(A)

Blocking ali kompetitivna ELISA se izvaja v skladu z naslednjim protokolom: Kompetitivna ELISA z monoklonskim protitelesom 3-17-A3 se uporablja za ugotavljanje protiteles za vse znane serotipe virusa bolezni modrikastega jezika (BTV). Načelo testa je prekinitev reakcije med antigenom virusa bolezni modrikastega jezika (BTV) ter grupno specifičnim monoklonskim protitelesom (3-17-A3) ob dodatku preiskovanega seruma. Protitelesa proti BTV, prisotna v preiskovanem serumu, ustavijo reaktivnost monoklonskega protitelesa (Mab), kar povzročijo zmanjšanje pričakovanega obarvanja po dodatku z encimom označenega protimišjega protitelesa in kromogena/substrata. Serumi se lahko testirajo v enkratni razredčitvi 1:5 (enkratna redčitev – Dodatek 1) ali pa se titrirajo (titracija seruma – Dodatek 2), da dobimo končne titre razredčitev seruma. Vrednosti inhibicije, ki so večje kot 50 %, se lahko obravnavajo kot pozitivne. Materiali in reagenti: 1. Ustrezne mikroplošče za test ELISA. 2. Antigen: koncentriran ekstrakt celic, ki se pripravi, kakor je opisano v nadaljevanju, in se hrani pri – 20 °C ali – 70 °C. 3. Bloking pufer: fosfatni pufer s soljo (PBS), ki vsebuje 0,3 % BTV negativnega bovinega seruma (odraslih govedi), 0,1 % (vol:vol) Tween-20 (na voljo kot sirup polioksietilen sorbiton monolaurata) v PBS. 4. Monoklonalno protitelo: 3-17-A3 (na voljo kot supernatant kulture tkiva hibridoma), usmerjeno na grupno specifični polipeptid VP7, shranjeno pri – 20 °C ali liofilizirano in pred uporabo razredčeno v razmerju 1:100 s pufrom za ustavitev reakcije. 5. Konjugat: kunčji protimišji globulin (adsorbiran in izpran), konjugiran s hrenovo peroksidazo in shranjen v temnem prostoru pri 4 °C. 6. Kromogen in substrat: ortofenilen-diamin (OPD-kromogen) s končno koncentracijo 0,4 mg/ml v sterilni destilirani vodi. Vodikov peroksid (30 % vol:vol-substrat) 0,05 % vol:vol, dodan neposredno pred uporabo (5 μl H2O2 na 10 ml OPD). (Previdno ravnajte z OPD – roke zaščitite z gumijastimi rokavicami – domnevno mutagena snov). 7. 1-molarna žveplena kislina: 26,6 ml kisline dodamo v 473,4 ml destilirane vode. (Opomba: vedno dodajte kislino v vodo in nikoli vode v kislino.) 8. Orbitalni stresalnik. 9. Čitalnik mikroplošč ELISA (test se lahko tudi vidno odčita). Oblika testa Cc: kontrola s konjugatom (brez seruma / brez monoklonalnih protiteles); C++: močno pozitivna kontrola s serumom; C+: šibko pozitivna kontrola s serumom; C–: negativna kontrola s serumom; Cm: kontrola z monoklonskim protitelesom (brez seruma).



DODATEK 1 Enkratna redčitev vzorca (1:5) (40 serumov/ploščo) Pregledi Testni serumi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E C+ C+ F C+ C+ G Cm Cm 40 H Cm Cm 40



DODATEK 2 Titracija seruma (10 serumov/ploščo) Pregledi Testni serumi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1:5 1:5 B Cc C- 1:10 1:10 C C++ C++ 1:20 1:20 D C++ C++ 1:40 1:40 E C+ C+ 1:80 1:80 F C+ C+ 1:160 1:160 G Cm Cm 1:320 1:320 H Cm Cm 1:640 1:640 Testni protokol: Kontrola konjugata (Cc) : jamici 1A in 1B sta slepa kontrola, ki je sestavljena iz antigena proti BTV in konjugata. Uporabi se lahko za izravnavo čitalnika testa ELISA. Kontrola Mab (Cm) : stolpca 1 in 2, vrstici G in H, sta kontrola z monoklonskim protitelesom in vsebujeta antigen proti BTV, monoklonsko protitelo in konjugat. V teh jamicah je obarvanje najbolj intenzivno. Srednja vrednost odčitanj optične gostote iz te kontrole je vrednost inhibicije 0 %. Pozitivna kontrola (C++, C+) : stolpca 1 in 2, vrstice C-D-E-F. Te jamice vsebujejo antigen proti BTV, močno pozitivno serumsko kontrolo proti BTV oziroma šibko pozitivno serumsko kontrolo proti BTV, Mab in konjugat. Negativna kontrola (C-) : jamici 2A in 2B sta negativni kontroli, ki vsebujeta antigen proti BTV, negativni serum proti BTV, Mab in konjugat. Testni serumi : za zelo obsežne serološke preiskave in hitre presejalne teste se lahko serumi testirajo v enkratni redčitvi 1:5 (Dodatek 1), po 10 serumov pa se lahko testira v obsegu razredčitev od 1:5 do 1:640 (Dodatek 2). Tako lahko približno določimo titer protitelesa v preiskovanem serumu. Postopek: 1. Antigen proti BTV razredčimo na predtitrirano koncentracijo v PBS, ga damo za kratek čas v sonikator, da se nakopičeni virus porazdeli (če sonikator ni na voljo, antigen porazdelimo s pipetiranjem), in dodamo po 50 μl v vse jamice na mikroplošči za test ELISA. Mikroploščo stresamo levo in desno, da se antigen enakomerno porazdeli. 2. Inkubiramo pri 37 °C 60 minut na orbitalnem stresalniku. Mikroplošče trikrat speremo s polnjenjem in praznjenjem jamic z nesterilnim PBS in jih osušimo na vpojnem papirju. 3. Kontrolne jamice: dodamo 100 μl bloking pufra v vse jamice Cc. Dodamo 50 μl pozitivnega in negativnega kontrolnega seruma v razredčitvi 1:5 (10 μl serumov + 40 μl pufra za ustavitev reakcije), v vsako posamezno jamico C-, C + in C++. Dodamo 50 μl bloking pufra v jamice za kontrolo Mab. Metoda enkratne redčitve: testni serum, razredčen 1:5 v bloking pufru, damo v paralelne jamice v stolpcih 3 do 12 (10 μl serumov + 40 μl pufra za ustavitev reakcije), ali metoda serumske titracije: pripravimo zaporedje dvojnih redčitev vsakega preiskovanega serumskega vzorca (1:5 do 1:640) v pufru za ustavitev reakcije, v osmih jamicah enojnih stolpcev 3 do 12. 4. Takoj po dodatku preiskovanih serumov razredčimo Mab 1:100 v bloking pufru in ga dodamo po 50 μl v vsako jamico na mikroplošči, razen slepe kontrole. 5. Inkubiramo pri 37 °C 60 minut na orbitalnem stresalniku. Trikrat speremo s PBS in osušimo na vpojnem papirju. 6. Razredčimo kunčji protimišji koncentrat na 1:5 000 v bloking pufru in ga dodamo po 50 μl v vsako jamico na mikroplošči. 7. Inkubiramo pri 37 °C 60 minut na orbitalnem stresalniku. Trikrat speremo s PBS in osušimo na vpojnem papirju. 8. Odtajamo O-fenilendiamin dihidroklorid (OPD) in tik pred uporabo dodamo 5 μl 30-odstotnega vodikovega peroksida v vsakih 10 ml OPD. Dodamo po 50 μl v vsako jamico na mikroplošči. Počakamo približno 10 minut, da se jamice obarvajo, in ustavimo reakcijo z 1 molarno žvepleno kislino (50 μl na jamico). Obarvati se morajo kontrolne jamice Mab ter jamice, v katerih so serumi brez protitelesa proti BTV. 9. Mikroplošče pregledamo vidno ali s spektrofotometričnim čitalnikom in zapišemo rezultate. Analiza rezultatov: Z ustreznim računalniškim programskim paketom izpišemo vrednosti optične gostote (OD) in odstotke inhibicije (PI) za testne in kontrolne serume na podlagi srednje vrednosti, ugotovljene v kontrolnih jamicah za antigen. Podatke, izražene kot vrednosti OD in PI, uporabimo za ugotavljanje, ali je test opravljen znotraj sprejemljivih kriterijev. Zgornje kontrolne meje (UCL) in spodnje kontrolne meje (LCL) za kontrolo Mab (antigen in Mab, brez testnih serumov) so v razponu vrednosti OD 0,4 do 1,4. Katera koli plošča, ki ne ustreza zgoraj navedenim kriterijem, se ne upošteva. Če računalniški programski paket ni na voljo, izpišemo vrednosti OD na tiskalniku testa ELISA. Izračunamo srednjo vrednost OD za kontrolne jamice za antigen, ki je enaka 100-odstotni vrednosti. Določimo 50-odstotno vrednost OD in ročno izračunamo pozitivnost in negativnost vsakega vzorca. Vrednost odstotka inhibicije (PI) = 100 – (OD vsake preiskovane kontrole/srednja vrednost OD kontrole za monoklonsko protitelo (Cm)) × 100. Dvojniki jamic z negativnim kontrolnim serumom in dvojniki praznih jamic morajo prikazati vrednosti PI med + 25 % in – 25 % oziroma med + 95 % in + 105 %. Če vrednosti niso znotraj predpisanih meja, plošča ni neveljavna, da pa slutiti, da se razvija barva ozadja. Močno in šibko pozitivni kontrolni serumi morajo prikazati vrednosti PI med + 81 % in + 100 % oziroma med + 51 % in + 80 %. Diagnostični prag za testne serume je 50 % (PI 50 % ali OD 50 %). Vzorci, ki prikažejo vrednosti PI < 50 %, se ocenijo kot negativni. Vzorci z vrednostmi PI nad pragom dvojnikov jamice in pod njim se ocenijo kot dvomljivi; takšne vzorce se mora ponovno testirati z enojnim redčenjem in/ali titracijo. Pozitivne vzorce se lahko tudi titrira, da se dobi stopnjo pozitivnosti. Vizualno odčitanje: pozitivne in negativne vzorce lahko enostavno razločimo s prostim očesom; šibko pozitivne ali močno negativne vzorce pa je težje oceniti s prostim očesom. Priprava antigena proti BTV za test ELISA: 1. 40-60 rouxovih stekleničk celic strnjene linije BHK-21 trikrat speremo z Eagle’s Medium brez seruma in jih inficiramo z virusom bolezni modrikastega jezika, serotip 1, v Eagle’s Medium brez seruma. 2. Inkubiramo pri 37 °C in vsak dan preverimo citopatski učinek (CPE). 3. Ko so citopatski učinki (CPE) prisotni v 90 do 100 odstotkih v vsaki Rouxovi steklenički celične linije BHK-21, zberemo virus s stresanjem še vseh pritrjenih celic s stekla. 4. Centrifugiramo pri 2 000 do 3 000 obr./min., da skoncentriramo celice. 5. Supernatant zavržemo in resuspendiramo celice v približno 30 ml PBS, ki vsebuje 1 % „Sarkosyla“ in 2 ml fenilmetilsulfonil fluorida (pufer za lizo celic). Pri tem se lahko iz celic tvori gel in dodati je treba več pufra za lizo, da se zmanjša ta učinek. (Opomba: fenilmetilsulfonil fluorid je škodljiv – z njim ravnamo izjemo previdno.) 6. Celice razbijamo 60 sekund z ultrazvočno sondo pri amplitudi 30 mikronov. 7. Centrifugiramo 10 minut pri 10 000 vrt/min. 8. Supernatant shranimo pri + 4 °C in pripravimo resuspenzijo ostanka celičnega centrifugata v 10 do 20 ml pufra za liziranje. 9. Trikrat sonificiramo in centrifugiramo ter na vsaki stopnji shranimo supernatant. 10. Pripravimo zbirni vzorec supernatantov in ga centrifugiramo na Beckmannovi centrifugi (s 30-mililitrskimi epruvetami in rotorjem SW 28) pri 24 000 obr./min. (100,000 g) 120 minut, pri + 4 °C, na 5 mililitrski podlagi 40-odstotne raztopine saharoze (vol:vol v PBS). 11. Supernatant zavržemo, epruvete temeljito odcedimo in resuspendiramo centrifugat v PBS s sonificiranjem. Antigen shranimo v enakih delih pri – 20 °C. Titriranje antigena proti BTV za test ELISA: Za titriranje antigena proti BTV se uporabi indirektna ELISA. Dvojne razredčine antigena titriramo glede na konstantno razredčino (1/100) monoklonalnih protiteles 3-17-A3. Protokol je naslednji: 1. Antigen proti BTV, razredčen 1:20 v PBS, titriramo z večkanalno pipeto po vsej mikroplošči v dvojnih padajočih razredčitvah (50 μl/jamico). 2. Inkubiramo 1 uro pri 37 °C na orbitalnem stresalniku. 3. Plošče trikrat speremo s PBS. 4. Dodamo 50 μl monoklonalnih protiteles 3-17-A3 (razredčenih 1:100) v vsako jamico na mikroplošči. 5. Inkubiramo 1 uro pri 37 °C na orbitalnem stresalniku. 6. Plošče trikrat speremo s PBS. 7. Dodamo 50 μl kunčjega protimišjega globulina, konjugiranega s hrenovo peroksidazo (HRP), razredčeno na optimalno koncentracijo, v vsako jamico na mikroplošči. 8. Inkubiramo 1 uro pri 37 °C na orbitalnem stresalniku. 9. Dodamo substrat in kromogen, kakor je opisano zgoraj. Reakcijo ustavimo po 10 minutah z dodatkom 1 molarne žveplene kisline (50 μl/jamico). Pri kompetitivni ELISA morajo biti monoklonska protitelesa prisotna v pribitku in zato izberemo razredčitev antigena, katere vrednost leži na titracijski krivulji (ne na ravnini) in da približno OD vrednost 0,8 po 10 minutah.