A.

Blocking ali kompetitivna ELISA se izvaja v skladu z naslednjim protokolom: Kompetitivna ELISA z monoklonskim protitelesom 3-17-A3 se uporablja za ugotavljanje protiteles za vse znane serotipe virusa bolezni modrikastega jezika (BTV). Načelo preskusa je prekinitev reakcije med antigenom virusa bolezni modrikastega jezika (BTV) ter grupno specifičnim monoklonskim protitelesom (3-17-A3) ob dodatku preiskovanega seruma. Protitelesa proti BTV, prisotna v preiskovanem serumu, ustavijo reaktivnost monoklonskega protitelesa (Mab) in povzročijo zmanjšanje pričakovanega obarvanja po dodatku z encimom označenega protimišjega protitelesa in kromogena/substrata. Serumi se lahko preskušajo v enkratni razredčitvi 1:5 (Točkasta razredčitev – Dodatek 1) ali pa se titrirajo (Titracija seruma – Dodatek 2), da dobimo končne titre razredčin seruma. Vrednosti inhibicije nad 50 odstotki se štejejo za pozitivne. 1. Ustrezne mikroplošče za test ELISA. 2. Antigen: na voljo v obliki koncentrata, ekstrahiranega iz celic, ki se pripravi, kakor je opisano v nadaljevanju, in se hrani pri bodisi -20 °C ali -70 °C. 3. Pufer za ustavitev reakcije: fosfatni pufer s soljo (PBS), ki vsebuje 0,3 % BTV negativnega bovinega seruma (odraslih govedi), 0,1 % (vol:vol) Tween-20 (na voljo kot sirup polioksietilen sorbiton monolaurata) v PBS. 4. Monoklonsko protitelo: 3-17-A3 (na voljo kot supernatant kulture tkiva hibridoma), usmerjeno na grupno specifični polipeptid VP7, shranjeno pri -20 °C ali suho zamrznjeno in pred uporabo razredčeno v razmerju 1:100 s pufrom za ustavitev reakcije. 5. Konjugat: kunčji protimišji globulin (adsorbiran in izpran), konjugiran na HRP (hrenovo peroksidazo) in shranjen v temnem prostoru pri 4 °C. 6. Kromogen in substrat: ortofenilen-diamin (OPD-kromogen) s končno koncentracijo 0,4 mg/ml v sterilni destilirani vodi. Vodikov peroksid (30 % vol:vol-substrat) 0,05 % vol:vol, dodan neposredno pred uporabo (5μl H2O2 na 10 ml OPD). (Previdno ravnajte z OPD – roke zaščitite z gumijastimi rokavicami – domnevno mutagena snov). 7. 1-molarna žveplena kislina: 26,6 ml kisline dodamo v 473,4 ml destilirane vode. (Pomnite – vedno dodajte kislino v vodo, in nikoli vode v kislino!) 8. Orbitalni stresalnik. 9. Čitalnik mikroplošč testa ELISA (test lahko odčitate tudi vizualno). Cc: kontrola s konjugatom (brez seruma/brez monoklonskih protiteles); C++: močno pozitivna kontrola s serumom; C+: šibko pozitivna kontrola s serumom; C-: negativna kontrola s serumom; Cm: kontrola z monoklonskim protitelesom (brez seruma).



1 Dodatek 1: Točkasta razredčitev (1:5) (40 serumov/ploščo) Kontrole Preiskovani serumi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C– 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C– 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E C + C + F C + C + G Cm Cm 40 H Cm Cm 40



Dodatek 2: Titracija seruma (10 serumov/ploščo) Kontrole Preiskovani serumi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C– 1:5 1:5 B Cc C– 1:10 1:10 C C++ C++ 1:20 1:20 D C++ C++ 1:40 1:40 E C+ C+ 1:80 1:80 F C+ C+ 1:160 1:160 G Cm Cm 1:320 1:320 H Cm Cm 1:640 1:640 Kontrola konjugata (Cc) : Jamici 1A in 1B predstavljata slepo kontrolo, ki sestoji iz antigena proti BTV in konjugata. Uporabi se lahko za izravnavo čitalnika testa ELISA. Kontrola Mab (Cm) : stolpca 1 in 2, vrstica G in H, predstavljata kontrolo z monoklonskim protitelesom in vsebujeta antigen proti BTV, monoklonsko protitelo in konjugat. V teh jamicah je obarvanje najbolj intenzivno. Srednja vrednost odčitanj optične gostote iz te kontrole predstavlja vrednost inhibicije 0 %. Pozitivna kontrola (C++, C-) : stolpca 1 in 2, vrstice C-D-E-F. Te jamice vsebujejo antigen proti BTV, močno pozitiven protiserum proti BTV oziroma šibko pozitiven protiserum proti BTV, Mab in konjugat. Negativna kontrola (C-) : Jamici 2A in 2B sta negativni kontroli, ki vsebujeta antigen proti BTV, negativni protiserum proti BTV, Mab in konjugat. Preiskovani serumi : za zelo obsežne serološke preiskave in hitre presejalne teste se lahko serumi preskušajo v enkratni razredčini 1:5 (Dodatek 1), po 10 serumov pa lahko preskušamo v obsegu razredčitev od 1:5 do 1:640 (Dodatek 2). Tako lahko približno določimo titer protitelesa v preiskovanem serumu. 1. Antigen proti BTV razredčimo na predtitrirano koncentracijo v PBS, ga damo za kratek čas v sonikator, da se nakopičeni virus enakomerno porazdeli (če sonikator ni na voljo, ga močno pipetiramo), in dodamo po 50 μl v vse jamice na mikroplošči za test ELISA. Mikroploščo stresamo levo in desno, da se antigen enakomerno porazdeli. 2. Inkubiramo pri 37 °C 60 minut na orbitalnem stresalniku. Mikroplošče trikrat speremo s prelivanjem in praznjenjem jamic z nesterilnim PBS in jih damo na vpojni papir, da se osušijo. 3. Kontrolne jamice: dodamo 100 μl pufra za ustavitev reakcije v vse jamice Cc. Dodamo 50 μl pozitivnih in negativnih kontrolnih serumov, v razredčitvi 1:5 (10 μl serumov + 40 μl pufra za ustavitev reakcije), v vsako posamezno jamico C-, C + in C++. Dodamo 50 μl pufra za ustavitev reakcije v kontrolne jamice Mab. Metoda točkaste titracije: preiskovani serum, razredčen 1:5 v pufru za ustavitev reakcije, damo v podvojene jamice v stolpcih 3 do 12 (10 μl serumov + 40 μl pufra za ustavitev reakcije), ali Metoda serumske titracije: pripravimo zaporedje dvojne razredčitve vsakega preiskovanega vzorca (1:5 do 1:640) v pufru za ustavitev reakcije, v osmih jamicah enojnih stolpcev 3 do 12. 4. Takoj po dodatku preiskovanih serumov razredčimo Mab 1:100 v pufru za ustavitev reakcije in ga dodamo po 50 μl v vsako jamico na mikroplošči, razen slepe kontrole. 5. Inkubiramo pri 37 °C 60 minut na orbitalnem stresalniku. Trikrat speremo s PBS in osušimo na vpojnem papirju. 6. Razredčimo kunčji protimišji koncentrat na 1:5000 v pufru za ustavitev reakcije in ga dodamo po 50 μl v vsako jamico na mikroplošči. 7. Inkubiramo pri 37 °C 60 minut na orbitalnem stresalniku. Trikrat speremo s PBS in osušimo na vpojnem papirju. 8. Odtajamo OPD in tik pred uporabo dodamo 5 μl 30-odstotnega vodikovega peroksida v vsakih 10 ml OPD. Dodamo po 50 μl v vsako jamico na mikroplošči. Počakamo približno 10 minut, da se jamice obarvajo, in ustavimo reakcijo z 1 M žvepleno kislino (50 μl na jamico). Obarvati se morajo kontrolne jamice Mab ter jamice, v katerih so serumi brez protitelesa proti BTV. 9. Mikroplošče pregledamo vizualno ali s spektrofotometričnim čitalnikom in zapišemo rezultate. S pomočjo ustreznega računalniškega programskega paketa izpišemo vrednosti OD, in odstotke inhibicije (PI) za preiskovane in kontrolne serume, na podlagi srednje vrednosti, zabeležene v kontrolnih jamicah za antigen. Podatke, izražene kot vrednosti OD in PI, uporabimo za ugotavljanje, ali je preskus uspel znotraj sprejemljivih meja. Zgornje kontrolne meje (UCL) in spodnje kontrolne meje (LCL) za kontrolo Mab (antigen in Mab, brez preiskovanih serumov) se nahajajo v razponu vrednosti OD 0,4 do 1,4. Vsako mikroploščo, ki ne izpolnjuje zgoraj navedenih meril, je treba zavreči. Če računalniški programski paket ni na voljo, izpišemo vrednosti OD na tiskalniku testa ELISA. Izračunamo srednjo vrednost OD za kontrolne jamice za antigen, ki je enaka 100-odstotni vrednosti. Določimo 50-odstotno vrednost OD in ročno izračunamo pozitivnost in negativnost vsakega vzorca. Vrednost odstotka inhibicije (PI) = 100 - (OD vsake preiskovane kontrole/srednja vrednost OD kontrole za monoklonsko protitelo (Cm)) × 100. Podvojene jamice z negativnim kontrolnim serumom in podvojene prazne jamice morajo prikazati vrednosti PI med + 25 % in -25 % oziroma med + 95 % in + 105 %. Če vrednosti niso v navedenih mejah, mikroplošče zato niso neuporabne, vendar nakazujejo, da se razvija obarvanje podlage. Močno in šibko pozitivni kontrolni serumi morajo prikazati vrednosti PI med + 81 % in + 100 % oziroma med + 51 % in + 80 %. Diagnostični prag za preiskovane serume je 50 % (PI 50 % ali OD 50 %). Vzorci, ki prikažejo vrednosti PI > 50 %, se ocenijo kot negativni. Vzorci z vrednostmi PI nad in pod pragom za podvojene jamice se ocenijo kot nedoločni; take vzorce lahko ponovno testiramo s točkastim testom in/ali titracijo. Tudi pozitivne vzorce lahko titriramo za ugotavljanje stopnje pozitivnosti. Vizualno odčitanje: pozitivne in negativne vzorce lahko enostavno razločimo s prostim očesom; šibko pozitivne ali močno negativne vzorce pa je težje oceniti s prostim očesom. 1. 40-60 Rouxovih celic pretočne celične linije BHK-21 trikrat speremo z Eagle’s Medium brez seruma, in jih inficiramo z virusom bolezni modrikastega jezika, serotip 1, v Eagle’s Medium brez seruma. 2. Inkubiramo pri 37 °C in vsak dan preverimo citopatski učinek (CPE). 3. Ko so citopatski učinki (CPE) v 90 do 100 odstotkih dovršeni v vsaki Rouxovi celici pretočne celične linije BHK-21, zberemo virus s stresanjem vseh še pritrjenih celic s stekla. 4. Centrifugiramo pri 2 000 do 3 000 obr./min. za peletiranje celic. 5. Supernatant zavržemo in pripravimo novo suspenzijo celic v približno 30 ml PBS, ki vsebuje 1 % Sarkosyla in 2 ml fenilmetilsulfonil fluorida (lizni pufer). Celice pri tem lahko tvorijo gel in dodati je treba več liznega pufra za zmanjšanje tega učinka. (Opomba: fenilmetilsulfonil fluorid je škodljiv – z njim ravnamo izjemo previdno.) 6. Celice ločujemo 60 sekund z ultrazvočno sondo z amplitudo 30 mikronov. 7. Centrifugiramo 10 minut pri 10 000 obr./min. 8. Supernatant shranimo pri + 4 °C in pripravimo novo suspenzijo ostalega celičnega peleta v 10 do 20 ml liznega pufra. 9. Trikrat sonificiramo in prečistimo ter na vsaki stopnji shranimo supernatant. 10. Pripravimo zbirni vzorec supernatantov in ga centrifugiramo na Beckmannovi centrifugi (s 30 ml epruvetami in rotorjem SW 28) pri 24 000 obr./min. (100 000 g) 120 minut, pri + 4 °C, na 5 mililitrski podlagi 40-odstotne raztopine saharoze (vol:vol v PBS). 11. Supernatant zavržemo, epruvete temeljito speremo in pripravimo novo suspenzijo peleta v PBS s soniciranjem. Antigen shranimo v enakih delih pri -20 °C. Za titriranje antigena proti BTV se uporabi indirektna ELISA. Dvojne razredčine antigena titriramo glede na konstantno razredčino (1/100) monoklonskih protiteles 3-17-A3. Protokol je naslednji: 1. Antigen proti BTV, razredčen 1:20 v PBS, titriramo z večkanalno pipeto po vsej mikroplošči v dveh paralelnih razredčitvah (50 μl/jamico). 2. Inkubiramo 1 uro pri 37 °C na orbitalnem stresalniku. 3. Plošče trikrat speremo s PBS. 4. Dodamo 50 μl monoklonskih protiteles 3-17-A3 (razredčenih 1:100) v vsako jamico na mikroplošči. 5. Inkubiramo 1 uro pri 37 °C na orbitalnem stresalniku. 6. Plošče trikrat speremo s PBS. 7. Dodamo 50 μl kunčjega protimišjega globulina, konjugiranega na hrenovo peroksidazo (HRP), razredčenega na predtitrirano optimalno koncentracijo, v vsako jamico na mikroplošči. 8. Inkubiramo 1 uro pri 37 °C na orbitalnem stresalniku. 9. Dodamo substrat in kromogen, kakor je opisano zgoraj. Reakcijo ustavimo po 10 minutah z dodatkom 1 molarne žveplene kisline (50 μl/jamico). Pri kompetitivni ELISI morajo biti monoklonska protitelesa prisotna v preobilju in zato izberemo razredčitev antigena, ki leži na titracijski krivulji (ne na ravnini) in da približno 0,8 OD po 10 minutah.