1991R2568 — SL — 01.10.2008 — 022.001

Ta dokument je mišljen zgolj kot dokumentacijsko orodje in institucije za njegovo vsebino ne prevzemajo nobene odgovornosti

spremenjena z:







(*) Ta akt ni bil nikoli objavljen v slovenščini.









▼B

UREDBA KOMISIJE (EGS) št. 2568/91

z dne 11. julija 1991

o značilnostih oljčnega olja in olja iz oljčnih tropin ter o ustreznih analiznih metodah







KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske gospodarske skupnosti, ob upoštevanju Uredbe Sveta št. 136/66/EGS z dne 22. septembra 1966 o vzpostavitvi skupne ureditve trga za olja in masti ( 1 ), nazadnje spremenjene z Uredbo (EGS) št. 3577/90 ( 2 ) , in zlasti člena 35a Uredbe, ker Priloga k Uredbi št. 136/66/EGS vsebuje opise in opredelitve pojmov za oljčno olje in olje iz oljčnih tropin, ki je v prometu znotraj vsake države članice, v trgovini v Skupnosti in v trgovini s tretjimi državami; ker naj bi se z namenom razločevanja med različnimi vrstami olja, opredelile fizikalne in kemijske lastnosti vsake od njih ter senzorične značilnosti deviškega olja, zato da se zagotovita pristnost in kakovost zadevnih proizvodov, ne da bi se posegalo v druge obstoječe določbe; ker naj bi bile značilnosti različnih vrst olj enotno opredeljene po vsej Skupnosti; ker naj bi bile s tem namenom vzpostavljene metode kemijske analize in senzorične ocene Skupnosti; ker naj bi bila v prehodnem obdobju dovoljena uporaba drugih analiznih metod, ki se uporabljajo v državah članicah pod pogojem, da če se rezultati razlikujejo, imajo odločilen vpliv rezultati, dobljeni z uporabo navedenih metod Skupnosti; ker opredelitev fizikalnih in kemijskih značilnosti oljčnega olja in analiznih metod povzročijo spremembo dodatnih opomb k Poglavju 15 kombinirane nomenklature; ker metoda za ocenjevanje senzoričnih značilnosti deviškega olja vključuje ustanovitev ocenjevalnih skupin; izbranih in usposobljenih pokuševalcev; ker naj bi se zato določilo obdobje, potrebno za vzpostavitev takšne strukture; ker naj bi bilo glede na težave, s katerimi se bodo soočale nekatere države članice pri ustanavljanju skupin pokuševalcev, odobri se uporaba skupin v drugih državah članicah; ker naj se za zagotovitev pravilnega delovanja sistema prelevmanov pri uvozu oljčnih tropin, določi enotna metoda za določanje vsebnosti olja v teh proizvodih; da se ne bi škodilo trgovanju, je treba olje, ki je bilo predpakirano pred začetkom veljavnosti te uredbe, prodati v omejenem roku; ker je treba razveljaviti Uredbo Komisije (EGS) št. 1058/77 ( 3 ), nazadnje spremenjeno z Uredbo (EGS) št. 1858/88 ( 4 ); ker Upravljalni odbor za olja in masti ni podal svojega mnenja v roku, ki ga je določil njegov predsedujoči, SPREJELA NASLEDNJO UREDBO:







▼M20

Člen 1

1. Olja, katerih značilnosti so skladne z značilnostmi iz točk 1 in 2 Priloge I k tej uredbi, se štejejo za deviška oljčna olja v smislu točke 1(a) in (b) Priloge k Uredbi št. 136/66/EGS.

2. Olje, katerega značilnosti so skladne z značilnostmi iz točke 3 Priloge I k tej uredbi, se šteje za lampante oljčno olje v smislu točke 1(c) Priloge k Uredbi št. 136/66/EGS.

3. Olje, katerega značilnosti so skladne z značilnostmi iz točke 4 Priloge I k tej uredbi, se šteje za rafinirano oljčno olje v smislu točke 2 Priloge k Uredbi št. 136/66/EGS.

4. Olje, katerega značilnosti so skladne z značilnostmi iz točke 5 Priloge I k tej uredbi, se šteje za oljčno olje, sestavljeno iz rafiniranih oljčnih olj in deviških oljčnih olj v smislu točke 3 Priloge k Uredbi št. 136/66/EGS.

5. Olje, katerega značilnosti so skladne z značilnostmi iz točke 6 Priloge I k tej uredbi, se šteje za surovo olje iz oljčnih tropin v smislu točke 4 Priloge k Uredbi št. 136/66/EGS.

6. Olje, katerega značilnosti so skladne z značilnostmi iz točke 7 Priloge I k tej uredbi, se šteje za rafinirano olje iz oljčnih tropin v smislu točke 5 Priloge k Uredbi št. 136/66/EGS.

7. Olje, katerega značilnosti so skladne z značilnostmi iz točke 8 Priloge I k tej uredbi, se šteje za olje iz oljčnih tropin v smislu točke 6 Priloge k Uredbi št. 136/66/EGS.

▼B

Člen 2

1. Značilnosti olj, določenih v Prilogi I, se določijo v skladu z naslednjimi analiznimi metodami:

— za določanje prostih maščobnih kislin, izraženih v masnem odstotnem deležu oleinske kisline, metoda, določena v Prilogi II,

— za določanje peroksidnega števila, metoda, določena v Prilogi III,

▼M19

— for determination of the wax content, the method given in Annex IV,

▼B

— za določanje vsebnosti sterolov, metoda, določena v Prilogi V,

— za določanje eritrodiola in uvaola, metoda, določena v Prilogi VI,

▼M21

— pri določanju odstotnega deleža 2-gliceril monopalmitata, metoda, določena v Prilogi VII,

▼M20 —————

▼B

— za spektrofotometrično analizo, metoda, določena v Prilogi IX,

— za določanje sestave maščobnih kislin, metoda, določena v Prilogi X A in X B,

— za določanje hlapnih halogeniranih topil, metoda, določena v Prilogi XI,

— za določanje senzoričnih značilnosti deviškega oljčnega olja, metoda, določena v Prilogi XII,

▼M20 —————

▼M11

— za določanje stigmastadienov metoda iz Priloge XVII,

▼M13

— for determining the content of triglycerides with ECN42, the method set out in Annex XVIII,

▼M19

— for determination of the aliphatic alcohol content, the method given in Annex XIX.

▼M19

2. Verification by national authorities or their representatives of the organoleptic characteristics of virgin oils shall be effected by tasting panels approved by the Member States.

The organoleptic characteristics of an oil as referred to in the first subparagraph shall be deemed consonant with the category declared if a panel approved by the Member State confirms the grading.

Should the panel not confirm the category declared as regards the organoleptic characteristics, at the interested party's request the national authorities or their representatives shall have two counter-assessments carried out by other approved panels, at least one by a panel approved by the producer Member State concerned. The characteristics concerned shall be deemed consonant with the characteristics declared if at least two of the counter-assessments confirm the declared grade. If that is not the case, the interested party shall be responsible for the cost of the counter-assessments.

▼M17

3. When the national authorities or their representatives verify the characteristics of the oil as provided for in paragraph 1, samples shall be taken in accordance with international standards EN ISO 661 on the preparation of test samples and EN ISO 5555 on sampling. However, notwithstanding point 6.8 of standard EN ISO 5555, in the case of batches of such oils in immediate packaging not exceeding 100 litres, the sample shall be taken in accordance with Annex Ia to this Regulation.

▼M19

Without prejudice to standard EN ISO 5555 and Chapter 6 of standard EN ISO 661, the samples taken shall be put in a dark place away from strong heat as quickly as possible and sent to the laboratory for analysis no later than:

— the tenth working day after they are taken, during the period from October to May, and

— the fifth working day after they are taken, during the period from June to September.

▼M17

4. ►M20 Za namene preverjanja iz odstavka 3 se analize, navedene v prilogah II, III, IX, X in XII, in, kjer je primerno, vse nasprotne analize, ki jih zahteva nacionalna zakonodaja, izvedejo pred iztekom minimalnega roka trajanja. Če se vzorčenje izvede več kot štiri mesece pred iztekom minimalnega roka trajanja, se analize izvedejo najpozneje štiri mesece po mesecu odvzema vzorca. Za druge analize iz zadevne uredbe ne veljajo nobeni roki. ◄

Unless the sample was taken less than one month before the minimum durability date, if the results of the analyses do not match the characteristics of the category of olive oil or olive-residue oil declared, the party concerned shall be notified no later than one month before the end of the period laid down in the first subparagraph.

▼M19

5. For the purpose of determining the characteristics of olive oils by the methods provided for in paragraph 1, the analysis results shall be directly compared with the limits laid down in this Regulation.

▼M20

Člen 2a

Nacionalni organi ali njihovi zastopniki lahko preverijo, ali je vzorec skladen z deklarirano kategorijo:

(a) bodisi z izvedbo analiz, po katerem koli vrstnem redu, iz Priloge I;

(b) bodisi z upoštevanjem vrstnega reda iz Priloge Ib o drevesu odločanja, dokler se ne sprejme ena od odločitev iz drevesa odločanja.

▼M19 —————

▼M5

Člen ►M19 3 ◄

Kadar se ugotovi, da senzorične značilnosti olja ne ustrezajo njegovemu opisu, mora zadevna država, članica brez vpliva na kakršne koli druge kazni, uporabiti upravne denarne kazni, ki se določijo glede na resnost odkritih nepravilnosti.

Pri ocenjevanju nepravilnosti je treba posebno pozornost posvetiti naravnim spremembam lastnosti olja, ki se hrani v normalnih pogojih.

Na začetku vsakega polletja morajo države članice obvestiti Komisijo o številu in vrsti odkritih nepravilnosti in o kaznih, uporabljenih v zadnjem polletju.

▼M5

Člen 4

▼M19

1. The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

— the requirements of Annex XII.4 are met,

— the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

— continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2. Če države članice naletijo na težave pri ustanavljanju skupin ocenjevalcev na svojem ozemlju, se lahko obrnejo na skupino ocenjevalcev, potrjeno v drugi državi članici.

3. Vsaka država članica sestavi seznam skupin ocenjevalcev, ki so jih ustanovile strokovne ali medpanožne organizacije v skladu s pogoji, določenimi v odstavku 1, in zagotovi, da so ti pogoji izpolnjeni.

▼M19 —————

▼B

Člen 6

1. Vsebnost olja v oljni pogači in drugi ostanki, ki nastanejo pri pridobivanju oljčnega olja (oznaki KN 2306 90 11 in 2306 90 19) se določijo z uporabo metode, predpisane v Prilogi XV.

2. Vsebnost olja, navedenega v odstavku 1, je izražena v masnem odstotnem deležu olja na maso suhe snovi.

▼M20

Člen 7

Uporabljajo se določbe Skupnosti o prisotnosti onesnaževalcev.

Kar zadeva halogenirana topila so mejne vrednosti za vse kategorije oljčnih olj naslednje:

— največji delež vsakega zaznanega halogeniranega topila: 0,1 mg/kg,

— največji skupni delež zaznanih halogeniranih topil: 0,2 mg/kg.

▼B

Člen 8

1. Države članice morajo obvestiti Komisijo o ukrepih, sprejetih za izvajanje te uredbe.

2. Države članice morajo na začetku vsakega polletja poslati Komisiji poročilo o analiznih podatkih v zvezi s preskusi, opravljenimi v teku predhodne polovice leta.

Upravljalni odbor za olja in masti mora proučiti rezultate v skladu s postopkom, predpisanim v členu 39 Uredbe št. 136/66/EGS.

Člen 9

Uredba (EGS) št. 1058/77 se s tem razveljavi.

Člen 10

1. Ta uredba začne veljati tretji dan po objavi v Uradnem listu Evropskih skupnosti.

Vendar se metoda, predpisana v Prilogi XII, uporablja od ►M1 1. november 1992 ◄ , razen če ne zadeva postopka sistema intervencij.

▼M5

Ta metoda se ne uporablja za deviško olje, ki je bilo pripravljeno za trg pred 1. novembrom 1992.

▼B

2. Ta uredba se ne uporablja za oljčno olje in oljčne tropine, predpakirane pred začetkom veljavnosti te uredbe in so v prometu do 31. oktobra 1992.

Ta uredba je v celoti zavezujoča in se neposredno uporablja v vseh državah članicah.









PRILOGE

Vsebina







Priloga I: Značilnosti oljčnega olja ▼M17 Priloga IA: Vzorčenje oljčnega olja ali olja iz oljčnih tropin, dostavljenega v izvirnem pakiranju, ki ne presega 100 litrov ▼M20 Priloga IB: Drevo odločanja ▼B Priloga II: ►M21 Določevanje prostih maščobnih kislin, metoda v hladnem ◄ Priloga III: Določanje peroksidnega števila Priloga IV: ►M6 Določanje vsebnosti voskov z uporabo kapilarne plinsko-tekočinske kromatografije ◄ Priloga V: Določanje sestave in vsebnosti sterolov s kapilarno plinsko kromatografijo Priloga VI: Določanje eritrodiola in uvaola Priloga VII: ►M21 Določevanje odstotnega deleža 2-gliceril monopalmitata ◄ ▼M20 ————— ▼B ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B ▼M11 Priloga XVII: Določanje stigmastadienov v rastlinskih oljih ▼M13 Annex XVIII: Method for determining the content of triglycerides with ECN42 ▼M19 Annex XIX: Method for determining aliphatic alcohol content

▼M21









PRILOGA I

LASTNOSTI OLJČNEGA OLJA







Kategorija Kislost (%) (*) Peroksidno število mekv O2/kg (*) Voski mg/kg (**) 2-gliceril monopalmitat (%) Stigmastadiena mg/kg (1) Razlika med HPLC ECN42 in teoretičnim izračunom ECN42 K232 (*) K270 (*) Delta-K (*) Organoleptično ocenjevanje Mediana napak (Md) (*) Organoleptično ocenjevanje Mediana sadežnosti (Mf) (*) 1. Ekstra deviško oljčno olje ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 če je skupni % palmitinske kisline ≤ 14 % ≤1,0 če je skupni % palmitinske kisline > 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 2. Deviško oljčno olje ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 če je skupni % palmitinske kisline ≤ 14 % ≤ 1,0 če je skupni % palmitinske kisline > 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ ►M22 3,5 ◄ Mf > 0 3. Lampante oljčno olje > 2,0 — ≤ 300 (2) ≤ 0,9 če je skupni % palmitinske kisline ≤ 14 % ≤ 1,1 če je skupni % palmitinske kisline > 14 % ≤ 0,50 ≤ 0,3 — — — Md > ►M22 3,5 ◄ (3) — 4. Rafinirano oljčno olje ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 350 ≤ 0,9 če je skupni % palmitinske kisline ≤ 14 % ≤ 1,1 če je skupni % palmitinske kisline > 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — 5. Oljčno olje – mešanica rafiniranega oljčnega olja ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 350 ≤ 0,9 če je skupni % palmitinske kisline ≤ 14 % ≤ 1,0 če je skupni % palmitinske kisline > 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — 6. Surovo olje iz oljčnih tropin — — > 350 (4) ≤ 1,4 — ≤ 0,6 — — — — — 7. Rafinirano olje iz oljčnih tropin ≤ 0,3 ≤ 5 > 350 ≤ 1,4 — ≤ 0,5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Olje iz oljčnih tropin ≤ 1,0 ≤ 15 > 350 ≤ 1,2 — ≤ 0,5 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — —







Kategorija Vsebnost kislin (1) Vsota translinolnih izomer (%) Vsote translinolenih in translinolenskih izomer (%) Sestava sterolov Skupni steroli (mg/kg) Eritrodiol in uvaol (%) (**) Miristinska (%) Linolenska (%) Arašidova (%) Eikozanojska (%) Behenska (%) Lignocerinska (%) Holesterol (%) Brasikasterol (%) Kampesterol (%) Stigmasterol (%) Betasitosterol (%) (2) Delta-7-stigmastenol (%) 1. Ekstra deviško oljčno olje ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Deviško oljčno olje ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Lampante oljčno olje ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (3) 4. Rafinirano oljčno olje ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Oljčno olje - mešanica rafiniranih oljčnih olj in deviških oljčnih olj ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Surovo olje iz oljčnih tropin ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (4) 7. Rafinirano olje iz oljčnih tropin ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Olje iz oljčnih tropin ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5

▼M20









PRILOGA IA

VZORČENJE OLJČNEGA OLJA ALI OLJA IZ OLJČNIH TROPIN, DOSTAVLJENEGA V IZVIRNEM PAKIRANJU, KI NE PRESEGA 100 LITROV

Ta metoda vzorčenja se uporablja za dobave oljčnega olja ali olja iz oljčnih tropin, ki ne presegajo 125 000 litrov, v izvirnem pakiranju, ki ne presega 100 litrov.

Če dobava presega 125 000 litrov, jo je treba razdeliti v serije po 125 000 litrov ali manj. Če znaša dobava manj kot 125 000 litrov, sestavlja eno serijo. Zadevna metoda se nato uporabi za vsako serijo.

Najmanjše število primarnih vzorcev, ki jih je treba vzeti, se določi na podlagi velikosti serije v skladu s tabelo iz točke 1.

Velikost primarnega vzorca se določi na podlagi prostornine izvirnega pakiranja v skladu s tabelo iz točke 2.1.

Opredelitve dobave, primarnega vzorca in laboratorijskega vzorca so navedene v standardu EN ISO 5555.

Serija‘ pomeni skupek prodajnih enot, ki se proizvajajo, izdelujejo in pakirajo v takih okoliščinah, da se olje, ki ga vsebuje vsaka prodajna enota, šteje za homogeno v smislu vseh analitičnih značilnosti.

1. ŠTEVILO PRIMARNIH VZORCEV, KI JIH JE TREBA VZETI

Najmanjše število primarnih vzorcev, ki jih je treba vzeti, se določi na podlagi velikosti serije v skladu z naslednjo tabelo:







Velikost serije (v litrih), ki znaša manj kot Najmanjše število primarnih vzorcev 7 500 2 25 000 3 75 000 4 125 000 5

Izvirna pakiranja, ki sestavljajo primarni vzorec, morajo biti izbrana med sosednjimi pakiranji v partiji.

V primeru dvoma države članice povečajo število primarnih vzorcev, ki jih je treba vzeti.

2. VSEBINA PRIMARNIH VZORCEV

2.1 Primarni vzorci morajo vsebovati naslednje:



Če je prostornina izvirnega pakiranja: Primarni vzorec zajema olje iz: (a) 5 litrov ali več (a) 3 izvirnih pakiranj (b) 3 litre ali več vendar manj kot 5 litrov (b) 3 izvirnih pakiranj (c) 2 litra ali več vendar manj kot 3 litre (c) 3 izvirnih pakiranj (d) 1 liter ali več vendar manj kot 2 litra (d) 6 izvirnih pakiranj (e) 0,75 litra ali več vendar manj kot 1 liter (e) 6 izvirnih pakiranj (f) manj kot 0,75 litra (f) trikratne količine olja iz najmanjšega števila pakiranj s skupno prostornino več kot 1,5 litra

2.2 Primarne vzorce je treba hraniti v izvirnem pakiranju do časa analize. Olje v primarnih vzorcih se nato, kakor je ustrezno, razdeli v tri laboratorijske vzorce za izvedbo: (a) analiz iz prilog II, III, IX in X, (a) analize iz Priloge XII, (c) drugih analiz.

2.3 Pakiranja, ki sestavljajo primarni vzorec, se razdelijo v skladu s postopki kontrole, ki jih določa nacionalna zakonodaja.

3. ANALIZE IN REZULTATI

(a) Vsak primarni vzorec iz točke 1 se razdeli v laboratorijske vzorce v skladu s točko 2.5 standarda EN ISO 5555 in analizira na naslednji način: — določanje prostih maščobnih kislin iz prve alinee člena 2(1), — določanje peroksidnega števila iz druge alinee člena 2(1), — spektrofotometrična analiza iz osme alinee člena 2(1), — določanje sestave maščobnih kislin iz devete alinee člena 2(1),

(b) Če eden od rezultatov analiz iz točke (a) za najmanj en primarni vzorec, vzet iz iste serije, ni v skladu z značilnostmi deklarirane kategorije olja, je treba celotno zadevno serijo deklarirati kot neskladno. Če rezultati analiz iz točke (a) za vsak primarni vzorec, vzet iz iste partije, niso enotni, ob upoštevanju značilnosti ponovljivosti zadevnih metod, je treba celotno serijo deklarirati kot neenotno in vsak primarni vzorec podvreči drugi zahtevani analizi. V nasprotnem primeru je treba en primarni vzorec iz serije podvreči drugi zahtevani analizi.

(c) Če eden od rezultatov analiz iz drugega odstavka točke (b) ni v skladu z značilnostmi deklarirane kategorije olja, je treba celotno zadevno serijo deklarirati kot neskladno. Če so vsi rezultati analiz iz drugega odstavka točke (b) v skladu z značilnostmi deklarirane kategorije olja, je treba celotno zadevno serijo deklarirati kot skladno.

▼M20









PRILOGA IB

DREVO ODLOČANJA ZA PREVERJANJE, ALI JE VZOREC OLJČNEGA OLJA SKLADEN Z DEKLARIRANO KATEGORIJO

Analiza za preverjanje, ali je oljčno olje ali olje iz oljčnih tropin skladno z deklarirano kategorijo, se lahko opravi:

(a) bodisi z izvedbo, po naključnem vrstnem redu, analiz, predvidenih za namen preverjanja skladnosti z značilnostmi iz Priloge I; bodisi

(b) z izvedbo, po vrstnem redu iz drevesa odločanja, analiz, ki so v njem opredeljene, dokler se ne sprejme ena od odločitev iz drevesa odločanja.

Analize, ki se nanašajo na onesnaževalce in so potrebne za preverjanje skladnosti s standardi Evropske skupnosti, je treba opraviti ločeno.

Drevo odločanja se uporablja za vse kategorije oljčnega olja in olja iz oljčnih tropin. Sestavljeno je iz tabel, oštevilčenih od 1 do 11, ki jim je treba slediti na podlagi deklarirane kategorije zadevnega olja po vrstnem redu, določenem v splošni tabeli.

Legenda splošne tabele in tabel od 1 do 11:

— dvojna črta (=) označuje smer, ki ji je treba slediti v primeru skladnosti (pozitiven odgovor) z merili, navedenimi v predhodnem okencu. Pikčasta črta (…) označuje nadomestno smer, ki ji je treba slediti v primeru neskladnosti,

— naslovi v okencih v tabelah 1 do 11 se nanašajo na analize iz te uredbe na podlagi tabele ekvivalentnosti iz Dodatka 1 k tej prilogi,

— naslovi v oklepajih, ki se pojavljajo v krogih z negativnimi odločitvami v tabelah 1 do 11, se sklicujejo na okvirne informacije iz Dodatka 2 k tej prilogi. Črke same po sebi ne zavezujejo k izvedbi analiz ali označujejo verodostojnost navedenih predpostavk.









DODATEK 1

Tabela ekvivalentnosti med prilogami k tej uredbi in analizami iz drevesa odločanja







▼M21 — Kislost Priloga II Določevanje prostih maščobnih kislin, metoda v hladnem ▼M20 — Peroksidno število Priloga III Določanje peroksidnega števila — UV absorbanca Priloga IX Spektrofotometrična analiza — Senzorična ocena Priloga XII Senzorična ocena deviškega oljčnega olja — 3,5-stigmastadieni Priloga XVII Metoda določanja stigmastadienov v rastlinskih oljih — Trans izomer maščobnih kislin Priloga Xa in Analiza metilnih estrov maščobnih kislin s plinsko kromatografijo Priloga Xb Priprava metilnih estrov maščobnih kislin — Delež maščobnih kislin Priloga Xa in Analiza metilnih estrov maščobnih kislin s plinsko kromatografijo Priloga Xb Priprava metilnih estrov maščobnih kislin — DECN42 Priloga XVIII Določanje sestave trigliceridov z ECN42 (razlika med podatki HPCL in teoretičnim deležem) — Sestava sterolov in skupni steroli Priloga V Določanje sestave in deleža sterolov s kapilarno plinsko kromatografijo — Eritrodiol in uvaol Priloga VI Določanje eritrodiola in uvaola — Voski Priloga IV Določanje deleža voskov s kapilarno plinsko kromatografijo — Alifatski alkoholi Priloga XIX Določanje deleža alifatskih alkoholov s kapilarno plinsko kromatografijo ▼M21 — Nasičene maščobne kisline na položaju 2 Priloga VII Določevanje odstotnega deleža 2-gliceril monopalmitata ▼M20









DODATEK 2

Tabela 1

(a) Glej deviško ali lampante oljčno olje (Merila kakovosti Tabela 2 ali Merila kakovosti in čistosti Tabela 4)

(b) Glej lampante oljčno olje (Merila kakovosti in čistosti Tabela 4)

Tabela 2

(a) Glej lampante oljčno olje (Merila kakovosti in čistosti Tabela 4)

(b) Glej ekstra deviško oljčno olje (Merila kakovosti Tabela 1)

Tabela 3

(a) Prisotnost rafiniranega olja (oljčnega ali drugih)

(b) Prisotnost olja iz oljčnih tropin

Tabela 4

(a) Glej ekstra deviško oljčno olje in deviško oljčno olje (Merila kakovosti Tabela 1 in Tabela 2)

(b) Prisotnost rafiniranega olja (oljčnega ali drugih)

(c) Prisotnost olja iz oljčnih tropin

(d) Prisotnost esterificiranih olj

Tabela 7

(a) Prisotnost olja iz oljčnih tropin

(b) Prisotnost esterificiranih olj

Tabela 8

(a) Prisotnost rafiniranega olja (oljčnega ali drugih)

(b) Glej lampante oljčno olje (Merila kakovosti in čistosti Tabela 4)

(c) Prisotnost esterificiranih olj

Tabela 11

(a) Prisotnost esterificiranih olj

▼B









PRILOGA II

▼M21

DOLOČEVANJE PROSTIH MAŠČOBNIH KISLIN, METODA V HLADNEM

▼B

1. DOLOČANJE KISLOSTI

Določanje prostih maščobnih kislin v oljčnih oljih. Vsebnost prostih maščobnih kislin je dogovorjeno izražena kot izračunana kislost.

1.1. Princip

Vzorec se raztopi v mešanici topil in obstoječe proste maščobne kisline, se titrira s pomočjo etanolne raztopine kalijevega hidroksida

1.2. Reagenti

Vsi reagenti naj bodo priznane analitske kakovosti in uporabljena voda naj bo destilirana ali enakovredne čistoče.

1.2.1. Dietilni eter; 95 % etanol (v/v), mešanica enakih volumenskih delov. Opomba: Dietilni eter je zelo vnetljiv in lahko tvori eksplozivne perokside. Pri njegovi uporabi je treba biti posebno pazljiv. Nevtalizirajte natančno v trenutku uporabe z raztopino kalijevega hidroksida (1.2.2), z dodatkom 0,3 ml fenolftaleinove raztopine (1.2.3) na 100 ml mešanice. Opomba: Če ni mogoče uporabiti dietilnega etra, se lahko uporabi mešanica topil, ki vsebujejo etanol in toluen. Če je treba, se etanol lahko nadomesti s 2-propanolom.

1.2.2. Kalijev hidroksid, standardizirana etanolna raztopina, c(KOH), približno 0,1 mol/1 ali, če je potrebno, c(KOH), približno 0,5 mol/1. Tik pred uporabo moramo poznati in preveriti točno koncentracijo etanolne raztopine kalijevega hidroksida. Uporabite raztopino, ki je bila pripravljena najmanj pet dni pred uporabo in prelita v rjavo steklenico z gumijastim zamaškom. Raztopina mora biti brezbarvna ali barve slame. Opomba: Stabilno brezbarvno raztopino kalijevega hidroksida lahko pripravimo kot sledi. Zavremo 1 000 ml etanola z 8 g kalijevega hidroksida in 0,5 aluminijevih ostružkov in nadaljujemo z vrenjem pod povratnim hladilnikom eno uro. Takoj destiliramo. Raztopimo v destilatu zahtevano količino kalijevega hidroksida. Pustimo mirovati nekaj dni in z dekantiranjem ločimo bistro raztopino od oborine kalijevega karbonata. Raztopino lahko brez destilacije pripravimo kot sledi: k 1 000 ml etanola dodamo 4 ml aluminijevega butilata in mešanico pustimo nekaj dni. V destilatu raztopimo zahtevano količino kalijevega hidroksida. Raztopina je pripravljena za uporabo.

1.2.3. Raztopina 10 g/l fenolftaleina v 95 do 96 % etanolu (v/v) ali raztopina 20 g/l alkalno modrega (v primeru močno obarvanih maščob) v 95 do 96 % etanolu (v/v).

1.3. Oprema

Običajna laboratorijska oprema, vključno z:

1.3.1. analitsko tehtnico;

1.3.2. 250-ml erlenmajerico;

1.3.3. 10-ml bireta, z razdelkom 0,05 ml.

1.4. Postopek

1.4.1. Priprava vzorca za preskus (Preskus izvajajte na filtriranem vzorcu. Kadar so vlaga in nečistoče skupaj nižje od 1 %, uporabite vzorec brez nadaljnje obdelave; kadar presegajo 1 %, ga je treba filtrirati.)

1.4.2. Odvzem vzorca Odvisno od predvidenega kislinskega števila natehtamo vzorec v skladu z naslednjo tabelo:



Pričakovano kislinsko število Masa vzorca (g) Točnost tehtanja (g) < 1 20 0,05 1 do 4 10 0,02 4 do 15 2,5 0,01 15 do 75, 0,5 0,0001 > 75 0,1 0,0002 Vzorec tehtamo v erlenmajerici (1.3.2).

1.4.3 Določanje Raztopimo vzorec (1.4.2) v 50- do 150-ml v predhodno nevtralizirani mešanici dietilnega etra in etanola (1.2.1). Med mešanjem titriramo z 0,1 mol/l raztopino kalijevega hidroksida (1.2.2) (glej Opombo 2) do preskoka barve indikatorja.(rožnata obarvanost fenolftaleina je obstojna najmanj 10 sekund). Opomba 1. Opomba 1. Standardizirano etanolno raztopino kalijevega hidroksida (1.2.2) se lahko nadomesti z vodno raztopino kalijevega ali natrijevega hidroksida pod pogojem, da količina vnešene vode ne sproži faznega ločevanja. Opomba 2. Opomba 2. Če zahtevana količina 0,1 mol/l raztopine kalijevega hidroksida preseže 10 ml, uporabite 0,5 mol/1raztopino. Opomba 3. Opomba 3. Če raztopina med titracijo postane motna, dodajte dovolj topil (1.2.1), da dobite prozorno raztopino.

1.5 Kislost: izražena v masnem odstotnem deležu oleinske kisline

Kislost v utežnih o dstotkih je enaka:

kjer je:

V = volumen uporabljene standardizirane raztopine kalijevega hidroksida, v mililitrih;

c = točna koncentracija v molih na liter uporabljene titrirane raztopine kalijevega hidroksida;

M = molska masa uporabljene kisline za izražanje rezultata (= 282);

m = masa vzorca v gramih.

Za rezultat je treba vzeti aritmetično povprečje ►M6 dveh določitev ◄ .









PRILOGA III

DOLOČANJE PEROKSIDNEGA ŠTEVILA

1. NAMEN

Ta standard opisuje metodo za določanje peroksidnega števila olj in masti.

2. PODROČJE UPORABE

Ta standard se uporablja za olja in masti živalskega in rastlinskega izvora.

3. DEFINICIJA POJMOV

Peroksidno število je količina tistih snovi v vzorcu, izražena v miliekvivalentih aktivnega kisika na kilogram, ki oksidira kalijev jodid v opisanih delovnih pogojih.

4. PRINCIP

Reakcija preskusnega deleža vzorca v raztopini ocetne kisline in kloroforma, z raztopino kalijevega jodida. Titracija sproščenega joda s standardizirano raztopino natrijevega tiosulfata.

5. OPREMA

Vsa uporabljena oprema je brez reducirajočih ali oksidirajočih snovi.

Opomba: Brušenih površin ne namažite.

5.1 3-ml steklena ladjica.

5.2 Bučke z obrusom kapacitete približno 250 ml predhodno osušimo z inertnim plinom (dušikom, ali še bolje, z ogljikovim dioksidom).

5.3 25-ml ali 50-ml bireta z razdelkom 0,1 ml.

6. REAGENTI

6.1 Kloroform, analitske čistoče, očiščen kisika s prepihovanjem s čistim, suhim inertnim plinom.

6.2 Ledocet, analitske čistoče, očiščen kisika s prepihovanjem s čistim, suhim inertnim plinom.

6.3 Nasičena vodna raztopina kalijevega jodida, sveže pripravljena, brez joda in jodatov.

6.4 Tik pred uporabo točno standardizirana 0,01 ali 0,002 mol/L vodna raztopina natrijevega tiosulfata.

6.5 Škrobovica, 10g/l vodna suspenzija, sveže pripravljena iz naravnega topnega škroba.

7. VZOREC

Pazimo, da vzorec jemljemo in skladiščimo v temnem, hranimo na hladnem v popolnoma zaprtih steklenih posodah. Posode so hermetično zatesnjene z zamaški z obrusom ali iz plute.

8. POSTOPEK

Preskus se izvede pri difuzni dnevni svetlobi ali pri umetni svetlobi. V skladu s pričakovanim peroksidnim številom, natehtamo na stekleni ladjici (5.1) ali,če vam to ne uspe, v bučki (5.2) s točnostjo 1 mg.







Pričakovano peroksidno število (mekv) Masa vzorca (g) 0 do 12 5,0 do 2,0 12 do 20 2,0 do 1,2 20 do 30 1,2 do 0,8 30 do 50 0,8 do 0,5 50 do 90 0,5 do 0,3

V bučko prenesemo stekleno ladjico z vzorcem. Dodamo 10 ml kloroforma (6.1). Vzorec hitro raztopimo z mešanjem. Dodamo 15 ml ocetne kisline (6.2), nato 1 ml raztopine kalijevega jodida (6.3). Hitro zamašimo z zamaškom, stresamo eno minuto in pustimo točno pet minut, v temnem prostoru na temperaturi od 15 do 25 °C.

Dodamo približno 75 ml destilirane vode. Titriramo sproščeni jod z raztopino natrijevega tiosulfata (6.4) (za pričakovana peroksidna števila, nižja od 12 titriramo z 0,002 mol/L raztopino in z 0,01 mol/L raztopino za pričakovana števila, nad 12), močno tresemo, uporabimo škrobovico (6.5) kot indikator.

Na istem preskusnem vzorcu opravimo dve določitvi.

Istočasno izvedemo slepi preskus. Če rezultat presega 0,05 ml 0,01 mol/L raztopine natrijevega tiosulfata (6.4), zamenjamo reagente s čistejšimi.

9. IZRAŽANJE REZULTATOV

Peroksidno število (PV), izraženo v miliekvivalentih aktivnega kisika na kilogram, se izrazi s formulo:

kjer je:

V = volumen raztopine standardiziranega natrijevega tiosulfata v ml (6.4), z upoštevanim volumnom slepega preskusa;

T = točna molarnost uporabljene raztopine natrijevega tiosulfata (6.4);

m = masa vzorca v gramih.

Za rezultat se vzame aritmetično povprečje dveh določitev.

▼M21









PRILOGA IV

DOLOČEVANJE VSEBNOSTI VOSKOV S KAPILARNO PLINSKO KROMATOGRAFIJO

1. NAMEN

Ta metoda opisuje postopek za določitev vsebnosti voskov v oljčnem olju. Voski se ločijo glede na število ogljikovih atomov. Metodo lahko uporabimo zlasti za razlikovanje med oljčnim oljem, pridobljenim s stiskanjem, in oljčnim oljem, pridobljenim z ekstrakcijo (olje iz oljčnih tropin).

2. PRINCIP

Maščobo, ki smo ji dodali ustrezen interni standard, na z vodo omočenem silikagelu frakcioniramo s kolonsko kromatografijo; eluirano frakcijo najprej ujamemo pri pogojih preskušanja (katere polarnost je manjša kot pri trigliceridih), nato jo neposredno analiziramo s kapilarno plinsko kromatografijo.

3. OPREMA

3.1 Erlenmajerica prostornine 25 ml.

3.2 Steklena kolona za plinsko kromatografijo, z notranjim premerom 15,0 mm, dolžine 30 do 40 cm in opremljena s petelinčkom.

3.3 Plinski kromatograf, primeren za uporabo s kapilarno kolono in opremljen s sistemom za neposredno injiciranje v kolono, ki obsega: 3.3.1 termostatsko kontrolirano komoro za kolone, s programatorjem temperature; 3.3.2 hladen injektor za injiciranje neposredno v kolono; 3.3.3 plamensko ionizacijski detektor in konverter-ojačevalec; 3.3.4 rekorder-integrator, primeren za uporabo s konverterjem-ojačevalcem (3.3.3), z odzivnim časom, manjšim od 1 sekunde, in nastavljivo hitrostjo pomika papirja. (Uporabimo lahko tudi računalniške sisteme, pri katerih je predvideno zajemanje podatkov plinske kromatografije prek osebnega računalnika.); 3.3.5 Steklena ali kvarčna kapilarna kolona dolžine 8 do 12 m, z notranjim premerom 0,25 do 0,32 mm, znotraj pokrita s tekočo stacionarno fazo in enotne debeline 0,10 do 0,30 μm. (Tekoče stacionarne faze, namenjene uporabi, v prodaji vrste SE 52 ali SE 54.)

3.4 10 μl-mikrobrizgalka s kaljeno iglo in z možnostjo neposrednega injiciranja v kolono.

3.5 Električni vibrator.

3.6 Rotavapor.

3.7 Žarilna peč.

3.8 Analitska tehtnica, ki zagotavlja ± 0,1 mg natančnost.

3.9 Običajna laboratorijska steklovina.

4. REAGENTI

4.1 Silikagel z velikostjo delcev med 60 in 200 μm. Silikagel vsaj 4 ure žarimo pri 500 °C. Nato ga ohladimo in dodamo 2 % vode glede na količino silikagela. Dobro premešamo, da se zmes homogenizira. Pred uporabo hranimo vsaj 12 ur v temi.

4.2 n-heksan, kromatografske čistoče.

4.3 Dietil eter, kromatografske čistoče.

4.4 n-heptan, kromatografske čistoče.

4.5 Standardna raztopina lauril arahidata koncentracije 0,1 % (m/V) v heksanu (interni standard). (Lahko uporabimo tudi -palmitil palmitat ali miristil stearat.) 4.5.1 Sudan 1 (1-fenilazo-2-naftol).

4.6 Nosilni plin: vodik ali helij, čist, plinsko-kromatografske čistoče.

4.7 Pomožni plini: — vodik, čist, plinsko-kromatografske čistoče, — zrak, čist, plinsko-kromatografske čistoče.

5. POSTOPEK

5.1 Priprava kromatografske kolone

V n-heksanu (4.2) suspendiramo 15 g silikagela (4.1) in napolnimo kolono (3.2). Počakamo, da se posede. Homogenost posedanja, ki poveča homogenost kromatografskih pasov, lahko dosežemo z električnim vibratorjem (3.5). Spiramo s 30 ml n-heksana, da odstranimo vse morebitne nečistoče. S tehtnico (3.8) v erlenmajerico prostornine 25 ml (3.1) natehtamo natanko 500 mg vzorca in dodamo ustrezno količino internega standarda (4.5), ki je odvisna od pričakovane vsebnosti voskov. Na primer, pri oljčnem olju dodamo 0,1 mg, pri olju iz oljčnih tropin pa 0,25 do 0,5 mg lauril arahidata. Tako pripravljen vzorec prenesemo v kromatografsko kolono, in sicer z dvema 2-ml odmerkoma n-heksana (4.2).

Topilo izpuščamo iz kolone tako dolgo, da doseže 1 mm nad zgornjim robom absorbenta, zatem spiramo z dodatnimi 70 ml n-heksana, da odstranimo morebitne naravno prisotne n-alkane. Nato začnemo kromatografsko eluiranje, in sicer zberemo 180 ml mešanice n-heksan/etilni eter v razmerju 99:1 in pri pretoku približno 15 kapljic na 10 sekund. Eluiranje vzorca mora potekati pri sobni temperaturi 22 ± 4 °C.

Opombe:

— Dnevno je treba pripraviti svežo mešanico n-heksana/etilnega etra (99:1).

— Za opazovanje pravilnega eluiranja voskov lahko vzorcu v raztopini dodamo 100 μl 1-odstotnega sudana v elucijski mešanici. Ker ima barvilo vmesno retencijo med voski in trigliceridi, je treba elucijo suspendirati, ko obarvanje doseže dno kromatografske kolone, ker so se eluirali vsi voski.

Iz tako dobljene frakcije na rotavaporju (3.6) odparimo skoraj vse topilo. Preostala 2 ml topila odstranimo z uporabo blagega toka dušika, nato dodamo 2-4 ml n-heptana.

5.2 Plinsko-kromatografska analiza

5.2.1 Predpriprava

Kolono pritrdimo na plinski kromatograf (3.3), in sicer vstopni del na injektor, izhodnega pa na detektor. Izvedemo splošno preverjanje plinskega kromatografa (tesnjenje plinskih povezav, pravilno delovanje detektorja in rekorderja itd.).

Če kolono uporabljamo prvič, je priporočljivo, da jo kondicioniramo. Pri majhnem pretoku plina skozi kolono vključimo plinski kromatograf. Postopoma segrevamo, tako da po približno 4 urah dosežemo temperaturo 350 °C. Pri tej temperaturi kolono kondicioniramo vsaj dve uri, nato naravnamo instrument v skladu s pogoji delovanja (naravnamo pretok, prižgemo plamen, povežemo z elektronskim rekorderjem (3.3.4), naravnamo delovno temperaturo peči za kolono, naravnamo detektor itd.). Pri občutljivosti, ki je vsaj dvakrat večja od delovne, posnamemo bazno linijo. Le-ta mora biti linearna, brez kakršnih koli vrhov in odklonov.

Negativen premočrtni odklon kaže na slabo tesnjenje med kolono in instrumentom, pozitiven odklon pa na slabo kondicionirano kolono.

5.2.2 Izbira delovnih pogojev

Splošni delovni pogoji, ki jih je treba upoštevati, so naslednji:

— temperatura kolone: —



20 °C/minuto 5 °C/minuto 20 °C/minuto na začetku 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— temperatura detektorja: 350 °C,

— količina injicirane snovi: 1 μl raztopine (2–4 ml) n-heptana,

— nosilni plin: helij ali vodik z optimalno linearno hitrostjo izbranega plina (glej Dodatek),

— občutljivost instrumenta: taka, da izpolnjuje spodnje pogoje:

Te pogoje lahko spremenimo glede na značilnosti kolone in plinskega kromografa, da bi dosegli ločevanje vseh voskov, zadostno resolucijo vrhov (glej sliko) in retencijski čas internega standarda C32, ki mora biti 18 ± 3 minute. Najznačilnejši vrh voskov mora biti izmerjen najmanj 60 % od spodnjega dela skale.

Integracijske parametre moramo določiti tako, da dobimo pravilno vrednotenje površin vrhov.

Opomba: Glede na visoko končno temperaturo je dovoljen pozitivni odklon, ki pa ne sme biti večji od 10 % od spodnjega dela skale.

5.3 Izvedba analize

Z 10-μl mikrobrizgalko odvzamemo 1 μl raztopine; bat izvlečemo, da se igla izprazni. Iglo vbodemo v injektor in po eni ali dveh sekundah hitro vbrizgnemo. Po približno petih sekundah iglo pazljivo izvlečemo.

Kromatogram snemamo, dokler ne eluirajo vsi voski.

Bazna linija mora ves čas izpolnjevati zahtevane pogoje.

5.4 Identifikacija vrhov

Različne vrhove identificiramo na podlagi retencijskih časov in s primerjavo med mešanicami voskov z znanimi retencijskimi časi, ki so bile analizirane pri enakih pogojih.

Slika prikazuje kromatogram voskov deviškega oljčnega olja.

5.5 Kvantitativna analiza

Z integratorjem izračunamo površine vrhov alifatskih estrov od C40 do C46 in površino vrha internega standarda.

Na podlagi naslednje formule izračunamo vsebnost voskov posameznega estra v mg/kg maščobe:

Kjer je:

Ax = površina vrha posameznega estra, v kvadratnih milimetrih;

As = površina vrha internega standarda, v kvadratnih milimetrih;

ms = masa dodanega internega standarda, v miligramih;

m = masa odvzetega vzorca za določitev, v gramih.

6. PODAJANJE REZULTATOV

Navedemo vsoto vsebnosti posameznih sestavin različnih voskov od C40 do C46, v mg/kg maščobe (ppm).

Opomba: Spojine, ki jih je treba količinsko določiti, se nanašajo na vrhove s sodim številom ogljikovih atomov med estri C40 do C46, tako kot je to prikazano na kromatograma voskov oljčnega olja. Če sta za ester C46 dva vrhova, je za njegovo identifikacijo priporočljiva analiza frakcije voskov olja iz oljčnih tropin, kjer je vrh C46 dobro viden, ker je razločno večji.

Rezultate je treba izraziti na eno decimalno mesto natančno.

Slika

Kromatogram voskov v oljčnem olju ( 5 )

Legenda:

I.S. = lauril arahidat

1. = diterpenski estri

2 + 2′ = estri C40

3 + 3′ = estri C42

4 + 4′ = estri C44

5. = estri C46

6. = sterolni estri in triterpenski alkoholi.









DODATEK

Določanje linearne hitrosti plina

V plinski kromatograf, naravnan na običajne delovne pogoje, injiciramo 1 do 3 μl metana (ali propana). Merimo čas, ki ga plin potrebuje za pot skozi kolono od trenutka vbrizga do trenutka, ko se pojavi vrh (tM).

Linearna hitrost v cm/s je izražena s formulo L/tM, kjer je L dolžina kolone v cm, tM pa izmerjeni čas v sekundah.

▼B









PRILOGA V

DOLOČANJE SESTAVE IN VSEBNOSTI STEROLOV S KAPILARNO PLINSKO KROMATOGRAFIJO

1. NAMEN

Ta metoda opisuje postopek za določanje vsebnosti posameznih in celokupnih sterolov v maščobah.

2. PRINCIP METODE

Maščoba z dodanim β-holestanolom kot internim standardom, se umili s kalijevim hidroksidom in etanolno raztopino in potem se neumiljive snovi ekstrahirajo z dietilnim etrom.

Sterolna frakcija se loči od neumiljivega ekstrakta s kromatografijo na z lugom obdelani silikagelni plošči. Steroli, dobljeni iz silikagela, se pretvorijo v trimetilsililne etre in se jih analizira s kapilarno plinsko kromatografijo.

3. OPREMA

3.1 250-ml steklenica, s povratnim hladilnikom, s priključki iz steklenih obrusov.

3.2 500-ml liji ločniki.

3.3 250-ml bučke.

3.4 Celotna oprema za analizo s tankoplastno kromatografijo s steklenimi ploščami 20 × 20 cm.

3.5 Ultravijolična svetilka z valovno dolžino 366 ali 254 nm.

3.6 100-μl in 500-μl mikrobrizgalke.

3.7 Cilindrični filtrirni liji s porozno frito G3 (poroznosti 15 do 40 μm), premera približno 2 cm in globine približno 5 cm, z nastavkom, primernim za filtriranje v vakuumu in priključek 12/21 z zunanjim obrusom.

3.8 50-ml presesalna erlenmajerica z 12/21 priključkom z notranjim obrusom za uporabo s filtrirnim lijem (3.7).

3.9 Epruveta kapacitete 10 ml s koničnim dnom in zamaškom.

3.10 Plinski kromatograf, primeren za uporabo s kapilarno kolono, opremljen s sistemom deljenja, ki ga sestavljajo: 3.10.1 termostatirana komora za kolone, ki lahko vzdržuje željeno temperaturo s točnostjo ± 1 °C; 3.10.2 temperaturno nastavljiv uparjalnik z uparjalnim elementom iz persilaniziranega stekla; 3.10.3 plamensko ionizacijski detektor in pretvornik z ojačevalnikom; 3.10.4 registrator z integratorjem za delovanje s pretvornikom z ojačevalnikom (3.10.3), z odzivnim časom, ki ne presega ene sekunde in s spremenljivo hitrostjo papirja.

3.11 Steklena ali kvarčna kapilarna kolona, dolžine 20 do 30 m, notranjega premera 0,25 do 0,32 mm, popolnoma prekrita s stacionarno fazo SE-52 ali SE-54 ali podobno, enakomerne debeline med 0,10 in 0,30 μm.

3.12 10-μl mikrosiringa za plinsko kromatografijo s konico iz kaljenega jekla.

4. REAGENTI

4.1 Kalijev hidroksid, približno 2 mol/L etanolna raztopina: Raztopite 130 g kalijevega hidroksida (minimalne koncentracije 85 %) s hlajenjem, v 200 ml distilirane vode in potem do enega litra dodajte etanol. Raztopino hranite v dobro zamašenih temnih steklenicah.

4.2 Dietilni eter, čistoče za analizo.

4.3 Brezvodni natrijev sulfat, čistoče za analizo.

4.4 Steklene plošče, premazane s silikagelom, brez indikatorja fluorescence, debeline 0,25 mm (ki se jih dobi v prodaji, pripravljene za uporabo).

4.5 Kalijev hidroksid, približno 0,2 mol/L etanolna raztopina; Raztopite 13 g kalijevega hidroksida v 20 ml distilirane vode in do enega litra dodajte etanol.

4.6 Benzen, kromatografske čistoče (Glej 5.2.2).

4.7 Aceton, kromatografske čistoče. (Glej 5.2.2)

4.8 Heksan, kromatografske čistoče. (Glej 5.2.2)

4.9 Dietilni eter, kromatografske čistoče. (Glej 5.2.2)

4.10 Kloroform,, kromatografske čistoče. (Glej 5.2.2)

4.11 Referenčna raztopina za tankoplastno kromatografijo: holesterol ali fitosteroli, ►M6 2 % ◄ raztopina v kloroformu.

4.12 2,7-diklorofluorescein, 0,2-% etanolna raztopina. Naredite rahlo bazično z dodatkom nekaj kapelj alkoholne raztopine 2 mol/L kalijevega hidroksida.

4.13 Brezvodni piridin, kromatografske čistoče.

4.14 Hexametil disilazan.

4.15 Trimetilklorosilan.

4.16 Referenčne raztopine sterolnih trimetilsililnih etrov. Pripravimo jih tik pred uporabo iz čistih sterolov ali iz mešanic sterolov iz olj, ki jih vsebujejo.

4.17 β-holestanol, 0,2 % raztopina (m/V) v kloroformu (interni standard).

4.18 Nosilni plin: vodik ali helij, plinsko-kromatografske čistoče.

4.19 Pomožni plini: — hydrogen, gas-chromatographic purity,– vodik, plinsko-kromatografske čistoče, — air, gas-chromatographic purity.– zrak, plinsko-kromatografske čistoče.

5. POSTOPEK

5.1 Priprava neumiljivih snovi. 5.1.1 S 500-μl mikrobrizgalko, v 250-ml bučko vnesite volumen raztopine 0,2 % 1 β-holestanola (4.17), ki vsebuje količino holestanola, ki ustreza približno 10 % vsebnosti sterolov v alikvotu vzorca, vzetega za določanje. Na primer, k 5 g vzorca dodajte 500 μl 0,2 % α-holestanolne raztopine v primeru oljčnega olja in 1 500 μl za ►M6 ————— ◄ olja iz oljčnih tropin. Odparite do suhega v toku dušika in potem natehtajte točno 5 g suhega filtriranega vzorca v isto bučko. ►M6 Olja ◄ ki vsebujejo precejšnje količine holesterola, lahko dajo vrh, ki ima retenzijski čas identičen holestanolu. Če se to pojavi, je treba sterole analizirati z internim standardom in brez njega ►M6 ali se uporabi betulinol namesto holestanola ◄ . 5.1.2 Dodajte 50 ml raztopine 2 mol/L etanolnega kalijevega hidroksida, namestite povratni hladilnik in segrejte na rahlo vretje na parni kopeli in stalno močno mešajte do končanega umiljenja (raztopina postane bistra). S segrevanjem nadaljujte še nadaljnih 20 minut in potem z vrha hladilnika dodajte 50 ml destilirane vode, snemite hladilnik in ohladite bučko na približno 30 °C. 5.1.3 Kvantitativno prenesite vsebino bučke v 500-ml lij ločnik, z večkratnim spiranjem z destilirano vodo v skupnem volumnu približno 50 ml. Dodajte približno 80 ml dietilnega etra, močno tresite 30 sekund in potem pustite, da se usede (Opomba 1). Odločite spodnjo vodno fazo, tako da jo pretočite v drugi lij ločnik. Iz vodne faze še dvakrat ekstrahiramo, vsakič z uporabo 60 do 70 ml dietilnega etra. Opomba 1. Emulzijo se lahko odstrani s pršenjem majhnih količin etilnega ali metilnega alkohola. 5.1.4 Združite etrske ekstrakte v skupnem liju ločniku in jih izperite z distilirano vodo (vsakokrat s 50 ml), dokler izpiralna voda ne da nevtralne reakcije. Potem, ko je izpiralna voda odstranjena, osušite z brezvodnim natrijevim sulfatom in filtrirajte skozi brezvodni natrijev sulfat v poprej stehtani 250-ml steklenici, pri tem pa lij in filter izperite z majhnimi količinami dietilnega etra. 5.1.5 Destilirajte eter na nekaj ml, potem ga posušite v rahlem vakuumu ali v toku dušika, s tem da zaključite šušenje s približno četrt urnim sušenjem v peči pri 100 °C in ga po ohladitvi v eksikatorju stehtajte.

5.2 Ločevanje sterolne frakcije. 5.2.1 Priprava bazičnih plošč. Silikagelne plošče (4.4) za 10 sekund popolnoma potopite v raztopino 0,2 mol/L etanolnega kalijevega hidroksida (4.5) in jih potem pustite dve uri, da se sušijo v digestoriju in jih na koncu dajte v sušilnik na 100 °C za eno uro. Vzemite jih iz peči in jih do uporabe hranite v eksikatorju, napolnjenim s kalcijevim kloridom (na ta način obdelane plošče je treba uporabiti v 15 dneh). Opomba 2. Kadar se za ločevanje sterolnih frakcij uporabljajo z lugom obdelane silikagelne plošče, neumiljivih snovi ni treba tretirati z aluminijevim oksidom. Na ta način se vse sestavine, ki so kisle narave (maščobne kisline in druge) obdržijo na mestu napršitve in se pas sterolov jasno loči od pasu alifatskih in triterpenskih alkoholov. 5.2.2 Mešanico benzena in acetona v razmerju 95 vol. % benzena in 5 vol. % acetona se uvede v razvijalno komoro na približno globino 1 cm. Alternativno se lahko uporabi mešanico heksana in dietilnega etra v razmerju 65 vol. % heksana in 35 vol. % dietilnega etra. Komoro zaprite z ustreznim pokrovom in pustite tako najmanj pol ure, da se lahko med hlapi in tekočino ustvari ravnotežje. Trakove filtrirnega papirja, namočene v eluent, se lahko namesti na notranje površine komore. To skrajša razvijalni čas za približno eno tretjino in omogoča bolj enotno in homogeno elucijo sestavin. Opomba 3. Razvijalno raztopino je treba zamenjati za vsako analizo, zato da se doseže popolnoma ponovljive pogoje elucije. 5.2.3 Pripravite približno 5-% raztopino neumiljivih snovi (5.1.5) v kloroformu in je s pomočjo 100 μl mikrobrizgalke nanesite 300 μl na kromatografsko ploščo (5.2.1) približno 2 cm od enega konca v progi, ki je čimbolj tanka in homogena. S progo poravnajte 2 ali 3 μl sterolne referenčne raztopine (4.11) na enem koncu plošče, tako da se po razvijanju sterolni pas lahko identificira. 5.2.4 Ploščo vložite v razvijalno komoro, kot je navedeno v 5.2.2. Temperaturo okolja je treba vzdrževati med 15 in 20 °C. Komoro takoj zaprite s pokrovom in pustite, da eluira, dokler fronta topila ne doseže razdalje približno 1 cm od vrhnjega roba plošče. Vzemite ploščo iz razvijalne komore in odparite topilo pod tokom vročega zraka ali pa tako, da ploščo nekaj časa pustite v digestoriju. 5.2.5 Rahlo in enokomerno ploščo napršite z raztopino 2,7-diklorofluorosceina. Če se ploščo opazuje pod ultravijolično svetlobo, se sterolni pas lahko identificira tako, da se ga poravna z madežem, dobljenim iz referenčne raztopine. Označite meje pasu vzdolž robu fluorescence s črnim svinčnikom. 5.2.6 S kovinsko žličko odstrgajte silikagel v označenem območju. Odstranjen, v fin prah zdrobljen material vnesite v filtrirni lij (3.7). Dodajte 10 ml vročega kloroforma, s kovinsko žličko previdno zmešajte in v vakuumu filtrirajte, tako da filtrat zberete v erlenmajerici (3.8), ki je pritrjena na filtrirni lij. Ostanek v lij ločniku trikrat izperite z dietilnim etrom (vsakokrat približno z 10 ml), tako da zberete filtrat v isti steklenici, pritrjeni na lij. Odparite filtrat do volumna 4 ali 5 ml, prenesite preostanek raztopine v poprej stehtano 10-ml epruveto (3.9) odparite do suhega z rahlim segrevanjem v rahlem toku dušika, ponovno dolijte nekaj kapelj acetona, spet odparite do suhega, dajte v peč na 105 °C za približno 10 min in potem pustite, da se ohladi v eksikatorju in stehtajte. Ostanek znotraj epruvete je sestavljen iz sterolne frakcije.

5.3 Priprava trimetilsililnih etrov. 5.3.1 Reagent za siliranje, sestavljen iz mešanice piridina, heksametildisilazana in trimetilklorosilana v razmerju 9:3:1(v/v/v), (Opomba 4), po 50 μl na vsak miligram sterolov, dodajte v epruveto, ki vsebuje sterolno frakcijo, tako da se izognete kakršnemu koli vnosu vlage (Opomba 5). Opomba 4. Raztopine, pripravljene za uporabo, se dobijo v prodaji; Na voljo so tudi drugi reagenti za silaniziranje, kot so na primer bis-trimetilsilil, trifluor acetamid + 1 % trimetil klorosilan, ki jih je treba razredčiti z enakim volumnom brezvodnega piridina. 5.3.2 Zamašite epruveto, previdno pretresite (ne da bi jo prevračali), dokler niso steroli popolnoma raztopljeni. Potem jo najmanj 15 minut pustite pri sobni temperaturi in zatem nekaj minut centrifugirajte. Prozorna raztopina je pripravljena za kromatografsko analizo. Opomba 5. Rahla opalescenca, ki bi lahko nastala, je normalna in ne povzroča nobene interference. Tvorjenje belega flokulata ali pojav rožnate obarvanosti sta znaka prisotnosti vlage ali pokvarjenosti reagenta. Če se to pojavi, je treba preskus ponoviti.

5.4 Plinsko kromatografska analiza 5.4.1 Predhodni postopki, priprava kolone. 5.4.1.1 Kapilarno kolono se pritrdi v plinski kromatograf s priključitvijo začetka kolone na uparjalnik, ki je povezan s sistemom deljenja in s koncem kolone na detektor. Naredite splošne preglede enot kromatografa (tesnenje tokokroga plinov, učinkovitost detektorja, učinkovitost sistema deljenja in sistema zapisovanja, itd.). 5.4.1.2 Če se kolono uporablja prvič, je priporočljivo, da se jo kondicionira. Skozi kapilarno kolono spustite malo plina in potem vključite plinski kromatograf in začnite postopno segrevanje do temperature najmanj 20 °C nad delovno temperaturo (glej Opombo 6). To temperaturo vzdržujete najmanj dve uri in potem se celoten sklop spravite v stanje delovnih pogojev (nastavitev pretoka plina in deljenja, vžig plamena, priključitev na elektronski rekorder, prilagoditev peči za kolono, prilagoditev temperature detektorja in injektorja itd.) in potem snemajte signal z občutljivostjo, ki je najmanj dvakrat večja od tiste, ki je nameravana za analize Potek bazne linije mora biti linearen, brez kakršnih koli vrhov in ne sme imeti odklona. Negativni odklon bazne linije kaže na slabo tesnenje v priključkih kolone; pozitivni odklon kaže na nezadostno kondicioniranje kolone. Opomba 6. Temperatura kondicioniranja mora biti najmanj 20 °C nižja od maksimalne temperature, določene za uporabljeno stacionarno fazo. 5.4.2 Izbor delovnih pogojev. 5.4.2.1 Splošni delovni pogoji so naslednji: — temperatura kolone: 260 ± 5 °C, — temperatura evaporatorja: 280 °C, — temperatura detektorja: 290 °C, — linearna hitrost nosilnega plina: helij 20 do 35 cm/s, dušik 30 do 50 cm/s, — delilno razmerje: od 1:50 do 1:100, — občutljivost instrumenta: 4 do 16 kratna minimalna atenuacija, — občutljivost beleženja: 1 do 2 mV polne skale, — hitrost papirja: 30 do 60 cm/h, — količina injicirane snovi: 0,5 do 1 μl raztopine TMSE. Te pogoje se lahko spreminja glede na lastnosti kolone in plinskega kromatografa, tako da se dobijo kromatogrami, ki izpolnjujejo naslednje zahteve: — retencijski čas β-sitosterola naj bi bil 20 ± 5 minut. — vrh kampesterola naj bi bil: za oljčno olje (povprečna vsebnost 3 %) 15 ± 5 % celotne skale; za sojino olje (povprečna vsebnost 20 %) 80 ± 10 % celotne skale; — vsi prisotni steroli morajo biti ločeni. Poleg tega, da so ločeni, morajo biti vrhovi tudi popolnoma razdvojeni, t.j., signal vrha se mora pred začetkom novega vrha vrniti na bazno linijo. Vendar se nepopolno ločenje vrhov tolerira pod pogojem, da se pik pri TRR 1.02 lahko kvantificira s pomočjo pravokotnice. 5.4.3 Analizni postopek 5.4.3.1 Z mikrobrizgalko kapacitete 10 μl vsrkajte 1 μl heksana, ki mu sledi 0,5 μl zraka in zatem 0,5 do 1 μl raztopine vzorca; Dvignite bat mikrobrizgalke, tako da se igla izprazni. Iglo uvedite skozi membrano injektorja in po eni do dveh sekundah raztopino hitro vbrizgnite in potem po približno petih sekundah iglo počasi izvlecite. 5.4.3.2 Beleženje nadaljujte, dokler TMSE prisotnih sterolov popolnoma ne eluirajo. Bazna linija mora vedno ustrezati zahtevam 5.4.1.2. 5.4.4 Identificiranje vrhov. Identificirajte posamezne vrhove na osnovi retenzijskih časov in s primerjavo z mešanicami sterolnih TMSE, analiziranih v enakih pogojih. Steroli eluirajo v naslednjem zaporedju: holesterol, brasikasterol, 24-metilen holesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ 7-kampesterol, Δ-5,23-stigmastadienol, klerosterol, ß-sistosterol, sitostanol, Δ-5-avenasterol, Δ-5,24-stigmastadienol, Δ-7-stigmasterol, Δ-7-avenasterol. Retenzijski časi časa za sitosterol za koloni SE-52 in SE-54 sta prikazana v Tabeli 1. Sliki 1 in 2 prikazujeta tipične kromatograme nekaterih olj. 5.4.5 Kvantitativna ocena. 5.4.5.1 Izračunajte površine vrhov β-holestanola in sterolov s pomočjo integratorja. Ne upoštevajte vrhov tistih spojin, ki niso vključene med tiste, navedene v Tabeli 1. Odzivni koeficient β-holestanola mora biti enak 1. 5.4.5.2 Izračunajte koncentracijo vsakega posameznega sterola v mg/100 g maščobe kot sledi: kjer je: Ax = površina vrhasterola × ►M6 ————— ◄ ; As = površina vrha β-holestanola ►M6 ————— ◄ ; ms = masa dodanega β-holestanola, v miligramih; m = masa vzorca, uporabljenega za določanje, v gramih;

6. IZRAŽANJE REZULTATOV

6.1 Zabeležite posamezne koncentracije sterola kot mg/100 g maščobe in njihovo vsoto kot „celokupni steroli“.

6.2 Izračunajte odstotek za vsak posamezni sterol iz razmerja med ustrezno površino vrha in površino vseh sterolnih vrhov. kjer je: Ax = površina vrha ×; ΣΑ = površina vseh sterolnih vrhov.









DODATEK

Določanje linearne hitrosti plina

Pri nastavitvi plinskega kromatografa na normalne delovne pogoje injicirajte 1 do 3 μl metana (ali propana) in izmerite čas, ki je potreben, da se plin pretoči skozi kolono, od trenutka injiciranja do trenutka, ko se pojavi vrh (tM).

Linearna hitrost v cm/s je podana z L/tM, pri čemer je L dolžina kolone v centimetrih in tM izmerjeni čas v sekundah.







Tabela 1 Relativni retenzijski časi sterolov Pik Identifikacija Relativni retenzijski čas SE 54 kolona SE 52 kolona 1 holesterol Δ-5-holesten-3ß-ol 0,67 0,63 2 holestanol 5α-holestan-3ß-ol 0,68 0,64 3 Brasikasterol [24S]-24-metil-Δ-5,22-holestadien-3ß-o1 0,73 0,71 4 24-metilen-holesterol 24-metilen-Δ-5,24-holesten-3ß-ol 0,82 0,80 5 kampesterol [24R]-24-metil-Δ-5-holesten-3ß-o1 0,83 0,81 6 kampestanol [24R]-24-metil-holestan-3ß-ol 0,85 0,82 7 stigmasterol [24R]-24-etil-Δ-5,22-holestadien-3ß-o1 0,88 0,87 8 Δ-7-kampesterol [24R]-24-metil-Δ-7-holesten-3ß-o1 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stigmastadienol [24R,S]-24-etil-Δ-5,23-holestadien-3ß-o1 0,95 0,95 10 klerosterol [24S]-24-etil-Δ-5,25-holastadien-3ß-ol 0,96 0,96 11 β-sitosterol [24R]-24-etil-Δ-5-holestan-3ß-ol 1,00 1,00 12 sitostanol 24-etil-holestan-3ß-ol 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasterol [24Z]-24-etiliden-5-holesten-3ß-o1 1,03 1,03 14 Δ-5,24-stigmastadienol [24R,S]-24-etil-Δ-5,24-holestadien-3ß-o1 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenol [24R,S]-24-etil-Δ-7,24-holestadien-3ß-ol 1,12 1,12 16 Δ-7-avenasterol [24Z]-24-etiliden-Δ-7-holesten-3ß-o1 1,16 1,16

Slika 1

Plinski kromatogram sterolne frakcije nerafiniranega oljčnega olja.

Slika 2

Plinski kromatogram sterolne frakcije rafiniranega oljčnega olja.









PRILOGA VI

DOLOČANJE ERITRODIOLA IN UVAOLA

UVOD

Eritrodiol (ki se ga običajno podaja kot vsoto glikolov eritrodiola in uvaola) je sestavina neumiljive frakcije, značilna za nekatere vrste maščob. V bistveno višjih koncentracijah se nahaja v oljčnem olju, ekstrahiranem s topili, kot pa v drugih oljih, kot sta prešano oljčno olje in olje iz grozdnih pešk, ki ga tudi vsebujeta in tako njegova prisotnost lahko potrdi prisotnost oljčnega olja, ekstrahiranega s topili.

1. NAMEN

Ta metoda opisuje postopek za določanje eritrodiola v maščobah.

2. PRINCIP METODE

Maščobo umilimo z etanolno raztopino kalijevega hidroksida. Neumiljivo frakcijo, potem ekstrahiramo z dietilnim etrom in očistimo s prehodom skozi kolono, napolnjeno z aluminijevim oksidom.

Neumiljive snovi tretiramo s tankoplastno kromatografijo na silikagelni plošči, dokler se ne ločijo pasovi, ki ustrezajo frakcijam sterola in eritrodiola. Steroli in eritrodiol, dobljeni s plošče, se pretvorijo v trimetilsililne etre in mešanico se analizira s plinsko kromatografijo.

Rezultati so izraženi v odstotnem deležu eritrodiola in mešanice eritrodiola in sterolov.

3. OPREMA

3.1 Oprema, kot je specificirana v Prilogi V (določanje vsebnosti sterolov).

4. REAGENTI

4.1 Reagenti, kot so specificirani v Prilogi V (določanje vsebnosti sterolov).

4.2 Referenčna raztopina eritrodiola, 0,5-% raztopina v kloroformu.

5. POSTOPEK

5.1 Priprava neumiljivih snovi.

Kot je opisano v odstavku 5.1.2 Priloge V.

5.2 Ločevanje eritrodiola in sterolov.

5.2.1 Glej odstavek 5.2.1 Priloge V.

5.2.2 Glej odstavek 5.2.2 Priloge V.

5.2.3 Pripravite 5-% raztopino neumiljivih snovi v kloroformu. Z 0,1 μl mikrobrizgalko nanesite na kromatografsko ploščo 0,3 ml raztopine, približno 1,5 cm od spodnjega robu v progi, ki je čimbolj tanka in homogena. Na en konec plošče nanesite nekaj mikrolitrov raztopin holesterola in eritrodiola, ki naj služita kot referenca.

5.2.4 Ploščo vložite v razvijalno komoro, pripravljeno kot je navedeno v 5.2.1. Temperatura okolja mora biti približno 20 °C. Takoj zaprite komoro s pokrovom in pustite, da poteka eluiranje, dokler fronta topila ne doseže razdalje 1 cm od vrhnjega roba plošče. Vzemite ploščo iz razvijalne komore in odparite topilo pod tokom vročega zraka.

5.2.5 Rahlo in enokomerno napršite ploščo z alkoholno raztopino 2,7-diklorofluorosceina. Če se ploščo opazuje pod ultravijolično svetlobo, se pasova sterola in eritrodiola lahko identificirata tako, da se ju poravna z referencami. Označite s piko izven robov fluorescence.

5.2.6 S kovinsko žličko odstrgajte silikagel v označenih območjih. Material s plošče dajte v 50-ml bučko. Dodajte 15 ml vročega kloroforma, dobro pretresite in filtrirajte skozi lij s ploščo iz sintranega stekla, tako da silikagel prenesete na filter. Trikrat sperite z vročim kloroformom (vsakokrat z 10 ml), tako da zberete filtrat v 100-ml bučki. Odparite filtrat na približno 4 do 5 ml volumna, prenesite v kalibrirano 10-ml epruveto za centrifugiranje s konusnim dnom, posušite z rahlim segrevanjem v toku dušika in stehtajte.

5.3 Priprava trimetilsililnih estrov

Kot je opisano v odstavku 5.3 Priloge V.

5.4 Plinsko kromatografska analiza

Kot je opisano v odstavku 5.4 zgoraj navedenega postopka. Delovni pogoji plinskega kromatografa morajo biti pri analizi takšni, da se izvede analiza sterolov in loči TMSE od eritrodiola in uvaola.

Potem, ko je bil vzorec vbrizgan, nadaljujte z beleženjem, dokler prisotni steroli, eritrodiol in uvaol ne eluirajo. Potem identificirajte vrhove (retenzijska časa za eritrodiol in uvaol glede na ß-sitosterol sta okrog 1,45 oziroma 1,55) in površine izračunajte kot za sterole.

6. IZRAŽANJE REZULTATOV

kjer je:

A1 = površina vrha eritrodiola ►M6 ————— ◄ ;

A2 = površina vrha uvaola ►M6 ————— ◄ ;

Σ Asteroli = vsota površin vrhov sterolov ►M6 ————— ◄ .

Rezultat se izrazi na eno decimalno mesto.

▼M21









PRILOGA VII

DOLOČANJE ODSTOTNEGA DELEŽA 2-GLICERIL MONOPALMITATA

1. PREDMET UREJANJA IN PODROČJE UPORABE

S to metodo je opisan analitski postopek za določevanje odstotnega deleža palmitinske kisline na položaju 2 v trigliceridih z ovrednotenjem 2-gliceril monopalmitata.

To metodo uporabljamo za rastlinska olja, tekoča pri sobni temperaturi (20 °C).

2. PRINCIP

Po pripravi pustimo, da na vzorec olja učinkuje pankreatična lipaza: poteče delna hidroliza, specifična za položaja 1 in 3 v molekuli triglicerida, ki povzroči nastanek 2-monoacilglicerolov. Odstotni delež 2-gliceril monopalmitata v monoacilglicerolni frakciji se po sililiranju določi s kapilarno plinsko kromatografijo.

3. APARATURE IN OBIČAJNA LABORATORIJSKA OPREMA

3.1 Erlenmajerica, 25 ml

3.2 Čaše 100, 250 in 300 ml

3.3 Steklena kromatografska kolona z notranjim premerom 21–23 mm, dolžine 400 mm, opremljena s sintrano stekleno ploščico in petelinčkom

3.4 Merilni valji prostornine 10, 50, 100 in 200 ml

3.5 Bučke prostornine 100 in 250 ml

3.6 Rotavapor

3.7 Epruvete za centrifugiranje prostornine 10 ml s koničnim dnom in obrušenim zamaškom

3.8 Centrifuga za epruvete prostornine 10 in 100 ml

3.9 Termostat, ki omogoča vzdrževanje temperature pri 40 °C ± 0,5 °C

3.10 Merilni pipeti prostornine 1 in 2 ml

3.11 Brizgalka prostornine 1 ml

3.12 Mikrobrizgalka prostornine 100 μl

3.13 Lij-ločnik, 1 000 ml

3.14 Plinski kromatograf za kapilarne kolone, opremljen z injicirnim sistemom za hladno injiciranje vzorca neposredno v kolono in pečjo, ki lahko vzdržuje izbrano temperaturo znotraj 1 °C

3.15 Injektor za hladno injiciranje vzorca neposredno v kolono

3.16 Plamensko ionizacijski detektor in elektrometer

3.17 Rekorder-integrator, kompatibilen z elektrometrom, z odzivnim časom, manjšim od 1 sekunde, in nastavljivo hitrostjo pomika papirja

3.18 Steklena ali kvarčna kapilarna kolona dolžine 8 do 12 m, z notranjim premerom 0,25 do 0,32 mm, pokrita z metilpolisiloksanom ali 5-odstotnim fenil metilpolisiloksanom, debeline 0,10–0,30 μm, ki jo je mogoče uporabiti pri 370 °C

3.19 Mikrobrizgalka prostornine 10 μl z nesnemljivo, vsaj 7,5 cm dolgo iglo, za neposredno vbrizganje na začetek kolone

4. REAGENTI

4.1 Silikagel z velikostjo delcev med 0,063 in 0,200 mm (70/280 mesh), pripravljen na naslednji način: silikagel damo v porcelansko posodico, ga pri 160 °C 4 ure sušimo v sušilniku, nato pa pustimo, da se na sobni temperaturi ohladi v eksikatorju. Nato dodamo količino vode, ki ustreza 5 % teže silikagela: v erlenmajerico prostornine 500 ml natehtamo 152 g silikagela in dodamo 8 g destilirane vode, zamašimo ter homogeniziramo. Pred uporabo pustimo mirovati vsaj 12 ur.

4.2 n-heksan (kromatografske čistoče)

4.3 Izopropanol

4.4 Izpropanol, vodna raztopina 1/1 (V/V)

4.5 Pankreatična lipaza. Aktivnost uporabljene lipaze mora biti med 2,0 in 10 lipaznimi enotami na mg (V prodaji so pankreatične lipaze z aktivnostjo med 2 in 10 enotami na mg encima.)

4.6 Pufrska raztopina tris-hidroksi-metilaminometana: 1 M vodna raztopina, ki ji s koncentrirano HCI (1/1 V/V) uravnamo pH na vrednost 8 (preverimo s pH-metrom)

4.7 Natrijev holat, encimske čistosti, 0,1-odstotna vodna raztopina (to raztopino je treba uporabiti v petnajstih dneh po pripravi)

4.8 Kalcijev klorid, 22-odstotna vodna raztopina

4.9 Dietil eter kromatografske čistoče

4.10 Elucijsko topilo: mešanica n-heksana/dietilnega etra (87/13) (V/V)

4.11 Natrijev hidroksid, 12-odstotna raztopina v masnih odstotkih

4.12 Fenolftalein, 1-odstotna raztopina v etanolu

4.13 Nosilni plin: vodik ali helij, za plinsko kromatografijo

4.14 Pomožna plina: vodik, najmanj 99-odstoten, brez vlage in organskih snovi, in zrak, za plinsko kromatografijo in enake čistoče

4.15 Regent za silaniziranje: mešanica piridina, heksametildisilazana, trimetilklorosilana v razmerju 9:3:1 (V/V/V) (V prodaji so raztopine, pripravljene za uporabo. Uporabimo lahko tudi druge reagente za silaniziranje, zlasti bis-trimetilsilil trifluoroacetamid + 1-odstoten trimetilklorosilan, razredčen z enako količino brezvodnega piridina.)

4.16 Referenčni vzorci: čisti monogliceridi ali mešanice monogliceridov, za katere je znano, da imajo podobno odstotkovno sestavo kot vzorec.

5. POSTOPEK

5.1 Priprava vzorca

5.1.1 Olj z deležem prostih kislin, manjšim od 3 %, pred kolonsko kromatografijo ni treba nevtralizirati s silikagelom. Olja, katerih delež prostih kislin je večji od 3 %, je treba nevtralizirati v skladu s točko 5.1.1.1. 5.1.1.1 V lij-ločnik prostornine 1 000 ml (3.13) vlijemo 50 g olja in 200 ml n-heksana. Dodamo 100 ml izopropanola in tako količino 12-odstotne raztopine natrijevega hidroksida (4.11), da ustreza deležu prostih kislin, povečanemu za 5 odstotkov. Eno minuto močno stresamo. Dodamo 100 ml destilirane vode, ponovno pretresemo in pustimo, da se usede. Po ločevanju odstranimo spodnjo plast, ki vsebuje mila. Odstranimo morebitne vmesne plasti (sluz in netopne snovi). Heksansko raztopino nevtraliziranega olja izpiramo z zaporednimi 50- do 60-mililitrskimi odmerki raztopine izopropanola in vode 1/1 (V/V) (4.4) tako dolgo, da je izpiralna faza nevtralna na fenolftalein. Večino heksana odstranimo z destilacijo v vakuumu (uporabimo na primer rotavapor) in olje prelijemo v 100-mililitrsko bučko (3.5). Olje sušimo v vakuumu, dokler se topilo v celoti ne odstrani. Po koncu tega postopka mora biti vsebnost kislin v olju manjša od 0,5 %.

5.1.2 V erlenmajerico prostornine 25 ml damo 1,0 g olja, pripravljenega po spodnjih navodilih (3.1), in ga raztopimo v 10 ml razvijalne mešanice (4.10). Pred kolonsko kromatografijo s silikagelom raztopino pustimo mirovati najmanj 15 minut. Če je raztopina motna, jo centrifugiramo, da zagotovimo optimalne pogoje za kromatografijo. (Uporabimo lahko komercialne 500-mg silikagelne kartuše SPE.)

5.1.3 Priprava kromatografske kolone V kolono (3.3) vlijemo približno 30 m razvijalnega topila (4.10), s stekleno paličko v spodnji del kolone vstavimo košček vate; stisnemo, da odstranimo zrak. V čaši pripravimo raztopino 25 g silikagela (4.1) v približno 80 ml razvijalne raztopine in jo z lijakom prelijemo v kolono. Preverimo, da smo v kolono dali ves silikagel; speremo z elucijskim topilom (4.10), odpremo petelinček in pustimo, da raven tekočine seže približno 2 mm nad zgornjo raven silikagela.

5.1.4 Kolonska kromatografija V erlenmajerico prostornine 25 ml (3.1.) natehtamo natanko 1,0 g vzorca, ki smo ga pripravili v skladu s točko 5.1. Vzorec raztopimo v 10 ml elucijskega topila (4.10). Raztopino prelijemo v kromatografsko kolono, ki smo jo pripravili v skladu s točko 5.1.3. Pazimo, da ne premešamo površine kolone. Odpremo ventil in pustimo raztopino vzorca odtekati, dokler ne doseže ravni silikagela. Eluiramo s 150 ml razvijalnega topila. Količino pretoka nastavimo na 2 ml/min (tako da 150 ml odteče v kolono v približno 60–70 minutah). Eluat zberemo v 250-mililitrsko bučko z znano maso. V vakuumu odparimo topilo in njegove zadnje sledi odstranimo s tokom dušika. Bučko stehtamo in izračunamo pridobljeni ekstrakt (Če uporabljamo silikagelne kartuše SPE, storimo naslednje: v kartuše, ki smo jih predhodno kondicionirali s 3 ml n-heksana, vlijemo 1 ml raztopine (5.1.2). Po filtraciji raztopine razvijemo s 4 ml n-heksana/dietilnega etra 9/1 (V/V). Eluat zberemo v 10-mililitrsko epruveto in ga z uvajanjem toka dušika odparimo do suhega. Na suhem preostanku pustimo učinkovati pankreatično lipazo (5.2). Ključno je, da pred in po uporabi kartuše SPE preverimo sestavo maščobnih kislin.

5.2 Hidroliza s pankreatično lipazo

5.2.1 V epruveto centrifuge natehtamo 0,1 g olja, pripravljenega v skladu s točko 5.1. Dodamo 2 ml pufrske raztopine (4.6), 0,5 ml raztopine natrijevega holata (4.7) in 0,2 ml raztopine kalcijevega klorida, pri čemer po vsakem dodajanju dobro pretresemo. Epruveto zapremo z obrušenim zamaškom in jo namestimo v termostat, naravnan na 40 ± 0,5 °C.

5.2.2 Dodamo 20 mg lipaze, previdno pretresemo (pazimo, da ne zmočimo zamaška) in damo epruveto za natanko 2 minuti v termostat, nato jo damo ven, jo natanko 1 minuto močno stresamo in pustimo, da se ohladi.

5.2.3 Dodamo 1 ml dietilnega etra, zamašimo in močno stresamo, nato centrifugiramo ter raztopino etra z mikrobrizgalko prenesemo v čisto in suho epruveto.

5.3 Priprava silaniziranih derivatov in plinska kromatografija

5.3.1 Z mikrobrizgalko prenesemo 100 μl raztopine (5.2.3) v epruveto prostornine 10 ml s koničastim dnom.

5.3.2 Topilo odstranimo z uvajanjem rahlega toka dušika, dodamo 200 μl reagenta za silaniziranje (4.15), zamašimo epruveto in pustimo mirovati 20 minut.

5.3.3 Po 20 minutah dodamo 1 do 5 ml n-heksana (odvisno od kromatografskih pogojev): raztopina, ki jo dobimo, je nared za plinsko kromatografijo.

5.4 Plinska kromatografija

Pogoji za postopek so naslednji:

— temperatura injektorja (injektor za vbrizgavanje v kolono) mora biti nižja od temperature vrelišča topila (68 °C),

— temperatura detektorja: 350 °C,

— temperatura kolone: programiranje temperature peči: 1 minuto pri 60 °C, s hitrostjo segrevanja 15 °C na minuto, dokler ne dosežemo temperature 180 °C, nato s hitrostjo 5 °C na minuto, dokler ne dosežemo temperature 340 °C, nato 13 minut pri 340 °C,

— nosilni plin: vodik ali helij, nastavljen na ustrezno linearno hitrost, da dosežemo resolucijo, navedeno na Sliki 1. Retencijski čas triglicerida C54 mora biti 40 + 5 minut (glej Sliko 2); (Pogoji za spodaj navedene postopke so okvirni. Vsak izvajalec jih mora optimizirati, da doseže želeno resolucijo. Najmanjša višina vrha za 2-gliceril monopalmitat mora biti enaka 10 % polne skale rekorderja.),

— količina injicirane snovi: 0,5-1 μl raztopine (5 ml) n-heksana (5.3.3).

5.4.1 Identifikacija vrhov

Posamezne monoacilglicerole identificiramo na podlagi dobljenih retencijskih časov in glede na čase, dobljene za standardne mešanice monogliceridov, analizirane pri enakih pogojih.

5.4.2 Kvantitativna analiza

Površina vsakega vrha se izračuna z elektronskim integratorjem.

6. PODAJANJE REZULTATOV

Odstotek gliceril monopalmitata izračunamo iz razmerja med ustrezno površino vrha in vsoto površin vrhov vseh monoacilglicerolov (glej Sliko 2), in sicer na podlagi formule:

kjer je:

Ax = površina vrha gliceril monopalmitata

ΣA = vsota površin vseh vrhov monoacilglicerolov

Rezultat je treba podati na eno decimalko natančno.

7. POROČILO O ANALIZI

V poročilu o analizi je treba podrobno navesti:

— sklicevanje na to metodo,

— vse informacije, potrebne za popolno identifikacijo vzorca,

— rezultat analize,

— vsako odstopanje od te metode, ne glede na to, ali gre za odločitev zadevnih oseb ali zaradi kakega drugega razloga,

— podrobne podatke o laboratoriju, datum analize in podpis njenih odgovornih oseb.

Slika 1

Kromatogram proizvodov reakcije silaniziranja, dobljenih z delovanjem lipaze na rafiniranem oljčnem olju, ki mu je dodanih 20 % 100 % zaestrenega olja

Legenda: Acides gras libres = proste maščobne kisline Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée = rafinirano oljčno olje + 20 % zaestrenega olja 1-2 monopalmitate = 1-2 monopalmitat 1-2 monopalmitoléine = 1-2 monopalmitolein 1-2 mono C18 insat. = 1-2 mono C18 nenasič. squalène = skvalen.

Slika 2

Kromatogram

(A) nezaestrenega oljčnega olja po delovanju lipaze, in silaniziranega; pri teh pogojih (kapilarna kolona 8–12 m) frakcija voskov eluira hkrati s frakcijo diacilglicerolov ali malo zatem. Vsebnost triacilglicerolov po lipazi ne sme preseči 15 %. Legenda: 1 = Proste maščobne kisline 2 = Monoacilgliceroli 3 = Diacilgliceroli 4 = Tracilgliceroli (*) = 2-monopalmitin (**) = Triacilglicerol C54

Kromatogram:

(B) zaestrenega olja po delovanju lipaze; po silaniziranju; pri teh pogojih (kapilarna kolona 8–12 m) frakcija voskov eluira hkrati s frakcijo diglicerida ali malo zatem. Vsebnost trigliceridov po lipazi ne sme preseči 15 % Legenda: 1 = Proste maščobne kisline 2 = Monogliceridi 3 = Digliceridi 4 = Trigliceridi (*) = 2-monopalmitin (**) = Triglicerid C54

8. OPOMBE

Lipaze z zadostno aktivnostjo so komercialno dostopne. Lahko jih pripravimo tudi v laboratoriju, in sicer na naslednji način:

5 kg sveže prašičje trebušne slinavke ohladimo na 0 °C. Odstranimo okoliško trdo maščevje in vezno tkivo ter jo zmeljemo v mlinčku z rezili, da dobimo kašasto tekočino. To tekočino 4 do 6 ur mešamo z 2,5 litra brezvodnega acetona in nato centrifugiramo. Izvleček naredimo še trikrat z enako količino acetona, nato dvakrat z mešanico acetona/dietilnega etra (1/1) (V/V) in dvakrat z dietilnim etrom.

Preostanek 48 ur sušimo v vakuumu, da dobimo stabilen prah, ki ga je treba dolgo časa hraniti v hladilniku in pred vlago.

Oljno emulzijo pripravimo na naslednji način:

V mešalniku 10 minut mešamo mešanico 165 ml raztopine gumarabikuma (100 g/l), 15 g zdrobljenega ledu in 20 ml predhodno nevtraliziranega oljčnega olja.

V čašo prostornine 50 ml zaporedoma damo 10 ml te emulzije, nato 0,3 ml raztopine natrijevega holata (0,2 g/ml) in 20 ml destilirane vode.

Čašo damo v termostat, naravnan na 37 °C; namestimo elektrode pH metra in spiralni mešalnik.

Z bireto po kapljicah dodajamo raztopino natrijevega hidroksida 0,1 N, dokler ne dobimo pH vrednosti 8,3.

Dodamo ustrezno količino v vodi raztopljene lipaze v prahu (0,1 g/ml lipaze). Takoj ko pH meter pokaže pH 8,3, sprožimo štoparico in po kapljah dodajamo raztopino natrijevega hidroksida, in sicer s tako hitrostjo, da ohranimo pH vrednost 8,3. Vsako minuto odčitamo volumen porabljene raztopine.

Podatke zabeležimo v sistem koordinatnih osi, in sicer odčitke časa navedemo kot absciso, kot ordinato pa ml alkalne raztopine 0,1 N, ki smo jih porabili za ohranitev konstantnega pH. Dobiti moramo linearen graf.

Aktivnost lipaze, izmerjena v lipaznih enotah na mg, je izražena z naslednjo formulo:

kjer je:

A aktivnost v lipaznih enotah/mg

V število ml raztopine natrijevega hidroksida 0,1 N na minuto (izračunano iz grafa)

N normalnost raztopine natrijevega hidroksida

m masa vzorca lipaze v mg.

Lipazna enota je opredeljena kot količina encima, ki sprosti 10 mikro-ekvivalentov kisline na minuto.

▼M20 —————

▼B









PRILOGA IX

SPEKTROFOTOMETRIČNO MERJENJE V UV PODROČJU

PREDGOVOR

Spektrofotometrično merjenje v UV področju lahko nudi podatke o kakovosti maščobe, njenem stanju ohranitve in spremembah, ki so jih v njej povzročili tehnološki procesi.

Do absorpcije valovnih dolžin, določenih v postopku, pride zaradi prisotnosti konjugiranih dienov in trienov. Te absorpcije so izražene kot specifične ekstinkcije E1 % 1 cm (ekstinkcija 1 % raztopine maščobe v specificiranem topilu, v debelini 1 cm), konvencionalno označena s K (imenovana tudi „ekstinkcijski koeficient“).

1. NAMEN

Ta metoda opisuje postopek za izvajanje spektrofotometrične preiskave oljčnega olja v UV področju.

2. PRINCIP METODE

Zadevna maščoba se raztopi v zahtevanem topilu in ekstinkcija raztopine se potem določi pri specifični valovni dolžini glede na čisto topilo. Specifične ekstinkcije se izračunajo iz spektrofotometričnih odčitkov.

3. OPREMA

3.1 Spektrofotometer za merjenje ekstinkcije v UV področju med 220 in 360 nm z možnostjo odčitavanja posameznih nanometrskih enot.

3.2 Pravokotne kvarčne kivete, s pokrovčki, z optično dolžino 1 cm. Če jo napolnimo z vodo ali drugim primernim topilom, ne sme kazati razlik med njimi za več kot 0,01 ekstinkcijske enote.

3.3 25-ml graduirane steklenice.

▼M6

3.4 Kromatografska kolona z zgornjim delom dolžine 270 mm in premerom 35 mm ter spodnjim delom dolžine 270 mm in premerom približno 10 mm.

▼B

4. REAGENTI

4.1 Spektrofotometrično čisti izo-oktan (2,2,4-trimetilpentan). Glede na referenco z destilirano vodo naj bi imel transmisijo, ki ni manjša od 60 % pri 220 nm in ne manjša od 95 % pri 250 nm, ali — spektrofotometrično čisti cikloheksan: glede na referenco z destilirano vodo naj bi to imelo transmisijo, ki ni manjša od 40 % pri 220 nm in ne manjša od 95 % pri 250 nm. ▼M6 ————— ▼B

4.2 Bazični aluminijev oksid za kolonsko kromatografijo, pripravljen in preverjen kot je opisano v Prilogi I

4.3 n-heksan, kromatografske čistoče.

5. POSTOPEK

5.1 Obravnavani vzorec mora biti popolnoma homogen in brez dvomljivih nečistoč. Olja, ki so pri temperaturi okolja tekoča, je treba prefiltrirati skozi papir pri temperaturi približno 30 °C, trde maščobe je treba homogenizirati in prefiltrirati pri temperaturi, ki ni več kot 10 °C nad tališčem.

5.2 Točno natehtajte približno 0,25 g tako pripravljenega vzorca v 25-ml graduirano bučko, dopolnite do označbe specificirano topilo in homogenizirajte. Tako pripravljena raztopina mora biti popolnoma čista. Če je raztopina opaloscentna ali motna, hitro prefiltrirajte skozi papir.

5.3 Napolnite kiveto s pripravljeno raztopino in izmerite ekstinkcijo pri ustrezni valovni dolžini med 232 in 276 nm, s tem da topilo uporabite kot referenco. Izmerjene ekstinkcijske vrednosti morajo biti v rangu od 0,1 do 0,8. Če ne, je treba meritve ponoviti z uporabo ustreznih bolj koncentriranih ali bolj razredčenih raztopin.

5.4 Kadar je pri prehodu preko aluminijevega oksida zahtevana opredelitev specifične ekstinkcije, nadaljujte kot sledi: Uvedite 30 g bazičnega aluminijevega oksida v heksansko suspenzijo v kromatografski koloni. Potem, ko se je adsorbent usedel, odstranite presežni heksan navzdol do približno 1 cm nad vrhom aluminijevega oksida. Raztopite 10 g maščobe, homogenizirane in filtrirane, kot je opisano v 5.1, v 100 ml heksana in vlijte raztopino v kolono. Zberite eluent in v vakuumu pri temperaturi pod 25 °C odparite stran vse topilo. Z uporabo tako dobljene maščobe takoj nadaljujte, kot je določeno v 5.2.

6. IZRAŽANJE REZULTATOV

6.1 Zabeležite specifične ekstinkcije (ekstinkcijski koeficienti) pri različnih valovnih dolžinah, izračunane kot sledi: kjer je: Kλ = specifična ekstinkcija pri valovni dolžini λ; Eλ = ekstinkcija izmerjena pri valovni dolžini λ; c = koncentracija raztopine v g/100 ml; s = debelina kivete v cm. Rezultate se izrazi na dve decimalni mesti.

6.2 Spektrofotometrična analiza oljčnega olja v skladu z uradnim posotpkom, v EGS predpisih specificira določanje specifične ekstinkcije v raztopini izo-oktana pri valovni dolžini 232 in 270 nm in določanje K, ki je podana s: kjer je Km specifična ekstinkcija pri valovni dolžini m, valovni dolžini za maksimalno absorpcijo okrog 270 nm.









DODATEK I

Priprava aluminijevega oksida in preskus njegove aktivnosti

A.1.1 Priprava aluminijevega oksida

Uvedite aluminijev oksid, ki je bil prej posušen v peči pri 380 do 400 °C za tri ure v hermetično zatesnjeno posodo, dodajte distilirano vodo v razmerju 5 ml na 100 g aluminijevega oksida, posodo takoj zaprite, večkrat pretresite in potem pred uporabo pustite počivati najmanj 12 ur.

A.1.2 Preverjanje aktivnosti aluminijevega oksida

Pripravite kromatografsko kolono s 30 g aluminijevega oksida. Ravnajte kot je opisano v odstavku 5.4, uvedite mešanico sestavljeno iz:

— 95 % deviškega oljčnega olja s specifično ekstinkcijo manjšo od 0,18 pri 268 nm,

— 5 % arašidovega olja, v procesu rafinacije tretiranega z aktivnimi zemljami, s specifično ekstinkcijo, ki ni manjša od 4 pri 268 nm

skozi kolono.

Če ima po prehodu skozi kolono mešanica specifično ekstinkcijo večjo od 0,11 pri 268 nm je alimunijev oksid sprejemljiv, če pa je nima, je treba nivo dehidracije dvigniti.









DODATEK II

Kalibracija spektrofotometra

A.2 Opremo je treba preverjati v intervalih (najmanj vsakih šest mesecev) na odziv valovne dolžine in točnosti odziva.

A.2.1 Valovno dolžino se lahko preveri z živosrebrovo žarnico ali s pomočjo ustreznih filtrov.

A.2.2 Da preverite odzivnost fotocelice in fotopomnoževalke ravnajte kot sledi: natehtajte 0,2000 g čistega kalijevega kromata za spektrofotometrijo in raztopite 0,05 raztopine N kalijevega hidroksida v 1 000-ml graduirano bučko in dolijte do oznake. Vzemite natančno 25 ml dobljene raztopine, prenesite jo v 500-ml graduirano bučko in razredčite do oznake z isto raztopino kalijevega hidroksida. Izmerite ekstinkcijo tako dobljene raztopine pri 275 nm, raztopino kalijevega hidroksida uporabite kot referenco. Ekstinkcija, izmerjena z uporabo 1 cm kivete bi morala biti 0,200 ± 0,005.









PRILOGA X A

PLINSKOKROMATOGRAFSKA ANALIZA METILNIH ESTROV MAŠČOBNIH KISLIN

1. NAMEN

Ta metoda daje splošne smernice za uporabo plinske kromatografije, z uporabo polnjenih ali kapilarnih kolon, za določanje kvalitativne in kvantitativne sestave mešanice metilnih estrov maščobnih kislin, dobljenih po postopku, določenem v Prilogi X B.

Metoda se ne uporablja za polimerizirane maščobne kisline.

2. REAGENTI

2.1 Nosilni plin

Inertni plin (dušik, helij, argon, vodik itd.) popolnoma posušen in z vsebnostjo kisika, manjšo od 10 mg/kg.

Opomba 1.

Vodik, ki se kot inertni plin uporablja samo pri kapilarnih kolonah, lahko hitrost analize podvoji, vendar je nevaren. Varnostne naprave so na voljo.

2.2 Pomožni plini:

2.2.1 Vodik (čistoče ≥ 99,9 %), brez organskih nečistoč.

2.2.2 Zrak ali kisik, brez organskih nečistoč.

2.3 Referenčni standard

Mešanica metilnih estrov čistih maščobnih kislin, ali metilnih estrov maščobe poznane sestave, najraje podobne maščobi, ki jo je treba analizirati.

Treba je paziti, da se prepreči oksidacija polinenasičenih maščobnih kislin.

3. OPREMA

Dana navodila se nanašajo na običajno opremo, ki se uporablja za plinsko kromatografijo, z uporabo polnjene in/ali kapilarne kolone in plamensko ionizacijskega detektorja. Primerne so vse aparature, ki dajo učinkovitost in resulocijo, specificirano v 4.1.2.

3.1 Plinski kromatograf

Plinski kromatograf vključuje naslednje elemente:

3.1.1 Injicirni sistem

Uporabite injicirni sistem:

(a) s polnjenimi kolonami, z najmanjšim možnim mrtvim volumnom (v tem primeru je injicirni sistem možno segreti na temperaturo, ki je 20 do 50 oC višja od temperature kolone); ali

(b) s kapilarnimi kolonami, v tem primeru je injicirni sistem posebej izdelan za uporabo s takšnimi kolonami. Lahko je tip injektorja z deljenjem vzorca ali tip injektorja brez deljenja vzorca v koloni.

Opomba 2. V odsotnosti maščobnih kislin z manj kot 16 ogljikovimi atomi, se lahko uporabi injektor s pomično iglo.

3.1.2 Peč

Peč je takšna, da lahko segreje kolono na temperaturo najmanj 260 oC in vzdržuje željeno temperaturo znotraj 1 oC v polnjeni koloni in znotraj 0,1 oC v kapilarni koloni. Zadnja zahteva je zlasti pomembna kadar se uporablja kapilarna kolona.

Uporabo programiranega temperaturnega gretja priporočamo v vseh primerih in zlasti za maščobne kisline z manj kot 16 ogljikovimi atomi.

3.1.3 Polnjena kolona

3.1.3.1 Kolona, iz materiala, inertnega na snovi, ki naj bi jih analizirali (t.j– steklo ali jeklo), naslednjih dimenzij: (a) dolžina: 1 do 3 m. Kadar so prisotne dolgoverižne maščobne kisline (nad C20) je treba uporabiti relativno kratko kolono. Kadar analizirate kisline s 4 ali 6 ogljikovimi atomi, je priporočljivo, da uporabite kolono dolžine 2 m; (b) notranji premer: 2 do 4 mm. Opomba 3. Če so prisotne polinenasičene komponente z več kot tremi dvojnimi vezmi, se v jekleni koloni lahko razgradijo. Opomba 4. Lahko se uporabi sistem z dvema identičnima polnjenima kolonama

3.1.3.2 Polnilo, ki vključuje naslednje elemente: (a) nosilec: kislinsko obdelana in silanizirana diatomejska zemlja, ali drugi primeren inertni nosilec z ozkim območjem velikosti delcev (25 μm območje med 125 do 200 μm), tako da je povprečna velikost delcev povezana z notranjim premerom in dolžino kolone; (b) stacionarna faza: polarna topila poliestrskega tipa (npr. dietilenglikol polisukcinat, butandiol polisukcinat, etilenglikol poliadipat, itd.) cianosilikoni ali katera koli druga tekočina, ki omogoča zahtevano kromatografsko ločevanje (glej klavzulo 4). Vsebnost stacionarne faze mora biti 5 do 20 % (m/m) polnila. Za nekatere analize se lahko uporabi nepolarna stacionarna faza.

3.1.3.3 Kondicioniranje kolone Ob odklopljeni koloni, če je mogoče, od detektorja, postopoma segrejte peč na 185 oC in uvajajte tok inertnega plina skozi sveže pripravljeno kolono s hitrostjo 20 do 60 ml/min najmanj 16 ur pri tej temperaturi in nadaljni 2 uri pri 195 oC.

3.1.4 Kapilarna kolona

3.1.4.1 Kolona, iz materiala, inertnega na snovi, ki naj bi jih analizirali (običajno steklo ali kvarčno steklo). Notranji premer mora biti med 0,2 in 0,8 mm. Notranja površina mora biti ustrezno obdelana (npr. površinska obdelava, pasiviranje) pred nanosom stacionarne faze. V večini primerov zadošča dolžina 25 mm.

3.1.4.2 Stacionarna faza, običajno poliglikolnega tipa (polietilenglikol 20 000), poliester (butandiol polisukcinat) ali polarni polisiloksan (cianosilikoni). Primerne so kolone, kjer je stacionarna faza kemijsko vezana (zamrežena) na nosilni material. Opomba 5. Obstaja nevarnost, da polarni polisiloksani povzročijo težave pri identifikaciji in ločevanju linolenske kisline ali pri kislinah C20. Nanosi stacionarne faze so tanki, t.j. 0,1 do 0,2 μm.

3.1.4.3 Namestitev in kondicioniranje kolone Upoštevajte običajne varnostne ukrepe za montažo kapilarnih kolon, t.j.namestitev kolone v peči (nosilec), izbira in montaža priključkov (tesnenje), pozicioniranje končnih mest kolone v injektorju in na detektorju (zmanjšanje mrtvih volumnov). Pretok nosilnega plina za kolono dolžine 25 mm in notranjega premera 0,3 mm naj bo 0,3 bar (30 kPa). Kondicionirajte kolono s temperaturnim programiranjem peči s hitrostjo 3 °C/min od temperature okolja na temperaturo 10 oC pod temperaturo razpada stacionarne faze. Vzdržujte tako temperaturo peči eno uro do stabilizacije bazne linije. Ohladite jo na 180 °C in nadaljujte pri izotermičnih pogojih. Opomba 6. Ustrezno predhodno kondicionirane kolone se dobijo v prodaji.

3.1.5 Detektor, po možnosti tak, ki ga je mogoče segreti na temperaturo, višjo od temperature kolone.

3.2 Brizgalka

Brizgalka je maksimalne kapacitete 10 μl z razdelki na 0,1 μl.

3.3 Rekorder

Če se bo krivuljo rekorderja uporabilo za izračun sestave analizirane mešanice, je potreben elektronski rekorder visoke natančnosti, kompatibilen z uporabljenimi aparaturami. Rekorder ima naslednje karakteristike:

(a) odzivna hitrost pod 1,5 s, če je mogoče 1 s (odzivna hitrost je čas, ki ga potrebuje pisalo rekorderja, da naredi prehod od 0 do 90 % po nenadnem vstopu 100 % signala);

(b) širina papirja najmanj 20 cm;

(c) hitrost papirja, ki jo je mogoče prilagoditi na vrednosti med 0,4 in 2,5 cm/min.

3.4 Integrator

Hitri in točni izračuni se lahko opravijo z elektronskim integratorjem. Ta daje linearni odziv z ustrezno občutljivostjo, in korekcija deviacij bazne linije mora biti zadovoljiva.

4. POSTOPEK

Postopki, opisani v 4.1 do 4.3, se nanašajo na uporabo plamensko ionizacijskega detektorja.

Kot alternativa se lahko uporabi plinski kromatograf s katarometrskim detektorjem (ki deluje na principu spremembe toplotne prevodnosti). Delovni pogoji se potem prilagodijo, kot je opisano v klavzuli 6.

4.1 Preskusni pogoji

4.1.1 Izbor optimalnih delovnih pogojev 4.1.1.1 Polnjena kolona Pri izbiri preskusnih pogojev je treba upoštevati naslednje spremenljivke: (a) dolžina in premer kolone; (b) narava in količina stacionarne faze; (c) temperatura kolone; (d) tok nosilnega plina; (e) zahtevana resolucija; (f) količina vbrizganega vzorca, izbrana tako, da sklop detektorja in elektrometra daje linearni odziv; (g) trajanje analize. Vrednosti, podane v tabelah št. 1 in 2, zagotavljajo najmanj 2 000 teoretskih prekatov na meter kolone za metilni stearat in njegovo elucijo v teku približno 15 min. Če aparatura to omogoča, mora biti injektor na temperaturi približno 200 oC in detektor na temperaturi, ki je enaka ali višja od temperature kolone. Praviloma je razmerje med pretokom vodika, dovajanega k plamensko ionizacijskemu detektorju ter med pretokom nosilnega plina, od 1:2 do 1:1, odvisno od premera kolone. Pretok kisika je približno 5 do 10 krat večji od pretoka dušika.



Tabela 1 Notranji premer kolone Mm Pretok nosilnega plina ml/min 1 15 do 15 3 20 do 40 4 40 do 60



Tabela 2 Koncentracija stacionarne faze % (m/m) Temperatura kolone °C 5 175 10 180 15 185 20 185 4.1.1.2 Kapilarna kolona Lastnosti učinkovitosti in prepustnosti kapilarne kolone pomeni, da sta ločevanje med sestavinami in trajanje analize v veliki meri odvisna od pretoka nosilnega plina v koloni. Treba bo torej optimizirati obratovalne pogoje z delovanjem na ta parameter (ali bolj enostavno, na glavno izgubljanje kolone), glede na to, ali želite izboljšati ločbo ali hitrost analize.

4.1.2 Določanje števila teoretskih prekatov (učinkovitost) in resolucija (glej Sliko 1) Naredite analizo mešanice metilnega stearata in metilnega oleata v približno ekvivalentnih razmerjih (na primer, metilni estri iz kakavovega masla). Izberite temperaturo kolone in pretok nosilnega plina, tako da je maksimalni vrh metilnega stearata zabeležen približno 15 minut po vrhu topila. Uporabite tako količino mešanice metilnih estrov, da bo vrh metilnega stearata dosegel približno tri-četrtine celotne skale. Izračunajte število teoretskih prekatov, n (učinkovitost), z uporabo formule: in resolucijo, R, z uporabo enačbe: kjer je: dr1 je retenzijska razdalja, v milimetrih, od začetka kromatograma do vrha pika za metilni stearat; ω1 in ω2 sta širini, v milimetrih, vrhov za metilni stearat oziroma metilni oleat, izmerjeni med sečišči tangent na prevojnih točkah krivulje z bazno linijo; Δ je razdalja, v milimetrih, med vrhoma metilnega stearata in metilnega oleata; ▼M2 in indeks resolucije, lr, z uporabo formule pri čemer je a = višina najmanjšega vrha, merjeno od osnovne črte; b = višina najnižje točke med dvema sosednjima vrhoma, merjeno od bazne linije. ▼B Slika 1 Kromatogram za določanje števila teoretskih prekatov (učinkovitosti) in resolucije Izbrati moramo take delovne pogoje, ki dajo najmanj 2 000 teoretskih prekatov na meter kolone stearat in resolucijo najmanj 1,25 za metilni stearat.

4.2 Količina vzorca

S pomočjo brizgalke (3.2) vzemite 0,1 do 2 μl raztopine metilnih estrov, pripravljenih v skladu s Prilogo X B in jih vbrizgajte v kolono.

Če nimate že pripravljene raztopine estrov, si jih pripravite v koncentraciji 100 mg/ml heptana kromatografske čistoče in vbrizgajte 0,1 do 1 ml te raztopine.

Če se analizira sestavine, prisotne samo v sledovih, se količina vbrizganega vzorca lahko poveča (do 10-krat).

4.3 Analiza

Splošni delovni pogoji so določeni v 4.1.1.

Vendar je možno delati pri nižji temperaturi kolone, kadar se zahteva določanje maščobnih kislin z manj kot 12 ogljikovimi atomi, ali pri višji temperaturi, za določanje maščobnih kislin z več kot 20 ogljikovimi atomi. Včasih je možno v obeh primerih uporabiti temperaturno programiranje. Na primer, če vzorec vsebuje metilne estre maščobnih kislin, z manj kot 12 ogljikovimi atomi, injicirajte vzorec pri 100 oC (ali pri 50 do 60 oC, če je prisotna butirična kislina) in takoj, s hitrostjo 4 do 8 oC/min, dvignite temperaturo na optimalno. V določenih primerih se lahko oba postopka kombinirata.

Po programiranem segrevanju nadaljujte z eluiranjem pri konstantni temperaturi dokler niso vse sestavine eluirane. Če instrument nima programiranega gretja, ga uporabite na dveh nespremenljivih temperaturah med 100 in 195 oC.

Če je potrebno, je priporočljivo, da se analiza izvaja na dveh nespremenljivih fazah z različnima polaritetama, da se preveri odsotnost skritih vrhov, na primer v primeru hkratne prisotnosti konjugiranih C18:3 in C20:0 ali C18:3 in C18:2 .

4.4 Priprava referenčnega kromatograma in referenčnih grafov

Analizirajte referenčno standardno mešanico (2.3) z uporabo istih delovnih pogojev kot so bili tisti, uporabljeni za vzorec ter izmerite retenzijske čase ali retenzijske razdalje za osnovne maščobne kisline. Na semi logaritemski papir za vsako stopnjo nenasičenosti naredite grafe, ki prikazujejo logaritem retenzijskega časa ali razdalje kot enačbo števila ogljikovih atomov. V izotermnih pogojih bi morali biti grafi za nerazvejane kisline iste stopnje nenasičenosti ravne črte. Te črte bi morale biti približno vzporedne.

Treba se je izogibati pogojev pri katerih lahko pride do skritih vrhov t.j., takrat, ko je resolucija nezadostna za ločevanje dveh sestavin.

5. IZRAŽANJE REZULTATOV

5.1 Kvalitativna analiza

Identificirajte vrhove metilnih estrov v vzorcu iz grafov, pripravljenih v 4.4, z interpolacijo, če je potrebno.

5.2 Kvantitativna analiza

5.2.1 Določanje sestave

Razen izjemnih primerov, uporabite interni normalizacijski postopek, t.j., predpostavite, da so vse sestavine vzorca zastopane na kromatogramu, tako da celotno področje, ki ga pokrivajo vrhovi, predstavlja 100 % sestavin (celokupno ločevanje).

Če oprema vključuje integrator, uporabite tam dobljene podatke. Če ne, določite površino vrha tako, da pomnožite višino vrha z njegovo širino na sredini višine in morebitne različne stopnje atenuacije, uporabljene med beleženjem.

5.2.2 IZRAČUN

5.2.2.1 Splošni primer Izračunajte vsebnost dane komponente i, izražene kot masni odstotni delež metilnih estrov tako da določite površinski delež danega vrha glede na površino vseh vrhov, z uporabo naslednje enačbe: kjer je: Ai je površina vrha, ki ustreza komponenti i; ΣA je vsota površin vseh vrhov. Izračunajte rezultat na eno decimalko Opomba 7: V tem splošnem primeru se šteje, da rezultat izračunan na podlagi relativnih površin predstavlja masni odstotek. Za primere, pri katerih ta predpostavka ni dovoljena, glej 5.2.2.2.

5.2.2.2 Uporaba korekcijskih faktorjev V določenih primerih, na primer ob prisotnosti maščobnih kislin z manj kot osmimi ogljikovimi atomi ali kislinami s sekundarnimi skupinami, če se uporabljajo detektorji toplotne prevodnosti ali kadar je izrecno zahtevana najvišja stopnja točnosti, je treba uporabiti korekcijske faktorje za pretvorbo površin vrhov v masne odstotne deleže sestavin. Določite korekcijske faktorje s pomočjo kromatograma iz referenčne mešanice metilnih estrov znane sestave, analizirane v delovnih pogojih, identičnih tistim, ki so bili uporabljeni za vzorec. Za to referenčno mešanico je masni odstotni delež sestavine i podan z enačbo: kjer je: mi je masa sestavine i v referenčni mešanici; Σm je vsota mas vseh sestavin v referenčni mešanici. Iz kromatograma referenčne mešanice (4.4) izračunajte delež (površina/površina) sestavine i tako: kjer je: Ai je površina vrha, ki ustreza sestavini i; ΣA je vsota površin vseh vrhov. Korekcijski faktor se potem izračuna kot: Običajno so korekcijski faktorji izraženi v odnosu na KC16, tako da relativni faktorji postanejo: Za vzorec je vsebina vsake sestavine i, izražena v masnem odstotnem deležu metilnih estrov: Izračunajte rezultat na eno decimalko.

5.2.2.3 Uporaba internega standarda Pri nekaterih analizah (na primer, kjer vse maščobne kisline niso kvantificirane, kot na primer, v prisotnosti kislin s štirimi ali šestimi ogljiki ob kislinah s 16 ali 18 ogljikovimi atomi, ali kadar je treba določiti absolutno količino maščobne kisline v vzorcu) je treba uporabiti interni standard. Pogosto se uporabljajo maščobne kisline s petimi, 15 ali 17 ogljikovimi atomi. Treba je določiti (morebitni) korekcijski faktor za interni standard. Masni odstotni delež sestavine i, izražen kot metilni estri, je potem podan z enačbo: kjer je: Ai je površina vrha sestavine i; As je površina vrha, ki ustreza internemu standardu; K′i je korekcijski faktor za komponento i (v odnosu na KC1); K′s je korekcijski faktor za interni standard (v odnosu na KC16); m je masa vzorca, v miligramih; ms je masa internega standarda, v miligramih. Izračunajte rezultate na eno decimalko.

▼M2

6. POSEBEN PRIMER – DOLOČANJE TRANS-IZOMEROV

Vsebnost trans-izomerov maščobnih kislin s številom ogljikovih atomov med 10 in 24 se ugotavlja z ločevanjem njihovih metilnih estrov s pomočjo kromatografskih kapilarnih kolon s specifično polarnostjo.

6.1. Kvarčna kolona z notranjim premerom med 0,25 mm in 0,32 mm in dolžino 50 m, prekrita z notranjim nanosom cioanopropilsilikona, debeline med 0,1 in 0,3 μm (tip SP 2380, C.P. sil 88, silor 10 in podobni tipi).

▼M21

6.2. Metilni estri se pripravijo v skladu s postopkom B, navedenim v Prilogi XB. Vse maščobe z deležem prostih maščobnih kislin, ki je večji od 3 %, je treba predhodno nevtralizirati v skladu s točko 5.1.1 Priloge VII.

▼M2

6.3. Delovni pogoji pri plinski kromatografiji so na splošno naslednji: — temperatura kolone, nastavljena med 150 °C in 230 °C (na primer 15 minut pri 165 °C, nakar se s hitrostjo 5 °C na minuto povišuje do 200 °C); — temperatura injektorja: 250 °C, če se uporablja split-splittless injektor, ali kar začetna temperatura kolone, če se uporablja sistem neposrednega injiciranja na kolono; — temperatura detektorja: 260 °C; — pretok nosilnega plina (helij in vodik): 1,2 ml na minuto. Vbrizgana količina mora biti taka, da je pri delovni občutljivosti višina vrha, ki ustreza metilnemu estru arašidove kisline enaka ali večja od 20 % uporabljene skale.

6.4. Identifikacija različnih metilnih estrov se opravi na podlagi retencijskih časov, ki se jih primerja s časi za referenčne mešanice (kot je navedeno v točki 2.3). Estri trans maščobnih kislin eluirajo pred ustreznimi cis-izomeri. Primer kromatograma je podan na Sliki 2. Slika 2: Plinski kromatogram trans izomrov maščobnih kislin na kapilarni koloni

6.5. Učinkovitost, ki je določena skladno s točko 4.1.2. mora biti taka, da omogoči ločevanje nekaterih kritičnih dvojic, npr. dvojico gruče trans-izoleinskih kislin in vrha oleinske kisline, trans C18:1/cis C18:1, z resolucijo večjo od 2.

6.6. Odstotni delež posameznih trans maščobnih kislin se izračuna na osnovi razmerja med površino posameznega vrha in vsoto površin vseh prisotnih vrhov. Odstotne deleže: — trans oktadecenojskih kislin (T 18:1), ki je v Prilogi I te uredbe označen kot vsota transoleinskih izomerov; — cis-trans in trans-cis oktadekadienojskih kislin [(CT/TC) 18:2], ki je v Prilogi I te uredbe označen kot vsota translinolenskih izomerov — trans-cis-trans, cis-cis-trans, cis-trans-cis, trans-cis-cis oktadekatrienojskih kislin [(TCT + CCT + CTC + TCC) 18:3], ki je v Prilogi I te uredbe označen kot vsota translinolenskih izomerov se računa. Opomba 8: Upoštevaje značilnosti te metode podajamo rezultate na dve decimalni mesti točno.

▼B

7. POSEBEN PRIMER – UPORABA KATAROMETRSKEGA DETEKTORJA (KI DELUJE NA PRINCIPU SPREMEMB TOPLOTNE PREVODNOSTI)

Plinski kromatograf z uporabo detektorja, ki deluje na osnovi sprememb toplotne prevodnosti (katarometer), se lahko uporabi za določanje kvantitativne in kvalitativne sestave mešanice metilnih estrov maščobnih kislin. Če se ga uporabi, je treba pogoje, določene v klavzuli 3 in klavzuli 4, prilagoditi tako, kot je to prikazano v Tabeli 3.

Za kvantitativno analizo uporabite korekcijske faktorje, določene v 5.2.2.2.







Tabela 3 Spremenljivka Stanje vrednosti Kolona Dolžina: 2 do 4 m Notranji premer: 4 mm Nosilec Velikost delcev med 160 in 200 μm Koncentracija stacionarne faze 15 do 25 % (m/m) Nosilni plin Helij ali, če tega ni, vodik, z najmanjšo možno vsebnostjo kisika Pomožni plini Noben Temperatura injektorja Od 40 do 60 °C nad temperaturo kolone Temperature kolone 180 do 200 °C Tok nosilnega plina Običajno med 60 in