo čajo ustrezna masna ravnovesja ( če se uporabi ozna ­ 
čena snov). Analitski izkoristki morajo biti v obmo čju 90 % do 
110 % za ozna čene in neozna čene kemikalije (7). Če je doseganje 
tega obmo čja tehnično zahtevno, je sprejemljiv analitski izkoristek 
70 % za neozna čene kemikalije, vendar je za to potrebna utemeljitev.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1031
 
1.7.2  Ponovljivost in ob čutljivost analitske metode  
Ponovljivost analitskih metod, uporabljenih za števil čno vrednotenje 
preskusne snovi in produktov hidrolize, je v kasnejših stopnjah možno preveriti z analizo istih pufrskih raztopin (ali njihovih 
ekstraktov) v dvojniku potem, ko je koli čina produktov hidrolize 
dovolj velika za števil čno vrednotenje. 
Analitska metoda mora biti zadostno ob čutljiva za števil čno vredno ­
tenje koncentracij preskusne snovi do 10 % ali manj za četne koncen ­
tracije. Če je ustrezno, morajo biti analitske metode tudi zadostno 
občutljive za števil čno vrednotenje produktov hidrolize v 10 % ali 
več uporabljene koncentracije (kadar koli v študiji) vse do 25 % ali 
manj najvišje koncentracije.
 
1.7.3  Intervali zaupanja za podatke kinetike hidrolize  
Intervale zaupanja je treba izra čunati in predstaviti za vse regresijske 
koeficiente, konstante hitrosti, razpolovne dobe in druge parametre kinetike (npr. DT
 50 ). 
1.8 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.8.1  Oprema in aparatura  
Studijo je treba izvesti v steklenih posodah (npr. epruvetah ali 
majhnih bu čkah) v temi in sterilnih pogojih, če je potrebno, razen 
če predhodni podatki (npr. porazdelitveni koeficient n-oktanol/voda) 
pokažejo, da se preskusna snov lahko veže na steklo. V teh primerih je morda treba preu čiti uporabo alternativnih materialov (npr. teflon). 
Problem vezave na steklo je možno zmanjšati na enega ali ve č 
naslednjih na činov: 
— določitev mase preskusne snovi in produktov hidrolize, vezanih 
na preskusno posodo, 
— uporaba ultrazvo čne kopeli, 
— spiranje vse steklovine s topili ob vsakem vzor čenju, 
— uporaba formuliranih proizvodov, — uporaba ve čjih količin sotopil pri dodajanju preskusne snovi 
v sistem; če se uporablja sotopilo, mora biti takšno, da ne 
povzroči hidrolize preskusne snovi. 
Običajno so za inkubacijo razli čnih preskusnih raztopin potrebne 
temperaturno nadzorovane stresalne vodne kopeli ali termostatsko 
nadzorovani inkubatorji. 
Potrebna je obi čajna laboratorijska oprema, zlasti naslednja oprema 
— pH-meter,
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1032
 
— analitski instrumenti, kot so oprema za GC, HPLC in TLC, 
vključno z ustreznimi sistemi detekcije za analizo radioaktivno 
označenih in neozna čenih snovi ali metodo obratnega red čenja 
izotopov, 
— instrumenti za identifikacijo (npr. MS, GC-MS, HPLC-MS, 
NMR itn.), 
— tekočinski scintilacijski števec, 
— separacijski liji za teko činsko-teko činsko ekstrakcijo, 
— instrumenti za koncentracijo raztopin in ekstraktov (npr. rota ­
cijski evaporator), 
— naprava za nadzorovanje temperature (npr. vodna kopel). Kemijski reagenti so med drugim npr: — organska topila analitske čistosti, npr. heksan, diklorometan itn., 
— scintilacijska teko čina, 
— pufrske raztopine (glej oddelek 1.8.3 za podrobnosti). Vso steklovino, analitsko čisto vodo in pufrske raztopine, upora ­
bljene v preskusu hidrolize, je treba sterilizirati.
 
1.8.2  Uporaba preskusne snovi  
Preskusna snov se vnese v obliki vodne raztopine v razli čne pufrske 
raztopine (glej Dodatek 3). Če je potrebno za zadostno raztapljanje, 
je za uporabo in porazdelitev preskusne snovi dovoljena uporaba 
majhnih koli čin topil, ki se mešajo z vodo (npr. acetonitril, aceton, 
etanol), vendar ne smejo presegati 1 % v/v. Če je treba uporabiti 
višje koncentracije (npr. pri slabo topnih preskusnih snoveh), se to dovoli le, kadar je mogo če dokazati, da topilo ne vpliva na hidrolizo 
preskusnih snovi. 
Rutinska uporaba formuliranih proizvodov ni priporo čljiva, saj ni možno 
izključiti vpliva sestavin formule na hidrolizo. Vendar je uporaba formu ­
liranih snovi ustrezna alternativa pri slabo vodotopnih preskusnih snoveh ali snoveh, ki se vežejo na steklo (glej oddelek 1.8.1). 
Uporabiti se sme ena koncentracija preskusne snovi; pri čemer njena 
koncentracija ne sme prese či 0,01 M ali polovice koncentracije nasi ­ 
čenosti (glej Dodatek 1).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1033
 
1.8.3  Pufrske raztopine  
Preskus hidrolize je treba opraviti pri vrednostih pH 4, 7 in 9. Za ta 
namen je treba pripraviti pufrske raztopine iz kemikalij in vode analitske čistosti. Nekaj uporabnih pufrskih sistemov je navedenih 
v Dodatku 3. Upoštevati je treba, da lahko uporabljeni pufrski sistem 
vpliva na hitrost hidrolize, zato je v teh primerih treba uporabiti drug pufrski sistem (
 1 ). 
Vrednost pH vsake pufrske raztopine je treba preveriti s kalibriranim 
pH-metrom z natan čnostjo najmanj 0,1 pri zahtevani temperaturi.  
1.8.4  Preskusni pogoji  
1.8.4.1  Preskusna temperatura  
Poskuse hidrolize je treba izvajati pri konstantnih temperaturah. 
Zaradi ekstrapolacije je pomembno, da se temperatura vzdržuje 
v mejah vsaj ±0,5  o C. 
Če hidrolitsko obnašanje preskusne snovi ni znano, je treba opraviti 
predhodni poskus (Stopnja 1) pri temperaturi 50  o C. Preskusi kine ­
tike v višjih stopnjah se izvajajo pri najmanj treh temperaturah 
(vključno s preskusom pri 50  o C), razen če je bila v preskusih 
Stopnje 1 ugotovljena odpornost preskusne snovi proti hidrolizi. Predlagano temperaturno obmo čje je 10–70
 o C (po možnosti 
z najmanj eno temperaturo pod 25  o C), kar zajema poro čevalno 
temperaturo 25  o C in večino temperatur, ki jih sre čamo na terenu.  
1.8.4.2  Svetloba in kisik  
Vse preskuse hidrolize je treba izvesti z ustrezno metodo, da se 
preprečijo fotolitski u činki. Izvesti je treba vse ustrezne ukrepe, da 
se prepre či dostop kisika (npr. 5-minutno vpihavanje mehur čkov 
helija, dušika ali argona pred pripravo raztopine).  
1.8.4.3  Trajanje preskusa  
Predhodni poskus mora trajati 5 dni, preskusi višjih stopenj pa se 
izvajajo, dokler se ne hidrolizira 90 % preskusne snovi ali 30 dni (do česar pride prej).
 
1.8.5  Izvedba preskusa  
1.8.5.1  Predhodni preskus (Stopnja 1)  
Predhodni poskus se izvede pri 50 ±0,5  o C in vrednostih pH 4,0, 7,0 
in 9,0. Če je hidroliza dolo čena po 5 dneh (t  0,5 25  o C > 1 leto) manj 
kot 10-odstotna, se šteje, da je preskusna snov hidrolitsko stabilna in običajno ni potrebno dodatno preskušanje. Če je znano, da je snov 
nestabilna pri za okolje ustreznih temperaturah (
 2 ), ni potreben pred ­
hodni preskus. Analitska metoda mora biti dovolj natan čna in občut­
ljiva za ugotavljanje 10-odstotnega zmanjšanja za četne koncentracije 
preskusne snovi.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1034  
( 1 ) Mabey in Mill priporo čata boratne ali acetatne pufre namesto fosfatnih (11). 
( 2 ) Ti podatki lahko izvirajo iz drugih virov, kot so podatki o hidrolizi strukturno podobnih 
spojin iz literature ali drugih predhodnih polkvantitativnih preskusov hidrolize 
s preskusno snovjo z zgodnejše stopnje razvoja.
 1.8.5.2  Hidroliza nestabilnih snovi (Stopnja 2)  
Preskus višje stopnje (napredni preskus) je treba opraviti pri vredno ­
stih pH, pri katerih je bilo v predhodnem poskusu ugotovljeno, da je preskusna snov nestabilna. Pufrske raztopine preskusne snovi je treba 
termostatirati pri izbranih temperaturah. Za preskušanje obnašanja 
prvega reda, je treba vsako reakcijsko raztopino analizirati v časovnih intervalih, ki dajo najmanj šest podatkov meritev 
v ustreznih razmikih med 10- in 90-odstotno hidrolizo preskusne 
snovi. Posamezne ponovitve preskusnih vzorcev (najmanj duplikatni 
vzorci v lo čenih reakcijskih posodah) je treba odstraniti in vsebino 
analizirati ob vsakem od najmanj šestih vzor čenj (za najmanj 
dvanajst podatkovnih to čk s ponovitvami). Uporaba enega skupnega 
vzorca, iz katerega se jemljejo posamezni alikvoti preskusne razto ­
pine v vsakem intervalu vzor čenja, se šteje kot nezadostna, saj ne 
dopušča analize variabilnosti podatkov in lahko povzro či težave 
zaradi kontaminacije preskusne raztopine. Ob koncu preskusa višjih 
stopenj je treba opraviti preskuse potrditve sterilnosti (t.j. po 90- odstotni hidrolizi ali po 30 dneh). Če pa ni ugotovljena razgradnja 
(t.j. pretvorba), se šteje, da preskusi sterilnosti niso potrebni.
 
1.8.5.3  Identifikacija produktov hidrolize (Stopnja 3)  
Z ustreznimi analitskimi metodami je treba identificirati vse pogla ­
vitne produkte hidrolize, vsaj tiste ki znašajo > 10 % uporabljenega odmerka.
 
1.8.5.4  Izbirni preskusi  
Pri hidrolitsko nestabilni preskusni snovi je morda treba opraviti 
dodatne preskuse pri pH vrednostih, ki so razli čne od 4, 7 in 
9. Npr. za fiziološke namene je morda treba opraviti preskus 
v bolj kislih pogojih (npr. pH 1,2) in pri eni sami fiziološko ustrezni temperaturi (37
 o C). 
2. PODATKI  
Če je ustrezno, je treba koli čino preskusne snovi in produktov hidro ­
lize navajati v % uporabljene za četne koncentracije in, kadar je 
primerno, v mg/L za vsako vzor čenje in vsako vrednost pH in 
preskusno temperaturo. Če je bila uporabljena ozna čena preskusna 
snov, je treba navesti tudi masno ravnovesje v odstotkih uporabljene 
začetne koncentracije. 
Narisati je treba grafi čno predstavitev logaritemsko pretvorjenih 
koncentracij preskusne snovi v odvisnosti od časa. Opredeliti je 
treba vse ve čje produkte hidrolize, vsaj tiste, ki so > 10 % upora ­
bljenega odmerka, in izrisati logaritemsko pretvorjene koncentracije 
teh snovi na enak na čin kot za izhodiš čno snov, da so prikazane 
njihove hitrosti nastajanja in izginjanja.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1035
 
2.1 OBDELAVA REZULTATOV 
Z uporabo ustreznega kineti čnega modela je treba natan čneje dolo čiti 
razpolovne dobe ali vrednosti DT  50 . Razpolovno dobo in/ali vred ­
nosti DT  50 (vključno z intervali zaupanja) je treba navesti za vsak 
pH in temperaturo skupaj z opisom uporabljenega modela, redom 
kinetike in koeficientom dolo čitve (r  2 ). Kadar je to primerno, je treba 
izračune opraviti tudi za produkte hidrolize. 
V primeru študij hitrosti, opravljenih pri razli čnih temperaturah, je 
treba konstante psevdoprvega reda (k  obs ) opisati kot funkcije tempe ­
rature. Izra čun mora temeljiti tako na lo čitvi k  obs v konstanti hitrosti 
za kislinsko katalizirano (k  H ), nevtralno (k  neutral  ) in bazično katalizi ­
rano hidrolizo (K  OH ) kot na Arrheniusovi ena čbi: 
k obs ¼ k H ½H þ â þ k neutral þ k OH ½OH Ä â ¼ Σ 
i ¼ H;neutral ;OH A i e ÄB i=T 
pri čemer je A  i oziroma B  i regresijska konstanta iz preseka oziroma 
naklona najbolje prirejenih premic, k  i nastanejo pri linearni regresiji 
ln ki v odvisnosti od obratne vrednosti absolutne temperature v kelvinih (T). Z Arrheniusovimi odvisnostmi za kislinsko, nevtralno 
in bazično katalizirano hidrolizo se lahko izra čunajo konstante 
hitrosti psevdoprvega reda in s tem razpolovne dobe za druge tempe ­
rature, pri katerih neposrednega dolo čevanja konstante hitrosti 
v poskusu ni možno izvesti (10).
 
2.2 VREDNOTENJE IN RAZLAGA REZULTATOV 
Večina hidrolitskih reakcij navidezno sledi konstantam prvega reda 
in so zato razpolovne dobe neodvisne od koncentracije (glej ena čbo 
4 v Dodatku 2). To obi čajno dovoljuje uporabo laboratorijskih rezul ­
tatov dolo čenih pri 10  -2 do 10  -3 M na okoljske pogoje (< 10  -6 
M) (10). Mabey in Mill (11) sta navedla ve č primerov dobrega 
ujemanja med hitrostmi hidrolize, izmerjenimi v čistih in naravnih 
vodah za razli čne kemikalije, pod pogojem, da sta bila izmerjena pH 
in temperatura.  
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preskusu mora vsebovati najmanj naslednje podatke: 
Preskusna snov: 
— splošno ime, kemijsko ime, številka CAS, strukturna formula 
(v kateri je naveden položaj ozna čevalca, če je bila uporabljena 
radioaktivno ozna čena snov) in zadevne fizikalno-kemijske last ­
nosti (glej to čko 1.5), 
— čistost (ne čistoče) preskušene snovi, 
— čistost ozna čevalca ozna čene kemikalije in molarna aktivnost 
(kadar je primerno).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1036
 
— Pufrske raztopine: 
— datum in podrobnosti priprave, — uporabljeni pufri in vode, 
— molarnost in pH pufrskih raztopin. 
Preskusni pogoji: — datumi izvedbe študij, 
— količina uporabljene preskusne snovi, 
— metode in topila (vrsta in koli čina), uporabljene pri uporabi 
preskusne snovi, 
— inkubirani volumen puferirane preskusne snovi, — opis uporabljenega inkubacij skega sistema, 
— pH in temperatura med študijo, 
— časi vzorčenja, 
— metoda(-e) ekstrakcije, 
— metode za števil čno vrednotenje in identifikacijo preskusne 
snovi ter njenih produktov hidrolize v pufrskih raztopinah, 
— število ponovitev. Rezultati: 
— ponovljivost in ob čutljivost uporabljene analitske metode, 
— analitski izkoristki (odstotne vrednosti za veljavnost raziskave so 
navedene v to čki 1.7.1), 
— podatki za ponovitve in povpre čne vrednosti v tabeli, 
— masno ravnotežje med študijo in pri koncu študije ( če je bila 
uporabljena ozna čena preskusna snov), 
— rezultati predhodnega preskusa, 
— razprava o rezultatih in interpretacija rezultatov, 
— vsi izvirni podatki in slike. Naslednji podatki so potrebni le pri dolo čevanju hitrosti hidrolize: 
— grafi koncentracij v odvisnosti od časa za preskusne snovi in, 
kadar je primerno, za produkte hidrolize pri vsaki vrednosti pH 
in temperaturi, 
— tabele rezultatov Arrheniusove ena čbe za temperaturo 
20
 o C/25  o C s pH, hitrostno konstanto [h  -1 ali dan  -1 ], razpolovno 
dobo ali DT  50 , temperaturami [  o C] in intervali zaupanja ter 
koeficienti korelacije (r  2 ) ali primerljivimi podatki, 
— predlagane poti hidrolize.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1037
 
4. LITERATURA  
(1) OECD (1981). Hydrolysis as a Function of pH. OECD Guide ­
line for Testing of ChemicalsNr. 111, adopted 12 May 1981. 
(2) US-Environmental Protection Agency (1982). 40 CFR 
796.3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25  o C. Pesticide 
Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environ ­
mental Fate. 
(3) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate 
Guidelines for registration of pesticides in Canada. 
(4) European Union (EU) (1995). Commission Directive 95/36/EC 
amending Council Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market. Annex V: Fate and Behaviour in the Environment. 
(5) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1991). 
Application for registration of a pesticide. Section 
G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air. 
(6) BBA (1980). Merkblatt Nr. 55, Teil I und II: Prüfung des 
Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser 
(October 1980). 
(7) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed. 
(8) OECD (2000). Guidance document on aquatic toxicity testing 
of difficult substances and mixtures, OECD Environmental 
Health and Safety Publications Series on Testing and Asses ­
sment Nr. 23. 
(9) OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994-2000): Addenda 6–11 to Guidelines for the 
Testing of Chemicals. 
(10) Nelson, H, Laskowski D, Thermes S, and Hendley P. (1997) 
Recommended changes in pesticide fate study guidelines for improving input to computer models. (Text version of oral presentation at the 14
 th Annual Meeting of the Society of 
Environmental Toxicology and Chemistry, Dallas TX, 
November 1993). 
(11) Mabey, W. and Mill, T. (1978). Critical review of hydrolysis 
of organic compounds in water under environmental condi ­
tions. J. Phys. Chem. Ref. Data 7, 383–415.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1038
 
DODATEK 1  
Stopenjski preskus hidrolize
  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1039
 
DODATEK 2  
Opredelitve in enote  
V vseh primerih je treba uporabiti  standardne mednarodne enote (SI). 
Preskusna snov:  vsaka snov, ki je lahko izhodiš čna spojina ali ustrezen produkt 
pretvorbe.  
Produkt pretvorbe:  vse snovi, ki nastanejo zaradi biotskih ali abiotskih pret ­
vorbenih reakcij preskusne snovi.  
Produkti hidrolize:  vse snovi, ki nastanejo zaradi hidrolitskih pretvorbenih 
reakcij preskusne snovi.  
Hidroliza  je reakcija preskusne snovi RX z vodo, pri kateri je v reakcijskem 
središču prišlo do neto zamenjave skupine X z OH: 
RX + HOH → ROH + HX [1] 
Hitrost manjšanja koncentracije RX v tem poenostavljenem postopku opisuje 
hitrost = k [H  2 O] [RX] reakcija drugega reda 
ali 
hitrost = k [RX] reakcija drugega reda 
odvisno od stopnje, ki omejuje hitrost. Ker koli čina vode znatno presega koli čino 
preskusne snovi, se ta vrsta reakcije obi čajno opiše kot reakcija psevdoprvega 
reda, pri kateri konstanto opazovane hitrosti dolo ča razmerje 
k obs = k [H  2 O] [2] 
in se lahko dolo či po enačbi (*)  
k obs ¼ 1 
t ln C o 
C t [3] 
pri čemer je 
t = čas 
in C  0 , C t = koncentraciji snovi (RX) ob času 0 in t. 
Enota te konstante je ( čas) -1 in razpolovna doba ( čas, potreben za reagiranje 50 % 
preskusne snovi) je  
t 0;5 ¼ ln2 
k obs [4] 
Razpolovna doba:  (t 0,5 ) je čas, potreben za 50-odstotno nidrolizo preskusne 
snovi, ce lahko reakcijo opišemo s kinetiko prvega reda: ni odvisna od koncen ­
tracije.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1040  
(*) Če grafična predstavitev logaritemsko pretvorjenih podatkov v odvisnosti od časa ne 
kaže linearne funkcije (izena čene s stopnjo reakcije prvega reda), uporaba ena čbe [3] ni 
ustrezna za dolo čanje konstante hitrosti hidrolize preskusne snovi.
 DT 50 (Čas razpada 50):  je čas, v katerem se koncentracija preskusne snovi 
zniža za 50 %; se razlikuje od razpolovne dobe t  0,5 , če reakcija ne sledi kinetiki 
prvega reda.  
Ocena k pri razli čnih temperaturah  
Kadar je konstanta hitrosti znana za dve temperaturi, lahko konstante hitrosti pri 
drugih hitrostih izra čunamo z Arrheniusovo ena čbo: 
k ¼ A Ü e Ä E 
R Ü T ali lnk ¼ ÄE 
R Ü T þ ln A 
Graf ln k v odvisnosti od l/T je ravna črta z naklonom –E/R 
pri čemer je: 
k = konstanta hitrosti, izmerjena pri razli čnih temperaturah 
E = aktivacijska energija [kJ/mol] T = absolutna temperatura [K] R = plinska konstanta [8,314 J/mol.K] Aktivacijska energija je bila izra čunana z regresijsko analizo ali naslednjo 
enačbo:
 
E ¼ R Ü lnk 2 Ä lnk 1 
1 
T 1 Ä 1 
T 2 Í Î  
pri čemer je: T  2 > T  1 . ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1041
 
DODATEK 3  
Pufrski sistemi  
A. CLARK IN LUBS:  
Pufrske zmesi po CLARKU in LUBSU  ( 1 ) 
Sestava pH  
0,2 N HCl IN 0,2 N KCl PRI 20  o C 
47,5 ml HCl + 25 ml KCl razred č. do 100 ml 1,0 
32,25 ml HCl + 25 ml KCl razred č. do 100 ml 1,2 
20,75 ml HCl + 25 ml KCl razred č. do 100 ml 1,4 
13,15 ml HCl + 25 ml KCl razred č. do 100 ml 1,6 
8,3 ml HCl + 25 ml KCl razred č. do 100 ml 1,8 
5,3 ml HCl + 25 ml KCl razred č. do 100 ml 2,0 
3,35 ml HCl + 25 ml KCl razred č. do 100 ml 2,2  
0,1 M kalijevega biftalata +0,1 N HCl pri 20  o C 
46,70 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalata do 100 ml 2,2 39,60 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalata do 100 ml 2,4 
32,95 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalata do 100 ml 2,6 
26,42 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalata do 100 ml 2,8 20,32 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalata do 100 ml 3,0 
14,70 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalata do 100 ml 3,2 
9,90 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalata do 100 ml 3,4 
5,97 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalata do 100 ml 3,6 
2,63 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalata do 100 ml 3,8  
0,1 M kalijev biftalat +0,1 N NaOH pri 20
 o C 
0,40 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalata do 100 ml 4,0 
3,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalata do 100 ml 4,2 7,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalata do 100 ml 4,4 
12,15 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalata do 100 ml 4,6 
17,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalata do 100 ml 4,8
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1042  
( 1 ) Vrednosti pH v teh tabelah so bile izra čunane iz potencialnih meritev s Sorensenovimi standardnimi ena čbami 
(1909). Ustrezne vrednosti pH so 0,04 enote višje od vrednosti iz preglednice.
 Sestava pH  
23,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalata do 100 ml 5,0 
29,95 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalata do 100 ml 5,2 35,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalata do 100 ml 5,4 39,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalata do 100 ml 5,6 43,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalata do 100 ml 5,8 45,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalata do 100 ml 6,0
 
Pufrske zmesi po CLARKU in LUBSU (nadaljevanje) 
0,1 M monokalijev fosfat +0,1 N NaOH pri 20  o C 
5,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfata do 100 ml 6,0 8,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfata do 100 ml 6,2 
12,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfata do 100 ml 6,4 17,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfata do 100 ml 6,6 23,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfata do 100 ml 6,8 29,63 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfata do 100 ml 7,0 35,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfata do 100 ml 7,2 
39,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfata do 100 ml 7,4 
42,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfata do 100 ml 7,6 45,20 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfata do 100 ml 7,8 46,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfata do 100 ml 8,0  
0,1 M H
 3 BO  3 v 0,1 M KCl +0,1 N NaOH pri 20  o C 
2,61 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borove kisline do 100 ml 7,8 3,97 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borove kisline do 100 ml 8,0 5,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borove kisline do 100 ml 8,2 
8,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borove kisline do 100 ml 8,4 
12,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borove kisline do 100 ml 8,6 16,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borove kisline do 100 ml 8,8 21,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borove kisline do 100 ml 9,0 26,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borove kisline do 100 ml 9,2
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1043
 
32,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borove kisline do 100 ml 9,4 
36,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borove kisline do 100 ml 9,6 40,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borove kisline do 100 ml 9,8 
43,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borove kisline do 100 ml 10,0
 
B. KOLTHOFF IN VLEESCHHOUWER:  
Citratni pufri po KOLTHOFFU in VLEESCHHOUWERJU  
Sestava pH  
0,1 M monokalijev citrat in 0,1 N HCl pri 18  o C (*) 
49,7 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrata do 100 ml 2,2 
43,4 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrata do 100 ml 2,4 
36,8 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrata do 100 ml 2,6 30,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrata do 100 ml 2,8 23,6 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrata do 100 ml 3,0 
17,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrata do 100 ml 3,2 
10,7 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrata do 100 ml 3,4 
4,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrata do 100 ml 3,6  
0,1 M monokalijev citrat in 0,1 N NaOH pri 18
 o C (*) 
2,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrata do 100 ml 3,8 
9,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrata do 100 ml 4,0 
16,3 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrata do 100 ml 4,2 23,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrata do 100 ml 4,4 31,5 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrata do 100 ml 4,6 
39,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrata do 100 ml 4,8 
46,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrata do 100 ml 5,0 54,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrata do 100 ml 5,2 61,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrata do 100 ml 5,4 68,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrata do 100 ml 5,6 
74,4 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrata do 100 ml 5,8 
81,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrata do 100 ml 6,0
 
(*) ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1044  
(*) Dodati droben kristal timola ali podobne snovi, da se prepre či rast plesni.
 C. SÖRENSEN:  
Zmesi borata po SÖRENSENU  
Sestava Sörensen 
18 o C Walbum, pH pri 
ml boraksa ml HCl/NaOH 10  o C 40  o C 70  o C 
0,05 M boraks +0,1 N HCl  
5,25 4,75 7,62 7,64 7,55 7,47 
5,50 4,50 7,94 7,98 7,86 7,76 
5,75 4,25 8,14 8,17 8,06 7,95 
6,00 4,00 8,29 8,32 8,19 8,08 6,50 3,50 8,51 8,54 8,40 8,28 7,00 3,00 8,08 8,72 8,56 8,40 7,50 2,50 8,80 8,84 8,67 8,50 
8,00 2,00 8,91 8,96 8,77 8,59 
8,50 1,50 9,01 9,06 8,86 8,67 9,00 1,00 9,09 9,14 8,94 8,74 9,50 0,50 9,17 9,22 9,01 8,80 
10,00 0,00 9,24 9,30 9,08 8,86  
0,05 M boraks +0,1 N NaOH  
10,0 0,0 9,24 9,30 9,08 8,86 
9,0 1,0 9,36 9,42 9,18 8,94 8,0 2,0 9,50 9,57 9,30 9,02 7,0 3,0 9,68 9,76 9,44 9,12 6,0 4,0 9,97 10,06 9,67 9,28
 
Zmesi fosfata po SÖRENSEN-u  
Sestava pH  
0,0667 M monokalijev fosfat + 0,0667 M dinatrijev fosfat pri 20  o C 
99,2 ml. KH  2 PO 4 + 0,8 ml Na  2 HPO  4 5,0 
98,4 ml. KH  2 PO 4 + 1,6 ml Na  2 HPO  4 5,2 
97,3 ml. KH  2 PO 4 + 2,7 ml Na  2 HPO  4 5,4 
95,5 ml. KH  2 PO 4 + 4,5 ml Na  2 HPO  4 5,6 
92,8 ml. KH  2 PO 4 + 7,2 ml Na  2 HPO  4 5,8 
88,9 ml. KH  2 PO 4 + 11,1 ml Na  2 HPO  4 6,0 
83,0 ml. KH  2 PO 4 + 17,0 ml Na  2 HPO  4 6,2 
75,4 ml. KH  2 PO 4 + 24,6 ml Na  2 HPO  4 6,4 
65,3 ml. KH  2 PO 4 + 34,7 ml Na  2 HPO  4 6,6 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1045
 
53,4 ml. KH  2 PO 4 + 46,6 ml Na  2 HPO  4 6,8 
41,3 ml. KH  2 PO 4 + 58,7 ml Na  2 HPO  4 7,0 
29,6 ml. KH  2 PO 4 + 70,4 ml Na  2 HPO  4 7,2 
19,7 ml. KH  2 PO 4 + 80,3 ml Na  2 HPO  4 7,4 
12,8 ml. KH  2 PO 4 + 87,2 ml Na  2 HPO  4 7,6 
7,4 ml. KH  2 PO 4 + 92,6 ml Na  2 HPO  4 7,8 
3,7 ml. KH  2 PO 4 + 96,3 ml Na  2 HPO  4 8,0 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1046
 
C.8 STRUPENOST ZA DEŽEVNIKE  
PRESKUS NA UMETNIH TLEH  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Pri tem laboratorijskem preskusu se preskusna snov doda umetnim 
tlem, v katera se dajo deževniki za 14 dni. Po tem obdobju (in poljubno po sedmih dneh), se pregleda smrtni u činek snovi na 
deževnike. Preskus ponuja metodo za relativno kratkotrajen pregled 
učinkov kemikalij na deževnike, po vnosu preko kože ali hrane.
 
1.2 OPREDELITEV POJMOV IN ENOTA 
LC 50 : Koncentracija snovi, za katero se ocenjuje, da v preskusnem 
obdobju ubije 50 % preskusnih živali.  
1.3 REFEREN ČNA SNOV 
Referenčna snov se uporablja v rednih časovnih presledkih da se 
prikaže, da se ob čutljivost preskusnega sistema ni bistveno spreme ­
nila. 
Kot referen čna snov se priporo ča analitsko čisti kloroacetamid.  
1.4 PRINCIP PRESKUSA 
Tla so spremenljiv medij, zato je treba za ta preskus uporabiti 
natančno opredeljena umetna ilovnata tla. Odrasli deževniki vrste  
Eisenia foetida  (glej opozorilo v Dodatku) se hranijo 
v opredeljenih umetnih tleh tretiranih z razli čnimi koncentracijami 
preskusne snovi. Vsebina posod se raztrese na pladenj 14 dni (ali 
sedem dni) po za četku preskusa ter se preštejejo preživeli deževniki 
pri vsaki koncentraciji.  
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Preskus je zasnovan tako, da je kolikor je mogo če, ponovljiv glede 
na preskusni substrat in organizem. Smrtnost v kontrolah na koncu preskusa ne sme presegati 10 %, sicer je preskus neveljaven.
 
1.6 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.6.1  Materiali  
1.6.1.1 P r e s k u s n i s u b s t r a t 
Kot osnovni preskusni substrat se uporabljajo opredeljena umetna tla. 
(a) Osnovni substrat (odstotki veljajo za suho maso) 
— 10 % šotnega maha ( čim bližje pH 5,5 do 6,0 brez kakršnih 
koli vidnih ostankov rastlin in fino zmlet),  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1047
 
— 20 % gline kaolinit, po možnosti z ve č kot 50 % kaolinita, 
— Približno 69 % industrijskega kremenovega peska (prevladu ­
joči fini pesek z ve č kot 50 % delcev velikosti 0,05 do 
0,2 mm). Če se snov v vodi ne dovolj dispergira, je treba 
imeti na voljo 10 g tega peska na preskusno posodo za 
poznejše mešanje s preskusno snovjo, 
— Približno 1 % kalcijevega karbonata (CaCO  3 ), zdrobljenega 
v prah, kemijsko čistega, ki se ga doda, za zvišanje pH na 
6,0±0,5. 
(b) Preskusni substrat 
Preskusni substrat vsebuje osnovni substrat, preskusno snov in 
deionizirano vodo. 
Vsebnost vode je od 25 do 42 % suhe teže osnovnega substrata. 
Vsebnost vode v substratu se dolo či z izsušitvijo vzorca do 
konstantne teže pri 105  o C. Glavno merilo je, da se umetna tla 
vlaži do to čke, dokler ni stoje če vode. Paziti je treba, da se 
z mešanjem ustvari enakomerna porazdelitev preskusne snovi in substrata. Poro čati je treba o na činu vnosa preskusne snovi 
v substrat. 
(c) Kontrolni substrat 
Kontrolni substrat vsebuje osnovni substrat in vodo. Če je upora ­
bljeno dodatno sredstvo, mora dodatna kontrola vsebovati enako količino tega dodatnega sredstva.
 
1.6.1.2 P r e s k u s n e p o s o d e 
Steklene posode prostornine približno enega litra (ustrezno pokrite 
s plastičnimi pokrovi, posodami ali plasti čnim filmom z luknjami za 
prezračevanje), napolnjeni s koli čino vlažnega preskusnega ali 
kontrolnega substrata, ki ustreza 500 g substrata suhe teže.  
1.6.2  Preskusni pogoji  
Posode je treba hraniti v klimatskih komorah pri temperaturi 20 ± 
2 o C in pod stalno svetlobo. Jakost svetlobe naj bo 400 do 800 
luksov. 
Preskusno obdobje traja 14 dni, smrtnost pa je mogo če oceniti tudi 
sedem dni po za četku preskusa.  
1.6.3  Preskusni postopek  
P r e s k u s n e k o n c e n t r a c i j e 
Koncentracije preskusne snovi se izrazijo kot masa snovi na suho 
maso osnovnega substrata (mg/kg).  
P r e s k u s z a u g o t a v l j a n j e o b m o č j a 
Razpon koncentracij, ki povzro čajo smrtnost od 0 do 100 % se lahko 
določi s preskusom za ugotavljanje obmo čja, da bi dobili podatke 
o razponu koncentracij, ki naj bi se jih uporabilo v kon čnem 
preskusu.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1048
 
Snovi je treba preskusiti pri naslednjih koncentracijah: 1 000; 100; 
10; 1; 0,1 mg snovi/kilogram preskusnega substrata (suha masa). 
Če naj se opravi popoln kon čni preskus, lahko za preskus za ugota ­
vljanje obmo čja zadostuje že ena preskusna serija na koncentracijo in 
ena za netretirano kontrolo, pri čemer vsebuje vsaka 10 deževnikov.  
K o n č n i p r e s k u s 
Rezultati preskusa za ugotavljanje obmo čja se uporabijo, za izbor 
najmanj petih koncentracij v geometrijskem zaporedju, ki povzro čijo 
smrtnost od 0 do 100 % in se lo čijo med sabo za konstanten faktor, 
ki ni večji od 1,8. 
Preskusi, pri katerih se uporablja navedena zaporedja koncentracij, 
naj bi omogo čili čimbolj natan čno določitev vrednost LC  50 in njenih 
mej zaupanja. 
V končnem preskusu se uporabijo najmanj štiri preskusne serije na 
koncentracijo in štiri netretirane kontrole, pri čemer ima vsaka po 10 
deževnikov. Rezultati teh ponovitvenih serij se kažejo kot povpre čje 
in standardna deviacija. 
Kadar dve zaporedni koncentraciji v razmerju 1,8 povzro čita le 0 % 
in 100 % smrtnost, t  i dve vrednosti zadostujeta za dolo čitev razpona, 
znotraj katerega leži LC  50 . 
M e š a n i c a o s n o v n e g a p r e s k u s n e g a s u b s t r a t a i n 
p r e s k u s n e s n o v i 
Preskusni substrat naj bo, kadar je mogo če, pripravljen brez doda ­
janja dodatnih sredstev, razen vode. Tik pred za četkom preskusa se 
emulzija ali disperzija preskusne snovi v deionizirani vodi ali 
drugem topilu zmeša z osnovnim preskusnim substratom ali pa se enakomerno razprši s finim kromatografskim ali drugim podobnim razpršilom. 
Če preskusna snov v vodi ni topna, se lahko raztopi v čim manjši 
količini ustreznega organskega topila (npr. heksan, aceton ali kloro ­
form). 
Za raztapljanje, razpršitev ali emulgiranje preskusne snovi se lahko 
uporabijo samo tista sredstva, ki hitro izhlapijo. Preskusni substrat je 
treba pred uporabo prezra čiti. Količino izparele vode je treba nadok ­
naditi. Kontrola mora vsebovati enako koli čino vsakega dodatnega 
sredstva. 
Če preskusne snovi ni mogo če raztopiti, razpršiti ali emulgirati 
v organskih topilih, se 10 g mešanice fino zdrobljenega kremenovega peska in koli čine preskusne snovi, ki je potrebna za tretiranje 
500 g suhe teže umetnih tal, zmeša s 490 g suhe teže preskusnega 
substrata. 
Za vsako preskusno serijo se koli čina vlažnega preskusnega 
substrata, ki ustreza 500 g suhe teže, postavi v steklene posode, na preskusni substrat pa se položi 10 deževnikov, ki so bili 24 ur 
kondicionirani v podobnem vlažnem osnovnem substratu, nato pa 
hitro oprani in posušeni s pomo čjo v filtrirnega papirja.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1049
 
Posode se pokrijejo s preluknjanimi plasti čnimi pokrovi, posodami 
ali filmom, da se prepre či izsuševanje substrata, nakar se jih za 14 
dni izpostavi preskusnim pogojem. 
Ocene je treba opraviti 14 dni (ali sedem dni) po za četku preskusa. 
Substrat se raztrese na ploš čo iz stekla ali nerjave čega jekla. Pregle ­
dajo se deževniki in dolo či se število preživelih deževnikov. Dežev ­
niki veljajo za mrtve, če se ne odzivajo na nežni mehani čni stimulus 
na sprednjem koncu. 
Kadar se pregled opravi po sedmih dneh, se posode ponovno napol ­
nijo s substratom, preživeli deževniki pa se ponovno položijo na isti 
preskusni substrat.  
1.6.4  Preskusni organizmi  
Preskusni organizmi naj bodo odrasli osebki vrste  Eisenia foetida  
(glej opozorilo v Dodatku) (stari najmanj dva meseca in s klitelumom) 300 do 600 mg mokre teže. (Za metodo razmnože ­
vanja glej Dodatek).
 
2. PODATKI  
2.1 OBDELAVA IN OCENA REZULTATOV 
Koncentracije snovi se poro čajo z navedbo ustreznih odstotkov 
mrtvih deževnikov. 
Kadar so podatki ustrezni, je treba vrednost LC  50 vain meje zaupanja 
(p = 0,05) dolo čiti z uporabo standardnih metod (Litchfield in Wilco ­
xon, 1949, za ustrezno metodo). LC  50 je treba podati kot mg 
preskusne snovi na kilogram preskusnega substrata (suha masa). 
V tistih primerih, kjer je nagib krivulje koncentracij prestrm, da bi 
omogočal izračun LC  50 , zadostuje že grafi čna določitev te vrednosti. 
Kadar dve zaporedni koncentraciji v razmerju 1,8 povzro čita le 0 % 
in 100 % smrtnost, t  i dve vrednosti zadostujeta za dolo čitev razpona, 
znotraj katerega leži LC  50 . 
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Če je mogo če, se v poro čilo o preskusu vklju čijo naslednji podatki: 
— izjava, da je bil preskus opravljen v skladu z zgoraj navedenimi 
merili kakovosti, 
— opravljeni preskus (preskus za ugotavljanje obmo čja in/ali kon čni 
preskus), 
— natančen opis preskusnih pogojev ali izjava, da je bil preskus 
opravljen v skladu z metodo; poro čati je treba o vseh morebitnih 
odstopanj, 
— natančen opis, kako se je preskusno snov vmešalo v osnovni 
preskusni substrat, 
— podatki o preskusnih organizmih (vrsta, starost, srednja vrednost in 
razpon v teži, pogoji vzdrževanja in razmnoževanja, dobavitelj),  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1050
 
— uporabljena metoda za dolo čitev LC  50 , 
— rezultati preskusa vklju čno z vsemi uporabljenimi podatki, 
— opis opaženih simptomov ali vedenjskih sprememb pri 
preskusnih organizmih, 
— smrtnost v kontrolah, — LC
 50 ali najvišja preskusna koncentracija brez smrtnosti in najn ­
ižja preskusna koncentracija s 100 % smrtnostjo, 14 dni (ali sedem dni) po za četku preskusa, 
— prikaz krivulje koncentracija/odziv, 
— rezultati, dobljeni s preskusno snovjo, bodisi v povezavi 
s dotičnim preskusom bodisi iz predhodnih preskusov kontrole 
kakovosti.
 
4. VIRI  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 207, Decision of the 
Council C(81) 30 final. 
(2) Edwards, C. A. in Lofty, J. R., 1977, Biology of Earthworms, 
Chapman and Hall, London, str. 331. 
(3) Bouche, M. B., 1972, Lombriciens de France, Ecologie et Systé ­
matique, Institut National de la Recherche Agronomique, str. 671. 
(4) Litchfield, J. T. in Wilcoxon, F. A simplified method of evalua ­
tion dose effect experiments. J. Pharm. Exp. Therap., zv. 96, 
1949, str. 99. 
(5) Commission of the European Communities, Development of 
a standardized laboratory method for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 
1983. 
(6) Umweltbunden/Biologische Bundesanstalt fur Land- un Forst ­
wirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag „Toxizitatstest am Regenwurm Eisenia foetida in kiinstlichem Boden“, 
v: Rudolph/Boje, Okotoxologie, ecomed, Landsberg, 1986.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1051
 
Dodatek  
Razmnoževanje in vzdrževanje deževnikov pred preskusom  
Za namen razmnoževanja se 30 do 50 odraslih deževnikov postavi v škatlo za 
razmnoževanje s svežim substratom in se odstrani po 14. dneh. Te živali se lahko uporabijo za nadaljnje razmnoževalne serije. Deževniki, ki se izležejo iz kokonov 
se, ko so zreli, uporabijo za preskušanje (pod predpisanimi pogoji po dveh ali 
treh mesecih).
 
Pogoji vzdrževanja in razmnoževanja  
Klimatska komora: temperatura 20 ± 2  o C, po možnosti pod stalno svet ­
lobo (jakost svetlobe 400 do 800 luksov). 
Škatle za razmnoževanje: ustrezne plitve posode prostornine 10 do 20 l. Substrat: Vrsta  Eisenia foetida  se lahko razmnožuje v razli čnih 
živalskih iztrebkih. Kot razmnoževalni medij je priporočljiva uporaba mešanice, ki jo do 50 % po 
prostornini sestavlja šota, 50 % pa kravji ali konjski 
gnoj. pH vrednost medija mora biti 6 do 7 (uravna ­
vano s kalcijevim karbonatom) in z nizko ionsko prevodnostjo (manj kot 6 mmho ali 0,5 % koncen ­
tracije soli). 
Substrat mora biti vlažen, vendar ne preve č moker. 
Poleg zgoraj navedene metode je mogo če uporabiti 
tudi druge uspešne postopke.  
Opomba : Eisenia foetida  obstaja v dveh rasah, ki so ju nekateri taksonomi lo čili 
v vrste (Bouche, 1972). Te so morfološko podobne, vendar so za vrsto  Eisenia 
foetida foetida  značilne prečne črte ali obro či na nekaterih predelih, medtem ko 
druga,  Eisenia foetida andrei,  tega nima in je bolj pisane rde čkaste barve. Kadar 
je mogoče, je treba uporabiti vrsto  Eisenia foetida andrei.  Drugo vrsto je mogo če 
uporabiti, če je na voljo potrebna metodologija.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1052
 
C.9 BIORAZGRADNJA  
ZAHN-WELLENSOV PRESKUS  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Namen te metode je ocena možne kon čne biorazgradljivosti vodo ­
topnih, nehlapljivih organskih snovi, ko so v stati čnem preskusu 
izpostavljene relativno visokim koncentracijam mikroorganizmom. 
Pri tem lahko pride do fizikalno-kemijske adsorbcije na suspendiranih 
trdnih delcih, kar je treba upoštevati pri razlagi rezultatov (glej 3.2). 
Snovi, ki se bodo preu čevale, se uporabijo v koncentracijah, ki 
ustrezajo vrednostim DOC v razponu od 50 do 400 mg/liter, ali 
vrednostim KPK v razponu od 100 do 1 000 mg/liter (DOC = razto ­
pljeni organski ogljik; KPK = kemijska potreba po kisiku). Prednost teh relativno visokih koncentracij je analitska zanesljivost. Spojine 
s strupenimi lastnostmi lahko odložijo ali zavrejo proces razgradnje. 
Pri tej metodi se merjenje koncentracije raztopljenega organskega 
ogljika ali kemijske potrebe po kisiku uporablja za oceno kon čne 
biorazgradljivosti preskusne snovi. 
Istočasna uporaba specifi čne analitske metode lahko omogo či oceno 
primarne biorazgradnje snovi (izginotje mati čne kemijske strukture). 
Metoda se uporablja le za tiste organske preskusne snovi, ki pri 
koncentraciji, uporabljeni v preskusu: 
— so topne v vodi pod preskusnimi pogoji, — imajo zanemarljiv parni tlak pod preskusnimi pogoji, 
— ne zavirajo bakterij, 
— se v preskusnem sistemu adsorbirajo le v omejenih razsežnostih, — se ne izgubijo iz preskusne raztopine s penjenjem. 
Podatki o relativnih deležih glavnih sestavin preskusnega materiala 
bodo uporabni pri razlagi dobljenih rezultatov, zlasti v primerih, kadar so ti rezultati nizki ali zanemarljivi. 
Podatki o strupenosti snovi za mikroorganizme so zaželeni pri razlagi 
nizkih rezultatov in pri izbiranju ustreznih preskusnih koncentracij.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1053
 
1.2 OPREDELITVE POJMOV IN ENOTE 
Obseg razgradljivosti, dosežen na koncu preskusa, se navede kot 
„Biorazgradljivost v Zahn-Wellensovem preskusu“:  
D T ð%Þ ¼ " 
1 Ä ðC T Ä C B Þ 
ðC A Ä C BA Þ # 
Ü 100 
pri čemer je: 
DT = biorazgradnja (%) v času T, 
CA = vrednosti DOC (ali KPK) v preskusni mešanici, izmerjene 
tri ure po za četku preskusa (mg/l) (DOC = raztopljeni 
organski ogljik, KPK = kemijska potreba po kisiku), 
CT = vrednosti DOC ali KPK v preskusni mešanici v času vzor­ 
čenja (mg/l), 
CB = vrednosti DOC ali KPK negativne kontrole v času vzor­ 
čenja (mg/l), 
CBA = vrednosti DOC ali KPK negativne kontrole, izmerjene tri 
ure po za četku preskusa (mg/l). 
Obseg razgradljivosti se zaokroži na najbližji celi odstotek. Odstotek razgradnje se navede kot odstotek odstranitve DOC (ali 
KPK) preskusne snovi. 
Razlika med izmerjeno vrednostjo po treh urah in izra čunano ali, po 
možnosti, izmerjeno za četno vrednostjo lahko da uporabne podatke 
o odstranitvi snovi (glej 3.2, Razlaga rezultatov).
 
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
V nekaterih primerih, kadar se preiskujejo nove snovi, so referen čne 
snovi lahko uporabne; vendar pa posebej dolo čene referen čne snovi 
še ni mogo če priporo čiti. 
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
V eno do štiri litrsko stekleno posodo opremljeno s mešalom in 
prezračevalom se skupaj vnese aktivno blato, mineralne hranilne 
snovi in preskusni material kot edini vir ogljika v vodni raztopini. 
Zmes se meša in prezra čuje pri 20 do 25  o C pod razpršeno svetlobo 
ali v temnem prostoru do 28 dni. Potek razgradnje se spremlja z določanjem vrednosti DOC (ali KPK) v filtrirani raztopini dnevno 
ali v drugih ustreznih rednih časovnih presledkih. Razmerje med 
izločenim DOC (ali KPK) po vsakem časovnem presledku in vred ­
nostjo tri ure po za četku, se prikaže kot odstotek biorazgradnje in 
služi kot merilo obsega razgradnje v tem času. Rezultat se prikaže 
v odvisnosti od časa, da se dobi krivulja biorazgradnje. 
Kadar je uporabljena specifi čna analitska metoda, se lahko izmerijo 
spremembe v koncentraciji mati čne molekule, ki so posledica bioraz ­
gradnje (primarna biorazgradljivost).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1054
 
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Ponovljivost tega preskusa je bila dokazana v krožnem preskusu. 
Občutljivost metode se na splošno dolo či s spremenljivostjo nega ­
tivne kontrole in, v manjši meri, z natan čnostjo s katero je mogo če 
določiti raztopljen organski ogljik in koli čino preskusne spojine 
v raztopini.  
1.6 OPIS PRESKUSNEGA POSTOPKA  
1.6.1  Priprave  
1.6.1.1 R e a g e n t i 
Preskusna voda: pitna voda z vsebnostjo organskega ogljika < 
5 mg/liter. Skupna koncentracija ionov kalcija in magnezija ne 
sme presegati 2,7 mmol/liter, sicer je potrebno ustrezno razred čenje 
z deionizirano ali destilirano vodo. 
Žveplena kislina, analitski reagent (A.R.): 50 g/l 
Raztopina natrijevega hidroksida A.R.: 40 g/l Mineralna hranilna raztopina: raztopiti v enem litru 
deionizirane vode: 
amonijev klorid, NH
 4 Cl, A.R.: 38,5 g 
natrijev dihidrogenfosfat, NaH  2 PO 4 .2H  2 O, A.R.: 33,4 g 
kalijev dihidrogenfosfat, KH  2 PO 4 , A.R.: 8,5 g 
dikalijev monohidrogenfosfat, K  2 HPO  4 , A.R.: 21,75 g 
Zmes služi kot hranilni in pufrski sistem.  
1.6.1.2 N a p r a v e 
Steklene posode s prostornino od enega do štirih litrov (npr. cilin ­
drične posode). 
Mešalec s steklenim ali kovinskim mešalom na primerni ro čici 
(mešalec naj rotira približno 5 do 10 cm nad dnom posode). 
Namesto tega se lahko uporabi magnetno mešalo s 7 do 10 cm 
dolgim telesom. 
Steklena cev notranjega premera 2 do 4 mm za dotok zraka. 
Odprtina cevi naj bo približno 1 cm nad dnom posode. 
Centrifuga (približno 3 550 g). 
Merilec pH vrednosti. 
Merilec raztopljenega kisika. 
Papirni filtri.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1055
 
Naprave za membransko filtracijo. 
Filtrirne membrane z velikostjo por 0,45 μm. Filtrirne membrane so 
primerne, če je zagotovljeno, da ne izpuš čajo ogljika in ne absorbi ­
rajo snovi med filtriranjem. 
Analitska oprema za dolo čanje vsebnosti organskega ogljika in 
kemijske potrebe po kisiku.  
1.6.1.3 P r i p r a v a i n o k u l u m a 
Aktivno blato iz biološke čistilne naprave se spere s (ponavljajo čim) 
centrifugiranjem ali usedanjem v preskusni vodi (zgoraj). 
Aktivno blato mora biti v ustreznem stanju. Takšno blato je na voljo 
v primerno delujo či čistilni napravi odpadnih vod. Da bi dobili čim 
več različnih vrst ali sevov bakterij, je priporo čljivo zmešati inoku ­
lume iz razli čnih virov (npr. razli čne čistilne naprave, ekstrakti tal, 
rečnih vod, itd.). Mešanico je treba tretirati, kot je opisano zgoraj. 
Za preverjanje aktivnosti aktivnega blata glej to čko „Funkcionalni 
nadzor“ spodaj.  
1.6.1.4 P r i p r a v a p r e s k u s n i h r a z t o p i n 
V preskusno posodo dodajte 500 ml preskusne vode, 2,5 ml/liter 
mineralne hranilne raztopine in aktivno blato v koli čini, ki ustreza 
od 0,2 do 1,0 g/liter suhe snovi v kon čni mešanici. Dodajte zadostno 
količino osnovne raztopine preskusne snovi, da bo v kon čni mešanici 
koncentracija DOC od 50 do 400 mg/liter. Ustrezne vrednosti KPK 
so 100 do 1 000 mg/liter. Dopolnite s preskusno vodo do skupne prostornine od enega do štirih litrov. Skupna prostornina, ki jo je treba izbrati, je odvisna od števila vzorcev, ki jih je treba vzeti za 
določitev DOC ali KPK, ter prostornin, potrebnih za analitski posto ­
pek. 
Običajno je zadovoljiva prostornina dveh litrov. Sestavi se najmanj 
ena kontrolna posoda (negativna kontrola), vzporedno z vsako 
preskusno serijo; ta vsebuje samo aktivno blato in mineralno 
hranilno raztopino v preskusni vodi enake skupne prostornine kot v preskusnih posodah.
 
1.6.2  Izvajanje preskusa  
Preskusne posode se premešajo z magnetnimi mešali ali propelerji 
pod razpršeno svetlobo ali v temnem prostoru pri 20 do 25  o C. 
Prezračevanje se doseže s stisnjenim zrakom, po potrebi pre čiščenim 
skozi bombažni filter in, če je potrebno steklenico za pranje. Zago ­
toviti je treba, da se blato ne usede, in da koncentracija kisika ne 
pade pod 2 mg/liter. 
pH vrednost je treba preverjati v rednih časovnih presledkih (npr. 
vsak dan) in po potrebi prilagoditi na pH 7 do 8.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1056
 
Izgube zaradi izhlapevanja se nadomesti tik pred vsakim vzor čenjem 
z deionizirano ali destilirano vodo v zahtevanih koli činah. Dober 
postopek je ozna čevanje nivoja teko čine na posodi pred za četkom 
preskusa. Nove oznake se naredijo po vsakem vzor čenju (brez 
zračenja in mešanja). Prvi vzorci se vedno vzamejo tri ure po 
začetku preskusa, da bi se odkrilo adsorpcijo preskusnega materiala 
v aktivnem blatu. 
Odstranitvi preskusnega materiala se sledi z dolo čitvami DOC in 
KPK, ki se jih opravi vsak dan ali v kakšnem drugem rednem 
časovnem presledku. Vzorci iz preskusne posode ali negativne 
kontrole se prefiltrirajo skozi previdno opran papirni filter. Prvih 5 ml filtrata preskusne snovi se zavrže. Blato, ki ga je težko filtrirati, 
se lahko predhodno odstrani z 10 minutnim centrifugiranjem. Dolo ­ 
čitve DOC in KPK se opravijo najmanj v dvojniku. Preskus poteka 
do 28 dni.  
Opomba : Vzorci, ki ostanejo motni, se prefiltrirajo skozi 
membranske filtre. Membranski filtri ne smejo prepuš čati ali adsor ­
birati nikakršnega organskega materiala.
 
F u n k c i o n a l n i n a d z o r a k t i v n e g a b l a t a 
Posoda, ki vsebuje znano snov, se uporabi vzporedno z vsako 
preskusno serijo, da se preveri funkcionalno zmogljivost aktivnega 
blata. V ta namen velja za uporabnega dietilenglikol.  
P r i l a g o d i t e v 
Če se analize opravijo v relativno kratkih časovnih presledkih (npr. 
vsak dan), je prilagoditev mogo če jasno prepoznati na krivulji 
razgradnje (glej Sliko 2). Preskus naj se zato ne pri čne tik pred 
koncem tedna. 
Če do prilagoditve pride ob koncu tega obdobja, je preskus mogo če 
podaljšati do zaklju čka razgradnje.  
Opomba:  Če je potrebno širše poznavanje vedenja prilagojenega 
blata, se isto aktivno blato še enkrat izpostavi istemu preskusnemu materialu v skladu z naslednjim postopkom: 
Izklopite mešalo in prezra čevalo ter pustite, da se aktivno blato 
usede. Odlijte teko čino supernatanta, napolnite do dveh litrov 
s preskusno vodo, mešajte 15 minut in ponovno pustite, da se usede. Ko ponovno odlijete teko čino supernatanta, uporabite preostalo blato 
za ponovitev preskusa z enakim materialom v skladu z 1.6.1.4 in 
1.6.2 zgoraj. Aktivno blato je namesto s usedanjem mogo če izolirati 
tudi s centrifugiranjem. 
Prilagojeno blato se lahko zmeša s svežim do koncentracije 0,2 do 
1 g suhe teže/liter.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1057
 
A n a l i t s k a s r e d s t v a 
Vzorci se obi čajno filtrirajo skozi previdno opran papirni filter (za 
pranje uporabite deionizirano vodo). 
Vzorci, ki ostanejo motni, se filtrirajo skozi membranske filtre (0,45 μm). 
Koncentracija DOC se dolo či v dvojniku v filtratih vzorcev (prvih 
5 ml se zavrže) s pomo čjo instrumenta za dolo čanje TOC. Če filtrata 
ni mogoče analizirati še isti dan, se ga mora do naslednjega dne 
shraniti v hladilniku. Daljše shranjevanje ni priporo čljivo. 
Koncentracijo KPK se dolo či v filtratih vzorcev z analitskim postop ­
kom, opisanim v viru (2) spodaj.  
2. PODATKI IN OCENA  
Koncentracije DOC in/ali KPK se dolo čijo najmanj v dvojniku na vzor ­
cih, v skladu s 1.6.2 zgoraj. Razgradnja v času T se izra čuna v skladu 
s formulo (z opredelitvami pojmov), podano v to čki 1.2 zgoraj. 
Obseg razgradnje se zaokroži na najbližji celi odstotek. Obseg 
razgradnje, dosežene na koncu preskusa, se opiše kot „Biorazgrad ­
ljivost v Zahn-Wellensovem preskusu“.  
Opomba:  Če je do popolne razgradnje prišlo pred zaklju čkom 
preskusa in je ta rezultat potrjen z drugo analizo, opravljeno 
naslednji dan, se preskus lahko zaklju či. 
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Če je mogo če, se v poro čilo o preskusu vklju čijo naslednji podatki: 
— začetna koncentracija snovi, 
— vsi drugi podatki in rezultati preskusa v zvezi s preskusno 
snovjo, referen čno snovjo, če je uporabljena, in negativno 
kontrola, 
— koncentracija po treh urah, 
— krivulja biorazgradnje z opisom, 
— datum in mesto vzor čenja preskusnih organizmov, status prilago ­
ditve, uporabljena koncentracija, itd., 
— znanstveni razlogi za vsako spremembo preskusnega postopka.  
3.2 RAZLAGA REZULTATOV 
Odstranitev DOC (KPK), ki poteka postopoma nekaj dni ali tednov, 
pomeni, da se preskusna snov biološko razgrajuje.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1058
 
Svojo vlogo pa lahko v nekaterih primerih odigra tudi fizikalno- 
kemijska adsorpcija, to pa se pokaže, kadar gre za celotno ali 
delno odstranitev na samem za četku, v prvih treh urah, razlika 
med kontrolo in preskusnimi supernatantnimi raztopinami pa ostaja na nepričakovano nizki ravni. 
Za razlikovanje med biološko razgrajenostjo (ali delno biološko 
razgrajenostjo) in adsorpcijo je treba opraviti dodatne preskuse, 
To je mogo če opraviti na številne na čine, najprepri čljivejša pa je 
uporaba supernatanta ali blata kot inokuluma v preskusu osnovne zbirke (po možnosti respirometri čni preskus). 
Preskusne snovi, ki v tem preskusu dajo visoko, neadsorptivno 
odstranitev DOC (KPK) je treba šteti za potencialno biorazgradljive. 
Delna, neadsorptivna odstranitev pomeni, da je kemikalija do neke mere podvržena nekakšni biorazgradnji. Nizka ali ni čna odstranitev 
DOC (KPK) lahko pomeni, da preskusna snov zavira mikroorgan ­
izme, to pa je mogo če ugotoviti tudi z lizo in izgubo blata, kar 
povzroča motne supernatante. Preskus je treba ponoviti z uporabo 
nižje koncentracije preskusne snovi. 
Uporaba za spojino zna čilne analitske metode ali preskusne snovi 
s 14C ozna čeno preskusno snovjo lahko omogo či večjo občutljivost. 
V primeru 14C preskusne spojine bo obnovitev 14 CO
 2 potrdila, da 
je prišlo do biorazgradnje. 
Kadar so rezultati podani za primarno biorazgradnjo, je treba, če je 
mogoče, razložiti spremembo kemijske strukture, ki povzro ča zmanj­ 
šanje odziva mati čne preskusne snovi. 
Validacija analitske metode mora biti podana skupaj z opaženim 
odzivom, v preskusnem mediju negativne kontrole.  
4. VIRI  
(1) OECD, Pariz, 1981, Test Guideline 302 B, Decision of the 
Council C(81) 30 final. 
(2) Annex V C.9 Degradation: Chemical Oxygen Demand, Commis ­
sion Directive 84/449/EEC (OJ L 251, 19.9.1984, str. 1).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1059
 
Dodatek  
PRIMER OCENE 
Organska spojina: 4-etoksibenzenska kislina 
Teoretična preskusna koncentracija: 600 mg/l 
Teoretični DOC: 390 mg/l 
Inokulum čistilna naprava odplak 
Koncentracija: 1 gram suhega materiala/liter Status prilagoditve: neprilagojen Analiza: dolo čitev DOC 
Količina vzorca: 3 ml 
Kontrolna snov: dietilenglikol Strupenost spojine: ni strupenih u činkov pod 1 000 mg/l 
uporabljen preskus: preskus s fermentacijskimi 
cevmi
 
Trajanje 
preskusa Kontrolna snov Preskusna snov 
negatίvna 
kontrola 
ROO (  1 ) 
mg/l DOC (  1 ) 
mg/l KPK neto 
mg/l Razgradnja 
% DOC (  1 ) 
mg/l KPK neto 
mg/l Razgradnja 
% 
0 — — 300,0 — — 390,0 — 
3 ure 4,0 298,0 294,0 2 371,6 367,6 6 1 dan 6,1 288,3 282,2 6 373,3 367,2 6 2 dneva 5,0 281,2 276,2 8 360,0 355,0 9 5 dni 6,3 270,5 264,2 12 193,8 187,5 52 
6 dni 7,4 253,3 245,9 18 143,9 136,5 65 
7 dni 11,3 212,5 201,2 33 104,5 93,2 76 8 dni 7,8 142,5 134,7 55 58,9 51,1 87 9 dni 7,0 35,0 28,0 91 18,1 11,1 97 10 dni 18,0 37,0 19,0 94 20,0 2,0 99
 
( 1 ) Srednje vrednosti treh dolo čitev. ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1060
 
Slika 1  
Primeri krivulj biorazgradnje
  
Slika 2  
Primeri prilagoditve blata
  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1061
C.10:  SIMULACIJSKI PRESKUS ZA AEROBNO ČIŠČENJE ODPADNE 
VODE: C.10-A: ENOTE Z AKTIVNIM BLATOM – C.10-B: BIOFILMI  
C.10-A: Enote z aktivnim blatom  
UVOD 
1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 303 
(2001). V petdesetih letih prejšnjega stoletja so spoznali, da na novo uvedene površinsko aktivne snovi povzro čajo čezmerno penjenje v čistilnih 
napravah in rekah. Te snovi z aerobnim čiščenjem niso bile v celoti odstra ­
njene, v nekaterih primerih pa so tudi omejevale odstranjevanje drugih 
organskih snovi. To je sprožilo številne raziskave o tem, kako bi bilo mogoče površinsko aktivne snovi odstraniti iz odpadnih voda in ali se 
nove kemikalije, ki jih proizvaja industrija, pri čiščenju odpadne vode 
odstranijo. Za to so bili uporabljeni modeli enot, ki so predstavljali dve 
glavni vrsti aerobnega biološkega čiščenja odpadne vode (z aktivnim blatom 
in precejanjem). Zelo neprakti čno in drago bi bilo, če bi vsako novo kemi ­
kalijo razširili po velikih čistilnih napravah in jo spremljali pri njih, tudi če 
bi se to izvajalo na lokalni ravni.
 
ZAČETNI PREUDARKI  
Enote z aktivnim blatom  
2. V opisih modelov enot z aktivnim blatom je navedena velikost od 300 ml 
do približno 2 000 ml. Nekateri modeli so bili natan čni posnetki naprav v 
naravni velikosti z usedalniki blata, pri katerih se usedeno blato črpa nazaj v 
prezračevalni bazen, medtem ko so bili drugi brez usedalnikov, npr. 
Swisher (1). Velikost naprave je kompromis; biti mora dovolj velika za uspešno mehansko delovanje in zagotovitev zadostne koli čine vzorcev, ne 
da bi to vplivalo na delovanje, ne sme pa biti tako velika, da bi bilo 
potrebnega preve č prostora in materiala. 
3. Dve obliki naprav, ki se obsežno in zadovoljivo uporabljata, sta Husman ­
nova naprava (2) in naprava s poroznimi posodami (3) (4), ki sta se najprej uporabljali pri preu čevanju površinsko aktivnih snovi in sta opisani v tej 
preskusni metodi. Zadovoljivo so se uporabljale tudi druge, npr. Eckenfel ­
derjeva naprava (5). Zaradi razmeroma visokih stroškov in velikega truda pri uporabi tega simulacijskega preskusa so se vzporedno raziskovali prepro ­
stejši in cenejši presejalni preskusi, ki so zdaj vklju čeni v poglavje C.4, 
A–F, te priloge (6). Izkušnje s številnimi površinsko aktivnimi snovmi in 
drugimi kemikalijami so pokazale, da so se tiste, ki so uspešno opravile presejalne preskuse (dobra biološka razgradljivost), razgradile tudi pri simu ­
lacijskem preskusu. Nekatere od tistih, ki presejalnih preskusov niso 
uspešno opravile, so uspešno opravile preskuse inherentne biološke razgrad ­
ljivosti (poglavji C.12 (7) in C.19 (8) te priloge), vendar so se samo neka ­
tere iz zadnje skupine razgradile pri simulacijskem preskusu, medtem ko se kemikalije, ki niso uspešno opravile preskusov inherentne biološke razgrad ­
ljivosti, pri simulacijskih preskusih niso razgradile (9) (10) (11). 
4. Za nekatere namene zadostujejo simulacijski preskusi, opravljeni na podlagi 
enega samega niza obratovalnih pogojev; rezultati so izraženi kot odstotni 
delež odstranitve preskusne kemikalije ali raztopljenega organskega ogljika (DOC). Tak preskus je opisan v tej preskusni metodi. Vendar v nasprotju s prejšnjo razli čico tega poglavja, v kateri je bila opisana samo 
ena vrsta naprave za čiščenje sinteti čne odpadne vode v sistemu spojenih 
enot, pri katerem se je uporabljala razmeroma preprosta metoda odvajanja
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1062
blata, to besedilo ponuja vrsto razli čnih možnosti. Opisane so razli čne 
možnosti glede na vrsto naprave, na čin delovanja, odpadno vodo in na čin 
odvajanja blata. To besedilo natan čno sledi besedilu standarda ISO 
11733 (12), ki je bil med njegovo pripravo natan čno pregledan, čeprav 
metoda ni bila predmet krožnega testa. 
5. Za druge namene mora biti koncentracija preskusne kemikalije v iztoku 
natančneje znana; za kar pa je potrebna celovitejša metoda. Na primer, 
hitrost odvajanja blata je treba natan čneje kontrolirati ves dan in skozi 
celoten preskus, naprave pa morajo obratovati pri razli čnih hitrostih odva ­
janja blata. Vsestransko celovita metoda zahteva, da se preskusi izvedejo tudi pri dveh ali treh razli čnih temperaturah: tako metodo je opisal Birch 
(13) (14) in je povzeta v Dodatku 6. Vendar sedanje znanje ne zadostuje za 
odločitev, kateri od kineti čnih modelov so uporabni za biološko razgradnjo 
kemikalij pri čiščenju odpadnih voda in v vodnem okolju na splošno. 
Uporaba Monodove kinetike, ki je v Dodatku 6 navedena kot primer, je omejena na kemikalije, katerih koncentracija je vsaj 1 mg/l, vendar je po 
mnenju nekaterih celo to še treba utemeljiti. Preskusi pri koncentracijah, ki 
so bolj podobne tistim iz odpadnih voda, so navedeni v Dodatku 7, vendar so taki preskusi in preskusi v Dodatku 6 vklju čeni v dodatke in niso obrav ­
navani kot lo čene preskusne metode.
 
Filtri  
6. Mnogo manj pozornosti je bilo namenjene modelom precejalnih filtrov, 
morda zato, ker so bolj nerodni in manj kompaktni kot modeli čistilnih 
naprav z aktivnim blatom. Gerike idr. so razvili enote s precejalniki in jih uporabili v sistemu spojenih enot (15). Ti filtri so bili razmeroma veliki 
(višina 2 m; prostornina 60 l), tako da sta bila za vsakega potrebna kar 2 l/h 
odpadne vode. Baumann idr. (16) so precejalne filtre simulirali tako, da so trakove iz poliestrske „volne“ najprej za 30 minut namo čili v koncentrirano 
aktivno blato, nato pa jih vstavili v enometrske cevi (z notranjim premerom 
14 mm). Preskusna kemikalija je bila kot edini vir ogljika v raztopini mine ­
ralnih snovi spuš čena po navpi čni cevi, biološka razgradnja pa je bila 
ocenjena na podlagi meritev DOC v iztoku in CO
 2 v nastalem plinu. 
7. Biofiltri so bili simulirani druga če (15); skozi vrte če se cevi, nagnjene pod 
majhnim kotom glede na vodoravno ploskev, je bila spuš čena odpadna voda 
(približno 250 ml/h) s preskusno kemikalijo in brez nje, v zbranih iztokih pa sta bila analizirana DOC in/ali dolo čena preskusna kemikalija.
 
NAČELO PRESKUSA 
8. Ta metoda je zasnovana za dolo čitev odstranitve ter primarne in/ali kon čne 
biološke razgradnje vodotopnih organskih kemikalij z aerobnimi mikroor ­
ganizmi v kontinuirano delujo čem preskusnem sistemu, ki simulira proces z 
aktivnim blatom. Lahko biološko razgradljiv organski medij in organska 
preskusna kemikalija sta vira ogljika in energije za mikroorganizme. 
9. Dve kontinuirano delujo či preskusni enoti (napravi z aktivnim blatom ali 
porozni posodi) obratujeta vzporedno v enakih pogojih, ki so izbrani glede 
na namen preskusa. Obi čajno je srednji hidravli čni zadrževalni čas 6 h, 
srednja starost blata (zadrževalni čas blata) pa 6 do 10 dni. Blato se odvaja 
po eni od dveh metod, preskusna kemikalija pa se obi čajno doda v koncen ­
traciji 10 mg/l do 20 mg/l raztopljenega organskega ogljika (DOC) v pritok 
(organskemu mediju) ene od enot. Druga enota se uporablja kot kontrolna 
enota za dolo čitev biološke razgradnje organskega medija.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1063
 
10. V pogosto vzetih vzorcih iztokov se s specifi čno analizo dolo či po možnosti 
DOC ali kemijska potreba po kisiku (KPK) ter koncentracija preskusne 
kemikalije (po potrebi) v iztoku iz enote, v katero se dovaja preskusna kemikalija. Domneva se, da razlika med koncentracijama DOC ali KPK v iztoku iz preskusne in kontrolne enote nastane zaradi preskusne kemikalije 
ali njenih organskih metabolitov. Ta razlika se primerja s koncentracijo 
DOC ali KPK v pritoku zaradi dodane preskusne kemikalije, da se ugotovi odstranitev preskusne kemikalije. 
11. Biološko razgradnjo je obi čajno mogo če ločiti od biološke adsorpcije s 
skrbno preu čitvijo časovne krivulje odstranitve in jo je obi čajno mogo če 
potrditi s preskusom dobre biološke razgradljivosti, pri katerem se uporabi aklimatizirani inokulum iz naprave, v katero se dovaja preskusna kemikalija.
 
INFORMACIJE O PRESKUSNI KEMIKALIJI 
12. Za pravilno razlago rezultatov morajo biti znani čistost, vodotopnost, hlap ­
nost in adsorpcijske lastnosti preskusne kemikalije. Hlapnih in netopnih kemikalij obi čajno ni mogo če preskusiti, če se ne sprejmejo posebni previd ­
nostni ukrepi (glej Dodatek 5). Za izra čun teoreti čnih vrednosti in/ali prever ­
janje izmerjenih vrednosti parametrov, npr. teoreti čne potrebe po 
kisiku (TPK), raztopljenega organskega ogljika (DOC) in kemijske potrebe po kisiku (KPK), je treba poznati kemi čno strukturo ali vsaj empiri čno 
formulo. 
13. Informacije o strupenosti preskusne kemikalije za mikroorganizme (glej 
Dodatek 4) so lahko uporabne za izbiro primernih preskusnih koncentracij in so lahko bistvene za pravilno razlago nizkih vrednosti biološke razgrad ­
ljivosti.
 
RAVNI USPEŠNO OPRAVLJENEGA PRESKUSA 
14. Pri prvotni uporabi tega simulacijskega (potrditvenega) preskusa za 
primarno biološko razgradnjo površinsko aktivnih snovi se zahteva ve č 
kot 80-odstotna odstranitev dolo čene kemikalije, preden se lahko površinsko 
aktivna snov da na trg. Če 80-odstotna vrednost ni dosežena, se ta simula ­
cijski (potrditveni) preskus lahko uporabi, površinsko aktivna snov pa se lahko da na trg samo, če je odstranjenih ve č kot 90 % dolo čene kemikalije. 
Pri kemikalijah na splošno ni dvoma o uspešno ali neuspešno opravljenem 
preskusu, dobljena vrednost deleža odstranitve v odstotkih pa se lahko 
uporabi v približnih izra čunih verjetne okoljske koncentracije, ki bo upora ­
bljena pri ocenah nevarnosti, ki jo pomenijo kemikalije. Rezultati navadno sledijo vzorcu vse ali ni č. V vrsti raziskav čistih kemikalij je bilo ugoto ­
vljeno, da je bil delež odstranitve DOC > 90-odstotni pri ve č kot treh 
četrtinah in > 80-odstotni pri ve č kot 90 % kemikalij, ki so pokazale 
kakršno koli zna čilno stopnjo biološke razgradljivosti. 
15. V odpadnih vodah je razmeroma malo kemikalij (npr. površinsko aktivnih 
snovi) prisotnih v koncentracijah (približno 10 mg C/l), uporabljenih pri tem preskusu. Nekatere kemikalije so lahko pri teh koncentracijah zaviralne, medtem ko je lahko kinetika odstranjevanja drugih pri nizkih koncentracijah 
drugačna. Natan čnejša ocena razgradnje bi bila mogo ča s spremenjenimi 
metodami, pri katerih bi se uporabile realno nizke koncentracije preskusne kemikalije, zbrani podatki pa bi se lahko uporabili za izra čun kineti čnih 
konstant. Vendar potrebne poskusne tehnike še niso bile v celoti potrjene 
niti niso bili vzpostavljeni kineti čni modeli, ki opisujejo biološko razgradne 
reakcije (glej Dodatek 7).
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1064
 
REFEREN ČNE KEMIKALIJE 
16. Za zagotovitev pravilnega izvajanja poskusnega postopka je koristno, da se 
hkrati s preu čevanjem preskusnih kemikalij ob časno preskusijo kemikalije, 
katerih obnašanje je znano. Med takimi kemikalijami so adipinska kislina, 2- 
fenilfenol, 1-naftol, difenil-2,2-dikarboksilna kislina in 1-karboksi nafta ­
lenska kislina (9) (10) (11).  
OBNOVLJIVOST REZULTATOV PRESKUSA 
17. O raziskavah simulacijskih preskusov je veliko manj poro čil kot o preskusih 
lahke biološke razgradljivosti. Ponovljivost pri (so časnih) ponovitvah je 
dobra (med 10- in 15-odstotna) pri preskusnih kemikalijah, katerih 
razgradnja je 80- ali ve č odstotna, vendar pa je pri kemikalijah, pri katerih 
razgradnja ni tako dobra, variabilnost ve čja. Prav tako so bili pri nekaterih 
mejnih kemikalijah dobljeni zelo razli čni rezultati (npr. 10 %, 90 %) ob 
različnih časih v obdobju devetih tednov, ki je dopuš čeno za preskus. 
18. Pri rezultatih, pridobljenih z dvema vrstama naprave, so bile razlike majhne, 
vendar pa so se nekatere kemikalije bolj in dosledneje razgrajevale pri 
gospodinjski odpadni vodi kot pri sinteti čni odpadni vodi OECD.  
OPIS PRESKUSNE METODE  
Naprava  
Preskusni sistem  
19. Preskusni sistem za eno preskusno kemikalijo sestavljata preskusna in 
kontrolna enota; če se izvajajo samo specifi čne analize (primarna biološka 
razgradnja), je potrebna samo preskusna enota. Ena kontrolna enota se lahko 
uporablja za ve č preskusnih enot, ki prejemajo enake ali razli čne preskusne 
kemikalije. V primeru sistema spojenih enot (Dodatek 3) mora imeti vsaka preskusna enota svojo kontrolno enoto. Preskusni sistem je lahko model 
čistilne naprave z aktivnim blatom, Husmannova naprava (Dodatek 1, 
slika 1) ali porozna posoda (Dodatek 1, slika 2). V obeh primerih so potrebne dovolj velike posode za shranjevanje pritokov in iztokov ter črpalke za odmerjanje pritoka, bodisi zmešanega z raztopino preskusne 
kemikalije bodisi lo čenega. 
20. Vsako čistilno napravo z aktivnim blatom sestavljata prezra čevalna posoda z 
znano prostornino približno 3 litrov aktivnega blata in usedalnik (sekundarni bistrilnik) s prostornino približno 1,5 litra; prostornini se lahko deloma 
spremenita z nastavitvijo višine usedalnika. Dopustne so posode druga čnih 
velikosti, če delujejo s primerljivimi hidravli čnimi obremenitvami. Če 
temperature v preskusnem prostoru ni mogo če ohranjati v želenem razponu, 
se priporo ča uporaba posod z vodnim plaš čem z nadzorovano temperaturo. 
Za recikliranje aktivnega blata iz usedalnika v prezra čevalno posodo, bodisi 
kontinuirano bodisi v rednih presledkih, se uporablja črpalka „airlift“ ali 
dozirna črpalka. 
21. Sistem poroznih posod je sestavljen iz notranjega poroznega valja s stož ča­
stim dnom, ki stoji v nekoliko ve čji posodi enake oblike, narejeni iz nepre ­
pustnega plasti čnega materiala. Primeren material za porozno posodo je 
porozni polietilen z najve čjo velikostjo por 90 μm in debelino 2 mm. 
Blato se iz obdelanega organskega medija se lo čuje z diferencialnim 
prehodom skozi porozno steno. Iztoki se zbirajo v krožnem prostoru, od 
koder se prelivajo v zbiralnik. Usedanja ni, zato se blato ne vra ča. Celotni 
sistem se lahko namesti v vodno kopel, nadzorovano s termostatom.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1065
 
Porozne posode se zamašijo, zato lahko v za četnih fazah pride do razlivanja. 
V takem primeru je treba porozni vložek zamenjati s čistim, pri čemer se 
blato najprej iz črpa iz posode v čisto vedro, nato pa se odstrani zamašeni 
vložek. Ko je neprepustni zunanji valj o čiščen, se vstavi čist vložek, blato 
pa se vrne v posodo. Prav tako je treba skrbno postrgati in prenesti blato, ki 
se je prijelo ob straneh zamašenega vložka. Zamašene posode se najprej 
očistijo s tankim curkom vode, da se odstrani preostalo blato, zatem se 
namočijo v razred čeno raztopino natrijevega hipoklorita in nato v vodo, 
nazadnje pa se temeljito sperejo z vodo. 
22. Za prezra čevanje blata v prezra čevalnih posodah obeh sistemov so potrebne 
primerne tehnike, na primer sintrane kocke (difuzorji) in stisnjen zrak. Zrak 
se po potrebi o čisti tako, da prehaja skozi primeren filter in nato opere. 
Skozi sistem mora prehajati zadostna koli čina zraka, da se vzdržujejo 
aerobni pogoji in da se kosmi blata ves čas preskusa ohranjajo v suspenziji.  
Naprava za filtriranje ali centrifuga  
23. Naprava za filtriranje vzorcev z membranskimi filtri ustrezne poroznosti 
(nazivni premer odprtine 0,45 μm), ki adsorbirajo topne organske kemikalije 
in sprostijo čim manj organskega ogljika. Če se uporabljajo filtri, ki sproš ­ 
čajo organski ogljik, jih je treba skrbno sprati z vro čo vodo, da se odstrani 
izlužljivi organski ogljik. Namesto tega se lahko uporabi centrifuga, ki lahko 
doseže 40 000 m/s  2 . 
Analitska oprema  
24. Naprava, potrebna za dolo čitev: 
— DOC (raztopljenega organskega ogljika) in TOC (celotnega organskega 
ogljika) ali KPK (kemijske potrebe po kisiku), 
— določene kemikalije, če se to zahteva, 
— suspendiranih trdnih snovi, vrednosti pH, koncentracije kisika v vodi, 
— temperature, kislosti in bazi čnosti, 
— amonija, nitrita in nitrata, če se preskus izvaja v nitrifikacijskih pogojih.  
Voda  
25. Vodovodna voda, ki vsebuje manj kot 3 mg/l DOC. Če bazičnost še ni 
znana, jo je treba dolo čiti. 
26. Deionizirana voda, ki vsebuje manj kot 2 mg/l DOC.  
Organski medij  
27. Kot organski medij so dovoljene sinteti čne odpadne vode, gospodinjske 
odpadne vode ali oboje. Izkazalo se je (11) (14), da je pri uporabi samo gospodinjske odpadne vode delež odstranitve DOC pogosto ve čji ter da celo 
omogoča odstranitev in biološko razgradnjo nekaterih kemikalij, ki se 
biološko ne razgradijo, kadar se uporabi sinteti čna odpadna voda OECD. 
Prav tako stalno ali ob časno dodajanje gospodinjske odpadne vode pogosto 
stabilizira aktivno blato, vklju čno z bistveno zmožnostjo dobrega usedanja. 
Zato se priporo ča uporaba gospodinjske odpadne vode. Koncentracijo DOC 
ali KPK je treba izmeriti v vsaki novi šarži organskega medija. Poznati je treba njegovo kislost ali bazi čnost. Pri nizki kislosti ali bazi čnosti mu je 
morda treba dodati primeren pufer (natrijev hidrogen karbonat ali kalijev 
dihidrogen fosfat), da se med preskusom vrednost pH v prezra čevalni posodi 
ohranja pri približno 7,5 ± 0,5. O koli čini puferja, ki jo je treba dodati, in 
času, ko ga je treba dodati, je treba odlo čiti v vsakem primeru posebej. 
Kadar se bodisi redno bodisi ob časno uporabljajo zmesi, je treba ohranjati 
približno konstantno vrednost DOC (ali KPK) v zmesi, npr. z red čenjem z 
vodo.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1066
 
Sintetična odpadna voda  
28. V vsakem litru vodovodne vode je treba raztopiti: 160 mg peptona; 110 mg 
mesnega ekstrakta; 30 mg se čnine; 28 mg brezvodnega dikalijevega 
hidrogen fosfata (K  2 HPO  4 ); 7 mg natrijevega klorida (NaCl); 4 mg kalcije ­
vega klorid dihidrata (CaCl  2 .2H  2 O) in 2 mg magnezijevega sulfat heptahi ­
drata (Mg  2 SO 4 .7H  2 0). Ta sinteti čna odpadna voda OECD je primer in pred ­
stavlja srednjo koncentracijo DOC v pritoku, ki znaša približno 100 mg/l. Uporabijo se lahko tudi druge sestave s približno enako koncentracijo DOC, 
ki so bolj podobne pravi odpadni vodi. Če je potreben manj koncentriran 
pritok, je treba sinteti čno odpadno vodo razred čiti z vodovodno vodo, na 
primer v razmerju 1 : 1, da nastane koncentracija približno 50 mg/l. Tak 
šibkejši pritok bo omogo čal boljšo rast nitirifikacijskih organizmov, zato je 
treba to spremembo uporabiti pri simulacijskem preskušanju čistilnih naprav 
z nitrifikacijo. Ta sinteti čna odpadna voda se lahko pripravi v destilirani 
vodi v koncentrirani obliki in shranjuje najve č en teden pri približno 1 °C. 
Po potrebi se razred či z vodovodno vodo. (Ta medij je nezadovoljiv, npr. 
koncentracija dušika je zelo visoka, vsebnost ogljika je razmeroma nizka, vendar ni bilo predlaganega ni č boljšega, razen naj se doda ve č fosfata kot 
puferja in dodatni pepton.)
 
Gospodinjska odpadna voda  
29. Uporabiti je treba svežo usedeno odpadno vodo, ki se dnevno zbira iz 
čistilne naprave, v katero se dovaja pretežno gospodinjska odpadna voda. 
Pred primarnim usedanjem jo je treba odvzeti iz prelivnega kanala primar ­
nega usedalnika ali vtoka v čistilno napravo z aktivnim blatom, biti pa mora 
večinoma brez grobih delcev. Odpadna voda se lahko uporabi po 
večdnevnem shranjevanju (ki na splošno ne sme trajati ve č kot 7 dni) pri 
približno 4 °C, če je dokazano, da se DOC (ali KPK) med shranjevanjem ni 
bistveno zmanjšal (tj. za manj kot 20 %). Da se omejijo motnje v sistemu, je 
treba DOC (ali KPK) vsake nove šarže pred uporabo uravnati na ustrezno konstantno vrednost, npr. z red čenjem z vodovodno vodo.
 
Aktivno blato  
30. Aktivno blato za inokulacijo je treba zbrati iz prezra čevalnega bazena dobro 
delujoče čistilne naprave ali laboratorijske enote z aktivnim blatom, v kateri 
se čistijo predvsem gospodinjske odpadne vode.  
Založne raztopine preskusne kemikalije  
31. Za kemikalije z ustrezno topnostjo je treba pripraviti osnovne raztopine z 
ustreznimi koncentracijami (npr. 1 do 5 g/l) v deionizirani vodi ali mine ­
ralnem deležu sinteti čne odpadne vode (za netopne in hlapne kemikalije glej 
Dodatek 5). Dolo čiti je treba DOC in celotni organski ogljik (TOC) osnovne 
raztopine, meritve pa ponoviti za vsako novo šaržo. Če je razlika med DOC 
in TOC ve čja od 20 %, je treba preveriti vodotopnost preskusne kemikalije. 
DOC ali koncentracijo preskusne kemikalije, izmerjeno s specifi čno analizo 
osnovne raztopine, je treba primerjati z nazivno vrednostjo, da se ugotovi, 
ali je izkoristek dovolj dober (obi čajno je mogo če pričakovati > 90-odstotni 
izkoristek). Zlasti za disperzije je treba ugotoviti, ali je mogo če DOC upora ­
biti kot analitski parameter ali ne oziroma ali je mogo če uporabiti samo 
analitsko tehniko, specifi čno za preskusno kemikalijo. Za disperzije je 
potrebno centrifugiranje vzorcev. Pri vsaki novi šarži je treba s specifi čno 
analizo izmeriti DOC, KPK ali preskusno kemikalijo.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1067
 
32. Dolo čiti je treba pH osnovne raztopine. Skrajne vrednosti kažejo, da lahko 
dodatek kemikalije vpliva na pH aktivnega blata v preskusnem sistemu. V 
takem primeru je treba osnovno raztopino nevtralizirati z majhnimi koli či­
nami anorganske kisline ali baze, da se doseže vrednost pH 7 ± 0,5, vendar pa je treba prepre čiti obarjanje preskusne kemikalije.
 
POSTOPEK 
33. Opisan je postopek za naprave z aktivnim blatom; za sistem s poroznimi 
posodami ga je treba nekoliko prilagoditi.  
Priprava inokuluma  
34. Na za četku preskusa je treba preskusni sistem inokulirati bodisi z aktivnim 
blatom bodisi z inokulumom, ki vsebuje nizko koncentracijo mikroorgan ­
izmov. Inokulum je treba do za četka uporabe prezra čevati pri sobni tempe ­
raturi in ga uporabiti v 24 urah. V prvem primeru se vzorec aktivnega blata 
vzame iz prezra čevalnega bazena u činkovito delujo če biološke čistilne 
naprave ali laboratorijske čistilne naprave, v katero se dovaja pretežno 
gospodinjska odpadna voda. Če je treba simulirati nitrifikacijske pogoje, 
se blato vzame iz čistilne naprave, v kateri poteka nitrifikacija. Dolo čiti je 
treba koncentracijo suspendiranih trdnih snovi in po potrebi blato zgostiti z 
usedanjem, tako da je koli čina, ki se doda v preskusni sistem, minimalna. 
Zagotoviti je treba, da je za četna koncentracija suhe snovi približno 2,5 g/l. 
35. V drugem primeru se kot inokulum uporabi 2 ml/l do 10 ml/l iztoka iz 
biološke čistilne naprave za gospodinjske odpadne vode. Da bi dobili čim 
več različnih vrst bakterij, je lahko koristno, če se dodajo inokulumi iz 
različnih drugih virov, na primer iz površinske vode. V tem primeru se 
bo aktivno blato razvijalo in raslo v preskusnem sistemu.  
Odmerjanje organskega medija  
36. Zagotoviti je treba, da so posode za pritok in iztok ter cevi, ki vodijo iz 
posod za pritok in v posode za iztok, povsem čiste, da se prepre či rast 
mikrobov na za četku in med celotnim preskusom. Preskusne sisteme je 
treba sestaviti v prostoru z nadzorovano temperaturo (obi čajno 20 do 25 °C) 
ali pa je treba uporabiti preskusne enote z vodnim plaš čem. Pripraviti je 
treba zadostno koli čino potrebnega organskega medija (odstavki 27 do 29). 
Najprej se z organskim medijem napolnita prezra čevalna posoda in usedal ­
nik, nato se doda inokulum (odstavka 34 in 35). Za čne se prezra čevanje, 
tako da se blato ohranja v suspenziji in v aerobnem stanju; nato se za čne 
odmerjanje pritoka in recikliranje usedenega blata. Organski medij se odmerja iz posod za shranjevanje v prezra čevalne posode (odstavka 20 in 
21) preskusne in kontrolne enote, ustrezni iztoki pa se zbirajo v podobne 
posode za shranjevanje. Da bi dobili obi čajni hidravli čni zadrževalni čas 6 h, 
se organski medij črpa s pretokom 0,5 l/h. Za potrditev tega pretoka je treba 
izmeriti dnevno koli čino odmerjenega organskega medija, tako da se zapiše 
zmanjšanje prostornine medija v posodah za shranjevanje. Za dolo čitev 
učinkov ob časnega spuš čanja ali „udarne“ obremenitve s kemikalijami bi 
bili potrebni drugi na čini odmerjanja. 
37. Če je organski medij pripravljen za uporabo ve č kot 1 dan, je potrebno 
hlajenje pri približno 4 °C ali druge ustrezne metode ohranjanja, da se preprečita rast mikrobov in biološka razgradnja zunaj preskusnih enot 
(odstavek 29). Če se uporablja sinteti čna odpadna voda, je mogo če pripraviti 
koncentrirano osnovno raztopino (npr. 10-kratnik obi čajne koncentracije, 
odstavek 28) in jo shranjevati pri približno 4 °C. Ta osnovna raztopina se lahko pred uporabo dobro zmeša z ustrezno koli čino vodovodne vode, lahko 
pa se tudi črpa neposredno, medtem ko se ustrezna koli čina vodovodne vode 
črpa ločeno.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1068
 
Odmerjanje preskusne kemikalije  
38. Ustrezna koli čina osnovne raztopine preskusne kemikalije (odstavek 31) se 
doda v posodo za shranjevanje pritoka ali pa se s posebno črpalko odmeri 
neposredno v prezra čevalno posodo. Obi čajna srednja preskusna koncentra ­
cija v pritoku mora biti med 10 mg/l in 20 mg/l DOC, zgornja koncentracija 
pa ne sme presegati 50 mg/l. Če je preskusna kemikalija slabo topna v vodi 
ali če obstaja velika možnost za nastanek strupenih u činkov, je treba 
koncentracijo zmanjšati na 5 mg/l DOC ali celo manj, vendar samo če je 
na voljo in izvedena primerna specifi čna analitska metoda (s posebnimi 
tehnikami odmerjanja se lahko dodajo dispergirane preskusne kemikalije, ki so slabo topne v vodi, glej Dodatek 5). 
39. Potem ko se sistem stabilizira in u činkovito odstranjuje DOC organskega 
medija (približno 80 %), se za čne dodajati preskusna kemikalija. Pred tem je 
treba preveriti, ali vse enote delujejo enako u činkovito; če ne, obi čajno 
pomaga, če se posamezna blata zmešajo in se v posamezne enote znova 
razdelijo enake koli čine. Kadar se uporabi inokulum iz (približno) 2,5 g/l 
(suhe teže) aktivnega blata, se lahko preskusna kemikalija dodaja od za četka 
preskusa, saj neposredno dodajanje vedno ve čjih količin od za četka 
omogoča, da se lahko aktivno blato bolje prilagodi preskusni kemikaliji. 
Ne glede na na čin dodajanja preskusne kemikalije je priporo čljivo, da se 
v rednih presledkih merijo ustrezni pretok in/ali prostornine v posodah za shranjevanje.
 
Ravnanje z aktivnim blatom  
40. Koncentracija trdnih snovi v aktivnem blatu se med preskusom obi čajno 
stabilizira znotraj omejitev ne glede na uporabljeni inokulum, in sicer 
znaša 1 do 3 g/l (suhe teže), odvisno od kakovosti in koncentracije organ ­
skega medija, obratovalnih pogojev, narave prisotnih mikroorganizmov in vpliva preskusne kemikalije. 
41. Treba je bodisi vsaj tedensko dolo čiti suspendirane trdne snovi v prezra če­
valnih posodah in odstraniti odve čno blato, da se ohrani koncentracija 1 do 
3 g/l (suhe teže), bodisi vzdrževati srednjo starost blata pri konstantni vred ­
nosti, obi čajno v razponu 6 do 10 dni. Če je na primer izbran zadrževalni 
čas blata 8 dni, je treba vsak dan odstraniti 1/8 aktivnega blata v prezra če­
valni posodi in ga zavre či. To je treba izvajati vsak dan, po možnosti s 
samodejno črpalko, ki deluje v presledkih. Z vzdrževanjem konstantne 
koncentracije suspendiranih trdnih snovi ali vzdrževanjem te koncentracije 
v ozkih mejah se ne vzdržuje konstantni zadrževalni čas blata (SRT), ki je 
obratovalna spremenljivka, ki dolo ča vrednost koncentracije preskusne 
kemikalije v iztoku. 
42. Med celotnim preskusom je treba vsaj enkrat na dan odstraniti vse blato, ki 
se prime na stene prezra čevalne posode in usedalnika, tako da se znova 
suspendira. Redno je treba preverjati in čistiti vse cevi, da se prepre či rast 
biofilma. Usedeno blato iz usedalnika je treba reciklirati v prezra čevalno 
posodo, po možnosti s črpanjem v presledkih. V sistemu poroznih posod 
recikliranja ni, vendar je treba zagotoviti, da se vstavijo čiste notranje 
posode, preden se prostornina v posodi znatno pove ča (odstavek 21). 
43. V Husmannovih enotah lahko pride do slabega usedanja in izgube blata. To 
je mogoče popraviti z enim ali ve č spodaj navedenimi ukrepi, ki se izvedejo 
sočasno v preskusni in kontrolni enoti: 
— v rednih presledkih, npr. tedensko, se lahko dodaja sveže blato ali 
flokulant (na primer 2 ml/posodo 50 g/l FeCl
 3 ), vendar se je treba 
prepričati, da ne pride do reakcije ali obarjanja preskusne kemikalije s 
FeCl  3 , ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1069
 
— črpalka „airlift“ se lahko nadomesti s peristalti čno črpalko, s čimer se 
omogočita pretok reciklata, ki je približno enak pretoku pritoka, ki ga je 
treba uporabiti, in razvoj anaerobnega obmo čja v usedenem blatu (geo ­
metrija črpalke „airlift“ omejuje minimalni pretok povratnega blata na 
približno 12-kratnik pretoka pritoka), 
— blato se lahko v presledkih črpa iz usedalnika v prezra čevalno 
posodo (npr. 5 minut vsake 2,5 h, da se reciklira od 1 l/h do 1,5 l/h), 
— za prepre čitev izgube zaradi penjenja se lahko uporabi nestrupeno 
sredstvo proti penjenju v minimalni koncentraciji (npr. silikonsko 
olje), 
— skozi blato v usedalniku se lahko v kratkih udarnih curkih spuš ča 
zrak (npr. 10 sekund vsako uro), 
— organski medij se lahko v prezra čevalno posodo odmerja v 
presledkih (npr. od 3 do 10 minut vsako uro).  
Vzorčenje in analiza  
44. V rednih presledkih je treba meriti koncentracijo raztopljenega kisika, 
temperaturo in vrednost pH aktivnega blata v prezra čevalnih posodah. Zago ­
toviti je treba, da je vedno na voljo dovolj kisika (> 2 mg/l) in da se temperatura vzdržuje v zahtevanem obsegu (obi čajno 20 do 25 °C). Vred ­
nost pH je treba vzdrževati pri 7,5 ± 0,5 z odmerjanjem majhnih koli čin 
anorganske baze ali kisline v prezra čevalno posodo ali pritok ali s pove če­
vanjem puferske sposobnosti organskega medija (glej odstavek 27). Pri 
nitrifikaciji nastane kislina, pri čemer pri oksidaciji 1 mg N nastane ekvi ­
valent približno 7 mg CO
 3 – . Pogostost meritev je odvisna od parametra, ki 
ga je treba izmeriti, in stabilnosti sistema, lahko pa se izvajajo dnevno ali tedensko. 
45. Izmeriti je treba DOC ali KPK v pritokih v kontrolne in preskusne posode. 
S specifično analizo je treba izmeriti koncentracijo preskusne kemikalije v 
preskusnem pritoku ali jo oceniti na podlagi koncentracije v osnovni razto ­
pini (odstavek 31), uporabljene koli čine in koli čine odpadne vode, odmer ­
jene v preskusno enoto. Priporo čljivo je, da se koncentracija preskusne 
kemikalije izra čuna, da se zmanjša variabilnost podatkov o koncentraciji. 
46. Iz zbranega iztoka je treba vzeti primerne vzorce (npr. 24-urne sestavljene 
vzorce) in jih filtrirati skozi membrano z velikostjo por 0,45 μm ali jih 
približno 15 minut centrifugirati pri približno 40 000 m/s
 2 . Centrifugiranje 
je treba uporabiti, če je filtriranje težavno. DOC ali KPK je treba dolo čiti 
vsaj v dveh ponovitvah, da se s specifi čno analizo za preskusno kemikalijo 
izmeri kon čna biološka razgradnja in po potrebi primarna biološka razgrad ­
nja. 
47. Uporaba KPK lahko pri nizkih koncentracijah povzro či analitične težave, 
zato se priporo ča samo, če je uporabljena dovolj visoka preskusna koncen ­
tracija (približno 30 mg/l). Prav tako se za kemikalije, ki se mo čno adsor­
birajo, priporo ča, da se koli čina adsorbirane kemikalije v blatu izmeri z 
analitsko tehniko, specifi čno za preskusno kemikalijo. 
48. Pogostost vzor čenja je odvisna od pri čakovanega trajanja preskusa. Pripo ­
roča se vzor čenje trikrat na teden. Ko enote u činkovito delujejo, je treba 
omogočiti prilagajanje, ki traja od 1 do najve č 6 tednov po vnosu preskusne 
kemikalije, da se doseže stabilno stanje. Po možnosti je treba za oceno 
rezultata preskusa pridobiti najmanj 15 veljavnih vrednosti v fazi konstantne 
ravni (odstavek 59), ki obi čajno traja 3 tedne. Preskus se lahko kon ča, če je 
dosežena zadostna stopnja odstranitve (npr. > 90-odstotna) in je na voljo teh 15 vrednosti, ki predstavljajo analize, ki so se 3 tedne izvajale vsak delovni 
dan. Običajno preskus ne sme trajati ve č kot 12 tednov po tem, ko je bila 
dodana preskusna kemikalija.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1070
 
49. Če se v blatu za čne nitrifikacija in je treba preu čiti učinke preskusne kemi ­
kalije na nitrifikacijo, je treba vzorce iz iztoka preskusne in kontrolne enote 
vsaj enkrat tedensko analizirati za dolo čitev amonija in/ali nitrita in nitrata. 
50. Vse analize je treba izvesti čim prej, zlasti dolo čitve dušika. Če je treba 
analize odložiti, je treba vzorce shraniti v temnem prostoru v polnih in tesno zaprtih steklenicah pri približno 4 °C. Če je treba vzorce shraniti za ve č kot 
48 h, jih je treba globoko zamrzniti, acidificirati (npr. 10 ml/l raztopine 400 
g/l žveplove kisline) ali dodati primerno strupeno snov (npr. 20 ml/l razto ­
pine 10 g/l živosrebrovega (II) klorida). Zagotoviti je treba, da tehnika shranjevanja ne vpliva na rezultate analize.
 
Spajanje preskusnih enot  
51. Če bodo uporabljene spojene enote (Dodatek 3), je treba dnevno izmenjati 
enako koli čino aktivnega blata (150 ml do 1 500 ml za prezra čevalne 
posode, ki vsebujejo 3 litre suspenzije) med prezra čevalnimi posodami 
preskusne enote in njene kontrolne enote. Če se preskusna kemikalija 
močno adsorbira na blato, je treba zamenjati samo supernatant iz usedalni ­
kov. V obeh primerih je treba za izra čun rezultatov preskusa uporabiti 
korekcijski faktor (odstavek 55).  
PODATKI IN PORO ČANJE  
Obdelava rezultatov  
52. Za vsako časovno dolo čeno oceno se izra čuna delež odstranitve DOC ali 
KPK preskusne kemikalije, za kar se uporabi ena čba: 
D t ¼ C s Ä ðE Ä E o Þ 
C s Ü 100 
pri čemer je: 
D t = odstotni delež odstranitve DOC ali KPK v času t, 
C s = DOC ali KPK v pritoku zaradi preskusne kemikalije, po možnosti 
ocenjen na podlagi osnovne raztopine (mg/l), 
E = izmerjena vrednost DOC ali KPK v preskusnem iztoku v času t 
(mg/l), 
E o = izmerjena vrednost DOC ali KPK v kontrolnem iztoku v času t 
(mg/l). 
53. Stopnja odstranitve DOC ali KPK organskega medija v kontrolni enoti je 
koristna informacija pri oceni biorazgradne dejavnosti aktivnega blata med 
preskusom. Delež odstranitve se izra čuna z ena čbo: 
D B ¼ C M Ä E o 
C M Ü 100 
pri čemer je: 
D B = odstotni delež odstranitve DOC ali KPK organskega medija v 
kontrolni enoti v času t, 
C M = DOC ali KPK organskega medija v kontrolnem pritoku (mg/l).  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1071
 
Po želji se lahko izra čuna tudi delež odstranitve DOC ali KPK zaradi 
organskega medija in preskusne kemikalije v preskusni enoti, za kar se 
uporabi ena čba: 
D T ¼ C T Ä E 
C T Ü 100 
pri čemer je: 
D T = odstotni delež odstranitve DOC ali KPK celotnega preskusnega 
pritoka, 
C T = DOC ali KPK celotnega preskusnega pritoka ali izra čunan na 
podlagi osnovnih raztopin (mg/l). 
54. Pri vsaki časovno dolo čeni oceni se izra čuna odstranitev preskusne kemika ­
lije, če je bila izmerjena s specifi čno analitsko metodo, za kar se uporabi 
enačba: 
D ST ¼ S i Ä S e 
S i Ü 100 
pri čemer je: 
D ST = odstotni delež primarne odstranitve preskusne kemikalije v času t, 
S i = izmerjena ali ocenjena koncentracija preskusne kemikalije v 
preskusnem pritoku (mg/l), 
S e = izmerjena koncentracija preskusne kemikalije v preskusnem iztoku 
v času t (mg/l). 
55. Če je bil uporabljen sistem spojenih enot, je treba razred čenje preskusne 
kemikalije v prezra čevalni posodi zaradi izmenjave blata izravnati s korek ­
cijskim faktorjem (glej Dodatek 3). Če sta bila uporabljena srednji hidrav ­
lični zadrževalni čas 6 h in izmenjava polovice koli čine aktivnega blata v 
prezračevalni posodi, je treba dolo čene vrednosti dnevne odstranitve (D  t , 
odstavek 52) popraviti, da se izra čuna dejanska stopnja odstranitve, D  tc , 
preskusne kemikalije, za kar se uporabi ena čba: 
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
Izražanje rezultatov preskusa  
56. Delež odstranitve D  t (ali D  tc ) in D  st , če je na voljo, se prikaže grafi čno v 
odvisnosti od časa (glej Dodatek 2). Na podlagi oblike krivulje odstranitve 
preskusne kemikalije ( per se  ali kot DOC) se lahko izpeljejo nekatere 
ugotovitve o procesu odstranjevanja.  
Adsorpcija  
57. Če se velika odstranitev DOC pri preskusni kemikaliji opazi na za četku 
preskusa, se preskusna kemikalija verjetno odstranjuje z adsorpcijo na trdne snovi aktivnega blata. To je mogo če dokazati z dolo čitvijo adsorbirane 
preskusne kemikalije s specifi čno analizo. Odstranitev DOC pri kemikalijah, 
ki se adsorbirajo, redko ostane visoka med celotnim preskusom; po navadi 
je stopnja odstranitve visoka na za četku, nato postopoma pade na ravno ­
težno vrednost. Če pa bi lahko preskusna kemikalija, ki se adsorbira, tako 
ali drugače povzročila aklimatizacijo mikrobne populacije, bi se odstranitev 
DOC pri preskusni kemikaliji pove čala in dosegla visoko vrednost 
konstantne ravni.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1072
 
Faza prilagajanja  
58. Kot pri stati čnih presejalnih preskusih je pri številnih preskusnih kemikalijah 
pred popolno biološko razgradnjo potrebna faza prilagajanja. V njej se bakterije, ki razgrajujejo, aklimatizirajo ali prilagodijo skoraj brez odstranje ­
vanja preskusne kemikalije; nato nastopi za četna rast teh bakterij. Ta faza se 
konča, za fazo razgradnje pa se šteje, da se je za čela, ko je odstranjenih 
približno 10 % za četne količine preskusne kemikalije (po dopuš čeni adsorp ­
ciji, če se zgodi). Faza prilagajanja je pogosto zelo spremenljiva in težko 
ponovljiva.
 
Faza konstantne ravni  
59. Faza konstantne ravni krivulje odstranjevanja v kontinuiranem preskusu je 
opredeljena kot faza, v kateri je razgradnja najve čja. Trajati mora vsaj 3 
tedne in imeti približno 15 izmerjenih veljavnih vrednosti.  
Srednja stopnja odstranitve preskusne kemikalije  
60. Izračuna se srednja vrednost na podlagi vrednosti odstranitve (D  t ) preskusne 
kemikalije v fazi konstantne ravni. Ta stopnja, ki je zaokrožena na najbližje 
celo število (1 %), je stopnja odstranitve preskusne kemikalije. Priporo ča se 
tudi, da se izra čuna 95-odstotni interval zaupanja za srednjo vrednost.  
Odstranitev organskega medija  
61. Delež odstranitve DOC ali KPK organskega medija v kontrolni enoti (D  B ) 
se prikaže grafi čno v odvisnosti od časa. Srednja stopnja odstranitve se 
navede enako kot pri preskusni kemikaliji (odstavek 60).  
Znak biološke razgradnje  
62. Če se preskusna kemikalija ne adsorbira znatno na aktivno blato in ima 
krivulja odstranitve zna čilno obliko krivulje biološke razgradnje s fazo prila ­
gajanja, fazo razgradnje in fazo konstantne ravni (odstavka 58 in 59), je 
mogoče izmerjeno odstranitev zanesljivo pripisati biološki razgradnji. Če se 
veliko preskusne kemikalije odstrani že na za četku, simulacijski preskus ne 
more razlikovati med biološkim in abiotskim procesom odstranitve. V takih 
in drugih primerih, v katerih obstaja dvom o biološki razgradnji (npr. pri 
ločevanju (stripping)), je treba analizirati adsorbirane preskusne kemikalije 
ali opraviti dodatne stati čne preskuse biološke razgradnje na podlagi para ­
metrov, ki jasno nakazujejo biološke procese. Taki preskusi so metode 
porabe kisika (poglavje C.4-D, E in F te priloge (6)), ali preskus z merje ­
njem nastajanja ogljikovega dioksida (poglavje C.4-C te priloge (6)), ali metoda nadprostora ISO (18), pri kateri se uporabi predhodno izpostavljeni 
inokulum iz simulacijskega preskusa. Če sta bili izmerjeni odstranitev DOC 
in odstranitev specifi čne kemikalije, velike razlike med odstranjenimi deleži 
(pri čemer je prva vrednost nižja od druge) kažejo, da so bili v iztokih 
vmesni organski produkti, ki se morda težje razgradijo kot mati čna kemi­
kalija.
 
Veljavnost rezultatov preskusa  
63. Informacije o obi čajnem biorazgradnem obnašanju inokuluma se pridobijo, 
če je dolo čena stopnja odstranitve organskega medija (odstavek 53) v 
kontrolni enoti. Preskus je treba šteti za veljaven, če je stopnja odstranitve 
DOC ali KPK v kontrolnih enotah po dveh tednih > 80-odstotna in če ni 
bilo opaženega ni č nenavadnega.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1073
 
64. Če je bila uporabljena lahko biološko razgradljiva (referen čna) kemikalija, 
mora biti stopnja biološke razgradnje (D  t , odstavek 52) > 90-odstotna. 
65. Če preskus poteka v nitrifikacijskih pogojih, mora biti srednja koncentracija 
v iztokih < 1 mg/l amonijevega dušika in < 2 mg/l nitritnega dušika. 
66. Če ta merila (odstavki 63 do 65) niso izpolnjena, je treba preskus ponoviti z 
inokulumom iz drugega vira, preskusiti referen čno kemikalijo in pregledati 
vse poskusne postopke.  
Poročilo o preskusu  
67. V poro čilu o preskusu morajo biti naslednje informacije:  
Preskusna kemikalija:  
— identifikacijski podatki, — fizikalno stanje, in kjer je ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti.  
Preskusni pogoji:  
— vrsta preskusnega sistema; spremembe za preskuse netopnih in hlapnih 
kemikalij, 
— vrsta organskega medija, — delež in vrsta industrijskih odplak v odpadni vodi, če sta znana, 
— inokulum, vrsta in mesta vzor čenja, koncentracija in predobdelava, 
— založna raztopina preskusne kemikalije: vsebnost DOC in TOC; kako je 
pripravljena, če je suspenzija; uporabljena preskusna koncentracija; 
razlogi za odstopanje od razpona 10–20 mg/l DOC; metoda dodajanja; 
datum prvega dodajanja; spremembe, 
— srednja starost blata in srednji hidravli čni zadrževalni čas; metoda 
odstranjevanja odve čnega blata; metode za prepre čevanje kopi čenja, 
izgube blata itd., 
— uporabljene analitske tehnike, — temperatura med preskusom, — lastnosti kopi čenja blata, volumski indeks blata (VIB), koncentracija 
aktivnega blata (MLSS), 
— odstopanja od standardnih postopkov in okoliš čine, ki bi lahko vplivale 
na rezultate.  
Rezultati preskusa:  
— vsi izmerjeni podatki (DOC, KPK, specifi čne analize, pH, temperatura, 
koncentracija kisika, suspendirane trdne snovi, dušikove snovi, če je 
ustrezno), 
— vse izra čunane vrednosti D
 t (ali D  tc ), D  B , D  St v tabelarni obliki in 
krivuljah odstranitve, 
— informacije o fazi prilagajanja in fazi konstantne ravni, trajanju preskusa, 
stopnji odstranitve preskusne kemikalije in organskega medija v 
kontrolni enoti, statisti čne informacije ter izjave o biološki razgradlji ­
vosti in veljavnosti preskusa, 
— obravnava rezultatov.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1074
 
VIRI:  
(1) Swisher, R. D. (1987). „Surfactant Biodegradation“, 2. izdaja, Marcel 
Dekker Inc. New York, 1085 str. 
(2) Nemška vlada (1962). Uredba o razgradljivosti detergentov v pralnih in 
čistilnih sredstvih. Bundesgesetzblatt, Pt. 1, št. 49: 698–706. 
(3) Painter, H. A., in King, E. F. (1978a). WRc porous-pot method for asses ­
sing biodegradability. Technical Report No. 70, Water Research Centre, Medmenham, Združeno kraljestvo. 
(4) Painter, H. A., in King, E. F. (1978b). The effect of phosphate and tempe ­
rature on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. 
Wat. Res. 12: 909–915. 
(5) Eckenfelder, W. W. (19), US EPA. (6) Poglavje C.4 te priloge, Dolo čanje „dobre“ biorazgradljivosti. 
(7) Poglavje C.12 te priloge, Biorazgradnja – Spremenjeni SCAS preskus. (8) Poglavje C.19 te priloge, Ocenjevanje adsorpcijskega koeficienta (K
 OC ) tal 
in odpadnega blata (blata iz čistilnih naprav) s teko činsko kromatografijo 
visoke lo čljivosti (HPLC). 
(9) Gerike, P., in Fischer, W. K. (1979). A correlation study of biodegradability 
determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 3: 157–173. 
(10) Gerike, P., in Fischer, W. K. (1981), kot (9), II Additional results and 
conclusions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45–55. 
(11) Painter, H. A., in Bealing, D. (1989). Experience and data from the OECD 
activated sludge simulation test, str. 113–138, V: Laboratory tests for simu ­
lation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. Ur. Jacobsen, B. N., Muntau, H., Angeletti, G. 
(12) ISO 11733 (1995; revidiran 2004). Vrednotenje odstranjevanja in bioraz ­
gradljivosti organskih snovi v vodi – simulacijski preskus z aktivnim blatom. 
(13) Birch, R. R. (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII 
Jornado Com. Espanol. Deterg.: 33–48. 
(14) Birch, R. R. (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 
(2): 340–343. 
(15) Gerike, P., Fischer, W. K., in Holtmann, W. (1980). Biodegradability deter ­
minations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. Wat. Res. 14: 753–758. 
(16) Baumann, U., Kuhn, G., in Benz, M. (1998). Einfache Versuchsanordnung 
zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltc ­
hem. Ökotox. 10: 214–220. 
(17) Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. 
Methods for the examination of waters and associated materials, str. 
91–98 ISBN 011 751661 9. 
(18) ISO 14593 (1998). Kakovost vode – Vrednotenje kon čne biorazgradljivosti 
organskih spojin v vodi. Metoda z analizo anorganskega ogljika v zaprtih posodah.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1075
 
Dodatek 1  
Slika 1  
Oprema za ocenjevanje biološke razgradljivosti  
Husmannova enota
  
A. Posoda za shranjevanje 
B. Dozirna črpalka 
C. Prezra čevalna komora (prostornina 3 l) 
D. Usedalnik E. Črpalka „airlift“ 
F. Zbiralna posoda G. Prezra čevalo 
H. Merilnik pretoka zraka
 
Slika 2  
Oprema za ocenjevanje biološke razgradljivosti  
Porozna posoda
  
A. Posoda za shranjevanje 
B. Dozirna črpalka 
C. Porozna prezra čevalna posoda 
D. Zunanja neprepustna posoda E. Zbiralna posoda 
F. Difuzor 
G. Merilnik pretoka zraka  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1076
 
Slika 3  
Podrobnosti o 3-litrski porozni prezra čevalni posodi
  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1077
 
Dodatek 2  
Primer krivulje odstranjevanja
  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1078
 
Dodatek 3  
[INFORMATIVNO]  
SPAJANJE PRESKUSNIH ENOT 
Da bi poskušali izena čiti populacije mikrobov v blatu v preskusni enoti, v katero 
priteka odpadna voda s preskusno kemikalijo, in kontrolni enoti, v katero priteka 
samo odpadna voda, je bila uvedena dnevna izmenjava blata (1). Postopek je bil poimenovan spajanje, metoda pa je znana kot spojene enote. Spajanje se je sprva izvajalo s Husmannovimi enotami z aktivnim blatom, vendar pa se je izvajalo 
tudi z enotami poroznih posod (2) (3). Med rezultati nespojenih in spojenih enot 
ni bilo ugotovljenih bistvenih razlik, najsi so bile uporabljene Husmannove enote ali porozne posode, zato čas in energija, vložena v spajanje enot, ne prinašata 
nobenih koristi. 
Izmenjave blata lahko ustvarijo videz precej velike odstranitve, ker se del 
preskusne snovi prenese in se koncentracije preskusne kemikalije v preskusnem in kontrolnem iztoku skoraj izena čijo. Zato je treba uporabiti korekcijske faktorje, 
ki so odvisni od izmenjanega deleža in srednjega hidravli čnega zadrževalnega 
časa. Objavljenih je bilo ve č podrobnosti o izra čunu (1). 
Izračuna se popravljena stopnja odstranitve DOC ali KPK, za kar se uporabi 
splošna formula: 
D
 tc ¼ ðD t Ä 100 · a · r=12Þ=ð1 Ä a · r=12Þ% 
pri čemer je: 
D tc = popravljeni odstotni delež odstranitve DOC ali KPK, 
D t = določeni odstotni delež odstranitve DOC ali KPK, 
a = delež izmenjane koli čine med enotami z aktivnim blatom, 
r = srednji hidravli čni zadrževalni čas (h). 
Če se na primer izmenja polovica koli čine aktivnega blata v prezra čevalnem 
bazenu (a = 0,5) in je srednji hidravli čni zadrževalni čas 6 h, je korekcijska 
formula naslednja: 
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
VIRI:  
(1) Fischer, W., Gerike, P., Holtmann, W. (1975). Biodegradability Determina ­
tions via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131–1135. 
(2) Painter, H. A., Bealing, D. J. (1989). Experience and Data from the OECD 
Activated Sludge Simulation Test, str. 113–138. V: Laboratory Tests for 
Simulation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Ur. Jacobsen, B. N., Muntau, H., Angeletti, G. 
(3) Painter, H. A., King, E. F. (1978). Water Research Centre Porous Pot 
Method for Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water 
Research Centre, Stevenage, Združeno kraljestvo.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1079
 
Dodatek 4  
VREDNOTENJE ZAVIRANJA AKTIVNEGA BLATA  
Postopek s preskusnimi kemikalijami  
1. Lahko se zgodi, da se kemikalija (ali odpadna voda) pri simulacijskem 
preskusu ne razgradi ali odstrani ter ima celo zaviralni u činek na mikroorgan ­
izme v blatu. Druge kemikalije se biološko razgradijo pri nizkih koncentra ­
cijah, pri višjih koncentracijah pa so zaviralne (hormeza). Zaviralni u činki se 
lahko pokažejo v zgodnejši fazi ali pa se dolo čijo s preskusom strupenosti, 
pri katerem se uporabi inokulum, ki je podoben ali enak inokulumu, upora ­
bljenemu pri simulacijskem preskusu (1). Take metode so zaviranje porabe kisika (poglavje C.11 te priloge (2) in ISO 8192 (3)) ali zaviranje rasti mikroorganizmov v blatu (ISO 15522 (4)). 
2. Pri simulacijskem preskusu se zaviranje pokaže tako, da je razlika v razto ­
pljenem organskem ogljiku (DOC) ali kemijski potrebi po kisiku (KPK) med 
iztokom iz preskusne posode in iztokom iz kontrolne enote ve čja od DOC, ki 
je dodan kot preskusna kemikalija. Z drugimi besedami, delež odstranitve DOC (in biokemijske potrebe po kisiku (BPK), kemijske potrebe po kisiku (KPK) in/ali NH
 + 4 ) obdelanega organskega medija se zaradi 
preskusne kemikalije zmanjša. Če se to zgodi, je treba preskus ponavljati z 
zniževanjem koncentracije preskusne kemikalije, dokler ni dosežena raven, na kateri ni zaviranja, in morda z nadaljnjim zniževanjem koncentracije, dokler ni preskusna kemikalija biološko razgrajena. Če pa preskusna kemi ­
kalija (ali odpadna voda) negativno vpliva na proces pri vseh preskušenih 
koncentracijah, to nakazuje, da je kemikalijo težko, če ne celo nemogo če 
biološko obdelati, vendar pa bi bilo morda koristno preskus ponoviti z aktivnim blatom iz drugega vira in/ali omogo čiti postopnejšo aklimatizacijo 
blata. 
3. V nasprotnem primeru, če je preskusna kemikalija biološko odstranjena pri 
prvem poskusu v simulacijskem preskusu, je treba njeno koncentracijo povi ­ 
šati, če je treba vedeti, ali bi lahko bila zaviralna. 
4. Ko se poskušajo dolo čiti stopnje zaviranja, je treba upoštevati, da se lahko 
populacija aktivnega blata spreminja, tako da lahko s časoma mikroorganizmi 
postanejo odporni proti zaviralni kemikaliji. 
5. Izračun stopnje zaviranja: 
Skupni delež odstranitve R
 o , BPK, DOC, KPK itd. za preskusno in kontrolno 
enoto se lahko izra čuna z ena čbo: 
R o ¼ 100 ðI Ä EÞ=I % 
pri čemer je: 
I = koncentracija BPK, DOC, KPK itd. v pritoku za preskusno ali 
kontrolno posodo (mg/l), 
E = zadevne koncentracije v iztoku (mg/l). I in E je treba popraviti za DOC zaradi preskusne kemikalije v preskusnih 
enotah, sicer bodo izra čuni deleža zaviranja nepravilni.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1080
 
Stopnja zaviranja, ki jo povzro či preskusna kemikalija, se lahko izra čuna z 
enačbo: 
% zaviranja ¼ 100 ðR c Ä R t Þ=R c 
pri čemer je: 
R c = delež odstranitve v kontrolnih posodah, 
R t = delež odstranitve v preskusnih posodah.  
VIRI:  
(1) Reynolds, L., idr. (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be 
assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259. 
(2) Poglavje C.11 te priloge, Biorazgradnja – Preskus zaviranja dihanja aktiv ­
nega blata. 
(3) ISO 8192 (2007) Kakovost vode – Preskus inhibicije porabe kisika z 
aktivnim blatom za oksidacijo ogljika in amonija. 
(4) ISO 15522 (1999) Kakovost vode – Dolo čanje zaviralnega u činka sestavin 
vode na rast mikroorganizmov aktivnega blata.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1081
 
Dodatek 5  
Slabo vodotopne preskusne kemikalije – hlapne kemikalije  
Slabo vodotopne kemikalije  
V zvezi z uporabo slabo vodotopnih in netopnih kemikalij v preskusih za simu ­
lacijo čiščenja odpadne vode je bilo objavljenih le malo poro čil (1) (2) (3). 
Ne obstaja ena sama metoda za dispergiranje preskusne kemikalije, ki bi se 
uporabljala za vse netopne kemikalije. Za poskus dispergiranja preskusnih kemi ­
kalij pri simulacijskem preskušanju bi se zdeli primerni dve od štirih metod, opisanih v ISO 10634 (4): uporaba emulgatorjev in/ali ultrazvoka. Ugotoviti je 
treba vsaj 24-urno stabilnost nastale disperzije. Primerno stabilizirane disperzije, 
ki se hranijo v zbiralniku s stalnim mešanjem (odstavek 38), se nato odmerijo v prezračevalni bazen lo čeno od gospodinjske (ali sinteti čne) odpadne vode. 
Če so disperzije stabilne, je treba preu čiti, kako se lahko preskusna kemikalija 
določi v dispergirani obliki. DOC verjetno ne bo primeren, zato bo treba dolo čiti 
posebno analitsko metodo za preskusno kemikalijo, ki jo bo mogo če uporabiti za 
iztoke, trdne snovi v iztoku in aktivno blato. Usoda preskusne kemikalije pri 
simulaciji procesa z aktivnim blatom bo nato dolo čena v teko či in trdni fazi. 
Določi se torej „masna bilanca“, na podlagi katere se ugotavlja, ali je bila 
preskusna kemikalija biološko razgrajena. Vendar bo to pomenilo samo primarno 
biološko razgradnjo. Kon čno biološko razgradnjo je treba poskusiti dokazati z 
respirometri čnim preskusom za dobro biološko razgradljivost (poglavje C.4 te 
priloge (5), C, F ali D), pri katerem se kot inokulum uporabi blato, izpostavljeno preskusni kemikaliji v simulacijskem preskusu.
 
Hlapne kemikalije  
Uporaba simulacij čiščenja odpadne vode za hlapne kemikalije je sporna in 
problemati čna. Podobno, kot pri slabo vodotopnih preskusnih kemikalijah, je 
bilo tudi o simulacijskih preskusih s hlapnimi kemikalijami objavljenih zelo 
malo poro čil. Klasična naprava s popolnim premešanjem je prilagojena z zates ­
nitvijo prezra čevalnega bazena in usedalnika, pri čemer se pretok zraka meri in 
nadzoruje z merilniki pretoka, izhodni plin pa prehaja skozi lovilnike za zbiranje 
hlapnih organskih snovi. V nekaterih primerih vakuumska črpalka usmeri izhodni 
plin skozi „hladni“ lovilnik ali lovilnik „izpihni in ujemi“, ki vsebuje Tenax ali silikagel za analize s plinsko kromatografijo. Preskusno kemikalijo v lovilniku je mogoče določiti analitično. 
Preskus se izvaja v dveh delih. Enote najprej delujejo brez blata, vendar s 
sintetično odpadno vodo in preskusno kemikalijo, ki se črpa v prezra čevalni 
bazen. Nekaj dni se zbirajo in analizirajo vzorci pritoka, iztoka in izhodnega plina, da se dolo či preskusna kemikalija. Na podlagi zbranih podatkov se 
lahko izra čuna delež (R
 vs ) preskusne kemikalije, izlo čene iz sistema. 
Nato se opravi obi čajni biološki preskus (z blatom) pri enakih obratovalnih 
pogojih kot pri raziskavi izlo čanja. Izmerita se tudi DOC ali KPK, s čimer se 
preveri u činkovitost delovanja enot. Opravijo se ob časne analize, s katerimi se 
določi preskusna kemikalija v pritoku, iztoku in izhodnem plinu v prvem delu 
preskusa; po aklimatizaciji se analize izvajajo pogosteje. Tudi tu se lahko na podlagi podatkov v stabilnem stanju izra čuna delež odstranitve preskusne kemi ­
kalije iz teko če faze z vsemi procesi (R
 T ) (fizikalnimi in biološkimi) in tudi delež 
(R V ), izločen iz sistema.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1082
 
Izračun: 
(a) Pri nebiološkem preskusu se lahko delež (R  VP ) preskusne snovi, izlo čene iz 
sistema, izra čuna z ena čbo: 
R VP ¼ S VP 
S IP · 100 
pri čemer je: 
R VP = odstranitev preskusne kemikalije s hlapenjem (%), 
S VP = preskusna kemikalija, zbrana v lovilniku, izražena kot ekvivalent 
koncentracije v teko či fazi (mg/l), 
S IP = koncentracija preskusne kemikalije v pritoku (mg/l). 
(b) Pri biološkem preskusu se lahko delež (R  V ) preskusne snovi, izlo čene iz 
sistema, izra čuna z ena čbo: 
R V ¼ S V 
S I · 100 
pri čemer je: 
R V = odstranitev preskusne kemikalije sz uplinjanjem pri biološkem 
preskusu (%), 
S V = preskusna kemikalija, zbrana v lovilniku pri biološkem preskusu, 
izražena kot ekvivalent koncentracije v teko čem pritoku (mg/l), 
S I = koncentracija preskusne kemikalije v pritoku (mg/l). 
(c) Pri biološkem preskusu je delež (R  T ) preskusne kemikalije, odstranjene z 
vsemi procesi, podan z ena čbo: 
R T ¼ 1 Ä S E 
S I · 100 
pri čemer je: 
S E = koncentracija preskusne kemikalije v (teko čem) iztoku (mg/l). 
(d) Delež (R  BA ), odstranjen z biološko razgradnjo in adsorpcijo, se torej lahko 
izračuna z ena čbo: 
R BA ¼ ðR T Ä R V Þ 
Opraviti je treba lo čene preskuse, da bi ugotovili, ali je preskusna kemikalija 
adsorbirana; če je, se lahko izvede nadaljnji popravek. 
(e) Primerjava med deležem preskusne kemikalije, izlo čene iz sistemov biolo ­ 
škega (R  v ) in nebiološkega preskusa (R  vp ), kaže splošni u činek, ki ga je 
biološka obdelava imela na emisijo preskusne kemikalije v ozra čje. 
Primer:  benzen 
Zadrževalni čas blata = 4 dni 
Sintetična odpadna voda; zadrževalni čas = 8 ur 
S IP = S  I = 150 mg/l 
S VP = 150 mg/l (S  EP = 0) 
S V = 22,5 mg/l 
S E = 50 μg/l ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1083
 
Torej: 
R VP = 100 %, R  V = 15 % 
R T = 100 % in R  BA = 85 %. 
Za benzen se je domnevalo, da se ne adsorbira na blato.  
VIRI:  
(1) Horn, J. A., Moyer, J. E., Hale, J. H. (1970). Biological degradation of 
tertiary butyl alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 
939–854. 
(2) Pitter, P., Chudoba, J. (1990). Biodegradability of organic substances in the 
aquatic environment. CRC Press. Boston, ZDA. 
(3) Stover, E. L., Kincannon, D. F (1983). Biological treatability of specific 
organic compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. 
Control Fed. 55: 97. 
(4) ISO 10634 (1995) Kakovost vode – Navodilo za pripravo in obdelavo v vodi 
slabo topnih organskih spojin za nadaljnje vrednotenje njihove biorazgrad ­
ljivosti v vodi. 
(5) Poglavje C.4 te priloge, Dolo čanje „dobre“ biorazgradljivosti.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1084
Dodatek 6  
Učinki zadrževalnega časa blata (SRT) na možnost obdelave kemikalij  
UVOD 
1. Metoda, opisana v glavnem besedilu, je bila zasnovana za ugotovitev, ali se 
lahko preskusne kemikalije (obi čajno tiste, za katere je znano, da so inhe ­
rentno, vendar ne dobro biološko razgradljive) biološko razgradijo v okvirih, določenih v čistilnih napravah. Rezultati so izraženi v deležu odstranitve in 
deležu biološke razgradnje. Pogoji delovanja enot z aktivnim blatom in izbira 
pritoka omogo čajo precej razli čne koncentracije preskusne kemikalije v 
iztoku. Preskusi se izvajajo pri samo eni nazivni koncentraciji trdnih snovi v blatu ali enem nazivnem zadrževalnem času blata (SRT), opisani sistemi 
odstranjevanja odve čnega blata pa lahko povzro čijo velika nihanja vrednosti 
SRT med preskusom, in sicer od enega do drugega dne in tudi v enem 
dnevu. 
2. V tej razli čici (1) (2) se SRT v celotnem 24-urnem obdobju vzdržuje v veliko 
ožjih mejah (tako, kot pri velikih sistemih), kar vodi do bolj konstantne 
koncentracije v iztokih. Priporo ča se gospodinjska odpadna voda, ker 
omogoča doslednejše in ve čje deleže odstranitve. Preu čijo se tudi u činki 
vrste vrednosti SRT, s podrobnejšim preu čevanjem pa se lahko dolo čijo 
učinki različnih temperatur na koncentracijo v iztoku. 
3. Ni še splošnega soglasja o tem, kateri kineti čni modeli delujejo pri biološki 
razgradnji kemikalij v pogojih čistilne naprave za odpadne vode. Za zbrane 
podatke je bil izbran Monodov model rasti bakterij in uporabe substrata (1) (2), saj je bila metoda namenjena samo uporabi za kemikalije, ki se 
proizvajajo v velikih koli činah in so tako v odpadnih vodah prisotne v 
koncentracijah, višjih od 1 mg/l. Veljavnost poenostavljenega modela in izdelanih predpostavk je bila dolo čena z nizom alkoholnih etoksilatov, ki 
imajo razli čne stopnje primarne biološke razgradljivosti (2) (3).  
Opomba:  v tej razli čici se večinoma natan čno upošteva besedilo preskusne 
metode C.10-A, zato so v nadaljevanju navedene samo tiste podrobnosti, ki se razlikujejo.
 
NAČELO PRESKUSA 
4. Enote poroznih posod z aktivnim blatom, zasnovane za olajšanje (skoraj) 
kontinuiranega odstranjevanja suspenzije aktivnega blata, ki omogo ča zelo 
natančen nadzor nad zadrževalnim časom blata (SRT ali θ s ), obratujejo v 
nespojenem na činu pri razli čnih SRT in lahko tudi pri razli čnih temperaturah. 
Zadrževalni čas je obi čajno 2 do 10 dni, temperatura pa 5 do 20 °C. 
Odpadna voda, po možnosti gospodinjska, in raztopina preskusne kemikalije 
se ločeno odmerjata v enote s hitrostjo, s katero se dosežeta zahtevani zadr ­ 
ževalni čas odpadne vode (3 do 6 ur) in zahtevana koncentracija preskusne 
kemikalije v pritoku. Kontrolne enote, v katere se preskusna kemikalija ne 
dovaja, zaradi primerjave obratujejo vzporedno. 
5. Uporabijo se lahko druge vrste naprav, vendar je treba zelo paziti, da se 
doseže dober nadzor nad SRT. Na primer, pri uporabi naprav, ki vklju čujejo 
usedalnik, bo morda treba upoštevati izgubo trdnih snovi prek iztoka iz 
naprave. Poleg tega je treba predvideti tudi posebne previdnostne ukrepe, 
da se prepre čijo napake zaradi spreminjanja koli čine blata v usedalniku.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1085
 
6. Enote obratujejo pri vsakem izbranem nizu pogojev, in ko je doseženo 
ravnotežje, se v približno treh tednih dobijo povpre čne koncentracije 
preskusne kemikalije v iztokih v stacionarnem stanju in (neobvezno) DOC. Poleg ocene deleža odstranitve preskusne kemikalije in (neobvezno) DOC je v grafični obliki izraženo razmerje med obratovalnimi pogoji naprave in 
koncentracijo v iztoku. Na podlagi tega poskusa se lahko izra čunajo okvirne 
kinetične konstante in napovejo pogoji, v katerih se lahko preskusna kemi ­
kalija obdela.
 
INFORMACIJE O PRESKUSNI KEMIKALIJI 
7. Uporabljata se odstavka 12 in 13 poglavja C.10-A.  
RAVNI USPEŠNO OPRAVLJENEGA PRESKUSA 
8. Uporabljata se odstavka 14 in 15 poglavja C.10-A.  
REFEREN ČNA PRESKUSNA KEMIKALIJA 
9. Uporablja se odstavek 16 poglavja C.10-A.  
PONOVLJIVOST REZULTATOV PRESKUSA 
10. Uporabljata se odstavka 17 in 18 poglavja C.10-A.  
OPIS METODE  
Naprava  
11. Primerna enota je modificirani sistem poroznih posod (Dodatek 6.1). Sesta ­
vlja ga notranja posoda (ali vložek), narejena iz poroznega polipropilena debeline 3,2 mm in z velikostjo por približno 90 μm, stik pa je soležno 
čelno zvarjen. (Enota je tako bolj robustna kot tista, opisana v odstavku 
21 tega poglavja C.10-A.) Vložek je vstavljen v neprepustno zunanjo posodo iz polietilena, ki je sestavljena iz dveh delov: krožnega podnožja, v katero so izvrtane luknje za dva voda za zrak in vod za odstranjevanje odve čnega 
blata, ter zgornjega valja, ki je z vijaki pritrjen na podnožje in ima odvod 
nameščen tako, da omogo ča znano prostornino (3 l) v porozni posodi. Eden 
od vodov za zrak je opremljen z difuzorjem, drugi pa je odprt in postavljen pravokotno na difuzor v posodi. Ta sistem proizvaja potrebno vrtin čenje za 
zagotovitev, da je vsebina posode popolnoma premešana in da so zagoto ­
vljene koncentracije raztopljenega kisika, ki so ve čje od 2 mg/l. 
12. Ustrezno število enot se vzdržuje pri nadzorovani temperaturi v razponu 5 do 
20 °C (± 1 °C) bodisi v vodnih kopelih bodisi v prostorih s stalno tempera ­
turo. Potrebni sta črpalki za odmerjanje raztopine preskusne kemikalije in 
usedenega blata v prezra čevalne posode s potrebnim pretokom (0–1,0 ml/min 
oziroma 0–25 ml/min) ter tretja črpalka za odstranjevanje odpadnega blata iz 
prezračevalnih posod. Potreben zelo majhen pretok odpadnega blata se 
doseže s črpalko, ki je nastavljena na ve čji pretok in deluje v presledkih z 
uporabo časovnega stikala, npr. delovanje 10 sekund na minuto, pretok 
črpalke 3 ml/min, s čimer se doseže pretok odve čnega blata 0,5 ml/min.
 
Naprava za filtriranje ali centrifuga  
13. Uporablja se odstavek 23 poglavja C.10-A.  
Analitska oprema  
14. Uporablja se odstavek 24 poglavja C.10-A.  
Voda  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1086
 
15. Uporabljata se odstavka 25 in 26 poglavja C.10-A.  
Organski medij  
16. Uporablja se odstavek 27 poglavja C.10-A.  
Sintetična odpadna voda  
17. Uporablja se odstavek 28 poglavja C.10-A.  
Gospodinjska odpadna voda  
18. Uporablja se odstavek 29 poglavja C.10-A.  
Aktivno blato  
19. Uporablja se odstavek 30 poglavja C.10-A.  
Založne raztopine preskusne kemikalije  
20. Uporabljata se odstavka 31 in 32 poglavja C.10-A.  
POSTOPEK  
Priprava inokuluma  
21. Uporablja se samo odstavek 34 poglavja C.10-A – uporaba aktivnega blata 
(približno 2,5 g/l).  
Število preskusnih enot  
22. Pri preprostem preskusu, pri katerem se izmeri delež odstranitve, je potreben 
samo en SRT, da pa bi dobili podatke, potrebne za izra čun okvirnih kineti ­ 
čnih konstant, pa so potrebne 4 ali 5 vrednosti SRT. Obi čajno se izberejo 
vrednosti od 2 do 10 dni. Pripravno je izvesti preskus pri 4 ali 5 SRT 
sočasno pri eni temperaturi; pri obsežnejših raziskavah se iste vrednosti 
SRT ali morda razli čen razpon vrednosti uporabijo pri drugih temperaturah 
v razponu od 5 do 20 °C. Za primarno biološko razgradnjo (glavna uporaba) 
je običajno potrebna samo ena enota na niz pogojev. Vendar je za kon čno 
biološko razgradljivost za vsak niz pogojev potrebna kontrolna enota, v katero se dovaja odpadna voda, ne pa tudi preskusna kemikalija. Če se 
domneva, da je v uporabljeni odpadni vodi preskusna kemikalija, je treba 
pri oceni primarne biološke razgradnje uporabiti kontrolne enote in opraviti 
potrebne popravke v izra čunih.
 
Odmerjanje organskega medija in preskusne kemikalije  
23. Uporabljajo se odstavki 36 do 39 poglavja C.10-A, vendar je treba upošte ­
vati, da se raztopina preskusne kemikalije odmerja lo čeno in da se upora ­
bljajo razli čni pretoki odve čnega blata. Pogosto je treba tudi spremljati in po 
potrebi prilagoditi – za ± 10 % – pretok pritokov, iztokov in odstranjevanja 
odvečnega blata, npr. dvakrat na dan. Če se pri uporabi gospodinjske 
odpadne vode pojavijo težave pri analitskih metodah, je treba preskus izvesti s sintetično odpadno vodo, vendar je treba zagotoviti, da razli čni mediji 
dajejo primerljive kineti čne podatke.
 
Ravnanje z enotami z aktivnim blatom  
24. Uporabljajo se odstavki 40 do 43 poglavja C.10-A, vendar je treba SRT 
nadzorovati samo s „konstantnim“ pretokom odve čnega blata.  
Vzorčenje in analiza  
25. Uporabljajo se odstavki 44 do 50 poglavja C.10-A, le da je treba dolo čiti 
koncentracijo preskusne kemikalije, poljubno pa tudi DOC; KPK naj se ne bi 
uporabljal.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1087
 
PODATKI IN PORO ČANJE  
Obdelava rezultatov  
26. Uporabljajo se odstavki 52 do 54 poglavja C.10-A.  
Izražanje rezultatov preskusa  
27. Uporabljajo se odstavki 56 do 62 poglavja C.10-A.  
Izračun kineti čnih konstant  
28. Realneje je navesti srednjo koncentracijo preskusne kemikalije v iztoku v 
stacionarnem stanju in opisati, kako se spreminja glede na obratovalne 
pogoje v napravi, kot navesti delež primarne biološke razgradnje. To se 
lahko stori z ena čbo (6) iz Dodatka 6.2, s katero lahko dobimo vrednosti 
za K  S , μ m in θ SC , kritični zadrževalni čas blata. 
(Približne vrednosti K  S in μm se lahko dobijo tudi s preprostim ra čunalni­ 
škim programom, ki teoreti čno krivuljo, izra čunano z ena čbo 2 (Dodatek 
6.2), prilagodi dobljenim poskusnim vrednostim. Čeprav nobena dana rešitev 
ne bo edinstvena, je mogo če dobiti razumen približek K  S in μ m .) 
Variabilnost rezultatov  
29. Iz izkušenj je znano, da se za posamezne kemikalije dobijo variabilne vred ­
nosti kineti čnih parametrov. Domneva se, da pogoji, v katerih je bilo blato 
gojeno, in pogoji, ki vladajo pri uporabljenem preskusu (kot v odstavku 5 in pri drugih preskusih), zelo vplivajo na dobljene vrednosti. En vidik te varia ­
bilnosti so obravnavali Grady idr. (4), ki so predlagali, da je treba za dvoje 
skrajnih stanj, ki predstavljata meje fiziološkega stanja, ki ga kultura lahko doseže med kineti čnim poskusom, uporabiti izraza „obstoje če“ in „intrinzi ­ 
čno“ uporabiti za dvoje skrajnih pogojev, Če se stanje med preskusom ne 
sme spremeniti, vrednosti kineti čnega parametra izražajo pogoje v okolju, iz 
katerega so bili mikroorganizmi vzeti; te vrednosti se imenujejo „obstoje če“ 
ali trenutne. V drugem skrajnem primeru, če so pogoji pri preskusu taki, da 
omogočajo popoln razvoj sistema za sintezo beljakovin, ki omogo ča največjo 
mogočo hitrost rasti, se za dobljene kineti čne parametre šteje, da so „intrin ­
zični“, ter so odvisni samo od narave substrata in vrst bakterij v kulturi. Na 
primer, obstoje če vrednosti bodo dobljene z ohranjanjem nizkega razmerja 
med koncentracijo substrata in kompetentnimi mikroorganizmi (S
 o /X o ), npr. 
0,025, intrinzi čne vrednosti pa nastopajo, ko je to razmerje visoko, npr. vsaj 
20. V obeh primerih mora biti S  o enak ustrezni vrednosti konstante polovi ­ 
čnega nasi čenja Ks ali jo presegati. 
30. Variabilnost in druge plati kinetike biološke razgradnje so bile obravnavane 
na nedavni delavnici SETAC (5). Iz takih raziskav, objavljenih in na črtova­
nih, bi moral izhajati jasnejši pogled na kinetiko, ki deluje v čistilnih napra ­
vah, da bi bilo mogo če bolje razlagati podatke in predlagati ustreznejše 
načrte za prihodnje preskusne metode.  
VIRI:  
(1) Birch, R. R. (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII 
Jornado Com. Espanol Deterg.: 33–48. 
(2) Birch, R. R. (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 
61(2): 340–343. 
(3) Birch, R. R. (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during 
sewage treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411–422.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1088
 
(4) Grady, C. P. L, Smets, B. F., in Barbeau, D. S. (1996). Variability in kinetic 
parameter estimates: A review of possible causes and a proposed termino ­
logy. Wat. Res., 30 (3): 742–748. 
(5) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Delavnica v Port Sunlightu, ZK. Ur. Hales, S. G., Feitjel, T., King, H., Fox, K., Verstraete, W., 4.–6. sept. 1996. SETAC Europe, Bruselj.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1089
 
Dodatek 6.1  
Porozna posoda z nadzorom SRT
  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1090
 
Dodatek 6.2  
Izračun kineti čnih konstant  
1. Ob predpostavki, da se uporablja Monodova kinetika, in ob upoštevanju 
masne bilance aktivnih trdnih snovi in substrata v sistemu z aktivnim blatom (1) je mogo če dobiti naslednji ena čbi, ki opisujeta stacionarno stanje:
 
1 
θ s ¼ μ m · S 1 
K s þ S 1 Ä K d [1] 
ali 
S 1 ¼ K s · ð1 þ K d · θ s Þ 
θ s · ðμ m Ä K d Þ Ä 1 [2] 
pri čemer je: 
S 1 = koncentracija substrata v iztoku (mg/l), 
K S = konstanta polovi čnega nasi čenja, koncentracija, pri kateri μ = μ m /2 
(mg/l), 
μ = specifi čna hitrost rasti (d  –1 ), 
μ m = največja vrednost μ m (d –1 ), 
K d = specifična hitrost odmiranja aktivnih trdnih snovi (d  –1 ), 
θ S = srednji zadrževalni čas blata, SRT (d). 
Preučitev te ena čbe vodi do naslednjih ugotovitev: 
(i) koncentracija v iztoku je neodvisna od koncentracije v pritoku (S  0 ); zato 
se delež biološke razgradnje spreminja s koncentracijo v pritoku S  0 ; 
(ii) edini parameter nadzora naprave, ki vpliva na S  1 , je zadrževalni čas 
blata θ S ; 
(iii) za dano koncentracijo v pritoku S  0 obstaja kriti čni zadrževalni čas blata, 
tako da velja:  
1 
θ SC ¼ μ s · S 0 
K s þ S 0 Ä K d [3] 
pri čemer je: 
θ SC = kritični zadrževalni čas blata, pred potekom katerega so mikro ­
organizmi odplaknjeni iz naprave; 
ker so drugi parametri v ena čbi (2) povezani s kinetiko rasti, temperatura 
verjetno vpliva na raven substrata v iztoku in kriti čno starost blata, tj. 
zadrževalni čas blata, potreben za dosego dolo čene stopnje obdelave, bi 
se z zniževanjem temperature pove čeval. 
2. Iz masne bilance trdnih snovi v sistemu poroznih posod in ob predpostavki, 
da je koncentracija trdnih snovi v iztoku iz naprave X  2 nizka v primerjavi s 
koncentracijo v prezra čevalni posodi X  1 , je zadrževalni čas blata:  
θ s ¼ V · X 1 
ðQ 0 Ä Q 1 Þ · X 2 þ Q 1 · X 1 [4] ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1091
 
in 
θ s ¼ V · X 1 
Q 1 · X 1 ¼ V 
Q 1 
pri čemer je: 
V = prostornina prezra čevalne posode (l), 
X 1 = koncentracija trdnih snovi v prezra čevalni posodi (mg/l), 
X 2 = koncentracija trdnih snovi v iztoku (mg/l), 
Q 0 = pretok pritoka (l/d), 
Q 1 = pretok odpadnega blata (l/d). 
Zadrževalni čas blata je torej pri kateri koli predhodno izbrani vrednosti 
mogoče nadzorovati z nadzorom nad pretokom odve čnega blata Q  1 . 
Sklepne ugotovitve 
3. Glavni namen preskusa je torej omogo čiti napovedovanje koncentracije v 
iztoku in s tem ravni preskusne kemikalije v vodi, v katero se dovaja. 
4. Z grafi čnim prikazom S  1 v odvisnosti od θ S je mogoče včasih takoj oceniti 
kritični zadrževalni čas blata θ SC , npr. krivulja 3 na sliki 1. Če to ni mogo če, 
se θ SC , skupaj s približnima vrednostma μ m in K  S , lahko izra čuna z grafi čnim 
prikazom S  1 v odvisnosti od S  1 •θ S . 
Enačba (1) se preoblikuje takole:  
S 1 · θ s 
1 þ θ s · K d ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [5] 
Če je K  d majhen, potem 1 + θ s • K  d ~ 1 in [5] se spremeni v naslednjo 
enačbo: 
S 1 · θ s ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [6] 
Grafični prikaz bi torej moral biti ravna črta (glej sliko 2) z naklonom 1/ μ m 
in sečiščem K  S /μ m ; tudi θ S ~1/μ m . ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1092
 
Slika 1  
Tri temperature; pet SRT
  
Slika 2  
Regresijska premica SRT · S 1 v odvisnosti od S  1 pri T = 5 °C
  
Glosar:  
Koncentracija v iztoku Krivulja
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1093
 
Dodatek 7  
PRESKUS PRI NIZKIH KONCENTRACIJAH ( μg/l) 
1. Številne kemikalije so obi čajno v vodnem okolju in celo v odpadnih vodah 
v zelo nizkih koncentracijah ( μg/l). Pri takih koncentracijah verjetno ne 
delujejo kot primarni substrati za rast, ampak se verjetneje razgradijo kot sekundarni substrati, ki ne posredujejo pri rasti, so časno z vrsto naravno 
prisotnih ogljikovih snovi. Posledi čno razgradnja takih kemikalij ni primerna 
za model, opisan v Dodatku 6. Uporabiti bi bilo mogo če številne modele, v 
pogojih, ki vladajo v sistemih za čiščenje odpadnih voda, pa lahko so časno 
deluje ve č kot en model. Za osvetlitev te težave bo potrebnih veliko ve č 
raziskav. 
2. Medtem se lahko uporablja postopek, naveden v glavnem besedilu (poglavje 
C.10-A), vendar samo za primarno biološko razgradljivost, pri čemer se 
uporabijo primerno nizke koncentracije (< 100 μg/l) in potrjen analitski 
postopek. Delež biološke razgradnje se lahko izra čuna (glej odstavek 54 
preskusne metode), če se upoštevajo abioti čni procesi (adsorpcija, hlapnost 
itd.). Primer je raziskava Nyholma in njegovih sodelavcev (1) (2), pri kateri je bil uporabljen 4-urni ciklus v sistemu „napolni in izprazni“. Poro čali so o 
konstantah psevdo prvega reda za 5 kemikalij, dodanih v sinteti čno odpadno 
vodo pri koncentraciji 5 do 100 μg/l. (Za dokon čno biološko razgradljivost 
se lahko uporabijo preskusne kemikalije, ozna čene s
 14 C.) Opis tega presega 
obseg uporabe te preskusne metode, saj za zdaj še ni dogovorjenih postop ­
kov, čeprav predlagana metoda za standard ISO 14592 (3) vsebuje navodilo 
za uporabo kemikalij, ozna čenih s  14 C. 
Preskus SCAS  
3. Pozneje je bil predlagan preprostejši dvostopenjski preskus (4) (5) (6); 
metodi polkontinuiranega aktivnega blata (SCAS) sledijo kratkoro čni kine­
tični preskusi na vzorcih, odvzetih iz enot SCAS. Sistem SCAS deluje z 
znanimi hitrostmi odstranjevanja odve čnega blata (v nasprotju s prvotno 
preskusno metodo iz poglavja C.12), vanj pa se dovaja spremenjena sinte ­
tična odpadna voda OECD ali gospodinjska odpadna voda. Sinteti čna 
odpadna voda je bila spremenjena (zaradi spremenljive vrednosti pH in 
slabe usedljivosti blata) z dodatkom fosfata kot puferja, kvasnega ekstrakta, železovega (III) klorida in soli elementov v sledovih, njen COD pa je bil povečan na približno 750 mg/l s pove čanjem koncentracije peptona in 
mesnega ekstrakta. Enote so delovale v 24-urnem ciklu: prezra čevanje 23 
ur, odstranjevanje odve čnega blata, usedanje, odvzem supernatanta (iztok), 
ki jim sledi dodajanje sinteti čne odpadne vode in preskusne kemikalije do 
100 μg/l (tj. pri približno enaki koncentraciji kot pri kratkoro čnem presku ­
su). Enkrat tedensko je bilo 10 % vsega blata nadomeš čenih s svežim 
blatom, da se je ohranila uravnotežena mikrobna populacija. 
4. Koncentracije preskusne kemikalije se izmerijo na za četku in koncu prezra ­ 
čevanja, preskus pa se nadaljuje, dokler ni doseženo konstantno odstranje ­
vanje preskusne kemikalije; to traja od enega tedna do ve č mesecev.
 
Kratkoro čni preskus  
5. Kratkoro čni preskus (npr. 8 ur) se uporabi za dolo čitev konstante kinetike 
(psevdo) prvega reda za razgradnjo preskusne kemikalije v aktivnem blatu znanega, a razli čnega izvora in razvoja. Zlasti se vzorci blata vzamejo iz 
reaktorjev SCAS – ob koncu prezra čevalnega obdobja, ko je koncentracija 
organskega substrata nizka – med potekom poskusa aklimatizacije (odstavka 
3 in 4). Blato se za primerjavo lahko vzame tudi iz vzporedne enote SCAS,
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1094
 
ki ni bila izpostavljena preskusni kemikaliji. Mešanice blata in preskusne 
kemikalije, dodane pri dveh ali ve č koncentracijah v razponu 1–50 μg/l, se 
prezračijo, ne da bi se dodala sinteti čna odpadna voda ali drug organski 
substrat. Preskusna kemikalija, ki ostane v raztopini, se dolo ča v rednih 
presledkih, npr. vsako uro, odvisno od razgradljivosti kemikalije, vendar 
ne več kot 24 ur. Vzorci se pred ustrezno analizo centrifugirajo.  
Izračuni 
6. Podatki iz enot SCAS se uporabijo za izra čun deleža odstranitve preskusne 
kemikalije (odstavek 54). Izra čuna se lahko tudi povpre čna hitrostna 
konstanta K  1 (normalizirana za koncentracijo suspendiranih trdnih snovi), 
za kar se uporabi ena čba: 
K 1 ¼ 1=t · ln C e 
C i · 1=SSð1=g hÞ 
pri čemer je: 
t = čas prezračevanja (23h), 
C e = koncentracija ob koncu prezra čevalnega obdobja ( μg/l), 
C i = koncentracija na za četku prezra čevanja (μg/l), 
SS = koncentracija trdnih snovi v aktivnem blatu (g/l). 
7. Pri kratkoro čnem preskusu se log% preostale koncentracije grafi čno prikaže 
v odvisnosti od časa, naklon za četnega dela (10–50-odstotna razgradnja) 
krivulje pa je enak K  1 , konstanti (psevdo) prvega reda. Konstanta se norma ­
lizira glede na koncentracijo trdnih snovi v blatu z delitvijo naklona s 
koncentracijo trdnih snovi v blata. Prikazani rezultat mora vklju čevati tudi 
podrobnosti o za četnih koncentracijah preskusne kemikalije in trdnih snovi, 
zadrževalnem času blata, nalaganju blata in viru ter podrobnosti o (morebi ­
tni) predhodni izpostavljenosti preskusni kemikaliji.  
Variabilnost rezultatov  
8. Variabilnost in druge plati kinetike biološke razgradnje so bile obravnavane 
na nedavni delavnici SETAC (7). Iz takih raziskav, objavljenih in na črto­
vanih, bi moral izhajati jasnejši pogled na kinetiko, ki deluje v čistilnih 
napravah, da bi bilo mogo če bolje razlagati podatke in predlagati ustreznejše 
načrte za prihodnje preskusne metode.  
VIRI:  
(1) Nyholm, N., Jacobsen, B. N., Pedersen, B. M., Poulsen, O., Dambourg, A., 
in Schultz, B. (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated 
sludge reactors. Biodegradability. Wat. Res. 26: 339–353. 
(2) Jacobsen, B. N., Nyholm, N., Pedersen, B. M., Poulsen, O., in Ostfeldt, P. 
(1993). Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 
1505–1510. 
(3) ISO 14592 (ISO/TC 147/ SC5/ WG4, N264) (1998). Kakovost vode – 
Vrednotenje aerobne biorazgradljivosti organskih spojin pri nizkih koncen ­
tracijah v vodi.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1095
 
(4) Nyholm, N., Ingerslev, F., Berg, U. T., Pedersen, J. P., in Frimer-Larsen, H. 
(1996). Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals 
in activated sludge waste water treatment plants using short-term batch expe ­
riments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851–864. 
(5) Berg, U. T., in Nyholm, N. (1996). Biodegradability simulation Studies in 
semi-continuous activated sludge reactors with low ( μg/l range) and standard 
(ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711–735. 
(6) Danish Environmental Protection Agency. (1996). Activated sludge biode ­
gradability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm, N., Berg, U. T., Ingerslev, F. Min. of Env. and Energy, Köbenhavn. 
(7) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Delavnica v Port Sunlightu, Združeno kraljestvo. Ur. Hales, 
S. G, Feitjel, T., King, H., Fox, K., in Verstraete, W., 4.–6. sept. 1996. SETAC Europe, Bruselj.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1096
 
C.10-B: Biofilmi  
UVOD 
1. Simulacijski preskusi se obi čajno uporabljajo za kemikalije, ki niso uspešno 
opravile presejalnega preskusa za dobro biološko razgradljivost (poglavje C.4-A do F te priloge (9)), vendar so uspešno opravile preskus za inherentno biološko razgradljivost. Simulacijski preskusi se izjemoma uporabijo tudi za 
kemikalijo, o kateri je potrebnih ve č informacij, zlasti za kemikalije, ki se 
proizvajajo v velikih koli činah; obi čajno se uporabi preskus z aktivnim 
blatom (C.10-A). Vendar pa so v nekaterih okoliš činah potrebne posebne 
informacije o odzivanju kemikalije na metode čiščenja odpadne vode, ki 
vključujejo biofilme, to so precejalniki, rotirajo či biološki kontaktorji in 
reaktorji s tehnologijo vrtin čnih plasti. Za izpolnitev te potrebe so bile 
razvite razli čne naprave. 
2. Gerike idr. (1) so uporabili velike precejalnike v pilotnem merilu, ki so 
delovali v spojenem na činu. Ti filtri so zavzeli veliko prostora in zahtevali 
razmeroma veliko odpadne vode ali sinteti čne odpadne vode. Truesdale idr. 
(2) so opisali manjše filtre (premer 1,83 × 1,83 metra), v katere so dovajali naravno odpadno vodo brez površinsko aktivnih snovi, vendar so bile še 
vedno potrebne razmeroma velike koli čine. Za nastanek „zrelega“ biofilma 
je bilo potrebnih kar 14 tednov, dodatnih 4 do 8 tednov pa je bilo potrebnih za začetek aklimatizacije po prvem vnosu preskusne površinsko aktivne 
snovi. 
3. Baumann idr. (3) so razvili mnogo manjši filter, za katerega so kot nosilni 
inertni medij uporabili umetno volno iz poliestra, predhodno namo čeno v 
aktivno blato. Preskusna kemikalija je bila uporabljena kot edini vir ogljika, biološka razgradljivost pa je bila ocenjena na podlagi meritev raztopljenega 
organskega ogljika (DOC) v pritoku in iztoku ter koli čine CO
 2 v izhodnem 
plinu. 
4. Precej druga čen pristop so uporabili Gloyna idr. (4), ki so izumili rotirajo či 
cevni reaktor. Na notranji površini rotirajo če cevi so na znani površini 
vzgojili biofilm, tako da so z vrha cevi, ki je bila pod majhnim kotom 
nagnjena glede na vodoravno površino, spuš čali pritok. Reaktor se je upora ­
bljal za preu čevanje biološke razgradljivosti površinsko aktivnih snovi (5), 
pa tudi za preu čevanje optimalne debeline biofilma in difuzije prek njega 
(6). Slednji avtorji so reaktor razvijali dalje, med drugim so ga spremenili 
tako, da je mogo če določiti CO  2 v izhodnem plinu. 
5. Stalni odbor analitikov (Združeno kraljestvo) je rotirajo či cevni reaktor 
sprejel kot standardno metodo za oceno biološke razgradljivosti kemikalij (7), možnosti čiščenja odpadnih voda in njihove strupenosti (8). Prednosti 
opisane metode so preprostost, pripravnost, ponovljivost in potrebne razme ­
roma majhne koli čine organskega medija.
 
NAČELO PRESKUSA 
6. Sinteti čna ali gospodinjska odpadna voda in preskusna kemikalija se v 
mešanici ali posamezno naneseta na notranjo površino po časi rotirajo če 
nagnjene cevi. Na notranji površini se ustvari plast mikroorganizmov, podobnih mikroorganizmom na mediju biološkega filtra. Izberejo se pogoji 
delovanja reaktorja, da se doseže ustrezna odstranitev organske snovi in po 
potrebi oksidacija amonija.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1097
 
7. Iztok iz cevi se zbere in pusti, da se usede, in/ali filtrira pred analizo za 
določitev raztopljenega organskega ogljika (DOC) in/ali preskusne kemika ­
lije s posebno metodo. Kontrolne enote, v katere se preskusna kemikalija ne dovaja, zaradi primerjave obratujejo vzporedno v enakih pogojih. Domneva se, da razlika med koncentracijami DOC v iztoku iz preskusne in kontrolne 
enote nastane zaradi preskusne kemikalije in njenih organskih metabolitov. 
Ta razlika se primerja s koncentracijo dodane preskusne kemikalije (kot DOC), da se izra čuna odstranitev preskusne kemikalije. 
8. Biološko razgradnjo je obi čajno mogo če ločiti od biološke adsorpcije s 
skrbno preu čitvijo časovne krivulje odstranitve. Obi čajno jo je mogo če 
potrditi s preskusom dobre biološke razgradljivosti (poraba kisika ali nasta ­
janje ogljikovega dioksida), pri katerem se uporabi aklimatizirani inokulum, 
ob koncu preskusa vzet iz reaktorjev, v katere se dovaja preskusna kemi ­
kalija.
 
INFORMACIJE O PRESKUSNI KEMIKALIJI 
9. Za pravilno razlago rezultatov morajo biti znani čistost, vodotopnost, hlap ­
nost in adsorpcijske lastnosti preskusne kemikalije. 
10. Običajno hlapnih in slabo topnih kemikalij ni mogo če preskusiti, če se ne 
sprejmejo posebni previdnostni ukrepi (glej Dodatek 5 k poglavju C.10-A). Za izračun teoreti čnih vrednosti in/ali preverjanje izmerjenih vrednosti para ­
metrov, npr. teoreti čne potrebe po kisiku (TPK) in DOC, je treba poznati 
tudi kemi čno strukturo ali vsaj empiri čno formulo. 
11. Informacije o strupenosti preskusne kemikalije za mikroorganizme (glej 
Dodatek 4 k poglavju C.10-A) so lahko uporabne za izbiro primernih preskusnih koncentracij in so lahko bistvene za pravilno razlago nizkih vrednosti biološke razgradljivosti.
 
RAVNI USPEŠNO OPRAVLJENEGA PRESKUSA 
12. Prvotno se je zahtevalo, da primarna biološka razgradnja površinsko 
aktivnih snovi doseže 80 % ali ve č, preden se lahko kemikalija da na trg. 
Če 80-odstotna vrednost ni dosežena, se lahko uporabi ta simulacijski (potr ­
ditveni) preskus, površinsko aktivna snov pa se lahko da na trg samo, če je 
odstranjenih ve č kot 90 % dolo čene kemikalije. Pri kemikalijah na splošno 
ni dvoma o uspešno ali neuspešno prestanem preskusu, dobljena vrednost odstranjenega odstotnega deleža pa se lahko uporabi v približnih izra čunih 
verjetne okoljske koncentracije, ki se uporablja pri ocenah nevarnosti, ki jo 
pomenijo kemikalije. V vrsti raziskav čistih kemikalij je bilo ugotovljeno, da 
je bil delež odstranitve DOC > 90-odstotni pri ve č kot treh četrtinah in > 80- 
odstotni pri ve č kot 90 % kemikalij, ki so pokazale kakršno koli pomembno 
stopnjo biološke razgradljivosti.
 
REFEREN ČNE KEMIKALIJE 
13. Za zagotovitev pravilnega izvajanja poskusnega postopka je ob časno kori ­
stno preskusiti referen čne kemikalije, katerih obnašanje je znano. Med 
takimi kemikalijami so adipinska kislina, 2-fenilfenol, 1-naftol, difenil-2,2- dikarboksilna kislina, 1-karboksi naftalenska kislina itd. (9) (10) (11).
 
PONOVLJIVOST REZULTATOV PRESKUSA 
14. Po ugotovitvah laboratorija iz Združenega kraljestva je relativni standardni 
odklon v preskusih 3,5-odstotni, med preskusi pa 5-odstotni (7).  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1098
 
OPIS METODE  
Naprava  
Rotirajoči cevni reaktorji  
15. Naprava (glej sliki 1 in 2 v Dodatku 8) je sestavljena iz niza akrilnih cevi z 
dolžino 30,5 cm in notranjim premerom 5 cm, oprtih na kolesca z gumija ­
stim robom v kovinskem nosilnem okvirju. Vsaka cev ima zunanji rob, globok približno 0,5 cm, ki jo drži na kolescih, notranja površina je bila hrapavljena z grobo ži čnato volno, na zgornjem (dovodnem) koncu pa je 
0,5 cm globok notranji rob, ki zadržuje teko čino. Cevi so nagnjene pod 
kotom približno 1 stopinje glede na vodoravno površino, da se doseže potrebni kontaktni čas, ko je preskusni medij vnesen v čisto cev. Kolesca 
z gumijastim robom poganja motor s po časno spremenljivo hitrostjo. 
Temperatura cevi se nadzoruje s postavitvijo v prostor s konstantno tempe ­
raturo. 
16. Z vstavitvijo vsakega cevnega reaktorja v nekoliko ve čjo cev, zaprto s 
pokrovom, ter zagotovitvijo, da so stiki neprepustni za plin, je mogo če v 
bazični raztopini zbrati izhodni CO
 2 za nadaljnje meritve (6). 
17. 24-urna zaloga organskega medija z dodano preskusno kemikalijo, če je 
ustrezno, za vsako cev je shranjena v 20-litrski posodi za shranjevanje (A) (glej sliko 2). Raztopina preskusne kemikalije se po potrebi 
lahko odmerja lo čeno. Pri dnu vsake posode za shranjevanje je izhod, ki je s 
cevjo iz primernega materiala, npr. silikonske gume, prek peristalti čne 
črpalke (B) povezan s stekleno ali akrilno dovodno cevjo, ki je potisnjena 
2–4 cm v notranjost višjega (dovodnega) konca nagnjene cevi (C). Iztok 
kaplja iz spodnjega konca nagnjene cevi in se zbira v drugi posodi za 
shranjevanje (D). Pred analizo se usede ali filtrira.
 
Naprava za filtriranje ali centrifuga  
18. Naprava za filtriranje vzorcev z membranskimi filtri ustrezne poroznosti 
(nazivni premer odprtine 0,45 μm), ki adsorbirajo organske kemikalije ali 
sprostijo čim manj organskega ogljika. Če se uporabljajo filtri, ki sproš čajo 
organski ogljik, jih je treba skrbno sprati z vro čo vodo, da se odstrani 
izlužljivi organski ogljik. Namesto tega se lahko uporabi centrifuga, ki 
lahko doseže 40 000 m/s  2 . 
19. Analitska oprema za dolo čanje: 
— DOC/celotnega organskega ogljika (TOC) ali kemijske potrebe po 
kisiku (KPK), 
— določene kemikalije (HPLC, GC itd.), če se to zahteva, 
— vrednosti pH, temperature, kislosti, bazi čnosti, 
— amonija, nitrita, nitrata, če se preskus izvaja v nitrifikacijskih pogojih.  
Voda  
20. Vodovodna voda, ki vsebuje manj kot 3 mg/l DOC. 
21. Destilirana ali deionizirana voda, ki vsebuje manj kot 2 mg/l DOC.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1099
 
Organski medij  
22. Kot organski medij so lahko uporabijo sinteti čne odpadne vode, gospo ­
dinjske odpadne vode ali mešanica obojih. Izkazalo se je, da je pri uporabi samo gospodinjske odpadne vode delež odstranitve DOC pogosto ve čji (v 
enotah z aktivnim blatom) in da celo omogo ča biološko razgradnjo nekaterih 
kemikalij, ki se biološko ne razgradijo, kadar se uporabi sinteti čna odpadna 
voda OECD. Zato se priporo ča uporaba gospodinjske odpadne vode. 
Koncentracijo DOC (ali KPK) je treba izmeriti v vsaki novi šarži organ ­
skega medija. Kislost ali bazi čnost organskega medija mora biti znana. 
Mediju bo morda treba dodati primeren pufer (natrijev hidrogen karbonat ali kalijev hidrogen fosfat), če je njegova kislost ali bazi čnost nizka, da se 
med preskusom vrednost pH v reaktorju ohranja pri približno 7,5 ± 0,5. O 
količini puferja, ki jo je treba dodati, in času, ko ga je treba dodati, je treba 
odločiti v vsakem primeru posebej.
 
Sintetična odpadna voda  
23. V vsakem litru vodovodne vode je treba raztopiti: 160 mg peptona; 110 mg 
mesnega ekstrakta; 30 mg se čnine; 28 mg brezvodnega dikalijevega 
hidrogen fosfata (K  2 HPO  4 ); 7 mg natrijevega klorida (NaCl); 4 mg kalcije ­
vega klorid dihidrata (CaCl  2 .2H  2 O) in 2 mg magnezijevega sulfat heptahi ­
drata (Mg  2 SO 4 .7H  2 0). Ta sinteti čna odpadna voda OECD je primer in pred ­
stavlja srednjo koncentracijo DOC v pritoku, tj. približno 100 mg/l. Upora ­
bijo se lahko tudi druge sestave s približno enakimi koncentracijami DOC, 
ki so bolj podobne pravi odpadni vodi. Ta sinteti čna odpadna voda se lahko 
pripravi v destilirani vodi v koncentrirani obliki in shranjuje najve č en teden 
pri približno 1 °C. Po potrebi se razred či z vodovodno vodo. (Ta medij je 
nezadovoljiv, npr. koncentracija dušika je zelo visoka, vsebnost ogljika je 
razmeroma nizka, vendar ni bilo boljšega predloga, razen, naj se doda ve č 
fosfata kot puferja in ve č peptona.)  
Gospodinjska odpadna voda  
24. Uporabiti je treba svežo usedeno odpadno vodo, ki se dnevno zbira iz 
čistilne naprave, v katero se dovaja pretežno gospodinjska odpadna voda. 
Zbrati jo je treba iz prelivnega kanala primarnega usedalnika ali vtoka v 
čistilno napravo z aktivnim blatom, biti pa mora ve činoma brez grobih 
delcev. Odpadna voda se lahko uporabi po ve čdnevnem shranjevanju pri 
približno 4 °C, če je dokazano, da se DOC (ali KPK) med shranjevanjem ni 
bistveno zmanjšal (tj. za manj kot 20 %). Da se omejijo motnje v sistemu, je 
treba DOC (ali KPK) vsake nove šarže pred uporabo uravnati na ustrezno 
konstantno vrednost, npr. z red čenjem z vodovodno vodo.  
Mazivo  
25. Za mazanje valj čkov peristalti čne črpalke se lahko uporablja glicerol ali 
oljčno olje: oba sta primerna za uporabo pri ceveh iz silikonske gume.  
Založne raztopine preskusne kemikalije  
26. Za kemikalije z ustrezno topnostjo je treba pripraviti osnovne raztopine z 
ustreznimi koncentracijami (npr. 1 do 5 g/l) v deionizirani vodi ali mine ­
ralnem deležu sinteti čne odpadne vode. Za netopne kemikalije glej Dodatek 
5 v poglavju C.10-A. Ta metoda brez sprememb cevnih reaktorjev ni 
primerna za hlapne kemikalije (odstavek 16). Dolo čiti je treba DOC in 
TOC osnovne raztopine, meritve pa ponoviti za vsako novo šaržo. Če je 
razlika med DOC in TOC ve čja od 20 %, je treba preveriti vodotopnost 
preskusne kemikalije. DOC ali koncentracijo preskusne kemikalije, izmer ­
jeno s specifi čno analizo osnovne raztopine, je treba primerjati z nazivno  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1100
 
vrednostjo, da se ugotovi, ali je izkoristek dovolj dober (obi čajno je mogo če 
pričakovati > 90-odstotnega). Zlasti za disperzije je treba ugotoviti, ali je 
mogoče DOC uporabiti kot analitski parameter ali ne oziroma ali je mogo če 
uporabiti samo analitsko tehniko, specifi čno za preskusno kemikalijo. Za 
disperzije je potrebno centrifugiranje vzorcev. Pri vsaki novi šarži je treba 
s specifično analizo izmeriti DOC, KPK ali koncentracijo preskusne kemi ­
kalije. 
27. Dolo čiti je treba pH osnovne raztopine. Skrajne vrednosti kažejo, da dodatek 
kemikalije lahko vpliva na pH aktivnega blata v preskusnem sistemu. V 
takem primeru je treba osnovno raztopino nevtralizirati z majhnimi koli či­
nami anorganske kisline ali baze, da se doseže vrednost pH 7 ± 0,5, vendar pa je treba prepre čiti obarjanje preskusne kemikalije.
 
POSTOPEK  
Priprava organskega medija za odmerjanje  
28. Zagotoviti je treba, da so vsi vsebniki pritoka in iztoka ter cevi, ki vodijo iz 
posod za pritok in vanje, povsem čisti, da se prepre či rast mikrobov na 
začetku in med celotnim preskusom. 
29. Vsak dan je treba pripraviti svežo sinteti čno odpadno vodo (odstavek 23), 
bodisi iz trdnih snovi bodisi iz koncentrirane osnovne raztopine z ustreznim redčenjem z vodovodno vodo. Potrebno koli čino je treba izmeriti v valju in 
dodati v čisto posodo za pritok. Po potrebi se sinteti čni odpadni vodi pred 
razredčenjem doda tudi potrebna koli čina osnovne raztopine preskusne 
kemikalije ali referen čne kemikalije. Če je bolj pripravno ali potrebno, da 
se prepreči izguba preskusne kemikalije, se pripravi lo čena razred čena razto­
pina preskusne kemikalije v lo čenem zbiralniku in se prek druge dozirne 
črpalke vnese v nagnjene cevi. 
30. Alternativno (in prednostno) se uporabi usedena gospodinjska odpadna voda 
(odstavek 24), po možnosti sveža, zbrana vsak dan.
 
Delovanje rotirajo čih cevnih reaktorjev  
31. Za oceno ene preskusne kemikalije sta potrebna dva enaka cevna reaktorja, 
ki se namestita v prostoru s konstantno temperaturo, ki obi čajno znaša 22 
± 2 °C. 
32. Peristalti čne črpalke je treba nastaviti tako, da dovajajo 250 ± 25 ml/h 
organskega medija (brez preskusne kemikalije) v nagnjene cevi, ki se vrtijo 
pri 18 ± 2 vrtljajih na minuto. Cevi črpalke je treba na za četku preskusa in 
med samim preskusom namazati (odstavek 25), da se podaljša njihova življenjska doba in zagotovi pravilno delovanje. 
33. Kot naklona cevi glede na vodoravno površino je treba nastaviti tako, da se 
zagotovi zadrževalni čas vtoka v čisti cevi 125 ± 12,5 s. Zadrževalni čas se 
oceni tako, da se v vtok doda nebiološki marker (npr. NaCl, inertno barvi ­
lo): čas, potreben za doseganje najvišje koncentracije v iztoku, se šteje za 
srednji zadrževalni čas (ko je film najve čji, se lahko zadrževalni čas poveča 
do približno 30 min). 
34. Za te pretoke, hitrosti in čase je bilo ugotovljeno, da zagotavljajo ustrezno 
odstranitev (> 80-odstotno) DOC (ali KPK) in proizvajajo nitrificirane iztoke. Hitrost pretoka je treba spremeniti, če odstranitev ni zadostna ali 
če je treba simulirati delovanje dolo čene čistilne naprave. V tem primeru 
je treba hitrost odmerjanja organskega medija prilagajati, dokler se delovanje 
reaktorja ne ujema z delovanjem čistilne naprave.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1101
 
Inokulacija  
35. Kadar se uporabi sinteti čna odpadna voda, lahko za za četek rasti mikroor ­
ganizmov zadostuje inokulacija z izpostavitvijo zraku, sicer je treba vtoku za 3 dni dodati 1 ml/l usedene odpadne vode.
 
Meritve  
36. V rednih presledkih je treba preverjati, ali so stopnje odmerjanja in hitrosti 
rotiranja v okviru zahtevanih meja. Izmeriti je treba tudi pH iztoka, zlasti če 
se pričakuje nitrifikacija.  
Vzorčenje in analiza  
37. Metoda, vzorec in pogostost vzor čenja se izberejo glede na namen preskusa. 
Na primer, vzamejo se enkratni (ali zajemni) vzorci pritoka in iztoka ali pa 
se vzorci zbirajo dlje, npr. 3 do 6 ur. V prvem obdobju brez preskusne 
kemikalije je treba vzorce jemati dvakrat tedensko. Treba jih je filtrirati skozi membrane ali jih približno 15 minut centrifugirati pri približno 40 000 m/s
 2 (odstavek 18). Morda jih bo treba pred filtriranjem skozi 
membrano pustiti, da se usedejo, in/ali jih prefiltirati skozi grobi filter. 
DOC (ali KPK) je treba dolo čiti vsaj v dveh ponovitvah, po potrebi pa 
tudi BPK, amonij in nitrit/nitrat. 
38. Vse analize je treba izvesti čim prej po zbiranju in pripravi vzorcev. Če je 
treba analize odložiti, je treba vzorce shraniti v temnem prostoru v polnih in 
tesno zaprtih steklenicah pri približno 4 °C. Če je treba vzorce shraniti za 
več kot 48 h, jih je treba globoko zamrzniti, acidificirati ali dodati primerno 
strupeno kemikalijo (npr. 20 ml/l raztopine 10 g/l živosrebrovega (II) klori ­
da). Zagotoviti je treba, da tehnika shranjevanja ne vpliva na rezultate 
analize.  
Pripravljalno obdobje  
39. V tem obdobju biofilm na površini raste, da doseže optimalno debelino. To 
obdobje obi čajno traja približno 2 tedna, vendar ne sme prese či 6 tednov. 
Odstranitev (odstavek 44) DOC (ali KPK) se pove ča in doseže vrednost 
konstantne ravni. Ko je v obeh ceveh dosežena podobna vrednost 
konstantne ravni, se za preostanek preskusa ena cev izbere za kontrolno. V tem času mora njuno delovanje ostati skladno.
 
Vnos preskusne kemikalije  
40. Na tej stopnji se v drugi reaktor doda preskusna kemikalija pri potrebni 
koncentraciji, ki je obi čajno 10–20 mg C/l. V kontrolno enoto se še naprej 
dovaja samo organski medij.  
Obdobje aklimatizacije  
41. Še naprej je treba dvakrat na teden izvajati analize za dolo čitev DOC (ali 
KPK), in če je treba oceniti primarno biološko razgradljivost, s specifi čno 
analizo izmeriti tudi koncentracijo preskusne kemikalije. Za aklimatizacijo je potrebnih od 1 do 6 tednov (ali ve č v posebnih pogojih) po prvem vnosu 
preskusne kemikalije. Ko delež odstranitve (odstavki 43 do 45) doseže 
najvišjo vrednost, je treba dobiti 12 do 15 veljavnih vrednosti v fazi konstantne ravni v približno 3 tednih, da se oceni srednji delež odstranitve. Preskus se šteje za kon čan, če je dosežena dovolj visoka stopnja odstranitve. 
Običajno preskus ne sme trajati ve č kot 12 tednov po tem, ko je bila prvi č 
dodana preskusna kemikalija.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1102
 
Luščenje filma  
42. Nenadno odstranjevanje velikih koli čin presežnega filma iz cevi ali luš čenje 
poteka v razmeroma rednih presledkih. Za zagotovitev, da to ne vpliva na primerljivost rezultatov, je treba omogo čiti, da preskusi zajemajo vsaj dva 
polna cikla rasti in luš čenja.
 
PODATKI IN PORO ČANJE  
Obdelava rezultatov  
43. Za vsako časovno dolo čeno oceno se izra čuna delež odstranitve DOC (ali 
KPK) preskusne kemikalije, za kar se uporabi ena čba: 
D t ¼ 100½C s Ä ðE Ä E o Þâ=C s % 
pri čemer je: 
D t = delež odstranitve DOC (ali KPK) pri času t, 
Cs = koncentracija DOC (ali KPK) v pritoku zaradi preskusne kemika ­
lije, po možnosti ocenjena na podlagi koncentracije v osnovni 
raztopini in dodane koli čine (mg/l), 
E = izmerjena vrednost DOC (ali KPK) v preskusnem iztoku v času t 
(mg/l), 
Eo = izmerjena vrednost DOC (ali KPK) v kontrolnem iztoku v času t 
(mg/l). 
Izračun se ponovi za referen čno kemikalijo, če se preskuša.  
Delovanje kontrolnega reaktorja  
44. Delež odstranitve DOC (ali KPK) (D  B ) organskega medija v kontrolnem 
reaktorju je koristna informacija pri oceni biorazgradne dejavnosti biofilma 
med preskusom. Delež odstranitve se izra čuna z ena čbo: 
D B ¼ 100ð1 Ä E o=C m Þ% 
pri čemer je: 
Cm = DOC (ali KPK) organskega medija v kontrolnem pritoku (mg/l). 
45. Pri vsaki časovno dolo čeni oceni se izra čuna odstranitev (D  ST ) preskusne 
kemikalije, če je bila izmerjena s specifi čno analitsko metodo, za kar se 
uporabi ena čba: 
DST ¼ 100ð1 Ä Se=SiÞ% 
pri čemer je: 
Si = izmerjena ali raje ocenjena koncentracija preskusne kemikalije v 
preskusnem pritoku (mg/l), 
Se = izmerjena koncentracija preskusne kemikalije v preskusnem iztoku 
v času t (mg/l).  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1103
 
Če je z analitsko metodo dobljena pozitivna vrednost v nespremenjeni 
odpadni vodi enaka S  c mg/l, se delež odstranitve (D  SC ) izračuna z ena čbo: 
DSC ¼ 100ðSi Ä Se þ ScÞ=ðSi þ ScÞ% 
Izražanje rezultatov preskusa  
46. Delež odstranitve D  t in D  ST (ali D  SC ), če je na voljo, se prikaže grafi čno v 
odvisnosti od časa (glej Dodatek 2 k poglavju C.10-A). Vzame se srednji 
(zaokrožen na najbližje celo število) in standardni odklon 12–15 vrednosti za D
 T (in za D  ST , če je na voljo), pridobljenih v fazi konstantne ravni kot 
delež odstranitve preskusne kemikalije. Na podlagi krivulje odstranitve se 
lahko izpeljejo nekatere ugotovitve o procesu odstranjevanja.  
Adsorpcija  
47. Če se velika odstranitev DOC preskusne kemikalije opazi na za četku 
preskusa, se preskusna kemikalija verjetno odstranjuje z adsorpcijo na biofilm. To je mogo če dokazati z dolo čitvijo adsorbirane preskusne kemi ­
kalije na trdnih snoveh, odluš čenih s filma. Odstranitev DOC kemikalij, ki 
se adsorbirajo, redko ostane visoka med celotnim preskusom; po navadi je stopnja odstranitve visoka na za četku, nato pa postopoma pade na ravno ­
težno vrednost. Če pa bi adsorbirana preskusna kemikalija lahko povzro čila 
aklimatizacijo mikrobne populacije, bi se odstranitev DOC preskusne kemi ­
kalije pove čala in dosegla visoko vrednost konstantne ravni.
 
Faza prilagajanja  
48. Kot pri stati čnih presejalnih preskusih je pri številnih preskusnih kemikalijah 
pred popolno biološko razgradnjo potrebna faza prilagajanja. V njej se kompetentne bakterije aklimatizirajo (ali prilagodijo) skoraj brez odstranitve preskusne kemikalije; nato nastopi za četna rast teh bakterij. Ta faza se 
konča, za fazo razgradnje pa se poljubno šteje, da se je za čela, ko je 
odstranjenih približno 10 % za četne koli čine preskusne kemikalije (po 
dopuščeni adsorpciji, če se zgodi). Faza prilagajanja je pogosto zelo spre ­
menljiva in slabo ponovljiva.
 
Faza konstantne ravni  
49. Faza konstantne ravni krivulje odstranjevanja v kontinuiranem preskusu je 
opredeljena kot faza, v kateri je razgradnja najve čja. Trajati mora vsaj 3 
tedne in imeti približno 12–15 izmerjenih veljavnih vrednosti.  
Srednja stopnja odstranitve preskusne kemikalije  
50. Izračuna se srednja vrednost na podlagi vrednosti odstranitve D  t (in D  st , če 
je na voljo) preskusne kemikalije v fazi konstantne ravni. Ta stopnja, ki je zaokrožena na najbližje celo število (1 %), je stopnja odstranitve preskusne kemikalije. Priporo ča se tudi, da se izra čuna 95-odstotni interval zaupanja za 
srednjo vrednost. Podobno se izra čuna tudi srednja stopnja (D
 B ) odstranitve 
organskega medija v kontrolni posodi.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1104
 
Znak biološke razgradnje  
51. Če se preskusna kemikalija ne adsorbira znatno na biofilm in ima krivulja 
odstranitve zna čilno obliko krivulje biološke razgradnje s fazo prilagajanja, 
fazo razgradnje in fazo konstantne ravni (odstavka 48 in 49), je mogo če 
izmerjeno odstranitev zanesljivo pripisati biološki razgradnji. Če se veliko 
preskusne kemikalije odstrani že na za četku, simulacijski preskus ne more 
razlikovati med biološkim in abiotskim procesom odstranitve. V takih in drugih primerih, v katerih obstaja dvom o biološki razgradnji (npr. pri 
ločevanju (stripping)), je treba analizirati adsorbirano preskusno kemikalijo 
na vzorcih filma ali opraviti dodatne stati čne (presejalne) preskuse biološke 
razgradljivosti na podlagi parametrov, ki jasno nakazujejo biološke procese. 
Taki preskusi so metode porabe kisika (poglavje C.4-D, E in F te priloge) 
(9) ali preskus, pri katerem se meri nastajanje CO
 2 (poglavje C.4-C te 
priloge ali metoda nadprostora) (10); kot inokulum se uporabi predhodno izpostavljeni biofilm iz ustreznega reaktorja. 
52. Če sta bili izmerjeni odstranitev DOC in odstranitev specifi čne kemikalije, 
velike razlike med odstranjenimi deleži (pri čemer je prva vrednost nižja od 
druge) kažejo, da so bili v iztokih vmesni organski produkti, ki se morda 
težje razgradijo; to je treba raziskati.
 
Veljavnost rezultatov preskusa  
53. Preskus je treba šteti za veljaven, če je stopnja odstranitve DOC (ali KPK) 
(D B ) v kontrolnih enotah po 2 tednih delovanja > 80-odstotna in če ni bilo 
opaženega ni č nenavadnega. 
54. Če se je preskušala dobro razgradljiva (referen čna) kemikalija, mora biti 
stopnja biološke razgradnje > 90-odstotna, razlika med vrednostmi pono ­
vitev pa ne sme biti ve čja od 5 %. Če ti merili nista izpolnjeni, je treba 
pregledati poskusne postopke in/ali dobiti gospodinjsko odpadno vodo iz drugega vira. 
55. Razlike med vrednostmi biološke razgradnje iz podvojenih enot ( če se 
uporabljajo), v katerih se obdeluje preskusna kemikalija, prav tako ne smejo biti ve čje od 5 %. Če to merilo ni izpolnjeno, vendar so odstranitve 
visoke, je treba analizo nadaljevati še 3 tedne. Če je odstranitev nizka, je 
treba preu čiti zaviralne u činke preskusne kemikalije, če niso znani, in 
preskus ponoviti pri nižji koncentraciji preskusne kemikalije, če je to izved ­
ljivo.
 
Poročilo o preskusu  
56. V poro čilu o preskusu morajo biti naslednje informacije:  
Preskusna kemikalija:  
— identifikacijski podatki, 
— fizikalno stanje, in kjer je ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti.  
Preskusni pogoji:  
— spremembe preskusnega sistema, zlasti če se preskušajo netopne ali 
hlapne snovi, 
— vrsta organskega medija, 
— delež in vrsta industrijskih odpadkov v odpadni vodi, če se uporabljata 
in sta znana, 
— metoda inokulacije,  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1105
 
— založna raztopina preskusne kemikalije – vsebnost DOC (raztopljenega 
organskega ogljika) in TOC (celotnega organskega ogljika); kako je 
pripravljena, če je suspenzija; uporabljene preskusne koncentracije; 
razlogi za odstopanje od razpona 10–20 mg/l DOC; metoda dodajanja; datum prvega dodajanja; spremembe v koncentraciji, 
— srednji hidravli čni zadrževalni čas (brez rasti); rotacijska hitrost cevi; 
približen kot naklona, če je mogo če, 
— podrobnosti o luš čenju; čas in intenzivnost, 
— preskusna temperatura in razpon, 
— uporabljene analitske tehnike.  
Rezultati preskusa:  
— vsi izmerjeni podatki DOC, KPK, specifi čne analize, pH, temperatura, 
dušikove snovi, če je ustrezno, 
— vsi izra čunani podatki D
 t (ali D  tc ), D  B , D St v tabelarni obliki in krivuljah 
odstranitve, 
— informacije o fazi prilagajanja in fazi konstantne ravni, trajanju preskusa, 
stopnji odstranitve preskusne kemikalije, referen čne kemikalije ( če se 
preskuša) in organskega medija (v kontrolni enoti), statisti čni podatki 
ter izjave o biološki razgradljivosti in veljavnosti preskusa, 
— obravnava rezultatov.  
VIRI:  
(1) Gerike, P., Fischer, W., Holtmann, W. (1980). Biodegradability determina ­
tions in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. Res. 14: 753–758. 
(2) Truesdale, G. A., Jones, K., Vandyke, K. G. (1959). Removal of synthetic 
detergents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically atta ­
ckable material. Wat. Waste Tr. J. 7: 441–444. 
(3) Baumann, U., Kuhn, G., in Benz, M. (1998) Einfache Versuchsanordnung 
zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltc ­
hem. Ökotox. 10: 214–220. 
(4) Gloyna, E. F., Comstock, R. F., Renn, C. E. (1952). Rotary tubes as 
experimental trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355–1357. 
(5) Kumke, G. W., Renn, C. E. (1966). LAS removal across an institutional 
trickling filter. JAOCS 43: 92–94. 
(6) Tomlinson, T. G., Snaddon, D. H. M. (1966). Biological oxidation of 
sewage by films of micro-organisms. Int. J. Air Wat. Pollut. 10: 865–881. 
(7) Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, London. 
(8) Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment processes, 1982, London. 
(9) Poglavje C.4 te priloge, Dolo čanje „dobre“ biorazgradljivosti. 
(10) ISO 14593 (1998). Kakovost vode – Vrednotenje kon čne biorazgradljivosti 
organskih snovi v vodi. Metoda z analizo sproš čenega anorganskega ogljika 
v zaprtih posodah.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1106
 
Dodatek 8  
Slika 1  
Rotirajoče cevi
  
Glosar:  
Tloris 
Pogled A/B 
Gnana kolesa Negnana kolesa Pogonski motor Reduktor Notranja prirobnica Nagibni mehanizem Stožčasti zobnik
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1107
Slika 2  
Diagram pretoka
  
A: Rezervoar 
B: Peristalti čna črpalka 
C: Rotirajo ča cev 
D: Zbiralnik iztoka  
OPREDELITEV POJMOV  
Preskusna kemikalija: snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne 
metode. 
Kemikalije: „Opozoriti je treba, da se izraz ‚kemikalija‘ v spora ­
zumih UNCED in nadaljnjih dokumentih uporablja v širokem pomenu ter vklju čuje snovi, proizvode, zmesi, 
pripravke ali vse druge izraze, ki se lahko v obstoje čih 
sistemih uporabijo za ozna čevanje vklju čenosti.“
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1108
 
C.11  BIORAZGRADNJA  
PRESKUS ZAVIRANJA DIHANJA AKTIVNEGA BLATA  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Opisana metoda ocenjuje u činek preskusne snovi na mikroorganizme 
z merjenjem stopnje respiracije pod dolo čenimi pogoji pri razli čnih 
koncentracijah preskusne snovi. 
Namen te metode je omogo čiti hitro presejalno metodo, s katero je 
mogoče prepoznati snovi, ki bi lahko negativno vplivale na aerobne 
mikrobiološke čistilne naprave, ter prikazati ustrezne koncentracije 
preskusnih snovi, ki niso zaviralne, za uporabo v preskusih bioraz ­
gradljivosti. 
Preskus za ugotavljanje obmo čja se lahko opravi pred kon čnim 
preskusom. Z njim se pridobijo podatki o razponu koncentracij, ki se uporabijo pri glavnem preskusu. 
V načrt preskusa sta vklju čeni dve kontroli brez preskusne snovi, ena 
na začetku in druga na koncu preskusnega niza. Vsako serijo aktiv ­
nega blata je treba preveriti z uporabo referen čne snovi. 
To metodo se najlažje uporabi za snovi, za katere je zaradi njihove 
topnosti v vodi in nizke hlapljivosti verjetno, da bodo ostale v vodi. 
Pri snoveh z omejeno topnostjo v preskusnem mediju verjetno ne bo 
mogoče določiti EC
 50 . 
Rezultati, ki temeljijo na sprejemu kisika, lahko pripeljejo do napa ­ 
čnih zaklju čkov, kadar je preskusna snov nagnjena razdvojitvi oksi ­
dativne fosforilacije. 
Za izvajanje preskusa je koristno razpolagati z naslednjimi podatki: — topnost v vodi, — parni tlak, — strukturalna formula, 
— čistost preskusne snovi.
 
Priporočilo 
Aktivno blato lahko vsebuje potencialno patogene organizme, zato je 
treba z njim ravnati previdno.  
1.2 OPREDELITEV POJMOV IN ENOTE 
Stopnja respiracije je poraba kisika mikroorganizmov odpadnih voda 
v aerobnem blatu, ki se na splošno izrazi kot mg O  2 na mg blata na uro.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1109
 
Da se izra čuna zaviralni u činek preskusne snovi pri dolo čeni koncen ­
traciji, se stopnja respiracije izrazi kot odstotek srednje vrednosti 
stopenj respiracije v dveh kontrolah:  
Í 
1 Ä 2R s 
Rc 1 þ Rc  2 Î 
Ü 100 ¼ odstotek zaviranja  
pri čemer je: 
R s = stopnja porabe kisika pri preskusni koncentraciji preskusne 
snovi, 
Rc 1 = stopnja porabe kisika, kontrola 1, 
Rc 2 = stopnja porabe kisika, kontrola 2. 
EC 50 je pri tej metodi koncentracija preskusne snovi, pri kateri je 
stopnja respiracije 50 % tiste, prikazane v kontroli pod pogoji, opisa ­
nimi v tej metodi.  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Priporoča se, da se kot poznan zaviralec respiracije za referen čno 
snov uporabi 3,5-diklorofenol in se ga preskusi za EC  50 na vsaki 
seriji aktivnega blata, s čimer se preveri, da ob čutljivost blata ni 
nenormalna.  
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Stopnja respiracije aktivnega blata, hranjenega s standardno koli čino 
hranil iz sinteti čnih odplak, se izmeri po kontaktnem času 30 minut 
ali treh ur ali obeh. Prav tako se izmeri stopnja respiracije istega 
aktivnega blata pri razli čnih koncentracijah preskusne snovi v sicer 
identičnih pogojih. Zaviralni u činek preskusne snovi pri dolo čeni 
koncentraciji se izrazi kot odstotek srednjih vrednosti stopenj respi ­
racije v dveh kontrolah. Vrednost EC  50 se izračuna na podlagi dolo ­ 
čitev pri razli čnih koncentracijah.  
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Preskusni rezultati so veljavni, če: 
— stopnji respiracije v dveh kontrolah ne razlikujeta druga od druge 
za več kot 15 %, 
— je EC  50 (30 minut in/ali tri ure) 3,5-diklorofenola 
v sprejemljivem razponu 5 do 30 mg/liter.  
1.6 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.6.1  Reagenti  
1.6.1.1 R a z t o p i n e p r e s k u s n e s n o v i 
Raztopine preskusne snovi se pripravijo sveže na za četku študije 
z uporabo osnovne raztopine. Koncentracija osnovne raztopine 
0,5 g/l je primerna, če se upošteva spodaj priporo čen postopek.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1110
 
1.6.1.2 R a z t o p i n a k o n t r o l n e s n o v i 
Raztopino 3,5-diklorofenola je na primer mogo če pripraviti 
z raztopitvijo 0,5 g 3,5-diklorofenola v 10 ml 1M NaOH, red čenjem 
na približno 30 ml z destilirano vodo, z dodajanjem (med mešanjem) 
0,5M H  2 SO 4 do točke začetne precipitacije – potrebne bo približno 
8 ml 0,5M H  2 SO 4 – končno z redčenjem mešanice do enega litra 
z destilirano vodo. Vrednost pH mora takrat biti med 7 in 8.  
1.6.1.3 S i n t e t i č n e o d p l a k e 
Hranila iz sinteti čnih odplak se naredijo z raztapljanjem naslednjih 
količin snovi v enem litru vode: 
— 16 g peptona, — 11 g mesnega ekstrakta, — 3 g se čnine, 
— 0,7 g NaCl, 
— 0,4 g CaCl
 2 .2H  2 O, 
— 0,2 g MgSO  4 .7H  2 O, 
— 2,8 g K  2 HPO  4 . 
Opomba 1:  Te sinteti čne odplake so 100-kratni koncentrat odplak, 
opisanih v Tehni čnem poro čilu OECD: „Predlagana metoda za dolo ­ 
čitev biorazgradljivosti površinsko aktivnih snovi, uporabljenih 
v sintetičnih detergentih“ (11. junij 1976), z dodatkom dikalijevega 
hidrogen fosfata.  
Opomba 2:  Če se pripravljeno gojiš če ne uporabi takoj, ga je 
potrebno najdlje en teden hraniti v temi pri 0 do 4  o C v pogojih, 
ki ne povzro čajo nikakršnih sprememb v njegovi sestavi. Gojiš če se 
pred shranitvijo lahko tudi sterilizira, ali pa se dodata pepton in 
mesni ekstrakt tik pred izvajanjem preskusa. Pred uporabo se ga dobro premeša in prilagodi pH.
 
1.6.2  Naprave  
Merilne naprave: natan čna oblika ni klju čnega pomena. Vendar pa 
mora biti posoda za merjenje popolnoma polna, sonda pa se mora tesno prilegati na vrat merilne posode. 
Potrebna je obi čajna laboratorijska oprema in zlasti naslednje: 
— merilna naprava, — naprava za prezra čevanje, 
— pH elektroda in oprema za merj enje, 
— O
 2 -elektroda.  
1.6.3  Priprava inokuluma  
Za preskus se kot mikrobiološki inokulum uporabi aktivno blato iz 
čistilnih naprav, ki v obdelujejo predvsem gospodinjske odplake. 
Če je potrebno se lahko ob prihodu v laboratorij grobi delci odstra ­
nijo s kratkotrajnim usedanjem, npr. 15 minut, in odlivanjem zgor ­
njih plasti drobnejših trdih delcev za uporabo. Lahko pa se blato tudi 
nekaj sekund meša z mešalom.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1111
 
Poleg tega, če se zdi, da je prisoten zaviralni material, je treba blato 
oprati pod vodo iz pipe ali z izotoni čno raztopino. Po centrifugiranju 
se supernatant odlije (ta postopek se trikrat ponovi). 
Majhna koli čina blata se stehta in posuši. Na podlagi tega je mogo če 
izračunati koli čino mokrega blata, ki ga je treba suspendirati v vodi, 
da bi dobili aktivno blato z razponom suspendiranih trdnih snovi 
v suspenziji aktivnega blata od 2 do 4 g/liter. Če se upošteva spodaj 
priporočeni postopek, ta koli čina v preskusnem gojiš ču ustvari 
koncentracijo med 0,8 in 1,6 g/liter. 
Če blata ni mogo če uporabiti na dan zbiranja, se 50 ml sinteti čnih 
odplak doda vsakemu litru aktivnega blata, pripravljenega, kot je opisano zgoraj; ta se nato čez noč zrači pri 20 ± 2
 o C. Zrači se še 
naprej za uporabo v teku dneva. Pred uporabo se po potrebi preveri 
in prilagodi pH na 6 do 8. V suspenziji aktivnega blata suspendirane 
trdne snovi je treba dolo čiti, kot je opisano v prejšnjem odstavku. 
Če je treba v naslednjih dneh uporabiti isto serijo blata (maksimalno 
štiri dni), se na koncu vsakega delovnega dne v liter blata doda 
50 ml hranil iz sinteti čnih odplak.  
1.6.4  Izvajanje preskusa  
Trajanje/kontaktni čas: 30 minut in/ali tri ure, medtem ko 
poteka zra čenje 
Voda: Pitna voda (po potrebi brez klora) Oskrba z zrakom: Čisti zrak, brez olja. Pretok zraka 0,5 
do 1 liter/minuto 
Merilne naprave: Bu čka z ravnim dnom, kot je BPK 
bučka 
Merilnik kisika: Ustrezna kisikova elektroda 
z rekorderjem 
Hranilna raztopina: Sinteti čne odplake (glej zgoraj) 
Preskusna snov: Sveže pripravljena preskusna snov na 
začetku preskusa 
Referenčna snov: Npr. 3,5-diklorofenol (najmanj tri 
koncentracije) 
Kontrole: Inokulirani vzorec brez preskusne snovi Temperatura: 20 ± 2
 o C. 
Predlagani preskusni postopek, ki ga je v triurnem kontaktnem 
obdobju mogo če upoštevati v primeru preskusne in referen čne snovi, 
je opisan spodaj: 
Uporabi se ve č posod (npr. čaše s prostornino 1 litra). 
Uporabiti je treba najmanj pet koncentracij, ki se med seboj razliku ­
jejo za stalen faktor, ki po možnosti ne presega 3,2. 
V času „0“ se iz 16 ml hranil iz sinteti čnih odplak z vodo naredi 
300 ml mešanice. Doda se 200 ml mikrobnega inokuluma, celotna 
mešanica (500 ml) se nato zlije v prvo posodo (prva kontrola C  1 ). ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1112
 
Preskusne posode je treba stalno prezra čevati da se zagotovi, da 
raztopljeni O  2 ne pade pod 2,5 mg/liter in da tik pred merjenjem 
stopnje respiracije koncentracija O  2 znaša približno 6,5 mg/liter. 
V času „15 minut“ (gre za poljuben, vendar primeren 15 minutni 
časovni presledek) se zgornji postopek ponovi, razen da se 100 ml 
osnovne raztopine preskusne snovi doda 16 ml sinteti čnih odplak, še 
preden se doda vodo, da se dobi koli čina 300 ml, in mikrobni 
inokulum, da se dobi koli čina 500 ml. Ta mešanica se nato izlije 
v drugo posodo in zra či, kot je opisano zgoraj. Ta proces se ponovi 
v 15 minutnih intervalih z razli čnimi koli činami osnovne raztopine 
preskusne snovi, da se dobi niz posod, ki vsebujejo razli čne koncen ­
tracije preskusne snovi. Na koncu se pripravi še druga kontrola (C  2 ). 
Po treh urah se zabeleži pH, dobro premešani vzorec vsebine prve 
posode pa se preto či v merilno napravo ter se v naslednjih 
10 minutah meri stopnjo respiracije. 
Ta določitev se opravi na vsebini vsake posode v 15 minutnih 
časovnih presledkih, tako da je kontaktni čas v vsaki posodi tri ure. 
Referenčna snov se preskuša na enak na čin na vsaki seriji mikrob ­
nega inokuluma. 
Kadar je treba meritve opraviti po 30 minutah kontakta, je potreben 
drugačen pristop (npr. ve č kot en merilec kisika). 
Če se zahteva merjenje kemijske porabe kisika, se pripravijo dodatne 
posode s preskusno snovjo, hranili iz sinteti čnih odplak in vodo, 
vendar brez aktivnega blata. Poraba kisika se izmeri in zabeleži po 30 minutnem času prezra čevanja in/ali treh urah (kontaktni čas).
 
2. PODATKI IN OCENA  
Stopnja respiracije se izra čuna na podlagi izsledkov rekorderja med 
približno 6,5 mg O  2 /liter in 2,5 mg O  2 /liter, ali v obdobju 10 minut 
v primeru nizke stopnje respiracije. Predel respiracijske krivulje, na kateri se meri stopnja respiracije, mora biti linearen. 
Če se stopnji respiracije v dveh kontrolah razlikujeta za ve č kot 
15 %, ali pa EC
 50 (30 minut in/ali tri ure) referen čne snovi ni 
v sprejemljivem razponu (5 do 30 mg/liter za 3,5-diklorofenol), je preskus neveljaven in se mora ponoviti. 
Odstotek zaviranja se izra čuna pri vsaki preskusni koncentraciji (glej 
1.2). Odstotek zaviranja se prikaže v odvisnosti od koncentracije na log-normalnem (ali log-verjetnost) grafu, in izpelje se vrednost EC
 50 . 
Z uporabo standardnih postopkov je mogo če določiti 95 % meje 
zaupanja za vrednosti EC  50 . ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1113
 
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Če je mogo če, se v poro čilo o preskusu vklju čijo naslednji podatki: 
— preskusna snov: kemijski identifikacijski podatki, — preskusni sistem: vir, koncentracija in vsako predhodno obdelo ­
vanje aktivnega blata, 
— preskusni pogoji: 
— pH reakcijske mešanice pred merjenjem respiracije, — temperatura med preskusom, — trajanje preskusa, — referen čna snov in nj ena izmerj ena vrednost EC
 50 , 
— abiotski sprejem kisika ( če obstaja). 
— rezultati: 
— vsi izmerjeni podatki, — krivulj a zaviranj a in metoda za izra čun EC
 50 , 
— EC  50 in če je možno, 95 % meje zaupanja, EC  20 in EC  80 , 
— vsa opažanja in vse deviacije od te preskusne metode, ki bi 
lahko vplivali na rezultat.  
3.2 RAZLAGA PODATKOV 
EC 50 vrednost je treba upoštevati le kot smernico za možno strupe ­
nost preskusne snovi za aktivno blato, ki se uporablja za obdelovanje odplak ali mikroorganizme v odpadnih vodah, saj zapletenih interak ­
cij, ki se pojavljajo v okolju, ni mogo če natančno simulirati 
z laboratorijskim preskusom. Poleg tega lahko preskusne snovi, ki lahko zaviralno u činkujejo na oksidacijo amoniaka, povzro čijo 
atipične krivulje zaviranja. Glede na to je s tem je pri razlagi takšnih 
krivulj potrebna previdnost.
 
4. VIRI  
(1) International Standard ISO 8192-1986. 
(2) Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11, 1977, str. 165. (3) Brown, D., Hitz, H. R., Schaefer, L., Chemosphere 10, 1981, 
str. 245. 
(4) ETAD (Ecological and Toxicological Association of Dreyfuss 
Manufacturing Industries), Recommended Method No. 103, 
prav tako opisano v: 
(5) Robra, B., Wasserl Abwasser 117, 1976, str. 80. (6) Schefer, W., Textilveredlung 6, 1977, str. 247. (7) OECD, Pariz, 1981, Test Guideline 209, Decision of the 
Council C(84) 30 final.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1114
 
C.12  BIORAZGRADNJA  
SPREMENJENI SCAS PRESKUS  
1. METODA  
1.1 UVOD 
Namen te metode je ocena potencialne skrajne biorazgradljivosti 
vodotopnih, nehlapnih organskih snovi, ki so za daljši čas izposta ­
vljene relativno visokim koncentracijam mikroorganizmov. Sposob ­
nost preživetja mikroorganizmov se v tem obdobju ohranja 
z dnevnim dodajanjem hranil iz posedenih odplak. (Med vikendi je 
treba odplake shraniti na 4  o C. Lahko pa se uporabi sinteti čne 
odplake potrditvenega preskusa OECD.) 
Lahko pride do fizikalno-kemijske adsorpcije na suspediranih trdnih 
snoveh, kar je treba upoštevati pri razlagi rezultatov (glej 3.2). 
Zaradi dolgega obdobja zadrževanja teko če faze (36 ur) in vmesnega 
dodajanja hranil, preskus ne simulira pogojev, ki so prisotni 
v čistilnih napravah. Pridobljeni rezultati z razli čnimi preskusnimi 
snovmi kažejo, da ima preskus visok potencial biorazgradnje. 
Preskusni pogoji, so zelo ugodni za izbor in/ali prilagoditev mikro ­
organizmov, ki lahko razgradijo preskusno spojino. (Ta postopek je mogoče uporabiti tudi za pridobitev aklimatiziranih inokulumov za 
uporabo v drugih preskusih.) 
Pri tej metodi se merilo koncentracije raztopljenega organskega 
ogljika uporablja za oceno skrajne biorazgradljivosti preskusnih 
snovi. Zaželena je dolo čitev DOC po zakisanju in čiščenju, in ne 
kot razliko med C
 skupni  – C  anorganski  . 
Istočasna uporaba specifi čne analitske metode lahko omogo či oceno 
primarne razgradnje snovi (izginotje mati čne kemijske strukture). 
Metoda se uporablja le za tiste organske preskusne snovi, ki so pri 
koncentracijah, uporabljenih v preskusu: 
— topne v vodi (najmanj 20 mg raztopljenega organskega ogljika/ 
liter), 
— imajo zanemarljiv parni tlak, — ne zaviraj o bakterij, — se bistveno ne adsorbirajo v preskusnem sistemu, — se ne izgubijo iz preskusne raztopine s penjenjem. Določiti je treba vsebnost organskega ogljika v preskusnem mate ­
rialu.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1115
 
Podatki o relativnih deležih glavnih sestavin preskusnega materiala 
bodo uporabni pri razlagi dobljenih rezultatov, zlasti v primerih, 
kadar so ti rezultati nizki ali obrobni. 
Podatki o strupenosti snovi za mikroorganizme so lahko uporabni pri 
razlagi nizkih rezultatov in pri izbiri ustreznih preskusnih koncen ­
tracij.  
1.2 OPREDELITEV POJMOV IN ENOTE 
C T = koncentracija preskusne spojine v obliki organskega ogljika, 
kot je prisotna ali dodana usedenim odplakam na za četku 
obdobja prezra čevanja (mg/liter), 
C t = koncentracija raztopljenega organskega ogljika, ugotovljenega 
v supernatantu v preskusni teko čini na koncu obdobja prezra ­ 
čevanja (mg/liter), 
C c = koncentracija raztopljenega organskega ogljika, odkritega 
v supernatantu kontrole na koncu obdobja prezra čevanja (mg/ 
liter). 
Biorazgradnja je v tej metodi opredeljena kot izginotje organskega 
ogljika. Biorazgradnja se lahko prikaže z: 
1. Odstotkom odstranitve D  da količine dnevno dodane snovi:  
D da ¼ C t Ä ðC t Ä C c Þ 
C t Ü 100 [1] 
pri čemer je 
D da = razgradnja/dnevno dodajanje. 
2. Odstotek odstranitve D  ssd količine snovi, prisotne na za četku 
vsakega dne:  
D ssd ¼ 2C T þ C ti Ä C ci Ä 3C  tðiþ1Þ þ 3C  cðiþ1Þ 
2C T þ C ti Ä C ci Ü 100 [2(a)]  
≈ 2C T Ä 2ðC t Ä C c Þ 
2C T þ ðC t Ä C c Þ Ü 100 [2(b)] 
pri čemer je 
D ssd = razgradnja/snov na za četku dneva, 
indeksa i in (i + 1) veljata za dan meritve. 
Enačba 2(a) je priporo čljiva, če se DOC iztoka razlikuje iz dneva 
v dan, medtem ko se ena čbo 2(b) lahko uporabi, kadar iztok DOC 
ostaja iz dneva v dan relativno konstanten.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1116
 
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
V nekaterih primerih, kadar se preiskuje nova snov, so referen čne 
snovi lahko uporabne; vendar pa specifi čne referen čne snovi tukaj 
niso priporo čene. 
Zagotovljeni so podatki o nekaj spojinah, ocenjenih s krožnimi testi 
(glej Dodatek 1), predvsem zaradi tega, da se lahko od časa do časa 
izvede umerjanje metode in da se omogo či primerjava rezultatov pri 
uporabi kakšne druge metode.  
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Aktivno blato iz čistilne naprave se prenese v polkontinuirano enoto 
aktivnega blata („semi-continuous activated sludge“ – SCAS). Doda 
se preskusna spojina in usedene gospodinjske odplake, mešanica pa se nato prezra čuje 23 ur. Nato se prezra čevanje ustavi, blato se pusti, 
da se usede, supernatanta se odstrani. 
Blato, ki ostane v prezra čevalnih komorah, se potem premeša 
z dodatnim alikvotom preskusne spojine in odplak in cikel se 
ponovi. 
Biorazgradnja se ugotovi z dolo čitvijo vsebnosti raztopljenega organ ­
skega ogljika v supernatantu. Ta vrednost se primerja z vrednostjo, 
dobljeno v supernatantu, dobljenem iz kontrole, dozirane samo s usedenimi odplakami. 
Pri uporabi specifi čne analitske metode, se lahko izmerijo spre ­
membe v koncentraciji mati čne molekule kot posledica biorazgradnje 
(primarna biorazgradljivost).
 
1.5 MERILA KAKOVOSTI 
Ponovljivost te metode, utemeljena na podlagi odstranitve raztoplje ­
nega organskega ogljika, še ni bilo dolo čena. (Kadar naj bi šlo za 
primarno biorazgradnja, se zelo natan čni podatki dobijo iz materia ­
lov, ki so znatno razgrajeni.) 
Občutljivost metode se na splošno dolo či s spremenljivostjo nega ­
tivne kontrole in, v manjši meri, z natan čnostjo dolo čitve raztoplje ­
nega organskega ogljika in stopnjo preskusne spojine v raztopini na začetku vsakega cikla.
 
1.6 OPIS PRESKUSNEGA POSTOPKA  
1.6.1  Priprave  
Uporabi se lahko zadostno število čistih prezra čevalnih enot ali pa 
originalna 1,5 litrska preskusna enota SCAS s cevmi za dovod zraka 
(Slika 1) za vsako preskusno snov in kontrole. Stisnjeni zrak, ki se 
dovaja v preskusne enote pre čiščen skozi bombažni filter, ne sme 
vsebovati organskega ogljika ali biti predhodno nasi čen z vodo, da bi 
se zmanjšale izgube zaradi izhlapevanja. 
Vzorec premešane suspenzije aktivnega blata, ki vsebuje 1 do 
4 g suspendiranih trdnih snovi/liter, se dobi iz čistilni napravi 
z aktivnim blatom, ki pretežno čistijo gospodinjske odplake. Za 
vsako prezra čevalno enoto se zahteva približno 150 ml suspenzije 
aktivnega blata.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1117
 
Osnovne raztopine preskusne snovi se pripravijo v destilirani vodi; 
običajno zahtevana koncentracija je 400 mg/liter organskega ogljika, 
s čimer dobimo koncentracijo preskusne spojine v višini 20 mg/liter 
ogljika na za četku vsakega prezra čevalnega cikla, v kolikor ne pride 
do biorazgradnje. 
Višje koncentracije so dovoljene, če to strupenost za mikroorgan ­
izmov omogo ča. 
Izmeri se vsebnost organskega ogljika v osnovnih raztopinah.  
1.6.2  Preskusnu pogoji  
Preskus je treba opraviti pri 20 do 25  o C. 
Uporabi se visoka koncentracija aerobnih mikroorganizmov (od 1 do 
4 g/liter suspendiranih trdnih snovi), u činkovito obdobje zadrževanja 
pa traja 36 ur. Karbonatni material v hranilih odplak se mo čno 
oksidira, obi čajno v osmih urah po za četku vsakega prezra čevalnega 
cikla. Potem blato endogeno diha v preostalem obdobju prezra čeva­
nja, v katerem je edini razpoložljivi substrat preskusna spojina, razen če tudi ta ni že metabolizirana. Te lastnosti skupaj z vsakodnevno 
ponovno inokulacijo preskusa, kadar se kot gojiš če uporablja gospo ­
dinjske odplake, ustvarjajo izredno ugodne pogoje tako za prilago ­
ditev kot tudi visoke stopnje biorazgradnje.
 
1.6.3  Izvajanje preskusa  
Vzame se vzorec suspenzije aktivnega blata iz čistilne naprave 
z aktivnim blatom za gospodinjske odplake ali pa se zame laborato ­
rijske enote in se jih ohranja v aerobnem stanju, dokler se jih ne 
uporabi v laboratoriju. Vsaka prezra čevalna enota, kakor tudi 
kontrolna enota, se napolni s 150 ml suspenzije aktivnega blata ( če 
se uporablja originalna preskusna enota SCAS, se dana koli čina 
pomnoži z 10) in pri čne se prezra čevanje. Po 23 urah se prezra če­
vanje ustavi in blato se pusti, da se 45 minut useda. V tem času se 
odpre zamašek na vsaki posodi in se odvzame 100 ml supernatanta. Tik pred uporabo se vzame vzorec usedenih gospodinjskih odplak, 
100 ml pa se doda blatu, ki ostane v vsaki prezra čevalni enoti. Še 
enkrat se pri čne prezra čevanje. V tej fazi se ne dodajajo nikakršni 
preskusni materiali, enote pa se vsak dan napolnijo z gospodinjskimi odplakami, dokler se pri usedanju ne dobi čisti supernatant. To 
ponavadi traja do dva tedna, v tem času pa se raztopljeni organski 
ogljik v supernatantu na koncu vsakega prezra čevalnega cikla 
približa konstantni vrednosti. 
Na koncu tega obdobja se premešajo posamezna usedena blata in 
v vsako enoto se doda 50 ml dobljenega sestavljenega blata. 
Kontrolnim enotam se doda 95 ml usedenih odplak in 5 ml vode, 
preskusnim enotam pa 95 ml usedenih odplak plus 5 ml ustrezne 
preskusne spojine osnovne raztopine (400 mg/liter). Ponovno se 
začne prezra čevanje, ki traja 23 ur. Blato se potem pusti, da se 
45 minut useda, in odvzame se supernatant, ki se ga analizira za raztopljeni organski ogljik. 
Zgoraj opisani postopek dodajanja in odvzemanja se ponavlja 
dnevno ves čas preskusa.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1118
 
Pred usedanjem bo lahko treba o čistiti stene enot, da bi se prepre čilo 
kopičenje trdnih snovi nad nivojem teko čine. Za vsako enoto se 
uporabi drugo strgalo ali krta ča, da bi se prepre čile navzkrižne 
okužbe. 
Najbolje je, da se raztopljeni organski ogljik v supernatantu dolo ča 
dnevno, čeprav so dopustne tudi manj pogoste analize. Pred analizo 
se raztopine prefiltrirajo skozi čiste 0,45 μm membranske filtre ali pa 
se centrifugirajo. Membranski filtri so ustrezni, če se zagotovi, da ne 
prepuščajo ogljika niti absorbirajo snovi med filtracijo. Temperatura 
snovi ne sme presegati 40  o C, medtem ko je v centrifugi. 
Trajanje preskusa v primeru spojin, ki kažejo malo ali sploh nika ­
kršne biorazgradnje, je neomejeno, vendar je na podlagi izkušenj 
priporočeno, da naj na splošno preskus traja najmanj 12 in ne dlje 
kot 26 tednov.  
2. PODATKI IN OCENA  
Vrednosti raztopljenega organskega ogljika v supernatantih 
preskusnih in kontrolnih enot se prikažejo v odvisnosti od časa. 
Ko se doseže biorazgradnja, se bo stopnja, ugotovljena v preskusu, 
približala stopnji, ugotovljeni v kontroli. Ko se ugotovi, da je razlika 
med dvema stopnjama po treh zaporednih meritvah konstantna, se določi število nadaljnjih meritev, potrebnih za omogo čanje statisti čne 
obdelave podatkov, in izra čuna se odstotek biorazgradnje preskusne 
spojine (D
 da ali D  ssd , glej 1.2).  
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Če je mogo če, se v poro čilo o preskusu vklju čijo naslednji podatki: 
— vse podatke o vrsti odplak, tipu uporabljene enote in rezultatih 
preskusa v zvezi s preskusno snovjo, referen čna snov, če je 
uporabljena, in negativna kontrola, 
— temperatur, 
— krivulja odstranitve z opisom, na čin izračunavanja (glej 1.2), 
— datum in mesto vzor čenja aktivnega blata in odplak, status prila ­
goditve, koncentracija, itd., 
— znanstveni razlogi za vsako spremembo preskusnega postopka, — podpis in datum.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1119
 
3.2 RAZLAGA REZULTATOV 
Ker snov, ki se preskuša s to metodo, še ne bo hitro biorazgradljiva, 
se bo vsaka odstranitev DOC, ki je izklju čno posledica biorazgrad ­
ljivosti, obi čajno odvijala postopoma nekaj dni ali tednov, razen 
v tistih primerih, kjer je prilagoditev trenutna, kar se kaže 
z nenadnim izginotjem, ki se zgodi po nekaj tednih. 
Pomembno vlogo pa lahko v nekaterih primerih odigra tudi fizi ­
kalno-kemijska adsorpcija; to se pokaže, kadar gre za celotno ali 
delno odstranitev dodanega DOC na samem za četku. Kaj se zgodi 
potem, je odvisno od dejavnikov, kot so stopnje adsorpcije in koncentracija suspendiranih trdnih snovi v zavrženem iztoku. Pona ­
vadi razlika med koncentracijo DOC v kontrolnih in preskusnih 
supernatantih postopoma naraš ča od začetne nizke vrednosti, ta 
razlika pa se potem ohranja pri novi vrednosti preostali del preskusa, razen če ne pride do prilagoditve. 
Če je treba dolo čiti razliko med biorazgradnjo (ali delno biorazgrad ­
njo) in adsorpcijo, so potrebni dodatni preskusi. To je mogo če opra­
viti na številne na čine, naj prepri čljivejša pa je uporaba supernatanta 
ali blata kot inokuluma v preskusu iz osnovne zbirke (po možnosti v respirometri čnem preskusu). 
Preskusne snovi, ki v tem preskusu povzro čajo visoko, neadsorp ­
tivno odstranitev DOC, je treba šteti za potencialno biorazgradljive. 
Delna, neadsorptivna odstranitev pomeni, da je kemikalija le izposta ­
vljena nekakšni biorazgradnji. 
Nizke ali ni čne odstranitve DOC lahko pomenijo, da preskusna snov 
zavira mikroorganizme, to pa je mogo če odkriti tudi z lizo in izgubo 
blata, kar povzro ča motne supernatante. Preskus je treba ponoviti 
z uporabo nižje koncentracije preskusne snovi. 
Uporaba specifi čne analitske metode ali preskusne snovi z oznako
 
14 C lahko omogo či večjo občutljivost. V primeru  14 C preskusne 
spojine bo predelava  14 CO 2 potrdila, da je prišlo do biorazgradnje. 
Kadar podani podatki veljajo za primarno biorazgradnjo, je treba, če 
je mogoče, razložiti spremembo kemijske strukture, ki povzro ča 
izgubo odziva mati čne preskusne snovi. 
Validacija analitske metode mora biti podana skupaj z odzivom, 
odkritim na preskusnem gojiš ču negativne kontrole.  
4. VIRI  
(1) OECD, Pariz, 1981, Test Guideline 302 A, Decision of the 
Council C(81) 30 final.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1120
 
Dodatek 1  
SCAS preskus: primeri rezultatov  
Snov C t 
(mg/l) C t -C c 
(mg/l) Odstotek 
biorazgradnje 
D da Trajanje preskusa 
(dni) 
4-acetil aminobenzensulfonat 17,2 2,0 85 40 
Tetrapropilen benzensulfonat 17,3 8,4 51,4 40 4-nitrofenol 16,9 0,8 95,3 40 
Dietilen glikol 16,5 0,2 98,8 40 
Anilin 16,9 1,7 95,9 40 Ciklopentan tetra karboksilat 17,9 3,2 81,1 120
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1121
 
Dodatek 2  
Primer preskusne naprave
  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1122
 
C.13  BIOKONCENTRACIJA: PRETO ČNI PRESKUS NA RIBAH  
1. METODA  
Ta biokoncentracijska metoda je v skladu s OECD smernico 305 
(1996).  
1.1 UVOD 
Ta metoda opisuje postopek za dolo čanje biokoncentracijskega 
potenciala snovi v ribah pod preto čnimi pogoji. Čeprav so preto čni 
preskusni režimi veliko bolj zaželeni, so dopustni tudi polstati čni 
režimi, vendar pod pogojem, da so izpolnjena merila veljavnosti (validacije). 
Navedena metoda nudi dovolj podatkov za izvedbo preskusa, hkrati 
pa dopušča dovolj svobode za prilagoditev na črta preskusa pogojem 
v posameznih laboratorijih in spreminjajo čim lastnostim preskusnih 
snovi. Najbolj ustrezna je za stabilne organske kemikalije z vrednostmi log P
 ow med 1,5 in 6,0 (1), kljub temu pa se lahko 
uporablja tudi pri superlipofilnih snoveh (ki imajo log P  ow > 6,0). 
Predocena biokoncentracijskega faktorja (BKF), v časih ozna čena 
s KB, bo za take superlipofilne snovi predvidoma višja od vrednosti biokoncentracijskega faktorja stabilnega stanja (BKF
 SS ), ki naj bi se 
določila na osnovi laboratorijskih poskusov. Predocene biokoncen ­
tracijskega faktorja za organske kemikalije z log P  ow vrednostmi do 
približno 9,0 se lahko pridobijo tako, da se uporabi ena čba iz lite ­
rature Bintein et al (2). Parametri, ki dolo čajo biokoncentracijski 
potencial, vsebujejo konstanto stopnje absorpcije (k  1 ), konstanto 
stopnje o čiščenja (k  2 ) in BKF  SS . 
Radioaktivno ozna čene preskusne snovi lahko pospešijo analizo 
vodnih in ribjih vzorcev ter se lahko uporabijo pri odlo čitvi, ali je 
treba ugotoviti in koli činsko opredeliti nepravilnosti. Če se merijo 
skupni radioaktivni ostanki (na primer z izgorevanjem ali topnostjo 
v tkivu), BKF temelji na izvorni spojini, vseh zadržanih metabolitih in tudi asimiliranem ogljiku. Biokoncentracijski faktorji, ki temeljijo na skupnih radioaktivnih ostankih, tako ne morejo biti neposredno 
primerljivi z biokoncentracijskimi faktorji, izpeljanim zgolj 
s specifično kemično analizo izvorne spojine. 
Postopki čiščenja se lahko uporabijo v študijah o radioaktivnosti, da 
se določi BKF, temelje č na izvorni spojini, če je treba, pa se dolo čijo 
tudi glavni metaboliti. Študija metabolizma rib se lahko s pomo čjo 
analize in ugotavljanja ostankov v tkivih združi tudi s študijo 
biokoncentracije.
 
1.2 DEFINICIJE IN ENOTE 
Biokoncentracija/bioakumulacija je pove čana koncentracija 
preskusne snovi v ali na organizmu (dolo čenih tkivih le-tega), ki 
je odvisna od koncentracije preskusne snovi v okoliškem gojiš ču. 
Biokoncentracijski faktor (BKF ali K  β ) je koncentracija preskusne 
snovi v/na ribah ali dolo čenih tkivih le-teh (C  f kot μg/g (ppm)) 
kadar koli med fazo absorpcije v tega akumulacijskega preskusa, 
deljena s koncentracijo kemikalije v okoliškem gojiš ču (C  w kot 
μg/ml (ppm)).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1123
 
Biokoncentracijski faktor stabilnega stanja (BCF  SS ali K  β ) se 
v daljšem časovnem obdobju znatno ne spreminja, pri čemer koncen ­
tracija preskusne snovi v okoliškem gojiš ču v tem obdobju ostaja 
konstantna. 
Plato ali stabilno stanje je doseženo v krivulji preskusne snovi 
v ribah (C  f ) proti času, ko krivulja postane vzporedna s časovno 
osjo in so tri zaporedne analize C  f na vzorcih, vzetih najmanj 
v razmaku dveh dni, v obsegu ± 20 % druga od druge, in ni znatnih razlik med tremi obdobji vzor čenja. Pri analiziranju združenih 
vzorcev so potrebne najmanj štiri zaporedne analize. Za preskusne 
snovi, ki se absorbirajo po časi, so bolj primerni sedemdnevni 
presledki. 
Biokoncentracijski faktorji, izra čunani neposredno iz konstant kine ­
tične stopnje (k
 1 /k 2 ), se imenujejo kineti čni faktor koncentracije, 
BFK  K . 
Koeficient porazdelitve oktanol/voda (P  ow ) je uravnoteženo razmerje 
topnosti kemikalije v n-oktanolu in vodi (metoda A.8), izraženo tudi 
kot K  ow . Logaritem P  ow se uporablja kot pokazatelj potenciala kemi ­
kalije za biokoncentracijo glede na vodne organizme. 
Faza izpostavitve ali absorpcije je čas, ko so ribe izpostavljene 
preskusni kemikaliji. 
Konstanta stopnje absorpcije (k  1 ) je števil čna vrednost, ki dolo ča 
stopnjo pove čanja koncentracije preskusne snovi v/na preskusnih 
ribah (ali dolo čenih tkivih le-teh), ko so ribe izpostavljene navedeni 
kemikaliji (k  1 se izrazi v dan  -1 ). 
Faza po izpostavitvi ali faza o čiščenja (izgube) je čas po prenosu 
preskusnih rib iz gojiš ča, ki vsebuje preskusno snov, v gojiš če, ki te 
snovi ne vsebuje, ko se preu či očiščenje (ali čista izguba) snovi iz 
preskusnih rib (ali dolo čenih tkiv le-teh). 
Konstanta stopnje o čiščenja (izgube) (k  2 ) je števil čna vrednost, ki 
določa stopnjo zmanjšanja koncentracije preskusne snovi 
v preskusnih ribah (ali dolo čenih tkivih le-teh) po prenosu 
preskusnih rib iz gojiš ča, ki vsebuje preskusno snov, v gojiš če, ki 
te snovi ne vsebuje (k  2 se izrazi v dan  -1 ). 
1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Preskus sestavljata dve fazi: faza izpostavitve (absorpcije) in faza po 
izpostavitvi (o čiščenja). Med fazo absorpcije so lo čene skupine rib 
ene vrste izpostavljene najmanj dvema koncentracijama preskusne 
snovi. Ribe se nato za fazo o čiščenja prestavijo v gojiš če, ki ne 
vsebuje preskusne snovi. Faza o čiščenja je vedno potrebna, razen 
če je bila absorpcija snovi v fazi absorpcije zanemarljiva (npr. 
BKF je manjši od 10). Koncentracija preskusne snovi v/na ribah 
(ali določenih tkivih le-teh) se spremlja v obeh fazah preskusa. 
Poleg dveh preskusnih koncentracij, se kontrolna skupina rib goji pod enakimi pogoji, le da ti ne vklju čujejo preskusne snovi, 
s čimer se morebitni škodljivi u činki, opaženi med biokoncetracij ­
skim preskusom, primerjajo z ustrezno kontrolno skupino, pridobijo 
pa se tudi osnovne koncentracije preskusne snovi.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1124
 
Faza absorpcije se izvaja 28 dni, razen če se izkaže, da je bilo 
ravnovesje doseženo že prej. Trajanje faze absorpcije in čas, 
potreben za dosego stabilnega stanja, se lahko predvidi na osnovi enačbe iz Dodatka 3. Faza o čiščenja se takrat pri čne tako, da se ribe 
prestavijo v enako gojiš če v drugi čisti posodi, ki pa ne vsebuje 
preskusne snovi. Kjer je možno, se biokoncentracijski faktor izra čuna 
tako kot razmerje (BKF
 SS ) koncentracije v ribah (C  f ) in v vodi (C  w ) 
med očitnim stabilnim stanjem ter kot kineti čni biokoncentracijski 
faktor (BKF  k ) kot razmerje konstant stopenj absorpcije (k  1 ) in očiš­ 
čenja (k  2 ), ob predpostavljanju kinetike prvega reda. Če kinetika 
prvega reda o čitno ni upoštevana, je treba uporabiti bolj zapletene 
modele (Dodatek 5). 
Če do stabilnega stanja ne pride v 28 dneh, se faza absorpcije 
podaljša, dokler se ne doseže stabilno stanje ali najve č za 60 dni; 
takrat se za čne faza o čiščenja. 
Konstanta stopnje absorpcije, konstanta stopnje o čiščenja (izgube) 
(ali konstante, kadar so vklju čeni bolj zapleteni modeli), biokoncen ­
tracijski faktor in, kjer je možno, meje zaupanja vsakega izmed teh 
parametrov, se izra čunajo na osnovi modela, ki najbolje opisuje 
izmerjene koncentracije preskusne snovi v ribah in vodi. 
BKF se izrazi kot funkcija skupne mokre teže rib. Vendar pa se, če 
so ribe dovolj velike, dolo čena tkiva ali organi (npr. mišice, jetra) 
lahko uporabijo za posebne namene ali pa se lahko razdelijo na 
užitne (fileji) in neužitne (drobovje) dele. Ker je pri mnogih organ ­
skih snoveh jasno razmerje med potencialom za biokoncentracijo in lipofilijo, obstaja tudi ustrezno razmerje med vsebnostjo lipida preskusnih rib in zabeleženo biokoncentracijo takšnih snovi. Da bi 
tako zmanjšali ta vir spremenljivosti v rezultatih preskusa za nave ­
dene snovi z visoko lipofilijo (t.j. z log P
 ow > 3), mora biti biokon ­
centracija dodatno izražena v odnosu do vsebnosti lipida in ne samo glede na telesno težo. 
Vsebnost lipida naj se dolo či na enakem biološkem materialu, kot se 
uporablja za dolo čanje koncentracije preskusne snovi, kadar je to 
izvedljivo.
 
1.4 PODATKI O PRESKUSNI SNOVI 
Pred izvedbo preskusa biokoncentracije je o preskusni snovi 
potrebno pridobiti naslednje podatke: 
— topnost v vodi, — koeficient porazdelitve oktanol/voda P
 ow (označen tudi kot K  ow , 
ki se dolo ča z metodo HPLC v A.8), 
— hidroliza, 
— fototransformacija v vodi, dolo čena pod son čnim ali simuliranim 
sončnim obsevanjem in pod pogoji obsevanja preskusa biokon ­
centracije (3),  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1125
 
— površinska napetost (t.j. za snovi, pri katerih se log P  ow ne more 
določiti), 
— parni tlak, — hitra biorazgradljivost (kadar je to primerno). Drug potreben podatek je strupenost za vrste rib, ki naj se uporabijo 
v preskusu, po možnosti asimptoti čni LC
 50 (t.j. neodvisen od časa). 
Dostopna mora biti ustrezna analiti čna metoda znane to čnosti, natan ­ 
čnosti in ob čutljivosti, saj mora biti omogo čena količinska oprede ­
litev preskusne snovi v preskusnih raztopinah in biološkem mate ­
rialu, prav tako pa podrobnosti o pripravi in shranjevanju vzorca. Ravno tako mora biti znana analiti čna meja zaznavnosti preskusne 
snovi v vodi in v ribjih tkivih. Ko je uporabljena preskusna snov 
z oznako
 14 C, mora biti znan odstotek radioaktivnosti, povezan 
z nečistotami.  
1.5 VELJAVNOST PRESKUSA 
Če naj bo preskus veljaven, morajo veljati naslednji pogoji: 
— temperatura niha za manj kot ± 2  o C, 
— koncentracija raztopljenega kisika ne pade pod 60 % nasi čenosti, 
— koncentracija preskusne snovi v posodah se vzdržuje v obsegu ± 
20 % povpre čja merjenih vrednosti med fazo absorpcije, 
— smrtnost ali drugi škodljivi u činki/bolezni v kontrolnih in opazo ­
vanih ribah na koncu preskusa znašajo manj kot 10 %; kadar 
preskus traja ve č tednov ali mesecev, morajo smrtnost ali drugi 
škodljivi u činki v obeh skupinah rib znašati manj kot 5 % na 
mesec in skupno ne smejo presegati 30 %.  
1.6 REFEREN ČNE SPOJINE 
Uporaba referen čnih spojin znanega biokoncentracijskega potenciala 
bi koristila pri preverjanju preskusnega postopka, kadar je to potre ­
bno. Vendar pa se dolo čenih snovi še ne more priporo čiti. 
1.7 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.7.1  Oprema  
Pri vseh delih opreme se je treba izogniti uporabi materialov za vse 
dele naprav, ki se lahko raztopijo, absorbirajo ali izlužijo in škodljivo učinkujejo na ribe. Uporabijo se lahko standardne pravokotne ali 
valjaste akvarije iz kemi čno neaktivnega materiala in ustrezne 
prostornine, ki je v skladu s stopnjo obremenitve. Uporabo cevnega 
materiala iz mehke plastike je treba čim bolj zmanjšati. Zaželena je 
raba cevnega materiala iz teflona®, nerjave čega jekla in/ali stekla. 
Izkušnje kažejo, da je priporo čljivo uporabljati snovi z visokim 
koeficientom absorpcije, na primer sinteti čne piretroide in silanizi ­
rano steklo. V teh primerih je treba opremo po uporabi zavre či.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1126
 
1.7.2  Voda  
Za preskus se obi čajno uporablja naravna voda, pridobljena iz 
neonesnaženega vira, ki omogo ča enotno kakovost. Kakovost vode 
za pripravo raztopine mora biti taka, da izbrani vrsti rib omogo ča 
preživetje ves čas trajanja prilagajanja in preskusnih obdobij, ne da 
bi ribe pokazale kakršen koli neobi čajen videz ali obnašanje. 
Najbolje bi bilo dokazati, da preskusne vrste v vodi za pripravo raztopine lahko preživijo, rastejo in se razmnožujejo (npr. 
v laboratorijski kulturi ali preskusu strupenosti v življenjskem ciklu). 
Vodi je treba dolo čiti najmanj pH-vrednost, trdoto, skupne trdne 
snovi, skupni organski ogljik in po možnosti tudi amonij, nitrit, 
alkalnost ter, za morske vrste, slanost. Parametri, ki so pomembni 
za najugodnejše po čutje rib, so dobro znani, vendar Dodatek 1 pripo ­
roča najvišje koncentracije številnih parametrov za sladko in morsko 
preskusno vodo. 
Voda mora biti ves čas preskusa enake kakovosti. Vrednost pH naj 
se nahaja v obmo čju 6,0 do 8,5, vendar mora biti v času danega 
preskusa v obmo čju ±0,5 pH enot. Da bi prepre čili vpliv vode za 
pripravo raztopine na rezultate preskusa (na primer s kompleksacijo 
preskusne snovi) ali njeno škodljivo u činkovanje na skupino rib, je 
treba v časovnih presledkih vzeti vzorce za analizo. Dolo čanje težkih 
kovin (npr. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), glavnih anionov in kationov 
(npr. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO
 4 ), pesticidov (npr. skupni organofos ­
forni in skupni organoklorni pesticidi), skupnega organskega ogljika in suspendiranih suhih snovi je treba izvesti, na primer, vsake tri mesece, kadar je voda za pripravo raztopine po svoji kakovosti 
relativno konstantna. Če je dokazano, da se kakovost vode ni spre ­
menila najmanj eno leto, so dolo čanja lahko manj pogosta, razmiki 
pa daljši (npr. šest mesecev). 
Vsebnost naravnih delcev in skupni organski ogljik (TOC) vode za 
pripravo raztopine morata biti čim nižja, s čimer prepre čimo, da bi 
organska snov absorbirala preskusne snovi, saj to lahko zmanjša njeno biološko dostopnost (4). Najvišja sprejemljiva vrednost je 
5 mg/l za delce (suha snov, ki jo zadrži 0,45 μm filter) in 
2 mg/l za skupni organski ogljik (glej Dodatek 1). Če je treba, naj 
se voda pred uporabo filtrira. Prispevek k vsebnosti organskega ogljika v vodi zaradi preskusnih rib (izlo čki) in iz ostankov hrane 
mora biti čim nižji. Koncentracija organskega ogljika v preskusni 
posodi v času preskusa ne sme presegati koncentracije organskega 
ogljika, ki izvira iz preskusne snovi in iz dodatka za topnost ( če se 
ga uporabi), za ve č kot 10 mg/l (± 20 %).
 
1.7.3  Preskusne raztopine  
Založna raztopina preskusne snovi se pripravi v ustrezni koncentra ­
ciji. Zaželeno je, da se založna raztopina pripravi preprosto z mešanjem ali tresenjem preskusne snovi v vodi za pripravo razto ­
pine. Uporaba topil ali sredstev za disperzijo (dodatkov za topnost) 
se odsvetuje; kljub temu pa se jih lahko uporabi v nekaterih prime ­
rih, da se pridobi ustrezno koncentrirana založna raztopina. Upora ­
bljajo se lahko topila, kot so etanol, metanol, etilen glikol monometil eter, etilen glikol dimetil eter, dimetilformamid in trietilen glikol. 
Sredstva za disperzijo, ki se lahko uporabijo, so Cremaphor RH40, 
Tween 80, metilceluloza 0,01 % in HCO-40. Ob uporabi hitro biorazgradljivih dodatkov za topnost je treba biti previden, saj lahko le-ti povzro čijo težave z rastjo bakterij v preto čnih preskusih. 
Preskusna snov je lahko radioaktivno ozna čena in mora biti visoke 
čistosti (npr. po možnosti > 98 %).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1127
 
Za pretočne preskuse je potreben sistem, ki neprestano razdeljuje in 
redči založno raztopino preskusne snovi (npr. merska črpalka, 
proporcionalno razred čilo, saturator), da lahko preskusne koncentra ­
cije dovaja v preskusne posode. Na dan naj bi se vsebina vsake preskusne posode zamenjala najmanj petkrat. Zaželena je preto čna 
metoda, kadar pa to ni mogo če (npr. kadar na preskusne organizme 
delujejo škodljivi u činki), se lahko uporabi polstati čna tehnika, pod 
pogojem, da je zadovoljeno merilom veljavnosti. Stopnje pretoka založnih raztopin in vode za pripravo raztopine je treba preveriti 
48 ur pred preskusom in nato v času preskusa najmanj vsak dan. 
Ta pregled vklju čuje dolo čanje stopnje pretoka skozi vsako 
preskusno posodo, pri čemer se zagotovi, da se le-ta znotraj posode 
ali med njimi ne spreminja za ve č kot 20 %.
 
1.7.4  Izbira vrst  
Pomembni pogoji za izbiro vrst so, da so lahko dostopne, da so na 
razpolago v primernih velikostih in da se lahko ustrezno gojijo v laboratoriju. Drugi pogoji za izbiro vrste rib vklju čujejo rekreacij ­
sko, tržno, ekološko pomembnost, pa tudi primerljivo ob čutljivost, 
dosedanjo uspešno rabo, itd. 
Priporočene preskusne vrste so navedene v Dodatku 2. Uporabijo se 
lahko tudi druge vrste, vendar je morda treba prilagoditi preskusni 
postopek, da se zagotovijo ustrezni preskusni pogoji. V tem primeru se princip izbora vrst in preskusne metode zabeleži.
 
1.7.5  Gojenje rib  
Založna populacija rib naj se najmanj dva tedna aklimatizira v vodi 
pri preskusni temperaturi in se ves čas prehranjuje tako pogosto in 
s tako hrano kot med preskusom. 
Po 48 urah od naselitve se zabeleži smrtnost, pri čemer se uporabijo 
naslednja merila: 
— smrtnost, ki v sedmih dneh preseže 10 % populacije; treba je 
zavrniti celotno serijo; 
— smrtnost, ki v sedmih dneh znaša 5 do 10 % populacije; aklima ­
tizirati jih je treba še sedem dni, 
— smrtnost, ki je v sedmih dneh manjša od 5 % populacije: serija se 
sprejme – če je smrtnost v naslednjih sedmih dneh višja od 5 %, 
se celotna serija zavrne. 
Poskrbeti je treba, da ribe, ki se uporabljajo v preskusu, nimajo 
opaznih bolezni in nepravilnosti. Vse bolne ribe je treba zavre či. 
Rib se dva tedna pred preskusom ali v času trajanja preskusa ne 
sme zdraviti.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1128
 
1.8 IZVEDBA PRESKUSA  
1.8.1  Predhodni preskus  
Da se izboljšajo preskusni pogoji kon čno veljavnega preskusa, npr. 
izbira koncentracij(e) preskusnih snovi, trajanje faze absorpcije in 
očiščenja, bi bilo koristno izvesti predhodni preskus.  
1.8.2  Pogoji izpostavitve  
1.8.2.1 T r a j a n j e f a z e a b s o r p c i j e 
Trajanje faze absorpcije se lahko predvidi na podlagi prakti čnih izku­ 
šenj (npr. na podlagi predhodne študije ali podatkov o biokoncentraciji 
sorodne kemikalije) ali dolo čenih empiri čnih razmerij, pri čemer se 
uporabijo podatki o topnosti v vodi ali koeficientu porazdelitve okta ­
nol/voda preskusne snovi (glej Dodatek 3). 
Fazo absorpcije je treba izvajati 28 dni, razen če se lahko dokaže, da 
je bilo ravnovesje doseženo že prej. Če stabilno stanje ni bilo dose ­ 
ženo v 28 dneh, je treba fazo absorpcije podaljšati in izvesti 
nadaljnje meritve, dokler se ne doseže stabilno stanje ali najve č za 
60 dni.  
1.8.2.2 T r a j a n j e f a z e o č i š č e n j a 
Obdobje, ki traja polovico trajanja faze absorpcije, ponavadi zado ­
stuje, da se pojavi ustrezno (npr. 95 %) zmanjšanje v obremenitvi 
telesa s snovjo (glej Dodatek 3 za razlago ocene). Če je čas, potreben 
za dosego 95 % izgube, predolg in na primer dvakrat presega normalno dolžino faze absorpcije (t.j. ve č kot 56 dni), se lahko 
uporabi krajše obdobje (t.j. dokler koncentracija preskusne snovi 
ne znaša manj kot 10 % koncentracije stabilnega stanja). Vendar pa se za snovi, ki imajo bolj zapletene vzorce absorpcije in o čišče­
nja, kot je predstavljeno v enodelnem modelu, ki zajame kinetiko 
prvega reda, dovoli daljša faza o čiščenja za dolo čanje konstant 
stopnje izgube. Na to obdobje pa lahko vendarle vpliva obdobje, v katerem koncentracija preskusne snovi v ribah ostaja nad analiti čno 
mejo zaznavnosti.
 
1.8.2.3 Š t e v i l o p r e s k u s n i h r i b 
Število rib na preskusno koncentracijo je treba izbrati tako, da so za 
vsako vzor čenje na voljo najmanj štiri ribe na vzorec. Če se zahteva 
večja statistična značilnost, je potrebnih ve č rib na vzorec. 
Če se uporabljajo odrasle ribe, je treba zabeležiti, ali so v preskusu 
uporabljeni samice, samci ali oba spola. Če sta uporabljena oba 
spola, je treba še pred izpostavitvijo dokazati, da so razlike 
v vsebnosti lipidov med spoloma zanemarljive; morda je potrebna 
združitev vseh samcev in samic.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1129
 
Za kateri koli preskus se izberejo ribe podobne teže, tako da 
najmanjše niso manjše od dveh tretjin teže najve čjih. Vse morajo 
biti vzgojene v istem letu in prihajati iz istega vira. Ker teža in starost rib v časih odlo čilno vplivata na BKF vrednosti (1), je treba 
te podatke to čno beležiti. Priporo ča se, da se podvzorci rib pred 
preskusom stehtajo, da se tako oceni povpre čna teža.
 
1.8.2.4 O b r e m e n i t e v 
Visoka razmerja voda-ribe se uporabijo, da bi se čim bolj zmanjšala 
redukcija v C  w , ki jo povzro ča dodajanje rib na za četku preskusa, in 
da bi se izognili upadu koncentracije raztopljenega kisika. Pomembno je, da stopnja obremenitve ustreza uporabljenim 
preskusnim vrstam. V vsakem primeru se ponavadi priporo ča stopnja 
obremenitve akvarija, ki znaša 0,1 do 1,0 g rib (mokra teža) na liter vode na dan. Visoke stopnje obremenitve se lahko uporabijo, če se 
pokaže, da se zahtevana koncentracija preskusne snovi lahko 
vzdržuje v obmo čju ± 20 % mejnih vrednosti, in da koncentracija 
raztopljenega kisika ni manjša od 60 % nasi čenosti. 
Pri izbiri ustreznih režimov obremenitve je treba upoštevati naravni 
habitat ribjih vrst. Ribe, ki živijo pri dnu, na primer, lahko zahtevajo 
več prostora na dnu akvarija pri enaki prostornini vode kot vrste 
pelagičnih rib.
 
1.8.2.5 H r a n j e n j e 
V času prilagajanja in preskusa se ribe hranijo s primerno prehrano 
znane vsebnosti lipida in skupnega proteina, v ustreznih koli činah, ki 
zagotavljajo zdrav razvoj in vzdržujejo telesno težo. Ribe se hranijo 
vsak dan ves čas prilagajanja in preskusa s hrano, ki znaša približno 
1 do 2 % telesne teže na dan; tako ostaja koncentracija lipida v času 
preskusa pri ve čini vrst rib na relativno stalni ravni. Koli čino hrane 
je treba prera čunati, na primer, enkrat na teden, da se vzdržuje stalna 
telesna teža in vsebnost lipida. Za ta izra čun se lahko teža rib v vsaki 
preskusni posodi oceni iz teže ribe, ki je bila nazadnje vzor čena iz 
navedene posode. Ribe, ki ostanejo v posodi, se ne tehtajo. 
Ostanki hrane in iztrebki se iz preskusnih snovi iz črpajo vsak dan 
kmalu po hranjenju (v roku 30 minut do ene ure). Posode so ves čas 
preskusa čim čistejše, tako da ostaja koncentracija organske snovi 
čim nižja, saj lahko prisotnost organskega ogljika omeji biološko 
dostopnost preskusne snovi (1). 
Ker veliko hrane izvira iz ribje moke, je treba hrano analizirati, da se 
ugotovi prisotnost preskusnih snovi. Zaželeno je tudi, da se v hrani 
analizira prisotnost pesticidov in težkih kovin.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1130
 
1.8.2.6 S v e t l o b a i n t e m p e r a t u r a 
Obdobje osvetljenosti ponavadi traja 12 do 16 ur, temperatura 
(nihanje ± 2  o C) pa mora ustrezati preskusnim vrstam (glej Dodatek 
2). Vrsta in lastnosti svetlobe morajo biti znane. Paziti je treba na 
morebitno fototransformacijo preskusne snovi pod obsevalnimi 
pogoji študije. Uporabiti je treba ustrezno svetlobo, da ribe niso izpostavljene nenaravnim fotoproizvodom. V nekaterih primerih je ustrezno uporabiti filter, da se prestreže UV obsevanje pod 290 nm.
 
1.8.2.7 P r e s k u s n e k o n c e n t r a c i j e 
Ribe so pod preto čnimi pogoji izpostavljene najmanj dvema koncen ­
tracijama preskusnih snovi v vodi. Višja (ali najvišja) koncentracija 
preskusne snovi ponavadi znaša okoli 1 % njenega akutnega asimp ­
totičnega LC  50 in je ob uporabi analiti čne metode najmanj desetkrat 
višja od njene meje zaznavnosti v vodi. 
Najvišja preskusna koncentracija se lahko dolo či tudi tako, da se 
akutni 96h LC  50 deli z ustreznim akutno/kroni čnim razmerjem (pri 
nekaterih kemikalijah so ustrezna razmerja lahko okoli tri do sto). Če 
je možno, se izbere druga koncentracija, ki se razlikuje od zgoraj 
navedene za faktor 10. Če zaradi 1 % kriterija LC  50 in analitične 
mejne vrednosti to ni možno, se lahko uporabi faktor, ki je nižji od 10, ali pa je treba razmisliti o uporabi preskusne snovi, ozna čene 
s
 14 C. Nobena uporabljena koncentracija ne sme presegati topnosti 
preskusne snovi. 
Če se uporabi dodatek za topnost, njegova koncentracija ne sme 
presegati 0,1 ml/l in mora biti enaka v vseh prekusnih posodah. Poznati je treba njegov prispevek, skupaj s preskusno snovjo, k skupni vsebnosti organskega ogljika v preskusni vodi. Vendar pa 
se je treba uporabi takšnih materialov na vsak na čin poskusiti 
izogniti.
 
1.8.2.8 K o n t r o l e 
Poleg preskusne serije je treba imeti še eno kontrolo z vodo za 
pripravo raztopine ali eno z dodatkom za topnost, če je ta 
v preskusu uporabljen, pod pogojem, da je bilo ugotovljeno, da navedeni dodatek ne vpliva na ribe. Če temu ni tako, je treba 
imeti obe kontroli.
 
1.8.3  Pogostost meritev kakovosti vode  
Med preskusom je treba raztopljeni kisik, TOC, pH in temperaturo 
meriti v vseh posodah. Skupna trdota in slanost, če je to primerno, se 
morata meriti v kontrolah in v eni posodi z višjo (ali najvišjo) 
koncentracijo. Raztopljeni kisik in slanost, če je to primerno, naj 
se izmerita najmanj trikrat – na za četku, približno na sredini in na 
koncu faze absorpcije – in enkrat tedensko v fazi o čiščenja. TOC je 
treba izmeriti na za četku preskusa (24 ur in 48 ur pred za četkom faze 
absorpcije), preden se dodajo ribe, in najmanj enkrat tedensko med fazo absorpcije in fazo o čiščenja. Temperaturo je treba meriti vsak 
dan, pH na za četku in koncu vsake faze, trdota pa enkrat na preskus. 
Temperatura naj se po možnosti nadzira neprekinjeno v najmanj eni 
posodi.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1131
 
1.8.4  Vzor čenje in analiza rib in vode  
1.8.4.1 R a z p o r e d i t e v v z o r č e n j a r i b i n v o d e 
Vzorec vode iz preskusnih posod se za dolo čanje koncentracije 
preskusne snovi vzame preden se dodajo ribe, med fazo absorpcije 
in fazo o čiščenja. Voda se vzor či istočasno kot ribe in pred hranje ­
njem, lahko pa tudi ve čkrat. Med fazo absorbcije se dolo čijo koncen ­
tracije preskusnih snovi, da se preveri skladnost z merili veljavnosti. 
Ribe se vzor čijo najmanj petkrat med fazo absorpcije in najmanj 
štirikrat med fazo o čiščenja. Ker je v nekaterih primerih na osnovi 
takega števila vzorcev težko izra čunati razmeroma natan čno oceno 
BKF vrednosti, zlasti če ne gre za preprosto kinetiko o čiščenja 
prvega reda, je priporo čljivo v obeh fazah vzorce vzeti bolj pogosto 
(glej Dodatek 4). Dodatni vzorci se shranijo in analizirajo samo, če 
se rezultati prvega kroga analiz izkažejo kot neustrezni za izra čun 
biokoncentracijskega faktorja z želeno natan čnostjo. 
Primer sprejemljivega razporeda vzor čenja je podan v Dodatku 
4. Druge razporeditve se izra čunajo preprosto tako, da se za izra čun 
časa izpostavitve uporabijo druge vrednosti P  ow , predvidene za 95 % 
absorpcijo. 
Vzorčenje se nadaljuje med fazo absorpcije, dokler ne pride do 
stabilnega stanja ali najve č 28 dni. Če do stabilnega stanja ne 
pride v 28 dneh, se vzor čenje nadaljuje, dokler ne pride do stabil ­
nega stanja ali še najve č 60 dni. Pred za četkom faze o čiščenja se ribe 
premestijo v čiste akvarije.  
1.8.4.2 V z o r č e n j e i n p r i p r a v a v z o r c e v 
Vzorci vode za analizo se pridobijo na primer tako, da se voda prek 
inertnega cevnega materiala iz črpa s središ čne točke preskusne 
posode. Glede na to, da ne filtriranje ne centrifugiranje vedno ne ločita delcev preskusne snovi, ki niso biološko dostopni, od tistih, ki 
so biouporabni (zlasti za superlipofilne kemikalije, t.j. kemikalije 
z log P
 ow > 5) (1) (5), vzorci ne smejo biti izpostavljeni takemu 
ravnanju. 
Namesto tega je treba poskrbeti, da so akvariji čim bolj čisti in da se 
vsebnost skupnega organskega ogljika nadzira tako med fazo absorp ­
cije kot med fazo o čiščenja. 
Ob vsakem vzor čenju se iz preskusnih posod odstrani ustrezno 
število rib (ponavadi najmanj štiri). Vzor čene ribe se hitro izperejo 
z vodo, osušijo, usmrtijo v hipu z najbolj ustrezno in humano metodo ter nato stehtajo. 
Zaželeno je, da se ribe in voda analizirajo takoj po vzor čenju, da se 
prepreči razgradnja ali druge izgube ter da se v teku preskusa izra ­ 
čunata približni stopnji absorpcije in o čiščenja. S takojšnjo analizo se 
izognemo tudi zamudam pri ugotavljanju kdaj je bil plato dosežen.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1132
 
Če takojšnja analiza ni izvedena, se vzorci shranijo z ustrezno 
metodo. Pred za četkom študije se pridobijo podatki o ustrezni metodi 
shranjevanja za dolo čeno preskusno snov – na primer globoko 
zmrzovanje, shranjevanje pri 4  o C, trajanja shranjevanja, ekstrakcija, 
itd. 
1.8.4.3 K a k o v o s t a n a l i t i č n e m e t o d e 
Ker je za celoten postopek pomembna to čnost, natan čnost in ob čut­
ljivost analiti čne metode, uporabljene za preskusno snov, je treba 
praktično preveriti, da sta natan čnost in reproduktivnost kemi čne 
analize, kakor tudi ponovna pridobitev preskusne snovi tako iz 
vode kot iz rib, zadovoljivi za dolo čeno metodo. Preveriti je treba 
tudi, da se preskusne snovi v vodi, ki se uporablja za pripravo raztopine, ne zazna. 
Če je treba, se vrednosti C
 w in C  f , pridobljeni s preskusom, popravita 
glede na prispevek oziroma na vrednosti ozadja kontrol. Z vzorci rib 
in vode se ves čas ravna tako, da se čim bolj zmanjša onesnaženje in 
izguba (npr. ki je posledica adsorpcije na vzor čevalno napravo).  
1.8.4.4 A n a l i z a v z o r c a r i b 
Če se v preskusu uporabljajo radioaktivno ozna čeni materiali, se 
lahko analizira koli čina skupnega radioaktivnega ozna čevala 
(t.j. izvornega in metabolitov) ali pa se vzorci o čistijo, tako da se 
izvorna spojina lahko analizira lo čeno. Glavni metaboliti se lahko 
določijo tudi na koncu faze absorpcije ali najkasneje med stabilnim 
stanjem. Če je BKF glede na skupne radioaktivno ozna čene ostanke 
> 1 000 %, je priporo čljivo in za dolo čene kategorije kemikalij, kot 
so na primer pesticidi, zelo priporo čljivo, da se ugotovijo in koli ­ 
činsko opredelijo razkroj ki, ki predstavljajo > 10 % skupnih 
ostankov v ribjem tkivu v stabilnem stanju. Če so razkrojki, ki 
predstavljajo > 10 % skupnih radioaktivno ozna čenih ostankov 
v ribjem tkivu, ugotovljeni in koli činsko dolo čeni, potem je priporo č­
ljivo tudi, da se ugotovijo in koli činsko opredelijo tudi razkrojki 
v preskusni vodi. 
Koncentracija preskusne snovi se obi čajno dolo či za vsako posa ­
mezno stehtano ribo. Če to ni mogo če, je združevanje vzorcev pri 
vsakem vzor čenju dovoljeno, vendar združevanje omejuje statisti čne 
postopke, ki se lahko uporabljajo za tako pridobljene podatke. Če sta 
določen statisti čni postopek in stopnja zna čilnosti pomembna 
faktorja, se mora v preskus vklju čiti ustrezno število rib, da se prila ­
godi zaželenemu postopku združevanja vzorcev in statisti čne značil­
nosti (6) (7). 
BKF je treba izraziti tako kot funkcijo mokre teže in, za visoko 
lipofilne snovi, kot funkcijo vsebnosti lipida. Vsebnost lipida rib 
se določi pri vsakem vzor čenju, če je to mogo če. Za dolo čanje 
vsebnosti lipida se morajo uporabiti ustrezne metode (Literatura 8 in 2 Dodatek 3). Kot standardna metoda se lahko priporo či tehnika 
z ekstrakcijo kloroforma/metanola (9). Razli čne metode ne dajo 
enakih vrednosti (10), zato je pomembno, da so znane podrobnosti o uporabljeni metodi. Če je mogo če, naj se analiza lipida izvede na 
istem ekstraktu, kot je bil pripravljen za analizo preskusne snovi, saj 
morajo biti nemalokrat lipidi odstranjeni iz ekstrakta, preden se ga 
lahko analizira s kromatografom. Vsebnost lipida v ribah (kot mg/kg mokre teže) se na koncu preskusa ne sme razlikovati od za četne 
vrednosti za ve č kot ± 25 %. Ravno tako je treba zabeležiti odstotek 
suhe snovi v tkivu, da se omogo či pretvorba koncentracije lipida od 
mokre do suhe osnove.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1133
 
2. PODATKI  
2.1 OBDELAVA REZULTATOV 
Krivulja absorpcije preskusne snovi se dobi tako, da se njena 
koncentracija v/na ribi (ali dolo čenih tkivih) v fazi absorpcije 
grafično prikaže kot funkcija časa na aritmeti čni lestvici. Če krivulja 
doseže plato, torej če postane približno asimptoti čna na časovno 
premico, se BKF  SS stabilnega stanja izra čuna na podlagi ena čbe: 
C f as steady Ä stateðmeanÞ 
C w as steady Ä stateðmeanÞ 
Če stabilno stanje ni doseženo, se za oceno nevarnosti BKF  SS lahko 
dovolj natan čno izračuna na podlagi „stabilnega stanja“ pri 80 % 
(1,6/k  2 ) ali 95 % (3,0/k  2 ) glede na ravnovesje. 
Določi se tudi koncentracijski faktor (BKF  k ) kot razmerje k  1 /k 2 , 
dveh konstant kinetike prvega reda. Konstanta stopnje o čiščenja 
(k 2 ) se ponavadi dolo či na osnovi krivulje o čiščenja (t.j. grafi čni 
prikaz upadanja koncentracije preskusne snovi v ribi s časom). 
Konstanta stopnje absorpcije (k  1 ) se nato izra čuna na podlagi danega 
k 2 in vrednosti C  f , ki se pridobi iz krivulje absorpcije (gl. tudi 
Dodatek 5). Za izra čun faktorja BKF  k in konstant stopenj k  1 in k  2 
je zaželena uporaba ra čunalniških metod za izra čun nelinearnih para ­
metrskih ocen (11). Sicer se za izra čun k  1 in k  2 lahko uporabijo 
grafične metode. Če krivulja o čiščenja očitno ni krivulja prvega 
reda, je treba uporabiti bolj zapletene modele (glej literaturo 
v Dodatku 3) in poiskati nasvet biostatistika.  
2.3 RAZLAGA REZULTATOV 
Rezultate je treba razlagati previdno, kadar se izmerjene koncentra ­
cije preskusnih raztopin pojavljajo na ravneh blizu meje zaznavnosti 
analitične metode. 
Jasno dolo čeni krivulji absorpcije in o čiščenja sta pokazateljici kako ­
vostnih podatkov o biokoncentraciji. Odstopanja v konstantah absorpcije/o čiščenja med dvema preskusnima koncentracijama 
morajo znašati manj kot 20 %. Ve čje opažene razlike v stopnjah 
absorpcije/o čiščenja med obema uporabljenima preskusnima koncen ­
tracijama je treba zabeležiti in navesti možne razloge. Ponavadi se meja zaupanja pri biokoncentracijskih faktorjih iz dobro zasnovanih študij približa ± 20 %.
 
3. PORO ČANJE  
Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje podatke:  
3.1 PRESKUSNA SNOV: 
— fizikalna narava in, kadar je to primerno, fizikalno-kemijske last ­
nosti, 
— podatki o kemi čni identifikaciji (vklju čno z vsebnostjo organ ­
skega ogljika, če je to primerno), 
— če gre za radioaktivno ozna čeno snov, to čen položaj radioa ­
ktivnih atoma/atomov in odstotek radioaktivnosti, združene 
z nečistotami.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1134
 
3.2 PRESKUSNE VRSTE 
— znanstveno ime, sev, vir, kakršna koli predobdelava, aklimatiza ­
cija, starost, red velikosti, itd.  
3.3 PRESKUSNI POGOJI: 
— uporabljeni preskusni postopek (npr. preto čni ali polstati čni), 
— tip in lastnosti uporabljene svetlobe in obdobje(a) osvetljenosti, 
— načrt preskusa (npr. število in velikost preskusnih posod, stopnja 
nadomeščene vodne prostornine, število ponovitev, število rib na 
ponovitev, število preskusnih koncentracij, dolžina faze absorp ­
cije in faze o čiščenja, pogostost vzor čenja ribjih in vodnih vzor ­
cev), 
— metoda priprave založnih raztopin in pogostost obnovitev 
(dodatek za topnost, njegova koncentracija in njegov prispevek k vsebnosti organskega ogljika v preskusni vodi morajo biti podani, kadar so uporabljeni), 
— nominalne preskusne koncentracije, povpre čje izmerjenih vred ­
nosti in njihovih normalnih odklonov v preskusnih posodah ter metoda, s pomo čjo katere so bili izmerjeni, 
— vir vode za pripravo raztopine, opis kakršnih koli predobdelav, 
rezultati katerih koli predstavitev sposobnosti preskusnih rib, da 
živijo v tej vodi, in zna čilnosti vode: pH, trdota, temperatura, 
koncentracija raztopljenega kisika, stopnje ostanka klora ( če so 
izmerjene), skupni organski ogljik, suspendirane suhe snovi, 
slanost preskusnega gojiš ča (če je to primerno) in katere koli 
druge opravljene meritve, 
— kakovost vode v preskusnih posodah, pH, trdota, TOC, tempera ­
tura in koncentracija raztopljenega kisika, 
— podrobni podatki o hranjenju (na primer vrsta hrane, vir, sestava 
– najmanj vsebnost lipida in proteina, če je možno, koli čina dane 
hrane in pogostost), 
— podatki o ravnanju z ribjimi in vodnimi vzorci, vklju čno 
s podrobnostmi o pripravi, shranjevanju, ekstrakciji in analiti čnih 
postopkih (in natan čnost) za preskusno snov in vsebnost lipida 
(če je izmerjena).
 
3.4 REZULTATI: 
— rezultati vseh poprej izvedenih študij, 
— smrtnost kontrolnih rib in rib v vsaki posodi s preskusno 
snovjo ter kakršno koli zabeleženo nenavadno obnašanje, 
— vsebnost lipida v ribah ( če je dolo čena med preskusom), 
— krivulje (vklju čno z vsemi izmerjenimi podatki) iz katerih je 
razvidna absorpcija in o čiščenje preskusne kemikalije v ribi ter 
čas, potreben za dosego stabilnega stanja,  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1135
 
— C  f in C  w (s standardno deviacijo in razponom, če je to primerno) 
za vsa vzor čenja (pri čemer je C  f izražen v μg/g mokre teže 
(ppm) celotnega telesa ali dolo čenega tkiva le-tega, npr. lipid, 
in C  w v μg/ml (ppm)). C  w vrednosti za kontrolno serijo (zabele ­ 
žiti je treba tudi ozadje), 
— biokoncentracijski faktor stabilnega stanja (BKF  SS ) in/ali kine ­
tični koncentracijski faktor (BKF  k ) ter, če je to primerno, 95 % 
meje zaupanja za konstante stopenj absorpcije in o čiščenja 
(izgube) (vse izraženo v odnosu do celega telesa in skupne vsebnosti lipida v živali ali dolo čenih tkiv le-te, če je izmerjena), 
meje zaupanja in standardna deviacija ( če je na razpolago) in 
metode analize ra čunavanja/analize podatkov za vsako koncen ­
tracijo uporabljene preskusne snovi, 
— kadar so uporabljene radioaktivno ozna čene snovi, in če je to 
potrebno, naj se predloži kopi čenje vseh zaznanih metabolitov, 
— kar koli nenavadnega v zvezi s preskusom, kakršno koli odsto ­
panje od teh postopkov in kateri koli drugi pomembni podatki, 
z razvojem metode pred preskusom in s preskusnim na črtom je treba 
zmanjšati rezultate v smislu „neopaženo znotraj mej zaznavnosti“, saj se takšni rezultati ne morejo uporabiti za izra čun konstante.
 
4. LITERATURA  
(1) Connell D. W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persi ­
stent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. 
Toxicol. 102, str. 117-156. 
(2) Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear 
dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water parti ­
tion coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, str. 29–390. 
(3) OECD, Pariz (1996). Direct phototransformation of chemicals 
in water. Environmental Health and Safety Guidance Docu ­
ment Series on Testing and Assessment of Chemicals. No. 3. 
(4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of 
bioconcentration factors derived from OECD and ASTM 
testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Danska. 
(5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality 
Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. Juli 1994. 
(6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide 
analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 
20852, Juli 1975. 
(7) US EPA (1974). Section 5, A(l). Analysis of Human or animal 
Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson J. F. (ur.) Research Triangle Park, N. C. 27711. 
(8) Compaan H. (1980) v „The determination of the possible 
effects of chemicals and wastes on the aquatic 
environment: degradation, toxicity, bioaccumulation“, poglavje 
2.3, del II. Government Publishing Office, Hag, Nizozemska.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1136
 
(9) Gardner et al, (1995). Limn. & Oceanogr. 30, str. 1099–1105. 
(10) Randall R. C, Lee H., Ozretich R. J., Lake J. L. and Pruell 
R. J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for norma ­
lising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, str. 1431–1436. 
(11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the 
flow-through method- Ring Test Programme, 1984 to 
1985. Final report March 1987. Avtorja: P. Kristensen in 
N. Nyholm. 
(12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for 
conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater 
Bivalve Molluscs.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1137
 
DODATEK 1  
Kemične lastnosti sprejemljive razred čene vode  
SNOV MEJNA 
KONCENTRACIJA  
1 Delci 5 mg/l 
2 Skupni organski ogljik 2 mg/l 
3 Neionizirani amoniak 1 μg/l 
4 Ostanki klora 10 μg/l 
5 Skupni organofosforni pesticidi 50 ng/l 6 Skupni organoklorni pesticidi plus poliklorirani bifenili 50 ng/l 7 Skupni organski klor 25 ng/l 8 Aluminij 1 μg/l 
9 Arzen 1 μg/l 
10 Krom 1 μg/l 
11 Kobalt 1 μg/l 
12 Baker 1 μg/l 
13 Železo 1 μg/l 
14 Svinec 1 μg/l 
15 Nikelj 1 μg/l 
16 Cink 1 μg/l 
17 Kadmij 100 ng/1 18 Živo srebro 100 ng/1 19 Srebro 100 ng/1
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1138
 
DODATEK 2  
Priporočene vrste rib za preskušanje  
Priporocene vrste Priporočen 
razpon 
preskusnih 
temperatur(  o C) Priporočena 
skupna dolžina 
preskusnih živali 
(cm) 
1 Danio rerio (  1 ) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton- 
Buchanan) navadna cebrica 20–25 3,0±0,5 
2 Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafi ­
nesque) črnoglavi pisanec 20–25 5,0±2,0 
3 Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus) 
Navadni krap 20–25 5,0±3,0 
4 Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck 
and Schlegel) medaka 20–25 4,0±1,0 
5 Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) 
gupi 20–25 3,0±1,0 
6 Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) 
(Rafinesque) Bluegill 20–25 5,0±2,0 
7 Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Wal ­
baum) šarenka 13–17 8,0±4,0 
8 Gasterosteus aculeatus (Teleostei, Gasterosteidae) 
(Linnaeus) zet 18–20 3,0±1,0  
( 1 ) Meyer A., Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B., zv. 252, str. 231  
Različne estuarske in morske vrste se uporabljajo v razli čnih državah, na primer: 
zebrasta grba  Leiostomus xanthurus  
ovčjeglavi zobati krapovec  Cyprinodon variegatus  
bibavični gavun  Menidia beryllina  
svetlikavi ostriž  Cymatogaster aggregata  
angleška iverka  Parophrys vetulus  
tihomorski jelenjerogi kapelj  Leptocottus armatus  
zet Gasterosteus aculeatus  
brancin  Dicentracus labrax  
zelenika  Alburnus alburnus  
Zbirka  
Sladkovodne ribe, navedene v tabeli, se gojijo brez posebnosti in/ali so zlahka na voljo vse leto, 
razpoložljivost morskih in estuarskih vrst pa je deloma omejena na posamezne države. Vzgojijo in gojijo se lahko ali v ribogojnicah ali laboratoriju, pod pogoji, ki nadzirajo bolezni in parazite, tako 
da je preskusna žival zdrava in znanega porekla. Te ribe so na voljo marsikje po svetu.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1139
 
DODATEK 3  
Napoved trajanja faz absorpcije in o čiščenja 
1. Napoved trajanje faze absorpcije  
Pred izvedbo preskusa se lahko ocena k  2 in posledi čno nekaj odstotkov 
časa, potrebnega za dosego stabilnega stanja, pridobi na osnovi empiri čnih 
razmerij med k  2 in koeficientom porazdelitve n-oktanol/voda (P  ow ) ali k  2 in 
topnostjo v vodi (s). 
Ocena k  2 (dan  -1 ) se lahko pridobi, na primer, na podlagi naslednjega empi ­
ričnega razmerja (1): 
log 10 k 2 = 0,414 log  10 (P ow ) + 1,47(r  2 = 0,95) [ena čba 1] 
Za druga razmerja glej literaturo (2). 
Če koeficient porazdelitve (P  ow ) ni znan, se ocena lahko pridobi (3) na 
podlagi poznavanja topnosti snovi v vodi (s): 
log 10 (P ow ) = 0,862 log  10 (s) + 0,710 (r  2 = 0,994) [ena čba 2] 
kjer je 
s = topnost (mol/l) : (n=36) 
Ta razmerja veljajo samo za kemikalije z log P  ow vrednostmi med 2 in 
6,5 (4). 
Čas, potreben za dosego dolo čenega odstotka stabilnega stanja, se lahko 
izračuna s pomo čjo ocene k  2 na podlagi splošne kineti čne enačbe, ki 
opisuje absorpcijo in o čiščenje (kinetika prvega reda):  
dC f 
dt ¼ k 1 ·C w Ä k 2 ·C f 
ali če je C  w konstanta:  
C f ¼ k 1 
k 2 ·C w ð1 Ä e Äk 2 t Þ [ena čba 3] 
Kadar se približamo stabilnemu stanju (t →∞), se enačba 3 lahko okrajša 
(5) (6):  
C f ¼ k 1 
k 2:C w or C f /C w = k  1 /k 2 = BCF 
Potem je k  1 /k 2 .C w približek koncentraciji v ribi pri „stabilnem stanju“ 
(C f, s ). 
Enačba 3 se lahko zapiše kot:  
C f ¼ C f;s ð1 Ä e Äk 2 t Þ ali C f 
C fs ¼ 1 Ä e Äk 2 t [enačba 4] 
Z uporabo ena čbe 4 se čas za dosego dolo čenega odstotka stabilnega stanja 
lahko predvidi, kadar je k  2 predhodno ocenjen z uporabo ena čb 1 ali 2.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1140
 
Kot napotek: statisti čno najugodnejše trajanje faze absorpcije za pridobitev 
statistično sprejemljivih podatkov (BKF  k ) je tisto obdobje, ki se zahteva za 
krivuljo logaritma koncentracije preskusne snovi v ribah, na črtano proti 
linearnemu času, da doseže razpoloviš če, ali 1,6/k  2 , ali 80 % stabilnega 
stanja, ne pa ve č kot 3,0/k  2 ali 95 % stabilnega stanja (7). 
Čas, potreben za dosego 80 % stabilnega stanja je (ena čba 4):  
0; 80 ¼ 1 Ä e Äk 2 t 80 ali t  80 ¼ 1; 6 
k 2 [enačba 5] 
Podobno je 95 % stabilnega stanja:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 [enačba 6] 
Na primer, trajanje faze absorpcije (up) za preskusno snov z log P  ow = 4 bi 
bilo (ob uporabi ena čb 1, 5 in 6): 
log 10 k 2 = - 0,414.(4) + 1,47 k  2 = 0,652 dni  -1 
fa (80 %) = 1,6/0,652, t.y. tj. 2,45 dni (59 ur) 
ali fa (95 %) = 3,0/0,652, t.y. tj. 4,60 dni (110 ur) Prav tako bi faza absorpcije za preskusno snov, ki ima s = 10
 -5 mol/l 
(log(s) = -5,0), trajala (ob uporabi ena čb 1, 2, 5 in 6): 
log 10 (P ow ) = 0,862 (-5,0) + 0,710 = 5,02 
log 10 K 2 = 0,414 (5,02) + 1,47 
k 2 = 0,246 dni  -1 
fa (80 %) = 1,6/0,246, tj. 6,5 dni (156 ur) 
ali fa (95 %) = 3,0/0,246, tj. 12,2 dni (293 ur) 
Uporabi se lahko tudi izraz: t
 eq = 6,54 × 10  3 P ow + 55,31 (ur) 
za izračun časa, potrebnega za dosego efektivnega stabilnega stanja (4).  
2. Napoved trajanja faze o čiščenja 
Napoved časa, potrebnega za zmanjšanje obremenitve telesna na nekaj 
odstotkov za četne koncentracije, se lahko prav tako izra čuna iz splošne 
enačbe, ki opisuje absorpcijo in o čiščenje (kinetika prvega reda) (1) (8). 
Za fazo o čiščenja se predvideva, da je C  w enak nič. Enačba se lahko 
okrajša na:  
dC f 
dt ¼ Äk 2 C f ali C f ¼ C f;o ·e Äk 2 t ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1141
 
kjer je  C f,0 koncentracija na za četku faze o čiščenja. 50 % o čiščenja bo tako 
opravljenega v času (t  50 ): 
C f 
C f;o ¼ 1 
2 ¼ e Äk 2 t 50 ali t  50 ¼ 0; 693 
k 2 
Podobno se bo 95 % o čiščenja doseglo pri:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 
Če se 80 % absorpcije uporabi za prvo obdobje 1,6/ k 2 ) in 95 % izgube 
v fazi očiščenja (3,0/ k 2 ), potem je faza o čiščenja približno dvakrat daljša od 
faze absorpcije. 
Pomembno pa je opozoriti, da ocene temeljijo na predvidevanju, da 
fazi absorpcije in o čiščenja sledita kinetiki prvega reda. Če kinetika prvega 
reda očitno ne ustreza, je treba uporabiti bolj zapletene modele (npr. lite ­
ratura (1)).  
Literatura  (Dodatek 3) 
(1) Spacie A. and Hamelink J.L. (1982) Alternative models for describing the 
bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, 
str. 309–320. 
(2) Kristensen P. (1991) Bioconcentration in fish: comparison of BCF's derived 
from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute. 
(3) Chiou C.T. and Schmedding D.W. (1982) Partitioning of organic 
compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), 
str. 4–10. 
(4) Hawker D.W. and Connell D.W. (1988) Influence of partition coefficient of 
lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 
(6), str. 701–707. 
(5) Branson D.R., Blau G.E., Alexander H.C. and Neely W.B. (1975) Transac ­
tions of the American Fisheries Society, 104 (4). str. 785–792. 
(6) Ernst W. (1985) Accumulation in Aquatic organisms. In: Appraisal of tests 
to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., 
Korte F., Klein W. and Bourdeau P.H. Part 4.4 str. 243–255. SCOPE, 1985, 
John Wiley & Sons Ltd. N.Y. 
(7) Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhoff 
M.W. (1977) Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, str. 614–622. 
(8) Konemann H. and Van Leeuwen K. (1980) Toxicokinetics in fish: Accu ­
mulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 
9, str. 3–19.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1142
 
DODATEK 4  
Teoretični primer vzor čne razporeditve biokoncentracijskih preskusov snovi z log P  ow = 4 
Vzročenje rib Časovni razpored vzor čenja 
Število vodnih vzorcev Število rib na vzorec Minimalna zahtevana 
pogostnost (v dnevih) Dodatno vzor čenje 
Faza absorpcije -1 
0 2 (*) 
2 dodati 45–80 rib 
1. 0,3 0,4 2 
(2) 4 
(4) 
2. 0,6 0,9 2 
(2) 4 
(4) 
3. 1,2 1,7 2 
(2) 4 
(4) 
4. 2,4 3,3 2 
(2) 4 
(4) 
5. 4,7 2 6 
Faza očiščenja Prenesti ribe v vodo 
brez preskusnih 
kemikalij 
6. 5,0 5,3 4 
(4) 
7. 5,9 7,0 4 
(4) 
8. 9,3 11,2 4 
(4) 
9. 14,0 17,5 6 
(4) 
(*) Vzor čna voda po najmanj treh zamenjanih vsebinah vode. 
Vrednosti v oklepajih so števila vzorcev (vode, rib), ki naj se upoštevajo, če se izvede dodatno vzor čenje.  
Opomba : Predhodna ocena k  2 za log P  ow = 4,0 je 0,652 dni  -1 . Skupno trajanje preskusa znaša 3 × up = 3 × 4,6 dni, t.j. 14 dni. Za 
oceno „up“ glej Dodatek 3.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1143
 
DODATEK 5  
Razlikovanje modelov  
Za večino biokoncentracijskih podatkov se predvideva, da se „razmeroma“ dobro 
opišejo s preprostim dvodelnim/dvoparametrskim modelom, kot je nakazano s premočrtno krivuljo, ki se približuje to čkam za koncentracijo v ribah med fazo 
očiščenja, kadar so le-te grafi čno prikazane na pollogaritemskem papirju. (Kadar te 
točke ne morejo biti na črtane s premo črtno krivuljo, je treba uporabiti bolj zaple ­
tene modele, glej na primer Spacie in Hamelink, literatura 1 v Dodatku 3).
 
Grafična metoda za dolo čanje konstante stopnje o čiščenja (izgube) k  2 
Koncentracija preskusne snovi, ki se nahaja v vsakem vzorcu rib, naj se na črta 
proti času vzorčenja na pollogaritemskem papirju. Nagib te linije je k  2 . 
k 2 ¼ ln ðC f1=C f2 Þ 
t 2 Ä t 1
 
Odstopanje od ravne linije lahko kaže na bolj zapleten vzorec o čiščenja kot je 
kinetika prvega reda. Grafi čna metoda se lahko uporabi za ugotavljanje tipov 
očiščenja, ki odstopajo od kinetike prvega reda.  
Grafična metoda za dolo čanje konstante stopnje absorpcije k  1 
Če je k  2 podan, se k  1 izračuna po naslednji ena čbi: 
k 1 ¼ C f k 2 
C w Ü ð1 Ä e Äk 2 t Þ [enačba 1] 
Vrednost C  f se razbere iz razpoloviš ča enakomerno padajo če krivulje absorpcije 
na podlagi podatkov, ko je logaritemska koncentracija na črtana proti času (na 
aritmetični lestvici).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1144
 
Računalniška metoda za izra čun konstant absorpcije in o čiščenja (izgube)  
Zaželeno je, da se za izra čun biokoncentracij skega faktorja ter konstant stopenj 
k 1 in k  2 uporabijo ra čunalniške nelinearne parametri čne metode ocenjevanja. Ti 
programi najdejo vrednosti za k  1 in k  2 , če imajo dovolj podatkov o koncentraciji 
zaporednega časa in model:  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü ð1 Ä e Äk 2 t Þ 0 < t < t  c [enačba 2]  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü ðe Äk 2 ðtÄt c Þ Ä e Äk 2 t Þ t > t  c [enačba 3] 
kjer je t  c = čas na koncu faze absorpcije. 
Ta pristop omogo ča ocene standardne deviacije k  1 in k  2 . 
Ker se k  2 v večini primerov lahko oceni na podlagi krivulje o čiščenja z relativno 
visoko natan čnostjo in ker med parametroma k  1 in k  2 obstaja mo čna soodvisnost, 
če ju dolo čamo sočasno, je priporo čljivo, da se najprej izra čuna k  2 zgolj na 
podlagi podatkov o čiščenja in šele nato k  1 na osnovi podatkov absorpcije, pri 
čemer se uporabi nelinearna regresija.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1145
 
C.14  PRESKUS RASTI RIBJIH MLADIC  
1. METODA  
Ta metoda preskušanja toksi čnosti za rast ustreza metodi OECD TG 
215 (2000).  
1.1 UVOD 
Ta preskus je namenjen ocenjevanju vplivov daljše izpostavljenosti 
kemikalijam na rast ribjih mladic. Temelji na metodi, ki je bila 
razvita in krožno preskušena (1) (2) v Evropski uniji, za ocenjevanje vplivov kemikalij na rast mladic šarenke  (Oncorhynchus mykiss)  
v pretočnih pogojih. Lahko se uporabljajo tudi druge dobro doku ­
mentirane vrste. Veliko izkušenj je bilo na primer pridobljenih 
s preskusi rasti na cebrici  (Danio rerio)  (
 1 ) (3) (4) in medaki 
(medaka,  Oryzias latipes)  (6) (7) (8). 
Glej tudi Splošni uvod Del C.  
1.2 OPREDELITEV POJMOV  
Najnižja koncentracija z opaznim u činkom (Lowest observed 
effect concentration – LOEC) : je najnižja preskušena koncentracija 
preskusne snovi, pri kateri je bilo opaženo, da ima snov pomemben učinek (pri p < 0,05) v primerjavi s kontrolo. Vendar pa morajo 
imeti vse preskusne koncentracije nad LOEC škodljiv u činek, ki je 
enak ali ve čji kot učinek, opažen pri LOEC.  
Koncentracija brez opaznih u činkov (No observed effect concen ­
tration – NOEC) : je preskusna koncentracija tik pod LOEC.  
EC
 x : v tej preskusni metodi je to koncentracija preskusne snovi, ki 
povzroča x % variacije v stopnji rasti rib, kadar jo primerjamo 
s kontrolo.  
Stopnja obremenitve:  je mokra teža rib na prostornino vode.  
Gostota rib:  je število rib na prostornino vode.  
Specifična stopnja rasti posameznih rib:  izraža stopnjo rasti posa ­
mezne ribe na osnovi njene za četne teže.  
Povprečna specifi čna stopnja rasti v bazenu:  izraža srednjo 
stopnjo rasti populacije bazena pri eni koncentraciji.  
Psevdo-specifi čna stopnja rasti:  izraža stopnjo rasti posamezne ribe 
v primerjavi s srednjo za četno težo populacije bazena.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1146  
( 1 ) Meyer, A., Bierman, C. H. and Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebra ­
fish (Danio rerio), a model system in developmental biology: an invitation to the compa ­
rative method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, str. 231–236.
 1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Mladice v fazi eksponentne rasti se po tehtanju dajo v preskusne 
komore in izpostavijo nizu subletalnih koncentracij preskusne snovi, ki je raztopljena v vodi, po možnosti s pretokom, ali, če to ni 
mogoče, pod ustreznimi polstati čnimi pogoji (stati čni pogoji 
s periodičnim obnavljanjem). Preskus traja 28 dni. Ribe se hranijo 
vsak dan. Obrok hrane temelji na za četni teži rib in se lahko 
ponovno prera čuna po 14 dneh. Na koncu preskusa se ribe ponovno 
stehtajo. U činki na stopnjo rasti se analizirajo z uporabo regresij ­
skega modela, da se oceni koncentracija, ki povzro či x % variacijo 
v stopnji rasti, t.j. EC
 X (npr. EC  10 , EC  20 , ali EC  30 ). Druga možnost 
pa je, da se podatki primerjajo s kontrolnimi vrednostmi, da bi 
določili najnižjo koncentracijo z opaznim u činkom (LOEC) ter tudi 
koncentracijo brez opaznih u činkov (NOEC).  
1.4 PODATKI O PRESKUSNI SNOVI 
Na voljo bi morali biti rezultati preskusa akutne toksi čnosti (glej 
preskusno metodo C.1), ki je bil po možnosti izveden na vrsti, 
izbrani za ta preskus. To pomeni, da sta znana topnost preskusne snovi v vodi in parni tlak preskusne snovi ter da je na voljo zane ­
sljiva analitska metoda za dolo čitev količine snovi v preskusnih 
raztopinah z znano in izpri čano točnostjo in mejo detekcije. 
Koristni podatki zajemajo tudi strukturno formulo, čistost snovi, 
stabilnost v vodi in na svetlobi, pKa, P
 ow in rezultate preskusov za 
lahko biorazgradljivost (glej preskusno metodo C.4).  
1.5 VELJAVNOST PRESKUSA 
Za veljavnost preskusa morajo biti izpolnjeni naslednji pogoji: 
— smrtnost v kontroli (kontrolah) na koncu preskusa ne sme prese ­
gati 10 %, 
— srednja teža rib v kontroli (kontrolah) se mora dovolj pove čati, 
da omogo ča odkrivanje minimalnih variacij stopenj rasti, ki 
veljajo za pomembne. Krožni preskus (3) je pokazal, da se mora pri šarenki srednja teža rib v kontroli pove čati vsaj za 
polovico (t.j. 50 %) njihove srednje za četne teže v 28 dneh; 
npr. začetna teža: 1 g/ribo (= 100 %), kon čna teža po 28 dneh: 
> 1,5 g/ribo (> 150 %), 
— koncentracija raztopljenega kisika mora ves čas preskusa znašati 
vsaj 60 % nasi čenosti zraka (air saturation value – ASV), 
— razlika v temperaturi vode v razli čnih preskusnih komorah med 
preskusom nikoli ne sme biti ve čja od ± 1
 o C in jo je treba 
ohranjati v razponu 2  o C znotraj temperaturnih razponov, ki so 
določeni za preskusno vrsto (Dodatek 1).  
1.6 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.6.1  Naprave  
Običajna laboratorijska oprema in zlasti naslednje: 
— oksimetri in pH-metri,  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1147
 
— oprema za ugotavljanje trdote in alkalnosti vode, 
— ustrezne naprave za nadzor temperature in, po možnosti, stalno 
spremljanje, 
— bazeni, izdelani iz kemijsko inertnih materialov, in primernega 
volumna glede na priporo čeno obremenitev in gostoto rib (glej 
poglavje 1.8.5 in Dodatek 1), 
— primerna to čna tehtnica (t.j. to čna do ±0,5 %).  
1.6.2  Voda  
Za preskusno vodo se lahko uporabi katera koli voda, v kateri kaže 
preskusna vrsta primerno dolgotrajno preživetje in rast. V času 
preskusa mora biti voda konstantne kakovosti. pH-vrednost vode 
mora biti med 6,5 in 8,5, v enem preskusu pa mora biti v območju ±0,5 pH enote. Priporo ča se trdota vode nad 
140 mg/l (kot CaCO
 3 ). Da bi zagotovili, da voda za red čenje ne 
bo preve č vplivala na rezultate preskusa (na primer 
s kompleksacijo preskusne snovi), je treba v ustreznih časovnih 
razmakih vzeti vzorce za analizo. Izvajati je treba meritve težkih kovin (npr. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd in Ni), glavnih anionov in kationov 
(npr. Ca, Mg, Na, K, Cl in SO
 4 ), pesticidov (npr. skupnih organo ­
fosforjevih in skupnih organoklorovih pesticidov), skupnega organ ­
skega ogljika in suspendiranih trdnih delcev, na primer vsake tri mesece, kadar se ve, da je voda za red čenje relativno konstantne 
kakovosti. Če je dokazano, da je kakovost vode konstantna vsaj 
eno leto, se lahko meritve izvajajo manj pogosto, časovni razmaki 
pa se lahko podaljšajo (npr. na vsakih šest mesecev). Nekatere kemijske lastnosti sprejemljive vode za red čenje so navedene 
v Dodatku 2.
 
1.6.3  Preskusne raztopine  
Preskusne raztopine izbranih koncentracij se pripravijo z red čenjem 
osnovne raztopine. 
Osnovno raztopino je treba po možnosti pripraviti preprosto 
z mešanjem ali stresanjem preskusne snovi v vodi za red čenje 
z uporabo mehanskih sredstev (npr. z mešanjem ali ultrazvokom). 
Za to, da se dobi primerno koncentrirana osnovna raztopina se lahko 
uporabijo kolone za nasi čevanje raztopine. 
V nekaterih primerih je lahko potrebna uporaba topil ali disperzijskih 
sredstev (topila), da se pripravi primerno koncentrirana osnovna 
raztopina. Med primernimi topili so aceton, etanol, metanol, dimetil ­
sulfoksid, dimetilformamid in trietilenglikol. Med primernimi disperzij skimi sredstvi so Cremophor RH40, Tween 80, metilcelu ­
loza 0,01 % in HCO-40. Pri uporabi lahko biorazgradljivih sredstev 
(npr.aceton) in/ali lahko hlapnih spojinah je treba paziti, saj lahko povzročijo težave zaradi namnožitve bakterij pri preto čnih preskusih. 
Kadar se uporabi topila, to ne sme imeti pomembnega vpliva na rast 
rib niti vidnih škodljivih u činkov na mladice, kar se pokaže 
s kontrolo, v kateri je le topilo.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1148
 
Pri pretočnih preskusih je potreben sistem, ki stalno odmerja in red či 
osnovno raztopino preskusne snovi (npr. merilna črpalka, proporcio ­
nalni razred čevalnik, sistem naprav za nasi čenje), da v preskusne 
komore dovaja serije koncentracij. Pretok osnovnih raztopin in vode za red čenje je treba preverjati v ustreznih časovnih razmakih, 
po možnosti vsak dan, med preskusom in se ne sme razlikovati za 
več kot 10 % med celotnim preskusom. Krožni preskus (3) je poka ­
zal, da je pri šarenki sprejemljiva pogostost odstranjevanja vode med preskusom 6 litrov/g ribe/dan (glej poglavje 1.8.2.2). 
Za semi-stati čne (obnavljajo če) preskuse, bo pogostost obnavljanja 
medija odvisna od stabilnosti preskusne snovi, vendar se priporo ča 
dnevno obnavljanje vode. Če iz predhodnih preskusov stabilnosti 
(glej poglavje 1.4) izhaja, da koncentracija preskusne snovi ni stabilna (t.j. izven obmo čja 80–120 % nominalne ali pod 80 % 
izmerjene za četne koncentracije) v času obnavljanja, je treba razmi ­
sliti o izvedbi preto čnega preskusa.
 
1.6.4  Izbira vrst  
Priporočena vrsta za ta preskus je šarenka  (Oncorhynchus mykiss),  
ker je bila ve čina izkušenj pridobljenih s krožnimi preskusi s to vrsto 
rib (1) (2). Uporabi pa se lahko tudi druge dobro dokumentirane vrste, za katere obstajajo dobri zapisi, vendar bo pri tem morda 
treba preskusni postopek prilagoditi, da se zagotovijo primerni 
preskusni pogoji. Izkušnje so na primer na voljo tudi za cebrico  
(Danio rerio)  (3) (4) in medako  (Oryzias latipes)  (5) (6) (7). 
V tem primeru je treba izbor vrste in eksperimentalne metode uteme ­
ljiti v poro čilu.
 
1.6.5  Vzdrževanje rib  
Preskusne ribe se izberejo iz populacije enega staleža, po možnosti iz 
istega drsta, ki so bile vsaj dva tedna pred preskusom kar zadeva 
kakovost vode in svetlobo v pogojih, podobnih tistim, ki se upora ­
bijo v preskusu. Ves čas vzdrževanja rib in med preskusom je treba 
ribe hraniti z minimalnim obrokom 2 % telesne teže na dan in po 
možnosti 4 % telesne teže na dan. 
Po 48-urnem času prilagoditve, se evidentira smrtnost in uporabijo se 
naslednja merila: 
— smrtnost v sedmih dneh je ve čja od 10 % populacije: celotna 
serija se zavrne, 
— smrtnost med 5 in 10 % populacije: prilagoditev naj traja doda ­
tnih sedem dni; če je v drugih sedmih dneh smrtnost ve čja od 
5 %, se zavrne celotna serija, 
— smrtnost v sedmih dneh manjša od 5 % populacije: serija se 
sprejme. 
Ribe v dveh tednih pred preskusom ali med poskusom ne smejo biti 
zdravljene zaradi bolezni.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1149
 
1.7 NA ČRT PRESKUSA 
Izraz „na črt preskusa“ se nanaša na izbiro števila in razmakov med 
preskusnimi koncentracijami, število bazenov za vsako koncentracijo ter število rib na bazen. V idealnem primeru bi bil 
načrt preskusa izbran ob upoštevanju: 
— cilja študije, 
— metode statisti čne analize, ki bo uporabljena, 
— razpoložljivosti in stroškov eksperimantalnih virov. Če je mogo če, bi morala izjava o cilju dolo čati statisti čno moč, pri 
kateri se zahteva zaznava dane velikosti razlike (npr. v stopnji rasti), 
ali – druga možnost – dolo čati točnost, s katero mora biti ocenjen 
EC
 X (npr. z x = 10, 20 ali 30 in po možnosti ne manj kot 10). Brez 
tega ne more biti zagotovo predpisana obsežnost študije. 
Pomembno je vedeti, da lahko na črt preskusa, ki je optimalen (naj ­
bolje izkoristi vire) za uporabo ene metode statisti čne analize, ni 
nujno optimalen za drugo. Priporo čeni načrt za oceno LOEC/NOEC 
torej ne bi bil enak kot na črt, priporo čen za regresijsko analizo. 
V večini primerov je regresijska analiza bolj zaželena kot analiza 
variance iz razlogov, ki jih obravnavata Stephan in Rogers (8). Kadar 
pa se ne najde noben primeren regresijski model (r  2 < 0,9), je treba 
uporabiti metodo LOEC/NOEC.  
1.7.1  Na črt preskusa za regresijsko analizo  
Pri načrtu preskusa, ki naj bi ga analizirali z regresijo, je pomembno 
razmisliti o naslednjem: 
— Koncentracija z u činkom (npr. EC  10 , 20 , 30 ) in razpon koncentra ­
cije, v katerem je vpliv preskusne snovi zanimiv, bi morala biti zajeta s koncentracijami, vklju čenimi v preskus. Natan čnost, 
s katero se ocenijo koncentracije z u činkom, bo najve čja, ko je 
koncentracija z u činkom na sredini razpona preskušanih koncen ­
tracij. V pomo č pri izbiri ustreznih preskusnih koncentracij je 
lahko predhodni preskus za ugotavljanje obmo čja. 
— Za zagotovitev zadovoljivega statisti čnega modeliranja mora 
preskus vklju čevati vsaj en kontrolni bazen in pet dodatnih 
bazenov z razli čnimi koncentracijami. Kjer je to ustrezno, je 
treba pri uporabi topila poleg preskusne serije izvesti eno 
kontrolo, ki vsebuje topilo pri najvišji preskušani koncentraciji (glej poglavja 1.8.3 in 1.8.4). 
— Uporabi se lahko ustrezno geometrijsko zaporedje ali logari ­
temsko zaporedje (9) (glej Dodatek 3). Zaželeno je logaritemsko 
določanje razmakov med preskusnimi koncentracijami.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1150
 
— Če je na voljo ve č kot šest bazenov, se dodatni bazeni bodisi 
uporabijo za zagotovitev ponovitve preskusa bodisi razporedijo 
preko razpona koncentracij, da se omogo čijo manjši razmaki med 
koncentracijami. Kateri koli od teh dveh ukrepov je enako zaže ­
len. 
1.7.2  Na črt za oceno NOEC/LOEC z uporabo analize variance 
(ANOVA)  
Po možnosti bi morale biti na voljo ponovitveni bazeni za vsako 
koncentracijo, statisti čna analiza pa bi morala biti izvedena na 
ravni bazenov (10). Brez ponovitvenih bazenov ne moremo ugota ­
vljati variabilnosti med bazeni, razen variabilnosti zaradi posameznih rib. Vendar pa izkušnje kažejo (11), da je bila med-bazenska varia ­
bilnost zelo majhna v primerjavi z variabilnostjo znotraj enega 
bazena (t.j. med ribami) v preu čenem primeru. Zato je relativno 
sprejemljiva možnost, da se izvede statisti čna analiza na ravni posa ­
meznih rib. 
Običajno se uporablja vsaj pet preskusnih koncentracij 
v geometri čnem zaporedju s faktorjem, ki po možnosti ne presega 3,2. 
V splošnem, kadar so preskusi izvedeni s ponovitvenimi bazeni, bi 
moralo biti število ponovitvenih kontrolnih bazenov in zato število 
rib dvakrat tolikšno kot število pri vsaki od preskusnih koncentracij, ki bi morale biti enake velikosti (12) (13) (14). V nasprotnem primeru, ko ni na voljo ponovitvenih bazenov, bi moralo biti število 
rib v kontrolni skupini enako številu rib pri vsaki preskusni koncen ­
traciji. 
Če naj ANOVA temelji na bazenih in ne na posameznih ribah (kar bi 
vključevalo ali posami čno označevanje rib ali uporabo psevdo-speci ­
fičnih stopenj rasti (glej poglavje 2.1.2), je potrebno dovolj veliko 
število ponovitvenih bazenov, da se omogo či določitev standardnega 
odklona „bazenov ene koncentracije“. To pomeni, da bi morale biti stopinje prostosti napake v analizi variance vsaj 5 (10). Če so pono ­
vljene le kontrole, obstaja nevarnost, da bo variabilnost napak 
pristranska, ker se lahko pove ča s srednjo vrednostjo zadevne stopnje 
rasti. Ker je verjetno, da se bo s pove čevanjem koncentracije stopnja 
rasti manjšala, to lahko vodi k precenjevanju variabilnosti.
 
1.8 POSTOPEK  
1.8.1  Izbira in tehtanje preskusnih rib  
Pomembno je, da se že na za četku preskusa čim bolj zmanjša varia ­
cija teže rib. Primerni razponi velikosti za razli čne vrste, priporo čene 
za uporabo v tem preskusu, so navedeni v Dodatku 1. Za celo serijo 
rib, ki so uporabljene v preskusu se v idealnem primeru razpon posameznih tež na za četku preskusa vzdržuje znotraj ± 10 % arit ­
metične sredine teže in v nobenem primeru ne sme presegati 25 %. 
Priporočljivo je, da se pred preskusom stehta podvzorec rib, da bi 
ocenili srednjo težo.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1151
 
Osnovne populacije rib se ne sme hraniti 24 ur pred za četkom 
preskusa. Ribe se nato izberejo naklju čno. Z uporabo splošnega 
anestetika (npr. vodna raztopina 100 mg/l trikain metan sulfonata (MS 222), nevtralizirana z dodatkom dveh delov natrijevega bikar ­
bonata na del MS 222), se dolo či mokra teža posameznih rib (osu ­ 
šenih s pivnikom) z natan čnostjo, navedeno v Dodatku 1. Ribe s težo 
znotraj zaželenega razpona se zadržijo in naklju čno porazdelijo po 
preskusnih posodah. Zapiše se skupna mokra teža rib v vsaki preskusni posodi. Uporaba anestetika in rokovanje z ribami (vklju čno 
s sušenjem in tehtanjem) lahko pri mladicah povzro či stres in 
poškodbe, zlasti pri majhnih vrstah. Zato je treba z mladicami ravnati izredno pazljivo, da se izognemo povzro čanju stresa in poškodb 
preskusnih živali. 
Ribe se ponovno stehtajo na 28. dan preskusa (glej poglavje 1.8.6). 
Če pa se zdi potrebno, da bi ponovno prera čunali obroke hrane, se 
lahko ribe ponovno stehtajo na 14. dan preskusa (glej poglavje 1.8.2.3). Lahko se uporabi tudi kakšna druga metoda, kot je foto ­
grafska metoda, da se ugotovi spremembe v velikosti rib, na osnovi 
katerih se lahko prilagodijo obroki hrane.
 
1.8.2  Pogoji izpostavljenosti  
1.8.2.1  Trajanje  
Preskus traja ≥ 28 dni.  
1.8.2.2  Stopnje obremenitve in gostota populacij  
Pomembno je, da sta stopnja obremenitve in gostota rib ustrezni za 
uporabljeno preskusno vrsto (glej Dodatek 1). Če je gostota rib 
prevelika, bo prišlo do stresa zaradi gne če, kar bo povzro čilo zmanj ­ 
šano stopnjo rasti in mogo če bolezen. Če je gostota premajhna, lahko 
to povzro či teritorialno vedenje, ki bi tudi lahko vplivalo na rast. 
V vsakem primeru bi morala biti stopnja obremenitve dovolj nizka, 
da se lahko ohranja koncentracija raztopljenega kisika vsaj 60 % nasičenosti zraka brez prezra čevanja. Krožni preskus (3) je pokazal, 
da je sprejemljiva stopnja obremenitve za šarenko 16 rib, težkih 3- 
5 g, na 40 litrov. Priporo čena pogostost odstranjevanja vode med 
preskusom je 6 litrov/g ribe/dan.
 
1.8.2.3  Hranjenje  
Ribe je treba hraniti z ustrezno hrano (Dodatek 1) z zadostno stop ­
njo, da se omogo či sprejemljiva stopnja rasti. Paziti je treba, da ne 
pride do rasti mikrobov in kalnosti vode. Pri šarenki je verjetno, da 
bo stopnja 4 % njihove teže na dan tem pogojem zadostila (2) (15) 
(16) (17). Dnevni obrok se lahko razdeli na dva enaka dela, ki se dasta ribam v dveh obrokih na dan v razmaku vsaj petih ur. Obrok temelji na za četni skupni teži vseh rib za vsako preskusno posodo. 
Če se ribe ponovno stehtajo na 14. dan, se obrok ponovno prera čuna. 
Pred tehtanjem se rib 24 ur ne sme hraniti.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1152
 
Hrano, ki je ribe ne pojedo, in fekalije je treba odstraniti iz posod 
vsak dan tako, da se s sesalko previdno o čisti dno vsakega bazena.  
1.8.2.4  Svetloba in temperatura  
Fotoperioda in temperatura vode bi morali biti ustrezni za preskusno 
vrsto (Dodatek 1).  
1.8.3  Preskusne koncentracije  
Običajno je potrebnih pet koncentracij preskusne snovi, ne glede na 
načrt preskusa (glej poglavje 1.7.2). V pomo č pri izbiri ustreznih 
preskusnih koncentracij je predhodno znanje o toksi čnosti preskusne 
snovi (npr. iz akutnega preskusa in/ali iz študij za ugotavljanje 
območja). Če se uporabi manj kot pet koncentracij, je treba to 
utemeljiti. Najvišja preskušana koncentracija ne sme prese či meje 
topnosti snovi v vodi. 
Kadar se za pomo č pri pripravi osnovne raztopine uporabi topilo, 
njegova kon čna koncentracija ne sme biti ve čja od 0,1 ml/l in je po 
možnosti enaka v vseh preskusnih posodah (glej poglavje 1.6.3). 
Vendar pa si je treba prizadevati, da se uporabi takih materialov izognemo.
 
1.8.4  Kontrole  
Število kontrol z vodo za red čenje je odvisno od na črta preskusa 
(glej poglavja 1.7–1.7.2). Če se uporabi topilo, je treba vklju čiti tudi 
enako število kontrol s topilom kot kontrol z vodo za red čenje.  
1.8.5  Pogostost analitskih dolo čitev in meritev  
Med preskusom se v rednih časovnih razmakih ugotavljajo koncen ­
tracije preskusne snovi (glej spodaj). 
V pretočnih preskusih je treba pretok raztopin za red čenje in osnovne 
raztopine preskusne snovi preverjati v časovnih razmakih, po 
možnosti dnevno, in ta se med preskusom ne sme spreminjati za 
več kot 10 %. Kadar se pri čakuje, da bo koncentracija preskusne 
snovi znotraj ± 20 % nominalne vrednosti (t.j. v razponu 80–120 %; glej poglavji 1.6.2 in 1.6.3), se priporo ča, da se analizirajo vsaj 
najvišje in najnižje preskusne koncentracije na za četku preskusa in 
nato v tedenskih presledkih. Pri preskusih, kjer se pri čakuje, da 
koncentracija preskusne snovi ne bo ostala znotraj ± 20 % nominalne koncentracije (na osnovi podatkov o stabilnosti preskusne snovi), je treba na enak na čin analizirati vse preskusne koncentracije. 
Pri semi-stati čnih (obnavljajo čih) preskusih, kjer se pri čakuje, da bo 
koncentracija preskusne snovi ostala znotraj ± 20 % nominalne vred ­
nosti, se priporo ča, da se analizirajo vsaj najvišje in najnižje sveže 
pripravljene preskusne koncentracije, tik pred obnovitvijo na za četku 
študije in kasneje vsak teden. Pri preskusih, kjer se pri čakuje, da 
koncentracija preskusne snovi ne bo ostala znotraj ± 20 % nominalne 
koncentracije, je treba analizirati vse preskusne koncentracije na enak 
način kot pri stabilnejših snoveh.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1153
 
Priporoča se, da rezultati temeljijo na merjenih koncentracijah. Če pa 
so na voljo dokazi, ki kažejo na to, da se je koncentracija preskusne 
snovi v raztopini zadovoljivo ohranjala znotraj ± 20 % nominalne ali izmerjene za četne koncentracije ves čas preskusa, lahko rezultati 
temeljijo na nominalnih ali merjenih vrednostih. 
Vzorce bo morda treba filtrirati (npr. z uporabo filtra z velikostjo por 
0,45 μm) ali centrifugirati. Priporo čen postopek je centrifugiranje. Če 
pa se preskusni material ne adsorbira na filtre, je lahko sprejemljivo tudi filtriranje. 
Med preskusom je treba meriti raztopljeni kisik, pH-vrednost in 
temperaturo v vseh preskusnih posodah. Skupna trdota, alkalnost 
in slanost ( če je primerno) se merijo v kontrolah in eni posodi 
z najvišjo koncentracijo. Raztopljeni kisik in slanost ( če je primerno) 
je treba izmeriti vsaj trikrat (na za četku, sredini in koncu preskusa). 
Pri semi-stati čnih preskusih je priporo čljivo, da se raztopljeni kisik 
meri pogosteje, po možnosti pred in po vsakokratni obnovitvi vode ali vsaj enkrat tedensko. pH-vrednost je treba meriti na za četku in na 
koncu vsakokratne obnove vode pri stati čnih obnovitvenih preskusih 
in vsaj tedensko pri preto čnih preskusih. Trdota in alkalnost se 
merita enkrat na vsak preskus. Temperatura se po možnosti stalno spremlja v vsaj eni preskusni posodi.
 
1.8.6  Opazovanja  
Teža: na koncu preskusa je treba stehtati vse preživele ribe kot 
mokro težo (ribe posušene s pivnikom) bodisi v skupinah po 
preskusnih posodah bodisi posami čno. Tehtanje živali po preskusnih 
posodah je bolj zaželeno kot posamezno tehtanje, pri katerem je treba posamezne ribe ozna čiti. V primeru merjenja posameznih tež 
rib za ugotavljanje specifi čne stopnje rasti posameznih rib, je treba 
tehniko ozna čevanja izbrati tako, da se ne povzro či stres pri živalih 
(ustrezne so lahko alternativne možnosti druga čne od zamrzovalnega 
označevanja („freeze marking“), npr. uporaba tanke obarvane ribiške 
vrvice). 
Ribe je treba pregledovati vsak dan v času trajanja preskusa, vse 
zunanje nepravilnosti (kot so krvavitve, razbarvanje) ter neobi čajno 
vedenje je treba zapisati. Zapisati je treba vse smrtne primere, mrtve 
ribe pa čim prej odstraniti. Mrtve ribe se ne nadomeš čajo, stopnja 
obremenitve in gostota rib pa sta zadovoljivi, da se prepre čijo vplivi 
na rast zaradi sprememb v številu rib na bazen. Vendar pa bo treba prilagoditi stopnjo hranjenja.
 
2. PODATKI IN PORO ČANJE  
2.1 OBDELAVA REZULTATOV 
Priporoča se, da naj bo tako v na črt kot analizo preskusa vklju čen 
tudi statistik, ker so pri tej preskusni metodi mogo če precejšnje 
variacije na črta eksperimenta, kot na primer v številu preskusnih 
komor, številu preskusnih koncentracij, številu rib itd. Glede na 
možnosti, ki so na voljo pri na črtu preskusa, tu niso podana speci ­
fična vodila za statisti čni postopek.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1154
 
Stopnja rasti se ne izra čuna za preskusne posode, v katerih smrtnost 
presega 10 %. Stopnja smrtnosti pa se navede za vse preskusne 
koncentracije. 
Ne glede na to, katera metoda se uporabi za analizo podatkov, je 
osrednji koncept specifi čna stopnja rasti r med časom t  1 in časom t  2. 
To se lahko opredeli na razli čne načine, odvisno od tega, ali so ribe 
posamično označene ali ne, oziroma ali je potrebno povpre čje 
bazena.  
r 1 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
r 2 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
r 3 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
pri čemer je: 
r 1 = specifi čna stopnja rasti posamezne ribe 
r 2 = povpre čna specifi čna stopnja rasti v bazenu 
r 3 = „psevdo“-specifi čna stopnja rasti 
W 1 , W  2 = teži posamezne ribe ob času t  1 in času t  2 
log e w 1 = logaritem teže posamezne ribe ob za četku študije 
log e w 2 = logaritem teže posamezne ribe ob koncu študije 
log e W 1 = povpre čje logaritmov vrednosti w  1 za ribe v bazenu ob 
začetku študije 
log e W 2 = povpre čje logaritmov vrednosti w  2 za ribe v bazenu ob 
koncu študije 
t 1 , t 2 = čas (dnevi) na za četku in na koncu študije 
r 1 , r 2 , r 3 se lahko izra čunajo za obdobje od 0–28 dni in, kjer je to 
ustrezno (npr. ko je bila izvedena meritev na 14. dan), za obdobje od 
0–14 dni in 14–28 dni.  
2.1.1  Regresijska analiza rezultatov (model koncentracija-odziv)  
Ta metoda poiš če primerno matemati čno razmerje med specifi čno 
stopnjo rasti in koncentracijo in tako omogo ča oceno „EC  X “, 
t.j. katero koli potrebno vrednost EC. Z uporabo te metode izra čun 
vrednosti r za posamezne ribe (r  1 ) ni nujen in namesto tega lahko 
analiza temelji na povpre čni vrednosti r za bazen (r  2 ). Zaželena je 
slednja metoda. Prav tako pa je ta ustreznejša v primeru uporabe najmanjših vrst. 
Povprečne specifi čne stopnje rasti v bazenih (r
 2 ) je treba grafi čno 
prikazati v odvisnosti od koncentracije, da se preveri razmerje med 
koncentracijo in odzivom.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1155
 
Za izražanje razmerja med r  2 in koncentracijo je treba izbrati 
ustrezen model in izbira modela mora biti ustrezno utemeljena. 
Če je število preživelih rib v vsakem bazenu razli čno, je treba 
pretehtati proces prilagoditve modela („model fitting“), pa naj bo 
ta enostaven ali nelinearen, da se upoštevajo neenake velikosti 
skupin. 
Metoda prilagoditve modela („fitting of model“) mora omogo čati 
oceno, na primer, EC  20 in njene porazdelitve (bodisi standardna 
napaka ali interval zaupanja). Graf prilagojenega modela je treba prikazati v odvisnosti od podatkov, da se lahko razbere ustreznost 
prilagoditve modela („fit of the model“) (8) (18) (19) (20).
 
2.1.2  Analiza rezultatov za oceno LOEC  
Če je preskus vklju čeval ponovitvene bazene pri vseh koncentracijah, 
lahko ocena LOEC temelji na analizi variance (ANOVA) povpre čne 
specifične stopnje rasti v posameznih bazenih (glej poglavje 2.1), ki 
ji sledi ustrezna metoda (npr. Dunnettov ali Williamsov test (12) (13) (14) (21)) primerjave povpre čja r za vsako koncentracijo 
s povprečjem r za kontrole, z namenom, da se identificira najnižja 
koncentracija, za katero je ta razlika pomembna pri stopnji verjet ­
nosti 0,05. Če niso izpolnjene zahtevane domneve za parametrske 
metode – nenormalna porazdelitev (npr. Shapiro-Wilov test) ali hete ­
rogena varianca (Bartlettov test), je potreben razmislek 
o preoblikovanju podatkov, da se poenotijo variance pred izvedbo 
ANOVA, ali pred izvedbo tehtane ANOVA. 
Če preskus ni vklju čeval ponovitvenih bazenov za vsako koncentra ­
cijo, bo ANOVA, ki temelji na bazenih, neob čutljiva ali nemogo ča. 
V takem primeru je sprejemljiv kompromis, da ANOVA temelji na „psevdo“-specifi čni stopnji rasti r
 3 za posamezne ribe. 
Povprečje r  3 za vsako preskusno koncentracijo se potem lahko 
primerja s povpre čnim r  3 za kontrole. LOEC se lahko dolo či kot 
prej. Zavedati se je treba, da ta metoda niti ne upošteva niti ne 
zagotavlja zaš čite pred variabilnostjo med bazeni, razen tiste, ki je 
utemeljena z variabilnostjo med posameznimi ribami. Izkušnje pa so pokazale (8), da je bila variabilnost med bazeni zelo majhna v primerjavi z variabilnostjo znotraj bazena (t.j. med ribami). Če 
posamezne ribe niso vklju čene v analizo, mora biti zagotovljena 
metoda dolo čitve osamelcev in treba je utemeljiti njeno uporabo.
 
2.2 RAZLAGA REZULTATOV 
Rezultati morajo biti previdno obrazloženi, kadar so merjene koncen ­
tracije snovi v preskusnih raztopinah blizu meje detekcije analitske 
metode ali, pri semi-stati čnih preskusih, kadar se koncentracija 
preskusne snovi zmanjša med sveže pripravljeno raztopino in pred obnovo.
 
2.3 PORO ČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje podatke:  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1156
 
2.3.1  Preskusna snov:  
— fizikalno stanje in ustrezne fizikalno-kemijske lastnosti, 
— identifikacijski podatki o kemikaliji, vklju čno s čistostjo in 
analitsko metodo za koli činsko dolo čanje preskusne snovi, kjer 
je to ustrezno.  
2.3.2  Preskusna vrsta:  
— znanstveno ime, če je mogo če, 
— ev, velikost, dobavitelj, kakršno koli predhodno tretiranje itd.  
2.3.3  Preskusni pogoji:  
— uporabljeni preskusni postopek (npr. semi-stati čni/obnavljajo či, 
pretočni, obremenitev, gostota rib itd.), 
— načrt preskusa (npr. število preskusnih posod, preskusnih koncen ­
tracij in ponovitev, število rib na posodo), 
— metoda priprave osnovnih raztopin in pogostost obnavljanja 
(navedena morata biti topilo in njegova koncentracija, kadar se 
uporabi), 
— nominalna preskusna koncentracija, srednje vrednosti izmerjenih 
vrednosti in njihovi standardni odkloni v preskusnih posodah in metoda, s katero so bile te dobljene, ter dokazi, da se meritve nanašajo na koncentracije preskusne snovi v pravi raztopini, 
— značilnosti vode za red čenje: pH-vrednost, trdota, alkalnost, 
temperatura, koncentracija raztopljenega kisika, koncentracija 
sledi klora ( če so bile merjene), skupni organski ogljik, suspen ­
dirani trdni delci, slanost preskusnega medija ( če je bila merjena) 
in katere koli druge izvedene meritve, 
— kakovost vode v preskusnih posodah: pH-vrednost, trdota, 
temperatura in koncentracija raztopljenega kisika, 
— podrobni podatki o hranjenju (npr. vrsta hrane, vir, dana koli čina 
in pogostost).
 
2.3.4  Rezultati:  
— dokazi, da so kontrole izpolnjevale merilo preživetja za veljav ­
nost, in podatki o smrtnosti v kateri koli od preskusnih koncen ­
tracij, 
— uporabljene statisti čne analitske tehnike, statistika, ki temelji na 
ponovitvah ali ribah, obdelava podatkov in upravi čenost upora ­
bljenih tehnik, 
— tabelari čen prikaz podatkov o posameznih in srednjih težah rib 
v dnevih 0, 14 ( če so bile merjene) in 28, vrednosti povpre čne 
stopnje rasti v bazenu ali psevdo-specifi čne stopnje rasti (kakor 
je ustrezno) za obdobje od 0–28 dni ali po možnosti od 0–14 dni 
in od 14–28 dni, 
— rezultati statisti čne analize (t.j. regresijske analize ali ANOVA), 
po možnosti v tabelari čni in grafi čni obliki in LOEC (p = 0,05) 
in NOEC ali EC  X , če je mogo če s standardnimi napakami,  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1157
 
— pojav kakršnih koli neobi čajnih reakcij rib in kakršnih koli 
vidnih učinkov, ki jih povzro či preskusna snov.  
3. LITERATURA 
(1) Solbe J.F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals 
(CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for 
Studying the Effects of Chemicals on the Growth rate of Fish. 
WRc Report No. PRD 1388-M/2. 
(2) Ashley S., Mallett M.J. and Grandy N.J. (1990). EEC Ring 
Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on 
the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M. 
(3) Crossland N.O. (1985). A method to evaluate effects of toxic 
chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, str. 1855–1870. 
(4) Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P.D., Market M., 
Munk R., Scholz N. and Hofte B.B. (1991). Effect of 3,4- dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish  (Brac­
hydanio rerio):  results of a comparative laboratory study. 
Ecotox. Environ. Safety, 21, str. 157–164. 
(5) Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biolo ­
gical field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japan. 
(6) Holcombe, G.W., Benoit D.A., Hammermeister, D.E., 
Leonard, E.N. and Johnson, R.D. (1995). Acute and long- term effects of nine chemicals on the Japanese medaka  (Ory­
zias latipes). Arch. Environ. Conta. Toxicol. 28, str. 287–297. 
(7) Benoit, D.A., Holcombe, G.W. and Spehar, R.L. (1991). 
Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese 
medaka  {Oryzias latipes).  Ecological Research Series EPA- 
600/3-91-063. U. S. Environmental Protection Agency, Duluth, Minesota. 
(8) Stephan C.E. and Rogers J.W. (1985). Advantages of using 
regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Sympo ­
sium, ASTM STP 891, R C Bahner and D J Hansen, Eds., 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, str. 328–338. 
(9) Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity 
tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, 
Ontario, Report EPS 1/RM/28, str. 81. 
(10) Cox D.R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt. 
(11) Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests 
for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts 
on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10- 
12 December 1991. 
(12) Dunnett C.W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. Assoc, 50, str. 1096–1121. 
(13) Dunnett C.W. (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, str. 482–491.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1158
 
(14) Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27, str. 103–117. 
(15) Johnston, W.L., Atkinson, J.L., Glanville N.T. (1994). 
A technique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout,  
Oncorhynchus mykiss:  effect of feeding level. Aquaculture 
120, str. 123–133. 
(16) Quinton, J. C. and Blake, R.W. (1990). The effect of feed 
cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout,  Oncorhynchus mykiss.  Journal of Fish 
Biology, 37, str. 33–41. 
(17) Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. 
Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 P. 
(18) Bruce, R.D. and Versteeg D.J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data . Environ. Toxicol. 
Chem. 11, 1485–1494. 
(19) DeGraeve, G.M., Cooney, J.M., Pollock, T.L., Reichenbach, 
J.H., Dean, Marcus, M.D. and Mclntyre, D.O. (1989). Preci ­
sion of EPA seven-day fathead minnow larval survival and 
growth test; intra and interlaboratory study, report EA-6189 (American Petroleum Institute Publication, n. 4468). Electric Power Research Institute, Palo alto, CA. 
(20) Norbert-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic 
toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection 
Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minesota. Tech. Rep. No 05–88 of National Effluent Toxicity Assesment Center. Sept. 1988. Str. 12. 
(21) Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28, str. 510–531.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1159
 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1160
 ▼B 
DODATEK 1  
PRIPORO ČENE VRSTE RIB ZA PRESKUŠANJE IN USTREZNI POGOJI PRESKUŠANJA  
Vrsta Priporočen razpon 
preskusne 
temperature 
( o C) Fotoperioda 
(v urah) Priporočen razpon 
začetne teže rib 
(g) Zahtevana 
natančnost merjenja Stopnja 
obremenitve 
(g/l) Gostota rib 
(na liter) Hrana Dolžina preskusa 
(v dnevih)  
Priporočena vrsta:  
Oncorhynchus mykiss  
šarenka 12,5–16,0 12–16 1–5 Zaokrožanje na 
najbližjih 
100 mg 1,2–2,0 4 Suha hrana zaš čitene znamke 
za salmonidne mladice ≥ 28 
Druge dobro dokumentirane 
vrste:  
Danio rerio  
cebrica 21–25 12–16 0,050–0,100 Zaokrožanje na 
najbližji 1 mg 0,2–-1,0 5–10 Živa hrana ( Brachionus Arte ­
mia) ≥ 28 
Oryzias latipes  
medaka 21–25 12–16 0,050–0,100 Zaokrožanje na 
najbližji 1 mg 0,2–1,0 5– 20 Živa hrana ( Brachionus Arte ­
mid) ≥ 28
DODATEK 2  
NEKATERE KEMIJSKE ZNA ČILNOSTI SPREJEMLJIVE VODE ZA 
REDČENJE  
SNOV KONCENTRACIJA  
Trdni delci < 20 mg/l 
Skupni organski ogljik < 2 mg/l 
Neionizirani amoniak < 1 μg/l 
Ostanek klora < 10 μg/l 
Skupni organofosfomi pesticide < 50 ng/l Skupni organoklorni pesticidi in poliklorirani bifenili < 50 ng/1 Skupni organski klor < 25 ng/1
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1161
DODATEK 3  
Logaritmi čne serije koncentracij, primerne za preskus toksi čnosti (9)  
Stolpec (število koncentracij med 100 in 10, ali med 10 in 1) (*) 
1 2 3 4 5 6 7  
100 100 100 100 100 100 100 
32 46 56 63 68 72 75 10 22 32 40 46 52 56 
3,2 10 18 25 32 37 42 1,0 4,6 10 16 22 27 32 
2,2 5,6 10 15 19 24 
1,0 3,2 6,3 10 14 18 
1,8 4,0 6,8 10 13 1,0 2,5 4,6 7,2 10 
1,6 3,2 5,2 7,5 1,0 2,2 3,7 5,6 
1,5 2,7 4,2 
1,0 1,9 3,2 
1,4 2,4 1,0 1,8 
1,3 1,0
 
(*) Iz stolpca se lahko izbere serija petih (ali ve č) zaporednih koncentracij. Vmesne vrednosti med koncentracijami v stolpcu (x) so 
v stolpcu (2x + 1). Navedene vrednosti lahko predstavljajo koncentracije, izražene v odstotkih na prostornino ali težo (mg/l al i μg/l). 
Vrednosti se lahko množijo ali delijo s katero koli potenco števila 10, kot je ustrezno. Stolpec 1 se lahko uporabi, če je ugotovljena 
znatna negotovost stopnje toksi čnosti. ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1162
 
C.15  RIBE, PRESKUS KRATKOTRAJNE TOKSI ČNOSTI NA 
EMBRIIH IN MLADICAH S HRANILNIM MEŠI ČKOM  
1. METODA  
Ta metoda preskušanja kratkotrajne toksi čnosti ustreza metodi 
OECD TG 212 (1998).  
1.1 UVOD 
Ta preskus kratkotrajne toksi čnosti na ribjih embriih in mladicah 
s hranilnim meši čkom je kratkotrajni preskus, pri katerem se izpo ­
stavijo življenjski stadiji od novo oplojene ikre do konca stadija 
mladice z rumenjakovo vre čko. Pri preskusu na embriih in mladicah 
z rumenjakovo vre čko ni predvideno hranjenje, zato se mora preskus 
končati, ko se mladica še hrani iz hranilnega meši čka. 
Preskus je namenjen za dolo čanje smrtnih in, delno, subletalnih 
učinkov kemikalij na posamezni preskušani stadij in vrsto. S tem 
preskusom se lahko pridobi koristne informacije, ker lahko 
(a) vzpostavi most med letalnimi in subletalnimi preskusi, (b) se uporabi kot presejalni preskus bodisi za popolni preskus zgodnjega razvojnega stadija ali za preskuse kroni čne toksičnosti in (c) se 
uporabi za preskušanje vrst, kjer tehnike gojitve rib niso dovolj 
razvite, da bi pokrile obdobje prehoda od endogenega do eksogenega hranjenja. 
Ne smemo pozabiti, da na splošno lahko dajo to čno oceno kroni čne 
toksičnosti kemikalij za ribe le preskusi, ki vklju čujejo vse razvojne 
stadije rib, in da lahko vsaka omejitev izpostavljenosti, glede življen ­
skih stadijev, zmanjša ob čutljivost in tako podceni kroni čno toksi­ 
čnost. Zato se lahko pri čakuje, da bo preskus na embriiih in 
mladicah s hranilnim meši čkom manj ob čutljiv kot popolni preskus 
na zgodnjem razvojnem stadiju, zlasti kar zadeva kemikalije z visoko lipofilnostjo (log P
 ow > 4) in kemikalije s posebnim na činom toksi ­ 
čnega delovanja. Pri čakovali pa bi manjše razlike v ob čutljivosti med 
obema preskusoma za kemikalije z nespecifi čnim, narkoti čnim 
načinom delovanja (1). 
Pred objavo tega preskusa, je bilo najve č izkušenj s tem preskusom 
na embriih in mladicah s hranilnim meši čkom pri sladkovodni ribi  
Danio rerio , Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae – cebrica). 
Zato so v Dodatku 1 podrobnejši napotki za izvedbo preskusa na tej vrsti. To ne izklju čuje uporabe drugih vrst, s katerimi imamo tudi že 
izkušnje (Tabela 1).
 
1.2 OPREDELITEV POJMOV  
Najnižja koncentracija z opaznim u činkom (lowest observed 
effect concentration – LOEC):  je najnižja preskušena koncentracija 
preskusne snovi, pri kateri je bilo opaženo, da ima snov pomemben učinek (pri p < 0,05) v primerjavi s kontrolo. Vendar pa morajo 
imeti vse preskusne koncentracije nad LOEC škodljiv u činek, ki je 
enak ali ve čji kot učinek, opažen pri LOEC.  
Koncentracija brez opaznih u činkov (no observed effect concen ­
tration – NOEC):  je preskusna koncentracija tik pod LOEC.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1163
 
1.3 PRINCIP PRESKUSA 
Embrionalni stadij in stadij mladice s hranilnim meši čkom se izpo ­
stavita nizu koncentracij preskusne snovi, raztopljene v vodi. V okviru protokola je možna izbira med semi-stati čnim in preto čnim 
postopkom. Izbira je odvisna od narave preskusne snovi. Preskus se 
začne tako, da se oplojene ikre položijo v preskusne komore, in se 
konča tik preden je hranilni meši ček katere koli li činke v kateri koli 
preskusni komori povsem absorbiran ali preden za čnejo osebki 
kontrole umirati od lakote. Smrtni in subletalni u činki se ocenjujejo 
in primerjajo s kontrolnimi vrednostmi, da se dolo či najnižja koncen ­
tracija z opaznim u činkom in iz tega koncentracija brez opaznih 
učinkov. Druga možnost je, da se jih analizira z uporabo regresij ­
skega modela, da se oceni koncentracija, ki povzro či dani odstotek 
učinka (t.j. LC/EC
 X , kjer je x dolo čen % učinka).  
1.4 PODATKI O PRESKUSNI SNOVI 
Na voljo bi morali biti rezultati preskusa akutne toksi čnosti (glej 
preskusno metodo C.1), ki je bil po možnosti izveden na vrsti, 
izbrani za ta preskus. Rezultati so lahko uporabni pri izbiri ustrez ­
nega obsega preskusnih koncentracij pri preskusu na zgodnjih razvojnih stadijih. Znana morata biti topnost v vodi (vklju čno 
s topnostjo v preskusni vodi) in parni tlak preskusne snovi. Na 
voljo mora biti zanesljiva analitska metoda za dolo čitev količine 
snovi v preskusnih raztopinah z znano in izpri čano točnostjo in 
mejo detekcije. 
Podatki o preskusni snovi, uporabni pri dolo čanju preskusnih pogo ­
jev, vklju čujejo strukturno formulo, čistost snovi, stabilnost na svet ­
lobi, stabilnost v preskusnih pogojih, pKa, P
 ow in rezultate preskusov 
za lahko biorazgradljivost (glej preskusno metodo C.4).  
1.5 VELJAVNOST PRESKUSA 
Za veljavnost preskusa morajo biti izpolnjeni naslednji pogoji: 
— celotno število preživelih oplojenih iker v kontrolah in kadar je 
primerno, v posodah, kjer je samo topilo, mora biti ve čje ali 
enako mejnim vrednostim, dolo čenih v Dodatkih 2 in 3, ali 
njim enako, 
— koncentracija raztopljenega kisika mora biti ves čas preskusa med 
60 in 100 % nasi čenostjo zraka (ASV), 
— razlika v temperaturi vode v razli čnih preskusnih komorah ali 
v zaporednih dneh med preskusom nikoli ne sme biti ve čja od 
±1,5  o C in jo je treba ohranjati znotraj temperaturnih razponov, 
ki so dolo čeni za preskusno vrsto (Dodatka 2 in 3).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1164
 
1.6 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.6.1  Preskusne komore  
Uporabijo se lahko kakršne koli steklene ali druge kemijsko inertne 
posode. Posode morajo biti dovolj velike, da omogo čajo skladnost 
s stopnjo obremenitve (glej poglavje 1.7.1.2). Priporo čljivo je, da se 
preskusne komore naklju čno postavijo v obmo čje, kjer poteka 
preskus. Kadar so v laboratoriju sistemati čni učinki, ki se jih lahko 
kontrolira z uporabo razdelitve v bloke, se bolj kot povsem naklju čni 
načrt priporo ča uporaba na črta naklju čnih blokov, pri čemer se 
v vsakem bloku izvajajo vsa tretiranja. Če se uporablja razdelitev 
v bloke, je to treba upoštevati pri poznejši analizi podatkov. 
Preskusne komore morajo biti zaš čitene pred neželenimi motnjami.  
1.6.2  Izbira vrst  
Priporočljive ribje vrste so navedene v Tabeli 1A. To ne izklju čuje 
uporabe drugih vrst (primeri so navedeni v Tabeli 1B), vendar bo morda treba temu prilagoditi preskusni postopek, da se zagotovijo 
primerni preskusni pogoji. V tem primeru je treba izbiro vrste in 
eksperimentalne metode utemeljiti v poro čilu.
 
1.6.3  Vzdrževanje plemenskih rib  
Podrobnosti o vzdrževanju plemenskih rib v zadovoljivih pogojih 
lahko najdemo v OECD TG 210 (  1 ) in v literaturi (2) (3) (4) (5) (6).  
1.6.4  Ravnanje z embrii in li činkami  
Embrii in li činke se lahko izpostavijo v glavni posodi, v manjših 
posodah, ki imajo mrežaste stranice ali konce, da se lahko skozi 
posodo pretaka preskusna raztopina. Neturbulentni tok skozi te 
majhne posode se lahko doseže tako, da se posode obesijo na držalo, nameščeno tako, da premika posodo gor in dol, vendar tako, da so 
organizmi ves čas potopljeni; uporabi se lahko tudi sistem 
s sifonskim splakovanjem. Oplojene ikre salmonidnih rib lahko ležijo 
na podstavkih ali mrežah z dovolj velikimi luknjicami, da lahko ličinke, ko se izležejo, padejo skoznje. Za odstranjevanje embriev 
in ličink pri semi-stati čnih preskusih s popolno vsakodnevno obnovo 
je primerna uporaba pasterjevih pipet (glej odstavek 1.6.6). 
Kadar se za zadrževanje iker v glavni preskusni posodi uporabljajo 
posodice, rešetke ali mreže za ikre, je treba te priprave odstraniti, ko 
se ličinke izležejo (
 1 ), obdržijo se le mreže, da ribe ne pobegnejo. Če 
je treba li činke prenesti, se te ne smejo izpostaviti zraku in pri 
spuščanju rib iz posod za ikre se ne smejo uporabljati lovilne 
mrežice (taka previdnost morda ni potrebna pri nekaterih manj 
nežnih vrstah, npr. pri krapu). Čas prenosa je razli čen, odvisno od 
vrste in tudi ni vselej potreben. Za semi-stati čno tehniko se lahko 
uporabijo čaše ali plitve posode, po potrebi opremljene z mrežastim 
zaslonom, ki je nekoliko dvignjen od dna posode. Če je prostornina 
teh posod zadostna glede na zahteve obremenitve (glej 1.7.1.2), prenos embriev ali li čink morda ni potreben.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1165  
( 1 ) OECD, Pariz, 1992, Preskusna navodila 210, Ribe, Preskus strupenosti v zgodnjih 
razvojnih stadijih.
 1.6.5  Voda  
Vsaka voda z ustreznimi kemi čnimi lastnostmi sprejemljive vode za 
redčenje, naštetimi v Dodatku 4, v kateri preskušana vrsta kaže vsaj 
tolikšno preživetje v kontrolah, kot je opisano v Dodatkih 2 in 3, je 
primerna za preskusno vodo. V času preskusa mora voda ohranjati 
konstantno kakovost. pH-vrednost mora ostati v obmo čju ±0,5 pH 
enote. Za zagotovitev, da voda za red čenje ne bi neprimerno vplivala 
na preskusni rezultat (na primer s kompleksacijo preskusne snovi) ali 
škodljivo u činkovala na produktivnost plemenskih rib, je treba 
v časovnih razmakih jemati vzorce za analizo. Izvajati je treba 
meritve težkih kovin (npr. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd in Ni), glavnih 
anionov in kationov (npr. Ca, Mg, Na, K, Cl in SO  4 ), pesticidov 
(npr. skupnih organofosfornih in skupnih organoklornih pesticidov), skupnega organskega ogljika in suspendiranih trdnih delcev, na primer vsake tri mesece, kadar se ve, da je voda za red čenje rela­
tivno konstantne kakovosti. Če se dokaže, da je bila kakovost vode 
konstantna vsaj eno leto, se lahko meritve izvajajo manj pogosto, časovni razmaki pa se lahko podaljšajo (npr. na vsakih šest mese ­
cev).
 
1.6.6  Preskusne raztopine  
Preskusne raztopine izbranih koncentracij se pripravijo z red čenjem 
osnovne raztopine. 
Osnovno raztopino je treba po možnosti pripraviti preprosto 
z mešanjem ali stresanjem preskusne snovi v vodi za red čenje 
z uporabo mehanskih sredstev (npr. z mešanjem ali ultrazvokom). 
Za to, da se dobi primerno koncentrirana osnovna raztopina se lahko 
uporabijo kolone za nasi čevanje raztopine. Kolikor je mogo če, se je 
treba izogibati uporabi topil ali disperzij skih sredstev (topil); vendar so take zmesi lahko potrebne v nekaterih primerih, da se pripravi 
primerno koncentrirana osnovna raztopina. Primeri ustreznih topil so 
aceton, etanol, metanol, dimetil formamid in trietilen glikol. Primeri primernih disperzij skih sredstev Cremophor RH40, Tween 80, metilceluloza 0,01 % in HCO-40. Pri uporabi lahko biorazgradljivih 
sredstev (npr. acetonu) in/ali lahko hlapnih spojin je treba paziti, saj 
lahko povzro čijo težave zaradi namnožitve bakteriji pri preto čnih 
preskusih. Kadar se uporabi topil, to ne sme imeti pomembnega vpliva na preživetje niti opaznih škodljivih vplivov na zgodnje 
razvojne stadije, kar se pokaže pri kontroli, v kateri je le topilo. 
V vsakem primeru si je treba prizadevati, da se izognemo rabi takih materialov. 
Za sem-stati čno tehniko se lahko uporabita dva razli čna postopka 
obnove; bodisi (i) se pripravijo nove preskusne raztopine v čistih 
posodah in se preživele ikre in li činke nežno prenesejo v nove 
posode v majhni koli čini stare raztopine, ne da bi se izpostavile 
zraku, bodisi (ii) preskusni organizmi ostanejo v posodah, medtem ko se zamenja del (vsaj tri četrtine) preskusne vode. Pogostost 
obnove medija je odvisna od stabilnosti preskusne snovi, vendar se 
priporoča dnevna obnova vode. Če predhodni preskusi stabilnosti 
(glej poglavje 1.4) pokažejo, da koncentracija preskusne snovi med obnavljanji vode ni stabilna (t.j. izven razpona 80–120 % nominalne ali pod 80 % izmerjene za četne koncentracije), je treba razmisliti 
o izvedbi preto čnega preskusa. V vsakem primeru je treba poskrbeti, 
da se ličink ne izpostavlja stresu med postopkom obnavljanja vode.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1166
 
Za pretočne preskuse je priporo čljiv sistem, ki stalno odmerja in 
redči osnovno raztopino preskusne snovi (npr. merilna črpalka, 
proporcionalni razred čevalnik, sistem naprav za nasi čenje), da dovaja 
niz koncentracij v preskusne komore. Pretok osnovnih raztopin in vode za red čenje je treba preverjati v ustreznih časovnih razmakih, 
po možnosti vsak dan, in se ne sme razlikovati za ve č kot 10 % med 
celotnim preskusom. Ugotovljeno je bilo, da je primeren pretok enak prostornini vsaj petih preskusnih komor na 24 ur (2).
 
1.7 POSTOPEK 
Koristne informacije o opravljanju preskusov strupenosti na ribjih 
embriih in mladicah s hranilnim meši čkom so na voljo v literaturi, neka ­
teri primeri so vklju čeni v poglavju o literaturi v tem besedilu (7) (8) (9).  
1.7.1  Pogoji izpostavljenosti  
1.7.1.1  Trajanje  
Preskus naj se po možnosti za čne v 30 minutah po oploditvi iker. 
Embrii se potopijo v preskusno raztopino pred za četkom brazdanja 
blastodiska ali takoj po njem in v vsakem primeru pred stadijem gastrule. Pri ikrah, ki se jih dobi od komercialnega dobavitelja, preskusa morda ne bo mogo če začeti takoj po oploditvi. Ker lahko 
odlašanje z za četkom preskusa resno vpliva na ob čutljivost preskusa, 
je treba s preskusom za četi v osmih urah po oploditvi. Ker se li činke 
v času izpostavitve ne hranijo, je treba preskus zaklju čiti, tik preden 
katera koli li činka v kateri koli izmed preskusnih komor povsem 
absorbira hranilni meši ček ali preden se v kontroli za čne umiranje 
zaradi lakote. Trajanje bo odvisno od uporabljene vrste. Nekatera priporočena trajanja so navedena v Dodatkih 2 in 3.
 
1.7.1.2  Obremenitev  
Število oplojenih iker mora biti na za četku preskusa dovolj veliko, 
da izpolnjuje statisti čne zahteve. Ikre morajo biti naklju čno razpore ­
jene po tretiranjih in na koncentracijo je treba uporabiti vsaj 30 
oplojenih iker, enakomerno porazdeljenih (ali vsaj kolikor je mogoče, ker je pri uporabi nekaterih vrst težko dobiti enake serije) 
med vsaj tri ponovitvene preskusne komore. Obremenitev (biomasa 
na prostornino preskusne raztopine) mora biti dovolj nizka za 
vzdrževanje koncentracije raztopljenega kisika na vsaj 60 % nasi če­
nosti zraka brez prezra čitve. Za preto čne preskuse je priporo čena 
obremenitev, ki nikoli ne presega 0,5 g/l na 24 ur in ne presega 
5 g/l raztopine (2).
 
1.7.1.3  Svetloba in temperatura  
Fotoperioda in temperatura vode morata biti primerni za preskusne 
vrste (Dodatka 2 in 3). Za spremljanje temperature, je morda 
primerno uporabiti dodatno preskusno posodo.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1167
 
1.7.2  Preskusne koncentracije  
Običajno je potrebnih pet koncentracij preskusne snovi v razmakih, 
določenih s konstantnim faktorjem, ki ne presega 3,2. Pri izbiri 
obsega preskusnih koncentracij je treba upoštevati krivuljo odvisnosti 
LC 50 od časa izpostavljenosti pri akutnem preskusu. V nekaterih 
okoliščinah bo morda primerno uporabiti manj kot pet koncentracij, 
na primer v mejnih preskusih, in manjši razmak med koncentraci ­
jami. Če se uporabi manj kot pet koncentracij, je treba to utemeljiti. 
Koncentracij snovi, ki so višje od LC  50 po 96 urah ali 
100 mg/l, katera koli je nižja, ni treba preskušati. Snovi se ne sme preskušati nad njihovo mejo topnosti v preskusni vodi. 
Kadar se pri pripravi osnovne raztopine uporabi topilo (glej poglavje 
1.6.6), njegova kon čna koncentracija v preskusnih posodah ne sme 
biti večja od 0,1 ml/l in mora biti enaka v vseh preskusnih posodah.
 
1.7.3  Kontrole  
Poleg preskusnega niza je treba imeti eno kontrolo z vodo za 
redčenje (z ustreznimi ponovitvami) ter, če je primerno, eno kontrolo 
s topilom (z ustreznimi ponovitvami).  
1.7.4  Pogostost analitskih dolo čitev in meritev  
Med preskusom se v rednih intervalih ugotavljajo koncentracije 
preskusnih snovi. 
Pri semi-stati čnih preskusih, kjer se pri čakuje, da bo koncentracija 
preskusne snovi ostala znotraj ± 20 % nominalne (t.j. v obsegu 80–120 %; glej oddelek 1.4 in 1.6.6), je priporo čljivo, da se anali ­
zirata vsaj najvišja in najnižja preskusna koncentracija, ko sta sveže 
pripravljeni in takoj pred obnovitvijo ob vsaj treh priložnostih, ki so 
enakomerno razporejene skozi ves preskus (t.j. treba je analizirati vzorec iste raztopine – ko je sveže pripravljena in ob obnavljanju). 
Za preskuse, kjer se ne pri čakuje, da bo koncentracija preskusne 
snovi ostala znotraj ± 20 % nominalne (na podlagi podatkov o stabilnosti snovi), je treba analizirati vse preskusne koncentracije, 
ko so sveže pripravljene in ob obnavljanju, vendar po enakem 
režimu (t.j. ob vsaj treh priložnostih, ki so enakomerno razporejene skozi preskus). Dolo čanje koncentracij preskusne snovi pred obna ­
vljanjem je treba izvesti le pri eni ponovitveni posodi pri vsaki 
preskusni koncentraciji. Dolo čitve je treba izvajati v ne ve č kot 
sedemdnevnih razmikih. Priporo ča se, da rezultati temeljijo na 
merjenih koncentracijah. Če pa so na voljo dokazi, ki dokazujejo, 
da se koncentracija preskusne snovi v raztopini zadovoljivo ohranja 
znotraj ± 20 % nominalne ali izmerjene za četne koncentracije ves čas 
preskusa, lahko rezultati temeljijo na nominalnih ali merjenih za če­
tnih vrednostih. 
Za pretočne preskuse je primeren podoben režim vzor čenja, kot je 
opisan za polstati čne preskuse (vendar se v tem primeru ne merijo 
„stare“ raztopine). Če pa preskus traja ve č kot sedem dni, je pripo ­
ročljivo pove čati število vzor čenj v prvem tednu (npr. trije nizi 
meritev), da se zagotovi stabilnost preskusne koncentracije.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1168
 
Vzorce je morda treba centrifugirati ali filtrirati (npr. z uporabo filtra 
s porami velikosti 0,45 μm). Ker pa ne centrifugiranje ne filtriranje 
ne ločita vselej tiste frakcije preskusne snovi, ki ni biorazpoložljiv, 
od biorazpoložljive frakcije, ni nujno, da se vzorci tako tretirajo. 
Med preskusom je treba meriti raztopljeni kisik, pH in temperaturo 
v vseh preskusnih posodah. V kontrolah in v eni posodi z najvišjo koncentracijo je treba meriti skupno trdoto in slanost ( če je primer ­
no). Raztopljeni kisik in slanost ( če je primerno) je treba izmeriti 
vsaj trikrat (na za četku, na sredi in na koncu preskusa). Pri polstati ­ 
čnih preskusih je priporo čljivo, da se raztopljeni kisik meri pogo ­
steje, po možnosti pred in po vsaki obnovitvi vode in po njej ali vsaj 
enkrat na teden. Pri semi-stati čnih preskusih je treba pH izmeriti na 
začetku in na koncu vsake obnovitve vode, pri preto čnih preskusih 
pa vsaj enkrat tedensko. Trdoto je treba izmeriti enkrat na vsak preskus. Temperaturo je treba meriti vsak dan in jo je najbolje 
nenehno spremljati v vsaj eni preskusni posodi.
 
1.7.5  Opazovanja  
1.7.5.1  Stadiji razvoja embria  
Embrionalni stadij (t.j. stadij gastrule) je treba na za četku izposta ­
vljenosti preskusni snovi kolikor je mogo če natančno preveriti. To se 
lahko naredi z uporabo reprezentativnega vzorca iker, ki so primerno konzervirane in o čiščene. Opis in prikaz embrionalnega stadija lahko 
najdemo tudi v literaturi (2) (5) (10) (11).
 
1.7.5.2  Izvolitev in preživetje  
Vsaj enkrat na dan je treba opazovati izvalitev in preživetje in to 
zapisati. Zaželeno je, da so opazovanja pogostejša na za četku 
preskusa (npr. vsakih 30 minut v prvih treh urah), ker je v nekaterih primerih čas preživetja bolj pomemben kot le število 
smrti (npr. pri akutnih toksi čnih učinkih). Mrtve embrie in li činke 
je treba odstraniti, takoj ko jih opazimo, ker se lahko zelo hitro 
razkrojijo. Izjemna pazljivost je potrebna, pri odstranjevanju posa ­
meznih mrtvih osebkov, da ne udarimo ali fizi čno poškodujemo 
sosednjih iker/li čink, saj so te izjemno nežne in ob čutljive. Merila 
za smrt so razli čna glede na razvojni stadij: 
— za ikre:  zlasti v zgodnjih stadijih opazna izguba prosojnosti in 
sprememba barve, ki jo povzro či koagulacija in/ali obarjanje 
beljakovin, ki povzro čajo bel moten videz, 
— za embrie:  odsotnost gibanja telesa in/ali odstonost sr čnega 
utripa in/ali motna razbarvanost pri vrstah, katerih embrii so sicer prosojni, 
— za ličinke:  negibnost in/ali odsotnost dihalnega gibanja in/ali 
odsotnost sr čnega utripa in/ali bela motna obarvanost osrednjega 
živčnega sistema in/ali pomanjkanje odzivanja na mehanske 
dražljaje.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1169
 
1.7.5.3  Nenormalen videz  
Število ličink, ki kažejo nenormalne telesne oblike in/ali nenormalno 
obarvanost, in stadij absorbcije hranilnega meši čka, je treba zapiso ­
vati v primernih intervalih, odvisno od trajanja preskusa in narave 
opisane anomalije. Opozoriti je treba, da so nenormalni embrii in 
ličinke lahko naraven pojav, in jih je v kontrolah pri nekaterih vrstah 
lahko več odstotkov. nenormalne živali se odstranijo iz posode šele, 
ko poginejo.  
1.7.5.4  Nenormalno vedenje  
Nenormalnosti, npr. hiperventilacija, nekoordinirano plavanje, neti ­
pično mirovanje je treba zapisovati v primernih časovnih razmakih 
odvisno od trajanja preskusa. Te u činke je sicer težko koli činsko 
opredeliti, vendar lahko, kadar jih opazimo, pripomorejo 
k interpretaciji podatkov o smrtnosti, t.j. pridobijo podatke 
o načinu toksičnega delovanja snovi.  
1.7.5.5  Dolžina  
Na koncu preskusa je priporo čljivo merjenje dolžine posameznih 
osebkov; uporabimo lahko standardno dolžino (dolžino do razcepa repne plavuti) ali celotno dolžino. Če pa pride do razpada ali erozije 
repne plavuti, je treba uporabiti standardno dolžino. Nasplošno mora 
biti pri preskusih, ki dobro potekajo, koeficient variacije dolžine med ponovitvami v kontrolah < 20 %.
 
1.7.5.6  Teža  
Na koncu preskusa se lahko izmerijo posamezne teže; bolje je izme ­
riti suho težo (24 ur pri 60  o C) kot mokro težo (po sušitvi 
s pivnikom). Nasplošno bi moral biti pri preskusu, ki dobro poteka, 
koeficient variacije teže med ponovitvami v kontrolah ≤ 20 %. 
Na podlagi teh opažanj bodo za statisti čno analizo na razpolago vsi 
oziroma nekateri spodaj navedeni podatki: 
— kumulativna umrljivost, 
— število zdravih li čink na koncu preskusa, 
— čas začetka in konca izvalitve iker (t.j. 90 % izvaljenih li čink pri 
vsaki ponovitvi), 
— število li čink, ki se izležejo vsak dan, 
— dolžina (in teža) preživelih živali na koncu preskusa, 
— število li čink, ki so deformirane ali nenormalnega videza, 
— število li čink, ki kažejo nenormalno vedenje.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1170
 
2. PODATKI IN PORO ČANJE  
2.1 OBDELAVA REZULTATOV 
Priporoča se, da naj bo tako v na črt kot analizo preskusa vklju čen 
tudi statistik, ker ta preskusna metoda omogo ča precejšnje variacije 
načrta eksperimenta, kot na primer v številu preskusnih komor, 
številu preskusnih koncentracij, v za četnem številu oplojenih iker 
in v izmerjenih parametrih. Glede na možnosti, ki so na voljo pri načrtu preskusa, tu niso podana specifi čna navodila za statisti čni 
postopek. 
Da bi ocenili LOEC/NOEC, bi bilo treba analizirati variance 
v vsakem nizu ponovitev z uporabo analize variance (ANOVA) ali kontingen čne tabele. Da bi naredili ve čkratno primerjavo med rezul ­
tati posameznih koncentracij in rezultaih v kontrolah, je lahko 
uporabna Dunnettova metoda (12) (13). Na voljo so tudi drugi 
uporabni primeri (14) (15). Izra čunati je treba velikost u činka, ki 
ga zaznamo z uporabo ANOVA ali drugih postopkov (t.j. mo č 
preskusa) in poro čati o njem. Opozoriti je treba, da vsa opazovanja, 
našteta v poglavju 1.7.5.6, niso primerna za statisti čno analizo 
z ANOVA. Na primer, kumulativna smrtnost in število zdravih li čink 
na koncu preskusa se lahko analizirata s probit metodami. 
Da bi ocenili LC/ECxs, je treba (a) ustrezno krivuljo, kot je logi ­
stična krivulja, prilagoditi podatkom, ki nas zanimajo, z uporabo 
statistične metode, kot je metoda najmanjših kvadratov ali metoda 
nelinearnih najmanjših kvadratov. Krivuljo je treba parametrizirati, 
tako da se lahko neposredno oceni LC/EC
 X , ki nas zanima, in 
njegova standardna napaka. To bo zelo olajšalo izra čun mej zaupanja 
okoli LC/EC  X . Če ni dobrih razlogov za uporabo druga čne ravni 
zaupanja, je treba navesti dvostransko 95 % zaupanje. Postopek 
prilagoditve naj po možnosti zagotavlja sredstva za oceno pomemb ­
nosti neprilagojenosti („lack of fit“). Uporabijo se lahko grafi čne 
metode za prilagajanje krivulj. Za vsa opazovanja, našteta 
v poglavju 1.7.5.6, je primerna regresijska analiza.  
2.2 RAZLAGA REZULTATOV 
Rezultate je treba razlagati previdno, kadar so merjene koncentracije 
toksičnih snovi v preskusnih raztopinah blizu meje detekcije 
analitske metode. Prav tako pazljivo je treba razložiti rezultate za koncentracije nad topnostjo snovi v vodi.
 
2.3 PORO ČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preskusu mora vklju čevati naslednje podatke:  
2.3.1  Preskusna snov:  
— fizikalno stanje in ustrezne fizikalno-kemijske lastnosti, 
— identifikacijski podatki o kemikaliji, vklju čno s čistostjo in 
analitsko metodo za koli činsko dolo čanje preskusne snovi, kjer 
je to ustrezno.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1171
 
2.3.2  Preskusna vrsta:  
— znanstveno ime, sev, število starševskih rib (t.j. koliko samic je 
bilo uporabljenih za zagotovitev potrebnega števila iker v preskusu), vir in metoda zbiranja oplojenih iker in nadaljnje 
ravnanje z njimi.
 
2.3.3  Preskusni pogoji:  
— uporabljeni preskusni postopek (npr. semi-stati čni ali preto čni, 
časovno obdobje od oploditve do za četka preskusa, obremenitev 
itn.), 
— fotoperioda, 
— načrt preskusa (npr. število preskusnih komor in ponovitev, 
število embriev na ponovitev), 
— metoda priprave osnovnih raztopin in pogostost obnove (navesti 
je treba topilo in njegovo koncentracijo, če je to uporabljeno), 
— nominalne preskusne koncentracije, izmerjene vrednosti, njihove 
srednje vrednosti in standardni odkloni v preskusnih posodah in 
metoda dolo čitve, ter če je preskusna snov topna v vodi 
v koncentracijah pod preskušenimi, je treba priskrbeti dokaze, da se meritve nanašajo na koncentracije preskusne snovi v raztopini, 
— značilnosti vode za red čenje: pH, trdota, temperatura, koncentra ­
cija raztopljenega kisika, koncentracija sledi klora ( če so bile 
merjene), skupni organski ogljik, suspendirani trdni delci, slanost preskusnega medija ( če je bila merjena) in katere koli druge 
izvedene meritve, 
— kakovost vode v preskusnih posodah: pH, trdota, temperatura in 
koncentracija raztopljenega kisika.
 
2.3.4  Rezultati:  
— rezultati kakršnih koli uvodnih študij stabilnosti preskusne snovi, 
— dokazi, da kontrole ustrezajo standardom sprejemljivega preži ­
vetja za to preskusno vrsto (Dodatka 2 in 3), 
— podatki o smrtnosti/preživetju v embrionalnem stadiju in stadiju 
ličink ter skupna smrtnost/preživetje, 
— dnevi do izvalitve in število izvaljenih li čink, 
— podatki o dolžini (in teži), — pojav in opis morebitnih morfoloških nepravilnosti, — pojav in opis morebitnih u činkov na vedenje, 
— statisti čna analiza in obdelava podatkov, 
— za preskuse, analizirane z metodo ANOVA, ocena najnižje 
koncentracije z opaznim u činkom (LOEC) pri p = 0,05 in 
koncentracije brez opaznih u činkov (NOEC) za vsak obravnavan 
odziv, vklju čno z opisom uporabljenih statisti čnih postopkov in 
obseg opaženega u činka,
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1172
 
— za preskuse, analizirane z regresijskimi tehnikami, LC/ECx in 
intervali zaupanja ter graf prilagojenega modela („graf of fitted 
model“), uporabljenega za izra čun, 
— pojasnilo morebitnih odstopanj od te preskusne metode.  
3. LITERATURA  
(1) Kristensen P. (1990) Evaluation of the Sensitivity of Short 
Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European 
Communities, str 60. Junij 1990. 
(2) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life- 
Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241-88. Str. 26. 
(3) Brauhn J.L. and Schoettger R.A. (1975). Acquisition and 
Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, 
Channel Catfish and Bluegills. p.54, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota. 
(4) Brungs W.A. and Jones B.R. (1977) Temperature Criteria for 
Freshwater Fish: Protocol and Procedures p. 128, Ecological 
Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota. 
(5) Laale H.W. (1977) The Biology and Use of the Zebrafish  
{Brachydanio rerio)  in Fisheries Research. A Literature 
Review. J. Biol. 10, 121–173. 
(6) Legault R. (1958) A Technique for Controlling the Time of 
Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish,  Brac­
hydanio rerio  (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, str. 328–330. 
(7) Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J.E., Rosander 
B. and Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxi ­
city Test with Zebrafish  {Brachydanio rerio)  Using Chromium 
and Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology and Chemi ­
stry , 6, str. 61–71. 
(8) Birge J.W., Black J.A. and Westerman A.G. (1985). Short-term 
Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining the 
Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Estimating 
Chronic Values for Single Compounds and Complex Effluents. Environmental Toxicology and Chemistry 4, str. 807–821. 
(9) Van Leeuwen C.J., Espeldoorn A. and Mol F. (1986) Aquatic 
Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related 
Compounds. III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout  
(Salmo gairdneri).  J. Aquatic Toxicology, 9, 129–145. 
(10) Kirchen R.V. and W. R. West (1969). Teleostean Develop ­
ment. Carolina Tips 32(4): 1–4. Carolina Biological Supply 
Company. 
(11) Kirchen R.V. and W. R. West (1976). The Japanese Medaka. 
Its care and Development. Carolina Biological Supply Company, North Carolina. Str. 36. 
(12) Dunnett C.W. (1955) A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. 
Assoc, 50, str. 1096–1121. 
(13) Dunnett C.W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons 
with a Control. Biometrics, 20, 482–491. 
(14) Mc Clave J.T., Sullivan J.H. and Pearson J.G. (1980). Stati ­
stical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Procee ­
dings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Phila ­
delphia.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1173
 
(15) Van Leeuwen C.J., Adema D.M.M. and Hermes J. (1990). 
Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early 
Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, str. 321–334. 
(16) Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Early Life 
Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or 
Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS l/RM/28, December 1992, str. 81. 
(17) Dave G. and Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury, Nickel, Lead 
and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish,  Brachydanio 
rerio.  Arch. of Environmental Contamination and Toxicology, 
21, 126–134. 
(18) Meyer A., Bierman C.H. and Orti G. (1993). The phylogenetic 
position of the Zebrafish  (Danio rerio),  a model system in 
developmental biology – an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: 231–236. 
(19) Ghillebaert F., Chaillou C, Deschamps F. and Roubaud 
P. (1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Refe ­
rence Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology 
and Environmental Safety 32, 19–28. 
(20) US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese 
Medaka,  Oryzias latipes.  EPA report EPA/600/3-91/064, 
Dec. 1991, EPA, Duluth. 
(21) US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage 
Toxicity Tests with Japanese Medaka,  (Oryzias latipes).  EPA 
report EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth. 
(22) De Graeve G.M., Cooney J.D., Mclntyre DO., Poccocic T.L., 
Reichenbach N.G., Dean J.H. and Marcus M.D. (1991). Vali ­
dity in the performance of the seven-day Fathead minnow  
(Pimephales promelas)  larval survival and growth test: an 
intra- and interlaboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, 1189–1203. 
(23) Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, 
Oxford. Vol. 1, chapter 10: Methods for spawning, culturing and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estua ­
rine and Marine fish. 
(24) Balon E.K. (1985). Early life history of fishes: New develop ­
mental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., 
Dordrecht, str. 280. 
(25) Blaxter J.H.S. (1988). Pattern and variety in development, In: 
W.S. Hoar and D.J. Randall Eds., Fish Physiology, vol. XIA, Academic press, str. 1–58.
 
Tabela 1A  
Ribje vrste, priporo čene za preskušanje  
SLADKOVODNE  
Oncorhvnchus mykiss  
Šarenka (9) (16)  
Danio rerio  
Cebrica (7) (17) (18)  
Cyprinus caprio  
Krap (8) (19)  
Oryzias latipes  
Medaka (20) (21)  
Pimephales promelas  
Črnoglavi pisanec (8) (22)  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1174
 
Tabela 1B  
Primeri drugih dobro dokumentiranih vrst, ki so bile tudi uporabljene  
SLADKOVODNE MORSKE  
Carassius auratus  
Zlata ribica (8)  Menidia peninsulae  
Bibavični glavun (23) (24) (25)  
Lepomis macrochirus  
Vrsta ostriža (8)  Clupea harengus  
Atlantska sled (24) (25)  
Gadus morhua  
Trska (24) (25)  
Cyprinodon variegatus  
Bisernasti krapi č (23) (24) (25)  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1175
 
DODATEK 1  
SMERNICE ZA IZVEDBO PRESKUSA TOKSI ČNOSTI NA EMBRIIH IN 
MLADICAH S HRANILNIM MEŠI ČKOM CEBRICE  (Brachydanio rerio)  
UVOD 
Cebrica izvira iz Koromandijske obale Indije, kjer naseljuje hitro teko če vode. To 
je pogosta akvarijska riba iz družine krapov, tako da lahko podatke o njeni negi 
in gojenju dobimo v standardni referen čni literaturi o tropskih ribah. Njeno 
biologijo in uporabo v ribogojniških raziskavah, je podal Laale (1). 
Ta riba redko doseže dolžino ve č kot 45 mm. Njeno telo je cilindri čne oblike 
s 7–9 temno modrimi vodoravnimi srebrnkastimi progami. Proge se stekajo 
v repno in predrepno plavut. Hrbet je olivnozelen. Samci so vitkejši od samic. 
Samice so bolj srebrnkaste in njihov trebuh je napihnjen, zlasti pred drstenjem. 
Odrasle ribe lahko prenesejo velika nihanja v temperaturi, pH in trdoti vode. 
Vendar je treba zagotoviti optimalne pogoje, da bi dobili zdrave ribe, ki proiz ­
vajajo kvalitetne ikre. 
Med drstenjem samec zasleduje samico in se zaletava vanjo, in ko samica izlo ča 
ikre, jih samec oplaja. Ikre, ki so prozorne in nelepljive, padejo na dno, kjer jih starši včasih pojedo. Na drstenje vpliva svetloba. Če je jutranja svetloba 
primerna, se ribe navadno drstijo v zgodnjih jutranjih urah takoj po zori. 
Samica lahko proizvede serije ve č sto iker v tedenskih razmikih.
 
POGOJI ZA STARŠEVSKE RIBE. REPRODUKCIJO IN ZGODNJE 
RAZVOJNE STADIJE 
Izberite primerno število zdravih rib in jih vsaj dva tedna pred nameravanim 
drstenjem hranite v ustrezni vodi (npr. Dodatek 4). Skupini rib je treba omogo ­ 
čiti, da se razmnožujejo vsaj enkrat, preden naredijo serijo iker, ki bo uporabljena 
v preskusu. Gostota rib v tem času ne sme prese či 1 gram rib na liter. Redno 
menjavanje vode ali uporaba pre čiščevalnih sistemov bosta omogo čila večjo 
gostoto. V bazenih je treba ohranjati temperaturo 25 ± 2  o C. Ribe morajo 
imeti raznoliko prehrano, ki je lahko na primer sestavljena iz ustrezne komer ­
cialne suhe hrane, živih, komaj izleglih rakocov rodu Artemia, trza č, vodnih 
bolh, belih črvov (Enchytracheidae). 
Spodaj sta opisana dva postopka, ki sta v praksi pripeljala do dovolj velike serije 
zdravih, oplojenih iker za izvedbo preskusa: 
(i) Osem samic in 16 samcev se da v bazen s 50 litri vode za red čenje, zaščiti 
pred neposredno svetlobo in pusti čim bolj pri miru vsaj 48 ur. Popoldan, en 
dan pred za četkom preskusa se na dno akvarija položi drstitveni pladenj. 
Drstitveni pladenj je sestavljen iz 5–7 cm visokega okvirja (iz pleksi stekla 
ali drugega primernega materiala), na zgornjo stran je pritrjena 2–5 milimetrska groba mreža, na dno pa 10–30 mikrometrska fina mreža. Na grobo mrežo na okvirju pritrdimo ve č „drstnih debel“, ki so iz ravne 
najlonske vrvice. Potem ko so bile ribe 12 ur v temi, prižgemo šibko 
svetilko, ki bo sprožila drstenje. Dve do štiri ure po drstenju odstranimo drstitveni pladenj in poberemo ikre. Drstitveni pladenj bo ribam onemogo čil, 
da bi pojedle ikre, hkrati pa omogo čil, da se jih brez težav pobere. Skupina 
rib se mora drstiti vsaj enkrat pred tistim drstenjem, katerega ikre so upora ­
bljene za preskušanje.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1176
 
(ii) Pet do deset ribjih samcev in samic nastanimo posami č vsaj dva tedna pred 
načrtovanim drstenjem. Po 5–10 dneh se trebuhi samic napihnejo in njihove 
genitalne papile postanejo vidne. Samci nimajo papil. Drstenje se opravi v drstitvenih bazenih, opremljenih z lažnim prežastim dnom (kot zgoraj). Bazen je napoljnen z vodo za red čenje, tako da je gladina vode 5–10 cm 
nad mrežico. Dan pred na črtovanim drstenjem damo v bazen eno samico in 
dva samca. Postopno pove čujemo temperaturo vode do ene stopinje nad 
prilagoditveno temperaturo. Ugasnemo svetilko in pustimo bazen čim bolj 
pri miru. Zjutraj prižgemo šibko svetilko, ki sproži drstenje. Po 2–4 urah 
odstranimo ribe in poberemo ikre. Če potrebujemo ve čje skupke iker, kot jih 
lahko dobimo od ene samice, lahko hkrati postavimo dovolj veliko število drstnih bazenov. Če si zapisujemo produktivnost posameznih samic pred 
preskusom (velikost in kakovost skupka), lahko izberemo tiste, ki so najbolj 
uspešne pri reprodukciji. 
Ikre moramo prenesti v preskusne posode s steklenimi cevkami (z notranjim 
premerom, ki ni manjši od 4 mm), ki imajo namestljivo sesalno bu čo. Količina 
vode pri prenosu iker mora biti čim manjša. Ikre so težje od vode in se odto čijo 
iz cevke. Paziti moramo, da ikre (in li činke) ne bi prišle v stik z zrakom. Narediti 
je treba mikroskopski pregled vzorcev serij, da se zagotovi, da ni nepravilnosti v prvih razvojnih stadijih. Dezinfekcija iker ni dovoljena. 
Stopnja smrtnosti iker je najvišja v prvih 24 urah po oploditvi. V tem obdobju je 
opažena smrtnost pogosto 5–40 %. Ikre degenerirajo zaradi neuspešne oploditve ali napak v razvoju. Kakovost serije iker je verjetno odvisna od samice, ker nekatere samice dosledno proizvajajo kakovostne ikre, druge pa nikoli. Serije 
se razlikujejo tudi v hitrosti razvoja in stopnja izvalitve. Preživetje uspešno 
oplojenih iker in li čink s hranilnim meši čkom je dobro, ve činoma 90 %. Pri 
25
 o C se ličinke izležejo 3–5 dni po oploditvi in absorbirajo hranilni meši ček 
približno 13 dni po oploditvi. 
Embrionalni razvoj sta dobro opisala Hisaoka in Battle (2). Zaradi prosojnosti 
iker in li čink po izvalitvi lahko sledimo razvoju ribe in opazimo prisotnost 
deformnosti. Približno štiri ure po drstenju lahko lo čimo neoplojene ikre od 
oplojenih (3). Za ta pregled položimo ikre v preskusne posode majhne prostor ­
nine in jih prou čujemo pod mikroskopom. 
Preskusni pogoji, ki se nanašajo na zgodnje razvojne stadije, so našteti v Dodatku 
2. Optimalna vrednost za pH je 7,8 in za trdoto vode pa 250 mg CaCO  3 /l. 
IZRAČUNI IN STATISTI ČNI PODATKI 
Priporočen je dvofazni pristop. Najprej se statisti čno analizirajo podatki 
o smrtnosti, nenormalnem razvoju in času izvalitve. Nato se statisti čno ovrednoti 
dolžina telesa pri tistih koncentracijah, pri katerih ne opazimo škodljivih u činkov 
na katerega koli od teh parametrov. Ta pristop je priporo čljiv, ker lahko toksi čna 
snov selektivno ubija manjše ribe, odloži čas izvalitve in povzro ča velike deform ­
nosti in so zato meritve dolžine lahko pristranske. Poleg je treba pri vsakem 
tretiranju izmeriti približno enako število rib, da zagotovimo veljavnost preskusne 
statistike.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1177
 
DOLOČANJE LC  50 IN EC  50 
Izračuna se odstotek preživelih iker in li čink ter korigira glede na smrtnost 
v kontrolah po Abbottovi ena čbi (4):  
P ¼ 100 Ä Í 
C Ä P 0 
C Ü 100 Î 
kjer je, 
P = korigiran % preživelih P' = % preživelih, opaženih v preskusni koncentraciji C = preživetje v kontroli 
Če je mogo če, se LC
 50 določa po primerni metodi na koncu preskusa. 
Če želimo v statistiko EC  50 vključiti morfološke nepravilnosti, najdemo ustrezna 
navodila v Stephan (5).  
OCENA LOEC IN NOEC 
Cilj preskusa na ikrah in mladicah s hranilnim meši čkom je primerjati koncen ­
tracije razli čne od nič s kontrolami, t.j. dolo čiti LOEC. Zato moramo uporabiti 
postopke multiple primerjave (6) (7) (8) (9) (10).  
LITERATURA 
(1) Laale H.W. (1977) The Biology and Use of the Zebrafish  (Brachydanio 
rerio)  in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, 
121–173. 
(2) Hisaoka K.K. and Battle H.I. (1958). The Normal Development Stages of 
the Zebrafish  Brachydanio rerio  (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, 
str. 311. 
(3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling  
(Brachydanio rerio  Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 
2, str. 173–181. 
(4) Finney D.J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, 
Great Britain, str. 1–333. 
(5) Stephan C.E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. 
Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J.G. Pearson, R.B. Foster and W.E. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials, str. 69–81. 
(6) Dunnett C.W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing 
Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, 
str. 1096–1121. 
(7) Dunnett C.W. (1964) New Tables for Multiple Comparisons with 
a Control. Biometrics, 20, 482–491. 
(8) Williams D.A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means 
when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. 
Biometrics, 27, str. 103–117. 
(9) Williams D.A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with 
a Zero Dose Control. Biometrics 28, str. 519–531. 
(10) Sokal R.R. and Rohlf F.J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of 
Statistics in Biological Research, W.H. Freeman and Co., San Francisco.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1178
 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1179
 ▼B 
DODATEK 2  
PRESKUSNI POGOJI, TRAJANJE IN MERILA PREŽIVETJA ZA PRIPORO ČENE VRSTE  
VRSTA TEMP 
( 0 C) SLANOST 
(0/00) FOTO- 
PERIODA 
(ure) TRAJANJE STADIJEV 
(dnevi) 
TIPIČNO TRAJANJE PRESKUSA PREŽIVETJE V KONTROLAH, 
(NAJMANJŠI %) 
EmbrIo mladica 
s hranilni 
m mešičko m uspeh izvalitve po izvalitvi  
SLADKOVODNE  
Brachydanio rerio  
cebrica 25 ± 1 — 12–16 3–5 8–10 Čim prej po oploditvi (zgodnji stadij 
gastrule) do 5 dni po izvalitvi (8–10 dni) 80 90  
Oncorhynchus mykiss  
šarenka 10 ± 1 (  1 ) 
12 ± 1 (  2 ) — 0 (  a ) 30–35 25–30 Čim prej po oploditvi (zgodnji stadij 
gastrule) do 20 dni po izvalitvi (50–55 dni) 66 70  
Cyprinus carpio  21 – 25 — 12–16 5 > 4 Čim prej po oploditvi (zgodnji stadij 
gastrule) do 4 dni po izvalitvi (8–9 dni) 80 75  
Oryzias latipes  
Medaka 24 ± 1 (  1 ) 
23 ± 1 (  2 ) — 12–16 8–11 4–8 Čim prej po oploditvi (zgodnji stadij 
gastrule) do 5 dni po izvalitvi (13–16 dni) 80 80  
Pimephales promelas  
črnoglavi pisanec 25 ± 2 — 16 4–5 5 Čim prej po oploditvi (zgodnji stadij 
gastrule) do 4 dni po izvalitvi (8–9 dni) 60 70  
( 1 ) Za embrie. 
( 2 ) Za ličinke. 
( a ) Tema ze embrie in li činke, dokler ne mine en teden po izvalitvi, razen kadar se jih pregleduje. Nato blaga svetloba skozi celoten preskus
 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1180
 ▼B 
DODATEK 3  
Preskusni pogoji, trajanje in merila preživetja za druge dobro dokumentirane vrste  
VRSTA TEMP (  o C) SLANOST 
(0/00) FOTOPERIODA 
(ure) TRAJANJE STADIJEV (dnevi) 
TIPIČNO TRAJANJE PRESKUSA PREŽIVETJE V KONTROLAH, 
(NAJMANJŠI %) 
EMBRI MLADICA 
S HRANILNIM 
MEŠIČKOM uspeh izvalitve po izvalitvi  
SLADKOVODNE  
Carassius auratus  
zlata ribica 24 ± 1 — — 3–4 > 4 Čim prej po oploditvi (zgodnji stadij 
gastrule) do 4 dni po izvalitvi (7 dni) — 80  
Leopomis macrochirus  
vrsta ostriža 21 ± 1 — 16 3 > 4 Čim prej po oploditvi (zgodnji stadij 
gastrule) do 4 dni po izvalitvi (7 dni) — 75 
MORSKE  
Menidia peninsulae  
bibavični glavun 22–25 15–22 12 1,5 10 Čim prej po oploditvi (zgodnji stadij 
gastrule) do 5 dni po izvalitvi (6–7 dni) 80 60  
Clupea harengus  
atlantski sled 10 ± 1 8–15 12 20–25 3–5 Čim prej po oploditvi (zgodnji stadij 
gastrule) do 3 dni po izvalitvi (23–27 dni) 60 80  
Gadus morhua  
trska 5 ± 1 5–30 12 14–16 3–5 Čim prej po oploditvi (zgodnji stadij 
gastrule) do 3 dni po izvalitvi (18 dni) 60 80  
Cyprinodon variegatus  
biserjasti krapi č 25 ± 1 15–30 12 — — Čim prej po oploditvi (zgodnji stadij 
gastrule) do 4/7 dni po izvalitvi (28 dni) > 75 80
DODATEK 4  
NEKATERE KEMI ČNE ZNA ČILNOSTI SPREJEMLJIVE VODE ZA 
REDČENJE  
Snov Koncentracije  
Trdni delci < 20 mg/l 
Skupni organski ogljik < 2 mg/l 
Neionizirani amoniak < 1 μg/l 
Klor v sledeh < 10 μg/l 
Skupni organofosforni pesticidi < 50 ng/l Skupni organoklorni pesticidi in poliklorirani bifenili < 50 ng/l Skupna koli čina organskega klora < 25 ng/l
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1181
 
C.16  ČEBELE DELAVKE – PRESKUS AKUTNE ORALNE 
TOKSIČNOSTI  
1. METODA  
Ta preskusna metoda akutne toksi čnosti ustreza metodi OECD TG 
213 (1998).  
1.1 UVOD 
Ta preskus toksi čnosti je laboratorijska metoda, namenjena oceni 
akutne oralne toksi čnosti fitofarmacevtskih sredstev in drugih kemi ­
kalij za odrasle čebele delavke. 
Pri ocenjevanju in vrednotenju toksi čnih značilnosti snovi je lahko 
potrebna dolo čitev akutne oralne toksi čnosti pri čebelah, npr. kadar 
je verjetna izpostavljenost čebel dani kemikaliji. Preskus akutne 
oralne toksi čnosti se izvede za dolo čitev inherentne toksi čnosti pesti ­
cidov in drugih kemikalij za čebele. Rezultate tega preskusa je treba 
uporabiti za dolo čane potrebe po nadaljnjem vrednotenju. Ta metoda 
se lahko uporablja zlasti v programih z ve č koraki za ocenjevanje 
nevarnosti pesticidov za čebele, ki temelji na zaporednem napredo ­
vanju preskusov toksi čnosti v laboratorijih do pol-poljskih in polj ­
skih poskusih (1). Pesticidi se lahko preskušajo kot aktivne snovi (a.s.) ali kot formulirani pripravki. 
Za preverjanje ob čutljivosti čebel in natan čnosti preskusnega 
postopka se uporabljajo toksi čni standardi.
 
1.2 OPREDELITEV POJMOV  
Akutna oralna toksi čnost:  so škodljivi u činki, ki se pojavijo 
v največ 96 urah (h) oralnega dajanja enkratnega odmerka preskusne 
snovi.  
Odmerek:  je količina zaužite preskusne snovi. Odmerek se izraža 
kot masa (ug) preskusne snovi na preskusno žival ( μg/čebelo). dejan ­
skega odmerka na vsako čebelo ni mogo če izračunati, ker se čebele 
hranijo skupinsko, lahko pa se oceni povpre čni odmerek (v celoti 
zaužita preskusna snov/število preskusnih čebel v eni kletki).  
LD 50 (srednji smrtni odmerek) oralno:  je statisti čno izpeljan 
enkratni odmerek snovi, ki lahko povzro či smrt pri 50 % živali, če 
ga dajemo po oralni poti. Vrednost LD  50 se izraža v (ug) preskusne 
snovi na čebelo. Za pesticide je preskusna snov lahko bodisi aktivna 
snov (a.s.) ali formuliran pripravek, ki vsebuje eno ali ve č aktivnih 
snovi.  
Smrtnost:  žival zapišemo kot mrtvo, ko je povsem negibna.  
1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Odrasle čebele delavke  (opis mellifera)  se izpostavijo nizu odmerkov 
preskusne snovi, dispregirane v raztopini saharoze. Čebele nato dobi ­
vajo enako hrano, v kateri ni preskusne snovi. Vsaj 48 ur se dnevno 
zapisuje smrtnost in se primerja s kontrolnimi vrednostmi. Če se 
stopnja smrtnosti pove čuje v času med 24. in 48. uro, smrtnost 
kontrol pa ostaja na sprejemljivi ravni, t.j. < 10 %, je primerno, da se preskus podaljša na najve č 96 ur. Rezultati se analizirajo, da 
se izračuna LD
 50 pri 24 in 48 urah in, če se preskus podaljša, pri 72 
in 96 urah.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1182
 
1.4 VELJAVNOST PRESKUSA 
Za veljavnost preskusa veljajo naslednji pogoji: 
— povpre čna smrtnost za skupno število kontrol ne sme presegati 
10 % na koncu preskusa, 
— LD  50 toksičnega standarda ustreza dolo čenemu obmo čju. 
1.5 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.5.1  Zbiranje čebel 
Uporabiti moramo mlade odrasle čebele delavke iste pasme, 
t.j. čebele iste starosti, prehranjevalnega statusa itn. Dobiti jih 
moramo iz kolonij z matico, ki so primerno hranjene, so zdrave, kolikor je mogo če brez bolezni, z znano zgodovino in fiziološkim 
stanjem. Zberemo jih lahko v zjutraj na dan preskusa ali ve čer pred 
preskusom in jih imamo pod preskusnimi pogoji do naslednjega dne.Primerne so čebele, ki jih zberemo s satnic brez zaroda. Izogibati 
se je treba zbiranju zgodaj spomladi in pozno jeseni, ker je v tem 
času fiziološko stanje čebel spremenjeno. Če je treba preskuse opra ­
viti zgodaj spomladi ali pozno jeseni, se čebele lahko dajo 
v inkubator in en teden hranijo s „ čebeljo poga čo“ (pelodom, 
nabranim iz sata) in raztopino saharoze. Čebele, ki se zdravijo 
s kemičnimi snovmi, kot so antibiotiki, pripravki proti varoozi itn., 
se ne smejo uporabljati za preskus toksi čnosti štiri tedne od časa, ko 
se je prenehalo z zadnjim zdravljenjem.
 
1.5.2  Bivalni in prehranjevalni pogoji  
Uporabljajo se kletke, ki jih je lahko čistiti in so zra čne. Uporabi se 
lahko kateri koli primeren material, npr. nerjave če jeklo, ži čna 
mreža, plastika ali lesene kletke za enkratno uporabo itn. Po možnosti naj bo v vsaki kletki 10 čebel. Velikost preskusnih kletk 
mora biti primerna za število čebel, t.j. da zagotavlja dovolj prostora. 
Čebele je treba imeti v temi v prostoru, kjer se preskus izvaja pri 
temperaturi 25 ± 2
 o C. Ves čas preskusa je treba zapisovati relativno 
vlažnost, ki je navadno okoli 50-70 %. Postopki ravnanja, vklju čno 
z tretiranji in opazovanji, se lahko izvajajo na (dnevni) svetlobi. Kot hrana se uporablja raztopina saharoze v vodi s kon čno koncentracijo 
500 g/l (50 % m/V). Po danih preskusnih odmerkih, je treba zago ­
toviti hrano ad libitum. Sistem hranjenja mora dopuš čati zapisovanje 
zaužite hrane za vsako kletko (glej poglavje 1.6.3.1). Uporablja se lahko steklena cevka (približno 50 mm dolga in 10 mm široka z odprtim koncem zoženim na približno 2 mm v premeru).
 
1.5.3  Priprava čebel 
Zbrane čebele naklju čno porazdelimo v preskusne kletke, ki jih 
naključno postavimo v prostor, kjer se izvaja preskus.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1183
 
Čebele se pred za četkom preskusa lahko stradajo do 2 uri. Priporo č­
ljivo je, da se čebel pred tretiranjem ne hrani, tako da so na za četku 
preskusa vse čebele v enakem stanju, glede vsebine prebavil. Umira ­
joče čebele moramo pred za četkom preskusa zavre či in jih nadome ­
stiti z zdravimi.  
1.5.4  Priprava odmerkov  
Kadar je preskusna snov zmes, ki se meša z vodo, se lahko disper ­
gira neposredno v 50-odstotni raztopini saharoze. Za tehni čne proiz­
vode in snovi, težko topne v vodi, lahko uporabimo nosilce, kot so organska topila, emulgatorji ali disperzna sredstva nizke toksi čnosti 
za čebele (npr. aceton, dimetil formamid, dimetil sulfoksid). Koncen ­
tracija nosilca je odvisna od topnosti preskusne snovi in mora biti 
enaka za vse preskusne koncentracije. Vendar je splošno primerna koncentracija topila 1 %, ki se ne sme prese či. 
Pripraviti je treba primerne kontrolne raztopine, t.j. kadar se za razta ­
pljanje preskusne snovi uporabi topilo ali disperzijsko sredstvo, je 
treba uporabiti dve lo čeni kontrolni skupini: raztopino v vodi in 
raztopino saharoze s topilom/nosilcem v koncentraciji, uporabljeni pri preskusnih raztopinah.
 
1.6 POSTOPEK  
1.6.1  Preskusne in kontrolne skupine  
Število preskušenih odmerkov in ponovitev mora zadoš čati statisti ­ 
čnim potrebam za dolo čanje LD  50 z intervalom zaupanja 95 %. 
Navadno je za preskus potrebnih pet odmerkov v geometrijskem 
zaporedju s faktorjem, ki ne presega 2,2 in pokriva obmo čje LD  50 . 
Vendar je treba faktor red čenja in število koncentracij za odmerjanje 
določiti glede na nagib krivulje toksi čnosti (odmerek/smrtnost) in 
z upoštevanjem statisti čne metode, izbrane za analizo rezultatov. 
Preskus za dolo čitev obmo čja omogo ča izbiro primernih koncentracij 
za odmerjanje. 
Vsako preskusno koncentracijo je treba odmeriti najmanj trem pono ­
vitvenim preskusnim skupinam, v vsaki naj bo 10 čebel. Poleg 
preskusnega niza je treba pripraviti še najmanj tri kontrolne serije 
po 10 čebel. Vklju čiti je treba tudi kontrolne serije za uporabljena 
topila/nosilce (glej poglavje 1.5.4).  
1.6.2  Toksi čni standard  
V preskusni niz je treba vklju čiti tudi toksi čni standard. Za zajetje 
pričakovane vrednosti LD  50 , je treba izbrati vsaj tri odmerke. Pri 
vsakem preskusnem odmerku je treba uporabiti najmanj tri ponovit ­
vene kletke, v vsaki mora biti po 10 čebel. Zaželen toksi čni standard 
je dimetoat, za katerega je znana vrednost LD  50 -24 h oralno 
v območju 0,10–0,35 μg a.s./čebelo (2). Kadar se lahko priskrbi 
dovolj podatkov za potrditev pri čakovanega odziva na odmerek 
(npr. parati on), se lahko uporabijo drugi toksi čni standardi.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1184
 
1.6.3  Izpostavljenost  
1.6.3.1  Dajanje odmerkov  
Vsaka preskusna skupina čebel mora dobiti 100–200 μl 50-odstotne 
vodne raztopine saharoze, ki vsebuje preskusno snov v ustrezni 
koncentraciji. Za proizvode z nizko topnostjo, nizko toksi čnostjo 
ali nizko koncentracijo v formulaciji, je potrebna ve čja količina, 
ker je treba uporabiti ve čje deleže raztopine saharoze. Treba je 
spremljati koli čino tretirane hrane, ki jo zaužije posamezna skupina. 
Ko je hrana porabljena (navadno v 3–4 urah), je treba krmilnik 
odstraniti iz kletke in ga nadomestiti s tistim, ki vsebuje samo razto ­
pino saharoze. Raztopina saharoze se nato dodaja  ad libitum . Za 
nekatere spojine pri višjih koncentracijah je lahko posledica zavr ­
nitve preskusnega odmerka ta, da je zaužite malo ali ni č hrane. Po 
največ 6 urah je treba nezaužito tretirano hrano nadomestiti s čisto 
raztopino saharoze. Treba je oceniti koli čino zaužite tretirane hrane 
(npr. meritve prostornine/teže preostale tretirane hrane).  
1.6.3.2  Trajanje  
Najbolje je, da preskus traja 48 ur po tem, ko se preskusna raztopina 
zamenja s čisto raztopino saharoze. Če se smrtnost še naprej pove ­ 
čuje za več kot 10 % po prvih 24 urah, je treba podaljšati preskus na 
največ 96 ur, pod pogojem, da smrtnost kontrolnih skupin ne presega 
10 %.  
1.6.4  Opazovanja  
Smrtnost se zapiše 4 ure po za četku preskusa in odtlej po 24 urah in 
48 urah (t.j. po tem ko se da odmerek). Če je treba podaljšati 
opazovalni čas, je treba izvesti dodatna opazovanja v 24-urnih inter ­
valih do najve č 96 ur, pod pogojem da kontrolna smrtnost ne preseže 
10 %. 
Oceniti je treba koli čino zaužite hrane na skupino. Primerjava 
stopnje zaužitja tretirane in netretirane hrane v danih 6 urah lahko zagotovi informacije o okusnosti tretirane hrane. 
Zapisati je treba vse nenormalne vedenjske u činke, opažene 
v preskusnem obdobju.
 
1.6.5  Mejni preskus  
V nekaterih primerih (npr. kadar se pri čakuje, da je preskusna snov 
nizke toksi čnosti) se lahko naredi mejni preskus, tako da uporabimo 
100 μg a.s./čebelo, da bi prikazali, da je LD  50 večji od te vrednosti. 
Uporabiti je treba isti postopek, vklju čno s tremi ponovitvenimi 
preskusnimi skupinami za preskusni odmerek, ustreznimi kontrolami, oceno koli čine zaužite tretirane hrane in uporabo toksi čnega stan ­
darda. Če se opazi umiranje, je treba izvesti popolno študijo. Če 
se opazijo subletalni u činki (glej poglavje 1.6.4), jih je treba zapisati.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1185
 
2. PODATKI IN PORO ČANJE  
2.1 PODATKI 
Podatke je treba povzeti v obliki tabele, ki za vsako tretirano 
Skupino ter za kontrolne skupine in za skupine toksi čnega standarda 
prikazujejo število uporabljenih čebel, smrtnost ob vsakem času 
opazovanja in število čebel, ki se nenormalno vedejo. Podatki 
o smrtnosti se analizirajo z ustreznimi statisti čnimi metodami (npr. 
probit analizo, drse čo sredino, binomsko verjetnostjo) (3) (4). 
Grafično se prikaže krivulje odziva v odvisnosti od odmerka ob 
vsakem priporo čenem opazovalnem času in izra čunajo nagib krivulj 
in srednji smrtni odmerki (LD  50 ) z 95 % intervalom zaupanja. 
Popravki glede na smrtnost kontrolnih skupin se lahko naredijo 
z uporabo Abbottovega popravka (4) (5). Kadar tretirana hrana ni v celoti porabljena, je treba dolo čiti odmerek preskusne snovi, ki jo 
zaužije posamezna skupina. LD
 50 je treba izraziti v μg preskusne 
snovi na čebelo.  
2.2 PORO ČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje podatke:  
2.2.1  Preskusna snov:  
— fizikalno stanje in ustrezne fizikalno-kemijske lastnosti (npr. 
stabilnost v vodi, parni tlak), 
— identifikacijski podatki o kemikaliji, vklju čno s strukturno 
formulo, čistostjo (t.j. za pesticide, identiteta in koncentracija 
aktivne snovi/aktivnih snovi).  
2.2.2  Preskusna vrsta:  
— znanstveno ime, pasma, približna starost (v tednih), metoda in 
datum zbiranja, 
— informacije o kolonijah, ki so bile uporabljene za zbiranje 
preskusnih čebel, vklju čno z zdravjem, morebitno boleznijo 
v odraslosti, morebitnim predhodnim zdravljenjem itn.  
2.2.3  Preskusni pogoji:  
— temperatura in relativna vlažnost prostora, kjer se izvaja preskus, 
— bivalni pogoji vklju čno z vrsto, velikostjo in materialom kletk, 
— metode priprave osnovnih in preskusnih raztopin (navesti je treba 
topilo, če je uporabljeno, in njegovo koncentracijo), 
— načrt preskusa, se pravi število in koncentracije preskusnih 
odmerkov, število kontrol; za vsako preskusno koncentracijo in 
kontrolo, število ponovitvenih kletk in število čebel na kletko, 
— datum preskusa.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1186
 
2.2.4  Rezultati:  
— rezultati morebitne predhodne študije za dolo čitev obmo čja, 
— grobi podatki: smrtnost pri vsakem preskušenem odmerku 
v vsakem opazovalnem času, 
— graf odziva v odvisnosti od odmerka na koncu preskusa, — vrednosti LD
 50 z 95 % intervalom zaupanja ob vsakem od pripo ­
ročenih opazovalnih časov za preskusno snov in toksi čni stan­
dard, 
— statisti čni postopki, uporabljeni za dolo čitev LD  50 , 
— smrtnost pri kontrolah, — drugi opaženi ali izmerjeni biološki u činki, npr. nenormalno 
vedenje čebel (vklju čno z zavra čanjem preskusnih odmerkov), 
stopnja zaužitja hrane v tretiranih in netretiranih skupinah, 
— kakršno koli odstopanje od tu opisanega preskusnega postopka in 
kakršni koli drugi relevantni podatki.
 
3. LITERATURA  
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products 
– Honeybees. EPPO bulletin, vol. 23, N.1, 151–165. March 
1993. 
(2) Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees  (Apis mellifera  L.) 1981-1992. Journal of 
Apicultural Research, 22, 119–125. 
(3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99–113. 
(4) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New York. 
(5) Abbott, W.S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol.,18, 265–267.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1187
 
C.17  ČEBELE – PRESKUS AKUTNE KONTAKTNE TOKSI ČNOSTI  
1. METODA  
Ta metoda preskušanja akutne toksi čnosti ustreza metodi OECD TG 
214 (1998).  
1.1 UVOD 
Ta preskus toksi čnosti je laboratorijska metoda, namenjena oceni 
akutne kontaktne toksi čnosti fitofarmacevtskih sredstev in drugih 
kemikalij za odrasle čebele delavke. 
Pri ocenjevanju in ovrednotenju toksi čnih lastnosti snovi, je lahko 
potrebna dolo čitev akutne kontaktne toksi čnosti pri čebelah, npr. 
kadar je verjetna izpostavljenost čebel dani kemikaliji. Preskus 
akutne kontaktne toksi čnosti se izvede, da se ugotovi inherentna 
toksičnost pesticidov in drugih kemikalij za čebele. Rezultate teh 
preskusov je treba uporabiti za opredelitev potrebe po nadaljnjem ocenjevanju. Ta metoda se lahko uporablja zlasti v programih 
z več koraki za vrednotenje nevarnosti pesticidov za čebele, ki teme ­
ljijo na zaporednem napredovanju od preskusov toksi čnosti 
v laboratorijih do pol-poljskih in poljskih preskusov (1). Pesticidi se lahko preskušajo kot aktivne snovi (a.s.) ali kot formulirani 
pripravki. 
Za potrditev ob čutljivosti čebel in natan čnosti preskusnega postopka 
je treba uporabiti toksi čni standard.
 
1.2 OPREDELITEV POJMOV  
Akutna kontaktna toksi čnost:  so škodljivi u činki, ki se pojavijo 
v največ 96 urah topi čne aplikacije enkratnega odmerka snovi.  
Odmerek:  je količina uporabljene preskusne snovi. Odmerek je 
izražen kot masa ( μg) preskusne snovi na testno žival ( μg/čebelo).  
LD 50 (srednji smrtni odmerek) pri kontaktu:  je statisti čno dobljen 
enkratni odmerek snovi, ki lahko povzro či smrt pri 50 % živalih, ki 
se aplicira s kontaktom. Vrednost LD  50 se navede v μg preskusne 
snovi na čebelo. Za pesticide je preskusna snov lahko bodisi aktivna 
snov (a.s.) ali formuliran proizvod, ki vsebuje eno aktivno snov ali več. 
Smrtnost:  žival zapišemo kot mrtvo, ko je povsem negibna.
 
1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Odrasle čebele delavke  (Apis mellifera)  se izpostavijo nizu odmerkov 
preskusne snovi, raztopljene v ustreznem nosilcu, z neposredno apli ­
kacijo na toraks (kapljice). Trajanje preskusa je 48 ur. Če se stopnja 
smrtnosti pove čuje v času med 24. in 48. uro, medtem ko smrtnost 
kontrolne skupine ostaja na sprejemljivi ravni, t.j. ± 10 %, je primerno podaljšati preskus na najve č 96 ur. Smrtnost se dnevno 
zapisuje in primerja s kontrolnimi vrednostmi. Rezultati se analizi ­
rajo, da se izra čuna LD
 50 po 24-ih urah in 48 urah, in če se preskus 
podaljša, po 72 urah in 96 urah.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1188
 
1.4 VELJAVNOST PRESKUSA 
Za veljavnost preskusa veljajo naslednji pogoji: 
— povpre čna smrtnost za celotno število kontrol ne sme prese či 
10 % na koncu preskusa, 
— LD  50 toksičnega standarda ustreza dolo čenemu obmo čju. 
1.5 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.5.1  Zbiranje čebel 
Uporabiti moramo mlade odrasle čebele delavke, t.j. čebele iste 
starosti, prehranjevalnega statusa, pasme itn. Dobiti jih moramo iz 
kolonij z matico, ki dobivajo primerno hrano, so zdrave, kolikor je 
mogoče brez bolezni, z znano zgodovino in fiziološkim stanjem. 
Zberemo jih lahko zjutraj na dan poskusa ali ve čer pred preskusom 
in jih imamo pod preskusnimi pogoji do naslednjega dne. Primerne 
so čebele, ki jih zberemo s satnic brez zaroda. Izogibati se je treba 
zbiranju zgodaj spomladi in pozno jeseni, ker je v tem času fizio­
loško stanje čebel spremenjeno. Če je treba preskuse opraviti zgodaj 
spomladi ali pozno jeseni, se čebele lahko dajo v inkubator in en 
teden hranijo s „ čebeljo poga čo“ (pelodom, nabranim iz sata) in 
raztopino saharoze. Čebele, ki se zdravijo s kemi čnimi snovmi, kot 
so antibiotiki, proizvodi proti varoozi itn., se ne smejo uporabiti za preskus toksi čnosti štiri tedne od časa, ko se je prenehalo z zadnjim 
zdravljenjem.
 
1.5.2  Bivalni in prehranjevalni pogoji  
Uporabljajo se kletke, ki jih je lahko čistiti in so zra čne. Uporabi se 
lahko kateri koli primeren material, npr. nerjavno jeklo, ži čna mreža, 
plastika ali lesene kletke za enkratno uporabo itn. Velikost preskusnih kletk mora biti primerna za število čebel, t.j. da zagota ­
vlja dovolj prostora. Po možnosti naj bo v vsaki kletki 10 čebel. 
Čebele je treba imeti v temi v prostoru, kjer se izvaja preskus pri 
temperaturi 25 ± 2
 o C. Ves čas preskusa je treba zapisovati relativno 
vlažnost, ki je navadno okoli 50-70 %. Postopki ravnanja, vklju čno 
z tretiranjem in opazovanji, se lahko izvajajo na (dnevni) svetlobi. Kot hrana se uporablja raztopina saharoze v vodi s kon čno koncen ­
tracijo 500 g/l (50 % m/v), ki jo je treba zagotavljati ad libitum 
v preskusnem času z uporabo krmilnika čebele. To je lahko steklena 
cevka (približno 50 mm dolga in 10 mm široka z odprtim koncem, zožanim na približno 2 mm v premeru).
 
1.5.3  Priprava čebel 
Zbrane čebele se lahko za nanos preskusne snovi anestezirajo 
z ogljikovim dioksidom ali dušikom. Uporabljena koli čina anestetika 
in čas izpostavljenosti morata biti čim manjša. Umirajo če čebele 
moramo pred za četkom preskusa zavre či in jih nadomestiti 
z zdravimi.  
1.5.4  Priprava odmerkov  
Preskusno snov je treba nanesti kot raztopino v nosilcu, 
t.j. v organskem topilu ali v vodni raztopini z vlažilnim sredstvom. Organsko topilo naj bo po možnosti aceton, vendar se lahko upora ­
bijo tudi druga organska topila nizke toksi čnosti za čebele (npr. 
dimetil formamid, dimetil sulfoksid). Za formulirane pripravke dispergirane v vodi in zelo polarne organske snovi, ki niso topne v organskih topilih, je raztopine lažje nanašati, če so pripravljene 
v šibki raztopini komercialnega vlažilnega sredstva (npr. Agral, 
Cittowett, Lubrol, Triton, Tween).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1189
 
Pripraviti je treba primerne kontrolne raztopine, t.j. kadar se za razta ­
pljanje preskusne snovi uporabi topilo ali disperzijsko sredstvo, je 
treba uporabiti dve lo čeni kontrolni skupini: eno, tretirano z vodo, in 
eno, tretirano z topilom/disperzij skim sredstvom.  
1.6 POSTOPEK  
1.6.1  Preskusne in kontrolne skupine  
Število preskušanih odmerkov in ponovitev mora zadoš čati statisti ­ 
čnim zahtevam za dolo čitev LD  50 z 95 % intervalom zaupanja. 
Navadno je za preskus potrebnih pet odmerkov v geometrijskemem zaporedju s faktorjem, ki ne presega 2,2 in 
pokriva obmo čje LD
 50 . Vendar je treba število odmerkov dolo čiti 
glede na nagib krivulje toksi čnosti (odmerek/smrtnost) in 
z upoštevanjem statisti čne metode, ki smo jo zbrali za analizo rezul ­
tatov. Preskus za dolo čitev obmo čja omogo ča izbiro primernih 
odmerkov. 
Z v preskusno koncentracijo je treba izvesti vsaj tri ponovitve, 
v vsaki mora biti 10 čebel. 
Poleg preskusnega niza je treba pripraviti še najmanj tri kontrolne 
serije, v vsaki mora biti po 10 čebel. Če se uporabi organsko topilo 
ali vlažilno sredstvo, je treba vklju čiti tri dodatne kontrolne skupine 
po 10 čebel za topilo ali vlažilno sredstvo.  
1.6.2  Toksi čni standard  
V preskusni niz je treba vklju čiti toksični standard. Da se zajame 
pričakovana vrednost LD  50 , je treba izbrati vsaj tri odmerke. Pri 
vsakem preskusnem odmerku je treba uporabiti najmanj tri ponovit ­
vene kletke, v vsaki mora biti po 10 čebel. Priporo čljiv toksi čen 
standard je dimetoat, za katerega je znana vrednost (kontaktna) LD
 50 -24 h v obmo čju 0,10–0,30 μg a.s./čebelo (2). Kadar se lahko 
priskrbi dovolj podatkov za potrditev pri čakovanega odziva na 
odmerek, se lahko uporabijo drugi toksi čni standardi (npr. paration).  
1.6.3  Izpostavljenost  
1.6.3.1  Dajanje odmerkov  
Čebele se pod anestezijo individualno tretirajo s topi čno aplikacijo. 
Čebele se naklju čno dodelijo skupinam z razli čnim preskusnim 
odmerkom in kontrolam. Na hrbtno stran toraksa vsake čebele se 
z mikroaplikatorjem nanese 1 μl raztopine, ki vsebuje preskusno 
snov v primerni koncentraciji. Uporabijo se lahko tudi druga čne 
količine, če je to utemeljeno. Po nanosu odmerka, se čebele dajo 
v preskusne kletke in oskrbijo z raztopino saharoze.  
1.6.3.2  Trajanje  
Preskus naj po možnosti traja 48 ur. Če se smrtnost pove ča za več 
kot 10 % med 24. in 48. uro, je treba podaljšati preskus na najve č 96 
ur, pod pogojem da smrtnost kontrolnih skupin ne presega 10 %.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1190
 
1.6.4  Opazovanja  
Smrtnost se zapiše 4 ure po odmerjanju in nato po 24 urah in 48 
urah. Če je potreben podaljšan opazovalni čas, je treba izvesti 
dodatna opazovanja v 24 urnih časovnih razmikih, najve č 96 ur, 
pod pogojem da smrtnost kontrolnih skupin ne presega 10 %. 
Zapisati je treba vse nenormalne vedenjske u činke, opažene v času 
preskusa.  
1.6.5  Mejni preskus  
V nekaterih primerih (npr. kadar se pri čakuje, da je preskusna snov 
nizke toksi čnosti) se lahko naredi mejni preskus, tako da se uporabi 
100 μg a.s./čebelo, da se prikaže, da je LD  50 večji od te vrednosti. 
Uporabiti je treba isti postopek, vklju čno s tremi ponovitvenimi 
preskusnimi skupinami za preskusni odmerek, ustreznimi kontrolnimi 
skupinami in uporabo toksi čnega standarda. Če se opazi umiranje, je 
treba izvesti popolno študijo. Če se opazijo subletalni u činki (glej 
poglavje 1.6.4), jih je treba zapisati.  
2. PODATKI IN PORO ČANJE  
2.1 PODATKI 
Podatke je treba povzeti v obliki tabele, ki za vsako tretirano 
Skupino in za kontrolne skupine in za skupine toksi čnega standarda 
prikazujejo število uporabljenih čebel, smrtnost ob vsakem času 
opazovanja in število čebel, ki se nenormalno vedejo. Podatki 
o smrtnosti se analizirajo z ustreznimi statisti čnimi metodami (npr. 
probit analizo, drse čo sredino, binomsko verjetnostjo) (3) (4). 
Grafično se prikaže krivulja odziva v odvisnosti od odmerka ob 
vsakem priporo čenem opazovalnem času (t.j. 24 ur, 48 ur in, če 
pride v poštev, 72 ur in 96 ur) in izra čunajo nagib krivulj in srednji 
smrtni odmerki (LD  50 ) z 95 % intervalom zaupanja. Popravki glede 
na smrtnost kontrolnih skupin se lahko izvedejo z uporabo Abbot ­
tovega popravka (4) (5). LD  50 je treba izraziti v μg preskusne snovi 
na čebelo.  
2.2 PORO ČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje podatke:  
2.2.1  Preskusna snov:  
— fizikalno stanje in fizikalno-kemijske lastnosti (npr. obstojnost 
v vodi, parni tlak), 
— identifikacijski podatki o kemikaliji, vklju čno s strukturno 
formulo, čistostjo (t.j. za pesticide, identiteta in koncentracija 
aktivne snovi/aktivnih snovi).  
2.2.2  Preskusna vrsta:  
— znanstveno ime, pasma, približna starost (v tednih), metoda in 
datum zbiranja, 
— informacije o kolonijah, ki so bile uporabljene za zbiranje 
preskusnih čebel, vklju čno z zdravjem, morebitno boleznijo 
v odraslosti, morebitnim predhodnim zdravljenjem itn.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1191
 
2.2.3  Preskusni pogoji:  
— temperatura in relativna vlažnost eksperimentalnega prostora, 
— bivalni pogoji vklju čno z vrsto, velikostjo in materialom kletk, 
— metode nanosa preskusne snovi, npr. uporabljeno topilo, prostor ­
nina nanešene preskusne raztopine, uporabljeni anestetiki, 
— načrt preskusa, npr. število in koncentracije preskusnih odmer ­
kov, število kontrol; za vsak preskusni odmerek in kontrolo, 
število ponovitvenih kletk in število čebel na kletko, 
— datum preskusa.  
2.2.4  Rezultati:  
— rezultati morebitne predhodne študije za dolo čitev obmo čja, 
— grobi podatki: smrtnost pri vsaki preskušani koncentraciji ob 
vsakem opazovalnem času, 
— graf odziva v odvisnosti od odmerka na koncu preskusa, 
— vrednosti LD  50 z 95 % intervalom zaupanja ob vsakem od pripo ­
ročenih opazovalnih časov za preskusno snov in toksi čni stan­
dard, 
— statisti čni postopki, uporabljeni za dolo čitev LD  50 , 
— smrtnost pri kontrolah, — drugi opaženi ali izmerjeni biološki u činki, npr. nenormalni 
odzivi čebel, 
— kakršno koli odstopanje od preskusnega postopka, ki je tu 
opisan, in kakršen koli drug relevanten podatek.
 
3. LITERATURA  
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO bulletin, vol. 23, N.1, 151–165. March, 
1993. 
(2) Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees  (Apis mellifera  L.), 1981–1992. Journal of 
Apicultural Research 22, 119–125. 
(3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99–113. 
(4) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New York. 
(5) Abbott, W.S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, 265–267.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1192
 
C.18  ADSORPCIJA/DESORPCIJA Z UPORABO METODE ŠARŽNIH 
PRESKUSOV RAVNOTEŽJA  
1. METODA  
Ta metoda ustreza metodi OECD tg 106 za dolo čanje adsorpcije/ 
desorpcije s pomo čjo metode šaržnega ravnotežja (2000).  
1.1 UVOD 
Metoda upošteva krožni preskus in delavnico o izbiranju tal za 
razvoj preskusa adsorpcije (1) (2) (3) (4) ter tudi obstoje če smernice 
na nacionalni ravni (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). 
Študije adsorpcije/desorpcije so koristne za pridobivanje bistvenih 
informacij o mobilnosti kemikalij in njihovi porazdelitvi v tleh, 
vodi in zraku znotraj biosfere (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) 
(19) (20) (21). Informacije se lahko uporabijo za napovedovanje ali ocenjevanje, na primer, razpoložljivosti kemikalije za razgradnjo 
(22) (23), transformacijo ali vnos v organizme (24); izluževanja 
skozi talni profil (16) (18) (19) (21) (25) (26) (27) (28); izhlapevanja iz tal (21) (29) (30); odtekanja s površin v naravne vode (18) (31) (32). Podatki o adsorpciji se lahko uporabijo za namene primerjave 
in modeliranja (19) (33) (34) (35). 
Porazdelitev kemikalije med talno in vodno fazo je kompleksen 
proces, odvisen od številnih razli čnih dejavnikov: kemi čne narave 
snovi (12) (36) (37) (38) (39) (40), lastnosti tal (4) (12) (13) (14) 
(41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) (49) in podnebnih dejavnikov, kot so padavine, temperatura, son čna svetloba in veter. Zato številnih 
pojavov in mehanizmov, vpletenih v proces adsorpcije kemikalije 
v tleh, ni mogo če popolnoma opredeliti s poenostavljenim laborato ­
rijskim modelom, kot je ta metoda. Vendar, čeprav ne more zajeti 
vseh primerov, možnih v okolju, daje dragocene informacije o pomembnosti adsorpcije kemikalije za okolje. 
Glej tudi Splošni uvod.
 
1.2 PODRO ČJE UPORABE 
Metoda je namenjena ocenjevanju adsorpcijskega/desorpcijskega 
obnašanja snovi v tleh. Cilj je ugotoviti sorptivno vrednost, ki se 
lahko uporabi za napovedovanje porazdelitve v vrsti razli čnih okolj­
skih pogojev; s tem namenom se dolo čijo ravnotežni adsorpcijski 
koeficienti za kemikalijo v razli čnih tleh kot funkcija lastnosti tal 
(npr. vsebnost organskega ogljika, vsebnost gline in tekstura tal ter 
pH). Uporabiti je treba razli čne tipe tal, da bi čim širše zajeli inte ­
rakcije dane snovi s tlemi, ki jih najdemo v naravi. 
Pri tej metodi adsorpcija predstavlja proces vezave kemikalije na 
površino tal; ne razlikuje med razli čnimi adsorpcijskimi procesi (fizi ­
kalna in kemijska adsorpcija) in procesi, kot so katalizirana razgradnja na površini, masovna adsorpcija ali kemi čna reakcija. 
Adsorpcija na koloidnih delcih (premer < 0,2 μm), ki jih tvorijo 
tla, se ne upošteva.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1193
 
Parametri tal, ki veljajo za najpomembnejše pri adsorpciji so: 
vsebnost organskega ogljika (3) (4) (12) (13) (14) (41) (43) (44) 
(45) (46) (47) (48); vsebnost gline in tekstura tal (3) (4) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) ter pH za spojine, ki lahko ionizirajo (3) (4) (42). Drugi parametri tal, ki lahko vplivajo na adsorpcijo/desorp ­
cijo neke snovi so efektivna kationska izmenjalna kapaciteta 
(ECEC), vsebnost amorfnega železa in aluminijevih oksidov, zlasti pri vulkanskih in tropskih tleh (4), ter specifi čna površina (49). 
Preskus je namenjen ovrednotenju adsorpcije kemikalije na razli čne 
tipe tal z razli čno vsebnostjo organskega ogljika, vsebnostjo gline in 
teksturo ter pH-vrednostjo. Zajema tri stopnje:  
Stopnja 1 : Predhodna študija za dolo čitev: 
— razmerja tla/raztopina, — časa potrebnega za vzpostavitev ravnotežja adsorp ­
cije in koli čine preskusne snovi, adsorbirane ob 
ravnotežju, 
— adsorpcija preskusne snovi na površine preskusnih 
posod in stabilnosti preskusne snovi med preskusnim obdobjem.  
Stopnja 2 : Presejalni preskus: adsorpcija se prou čuje na petih razli ­ 
čnih tipih tal s pomo čjo kinetike adsorpcije pri eni 
koncentraciji in dolo čanja porazdelitvenega koeficienta 
K
 d in K  oc . 
Stopnja 3 : Določitev Freundlichovih adsorpcijskih izoterm za dolo ­ 
čitev vpliva koncentracije na obseg adsorpcije na tla. 
Proučevanje desorpcije s pomo čjo kinetike desorpcije/ 
Freundlichovih desorpcijskih izoterm (Dodatek 1).  
1.3 OPREDELITEV POJMOV IN ENOTE  
Simbol Opredelitev Enota  
A t i odstotek adsorpcije ob č času t  i % 
A eq odstotek adsorpcije ravnotežju ob adsorpcijskem %  
m s ads ðt i Þ masa preskusne snovi, času t  i adsorbirane na tla ob μg 
m s ads ðΔt i Þ masa preskusne snovi, časovnem intervalu Δt i adsorbirane 
na tla v μg 
m s ads ðeqÞ masa preskusne snovi, adsorbirane na tla ob adsorpcijskem 
ravnotežju μg 
m 0 masa preskusne snovi v epruveti na za četku preskusa 
adsorpcije μg 
m m ads ðt i Þ masa preskusne snovi, izmerjena v alikvotu ( v a A ) občasu t  i μg 
m aq ads ðeqÞ masa snovi v raztopini ob adsorpcijskem ravnotežju μg 
m soil količina talne faze, izražena v suhi masi tal g  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1194
 
Simbol Opredelitev Enota  
C st masna koncentracija osnovne raztopine snovi μg cm  -3 
C 0 začetna masna koncentracija preskusne raztopine v stiku 
s tlemi μg cm  -3 
C aq ads ðt i Þ masna koncentracija snovi v vodni fazi ob času t  i , ko se 
izvaja analiza μg cm  -3 
C s ads ðeqÞ vsebnost snovi, adsorbirane na tla ob adsorpcijskem 
ravnotežju μg cm  -1 
C aq ads ðeqÞ masna koncentracija snovi v vodni fazi ob adsorpcijskem 
ravnotežju μg cm  -3 
V 0 začetna prostornina vodne faze v stiku s tlemi med 
preskusom adsorpcije cm 3 
v a A prostornina alikvota, v katerem se meri preskusna snov cm  3 
K d porazdelitveni koeficient za adsorpcijo cm  3 g -1 
K oc adsorpcijski koeficient, normiran na organski ogljik cm  3 g -1 
K om porazdelitveni koeficient, normiran na organsko snov cm  3 g -1 
K F ads Freundlichov adsorpcijski koeficient μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 
1/n Freundlichov eksponent  
D t i odstotek desorpcije ob času t  i % 
D Δt i odstotek desorpcije, ki ustreza časovnemu intervalu Δt i % 
K des navidezni desorpscijski koeficient cm  3 g– 1 
K F des Freundlichov desorpscijski koeficient μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 
m aq des ðt i Þ masa preskusne snovi, desorbirane s tal ob času Δt i μg 
m m des ðΔt i Þ masa preskusne snovi, desorbirane s tal v časovnem 
intervalu Δt i μg 
m m des ðeqÞ masa snovi, dolo čena analitsko v vodni fazi ob desorpcij ­
skem ravnotežju μg 
m aq des ðeqÞ skupna masa preskusne snovi, desorbirane ob desorpcij ­
skem ravnotežju μg 
m s des ðΔt i Þ masa snovi, ki ostane adsorbirana na tleh po časovnem 
intervalu Δti μg 
m aq A masa snovi, ki ostane od adsorpcijskega ravnotežja zaradi 
nepopolne nadomestitve prostornine μg 
C s des ðeqÞ vsebnost preskusne snovi, ki ostane adsorbirana na tleh ob 
desorpcijskem ravnotežju μg g  –1 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1195
 
Simbol Opredelitev Enota  
C aq des ðeqÞ masna koncentracija preskusne snovi v vodni fazi ob 
desorpcijskem ravnotežju μg cm  -3 
V T skupna prostornina vodne faze v stiku s tlemi med 
poskusom kinetike desorpcije, izvedenem s serijalno metodo cm
 3 
V R prostornina supernatanta, odstranjenega iz epruvete po 
vzpostavitvi adsorpcijskega ravnotežja in nadomeš čenega 
z enako prostornino 0,01 M raztopine CaCl  2 cm 3 
v a D prostornina alikvota, odvzetega iz epruvete za namen 
analize (i) med preskusom kinetike desorpcije, izvedenim s serijalnoo metodo cm
 3 
V ra i D prostornina raztopine, odvzete iz epruvete (i) za meritev 
preskusne snovi med poskusom kinetike desorpcije (para ­
lelna metoda) cm 3 
V r F prostornina raztopine, odvzete iz epruvete za meritev 
preskusne snovi ob desorpcijskem ravnotežju cm 3 
MB masna bilanca % 
m E skupna masa preskusne snovi, ekstrahirane iz tal in sten 
preskusne posode v dveh fazah μg 
V rec prostornina supernatanta, rekuperiranega po adsorpcijskem 
ravnotežju cm 3 
P ow porazdelitveni koeficient oktanol/voda 
pKa disociacijska konstanta 
S w topnost v vodi g l  -1 
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Znane prostornine raztopin preskusne snovi, neozna čene ali radioa ­
ktivno ozna čene, pri znanih koncentracijah v 0,01 M CaCl  2 se 
dodajo vzorcem tal znane suhe teže, pri katerih je bilo predhodno 
doseženo ravnotežje v 0,01 M CaCl  2 . Zmes se ustrezno dolgo stresa. 
Suspenzije tal se nato lo čijo s centrifugiranjem in po želji s filtracijo, 
nato se vodna faza analizira. Koli čina preskusne snovi, adsorbirane 
na vzorcu tal, se izra čuna kot razlika med koli čino preskusne snovi 
v raztopini na za četku in koli čino, ki ostane na koncu poskusa 
(posredna metoda). 
Kot druga možnost se lahko koli čina adsorbirane preskusne snovi 
določi tudi neposredno z analizo tal (neposredna metoda). Ta posto ­
pek, ki zajema postopno ekstrakcijo tal z ustreznim topilom, je priporočljiv v primerih, ko razlike v koncentraciji raztopine snovi 
ni mogoče točno določiti. Taki primeri so na primer: adsorpcija 
preskusne snovi na površino preskusnih posod, nestabilnost 
preskusne snovi v času trajanja preskusa, šibka adsorpcija, ki 
povzroči samo majhno spremembo koncentracije v raztopini, ter 
močna adsorpcija, ki povzro či nizke koncentracije, ki jih ni mogo če 
točno določiti. Če se uporabi radioaktivno ozna čena snov, se je 
mogoče izogniti ekstrakciji tal z analizo talne faze s sežigom in 
tekočinskim scintilacijskim štetjem. Vendar je teko činsko scintila ­
cijsko štetje nespecifi čna tehnika, ki ne more razlikovati med izho ­
diščno snovjo in produkti transformacije; zato se uporabi samo, če je 
preskusna kemikalija stabilna v času trajanja študije.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1196
 
1.5 INFORMACIJE O PRESKUSNI SNOVI 
Kemični reagenti morajo biti analitsko čisti. priporo čena je uporaba 
neoznačenih preskusnih snovi z znano sestavo in najbolje najmanj 
95-odstotno čistostjo ali radioaktivno ozna čenih snovi z znano 
sestavo in radioaktivno čistostjo. V primeru sledil kratke razpolovne 
dobe, je treba uporabiti korekcije za upoštevanje razpadanja. 
Pred izvajanjem preskusa adsorpcije/desorpcije morajo biti na voljo 
naslednje informacije o preskusni snovi: 
(a) topnost v void (A.6); 
(b) parni tlak (A.4) in/ali Henryjeva konstanta; 
(c) abiotska razgradnja: hidroliza kot funkcija pH (C.7); 
(d) porazdelitveni koeficient (A.8); 
(e) lahka biorazgradljivost (C.4) ali aerobna in anaerobna transfor ­
macija v tleh; 
(f) pKa snovi, ki lahko ionizirajo; 
(g) neposredna fotoliza v vodi (t.j. absorpcijski spekter UV-VIS 
v vodi, kvantni izkoristek) in fotorazgradnja na tleh.  
1.6 UPORABNOST PRESKUSA 
Preskus se uporablja za kemi čne snovi, za katere je na voljo 
analitska metoda z zadostno to čnostjo. Pomemben parameter, ki 
lahko vpliva na zanesljivost rezultatov, zlasti pri posredni metodi, je stabilnost preskusne snovi v času trajanja preskusa. Zato je pred ­
pogoj preverjanje stabilnosti v predhodni študiji; če se ugotovi, da 
pride do transformacije snovi v času, kolikor bi trajal preskus, je 
priporočljivo, da se glavna študija izvede z analiziranjem tako 
talne kot vodne faze. 
Težave lahko nastanejo pri izvajanju tega preskusa na preskusnih 
snoveh, ki so slabo topne v vodi (S
 w < 10  -4 g l -1 ) ter pri visoko 
nabitih snoveh, ker koncentracije v vodni fazi ni mogo če analitično 
izmeriti z zadostno to čnostjo. V teh primerih so potrebni dodatni 
koraki. Smernice za reševanje teh težav so dane v ustreznih poglavjih te metode. 
Pri preskušanju hlapnih snovi je treba paziti, da med študijo ne pride 
do izgub.
 
1.7 OPIS METODE  
1.7.1  Naprave in reagenti  
Standardna laboratorijska oprema, zlasti naslednje: 
(a) Epruvete ali posode za izvedbo poskusov. Pomembno je, da: 
— se te epruvete ali posode neposredno prilegajo prostoru 
v centrifugi za prepre čevanje napak pri rokovanju in prena ­ 
šanju, 
— so te epruvete ali posode iz inertnega materiala, ki omogo ča 
čim manjšo adsorpcijo preskusne snovi na njihovo površino.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1197
 
(b) Naprava za stresanje: stresalnik ali enakovredna naprava; 
naprava za stresanje mora delovati tako, da so tla med tresenjem 
ves čas v suspenziji. 
(c) Centrifuga: najbolje z visoko hitrostjo, npr. centrifugalna sila > 
3 000 g, z uravnavano temperaturo, ki iz vodne raztopine lahko 
odstrani delce s premerom nad 0,2 μm. Posode je treba med 
stresanjem in centrifugiranjem zapreti s pokrovom, da se prepre či 
izhlapevanje in izguba vode; za čim manjšo adsorpcijo na 
pokrove je treba uporabiti deaktivirane pokrove, kot so 
s teflonom prevle čeni pokrovi z navojem. 
(d) Neobvezno: naprava za filtriranje; filtri s porami 0,2 μm, sterilni, 
za enkratno uporabo. Posebna pozornost je potrebna pri izbiri 
materiala filtra, da ne bi na njem ostajala preskusna snov; za 
slabo topne preskusne snovi se ne priporo čajo filtri iz organskih 
materialov. 
(e) Analitski inštrumenti, primerni za merjenje koncentracije 
preskusne kemikalije. 
(f) Laboratorijski sušilnik, v katerem je mogo če vzdrževati tempe ­
raturo 103  o C do 110  o C. 
1.7.2  Opredelitev in izbira tal  
Tla je treba opredeliti s tremi parametri, ki veljajo za prvenstveno 
odgovorne za adsorptivno sposobnost: organski ogljik, vsebnost gline in tekstura tal ter pH. Kot je bilo že omenjeno (glej Podro čje 
uporabe), lahko tudi druge fizikalno-kemijske lastnosti tal vplivajo 
na adsorpcijo/desorpcijo neke snovi in jih je treba v takih primerih upoštevati. 
Metode, uporabljene za opredelitev tal, so zelo pomembne in imajo 
lahko precejšen vpliv na rezultate. Zato je priporo čljivo pH tal meriti 
v raztopini 0,01 M CaCl
 2 (raztopini, ki se uporablja pri preskušanju 
adsorpcije/desorpcije) po ustrezni metodi ISO (ISO-10390-1). Pripo ­
ročljivo je tudi, da se druge ustrezne lastnosti tal dolo čijo po stan ­
dardnih metodah (na primer ISO „Handbook of Soil Analysis“); s tem se omogo či, da analiza sorpcijskih podatkov temelji na 
globalno standardiziranih parametrih za tla. Nekaj smernic za obsto ­
ječe standardne metode analize in opredeljevanja tal je na voljo 
v literaturi (50–52). Za umerjanje preskusnih metod za tla je pripo ­
ročljiva uporaba referen čnih tal. 
Smernice za izbiranje tal za poskuse adsorpcije/desorpcije so v tabeli 
1. Sedem izbranih tal zajema tipe iz zmernih geografskih obmo čij. 
Pri preskusnih snoveh, ki lahko ionizirajo, naj izbrana tla zajemajo širok razpon pH, da bi lahko ovrednotili adsorpcijo snovi v njeni 
ionizirani in neionizirani obliki. Navodila o tem, koliko razli čnih 
tipov tal uporabiti v razli čnih fazah preskusa, so navedena pod 1.9 
„Izvedba preskusa“. 
Če se da prednost drugim vrstam tal, jih je treba opredeliti z istimi 
parametri in morajo imeti podobne razlike v lastnostih kot tiste, 
opisane v tabeli 1, četudi niso popolnoma skladne z merili.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1198
 
Tabela 1  
Smernice za izbiranje vzorcev tal za adsorpcijo/desorpcijo  
Tip tal Razpon pH 
(v 0,01 M CaCl  2 ) Vsebnost organskega 
ogljika (%) Vsebnost gline (%) Tekstura tal (  1 ) 
1 4,5–5,5 1,0–2,0 65–80 glina 
2 > 7,5 3,5–5,0 20–40 glinasta ilovica 
3 5,5–7,0 1,5–3,0 15–25 meljasta ilovica 4 4,0–5,5 3,0–4,0 15–30 ilovica 5 < 4,0–6,0 (
 2 ) < 0,5–1,5 (  2 ) ( 3 ) < 10–15 (  2 ) ilovnat pesek 
6 > 7,0 < 0,5–1,0 (  2 ) ( 3 ) 40–65 glinasta ilovica/ 
glina 
7 < 4,5 > 10 < 10 pesek/ilovnat pesek  
( 1 ) Po FAO in ameriškem sistemu (85). 
( 2 ) Najbolje je, da imajo ustrezne spremenljivke vrednosti znotraj razpona. Če se pojavijo težave pri iskanju ustreznega 
talnega materiala, so sprejemljive tudi vrednosti pod navedenim minimumom. 
( 3 ) Tla z manj kot 0,3 % organskega ogljika lahko povzro čijo motnje v korelaciji med vsebnostjo organskih snovi in 
adsorpcijo. Zato je priporo čljivo uporabiti tla z vsebnostjo organskega ogljika najmanj 0,3 %.  
1.7.3  Zbiranje in shranjevanje vzorcev tal  
1.7.3.1  Zbiranje  
Ne priporo ča se nobena posebna tehnika vzor čenja ali orodja; 
tehnika vzor čenja je odvisna od namena študije (53) (54) (55) (56) 
(57) (58). 
Treba je upoštevati naslednje: 
(a) potrebne so podrobne informacije o preteklosti mesta vzor čenja; 
to vključuje lokacijo, pokritost z vegetacijo, uporabo pesticidov 
in/ali gnojil, biološke dodatke ali naklju čno kontaminacijo. Treba 
je upoštevati priporo čila standarda ISO o vzor čenju tal (ISO 
10381-6) glede opisa mesta vzor čenja; 
(b) mesto vzor čenja je treba definirati z UTM (Universal Transversal 
Mercator-Projection/European Horizontal Datum) ali zemljepis ­
nimi koordinatami; s tem je v prihodnosti omogo čen ponoven 
odvzem vzorca teh tal ali pa to lahko pomaga pri definiranju tal 
po različnih sistemih klasifikacije, uporabljenih v razli čnih drža­
vah. Poleg tega je treba odvzeti vzorec samo iz horizonta A do največje globine 20 cm. Zlasti, če je pri tipu tal št. 7 horizont O
 h 
prisoten kot del tal, ga je treba pri vzor čenju vklju čiti. 
Vzorce tal je treba prenašati v posodah in v temperaturnih razmerah, 
ki zagotavljajo, da se prvotne lastnosti tal bistveno ne spremenijo.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1199
 
1.7.3.2  Shranjevanje  
Najbolje je uporabiti tla, na sveže odvzeta na terenu. Samo če to ni 
mogoče, se lahko vzorec tal shrani pri temperaturi prostora, posušen 
na zraku. Nobena omejitev časa shranjevanja ni priporo čena, vendar 
je treba tla, hranjena ve č kot tri leta, pred uporabo ponovno anali ­
zirati glede na njihovo vsebnost organskega ogljika, pH in CEC.  
1.7.3.3  Rokovanje z vzorci tal in njihova priprava na preskus  
Tla se posušijo na zraku pri temperaturi prostora (najbolje med 20 in 
25 o C). Desagregacija (razdruževanje) naj se izvede s čim manjšo 
silo, tako da se prvotna tekstura tal čim manj spremeni. Tla se 
presejejo tako, da je velikost delcev < 2 mm; glede postopka prese ­
janja se upoštevajo priporo čila standarda ISO o vzor čenju tal (ISO 
10381-6). Priporo čena je previdna homogenizacija, saj se s tem 
poveča ponovljivost rezultatov. Vsebnost vlage v posameznem 
vzorcu tal se dolo či na treh alikvotnih delih s segrevanjem pri 
105  o C dokler ni ve č pomembnih sprememb mase (sušenje do 
konstantne mase, približno 12 h). Pri vseh izra čunih se masa tal 
nanaša na maso po sušenju, t.j. maso tal, brez vsebnosti vlage.  
1.7.4  Priprava preskusne snovi za aplikacijo na tla  
Preskusna snov se raztopi v 0,01 M raztopini CaCl  2 v destilirani ali 
deionizirani vodi, pri čemer se raztopina CaCl  2 uporabi kot vodna 
topilna faza za izboljšanje centrifugiranja in doseganje čim manjše 
kationske izmenjave. Najbolje je, da je koncentracija osnovne razto ­
pine tri velikostne rede ve čja od meje detekcije uporabljene analitske 
metode. S tem pragom se zavaruje to čnost meritev glede na meto ­
dologijo, ki jo ta metoda upošteva; poleg tega mora biti koncentra ­
cija osnovne raztopine pod topnostjo preskusne snovi v vodi. 
Osnovno raztopino je najbolje pripraviti tik pred apliciranjem na 
vzorce tal, hraniti pa jo je treba zaprto v temi pri 4  o C. Čas hranjenja 
je odvisen od stabilnosti preskusne snovi in njene koncentracije v raztopini. 
Samo pri slabo topnih snoveh (S
 w < 10  -4 g l -1 ) je lahko potrebno 
uporabiti ustrezno topilo, če je preskusno snov težko raztopiti. To 
topilo: (a) naj bo tako, ki se meša z vodo, kot sta metanol ali acetonitril; (b) njegova koncentracija naj ne presega 1 % skupne 
prostornine osnovne raztopine in naj bo manjša od te koncentracije 
v raztopini preskusne snovi, ki bo prišla v stik s tlemi (najbolje manj kot 0,1 %); in (c) naj ne bo površinsko aktivna snov in naj ne bo podvrženo solvoliznim reakcijam s preskusno kemikalijo. Uporabo 
topila je treba navesti in utemeljiti pri poro čanju o podatkih. 
Druga možnost za slabo topne snovi je dodajanje preskusne snovi 
v preskusni sistem s primešanjem: preskusna snov se raztopi v organskem topilu, katerega alikvot se doda sistemu tal in 0,01 
M raztopine CaCl
 2 v destilirani ali deionizirani vodi. Vsebnost 
organskega topila v vodni fazi naj bo čim manjša in naj normalno 
ne presega 0,1 %. Težava pri primešanju iz organske raztopine je lahko neponovljivost glede prostornine. Tako lahko pride do dodatne 
napake, ker koncentracije preskusne snovi in pomožnega topila ne 
bodo enake pri vseh preskusih.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1200
 
1.8 PREDPOGOJI ZA IZVEDBO PRESKUSA ADSORPCIJE/DE ­
SORPCIJE  
1.8.1  Analitska metoda  
Ključni parametri, ki lahko vplivajo na to čnost meritev sorpcije, 
zajemajo to čnost analitske metode pri analiziranju faze raztopine in 
adsorbirane faze, stabilnost in čistost preskusne snovi, doseganje 
sorpcijskega ravnotežja, velikost spremembe koncentracije raztopine, razmerje tla/raztopina in spremembe strukture tal med procesom 
uravnoteženja (35) (59–62). Nekaj primerov v zvezi z vprašanjem 
točnosti je navedenih v Dodatku 2. 
Zanesljivost uporabljene analitske metode je treba preveriti pri 
območju koncentracij, ki se bodo verjetno pojavile v preskusu. Izva ­
jalec poskusa naj svobodno razvije ustrezno metodo z ustrezno 
točnostjo, natan čnostjo, ponovljivostjo, mejami detekcije in rekupe ­
racijo. Smernice za izvedbo takega preskusa so dane s spodnjim poskusom. 
Ustrezna prostornina 0,01 M CaCl
 2 , npr. 100 cm  3 , se stresa 4 
h z dolo čeno količino, npr. 20 g, tal z visoko adsorptivnostjo 
t.j. tal z veliko vsebnostjo organskega ogljika in gline; te teže in 
prostornine so lahko razli čne glede na analitske potrebe, vendar je 
primerno izhodiš če razmerje tla/raztopina 1:5. Zmes se centrifugira 
in vodna faza se lahko filtrira. Dolo čena prostornina osnovne razto ­
pine preskusne snovi se doda vodni fazi, da se doseže nominalna 
koncentracija v obmo čju koncentracij, ki se bodo verjetno pojavile 
v preskusu. Ta prostornina naj ne presega 10 % kon čne prostornine 
vodne faze, da se narava raztopine pred uravnoteženjem čim manj 
spremeni. Raztopina se analizira. 
Vključiti je treba slepi vzorec, ki ga sestavlja sistem tal in raztopine 
CaCl  2 (brez preskusne snovi) za preverjanje artefaktov pri analitski 
metodi in vplivov matriksa, ki jih povzro čijo tla. 
Analitske metode, ki se lahko uporabijo za merjenje sorpcije, zaje ­
majo plinsko-teko činsko kromatografijo (GLC), teko činsko kromato ­
grafijo visoke lo čljivosti (HPLC), spektrometrijo (npr. GC/masna 
spektrometrija, HPLC/masna spektromertrija) in teko činsko scintila ­
cijsko štetje (za radioaktivno ozna čene snovi). Ne glede na upora ­
bljeno analitsko metodo, velja za primerno, če je rekuperacija med 
90 % in 110 %) nominalne vrednosti. Da bi bila po porazdelitvi 
mogoča detekcija in ovrednotenje, naj bodo meje detekcije analitske 
metode vsaj dva velikostna reda pod nominalno koncentracijo. 
Lastnosti in meje detekcije analitske metode za izvajanje študij 
adsorpcije imajo pomembno vlogo pri dolo čanju preskusnih pogojev 
in celotne eksperimentalne izvedbe preskusa. Ta metoda sledi splošni eksperimentalni poti ter daje priporo čila in smernice za alternativne 
rešitve, kadar analitska metoda ali zmožnosti laboratorija omejujejo 
izvedbo.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1201
 
1.8.2  Izbira optimalnih razmerij tla/raztopina  
Izbira ustreznih razmerij tla/raztopino za študije sorptivnosti je 
odvisna od porazdelitvenega koeficienta K  d in želene relativne 
stopnje adsorpcije. Sprememba koncentracije snovi v raztopini 
določa statistično točnost meritve na osnovi oblike adsorpcijske 
enačbe in meje analitske metodologije pri zaznavanju koncentracije 
kemikalije v raztopini. Zato je v splošni praksi koristno dolo čiti 
nekaj fiksnih razmerij, pri katerih je adsorbirani odstotek nad 
20 % in najbolje nad 50 % (62), pri tem pa je treba paziti, da je 
koncentracija preskusne snovi v vodni fazi ves čas dovolj velika, da 
omogoča točne meritve. To je zlasti pomembno v primeru visokih 
adsorpcijskih odstotkov. 
Primeren pristop k izbiranju ustreznih razmerij tla/raztopina temelji 
na oceni vrednosti K  d s predhodnimi študijami ali po uveljavljenih 
tehnikah ocenjevanja (Dodatek 3). Ustrezno razmerje se nato lahko 
izbere na podlagi grafi čnega prikaza razmerja tla/raztopina 
v odvisnosti od K  d za fiksne odstotke adsorpcije (slika 1). V tem 
grafičnem prikazu se predpostavlja, da je adsorpcijska ena čba 
linearna (  1 ). Uporabna odvisnost se dobi s preureditvijo ena čbe (4) 
za K  d v obliko ena čbe (1):  
V 0 
m soil ¼ Í 
m 0 
m s ads ðeqÞ Ä 1 Î 
K d (1) 
ali v njeni logaritemski obliki, ob predpostavki, da R = m  soil /V 0 and 
A eq %/100 =  m s ads ðeqÞ 
m 0 : 
logR ¼ ÄlogK  d þ log " 
ðA eq %=100Þ 
ð1 Ä A eq %=100Þ # (2)
 
Slika 1:  Odvisnost med razmerji tla/raztopina in K  d pri različnih odstotkih adsorbi ­
rane preskusne snovi  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1202  
( 1 ) C s ads ðeqÞ ¼ K d · C aq ads ðeqÞ
 Slika 1 prikazuje potrebna razmerja tla/raztopina kot funkcija K  d za 
različne stopnje adsorpcije. Na primer, pri razmerju tla/raztopina 1:5 
in K  d 20 bi prišlo do približno 80-odstotne adsorpcije. Da bi pri 
enakem K  d dobili 50-odstotno adsorpcijo, je treba uporabiti razmerje 
1:25. Ta pristop k izbiranju ustreznih razmerij tla/raztopina omogo ča 
preiskovalcu fleksibilnost, da lahko zadovolji potrebe preskusa. 
Težavnejši primeri so tisti, kjer se kemikalija zelo dobro ali zelo 
slabo adsorbira. Kadar je adsorpcija nizka, je priporo čeno razmerje 
tla/raztopina 1:1, vendar so pri nekaterih zelo organskih tipih tal lahko potrebna manjša razmerja, da dobimo blato. Pri analitski meto ­
dologiji je potrebna previdnost, da se izmerijo majhne spremembe 
v koncentraciji raztopine; druga če bo meritev adsorpcije neto čna. Po 
drugi strani lahko pri zelo visokih porazdelitvenihih koeficientih K
 d 
uporabimo lahko razmerje tla/raztopina do 1:100, da bi v raztopini 
ostala pomembna koli čina kemikalije. Vendar je treba paziti, da 
zagotovimo dobro mešanje, in omogo čimo dovolj časa za vzposta ­
vitev ravnotežja v sistemu. Druga možnost za obvladovanje teh ekstremnih primerov, ko ni primerne analitske metodologije, je napo ­
vedovanje vrednosti K
 d z uporabo tehnik ocenjevanja, na primer na 
osnovi vrednosti P  ow (Dodatek 3). To je lahko uporabno zlasti pri 
slabo adsorbiranih/polarnih kemikalijah s P  ow < 20 in lipofilnih/zelo 
sorptivnih kemikalijah s P  ow > 104.  
1.9 IZVEDBA PRESKUSA  
1.9.1  Preskusni pogoji  
Vsi preskusi se izvedejo pri normalni temperaturi in, če je mogo če, 
pri stalni temperaturi med 20 in 25  o C. 
Pogoji centrifugiranja morajo omogo čati odstranitev delcev iz razto ­
pine, ki so ve čji od 0,2 μm. Ta velikost ustreza najmanjšemu delcu, 
ki še velja za trden delec, in je meja med trdnimi in koloidnimi delci. 
Smernice za dolo čitev pogojev centrifugiranja so navedena 
v Dodatku 4. 
Če centrifuga ne more zagotoviti odstranitve delcev, ve čjih od 
0,2 μm, se lahko uporabi kombinacija centrifugiranja in filtriranja 
z 0,2 μm filtri. Ti filtri naj bodo iz primernega inertnega materiala, 
da se na njih ne bi izgubljala preskusna snov. V vsakem primeru je 
treba dokazati, da med filtracijo ne prihaja do izgub preskusne snovi.  
1.9.2  Stopnja 1 – Predhodna študija  
Namen predhodne študije je bil že naveden v poglavju Podro čje 
uporabe. Smernice za postavitev takega preskusa pa so dane 
s spodaj predlaganim preskusom.  
1.9.2.1  Izbira optimalnih razmerij tla/raztopina  
Uporabita se dva tipa tal in tri razmerja tla/raztopina (šest poskusov). 
En tip tal naj ima visoko vsebnost organskega ogljika in nizko 
vsebnost gline, drugi pa nizko vsebnost organskega ogljika in visoko vsebnost gline. Predlagana so naslednja razmerja tla/raztopina: 
— 50 g tal in 50 cm
 3 vodne raztopine preskusne snovi (razmerje 1/1),  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1203
 
— 10 g tal in 50 cm  3 vodne raztopine preskusne snovi (razmerje 1/5), 
— 2 g tal in 50 cm  3 vodne raztopine preskusne snovi (razmerje 1/25). 
Minimalna koli čina tal, s katero se lahko izvede poskus, je odvisna 
od laboratorijskih zmožnosti in u činkovitosti uporabljenih analitskih 
metod. Vendar je priporo čljivo uporabiti vsaj 1 g, najbolje pa 2 g, da 
bi bili rezultati preskusa zanesljivi. 
Kontrolni vzorec samo s preskusno snovjo v 0,01 M raztopini CaCl  2 
(brez tal) se tretira po natan čno enakem postopku kot preskusni 
sistem, da se preveri stabilnost preskusne snovi v raztopini CaCl  2 
in njeno morebitno adsorpcijo na površine preskusnih posod. 
Po en slepi vzorec na tip tal z enako koli čino tal in skupno prostor ­
nino 50 cm  3 0,01 M raztopine CaCl  2 (brez preskusne snovi) se treti ­
rajo po enakem preskusnem postopku. To je namenjeno kontroli 
ozadja med analizo, da se zaznajo mote če snovi ali kontaminirana 
tla. 
Vse poskuse, vklju čno s kontrolami in slepimi vzorci, je treba izva ­
jati vsaj v dveh ponovitvah. Skupno število vzorcev, ki jih je treba 
pripraviti za študijo, se lahko izra čuna glede na metodologijo, ki bo 
uporabljena. 
Metode za predhodno študijo in glavno študijo so na splošno enake, 
kjer je ustrezno, so navedene izjeme. 
Na zraku posušeni vzorci tal se uravnotežijo s stresanjem 
s prostornino vsaj 45 cm  3 0,01 M CaCl  2 čez noč (12 h) pred dnem 
preskusa. Nato se doda dolo čena koli čina osnovne raztopine 
preskusne snovi, da se kon čna prostornina dopolni do 50 cm  3 . Ta 
količina dodane osnovne raztopine: (a) naj ne presega 10 % kon čne 
prostornine vodne faze 50 cm  3 , da se narava raztopine pred uravno ­
teženjem čim manj spremeni; in (b) naj bo taka, da bo za četna 
koncentracija preskusne snovi v stiku s tlemi (C  o ) vsaj dva veliko ­
stna reda ve čja od meje detekcije analitske metode; ta prag omogo ča 
izvajanje to čnih meritev, tudi če pride do mo čne adsorpcije 
(> 90 %), in kasnejšo dolo čitev adsorpcijskih izoterm. Priporo čljivo 
je tudi, da za četna koncentracija snovi (C  o ), če je to mogo če, ne 
presega polovice njene meje topnosti. 
Primer za izra čun koncentracije osnovne raztopine (C  st ) je naveden 
spodaj. Predpostavlja se meja detekcije pri 0,01 ug cm  -3 in 90- 
odstotna adsorpcija; tako, da je najbolje, da je za četna koncentracija 
preskusne snovi v stiku s tlemi 1 ug cm  -3 (dva velikostna reda nad 
mejo detekcije). Če predpostavljamo, da se doda najve čja priporo ­ 
čena prostornina osnovne raztopine, t.j. 5 cm  3 k 45 cm  3 0,01 
M CaCl  2 raztopine za uravnoteženje (= 10 % osnovne raztopine 
v 50 cm  3 skupne prostornine vodne faze), bi morala biti koncentra ­
cija osnovne raztopine 10 μg cm  -3 ; to je tri velikostne rede nad mejo 
detekcije analitske metode. 
pH vodne faze se meri pred in po stiku s tlemi, saj ima pomembno 
vlogo v adsorpcij skem procesu, zlasti pri snoveh, ki lahko ionizirajo.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1204
 
Zmes se stresa, dokler ni vzpostavljeno adsorpcijsko ravnotežje. Čas 
potreben za vzpostavitev ravnotežja v tleh je zelo razli čen glede na 
kemikalijo in tip tal; navadno zadostuje 24 h (77). V predhodni študiji se vzorci lahko zbirajo zaporedno v času 48 h mešanja (na 
primer po 4, 8, 24, 48 h). Vendar naj bodo časi analize fleksibilni ob 
upoštevanju delovnega razporeda v laboratoriju. 
Za analiziranje preskusne snovi v vodni raztopini obstajata dve 
možnosti: (a) paralelna metoda in (b) serialna metoda. Poudariti je treba, da je pri paralelni metodi matemati čna obdelava rezultatov 
enostavnejša (Dodatek 5), čeprav je metoda eksperimentalno bolj 
zahtevna. Vendar je izbira metodologije prepuš čena izvajalcu, ki 
mora pretehtati zmožnosti in sredstva laboratorija. 
(a) Paralelna metoda: pripravijo se vzorci z enakim razmerjem tla/ 
raztopina, toliko vzorcev, kot je časovnih intervalov, pri katerih 
se želi prou čevati kinetiko adsorpcije. Po centrifugiranju in po 
želji po filtriranju se vodna faza prve epruvete v čim večji meri 
rekuperira in se izmeri po na primer 4 h, vodna faza druge 
epruvete po 8 h, tista iz tretje po 24 h itd. 
(b) Serialna metoda: za vsako razmerje tla/raztopina se pripravita 
samo dva vzorca. V opredeljenih časovnih intervalih se zmes 
centrifugira, da se lo čijo faze. V majhnem alikvotu vodne faze 
se takoj dolo či preskusna snov; nato se poskus nadaljuje 
s prvotno zmesjo. Če se po centrifugiranju izvede filtracija, 
mora imeti laboratorij možnost filtriranja majhnih vodnih alikvo ­
tov. Priporo čeno je, da skupna prostornina odvzetih alikvotov ne 
presega 1 % skupne prostornine raztopine tako, da se razmerje tla/raztopina ne spremeni bistveno in da se ne zmanjša masa topljenca, ki je med preskusom na voljo za adsorpcijo. 
Odstotek adsorpcije
 A t i se izračuna za vsako posamezno časovno 
točko (t  i ) na osnovi nominalne za četne koncentracije in izmerjene 
koncentracije ob času vzorčenja (t  i ), korigirane glede na vrednost 
slepega vzorca. Izdelajo se grafi čni prikazi  A  t i v odvisnosti od 
časa (slika 1 v Dodatku 5), da se oceni vzpostavitev ravnotežnega 
konstantnega nivoja (  1 ). Izračuna se tudi vrednost K  d ob ravnotežju. 
Na osnovi te vrednosti K  d se iz slike 1 izberejo ustrezna razmerja 
tla/raztopina, tako da je odstotek adsorpcije nad 20 % in najbolje nad 
50 % (61). Vse uporabljene ena čbe in načela izdelave grafov so 
navedeni v poglavju „Podatki in poro čanje“ in v Dodatku 5.  
1.9.2.2  Dolo čanje časa adsorpcijskega ravnotežja in koli čine preskusne 
snovi, adsorbirane ob ravnotežju  
Kot je bilo že omenjeno, grafi čni prikazi  A t i ali C aq ads v odvisnosti od 
časa omogo čajo ocenitev vzpostavitve adsorpcijskega ravnotežja in 
količine preskusne snovi, adsorbirane ob ravnotežju. Sliki 1 in 2 
v Dodatku 5 sta primera takih grafi čnih prikazov. Čas, potreben za 
vzpostavitev ravnotežja pove, koliko časa sistem potrebuje, da 
doseže konstanten nivo.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1205  
( 1 ) Za ocenjevanje vzpostavitve ravnotežnega konstantnega nivoja se lahko uporabijo tudi 
grafi koncentracije preskusne snovi v vodni fazi  C aq ads v odvisnosti od časa (glej sliko 2 
v Dodatku 5).
 Če se za neka tla ne ugotovi konstantnega nivoja, temve č gre za 
stalno naraš čanje, so za to lahko krivi dejavniki, kot sta bioraz ­
gradnja ali po časna difuzija. Biorazgradnja se lahko ugotovi 
s ponovitvijo poskusa s steriliziranim vzorcem tal. Če tudi v tem 
primeru ni dosežen konstanten nivo, mora izvajalec poiskati druge 
pojave, ki bi lahko bili vpleteni v njegovi študiji; to se lahko naredi 
z ustreznimi spremembami eksperimentalnih pogojev (temperatura, čas stresanja, razmerja tla/raztopina). Izvajalcu je prepuš čeno, da 
odloči, ali nadaljevati s preskusnim postopkom, čeprav se ravnotežje 
morda ne bo vzpostavilo.
 
1.9.2.3  Adsorpcija na površino preskusne posode in stabilnost preskusne 
snovi  
Nekatere informacije o adsorpciji preskusne snovi na površino 
preskusnih posod in o njeni stabilnosti se lahko pridobijo 
z analiziranjem kontrolnih vzorcev. Če se ugotovi iz črpanje snovi 
za več kot za standardno napako analitske metode, sta lahko vzrok 
abiotska razgradnja in/ali adsorpcija na površino preskusne posode. 
Ta dva pojava se lahko razlo čita s temeljitim izpiranjem sten posode 
z znano prostornino ustreznega topila in analiziranjem vsebnosti preskusne snovi v izpiralni raztopini za izpiranje. Če ni ugotovljena 
adsorpcija na površino posode, je izgubljanje dokaz za abiotsko 
nestabilnost preskusne snovi. Če je adsorpcija ugotovljena, je treba 
zamenjati material preskusne posode. Vendar podatkov o adsorpciji na površino preskusnih posod, dobljenih s tem poskusom, ni mogo če 
neposredno ekstrapolirati na preskus tla/raztopina. Prisotnost vzorca 
tal bo vplivala na to adsorpcijo. 
Dodatne informacije o stabilnosti preskusne snovi je mogo če dobiti 
z določitvijo masne bilance izhodiš čne snovi v odvisnosti od časa. 
To pomeni, da se analizira vsebnost preskusne snovi v vodni fazi, 
ekstraktu tal in na stenah preskusne posode. Razlika med maso dodane preskusne kemikalije in vsoto mas preskusne kemikalije v vodni fazi, ekstraktih tal in na stenah preskusne posode je enaka 
razgrajeni in/ali izhlapeli in/ali neekstrahirani masi. Za dolo čitev 
masne bilance bi moralo biti adsorpcijsko ravnotežje vzpostavljeno v času trajanja poskusa. 
Masna bilanca se dolo či za oba tipa tal in za eno razmerje tla/raz ­
topina, pri katerem v ravnotežju pride do izgubljanja nad 20 % in najbolje nad 50 %>. Ko je poskus za dolo čitev razmerja kon čan 
z analiziranjem zadnjega vzorca vodne faze po 48 h, se faze lo čijo 
s centrifugiranjem in, po želji, s filtracijo. Vodna faza se v čim večji 
meri rekuperira, tlom pa se za ekstrakcijo preskusne snovi doda primerno ekstrakcijsko topilo (z ekstrakcijskim koeficientom najmanj 95 %). Priporo čeni sta vsaj dve zaporedni ekstrakcij i. Dolo či se 
količina preskusne snovi v ekstraktih tal in ekstraktih preskusnih 
posod in izra čuna se masna bilanca (ena čba 10, Podatki in poro ča­
nje). Če je manjša od 90 %>, preskusna snov velja za nestabilno 
v času trajanja preskusa. Vendar se lahko študija nadaljuje ob 
upoštevanju neobstojnosti preskusne snovi; v tem primeru je pripo ­
ročljivo analizirati obe fazi v glavni študiji.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1206
 
1.9.2.4  Stopnja 2 – Kinetika adsorpcije pri eni koncentraciji preskusne snovi  
Uporabi se pet tipov tal, izbranih iz tabele 1. Med teh pet tipov je, če 
je primerno, koristno vklju čiti nekatere ali vse tipe tal, uporabljene 
v predhodni študiji. V tem primeru stopnje 2 ni treba ponoviti za tipe 
tal, uporabljene v predhodni študiji. 
Čas potreben za vzpostavitev ravnotežja, razmerje tla/raztopina, teža 
vzorca tal, prostornina vodne faze v stiku s tlemi in koncentracija 
preskusne snovi v raztopini se izberejo na podlagi izsledkov pred ­
hodne študije. Analizo je najbolje opraviti približno po 2, 4, 6, 8 (po možnosti tudi 10) in 24 urah stika; čas stresanja se lahko podaljša na 
največ 48 h, če kemikalija zahteva daljši čas za vzpostavitev ravno ­
težja glede na rezultate dolo čanja razmerja. Vendar se časi analize 
lahko pretehtajo s fleksibilnostjo. 
Vsak poskus (en tip tal in ena raztopina) se izvede vsaj v dveh 
ponovitvah, da se omogo či oceno variance rezultatov. V vsakem 
poskusu je en slepi vzorec. Sestavljen je iz vzorca tal in 0,01 M raztopine CaCl
 2 brez preskusne snovi ter ima tako težo in prostor ­
nino, kot sta uporabljeni v preskusu. Kontrolni vzorec, ki vsebuje 
samo preskusno snov v 0,01 M raztopini CaCl  2 (brez tal), se tretira 
po enakem preskusnem postopku in služi kot zaš čita pred nepri ča­
kovanim. 
Odstotek adsorpcije se izra čuna za vsak čas A  t i in/ali časovni 
interval  A t i (glede na potrebe) in se grafi čno prikaže v odvisnosti 
od časa. Izračunata se tudi porazdelitveni koeficient K  d ob ravnotežju 
in adsorpcijski koeficient normiran na organski ogljik K  oc (za nepo­
larne organske kemikalije). 
Rezultati preskusa kinetike adsorpcije 
Linearna vrednost K  d navadno to čno opiše obnašanje pri sorpciji 
v tleh (35) (78) in izraža inherentno mobilnost kemikalij v tleh. 
Na primer, na splošno kemikalije s K  d ≤ 1 cm  3 g -1 veljajo za kvali ­
tativno mobilne. Podobno so MacCall et al. (16) razvili sistem razvrščanja po mobilnosti na osnovi vrednosti K
 oc . Poleg tega obsta ­
jajo sistemi razvrš čanja glede na izluževanje, ki temeljijo na odnosu 
med K  oc DT-50 (  1 ) (32) (79). 
Glede na študije analize napake (61) se vrednosti K  d pod 0,3 cm  3 g -1 
ne dajo to čno oceniti iz zmanjšanja koncentracije v vodni fazi, četudi 
se uporabi najugodnejše (z vidika to čnosti) razmerje tla/raztopina, 
t.j. 1:1. Vtem primeru je priporo čljiva analiza obeh faz, tal in razto ­
pine. ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1207  
( 1 ) DT-50: čas razgradnje 50 % preskusne snovi.
 Glede na zgornje opombe je priporo čljivo, da se študija adsorptiv ­
nega obnašanja kemikalije v tleh in njene potencialne mobilnosti 
nadaljuje z dolo čitvijo Freundlichovih adsorpcijskih izoterm za te 
sisteme, za katere je mogo ča točna določitev K  d po eksperimen ­
talnem protokolu iz te preskusne metode. To čna določitev je 
mogoča, če je rezultat pomnožitve K  d z razmerjem tla/raztopina > 
0,3, kadar meritve temeljijo na zmanjševanju koncentracije v vodni fazi (posredna metoda), oziroma > 0,1, kadar se analizirata obe fazi (neposredna metoda) (61).
 
1.9.2.5  Stopnja 3 – Adsorpcijske izoterme in kinetika desorpcije/desorpcijske 
izoterme  
1.9.2.5.1 A d s o r p c i j s k e i z o t e r m e 
Uporabi se pet koncentracij preskusne snovi, ki najbolje da zajemajo 
dva velikostna reda; pri izbiri teh koncentracij se upoštevajo topnost 
v vodi in posledi čne koncentracije vodnega ravnotežja. Med študijo 
je potrebno ohranjati isto razmerje tla/raztopina za posamezni tip tal. 
Preskus adsorpcije se izvede, kakor je opisano zgoraj, z edino 
razliko, da se vodna faza analizira samo enkrat ob času, potrebnem 
za vzpostavitev ravnotežja, kakor je že bilo dolo čeno v stopnji 
2. Določijo se ravnotežne koncentracije v raztopini, adsorbirana koli ­ 
čina pa se izra čuna iz izgubljanja preskusne snovi v raztopini ali 
z neposredno metodo. Adsorbirana masa na enoto mase tal se prikaže grafi čno kot funkcija ravnotežne koncentracije preskusne 
snovi (glej poglavje „Podatki in poro čanje“). 
Rezultati poskusa adsorpcijskih izoterm 
Med doslej predlaganimi matemati čnimi modeli adsorpcije se za 
opisovanje adsorpcijskih procesov najpogosteje uporablja Freundlic ­
hova izoterma. Bolj podrobne informacije o razlagi in pomenu 
adsorpcij skih modelov so na voljo v literaturi (41) (45) (80) (81) (82).  
Opomba:  Treba je omeniti, da je primerjava vrednosti K
 F (Freund­
lichov adsorpcijski koeficient) za razli čne snovi mogo ča samo, če so 
te vrednosti K  F izražene v enakih enotah (83).  
1.9.2.5.2 K i n e t i k a d e s o r p c i j e 
Namen tega preskusa je prou čiti, ali se kemikalija reverzibilno ali 
ireverzibilno adsorbira na tla. Ta podatek je pomemben, saj ima tudi 
desorpcijski proces pomembno vlogo pri obnašanju kemikalije 
v tleh. Poleg tega so podatki o desorpciji koristni vhodni podatki pri računalniškem modeliranju izluževanja in odtekanja raztopljenih 
snovi. Če se želi opraviti študija desorpcije, je priporo čljivo, da se 
spodaj opisana študija izvede za vsak sistem, za katerega je bila 
v prejšnjem preskusu kinetike desorpcije mogo ča točna določitev K
 d . 
Kot pri študiji kinetike desorpcije, obstajata dve možnosti izvajanja 
poskusa kinetike desorpcije: (a) paralelna metoda in (b) serialna 
metoda. Izbira metodologije je prepuš čena izvajalcu, ki mora preteh ­
tati zmožnosti in sredstva laboratorija.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1208
 
(a) Paralelna metoda: za vsak tip tal, ki se izbere za študijo desorp ­
cije, se pripravijo vzorci z enakim razmerjem tla/raztopina, in 
sicer toliko vzorcev, kolikor je časovnih intervalov, v katerih 
se želi prou čevati kinetika desorpcije. Najbolje je uporabiti 
enake časovne intervale kot pri poskusu kinetike adsorpcije; 
vendar se lahko skupni čas ustrezno podaljša, da se lahko 
v sistemu vzpostavi desorpcijsko ravnotežje. Za vsak preskus (en tip tal, ena raztopina) se pripravi en slepi vzorec. Sestavljen je iz vzorca tal in 0,01 M raztopine CaCl
 2 brez preskusne 
snovi ter ima težo in prostornino, enaki tistima v preskusu. 
Kot kontrolni vzorec se po enakem preskusnem postopku tretira preskusna snov v 0,01 M raztopini CaCl
 2 (brez tal). Vse zmesi 
tal z raztopino se stresajo, dokler se ne vzpostavi adsorpcijsko 
ravnotežje (kot je bilo dolo čeno zgoraj v stopnji 2). Nato se faze 
ločijo s centrifugiranjem in vodne faze se v čim večji meri 
odstranijo. Prostornina odstranjene raztopine se nadomesti z enako prostornino 0,01 M CaCl
 2 brez preskusne snovi in 
nove zmesi se zopet stresajo. Vodna faza v prvi epruveti se 
v čim večji meri rekuperira in se izmeri po na primer 2 
h, tista v drugi epruveti po 4 h, tista v tretji po 6 h itd., dokler se ne vzpostavi desorpcijsko ravnotežje. 
(b) Serijska metoda: po preskusu kinetike adsorpcije se zmes centri ­
fugira in vodna faza v čim večji meri odstrani. Prostornina 
odstranjene raztopine se nadomesti z enako prostornino 0,01 
M CaCl
 2 brez preskusne snovi. Nova zmes se stresa, dokler ni 
vzpostavljeno desorpcijsko ravnotežje. V tem času se 
v določenih časovnih intervalih zmes centrifugira, da se lo čijo 
faze. V majhnem alikvotu vodne faze se takoj analizira vsebnost 
preskusne snovi; nato se preskus nadaljuje s prvotno zmesjo. 
Prostornina posameznega alikvota naj bo manjša od 1 % skupne prostornine. Enaka koli čina sveže raztopine 0,01 M CaCl
 2 se 
doda zmesi, da se ohrani razmerje tla/raztopina, stresanje pa se 
nadaljuje do naslednjega časovnega intervala. 
Odstotek desorbcije se izra čuna za vsak čas ðD t i Þ ali časovni interval 
ðD Δt i Þ (glede na potrebe študije) in grafi čno prikaže v odvisnosti od 
časa. Izračuna se tudi desorpcijski koeficient K  des ob ravnotežju. Vse 
uporabljene ena čbe so navedene v poglavju Podatki in poro čanje in 
Dodatku 5. 
Rezultati preskusa kinetike desorpcije 
Skupni grafi čni prikazi odstotkov desorpcije ( D t i ) in adsorpcije 
(A Δt i ) v odvisnosti od časa omogo čajo ocenitev reverzibilnosti 
adsorpcijskega procesa. Če se desorpcijsko ravnotežje vzpostavi 
tudi v dvakrat daljšem času od adsorpcij skega ravnotežja in če je 
skupna desorpcija ve čja od 75 % adsorbirane koli čine, velja 
adsorpcij a za reverzibilno.  
1.9.2.5.3 D e s o r p c i j s k e i z o t e r m e 
Freundlichove desorpcij ske izoterme se dolo čajo na tleh, upora ­
bljenih pri preskusu adsorpcij skih izoterm. Preskus desorpcije se izvede, kakor je opisano v poglavju „Kinetika desorpcije“, z edino 
razliko, da se vodna faza analizira samo enkrat, ob desorpcij skem 
ravnotežju. Izra čuna se koli čina desorbirane preskusne snovi. 
Vsebnost preskusne snovi, ki ostane adsorbirana na tleh ob desorpcij skem ravnotežju, se grafi čno prikaže kot funkcija ravnotežne koncen ­
tracije preskusne snovi v raztopini (glej poglavje Podatki in 
poročanje ter Dodatek 5).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1209
 
2. PODATKI IN PORO ČANJE  
Analitski podatki se prikažejo v obliki tabel (glej Dodatek 6). Nave ­
dejo se posamezne meritve in izra čunana povpre čja. Dodajo se 
grafični prikazi adsorpcij skih izoterm. Izra čuni se opravijo, kot je 
opisano spodaj. 
Za namen preskusa velja, da je teža 1 cm  3 vodne raztopine 
1 g. Razmerje tla/raztopina se lahko z isto številko izrazi v enotah 
m/m ali m/V.  
2.1 ADSORPCIJA 
Adsorpcija  A t i je opredeljena kot odstotek snovi, adsorbirane na tla, 
glede na koli čino na za četku preskusa, v preskusnih pogojih. Če je 
preskusna snov stabilna in se bistveno ne adsorbira na stene posode, 
se A t i izračuna za vsak čas t  i po enačbi: 
A t i ¼ m s ads ðt i Þ · 100 
m 0 ð%Þ (3) 
pri čemer je:  
A t i = odstotek adsorpcije ob času t  i (%); 
m s ads ðt i Þ = masa preskusne snovi, adsorbirane na tla ob času t  i 
(μg); 
m 0 = masa preskusne snovi v epruveti na za četku preskusa 
(μg). 
Podrobne informacije o izra čunavanju odstotka  A t i pri paralelni in 
serijski metodi so navedene v Dodatku 5. 
Porazdelitvenii koeficient K  d je razmerje med vsebnostjo snovi v fazi 
tal in masno koncentracijo snovi v vodni raztopini v preskusnih 
pogojih, ko je doseženo adsorpcijsko ravnotežje.  
K d ¼ C s ads ðeqÞ 
C aq ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (4) 
pri čemer je:  
C s ads ðeqÞ = vsebnost snovi, adsorbirane na tla ob adsorpcijskem 
ravnotežju ( μg g  -1 ); 
C aq ads ðeqÞ = masna koncentracija snovi v vodni fazi ob adsorpcij ­
skem ravnotežju ( μg cm  -3 ). Ta koncentracija se 
določi analitsko ob upoštevanju vrednosti, dobljenih 
pri slepem vzorcu;  
m s ads ðeqÞ = masa snovi, adsorbirane na tla ob adsorpcijskem 
ravnotežju ( μg); 
m aq ads ðeqÞ = masa snovi v raztopini ob adsorpcijskem ravnotežju 
(μg); 
m soil = količina talne faze, izražena v suhi masi tal (g) 
V 0 = začetna prostornina vodne faze v stiku s tlemi (cm  3 ). 
Odnos med A  eq in K  d se navede z:  
K d ¼ A eq 
100 Ä A eq · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (5) ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1210
 
pri čemer je: 
A eq = odstotek adsorpcije ob adsorpcijskem ravnotežju, %. 
Adsorpcijski koeficient normiran na organski ogljik K  oc ; povezuje 
porazdelitveni koeficient K  d z vsebnostijo organskega ogljika 
v vzorcu tal:  
K oc ¼ K d · 100 
%OC  (cm  3 g -1 ) (6) 
pri čemer je: 
%OC = odstotek organskega ogljika v vzorcu tal (g g  -1 ). 
Koeficient K  oc predstavlja eno samo vrednost, ki ozna čuje porazde ­
litev večinoma nepolarnih organskih kemikalij med organski ogljik 
v tleh ali usedlinah in vodi. Adsorpcija teh kemikalij je v korelaciji 
z organsko vsebnostjo sorptivnih trdnih snovi (7); tako so vrednosti K
 oc odvisne od specifi čnih lastnosti huminskih frakcij, ki se precej 
razlikujejo po zmožnosti sorpcije zaradi razlik v izvoru, genezi itd.  
2.1.1  Adsorpcijske izoterme  
Enačba Freundlichovih adsorpcij skih izoterm predstavlja odvisnost 
med količino adsorbirane preskusne snovi in koncentracijo preskusne 
snovi v raztopini ob ravnotežju (ena čba 8). 
Podatki se obdelajo kot pri „Adsorpciji“ in za vsako epruveto se 
izračuna vsebnost preskusne snovi, adsorbirane na tla po preskusu 
adsorpcije ( C s ads ðeqÞ, drugje navedeno kot x/m). Predpostavlja se, 
da je bilo ravnotežje vzpostavljeno in da  C s ads ðeqÞpredstavlja ravno ­
težno vrednost:  
C s ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m soil ¼ C 0 Ä C aq ads ðeqÞ h i
:V 0 
m soil (μg g  -1 ) (7) 
Freundlichova adsorpcijska ena čba je (8):  
C s ads ðeqÞ ¼ K F ads Ö C aq ads ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) (8) 
ali v linearni obliki:  
logC  s ads ðeqÞ ¼ logK  F ads þ 1=n·logC  aq ads ðeqÞ (9) 
pri čemer je:  
K F ads = Freundlichov adsorpcijski koeficient; njegova dimenzija 
je cm  3 g -1 samo pri 1/n = 1; v vseh drugih primerih se 
nagib 1/n vpelje v dimenziji  K F ads (μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 ); 
n = regresijska konstanta; 1/n ima navadno vrednost med 0,7 
in 1,0 in kaže na to, da so podatki o sorpciji pogosto 
rahlo nelinearni. 
Enačbi (8) in (9) se grafi čno prikažeta in vrednosti  K F ads in 1/n se 
izračunajo z regresijsko analizo po ena čbi 9. Izra čuna se tudi kore ­
lacijski koeficient r  2 logaritemske ena čbe. Primer takih grafov na 
sliki 2.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1211
 
Slika 2:  Freundlichova adsorpcijska krivulja, normalna in linearizi ­
rana 
2.1.2  Masna bilanca  
Masna bilanca („Mass balance MB) je opredeljena kot odstotek 
snovi, ki jo je mogo če analitično rekuperirati po preskusu adsorpcije, 
glede na nominalno koli čino snovi na za četku preskusa. 
Obdelava podatkov je druga čna, če se topilo popolnoma meša 
z vodo. V primeru topila, ki se meša z vodo, se lahko za dolo čitev 
količine snovi, rekuperirane z ekstrakcijo s topilom, uporabi obde ­
lava podatkov, opisana pod „Desorpcija“. Če se topilo manj meša 
z vodo, je treba dolo čiti rekuperirano koli čino. 
Masna bilanca (MB) za adsorpcijo se izra čuna, kakor sledi; pred ­
postavlja se, da izraz (m  E ) ustreza vsoti mas preskusnih kemikalij, 
ekstrahiranih iz tal in površin preskusne posode z organskim topi ­
lom: 
MB ¼ V rec ·C aq ads ðeqÞ þ m E Ê Ì  
·100 
V 0 ·C 0 ð%Þ (10) 
pri čemer je: 
MB = masna bilanca (%), m
 E = skupna masa preskusne snovi, ekstrahirane iz tal in sten 
preskusne posode v dveh fazah ( μg), 
C 0 = začetna masna koncentracija preskusne raztopine v stiku 
s tlemi (μg cm  -3 ), 
V rec = prostornina supernatanta, rekuperiranega po adsorpcijskem 
ravnotežju (cm  -3 ). 
2.2 DESORPCIJA 
Desorpcija (D) je opredeljena kot odstotek desorbirane preskusne 
snovi glede na koli čino prej adsorbirane snovi v preskusnih pogojih:  
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100ð%Þ (11) 
pri čemer je:  
D t i = odstotek desorpcije ob času t  i (%); ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1212
 
m aq des ðt i Þ = masa preskusne snovi, desorbirane s tal ob času t  i 
(μg); 
m s ads ðeqÞ = masa preskusne snovi, adsorbirane na tla ob adsorpcij ­
skem ravnotežju ( μg) 
Podrobne informacije o izra čunavanju odstotka desorpcije  D  
t i pri 
paralelni in serijski metodi so navedene v Dodatku 5. 
Navidezni desorpscijski koeficient (K  des ) je v preskusnih pogojih 
razmerje med vsebnostjo snovi, ki ostane v talni fazi, in masno 
koncentracijo desorbirane snovi v vodni raztopini, ko je doseženo 
desorpcijsko ravnotežje:  
K des ¼ m s ads ðeqÞ Ä m aq des ðeqÞ 
m aq des ðeqÞ V T 
m soil (cm  3 g -1 ) (12) 
pri čemer je: 
K des = desorpscijski koeficient (cm  3 g -1 ); 
m aq des ðeqÞ = skupna masa preskusne snovi, desorbirane ob desorp ­
cijskem ravnotežju ( μg); 
V T = skupna prostornina vodne faze v stiku s tlemi med 
preskusom kinetike desorpcije (cm  3 ). 
Navodila za izra čun m  aq des ðeqÞ so v dodatku 5 pod naslovom 
„Desorpcija“. 
Opomba Če je bil že opravljeni preskus adsorpcije izveden po paralelni 
metodi, velja, da je prostornina V
 T v enačbi 12 enaka V  o . 
2.2.1  Desorpcijske izoterme  
Enačba Freundlichovih desorpcijskih izoterm odvisnost med 
vsebnostjo preskusne snovi, ki ostane adsorbirana na tleh, in koncen ­
tracijo preskusne snovi v raztopini ob desorpcij skem ravnotežju 
(enačba 16). 
Za vsako epruveto se vsebnost snovi, ki ostane adsorbirana na tleh 
ob desorpcij skem ravnotežju, izra čuna, kakor sledi:  
C s des ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ Ä m aq des ðeqÞ 
m soil (μg g  -1 ) (13) 
m aq des ðeqÞ je opredeljen kot:  
m aq des ðeqÞ ¼ m  m des ðeqÞ · V 0 
V r F Ä m  aq A (μg) (14) 
pri čemer je:  
C s des ðeqÞ = vsebnost preskusne snovi, ki ostane adsorbirana na 
tla ob desorpcijskem ravnotežju ( μg g  -1 ); 
m m des ðeqÞ = masa snovi, dolo čena analitsko v vodni fazi ob 
desorpcijskem ravnotežju ( μg); ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1213
 
m aq A = masa preskusne snovi, ki ostane od adsorpcijskega 
ravnotežja zaradi nepopolne nadomestitve prostornine 
(μg); 
m aq des ðeqÞ = masa snovi v raztopini ob adsorpcijskem ravnotežju 
(μg); 
m aq A ¼ m  aq ads ðeqÞ · V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  (15) 
V r F = prostornina raztopine, vzete iz epruvete za meritev 
preskusne snovi ob desorpcijskem ravnotežju (cm  3 ); 
V R = prostornina supernatanta, odstranjenega iz epruvete po vzpo ­
stavitvi adsorpcijskega ravnotežja in nadomeš čenega 
z enako prostornino 0,01 M raztopine CaCl  2 (cm  3 ); 
Freundlichova desorpcijska ena čba je (16):  
C s des ðeqÞ ¼ K  F des · C aq des ðeqÞ 1=n (μg g -1 ) (16) 
ali v linearni obliki:  
log C  s des ðeqÞ ¼ log K  F des þ 1=n · log C  aq des ðeqÞ (17) 
pri čemer je:  
K F des = Freundlichov desorpcijski koeficient; 
n = regresijska konstanta;  
C aq des ðeqÞ = masna koncentracija snovi v vodni fazi ob desorpcij ­
skem ravnotežju ( μg cm  -3 ). 
Enačbi 16 in 17 se lahko prikažeta grafi čno in vrednosti  K F des in 
1/n se izra čunata z regresijsko analizo po ena čbi 17. 
Opomba: Če je Freundlichov adsorpcijski ali desorpcijski eksponent 1/n enak 
1, bo Freundlichova ravnotežna konstanta adsorpcije ali desorpcije 
(vezalna konstanta) (
K F ads and K F des ) naka konstanti adsorpcijskega 
ali desorpcijskega ravnotežja (K  d and K  des ), kot je primerno, grafi C  s 
v odvisnosti od C  aq pa bodo linearni. Če eksponenti niso enaki 1, 
bodo grafi čni prikazi C  s v odvisnosti od C  aq nelinearni, adsorpcijske 
in desorpcijske konstante pa se bodo spreminjale glede na izoterme.  
2.2.2  Poro čilo o preskusu  
Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: 
— popolno identifikacijo uporabljenih vzorcev tal, vklju čno z: 
— geografsko oznako mesta (zemljepisna širina, zemljepisna dolži ­
na), 
— datumom vzor čenja, ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1214
 
— vrsto rabe (npr. kmetijsko zemljiš če, gozd itd.), 
— globino vzor čenja, 
— vsebnostjo peska/mulja/gline, pH-vrednostmi (v 0,01 M CaCl  2 ), 
— vsebnostjo organskega ogljika, — vsebnostjo organskih snovi, — vsebnostjo dušika, — razmerjem C/N, — kationsko izmenjalno kapaciteto (mmol/kg), — vsemi informacijami v zvezi z zbiranjem in shranjevanjem 
vzorcev tal, 
— kadar je primerno, vsemi relevantnimi informacijami za razlago 
adsorpcije/desorpcije preskusne snovi, 
— sklici na metode, uporabljene za dolo čanje posameznih parame ­
trov, 
— informacije o preskusni snovi, kakor je primerno, — temperaturo preskusov, — pogoje centrifugiranja, — analitski postopek, uporabljen za analiziranje preskusne snovi, — utemeljitev morebitne uporabe topila za pripravo osnovne razto ­
pine preskusne snovi, 
— razlage popravkov izra čunov, če je ustrezno, 
— podatke v skladu z obrazcem (Dodatek 6) in grafi čne prikaze, 
— vse informacije in opažanja, koristne za razlago rezultatov 
preskusa.
 
4. LITERATURA  
(1) Kukowski H. and Brümmer G., (1987). Investigations on the 
Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. 
UBA Report 106 02045, Part II. 
(2) Fränzle O., Kuhnt G. and Vetter L., (1987). Selection of Repre ­
sentative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 02045, Part I. 
(3) Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, 
Collection, Treatment, Characterisation. Special Publication no. 1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, ISPRA, December 1994. 
(4) OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD 
Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 
18–20 January 1995 (June 1995). 
(5) US-Environment Protection Agency: Pesticide Assessment 
Guidelines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate, 
Series 163-1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, 
Addendum 6 on Data Reporting, 540/09-88-096, Date: 1/1988.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1215
 
(6) US-Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and 
Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 
835-Fate, Transport and Transformation Test Guidelines, 0PPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/Desorption Isotherm. EPA No: 712-C-96-048, April 1996. 
(7) ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for Deter ­
mining a Sorption Constant (K
 oc ) for an Organic Chemical in 
Soil and Sediments. 
(8) Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. Guide ­
lines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987. 
(9) Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): Appli ­
cation for registration of a pesticide. Section G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air. 
(10) Danish National Agency of Environmental Protection (October 
1988): Criteria for registration of pesticides as especially dange ­
rous to health or especially harmful to the environment. 
(11) BBA (1990), Guidelines for the Official Testing of Plant 
Protection Products, Biological Research Centre for Agriculture 
and Forestry, Braunschweig, Germany. 
(12) Calvet R., (1989), „Evaluation of adsorption coefficients and 
the prediction of the mobilities of pesticides in soils“, in 
Methodological Aspects of the Study of Pesticide Behaviour 
in Soil (ed. P. Jamet), INRA, Paris, (Review). 
(13) Calvet R., (1980) „Adsorption-Desorption Phenomena“ in Inte ­
ractions between herbicides and the soil. (R.J. Hance ed.), 
Academic Press, London, str. 83–122. 
(14) Hasset J.J., and Banwart W.L., (1989), „The sorption of 
nonpolar organics by soils and sediments“ in Reactions and 
Movement of Organic Chemicals in Soils. Soil Science Society 
of America (S.S.S.A), Special Publication no. 22, str. 31–44. 
(15) van Genuchten M. Th., Davidson J.M., and Wierenga P.J., 
(1974), „An evaluation of kinetic and equilibrium equations 
for the prediction of pesticide movement through porous 
media“. Soil Sci. Soc. Am. Proc., Vol. 38(1), 29–35. 
(16) McCall P.J., Laskowski D.A., Swann R.L., and Dishburger 
H.J., (1981), „Measurement of sorption coefficients of organic 
chemicals and their use, in environmental fate analysis“, in Test 
Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxicants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington DC. 
(17) Lambert S.M., Porter P.E., and Schieferrstein R.H., (1965), 
„Movement and sorption of chemicals applied to the soil“. 
Weeds, 13, 185–190. 
(18) Rhodes R.C., Belasco I.J., and Pease H.L., (1970) „Determina ­
tion of mobility and adsorption of agrochemicals in soils“. 
J.Agric.Food Chem., 18, 524–528. 
(19) Russell M.H., (1995), „Recommended approaches to assess 
pesticide mobility in soil“ in Environmental Behavior of Agroc ­
hemicals (ed. T.R. Roberts and P.C. Kearney). John Wiley & 
Sons Ltd. 
(20) Esser H.O., Hemingway R.J., Klein W., Sharp D.B., Vonk 
J.W. and Holland P.T., (1988), „Recommended approach to the evaluation of the environmental behavior of pesticides“, 
IUPAC Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, 
901–932.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1216
 
(21) Guth J.A., Burkhard N., and D.O. Eberle, (1976), „Experi ­
mental models for studying the persistence of pesticides in 
soils“. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, pp 137–157, BCPC, Surrey, UK. 
(22) Furminge C.G.L., and Osgerby J.M., (1967), „Persistence of 
herbicides in soil“. J. Sci. Fd Agric., 18, 269–273. 
(23) Burkhard N., and Guth J.A., (1981), „Chemical hydrolysis of 2- 
Chloro-4,6-bis(alkylamino)-1,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption“. Pestic. 
Sci. 12, 45–52. 
(24) Guth J.A., Gerber H.R., and Schlaepfer T., (1977). „Effect of 
adsorption, movement and persistence on the biological availa ­
bility of soil-applied pesticides“. Proc. Br. Crop Prot. Conf., 3, 961–971. 
(25) Osgerby J.M., (1973), „Process affecting herbicide action in 
soil“. Pestic. Sci., 4, 247–258. 
(26) Guth J.A., (1972), „Adsorptions- und Einwascheverhalten von 
Pflanzenschutzmitteln in Böden“. Schr. Reihe Ver. Wass. 
-Boden-Lufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, 143–154. 
(27) Hamaker J.W., (1975), „The interpretation of soil leaching 
experiments“, in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R. Haque and V.H. freed), pp. 135–172, Plenum Press, NY. 
(28) Helling C.S., (1971), „Pesticide mobility in soils“. Soil Sci. 
Soc. Amer. Proc., 35, 732–210. 
(29) Hamaker J.W., (1972), „Diffusion and volatilization“ in 
Organic chemicals in the soil environment (C.A.I. Goring and 
J.W. Hamaker eds), Vol. I, 49–143. 
(30) Burkhard N. and Guth J.A., (1981), „Rate of volatilisation of 
pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results 
with those determined in a laboratory model system“. Pestic. Sci. 12, 37–44. 
(31) Cohen S.Z., Creeger S.M., Carsel R.F., and Enfield C.G., 
(1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses“, in Treatment and Disposal of Pesticide 
Wastes, pp. 297–325, Acs Symp. Ser. 259, American Chemical 
Society, Washington, DC. 
(32) Gustafson D.I., (1989), „Groundwater ubiquity score: a simple 
method for assessing pesticide leachability“. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), 339–357. 
(33) Leistra M., and Dekkers W.A., (1976). „Computed effects of 
adsorption kinetics on pesticide movement in soils“. J. of Soil 
Sci., 28, 340–350. 
(34) Bromilov R.H., and Leistra M., (1980), „Measured and simu ­
lated behavior of aldicarb and its oxydation products in fallow soils“. Pest. Sci., 11, 389–395. 
(35) Green R.E., and Karickoff S.W., (1990), „Sorption estimates 
for modeling“, in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., 
Book Series no. 2, pp.80–101, 
(36) Lambert S.M., (1967), „Functional relationship between sorp ­
tion in soil and chemical structure“. J. Agri. Food Chem., 15, 
572–576.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1217
 
(37) Hance R.J., (1969), „An empirical relationship between 
chemical structure and the sorption of some herbicides by 
soils“. J. Agri. Food Chem., 17, 667–668. 
(38) Briggs G.G. (1969), „Molecular structure of herbicides and 
their sorption by soils“. Nature, 223, 1288. 
(39) Briggs G.G. (1981). „Theoretical and experimental relationships 
between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor“. J. Agric. Food Chem., 29, 1050–1059. 
(40) Sabljic A., (1984), „Predictions of the nature and strength of 
soil sorption of organic polutance by molecular topology“. 
J. Agric. Food Chem., 32, 243–246. 
(41) Bailey G.W., and White J.L., (1970), „Factors influencing the 
adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil“. Residue Rev., 32, 29–92. 
(42) Bailey G.W., J.L. White and Y. Rothberg., (1968), „Adsorption 
of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate“. Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 
32:222–234. 
(43) Karickhoff S.W., (1981) „Semi-empirical estimation of sorption 
of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils“. Chemosphere 10, 833–846. 
(44) Paya-Perez A., Riaz M. and Larsen B., (1989), „Soil Sorption 
of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners“. Environ. Toxi ­
col. Safety 21, 1–17. 
(45) Hamaker J.W., and Thompson J.M., (1972). „Adsorption in 
organic chemicals“ in Organic Chemicals in the Soil Environ ­
ment (Goring C.A.I. and Hamaker J.W., eds), Vol I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972, str. 49–143. 
(46) Deli J., and Warren G.F., 1971, „Adsorption, desorption and 
leaching of diphenamid in soils“. Weed Sci. 19:67–69. 
(47) Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J.M. and Santelmann, 
(1975), „Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils“. Weed Science, Vol. 23, 454–457. 
(48) Haues M.H.B., Stacey M., and Thompson J.M., (1968) 
„Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic prepara ­
tions“ in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, p.75, International. Atomic Energy Agency, Vienna. 
(49) Pionke H.B., and Deangelis R.J., (1980), „Methods for distri ­
buting pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase“, CREAMS, in A Field Scale Model for 
Chemicals, Run-off and Erosion from Agricultural Management 
Systems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Documentation, USDA Conservation Research report. 
(50) ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality – 
General aspects; chemical and physical methods of analysis; 
biological methods of analysis. First Edition (1994). 
(51) Scheffer F., and Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde, 
F. Enke Verlag, Stuttgart (1982), 11th edition. 
(52) Black, Evans D.D., White J.L., Ensminger L.E., and Clark F.E., 
eds. „Methods of Soil Analysis“, Vol 1 and 2, American 
Society of Agronomy, Madison, WI, 1982.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1218
 
(53) ISO/DIS 10381-1 Soil Quality – Sampling – Part 1: Guidance 
on the design of sampling programmes. 
(54) ISO/DIS 10381-2 Soil Quality – Sampling – Part 2: Guidance 
on sampling techniques. 
(55) ISO/DIS 10381-3 Soil Quality – Sampling – Part 3: Guidance 
on safety of sampling. 
(56) ISO/DIS 10381-4 Soil Quality – Sampling – Part 4: Guidance 
on the investigation of natural and cultivated soils. 
(57) ISO/DIS 10381-5 Soil Quality – Sampling – Part 5: Guidance 
on the investigation of soil contamination of urban and indu ­
strial sites. 
(58) ISO 10381-6, 1993: Soil Quality – Sampling – Part 6: 
Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. 
(59) Green R.E., and Yamane V.K., (1970) „Precision in pesticide 
adsorption measurements“. Soil Sci. Am. Proc., 34, 353–354. 
(60) Grover R., and Hance R.J. (1970), „Effect of ratio of soil to 
water on adsorption of linuron and atrazine“. Soil Sci., 109–138. 
(61) Boesten, J.J.T.I, „Influence of soil/liquid ratio on the experi ­
mental error of sorption coefficients in pesticide/soil system“. 
Pest. Sci. 1990, 30, 31–41. 
(62) Boesten, J.J.T.I. „Influence of soil/liquid ratio on the experi ­
mental error of sorption coefficients in relation to OECD guide ­
line 106“ Proceedings of 5th international workshop on envi ­
ronmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brus ­
sels, 26–29 April 1994. 
(63) Bastide J., Cantier J.M., et Coste C., (1980), „Comportement de 
substances herbicides dans le sol en fonction de leur structure chimique“. Weed Res. 21, 227–231. 
(64) Brown D.S., and Flagg E.W., (1981), „Empirical prediction of 
organic pollutants sorption in natural sediments“. J. Environ.Qual., 10(3), 382–386. 
(65) Chiou C.T., Porter P.E., and Schmedding D.W., (1983), „Par ­
tition equilibria of non-ionic organic compounds between soil organic matter and water“. Environ. Sci. Technol., 17(4), 227–231. 
(66) Gerstl Z., and Mingelgrin U., (1984), „Sorption of organic 
substances by soils and sediments“. J. Environm. Sci. Health, B19 (3), 297–312. 
(67) Vowles P.D., and Mantoura R.F.C., (1987), „Sediment-water 
partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons“. Chemosphere, 16(1), 109–116. 
(68) Lyman W.J. , Reehl W.F.and Rosenblatt D.H. (1990). Hand ­
book of Chemical Property Estimation Methods. Environmental Behaviour of Organic Compounds. American Chemical 
Society, Washington DC. 
(69) Keniga E.E., and Goring, C.A.I. (1980). „Relationship between 
water solubility, soil sorption, octanol-water partitioning and concentration of chemicals in the biota“ in Aquatic Toxicology 
(eds J.G. Eaton, et al.), pp.78–115, ASTM STP 707, Philadelp ­
hia.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1219
 
(70) Chiou C.T., Peters L.J., and Freed V.H., (1979), „A physical 
concept of soil-water equilibria for non-ionic organic 
compounds“. Science, Vol. 206, 831–832. 
(71) Hassett J.J., Banwart W.I., Wood S.G., and Means J.C., (1981), 
„Sorption of/-Naphtol: implications concerning the limits of hydrophobic sorption“. Soil Sci. Soc. Am. J. 45, 38–42. 
(72) Karickhoff S.W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils“. 
Chemosphere, Vol. 10(8), 833–846. 
(73) Moreale A., van Bladel R., (1981), „Adsorption de 13 herbi ­
cides et insecticides par le sol. Relation solubilité – reactivité“. 
Revue de l'Agric., 34 (4), 319–322. 
(74) Müller M., Kördel W. (1996), „Comparison of screening 
methods for the determination/estimation of adsorption coeffi ­
cients on soil“. Chemosphere, 32(12), 2493–2504. 
(75) Kördel W., Kotthoff G., Müller M. (1995), „HPLC – screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on 
soil – results of a ring test“. Chemosphere 30 (7), 1373–1384. 
(76) Kördel W., Stutte J., Kotthoff G. (1993), „HPLC – screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil – comparison of different stationary phases“. Chemosphere 
27 (12), 2341–2352. 
(77) Hance, R.J., (1967), „The speed of Attainment of Sorption 
Equilibria in Some Systems Involving Herbicides“. Weed Research, Vol. 7, str. 29–36. 
(78) Koskinen W.C., and Harper S.S., (1990), „The retention 
processes: mechanisms“ in Pesticides in the Soil Environment: 
Processes, Impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin. 
(79) Cohen S.Z., Creeger S.M., Carsel R.F., and Enfield 
C.G. (1984), „Potential pesticide contamination of groundwater 
from agricultural uses“, in Treatment and Disposal of Pesticide 
Wastes, pp. 297–325, ACS Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC. 
(80) Giles C.H., (1970), „Interpretation and use of sorption isot ­
herms“ in Sorption and Transport Processes in Soils. 
S.C.I. Monograph No. 37, 14–32. 
(81) Giles, C.H.; McEwan J.H.; Nakhwa, S.N. and Smith, 
D, (1960), „Studies in adsorption: XI. A system of classifica ­
tion of solution adsorption isotherms and its use in the 
diagnosis of adsorption mechanisms and in measurements of 
pesticides surface areas of soils“. J. Chem. Soc., 3973–93. 
(82) Calvet R., Tercé M., and Arvien J.C., (1980), „Adsorption des 
pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caractéristiques générales de l'adsorption“. Ann. Agron. 31: 239–251. 
(83) Bedbur E., (1996), „Anomalies in the Freundlich equation“, 
Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environ ­
ment, 13–15 May 1996, Stratford-upon-Avon, U.K. 
(84) Guth, J.A., (1985), „Adsorption/desorption“, in Joint Interna ­
tional Symposium, Physicochemical Properties and their Role 
in Environmental Hazard Assessment, July 1–3, Canterbury, 
UK. 
(85) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 
26:305 (1962).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1220
 
DODATEK 1  
Shema preskusa
  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1221
 
DODATEK 2  
VPLIV TO ČNOSTI ANALITSKE METODE IN SPREMEMBE 
KONCENTRACIJE NA TO ČNOST REZULTATOV ADSORPCIJE  
Iz nasleduje tabele (84) je o čitno, da pri zelo majhni razhki med za četno maso 
(m o = 110 μg) in ravnotežno maso ( m aq ads ðeqÞ = 100 μg) preskusne snoví 
v raztopini. 5 % napaka v merjenju ravnotežne koncentracije povzro či 50 % 
napako pri ízra čunavanja mase soovi, adsorbirane na tla ( m s ads ðeqÞ) and of 
52,4 % napako pri izra čunavanju K  d . 
Količina tal m  soil m soil = 10 g 
Prostornina raztopine V  0 = 100 cm  3 
m aq ads ðeqÞ 
(μg) C aq ads ðeqÞ 
(μg cm  -3 ) R m s ads ðeqÞä 
(μg) C s ads ðeqÞä 
(μg g  -1 ) R‡ K  d * R‡  
ZA A = 9 %
 m 0 ¼ 110 μg or 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
100 1,000 Dejanska 
vrednost 10 1,00 Dejanska 
vrednost 1 
101 1,010 1 % 9 0,90 10 % 0,891 10,9 % 
105 1,050 5 % 5 0,50 50 % 0,476 52,4 % 
109 1,090 9 % 1 0,10 90 % 0,092 90,8 %  
ZA A = 55 %
 m 0 ¼ 110 μg or 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
50,0 0,500 Dejanska 
vrednost 60,0 6,00 Dejanska 
vrednost 12,00 
50,5 0,505 1 % 59,5 5,95 0,8 % 11,78 1,8 % 
52,5 0,525 5 % 57,5 5,75 4,0 % 10,95 8,8 % 55,0 0,550 10 % 55,0 5,50 8,3 % 10,00 16,7 %  
ZA A = 99 %
 m 0 ¼ 110 μg or 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
1,100 0,011 Dejanska 
vrednost 108,9 10,89 Dejanska 
vrednost 990 
1,111 0,01111 1 % 108,889 10,8889 0,01 % 980 1,0 % 
1,155 0,01155 5 % 108,845 10,8845 0,05 % 942 4,8 % 
1,21 0,0121 10 % 108,790 10,8790 0,10 % 899 9,2 %  
äm s ads ðeqÞ = m  0 Ä m aq ads ðeqÞ; C s ads ðeqÞ ¼ h 
C 0 Ä C aq ads ðeqÞ i 
V 0 
m soil: Kd ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ V 0 
m soil 
m s ads ðeqÞ = masa preskusne snovi v talni fazi ob ravnotežju, μg; 
m aq ads ðeqÞ = masa preskusne snoví vodni fazi ob ravnotežju, μg; 
C s ads ðeqÞ = vsebnost preskisne snovi v talni fazi ob ravnotežju, μg g  -1 ; 
C aq ads ðeqÞ = masna konceutracija preskusne snovi v vodili fazi ob ravnotežju. μg cm  -3 ; 
R = analitska napaka pri dolocanju  m aq ads ðeqÞ; 
R‡ = izra čunana napaka zaradi analitske napake R.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1222
 
DODATEK 3  
TEHNIKE OCENJEVANJA K  d 
1. Tehnike ocenjevanja omogo čajo napovedovanje K  d na podlagi korelacij 
z, na primer, vrednostmi P  ow (12) (39) (63–68), podatki o topnosti 
v vodi (12) (19) (21) (39) (68–73) ali podatki o polarnosti, dobljenimi 
z uporabo HPLC z obrnjeno fazo (74–76). Kakor je prikazano v tabelah 
1 in 2, se iz teh ena čb izračuna K  oc ali K  om in nato, posredno, K  d iz enačb: 
K oc ¼ K  d · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ K  om ¼ K d 
1; 724 · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ 
2. Koncept teh korelacij temelji na dveh predpostavkah: (1) na adsorpcijo 
snovi v najve čji meri vplivajo organske snovi v tleh; in (2) vpletene inte ­
rakcije so ve činoma nepolarne. Zaradi tega te korelacije: (1) niso uporabne 
za polarne snovi ali so zanje uporabne samo do neke mere, in (2) niso 
uporabne v primerih, ko je vsebnost organskih snovi v tleh zelo majhna (12). Poleg tega, čeprav so bile med P
 ow in adsorpcijo sicer ugotovljene 
zadovoljive korelacije, tega ni mogo če trditi za odnos med topnostjo v vodi 
in obsegom adsorpcije (19) (21); dosedanje študije si zelo nasprotujejo. 
3. Nekaj primerov korelacije med adsorpcijskim koeficientom in porazdelit ­
venim koeficientom oktanol/voda ter topnostjo v vodi je navedenih v tabeli 1 oziroma 2.
 
Tabela 1  
Primeri korelacij med adsorpcij skim porazdelitvenimim koeficientom in porazdelitvenim koeficientom 
oktanol/voda; za dodatne primere glej (12) (68)  
Snovi Korelacije Avtorji  
Substituirane se čnine log K  om = 0,69 + 0,52 log P  ow Briggs (1981) (39) 
Aromatske klorirane log K  oc = -0,779 + 0,904 log P  ow Chiou  et al . (1983) (65) 
Razni pesticidi log K  om = 4,4 + 0,72 log P  ow Gerstl in Mingelgrin (1984) (66) 
Aromatski ogljikovodiki log K  oc = -2,53 + 1,15 log P  ow Vowles in Mantoura (1987) (67)  
Tabela 2  
Primeri korelacij med adsorpcijskim porazdelitvenim koeficientom in topnostjo v vodi; za dodatne primere 
glej (68) (69)  
Spojine Korelacije Avtorji  
Razni pesticidi log K  om = 3,8 – 0,561 log S  w Gerstl in Mingelgrin (1984) (66) 
Alifatske, aromatske klori ­
rane snovi log K  om = (4,040 +/– 0,038) – (0,557 
+/– 0,012) log S  w Chiou  et al . (1979) (70) 
α-naftol logK  oc = 4,273 – 0,686 log S  w Hasset et al. (1981) (71) 
Ciklične, alifatske aromatske 
snovi logK  oc = -1,405 – 0,921 log S  w - 
0,00953 (mp-25) Karickhoff (1981) (72) 
Razne spojine log K  om = 2,75 – 0,45 log S  w Moreale van Blade (1982) (73)  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1223
 
DODATEK 4  
IZRAČUNI ZA DOLO ČITEV POGOJEV CENTRIFUGIRANJA  
1. Čas centrifugiranja se izra čuna po naslednji ena čbi ob predpostavki krogla ­
stih delcev:  
t ¼ 9 
2 η 
ω 2 rp 2 ρ s Ä ρ aq Ä Ö " #  
ln ðR b=R t Þ (1) 
Za poenostavitev so vsi parametri opisani z enotami, ki niso enote SI 
(g, cm). 
pri čemer je: 
ω = hitrost vrtenja (=2 π rpm/60), rad s  -1 ; 
rpm = vrtljaji na minuto; η = viskoznost raztopine, g s
 -1 cm -1 ; 
r p = polmer delcev, cm; 
ρ s = gostota tal, g cm  -3 ; 
ρ aq = gostota raztopine, g cm  -3 ; 
R t = razdalja od središ ča rotorja centrifuge do gladine raztopine 
v centrifugirki, cm; 
R b = razdalja od središ ča rotorja centrifuge do dna centrifugirke, cm; 
R b -R t = dolžina zmesi tla/raztopina v centrifugirki, cm. 
V splošni praksi se uporabljajo dvakratni izra čunani časi za zagotovitev 
popolne lo čitve. 
2. Ena čbo (1) je mogo če še bolj poenostaviti, če predpostavimo, da sta 
viskoznost ( η) in gostota ( ρ aq ) raztopine enaki viskoznosti in gostoti vode 
pri 25  o C; torej, η = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 IN ρ aq = 1,0 g.cm  -3 . 
Nato se izra čuna čas centrifugiranja po ena čbi (2):  
t ¼ 3:7 
rpmð Þ  2 · r p 2 ρ s Ä 1ð Þ  ln Rb 
Rt (2) 
3. Iz ena čbe 2 postane o čitno, da sta pri dolo čanju pogojev centrifugiranja, 
t.j. časa (t) in hitrosti (rpm) pomembna dva parametra, za lo čitev delcev 
specifične velikosti (v našem primeru s polmerom 0,1 μm): (1) gostota tal 
in (2) dolžina zmesi v centrifugirki (R  b -R t ), oz. razdalja, ki jo prepotuje 
delec od gladine raztopine do dna centrifugirke; seveda je pri fiksni prostor ­
nini dolžina zmesi v centrifugirki odvisna od kvadrata polmera centrifu ­
girke. 
4. Slika 1 prikazuje spreminjanje časa centrifugiranja (t) v odvisnosti od 
hitrosti centrifugiranja (rpm) pri razli čnih gostotah tal (p  s ) (slika 1a) in 
različnih dolžinah zmesi v centrifugirkah (slika 1b). Iz slike 1a je vpliv 
gostote tal o čiten; na primer, pri klasi čnem centrifugiranju s 3 000 rpm je 
čas centrifugiranja približno 240 minut za gostoto tal 1,2 g cm  3 , za gostoto 
20 g cm  3 pa je samo 50 minut. Podobno slika lb kaže, da je pri klasi čnem 
centrifugiranju s 3 000 rpm čas centrifugiranja približno 50 minut, če je 
dolžina zmesi 10 cm, in samo 7 minut pri dolžini 1 cm. Vendar je 
pomembno najti optimalen odnos med centrifugiranjem, ki zahteva 
najmanjšo možno dolžino, in čim lažjim lo čevanjem faz po centrifugiranju.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1224
 
5. Poleg tega je pri dolo čanju eksperimentalnih pogojev za lo čevanje faz tla/ 
raztopina pomembno upoštevati morebiten obstoj tretje „psevdofaze“ – 
koloidov. Ti delci, manjši od 0,2 μm, lahko pomembno vplivajo na celoten 
mehanizem adsorpcije snovi v suspenziji tal. Kadar se centrifugiranje izvaja po zgornjem opisu, koloidi ostanejo v vodni fazi in se analizirajo skupaj 
z vodno fazo. Tako se informacije o njihovem vplivu izgubijo. 
Če ima zadevni laboratorij možnost ultracentrifugiranja ali ultrafiltracije, je 
mogoče adsorpcijo/desorpcijo snovi v tleh prou čiti bolj podrobno ter tako 
pridobiti tudi informacije o adsorpciji snovi na koloide. V tem primeru se izvede ultracentrifugiranje pri 60 000 rpm/min ali ultrafiltracija 
s poroznostjo filtra 100 000 Daltonov za lo čitev treh faz – tal, koloidov 
in raztopine. Tudi preskusni protokol se ustrezno prilagodi, da bodo vse tri faze analizirane.
 
Slika 1a
  
Spreminjanje časa centrifugiranja (t) v odvisnosti od hitrosti centrifugiranja 
(rpm) za razli čne gostote tal ( ρ s ). R  t = 10 cm, R  b -R t = 10 cm, η = 8,95 × 
10 -3 g s -1 cm -1 and ρ aq = 1,0 g.cm  -3 at 25  o C. 
Slika 1b.
  
Spreminjanje časa centrifugiranja (t) v odvisnosti od hitrosti centrifugiranja 
(rpm) za razli čne dolžine zmesi v centrifugirki (Rb -Rt) = L; R  t = 10 cm, 
η = 8,95 x 10-  3 g s -1 cm -1 , ρ aq = 1,0 g.cm  -3 pri 25  o C in ρ s = 2,0 g cm  -3 . ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1225
 
DODATEK 5  
IZRAČUN ADSORPCIJE A ( %) IN DESORPCIJE D ( %)  
Časovna shema postopka je:
  
Pri vseh izra čunih se predpostavlja, da je preskusna snov stabilna in da se 
bistveno ne adsorbira na stene posode.  
ADSORPCIJA A (A %)  
(a) Paralelna metoda  
Odstotek adsorpcije se izra čuna za vsako epruveto (i) za vsak čas (t  i ) po 
enačbi: 
A t i ¼ m s ads ðt i Þ·100 
m 0 (%) (1) 
Elementi te ena čbe se lahko izra čunajo na naslednji na čin: 
m 0 = C  0 · V 0 (μg) (2)  
m s ads ðt i Þ ¼ m 0 Ä C aq ads ðt i Þ·V 0 (μg) (3) 
pri čemer je:  
A t i = odstotek adsorpcije ( %) ob času t  i ; 
m s ads ðt i Þ = masa preskusne snovi na tleh ob času t  i , ko se opravi analiza 
(μg); 
m 0 = masa preskusne snovi v epruveti na za četku preskusa ( μg); 
C 0 = začetna masna koncentracija preskusne raztopine v stiku 
s tlemi (μg cm  -3 ); ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1226
 
C aq ads ðt i Þ = masna koncentracija snovi v vodni fazi ob času t  i , ko se 
izvaja analiza ( μg cm  -3 ); ta koncentracija se dolo či analitsko 
ob upoštevanju vrednosti, dobljenih s slepimi vzorci. 
V 0 = začetna prostornina preskusne raztopine v stiku s tlemi (cm  3 ). 
Vrednosti odstotka adsorpcije  A  t i ali C  aq ads ðt i Þ se prikažejo grafi čno 
v odvisnosti od časa in dolo či se čas, potreben za vzpostavitev sorpcijskega 
ravnotežja. Primera takih grafov sta sliki 1 in 2.
  
Slika 1  
Graf adsorpcijskega ravnotežja
  
Slika 2  
Masna koncentracija preskusne snovi v vodni fazi (C  aq ) v odvisnosti od časa ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1227
 
(b) Serialna metoda  
Naslednje ena čbe upoštevajo, da se adsorpcij ski postopek izvaja 
z merjenjem preskusne snovi v majhnih alikvotnih delih vodne faze v točno določenih časovnih intervalih. 
— Za vsak časovni interval se koli čina snovi, adsorbirane na tla, izra čuna 
po naslednjih ena čbah: 
— za prvi časovni interval Δt
 i = t 1 – t 0 
m s ads ðΔt 1 Þ ¼ m 0 Ä m ads 
m ðt 1 Þ· Í 
V 0 
v a A Î 
(4) 
— za drugi časovni interval Δt2 = t2 – t1  
m s ads ðΔt 2 Þ ¼ m  m ads ðt 1 Þ · Í 
V 0 
v a A Î 
Ä m  m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î 
(5) 
— za tretji časovni interval Δt3 = t3 – t2  
m s ads ðΔt 3 Þ ¼ m m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î 
Ä m  m ads ðt 3 Þ · Í 
V 0 Ä 2 · v a A 
v a A Î 
(6) 
— za n-ti časovni interval Δtn = tn – tn – 1  
m s ads ðΔt n Þ ¼ m  m ads ðt nÄ1 Þ · Í 
V 0 Ä ðn Ä 2Þ · v a A 
v a A Î 
Ä m m ads ðt n Þ · V 0 Ä ðn Ä 1Þ · v a A Ê Ì  
v a A 0 
@ 1 
A (7) 
— Odstotek adsorpcije za vsak časovni interval,  A Δt i , se izračuna po naslednji ena čbi: 
A Δt i ¼ m s ads ðΔt i Þ 
m 0 · 100ð%Þ (8) 
odstotek adsorpcije  A t i ob času t  i pa se izra čuna po ena čbi: 
A t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m s ads ðjÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (9) 
Vrednosti adsorpcije  A t i ali A Δt i (glede na potrebe študije) se prikažejo 
grafično v odvisnosti od časa in dolo či se čas, potreben za vzpostavitev 
sorpcijskega ravnotežja. 
— Ob času uravnoteženja t  eq : 
— je masa preskusne snovi, adsorbirane na tla:  
m s ads ðeqÞ ¼ Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (10) ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1228
 
— je masa preskusne snovi v raztopini:  
m aq ads ðeqÞ ¼ m  0 Ä Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (11) 
— odstotek adsorpcije ob ravnotežju pa je:  
A eq ¼ m s ads ðeqÞ 
m 0 · 100ð%Þ (12) 
Zgoraj uporabljeni parametri so:  
m s ads ðΔt 1 Þ; m s ads ðΔt 2 Þ; :::; m s ads ðΔt n Þ = masa snovi, adsorbirane na tla 
v časovnih intervalih Δ t1 , Δ t2 ,..., 
Δ tn (μg); 
m m ads ðt 1 Þ; m m ads ðt 2 Þ; :::; m n ads ðt n Þ = masa snovi, izmerjena v alikvotu  
v a A ob časih t  1 , t 2 , t n (μg); 
m s ads ðeqÞ = masa snovi, adsorbirane na tla ob 
adsorpcijskem ravnotežju ( μg); 
m aq ads ðeqÞ = masa snovi v raztopini ob adsorp ­
cijskem ravnotežju ( μg); 
v a A = prostornina alikvota, v katerem se 
meri preskusna snov (cm  3 ); 
A Δt i = odstotek adsorpcije, ki ustreza 
časovnemu intervalu Δt i ( %);  
A eq = odstotek adsorpcije ob adsorpcij ­
skem ravnotežju ( %).  
DESORPCIJA D ( %) 
Za čas t  0 , ko se za čne poskus kinetike desorpcije, velja trenutek, ko se najve čja 
rekuperirana prostornina raztopine preskusne snovi (potem, ko je adsorpcijsko ravnotežje vzpostavljeno) nadomesti z enako prostornino 0,01 M raztopine CaCl
 2 . 
(a) Paralelna metoda  
Ob času t  i se masa preskusne snovi izmeri v vodni fazi, vzeti iz epruvete 
i (V i 
r ), desorbirana masa pa se izra čuna po ena čbi: 
m aq des ðt i Þ ¼ m  m des ðt i Þ · Í 
V 0 
v r i Î 
Ä m aq A (13) 
Ob desorpcijskem ravnotežju je t  i = t eq in zato je  m aq des ðt i Þ = m aq des ðeqÞ. 
Masa preskusne snovi, desorbirane v nekem časovnem intervalu ( Δt i ) se 
izračuna po ena čbi: 
m aq des ðΔt i Þ ¼ m  aq des ðt i Þ Ä Σ 
j ¼ 1 i ¼ 1 
m aq des ðjÞ (14) 
Odstotek desorpcije se izra čuna: 
b času t  i po enačbi: ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1229
 
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (15) 
in za časovni interval ( Δt i ) po enačbi: 
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (16) 
pri čemer je:  
D t i = odstotek desorpcije ob času t  i ( %);  
D Δt i = odstotek desorpcije, ki ustreza časovnemu intervalu Δt i 
( %);  
m aq des ðt 1 Þ = masa preskusne snovi, desorbirane ob času t  i , (μg); 
m aq des ðΔt 1 Þ = masa preskusne snovi, desorbirane v časovnem intervalu 
Δt i (μg); 
m m des ðt i Þ = masa preskusne snovi, analitsko izmerjena ob času t  i 
v prostornini raztopine  V r i , odvzeti za analizo ( μg); 
m aq A = masa preskusne snovi, ki ostane od adsorpcijskega ravno ­
težja zaradi nepopolne nadomestitve prostornine ( μg); 
m aq A ¼ m aq ads ðeqÞ · V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  
(17) 
m aq ads ðeqÞ = masa preskusne snovi v raztopini ob adsorpcijskem ravno ­
težju (μg); 
V R = prostornina supernatanta, odstranjenega iz epruvete po 
vzpostavitvi adsorpcijskega ravnotežja in nadomeš čenega 
z enako prostornino 0,01 M raztopine CaCl  2 (cm  3 ); 
V r i = prostornina raztopine, vzete iz epruvete (i) za meritev 
preskusne snovi pri poskusu kinetike desorpcije (cm  3 ). 
Vrednosti desorpcije  D t i ali D Δt i (glede na potrebe študije) se prikažejo 
grafično v odvisnosti od časa in dolo či se čas, potreben za vzpostavitev 
desorpcijskega ravnotežja.  
b) Serialna metoda  
Naslednje ena čbe upoštevajo, da je bil predhodni adsorpcijski postopek 
izveden z merjenjem preskusne snovi v majhnih alikvotnih delih  ðv A 
a Þ 
vodne faze (serijska metoda pod 1.9 „Izvedba preskusa“). Predpostavlja se: (a) da je bila prostornina supernatanta, odstranjenega iz epruvete po preskusu kinetike adsorpcije, nadomeš čena z enako prostornino 0,01 
M raztopine CaCl
 2 (V R ) in (b) da skupna prostornina vodne faze v stiku 
s tlemi (V  T ) med poskusom kinetike desorpcije ostane konstantna in se 
izračuna po ena čbi: 
V T ¼ V  0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v a A ðiÞ (18) ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1230
 
Ob času t  i : 
— se masa preskusne snovi izmeri v majhnem alikvotnem delu  ðv a D Þ, 
desorbirana masa pa se izra čuna po ena čbi: 
m aq des ðt i Þ ¼ m  m des ðt i Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A · V T Ä ði Ä 1Þ · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A (19) 
— Ob desorpcijskem ravnotežju je t  i = t eq in zato je  m aq des ðt i Þ = m aq des ðeqÞ. 
— Odstotek desorpcije  D t i se izračuna po naslednji ena čbi: 
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (20) 
Ob časovnem intervalu ( Δt i ): 
Za vsak časovni interval se koli čina desorbirane snovi izra čuna: 
— za prvi časovni interval Δt 1 = t 1 - t 0 
m aq des ðΔt 1 Þ ¼ m  m des ðt 1 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A and m  s des ðt 1 Þ ¼ m  s aq ðeqÞ Ä m aq des ðΔt 1 Þ (21) 
— za drugi časovni interval Δt 2 = t 2 -t 1 
m aq des ðΔt 2 Þ ¼ m  m des ðt 2 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq des ðΔt 1 Þ · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A Ä m  aq A · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A and 
m s des ðt 2 Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä m  aq des ðΔt 1 Þ þ m aq des ðΔt 2 Þ h i  
(22) 
— za n-ti časovni interval Δt n = t n -t n-1 
m aq des ðΔt n Þ ¼ " 
m m des ðt n Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A · V T Ä n Ä 1ð Þ  · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 nÄ1 V T Ä n Ä ið Þ  · v a D Ê Ì  
V T · m aq des ðΔt i Þ 0 
@ 1 
A # 
and m s des ðt n Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä P  
i ¼ 1; n ≠ 1 n 
m aq des ðΔt i Þ 
(23) 
Nazadnje se izra čuna odstotek desorpcije za vsak časovni interval  D Δt i po 
naslednji ena čbi: 
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (24) 
odstotek desorpcije  D t i ob času t  i pa se izra čuna po ena čbi: 
D t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m aq des ðjÞ 
m s ads ðeqÞ · 100 ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (25) ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1231
 
pri čemer so zgoraj uporabljeni parametri:  
m des 
s ðΔt 1 Þ, m des 
s ðΔt 2 Þ,... , m des 
s ðΔt n Þ = masa snovi, ki ostane 
adsorbirana v tleh po 
časovnih intervalih Δt 1 , 
Δt 2 ,..., Δt n (μg); 
m des 
aq ðΔt 1 Þ, m des 
aq ðΔt 2 Þ,... , m des 
aq ðΔt n Þ = masa preskusne snovi, 
desorbirane v časovnih 
intervalih Δt 1 , Δt 2 ,..., 
Δt n (μg); 
m des 
m ðt 1 Þ, m des 
m ðt 2 Þ,... , m des 
m ðt n Þ = masa snovi, izmerjene 
v alikvotu ðv D 
a Þ ob časih 
t 1 , t 2 ,..., t  n , (μg); 
V T = skupna prostornina vodne 
faze v stiku s tlemi med poskusom kinetike desorp ­
cije, izvedenem s serijsko 
metodo (cm
 3 ); 
m A 
aq = masa snovi, ki ostane od 
adsorpcijskega ravnotežja zaradi nepopolne nado ­
mestitve prostornine ( μg);
 
m A 
aq ¼ V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 
Ä V R 
V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 0 
B B B @ 1 
C C C A · m
 ads 
aq ðeqÞ (26) 
V R = prostornina supernatanta, 
odstranjenega iz epruvete 
po vzpostavitvi adsorpcij ­
skega ravnotežja in nado ­
meščenega z enako 
prostornino 0,01 M razto ­
pine CaCl  2 (cm  3 ); 
v D 
a = prostornina alikvota, 
odvzetega iz epruvete (i) za namen analize 
med poskusom kinetke 
desorpcije, izvedenim s serijsko metodo (cm
 3 ); 
v D 
a ≤ 0; 02 · V T (27) ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1232
 
DODATEK 6  
ADSORPCIJA/DESORPCIJA V TLEH: LISTI ZA PORO ČANJE PODATKOV  
Preskušana snov: 
Preskušan tip tal: Vsebnost suhe mase v tleh (105
 o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . % 
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Primernost analitske metode  
Teža tal g 
Tla: suha masa g 
Prostornina raztopine CaCl  2 cm 3 
Nominalna koncentracija kon čne razopine μg cm  -3 
Analitska koncentracija kon čne razopine μg cm  -3 
Princip uporabljene analitske metode: 
Umerjanje analitske metode: Preskušana snov: 
Preskušan tip tal: 
Vsebnost suhe mase v tleh (105
 o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . % 
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Uporabljena analitska metodologija: Posredna  □ Paralelna  □ Serialna  □ 
Neposredna  □ 
Preskus adsorpcije: preskusni vzorci  
Simbol Enota Čas 
uravnoteženja Čas uravnote ­ 
ženja Čas uravnote ­ 
ženja Čas 
uravnotežen  
Št. epruvete 
Masa tal — g 
Tla: suha masa m  soil g 
Prostornina vode v zatehtanih 
tleh (izračunana) V WS cm 3 
Prostornina 0,01 M raztopine 
CaCl  2 za vzpostavitev ravno ­
težja v tleh cm 3 
Prostornina osnovne raztopine cm  3 
Skupna prostornina vodne faze 
v stiku s tlemi V 0 cm 3 
Začetna koncentracija preskusne 
raztopine C 0 μgcm  -3 
Masa preskusne snovi na 
začetku preskusa m 0 μg ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1233
 
Simbol Enota Čas 
uravnoteženja Čas uravnote ­ 
ženja Čas uravnote ­ 
ženja Čas 
uravnotežen  
Po stresanju in centrifugiranju  
NEPOSREDNA METODA 
Paralelna metoda 
Koncentracija preskusne snovi 
v vodni fazi, vklju čno 
s korekcijo za vrednost slepega 
vzorca  C aq ads ðt i Þ μg cm  -3 
Serialna metoda 
Masa preskusne snovi, izmer ­
jena v alikvotu V  A a m m ads ðt i Þ μg 
NEPOSREDNA METODA 
Masa preskusne snovi adsorbi ­
rane v tleh  m s ads ðt i Þ μg 
Izračun adsorpcije 
Adsorpcija  A  t i % 
A Δt i % 
Srednje velikosti 
Adsorpcijski koeficient K  d cm 3 g -1 
Srednje velikosti 
Adsorpcijski koeficient K  d cm 3 g -1 
Srednje velikosti 
Preskušana snov: 
Preskušan tip tal: Vsebnost suhe mase v tleh (105
 o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . % 
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Preskus adsorpcije: slepi vzorci in kontrola  
Simb ol Enota Slepi vzorec Slepi vzorec Kontrola  
Št. epruvete 
Masa tal g 0 0 
Prostornina vode v zatehtanih tleh 
(izračunana) cm 3 — — 
Prostornina 0,01 M raztopine CaCl  2 za 
vzpostavitev ravnotežja v tleh cm 3 
Prostornina osnovne raztopine cm  3 0 0 
Skupna prostornina vodne faze v stiku 
s tlemi cm 3 — —  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1234
 
Simb ol Enota Slepi vzorec Slepi vzorec Kontrola  
Začetna koncentracija preskusne snovi 
v vodni fazi μg cm  -3 
Po stresanju in centrifugiranju  
Koncentracija v vodni fazi μg cm  -3 
Opomba: Po potrebi dodajte stolpce 
Preskušana snov: Preskušan tip tal: V sebnost suhe mase v tleh (105
 o C 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . % 
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Masna bilanca  
Simbol Enota  
Št. epruvete 
Masa tal — g Tla: suha masa ms
 oil g 
Prostornina vode v zatehtanih tleh (izra ­ 
čunana) V WS ml 
Prostornina 0,01 M raztopine CaCl  2 za 
vzpostavitev ravnotežja v tleh ml 
Prostornina osnovne raztopine cm  3 
Skupna prostornina vodne faze v stiku 
s tlemi V 0 cm 3 
Začetna koncentracija preskusne razto ­
pine C 0 μg cm  -3 
Čas potreben za vzpostavitev ravnotežja — h  
Po stresanju in centrifugiranju  
Koncentracija preskusne snovi v vodni 
fazi ob adsorpcijskem ravnotežju, 
vključno s korekcijo za vrednost slepega 
vzorca  C aq ads ðeqÞ μg cm  -3 
Čas uravnoteženja t  eq h 
Prvo redčenje s topilom 
Odstranjena prostornina vodne faze V  rec cm 3 
Dodana prostornina topila ΔV cm  3 
Prva ekstrakcija s topilom 
Signal, analiziran v topilu S  E1 var. 
Koncentracija preskusne snovi v topilu C  E1 μg cm  -3 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1235
 
Simbol Enota  
Masa snovi, ekstrahirane iz tal in sten 
posode m E1 μg 
Drugo red čenje s topilom 
Odstranjena prostornina topila _V  s cm 3 
Dodana prostornina topila V cm  3 
Druga ekstrakcija s topilom 
Signal, analiziran v fazi topila S  E2 var. 
Koncentracija preskusne snovi v topilu C  E2 μg cm  -3 
Masa snovi, ekstrahirane iz tal in sten 
posode m E2 μg 
Skupna masa preskusne snovi, ekstrahi ­
rana v dveh kroakih m E μg 
Masna bilanca MB % 
Preskušana snov: 
Preskušan tip tal: 
Vsebnost suhe mase v tleh (105  o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . % 
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Adsorpcijske izoterme  
Simbol Enota  
Št. epruvete 
Masa tal — g 
Tla: suha masa E g 
Prostornina vode v zatehtanih 
tleh (izračunana) V WS cm 3 
Prostornina 0,01 M raztopine 
CaCl  2 za vzpostavitev ravno ­
težja vtleh cm 3 
Prostornina dodane osnovne 
raztopine cm 3 
Skupna prostornina vodne faze 
v stiku s tlemi (izra čunana) V 0 cm 3 
Koncentracija raztopine C  0 μg cm  -3 
Čas potreben za vzpostavitev 
ravnotežja — h  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1236
 
Simbol Enota  
Po stresanju in centrifugiranju  
Koncentracija snovi v vodni 
fazi, vkljulno s korekcijo za vrednost slepega vzorca
 C aq ads ðeqÞ μg cm  -3 
Temperatura  o C 
Adsorbirana masa na enoto tal  C s ads ðeqÞ μg g  -1 
Regresijska analiza: 
vrednost K  ads F : 
vrednost l/n: regresijski koeficient r
 2 : 
Preskušana snov: 
Preskušan tip tal: 
Vsebnost suhe mase v tleh (105  o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . % 
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Uporabljena metodologija: analitska 
Posredna  □ Paralelna  □ Serialna  □ 
Preskus desorpcije  
Simbol Enota Časovni 
interval Časovni 
interval Časovni 
interval Časovni 
interval  
Št. epruvete iz faze adsorpcije 
Masa snovi, adsorbirane na tla 
v adsorpcijskem ravnotežju  m s ads ðeqÞ μg 
Odstranjena prostornina vodne faze, 
nadomeščena z 0,01 M CaCl  2 V R cm 3 
Skupna prostornina vodne 
faze v stiku s tlemi PM V  0 cm 3 
SM V  T cm 3 
Masa preskusne snovi, ki ostane od 
adsorpcijskega ravnotežja zaradi nepo ­
polne nadomestitve prostornine  m aq A μg 
Kinetika desorpcije  
Izmerjena masa snovi, desorbirane s tal 
ob času t  i m m des ðt i Þ μg 
Prostornina raztopine, 
vzete iz epruvete (i) za 
meritev preskusne snovi PM V  i r cm 3 
SM v  D a cm 3 
Masa snovi, desorbirane s tal ob času t  i 
(izračunana)  m aq des ðt i Þ μg 
Masa snovi, desorbirane s tal v časovnem 
intervalu Δt i (izračunana)  m aq des ðΔt i Þ μg ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1237
 
Simbol Enota Časovni 
interval Časovni 
interval Časovni 
interval Časovni 
interval  
Odstotek desorpcije  
Desorpcija ob časut  i D ti % % 
Desorpcija v časovnem intervalu Δt i D Δt i % 
Desorpcijski koeficient K  des 
PM: Paralelna metoda 
SM: Serialna metoda  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1238
 
C.19  OCENJEVANJE ADSORPCIJSKEGA KOEFICIENTA ( K OC ) 
TAL IN ODPADNEGA BLATA (BLATA IZ ČISTILNIH 
NAPRAV) S TEKO ČINSKO KROMATOGRAFIJO VISOKE 
LOČLJIVOSTI (HPLC)  
1. METODA  
Ta metoda ustreza metodi OECD TG121 (2001).  
1.1 UVOD 
Sorptivno obnašanje snovi v tleh ali odpadnem blatu iz čistilnih 
naprav lahko opišemo s parametri, ki se eksperimentalno ugotovijo 
s preskusno metodo C.18. Eden od pomembnih parametrov je adsorpcijski koeficient, ki je opredeljen kot razmerje med koncen ­
tracijo snovi v tleh/blatu in koncentracijo snovi v vodni fazi ob 
adsorpcijskem ravnotežju. Adsorpcijski koeficient, normiran na 
vsebnost organskega ogljika v tleh (K
 oc ), je koristen pokazatelj 
sposobnosti vezave kemikalije na organske snovi v tleh in odpadnem 
blatu ter omogo ča primerjavo med razli čnimi kemikalijami. Ta para ­
meter je mogo če oceniti prek korelacije s topnostjo v vodi in poraz ­
delitvenim koeficientom n-oktanol/voda (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). 
Eksperimentalna metoda, opisana v tem preskusu, uporablja HPLC 
za ocenitev adsorpcijskega koeficienta K  oc v tleh in odpadnem blatu 
(8). Dobljene vrednosti so bolj zanesljive kot tiste, izra čunane 
z metodo QSAR (9). Kot ocenjevalna metoda ne more popolnoma 
nadomestiti šaržnih preskusov ravnotežja, ki se uporabljajo 
v preskusni metodi C.18. Kljub temu je lahko ocenjeni K  oc koristen 
pri izbiranju ustreznih preskusnih parametrov za prou čevanje adsorp ­
cije/desorpcije po preskusni metodi C.18 z ra čunanjem K  d (porazde­
litveni koeficient) ali K  f (Freundlichov adsorpcijski koeficient) po 
enačbi 3 (glej poglavje 1.2).  
1.2 OPREDELITEV POJMOV  
K d : Porazdelitveni koeficient je opredeljen kot razmerje med ravno ­
težnimi koncentracijami C raztopljene preskusne snovi v dvofaznem 
sistemu iz sorbenta (tla ali odpadno blato) in vodne faze; to je vrednost brez enote, kadar sta koncentraciji v obeh fazah izraženi kot teža/težo. Če je koncentracija v vodni fazi podana kot teža/pro ­
stornino, je enota ml · g
 -1 . K d se lahko spreminja glede na sorptivne 
lastnosti in je lahko odvisen od koncentracije.  
K d ¼ C soil 
C aq or C sludge 
C aq (1) 
pri čemer je: 
C soil = koncentracija preskusne snovi v tleh ob ravnotežju 
(μg· g -1 ) 
C sludge  = koncentracija preskusne snovi v blatu ob ravnotežju 
(μg· g -1 ) 
C aq = koncentracija preskusne snovi v vodni fazi ob ravno ­
težju (μg· g -1 , μg· ml  -1). ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1239
 
K f : Freundlichov adsorpcijski koeficient je opredeljen kot koncen ­
tracija preskusne snovi v tleh ali odpadnem blatu (x/m), ko je ravno ­
težna koncentracija C  aq v vodni fazi enaka ena; enota je μg· g -1 
sorbenta. Vrednost se lahko spreminja glede na sorptivne lastnosti.  
log x 
m ¼ logK  f þ 1 
n ·logC  aq (2) 
pri čemer je: 
x/m = koli čina preskusne snovi x ( μg), adsorbirane na koli čino 
sorbenta m (g) ob ravnotežju 
1/n = nagib Freundlichove adsorpcijske izoterme C
 aq = koncentracija preskusne snovi v vodni fazi ob ravnotežju 
(μg· ml  -1 ) 
AtC aq ¼ 1; logK  f ¼ log x 
m 
K oc : Porazdelitveni koeficient (K  d ) ali Freundlichov adsorpcijski 
koeficient (K  f ), normiran na vsebnost organskega ogljika (f  oc ) 
v sorbentu; zlasti za neionizirane kemikalije je približni pokazatelj obsega adsorpcije med snovjo in sorbentom in omogo ča primerjavo 
med razli čnimi kemikalijami. Glede na enote K
 d in K  f je K  oc lahko 
brez enote ali ima enoto ml · g -1 ali μg· g -1 organske snovi.  
Koc ¼ Kd 
foc dimensionless or ml ·g Ä1 Ê Ì  
or Kf 
foc μg·g Ä1 Ê Ì  (3) 
Razmerje med K  oc in K  d ni vedno lineareno, tako da so lahko 
vrednosti K  oc različne pri razli čnih tipih tal, vendar je njihova varia ­
bilnost mo čno zmanjšana v primerjavi z vrednostmi K  d ali K  f . 
Adsorpcijski koeficient (K  oc ) se izpelje iz kapacitivnega faktorja (k“) 
s pomočjo umeritvenega grafa log k' v odvisnosti od log K  oc 
izbranih referen čnih spojin.  
k 0 ¼ t R Ä t 0 
t 0 (4) 
pri čemer je: 
t R = retencijski čas preskusne in referen čne snovi pri HPLC 
(minute) 
t 0 = mrtvi čas pri HPLC (minute) (glej poglavje 1.8.2).  
P OW : Porazdelitveni koeficient oktanol/voda je opredeljen kot 
razmerje med koncentracijama raztopljene snovi v n-oktanolu in 
vodi; to je vrednost brez enote.  
Pow ¼ Coctanol 
Caq ð¼ KowÞ (5) 
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Pred uporabo metode naj bodo znane strukturna formula, čistost In 
disociacijska konstanta ( če je ustrezno). Koristne so informacije 
o topnosti v vodi in organskih topilih, porazdelitvenem koeficientu 
oktanol/voda in hidroliznih lastnostih.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1240
 
Za korelacijo izmerjenih podatkov o retenciji pri FIPLC za 
preskusno snov z njenim adsorpcijskim koeficientom K  oc je treba 
izdelati umeritveni graf log K  oc v odvisnosti od k'. Uporabiti je 
treba vsaj šest referen čnih točk, pri čemer je vsaj ena nad in ena 
pod pričakovano vrednostjo za preskusno snov. To čnost metode se 
znatno izboljša, če se uporabijo referen čne snovi, ki so strukturno 
sorodne preskusni snovi. Če t i podatki niso na razpolago, uporabnik 
sam izbere ustrezne umeritvene snovi. V tem primeru se izbere bolj splošna skupina strukturno heterogenih snovi. Snovi in vrednosti 
K
 oc , ki se lahko uporabijo, so naštete v Dodatku in sicer v tabeli 
1 za odpadno blato in v tabeli 3 za tla. Izbira drugih umeritvenih snovi mora biti utemeljena.
 
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
HPLC se izvaja s analiznimi kolonami, polnjenimi s cianopropilno 
trdno fazo (cianopropilnimi trdnimi delci), ki je na voljo na tržiš ču in 
ki vsebuje lipofilne in polarne dele. Uporablja se zmerno polarna stacionarna faza na osnovi matrice iz silicijevega oksida: 
— O — Si — CH
 2 — CH  2 — CH  2 — CN 
silicijev oksid nepolarni vmesnik polami del 
Princip preskusne metode je podoben kot pri preskusni metodi A.8 
(porazdelitveni koeficient, metoda HPLC). Pri potovanju skozi kolono skupaj z mobilno fazo pride do interakcije med preskusno 
snovjo in stacionarno fazo. Porazdeljevanje med mobilno in stacio ­
narno fazo zadrži preskusno snov. Dvojna sestava stacionarne faze, ki ima polarna in nepolarna mesta, omogo ča interakcijo med polar ­
nimi in nepolarnimi skupinami molekule na podoben na čin kot pri 
organskih snoveh v matriksu tal ali odpadnega blata. To omogo ča 
določitev odnosa med retencijskim časom v koloni in adsorpcijskim 
koeficientom na organski snovi. 
pH ima pomemben vpliv na obnašanje pri sorpcij zlasti pri polarnih 
snoveh. Pri kmetijskih tleh in v bazenih komunalnih čistilnih naprav 
je pH navadno med 5,5 in 7,5. Za snovi, ki lahko ionizirajo, je treba 
izvesti dva preskusa, za ionizirano in neionizirano obliko, v ustreznih 
pufrih, vendar samo če najmanj 10 % preskusne spojine disociira 
v območju pH 5,5 do 7,5. 
Ker se pri ocenjevanju uporabi samo razmerje med retencijo na 
koloni HPLC in adsorpcijskim koeficientom, kvantitativna analitska metoda ni potrebna, potrebna je samo dolo čitev retencijskega časa. 
Če je na voljo primerna skupina referen čnih snovi in se lahko upora ­
bijo standardni eksperimentalni pogoji, ta metoda predstavlja hiter in učinkovit na čin ocenjevanja adsorpcijskega koeficienta K
 oc . 
1.5 UPORABNOST PRESKUSA 
Metoda HPLC je uporabna za kemi čne snovi (ozna čene ali neozna ­ 
čene), za katere je na razpolago ustrezen sistem za detekcijo (npr. 
spektrofotometer, detektor radioaktivnosti) in ki so v času trajanja 
poskusa dovolj stabilne. Zlasti koristna je lahko za kemikalije, ki jih 
je z drugimi eksperimentalnimi sistemi težko prou čevati (t.j. hlapne 
snovi; snovi, ki v vodi niso topne pri koncentraciji, ki jo je mogo če 
analitsko izmeriti; snovi z visoko afiniteto do površine inkubacijskih sistemov). Metoda se lahko uporabi za zmesi, pri katerih ostanejo 
neločljivi elucijski trakovi. V tem primeru je treba navesti zgornje in 
spodnje mejne vrednosti log K
 oc spojin preskusne zmesi.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1241
 
Nečistote lahko v časih povzro čijo težave pri razlagi rezultatov 
HPLC, vendar so majhnega pomena, če je mogo če preskusno snov 
analitsko jasno dolo čiti in ločiti od nečistot. 
Metoda je validirana za snovi iz tabele 1 v Dodatku in je bila 
uporabljena tudi za razne druge kemikalije iz naslednjih razredov: 
— aromatski amini (npr. trifluralin, 4-kloroanilin, 3,5-dinitroanilin, 
4-metilanilin, N-metilanilin, 1-naftilamin), 
— aromatski estri karboksilne kisline (npr. metilester benzojske 
kisline, etilester 3,5-dinitrobenzojske kisline), 
— aromatski ogljikovodiki (npr. toluen, ksilen, etilbenzen, nitroben ­
zen), 
— estri ariloksifenoksipropionske kisline (npr. diklofop-metil, 
fenoksaprop-etil, fenoksaprop-P-etil), 
— benzimidazolijevi in imidazolijevi fungi cidi (npr. karbendazim, 
fuberidazol, triazokside), 
— amidi karboksilne kisline (npr. 2-klorobenzamid, N,N-dimetilben ­
zamid, 3,5-dinitrobenzamid, N-metilbenzamid, 2-nitrobenzamid, 3-nitrobenzamid), 
— klorirani ogljikovodiki (npr. endosulfan, DDT, heksaklorobenzen, 
kvintozen, 1,2,3-triklorobenzen), 
— organofosforjevi insekticidi (npr. azinfos-metil, disulfoton, fena ­
mifos, izofenfos, pirazofos, sulprofos, triazofos), 
— fenoli (npr. fenol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol, pentaklorofenol, 
2,4,6-triklorofenol, 1-naftol), 
— derivati feniluree (npr. izoproturon, monolinuron, pencikuron), — pigmentna barvila (npr. Acid Yellow 219, Basic Blue 41, Direct 
Red 81), 
— poliaromatski ogljikovodiki (npr. acenaften, naftalen), — 1,3,5-triazin herbicidi (npr. prometrin, propazin, simazin, terbu ­
trin), 
— derivati triazola (npr. tebukonazol, triadimefon, tradimenol, tria ­
pentenol). 
Metoda ni uporabna za snovi, ki reagirajo bodisi z eluentom ali 
stacionarno fazo. Prav tako ni uporabna za snovi, ki na specifi čen 
način interagirajo z anorganskimi komponentami (npr. tvorba gru ča­
stih kompleksov z minerali gline). Metoda morda ne bo delovala pri 
površinsko aktivnih snoveh, anorganskih spojinah in zmernih ali močnih organskih kislinah ali bazah. Dolo čiti je mogo če vrednosti 
log K
 oc v razponu od 1,5 to 5,0. Snovi, ki lahko ionizirajo, je treba 
meriti s pomo čjo pufrske mobilne faze, vendar je treba paziti, da se 
prepreči obarjanje pufrskih komponent ali preskusne snovi.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1242
 
1.6 MERILA KAKOVOSTI  
1.6.1  To čnost 
Navadno je adsorpcijski koeficient preskusne snovi mogo če oceniti 
do ±0,5 logaritemske enote vrednosti, dolo čene z metodo šaržnih 
preskusov ravnotežja (glej tabelo 1 v Dodatku). Boljša to čnost se 
lahko doseže, če so referen čne snovi strukturno sorodne preskusni 
snovi.  
1.6.2  Ponovljivost  
Določanje je treba izvesti vsaj v dveh ponovitvah. Vrednosti log K  oc 
dobljene pri posameznih merjenjih naj bodo znotraj obsega 0,25 
logaritemske enote.  
1.6.3  Obnovljivost  
Dosedanje izkušnje z uporabo te metode potrjujejo njeno veljavnost. 
Pri preiskavi metode HPLC s pomo čjo 48 snovi (ve činoma pestici ­
dov), za katere so bili na razpolago zanesljivi podatki o K  oc tal, je bil 
ugotovljen korekcijski koeficient R = 0,95 (10) (11). 
Za izboljšanje in validacijo metode je bil izveden preskus 
s primerjavo med laboratoriji, v katerem je sodelovalo 11 laborato ­
rijev (12). Izsledki so navedeni v tabeli 2 v Dodatku.  
1.7 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.7.1  Predhodna ocenitev adsorpcijskega koeficienta  
Porazdelitveni koeficient oktanol/voda P  ow (= K  ow ) in, do neke mere, 
topnost v vodi se lahko uporabita kot pokazatelja obsega adsorpcije, zlasti za neionizirane snovi, in se tako lahko uporabita za predhodno 
določanje obmo čja. Objavljena je bila že vrsta koristnih korelacij za 
več skupin kemikalij (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).
 
1.7.2  Naprave  
Potreben je teko činski kromatograf, opremljen s črpalko brez pulzov 
in primernim detektorjem. Priporo čljiva je uporaba injekcijskega 
ventila z injekcijsko zanko. Uporabi se komercialni cianopropil 
vezan na silikagel (npr. Hypersil in Zorbax CN). Med injekcijski sistem in analizno kolono se lahko namesti varovalna kolona iz enakega materiala. Kolone razli čnih dobaviteljev se lahko znatno 
razlikujejo glede na u činkovitost lo čevanja. Kot vodilo je treba 
doseči naslednje faktorje zmogljivosti k': log k' > 0,0 za log K
 oc = 
3,0 in log k' > – 0,4 za log K  oc = 2,0 pri uporabi mobilne faze 
metanol/voda 55/45 %.  
1.7.3  Mobilne faze  
Preskušenih je bilo ve č mobilnih faz, priporo čljivi pa sta naslednji dve: 
— metanol/voda (55/45 % v/v) 
— metanol/0,01 M citratni pufer pH 6,0 (55/45 % V/V)  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1243
 
Metanol čistosti za HPLC in destilirana voda ali citratni pufer se 
uporabita za pripravo elucijskega topila. Zmes se pred uporabo 
razplini. Uporabiti je treba izokratsko elucijo. Če zmes metanol/voda 
ni ustrezna, se lahko poskusi z drugimi zmesmi organskih topil in vode, npr. etanol/voda ali acetonitril/voda. Pri spojinah, ki lahko 
ionizirajo, je priporo čljiva uporaba pufra za stabilizacijo pH. Poskr ­
beti je treba, da ne pride do obarjanja soli in uni čenja kolone, kar se 
lahko zgodi pri nekaterih zmeseh: organska faza/pufer. 
Ne smejo se uporabljati dodatki, kot so reagenti z ionskim parom, 
ker lahko vplivajo na sorptivne lastnosti stacionarne faze. Take spre ­
membe stacionarne faze so lahko ireverzibilne. Zaradi tega je treba 
poskuse z dodatki obvezno izvajati na lo čenih kolonah.
 
1.7.4  Topljenci  
Preskusne in referen čne snovi je treba raztopiti v mobilni fazi.  
1.8 IZVEDBA PRESKUSA  
1.8.1  Preskusni pogoji  
Treba je beležiti temperaturo med meritvami. Uporaba termostatirane 
peči s kromatografsko kolono je zelo priporo čljiva za zagotavljanje 
konstantnih pogojev med umerjanjem in ocenjevanjem ter merjenjem 
preskusne snovi.  
1.8.2  Dolo čanje mrtvega časa t  0 
Za določanje mrtvega časa t  0 se lahko uporabita dve razli čni metodi 
(glej tudi poglavje 1.2).  
1.8.2.1  Dolo čanje mrtvega časa to s pomo čjo homologne serije  
Ta postopek dokazano daje zanesljive in standardizirane vrednosti t  0 . 
Za podrobnosti glej preskusno metodo A.8: porazdelitveni koeficient (n-oktanol/voda), metoda HPLC.
 
1.8.2.2  Dolo čanje mrtvega časa to s pomo čjo inertnih snovi, ki jih kolona ne 
zadrži  
Ta tehnika temelji na injiciranju raztopin formamida, se čnine ali 
natrijevega nitrata. Meritve je treba opraviti vsaj v dveh ponovitvah.  
1.8.3  Dolo čanje retencijskega časa t  R 
Referenčne snovi se izberejo kakor je opisano v poglavju 1.3. Lahko 
se injicirajo kot mešani standard za dolo čitev njihovih retencijskih 
časov, pod pogojem da je bilo potrjeno, da prisotnost drugih referen ­ 
čnih standardov ne vpliva na retencijski čas posameznega referen ­ 
čnega standarda. Umerjanje se opravlja v rednih presledkih vsaj 
dvakrat dnevno, da se lahko upoštevajo nepri čakovane spremembe 
v delovanju kolone. Najbolje je umeritveno injiciranje izvesti pred in po injiciranju preskusne snovi za potrditev, da se retencijski časi niso 
spremenili. Preskusne snovi se injicirajo lo čeno v čim manjših koli ­ 
činah (da ne bi prišlo do preobremenitve kolone) in dolo čijo se 
njihovi retencijski časi.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1244
Za večjo zanesljivost meritev je treba dolo čitev opraviti vsaj dvakrat. 
Vrednosti log K  oc v posameznih meritvah morajo biti v obmo čju 
0,25 logaritemske enote.  
1.8.4  Vrednotenje  
Kapacitivni faktorji k' se izra čunajo iz mrtvega časa t  0 in retencijskih 
časov t  R izbranih referen čnih snovi po ena čbi 4 (glej poglavje 1.2). 
Podatke log k' za referen čne snovi se nato vnese v graf odvisnosti od 
njihovih vrednosti K  oc iz poskusov s šaržnim ravnotežjem iz tabel 1 
in 3 v Dodatku. S pomo čjo tega grafi čnega prikaza se nato vrednost 
log k' preskusne snovi uporabi za dolo čitev njene vrednosti log K  oc . 
Če dejanski rezultati pokažejo, da je log K  oc preskusne snovi izven 
umeritvenega obmo čja, je treba preskus ponoviti in uporabiti druge, 
bolj ustrezne referen čne snovi.  
2. PODATKI IN PORO ČANJE  
Poročilo mora vsebovati naslednje informacije: 
— identiteto preskusnih in referen čnih snovi in njihovo čistost ter 
vrednosti pK  a , če je ustrezno, 
— opis opreme in delovnih pogojev, npr. vrsta in dimenzije analizne 
(in varovalne) kolone, detekcijsko sredstvo, mobilna faza (raz ­
merje komponent in pH), temperaturni razpon med meritvami, 
— mrtvi čas in metodo za njegovo dolo čanje, 
— količine preskusnih in referen čnih snovi v koloni, 
— retencijske čase referen čnih spojin, uporabljenih za umerjanje, 
— podrobnosti o prilagojeni regresijski premici (log k' v odvisnosti 
od log K  oc ) in graf regresijske premice, 
— podatke o povpre čni retenciji in ocenjeno vrednost log K  oc za 
preskusno spojino, 
— kromatograme.  
3. LITERATURA  
(1) W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt (ed). (1990). 
Handbook of chemical property estimation methods, 
chapt. 4, McGraw-Hill, New York. 
(2) J. Hodson, N.A. Williams (1988). The estimation of the 
adsorption coefficient (K  oc ) for soils by HPLC. Chemosphere, 
17, 1 67. 
(3) G.G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relations ­
hips between soil adsorption, octanol-water partition coeffi ­
cients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J. Agric. Food Chem., 29, 1050–1059. 
(4) C.T. Chiou, P.E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition 
equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, 227–231. 
(5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic 
substances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, 
B19, 297–312.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1245
 
(6) C.T. Chiou, L.J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical 
concept of soil water equilibria for nonionic organic 
compounds, Science, 106, 831–832. 
(7) S.W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, 833–846. 
(8) W. Kordel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application 
of the HPLC-screening method for the determination of the 
adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35 ­
(1/2). 121–128. 
(9) M. Mueller, W. Kordel (1996). Comparison of screening 
methods for the estimation of adsorption coefficients on 
soil. Chemosphere, 32(12), 2493–2504. 
(10) W. Kordel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemo ­
sphere, 27(12). 2341–2352. 
(11) B. von Oepen, W. Kordel, W. Klein (1991). Sorption of 
nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measure ­
ments and experience with the applicability of the modified 
OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, 285–304. 
(12) W. Kordel, G. Kotthoff, J. Muller (1995). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), 1373–1384.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1246
 
DODATEK  
Tabela 1  
Primerjava vrednosti K  oc za tla in blato iz čistilnih naprav ter vrednosti, izra čunane po presejalni metodi 
HPLC  ( 1 ), ( 2 ) 
Snov Št. CAS log K  oc za 
odpadno 
blato log K  oc pri 
HPLC Δ log K  oc za 
tla log K  oc pri 
HPLC Δ 
Atrazin 1912-24-9 1,66 2,14 0,48 1,81 2,20 0,39 
Linuron 330-55-2 2,43 2,96 0,53 2,59 2,89 0,30 Fention 55-38-9 3,75 3,58 0,17 3,31 3,40 0,09 Monuron 150-68-5 1,46 2,21 0,75 1,99 2,26 0,27 Fenantren 85-01-8 4,35 3,72 0,63 4,09 3,52 0,57 Fenil benzoat 93-99-2 3,26 3,03 0,23 2,87 2,94 0,07 Benzamid 55-21-0 1,60 1,00 0,60 1,26 1,25 0,01 4-Nitrobenzamid 619-80-7 1,52 1,49 0,03 1,93 1,66 0,27 Acetanilid 103-84-4 1,52 1,53 0,01 1,26 1,69 0,08 Anilin 62-53-3 1,74 1,47 0,27 2,07 1,64 0,43 2,5-Dikloroanilin 95-82-9 2,45 2,59 0,14 2,55 2,58 0,03
 
( 1 ) W. Kordel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption 
coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2). 121–128. 
( 2 ) W. Kordel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludge s. 
Chemosphere, 35 (1/2), 107–119.  
Tabela 2  
Izsledki preskusa s primerjavo med laboratoriji (11 sodelujo čih laboratorijev), izvedenega za izboljšanje in 
validacijo metode HPLC  ( 1 ) 
Snov Št. CAS log K  oc K oc log K  oc 
[OECD 106] [metoda HPLC]  
Atrazin 1912-24-9 1,81 78 + 16 1,89 
Monuron 150-68-5 1,99 100 + 8 2,00 Triapentenol 77608-88-3 2,37 292 + 58 2,47 Linuron 330-55-2 2,59 465 + 62 2,67 Fention 55-38-9 3,31 2062 + 648 3,31
 
( 1 ) W. Kordel, G. Kotthoff, J. Muller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil- 
results of a ring test. Chemosphere, 30(7), 1373–1384  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1247
 
Tabela 3  
Priporočene referen čne snovi za presejalno metodo HPLC na osnovi adsorpcijskih podatkov za tla  
Referenčna snov Št. CAS Povprečne 
vrednosti log K  oc 
iz šaržnega 
preskusa ravno ­
težja Število 
podatkov K  oc log S.D. Vir  
Acetanilid 103-84-4 1,25 4 0,48 (  a ) 
Fenol 108-95-2 1,32 4 0,70 (  a ) 
2-Nitrobenzamid 610-15-1 1,45 3 0,90 (  b ) 
N.N-dimetilbenzamid 611-74-5 1,52 2 0,45 (  a ) 
4-Metilbenzamid 619-55-6 1,78 3 1,76 (  a ) 
Metil benzoat 93-58-3 1,80 4 1,08 (  a ) 
Atrazin 1912-24-9 1,81 3 1,08 (  c ) 
Isoproturon 34123-59-6 1,86 5 1,53 (  c ) 
3 -Nitrob enzami d 645-09-0 1,95 3 1,31 (  b ) 
Anilin 62-53-3 2,07 4 1,73 (  a ) 
3,5-Dinitrobenzamid 121-81-3 2,31 3 1,27 (  b ) 
Karbendazim 10605-21- 7 2,35 3 1,37 (  c ) 
Triadimenol 55219-65-3 2,40 3 1,85 (  c ) 
Triazoksid 72459-58-6 2,44 3 1,66 (  c ) 
Triazofos 24017-47-8 2,55 3 1,78 (  c ) 
Linuron 330-55-2 2,59 3 1,97 (  c ) 
Naftalen 91-20-3 2,75 4 2,20 (  a ) 
Endosulfandiol 2157-19-9 3,02 5 2,29 (  c ) 
Metiokarb 2032-65-7 3,10 4 2,39 (  c ) 
Acid Yellow 219 63405-85-6 3,16 4 2,83 (  a ) 
1,2,3 -Triklorobenzen 87-61-6 3,16 4 1,40 (  a ) 
y-HCH 58-89-9 3,23 5 2,94 (  a ) 
Fention 55-38-9 3,31 3 2,49 (  c ) 
Direct Red 81 2610-11-9 3,43 4 2,68 (  a ) 
Pirazofos 13457-18-6 3,65 3 2,70 (  c ) 
α-Endosulfan 959-98-8 4,09 5 3,74 (  c ) 
Diklofop-metil 51338-27-3 4,20 3 3,77 (  c ) 
Fenantrene 85-01-8 4,09 4 3,83 (  a ) 
Basic Blue 41 (zmes) 26850-47- 5 
12270-13-2 4,89 4 4,46 (  a ) 
DDT 50-29-3 5,63 1 — (  b ) 
( a ) W. Kordel, J. Miiller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA 
R&D Report No. 106 01 044 (1994). 
( b ) B.V. Oepen, W. Kordel, W. Klein. (1991). Chemosphere, 22, 285–304 
( c ) Podatki iz industrije  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1248
 
C.20  PRESKUS RAZMNOŽEVANJA VRSTE  DAPHNIA MAGNA  
1. METODA  
Ta metoda preskušanja toksi čnosti za razmnoževanje ustreza metodi 
OECD TG 211 (1998).  
1.1 UVOD 
Glavni cilj preskusa je oceniti vpliv kemikalij na sposobnost razmno ­ 
ževanja vrste  Daphnia magna.  
1.2 OPREDELITEV POJMOV IN ENOTE  
Starši:  so samice vodne bolhe (iz rodu  Daphnia),  ki so prisotne na 
začetku preskusa in katerih sposobnost razmnoževanja je predmet te 
študije.  
Potomci:  so mladi či vodne bolhe, ki jih starši producirajov času 
preskusa.  
Najnižja koncentracija z opaznim u činkom (LOEC):  je najnižja 
preskušena koncentracija, pri kateri je ugotovljeno, da ima snov 
v danem obdobju izpostavljenosti statisti čno značilen učinek na 
razmnoževanje in smrtnost staršev (pri p < 0,05) ob primerjavi 
s kontrolo. Vendar morajo imeti vse preskusne koncentracije nad 
LOEC škodljiv u činek, ki je enak ali ve čji kot učinek, opažen pri 
LOEC. Če teh dveh pogojev ni mogo če izpolniti, je treba podrobno 
razložiti, kako je bil izbran LOEC (in s tem NOEC).  
Koncentracija brez opaznih u činkov (NOEC):  je preskusna 
koncentracija neposredno pod LOEC, ki v primerjavi s kontrolo 
nima statisti čno značilnega učinka (p < 0,05) v danem obdobju 
izpostavljenosti. 
EC x : je koncentracija preskusne snovi, raztopljene v vodi, ki 
povzroči x- % zmanjšanje v razmnoževanju vrste  Daphnia magna  
v danem obdobju izpostavljenosti.  
Za populacijo zna čilna stopnja rasti:  je merilo rasti populacije, ki 
združuje sposobnost razmnoževanja in smrtnost v dolo čeni starosti 
(20) (21) (22). Pri populacijah v dinami čnem ravnotežju je enaka 
nič. Pri rasto čih populacijah je pozitivna, pri upadajo čih pa negati ­
vna. Slednja seveda ni samovzdržna in na koncu vodi k izumrtju.  
Meja detekcije:  je najnižja koncentracija, ki jo je mogo če zaznati, 
ne pa tudi koli činsko ovrednotiti.  
Meja dolo čanja:  je najnižja koncentracija, ki jo je mogo če koli­ 
činsko izmeriti.  
Smrtnost:  žival se zabeleži kot mrtva, če je nepremi čna, t.j. če ne 
more plavati ali če v 15 sekundah po rahlem tresenju preskusne 
posode ni opaziti premikanja okon čin ali postabdomna. ( Če se 
uporabi druga opredelitev pojmov, je treba o tem poro čati, skupaj 
z navedbo literature.)  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1249
 
1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Mlade samice vodne bolhe iz rodu  daphnia  (starši), na za četku 
preskusa mlajše od 24 ur, se izpostavijo preskusni snovi, dodani vodi v razli čnih koncentracijah. Preskus traja 21 dni. Na koncu 
preskusa se oceni celotno število živih potomcev na starša, ki je 
ob koncu poskusa živ. To pomeni, da se mladi či odraslih živali, ki 
med preskusom poginejo, pri ra čunanju ne upoštevajo. Sposobnost 
razmnoževanja staršev je mogo če izraziti tudi na druge na čine (npr. 
število živih potomcev, ki jih ima žival na dan od prvega dne, ko so 
opaženi potomci), vendar je treba o tem poro čati poleg celotnega 
števila mladi čev na starša, ki je ob koncu preskusa še živ. Sposob ­
nost razmnoževanja živali, izpostavljenih preskusni snovi, se 
primerja z živalmi kontrol, da se dolo čita najnižja koncentracija 
z opaznim u činkom (LOEC) in s tem koncentracija brez opaznih 
učinkov (NOEC). Poleg tega se, kolikor je mogo če, podatki analizi ­
rajo s pomo čjo regresijskega modela, da se oceni koncentracija, ki bi 
povzročila x-odstotno znižanje sposobnosti razmnoževanja (t.j. EC
 50 , 
EC 20 ali EC  10 ). 
Poročati je treba tudi o preživetju staršev in času do produkcije 
prvega zaroda. Prou čijo se lahko tudi drugi od snovi odvisni u činki 
na parametre, kot sta rast (npr. dolžina) in po možnosti za populacijo značilna stopnja rasti.
 
1.4 PODATKI O PRESKUSNI SNOVI 
Na razpolago naj bodo izsledki preskusa akutne toksi čnosti (glej 
metodo C.2, del I) za vrsto  Daphnia magna.  Ti izsledki so lahko 
koristni pri izbiranju ustreznega razpona preskusnih koncentracij za 
preskuse razmnoževanja. Znana morata biti topnost v vodi in parni tlak preskusne snovi, na razpolago pa mora biti zanesljiva analitska 
metoda za dolo čanje koli čine snovi v preskusnih raztopinah, za 
katero obstajajo poro čila o uspešnosti rekuperacije in meji dolo čanja. 
Informacije o preskusni snovi, ki so lahko koristne pri dolo čanju 
preskusnih pogojev, vklju čujejo strukturno formulo, čistost snovi, 
stabilnost na svetlobi, stabilnost pri preskusnih pogojih, pK
 a , P ow 
in izsledke preskusa lahke biorazgradljivosti (glej metodo C.4).  
1.5 VELJAVNOST PRESKUSA 
Da bi bil preskus veljaven, morajo kontrole izpolnjevati naslednja 
merila: 
— smrtnost staršev (samic vodnih bolh) ob koncu preskusa ne 
presega 20 %, 
— povpre čno število živih potomcev na starša, ki preživi do konca 
poskusa, je ≥ 60. 
1.6 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.6.1  Naprave  
Preskusne posode in druge priprave, ki pridejo v stik s preskusno 
snovjo, morajo biti v celoti iz stekla ali drugega kemi čno inertnega 
materiala. Preskusne posode so navadno steklene čaše. 
Poleg tega bo lahko potrebna naslednja oprema: 
— oksimeter (z mikroelektrodo ali drugo primerno opremo za 
merjenje raztopljenega kisika v vzorcih z majhno prostornino),  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1250
 
— primerna naprava za uravnavanje temperature, 
— pH meter, — oprema za dolo čanje trdote vode, 
— oprema za dolo čanje koncentracije skupnega organskega ogljika 
(TOC) v vodi ali oprema za dolo čanje kemijske potrebe po 
kisiku (KPK), 
— primerna naprava za nadzorovanje režima osvetlitve in merjenje 
jakosti svetlobe.
 
1.6.2  Preskusni organizem  
V preskusu se uporabi vrsta  Daphnia magna,  Straus. Lahko se 
uporabijo druge vrste iz rodu  Daphnia,  pod pogojem, da ustrezno 
izpolnjujejo merila za veljavnost (merilo za veljavnost v zvezi s sposobnostjo razmnoževanja kontrole mora biti ustrezno za vrsto 
vodne bolhe). Če se uporabijo druge vrste vodnih bolh, morajo biti 
jasno identificirane, njihova uporaba pa utemeljena. 
Najbolje je, če je klon identificiran z genotipizacijo. Raziskave (1) so 
pokazale, da sposobnost razmnoževanja klona A (ki izvira iz IRCHA v Franciji) (3) dosledno izpolnjuje merilo za veljavnost, ki zahteva, da je povpre čno število preživelih potomcev na preživelega starša ≥ 
60, če so gojeni v razmerah, opisanih v tej metodi. Vendar so spre ­
jemljivi tudi drugi kloni, pod pogojem da kultura vodnih bolh doka ­
zano izpolnjuje merila za veljavnost preskusa. 
Na začetku preskusa morajo biti živali mlajše od 24 ur in ne smejo 
biti prva generacija potomcev. Izvirati morajo iz zdravega staleža 
(t.j. ne smejo kazati znakov stresa, kot je visoka smrtnost, prisotnost 
samcev in efipijev, zamuda pri produkciji prvega zaroda, razbarvane živali itd.). Živali v staležu morajo biti gojene v razmerah (svetloba, temperatura, medij, hranjenje in živali na enoto prostornine), 
podobnih tistim, ki se uporabijo v preskusu. Če se v preskusu 
uporabi gojitveni medij vodnih bolh, ki je razli čen od tistega, ki se 
ga uporablja za rutinsko gojenje vodnih bolh, je dobro vklju čiti 
prilagoditveno obdobje pred preskusom, ki navadno traja okoli tri 
tedne (t.j. eno generacijo), da starši ne bi bili pod stresom.
 
1.6.3  Preskusni medij  
Za ta preskus je priporo čljivo uporabiti popolnoma definiran medij. 
S tem se je mogo če izogniti uporabi dodatkov (npr. morske alge, 
ekstrakt tal itd.), ki jih je težko opredeliti, s čimer se izboljšajo 
možnosti za standardizacijo med laboratoriji. Ugotovljeno je bilo, da sta medija Elendt M4 (4) in M7 (glej Dodatek 1) primerna za 
ta namen. Sprejemljivi pa so tudi drugi mediji (npr. (5) (6)), pod 
pogojem da sposobnost kulture vodnih bolh dokazano izpolnjuje merila za veljavnost preskusa. 
Če se uporabijo mediji, ki vsebujejo nedefinirane dodatke, je treba te 
dodatke jasno navesti, poro čilo o preskusu pa naj vsebuje informa ­
cije o sestavi, zlasti v zvezi z vsebnostjo ogljika, ker to lahko vpliva 
na prehrano. Priporo čljivo je dolo čiti skupni organski ogljik (TOC) 
in/ali kemijsko potrebo po kisiku (KPK) osnovnega pripravka organ ­
skega dodatka in oceniti posledi čni prispevek k TOC/KPK preskus ­
nega medija. Priporo čljivo je, da je raven TOC v mediju (t.j. pred 
dodatkom alg) pod 2 mg/l (7).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1251
 
Pri preskušanju snovi, ki vsebujejo kovine, se je pomembno zave ­
dati, da lahko lastnosti preskusnega medija (npr. trdota, sposobnost 
tvorbe kelatov) vplivajo na toksi čnost preskusne snovi. Zato je 
zaželen popolnoma definiran medij. Vendar sta trenutno edina popol ­
noma definirana medija, ki sta dokazano primerna za dolgotrajno 
gojenje vrste  Daphnia magna,  Elendt M4 in M7. Oba medija vsebu ­
jeta kelatni reagent EDTA. Pri delu se je izkazalo (2), da je „navi ­
dezna toksi čnost“ kadmija na splošno manjša, če se preskus 
z razmnoževanjem izvede v medijih M4 in M7, kot če se izvede 
v medijih, ki ne vsebujejo EDTA. M4 in M7 zato nista priporo čljiva 
za preskusne snovi, ki vsebujejo kovine, izogibati pa se je treba tudi drugim medijem, ki vsebujejo znane kelatne reagente. Za snovi, ki vsebujejo kovine, je morda primerno uporabiti alternativni medij, kot 
je na primer trda sladka voda, rekonstituirana po ASTM (7), ki ne 
vsebuje EDTA, z dodanim izvle čkom morskih alg (8). Ta kombina ­
cija trde sladke vode, rekonstituirane po ASTM, in izvle čka morskih 
alg je primerna tudi za dolgoro čno gojenje in preskušanje vrste  
Daphnia magna  (2), čeprav še vedno kaže rahlo kelatno delovanje 
zaradi organske sestavine v dodanem izvle čku morskih alg. 
Na začetku preskusa in med njim mora biti koncentracija raztoplje ­
nega kisika nad 3 mg/l. pH mora biti med 6 in 9 in se navadno 
v času enega preskusa ne sme spreminjati za ve č kot 1,5 enote. 
Priporočljiva je trdota nad 140 mg/l (kot CaCO
 3 ). Pri preskusih na 
tej ravni in nad njo je bila ugotovljena sposobnost razmnoževanja, ki 
je v skladu z merili za veljavnost (9) (10).  
1.6.4  Preskusne raztopine  
Preskusne raztopine izbranih koncentracij se navadno pripravijo 
z redčenjem osnovne raztopine. Osnovne raztopine je najbolje pripra ­
viti z raztapljanjem snovi v preskusnem mediju. 
V nekaterih primerih je lahko potrebno uporabiti organsko topilo ali 
disperzijsko sredstvo za pripravo primerne koncentracije osnovne raztopine, vendar se je treba čim bolj izogibati uporabi takih mate ­
rialov. Primeri primernih topil so aceton, etanol, metanol, dimetilfor ­
mamid in trietilen glikol. Primeri primernih disperzijskih sredstev so Cremophor RH40, metilceluloza 0,01 % in HCO-40. V nobenem primeru preskusna snov v preskusni raztopini ne sme prese či meje 
topnosti v preskusnem mediju. 
Topila se uporabijo za pripravo osnovne raztopine, ki jo je mogo če 
natančno dozirati v vodo. Pri priporo čeni koncentraciji topila 
v končnem preskusnem mediju (t.j. ≤ 0,1 ml/l) zgoraj našteta topila 
niso toksi čna in ne pove čajo topnosti snovi v vodi. 
Disperzijska sredstva lahko pomagajo pri natan čnem doziranju in 
disperziji. Pri priporo čeni koncentraciji v kon čnem preskusnem 
mediju (t.j. ≤ 0,1 ml/l) zgoraj našteta disperzijska sredstva niso 
toksična in ne pove čajo topnosti snovi v vodi.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1252
 
1.7 NA ČRT PRESKUSA 
Dodelitev preskusnih posod v tretiranje in vse nadaljnje ravnanje 
s preskusnimi posodami naj bo naklju čno. Če ni, lahko pride do 
pristranskosti, ki bi jo lahko razumeli kot u činek koncentracije. Zlasti 
če se poskusne enote tretirajo po vrstnem redu tretiranj ali koncen ­
tracij, lahko u činek, odvisen od časa, kot je utrujenost izvajalca ali 
druge napake, vodi do ve čjega učinka pri višjih koncentracijah. 
Nadalje, če je verjetno, da bodo na rezultate preskusa vplivale 
začetne ali okoljske razmere preskusa, kot je položaj 
v laboratoriju, je treba razmisliti o razdelitvi v bloke.  
1.8 POSTOPEK  
1.8.1  Pogoji izpostavitve  
1.8.1.1  Trajanje  
Preskus traja 21 dni.  
1.8.1.2  Obremenitev  
Starši se razporedijo posami č, po en na preskusno posodo s po 
50–100 ml medija. 
Včasih so lahko potrebne ve čje prostornine za zadovoljitev potreb 
analitskega postopka, uporabljenega za dolo čanje koncentracije 
preskusne snovi, čeprav je dopustno tudi združevanje ponovitev za 
kemijsko analizo. Če se uporabijo prostornine, ve čje od 100 ml, je 
včasih treba pove čati obroke vodnim bolham, za zagotovitev zado ­
stne dostopnosti hrane in skladnosti z merili za veljavnost. Za pretočne preskuse se lahko zaradi tehni čnih razlogov pretehtajo alter ­
nativni na črti (npr. štiri skupine po 10 živali v ve čji preskusni 
prostornini), vendar je treba o vseh spremembah na črta preskusa 
poročati.
 
1.8.1.3  Število živali  
Pri semi-stati čnih preskusih najmanj 10 živali, razporejenih posami č, 
za vsako preskusno koncentracijo in najmanj 10 živali, razporejenih 
posamič, v kontrolni seriji. 
Pri pretočnih preskusih se je izkazalo, da je primerno število 40 
živali, razdeljenih v štiri skupine po 10 živali za vsako preskusno 
koncentracijo (1). Uporabi se lahko manjše število preskusnih organ ­
izmov, priporo čeno pa je najmanj 20 živali na koncentracijo, razde ­
ljenih v dve ali ve č ponovitev z enakim številom živali (npr. štiri 
ponovitve, vsaka s petimi vodnimi bolhami). Zavedati se je treba, da 
pri preskusih, v katerih so živali v skupinah, sposobnosti razmnože ­
vanja ni mogo če izraziti kot skupno število živih potomcev, ki jih 
imajo ob koncu preskusa živi starši, če starši poginejo. V tem 
primeru je treba sposobnost razmnoževanja izraziti kot „skupno 
število živih potomcev, ki jih imajo starši, prisotni na za četku 
preskusa“.  
1.8.1.4  Hranjenje  
Pri semi-stati čnih preskusih je živali najbolje hraniti dnevno 
vsekakor pa vsaj trikrat na teden (t.j. v skladu s spremembami medi ­
ja). O odstopanjih od tega (npr. pri preto čnih preskusih) je treba 
poročati. ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1253
 
Najbolje je, da je med preskusom prehrana staršev sestavljena iz 
živih celic alg ene ali ve č naslednjih vrst:  Chlorella  sp., Selenastrum 
capricornutum  (zdaj  Pseudokirchneriella subcapitata  (11) in  Scene­
desmus subspicatus.  Prehrana naj temelji na koli čini organskega 
ogljika (C), zagotovljenega posamezni starševski živali. Raziskave 
(12) so pokazale, da za vrsto  Daphnia magna  obroki med 0,1 in 
0,2 mg C/vodno bolho/dan zadostujejo za doseganje zahtevanega števila potomcev za izpolnitev meril za veljavnost preskusa. Obroki se lahko zagotavljajo v enakih koli činah ves čas trajanja preskusa ali 
pa, po želji, se lahko na za četku uporabijo manjše koli čine in se nato 
povečujejo ob upoštevanju rasti staršev. Vendar naj tudi v tem 
primeru obroki ves čas ostanejo v priporo čenem razponu 0,1–0,2 
mg C/vodno bolho/dan. 
Če se za ugotavljanje potrebnega obroka hrane uporabijo nadomestne 
meritve, kot sta število celic alg ali absorpcija svetlobe (t.j. zaradi večje pripravnosti, ker je merjenje vsebnosti ogljika zamudno), mora 
vsak laboratorij pripraviti svoj nomogram povezanosti nadomestnih 
meritev z vsebnostjo ogljika v kulturi alg (glej Dodatek 2 za nasvet o pripravi nomogramov). Nomograme je treba preveriti vsaj enkrat letno in bolj pogosto, če se spremenijo pogoji kulture alg. Ugoto ­
vljeno je bilo, da je absorpcija svetlobe boljše nadomestilo za 
vsebnost ogljika kot število celic (13). 
Vodne bolhe je treba hraniti s koncentrirano suspenzijo alg, da je 
prostornina gojitvenega medija kulture alg, prenesenega v preskusne posode, čim manjša. Koncentrirane alge se lahko pripravi 
s centrifugiranjem, ki mu sledi resuspendiranje v destilirani vodi, 
deionizirani vodi ali v gojitvenem mediju za gojenje vodnih bolh.
 
1.8.1.5  Svetloba  
16 ur svetlobe z jakostjo, ki ne presega 15-20 μE· m -2 ·s -1 . 
1.8.1.6  Temperatura  
Temperatura preskusnega medija naj bo med 18 in 22  o C. Vendar 
naj se pri posameznem preskusu temperatura, če je mogo če, ne 
spreminja za ve č kot za 2  o C znotraj teh meja (npr. 18–20, 19–21 
ali 20–22  o C). Včasih je za spremljanje temperature ustrezno upora ­
biti dodatno preskusno posodo.  
1.8.1.7  Prezra čevanje  
Preskusne posode se med preskusom ne smejo prezra čevati.  
1.8.2  Preskusna koncentracija  
Navadno bi moralo biti vsaj pet preskusnih koncentracij, urejenih po 
geometrijskem zaporedju s faktorjem separacije, za katerega je najbolje, da ne presega 3,2, uporabiti pa je treba tudi ustrezno število ponovitev za vsako preskusno koncentracijo (glej poglavje 1.8.1.3). 
Pri uporabi manj od petih koncentracij je treba to utemeljiti. Snovi se 
ne preskušajo nad njihovo mejo topnosti v preskusnem mediju.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1254
 
Pri določanju razpona koncentracij se upošteva naslednje: 
(i) Če je cilj ugotoviti LOEC/NOEC, mora biti najnižja preskusna 
koncentracija dovolj nizka, da plodnost pri tej koncentraciji ni značilno nižja od kontrolne. Če ni tako, je treba preskus pono ­
viti z manjšo najnižjo koncentracijo. 
(ii) Če je cilj ugotoviti LOEC/NOEC, mora biti najvišja preskusna 
koncentracija dovolj visoka, da je plodnost pri tej koncentraciji 
značilno nižja od kontrolne. Če ni tako, je treba preskus pono ­
viti z večjo najvišjo koncentracijo. 
(iii) Če se ocenjuje EC
 x za vplive na razmnoževanje, je priporo čljivo 
uporabiti zadostne koncentracije, da se EC  x lahko dolo či 
z ustrezno stopnjo zaupanja. Če se ocenjuje EC  50 za vpliv na 
razmnoževanje, je priporo čljivo, da je najvišja preskusna 
koncentracija ve čja od te EC  50 . Drugače bo sicer še vedno 
mogoče oceniti EC  50 , vendar bo interval zaupanja za ta EC  50 
zelo širok in morda ne bo mogo če zadovoljivo oceniti primer ­
nosti prilagojenega modela. 
(iv) Najbolje je, da razpon preskusnih koncentracij ne zajema 
koncentracij, ki imajo statisti čno značilen vpliv na preživetje 
odraslih, saj bi se s tem spremenila vrsta preskusa iz preprostega preskusa razmnoževanja v sestavljen preskus razmnoževanja in 
smrtnosti, za katerega je potrebna veliko bolj zapletena stati ­
stična analiza. 
Predhodno poznavanje toksi čnosti preskusne snovi (npr. iz akutnega 
preskusa in/ali študij za dolo čanje obmo čja) bi moralo biti v pomo č 
pri izbiranju ustreznih preskusnih koncentracij. 
Če se za lažjo pripravo preskusnih raztopin uporabi topilo ali disper ­
zijsko sredstvo (glej poglavje 1.6.4), njegova kon čna koncentracija 
v preskusni posodi ne sme presegati 0,1 ml/l in mora biti enaka 
v vseh preskusnih posodah.
 
1.8.3  Kontrole  
Poleg preskusne serije je treba izvesti kontrolno serijo s preskusnim 
medijem in, če je ustrezno, kontrolno serijo s topilom ali disperzij 
skim sredstvom. Če se uporabi topilo ali disperzij sko sredstvo, mora 
biti njegova koncentracija enaka tisti v posodah s preskusno snovjo. Uporabiti je treba ustrezno število ponovitev (glej poglavje 1.8.1.3). 
Na splošno bi moral biti pri pravilno izvedenem preskusu koeficient 
variacije okoli srednjega števila živih potomcev na starša v kontrolah ≤ 25 % in o tem je treba poro čati pri načrtih preskusa, pri katerih se 
uporabljajo posami čno razporejene živali.
 
1.8.4  Obnavljanje preskusnega medija  
Pogostost obnavljanja medija je odvisna od stabilnosti preskusne 
snovi, vendar mora biti vsaj trikrat na teden. Če je iz predhodnih 
preskusov stabilnosti (glej poglavje 1.4) razvidno, da koncentracija 
preskusne snovi ni stabilna (t.j. da je izven obmo čja 80–120 % 
nominalne ali pod 80 % izmerjene za četne koncentracije) 
v najdaljšem obdobju obnovitve (t.j. tri dni), je treba razmisliti 
o bolj pogostem obnavljanju medija ali o uporabi preto čnega 
preskusa.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1255
 
Ko se medij obnavlja pri semi-stati čnem preskusu, se pripravi druga 
serija preskusnih posod, vanje pa se prenese starše, na primer 
s stekleno pipeto primernega premera. Prostornina medija, prenese ­
nega z vodnimi bolhami, mora biti čim manjša.  
1.8.5  Opazovanja  
Rezultati opazovanj med preskusom naj se navedejo na podatkovnem 
listu (glej primere v dodatkih 3 in 4). Če so potrebne druge meritve 
(glej 1.3 in 1.8.8), so lahko potrebna dodatna opazovanja.  
1.8.6  Potomci  
Najbolje je, da se potomci posameznega starša odstranijo in prešte ­
jejo vsakodnevno od pojava prvega zaroda, da ne bi jedli hrane, 
namenjene odraslim. Za namen te metode je treba prešteti samo število živih potomcev, vendar je treba zabeležiti prisotnost nedozo ­
relih jajčec ali mrtvih potomcev.
 
1.8.7  Smrtnost  
Smrtnost med starši je najbolje beležiti dnevno, vsaj ob časih, ko se 
štejejo potomci.  
1.8.8  Drugi parametri  
Čeprav je ta metoda namenjena predvsem ocenjevanju u činkov na 
razmnoževanje, so lahko tudi drugi vplivi v zadostni meri kvantifi ­
cirani za statisti čno analizo. Meritve rasti so zelo zaželene, saj dajejo 
informacije o morebitnih subletalnih u činkih, ki so lahko bolj kori ­
stne od samih meritev razmnoževanja; priporo čeno je merjenje 
dolžine staršev (t.j. dolžine telesa, razen analne osti) na koncu 
preskusa. Drugi parametri, ki se lahko izmerijo ali izra čunajo, so 
čas do pojava prvega zaroda (in naslednjih zarodov), število in veli ­
kost zarodov na žival, število nedozorelih zarodov, prisotnost samcev 
ali efipijev in za populacijo zna čilna stopnja rasti.  
1.8.9  Pogostost analitskih dolo čitev in meritev  
Koncentracijo kisika, temperaturo, trdoto in vrednosti pH je treba 
meriti vsaj enkrat tedensko v svežih in starih medijih, kontrolah in 
najvišjih koncentracijah preskusne snovi. 
Med preskusom se v rednih časovnih presledkih dolo čajo koncen ­
tracije preskusne snovi. 
Pri semi-stati čnih preskusih, pri katerih se pri čakuje, da bo koncen ­
tracija preskusne snovi ostala znotraj ± 20 % nominalne vrednosti 
(t.j. znotraj obmo čja 80–120 % – glej 1.4 in 1.8.4), je priporo čeno, 
da se analizirajo vsaj najvišje in najnižje preskusne koncentracije, ko so sveže pripravljene, in ob eni od obnovitev v prvem tednu preskusa (t.j. analize je treba opraviti na vzorcu iste raztopine – ko 
je sveže pripravljena in ob obnovitvi). Te dolo čitve naj se potem 
ponavljajo najmanj tedensko.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1256
 
Pri preskusih, pri katerih se ne pri čakuje, da bo koncentracija 
preskusne snovi ostala znotraj ± 20 % nominalne vrednosti, je 
treba analizirati vse preskusne koncentracije, ko so sveže pripravljene in ob obnovitvi. Vendar se lahko pri preskusih, pri katerih izmerjena začetna koncentracija preskusne snovi ni znotraj ± 20 % nominalne 
vrednosti, a se lahko zagotovijo zadostni dokazi, da so za četne 
koncentracije ponovljive in stabilne (t.j. znotraj obmo čja 80–120 % 
začetnih koncentracij), se kemijske dolo čitve v drugem in tretjem 
tednu preskusa lahko skr čijo na najvišje in najnižje preskusne 
koncentracije. V vseh primerih je treba dolo čitev koncentracij 
preskusne snovi pred obnovitvijo izvesti samo za eno ponovitveno posodo pri vsaki preskusni koncentraciji. 
Za pretočni preskus je ustrezen podoben režim vzor čenja kot je 
opisan za semi-stati čne preskuse (vendar v tem primeru ni merjenja 
„starih“ raztopin). Vseeno je priporo čljivo pove čati pogostost 
jemanja vzorcev v prvem tednu (npr. trije nizi meritev) za zagotovi ­
tev, da so preskusne koncentracije ostale stabilne. Pri tej vrsti preskusa se dnevno preverja pretok razred čila in preskusne snovi. 
Če obstajajo dokazi, da je bila koncentracija preskusne snovi ves čas 
trajanja preskusa zadovoljivo znotraj ± 20 % nominalne ali izmerjene začetne koncentracije, lahko rezultati temeljijo na nominalni ali 
izmerjeni za četni vrednosti. Če je odmik od nominalne ali izmerjene 
začetne koncentracije ve čji od ± 20 %, je treba rezultate izraziti kot 
časovno tehtano sredino (glej Dodatek 5).
 
2. PODATKI IN PORO ČANJE  
2.1 OBDELAVA REZULTATOV 
Namen tega preskusa je dolo čiti vpliv preskusne snovi na skupno 
število živih potomcev na starša, ki je ob koncu preskusa živ. 
Skupno število potomcev na starša se izra čuna za vsako preskusno 
posodo (t.j. ponovitev). Če v kateri koli ponovitvi starš med 
preskusom pogine ali se zanj izkaže, da je samec, se ponovitev izključi iz analize. Analiza potem temelji na zmanjšanem številu 
ponovitev. 
Za ocenitev LOEC in s tem NOEC za u činke kemikalije na sposob ­
nost razmnoževanja je treba izra čunati srednjo sposobnost razmno ­ 
ževanja za ponovitve za vsako koncentracijo in standardni odklon ostanka združenih podatkov („pooled“), kar se lahko naredi s pomočjo analize variance (ANOVA). Srednjo vrednost za vsako 
koncentracijo je treba nato primerjati s srednjo vrednostjo kontrole 
s pomočjo ustrezne metode multiple primerjave. Koristna sta lahko 
Dunnettov in Williamsov test (14) (15) (16) (17). Treba je preveriti, ali drži predpostavka ANOVA o homogenosti variance. Priporo čeno 
je, da se to naredi grafi čno, kot pa s formalnim preskusom zna čil­
nosti (18); primerna alternativa je izvedba Bartlettovega testa. Če ta 
predpostavka ne drži, je treba razmisliti o preoblikovanju podatkov za homogenizacijo varianc pred izvedbo ANOVA ali pa se izvede 
tehtana ANOVA. Treba je izra čunati velikost u činka, zaznavnega 
z ANOVA (t.j. najmanjša zna čilna razlika), in o tem poro čati.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1257
 
Za ocenitev koncentracije, ki bi povzro čila 50-odstotno zmanjšanje 
razmnoževalne sposobnosti (t.j. EC  50 ), je treba primerno krivuljo, kot 
je logisti čna krivulja, prilagoditi podatkom s pomo čjo statisti čne 
metode, kot je metoda najmanjših kvadratov. Krivulja je lahko para ­
metrizirana, tako da je mogo če EC  50 in njeno standardno napako 
oceniti neposredno. To zelo olajša izra čun mej zaupanja za EC  50 . 
Razen če obstajajo dobri razlogi, da so boljše druga čne stopnje 
zaupanja, je treba navesti dvostranske 95-odstotne meje zaupanja. Najbolje je, če se postopek prilagajanja uporabi za ocenjevanje 
značilnosti neprilagojenosti. To se lahko naredi grafi čno ali 
z delitvijo vsote ostanka kvadratov na „komponente neprilagojeno ­
sti“ in „čiste napake“ ter izvedbo preskusa zna čilnosti za neprilago ­
jenost. Ker imajo tretiranja, pri katerih je plodnost visoka, verjetno 
večjo varianco števila mladi čev kot tretiranja, pri katerih je plodnost 
nizka, je treba razmisliti o tehtanju opaženih vrednosti, da bi se pokazale razli čne variance za razli čne tretirane skupine (za informa ­
cije o ozadju glej literaturo (18). 
Pri analiziranju podatkov iz kon čnega krožnega preskusa (2) je bila 
logistična krivulja prilagojena s pomo čjo naslednjega modela, čeprav 
je mogoče uporabiti tudi druge primerne modele:
 
Y ¼ c 
1 þ x 
x 0 Í Î  b 
pri čemer je: 
Y = skupno število mladi čev na starša, živega ob koncu preskusa 
(izračunano za vsako posodo) 
x = koncentracija snovi 
c = pri čakovano število mladi čev pri x = 0 
x 0 = EC  50 populacije 
b = parameter nagiba Ta model bo verjetno primeren v mnogih primerih, vendar obstajajo 
preskusi, za katere ni ustrezen. Preveriti je treba veljavnost modela, kot je nakazano zgoraj. V nekaterih primerih je lahko ustrezen model hormeze, pri katerem nizke koncentracije povzro čajo pove čane 
učinke (19). 
Oceniti je mogo če tudi druge koncentracije z u činkom, kot sta EC
 10 
ali EC  20 , čeprav je morda bolje uporabiti druga čno parametrizacijo 
modela od tiste, uporabljene za ocenitev EC  50 . 
2.2 PORO ČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje:  
2.2.1  Preskusna snov:  
— fizikalno stanje in ustrezne fizikalno-kemijske lastnosti,  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1258
 
— identifikacijski podatki o kemikaliji, vklju čno s čistostjo.  
2.2.2  Preskusne vrste:  
— klon (ali je bil genetsko tipiziran), dobavitelj ali vir ( če je znano) 
in uporabljeni pogoji gojenja. Če se ne uporabi vrsta  Daphnia 
magna, je  treba o tem poro čati in to utemeljiti.  
2.2.3  Preskusni pogoji:  
— uporabljen preskusni postopek (npr. semi-stati čni ali preto čni, 
prostornina, obremenitev s številom vodnih bolh na liter), 
— fotoperioda in jakost svetlobe, 
— načrt preskusa (npr. število ponovitev, število staršev na ponovitev), 
— podrobnosti o uporabljenem gojitvenem mediju, 
— dodatki organskega materiala, če so uporabljeni, vklju čno 
s sestavo, virom, metodo priprave, TOC/KPK osnovnih priprav ­
kov, oceno posledi čnega TOC/KPK v preskusnem mediju, 
— podrobne informacije o hranjenju, vklju čno s koli čino (v mg 
C/vodno bolho/dan) in razporedom (npr. vrsta hrane, pri algah 
vključno z imenom vrste in, če je znano, sevom, pogoji gojenja 
kulture), 
— metoda priprave osnovne raztopine in pogostost obnavljanja ( če 
je uporabljeno topilo ali disperzijsko sredstvo, ga je treba navesti, 
prav tako njegovo koncentracijo).  
2.2.4  Rezultati  
— rezultati kakršnih koli predhodnih študij obstojnosti preskusne 
snovi, 
— nominalne preskusne koncentracije in rezultati vseh analiz za 
določanje koncentracije preskusne snovi v preskusnih posodah 
(glej primer podatkovnega lista v Dodatku 4); poro čati je treba 
tudi o uspešnosti rekuperacije metode in o meji dolo čanja, 
— kakovost vode v preskusnih posodah (t.j. pH, temperatura in 
koncentracija raztopljenega kisika ter TOC in/ali KPK in trdota, 
kjer je ustrezno) (glej primer podatkovnega lista v Dodatku 3), 
— popolna evidenca živih potomcev na vsakega starša (glej primer 
podatkovnega lista v Dodatku 3), 
— število smrti pri starših in dan posameznih smrti (glej primer 
podatkovnega lista v Dodatku 3), 
— koeficient variacije za plodnost kontrol (na osnovi skupnega 
števila živih potomcev na živega starša ob koncu preskusa), 
— graf skupnega števila živih potomcev na ob koncu preskusa 
živega starša (za vsako ponovitev) v odvisnosti od koncentracije preskusne snovi, 
— najnižja koncentracija z opaznim u činkom (LOEC) na razmnože ­
vanje, vklju čno z opisom uporabljenega statisti čnega postopka in 
navedbo, velikosti u činka, ki je bil zaznan, ter koncentracija brez 
opaznega u činka (NOEC) na razmnoževanje; kjer je ustrezno, je 
treba poro čati tudi o LOEC/NOEC za smrtnost staršev,
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1259
 
— kjer je ustrezno, EC  x za razmnoževanje ter intervali zaupanja in 
graf prilagojenega modela („fitted model“), uporabljenega za njen 
izračun, nagib krivulje odmerek/odziv in njena standardna 
napaka, 
— drugi opaženi biološki u činki ali meritve: poro čajte o vseh drugih 
bioloških u činkih, ki so bili opaženi ali izmerjeni (npr. rast star ­ 
šev), vklju čno z morebitno ustrezno utemeljitvijo, 
— razlaga kakršnega koli odstopanja od preskusne metode.  
3. LITERATURA  
(1) OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on 
the Daphnia magna  Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 
20–21 March 1993. 
(2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Series 
on Testing and Assessment No.6. Report of the Final Ring 
Test of the  Daphnia magna  Reproduction Test Paris. 1997. 
(3) Baird D.J., Barber J., Bradley M.C., Soares A.M.V.M. and 
Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of  Daphnia magna  Strauss. 
Ecotoxicology and Environmental Safety, 21, 257–265. 
(4) Elendt B.P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An 
ultrastructural approach to antennal damage in  Daphnia 
magna  Straus. Protoplasma, 154, 25–33. 
(5) EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of 
Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine 
Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio. 
(6) Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring 
waters as standard medium for culturing  Daphnia magna.  Bull. 
Environ. Contam. Toxicol.,47, 775–782. 
(7) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity 
Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729- 88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia 
P.A., str. 20. 
(8) Baird D.J., Soares A.M.V.M., Girling A., Barber J., Bradley 
M.C. and Calow P. (1989). The long term maintenance of  
Daphnia magna  Straus for use in ecotoxicological tests; 
problems and prospects. In: Proceedings of the 1st European 
Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H.Lokke, 
H. Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.), str. 144–148. 
(9) Parkhurst B.R., Forte J.L. and Wright G.P. (1981). Reprodu ­
cibility of a life-cycle toxicity test with  Daphnia magna.  Bull. 
Environ. Contam. and Toxicol., 26, 1–8. 
(10) Cowgill U.M. and Milazzo D.P. (1990) The sensitivity of two 
cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), 185–196. 
(11) Korshikov (1990).  Pseudokirchneriella subcapitata  Hindak, F- 
1990. Biologice Prace, 36, 209. 
(12) Sims I.R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward 
a standard  Daphnia  juvenile production test. Environmental 
Toxicology and Chemistry, 12, 2053–2058.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1260
 
(13) Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the 
relationship between total organic carbon with three commonly 
used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, 459–466. 
(14) Dunnett C.W., (1955). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc, 50, 1096–1121. 
(15) Dunnett C.W., (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, 482–491. 
(16) Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27, 103–117. 
(17) Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28, 510–531. 
(18) Draper N.R. and Smith H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition, Wiley, N.Y. 
(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, 93–96. 
(20) Wilson E.O. and Bossert, W.H. (1971). A Primer of Population 
Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers. 
(21) Poole R.W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. 
Mc Graw Hill Series in Population Biology, New York, 
str. 532. 
(22) Meyer J.S., Ingersoll C.G., McDonald L.L. and Boyce 
M.S. (1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, 1156–1166.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1261
 
DODATEK 1  
PRIPRAVA POPOLNOMA DEFINIRANIH MEDIJEV ELENDT M7 IN M4  
Aklimatizacija na medija Elendt M7 in M4  
Nekateri laboratoriji so imeli težave pri neposrednem prenosu vodnih bolh 
v medija M4 (1) in M7. Vendar je bilo doseženega nekaj uspeha s postopno 
prilagoditvijo, tj. selitvijo iz lastnega medija v 30-odstotni Elendt, nato v 60- 
odstotni Elendt in potem v 100-odstotnega. Za prilagoditev je lahko potreben do en mesec časa.
 
PRIPRAVA  
Elementi v sledeh  
Najprej se pripravijo lo čene osnovne raztopine (I) posameznih elementov v sledeh 
v primerno čisti vodi, npr. deionizirani, destilirani ali izpostavljeni obratni osmozi. 
Iz teh razli čnih osnovnih raztopin (I) se pripravi druga enotna osnovna raztopina 
(II), ki vsebuje vse elemente v sledeh (sestavljena raztopina), tj.:  
Osnovne raztopine I 
(posamezne snovi) Količina, dodana 
vodi 
mg/l Koncentr acija 
(glede na medij 
M4) 
(kratna) Za pripravo sestavljene osnovne 
raztopine II se vodi dodajo naslednje 
količine osnovne raztopine I 
ml/l 
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190 20 000 1,0 0,25 
MnCl  2 * 4 H  2 O 7 210 20 000 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000 1,0 0,25 RbCl 1 420 20 000 1,0 0,25 SrCl
 2 * 6 H  2 O 3 040 20 000 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000 1,0 0,25 
Na 2 MoO  4 * 2 H  2 O 1 260 20 000 1,0 0,25 
CuCl  2 * 2 H  2 O 335 20 000 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000 1,0 1,0 
CoCl  2 * 6 H  2 O 200 20 000 1,0 1,0 
KI 65 20 000 1,0 1,0 Na
 2 SeO  3 43,8 20 000 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000 1,0 1,0 
Na 2 EDTA * 2 H  2 O 5 000 2 000 — — 
FeSO  4 * 7 H  2 O 1 991 2 000 — — 
Raztopini Na  2 EDTA in FeSO  4 se pripravita lo čeno, zlijeta se skupaj in takoj avtoklavirata. S tem nastane: 
Raztopina 21 Fe-EDTA 1 000-kratna 20,0 5,0  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1262
 
Medija M4 in M7  
Medija M4 in M7 se pripravita iz osnovne raztopine II, makronutrientov in 
vitaminov na naslednji na čin: 
Količina, dodana 
vodi 
mg/l Koncentra cija 
(glede na medij 
M4) 
(kratna) Količina osnovne raztopine, dodane za 
pripravo medija 
ml/l 
M4 M7  
Osnovna raztopina II s kombiniranimi 
elementi v sledeh 20 50 50 
Osnovne raztopine makronutrientov (posamezna snov) 
CaCl  2 * 2 H  2 O 293 800 1 000 1,0 1,0 
MgSO  4 * 7 H  2 O 246 600 2 000 0,5 0,5 
KCl 58 000 10 000 0,1 0,1 NaHCO
 3 64 800 1 000 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 * 9 H  2 O 50 000 5 000 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000 0,1 0,1 
Sestavljena osnovna raztopina vitaminov — 10 000 0,1 0,1 Sestavljena osnovna raztopina vitaminov se pripravi z dodatkom 3 vitaminov v 1 liter vode, kot je prikazano spodaj: 
Tiamin hidroklorid 750 10 000 — — 
Cianokobalamin (B
 12 ) 10 10 000 — — 
Biotin 7,5 10 000 — —  
Sestavljena osnovna raztopina vitaminov se hrani zamrznjena v majhnih alikvotih. Vitamini se dodajo medijem tik pred uporabo.  
Opombe  Da se pri pripravi celotnih medijev ne bi obarjale soli, se okoli 500–800 ml deionizirane vode dodajo alikvoti osnovnih 
raztopin in nato se razopina dopolni do 1 litra. 
Prva objava medija M4 je Elendt, B.P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructural approach to antennal 
damage in  Daphnia magna  Straus. Protoplasma, 154, 25–33.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1263
 
DODATEK 2  
ANALIZA SKUPNEGA ORGANSKEGA OGLJIKA (TOC) IN IZDELAVA 
NOMOGRAMA ZA VSEBNOST TOC V HRANI IZ ALG  
Priznano je, da se vsebnost ogljika v hrani iz alg navadno ne meri neposredno, 
temveč iz korelacij (t.j. nomogramov) z nadomestnimi meritvami, kot sta število 
celic alg ali absorpcija svetlobe. 
TOC je bolje meriti z visokotemperaturno oksidacijo kot z UV ali persulfatno 
metodo (glej The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total 
Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB). 
Za izdelavo nomograma je treba alge lo čiti od gojitvenega medija 
s centrifugiranjem, ki mu sledi resuspendiranje v destilirani vodi. Nadomestni 
parameter in koncentracija TOC za vsak vzorec se izmerita trikrat. Analizirati je 
treba negativne kontrole z destilirano vodo in izpeljati koncentracijo TOC iz koncentracije TOC v vzorcu alg. 
Nomogram mora biti linearen v zahtevanem razponu koncentracij ogljika. Primeri 
so navedeni spodaj.  
Opomba:  Ti primeri se ne smejo uporabiti za pretvorbo; bistvenega pomena je, 
da laboratoriji pripravijo svoje lastne nomograme.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1264
 
▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1265
 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1266
 ▼B 
DODATEK 3  
PRIMER PODATKOVNEGA LISTA ZA EVIDENTIRANJE OBNAVLJANJA MEDIJEV, PODATKOV FIZIKALNEGA/KEMIJSKEGA SPREMLJANJA, HRANJENJA, 
RAZMNOŽEVANJA VODNIH BOLH IN SMRTNOSTI PRI ODRASLIH  
Poskus št.: Za četni podatki Klon: Medij: Vrstahrane: Preskusna snov: Nominalna koncentracija: 
Dan 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
Obnovitev medija 
(odkljukaj) 
pH (  1 ) nov 
star 
O 2 mg/l (  1 ) nov 
star 
Temperatura (  o C) (  1 ) nov 
star 
Hranjenje (odkljukaj) 
Št. živih potomcev (  2 ) Skupaj 
Posoda1 2 
3 
4 5
 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1267
 ▼B 
Poskus št.: Za četni podatki Klon: Medij: Vrstahrane: Preskusna snov: Nominalna koncentracija: 
Dan 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
6 
7 8 9 10 
Skupaj 
Kumulativna smtnost pri 
odraslih (
 3 ) 
( 1 ) Navedite, katera posoda je bila uporabljena za poskus. 
( 2 ) Zabeležite smrt katere koli odrasle živali kot „M“ v ustreznem okvir čku. 
( 3 ) Zabeležite abortiran zarod kot „AB“ v ustreznem okvir čku.u.
 DODATEK 4  
PRIMER PODATKOVNEGA LISTA ZA EVIDENTIRANJE REZULTATOV KEMIJSKE ANALIZE  
(a) Izmerjene koncentracije  
Nominalna 
konc. Vzorec 1. tedna Vzorec 2. tedna Vzorec 3. tedna 
Svež Star Svež Star Svež Star  
(b) Izmerjene koncentracije kot odstotek nominalne vrednosti  
Nominalna 
konc. Vzorec 1. tedna Vzorec 2. tedna Vzorec 3. tedna 
Svež Star Svež Star Svež Star  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1268
 
DODATEK 5  
IZRAČUN ČASOVNO TEHTANE SREDINE  
Časovno tehtana sredina  
Ker se lahko koncentracija preskusne snovi v času med obnovitvami medija 
zniža, je treba razmisliti o tem, kakšne koncentracije izbrati kot reprezentativne 
za razpon koncentracij, ki so jim izpostavljene starševske vodne bolhe. Izbor 
mora temeljiti tako na bioloških kot statisti čnih vidikih. Če naj bi, na primer, 
na razmnoževanje najbolj vplivala najvišja koncentracija, ki so ji živali izposta ­
vljene, je treba uporabiti najvišjo koncentracijo. Če pa velja, da je bolj 
pomemben akumuliran ali dolgodobni u činek toksi čne snovi, je bolj ustrezna 
povprečna koncentracija. V tem primeru je ustrezno uporabiti povpre čje, ki je 
časovno tehtana srednja koncentracija, saj ta upošteva spreminjanje trenutne 
koncentracije v odvisnosti od časa. 
Slika 1  
Primer časovno tehtane sredine
  
Slika 1 prikazuje primer (poenostavljenega) preskusa, ki je trajal sedem dni, 
z obnovitvijo medija na dneve 0, 2 in 4. 
Tanka cikcakasta črta predstavlja koncentracijo v odvisnosti od časa. Padec 
koncentracije naj bi sledil eksponentnemu procesu razpadanja. 
Šest ozna čenih točk predstavlja ugotovljene koncentracije, izmerjene na 
začetku in na koncu posameznega obdobja obnovitve. 
Ravna debela črta kaže položaj časovno tehtane sredine. 
Časovno tehtana sredina se izra čuna tako, da je površina pod časovno tehtano 
sredino enaka površini pod krivuljo koncentracije. Izra čun za zgornji primer je 
naveden v tabeli 1.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1269
 
Tabela 1  
Izračun časovno tehtane sredine  
Obnovitev št. Dnevi Konc0 Konc1 Ln(Konc0) Ln(Konc1) Površina  
1 2 10,000 4,493 2,303 1,503 13,767 
2 2 11,000 6,037 2,398 1,798 16,544 3 3 10,000 4,066 2,303 1,403 19,781 
Skupaj dnevi: 7 Skupna povr ­ 
šina 50,091 
Časovno 
tehtana 
sredina 7,156
 
Dnevi  je število dni v obdobju obnovitve  
Konc0 je  koncentracija, izmerjena na za četku posameznega obdobna obnovitve  
Konc1  je koncentracija, izmerjena na koncu posameznega obdobna obnovitve  
Ln(Konc0)  je naravni logaritem Konc0  
Ln(Koncl)  je naravni logaritem Konc1  
Površina  je površina pod eksponentno krivuljo za posamezno obdobje obnovitve. Izra čuna 
se po ena čbi: 
Površina ¼ Conc 0 Ä Conc 1 
LnðConc 0Þ Ä LnðConc 1Þ Ü Dnevi  
Časovno tehtana sredina je  Skupna površina  deljena s  Skupaj dnevi.  
Seveda je treba za preskus z razmnoževanjem vodnih bolh tabelo razširiti na 21 
dni. 
Jasno je, da pri beleženju opažanj samo na za četku in na koncu posameznega 
obdobja obnovitve ni mogo če potrditi, ali je proces razpadanja dejansko ekspo ­
nenten. Pri druga čni krivulji bi prišlo do druga čnega izra čuna za  
Površino.  Vendar eksponenten proces razpadanja ni neverjeten in je verjetno 
najboljša krivulja, ki se jo da uporabiti v odsotnosti drugih informacij. 
Potrebna pa je previdnost, če na koncu obdobja obnovitve kemijska analiza ne 
pokaže obstoja snovi. Če ni mogo če oceniti, kako hitro snov izgine iz raztopine, 
je nemogo če dobiti realisti čno površino pod krivuljo in tako je torej nemogo če 
dobiti sprejemljivo časovno tehtano sredino.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1270
 
C.21  TALNI MIKROORGANIZMI: PRESKUS TRANSFORMACIJE 
DUŠIKA  
1. METODA  
Ta preskusna metoda ustreza metodi OECD TG 216 (2000).  
1.1 UVOD 
Ta preskusna metoda opisuje laboratorijsko metodo, namenjeno razi ­
skovanju dolgoro čnih učinkov kemikalij po enkratni izpostavljenosti 
na dejavnost talnih mikroorganizmov pri transformaciji dušika. Preskus na čeloma temelji na priporo čilih Evropske in sredozemske 
organizacije za varstvo rastlin (1). Vendar so bile upoštevane tudi 
druge smernice, na primer smernice Nemškega zveznega zavoda za 
biologijo (2), Ameriške agencije za varstvo okolja (3) SET AC (4) in Mednarodne organizacije za standardizacijo (5). Na delavnici OECD o izbiri tal/usedline, ki je bila leta 1995 v Belgiratu v Italiji (6), je bil 
dosežen dogovor o številu in vrstah tal za uporabo v tem preskusu. 
Priporočila za odvzemanje, obravnavanje in shranjevanje vzorcev tal 
temeljijo na napotkih ISO (7) in priporo čilih delavnice iz Belgirata. 
Pri ocenjevanju in vrednotenju toksi čnih lastnosti preskusnih snovi, 
je lahko potrebno dolo čanje učinkov na mikrobno dejavnost v tleh, 
npr. kadar so potrebni podatki o potencialnih stranskih u činkih 
izdelkov za zaš čito pridelka na talno mikrofloro ali kadar se pri ča­
kuje izpostavljenost mikroorganizmov kemikalijam, ki niso izdelki za 
zaščito pridelka. Preskus transformacije dušika se izvaja za dolo čitev 
učinkov teh kemikalij na talno mikrofloro. Če se preskušajo agroke ­
mikalije (npr. izdelki za zaš čito pridelka, gnojila, gozdarske kemika ­
lije), se izvedejo preskusi transformacije dušika in transformacije 
ogljika. Če se preskušajo kemikalije, ki niso agrokemikalije, zadoš ča 
preskus transformacije dušika. Če pa spadajo vrednosti preskusa 
transformacije dušika E
 50 za take kemikalije v izbor nitrifikacijskih 
inhibitorjev, ki so na voljo na tržiš ču (npr. nitrapirin), se lahko za 
pridobitev dodatnih informacij izvede preskus transformacije ogljika. 
Tla so sestavljena iz živih in neživih sestavin, ki obstajajo 
v sestavljenih in heterogenih zmeseh. Mikroorganizmi imajo pomembno vlogo pri razgradnji in transformaciji organskih snovi 
v rodovitnih tleh in številne vrste prispevajo k razli čnim vidikom 
rodovitnosti tal. Vsaka dolgoro čna motnja teh biokemi čnih procesov 
lahko potencialno vpliva na kroženje hranilnih snovi, to pa lahko spremeni rodovitnost tal. Transformacija ogljika in dušika se pojavlja 
v vseh rodovitnih vrstah tal. Čeprav se mikrobne združbe, ki so 
odgovorne za te procese, razlikujejo od ene do druge vrste tal, so poti transformacije v bistvu enake. 
Ta opisana preskusna metoda je namenjena odkrivanju dolgoro čnih 
škodljivih u činkov snovi na proces transformacije dušika v aerobnih 
površinskih vrstah tal. Preskusna metoda omogo ča tudi oceno 
učinkov snovi na transformacijo ogljika s talno mikrofloro. Nasta ­
janje nitrata sledi razgradnji vezi med ogljikom in dušikom. Zato je, če so v tretiranih in kontrolnih tleh ugotovljene enake stopnje nasta ­
janja nitrata, velika verjetnost, da so glavne poti razgradnje ogljika 
nedotaknjene in delujejo. Substrat, izbran za preskušanje (zdrob iz lucerne v prahu), ima ugodno razmerje ogljik-dušik (navadno med 12/1 in 16/1). Zato se pomanjkanje ogljika med preskusom zmanjša 
in če so mikrobne združbe zaradi kemikalije poškodovane, se lahko 
obnovijo v 100 dneh.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1271
 
Preskusi, na katerih je bila razvita ta preskusna metoda, so bili 
prvenstveno namenjeni za snovi, pri katerih je mogo če predvideti 
količino, ki bo prišla v tla. Tak primer so izdelki za zaš čito pridelka, 
pri katerih je stopnja uporabe na podro čju znana. Pri agrokemikalijah 
zadošča preskušanje dveh odmerkov, ki ustrezata pri čakovani ali 
napovedani stopnji uporabe. Agrokemikalije se lahko preskušajo 
kot aktivne sestavine (a.i.) ali kot formulirani pripravki. Vendar preskus ni omejen na agrokemikalije. S spreminjanjem obojega, koli ­ 
čine preskusne snovi, ki se uporabi v tleh, in na čina vrednotenja 
podatkov, se lahko preskus uporabi tudi za kemikalije, pri katerih 
ni znana koli čina, ki naj bi prišla v tla. Tako se s kemikalijami, ki 
niso agrokemikalije, dolo čijo učinki serije koncentracij pri transfor ­
maciji dušika. Podatki iz teh preskusov se uporabijo za pripravo 
krivulje odziva na odmerek in izra čun vrednosti EC
 x , kjer je 
x opredeljen % u činka.  
1.2 OPREDELITVE POJMOV  
Transformacija dušika:  je dokon čna razgradnja organske snovi, ki 
vsebuje dušik, z mikroorganizmi preko procesa amonifikacije in nitrifikacije do anorganskega kon čnega produkta nitrata.  
EC
 x (efektivna koncentracija):  je koncentracija preskusne snovi 
v tleh, ki daje x-odstotno inhibicijo transformacije dušika v nitrat.  
EC 50 (srednja efektivna koncentracija):  je koncentracija preskusne 
snovi v tleh, ki daje 50-odstotno (50 %) inhibicijo transformacije dušika v nitrat.
 
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Jih ni.  
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Presejana tla se dopolnijo z rastlinskim zdrobom v prahu in bodisi 
tretirajo s preskusno snovjo ali pustijo netretirana (kontrolna). Če se 
preskušajo agrokemikalije, se priporo ča najmanj dve preskusni 
koncentraciji, izbereta pa se glede na najve čjo pričakovano koncen ­
tracijo na podro čju. Po 0, 7, 14 dnevih in 28 dnevih inkubacije se 
z ustreznim topilom ekstrahira vzorce tretiranih in kontrolnih tal in določi količina nitrata v ekstraktih. Stopnja nastajanja nitrata 
v tretiranih vzorcih se primerja s stopnjo v kontrolnih vzorcih in 
izračuna odstotek odklona tretiranih od kontrolnih. Vsi preskusi 
trajajo najmanj 28 dni. Če so 28. dan razlike med tretiranimi in 
netretiranimi tlemi enake ali ve čje od 25 %, se merjenje nadaljuje 
do največ 100 dni. Če se preskušajo kemikalije, ki niso agrokemi ­
kalije, se v vzorce tal doda serija koncentracij preskusne snovi in po 
28 dnevih inkubacije se izmerijo koli čine nitrata, ki nastane 
v tretiranih in kontrolnih vzorcih. Z regresijskim modelom se anali ­
zirajo rezultati preskusov z ve č koncentracijami in izra čunajo vred ­
nosti EC
 x (to je EC  50 , EC  25 in/ali EC  10 ). Glej opredelitve pojmov.  
1.5 VELJAVNOST PRESKUSA 
Vrednotenje rezultatov preskusa z agrokemikalijami temelji na 
razmeroma majhnih razlikah (povpre čna vrednost ± 25 %) med 
koncentracijami nitrata v kontrolnih in tretiranih vzorcih tal, tako da lahko velike razlike v kontrolah vodijo v napa čne rezultate. 
Zato morajo biti razlike med ponovljenimi kontrolnimi vzorci manjše 
od ± 15 %.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1272
 
1.6 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.6.1  Naprave  
Za preskuse se uporabljajo posode iz kemijsko inertnega materiala. 
Imeti morajo ustrezno prostornino v skladu s postopkom, ki se 
uporablja za inkubacijo tal, se pravi za inkubacijo v razsutem stanju 
ali kot serija posameznih vzorcev tal (glej oddelek 1.7.1.2). Paziti je treba, da je med preskusom izguba vode čim manjša in da se 
omogoči izmenjava plinov (npr. posode za preskus so lahko pokrite 
s perforirano polietilensko folijo). Kadar se preskušajo hlapne snovi, 
je treba uporabiti zatesnjene, nepredušno zaprte posode. Te naj bodo take velikosti, da je približno ena četrtina prostornine napolnjena 
z vzorcem tal. 
Uporablja se standardna laboratorijska oprema, ki vklju čuje: 
— napravo za stresanje: mehanski mešalnik ali enakovredno 
opremo, 
— centrifugo (3 000 g) ali napravo za filtriranje (z uporabo filtrir ­
nega papirja, ki ne vsebuje nitrata), 
— instrument za analizo nitrata z ustrezno ob čutljivostjo in pono ­
vljivostjo.
 
1.6.2  Izbira in število tal  
Uporabljajo se samo ena tla. Priporo čene lastnosti tal so: 
— vsebnost peska: ne manj kakor 50 % in ne ve č kakor 75 %, 
— pH: 5,5–7,5, 
— vsebnost organskega ogljika: 0,5–1,5 %, — mikrobno biomaso je treba izmeriti (8) (9) in njena vsebnost 
ogljika naj bo vsaj 1 % skupnega organskega ogljika tal. 
V večini primerov predstavljajo tla s temi lastnostmi najslabše 
možno stanje, ker je adsorpcija preskusne kemikalije najmanjša in 
razpoložljivost za mikrofloro najve čja. Zato navadno niso potrebni 
preskusi z drugimi vrstami tal. Kljub temu je lahko v nekaterih primerih, npr. kadar je glavni del pri čakovane uporabe preskusne 
snovi v posebnih tleh, na primer kislih gozdnih, ali pri elektrosta ­
tično nabitih kemikalijah, potrebna uporaba dodatnih tal.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1273
 
1.6.3  Odvzemanje in shranjevanje vzorcev tal  
1.6.3.1  Odvzemanje  
Na voljo morajo biti podrobne informacije o preteklosti mesta vzor ­ 
čenja, kjer se odvzemajo tla za preskus. Podrobnosti vklju čujejo 
točno lokacijo, pokritost z vegetacijo, datume uporabe izdelkov za 
zaščito pridelka, uporabo organskih in anorganskih gnojil, dodatke 
bioloških materialov ali naklju čno kontaminacijo. Mesto, izbrano za 
odvzemanje tal, naj omogo ča dolgotrajno uporabo. Primerni so trajni 
pašniki, polja z letnimi posevki žit (razen koruze) ali gosto pose ­
janim zelenim gnojilom. Izbrano mesto vzor čenja najmanj eno leto 
pred jemanjem vzorcev ne sme biti tretirano z izdelki za zaš čito 
pridelka. Tudi organska gnojila se ne smejo uporabljati najmanj 
šest mesecev. Sprejemljiva je samo uporaba mineralnega gnojila, kadar je v skladu z zahtevami posevka, vzorcev tal pa se ne sme vzeti še najmanj tri mesece po uporabi gnojila. Uporabi tal, tretiranih 
z gnojili, ki imajo znane biocidne u činke (npr. kalcijev cianamid), se 
je treba izogibati. 
Vzorčenju se je treba izogibati med dolgimi obdobji (daljšimi od 30 
dni) suše ali poplave in takoj po njih. Pri zoranih tleh se vzorci jemljejo iz globine od 0 do 20 cm globine. Pri traviš čih (pašnikih) 
ali drugih tleh, ki dolgo niso preorana (najmanj eno sezono), je 
največja globina vzor čenja lahko malo ve č kakor 20 cm (npr. do 
25 cm). 
Vzorce tal je treba prenašati v posodah in v temperaturnih razmerah, 
ki zagotavljajo, da se prvotne lastnosti tal bistveno ne spremenijo.
 
1.6.3.2  Shranjevanje  
Najbolje je uporabiti tla, na sveže odvzeta na terenu. Če se shranje ­
vanju v laboratoriju ne da izogniti, se lahko vzorci tal shranjujejo 
največ tri mesece v temi pri 4 ± 2  o C. Med shranjevanjem tal morajo 
biti zagotovljeni aerobni pogoji. Če se tla odvzemajo na obmo čjih, ki 
so zamrznjena najmanj tri mesece na leto, je treba razmisliti o shranitvi za šest mesecev pri –18
 o C do –22  o C. Mikrobna biomasa 
shranjenih tal se izmeri pred vsakim poskusom in ogljika v biomasi 
mora biti najmanj 1 % skupne vsebnosti organskega ogljika v tleh (glej oddelek 1.6.2).
 
1.6.4  Ravnanje s tlemi in priprava na preskus  
1.6.4.1  Predhodna inkubacija  
Če so bila tla shranjena (glej oddelek 1.6.3.2), se priporo ča pred­
hodna inkubacija za čas od 2 do 28 dni. Temperatura in vsebnost 
vlage tal med predhodno inkubacijo naj bosta podobni kakor med 
preskusom (glej oddelka 1.6.4.2 in 1.7.1.3).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1274
 
1.6.4.2  Fizikalno-kemijske lastnosti  
Iz tal se ro čno odstranijo ve čji objekti (npr. kamni, deli rastlin itd.), 
nato se vlažno presejejo brez odve čnega sušenja na velikost delcev, 
ki so manjši ali enaki 2 mm. Vsebnost vlage v vzorcu tal je treba 
prilagoditi z destilirano ali deionizirano vodo na vrednost med 40 % 
in 60 % najve čje zmogljivosti zadrževanja vode.  
1.6.4.3  Dopolnitev z organskim substratom  
Tla je treba dopolniti z ustreznim organskim substratom, npr. 
zdrobom iz travnato zelene lucerne v prahu (glavna sestavina: Medi ­
cago sativa) v razmerju C/N med 12/1 in 16/1. Priporo čeno razmerje 
lucerna/tla je 5 g lucerne na kilogram tal (suha teža).  
1.6.5  Priprava preskusne snovi za aplikacijo na tla  
Preskusna snov se normalno uporablja z nosilcem. Nosilec je lahko 
voda (za snovi, topne v vodi) ali inertna trdna snov, kot je droben 
kremenov pesek (velikost delcev: 0,1–0,5 mm). Teko čih nosilcev, ki 
niso voda (npr. organska topila, kot sta aceton, kloroform), se je treba izogibati, ker lahko škodijo mikroflori. Če se kot nosilec upora ­
blja pesek, se lahko prelije s preskusno snovjo, raztopljeno ali 
suspendirano v ustreznem topilu. V takih primerih je treba topilo 
pred mešanjem s tlemi odstraniti z izhlapevanjem. Za optimalno razporeditev preskusne snovi v tleh, se priporo ča razmerje 
10 g peska na kilogram tal (suhe teže). Kontrolni vzorci se tretirajo 
z enakovredno koli čino vode in/ali samo s kremenovim peskom. 
Pri preskušanju hlapnih kemikalij se je treba, kolikor je mogo če, 
izogniti izgubam in poskusiti zagotoviti homogeno porazdelitev 
v tleh (npr. preskusno snov je treba vbrizgati v tla na ve č mestih).
 
1.6.6  Preskusne koncentracije  
Če se preskušajo agrokemikalije, je treba uporabiti najmanj dve 
koncentraciji. Nižja koncentracija mora odražati najmanj najve čjo 
količino, za katero se pri čakuje, da bi jo tla dosegla v prakti čnih 
razmerah, višja koncentracija pa naj bo mnogokratnik nižje. Koncen ­
tracije preskusne snovi, dodane v tla, se izra čunajo ob predpostavki 
enotne vklju čitve v globino 5 cm in gostote tal v razsutem stanju 1,5. 
Za agrokemikalije, ki se aplicirajo neposredno na tla ali za kemika ­
lije, pri katerih je mogo če napovedati koli čino, ki pride v tla, so 
priporočene preskusne koncentracije najve čje predvidene koncentra ­
cije v okolju (PKO) in petkratniki te koncentracije. Snovi, za katere se pričakuje, da bodo v eni sezoni ve čkrat aplicirane na tla, je treba 
preskusiti pri koncentracijah, dobljenih z množenjem PKO 
z največjim pričakovanim številom aplikacij. Vendar zgornja presku ­ 
šena koncentracija ne sme presegati desetkratnika najve čje posa­
mične stopnje aplikacije. Če se preskušajo kemikalije, ki niso agro ­
kemikalije, se uporabi geometri čna serija najmanj petih koncentracij. 
Preskušene koncentracije naj zajemajo razpon, ki je potreben za 
določitev vrednosti EC
 x . ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1275
 
1.7 IZVEDBA PRESKUSA  
1.7.1  Pogoji izpostavljenosti  
1.7.1.1  Tretiranje in kontrola  
Če se preskušajo agrokemikalije, se tla razdelijo v tri dele enake 
teže. Dva dela se zmešata z nosilcem, ki vsebuje proizvod, tretji 
pa se zmeša z nosilcem brez proizvoda (kontrola). Priporo čajo se 
najmanj tri ponovitve s tretiranimi in netretiranimi tlemi. Če se 
preskušajo kemikalije, ki niso agrokemikalije, se tla razdelijo 
v šest delov enake teže. Pet vzorcev se zmeša z nosilcem, ki vsebuje 
preskusno snov, in šesti vzorec se zmeša z nosilcem brez kemikalije. Priporočajo se po tri ponovitve za tretirane vzorce in kontrolo. Paziti 
je treba, da se zagotovi homogeno razporeditev preskusne snovi 
v tretiranih vzorcih tal. Med mešanjem se je treba izogibati stiskanju tal in nastajanju kep.
 
1.7.1.2  Inkubacija vzorcev tal  
Inkubacija vzorcev tal se lahko izvede na dva na čina: kot vzorci treti ­
ranih in netretiranih tal v razsutem stanju ali kot serija posameznih podvzorcev vsakih tretiranih in netretiranih tal enake velikosti. Vendar 
pa se lahko, kadar se preskušajo hlapne snovi, preskus izvede samo 
s serijo posameznih podvzorcev tal. Kadar se tla inkubirajo v razsutem stanju, se pripravijo velike koli čine tretiranih in netretiranih tal, podv ­
zorci za analizo pa se jemljejo po potrebi med preskusom. Koli čina, ki 
se na začetku pripravi za vsako tretiranje in kontrolo, je odvisna od 
velikosti podvzorcev, števila za analizo uporabljenih ponovitev in pričakovanega najve čjega števila ponovitev vzor čenja. Tla, inkubirana 
v razsutem stanju, je treba pred podvzor čenjem temeljito premešati. 
Kadar se tla inkubirajo kot serija posameznih vzorcev tal, se vsak 
vzorec tretiranih in netretiranih tal v razsutem stanju razdeli na zahte ­
vano število podvzorcev in ti se uporabljajo po potrebi. Pri preskusih, kjer se lahko pri čakuje več kakor dve vzor čenji, je treba pripraviti 
dovolj vzorcev, ob upoštevanju vseh ponovitev in vseh vzor čenj. 
Najmanj tri ponovitve vzorcev tal za preskus je treba inkubirati v aerobnih pogojih (glej oddelek 1.7.1.1). Pri vseh preskusih je treba 
uporabljati ustrezne posode z dovolj velikim volumnom nad vzorcem, 
da se prepre či razvoj anaerobnih pogojev. Vendar pa se lahko, kadar se 
preskušajo hlapne snovi, preskus izvede samo s serijo posameznih podvzorcev tal.
 
1.7.1.3  Preskusni pogoji in trajanje  
Preskus se izvaja v temi pri sobni temperaturi 20 ± 2  o C. Vsebnost 
vlage v vzorcih tal se med preskusom vzdržuje med 40 % in 60 % 
največje zmogljivosti zadrževanja vode v tleh (glej oddelek 1.6.4.2) 
v razponu ± 5 %. Po potrebi se lahko doda destilirana, deionizirana voda. 
Najkrajše trajanje preskusov je 28 dni. Če se preskušajo agrokemi ­
kalije, se primerjajo stopnje nastajanja nitrata v tretiranih in 
kontrolnih vzorcih. Če se te na 28. dan razlikujejo za ve č kakor 
25 %, se preskus nadaljuje, dokler ni dosežena razlika, ki je enaka ali manjša od 25 % ali do najve č 100 dni, kar je prej. Pri kemika ­
lijah, ki niso agrokemikalije, se preskus prekine po 28 dneh. Na 28. 
dan se dolo čijo količine nitrata v vzorcih tretiranih in kontrolnih tal 
in izračunajo vrednosti EC
 x . ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1276
 
1.7.2  Vzor čenje in analiza tal  
1.7.2.1  Načrt za vzor čenje tal  
Če se preskušajo agrokemikalije, se vzorci tal 0., 7., 14. in 28. dan 
analizirajo na nitrat. Če se zahteva podaljšan preskus, je treba 
nadaljnje meritve opraviti v 14-dnevnih presledkih po 28. dnevu. 
Če se preskušajo kemikalije, ki niso agrokemikalije, se uporabi 
najmanj pet preskusnih koncentracij, vzorci tal pa se analizirajo na 
nitrat na za četku (dan 0) in na koncu obdobja izpostavljenosti (28 
dni). Če se zdi potrebno, se lahko doda še vmesno merjenje, npr. 7. 
dan. Podatki, dobljeni na 28. dan, se uporabljajo za dolo čitev vred­
nosti EC  x za kemikalijo. Po želji se lahko podatki o kontrolnih 
vzorcih iz dneva 0 uporabijo za poro čanje o za četni količini nitrata 
v tleh.  
1.7.2.2  Analiza vzorcev tal  
Količina nitrata, ki nastane v vsaki tretirani in kontrolni ponovitvi, se 
določi ob vsakem vzor čenju. Nitrat se ekstrahira iz tal s stresanjem 
vzorcev z ustreznim ekstrakcijskim topilom, npr. z 0,1 M raztopino 
kalijevega klorida. Priporo ča se razmerje 5 ml raztopine KCl na 
gram suhe teže tal. Da bi optimizirali ekstrakcijo, posode, v katerih so vzorci tal in ekstrakcijska raztopina, ne smejo biti ve č 
kakor do polovice polne. Mešanice se 60 minut stresajo s 150 obrati 
na minuto. Zmesi se centrifugirajo ali filtrirajo in teko če faze se 
analizirajo na nitrat. Teko či ekstrakti brez delcev se lahko pred 
analizo shranijo pri minus 20 ± 5
 o C za čas do šest mesecev.  
2. PODATKI  
2.1 OBDELAVA REZULTATOV 
Če so preskusi izvedeni z agrokemikalijami, je treba zabeležiti koli ­ 
čino nitrata, nastalega v vsaki ponovitvi vzorca tal, in podati 
povprečne vrednosti vseh ponovitev v tabelari čni obliki. Stopnje 
transformacije dušika se ovrednotijo z ustreznimi in splošno spreje ­
timi statisti čnimi metodami (npr. F-preskus, 5 % raven pomembno ­
sti). Količine nastalega nitrata so izražene v mg nitrata/kg suhe teže 
tal/dan. Stopnja nastajanja nitrata pri vsakem tretiranju se primerja 
s kontrolo in izra čuna odstotek odstopanja od kontrole. 
Če so preskusi izvedeni s kemikalijami, ki niso agrokemikalije, se 
določi količina nitrata, ki nastane v vsaki ponovitvi in pripravi 
krivulja odziva na odmerek za oceno vrednosti EC  x . Količine nitrata 
(to je mg nitrata/kg suhe teže tal), ugotovljene v tretiranih vzorcih po 28 dneh se primerjajo s koli činami, ugotovljenimi v kontroli. Iz teh 
podatkov se izra čuna % vrednosti inhibicije za vsak preskus koncen ­
tracije. Ti odstotki se potem glede na koncentracijo in statisti čne 
postopke uporabijo za izra čun vrednosti EC
 x . Intervali zaupanja 
(p = 0,95) za izra čunane EC  x so določeni tudi z uporabo standardnih 
postopkov (10) (11) (12). 
Preskusne snovi, ki vsebujejo velike koli čine dušika, lahko prispe ­
vajo h koli činam nitrata, ki nastanejo med preskusom. Če se te snovi 
preskusijo pri visoki koncentraciji (npr. kemikalije, za katere se pričakuje, da bodo uporabljene v ponovljenih aplikacijah), je 
v preskus treba vklju čiti ustrezne kontrole (to je tla plus preskusno 
snov, vendar brez rastlinskega zdroba). Podatki iz teh kontrol se 
morajo upoštevati pri izra čunih EC
 x . ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1277
 
2.2 RAZLAGA REZULTATOV 
Kadar se ocenjujejo rezultati iz preskusov z agrokemikalijami in je 
razlika med stopnjami nastalih nitratov med nižjim tretiranjem (to je največjo predvideno koncentracijo) in kontrolo pri katerem koli vzor ­ 
čenju po 28. dnevu enaka ali manjša od 25 %, se lahko oceni, da 
proizvod nima dolgoro čnega vpliva na transformacijo dušika v tleh. 
Kadar se vrednotijo rezultati iz preskusov s kemikalijami, ki niso agrokemikalije, se uporabijo vrednosti EC
 50 , EC  25 in/ali EC  10 . 
3 PORO ČANJE  
Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: 
Popolna identifikacija uporabljenih tal, vklju čno z: 
— geografsko oznako mesta (zemljepisno širino, zemljepisno dolži ­
no), 
— informacijami o preteklosti mesta preskusa (pokritost 
z vegetacijo, uporaba izdelkov za zaš čito pridelkov, uporaba 
gnojil, naklju čna kontaminacija itd.), 
— vrsto rabe (npr. kmetijsko zemljiš če, gozd itd.), 
— globino vzor čenja (cm), 
— vsebnostjo peska/mulja/gline ( % suhe teže), — pH (v vodi), 
— organsko vsebnostjo ogljika ( % suhe teže), 
— vsebnostjo dušika ( % suhe teže), — začetno koncentracijo nitrata (mg nitrata/kg suhe teže), 
— kationsko izmenjalno kapaciteto (mmol/kg), 
— mikrobno biomaso glede na odstotke skupnega organskega 
ogljika, 
— sklici na metode, uporabljene za dolo čanje posameznih parame ­
trov, 
— vsemi informacijami v zvezi z odvzemanjem in shranjevanjem 
vzorcev tal, 
— podrobnostmi o predhodni inkubaciji tal, če je bila. 
Preskusna snov: 
— fizikalno stanje in ustrezne fizikalno-kemijske lastnosti, 
— kemijske identifikacijske podatke, kadar je ustrezno, vklju čno 
s strukturno formulo, čistostjo (odstotek aktivne sestavine 
v izdelkih za zaš čito pridelka), vsebnostjo dušika. 
Substrat: 
— vir substrata, — sestavo (zdrob iz lucerne, zdrob iz travnato zelene lucerne), 
— vsebnost ogljika, dušika ( % suhe teže), 
— velikost presejanih delcev (mm).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1278
 
Preskusni pogoji: 
— podatke o dopolnitvi tal z organskim substratom, 
— število koncentracij uporabljene preskusne kemikalije in, kadar je 
primerno, utemeljitev izbranih koncentracij, 
— podatke o aplikaciji preskusne snovi na tla, 
— inkubacijsko temperaturo, 
— vsebnost vlage v tleh na za četku preskusa in med njim, 
— uporabljeno metodo inkubacije tal (v razsutem stanju ali kot 
serija posameznih podvzorcev), 
— število ponovitev, 
— število vzor čenj, 
— uporabljeno metodo za ekstrakcijo nitrata iz tal. 
Rezultati: 
— analiti čni postopek in opremo, uporabljeno za analizo nitrata, 
— tabelari čne podatke, vklju čno s posameznimi in srednjimi vred ­
nostmi meritev nitrata, 
— razliko med ponovitvami s tretiranimi in kontrolnimi vzorci, 
— razlage popravkov izra čunov, če je ustrezno, 
— odstotek razlik v stopnjah nastajanja nitrata pri vsakem vzor čenju 
ali, če je primerno, vrednost EC  50 s 95-odstotno mejo zaupanja, 
drugo EC  x (EC  25 ali EC  10 ) z intervalom zaupanja in graf krivulje 
odziva na odmerek, 
— statisti čno obdelavo rezultatov, 
— vse informacije in opažanja, koristne za razlago rezultatov 
preskusa.  
4. LITERATURA  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1–16, 1994. 
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1–1 (2nd eds., 1990). 
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guide ­
lines; Proposed rule. September 28, 1987. 
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SET AC-Europe, Brussels. 
(5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality – Determination of 
Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical 
Committee ISO/TC 190/SC 4:  Soil Quality – Biological 
Methods.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1279
 
(6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18–20 January 1995. 
(7) ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the 
collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. 
(8) ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration 
method. 
(9) ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method. 
(10) Litchfield, J.T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and 
Exper. Ther., 96, 99–113. 
(11) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New York. 
(12) Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1280
 
C.22  TALNI MIKROORGANIZMI: PRESKUS TRANSFORMACIJE 
OGLJIKA  
1. METODA  
Ta metoda ustreza metodi OECD TG 217 (2000).  
1.1 UVOD 
Ta preskusna metoda opisuje laboratorijsko metodo, namenjeno razi ­
skovanju potencialnih dolgoro čnih učinkov enkratne izpostavljenosti 
izdelkov za zaš čito pridelka in morebitnih drugih kemikalij na dejav ­
nost talnih mikroorganizmov pri transformaciji ogljika. Preskus na če­
loma temelji na priporo čilih Evropske in sredozemske organizacije 
za varstvo rastlin (1). Vendar so bile upoštevane tudi druge smernice, na primer smernice Nemškega zveznega zavoda za biologijo (2), Ameriške agencije za varstvo okolja (3) in SET AC (4). Na delavnici 
OECD o izbiri tal/usedline, ki je bila leta 1995 v Belgiratu v Italiji 
(5), je bil dosežen dogovor o številu in vrstah tal za uporabo v tem preskusu. Priporo čila za odvzemanje, obravnavanje in shranjevanje 
vzorcev tal temeljijo na napotkih ISO (6) in priporo čilih delavnice iz 
Belgirata. 
Pri ocenjevanju in vrednotenju toksi čnih lastnosti preskusnih snovi, 
je lahko potrebno dolo čanje učinkov na mikrobno dejavnost v tleh, 
npr. kadar so potrebni podatki o potencialnih stranskih u činkih 
izdelkov za zaš čito pridelka na talno mikrofloro ali kadar se pri ča­
kuje izpostavljenost mikroorganizmov kemikalijam, ki niso izdelki za zaščito pridelka. Preskus transformacije ogljika se izvaja za dolo čitev 
učinkov teh kemikalij na talno mikrofloro. Če se preskušajo agroke ­
mikalije (npr. izdelki za zaš čito pridelka, gnojila, gozdarske kemika ­
lije), se izvedejo preskusi transformacije ogljika in transformacije dušika. Če se preskušajo kemikalije, ki niso agrokemikalije, zadoš ča 
preskus transformacije dušika. Če pa spadajo vrednosti preskusa 
transformacije dušika E
 50 za take kemikalije v izbor nitrifikacijskih 
inhibitorjev, ki so na voljo na tržiš ču (npr. nitrapirin), se lahko 
preskus transformacije ogljika izvede za pridobitev dodatnih infor ­
macij. 
Tla so sestavljena iz živih in neživih sestavin, ki obstajajo 
v sestavljenih in heterogenih zmeseh. Mikroorganizmi imajo pomembno vlogo pri razgradnji in transformaciji organskih snovi v rodovitnih tleh in številne vrste prispevajo k razli čnim vidikom 
rodovitnosti tal. Vsaka dolgoro čna motnja teh biokemi čnih procesov 
lahko potencialno vpliva na kroženje hranilnih snovi, to pa lahko spremeni rodovitnost tal. Transformacija ogljika in dušika se pojavlja v vseh rodovitnih vrstah tal. Čeprav se mikrobne združbe, ki so 
odgovorne za te procese, razlikujejo od ene do druge vrste tal, so 
poti transformacije v bistvu enake.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1281
 
Ta preskusna metoda je namenjena odkrivanju dolgoro čnih škod­
ljivih učinkov snovi na proces transformacije ogljika v aerobnih 
površinskih vrstah tal. Preskus je ob čutljiv na spremembe velikosti 
in dejavnosti mikrobnih združb, ki so odgovorne za transformacijo ogljika, ker so te združbe odvisne od poudarjene kemikalije in 
pomanjkanja ogljika. Uporabijo se peš čena tla z malo organskih 
snovi. Ta tla se tretirajo s preskusno snovjo in inkubirajo v pogojih, ki omogo čajo hitro mikrobiološko presnovo. V teh 
pogojih se viri razpoložljivega ogljika v tleh hitro praznijo. To 
povzroča pomanjkanje ogljika, ki ubija mikrobne celice in povzro ča 
mrtvilo in/ali spomlacijo. Če teče preskus ve č kakor 28 dni, se lahko 
vsota teh reakcij izmeri v kontrolah (netretiranih tleh) kot progre ­
sivna izguba presnovno aktivne mikrobne biomase (7). Če je 
biomasa v tleh s poudarjenim ogljikom v teh pogojih preskusa priza ­
deta zaradi navzo čnosti kemikalije, se morda ne vrne na enako raven 
kot kontrola. Zato motnje, ki jih povzro či preskusna snov kadar koli 
med preskusom, pogosto trajajo do konca preskusa. 
Preskusi, na katerih je bila razvita ta preskusna metoda, so bili 
prvenstveno namenjeni za snovi, pri katerih je mogo če predvideti 
količino, ki bo prišla v tla. Tak primer so izdelki za zaš čito pridelka, 
pri katerih je stopnja uporabe na podro čju znana. Pri agrokemikalijah 
zadošča preskušanje dveh odmerkov, ki ustrezata pri čakovani ali 
napovedani stopnji uporabe. Agrokemikalije se lahko preskušajo 
kot aktivne sestavine (a.i.) ali kot formulirani pripravki. Vendar 
preskus ni omejen na kemikalije s predvidenimi koncentracijami v okolju. S spreminjanjem obojega, koli čine preskusne snovi, ki se 
uporabi v tleh, in na čina vrednotenja podatkov, se lahko preskus 
uporabi tudi za kemikalije, pri katerih ni znana koli čina, ki naj bi 
prišla v tla. Tako se s kemikalijami, ki niso agrokemikalije, dolo čijo 
učinki serije koncentracij pri transformaciji ogljika. Podatki iz teh 
preskusov se uporabijo za pripravo krivulje odziva na odmerek in 
izračun vrednosti EC
 x , kjer je x opredeljen % u činka.  
1.2 OPREDELITVE POJMOV  
Transformacija ogljika:  je razgradnja organske snovi 
z mikroorganizmi, pri kateri nastane anorganski kon čni produkt 
ogljikov dioksid.  
EC x (efektivna koncentracija):  je koncentracija preskusne snovi 
v tleh, ki daje x-odstotno inhibicijo transformacije ogljika v ogljikov dioksid.  
EC
 50 (srednja efektivna koncentracija):  je koncentracija preskusne 
snovi v tleh, ki daje 50-odstotno inhibicijo transformacije ogljika v ogljikov dioksid.
 
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Jih ni.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1282
 
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Presejana tla se bodisi tretirajo s preskusno snovjo ali pustijo netre ­
tirana (kontrolna). Če se preskušajo agrokemikalije, se priporo ča 
najmanj dve preskusni koncentraciji, izbereta pa se glede na najve čjo 
pričakovano koncentracijo na podro čju. Po 0, 7, 14 dnevih in 28 
dnevih inkubacije se tretirane in kontrolne vzorce tal pomeša z glukozo, stopnje respiracije, ki jo povzro či glukoza, pa se merijo 
12 zaporednih ur. Stopnje respiracije so izražene kot sproš čeni 
ogljikov dioksid (mg ogljikovega dioksida/kg suhih tal/uro) ali kot 
porabljeni kisik (mg kisika/kg tal/uro). Povpre čna stopnja respiracije 
v vzorcih tretiranih tal se primerja s stopnjo v kontrolni in se izra ­ 
čuna odstotek odstopanja tretiranih tal od kontrolnih. Vsi preskusi 
trajajo najmanj 28 dni. Če so 28. dan razlike med tretiranimi in 
netretiranimi tlemi enake ali ve čje od 25 %, se merjenje v 14- 
dnevnih presledkih nadaljuje do najve č 100 dni. Če se preskušajo 
kemikalije, ki niso agrokemikalije, se v vzorce tal doda serija 
koncentracij preskusne snovi in po 28 dnevih se izmerijo stopnje respiracije, ki jih povzro či glukoza (to je povpre čna količina nasta­
lega ogljikovega dioksida ali porabljenega kisika). Z regresijskim 
modelom se analizirajo rezultati preskusov s serijo koncentracij in 
izračunajo vrednosti EC
 x (to je EC  50 , EC  25 in/ali EC  10 ). Glej opre ­
delitve pojmov.  
1.5 VELJAVNOST PRESKUSA 
Vrednotenje rezultatov preskusa z agrokemikalijami temelji na 
razmeroma majhnih razlikah (povpre čna vrednost ± 25 %) med 
sproščenim ogljikovim dioksidom in porabljenim kisikom 
v kontrolnih in tretiranih vzorcih tal, tako da lahko velike razlike 
v kontrolah vodijo v napa čne rezultate. Zato morajo biti razlike med 
ponovljenimi kontrolnimi vzorci manjše od ± 15 %.  
1.6 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.6.1  Naprave  
Za preskuse se uporabljajo posode iz kemijsko inertnega materiala. 
Imeti morajo ustrezno prostornino v skladu s postopkom, ki se uporablja za inkubacijo tal, se pravi za inkubacijo v razsutem stanju 
ali kot serija posameznih vzorcev tal (glej oddelek 1.7.1.2). Paziti je 
treba, da je med preskusom izguba vode čim manjša in da se 
omogoči izmenjava plinov (npr. posode za preskus so lahko pokrite 
s perforirano polietilensko folijo). Kadar se preskušajo hlapne snovi, 
je treba uporabiti zatesnjene, nepredušno zaprte posode. Te naj bodo 
take velikosti, da je približno ena četrtina prostornine napolnjena 
z vzorcem tal. 
Za določitev respiracije, ki jo povzro či glukoza, so potrebni inkuba ­
cijski sistemi in instrumenti za merjenje produkcije ogljikovega diok ­
sida ali porabe kisika. Primeri takih sistemov in instrumentov so 
v literaturi (8) (9) (10) (11).
 
1.6.2  Izbira in število tal  
Uporabljajo se samo ena tla. Priporo čene lastnosti tal so: 
— vsebnost peska: ne manj kakor 50 % in ne ve č kakor 75 %,  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1283
 
— pH: 5,5–7,5, 
— vsebnost organskega ogljika: 0,5–1,5 %, 
— mikrobno biomaso je treba izmeriti (12) (13) in njena vsebnost 
ogljika naj bo vsaj 1 % skupnega organskega ogljika tal. 
V večini primerov predstavljajo tla s temi lastnostmi najslabše 
možno stanje, ker je adsorpcija preskusne kemikalije najmanjša in razpoložljivost za mikrofloro najve čja. Zato navadno niso potrebni 
preskusi z drugimi vrstami tal. Kljub temu je lahko v nekaterih 
primerih, npr. kadar je glavni del pri čakovane uporabe preskusne 
snovi v posebnih tleh, na primer kislih gozdnih tleh, ali pri elektro ­
statično nabitih kemikalijah, treba nadomestiti dodatna tla.
 
1.6.3  Odvzemanje in shranjevanje vzorcev tal  
1.6.3.1  Odvzemanje  
Na voljo morajo biti podrobne informacije o preteklosti mesta vzor ­ 
čenja, kjer se odvzemajo tla za preskus. Podrobnosti vklju čujejo 
točno lokacijo, pokritost z vegetacijo, datume uporabe izdelkov za 
zaščito pridelka, uporabo organskih in anorganskih gnojil, dodatke 
bioloških materialov ali naklju čno kontaminacijo. Mesto, izbrano za 
odvzemanje tal, naj omogo ča dolgotrajno uporabo. Primerni so trajni 
pašniki, polja z letnimi posevki žit (razen koruze) ali gosto pose ­
janim zelenim gnojilom. Izbrano mesto vzor čenja ne sme biti treti ­
rano z izdelki za zaš čito pridelka najmanj eno leto pred jemanjem 
vzorcev. Tudi organska gnojila se ne smejo uporabljati najmanj šest mesecev. Sprejemljiva je samo uporaba mineralnega gnojila, kadar je 
v skladu z zahtevami posevka, vzorcev tal pa se ne sme vzeti še 
najmanj tri mesece po uporabi gnojila. Uporabi tal, tretiranih z gnojili, ki imajo znane biocidne u činke (npr. kalcijev cianamid), 
se je treba izogibati. 
Vzorčenju se je treba izogibati med dolgimi obdobji (daljšimi od 30 
dni) suše ali poplave in takoj po njih. Pri zoranih tleh se vzorci jemljejo iz globine od 0 do 20 cm globine. Pri traviš čih (pašnikih) 
ali drugih tleh, ki dolgo niso preorana (najmanj eno sezono), je 
največja globina vzor čenja lahko malo ve č kakor 20 cm (npr. do 
25 cm). Vzorce tal je treba prenašati v posodah in v temperaturnih razmerah, ki zagotavljajo, da se prvotne lastnosti tal bistveno ne 
spremenijo.
 
1.6.3.2  Shranjevanje  
Najbolje je uporabiti tla, na sveže odvzeta na terenu. Če se shranje ­
vanju v laboratoriju ne da izogniti, se lahko vzorec tal shranjuje največ tri mesece v temi pri 4 ± 2
 o C. Med shranjevanjem tal morajo 
biti zagotovljeni aerobni pogoji. Če se tla odvzamejo na obmo čjih, ki 
so zamrznjena najmanj tri mesece na leto, je treba razmisliti o shranitvi za šest mesecev pri –18
 o C do –22  o C. Mikrobna biomasa 
shranjenih tal se izmeri pred vsakim poskusom in ogljika v biomasi 
mora biti najmanj 1 % skupne vsebnosti organskega ogljika v tleh 
(glej oddelek 1.6.2).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1284
 
1.6.4  Ravnanje s tlemi in priprava na preskus  
1.6.4.1  Predhodna inkubacija  
Če so bila tla shranjena (glej oddelka 1.6.4.2 in 1.7.1.3), se priporo ča 
predhodna inkubacija za čas od 2 do 28 dni. Temperatura in 
vsebnost vlage tal med predhodno inkubacijo naj bosta podobni 
kakor med preskusom (glej oddelka 1.6.4.2 and 1.7.1.3).  
1.6.4.2  Fizikalno-kemijske lastnosti  
Iz tal se ro čno odstranijo ve čji objekti (npr. kamni, deli rastlin itd.), 
nato se vlažno presejejo brez odve čnega sušenja na velikost delcev, 
ki so manjši ali enaki 2 mm. Vsebnost vlage v vzorcu tal je treba prilagoditi z destilirano ali deionizirano vodo na vrednost med 40 % in 60 % najve čje zmogljivosti zadrževanja vode.
 
1.6.5  Priprava preskusne snovi za aplikacijo na tla  
Preskusna snov se normalno uporablja z nosilcem. Nosilec je lahko 
voda (za snovi, topne v vodi) ali inertna trdna snov, kot je droben kremenov pesek (velikost delcev: 0,1–0,5 mm). Teko čih nosilcev, ki 
niso voda (npr. organska topila, kot sta aceton, kloroform), se je 
treba izogibati, ker lahko škodijo mikroflori. Če se kot nosilec upora ­
blja pesek, se lahko prelije s preskusno snovjo, raztopljeno ali suspendirano v ustreznem topilu. V takih primerih je treba topilo 
pred mešanjem s tlemi odstraniti z izhlapevanjem. Za optimalno 
razporeditev preskusne snovi v tleh, se priporo ča razmerje 
10 g peska na kilogram tal (suhe teže). Kontrolni vzorci se tretirajo z enakovredno koli čino vode in/ali samo s kremenovim peskom. 
Pri preskušanju hlapnih kemikalij se je treba izogibati izgubam in 
poskusiti zagotoviti homogeno porazdelitev v tleh (npr. preskusno 
snov je treba vbrizgati v tla na ve č mestih).
 
1.6.6  Preskusne koncentracije  
Če se preskušajo izdelki za zaš čito pridelka ali druge kemikalije 
s predvidenimi koncentracijami v okolju, je treba uporabiti najmanj 
dve koncentraciji. Nižja koncentracija mora odražati najmanj 
največjo količino, za katero se pri čakuje, da bi jo tla dosegla 
v praktičnih razmerah, višja koncentracija pa naj bo mnogokratnik 
nižje. Koncentracije preskusne snovi, dodane v tla, se izra čunajo ob 
predpostavki enotne vklju čitve v globino 5 cm in gostote tal 
v razsutem stanju 1,5. Za agrokemikalije, ki se aplicirajo neposredno na tla ali za kemikalije, pri katerih je mogo če napovedati koli čino, ki 
pride v tla, so priporo čene najvišje preskusne koncentracije pred ­
videnih koncentracij v okolju (PKO) in petkratniki te koncentracije. 
Snovi, za katere se pri čakuje, da bodo v eni sezoni ve čkrat aplicirane 
na tla, je treba preskusiti pri koncentracijah, dobljenih z množenjem PKO z najve čjim pričakovanim številom aplikacij. Vendar zgornja 
preskušena koncentracija ne sme presegati desetkratnika najve čje 
posamične stopnje aplikacije. 
Če se preskušajo kemikalije, ki niso agrokemikalije, se uporabi geome ­
trična serija najmanj petih koncentracij. Preskušene koncentracije naj 
zajemajo razpon, ki je potreben za dolo čitev vrednosti EC
 x . ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1285
 
1.7 IZVEDBA PRESKUSA  
1.7.1  Pogoji izpostavljenosti  
1.7.1.1  Tretiranje in kontrola  
Če se preskušajo agrokemikalije, se tla razdelijo v tri dele enake 
teže. Dva dela se zmešata z nosilcem, ki vsebuje proizvod, tretji 
pa se zmeša z nosilcem brez proizvoda (kontrola). Priporo čajo se 
najmanj tri ponovitve s tretiranimi in netretiranimi tlemi. Če se 
preskušajo kemikalije, ki niso agrokemikalije, se tla razdelijo 
v šest delov enake teže. Pet vzorcev se zmeša z nosilcem, ki vsebuje 
preskusno snov, in šesti vzorec se zmeša z nosilcem brez kemikalije. Priporočajo se po tri ponovitve za tretirane vzorce in kontrolo. Paziti 
je treba, da se zagotovi homogeno razporeditev preskusne snovi 
v tretiranih vzorcih tal. Med mešanjem se je treba izogibati stiskanju tal in nastajanju kep.
 
1.7.1.2  Inkubacija vzorcev tal  
Inkubacija vzorcev tal se lahko izvede na dva na čina: kot vzorci treti ­
ranih in netretiranih tal v razsutem stanju ali kot serija posameznih podvzorcev vsakih tretiranih in netretiranih tal enake velikosti. Vendar 
pa se lahko, kadar se preskušajo hlapne snovi, preskus izvede samo 
s serijo posameznih podvzorcev tal. Kadar se tla inkubirajo v razsutem stanju, se pripravijo velike koli čine tretiranih in netretiranih tal, podv ­
zorci za analizo pa se jemljejo po potrebi med preskusom. Koli čina, ki 
se na začetku pripravi za vsako tretiranje in kontrolo, je odvisna od 
velikosti podvzorcev, števila za analizo uporabljenih ponovitev in pričakovanega najve čjega števila ponovitev vzor čenja. Tla, inkubirana 
v razsutem stanju, je treba pred podvzor čenjem temeljito premešati. 
Kadar se tla inkubirajo kot serija posameznih vzorcev tal, se vsak 
vzorec tretiranih in netretiranih tal v razsutem stanju razdeli na zahte ­
vano število podvzorcev in ti se izkoriš čajo po potrebi. Pri preskusih, 
kjer se lahko pri čakuje več kakor dve vzor čenji, je treba pripraviti 
dovolj vzorcev, ob upoštevanju vseh ponovitev in vseh vzor čenj. 
Najmanj tri ponovitve vzorcev tal za preskus je treba inkubirati v aerobnih pogojih (glej oddelek 1.7.1.1). Pri vseh preskusih je treba 
uporabljati ustrezne posode z dovolj velikim volumnom nad vzorcem, 
da se prepre či razvoj anaerobnih pogojev. Vendar pa se lahko, kadar se 
preskušajo hlapne snovi, preskus izvede samo s serijo posameznih podvzorcev tal.
 
1.7.1.3  Preskusni pogoji in trajanje  
Preskus se izvaja v temi pri sobni temperaturi 20 ± 2  o C. Vsebnost vlage 
v vzorcih tal se med preskusom vzdržuje med 40 % in 60 % najve čje 
zmogljivosti zadrževanja vode v tleh (glej oddelek 1.6.4.2) v razponu 
± 5 %. Po potrebi se lahko doda destilirana, deionizirana voda. 
Najkrajše trajanje preskusov je 28 dni. Če se preskušajo agrokemi ­
kalije, se primerjajo koli čine sproš čenega ogljikovega dioksida ali 
porabljenega kisika v tretiranih in kontrolnih vzorcih. Če se te na 
28. dan razlikujejo za ve č kakor 25 %, se preskus nadaljuje, dokler 
ni dosežena razlika, ki je enaka ali manjša od 25 % ali do najve č 100 
dni, kar je prej. Če se preskušajo kemikalije, ki niso agrokemikalije, 
se preskus prekine po 28 dneh. Na 28. dan se dolo čijo količine 
sproščenega ogljikovega dioksida ali porabljenega kisika v vzorcih 
tretiranih in kontrolnih tal in izra čunajo vrednosti EC  x . ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1286
 
1.7.2  Vzor čenje in analiza tal  
1.7.2.1  Načrt za vzor čenje tal  
Če se preskušajo agrokemikalije, se vzorci tal na 0., 7., 14. in 28. 
dan analizirajo glede stopnje respiracije, ki jo povzro ča glukoza. Če 
je potreben podaljšan preskus, se nadaljnje meritve opravijo v 14- 
dnevnih presledkih po 28. dnevu. 
Če se preskušajo kemijalije, ki niso agrokemikalije, se uporabi in 
analizira vsaj pet preskusnih koncentracij in vzorcev tal glede respi ­
racije, ki jo povzro či glukoza, na za četku (dan 0) in na koncu 
obdobja izpostavljenosti (28 dni). Če se zdi potrebno, se lahko 
doda še vmesno merjenje, npr. 7. dan. Podatki, dobljeni na 28. 
dan, se uporabljajo za dolo čitev vrednosti EC  x za kemikalijo. Po 
potrebi se lahko podatki o kontrolnih vzorcih iz dneva 0 uporabijo za oceno za četnih koli čin presnovno dejavne mikrobne biomase 
v tleh (12).
 
1.7.2.2  Merjenje stopenj respiracije, ki jo povzro či glukoza  
Stopnja respiracije, ki jo povzro či glukoza v vsaki tretirani in 
kontrolni ponovitvi, se dolo či ob vsakem vzor čenju. Vzorci tal se 
pomešajo z zadostno koli čino glukoze, da izzove takojšnji najve čji 
odziv respiracije. Koli čina glukoze, ki je potrebna za sprožanje 
največjega respiratornega odziva iz danih tal, se lahko dolo či 
s predhodnim preskusom s serijo koncentracij glukoze (14). Vendar za peščena tla z 0,5–1,5 % organskega ogljika navadno zadoš ča 
2 000 mg do 4 000 mg glukoze na kg suhe teže tal. Glukoza se 
lahko zmelje v prah s čistim kremenovim peskom (10 g peska/kg 
suhe teže tal) in homogeno pomeša s tlemi. 
Vzorci tal, dopolnjeni z glukozo, se inkubirajo v primerni napravi za 
merjenje stopenj respiracije, bodisi neprekinjeno, vsako uro ali vsaki 
dve uri (glej oddelek 1.6.1) pri 20 ± 2
 o C. Sproščeni ogljikov dioksid 
ali porabljeni kisik se meri 12 zaporednih ur in meritve se morajo začeti čim prej, to je 1 ali 2 uri po dopolnitvi z glukozo. Izmeri se 
skupna koli čina sproš čenega ogljikovega dioksida ali porabljenega 
kisika v 12 urah in dolo či srednja stopnja respiracije.
 
2. PODATKI  
2.1 OBDELAVA REZULTATOV 
Če se preskušajo agrokemikalije, je treba zabeležiti sproš čeni 
ogljikov dioksid ali porabljeni kisik v vsakem ponovljenem vzorcu 
tal in v tabelari čni obliki podati povpre čne vrednosti vseh ponovitev. 
Rezultati se ovrednotijo z ustreznimi in splošno sprejetimi statisti ­ 
čnimi metodami (npr. F-preskus, 5 % raven pomembnosti). Stopnje 
respiracije, ki jo povzro či glukoza, so izražene v mg ogljikovega 
dioksida/kg suhe teže tal/uro ali mg kisika/suho težo tal/uro. Povprečna stopnja nastajanja ogljikovega dioksida ali povpre čna 
stopnja porabe kisika v vsakem tretiranem vzorcu se primerja 
s stopnjo porabe v kontroli in izra čuna odstotek odstopanja od 
kontrole.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1287
 
Če so preskusi izvedeni s kemikalijami, ki niso agrokemikalije, se 
določi količina sproš čenega ogljikovega dioksida ali porabljenega 
kisika v vsaki ponovitvi in pripravi krivulja odziva na odmerek za oceno vrednosti EC
 x . Stopnje respiracije, ki jih povzro či glukoza (to je 
mg ogljikovega dioksida/kg suhe teže tal/uro ali mg kisika/suho težo 
tal/uro), ugotovljene v tretiranih vzorcih po 28 dnevih, se primerjajo 
s tistimi, ki so ugotovljene v kontroli. Iz teh podatkov se izra čuna % 
vrednosti inhibicije za vsak preskus koncentracije. Ti odstotki se glede na koncentracijo in statisti čne postopke uporabijo za izra čun vrednosti 
EC
 x . Intervali zaupanja (p = 0,95) za izra čunane EC  x so določeni tudi 
z uporabo standardnih postopkov (15) (16) (17).  
2.2 RAZLAGA REZULTATOV 
Kadar se ocenjujejo rezultati iz preskusov z agrokemikalijami in je 
razlika med stopnjami respiracije med nižjim tretiranjem (to je največjo predvideno koncentracijo) in kontrolo pri katerem koli vzor ­ 
čenju po 28. dnevu enaka ali manjša od 25 %, se lahko oceni, da 
proizvod nima dolgoro čnega vpliva na transformacijo ogljika v tleh. 
Kadar se vrednotijo rezultati iz preskusov s kemikalijami, ki niso agrokemikalije, se uporabijo vrednosti EC
 50 , EC  25 in/ali EC  10 . 
3 PORO ČANJE  
POROČILO O PRESKUSU  
Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: 
Popolna identifikacija uporabljenih tal, vklju čno z: 
— geografsko oznako mesta (zemljepisno širino, zemljepisno dolži ­
no), 
— informacijami o preteklosti mesta preskusa (pokritost 
z vegetacijo, uporaba izdelkov za zaš čito pridelkov, uporaba 
gnojil, naklju čna kontaminacija itd.), 
— vrsto rabe (npr. kmetijsko zemljiš če, gozd itd.), 
— globino vzor čenja (cm), 
— vsebnostjo peska/mulja/gline ( % suhe teže), 
— pH (v vodi), 
— organsko vsebnostjo ogljika ( % suhe teže), — vsebnostjo dušika ( % suhe teže), — kationsko izmenjalno kapaciteto (mmol/kg), — začetno mikrobno biomaso glede na odstotke skupnega organ ­
skega ogljika, 
— sklici na metode, uporabljene za dolo čanje posameznih parame ­
trov, 
— vsemi informacijami v zvezi z odvzemanjem in shranjevanjem 
vzorcev tal, 
— podrobnostmi o predhodni inkubaciji tal, če je bila.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1288
 
Preskusna snov: 
— fizikalno stanje in ustrezne fizikalno-kemijske lastnosti, 
— kemijske identifikacijske podatke, kadar je ustrezno, vklju čno 
s strukturno formulo, čistostjo (odstotek aktivne sestavine 
v izdelkih za zaš čito pridelka), vsebnostjo dušika. 
Preskusni pogoji: 
— podatke o dopolnitvi tal z organskim substratom, — število koncentracij uporabljene preskusne kemikalije in, kadar je 
primerno, utemeljitev izbranih koncentracij, 
— podatke o aplikaciji preskusne snovi na tla, — inkubacijsko temperaturo, 
— vsebnost vlage v tleh na za četku preskusa in med njim, 
— uporabljeno metodo inkubacije tal (v razsutem stanju ali kot 
serija posameznih podvzorcev), 
— število ponovitev, 
— število vzor čenj. 
Rezultati: — metodo in opremo, uporabljeno za merjenje stopenj respiracije, 
— tabelari čne podatke, vklju čno s posameznimi in srednjimi vred ­
nostmi koli čin ogljikovega dioksida ali kisika, 
— razliko med ponovitvami s tretiranimi in kontrolnimi vzorci, 
— razlage popravkov izra čunov, če je ustrezno, 
— odstotek razlik v stopnjah respiracije, povzro čene z glukozo, pri 
vsakem vzor čenju ali, če je primerno, vrednost EC
 50 s 95 
odstotno mejo zaupanja, drugo EC  x (EC  25 ali EC  10 ) 
z intervalom zaupanja in graf krivulje odziva na odmerek, 
— statisti čno obdelavo rezultatov, po potrebi, 
— vse informacije in opažanja, koristne za razlago rezultatov 
preskusa.  
4. LITERATURA  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1–16, 1994. 
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Pl ant Protection Products, VI, 1–1 (2nd eds., 1990). 
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guide ­
lines; Proposed rule. September 28, 1987.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1289
 
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, 
Pub. SETAC-Europe, Brussels. 
(5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18–20 January 1995. 
(6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the 
collection, handling and storage of soil for the assessment of 
aerobic microbial processes in the laboratory. 
(7) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils for 
Pesticide Experiments, in „Pesticide Effects on Soil Microflo ­
ra“. Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 45–60. 
(8) Anderson, J.P.E. (1982). Soil Respiration, in „Methods of Soil 
Analysis – Part 2: Chemical and Microbiological Properties“. 
Agronomy Monograph N  o 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and 
D.R. Keeney. 41: 831–871. 
(9) ISO 11266-1. (1993). Soil Quality – Guidance on Laboratory 
Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions. 
(10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality – Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions. 
(11) Heinemeye, r O., Insam, H., Kaiser, E.A, and Walenzik, 
G. (1989). Soil microbial biomass and respiration measure ­
ments; an automated technique based on infrared gas analyses. 
Plant and Soil, 116: 77–81. 
(12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration 
method. 
(13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method. 
(14) Malkomes, H.-P. (1986). Einfluß von Glukosemenge auf die 
Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegeniiber Pflan ­
zenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Inf ­
luence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzensc ­
hutzd., Braunschweig, 38: 113–120. 
(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99–113. 
(16) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New York. 
(17) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1290
 
C.23  AEROBNA IN ANAEROBNA TRANSFORMACIJA V TLEH  
1. METODA  
Ta preskusna metoda ustreza metodi OECD TG 307 (2002).  
1.1 UVOD 
Ta preskusna metoda temelji na obstoje čih smernicah (1) (2) (3) (4) 
(5) (6) (7) (8) (9). Metoda, opisana v tej preskusni metodi, je name ­
njena ovrednotenju aerobne in anaerobne transformacije kemikalij v tleh. Izvajajo se poskusi za dolo čitev (i) stopnje transformacije 
preskusne snovi in (ii) narave in stopenj nastajanja in zmanjševanja 
produktov transformacije, ki so jim lahko izpostavljene rastline in 
talni organizmi. Take študije so potrebne za kemikalije, ki se nana ­ 
šajo neposredno na tla ali za katere je verjetno, da bodo prišle v talno okolje. Rezultati teh laboratorijskih študij se lahko uporabijo 
tudi za razvoj protokolov vzor čenja in analiz za študije na sorodnih 
področjih. 
Aerobne in anaerobne študije z eno vrsto tal navadno zadoš čajo za 
ovrednotenje poti transformacije (8) (10) (11). Stopnje transformacije 
je treba dolo čiti še v najmanj treh dodatnih vzorcih tal (8) (10). 
Na delavnici OECD o izbiri tal/usedline, ki je bila leta 1995 
v Belgiratu v Italiji (10), je bil dosežen dogovor predvsem 
o številu in vrstah tal za uporabo v tem preskusu. Vrste preskušanih 
tal morajo biti reprezentativne za okoljske razmere, kjer se bo poja ­
vila uporaba ali sproš čanje. Na primer kemikalije, ki se lahko sproš ­ 
čajo v subtropskih do tropskih podnebjih, se morajo preskušati na 
ferasolih ali nitosolih (sistem FAO). Na delavnici so bila dana tudi 
priporočila v zvezi z odvzemanjem, obravnavanjem in shranjevanjem 
vzorcev tal, ki temeljijo na napotkih ISO (15). Ta metoda obravnava tudi uporabo riževih (namakalnih, poplavljenih) tal.
 
1.2 OPREDELITVE POJMOV  
Preskusna snov:  katera koli snov, bodisi osnovna zmes ali ustrezni 
produkti transformacije.  
Produkti transformacije:  vse snovi, ki so posledica biotskih ali 
abiotskih transformacijskih reakcij preskusne snovi, vklju čno s CO  2 
in produkti, ki so v vezanih ostankih.  
Vezani ostanki : „vezani ostanki“ predstavljajo spojine v tleh, rast ­
linske ali živalske, ki vztrajajo v matrici v obliki osnovne snovi ali 
njenega(ih) metabolita(ov)/produktov transformacije po ekstrakciji. 
Ekstrakcijska metoda ne sme bistveno spremeniti samih spojin ali strukture matrice. Narava vezi se lahko delno pojasni z ekstrakcijskimi metodami, ki spreminjajo matrico, in z visoko 
razvitimi analitskimi tehnikami. Do sedaj so bile, na primer, na ta 
način odkrite kovalentne ionske in sorptivne vezi. Na splošno nasta ­
janje vezanih ostankov znatno zmanjša biološko dostopnost in biološko razpoložljivost (12) (prikrojeno po IUPAC-u 1984 (13)).  
Aerobna transformacija:  reakcije, ki se pojavljajo v navzo čnosti 
molekularnega kisika (14).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1291
 
Anaerobna transformacija:  reakcije, ki se pojavljajo v odsotnosti 
molekularnega kisika (14).  
Tla: so mešanica mineralnih in organskih kemi čnih sestavin, slednje 
vsebujejo spojine z visoko vsebnostjo ogljika in dušika in z veliko 
molsko maso, ki jih poživljajo majhni (ve činoma mikro-) organizmi. 
Tla se lahko obdelujejo v dveh stanjih: 
(a) v neoviranem, kakor so se razvila s časom, z zna čilnimi plastmi 
različnih vrst tal; 
(b) oviranem, kakor jih navadno najdemo na ornih zemljiš čih ali 
kakor se pojavljajo, kadar se vzorci jemljejo s kopanjem in se 
uporablja ta preskusna metoda (14).  
Mineralizacija:  je popolna razgradnja organske spojine v CO  2 in 
H 2 O v aerobnih razmerah in CH  4 , CO  2 in H  2 O v anaerobnih razme ­
rah. V smislu te preskusne metode, kjer se uporablja spojina z oznako
 14 C, mineralizacija pomeni obsežno razgradnjo, v kateri 
se označen ogljikov atom oksidira s sproš čanjem ustrezne koli čine 
14 CO 2 (14).  
Razpolovna doba:  t 0,5 je čas, potreben za 50 %-no transformacijo 
preskusne snovi, kadar lahko transformacijo opišemo kot kinetiko 
prvega reda; razpolovna doba ni odvisna od koncentracije.  
Čas razgradnje DT  50 : je čas, v katerem se koncentracija preskusne 
snovi zmanjša za 50 %; je druga čen od razpolovne dobe t  0,5 , ko 
transformacija ne sledi kinetiki prvega reda.  
Čas razgradnje DT  75 : je čas, v katerem se koncentracija preskusne 
snovi zmanjša za 75 %.  
Čas razgradnje DT  90 : je čas, v katerem se koncentracija preskusne 
snovi zmanjša za 90 %.  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Referenčne snovi se uporabljajo za opis in/ali dolo čitev produktov 
transformacije s spektroskopsko in kromatografsko metodo.  
1.4 UPORABNOST PRESKUSA 
Metoda se uporablja za vse kemijske snovi (brez oznake ali 
z radioaktivno oznako), za katere je na voljo dovolj natan čna in 
občutljiva analitska metoda. Uporablja se za rahlo hlapne, nehlapne, 
vodotopne ali v vodi netopne spojine. Preskus naj se ne uporablja za kemikalije v tleh, ki so lahko hlapne (npr. fumiganti, organska 
topila) in se tako ne morejo zadrževati v tleh za poskusne pogoje 
tega preskusa.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1292
 
1.5 PODATKI O PRESKUSNI SNOVI 
Za merjenje stopnje transformacije se lahko uporabi neozna čena ali 
označena preskusna snov. Ozna čeni material je potreben za preu če­
vanje poti transformacije in za vzpostavitev masne bilance. Priporo ča 
se oznaka  14 C, vendar je lahko koristna tudi uporaba drugih izoto ­
pov, na primer C, N, H, P. Če je to mogo če, naj se oznaka namesti 
na najstabilnejši del(e) molekule (  1 ). Čistost preskusne snovi naj bo 
vsaj 95 %. 
Pred izvajanjem preskusa o aerobni in anaerobni transformaciji 
v tleh, naj bodo na voljo naslednje informacije o preskusni snovi: 
(a) topnost v vodi (metoda A.6); 
(b) topnost v organskih topilih; 
(c) tlak pare (metoda A.4) in Henryjeva konstanta; 
(d) porazdelitveni koeficient n-oktanol/voda (metoda A.8); 
(e) kemijska stabilnost v temi (hidroliza) (metoda C.7); 
(f) pK  a , če je molekula nagnjena k dodajanju ali odvzemanju 
protonov [Smernica OECD 112] (16). 
Druge uporabne informacije lahko vklju čujejo podatke o toksi čnosti 
preskusne snovi na talne mikroorganizme [metodi preskušanja C.21 in C.22] (16). 
Na voljo morajo biti analitske metode (vklju čno z metodami ekstrak ­
cije in očiščenja) za koli činsko opredelitev in dolo čitev preskusne 
snovi in njenih produktov transformacije.
 
1.6 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Vzorci tal se tretirajo s preskusno snovjo in inkubirajo v temi 
v bučkah biometri čnega tipa ali v preto čnih sistemih 
v nadzorovanih laboratorijskih razmerah (pri stalni temperaturi in 
vlažnosti tal). Po ustreznih časovnih presledkih se vzorci tal ekstra ­
hirajo in analizirajo se osnovna snov in produkti transformacije. Tudi 
hlapni produkti se zberejo za analizo z ustreznimi absorpcijskimi 
pripomočki. Z uporabo materiala z oznako  14 C se lahko izmerijo 
različne stopnje mineralizacije preskusne snovi z zajemanjem sproš ­ 
čenega  14 CO 2 in ugotovi se masna bilanca, vklju čno z nastajanjem 
talnih vezanih ostankov.  
1.7 MERILA KAKOVOSTI  
1.7.1  Izkoristek  
Ekstrakcija in analiza najmanj dvojnih vzorcev tal takoj po dodajanju 
preskusne snovi da prvi prikaz ponovljivosti analitske metode in izena ­ 
čenosti postopka uporabe za preskusno snov. Izkoristki poznejših 
stopenj poskusov so podani z ustreznimi masnimi bilancami. Izkoristki 
so v razponu od 90 % do 110 % pri ozna čenih kemikalijah (8) in od 
70 % do 110 % pri neozna čenih kemikalijah (3).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1293  
( 1 ) Na primer, če preskusna snov vsebuje en obro č, je potrebna oznaka tega obro ča; če 
preskusna snov vsebuje dva ali ve č obročev, so lahko potrebne študije za ovrednotenje 
usode vsakega ozna čenega obro ča in pridobitev ustreznih informacij o oblikovanju 
produktov transformacije.
 1.7.2  Ponovljivost in ob čutljivost analitske metode  
Ponovljivost analitske metode (brez za četne učinkovitosti ekstrakcije) 
za količinsko dolo čitev preskusne snovi in proizvodov transformacije 
se lahko preveri z dvojno analizo istega ekstrakta tal, ki je inkubiran 
dovolj dolgo, da nastajajo proizvodi transformacije. 
Meja detekcije analitske metode za preskusno snov in za proizvode 
transformacije mora biti najmanj 0,01 mg · kg  -1 tal (kot preskusne 
snovi) ali 1 % uporabljenega odmerka, kar je manj. Opredeliti je treba tudi mejo koli činske opredelitve.
 
1.7.3  To čnost podatkov transformacije  
Regresijska analiza koncentracij preskusne snovi v funkciji časa daje 
ustrezne informacije o zanesljivosti krivulje transformacije in 
omogoča izračun intervala zaupanja za razpolovne dobe (v primeru 
psevdo kinetike prvega reda) ali vrednosti DT  50 in, če je primerno, 
vrednosti DT  75 in DT  90 . 
1.8 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.8.1  Oprema in kemijski reagenti  
Inkubacijski sistemi so sestavljeni iz stati čnih zaprtih sistemov ali 
ustreznih preto čnih sistemov (7) (17). Primera ustrezne preto čne 
naprave za inkubacijo tal in bu čke biometri čnega tipa sta prikazana 
na slikah 1 in 2. Obe vrsti inkubacijskih sistemov imata prednosti in omejitve (7) (17). 
Potrebna je standardna laboratorijska oprema in zlasti naslednje: — instrumenti za analizo, na primer oprema GLC, HPLC, TLC, 
vključno z ustreznimi sistemi detekcije za analiziranje radioa ­
ktivno ozna čenih ali neozna čenih snovi ali inverzno metodo 
izotopskega red čenja, 
— instrumenti za prepoznavanje (npr. MS, GC-MS, HPLC-MS, 
NMR itd.), 
— tekočinski scintilacijski števec, 
— oksidacijsko sredstvo za izgorevanje radioaktivnega materiala, — centrifuga, — naprave za ekstrakcijo (na primer centrifugirne epruvete za 
hladno ekstrakcijo in naprava Soxhlet za kontinuirano ekstrakcijo 
pod refluksom), 
— instrumenti za koncentriranje raztopin in ekstraktov (npr. rota ­
cijski evaporator), 
— vodna kopel, — mehanska naprava za mešanje (npr. stroj za gnetenje, rotacijski 
mešalnik).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1294
 
Uporabljeni kemi čni reagenti vklju čujejo na primer: 
— NaOH, analitsko čist, 2 mol · dm  -3 ali drugo ustrezno bazo (npr. 
KOH, etanolamin), 
— H  2 SO 4 , analitsko čisto, 0,05 mol · dm  -3 , 
— etilen glikol, analitsko čist, 
— trdne absorpcijske materiale, na primer natrijevo sol in poliure ­
tanske čepe, 
— organska topila, analitsko čista, na primer aceton, metanol itd., 
— scintilacijsko teko čino. 
1.8.2  Aplikacija preskusne snovi  
Za dodajanje in porazdelitev v tla se lahko preskusna snov raztopi 
v vodi (deionizirani ali destilirani) ali po potrebi v manjši koli čini 
acetona ali drugega organskega topila (6), v katerem je preskusna snov dovolj topna in stabilna. Vendar koli čina izbranega topila ne 
sme znatno vlivati na mikrobno dejavnost v tleh (glej oddelke 1.5 in 
1.9.2–1.9.3.) Uporabi topil, ki zavirajo mikrobno dejavnost, na 
primer kloroformu, diklorometanu in drugim halogeniranim topilom, se je treba izogibati. 
Preskusna snov se lahko doda tudi kot trdna, npr. pomešana 
v kremenov pesek (6) ali v majhen podvzorec preskusnih tal, ki je 
bil posušen na zraku in steriliziran. Če se preskusna snov doda 
z uporabo topila, je treba topilu omogo čiti, da izhlapi, preden se 
v originalni nesterilni vzorec tal doda primešan podvzorec. 
Pri splošnih kemikalijah, katerih glavna pot vstopa v tla je preko odpad ­
nega blata/kmetijskega nanosa, je treba preskusno snov najprej dodati 
v blato, ki se potem uvede v vzorec tal (glej oddelka 1.9.2 in 1.9.3). 
Ne priporo ča se rutinska uporaba formuliranih pripravkov. Vendar je 
uporaba formuliranega materiala lahko ustrezna rešitev npr. pri slabo topnih preskusnih snoveh.
 
1.8.3  Tla  
1.8.3.1  Izbira tal  
Za določitev poti transformacije se lahko uporabijo reprezentativna 
tla; priporo ča se peščena ilovica ali muljasta ilovica ali ilovica ali 
ilovnati pesek [v skladu s klasifikacijo FAO in USDA (18)] s pH 
5,5–8,0, vsebnostjo organskega ogljika 0,5–2,5 % in mikrobno biomaso najmanj 1 % skupnega organskega ogljika (10). 
Za preučevanje stopnje transformacije je treba uporabiti najmanj tri 
dodatne vzorce tal, ki predstavljajo izbor ustreznih tal. Tla se morajo 
razlikovati po vsebnosti organskega ogljika, pH, vsebnosti gline in 
mikrobne biomase (10).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1295
 
Vse vrste tal je treba opredeliti vsaj glede teksture ( % peska, % 
mulja, % gline) [v skladu s klasifikacijo FAO in USDA (18)], pH, 
kationske izmenjalne kapacitete, organskega ogljika, gostote v razsutem stanju, zna čilnosti zadrževanja vode (
 1 ) in mikrobne 
biomase (le za aerobne študije). Dodatne informacije o lastnostih 
tal so lahko koristne pri razlagi rezultatov. Za dolo čitev lastnosti 
tal se lahko uporabijo metode, priporo čene v sklicih (19) (20) (21) 
(22) (23). Mikrobno biomaso je treba dolo čiti z uporabo metode 
respiracije, ki jo povzro či substrat (25) (26), ali z alternativnimi 
metodami (20).  
1.8.3.2  Odvzemanje, obravnavanje in shranjevanje tal  
Na voljo morajo biti podrobne informacije o preteklosti mesta vzor čenja, 
kjer se odvzemajo tla za preskus. Podrobnosti vklju čujejo točno lokacijo, 
pokritost z vegetacijo, uporabo kemikalij, uporabo organskih in anorganskih gnojil, dodatke bioloških materialov ali drugo kontamina ­
cijo. Če so bila tla tretirana s preskusno snovjo ali analognimi 
strukturami, se ne uporabljajo v študijah transformacije (10) (15). 
Tla je treba na sveže odvzeti na terenu (iz horizonta A ali zgornjega 
20 cm sloja) z vsebnostjo vode, ki omogo ča presejanje. Pri tleh, ki 
niso iz riževih polj, se je treba izogibati vzor čenju med ali takoj po 
dolgih obdobjih (> 30 dni) suše, zmrzali ali poplave (14). Vzorce je 
treba prepeljati na na čin, ki čim bolj zmanjša spremembe v vsebnosti 
vode v tleh in jih čim bolj zadrževati v temi, brez dostopa do zraka. 
V ta namen je na splošno primerna ohlapno zavezana polietilenska 
vreča. 
Tla se obdelajo čimprej po vzor čenju. Vegetacijo, ve čje živalske 
vrste in kamne v tleh je treba odstraniti, preden se tla presujejo skozi 2 mm sito, ki odstrani manjše kamne, živalske vrste in rast ­
linske odpadke. Obsežnemu sušenju in drobljenju tal pred sejanjem 
se je treba izogibati (15). 
Kadar je pozimi jemanje vzorcev na terenu težko (tla zamrznjena ali 
prekrita s plastmi snega), se smejo vzeti iz serije tal, shranjenih v topli gredi pod rastlinsko prevleko (npr. travo ali mešanico trave in detelje). Mo čno se priporo čajo študije s tlemi, ki so na sveže 
odvzeta na terenu, če pa je treba odvzeta in obdelana tla pred 
začetkom študije shraniti, je potrebno skladiš čenje v ustreznih 
razmerah in samo za omejen čas (4 ± 2
 o C za najve č tri mesece), 
da se ohrani mikrobna dejavnost (  2 ). Podrobna navodila 
o odvzemanju, obravnavanju in shranjevanju tal, ki se uporabljajo 
za biotransformacijske poskuse, so v (8) (10) (15) (26) (27).  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1296  
( 1 ) Sposobnost tal glede zadrževanja vode se lahko izmeri kot poljska kapaciteta tal za vodo, 
kot zmogljivost zadrževanja vode ali kot pritisk črpanja vode (pF). Za razlago glej 
Dodatek 1. V poro čilu o preskusu je treba navesti, ali sta bili sposobnost zadrževanja 
vode in gostota v razsutem stanju dolo čeni v neoviranih vzorcih zemljiš ča ali v oviranih 
(predelanih) vzorcih. 
( 2 ) Rezultati novejših raziskav kažejo, da se lahko tudi tla iz zmernih pasov shranijo pri 
–20  o C za več kakor tri mesece (28) (29) brez ve čjih izgub mikrobne dejavnosti.
 Preden se obdelana tla uporabijo za ta preskus, jih je treba pred ­
hodno inkubirati, da se omogo či kaljenje in odstranitev semen in 
ponovna vzpostavitev ravnovesja mikrobne presnove po spremembi razmer med vzor čenjem ali shranjevanjem na inkubacijske razmere. 
Na splošno zadoš ča obdobje predhodne inkubacije od 2 do 28 dni, ki 
približa pogoje temperature in vlage dejanskemu preskusu (15). 
Skupen čas shranjevanja in predhodne inkubacije ne sme presegati 
treh mesecev.
 
1.9 IZVEDBA PRESKUSA  
1.9.1  Preskusni pogoji  
1.9.1.1  Preskusna temperatura  
V celotnem obdobju preskusa morajo biti tla inkubirana v temi pri 
stalni temperaturi, ki je reprezentativna za podnebne razmere, kjer bo potekala uporaba ali sproš čanje. Temperatura 20 ± 2
 o C se priporo ča 
za vse preskusne snovi, ki lahko pridejo v tla v zmernih podnebjih. 
Temperaturo je treba spremljati. 
Za kemikalije, ki se uporabljajo ali sproš čajo v hladnejših podnebjih 
(npr. v severnih državah v jesenskih/zimskih obdobjih), je treba inku ­
birati dodatne vzorce tal, vendar pri nižji temperaturi (npr. 10 ± 2  o C). 
1.9.1.2  Vsebnost vlage  
Za preskuse transformacije v aerobnih razmerah je treba prilagoditi 
vsebnost vlage[4] in jo vzdrževati pri pF med 2,0 in 2,5 (3). Vsebnost vlage v tleh je izražena kot masa vode na maso suhih tal 
in se mora redno nadzorovati (npr. v 2-tedenskih razmikih) 
s tehtanjem inkubacijskih bu čk in izgubo vode nadomestiti 
z dodajanjem vode (najbolje s sterilno filtrirano vodo iz pipe). Paziti je treba, da se prepre čijo ali čim bolj zmanjšajo izgube preskusne 
snovi in/ali produktov transformacije z izhlapevanjem in/ali fotoraz ­
gradnjo ( če obstaja) med dodajanjem vlage. 
Za preskuse transformacije v razmerah anaerobnih in riževih tal se 
tla prepojijo z vodo s poplavljanjem.
 
1.9.1.3  Aerobne inkubacijske razmere  
V pretočnih sistemih se aerobne razmere ohranjajo s prekinjenim 
splakovanjem ali z neprekinjenim prezra čevanjem z navlaženim 
zrakom. V biometri čnih bučkah se izmenjava zraka ohranja 
z difuzijo.  
1.9.1.4  Sterilne aerobne razmere  
Da bi dobili informacije o ustreznosti abiotske transformacije 
preskusne snovi, se lahko vzorci tal sterilizirajo (glede sterilizacijskih 
metod glej sklica 16 in 29), tretirajo s sterilno preskusno snovjo (npr. dodatek raztopine skozi sterilni filter) in prezra čijo z navlaženim 
sterilnim zrakom, kot je opisano v oddelku 1.9.1.3. Pri riževih tleh 
je treba tla in vodo sterilizirati in izvesti inkubacijo, kot je opisano 
v oddelku 1.9.1.6.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1297
 
1.9.1.5  Anaerobne inkubacijske razmere  
Za vzpostavitev in ohranjanje anaerobnih razmer se tla, ki so treti ­
rana s preskusno snovjo in inkubirana v aerobnih razmerah za 30 dni ali eno razpolovno dobo ali DT
 50 (kar je krajše), potem namo čijo 
z vodo (1–3 cm plast vode), inkubacijski sistem pa se spere 
z inertnim plinom (npr. dušikom ali argonom) (  1 ). Preskusni sistem 
mora omogo čati meritve, kot na primer pH, koncentracijo kisika in 
redoks potenciala, ter vklju čevati naprave za zajemanje hlapnih 
produktov. Biometri čni tip sistema mora biti zaprt, da se izogne 
vstopu zraka z difuzijo.  
1.9.1.6  Razmere inkubacije na riževih poljih  
Za preučevanje transformacije na riževih tleh se tla poplavijo 
s približno 1–5 centimetrsko plastjo vode, preskusna snov pa se 
nanese na vodno fazo (9). Priporo čena globina tal je najmanj 
5 cm. Sistem se prezra čuje z zrakom, kakor v aerobnih razmerah, 
spremljati in poro čati pa je treba o pH, koncentraciji kisika in redoks 
potencialu vodne plasti. Pred za četkom študij transformacije je 
potrebno najmanj dvotedensko obdobje predhodne inkubacije (glej oddelek 1.8.3.2).
 
1.9.1.7  Trajanje preskusa  
Stopnja in pot študije normalno ne sme presegati 120 dni (  2 ) (6) (8), 
ker se po tem pri čakuje postopno upadanje mikrobne dejavnosti 
v tleh v umetnem laboratorijskem sistemu, izoliranem od naravnega dopolnjevanja. Kadar je treba opredeliti zmanjševanje preskusne snovi in nastajanje ali zmanjševanje glavnih produktov transforma ­
cije, se lahko študije nadaljujejo v daljših obdobjih (npr. 6 ali 
12 mesecev) (8). Daljša inkubacijska obdobja je treba utemeljiti v poročilu o preskusu in priložiti meritve biomase na koncu teh 
obdobij in med njimi.
 
1.9.2  Izvajanje preskusa  
V vsako inkubacijsko bu čko (glej sliki 1 in 2 v Dodatku 3) se vloži 
približno 50 do 200 g tal (na osnovi suhe teže) in tla, tretirana s preskusno snovjo po eni od metod, opisanih v oddelku 1.8.2. Če 
se za aplikacijo preskusne snovi uporabijo organska topila, jih je 
treba odstraniti iz tal z izhlapevanjem. Potem se tla temeljito preme ­ 
šajo z lopatico in/ali stresanjem bu čk. Če se študija izvaja 
v razmerah riževega polja, je treba tla in vodo po aplikaciji 
preskusne snovi temeljito premešati. Majhne alikvote (npr. 
1 g) tretiranih tal je treba analizirati glede preskusne snovi, da se preveri enotna porazdelitev. Za alternativne metode glej spodaj.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1298  
( 1 ) Aerobne razmere prevladujejo v površinskih tleh in celo v podpovršinskih tleh, kot je 
prikazano v raziskovalnem projektu, ki ga je sponzorirala EU (K. Takagi et al. (1992). Microbial diversity and activity in subsoils: Methods, field site, seasonal variation in 
subsoil temperatures and oxygen contents. Proc. Internat. Symp. Environm. Aspects 
Pesticides Microbiol., 270–277, 17.–21. avgust 1992, Sigtuna, Švedska). Anaerobne 
razmere se lahko samo ob časno pojavijo med poplavami tal po hudem deževju ali 
kadar so vzpostavljene namakalne razmere na riževih poljih. 
(
 2 ) Aerobne študije se lahko prekinejo precej pred 120 dnevi, pod pogojem, da je do takrat 
jasno dosežena pot transformacije in dokon čna mineralizacija. Prekinitev preskusa je 
mogoča po 120 dneh ali ko je transformiranih najmanj 90 % preskusne snovi, vendar 
le, če je oblikovanih najmanj 5 % CO  2 .
 Stopnja tretiranja naj ustreza najve čji stopnji aplikacije izdelka za 
zaščito pridelka, priporo čeni v navodilih za uporabo in enotni vklju ­ 
čitvi v ustrezno globino polja (npr. 10 cm vrhnje plasti tal (  1 ). Na 
primer za kemikalije, uporabljene na listju ali tleh brez vklju čitve, je 
ustrezna globina za izra čun, koliko kemikalije bi bilo treba dodati 
v vsako bu čko, 2,5 cm. Za kemikalije, vklju čene v tla, je ustrezna 
globina vklju čitve opredeljena v navodilih za uporabo. Za splošne 
kemikalije se stopnja uporabe oceni na podlagi najustreznejše poti vstopa, na primer, če je glavna pot vstopa v tla preko odpadnega 
blata, se kemikalija dozira v blato s koncentracijo, ki odraža pri ča­
kovano koncentracijo blata in mora koli čina blata, dodanega v tla, 
odražati normalno nalaganje blata na kmetijska tla. Če ta koncen ­
tracija ni dovolj visoka za ugotavljanje produktov transformacije, 
lahko pomagajo lo čeni vzorci tal, ki vsebujejo višje stopnje, vendar 
se je treba izogibati pretiranim stopnjam, ki vplivajo na mikrobne funkcije tal (glej oddelka 1.5 in 1.8.2). 
Namesto tega se ve čja serija (npr. 1 do 2 kg) tal lahko tretira 
s preskusno snovjo, pazljivo primešano v ustreznem mešalnem stroju in potem v manjših 50 do 200 gramskih delih prenešeno v inkubacijske bu čke (na primer z uporabo razdeljenih vzorcev). 
Manjše alikvote (npr. 1 g) tretirane serije tal je treba analizirati 
glede preskusne snovi, da se preveri enotna porazdelitev. Tak postopek se priporo ča, ker omogo ča enotnejšo porazdelitev 
preskusne snovi v tla. 
Tudi netretirani vzorci tal se inkubirajo v enakih razmerah (aerobnih) 
kot vzorci, tretirani s preskusno snovjo. Ti vzorci se uporabijo za meritve biomase na koncu študij in med njimi. 
Kadar se preskusna snov uporabi na tleh, raztopljenih z organskim 
topilom ali topili, se vzorci tal, tretirani z enako koli čino topil(a), 
inkubirajo v enakih razmerah (aerobnih) kakor vzorci, tretirani s preskusno snovjo. Ti vzorci se uporabljajo za za četne meritve 
biomase na koncu študij in med njimi za preverjanje u činkov 
topil(a) na mikrobno biomaso. 
Bučke, ki vsebujejo tretirana tla, so bodisi priložene preto čnemu 
sistemu, opisanemu v sliki 1, ali zaprte z absorpcijsko kolono, prika ­
zano v sliki 2 (glej Dodatek 3).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1299  
( 1 ) Izračun začetne koncentracije na podro čni osnovi z uporabo naslednje ena čbe: 
C soil mg =kg soil ½ â ¼ A½kg=haâ·10 6 ½mg =kgâ 
l½mâ·10 4 ½m 2=haâ·d kg  soil=m 3 h i  
C soil = začetna koncentracija v tleh [mg ·kg -1 ] 
A = stopnja aplikacije [kg · ha -1 ]; 1 = gostota plasti tal na polju[m]; d = gostota suhih tal 
v razsutem stanju [m]; d = gostota sunih tal v razsutem stanju [kg · m -3 ]. 
Praviloma daje stopnja uporabe 1 kg-ha  -1 v tleh koncentracijo približno 1 mg · kg  -1 
v 10-centimetrski plasti (ob predpostavki gostote v razsutem stanju 1 g · cm  -3 ).
 1.9.3  Vzor čenje in meritve  
Dvojne inkubacijske bu čke se odstranijo v ustreznih časovnih 
razmikih in vzorci tal se ekstrahirajo z ustreznimi topili razli čne 
polarnosti in analizirajo glede preskusne snovi in/ali produktov trans ­
formacije. Dobro na črtovana študija vklju čuje dovolj bu čk, tako da 
se pri vsakem vzor čenju žrtvujeta dve bu čki. Tudi absorpijske razto ­
pine ali trdni absorpcijski materiali se odstranijo v razli čnih časovnih 
razmikih (v prvem mesecu v 7-dnevnih razmikih in po prvem 
mesecu 17-dnevnih razmikih) med in na koncu inkubacije vsakega 
vzorca tal in analizirajo glede hlapnih produktov. Poleg vzorca tal, vzetega neposredno po uporabi (vzorec dneva 0), se vklju či najmanj 
5 dodatnih vzor čnih točk. Časovne razmike je treba izbrati na tak 
način, da je mogo če vzpostaviti vzorec zmanjševanja preskusne 
snovi in vzorce nastajanja in zmanjševanja produktov transformacije (npr. 0, 1, 3, 7 dni; 2, 3 tedne; 1, 2, 3 mesece itd.). 
Pri uporabi preskusne snovi z oznako
 14 C, se koli činsko dolo či 
neizločljiva radioaktivnost z izgorevanjem in izra čuna masna bilanca 
za vsak vzor čni interval. 
V primeru anaerobne in riževe inkubacije se talna in vodna faza 
skupaj analizirata glede preskusne snovi in produktov transformacije 
ali ločeno s filtracijo ali centrifugitanjem pred ekstrakcijo in analizo.  
1.9.4  Neobvezni preskusi  
Aerobne, nesterilne študije pri dodatnih temperaturah in vlagi tal so 
lahko koristne pri oceni vpliva temperature in vlage tal na stopnje 
transformacije preskusne snovi in/ali produktov njene transformacije v tleh. 
Nadaljnja opredelitev neizlo čljive radioaktivnosti se lahko poskuša 
recimo z uporabo izjemno kriti čne ekstrakcije teko čin.
 
2. PODATKI  
2.1 OBDELAVA REZULTATOV 
Količine preskusne snovi, produktov transformacije, hlapnih (samo 
v %) in neizlo čljivih snovi se podajo kot % uporabljenih za četnih 
koncentracij in, kadar je primerno, kot mg · kg -1 tal (na podlagi suhe 
teže tal) za vsak interval vzor čenja. Masno bilanco je treba podati 
v odstotku uporabljene za četne koncentracije za vsak interval vzor ­ 
čenja. Grafi čna predstavitev koncentracij preskusne snovi glede na 
čas omogo ča oceno njene razpolovne dobe transformacije ali DT  50 . 
Treba je prepoznati glavne produkte transformacije in zarisati tudi njihove koncentracije glede na čas, da se prikažejo stopnje njihovega 
nastajanja in zmanjševanja. Glavni produkt transformacije je vsak 
produkt, ki predstavlja > 10 % uporabljenega odmerka v katerem 
koli času med študijo. 
Zajeti hlapni produkti dajejo neko navedbo hlapnega potenciala 
preskusne snovi in njenih produktov transformacije iz tal.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1300
 
Natančnejše dolo čitve razpolovnih dob ali vrednosti DT  50 in po 
potrebi DT  75 in vrednosti DT  90 je treba pridobiti z uporabo ustreznih 
izračunov kineti čnih modelov. Razpolovna doba in vrednosti DT  50 
se sporočajo skupaj z opisom uporabljenega modela, vrstnega reda 
kinetike in dolo čitve koeficienta (r  2 ). Kinetika prvega reda ima pred ­
nost, razen če je r  2 < 0,7. Po potrebi se izra čuni uporabijo tudi za 
glavne produkte transformacije. Primeri ustreznih modelov so opisani v sklicih od 31 do 35. 
V primeru stopenjske študije, izvedene pri razli čnih temperaturah, so 
transformacijske stopnje opisane kot funkcija temperature 
v temperaturnem razponu pri poskusu z uporabo Arrheniusovega zakona v formuli:
 
k ¼ A·e ÄB=T or lnk ¼ 1nA Ä B 
T , 
kjer sta In A in B regresijski konstanti iz preseka in nagiba najboljše 
linije, nastale iz linearno padajo če 1n k do l/T, kjer je k konstantna 
stopnja pri temperaturi T in je T temperatura v Kelvinu. Paziti je 
treba na omejeni razpon temperature, v katerem je Arreheniusov zakon veljaven v primeru, če transformacijo ureja mikrobna dejav ­
nost.
 
2.2 VREDNOTENJE IN RAZLAGA REZULTATOV 
Čeprav se študije izvajajo v umetnem laboratorijskem sistemu, rezu ­
lati omogo čajo ocene stopnje transformacije preskusne snovi in tudi 
stopnje nastajanja in zmanjševanja produktov transformacije 
v terenskih razmerah (36) (37). 
Študija poti transformacije preskusne snovi zagotavlja informacije 
o poteh, po katerih se uporabljena snov strukturno spremeni v tleh 
s kemičnimi in mikrobnimi reakcijami.  
3. PORO ČANJE  
POROČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preskusu mora vklju čevati: 
Preskusna snov: 
— splošno ime, kemijsko ime, številko po CAS, strukturno formulo 
(z navedbo položaja oznak(e), kadar se uporabi radioaktivno označeni material) in ustrezne fizikalno-kemijske lastnosti (glej 
oddelek 1.5), 
— čistost (ne čistoče) preskusne snovi, 
— radiokemijsko čistost ozna čene kemikalije in specifi čno dejavnost 
(kjer je primerno). 
Referenčne snovi: 
— kemijsko ime in strukturo referen čnih snovi, uporabljenih za 
opredelitev in/ali dolo čitev produktov transformacije. 
Preskusna tla: 
— podrobnosti o mestu odvzema, 
— datum in postopek vzor čenja tal,
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1301
 
— lastnosti tal, kot so pH, vsebnost organskega ogljika, teksturo ( % 
peska, % mulja, % gline), kationsko izmenjalno kapaciteto, 
gostoto v razsutem stanju, zna čilnost zadrževanja vode in 
mikrobno biomaso, 
— dolžino shranjevanja tal in razmere shranjevanja ( če se shranjuje). 
Preskusni pogoji: 
— datume izvajanja študij, — količino uporabljene preskusne snovi, 
— uporabljena topila in metodo aplikacije preskusne snovi, 
— začetno težo tretiranih tal in vzorcev, odvzetih za analizo 
v vsakem časovnem obdobju, 
— opis uporabljenega sistema inkubacije, — stopnje pretoka zraka (le za preto čne sisteme), 
— temperaturo poskusnega okolja, 
— vsebnost vlage v tleh med inkubacijo, — mikrobno biomaso na za četku, med potekom in na koncu 
aerobnih študij, 
— pH, koncentracijo kisika in redoks potenciala na za četku, med 
potekom in na koncu študij anaerobnih in riževih tal, 
— metodo(-e) ekstrakcije, 
— metode za koli činsko opredelitev in dolo čitev preskusne snovi in 
glavnih produktov transformacije v tleh in absorpcijskih materia ­
lih, 
— število ponovitev in število kontrol. 
Rezultati: — rezultat dolo čitve mikrobne dejavnosti, 
— ponovljivost in ob čutljivost uporabljenih analitskih metod, 
— stopnje izkoristka (vrednosti v % za veljavno študijo so podane 
v oddelku 1.7.1), 
— tabele rezultatov, izraženih kot % apliciranega za četnega 
odmerka in, kadar je primerno, kot mg · kg
 -1 tal (na osnovi 
suhe teže), 
— masno bilanco med potekom in na koncu študij, 
— opredelitev neizlo čljive (vezane) radioaktivnosti ali ostankov 
v tleh, 
— količinsko opredelitev sproš čenega CO  2 in drugih hlapnih spojin, 
— prikaze koncentracij tal glede na čas za preskusno snov in, kadar 
je primerno, za glavne produkte transformacije, 
— razpolovno dobo ali DT  50 , DT  75 in DT  90 za preskusno snov in, 
kadar je primerno, za glavne produkte transformacije vklju čno 
z intervalom zaupanja,  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1302
— oceno stopnje abiotske razgradnje v sterilnih razmerah, 
— oceno kinetike transformacije za preskusno snov in, kadar je 
primerno, za glavne produkte transformacije, 
— predlagane poti transformacije, kadar je primerno, 
— razpravo in razlago rezultatov, 
— surove podatke (to je vzor čne kromatograme, vzor čne izračune 
stopenj transformacije in sredstev, uporabljenih za dolo čitev 
produktov transformacije).  
4. LITERATURA  
(1) US-Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Asses ­
sment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate. 
(2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. 
Guidelines for registration of pesticides in Canada. 
(3) Evropska Unija (EU) (1995). Direktiva Komisije 95/36/ES 
z dne 14. julija 1995 o spremembi Direktive Sveta 91/414/EGS o dajanju fitofarmacevtskih sredstev v promet. Priloga II, Del A in Priloga III, Del A: Vpliv in porazdelitev v okolju. 
(4) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). Appli ­
cation for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of 
the product and its metabolites in soil, water and air. 
(5) BBA (1986). Richtlinie fur die amtliche Priifung von Pflan ­
zenschutzmitteln, Teil IV, 4–1. Verbleib von Pflanzenschutz ­
mitteln im Boden – Abbau, Umwandlung und Metabolismus. 
(6) ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality – Guidance on labora ­
tory tests for biodegradation of organic chemicals in soil – Part 
1: Aerobic conditions. 
(7) ISO 14239 (1997). Soil Quality – Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralization of organic chemicals 
in soil under aerobic conditions. 
(8) SET AC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed. 
(9) MAFF – Japan 2000 – Draft Guidelines for transformation 
studies of pesticides in soil – Aerobic metabolism study in 
soil under paddy field conditions (flooded). 
(10) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18–20 January 1995. 
(11) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions 
between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic 
Press, 123–157. 
(12) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley – VCH (1998). 
(13) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945–956 (IUPAC 1984) 
(14) OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981)
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1303
 
(15) ISO 10381-6 (1993). Soil Quality – Sampling – Part 6: 
Guidance on the collection, handling and storage of soil for 
the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. 
(16) Priloga V k Dir. 67/548/EGS 
(17) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate 
of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85–114. 
(18) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962). 
(19) Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Minera ­
logical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition. 
(20) Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Micro ­
biological Properties. AL. Page, R.H. Miller and D.R. Kelney, Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition. 
(21) ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality – 
General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition. 
(22) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologisc ­
hen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main. 
(23) Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Boden ­
kunde. F. Enke Verlag, Stuttgart. 
(24) Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978) A physiological 
method for the quantitative measurement of microbial biomass 
in soils. Soil Biol. Biochem. 10, 215–221. 
(25) ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil Quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration 
method. Part 2: fumigation-extraction method. 
(26) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage of soils for 
pesticide experiments. In Pesticide Effects on Soil 
Microflora. L. Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & 
Francis, 45–60. 
(27) Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation 
in the environment: Aerobic and bio-transformation of pesti ­
cides in aqueous environment. Proceedings of the 16
 th Sympo­
sium on Environmental Science of Pesticide, 105–120. 
(28) Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of storage on 
biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology 
and Soil Quality, 59–63 (SETAC-Europe). 
(29) Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjödahl-Svensson K., Sten ­
strom J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and cold storage 
of soil on microbial activities and biomass. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 68–69 (SETAC-Europe). 
(30) Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of ethy ­
lene oxide on soil microbial content and some chemical charac ­
teristics. Plant and Soil 102, 197–200. 
(31) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte 
auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im 
Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141–146.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1304
 
(32) Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical model ­
ling to the soil persistence and accumulation of pesticides. Proc. 
BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, 181–199. 
(33) Goring, C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, 
R.W. (1975). Principles of pesticide degradation in soil. In 
„Environmental Dynamics of Pesticides“. R. Haque and 
V.H. Freed, Eds., 135–172. 
(34) Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpreta ­
tion and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz -Nachrichten Bayer 39, 
188–204. 
(35) Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesti ­
cide residues. I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 33, 47–60. 
(36) Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non-linear pesticide dissi ­
pation in soil; a new model based on spatial variability. Envi ­
ronm. Sci. Technol. 24, 1032–1041. 
(37) Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In 
Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), 
Academic Press, 83–122.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1305
 
DODATEK 1  
PRITISK VODE, POLJSKA KAPACITETA TAL ZA VODO (FC) IN ZMOGLJIVOST 
ZADRŽEVANJA VODE (WHC)  ( 1 ) 
Visina vodne kolone 
[cm] pF (  a ) bar (  b ) Pripombe  
10 7 7 10  4 suha tla 
1,6 · 10 4 4,2 16 tocka izsusenosti 
10 4 4 10 
10 3 3 1 
6· 10 2 2,8 0,6 
3,3 · 10 2 2,5 0,33 (  c ) 
razpon poljske 
kapacitete tal za vodo (  d ) 10 2 2 0,1 
60 1,8 0,06 33 1,5  9 
> > > > > > = 
> > > > > > ; 0,033 
10 1 0,01 WHC (približek) 1 0 0,001 tla, nasi čena z vodo
 
( a ) pF = logaritem cm vodne kolone. 
( b ) 1 bar =105 Pa. 
( c ) Približno ustreza vsebnosti vode 10 % v pesku, 35 % v ilovici in 45 % v glini. 
( d ) Poljska kapaciteta tal za vodo ni stalna, ampak se spreminja z vrsto tal med pF 1,5 in 2,5.  
Pritisk vode  se meri v cm vodne kolone ali v barih. Zaradi velikega razpona vleka je pritisk izražen 
preprosto kot vrednost pF, ki je enaka logaritmu cm vodne kolone.  
Poljska kapaciteta tal za vodo  je opredeljena kot koli čina vode glede na maso, ki jo lahko naravna 
tla shranijo 2 dni po dolgem deževnem obdobju ali po zadostnem namakanju. Dolo či se 
v neoviranih tleh in situ na terenu. Merjenje se zato ne uporablja na oviranih laboratorijskih vzorcih tal. Vrednosti poljske kapacitete tal za vodo, dolo čene v oviranih tleh lahko kažejo velika sistema ­
tična odstopanja.  
Zmogljivost zadrževanja vode  (WHC) je opredeljena v laboratoriju z neoviranimi in oviranimi tlemi 
z nasičenjem talne kolone z vodo s kapilarnim prenosom. Posebno uporabna je pri oviranih tleh in 
je lahko do 30 % ve čja kakor poljska kapaciteta tal za vodo (1). Eksperimentalno jo je tudi lažje 
določiti kakor zanesljive vrednosti poljske kapacitete. 
Opombe
 
( 1 ) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen 
und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1306
 
DODATEK 2  
VSEBNOST VLAGE V TLEH (g vode na 100 g suhih tal) V RAZLI ČNIH VRSTAH TAL 
V RAZLI ČNIH DRŽAVAH  
Vsebnost vlage v tleh pri 
Vrsta tal Država 
WHC (  1 ) pF = 1,8 pF = 2,5  
Pesek Nem čija 28,7 8,8 3,9 
Ilovnati pesek Nem čija 50,4 17,9 12,1 
Ilovnati pesek Švica 44,0 35,3 9,2 
Muljasta ilovica Švica 72,8 56,6 28,4 Glinasta ilovica Brazilija 69,7 38,4 27,3 Glinasta ilovica Japonska 74,4 57,8 31,4 Peščena ilovica Japonska 82,4 59,2 36,0 
Muljasta ilovica ZDA 47,2 33,2 18,8 Peščena ilovica ZDA 40,4 25,2 13,3
 
( 1 ) Zmogljivost zadrževanja vode.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1307
 
DODATEK 3  
Slika 1  
Primer preto čne naprave za preu čevanje transformacije kemikalij v tleh (  1 ) ( 2 )
 
Slika 2  
Primer bu čke biometri čnega tipa za preu čevanje transformacije kemikalij v tleh  ( 3 )
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1308  
( 1 ) Guth, J. A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, 
Ed.), Academic Press, 123–157. 
( 2 ) Guth, J. A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide 
Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85–114. 
( 3 ) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von 
Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141–146.
 C.24  AEROBNA IN ANAEROBNA TRANSFORMACIJA V SISTEMIH 
VODNIH USEDLIN  
1. METODA  
Ta preskusna metoda ustreza metodi OECD TG 308 (2002).  
1.1 UVOD 
Kemikalije lahko vstopijo v plitve ali globoke površinske vode po 
poteh, kot so neposredni vnos, pronicanje pršenja, površinsko odte ­
kanje, drenaža, odlaganje odpadkov, industrijske, doma če ali 
kmetijske odplake in usedline iz zraka. Ta preskusna metoda opisuje 
laboratorijsko metodo za ocenjevanje aerobne in anaerobne transfor ­
macije organskih kemikalij v sistemih vodnih usedlin. Temelji na obstoječih smernicah (1) (2) (3) (4) (5) (6). Na delavnici OECD 
o izbiri tal/usedline, ki je bila leta 1995 v Belgiratu v Italiji (7), je 
bil dosežen dogovor predvsem o številu in vrstah tal za uporabo 
v tem preskusu. Dana so bila tudi priporo čila v zvezi 
z odvzemanjem, obravnavanjem in shranjevanjem vzorcev usedlin, ki temeljijo na napotkih ISO (8). Take študije so potrebne za kemi ­
kalije, ki se vnašajo neposredno v vodo ali za katere je verjetno, da 
bodo prišle v vodno okolje po zgoraj opisanih poteh. 
Razmere v naravnih sistemih vodnih usedlin so v zgornji vodni fazi 
pogosto aerobne. Površinska plast usedline je lahko bodisi aerobna ali anaerobna, globlje usedline pa so navadno anaerobne. Da bi zajeli 
vse te možnosti, so v tem dokumentu opisani tako aerobni kot 
anaerobni preskusi. Aerobni preskus simulira aerobno vodno kolono nad plastjo aerobne usedline, pod katero je anaerobno pobo čje. 
Anaerobni preskus simulira povsem anaerobni sistem vode in used ­
line. Če okoliščine kažejo, da je treba znatno odstopati od teh pripo ­
ročil, na primer z uporabo nedotaknjenih jeder usedlin ali usedlin, ki 
so bile morda izpostavljene preskusni snovi, so v ta namen na volji druge metode (9).
 
1.2 OPREDELITVE POJMOV 
V vsakem primeru se uporabljajo standardne mednarodne enote (SI).  
Preskusna snov:  katera koli snov, bodisi osnovna ali ustrezni 
produkti transformacije.  
Produkti transformacije:  vse snovi, ki so posledica biotskih in 
abiotskih transformacijskih reakcij preskusne snovi, vklju čno s CO  2 
in vezanimi ostanki.  
Vezani ostanki: „vezani ostanki“ predstavljajo spojine v tleh, rast ­
linske ali živalske, ki vztrajajo v matrici v obliki osnovne snovi ali njenega metabolita ali njenih metabolitov/produktov po ekstrakciji. Ekstrakcijska metoda ne sme bistveno spremeniti samih spojin ali 
strukture matrice. Narava vezi se lahko delno pojasni 
z ekstrakcijskimi metodami, ki spreminjajo matrico, in z visoko razvitimi analitskimi tehnikami. Do sedaj so bile, na primer, na ta način odkrite kovalentne ionske in sorptivne vezi. Na splošno nasta ­
janje vezanih ostankov znatno zmanjša biološko dostopnost in 
biološko razpoložljivost (10) [prikrojeno po IUPAC-u (11)].
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1309
 
Aerobna transformacija  (oksidacija): reakcije, ki se pojavljajo 
v navzočnosti molekularnega kisika (12).  
Anaerobna transformacija  (redukcija): reakcije, ki se pojavljajo 
v odsotnosti molekularnega kisika (12).  
Naravne vode:  so površinske vode, dobljene iz ribnikov, rek, 
potokov itd.  
Usedlina:  je mešanica mineralnih in organskih kemi čnih sestavin, 
slednje vsebujejo spojine z visoko vsebnostjo ogljika in dušika in 
z veliko molsko maso. Odlaga jo naravna voda in tvori povezavo 
z vodo.  
Mineralizacija:  je popolna razgradnja organske spojine v CO  2 , 
H 2 O v aerobnih razmerah in CH  4 , CO  2 in H  2 O v anaerobnih razme ­
rah. V smislu te preskusne metode, kjer se uporablja spojina 
z radioaktivno oznako, mineralizacija pomeni obsežno razgradnjo molekule, v kateri se ozna čeni ogljikov atom oksidira ali koli činsko 
reducira s sproš čanjem ustrezne koli čine
 14 CO 2 oziroma  14 CH 4 . 
Razpolovna doba,  t 0,5 , je čas, potreben za 50 %-no transformacijo 
preskusne snovi, kadar lahko transformacijo opišemo kot kinetiko prvega reda; razpolovna doba ni odvisna od za četne koncentracije.  
Čas razgradnje DT
 50 : je čas, v katerem se za četna koncentracija 
preskusne snovi zmanjša za 50 %.  
Čas razgradnje DT  75 : je čas, v katerem se za četna koncentracija 
preskusne snovi zmanjša za 75 %.  
Čas razgradnje DT  90 : je čas, v katerem se za četna koncentracija 
preskusne snovi zmanjša za 90 %.  
1.3 REFEREN ČNE SNOVI 
Referenčne snovi se uporabljajo za dolo čitev in koli činsko oprede ­
litev produktov transformacije s spektroskopsko in kromatografsko 
metodo.  
1.4 PODATKI O PRESKUSNI SNOVI 
Za merjenje stopnje transformacije se lahko uporabi neozna čena ali 
izotopno ozna čena preskusna snov, čeprav se priporo ča označeni 
material. Ozna čeni material je potreben za preu čevanje poti trans ­
formacije in za vzpostavitev masne bilance. Priporo ča se oznaka  14 C, 
vendar je lahko koristna tudi uporaba drugih izotopov, na primer C, N, H, P. Ce je to mogo če, naj se oznaka namesti na najstabilnejši 
del(e) molekule (
 1 ). Kemijska in/ali radiokemij ska čistost preskusne 
snovi naj bo vsaj 95 %. 
Pred izvajanjem preskusa morajo biti na voljo naslednje informacije 
o preskusni snovi: 
(a) topnost v vodi (metoda A.6); 
(b) topnost v organskih topilih; 
(c) tlak pare (metoda A.4) in Henryjeva konstanta;  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1310  
( 1 ) Na primer, če snov vsebuje en obro č, je potrebna oznaka tega obro ča; če preskusna snov 
vsebuje dva ali ve č obročev, so lahko potrebne študije za ovrednotenje usode vsakega 
označenega obro ča in pridobitev ustreznih informacij o oblikovanju produktov transfor ­
macije.
 (d) porazdelitveni koeficient n-oktanol/voda (metoda A. 8); 
(e) adsorpcijski koeficient (K  d , K  f or K  oc , kjer je primerno) 
(metoda C.18); 
(f) hidroliza (metoda C.7); 
(g) disociacijska konstanta (pK  a ) [Smernica OECD 112] (13); 
(h) kemijska struktura preskusne snovi in po potrebi položaj 
oznak(e) izotopa.  
Opomba:  Poročati je treba o temperaturi, pri kateri so bile opravljene 
te meritve. 
Druge uporabne informacije lahko vklju čujejo podatke o toksi čnosti 
preskusne snovi za talne mikroorganizme, podatke o lahki in/ali inherentni biorazgradljivosti in podatke o aerobni in anaerobni trans ­
formaciji v tleh. 
Na voljo morajo biti analitske metode (vklju čno z metodami ekstrak ­
cije in očiščenja) za dolo čitev in koli činsko opredelitev preskusne 
snovi in njenih produktov transformacije v vodi in usedlini (glej oddelek 1.7.2).
 
1.5 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Metoda, opisana v tem preskusu, uporablja sistem aerobnih in 
anaerobnih vodnih usedlin (glej Dodatek 1), ki omogo ča: 
— merjenje stopnje transformacije preskusne snovi v sistemu vode 
in usedline, 
— merjenje stopnje transformacije preskusne snovi v usedlini, — merjenje stopnje mineralizacije preskusne snovi in/ali njenih 
produktov transformacije ( če se uporablja preskusna snov 
z oznako
 14 C), 
— določitev in koli činsko opredelitev produktov transformacije 
v vodni fazi in fazi usedline, vklju čno z masno bilanco ( če se 
uporablja ozna čena preskusna snov), 
— merjenje porazdelitve preskusne snovi in njenih produktov trans ­
formacije med dve fazi v času inkubacije v temi (na primer, da bi 
se izognili cvetenju alg) pri stalni temperaturi. Razpolovne dobe in vrednosti DT
 50 , DT  75 in DT  90 se določijo, kadar so podatki 
zanesljivi, vendar se ne smejo ekstrapolirati še dolgo po koncu 
poskusnega obdobja (glej oddelek 1.2). 
Tako za aerobne kot za anaerobne študije sta potrebni najmanj dve 
usedlini in z njimi povezana voda (7). Seveda pa lahko obstajajo primeri, ko je treba uporabiti ve č kakor dve vodni usedlini, na 
primer, pri kemikaliji, ki je lahko navzo ča v sveži vodi in/ali 
morskem okolju.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1311
 
1.6 UPORABNOST PRESKUSA 
Metoda se navadno uporablja za kemi čne snovi (brez oznake ali 
z radioaktivno oznako), za katere je na voljo dovolj natan čna in 
občutljiva analitska metoda. Uporablja se za rahlo hlapne, nehlapne, 
vodotopne ali v vodi slabo topne spojine. Preskus naj se ne uporablja 
za kemikalije v vodi, ki so lahko hlapne (npr. fumiganti, organska topila) in se tako ne morejo zadrževati v vodi in/ali usedlini za poskusne pogoje tega preskusa. 
Metoda se je do zdaj uporabljala za študije transformacije kemikalij 
v sveži vodi in usedlinah, vendar bi se na čeloma lahko uporabljala 
tudi za morske rokave in priobalne sisteme. Ni pa primerna za 
simuliranje razmer v teko či vodi (npr. rekah) ali na odprtem morju.
 
1.7 MERILA KAKOVOSTI  
1.7.1  Izkoristek  
Ekstrakcija in analiza najmanj dvojnih vzorcev vode in usedline 
takoj po dodajanju preskusne snovi da prvi prikaz ponovljivosti analitske metode in izena čenosti postopka uporabe za preskusno 
snov. Izkoristki poznejših stopenj poskusov so podani z ustreznimi 
masnimi bilancami (kadar se uporabi ozna čeni material). Izkoristki 
so v razponu od 90 % do 110 % pri ozna čenih kemikalijah (6) in od 
70 % do 110 % pri neozna čenih kemikalijah.
 
1.7.2  Ponovljivost in ob čutljivost analitske metode  
Ponovljivost analitske metode (brez za četne učinkovitosti ekstrakcije) 
za količinsko dolo čitev preskusne snovi in proizvodov transformacije 
se lahko preveri z dvojno analizo istega ekstrakta vode ali vzorcev usedline, ki so bili inkubirani dovolj dolgo, da nastajajo proizvodi 
transformacije. 
Meja detekcije analitske metode za preskusno snov in za proizvode 
transformacije mora biti najmanj 0,01 mg · kg
 -1 vode ali usedline (kot 
preskusne snovi) ali 1 % za četne količine, uporabljene v preskusnem 
sistemu, kar je manj. Opredeliti je treba tudi mejo koli činske opre ­
delitve.  
1.7.3  To čnost podatkov transformacije  
Regresijska analiza koncentracij preskusne snovi v funkciji časa daje 
ustrezne informacije o to čnosti krivulje transformacije in omogo ča 
izračun intervala zaupanja za razpolovne dobe ( če se uporablja 
psevdo kinetika prvega reda) ali vrednosti DT  50 in, če je primerno, 
vrednosti DT  75 in DT  90 . 
1.8 OPIS METODE  
1.8.1  Preskusni sistem in naprave  
Studijo je treba opraviti v steklenih posodah (npr. steklenicah, epru ­
vetah za centrifugiranje), razen če predhodne informacije (na primer 
porazdelitveni koeficient n-oktanol/voda, sorpcijski podatki itd.) kažejo, da se lahko preskusna snov lepi na steklo in je treba v tem primeru razmisliti o drugem materialu (na primer o teflonu). 
Če je znano, da se preskusna snov oprijema stekla, je ta problem 
mogoče odpraviti z eno ali ve č od naslednjih metod:
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1312
 
— določimo maso preskusne snovi in produktov transformacije, ki 
so se oprijeli stekla, 
— zagotovimo, da se na koncu preskusa vsa steklena oprema izpere 
z raztopino, 
— uporabimo formulirane produkte (glej tudi oddelek 1.9.2), — uporabimo pove čano količino pomožnega topila za dodajanje 
preskusne snovi v sistem; če se uporablja pomožno topilo, naj 
bo to pomožno topilo, ki ne raztaplja preskusne snovi. 
Primera tipi čnih preskusnih naprav, to je plinske preto čne naprave in 
sistema biometri čnega tipa, sta prikazana v dodatkih 2 in 3 (14). 
Drugi uporabni inkubacijski sistemi so opisani v sklicu 15. Na črt 
poskusne naprave mora omogo čati izmenjavo zraka ali dušika in 
zajemanje hlapnih produktov. Mere naprave morajo izpolnjevati zahteve preskusa (glej oddelek 1.9.1). Prezra čevanje se lahko zago ­
tovi bodisi z blagim vpihavanjem mehur čkov ali spuš čanjem zraka 
ali dušika preko vodne površine. V slednjem primeru je priporo čljivo 
rahlo mešanje vode od zgoraj zaradi boljše porazdelitve kisika ali dušika v vodi. Zrak brez CO
 2 se ne sme uporabljati, ker lahko 
povzroči povečanje pH vode. V obeh primerih je nezaželeno motenje 
usedline in se je treba temu čim bolj izogibati. Rahlo hlapne kemi ­
kalije je treba preskusiti v sistemu biometri čnega tipa z blagim meša ­
njem vodne površine. Lahko se uporabljajo tudi zaprte posode 
z volumnom nad vzorcem bodisi z atmosferskim zrakom ali dušikom 
in notranjimi stekleni čkami za zajemanje hlapnih produktov (16). Pri 
aerobnem preskusu je potrebna redna izmenjava plina v volumnu nad vzorcem, da se nadomesti kisik, ki ga porabi biomasa. 
Primerni lovilniki za zbiranje hlapnih produktov transformacije med 
drugim zajemajo 1 mol ·dm
 -3 raztopine kalijevega hidroksida ali 
natrijevega hidroksida za ogljikov dioksid [9] in etilen glikol, etano ­
lamin ali 2 % parafin v ksilenu za organske spojine. Hlapne snovi, ki 
nastanejo v anaerobnih razmerah, kot na primer metan, se lahko 
zberejo recimo z molekulskimi siti. Take hlapne snovi se lahko sežgejo, na primer v CO
 2 , tako da se plin spusti skozi kremenovo 
epruveto, napolnjeno s CuO, pri temperaturi 900  o C in se nastali 
CO 2 zajame v absorpcijsko posodo z alkalijskimi snovmi (17). 
Potrebni so laboratorijski instrumenti za kemijsko analizo preskusne 
snovi in produktov transformacije (npr. plinsko teko činsko kromato ­
grafijo (GLC), teko činsko kromatografijo visoke lo čljivosti (HPLC), 
tankoplastno kromatografijo (TLC), masno spektroskopijo (MS), 
plinsko kromatografijo-masno spektroskopijo (GC-MS), teko činsko 
kromatografijo-masno spektroskopijo (LC-MS), jedrsko magnetno resonanco (NMR) itd.), vklju čno s sistemi detekcije radioaktivno 
označenih ali neozna čenih kemikalij, kot je primerno. Kadar se 
uporablja radioaktivno ozna čeni material, sta potrebna tudi teko činski 
scintilacijski števec in oksidacijsko sredstvo za izgorevanje (za sežig vzorcev usedline pred analizo radioaktivnosti). 
Po potrebi se zahteva še druga standardna laboratorijska oprema za 
fizikalno-kemijske in biološke dolo čitve (glej oddelek tabele 1, 
oddelek 1.8.2.2), steklena posoda, kemikalije in reagenti.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1313
 
1.8.2  Izbira in število vodnih usedlin  
Mesta vzor čenja je treba izbrati v skladu z namenom preskusa v dani 
situaciji. Pri izbiranju mesta vzor čenja je treba upoštevati preteklost 
morebitnih kmetijskih, industrijskih ali doma čih vnosov v zajetje in 
vode v zgornjem toku. Usedline se ne smejo uporabiti, če so bile 
v predhodnih 4 letih kontaminirane s preskusno snovjo ali analo ­
gnimi strukturami.  
1.8.2.1  Izbira usedine  
Za aerobne študije se navadno uporabita dve usedlini (7). Izbrani 
usedlini se morata razlikovati glede vsebnosti organskega ogljika in teksture. Ena usedlina naj ima visoko vsebnost organskega ogljika 
(2,5–7,5 %) in fino teksturo, druga usedlina naj ima nizko vsebnost 
organskega ogljika (0,5–2,5 %) in grobo teksturo. Razlika med vsebnostjo organskega ogljika naj bo normalno vsaj 2 %. „Fina tekstura“ je opredeljena kot vsebnost [gline + mulja] [10] > 50 % 
in „groba tekstura“ je opredeljena kot vsebnost [gline + mulja] < 
50 %. Razlika v vsebnosti [gline + mulja] obeh usedlin naj bo normalno vsaj 20 %. V primerih, ko lahko pride kemikalija tudi v morsko vodo, naj bo vsaj en sistem vode in usedline morskega 
izvora. 
Pri povsem anaerobnih študijah, je treba vzorce za dve usedlini 
(vključno z njunimi povezanimi vodami) vzeti iz anaerobnih con 
teles površinskih vod (7). Z obema fazama, fazo usedline in vodno fazo, je treba ravnati previdno in ju prenesti brez navzo čnosti kisika. 
Pri izbiri usedlin so lahko pomembni še drugi parametri in jih je 
treba upoštevati za vsak primer posebej. Na primer razpon pH usedlin bi bil pomemben za preskušanje kemikalij, pri katerih je transformacija in/ali sorpcija lahko odvisna od pH. Odvisnost sorp ­
cije od pH se lahko odraža v pK
 a preskusne snovi.  
1.8.2.2  Opis zna čilnosti vzorcev vode in usedline  
Ključni parametri, ki se morajo izmeriti in je treba o njih poro čati 
(s sklicevanjem na uporabljeno metodo) tako za vodo kot usedlino, 
in stopnja preskusa, pri kateri je treba te parametre dolo čiti, so 
povzeti v tukajšnji tabeli. Metode za dolo čanje teh parametrov so 
v vednost podane v sklicih (18) (19) (20) (21). 
Poleg tega utegne biti glede na posamezen primer potrebno izmeriti 
in poročati o drugih parametrih (npr. za svežo vodo: o delcih, alkal ­
nosti, trdoti, prevodnosti, NO  3 /PO  4 (razmerje in posamezne vredno ­
sti); za usedline: o kationski izmenjalni kapaciteti, zmogljivosti zadr ­ 
ževanja vode, karbonatu, skupnem dušiku in fosforju in za morske sisteme: o slanosti). Analiza nitrata, sulfata, biološko razpoložljivega železa in drugih možnih sprejemnikov elektronov v usedlinah in 
vodah je lahko koristna tudi pri ocenjevanju redoks pogojev, zlasti 
v zvezi z anaerobno transformacijo.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1314
 
Meritve parametrov za opredelitev vzorcev vode in usedline (7) (22) (23)  
Parameter Stopnja preskusnega postopka 
Terensko 
vzorčenje Poznejše ra ­
vnanje Začetek 
prilagoditve Začete 
k preskusa Med 
preskusom Konec 
preskusa  
Voda  
Izvor/vir X Temperatura X pH X X X X X 
Skupni organski ogljik X X X 
Koncentracija O
 2 (*) X X X X X 
Redoks potencial (*) X X X X  
Usedlina  
Izvor/vir X Globina plasti X pH X X X X X Porazdelitev velikosti delcev X Skupni organski ogljik X X X X Microbna biomasa (*) X X X Redoks potencial (**) Opazo ­
vanje 
(barva/ 
vonj) X X X X
 
(*) Metoda stopnje mikrobne respiracije (26), metoda zaplinjanja (27) ali meritve s štetjem (npr. bakterij, aktinomicet, 
gliv in skupnih kolonij) pri aerobnih študijah; stopnja metanogeneze pri anaerobnih študijah. 
(**) Rezultati novejših raziskav kažejo, da meritve koncentracij kisika v vodi in redoks potencialov nimajo niti mehani ­
stične niti napovedovalne vrednosti glede rasti in razvoja mikrobn ih populacij na površini teh vod (24) (25). Boljša 
orodja za razlago in vrednotenje stopenj in poti aerobne biotransformacije so lahko dolo čitev potrebe po biokemij ­
skem kisiku (BOD pri terenskem vzor čenju, na za četku in na koncu preskusa) in koncentracij mikro/makro hranilnih 
snovi Ca, Mg in Mn (na za četku in na koncu preskusa) v vodi in meritve skupnega N in skupnega P v usedlinah (pri 
terenskem vzor čenju in na koncu preskusa).  
1.8.3  Odvzemanje, obravnavanje in shranjevanje  
1.8.3.1  Odvzemanje  
Pri vzorčenju usedlin je treba upoštevati osnutek smernice ISO 
o vzorčenju usedlin z dna (8). Vzorce usedlin je treba jemati 
s celotnih 5 do 10 cm zgornje plasti usedline. Z usedlino povezano vodo je treba odvzeti z istega mesta ali lokacije in v istem času 
kakor usedlino. Pri anaerobnih študijah je treba usedline in z njimi 
povezano vodo vzor čiti in prevažati brez navzo čnosti kisika (28) 
(glej oddelek 1.8.2.1). Nekaj pripomo čkov za vzor čenje je opisanih 
v literaturi (8) (23).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1315
 
1.8.3.2  Ravnanje  
Usedlina se lo či od vode s filtriranjem in se mokro preseje skozi 2 mm 
sito z uporabo odve čne vode z lokacije, ki se nato zavrže. Nato se znane 
količine usedlin in vode zmešajo v želenem razmerju (glej oddelek 
1.9.1) v inkubacijskih bu čkah in pripravijo za prilagoditveno obdobje 
(glej oddelek 1.8.4). Pri anaerobnih študijah je treba vse stopnje ravnanja opraviti brez navzo čnosti kisika (29) (30) (31) (32) (33).
 
1.8.3.3  Shranjevanje  
Močno se priporo ča uporaba sveže odvzetih vzorcev usedlin in vode, 
če pa je nujno shranjevanje, je treba usedlino in vodo presejati, kakor 
je opisano zgoraj, in shraniti skupaj, namo čeno v vodi (6–10 cm 
plast vode) v temi pri 4 ± 2  o C 4 za največ 4 tedne (7) (8) (23). 
Vzorce, ki se uporabijo za aerobne študije, je treba shraniti s prostim dostopom do zraka (npr. v odprtih posodah), tiste za anaerobne študije pa brez navzo čnosti kisika. Med prevozom in shranjevanjem 
ne sme priti do zamrznitve usedlin in vode in izsuševanja usedline.
 
1.8.4  Priprava vzorcev usedline/vode za preskus  
Obdobje prilagoditve naj poteka pred dodajanjem preskusne snovi, 
vsak vzorec usedline/vode se položi v inkubacijsko posodo za 
uporabo pri glavnem preskusu, prilagoditev pa naj se izvaja v povsem enakih razmerah kakor preskusna inkubacija (glej oddelek 1.9.1). Prilagoditveno obdobje je čas, potreben, da se doseže 
razumna stabilnost sistema, kot jo odražajo pH, koncentracija kisika 
v vodi, redoks potencial usedline in vode in makroskopska lo čitev 
faz. Obdobje prilagoditve naj normalno traja od enega tedna do dveh tednov in ne sme presegati štirih tednov. Poro čati je treba 
o rezultatih dolo čitev, ki se izvedejo v tem obdobju.
 
1.9 IZVEDBA PRESKUSA  
1.9.1  Preskusni pogoji  
Preskus je treba izvesti v inkubacijski napravi (glej oddelek 1.8.1) 
z vodno usedlino v volumenskem razmerju med 3: 1 in 4: 1 in plastjo usedline 2,5 cm (±0,5 cm) (
 1 ). Priporo čena najmanjša koli čina 
na inkubacijsko posodo je 50 g usedline (na osnovi suhe teže). 
Preskus je treba opraviti v temi pri stalni temperaturi v razponu od 
10 do 30  o C. Primerna je temperatura (20 ± 2)  o C. Po potrebi se 
lahko v posameznih primerih, odvisno od informacij, ki se zahtevajo 
od preskusa, razmisli o dodatni nižji temperaturi (npr. 10  o C). Inku­
bacijsko temperaturo je treba spremljati in o njej poro čati. ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1316  
( 1 ) Novejše študije so pokazale, da lahko shranjevanje pri 4  o C vodi v zmanjšanje vsebnosti 
organskega ogljika v usedlini, kar lahko povzro či tudi zmanjšanje mikrobne dejavnosti (34).
 1.9.2  Ravnanje s preskusno snovjo in njena uporaba  
Uporabi se ena preskusna koncentracija kemikalije (  1 ). Pri kemika ­
lijah za zaš čito pridelka, ki se vnašajo neposredno v vodna telesa, se 
največji odmerek na nalepki jemlje kot najve čja stopnja aplikacije, 
računano na osnovi površinskega obmo čja vode v preskusni posodi. 
V vseh drugih primerih naj se uporabijo koncentracije, ki temeljijo na napovedih iz emisij v okolje. Treba je paziti, da se zagotovi vnos zadostne koncentracije preskusne snovi za opredelitev poti 
transformacije ter nastajanje in zmanjševanje produktov transforma ­
cije. V primerih, ko so koncentracije preskusne snovi blizu mejam detekcije na za četku študije in/ali kadar glavni produkti transforma ­
cije niso zlahka zaznavni ob navzo čnosti 10 % stopnje aplikacije 
preskusne snovi, je morda treba uporabiti ve čje odmerke (npr. 10- 
krat). A če se uporabijo višje preskusne koncentracije, ne smejo 
imeti opaznega škodljivega u činka na mikrobno dejavnost sistema 
vode in usedline. Da bi dosegli stalno koncentracijo preskusne snovi 
v posodah razli čnih velikosti, je morda primerno razmisliti 
o prilagoditvi koli čine uporabljenega materiala na podlagi globine 
vodne kolone v posodi glede na globino vode na terenu (za katero 
se predvideva, da je 100 cm, vendar se lahko uporabijo druge globi ­
ne). Glej Dodatek 4 za primer izra čuna. 
V idealnem primeru se preskusna snov uporabi kot vodna raztopina 
v vodni fazi preskusnega sistema. Če se temu ne da izogniti, je 
dovoljena uporaba manjših koli čin topil, ki se mešajo z vodo (npr. 
aceton, etanol), za nanos in porazdelitev preskusne snovi, vendar ne 
sme presegati 1 % v/v in ne sme imeti škodljivih u činkov na 
mikrobno dejavnost preskusnega sistema. Pri izdelavi vodne razto ­
pine preskusne snovi je potrebna pazljivost, za zagotavljanje popolne 
homogenosti je morda primerna uporaba generatorskih kolon in 
predhodno mešanje. Po dodajanju vodne raztopine v preskusni sistem se priporo ča nežno mešanje vodne faze, tako da se čim 
manj moti usedlina. 
Ne priporo ča se rutinska uporaba formuliranih pripravkov, ker lahko 
formulirane sestavine škodujejo porazdelitvi preskusne snovi in/ali 
produktov transformacije med vodno fazo in fazo usedline. Vendar je lahko uporaba formuliranega materiala ustrezna rešitev pri slabo 
topnih preskusnih snoveh. 
Število inkubacijskih posod je odvisno od števila vzor čenj (glej 
oddelek 1.9.3). Treba je vklju čiti zadostno število preskusnih siste ­
mov, tako da se lahko pri vsakem vzor čenju žrtvujeta dva sistema. 
Če se pri vsaki vodni usedlini uporabijo kontrolne enote, se ne smejo 
tretirati s preskusno snovjo. Kontrolne enote se lahko uporabljajo za 
določanje mikrobne biomase usedline in skupnega organskega 
ogljika v vodi in usedlini na koncu študije. Dve kontrolni enoti (to je po ena kontrolna enota iz vsake vodne usedline) se lahko uporabi 
za spremljanje potrebnih parametrov v usedlini in vodi med prilago ­
ditvenim obdobjem (glej tabelo v oddelku 1.8.2.2). Dve dodatni kontrolni enoti je treba vklju čiti v primeru, če se preskusna snov 
nanese s pomo č
jo topila, da se izmeri škodljive u činke na mikrobno 
dejavnost preskusnega sistema.  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1317  
( 1 ) Preskus z drugo koncentracijo je lahko koristen pri kemikalijah, ki pridejo v površinske 
vode po drugih vstopnih poteh in povzro čijo znatno druga čne koncentracije, če se lahko 
manjša koncentracija dovolj natan čno analizira.
 1.9.3  Trajanje preskusa in vzor čenje 
Trajanje poskusa normalno ne presega 100 dni (6) in naj se nada ­
ljuje, dokler se ne vzpostavijo pot razgradnje in vzorec razporeditve vode/usedline ali dokler se 90 % preskusne snovi ne porabi 
s transformacijo in/ali izhlapevanjem. Število vzor čenj naj bo vsaj 
šest (vklju čno z ničelnim), z neobvezno predhodno študijo (glej 
oddelek 1.9.4), ki se uporabi za vzpostavitev ustreznega režima vzor ­ 
čenja in trajanja preskusa, razen če je iz prejšnjih študij na voljo 
dovolj podatkov o preskusni snovi. Za hidrofobne preskusne snovi 
so lahko v za četnem obdobju študije potrebne dodatne to čke vzor­ 
čenja zaradi dolo čitve stopnje razporeditve med vodno fazo in fazo 
usedline. 
Po ustreznem številu vzor čenj se vse inkubacijske posode 
(v ponovitvah) odstranijo za analizo. Usedlina in nad njo leže ča 
voda se analizirata posebej[15]. Površinska voda se previdno odstrani s čim manjšim motenjem usedline. Pri ekstrakciji in opredelitvi 
preskusne snovi in produktov transformacije je treba upoštevati 
ustrezne analitske postopke. Paziti je treba, da se odstrani material, ki se je morda adsorbiral na inkubacijsko posodo ali na povezovalne cevi, ki se uporabljajo za zajemanje hlapnih snovi.
 
1.9.4  Neobvezni predhodni preskus  
Če se trajanje in režim vzor čenja ne moreta oceniti po drugih 
ustreznih študijah preskusne snovi, je lahko primeren neobvezni 
predhodni preskus, ki ga je treba izvesti z uporabo enakih preskusnih 
razmer, kakor so predlagane za dejansko študijo. O ustreznih poskusnih razmerah in rezultatih predhodnega preskusa, če se izvede, 
je treba na kratko poro čati.
 
1.9.5  Meritve in analiza  
Koncentracijo preskusne snovi in produktov transformacije je treba 
pri vsaki ponovitvi vzor čenja izmeriti in o njej poro čati 
(o koncentraciji in o uporabljenem odstotku). Na splošno je treba ugotoviti produkte transformacije, ki se pri katerem koli vzor čenju 
zaznajo pri > 10 % uporabljene radioaktivnosti v skupnem sistemu 
voda-usedlina, razen če ni upravi čeno utemeljeno druga če. Tudi 
produkte transformacije, pri katerih se koncentracije med študijo nenehno pove čujejo, je treba upoštevati pri ugotavljanju, tudi če 
njihove koncentracije ne presegajo zgornjih omejitev, ker lahko 
označujejo obstojnost. Slednje je treba upoštevati glede na vsak 
primer posebej in v poro čilu podati utemeljitev. 
O rezultatih iz sistemov zajemanja plinov/hlapnih snovi (CO
 2 in 
drugih, to je hlapnih organskih spojin) je treba poro čati za vsako 
ponovitev vzor čenja. Poro čati je treba o stopnjah mineralizacije. 
O neizločljivih (vezanih) ostankih v usedlini je treba poro čati za 
vsako točko vzorčenja. ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1318
 
2. PODATKI  
2.1 OBDELAVA REZULTATOV 
Skupno masno bilanco ali izkoristek (glej oddelek 1.7.1) dodane 
radioaktivnosti je treba izra čunati za vsako ponovitev vzor čenja. 
O rezultatih se poro ča v obliki odstotka dodane radioaktivnosti. 
O porazdelitvi radioaktivnosti med vodo in usedlino se poro ča 
v obliki koncentracij in odstotkov za vsako ponovitev vzor čenja. 
Razpolovna doba, DT  50 in po potrebi DT  75 in DT  90 preskusne snovi 
se izračunajo skupaj z njihovim intervalom zaupanja (glej oddelek 
1.7.3). Informacije o stopnji razpršitve preskusne snovi v vodi in usedlini se lahko dobijo z uporabo ustreznih ocenjevalnih orodij. 
Te so lahko vse od uporabe psevdo kinetike prvega reda, empiri čnih 
tehnik prilagajanja krivulje, pri katerih se uporabljajo grafi čne ali 
številčne rešitve do bolj zapletenega ocenjevanja, na primer 
z uporabo eno- ali ve čprekatnih modelov. Nadaljnji podatki so na 
voljo v ustrezni objavljeni literaturi (35) (36) (37). 
Vsi pristopi imajo svoje prednosti in slabosti in se znatno razlikujejo 
po sestavljenosti. Predpostavka kinetike prvega reda je lahko preve ­
lika poenostavitev procesov razgradnje in porazdelitve, a kadar je 
mogoče, daje pojem (stopnjo konstante ali razpolovno dobo), ki je 
lahko razumljiv in ima vrednost pri simulacij skem modeliranju in izračunavanju predvidenih okoljskih koncentracij. Empir čni pristopi 
ali linearne transformacije se lahko bolje ujemajo s krivuljami poda ­
tkov in zato omogo čajo boljše ocene razpolovnih dob, vrednosti 
DT
 50 in po potrebi DT  75 in DT  90 . Uporaba izpeljanih konstant pa 
je omejena. Modeli s prekati lahko dajo številne uporabne konstante 
vrednosti pri ocenjevanju tveganja, ki opisujejo stopnjo razgradnje 
v različnih prekatih in porazdelitev kemikalije. Uporabljajo se lahko 
tudi za ocenjevanje stopnje konstant pri oblikovanju in razgradnji glavnih produktov transformacije. V vseh primerih mora biti izbrana 
metoda utemeljena in mora izvajalec poskusa grafi čno in/ali stati ­
stično prikazati, zakaj je izbira dobra.
 
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Poročilo mora vsebovati naslednje informacije: 
Preskusna snov: — splošno ime, kemijsko ime, številko po CAS, strukturno formulo 
(z navedbo položaja oznak(e), kadar se uporabi radioaktivno 
označeni material) in ustrezne fizikalno-kemijske lastnosti, 
— čistost (ne čistoče) preskusne snovi, 
— radiokemijsko čistost ozna čene kemikalije in molarno dejavnost 
(kjer je primerno).
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1319
 
Referenčne snovi: 
— kemijsko ime in strukturo referen čnih snovi, uporabljenih za 
opredelitev in/ali dolo čitev produktov transformacije. 
Preskusne usedline in vode: — lokacijo in opis mest(a) vzor čenja vodnih usedlin, vklju čno, če je 
mogoče, s preteklo kontaminacijo, 
— vse informacije v zvezi z odvzemanjem, shranjevanjem ( če se 
izvaja) in prilagoditvijo sistemov vode in usedlin, 
— značilnosti vzorcev vode in usedlin, ki so naštete v tabeli 
v oddelku 1.8.2.2. 
Preskusni pogoji: — uporabljeni preskusni sistem (npr. preto čni, biometri čni, način 
prezračevanja, metodo mešanja, koli čino vode, maso usedline, 
gostoto obeh plasti, vode in usedline, mere preskusnih posod itd.), 
— uporabo preskusne snovi v preskusnem sistemu: uporabljeno 
preskusno koncentracijo, število ponovitev in na čin uporabe 
kontrol preskusne snovi (npr. morebitno uporabo topila) itd., 
— inkubacijsko temperaturo, — število vzor čenj, 
— metode ekstrakcije in u činkovitost, pa tudi analitske metode in 
meje detekcije, 
— metode opredelitve/dolo čitve produktov transformacije, 
— odstopanja od preskusnega protokola ali preskusnih razmer med 
študijo. 
Rezultati: — vrednosti surovih podatkov reprezentativnih analiz (vsi surovi 
podatki se morajo shraniti v GLP arhivu), 
— ponovljivost in ob čutljivost uporabljenih analitskih metod, 
— stopnje izkoristka (vrednosti v % za veljavno študijo so podane 
v oddelku 1.7.1), 
— tabele rezultatov, izražene v % uporabljenega odmerka in 
v mg· kg
 -1 v vodi, usedlini in skupnem sistemu (samo %) za 
preskusno snov in, če je primerno, za produkte transformacije in 
neizločljivo radioaktivnost, 
— masno bilanco med potekom in na koncu študij, 
— grafično predstavitev transformacije v vodi in frakcijah 
usedlin ter v skupnem sistemu (vklju čno z mineralizacijo), 
— stopnje mineralizacije,  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1320
 
— razpolovno dobo, vrednosti DT  50 in po potrebi DT  75 in DT  90 za 
preskusno snov in, kadar je primerno, za glavne produkte trans ­
formacije, vklju čno z intervalom zaupanja v vodi, usedlini in 
skupnem sistemu, 
— oceno kinetike transformacije za preskusno snov in, kadar je 
primerno, za glavne produkte transformacije, 
— predlagane poti transformacije, kadar je primerno, — razpravo o rezultatih.
 
4 LITERATURA  
(1) BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the 
registration process. (1990). Part IV, Section 5–1: Degradabi ­
lity and fate of plant protectors in the water/sediment system. Nemčija. 
(2) Commission for registration of pesticides: Application for regi ­
stration of a pesticide. (1991). Part G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 (a). 
Nizozemska. 
(3) MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992). Preliminary 
guideline for the conduct of biodegradability tests on pesticides 
in natural sediment/water systems. Ref No SC 9046. Združeno kraljestvo. 
(4) Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate. (1987). 
Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) – Anaerobic and aerobic. Kanada. Str. 35–37. 
(5) US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision 
N. Chemistry: Environmental fate (1982). Section 162-3, 
Anaerobic aquatic metabolism. 
(6) SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing 
the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr 
Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels. 
(7) OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the 
OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, Italy, 18–20 January 1995. 
(8) ISO/DIS 5667-12. (1994). Water quality – Sampling – Part 12: 
Guidance on sampling of bottom sediments. 
(9) US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation 
test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 
712-C-98-080. 
(10) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998). 
(11) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945–956 (IUPAC 1984). 
(12) OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981). 
(13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994-2000): Addenda 6–11 to Guidelines for the 
Testing of Chemicals. 
(14) Scholz, K., Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988) 
Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. 
BCPC – Pests and Diseases, 3B-4, 149–158.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1321
 
(15) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the 
fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry 
(D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds.), Vol. 1, 85-114. J. Wiley & Sons. 
(16) Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inocu ­
lation and non-ionic surfactants on degradation of poly cyclic 
aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 631–637. 
(17) Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of 
detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with
 14 C- 
labelled model surfactants. Water Research 21, 661–667. 
(18) Black, C.A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy 
Monograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison. 
(19) APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water 
and Wastewater (17  th edition). American Public Health Asso ­
ciation, American Water Works Association and Water Pollu ­
tion Control Federation, Washington D.C. 
(20) Rowell, D.L. (1994). Soil Science Methods and Applications. 
Longman. 
(21) Light, T.S. (1972). Standard solution for redox potential 
measurements. Anal. Chemistry 44, 1038–1039. 
(22) SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on 
testing procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop „A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests“, 3–4 July 1991. 
(23) SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on 
sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and marine environments. From the Workshop On Sediment Toxicity Assessment (WOSTA), 8-10 November 1993. Eds.: I.R. Hill, 
P. Matthiessen and F. Heimbach. 
(24) Vink, J.P.M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997). Pesticide 
biotransformation in surface waters: multivariate analyses of 
environmental factors at field sites. Water Research 31, 
2858–2868. 
(25) Vink, J.P.M., Schraa, G, van der Zee, S.E.A.T.M. (1999). 
Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in 
nitrifying waters. Environ. Toxicol, 329–338. 
(26) Anderson, T.H., Domsch, K.H. (1985). Maintenance carbon 
requirements of actively-metabolising microbial populations under  in-situ  conditions. Soil Biol. Biochem. 17, 197–203. 
(27) ISO-14240-2. (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method. 
(28) Beelen, P. Van and F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the 
Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sedi ­
ment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), 13–21. 
(29) Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984). General method for 
determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850–857. 
(30) Birch, R.R., Biver, C, Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, 
U., Steber, J., Reust, H. and Bontinck, W.J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 1527–1550. 
(31) Pagga, U. and Beimborn, D.B. (1993). Anaerobic biodegradation 
tests for organic compounds. Chemoshpere 27, 1499–1509.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1322
 
(32) Nuck, B.A. and Federle, T.W. (1986). A batch test for asses ­
sing the mineralisation of  14 C-radiolabelled compounds under 
realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, 3597–3603. 
(33) US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic 
chemicals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). 
EPA 712-C-98-090. 
(34) Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of storage on sedi ­
ment characteristics and drying sediment on sorption coeffi ­
cients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 58, 961–968. 
(35) Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical inter ­
pretation and graphic representation of the degradational beha ­
viour of pesticide residues II. Pflanzenschutz-Nachrichten Bayer, 39, 187–203. 
(36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesti ­
cide residues I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 33, 47–60. 
(37) Carlton, R.R. and Allen, R. (1994). The use of a compartment 
model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water 
systems. Brighton Crop Protection Conference – Pest and Diseases, str. 1349–1354.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1323
 
DODATEK 1  
NAPOTKI ZA AEROBNE IN ANAEROBNE PRESKUSNE SISTEME  
Aerobni preskusni sistem  
Aerobni preskusni sistem, opisan v tej preskusni metodi, je sestavljen iz aerobne 
vodne plasti (tipi čne koncentracije kisika so v razponu od 7 do 10 mg · 1 -l ) in 
plasti usedline, aerobne na površini in anaerobne pod površino (tipi čni povpre čni 
redoks potenciali (Eh) v anaerobni coni usedline so v razponu od –80 do –190 mV). V vsaki inkubacijski enoti se vlažen zrak spusti preko površine vode, da se ohrani dovolj kisika v volumnu nad vzorcem.
 
Anaerobni preskusni sistem  
Pri anaerobnem preskusnem sistemu je preskusni postopek v bistvu enak kakor je 
opisan za aerobni sistem, le da se preko površine vode v vsaki inkubacijski enoti spusti dušik za ohranjanje dušika v volumnu nad vzorcem. Usedlina in voda se 
štejeta za anaerobna, dokler je redoks potencial (Eh) nižji od –100 mV. 
Pri anaerobnem preskusu ocenjevanje mineralizacije vklju čuje meritve vsebova ­
nega ogljikovega dioksida in metana.
 ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1324
 
DODATEK 2  
PRIMER PLINSKE PRETO ČNE NAPRAVE
  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1325
 
DODATEK 3  
PRIMER BIOMETRI ČNE NAPRAVE
  ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1326
 
DODATEK 4  
PRIMER IZRA ČUNA ZA DOLO ČANJE KONCENTRACIJE 
PRESKUSNE SNOVI V PRESKUSNIH POSODAH  
Notranji premer cilindra: = 8 cm 
Globina vodne kolone brez usedline: = 12 cm Površina: 3,142 × 4
 2 = 50,3 cm  2 
Stopnja aplikacije: 500 g preskusne snovi/ha 
ustreza 5 μg/cm  2 
Skupno μg: 5 × 50,3 = 251,5 μg 
Prilagojena koli čina glede na globino 100 cm: 
12 × 251,5 ÷100 = 30,18 μg 
Volumen vodne kolone: 50,3 × 12 = 603 ml 
Koncentracija v vodi: 30,18 ÷ 603 = 0,050 μg/ml ali 50 μg/l ▼B 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1327
 
C.25.  AEROBNA MINERALIZACIJA V POVRŠINSKI VODI – 
SIMULACIJSKI PRESKUS BIORAZGRADNJE  
1 METODA  
Ta preskusna metoda je enakovredna OECD TG 309 (2004) (1).  
1.1 UVOD 
Namen tega preskusa je izmeriti časovni potek biorazgradnje 
preskusne snovi z nizko koncentracijo v aerobni naravni vodi in 
opažanja koli činsko opredeliti v obliki ena čbe kinetike. Ta simula ­
cijski preskus je laboratorijski preskus serije stresanih bu čk za dolo ­ 
čitev hitrosti aerobne biorazgradnje organskih snovi v vzorcih 
naravne površinske vode (sladke, braki čne ali morske). Temelji na 
ISO/DIS 14592–1 (2) in vklju čuje tudi elemente iz preskusnih metod 
C.23 in C.24 (3)(4). Pri preskušanjih, ki trajajo dolgo, lahko neob ­
vezno polkontinuirano delovanje zamenja serije, da se prepre či 
razpad mikrokozma. Glavni cilj simulacijskega preskusa je dolo čitev 
mineralizacije preskusne snovi v površinski vodi in mineralizacija predstavlja osnovo za izražanje kinetike razgradnje. Vendar je neob ­
vezni sekundarni cilj preskusa pridobiti podatke o primarni 
razgradnji in o tvorbi poglavitnih produktov transformacije. Dolo ­ 
čitev produktov transformacije in po možnosti koli činska opredelitev 
njihovih koncentracij, sta zlasti pomembna za snovi, ki se zelo 
počasi mineralizirajo (npr. ko razpolovna doba skupnega ostanka
 
14 C presega 60 dni). Obi čajno se za dolo čitev in koli činsko oprede ­
litev produktov transformacije uporabijo višje koncentracije preskusne snovi (npr, > 100 μg/l) zaradi analiti čnih omejitev. 
Nizka koncentracija v tem preskusu pomeni koncentracijo (npr. manj 
kot 1 μg/l do 100 μg/l), ki je dovolj nizka, da se v preskusu zagotovi 
biorazgradna kinetika, ki odraža biorazgradno kinetiko, kakršna se pričakuje v okolju. V primerjavi s skupno maso biorazgradljivih 
substratov iz ogljika, ki so na voljo v naravni vodi, uporabljeni 
v preskusu, bo preskusna snov v nizki koncentraciji služila kot sekundarni substrat. Ta pomeni, da je pri čakovana biorazgradna 
kinetika prvega reda (kinetika „brez rasti“) in da se lahko preskusna 
snov razgradi s „sopresnovo“. Kinetika prvega reda pomeni, da je 
hitrost razgradnje (mg/l/dan) sorazmerna s koncentracijo substrata, ki se s časom znižuje. Pri kinetiki pravega prvega reda je konstanta 
specifične hitrosti razgradnje k neodvisna od časa in koncentracije. 
To pomeni, da se k znatno ne spreminja med potekom poskusa in se 
ne spremeni, če se med poskusi koncentracija doda. Po opredelitvi je 
konstanta specifi čne hitrosti razgradnje enaka relativni spremembi 
koncentracije s časom: k = (1/C) · (dC/dt). Čeprav v predpisanih 
pogojih obi čajno pričakujemo kinetiko prvega reda, so dolo čenih 
okoliščinah bolj primerne druge kinetike. Odstopanja od kinetike 
prvega reda lahko npr. opazimo, če hitrost biopretvorbe namesto 
hitrosti biološke reakcije omejuje pojav prenosa mase, kot je hitrost 
difuzije. Vendar lahko podatke skoraj vedno opišemo s psevdo kine ­
tiko prvega reda s sprejeto konstanto odvisno od koncentracije.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1328
 
Pred preskušanjem morajo biti na voljo podatki od biorazgradljivosti 
preskusne snovi v višjih koncentracijah (npr. v standardnih prese ­
jalnih preskusih) kot tudi podatki o abiotski razgradljivosti, produktih transformacije in pomembnih fizikalno-kemijskih lastnostih, da se omogoči načrtovanje poskusa in interpretacija rezultatov. Dolo čitev 
popolne biorazgradljivosti omogo čajo preskusne snovi, ozna čene 
s
 14 C, in dolo čevanje fazne porazdelitve  14 C na koncu preskusa. 
Če se uporablja neozna čena preskusna snov, se lahko popolna 
biorazgradnja oceni le, če se preskuša višja koncentracija in če so 
znani vsi poglavitni produkti transformacije.  
1.2 OPREDELITVE  
Primarna biorazgradnja : Strukturna sprememba (transformacija) 
kemijske snovi z mikroorganizmi, pri čemer izgine kemijska identi ­
teta. 
Funkcionalna biorazgradnja : Strukturna sprememba (transforma ­
cija) kemijske snovi z mikroorganizmi, pri čemer izgine specifi čna 
lastnost.  
Popolna aerobna biorazgradnja : Razgradnja kemijske snovi 
z mikroorganizmi v prisotnosti kisika v ogljikov dioksid in mineralne 
soli katerih koli drugih elementov, ki so prisotni, (mineralizacija) ter 
nastanek nove biomase in organskih produktov mikrobne biosinteze.  
Mineralizacija : Razgradnja kemijske ali organske snovi 
z mikroorganizmi v prisotnosti kisika v ogljikov dioksid, vodo in 
mineralne soli katerih koli drugih elementov, ki so prisotni.  
Faza prilagajanja : Čas, ki prete če od začetka preskusa, dokler se 
razgradni mikroorganizmi ne prilagodijo in dokler se stopnja bioraz ­
gradnje kemijske ali organske snovi ne pove ča do zaznavne ravni 
(npr. 10 % najve čje teoretične biorazgradnje ali manj, odvisno od 
točnosti merilne tehnike).  
Največja stopnja biorazgradnje : Stopnja biorazgradnje kemijske ali 
organske snovi v preskusu v odstotkih, nad katero v preskusu ni bilo dodatne biorazgradnje.  
Primarni substrat : Zbirka naravnih virov ogljika in energije, ki 
omogočajo rast in ohranjanje mikrobne biomase.  
Sekundarni substrat : Sestavina substrata, ki je prisotna v tako nizki 
koncentraciji, da pri svoji razgradnji mikroorganizmom, zmožnim razgradnje te snovi, prinese le nepomembno koli čino ogljika in ener ­
gije v primerjavi s koli čino ogljika in energije, ki jo prinese 
razgradnja sestavin glavnenega substrata (primarnih substratov).  
Konstanta hitrosti razgradnje : Konstanta kinetike prvega reda ali 
psevdo kinetike prvega reda k (d
 –1 ), ki kaže hitrost razgradnje 
v procesu. V serijskem poskusu se k oceni iz za četnega dela krivulje 
razgradnje, ki se izdela po koncu faze prilagajanja.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1329
 
Razpolovna doba, t  1/2 (d): Izraz, ki opisuje hitrost reakcije prvega 
reda. Razpolovna doba je čas, ki ustreza znižanju koncentracije za 
faktor 2. Razpolovna doba in konstanta hitrosti razgradnje sta v zvezi v enačbi t
 1/2 = ln2/k.  
Razpolovna doba razgradnje, DT  50 (d): Izraz, s katerim se koli ­ 
činsko opredeli izid preskusov biorazgradnje. Razpolovna doba 
razgradnje je čas, vključno s fazo prilagajanja, ki je potreben za 
doseganje 50-odstotne biorazgradnje.  
Meja zaznavnosti (LOD) in meja koli činske opredelitve (LOQ) : 
Meja zaznavnosti (LOD) je koncentracija snovi, pod katero identitete 
snovi ni možno razlikovati od analiti čnih artefaktov. Meja koli činske 
opredelitve (LOQ) je koncentracija snovi, pod katero koncentracije ni možno dolo čiti s sprejemljivo natan čnostjo.  
Raztopljeni organski ogljik (DOC) : Tisti del organskega ogljika 
v vzorcu vode, ki ga ni mogo če odstraniti z navedeno separacijo 
faz, npr. s centrifugiranjem pri 40 000 ms
 –2 za 15 min ali 
z membransko filtracijo z membranami, ki imajo pore s premerom 
od 0,2 μm do 0,45 μm. 
Skupna aktivnost organskega  14 C (TOA) : Skupna aktivnost  14 C, 
odvisna od organskega ogljika.  
Aktivnost raztopljenega organskega  14 C (DOA) : Skupna aktivnost  
14 C, odvisna od raztopljenega organskega ogljika.  
Aktivnost organskega  14 C v delcih (POA) : Skupna aktivnost  14 C, 
odvisna od organskega ogljika v delcih.  
1.3 UPORABNOST PRESKUSA 
Ta simulacijski preskus se uporablja za nehlapne ali rahlo hlapne 
organske spojine, ki se preskušajo v nizkih koncentracijah. Če se 
uporabljajo bu čke odprte proti atmosferi (npr. zamašene z vato) se 
snovi s konstantami Henryevega zakona manj od približno 1 Pa·m
 3 /mol (približno 10  –5 atm·m  3 /mol) lahko štejejo za prakti čno 
nehlapne. Z uporabo zaprtih bu čk z nadprostorom je možno presku ­ 
šati rahlo hlapne snovi (s konstantami Henryevega zakona < 100 Pa·m
 3 /mol ali < 10  –3 atm·m  3 /mol) brez izgub iz preskusnega 
sistema. Če se pri odstranjevanju CO  2 ne upoštevajo ustrezni previd ­
nostni ukrepi, lahko to povzro či izgubo snovi, ozna čenih s  14 C. 
V takšnih primerih bo morda treba zajeti CO  2 v notranjo absorp ­
cijsko posodo z alkalijskimi snovmi ali uporabiti zunanji absorpcijski sistem za CO
 2 (neposredno dolo čevanje  14 CO 2 ; glejte Prilogo 3). Za 
določevanje kinetike biorazgradnje morajo biti koncentracije 
preskusne snovi pod lastno topnostjo v vodi. Kljub temu je treba opozoriti, da so lahko vrednosti topnosti v vodi iz literature znatno višje od topnosti preskusne snovi v naravnih vodah. Neobvezno se 
lahko dolo či topnost še zlasti slabo vodotopnih preskusnih snovi 
z uporabo preskušanih naravnih vod. 
Ta metoda se lahko uporabi za simuliranje biorazgradnje 
v površinskih vodah brez grobih delcev (pelagi čni preskus) ali 
v motnih površinskih vodah, ki so blizu mejne ploskve med vodo 
in sedimentom (preskus suspendiranega sedimenta).
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1330
 
1.4 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Preskus se opravi v seriji z inkubacijo preskusne snovi bodisi s samo 
površinsko vodo (pelagi čni preskus) bodisi s površinsko vodo 
z dodanimi suspendiranimi trdnimi snovmi/sedimentom 
v koncenctraciji 0,01 do 1 g/l suhe mase (preskus suspendiranega 
sedimenta), da se simulira vodno telo s suspendiranim ali resuspen ­
diranim sedimentom. Za ve čino površinskih vod je zna čilna koncen ­
tracija suspendiranih trdnih snovi/sedimenta na spodnji meji navede ­
nega razpona. Preskusne bu čke se inkubirajo v temi pri temperaturi 
okolja v aerobnih pogojih in ob agitaciji. Za dolo čitev kinetike 
biorazgradnje je treba uporabiti najmanj dve razli čni koncentraciji 
preskusne snovi. Koncentraciji se morata med seboj razlikovati za 
faktor od 5 do 10. Koncentraciji morata predstavljati pri čakovano 
območje koncentracij v okolju. Najvišja koncentracija preskusne 
snovi ne sme prese či 100 μg/l, vendar imajo kot najvišje koncen ­
tracije prednost preskusne koncentracije pod 10 μg/l ali manj, 
s čimer se zagotovi, da biorazgradnja sledi kinetiki prvega reda. 
Najnižja koncentracija ne sme prese či 10 μg/l, vendar imajo kot 
najnižje koncentracije prednost preskusne koncentracije od 1 do 
2 μg/l ali manj kot 1 μg/l. Običajno je mogo če zadostno analizo 
tako nizkih koncentracij dose či s komercialno dostopnimi snovmi, 
označenimi s  14 C. Če se preskusna snov vnese v koncentraciji 
≤ 100 μg/l, je zaradi analitskih omejitev pogosto nemogo če izmeriti 
koncentracijo preskusne snovi z zahtevano to čnostjo (glejte drugi 
odstavek oddelka 1.7.2). Za dolo čitev in koli činsko opredelitev 
poglavitnih produktov transformacije ali kadar ni na voljo specifi čna 
analitska metoda z nizko mejo zaznavnosti, se lahko uporabijo višje 
koncentracije preskusne snovi (> 100 μg/l ali včasih > 1 mg/l). Če se 
preskušajo visoke koncentracije preskusne snovi, morda ne ni možno uporabiti rezultatov za oceno konstante razgradnje prvega reda in razpolovne dobe, saj razgradnja ne bo sledila kinetiki prvega reda. 
Razgradnjo je treba spremljati v ustreznih časovnih razmikih 
z merjenjem bodisi preostalega
 14 C bodisi preostale koncentracije 
preskusne snovi, če se uporabi specifi čna kemijska analiza. Ozna če­
vanje najbolj obstojnega dela molekule s  14 C omogo ča določevanje 
skupne mineralizacije. Ozna čevanje manj obstojnega dela molekule 
s 14 C in specifi čna analiza pa omogo čata vrednotenje le primarne 
biorazgradnje. Vendar ni nujno, da najbolj obstojen del molekule 
obsega relevantno funkcionalno podro čje molekule (podro čje, ki je 
odvisno od specifi čne lastnosti, npr. strupenosti, bioakumulacije itn.). 
V tem primeru je morda treba uporabiti preskusno snov, ki je ozna ­ 
čena s  14 C v funkcionalnem delu, da je mogo če slediti odstranje ­
vanju specifi čne lastnosti.  
1.5 PODATKI O PRESKUSNI SNOVI 
V tem preskusu je mogo če uporabiti radioaktivno ozna čene in 
neoznačene preskusne snovi. Priporo čljiva je tehnika ozna čevanja 
s 14 C, pri čemer se obi čajno ozna či(-jo) najobstojnejši del(-i) mole ­
kule (glejte tudi oddelek 1.4). Za snovi, ki vsebujejo ve č kot en 
aromatski obro č, enega ali ve č ogljikovih atomov v vsakem obro ču, 
je označevanje s  14 C prednostno. Poleg tega ima prednost ozna če­
vanje enega ali ve č ogljikovih atomov s  14 C na obeh straneh lahko 
cepljivih vezi. Kemijska in/ali radiokemijska čistota preskusne snovi 
mora biti > 95 %. Pri radioaktivno ozna čenih snoveh ima prednost 
specifična aktivnost približno 50 μCi/mg (1,85 MBq) ali ve č, kar 
omogoči merjenje  14 C v preskusih, ki vsebujejo nizke za četne 
koncentracije. Na voljo morajo biti naslednji podatki o preskusni 
snovi:  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1331
 
— topnost v vodi [metoda A.6], 
— topnost v organskem topilu ali organskih topilih (za snovi, ki se 
vnesejo s topilom ali imajo majhno topnost v vodi), 
— disociacijska konstanta (pKa), če je snov nagnjena 
k protonaciji ali deprotonaciji [OECD TG 112] (5), 
— parni tlak [metoda A.4] in konstanta Henryevega zakona, 
— kemijska obstojnost v vodi v temi (hidroliza) [metoda C.7]. V primeru preskušanja slabo vodotopnih snovi v morski vodi je 
morda uporabno poznati konstanto izsoljevanja (ali „Setschenowovo 
konstanto“) K
 s , ki je dolo čena z ena čbo: log (S/S’) = K  s C m , kjer 
pomeni: S – topnost snovi v sladki vodi, S’ – topnost snovi v morski vodi in C
 m – molarnost soli. 
Če se preskus opravlja kot „preskus suspendiranega sedimenta“, 
morajo biti na voljo tudi naslednji podatki: 
— porazdelitveni koeficient n-oktanol/voda [metoda A.8], — adsorpcijski koeficient [metoda C.18]. Drugi uporabni podatki so med drugim: — koncentracija v okolju, če je znana ali ocenjena, 
— strupenost preskusne snovi za mikroorganizme [metoda C.11], — lahka in/ali inherentna biorazgradljivost [metode C.4 A–F, C.12, 
C.9, OECD TG 302 (5)], 
— aerobna ali anaerobna biorazgradljivost v raziskavah transforma ­
cije v prsti in sedimentu/vodi [metode C.23, C.24].
 
1.6 REFEREN ČNA SNOV 
Kot referen čno snov je treba uporabiti snov, ki se obi čajno lahko 
razkraja v aerobnih pogojih (npr. anilin ali natrijev benzoat). Pri ča­
kovani časovni interval razgradnje anilina in natrijevega benzoata je 
ponavadi manj kot 2 tedna. Namen referen čnih snovi je zagotoviti, 
da je mikrobna aktivnost v preskusni vodi v dolo čenih mejah, tj. da 
voda vsebuje aktivno mikrobno populacijo.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1332
 
1.7 MERILA KAKOVOSTI  
1.7.1  Izkoristek  
Neposredno po dodatku preskusne snovi je treba vsako za četno 
preskusno koncentracijo najmanj v dveh vzorcih preveriti 
z meritvami aktivnosti  14 C ali s kemijskimi analizami v primeru 
neoznačenih snovi. S tem se pridobijo podatki o uporabnosti in 
ponovljivosti analitske metode in podatki o homogenosti porazde ­
litve preskusne snovi. Obi čajno se v naknadnih analizah podatkov 
namesto nazivne koncentracije uporablja izmerjena za četna aktivnost  
14 C ali koncentracija preskusne snovi, saj se s tem upoštevajo izgube 
zaradi sorpcije in napak pri odmerjanju. Za snovi, ozna čene s  14 C, 
izkoristek na koncu preskusa daje masna bilanca (glejte zadnji 
odstavek oddelka 1.8.9.4). V idealnem primeru bi morala biti bilanca radioaktivne mase v obmo čju od 90 % do 110 %, vendar za neozna ­ 
čene preskusne snovi analitska to čnost privede do za četnega izko ­
ristka med 70 % in 110 %. Ta obmo čja se morajo šteti za ciljna in 
ne kot kriteriji za sprejemljivost preskusa. Neobvezno se lahko za preskusno snov dolo či analitska to čnost pri nižji koncentraciji kot je 
začetna koncentracija in tudi za poglavitne produkte transformacije.
 
1.7.2  Ponovljivost in ob čutljivost analitske metode  
Ponovljivost analitske metode (vklju čno z učinkovitostjo za četne 
ekstrakcije) za koli činsko opredelitev preskusne snovi in proizvodov 
transformacije, če je smiselno, je treba preveriti s petimi ponovitvami 
analiz posameznih ekstraktov površinske vode. 
Meja zaznavnosti (LOD) analitske metode za preskusno snov in za 
produkte transformacije mora biti, če je možno, vsaj 1 % za četne 
vnesene koli čine v preskusnem sistem. Meja koli činske opredelitve 
(LOQ) mora biti enaka ali manj od 10 % vnesene koncentracije. Kemijske analize številnih organskih snovi in njihovih produktov transformacije pogosto zahtevajo vnos relativno visoke koncentracije 
preskusne snovi, tj. > 100 μg/l.
 
1.8 OPIS PRESKUSNE METODE  
1.8.1  Oprema  
Preskus se lahko opravlja v stož častih ali valjastih bu čkah ustrezne 
prostornine (npr. 0,5 ali 1,0 litra), ki so zamašene z zamaški iz 
silikona ali kav čuka. Preskus se lahko opravlja tudi v serumskih 
bučkah z zaporkami, ki tesnijo CO  2 (npr. septumi z butilnega kav ču­
ka). Druga možnost je izvedba preskusa z uporabo ve č bučk, pri 
čemer se v vzor čnih časovnih razmikih odvzameta najmanj dve 
celi bučki (glejte zadnji odstavek oddelka 1.8.9.1). Za nehlapne 
preskusne snovi, ki niso radioaktivno ozna čene, plinotesni 
zamaški ali zaporke niso potrebne; primerni so vatirani čepi, ki 
preprečujejo onesnaženje iz zraka (glejte drugi odstavek oddelka 
1.8.9.1). Rahlo hlapne snovi je treba preskusiti v sistemu biometri ­ 
čnega tipa z blagim mešanjem vodne gladine. Zagotoviti je treba, da 
ne pride do bakterijskega onesnaženja. Neobvezno se lahko posode pred uporabo sterilizirajo s segrevanjem ali avtoklaviranjem. Poleg 
naštetega, je potrebna naslednja standardna laboratorijska oprema: 
— stresalna miza ali magnetni mešalniki za neprekinjeno agitacijo 
preskusnih bu čk,
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1333
 
— centrifuga, 
— pH-meter, 
— turbidimeter za nefelometri čne meritve motnosti, 
— pečica ali mikrovalovna pe čica za dolo čitev suhe mase, 
— oprema za membransko filtracijo, 
— avtoklav ali pe čica za toplotno sterilizacijo steklovine, 
— oprema za ravnanje s snovmi, ozna čenimi s  14 C, 
— oprema za koli činsko opredelitev aktivnosti  14 C v vzorcih iz 
raztopin za lovljenje CO  2 in, če je treba, iz vzorcev sedimenta, 
— analitska oprema za dolo čevanje preskusne (in referen čne) snovi, 
če se uporablja kemijska analiza (npr. plinski kromatograf, viso ­
kotlačni tekočinski kromatograf).  
1.8.2  Založne raztopine preskusne snovi  
Za pripravo založnih raztopin preskusne in referen čne snovi je treba 
uporabiti deionizirano vodo (glejte prvi odstavek oddelka 1.8.7). 
Deionizirana voda mora biti brez snovi, ki so lahko strupene za mikroorganizme. Ne sme vsebovati ve č kot 1 mg/l raztopljenega 
organskega ogljika (DOC) (6).
 
1.8.3  Odvzem in prevoz površinske vode  
Mesto vzor čenja površinske vode je treba izbrati v skladu 
z namenom preskusa v dani situaciji. Pri izbiranju mesta vzor čenja 
je treba upoštevati preteklost morebitnih kmetijskih, industrijskih ali domačih vnosov. Če je bilo vodno okolje v zadnjih štirih letih ones ­
naženo s preskusno snovjo ali njenimi strukturnimi analogi, se ne 
sme uporabiti za odvzem preskusne vode, razen če je raziskovanje 
hitrosti razgrajevanja na predhodno izpostavljenih mestih izrecen namen raziskovalca. Na mestu vzor čenja je treba izmeriti pH in 
temperaturo vode. Zabeležiti je treba tudi globino vzor čenja in izgled 
vzorca vode (npr. barva in motnost) (glejte oddelek 3). Izmeriti je treba koncentracijo kisika in/ali redoks potencial v vodi ter v površinskem sloju sedimenta, da se dokažejo aerobni pogoji, 
razen če je to o čitno na podlagi izgleda in preteklih izkušenj na 
mestu vzor čenja. Površinsko vodo je treba prenesti v temeljito o čiš­ 
čeni posodi. Med prevozom temperatura vzorca ne sme bistveno 
preseči temperature, ki se uporablja med preskusom. Če trajanje 
prevoza preseže 2 do 3 ure, je priporo čljivo ohlajanje na 4 °C 
med prevozom. Vzorec vode ne sme zamrzniti.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1334
 
1.8.4  Shranjevanje in priprava površinske vode  
Preskus je treba po možnosti za četi v enem dnevu po odvzemu 
vzorca. Trajanje shranjevanja vode, kadar je potrebno, je treba čimbolj skrajšati. V nobenem primeru pa ne sme prese či 4 tednov. 
Do uporabe je treba vzorec vode hraniti pri 4 °C z aeracijo. Pred 
uporabo je treba odstraniti grobe delce, npr. s filtracijsko skozi najlonski filter z velikostjo mreže približno 100 μm ali skozi grobi 
filter papir oz. s sedimentacijo.
 
1.8.5  Priprava vode z dodanim sedimentom (neobvezno)  
Za preskus suspendiranega sedimenta je treba v bu čke, ki vsebujejo 
naravno vodo (filtrirano za odstranitev grobih delcev, kakor je opisano v razdelku 1.8.4), dodati površinski sediment, da nastane suspenzija. Koncentracija suspendiranih trdnih snovi mora biti med 
0,01 in 1 g/l. Površinski sediment mora izvirati iz istega mesta 
vzorčenja kot vzorec vode. Odvisno od posameznega vodnega okolja 
je možno opredeliti površinski sediment kot sediment z visoko vsebnostjo organskega ogljika (2,5–7,5 %) in fino teksturo ali kot 
sediment z nizko vsebnostjo organskega ogljika (0,5–2,5 %) in grobo 
teksturo (3). Površinski sediment se lahko pripravi po naslednjem postopku: neposredno po vzor čenju se s cevko iz prosojne plasti čne 
mase izvle če več sredic sedimenta, odreže zgornje aerobne plasti (od 
površine do globine najve č 5 mm), nato pa se sredice združijo. 
Dobljeni vzorec sedimenta je treba prenesti v posodi z dovolj velikim zra čnim nadprostorom, da je sediment v aerobnih pogojih 
(če trajanje prevoza preseže 2 do 3 ure, je potrebno ohlajanje na 
4 °C). Vzorec sedimenta je treba suspendirati v preskusni vodi 
v razmerju 1:10 in do uporabe hraniti pri 4 °C z aeracijo. Trajanje shranjevanja sedimenta, kadar je potrebno, je treba čimbolj skrajšati. 
V nobenem primeru pa ne sme prese či 4 tednov.
 
1.8.6  Polkontinuiran postopek (neobvezen)  
Če je potrebno dlje časa trajajo če prilagajanje preden je mogo če 
izmeriti znatno razgradnjo preskusne snovi, bo morda potrebna daljša inkubacija (ve č mesecev). Če je to znano iz predhodnega preskušanja 
snovi, se lahko preskus za čne s polkontinuiranim postopkom, ki 
omogoča obdobno obnavljanje dela preskusne vode ali suspenzije 
(glejte Prilogo 2). Namesto tega se lahko obi čajni serijski preskus 
spremeni v polkontinuirani postopek, če v približno 60 dneh ne pride 
do razgradnje preskusne snovi v serijskem postopku (glejte drugi 
odstavek oddelka 1.8.8.3).
 
1.8.7  Dodajanje preskusne (ali referen čne) snovi  
Za snovi z veliko topnostjo v vodi (> 1 mg/l) in majhno hlapnostjo 
(konstante Henryevega zakona < 1 Pa·m  3 /mol ali 
< 10  –5 atm·m  3 /mol) se lahko pripravi založna raztopina 
v deionizirani vodi (glejte oddelek 1.8.2). Ustrezni volumni založne 
raztopine se lahko dolivajo v preskusne posode, da se doseže želena 
koncentracija. Volumen kakršne koli dodane založne raztopine mora biti najmanjši prakti čni volumen (< 10 % kon čnega volumna teko ­ 
čine, če je možno). Druga čen postopek je raztapljanje preskusne 
snovi v ve čjem volumnu preskusne vode, kar je morda lahko alter ­
nativni postopek namesto uporabe organskih topil.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1335
 
Če se temu ne da izogniti, je treba založne raztopine nehlapnih snovi 
s slabo topnostjo v vodi pripraviti s hlapnim organskim topilom, 
vendar koli čina topila, dodanega v preskusni sistem, ne sme prese ­
gati 1 % v/v in ne sme imeti škodljivih u činkov na mikrobno dejav ­
nost. Topilo ne sme vplivati na obstojnost preskusne snovi v vodi. 
Topilo je treba zmanjšati na izjemno majhno koli čino, tako da 
bistveno ne pove ča koncentracije DOC v preskusni vodi ali suspen ­
ziji. To je treba preveriti z analizo, specifi čno za snov, ali, če je 
možno, analizo DOC (6). Zelo veliko pozornosti je treba posvetiti 
omejevanju koli čine prenesenega topila na zares potrebno koli čino. 
Ravno tako natan čno pa je treba preveriti, da se koli čina preskusne 
snovi lahko raztopi v kon čnem volumnu preskusne vode. Uporabijo 
se lahko druge tehnike za vnos preskusne snovi v preskusne posode, 
kot so opisane v (7) in (8). Kadar se za vnos preskusne snovi upora ­
blja organsko topilo, je treba kontrolne vzorce s topilom, ki vsebu ­
jejo preskusno vodo (brez dodatkov), in preskusno vodo z dodatkom referenčne snovi obdelati podobno kot aktivne preskusne posode 
z dodatno preskusno snovjo v topilu kot nosilcu. Namen kontrolnih 
vzorcev s topilom je preveriti možne neželene u činke topila na 
mikrobno populacijo, kar se pokaže z razgradnjo referen čne snovi.
 
1.8.8  Preskusni pogoji  
1.8.8.1  Preskusna temperatura  
Inkubacijo je treba izvajati v temi (prednostno) ali v difuzni svetlobi 
pri kontrolirani (± 2 °C) temperaturi. Temperatura je lahko tempera ­
tura na terenu ali standardna temperatura 20–25 °C. Temperatura na terenu je lahko bodisi dejanska temperatura na mestu vzor čenja 
v času vzorčenja ali povpre čna terenska temperatura na mestu vzor ­ 
čenja.
 
1.8.8.2  Agitacija  
Zagotoviti je treba agitacijo z neprekinjenim stresanjem ali meša ­
njem, da se delci in mikroorganizmi ohranjajo v suspenziji. Agitacija 
tudi olajša prenos kisika iz nadprostora v teko čino, da se lahko 
zadostno ohranjajo aerobni pogoji. Bu čke se postavijo na stresalno 
mizo (stresanje s hitrostjo približno 100 o/min) ali pa se uporabi 
magnetno mešanje. Agitacija mora biti neprekinjena. Kljub temu, mora biti stresanje ali mešanje čimbolj nežno, da se še ohranja 
homogena suspenzija.
 
1.8.8.3  Trajanje preskusa  
Trajanje preskusa obi čajno ne sme prese či 60 dni, razen če se 
uporabi polkontinuiran postopek z obdobnim obnavljanjem 
preskusne suspenzije (glejte oddelek 1.8.6 in Prilogo 2). Če pa se 
razgradnja preskusne snovi za čne v prvih 60 dneh, je možno serijski 
preskus podaljšati do najve č 90 dni. Razgradnjo je treba spremljati 
v ustreznih časovnih razmikih z dolo čevanje bodisi preostalega  14 C 
bodisi sproš čenega  14 CO 2 (glejte oddelek 1.8.9.4) in/ali s specifi čno 
kemijsko analizo (glejte 1.8.9.5). Trajanje inkubacije mora biti dovolj dolgo, da se ovrednoti postopek razgradnje. Obseg razgradnje mora prednostno prese či 50 %; za po časi razgradljive snovi mora biti 
obseg razgradnje zadosten (obi čajno večji od 20 %), da se lahko 
oceni kineti čna konstanta hitrosti razgradnje.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1336
 
V preskusnem sistemu je treba opraviti obdobne meritve pH in 
koncentracije kisika, razen če so takšne meritve nepotrebne zaradi 
predhodnih izkušenj iz podobnih preskusov z vodo in sedimenti iz istega mesta vzor čenja. V nekaterih pogojih lahko presnova 
primarnih substratov v veliko višjih koncentracijah v vodi ali sedi ­
mentu povzro či dovolj sproš čenega CO
 2 in izrabo kisika, da se 
bistveno spremenijo pogoji poskusa.  
1.8.9  Postopek  
1.8.9.1  Priprava bu čk za pelagi čni preskus  
Primeren volumen preskusne vode se prenese v preskusne bu čke, ki 
se napolnijo do približno ene tretjine volumna bu čke, vendar ne manj 
kot približno 100 ml. Če se uporabi ve č bučk (da je omogo čen 
odvzem celotnih bu čk za vsako vzor čenje) je primeren volumen 
preskusne vode tudi približno 100 ml, saj lahko majhni volumni 
vzorca vplivajo na dolžino faze prilagajanja. Preskusna snov se 
doda iz založne raztopine, kakor je opisano v oddelkih 1.8.2 in 1.8.7. Uporabiti je treba najmanj dve razli čni koncentraciji preskusne 
snovi, ki se razlikujeta za faktor od 5 do 10, da se dolo či kinetika 
razgradnje in izra čuna kineti čna konstanta hitrosti razgradnje. Obe 
izbrani koncentraciji morata biti nižji od 100 μg/l in prednostno 
v območju < 1–10 μg/l. 
Bučke se zaprejo z zamaški ali zaporkami, ki ne prepuš čajo zraka in 
CO
 2 . Za nehlapne preskusne kemikalije, ki niso ozna čene s  14 C, so 
primerni razrahljani vatirani čepi, ki prepre čujejo onesnaženje iz 
zraka (glejte oddelek 1.8.1), pod pogojem, da je za poglavitne 
produkte razgradnje znano, da so nehlapni in da se uporablja posredno dolo čevanje CO
 2 (glejte Dodatek 3). 
Bučke inkubirajte pri izbrani temperaturi (glejte oddelek 1.8.8.1). 
Vzorci za kemijsko analizo ali meritve  14 C se odvzamejo na za četku 
preskusa (tj. preden se za čne biorazgradnja; glejte oddelek 1.7.1) in 
v primernih časovnih razmikih med preskusom. Vzor čenje se opravi 
z odvzemom podvzorcev (npr. 5-ml alikvotov) iz vsake ponovitve ali 
z odvzemom celotnih bu čk pri vsakem času vzorčenja. Mineraliza ­
cija preskusne snovi se lahko dolo či posredno ali neposredno (glejte 
Dodatek 3). Obi čajno je med fazo razgradnje (tj. po zaklju čeni fazi 
prilagajanja) potrebnih najmanj pet vzor čnih točk, da se zanesljivo 
oceni konstanta hitrosti, razen če se za hitro razgradljive snovi 
utemelji, da so dovolj tri vzor čne točke. Za snovi, ki se ne razkrajajo 
hitro, je med fazo razgradnje enostavno opraviti ve č meritev in zato 
je treba v oceno k vklju čiti več podatkovnih to čk. Ni mogo če dolo­ 
čiti fiksnega časovnega razporeda vzor čenja, saj hitrost biorazgradnje 
variira. Vendar pa je priporo čljivo vzor čiti enkrat tedensko, če je 
razgradnja po časna. Če se preskusna snov hitro razkraja, je treba 
vzorčenje opraviti enkrat dnevno v prvih treh dneh in nato vsak 
drug ali tretji dan. V dolo čenih pogojih, kot so zelo hitro hidrolizi ­
rajoče snovi, je morda treba vzor čiti v urnih razmikih. Priporo čljivo 
je, da se pred preskusom opravi predhodna raziskava, v kateri se 
določijo ustrezni razmiki vzor čenja. Če je treba vzorce ohraniti za 
dodatne specifi čne analize, je priporo čljivo, da se odvzame ve č 
vzorcev in izberejo tisti, ki jih je treba analizirati na koncu poskusa z vzvratno strategijo, tj. zadnji vzorci se analizirajo prvi (glejte drugi 
odstavek v oddelku 1.8.9.5 za smernice o obstojnosti vzorcem med 
shranjevanjem).
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1337
 
1.8.9.2  Število bu čk in vzorcev  
Pripraviti je treba dovolj veliko število preskusnih bu čk, da so na voljo: 
— preskusne bu čke; najmanj dvojnik za vsako koncentracijo 
preskusne snovi (prednostno najmanj 3) ali ve č preskusnih 
bučk za vsako koncentracijo, če se ob vsakem vzor čenju odvza ­
mejo cele bu čke (označene z F  T ), 
— preskusne bu čke za izra čun masne bilance; najmanj dvojnik za 
vsako preskusno koncentracijo (ozna čeno z F  M ), 
— slepi kontrolni vzorec brez preskusne snovi; najmanj ena slepa 
kontrolna preskusna bu čka, ki vsebuje le preskusno vodo (ozna ­ 
čeno z F  B ), 
— referen čni kontrolni vzorec; dvojnik z referen čno snovjo (npr. 
anilin ali natrijev benzoat, koncentracija 10 μg/l) (ozna čeno 
z F  C ). Namen referen čnega kontrolnega vzorca je potrditev 
najmanjše mikrobne aktivnosti. Če je ustrezno, se lahko uporabi 
radioaktivno ozna čena snov, tudi če se razgradnja preskusne 
snovi spremlja s kemijskimi analizami, 
— sterilni kontrolni vzorec; ena ali dve bu čki, ki vsebujeta sterili ­
zirano preskusno vodo, za preu čevanje možne abiotske 
razgradnje ali druga čnega nebiološkega izginevanja preskusne 
snovi (ozna čeno z F  S ). Biološko aktivnost je možno ustaviti 
z avtoklaviranjem (121 °C; 20 min) preskusne vode ali 
z dodajanjem strupene snovi (npr. natrijevega azida (NaN  3 ) 
v koncentraciji 10–20 g/l, živosrebrnega klorida (HgCl  2 ) 
v koncentraciji 100 mg/l ali formalina v koncentraciji 100 mg/l) ali s sevanjem gama. Če se uporabi HgCl
 2 , ga je 
treba odstraniti kot strupen odpadek. Če se vodi doda sediment 
v veliki koli čini, sterilnosti ni enostavno dose či. V tem primeru je 
priporočljivo zaporedno avtoklaviranje (npr. trikrat). Preu čiti je 
treba, ali avtoklaviranje morda spremeni sorpcijske lastnosti sedi ­
menta, 
— kontrolni vzorci s topilom, vsebujejo preskusno vodo in 
preskusno vodo z referen čno snovjo; dvojniki bu čk, obdelani 
z enako koli čino topila in enakim postopkom, kakor se uporablja 
za vnos preskusne snovi. Namen je preveriti možne neželene 
učinke topila z dolo čitvijo razgradnje referen čne snovi. 
V zasnovi preskusa mora raziskovalec preu čiti relativni pomen pove ­ 
čanja števila ponovitev proti pove čanju števila vzor čenj. Natan čno 
število potrebnih bu čk bo odvisno od metode za merjenje razgradnje 
(glejte tretji odstavek v oddelku 1.8.9.1; oddelek 1.8.9.4 in Dodatek 3).  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1338
 
V vsakem vzor čenju je treba iz vsake preskusne bu čke odvzeti dva 
podvzorca (npr. 5-ml alikvota). Če se uporablja ve č bučk, da je 
omogočen odvzem celotnih bu čk, je treba pri vsakem vzor čenju 
žrtvovati najmanj dve bu čki (glejte prvi odstavek v oddelku 1.8.9.1).  
1.8.9.3  Priprava bu čk za preskus s suspendiranim sedimentom [neobvezen]  
V preskusne posode se doda potrebni volumen preskusne vode in 
sedimenta, če je treba (glejte oddelek 1.8.5). Priprava bu čk za 
preskus suspendiranega sedimenta je enaka kot za pelagi čni preskus 
(glejte oddelka 1.8.9.1. in 1.8.9.2). Prednostno je treba uporabljati 
serumske steklenice ali podobno oblikovane bu čke. Zaprte bu čke se 
položijo na stresalnik. Seveda je treba odprte bu čke za nehlapne 
snovi, ki niso ozna čene s  14 C, postaviti pokonci. V tem primeru je 
priporočljiva uporaba magnetnega mešanja in magnetnih pal čk, ki so 
prevlečene s steklom. Po potrebi se steklenice aerirajo, da se ohra ­
njajo ustrezni aerobni pogoji.  
1.8.9.4  Radiokemijske dolo čitve 
Sproščeni 14 CO 2 se meri posredno ali neposredno (glejte Dodatek 3).  
14 CO 2 se določa posredno z razliko med za četno aktivnostjo  14 C 
v preskusni vodi ali suspenziji in skupno preostalo aktivnostjo v času vzorčenja, ki se izmeri po zakisanju vzorca na pH 2–3 in 
odstranitvi CO
 2 . S tem se odstrani anorganski ogljik in izmerjena 
preostala aktivnost izvira iz organskega materiala. Če se med trans ­
formacijo preskusne snovi tvorijo poglavitni hlapni produkti trans ­
formacije, se posredno dolo čevanje  14 CO 2 ne sme uporabiti (glejte 
Dodatek 3). Če je možno, je treba sproš čanje  14 CO 2 meriti nepo ­
sredno (glejte Dodatek 3) v vsakem času vzorčenja in v najmanj eni 
preskusni bu čki. Ta postopek omogo ča preverjanje tako masne 
bilance in postopka biorazgradnje, vendar je omejen na preskuse, ki se opravljajo v zaprtih bu čkah. 
Če se sproš čeni
 14 CO 2 med preskusom meri neposredno, je treba v ta 
namen na za četku preskusa pripraviti ve č bučk. Če se med trans ­
formacijo preskusne snovi tvorijo poglavitni hlapni produkti trans ­
formacije, je priporo čljivo neposredno dolo čevanje  14 CO 2 . V vsaki 
točki merjenja se dodatne preskusne bu čke zakisajo na pH 2–3, nato 
pa se  14 CO 2 zbere v notranji ali zunanji absorpcijski posodi (glejte 
Dodatek 3). 
Neobvezno se lahko koncentracije s  14 C označene preskusne snovi in 
poglavitnih produktov transformacije dolo čijo z radiokromatografijo 
(npr. tankoplastno kromatografijo, RAD-TLC) ali HPLC 
z radiokemijskim zaznavanjem. 
Neobvezno se lahko dolo či fazna porazdelitev preostale radioaktiv ­
nosti (glejte Dodatek 1) ter preostala preskusna snov in produkti 
transformacije.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1339
 
Na koncu preskusa je treba dolo čiti masno bilanco z neposrednim 
merjenjem  14 CO 2 v ločeni poskusni bu čki, iz katere med poskusom 
ni bil odvzet noben vzorec (glejte Dodatek 3).  
1.8.9.5  Specifi čna kemijska analiza  
Če je na voljo specifi čna analitska metoda, se lahko primarna bioraz ­
gradnja dolo či z merjenjem preostale koncentracije preskusne snovi 
namesto uporabe tehnik radioaktivnega ozna čevanja. Če se uporabi 
radioaktivno ozna čena preskusna snov (za merjenje skupne minera ­
lizacije), se lahko vzporedno opravijo specifi čne kemijske analize, ki 
dajo uporabne dodatne podatke in s katerimi se preverja postopek. 
Specifične kemijske analize se lahko tudi uporabijo za merjenje 
produktov transformacije, ki nastanejo med razgradnjo preskusne snovi. Ta pristop je priporo čljiv za snovi, ki se mineralizirajo 
z razpolovno dobo, daljšo od 60 dni. Koncentracijo preskusne 
snovi in produktov transformacije je treba pri vsaki ponovitvi vzor ­ 
čenja izmeriti in o njej poro čati (o koncentraciji in o uporabljenem 
odstotku). Na splošno je treba ugotoviti produkte transformacije, ki 
se pri katerem koli vzor čenju zaznajo pri ≥ 10 % uporabljene 
koncentracije, razen če ni upravi čeno utemeljeno druga če. Tudi 
produkte transformacije, pri katerih se koncentracije med raziskavo nenehno pove čujejo, je treba upoštevati pri ugotavljanju, tudi če 
njihove koncentracije ne presegajo zgornje omejitve, ker lahko ozna ­ 
čujejo obstojnost. Če je možno, da se preskusna snov hitro abiotsko 
pretvarja (npr. s hidrolizo), je treba preu čiti izvedbo analiz produktov 
transformacije v sterilnih kontrolnih vzorcih. Potrebo po koli činski 
opredelitvi in dolo čevanju produktov transformacije je treba upošte ­
vati glede na vsak primer posebej in v poro čilu podati utemeljitev. 
Tehnike ekstrakcije z organskim topilom je treba uporabiti po navo ­
dilih v ustreznem analiti čnem postopku. 
Če se analiza opravi v 24 urah (prednostno), je treba vse vzorce 
shranjevati pri 2 do 4 °C in zrakotesno. Če je shranjevanje daljše, 
je treba vzorce zamrzniti pod –18 °C ali kemijsko konzervirati. 
Zakisanje ni priporo čljiva metoda konzerviranja vzorcev saj so 
lahko zakisani vzorci neobstojni. Če se vzorci ne analizirajo v 24 
urah in so shranjevani dlje, je treba opraviti raziskavo obstojnosti 
med shranjevanjem, da se dokaže obstojnost želenih kemikalij med 
shranjevanjem pri –18 °C ali v pogojih konzerviranja. Če analiti
čna 
metoda vklju čuje bodisi ekstrakcijo s topili ali ekstrakcijo trdne faze 
(SPE), je treba ekstrakcijo opraviti nemudoma po vzor čenju ali po 
ohlajenem shranjevanju za najve č 24 ur. 
Morda bodo potrebni volumni vzorcev, ve čji od prikazanih 
v oddelku 1.8.1, odvisno od ob čutljivosti analiti čne metode. Preskus 
se enostavno izvede s preskusnim volumnom 1 liter v bu čkah 
s prostornino 2–3 litra, ko je možno jemati vzorce približno 100 ml.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1340
 
2. PODATKI IN PORO ČANJE  
2.1 OBDELAVA REZULTATOV  
2.1.1  Prikaz podatkov  
Čase vzorčenja je treba zaokrožiti na celo število ur (razen, če se 
snov bistveno razkraja v minutah do urah), ne pa na celo število dni. 
Prikazati je treba ocene preostale aktivnosti preskusne snovi (za snovi ozna čene s
 14 C) ali preostale koncentracije (za neozna čene 
snovi) v odvisnosti od časa v linearnem in pollogaritemskem prikazu 
(glejte sliki 1a in 1b). Če je prišlo do razgradnje, se primerjajo 
rezultati iz bu čk F T in bučk F S . Če se povpre čne vrednosti rezultatov 
iz bučk s preskusno snovjo (F  T ) in sterilnih bu čk (F  S ) razlikujejo za 
manj kot 10 %, se lahko predpostavi, da je opažena razgradnja 
pretežno abiotska. Če je razgradnja v bu čkah F  S manjša, se lahko 
s temi številkami popravi številke bu čk F  T (z odštevanjem), da se 
oceni obseg biorazgradnje. Kadar se opravljajo neobvezne analize za 
poglavitne produkte transformacije, je treba prikazati njihovo nasta ­
janje ali upad poleg prikaza upada preskusne snovi. 
V krivulji razgradnje (pollogaritemski prikaz) se z ekstrapolacijo 
krivulje do odsotnosti razgradnje oceni dolžina faze prilagajanja. 
Namesto tega se lahko dolžina faze prilagajanja oceni z dolo čitvijo 
časa, potrebnega za približno 10 % razgradnje (glejte sliki 1a in 1b). 
Iz pollogaritemskega prikaza se z linearno regresijo odvisnosti ln (preostale aktivnosti
 14 C ali koncentracije preskusne snovi) od časa 
oceni konstanto hitrosti prvega reda, k, in njeno standardno napako. 
Zlasti pri meritvah  14 C se uporabijo le podatki iz za četnega linear ­
nega dela krivulje po zaklju čku faze prilagajanja, pri čemer se pred ­
nostno izbere nekaj reprezentativnih podatkov pred izborov ve čjega 
števila bolj negotovih podatkov. Tu negotovost vklju čuje napake, ki 
so vezane na priporo čljivo neposredno uporabo izmerjenih preostalih 
aktivnosti  14 C (glejte spodaj). V dolo čenih primerih je pomembno 
izračunati dve razli čni konstanti hitrosti, če razgradnja sledi bifaz ­
nemu vzorcu. Za ta namen se dolo čijo dve razli čni fazi krivulje 
razgradnje. Konstanto hitrosti, k, in razpolovno dobo t  1 = ln2/k je 
treba izra čunati za vsako posamezno vzporedno bu čko, če se iz iste 
bučke jemlje ve č podvzorcev, ali s pomo čjo povpre čnih vrednosti, če 
se ob vzor čenju jemljejo celotne bu čke (glejte zadnji odstavek 
oddelka 1.8.9.2). Če se uporabi prvi omenjeni postopek, je treba 
konstanto hitrosti razgradnje in razpolovno dobo navesti za vsako posamezno vzporedno bu čko in kot povpre čno vrednost s standardno 
napako. Če se uporabijo visoke koncentracije preskusne snovi, lahko 
krivulja razgradnje znatno odstopa od premice (pollogaritemski prikaz) in kinetika prvega reda morda ne velja. Dolo čitev razpolovne 
dobe zato nima smisla. Vendar je mogo če za omejen niz podatkov 
uporabiti psevdo kinetiko prvega reda in oceni razpolovno dobo 
DT
 50 (čas za 50 % razgradnje). Vendar je treba upoštevati, da časov­
nega poteka razgradnje po izbranem nizu podatkov ni mogo če napo­
vedati z DT  50 , ki opisuje le dani nabor podatkov. Analiti čna orodja 
za statisti čne izračune in prilagajanje krivulj so enostavno dostopna 
in uporaba tovrstne programske opreme je priporo čljiva. ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1341
 
Če se opravljajo specifi čne kemijske analize, se ocenijo konstante 
hitrosti in razpolovne dobe za primarno razgradnjo, kakor je opisano 
zgoraj za skupno mineralizacijo. Če je primarna razgradnja omejen 
proces, se lahko v nekaterih primerih uporabijo podatkovne to čke iz 
celotnega poteka razgradnje. To je zato, ker so meritve neposredne, 
nasprotno kot pri meritvah aktivnosti  14 C. 
Če so se uporabile s  14 C označene snovi, je treba masno ravnovesje 
izraziti v odstotkih vnesene za četne koncentracije, najmanj na koncu 
preskusa.  
2.1.2  Preostala aktivnost  
Ko se biorazkraja s  14 C označen del organske snovi, se ve čji del  14 C 
pretvori v  14 CO 2 , drugi del pa se uporabi za rast biomase in/ali 
sintezo izvenceli čnih presnovkov. Zato dokon čna „popolna“ bioraz ­
gradnja snovi ne pomeni 100-odstotne pretvorbe ogljika iz te snovi v
 14 CO 2 . 14 C, ki se vgradi v produkte, nastale v biosintezi, se 
naknadno po časi sprosti kot  14 CO 2 zaradi „sekundarne mineralizaci ­
je“. Zaradi tega prikazi preostale aktivnosti organskega  14 C (izmer­
jeni po odstranitvi CO  2 ) ali nastalega  14 CO 2 v odvisnosti od časa 
kažejo „rep“ po zaklju čku razgradnje. To zaplete kineti čno interpre ­
tacijo podatkov in za ta namen je treba za oceno konstante hitrosti 
razgradnje obi čajno uporabiti le za četni del krivulje (po zaklju čku 
faze prilagajanje in pred 50-odstotno razgradnjo). Če se preskusna 
snov razkraja, je skupna preostala aktivnost organskega  14 C vedno 
večja od aktivnosti  14 C, povezane s preostalo nerazgrajeno preskusno 
snovjo. Če poteka razgradnja preskusne snovi z reakcijo prvega reda 
in se v CO  2 mineralizira konstantni delež α, je začetni naklon 
krivulje izginevanja  14 C (skupni organski  14 C v odvisnosti od 
časa) α-krat naklon ustrezne krivulje koncentracije preskusne snovi 
(oz. natan čno rečeno, dela preskusne snovi, ki je ozna čen s  14 C). 
Konstanta hitrosti razgradnje, izra čunana iz nepopravljenih meritev 
aktivnosti skupnega organskega  14 C, bo zato konzervativna. Postopki 
za ocenjevanje koncentracij preskusne snovi iz izmerjenih radioke ­
mijskih aktivnosti, ki temeljijo na raznih poenostavitvenih pred ­
postavkah, so opisani v virih (2)(9)(10)(11). Takšne postopke je 
najenostavneje uporabiti za hitro razgradljive snovi.  
2.2 RAZLAGA REZULTATOV 
Če se ugotovi, da je k neodvisen od dodane koncentracije (tj. če je 
izračunani k približno enak pri razli čnih koncentracijah preskusne 
snovi), se lahko predpostavi, da je konstanta hitrosti prvega reda reprezentativna za uporabljene pogoje preskušanja, tj. preskusno 
snov, vzorec vode in preskusno koncentracijo. Do kakšne mere se 
lahko rezultati generalizirajo ali ekstrapolirajo na druge sisteme, pa je treba ovrednotiti s strokovno presojo. Če se uporabijo visoke 
koncentracije preskusne snovi in razgradnja zato ne sledi kinetiki 
prvega reda, podatkov ni mogo če uporabiti za neposredno oceno 
konstante hitrosti prvega reda ali ustrezne razpolovne dobe. Vendar so podatki, pridobljeni iz preskusa z visokimi koncentracijami preskusne snovi, lahko še vedno uporabni za ocenjevanje stopnje 
skupne mineralizacije in/ali zaznavanje in koli činsko produktov 
transformacije.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1342
 
Če so znane hitrosti drugih postopkov izginevanja poleg bioraz ­
gradnje (npr. hidrolize ali izhlapevanja), se lahko odštejejo od neto 
hitrosti izginevanja med preskusom, da se dobi približna ocena hitrosti biorazgradnje. Podatki za hidrolizo se lahko npr. pridobijo iz sterilnega kontrolnega vzorca ali iz vzporednega preskušanja 
z višjo koncentracijo preskusne snovi. 
Posredno in neposredno dolo čevanje
 14 CO 2 (oddelek 1.8.9.4 in 
Dodatek 3) se lahko uporabita le za merjenje obsega mineralizacije preskusne snovi v CO
 2 . Za analizo koncentracij s  14 C označene 
preskusne snovi in tvorbe poglavitnih produktov transformacije (tretji 
odstavek oddelka 1.8.9.4) se lahko uporabita radiokromatografija (RAD-TLC) ali HPLC. Da se omogo či neposredno ocenjevanje 
razpolovne dobe, je nujno, da ni prisotnih drugih poglavitnih 
produktov transformacije (opredeljeno kot ≥ 10 % vnesene koli čine 
preskusne snovi). Če so prisotni poglavitni produkti transformacije, 
kakor so opredeljeni tu, je potrebno podrobno vrednotenje podatkov. To lahko vklju čuje ponovitve preskušanja in/ali dolo čitev produktov 
transformacije (glejte prvi odstavek oddelka 1.8.9.5), razen če lahko 
usodo produktov transformacije upravi čeno ovrednotimo na podlagi 
izkušenj (npr. podatki o poteh razgradnje). Ker se delež preskusne snovi, ki se pretvori v CO
 2 , razlikuje (odvisno v ve čji meri od 
koncentracije preskusne snovi in drugih dostopnih substratov, 
preskusnih pogojev in mikrobne skupnosti), ta preskus ne omogo ča 
enostavne ocene popolne biorazgradnje kakor v preskusu upadanja DOC, vendar je rezultat podoben kakor pri respirometri čnem 
preskusu. Stopnja mineralizacije bo tako manjša ali enaka najnižji 
ravni popolne biorazgradnje. Da se dolo či popolnejša slika popolne 
biorazgradnje (mineralizacija in vgradnja v biomaso), je treba na koncu preskusa opraviti analizo fazne porazdelitve
 14 C (glejte 
Dodatek 1).  14 C v delcih bo sestavljen iz  14 C, ki je vgrajen 
v bakterijsko biomaso, in  14 C, ki je sorbiran na organske delce.  
2.3 VELJAVNOST PRESKUSA 
Če se referen čna snov ne razgradi v pri čakovanem časovnem 
obdobju (za anilin in natrijev benzoat obi čajno prej kot v dveh 
tednih), obstaja dvom o veljavnosti preskusa, zato je treba veljavnost 
dodatno preveriti ali pa se preskus ponovi z novim vzorcem vode. V ISO preskusu primerljivosti metode je sedem laboratorijev, izbranih iz cele Evrope, ugotovilo konstante hitrosti razgradnje za 
anilin, ki so variirale od 0,3 do 1,7 dan
 –1 s povprečno vrednostjo 
0,8 d  –1 pri 20  o C in standardno napako ±0,4 d  –1 (t ½ = 0,9 dni). 
Tipični časi prilagoditve so bili od 1 do 7 dni. Preiskane vode so 
imele po navedbah bakterijsko maso, ki je ustrezala 10  3 –10  4 kolonije 
tvorečim delcem (CFU) na ml. Hitrosti razgradnje v srednjeevropskih 
vodah, bogatih s hranili, so bile višje od hitrosti v nordijskih oligo ­
trofnih vodah. Razlike so lahko nastale zaradi razli čnega trofi čnega 
statusa ali zaradi predhodne izpostavitve kemijskim snovem. 
Skupni izkoristek (masna bilanca) na koncu poskusa bi morala biti 
med 90 % in 110 % za radioaktivno ozna čene snovi, za četni izkori ­
stek na za četku poskusa bi moral biti med 70 % in 110 % za 
neoznačene snovi. Vendar se morajo nakazana obmo čja šteti le za 
ciljna in se ne smejo uporabiti kot kriteriji za sprejemljivost 
preskusa.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1343
 
3. PORO ČILO O PRESKUSU  
Na poročilu o preskusu je treba jasno navesti vrsto raziskave, tj. 
pelagični preskus ali preskus suspendiranega sedimenta. Poro čilo 
o preskusu mora vsebovati tudi najmanj naslednje podatke: 
Preskusna snov in referen čna snov/referen čne snovi: 
— splošna imena, kemijska imena (priporo čeno poimenovanje po 
IUPAC in/ali CAS), številke po CAS, strukturne formule (z 
navedbo položaja  14 C, če se uporabi radioaktivno ozna čena 
snov) in ustrezne fizikalno-kemijske lastnosti preskusne in refe ­
renčne snovi (glej oddelka 1.5 in 1.6), 
— kemijska imena, številke po CAS, strukturne formule (z navedbo 
položaja  14 C, če se uporabi radioaktivno ozna čena snov) in 
ustrezne fizikalno-kemijske lastnosti snovi, ki se uporabijo kot 
standardi za dolo čitev in koli činsko opredelitev produktov trans ­
formacije, 
— čistoto (ne čistote) preskusne snovi in referen čnih snovi, 
— radiokemijsko čistoto ozna čene kemikalije in specifi čno aktivnost 
(kadar je primerno). 
Površinska voda: Navesti je treba najmanj naslednje podatke o odvzetem vzorcu vode: — lokacijo in opis mesta vzor čenja, vklju čno, če je mogo če, 
s preteklim onesnaženjem, 
— datum in uro vzor čenja, 
— hranila (skupni N, amoniak, nitrit, nitrat, skupni P, raztopljeni 
ortofosfat), 
— globina odvzema, — izgled vzorca (npr. barva in motnost), — vrednosti DOC in TOC, — vrednost BOD, 
— temperaturo in pH na mestu vzor čenja v času vzorčenja, 
— kisikov in redoks potencial (obvezno, če aerobni pogoji niso 
očitni), 
— slanost ali prevodnost (v primeru morske vode in braki čne vode), 
— suspendirane trdne snovi (v primeru motnega vzorca), — po možnosti druge pomembne podatke o mestu vzor čenja v času 
vzorčenja (npr. dejanski ali zgodovinski podatki o pretoku rek ali 
morskih tokov, bližnji poglavitni iztoki in vrsta iztokov, 
vremenski pogoji pred časom vzor čenja), 
in neobvezno: — mikrobno biomaso (npr. neposredno štetje z akridinskim 
oranžnim ali dolo čitev delcev, ki tvorijo kolonije),
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1344
 
— anorganski ogljik, 
— koncentracijo klorofila kot specifi čno oceno biomase alg. 
Poleg opisanega je treba navesti naslednje podatke o sedimentu, če 
se opravlja preskus suspendiranega sedimenta: 
— globina odvzema sedimenta, 
— izgled sedimenta (npr. obarvan, blaten, muljast ali peš čen), 
— tekstura (npr. delež grobega peska, drobnega peska, mulja in 
gline), 
— suha masa v g/l suspendiranih trdnih snovi, koncentracija 
TOC ali zmanjšanje mase po sežigu kot merilo vsebnosti 
organske snovi, 
— pH, — kisikov in redoks potencial (obvezno, če aerobni pogoji niso 
očitni). 
Preskusni pogoji: — zakasnitev med odvzemom in uporabo v laboratorijskem preskus, 
shranjevanje vzorca in predobdelava vzorca, datum izvedbe razi ­
skav, 
— količina uporabljene preskusne snovi, preskusne koncentracije in 
referenčne snovi, 
— metoda vnosa preskusne snov, vklju čno z uporabo topil, 
— uporabljeni volumen površinske vode in sedimenta ( če se je 
uporabil) in volumen vzorcev, odvzetih za analizo v vsakem 
časovnem obdobju, 
— opis uporabljenega preskusnega sistema. 
Če se ne uporabi tema, podatki o pogojih „difuzne svetlobe“; 
— podatke o metodi/metodah uporabljenih za vzpostavitev sterilnih 
kontrol (npr. temperatura, trajanje in število ciklov avtoklavira ­
nja), 
— inkubacijsko temperaturo, — podatke o analitskih tehnika in metodi/metodah, uporabljenih za 
radiokemijske meritve in za preverjanje masne bilance ter meritve 
fazne porazdelitve ( če so bile opravljene), 
— število ponovitev. 
Rezultati: 
— odsotki izkoristka (glejte oddelek 1.7.1), — ponovljivost in ob čutljivost uporabljenih analitskih metod, 
vključno z mejo zaznavnosti (LOD) in mejo koli činske oprede ­
litve (LOQ) (glejte oddelek 1.7.2),
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1345
 
— vse izmerjene podatke (vklju čno s časom vzor čenja) in izra ču­
nane vrednosti v preglednici ter krivulje razgradnje; za vsako 
preskusno koncentracijo in za vsako vzporedno bu čko je treba 
navesti koeficient linearne korelacije za naklon logaritemske krivulje, ocenjeno fazo prilagajanja in konstanto hitrosti prvega 
reda ali psevdo prvega reda ( če je možno) ter ustrezno razpo ­
lovno dobo razgradnje (ali trajanje razpolovne dobe t
 50 ), 
— navesti pomembne vrednosti, kot so povpre čja rezultatov, 
opaženih v posameznih ponovitvah, npr. dolžina faze prilagaja ­
nja, konstanto hitrosti razgradnje in razpolovno dobo razgradnje 
(ali t  50 ), 
— uvrstiti sistem kot neprilagojen ali prilagojen na osnovi izgleda 
krivulje razgradnje in iz možnih vplivov na preskusno koncen ­
tracijo, 
— rezultate kon čnega preverjanja masne bilance in rezultate meritev 
fazne porazdelitve ( če so bile opravljene), 
— delež mineraliziranega  14 C in končna raven primarne razgradnje, 
če se uporabijo specifi čne analize, 
— določitev, molska koncentracija in odstotek vnesenih in poglavi ­
tnih produktov transformacije (glejte prvi odstavek oddelka 1.8.9.5), kadar je primerno, 
— predlagane poti transformacije, kadar je primerno, 
— razpravo o rezultatih.
 
4. VIRI  
(1) OECD TG 309 (2004) Aerobic Mineralisation in surface water 
– Simulation Biodegradation Test. 
(2) ISO/DIS 14592–1 (1999) Water quality – Evaluation of the 
aerobic biodegradability of organic compounds at low concen ­
trations – Part 1: Shake flask batch test with surface water or 
surface water/sediment suspensions. 
(3) Testing Method C.23. Aerobic and anaerobic transformation in 
soil. 
(4) Testing Method C.24. Aerobic and anaerobic transformation in 
aquatic sediments. 
(5) OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. OECD, 
Paris. 
(6) ISO 8245 (1999). Water quality – Guidelines on the determi ­
nation of total organic carbon (TOC) and dissolved organic carbon (DOC). 
(7) ISO 10634 (1995). Water quality – Guidance for the prepara ­
tion and treatment of poorly water-soluble organic compounds 
for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium. 
(8) OECD draft (2000). Guidance Document on aquatic toxicity 
testing of difficult substances and mixtures. Environmental 
Health and Safety Publications. Series on Testing and Asses ­
sment. No 22 (to be published summer 2000).
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1346
 
(9) Simkins, S. in Alexander, M. (1984). Models for mineralization 
kinetics with the variables of substrate concentration and popu ­
lation density. Appl. Environ. Microbiol.47, 394–401. 
(10) Ingerslev, F. in N. Nyholm. (2000). Shake-flask test for deter ­
mination of biodegradation rates of  14 C-labeled chemicals at 
low concentrations in surface water systems. Ecotoxicol. Envi ­
ron. Saf. 45, 274–283. 
(11) ISO/CD 14592–1 (1999). Ring test report: Water Quality – 
Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations part 1 – report of 1998/1999 ring-test. Shake flask batch test with surface water or surface 
water/sediment suspensions.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1347
 
Dodatek 1  
Fazna porazdelitev  14 C 
Zaradi preverjanja postopka je treba rutinske meritve preostale skupne aktivnosti 
organskega  14 C (TOA) dopolniti z meritvami masne bilance, ki vklju čujejo nepo ­
sredno dolo čevanje sproš čenega  14 CO 2 po zajetju v absorpcijsko posodo (glejte 
Dodatek 3). Pozitiven rezultat tvorbe  14 CO 2 je sam po sebi neposreden dokaz 
biorazgradnje in je v nasprotju z abiotsko razgradnjo ali druga čnim izginevanjem, 
npr. izhlapevanjem in sorpcijo. Dodatne uporabne podatke, ki opisujejo obna ­ 
šanje biorazgradnje, je možno dobiti iz meritev porazdelitve TOA med razto ­
pljenim stanjem (raztopljena aktivnost organskega  14 C, DOA) in delci (aktivnost 
organskega  14 C v delcih, POA) po lo čevanju delcev z membransko filtracijo ali 
centrifugiranjem. POA obsega preskusno snov, ki je sorbirana na mikrobno biomaso in na druge delce, ter ogljik preskusne snovi, ki je bil uporabljen za 
sintezo novega celi čnega materiala in s tem vgrajen v frakcijo biomase, ki jo 
predstavljajo delci. Kot oceno nastajanja raztopljenega organskega materiala s
 14 C lahko uporabimo DOA na koncu biorazgradnje (izravnanje krivulje odvis ­
nosti razgradnje od časa). 
Fazna porazdelitev preostalega  14 C v izbranih vzorcih se oceni s filtracijo 
vzorcev skozi 0,22- μm ali 0,45- μm membranski filter iz materiala, ki ne adsor ­
bira znatnih koli čin preskusne snovi (primerni so lahko polikarbonatni filtri). Če 
je sorpcija preskusne snovi na filter preobsežna, da bi jo lahko zanemarili (kar je treba preverite pred poskusom), se lahko namesto filtracije uporabi centrifugi ­
ranje (2 000 g; 10 min). 
S filtratom oziroma centrifugatom ravnajte, kakor je opisano v Dodatku 3 za 
nefiltrirane vzorce. Membranske filtre je treba raztopiti v primerni scintilacijski tekočini in prešteti, kakor ponavadi. Obi čajno se uporabi le metoda razmerja 
zunanjega standarda za korekcijo pojenjanja ali oksidant za vzorec. Če se je 
uporabilo centrifugiranje, se sediment resuspendira, da nastane frakcija z delci v 1–2 ml destilirane vode, ki se jo prenese v scintilacijsko vialo. Centrifugirano posodo dvakrat speremo z 1 ml destilirane vode in izpirek prenesemo 
v scintilacijsko vialo. Če je treba, se lahko suspenzijo vklopi v gel za teko činsko 
scintilacijsko štetje.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1348
 
Dodatek 2  
Polkontinuiran postopek  
Da se doseže zadostna razgradnja odpornih snovi je lahko potrebna podaljšana 
inkubacija do ve č mesecev. Trajanje preskusa obi čajno ne sme prese či 60 dni, 
razen če se lastnosti prvotnega vzorca vode ohranjajo z obnavljanjem preskusne 
suspenzije. Vendar je možno preskusno obdobje podaljšati do najve č 90 dni brez 
obnavljanja preskusne suspenzije, če se razgradnja preskusne snovi po prvih 60 
dneh še ni za čela. 
Med inkubacijo za dolga obdobja se lahko raznolikost mikrobne združbe zmanjša 
zaradi razli čnih mehanizmov izginjanja in zaradi možnega osiromašenja vzorca 
vode esencialnih hranil in primarnih substratov ogljika. Zato je priporo čljivo, da 
se uporabi polkontinuiran preskus, s katerim se zadostno dolo či hitrost razgradnje 
počasi razgradljivih snovi. Preskus je treba za četi s polkontinuiranim postopkom, 
če se za 20-odstotno razgradnjo snovi lahko na podlagi predhodnih izkušenj 
pričakuje trajanje inkubacije tri mesece. V nasprotnem primeru se lahko obi čajni 
serijski preskus spremeni v polkontinuiran preskus, če v približno 60 dneh 
preskušanja v serijskem preskusu ni dosežena nikakršna razgradnja preskusne snovi. Če se opazi znatna razgradnja (npr. > 20 %) se lahko polkontinuiran 
postopek ustavi in preskus nadaljuje kot serijski poskus. 
V polkontinuiranem preskusu se vsake dva tedna približno ena tretjina volumna 
preskusne suspenzije zamenja s sveže odvzeto vodo, kateri je dodana preskusna snov v za četni koncentraciji. Nadomestni vodi podobno dodamo sediment 
v začetni koncentraciji (med 0,01 in 1 g/l), če se opravlja preskus suspendiranega 
sedimenta. Če se opravlja preskus suspendirane trdne snovi iz sedimenta, je 
pomembno, da popolnoma suspendiran sistem ohranjamo tudi med obnavljanjem vode in da je zadrževalni čas identičen za trdne snovi in vodo, saj lahko 
v nasprotnem primeru izgubimo nameravano podobnost s homogenim vodnim 
sistemom brez fiksiranih faz. Iz teh razlogov ima pri uporabi polkontinuiranega postopka prednost za četna koncentracija suspendiranih sedimentov na spodnji 
meji navedenega intervala. 
Predpisano dodajanje preskusne snovi kaže, da se za četne koncentracije 
preskusne snovi pri delnem obnavljanju preskusne suspenzije ne presežejo, 
zato ne pride do prilagajanja, ki se sicer pogosto pojavi pri visokih koncentraci ­
jah. Ker postopek obsega tako ponovno inokulacijo in nadomestilo osiromašenih hranil in primarnih substratov, se izvirna mikrobna raznolikost obnovi in trajanja 
preskusa se lahko podaljša v principu do neskon čnosti. Kadar se uporabi polkon ­
tinuiran postopek, je pomembno upoštevati, da se preostala koncentracija preskusne snovi popravi za koli čino preskusne snovi, ki se doda in odvzame 
pri vsakem postopku obnove. Pri spojinah, ki se sorbirajo v majhnem obsegu, se 
lahko pojma skupna in raztopljena koncentracija preskusne snovi uporabljata 
enakovredno. V navedenih pogojih (0,1–1 g trdnih snovi/l) je sorpcija nepo ­
membna (< 5 %) za snovi z log Kow < 3 (velja za nevtralne, lipofilne spojine). To ponazarja naslednji primer izra čuna. 0,1 g/l trdnih snovi grobo ustreza 10 mg 
ogljika na liter (delež ogljika, f
 C = 0,01). Ob predpostavki, da: 
Log K  ow (preskusne snovi) = 3 
K oc = 0,42 × K  ow 
Porazdelitveni koeficient, K  d = f C × K  oc 
velja, da raztopljena frakcija skupne koncentracije (C-voda (C  w )/C-skupno (C  t ) je: 
C w /C t = 1/(1 + K  d × SS) = 1(1 + K  oc × f C × SS) = 1/(1 + 0,42 × 10  3 × 0,01 
× 0,1 × 10  –3 ) = 0,999  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1349
 
Dodatek 3  
Določitev  14 CO  2 
Posredna dolo čitev  14 CO  2 
Za rutinske meritve je posredna metoda ponavadi najhitrejša in najbolj natan čna, 
če je preskusna metoda nehlapna in se ne pretvarja v hlapne produkte trans ­
formacije. Nefiltrirane vzorce, npr. 5 ml, se preprosto prenese v scintilacijske 
viale. Primerna za četna aktivnost v vzorcih je 
5 000 dpm–10 000 dpm (80–170 Bq), najmanjša za četna aktivnost pa je približno 
1 000 dpm. Po zakisanju na pH 2–3 z 1–2 kapljicama koncentrirane H  3 PO 4 ali 
HCl je treba CO  2 odstraniti. Odstranjevanje CO  2 se lahko opravi z uvajanjem 
zraka za približno ½–1 ure. Namesto tega se lahko viale mo čno stresa za 1–2 uri 
(npr. za stresalniku za mikroploš če) ali pusti preko no či pri nežnejšem stresanju. 
Učinkovitost odstranjevanja CO  2 je treba preveriti (s podaljševanjem trajanja 
aeracije ali stresanja). Nato se doda scintilacijska teko čina, ki je primerna za 
štetje vodnih vzorcev. Vzorec se homogenizira na vrtin častem mešalu, nato pa 
se s teko činskim scintilacijskim štetjem dolo či radioaktivnost, pri čemer se 
odšteje aktivnost ozadja, dolo čena v slepih vzorcih (F  B ). Če preskusna voda ni 
zelo obarvana in ne vsebuje visoko koncentracijo delcev, bodo vzorci obi čajno 
kazali enakomerno pojenjanje, kar bo dovolj za izvedbo korekcije pojenjanja z zunanjim standardom. Če je preskusna voda zelo obarvana, bo potrebna korek ­
cija pojenjanja z dodatkom notranjega standarda. Če je koncentracija delcev 
visoka, morda ne bo možno dose či homogene raztopine ali gela ali pa bo varia ­
cija pojenjanja med vzorci velika. V tem primeru se lahko uporabi metoda štetja, ki je opisana spodaj za preskusne suspenzije. Če se preskus opravlja kot preskus 
suspendiranega sedimenta, se lahko meritve
 14 CO 2 opravijo posredno 
z odvzemom 10 ml homogenega vzorca preskusne vode/suspenzije in lo čitvijo 
faz s centrifugiranjem pri primerni hitrosti (npr. pri 40 000 m/s  2 za 15 min). 
Vodno fazo se nato obdela, kakor je opisano zgoraj. Aktivnost  14 C v fazi 
z delci (POA) je treba dolo čiti z resuspendiranjem sedimenta v majhnem 
volumnu destilirane vode, prenosom v scintilacijske viale in dodatkom scintila ­
cijske teko čine, da nastane gel (za ta namen so na voljo posebne scintilacijske 
tekočine). Odvisno od narave delcev (npr. njihove vsebnosti organskega ogljika) 
je morda možno pred dodatkom scintilacijske teko čine vzorec razkrojiti preko 
noči v topilniku tkiv in ga nato homogenizirati na vrtin častem mešalu. Namesto 
tega se lahko POA dolo či s sežigom v prebitku kisika v oksidantu vzorca. Pri 
štetju je treba vedno vklju čiti notranje standarde. Morda bo treba opraviti korek ­
cijo pojenjanja z dodatkom notranjega standarda v vsak posamezni vzorec.  
Neposredna dolo čitev  14 CO  2 
Če se sproš čeni 14 CO 2 meri neposredno, je treba na za četku poskusa za četi z več 
bučkami, odvzemom preskusnih bu čk v vsaki merilni časovni točki z zakisanjem 
vsebine na pH 2–3 in zajemom  14 CO 2 v notranji (vstavljenem v vsako preskusno 
bučko na za četku preskusa) ali zunanji absorpcijski posodi. Kot absorpcijsko 
sredstvo se lahko uporabi bodisi alkalijska snov (npr. 1-normalna raztopina NaOH ali zrno NaOH) bodisi etanolamin ali absorbent na osnovi etanolamina bodisi komercialno dostopni absorbent. Pri neposrednem merjenju
 14 CO 2 je treba 
bučke zapreti z npr. septumom iz butilnega kav čuka. ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1350
 
Slika 1a  
Primer aritmeti čnega prikaza podatkov (preostala aktivnost v odvisnosti od 
časa)
 
Slika 1b  
Primer pologaritemskega prikaza podatkov (ln preostale aktivnosti 
v odvisnosti od časa).
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1351
 
C.26.  PRESKUS ZAVIRANJA RASTI  LEMNA  SP. 
1. METODA  
Ta preskusna metoda je enakovredna OECD TG 221 (2006) (1). 
Pristojni organi EU so dosegli širše soglasje o primernosti preskusov z vodno le čo kot druge možnosti za preskuse na algah za mo čno 
obarvane snovi (2)(3).
 
1.1 UVOD 
Ta preskusna metoda je zasnovana za dolo čanje strupenosti snovi za 
sladkovodne rastline iz rodu  Lemna  (vodolečevke). Temelji na obsto ­
ječih smernicah (4)(5)(6)(7)(8)(9), vendar zaradi upoštevanja 
nedavnih raziskav in posvetovanj o številnih klju čnih vprašanjih 
vključuje spremembe navedenih metod. Predlagana metoda je bila 
validirana v mednarodnem preskusu primerljivosti (10). 
Ta preskusna metoda opisuje preskušanje strupenosti z organizmoma  
Lemna gibba  in Lemna minor . Oba organizma sta bila obsežno 
proučena in sta predmet zgoraj navedenih standardov. Taksonomija 
rodu Lemna  je težka zaradi prisotnosti velike množice fenotipov. 
Čeprav lahko pride do genetske variabilnosti kot odziv na strupene 
snovi, trenutno ni dovolj podatkov o tej vrsti variabilnosti, na podlagi katerih bi bilo za to preskusno metodo mogo če priporo čiti 
uporabo specifi čnega klona. Opozoriti je treba, da se preskus ne 
opravlja akseni čno, ampak se med preskusom uporabljajo postopki, 
da se čimbolj zmanjša onesnaženje z drugimi organizmi. 
Podrobno je opisano preskušanje z obnavljanjem preskusne raztopine 
(polstatično ali preto čno) ali brez obnavljanja le-te (stati čno). Glede na 
cilje preskusa in zakonske zahteve je priporo čljivo prou čiti možnosti 
uporabe polstati čnih ali preto čnih metod, npr. za snovi, ki hitro izgi ­
njajo iz raztopine zaradi izhlapevanja, svetlobne razgradnje, obarjanja 
ali biorazgradnje. Ve č smernic je na voljo v (11).
 
1.2 OPREDELITVE 
Za namene te preskusne metode se uporabljajo naslednje opredelitve 
in okrajšave:  
Biomasa : masa suhe snovi živih organizmov, ki so prisotni 
v populaciji. V tem preskusu se kot nadomestek za biomaso obi čajno 
meri število listov oziroma površina listov. Ravno tako se izraz 
„biomasa“ nanaša na te nadomestne meritve.  
Kloroza : porumenelost listnega tkiva.  
Klon : je organizem ali celica, ki se z nespolnim razmnoževanjem 
razvije iz enega organizma. Zato so osebki iz istega klona genetsko identični. 
Kolonija : pomeni skupek materinskih in h čerinskih listov (ponavadi 
2 do 4), ki so pritrjeni eden na drugega. V nekaterih primeri to 
pomeni rastlino.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1352
 
EC x : je koncentracija preskusne snovi, raztopljene v preskusnem 
mediju, ki povzro či x-odstotno (npr. 50-odstotno) zmanjšanje rasti 
vodne leče v navedenem obdobju izpostavljanja (v primeru, da je 
trajanje poskusa odstopalo od popolne ali obi čajne dolžine, ga je 
treba navesti nedvoumno). Da se nedvoumno ozna či, da vrednost 
EC izhaja iz hitrosti rasti ali izplena, se uporabi simbol „E  r C“ za 
hitrost rasti in „E  y C“ za izplen, sledi pa merjena spremenljivka, npr. 
E r C (število listov).  
Pretočen: preskus, v katerem se preskusna raztopina neprekinjeno 
menja.  
List: posamezna/ena „listu podobna“ struktura rastline vodne le če. Je 
najmanjša enota, tj. osebek, ki je zmnožen razmnoževanja.  
Grbavost : pomeni liste, ki so grbasti ali otekli.  
Rast : je pove čanje merjene spremenljivke, npr. števila listov, suhe 
mase, mokre mase ali površine listov, v času preskusa.  
Hitrost rasti (povpre čna specifi čna hitrost rasti) : je logaritemsko 
povečanje biomase v obdobju izpostavljanja.  
Najnižja koncentracija z opaznim u činkom (LOEC) : je najnižja 
preskušena koncentracija snovi, pri kateri je opaziti statisti čno 
značilen učinek zmanjšanja rasti (pri p < 0,05) v primerjavi 
s kontrolnim vzorcem v navedenem obdobju izpostavljanja. Vendar 
morajo imeti vse koncentracije nad LOEC škodljiv u činek, ki je enak 
ali večji od škodljivega u činka, opaženega pri LOEC. Če ta dva 
pogoja ni možno izpolniti, je treba navesti popolno razlago izbire LOEC (in posledi čno NOEC).  
Merjene spremenljivke : so vse vrste spremenljivk, ki se merijo, da 
se izrazi izid preskusa z eno ali ve č različnimi spremenljivkami 
odziva. V tej metodi so merjene spremenljivke število listov, povr ­ 
šina listov, sveža masa in suha masa.  
Monokultura : je kultura z eno rastlinsko vrsto.  
Nekroza : je odmrlo (tj. belo ali z vodo prepojeno) listno tkivo.  
Koncentracija brez opaznega u činka (NOEC) : je preskušena 
koncentracija neposredno pod LOEC.  
Fenotip : so opazne lastnosti organizma, ki jih dolo čajo njegovi geni 
v interakciji z okoljem.  
Spremenljivke odziva : so spremenljivke za oceno strupenosti, ki so 
izpeljane iz katere koli merjene spremenljivke za opis biomase 
z različnimi postopki izra čuna. V tej metodi sta hitrost rasti in izplen 
spremenljivki odziva, ki sta izpeljani iz merjenih spremenljivk, kot 
so število listov, površina listov, sveža masa in suha masa.  
Polstatični (obnavljajo či) preskus : je preskus, v katerem se 
preskusna raztopina v danih časovnih presledkih med preskusom 
redno menja.  
Statični preskus : je preskusna metoda, v kateri preskusna raztopina 
med preskusom ne obnavlja.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1353
 
Kazalec izida preskusa : opisuje splošen dejavnik, ki ga preskušana 
snov spremeni glede na kontrolni vzorec in je cilj preskusa. V tej 
metodi je kazalec izida zaviranje rasti, ki ga lahko izrazimo z različnimi spremenljivkami odziva, katere temeljijo na eni ali ve č 
merjenih spremenljivk.  
Preskusni medij : je popolnoma sinteti čno gojišče, na katerem 
preskusne rastline rastejo ob izpostavitvi preskusni snovi. Obi čajno 
se preskusna snov raztopi v preskusnem mediju.  
Izplen : je vrednost merjene spremenljivke za izražanje biomase na 
koncu obdobja izpostavljanja minus vrednost merjene spremenljivke 
na začetku obdobja izpostavljanja.
 
1.3 PRINCIP PRESKUSNE METODE 
Kulturam rastlin iz rodu  Lemna  v eksponentni fazi rasti se omogo či, 
da sedem dni rastejo kot monokultura v prisotnosti razli čnih koncen ­
tracij preskusne snovi. Cilj preskusa je koli činsko opredeliti u činke 
snovi na vegetativno rast v tem obdobju, na osnovi izbranih merjenih spremenljivk. Primarna merjena spremenljivka je število listov. Poleg 
nje se meri vsaj še ena merjena spremenljivka (skupna površina 
listov, suha teža ali sveža teža), saj lahko nekatere snovi bolj vpli ­
vajo na druge merjene spremenljivke kot na število listov. U činki, ki 
so odvisni od snovi, se koli činsko opredelijo tako, da se rast 
v preskusni raztopini primerja z rastjo kontrolnih vzorcev, nato pa 
se določi koncentracija, ki je povzro čila navedeno x-odstotno zavi ­
ranje rasti (npr. 50-odstotno). Ta koncentracija se izrazi kot EC
 x 
(npr. EC  50 ). 
Kazalec izida je zaviranje rasti, ki je izraženo kot logaritemsko 
povečanje merjene spremenljivke (povpre čne specifi čne hitrosti rasti) 
v obdobju izpostavljanja. Iz povpre čne specifi čne hitrosti rasti niza 
preskusnih raztopin se dolo či koncentracija, ki je povzro čila nave­
deno x-odstotno zaviranje hitrosti rasti (npr. 50-odstotno). Ta koncentracija se izrazi kot E
 r C x (npr. E  r C 50 ). 
Dodatna spremenljivka odziva, ki se uporablja v tej preskusni 
metodi, je izplen, ki ga je morda treba dolo čiti, da se izpolnijo 
specifične zakonske zahteve nekaterih držav. Izplen se dolo či kot 
vrednost merjenih spremenljivk na koncu obdobja izpostavljanja minus vrednost merjenih spremenljivk na za četku obdobja izposta ­
vljanja. Iz izplena niza preskusnih raztopin se dolo či koncentracija, 
ki je povzro čila navedeno x-odstotno zaviranje izplena (npr. 50- 
odstotono). Ta koncentracija se izrazi kot E
 y C x (npr. E  y C 50 ). 
Poleg navedenega se lahko statisti čno določita tudi najnižja koncen ­
tracija z opaznim u činkom (LOEC) in koncentracija brez opaznega 
učinka (NOEC).  
1.4 PODATKI O PRESKUSNI SNOVI 
Na voljo mora biti analitska metoda z zadostno ob čutljivostjo za 
količinsko opredelitev snovi v preskusnem mediju.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1354
 
Podatki o preskusni snovi, ki so morda uporabni za dolo čevanje 
pogojev preskusa, so med drugim strukturna formula, čistota, topnost 
v vodi, obstojnost v vodi in na svetlobi, pK  a , K  ow , parni tlak in 
biorazgradljivost. Topnost v vodi in parni tlak se lahko uporabita za izračun konstante Henryevega zakona, ki pokaže, ali so 
v časovnem obdobju poskusa verjetne bistvene izgube preskusne 
snovi. To pripomore k odlo čitvi o uvedbi posameznih postopkov 
za nadzorovanje takšnih izgub. Če so podatki o topnosti in obstoj ­
nosti preskusne snovi negotovi, je priporo čljivo, da se te vrednosti 
določijo v pogojih preskusa, tj. v gojiš ču, pri temperaturi in režimu 
osvetljevanja, ki se uporabijo v preskusu. 
Kadar je zlasti pomembno nadzorovanje pH preskusnega medija (npr. 
pri preskušanju kovin ali snovi, ki so hidroliti čno neobstojne), je pripo ­
ročljivo dodajanje pufra v gojiš če (glejte prvi odstavek oddelka 1.7.4). 
Več smernic za preskusne snovi z fizikalno-kemijskimi lastnostmi, 
zaradi katerih je preskušanje oteženo, je navedenih v (11).
 
1.5 REFEREN ČNE SNOVI 
Za preverjanje preskusnega postopka, se lahko uporabi referen čna 
snov oz. referen čne snovi, kot je 3,5-diklorofenol, ki je bil upora ­
bljen v mednarodnem preskusu primerljivosti (10). Priporo čljivo je 
referenčno snov preskusiti najmanj dvakrat letno oz. vzporedno 
z določevanjem strupenosti preskusne snovi, kadar se preskušanja 
opravljajo redkeje.  
1.6 VELJAVNOST PRESKUSA 
Za veljavnost preskusa mora biti podvojitveni čas števila listov 
v kontrolnem vzorcu krajši od 2,5 dni (60 h), kar ustreza približno sedemkratnemu pove čanju v sedmih dneh in povpre čni specifi čni 
hitrosti 0,275 dan
 –1 . Ta kriterij je mogo če doseči z mediji in pogoji 
preskusa, ki so opisani v tej preskusni metodi, ter stati čnim 
preskusnim režimom (8). Pri čakovati je tudi, da je ta kriterij dose ­
gljiv tudi v polstati čnih in preto čnih pogojih preskusa. Izra čun 
podvojitvenega časa je prikazan v oddelku 2.1  
1.7 OPIS METODE  
1.7.1  Aparatura  
Vsa oprema v stiku s preskusnimi mediji mora biti izdelana iz stekla 
ali druge kemijsko inertne snovi. Steklovino za gojenje in presku ­ 
šanje je treba o čistiti kemijskih onesnaževalcev, ki se lahko spirajo 
v preskusni medij. Ta steklovina mora biti sterilna. Preskusne posode morajo biti dovolj široke, da listi posameznih kolonij v posodah kontrolnih vzorcev rastejo brez prekrivanja do konca preskusa. Ni 
pomembno, ali se korenine dotikajo dna preskusnih posod, vendar je 
najmanjša priporo čljiva globina vsake preskusne posode 20 mm, 
najmanjša priporo čljiva prostornina vsake preskusne posode pa 
100 ml. Če se izpolnijo te zahteve, izbira preskusnih posod ni klju ­ 
čna. Kot primerne so se izkazale steklene čaše, kristalizacijske poso ­
dice in steklene petrijevke ustreznih mer. Preskusne posode morajo biti pokrite, da se čimbolj zmanjša izhlapevanje in nenamerno ones ­
naženje, hkrati pa je omogo čena potrebna izmenjava zraka. Primerne 
poskusne posode in zlasti pokrovi ne smejo sen čiti ali spremeniti 
spektralnih zna čilnosti svetlobe.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1355
 
Kulture in preskusne posode se ne smejo hraniti skupaj. To je 
najbolje dose či z ločenimi okoljskimi gojitvenimi komorami, 
inkubatorji ali prostori. Mora biti omogo čeno nadzorovanje osvet ­
litve in temperature ter ohranjanje teh parametrov na konstantni ravni (glejte oddelek 1.7.8).
 
1.7.2  Preskusni organizem  
V tem preskusu se uporabi bodisi  Lemna gibba  bodisi  Lemna minor . 
Kratki opisi vrst vodne le če, ki so bile uporabljene v preskušanjih 
strupenosti, so navedeni v Dodatku 1. Rastlinski material je možno 
dobiti iz zbirke kultur, drugega laboratorija ali na terenu. Če se 
rastlinski material odvzame na terenu, je treba rastline ohranjati v kulturi v istem mediju, kakor se uporablja za preskus, najmanj 
osem tednov pred uporabo. Terenska mesta, kjer se jemljejo za četne 
kulture, morajo biti brez o čitnih virov onesnaženja. Če se kulture 
pridobijo iz drugega laboratorija ali zbirke kultur, jih je treba na podoben na čin ohranjati najmanj tri tedne. V poro čilu je treba 
vedno navesti v preskusu uporabljen vir rastlinskega materiala ter 
vrsta in klon ( če sta znana). 
Monokulture, za katere se s prostim o česom oceni, da niso onesna ­ 
žene z drugimi organizmi, npr. algami in praživalmi. Zdrave rastline vrste  L. minor  bodo sestavljale kolonije, ki imajo od dva do pet 
listov. Zdrave kolonije vrste  L. gibba  pa lahko imajo do sedem 
listov. 
Kakovost in enakomernost rastlin, ki se uporabijo v preskusu, bosta 
pomembno vplivali na izid preskusa, zato je treba rastline natan čno 
izbrati. Uporabiti je treba mlade, hitrorasto če rastline brez vidnih 
lezij ali sprememb barve (kloroza). Kulture dobre kakovosti nakazuje 
visoka pojavnost kolonij, ki imajo najmanj dva lista. Veliko število 
posameznih listov kaže na okoljski stres, npr. omejitev hranil, in rastlinski material, katerega kulture se ne smejo uporabiti za presku ­ 
šanje.
 
1.7.3  Gojenje  
Kulture se lahko hranijo pri zmanjšani osvetlitvi in znižani tempera ­
turi (4–10 °C), da se zmanjša pogostnost vzdrževanja kultur (npr. 
kadar se za neko obdobje ne na črtuje preskusov z vodno le čo). 
Podrobnosti gojenja so navedene v Dodatku 2. Kadar se pojavijo očitni znaki onesnaženja z algami ali drugimi organizmi, je treba 
podvzorec listov vodne le če površinsko sterilizirati ter nato prenesti 
v sveži medij (glejte Dodatek 2). V tem primeru je treba preostalo onesnaženo kulturo zavre či. 
Najmanj sedem dni pred preskušanjem je treba zadostno število 
kolonij asepti čno prenesti v sveži sterilni medij in gojiti 7–10 dni 
v pogojih preskusa.
 
1.7.4  Preskusni medij  
Kakor je opisano spodaj, so za  Lemna gibba  in Lemna minor  pripo­
ročeni različni mediji. Natan čno je treba prou čiti vključitev pufra 
v preskusni medij (MOPS (4-morfolinpropan sulfonska kislina, 
CAS št.: 1132–61–2; EINECS št.: 214–478–5) v medij za  L. 
minor  in NaHCO  3 v medij za  L. gibba ), kadar sumimo, da lahko 
reagira s preskusno snovjo in vpliva na izražanje strupenosti. Če 
se izpolnijo zahteve veljavnosti, je sprejemljiv tudi medij po Stein ­
bergu (12).  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1356
 
Za gojenje  L. minor  in preskušanje z  L. minor  je priporo čljiva modi ­
fikacija gojiš ča za vodno le čo iz švedskega standarda (SIS). Sestava 
tega medija je navedena v Dodatku 3. 
Za gojenje  L. gibba  in preskušanje z  L. gibba  je priporo čljivo gojiš če 
20X – AAP, kakor je opisano v Dodatku 3. 
Za L. minor  je primeren tudi medij po Steinbergu, kakor je opisan 
v Dodatku 3, vendar se lahko uporabi tudi za  L. gibba  pod pogojem, 
da se izpolnijo zahteve veljavnosti.  
1.7.5  Preskusne raztopine  
Preskusne raztopine se ponavadi pripravijo z razred čitvijo založnih 
raztopin. Založne raztopine preskusne snovi se obi čajno pripravijo 
z raztopitvijo snovi v gojiš ču. 
Najvišja preskušena koncentracija preskusne snovi obi čajno ne sme 
preseči topnosti te snovi v vodi v pogojih preskusa. Vendar je treba 
opozoriti, da  Lemna  spp. plavajo na gladini in so lahko izpostavljene 
snovem, ki se zbirajo na mejni ploskvi med vodo in zrakom (npr. 
slabo vodotopne snovi ali hidrofobne snovi ali površinsko aktivne 
snovi). V takšnih pogojih izpostavitev ne bo posledica snovi iz raztopine in preskusne koncentracije lahko, odvisno od zna čilnosti 
preskusne snovi, presežejo topnost v vodi. Za preskusne snovi 
z majhno topnostjo v vodi bo morda treba pripraviti koncentrirano 
založno raztopino ali dispergirati snov s pomo čjo organskega topila 
ali disperzijskega sredstva, da se omogo či dodajanje to čnih količin 
preskusne snovi v preskusni medij ter da se olajša njeno razprševanje 
in raztapljanje. Čim bolj si je treba prizadevati, da se izognemo 
uporabi takšnih snovi. Uporaba pomožnih topil ali disperzijskih sred ­
stev ne sme povzro čiti fitotoksi čnosti. Npr. pogosto uporabljeni 
topili, ki ne povzro čata fitotoksi čnosti pri koncentracijah do 
100 μl·l
 –1 , sta med drugim aceton in dimetilformamid. Če se uporabi 
topilo ali disperzijsko sredstvo, je treba kon čno koncentracijo te 
snovi navesti v poro čilu in jo ohranjati na najnižji ravni 
(≤ 100 μl·l –1 ). Ravno tako morajo vsi postopki obdelave in kontrolni 
vzorci vsebovati enako koncentracijo topila ali disperzijskega sred ­
stva. Več smernic o uporabi disperzijskih sredstev je na voljo v (11).  
1.7.6  Preskusne in kontrolne skupine  
Pri izbiri primernih preskusnih koncentracij pripomore predhodno 
poznavanje strupenosti preskusne snovi za vodno le čo, npr. podatki 
iz preskusa za ugotavljanje obmo čja. V dokon čnem preskusu strupe ­
nosti mora biti obi čajno najmanj pet preskusnih koncentracij, ki so 
urejene v geometrijskem zaporedju. Po možnosti lo čilni faktor med 
preskusnimi koncentracijami ne sme presegati 3,2, vendar se lahko uporabijo ve čje vrednosti, če je krivulja odziva na koncentracijo 
ravna. Če se uporabi manj kot pet koncentracij, je treba to utemeljiti. 
Za vsako preskusno koncentracijo je treba uporabiti najmanj tri 
ponovitve. 
Pri določevanju obmo čja preskusnih koncentracij (pri ugotavljanju 
območja in/ali v dokon čnem preskusu strupenosti) je treba prou čiti 
naslednje možnosti:
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1357
 
— Za dolo čitev EC  x z ustrezno ravnijo zaupanja morajo preskusne 
koncentracije oklepati vrednost EC  x . Npr. če ocenjujemo EC  50 , 
mora biti najvišja preskusna koncentracija višja od vrednosti EC
 50 . Če vrednost EC  50 leži izven obmo čja preskusnih koncen ­
tracij, bodo povezani intervali zaupanja veliki in pravilna ocena 
statističnega ujemanja modela morda ne bo možna. 
— Če je cilj dolo čitev LOEC/NOEC, mora biti najnižja preskusna 
koncentracija dovolj nizka, da rast ni bistveno manjša od kontrole. Poleg tega mora biti najvišja preskusna koncentracija 
dovolj visoka, da je rast bistveno manjša od kontrole. 
V nasprotnem primeru bo treba preskus ponoviti z druga čnim 
območjem koncentracij (razen če je najvišja koncentracija na 
meji topnosti ali najvišji zahtevani mejni koncentraciji, npr. 
100 mg·l
 –1 ). 
Vsak preskus mora vklju čevati kontrole, ki so sestavljene iz enakega 
hranilnega medija, števila listov in kolonij, okoljskih pogojev in postopkov, kakor se uporabljajo za preskusne posode, vendar brez 
preskusne snovi. Če se uporablja pomožno topilo ali disperzijsko 
sredstvo, je treba vklju čiti dodatno kontrolno obdelavo 
s topilom/disperzijskim sredstvom, ki je prisotno v enaki koncentra ­
ciji kot v posodah s preskusno snovjo. Število ponovitev kontrolnih 
posod (in posod s topilom, če je smiselno) mora biti najmanj enako, 
idealno dvakrat ve čje, številu posod za vsako preskusno koncentra ­
cijo. 
Če določevanje NOEC ni zahtevano, se na črt preskusa lahko spre ­
meni, tako da se pove ča število koncentracij in zmanjša število 
ponovitev na koncentracijo. Kljub temu morajo imeti kontrolni vzorci najmanj tri ponovitve.
 
1.7.7  Izpostavitev  
Iz inokulacijske kulture se prenesejo kolonije, ki obsegajo od 2 do 4 
vidne liste, in naklju čno določijo preskusnim posodam v asepti čnih 
pogojih. Vsaka preskusna posoda mora vsebovati skupno od 9 do 12 listov. Število listov in kolonij mora biti v vsaki preskusni posodi enako. Izkušnje, pridobljene s to metodo in v preskusih primerljivo ­
sti, kažejo, da tri ponovitve na postopek obdelave, pri čemer vsaka 
ponovitev na za četku vsebuje 9 do 12 listov, zadostujejo za odkritje 
razlike v rasti, ki znaša od 4 do 7 % zaviranja med obdelavami, izračunanega s hitrostjo rasti (od 10 do 15 % zaviranja, izra čunanega 
z izplenom) (10). 
Za inkubator je treba pripraviti naklju čno porazdelitev položajev 
testnih posod, da se čimbolj zmanjša vpliv prostorskih razlik 
v temperaturi in jakosti svetlobe. Pri beleženju opažanj se tudi 
zahteva blokovska zasnova oz. naklju čna razporeditev posod (ali 
pogostejše premeš čanje).
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1358
 
Če predhodni preskus obstojnosti kaže, da koncentracije preskusne 
snovi ni možno ohranjati (tj. izmerjena koncentracija pade pod 80 % 
začetno izmerjene koncentracije) v obdobju trajanja poskusa (7 dni), je 
priporočljiv polstati čni režim preskusa. V tem primeru je treba kolonije 
izpostaviti sveže pripravljenim preskusnim in kontrolnim raztopinam 
najmanj dvakrat med poskusom (npr. 3. in 5. dan). Pogostost izposta ­
vitve svežemu mediju mora biti odvisna od obstojnosti preskusne snovi: ve čja pogostnost bo potrebna za ohranjanje približno 
konstantnih koncentracij zelo neobstojnih ali hlapnih snovi. 
V določenih okoliš činah bo morda treba uporabiti preto čni 
postopek (11)(13). 
Izpostavitev s foliarnim nanosom (pršenjem) ni obravnavana v tej 
preskusni metodi. Glejte (14).
 
1.7.8  Pogoji inkubacije  
Uporabiti je treba neprekinjeno toplo ali hladno belo fluorescentno 
osvetlitev, da je jakost svetlobe v obmo čju od 85 do 135 μE·m  –2 ·s –1 , 
če se meri v fotosintetsko aktivnem sevanju (400–700 nm) v to čkah, 
ki so enako oddaljene od vira svetlobe kot listi vodne le če (enako­
vredno 6 500–10 000 lux). Razlike v izbrani jakosti svetlobe preko 
preskusnega obmo čja ne smejo prese či ± 15 %. Metoda zaznavanja 
in merjenja svetlobe, zlasti vrsta tipala, vpliva na izmerjeno vrednost. Sferična tipala (ki se odzivajo na svetlobo iz vseh kotov nad in pod 
ravnino merjenja) in „kosinusnih“ tipal (ki se odzivajo na svetlobo iz 
vseh kotov nad ravnino merjenja) so bolj primerna od enosmernih 
tipal in dajejo višje od čitke v primeru ve č točkovnih virov svetlobe, 
ki so takšne vrste, kot je opisano tu. 
Temperatura preskusnih posod mora biti 24 ± 2 °C. Vrednost pH 
kontrolnega medija se med preskusom ne bi smela pove čati za več 
kot 1,5 enote. Vendar odstopanje za ve č kot 1,5 enote ne razveljavi 
preskusa, če se dokaže, da preskus ustreza kriterijem veljavnosti. 
Posebno pozornost je treba posvetiti lezenju vrednosti pH v posebnih primerih, ko se preskušajo neobstojne snovi ali kovine. Glejte (11) za dodatne smernice.
 
1.7.9  Trajanje  
Preskus se prekine 7 dni po prenosu rastlin v preskusne posode.  
1.7.10  Meritve in analitske dolo čitve 
Ob začetku preskusa se prešteje in zabeleži število listov 
v preskusnih posodah, pri čemer je treba zajeti štrle če, razločno 
vidne liste. Število listov, ki izgledajo normalni ali nenormalni, je treba dolo čiti na začetku preskusa, najmanj vsake 3 dni v obdobju 
izpostavljanja (tj. najmanj dvakrat v 7-dnevnem obdobju) in ob 
prekinitvi preskusa. Zabeležiti je treba spremembe v razvoju rastline, 
npr. v velikosti in izgledu listov, indikacije nekroze, kloroze ali grbavosti, razpadanje kolonij ali izgubo zmožnosti plavanja na gladini ter spremembe dolžine korenin in izgleda. Zabeležiti je 
treba tudi bistvene zna čilnosti preskusnega medija (npr. prisotnost 
neraztopljenih snovi, rast alge v preskusni posodi).
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1359
 
Poleg dolo čitev števila listov med preskusom je treba dolo čiti tudi 
učinke preskusne snovi na eno (ali ve č) od naslednjih merjenih 
spremenljivk: 
(i) skupna površina listov; 
(ii) suha masa; 
(iii) sveža masa. Skupna površina listov ima prednost v tem, da jo je mogo če določiti 
za vsako preskusno in kontrolno posodo na za četku preskusa, med 
preskusom in na koncu preskusa. Suho ali svežo maso je treba 
določiti na začetku preskusa iz vzorca inokulacijske kulture, ki je 
reprezentativen za material, s katerim se preskus za čne, in na koncu 
preskusa z rastlinskim materialom iz vsake preskusne in kontrolne 
posode. Če se površina listov ne izmeri, ima suha masa prednost 
pred svežo maso. 
Skupna površina listov, suha masa in sveža masa se lahko izra čunajo 
po naslednjih postopkih: 
(i) Skupna površina listov: Skupna površina listov vseh kolonij se 
lahko dolo či s slikovno analizo. Obris preskusne posode in 
rastlin se lahko zajame z videokamero (npr. z osvetlitvijo posode od spodaj) in nastala slika nato digitalizira. S kalibracijo s ploskimi oblikami znane površine se lahko 
določi skupna površina listov v preskusni posodi. Paziti je treba, 
da se izklju čijo motnje, ki jih povzro ča rob preskusne posode. 
Druga možnost, ki je delovno zahtevnejša, pa je fotografiranje preskusnih posod in rastlin, izrezovanje nastalih obrisov kolonij 
in določevanje njihove površine z analizatorjem površine 
listov ali milimetrskim papirjem. Druge tehnike (npr. razmerje teže papirja s površino obrisa kolonij in površine merske enote) so lahko tudi primerne. 
(ii) Suha masa: Zbere se vse kolonije iz vsake preskusne posode in jih 
spere z destilirano ali deionizirano vodo. Kolonije se popivna, da se odstrani odve čno vodo. Nato se posušijo pri 60 °C do 
konstantne mase. Vklju čiti je treba vse fragmente korenin. Suho 
maso je treba izraziti z natan čnostjo najmanj 0,1 mg. 
(iii) Sveža masa: Vse kolonije se prenese v zatehtane polistirenske 
epruvete (ali iz druge inertne snovi) z majhnimi (1 mm) odprti ­
nami v zaobljenem dnu. Epruvete se nato centrifugirajo pri 3 000 o/min za 10 minut pri sobni temperaturi. Epruvete, ki 
vsebujejo sedaj posušene kolonije, se ponovno stehtajo. Sveža 
masa se izra čuna z odštevanjem mase prazne epruvete.
 
1.7.10.1  Pogostost meritev in analitskih dolo čitev 
Če se uporabi stati čno zasnovo preskusa, je treba pH vsake obdelave 
izmeriti na za četku in na koncu preskusa. Če se uporabi polstati čno 
zasnovo preskusa, je treba pH izmeriti za vsako šaržo „sveže“ 
preskusne raztopine pred obnovitvijo in za ustrezno „iztrošeno“ 
raztopino.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1360
 
Jakost svetlobe je treba meriti v rastni komori, inkubatorju ali 
prostoru v to čkah, ki so enako oddaljene od vira svetlobe kot listi 
vodne leče. Jakost svetlobe je treba izmeriti najmanj enkrat med 
preskusom. Najmanj dnevno je treba beležiti temperaturo medija v nadomestni posodi, ki je v enakih pogojih v rastni komoro, inku ­
batorju ali sobi. 
Med preskusom se v primernih časovnih presledkih dolo čajo koncen ­
tracije preskusne snovi. V stati čnih preskusih je treba dolo čiti 
koncentracije najmanj na za četku in na koncu preskusa. 
V polstati čnih preskusih se ne pri čakuje da bo koncentracija 
preskusne snovi ostala v obmo čju ± 20 % nazivne koncentracije, 
zato je treba analizirati vse sveže pripravljene preskusne raztopine in enake raztopine pri vsaki obnovitvi (glejte tretji odstavek 
v oddelku 1.7.7). Pri tistih preskusih, v katerih izmerjena za četna 
koncentracije preskusne snovi ni v ± 20 % nazivne koncentracije, vendar obstajajo zadostni dokazi, da so za četne koncentracije pono ­
vljive in obstojne (tj. v obmo čju 80–120 % za četne koncentracije), se 
lahko kemijske dolo čitve opravijo le na najvišji in najnižji koncen ­
traciji. V vseh primerih je treba dolo čitev koncentracije preskusne 
snovi pred obnovitvijo opraviti le za eno ponovitev vsake preskusne koncentracije (ali združene vsebine posod posameznih ponovitev). 
Če se uporabi preto čni preskus, je treba izvajati podoben režim 
vzorčenja, kakor je opisan za polstati čne preskuse, vklju čno za 
analizo na za četku, na sredini in na koncu preskusa, če je smiselno. 
Vendar meritve „iztrošenih“ raztopin niso primerne v tem primeru. V preskusu te vrste je treba pretok red čila in preskusne snovi ali 
založne raztopine preskusne snovi preverjati dnevno. 
Če so na voljo dokazi, da so se koncentracije preskusne snovi zado ­
voljivo vzdrževale v obmo čju ± 20 % nazivne ali izmerjene za četne 
koncentracije ves čas preskusa, lahko analiza rezultatov temelji na 
nazivnih ali izmerjenih za četnih vrednostih. Če je odklon od nazivne 
ali izmerjene za četne koncentracije ve č kot ± 20 %, mora analiza 
rezultatov temeljiti na geometrijskem povpre čju koncentracije med 
izpostavljanjem ali modelih, ki opisujejo zmanjševanje koncentracije 
preskusne snovi (11).
 
1.7.11  Mejni preskus  
V določenih okoliš činah, npr. ko predhodni preskus kaže, da 
preskusna snov nima strupenih u činkov pri koncentracijah do 
100 mg·l  –1 ali do meje topnosti v preskusnem mediju (katera koli 
vrednost je nižja), je treba opraviti mejni preskus, ki vklju čuje 
primerjavo odzivov kontrolne skupine in obdelane skupine 
(100 mg·l  –1 ali koncentracija, ki je enaka meji topnosti). Zelo se 
priporoča, da se ta poskus podpre z analizo koncentracije izposta ­
vljanja. Vsi predhodni pogoji preskusa in kriteriji veljavnosti veljajo za mejni preskus, le število ponovitev v obdelani skupini je treba 
podvojiti. Rast v kontrolni in obdelani skupini se lahko analizira 
s statističnim preskusom za primerjavo sredin, npr. Studentov t-test.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1361
 
2. PODATKI IN PORO ČANJE  
2.1 PODVOJITVENI ČAS 
Podvojitveni čas (T  d ) števila listov in izpolnjevanje tega kriterija 
veljavnosti raziskave (oddelek 1.6) se dolo či po naslednji ena čbi 
skupaj s podatki iz kontrolnih posod: 
T d = ln 2/μ 
kjer je μ povprečna specifi čna hitrost, dolo čena, kakor je opisano 
v prvem in drugem odstavku oddelka 2.2.1.  
2.2 SPREMENLJIVKE ODZIVA 
Namen tega preskusa je dolo čiti učinke preskusne snovi na vegeta ­
tivno rast vrst rodu  Lemna . Ta preskusna metoda opisuje dve spre ­
menljivki odziva, saj imajo države članice razli čne prednosti in 
zakonske zahteve. Rezultati preskusa bodo sprejemljivi v vseh 
državah članicah, če se učinki ovrednotijo z obema spremenljivkama 
odziva, (a) in (b), ki sta opisani spodaj. 
(a) Povpre čna specifi čna hitrost rasti: ta spremenljivka odziva se 
izračuna na osnovi spremembe logaritmov števila listov in na 
osnovi spremembe logaritmov drugega merjenega parametra 
(skupne površine listov, suhe mase ali sveže mase) skozi čas 
(izražen v dnevih) v kontrolni in vsaki obdelani skupini. V časih 
se to imenuje relativna hitrost rasti (15). 
(b) Izplen: ta spremenljivka odziva se izra čuna na osnovi spre ­
membe števila listov in na osnovi spremembe drugega merjenega parametra (skupne površine listov, suhe mase ali sveže mase) v kontrolni in vsaki obdelani skupini. 
Opozoriti je treba, da vrednosti strupenosti, ki se izra čunajo iz teh 
dveh spremenljivk odziva niso primerljive. To razliko je treba 
upoštevati pri uporabi rezultatov preskusa. Če se upoštevajo pogoji 
preskusa iz te preskusne metode, bodo vrednosti EC
 x , ki temeljijo na 
povprečni specifi čni hitrosti rasti (E  r C x ), ponavadi višje od rezulta ­
tov, ki temeljijo na izplenu (E  y C x ), zaradi matemati čne osnove teh 
dveh pristopov. To se ne sme razlagati kot razlika v ob čutljivosti 
obeh spremenljivk odziva. Razlika enostavno izvira iz razli čne mate­
matične narave vrednosti. Pojem povpre čne specifi čne hitrosti rasti 
temelji na splošnem vzorcu eksponentne rasti vodne le če 
v nelimitiranih kulturah, ko se strupenost ocenjuje na osnovi u činkov 
na hitrost rasti brez odvisnosti od absolutne ravni specifi čne hitrosti 
rasti v kontrolnem vzorcu, naklona krivulje odziva na koncentracijo ali od trajanja preskusa. Nasprotno pa so rezultati, ki temeljijo na 
odzivni spremenljivki izplen odvisni od vseh teh drugih spremen ­
ljivk. Vrednost E
 y C x je odvisna od specifi čne hitrosti rasti 
v posameznem preskusu uporabljene vrste vodne le če in od najve čje 
specifične hitrosti rasti, ki se lahko med vrstami razlikuje ali celo 
med kloni. Ta spremenljivka odziva se ne sme uporabiti za primer ­
janje občutljivosti za strupene snovi med vrstami vodne le če ali celo 
med kloni. Iz znanstvenega vidika ima uporaba povpre čne specifi čne 
hitrosti rasti prednost pri ocenjevanju strupenosti. Ocene strupenosti 
na osnovi izplena pa so vklju čene v to preskusno metodo, da se 
izpolnijo trenutne zakonske zahteve nekaterih držav.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1362
 
Ocene strupenosti morajo temeljiti na številu listov in še eni dodatni 
merjeni spremenljivki (skupna površina listov, suha teža ali sveža 
teža), saj lahko nekatere snovi bolj vplivajo na druge merjene spre ­
menljivke kot na število listov. V primeru izra čunavanja le števila 
listov te razlike ne bi zaznali. 
Pri vsaki meritvi se število listov in vse druge zabeležene merjene 
spremenljivke, tj. skupna površina listov, suha teža ali sveža, pred ­
stavi v tabeli skupaj s koncentracijami preskusne snovi. Naknadna analiza podatkov, npr. za oceno LOEC, NOEC ali EC
 x , mora teme ­
ljiti na vrednostih posameznih ponovitev in ne na izra čunanih 
povprečnih vrednostih vsake obdelane skupine.  
2.2.1  Povpre čna specifi čna hitrost rasti  
Povprečna specifi čna hitrost rasti se za dolo čeno obdobje za vsako 
ponovitev v kontrolni in vsaki obdelani skupini izra čuna kot logari ­
temsko pove čanje spremenljivk rasti – števila listov in še ene druge 
merjene spremenljivke (skupna površina listov, suha masa ali sveža 
masa) – po spodnji ena čbi: 
μ i–j ¼ ln ðN j Þ – ln ðN i Þ 
t 
pri čemer je: 
— μ i–j : povpre čna specifi čna hitrost rasti od časa i do časa j 
— N  i : merjena spremenljivka v preskusni posodi ali kontrolni 
posodi v času i 
— N  j : merjena spremenljivka v preskusni posodi ali kontrolni 
posodi v času j 
— t: časovno obdobje od i do j. 
Za vsako obdelano skupino in kontrolno skupino se izra čuna 
povprečna vrednost hitrosti rasti in oceni varianca. 
Povprečna specifi čna hitrost rasti se izra čuna za celotno preskusno 
obdobje ( čas „i“ v zgornji ena čbi pomeni za četek preskusa, čas „j“ 
pa konec preskusa). Za vsako preskusno koncentracijo in kontrolno 
skupino se izra čuna povpre čna vrednost povpre čne specifi čne hitrosti 
rasti in oceni varianca. Ovrednoti se tudi prese čna hitrost rasti, da se 
ocenijo u činki preskusne snovi, ki se pojavljajo med obdobjem izpo ­
stavljanja (npr. pregledovanje logaritemsko pretvorjenih rastnih 
krivulj). Znatne razlike med prese čno hitrostjo rasti in povpre čno 
hitrostjo rasti kažejo odstopanje od konstantne eksponentne rasti. Tedaj je utemeljeno natan čno preverjanje rastnih krivulj. Konzerva ­
tivni pristop v tem primeru je primerjanje specifi čnih rastnih krivulj 
obdelanih kultur v času najve čjega zaviranja s specifi čnimi rastnimi 
krivuljami kontrolnih kultur v istem času.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1363
 
Nato se lahko za vsako koncentracijo preskusne snovi (obdelana 
skupina) izra čuna odstotek zaviranja hitrosti rasti (I  r ) po naslednji 
enačbi: 
%I r ¼ ðμ C – μ T Þ 
μ C Ü 100 
pri čemer je: 
— % I  r : odstotek zaviranja povpre čne specifi čne hitrosti rasti 
— μ C : povpre čna vrednost μ v kontrolnem vzorcu 
— μ T : povpre čna vrednost μ v obdelanem vzorcu.  
2.2.2  Izplen  
Učinki na izplen se dolo čijo na osnovi dveh merjenih spremenljivk, 
števila listov in še ene druge merjene spremenljivke (skupna povr ­ 
šina listov, suha teža ali sveža teža), ki jo je mogo če določiti v vsaki 
preskusni posodi na za četku in na koncu preskusa. V primeru suhe 
mase ali sveže mase se dolo či začetna biomasa na osnovi vzorca 
listov, odvzetih iz iste šarže, kakor se uporabi za inokulacijo preskusnih posod (glejte drugi odstavek v oddelku 1.7.3). Za vsako preskusno koncentracijo in kontrolno skupino se izra čuna 
povprečna vrednost izplena in oceni varianca. Za vsako obdelano 
skupino se lahko izra čuna odstotek zaviranja v izplenu (% I
 y ) po 
naslednji ena čbi: 
%I y ¼ ðb C –b T Þ 
b C Ü 100 
pri čemer je: 
— % I  y : odstotek zmanjšanja izplena 
— b  C : kon čna biomasa minus za četna biomasa v kontrolni 
skupini 
— b  T : kon čna biomasa minus za četna biomasa v obdelani 
skupini.  
2.2.3  Izdelava krivulj odziva na koncentracijo  
Izrisati je treba krivulje odziva na koncentracijo, ki posredujejo 
povprečno odstotno zaviranje spremenljivke odziva (I  r , ki se izra ­ 
čuna, kakor je prikazano v zadnjem odstavku oddelka 2.2.1, ali I  y , 
ki se izra čuna, kakor je prikazano v zadnjem odstavku oddelka 
2.2.2) in logaritemsko pretvorjeno koncentracijo preskusne snovi.  
2.2.4  Ocena EC  x 
Ocene vrednosti EC  x (npr. EC  50 ) morajo temeljiti na povpre čni 
specifični hitrosti rasti (E  r C x ) in izkoristku (E  y C x ). Vsaka od teh 
vrednosti pa temelji na številu listov in še eni dodatni merjeni spre ­
menljivki (skupna površina listov, suha masa ali sveža masa). 
Postopek je takšen, ker obstajajo preskusne snovi, ki razli čno vpli­
vajo na število listov in druge merjene spremenljivke. Želeni para ­
metri strupenosti so torej štiri vrednosti EC  x za vsako izra čunano 
raven zaviranja x: E  r C x (število listov), E  r C x (skupna površina listov, 
suha masa ali sveža masa), E  y C x (število listov) in E  y C x (skupna 
površina listov, suha masa ali sveža masa).  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1364
 
2.3 STATISTI ČNI POSTOPKI 
Cilj je koli činsko ovrednotiti odziv na koncentracijo z regresijsko 
analizo. Možno je uporabiti uteženo linearno regresijo po opravljeni linearizacijski transformaciji podatkov odziva – npr. v probit, logit 
ali Weibullove enote (16), vendar imajo prednost nelinearni regre ­
sijski postopki, saj bolje obravnavajo neizogibne nepreavilnosti v podatkih ter odklone od enakomernih porazdelitev. Takšne nepra ­
vilnosti se lahko ob približevanju ni čli ali popolni inhibiciji 
s transformacijo pove čajo, kar moti analizo (16). Opozoriti je treba, 
da so standardne metode analize s probit, logit ali Weibullovo trans ­
formacijo namenjene uporabi na kvantnih podatkih (npr. smrtnosti ali 
preživetju), zato jih je treba prilagoditi za uporabo na podatkih 
o hitrosti rasti ali izplenu. Specifi čni postopki za dolo čevanje vred ­
nosti EC
 x iz kontinuiranih podatkov so na voljo v (17), (18) in (19). 
Za vsako analizirano spremenljivko odziva se izra čuna točkasta 
ocena vrednosti EC  x , pri čemer se uporabi zveza med odzivom in 
koncentracijo. Če je možno, se za vsako oceno dolo či 95-odstotni 
interval zaupanja. Grafi čno ali statisti čno je treba dolo čiti ustreznost 
prileganja podatkov odzivan na regresijski model. Regresijska 
analiza se mora opraviti na odzivih posameznih ponovitev in ne na povprečnih vrednostih obdelanih skupin. 
Če dostopni regresijski modeli/metode niso primerni za podatke, se 
lahko ocene EC
 50 in intervali zaupanja dolo čijo tudi z linearno inter ­
polacijo s postopkom bootstrapping (20). 
Za oceno LOEC in posledi čno NOEC je nujno primerjati povpre čne 
vrednosti obdelanih skupin s tehnikami analize variance (ANOVA). 
Povprečna vrednost za vsako koncentracijo se primerja s povpre čno 
vrednostjo kontrole z ustrezno metodo ve čkratne primerjave ali 
preskusa trenda. Uporabna sta lahko preskus po Dunnettu ali preskus Williamsu (21)(22)(23)(24). Po potrebi se ugotovi, ali velja domneva 
homogenosti variance v ANOVA. To vrednotenje se lahko opravi 
grafično ali s formalnim preskusom (25). Primerna preskusa sta 
preskus po Levenu ali preskus po Bartlettu. Če domneva homoge ­
nosti variance ni izpolnjena, lahko to odpravimo z logaritemsko 
transformacijo podatkov. Če je heterogenost variance skrajna in je 
ni mogoče odpraviti s transformacijo, je treba prou čiti možnosti 
analize z metodami, kot so ve čstopenjski preskusi Jonkheere. Ve č 
smernic o dolo čevanju vrednosti NOEC je na voljo v (19). 
Nedavni razvoj znanosti je privedel do priporo čila o opuš čanju 
pojma NOEC in njegovi zamenjavi z regresijsko dolo čenimi točkov­
nimi ocenami EC
 x . Za ta preskus z vodno le čo ustrezna vrednost 
x še ni dolo čena. Vendar izgleda, da je primeren razpon od 10 do 
20 % (odvisno od izbrane spremenljivke odziva), zato je treba v poročilih prednostno navajati vrednosti EC
 10 in EC  20 . 
3. PORO ČANJE  
3.1 PORO ČILO O PRESKUSU 
Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje podatke: 
Preskušana snov: — agregatno stanje in fizikalno-kemijske lastnosti, vklju čno z mejo 
topnosti v vodi,
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1365
 
— kemijski identifikacijski podatki (npr. CAS številka), vklju čno 
s čistoto. 
Preskusna vrsta: — znanstveno ime, klon ( če je znan) in vir. 
Preskusni pogoji: — uporabljeni preskusni postopek (stati čni, polstati čni ali preto čni), 
— datum za četka preskusa in trajanje preskusa, 
— preskusni medij, — opis zasnove poskusa: preskusne posode in pokrovi, volumni 
raztopin, število kolonij in listov na preskusno posodo na za četku 
preskusa, 
— preskusne koncentracije (nazivne in izmerjene, kakor je 
smiselno) in število ponovitev na posamezno koncentracijo, 
— metode priprave založnih in preskusnih raztopin, vklju čno 
z uporabo kakršnihkoli topil ali disperzivnih sredstev, 
— temperatura med preskusom, — vir svetlobe, jakost in homogenost svetlobe, — vrednosti pH preskusnega in kontrolnega medija, — koncentracije preskusne snovi in analizna metoda z ustreznimi 
podatki za vrednotenje kakovosti (validacijske raziskave, stan ­
dardni odkloni in intervali zaupanja analiz), 
— metode za dolo čevanje števila listov in drugih merjenih spremen ­
ljivk, npr. suha masa, sveža masa ali površina listov, 
— vsa odstopanja od te preskusne metode. Rezultati: — neobdelani podatki: število listov in druge merjene spremenljivke 
v vsaki preskusni in kontrolni posodi za vsa opazovanja in analize, 
— povpre čne vrednosti in standardni odkloni za vsako merjeno 
spremenljivko, 
— rastne krivulje za vsako koncentracijo (priporo čljivo 
z logaritemsko pretvorjeno merjeno spremenljivko, glejte drugi 
odstavek oddelka 2.2.1), 
— podvojitveni čas/hitrost rasti v kontroli na podlagi števila listov, 
— izračunane spremenljivke odziva za vsako ponovitev obdelave 
s povprečnimi vrednostmi in koeficientom variacije za ponovitve, 
— grafična predstavitev razmerja med koncentracijo in u činkom, 
— ocene strupenih kon čnih točk spremenljivk odziva, npr. EC
 50 , 
EC 10 , EC  20 in povezane intervale zaupanja. LOEC in/ali 
NOEC, če sta izra čunani, in statisti čne metode za njuno dolo či­
tev, ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1366
 
— če se uporablja ANOVA, obseg u činka, ki se lahko zazna (npr. 
najmanjša statisti čno značilna razlika), 
— kakršni koli stimulacijski u činki na rast v kateri koli obdelani 
skupini, 
— kakršni koli vidni znaki fitotoksi čnosti ter opažanja preskusne 
raztopine, 
— razprava o rezultatih, ki vklju čuje vse vplive na izid preskusa, ki 
so izvirali iz odstopanj od te preskusne metode.  
4. VIRI  
(1) OECD TG 221 (2006).  Lemna  Sp. Growth Inhibition Test. 
(2) Uporaba raziskave o vodni le či za obarvane snovi je razložena 
v odstavku 13.5.3 Priro čnika o odlo čitvah EU, julij 2006, na 
naslovu http://ecb.jrc.ec.europa.eu/new-chemicals 
(3) Guidance on information requirements and chemical safety 
assessment – Poglavje R.7b: Endpoint specific guidance; Preglednica 7.8.3 Summary of difficult substance testing issues, 
na naslovu 
http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/infor ­
mation_requirements_en.htm?time=1234958685#A 
(4) ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting 
Static Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415–91 (Reap ­
proved 1998). pp. 733–742. In, Annual Book of ASTM Stan ­
dards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; 
Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA. 
(5) USEPA – United States Environmental Protection Agency. 
(1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  
Lemna  spp., „Public draft“. EPA 712-C-96–156. 8pp. 
(6) AFNOR – Association Française de Normalisation. (1996). XP 
T 90–337: Détermination de l’inhibition de la croissance de  
Lemna minor . 10pp. 
(7) SSI – Swedish Standards Institute. (1995). Water quality – 
Determination of growth inhibition (7-d)  Lemna minor , duck­
weed. SS 02 82 13. 15pp. (v švedš čini). 
(8) Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for 
Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte,  Lemna minor . EPS 1/RM/37–120 pp. 
(9) Environment Canada. (1993). Proposed Guidelines for Registra ­
tion of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and 
Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series 
No. 145. 
(10) Sims I., Whitehouse P., in Lacey R. (1999). The OECD  Lemna  
Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc 
plc – Environment Agency. 
(11) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity 
Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environ ­
mental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.23. 
(12) ISO DIS 20079. Water Quality – Determination of the Toxic 
Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed 
(Lemna minor ) – Duckweed Growth Inhibition Test.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1367
 
(13) Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with 
duckweed ( Lemna minor  L.). Environmental Research Labora ­
tory – Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA- 600/3–77 108. September 1977. 
(14) Lockhart W. L., Billeck B. N. in Baron C. L. (1989). Bioassays 
with a floating plant ( Lemna minor ) for effects of sprayed and 
dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353–359. 
(15) Huebert, D.B. in Shay J.M. (1993). Considerations in the asses ­
sment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 481–483. 
(16) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 
19, 713–718. 
(17) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. in Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157–167. 
(18) Bruce R.D. in Versteeg D.J. (1992). A statistical procedure for 
modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485–1494. 
(19) OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data. 
(20) Norberg-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Asses ­
sment Center Technical Report 05–88. USEPA, Duluth, MN. 
(21) Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, 1096–1121. 
(22) Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, 482–491. 
(23) Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics, 27: 103–117. 
(24) Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28: 510–531. 
(25) Brain P. in Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93–96.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1368
 
Dodatek 1  
Opis  Lemna  spp.  
Vodne rastline  Lemna  spp., ki jih navadno imenujemo vodna le ča, spadajo 
v družino  Lemnaceae , ki ima v štirih rodovih številne vrste, ki rastejo po 
vsem svetu. Njihov raznolik izgled in raznolika taksonomija sta obsežno opisana 
(1)(2). Vrsti  Lemna gibba  in L. minor  sta predstavnici iz zmernega podnebja. 
Pogosto se uporabljata za preskuse strupenosti. Obe vrsti imata plavajo če ali 
potopljeno diskoidno steblo (list) in zelo tanko korenino, ki izhaja iz središ ča 
spodnje površine vsakega lista. Predstavnice rodu  Lemna  spp. redko cvetijo. 
Rastline se razmnožujejo vegetativno z nastajanjem novih listov (3). Mlajše 
rastline so v primerjavi s starejšimi rastlinami svetlejše, imajo krajše korenine in dva do tri liste razli čnih velikosti. Vodna le ča je zaradi majhnosti, preproste 
strukture, nespolnega razmnoževanja in kratkega generacijskega časa zelo 
primerna za laboratorijsko preskušanje (4)(5). 
Zaradi verjetne medvrstne variacije v ob čutljivosti so veljavne le primerjave 
znotraj iste vrste.
 
Primeri vrst vodne le če, ki so bile uporabljene za preskušanje: referenca vrst  
Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga  Ceramium 
strictum  and the duckweed  Lemna aequinoctialis  in aquatic ecotoxicological 
bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, 
Stockholm University.  
Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of  Lemna major  as 
a function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935–941.  
Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). 
OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., „Public draft“. 
EPA 712-C-96–156. 8pp. 
Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90–337: Déter ­
mination de l’inhibition de la croissance de  Lemna minor . 10pp. 
Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Water quality – Determination of growth 
inhibition (7-d)  Lemna minor , duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (v švedš čini). 
Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static 
Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415–91 (Reapproved 1998). pp. 733–742. 
United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). OPPTS 
850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., „Public draft“. EPA 
712-C-96–156. 8pp.  
Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981).  Lemna  (duckweed) as an 
indicator of water pollution. I. The sensitivity of  Lemna paucicostata  to heavy 
metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959–1969.  
Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of 
metals by duckweed ( Lemna perpusilla ). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87–96.  
Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the asses ­
sment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481–483.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1369
 
Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity 
and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102–2111.  
Viri vrst vodne le če 
University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria 
Department of Botany, University of Toronto 
Toronto, Ontario, Canada, M5S 3 B2 
Tel. +1 416 9783641 Faks +1 416 9785878 e-naslov: jacreman@botany.utoronto.ca 
http://www.botany.utoronto.ca/utcc 
North Carolina State University 
Forestry Dept Duckweed Culture Collection 
Campus Box 8002 
Raleigh, NC 27695–8002 United States Tel. 001 (919) 515–7572 
astomp@unity.ncsu.edu 
Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University 
SE-106 91 Stockholm Sweden 
Tel. +46 86747240 
Faks +46 86747636 
Federal Environmental Agency (UBA) 
FG III 3.4 
Schichauweg 58 
12307 Berlin Germany e-naslov: lemna@uba.de 
http://www.umweltbundesamt.de/contact.htm
 
Literatura  
(1) Hillman, W.S. (1961). The  Lemnaceae  or duckweeds: A review of the 
descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221–287. 
(2) Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed 
(Lemnaceae ). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, 
Switzerland. 
(3) Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utili ­
zation of duckweeds ( Lemnaceae  family). ISBN 82–991150–0–0. The Agri ­
cultural Research Council of Norway, University of Oslo. 
(4) Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common 
duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1–14. 
(5) Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environ ­
mental Research, 52:7–22.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1370
 
Dodatek 2  
Vzdrževanje založne kulture  
Založne kulture se lahko vzdržujejo pri nizkih temperaturi (4–10 °C) dlje časa 
brez potrebe po obnovitvi. Gojiš če za vodno le čo je lahko enako, kakor se 
uporablja za preskušanje, vendar se lahko za založne kulture uporabijo tudi 
drugi mediji, bogati s hranili. 
Obdobno se z asepti čnimi tehnikami dolo čeno število mladih, svetlozelenih 
rastlin prenese v novo gojitveno posodo, ki vsebuje sveži medij. V ohlajenih pogojih, kakor so priporo čeni tukaj, se lahko presajanje opravlja v časovnih 
presledkih, dolgih do tri mesece. 
Uporabljati je treba kemijsko čiste (kislinsko oprane) in sterilne steklene gojit ­
vene posode ter asepti čne tehnike. V primeru kontaminacije založne kulture, npr. 
z algami ali glivami, je treba uporabiti postopke, s katerimi odpravimo kontami ­
nirajoče organizme. V primeru alg in ve čine drugih kontaminirajo čih organizmov 
lahko uporabimo površinsko sterilizacijo. Odvzame se vzorec onesnaženega rast ­
linskega materiala in odrežejo se korenine. Material se nato mo čno stresa v čisti 
vodi, čemur sledi potapljanje v 0,5-odstotno (v/v) raztopino natrijevega hipoklo ­
rita za 30 sekund do 5 minut. Rastlinski material nato speremo s sterilno vodo in 
prenesemo v ve č šaržah v gojitvene posode, ki vsebujejo sveže gojiš če. Veliko 
listov bo zaradi obdelave odmrlo, zlasti če se uporabijo daljši časi izpostavitve, 
vendar nekaj preživelih bo ponavadi nekontaminiranih. S temi se lahko inokuli ­
rajo nove kulture.
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1371
 
Dodatek 3  
Mediji  
Za L. minor  in L. gibba  so priporo čena različna gojišča. Za  L. minor  je priporo č­
ljiva modifikacija medija iz švedskega standarda (SIS), za  L. gibba  pa je pripo ­
ročljiva modifikacija medija 20X AAP. Sestavi obeh medijev sta navedeni 
spodaj. Pri pripravi teh medijev je treba uporabiti reagente analitske čistote in 
deionizirano vodo.  
Gojišče za vodno le čo iz švedskega standarda (SIS)  
— Založne raztopine I–V steriliziramo z avtoklaviranjem (120 °C, 15 minut) ali 
membransko filtracijo (velikost por približno 0,2 μm). 
— Založno raztopino VI (in neobvezno raztopino VII) steriliziramo le 
z membransko filtracijo; ti dve raztopini se ne smeta avtoklavirati. 
— Sterilne založne raztopine je treba shranjevati v hladnih in temnih pogojih. 
Založne raztopine I–V je treba zavre či po šestih mesecih, založna raztopina 
VI (in neobvezno raztopina VII) pa imajo rok uporabnosti en mesec.  
Št. založne 
raztopine Snov Koncentracija 
v založni raztopini 
(g· l  –1 ) Koncentracija 
v pripravljenem 
mediju (mg·l  –1 ) Pripravljen medij 
Element Koncentracija 
(mg·l  –1 ) 
I NaNO  3 
KH  2 PO4 8,50 
1,34 85 
13,4 Na; N 
K; P 32; 14 
6,0; 2,4 
II MgSO  4 · 7H  2 O 15 75 Mg; S 7,4; 9,8 
III CaCl  2 · 2H  2 O 7,2 36 Ca; Cl 9,8; 17,5 
IV Na 2 CO 3 4,0 20 C 2,3 
V H 3 BO 3 
MnCl  2 · 4H  2 O 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 
ZnSO  4 · 7H  2 O 
CuSO  4 · 5H  2 O 
Co(NO  3 ) 2 · 6H  2 O 1,0 
0,20 
0,010 
0,050 0,0050 0,010 1,00 
0,20 
0,010 
0,050 0,0050 0,010 B 
Mn 
Mo 
Zn Cu Co 0,17 
0,056 
0,0040 
0,011 0,0013 0,0020 
VI FeCl
 3 · 6H  2 O 
Na 2 -EDTA·2H  2 O 0,17 
0,28 0,84 
1,4 Fe 
— 0,17 
— 
VII MOPS (pufer) 490 490 — — 
— Za pripravo enega litra medija SIS se naslednje sestavine dodajo v 900 ml 
deionizirane vode: 
— 10 ml založne raztopine I, — 5 ml založne raztopine II, — 5 ml založne raztopine III, — 5 ml založne raztopine IV,
 ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1372
 
— 1 ml založne raztopine V, 
— 5 ml založne raztopine VI, — 1 ml založne raztopine VII (neobvezno),
 
Opomba:  Za preskušanje dolo čenih preskusnih snovi bo morda potrebna dodatna 
količina založne raztopine VII (MOPS pufer) (glejte zadnji odstavek 
v oddelku 1.4).  
— Vrednost pH se uravna na 6,5 ± 0,2 z 0,1 ali 1 molom HCl oziroma NaOH. 
Volumen se dopolni na en liter z deionizirano vodo.  
Gojišče 20X AAP  
Pripravijo se založne raztopine v sterilni destilirani ali deionizirani vodi. 
Sterilne založne raztopine je treba shranjevati v hladnih in temnih pogojih. V teh 
pogojih imajo založne raztopine rok uporabnosti najmanj 6–8 tednov. 
Za medij 20X-AAP se pripravi pet hranilnih založnih raztopin (A1, A2, A3, B in 
C) iz kemikalij reagentne čistote. Za pripravo gojiš ča se doda 20 ml vsake 
hranilne založne raztopine v približno 850 ml deionizrane vode. Vrednost pH se uravna na 7,5 ± 0,1 z bodisi 0,1 bodisi 1 mol HCl oziroma NaOH. Volumen 
se uravna na en liter z deionizirano vodo. Gojiš če se nato filtrira skozi 0,2- μm 
(približno) membranski filter v sterilno posodo. 
Gojišče, namenjeno za preskušanje, je treba pripraviti 1–2 dni pred uporabo, da 
se pH stabilizira. Pred uporabo je treba preveriti vrednost pH gojiš ča. Po potrebi 
se znova uravna z dodajanjem 0,1 ali 1 molom NaOH oziroma HCl, kakor je 
opisano zgoraj.
 
Št. Založne 
raztopine Snov Koncentracija 
v založni raztopini 
(g·l –1 ) (*) Koncentracija 
v pripravljenem 
mediju (mg·l  –1 ) (*) Pripravljen medij 
Element Koncentracija 
(mg·l  –1 ) (*) 
A1 NaNO  3 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 26 
12 4,4 510 
240 90 Na; N 
Mg Ca 190; 84 
58,08 24,04 
A2 MgSO
 4 ·7H  2 O 15 290 S 38,22 
A3 K 2 HPO  4 ·3H  2 O 1,4 30 K; P 9,4;3,7 
B H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 0,19 
0,42 
0,16 
0,30 3,3 mg·l
 –1 
1,4 mg·l  –1 
7,3 mg·l  –1 
0,012 mg·l  –1 3,7 
8,3 
3,2 
6,0 66 μg·l
 –1 
29 μg·l –1 
145 μg·l –1 
0,24 μg·l –1 B 
Mn 
Fe 
— Zn Co 
Mo 
Cu 0,65 
2,3 
0,66 
— 31 μg·l
 –1 
7,1 μg·l –1 
58 μg·l –1 
0,080 μg·l –1 
C NaHCO  3 15 300 Na; C 220; 43  
(*) Razen če ni druga čne opombe  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1373
 
Končna opomba:  Teoretično primerna kon čna koncentracija bikarbonata (pri kateri ni treba 
znatno uravnavati vrednosti pH) je 15 mg/l, ne 300 mg/l. Vendar zgodo ­
vinska uporaba medija 20X-AAP, vklju čno z uporabo v preskusu primer ­
ljivosti, temelji na 300 mg/l. (I. Sims, P. Whitehouse in R. Lacey. (1999) The OECD  Lemna  Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing 
of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc 
plc – Environment Agency.)
 
Medij po STEINBERGU (po ISO 20079)  
Koncentracije in založne raztopine:  
— Modificiran medij po Steinbergu se v ISO 20079 uporablja le za  Lemna 
minor  (saj je v tem standardu dovoljena le  Lemna minor ), vendar so preskusi 
pokazali, da se lahko dobri rezultati dosežejo tudi z  Lemna gibba . 
— Pri pripravi medija je treba uporabiti kemikalije reagentne ali analitske čistote 
in deionizirano vodo. 
— Gojišče se pripravi iz založnih raztopin ali 10-kratno koncentriranega medija, 
ki omogo ča najvišjo koncentracijo medija brez obarjanja.  
Tabela 1  
pH-stabiliziran medij po STEINBERGU (modificiran po Altenburgerju)  
Snov Gojiš če 
Makroelementi  mol. masa mg/l mmol/l  
KNO  3 101,12 350,00 3,46 
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 236,15 295,00 1,25 
KH  2 PO 4 136,09 90,00 0,66 
K 2 HPO  4 174,18 12,60 0,072 
MgSO  4 · 7H  2 O 246,37 100,00 0,41  
Mikroelementi  mol. masa μg/l μmol/l 
H 3 BO 3 61,83 120,00 1,94 
ZnSO  4 · 7H  2 O 287,43 180,00 0,63 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 241,92 44,00 0,18 
MnCl  2 · 4H  2 O 197,84 180,00 0,91 
FeCl  3 · 6H  2 O 270,21 760,00 2,81 
EDTA dinatrijev dihidrat 372,24 1 500,00 4,03  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1374
 
Tabela 2  
Založne raztopine (makroelementi)  
1. Makroelementi (50-kratno koncentrirani)  g/l  
Založna raztopina 1:  
KNO  3 17,50 
KH  2 PO 4 4,5 
K 2 HPO  4 0,63 
Založna raztopina 2:  
MgSO  4 · 7H  2 O 5,00  
Založna raztopina 3:  
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 14,75  
Tabela 3  
Založne raztopine (mikroelementi)  
2. Mikroelementi (1 000-kratno koncentrirani)  mg/l  
Založna raztopina 4:  
H 3 BO 3 120,0  
Založna raztopina 5:  
ZnSO  4 · 7H  2 O 180,0  
Založna raztopina 6:  
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 44,0  
Založna raztopina 7:  
MnCl  2 · 4H  2 O 180,0  
Založna raztopina 8:  
FeCl  3 · 6H  2 O 760,00 
EDTA dinatrijev dihidrat 1 500,00 
— Založni raztopini 2 in 3 je možno združiti (ob upoštevanju zahtevanih 
koncentracij). Ravno tako založne raztopine 4 do 7. 
— Za daljši rok uporabnosti se lahko založne raztopine obdelajo v avtoklavu pri 
121 °C za 20 min. Druga možnost pa je sterilna filtracija (0,2 μm). Za 
založno raztopino 8 je mo čno priporo čljiva sterilna filtracija (0,2 μm). 
Priprava kon čne koncentracije (modificiranega) medija po STEINBERGU  
— V približno 900 ml deionizrane vode se doda 20 ml založnih raztopin 1, 2 in 
3 (glejte tabelo 2), da se prepre či obarjanje. 
— Doda se 1,0 ml založnih raztopin 4, 5, 6 in 7 (glejte tabelo 3). 
— Vrednost pH mora biti 5,5 ± 0,2 (uravnava se z dodajanjem minimalnega 
volumna raztopine NaOH ali HCl).  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1375
 
— Z vodo se dopolni do 1 000 ml. 
— Če so založne raztopine sterilizirane in se uporabi ustrezna voda, dodatna 
sterilizacija ni potrebna. Če se sterilizira kon čni medij, je treba založno 
raztopino 8 dodati po avtoklaviranju (pri 121 °C za 20 min).  
Priprava 10-kratno koncentriranega (modificiranega) medija po STEIN ­
BERGU za za časno hranjenje  
— V približno 30 ml vode se doda 20 ml založnih raztopin 1, 2 in 3 (glejte 
tabelo 2), da se prepre či obarjanje. 
— Doda se 1,0 ml založnih raztopin 4, 5, 6 in 7 (glejte tabelo 3). Z vodo se 
dopolni do 100 ml. 
— Če so založne raztopine sterilizirane in se uporabi ustrezna voda, dodatna 
sterilizacija ni potrebna. Če se sterilizira kon čni medij, je treba založno 
raztopino 8 dodati po avtoklaviranju (pri 121 °C za 20 min). 
— Vrednost pH medija (kon čne koncentracije) mora biti 5,5 ± 0,2.  ▼M1 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1376
 
C.27  PRESKUS STRUPENOSTI S TRZA ČAMI V SISTEMU VODE IN 
USEDLINE Z UPORABO USEDLINE S PRIMEŠANO PRESKUSNO 
SNOVJO  
UVOD 
1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 218 
(2004). Zasnovana je za oceno u činkov daljše izpostavljenosti kemikalijam 
na ličinke sladkovodne trza če Chironomus  sp., ki živijo v usedlinah. Temelji 
na obstoje čih protokolih za preskušanje strupenosti za  Chironomus riparius  
in Chironomus tentans , ki so bili razviti v Evropi (1) (2) (3) in Severni 
Ameriki (4) (5) (6) (7) (8) ter krožno preskušeni (1) (6) (9). Uporabijo se 
lahko tudi druge dobro dokumentirane vrste trza če, npr.  Chironomus yoshi ­
matsui  (10) (11). 
2. Scenarij izpostavljenosti, uporabljen v tej preskusni metodi, je primešanje 
preskusne snovi v usedlino. Izbira ustreznega scenarija izpostavljenosti je 
odvisna od namena uporabe preskusa. Namen primešanja snovi v usedlino je simulirati nakopi čene ravni kemikalij, ki ostajajo v usedlini. Ta sistem 
izpostavljenosti vklju čuje primešanje snovi v usedlino v preskusnem sistemu 
vode in usedline. 
3. Snovi, ki jih je treba preskusiti v zvezi z organizmi, žive čimi v usedlinah, se 
običajno v tem delu zelo dolgo obdržijo. Organizmi, žive či v usedlinah, so 
lahko izpostavljeni na številne na čine. Relativni pomen vsakega na čina 
izpostavljenosti in čas, da ta prispeva k skupnim strupenim u činkom, sta 
odvisna od fizikalno-kemijskih lastnosti zadevne kemikalije. Pri snoveh, ki se močno adsorbirajo (npr. z log K
 ow > 5), ali snoveh, ki se kovalentno 
vežejo na usedlino, je lahko zaužitje kontaminirane hrane pomemben na čin 
izpostavljenosti. Da ne bi podcenili strupenosti visoko lipofilnih snovi, se lahko predvidi uporaba hrane, dodane usedlini pred uporabo preskusne snovi. Da bi se upoštevali vsi morebitni na čini izpostavljenosti, je ta 
preskusna metoda osredoto čena na dolgoro čno izpostavljenost. Preskus za  
C. riparius  in C. yoshimatsui  traja 20 do 28 dni, za  C. tentans  pa 28 do 65 
dni. Če so za dolo čen namen potrebni kratkoro čni podatki, na primer da se 
raziščejo učinki nestabilne kemikalije, se lahko dodatne ponovitve umaknejo 
po 10 dneh. 
4. Izmerjene kon čne točke so skupno število preobraženih odraslih osebkov in 
čas do preobrazbe. Če so potrebni dodatni kratkoro čni podatki, je priporo č­
ljivo, da se preživetje in rast li čink izmerita šele po 10-dnevnem obdobju, po 
potrebi z dodatnimi ponovitvami. 
5. Priporo ča se uporaba formulirane usedline. Ta ima pred naravnimi usedli ­
nami več prednosti: 
— variabilnost pri poskusih je manjša, saj formulirana usedlina pomeni 
ponovljivo „standardizirano matrico“, poleg tega ni ve č treba iskati 
nekontaminiranih in čistih virov usedlin, 
— preskusi se lahko za čnejo kadar koli, ne da bi se bilo treba ukvarjati s 
sezonsko variabilnostjo v preskusni usedlini, poleg tega usedline ni treba predhodno obdelati, da bi se odstranila domorodna favna; s formulirano 
usedlino se tudi znižajo stroški, povezani z zbiranjem zadostne koli čine 
usedline na terenu za rutinsko preskušanje, 
— uporaba formulirane usedline omogo ča primerjave strupenosti in 
ustrezno razvrstitev snovi. 
6. Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1377
 
NAČELO PRESKUSA 
7. Ličinke trza če prvega stadija so izpostavljene razponu koncentracije 
preskusne kemikalije v sistemih vode in usedline. Preskusna snov se primeša v usedlino, li činke prvega stadija pa se nato vnesejo v preskusne 
čaše, v katerih so bile koncentracije usedline in vode stabilizirane. Hitrost 
preobrazbe in razvoja trza č se izmeri ob koncu preskusa. Preživetje in teža 
ličink se lahko izmerita tudi po 10 dneh, če je to potrebno (z dodatnimi 
ponovitvami, kot je ustrezno). Ti podatki se analizirajo bodisi z regresijskim 
modelom, da se oceni koncentracija, ki bi povzro čila x-odstotno zmanjšanje 
preobrazbe, ali preživetja, ali rasti li čink (npr. EC
 15 , EC  50 itd.), bodisi s 
preskušanjem statisti čnih domnev za dolo čitev NOEC/LOEC. Slednje 
zahteva primerjavo vrednosti u činkov s kontrolnimi vrednostmi, za kar se 
uporabijo statisti čni preskusi.  
INFORMACIJE O PRESKUSNI SNOVI 
8. Znani morajo biti vodotopnost preskusne snovi, njen parni tlak, izmerjeni ali 
izračunani koeficient porazdelitve v usedlini ter stabilnost v vodi in usedlini. 
Za določitev količine preskusne snovi v vodi nad usedlino, porni vodi in 
usedlini mora biti na voljo zanesljiva analitska metoda z znano in izpri čano 
natančnostjo ter mejo zaznave. Koristni informaciji sta tudi strukturna 
formula in čistost preskusne snovi. Prav tako je koristno poznati obnašanje 
preskusne snovi v okolju (npr. disipacija, abiotska in biotska razgradnja itd.). Dodatne smernice za preskušanje snovi s fizikalno-kemijskimi last ­
nostmi, zaradi katerih je preskus otežen, so navedene v (12).
 
REFEREN ČNE KEMIKALIJE 
9. Redno se lahko preskušajo referen čne kemikalije, da se tako zagotavlja 
zanesljivost protokola za preskušanje in preskusnih pogojev. Primeri referen ­ 
čnih strupenih snovi, ki so bile uspešno uporabljene v krožnih preskusih in 
potrditvenih raziskavah, so: lindan, trifluralin, pentaklorofenol, kadmijev klorid in kalijev klorid (1) (2) (5) (6) (13).
 
VELJAVNOST PRESKUSA 
10. Za veljavnost preskusa morajo biti izpolnjeni naslednji pogoji: 
— preobrazba v kontrolnih posodah ob koncu preskusa mora biti vsaj 70- 
odstotna (1) (6), 
— C. riparius  in C. yoshimatsui  v kontrolnih posodah se morajo v odrasle 
osebke preobraziti med 12. in 23. dnem po vnosu v posode;  C. tentans  
potrebujejo 20 do 65 dni, 
— ob koncu preskusa je treba v vsaki posodi izmeriti pH in koncentracijo 
raztopljenega kisika. Koncentracija kisika mora biti vsaj 60 % nasi če­
nosti zraka (ASV) pri uporabljeni temperaturi, pH vode nad usedlino pa mora biti v vseh preskusnih posodah med 6 in 9, 
— temperatura vode se ne sme razlikovati za ve č kot ± 1,0 °C; temperaturo 
vode bi bilo mogo če nadzorovati z izotermalnim prostorom; v takem 
primeru je treba temperaturo v prostoru potrjevati v ustreznih časovnih 
presledkih.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1378
 
OPIS METODE  
Preskusne posode  
11. Raziskava se izvaja v steklenih 600-mililitrskih čašah z 8-centimetrskim 
premerom. Primerne so tudi druge posode, vendar morajo zagotavljati primerno globino usedline in vode nad njo. Površina usedline mora biti dovolj velika, da zagotavlja 2 do 3 cm
 2 na ličinko. Razmerje med debelino 
usedline in globino vode nad njo mora biti 1 : 4. Preskusne posode in druge 
naprave, ki bodo prišle v stik s preskusnim sistemom, morajo biti v celoti iz stekla ali drugega kemijsko inertnega materiala (npr. teflona).
 
Izbira vrst  
12. Če je mogo če, naj se v preskusu uporabi vrsta  Chironomus riparius . Chiro­
nomus tentans  je prav tako primerna, vendar je z njo težje delati in zahteva 
daljše preskusno obdobje. Uporabi se lahko tudi  Chironomus yohimatsui . 
Podrobnosti o metodah gojenja za  Chironomus riparius  so navedene v 
Dodatku 2. Informacije o pogojih gojenja so na voljo tudi za druge vrste, 
npr. Chironomus tentans  (4) in  Chironomus yoshimatsui  (11). Identifikacijo 
vrst je treba potrditi pred preskusom, ni pa to potrebno pred vsakim presku ­
som, če organizmi prihajajo iz internega gojiš ča. 
Usedlina  
13. Če je mogo če, je treba uporabiti formulirano usedlino (imenovano tudi 
rekonstituirana, umetna ali sinteti čna usedlina). Če se uporabi naravna used ­
lina, je treba dolo čiti njene lastnosti (vsaj pH in vsebnost organskega 
ogljika, priporo ča se tudi dolo čitev drugih parametrov, kot sta razmerje 
C/N in granulometrija), poleg tega ne sme biti onesnažena in ne sme vsebo ­
vati drugih organizmov, ki bi lahko tekmovali s trza čami ali jih požrli. Prav 
tako se priporo ča, naj se naravna usedlina pred uporabo v preskusu strupe ­
nosti s trza čami 7 dni kondicionira v enakih pogojih, kakršni vladajo v 
poznejšem preskusu. Za uporabo v tem preskusu (1) (15) (16) se priporo ča 
naslednja formulirana usedlina, ki temelji na umetni zemljini, uporabljeni v preskusni metodi C.8 (14): 
(a) 4–5 % (suhe teže) šote: čim bližje vrednosti pH 5,5 do 6,0; pomembno 
je uporabiti fino mleto šoto v prahu (velikost delcev ≤ 1 mm), sušeno 
samo na zraku; 
(b) 20 % (suhe teže) kaolinske gline (vsebnost kaolinita po možnosti nad 
30 %); 
(c) 75–76 % (suhe teže) kremenovega peska (prevladovati mora fini pesek, 
pri katerem je ve č kot 50 % delcev velikih 50 do 200 μm); 
(d) doda se deionizirana voda, tako da je v kon čni mešanici vsebnost vlage 
30- do 50-odstotna; 
(e) doda se kemijsko čist kalcijev karbonat (CaCO
 3 ), da se pH v kon čni 
mešanici usedline uravna na 7,0 ± 0,5. Vsebnost organskega ogljika v 
končni mešanici mora biti 2 % (± 0,5 %), uravnava pa se z ustreznimi 
količinami šote in peska v skladu s to čkama (a) in (c). 
14. Vir šote, kaolinske gline in peska mora biti znan. Preveriti je treba, da 
sestavine usedline niso kemi čno onesnažene (npr. da ne vsebujejo težkih 
kovin, organoklornih spojin, organofosfornih spojin itd.). Primer priprave formulirane usedline je opisan v Dodatku 3. Sprejemljiva je tudi mešanica suhih sestavin, če se dokaže, da se sestavine usedline po dodatku vode nad 
usedlino ne za čnejo ločevati (npr. lebdenje šotnih delcev) in da je šota ali 
usedlina zadostno kondicionirana.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1379
 
Voda  
15. Za preskusno vodo je primerna vsaka voda, ki ustreza kemijskim zna čilno­
stim sprejemljive vode za red čenje, ki so navedene v dodatkih 2 in 4. Za 
gojiščno vodo in preskusno vodo je sprejemljiva vsaka primerna voda, 
naravna voda (površinska ali podzemna voda), obdelana voda (glej Dodatek 
2) ali deklorirana vodovodna voda, če trzače čas gojenja in preskušanja v 
njej preživijo brez znakov stresa. Na za četku preskusa mora biti pH 
preskusne vode med 6 in 9, skupna trdota pa ne sme biti višja od 400 
mg/l kot CaCO  3 . Če se domneva, da bo prišlo do interakcije med ioni, ki 
povzročajo trdoto vode, in preskusno snovjo, je treba uporabiti vodo z 
manjšo trdoto (v takem primeru se torej ne sme uporabiti medij Elendt 
M4). Ves čas raziskave je treba uporabljati isto vrsto vode. Lastnosti 
vode, navedene v Dodatku 4, je treba izmeriti vsaj dvakrat na leto ali kadar se sumi, da so se morda te lastnosti bistveno spremenile.
 
Založne raztopine – usedline s primešano preskusno snovjo  
16. Usedline s primešano preskusno snovjo izbrane koncentracije se obi čajno 
pripravijo z dodatkom raztopine preskusne snovi neposredno v usedlino. osnovna raztopina preskusne snovi, raztopljene v deionizirani vodi, se 
zmeša s formulirano usedlino z valj čnim mlinom, mešalnikom za krmo ali 
ročno. Če je preskusna snov slabo topna v vodi, se lahko raztopi v čim 
manjši koli čini ustreznega organskega topila (npr. heksana, acetona ali 
kloroforma). Ta raztopina se nato zmeša z 10 g finega kremenovega 
peska za eno preskusno posodo. Topilo je treba pustiti, da izhlapi, in 
mora biti v celoti odstranjeno iz peska; pesek se nato zmeša z ustrezno količino usedline na preskusno čašo. Za raztapljanje, razpršitev ali emulgi ­
ranje preskusne snovi se lahko uporabijo samo tista sredstva, ki hitro izhla ­
pijo. Ne smemo pozabiti, da je treba pri pripravi usedline upoštevati koli čino 
peska, prinesenega z mešanico preskusne snovi in peska (tj. usedlino je torej treba pripraviti z manj peska). Paziti je treba, da je preskusna snov, dodana usedlini, v njej temeljito in enakomerno razporejena. Po potrebi se lahko 
analizirajo podvzorci, da se ugotovi stopnja homogenosti.
 
NAČRT PRESKUSA 
17. Načrt preskusa se nanaša na izbiro števila preskusnih koncentracij in 
razmikov med njimi, število posod za vsako koncentracijo in število li čink 
na posodo. Opisani so na črti za točkovno oceno EC, oceno NOEC in 
izvedbo mejnega preskusa.  
Načrt za regresijsko analizo  
18. S koncentracijami, vklju čenimi v preskus, bi morala biti zajeta efektivna 
koncentracija (npr. EC  15 , EC  50 ) in razpon koncentracije, v katerem je 
zanimiv vpliv preskusne snovi. Na splošno se natan čnost in zlasti veljav ­
nost, ki ju je mogo če doseči pri ocenah efektivnih koncentracij (EC  x ), 
izboljšata, kadar je efektivna koncentracija v okviru preskušanega razpona koncentracij. Izogibati se je treba ekstrapolaciji veliko pod najnižjo pozi ­
tivno koncentracijo ali veliko nad najvišjo koncentracijo. Kot pomo č pri 
izbiri razpona koncentracij, ki bo uporabljen (glej odstavek 27), se lahko 
izvede predhodni preskus za ugotavljanje razpona.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1380
 
19. Če je treba oceniti EC  x , je treba preskusiti vsaj 5 koncentracij in izvesti 3 
ponovitve za vsako koncentracijo. Vsekakor je priporo čljivo uporabiti dovolj 
preskusnih koncentracij, da se omogo či dobra ocena modela. Faktor med 
koncentracijami ne sme biti ve čji od 2 (izjema je dopustna, kadar naklon 
krivulje odmerek-u činek ni strm). Število ponovitev na posamezno posodo s 
preskusno snovjo se lahko zmanjša, če se pove ča število preskusnih koncen ­
tracij z razli čnimi učinki. Pove čanje števila ponovitev ali zmanjšanje veli ­
kosti razmikov med preskusnimi koncentracijami obi čajno vodi do ožjih 
intervalov zaupanja za preskus. Dodatne ponovitve so potrebne, če se 
ocenjujeta 10-dnevno preživetje in rast li čink. 
Načrt za oceno NOEC/LOEC  
20. Če je treba oceniti LOEC ali NOEC, bi bilo treba uporabiti pet preskusnih 
koncentracij in izvesti vsaj štiri ponovitve, faktor med koncentracijami pa ne sme biti ve čji od 2. Število ponovitev mora zadostovati, da se zagotovi 
ustrezna statisti čna vrednost za ugotovitev 20-odstotne razlike v primerjavi 
s kontrolno enoto pri 5-odstotni stopnji zna čilnosti (p = 0,05). Pri hitrosti 
razvoja je obi čajno ustrezna analiza variance (ANOVA), kot sta Dunnettov 
preskus in Williamsov preskus (17) (18) (19) (20). Pri koeficientu preobrazbe se lahko uporabijo Cochran-Armitageev preskus, Fisherjev 
eksaktni preskus (z Bonferronijevim popravkom) ali Mantel-Haenszelov 
preskus.
 
Mejni preskus  
21. Če v predhodnem preskusu za ugotavljanje razpona ni bilo opaženih u čin­
kov, se lahko opravi mejni preskus (ena preskusna koncentracija in kontrolna enota). Namen mejnega preskusa je izvesti preskus pri dovolj 
visoki koncentraciji, da lahko nosilci odlo čanja izklju čijo mogo če strupene 
učinke preskusne snovi, meja pa je dolo čena pri koncentraciji, za katero ni 
pričakovati, da bi se pojavila v katerem koli primeru. Priporo ča se 1 000 
mg/kg (suhe teže). Obi čajno je potrebnih vsaj šest ponovitev za preskusne in 
kontrolne posode. Izkazati je treba ustrezno statisti čno vrednost za ugoto ­
vitev 20-odstotne razlike v primerjavi s kontrolno enoto pri 5-odstotni stopnji zna čilnosti (p = 0,05). Kar zadeva u činek na hitrost razvoja in 
težo, je t-test primerna statisti čna metoda, če podatki izpolnjujejo zahteve 
za ta preskus (normalnost, homogenost varianc). Če te zahteve niso izpol ­
njene, se lahko uporabi t-preskus za neenake variance ali neparametri čni 
preskus, kot je Wilcoxon-Mann-Whitneyjev preskus. Pri koeficientu preobrazbe je primeren Fisherjev eksaktni preskus.
 
POSTOPEK  
Pogoji izpostavljenosti  
Priprava sistema vode in usedline, v katerem je preskusna snov primešana v 
usedlino  
22. Za uporabo preskusne snovi (14) se priporo ča postopek primešanja, opisan v 
preskusni metodi C.8: Strupenost za deževnike. Usedline s primešano preskusno snovjo se vnesejo v posode, nad usedlino pa se doda voda, da 
nastane volumensko razmerje med usedlino in vodo 1 : 4 (glej odstavka 11 
in 15). Plast usedline mora biti debela 1,5 do 3 cm. Da se prepre či ločevanje 
sestavin usedline in ponovna suspenzija finega materiala med dodajanjem preskusne vode v vodni stolpec, se lahko usedlina med to čenjem vode 
prekrije s plasti čnim pokrovom, ki se takoj nato odstrani. Primerna so 
lahko tudi druga sredstva. 
23. Preskusne posode je treba pokriti (npr. s steklenimi ploš čami). Po potrebi se 
med raziskavo voda doto či do prvotne koli čine, da se nadomesti izhlapela 
voda. Za to je treba uporabiti destilirano ali deionizirano vodo, da se 
prepreči kopičenje soli.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1381
 
Stabilizacija  
24. Ko je usedlina s primešano preskusno snovjo in vodo nad njo pripravljena, 
je zaželeno, da se omogo či porazdelitev preskusne snovi iz vodne faze v 
usedlino (3) (4) (6) (13). To je po možnosti treba storiti v temperaturnih in 
prezračevalnih pogojih, ki bodo uporabljeni v preskusu. Ustrezen čas za 
vzpostavitev ravnotežja je odvisen od usedline in kemikalije, lahko pa traja od ve č ur do ve č dni in v redkih primerih do ve č tednov (4 do 5 
tednov). Ker bi bil tako na voljo čas za razgradnjo številnih kemikalij, se na 
vzpostavitev ravnotežja ne sme čakati, ampak se za to priporo ča 48-urno 
obdobje. Po koncu tega dodatnega obdobja za vzpostavitev ravnotežja je treba izmeriti koncentracijo preskusne snovi v vodi nad usedlino, porni vodi 
in usedlini vsaj pri najvišji in nižji koncentraciji (glej odstavek 38). Te 
analitske dolo čitve preskusne snovi omogo čajo izračun masne bilance in 
izražanje rezultatov na podlagi izmerjenih koncentracij.
 
Dodajanje preskusnih organizmov  
25. Od 4 do 5 dni pred vnosom preskusnih organizmov v preskusne posode je 
treba iz gojiš č vzeti jaj čna legla in jih vstaviti v majhne posode v gojit ­
venem mediju. Uporabi se lahko starejši medij iz osnovne kulture ali sveže 
pripravljeni medij. Če se uporabi slednji, je treba v gojitveni medij dodati 
majhno koli čino hrane, npr. zelenih alg in/ali nekaj kapljic filtrata suspenzije 
iz fino mlete ribje hrane v kosmi čih (glej Dodatek 2). Uporabiti je treba 
samo sveže odložena jaj čna legla. Obi čajno se li činke izležejo nekaj dni po 
tem, ko so bila jaj čeca odložena (2 do 3 dni za  Chironomus riparius  pri 
20 °C ter 1 do 4 dni za  Chironomus tentans  pri 23 °C in  Chironomus 
yoshimatsui  pri 25 °C), rast li čink pa poteka v 4 stadijih, od katerih vsak 
traja 4 do 8 dni. V preskusu je treba uporabiti li činke prvega stadija (2 do 3 
ali 1 do 4 dni po tem, ko se izležejo). Stadij trza č se lahko po možnosti 
preveri z merjenjem širine glave (6). 
26. 20 li čink prvega stadija se s topo pipeto naklju čno vnese v vsako preskusno 
posodo, ki vsebuje usedlino s primešano preskusno snovjo in vodo. Med 
dodajanjem li čink v preskusne posode je treba ustaviti prezra čevanje vode, 
ki se ne sme izvajati še 24 ur potem, ko so bile li činke dodane (glej 
odstavka 25 in 32). Glede na uporabljeni na črt preskusa (glej odstavka 19 
in 20) se za to čkovno oceno EC uporabi vsaj 60 li čink na koncentracijo, za 
določitev NOEC pa 80.  
Preskusne koncentracije  
27. Preskus za ugotavljanje razpona je lahko koristen za dolo čitev razpona 
koncentracij za kon čni preskus. Za ta namen se uporabi niz široko razma ­
knjenih koncentracij preskusne snovi. Da se zagotovi enaka gostota površine 
na trzačo, kot bo uporabljena za kon čni preskus, se trza če izpostavijo vsaki 
koncentraciji preskusne snovi za obdobje, ki omogo ča oceno ustreznih 
preskusnih koncentracij, pri čemer ponovitve niso potrebne. 
28. Preskusne koncentracije za kon čni preskus se dolo čijo na podlagi rezultata 
preskusa za ugotavljanje razpona. Izbrati in uporabiti je treba vsaj pet 
koncentracij, kot je opisano v odstavkih 18 do 20.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1382
 
Kontrolne enote  
29. V preskus je treba vklju čiti kontrolne posode, v katerih ni preskusne snovi, 
toda ki vsebujejo usedlino, z ustreznim številom ponovitev (glej odstavka 19 in 20). Če je bilo za aplikacijo preskusne snovi uporabljeno topilo (glej 
odstavek 16), je treba dodati kontrolno posodo, katere usedlina vsebuje 
tudi topilo.
 
Preskusni sistem  
30. Uporabljajo se stati čni sistemi. Polstati čni ali preto čni sistemi z ob časnim ali 
kontinuiranim obnavljanjem vode nad usedlino se lahko uporabijo v izjemnih primerih, na primer če specifikacije kakovosti vode postanejo 
neprimerne za preskusni organizem ali vplivajo na kemijsko ravnotežje 
(npr. ravni raztopljenega kisika se preve č znižajo, koncentracija izlo čkov 
se preveč poviša ali minerali iztekajo iz usedline in vplivajo na pH in/ali 
trdoto vode). Vendar za izboljšanje kakovosti vode nad usedlino obi čajno 
zadoščajo in se prednostno uporabljajo druge metode, kot je prezra čevanje.
 
Hrana  
31. Ličinke je treba hraniti, po možnosti vsak dan ali vsaj trikrat na teden. Za 
mlade ličinke v prvih desetih dneh ustreza 0,25–0,5 mg (0,35–0,5 mg za  C. 
yoshimatsui ) ribje hrane (suspenzija v vodi ali fino mleta hrana, npr. 
TetraMin ali TetraPhyll; glej podrobnosti v Dodatku 2) na li činko na dan. 
Nekoliko ve č hrane bodo morda potrebovale starejše li činke: za preostanek 
preskusa mora zadostovati 0,5–1 mg na li činko na dan. Obrok hrane je treba 
zmanjšati v vseh preskusnih in kontrolnih posodah, če se opazi rast glivic ali 
smrtnost v kontrolnih posodah. Če razvoja glivic ni mogo če ustaviti, je treba 
preskus ponoviti. Kadar se preskušajo snovi, ki se mo čno adsorbirajo (npr. z 
log K  ow > 5), ali snovi, ki se kovalentno vežejo na usedlino, se lahko 
količina hrane, potrebna za zagotovitev preživetja in naravne rasti organ ­
izmov, doda formulirani usedlini pred obdobjem stabilizacije. Za to je treba namesto ribje hrane uporabiti rastlinski material, npr. dodatek 0,5 % (suhe teže) fino mletih listov npr. velike koprive ( Urtica dioica ), bele murve 
(Morus alba ), plazeče detelje ( Trifolium repens ), špinače (Spinacia olera ­
cea) ali drugega rastlinskega materiala ( Cerophyl  ali alfa celuloza).
 
Pogoji inkubacije  
32. Zagotovi se rahlo prezra čevanje vode nad usedlino v preskusnih posodah, 
po možnosti 24 ur po vnosu li čink, in se izvaja ves čas preskusa (paziti je 
treba, da koncentracija raztopljenega kisika ne pade pod 60 % ASV). Prezračevanje se zagotavlja prek steklene pasteurjeve pipete, pritrjene 2 do 
3 cm nad plastjo usedline (tj. 1 ali nekaj mehur čkov/s). Kadar se preskušajo 
hlapne kemikalije, je mogo če razmisliti o tem, da se sistem vode in usedline 
ne bi prezra čeval. 
33. Preskus se izvaja pri konstantni temperaturi 20 °C (± 2 °C). Za  C. tentans  in 
C. yoshimatsui  sta priporo čeni temperaturi 23 °C oziroma 25 °C (± 2 °C). 
Uporablja se 16-urno obdobje osvetljenosti, jakost svetlobe pa mora biti 500 
do 1 000 lux.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1383
 
Trajanje izpostavljenosti  
34. Izpostavljenost se za čne z vnosom li čink v posode s primešano preskusno 
snovjo in kontrolne posode. Najdaljši čas izpostavljenosti za  C. riparius  in 
C. yoshimatsui  je 28 dni, za  C. tentans  pa 65 dni. Če se ličinke v odrasle 
osebke preobrazijo prej, se lahko preskus kon ča najmanj pet dni po 
preobrazbi zadnjega odraslega osebka v kontrolni posodi.  
Opažanja  
Preobrazba  
35. Dolo čita se čas razvoja in skupno število v celoti preobraženih samcev in 
samic trza če. Samce je mogo če preprosto prepoznati po pahlja častih tipal ­
kah. 
36. Preskusne posode je treba opazovati vsaj trikrat na teden, da se ugotovi 
kakršno koli neobi čajno obnašanje (npr. zapuš čanje usedline, nenavadno 
plavanje) v primerjavi s kontrolno posodo. V obdobju pri čakovane 
preobrazbe je potrebno dnevno štetje preobraženih trza č. Spol in število v 
celoti preobraženih trza č se zapišeta dnevno. Po identifikaciji se trza če 
odstranijo iz posod. Vsa jaj čna legla, odložena pred zaklju čkom preskusa, 
je treba evidentirati in nato odstraniti, da se prepre či vnovični vnos li čink v 
usedlino. Evidentira se tudi število vidnih bub, ki se niso preobrazile. Napotek za spremljanje preobrazbe je v Dodatku 5.
 
Rast in preživetje  
37. Če je treba zagotoviti podatke o 10-dnevnem preživetju in rasti li čink, je 
treba na za četku vklju čiti dodatne preskusne posode, ki se lahko uporabijo 
pozneje. Usedlina iz teh dodatnih posod se preseje skozi sito z 250 μm 
velikimi luknjicami, da se zadržijo li činke. Merili za pogin sta negibnost 
ali neodzivnost na mehanske dražljaje. Li činke, ki ostanejo v usedlini, je 
prav tako treba šteti za mrtve (li činke, ki so poginile na za četku preskusa, so 
morda razgradili mikrobi). Dolo či se suha teža (brez pepela) preživelih 
ličink na preskusno posodo in izra čuna srednja suha teža posamezne li činke 
na posodo. Koristno je dolo čiti, v kateri stadij spadajo preživele li činke; za 
to se lahko izmeri širina glave vsakega osebka.  
Analitske meritve  
Koncentracija preskusne snovi  
38. Pred za četkom preskusa (tj. dodatkom li čink) se za analitsko dolo čitev 
koncentracije preskusne snovi v usedlini odvzamejo vzorci usedline vsaj iz ene posode na posamezno obdelavo. Priporo ča se, da se na za četku in 
koncu preskusa analizirajo vsaj vzorci vode nad usedlino, porne vode in 
usedline (glej odstavek 24), in sicer pri najvišji in nižji koncentraciji. Te 
določitve koncentracije preskusne snovi pokažejo obnašanje/porazdelitev 
preskusne snovi v sistemu vode in usedline. 
39. Kadar se izvajajo vmesne meritve (npr. 7. dan) in če so za analize potrebni 
veliki vzorci, ki jih ni mogo če vzeti iz preskusnih posod, ne da bi to 
vplivalo na preskusni sistem, je treba analitske dolo čitve izvesti na vzorcih 
iz dodatnih preskusnih posod, ki se obdelujejo enako (vklju čno s prisot ­
nostjo preskusnih organizmov), vendar se za biološka opažanja ne upora ­
bljajo.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1384
 
40. Za izolacijo intersticijske vode se priporo ča 30-minutno centrifugiranje pri 
npr. 10 000 g in 4 °C. Če pa se za preskusno snov izkaže, da se ne adsor ­
bira na filtre, je lahko sprejemljivo tudi filtriranje. V nekaterih primerih koncentracij v porni vodi zaradi premajhnega vzorca morda ne bo mogo če 
analizirati.
 
Fizikalno-kemijski parametri  
41. Vrednost pH in temperaturo v preskusnih posodah je treba ustrezno meriti 
(glej odstavek 10). Trdoto in amonij je treba izmeriti v kontrolnih posodah in eni preskusni posodi pri najvišji koncentraciji na za četku in koncu 
preskusa.
 
PODATKI IN PORO ČANJE  
Obdelava rezultatov  
42. Namen tega preskusa je dolo čiti učinek preskusne snovi na hitrost razvoja in 
skupno število v celoti preobraženih samcev in samic trza če oziroma, pri 10- 
dnevnem preskusu, u činke na preživetje in težo li čink. Če ni znakov o 
statistično različni občutljivosti spolov, se lahko rezultati za samce in samice 
za statisti čne analize združijo. Razlike v ob čutljivosti med spoloma je 
mogoče statistično oceniti, na primer s preskusom χ 2 -r × 2. Po potrebi je 
treba po 10 dneh dolo čiti preživetje li čink in srednjo suho težo posamezne 
ličinke na posodo. 
43. Če je mogo če, se efektivne koncentracije, ki so izražene in temeljijo na suhi 
teži, izračunajo na podlagi izmerjenih koncentracij v usedlini na za četku 
preskusa (glej odstavek 38). 
44. Za to čkovno oceno EC  50 ali druge EC  x se lahko statisti čni podatki po 
posodah uporabijo kot dejanske ponovitve. Pri izra čunu intervala zaupanja 
za EC  x je treba upoštevati variabilnost med posodami ali pa dokazati, da je 
ta zanemarljiva. Če se model prilega po metodi najmanjših kvadratov, je 
treba statisti čne podatke po posameznih posodah transformirati, da se 
izboljša homogenost variance. Vendar je treba vrednosti EC  x izračunati po 
tem, ko so bili rezultati transformirani nazaj na prvotno vrednost. 
45. Kadar je namen statisti čne analize dolo čiti NOEC/LOEC s preskušanjem 
domnev, je treba upoštevati variabilnost med posodami, npr. z vgnezdeno 
ANOVO. Alternativno se lahko uporabijo robustnejši preskusi (21), kadar so običajne predpostavke ANOVE kršene.
 
Koeficient preobrazbe  
46. Koeficient preobrazbe da odgovor „vse ali ni č“ in se lahko analizira s 
Cochran-Armitageevim preskusom, uporabljenim regresivno (step-down), kadar se pri čakuje monotono razmerje odmerek-u činek in so ti podatki v 
skladu s tem pri čakovanjem. Če niso, se lahko uporabi Fisherjev eksaktni 
preskus ali Mantel-Haenszelov preskus z Bonferroni-Holmovimi popravlje ­
nimi p-vrednostmi. Če se izkaže, da je variabilnost med ponovitvami v 
okviru iste koncentracije ve čja, kot bi kazala binomska porazdelitev 
(pogosto imenovana „ekstra-binomska“ variacija), potem je treba uporabiti 
robustni Cochran-Armitageev preskus ali Fisherjev eksaktni preskus, kot je 
predlagano v (21).
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1385
 
Vsota preobraženih trza č na posodo ne se dolo či in deli s številom vnesenih 
ličink na:  
ER ¼ n e 
n a 
pri čemer je:  
ER = koeficient preobrazbe,  
n e = število preobraženih trza č na posodo,  
n a = število vnesenih li čink na posodo. 
47. Druga možnost, ki je najprimernejša za velike vzorce, kadar obstaja ekstra 
binomska varianca, je, da se koeficient preobrazbe obravnava kot zvezni odgovor in se uporabijo postopki, kot je Williamsov preskus, kadar se pričakuje monotono razmerje odmerek-u činek in kadar je to v skladu s 
temi podatki o koeficientu preobrazbe. Dunettov preskus je primeren, 
kadar monotonost ne drži. Velik vzorec je tu opredeljen kot število preobra ­ 
ženih osebkov in število nepreobraženih osebkov po posameznih ponovitvah (posodah), pri čemer je obojih ve č kot pet. 
48. Za uporabo metod ANOVA je treba vrednosti ER najprej transformirati z 
arkus sinus-korensko transformacijo ali Freeman-Tukeyevo transformacijo, da se dobi približna normalna porazdelitev in da se variance izena čijo. 
Cochran-Armitageev preskus, Fisherjev eksaktni preskus (Bonferroni) ali 
Mantel-Haenszelov preskus se lahko uporabijo, kadar se uporabljajo abso ­
lutne pogostosti. Pri arkus sinus-korenski transformaciji se izra čuna arkus 
sinus (sin
 -1 ) kvadratnega korena ER. 
49. Za koeficiente preobrazbe se vrednosti EC  x izračunajo z regresijsko analizo 
(ali npr. probit (22), logit, Weibull, ustrezno programsko opremo itd.). Če 
regresijska analiza ni uspešna (npr. kadar sta manj kot dva delna odgovora), 
se uporabijo druge neparametri čne metode, kot sta drse če povpre čje ali 
linearna interpolacija.  
Hitrost razvoja  
50. Srednji čas razvoja pomeni srednji časovni razpon med vnosom li čink (dan 
0 preskusa) in preobrazbo poskusne kohorte trza č. (Za izra čun dejanskega 
časa razvoja je treba upoštevati starost li čink ob vnosu.) Hitrost razvoja je 
obratna času razvoja (enota: 1/dan) in predstavlja tisti delež razvoja li čink, 
ki se zgodi na dan. Za oceno teh raziskav strupenosti v usedlini je primer ­
nejša hitrost razvoja, saj je njena varianca manjša, poleg tega je bolj homo ­
gena in bližje normalni porazdelitvi v primerjavi s časom razvoja. Zato so 
učinkoviti parametri čni preskusi primernejši za hitrost razvoja kot za čas 
razvoja.Če se hitrost razvoja obravnava kot zvezni odgovor, se lahko vred ­
nosti EC  x ocenijo z regresijsko analizo (npr. (23), (24)). 
51. Za naslednje statisti čne preskuse se za število trza č, opaženih na dan opazo ­
vanja x, domneva, da so se preobrazile na sredini časovnega intervala med 
dnevom × in dnevom x – 1 (l = dolžina intervala opazovanja, obi čajno 1 
dan). Srednja hitrost razvoja na posodo ( x) se izračuna z ena čbo: 
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1386
 
pri čemer je:  
x: srednja hitrost razvoja za posodo, 
i: indeks intervala opazovanja, 
m: najve čje število intervalov opazovanja,  
ƒ i : število trza č, preobraženih v intervalu opazovanja i, 
n e : skupno število preobraženih trza č ob koncu poskusa, (=  P ƒ i ) 
x i : hitrost razvoja trza č, preobraženih v intervalu i. 
x i ¼ 1 
ðday  i Ä 1 i 
2 Þ 
pri čemer je: 
day  i : dan opazovanja (dnevi od vnosa), 
l i : dolžina intervala opazovanja i (dnevi, obi čajno 1 dan).  
Poročilo o preskusu  
52. V poro čilu o preskusu morajo biti navedene vsaj naslednje informacije:  
Preskusna snov:  
— fizikalno stanje, in kjer je ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti (vodo ­
topnost, parni tlak, porazdelitveni koeficient v tleh (ali v usedlini, če je 
na voljo), stabilnost v vodi itd.), 
— kemijski identifikacijski podatki (splošno ime, kemijsko ime, strukturna 
formula, številka CAS itd.), vklju čno s čistostjo in analitsko metodo za 
količinsko dolo čanje preskusne snovi.  
Preskusne vrste:  
— uporabljene preskusne živali: vrsta, znanstveno ime, vir organizmov in 
pogoji razmnoževanja, 
— informacije o ravnanju z jaj čnimi legli in li činkami, 
— starost preskusnih živali ob vnosu v preskusne posode.  
Preskusni pogoji:  
— uporabljena usedlina, tj. naravna ali formulirana, 
— za naravno usedlino lokacija in opis mesta vzor čenja usedline, vklju čno, 
če je mogo če, s preteklim onesnaženjem; zna čilnosti: pH, vsebnost 
organskega ogljika, razmerje C/N in granulometrija ( če je ustrezno), 
— priprava formulirane usedline: sestavine in zna čilnosti (vsebnost organ ­
skega ogljika, pH, vlaga itd. na za četku preskusa), 
— priprava preskusne vode ( če se uporablja obdelana voda) in zna čilnosti 
(koncentracija kisika, pH, prevodnost, trdota itd. na za četku preskusa), 
— globina usedline in vode nad njo, — količina vode nad usedlino in porne vode; teža mokre usedline s porno 
vodo in brez nje,
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1387
 
— preskusne posode (material in velikost), 
— metoda primešanja preskusne snovi v usedlino: uporabljene preskusne 
koncentracije, število ponovitev in uporaba topila, če je bilo uporabljeno, 
— faza stabilizacije za vzpostavitev ravnotežja sistema vode in usedline: 
trajanje in pogoji, 
— pogoji inkubacije: temperatura, svetlobni ciklus in jakost svetlobe, 
prezračevanje (pogostost in jakost), 
— podrobne informacije o hranjenju, vklju čno z vrsto hrane, pripravo, 
količino in na činom.  
Rezultati:  
— nazivne preskusne koncentracije, izmerjene preskusne koncentracije in 
rezultati vseh analiz za dolo čitev koncentracije preskusne snovi v 
preskusni posodi, 
— kakovost vode v preskusnih posodah, tj. pH, temperatura, raztopljeni 
kisik, trdota in amonij, 
— morebitna nadomestitev izhlapele preskusne vode, — število preobraženih samcev in samic trza če na posodo in na dan, 
— število li čink, ki se niso preobrazile v trza če, na posodo, 
— srednja suha teža posamezne li činke na posodo in po stadijih, če je 
ustrezno, 
— delež preobrazbe na ponovitev in preskusno koncentracijo (združeni 
samci in samice trza če), 
— srednja hitrost razvoja v celoti preobraženih trza č na ponovitev in 
stopnjo koncentracije (združeni samci in samice trza če), 
— ocene strupenih kon čnih točk, npr. ECx (in s tem povezani intervali 
zaupanja), NOEC in/ali LOEC, ter statisti čne metode, uporabljene za 
njihovo dolo čitev, 
— obravnava rezultatov, vklju čno z vsemi vplivi na rezultat preskusa, ki 
izvirajo iz odstopanj od te preskusne metode.
 
VIRI:  
(1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Develop ­
ment and validation of a new test system. Uredila M. Streloke in H. Köpp. Berlin 1995. 
(2) Fleming, R., idr. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Kon čno poročilo za Evropsko komisijo. Poro čilo št.: EC 3738. 
Avgust 1994. WRc, Združeno kraljestvo. 
(3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioas ­
says for Freshwater and Marine Environments. Z delavnice WOSTA, ki je potekala na Nizozemskem. 
(4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the 
Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebra ­
tes, str. 1125–1241. V ASTM International 2002 Annual Book of Stan ­
dards. Zvezek 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotech ­
nology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA. 
(5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1388
 
(6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Druga 
izdaja. EPA 600/R-99/064. Marec 2000. Sprememba prve izdaje iz junija 1994. 
(7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates. 
(8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. 
(9) Milani, D., Day, K. E., McLeay, D. J., in Kirby, R. S. (1996). Recent intra- 
and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  
(Chironomus riparius).  Technical Report. Environment Canada. National 
Water Research Institute. Burlington, Ontario, Kanada. 
(10) Sugaya, Y. (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecti ­
cides  in Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350. 
(11) Kawai, K. (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47–57. 
(12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Diffi ­
cult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. 
(13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxi ­
city Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxi ­
cant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. 
(14) Preskusna metoda C.8 iz te priloge, Strupenost za deževnike. (15) Suedel, B. C., in Rodgers, J. H. (1994). Development of formulated refe ­
rence sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. 
Toxicol. Chem. 13: 1163–1175. 
(16) Naylor, C., in Rodrigues, C. (1995). Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303. 
(17) Dunnett, C. W. (1964). A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096–1121. 
(18) Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics, 20: 482–491. 
(19) Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means 
when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 
27: 103–117. 
(20) Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero 
dose control. Biometrics, 28: 510–531. 
(21) Rao, J. N. K., in Scott, A. J. (1992). A simple method for the analysis of 
clustered binary data. Biometrics 48: 577–585. 
(22) Christensen, E. R. (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity 
testing and the Weibull model. Water Research 18: 213–221. 
(23) Bruce in Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous 
toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485–1494. 
(24) Slob, W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxi ­
col. Sci. 66: 298–312.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1389
 
Dodatek 1  
OPREDELITEV POJMOV 
Za to preskusno metodo se uporabljajo naslednje opredelitve pojmov:  
formulirana usedlina  ali rekonstituirana, umetna ali sinteti čna usedlina je zmes 
snovi, uporabljenih za posnemanje fizi čnih sestavin naravne usedline;  
voda nad usedlino  je voda, ki se nalije nad usedlino v preskusni posodi;  
intersticijska voda  ali porna voda je voda, ki zavzema prostor med delci used ­
line in zemljine;  
usedlina s primešano snovjo  je usedlina, ki ji je bila dodana preskusna snov;  
preskusna kemikalija  je snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne 
metode.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1390
 
Dodatek 2  
Priporočila za gojenje  Chironomus riparius  
1. Ličinke Chironomus  se lahko gojijo v kristalizirkah ali ve čjih vsebnikih. Na 
dno vsebnika se nanese tanka plast finega kremenovega peska (debela približno 5 do 10 mm). Za primeren substrat se je izkazal tudi kieselguhr (npr. Merck, Art 8117) (zadoš ča tanjša plast, debela samo nekaj mm). Nato 
se doda primerna voda do globine ve č cm. Vodo je treba po potrebi doto ­ 
čiti, da se nadomestijo izgube zaradi izhlapevanja in prepre či izsušitev. 
Voda se po potrebi lahko zamenja. Zagotoviti je treba rahlo prezra čevanje. 
Posode, v katerih se gojijo li činke, morajo biti v primerni kletki, ki bo 
preprečila pobeg odraslih preobraženih osebkov. Kletka mora biti dovolj 
velika, da lahko preobraženi odrasli osebki rojijo, sicer se lahko zgodi, da ne bo parjenja (najmanjša velikost je približno 30 × 30 × 30 cm). 
2. Kletke morajo biti v prostoru s sobno temperaturo ali prostoru s stalnim 
ozračjem pri 20 ± 2 °C s 16-urnim obdobjem svetlobe (jakost približno 
1 000 lux) in 8-urno temo. Po poro čilih lahko manj kot 60-odstotna rela ­
tivna vlažnost zraka ovira razmnoževanje.
 
Voda za red čenje 
3. Uporabi se lahko vsaka primerna naravna ali sinteti čna voda. Obi čajno se 
uporabljajo voda iz vodnjaka, deklorirana vodovodna voda in umetni mediji 
(npr. medij Elendt „M4“ ali „M7“, glej spodaj). Vodo je treba pred uporabo 
prezračiti. Voda za gojenje se lahko po potrebi obnovi, tako da se upora ­
bljena voda iz gojitvenih posod skrbno preto či ali izsesa, ne da bi pri tem 
uničili ovoj li čink. 
Hranjenje li čink 
4. Ličinke Chironomus  je treba hraniti s približno 250 mg ribje hrane v 
kosmičih (TetraMin®, TetraPhyll® ali druga podobna zaš čitena znamka 
ribje hrane) na posodo na dan. Hrana se lahko daje v obliki suhega mletega prahu ali kot suspenzija v vodi: 1,0 g hrane v kosmi čih se doda 20 ml vode 
za redčenje in zmeša, da nastane homogena mešanica. Ta pripravek se lahko 
daje v koli čini približno 5 ml na posodo na dan (pred uporabo ga je treba 
pretresti). Starejše li činke lahko dobijo ve č hrane. 
5. Hranjenje se prilagaja kakovosti vode. Če gojitveni medij postane „moten“, 
je treba hranjenje zmanjšati. Dodajanje hrane je treba skrbno spremljati. 
Premalo hrane bo povzro čilo selitev li čink v vodni stolpec, preve č hrane 
pa povečano mikrobno dejavnost in zmanjšane koncentracije kisika. Oboje 
lahko privede do po časnejše rasti. 
6. Ko se pripravijo nove gojitvene posode, se lahko dodajo tudi celice neka ­
terih zelenih alg (npr.  Scenedesmus subspicatus , Chlorella vulgaris) .
 
Hranjenje preobraženih odraslih osebkov  
7. Nekateri raziskovalci so predlagali, da se lahko kot hrana za odrasle 
preobražene osebke uporabi vatna blazinica, namo čena v nasi čeno raztopino 
saharoze.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1391
 
Preobrazba  
8. Pri 20 ± 2 °C se bo preobrazba v odrasle osebke iz posod za gojenje li čink 
začela po približno 13 do 15 dneh. Samce je mogo če preprosto prepoznati 
po pahlja častih tipalkah.  
Jajčna legla  
9. Ko so v kletki za razmnoževanje odrasli osebki, je treba vse posode za 
gojenje li čink trikrat tedensko preveriti zaradi morebitnih odloženih želati ­
nastih jajčnih legel, ki jih je treba previdno odstraniti. Prenesti jih je treba v 
majhno posodo, ki vsebuje vzorec vode za razmnoževanje. Jaj čna legla se 
uporabijo za pripravo nove gojitvene posode (npr. 2 do 4 jaj čna legla/po ­
sodo) ali za preskuse strupenosti. 
10. Ličinke prvega stadija bi se morale izle či po 2 ali 3 dneh.  
Priprava novih gojitvenih posod  
11. Ko so gojiš ča vzpostavljena, bi moralo biti mogo če novo gojitveno posodo 
za ličinke pripraviti vsak teden ali manj pogosto, odvisno od zahtev presku ­ 
šanja, stare posode pa odstraniti, ko se li činke preobrazijo v odrasle osebke. 
S takim sistemom bo najpreprosteje zagotovljena redna oskrba z odraslimi 
osebki.  
Priprava preskusnih raztopin „M4“ in „M7“  
12. Elendt (1990) je opisal medij „M4“. Medij „M7“ se pripravi kot medij 
„M4“, z izjemo snovi, navedenih v preglednici 1, za katere so koncentracije 
pri „M7“ štirikrat nižje kot pri „M4“. Publikacija o mediju „M7“ je v 
pripravi (Elendt, osebno sporo čilo). Preskusna raztopina se ne sme pripraviti 
po Elendt in Bias (1990), saj koncentracije NaSiO  3 5 H  2 O, NaNO  3 , 
KH  2 PO 4 in K  2 HPO  4 , navedene za pripravo osnovnih raztopin, niso ustre ­
zne. 
Priprava medija „M7“  
13. Vsaka osnovna raztopina (I) se pripravi posebej, sestavljena osnovna 
raztopina (II) pa se pripravi iz teh osnovnih raztopin (I) (glej preglednico 1). V 50 ml sestavljene osnovne raztopine (II), ki ji je dodana koli čina 
vsake osnovne raztopine makrohranilnih snovi, navedena v preglednici 2, 
se dolije deionizirana voda do 1 litra, da se pripravi medij „M7“. Založna raztopina vitaminov se pripravi tako, da se trije vitamini dodajo v deioni ­
zirano vodo, kot je navedeno v preglednici 3, 0,1 ml sestavljene osnovne 
raztopine vitaminov pa se doda kon čnemu mediju „M7“ malo pred uporabo. 
(Založna raztopina vitaminov se shranjuje zamrznjena v majhnih alikvotih.) Medij se prezra čuje in stabilizira.
 
VIRI:  
BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Development 
and validation of a new test system. Uredila M. Streloke in H. Köpp. Berlin 
1995.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1392
 
Preglednica 1  
Založne raztopine elementov v sledeh za medija M4 in M7  
Založne raztopine (I) Količina (mg) za 
pripravo 1 litra z 
deionizirano 
vodo Za pripravo sestavljene osnovne 
raztopine (II): zmešajte naslednje 
količine (ml) osnovnih raztopin (I) in 
dopolnite do 1 litra z deionizirano 
vodo Končne koncentracije v preskusnih 
raztopinah (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na
 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na 2 EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 1 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO  4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 1 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Te snovi se pri M4 in M7 razlikujejo, kot je navedeno zgoraj. 
( 2 ) Te raztopine se pripravijo posamezno, nato zlijejo skupaj in takoj avtoklavirajo.  
Preglednica 2  
Založne raztopine makrohranilnih snovi za medija M4 in M7  
Količina za pripravo 1 
litra z deionizirano 
vodo 
(mg) Količina osnovnih raztopin 
makrohranilnih snovi za 
pripravo medijev M4 in M7 
(ml/l) Končne koncentracije 
v preskusnih 
raztopinah M4 in M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO
 3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1393
 
Preglednica 3  
Založna raztopina vitaminov za medija M4 in M7. Vse tri raztopine vitaminov so združene 
v eno.  
Količina za pripravo 1 
litra z deionizirano vodo 
(mg) Količina dodane osnovne 
raztopine vitaminov za 
pripravo medijev M4 in M7 
(ml/l) Končne koncentracije v 
preskusnih raztopinah 
M4 in M7 
(mg/l)  
Tiamin hidroklorid 750 0,1 0,075 
Cianokobalamin (B12) 10 0,1 0,0010 Biotin 7,5 0,1 0,00075
 
VIRI:  
Elendt, B. P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 
25–33. 
Elendt, B. P. in Bias, W.-R. (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia 
magna  Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Opti ­
mization of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water 
Research  24 (9): 1157–1167.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1394
 
Dodatek 3  
PRIPRAVA FORMULIRANE USEDLINE  
Sestava usedline  
Sestava formulirane usedline mora biti naslednja:  
Sestavina Zna čilnosti Delež suhe 
teže usedline v %  
Šota Šotni mah, čim bližje pH 5,5 
do 6,0, brez vidnih ostankov rastlin, fino mlet (velikost delcev ≤ 1 mm) in sušen na 
zraku. 4–5 
Kremenov pesek Velikost zrn: > 50 % delcev 
mora biti velikih 50–200 μm. 75–76 
Kaolinska glina Vsebnost kaolinita ≥ 30 %. 20 
Organski ogljik Uravnava se z dodatkom šote 
in peska. 2 (± 0,5) 
Kalcijev karbonat CaCO
 3 , zdrobljen v prah, 
kemijsko čist. 0,05–0,1 
Voda Prevodnost ≤ 10 μS/cm. 30–50  
Priprava  
Šota se posuši na zraku in zmelje v fin prah. Pripravi se suspenzija potrebne 
količine šote v prahu v deionizirani vodi, za kar se uporabi visoko zmogljiva 
naprava za homogenizacijo. pH te suspenzije se s CaCO  3 uravna na 5,5 ± 0,5. 
Suspenzija se vsaj 2 dneva kondicionira z rahlim mešanjem pri 20 ± 2 °C, da se stabilizira pH in vzpostavi stabilna mikrobna komponenta. Vrednost pH se znova izmeri in mora biti 6,0 ± 0,5. Šotna suspenzija se nato zmeša z drugimi sesta ­
vinami (peskom in kaolinsko glino) in deionizirano vodo, da nastane homogena 
usedlina z vsebnostjo vode v razponu 30 do 50 % suhe teže usedline. pH kon čne 
mešanice se znova izmeri in po potrebi uravna na 6,5 do 7,5 s CaCO
 3 . Vzamejo 
se vzorci usedline, da se dolo čita suha teža in vsebnost organskega ogljika. 
Priporoča se, da se formulirana usedlina pred uporabo v preskusu strupenosti s 
trzačami 7 dni kondicionira v enakih pogojih, kakršni vladajo v poznejšem 
preskusu.  
Shranjevanje  
Suhe sestavine za pripravo umetne usedline se lahko shranjujejo v suhem in 
hladnem prostoru pri sobni temperaturi. Formulirana (mokra) usedlina se pred uporabo v preskusu ne sme shranjevati. Uporabiti jo je treba takoj po 7-dnevnem obdobju kondicioniranja, s katerim se njena priprava kon ča.
 
VIRI:  
Poglavje C.8 te priloge. Strupenost za deževnike. 
Meller, M., Egeler, P., Rombke, J., Schallnass, H., Nagel, R., Streit, B. (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubi ­
ficid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 
39: 10–20.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1395
 
Dodatek 4  
Kemijske lastnosti sprejemljive vode za red čenje  
Snov Koncentracije  
Delci < 20 mg/l 
Celotni organski ogljik < 2 mg/l Neionizirani amoniak < 1 μg /l 
Trdota kot CaCO
 3 < 400 mg/l (*) 
Ostanek klora < 10 μg /l 
Skupni organofosforni pesticidi < 50 ng/1 Skupni organoklorni pesticidi in poliklorirani bifenili < 50 ng/1 Skupni organski klor < 25 ng/1
 
(*) Če se domneva, da bo prišlo do interakcije med ioni, ki povzro čajo trdoto vode, in 
preskusno snovjo, je treba uporabiti vodo z manjšo trdoto (v takem primeru se torej ne 
sme uporabiti medij Elendt M4).  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1396
 
Dodatek 5  
Napotek za spremljanje preobrazbe li čink trzače 
Na preskusne čaše se namestijo lovilniki za preobražene osebke. Potrebni so od 
20. dne do konca preskusa. Primer lovilnika je narisan spodaj:
  
A: najlonska mrežica 
B: obrnjen plasti čni lonček 
C: poskusna čaša brez ustja D: mrežasti okenci za izmenjavo vode 
E: voda F: usedlina
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1397
C.28  PRESKUS STRUPENOSTI S TRZA ČAMI V SISTEMU VODE IN 
USEDLINE Z UPORABO VODE S PRIMEŠANO PRESKUSNO 
SNOVJO  
UVOD 
1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD TG 219 
(2004). Zasnovana je za oceno u činkov daljše izpostavljenosti kemikalijam 
na ličinke sladkovodne trza če Chironomus  sp., ki živijo v usedlinah. Temelji 
predvsem na smernici BBA, v kateri je scenarij izpostavljenosti uporaba 
sistema vode in usedline, sestavljenega iz umetne zemljine in vodnega 
stolpca (1). Upošteva tudi obstoje če protokole za preskušanje strupenosti 
za Chironomus riparius  in Chironomus tentans , ki so bili razviti v Evropi 
in Severni Ameriki (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) ter krožno preskušeni (1) (6) 
(9). Uporabijo se lahko tudi druge dobro dokumentirane vrste trza če, npr.  
Chironomus yoshimatsui  (10) (11). 
2. Scenarij izpostavljenosti, uporabljen v tej preskusni metodi, je primešanje 
preskusne snovi v vodo. Izbira ustreznega scenarija izpostavljenosti je 
odvisna od namena uporabe preskusa. Scenarij izpostavljenosti, ki vklju čuje 
primešanje preskusne snovi v vodni stolpec, je namenjen simulaciji pojava zanašanja pesticidov in zajema za četne najvišje koncentracije v porni vodi. 
Uporaben je tudi za druge vrste izpostavljenosti (vklju čno z razlitji kemika ­
lij), razen za procese kopi čenja, ki trajajo dlje od preskusnega obdobja. 
3. Snovi, ki jih je treba preskusiti v zvezi z organizmi, žive čimi v usedlinah, se 
običajno v tem delu zelo dolgo obdržijo. Organizmi, žive či v usedlinah, so 
lahko izpostavljeni na številne na čine. Relativni pomen vsakega na čina 
izpostavljenosti in čas, da ta prispeva k skupnim strupenim u činkom, sta 
odvisna od fizikalno-kemijskih lastnosti zadevne kemikalije. Pri snoveh, ki se močno adsorbirajo (npr. z log K
 ow > 5), ali snoveh, ki se kovalentno 
vežejo na usedlino, je lahko zaužitje kontaminirane hrane pomemben na čin 
izpostavljenosti. Da ne bi podcenili strupenosti visoko lipofilnih snovi, se 
lahko predvidi uporaba hrane, dodane usedlini pred uporabo preskusne snovi. Da bi se upoštevali vsi morebitni na čini izpostavljenosti, je ta 
preskusna metoda osredoto čena na dolgoro čno izpostavljenost. Preskus za  
C. riparius  in C. yoshimatsui  traja 20 do 28 dni, za  C. tentans  pa 28 do 65 
dni. Če so za dolo čen namen potrebni kratkoro čni podatki, na primer da se 
raziščejo učinki nestabilne kemikalije, se lahko dodatne ponovitve umaknejo 
po 10 dneh. 
4. Izmerjene kon čne točke so skupno število preobraženih odraslih osebkov in 
čas do preobrazbe. Če so potrebni dodatni kratkoro čni podatki, je priporo č­
ljivo, da se preživetje in rast li čink izmerita šele po 10-dnevnem obdobju, po 
potrebi z dodatnimi ponovitvami. 
5. Priporo ča se uporaba formulirane usedline. Ta ima pred naravnimi usedli ­
nami več prednosti: 
— variabilnost pri poskusih je manjša, saj formulirana usedlina pomeni 
ponovljivo „standardizirano matrico“, poleg tega ni ve č treba iskati 
nekontaminiranih in čistih virov usedlin, 
— preskusi se lahko za čnejo kadar koli, ne da bi se bilo treba ukvarjati s 
sezonsko variabilnostjo v preskusni usedlini, poleg tega usedline ni treba predhodno obdelati, da bi se odstranila domorodna favna; s formulirano 
usedlino se tudi znižajo stroški, povezani z zbiranjem zadostne koli čine 
usedline na terenu za rutinsko preskušanje,
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1398
 
— uporaba formulirane usedline omogo ča primerjave strupenosti in 
ustrezno razvrstitev snovi: podatki o strupenosti iz preskusov z narav ­
nimi in umetnimi usedlinami so bili primerljivi za ve č kemikalij (2). 
6. Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1.  
NAČELO PRESKUSA 
7. Ličinke trza če prvega stadija so izpostavljene razponu koncentracije 
preskusne kemikalije v sistemih vode in usedline. Preskus se za čne z 
vnosom li čink prvega stadija v preskusne čaše, ki vsebujejo sistem vode 
in usedline, nato pa se preskusna snov primeša v vodo. Hitrost preobrazbe 
in razvoja trza č se izmerita ob koncu preskusa. Preživetje in teža li čink se 
lahko izmerita tudi po 10 dneh, če je to potrebno (z dodatnimi ponovitvami, 
kot je ustrezno). Ti podatki se analizirajo bodisi z regresijskim modelom, da 
se oceni koncentracija, ki bi povzro čila x-odstotno zmanjšanje preobrazbe, 
preživetja ali rasti li čink (npr. EC  15 , EC  50 itd.), bodisi s preskušanjem stati ­
stičnih domnev za dolo čitev NOEC/LOEC. Slednje zahteva primerjavo 
vrednosti u činkov s kontrolnimi vrednostmi, za kar se uporabijo statisti čni 
preskusi.  
INFORMACIJE O PRESKUSNI SNOVI 
8. Znani morajo biti vodotopnost preskusne snovi, njen parni tlak, izmerjeni ali 
izračunani koeficient porazdelitve v usedlini ter stabilnost v vodi in usedlini. 
Za določitev količine preskusne snovi v vodi nad usedlino, porni vodi in 
usedlini mora biti na voljo zanesljiva analitska metoda z znano in izpri čano 
natančnostjo in mejo zaznave. Med Koristni informaciji sta tudi strukturna 
formula in čistost preskusne snovi. Prav tako je koristno poznati obnašanje 
preskusne snovi v okolju (npr. disipacija, abiotska in biotska razgradnja 
itd.). Dodatne smernice za preskušanje snovi s fizikalno-kemijskimi last ­
nostmi, zaradi katerih je preskušanje oteženo, so navedene v (12).  
REFEREN ČNE KEMIKALIJE 
9. Redno se lahko preskušajo referen čne kemikalije, da se tako zagotavlja 
zanesljivost protokola za preskušanje in preskusnih pogojev. Primeri referen ­ 
čnih strupenih snovi, ki so bile uspešno uporabljene v krožnih preskusih in 
potrditvenih raziskavah, so: lindan, trifluralin, pentaklorofenol, kadmijev klorid in kalijev klorid (1) (2) (5) (6) (13).
 
VELJAVNOST PRESKUSA 
10. Za veljavnost preskusa morajo biti izpolnjeni naslednji pogoji: 
— preobrazba v kontrolnih posodah ob koncu preskusa mora biti vsaj 70- 
odstotna (1) (6), 
— C. riparius  in C. yoshimatsui  v kontrolnih posodah se morajo v odrasle 
osebke preobraziti med 12. in 23. dnem po vnosu v posode;  C. tentans  
potrebujejo 20 do 65 dni, 
— ob koncu preskusa je treba v vsaki posodi izmeriti pH in koncentracijo 
raztopljenega kisika. Koncentracija kisika mora biti vsaj 60 % nasi če­
nosti zraka (ASV) pri uporabljeni temperaturi, pH vode nad usedlino pa 
mora biti v vseh preskusnih posodah med 6 in 9,  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1399
 
— temperatura vode se ne sme razlikovati za ve č kot ± 1,0 °C. Tempera ­
turo vode bi bilo mogo če nadzorovati z izotermalnim prostorom; v 
takem primeru je treba temperaturo v prostoru potrjevati v ustreznih časovnih presledkih.
 
OPIS METODE  
Preskusne posode  
11. Raziskava se izvaja v steklenih 600-mililitrskih čašah z 8-centimetrskim 
premerom. Primerne so tudi druge posode, vendar morajo zagotavljati 
primerno globino usedline in vode nad njo. Površina usedline mora biti 
dovolj velika, da zagotavlja 2 do 3 cm  2 na ličinko. Razmerje med debelino 
usedline in globino vode nad njo mora biti 1 : 4. Preskusne posode in druge naprave, ki bodo prišle v stik s preskusnim sistemom, morajo biti v celoti iz 
stekla ali drugega kemijsko inertnega materiala (npr. teflona).
 
Izbira vrst  
12. Če je mogo če, naj se v preskusu uporabi vrsta  Chironomus riparius . Chiro­
nomus tentans  je prav tako primerna, vendar je z njo težje delati in zahteva 
daljše preskusno obdobje. Uporabi se lahko tudi  Chironomus yohimatsui . 
Podrobnosti o metodah gojenja za  Chironomus riparius  so navedene v 
Dodatku 2. Informacije o pogojih gojenja so na voljo tudi za druge vrste, npr. Chironomus tentans  (4) in  Chironomus yoshimatsui  (11). Identifikacijo 
vrst je treba potrditi pred preskusom, ni pa to potrebno pred vsakim presku ­
som, če organizmi prihajajo iz internega gojiš ča.
 
Usedlina  
13. Če je mogo če, je treba uporabiti formulirano usedlino (imenovano tudi 
rekonstituirana, umetna ali sinteti čna usedlina). Če se uporabi naravna used ­
lina, je treba dolo čiti njene lastnosti (vsaj pH in vsebnost organskega 
ogljika, priporo ča se tudi dolo čitev drugih parametrov, kot sta razmerje 
C/N in granulometrija), poleg tega ne sme biti onesnažena in ne sme vsebo ­
vati drugih organizmov, ki bi lahko tekmovali s trza čami ali jih požrli. Prav 
tako se priporo ča, naj se naravna usedlina pred uporabo v preskusu strupe ­
nosti s trza čami 7 dni kondicionira v enakih pogojih, kakršni vladajo v 
poznejšem preskusu. Za uporabo v tem preskusu (1) (15) (16) se priporo ča 
naslednja formulirana usedlina, ki temelji na umetni zemljini, uporabljeni v preskusni metodi C.8 (14): 
(a) 4–5 % (suhe teže) šote: čim bližje vrednosti pH 5,5 do 6,0; pomembno 
je uporabiti fino mleto šoto v prahu (velikost delcev ≤ 1 mm), sušeno 
samo na zraku; 
(b) 20 % (suhe teže) kaolinske gline (vsebnost kaolinita po možnosti nad 
30 %); 
(c) 75–76 % (suhe teže) kremenovega peska (prevladovati mora fini pesek, 
pri katerem je ve č kot 50 % delcev velikih 50 do 200 μm); 
(d) doda se deionizirana voda, tako da je v kon čni mešanici vlaga 30- do 
50-odstotna; 
(e) doda se kemijsko čist kalcijev karbonat (CaCO
 3 ), da se pH v kon čni 
mešanici usedline uravna na 7,0 ± 0,5; 
(f) vsebnost organskega ogljika v kon čni mešanici mora biti 2 % (± 0,5 %), 
uravnava pa se z ustreznimi koli činami šote in peska v skladu s to čkama 
(a) in (c).  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1400
14. Vir šote, kaolinske gline in peska mora biti znan. Preveriti je treba, da 
sestavine usedline niso kemi čno onesnažene (npr. da ne vsebujejo težkih 
kovin, organoklornih spojin, organofosfornih spojin itd.). Primer priprave formulirane usedline je opisan v Dodatku 3. Sprejemljiva je tudi mešanica suhih sestavin, če se dokaže, da se sestavine usedline po dodatku vode nad 
usedlino ne za čnejo ločevati (npr. lebdenje šotnih delcev) in da je šota ali 
usedlina zadostno kondicionirana.
 
Voda  
15. Za preskusno vodo je primerna vsaka voda, ki ustreza kemijskim zna čilno­
stim sprejemljive vode za red čenje, ki so navedene v dodatkih 2 in 4. Za 
gojiščno vodo in preskusno vodo je sprejemljiva vsaka primerna voda, 
naravna voda (površinska ali podzemna voda), obdelana voda (glej 
Dodatek 2) ali deklorirana vodovodna voda, če trzače čas gojenja in presku ­ 
šanja v njej preživijo brez znakov stresa. Na za četku preskusa mora biti pH 
preskusne vode med 6 in 9, skupna trdota pa ne sme biti višja od 400 mg/l 
kot CaCO  3 . Če se domneva, da bo prišlo do interakcije med ioni, ki povzro ­ 
čajo trdoto vode, in preskusno snovjo, je treba uporabiti vodo z manjšo 
trdoto (v takem primeru se torej ne sme uporabiti medij Elendt M4). Ves čas raziskave je treba uporabljati isto vrsto vode. Lastnosti vode, navedene v 
Dodatku 4, je treba izmeriti vsaj dvakrat na leto ali kadar se sumi, da so se 
morda te lastnosti bistveno spremenile.
 
Založne raztopine – voda s primešano preskusno snovjo  
16. Preskusne koncentracije se izra čunajo na podlagi koncentracij v vodnem 
stolpcu, tj. vodi nad usedlino. Preskusne raztopine izbranih koncentracij se 
običajno pripravijo z red čenjem osnovne raztopine. Založne raztopine je po 
možnosti treba pripraviti tako, da se preskusna snov raztopi v preskusnem mediju. V nekaterih primerih bo morda treba uporabiti topila ali disperzijska sredstva, da se pripravi primerno koncentrirana osnovna raztopina. Primerna 
topila so na primer aceteon, etanol, metanol, etilen glikol monoetil eter, 
etilen glikol dimetil eter, dimetil formamid in trietilen glikol. Disperzijska sredstva, ki se lahko uporabijo, so Cremaphor RH40, Tween 80, metil celuloza 0,01 % in HCO-40. Koncentracija topila v kon čnem preskusnem 
mediju mora biti minimalna (tj. ≤ 0,1 ml/l) in mora biti enaka v vseh 
posodah s preskusno snovjo. Kadar se uporabi topilo, to ne sme bistveno vplivati na preživetje li čink trzače ali imeti vidnih škodljivih u činkov nanje, 
kar se pokaže s kontrolno enoto, v kateri je le topilo. Vendar si je treba čim 
bolj prizadevati, da se taki materiali ne uporabijo.
 
NAČRT PRESKUSA 
17. Načrt preskusa se nanaša na izbiro števila preskusnih koncentracij in 
razmikov med njimi, število posod za vsako koncentracijo in število li čink 
na posodo. Opisani so na črti za točkovno oceno EC, oceno NOEC in 
izvedbo mejnega preskusa. Regresijska analiza je primernejša od pristopa 
s preskušanjem domnev.  
Načrt preskusa za regresijsko analizo  
18. S koncentracijami, vklju čenimi v preskus, bi morala biti zajeta efektivna 
koncentracija (npr. EC  15 , EC  50 ) in razpon koncentracije, v katerem je 
zanimiv vpliv preskusne snovi. Na splošno se natan čnost in zlasti veljav ­
nost, ki ju je mogo če doseči pri ocenah efektivnih koncentracij (EC  x ), 
izboljšata, kadar je efektivna koncentracija v okviru preskušanega razpona  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1401
 
koncentracij. Izogibati se je treba ekstrapolaciji veliko pod najnižjo pozi ­
tivno koncentracijo ali veliko nad najvišjo koncentracijo. Kot pomo č pri 
izbiri razpona koncentracij, ki bo uporabljen (glej odstavek 27), se lahko izvede predhodni preskus za ugotavljanje razpona. 
19. Če je treba oceniti EC
 x , je treba preskusiti vsaj 5 koncentracij in izvesti 3 
ponovitve za vsako koncentracijo. Vsekakor je priporo čljivo uporabiti dovolj 
preskusnih koncentracij, da se omogo či dobra ocena modela. Faktor med 
koncentracijami ne sme biti ve čji od 2 (izjema je dopustna, kadar naklon 
krivulje odmerek-u činek ni strm). Število ponovitev na posamezno posodo s 
preskusno snovjo se lahko zmanjša, če se pove ča število preskusnih koncen ­
tracij z razli čnimi učinki. Pove čanje števila ponovitev ali zmanjšanje veli ­
kosti razmikov med preskusnimi koncentracijami obi čajno vodi do ožjih 
intervalov zaupanja za preskus. Dodatne ponovitve so potrebne, če se 
ocenjujeta 10-dnevno preživetje in rast li čink. 
Načrt za oceno NOEC/LOEC  
20. Če je treba oceniti LOEC/NOEC, bi bilo treba uporabiti pet preskusnih 
koncentracij in izvesti vsaj štiri ponovitve, faktor med koncentracijami pa ne sme biti ve čji od 2. Število ponovitev mora zadostovati, da se zagotovi 
ustrezna statisti čna vrednost za ugotovitev 20-odstotne razlike v primerjavi s 
kontrolno enoto pri 5-odstotni stopnji zna čilnosti (p = 0,05). Pri hitrosti 
razvoja je obi čajno ustrezna analiza variance (ANOVA), kot sta Dunnettov 
preskus in Williamsov preskus (17) (18) (19) (20). Pri koeficientu preobrazbe se lahko uporabijo Cochran-Armitageev preskus, Fisherjev 
eksaktni preskus (z Bonferronijevim popravkom) ali Mantel-Haenszelov 
preskus.
 
Mejni preskus  
21. Če v predhodnem preskusu za ugotavljanje razpona ni bilo opaženih u čin­
kov, se lahko opravi mejni preskus (ena preskusna koncentracija in kontrolna enota). Namen mejnega preskusa je pokazati, da je toksi čna vred­
nost preskusne snovi ve čja od preskušene mejne koncentracije. Pri tej 
preskusni metodi priporo čene koncentracije ni mogo če predlagati; to je 
prepuščeno presoji regulatorjev. Obi čajno je potrebnih vsaj šest ponovitev 
za preskusne in kontrolne posode. Izkazati je treba ustrezno statisti čno 
vrednost za ugotovitev 20-odstotne razlike v primerjavi s kontrolno enoto 
pri 5-odstotni stopnji zna čilnosti (p = 0,05). Kar zadeva u činek na hitrost 
razvoja in težo, je t-preskus primerna statisti čna metoda, če podatki izpol ­
njujejo zahteve tega preskusa (normalnost, homogenost varianc). Če te 
zahteve niso izpolnjene, se lahko uporabi t-preskus za neenake variance 
ali neparametri čni preskus, kot je Wilcoxon-Mann-Whitneyjev preskus. Pri 
koeficientu preobrazbe je primeren Fisherjev eksaktni preskus.
 
POSTOPEK  
Pogoji izpostavljenosti  
Priprava sistema vode in usedline, v katerem je preskusna snov primešana v 
vodo  
22. V preskusne posode se dodajo ustrezne koli čine formulirane usedline (glej 
odstavka 13 in 14 ter Dodatek 3), da nastane plast, debela vsaj 1,5 cm. Doda se voda do globine 6 cm (glej odstavek 15). Razmerje med debelino usedline in globino vode ne sme biti ve čje od 1 : 4, usedlina pa ne sme biti 
debelejša od 3 cm. Sistem vode in usedline je treba sedem dni rahlo prezra ­ 
čevati, preden se dodajo preskusni organizmi (glej odstavek 14 in Dodatek 
3). Da se prepre či ločevanje sestavin usedline in ponovna suspenzija finega 
materiala med dodajanjem preskusne vode v vodni stolpec, se lahko used ­
lina med to čenjem vode prekrije s plasti čnim pokrovom, ki se takoj nato 
odstrani. Primerna so lahko tudi druga sredstva.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1402
 
23. Preskusne posode je treba pokriti (npr. s steklenimi ploš čami). Po potrebi se 
med raziskavo voda doto či do prvotne koli čine, da se nadomesti izhlapela 
voda. Za to je treba uporabiti destilirano ali deionizirano vodo, da se prepreči kopičenje soli.
 
Dodajanje preskusnih organizmov  
24. Od 4 do 5 dni pred vnosom preskusnih organizmov v preskusne posode je 
treba iz gojiš č vzeti jaj čna legla in jih vstaviti v majhne posode v gojit ­
venem mediju. Uporabi se lahko starejši medij iz osnovne kulture ali sveže pripravljeni medij. Če se uporabi slednji, je treba v gojitveni medij dodati 
majhno koli čino hrane, npr. zelenih alg in/ali nekaj kapljic filtrata suspenzije 
iz fino mlete ribje hrane v kosmi čih (glej Dodatek 2). Uporabiti je treba 
samo sveže odložena jaj čna legla. Obi čajno se li činke izležejo nekaj dni po 
tem, ko so bila jaj čeca odložena (2 do 3 dni za  Chironomus riparius  pri 
20 °C ter 1 do 4 dni za  Chironomus tentans  pri 23 °C in  Chironomus 
yoshimatsui  pri 25 °C), rast li čink pa poteka v 4 stadijih, od katerih vsak 
traja 4 do 8 dni. V preskusu je treba uporabiti li činke prvega stadija (2 do 3 
ali 1 do 4 dni po tem, ko se izležejo). Stadij trza č se lahko po možnosti 
preveri z merjenjem širine glave (6). 
25. 20 li čink prvega stadija se s topo pipeto naklju čno vnese v vsako preskusno 
posodo, ki vsebuje usedlino in vodo s primešano preskusno snovjo. Med 
dodajanjem li čink v preskusne posode je treba ustaviti prezra čevanje vode, 
ki se ne sme izvajati še 24 ur po tem, ko so bile li činke dodane (glej 
odstavka 24 in 32). Glede na uporabljeni na črt preskusa (glej odstavka 19 
in 20) se za to čkovno oceno EC uporabi vsaj 60 li čink na koncentracijo, za 
določitev NOEC pa 80. 
26. 24 ur po vnosu li čink se preskusna snov vmeša v vodni stolpec nad used ­
lino, znova se zagotovi prezra čevanje. Pod površino vodnega stolpca se s 
pipeto vnesejo majhne koli čine raztopine preskusne snovi. Vodo nad used ­
lino je nato treba premešati, pri čemer je treba paziti, da se ne premeša še 
usedlina.
 
Preskusne koncentracije  
27. Preskus za ugotavljanje razpona je lahko koristen za dolo čitev razpona 
koncentracij za kon čni preskus. Za ta namen se uporabi niz široko razma ­
knjenih koncentracij preskusne snovi. Da se zagotovi enaka gostota površine 
na trzačo, kot bo uporabljena za kon čni preskus, se trza če izpostavijo vsaki 
koncentraciji preskusne snovi za obdobje, ki omogo ča oceno ustreznih 
preskusnih koncentracij, pri čemer ponovitve niso potrebne. 
28. Preskusne koncentracije za kon čni preskus se dolo čijo na podlagi rezultata 
preskusa za ugotavljanje razpona. Izbrati in uporabiti je treba vsaj pet 
koncentracij, kot je opisano v odstavkih 18 do 20.  
Kontrolne enote  
29. V preskus je treba vklju čiti kontrolne posode, v katerih ni preskusne snovi, 
toda ki vsebujejo usedlino, z ustreznim številom ponovitev (glej odstavka 19 in 20). Če je bilo za aplikacijo preskusne snovi uporabljeno topilo (glej 
odstavek 16), je treba dodati kontrolno posodo, katere usedlina vsebuje 
tudi topilo.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1403
 
Preskusni sistem  
30. Uporabljajo se stati čni sistemi. Polstati čni ali preto čni sistemi z ob časnim ali 
kontinuiranim obnavljanjem vode nad usedlino se lahko uporabijo v izjemnih primerih, na primer če specifikacije kakovosti vode postanejo 
neprimerne za preskusni organizem ali vplivajo na kemijsko ravnotežje 
(npr. ravni raztopljenega kisika se preve č znižajo, koncentracija izlo čkov 
se preveč poviša ali minerali iztekajo iz usedline in vplivajo na pH in/ali 
trdoto vode). Vendar za izboljšanje kakovosti vode nad usedlino obi čajno 
zadoščajo in se prednostno uporabljajo druge metode, kot je prezra čevanje.
 
Hrana  
31. Ličinke je treba hraniti, po možnosti vsak dan ali vsaj trikrat na teden. Za 
mlade ličinke v prvih desetih dneh ustreza 0,25–0,5 mg (0,35–0,5 mg za  C. 
yoshimatsui ) ribje hrane (suspenzija v vodi ali fino mleta hrana, npr. 
TetraMin ali TetraPhyll; glej podrobnosti v Dodatku 2) na li činko na dan. 
Nekoliko ve č hrane bodo morda potrebovale starejše li činke: za preostanek 
preskusa mora zadostovati 0,5–1 mg na li činko na dan. Obrok hrane je treba 
zmanjšati v vseh preskusnih in kontrolnih posodah, če se opazi rast glivic ali 
smrtnost v kontrolnih posodah. Če razvoja glivic ni mogo če ustaviti, je treba 
preskus ponoviti. Kadar se preskušajo snovi, ki se mo čno adsorbirajo (npr. z 
log K  ow > 5), ali snovi, ki se kovalentno vežejo na usedlino, se lahko 
količina hrane, potrebna za zagotovitev preživetja in naravne rasti organ ­
izmov, doda formulirani usedlini pred obdobjem stabilizacije. Za to je treba 
namesto ribje hrane uporabiti rastlinski material, npr. dodatek 0,5 % (suhe 
teže) fino mletih listov npr. velike koprive ( Urtica dioica ), bele murve 
(Morus alba ), plazeče detelje ( Trifolium repens ), špinače (Spinacia olera ­
cea) ali drugega rastlinskega materiala ( Cerophyl  ali alfa celuloza).  
Pogoji inkubacije  
32. Zagotovi se rahlo prezra čevanje vode nad usedlino v preskusnih posodah, 
po možnosti 24 ur po vnosu li čink, in se izvaja ves čas preskusa (paziti je 
treba, da koncentracija raztopljenega kisika ne pade pod 60 % ASV). 
Prezračevanje se zagotavlja prek steklene pasteurjeve pipete, pritrjene 2 do 
3 cm nad plastjo usedline (tj. 1 ali nekaj mehur čkov/s). Kadar se preskušajo 
hlapne kemikalije, je mogo če razmisliti o tem, da se sistem vode in usedline 
ne bi prezra čeval. 
33. Preskus se izvaja pri konstantni temperaturi 20 °C (± 2 °C). Za  C. tentans  in 
C. yoshimatsui  sta priporo čeni temperaturi 23 °C oziroma 25 °C (± 2 °C). 
Uporablja se 16-urno obdobje osvetljenosti, jakost svetlobe pa mora biti 500 do 1 000 lux.
 
Trajanje izpostavljenosti  
34. Izpostavljenost se za čne z vnosom li čink v posode s primešano preskusno 
snovjo in kontrolne posode. Najdaljši čas izpostavljenosti za  C. riparius  in 
C. yoshimatsui  je 28 dni, za  C. tentans  pa 65 dni. Če se ličinke v odrasle 
osebke preobrazijo prej, se lahko preskus kon ča najmanj pet dni po 
preobrazbi zadnjega odraslega osebka v kontrolni posodi.  
OPAŽANJA  
Preobrazba  
35. Dolo čita se čas razvoja in skupno število v celoti preobraženih samcev in 
samic trza če. Samce je mogo če preprosto prepoznati po pahlja častih tipal ­
kah. ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1404
 
36. Preskusne posode je treba opazovati vsaj trikrat na teden, da se ugotovi 
kakršno koli neobi čajno obnašanje (npr. zapuš čanje usedline, nenavadno 
plavanje) v primerjavi s kontrolno posodo. V obdobju pri čakovane 
preobrazbe je potrebno dnevno štetje preobraženih trza č. Spol in število v 
celoti preobraženih trza č se zapišeta dnevno. Po identifikaciji se trza če 
odstranijo iz posod. Vsa jaj čna legla, odložena pred zaklju čkom preskusa, 
je treba evidentirati in nato odstraniti, da se prepre či vnovični vnos li čink v 
usedlino. Evidentira se tudi število vidnih bub, ki se niso preobrazile. Napotek za spremljanje preobrazbe je v Dodatku 5.
 
Rast in preživetje  
37. Če je treba zagotoviti podatke o 10-dnevnem preživetju in rasti li čink, je 
treba na za četku vklju čiti dodatne preskusne posode, ki se lahko uporabijo 
pozneje. Usedlina iz teh dodatnih posod se preseje skozi sito z 250 μm 
velikimi luknjicami, da se zadržijo li činke. Merili za pogin sta negibnost 
ali neodzivnost na mehanske dražljaje. Li činke, ki ostanejo v usedlini, je 
prav tako treba šteti za mrtve (li činke, ki so poginile na za četku preskusa, so 
morda razgradili mikrobi). Dolo či se suha teža (brez pepela) preživelih 
ličink na preskusno posodo in izra čuna srednja suha teža posamezne li činke 
na posodo. Koristno je dolo čiti, v kateri stadij spadajo preživele li činke; za 
to se lahko izmeri širina glave vsakega osebka.  
Analitske meritve  
Koncentracija preskusne snovi  
38. Na za četku (po možnosti 1 uro po vnosu preskusne snovi) in koncu 
preskusa je treba analizirati vsaj vzorce vode nad usedlino, porne vode in 
usedline, in sicer pri najvišji in nižji koncentraciji. Te dolo čitve koncentra ­
cije preskusne snovi pokažejo obnašanje/porazdelitev preskusne snovi v sistemu vode in usedline. Vzor čenje usedline na za četku preskusa lahko 
vpliva na preskusni sistem (npr. odstranitev preskusnih li čink), zato je 
treba za analitske dolo čitve na za četku preskusa in med njim po potrebi 
uporabiti dodatne preskusne posode (glej odstavek 39). Meritve v usedlini morda ne bodo potrebne, če je bila porazdelitev preskusne snovi med vodo 
in usedlino jasno dolo čena z raziskavo vode/usedline v primerljivih pogojih 
(npr. razmerje usedline in vode, vrsta uporabe, vsebnost organskega ogljika v usedlini). 
39. Kadar se izvajajo vmesne meritve (npr. sedmi dan) in če so za analize 
potrebni veliki vzorci, ki jih ni mogo če vzeti iz preskusnih posod, ne da 
bi to vplivalo na preskusni sistem, je treba analitske dolo čitve izvesti na 
vzorcih iz dodatnih preskusnih posod, ki se obdelujejo enako (vklju čno s 
prisotnostjo preskusnih organizmov), vendar se za biološka opažanja ne 
uporabljajo. 
40. Za izolacijo intersticijske vode se priporo ča 30-minutno centrifugiranje pri 
npr. 10 000 g in 4 °C. Če pa se za preskusno snov izkaže, da se ne adsor ­
bira na filtre, je sprejemljivo tudi filtriranje. V nekaterih primerih morda 
koncentracij v porni vodi zaradi premajhnega vzorca ne bo mogo če anali­
zirati.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1405
 
Fizikalno-kemijski parametri  
41. Vrednost pH, raztopljeni kisik v preskusni vodi in temperaturo preskusnih 
posod je treba ustrezno meriti (glej odstavek 10). Trdoto in amonij je treba izmeriti v kontrolnih posodah in eni preskusni posodi pri najvišji koncen ­
traciji na za četku in koncu preskusa.
 
PODATKI IN PORO ČANJE  
Obdelava rezultatov  
42. Namen tega preskusa je dolo čiti učinek preskusne snovi na hitrost razvoja in 
skupno število v celoti preobraženih samcev in samic trza če oziroma, pri 10- 
dnevnem preskusu, u činke na preživetje in težo li čink. Če ni znakov o 
statistično različni občutljivosti spolov, se lahko rezultati za samce in samice 
za statisti čne analize združijo. Razlike v ob čutljivosti med spoloma je 
mogoče statistično oceniti, na primer s preskusom χ 2 -r × 2. Po potrebi je 
treba po 10 dneh dolo čiti preživetje li čink in srednjo suho težo posamezne 
ličinke na posodo. 
43. Če je mogo če, se efektivne koncentracije, izražene kot koncentracije v vodi 
nad usedlino, izra čunajo na podlagi izmerjenih koncentracij na za četku 
preskusa (glej odstavek 38). 
44. Za to čkovno oceno EC  50 ali druge EC  x se lahko statisti čni podatki po 
posameznih posodah uporabijo kot dejanske ponovitve. Pri izra čunu inter ­
vala zaupanja za EC  x je treba upoštevati variabilnost med posodami ali pa 
dokazati, da je ta zanemarljiva. Če se model prilega po metodi najmanjših 
kvadratov, je treba statisti čne podatke po posameznih posodah transformi ­
rati, da se izboljša homogenost variance. Vendar je treba vrednosti EC  x 
izračunati po tem, ko so bili rezultati transformirani nazaj na prvotno vred ­
nost. 
45. Kadar je namen statisti čne analize dolo čiti NOEC/LOEC s preskušanjem 
domnev, je treba upoštevati variabilnost med posodami, npr. z vgnezdeno 
ANOVO. Alternativno se lahko uporabijo robustnejši preskusi (21), kadar so običajne predpostavke ANOVE kršene.
 
Koeficient preobrazbe  
46. Koeficient preobrazbe da odgovor „vse ali ni č“ in se lahko analizira s 
Cochran-Armitageevim preskusom, uporabljenim regresivno (step-down), 
kadar se pri čakuje monotono razmerje odmerek-u činek in so ti podatki v 
skladu s tem pri čakovanjem. Če niso, se lahko uporabi Fisherjev eksaktni 
preskus ali Mantel-Haenszelov preskus z Bonferroni-Holmovimi popravlje ­
nimi p-vrednostmi. Če se izkaže, da je variabilnost med ponovitvami v 
okviru iste koncentracije ve čja, kot bi kazala binomska porazdelitev 
(pogosto imenovana „ekstra-binomska“ variacija), potem je treba uporabiti robustni Cochran-Armitageev preskus ali Fisherjev eksaktni preskus, kot je predlagano v (21). 
47. Vsota preobraženih trza č na posodo ne se dolo či in deli s številom vnesenih 
ličink na:  
ER ¼
 n e 
n a ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1406
 
pri čemer je:  
ER = koeficient preobrazbe,  
n e = število preobraženih trza č na posodo,  
n a = število vnesenih li čink na posodo. 
48. Druga možnost, ki je najprimernejša za velike vzorce, kadar obstaja ekstra 
binomska varianca, je, da se koeficient preobrazbe obravnava kot zvezni 
odgovor in se uporabijo postopki, kot je Williamsov preskus, kadar se pričakuje monotono razmerje odmerek-u činek in kadar podatki ER potrju ­
jejo to predpostavko. Dunettov preskus je primeren, kadar monotonost ne 
drži. Velik vzorec je tu opredeljen kot število preobraženih osebkov in 
število nepreobraženih osebkov po posameznih ponovitvah (posodah), pri čemer je obojih ve č kot pet. 
49. Za uporabo metod ANOVA je treba vrednosti ER najprej transformirati z 
arkus sinus-korensko transformacijo ali Freeman-Tukeyevo transformacijo, 
da se dobi približna normalna porazdelitev in da se variance izena čijo. 
Cochran-Armitageev preskus, Fisherjev eksaktni preskus (Bonferroni) ali Mantel-Haenszelov preskus se lahko uporabijo, kadar se uporabljajo abso ­
lutne pogostosti. Pri arkus sinus-korenski transformaciji se izra čuna arkus 
sinus (sin
 –1 ) kvadratnega korena ER. 
50. Za koeficiente preobrazbe se vrednosti EC  x izračunajo z regresijsko analizo 
(ali npr. probit (22), logit, Weibull, ustrezno programsko opremo itd.). Če 
regresijska analiza ni uspešna (npr. kadar sta manj kot dva delna odgovora), 
se uporabijo druge neparametri čne metode, kot sta drse če povpre čje ali 
linearna interpolacija.  
Hitrost razvoja  
51. Srednji čas razvoja pomeni srednji časovni razpon med vnosom li čink (dan 
0 preskusa) in preobrazbo poskusne kohorte trza č. (Za izra čun dejanskega 
časa razvoja je treba upoštevati starost li čink ob vnosu.) Hitrost razvoja je 
obratna času razvoja (enota: 1/dan) in predstavlja tisti delež razvoja li čink, 
ki se zgodi na dan. Za oceno teh raziskav strupenosti v usedlini je primer ­
nejša hitrost razvoja, saj je njena varianca manjša, poleg tega je bolj homo ­
gena in bližje normalni porazdelitvi v primerjavi s časom razvoja. Zato so 
učinkoviti parametri čni preskusi primernejši za hitrost razvoja kot za čas 
razvoja. Če se hitrost razvoja obravnava kot zvezni odgovor, se lahko vred ­
nosti EC  x ocenijo z regresijsko analizo (npr. (23) (24)). 
52. Za naslednje statisti čne preskuse se za število trza č, opaženih na dan opazo ­
vanja x, domneva, da so se preobrazile na sredini časovnega intervala med 
dnevom × in dnevom x – 1 (l = dolžina intervala opazovanja, obi čajno 1 
dan). Srednja hitrost razvoja na posodo ( x) se izračuna z ena čbo: 
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e 
pri čemer je:  
x: srednja hitrost razvoja na posodo, 
i: indeks intervala opazovanja, 
m: najve čje število intervalov opazovanja,  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1407
 
ƒ i : število trza č, preobraženih v intervalu opazovanja i, 
n e : skupno število preobraženih trza č ob koncu poskusa, (=  P ƒ i ) 
x: hitrost razvoja trza č, preobraženih v intervalu i. 
x i ¼ 1= Ê 
day  i Ä l i 
2 Ì 
pri čemer je: 
day  i : dan opazovanja (dnevi od vnosa), 
l i : dolžina intervala opazovanja i (dnevi, obi čajno 1 dan).  
Poročilo o preskusu  
53. V poro čilu o preskusu morajo biti vsaj naslednje informacije:  
Preskusna snov:  
— fizikalno stanje, in kjer je ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti (vodo ­
topnost, parni tlak, porazdelitveni koeficient v tleh (ali v usedlini, če je 
na voljo), stabilnost v vodi itd.), 
— kemijski identifikacijski podatki (splošno ime, kemijsko ime, strukturna 
formula, številka CAS itd.), vklju čno s čistostjo in analitsko metodo za 
količinsko dolo čanje preskusne snovi.  
Preskusne vrste:  
— uporabljene preskusne živali: vrsta, znanstveno ime, vir organizmov in 
pogoji razmnoževanja, 
— informacije o ravnanju z jaj čnimi legli in li činkami, 
— starost preskusnih živali ob vnosu v preskusne posode.  
Preskusni pogoji:  
— uporabljena usedlina, tj. naravna ali formulirana, — za naravno usedlino lokacija in opis mesta vzor čenja usedline, vklju čno, 
če je mogo če, s preteklim onesnaženjem, zna čilnosti: pH, vsebnost 
organskega ogljika, razmerje C/N in granulometrija ( če je ustrezno), 
— priprava formulirane usedline: sestavine in zna čilnosti (vsebnost organ ­
skega ogljika, pH, vlaga itd. na za četku preskusa), 
— priprava preskusne vode ( če se uporablja obdelana voda) in zna čilnosti 
(koncentracija kisika, pH, prevodnost, trdota itd. na za četku preskusa), 
— globina usedline in vode nad njo, — količina vode nad usedlino in porne vode; teža mokre usedline s porno 
vodo in brez nje, 
— preskusne posode (material in velikost), — način priprave osnovnih raztopin in preskusnih koncentracij,
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1408
 
— uporaba preskusne snovi: uporabljene preskusne koncentracije, število 
ponovitev in uporaba topila, če je bilo uporabljeno, 
— pogoji inkubacije: temperatura, svetlobni ciklus in jakost svetlobe, 
prezračevanje (pogostost in jakost), 
— podrobne informacije o hranjenju, vklju čno z vrsto hrane, pripravo, 
količino in na činom.  
Rezultati:  
— nazivne preskusne koncentracije, izmerjene preskusne koncentracije in 
rezultati vseh analiz za dolo čitev koncentracije preskusne snovi v 
preskusni posodi, 
— kakovost vode v preskusnih posodah, tj. pH, temperatura, raztopljeni 
kisik, trdota in amonij, 
— morebitna nadomestitev izhlapele preskusne vode, 
— število preobraženih samcev in samic trza če na posodo in na dan, 
— število li čink, ki se niso preobrazile v trza če, na posodo, 
— srednja suha teža posamezne li činke na posodo in po stadijih, če je 
ustrezno, 
— delež preobrazbe na ponovitev in preskusno koncentracijo (združeni 
samci in samice trza če), 
— srednja hitrost razvoja v celoti preobraženih trza č na ponovitev in 
stopnjo koncentracije (združeni samci in samice trza če), 
— ocene strupenih kon čnih točk, npr. ECx (in s tem povezani intervali 
zaupanja), NOEC in/ali LOEC, ter statisti čne metode, uporabljene za 
njihovo dolo čitev, 
— obravnava rezultatov, vklju čno z vsemi vplivi na rezultat preskusa, ki 
izvirajo iz odstopanj od te preskusne metode.  
VIRI:  
(1) BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Develop ­
ment and validation of a new test system. Uredila M. Streloke in H. Köpp. Berlin 1995. 
(2) Fleming, R., idr. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Kon čno poročilo za Evropsko komisijo. Poro čilo št.: EC 3738. 
Avgust 1994. WRc, Združeno kraljestvo. 
(3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioas ­
says for Freshwater and Marine Environments. Z delavnice WOSTA, ki je 
potekala na Nizozemskem. 
(4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the 
Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebra ­
tes. pp 1125-1241. V ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Zvezek 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. 
(5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. 
(6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Druga 
izdaja. EPA 600/R-99/064. Marec 2000. Sprememba prve izdaje iz junija 
1994.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1409
 
(7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates. 
(8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. (9) Milani, D., Day, K. E., McLeay, D. J., Kirby, R. S. (1996). Recent intra- 
and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  
(Chironomus riparius).  Technical Report. Environment Canada. National 
Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. 
(10) Sugaya, Y. (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecti ­
cides  in Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350. 
(11) Kawai, K. (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47–57. 
(12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Diffi ­
cult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety 
Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. 
(13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxi ­
city Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxi ­
cant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. 
(14) Poglavje C.8 te priloge, Strupenost za deževnike. (15) Suedel, B. C., in Rodgers, J. H. (1994). Development of formulated refe ­
rence sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. 
Toxicol. Chem. 13: 1163–1175. 
(16) Naylor, C., in Rodrigues, C. (1995). Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303. 
(17) Dunnett, C. W. (1964). A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096–1121. 
(18) Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics 20: 482–491. 
(19) Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means 
when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 
27: 103–117. 
(20) Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero 
dose control. Biometrics 28: 510–531. 
(21) Rao, J. N. K., in Scott, A. J. (1992). A simple method for the analysis of 
clustered binary data. Biometrics 48: 577–585. 
(22) Christensen, E. R. (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity 
testing and the Weibull model. Water Research 18: 213–221. 
(23) Bruce in Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous 
toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485–1494. 
(24) Slob, W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxi ­
col. Sci. 66: 298–312.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1410
 
Dodatek 1  
OPREDELITEV POJMOV 
Za to metodo se uporabljajo naslednje opredelitve pojmov:  
formulirana usedlina  ali rekonstituirana, umetna ali sinteti čna usedlina je zmes 
snovi, uporabljenih za posnemanje fizi čnih sestavin naravne usedline;  
voda nad usedlino  je voda, ki se nalije nad usedlino v preskusni posodi;  
intersticijska voda  ali porna voda je voda, ki zavzema prostor med delci used ­
line in zemljine;  
voda s primešano snovjo  je preskusna voda, ki ji je bila dodana preskusna snov;  
preskusna kemikalija  je snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne 
metode.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1411
 
Dodatek 2  
Priporočila za gojenje  Chironomus riparius  
1. Ličinke Chironomus  se lahko gojijo v kristalizirkah ali ve čjih vsebnikih. Na 
dno vsebnika se nanese tanka plast finega kremenovega peska (debela približno 5 do 10 mm). Za primeren substrat se je izkazal tudi kieselguhr (npr. Merck, Art 8117) (zadoš ča tanjša plast, debela samo nekaj mm). Nato 
se doda primerna voda do globine ve č cm. Vodo je treba po potrebi doto ­ 
čiti, da se nadomestijo izgube zaradi izhlapevanja in prepre či izsušitev. 
Voda se po potrebi lahko zamenja. Zagotoviti je treba rahlo prezra čevanje. 
Posode, v katerih se gojijo li činke, morajo biti v primerni kletki, ki bo 
preprečila pobeg odraslih preobraženih osebkov. Kletka mora biti dovolj 
velika, da lahko preobraženi odrasli osebki rojijo, sicer se lahko zgodi, da ne bo parjenja (najmanjša velikost je približno 30 × 30 × 30 cm). 
2. Kletke morajo biti v prostoru s sobno temperaturo ali prostoru s stalnim 
ozračjem pri 20 ± 2 °C s 16-urnim obdobjem svetlobe (jakost približno 
1 000 lux) in 8-urno temo. Po poro čilih lahko manj kot 60-odstotna rela ­
tivna vlažnost zraka ovira razmnoževanje.
 
Voda za red čenje 
3. Uporabi se lahko vsaka primerna naravna ali sinteti čna voda. Obi čajno se 
uporabljajo voda iz vodnjaka, deklorirana vodovodna voda in umetni mediji 
(npr. medij Elendt „M4“ ali „M7“, glej spodaj). Vodo je treba pred uporabo 
prezračiti. Voda za gojenje se lahko po potrebi obnovi, tako da se upora ­
bljena voda iz gojitvenih posod skrbno preto či ali izsesa, ne da bi pri tem 
uničili ovoj li čink. 
Hranjenje li čink 
4. Ličinke Chironomus  je treba hraniti s približno 250 mg ribje hrane v 
kosmičih (TetraMin®, TetraPhyll® ali druga podobna zaš čitena znamka 
ribje hrane) na posodo na dan. Hrana se lahko daje v obliki suhega mletega prahu ali kot suspenzija v vodi: 1,0 g hrane v kosmi čih se doda 20 ml vode 
za redčenje in zmeša, da nastane homogena mešanica. Ta pripravek se lahko 
daje v koli čini približno 5 ml na posodo na dan (pred uporabo ga je treba 
pretresti). Starejše li činke lahko dobijo ve č hrane. 
5. Hranjenje se prilagaja kakovosti vode. Če gojitveni medij postane „moten“, 
je treba hranjenje zmanjšati. Dodajanje hrane je treba skrbno spremljati. 
Premalo hrane bo povzro čilo selitev li čink v vodni stolpec, preve č hrane 
pa povečano mikrobno dejavnost in zmanjšane koncentracije kisika. Oboje 
lahko privede do po časnejše rasti. 
6. Ko se pripravijo nove gojitvene posode, se lahko dodajo tudi celice neka ­
terih zelenih alg (npr.  Scenedesmus subspicatus , Chlorella vulgaris) .
 
Hranjenje preobraženih odraslih osebkov  
7. Nekateri raziskovalci so predlagali, da se lahko kot hrana za odrasle 
preobražene osebke uporabi vatna blazinica, namo čena v nasi čeno raztopino 
saharoze.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1412
 
Preobrazba  
8. Pri 20 ± 2 °C se bo preobrazba v odrasle osebke iz posod za gojenje li čink 
začela po približno 13 do 15 dneh. Samce je mogo če preprosto prepoznati 
po pahlja častih tipalkah.  
Jajčna legla  
9. Ko so v kletki za razmnoževanje odrasli osebki, je treba vse posode za 
gojenje li čink trikrat tedensko preveriti zaradi morebitnih odloženih želati ­
nastih jajčnih legel, ki jih je treba previdno odstraniti. Prenesti jih je treba v 
majhno posodo, ki vsebuje vzorec vode za razmnoževanje. Jaj čna legla se 
uporabijo za pripravo nove gojitvene posode (npr. 2 do 4 jaj čna legla/po ­
sodo) ali za preskuse strupenosti. 
10. Ličinke prvega stadija bi se morale izle či po 2 ali 3 dneh.  
Priprava novih gojitvenih posod  
11. Ko so gojiš ča vzpostavljena, bi moralo biti mogo če novo gojitveno posodo 
za ličinke pripraviti vsak teden ali manj pogosto, odvisno od zahtev presku ­ 
šanja, stare posode pa odstraniti, ko se li činke preobrazijo v odrasle osebke. 
S takim sistemom bo najpreprosteje zagotovljena redna oskrba z odraslimi osebki.
 
Priprava preskusnih raztopin „M4“ in „M7“  
12. Elendt (1990) je opisal medij „M4“. Medij „M7“ se pripravi kot medij 
„M4“, razen za snovi, navedene v preglednici 1, za katere so koncentracije pri „M7“ štirikrat nižje kot pri „M4“. Publikacija o mediju „M7“ je v pripravi (Elendt, osebno sporo čilo). Preskusna raztopina se ne sme pripraviti 
po Elendt in Bias (1990), saj koncentracije NaSiO
 3 5 H  2 O, NaNO  3 , 
KH  2 PO 4 in K  2 HPO  4 , navedene za pripravo osnovnih raztopin, niso ustre ­
zne. 
Priprava medija „M7“  
13. Vsaka osnovna raztopina (I) se pripravi posebej, sestavljena osnovna 
raztopina (II) pa se pripravi iz teh osnovnih raztopin (I) (glej preglednico 
1). V 50 ml sestavljene osnovne raztopine (II), ki ji je dodana koli čina 
vsake osnovne raztopine makrohranilnih snovi, navedena v preglednici 2, 
se dolije do 1 litra deionizirana voda, da se pripravi medij „M7“. Založna 
raztopina vitaminov se pripravi tako, da se trije vitamini dodajo v deioni ­
zirano vodo, kot je navedeno v preglednici 3, 0,1 ml sestavljene osnovne raztopine vitaminov pa se doda kon čnemu mediju „M7“ malo pred uporabo. 
(Založna raztopina vitaminov se shranjuje zamrznjena v majhnih alikvotih.) 
Medij se prezra čuje in stabilizira.
 
Preglednica 1  
Založne raztopine elementov v sledeh za medija M4 in M7  
Založne raztopine (I) Količina (mg) za 
pripravo 1 litra z 
deionizirano 
vodo Za pripravo sestavljene osnovne 
raztopine (II): zmešajte naslednje 
količine (ml) osnovnih raztopin (I) in 
dopolnite do 1 litra z deionizirano 
vodo Končne koncentracije v preskusnih 
raztopinah (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1413
 
Založne raztopine (I) Količina (mg) za 
pripravo 1 litra z 
deionizirano 
vodo Za pripravo sestavljene osnovne 
raztopine (II): zmešajte naslednje 
količine (ml) osnovnih raztopin (I) in 
dopolnite do 1 litra z deionizirano 
vodo Končne koncentracije v preskusnih 
raztopinah (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na2EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 1 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 1 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Te snovi se pri M4 in M7 razlikujejo, kot je navedeno zgoraj. 
( 2 ) Te raztopine se pripravijo posamezno, nato zlijejo skupaj in takoj avtoklavirajo.  
Preglednica 2  
Založne raztopine makrohranilnih snovi za medija M4 in M7  
Količina za pripravo 1 
litra z deionizirano 
vodo 
(mg) Količina osnovnih raztopin 
makrohranilnih snovi za 
pripravo medijev M4 in M7 
(ml/l) Končne koncentracije 
v preskusnih 
raztopinah M4 in M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 
NaHCO  3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1414
 
Preglednica 3  
Založna raztopina vitaminov za medija M4 in M7  
Vse tri raztopine vitaminov so združene v eno.  
Količina za pripravo 1 
litra z deionizirano vodo 
(mg) Količina dodane osnovne 
raztopine vitaminov za 
pripravo medijev M4 in M7 
(ml/l) Končne koncentracije v 
preskusnih raztopinah 
M4 in M7 
(mg/l)  
Tiamin hidroklorid 750 0,1 0,075 
Cianokobalamin (B12) 10 0,1 0,0010 
Biotin 7,5 0,1 0,00075  
VIRI:  
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and 
validation of a new test system. Uredila M. Streloke in H. Köpp. Berlin 1995. 
Elendt, B. P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 
25–33. 
Elendt, B. P., in Bias, W.-R. (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia 
magna  Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Opti ­
mization of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water 
Research  24 (9): 1157–1167.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1415
 
Dodatek 3  
PRIPRAVA FORMULIRANE USEDLINE  
Sestava usedline  
Sestava formulirane usedline mora biti naslednja:  
Sestavina Zna čilnosti Delež suhe 
teže usedline v %  
Šota Šotni mah, čim bližje pH 5,5 
do 6,0, brez vidnih ostankov 
rastlin, fino mlet (velikost 
delcev ≤ 1 mm) in sušen na 
zraku. 4–5 
Kremenov pesek Velikost zrn: > 50 % delcev 
mora biti velikih 50–200 μm. 75–76 
Kaolinska glina Vsebnost kaolinita ≥ 30 %. 20 
Organski ogljik Uravnava se z dodatkom šote 
in peska. 2 (± 0,5) 
Kalcijev karbonat CaCO  3 , zdrobljen v prah, 
kemijsko čist. 0,05–0,1 
Voda Prevodnost ≤ 10 μS/cm. 30–50  
Priprava  
Šota se posuši na zraku in zmelje v fin prah. Pripravi se suspenzija potrebne 
količine šote v prahu v deionizirani vodi, za kar se uporabi visoko zmogljiva 
naprava za homogenizacijo. pH te suspenzije se s CaCO  3 uravna na 5,5 ± 0,5. 
Suspenzija se vsaj 2 dneva kondicionira z rahlim mešanjem pri 20 ± 2 °C, da se 
stabilizira pH in vzpostavi stabilna mikrobna komponenta. Vrednost pH se znova 
izmeri in mora biti 6,0 ± 0,5. Šotna suspenzija se nato zmeša z drugimi sesta ­
vinami (peskom in kaolinsko glino) in deionizirano vodo, da nastane homogena 
usedlina z vsebnostjo vode v razponu 30 do 50 % suhe teže usedline. pH kon čne 
mešanice se znova izmeri in po potrebi uravna na 6,5 do 7,5 s CaCO  3 . Vzamejo 
se vzorci usedline, da se dolo čita suha teža in vsebnost organskega ogljika. 
Priporoča se, da se formulirana usedlina pred uporabo v preskusu strupenosti s 
trzačami 7 dni kondicionira v enakih pogojih, kakršni vladajo v poznejšem 
preskusu.  
Shranjevanje  
Suhe sestavine za pripravo umetne usedline se lahko shranjujejo v suhem in 
hladnem prostoru pri sobni temperaturi. Formulirana (mokra) usedlina se pred uporabo v preskusu ne sme shranjevati. Uporabiti jo je treba takoj po 7-dnevnem obdobju kondicioniranja, s katerim se njena priprava kon ča.
 
VIRI:  
Poglavje C.8 te priloge. Strupenost za deževnike. 
Meller, M., Egeler, P., Rombke, J., Schallnass, H., Nagel, R., Streit, B. (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubi ­
ficid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 
39: 10–20.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1416
 
Dodatek 4  
Kemijske lastnosti sprejemljive vode za red čenje  
Snov Koncentracije  
Delci < 20 mg/l 
Celotni organski ogljik < 2 mg/l Neionizirani amoniak < 1 μg /l 
Trdota kot CaCO
 3 < 400 mg/l (*) 
Ostanek klora < 10 μg /l 
Skupni organofosforni pesticidi < 50 ng/1 Skupni organoklorni pesticidi in poliklorirani bifenili < 50 ng/1 Skupni organski klor < 25 ng/1
 
(*) Če se domneva, da bo prišlo do interakcije med ioni, ki povzro čajo trdoto vode, in 
preskusno snovjo, je treba uporabiti vodo z manjšo trdoto (v takem primeru se torej ne 
sme uporabiti medij Elendt M4).  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1417
 
Dodatek 5  
Napotek za spremljanje preobrazbe li čink trzače 
Na preskusne čaše se namestijo lovilniki za preobražene osebke. Potrebni so od 
20. dne do konca preskusa. Primer lovilnika je narisan spodaj:
  
A: najlonska mrežica 
B: obrnjen plasti čni lonček 
C: poskusna čaša brez ustja D: mrežasti okenci za izmenjavo vode 
E: voda 
F: usedlina  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1418
 
C.29.  DOBRA BIORAZGRADLJIVOST – CO  2 V ZAPRTIH POSODAH 
(PRESKUS NADPROSTORA)  
UVOD 
1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 310 
(2006). Je presejalna metoda za ocenjevanje dobre biološke razgradljivosti 
kemikalij in daje podobne informacije kot šest preskusnih metod, opisanih v poglavju C.4, A–F, te priloge. Zato se lahko kemikalija, pri kateri so rezul ­
tati te preskusne metode pozitivni, šteje za dobro biološko razgradljivo in 
zato hitro razgradljivo v okolju. 
2. Uveljavljena metoda z ogljikovim dioksidom (CO
 2 ) (1), ki temelji na 
izvirnem Sturmovem preskusu (2) za ocenjevanje biološke razgradljivosti 
organskih kemikalij z merjenjem ogljikovega dioksida, ki je nastal zaradi mikrobne dejavnosti, je obi čajno prva izbira za preskušanje slabo topnih in 
močno adsorptivnih kemikalij. Izbere se tudi za topne (vendar ne hlapne) 
kemikalije, ker številni menijo, da je nastajanje ogljikovega dioksida edini nedvoumni dokaz mikrobne dejavnosti. Raztopljeni organski ogljik se lahko odstrani s fizikalno-kemijskimi procesi (adsorpcija, izhlapevanje, obarjanje, 
hidroliza) in mikrobno dejavnostjo, pri številnih nebioloških reakcijah pa se 
porablja kisik; CO
 2 redko nastane abiotsko iz organskih kemikalij. Pri 
izvirnem in prilagojenem Sturmovem preskusu (1) (2) se CO  2 odstrani iz 
tekoče faze v posode za absorpcijo s prepihovanjem (tj. uvajanjem 
mehurčkov obdelanega zraka za odstranitev CO  2 prek teko čega medija), 
pri Larsonovi razli čici (3) (4) pa se CO  2 prenese iz reakcijske posode v 
absorberje s spuš čanjem zraka brez CO  2 skozi nadprostor in dodatno z 
nenehnim stresanjem preskusne posode. Reaktorska posoda se stresa samo 
pri prilagojeni Larsonovi razli čici; v ISO 9439 (5) in izvirni ameriški razli ­ 
čici (6), ki oba dolo čata prepihovanje in ne zamenjave v nadprostoru, je 
mešanje predpisano samo za netopne snovi. Pri drugi uradni metodi Agen ­
cije za varstvo okolja Združenih držav (US EPA) (7), ki temelji na Gled ­
hillovi metodi (8), je reakcijska posoda, ki se stresa, zaprta za ozra čje, 
nastali CO  2 pa se zbira v notranjem alkalnem lovilniku neposredno iz 
plinske faze kot pri klasi čnih Warburgovih/Barcroftovih respirometrih. 
3. Toda pokazalo se je, da se pri uporabi standardnega prilagojenega Sturmo ­
vega preskusa pri številnih kemikalijah (9) v mediju nabira anorganski 
ogljik (IC). Pri razgradnji 20 mg C/l anilina je bila ugotovljena koncentracija 
IC kar 8 mg/l. Zato zbiranje CO  2 v alkalnih lovilnikih ni pravilno pokazalo 
količine mikrobiološko nastalega CO  2 pri vmesnih časih med razgradnjo. 
Zato pogoja, da je treba za uvrstitev preskusne kemikalije med dobro 
biološko razgradljive v „10-dnevnem obdobju“ (10 dneh, ki neposredno 
sledijo dosegu 10-odstotne biološke razgradljivosti) nabrati > 60 % teore ­
tično največje količine nastalega CO  2 (ThCO  2 ), ne izpolnjujejo nekatere 
kemikalije, ki bi se med dobro biološko razgradljive uvrstile ob odstranje ­
vanju raztopljenega organskega ogljika (DOC). 
4. Kadar je delež razgradnje manjši, kot je bilo pri čakovano, se v preskusni 
raztopini morda nabira IC. V takem primeru se lahko razgradljivost oceni z 
drugimi preskusi dobre biološke razgradljivosti.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1419
 
5. Zaradi drugih pomanjkljivosti Sturmove metodologije (okornost, dolgotraj ­
nost, nagnjenost k eksperimentalnim napakam in neuporabnost za hlapne 
kemikalije) se je že prej poleg Gledhillove metode iskala tehnika z zaprtimi posodami, in ne s pretokom plina. Boatman idr. (12) so pregledali prejšnje metode in uporabili zaprt sistem z nadprostorom, pri čemer je bil CO
 2 
sproščen v nadprostor ob koncu inkubacije z zakisanjem medija. CO  2 se 
je meril z analizo s plinsko kromatografijo (GC)/IC v samodejno odvzetih vzorcih iz nadprostora, a se pri tem ni upošteval raztopljeni anorganski ogljik (DIC) v teko či fazi. Poleg tega so bile uporabljene posode zelo 
majhne (20 ml) in so vsebovale samo 10 ml medija, kar je povzro čalo 
težave, npr. pri dodajanju nujno zelo majhnih koli čin netopnih preskusnih 
kemikalij in/ali pa v inokuliranem mediju ni bilo (dovolj) mikroorganizmov, ki so sposobni razgraditi preskusne kemikalije. 
6. Te težave so v neodvisnih raziskavah premagali Struijs in Stoltenkamp (13) 
ter Birch in Fletcher (14), pri čemer so slednja navdihnile njune izkušnje z 
napravo, ki se uporablja pri preskusu anaerobne biološke razgradnje (15). 
Pri prvi metodi (13) se CO
 2 meri v nadprostoru po zakisanju in uravnoteže ­
nju, pri drugi (14) pa je bil DIC izmerjen v plinski in teko či fazi, brez 
obdelave; ve č kot 90 % nastalega IC je bilo v teko či fazi. Obe metodi 
imata prednosti pred Sturmovim preskusom, ker je preskusni sistem bolj 
priročen in lažje obvladljiv, ker je mogo če preskusiti hlapne kemikalije in 
ker je prepre čena možnost zakasnitve pri merjenju nastalega CO  2 . 
7. Pristopa sta bila združena v standard ISO za CO  2 v nadprostoru (16), ki je 
bil krožno preskušen (17), na njem pa temelji tudi ta preskusna metoda. Podobno sta pristopa uporabljena v metodi US EPA (18). Priporo čeni sta 
dve metodi merjenja CO
 2 , in sicer CO  2 v nadprostoru po zakisanju (13) in 
IC v teko či fazi po dodajanju presežne baze. Drugo metodo je uvedel 
Peterson pri krožnem preskusu CONCAWE (19) te metode z nadprostorom, prilagojene za merjenje inherentne biološke razgradljivosti. Spremembe iz revizije teh metod iz leta 1992 (20) v poglavju C.4 te priloge za dobro 
biološko razgradljivost so bile vklju čene v to preskusno metodo, tako da 
so pogoji (medij, trajanje itd.) sicer enaki kot pri revidiranem Sturmovem preskusu (20). Birch in Fletcher (14) sta pokazala, da ta preskus nadprostora daje zelo podobne rezultate, kot so bili za iste kemikalije ugotovljeni v 
krožnem preskusu OECD (21) revidiranih preskusnih metod.
 
NAČELO PRESKUSA 
8. Preskusna kemikalija, obi čajno 20 mg C/l, se kot edini vir ogljika in ener ­
gije inkubira v pufrskem mediju z mineralnimi solmi, ki je inokuliran z mešano populacijo mikroorganizmov. Preskus se opravi v zaprtih stekle ­
nicah z nadprostorom, v katerem je zrak, ki predstavlja zalogo kisika za 
aerobno biološko razgradnjo. Nastajanje CO
 2 zaradi popolne aerobne 
biološke razgradnje preskusne kemikalije se dolo či z merjenjem nastalega 
IC v preskusnih steklenicah, ki presega IC, ki nastane v posodah s slepim 
vzorcem, ki vsebujejo samo inokuliran medij. Obseg biološke razgradnje se 
izrazi kot delež teoreti čno največje količine nastalega IC (ThIC) na podlagi 
prvotno dodane koli čine preskusne kemikalije (kot organski ogljik). 
9. Merita se lahko tudi odstranitev DOC in/ali obseg primarne biološke 
razgradnje preskusne kemikalije (2).  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1420
 
INFORMACIJE O PRESKUSNI KEMIKALIJI 
10. Za izra čun deleža razgradnje je treba poznati vsebnost organskega ogljika 
(% w/w) v preskusni kemikaliji, ki se dolo či na podlagi njene kemi čne 
strukture ali z merjenjem. Pri hlapnih preskusnih kemikalijah je izmerjena 
ali izračunana Henryjeva konstanta koristna za dolo čanje ustreznega volum ­
skega razmerja med nadprostorom in teko čino. Informacije o strupenosti 
preskusne kemikalije za mikroorganizme so koristne pri izbiri ustrezne preskusne koncentracije in za razlago rezultatov, ki kažejo slabo biološko 
razgradljivost. Priporo ča se vklju čitev kontrole zaviranja, razen če je znano, 
da preskusna kemikalija ne zavira mikrobne dejavnosti (glej odstavek 24).
 
UPORABA METODE 
11. Preskus se uporablja za vodotopne in netopne preskusne kemikalije, vendar 
je treba zagotoviti njihovo dobro porazdelitev. S priporo čenim volumskim 
razmerjem med nadprostorom in teko čino 1 : 2 se lahko preskusijo hlapne 
kemikalije s Henryjevo konstanto do 50 Pa.m  3 .mol  -1 , saj delež preskusne 
kemikalije v nadprostoru ne preseže 1 % (13). Pri preskušanju bolj hlapnih kemikalij se lahko uporabi manjša prostornina nadprostora, vendar je lahko njihova biološka razpoložljivost omejujo ča, zlasti če so slabo topne v vodi. 
Toda uporabniki morajo zagotoviti, da sta volumsko razmerje med nadpro ­
storom in teko čino ter koncentracija preskusne kemikalije taka, da je na 
voljo dovolj kisika za popolno aerobno biološko razgradnjo (npr. treba se je izogibati visoki koncentraciji substrata in majhni prostornini nadprostora). 
Navodila glede tega so na voljo v (13) (23).
 
REFEREN ČNE KEMIKALIJE 
12. Za preverjanje preskusnega postopka je treba vzporedno preskusiti refe ­
renčno kemikalijo z znano biološko razgradljivostjo. Za ta namen se 
lahko pri preskušanju vodotopnih preskusnih kemikalij uporabijo anilin, natrijev benzoat ali etilen glikol, pri preskušanju slabo topnih preskusnih kemikalij pa 1-oktanol (13). Biološka razgradnja teh kemikalij mora v 14 
dneh dose či > 60 % ThIC.
 
PONOVLJIVOST 
13. Pri krožnem preskusu metode po ISO (17) so bili pri priporo čenih pogojih, 
vključno z 20 mg C preskusne kemikalije/l, dobljeni spodnji rezultati.  
Preskusna 
kemikalija Povprečni delež 
biološke 
razgradnje v % 
(28d) Koeficient 
variacije 
(%) Število 
laboratorijev  
Anilin 90 16 17 
1-oktanol 85 12 14 
Variabilnost znotraj preskusa (ponovljivost) pri uporabi anilina je bila 
majhna, pri čemer koeficienti variacije niso presegli 5 % v skoraj nobeni 
izvedbi preskusa. V dveh primerih, v katerih je bila ponovljivost slabša, je 
bilo za ve čjo variabilnost verjetno krivo ve čje nastajanje IC v slepih vzorcih. 
Pri 1-oktanolu je bila ponovljivost slabša, vendar je bila še vedno manjša od 10 % pri 79 % izvedenih preskusov. Za to ve čjo variabilnost znotraj 
preskusa so lahko krive napake pri odmerjanju, saj je treba v zaprte 
preskusne steklenice vbrizgati majhno koli čino 1-oktanola (3 do 4 μl). 
Višji koeficienti variacije nastanejo pri nižjih koncentracijah preskusne kemikalije, zlasti pri koncentracijah pod 10 mg C/l. Temu se je mogo če 
delno izogniti z znižanjem koncentracije skupnega anorganskega 
ogljika (TIC) v inokulumu.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1421
 
14. Pri krožnem preskusu EU (24) petih površinsko aktivnih snovi, dodanih v 
10 mg C/l, so bili dobljeni naslednji rezultati:  
Preskusna kemikalija Povprečni delež 
biološke 
razgradnje v % 
(28d) Koeficient 
variacije 
(%) Število 
laboratorijev  
Tetrapropilen 
benzen sulfonat 17 45 10 
Diizooktilsulfo- 
sukcinat 
(anionski) 72 22 9 
Heksadecil-trimetil (*) 
amonijev klorid (kationski) 75 13 10 
Izononilfenol-(etoksi ­
lat)
 9 
(neionski) 41 32 10 
Kokoamidopropil 
dimetilhidroksi sulfobetain (amfoteričen) 60 23 11
 
(*) SiO  2 je bil dodan za nevtralizacijo strupenosti.  
Rezultati kažejo, da je bila na splošno variabilnost ve čja pri slabše razgra ­
jenih površinsko aktivnih snoveh. Variabilnost znotraj poskusa je bila manjša od 15 % v 90 % primerov, dosegla pa je najve č 30–40 %. 
OPOMBA: ve čine površinsko aktivnih snovi ne sestavlja ena sama mole ­
kulska vrsta, temve č so mešanica izomerov, homologov itd., ki 
se razgradijo po razli čnih značilnih časih prilagajanja in z 
različno kineti čno hitrostjo, zaradi česar nastanejo „zabrisane“ 
oslabele krivulje, tako da v 10-dnevnem obdobju ni mogo če 
doseči praga 60 %, čeprav bi vsaka posamezna molekulska 
vrsta v 10 dneh dosegla > 60 %, če bi se preskušala sama. 
To je bilo ugotovljeno tudi pri drugih kompleksnih mešanicah.
 
OPIS METODE  
Oprema  
15. Običajna laboratorijska oprema in: 
(a) steklene serumske steklenice, zatesnjene z zamaški iz butilne gume in 
stisnjenimi aluminijskimi tesnili. Priporo čena velikost je „125 ml“, pri 
čemer je celotna prostornina takih steklenic 160 ml (v tem primeru bi 
moralo biti znano, da je prostornina posamezne steklenice 160 ± 1 ml). Manjše steklenice se lahko uporabijo, kadar rezultati izpolnjujejo pogoje 
iz odstavkov 66 in 67; 
(b) analizator ogljika ali drug instrument (npr. plinski kromatograf) za 
merjenje anorganskega ogljika;
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1422
 
(c) zelo natan čne brizge za plinaste in teko če vzorce; 
(d) krožni stresalnik v temperaturno nadzorovanem okolju; 
(e) dotok zraka brez CO  2 – pripravi se lahko s spuš čanjem zraka skozi 
zrnca zmesi natrijevega in kalcijevega hidroksida ali z uporabo plinske mešanice 80 % N
 2 / 20 % 0  2 (neobvezno) (glej odstavek 28); 
(f) naprava za membransko filtracijo poroznosti od 0,20 do 0,45 μm (neob­
vezno); 
(g) analizator organskega ogljika (neobvezno).  
Reagenti  
16. Ves čas se uporabljajo analitsko čisti reagenti.  
Voda  
17. Uporabljati je treba destilirano ali deionizirano vodo, ki vsebuje ≤ 1 mg/l 
skupnega organskega ogljika. To predstavlja ≤ 5 % začetne vsebnosti organ ­
skega ogljika, uvedene s priporo čenim odmerkom preskusne kemikalije.  
Založne raztopine za medij z mineralnimi solmi  
18. Založne raztopine in medij z mineralnimi solmi so podobni kot pri preskusih 
ISO 14593 (16) in C.4 „dobra biološka razgradljivost“ (20). Ve čja koncen ­
tracija amonijevega klorida (2,0 g/l namesto 0,5 g/l) bi morala biti potrebna samo v zelo izjemnih primerih, npr. kadar je koncentracija preskusne kemi ­
kalije > 40 mg C/l. Založne raztopine je treba hraniti na hladnem in jih 
zavreči po šestih mesecih ali prej, če se pokažejo znaki obarjanja ali 
mikrobne rasti. Pripravijo se naslednje osnovne raztopine: 
(a) kalijev dihidrogen fosfat (KH
 2 PO 4 ) 8,50 g 
dikalijev hidrogen fosfat (K  2 HPO  4 ) 21,75 g 
dinatrijev hidrogen fosfat dihidrat (Na  2 HPO  4 .2H  2 O) 33,40 g 
amonijev klorid (NH  4 Cl) 0,50 g 
Raztopijo se v vodi in dopolnijo do 1 litra. pH te raztopine mora biti 7,4 
(± 0,2). Če ni, je treba pripraviti novo raztopino. 
(b) kalcijev klorid dihidrat (CaCl  2 .2H  2 O) 36,40 g 
Raztopi se v vodi in dopolni do 1 litra. 
(c) magnezijev sulfat heptahidrat (MgSO  4 .7H  2 O) 22,50 g 
Raztopi se v vodi in dopolni do 1 litra. 
(d) železov (III) klorid heksahidrat (FeCl  3 .6H  2 0) 0,25 g 
Raztopi se v vodi in dopolni do 1 litra ter doda kapljica koncentrirane 
HCl.  
Priprava mineralnega medija  
19. Zmeša se 10 ml raztopine (a) in približno 800 ml vode (odstavek 17), nato 
se doda po 1 ml raztopin (b), (c) in (d) ter dopolni z vodo do 1 litra 
(odstavek 17).  
Drugi reagenti  
20. Koncentrirana ortofosforna kislina (H  3 PO 4 ) (> 85 % mase na volumen).  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1423
 
Raztopina natrijevega hidroksida 7M  
21. 280 g natrijevega hidroksida (NaOH) se raztopi v 1 litru vode (odstavek 17). 
Določi se koncentracija DIC za to raztopino, ta vrednost pa se upošteva pri 
izračunu rezultata preskusa (glej odstavka 55 in 61), zlasti ob upoštevanju 
merila veljavnosti iz odstavka 66(b). Če je koncentracija DIC previsoka, se 
pripravi sveža raztopina.  
Preskusna kemikalija  
22. Pripravi se osnovna raztopina preskusne kemikalije, ki se dovolj dobro topi 
v vodi (odstavek 17) ali preskusnem mediju (odstavek 19), s koncentracijo, 
ki je po možnosti 100-krat višja od kon čne koncentracije, ki bo uporabljena 
v preskusu; morda bo treba pH osnovne raztopine prilagoditi. Založno raztopino je treba dodati mineralnemu mediju, da nastane kon čna koncen ­
tracija organskega ogljika, ki znaša med 2 in 40 mg C/l, po možnosti 20 mg 
C/l. Če se uporabijo nižje koncentracije, se lahko natan čnost poslabša. V 
posode se lahko neposredno z zelo natan čnimi brizgami dodajo topne in 
netopne teko če kemikalije. Pri slabo topnih in netopnih preskusnih kemika ­
lijah je lahko potrebna posebna obdelava (25). Na izbiro so: 
(a) neposredno dodajanje znanih tehtanih koli čin; 
(b) ultrazvo čno dispergiranje pred dodajanjem; 
(c) dispergiranje z emulgatorji; pred dodajanjem je treba ugotoviti, ali imajo 
zaviralne ali spodbujevalne u činke na mikrobno dejavnost; 
(d) adsorpcija teko čih preskusnih kemikalij ali raztopine v primernem 
hlapnem topilu na inertni medij ali nosilec (npr. filter iz steklenih 
vlaken), ki ji sledi izhlapevanje topila, če je uporabljeno, in neposredno 
dodajanje znanih koli čin; 
(e) dodajanje znanih koli čin raztopine preskusne kemikalije v lahko 
hlapnem topilu v prazno preskusno posodo, ki mu sledi izhlapevanje 
topila. 
Preskusiti je treba spodbujevalni ali zaviralni u činek sredstev in topil, upora ­
bljenih v (c), (d) in (e), na mikrobno dejavnost (glej odstavek 42(b)).
 
Referenčna kemikalija  
23. Pripravi se osnovna raztopina (topne) referen čne kemikalije v vodi (odstavek 
17) s koncentracijo, ki je po možnosti 100-krat višja od kon čne koncen ­
tracije, ki bo uporabljena v preskusu (20 mg C/l).  
Preverjanje zaviranja  
24. Preskusne kemikalije pogosto ne pokažejo znatne razgradnje v pogojih, 
uporabljenih pri ocenjevanjih dobre biološke razgradljivosti. Eden od 
mogočih vzrokov je ta, da preskusna kemikalija zavira inokulum pri koncen ­
traciji, ki je uporabljena v preskusu. V na črt preskusa se lahko vklju či 
preverjanje zaviranja, da se omogo či ugotavljanje (za nazaj) zaviranja kot 
mogočega vzroka ali prispevajo čega dejavnika. S preverjanjem zaviranja je 
mogoče tudi ovre či take motnje in pokazati, da se lahko ni čna ali rahla 
razgradnja pripiše izklju čno nedovzetnosti za napad mikrobov v pogojih 
preskusa. Za pridobitev informacij o strupenosti preskusne kemikalije za (aerobne) mikroorganizme se pripravi raztopina v preskusnem mediju, ki 
vsebuje enako koncentracijo preskusne kemikalije in referen čne kemikalije 
(odstavek 19), kot je bila dodana (glej odstavka 22 in 23).
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1424
 
Inokulum  
25. Inokulum se lahko pridobi iz razli čnih virov: aktivnega blata, komunalnih 
odplak (nekloriranih), površinskih voda in tal ali zmesi teh sestavin (20). Biorazgradno aktivnost vira je treba preveriti z referen čno kemikalijo. Ne 
glede na vir se ne smejo uporabiti mikroorganizmi, ki so bili že prej izpo ­
stavljeni preskusni kemikaliji, če se postopek uporablja kot preskus dobre 
biološke razgradljivosti.
 
Opozorilo: aktivno blato, odpadne vode in komunalne odplake vsebujejo 
patogene organizme, zato je treba z njimi ravnati previdno. 
26. Glede na izkušnje je optimalna koli čina inokuluma taka, ki: 
— zadostuje za primerno biološko razgradno aktivnost, 
— razgradi predpisani delež referen čne kemikalije (glej odstavek 66), 
— daje 10  2 do 10  5 enot, ki tvorijo kolonije, na mililiter kon čne mešanice, 
— pri uporabi aktivnega blata obi čajno daje koncentracijo 4 mg/l nerazto ­
pljenih trdnih snovi v kon čni mešanici; uporabijo se lahko koncentracije 
do 30 mg/l, vendar lahko te znatno pove čajo nastajanje CO  2 v slepih 
vzorcih (26), 
— prispeva manj kot 10 % za četne koncentracije organskega ogljika, 
uvedenega s preskusno kemikalijo, 
— običajno znaša 1–10 ml inokuluma za 1 liter preskusne raztopine.  
Aktivno blato  
27. Iz prezra čevalnega bazena čistilne naprave ali laboratorijske enote, v kateri 
se čistijo predvsem gospodinjske odplake, se vzame svež vzorec aktivnega 
blata. Po potrebi se grobi delci odstranijo s presejanjem (npr. s sitom z 
1 mm  2 velikimi luknjicami), blato pa je treba do uporabe ohranjati v 
aerobnem stanju. 
28. Po odstranitvi grobih delcev se lahko tudi pusti, da se usede, ali se centri ­
fugira (npr. 10 minut pri 1 100 × g). Supernatantna teko čina se zavrže. Blato 
se lahko spere v mineralni raztopini. Koncentrirano blato se suspendira v mineralnem mediju tako, da bo koncentracija neraztopljenih trdnih snovi 
3–5 g/l. Nato se prezra čuje do uporabe. 
29. Blato je treba odvzeti iz pravilno delujo če konvencionalne čistilne naprave. 
Če ga je bilo treba odvzeti iz čistilne naprave z visoko stopnjo čiščenja ali 
če se domneva, da vsebuje zaviralce, ga je treba sprati. Resuspendirano 
blato se po temeljitem mešanju pusti, da se usede, ali se centrifugira, super ­
natantna teko čina se zavrže, sprano blato pa znova suspendira v dodatni 
količini mineralnega medija. Postopek se ponavlja, dokler se ne šteje, da 
je blato brez presežnega substrata ali zaviralcev. 
30. Tik pred uporabo popolnoma resuspendiranega ali neobdelanega blata se 
odvzame vzorec za dolo čitev suhe teže neraztopljenih trdnih snovi. 
31. Dodatna možnost je, da se aktivno blato homogenizira (3–5 g neraztopljenih 
trdnih snovi/l). Blato se 2 minuti obdeluje z Waringovim mešalnikom pri srednji hitrosti. Zmešano blato se mora usedati 30 minut, če je potrebno, pa 
tudi dlje, nato pa se odlije teko čina, ki se uporabi kot inokulum v koncen ­
traciji približno 10 mg/l mineralnega medija.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1425
 
32. Nastajanje CO  2 v slepih vzorcih je mogo če dodatno zmanjšati, če se blato 
čez noč prezračuje z zrakom brez CO  2 . Kot koncentracija inokuluma pri tem 
preskusu (13) se uporabi 4 mg/l aktivnega blata v obliki trdnih snovi.  
Sekundarni komunalni iztok  
33. Inokulum se lahko pridobi tudi iz sekundarnega iztoka iz čistilne naprave ali 
laboratorijske enote, v katero priteka predvsem gospodinjska odpadna voda. 
Vzorec se hrani v aerobnih pogojih in uporabi na dan odvzema ali pa se po 
potrebi aklimatizira. Iztok je treba filtrirati skozi grobi filter, da se odstranijo večji delci, in izmeriti vrednost pH. 
34. Za zmanjšanje vsebnosti IC se filtrat 1 uro prepihuje z zrakom brez CO
 2 
(odstavek 15(e)) ob ohranjanju vrednosti pH 6,5 z ortofosforno kislino 
(odstavek 20). Vrednost pH se vrne na prvotno vrednost z natrijevim hidroksidom (odstavek 21). Po približno 1-urnem usedanju se vzame 
primerna koli čina supernatanta za inokulacijo. Ta postopek prepihovanja 
zmanjša vsebnost IC v inokulumu. Ko je bila na primer kot inokulum uporabljena najve čja priporo čena količina filtriranega prepihanega iztoka 
(100 ml) na liter, je bilo v posodah s slepim kontrolnim vzorcem med 0,4 
in 1,3 mg/l IC (14), kar je predstavljalo 2–6,5 % C iz preskusne kemikalije 
pri 20 mg C/l in 4–13 % pri 10 mg C/l.
 
Površinske vode  
35. Vzame se vzorec primerne površinske vode. Hrani se v aerobnih pogojih in 
uporabi na dan odvzema. Po potrebi se koncentrira s filtriranjem ali centri ­
fugiranjem. Koli čina inokuluma, ki se uporabi v posamezni preskusni 
posodi, mora izpolnjevati merila iz odstavka 26.  
Tla 
36. V globini do 20 cm pod površino se vzame vzorec ustreznih tal. Iz njega je 
treba pred presejanjem skozi sito z 2 mm velikimi luknjicami odstraniti 
kamne, ostanke rastlin in nevreten čarje (če je vzorec prevlažen za takojšnje 
presejanje, se za lažje presejanje delno posuši na zraku). Hraniti ga treba v aerobnih pogojih in uporabiti na dan jemanja ( če se vzorec prevaža v 
ohlapno zavezani polietilenski vre čki, se lahko najve č en mesec hrani v 
vrečki pri 2 do 4 °C).
 
Aklimatizacija inokuluma  
37. Inokulum se lahko aklimatizira na preskusne pogoje, ne sme pa se prilago ­
diti na preskusno kemikalijo. Z aklimatizacijo je mogo če zmanjšati nasta ­
janje CO  2 v slepem vzorcu. Aklimatizacija vklju čuje prezra čevanje aktiv ­
nega blata po razred čitvi v preskusnem mediju na 30 m/l z vlažnim zrakom 
brez CO  2 5–7 dni pri temperaturi preskusa.  
PRESKUSNI POSTOPEK  
Število steklenic  
38. Število steklenic (odstavek 15(a)), potrebnih za preskus, je odvisno od pogo ­
stosti analize in trajanja preskusa. 
39. Priporo ča se, da se po zadostnem številu časovnih intervalov analizirajo po 
tri steklenice, tako da je mogo če določiti 10-dnevno obdobje. Ob koncu 
preskusa se analizira tudi vsaj pet preskusnih steklenic (odstavek 15(a)) iz 
skupin (a), (b) in (c) (glej odstavek 42), da je mogo če izračunati 95-odstotne 
intervale zaupanja za srednjo vrednost deleža biološke razgradnje.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1426
 
Inokulirani medij  
40. Inokulum se uporabi v koncentraciji 4 mg/l aktivnega blata v obliki suhih 
trdnih snovi. Tik pred uporabo se pripravi dovolj inokuliranega medija tako, da se na primer 1 litru medija z mineralnimi solmi (odstavek 19) doda 2 ml 
ustrezno obdelanega aktivnega blata (odstavki 27 do 32) pri 2 000 mg/l. Pri 
uporabi sekundarnega komunalnega iztoka se v 900 ml medija z mineral ­
nimi solmi (odstavek 19) doda do 100 ml iztoka (odstavek 33) in z medijem razredči na 1 liter.
 
Priprava steklenic  
41. Alikvoti inokuliranega medija se odmerijo v ponovitvene steklenice, da 
nastane razmerje med nadprostorom in teko čino 1 : 2 (npr. v 160-mililitrske 
steklenice se da 107 ml). Uporabijo se lahko tudi druga razmerja, vendar je 
treba upoštevati opozorilo iz odstavka 11. Pri uporabi katere koli vrste 
inokuluma je treba poskrbeti za to, da je inokulirani medij primerno zmešan, tako da se zagotovi njegova enakomerna porazdeljenost po preskusnih steklenicah. 
42. Pripravijo se skupine steklenic (odstavek 15(a)), ki vsebujejo naslednje: 
(a) preskusne posode (ozna čene s F
 T ), ki vsebujejo preskusno kemikalijo; 
(b) slepe kontrolne vzorce (ozna čene s F  B ), ki vsebujejo samo preskusni 
medij in inokulum; dodati je treba tudi vse kemikalije, topila, sredstva ali filtre iz steklenih vlaken, ki se uporabljajo za uvajanje preskusne kemikalije v preskusne posode; 
(c) posode (ozna čene s F
 C ) za preverjanje postopka, ki vsebujejo referen čno 
kemikalijo; 
(d) po potrebi posode (ozna čene s F  I ) za preverjanje morebitnega zaviral ­
nega učinka preskusne kemikalije, ki vsebujejo enako koncentracijo 
preskusne kemikalije in referen čne kemikalije (odstavek 24) kot v 
steklenicah F  T oziroma F  C ; 
(e) posode (ozna čene s F  S ) za preverjanje morebitne abiotske razgradnje, 
enako kot (a) z dodatkom 50 mg/l HgCl  2 ali se sterilizirajo druga če 
(npr. z avtoklaviranjem). 
43. Vodotopne preskusne kemikalije in referen čne kemikalije se dodajo kot 
vodne osnovne raztopine (odstavki 22, 23 in 24), da nastane koncentracija 10 do 20 mg C/l. 
44. Netopne preskusne kemikalije in netopne referen čne kemikalije se dodajo v 
steklenice na razli čne načine (glej odstavek 22(a–e)), glede na naravo 
preskusne kemikalije bodisi pred dodatkom inokuliranega medija ali po 
njem, odvisno od na čina obdelave preskusne kemikalije. Če se uporabi 
eden od postopkov iz odstavka 22(a–e), je treba s steklenicami F
 B s slepim 
vzorcem (odstavek 42(b)) ravnati podobno, vendar brez preskusne kemika ­
lije in referen čne kemikalije. 
45. Hlapne preskusne kemikalije je treba vbrizgati v zaprte posode (odstavek 
47) z mikrobrizgo. Odmerek se izra čuna iz vbrizgane koli čine in gostote 
preskusne kemikalije. 
46. Po potrebi je treba v posode dodati vodo, da je v vsaki posodi enaka 
količina tekočine. Treba je zagotoviti, da sta razmerje med nadprostorom 
in tekočino (običajno 1 : 2) ter koncentracija preskusne kemikalije taka, da 
je v nadprostoru na voljo dovolj kisika za popolno biološko razgradnjo.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1427
 
47. Vse steklenice se nato zatesnijo, na primer s septumi iz butilne gume in 
aluminijastimi pokrov čki. V tej fazi je treba dodati hlapne preskusne kemi ­
kalije (odstavek 45). Če je treba spremljati zniževanje koncentracije DOC v 
preskusni raztopini in če je treba za za četno koncentracijo IC (sterilni 
kontrolni vzorci, odstavek 42(e)) ali druge determinante opraviti analizo 
ob času nič, se iz preskusne posode odvzame ustrezni vzorec. Preskusna 
posoda in njena vsebina se nato zavržeta. 
48. Zaprte posode se položijo na rotacijski stresalnik (odstavek 15(d)), pri čemer 
mora biti hitrost stresanja zadostna, da vsebina steklenic ostaja dobro preme ­ 
šana in v obliki suspenzije (npr. 150 do 200 vrtljajev na minuto), ter se inkubirajo v temi pri 20 °C, pri čemer se temperatura ohranja v razponu 
± 1 °C.
 
Vzorčenje 
49. Način vzorčenja je odvisen od časa prilagajanja in kineti čne hitrosti biološke 
razgradnje preskusne kemikalije. Steklenice se za analizo žrtvujejo na dan vzorčenja, kar bi moralo biti vsaj tedensko ali pogosteje (npr. dvakrat teden ­
sko), če je potrebna popolna krivulja razgradnje. Iz stresalnika se vzame 
potrebno število ponovitvenih steklenic, ki predstavljajo F
 T , F B in F  C ter F  I 
in F  S , če sta uporabljena (glej odstavek 42). Preskus obi čajno traja 28 dni. 
Če krivulja biološke razgradnje kaže, da je bila konstantna raven dosežena 
pred 28. dnem, se lahko preskus kon ča prej kot v 28 dneh. Vzamejo se 
vzorci iz petih steklenic, prihranjenih za 28. dan preskusa za analizo, rezul ­
tati pa se uporabijo za izra čun intervala zaupanja ali koeficienta variacije 
deleža biološke razgradnje. Steklenic, ki se uporabljajo za preverjanje zavi ­
ranja in abiotske razgradnje, ni treba vzor čiti tako pogosto kot druge stekle ­
nice; zadostuje vzor čenje 1. in 28. dan.  
Analiza anorganskega ogljika (IC)  
50. Nastajanje CO  2 v steklenicah se dolo či z merjenjem pove čanja koncentracije 
anorganskega ogljika (IC) med inkubacijo. Za merjenje koli čine IC, ki 
nastane pri preskusu, sta na voljo dve priporo čeni metodi, ki sta opisani 
spodaj. Ker se lahko njuni rezultati med seboj nekoliko razlikujejo, naj se v posameznem preskusu uporabi samo ena od njiju. 
51. Metoda (a) je priporo čena, če medij verjetno vsebuje ostanke, na primer, 
filtrirnega papirja iz steklenih vlaken in/ali netopne preskusne kemikalije. Ta 
analiza se lahko izvede s plinskim kromatografom, če ni na voljo analizator 
organskega ogljika. Pomembno je, da imajo steklenice pri analizi plina v nadprostoru preskusno temperaturo ali da je njihova temperatura blizu preskusne temperature. Metoda (b) je morda lažja za laboratorije, ki za 
merjenje IC uporabljajo analizator ogljika. Pomembno je, da je raztopina 
natrijevega hidroksida (odstavek 21), ki se uporablja za pretvorbo CO
 2 v 
karbonat, bodisi sveže pripravljena ali pa je znana vsebnost IC v njej, tako 
da se ta lahko upošteva pri izra čunavanju preskusnih rezultatov (glej 
odstavek 66(b)).  
Metoda (a): zakisanje na pH < 3  
52. Pred vsako serijo analiz se analizator IC umeri z ustreznim standardom za 
IC (npr. 1 % w/w CO  2 v N  2 ). Koncentrirana ortofosforna kislina (odstavek 
20) se vbrizga skozi septum posamezne vzor čene steklenice, da se pH 
medija zniža na < 3 (npr. 107 ml preskusnega medija dodamo 1 ml). Steklenice se vrnejo na stresalnik. Po enournem stresanju pri preskusni temperaturi se odstranijo s stresalnika, iz nadprostora posamezne steklenice 
pa se odvzamejo alikvoti (npr. 1 ml) plina in vbrizgajo v analizator IC. 
Izmerjene koncentracije IC se zapišejo kot mg C/l.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1428
 
53. Načelo te metode je, da je po zakisanju na pH < 3 in uravnoteženju pri 
20 °C konstanta ravnotežja za porazdelitev CO  2 med teko činsko in plinsko 
fazo v preskusnih steklenicah 1,0, če je merjena kot koncentracija (13). To 
je treba za preskusni sistem dokazati vsaj enkrat na naslednji na čin: 
Pripravijo se steklenice, ki vsebujejo 5 in 10 mg/l IC, tako da se uporabi 
raztopina brezvodnega natrijevega karbonata (Na  2 CO 3 ) v vodi brez CO  2 , ki 
se pripravi z zakisanjem vode na pH 6,5 s koncentrirano ortofosforno kislino 
(odstavek 20), prepihovanjem z zrakom brez CO  2 čez noč in povišanjem pH 
na nevtralno vrednost z bazo. Zagotovi se, da je razmerje med prostornino nadprostora in koli čino tekočine enako kot pri preskusih (npr. 1 : 2). Teko ­ 
čina se zakisa in uravnoteži, kot je opisano v odstavku 52, nato se izmerijo 
koncentracije IC v nadprostoru in teko či fazi. Preveri se, da sta koncentraciji 
enaki znotraj preskusne napake. Če nista, bi moral izvajalec pregledati 
postopke. Porazdelitve IC med teko čo in plinasto fazo ni treba preverjati 
vsakokrat, ko se izvaja preskus; verjetno se lahko preveri pri umerjanju. 
54. Če je treba izmeriti odstranjeni DOC (samo pri vodotopnih preskusnih 
kemikalijah), je treba iz lo čenih (nezakisanih) steklenic vzeti vzorce teko če 
faze, jih filtrirati skozi membranski filter in vbrizgati v analizator DOC. Te 
steklenice se lahko po potrebi uporabijo za druge analize za merjenje 
primarne biološke razgradnje.
 
Metoda (b): pretvorba CO  2 v karbonat  
55. Pred vsako serijo analiz se analizator IC umeri z ustreznim standardom, na 
primer raztopino natrijevega bikarbonata (NaHCO  3 ) v vodi brez CO  2 (glej 
odstavek 53) v razponu od 0 do 20 mg/l kot IC. Skozi septum posamezne 
vzorčene steklenice se vbrizga raztopina natrijevega hidroksida (7M, 
odstavek 21) (npr. 1 ml se doda 107 ml medija), nato se steklenice eno uro stresajo pri preskusni temperaturi. Pri vseh steklenicah, žrtvovanih na določeni dan, se uporabi enaka raztopina NaOH, ni pa nujno, da se enaka 
raztopina uporabi pri vsakem vzor čenju v preskusu. Če so pri vseh vzor če­
njih potrebne absolutne vrednost IC v slepem vzorcu, je treba ob vsaki uporabi raztopine NaOH v njej dolo čiti IC. Steklenice se odstranijo s stre ­
salnika, da se vsebina usede. Z brizgo se iz vsake posode odvzame ustrezna 
količina (npr. 50 do 1 000 μl) tekoče faze. Vzorci se vbrizgajo v analizator 
IC, nato se zapišejo koncentracije IC. Treba je zagotoviti, da je uporabljeni analizator ustrezno opremljen za uporabo bazi čnih vzorcev, ki nastanejo pri 
tej metodi. 
56. Načelo te metode je, da je koncentracija IC v nadprostoru po dodajanju baze 
in stresanju zanemarljiva. To je treba za preskusni sistem preveriti vsaj enkrat s standardi za IC, dodajanjem baze in uravnoteženjem ter merjenjem koncentracije IC v nadprostoru in teko či fazi (glej odstavek 53). Koncen ­
tracija v nadprostoru bi morala biti blizu ni č. Tega preverjanja skoraj 
popolne absorpcije CO
 2 ni treba opravljati pri vsakem preskusu. 
57. Če je treba izmeriti odstranitev DOC (samo pri vodotopnih preskusnih 
kemikalijah), je treba iz lo čenih steklenic (ki ne vsebujejo dodane baze) 
vzeti vzorce teko če faze, jih filtrirati skozi membranski filter in vbrizgati 
v analizator DOC. Te steklenice se lahko po potrebi uporabijo pri drugih 
analizah za merjenje primarne biološke razgradljivosti.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1429
 
PODATKI IN PORO ČANJE  
Izračun rezultatov  
58. Ob predpostavki, da je mineralizacija preskusne kemikalije v CO  2 100- 
odstotna, je presežni ThIC, ki nastane v slepih kontrolnih vzorcih, enak TOC, dodanemu posamezni preskusni steklenici na za četku preskusa, in 
sicer: 
ThIC ¼ TOC : 
Skupna masa (mg) anorganskega ogljika (TIC) v posamezni steklenici je: 
TIC ¼ ðmg C v teko čini þ mg Cv nadprostoru Þ 
¼ ðV
 L Ü C L Þ þ ðV H Ü C H Þ enačba [1], 
pri čemer je: 
V L = količina tekočine v steklenici (l), 
CL = koncentracija IC v teko čini (ogljik v mg/l), 
VH = prostornina nadprostora (l), 
CH = koncentracija IC v nadprostoru (ogljik v mg/l). 
Izračuni TIC za dve analiti čni metodi, uporabljeni za merjenje IC v tem 
preskusu, so opisani spodaj v odstavkih 60 in 61. Delež biološke razgradnje 
(% D ) v posameznem primeru se dobi na naslednji na čin: 
%D ¼ ðTIC  t Ä TIC  b Þ 
TOC Ü 100 enačba [2], 
pri čemer je: 
TIC  t = mg TIC v preskusni steklenici ob času t, 
TIC  b = srednja vrednost mg TIC v steklenicah s slepim vzorcem ob času t, 
TOC = mg TOC, dodanega v preskusno posodo na za četku. 
Delež biološke razgradnje % D se izra čuna za preskusne steklenice (F  T ), 
referenčne steklenice (F  C ) in kontrolne steklenice za spremljanje zaviranja 
(F I ), če so vklju čene, iz zadevnih koli čin TIC, nastalega do posameznega 
časa vzorčenja. 
59. Če se je v sterilnih kontrolnih vzorcih (F  S ) vsebnost TIC v preskusnem 
obdobju znatno pove čala, je mogo če sklepati o abiotski razgradnji preskusne 
kemikalije, kar je treba upoštevati pri izra čunu D v ena čbi [2].  
Zakisanje na pH < 3  
60. Ker se z zakisanjem na pH < 3 in uravnoteženjem koncentracije TIC v teko či 
in plinasti fazi izena či, je treba izmeriti samo koncentracijo IC v plinasti fazi. 
Tako iz ena čbe [1] sledi  TIC ¼ ðV L þ V H Þ Ü C H ¼ V B Ü C H , pri čemer je 
V B = prostornina serumske steklenice.  
Pretvorba CO  2 v karbonat  
61. Pri tej metodi se izra čuni izvedejo kot pri ena čbi [1], vendar se zanemarljiva 
količina IC v plinasti fazi zanemari, tako da je  V  H Ü C H ¼ 0, 
TIC ¼ V L Ü C L . ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1430
 
Prikaz rezultatov  
62. Krivulja biološke razgradnje se dobi z grafi čnim prikazom deleža biološke 
razgradnje D v odvisnosti od časa inkubacije, po možnosti pa se prikažejo 
faza prilagajanja, faza biološke razgradnje, 10-dnevno obdobje in faza 
konstantne ravni, ki je faza, v kateri je dosežena najve čja razgradnja, 
krivulja biološke razgradnje pa se zravna. Če se za vzporedne preskusne 
posode F  T dobijo primerljivi rezultati (< 20-odstotna razlika), se grafi čno 
prikaže srednja krivulja (glej Dodatek 2, slika 1); če ne, se krivulje prikažejo 
za vsako posamezno posodo. Dolo či se srednja vrednost deleža biološke 
razgradnje v fazi konstantne ravni ali oceni najvišja vrednost (npr. kadar krivulja v fazi konstantne vrednosti pada), vendar je pomembno oceniti, da 
vrednost v slednjem primeru ni izjema. V poro čilu o preskusu se ta najvišja 
raven biološke razgradnje navede kot „stopnja biološke razgradnje preskusne kemikalije“. Če je bilo število preskusnih posod nezadostno za ozna čitev 
faze konstantne ravni, se za izra čun srednje vrednosti uporabijo izmerjeni 
podatki za zadnji dan preskusa. Ta zadnja vrednost, srednja vrednost petih 
ponovitev, se uporabi za ozna čitev natan čnosti, s katero je bil dolo čen delež 
biološke razgradnje. Poro ča se tudi o vrednosti, dobljeni na koncu 10-dnev ­
nega obdobja. 
63. Enako se grafi čno prikaže krivulja za referen čno kemikalijo F
 C ter prever ­
janje abiotskega izlo čanja F  S in kontrola zaviranja F  I , če sta vklju čena. 
64. Koli čine TIC v slepih kontrolnih vzorcih (F  B ) in bučkah F  S (abiotsko 
preverjanje) se zapišejo, če so te posode vklju čene v preskus. 
65. Na podlagi teoreti čno nastalega IC, pri čakovanega samo glede na referen čno 
sestavino mešanice, se izra čuna D za posode F  I . Če je 28. dan [(D  FC ( 1 ) – 
D FI ( 2 ))/D  FC ] × 100 > 25 %, je mogo če sklepati, da je preskusna kemikalija 
zavrla aktivnost inokuluma, kar je lahko razlog za nizke vrednosti D  FT , 
dobljene v pogojih preskusa. V tem primeru se lahko preskus ponovi pri nižji preskusni koncentraciji ter po možnosti z zmanjšanjem DIC v inoku ­
lumu in TIC, ki nastane v slepih kontrolnih vzorcih, saj se bo sicer zaradi 
nižje koncentracije zmanjšala natan čnost metode. Uporabiti pa je mogo če 
tudi drug inokulum. Če je v bučki F
 S (abiotski) opaženo bistveno pove čanje 
(> 10-odstotno) koli čine TIC, je morda prišlo do procesa abiotske razgrad ­
nje. 
Veljavnost rezultatov  
66. Šteje se, da je preskus veljaven, če: 
(a) je srednji delež razgradnje v posodah F  C , ki vsebujejo referen čno kemi­
kalijo, > 60-odstoten do 14. dneva inkubacije, in 
(b) če je srednja koli čina TIC v slepih kontrolnih vzorcih F  B ob koncu 
preskusa > 3 mg C/l. 
Če so te omejitve presežene, je treba preskus ponoviti z inokulumom iz 
drugega vira in/ali pregledati postopke. Če je na primer težava velika koli ­ 
čina nastajanja IC v slepem vzorcu, je treba uporabiti postopek iz odstavkov 
27 do 32.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1431  
( 1 ) Odstotni delež razgradnje v posodah F  C , ki vsebujejo referen čno snov. 
( 2 ) Odstotni delež razgradnje v posodah F  I .
 67. Če preskusna kemikalija ne doseže 60 % ThIC in zanjo ni dokazan zaviralni 
učinek (odstavek 65), je mogo če preskus ponoviti s pove čano koncentracijo 
inokuluma (do 30 mg/l aktivnega blata in 100 ml iztoka/l) ali z inokulumi iz drugih virov, zlasti če je bila razgradnja 20- do 60-odstotna.
 
Razlaga rezultatov  
68. Če je pri tem preskusu v 10-dnevnem obdobju biološka razgradnja ThIC > 
60-odstotna, to pomeni, da je preskusna kemikalija v aerobnih pogojih 
dobro razgradljiva. 
69. Če prag 60 % ThIC ni dosežen, se dolo či vrednost pH v medijih v stekle ­
nicah, ki niso bile zakisane ali alkalizirane; vrednost pod 6,5 lahko nakazuje, da je prišlo do nitrifikacije. V tem primeru se preskus ponovi s pufrsko 
raztopino z višjo koncentracijo.
 
Poročilo o preskusu  
70. Oblikuje se preglednica, ki prikazuje odstotni delež D za vsako preskusno 
steklenico (F  T ), referen čno steklenico (F  C ) in steklenico za kontrolo zavi ­
ranja (F  I ), če je vklju čena, za vsak dan vzor čenja. Če so za ponovitvene 
steklenice rezultati primerljivi, se grafi čno prikaže krivulja srednjega odstot ­
nega deleža D v odvisnosti od časa. Zapišejo se koli čina TIC v slepih 
vzorcih (F  B ) in sterilnih kontrolnih vzorcih (F  S ), DOC in/ali drugi determi ­
nanti ter njihov delež odstranitve. 
71. Dolo či se srednja vrednost deleža D v fazi konstantne ravni ali uporabi 
največja vrednost, če krivulja biološke razgradnje v fazi konstantne ravni 
pada, ter se navede kot „stopnja biološke razgradnje preskusne kemikalije“. Pomembno je zagotoviti, da v slednjem primeru najvišja vrednost ni izjema. 
72. V poro čilu o preskusu morajo biti naslednji podatki:  
Preskusna kemikalija:  
— splošno ime, kemijsko ime, številka CAS, strukturna formula in 
pomembne fizikalno-kemijske lastnosti, 
— čistost (ne čistote) preskusne kemikalije.  
Preskusni pogoji:  
— sklicevanje na to preskusno metodo, — opis uporabljenega preskusnega sistema (npr. prostornina posode, 
razmerje med nadprostorom in teko čino, način mešanja itd.), 
— uporaba preskusne in referen čne kemikalije v preskusnem sistemu: 
uporabljena preskusna koncentracija in koli čina ogljika, odmerjena v 
posamezno preskusno steklenico, ter morebitna uporaba topil, 
— podrobnosti o uporabljenem inokulumu, morebitna predobdelava in akli ­
matizacija, 
— inkubacijska temperatura, — validacija na čela analize IC, 
— glavne zna čilnosti uporabljenega analizatorja IC (in drugih uporabljenih 
analitičnih metod), 
— število ponovitev.  
Rezultati:  
— neobdelani podatki in izra čunane vrednosti biološke razgradljivosti v 
obliki preglednice,
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1432
 
— graf odstotnega deleža razgradnje v odvisnosti od časa za preskusne in 
referenčne kemikalije, faza prilagajanja, faza razgradnje, 10-dnevno 
obdobje in naklon, 
— odstotni delež odstranitve v fazi konstantne ravni, ob koncu preskusa in 
po 10-dnevnem obdobju, 
— razlogi za morebitno zavrnitev rezultatov preskusa, 
— drugi dejavniki, ki so pomembni za uporabljeni postopek, — razprava o rezultatih.
 
VIRI:  
(1) Poglavje C.4 te priloge, Dolo čanje „dobre“ biorazgradljivosti – preskus 
razvijanja CO  2 (metoda C.4-C) 
(2) Sturm, R. N. (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening 
test for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,. Oil Chem Soc. 50: 
159–167. 
(3) Larson, R. J. (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic 
organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153–1161. 
(4) Larson, R. J., Hansmann, M. A. in Bookland, E. A. (1996). Carbon dioxide 
recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195–1210. 
(5) ISO 9439 (1990; revidiran leta 1999). Kakovost vode – Vrednotenje 
popolne aerobne biološke razgradljivosti organskih snovi v vodi – Preskus z merjenjem sproš čenega ogljikovega dioksida (Sturm) 
(6) US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic 
Substances Washington, DC. 
(7) US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and 
Toxic Substances Washington, DC. 
(8) Gledhill, W. E. (1975). Screening test for assessment of biodegradability: 
Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922–929. 
(9) Weytjens, D., Van Ginneken, I., in Painter, H. A. (1994). The recovery of 
carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801–812. 
(10) Ennis, D. M., in Kramer, A. (1975). A rapid microtechnique for testing 
biodegradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181–185. 
(11) Ennis, D. M., Kramer, A., Jameson, C. W., Mazzoccki, P. H., in Bailey, P. 
H. (1978). Appl. Env. Microbiol. 35: 51–53. 
(12) Boatman, R. J., Cunningham, S. L., in Ziegler, D. A. (1986). A method for 
measuring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233–243. 
(13) Struijs, J., in Stoltenkamp, J. (1990). Head space determination of evolved 
carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 204–211. 
(14) Birch, R. R., in Fletcher, R. J. (1991). The application of dissolved inor ­
ganic carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. 
Chemosphere 23: 507–524. 
(15) Birch, R. R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W. E., Pagga, U., Steber, 
J., Reust, H., in Bontinck, W. J. (1989). Screening of chemicals for 
anaerobic biodegradation. Chemosphere 19: 1527–1550.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1433
 
(16) ISO 14593 (1999). Kakovost vode – Vrednotenje popolne aerobne bioraz ­
gradljivosti organskih spojin v aerobnem mediju – Metoda z analizo anor ­
ganskega ogljika v zaprtih posodah (preskus CO  2 v nadprostoru). 
(17) Battersby, N. S. (1997). The ISO headspace CO  2 biodegradation test, 
Chemosphere 34: 1813–1822. 
(18) US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed 
vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and 
Toxic Substance, Washington, DC. 
(19) Battersby, N. S., Ciccognani, D., Evans, M. R., King, D., Painter, H.A., 
Peterson, D. R. in Starkey, M. (1999). An „inherent“ biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemo ­
sphere 38: 3219–3235. 
(20) Poglavje C.4 te priloge, Dolo čanje „dobre“ biološke razgradljivosti. 
(21) OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biode ­
gradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. Kitano in M. Takatsuki; CITI). Pariz. 
(22) Poglavje C.11 te priloge, Preskus zaviranja dihanja aktivnega blata. (23) Struijs, J., Stoltenkamp-Wouterse, M. J., in Dekkers, A. L. M. (1995). A 
rationale for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability 
tests. Biodegradation 6: 319–327. 
(24) EU (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO
 2 method: application to 
surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research 
Centre, maj 1999, Medmenham, SL7 2HD, Združeno kraljestvo. 
(25) ISO 10634 (1996). Kakovost vode – Navodilo za pripravo in obdelavo v 
vodi slabo topnih organskih spojin za nadaljnje vrednotenje njihove bioraz ­
gradljivosti v vodi.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1434
 
Dodatek 1  
OKRAJŠAVE IN OPREDELITEV POJMOV  
IC: anorganski ogljik;  
ThCO  2 :teoretični ogljikov dioksid (mg) je koli čina ogljikovega dioksida, izra ču­
nana iz znane ali izmerjene vsebnosti ogljika v preskusni kemikaliji, ki se proiz ­
vede ob njeni popolni mineralizaciji; izražena tudi v mg ogljikovega dioksida, 
nastalega na mg preskusne kemikalije;  
DOC: raztopljeni organski ogljik je organski ogljik, ki je prisoten v raztopini, ali 
gre skozi 0,45-mikrometrski filter, ali ostane v supernatantu po 15-minutnem centrifugiranju pri približno 4 000 g (40 000 m s
 -2 ); 
DIC:  raztopljeni anorganski ogljik;  
ThIC:  teoretični anorganski ogljik;  
TIC:  skupni anorganski ogljik;  
dobro biološko razgradljivo:  arbitrarna razvrstitev kemikalij, ki so uspešno 
opravile nekatere specifi čne presejalne preskuse za popolno biološko razgradlji ­
vost; ker so ti preskusi dovolj strogi, se predpostavlja, da se bodo take kemikalije v vodnem okolju in aerobnih pogojih hitro in povsem biološko razgradile;  
10-dnevno obdobje:  obdobje 10 dni, ki se za čne takoj, ko je dosežena 10- 
odstotna biološka razgradnja;  
inherentna biološka razgradljivost:  razvrstitev snovi, za katere obstajajo 
nedvoumni dokazi biološke razgradljivosti (primarni ali popolni) iz katerega koli preskusa biološke razgradljivosti;  
popolna aerobna biološka razgradnja:  raven biološke razgradnje, ki je dose ­ 
žena, ko mikroorganizmi povsem porabijo preskusno kemikalijo, pri čemer nasta ­
nejo ogljikov dioksid, voda, mineralne soli in nove mikrobne celi čne sestavine 
(biomasa);  
mineralizacija:  popolna razgradnja organske kemikalije v CO
 2 in H  2 O v 
aerobnih pogojih oziroma CH  4 , CO  2 in H  2 O v anaerobnih pogojih;  
faza prilagajanja:  čas, ki prete če od začetka preskusa do aklimatizacije in/ali 
prilagoditve razgradnih mikroorganizmov in do povišanja stopnje biološke 
razgradnje preskusne kemikalije ali organske snovi do zaznavne ravni (npr. 10 % najve čje teoreti čne biološke razgradnje ali manj, odvisno od to čnosti 
merilne tehnike);  
faza razgradnje:  čas od konca obdobja prilagajanja do trenutka, ko se doseže 
90 % najvišje ravni razgradnje;  
faza konstantne ravni:  faza, v kateri se doseže najve čja razgradnja, krivulja 
biološke razgradnje pa se zravna;  
preskusna kemikalija:  snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne 
metode.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1435
 
Dodatek 2  
Primer krivulje biološke razgradnje  
Slika 1  
Biološka razgradnja 1-oktanola v preskusu CO  2 v nadprostoru
  
Glosar: 
Biološka razgradnja Faza razgradnje Najvišja stopnja biološke razgradnje Faza konstantne ravni 
10-dnevno obdobje 
Čas preskusa (dnevi)
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1436
 
C.30  BIOAKUMULACIJA V KOPENSKIH MALOŠ ČETINCIH  
UVOD 
1. Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 317 
(2010). Med preskusnimi metodami, ki se nanašajo na okoljsko usodo, je 
bila leta 1996 objavljena Biokoncentracija: preto čni preskus na ribah 
(poglavje C.13 te priloge (49)), leta 2008 pa Bioakumulacija v bentoških maloščetincih, ki živijo v usedlinah (53). Ekstrapolacija podatkov o bioaku ­
mulaciji v vodnih organizmih na kopenske organizme, kot so deževniki, je 
zahtevna, če je sploh mogo ča. Za ocenjevanje bioakumulacije kemikalij v 
tleh se trenutno uporabljajo modelni izra čuni na podlagi lipofilnosti 
preskusne kemikalije, npr. (14) (37), kot na primer v tehni čnih smernicah 
EU (19). Potreba po preskusni metodi za posamezna podro čja se je že za čela 
obravnavati, npr. (55). Taka metoda je zlasti pomembna za ocenjevanje 
sekundarne zastrupitve v kopenskih prehranjevalnih verigah (4). Ve č nacio­
nalnih preskusnih metod se ukvarja z vprašanjem bioakumulacije v organ ­
izmih, ki niso ribe, npr. (2) in (72). Ameriško združenje za preskušanje in 
materiale (American Society for Testing and Materials) je razvilo metodo za 
merjenje bioakumulacije v deževnikih ( Eisenia fetida , Savigny) in enhitrejih 
iz kontaminiranih tal (3). Mednarodno priznana metoda za dolo čanje bioa ­
kumulacije v tleh s primešano preskusno snovjo bo izboljšala ocenjevanje 
tveganja kemikalij v kopenskih ekosistemih, npr. (25) (29). 
2. Nevreten čarji, ki jedo prst, so izpostavljeni kemikalijam v tleh. Med temi 
živalmi imajo kopenski maloš četinci pomembno vlogo pri strukturi in funk ­
ciji tal (15) (20). Živijo v tleh in delno ob površju (zlasti v plasti rastlin ­
skega odpada); pogosto so najštevilnejša vrsta v biomasi (54). Z bioturbacijo 
tal in kot plen lahko te živali mo čno vplivajo na biološko razpoložljivost 
kemikalij za druge organizme, kot so nevreten čarji (npr. plenilske pršice in 
hrošči; npr. (64)) ali plenilski vreten čarji (npr. lisice in galebi) (18) (62). 
Nekatere vrste kopenskih maloš četincev, ki se trenutno uporabljajo pri 
ekotoksikološkem preskušanju, so opisane v Dodatku 5. 
3. V Standardnih smernicah ASTM za izvajanje laboratorijskih preskusov stru ­
penosti tal ali bioakumulacije z deževniki  Eisenia fetida  (Lumbricidae ) in 
enhitrejev  Enchytraeus albidus  (Enchytraeidae ) (3) so navedene številne 
bistvene in koristne podrobnosti za izvajanje te preskusne metode za bioa ­
kumulacijo v tleh. Nadaljnja dokumenta, ki sta navedena v tej preskusni metodi, sta poglavje C.13 te priloge Biokoncentracija: preto čni preskus na 
ribah (49) in Smernica za preskušanje OECD št. 315: Bioakumulacija v 
bentoških maloš četincih, ki živijo v usedlinah (53). Za to preskusno metodo 
so pomembni viri informacij tudi prakti čne izkušnje iz raziskav o bioaku ­
mulaciji v tleh in objave iz virov, npr. (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) 
(57) (59) (76) (78) (79). 
4. Ta preskusna metoda se v glavnem uporablja za stabilne nevtralne organske 
kemikalije, ki se rade adsorbirajo na zemljino. S to preskusno metodo je 
mogo
če preskušanje bioakumulacije stabilnih organokovinskih spojin, 
vezanih v tleh. Uporabi se lahko tudi za kovine in druge elemente v sledeh.  
OSNOVNI POGOJ 
5. Preskusi za merjenje bioakumulacije kemikalije v kopenskih maloš četincih 
se izvajajo s težkimi kovinami (glej npr. (63)) in obstojnimi organskimi kemikalijami z vrednostmi log K
 ow med 3,0 in 6,0, npr. (40). Uporabljajo 
se tudi za: 
— kemikalije, pri katerih je vrednost log K  ow večja od 6,0 (superhidrofobne 
kemikalije),  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1437
 
— kemikalije, ki spadajo v razred organskih kemikalij, za katere je znano, 
da se lahko kopi čijo v živih organizmih, npr. površinsko aktivne ali 
močno adsorptivne kemikalije, 
— kemikalije, katerih strukturne zna čilnosti kažejo na možnost bioakumu ­
lacije, npr. analogi kemikalij z znanim bioakumulacijskim potencialom, in 
— kovine. 
6. Pred za četkom raziskave je treba pridobiti informacije o preskusni kemika ­
liji, kot so splošno ime, kemijsko ime (po možnosti ime IUPAC), strukturna 
formula, registrska številka CAS, čistost, varnostni ukrepi, ustrezni pogoji 
shranjevanja in analitske metode. Poleg tega bi bilo treba poznati naslednje podatke: 
(a) topnost v vodi; 
(b) koeficient porazdelitve oktanol/voda, K
 ow ; 
(c) koeficient porazdelitve zemljina/voda, izražen kot K  oc ; 
(d) parni tlak; 
(e) razgradljivost (npr. v tleh, vodi); 
(f) znani metaboliti. 
7. Uporabiti je mogo če tudi radioaktivno ozna čene in neozna čene preskusne 
kemikalije. Za lažjo analizo se priporo ča uporaba radioaktivno ozna čene 
preskusne kemikalije. Odlo čitev se sprejme na podlagi meja zaznavnosti 
ali zahteve glede merjenja mati čne preskusne kemikalije in metabolitov. 
Če se uporabi radioaktivno ozna čena preskusna kemikalija in merijo skupni 
radioaktivni ostanki, je pomembno, da se radioaktivno ozna čeni ostanki v 
tleh in preskusnih organizmih opredelijo glede deležev mati čne preskusne 
kemikalije in tiste, ki je ozna čena za nemati čno, npr. v vzorcih, vzetih v 
stabilnem stanju ali ob koncu faze absorpcije, da je mogo če izračunati 
bioakumulacijski faktor (BAF) za mati čno preskusno kemikalijo in zadevne 
metabolite v tleh (glej odstavek 50). Za merjenje radioaktivno neozna čenih 
organskih preskusnih kemikalij ali kovin je tu opisano metodo morda treba 
prilagoditi, npr. za zagotovitev zadostne biomase. Pri merjenju skupnih radioaktivnih ostankov (s teko činskim scintilacijskim štetjem po ekstrakciji, 
sežigu ali omogo čitvi topnosti tkiva) bioakumulacijski faktor temelji na 
matični preskusni kemikaliji in metabolitih. Izra čun BAF mora po možnosti 
temeljiti na koncentraciji mati čne preskusne kemikalije v organizmih in 
skupnih radioaktivnih ostankov. Nato je treba za primerljivost rezultatov iz različnih preskusov bioakumulacije iz BAF izra čunati faktor akumulacije 
v organizmih glede na tla (BSAF), normaliziran na vsebnost lipidov v črvih 
in vsebnost organskega ogljika (OC) v tleh. 
8. Znana mora biti strupenost preskusne kemikalije za vrsto, uporabljeno v 
preskusu, npr. koncentracija z u činkom (ECx) ali smrtna koncentracija 
(LCx) v fazi absorpcije (npr. (19)). Izbrana koncentracija preskusne kemi ­
kalije mora biti po možnosti približno 1 % njenega akutnega asimptoti čnega 
LC
 50 in vsaj desetkrat višja kot meja njenega zaznavanja v tleh z upora ­
bljeno analitsko metodo. Prednost je treba dati vrednostim strupenosti, ki izhajajo iz dolgotrajnih raziskav subletalnih kon čnih točk, če so na voljo 
(51) (52). Če taki podatki niso na voljo, je koristne informacije mogo če 
dobiti s preskusom akutne strupenosti (glej npr. (23)).
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1438
 
9. Na voljo mora biti ustrezna analitska metoda znane to čnosti, natan čnosti in 
občutljivosti za koli činsko opredelitev kemikalije v preskusnih raztopinah, 
tleh in biološkem materialu, pa tudi podrobnosti o pripravi in shranjevanju vzorcev ter varnostni listi za snov. Znane morajo biti tudi analitske meje zaznavnosti preskusne snovi v tleh in tkivu črvov. Pri uporabi preskusne 
kemikalije, ozna čene s
 14 C, je treba poznati specifi čno radioaktivnost (tj. Bq 
mol-1) in delež radioaktivnosti, povezan z ne čistotami. Specifi čna radioa ­
ktivnost preskusne kemikalije mora biti dovolj visoka, da omogo ča analizo, 
uporabljene preskusne koncentracije pa ne smejo sprožiti strupenih u činkov. 
10. Preskus se lahko izvaja z umetnimi ali naravnimi zemljinami. Pred za četkom 
preskusa je treba poznati informacije o zna čilnostih uporabljene naravne 
zemljine, npr. izvor zemljine ali njenih sestavin, pH, vsebnost organskega 
ogljika, velikostno porazdelitev delcev (delež peska, mulja in gline) in 
zmogljivost zadrževanja vode (WHC) (3) (48).  
NAČELO PRESKUSA 
11. Med parametri, ki so zna čilni za bioakumulacijo preskusne kemikalije, so 
bioakumulacijski faktor (BAF), konstanta hitrosti absorpcije (k  s ) in 
konstanta hitrosti izlo čanja (k  e ). Opredelitve so navedene v Dodatku 1. 
12. Preskus sestavljata dve fazi: faza absorpcije (izpostavljenosti) in faza izlo ­ 
čanja (po izpostavljenosti). V fazi absorpcije so ponovitvene skupine črvov 
izpostavljene zemljini, ki ji je dodana preskusna kemikalija. Poleg 
preskusnih živali so v enakih pogojih kontrolne skupine črvov, le brez 
preskusne kemikalije. Izmerita se suha teža preskusnih organizmov in vsebnost lipidov v njih. Pri tem je mogo če uporabiti črve iz kontrolne 
skupine. Analitske vrednosti ozadja (slepi vzorec) je mogo če dobiti z analizo 
kontrolnih vzorcev črvov in tal. Za fazo izlo čanja se črvi prenesejo v tla, v 
katerih ni preskusne kemikalije. Faza izlo čanja je vedno potrebna, razen če 
je absorpcija preskusne kemikalije v fazi izpostavljenosti zanemarljiva. Faza izločanja zagotavlja informacije o hitrosti, s katero se preskusna kemikalija 
izloča iz preskusnih organizmov (npr. (27)). Če v fazi absorpcije stabilno 
stanje ni doseženo, mora dolo čitev kineti čnih parametrov – kineti čnega 
bioakumulacijskega faktorja BAFk, konstante hitrosti absorpcije in konstante hitrosti izlo čanja – po možnosti temeljiti na hkratnem prilagajanju rezultatov 
iz faze absorpcije in faze izlo čanja. Koncentracija preskusne kemikalije v/na 
črvih se spremlja ves čas trajanja obeh faz preskusa. 
13. V fazi absorpcije se meritve opravljajo ob časih vzorčenja do najve č 14 dni 
(enhitreji) oziroma 21 dni (deževniki), dokler ni doseženo stabilno stanje 
(11) (12) (67). Stabilno stanje je vzpostavljeno, ko je krivulja koncentracije v črvih v odvisnosti od časa vzporedna s časovno osjo in se tri zaporedne 
analize koncentracije vzorcev, vzetih v vsaj dvodnevnih intervalih, med 
seboj ne razlikujejo za ve č kot ± 20 % glede na statisti čne primerjave 
(npr. analiza variance, regresijska analiza). 
14. V fazi izlo čanja se preskusni organizmi prenesejo v posode z istim 
substratom brez preskusne kemikalije. V fazi izlo čanja se meritve opravljajo 
14 dni (enhitreji) oziroma 21 dni (deževniki) ob časih vzorčenja, razen če je 
prejšnje analitsko dolo čanje pokazalo 90-odstotno zmanjšanje ostankov 
preskusne kemikalije v črvih. O koncentraciji preskusne kemikalije v 
črvih ob koncu faze izlo
čanja se poro ča kot o neizlo čenih ostankih. Bioa ­
kumulacijski faktor stabilnega stanja (BAFss) se izra čuna po možnosti kot  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1439
 
razmerje med koncentracijo v črvih (ca) in tleh (Cs) v o čitnem stabilnem 
stanju ter kot kineti čni bioakumulacijski faktor (BAFK) oziroma razmerje 
med konstanto hitrosti absorpcije iz tal (ks) in konstanto hitrosti izlo čanja 
(ke) (za opredelitve glej Dodatek 1) ob predpostavki kinetike prvega reda (za izračune glej Dodatek 2). Če kinetika prvega reda o čitno ni ustrezna, je 
treba uporabiti druge modele. 
15. Konstanta hitrosti absorpcije, konstanta hitrosti izlo čanja (ali konstante pri 
uporabi drugih modelov), kineti čni bioakumulacijski faktor (BAFK), in kjer 
je to mogo če, intervali zaupanja za vse te parametre se izra čunajo po ra ču­
nalniških modelnih ena čbah (za navodila glej Dodatek 2). Ustreznost prile ­
ganja modela je mogo če ugotoviti na primer na podlagi korelacijskega 
koeficienta ali determinacijskega koeficienta (koeficienti blizu ena pomenijo dobro prileganje) ali hi-kvadrata. Kažeta jo lahko tudi velikost standardne 
napake ali interval zaupanja za ocenjene parametre. 
16. Za zmanjšanje variabilnosti rezultatov preskusa za preskusne kemikalije z 
visoko lipofilnostjo je treba bioakumulacijske faktorje izraziti v odvisnosti 
od vsebnosti lipidov in vsebnosti organskega ogljika (vsebnost organskega 
ogljika (OC) v kg zemljine, vsebnost lipidov v kg-1 črvov). Ta pristop 
temelji na dejstvu, da pri nekaterih razredih kemikalij obstaja jasna poveza ­
nost med potencialom bioakumulacije in lipofilnostjo; to je že dobro doka ­
zano pri ribah (47). Obstaja povezanost med vsebnostjo lipidov v ribah in 
bioakumulacijo takih kemikalij. Podobna medsebojna odvisno je bila ugoto ­
vljena pri bentoških organizmih, npr. (30) (44), dokazana pa je tudi za kopenske maloš četince, npr. (5) (6) (7) (14). Če je na voljo dovolj črvjega 
tkiva, je mogo če vsebnost lipidov v preskusnih živalih dolo čiti z uporabo 
istega biološkega materiala kot za dolo čanje koncentracije preskusne kemi ­
kalije. Sicer se lahko za meritev vsebnosti lipidov uporabijo kontrolne živali.
 
VELJAVNOST PRESKUSA 
17. Da je preskus veljaven, morajo kontrolni in tretirani vzorci izpolnjevati 
naslednja merila: 
— ob koncu preskusa skupna smrtnost v fazah absorpcije in izlo čanja ne 
sme presegati 10 % (deževniki) oziroma 20 % (enhitreji) skupnega števila uporabljenih črvov, 
— pri  Eisenia fetida  in Eisenia andrei  srednja izguba teže, merjena ob 
koncu faze absorpcije in ob koncu faze izlo čanja, ne sme presegati 
20 % v primerjavi z za četno svežo težo (f.w.) na za četku posamezne 
faze.
 
OPIS METODE  
Preskusne vrste  
18. Za preskušanje bioakumulacije je priporo čenih več vrst kopenskih maloš če­
tincev. Najve čkrat uporabljene vrste  Eisenia fetida,  ali Eisenia andrei  (Lum­
bricidae ), ali  Enchytraeus albidus , Enchytraeus crypticus,  ali Enchytraeus 
luxuriosus  (Enchytraeidae ) so opisane v Dodatku 5.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1440
 
Oprema  
19. Pri vseh delih opreme se je treba izogibati uporabi materialov, ki se lahko 
raztopijo, adsorbirajo preskusno kemikalijo ali iz katerih se lahko izlužijo druge kemikalije in ki škodljivo u činkujejo na preskusne živali. Uporabiti je 
mogoče standardne pravokotne ali valjaste posode iz kemijsko inertne snovi 
in s primerno prostornino, ki ustrezajo stopnji obremenitve, tj. številu preskusnih črvov. Za opremo, ki je v stiku s preskusnimi mediji, se lahko 
uporabijo nerjavno jeklo, plastika ali steklo. Preskusne posode je treba 
ustrezno pokriti, da se prepre či uhajanje črvov, hkrati pa omogo či zadosten 
dotok zraka. Pri kemikalijah z visokimi adsorpcijskimi koeficienti, kot so sintetični piretroidi, je lahko potrebno silanizirano steklo. V teh primerih je 
treba opremo po uporabi zavre či (49). Prepre čiti je treba uhajanje radioa ­
ktivno ozna čenih preskusnih snovi in hlapnih kemikalij. Uporabiti je treba 
lovilnike (npr. steklene plinske izpiralke), ki vsebujejo ustrezne absorbente za zadrževanje morebitnih ostankov, ki izparijo iz preskusnih posod.
 
Tla 
20. Tla morajo biti take kakovosti, ki omogo ča preživetje in po možnosti 
razmnoževanje preskusnih organizmov med aklimatizacijo in preskušanjem, 
ne da bi bili pri tem videti nenormalno ali bi se nenormalno obnašali. Črvi 
se morajo zariti v tla. 
21. Umetna zemljina, opisana v poglavju C.8 te priloge (48), je priporo čena za 
uporabo kot substrat v preskusih. V Dodatku 4 so podani opis priprave 
umetne zemljine za uporabo pri preskusu bioakumulacije in priporo čila za 
shranjevanje umetne zemljine. Na zraku posušena umetna zemljina se lahko do uporabe hrani pri sobni temperaturi. 
22. Za preskusna tla in/ali tla za gojenje je mogo če uporabiti tudi naravno 
zemljino z neonesnaženih obmo čij. Pri naravni zemljini je treba opredeliti 
vsaj izvor (mesto odvzema), pH, vsebnost organskega ogljika, velikostno 
porazdelitev delcev (delež peska, mulja in gline), najve čjo zmogljivost zadr ­ 
ževanja vode (WHCmax) in delež vsebnosti vode (3). Analiza tal ali njihovih sestavin, kar zadeva mikro onesnaževala, pred uporabo bi morala dati koristne informacije. Če se uporabi zemljina s kmetijskih zemljiš č, se že 
vsaj eno leto pred vzor čenjem ne smejo obdelovati z izdelki za zaš čito 
pridelka ali gnojem tretiranih živali kot gnojili, z organskimi gnojili pa že vsaj šest mesecev pred vzor čenjem (50). Postopki ravnanja z naravno 
zemljino pred uporabo v ekotoksikoloških preskusih z maloš četinci v labo ­
ratoriju so opisani v (3). Pri naravni zemljini mora biti čas shranjevanja v 
laboratoriju čim krajši.
 
Uporaba preskusne kemikalije  
23. Preskusna kemikalija se vnese v tla. Pri tem je treba upoštevati njene 
fizikalno-kemijske lastnosti. Preskusno kemikalijo, ki se topi v vodi, je treba pred mešanjem z zemljino povsem raztopiti v vodi. Priporo čeni 
postopek dodajanja preskusnih kemikalij, ki se slabo topijo v vodi, vklju čuje 
prekrivanje ene ali ve č sestavin (umetne) zemljine s preskusno kemikalijo. 
Kremenov pesek ali del kremenovega peska je mogo če na primer namo čiti v 
raztopini preskusne kemikalije v primernem organskem topilu ter jo nato 
počasi izpariti do suhega. Prekriti del se lahko nato vmeša v vlažna tla. 
Velika prednost tega postopka je, da se v tla ne vnese topilo. Pri uporabi
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1441
 
naravne zemljine je mogo če preskusno kemikalijo dodati s primešanjem k 
delu na zraku posušene zemljine, kot je opisano zgoraj za umetno zemljino, 
ali z vmešanjem preskusne kemikalije v vlažno zemljino, z naknadnim izparevanjem, če je uporabljeno topilo. Na splošno se je treba čim bolj 
izogibati stiku vlažne zemljine s topili. Treba je upoštevati naslednje (3): 
— če se uporabi topilo, ki ni voda, mora biti tako, da se lahko meša z vodo 
in/ali da ga je mogo če odstraniti (na primer upariti), tako da v tleh 
ostane samo preskusna kemikalija, 
— če se uporabi kontrolni vzorec s topilom, negativna kontrola ni potrebna. 
Kontrolni vzorec s topilom mora vsebovati najve čjo koncentracijo topila, 
dodano zemljini, uporabiti pa je treba topilo iz iste šarže kot za osnovno 
raztopino. Strupenost in hlapnost topila ter topnost preskusne kemikalije 
v izbranem topilu bi morale biti glavna merila za izbiro primernega topila. 
24. Pri kemikalijah, ki so slabo topne v vodi in organskih topilih, je mogo če 
2,0–2,5 g drobno mletega kremenovega peska na preskusno posodo zmešati 
z določeno količino preskusne kemikalije, npr. s terilnico in pestilom, da 
nastane želena preskusna koncentracija. Ta mešanica kremenovega peska in preskusne kemikalije se lahko doda predhodno navlaženi zemljini in teme ­
ljito zmeša z ustrezno koli čino deionizirane vode, da nastane potrebna 
vsebnost vlage. Kon čna mešanica se porazdeli v preskusne posode. 
Postopek se ponovi za vsako preskusno koncentracijo in pripravi tudi ustrezni kontrolni vzorec z 2,0–2,5 g drobno mletega kremenovega peska 
na preskusno posodo. 
25. Koncentracijo preskusne kemikalije v tleh je treba dolo čiti po primešanju. 
Pred uvedbo preskusnih organizmov je treba preveriti homogeno porazde ­
litev preskusne kemikalije v tleh. Poro čati je treba o metodi, uporabljeni za 
primešanje, in razlogih za izbiro posebnega postopka primešanja (24). 
26. Idealno je, če se pred dodajanjem organizmov vzpostavi ravnotežje med 
zemljino in fazo porne vode; priporo čeno je štiridnevno obdobje pri 20 °C. 
Pri številnih organskih kemikalijah, ki so slabo topne v vodi, se lahko čas, 
potreben za vzpostavitev resni čnega ravnotežja med adsorbiranimi in razto ­
pljenimi delci, šteje v dnevih ali mesecih. Glede na namen raziskave, na 
primer pri posnemanju razmer v okolju, se lahko zemljina s primešano preskusno snovjo „stara“ dlje, npr. pri kovinah tri tedne pri 20 °C (22).
 
Gojenje preskusnih organizmov  
27. Črvi se po možnosti gojijo v trajni laboratorijski kulturi. Navodila o 
metodah laboratorijskega gojenja za vrste  Eisenia fetida  in Eisenia andrei  
ter Enchytraeid  so podana v Dodatku 5 (glej tudi (48) (51) (52)). 
28. Črvi, uporabljeni v preskusih, morajo biti brez ugotovljivih bolezni, bolezen ­
skih sprememb in zajedavcev.  
IZVEDBA PRESKUSA 
29. Preskusni organizmi so preskusni kemikaliji izpostavljeni v fazi absorpcije. 
Ta mora trajati 14 dni (enhitreji) oziroma 21 dni (deževniki), razen če se 
dokaže, da je bilo vzpostavljeno stabilno stanje.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1442
 
30. Za fazo izlo čanja se črvi prenesejo v tla, v katerih ni preskusne kemikalije. 
Prvi vzorec je treba vzeti 4–24 h po za četku faze izlo čanja. Primeri časovnih 
razporedov vzor čenja za 21-dnevno fazo absorpcije in 21-dnevno fazo izlo ­ 
čanja so podani v Dodatku 3.  
Preskusni organizmi  
31. Pri številnih vrstah kopenskih enhitrejev je teža posameznih osebkov zelo 
majhna (npr. 5–10 mg mokre teže na posamezno žival vrste  Enchytraeus 
albidus  in manj pri vrstah  Enchytraeus crypticus  ali Enchytraeus luxurio ­
sus); za meritev teže in kemi čno analizo je v časih treba združevati črve iz 
ponovitvenih preskusnih posod (tj. uporabijo se vsi črvi iz ponovitvene 
posode, da se dobi en analitski rezultat za tkivo). Vsaki ponovitvi se doda 
20 posameznih enhitrejev, uporabiti pa je treba vsaj tri ponovitve. Če je 
analitska meja zaznavnosti preskusne kemikalije visoka, je lahko potrebnih več črvov. Pri preskusnih vrstah z ve čjo težo posameznega osebka ( Eisenia 
fetida  in Eisenia andrei ) je mogo če uporabiti ponovitvene posode z enim 
osebkom. 
32. Deževniki, uporabljeni v preskusu, morajo imeti podobno težo (npr. posa ­
mezne živali vrst  Eisenia fetida  in Eisenia andrei  bi morale tehtati 250–600 
mg). Enhitreji (npr.  Enchytraeus albidus ) morajo biti dolgi približno 1 cm. 
Vsi črvi, uporabljeni v posameznem preskusu, morajo biti iz istega vira in 
biti odrasle živali s klitelumom (glej Dodatek 5). Ker lahko teža in starost živali vplivata na vrednosti BAF (npr. zaradi razli čnih vsebnosti lipidov 
in/ali prisotnosti jaj čec), je treba te parametre natan čno zapisovati in jih 
upoštevati pri razlagi rezultatov. Poleg tega lahko živali v obdobju izposta ­
vljenosti odložijo kokone, kar tudi vpliva na vrednosti BAF. Priporo čeno je 
pred preskusom stehtati podvzorec preskusnih črvov, da se ocenita srednja 
mokra in suha teža. 
33. Uporabiti je treba visoko razmerje med zemljino in črvi, da se v fazi 
absorpcije čim bolj zmanjša zniževanje koncentracije preskusne kemikalije 
v tleh. Za vrsti  Eisenia fetida  in Eisenia andrei  je priporo čenih najmanj 50 g 
suhe teže (d.w.) zemljine na črva, za enhitreje pa najmanj 10–20 g d.w. 
zemljine na preskusno posodo. Posode morajo vsebovati 2–3-centimetrski (enhitreji) oziroma 4–5-centimetrsko plast zemljine (deževniki). 
34. Črvi, uporabljeni v preskusu, se odstranijo iz gojiš ča (npr. enhitreji se 
odstranijo s pinceto z zaobljeno konico). Odrasle živali se prestavijo v neobdelana preskusna tla za aklimatizacijo in nahranijo (glej odstavek 36). 
Če se preskusni pogoji razlikujejo od pogojev gojenja, bi morala aklimati ­
zacijska faza, ki traja 24–72 h, zadostovati za prilagoditev črvov na 
preskusne pogoje. Po aklimatizaciji se deževniki s premestitvijo sperejo v 
steklene posode (npr. petrijevke), ki vsebujejo čisto vodo, nato pa se steh ­
tajo, preden se dodajo v preskusna tla. Pred tehtanjem je treba odstraniti 
odvečno vodo s črvov tako, da se nežno pritisnejo ob rob posode ali pa se 
voda previdno popivna z njih z rahlo navlaženo papirnato brisa čo. 
35. Opazovati in zapisovati je treba obnašanje preskusnih organizmov v zvezi z 
zarivanjem. Pri preskusih z deževniki se živali (kontrolni in tretirani vzorci) običajno zarijejo v tla v nekaj urah; to je treba preveriti najpozneje 24 h po 
tem, ko se črvi dajo v preskusne posode. Če se deževniki ne zarijejo v tla 
(npr. več kot 10 % v ve č kot polovici faze absorpcije), to pomeni, da 
preskusni pogoji niso ustrezni ali da preskusni organizmi niso zdravi.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1443
 
V takem primeru je treba preskus ustaviti in ponoviti. Enhitreji ve činoma 
živijo v intersticijskih porah v tleh, njihov integument pa je pogosto samo 
delno v stiku s substratom v okolju; izpostavljenost enhitrejev, ki se zarijejo v tla, in tistih, ki se ne, se šteje za enakovredno, če se enhitreji ne zarijejo v 
tla, pa to ne pomeni nujno, da je treba preskus ponoviti.
 
Hranjenje  
36. Pri uporabi zemljine z majhno vsebnostjo skupnega organskega ogljika je 
treba predvideti hranjenje. Pri uporabi umetne zemljine je za deževnike 
priporočena tedenska koli čina hrane ( črvi naj se hranijo enkrat tedensko), 
ki znaša 7 mg posušenih iztrebkov na g suhe teže zemljine, za enhitreje pa tedenska koli čina 2–2,5 mg mletih ovsenih kosmi čev na g suhe teže 
zemljine (11). Prvi obrok hrane je treba primešati v zemljino tik pred doda ­
janjem preskusnih organizmov. Po možnosti se uporabi ista vrsta hrane kot v gojiščih (glej Dodatek 5).
 
Svetloba in temperatura  
37. Preskuse je treba izvajati v kontroliranem ciklusu 16 ur svetlobe in 8 ur 
teme, po možnosti pri 400–800 lux na mestu s preskusnimi posodami (3). 
Preskusna temperatura mora biti ves čas preskusa 20 ± 2 °C.  
Preskusne koncentracije  
38. Uporabi se samo ena koncentracija. Uporabo dodatnih koncentracij je treba 
utemeljiti. Če je strupenost (ECx) preskusne kemikalije blizu analitski meji 
zaznavnosti, je priporo čena uporaba radioaktivno ozna čene preskusne kemi ­
kalije z visoko specifi čno radioaktivnostjo. Pri kovinah mora biti koncen ­
tracija nad ravnjo ozadja v tkivu in tleh.  
Ponovitve  
39. Za kineti čne meritve (fazi absorpcije in izlo čanja) morajo biti najmanj tri 
ponovitvene posode s tretiranim vzorcem na to čko vzorčenja. Skupno 
število pripravljenih ponovitev mora zadostovati za vse čase vzorčenja v 
fazi absorpcije in fazi izlo čanja. 
40. Za biološka opazovanja in meritve (npr. razmerje med suho in mokro težo, 
vsebnost lipidov) ter analizo koncentracij ozadja v črvih in tleh je treba 
zagotoviti vsaj 12 ponovitvenih posod z negativnim kontrolnim vzorcem (štiri, vzor čene na za četku, štiri na koncu absorpcije in štiri na koncu izlo ­ 
čanja), če se ne uporablja drugo topilo kot voda. Če se za dodajanje 
preskusne kemikalije uporabi drugo topilo, je treba poleg tretiranih pono ­
vitev pripraviti tudi kontrolni vzorec s topilom (štiri ponovitvene posode je treba vzor čiti na začetku, štiri na koncu faze absorpcije in štiri na koncu faze 
izločanja), ki vsebuje vse sestavine, razen preskusne snovi. V tem primeru je 
mogoče uporabiti tudi štiri dodatne ponovitvene posode z negativnim 
kontrolnim vzorcem (brez topila) za neobvezno vzor čenje na koncu faze 
absorpcije. Te ponovitve je mogo če biološko primerjati s kontrolnim 
vzorcem s topilom, da se dobijo informacije o morebitnem vplivu topila 
na preskusne organizme. Priporo čeno je pripraviti zadostno število dodatnih 
rezervnih ponovitvenih posod (npr. osem) za tretirane in kontrolne vzorce.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1444
 
Pogostost meritev kakovosti tal  
41. Na za četku in koncu faz absorpcije in izlo čanja je treba izmeriti vrednost pH 
tal, vsebnost vlage v tleh in temperaturo (stalno) v sobi, v kateri se izvaja preskus. Enkrat tedensko je treba preveriti vsebnost vlage v tleh s tehtanjem 
preskusnih posod in primerjanjem dejanskih tež z za četnimi težami na 
začetku preskusa. Izgubo vode je treba nadomestiti z dodajanjem deionizi ­
rane vode.
 
Vzorčenje in analiza črvov in tal  
42. Primer časovne razporeditve faz absorpcije in izlo čanja v preskusih bioaku ­
mulacije v deževnikih in enhitrejih je podan v Dodatku 3. 
43. Vzorci tal se odvzamejo iz preskusnih posod za dolo čitev koncentracije 
preskusne kemikalije pred vnosom črvov ter v fazah absorpcije in izlo čanja. 
Med preskusom se dolo čajo koncentracije preskusne kemikalije v črvih in 
tleh. Na splošno se merijo skupne koncentracije v tleh. Mogo če je meriti 
tudi koncentracije v porni vodi; v takem primeru je treba pred za četkom 
raziskave podati razloge za to in zagotoviti ustrezne metode ter jih vklju čiti 
v poročilo. 
44. Črvi in tla se vzor čijo vsaj šestkrat v fazah absorpcije in izlo čanja. Če se 
dokaže stabilnost preskusne kemikalije, je lahko analiz tal manj. Priporo čeno 
je analizirati vsaj tri ponovitve na za četku in koncu faze absorpcije. Če 
koncentracija v tleh, izmerjena na koncu faze absorpcije, odstopa od za četne 
koncentracije za ve č kot za 30 %, je treba analizirati tudi vzorce tal, vzete v 
drugih dneh. 
45. Ob vsakem času vzorčenja se črvi iz ponovitve odstranijo iz tal (npr. ko se 
zemljina iz ponovitve razporedi na plitev pladenj, se črvi poberejo z mehko 
pinceto z zaobljeno konico) in na hitro sperejo z vodo v plitvem steklenem 
ali jeklenem pladnju. Odve čna voda se odstrani (glej odstavek 34). Črvi se 
pazljivo premestijo v predhodno stehtano posodo in takoj stehtajo, vklju čno 
z vsebino prebavil. 
46. Deževnikom ( Eisenia  sp.) je nato treba omogo čiti, da čez noč praznijo 
prebavila, npr. na vlažnem filtrirnem papirju v pokriti petrijevki (glej 
odstavek 34). Po tem je treba dolo čiti težo črvov, da se oceni morebitno 
zmanjšanje biomase med preskusom (glej merila veljavnosti v odstavku 17). Tkiva enhitrejev se tehtajo in analizirajo brez praznjenja prebavil, saj je to tehnično zahtevno, ker so ti 
črvi tako majhni. Po dolo čitvi končne teže jih je 
treba takoj ubiti z najprimernejšo metodo (npr. s teko čim dušikom ali zamrz ­
njenjem pri temperaturi pod –18 °C). 
47. Črvi v fazi izlo čanja nadomestijo kontaminirano vsebino prebavil s čisto 
zemljino. To pomeni, da meritve pri črvih z neizpraznjenimi prebavili (v 
tem primeru enhitrejih), vzor čenih tik pred fazo izlo čanja, vklju čujejo konta ­
minirano zemljino v prebavilih. Pri vodnih maloš četincih se predpostavlja, 
da se po za četnih 4–24 h faze izlo čanja večina kontaminirane vsebine 
prebavil nadomesti s čistim sedimentom, npr. (46). O podobnih ugotovitvah 
se je poro čalo v zvezi z deževniki v raziskavah o kopi čenju radioaktivno 
označenega kadmija in cinka (78). Pri enhitrejih z neizpraznjenimi prebavili 
se lahko koncentracija tega prvega vzorca v fazi izlo čanja šteje za koncen ­
tracijo v tkivu po praznjenju prebavil. Da bi upoštevali razred čenje koncen ­
tracije preskusne snovi z nekontaminirano zemljino v fazi izlo čanja, je 
mogoče oceniti težo vsebnosti prebavil iz razmerja med mokro težo črvov 
in težo pepela črvov ali razmerja med suho težo črvov in težo pepela črvov. ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1445
 
48. Vzorci tal in črvov se po možnosti analizirajo takoj po odstranitvi (tj. v 1–2 
dneh), da se prepre čijo razgradnja ali druge izgube. Priporo čljivo je že med 
izvajanjem preskusa izra čunati približne hitrosti absorpcije in izlo čanja. Če 
se analiza odloži, je treba vzorce ustrezno shraniti, npr. z globokim zamr ­
zovanjem ( ≤ –18 °C). 
49. Preveriti je treba, ali so natan čnost in ponovljivost kemijske analize ter 
rekuperacija preskusne kemikalije iz vzorcev tal in črvov zadovoljivi za 
zadevno metodo; poro čati je treba o u činkovitosti ekstrakcije, meji 
zaznavnosti (LOD) in meji koli činske opredelitve (LOQ). Poleg tega je 
treba preveriti, da preskusna kemikalija v kontrolnih posodah ni zaznavna 
v koncentracijah, ki so višje kot v ozadju. Če je pri kontrolnih črvih koncen ­
tracija preskusne kemikalije v preskusnem organizmu Ca > 0, je to treba vključiti v izra čun kineti čnih parametrov (glej Dodatek 2). V celotnem 
preskusu je treba z vsemi vzorci ravnati tako, da se kontaminacija in izguba 
čim bolj zmanjšata (npr. zaradi adsorpcije preskusne kemikalije na napravo 
za vzorčenje). 
50. Pri delu z radioaktivno ozna čenimi preskusnimi kemikalijami je mogo če 
analizirati mati čne snovi in metabolite. Koli činska opredelitev mati čne 
preskusne kemikalije in metabolitov v stabilnem stanju ali na koncu faze absorpcije vsebuje pomembne informacije. Vzorce je nato treba „o čistiti“, da 
je mogoče matično preskusno kemikalijo koli činsko ločeno opredeliti. Če 
posamezni metaboliti presegajo 10 % skupne radioaktivnosti v analiziranih vzorcih, se priporo ča identifikacija teh metabolitov. 
51. Navesti je treba skupno rekuperacijo ter rekuperacijo preskusne kemikalije v 
črvih, tleh in lovilnikih, ki vsebujejo absorbente za zadrževanje uparjene 
preskusne kemikalije, če se uporabijo, in poro čati o njiju. 
52. Združevanje posameznih vzor čenih živali iz dane preskusne posode je spre ­
jemljivo pri enhitrejih, ki so manjši od deževnikov. Če združevanje vklju ­ 
čuje zmanjševanje števila ponovitev, to omejuje statisti čne postopke, ki jih 
je mogoče uporabiti za podatke. Če sta potrebna posebna statisti čni postopek 
in vrednost, je treba v preskus vklju čiti primerno število ponovitvenih 
preskusnih posod za prilagoditev želenemu združevanju, postopku in vred ­
nosti. 
53. Priporo ča se, naj se BAF izrazi v odvisnosti od skupne suhe teže, in kadar je 
to potrebno (tj. pri mo čno hidrofobnih kemikalijah), v odvisnosti od 
vsebnosti lipidov. Za dolo čanje vsebnosti lipidov je treba uporabiti primerne 
metode (za ta namen je treba prilagoditi nekatere obstoje če metode, npr. 
(31) (58)), pri katerih se uporablja tehnika ekstrakcije s kloroformom/meta ­
nolom. Da bi se izognili uporabi kloriranih topil, pa je treba uporabiti 
prilagojeno metodo Bligha in Dyerja (9), kot je opisana v (17). Ker razli čne 
metode ne dajo nujno enakih vrednosti, je pomembno navesti podrobnosti o uporabljeni metodi. Kadar je to mogo če, tj. če je na voljo dovolj črvjega 
tkiva, je analizo lipidov najbolje opraviti na istem vzorcu ali ekstraktu, na 
katerem je bila analizirana preskusna kemikalija, ker je treba lipide pogosto odstraniti iz ekstrakta, preden ga je mogo če kromatografsko analizirati (49). 
Sicer je mogo če za merjenje vsebnosti lipidov uporabiti kontrolne živali, kar 
je mogoče nato uporabiti za normalizacijo vrednosti BAF. Pri slednjem 
pristopu se zmanjša kontaminacija opreme s preskusno kemikalijo.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1446
 
PODATKI IN PORO ČANJE  
Obdelava rezultatov  
54. Krivulja absorpcije preskusne kemikalije se dobi tako, da se njena koncen ­
tracija v/na črvih v fazi absorpcije grafi čno prikaže v odvisnosti od časa na 
aritmetični lestvici. Ko krivulja doseže konstantno raven ali stabilno stanje 
(glej opredelitve v Dodatku 1), se bioakumulacijski faktor stabilnega stanja 
BAFss izra čuna iz:  
C a v stabilnem stanju ali na koncu faze absorpcije  ðsrednja vrednostÞ 
C s v stabilnem stanju ali na koncu faze absorpcije  ðsrednja vrednostÞ 
C a je koncentracija preskusne kemikalije v preskusnem organizmu, 
C s je koncentracija preskusne kemikalije v tleh. 
55. Kadar stabilno stanje ni doseženo, je treba namesto BAFss dolo čiti BAFK 
na podlagi konstant hitrosti, kot je opisano spodaj: 
— akumulacijski faktor (BAF  K ) se dolo či kot razmerje med k  s in k  e , 
— hitrosti absorpcije in izlo čanja se po možnosti izra čunata hkrati (glej 
enačbo 11 v Dodatku 2), 
— konstanta hitrosti izlo čanja (k  e ) se običajno dolo či na podlagi krivulje 
izločanja (tj. grafi čnega prikaza koncentracije preskusne snovi v črvih v 
fazi izločanja). Konstanta hitrosti absorpcije k  s se nato izra čuna iz k  e in 
vrednosti C  a , ki se dobi iz krivulje absorpcije – za opis teh metod glej 
Dodatek 2. Za izra čun faktorja BAF  K in konstant hitrosti k  s in k  e je 
najbolje uporabiti ra čunalniške metode za ocenjevanje nelinearnih para ­
metrov. Če izločanje očitno ni prvega reda, je treba uporabiti kompleks ­
nejše modele.  
Poročilo o preskusu  
56. V poro čilu o preskusu morajo biti naslednje informacije:  
Preskusna kemikalija:  
— vse razpoložljive informacije o akutni ali dolgotrajni strupenosti (npr. 
EC x , LC  x “ NOEC) preskusne kemikalije za maloš četince, ki živijo v 
tleh, 
— čistost, fizikalno stanje in fizikalno-kemijske lastnosti, npr. log K  ow , 
vodotopnost, 
— kemijski identifikacijski podatki, vir preskusne snovi, identiteta in 
koncentracija uporabljenega topila, 
— če je uporabljena radioaktivno ozna čena preskusna kemikalija, to čen 
položaj ozna čenih atomov, specifi čna radioaktivnost in radiokemijska 
čistost.  
Preskusna vrsta:  
— znanstveno ime, sev, vir, morebitna predobdelava, aklimatizacija, starost, 
red velikosti itd.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1447
 
Preskusni pogoji:  
— uporabljeni preskusni postopek, — tip in lastnosti uporabljene svetlobe in obdobja osvetljenosti, 
— načrt preskusa (npr. število in velikost preskusnih posod, teža zemljine 
in debelina plasti tal, število ponovitev, število črvov na ponovitev, 
število preskusnih koncentracij, trajanje faz absorpcije in izlo čanja, 
pogostost vzor čenja), 
— razlogi za izbiro materiala, iz katerega so preskusne posode, — metoda priprave in dodajanja preskusne snovi ter razlogi za izbiro 
metode, 
— nazivne preskusne koncentracije, srednje izmerjene vrednosti in njihovi 
standardni odkloni v preskusnih posodah ter metoda, s katero so bile te vrednosti pridobljene, 
— vir sestavin umetne zemljine ali – pri uporabi naravnih medijev – izvor 
zemljine, opis morebitne predobdelave, rezultati kontrol (preživetje, razvoj biomase, razmnoževanje), lastnosti tal (pH, vsebnost skupnega 
organskega ogljika, velikostna porazdelitev delcev (odstotni delež peska, 
mulja in gline), WHC
 max , odstotni delež vsebnosti vode na za četku in 
koncu preskusa ter druge opravljene meritve), 
— podrobne informacije o obdelavi vzorcev tal in črvov, vklju čno s 
podrobnostmi o pripravi, shranjevanju, postopkih dodajanja snovi, ekstrakciji in analitskih postopkih (in natan čnosti) za preskusno snov v 
črvih in tleh ter o vsebnosti lipidov ( če je bila izmerjena) in rekuperaciji 
preskusne snovi.  
Rezultati:  
— smrtnost kontrolnih črvov in črvov v vsaki preskusni posodi ter opaženo 
nenormalno obnašanje (npr. izogibanje tlom, slabo razmnoževanje pri 
preskusu bioakumulacije v enhitrejih), 
— razmerje med suho in mokro težo zemljine in preskusnih organizmov 
(koristno za normalizacijo), 
— mokre teže črvov ob vsakem času vzorčenja; za deževnike mokre teže 
na začetku preskusa ter ob vsakem času vzorčenja pred praznjenjem 
prebavil in po njem, 
— vsebnost lipidov v preskusnih organizmih ( če je bila dolo čena), 
— krivulje, ki prikazujejo kinetiko absorpcije in izlo čanja preskusne kemi ­
kalije pri črvih ter čas do vzpostavitve stabilnega stanja, 
— C
 a in C  s (s standardnim odklonom in razponom, če je ustrezno) za vse 
čase vzorčenja (C  a izražen v g ·kg -1 mokre in suhe teže celega telesa, C  s 
izražen v g ·kg -1 mokre in suhe teže zemljine). Če je potreben faktor 
akumulacije v organizmih glede na tla (BSAF) (npr. za primerjavo 
rezultatov dveh ali ve č preskusov, opravljenih z živalmi z razli čno 
vsebnostjo lipidov), je lahko C  a dodatno izražen v g ·kg -1 vsebnosti 
lipidov v organizmu, C  s pa je lahko izražen v g ·kg -1 organskega 
ogljika (OC) v tleh, 
— BAF (izražen v kg zemljine ·kg -1 črvov), konstanta hitrosti absorpcije 
zemljine k  s (izražena v g zemljine kg  -1 črvov dan  -1 ) in konstanta hitrosti 
izločanja k  e (izražena v dan  -1 ); v poro čilu je lahko dodatno naveden 
BSAF (izražen v kg zemljine OC kg  -1 vsebnosti lipidov v črvih),  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1448
 
— če so bili izmerjeni: odstotni deleži mati čne kemikalije, metabolitov in 
vezanih ostankov (tj. odstotni delež preskusne kemikalije, ki ga ni 
mogoče ekstrahirati z obi čajnimi metodami ekstrakcije), zaznani v tleh 
in preskusnih živalih, 
— metode, uporabljene za statisti čno analizo podatkov.  
Vrednotenje rezultatov:  
— skladnost rezultatov z merili veljavnosti, navedenimi v odstavku 17, — nepričakovani ali nenavadni rezultati, npr. nepopolno izlo čanje 
preskusne kemikalije iz preskusnih živali.
 
VIRI:  
(1) Amorim, M. (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane ( γ- 
HCH) in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Master thesis, University Coimbra. 
(2) ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation 
of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. American 
Society for Testing and Materials, E 1688–00a. 
(3) ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil 
toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm  Eisenia 
fetida  and the Enchytraeid potworm  Enchytraeus albidus.  ASTM Interna ­
tional, E1676–04: str. 26. 
(4) Beek, B., Boehling, S., Bruckmann, U., Franke, C., Joehncke, U., Studin ­
ger, G. (2000). The assessment of bioaccumulation. In Hutzinger, O. (ured ­
nik), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (urednik zvezka: B. Beek): Bioaccumulation - New Aspects and Developments. 
Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 235–276. 
(5) Belfroid, A., Sikkenk, M., Seinen, W., Van Gestel, C., Hermens, J. (1994). 
The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms ( Eisenia 
andrei ): Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93–99. 
(6) Belfroid, A., Van Wezel, A., Sikkenk, M., Van Gestel, C., Seinen, W. & 
Hermens, J. (1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earth ­
worms ( Eisenia andrei ): Experiments in water. Ecotox. Environ. Safety 25: 
154–165. 
(7) Belfroid, A., Meiling, J., Drenth, H., Hermens, J., Seinen, W., Van Gestel, 
C. (1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms (Eisenia andrei ). Ecotox. Environ. Safety 31: 185–191. 
(8) Bell, A. W. (1958). The anatomy of  Enchytraeus albidus , with a key to the 
species of the genus  Enchytraeus.  Ann. Mus. Novitat. 1902: 1–13. 
(9) Bligh, E. G., in Dyer, W. J. (1959). A rapid method of total lipid extraction 
and purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911–917. 
(10) Bouche, M. (1972). Lombriciens de France. Ecologie et Systematique. 
INRA, Annales de Zoologie-Ecologie animale, Paris, str. 671. 
(11) Bruns, E., Egeler, Ph., Moser, T., Römbke, J., Scheffczyk, A., Spörlein, P. 
(2001a). Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestrischen Oligochaeten. Report to the German Federal Environmental 
Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 298 64 416. 
(12) Bruns, E., Egeler, Ph., Römbke, J. Scheffczyk, A., Spörlein, P. (2001b). 
Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes  
Enchytraeus luxuriosus  and  Enchytraeus albidus  (Enchytraeidae, Oligoc ­
haeta, Annelida). Hydrobiologia 463: 185–196. 
(13) Conder, J. M., in Lanno, R. P. (2003). Lethal critical body residues as 
measures of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm  
Eisenia fetida.  J. Soils Sediments 3: 13–20.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1449
 
(14) Connell, D. W., in Markwell, R. D. (1990). Bioaccumulation in the Soil to 
Earthworm System. Chemosphere 20: 91–100. 
(15) Didden, W. A. M. (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobio ­
logia 37: 2–29. 
(16) Didden, W. (2003). Oligochaeta, In: Bioindicators and biomonitors. 
Markert, B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (ur.). Elsevier Science 
Ltd., The Netherlands, str. 555–576. 
(17) De Boer, J., Smedes, F., Wells, D., Allan, A. (1999). Report on the 
QUASH interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish 
and shellfish. Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and Testing Programme. 
(18) Dietrich, D. R., Schmid, P., Zweifel, U., Schlatter, C., Jenni-Eiermann, S., 
Bachmann, H., Bühler, U., Zbinden, N. (1995). Mortality of birds of prey 
following field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 29: 140–145. 
(19) Uredba (ES) št. 1907/2006 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 
18. decembra 2006 o registraciji, evalvaciji, avtorizaciji in omejevanju kemikalij (REACH), o ustanovitvi Evropske agencije za kemikalije ter spremembi Direktive 1999/45/ES ter razveljavitvi Uredbe Sveta (EGS) 
št. 793/93 in Uredbe Komisije (ES) št. 1488/94 ter Direktive Sveta 
76/769/EGS in direktiv Komisije 91/155/EGS, 93/67/EGS, 93/105/ES in 2000/21/ES (UL L 396, 30.12.2006, str. 1). 
(20) Edwards, C. A., in Bohlen, P. J. (1996). Biology and ecology of earth ­
worms. Third Edition, Chapman & Hall, London, str. 426. 
(21) OECD (2008), Bioakumulacija v bentoških maloš četincih, ki živijo v used ­
linah, Smernica za preskušanje št. 315, Smernice za preskušanje kemikalij, 
OECD, Pariz. 
(22) Egeler, Ph., Gilberg, D., Scheffczyk, A., Moser, Th., in Römbke, J. (2009). 
Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisierten 
Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). Report to 
the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), R&D No.: 204 67 458: str. 149. Na voljo za prenos na: http:// 
www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf. 
(23) Elmegaard, N., in Jagers op Akkerhuis, G. A. J. M. (2000). Safety factors in 
pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI 
Technical Report 325: str. 57. 
(24) Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxi ­
city test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. 
Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30. 
(25) EPPO (2003). Environmental Risk Assessment scheme for plant protection 
products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195–208. 
(26) Franke, C. (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk 
assessment? Chemosphere 32: 1897–1905. 
(27) Franke, C., Studinger, G., Berger, G., Böhling, S., Bruckmann, U., 
Cohors-Fresenborg, D., Jöhncke, U. (1994). The assessment of bioaccumu ­
lation. Chemosphere 29: 1501–1514. 
(28) Füll, C. (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6- 
Hexachlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure 
(Dichlorprop) beim Regenwurm  Lumbricus rubellus  (Oligochaeta, Lumbri ­
cidae). Dissertation University Mainz, str. 156.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1450
 
(29) Füll, C., Schulte, C., Kula, C. (2003). Bewertung der Auswirkungen von 
Pflanzenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF - Z. Umweltchem, Ökotox. 
15: 78–84. 
(30) Gabric, A. J., Connell, D. W., Bell, P. R. F. (1990). A kinetic model for 
bioconcentration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225–1231. 
(31) Gardner, W. S., Frez, W. A., Cichocki, E. A., Parrish, C. C. (1985). 
Micromethods for lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceano ­
graphy 30: 1099–1105. 
(32) Hawker, D. W., in Connell, D. W. (1988). Influence of partition coefficient 
of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701–707. 
(33) Hund-Rinke, K., in Wiechering, H. (2000). Earthworm avoidance test for 
soil assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils 
Sediments 1: 15–20. 
(34) Hund-Rinke, K., Römbke, J., Riepert, F., Achazi, R. (2000). Beurteilung 
der Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. In: 
Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & 
Eisentraeger, A. (ur.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59–81. 
(35) ISO 11268-2 (1998). Kakovost tal – Vpliv onesnaževal na deževnike 
(Eisenia fetida ). Del 2: Dolo čanje vplivov na razmnoževanje. 
(36) Jaenike, J. (1982). „ Eisenia foetida “ is two biological species. Megadrilo ­
gica 4: 6–8. 
(37) Jager, T. (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of 
organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 
17: 2080–2090. 
(38) Jager, T., Sanchez, P. A., Muijs, B., van der Welde, E., Posthuma, L. 
(2000). Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in  Eisenia 
andrei  (Oligochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 
953–961. 
(39) Jager, T., Baerselman, R., Dijkman, E., De Groot, A. C., Hogendoorn, E. 
A., DeJong, A., Kruitbosch, J. A. W., Peijnenburg, W. J. G. M (2003a). Availability of polycyclic aromatic hydrocarbons to earthworms ( Eisenia 
andrei , Oligochaeta) in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. 
Environ. Toxicol. Chem. 22: 767–775. 
(40) Jager, T., Fleuren, R. L. J., Hoogendoorn, E., de Korte, G. (2003b). Eluci ­
dating the routes of exposure for organic chemicals in the earthworm,  
Eisenia andrei  (Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399–3404. 
(41) Janssen, M. P. M., Bruins, A., De Vries, T. H., Van Straalen, N. M. (1991). 
Comparison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. 
Environ. Contam. Toxicol. 20: 305–312. 
(42) Kasprzak, K. (1982). Review of enchytraeid community structure and func ­
tion in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217–232. 
(43) Khalil, A. M. (1990). Aufnahme und Metabolismus von
 14 C-Hexachlor ­
benzol und  14 C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Dissertation 
University München, str. 137. 
(44) Landrum, P. F. (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic 
aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod  Pontoporeia 
hoyi.  Environ. Sci. Toxicol. 23: 588–595. 
(45) Marinussen, M. P. J. C., Van der Zee, S. E. A. T. M., De Haan, F. A. 
(1997). Cu accumulation in  Lumbricus rubellus  under laboratory conditions 
compared with accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. Safety 36: 17–26. 
(46) Mount, D. R., Dawson, T. D., Burkhard, L. P. (1999). Implications of gut 
purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sedi ­
ment with  Lumbriculus variegates.  Environ. Toxicol. Chem. 18: 
1244–1249.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1451
 
(47) Nendza, M. (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log 
K ow /log BCF correlations, In: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumu ­
lation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlin 1990, VCH, Weinheim. 
(48) Poglavje C.8 te priloge, Strupenost za deževnike. (49) Poglavje C.13 te priloge, Biokoncentracija: preto čni preskus na ribah. 
(50) Poglavje C.21 te priloge, Talni mikroorganizmi: preskus transformacije 
dušika. 
(51) OECD (2004a), Preskus razmnoževanja enhitrejev, Smernica za preskušanje 
št. 220, Smernice za preskušanje kemikalij, OECD, Pariz. 
(52) OECD (2004b), Preskus razmnoževanja deževnikov (Eisenia fetida/Eisenia 
Andrei), Smernica za preskušanje št. 222, Smernice za preskušanje kemi ­
kalij, OECD, Pariz. 
(53) OECD (2008), Bioakumulacija v bentoških maloš četincih, ki živijo v used ­
linah, Smernica za preskušanje št. 315, Smernice za preskušanje kemikalij, 
OECD, Pariz. 
(54) Petersen, H., in Luxton, M. (1982). A comparative analysis of soil fauna 
populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287–388. 
(55) Phillips, D. J. H. (1993). Bioaccumulation. In: Handbook of Ecotoxicology 
Vol. 1. Calow P. (ur.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378–396. 
(56) Pflugmacher, J. (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen 
der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser- Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77–81. 
(57) Posthuma, L., Weltje, L., Anton-Sanchez, F. A. (1996). Joint toxic effects 
of cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm  
Eisenia fetida.  RIVM Report No. 607506001, Bilthoven. 
(58) Randall, R. C., Lee, II. H., Ozretich, R. J., Lake, J. L., Pruell, R. J. (1991). 
Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumu ­
lation. Environ.Toxicol. Chem. 10: 1431–1436. 
(59) Römbke, J., Egele, P., Füll, C. (1998). Literaturstudie über Bioakkumula ­
tionstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 
S. 
(60) Römbke, J. in Moser, Th. (1999). Organisation and performance of an 
international ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: str. 373. 
(61) Römbke, J., Riepert, F., Achazi, R. (2000). Enchytraeen als Testorgani ­
smen, In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (ur.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105–129. 
(62) Romijn, C. A. F. M., Luttik, R., Van De Meent, D., Slooff, W., Canton, J. 
H. (1993). Presentation of a General Algorithm to Include Effect Asses ­
sment on Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality 
Criteria, Part 2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107–127. 
(63) Sample, B. E., Suter, D. W., Beauchamp, J. J., Efroymson, R. A. (1999). 
Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110–2120. 
(64) Schlosser, H.-J., in Riepert, F. (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für 
Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 
413–433. 
(65) Schmelz, R., in Collado, R. (1999).  Enchytraeus luxuriosus  sp. nov., a new 
terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). Carolinea 
57: 93–100.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1452
 
(66) Sims, R. W., in Gerard, B. M. (1985). Earthworms, In: Kermack, D. M. & 
Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No. 
31. 171 S. London: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys. 
(67) Sousa, J. P., Loureiro, S., Pieper, S., Frost, M., Kratz, W., Nogueira, A. J. 
A., Soares, A. M. V. M. (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 
2557–2563. 
(68) Spacie, A. in Hamelink, J. L. (1982). Alternative models for describing the 
bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309–320. 
(69) Stephenson, G. L., Kaushik, A., Kaushik, N. K., Solomon, K. R., Steele, T., 
Scroggins, R. P. (1998). Use of an avoidance-response test to assess the 
toxicity of contaminated soils to earthworms. In: Advances in earthworm 
ecotoxicology. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (ur.). Setac Press, Pensacola, 67–81. 
(70) Sterenborg, I., Vork, N. A., Verkade, S. K., Van Gestel, C. A. M., Van 
Straalen, N. M. (2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein 
binding and elimination of cadmium in the springtail  Orchesella cincta.  
Environ. Toxicol. Chemistry 22: 1167–1171. 
(71) UBA (Umweltbundesamt) (1991). Bioakkumulation - Bewertungskonzept 
und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlin. 
(72) US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation 
of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second 
Edition, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, Duluth, MN, marec 2000. 
(73) Van Brummelen, T. C. in Van Straalen, N. M. (1996). Uptake and elimi ­
nation of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod  Porcellio scaber.  Arch. 
Environ. Contam. Toxicol. 31: 277–285. 
(74) Van Gestel, C. A. M. (1992). The influence of soil characteristics on the 
toxicity of chemicals for earthworms; a review, In: Ecotoxicology of Earth ­
worms (Ur. Becker, H, Edwards, PJ, Greig-Smith, PW & Heimbach, F). 
Intercept Press, Andover (GB). 
(75) Van Gestel, C. A., in Ma, W.-C. (1990). An approach to quantitative 
structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. Chemosphere 21: 1023–1033. 
(76) Van Straalen, N. M., Donker, M. H., Vijver, M. G., van Gestel, C. A. M. 
(2005). Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil 
invertebrates. Environmental Pollution 136: 409–417. 
(77) Venter, J. M. in Reinecke, A. J. (1988). The life-cycle of the compost-worm  
Eisenia fetida  (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161–165. 
(78) Vijver, M. G., Vink, J. P. M., Jager, T., Wolterbeek, H. T., van Straalen, N. 
M., van Gestel, C. A. M. (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics 
of Zn and Cd in the earthworm  Lumbricus rubellus  exposed to contami ­
nated floodplain soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843–1851. 
(79) Widianarko, B., in Van Straalen, N. M. (1996). Toxicokinetics-based 
survival analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxi ­
col. Chem. 15: 402–406.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1453
 
Dodatek 1  
OPREDELITEV POJMOV  
Bioakumulacija  je povečanje koncentracije preskusne kemikalije v organizmu 
ali na njem, glede na koncentracijo preskusne kemikalije v okoliškem mediju. Izhaja iz procesov biokoncentracije in biomagnifikacije (glej spodaj);  
biokoncentracija  je povečanje koncentracije preskusne kemikalije v organizmu 
ali na njem zaradi absorpcije kemikalije izklju čno iz okoliškega medija (tj. prek 
telesne površine in z zaužitjem), ki je odvisna od koncentracije preskusne kemi ­
kalije v okoliškem mediju;  
biomagnifikacija  je povečanje koncentracije preskusne kemikalije v organizmu 
ali na njem predvsem zaradi absorpcije iz kontaminirane hrane ali plena, ki je odvisna od koncentracije preskusne kemikalije v hrani ali plenu. Biomagnifika ­
cija lahko vodi do prenosa ali kopi čenja preskusne snovi v prehranjevalnem 
spletu;  
izločanje preskusne kemikalije je odstranitev te kemikalije iz tkiva preskusnega 
organizma z aktivnimi ali pasivnimi procesi, ki se pojavijo neodvisno od prisot ­
nosti ali odsotnosti preskusne snovi v okoliškem mediju;  
bioakumulacijski faktor  (BAF) ob katerem koli času v fazi absorpcije tega 
preskusa bioakumulacije je koncentracija preskusne kemikalije v/na preskusnem organizmu (C
 a v g·kg -1 suhe teže črva), deljena s koncentracijo kemikalije v 
okoliškem mediju (C  s v g·kg -1 suhe teže zemljine); BAF se izrazi v enotah kg 
zemljine·kg -1 črvov;  
bioakumulacijski faktor stabilnega stanja  (BAF  ss ) je BAF v stabilnem stanju 
in se ne spreminja znatno v daljšem časovnem obdobju, saj je koncentracija 
preskusne kemikalije v okoliškem mediju (C  s v g·kg -1 suhe teže zemljine) v 
tem obdobju konstantna;  
bioakumulacijski faktorji , izračunani neposredno iz razmerja med konstanto 
hitrosti absorpcije tal in konstanto hitrosti izlo čanja (k  s in k  e , glej spodaj), se 
imenujejo  kinetični bioakumulacijski faktor (BAF  K ); 
faktor akumulacije v organizmih glede na tla  (BSAF) je na lipide normalizi ­
rana koncentracija preskusne kemikalije v/na preskusnem organizmu, deljena s 
koncentracijo preskusne kemikalije v tleh v stabilnem stanju, normalizirano na organski ogljik. C
 a se tako izrazi kot g ·kg -1 vsebnosti lipidov v organizmu, C  s pa 
kot g·kg -1 vsebnosti organskega ogljika v tleh; BSAF se izrazi v enotah kg 
OC·kg -1 lipidov;  
konstantna raven  ali stabilno stanje  je opredeljeno kot ravnotežje med proce ­
soma absorpcije in izlo čanja, ki potekata hkrati v fazi izpostavljenosti. Stabilno 
stanje je v grafi čnem prikazu BAF v odvisnosti od časa doseženo, ko krivulja 
postane vzporedna s časovno osjo in se tri zaporedne analize BAF na vzorcih, 
vzetih v razmiku najmanj dveh dni, druga od druge ne razlikuje za ve č kot 20 % 
ter ni statisti čno značilnih razlik med tremi obdobji vzor čenja. Za preskusne 
kemikalije, ki se po časi absorbirajo, so primernejši sedemdnevni razmiki (49);  
koeficient porazdelitve organski ogljik/voda  (K  oc ) je razmerje med koncentra ­
cijo kemikalije v/na delu tal z organskim ogljikom in koncentracijo kemikalije v vodi v ravnotežju;  
koeficient porazdelitve oktanol/voda  (K
 ow ) je uravnoteženo razmerje topnosti 
kemikalije v n-oktanolu in vodi, v časih izraženo tudi kot P  ow . Logaritem K  ow 
(log K  ow ) se uporablja kot kazalnik potenciala kemikalije za kopi čenje v vodnih 
organizmih;  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1454
 
faza absorpcije ali izpostavitve  je čas, v katerem so preskusni organizmi izpo ­
stavljeni preskusni kemikaliji;  
konstanta hitrosti absorpcije tal  (k s ) je numeri čna vrednost, ki opredeljuje 
stopnjo povišanja koncentracije preskusne snovi v/na preskusnem organizmu zaradi absorpcije iz talne faze. Konstanta k
 s se izrazi v g zemljine kg  -1 
črvov d  -1 ; 
faza izlo čanja  je čas po prenosu preskusnih organizmov iz kontaminiranega 
medija v medij brez preskusne snovi, v katerem se preu čuje izločanje (ali neto 
izguba) kemikalije iz preskusnih organizmov;  
konstanta hitrosti izlo čanja  (k e ) je numeri čna vrednost, ki opredeljuje stopnjo 
znižanja koncentracije preskusne snovi v/na preskusnih organizmih po prenosu 
preskusnih organizmov iz medija s preskusno snovjo v medij brez kemikalije; k  e 
se izrazi v d  -1 ; 
preskusna kemikalija:  snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne 
metode.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1455
 
Dodatek 2  
Izračun parametrov absorpcije in izlo čanja  
Glavni cilj preskusa bioakumulacije je dolo čitev bioakumulacijskega faktorja 
BAF. Izmerjeni BAF je mogo če izračunati z deljenjem koncentracije v 
preskusnem organizmu C  a s koncentracijo v tleh C  s v stabilnem stanju. Če v 
fazi absorpcije stabilno stanje ni doseženo, se BAF  K izračuna iz konstant hitrosti 
namesto iz BAFss. Vendar je treba navesti, ali BAF temelji na koncentracijah v 
stabilnem stanju ali ne. 
Kinetični bioakumulacijski faktor (BAF  K ), konstanta hitrosti absorpcije tal (k  s ) in 
konstanta hitrosti izlo čanja (k  e ) se običajno dobijo z ra čunalniškimi metodami za 
ocenjevanje nelinearnih parametrov, npr. na podlagi modelov, opisanih v (68). 
Na podlagi skupine podatkov o zaporednih koncentracijah v odvisnosti od časa 
in modelnih ena čb: 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [enačba 1] 
ali 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [enačba 2] 
pri čemer je: 
C a = koncentracija kemikalije v črvih [g·kg-1 mokre ali suhe teže], 
k s = konstanta hitrosti absorpcije v tkivu [g zemljine kg-1 črvov d-1], 
C s = koncentracija kemikalije v tleh [g ·kg-1 mokre ali suhe teže], 
k e = konstanta hitrosti izlo čanja [d-1], 
t c = čas na koncu faze absorpcije, 
ti računalniški programi izra čunajo vrednosti BAF  K , k s in k  e . 
Kadar se koncentracija ozadja pri neizpostavljenih črvih, npr. na dan 0, znatno 
razlikuje od ni č (tako je lahko na primer pri kovinah), mora biti ta koncentracija 
ozadja (C  a,0 ) vključena v te ena čbe, tako da se glasijo: 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [enačba 3] 
in 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [enačba 4] 
Kadar se v fazi absorpcije ugotovi znatno zmanjšanje koncentracije preskusne 
kemikalije v tleh v odvisnosti od časa, je mogo če uporabiti naslednje modele, 
npr. (67) (79): 
C s ¼ C 0 ðe –k0 tÞ [enačba 5]  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1456
 
pri čemer je: 
C s = koncentracija kemikalije v tleh [g ·kg-1 mokre ali suhe teže], 
k 0 = konstanta hitrosti razgradnje v tleh [d-1], 
C 0 = začetna koncentracija kemikalije v tleh [g ·kg-1 mokre ali suhe teže]. 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü ðe –k 0 t Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [enačba 6] 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü e –k 0 tc Ä e –k e tc ä e ÄkðtÄtcÞ t > t  c [enačba 7] 
pri čemer je: 
C a = koncentracija kemikalije v črvih [g·kg-1 mokre ali suhe teže], 
k s = konstanta hitrosti absorpcije v tkivu [g zemljine kg-1 črvov d-1], 
k 0 = konstanta hitrosti razgradnje v tleh [d-1], 
k e = konstanta hitrosti izlo čanja [d-1], 
t c = čas na koncu faze absorpcije. 
Kadar je v fazi absorpcije doseženo stabilno stanje (tj. t = ∞), je mogo če 
enačbo 1 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [enačba 1] 
skrajšati na: 
C a ¼ k s 
k e Ü C s 
ali 
C a=C s ¼ k s=k e ¼ BAF  K [enačba 8] 
Nato je k  s /k e x C  s pristop za ugotavljanje koncentracije preskusne snovi v črvjem 
tkivu v stabilnem stanju (C  a,ss ). 
Faktor akumulacije v organizmih glede na tla (BSAF) je mogo če izračunati na 
naslednji na čin: 
BSAF ¼ BAF  K ä f oc 
f lip [enačba 9] 
pri čemer je f  oc del organskega ogljika v tleh, f  lip pa del lipidov v črvih, pri 
čemer sta oba po možnosti dolo čena na vzorcih, vzetih v preskusu, ter temeljita 
na suhi teži oziroma mokri teži. 
Model kinetike izlo čanja je mogo če oblikovati na podlagi podatkov iz faze 
izločanja ter z uporabo spodnje modelne ena čbe in računalniške metode za 
ocenjevanje nelinearnih parametrov. Če podatkovne to čke, grafično prikazane v 
odvisnosti od časa, nakazujejo konstantno eksponentno padanje koncentracije 
preskusne snovi v živalih, je mogo če za opis časovnega poteka izlo čanja upora ­
biti enodelni model (ena čba 9). 
C a ðtÞ ¼ C a;ss Ü e –k e t [enačba 10]  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1457
 
Procesi izlo čanja so v časih videti dvofazni, pri čemer v zgodnjih fazah C  a hitro 
upada, kar se v poznejših fazah izlo čanja spremeni v po časnejšo izgubo 
preskusnih snovi, npr. (27) (68). Dve fazi je mogo če razložiti s predpostavko, 
da sta v organizmu dva razli čna dela, iz katerih se preskusna snov izlo ča z 
različno hitrostjo. V takih primerih je treba preu čiti posebne vire, npr. (38) 
(39) (40) (78). 
Z zgornjimi modelnimi ena čbami je mogo če kinetična parametra (k  s in k  e ) izra­ 
čunati tudi naenkrat z modelom kinetike prvega reda za vse podatke iz faz 
absorpcije in izlo čanja hkrati. Opis metode, ki lahko omogo ča tak združeni 
izračun konstant hitrosti absorpcije in izlo čanja, je na voljo v virih (191), 
(223) in (220). 
C a ¼ Ï K s 
K e · C s ð1 Ä e –k e t Þ Ü ðm ¼ 1Þ # 
þ Ï K s 
k e Ü C s ðe ÄK e ðtÄt c Þ Ä e –K e t Þ Ü ðm ¼ 2Þ # 
[enačba 11]  
Opomba:  kadar se parametra absorpcije in izlo čanja ocenjujeta hkrati iz zdru ­ 
ženih podatkov o absorpciji in izlo čanju, je „m“, kot je prikazan v 
enačbi 11, deskriptor, ki ra čunalniškemu programu omogo ča, da 
podizraze v ena čbi pripiše skupinam podatkov iz zadevne faze in da 
pravilno izvede ocenjevanje (m = 1 za fazo absorpcije; m = 2 za fazo 
izločanja). 
Vseeno je treba te modelne ena čbe uporabljati previdno, zlasti kadar se med 
preskusom pojavijo spremembe v biološki razpoložljivosti preskusne kemikalije ali (biološki) razgradnji (glej npr. (79)).
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1458
 
Dodatek 3  
PRIMERI ČASOVNIH RAZPOREDOV ZA PRESKUSE BIOAKUMULACIJE 
V TLEH  
Preskus z deževniki  
(a) Faza absorpcije z 8 datumi vzor čenja za izra čun kinetike  
Dan Dejavnost  
– 6 48-urno kondicioniranje pripravljene zemljine; 
– 4 dodajanje raztopine preskusne kemikalije v del zemljine; izpare ­
vanje morebitnega topila; mešanje sestavin zemljine; razporejanje 
zemljine v preskusne posode; 4-dnevno vzpostavljanje ravnotežja 
v preskusnih pogojih (3 tedne za zemljine s primešano kovino); 
– 3 do – 1 izlo čevanje preskusnih organizmov iz gojiš ča za aklimatizacijo; 
priprava in vlaženje sestavin zemljine; 
0 merjenje temperature in vrednosti pH tal; odstranjevanje vzorcev 
tal iz tretiranih posod in kontrolnih vzorcev s topilom za dolo ­ 
čitev koncentracije preskusne kemikalije; dodajanje obroka hrane; 
tehtanje in naklju čna razporeditev črvov v preskusne posode; 
zadržanje zadostnih podvzorcev črvov za dolo čanje analitskih 
vrednosti ozadja, mokre in suhe teže ter vsebnosti lipidov; tehtanje vseh preskusnih posod za kontrolo vlage v tleh; kontrola dotoka zraka, če se uporabi zaprt preskusni sistem; 
1 kontrola dotoka zraka, zapisovanje obnašanja črvov in tempera ­
ture; jemanje vzorcev tal in črvov za dolo čitev koncentracije 
preskusne snovi; 
2 enako kot 1. dan; 
3 kontrola dotoka zraka, obnašanja črvov in temperature; 
4 enako kot 1. dan; 
5–6 enako kot 3. dan; 
7 enako kot 1. dan; dodajanje obroka hrane; kontrola vlage v tleh s 
ponovnim tehtanjem preskusnih posod in nadomeš čanje izhlapele 
vode; 
8–9 enako kot 3. dan; 
10 enako kot 1. dan; 
11–13 enako kot 3. dan; 
14 enako kot 1. dan; dodajanje obroka hrane; kontrola vlage v tleh s 
ponovnim tehtanjem preskusnih posod in nadomeš čanje izhlapele 
vode; 
15–16 enako kot 3. dan; 
17 enako kot 1. dan; 
18–20 enako kot 3. dan;
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1459
 
Dan Dejavnost  
21 enako kot 1. dan; merjenje temperature in vrednosti pH tal; 
kontrola vlage v tleh s ponovnim tehtanjem preskusnih posod; konec faze absorpcije; premestitev črvov iz preostalih izposta ­
vljenih ponovitev v posode s čisto zemljino za fazo izlo čanja 
(brez praznjenja prebavil); vzor čenje tal in črvov iz kontrolnih 
vzorcev s topilom. 
Dejavnosti pred izpostavljenostjo (faza uravnoteženja) je treba 
časovno na črtovati ob upoštevanju lastnosti preskusne kemikalije. 
Dejavnosti, opisane za 3. dan, je treba izvajati dnevno (vsaj ob 
delovnikih). 
(b) Faza izlo čanja
 
Dan Dejavnost  
– 6 Priprava in vlaženje sestavin zemljine; 48-urno kondicioniranje 
pripravljene zemljine; 
– 4 mešanje sestavin zemljine; razporejanje zemljine v preskusne 
posode; 4-dnevna inkubacija v preskusnih pogojih; 
0 (konec faze 
absorpcije) merjenje temperature in vrednosti pH tal; tehtanje in naklju čna 
razporeditev črvov v preskusne posode; dodajanje obroka hrane; 
premestitev črvov iz preostalih izpostavljenih ponovitev v posode 
s čisto zemljino; jemanje vzorcev tal in črvov po 4–6 urah za 
določitev koncentracije preskusne kemikalije; 
1 kontrola dotoka zraka, zapisovanje obnašanja črvov in tempera ­
ture; jemanje vzorcev tal in črvov za dolo čitev koncentracije 
preskusne kemikalije; 
2 enako kot 1. dan; 
3 kontrola dotoka zraka, obnašanja črvov in temperature; 
4 enako kot 1. dan; 
5–6 enako kot 3. dan; 
7 enako kot 1. dan; dodajanje obroka hrane; kontrola vlage v tleh s 
ponovnim tehtanjem preskusnih posod in nadomeš čanje izhlapele 
vode; 
8–9 enako kot 3. dan; 
10 enako kot 1. dan; 
11–13 enako kot 3. dan; 
14 enako kot 1. dan; dodajanje obroka hrane; kontrola vlage v tleh s 
ponovnim tehtanjem preskusnih posod in nadomeš čanje izhlapele 
vode; 
15–16 enako kot 3. dan; 
17 enako kot 1. dan;  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1460
 
Dan Dejavnost  
18–20 enako kot 3. dan; 
21 enako kot 1. dan; merjenje temperature in vrednosti pH tal; 
kontrola vlage v tleh s ponovnim tehtanjem preskusnih posod; vzorčenje tal in črvov iz kontrolnih vzorcev s topilom. 
Tla pred za četkom faze izlo čanja je treba pripraviti enako kot 
pred fazo absorpcije. 
Dejavnosti, opisane za 3. dan, je treba izvajati dnevno (vsaj ob 
delovnikih).
 
Preskus z enhitreji  
(a) Faza absorpcije z 8 datumi vzor čenja za izra čun kinetike  
Dan Dejavnost  
– 6 48-urno kondicioniranje pripravljene zemljine; 
– 4 dodajanje raztopine preskusne kemikalije v del zemljine; izpare ­
vanje morebitnega topila; mešanje sestavin zemljine; razporejanje 
zemljine v preskusne posode; 4-dnevno vzpostavljanje ravnotežja 
v preskusnih pogojih (3 tedne za zemljinela s primešano kovino); 
–3 do –1 izlo čevanje preskusnih organizmov iz gojiš ča za aklimatizacijo; 
priprava in vlaženje sestavin zemljine; 
0 merjenje temperature in vrednosti pH tal; odstranjevanje vzorcev 
tal iz tretiranih posod in kontrolnih vzorcev s topilom za dolo ­ 
čitev koncentracije preskusne kemikalije; dodajanje obroka hrane 
v tla; tehtanje in naklju čna razporeditev črvov v preskusne 
posode; zadržanje zadostnih podvzorcev črvov za dolo čanje 
analitskih vrednosti ozadja, mokre in suhe teže ter vsebnosti lipidov; tehtanje vseh preskusnih posod za kontrolo vlage v 
tleh; kontrola dotoka zraka, če se uporabi zaprt preskusni sistem; 
1 kontrola dotoka zraka, zapisovanje obnašanja črvov in tempera ­
ture; jemanje vzorcev tal in črvov za dolo čitev koncentracije 
preskusne snovi; 
2 enako kot 1. dan; 3 kontrola dotoka zraka, obnašanja črvov in temperature; 
4 enako kot 1. dan; 
5–6 enako kot 3. dan; 
7 enako kot 1. dan; dodajanje obroka hrane v tla; kontrola vlage v 
tleh s ponovnim tehtanjem preskusnih posod in nadomeš čanje 
izhlapele vode; 
9 enako kot 1. dan; 
10 enako kot 3. dan;
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1461
 
Dan Dejavnost  
11 enako kot 1. dan; 
12–13 enako kot 3. dan; 
14 enako kot 1. dan; dodajanje obroka hrane v tla; merjenje tempe ­
rature in vrednosti pH tal; kontrola vlage v tleh s ponovnim 
tehtanjem preskusnih posod; konec faze absorpcije; premestitev 
črvov iz preostalih izpostavljenih ponovitev v posode s čisto 
zemljino za fazo izlo čanja (brez praznjenja prebavil); vzor čenje 
tal in črvov iz kontrolnih vzorcev s topilom. 
Dejavnosti pred izpostavljenostjo (faza uravnoteženja) je treba 
časovno na črtovati ob upoštevanju lastnosti preskusne kemikalije. 
Dejavnosti, opisane za 3. dan, je treba izvajati dnevno (vsaj ob 
delovnikih).  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1462
 
Dodatek 4  
Umetna zemljina – priporo čila glede priprave in shranjevanja  
Ker naravna zemljina iz dolo čenega vira ni nujno na voljo vse leto in ker lahko 
domorodni organizmi in prisotna mikroonesnaževala vplivajo na preskus, se za ta 
preskus priporo ča umetni substrat – umetna zemljina v skladu s poglavjem C.8 te 
priloge, Strupenost za deževnike (48). V takih tleh lahko preživi, raste in se razmnožuje ve č preskusnih vrst, zagotovljeni pa so tudi najve čja mogoča stan­
dardizacija ter primerljivost preskusnih pogojev in pogojev gojenja znotraj labo ­
ratorija in med laboratoriji. 
Sestavine zemljine 
Šota: 10 % Šotni mah, v skladu s smernico OECD 207 
(48). 
Kremenov pesek: 70 % Industrijski kremenov pesek (sušen na 
zraku); velikost zrnc: ve č kot 50 % delcev 
mora biti velikih 50 do 200 μm, vsi delci pa 
morajo biti ≤ 2 mm. 
Kaolinska glina: 20 % Vsebnost kaolinita ≥ 30-odstotna. 
Kalcijev karbonat: ≤ 1 % CaCO
 3 , zdrobljen v prah, kemijsko čist. 
Lahko se tudi zmanjša vsebnost organskega ogljika v umetni zemljini, npr. z 
zmanjšanjem vsebnosti šote na 4–5 % suhe zemljine in ustreznim pove čanjem 
vsebnosti peska. S takim zmanjšanjem vsebnosti organskega ogljika se lahko 
zmanjšajo možnosti adsorpcije preskusne kemikalije na zemljino (organski ogljik), razpoložljivost preskusne kemikalije za črve pa se lahko pove ča (74). 
Dokazano je, da lahko  Enchytraeus albidus  in Eisenia fetida  izpolnjujeta merila 
veljavnosti v zvezi z razmnoževanjem, če se preskus izvaja z naravno zemljino z 
manjšo vsebnostjo organskega ogljika, npr. 2,7 % (33), (211), izkušnje pa kažejo, da je to mogo če doseči tudi pri umetni zemljini s 5 % šote.
 
Priprava  
Suhe sestavine zemljine se temeljito premešajo (npr. v velikem laboratorijskem 
mešalniku). To je treba storiti približno en teden pred za četkom preskusa. 
Zmešane suhe sestavine zemljine je treba navlažiti z deionizirano vodo vsaj 48 
h pred primešanjem preskusne snovi, da se kislost uravnoteži/stabilizira. Za 
določitev pH se uporabi mešanica zemljine in 1 M raztopine KCl v razmerju 
1 : 5. Če vrednost pH ni znotraj zahtevanega obsega (6,0 ± 0,5), se zemljini doda 
zadostna koli čina CaCO  3 ali pripravi nova šarža zemljine. 
Največja zmogljivost zadrževanja vode (WHC) v umetni zemljini se dolo či v 
skladu z ISO 11268-2 (35). Vsaj dva dneva pred za četkom preskusa se suha 
umetna zemljina navlaži z dovolj deionizirane ali rekonstituirane vode, da 
nastane približno polovica kon čne vsebnosti vode. Kon čna vsebnost vode mora 
biti med 40 in 60 % najve čje WHC. Na za četku preskusa se predhodno navla ­ 
žena zemljina razdeli na toliko šarž, kot je preskusnih koncentracij in kontrolnih 
vzorcev, uporabljenih v preskusu, vsebnost vlage pa se prilagodi na 40–60 % 
WHC  max z raztopino preskusne snovi in/ali dodajanjem deionizirane ali rekon ­
stituirane vode. Vsebnost vlage se dolo či na začetku in koncu preskusa (pri 
105 °C). Biti mora optimalna za potrebe uporabljenih vrst živali (vsebnost 
vlage je mogo če preveriti tudi na naslednji na čin: če se zemljina nežno stisne 
v roki, se morajo med prsti pojaviti majhne kapljice vode).  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1463
 
Shranjevanje  
Suhe sestavine umetne zemljine se lahko do uporabe hranijo pri sobni tempera ­
turi. Pripravljena predhodno navlažena zemljina se lahko hrani na hladnem do tri 
dni pred primešanjem preskusne kemikalije; paziti je treba, da je izhlapevanje vode čim manjše. Zemljino s primešano preskusno snovjo je treba uporabiti 
takoj, razen če obstajajo podatki o tem, da je mogo če določeno zemljino shra ­
njevati, ne da bi to vplivalo na strupenost in biološko razpoložljivost preskusne 
snovi. Vzorci zemljine s primešano preskusno snovjo se lahko nato do analize hranijo v pogojih, priporo čenih za zadevno preskusno snov.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1464
 
Dodatek 5  
Vrste kopenskih maloš četincev, priporo čene za preskušanje bioakumulacije 
iz tal  
Deževniki  
Priporočena preskusna vrsta je  Eisenia fetida  (Savigny 1826), ki spada v družino  
Lumbricidae . Od leta 1972 se deli na dve podvrsti ( Eisenia fetida  in Eisenia 
andrei  (10)). Jaenike trdi (36), da sta to pravi lo čeni vrsti. Vrsto  Eisenia fetida  je 
mogoče brez težav prepoznati po svetlih rumenih črtah med kolobarji,  Eisenia 
andrei  pa je enotne temno rde če barve. Izvirajo verjetno iz črnomorske regije, 
danes pa so razširjeni po vsem svetu, zlasti v antropogeno prilagojenih habitatih, kot so kompostni kupi. Obe podvrsti je mogo če uporabljati za ekotoksikološke in 
bioakumulacijske preskuse.  
Eisenia fetida  in Eisenia andrei  sta komercialno dostopni vrsti, npr. kot vaba za 
ribe. V primerjavi z drugimi deževniki iz družine  Lumbricidae  imajo kratek 
življenjski ciklus in dosežejo zrelost pri približno 2–3 mesecih (pri sobni tempe ­
raturi). Njihova optimalna temperatura je približno 20–24 °C. Najraje imajo 
razmeroma vlažne substrate s skoraj nevtralno vrednostjo pH in visoko 
vsebnostjo organske snovi. Ker se ti vrsti zelo pogosto uporabljata v standardi ­
ziranih ekotoksikoloških preskusih že približno 25 let, je njuno gojenje dobro uveljavljeno (48) (77). 
Obe vrsti je mogo če gojiti v zelo razli čnih živalskih odpadkih. Medij za gojenje, 
priporočen v ISO (35), je mešanica konjskega ali govejega gnoja in šote v 
razmerju 50: 50. Medij mora imeti vrednost pH približno 6–7 (uravnavano s kalcijevim karbonatom), majhno ionsko prevodnost (manj kot 6 mS/cm ali 
manj kot 0,5-odstotna koncentracija soli) in ne sme biti pretirano kontaminiran 
z amonijem ali živalskim urinom. Uporabiti je mogo če tudi komercialno vrtno 
prst brez aditivov ali umetno zemljino v skladu z OECD (48) ali mešanico obeh v razmerju 50: 50. Substrat mora biti vlažen, vendar ne preve č moker. Primerne 
so škatle za gojenje s prostornino 10 do 50 litrov. 
Za črve standardne starosti in teže je gojenje najbolje za četi s kokoni. Zato se v 
škatle za gojenje s svežim substratom dajo odrasli črvi, da naredijo kokone. 
Praktične izkušnje so pokazale, da so pri gostoti populacije približno 100 odraslih 
črvov na kg substrata (mokra teža) dobre stopnje razmnoževanja. Po 28 dneh se 
odrasli črvi odstranijo. Deževniki, ki se izležejo iz kokonov, se uporabijo za 
preskušanje, ko so zreli, po vsaj 2 mesecih, vendar prej kot v 12 mesecih. 
Črve zgoraj opisanih vrst je mogo če šteti za zdrave, če se premikajo skozi 
substrat, ga ne poskušajo zapustiti in se stalno razmnožujejo. Zelo po časno 
premikanje ali rumen zadnji del (pri vrsti  Eisenia fetida ) kaže na iz črpanje 
substrata. V tem primeru se priporo č
a svež substrat in/ali manjše število živali 
na škatlo.  
Dodatni izbrani viri  
Gerard, B. M. (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean 
Soc. London, 6: 1–58. 
Graff, O. (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Land ­
wirtsch. 7: 1–81. 
Römbke, J., Egeler, P., Füll, C. (1997). Literaturstudie über Bioakkumulation ­
stests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S. 
Rundgren, S. (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern 
Sweden. Oikos 28: 49–55. 
Satchell, J. E. (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology 
(Kevan): 180–201.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1465
 
Sims, R. W., in Gerard, B. M. (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean 
Soc. London 31: 1–171. 
Tomlin, A. D. (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earth ­
worm Ecology – from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ur.), Chapman & 
Hall, London. str. 331–338.  
Enhitreji  
Priporočena preskusna vrsta je  Enchytraeus albidus  Henle 1837 (enhitrej).  
Enchytraeus albidus  je ena od najve čjih (do 15 mm) vrst maloš četinarjev kolo ­
barnikov iz družine  Enchytraeidae  in je razširjena po vsem svetu, npr. (8). Živi v 
morskih, sladkovodnih in kopenskih habitatih, ve činoma v razpadajo či organski 
snovi (morske alge, kompost), redko pa na travnikih (42). Ta široka ekološka toleranca in nekatere morfološke variacije kažejo na to, da morda obstajajo 
različne podvrste te vrste.  
Enchytraeus albidus  je komercialno dostopna vrsta in se prodaja kot hrana za 
ribe. Treba je preveriti, ali je kultura kontaminirana z drugimi, obi čajno manjšimi 
vrstami (60). Ob kontaminaciji je treba vse črve oprati z vodo v petrijevki. Nato 
se (s stereomikroskopom) izberejo veliki odrasli osebki vrste  Enchytraeus albi ­
dus, da se iz njih vzgoji nova kultura. Vsi drugi črvi se zavržejo. Življenjski 
ciklus enhitrejev je kratek, saj zrelost dosežejo v starosti med 33 dnevi (pri 
18 °C) in 74 dnevi (pri 12 °C). Za preskus se uporabijo samo kulture, ki so 
bile v laboratoriju brez težav že vsaj 5 tednov (ena generacija). 
Primerne so tudi druge vrste rodu  Enchytraeus , zlasti  Enchytraeus luxuriosus . Ta 
vrsta je pravi prebivalec tal, ki je bil na novo opisan v (65). Če se uporabijo 
druge vrste  Enchytraeus , jih je treba jasno identificirati in poro čati o razlogih za 
izbiro.  
Enchytraeus crypticus  (Westheide in Graefe 1992) je vrsta, ki spada v isto 
skupino kot  Enchytraeus luxuriosus . Ni bilo nedvomno ugotovljeno, da obstaja 
v naravnem okolju, saj je bila opisana samo v kulturah deževnikov in kompos ­
tnih kupih (Römbke 2003). Njene izvirne ekološke potrebe zato niso znane. Toda 
nedavne laboratorijske raziskave z razli čnimi naravnimi zemljinami so potrdile, 
da ta vrsta dobro prenaša razli čne lastnosti tal, kot so pH in tekstura (Jänsch idr. 
2005). V zadnjih letih se ta vrsta pogosto uporablja v ekotoksikoloških raziska ­
vah, ker jo je preprosto gojiti in preskušati, npr. Kuperman idr. 2003. Vendar so 
te živali majhne (3–12 mm; povpre čno 7 mm (Westheide in Müller 1996)), zato 
je z njimi težje ravnati kot z vrsto  Enchytraeus albidus . Če se uporablja ta vrsta 
namesto vrste  Enchytraeus albidus , je lahko preskusna posoda manjša, ni pa to 
nujno. Poleg tega je treba upoštevati, da se ta vrsta zelo hitro razmnožuje in da je 
obdobje ene generacije krajše od 20 dni pri 20 ± 2 °C (Achazi idr. 1999), pri 
višjih temperaturah pa še krajše.  
Enchytraeidae  vrste  Enchytraeus albidus  (in druge vrste roda  Enchytraeus ) je 
mogo
če gojiti v velikih plasti čnih škatlah (npr. 30 × 60 × 10 cm ali 20 × 12 × 
8 cm, kar je primerno za kulturo majhnih črvov), napolnjenih z mešanico umetne 
zemljine in komercialne dostopne nekontaminirane vrtne prsti brez aditivov. Kompostnemu materialu se je treba izogibati, saj lahko vsebuje strupene kemi ­
kalije, kot so težke kovine. Živali je treba pred uporabo odstraniti iz zemljine za 
gojenje s trikratnim globokim zamrzovanjem. Uporabiti je mogo če tudi čisto 
umetno zemljino, vendar je lahko razmnoževanje po časnejše v primerjavi z 
mešanimi substrati. Substrat mora imeti pH 6,0 ± 0,5. Kultura se goji v inkuba ­
torju pri temperaturi 15 ± 2 °C brez svetlobe. Vsekakor se je treba izogibati 
temperaturi, višji od 23 °C. Umetna/naravna zemljina mora biti vlažna, vendar ne mokra. Če se nežno stisne v roki, bi se morale pojaviti samo majhne kaplje 
vode. Vsekakor se je treba izogibati anoksi čnim pogojem (npr. če se uporabi 
pokrov, mora število lukenj v pokrovu zadostovati za zadostno izmenjavo zraka). 
Tla za gojenje je treba enkrat tedensko prezra čevati s pazljivim mešanjem.
 ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1466
 
Črve je treba vsaj enkrat tedensko hraniti  ad libitum  z ovsenimi kosmi či, polo­ 
ženimi v luknjo na površini tal in pokritimi s prstjo. Če hrana, dodana na zadnji 
datum hranjenja, ostane v posodi, je treba koli čino hrane ustrezno prilagoditi. Če 
na preostali hrani zrasejo glive, jo je treba nadomestiti z novo koli čino ovsenih 
kosmičev. Za spodbujanje razmnoževanja se lahko ovsenim kosmi čem vsaka dva 
tedna doda komercialno dostopen proteinski prah, obogaten z vitamini. Po treh 
mesecih se živali premestijo v sveže pripravljeno gojiš če ali substrat za gojenje. 
Ovsene kosmi če, ki morajo biti shranjeni v zatesnjenih posodah, je treba pred 
uporabo avtoklavirati ali segreti, da se prepre čijo okužbe s pršicami iz moke (npr.  
Glyzyphagus  sp., Astigmata, Acarina) ali predatorskimi pršicami (npr.  Hypoaspis 
(Cosmolaelaps) miles , Gamasida, Acarina). Ko je hrana razkužena, jo je treba 
zmleti, da jo je mogo če z lahkoto potresti po površini tal. Vir hrane je lahko tudi 
pekovski kvas ali hrana za ribe TetraMin  ® . 
Na splošno so pogoji gojenja zadovoljivi, če črvi ne poskušajo zapustiti substrata, 
se skozi tla hitro gibljejo, imajo bleš čečo zunanjo površino brez delcev zemljine, 
ki bi se je držali, in so bolj ali manj belkaste barve ter če so vidni črvi različnih 
starosti. Dejansko je mogo če črve šteti za zdrave, če se stalno razmnožujejo.  
Dodatni izbrani viri  
Achazi, R. K., Fröhlich, E., Henneken, M., Pilz, C. (1999). The effect of soil 
from former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and 
colonizing success of the annelid  Enchytraeus crypticus  (Enchytraeidae, Oligoc ­
haeta). Newsletter on Enchytraeidae 6: 117–126. 
Jänsch, S., Amorim, M. J. B., Römbke, J. (2005). Identification of the ecological 
requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. 
Reviews 13: 51–83. 
Kuperman, R. G., Checkai, R. T., Simini, M., Phillips, C. T., Kolakowski, J. E., 
Kurnas, C. W., Sunahara, G. I. (2003). Survival and reproduction of  Enchytraeus 
crypticus  (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with 
the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651–656. 
Römbke, J. (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A 
review. Pedobiologia 47: 607–616. 
Westheide, W., in Graefe, U. (1992). Two new terrestrial  Enchytraeus  species 
(Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479–488. 
Westheide, W., in Müller, M. C. (1996). Cinematographic documentation of 
enchytraeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263–267.  ▼M4 2008R0440 — SL — 24.08.2014 — 005.001 — 1467