1976L0372 — SL — 03.05.1994 — 003.001

Ta dokument je mišljen zgolj kot dokumentacijsko orodje in institucije za njegovo vsebino ne prevzemajo nobene odgovornosti

►B SEDMA DIREKTIVA KOMISIJE z dne 1. marca 1976 o določitvi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme (76/372/EGS) (UL L 102, 15.4.1976, p.8)

spremenjena z:









▼B

SEDMA DIREKTIVA KOMISIJE

z dne 1. marca 1976

o določitvi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme

(76/372/EGS)







KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske gospodarske skupnosti, ob upoštevanju Direktive Sveta z dne 20. julija 1970 o uvedbi metod vzorčenja in analiz Skupnosti za uradni nadzor krme ( 1 ), kakor je bila nazadnje spremenjena z Aktom o pristopu ( 2 ), in zlasti člena 2 Direktive, ker navedena direktiva zahteva, da se uradni nadzor krme izvaja z uporabo metod vzorčenja in analiz Skupnosti z namenom preverjanja izpolnjevanja zahtev, določenih z zakoni in drugimi predpisi v zvezi s kakovostjo in sestavo krme; ker so direktive Komisije 71/250/EGS z dne 15. junija 1971 ( 3 ), 71/393/EGS z dne 18. novembra 1971 ( 4 ), 72/199/EGS z dne 27. aprila 1972 ( 5 ), 73/46/EGS z dne 5. decembra 1972 ( 6 ), 74/203/EGS z dne 25. marca 1974 ( 7 ) in 75/84/EGS z dne 20. decembra 1974 ( 8 ) že določile številne analitske metode Skupnosti; ker je zaradi napredka dela odtlej priporočljivo sprejeti sedmi sklop metod; ker so ukrepi, predvideni s to direktivo, v skladu z mnenjem Stalnega odbora za krmo, SPREJELA NASLEDNJO DIREKTIVO:







Člen 1

Države članice zahtevajo, da se analize za uradni nadzor vsebnosti aflatoksina B1 v krmi izvaja skladno z metodo, opisano v Prilogi k tej direktivi.

▼M1 —————

▼B

Člen 2

Države članice sprejmejo zakone in druge predpise, potrebne za uskladitev s to direktivo, najpozneje do 1. oktobra 1976. O tem takoj obvestijo Komisijo.

Člen 3

Ta direktiva je naslovljena na države članice.









PRILOGA

DOLOČANJE AFLATOKSINA B1

A. ENODIMENZIONALNA TANKOPLASTNA KROMATOGRAFSKA METODA

▼M2

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje vsebnosti aflatoksina B1 v surovinah in posamičnih krmilih. Ta metoda se ne uporablja kadar je v krmi prisotna citrusova pulpa. Spodnja meja določevanja je 0,01 mg/kg (10 ppb).

Ob prisotnosti motečih snovi je treba ponoviti analizo z uporabo metode B (tekočinska kromatografija visoke ločljivosti).

▼B

2. Princip

Vzorec se ekstrahira s kloroformom. Ekstrakt se filtrira in ustrezen alikvot prečisti s kolonsko kromatografijo na silikagelu. Eluat se upari in ostanek raztopi v določenem volumnu kloroforma ali mešanici benzena in acetonitrila. Alikvot se kromatografira na tankoplastni kromatografiji (TLC). Količina aflatoksina B1 se določi z opazovanjem kromatograma pod UV-svetlobo, vizualno ali s fluorodensitometrijo, s primerjavo z znanimi količinami standardnega aflatoksina B1. Identiteta aflatoksina B1, ekstrahiranega iz krmila, mora biti potrjena z opisanim postopkom.

3. Reagenti

Opomba: Vsi reagenti morajo biti kakovosti „analitskega reagenta“, če ni navedeno drugače.

3.1 Aceton.

3.2 Kloroform, stabiliziran z 0,5 do 1,0 % 96-odstotnega etanola (v/v).

3.3 N-heksan.

3.4 Metanol.

3.5 Brezvodni dietileter, brez peroksidov.

3.6 Mešanica benzena in acetonitrila: 98/2 (v/v).

3.7 Mešanica kloroforma (3.2) in metanola (3.4): 97/3 (v/v).

3.8 Silikagel za kolonsko kromatografijo, velikost delcev od 0,05 do 0,20 mm.

3.9 Hidrofilna vata, predhodno razmaščena s kloroformom, ali steklena volna.

3.10 Natrijev sulfat, brezvoden, v zrnu.

3.11 3.11. Inertni plin, npr. dušik.

3.12 1 N klorovodikova kislina.

3.13 50-odstotna (v/v) žveplova (VI) kislina.

3.14 Kiselgur (hyflosupercel), opran v kislini.

3.15 Silikagel G-HR ali enakovreden, za TLC.

3.16 Standardna raztopina s približno 0,1 μg aflatoksina B1 na ml v kloroformu (3.2) ali mešanici benzen/acetonitril (3.6), pripravljena in preverjena, kakor je navedeno v oddelku 7.

3.17 Standardna raztopina za kvalitativen preskus s približno 0,1 μg aflatoksina B1 in B2 na ml v kloroformu (3.2) ali mešanici benzen/acetonitril (3.6). Te koncentracije so navedene kot vodilo. Njihovo razmerje mora biti tako, da je intenziteta fluorescence za oba aflatoksina enaka.

3.18 Topila za razvijanje: 3.18.1 Kloroform (3.2)/aceton (3.1): 9/1 (v/v), nenasičena kad; 3.18.2 Dietileter (3.5)/metanol (3.4)/voda: 96/3/1 (v/v/v), nenasičena kad; 3.18.3 Dietileter (3.5)/metanol (3.4)/voda: 94/4.5/1.5 (v/v/v), nasičena kad; 3.18.4 Kloroform (3.2)/metanol (3.4): 94/6 (v/v), nasičena kad; 3.18.5 Kloroform (3.2)/metanol (3.4): 97/3 (v/v), nasičena kad.

4. Oprema

4.1 Drobilni mešalnik.

4.2 Naprava za stresanje ali magnetno mešalo.

4.3 Nagubani filtri, Schleicher in Schüll št. 588 ali enakovredni, premer: 24 cm.

4.4 Steklena cev za kromatografijo (notranji premer: 22 mm, dolžina: 300 mm) s teflonskim petelinčkom in 250-mililitrskim napajalnikom.

4.5 Rotacijski vakuumski uparjalnik s 500-mililitrsko bučko z okroglim dnom.

4.6 4.6 500-mililitrske erlenmajerice z brusom.

4.7 Aparatura za TLC.

4.8 Steklene plošče za TLC, 200 × 200 mm, pripravljene, kakor sledi (navedene količine zadostujejo za premaz petih plošč). V erlenmajerico se prenese 30 g silikagela G-HR (3.15). Doda se 60 ml vode, zamaši in stresa eno minuto. Suspenzija se porazdeli po ploščah tako, da se dobi enakomerna plast, debela 0,25 mm. Pusti se, da se posuši na zraku, in nato se shrani v eksikator s silikagelom. Pred uporabo se plošče aktivirajo tako, da se eno uro sušijo v sušilniku pri temperaturi 110 °C. Plošče, pripravljene za uporabo, so primerne, če dajo podobne rezultate, kakor se dobijo s ploščami, pripravljenimi, kakor je navedeno zgoraj.

4.9 Dolgovalovna (360 nm) UV-svetilka. Intenziteta sevanja mora omogočiti, da se madež 1 mg aflatoksina B1 še vedno jasno razloči na plošči TLC z razdalje 10 cm od svetilke.

4.10 10-mililitrske graduirane epruvete s polietilenskimi zamaški.

4.11 UV-spektrofotometer.

4.12 Fluorodensitometer (neobvezno).

5. Postopek

5.1 Priprava vzorca (glej „Opombe“, del C, točka 1).

Vzorec se zdrobi tako, da v celoti preide skozi sito z velikostjo odprtin 1 mm (skladno s priporočilom ISO R 565).

5.2 Ekstrakcija

50 g zdrobljenega, homogeniziranega vzorca se prenese v 500-mililitrsko erlenmajerico (4.6). Doda se 25 g kiselgurja (3.14), 25 ml vode in 250 ml kloroforma (3.2). Erlenmajerica se zamaši, stresa ali meša 30 minut z napravo (4.2) in filtrira skozi naguban filter (4.3). Prvih 10 ml filtrata se zavrže in nato zbere 50 ml.

5.3 Čiščenje kolon

Spodnji del kromatografske cevi (4.4) se zamaši z vato ali stekleno volno (3.9), dve tretjini cevi se napolnita s kloroformom (3.2) in doda se 5 g natrijevega sulfata (3.10).

Preveri se, da je zgornja površina plasti natrijevega sulfata ravna, nato se v majhnih porcijah doda 10 g silikagela (3.8). Po vsakem dodajanju se pazljivo premeša, da se odstranijo zračni mehurčki. Pusti se stati 15 minut in nato se pazljivo doda 15 g natrijevega sulfata (3.10). Pusti se, da tekočina upade, dokler ni tik nad zgornjo površino plasti natrijevega sulfata.

50 ml ekstrakta, dobljenega v 5.2, se zmeša s 100 ml n-heksana (3.3) in mešanica se kvantitativno prenese v kolono. Pusti se, da tekočina upade, dokler ni tik nad zgornjo površino plasti natrijevega sulfata. Izpiralna tekočina se zavrže. Nato se doda 100 ml dietiletra (3.5) in ponovno pusti, da upade do zgornje površine plasti natrijevega sulfata. Med temi postopki se pazi, da je hitrost pretoka od 8 do 12 ml na minuto in da se kolona ne osuši. Tekočina, ki izteka, se zavrže. Nato se eluira s 150 ml mešanice kloroforma/metanola (3.7) in zbere ves eluat.

Eluat se upari skoraj do suhega pri temperaturi, ki ne presega 50 °C, pod tokom inertnega plina (3.11) v rotacijskem uparjalniku (4.5). Kvantitativno se ostanek z uporabo kloroforma (3.2) ali mešanici benzen/acetonitril (3.6) prenese v 10-mililitrsko graduirano epruveto (4.10). Raztopina se koncentrira pod tokom inertnega plina (3.11) ter nato se dopolni volumen do 2 ml s kloroformom (3.2) ali mešanico benzen/acetonitril (3.6).

5.4 Tankoplastna kromatografija

Na TLC-ploščo (4.8), 2 cm od spodnjega roba in v razdaljah 2 cm, se nanesejo volumni standardne raztopine in ekstrakta, navedeni spodaj:

— 10, 15, 20, 30 in 40 μl standardne raztopine aflatoksina B1 (3.16),

— 10 μl ekstrakta, dobljenega v 5.3, in, naneseno na isto točko, 20 μl standardne raztopine (3.16),

— 10 in 20 μl ekstrakta, dobljenega v 5.3.

Kromatogram se razvije v temi z enim od topil za razvijanje (3.18). Topilo je treba izbrati vnaprej, tako da se nanese 25 μl kvalitativne standardne raztopine (3.17) na ploščo in preveri, da sta, kadar sta razvita, aflatoksina B1 in B2 popolnoma ločena.

Pusti se, da topila izhlapijo v temi, in nato se plošča osvetli z UV-svetlobo, tako da se postavi 10 cm od svetilke (4.9). Madeži aflatoksina B1 oddajajo modro fluorescenco.

5.5 Kvantitativno določanje

Določi se vizualno ali s fluorodensitometrijo, kakor je navedeno spodaj.

5.5.1 Vizualne meritve

Količina aflatoksina B1 v ekstraktu se določi s primerjanjem intenzitete fluorescence madežev ekstrakta s fluorescenco madežev standardne raztopine. Po potrebi se interpolira. Fluorescenca, dobljena z nanosom ekstrakta na standardno raztopino, mora biti intenzivnejša od fluorescence 10 μl ekstrakta in viden sme biti samo en madež. Če je intenziteta fluorescence, ki jo povzroči 10 μl ekstrakta, večja od intenzitete 40 μl standardne raztopine, se ekstrakt 10- ali 100-krat razredči s kloroformom (3.2) ali mešanico benzen/acetonitril (3.6), preden se ponovno izpostavi tankoplastni kromatografiji.

5.5.2 Meritve s fluorodensitometrijo

Intenziteta fluorescence madežev aflatoksina B1 se meri s fluorodensitometrom (4.12) pri valovni dolžini vzbujanja 365 nm in valovni dolžini emisije 443 nm. Količina aflatoksina B1 v madežih ekstrakta se določi s primerjanjem intenzitete njihove fluorescence s fluorescenco madežev standardnega aflatoksina B1.

5.6 Potrditev identitete aflatoksina B1

Identiteta aflatoksina B1 v ekstraktu se potrdi s postopki, navedenimi spodaj.

5.6.1 Obdelava z žveplovo (VI) kislino

Žveplova (VI) kislina (3.13) se razprši na kromatogram, dobljen v 5.4. Fluorescenca madežev aflatoksina B1 se mora pod UV-žarki iz modre spremeniti v rumeno.

5.6.2 Dvodimenzionalna kromatografija, ki vključuje nastanek aflatoksina B1-hemiacetala (aflatoksina B2a)

Opomba: Pri izvajanju spodaj navedenih postopkov je treba natančno upoštevati diagram na sliki 3.

5.6.2.1 Nanašanje raztopin Na ploščo (4.8) se vzporedno z robovi (6 cm navznoter od vsake strani) vrežeta dve ravni črti, da se omeji potovanje fronte topil. Na ploščo se s kapilarnimi pipetami ali mikrobrizgalkami naneseta naslednji raztopini: — na točko A: volumen prečiščenega ekstrakta vzorca, dobljenega v 5.3, ki vsebuje približno 2,5 nm aflatoksina B1, — na točki B in C: 25 μl standardne raztopine (3.16).

5.6.2.2 Razvijanje Kromatogram se razvije v smeri I, v temi, z uporabo topila za razvijanje (3.18.1) (1-centimetrska plast v nenasičeni kadi), dokler fronta topila ne doseže mejne črte topila. Plošča se odstrani iz kadi in pusti, da se pet minut suši v temi pri sobni temperaturi. Nato se klorovodikova kislina (3.12) razprši po 2,5 cm visokem pasu, ki zajema točki A in B (prikazano s šrafiranim območjem na sliki 3), dokler ne potemni, pri tem pa se preostanek plošče zaščiti s stekleno ploščo. Pusti se 10 minut, da reagira v temi, in posuši v toku zraka pri sobni temperaturi. Nato se kromatogram razvije v smeri II, v temi, z uporabo topila za razvijanje (3.18.1) (1-centimetrska plast v nenasičeni kadi), dokler fronta topila ne doseže mejne črte topila. Plošča se odstrani iz kadi in pusti, da se posuši pri sobni temperaturi.

5.6.2.3 Interpretacija kromatograma Kromatogram se opazuje pod UV-svetlobo (4.9) in preverijo se naslednje značilnosti. (a) Pojav modrega fluorescentnega madeža aflatoksina B1, ki izhaja iz standardne raztopine, nanesene na C (potovanje v smeri I). (b) Pojav modrega fluorescentnega madeža nereagiranega (s klorovodikovo kislino) aflatoksina B1 in intenzivnejše modrega fluorescentnega madeža aflatoksina B1-hemiacetala, ki oba izhajata iz standardne raztopine, nanesene na B (potovanje v smeri II). (c) Pojav madežev, ki ustrezajo madežem, opisanim v (b); izhajajo iz vzorca ekstrakta, nanesenega na A. Položaj teh madežev je opredeljen najprej s potovalno razdaljo aflatoksina B1 iz A v smeri I (enaka, kakor jo je prepotoval standard, nanesen na C) ter nato s potovalnimi razdaljami aflatoksina B1-hemiacetala od tam v smeri II (enake, kakor jih je prepotoval standard, nanesen na B). Intenziteti fluorescence madežev hemiacetala, ki izhajajo iz ekstrakta in iz standarda, nanesenega na B, bi morali sovpadati.

6. Izračun rezultatov

6.1 Iz vizualnih meritev

Vsebnost aflatoksina B1 v mikrogramih na kg vzorca (ppb) se izračuna z enačbo:

pri čemer je:

Y in X = volumna, v mikrolitrih, standardne raztopine aflatoksina B1 (3.16) in ekstrakta, ki ima podobno intenziteto fluorescence;

S = koncentracija, v mikrogramih, aflatoksina B1 na ml, v standardni raztopini (3.16);

V = končni volumen ekstrakta, v mikrolitrih, ob upoštevanju potrebnih razredčitev;

W = masa, v gramih, vzorca, ki ustreza volumnu ekstrakta, prečiščenega na kolonah.

6.2 Iz fluorodensitometričnih meritev

Vsebnost aflatoksina B1 v mikrogramih na kg vzorca se izračuna z enačbo:

pri čemer je:

Y = volumen, v mikrolitrih, ekstrakta, nanesenega na ploščo (10 ali 20 μl);

S = količina, v nanogramih, aflatoksina B1 v madežu ekstrakta (proporcionalna vrednosti vzetega Y), ki izhaja iz meritev;

V = končni volumen ekstrakta, v mikrolitrih, ob upoštevanju potrebnih razredčitev;

W = masa, v gramih, vzorca, ki ustreza volumnu ekstrakta, prečiščenega v koloni.

7. Priprava in preskušanje standardne raztopine (3.16)

7.1 Določitev koncentracije aflatoksina B1

Pripravi se standardna raztopina aflatoksina B1 v kloroformu (3.2) ali mešanici benzen/acetonitril (3.6) s koncentracijo od 8 do 10 μg/ml. S spektrofotometrom (4.11) se določi absorpcijski spekter med 330 in 370 nm.

Izmeri se optična gostota (A) pri 363 nm, če je bila uporabljena raztopina kloroforma; oziroma pri 348 nm, če je raztapljanje potekalo v mešanici benzen/acetonitril.

Koncentracija v mikrogramih aflatoksina B1 na ml raztopine se izračuna s spodaj navedenimi enačbami:

za raztopino kloroforma;

za raztopino v mešanici benzen/acetonitril.

Razredči se po potrebi, zaščiteno pred dnevno svetlobo, da se dobi delovna standardna raztopina s koncentracijo aflatoksina B1 približno 0,1 μg/ml. Če se hrani v hladilniku pri 4 °C, je raztopina stabilna dva tedna.

7.2 Preskušanje kromatografske čistosti

Na ploščo (4.8) se nanese 5 μl standardne raztopine aflatoksina B1, ki vsebuje od 8 do 10 μg/ml (7.1). Razvije se kromatogram, kakor je navedeno v 5.4. Na UV-svetlobi bi kromatogram moral prikazovati samo en madež in na območju začetnega nanosa ne sme biti zaznavne fluorescence.

8. Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določitev, ki jih na istem vzorcu izvaja isti analitik, ne sme biti večja od:

— 25 % glede na največjo vrednost, za vsebnosti aflatoksina B1 od 10 do 20 μg/kg,

— 5 μg, v absolutni vrednosti, za vsebnosti med 20 in do 50 μg/kg,

— 10 % glede na največjo vrednost, za vsebnosti nad 50 μg/kg.

9. Obnovljivost

Glej „Opombe“, del C, točka 2.

▼M2

B. DOLOČANJE AFLATOKSINA B1 Z METODO TEKOČINSKE KROMATOGRAFIJE VISOKE LOČLJIVOSTI

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje aflatoksina B1 v krmi, vključno s krmo, ki vsebuje citrusovo pulpo. Spodnja meja določevanja je 0,001 mg/kg (1 ppb).

2. Princip

Vzorec ekstrahiramo s kloroformom. Ekstrakt prefiltriramo in alikvotne dele prečistimo v Florisil kartuši in nato v kartuši C18. Končno ločevanje in določanje poteka po postopku tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC) z uporabo kolone C18 z reverzno fazo, čemur sledi postkolonska derivatizacija z jodom in vodo, ter določanje fluorescence.

Opomba:

Mikotoksini so izredno toksične snovi. Ravnanje z njimi se mora opravljati v digestoriju. Kadar so toksini v suhi obliki se morajo sprejeti posebni varstveni ukrepi zaradi njihove elektrostatične narave in tendence, da se razpršijo po delovni površini.

3. Reagenti

3.1 Kloroform, stabiliziran z 0,5 do 1,0 % etanola, glede na maso. Glej točko 10.2.

3.2 Metanol, primeren za metodo HPLC za pripravo 3.6.

3.3 Aceton.

3.4 Acetonitril, primeren za metodo HPLC.

3.5 Topila za razvijanje: Pripravimo jih en dan pred uporabo ali pa zrak v topilih odstranimo ultrazvočno. 3.5.1 Mešanica acetona (3.3) in vode, 98 + 2 (v + v). 3.5.2 Mešanica vode in metanola (3.2), 80 + 20 (v + v). 3.5.3 Mešanica vode in acetona (3.3), 85 + 15 (v + v).

3.6 Mobilna faza za HPLC. Mešanica vode, metanola (3.2) in acetonitrila (3.4), 130 + 70 + 40 (v + v + v). Opomba: Sestavo topila mobilne faze je treba prilagoditi glede na značilnosti uporabljene kolone HPLC.

3.7 Nasičena jodova raztopina: 400 ml vode dodamo 2 g joda. Mešamo vsaj 90 minut in filtriramo skozi membranski filter (4.15). Nasičeno raztopino zavarujemo pred svetlobo, da preprečimo fotokemijsko razgradnjo.

3.8 Celit 545, izpran v kislini, ali enakovreden.

3.9 Florisil kartuša (Waters SEP-PAK) ali enakovredna.

3.10 Kartuša C18 (Waters SEP-PAK) ali enakovredna.

3.11 Inertni plin, npr. dušik.

3.12 Standardna raztopina aflatoksina B1 v kloroformu, koncentracije 10 μg/ml. Koncentracijo raztopine preverimo na naslednji način: določimo absorpcijski spekter raztopine med 330 in 370 nm s pomočjo spektrofotometra (4.23). Izmerimo absorbanco (A) pri največji vrednosti blizu 363 nm. Izračunamo koncentracijo aflatoksina B1 v mikrogramih na mililiter raztopine po enačbi: 3.12.1 Osnovna standardna raztopina aflatoksina B1 v kloroformu. Prenesemo 2,5 ml standardne raztopine aflatoksina B1 (3.12) v 50-ml merilno bučko in dopolnimo s kloroformom do oznake (3.1). Dobro zaprto raztopino, zavito v aluminijasto folijo, shranimo na hladno (4 °C) v temnem prostoru.

3.13 Raztopine aflatoksina B1 za umeritev po metodi HPCL. Opomba: Za pripravo teh raztopin uporabimo stekleno posodo, izprano v kislini (glej 4, Oprema). 3.13.1 Raztopina za umeritev 4ng/ml. Merilno bučko z osnovno standardno raztopino (3.12.1) segrevamo na sobno temperaturo v aluminijasti foliji (nekaj ur). Prenesemo 400 μl osnovne standardne raztopine (200 ng aflatoksina B1) v 50-ml merilno bučko in raztopino odparimo do suhega pod tokom inertnega plina (3.11). Dobljen ostanek raztopimo v približno 20-ml mešanice vode/acetona (3.5.3), dopolnimo do oznake z mešanico vode/acetona in dobro premešamo. 3.13.2 Raztopina za umeritev 3 ng/ml. Kvantitativno prenesemo 7,5 ml raztopine za umeritev (3.13.1) v 10-ml merilno bučko, dopolnimo do oznake z mešanico vode/acetona (3.5.3) in dobro premešamo. 3.13.3 Raztopina za umeritev 2 ng/ml. Kvantitativno prenesemo 25 ml raztopine za umeritev (3.13.1) v 50-ml merilno bučko, dopolnimo do oznake z mešanico vode/acetona (3.5.3) in dobro premešamo. Ta raztopina se imenuje tudi referenčni standard, ki se uporablja za ponovno vbrizganje med HPLC (5.5). 3.13.4 Raztopina za umeritev 1 ng/ml. Kvantitativno prenesemo 2,5 ml raztopine za umeritev (3.13.1) v 10-ml merilno bučko, dopolnimo do oznake z mešanico vode/acetona (3.5.3) in dobro premešamo.

3.14 Ampula, ki vsebuje mešanice aflatoksinov B1, B2, G1 in G2, s koncentracijami približno 1, 0,5, 1 in 0,5 μg/ml v 1 ml kloroforma. 3.14.1 Kromatografska preskusna raztopina. Vsebino ampule (3.14) prenesemo v epruveto s steklenim zamaškom ali fiolo z navojem. Prenesemo 40 μl te raztopine v epruveto s steklenim zamaškom (izprano v kislini) (4.22). Kloroform odparimo pod tokom inertnega plina (3.11) in ponovno raztopimo v 10 ml mešanice vode/acetona (3.5.3).

3.15 Reagenti za potrditveni preskus (6). 3.15.1 Nasičena raztopina natrijevega klorida. 3.15.2 Natrijev sulfat, brezvoden, v zrnu.

4. Oprema

Opozorilo: Uporaba steklene posode, ki ni izprana v kislini, za vodne raztopine aflatoksina lahko povzroči izgube. Posebno pazljivo je treba ravnati z novo stekleno posodo in stekleno posodo za enkratno uporabo, kot so fiole za samovzorčenje in pasteurjeve pipete. Laboratorijsko stekleno posodo, ki pride v stik z vodno raztopino aflatoksinov, je treba namočiti v razredčeno kislino (npr. žveplena kislina = 2 mol/1) več ur, nato pa izprati z destilirano vodo, da odstranimo sledove kisline (npr. trikrat, preverimo s pH indikatorjem). V praksi je to potrebno narediti za bučko z ovalnim dnom (4.4), merilne bučke, merilne valje, fiole ali epruvete, ki se uporabljajo za raztopine za umeritev in končne ekstrakte (zlasti fiole za samovzorčenje) in pasteurjeve pipete, če se te uporabljajo za prenos raztopin za umeritev ali ekstrakte.

4.1 Naprava za mešanje in mletje.

4.2 Velikost odprtine sita 1,0 mm, (ISO R 565).

4.3 Mehanski stresalnik.

4.4 Rotacijski vakumski izparilnik s 150 do 250-ml bučko z ovalnim dnom.

4.5 Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti, injektor z zanko primeren za vbrizganje 250 ml. Glej navodila proizvajalca za delno ali popolno polnjenje zanke.

4.6 Analitska kolona HPLC: pakiranje 3 μm ali 5 μm C18.

4.7 Nepulzirajoča črpalka za dodajanje jodovega postkolonskega reagenta.

4.8 Valco zero dead volume Tee, nerjavno jeklo (1/16” x 0,75 mm).

4.9 Reakcijska spirala; Teflon ali nerjavno jeklo. Dimenzije 3 000 x 0,5 mm do 5 000 x 0,5 mm so bile ugotovljene kot ustrezne v kombinaciji s 5-μm ali 3-μm HPLC kolonami.

4.10 Termostatično vzdrževana vodna kopel, nastavljena na 60 °C, pri čemer se lahko temperatura regulira za vsaj 0,1 °C.

4.11 Detektor fluorescence z valovnima dolžinama vzbujanja pri 365 nm in emisije pri 435 nm. (Za filtrirni instrument: valovna dolžina emisije > 400 nm). Ki omogoča detekcijo vsaj 0,05 ng aflatoksina B1. Protipritisk je priporočljiv (npr. restriktor, spirala iz teflona ali nerjavnega jekla, povezana z izhodom iz detektorja), da bi s tem preprečili zračne mehurčke v pretočni celici.

4.12 Tračni zapisovalnik.

4.13 Elektronski integrator (neobvezen).

4.14 Naguban filtrirni papir s premerom: 24 cm, Macherey-Nagel 617 1/4 ali enakovreden.

4.15 Membranski filter z velikostjo por 0,45 μm, Millipore HAWP 04700 ali enakovreden.

4.16 500-ml erlenmajerica s steklenim zamaškom.

4.17 Steklena kolona (notranji premer približno 1 cm, dolžina približno 30 cm), opremljena s konico Luer.

4.18 Luer petelinček, odporen na kloroform (npr. Bio-rad 7328017, Analytichem Al 6078, J.T. Baker 4514 ali enakovreden).

4.19 Brizga, odporna na kemikalije, 10-ml konektor Luer.

4.20 Brizga za HPLC vbrizgavanje 250 μl (glej 4.5).

4.21 100-μl mikro brizga za pripravo raztopin za umeritev (s tehtanjem preverimo, ali je točnost v okviru 2 %).

4.22 10-ml steklenička z zamaškom, kalibrirana.

4.23 Spektrofotometer, primeren za meritve v UV območju spektra.

4.24 Oprema za potrditveni preskus (6). 4.24.1 100-ml lij ločnik, izpran v kislini, s teflonskim petelinčkom. 4.24.2 Grelni blok, 40 to 50 °C.

5. Postopek

5.1 Priprava vzorca.

Vzorec zdrobimo tako, da v celoti preide skozi sito (4.2).

5.2 Preskusni vzorec.

Natehtamo 50 g pripravljenega preskusnega vzorca v erlenmajerico (4.16).

5.3 Ekstrakcija

Preskusnemu vzorcu dodamo 25 g Celita (3.8), 250 ml kloroforma (3.1) in 25 ml vode (5.2). Erlenmajerico zamašimo in stresamo 30 minut z mehanskim stresalnikom (4.3). Filtriramo skozi naguban filter (4.14). Zberemo 50 ml filtrata. Če je potrebno, vzamemo alikvot filtrata in razredčimo do 50 ml s kloroformom, tako da koncentracija aflatoksina B1 ni večja od 4 ng/ml.

5.4 Čiščenje (postopek je treba izvesti brez večjih prekinitev).

Opozorilo:

— Laboratorij, v katerem opravljamo analize, ustrezno zavarujemo pred dnevno svetlobo. To lahko učinkovito opravimo tako, da uporabimo: — (i) folijo, ki absorbira UV, na oknih v kombinaciji z zasenčeno svetlobo (ni neposredne sončne svetlobe); (ii) zavese ali žaluzije v kombinaciji z umetno svetlobo (sprejemljive so fluorescenčne cevi);

— Raztopine, ki vsebujejo aflatoksin, moramo čim bolj zaščititi pred svetlobo (hranimo jih na temnem, uporabimo aluminijasto folijo).

5.4.1 Čiščenje s Florisil SEP-PAK

5.4.1.1 Priprava sestava kolona-kartuša

Petelinček (4.18) pritrdimo na krajši del kartuše Florisil (3.9) (Glej sliko 1). Kartušo izperemo in odstranimo zrak tako, da vzamemo 10 ml kloroforma (3.1) in hitro pretočimo 8 ml kloroforma prek petelinčka skozi kartušo z uporabo brizge (4.19). Daljši del kartuše pritrdimo na stekleno kolono (4.17) in pretočimo preostala 2 ml kloroforma skozi kartušo v kolono. Petelinček zapremo. Brizgo odstranimo.

5.4.1.2 Čiščenje

V sestav kolona-kartuša dodamo filtrat iz 5.3 in pustimo, da odteče s pomočjo težnosti. Izperemo s 5 ml kloroforma (3.1) in nato z 20 ml metanola (3.2). Eluate zavržemo. Med temi postopki zagotovimo, da se sestav kolona-kartuša ne osuši.

Eluiramo aflatoksin B1 s 40 ml mešanice aceton/voda (3.5.1) in v bučko z ovalnim dnom rotacijskega uparjalnika zberemo ves eluat (4.4). Eluat koncentriramo na rotacijskem uparjalniku pri 40 °C do 50 °C, dokler se aceton ne destilira več. (Opomba: približno 0,5 ml tekočine ostane v bučki. Preskusi so pokazali, da nadaljnje uparjanje ni škodljivo in kadar ostane 0,5 ml tekočine, ni več znatne vsebnosti acetona. Ostanki acetona bi lahko povzročili izgube aflatoksina B1 na kartuši C18). Dodamo 1 ml metanola (3.2), bučko stresemo, da raztopimo aflatoksin B1 na straneh bučke, dodamo 4 ml vode in premešamo. Kartušo odstranimo in zavržemo. Stekleno kolono izperemo z vodo in pripravimo za čiščenje na C18.

5.4.2 Čiščenje C18 SEP-PAK.

5.4.2.1 Priprava sestava kolona-kartuša.

Petelinček pritrdimo (4.18) na krajši del kartuše C18 (3.10) (glej sliko 1). Nastavimo kartušo in odstranimo zrak, tako da hitro pretočimo 10 ml metanola (3.2) prek petelinčka z uporabo brizge (4.19). (Zračni mehurčki v kartuši so vidni kot svetle pike na sicer sivkastem ozadju). Vzamemo 10 ml vode in pretočimo 8 ml skozi kartušo (pri prehodu z metanola na vodo pazimo, da zrak ne pride v kartušo). Daljši del kartuše pritrdimo na stekleno kolono (4.17) in pretočimo preostala 2 ml vode skozi kartušo v kolono. Petelinček zapremo. Brizgo odstranimo.

5.4.2.2 Čiščenje

Ekstrakt, dobljen v 5.4.1.2, kvantitativno prenesemo v stekleno kolono (4.17), pri čemer bučko dvakrat speremo z mešanico 5 ml vode/metanola (3.5.2), pri čemer mešanica odteče s pomočjo težnosti. Med temi postopki zagotovimo, da se sestav kolona-kartuša ne osuši. (Kadar se naredijo zračni mehurčki v zoženem delu blizu kartuše, ustavimo pretok in potolčemo po vrhu steklene kolone, da odstranimo zračne mehurčke. Nato nadaljujemo). Eluiramo s 25 ml mešanice vode/metanola. Eluat zavržemo. Aflatoksin B1 eluiramo s 50 ml mešanice vode/acetona (3.5.3), in v 50-ml merilno bučko zberemo ves eluat. Z vodo dopolnimo do oznake in premešamo: nastalo preskusno raztopino uporabimo za kromatografijo (5.5).

Filtracija končnega ekstrakta pred HPLC običajno ni potrebna. Če štejemo za potrebno, ne smemo uporabiti celuloznega filtra, ker lahko povzroči izgubo aflatoksina B1. Sprejemljivi so teflonski filtri.

5.5 Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti

(Za nastavitev opreme glej sliko 2). Potrebno je dovolj časa za pripravo in stabilizacijo instrumentov.

Opomba 1:

Stopnje pretoka za mobilno fazo in za postkolonski reagent so le okvirne. Po možnosti jih prilagodimo glede na značilnosti kolone HPLC.

Opomba 2:

Odziv detektorja na aflatoksin B1 je odvisen od temperature, zato je potrebna kompenzacija odklona (glej sliko 3). Z vbrizganjem določene količine referenčnega standarda aflatoksina B1 (3.13.3) v rednih časovnih razmikih (tj. vsako tretje vbrizganje), lahko korigiramo vrednosti vrha aflatoksina B1 med temi referenčnimi standardi tako, da uporabimo povprečni odziv, če je razlika med odzivi zaporednih referenčnih standardov zelo majhna (< 10 %). Zato je treba opraviti vbrizganje brez prekinitev. Če je potrebna prekinitev, mora biti prvo vbrizganje pred prekinitvijo in prvo vbrizganje po prekinitvi referenčni standard (3.13.3). Ker je umeritvena krivulja linearna in poteka skozi izhodišče, se količine aflatoksina B1 v vzorcih določijo neposredno s sklicevanjem na bližnje standarde.

5.5.1 Nastavitev črpalke HPLC

Črpalko HPLC (4.5) nastavimo na pretok 0,5 ali 0,3 ml/min za 5-μm ali 3-μm kolono HPLC (4.6) z uporabo mobilne faze (3.6).

5.5.2 Nastavitev črpalke za postkolonsko reakcijo

Črpalko nastavimo (4.7) na pretok 0,2 do 0,4 ml/min z jodom nasičene vodne raztopine (3.7). Okvirni napotek: Pretoki približno 0,4 ali 0,2 ml/min so priporočljivi v kombinaciji s pretoki 0,5 oziroma 0,3 ml/min mobilne faze (3.6).

5.5.3 Detektor fluorescence

Detektor fluorescence nastavimo (4.11) na valovno dolžino vzbujanja = 365 nm in emisije = 435 nm (instrument s filtrom: > 400 nm). Atenuator detektorja nastavimo tako, da dosežemo približno 80 % polnega odklona pisala za 1 ng aflatoksina B1.

5.5.4 Injektor

Za vse raztopine vbrizgamo 250 μ1 v skladu z navodili proizvajalca injektorja.

5.5.5 Preverjanje kromatografske separacije

Vbrizgamo kromatografsko preskusno raztopino (3.14.1). Spodnji deli krivulje morajo biti manjši od 5 % vsote zgornjih delov krivulje sosednjih vrhov.

5.5.6 Preverjanje stabilnosti sistema

Pred vsako serijo analiz vbrizgamo referenčni standard (3.13.3), dokler ne dosežemo stabilne površine vrhov (Opomba: Vrhovi aflatoksina B1 med dvema zaporednima vbrizgoma se ne smejo razlikovati za več kot 6 %). Nemudoma nadaljujemo s preverjanjem linearnosti (5.5.7).

5.5.7 Preverjanje linearnosti

Vbrizgamo umeritvene raztopine aflatoksina B1 (3.13.1 do 3.13.4). Pri vsakem tretjem vbrizganju uporabimo referenčni standard (3.13.3) za popravek odklona pri odzivu (Opomba: Odzivi vrhov za ta referenčni standard se ne smejo razlikovati za več kot 10 % v 90 minutah). Popravek odklona je v skladu z enačbo, navedeno v točki 7. Umeritveni graf mora biti linearen in potekati skozi izvor znotraj dvakratne standardne napake ocenjenega Y. Vrednosti se ne smejo razlikovati za več kot 3 % od nazivnih vrednosti. Če so te zahteve izpolnjene, nemudoma nadaljujemo. Če niso izpolnjene, pa težavo ugotovimo in odpravimo, preden nadaljujemo.

5.5.8 Vbrizganje ekstraktov vzorcev

Vbrizgamo očiščene ekstrakte vzorca (5.4.2.2). Po vsakem drugem vbrizganju ekstrakta vzorca ponovimo vbrizganje referenčnega standarda (3.13.3) v skladu z naslednjim nizom: referenčni standard, ekstrakt, ekstrakt, referenčni standard, ekstrakt, ekstrakt, referenčni standard itd.

6. Potrditveni preskus

6.1 Nadaljnja obdelava ekstrakta (5.4.2.2)

Končnemu ekstraktu iz 5.4.2.2. dodamo 5 ml raztopine natrijevega klorida (3.15.1). Ekstrahiramo trikrat z 2 ml kloroforma (3.1) eno minuto v liju ločniku (4.24.1). Kombinirane ekstrakte kloroforma prelijemo čez približno 1 g natrijevega sulfata (3.15.2) v 10-ml epruveto. Uporabimo lahko manjši lij (premer: 4 cm) s koščkom surovega bombaža v vratu lija, ki ga pokriva približno 1 g natrijevega sulfata.

Plast natrijevega sulfata izperemo z nekaj ml kloroforma, ki ga zberemo v isti epruveti. Ekstrakt kloroforma izparimo do suhega v isti epruveti z uporabo grelnega bloka (4.24.2) in ponovno raztopimo v 1 ml kloroforma.

6.2 Priprava derivata in tankoplastna kromatografija:

Glej Prilogo k Direktivi Sveta 76/372/EGS metoda A, točka 5.6.2.

7. Izračun rezultatov

Vsebnost aflatoksina B1(mg/kg) v vzorcu izračunamo s formulo:

pri čemer je:

m = količina aflatoksina B1 v ng, ki jo predstavlja vrh vzorca aflatoksina B1, izračunana na naslednji način:

P (vzorec) = površina vrha aflatoksina B1 vzorca

P(st1) = površina vrha aflatoksina B1, ki izhaja iz predhodnega vbrizganja referenčnega standarda (3.13.3)

P(st2) = površina vrha aflatoksina B1, ki izhaja iz naslednjega vbrizganja referenčnega standarda (3.13.3)

r(st) = vbrizgana količina aflatoksina B1 v referenčnem standardu (3.13.3) v ng

Vm = prostornina vbrizganega ekstrakta vzorca v ml

Vext = končna prostornina ekstrakta vzorca v ml, z upoštevanjem opravljene razredčitve (5.3)

M = masa vzorca v g

Vf = prostornina filtrata, prenesenega v kartušo Florisil (5.4.1.2) v ml

Vc = prostornina kloroforma, uporabljenega za ekstrahiranje vzorca v ml

Če upoštevamo postopek v tem protokolu, se formula glasi:

vsebnost aflatoksina B1 v μg/kg = 20 x m.

7.1 Izračun lahko izvedemo tudi z merjenjem vrhov.

8. Ponovljivost:

Glej točko 10.1.

9. Obnovljivost:

Glej točko 10.1

10. Opazovanje

10.1 Natančnost

Rezultati ponovljivosti in obnovljivosti medlaboratorijske študije ( 9 ), opravljene na mednarodni ravni za krmne mešanice, so navedeni v Razpredelnici 1. Tu uporabljeni izraz ponovljivost (r) je definiran kot največje razmerje, ki ni signifikantno pri 95 % ravni verjetnosti za primerjavo dveh odčitkov za isti vzorec v istem laboratoriju pod podobnimi pogoji. Izraz obnovljivost (R) je definiran podobno, za primerjavo dveh različnih laboratorijev. V skladu z ISO 3534 — 1977, 2.35 ( 10 ) in Odločbo Komisije 89/610/EGS ( 11 ) sta r in R navedena v Razpredelnici 1 kot koeficienta variacije.







Razpredelnica 1 Ponovljivost (r) in obnovljivost (R), izraženi kot razmerje in ustrezni koeficienti variacije (15 laboratorijev) Raven r R CVr (1) CVR (μg/kg) (%) (%) 8 & 14 1,4 1,7 11 18 (1) CV = koeficient variacije

10.2 Stabilizacija kloroforma (3.1)

Adsorpcijske značilnosti kartuše se lahko spremenijo, če se uporabijo drugi stabilizatorji in ne etanol. To je treba preveriti v skladu s točko 10.3, kadar opisani kloroform ni na voljo.

10.3 Točnost

Pravilna uporaba metode se preveri s ponovljenimi merjenji na potrjenih referenčnih materialih. Če slednji niso na voljo, je treba izvajanje metode preveriti s ponovnimi preskusi na ojačanih slepih vzorcih. Odklon srednje vrednosti od dejanske vrednosti, izražene kot odstotek dejanske vrednosti, mora biti v mejah od -20 do + 10 %.

Slika 1: Sestav kolona-kartuša

Slika 2: Shema poteka sistema LC s postkolonsko derivatizacijo z jodom.

Slika 3: Kompenzacija odklona pri odzivu na aflatoksin B1 z vbrizganjem referenčnega standarda (3.13.3) v rednih razmikih

▼M3

C. OPOMBE V ZVEZI Z METODAMA A IN B

1. Razmastitev

Vzorce, ki vsebujejo več kakor 5 % maščob, moramo razmastiti s petroletrom (vrelišče 40 do 60 oC) po pripravah, navedenih v 5.1.

V takih primerih morajo biti rezultati analize izraženi glede na maso nerazmaščenega vzorca.

2. Obnovljivost rezultatov za metodo A

Obnovljivost rezultatov, tj. odstopanje med rezultati, dobljenimi v dveh ali več laboratorijih na istem vzorcu, je bila ocenjena pri:

± 50 % glede na srednjo vrednost za srednje vrednosti aflatoksina B od 10 do 20 μg/kg;

± 10 μg/kg k srednji vrednosti za srednje vrednosti, večje od 20 in do 50 μg/kg;

± 20 % glede na srednjo vrednost za srednje vrednosti nad 50 μg/kg.

▼B









Dodatek k Prilogi

Slika 1

Slika 2

Slika 3