1991R2568 — SL — 04.08.2016 — 029.001

To besedilo je zgolj informativne narave in nima pravnega učinka. Institucije Unije za njegovo vsebino ne prevzemajo nobene odgovornosti. Verodostojne različice zadevnih aktov, vključno z uvodnimi izjavami, so objavljene v Uradnem listu Evropske unije. Na voljo so na portalu EUR-Lex. Uradna besedila so neposredno dostopna prek povezav v tem dokumentu

spremenjena z:





popravljena z:







(*) Ta akt ni bil nikoli objavljen v slovenščini.









▼B

UREDBA KOMISIJE (EGS) št. 2568/91

z dne 11. julija 1991

o značilnostih oljčnega olja in olja iz oljčnih tropin ter o ustreznih analiznih metodah







▼M20

Člen 1

1. Olja, katerih značilnosti so skladne z značilnostmi iz točk 1 in 2 Priloge I k tej uredbi, se štejejo za deviška oljčna olja v smislu točke 1(a) in (b) Priloge k Uredbi št. 136/66/EGS.

2. Olje, katerega značilnosti so skladne z značilnostmi iz točke 3 Priloge I k tej uredbi, se šteje za lampante oljčno olje v smislu točke 1(c) Priloge k Uredbi št. 136/66/EGS.

3. Olje, katerega značilnosti so skladne z značilnostmi iz točke 4 Priloge I k tej uredbi, se šteje za rafinirano oljčno olje v smislu točke 2 Priloge k Uredbi št. 136/66/EGS.

4. Olje, katerega značilnosti so skladne z značilnostmi iz točke 5 Priloge I k tej uredbi, se šteje za oljčno olje, sestavljeno iz rafiniranih oljčnih olj in deviških oljčnih olj v smislu točke 3 Priloge k Uredbi št. 136/66/EGS.

5. Olje, katerega značilnosti so skladne z značilnostmi iz točke 6 Priloge I k tej uredbi, se šteje za surovo olje iz oljčnih tropin v smislu točke 4 Priloge k Uredbi št. 136/66/EGS.

6. Olje, katerega značilnosti so skladne z značilnostmi iz točke 7 Priloge I k tej uredbi, se šteje za rafinirano olje iz oljčnih tropin v smislu točke 5 Priloge k Uredbi št. 136/66/EGS.

7. Olje, katerega značilnosti so skladne z značilnostmi iz točke 8 Priloge I k tej uredbi, se šteje za olje iz oljčnih tropin v smislu točke 6 Priloge k Uredbi št. 136/66/EGS.

▼M26

Člen 2

1. Značilnosti olj, določenih v Prilogi I, se določijo v skladu z naslednjimi analiznimi metodami:

(a) za določanje prostih maščobnih kislin, izraženih v deležu oleinske kisline, metoda, določena v Prilogi II;

(b) za določanje peroksidnega števila, metoda, določena v Prilogi III;

(c) za določanje vsebnosti voskov, metoda, določena v Prilogi IV;

(d) za določanje sestave in vsebnosti sterolov in triterpenskih dialkoholov s kapilarno plinsko kromatografijo, metoda, določena v Prilogi V;

(e) za določanje deleža 2-gliceril monopalmitata, metoda, določena v Prilogi VII;

(f) za spektrofotometrično analizo, metoda, določena v Prilogi IX;

▼M28

(g) za določanje sestave maščobnih kislin, metoda, določena v Prilogi X;

▼M26

(h) za določanje hlapnih halogeniranih topil, metoda, določena v Prilogi XI;

(i) za določanje organoleptičnih značilnosti deviškega oljčnega olja, metoda, določena v Prilogi XII;

(j) za določanje stigmastadienov, metoda, določena v Prilogi XVII;

(k) za določanje vsebnosti trigliceridov z ECN42, metoda, določena v Prilogi XVIII;

▼M28

(l) za določanje vsebnosti alifatskih in triterpenskih alkoholov, metoda, določena v Prilogi XIX;

▼M26

(m) za določanje vsebnosti voskov, metilnih estrov maščobnih kislin in etilnih estrov maščobnih kislin, metoda, določena v Prilogi XX.

▼M28 —————

▼M26

2. Preverjanje organoleptičnih značilnosti deviških olj izvajajo nacionalni organi ali njihovi zastopniki v okviru ocenjevalnih komisij, ki jih odobrijo države članice.

Organoleptične značilnosti olja, kot so navedene v prvem pododstavku, se štejejo za skladne z deklarirano kategorijo, če ocenjevalna komisija, ki jo odobri država članica, potrdi razvrstitev.

Če ocenjevalna komisija ne potrdi deklarirane kategorije v zvezi z organoleptičnimi značilnostmi, nacionalni organi ali njihovi zastopniki na zahtevo zainteresirane strani nemudoma opravijo dve ponovljeni oceni, pri čemer ju izvedejo druge odobrene ocenjevalne komisije, vsaj eno oceno pa opravi ocenjevalna komisija, ki jo odobri zadevna država članica proizvajalka. Zadevne značilnosti se štejejo za skladne z deklariranimi značilnostmi, če vsaj dve ponovljeni oceni potrdita deklarirano razvrstitev. V nasprotnem primeru stroške ponovljenih ocen krije zainteresirana stran.

3. Ko nacionalni organi ali njihovi zastopniki preverijo značilnosti olja, kot je določeno v odstavku 1, se vzamejo vzorci v skladu z mednarodnima standardoma EN ISO 661 za pripravo preskusnih vzorcev in EN ISO 5555 za vzorčenje. Vendar pa se ne glede na točko 6.8 standarda EN ISO 5555 v primeru serij takih olj v izvirnem pakiranju vzorec vzame v skladu s Prilogo Ia k tej uredbi. V primeru nepakiranih olj, ki jih ni mogoče vzorčiti v skladu s standardom EN ISO 5555, se vzorčenje opravi v skladu z navodili pristojnega organa države članice.

Brez poseganja v standard EN ISO 5555 in poglavje 6 standarda EN ISO 661 se vzeti vzorci nemudoma spravijo v temen prostor, v katerem temperatura ni previsoka, in pošljejo v laboratorij za analizo najpozneje v petih delovnih dneh po tem, ko so bili vzeti, pri čemer se hranijo tako, da med prevozom ali hrambo ne propadejo ali se poškodujejo, preden se pošljejo v laboratorij.

4. Za preverjanje iz odstavka 3 se v primeru pakiranih proizvodov analize, navedene v prilogah II, III, IX, XII in XX, ter, kjer je primerno, vse ponovljene analize, ki jih zahteva nacionalna zakonodaja, izvedejo pred iztekom minimalnega roka trajanja. V primeru vzorčenja nepakiranih olj se navedene analize izvedejo najpozneje šest mesecev po mesecu, v katerem je bil vzorec vzet.

Za druge analize iz te uredbe ne veljajo nobeni roki.

Če se rezultati analiz ne ujemajo z značilnostmi deklarirane kategorije oljčnega olja ali olja iz oljčnih tropin, se zadevna stran o tem uradno obvesti najpozneje en mesec pred koncem obdobja iz prvega pododstavka, razen če je bil vzorec vzet manj kot dva meseca pred minimalnim rokom trajanja.

5. Za ugotavljanje značilnosti oljčnih olj z metodami, določenimi v prvem pododstavku odstavka 1, se rezultati analize neposredno primerjajo z mejnimi vrednostmi iz te uredbe.

▼M25

Člen 2a

1. Za namene tega člena „oljčno olje, dano na trg“ pomeni skupno količino oljčnega olja in olja iz oljčnih tropin posamezne države članice, ki se porabi v navedeni državi članici ali se iz nje izvozi.

2. Države članice zagotovijo, da se na podlagi analize tveganja selektivno in dovolj pogosto opravijo preverjanja skladnosti, in tako zagotovijo, da je oljčno olje, dano na trg, skladno z deklarirano kategorijo.

3. Merila za ocenjevanje tveganja lahko vključujejo:

(a) kategorijo olja, čas proizvodnje, ceno olja v primerjavi z drugimi rastlinskimi olji, mešanje in pakiranje, skladiščne prostore in razmere, državo porekla, namembno državo, prevozno sredstvo ali količino serije;

(b) položaj izvajalcev v tržni verigi, količino in/ali vrednost, ki jo tržijo, razpon kategorij olja, ki jih tržijo, vrsto dejavnosti, ki se izvajajo, kot so mletje, skladiščenje, rafiniranje, mešanje, pakiranje ali prodaja na drobno;

(c) ugotovitve iz prejšnjih pregledov, vključno s številom in vrsto ugotovljenih pomanjkljivosti, običajno kakovost olja, danega na trg, učinkovitost uporabljene tehnične opreme;

(d) zanesljivost sistemov izvajalcev za zagotavljanje kakovosti ali samonadzor v zvezi s skladnostjo s tržnimi standardi;

(e) mesto, kjer se opravi preverjanje, zlasti, če je to mesto prvega vstopa v Unijo, mesto zadnjega izstopa iz Unije, ali mesto, kjer se olje proizvaja, pakira, natovarja ali prodaja končnemu potrošniku;

(f) kakršne koli informacije, ki bi lahko nakazovale tveganje za neskladnost.

4. Države članice vnaprej določijo:

(a) merila za ocenjevanje tveganja za neskladnost serij;

(b) na podlagi analize tveganja za vsako kategorijo tveganja najmanjše število izvajalcev ali serij in/ali količin, pri katerih se preverja skladnost.

Vsako leto je treba izvesti vsaj eno preverjanje skladnosti na tisoč ton oljčnega olja, danega na trg v državi članici.

5. Države članice preverjajo skladnost:

(a) z izvedbo analiz, po katerem koli vrstnem redu, iz Priloge I, ali

(b) z upoštevanjem vrstnega reda iz Priloge Ib o drevesu odločanja, dokler se ne sprejme ena od odločitev iz drevesa odločanja.

▼M19 —————

▼M25

Člen 3

Kadar se ugotovi, da olje ne ustreza opisu svoje kategorije, mora zadevna država članica, brez poseganja v kakršne koli druge kazni, uporabiti učinkovite, sorazmerne in odvračilne kazni, ki se določijo glede na resnost odkrite nepravilnosti.

Če se pri pregledih odkrijejo večje nepravilnosti, države članice opravljajo pogostejše preglede v zvezi s fazo trženja, kategorijo olja, poreklom ali drugimi merili.

▼M5

Člen 4

▼M19

1. The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

— the requirements of Annex XII.4 are met,

— the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

— continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2. Če države članice naletijo na težave pri ustanavljanju skupin ocenjevalcev na svojem ozemlju, se lahko obrnejo na skupino ocenjevalcev, potrjeno v drugi državi članici.

3. Vsaka država članica sestavi seznam skupin ocenjevalcev, ki so jih ustanovile strokovne ali medpanožne organizacije v skladu s pogoji, določenimi v odstavku 1, in zagotovi, da so ti pogoji izpolnjeni.

▼M19 —————

▼B

Člen 6

1. Vsebnost olja v oljni pogači in drugi ostanki, ki nastanejo pri pridobivanju oljčnega olja (oznaki KN 2306 90 11 in 2306 90 19 ) se določijo z uporabo metode, predpisane v Prilogi XV.

2. Vsebnost olja, navedenega v odstavku 1, je izražena v masnem odstotnem deležu olja na maso suhe snovi.

▼M20

Člen 7

Uporabljajo se določbe Skupnosti o prisotnosti onesnaževalcev.

Kar zadeva halogenirana topila so mejne vrednosti za vse kategorije oljčnih olj naslednje:

— največji delež vsakega zaznanega halogeniranega topila: 0,1 mg/kg,

— največji skupni delež zaznanih halogeniranih topil: 0,2 mg/kg.

▼M25

Člen 7a

Fizične ali pravne osebe in skupine oseb, ki imajo v lasti oljčno olje in olje iz oljčnih tropin od faze pridobivanja olja v oljarni do ustekleničenja, v kakršne koli poslovne ali komercialne namene, morajo za vsako kategorijo teh olj voditi evidence dobav in izdanih količin.

Države članice zagotovijo, da je obveznost iz prvega odstavka ustrezno izpolnjena.

▼M25

Člen 8

1. Države članice morajo obvestiti Komisijo o ukrepih, sprejetih za izvajanje te uredbe. Komisijo obvestijo o kakršnih koli naknadnih spremembah.

2. Države članice Komisiji vsako leto najpozneje 31. maja predložijo poročilo o izvajanju te uredbe v preteklem koledarskem letu. Poročilo vsebuje vsaj rezultate opravljenih preverjanj skladnosti oljčnega olja v skladu s predlogami iz Priloge XXI.

3. Obvestila iz te uredbe se predložijo v skladu z Uredbo Komisije (ES) št. 792/2009 ( 1 ).

▼B

Člen 9

Uredba (EGS) št. 1058/77 se s tem razveljavi.

Člen 10

1. Ta uredba začne veljati tretji dan po objavi v Uradnem listu Evropskih skupnosti.

Vendar se metoda, predpisana v Prilogi XII, uporablja od ►M1 1. november 1992 ◄ , razen če ne zadeva postopka sistema intervencij.

▼M5

Ta metoda se ne uporablja za deviško olje, ki je bilo pripravljeno za trg pred 1. novembrom 1992.

▼B

2. Ta uredba se ne uporablja za oljčno olje in oljčne tropine, predpakirane pred začetkom veljavnosti te uredbe in so v prometu do 31. oktobra 1992.

Ta uredba je v celoti zavezujoča in se neposredno uporablja v vseh državah članicah.









PRILOGE

Vsebina







Priloga I: Značilnosti oljčnega olja Priloga IA: Vzorčenje oljčnega olja ali olja iz oljčnih tropin, dostavljenega v izvirnem pakiranju Priloga IB: Drevo odločanja za preverjanje, ali je vzorec oljčnega olja skladen z deklarirano kategorijo Priloga II: Določanje prostih maščobnih kislin, metoda v hladnem Priloga III: Določanje peroksidnega števila Priloga IV: Določevanje vsebnosti voskov s kapilarno plinsko kromatografijo Priloga V: Določanje sestave in vsebnosti sterolov in triterpenskih dialkoholov s kapilarno plinsko kromatografijo Priloga VII: ►M21 Določevanje odstotnega deleža 2-gliceril monopalmitata ◄ ▼M20 ————— ▼B Priloga IX: Spektrofotometrično merjenje na UV-območju ▼M28 Priloga X: Določanje metilnih estrov maščobnih kislin s plinsko kromatografijo ▼B Priloga XI: Določanje hlapnih halogeniranih topil v oljčnem olju Priloga XII: Metoda mednarodnega sveta za oljke za organoleptično ocenjevanje deviškega oljčnega olja ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B Priloga XV: Vsebnost olja v oljčnih tropinah Priloga XVI: Določanje jodnega števila Priloga XVII: Metoda za določanje stigmastadienov v rastlinskih oljih Priloga XVIII: Določanje razlike med dejansko in teoretično vsebnostjo triacilglicerolov z ekvivalentnim ogljikovim številom (ECN) 42 Priloga XIX: ►M28 Določanje vsebnosti alifatskih in triterpenskih alkoholov s kapilarno plinsko kromatografijo ◄ ▼M23 Priloga XX: Metoda za določanje vsebnosti voskov, metilnih estrov maščobnih kislin in etilnih estrov maščobnih kislin s kapilarno plinsko kromatografijo ▼M28 ————— ▼M25 Priloga XXI: Rezultati preverjanj skladnosti oljčnega olja iz člena 8(2)

▼M27









PRILOGA I

ZNAČILNOSTI OLJČNEGA OLJA







Kategorija Etilni estri maščobnih kislin (FAEE) (*) Vsebnost kislin (%) (*) Peroksidno število mEq O2/kg (*) Voski mg/kg (**) 2-gliceril monopalmitat (%) Stigmastadieni mg/kg (1) Razlika: ECN42 (HPLC) in ECN42 (teoretični izračun) K232 (*) K268 ali K270 (*) Delta-K (*) Organoleptična ocena Mediana napake (Md) (*) Organoleptična ocena Mediana sadežnosti (Mf) (*) 1. Ekstra deviško oljčno olje FAEE ≤ 40 mg/kg (leto pridelave 2013–2014) (2) FAEE ≤ 35 mg/kg (leto pridelave 2014–2016) FAEE ≤ 30 mg/kg (leta pridelave po letu 2016) ≤ 0,8 ≤ 20 C42 + C44 + C46 ≤ 150 ≤ 0,9, če je skupni % palmitinske kisline ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 1,0, če je skupni % palmitinske kisline > 14 % 2. Deviško oljčno olje — ≤ 2,0 ≤ 20 C42 + C44 + C46 ≤ 150 ≤ 0,9, če je skupni % palmitinske kisline ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 ≤ 1,0, če je skupni % palmitinske kisline > 14 % 3. Lampante oljčno olje — > 2,0 — C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (3) ≤ 0,9, če je skupni % palmitinske kisline ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ |0,3| — — — Md > 3,5 (4) — ≤ 1,1, če je skupni % palmitinske kisline > 14 % 4. Rafinirano oljčno olje — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 ≤ 0,9, če je skupni % palmitinske kisline ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1, če je skupni % palmitinske kisline > 14 % 5. Oljčno olje – mešanica rafiniranega oljčnega olja in deviškega oljčnega olja — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 ≤ 0,9, če je skupni % palmitinske kisline ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0, če je skupni % palmitinske kisline > 14 % 6. Surovo olje iz oljčnih tropin — — — C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (5) ≤ 1,4 — ≤ |0,6| — — — — — 7. Rafinirano olje iz oljčnih tropin — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 ≤ 1,4 — ≤ |0,5| — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Olje iz oljčnih tropin — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 ≤ 1,2 — ≤ |0,5| — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) Vsota izomerov, ki jih je mogoče (ali ne) ločiti s kapilarno kolono. (2) Mejna vrednost se nanaša na oljčna olja, proizvedena od 1. marca 2014. (3) Olja z vsebnostjo voskov med 300 mg/kg in 350 mg/kg se uvrščajo med lampante oljčna olja, če je skupna vsebnost alifatskih alkoholov nižja ali enaka 350 mg/kg ali če je vsebnost eritrodiola in uvaola nižja ali enaka 3,5 %. (4) Mediana napake je lahko manjša ali enaka 3,5, mediana sadežnosti pa je lahko 0. (5) Olja z vsebnostjo voskov med 300 mg/kg in 350 mg/kg se uvrščajo med surova olja iz oljčnih tropin, če je skupna vsebnost alifatskih alkoholov višja od 350 mg/kg ter če je vsebnost eritrodiola in uvaola višja od 3,5 %.







Kategorija Sestava maščobnih kislin (1) Vsota transizomerov oleinske kisline (%) Vsota transizomerov linolne in linolenske kisline (%) Sestava sterolov Steroli skupaj (mg/kg) Eritrodiol in uvaol (%) (**) Miristinska (%) Linolenska (%) Arahidonska (%) Eikozanojska (%) Behenska (%) Lignocerinska (%) Holesterol (%) Brasikasterol (%) Kampesterol (2) (%) Stigmasterol (%) App betasitosterol (3) (%) (**) Delta-7- stigmastenol (2) (%) 1. Ekstra deviško oljčno olje ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Deviško oljčno olje ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Lampante oljčno olje ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (4) 4. Rafinirano oljčno olje ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Oljčno olje – mešanica rafiniranega oljčnega olja in deviškega oljčnega olja ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Surovo olje iz oljčnih tropin ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (5) 7. Rafinirano olje iz oljčnih tropin ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Olje iz oljčnih tropin ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 (1) Vsebnost drugih maščobnih kislin (%): palmitinske: 7,50–20,00; palmitoleinske: 0,30–3,50; heptadekanojske: ≤ 0,30; heptadecenojske: ≤ 0,30; stearinske: 0,50–5,00; oleinske: 55,00–83,00; linolne: 2,50–21,00. (2) Glej Dodatek k tej prilogi. (3) App betasitosterol: delta-5,23-stigmastadienol + klerosterol + beta-sitosterol + sitostanol + delta-5-avenasterol + delta-5,24-stigmastadienol. (4) Olja z vsebnostjo voskov med 300 mg/kg in 350 mg/kg se uvrščajo med lampante oljčna olja, če je skupna vsebnost alifatskih alkoholov nižja ali enaka 350 mg/kg ali če je vsebnost eritrodiola in uvaola nižja ali enaka 3,5 %. (5) Olja z vsebnostjo voskov med 300 mg/kg in 350 mg/kg se uvrščajo med surova olja iz oljčnih tropin, če je skupna vsebnost alifatskih alkoholov višja od 350 mg/kg ali če je vsebnost eritrodiola in uvaola višja od 3,5 %.

Opombe:

(a) Rezultate analiz je treba navesti na enako število decimalnih mest natančno, kot je določeno za posamezno značilnost. Zadnjo števko v številki je treba povečati za ena, če je naslednja števka večja od 4.

(b) Če samo ena značilnost ni v skladu z navedenimi vrednostmi, se lahko olje razvrsti v drugo kategorijo ali se označi kot neustrezno glede čistosti za namene te uredbe.

(c) Značilnosti, ki so označene z zvezdico (*) in se nanašajo na kakovost olja, pomenijo: – da sta za lampante oljčno olje lahko ustrezni mejni vrednosti hkrati različni od navedenih vrednosti; – da je za deviška oljčna olja neupoštevanje samo ene od mejnih vrednosti vzrok za spremembo kategorije, vendar olje ostane razvrščeno v eno od kategorij deviških oljčnih olj.

(d) Značilnosti, označene z dvema zvezdicama (**), pomenijo, da sta za vse vrste olja iz oljčnih tropin lahko obe ustrezni mejni vrednosti hkrati različni od navedenih vrednosti.









Dodatek

DREVO ODLOČANJA

Drevo odločanja za vsebnost kampesterola v deviških in ekstra deviških oljčnih oljih:

Drugi parametri so skladni z mejnimi vrednostmi, določenimi v tej uredbi.

Drevo odločanja za vsebnost delta-7-stigmastenola v:

— ekstra deviških in deviških oljčnih oljih —

Drugi parametri so skladni z mejnimi vrednostmi, določenimi v tej uredbi.

— oljih iz oljčnih tropin (surovih in rafiniranih) —

▼M26









PRILOGA Ia

VZORČENJE OLJČNEGA OLJA ALI OLJA IZ OLJČNIH TROPIN, DOSTAVLJENEGA V IZVIRNEM PAKIRANJU

Ta metoda vzorčenja se uporablja za serije oljčnega olja ali olja iz oljčnih tropin v izvirnem pakiranju. Uporabljajo se različne metode vzorčenja, odvisno od tega, ali izvirno pakiranje presega 5 litrov ali ne.

„Serija“ pomeni skupek prodajnih enot, ki se proizvajajo, izdelujejo in pakirajo v takih okoliščinah, da se olje, ki ga vsebuje vsaka prodajna enota, šteje za homogeno v smislu vseh analitičnih značilnosti. Posamezne serije se določijo v skladu z Direktivo 2011/91/EU Evropskega parlamenta in Sveta ( 2 )

„Posamični vzorec“ pomeni količino olja v izvirnem pakiranju, ki je vzeta iz naključnega dela serije.

1. VSEBINA PRIMARNEGA VZORCA

1.1 Izvirno pakiranje, ki ne presega 5 litrov

„Primarni vzorec“ za izvirno pakiranje, ki ne presega 5 litrov, pomeni število posamičnih vzorcev, vzetih iz serije, v skladu s tabelo 1.







Tabela 1 Najmanjši primarni vzorec mora vsebovati naslednje Če je prostornina izvirnega pakiranja Primarni vzorec mora zajemati olje iz (a) 1 liter ali več (a) 1 izvirnega pakiranja (b) manj kot 1 liter (b) najmanjšega števila pakiranj s skupno prostornino vsaj 1,0 litra

Število pakiranj iz tabele 1, ki predstavljajo primarni vzorec, lahko vsaka država članica po lastnih potrebah poveča (na primer zaradi organoleptičnega ocenjevanja v drugem laboratoriju, kot je tisti, ki je izvedel kemijske analize, ponovljeno analizo itd.).

1.2 Izvirno pakiranje, ki presega 5 litrov

„Primarni vzorec“ za izvirno pakiranje, ki presega 5 litrov, pomeni reprezentativen del vseh posamičnih vzorcev, pridobljen z zmanjšanjem, v skladu s tabelo 2. Primarni vzorec mora biti sestavljen iz različnih primerov.

„Primer“ primarnega vzorca pomeni vsako od pakiranj, ki sestavljajo primarni vzorec.







Tabela 2 Najmanjše število posamičnih vzorcev, ki jih je treba izbrati Število pakiranj v seriji Najmanjše število posamičnih vzorcev, ki jih je treba izbrati Do vključno 10 1 Od 11 do 150 2 Od 151 do 500 3 Od 501 do 1 500 4 Od 1 501 do 2 500 5 > 2 500 na 1 000 pakiranj 1 dodaten posamični vzorec

Da bi se zmanjšala prostornina vzorčenih izvirnih pakiranj, se vsebina vzorčenih posamičnih vzorcev homogenizira za pripravo primarnega vzorca. Odmerki različnih posamičnih vzorcev se prelijejo v skupno posodo za homogenizacijo z mešanjem, kar zagotavlja najboljšo zaščito pred zrakom.

Vsebino primarnega vzorca je treba preliti v več pakiranj z najmanjšo prostornino 1,0 litra, pri čemer vsako pakiranje predstavlja primer primarnega vzorca.

Število primarnih vzorcev lahko vsaka država članica po lastnih potrebah poveča (na primer zaradi organoleptičnega ocenjevanja v drugem laboratoriju, kot je tisti, ki je izvedel kemijske analize, ponovljeno analizo itd.).

Vsako pakiranje je treba napolniti tako, da je zračna plast na vrhu čim manjša, nato pa ustrezno zapreti in zatesniti, tako da je proizvod zaščiten pred nedovoljenimi posegi.

Te primere je treba zaradi pravilne identifikacije označiti.

2. ANALIZE IN REZULTATI

2.1 Vsak primarni vzorec je treba razdeliti na laboratorijske vzorce v skladu s točko 2.5 standarda EN ISO 5555 in analizirati po vrstnem redu, kot je prikazan v drevesu odločanja iz Priloge Ib, ali po kakršnem koli drugem naključnem vrstnem redu.

2.2 Če so vsi rezultati analiz v skladu z značilnostmi deklarirane kategorije olja, se celotna serija deklarira kot skladna. Če eden od rezultatov analiz ni v skladu z značilnostmi deklarirane kategorije olja, se celotna serija deklarira kot neskladna.

3. PREVERJANJE KATEGORIJE SERIJE

3.1 Za preverjanje kategorije serije lahko pristojni organ poveča število primarnih vzorcev, vzetih na različnih delih serije, v skladu z naslednjo tabelo:



Tabela 3 Število primarnih vzorcev, določeno na podlagi velikosti serije Velikost serije (v litrih) Število primarnih vzorcev Manj kot 7 500 2 Od 7 500 do manj kot 25 000 3 Od 25 000 do manj kot 75 000 4 Od 75 000 do manj kot 125 000 5 125 000 ali več 6 + 1 na vsakih dodatnih 50 000 litrov Vsak posamični vzorec, ki predstavlja primarni vzorec, je treba vzeti na istem mestu v seriji, pri čemer je treba zabeležiti lokacijo vsakega primarnega vzorca in jo nedvoumno identificirati. Vsak primarni vzorec je treba oblikovati v skladu s postopki iz točk 1.1 in 1.2. Nato se za vsak primarni vzorec izvedejo analize iz člena 2(1).

3.2 Če rezultati analiz iz člena 2(1), izvedeni za vsaj en primarni vzorec, niso v skladu z značilnostmi deklarirane kategorije olja, se celotna vzorčena serija deklarira kot neskladna.









PRILOGA Ib

DREVO ODLOČANJA ZA PREVERJANJE, ALI JE VZOREC OLJČNEGA OLJA SKLADEN Z DEKLARIRANO KATEGORIJO

Tabela 1

Tabela 2

Tabela 3









Dodatek 1







Tabela ekvivalentnosti med prilogami k tej uredbi in analizami iz drevesa odločanja — Vsebnost kislin Priloga II Določanje prostih maščobnih kislin, metoda v hladnem — Peroksidno število Priloga III Določanje peroksidnega števila — UV absorbanca Priloga IX Spektrofotometrična analiza — Organoleptična ocena Priloga XII Organoleptična ocena deviškega oljčnega olja — Etilni estri Priloga XX Metoda za določanje vsebnosti voskov, metilnih estrov maščobnih kislin in etilnih estrov maščobnih kislin s kapilarno plinsko kromatografijo — 3,5-stigmastadieni Priloga XVII Metoda za določanje stigmastadienov v rastlinskih oljih ▼M28 — Trans-izomeri maščobnih kislin Priloga X Določanje metilnih estrov maščobnih kislin s plinsko kromatografijo — Vsebnost maščobnih kislin Priloga X Določanje metilnih estrov maščobnih kislin s plinsko kromatografijo ▼M26 — ΔECN42 Priloga XVIII Določanje sestave trigliceridov z ECN42 (razlika med podatki HPCL in teoretično vsebnostjo) — Sestava sterolov in steroli skupaj — Eritrodiol in uvaol Priloga V Določanje sestave in vsebnosti sterolov in triterpenskih dialkoholov s kapilarno plinsko kromatografijo — Voski Priloga IV Določevanje vsebnosti voskov s kapilarno plinsko kromatografijo ▼M28 — Alifatski in triterpenski alkoholi Priloga XIX Določanje vsebnosti alifatskih in triterpenskih alkoholov s kapilarno plinsko kromatografijo ▼M26 — Nasičene maščobne kisline na položaju 2 Priloga VII Določanje deleža 2-gliceril monopalmitata

▼M29









PRILOGA II

DOLOČANJE PROSTIH MAŠČOBNIH KISLIN, METODA V HLADNEM

1. NAMEN IN PODROČJE UPORABE

Ta metoda opisuje določanje prostih maščobnih kislin v oljčnih oljih in oljih iz oljčnih tropin. Vsebnost prostih maščobnih kislin je izražena kot kislost, izračunana v deležu oleinske kisline.

2. PRINCIP

Vzorec se raztopi v mešanici topil in prisotne proste maščobne kisline se titrirajo z uporabo raztopine kalijevega hidroksida ali natrijevega hidroksida.

3. REAGENTI

Vsi reagenti naj bodo priznane analitske kakovosti in uporabljena voda naj bo destilirana ali enakovredne čistoče.

3.1 Dietilni eter; 95 % etanol (v/v), mešanica enakih volumenskih delov. Natančno v trenutku uporabe nevtraliziramo z raztopino kalijevega hidroksida (3.2) z dodatkom 0,3 ml fenolftaleinove raztopine (3.3) na 100 ml mešanice. Opomba 1: Dietilni eter je zelo vnetljiv in lahko tvori eksplozivne perokside. Pri njegovi uporabi je treba biti posebno pazljiv. Opomba 2: Če ni mogoče uporabiti dietilnega etra, se lahko uporabi mešanica topil, ki vsebujejo etanol in toluen. Če je treba, se etanol lahko nadomesti s 2-propanolom.

3.2 Kalijev hidroksid ali natrijev hidroksid, standardizirana etanolna ali vodna raztopina, približno 0,1 mol/l c(KOH) [ali c(NaOH)], ali če je potrebno, približno 0,5 mol/l c(KOH) [ali c(NaOH)]. Na voljo so raztopine v prodaji. Pred uporabo moramo poznati in preveriti točno koncentracijo raztopine kalijevega hidroksida (ali natrijevega hidroksida). Uporabimo raztopino, ki je bila pripravljena najmanj pet dni pred uporabo in prelita v rjavo steklenico z gumijastim zamaškom. Raztopina mora biti brezbarvna ali barve slame. Če pri uporabi vodne raztopine kalijevega hidroksida (ali natrijevega hidroksida) opazimo fazno ločevanje, nadomestimo vodno raztopino z etanolno raztopino. Opomba 3: Stabilno brezbarvno raztopino kalijevega hidroksida (ali natrijevega hidroksida) lahko pripravimo, kot sledi. Zavremo 1 000 ml etanola ali vode z 8 g kalijevega hidroksida (ali natrijevega hidroksida) in 0,5 g aluminijevih ostružkov in še naprej vremo pod povratnim hladilnikom eno uro. Takoj destiliramo. Raztopimo v destilatu zahtevano količino kalijevega hidroksida (ali natrijevega hidroksida). Pustimo mirovati nekaj dni in z dekantiranjem ločimo bistri supernatant od oborine kalijevega karbonata (ali natrijevega karbonata). Raztopino lahko brez destilacije pripravimo, kot sledi: k 1 000 ml etanola (ali vode) dodamo 4 ml aluminijevega butilata in mešanico pustimo nekaj dni. Dekantiramo tekoči supernatant in raztopimo zahtevano količino kalijevega hidroksida (ali natrijevega hidroksida). Raztopina je pripravljena za uporabo.

3.3 Raztopina 10 g/l fenolftaleina v 95- do 96-odstotnem etanolu (v/v) ali raztopina 20 g/l bazičnega modrila 6B ali timolftaleina v 95- do 96-odstotnem etanolu (v/v). Pri močno obarvanih oljih se uporabljata bazično modrilo ali timolftalein.

4. APARATURA

Običajna laboratorijska oprema, vključno z:

4.1 analizno tehtnico,

4.2 250-mililitrsko erlenmajerico,

4.3 10-mililitrsko bireto razreda A z razdelkom 0,05 ml ali enakovredno avtomatsko bireto.

5. POSTOPEK

5.1 Priprava vzorca

Ko je vzorec moten, ga je treba filtrirati.

5.2 Testni vzorec

Odvisno od predvidene kislosti natehtamo vzorec po naslednji tabeli:







Pričakovana kislost (g oleinske kisline na 100 g) Masa vzorca (g) Točnost tehtanja (g) 0 do 2 10 0,02 > 2 do 7,5 2,5 0,01 > 7,5 0,5 0,001

Vzorec tehtamo v erlenmajerici (4.2).

5.3 Določanje

Raztopimo vzorec (5.2) v 50 do 100 ml predhodno nevtralizirane mešanice dietilnega etra in etanola (3.1).

Med mešanjem titriramo z raztopino 0,1 mol/l kalijevega hidroksida (ali natrijevega hidroksida) (3.2) (glej opombo 4) do preskoka barve indikatorja (barva obarvanega indikatorja je obstojna najmanj 10 sekund).

Opomba 4: Če zahtevana količina 0,1 mol/l kalijevega hidroksida (ali natrijevega hidroksida) preseže 10 ml, uporabimo raztopino 0,5 mol/l ali spremenimo maso vzorca po pričakovani prosti kislosti v navedeni tabeli.

Opomba 5: Če raztopina med titracijo postane motna, dodamo dovolj topil (3.1), da dobimo bistro raztopino.

Vsebnost določamo drugič le, če je prvi rezultat višji od omejitve, navedene za kategorijo olja.

6. IZRAŽANJE REZULTATOV

Kislost kot odstotek oleinske kisline je enaka:

pri čemer:

V = volumen uporabljene standardizirane raztopine kalijevega hidroksida (ali natrijevega hidroksida) v mililitrih;

c = točna koncentracija v molih na liter uporabljene standardizirane raztopine kalijevega hidroksida (ali natrijevega hidroksida);

M = 282 g/mol, molska masa v gramih na mol oleinske kisline;

m = masa vzorca v gramih.

Oleinska kislina se zapiše, kot sledi:

(a) na dve decimalni mesti natančno za vrednosti od 0 do vključno 1;

(b) na eno decimalno mesto natančno za vrednosti od 1 do vključno 100.

▼B









PRILOGA III

DOLOČANJE PEROKSIDNEGA ŠTEVILA

1. NAMEN

Ta standard opisuje metodo za določanje peroksidnega števila olj in masti.

2. PODROČJE UPORABE

Ta standard se uporablja za olja in masti živalskega in rastlinskega izvora.

3. DEFINICIJA POJMOV

Peroksidno število je količina tistih snovi v vzorcu, izražena v miliekvivalentih aktivnega kisika na kilogram, ki oksidira kalijev jodid v opisanih delovnih pogojih.

4. PRINCIP

Reakcija preskusnega deleža vzorca v raztopini ocetne kisline in kloroforma, z raztopino kalijevega jodida. Titracija sproščenega joda s standardizirano raztopino natrijevega tiosulfata.

5. OPREMA

Vsa uporabljena oprema je brez reducirajočih ali oksidirajočih snovi.

Opomba: Brušenih površin ne namažite.

5.1 3-ml steklena ladjica.

5.2 Bučke z obrusom kapacitete približno 250 ml predhodno osušimo z inertnim plinom (dušikom, ali še bolje, z ogljikovim dioksidom).

5.3 25-ml ali 50-ml bireta z razdelkom 0,1 ml.

6. REAGENTI

6.1 Kloroform, analitske čistoče, očiščen kisika s prepihovanjem s čistim, suhim inertnim plinom.

6.2 Ledocet, analitske čistoče, očiščen kisika s prepihovanjem s čistim, suhim inertnim plinom.

6.3 Nasičena vodna raztopina kalijevega jodida, sveže pripravljena, brez joda in jodatov.

6.4 Tik pred uporabo točno standardizirana 0,01 ali 0,002 mol/L vodna raztopina natrijevega tiosulfata.

6.5 Škrobovica, 10g/l vodna suspenzija, sveže pripravljena iz naravnega topnega škroba.

7. VZOREC

Pazimo, da vzorec jemljemo in skladiščimo v temnem, hranimo na hladnem v popolnoma zaprtih steklenih posodah. Posode so hermetično zatesnjene z zamaški z obrusom ali iz plute.

8. POSTOPEK

Preskus se izvede pri difuzni dnevni svetlobi ali pri umetni svetlobi. V skladu s pričakovanim peroksidnim številom, natehtamo na stekleni ladjici (5.1) ali,če vam to ne uspe, v bučki (5.2) s točnostjo 1 mg.







Pričakovano peroksidno število (mekv) Masa vzorca (g) 0 do 12 5,0 do 2,0 12 do 20 2,0 do 1,2 20 do 30 1,2 do 0,8 30 do 50 0,8 do 0,5 50 do 90 0,5 do 0,3

V bučko prenesemo stekleno ladjico z vzorcem. Dodamo 10 ml kloroforma (6.1). Vzorec hitro raztopimo z mešanjem. Dodamo 15 ml ocetne kisline (6.2), nato 1 ml raztopine kalijevega jodida (6.3). Hitro zamašimo z zamaškom, stresamo eno minuto in pustimo točno pet minut, v temnem prostoru na temperaturi od 15 do 25 °C.

Dodamo približno 75 ml destilirane vode. Titriramo sproščeni jod z raztopino natrijevega tiosulfata (6.4) (za pričakovana peroksidna števila, nižja od 12 titriramo z 0,002 mol/L raztopino in z 0,01 mol/L raztopino za pričakovana števila, nad 12), močno tresemo, uporabimo škrobovico (6.5) kot indikator.

Na istem preskusnem vzorcu opravimo dve določitvi.

Istočasno izvedemo slepi preskus. Če rezultat presega 0,05 ml 0,01 mol/L raztopine natrijevega tiosulfata (6.4), zamenjamo reagente s čistejšimi.

9. IZRAŽANJE REZULTATOV

Peroksidno število (PV), izraženo v miliekvivalentih aktivnega kisika na kilogram, se izrazi s formulo:

kjer je:

V = volumen raztopine standardiziranega natrijevega tiosulfata v ml (6.4), z upoštevanim volumnom slepega preskusa;

T = točna molarnost uporabljene raztopine natrijevega tiosulfata (6.4);

m = masa vzorca v gramih.

Za rezultat se vzame aritmetično povprečje dveh določitev.

▼M21









PRILOGA IV

DOLOČEVANJE VSEBNOSTI VOSKOV S KAPILARNO PLINSKO KROMATOGRAFIJO

1. NAMEN

Ta metoda opisuje postopek za določitev vsebnosti voskov v oljčnem olju. Voski se ločijo glede na število ogljikovih atomov. Metodo lahko uporabimo zlasti za razlikovanje med oljčnim oljem, pridobljenim s stiskanjem, in oljčnim oljem, pridobljenim z ekstrakcijo (olje iz oljčnih tropin).

2. PRINCIP

Maščobo, ki smo ji dodali ustrezen interni standard, na z vodo omočenem silikagelu frakcioniramo s kolonsko kromatografijo; eluirano frakcijo najprej ujamemo pri pogojih preskušanja (katere polarnost je manjša kot pri trigliceridih), nato jo neposredno analiziramo s kapilarno plinsko kromatografijo.

3. OPREMA

3.1 Erlenmajerica prostornine 25 ml.

3.2 Steklena kolona za plinsko kromatografijo, z notranjim premerom 15,0 mm, dolžine 30 do 40 cm in opremljena s petelinčkom.

3.3 Plinski kromatograf, primeren za uporabo s kapilarno kolono in opremljen s sistemom za neposredno injiciranje v kolono, ki obsega: 3.3.1 termostatsko kontrolirano komoro za kolone, s programatorjem temperature; 3.3.2 hladen injektor za injiciranje neposredno v kolono; 3.3.3 plamensko ionizacijski detektor in konverter-ojačevalec; 3.3.4 rekorder-integrator, primeren za uporabo s konverterjem-ojačevalcem (3.3.3), z odzivnim časom, manjšim od 1 sekunde, in nastavljivo hitrostjo pomika papirja. (Uporabimo lahko tudi računalniške sisteme, pri katerih je predvideno zajemanje podatkov plinske kromatografije prek osebnega računalnika.); 3.3.5 Steklena ali kvarčna kapilarna kolona dolžine 8 do 12 m, z notranjim premerom 0,25 do 0,32 mm, znotraj pokrita s tekočo stacionarno fazo in enotne debeline 0,10 do 0,30 μm. (Tekoče stacionarne faze, namenjene uporabi, v prodaji vrste SE 52 ali SE 54.)

3.4 10 μl-mikrobrizgalka s kaljeno iglo in z možnostjo neposrednega injiciranja v kolono.

3.5 Električni vibrator.

3.6 Rotavapor.

3.7 Žarilna peč.

3.8 Analitska tehtnica, ki zagotavlja ± 0,1 mg natančnost.

3.9 Običajna laboratorijska steklovina.

4. REAGENTI

4.1 Silikagel z velikostjo delcev med 60 in 200 μm. Silikagel vsaj 4 ure žarimo pri 500 °C. Nato ga ohladimo in dodamo 2 % vode glede na količino silikagela. Dobro premešamo, da se zmes homogenizira. Pred uporabo hranimo vsaj 12 ur v temi.

4.2 n-heksan, kromatografske čistoče.

4.3 Dietil eter, kromatografske čistoče.

4.4 n-heptan, kromatografske čistoče.

4.5 Standardna raztopina lauril arahidata koncentracije 0,1 % (m/V) v heksanu (interni standard). (Lahko uporabimo tudi -palmitil palmitat ali miristil stearat.) 4.5.1 Sudan 1 (1-fenilazo-2-naftol).

4.6 Nosilni plin: vodik ali helij, čist, plinsko-kromatografske čistoče.

4.7 Pomožni plini: — vodik, čist, plinsko-kromatografske čistoče, — zrak, čist, plinsko-kromatografske čistoče.

5. POSTOPEK

5.1 Priprava kromatografske kolone

V n-heksanu (4.2) suspendiramo 15 g silikagela (4.1) in napolnimo kolono (3.2). Počakamo, da se posede. Homogenost posedanja, ki poveča homogenost kromatografskih pasov, lahko dosežemo z električnim vibratorjem (3.5). Spiramo s 30 ml n-heksana, da odstranimo vse morebitne nečistoče. S tehtnico (3.8) v erlenmajerico prostornine 25 ml (3.1) natehtamo natanko 500 mg vzorca in dodamo ustrezno količino internega standarda (4.5), ki je odvisna od pričakovane vsebnosti voskov. Na primer, pri oljčnem olju dodamo 0,1 mg, pri olju iz oljčnih tropin pa 0,25 do 0,5 mg lauril arahidata. Tako pripravljen vzorec prenesemo v kromatografsko kolono, in sicer z dvema 2-ml odmerkoma n-heksana (4.2).

Topilo izpuščamo iz kolone tako dolgo, da doseže 1 mm nad zgornjim robom absorbenta, zatem spiramo z dodatnimi 70 ml n-heksana, da odstranimo morebitne naravno prisotne n-alkane. Nato začnemo kromatografsko eluiranje, in sicer zberemo 180 ml mešanice n-heksan/etilni eter v razmerju 99:1 in pri pretoku približno 15 kapljic na 10 sekund. Eluiranje vzorca mora potekati pri sobni temperaturi 22 ± 4 °C.

Opombe:

— Dnevno je treba pripraviti svežo mešanico n-heksana/etilnega etra (99:1).

— Za opazovanje pravilnega eluiranja voskov lahko vzorcu v raztopini dodamo 100 μl 1-odstotnega sudana v elucijski mešanici. Ker ima barvilo vmesno retencijo med voski in trigliceridi, je treba elucijo suspendirati, ko obarvanje doseže dno kromatografske kolone, ker so se eluirali vsi voski.

Iz tako dobljene frakcije na rotavaporju (3.6) odparimo skoraj vse topilo. Preostala 2 ml topila odstranimo z uporabo blagega toka dušika, nato dodamo 2-4 ml n-heptana.

5.2 Plinsko-kromatografska analiza

5.2.1 Predpriprava

Kolono pritrdimo na plinski kromatograf (3.3), in sicer vstopni del na injektor, izhodnega pa na detektor. Izvedemo splošno preverjanje plinskega kromatografa (tesnjenje plinskih povezav, pravilno delovanje detektorja in rekorderja itd.).

Če kolono uporabljamo prvič, je priporočljivo, da jo kondicioniramo. Pri majhnem pretoku plina skozi kolono vključimo plinski kromatograf. Postopoma segrevamo, tako da po približno 4 urah dosežemo temperaturo 350 °C. Pri tej temperaturi kolono kondicioniramo vsaj dve uri, nato naravnamo instrument v skladu s pogoji delovanja (naravnamo pretok, prižgemo plamen, povežemo z elektronskim rekorderjem (3.3.4), naravnamo delovno temperaturo peči za kolono, naravnamo detektor itd.). Pri občutljivosti, ki je vsaj dvakrat večja od delovne, posnamemo bazno linijo. Le-ta mora biti linearna, brez kakršnih koli vrhov in odklonov.

Negativen premočrtni odklon kaže na slabo tesnjenje med kolono in instrumentom, pozitiven odklon pa na slabo kondicionirano kolono.

5.2.2 Izbira delovnih pogojev

Splošni delovni pogoji, ki jih je treba upoštevati, so naslednji:

— temperatura kolone: —



20 °C/minuto 5 °C/minuto 20 °C/minuto na začetku 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— temperatura detektorja: 350 °C,

— količina injicirane snovi: 1 μl raztopine (2–4 ml) n-heptana,

— nosilni plin: helij ali vodik z optimalno linearno hitrostjo izbranega plina (glej Dodatek),

— občutljivost instrumenta: taka, da izpolnjuje spodnje pogoje:

Te pogoje lahko spremenimo glede na značilnosti kolone in plinskega kromografa, da bi dosegli ločevanje vseh voskov, zadostno resolucijo vrhov (glej sliko) in retencijski čas internega standarda C32, ki mora biti 18 ± 3 minute. Najznačilnejši vrh voskov mora biti izmerjen najmanj 60 % od spodnjega dela skale.

Integracijske parametre moramo določiti tako, da dobimo pravilno vrednotenje površin vrhov.

Opomba:Glede na visoko končno temperaturo je dovoljen pozitivni odklon, ki pa ne sme biti večji od 10 % od spodnjega dela skale.

5.3 Izvedba analize

Z 10-μl mikrobrizgalko odvzamemo 1 μl raztopine; bat izvlečemo, da se igla izprazni. Iglo vbodemo v injektor in po eni ali dveh sekundah hitro vbrizgnemo. Po približno petih sekundah iglo pazljivo izvlečemo.

Kromatogram snemamo, dokler ne eluirajo vsi voski.

Bazna linija mora ves čas izpolnjevati zahtevane pogoje.

5.4 Identifikacija vrhov

Različne vrhove identificiramo na podlagi retencijskih časov in s primerjavo med mešanicami voskov z znanimi retencijskimi časi, ki so bile analizirane pri enakih pogojih.

Slika prikazuje kromatogram voskov deviškega oljčnega olja.

5.5 Kvantitativna analiza

Z integratorjem izračunamo površine vrhov alifatskih estrov od C40 do C46 in površino vrha internega standarda.

Na podlagi naslednje formule izračunamo vsebnost voskov posameznega estra v mg/kg maščobe:

Kjer je:

Ax = površina vrha posameznega estra, v kvadratnih milimetrih;

As = površina vrha internega standarda, v kvadratnih milimetrih;

ms = masa dodanega internega standarda, v miligramih;

m = masa odvzetega vzorca za določitev, v gramih.

6. PODAJANJE REZULTATOV

Navedemo vsoto vsebnosti posameznih sestavin različnih voskov od C40 do C46, v mg/kg maščobe (ppm).

Opomba:Spojine, ki jih je treba količinsko določiti, se nanašajo na vrhove s sodim številom ogljikovih atomov med estri C40 do C46, tako kot je to prikazano na kromatograma voskov oljčnega olja. Če sta za ester C46 dva vrhova, je za njegovo identifikacijo priporočljiva analiza frakcije voskov olja iz oljčnih tropin, kjer je vrh C46 dobro viden, ker je razločno večji.

Rezultate je treba izraziti na eno decimalno mesto natančno.

Slika

Kromatogram voskov v oljčnem olju ( 3 )

Legenda:

I.S. = lauril arahidat

1. = diterpenski estri

2 + 2′ = estri C40

3 + 3′ = estri C42

4 + 4′ = estri C44

5. = estri C46

6. = sterolni estri in triterpenski alkoholi.









DODATEK

Določanje linearne hitrosti plina

V plinski kromatograf, naravnan na običajne delovne pogoje, injiciramo 1 do 3 μl metana (ali propana). Merimo čas, ki ga plin potrebuje za pot skozi kolono od trenutka vbrizga do trenutka, ko se pojavi vrh (tM).

Linearna hitrost v cm/s je izražena s formulo L/tM, kjer je L dolžina kolone v cm, tM pa izmerjeni čas v sekundah.

▼M26









PRILOGA V

DOLOČANJE SESTAVE IN VSEBNOSTI STEROLOV IN TRITERPENSKIH DIALKOHOLOV S KAPILARNO PLINSKO KROMATOGRAFIJO

1. PODROČJE UPORABE

Metoda opisuje postopek za določanje posamezne in skupne vsebnosti sterolov in triterpenskih dialkoholov v oljčnih oljih in oljih iz oljčnih tropin.

2. PRINCIP

Olje z dodanim α-holestanolom kot internim standardom se umili s kalijevim hidroksidom in etanolno raztopino, neumiljive snovi pa se nato ekstrahirajo z etilnim etrom.

Sterolni in triterpenski dialkoholni frakciji se ločita od neumiljivih snovi s tankoplastno kromatografijo na z lugom obdelani silikagelni plošči. Frakcije, dobljene iz silikagela, se pretvorijo v trimetilsililne etre in se nato analizirajo s kapilarno plinsko kromatografijo.

3. OPREMA

Običajna laboratorijska oprema in zlasti:

3.1 250 ml bučka s povratnim hladilnikom in priključki iz steklenih obrusov.

3.2 500 ml lij ločnik.

3.3 250 ml bučke.

3.4 Celotna oprema za analizo s tankoplastno kromatografijo s steklenimi ploščami 20 × 20 cm.

3.5 Ultravijolična svetilka z valovno dolžino 254 ali 366 nm.

3.6 100 μl in 500 μl mikrobrizgalki.

3.7 Cilindrični filtrirni lij s porozno frito G3 (poroznosti 15–40 μm), premera približno 2 cm in globine 5 cm, z nastavkom, primernim za filtriranje v vakuumu, in priključkom z zunanjim obrusom.

3.8 50 ml presesalna erlenmajerica s priključkom z notranjim obrusom za uporabo s filtrirnim lijem (točka 3.7).

3.9 10 ml epruveta s koničnim dnom in steklenim zamaškom.

3.10 Plinski kromatograf, primeren za uporabo s kapilarno kolono, s sistemom za vbrizgavanje z deljenjem vzorca, ki ga sestavljajo: 3.10.1 termostatirana komora za kolone, ki lahko ohranja želeno temperaturo do ± 1 °C natančno; 3.10.2 temperaturno nastavljiv injektor z uparjalnim elementom iz persilaniziranega stekla in sistemom za vbrizgavanje z deljenjem vzorca; 3.10.3 plamensko-ionizacijski detektor; 3.10.4 sistem za zajemanje podatkov, ki je primeren za uporabo s plamensko-ionizacijskim detektorjem (točka 3.10.3) in omogoča ročno integracijo.

3.11 Kvarčna kapilarna kolona, dolžine 20 do 30 m, notranjega premera 0,25 do 0,32 mm, pokrita s 5 % difenil- in 95 % dimetilpolisiloksana (stacionarna faza SE-52 ali SE-54 ali podobno) enakomerne debeline med 0,10 in 0,30 μm.

3.12 10 μl mikrobrizgalka za plinsko kromatografijo z nesnemljivo iglo, primerno za vbrizgavanje z deljenjem vzorca.

3.13 Eksikator, napolnjen s kalcijevim dikloridom.

4. REAGENTI

4.1 Kalijev hidroksid (minimalne koncentracije 85 %).

4.2 Etanolna raztopina kalijevega hidroksida, približno 2 N. Raztopite 130 g kalijevega hidroksida (točka 4.1) s hlajenjem v 200 ml destilirane vode in potem do enega litra dodajte etanol (točka 4.10). Raztopino hranite v dobro zamašenih temnih steklenicah, in sicer največ dva dni.

4.3 Etilni eter čistoče za analizo.

4.4 Etanolna raztopina kalijevega hidroksida, približno 0,2 N. Raztopite 13 g kalijevega hidroksida (točka 4.1) v 20 ml destilirane vode in do enega litra dodajte etanol (točka 4.10).

4.5 Brezvodni natrijev sulfat čistoče za analizo.

4.6 Steklene plošče (20 × 20 cm), premazane s silikagelom, brez indikatorja fluorescence debeline 0,25 mm (ki so naprodaj, pripravljene za uporabo).

4.7 Toluen kromatografske čistoče.

4.8 Aceton kromatografske čistoče.

4.9 n-heksan kromatografske čistoče.

4.10 Etilni eter kromatografske čistoče.

4.11 Etanol čistoče za analizo.

4.12 Etilacetat čistoče za analizo.

4.13 Referenčna raztopina za tankoplastno kromatografijo: holesterol ali fitosteroli in 5-odstotna raztopina eritrodiola v etilacetatu (točka 4.11).

4.14 2,7-diklorofluorescein, 0,2-odstotna etanolna raztopina. Naredite rahlo bazično z dodatkom nekaj kapelj alkoholne raztopine 2 N kalijevega hidroksida (točka 4.2).

4.15. Brezvodni piridin kromatografske čistoče (glej opombo 5).

4.16. Heksametil disilazan čistoče za analizo.

4.17. Trimetilklorosilan čistoče za analizo.

4.18 Vzročne raztopine sterolnih trimetilsililnih etrov. Pripravite jih tik pred uporabo iz sterolov in eritrodiola iz olj, ki jih vsebujejo.

4.19 α-holestanol več kot 99-odstotne čistoče (čistost je treba preveriti s plinskokromatografsko analizo).

4.20 0,2-odstotna interna standardna raztopina α-holestanola (m/V) v etilacetatu (točka 4.11).

4.21 Raztopina 10 g/l fenolftaleina v etanolu (točka 4.10).

4.22 Nosilni plin: vodik ali helij plinskokromatografske čistoče.

4.23 Pomožni plini: vodik, helij, dušik in zrak plinskokromatografske čistoče.

4.24 Mešanica n-heksana (točka 4.9) in etilnega etra (točka 4.10) v razmerju 65: 35 (V/V).

4.25 Reagent za sililiranje, sestavljen iz mešanice piridina, heksametildisilizana in trimetilklorosilana v razmerju 9: 3: 1 (V/V/V).

5. POSTOPEK

5.1 Priprava neumiljivih snovi 5.1.1 S 500 μl mikrobrizgalko (točka 3.6) vnesite v 250 ml bučko (točka 3.1) interno standardno raztopino α-holestanola (točka 4.20), ki vsebuje količino holestanola, ki ustreza približno 10 % vsebnosti sterolov v vzorcu. Na primer za 5 g vzorca oljčnega olja dodajte 500 μl raztopine α-holestanola (točka 4.20), za olje iz oljčnih tropin pa 1 500 μl. Po ohladitvi bučke raztopino odparite do suhega z blagim tokom dušika na parni kopeli, nato pa v isto bučko natehtajte 5 ± 0,01 g suhega filtriranega vzorca. Opomba 1: Olja in masti živalskega ali rastlinskega izvora, ki vsebujejo precejšnje količine holesterola, lahko dajo vrh, ki ima retenzijski čas podoben holestanolu. V takem primeru je treba sterolno frakcijo analizirati dvakrat, in sicer z internim standardom in brez njega. 5.1.2 Dodajte 50 ml 2 N etanolne raztopine kalijevega hidroksida (točka 4.2) in nekaj plovca, namestite povratni hladilnik in segrejte na rahlo vretje do končanega umiljenja (raztopina postane bistra). S segrevanjem nadaljujte še nadaljnjih 20 minut in potem z vrha hladilnika dodajte 50 ml destilirane vode, snemite hladilnik in ohladite bučko na približno 30 °C. 5.1.3 Kvantitativno prenesite vsebino bučke v 500 ml lij ločnik (točka 3.2), in sicer z večkratnim spiranjem z destilirano vodo (50 ml). Dodajte približno 80 ml etilnega etra (točka 4.10), močno tresite približno 60 sekund ter postopoma sproščajte pritisk, tako da obrnete lij ločnik in odprete petelinčka. Pustite mirovati, dokler fazi nista popolnoma ločeni (opomba 2). Nato milnico v celoti prelijte v drug lij ločnik. Iz vodno-alkoholne faze še dvakrat ekstrahirajte, in sicer z uporabo 60 do 70 ml etilnega etra (točka 4.10). Opomba 2: Emulzijo je mogoče odstraniti z dodajanjem majhnih količin etanola (točka 4.11). 5.1.4 Združite etrske ekstrakte v skupnem liju ločniku, ki vsebuje 50 ml vode. Nadaljujte z izpiranjem (50 ml), dokler izpiralna voda ob dodatku kapljice raztopine fenolftaleina ni več rožnato obarvana (točka 4.21). Potem ko je izpiralna voda odstranjena, filtrirajte skozi brezvodni natrijev sulfat (točka 4.5) v predhodno stehtani 250 ml bučki, pri tem pa lij in filter izperite z majhnimi količinami etilnega etra (točka 4.10). 5.1.5 Topilo odparite z destilacijo na rotacijskem izparilniku pri 30 °C v vakuumu. Dodajte 5 ml acetona in z blagim tokom zraka v celoti odstranite hlapno topilo. Ostanek sušite v peči 15 minut pri 103 ± 2 °C. Po ohladitvi v eksikatorju ga stehtajte z natančnostjo 0,1 mg.

5.2 Ločevanje sterolne in triterpenske dialkoholne frakcije (eritrodiol + uvaol) 5.2.1 Priprava z lugom obdelanih plošč za tankoplastno kromatografijo: silikagelne plošče (točka 4.6) za 10 sekund potopite približno 4 cm globoko v raztopino 0,2 N etanolnega kalijevega hidroksida (točka 4.5) in jih potem pustite dve uri, da se sušijo v digestoriju, na koncu pa jih dajte v peč na 100 °C za eno uro. Vzemite jih iz peči in jih do uporabe hranite v eksikatorju, napolnjenem s kalcijevim kloridom (točka 3.13) (na ta način obdelane plošče je treba uporabiti v 15 dneh). Opomba 3: Kadar se za ločevanje sterolnih frakcij uporabljajo z lugom obdelane silikagelne plošče, neumiljivih frakcij ni treba tretirati z aluminijevim oksidom. Na ta način se vse sestavine, ki so kisle narave (maščobne kisline in druge), obdržijo na mestu napršitve, pas sterolov pa se jasno loči od pasov alifatskih in triterpenskih alkoholov. 5.2.2 Mešanico heksana in etilnega etra (točka 4.24) (opomba 4) vstavite v razvijalno komoro na globino približno 1 cm. Komoro zaprite z ustreznim pokrovom in jo tako pustite najmanj pol ure na hladnem, da se lahko med hlapi in tekočino ustvari ravnotežje. Trakovi filtrirnega papirja, namočeni v eluent, se lahko položijo na notranje površine komore. To skrajša razvijalni čas za približno eno tretjino ter omogoča enotnejšo in bolj homogeno elucijo sestavin. Opomba 4: Razvijalno mešanico je treba zamenjati za vsak preskus, zato da se dosežejo popolnoma ponovljivi pogoji elucije. Kot alternativa se lahko uporabi mešanica n-heksana in etilnega etra v razmerju 50: 50 (V/V). 5.2.3 Pripravite približno 5-odstotno raztopino neumiljivih snovi (točka 5.1.5) v etilacetatu (točka 4.12) ter s pomočjo 100 μl mikrobrizgalke nanesite 0,3 ml raztopine na tanko in homogeno progo na nižjem koncu (2 cm) kromatografske plošče (točka 5.2.1). Vzporedno s progo nanesite 2 do 3 μl materialne referenčne raztopine (točka 4.13), tako da se po razvijanju sterolna in triterpenska dialkoholna pasova lahko identificirata. 5.2.4 Ploščo vstavite v razvijalno komoro, pripravljeno, kot je navedeno v točki 5.2.2. Temperaturo okolja je treba vzdrževati med 15 in 20 °C (opomba 5). Komoro takoj zaprite s pokrovom in pustite, da poteka eluiranje, dokler fronta topila ne doseže razdalje 1 cm od vrhnjega roba plošče. Vzemite ploščo iz razvijalne komore in odparite topilo s tokom vročega zraka ali tako, da ploščo nekaj časa pustite v digestoriju. Opomba 5: Višja temperatura lahko negativno vpliva na ločevanje. 5.2.5 Rahlo in enakomerno napršite ploščo z raztopino 2,7-diklorofluorosceina (točka 4.14) ter pustite, da se posuši. Če se plošča opazuje pod ultravijolično svetlobo, se sterolna in triterpenska dialkoholna pasova lahko identificirata tako, da se poravnata s pikami, dobljenimi iz referenčne raztopine (točka 4.13). S črnim svinčnikom označite meje pasov vzdolž roba fluorescence (glej tankoplastno kromatografijo na sliki 3). 5.2.6 S kovinsko žličko odstrgajte silikagel na označeni površini. Odstranjen, v fin prah zdrobljen material dajte v filtrirni lij (točka 3.7). Dodajte 10 ml vročega etilacetata (točka 4.12), s kovinsko žličko previdno zmešajte in v vakuumu filtrirajte, tako da filtrat zberete v erlenmajerici (točka 3.8), ki je pritrjena na filtrirni lij. Ostanek v erlenmajerici trikrat izperite z etilnim etrom (točka 4.3) (vsakokrat približno z 10 ml), tako da zberete filtrat v isti erlenmajerici, ki je pritrjena na lij. Odparite filtrat do prostornine 4 do 5 ml, prenesite preostanek raztopine v predhodno stehtano 10 ml epruveto (točka 3.9), odparite do suhega z rahlim segrevanjem v blagem toku dušika, ponovno dolijte nekaj kapelj acetona (točka 4.8) in spet odparite do suhega. Ostanek v epruveti mora biti sestavljen iz sterolnih in triterpenskih dialkoholnih frakcij.

5.3 Priprava trimetilsililnih etrov 5.3.1 Reagent za sililiranje (točka 4.25) (opomba 6), v razmerju 50 μl za vsak miligram sterolov in triterpenskih dialkoholov, dodajte v epruveto, ki vsebuje sterolsko in triterpensko dialkoholno frakcijo, tako da se izognete kakršnemu koli vnosu vlage (opomba 7). Opomba 6: Raztopine, pripravljene za uporabo, se dobijo v prodaji. Na voljo so tudi drugi reagenti za sililiranje, kot je na primer bis-trimetilsilil trifluoroacetamid + 1-odstoten trimetilklorosilan, ki ga je treba razredčiti z enako količino brezvodnega piridina. Piridin se lahko zamenja z enako količino acetonitrila. 5.3.2 Zamašite epruveto in jo previdno pretresite (ne da bi jo prevračali), dokler niso sestavine popolnoma raztopljene. Pustite jo pri sobni temperaturi najmanj 15 minut, nato pa nekaj minut centrifugirajte. Prozorna raztopina je pripravljena za plinskokromatografsko analizo. Opomba 7: Rahla opalescenca, ki lahko nastane, je normalna in ne povzroča nobenih nepravilnost. Tvorjenje belega flokulata ali pojav rožnate obarvanosti sta znaka prisotnosti vlage ali pokvarjenosti reagenta. V takem primeru je treba preskus ponoviti (le če se uporabi heksametildisilizan/trimetilklorosilan).

5.4 Plinskokromatografska analiza 5.4.1 Predhodni postopki, kondicioniranje kapilarne kolone 5.4.1.1 Kolono (točka 3.11) pritrdite na plinski kromatograf, in sicer vstopni del na injektor z deljenjem vzorca, izhodnega pa na detektor. Opravite splošne preglede plinskega kromatografa (tesnjenje tokokroga plinov, učinkovitost detektorja, učinkovitost sistema za vbrizgavanje z deljenjem vzorca in sistema beleženja itd.). 5.4.1.2. Če kolono uporabljate prvič, je priporočljivo, da jo kondicionirate, in sicer tako, da skozi kapilarno kolono spustite blag tok plina, nato pa vključite plinski kromatograf in začnete postopno segrevanje do temperature najmanj 20 °C nad delovno temperaturo (opomba 8). To temperaturo vzdržujte najmanj dve uri, nato pa vzpostavite delovne pogoje (nastavitev pretoka plina in deljenja vzorca, vžig plamena, priključitev na računalniški sistem, prilagoditev temperature kolone, detektorja in injektorja itd.) in beležite signal z občutljivostjo, ki je najmanj dvakrat večja od tiste, ki je predvidena za analize. Potek bazne linije mora biti linearen, brez kakršnih koli vrhov, in ne sme imeti odklona. Negativen premočrtni odklon kaže na slabo tesnjenje med kolono in instrumentom, pozitiven odklon pa na slabo kondicionirano kolono. Opomba 8: Temperatura kondicioniranja mora vedno biti najmanj 20 °C nižja od najvišje temperature, določene za uporabljeno stacionarno fazo. 5.4.2 Izbor delovnih pogojev 5.4.2.1 Delovni pogoji so naslednji: — temperatura kolone: 260 ± 5 °C, — temperatura injektorja: 280–300 °C, — temperatura detektorja: 280–300 °C, — linearna hitrost nosilnega plina: 20 do 35 cm/s za helij, 30 do 50 cm/s za dušik, — delilno razmerje: od 1: 50 do 1: 100, — občutljivost instrumenta: 4- do 16-kratna minimalna atenuacija, — občutljivost beleženja: 1 do 2 mV celotne skale, — količina vbrizgane snovi: 0,5 do 1 μl raztopine TMSE. Ti pogoji se lahko spremenijo glede na značilnosti kolone in plinskega kromatografa, tako da se dobijo kromatogrami, ki izpolnjujejo naslednje zahteve: — retenzijski čas β-sitosterola mora biti 20 ± 5 minut, — vrh za kampesterol mora biti: za oljčno olje (povprečna vsebnost 3 %) 20 ± 5 % celotne skale; za sojino olje (povprečna vsebnost 20 %) 80 ± 10 % celotne skale, — vsi prisotni steroli morajo biti ločeni. Poleg tega, da so ločeni, morajo biti vrhovi tudi popolnoma razdvojeni, tj. signal vrha se mora pred začetkom novega vrha vrniti na bazno linijo. Vendar je nepopolna resolucija sprejemljiva pod pogojem, da se vrh pri TRR 1.02 (sitostanol) lahko količinsko opredeli s pomočjo pravokotnice. 5.4.3 Analizni postopek 5.4.3.1 Z 10 μl mikrobrizgalko odmerite 1 μl heksana, 0,5 μl zraka in 0,5 do 1 μl vzorčne raztopine. Dvignite bat mikrobrizgalke, tako da se igla izprazni. Iglo potisnite skozi membrano injektorja in po eni do dveh sekundah raztopino hitro vbrizgajte in potem po približno petih sekundah iglo počasi izvlecite. Uporabi se lahko tudi avtomatski injektor. 5.4.3.2 Beležite, dokler TMSE prisotnih triterpenskih dialkoholov popolnoma ne eluirajo. Bazna linija mora vedno ustrezati zahtevam (točka 5.4.1.2). 5.4.4 Identifikacija vrhov Identificirajte posamezne vrhove na podlagi retenzijskih časov in s primerjavo z mešanico sterolnih in triterpenskih dialkoholnih TMSE, analiziranih v enakih pogojih (glej Dodatek). Steroli in triterpenski dialkoholi eluirajo v naslednjem zaporedju: holesterol, brasikasterol, ergosterol, 24-metilen holesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ7-kampesterol, Δ5,23-stigmastadienol, klerosterol, ß-sistosterol, sitostanol, Δ5-avenasterol, Δ5,24-stigmastadienol, Δ7-stigmastenol, Δ7-avenasterol, eritrodiol in uvaol. Retenzijska časa za ß-sitosterol za koloni SE-52 in SE-54 sta prikazana v tabeli 1. Sliki 1 in 2 prikazujeta tipične kromatograme nekaterih olj. 5.4.5 Kvantitativna ocena 5.4.5.1 Z računalniškim sistemom izračunajte površine vrhov za α-holestanol ter sterole in triterpenske dialkohole. Ne upoštevajte vrhov za tiste spojine, ki niso vključene med tiste, navedene v tabeli 1 (ergosterol se ne računa). Za odzivni faktor α-holestanola je treba šteti, da je enak 1. 5.4.5.2 Izračunajte koncentracijo vsakega posameznega sterola v mg/kg maščobe: pri čemer je: Ax = površina vrha za sterol x, izračunana z računalniškim sistemom; As = površina vrha za α-holestanol, izračunana z računalniškim sistemom; ms = masa dodanega α-holestanola, v miligramih; m = masa vzorca, uporabljenega za določanje, v gramih.

6. IZRAŽANJE REZULTATOV

6.1. Zabeležite posamezne koncentracije sterola kot mg/kg maščobe in njihovo vsoto kot „steroli skupaj“. Sestavo vsakega posameznega sterola ter eritrodiola in uvaola je treba izraziti na eno decimalno mesto natančno. Vsoto skupnih sterolov je treba izraziti brez decimalk.

▼M28

6.2. Izračunajte odstotek za vsak posamezni sterol iz razmerja med ustrezno površino vrha in površino vseh sterolnih vrhov: pri čemer: Ax = površina vrha x; ΣA = površina vseh sterolnih vrhov.

▼M26

6.3. Navidezni β-sitosterol: Δ5-23-stigmastadienol + klerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-avenasterol + Δ5-24-stigmastadienol.

6.4. Izračunajte delež eritrodiola in uvaola: pri čemer je ΣA = površina vseh vrhov za sterol, izračunana z računalniškim sistemom; Er = površina vrha za eritrodiol, izračunana z računalniškim sistemom; Uv = površina vrha za uvaol, izračunana z računalniškim sistemom.









Dodatek

Določanje linearne hitrosti plina

Pri nastavitvi plinskega kromatografa na normalne delovne pogoje vbrizgajte 1 do 3 μl metana (ali propana) in izmerite čas, ki ga plin potrebuje za pot skozi kolono, od trenutka vbrizganja do trenutka, ko se pojavi vrh (tM).

Linearna hitrost v cm/s je podana z L/tM, pri čemer je L dolžina kolone v centimetrih in tM izmerjeni čas v sekundah.







Tabela 1 Relativni retenzijski časi sterolov Vrh Identifikacija Relativni retenzijski čas Kolona SE 54 Kolona SE 52 1 holesterol Δ-5-holesten-3ß-ol 0,67 0,63 2 holestanol 5α-holestan-3ß-ol 0,68 0,64 3 brasikasterol [24S]-24-metil-Δ-5,22-holestadien-3ß-ol 0,73 0,71 * ergosterol [24S]-24-metil-Δ5-7-22-holestatrien-3β-ol 0,78 0,76 4 24-metilen-holesterol 24-metilen-Δ-5,24-holestadien-3ß-o1 0,82 0,80 5 kampesterol (24R)-24-metil-Δ-5-holesten-3ß-ol 0,83 0,81 6 kampestanol (24R)-24-metil-holestan-3ß-ol 0,85 0,82 7 stigmasterol (24S)-24-etil-Δ-5,22-holestadien-3ß-ol 0,88 0,87 8 Δ-7-kampesterol (24R)-24-metil-Δ-7-holesten-3ß-ol 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stigmastadienol (24R,S)-24-etil-Δ-5,23-holestadien-3ß-ol 0,95 0,95 10 klerosterol (24S)-24-etil-Δ-5,25-holestadien-3ß-ol 0,96 0,96 11 ß-sitosterol (24R)-24-etil-Δ-5-holesten-3ß-ol 1,00 1,00 12 sitostanol 24-etil-holestan-3ß-ol 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasterol (24Z)-24-etiliden-Δ-holesten-3ß-ol 1,03 1,03 14 Δ-5-24-stigmastadienol (24R,S)-24-etil-Δ-5,24-holestadien-3ß-ol 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenol (24R,S)-24-etil-Δ-7-holesten-3ß-ol 1,12 1,12 16 Δ-7-avenasterol (24Z)-24-etiliden-Δ-7-holesten-3ß-ol 1,16 1,16 17 eritrodiol 5α-olean-12-en-3β28-diol 1,41 1,41 18 uvaol Δ12-ursen-3β28-diol 1,52 1,52

Slika 1

Plinski kromatogram sterolnih in triterpenskih dialkoholnih frakcij lampante oljčnega olja (z dodanim notranjim standardom)

Slika 2

Plinski kromatogram sterolnih in triterpenskih dialkoholnih frakcij rafiniranega oljčnega olja (z dodanim notranjim standardom)

Slika 3

Tankoplastna kromatografija olja iz oljčnih tropin s površino, s katere je treba odstraniti silikagel za določitev sterolov in triterpenskih dialkoholov

1 – skvalen

2 – triterpenski in alifatski alkoholi

3 – steroli in triterpenski dialkoholi

4 – začetne in proste maščobne kisline

▼M26 —————

▼M21









PRILOGA VII

DOLOČANJE ODSTOTNEGA DELEŽA 2-GLICERIL MONOPALMITATA

1. PREDMET UREJANJA IN PODROČJE UPORABE

S to metodo je opisan analitski postopek za določevanje odstotnega deleža palmitinske kisline na položaju 2 v trigliceridih z ovrednotenjem 2-gliceril monopalmitata.

To metodo uporabljamo za rastlinska olja, tekoča pri sobni temperaturi (20 °C).

2. PRINCIP

Po pripravi pustimo, da na vzorec olja učinkuje pankreatična lipaza: poteče delna hidroliza, specifična za položaja 1 in 3 v molekuli triglicerida, ki povzroči nastanek 2-monoacilglicerolov. Odstotni delež 2-gliceril monopalmitata v monoacilglicerolni frakciji se po sililiranju določi s kapilarno plinsko kromatografijo.

3. APARATURE IN OBIČAJNA LABORATORIJSKA OPREMA

3.1 Erlenmajerica, 25 ml

3.2 Čaše 100, 250 in 300 ml

3.3 Steklena kromatografska kolona z notranjim premerom 21–23 mm, dolžine 400 mm, opremljena s sintrano stekleno ploščico in petelinčkom

3.4 Merilni valji prostornine 10, 50, 100 in 200 ml

3.5 Bučke prostornine 100 in 250 ml

3.6 Rotavapor

3.7 Epruvete za centrifugiranje prostornine 10 ml s koničnim dnom in obrušenim zamaškom

3.8 Centrifuga za epruvete prostornine 10 in 100 ml

3.9 Termostat, ki omogoča vzdrževanje temperature pri 40 °C ± 0,5 °C

3.10 Merilni pipeti prostornine 1 in 2 ml

3.11 Brizgalka prostornine 1 ml

3.12 Mikrobrizgalka prostornine 100 μl

3.13 Lij-ločnik, 1 000 ml

3.14 Plinski kromatograf za kapilarne kolone, opremljen z injicirnim sistemom za hladno injiciranje vzorca neposredno v kolono in pečjo, ki lahko vzdržuje izbrano temperaturo znotraj 1 °C

3.15 Injektor za hladno injiciranje vzorca neposredno v kolono

3.16 Plamensko ionizacijski detektor in elektrometer

3.17 Rekorder-integrator, kompatibilen z elektrometrom, z odzivnim časom, manjšim od 1 sekunde, in nastavljivo hitrostjo pomika papirja

3.18 Steklena ali kvarčna kapilarna kolona dolžine 8 do 12 m, z notranjim premerom 0,25 do 0,32 mm, pokrita z metilpolisiloksanom ali 5-odstotnim fenil metilpolisiloksanom, debeline 0,10–0,30 μm, ki jo je mogoče uporabiti pri 370 °C

3.19 Mikrobrizgalka prostornine 10 μl z nesnemljivo, vsaj 7,5 cm dolgo iglo, za neposredno vbrizganje na začetek kolone

4. REAGENTI

4.1 Silikagel z velikostjo delcev med 0,063 in 0,200 mm (70/280 mesh), pripravljen na naslednji način: silikagel damo v porcelansko posodico, ga pri 160 °C 4 ure sušimo v sušilniku, nato pa pustimo, da se na sobni temperaturi ohladi v eksikatorju. Nato dodamo količino vode, ki ustreza 5 % teže silikagela: v erlenmajerico prostornine 500 ml natehtamo 152 g silikagela in dodamo 8 g destilirane vode, zamašimo ter homogeniziramo. Pred uporabo pustimo mirovati vsaj 12 ur.

4.2 n-heksan (kromatografske čistoče)

4.3 Izopropanol

4.4 Izpropanol, vodna raztopina 1/1 (V/V)

4.5 Pankreatična lipaza. Aktivnost uporabljene lipaze mora biti med 2,0 in 10 lipaznimi enotami na mg (V prodaji so pankreatične lipaze z aktivnostjo med 2 in 10 enotami na mg encima.)

4.6 Pufrska raztopina tris-hidroksi-metilaminometana: 1 M vodna raztopina, ki ji s koncentrirano HCI (1/1 V/V) uravnamo pH na vrednost 8 (preverimo s pH-metrom)

4.7 Natrijev holat, encimske čistosti, 0,1-odstotna vodna raztopina (to raztopino je treba uporabiti v petnajstih dneh po pripravi)

4.8 Kalcijev klorid, 22-odstotna vodna raztopina

4.9 Dietil eter kromatografske čistoče

4.10 Elucijsko topilo: mešanica n-heksana/dietilnega etra (87/13) (V/V)

4.11 Natrijev hidroksid, 12-odstotna raztopina v masnih odstotkih

4.12 Fenolftalein, 1-odstotna raztopina v etanolu

4.13 Nosilni plin: vodik ali helij, za plinsko kromatografijo

4.14 Pomožna plina: vodik, najmanj 99-odstoten, brez vlage in organskih snovi, in zrak, za plinsko kromatografijo in enake čistoče

4.15 Regent za silaniziranje: mešanica piridina, heksametildisilazana, trimetilklorosilana v razmerju 9:3:1 (V/V/V) (V prodaji so raztopine, pripravljene za uporabo. Uporabimo lahko tudi druge reagente za silaniziranje, zlasti bis-trimetilsilil trifluoroacetamid + 1-odstoten trimetilklorosilan, razredčen z enako količino brezvodnega piridina.)

4.16 Referenčni vzorci: čisti monogliceridi ali mešanice monogliceridov, za katere je znano, da imajo podobno odstotkovno sestavo kot vzorec.

5. POSTOPEK

5.1 Priprava vzorca

5.1.1 Olj z deležem prostih kislin, manjšim od 3 %, pred kolonsko kromatografijo ni treba nevtralizirati s silikagelom. Olja, katerih delež prostih kislin je večji od 3 %, je treba nevtralizirati v skladu s točko 5.1.1.1. 5.1.1.1 V lij-ločnik prostornine 1 000 ml (3.13) vlijemo 50 g olja in 200 ml n-heksana. Dodamo 100 ml izopropanola in tako količino 12-odstotne raztopine natrijevega hidroksida (4.11), da ustreza deležu prostih kislin, povečanemu za 5 odstotkov. Eno minuto močno stresamo. Dodamo 100 ml destilirane vode, ponovno pretresemo in pustimo, da se usede. Po ločevanju odstranimo spodnjo plast, ki vsebuje mila. Odstranimo morebitne vmesne plasti (sluz in netopne snovi). Heksansko raztopino nevtraliziranega olja izpiramo z zaporednimi 50- do 60-mililitrskimi odmerki raztopine izopropanola in vode 1/1 (V/V) (4.4) tako dolgo, da je izpiralna faza nevtralna na fenolftalein. Večino heksana odstranimo z destilacijo v vakuumu (uporabimo na primer rotavapor) in olje prelijemo v 100-mililitrsko bučko (3.5). Olje sušimo v vakuumu, dokler se topilo v celoti ne odstrani. Po koncu tega postopka mora biti vsebnost kislin v olju manjša od 0,5 %.

5.1.2 V erlenmajerico prostornine 25 ml damo 1,0 g olja, pripravljenega po spodnjih navodilih (3.1), in ga raztopimo v 10 ml razvijalne mešanice (4.10). Pred kolonsko kromatografijo s silikagelom raztopino pustimo mirovati najmanj 15 minut. Če je raztopina motna, jo centrifugiramo, da zagotovimo optimalne pogoje za kromatografijo. (Uporabimo lahko komercialne 500-mg silikagelne kartuše SPE.)

5.1.3 Priprava kromatografske kolone V kolono (3.3) vlijemo približno 30 m razvijalnega topila (4.10), s stekleno paličko v spodnji del kolone vstavimo košček vate; stisnemo, da odstranimo zrak. V čaši pripravimo raztopino 25 g silikagela (4.1) v približno 80 ml razvijalne raztopine in jo z lijakom prelijemo v kolono. Preverimo, da smo v kolono dali ves silikagel; speremo z elucijskim topilom (4.10), odpremo petelinček in pustimo, da raven tekočine seže približno 2 mm nad zgornjo raven silikagela.

5.1.4 Kolonska kromatografija V erlenmajerico prostornine 25 ml (3.1.) natehtamo natanko 1,0 g vzorca, ki smo ga pripravili v skladu s točko 5.1. Vzorec raztopimo v 10 ml elucijskega topila (4.10). Raztopino prelijemo v kromatografsko kolono, ki smo jo pripravili v skladu s točko 5.1.3. Pazimo, da ne premešamo površine kolone. Odpremo ventil in pustimo raztopino vzorca odtekati, dokler ne doseže ravni silikagela. Eluiramo s 150 ml razvijalnega topila. Količino pretoka nastavimo na 2 ml/min (tako da 150 ml odteče v kolono v približno 60–70 minutah). Eluat zberemo v 250-mililitrsko bučko z znano maso. V vakuumu odparimo topilo in njegove zadnje sledi odstranimo s tokom dušika. Bučko stehtamo in izračunamo pridobljeni ekstrakt (Če uporabljamo silikagelne kartuše SPE, storimo naslednje: v kartuše, ki smo jih predhodno kondicionirali s 3 ml n-heksana, vlijemo 1 ml raztopine (5.1.2). Po filtraciji raztopine razvijemo s 4 ml n-heksana/dietilnega etra 9/1 (V/V). Eluat zberemo v 10-mililitrsko epruveto in ga z uvajanjem toka dušika odparimo do suhega. Na suhem preostanku pustimo učinkovati pankreatično lipazo (5.2). Ključno je, da pred in po uporabi kartuše SPE preverimo sestavo maščobnih kislin.

5.2 Hidroliza s pankreatično lipazo

5.2.1 V epruveto centrifuge natehtamo 0,1 g olja, pripravljenega v skladu s točko 5.1. Dodamo 2 ml pufrske raztopine (4.6), 0,5 ml raztopine natrijevega holata (4.7) in 0,2 ml raztopine kalcijevega klorida, pri čemer po vsakem dodajanju dobro pretresemo. Epruveto zapremo z obrušenim zamaškom in jo namestimo v termostat, naravnan na 40 ± 0,5 °C.

5.2.2 Dodamo 20 mg lipaze, previdno pretresemo (pazimo, da ne zmočimo zamaška) in damo epruveto za natanko 2 minuti v termostat, nato jo damo ven, jo natanko 1 minuto močno stresamo in pustimo, da se ohladi.

5.2.3 Dodamo 1 ml dietilnega etra, zamašimo in močno stresamo, nato centrifugiramo ter raztopino etra z mikrobrizgalko prenesemo v čisto in suho epruveto.

5.3 Priprava silaniziranih derivatov in plinska kromatografija

5.3.1 Z mikrobrizgalko prenesemo 100 μl raztopine (5.2.3) v epruveto prostornine 10 ml s koničastim dnom.

5.3.2 Topilo odstranimo z uvajanjem rahlega toka dušika, dodamo 200 μl reagenta za silaniziranje (4.15), zamašimo epruveto in pustimo mirovati 20 minut.

5.3.3 Po 20 minutah dodamo 1 do 5 ml n-heksana (odvisno od kromatografskih pogojev): raztopina, ki jo dobimo, je nared za plinsko kromatografijo.

5.4 Plinska kromatografija

Pogoji za postopek so naslednji:

— temperatura injektorja (injektor za vbrizgavanje v kolono) mora biti nižja od temperature vrelišča topila (68 °C),

— temperatura detektorja: 350 °C,

— temperatura kolone: programiranje temperature peči: 1 minuto pri 60 °C, s hitrostjo segrevanja 15 °C na minuto, dokler ne dosežemo temperature 180 °C, nato s hitrostjo 5 °C na minuto, dokler ne dosežemo temperature 340 °C, nato 13 minut pri 340 °C,

— nosilni plin: vodik ali helij, nastavljen na ustrezno linearno hitrost, da dosežemo resolucijo, navedeno na Sliki 1. Retencijski čas triglicerida C54 mora biti 40 + 5 minut (glej Sliko 2); (Pogoji za spodaj navedene postopke so okvirni. Vsak izvajalec jih mora optimizirati, da doseže želeno resolucijo. Najmanjša višina vrha za 2-gliceril monopalmitat mora biti enaka 10 % polne skale rekorderja.),

— količina injicirane snovi: 0,5-1 μl raztopine (5 ml) n-heksana (5.3.3).

5.4.1 Identifikacija vrhov

Posamezne monoacilglicerole identificiramo na podlagi dobljenih retencijskih časov in glede na čase, dobljene za standardne mešanice monogliceridov, analizirane pri enakih pogojih.

5.4.2 Kvantitativna analiza

Površina vsakega vrha se izračuna z elektronskim integratorjem.

6. PODAJANJE REZULTATOV

Odstotek gliceril monopalmitata izračunamo iz razmerja med ustrezno površino vrha in vsoto površin vrhov vseh monoacilglicerolov (glej Sliko 2), in sicer na podlagi formule:

gliceril monopalmitat (%):

kjer je:

Ax = površina vrha gliceril monopalmitata

ΣA = vsota površin vseh vrhov monoacilglicerolov

Rezultat je treba podati na eno decimalko natančno.

7. POROČILO O ANALIZI

V poročilu o analizi je treba podrobno navesti:

— sklicevanje na to metodo,

— vse informacije, potrebne za popolno identifikacijo vzorca,

— rezultat analize,

— vsako odstopanje od te metode, ne glede na to, ali gre za odločitev zadevnih oseb ali zaradi kakega drugega razloga,

— podrobne podatke o laboratoriju, datum analize in podpis njenih odgovornih oseb.

Slika 1

Kromatogram proizvodov reakcije silaniziranja, dobljenih z delovanjem lipaze na rafiniranem oljčnem olju, ki mu je dodanih 20 % 100 % zaestrenega olja

Legenda: Acides gras libres = proste maščobne kisline Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée = rafinirano oljčno olje + 20 % zaestrenega olja 1-2 monopalmitate = 1-2 monopalmitat 1-2 monopalmitoléine = 1-2 monopalmitolein 1-2 mono C18 insat. = 1-2 mono C18 nenasič. squalène = skvalen.

Slika 2

Kromatogram

(A) nezaestrenega oljčnega olja po delovanju lipaze, in silaniziranega; pri teh pogojih (kapilarna kolona 8–12 m) frakcija voskov eluira hkrati s frakcijo diacilglicerolov ali malo zatem. Vsebnost triacilglicerolov po lipazi ne sme preseči 15 %. Legenda: 1 = Proste maščobne kisline 2 = Monoacilgliceroli 3 = Diacilgliceroli 4 = Tracilgliceroli (*) = 2-monopalmitin (**) = Triacilglicerol C54

Kromatogram:

(B) zaestrenega olja po delovanju lipaze; po silaniziranju; pri teh pogojih (kapilarna kolona 8–12 m) frakcija voskov eluira hkrati s frakcijo diglicerida ali malo zatem. Vsebnost trigliceridov po lipazi ne sme preseči 15 % Legenda: 1 = Proste maščobne kisline 2 = Monogliceridi 3 = Digliceridi 4 = Trigliceridi (*) = 2-monopalmitin (**) = Triglicerid C54

8. OPOMBE

PRIPRAVA LIPAZE

Lipaze z zadostno aktivnostjo so komercialno dostopne. Lahko jih pripravimo tudi v laboratoriju, in sicer na naslednji način:

5 kg sveže prašičje trebušne slinavke ohladimo na 0 °C. Odstranimo okoliško trdo maščevje in vezno tkivo ter jo zmeljemo v mlinčku z rezili, da dobimo kašasto tekočino. To tekočino 4 do 6 ur mešamo z 2,5 litra brezvodnega acetona in nato centrifugiramo. Izvleček naredimo še trikrat z enako količino acetona, nato dvakrat z mešanico acetona/dietilnega etra (1/1) (V/V) in dvakrat z dietilnim etrom.

Preostanek 48 ur sušimo v vakuumu, da dobimo stabilen prah, ki ga je treba dolgo časa hraniti v hladilniku in pred vlago.

PREVERJANJE AKTIVNOSTI LIPAZE

Oljno emulzijo pripravimo na naslednji način:

V mešalniku 10 minut mešamo mešanico 165 ml raztopine gumarabikuma (100 g/l), 15 g zdrobljenega ledu in 20 ml predhodno nevtraliziranega oljčnega olja.

V čašo prostornine 50 ml zaporedoma damo 10 ml te emulzije, nato 0,3 ml raztopine natrijevega holata (0,2 g/ml) in 20 ml destilirane vode.

Čašo damo v termostat, naravnan na 37 °C; namestimo elektrode pH metra in spiralni mešalnik.

Z bireto po kapljicah dodajamo raztopino natrijevega hidroksida 0,1 N, dokler ne dobimo pH vrednosti 8,3.

Dodamo ustrezno količino v vodi raztopljene lipaze v prahu (0,1 g/ml lipaze). Takoj ko pH meter pokaže pH 8,3, sprožimo štoparico in po kapljah dodajamo raztopino natrijevega hidroksida, in sicer s tako hitrostjo, da ohranimo pH vrednost 8,3. Vsako minuto odčitamo volumen porabljene raztopine.

Podatke zabeležimo v sistem koordinatnih osi, in sicer odčitke časa navedemo kot absciso, kot ordinato pa ml alkalne raztopine 0,1 N, ki smo jih porabili za ohranitev konstantnega pH. Dobiti moramo linearen graf.

Aktivnost lipaze, izmerjena v lipaznih enotah na mg, je izražena z naslednjo formulo:

kjer je:

A aktivnost v lipaznih enotah/mg

V število ml raztopine natrijevega hidroksida 0,1 N na minuto (izračunano iz grafa)

N normalnost raztopine natrijevega hidroksida

m masa vzorca lipaze v mg.

Lipazna enota je opredeljena kot količina encima, ki sprosti 10 mikro-ekvivalentov kisline na minuto.

▼M20 —————

▼M28









PRILOGA IX

SPEKTROFOTOMETRIČNO MERJENJE NA UV-OBMOČJU

PREDGOVOR

Spektrofotometrično merjenje na UV-območju lahko daje informacije o kakovosti maščobe, njenem stanju ohranitve in spremembah, ki so jih v njej povzročili tehnološki procesi. Absorpcijo valovnih dolžin, določenih v postopku, povzroči prisotnost konjugiranih dienov in trienov, ki so posledica oksidacije in/ali rafinacije. Te absorpcije so izražene kot specifične ekstinkcije

(ekstinkcija 1-odstotne w/v raztopine maščobe v specificiranem topilu, v 10-milimetrski kiveti), konvencionalno označene s K (imenuje se tudi „ekstinkcijski koeficient“).

1. NAMEN

Ta priloga opisuje postopek za izvajanje spektrofotometričnega merjenja oljčnega olja na UV-območju.

2. PRINCIP METODE

Vzorec se raztopi v zahtevanem topilu in absorbanca raztopine se izmeri pri specifični valovni dolžini glede na čisto topilo.

Specifične ekstinkcije pri 232 nm in 268 nm v izooktanu ali 232 nm in 270 nm v cikloheksanu se izračunajo za koncentracijo 1 % w/v v 10-milimetrski kiveti.

3. OPREMA

3.1 Spektrofotometer, primeren za meritve pri ultravijoličnih valovnih dolžinah (220 nm do 360 nm), z zmožnostjo odčitavanja posameznih nanometrskih enot. Redni pregledi so priporočljivi zaradi natančnosti in obnovljivosti lestvic absorbance in valovnih dolžin ter zaradi razpršene svetlobe. 3.1.1 Lestvica valovnih dolžin: preveriti jo je mogoče z referenčnim materialom, ki ga sestavlja filter iz optičnega stekla s holmijevim oksidom ali raztopino holmijevega oksida (zatesnjeno ali ne), ki ima izrazite absorpcijske pasove. Referenčni material je namenjen preverjanju in kalibriranju lestvic valovnih dolžin spektrofotometrov za vidno in ultravijolično svetlobo z nominalnimi spektralnimi širinami 5 nm ali manj. Meritve se izvedejo proti zraku kot slepemu vzorcu v razponu valovnih dolžin od 640 do 240 nm v skladu z navodili, priloženimi referenčnemu materialu. Pri vsaki spremembi širine špranje se izvede korekcija bazne linije s prazno potjo svetlobnega pramena. Valovne dolžine v skladu s standardom so navedene v potrdilu referenčnega materiala. 3.1.2 Lestvica absorbance: preveriti jo je mogoče z zatesnjenim referenčnim materialom, ki je v prodaji in ki ga sestavljajo kisle raztopine kalijevega dikromata, v določenih koncentracijah in certificiranih vrednostih absorbance pri valovni dolžini maksimalne absorbance (v nadaljnjem besedilu: λmax) (iz 4 raztopin kalijevega dikromata in perklorove kisline, ki so zaprti v štirih ultravijoličnih kvarčnih kivetah za merjenje linearnosti in fotometrične natančnosti na ultravijoličnem območju). Raztopine kalijevega dikromata se izmerijo proti slepemu vzorcu uporabljene kisline, po korekciji bazne linije, v skladu z navodili, priloženimi referenčnemu materialu. Vrednosti absorbance so navedene v potrdilu referenčnega materiala. Drug način preverjanja odzivnosti fotocelice in fotopomnoževalke je naslednji: natehtajte 0,2000 g čistega kalijevega kromata za spektrofotometrijo in raztopite 0,05 raztopine N kalijevega hidroksida v 1 000 -mililitrsko graduirano bučko in dolijte do oznake. Vzemite natančno 25 ml dobljene raztopine, prenesite jo v 500-mililitrsko graduirano bučko in razredčite do oznake z isto raztopino kalijevega hidroksida. Izmerite ekstinkcijo tako dobljene raztopine pri 275 nm, raztopino kalijevega hidroksida uporabite kot referenco. Ekstinkcija, izmerjena z uporabo 1 cm kivete, bi morala biti 0,200 ± 0,005.

3.2 Pravokotne kvarčne kivete, s pokrovčki, primerne za meritve pri ultravijoličnih valovnih dolžinah (220 do 360 nm), z optičnim dosegom 10 mm. Če jih napolnimo z vodo ali drugim primernim topilom, ne smejo kazati razlik med njimi za več kot 0,01 ekstinkcijske enote.

3.3 Merilne bučke z eno oznako s prostornino 25 ml, razred A.

3.4 Analitska tehtnica, ki omogoča tehtanje do 0,0001 g natančno.

4. REAGENTI

Če ni določeno drugače, pri analizi uporabite le reagente priznane čistoče za analizo in destilirano ali demineralizirano vodo ali vodo enakovredne čistoče.

Topilo: izooktan (2,2,4-trimetilpentan) za merjenje pri 232 nm in 268 nm ter cikloheksan za merjenje pri 232 nm in 270 nm z absorbanco, manjšo od 0,12 pri 232 nm in manjšo od 0,05 pri 270 nm, proti destilirani vodi, izmerjeno v 10-milimetrski kiveti.

5. POSTOPEK

5.1 Vzorec mora biti popolnoma homogen in brez suspendiranih nečistoč. Sicer ga je treba filtrirati skozi papir pri temperaturi približno 30 °C.

5.2 Točno natehtajte približno 0,25 g (na 1 mg natančno) tako pripravljenega vzorca v 25-mililitrsko merilno bučko, dopolnite do oznake s specificiranim topilom in homogenizirajte. Tako pripravljena raztopina mora biti popolnoma čista. Če je raztopina opalescentna ali motna, hitro prefiltrirajte skozi papir. OPOMBA: Na splošno za merjenje absorbance deviških in ekstra deviških oljčnih olj pri 268 nm in 270 nm zadostuje masa 0,25–0,30 g. Za merjenje pri 232 nm je običajno potrebnega 0,05 g vzorca, zato se običajno pripravita dve ločeni raztopini. Za merjenje absorbance olj iz oljčnih tropin, rafiniranih oljčnih olj in oljčnih olj s primesmi je zaradi njihove večje absorbance običajno potreben manjši vzorec, npr. 0,1 g.

5.3 Če je potrebno, popravite bazno linijo (220–290 nm) s topilom v obeh kvarčnih kivetah (vzorčni in referenčni), potem napolnite vzorčno kvarčno kiveto s preskusno raztopino in izmerite ekstinkcije pri 232, 268 ali 270 nm nasproti topilu, ki se uporabi kot referenca. Izmerjene ekstinkcijske vrednosti morajo biti v razponu od 0,1 do 0,8 ali v razponu linearnosti spektrofotometra, ki jo je treba preveriti. Če niso, je treba meritve ponoviti z ustreznimi bolj koncentriranimi ali bolj razredčenimi raztopinami.

5.4 Po opravljenih meritvah absorbance pri 268 ali 270 nm izmerite absorbanco pri λmax, λmax + 4 in λmax – 4. Na podlagi teh vrednosti absorbance se določi variacija specifične ekstinkcije (ΔΚ). OPOMBA: λmax se obravnava kot 268 nm za izooktan, ki se uporablja kot topilo, in 270 nm za cikloheksan.

6. IZRAŽANJE REZULTATOV

6.1 Zapišite specifične ekstinkcije (ekstinkcijske koeficiente) pri različnih valovnih dolžinah, izračunane, kot sledi: pri čemer: Κλ = specifična ekstinkcija pri valovni dolžini λ; Ελ = ekstinkcija, izmerjena pri valovni dolžini λ; c = koncentracija raztopine v g/100 ml; s = dolžina poti kvarčne kivete v cm; izražene na dve decimalni mesti natančno.

6.2 Variacija specifične ekstinkcije (ΔΚ) Variacija absolutne vrednosti ekstinkcije (ΔΚ) se izračuna na naslednji način: pri čemer je Km specifična ekstinkcija pri valovni dolžini maksimalne absorbance pri 270 nm in 268 nm, odvisno od uporabljenega topila. Rezultati se izrazijo na dve decimalni mesti natančno.









PRILOGA X

DOLOČANJE METILNIH ESTROV MAŠČOBNIH KISLIN S PLINSKO KROMATOGRAFIJO

1. NAMEN

V tej prilogi so navodila za določanje prostih in vezanih maščobnih kislin v masti in oljih rastlinskega izvora s plinsko kromatografijo po njihovi pretvorbi v metil estre maščobnih kislin (FAME).

Vezane maščobne kisline triacilglicerolov (TAG) in glede na metodo esterifikacije proste maščobne kisline (FFA) se pretvorijo v metil estre maščobnih kislin (FAME), ki se določijo s kapilarno plinsko kromatografijo.

Metoda iz te priloge omogoča določitev FAME od C12 do C24, vključno z nasičenimi, cis in trans mononenasičenimi ter cis in trans polinenasičenimi metil estri maščobnih kislin.

2. PRINCIP

Plinska kromatografija se uporablja za kvantitativno analizo FAME. FAME se pripravijo v skladu z delom A. Potem se vbrizgajo v injektor in v njem uparijo. Ločevanje FAME se izvaja z analitskimi kolonami s specifično polarnostjo in dolžino. Za ugotavljanje prisotnosti FAME se uporablja plamensko-ionizacijski detektor. Pogoji analize so določeni v delu B.

Kot nosilni plin (mobilna faza) v plinski kromatografiji FAME s plamensko-ionizacijskim detektorjem se lahko uporabi vodik ali helij. Vodik pospeši ločevanje in zagotovi ostrejše vrhove. Stacionarna faza je mikroskopska plast tankega tekočega filma na inertni trdni podlagi iz zlitega silicijevega dioksida.

Pri prehodu skozi kapilarno kolono hlapne spojine, ki se analizirajo, reagirajo s stacionarno fazo, ki je nanesena na notranji površini kolone. Zaradi različnih reakcij različnih spojin je čas eluiranja teh spojin različen, tj. retenzijski čas spojine za določen sklop analiznih parametrov. Primerjava retenzijskih časov se uporablja za določanje različnih spojin.

DEL A

PRIPRAVA METILNIH ESTROV MAŠČOBNIH KISLIN IZ OLJČNEGA OLJA IN OLJA IZ OLJČNIH TROPIN

1. NAMEN

Ta del določa pripravo metilnih estrov maščobnih kislin. Vključuje metodi za pripravo metilnih estrov maščobnih kislin iz oljčnega olja in olja iz oljčnih tropin.

2. PODROČJE UPORABE

Priprava metilnih estrov maščobnih kislin iz oljčnega olja in olja iz oljčnih tropin se izvaja s transesterifikacijo z metanolno raztopino kalijevega hidroksida pri sobni temperaturi. Potreba po čiščenju vzorca pred transesterifikacijo je odvisna od vsebnosti prostih maščobnih kislin v vzorcu in analitskega parametra, ki se lahko določi glede na naslednjo preglednico:







Kategorija olja Metoda Deviško oljčno olje z vsebnostjo kislin ≤ 2,0 % 1. maščobne kisline 2. transmaščobne kisline 3. ΔECN42 (po čiščenju z ekstrakcijo v trdni fazi na silikagelnih kartušah) Rafinirano oljčno olje Oljčno olje, sestavljeno iz rafiniranih oljčnih olj in deviških oljčnih olj Rafinirano oljčno olje iz oljčnih tropin Oljčno olje iz oljčnih tropin Deviško oljčno olje z vsebnostjo kislin > 2,0 % Surovo oljčno olje iz oljčnih tropin 1. maščobne kisline (po čiščenju z ekstrakcijo v trdni fazi na silikagelnih kartušah) 2. transmaščobne kisline (po čiščenju z ekstrakcijo v trdni fazi na silikagelnih kartušah) 3. ΔECN42 (po čiščenju z ekstrakcijo v trdni fazi na silikagelnih kartušah)

3. METODOLOGIJA

3.1 Transesterifikacija z metanolno raztopino kalijevega hidroksida pri sobni temperaturi

3.1.1 Princip

Metilni estri se pripravijo s transesterifikacijo z metanolno raztopino kalijevega hidroksida kot vmesna stopnja pred izvedbo umiljenja.

3.1.2 Reagenti

3.1.2.1 Metanol, ki vsebuje največ 0,5 % (m/m) vode.

3.1.2.2 Heksan kromatografske čistoče.

3.1.2.3 Heptan kromatografske čistoče.

3.1.2.4 Dietil eter, stabiliziran za analizo.

3.1.2.5 Aceton kromatografske čistoče.

3.1.2.6 Elucijsko topilo za čiščenje olja s kolonsko kromatografijo/kromatografijo z ekstrakcijo v trdni fazi, mešanica heksana/dietilnega etra 87/13 (v/v).

3.1.2.7 Kalijev hidroksid, približno 2 M metanolne raztopine: raztopite 11,2 g kalijevega hidroksida v 100 ml metanola.

3.1.2.8 Silikagelne kartuše, 1 g (6 ml), za ekstrakcijo v trdni fazi.

3.1.3 Oprema

3.1.3.1 Epruvete z navojnim zamaškom (s prostornino 5 ml), opremljene s priključkom iz politetrafluoroetilena.

3.1.3.2 Merilna in avtomatska pipeta, prostornine 2 ml in 0,2 ml.

3.1.4 Čiščenje vzorcev olj

Vzorci se po potrebi očistijo, pri čemer se olje spusti skozi silikagelno kartušo za ekstrakcijo v trdni fazi. Silikagelna kartuša (3.1.2.8) se vstavi v vakuumsko napravo za eluiranje in izpere s 6 ml heksana (3.1.2.2); izpiranje se izvede brez vakuuma. Potem se v kolono vnese raztopina olja (približno 0,12 g) v 0,5 ml heksana (3.1.2.2). Raztopina gre skozi kolono in nato eluira z 10 ml heksana/dietil etra (87:13 v/v) (3.1.2.6). Združena eluata se homogenizirata in ločita na dva enaka dela. Alikvot se odpari do suhega v rotacijskem izparilniku pod znižanim pritiskom in pri sobni temperaturi. Ostanek se raztopi v 1 ml heptana in raztopina je pripravljena na analizo maščobnih kislin s plinsko kromatografijo. Drugi alikvot se odpari in ostanek se raztopi v 1 ml acetona za analizo trigliceridov s HPLC, če je to potrebno.

3.1.5 Postopek

V epruveti z navojnim zamaškom in prostornino 5 ml (3.1.3.1) natehtajte približno 0,1 g vzorca olja. Dodajte 2 ml heptana (3.1.2.2) in pretresite. Dodajte 0,2 ml metanolne raztopine kalijevega hidroksida (3.1.2.7), zaprite epruveto z zamaškom, opremljenim s priključkom iz politetrafluoroetilena, in ga čvrsto zamašite ter močno tresite 30 sekund. Pustite, da se razsloji, dokler zgornja raztopina ne postane bistra. Z dekantiranjem ločite zgornjo plast, ki vsebuje metilne estre. Raztopina heptana je pripravljena za vbrizganje v plinski kromatograf. Priporočljivo je, da se raztopina do analize s plinsko kromatografijo hrani v hladilniku. Hramba raztopine več kot 12 ur ni priporočljiva.

DEL B

ANALIZA METILNIH ESTROV MAŠČOBNIH KISLIN S PLINSKO KROMATOGRAFIJO

1. NAMEN

Ta del vključuje splošne smernice za uporabo plinske kromatografije s kapilarnimi kolonami za določanje kvalitativne in kvantitativne sestave mešanice metilnih estrov maščobnih kislin, dobljenih v skladu z metodo iz dela A.

Ta del se ne uporablja za polimerizirane maščobne kisline.

2. REAGENTI

2.1 Nosilni plin

Inertni plin (helij ali vodik), popolnoma posušen in z vsebnostjo kisika, nižjo od 10 mg/kg.

Opomba 1: Vodik lahko podvoji hitrost analize, vendar je nevaren. Varnostne naprave so na voljo.

2.2 Pomožni plini

2.2.1 Vodik (čistost ≥ 99,9 %), brez organskih nečistoč.

2.2.2 Zrak ali kisik, brez organskih nečistoč.

2.2.3 Dušik (čistost > 99 %).

2.3 Referenčni standard

Mešanica metilnih estrov čistih maščobnih kislin ali metilnih estrov maščobe poznane sestave, po možnosti podobne maščobi, ki jo je treba analizirati. Cis in trans izomeri oktadecenojskih, oktadekadienojskih in oktadekatrienojskih metilnih estrov so uporabni za določanje trans izomerov nenasičenih kislin.

Treba je paziti, da se prepreči oksidacija polinenasičenih maščobnih kislin.

3. OPREMA

Navedena navodila se nanašajo na običajno opremo, ki se uporablja za plinsko kromatografijo, z uporabo kapilarnih kolon in plamensko ionizacijskega detektorja.

3.1 Plinski kromatograf

Plinski kromatograf vključuje naslednje elemente:

3.1.1 Sistem za vbrizgavanje

Uporabite sistem za vbrizgavanje s kapilarnimi kolonami, pri čemer mora biti sistem za vbrizgavanje posebej izdelan za uporabo s takšnimi kolonami. Lahko je tip sistema z deljenjem vzorca ali brez deljenja vzorca v koloni.

3.1.2 Peč

Peč je takšna, da lahko segreje kapilarno kolono na temperaturo najmanj 260 °C in ohranja želeno temperaturo do ± 0,1 °C natančno. Zadnja zahteva je zlasti pomembna, kadar se uporablja kapilarna kolona.

Uporaba programiranega temperaturnega gretja se priporoča v vseh primerih in zlasti za maščobne kisline z manj kot 16 ogljikovimi atomi.

3.1.3 Kapilarna kolona

3.1.3.1 Kolona, iz materiala, inertnega na snovi, ki naj bi se analizirale (običajno steklo ali kvarčno steklo). Notranji premer je med 0,20 in 0,32 mm. Notranja površina mora biti ustrezno obdelana (npr. površinska obdelava, pasiviranje) pred nanosom stacionarne faze. Za maščobne kisline ter cis in trans izomere maščobnih kislin zadostuje dolžina 60 m.

3.1.3.2 Primerne so kolone z vezano (zamreženo) stacionarno fazo tipa polarni polisiloksan (cianopropilsilikon). Opomba 2: Obstaja nevarnost, da polarni polisiloksani povzročijo težave pri določanju in ločevanju linolenske kisline in pri kislinah C20. Nanosi so tanki, tj. 0,1 do 0,2 μm.

3.1.3.3 Namestitev in kondicioniranje kolone Upoštevajte običajne varnostne ukrepe za montažo kapilarnih kolon, tj. namestitev kolone v peči (nosilec), izbira in montaža priključkov (tesnjenje), pozicioniranje končnih mest kolone v injektorju in na detektorju (zmanjšanje mrtvih volumnov). Pretok nosilnega plina za kolono dolžine 25 m in notranjega premera 0,3 mm naj bo 0,3 bara (30 kPa). Kondicionirajte kolono s temperaturnim programiranjem peči s hitrostjo 3 °C/min od temperature okolja na temperaturo 10 °C pod temperaturo razpada stacionarne faze. Vzdržujte tako temperaturo peči eno uro do stabilizacije bazne linije. Ohladite jo na 180 °C in nadaljujte pod izotermičnimi pogoji. Opomba 3: Ustrezno predhodno kondicionirane kolone so na voljo v prodaji.

3.1.4 Plamensko ionizacijski detektor in konverter-ojačevalec

3.2 Brizgalka

Brizgalka je maksimalne kapacitete 10 μl z razdelki na 0,1 μl.

3.3 Sistem za pridobivanje podatkov

Sistem za pridobivanje podatkov je prek spleta povezan z detektorji in se uporablja s programsko opremo, primerno za integracijo in normalizacijo vrhov.

4. POSTOPEK

Postopki, opisani v 4.1 do 4.3, se nanašajo na uporabo plamensko ionizacijskega detektorja.

4.1 Preskusni pogoji

4.1.1 Izbor optimalnih delovnih pogojev za kapilarne kolone

Zaradi učinkovitosti in prepustnosti kapilarnih kolon sta ločevanje sestavin in trajanje analize v veliki meri odvisna od pretoka nosilnega plina v koloni. Zato bo treba optimizirati delovne pogoje s prilagoditvijo tega parametra (ali preprosto izgube glave kolone), odvisno od tega, ali je cilj izboljšati ločevanje ali pospešiti analizo.

Naslednji pogoji so se izkazali za primerne za ločevanje FAME (C4 do C26). Primeri kromatogramov so navedeni v Dodatku B:







Temperatura injektorja: 250 °C Temperatura detektorja: 250 °C Temperatura peči: 165 °C (8 min) do 210 °C pri 2 °C/min Nosilni plin hidrogen: tlak v glavi kolone, 179 kPa Skupni pretok: 154,0 ml/min Delilno razmerje: 1:100 Volumen, ki se vbrizga: 1 μl

4.1.2 Določanje resolucije (glej Dodatek A)

Izračunajte resolucijo R dveh sosednjih vrhov I in II na podlagi naslednje formule:

R = 2 × ((dr(II) – d r(I))/(ω(I) + ω(II))) ali R = 2 × ((tr(II) – t r(I))/(ω(I) + ω(II))) (USP) (Farmakopeja Združenih držav Amerike)

ali

R = 1,18 × ((tr(II) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB) (JP (Japonska farmakopeja), EP (Evropska farmakopeja), BP (Britanska farmakopeja))

pri čemer je:

d r(I) retenzijska razdalja vrha I;

d r(II) retenzijska razdalja vrha II;

t r(I) retenzijski čas vrha I;

t r(II) retenzijski čas vrha II;

ω(I) širina baze vrha I;

ω(II) širina baze vrha II;

ω0,5 širina vrha določene spojine na sredini višine vrha.

Če velja ω(I) ≈ ω(II), izračunajte R na podlagi naslednje formule:

R = (dr(II) – d r(I))/ω = (dr(II) – d r(I))/4σ

pri čemer je:

σ običajno odstopanje (glej sliko 1 v Dodatku A).

Če je razdalja dr med dvema vrhovoma d r(II) – d r(I) enaka 4σ, je faktor ločljivosti R = 1.

Če vrhova nista popolnoma ločena, se tangenti na prevojnih točkah sekata na točki C. Da bi bila vrha popolnoma ločena, mora biti razdalja med njima enaka:

d r(II) – d r(I) = 6 σ, pri čemer je R = 1,5 (glej sliko 3 v Dodatku A).

5. IZRAŽANJE REZULTATOV

5.1 Kvalitativna analiza

Identificirajte vrhove metilnih estrov v vzorcu iz kromatograma iz slike 1 v Dodatku B, po potrebi z interpolacijo ali primerjavo z referenčnimi mešanicami za vrhove metilnih estrov (kot je navedeno v točki 2.3).

5.2 Kvantitativna analiza

5.2.1 Določanje sestave

Izračunajte masni delež w i posameznih metilnih estrov maščobnih kislin, izražen kot masni odstotni delež metilnih estrov, na naslednji način:

5.2.2 Metoda izračuna

5.2.2.1 Splošni primer

Izračunajte vsebnost dane komponente i, izražene kot masni odstotni delež metilnih estrov, tako da določite površinski delež zadevnega vrha glede na vsoto površin vseh vrhov, na podlagi naslednje formule:

wi = (Ai/ΣA) × 100

pri čemer je:

Ai površina vrha posameznega metilnega estra maščobnih kislin i;

ΣA vsota površin vseh vrhov vseh metilnih estrov maščobnih kislin.

Rezultati se izrazijo na dve decimalni mesti natančno.

Opomba 4: Pri maščobah in oljih je masni delež metilnih estrov maščobnih kislin enak masnemu deležu triacilglicerolov v gramih na 100 g. V primerih, ko ta predpostavka ni dovoljena, glej 5.2.2.2.

5.2.2.2 Uporaba korekcijskih faktorjev

V določenih primerih, na primer ob prisotnosti maščobnih kislin z manj kot osmimi ogljikovimi atomi ali kislinami s sekundarnimi skupinami, se površine popravijo s specifičnimi korekcijskimi faktorji (Fci). Ti faktorji se določijo za vsak instrument. V ta namen se uporabi primeren referenčni material s certificirano sestavo maščobnih kislin v ustreznem razponu.

Opomba 5: Ti korekcijski faktorji niso enaki teoretičnim korekcijskim faktorjem plamensko-ionizacijskega detektorja iz Dodatka A, ki vključujejo tudi uspešnost sistema za vbrizgavanje itd. Vendar bi bilo treba v primeru večjih razlik preveriti uspešnost celotnega sistema.

Za to referenčno mešanico je masni odstotni delež FAME i podan s formulo:

wi = (mi /Σm) × 100

pri čemer:

m i je masa FAME i v referenčni mešanici;

Σm je vsota mas vseh sestavin kot FAME v referenčni mešanici.

Iz kromatograma referenčne mešanice izračunajte odstotni delež površine FAME i, kot sledi:

wi = (Ai/ΣA) × 100

pri čemer:

Ai je površina FAME i v referenčni mešanici;

ΣA je vsota vseh površin vseh FAME v referenčni mešanici.

Korekcijski faktor Fc se izračuna:

Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm)

V vzorcu se masni odstotni delež posameznega FAME i izračuna:

wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai)

Rezultati se izrazijo na dve decimalni mesti natančno.

Opomba 6: Izračunana vrednost ustreza masnemu odstotnemu deležu posamezne maščobne kisline, ki je izračunan kot triacilgliceroli na 100 g maščobe.

5.2.2.3 Uporaba internega standarda

Pri nekaterih analizah (na primer, kadar vse maščobne kisline niso kvantificirane, kot v prisotnosti kislin s štirimi ali šestimi ogljiki ob kislinah s 16 ali 18 ogljikovimi atomi ali kadar je treba določiti absolutno količino maščobne kisline v vzorcu) je treba uporabiti interni standard. Pogosto se uporabljajo maščobne kisline s 5, 15 ali 17 ogljikovimi atomi. Treba je določiti (morebitni) korekcijski faktor za interni standard.

Masni odstotni delež sestavine i, izražen kot metilni estri, je potem podan s formulo:

wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS)

pri čemer:

A i je površina FAME i;

A IS je površina internega standarda;

F i je korekcijski faktor maščobne kisline i, izražene kot FAME;

F IS je korekcijski faktor internega standarda;

m je masa vzorca za analizo v miligramih;

m IS je masa internega standarda v miligramih.

Rezultati se izrazijo na dve decimalni mesti natančno.

6. POROČILO O PRESKUSU

V poročilu o preskusu se navedejo metode, uporabljene za pripravo metilnih estrov in za analizo s plinsko kromatografijo. Navedejo se tudi vse delovne podrobnosti, ki v tej standardni metodi niso določene ali veljajo za neobvezne, skupaj s podrobnostmi kakršnega koli dogodka, ki bi lahko vplival na rezultate.

Poročilo o preskusu vključuje vse informacije, potrebne za popolno identifikacijo vzorca.

7. TOČNOST

7.1 Rezultati medlaboratorijskega preskusa

Podrobnosti medlaboratorijskega preskusa glede točnosti metode so določene v Prilogi C k standardu IOC/T.20/Dok. št. 33. Vrednosti, ki izhajajo iz tega medlaboratorijskega preskusa, mogoče ne bodo ustrezale razponom koncentracij in matricam, ki se od danih razlikujejo.

7.2 Ponovljivost

Absolutna razlika med rezultatoma dveh neodvisnih posameznih preskusov, ki ju v kratkem časovnem presledku po enaki metodi na enakem preskusnem materialu v istem laboratoriju izvede isti izvajalec z uporabo iste opreme, ne sme biti v več kot 5 % primerov večja od vrednosti r iz preglednic 1 do 14 iz Priloge C k standardu IOC/T.20/Dok. št. 33.

7.3 Obnovljivost

Absolutna razlika med rezultatoma dveh posamezni