2009R0152 — SL — 12.02.2013 — 002.001

Ta dokument je mišljen zgolj kot dokumentacijsko orodje in institucije za njegovo vsebino ne prevzemajo nobene odgovornosti

►B UREDBA KOMISIJE (ES) št. 152/2009 z dne 27. januarja 2009 o določitvi metod vzorčenja in analitskih metod za uradni nadzor krme (Besedilo velja za EGP) (UL L 054, 26.2.2009, p.1)

spremenjena z:









▼B

UREDBA KOMISIJE (ES) št. 152/2009

z dne 27. januarja 2009

o določitvi metod vzorčenja in analitskih metod za uradni nadzor krme

(Besedilo velja za EGP)







KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE – ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske skupnosti, ob upoštevanju Uredbe (ES) št. 882/2004 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 29. aprila 2004 o izvajanju uradnega nadzora, da se zagotovi preverjanje skladnosti z zakonodajo o krmi in živilih ter s pravili o zdravstvenem varstvu živali in zaščiti živali ( 1 ), ter zlasti člena 11(4)(a), (b) in (c) Uredbe, ob upoštevanju naslednjega: (1) Naslednji akti so bili sprejeti za izvajanje Direktive 70/373/EGS in ostanejo veljavni v skladu s členom 61(2) Uredbe (ES) št. 882/2004: — Prva Direktiva Komisije 71/250/EGS z dne 15. junija 1971 o določitvi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme ( 2 ), — Druga Direktiva Komisije 71/393/EGS z dne 18. novembra 1971 o uvedbi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme ( 3 ), — Tretja Direktiva Komisije 72/199/EGS z dne 27. aprila 1972 o določitvi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme ( 4 ), — Četrta Direktiva Komisije 73/46/EGS z dne 5. decembra 1972 o določitvi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme ( 5 ), — Prva Direktiva Komisije 76/371/EGS z dne 1. marca 1976 o določitvi metod Skupnosti za vzorčenje pri uradnem nadzoru krme ( 6 ), — Sedma Direktiva Komisije 76/372/EGS z dne 1. marca 1976 o določitvi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme ( 7 ), — Osma Direktiva Komisije 78/633/EGS z dne 15. junija 1978 o uvedbi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme ( 8 ), — Deveta Direktiva Komisije 81/715/EGS z dne 31. julija 1981 o določitvi metod analize Skupnosti pri uradnem nadzoru krme ( 9 ), — Deseta Direktiva Komisije 84/425/EGS z dne 25. julija 1984 o določitvi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme ( 10 ), — Direktiva Komisije 86/174/EGS z dne 9. aprila 1986 o določitvi metode računanja energijske vrednosti krmnih mešanic za perutnino ( 11 ), — Enajsta Direktiva Komisije 93/70/EGS z dne 28. julija 1993 o določitvi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme ( 12 ), — Dvanajsta Direktiva Komisije 93/117/ES z dne 17. decembra 1993 o uvedbi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme ( 13 ), — Direktiva Komisije 98/64/ES z dne 3. septembra 1998 o uvedbi analitskih metod Skupnosti za določanje vsebnosti aminokislin, surovih olj in masti ter olakvindoksa v krmi in o spremembi Direktive 71/393/EGS ( 14 ), — Direktiva Komisije 1999/27/ES z dne 20. aprila 1999 o določitvi analitskih metod Skupnosti za določanje amproliuma, diklazurila in karbadoksa v krmi in spremembi direktiv 71/250/EGS in 73/46/EGS ter o razveljavitvi Direktive 74/203/EGS ( 15 ), — Direktiva Komisije 1999/76/ES z dne 23. julija 1999 o določitvi analitskih metod Skupnosti za določanje lasalocid natrija v krmi ( 16 ), — Direktiva Komisije 2000/45/ES z dne 6. julija 2000 o določitvi analitskih metod Skupnosti za določanje vitamina A, vitamina E in triptofana v krmi ( 17 ), — Direktiva Komisije 2002/70/ES z dne 26. julija 2002 o določitvi zahtev za določanje vrednosti dioksinov in dioksinom podobnih PCB-jev v krmi ( 18 ), — Direktiva Komisije 2003/126/ES z dne 23. decembra 2003 o analitski metodi za določanje sestavin živalskega izvora pri uradnem nadzoru krme ( 19 ). (2) Ker je Uredba (ES) št. 882/2004 nadomestila Direktivo 70/373/EGS, je primerno nadomestiti izvedbene akte k navedeni direktivi z eno uredbo. Hkrati je treba prilagoditi metode glede na znanstvene in tehnološke dosežke. Črtati je treba metode, ki ne veljajo več za njihovo nameravano uporabo. Čeprav je predvidena pravočasna posodobitev določb o vzorčenju, da se upoštevajo zadnji dosežki pri proizvodnji, shranjevanju, prevozu in trženju krme, je za zdaj ustrezno ohraniti obstoječe določbe o vzorčenju. (3) Zato je treba razveljaviti direktive 71/250/EGS, 71/393/EGS, 72/199/EGS, 73/46/EGS, 76/371/EGS, 76/372/EGS, 78/633/EGS, 81/715/EGS, 84/425/EGS, 86/174/EGS, 93/70/EGS, 93/117/ES, 98/64/ES, 1999/27/ES, 1999/76/ES, 2000/45/ES, 2002/70/ES in 2003/126/ES. (4) Ukrepi, predvideni s to uredbo, so v skladu z mnenjem Stalnega odbora za prehranjevalno verigo in zdravje živali – ob upoštevanju naslednjega: SPREJELA NASLEDNJO UREDBO:







Člen 1

Vzorčenje za uradni nadzor krme v zvezi z določanjem sestavin, dodatkov in nezaželenih snovi, razen ostankov pesticidov in mikroorganizmov, se izvaja v skladu z metodami iz Priloge I.

Člen 2

Priprava vzorcev za analizo in prikaz rezultatov se izvajata v skladu z metodami iz Priloge II.

Člen 3

Analiza za uradni nadzor krme se izvaja z uporabo metod iz Priloge III (Analitske metode za nadzor sestave posamičnih krmil in krmnih mešanic), Priloge IV (Analitske metode za nadzor ravni dovoljenih krmnih dodatkov), Priloge V (Analitske metode za nadzor nezaželenih snovi v krmi) in Priloge VI (Analitske metode za določitev sestavin živalskega izvora za uradni nadzor krme).

Člen 4

Energijska vrednost krmnih mešanic za perutnino se izračuna v skladu s Prilogo VII.

Člen 5

Za potrditev se uporabljajo analitske metode za nadzor nedovoljenih krmnih dodatkov iz Priloge VIII.

Člen 6

Direktive 71/250/EGS, 71/393/EGS, 72/199/EGS, 73/46/EGS, 76/371/EGS, 76/372/EGS, 78/633/EGS, 81/715/EGS, 84/425/EGS, 86/174/EGS, 93/70/EGS, 93/117/ES, 98/64/ES, 1999/27/ES, 1999/76/ES, 2000/45/ES, 2002/70/ES in 2003/126/ES se razveljavijo.

Sklici na razveljavljene direktive se upoštevajo kot sklici na to uredbo in se berejo v skladu s korelacijsko tabelo iz Priloge IX.

Člen 7

Ta uredba začne veljati dvajseti dan po objavi v Uradnem listu Evropske unije.

Uporablja se od 26. avgusta 2009

Ta uredba je v celoti zavezujoča in se neposredno uporablja v vseh državah članicah.









PRILOGA I

METODE VZORČENJA

1. NAMEN IN PODROČJE UPORABE

Vzorci za uradni nadzor krme se jemljejo v skladu s spodaj opisanimi metodami. Tako dobljeni vzorci se obravnavajo kot reprezentativni za vzorčene deleže.

2. OSEBJE, KI JEMLJE VZORCE

Vzorce jemljejo osebe, ki jih za to pooblastijo države članice.

3. OPREDELITEV POJMOV

Vzorčeni delež: količina proizvoda, ki predstavlja enoto in ima značilnosti, ki se obravnavajo kot enotne.

Posamični vzorec: količina, ki se vzame iz ene točke vzorčenega deleža.

Skupni vzorec: skupek posamičnih vzorcev, vzetih iz istega vzorčenega deleža.

Zmanjšan skupni vzorec: reprezentativni del skupnega vzorca, dobljen iz slednjega s postopkom redukcije.

Končni vzorec: del zmanjšanega skupnega vzorca ali homogeniziranega skupnega vzorca.

4. OPREMA

4.1 Oprema za vzorčenje mora biti izdelana iz snovi, ki ne morejo onesnažiti proizvodov, katerih vzorci se jemljejo. Takšno opremo lahko države članice uradno odobrijo.

4.2 Priporočena oprema za vzorčenje trdne krme

4.2.1 Ročno vzorčenje

4.2.1.1 Lopatka z ravnim dnom in navpičnimi stranicami.

4.2.1.2 Sonda za vzorčenje z dolgo režo ali razdelki. Dimenzije sonde za vzorčenje morajo ustrezati značilnostim vzorčenega deleža (globina posode, velikost vreče itd.) in velikosti delcev krme.

4.2.2 Mehansko vzorčenje

Za vzorčenje premikajoče se krme se lahko uporablja odobrena mehanska oprema.

4.2.3 Razdelilnik

Naprava, namenjena za delitev vzorca na približno enake dele, ki se lahko uporablja za jemanje posamičnih vzorcev ter za pripravo zmanjšanih skupnih in končnih vzorcev.

5. KOLIČINSKE ZAHTEVE







5.A Pri nadzoru snovi ali proizvodov, ki so enakomerno porazdeljeni po krmi. 5.A.1 Vzorčeni delež Velikost vzorčenega deleža mora biti takšna, da se lahko vzorči vsak njegov sestavni del. 5.A.2 Posamični vzorci 5.A.2.1 Razsuta krma: Najmanjše število posamičnih vzorcev: 5.A.2.1.1 vzorčeni deleži, ki ne presegajo 2,5 tone 7 5.A.2.1.2 vzorčeni deleži, ki presegajo 2,5 tone √ 20-kratnik teže vzorčenega deleža (1) v tonah, do največ 40 posamičnih vzorcev 5.A.2.2 Pakirana krma: Najmanjše število paketov za vzorčenje (2): 5.A.2.2.1 Paketi, težji od 1 kg: 5.A.2.2.1.1 vzorčeni deleži iz 1 do 4 paketov vsi paketi 5.A.2.2.1.2 vzorčeni deleži iz 5 do 16 paketov 4 5.A.2.2.1.3 vzorčeni deleži iz več kot 16 paketov √ število paketov, ki sestavljajo vzorčeni delež (1), do največ 20 paketov 5.A.2.2.2 Paketi, težki do 1 kg 4 5.A.2.3 Tekoča ali poltekoča krma: Najmanjše število posod za vzorčenje (2): 5.A.2.3.1 posode s prostornino več kot 1 liter: 5.A.2.3.1.1 vzorčeni deleži iz 1 do 4 posod vse posode 5.A.2.3.1.2 vzorčeni deleži iz 5 do 16 posod 4 5.A.2.3.1.3 vzorčeni deleži iz več kot 16 posod √ število posod, ki sestavljajo vzorčeni delež (1), do največ 20 posod 5.A.2.3.2 Posode s prostornino do 1 litra 4 5.A.2.4 Krmni bloki in mineralni lizalni kamni Najmanjše število blokov ali lizalnih kamnov za vzorčenje (2): 1 blok ali lizalni kamen na vzorčeni delež s 25 enotami, do največ 4 bloki ali lizalni kamni 5.A.3 Skupni vzorec: zahtevan je en skupni vzorec na vzorčeni delež. Skupno število posamičnih vzorcev, ki sestavljajo skupni vzorec, ne sme biti manjše kot: 5.A.3.1 razsuta krma 4 kg 5.A.3.2 pakirana krma: 5.A.3.2.1 paketi, težji od 1 kg 4 kg 5.A.3.2.2 paketi, težki do 1 kg teža vsebine 4 izvirnih paketov 5.A.3.3 Tekoča ali poltekoča krma: 5.A.3.3.1 posode s prostornino več kot 1 liter 4 litre 5.A.3.3.2 posode s prostornino do 1 litra količina vsebine 4 izvirnih paketov 5.A.3.4 Krmni bloki ali mineralni lizalni kamni: 5.A.3.4.1 teže več kot 1 kg po kosu 4 kg 5.A.3.4.2 teže do 1 kg po kosu teža štirih izvirnih blokov ali lizalnih kamnov 5.A.4 Končni vzorci Iz skupnega vzorca se po potrebi po redukciji oblikuje končni vzorec. Zahtevana je analiza vsaj enega končnega vzorca. Količina končnega vzorca za analizo ne sme biti manjša od: trdna krma 500 g tekoča ali poltekoča krma 500 ml 5.B Pri nadzoru nezaželenih snovi ali proizvodov, za katere obstaja verjetnost, da bodo neenakomerno porazdeljeni po krmi, kot so aflatoksini, rženi rožički, ricinus in krotalarija v posamičnih krmilih (3) 5.B.1 Vzorčeni delež: glej 5.A.1 5.B.2 Posamični vzorci 5.B.2.1 Razsuta krma: glej 5.A.2.1 5.B.2.2 Pakirana krma: Najmanjše število paketov za vzorčenje: 5.B.2.2.1 vzorčeni deleži iz 1 do 4 paketov vsi paketi 5.B.2.2.2 vzorčeni deleži iz 5 do 16 paketov 4 5.B.2.2.3 vzorčeni deleži iz več kot 16 paketov √ število paketov, ki sestavljajo vzorčeni delež (1), do največ 40 paketov 5.B.3 Skupni vzorci Število skupnih vzorcev je odvisno od velikosti vzorčenega deleža. Najmanjše število skupnih vzorcev na vzorčeni delež je navedeno spodaj. Skupna teža posamičnih vzorcev, ki sestavljajo vsak skupni vzorec, ne sme biti manjša od 4 kg: 5.B.3.1 Razsuta krma Teža vzorčenega deleža v tonah: Najmanjše število skupnih vzorcev na vzorčen delež: do vključno 1 1 več kot 1 in do vključno 10 2 več kot 10 in do vključno 40 3 več kot 40 4 5.B.3.2 Pakirana krma Število paketov vzorčenega deleža: Najmanjše število skupnih vzorcev na vzorčen delež: 1 do 16 1 17 do 200 2 201 do 800 3 več kot 800 4 5.B.4 Končni vzorci Iz vsakega skupnega vzorca se po zmanjšanju oblikuje končni vzorec. Zahteva se analiza vsaj enega končnega vzorca na vzorčeni delež. Teža končnega vzorca za analizo ne sme biti manjša od 500 g. (1) Kadar število ni celo število, se zaokroži navzgor na naslednje celo število. (2) Za pakete ali posode, katerih vsebina ne presega 1 kg ali 1 litra, ter za bloke ali lizalne kamne, ki posamično ne tehtajo več kot 1 kg, je vsebina posamičnega vzorca en izvirni paket ali izvirna posoda, en blok ali en kamen. (3) Metode iz 5.A se uporabljajo za nadzor aflatoksinov, rženih rožičkov, ricinusa in krotalarije pri popolnih in dopolnilnih krmnih mešanicah.

6. NAVODILA ZA JEMANJE, PRIPRAVO IN PAKIRANJE VZORCEV

6.1 Splošno

Vzorci se morajo jemati in pripravljati v najkrajšem možnem času, pri tem pa se morajo upoštevati vsi potrebni previdnostni ukrepi za preprečitev spremembe ali onesnaženja proizvoda. Instrumenti ter površine in posode, namenjeni za sprejem vzorcev, morajo biti čisti in suhi.

6.2 Posamični vzorci

6.2.A Pri nadzoru snovi ali proizvodov, ki so enakomerno porazdeljeni po krmi

Posamični vzorci morajo biti vzeti naključno iz celega vzorčenega deleža in morajo biti približno enako veliki.

6.2.A.1 Razsuta krma

Vzorčeni delež se razdeli na približno enake namišljene dele. Število delov, ki ustreza zahtevanemu številu posamičnih vzorcev v skladu s točko 5.A.2, se izbere naključno in iz vsakega od njih se vzame vsaj en vzorec.

Po potrebi se lahko vzorčenje opravi med premikanjem (nakladanjem ali razkladanjem) vzorčenega deleža.

6.2.A.2 Pakirana krma

Po izbiri zahtevanega števila paketov za vzorčenje, kot je navedeno v točki 5.A.2, se del vsebine vsakega paketa odstrani s sondo ali lopatko. Po potrebi se paketi izpraznijo ločeno in šele nato vzamejo vzorci. V vsakem posameznem skupnem vzorcu se kakršne koli grude razbijejo po potrebi z ločevanjem in vrnitvijo v vzorec.

6.2.A.3 Homogenizirana ali za homogeniziranje primerna tekoča ali poltekoča krma

Po izbiri zahtevanega števila posod za vzorčenje iz točke 5.A.2 se vsebina po potrebi homogenizira in iz vsake posode se vzame določena količina.

Posamični vzorci se lahko vzamejo, ko se posoda izprazni.

6.2.A.4 Tekoča ali poltekoča krma, ki ni primerna za homogeniziranje

Po izbiri zahtevanega števila posod za jemanje vzorcev iz točke 5.A.2 se vzorci vzamejo z različnih ravni.

Vzorci se lahko vzamejo tudi, ko se posoda izprazni, vendar se prvi deli zavržejo.

Vsa odvzeta količina v nobenem primeru ne sme biti manjša od 10 litrov.

6.2.A.5 Krmni bloki in mineralni lizalni kamni

Po izbiri zahtevanega števila blokov ali lizalnih kamnov za vzorčenje iz točke 5.A.2 se vzame del vsakega bloka ali lizalnega kamna.

6.2.B Pri nadzoru nezaželenih snovi ali proizvodov, za katere obstaja verjetnost, da bodo neenakomerno porazdeljeni po krmi, kot so aflatoksini, rženi rožički, ricinus in krotalarija v posamičnih krmilih

Vzorčeni delež se razdeli na približno enake namišljene dele, ki ustrezajo številu skupnih vzorcev iz točke 5.B.3. Če je to število višje od ena, se skupno število posamičnih vzorcev iz točke 5.B.2 približno enakomerno razdeli po različnih delih. Nato se vzamejo približno enako veliki vzorci ( 20 ), ki morajo biti takšni, da skupna količina v vzorcih iz vsakega dela ni manjša od najmanj 4 kg, kolikor se zahteva za vsak skupni vzorec. Posamični vzorci, odvzeti iz različnih delov, se ne združijo v skupni vzorec.

6.3 Priprava skupnih vzorcev

6.3.A Pri nadzoru snovi ali proizvodov, ki so enakomerno porazdeljeni po krmi

Posamični vzorci se zmešajo, da sestavljajo skupni vzorec.

6.3.B Pri nadzoru nezaželenih snovi ali proizvodov, za katere obstaja verjetnost, da bodo neenakomerno porazdeljeni po krmi, kot so aflatoksini, rženi rožički, ricinus in krotalarija v posamičnih krmilih

Posamični vzorci iz vsakega dela vzorčenega deleža se zmešajo in pripravi se število skupnih vzorcev iz točke 5.B.3, pri čemer je treba zabeležiti izvor vsakega skupnega vzorca.

6.4 Priprava končnih vzorcev

Material v vsakem skupnem vzorcu se previdno zmeša, da nastane homogeniziran vzorec ( 21 ). Po potrebi se skupni vzorec najprej zmanjša na najmanj 2 kg ali 2 litra (zmanjšan skupni vzorec), in sicer z uporabo mehanskega ali avtomatskega razdelilnika ali razdelitvijo na četrtine.

Nato se pripravijo vsaj trije končni vzorci, ki so približno enako veliki in ustrezajo količinskim zahtevam iz točke 5.A.4 ali 5.B.4. Vsak vzorec se shrani v ustrezno posodo. Sprejeti je treba vse potrebne previdnostne ukrepe, da se med prevozom ali shranjevanjem prepreči kakršna koli sprememba sestave vzorca, onesnaženje ali mešanje.

6.5 Pakiranje končnih vzorcev

Posode ali paketi se zapečatijo in označijo z etiketami (celotna etiketa mora biti vključena v pečat) tako, da jih ni mogoče odpreti, ne da bi se pri tem poškodoval pečat.

7. EVIDENTIRANJE VZORČENJA

Vsako vzorčenje je treba evidentirati, tako da se lahko vsak vzorčeni delež nedvoumno prepozna.

8. POŠILJANJE VZORCEV

Za vsak skupni vzorec se v pooblaščeni laboratorij za analizo v najkrajšem možnem času pošlje najmanj en končni vzorec skupaj z vsemi informacijami, ki jih potrebuje oseba, ki izvaja analizo.









PRILOGA II

SPLOŠNE DOLOČBE O ANALITSKIH METODAH ZA KRMO

A. PRIPRAVA VZORCEV ZA ANALIZO

1. Namen

Spodaj navedeni postopki opisujejo pripravo končnih vzorcev za analizo, ki se pošljejo nadzornim laboratorijem po vzorčenju v skladu z določbami iz Priloge I.

Ti vzorci se morajo pripraviti tako, da so natehtane količine, določene za analitske metode, homogene in reprezentativne za končne vzorce.

2. Previdnostni ukrepi

Postopek za pripravo vzorca je odvisen od uporabljene analitske metode. Zato je zelo pomembno zagotoviti, da je postopek za pripravo vzorca primeren za uporabljeno analitsko metodo.

Vse potrebne operacije se morajo izvesti tako, da se čim bolj prepreči onesnaženje vzorca in sprememba njegove sestave.

Drobljenje, mešanje in sejanje se izvedejo na najhitrejši možni način, tako da je vzorec čim manj izpostavljen zraku in svetlobi. Mlini in drobilci, ki verjetno znatno segrejejo vzorec, se ne uporabljajo.

Krmo, ki je posebej občutljiva na toploto, je priporočljivo drobiti ročno. Pri delu z opremo se zagotovi, da ni vir onesnaženja z elementi v sledovih.

Če pri pripravi ni možno preprečiti bistvene spremembe vsebnosti vlage v vzorcu, je treba v skladu z metodo iz dela A Priloge III določiti vsebnost vlage pred in po pripravi.

3. Postopek

Vzorec se z ustreznimi tehnikami delitve, kot sta izmenično odvzemanje vzorca z zajemalko ali odvzemanje vzorca ob stacionarnem ali rotacijskem mešanju, razdeli na ustrezne manjše vzorce za analizo in za referenčne vzorce. Stožčasta delitev vzorca ali delitev vzorca v četrtine nista priporočljivi, ker se lahko pojavijo hude napake v cepitvi podvzorcev. Referenčni vzorec je treba hraniti v primerno čisti in suhi posodi z neprepustnim zamaškom, manjše dele, ki tehtajo vsaj 100 g, pa je treba pripraviti za analizo, kakor je navedeno v nadaljnjem besedilu.

3.1 Krma, ki jo je mogoče drobiti kot tako

Če v analitski metodi ni navedeno drugače, se po drobljenju celoten vzorec po potrebi preseje s sitom s kvadratnimi odprtinami 1 mm (v skladu s priporočilom ISO R565). Izogibati se je treba prekomernemu drobljenju.

Presejani vzorec se premeša in zbere v primerno čisto in suho posodo z neprepustnim zamaškom. Tik preden se natehta količina za analizo, se vzorec še enkrat premeša.

3.2 Krma, ki jo je mogoče drobiti po sušenju

Če v analitski metodi ni navedeno drugače, se vzorec v skladu s postopkom za predhodno sušenje iz točke 4.3 metode za določanje vsebnosti vlage iz dela A Priloge III suši toliko časa, da se vsebnost vlage zniža na 8–12 %. Nato se nadaljuje, kakor je navedeno v oddelku 3.1.

3.3 Tekoča ali poltekoča krma

Vzorec se zbere v primerno čisto in suho posodo z neprepustnim zamaškom. Tik preden se natehta količina za analizo, se vzorec še enkrat dobro premeša.

3.4 Druga krma

Vzorci, ki se ne morejo pripraviti v skladu z enim izmed zgoraj navedenih postopkov, se obdelajo po katerem koli drugem postopku, ki zagotavlja, da bo količina vzorca, natehtana za analizo, homogena in reprezentativna za končne vzorce.

4. Shranjevanje vzorcev

Vzorci se morajo hraniti pri temperaturi, ki ne bo spremenila njihove sestave. Vzorci, namenjeni za analizo vitaminov ali snovi, ki so posebno občutljive na svetlobo, se hranijo v posodah iz rjavega stekla.

B. DOLOČBE O REAGENTIH IN OPREMI, KI SE UPORABLJAJO PRI ANALITSKIH METODAH

1. Če v analitskih metodah ni posebej določeno, morajo biti vsi reagenti za analizo analitsko čisti (a.č.). Pri analiziranju sledov se mora čistost reagentov preveriti s slepim preskusom. Glede na dobljene rezultate je morda potrebno dodatno čiščenje reagentov.

2. Pri vseh postopkih analitskih metod, ki vključujejo pripravo raztopin, razredčevanje, spiranje ali izpiranje in pri katerih vrsta uporabljenega topila ali razredčila ni navedena, se mora uporabiti voda. Praviloma je voda demineralizirana ali destilirana. V posameznih primerih, ki so posebej navedeni v analitskih metodah, jo je treba prečistiti s posebnimi postopki.

3. Ob upoštevanju opreme, ki je ponavadi prisotna v kontrolnih laboratorijih, so pri analitskih metodah navedeni le posebni instrumenti in naprave ali tisti, ki zahtevajo posebno uporabo. Biti morajo čisti, zlasti pri določanju zelo nizkih količin snovi.

C. UPORABA ANALITSKIH METOD IN PRIKAZ REZULTATOV

1. Postopek ekstrakcije

Pri številnih metodah je določen poseben postopek ekstrakcije. Praviloma se lahko uporabijo postopki ekstrakcije, ki se razlikujejo od postopka iz metode, če je za uporabljeni postopek učinkovitost ekstrakcije za analizirano matrico dokazano enakovredna postopku iz metode.

2. Postopek čiščenja

Pri številnih metodah je določen poseben postopek čiščenja. Praviloma se lahko uporabijo drugi postopki čiščenja, ki se razlikujejo od postopka iz metode, če je za uporabljeni postopek analitska učinkovitost čiščenja za analizirano matrico dokazano enakovredna postopku iz metode.

3. Poročanje o uporabljeni analitski metodi

Na splošno je za določanje vsake snovi v krmi določena ena sama metoda. Kadar je določenih več metod, mora kontrolni laboratorij v poročilu o analizi navesti, katero metodo je uporabil.

4. Število določanj

Rezultat, naveden v poročilu o analizi, je srednja vrednost vsaj dveh določanj z zadovoljivo ponovljivostjo, izvedenih na ločenih vzorčenih deležih.

Vendar pri analizi nezaželenih snovi, če je rezultat prvega določanja bistveno (> 50 %) nižji od specifikacije, ki se nadzira, dodatna določanja niso potrebna, če so bili uporabljeni ustrezni kakovostni postopki.

Pri nadzoru navedene vsebnosti snovi ali sestavine, če rezultat prvega določanja potrdi navedeno vsebnost, tj. rezultat analize je znotraj sprejemljivih meja odstopanja navedene vsebnosti, dodatna določanja niso potrebna, če so bili uporabljeni ustrezni kakovostni postopki.

V nekaterih primerih je ta sprejemljiva meja odstopanja opredeljena v zakonodaji, kot je Direktiva Sveta 79/373/EGS ( 22 ).

5. Poročanje o rezultatih analize

Rezultat analize se prikaže tako, kakor je navedeno v analitski metodi, na primerno število decimalk, in se po potrebi popravi glede na vsebnost vlage v končnem vzorcu pred pripravo.

6. Nezanesljivost meritve in popravek za izkoristek pri analizi nezaželenih snovi

V zvezi z nezaželenimi snovmi po Direktivi 2002/32/ES, vključno z dioksini in dioksinom podobnimi PCB, se proizvod, namenjen za živalsko krmo, šteje za neskladnega z določeno najvišjo vsebnostjo, če rezultat analize presega najvišjo vsebnost ob upoštevanju razširjene nezanesljivosti meritve in popravka za izkoristek. Za oceno skladnosti se uporabi analizirana koncentracija s popravkom za izkoristek, od katere se odšteje razširjena nezanesljivost meritve. Ta postopek se uporabi le v primerih, kadar analitska metoda omogoča oceno nezanesljivosti meritve in popravka za izkoristek (tj. ni možna na primer v primeru mikroskopske analize).

O rezultatu analize se poroča (če uporabljena analitska metoda omogoča oceno nezanesljivosti meritve in popravka za izkoristek) na naslednji način:

(a) s popravkom za izkoristek, pri čemer se navede raven popravka. Popravek za izkoristek ni potrebno uporabiti, če je 90–110-odstoten;

(b) kot „x +/– U“, pri čemer je x rezultat analize in U razširjena nezanesljivost meritve, ob uporabi faktorja za zajetje 2, zaradi katerega je stopnja zanesljivosti približno 95 %.

Vendar če je rezultat analize bistveno (> 50 %) nižji od specifikacije, ki se določa, in je bil uporabljen ustrezni kakovostni postopek ter je namen analize le preverjanje skladnosti z zakonodajnimi določbami, se lahko rezultat analize poroča brez popravka za izkoristek, popravek za izkoristek in nezanesljivost meritve pa se lahko v teh primerih izpustita.









PRILOGA III

ANALITSKE METODE ZA NADZOR SESTAVE POSAMIČNIH KRMIL IN KRMNIH MEŠANIC

A. DOLOČANJE VLAGE

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje vsebnosti vlage v krmi. Kadar krma vsebuje hlapne snovi, kot so organske kisline, je treba upoštevati, da se pri določanju vlage zajame tudi bistvena količina hlapnih snovi.

Ta metoda ne zajema analizo mlečnih izdelkov kot posamičnih krmil, analizo mineralnih snovi, analizo mineralnih mešanic, sestavljenih predvsem iz mineralnih snovi, analizo živalskih in rastlinskih maščob in olj ali analizo oljnih semen in oljnatega sadja.

2. Načelo

Vzorec se osuši pri določenih pogojih, ki se spreminjajo glede na vrsto krme. Izguba mase se določi s tehtanjem. Pri trdni krmi z visoko vsebnostjo vlage je treba izvesti predhodno sušenje.

3. Oprema

3.1 Drobilec iz materiala, ki ne absorbira vlage, in se lahko enostavno čisti, omogoča hitro in enakomerno drobljenje brez pregretja, v največji možni meri preprečuje stik z zunanjim zrakom ter ustreza zahtevam iz 4.1.1 in 4.1.2 (npr. udarni ali vodno hlajeni mikrodrobilci, konusni mlini, počasni drobilniki ali drobilniki na zobata kolesa).

3.2 Analitska tehtnica, natančna na 1 mg

3.3 Suhe posode iz nerjaveče kovine ali stekla s pokrovi, ki omogočajo zapiranje, neprepustno za zrak; delovna površina, ki omogoča razprostrtje vzorca na približno 0,3 g/cm2.

3.4 Električno ogrevan izotermičen sušilnik (± 2 oC) s primerno ventilacijo in ki zagotavlja hitro uravnavanje temperature ( 23 ).

3.5 Nastavljiv električni vakuumski sušilnik, opremljen z oljno črpalko in mehanizmom za dovajanje suhega vročega zraka ali s sušilnim sredstvom (npr. kalcijevim oksidom).

3.6 Eksikator z debelo kovinsko ali porcelansko perforirano ploščo, ki vsebuje učinkovito sušilno sredstvo.

4. Postopek

Opomba : Postopki, opisani v tem oddelku, se morajo izvajati takoj po odprtju posod z vzorci. Analiza se mora izvesti najmanj v dveh vzporednih določitvah.

4.1 Priprava

4.1.1 Krma, razen tiste iz točk 4.1.2 in 4.1.3

Vzame se najmanj 50 g vzorca. Po potrebi se zdrobi ali razdeli tako, da se prepreči sprememba vsebnosti vlage (glej točko 6).

4.1.2 Žita in drobljenci

Vzame se najmanj 50 g vzorca. Zdrobi se tako, da najmanj 50 % delcev preide skozi sito z odprtinami velikosti 0,5 mm in jih na situ z okroglimi odprtinami velikosti 1 mm ostane največ 10 %.

4.1.3 Tekoča ali kašasta krma in krma, sestavljena predvsem iz olj in maščob

Približno 25 g vzorca se natehta na 10 mg natančno, doda se primerna količina brezvodnega peska, stehtanega na 10 mg natančno, in se meša do nastanka homogene mase.

4.2 Sušenje

4.2.1 Krma, razen tiste iz točk 4.2.2 in 4.2.3

Posoda (3.3) s pokrovom se stehta na 1 mg natančno. V stehtano posodo se natehta 5 g vzorca na 1 mg natančno, ki se enakomerno porazdeli. Posoda brez pokrova se postavi v sušilnik, segret na 103 oC. Posoda se postavi v sušilnik v najkrajšem možnem času, da se prepreči prevelik padec temperature. Sušenje traja štiri ure od trenutka, ko je temperatura v sušilniku ponovno 103 oC. Posoda se pokrije s pokrovom, vzame iz sušilnika, pusti v eksikatorju (3.6) 30 do 45 minut, da se ohladi, in stehta na 1 mg natančno.

Krma, sestavljena zlasti iz olj in maščob, se suši v sušilniku nadaljnjih 30 minut pri 130 oC. Razlika med obema tehtanjema ne sme presegati 0,1 % vlage.

4.2.2 Žita, moka, drobljenci in zdrob

Posoda (3.3) s pokrovom se stehta na 0,5 mg natančno. V stehtano posodo se natehta približno 5 g zdrobljenega vzorca na 1 mg natančno, ki se enakomerno porazdeli. Posoda brez pokrova se postavi v sušilnik, segret na 130 oC. Posoda se postavi v sušilnik v najkrajšem možnem času, da se prepreči prevelik padec temperature. Sušenje traja 2 uri od trenutka, ko je temperatura v sušilniku ponovno 130 oC. Posoda se pokrije s pokrovom, vzame iz sušilnika, pusti v eksikatorju (3.6) 30 do 45 minut, da se ohladi, in stehta na 1 mg natančno.

4.2.3 Krmne mešanice, ki vsebujejo več kot 4 % saharoze ali laktoze: posamična krmila, kot so rožiči, hidrolizirani žitni proizvodi, fermentirana semena, posušena mleta pesa, ribe in raztopine sladkorja; krmne mešanice, ki vsebujejo več kot 25 % mineralnih soli, vključno s kristalno vodo. Posoda (3.3) s pokrovom se stehta na 0,5 mg natančno. V stehtano posodo se natehta približno 5 g vzorca na 1 mg natančno, ki se enakomerno porazdeli. Posoda brez pokrova se postavi v vakuumski sušilnik (3.5), segret na 80–85 oC. Posoda se postavi v sušilnik v najkrajšem možnem času, da se prepreči prevelik padec temperature. Počaka se, da tlak naraste do 100 torov in pri tem tlaku sušenje traja štiri ure na vročem suhem zraku ali s sušilnim sredstvom (približno 300 g za 20 vzorcev). V zadnjem primeru se vakuumska črpalka izklopi, ko je želeni tlak dosežen. Čas sušenja se računa od trenutka, ko je temperatura v sušilniku ponovno 80–85 oC. Tlak v sušilniku se previdno izenači z atmosferskim. Sušilnik se odpre, posoda se takoj pokrije s pokrovom in vzame iz peči, pusti se 30 do 45 minut v eksikatorju (3.6), da se ohladi, in stehta na 1 mg natančno. Suši se nadaljnjih 30 minut v vakuumskem sušilniku pri 80–85 oC in ponovno stehta. Razlika med obema tehtanjema ne sme presegati 0,1 % vlage.

4.3 Predhodno sušenje

4.3.1 Krma, razen tiste iz točke 4.3.2

Trdna krma z visoko vsebnostjo vlage, ki jo je težko drobiti, mora biti predhodno sušena na naslednji način:

v primerno posodo (npr. aluminijast krožnik velikosti 20 × 12 cm in z robom 0,5 cm) se natehta 50 g nezdrobljenega vzorca na 10 mg natančno (stisnjeno ali zgoščeno krmo se lahko po potrebi na grobo razdeli). V sušilniku se suši pri 60–70 oC, dokler se vsebnost vlage ne zniža na 8–12 %. Posoda se vzame iz sušilnika in eno uro ohlaja v laboratoriju brez pokrova, nato pa stehta na 10 mg natančno. Krma se takoj zdrobi, kakor je navedeno v točki 4.1.1, in osuši, kakor je navedeno v točki 4.2.1 ali 4.2.3 glede na vrsto krme.

4.3.2 Žita

Zrna z vsebnostjo vlage nad 17 % morajo biti predhodno sušena na naslednji način:

v primerno posodo (npr. aluminijast krožnik velikosti 20 × 12 cm in z robom 0,5 cm) se natehta 50 g nezdrobljenega zrna na 10 mg natančno. Suši se 5 do 7 minut v sušilniku pri 130 oC. Posoda se vzame iz sušilnika in 2 uri ohlaja v laboratoriju brez pokrova ter nato stehta na 10 mg natančno. Krma se takoj zmelje, kakor je navedeno v točki 4.1.2, in osuši, kakor je navedeno v točki 4.2.2.

5. Izračun rezultatov

Vsebnost vlage (X), izražena kot masni delež vzorca, se izračuna po naslednji formuli:

5.1 Sušenje brez predhodnega sušenja

pri čemer je:

m = začetna masa vzorčenega deleža v gramih;

m0 = masa suhega vzorčenega deleža v gramih.

5.2 Sušenje s predhodnim sušenjem

pri čemer je:

m = začetna masa vzorčenega deleža v gramih;

m1 = masa vzorčenega deleža po predhodnem sušenju v gramih;

m2 = masa vzorčenega deleža po drobljenju ali mletju v gramih;

m0 = masa suhega vzorčenega deleža v gramih.

5.3 Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne presega 0,2 % absolutne vrednosti vlage.

6. Opomba

Če se izkaže, da je potrebno drobljenje, in če se izkaže, da se pri tem spremeni vsebnost vlage v proizvodu, se morajo rezultati analize sestavin krme popraviti glede na vsebnost vlage v vzorcu v prvotnem stanju.

B. DOLOČANJE VLAGE V MAŠČOBAH IN OLJIH ŽIVALSKEGA IN RASTLINSKEGA IZVORA

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda se uporablja za določanje vsebnosti vode in hlapnih snovi v maščobah in oljih živalskega in rastlinskega izvora.

2. Načelo

Vzorec se posuši do konstantne mase (izguba mase med dvema zaporednima tehtanjema ne sme presegati 1 mg) pri 103 oC. Izguba mase se določi s tehtanjem.

3. Oprema

3.1 Posoda z ravnim dnom iz nerjavečega materiala s premerom 8 do 9 cm in višino približno 3 cm

3.2 Termometer z utrjeno bučko in podaljškom na zgornjem delu, s skalo od približno 80 oC do vsaj 110 oC in dolžino približno 10 cm

3.3 Peščena kopel ali električna plošča

3.4 Eksikator, ki vključuje učinkovito sušilo

3.5 Analitska tehtnica

4. Postopek

Približno 20 g homogeniziranega vzorca se natehta na 1 mg natančno in prenese v suho, stehtano posodo (3.1), v kateri je termometer (3.2). Ob nenehnem mešanju s termometrom se segreva na peščeni kopeli ali vroči plošči (3.3) tako, da temperatura doseže 90 oC v približno 7 minutah.

Temperatura se zniža, pri čemer se opazuje pogostost dviganja mehurčkov z dna posode. Temperatura ne sme preseči 105 oC. Nadaljuje se z mešanjem in pri tem se drgne dno posode, dokler mehurčki ne prenehajo izhajati.

Da se zagotovi popolna odstranitev vlage, se večkrat segreje na 103 ± 2 oC ob ohlajevanju na 93 oC med zaporednimi segrevanji. Nato se pusti, da se vzorec v eksikatorju (3.4) ohladi na sobno temperaturo, in se stehta. Postopek se ponavlja, dokler izguba mase med dvema zaporednima tehtanjema ni manjša od 2 mg.

Opomba : Povečanje mase vzorca po ponovljenem segrevanju kaže na oksidacijo maščobe, v tem primeru je treba upoštevati rezultat tehtanja, izvedenega neposredno pred začetkom povečevanja mase.

5. Izračun rezultatov

Masni delež vlage (X) v vzorcu se izračuna po naslednji formuli:

pri čemer je:

m = masa vzorčenega deleža v gramih;

m1 = masa posode z vsebino pred segrevanjem v gramih;

m2 = masa posode z vsebino po segrevanju v gramih.

Rezultati, nižji od 0,05 %, se navedejo kot „manj kot 0,05 %“.

Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati 0,05 % absolutne vrednosti.

C. DOLOČANJE VSEBNOSTI SUROVIH BELJAKOVIN

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda se uporablja za določanje vsebnosti surovih beljakovin v krmi na podlagi vsebnosti dušika, določenega po Kjeldahlovi metodi.

2. Načelo

Vzorec se razkroji z žveplovo kislino v prisotnosti katalizatorja. Raztopina natrijevega hidroksida se doda kisli raztopini, da postane bazična. Amonijak se destilira in zbere v odmerjeno količino žveplove kisline, katere presežek se titrira s standardno raztopino natrijevega hidroksida.

Sproščeni amonijak se lahko destilira v presežek raztopine borove kisline ter nato titrira z raztopino klorovodikove ali žveplove kisline.

3. Reagenti

3.1 Kalijev sulfat

3.2 Katalizator: bakrov (II) oksid CuO ali bakrov (II) sulfat pentahidrat, CuSO4 5H2O

3.3 Cink v zrncih

3.4 Žveplova kislina, ρ20 = 1,84 g/ml

3.5 Žveplova kislina, standardna volumetrična raztopina, c(H2SO4) = 0,25 mol/l

3.6 Žveplova kislina, standardna volumetrična raztopina, c(H2SO4) = 0,10 mol/l

3.7 Žveplova kislina, standardna volumetrična raztopina, c(H2SO4) = 0,05 mol/l

3.8 Indikator metil rdeče; 300 mg metil rdečega se raztopi v 100 ml etanola, σ = 95–96 % (v/v)

3.9 Raztopina natrijevega hidroksida (lahko tehnična) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %)

3.10 Žveplova kislina, standardna volumetrična raztopina, c(NaOH) = 0,25 mol/l

3.11 Žveplova kislina, standardna volumetrična raztopina, c(NaOH) = 0,10 mol/l

3.12 Zdrobljen plovec, opran v klorovodikovi kislini in prežaren

3.13 Acetanilid (tališče = 114 oC, N-vsebnost = 10,36 %)

3.14 Saharoza (brez dušika)

3.15 Borova kislina (H3BO3)

3.16 Raztopina indikatorja metil rdeče: 100 mg metil rdečega se raztopi v 100 ml etanola ali metanola.

3.17 Raztopina bromokrezol zelenega: 100 mg bromokrezol zelenega se raztopi v 100 ml etanola ali metanola.

3.18 Raztopina borove kisline (10–40 g/l glede na uporabljeno opremo) Pri določanju s kolorimetrično ekvivalentno točko se morata raztopinam borove kisline dodati indikatorja metil rdeče in bromokrezol. Pri pripravi 1 litra raztopine borove kisline se pred uravnavanjem volumna doda 7 ml raztopine indikatorja metil rdeče (3.16) in 10 ml raztopine bromokrezol zelenega (3.17). Glede na uporabljeno vodo se lahko pH raztopine borove kisline med serijami razlikuje. Pogosto je za doseganje pozitivnega slepega vzorca treba dodati majhen volumen baze. Opomba : 3 do 4 ml NaOH (3.11) v 1 liter 10 g/l borove kisline ponavadi zadošča. Raztopina se shrani pri sobni temperaturi ter zaščiti pred svetlobo in viri amonijevih hlapov.

3.19 Klorovodikova kislina, standardna volumetrična raztopina, c(HCl) = 0,10 mol/l Opomba : Druge koncentracije volumetričnih raztopin (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 in 3.19) se lahko uporabljajo, če se upoštevajo v izračunih. Koncentracije se vedno izrazijo na štiri decimalke natančno.

4. Oprema

Naprava, primerna za izvajanje razklopa, destilacije in titracije po Kjeldahlovi metodi.

5. Postopek

5.1 Razklop

1 g vzorca se natehta na 0,001 g natančno in se prenese v bučko naprave za razklop. Doda se 15 g kalijevega sulfata (3.1), ustrezna količina katalizatorja (3.2) (0,3–0,4 g bakrovega (II) oksida ali 0,9–1,2 g bakrovega (II) sulfat pentahidrata), 25 ml žveplove (VI) kisline (3.4) in po potrebi nekaj zrnc plovca (3.12) ter vse skupaj premeša.

Bučka se najprej zmerno segreva in po potrebi občasno obrne, dokler masa ne zogleni in pena ne izgine; nato se močneje segreva do enakomernega vretja tekočine. Segrevanje je ustrezno, če se vrela kislina kondenzira na stenah bučke. Paziti je treba, da se stene bučke ne pregrejejo in da se organski delci ne sprimejo nanje.

Ko se raztopina zbistri in obarva rahlo zeleno, se pusti vreti še 2 uri, nato pa pusti, da se ohladi.

5.2 Destilacija

Previdno se doda toliko vode, da se sulfati povsem raztopijo. Pusti se, da se ohladi, nato pa se po potrebi doda nekaj zrnc cinka (3.3). Nadaljuje se v skladu s točko 5.2.1 ali 5.2.2.

5.2.1 Destilacija v žveplovo kislino

V zbirno bučko naprave za destilacijo se doda natančno 25 ml žveplove kisline (3.5) ali (3.7) glede na pričakovano vsebnost dušika. Doda se nekaj kapljic indikatorja metil rdeče (3.8).

Bučka za razklop se poveže s kondenzatorjem naprave za destilacijo in konica kondenzatorja se potopi v tekočino v zbirni bučki vsaj do globine 1 cm (glej opombo 8.3). V bučko za razklop se počasi vlije 100 ml raztopine natrijevega hidroksida (3.9) tako, da ne pride do izgube amonijaka (glej opombo 8.1). Bučka se segreva do popolne destilacije amonijaka.

5.2.2. Destilacija v borovo kislino

Pri ročni titraciji amonijaka iz destilata se uporablja spodaj navedeni postopek. Kadar je destilacijska enota v celoti avtomatizirana in vključuje titracijo amonijaka iz destilata, se upoštevajo navodila proizvajalca za upravljanje z destilacijsko enoto.

Zbirna bučka s 25–30 ml raztopine borove kisline (3.18) se postavi pod izhodno odprtino kondenzatorja tako, da je dovodna cev pod površino presežka raztopine borove kisline. Destilacijska enota se nastavi tako, da se dovaja 50 ml raztopine natrijevega hidroksida (3.9). Destilacijska enota se upravlja v skladu z navodili proizvajalca, sproščeni amonijak pa se destilira z raztopino natrijevega hidroksida. Destilat se zbere v raztopino borove kisline. Na količino destilata (čas parne destilacije) vpliva količina dušika v vzorcu. Upoštevati je treba navodila proizvajalca.

Opomba : V polavtomatski destilacijski enoti sta dodajanje presežka natrijevega hidroksida in parna destilacija avtomatizirana postopka.

5.3 Titracija

Nadaljuje se v skladu s točko 5.3.1 ali 5.3.2.

5.3.1 Žveplova kislina

Presežek žveplove kisline v zbirni bučki se titrira do ekvivalentne točke z raztopino natrijevega hidroksida (3.10 ali 3.11) glede na koncentracijo uporabljene žveplove kisline.

5.3.2 Borova kislina

Vsebina zbirne bučke se titrira s standardno volumetrično raztopino klorovodikove kisline (3.19) ali standardno volumetrično raztopino žveplove kisline (3.6), pri čemer se uporabi bireta in odčita količina uporabljene titracijske snovi.

Pri določanju s kolorimetrično ekvivalentno točko je ekvivalentna točka dosežena pri prvem znaku rožnatega obarvanja vsebine. Volumen birete se odčita na 0,05 ml natančno. Magnetna mešalna plošča z osvetlitvijo ali fotometrični detektor lahko pripomoreta k določanju ekvivalentne točke.

Parni destilator z avtomatično titracijo lahko to opravi avtomatično.

Upoštevati je treba navodila proizvajalca za upravljanje specifičnega destilatorja ali destilatorja/titratorja.

Opomba : Pri avtomatičnem sistemu titriranja se titracija začne takoj po začetku destilacije, uporabi pa se 1-odstotna raztopina borove kisline (3.18). Pri popolnoma avtomatizirani destilacijski enoti se lahko izvaja avtomatična titracija amonijaka, ekvivalentna točka pa se lahko določa s potenciometričnim pH sistemom. V tem primeru se uporablja avtomatični titrator s pH metrom. Ta pH meter se ustrezno umeri med pH 4 in pH 7 z običajnimi laboratorijskimi postopki za umerjanje pH. Ekvivalentna točka pH pri titraciji je dosežena pri pH 4,6, ko je naklon titracijske krivulje največji (točka pregiba).

5.4 Slepi preskus

Slepi preskus (razklop, destilacija in titracija), v katerem se namesto vzorca uporabi 1 g saharoze (3.14), se izvede za potrditev, da reagenti ne vsebujejo dušika.

6. Izračun rezultatov

Izračuni se izvedejo v skladu s točko 6.1 ali 6.2.

6.1 Izračun za titracijo v skladu s točko 5.3.1

Vsebnost surovih beljakovin, izražena kot masni delež, se izračuna po naslednji formuli:

pri čemer je:

Vo = volumen (ml) NaOH (3.10 ali 3.11), uporabljen pri slepem preskusu;

V1 = volumen (ml) NaOH (3.10 ali 3.11), uporabljen pri titraciji vzorca;

c = koncentracija (mol/l) natrijevega hidroksida (3.10 ali 3.11);

m = masa (g) vzorca.

6.2 Izračun za titracijo v skladu s točko 5.3.2

6.2.1 Titracija s klorovodikovo kislino

Vsebnost surovih beljakovin, izražena kot masni delež, se izračuna po naslednji formuli:

pri čemer je:

m = masa (g) vzorčenega deleža;

c = koncentracija (mol/l) standardne volumetrične raztopine klorovodikove kisline (3.19);

V0 = volumen (ml) klorovodikove kisline, uporabljen pri slepem preskusu;

V1 = volumen (ml) klorovodikove kisline, uporabljen v vzorčenem deležu.

6.2.2 Titracija s žveplovo kislino

Vsebnost surovih beljakovin, izražena kot masni delež, se izračuna po naslednji formuli:

pri čemer je:

m = masa (g) vzorčenega deleža;

c = koncentracija (mol/l) standardne volumetrične raztopine žveplove kisline (3.6);

V0 = volumen (ml) žveplove kisline (3.6), uporabljen v slepem preskusu;

V1 = volumen (ml) žveplove kisline (3.6), uporabljen v vzorčenem deležu.

7. Preverjanje metode

7.1 Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati:

— 0,2 % absolutne vrednosti za vsebnosti surovih beljakovin pod 20 %,

— 1,0 % višje vrednosti za vsebnosti surovih beljakovin 20–40 %,

— 0,4 % absolutne vrednosti za vsebnosti surovih beljakovin nad 40 %.

7.2 Točnost

Za analizo (razklop, destilacija, titracija) se uporabi 1,5 do 2,0 g acetanilida (3.13) ob navzočnosti 1 g saharoze (3.14); za 1 g acetanilida se porabi 14,80 ml žveplove kisline (3.5). Izkoristek mora biti najmanj 99-odstoten.

8. Opombe

8.1 Naprava je lahko ročna, polavtomatska ali avtomatska. Če je pri napravi med razklopom in destilacijo potreben prenos, se ta prenos mora izvesti brez kakršne koli izgube. Če bučka naprave za destilacijo ni opremljena s kapalnim lijakom, se natrijev hidroksid doda tik pred povezavo bučke s kondenzatorjem, pri čemer se tekočina vliva počasi ob steni bučke.

8.2 Če se vsebina bučke strjuje, se določanje začne znova, vendar z večjo količino žveplove kisline (3.4), kakor je navedeno zgoraj.

8.3 Pri proizvodih z nizko vsebnostjo dušika se lahko volumen žveplove kisline (3.7), ki se doda v zbirno bučko, po potrebi zmanjša na 10 ali 15 ml, bučka pa se dopolni do 25 ml z vodo.

8.4 Pri redni analizi se lahko za določanje surovih beljakovin uporabi nadomestna analitska metoda, vendar je Kjeldahlova metoda, opisana v tem delu C, referenčna metoda. Za vsako matrico posebej je treba dokazati, da so rezultati, pridobljeni z nadomestno metodo (npr. DUMAS), enakovredni rezultatom, pridobljenim z referenčno metodo. V poročilu o analizi je treba navesti analitsko metodo, uporabljeno za določanje surovih beljakovin, saj lahko rezultati, pridobljeni z nadomestno metodo, kljub potrditvi enakovrednosti, odstopajo od rezultatov, pridobljenih z referenčno metodo.

D. DOLOČANJE SEČNINE

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje ravni sečnine v krmi.

2. Načelo

Vzorec se suspendira v vodi s snovjo za zbistritev. Suspenzija se filtrira. Doda se 4-dimetilaminobenzaldehid (4-DMAB), nato pa se določi vsebnost sečnine v filtratu z merjenjem optične gostote pri valovni dolžini 420 nm.

3. Reagenti

3.1 Raztopina 4-dimetilaminobenzaldehida: 1,6 g 4-DMAB se raztopi v 100 ml 96-odstotnega etanola in doda 10 ml klorovodikove kisline (ρ201,19 g/ml). Reagent se lahko hrani največ dva tedna.

3.2 Raztopina Carrez I: 21,9 g cinkovega acetata Zn(CH3COO)2 2H2O in 3 g ledoceta se raztopi v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.3 Raztopina Carrez II: 10,6 g kalijevega ferocianida K4 Fe (CN)6 3H2O se raztopi v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.4 Aktivno oglje, ki ne absorbira sečnine (treba je preveriti).

3.5 Sečnina, 0,1-odstotna raztopina (m/v)

4. Oprema

4.1 Mešalnik: približno 35 do 40 obr./min.

4.2 Epruvete: 160 × 16 mm z brušenimi zamaški

4.3 Spektrofotometer

5. Postopek

5.1 Analiza vzorca

2 g vzorca se natehta na 1 mg natančno in skupaj z 1 g aktivnega oglja (3.4) prenese v 500-mililitrsko merilno bučko. Doda se 400 ml vode in 5 ml raztopine Carrez I (3.2), meša se približno 30 sekund in doda 5 ml raztopine Carrez II (3.3). Meša se 30 minut v mešalniku. Dopolni se z vodo do oznake, pretrese in filtrira.

5 ml prozornega brezbarvnega filtrata se odstrani in prenese v epruvete z brušenimi zamaški, doda se 5 ml raztopine 4-DMAB (3.1) ter premeša. Epruvete se postavijo v kopel z vodo pri 20 oC (+/- 4 oC). Po 15 minutah se izmeri optična gostota raztopine vzorca s spektrofotometrom pri 420 nm. Rezultat se primerja z raztopino reagentov iz slepega preskusa.

5.2 Umeritvena krivulja

V 100-mililitrske merilne bučke se prenese 1, 2, 4, 5 in 10 ml raztopine sečnine (3.5), ki se dopolnijo z vodo do oznake. Od vsake raztopine se odpipetira 5 ml, vsaki se doda 5 ml raztopine 4-DMAB (3.1), homogenizira se in izmeri optična gostota, kakor je opisano zgoraj s primerjavo s kontrolno raztopino, ki vsebuje 5 ml 4-DMAB in 5 ml vode brez sečnine. Pripravi se umeritvena krivulja.

6. Izračun rezultatov

Količina sečnine v vzorcu se določi iz umeritvene krivulje.

Rezultat se izrazi kot masni delež vzorca.

7. Opombe

7.1 Če vsebnost sečnine presega 3 %, se vzorec zmanjša na 1 g ali se prvotna raztopina razredči, tako da v 500 ml ni več kot 50 mg sečnine.

7.2 Če je vsebnost sečnine nizka, se vzorec poveča, dokler je filtrat še prozoren in brezbarven.

7.3 Če vzorec vsebuje preproste dušikove spojine, kot so aminokisline, se optična gostota meri pri 435 nm.

E. DOLOČANJE HLAPNIH DUŠIKOVIH BAZ

I. Z MIKRODIFUZIJO

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda se uporablja za določanje vsebnosti hlapnih dušikovih baz v krmi, izraženih kot amonijak.

2. Načelo

Vzorec se ekstrahira z vodo, raztopina pa zbistri in filtrira. Hlapne dušikove baze se ločijo z mikrodifuzijo z uporabo raztopine kalijevega karbonata, zberejo v raztopino borove kisline in titrirajo z žveplovo kislino.

3. Reagenti

3.1 Trikloroocetna kislina, 20-odstotna raztopina (m/v)

3.2 Indikator: 33 mg bromokrezol zelenega in 65 mg metil rdečega se raztopi v 100 ml 95–96-odstotnega (v/v) etanola.

3.3 Raztopina borove kisline: v litrski merilni bučki se v 200 ml 95–96-odstotnega (v/v) etanola in 700 ml vode raztopi 10 g borove kisline. Doda se 10 ml indikatorja (3.2). Premeša se, po potrebi pa se barva raztopine spremeni v svetlo rdečo z dodajanjem raztopine natrijevega hidroksida. 1 ml te raztopine ustreza največ 300 μg NH3.

3.4 Nasičena raztopina kalijevega karbonata: v 100 ml vrele vode se raztopi 100 g kalijevega karbonata. Pusti se, da se ohladi, ter nato filtrira.

3.5 Žveplova kislina, 0,01 mol/l

4. Oprema

4.1 Mešalec: približno 35 do 40 obr./min.

4.2 Steklene ali plastične Conwayeve celice (glej diagram)

4.3 Mikrobirete z označenim merilom 1/100 ml

5. Postopek

10 g vzorca se natehta na 1 mg natančno in se s 100 ml vode prenese v 200-mililitrsko merilno bučko. V mešalcu se meša ali stresa 30 minut. Doda se 50 ml raztopine trikloroocetne kisline (3.1), dopolni z vodo do oznake, močno pretrese in filtrira skozi nagubani filter.

S pipeto se doda 1 ml raztopine borove kisline (3.3) v srednji del Conwayeve celice in 1 ml filtrata vzorca v zgornji del celice. Delno se pokrije z namaščenim pokrovom. V zgornji del celice se hitro nakapa 1 ml nasičene raztopine kalijevega karbonata (3.4), nato se neprepustno zapre. Celica se pazljivo obrača v vodoravni ravnini, da se reagenta premešata. Pusti se najmanj štiri ure pri sobni temperaturi ali eno uro pri temperaturi 40 oC.

Z mikrobireto (4.3) se hlapne baze v raztopini borove kisline titrirajo z žveplovo kislino (3.5).

Slepi preskus se izvede po istem postopku, vendar brez vzorca, ki se analizira.

6. Izračun rezultatov

1 ml H2SO40,01 mol/l ustreza 0,34 mg amonijaka.

Rezultat se izrazi kot masni delež vzorca.

Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne presega:

— 10 % relativne vrednosti, če je vsebnost amonijaka nižja od 1,0 %,

— 0,1 % absolutne vrednosti, če je vsebnost amonijaka 1,0 % ali več.

7. Opomba

Če vsebnost amonijaka v vzorcu presega 0,6 %, se začetni filtrat razredči.

II. Z DESTILACIJO

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda se uporablja za določanje vsebnosti hlapnih dušikovih baz, izraženih kot amonijak, v ribji moki, ki praktično ne vsebuje sečnine. Uporablja se le za vsebnost amonijaka, ki je nižja od 0,25 %.

2. Načelo

Vzorec se ekstrahira z vodo, raztopina pa zbistri in filtrira. Hlapne dušikove baze se izločijo pri temperaturi vrelišča z dodatkom magnezijevega oksida in zberejo v določeno količino žveplove kisline, katere presežek se titrira z raztopino natrijevega hidroksida.

3. Reagenti

3.1 Trikloroocetna kislina, 20-odstotna raztopina (m/v)

3.2 Magnezijev oksid

3.3 Emulzija proti penjenju (npr. silikon)

3.4 Žveplova kislina, 0,05 mol/l

3.5 Raztopina natrijevega hidroksida, 0,1 mol/l

3.6 0,3-odstotna raztopina metil rdečega v 95–96-odstotnem (v/v) etanola

4. Oprema

4.1 Mešalec: približno 35 do 40 obr./min.

4.2 Naprava za destilacijo po Kjeldahlu

5. Postopek

10 g vzorca se natehta na 1 mg natančno in s 100 ml vode prenese v 200-mililitrsko merilno bučko. V mešalcu se meša ali stresa 30 minut. Doda se 50 ml raztopine trikloroocetne kisline (3.1), dopolni z vodo do oznake, močno pretrese in filtrira skozi nagubani filter.

Odpipetira se volumen bistrega filtrata, ki ustreza pričakovani vsebnosti hlapnih dušikovih baz (ponavadi zadošča 100 ml). Razredči se na 200 ml, doda se 2 g magnezijevega oksida (3.2) in nekaj kapljic emulzije proti penjenju (3.3). Raztopina mora biti alkalna pri preskusu z lakmusovim papirjem, če ni, se doda magnezijev oksid (3.2). Nadaljevati je treba v skladu s točkama 5.2 in 5.3 dela C te priloge, tj. Analitske metode za določanje vsebnosti surovih beljakovin.

Slepi preskus se izvede po istem postopku, vendar brez vzorca, ki se analizira.

6. Izračun rezultatov

1 ml H2SO40,05 mol/l ustreza 1,7 mg amonijaka.

Rezultat se izrazi kot masni delež vzorca.

Ponovljivost

Relativna razlika med rezultatoma dveh vzporednih določitev, izvedenih na istem vzorcu, ne presega 10 % amonijaka.

F. DOLOČANJE AMINOKISLIN (RAZEN TRIPTOFANA)

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda se uporablja za določanje prostih (sintetičnih in naravnih) in celotnih (vezanih s peptidi in prostih) aminokislin v krmi z uporabo analizatorja aminokislin. Uporablja se za naslednje aminokisline: cist(e)in, metionin, lizin, treonin, alanin, arginin, aspartat, glutaminsko kislino, glicin, histidin, izolevcin, levcin, fenilalanin, prolin, serin, tirozin in valin.

S metodo ni možno ločiti soli aminokislin ter D in L oblik aminokislin. Ne uporablja se za določanje triptofana ali hidroksi-analogov aminokislin.

2. Načelo

2.1 Proste aminokisline

Proste aminokisline se ekstrahirajo z razredčeno klorovodikovo kislino. Soekstrahirane dušikove makromolekule se oborijo s sulfosalicilno kislino in odstranijo s filtriranjem. pH filtrirane raztopine se uravna na 2,20. Aminokisline se ločijo z ionsko izmenjevalno kromatografijo in določijo z reakcijo z ninhidrinom s fotometrično detekcijo pri 570 nm.

2.2 Celotne aminokisline

Postopek se izbere glede na preiskovane aminokisline. Cist(e)in in metionin se morata pred hidrolizo oksidirati v cisteinsko kislino in metionin-sulfon. Tirozin se mora določiti v hidrolizatih neoksidiranih vzorcev. Vse druge aminokisline, navedene v točki 1, se lahko določajo v oksidiranem ali neoksidiranem vzorcu.

Oksidacija se izvede pri 0 oC z mešanico peroksimravljične kisline in fenola. Presežek oksidacijskega reagenta se razgradi z natrijevim disulfitom. Oksidiran ali neoksidiran vzorec se 23 ur hidrolizira s klorovodikovo kislino (3.20). pH hidrolizata se uravna na 2,20. Aminokisline se ločijo z ionsko izmenjevalno kromatografijo in določijo z reakcijo z ninhidrinom s fotometrično detekcijo pri 570 nm (440 nm za prolin).

3. Reagenti

Uporabiti je treba dvojno destilirano vodo ali vodo enakovredne kakovosti (prevodnost < 10 μS)

3.1 Vodikov peroksid, m (m/m) = 30 %

3.2 Mravljična kislina, m (m/m) = 98–100 %

3.3 Fenol

3.4 Natrijev disulfit

3.5 Natrijev hidroksid

3.6 5-sulfosalicilat dihidrat

3.7 Klorovodikova kislina, približno 1,18 g/ml

3.8 Tri-natrijev citrat dihidrat

3.9 2,2'-tiodietanol (tiodiglikol)

3.10 Natrijev klorid

3.11 Ninhidrin

3.12 Petroleter, vrelišče 40–60 oC

3.13 Norlevcin ali druga spojina, primerna za uporabo kot notranji standard

3.14 Plinasti dušik (< 10 ppm kisika)

3.15 1-oktanol

3.16 Aminokisline

3.16.1 Standardne snovi iz točke 1. Čiste spojine, ki ne vsebujejo kristalne vode. Pred uporabo se suši 1 teden pod vakuumom s P2O5 ali H2SO4.

3.16.2 Cisteinska kislina

3.16.3 Metionin-sulfon

3.17 Raztopina natrijevega hidroksida, c = 7,5 mol/l: 300 g NaOH (3.5) se raztopi v vodi in dopolni z vodo do 1 litra.

3.18 Raztopina natrijevega hidroksida, c = 1 mol/l: 40 g NaOH (3.5) se raztopi v vodi in dopolni z vodo do 1 litra.

3.19 Mravljična kislina – raztopina fenola: 889 g mravljične kisline (3.2) se zmeša s 111 g vode ter se doda 4,73 g fenola (3.3).

3.20 Hidrolizna mešanica, c = 6 mol HCl/l, ki vsebuje 1 g fenola/l: 1 g fenola (3.3) se doda k 492 ml HCl (3.7) in dopolni z vodo do 1 litra.

3.21 Mešanica ekstrakcije, c = 0,1 mol HCl/l, ki vsebuje 2 % tiodiglikola: 8,2 ml HCl (3.7) se razredči s približno 900 ml vode, doda se 20 ml tiodiglikola (3.9) in dopolni z vodo do 1 litra (3.7 in 3.9 se ne smeta zmešati neposredno).

3.22 5-sulfosalicilna kislina, ß = 6 %: 60 g 5-sulfosalicilne kisline (3.6) se raztopi v vodi in dopolni z vodo do 1 litra.

3.23 Oksidacijska mešanica (peroksimravljična kislina – fenol): 0,5 ml vodikovega peroksida (3.1) se zmeša s 4,5 ml raztopine mravljične kisline in fenola (3.19) v majhni čaši. Inkubira se 1 uro pri 20–30 oC, da nastane peroksimravljična kislina, nato se ohladi v ledeni kopeli (15 min), preden se doda vzorcu. Opozorilo: Izogibati se je treba stiku s kožo in nositi je treba zaščitna oblačila.

3.24 Citratni pufer, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: v približno 800 ml vode se raztopi 19,61 g natrijevega citrata (3.8), 5 ml tiodiglikola (3.9), 1 g fenola (3.3) in 16,50 ml HCl (3.7). pH se uravna na 2,20. Dopolni se z vodo do 1 litra.

3.25 Pufri za eluiranje, pripravljeni v skladu z navodili za uporabljeni analizator (4.9)

3.26 Reagent ninhidrin, pripravljen v skladu z navodili za uporabljeni analizator (4.9)

3.27 Standardne raztopine aminokislin. Te raztopine se hranijo pri temperaturi do 5 oC.

3.27.1 Osnovna standardna raztopina aminokislin (3.16.1). c = 2,5 μmol/ml za vsako v klorovodikovi kislini. Lahko se priskrbi iz proste prodaje.

3.27.2 Osnovna standardna raztopina cisteinske kisline in metionin-sulfona, c = 1,25 μmol/ml. V litrski merilni bučki se raztopi 0,2115 g cisteinske kisline (3.16.2) in 0,2265 g metionin-sulfona (3.16.3) v citratnem pufru (3.24) ter dopolni s citratnim pufrom do oznake. Hrani se največ 12 mesecev pri temperaturi do 5 oC. Ta raztopina se ne uporablja, če osnovna standardna raztopina (3.27.1) vsebuje cisteinsko kislino in metionin-sulfon.

3.27.3 Osnovna standardna raztopina notranjega standarda, npr. norlevcina, c = 20 μmol/ml. V merilni bučki se raztopi 0,6560 g norlevcina (3.13) v citratnem pufru (3.24) in dopolni s citratnim pufrom do 250 ml. Hrani se največ 6 mesecev pri temperaturi do 5 oC.

3.27.4 Raztopina za umerjanje standardnih aminokislin, ki se uporablja s hidrolizati, c = 5 nmol/50 μl za cisteinsko kislino in metionin-sulfon ter c = 10 nmol/50 μl za druge aminokisline. V 100-mililitrski čaši se raztopi 2,2 g natrijevega klorida (3.10) s 30 ml citratnega pufra (3.24). Dodajo se 4,00 ml osnovne standardne raztopine aminokisline (3.27.1), 4,00 ml osnovne standardne raztopine cisteinske kisline in metionin-sulfona (3.27.2) ter 0,50 ml osnovne standardne raztopine notranjega standarda (3.27.3), če se uporablja. pH se uravna na 2,20 z natrijevim hidroksidom (3.18). Vsebina se prenese v 50-mililitrsko merilno bučko, dopolni se s citratnim pufrom (3.24) do oznake in premeša. Hrani se največ 3 mesece pri temperaturi do 5 oC. Glej tudi opombo 9.1.

3.27.5 Raztopina za umerjanje standardnih aminokislin, ki se uporablja s hidrolizati, se pripravi v skladu s točko 5.3.3.1, za ekstrakte pa v skladu s točko 5.2. Raztopina za umerjanje se pripravi v skladu s točko 3.27.4, vendar brez natrijevega klorida. Hrani se največ 3 mesece pri temperaturi do 5 oC.

4. Oprema

4.1 100- ali 250-mililitrska bučka z okroglim dnom in kondenzatorjem povratnega toka

4.2 100-mililitrska borosilikatna steklena posoda z zamaškom z navojem in ovita v gumo/teflon (npr. Duran, Schott) za uporabo v sušilniku

4.3 Sušilnik s prezračevanjem z umetnim dotokom zraka in regulatorjem temperature z natančnostjo, boljšo od ± 2 oC

4.4 pH meter (na tri decimalke)

4.5 Membranski filter (0,22 μm)

4.6 Centrifuga

4.7 Rotacijski vakuumski uparjalnik

4.8 Mehanski stresalnik ali magnetno mešalo

4.9 Aminokislinski analizator ali oprema za HPLC s kolono z ionskim izmenjevalcem, pripravo za ninhidrin, derivatizacijo po koloni in fotometričnim detektorjem Kolona se napolni s smolo sulfoniranega polistirena, ki lahko loči aminokisline med seboj in od drugih materialov, ki vsebujejo ninhidrin. Črpalki s stabilnim tokom ±0,5 % zagotavljata tok v pufrski in ninhidrinski črti pri standardnem umerjanju in analizi vzorca. Za nekatere aminokisline se lahko uporabi hidroliza v analizatorju, pri čemer je koncentracija natrija v hidrolizatu c = 0,8 mol/l in v hidrolizatu je vsa mravljična kislina, ki nastane pri oksidaciji. Druge metode ne zagotavljajo zadovoljive ločitve nekaterih aminokislin, če je v hidrolizatu preveč mravljične kisline in/ali visoka koncentracija natrijevih ionov. V tem primeru se volumen kisline po hidrolizi in pred uravnavanjem pH zmanjša z uparevanjem na približno 5 ml. Uparevanje se izvede pod vakuumom pri največ 40 oC.

5. Postopek

5.1 Priprava vzorca

Vzorec se zdrobi, tako da preide skozi 0,5 mm sito. Vzorci z visoko vlago se morajo pred drobljenjem osušiti na zraku pri temperaturi, ki ne presega 50 oC, ali osušiti z zmrzovanjem. Vzorci z visoko vsebnostjo maščobe se pred drobljenjem ekstrahirajo s petroletrom (3.12).

5.2 Določanje prostih aminokislin v krmi in premiksih

Primerna količina (1–5 g) pripravljenega vzorca (5.1) se natehta na 0,2 mg natančno in prenese v erlenmajerico, temu pa se doda 100,0 ml mešanice ekstrakcije (3.21). Z mehanskim stresalnikom ali magnetnim mešalom (4.8) se mešanica stresa 60 minut. Pusti se, da se usedlina usede na dno, in odpipetira 10,0 ml supernatanta v 100-mililitrsko čašo.

Med mešanjem se doda 5,0 ml raztopine sulfosalicilne kisline (3.22) in 5 minut nadaljuje z mešanjem s pomočjo magnetnega mešala. Supernatant se filtrira ali centrifugira, da se odstrani ves precipitat. 10,0 ml te raztopine se prenese v 100-mililitrsko čašo in pH uravnava na 2,20 z raztopino natrijevega hidroksida (3.18), s citratnim pufrom (3.24) se prenese v merilno bučko ustreznega volumna in dopolni z raztopino pufra (3.24) do oznake.

Če se uporablja notranji standard, se za vsakih 100 ml končne raztopine doda 1,00 ml notranjega standarda (3.27.3) ter dopolni z raztopino pufra (3.24) do oznake.

Nadaljuje se s kromatografijo v skladu s točko 5.4.

Če se ekstrakti ne pregledajo isti dan, se morajo hraniti pri temperaturi do 5 oC.

5.3 Določanje celotnih aminokislin

5.3.1 Oksidacija

0,1–1 g pripravljenega vzorca (5.1) se natehta na 0,2 mg natančno in prenese v:

— 100-mililitrsko bučko z okroglim dnom (4.1) (za odprto hidrolizo 5.3.2.3) ali

— 250-mililitrsko bučko z okroglim dnom (4.1), če je zahtevana nizka koncentracija natrija (5.3.3.1), ali

— 100-mililitrsko steklenico z zamaškom z navojem (4.2) (za zaprto hidrolizo 5.3.2.4).

V natehtanem vzorčenem deležu mora biti vsebnost dušika približno 10 mg, vsebnost vlage pa ne sme preseči 100 mg.

Bučka/steklenica se postavi v ledeno kopel in ohladi na 0 oC, doda se 5 ml oksidacijske mešanice (3.23) in meša s stekleno lopatico z ukrivljeno konico. Bučka/steklenica z lopatico se nepredušno zapre s filmom, ledena kopel, ki vsebuje nepredušno zaprto posodo, pa se postavi v hladilnik s temperaturo 0 oC in pusti 16 ur. Po 16 urah se posoda vzame iz hladilnika, presežni oksidacijski reagent pa se razgradi z dodatkom 0,84 g natrijevega disulfita (3.4).

Nadaljuje se s točko 5.3.2.1.

5.3.2 Hidroliza

5.3.2.1 Hidroliza oksidiranih vzorcev

Oksidiranemu vzorcu, pripravljenemu v skladu s točko 5.3.1, se doda 25 ml hidrolizne mešanice (3.20), pri čemer je treba pazljivo sprati kakršne koli ostanke vzorca s stene posode in lopatice.

Nadaljuje se v skladu s točko 5.3.2.3 ali 5.3.2.4 odvisno od uporabljenega postopka hidrolize.

5.3.2.2 Hidroliza neoksidiranih vzorcev

V 100- ali 250-mililitrsko bučko z okroglim dnom (4.1) ali 100-mililitrsko steklenico z zamaškom z navojem (4.2) se natehta 0,1–1 g pripravljenega vzorca (5.1) na 0,2 mg natančno. V natehtanem vzorčenem deležu mora biti vsebnost dušika približno 10 mg. Pazljivo se doda 25 ml hidrolizne mešanice (3.20) in zmeša z vzorcem. Nadaljuje se v skladu s točko 5.3.2.3 ali 5.3.2.4.

5.3.2.3 Odprta hidroliza

Mešanici v bučki (pripravljeni v skladu s točko 5.3.2.1 ali 5.3.2.2) se dodajo 3 steklene kroglice, nato se pusti vreti z neprestanim mehurčenjem pri povratnem toku 23 ur. Po zaključku hidrolize se kondenzator spere s 5 ml citratnega pufra (3.24). Bučka se odstrani in ohladi v ledeni kopeli.

Nadaljuje se v skladu s točko 5.3.3.

5.3.2.4 Zaprta hidroliza

Steklenica, ki vsebuje mešanico, pripravljeno v skladu s točko 5.3.2.1 ali 5.3.2.2, se postavi v sušilnik (4.3) pri 110 oC. V prvi uri se za preprečitev povečanja tlaka (zaradi nastanka plinastih snovi) in eksplozije zamašek z navojem postavi čez vrh steklenice. Steklenica se ne sme zapreti z zamaškom. Po eni uri se steklenica zapre z zamaškom in pusti v sušilniku (4.3) 23 ur. Po zaključku hidrolize se steklenica odstrani iz sušilnika, zamašek steklenice se pazljivo odpre, steklenica pa položi v ledeno kopel. Pusti se, da se ohladi.

Odvisno od postopka za uravnavanje pH (5.3.3) se vsebina steklenice z uporabo citratnega pufra (3.24) prenese v 250-mililitrsko čašo ali 250-mililitrsko bučko z okroglim dnom.

Nadaljuje se v skladu s točko 5.3.3.

5.3.3 Uravnavanje pH

Glede na odstopanje analizatorja aminokislin (4.9) za natrij se za uravnavanje pH nadaljuje v skladu točko 5.3.3.1 ali 5.3.3.2.

5.3.3.1 Kromatografski sistemi (4.9), pri katerih je zahtevana nizka koncentracija natrija

Ko se uporabljajo analizatorji aminokislin, pri katerih je zahtevana nizka koncentracija natrija (ko je treba zmanjšati volumen kisline), je priporočljivo uporabiti raztopino notranjega osnovnega standarda (3.27.3).

V tem primeru se hidrolizatu pred uparevanjem dodata 2,00 ml raztopine notranjega osnovnega standarda (3.27.3).

Hidrolizatu, pridobljenemu v skladu s točko 5.3.2.3 ali 5.3.2.4, se dodata 2 kaplji 1-oktanola (3.15).

Z rotacijskim uparilnikom (4.7) se pod vakuumom pri 40 oC volumen zmanjša na 5–10 ml. Če se volumen nenamerno zmanjša na manj kot 5 ml, se mora hidrolizat izločiti in analiza začeti znova.

pH se uravna na 2,20 z raztopino natrijevega hidroksida (3.18), nato pa se nadaljuje v skladu s točko 5.3.4.

5.3.3.2 Za vse druge analizatorje aminokislin (4.9)

Hidrolizati, pridobljeni v skladu s točko 5.3.2.3 ali 5.3.2.4, se delno nevtralizirajo, tako da se med mešanjem pazljivo doda 17 ml raztopine natrijevega hidroksida (3.17), pri čemer se mora ohranjati temperatura pod 40 oC.

Pri sobni temperaturi se pH uravna na 2,20 z raztopino natrijevega hidroksida (3.17) in nato raztopino natrijevega hidroksida (3.18). Nadaljuje se v skladu s točko 5.3.4.

5.3.4 Raztopina vzorca za kromatografijo

Hidrolizat (5.3.3.1 ali 5.3.3.2), uravnan na pH, se s citratnim pufrom (3.24) prenese v 200-mililitrsko merilno bučko in dopolni s pufrom (3.24) do oznake.

Če notranji standard še ni bil uporabljen, se dodata 2,00 ml notranjega standarda (3.27.3), nato pa se dopolni s citratnim pufrom (3.24) do oznake. Temeljito se premeša.

Nadaljuje se s kromatografijo (5.4).

Če se raztopine vzorca ne pregledajo še isti dan, se morajo shraniti pri temperaturi pod 5 oC.

5.4 Kromatografija

Pred kromatografijo mora biti temperatura ekstrakta (5.2) ali hidrolizata (5.3.4) enaka sobni temperaturi. Mešanica se stresa, primerna količina pa se filtrira skozi membranski filter 0,22 μm (4.5). S to bistro raztopino se opravi ionska izmenjevalna kromatografija z analizatorjem aminokislin (4.9).

Vbrizgavanje je lahko ročno ali avtomatično. Pomembno je, da se ista količina raztopine (± 0,5 %) doda koloni za analizo standardov in vzorcev, razen ko se uporablja notranji standard, ter da je razmerje med natrijem in aminokislino v raztopinah standarda in vzorca takšno, kot se uporablja ponavadi.

Na splošno je pogostost umerjanja odvisna od stabilnosti reagenta ninhidrina in analitskega sistema. Standard ali vzorec se razredči s citratnim pufrom (3.24), da se doseže površina vrha standarda, ki je 30–200 % površine vrha aminokislin v vzorcu.

Kromatografija aminokislin se nekoliko razlikuje glede na vrsto uporabljenega analizatorja in smole. Izbrani sistem mora imeti možnost ločitve aminokisline med seboj in od materialov, ki vsebujejo ninhidrin. V delovnem območju se mora kromatografski sistem odzivati linearno na spremembe količin aminokislin, dodanih koloni.

Pri kromatografiji se uporabljajo spodaj navedena razmerja med najnižjimi in najvišjimi vrednostmi, ko se analizira istomolarna raztopina (aminokislin, ki se določajo). Istomolarna raztopina mora vsebovati vsaj 30 % največje vsebnosti vsake aminokisline, ki se lahko natančno izmeri s sistemom za analizo aminokislin (4.9).

Za ločevanje treonina od serina razmerje med najnižjo in najvišjo vrednostjo za aminokislino z nižjo vrednostjo izmed dveh prekrivajočih se aminokislin ne sme presegati 2:10. (Če se določajo le cistein, metionin, treonin in lizin, bo neustrezna ločitev od sosednjih vrhov negativno vplivala na določanje.) Za vse druge aminokisline mora biti ločevanje boljše od 1:10.

Sistem mora zagotavljati, da se lizin loči od „lizinskih artefaktov“ in ornitina.

6. Izračun rezultatov

Za vsako posamezno aminokislino se izračuna površina vzorca in najvišje vrednosti standarda ter količina (X), izražena v g aminokislin na kg vzorca.

Če se uporablja notranji standard, se pomnoži z:

A = površina vrha hidrolizata ali ekstrakta;

B = površina vrha standardne raztopine za umerjanje;

C = površina vrha hidrolizata ali ekstrakta kot notranjega standarda;

D = površina vrha standardne raztopine za umerjanje kot notranjega standarda;

M = molska masa aminokisline, ki se določa;

c = koncentracija standarda v μmol/ml;

m = masa vzorca v gramih (popravljena na prvotno maso, če je vzorec posušen ali razmaščen);

V = ml celotnega hidrolizata (5.3.4) ali izračunani celotni volumen razredčitve ekstrakta (6.1) v ml.

Cistin in cistein se določata kot cisteinska kislina v hidrolizatih oksidiranega vzorca, vendar se izračunata kot cistin (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) z uporabo molske mase 120,15 g/mol (= 0,5 x 240,30 g/mol).

Metionin se določa kot metionin-sulfon v hidrolizatih oksidiranega vzorca, vendar se izračuna kot metionin, pri čemer se uporabi molska masa metionina: 149,21 g/mol.

Dodani prosti metionin se določa po ekstrakciji kot metionin, za izračun pa se uporabi ista molska masa.

6.1 Celotni volumen razredčitve ekstraktov (F) za določanje prostih aminokislin (5.2) se izračuna po naslednji formuli: V = volumen končnega ekstrakta.

7. Ocena metode

Metoda je bila preskušena v mednarodni medlaboratorijski primerjavi, ki je bila izvedena leta 1990 s štirimi različnimi vrstami krme (mešana prašičja krma, mešanica za pitovne piščance, beljakovinski koncentrat, premiks). Rezultati, brez izjem, s srednjimi vrednostmi in standardnimi odmiki so prikazani v preglednici v tej točki:







Srednje vrednosti v g/kg Referenčni material Aminokislina Treonin Cist(e)in Metionin Lizin Mešana prašičja krma 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Mešanica za pitovne piščance 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Beljakovinski koncentrat 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Premiks 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = število sodelujočih laboratorijev.

7.1 Ponovljivost

Ponovljivost zgoraj navedene primerjave, izražena kot „standardni odmik v laboratoriju“, je prikazana v spodnji preglednici:







Standardni odmik (Sr) v laboratoriju, izražen v g/kg Referenčni material Aminokislina Treonin Cist(e)in Metionin Lizin Mešana prašičja krma 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Mešanica za pitovne piščance 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Beljakovinski koncentrat 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Premiks 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = število sodelujočih laboratorijev.







Koeficient variacije (%) standardnega odmika (Sr) v laboratoriju Referenčni material Aminokislina Treonin Cist(e)in Metionin Lizin Mešana prašičja krma 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Mešanica za pitovne piščance 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Beljakovinski koncentrat 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Premiks 2,2 n= 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = število sodelujočih laboratorijev.

7.2 Obnovljivost

Rezultati zgoraj navedene primerjave, izraženi kot standardni odmik med laboratoriji, so prikazani v spodnji preglednici:







Standardni odmik (SR) med laboratoriji, izražen v g/kg Referenčni material Aminokislina Treonin Cist(e)in Metionin Lizin Mešana prašičja krma 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Mešanica za pitovne piščance 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Beljakovinski koncentrat 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Premiks 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = število sodelujočih laboratorijev.







Koeficient variacije (%) standardnega odmika (SR) med laboratoriji Referečni material Amino Acid Treonin Cist(e)in Metionin Lizin Mešana prašičja krma 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Mešanica za pitovne piščance 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Beljakovinski koncentrat 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Premiks 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = število sodelujočih laboratorijev.

8. Uporaba referenčnih materialov

Pravilna uporaba metode se preveri s ponovljenimi merjenji na potrjenih referenčnih materialih, kadar so na voljo. Priporočeno je umerjanje s potrjeno raztopino za umerjanje aminokislin.

9. Opombe

9.1 Zaradi razlik med analizatorji aminokislin se kot smernica obravnavajo končne koncentracije raztopin standardnih aminokislin za umerjanje (glej 3.27.4 in 3.27.5) in hidrolizata (glej 5.3.4). Za vse aminokisline je treba preveriti območje naprave, v katerem je odziv linearen. Standardna raztopina se razredči s citratnim pufrom, da je površina vrha na sredini tega območja.

9.2 Kadar se za analizo hidrolizatov uporablja oprema za tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti, se morajo eksperimentalni pogoji optimizirati v skladu s priporočili proizvajalca.

9.3 Pri uporabi metode za krmo, ki vsebuje več kot 1 % klorida (koncentrat, mineralna krma, nadomestna krma), se lahko pojavi prenizka vrednost vsebnosti metionina in je zato potrebna posebna obdelava.

G. DOLOČANJE TRIPTOFANA

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje celotnega in prostega triptofana v krmi. Ne omogoča pa ločevanja med oblikama D in L.

2. Načelo

Za določanje celotnega triptofana se vzorec hidrolizira pri bazičnih pogojih z nasičeno raztopino barijevega hidroksida in 20 ur segreva do 110 oC. Po hidrolizi se doda notranji standard.

Za določanje prostega triptofana se vzorec ekstrahira pri rahlo kislih pogojih v prisotnosti notranjega standarda.

Triptofan in notranji standard v hidrolizatu ali ekstraktu se določata s HPLC s fluorescenčno detekcijo.

3. Reagenti

3.1 Uporabljati je treba dvakrat destilirano vodo ali vodo enake kakovosti (prevodnost < 10 μS/cm).

3.2 Standardna snov: triptofan (čistoča/vsebnost ≥ 99 %), osušen pod vakuumom nad fosforjevim pentoksidom

3.3 Snov, ki je notranji standard: α-metil-triptofan (čistoča/vsebnost ≥ 99 %), osušen pod vakuumom nad fosforjevim pentoksidom.

3.4 Barijev hidroksid oktahidrat (paziti je treba, da Ba(OH)2 .8 H2O ni pretirano izpostavljen zraku, da se ne bi tvoril BaCO3, ki lahko moti določanje) (glej opombo 9.3).

3.5 Natrijev hidroksid

3.6 Ortofosforna kislina, m (m/m) = 85 %

3.7 Klorovodikova kislina, ρ201,19 g/ml

3.8 Metanol, za HPLC

3.9 Petroleter, vrelišče 40–60 oC

3.10 Raztopina natrijevega hidroksida, c = 1 mol/l: 40,0 g NaOH (3.5) se raztopi v vodi in dopolni z vodo do 1 litra (3.1).

3.11 Klorovodikova kislina, c = 6 mol/l: 492 ml HCl (3.7) se dopolni z vodo do 1 litra.

3.12 Klorovodikova kislina, c = 1 mol/l: 82 ml HCl (3.7) se dopolni z vodo do 1 litra.

3.13 Klorovodikova kislina, c = 0,1 mol/l: 8,2 ml HCl (3.7) se dopolni z vodo do 1 litra.

3.14 Ortofosforna kislina, c = 0,5 mol/l: 34 ml ortofosforne kisline (3.6) se dopolni z vodo (3.1) do 1 litra.

3.15 Koncentrirana raztopina triptofana (3.2), c = 2,50 μmol/ml: v 500-mililitrski merilni bučki se raztopi 0,2553 g triptofana (3.2) v klorovodikovi kislini (3.13) in dopolni s klorovodikovo kislino (3.13) do oznake. Hrani se največ 4 tedne pri –18 oC.

3.16 Koncentrirana raztopina notranjega standarda, c = 2,50 μmol/ml: v 500-mililitrski merilni bučki se raztopi 0,2728 g α-metil-triptofana (3.3) v klorovodikovi kislini (3.13) in dopolni se s klorovodikovo kislino (3.13) do oznake. Pri –18 oC se shrani največ 4 tedne.

3.17 Standardna raztopina triptofana in notranjega standarda za umerjanje: pripravi se 2,00 ml koncentrirane raztopine triptofana (3.15) in 2,00 ml koncentrirane raztopine notranjega standarda (α-metil-triptofan) (3.16). Razredči se z vodo (3.1) in metanolom (3.8) na približno enak volumen in približno enako koncentracijo metanola (10–30 %) kot pri končnem hidrolizatu. Ta raztopina se mora pripraviti sveža pred uporabo. Med pripravo jo je treba zaščititi pred neposredno sončno svetlobo.

3.18 Ocetna kislina

3.19 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanol

3.20 Etanolamin, m (m/m) > 98 %

3.21 1 g 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanola (3.19) se raztopi v 100 ml metanola (3.8).

3.22 Mobilna faza za HPLC: 3,00 g ocetne kisline (3.18) + 900 ml vode (3.1) +50,0 ml raztopine (3.21) 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanola (3.19) v metanolu (3.8) (1 g/100 ml). pH se uravna na 5,00 z etanolaminom (3.20). Dopolni se z vodo do 1 000 ml (3.1).

4. Oprema

4.1 Oprema HPLC s spektrofluorometričnim detektorjem

4.2 Kolona za tekočinsko kromatografijo, 125 mm x 4 mm C18, polnitev 3 μm ali enakovredna

4.3 pH meter

4.4 Bučka iz polipropilena, volumna 125 ml, s širokim vratom in zamaškom z navojem

4.5 Membranski filter, 0,45 μm

4.6 Avtoklav, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1) bar

4.7 Mehanski stresalnik ali magnetno mešalo

4.8 Vorteks mešalnik

5. Postopek

5.1 Priprava vzorcev

Vzorec se zdrobi, tako da preide skozi 0,5 mm sito. Vzorce z visoko vsebnostjo vlage je treba pred drobljenjem osušiti na zraku pri temperaturi do 50 oC ali pa osušiti z zmrzovanjem. Vzorci z visoko vsebnostjo maščobe se pred drobljenjem ekstrahirajo s petroletrom (3.9).

5.2 Določanje prostega triptofana (ekstrakt)

Primerna količina (1–5 g) pripravljenega vzorca (5.1) se natehta na 1 mg natančno in prenese v erlenmajerico. Doda se 100,0 ml klorovodikove kisline (3.13) in 5,00 ml koncentrirane raztopine notranjega standarda (3.16). Z mehanskim stresalnikom ali magnetnim mešalom (4.7) se stresa ali meša 60 minut. Pusti se, da se usedlina usede na dno, nato pa se odpipetira 10,0 ml supernatanta v čašo. Doda se 5 ml ortofosforne kisline (3.14). pH raztopine se z natrijevim hidroksidom (3.10) uravna na 3. Doda se dovolj metanola (3.8), da je v končnem volumnu koncentracija metanola 10–30 %. Prenese se v merilno bučko primernega volumna in razredči z vodo na volumen, potreben za kromatografijo (približno enak volumen kot pri standardni raztopini za umerjanje (3.17)).

Pred vbrizganjem na HPLC kolono se nekaj ml raztopine prefiltrira skozi 0,45 μm membranski filter (4.5). Nadaljuje se s kromatografijo v skladu s točko 5.4.

Standardna raztopina in ekstrakti se zaščitijo pred neposredno sončno svetlobo. Če ni možno analizirati ekstraktov istega dne, se lahko hranijo največ 3 dni pri 5 oC.

5.3 Določanje celotnega triptofana (hidrolizat)

0,1–1 g pripravljenega vzorca (5.1) se natehta na 0,2 mg natančno in prenese v bučko iz polipropilena (4.4). Vsebnost dušika v natehtanem delu vzorca je približno 10 mg. Doda se 8,4 mg barijevega hidroksid oktahidrata (3.4) in 10 ml vode. Meša se na vorteks mešalniku (4.8) ali z magnetnim mešalom (4.7). S teflonom prevlečeni magnet se pusti v mešanici. Stene posode se sperejo s 4 ml vode. Zapre se z zamaškom z navojem, bučka pa se rahlo zapre. Prenese se v avtoklav (4.6), kjer je vrela voda, in pusti v pari 30–60 minut. Zapre se avtoklav in 20 ur avtoklavira pri 110 (± 2) oC.

Preden se avtoklav odpre, se temperatura zmanjša nekoliko pod 100 oC. Da se prepreči kristalizacija Ba(OH)2 ×8 H2O, se topli mešanici doda 30 ml vode sobne temperature. Rahlo se pretresa ali meša. Doda se 2,00 ml koncentrirane raztopine notranjega standarda (α-metil-triptofana) (3.16). Posode se 15 minut hladijo na vodni/ledeni kopeli.

Nato se doda 5 ml ortofosforne kisline (3.14). Posoda se zadrži v hladilni kopeli, med mešanjem nevtralizira s HCl (3.11), pH pa se s HCl (3.12) uravna na 3,0. Doda se dovolj metanola, da je koncentracija metanola v končnem volumnu 10–30 %. Prenese se v merilno bučko primernega volumna in razredči z vodo do volumna, potrebnega za kromatografijo (na primer 100 ml). Dodatek metanola ne povzroči obarjanja.

Pred vbrizganjem na HPLC kolono se nekaj ml raztopine prefiltrira skozi 0,45 μm membranski filter (4.5). Nadaljuje se s kromatografijo v skladu s točko 5.4.

Standardna raztopina in hidrolizati se zaščitijo pred neposredno sončno svetlobo. Če ni možno analizirati ekstraktov istega dne, se lahko hranijo največ 3 dni pri 5 oC.

5.4 Določanje s HPLC

Za izokratsko eluiranje se lahko kot smernica uporabljajo naslednji pogoji; lahko se uporabljajo tudi drugi pogoji, če zagotavljajo enakovredne rezultate (glej tudi opombi 9.1 in 9.2).







Kolona za tekočinsko kromatografijo (4.2): 125 mm × 4 mm, C18, polnitev 3 μm ali enakovredna Temperatura kolone: sobna temperatura Mobilna faza (3.22): 3,00 g ocetne kisline (3.18) + 900 ml vode (3.1) +50,0 ml raztopine (3.21) 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanola (3.19) v metanolu (3.8) (1 g/100 ml). pH raztopine se z etanolaminom (3.20) uravna na 5,00. Dopolni se z vodo (3.1) do 1 000 ml. Hitrost pretoka: 1 ml/min Skupni čas izvedbe: približno 34 min Detekcijska valovna dolžina: ekscitacija: 280 nm, emisija: 356 nm. Volumen, ki se vbrizga: 20 μl

6. Izračun rezultatov

Količina triptofana (X), izražena v g na 100 g vzorca, se izračuna po naslednji formuli:

A = površina vrha notranjega standarda, standardne raztopina za umerjanje (3.17);

B = površina vrha triptofana, ekstrakta (5.2) ali hidrolizata (5.3);

V1 = volumen, v ml (2 ml), koncentrirane raztopine triptofana (3.15), dodane raztopini za umerjanje (3.17);

c = koncentracija, v μmol/ml (= 2,50), koncentrirane raztopine triptofana (3.15), dodane raztopini za umerjanje (3.17);

V2 = volumen, v ml, koncentrirane raztopine notranjega standarda (3.16), dodane pri ekstrakciji (5.2) (= 5,00 ml) ali hidrolizatu (5.3) (= 2,00 ml);

C = površina vrha notranjega standarda, ekstrakta (5.2) ali hidrolizata (5.3);

D = površina vrha triptofana, standardne raztopine za umerjanje (3.17);

V3 = volumen, v ml (= 2,00 ml), koncentrirane raztopine notranjega standarda (3.16), dodane standardni raztopini za umerjanje (3.17);

m = masa vzorca v g (popravljena na prvotno maso, če je vzorec posušen in/ali razmaščen);

M = molska masa triptofana (= 204,23 g/mol).

7. Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati 10 % najvišjega rezultata.

8. Rezultati medlaboratorijske študije

Organizirana je bila medlaboratorijska študija ES (četrta medlaboratorijska primerjava), pri kateri je 12 laboratorijev analiziralo 3 vzorce, da se potrdi metoda za hidrolizo. Vsak vzorec je bil analiziran petkrat. Rezultati so prikazani v spodnji preglednici:







Vzorec 1 Prašičja krma Vzorec 2 Prašičja krma z dodanim L-triptofanom Vzorec 3 Koncentrat prašičje krme L 12 12 12 n 50 55 50 Srednja vrednost [g/kg] 2,42 3,40 4,22 Sr [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CVr [ %] 1,9 1,6 1,9 SR [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 CVR [ %] 6,3 6,0 2,2

L = število laboratorijev, ki so predložili rezultate;

n = število uporabljenih posameznih rezultatov, razen izjem (identificiranih s testom za izjeme po Cochranu in Dixonu);

Sr = standardni odmik ponovljivosti;

SR = standardni odmik obnovljivosti;

r = ponovljivost;

R = obnovljivost;

CVr = koeficient variacije ponovljivosti v %;

CVR = koeficient variacije obnovljivosti v %.

Organizirana je bila še ena medlaboratorijska študija ES (tretja medlaboratorijska primerjava), v kateri je 13 laboratorijev analiziralo 2 vzorca, da se potrdi metoda za ekstrakcijo prostega triptofana. Vsak vzorec je bil analiziran petkrat. Rezultati so prikazani v spodnji preglednici:







Vzorec 4 Mešanica pšenice in soje Vzorec 5 Mešanica pšenice in soje (= vzorec 4) z dodanim triptofanom (0,457 g/kg1) L 12 12 n 55 60 Srednja vrednost [g/kg] 0,391 0,931 Sr [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 CVr [ %] 1,34 1,34 SR [g/kg] 0,018 0,048 R [g/kg] 0,050 0,134 CVR [ %] 4,71 5,11

L = število laboratorijev, ki so predložili rezultate;

n = število uporabljenih posameznih rezultatov, razen izjem (identificiranih s testom za izjeme po Cochranu in Dixonu);

Sr = standardni odmik ponovljivosti;

SR = standardni odmik obnovljivosti;

r = ponovljivost;

R = obnovljivost;

CVr = koeficient variacije ponovljivosti v %;

CVR = koeficient variacije obnovljivosti v %.

Organizirana je bila še ena medlaboratorijska študija ES, v kateri je do 7 laboratorijev analiziralo 4 vzorce, da se potrdi metoda za hidrolizo triptofana. Rezultati so prikazani spodaj. Vsak vzorec je bil analiziran petkrat.







Vzorec 1 Mešana prašičja krma (CRM 117) Vzorec 2 Ribja moka z nizko vsebnostjo maščob (CRM 118) Vzorec 3 Sojina moka (CRM 119) Vzorec 4 Posneto mleko v prahu (CRM 120) L 7 7 7 7 n 25 30 30 30 Srednja vrednost [g/kg] 2,064 8,801 6,882 5,236 Sr [g/kg] 0,021 0,101 0,089 0,040 r [g/kg] 0,059 0,283 0,249 0,112 CVr [ %] 1,04 1,15 1,30 0,76 SR [g/kg] 0,031 0,413 0,283 0,221 R [g/kg] 0,087 1,156 0,792 0,619 CVR [ %] 1,48 4,69 4,11 4,22

L = število laboratorijev, ki so predložili rezultate;

n = število uporabljenih posameznih rezultatov, po izločitvi izjem (identificiranih s testom za izjeme po Cochranu in Dixonu);

Sr = standardni odmik ponovljivosti;

SR = standardni odmik obnovljivosti;

r = ponovljivost;

R = obnovljivost;

CVr = koeficient variacije ponovljivosti v %;

CVR = koeficient variacije obnovljivosti v %.

9. Opombe

9.1 Ločevanje triptofana in α-metil-triptofana lahko izboljšajo naslednji posebni kromatografski pogoji. Izokratsko eluiranje, ki mu sledi gradientno čiščenje kolone:



Kolona za tekočinsko kromatografijo: 125 mm x 4 mm, C18, polnitev 5 μm ali enakovredna Temperatura kolone: 32 oC Mobilna faza: A. 0,01 mol/l KH2PO4/Metanol, 95+5 (V+V). B: Metanol Gradientni program: 0 min 100 % A 0 % B 15 min 100 % A 0 % B 17 min 60 % A 40 % B 19 min 60 % A 40 % B 21 min 100 % A 0 % B 33 min 100 % A 0 % B Hitrost pretoka: 1,2 ml/min Skupni čas izvedbe: približno 33 min

9.2 Kromatografija se spreminja glede na vrsto HPLC in uporabljeni material za polnitev kolone. Izbrani sistem mora zagotavljati ločevanje bazne linije triptofana in notranjega standarda. Poleg tega je pomembno, da se produkti razgradnje dobro ločijo od triptofana in notranjega standarda. Izvede se postopek s hidrolizatom brez notranjega standarda, da se preveri bazna linija notranjega standarda za nečistoče. Pomembno je, da je čas izvedbe dovolj dolg, da se eluirajo vsi produkti razgradnje, sicer lahko zapozneli vrhovi eluiranja motijo nadaljnje kromatografiranje. Kromatografski sistem se v delovnem območju odziva linearno. Linearni odziv se izmeri s konstantno (običajno) koncentracijo notranjega standarda in različnimi koncentracijami triptofana. Zelo pomembno je, da so velikosti vrhov triptofana in notranjega standarda v linearnem območju HPLC/fluorescenčnega sistema. Če so vrhovi triptofana in/ali notranjega standarda prenizki ali previsoki, se analiza ponovi z drugačno količino vzorca in/ali drugačnim končnim volumnom.

9.3 Barijev hidroksid Topnost barijevega hidroksida se s staranjem zmanjša. Posledica tega je motna raztopina za določitev HPLC, kar lahko povzroči nizke rezultate za triptofan.

H. DOLOČANJE SUROVIH OLJ IN MAŠČOB

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje vsebnosti surovih olj in maščob v krmi. Ne omogoča analize oljnih semen in oljnatega sadja.

Vrsta in sestava krme ter namena izvajanja analize vplivata na uporabo spodaj opisanih postopkov.

1.1 Postopek A – Surova olja in maščobe, ki se ekstrahirajo neposredno

Ta metoda se uporablja za krmo rastlinskega izvora, razen tiste, ki je zajeta v področju uporabe postopka B.

1.2 Postopek B – Celotna surova olja in maščobe

Ta metoda se uporablja za krmo živalskega izvora in za vse krmne mešanice. Uporablja se za vso krmo, iz katere ni mogoče povsem ekstrahirati olj in maščob brez predhodne hidrolize (npr. gluteni, kvas, krompirjeve beljakovine in izdelki, pri katerih se izvaja izrivanje, kosmičenje in segrevanje).

1.3 Razlaga rezultatov

Vedno kadar je rezultat pri postopku B višji od rezultata pri postopku A, se kot prava vrednost sprejme rezultat, dobljen pri postopku B.

2. Načelo

2.1 Postopek A

Vzorec se ekstrahira s petroletrom. Topilo se oddestilira, ostanek pa osuši in stehta.

2.2 Postopek B

Vzorec se med segrevanjem obdela s klorovodikovo kislino. Mešanica se ohladi in filtrira. Ostanek se spere in osuši, nato pa se izvede določanje v skladu s postopkom A.

3. Reagenti

3.1 Petroleter, vrelišče 40–60 oC. Bromno število mora biti nižje od 1 in ostanek pri uparevanju nižji od 2 mg/100 ml.

3.2 Natrijev sulfat, brezvodni

3.3 Klorovodikova kislina, c = 3 mol/l

3.4 Filtracijsko sredstvo, npr. Kieselguhr, Hyflo-supercel

4. Oprema

4.1 Naprava za ekstrakcijo. Če je opremljena s sifonom (naprava Soxhlet), je hitrost povratnega toka približno 10 ciklov na uro; če ni opremljena s sifonom, je hitrost povratnega toka približno 10 ml na minuto.

4.2 Kartuše za ekstrakcijo, ki ne vsebujejo materialov, topnih v petroletru, in s poroznostjo, ki je v skladu z zahtevami iz točke 4.1.

4.3 Sušilnik, vakuumski, nastavljen na 75 oC ± 3 oC, ali zračni, nastavljen na 100 oC ± 3 oC.

5. Postopek

5.1 Postopek A (glej točko 8.1)

5 g vzorca se natehta na 1 mg natančno, prenese v kartušo za ekstrakcijo (4.2) in pokrije s čepkom iz vate, ki ne vsebuje maščobe.

Kartuša se postavi v ekstraktor (4.1) in šest ur ekstrahira s petroletrom (3.1). Ekstrakt petroletra se zbere v suho stehtano bučko, v kateri so delci plovca ( 24 ).

Topilo se oddestilira. Ostanek se osuši tako, da se bučka za uro in pol postavi v sušilnik (4.3). Pusti se, da se ohladi v eksikatorju, in stehta. Ponovno se suši 30 minut, da se zagotovi ohranitev konstantne mase olj in maščob (izguba mase med dvema zaporednima tehtanjema ne sme presegati 1 mg).

5.2 Postopek B

2,5 g vzorca se natehta na 1 mg natančno (glej točko 8.2), prenese v 400-mililitrsko čašo ali 300-mililitrsko erlenmajerico in ter doda 100 ml klorovodikove kisline (3.3) in delci plovca. Čaša se pokrije z urnim steklom ali pa se erlenmajerica spoji s kondenzatorjem povratnega toka. Pri nizkem plamenu ali na električnem kuhalniku se mešanica počasi zavre in se pusti rahlo vreti eno uro. Paziti je treba, da se vzorec ne oprijema sten posode.

Ohladi se in doda toliko filtracijskega sredstva (3.4), da med filtracijo ne pride do izgub olja in maščob. Filtrira se skozi navlažen, dvojni filtrirni papir, ki ne vsebuje maščob. Ostanek se spere s hladno vodo, dokler filtrat ni nevtralen. Prepričati se je treba, da filtrat ne vsebuje nobenih olj ali maščob. Njihova prisotnost pomeni, da se mora vzorec pred hidrolizo ekstrahirati s petroletrom po postopku A.

Dvojni filtrirni papir, na katerem je ostanek, se prenese na urno steklo in se uro in pol suši v sušilniku (4.3) pri 100 oC ± 3 oC.

Dvojni filtrirni papir s suhim ostankom se prenese v kartušo za ekstrahiranje (4.2) in pokrije s čepkom iz vate, ki ne vsebuje maščob. Kartuša se postavi v ekstraktor (4.1), nato pa se nadaljuje, kakor je navedeno v drugem in tretjem odstavku točke 5.1.

6. Prikaz rezultatov

Masa ostanka se izrazi kot masni delež vzorca.

7. Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, ki jih na istem vzorcu izvaja isti analitik, ne presega:

— 0,2 % absolutne vrednosti za vsebnosti surovih olj in maščobe, nižje od 5 %,

— 4,0 % višjega rezultata za vsebnosti 5–10 %,

— 0,4 % absolutne vrednosti za vsebnosti nad 10 %.

8. Opombe

8.1 Pri proizvodih z visoko vsebnostjo olj in maščob, ki jih je težko zdrobiti ali so neprimerni za pripravo homogenega zmanjšanega skupnega preskusnega vzorca, se uporabi naslednji postopek. 20 g vzorca se natehta na 1 mg natančno in zmeša z 10 g ali več brezvodnega natrijevega sulfata (3.2). Ekstrahira se s petroletrom (3.1), kakor je navedeno v točki 5.1. Ekstrakt se dopolni s petroletrom do 500 ml (3.1) in premeša. 50 ml raztopine se prenese v majhno suho stehtano bučko, v kateri so delci plovca. Oddestilira se topilo, se osuši, nato pa se nadaljuje, kakor je določeno v zadnjem odstavku točke 5.1. Iz ostanka po ekstrakciji v kartuši se odstrani topilo, ostanek se zdrobi do velikosti delcev 1 mm, vrne v kartušo za ekstrakcijo (natrijev sulfat se ne doda), nato pa se nadaljuje, kakor je določeno v drugem in tretjem odstavku točke 5.1. Vsebnost olj in maščob kot masni delež vzorca se izračuna po naslednji formuli: (10m1 + m2) × 5 pri čemer je: m1 = masa ostanka po prvi ekstrakciji (alikvot ekstrakta) v gramih; m2 = masa ostanka po drugi ekstrakciji v gramih.

8.2 Pri proizvodih z nizko vsebnostjo olj in maščob se lahko preskusni vzorec poveča na 5 g.

8.3 Hrano za hišne živali, ki vsebuje veliko vode, je treba včasih pred hidrolizo in ekstrakcijo po postopku B zmešati z brezvodnim natrijevim sulfatom.

8.4 Pri točki 5.2 je za spiranje ostanka po filtraciji morda učinkoviteje uporabiti vročo vodo namesto hladne.

8.5 Pri nekateri krmi je morda treba podaljšati čas sušenja na več kot uro in pol. Odvečnemu sušenju se izogiba, saj lahko povzroči nizke rezultate. Uporabi se lahko tudi mikrovalovna pečica.

8.6 Če je vsebnost surovih olj/maščob višja od 15 %, se pred hidrolizo po postopku A priporoča predhodna ekstrakcija, pri postopku B pa ponovna ekstrakcija. Do določene mere je to odvisno od vrste krme ter vrste olj in maščob v krmi.

I. DOLOČANJE SUROVIH VLAKEN

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje nemastnih organskih snovi v krmi, ki so netopne v kislih in baznih medijih ter so ponavadi poimenovane surova vlakna.

2. Načelo

Vzorec se po potrebi razmasti in zaporedno obdela s specificiranimi koncentracijami vrelih raztopin žveplove kisline in kalijevega hidroksida. Ostanek se loči s filtracijo skozi filter iz sintranega stekla, spere, posuši, stehta in upepeli pri 475–500 oC. Izguba teže pri upepeljevanju ustreza vsebnosti surovih vlaken v preskusnem vzorcu.

3. Reagenti

3.1 Žveplova kislina, c = 0,13 mol/l

3.2 Sredstvo proti penjenju (npr. n-oktanol)

3.3 Filtrirno sredstvo (Celite 545 ali enakovredno), segreto na 500 oC za štiri ure (8.6)

3.4 Aceton

3.5 Petroleter, vrelišče 40–60 oC

3.6 Klorovodikova kislina, c = 0,5 mol/l

3.7 Raztopina kalijevega hidroksida, c = 0,23 mol/l

4. Oprema

4.1 Enota za segrevanje za razklop z žveplovo kislino in raztopino kalijevega hidroksida, opremljena z dodatkom za filtrirni lonček (4.2) in odtočno cevjo, ki je preko zamaška priklopljena na tekočino in vakuum, po možnosti s stisnjenim zrakom. Pred vsako uporabo se enota pet minut segreva z vrelo vodo.

4.2 Stekleni filtrirni lonček z nameščeno filtrirno ploščo iz sintranega stekla in velikosti por 40–90 μm. Pred prvo uporabo ga je treba za nekaj minut segreti na 500 oC in ohladiti (8.6).

4.3 Valj, volumna vsaj 270 ml, s kondenzatorjem povratnega toka, primernim za vretje

4.4 Sušilnik s termostatom

4.5 Žarilna peč s termostatom

4.6 Enota za ekstrakcijo, sestavljena iz podporne plošče za filtrirni lonček (4.2) in odtočne cevi, ki je preko zamaška priklopljena na vakuum in tekočino.

4.7 Obročki, ki povežejo enoto za segrevanje (4.1), lonček (4.2) in valj (4.3) ter enoto za hladno ekstrakcijo (4.6) in lonček.

5. Postopek

1 g pripravljenega vzorca se natehta na 1 mg natančno in prenese v lonček (4.2) (glej opombe 8.1, 8.2 in 8.3), čemur se doda 1 g filtrirnega sredstva (3.3).

Najprej se povežeta enota za segrevanje (4.1) in filtrirni lonček (4.2), nato pa valj (4.3) in lonček. V povezana valj in lonček se nalije 150 ml vrele žveplove kisline (3.1) in po potrebi nekaj kapljic sredstva proti penjenju (3.2).

Tekočina se zavre v 5 ± 2 minutah ter pusti močno vreti natančno 30 minut.

Odpre se zamašek na odtočni cevi (4.1), žveplova kislina se pod vakuumom filtrira skozi filtrirni lonček, ostanek pa se trikrat spere s po 30 ml vrele vode, da je filtrirni ostanek po vsakem spiranju suh.

Odtočni zamašek se zapre, v povezana valj in lonček se nalije 150 ml vrele raztopine kalijevega hidroksida (3.7), nato pa se doda nekaj kapljic sredstva proti penjenju (3.2). Tekočina se zavre v 5 ± 2 minutah ter pusti močno vreti natančno 30 minut. To se filtrira, postopek spiranja pa se ponovi, kakor je bil uporabljen za žveplovo kislino.

Po končnem spiranju in sušenju se lonček z vsebino odklopi in priklopi na enoto za hladno ekstrakcijo (4.6). Ostanek v lončku se pod vakuumom trikrat spere s po 25 ml acetona (3.4), da je filtrirni ostanek po vsakem spiranju suh.

Lonček se suši v sušilniku pri 130 oC do konstantne teže. Po vsakem sušenju se ohladi v eksikatorju in hitro stehta. Lonček se postavi v žarilno peč in pri 475–500 oC žari najmanj 30 minut do konstantne teže (izguba teže med dvema zaporednima tehtanjema ne sme presegati 2 mg).

Po vsakem segrevanju in pred merjenjem se lonček najprej ohladi v peči, nato pa še v eksikatorju.

Slepi preskus se izvede brez vzorca. Izguba teže pri žarjenju ne sme presegati 4 mg.

6. Izračun rezultatov

Vsebnost surovih vlaken, izražena kot masni delež vzorca, se izračuna po naslednji formuli:

pri čemer je:

m = masa vzorca v gramih;

m0 = izguba mase po žarjenju pri določanju v gramih;

m1 = izguba mase po žarjenju pri slepem preskusu v gramih.

7. Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati:

— 0,6 % absolutne vrednosti za vsebnosti surovih vlaken, manjše od 10 %,

— 6 % višje vrednosti za vsebnosti surovih vlaken 10 % ali več.

8. Opombe

8.1 Krmo, ki vsebuje več kakor 10 % surovih maščob, je treba pred analizo razmastiti s petroletrom (3.5). Filtrirni lonček (4.2) z vsebino se poveže z enoto za hladno ekstrakcijo (4.6), ostanek pa se pod vakuumom trikrat spere s po 30 ml petroletra, da je ostanek suh. Lonček z vsebino se poveže z enoto za segrevanje (4.1), nadaljuje pa se v skladu s točko 5.

8.2 Krmo, ki vsebuje maščobe, ki se ne morejo neposredno ekstrahirati s petroletrom (3.5), je treba razmastiti, kakor je navedeno v točki 8.1, in ponovno razmastiti po vretju s kislino. Po vretju s kislino in nadaljnjim spiranjem se lonček z vsebino poveže z enoto za hladno ekstrakcijo (4.6) ter trikrat spere s po 30 ml acetona in trikrat s po 30 ml petroletra. Filtrira se pod vakuumom do suhega stanja, nadaljuje pa se, kakor je navedeno v točki 5, pri čemer se začne z dodajanjem kalijevega hidroksida.

8.3 Če krma vsebuje več kot 5 % karbonatov, izraženih kot kalcijev karbonat, se lonček (4.2) z natehtanim vzorcem poveže z enoto za segrevanje (4.1). Vzorec se trikrat spere s po 30 ml klorovodikove kisline (3.6). Po vsakem dodajanju je treba vzorec pustiti stati približno eno minuto, preden se filtrira. Ponovno se spere s 30 ml vode, nato pa se nadaljuje, kakor je navedeno v točki 5.

8.4 Če se uporablja naprava v obliki stojala (številni lončki, povezani na isto enoto za segrevanje), se v isti seriji ne smeta opraviti posamezni določanji na istem vzorcu za analizo.

8.5 Če je po vretju težko filtrirati kisle in bazične raztopine, se uporabi stisnjen zrak skozi odtočno cev enote za segrevanje in se nato nadaljuje s filtriranjem.

8.6 Temperatura žarjenja ne presega 500 oC, da se podaljša obstojnost steklenih filtrirnih lončkov. Potrebna je previdnost, da se preprečijo odvečni toplotni šoki med segrevanjem ali hlajenjem.

J. DOLOČANJE SLADKORJA

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje količine reducirajočih sladkorjev in celotnih sladkorjev po inverziji, izraženih kot glukoza ali, kadar je to primerno, saharoza s faktorjem preračunavanja 0,95. Uporablja se za krmne mešanice. Za drugo krmo se uporabljajo posebne metode. Kadar je primerno, se laktoza izmeri ločeno in upošteva pri izračunu rezultata.

2. Načelo

Sladkorji se ekstrahirajo z razredčenim etanolom in raztopina se zbistri z raztopinama Carrez I in II. Po odstranitvi etanola se določijo količine pred inverzijo in po njej po Luff-Schoorlovi metodi.

3. Reagenti

3.1 Etanol, 40-odstotna raztopina (v/v), gostota: 0,948 g/ml pri 20 oC, nevtraliziran proti fenolftaleinu

3.2 Raztopina Carrez I: 21,9 g cinkovega acetata Zn (CH3COO)2 × 2H2O in 3 g ledoceta se raztopijo v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.3 Raztopina Carrez II: 10,6 g kalijevega ferocianida K4 Fe (CN)6 × 3H2O se raztopi v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.4 Metiloranž 0,1-odstotna raztopina (m/v)

3.5 Klorovodikova kislina, 4 mol/l

3.6 Klorovodikova kislina, 0,1 mol/l

3.7 Raztopina natrijevega hidroksida, 0,1 mol/l

3.8 Luff-Schoorlov reagent: Med previdnim mešanjem se v raztopimo natrijevega karbonata (3.8.3) vlije raztopina citronske kisline (3.8.2). Doda se raztopina bakrovega sulfata (3.8.1), nato pa se dopolni z vodo do 1 litra. Pusti se čez noč in nato filtrira. Preveri se koncentracija tako dobljenega reagenta (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l), glej zadnji odstavek točke 5.4. pH raztopine je približno 9,4.

3.8.1 Raztopina bakrovega sulfata: v 100 ml vode se raztopi 25 g bakrovega sulfata (Cu SO4 5H2O), ki ne vsebuje železa.

3.8.2 Raztopina citronske kisline: v 50 ml vode se raztopi 50 g citronske kisline (C6H8O7.H2O).

3.8.3 Raztopi