1978L0633 — SL — 20.12.1983 — 002.001

Ta dokument je mišljen zgolj kot dokumentacijsko orodje in institucije za njegovo vsebino ne prevzemajo nobene odgovornosti

►B OSMA DIREKTIVA KOMISIJE z dne 15. junija 1978 o uvedbi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme (78/633/EGS) (UL L 206, 29.7.1978, p.43)

spremenjena z:









▼B

OSMA DIREKTIVA KOMISIJE

z dne 15. junija 1978

o uvedbi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme

(78/633/EGS)







KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske gospodarske skupnosti, ob upoštevanju Direktive Sveta 70/373/EGS z dne 20. julija 1970 o uvedbi metod vzorčenja in analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme ( 1 ), kakor je bila nazadnje spremenjena z Aktom o pristopu, in zlasti člena 2 Direktive, ker zahteva navedena direktiva, da se uradni nadzor krme izvaja z uporabo metod vzorčenja in analitskih metod Skupnosti za preverjanje izpolnjevanja zahtev, določenih z zakoni in drugimi predpisi v zvezi s kakovostjo in sestavo krme; ker so direktive Komisije 71/250/EGS z dne 15. junija 1971 ( 2 ), 71/393/EGS z dne 18. novembra 1971 ( 3 ), 72/199/EGS z dne 27. aprila 1972 ( 4 ), 73/46/EGS z dne 5. decembra 1972 ( 5 ), 74/203/EGS z dne 25. marca 1974 ( 6 ), 75/84/EGS z dne 20. decembra 1974 ( 7 ) in 76/372/EGS z dne 1. marca 1976 ( 8 ) že določile številne analitske metode Skupnosti; ker je zaradi napredka dela od tedaj priporočljivo sprejeti osmi sklop metod; ker so ukrepi, predvideni s to direktivo, v skladu z mnenjem Stalnega odbora za krmo, SPREJELA NASLEDNJO DIREKTIVO:







Člen 1

1. Države članice zahtevajo, da se analiza za uradni nadzor vsebnosti cinkovega bacitracina, flavofosfolipola, železa, bakra, mangana in cinka v krmi opravlja skladno z metodami, opisanimi v Prilogi k tej direktivi.

▼M1 —————

▼B

Člen 2

Države članice sprejmejo zakone ali druge predpise, potrebne za uskladitev s to direktivo, do 1. januarja 1979. O tem takoj obvestijo Komisijo.

Člen 3

Ta direktiva je naslovljena na države članice.









PRILOGA

▼M2

1. DOLOČANJE VSEBNOSTI CINK BACITRACINA

— z difuzijo na agarskem gojišču –

1. NAMEN IN PODROČJE UPORABE

S to metodo se določa vsebnost cink bacitracina v krmi in premiksih. Spodnja meja določanje je 5 mg/kg (5 ppm) ( 9 ).

2. PRINCIP

Vzorec se ekstrahira pri pH 2 z mešanico metanol/voda/klorovodikova kislina in raztopine natrijevega sulfida. Natrijev sulfid se doda zato, da se oborijo topne bakrove soli, ki bi sicer lahko motile preskus. Ekstrakt se naravna do vrednosti pH 6,5, koncentrira (kjer je potrebno) in razredči. Njegova antibiotična aktivnost se določi tako, da se izmeri difuzija cink bacitracina v agarskem gojišču, ki je nacepljeno z Micrococcus luteus (flavus). Znak difuzije je oblikovanje inhibicijskih con mikroorganizma. Za premer teh con velja, da je premosorazmeren logaritmu koncentracije antibiotika v območju uporabljenih koncentracij antibiotika.

3. MIKROORGANIZEM: MICROCOCCUS LUTEUS (FLAVUS) ATCC 10240

3.1 Vzdrževanje osnovne kulture

Epruvete s poševnimi nanosi gojišča (4.1) se nacepijo z Micrococcus luteus (flavus) in inkubirajo 24 ur pri 30 °C. Kultura se hrani v hladilniku pri 4 °C. Vsakih štirinajst dni se precepi.

3.2 Priprava suspenzije bakterij ( 10 )

Z 2 do 3 ml raztopine natrijevega klorida (4.3) se posname prirastek z agarskega nanosa (3.1). S to suspenzijo se nacepi 250 ml gojišča (4.1), ki se nahaja v Rouxovi steklenici, in se inkubira od 18 do 20 ur pri 30 °C. Kultura se posname v 25 ml natrijevega klorida (4.3) in premeša. Suspenzija se z raztopino natrijevega klorida (4.3) razredči na 1/10. Prepustnost svetlobe suspenzije mora biti 75 %, izmerjena pri 650 nm v 1-centimetrski kiveti, proti raztopini natrijevega klorida (4.3). Suspenzija je obstojna en teden pri približno 4 °C.

4. GOJIŠČA KULTURE IN REAGENTI

4.1 Gojišče ( 11 )







Mesni pepton 6,0 g Tripton 4,0 g Kvasni ekstrakt 3,0 g Mesni ekstrakt 1,5 g Glukoza 1,0 g Agar od 10,0 do 20,0 g Voda 1 000 ml pH 6,5 do 6,6 (po sterilizaciji).

4.2 Preskusno gojišče (11)







Tripton 10,0 g Kvasni ekstrakt 3,0 g Mesni ekstrakt 1,5 g Glukoza 1,0 g Agar od 10,0 do 20,0 g Tween 80 1 ml Voda 1 000 ml pH 6,5 (po sterilizaciji).

4.3 Raztopina natrijevega klorida 0,8 % (m/v): v vodi se raztopi 8 g natrijevega klorida in razredči do 1 000 ml; nato se sterilizira.

4.4 Mešanica metanol/voda in klorovodikove kisline (4.6): 80/17,5/2,5 (v/v/v).

4.5 Fosfatni pufer, pH 6,5:



Kalijev hidrogenfosfat, K2HPO4 22,15 g. Kalijev dihidrogenfosfat, KH2PO4 27,85 g. Voda do 1 000 ml.

4.6 Klorovodikova kislina (d: od 1,18 do 1,19).

4.7 Klorovodikova kislina (0,1 M).

4.8 Raztopina natrijevega hidroksida 1 M.

4.9 Raztopina natrijevega sulfida 0,5 M.

4.10 Bromkrezol rdeče, raztopina 0,04 % (m/v): 0,1 g bromkrezol rdečega se raztopi v 18,5 ml raztopine natrijevega hidroksida 0,01 M. Dopolni se z vodo do 250 ml in premeša.

4.11 Standardna substanca: cink bacitracin z znano aktivnostjo (v mednarodnih enotah).

5. STANDARDNE RAZTOPINE

Natehta se določena količina standardnega cink bacitracina (4.11), ki ustreza 1 050 mednarodnim enotam (glede na navedeno aktivnost). Doda se 5 ml klorovodikove kisline 0,1 M (4.7) in pusti stati 15 minut. Doda se 30 ml vode, s fosfatnim pufrom (4.5) (približno 4 ml) se vrednost pH naravna na 4,5, nato se z vodo dopolni do 50 ml in dobro premeša (1 ml = 21 i.u., mednarodnih enot).

Z zaporednim razredčevanjem s fosfatnim pufrom (4.5) se iz te raztopine pripravijo naslednje raztopine:







s8 0,42 i.u./ml s4 0,21 i.u./ml s2 0,105 i.u./ml s1 0,0525 i.u./ml

6. PRIPRAVA EKSTRAKTA IN PRESKUSNIH RAZTOPIN

6.1 Ekstrakcija

6.1.1 Premiksi in mineralna krma

Natehta se od 2,0 do 5,0 g vzorca, dodata se 29,0 ml mešanice (4.4) in 1,0 ml raztopine natrijevega sulfida (4.9) ter na hitro pretrese. Preveri se, da je vrednost pH približno 2. Nato se stresa 10 minut, doda 30 ml fosfatnega pufra (4.5), stresa 15 minut in centrifugira. Odpipetira se ustrezen alikvot bistre raztopine nad usedlino in z 1 M raztopino hidroksida (4.8) se vrednost pH naravna na 6,5, pri čemer kot indikator služi bodisi pH-meter bodisi raztopina bromkrezol rdečega (4.10). Mešanica se razredči s fosfatnim pufrom (4.5), da se dobi pričakovana vsebnost cink bacitracina 0,42 i.u./ml (= u8).

6.1.2 Beljakovinski koncentrati

Natehta se 10,0 g vzorca, dodata se 49,0 ml mešanice (4.4) in 1,0 ml raztopine natrijevega sulfida (4.9) ter na hitro pretrese. Preveri se, da je pH vrednost približno 2, in stresa 10 minut. Doda se 50 ml fosfatnega pufra (4.5), stresa 15 minut in centrifugira. Odpipetira se ustrezen volumen bistre raztopine nad usedlino in z dodajanjem raztopine natrijevega hidroksida 1 M (4.8) se vrednost pH naravna na 6,5, pri čemer kot indikator služi bodisi pH-meter bodisi raztopina bromkrezol rdečega (4.10). V rotacijskem uparjalniku se upari približno polovica volumna pri temperaturi, ki ne presega 35 °C.

Razredči se s fosfatnim pufrom (4.5), da se dobi pričakovana vsebnost cink bacitracina 0,42 i.u./ml (= u8).

6.1.3 Druga krma

Natehta se 10,0 g vzorca (20,0 g za pričakovano vsebnost cink bacitracina 5 mg/kg). Dodata se 24,0 ml mešanice (4.4) in 1,0 ml raztopine natrijevega sulfida (4.9) ter 10 minut meša. Doda se 25 ml fosfatnega pufra (4.5), stresa 15 minut in centrifugira. Odpipetira se 20 ml bistre raztopine nad usedlino in z dodajanjem raztopine natrijevega hidroksida 1 M (4.8) se vrednost pH naravna na 6,5, pri čemer kot indikator služi bodisi pH-meter bodisi raztopina bromkrezol rdečega (4.10). V rotacijskem uparjalniku se upari do 4 ml pri temperaturi, ki ne presega 35 °C. Ostanek se razredči s fosfatnim pufrom (4.5), da se dobi pričakovana vsebnost cink bacitracina 0,42 i.u./ml (= u8).

6.2 Preskusne raztopine

Z zaporednim razredčevanjem (1 + 1) s fosfatnim pufrom (4.5) se iz raztopine u8 pripravijo raztopine u4 (pričakovana vsebnost: 0,21 i.u./ml), u2 (pričakovana vsebnost: 0,105 i.u./ml), in u1 (pričakovana vsebnost: 0,0525 i.u./ml).

7. PRESKUSNI POSTOPEK

7.1 Nacepljenje preskusnega gojišča

Preskusno gojišče (4.2) se nacepi s suspenzijo bakterij (3.2) pri približno 50 °C. S predhodnimi preskusi na ploščah s preskusnim gojiščem (4.2) se določi količina suspenzije bakterij, ki je potrebna, da se dobijo največje in najbistrejše inhibicijske cone z različnimi koncentracijami cink bacitracina.

7.2 Priprava plošč

Difuzija skozi agar se izvaja na ploščah s štirimi koncentracijami standardne raztopine (s8, s4, s2 in s1) in s štirimi koncentracijami preskusne raztopine (u8, u4, u2 in u1). Na vsako ploščo je treba nujno nanesti vse štiri koncentracije ekstrakta in standardne raztopine. V ta namen se zberejo plošče, ki so dovolj velike za najmanj osem vdolbin s premerom od 10 do 13 mm in z razdaljo najmanj 30 mm med središči, ki jih je treba vdolbsti v agarsko gojišče. Preskus se lahko izvaja na steklenih ploščah, na katerih je obroč iz obdelanega aluminija ali plastike s premera 200 mm in višino 20 mm.

Na plošče se nanese določena količina gojišča (4.2), ki je nacepljeno skladno s točko 7.1, da se dobi približno 2 mm debela plast (60 ml za ploščo s premerom 200). Počaka se, da se površina utrdi. Nato se izdolbejo vdolbine in vanje nanesejo natanko odmerjeni volumni preskusnih in standardnih raztopin (med 0,10 in 0,15 ml na vdolbino, odvisno od premera). Vsaka koncentracija se uporabi najmanj štirikrat, tako da se pri vsakem preskusu ovrednoti 32 inhibicijskih con.

7.3. Inkubacija

Plošče se inkubirajo od 16 do 18 ur pri 30 ± 2 °C.

8. VREDNOTENJE

Premer inhibicijskih con se izmeri s točnostjo 0,1 mm. Srednje vrednosti za vsako koncentracijo se vnesejo v semilogaritemski diagram, ki prikazuje logaritem koncentracij v odvisnosti od premerov inhibicijskih con. Na diagramu se izrišeta premici z najboljšim potekom, tako za standardno raztopino kot tudi za ekstrakt, kakor je navedeno na primeru spodaj:

Z naslednjo enačbo se določi „najboljša“ točka za najmanjšo vrednost standardne raztopine (SL):

(a)

Z naslednjo enačbo se določi „najboljša“ točka za največjo vrednost standardne raztopine (SH):

(b)

Na podoben način se izračunata „najboljši“ točki za najmanjšo (UL) in največjo (UH) vrednost ekstrakta, in sicer tako, da se u1, u2, u4 in u8 v zgornjih enačbah zamenjajo s s1, s2, s4 in s8.

Izračunani vrednosti SL in SH se vneseta v isti diagram in povežeta, da se dobi premica z „najboljšim“ potekom za standardno raztopino. Na podoben način se izračunata vrednosti UL in UH ter povežeta, da se dobi premica z „najboljšim“ potekom za ekstrakt.

Če ni interferenc, morata biti premici vzporedni. Iz praktičnih razlogov se premici lahko štejeta za vzporedni, če se vrednosti (SH-SL) ter (UH-UL) ne razlikujejo za več kot 10 % od njihove srednje vrednosti.

Če premici nista vzporedni, se lahko izločita bodisi u1 in s1 ali u8 in s8 in se vrednosti SL, SH, UL in UH izračunajo z alternativnima enačbama, s katerima se dobita alternativni premici z „najboljšim“ potekom:







(a′) SL = ali (b′) SH = ali

in podobno velja tudi za UL in UH. Tudi v tem primeru veljajo ista merila za vzporednost. Če je bil rezultat izračunan s tremi vrednostmi, je treba to navesti v končnem poročilu.

Kadar se šteje, da sta premici vzporedni, se izračuna logaritem relativne aktivnosti (log A), in sicer z eno od naslednjih enačb, odvisno od tega, ali so bile za oceno vzporednosti uporabljene tri ali štiri vrednosti.

Za štiri vrednosti

(c)

Za tri vrednosti

(d)

ali

(d′ )

Aktivnost ekstrakta vzorca = aktivnost ustreznega standarda × A

(u8 = s8 × A)

Če relativna aktivnost presega območje od 0,5 do 2,0, se preskus ponovi tako, da se ustrezno prilagodijo koncentracije ekstrakta, ali če to ni mogoče, prilagodijo standardne raztopine. Kadar relativne aktivnosti ni mogoče dovesti do zahtevanega območja, je treba vsak dobljeni rezultat obravnavati kot približek in to tudi navesti v končnem poročilu.

Kadar se šteje, da premici nista vzporedni, se določanje ponovi. Če vzporednosti še vedno ni dosežena, se določanje šteje za nezadovoljivo.

Rezultat se izrazi v milligramih cink bacitracina na kilogram krme.

9. PONOVLJIVOST

Razlika med rezultatoma dveh določanj, ki jih na istem vzorcu izvaja isti analitik, ne sme presegati:

— 2 mg/kg, v absolutni vrednosti, za vsebnosti cink bacitracina do 10 mg/kg,

— 20 % glede na večjo vrednost za vsebnosti od 10 do 25 mg/kg,

— 5 mg/kg, v absolutni vrednosti, za vsebnosti od 25 do 50 mg/kg,

— 10 % glede na večjo vrednost za vsebnosti nad 50 mg/kg.

▼B

2. DOLOČANJE FLAVOFOSFOLIPOLA Z DIFUZIJO NA AGARSKEM GOJIŠČU

1. NAMEN IN PODROČJE UPORABE

S to metodo določamo flavofosfolipol v krmi, koncentratih in premiksih. Spodnja meja določanja je 1 mg/kg (1 ppm).

2. PRINCIP

Vzorec ekstrahiramo z razredčenim metanolom s segrevanjem pod povratnim tokom. Po centrifugiranju ekstrakt prečistimo (po potrebi) z ionskimi izmenjevalci in razredčimo. Njegovo antibiotično aktivnost določimo z merjenjem difuzije flavofosfolipola na agarskem gojišču, nacepljenem s Staphylococcus aureus. Znak difuzije je oblikovanje inhibicijskih con mikroorganizma. Za premer teh con velja, da je premosorazmeren z logaritmom koncentracije antibiotika v območju uporabljenih koncentracij antibiotika.

3. MIKROORGANIZEM: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P

3.1 Vzdrževanje osnovne kulture

Staphylococcus aureus nacepimo na poševen nanos agarja na gojišču (4.1). Inkubiramo 24 ur pri 37 °C, hranimo v hladilniku pri približno 4 °C in vsak mesec precepimo na poševne nanose agarja.

3.2 Priprava bakterijske suspenzije ( 12 )

Dve epruveti osnovne kulture (3.1) precepimo vsak teden. Inkubiramo 24 ur pri 37 °C in hranimo v hladilniku pri približno 4 °C.

24 ur pred preskusom s tem prirastkom nacepimo dve do štiri epruvete s poševnimi nanosi gojišč (4.1). Inkubiramo od 16 do 18 ur pri 37 °C. Pripravimo suspenzijo rasti v raztopini natrijevega klorida (4.3). Prepustnost svetlobe suspenzije mora biti približno 40 %, izmerjena pri 578 nm v 1-centimetrski kiveti proti raztopini natrijevega klorida (4.3).

4. GOJIŠČA IN REAGENTI

4.1 Gojišče ( 13 )







Mesni pepton 6,0 g Tripton 4,0 g Kvasni ekstrakt 3,0 g Mesni ekstrakt 1,5 g Glukoza 1,0 g Agar 15,0 g Voda 1 000 ml pH 6,5 (po sterilizaciji)

4.2. Preskusno gojišče ( 14 )

4.2.1 Osnovna plast (14)







Mesni pepton 6,0 g Kvasni ekstrakt 3,0 g Mesni ekstrakt 1,5 g Agar 10,0 g Voda 1 000 ml pH 6,5 (po sterilizaciji)

4.2.2 Zasejalna plast

Kot v točki 4.1, z dodatkom 2,0 g silikonske emulzije proti penjenju ( 15 ).

4.3 Raztopina natrijevega klorida 0,4 % (m/v): v vodi raztopimo 4 g natrijevega klorida p.a. in razredčimo do 1 000 ml; steriliziramo.

4.4 Metanol, čisti.

4.5 Metanol 50 % (v/v): 500 ml metanola (4.4) razredčimo s 500 ml vode.

4.6. Metanol 80 % (v/v): 800 ml metanola razredčimo (4.4) z 200 ml vode.

4.7 Tris (hidroksimetil) aminometan a.p.

4.8 Metanolan raztopina kalijevega klorida 1,5 % (m/v): 1,5 g kalijevega klorida p.a. raztopimo v 20 ml vode, nato dopolnimo z metanolom do 100 ml (4.4).

4.9 Kationski izmenjevalec: Dowex 50 W 8, 20 do 50 meš, Na oblika (kat. Serva št. 41 600) ali enakovreden.

4.10 Anionski izmenjevalec: Dowex 1 2, 20 do 50 meš, Cl oblika (kat. Serva. št 41 010) ali enakovreden. Pred uporabo 12 do 14 ur pustimo v 80-odstotnem metanolu (4.6).

4.11 Steklena volna.

4.12 pH indikatorski papir (pH 6,6 do 8,1).

4.13 Askorbinska kislina.

4.14 Standardna substanca: flavofosfolipol znane aktivnosti.

5. OPREMA

5.1 Steklena cev za kromatografijo, notranji premer: 9 mm, dolžina: 150 do 200 mm, opremljena s petelinčkom na zoženem spodnjem delu in brusom (za povezavo s kapalnim lijakom (5.2)) na zgornjem delu.

5.2 Kapalni lijak 250 ml, opremljen s petelinčkom in brusom.

5.3 250-mililitrska erlenmajerica z brusom.

5.4 Povratni hladilnik z brusom.

6. STANDARDNE RAZTOPINE

Točno natehtano količino standardne substance (4.14) raztopimo v 50-odstotnem metanolu (4.5) in razredčimo, da dobimo osnovno raztopino, ki vsebuje 100 μg flavofosfolipola na mililiter. Raztopina je stabilna do dveh mesecev, če jo hranimo v zaprti posodi pri 4 °C.

Z zaporednim razredčevanjem s 50-odstotnim metanolom (4.5) iz te osnovne raztopine pripravimo naslednje raztopine:







S8 0,2 μg/ml S4 0,1 μg/ml S2 0,05 μg/ml S1 0,025 μg/ml

7. PRIPRAVA EKSTRAKTA

7.1. Ekstrakcija

7.1.1 Koncentrati, premiksi in mineralna krma

Natehtamo od 2,0 do 5,0 g vzorca in dodamo približno 150 mg askorbinske kisline (4.13). V erlenmajerici (5.3) premešamo s 150 ml 50-odstotnega metanola (4.5) in z okoli 400 mg tris(hidroksimetil)aminometana (4.7) naravnamo pH na 8,1 do 8,2. Preverimo pH z indikatorskim papirjem (4.12). Pustimo stati 15 minut, nato s tris(hidroksimetil)aminometanom (4.7) ponovno naravnamo pH na 8,1 do 8,2 in 10 minut vremo pod povratnim hladilnikom (5.4) ter pri tem neprestano mešamo. Mešanico ohladimo in centrifugiramo, nato oddekantiramo ekstrakt.

7.1.2 Druga krma

Natehtamo od 5,0 do 30,0 g količino vzorca, ki vsebuje vsaj 30 μg flavofosfolipola. V erlenmajerici (5.3) premešamo s 150 ml 50-odstotnega metanola (4.5) in naravnamo pH na 8,1 do 8,2 s približno 400 mg tris(hidroksimetil)aminometan (4.7). Preverimo pH z indikatorskim papirjem (4.12). Pustimo stati 15 minut, nato s tris(hidroksimetil)aminometanom (4.7) ponovno naravnamo pH na 8,1 do 8,2 in 10 minut vremo pod povratnim hladilnikom (5.4) ter pri tem neprestano mešamo. Mešanico ohladimo, centrifugiramo in oddekantiramo ekstrakt.

7.2 Čiščenje (ta korak lahko pri koncentratih, premiksih in mineralni krmil izpustimo)

110 ml ekstrakta dodamo 11 g kationskega izmenjalca (4.9), eno minuto vremo pod povratnim hladilnikom (5.4) in neprestano mešamo. Kationski izmenjevalec ločimo s centrifugiranjem ali filtriranjem. 100 ml ekstrakta dodamo 150 ml metanola (4.4) in raztopino hranimo 12 do 15 ur pri temperaturi 4 °C. Na hladnem odfiltriramo kosmiče.

Na dno steklene cevi (5.1) vstavimo zamašek iz steklene volne (4.11), v cev vlijemo 5 ml anionskega izmenjevalca (4.10) in kolono speremo s 100 ml 80-odstotnega metanola (4.6). Z uporabo lijaka (5.2) v kolono prenesemo najmanj 100 ml filtrata, za katerega predvidevamo, da vsebuje 16 μg flavofosfolipola (200 ml za 30-gramski vzorec krme pri 1 ppm). Po potrebi, preden ga vlijemo v kolono, filtrat razredčimo z 80-odstotnim metanolom (4.6), da dobimo pričakovano vsebnost flavofosfolipola 16 μg/100 ml. Hitrost pretoka naravnamo na približno 2 ml/minuto. Eluat zavržemo. Nato speremo kolono s 50 ml 80-odstotnega metanola (4.6) in eluat zavržemo.

Flavofosfolipol eluiramo z metanolno raztopino kalijevega klorida (4.8) s hitrostjo pretoka do približno 2 ml/minuto. 50 ml eluata prenesemo v merilno bučko, dodamo 30 ml vode in premešamo. Ta raztopina bi morala vsebovati 0,2 μg/ml (= U8) flavofosfolipola.

7.3 Preskusne raztopine

Po potrebi (to je, če smo izpustili čiščenje) ekstrakt, dobljen v točki 7.1.1, razredčimo s 50-odstotnim metanolom (4.5), da dobimo pričakovano vsebnost flavofosfolipola 0,2 μg/ml (= U8).

Iz raztopine U8 pripravimo raztopine U4 (pričakovana vsebnost: 0,1 μg/ml), U2 (pričakovana vsebnost: 0,05 μg/ml), in U1 (pričakovana vsebnost: 0,025 μg/ml), in sicer z zaporednim razredčevanjem (1 + 1) s 50-odstotnim metanolom (4.5).

8. PRESKUSNI POSTOPEK

8.1 Nacepljenje preskusnega gojišča

Preskusno gojišče (4.2.2) nacepimo z bakterijsko suspenzijo (3.2) pri približno 50 °C. S predhodnimi preskusi na ploščah s preskusnim gojiščem (4.2.2) določimo količino bakterijske suspenzije, ki je potrebna, da dobimo največje in najjasnejše inhibicijske cone z različnimi koncentracijami flavofosfolipola (približno 30 ml/l).

8.2 Priprava plošč

Difuzijo skozi agar izvajamo na ploščah s štirimi koncentracijami standardnih raztopin (S8, S4, S2 in S1) in s štirimi koncentracijami preskusnih raztopin (U8, U4, U2 in U1) na vsaki izmed njih. Te štiri koncentracije ekstrakta in standardne raztopine moramo nujno dodati na vsako ploščo. Zato izberemo dovolj velike plošče za vsaj osem vdolbin s premerom od 10 do 13 mm, z najmanj 30 mm razdalje med središči, ki jih vdolbemo v agarsko gojišče. Preskus lahko izvajamo na steklenih ploščah, na katere postavimo obroč iz obdelanega aluminija ali plastike in imajo premer 200 mm, v višino pa merijo 20 mm.

Na plošče nalijmo določeno količino gojišča (4.2.1), da dobimo približno 1,5 mm debelo plast (45 ml za ploščo s premerom 200 mm). Ko se vsebina izravna, prelijemo določeno količino gojišča (4.2.2), ki je nacepljeno skladno s točko 8.1, da dobimo približno 1 mm debelo plast (30 ml za ploščo s premerom 200 mm). Počakamo, da se površina ponovno izravna. Nato izdolbemo vdolbine in vanje nanesemo točno odmerjene volumne preskusnih in standardnih raztopin (med 0,10 in 0,15 ml na vdolbino, glede na premer).

Vsako koncentracijo nanesemo najmanj štirikrat, tako da pri vsakem preskusu ovrednotimo 32 inhibicijskih con.

8.3 Inkubacija

Plošče inkubiramo od 16 do 18 ur pri 28 do 30 °C.

9. OVREDNOTENJE

Izmerimo premer inhibicijskih con s točnostjo 0,1 mm. Srednje vrednosti za vsako koncentracijo nanesemo v semilogaritemski diagram, ki prikazuje logaritem koncentracij glede na premer inhibicijskih con. Na diagramu izrišemo premice z najboljšim potekom tako za standardno raztopino kot tudi za ekstrakt, kakor je prikazano spodaj.

Z naslednjo enačbo določimo „najboljšo“ točko za najnižjo vsebnost standardne raztopine (SL):

(a)

(b)

Na podoben način izračunamo „najboljše“ točke za najnižjo (UL) in najvišjo (UH) vsebnost ekstrakta, in sicer tako, da v zgornjih enačbah U1, U2, U4 in U8 nadomestimo s S1, S2, S4 in S8.

Izračunane vrednosti SL in SH nanesemo na isti diagram in jih povežemo, da dobimo premico z najboljšim potekom za standardno raztopino. Na podoben način zabeležimo vrednosti UL in UH ter jih povežemo, da dobimo premico z najboljšim potekom za ekstrakt.

Če ni interferenc, bi morale biti premice vzporedne. Za praktične namene lahko premice štejemo za vzporedne, če se vrednosti (SH-SL) ter (UH-UL) ne razlikujejo za več kot 10 % od njihovih srednjih vrednosti.

Če premice niso vzporedne, lahko izločimo bodisi U1 in S1 ali U8 in S8, in SL, SH, UL in UH izračunamo z alternativnimi enačbami, s katerimi dobimo alternativne premice z najboljšim potekom:

a’) ali ali

b’) ali ali

Z najboljšim potekom preverimo vzporednost kot zgoraj. Če rezultat izračunamo iz treh vsebnosti, moramo to navesti v končnem poročilu.

Ko premice štejemo za vzporedne, izračunamo logaritem relativne aktivnosti (log. A) s pomočjo ene izmed naslednjih formul.

Za štiri vrednosti

(c)

Za tri vrednosti

(d)

ali

d’)

Dejanska aktivnost = domnevna aktivnost × relativna aktivnost.

Kadar premic ne štejemo za vzporedne, določitev ponovimo. Če vzporednost še vedno ni dosežena, izračunamo logaritem relativne aktivnosti (log. A) s formulo (c). Vendar moramo tako dobljeni rezultat jemati kot približnega, in to moramo navesti v končnem poročilu.

10. PONOVLJIVOST

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki jih na istem vzorcu izvaja isti analitik, ne sme presegati:

0,5 mg/kg v absolutni vrednosti, za vsebnosti flavofosfolipola od 1 do 2 mg/kg;

25 % glede na višjo vrednost, za vsebnosti nad 2 in do 10 mg/kg;

20 % glede na višjo vrednost, za vsebnosti nad 10 in do 25 mg/kg;

5 mg/kg v absolutni vrednosti, za vsebnosti nad 25 in do 50 mg/kg;

10 % glede na višjo vrednost, za vsebnosti nad 50 mg/kg.

3. DOLOČANJE ŽELEZA, BAKRA, MANGANA IN CINKA V SLEDOVIH

1. NAMEN IN PODROČJE UPORABE

S to metodo je mogoče določiti vsebnost železa, bakra, mangana in cinka v sledovih v krmi. Spodnje meje določanja so:

železo (Fe): 20 mg/kg

baker (Cu): 10 mg/kg

mangan (Mn): 20 mg/kg

cink (Zn): 20 mg/kg

2. PRINCIP

Po razkroju morebitnih organskih snovi vzorec raztopimo v klorovodikovi kislini. Po primernem razredčenju določimo železo, baker, mangan in cink z atomsko absorpcijsko spektrometrijo.

3. REAGENTI

Uvodne opombe

Za pripravo reagentov in raztopin za analizo uporabimo vodo brez kationov, ki jih je treba določiti, ki jo pripravimo z dvojnim destiliranjem vode v destilatorju iz borosilikatnega ali kremenovega stekla ali z dvojno ionsko izmenjavo.

Reagenti morajo biti najmanj analitske čistoče (p.a.). Odsotnost elementa, ki ga določamo, preverjamo s slepim preskusom. Po potrebi moramo reagente dodatno prečistiti.

Namesto spodaj opisanih običajnih raztopin lahko uporabimo komercialne standardne raztopine, če so zajamčene in so bile pred uporabo preverjene.

3.1 Klorovodikova kislina p.a. (d: 1,19).

3.2 Klorovodikova kislina p.a. (6 N).

3.3 Klorovodikova kislina p.a. (0,5 N).

3.4 38 do 40-odstotna (v/v) klorovodikova kislina z vsebnostjo železa manj kot 1 mg Fe/liter in z manj kot 10 mg (v obliki sulfata)/liter ostanka po izparevanju.

3.5 Žveplova (VI) kislina p.a. (d: 1,84).

3.6 Vodikov peroksid p.a. (približno 100 volumnov kisika (30 % po masi)).

3.7 Standardna raztopina železa (1 000 μg Fe/ml), pripravljena: v 200 ml 6 N klorovodikove kisline (3.2) raztopimo 1 g železne žice p.a., dodamo 16 ml vodikovega peroksida (3.6) in dopolnimo z vodo do litra. 3.7.1 Standardna delovna raztopina železa (100 μg Fe/ml), pripravljena tako, da razredčimo standardno raztopino (3.7) z vodo 1 + 9.

3.8 Standardna raztopina bakra (1 000 μg Cu/ml), pripravljena: v 25 ml 6 N klorovodikove kisline (3.2) raztopimo 1 g bakra v prahu (p.a.), dodamo 5 ml vodikovega peroksida (3.6) in dopolnimo z vodo do litra. 3.8.1 Standardna delovna raztopina bakra (10 μg Cu/ml), pripravljena tako, da razredčimo standardno raztopino (3,8) z vodo 1 + 9, nato pa to raztopino ponovno razredčimo z vodo 1 + 9.

3.9 Standardna raztopina mangana (1 000 μg Mn/ml), pripravljena: v 25 ml 6 N klorovodikove kisline (3.2) raztopimo 1 g mangana v prahu (p.a.) in dopolnimo z vodo do litra. 3.9.1 Standardna delovna raztopina mangana (10 μg Mn/ml), pripravljena tako, da razredčimo standardno raztopino (3,9) z vodo 1 + 9, nato pa to raztopino ponovno razredčimo z vodo 1 + 9.

3.10 Standardna raztopina cinka (1 000 μg Zn/ml), pripravljena: v 25 ml 6 N klorovodikove kisline (3.2) raztopimo 1 g cinka v foliji ali granulah (p.a.) in dopolnimo z vodo do litra. 3.10.1 Standardna delovna raztopina cinka (10 μg Zn/ml), pripravljena tako, da razredčimo standardno raztopino (3.10) z vodo 1 + 9, nato pa to raztopino ponovno razredčimo z vodo 1 + 9.

3.11 Raztopina lantanovega klorida, pripravljena: v 150 ml vode raztopimo 12 g lantanovega klorida, dodamo 100 ml 6 N klorovodikove kisline (3.2) in dopolnimo z vodo do litra.

4. OPREMA

4.1 Žarilna peč z regulacijo temperature in rekorderjem.

4.2 Stekleni deli morajo biti iz odpornega borosilikata in priporočljivo je, da uporabljamo opremo, ki je namenjena izključno določanju elementov v sledovih.

4.3 Žarilni lonček iz platine in (možno) iz kvarca.

4.4 Atomski absorpcijski spektrofotometer, ki ustreza zahtevam metode glede občutljivosti in natančnost zahtevanega območja.

5. POSTOPEK

5.1 Vzorci, ki vsebujejo organske snovi

5.1.1 Upepeljevanje in priprava raztopine za analizo ( 16 )

(i) Natehtamo 5 do 10 g vzorca s točnostjo 0,2 mg in ga prenesemo v žarilni lonček iz kvarca ali platine (4.3) (glej opombo (b)), osušimo v sušilniku pri 105 °C in ga nato postavimo v hladno žarilno peč (4.1). Peč zapremo (glej opombo (c)) in približno 90 minut postopoma višamo temperaturo na 450 do 475 °C. To temperaturo ohranjamo 4 do 16 ur (npr. čez noč), da odstranimo zoglenele snovi, nato pa peč odpremo in ohladimo (glej opombo (d)). Lonček izperemo s skupno okoli 5 ml klorovodikove kisline (3.1) in to počasi in previdno prelijemo v čašo (lahko pride do burne reakcije zaradi nastanka CO2). Po kapljicah dodajamo klorovodikovo kislino (3.1) in mešamo, dokler penjenje ne poneha. Izparevamo do suhega in pri tem občasno premešamo s stekleno palčko. Nato dodamo preostanku 15 ml 6 N klorovodikove kisline (3.2) in nato približno 120 ml vode. Premešamo s stekleno palčko, ki jo pustimo v čaši, čašo pa pokrijemo z urnim steklom. Počasi segrejemo do vrenja in pustimo vreti do popolnega raztapljanja pepela. Filtriramo skozi filter, ki ne vsebuje pepela, v 250-mililitrsko merilno bučko. Čašo in filter speremo s 5 ml vroče 6 N klorovodikove kisline (3.2) in dvakrat z vrelo vodo. Merilno bučko napolnimo z vodo do oznake (koncentracija HCl okoli 0,5 N).

(ii) Če je preostanek na filtru videti črn (ogljik), ga ponovno postavimo v peč in ponovno upepelimo pri 450 do 475 °C. Ta upepelitev, ki zahteva le nekaj ur (okoli tri do pet ur), je dokončana, ko je pepel videti bel ali skoraj bel. Preostanek raztopimo v 2 ml klorovodikove kisline (3.1), izparimo do suhega in dodamo 5 ml 6 N klorovodikove kisline (3.2). Segrejemo, filtriramo raztopino v merilno bučko in dopolnimo z vodo do oznake (koncentracija HCl okoli 0,5 N).

Opombe:

(a) Pri določanju elementov v sledovih je pomembno, da smo pozorni na nevarnost kontaminacije, predvsem s cinkom, bakrom in železom. Zato oprema, ki se uporablja pri pripravi vzorcev, ne sme vsebovati teh kovin. Da bi zmanjšali splošno tveganje kontaminacije, delamo v brezprašnem prostoru s čisto opremo in dobro oprano stekleno posodo. Določanje cinka je posebej občutljivo na več vrst kontaminacije, npr. s stekleno posodo, reagenti, prahom, itd.

(b) Maso vzorca, ki ga bomo upepelili, izračunamo iz približne vsebnosti elementov v sledovih v krmi glede na občutljivost uporabljenega spektrofotometra. Pri nekateri krmi, ki vsebujejo malo prvin v sledovih, bi lahko začeli z vzorcem, težkim 10 do 20 g in razredčenjem končne raztopine le do 100 ml.

(c) Upepeljevanje izvajamo v zaprti peči brez dovajanja zraka ali kisika.

(d) Temperatura na pirometru ne sme preseči 475 °C.

5.1.2 Določanje s spektrofotometrijo

5.1.2.1 Priprava raztopin za umeritev Za vsakega izmed elementov, ki ga bomo določali, pripravimo iz standardnih delovnih raztopin, navedenih v točkah 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 in 3.10.1, serijo raztopin za umeritev, od katerih ima vsaka koncentracijo HCl okoli 0,5 N in (pri železu, manganu in cinku) koncentracijo lantanovega klorida, ki ustreza 0,1 % La (m/v). Izbrane koncentracije elementov v sledovih se morajo nahajati v območju občutljivosti uporabljenega spektrofotometra. V tabelah spodaj so kot primer navedene sestave tipičnih območij raztopin za umeritev, odvisnih od vrste in občutljivosti spektrofotometra, ki ga uporabljamo, zato bo morda treba izbrati drugačne koncentracije.



Železo μg Fe/ml 0 0,5 1 2 3 4 5 ml standardne delovne raztopine (3.7.1) (1 ml = 100 μg Fe) 0 0,5 1 2 3 4 5 + ml 6 N HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7 + 10 ml raztopine lantanovega klorida (3.11) in do 100 ml dopolnimo z vodo.



Baker μg Cu/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 ml delovne standardne raztopine (3.8.1) (1 ml = 10 μg Cu) 0 1 2 4 6 8 10 + ml 6 N HCl (3.2) 8 8 8 8 8 8 8 Do 100 ml dopolnimo z vodo.



Mangan μg Mn/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 ml delovne standardne raztopine (3.9.1) (1 ml = 10 μg Mn) 0 1 2 4 6 8 10 + ml 6 N HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7 + 10 ml raztopine lantanovega klorida (3.11) in do 100 ml dopolnimo z vodo.



Cink μg Zn/ml 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 ml delovne standardne raztopine (3.10.1) (1 ml = 10 μg Zn) 0 0,5 1 2 4 6 8 + ml 6 N HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7 + 10 ml raztopine lantanovega klorida (3.11) in do 100 ml dopolnimo z vodo.

5.1.2.2 Priprava raztopine za analizo Za določanje bakra se lahko raztopina, pripravljena po točki 5.1.1, običajno uporabi direktno. Če je treba koncentracijo prilagoditi območju umeritve, odpipetiramo ustrezen alikvot v 100- mililitrsko merilno bučko in jo dopolnimo do oznake z 0,5 N klorovodikovo kislino (3.3). Za določanje železa, mangana in cinka odpipetiramo ustrezen alikvot raztopine, pripravljene po točki 5.1.1, v 100-mililitrsko merilno bučko, dodamo 10 ml raztopine lantanovega klorida (3.11) in do oznake dopolnimo z 0,5 N klorovodikovo kislino (3.3) (glej tudi točko 8 „Opomba“).

5.1.2.3 Slepi preskus Slepi preskus vključuje vse predpisane korake postopka, le da izpustimo vzorec. Umeritvena raztopina „0“ se ne sme uporabljati kot slepa.

5.1.2.4 Merjenje atomske absorpcije Atomsko absorpcijo umeritvenih raztopin in raztopine, ki jo bomo analizirali, izmerimo z uporabo oksidnega plamena zrak-acetilen pri naslednjih valovnih dolžinah: Fe: 248,3 nm Cu: 324,8 nm Mn: 279,5 nm Zn: 213,8 nm Vsako merjenje izvedemo štirikrat.

5.2 Mineralna krma

Če vzorec ne vsebuje organskih snovi, je predhodno upepeljevanje nepotrebno. Nadaljujemo drugi odstavek točke 5.1.1 pod (i). Izparevanje s klorovodikovo kislino lahko izpustimo.

6. IZRAČUN REZULTATOV

Iz umeritvene krivulje izračunamo koncentracije elementov v sledovih v analizirani raztopini in izrazimo rezultat v miligramih elementov v sledovih na kilogram vzorca (ppm).

7. PONOVLJIVOST

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določevanj, ki jih na istem vzorcu izvaja isti analitik, ne sme presegati:

— 5 mg/kg, v absolutni vrednosti, za vsebnosti elementov v sledovih do 50 mg/kg;

— 10 % od višjega rezultata za vsebnosti elementov v sledovih od 50 do 100 mg/kg;

— 10 mg/kg, v absolutni vrednosti, za vsebnosti elementov v sledovih od 100 do 200 mg/kg;

— 5 % od višjega rezultata za vsebnosti elementov v sledovih nad 200 mg/kg.

8. OPOMBA

Prisotnost večjih količin fosfatov lahko vpliva na določitev železa, mangana in cinka. Tako interferenco moramo korigirati z dodatkom raztopine lantanovega klorida (3.11). Če pa je razmerje mase v vzorcu

· 2, lahko opustimo dodatek raztopine lantanovega klorida (3.11) raztopinam za analizo in umeritev.