2009R0152 — SL — 01.01.2014 — 003.001

Ta dokument je mišljen zgolj kot dokumentacijsko orodje in institucije za njegovo vsebino ne prevzemajo nobene odgovornosti

►B UREDBA KOMISIJE (ES) št. 152/2009 z dne 27. januarja 2009 o določitvi metod vzorčenja in analitskih metod za uradni nadzor krme (Besedilo velja za EGP) (UL L 054, 26.2.2009, p.1)

spremenjena z:









▼B

UREDBA KOMISIJE (ES) št. 152/2009

z dne 27. januarja 2009

o določitvi metod vzorčenja in analitskih metod za uradni nadzor krme

(Besedilo velja za EGP)







KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE – ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske skupnosti, ob upoštevanju Uredbe (ES) št. 882/2004 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 29. aprila 2004 o izvajanju uradnega nadzora, da se zagotovi preverjanje skladnosti z zakonodajo o krmi in živilih ter s pravili o zdravstvenem varstvu živali in zaščiti živali ( 1 ), ter zlasti člena 11(4)(a), (b) in (c) Uredbe, ob upoštevanju naslednjega: (1) Naslednji akti so bili sprejeti za izvajanje Direktive 70/373/EGS in ostanejo veljavni v skladu s členom 61(2) Uredbe (ES) št. 882/2004: — Prva Direktiva Komisije 71/250/EGS z dne 15. junija 1971 o določitvi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme ( 2 ), — Druga Direktiva Komisije 71/393/EGS z dne 18. novembra 1971 o uvedbi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme ( 3 ), — Tretja Direktiva Komisije 72/199/EGS z dne 27. aprila 1972 o določitvi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme ( 4 ), — Četrta Direktiva Komisije 73/46/EGS z dne 5. decembra 1972 o določitvi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme ( 5 ), — Prva Direktiva Komisije 76/371/EGS z dne 1. marca 1976 o določitvi metod Skupnosti za vzorčenje pri uradnem nadzoru krme ( 6 ), — Sedma Direktiva Komisije 76/372/EGS z dne 1. marca 1976 o določitvi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme ( 7 ), — Osma Direktiva Komisije 78/633/EGS z dne 15. junija 1978 o uvedbi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme ( 8 ), — Deveta Direktiva Komisije 81/715/EGS z dne 31. julija 1981 o določitvi metod analize Skupnosti pri uradnem nadzoru krme ( 9 ), — Deseta Direktiva Komisije 84/425/EGS z dne 25. julija 1984 o določitvi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme ( 10 ), — Direktiva Komisije 86/174/EGS z dne 9. aprila 1986 o določitvi metode računanja energijske vrednosti krmnih mešanic za perutnino ( 11 ), — Enajsta Direktiva Komisije 93/70/EGS z dne 28. julija 1993 o določitvi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme ( 12 ), — Dvanajsta Direktiva Komisije 93/117/ES z dne 17. decembra 1993 o uvedbi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme ( 13 ), — Direktiva Komisije 98/64/ES z dne 3. septembra 1998 o uvedbi analitskih metod Skupnosti za določanje vsebnosti aminokislin, surovih olj in masti ter olakvindoksa v krmi in o spremembi Direktive 71/393/EGS ( 14 ), — Direktiva Komisije 1999/27/ES z dne 20. aprila 1999 o določitvi analitskih metod Skupnosti za določanje amproliuma, diklazurila in karbadoksa v krmi in spremembi direktiv 71/250/EGS in 73/46/EGS ter o razveljavitvi Direktive 74/203/EGS ( 15 ), — Direktiva Komisije 1999/76/ES z dne 23. julija 1999 o določitvi analitskih metod Skupnosti za določanje lasalocid natrija v krmi ( 16 ), — Direktiva Komisije 2000/45/ES z dne 6. julija 2000 o določitvi analitskih metod Skupnosti za določanje vitamina A, vitamina E in triptofana v krmi ( 17 ), — Direktiva Komisije 2002/70/ES z dne 26. julija 2002 o določitvi zahtev za določanje vrednosti dioksinov in dioksinom podobnih PCB-jev v krmi ( 18 ), — Direktiva Komisije 2003/126/ES z dne 23. decembra 2003 o analitski metodi za določanje sestavin živalskega izvora pri uradnem nadzoru krme ( 19 ). (2) Ker je Uredba (ES) št. 882/2004 nadomestila Direktivo 70/373/EGS, je primerno nadomestiti izvedbene akte k navedeni direktivi z eno uredbo. Hkrati je treba prilagoditi metode glede na znanstvene in tehnološke dosežke. Črtati je treba metode, ki ne veljajo več za njihovo nameravano uporabo. Čeprav je predvidena pravočasna posodobitev določb o vzorčenju, da se upoštevajo zadnji dosežki pri proizvodnji, shranjevanju, prevozu in trženju krme, je za zdaj ustrezno ohraniti obstoječe določbe o vzorčenju. (3) Zato je treba razveljaviti direktive 71/250/EGS, 71/393/EGS, 72/199/EGS, 73/46/EGS, 76/371/EGS, 76/372/EGS, 78/633/EGS, 81/715/EGS, 84/425/EGS, 86/174/EGS, 93/70/EGS, 93/117/ES, 98/64/ES, 1999/27/ES, 1999/76/ES, 2000/45/ES, 2002/70/ES in 2003/126/ES. (4) Ukrepi, predvideni s to uredbo, so v skladu z mnenjem Stalnega odbora za prehranjevalno verigo in zdravje živali – ob upoštevanju naslednjega: SPREJELA NASLEDNJO UREDBO:







▼M3

Člen 1

Vzorčenje za uradni nadzor krme, zlasti v zvezi z določanjem sestavin, vključno s snovmi, ki vsebujejo, sestojijo iz ali so proizvedene iz gensko spremenjenih organizmov (GSO), krmnih dodatkov, kakor so opredeljeni v Uredbi (ES) št. 1831/2003 Evropskega parlamenta in Sveta ( 20 ), in nezaželenih snovi, kakor so opredeljene v Direktivi 2002/32/ES Evropskega Parlamenta in Sveta ( 21 ), se izvaja v skladu z metodami iz Priloge I.

Metoda vzorčenja iz Priloge I se uporablja za nadzor krme v zvezi z določanjem ostankov pesticidov, kakor so opredeljeni v Uredbi (ES) št. 396/2005 Evropskega parlamenta in Sveta ( 22 ), in nadzor skladnosti z Uredbo (EU) št. 619/2011.

▼B

Člen 2

Priprava vzorcev za analizo in prikaz rezultatov se izvajata v skladu z metodami iz Priloge II.

Člen 3

Analiza za uradni nadzor krme se izvaja z uporabo metod iz Priloge III (Analitske metode za nadzor sestave posamičnih krmil in krmnih mešanic), Priloge IV (Analitske metode za nadzor ravni dovoljenih krmnih dodatkov), Priloge V (Analitske metode za nadzor nezaželenih snovi v krmi) in Priloge VI (Analitske metode za določitev sestavin živalskega izvora za uradni nadzor krme).

Člen 4

Energijska vrednost krmnih mešanic za perutnino se izračuna v skladu s Prilogo VII.

Člen 5

Za potrditev se uporabljajo analitske metode za nadzor nedovoljenih krmnih dodatkov iz Priloge VIII.

Člen 6

Direktive 71/250/EGS, 71/393/EGS, 72/199/EGS, 73/46/EGS, 76/371/EGS, 76/372/EGS, 78/633/EGS, 81/715/EGS, 84/425/EGS, 86/174/EGS, 93/70/EGS, 93/117/ES, 98/64/ES, 1999/27/ES, 1999/76/ES, 2000/45/ES, 2002/70/ES in 2003/126/ES se razveljavijo.

Sklici na razveljavljene direktive se upoštevajo kot sklici na to uredbo in se berejo v skladu s korelacijsko tabelo iz Priloge IX.

Člen 7

Ta uredba začne veljati dvajseti dan po objavi v Uradnem listu Evropske unije.

Uporablja se od 26. avgusta 2009

Ta uredba je v celoti zavezujoča in se neposredno uporablja v vseh državah članicah.

▼M3









PRILOGA I

METODE VZORČENJA

1. NAMEN IN PODROČJE UPORABE

Vzorci za uradni nadzor krme se jemljejo v skladu s spodaj opisanimi metodami. Tako dobljeni vzorci se obravnavajo kot reprezentativni za vzorčene deleže.

Namen reprezentativnega vzorčenja je pridobiti majhen delež iz serije, pri čemer opredelitev katere koli značilnosti tega deleža pomeni srednjo vrednost značilnosti serije. Serija se vzorči tako, da se večkrat odvzamejo posamezni vzorci na različnih mestih v seriji. Posamezni vzorci se z mešanjem združijo v zbirni vzorec, iz katerega se pripravijo reprezentativni končni vzorci z reprezentativno delitvijo.

Če se na podlagi vizualnega pregleda deležev krme za vzorčenje ugotovi, da se ti po kakovosti razlikujejo od preostale krme iz iste serije, se taki deleži ločijo od preostale krme in obravnavajo kot ločena podserija. Če krme ni mogoče razdeliti v ločene podserije, se vzorči kot ena serija. V takih primerih je to treba navesti v zapisniku o vzorčenju.

Če se ugotovi, da krma, ki je vzorčena v skladu z določbami te uredbe, del serije krme iz iste kategorije ali z istim opisom za katerega je ugotovljeno da ne izpolnjuje zahtev EU, se domneva, da je enako neustrezna vsa krma v zadevni seriji, razen če po podrobni oceni ni nobenega dokaza, da preostanek serije ne izpolnjuje zahtev EU.

2. OPREDELITEV POJMOV

— Lot (ali serija) : določena količina krme s skupnimi značilnostmi, kot so izvor, sorta, vrsta pakiranja, izvajalec pakiranja, pošiljatelj ali označevanje, in v primeru proizvodnega postopka enota proizvodnje iz posameznega obrata, pri kateri so uporabljeni enotni proizvodni parametri, ali več takšnih enot, kadar se proizvedejo v zaporednem vrstnem redu in se skupaj skladiščijo.

— Vzorčeni delež : serija ali opredeljeni del serije oziroma podserije.

— Zapečateni vzorec : vzorec, ki je zapečaten na način, ki preprečuje kakršen koli dostop do vzorca, pri katerem se pečat ne bi zlomil ali odstranil.

— Posamezni vzorec : količina, ki se odvzame z ene točke vzorčenega deleža.

— Zbirni vzorec : zbirek posameznih vzorcev, odvzetih iz istega vzorčenega deleža.

— Zmanjšani vzorec : del zbirnega vzorca, pridobljen z reprezentativnim zmanjšanjem istega vzorca.

— Končni vzorec : del zmanjšanega vzorca ali homogeniziranega zbirnega vzorca.

— Laboratorijski vzorec : vzorec, namenjen za laboratorij (kakor ga sprejme laboratorij), in je lahko končni vzorec, zmanjšan vzorec oziroma zbirni vzorec.

3. SPLOŠNE DOLOČBE

— Osebje, ki jemlje vzorce: vzorce jemljejo osebe, ki jih za to pooblasti pristojni organ.

— Vzorec mora biti zapečaten tako, da se vanj ne more poseči, ne da bi se pri tem zlomil ali odstranil pečat. Oznaka na pečatu mora biti jasno razpoznavna in vidna. Lahko pa se vzorec položi tudi v sprejemno posodo, ki se lahko zapre tako, da je ni mogoče odpreti, ne da bi se pri tem nepopravljivo poškodovala zbiralna posoda ali posoda, s čimer se prepreči ponovna uporaba zbiralne posode ali posode.

— Identifikacija vzorca: vzorec mora biti neizbrisno označen in identificiran tako, da je nedvoumno povezan z zapisnikom o vzorčenju.

— Iz vsakega zbirnega vzorca se odvzameta najmanj dva končna vzorca: vsaj en vzorec za nadzor (uradni nadzor) in en vzorec za nosilca dejavnosti poslovanja s krmo (dopolnilno izvedensko mnenje). Lahko se odvzame tudi en končni vzorec za referenčne namene. Če je ves zbirni vzorec homogeniziran, se končni vzorci odvzamejo iz homogeniziranega zbirnega vzorca, če tak postopek ni v nasprotju s pravili držav članic o pravicah nosilca dejavnosti poslovanja s krmo.

4. OPREMA

4.1 Oprema za vzorčenje mora biti izdelana iz snovi, ki ne morejo onesnažiti proizvodov, katerih vzorci se jemljejo. Oprema, ki je namenjena večkratni uporabi, mora biti preprosta za čiščenje, da se prepreči navzkrižno onesnaženje.

4.2 Priporočena oprema za vzorčenje trdne krme 4.2.1 Ročno vzorčenje 4.2.1.1 Lopatka z ravnim dnom in navpičnimi stranicami. 4.2.1.2 Sonda za vzorčenje z dolgo režo ali razdelki. Dimenzije sonde za vzorčenje morajo ustrezati značilnostim vzorčenega deleža (globina posode, velikost vreče itd.) in velikosti delcev krme. Če ima sonda za vzorčenje več rež, morajo biti te ločene z razdelki ali zaporedno razporejenimi odprtinami, da se zagotovi, da se vzorec odvzame na različnih mestih sonde. 4.2.2 Mehansko vzorčenje Za vzorčenje premikajoče se krme se lahko uporablja ustrezna mehanska oprema. Ustrezna pomeni, da se vzorči najmanj ves del pretoka. Vzorčenje premikajoče se krme (pri visokih hitrostih pretoka) se lahko opravi z avtomatskimi napravami za vzorčenje. 4.2.3 Razdelilnik Če je to mogoče in primerno, se mora naprava, namenjena za delitev vzorca na približno enake dele, uporabiti za pripravo reprezentativnih zmanjšanih vzorcev.

5. KOLIČINSKE ZAHTEVE GLEDE ŠTEVILA POSAMEZNIH VZORCEV

— Količinske zahteve v točkah 5.1 in 5.2 glede števila posameznih vzorcev veljajo za velikosti vzorčenih deležev do največ 500 ton, ki se lahko reprezentativno vzorčijo. Opisani postopek vzorčenja velja tudi za količine, večje od predpisane največje velikosti vzorčenega deleža, če se ne upošteva največje število posameznih vzorcev, navedeno v spodnjih preglednicah, pri čemer se število posameznih vzorcev določi s formulo kvadratnega korena, navedeno v ustreznem delu postopka (glej točko 5.3), najmanjša velikost zbirnega vzorca pa se sorazmerno poveča. To ne onemogoča delitve večje serije v manjše podserije, pri čemer se vsaka podserija vzorči v skladu s postopkom iz točk 5.1 in 5.2.

— Velikost vzorčenega deleža mora biti takšna, da se lahko vzorči vsak njegov sestavni del.

— Za zelo velike serije ali podserije (> 500 ton) in za serije, ki se prevažajo ali skladiščijo tako, da ni mogoče opraviti vzorčenja v skladu s postopkom vzorčenja iz točk 5.1 in 5.2 tega poglavja, se uporabi postopek vzorčenja iz točke 5.3.

— Če zakonodaja določa, da mora nosilec dejavnosti poslovanja s krmo ravnati v skladu s to uredbo v okviru obveznega sistema spremljanja, lahko nosilec dejavnosti poslovanja s krmo zaradi upoštevanja operativnih značilnosti odstopa od količinskih zahtev iz tega poglavja, pod pogojem, da pristojnemu organu predloži dokaz o enakovrednosti postopka vzorčenja, s katerim se pristojni organ strinja.

— V izjemnih primerih, če ni mogoče izvesti metode vzorčenja z opredeljenimi količinskimi zahtevami zaradi nesprejemljivih poškodb serije pri trženju (zaradi oblik pakiranj, prevoznih sredstev, načina skladiščenja itd.), se lahko uporabi alternativna metoda vzorčenja, pod pogojem, da je kar najbolj reprezentativna ter obširno opisana in dokumentirana.

5.1 Količinske zahteve glede posameznih vzorcev pri nadzoru snovi ali proizvodov, ki so enakomerno porazdeljeni po krmi

5.1.1 Razsuta trdna krma







Velikost vzorčenega deleža Najmanjše število posameznih vzorcev ≤ 2,5 tone 7 > 2,5 tone √20-kratnik mase vzorčenega deleža (1) v tonah, do največ 40 posameznih vzorcev (1) Kadar število ni celo število, se zaokroži navzgor na naslednje celo število.

5.1.2 Razsuta tekoča krma







Velikost vzorčenega deleža Najmanjše število posameznih vzorcev ≤ 2,5 tone ali ≤ 2 500 litrov 4 (1) > 2,5 tone ali > 2 500 litrov 7 (1) (1) Če tekočine ni mogoče homogenizirati, je treba povečati število posameznih vzorcev.

5.1.3 Pakirana krma

Krma (trdna in tekoča) je lahko pakirana v torbe, vreče, pločevinke, sode itd., ki so v preglednicah navedeni kot enote. Velike enote (≥ 500 kg ali l) je treba vzorčiti v skladu z določbami za razsuto krmo (glej točki 5.1.1 in 5.1.2)







Velikost vzorčenega deleža Najmanjše število enot, iz katerih je treba vzeti (najmanj) en posameznih vzorec (1) od 1 do 20 enot 1 enota (2) od 21 do 150 enot 3 enote (2) od 151 do 400 enot 5 enot (2) > 400 enot ¼ √število enot vzorčenega deleža (3), do 40 enot (1) Če bi lahko odprtje enote vplivalo na analizo (na primer pokvarljiva mokra krma), se kot posamezen vzorec vzame neodprta enota. (2) Pri enotah, katerih vsebina ne presega 1 kg oziroma 1 l, je vsebina posameznega vzorca ena izvirna enota. (3) Kadar dobljeno število ni celo število, se zaokroži navzgor na naslednje celo število.

5.1.4 Krmni bloki in mineralni lizalni kamni

Vzorči se najmanj en blok ali lizalni kamen na vzorčeni delež s 25 enotami, do največ štirih blokov ali lizalnih kamnov.

Pri blokih ali lizalnih kamnih, ki posamično ne tehtajo več kot 1 kg, je vsebina posameznega vzorca en blok ali en kamen.

5.1.5 Voluminozna krma/sveža krma







Velikost vzorčenega deleža Najmanjše število posameznih vzorcev (1) ≤ 5 ton 5 > 5 ton √5-kratnik mase vzorčenega deleža (2) v tonah, do največ 40 posameznih vzorcev (1) Ugotovljeno je, da v nekaterih okoliščinah (na primer silaža) ni mogoče vzeti zahtevanih posameznih vzorcev, ne da bi pri tem nesprejemljivo poškodovali serijo. V takih primerih se lahko uporabi druga metoda vzorčenja, smernice za vzorčenje takih serij pa bodo pripravljene pred začetkom veljavnosti te uredbe. (2) Kadar dobljeno število ni celo število, se zaokroži navzgor na naslednje celo število.

5.2 Količinske zahteve glede posameznih vzorcev pri nadzoru sestavin ali snovi, za katere obstaja verjetnost, da so neenakomerno porazdeljene po krmi

Te količinske zahteve glede posameznih vzorcev se morajo uporabljati v naslednjih okoliščinah:

— nadzor nad aflatoksini, rženimi rožički, drugimi mikotoksini in škodljivimi botaničnimi nečistočami v posamičnih krmilih,

— nadzor nad navzkrižnim onesnaženjem s sestavino, vključno z gensko spremenjenimi snovmi, ali snovjo, za katero obstaja verjetnost, da je neenakomerno porazdeljena po krmi.

Če nadzorni organ utemeljeno sumi, da velja taka neenakomerna porazdelitev tudi v primeru navzkrižnega onesnaženja s sestavino ali snovjo v krmni mešanici, se lahko uporabijo količinske zahteve iz spodnje preglednice.







Velikost vzorčenega deleža Najmanjše število posameznih vzorcev < 80 ton Glej količinske zahteve iz točke 5.1. Število posameznih vzorcev, ki jih je treba vzeti, je treba pomnožiti z 2,5. ≥ 80 ton 100

5.3 Količinske zahteve glede posameznih vzorcev v primeru zelo velikih serij

V primeru velikih vzorčenih deležev (vzorčeni deleži > 500 ton) je treba vzeti 40 posameznih vzorcev + √ton pri nadzoru snovi ali proizvodov, ki so enakomerno porazdeljeni po krmi, ali 100 posameznih vzorcev + √ton pri nadzoru sestavin ali snovi, za katere obstaja verjetnost, da so neenakomerno porazdeljene po krmi.

6. KOLIČINSKE ZAHTEVE GLEDE ZBIRNEGA VZORCA







Zahtevan je en zbirni vzorec na vzorčeni delež. Vrsta krme Najmanjša velikost zbirnega vzorca (1) (2) 6.1. Razsuta krma 4 kg 6.2. Pakirana krma 4 kg (3) 6.3. Tekoča ali poltekoča krma 4 litri 6.4. Krmni bloki ali mineralni lizalni kamni 6.4.1. mase več kot 1 kg po kosu 4 kg 6.4.2. mase do 1 kg po kosu masa štirih izvirnih blokov ali lizalnih kamnov 6.5. Voluminozna krma/sveža krma 4 kg (4) (1) Če je vzorčena krma velike vrednosti, se lahko odvzame manjša količina zbirnega vzorca, pri čemer se to opiše in dokumentira v zapisniku o vzorčenju. (2) V skladu z določbami Uredbe Komisije (EU) št. 619/2011 z dne 24. junija 2011 o določitvi metod vzorčenja in analitskih metod za uradni nadzor krme glede prisotnosti gensko spremenjene snovi, za katero je bil začet postopek odobritve ali je odobritev zanjo potekla (UL L 166, 25.6.2011, str. 9), mora zbirni vzorec za nadzor glede prisotnosti gensko spremenjene snovi vsebovati najmanj 35 000 zrn/semen. To pomeni, da mora biti velikost zbirnega vzorca pri koruzi najmanj 10,5 kg, pri soji pa najmanj 7 kg. Pri drugih zrnih in semenih, kot so ječmen, proso, oves, riž, rž, pšenica in seme oljne ogrščice, velikost zbirnega vzorca 4 kg ustreza več kot 35 000 zrn/semen. (3) Pri pakirani krmi včasih prav tako ni mogoče doseči velikosti zbirnega vzorca 4 kg, kar je odvisno od velikosti posamezne enote. (4) Pri voluminozni krmi ali sveži krmi z majhno specifično težo (npr. seno, slama) mora biti najmanjša velikost zbirnega vzorca 1 kg.

7. KOLIČINSKE ZAHTEVE GLEDE KONČNIH VZORCEV

Končni vzorci

Zahtevana je analiza vsaj enega končnega vzorca. Količina končnega vzorca za analizo ne sme biti manjša od:







trdna krma 500 g (1) (2) (3) tekoča ali poltekoča krma 500 ml (1) (1) V skladu z določbami Uredbe Komisije (EU) št. 619/2011 mora končni vzorec za nadzor glede prisotnosti gensko spremenjene snovi vsebovati najmanj 10 000 zrn/semen. To pomeni, da mora biti velikost končnega vzorca pri koruzi najmanj 3 000 g, pri soji pa najmanj 2 000 g. Pri drugih zrnih in semenih, kot so ječmen, proso, oves, riž, rž, pšenica in seme oljne ogrščice, velikost končnega vzorca 500 g ustreza več kot 10 000 zrn/semen. (2) Če je velikost končnega vzorca precej manjša od 4 kg oziroma litrov (glej opombe pod točko 6), se lahko odvzame tudi manjša količina končnega vzorca, pod pogojem, da je to opisano in dokumentirano v zapisniku o vzorčenju. (3) Pri vzorčenju stročnic, žitnih zrn in lupinarjev za ugotavljanje ostankov pesticidov je najmanjša velikost končnega vzorca v skladu z določbami Direktive Komisije 2002/63/ES (UL L 187, 16.7.2002, str. 30) 1 kg.

8. METODA VZORČENJA ZA ZELO VELIKE SERIJE ALI SERIJE, KI SE SKLADIŠČIJO ALI PREVAŽAJO TAKO, DA NI MOGOČE VZORČENJE PO CELOTNI SERIJI

8.1 Splošna načela

Če način prevoza ali skladiščenja serije ne omogoča odvzema posameznih vzorcev po celotni seriji, se vzorčenje takih serij po možnosti opravi ob pretoku serije.

V primeru velikih skladišč, namenjenih skladiščenju krme, je treba nosilce dejavnosti spodbujati, da v skladišče vgradijo opremo, ki omogoča (avtomatsko) vzorčenje celotne skladiščene serije.

Če se uporabljajo postopki vzorčenja, določeni v tem poglavju, se o postopku vzorčenja obvesti nosilca dejavnosti poslovanja s krmo. Če nosilec dejavnosti poslovanja s krmo ali njegov predstavnik izrazi dvom o postopku vzorčenja, pristojnemu organu omogoči, da na njegove stroške vzorči celotno serijo.

8.2 Velike serije, ki se prevažajo z ladjo

8.2.1 Dinamično vzorčenje velikih serij, ki se prevažajo z ladjo

Vzorčenje velikih serij na ladjah se po možnosti izvaja med samim pretokom proizvoda (dinamično vzorčenje).

Vzorčenje se izvaja po posameznih ladijskih skladiščih (fizično ločenih enotah). Ladijska skladišča se sicer praznijo drugo za drugo tako, da po prenosu v skladiščne prostore prvotne fizične ločitve ni več. Vzorčenje se zato lahko izvede na začetku, ko je proizvod še fizično ločen ali po izvedenem prenosu v skladiščne prostore.

Raztovarjanje ladje lahko traja več dni. Običajno je treba vzorčenje izvesti v rednih presledkih med celotnim trajanjem raztovarjanja. Vendar ni vedno mogoče ali primerno, da je uradni inšpektor prisoten za vzorčenje med celotnim trajanjem raztovarjanja. Zato je dopustno, da se vzorčenje opravi za del (vzorčeni delež) celotne serije. Število posameznih vzorcev se določi ob upoštevanju velikosti vzorčenega deleža.

V primeru vzorčenja dela serije krme iz iste kategorije ali z istim opisom,za katerega je ugotovljeno, da ne izpolnjuje zahtev EU, se domneva, da je enako neustrezna vsa krma v zadevni seriji, razen če po podrobni oceni ni nobenega dokaza, da preostanek serije ne izpolnjuje zahtev EU.

Inšpektor mora biti prisoten tudi, če se avtomatsko odvzame uradni vzorec. Pri avtomatskem vzorčenju s prednastavljenimi parametri, ki jih ni mogoče spremeniti med vzorčenjem, in če se posamezni vzorci zbirajo v zapečateni zbiralni posodi, da se preprečijo morebitne goljufije, mora biti inšpektor prisoten le na začetku vzorčenja, vsakokrat, ko je treba zamenjati posodo za zbiranje vzorcev, in na koncu vzorčenja.

8.2.2 Statično vzorčenje serij, ki se prevažajo z ladjo

Če se izvaja statično vzorčenje, je treba uporabiti enak postopek, kot je določen za skladiščne prostore (silose), ki so dostopni od zgoraj (glej točko 8.4.1).

Vzorčenje je treba izvajati na dostopnem delu (od zgoraj) serije/ladijskega skladišča. Število posameznih vzorcev se določi ob upoštevanju velikosti vzorčenega deleža. V primeru vzorčenja dela serije krme iz iste kategorije ali z istim opisom, za katerega je ugotovljeno,, da ne izpolnjuje zahtev EU, se domneva, da je enako neustrezna vsa krma v zadevni serije, razen če po podrobni oceni ni nobenega dokaza, da preostanek serije ne izpolnjuje zahtev EU.

8.3 Vzorčenje velikih serij, ki se skladiščijo v skladiščih

Vzorčenje je treba izvajati na dostopnem delu serije. Število posameznih vzorcev se določi ob upoštevanju velikosti vzorčenega deleža. V primeru vzorčenja dela serije krme iz iste kategorije ali z istim opisom za katerega je ugotovljeno, da ne izpolnjuje zahtev EU, se domneva, da je enako neustrezna vsa krmo v zadevni seriji, razen če po podrobni oceni ni nobenega dokaza, da preostanek serije ne izpolnjuje zahtev EU.

8.4 Vzorčenje skladiščnih prostorov (silosov)

8.4.1 Vzorčenje silosov, (zlahka) dostopnih od zgoraj

Vzorčenje je treba izvajati na dostopnem delu serije. Število posameznih vzorcev se določi ob upoštevanju velikosti vzorčenega deleža. V primeru vzorčenja dela serije krme iz iste kategorije ali z istim opisom za katerega je ugotovljeno, da ne izpolnjuje zahtev EU, se domneva, da je enako neustrezna vsa krma v zadevni seriji, razen če po podrobni oceni ni nobenega dokaza, da preostanek serije ne izpolnjuje zahtev EU.

8.4.2 Vzorčenje silosov, ki niso dostopni od zgoraj (zaprti silosi)

8.4.2.1 Silosi, ki niso dostopni od zgoraj (zaprti silosi), velikosti > 100 ton

Krme, ki se skladišči v takih silosih, ni mogoče statično vzorčiti. Če je treba krmo v silosu vzorčiti in pošiljke ni mogoče premakniti, se je treba z nosilcem dejavnosti dogovoriti, da inšpektorja obvesti, kdaj se bo silos razkladal, da se omogoči vzorčenje med pretokom krme.

8.4.2.2 Silosi, ki niso dostopni od zgoraj (zaprti silosi), velikosti < 100 ton

Postopek vzorčenja vključuje prenos od 50 do 100 kg krme v zbiralno posodo in odvzem vzorca iz nje. Velikost zbirnega vzorca ustreza celotni seriji, število posameznih vzorcev pa je povezano s količino iz silosa, preneseno v zbiralno posodo za vzorčenje. V primeru vzorčenja dela serije krme iz iste kategorije ali z istim opisom za katerega je ugotovljeno, da ne izpolnjuje zahtev EU, se domneva, da je enako neustrezna vsa krma v zadevni seriji, razen če po podrobni oceni ni nobenega dokaza, da preostanek serije ne izpolnjuje zahtev EU.

8.5 Vzorčenje razsute krme v velikih zaprtih zabojnikih

Take serije se pogosto lahko vzorčijo šele, ko se razkladajo. V nekaterih primerih ni mogoče opraviti raztovarjanja na točki uvoza ali kontrolni točki, zato se mora vzorčenje izvesti, ko se taki zabojniki razkladajo.

9. NAVODILA ZA JEMANJE, PRIPRAVO IN PAKIRANJE VZORCEV

9.1 Splošno

Vzorci se morajo jemati in pripravljati brez nepotrebnega odlašanja, pri tem pa se morajo upoštevati vsi potrebni previdnostni ukrepi za preprečitev spremembe ali onesnaženja proizvoda. Instrumenti ter površine in posode, namenjeni za sprejem vzorcev, morajo biti čisti in suhi.

9.2 Posamezni vzorci

Posamezne vzorce je treba vzeti naključno iz celotnega vzorčenega deleža in morajo biti približno enako veliki.

Velikost posameznega vzorca je najmanj 100 g oziroma 25 g v primeru voluminozne krme ali sveže krme z majhno specifično težo.

Če je treba v skladu s pravili za postopek vzorčenja iz točke 8 vzeti manj kot 40 posameznih vzorcev, se velikost posameznih vzorcev določi glede na zahtevano velikost zbirnega vzorca (glej točko 6).

Če se vzorčijo majhne serije pakirane krme, pri katerih je treba v skladu s količinskimi zahtevami vzeti omejeno število posameznih vzorcev, je vsebina posameznega vzorca ena izvirna enota, ki ne presega 1 kg ali 1 litra.

Če se vzorči pakirana krma, ki je sestavljena iz majhnih enot (npr. < 250 g), je velikost posameznega vzorca odvisna od velikosti enote.

9.2.1 Razsuta krma

Po potrebi se lahko vzorčenje opravi med premikanjem (nakladanjem ali raztovarjanjem) vzorčenega deleža.

9.2.2 Pakirana krma

Po izbiri zahtevanega števila enot za vzorčenje, kot je navedeno v poglavju 5, se del vsebine vsake enote odstrani s sondo ali lopatko. Po potrebi se enote izpraznijo ločeno in šele nato odvzamejo vzorci.

9.2.3 Homogenizirana ali za homogeniziranje primerna tekoča ali poltekoča krma

Po izbiri zahtevanega števila enot za vzorčenje, kot je navedeno v poglavju 5, se vsebina po potrebi homogenizira in iz vsake enote se odvzame določena količina.

Posamezni vzorci se lahko odvzamejo, ko se enota izprazni.

9.2.4 Tekoča ali poltekoča krma, ki ni primerna za homogeniziranje

Po izbiri zahtevanega števila enot za jemanje vzorcev, kot je navedeno v poglavju 5, se vzorci odvzamejo z različnih ravni.

Vzorci se lahko odvzamejo tudi, ko se enota izprazni, vendar se prvi deli zavržejo.

Vsa odvzeta količina v nobenem primeru ne sme biti manjša od 10 litrov.

9.2.5 Krmni bloki in mineralni lizalni kamni

Po izbiri zahtevanega števila blokov ali lizalnih kamnov za vzorčenje, kot je navedeno v poglavju 5, se odvzame del vsakega bloka ali lizalnega kamna. Če obstaja sum, da je blok ali lizalni kamen nehomogeniziran, se lahko kot vzorec vzame cel blok ali lizalni kamen.

Pri blokih ali lizalnih kamnih, ki posamično ne tehtajo več kot 1 kg, je vsebina posameznega vzorca en blok ali en kamen.

9.3 Priprava zbirnih vzorcev

Posamezni vzorci se zmešajo, da sestavljajo zbirni vzorec.

9.4 Priprava končnih vzorcev

Material v zbirnem vzorcu se previdno zmeša ( 23 ).

— Vsak vzorec se shrani v ustrezno posodo/zbiralno posodo. Sprejeti je treba vse potrebne previdnostne ukrepe, da se med prevozom ali shranjevanjem prepreči kakršna koli sprememba sestave vzorca, onesnaženje ali mešanje.

— Pri nadzoru sestavin ali snovi, ki so enakomerno porazdeljene po krmi, se lahko zbirni vzorec reprezentativno zmanjša na najmanj 2,0 kg ali 2,0 l(zmanjšan vzorec) ( 24 ), po možnosti z uporabo mehanskega ali avtomatskega razdelilnika. Za nadzor nad vsebnostjo ostankov pesticidov v stročnicah, žitnih zrnih in lupinarjih je najmanjša velikost zmanjšanega vzorca 3 kg. Če zaradi vrste krme ni mogoče uporabiti razdelilnika ali če ta ni na voljo, se lahko vzorec zmanjša z razdelitvijo na četrtine. Iz zmanjšanih vzorcev se nato pripravijo končni vzorci (za uradni nadzor, dopolnilno izvedensko mnenje in referenčne namene) približno enake količine, ki izpolnjujejo količinske zahteve iz poglavja 7. Pri nadzoru sestavin, vključno z gensko spremenjenimi snovmi, ali snovi, za katere obstaja verjetnost, da so neenakomerno porazdeljene po krmi, je zbirni vzorec: — — popolnoma homogeniziran in nato razdeljen v končne vzorce ali — zmanjšan na najmanj 2 kg ali 2 l ( 25 ) z uporabo mehanskega ali avtomatskega razdelilnika. Le v primeru, če zaradi vrste krme ni mogoče uporabiti razdelilnika, se lahko vzorec po potrebi zmanjša z razdelitvijo na četrtine. Pri nadzoru glede prisotnosti gensko spremenjenih snovi v okviru Uredbe (EU) št. 619/2011 mora zmanjšan vzorec vsebovati najmanj 35 000 zrn/semen, da se lahko pridobijo končni vzorci za uradni nadzor, dopolnilno izvedensko mnenje in referenčne namene, ki vsebujejo najmanj 10 000 zrn/semen (glej opombo (**) v poglavju 6 in opombo (*) v poglavju 7).

9.5 Pakiranje vzorcev

Posode ali paketi se zapečatijo in označijo z etiketami tako, da jih ni mogoče odpreti, ne da bi se pri tem poškodoval pečat. Celotna etiketa mora biti vključena v pečat.

9.6 Pošiljanje vzorcev v laboratorij

Vzorec se brez nepotrebnega odlašanja pošlje v pooblaščeni laboratorij skupaj z vsemi informacijami, ki jih potrebuje oseba, ki izvaja analizo.

10. EVIDENTIRANJE VZORČENJA

Ob odvzemu vzorca se napiše zapisnik o vzorčenju, ki omogoča nedvoumno prepoznavanje vsakega vzorčenega deleža in njegove velikosti.

V zapisniku je treba navesti tudi kakršno koli odstopanje od postopka vzorčenja, določenega v tej uredbi.

Izvod zapisnika prejme laboratorij za uradni nadzor ter nosilec dejavnosti poslovanja s krmo in/ali laboratorij, ki ga določi nosilec dejavnosti poslovanja s krmo.









PRILOGA II

SPLOŠNE DOLOČBE O ANALITSKIH METODAH ZA KRMO

A. PRIPRAVA VZORCEV ZA ANALIZO

1. Namen

Spodaj navedeni postopki opisujejo pripravo vzorcev za analizo, ki se pošljejo nadzornim laboratorijem po vzorčenju v skladu z določbami iz Priloge I.

Laboratorijski vzorci se morajo pripraviti tako, da so natehtane količine, določene za analitske metode, homogene in reprezentativne za končne vzorce.

2. Previdnostni ukrepi

Postopek za pripravo vzorca je odvisen od uporabljene analitske metode in od sestavin ali snovi, ki se nadzirajo. Zato je zelo pomembno zagotoviti, da je postopek za pripravo vzorca primeren za uporabljeno analitsko metodo in sestavine ali snovi, ki se nadzirajo.

Vse potrebne operacije se morajo izvesti tako, da se čim bolj preprečita onesnaženje vzorca in sprememba njegove sestave.

Mletje, mešanje in sejanje se izvedejo brez odlašanja, tako da je vzorec čim manj izpostavljen zraku in svetlobi. Uporaba mlinov in drobilcev, pri katerih se vzorec močno segreje, ni dovoljena.

Krmo, ki je posebej občutljiva na toploto, je priporočljivo drobiti ročno. Pri delu z opremo se zagotovi, da ta ni vir onesnaženja.

Če pri pripravi ni mogoče preprečiti bistvene spremembe vsebnosti vlage v vzorcu, je treba v skladu z metodo iz dela A Priloge III določiti vsebnost vlage pred pripravo in po njej.

3. Postopek

3.1 Splošni postopek

Iz končnega vzorca se odvzame testni alikvot. Stožčasta delitev vzorca ali delitev vzorca v četrtine nista priporočljivi, ker se lahko pojavijo hude napake v delitvi testnih alikvotov.

3.1.1 Krma, ki jo je mogoče drobiti kot tako

— Presejani končni vzorec se premeša in zbere v primerno čisto in suho posodo z neprepustnim zamaškom. Tik preden se natehta količina za analizo (testni alikvot), se vzorec še enkrat premeša, da se zagotovi popolna homogenizacija.

3.1.2 Krma, ki jo je mogoče drobiti po sušenju

— Če v analitski metodi ni navedeno drugače, se končni vzorec v skladu s postopkom za predhodno sušenje iz točke 4.3 metode za določanje vsebnosti vlage iz dela A Priloge III suši toliko časa, da se vsebnost vlage zniža na 8–12 %. Nato se nadaljuje, kakor je navedeno v oddelku 3.1.1.

3.1.3 Tekoča ali poltekoča krma

— Končni vzorec se zbere v primerno čisto in suho posodo z neprepustnim zamaškom. Tik preden se natehta količina za analizo (testni alikvot), se vzorec še enkrat dobro premeša, da se zagotovi popolna homogenizacija.

3.1.4 Druga krma

— Končni vzorci, ki se ne morejo pripraviti v skladu z enim izmed zgoraj navedenih postopkov, se obdelajo po katerem koli drugem postopku, ki zagotavlja, da bo količina vzorca, natehtana za analizo (testni alikvot), homogena in reprezentativna za končne vzorce.

3.2 Poseben postopek v primeru vizualnega pregleda ali mikroskopije ali kadar je homogeniziran celoten zbirni vzorec

— V primeru vizualnega pregleda (brez uporabe mikroskopa) se za pregled uporabi celoten laboratorijski vzorec.

— V primeru mikroskopske preiskave lahko laboratorij zmanjša zbirni vzorec ali dodatno zmanjša zmanjšani vzorec. Končni vzorci za dopolnilno izvedensko mnenje in morebitne referenčne namene se odvzamejo v skladu s postopkom, ki je enakovreden postopku za jemanje končnega vzorca za uradni nadzor.

— Če je celoten zbirni vzorec homogeniziran, se končni vzorci odvzamejo iz homogeniziranega zbirnega vzorca.

4. Shranjevanje vzorcev

Vzorci se morajo hraniti pri temperaturi, ki ne bo spremenila njihove sestave. Vzorci, namenjeni za analizo vitaminov ali snovi, ki so posebno občutljive na svetlobo, se hranijo pod pogoji, ki preprečujejo škodljiv učinek svetlobe na vzorec.

B. DOLOČBE O REAGENTIH IN OPREMI, KI SE UPORABLJAJO PRI ANALITSKIH METODAH

1. Če v analitskih metodah ni posebej določeno, morajo biti vsi reagenti za analizo analitsko čisti (p.a.). Pri analiziranju sledov se mora čistost reagentov preveriti s slepim preizkusom. Glede na dobljene rezultate je morda potrebno dodatno čiščenje reagentov.

2. Pri vseh postopkih analitskih metod, ki vključujejo pripravo raztopin, razredčevanje, spiranje ali izpiranje in pri katerih vrsta uporabljenega topila ali razredčila ni navedena, se mora uporabiti voda. Praviloma je voda demineralizirana ali destilirana. V posameznih primerih, ki so posebej navedeni v analitskih metodah, jo je treba prečistiti s posebnimi postopki.

3. Ob upoštevanju opreme, ki je po navadi v kontrolnih laboratorijih, so pri analitskih metodah navedeni le posebni instrumenti in naprave ali tisti, ki zahtevajo posebno uporabo. Biti morajo čisti, zlasti pri določanju zelo majhnih količin snovi.

C. UPORABA ANALITSKIH METOD IN PRIKAZ REZULTATOV

1. Postopek ekstrakcije

Pri številnih metodah je določen poseben postopek ekstrakcije. Praviloma se lahko uporabijo postopki ekstrakcije, ki se razlikujejo od postopka iz metode, če je za uporabljeni postopek učinkovitost ekstrakcije za analiziran matriks dokazano enakovredna postopku iz metode.

2. Postopek čiščenja

Pri številnih metodah je določen poseben postopek čiščenja. Praviloma se lahko uporabijo drugi postopki čiščenja, ki se razlikujejo od postopka iz metode, če je za uporabljeni postopek analitska učinkovitost čiščenja za analiziran matriks dokazano enakovredna postopku iz metode.

3. Število določanj

Če je pri analizi nezaželenih snovi rezultat prvega določanja bistveno (> 50 %) nižji od specifikacije, ki se nadzira, dodatna določanja niso potrebna, če so bili uporabljeni ustrezni postopki kakovosti. V drugih primerih je potrebna dvakratna analiza (drugo določanje), da se izključi možnost notranjega navzkrižnega onesnaženja ali naključne zamenjave vzorcev. Srednja vrednost obeh določanj se ob upoštevanju merilne negotovosti uporablja za potrditev skladnosti.

Pri nadzoru navedene vsebnosti snovi ali sestavine, če rezultat prvega določanja potrdi navedeno vsebnost, tj. rezultat analize je znotraj sprejemljivih meja odstopanja navedene vsebnosti, dodatna določanja niso potrebna, če so bili uporabljeni ustrezni postopki kakovosti. V drugih primerih je potrebna dvakratna analiza (drugo določanje), da se izključi možnost notranjega navzkrižnega onesnaženja ali naključne zamenjave vzorcev. Srednja vrednost obeh določanj se ob upoštevanju merilne negotovosti uporablja za potrditev skladnosti.

V nekaterih primerih je ta sprejemljiva meja odstopanja opredeljena v zakonodaji, kot je Uredba (ES) št. 767/2009 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 13. julija 2009 o dajanju krme v promet in njeni uporabi, spremembi Uredbe (ES) št. 1831/2003 Evropskega parlamenta in Sveta in razveljavitvi Direktive Sveta 79/373/EGS, Direktive Komisije 80/511/EGS, direktiv Sveta 82/471/EGS, 83/228/EGS, 93/74/EGS, 93/113/ES in 96/25/ES ter Odločbe Komisije 2004/217/ES ( 26 ).

4. Poročanje o uporabljeni analitski metodi

V zapisniku o analizi se navede uporabljena analitska metoda.

5. Poročanje o rezultatih analize

Rezultat analize se prikaže tako, kakor je navedeno v analitski metodi, na primerno število decimalk, in se po potrebi popravi glede na vsebnost vlage v končnem vzorcu pred pripravo.

6. Merilna negotovost in popravek za izkoristek pri analizi nezaželenih snovi

V zvezi z nezaželenimi snovmi po Direktivi 2002/32/ES se proizvod, namenjen za krmo, šteje za neskladnega z določeno najvišjo vsebnostjo, če rezultat analize za krmo z 12 % vsebnostjo vlage presega najvišjo vsebnost ob upoštevanju razširjene merilne negotovosti in popravka za izkoristek. Za oceno skladnosti se uporabi koncentracija, popravljena za izkoristek, od katere se odšteje razširjena merilna negotovost. Ta postopek se uporabi le v primerih, kadar analitska metoda omogoča oceno merilne negotovosti in popravka za izkoristek (npr. to ni možno v primeru mikroskopske analize).

O rezultatu analize se poroča (če uporabljena analitska metoda omogoča oceno merilne negotovosti in popravka za izkoristek) na naslednji način:

(a) s popravkom za izkoristek, pri čemer se navede raven izkoristka. Popravka za izkoristek ni treba uporabiti, če je izkoristek med 90–110 %;

(b) kot „x +/– U“, pri čemer je x rezultat analize in U razširjena merilna negotovost, ob uporabi faktorja pokritja 2, zaradi katerega je stopnja zanesljivosti približno 95 %.

Vendar če je rezultat analize bistveno (> 50 %) nižji od specifikacije, ki se nadzira, in je bil uporabljen ustrezni postopek kakovosti ter je namen analize le preverjanje skladnosti z zakonodajnimi določbami, se lahko o rezultatu analize poroča brez popravka za izkoristek, popravek za izkoristek in merilna negotovost pa se lahko v teh primerih izpustita.

▼B









PRILOGA III

ANALITSKE METODE ZA NADZOR SESTAVE POSAMIČNIH KRMIL IN KRMNIH MEŠANIC

À. DOLOČANJE VLAGE

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje vsebnosti vlage v krmi. Kadar krma vsebuje hlapne snovi, kot so organske kisline, je treba upoštevati, da se pri določanju vlage zajame tudi bistvena količina hlapnih snovi.

Ta metoda ne zajema analizo mlečnih izdelkov kot posamičnih krmil, analizo mineralnih snovi, analizo mineralnih mešanic, sestavljenih predvsem iz mineralnih snovi, analizo živalskih in rastlinskih maščob in olj ali analizo oljnih semen in oljnatega sadja.

2. Načelo

Vzorec se osuši pri določenih pogojih, ki se spreminjajo glede na vrsto krme. Izguba mase se določi s tehtanjem. Pri trdni krmi z visoko vsebnostjo vlage je treba izvesti predhodno sušenje.

3. Oprema

3.1 Drobilec iz materiala, ki ne absorbira vlage, in se lahko enostavno čisti, omogoča hitro in enakomerno drobljenje brez pregretja, v največji možni meri preprečuje stik z zunanjim zrakom ter ustreza zahtevam iz 4.1.1 in 4.1.2 (npr. udarni ali vodno hlajeni mikrodrobilci, konusni mlini, počasni drobilniki ali drobilniki na zobata kolesa).

3.2 Analitska tehtnica, natančna na 1 mg

3.3 Suhe posode iz nerjaveče kovine ali stekla s pokrovi, ki omogočajo zapiranje, neprepustno za zrak; delovna površina, ki omogoča razprostrtje vzorca na približno 0,3 g/cm2.

3.4 Električno ogrevan izotermičen sušilnik (± 2 oC) s primerno ventilacijo in ki zagotavlja hitro uravnavanje temperature ( 27 ).

3.5 Nastavljiv električni vakuumski sušilnik, opremljen z oljno črpalko in mehanizmom za dovajanje suhega vročega zraka ali s sušilnim sredstvom (npr. kalcijevim oksidom).

3.6 Eksikator z debelo kovinsko ali porcelansko perforirano ploščo, ki vsebuje učinkovito sušilno sredstvo.

4. Postopek

Opomba : Postopki, opisani v tem oddelku, se morajo izvajati takoj po odprtju posod z vzorci. Analiza se mora izvesti najmanj v dveh vzporednih določitvah.

4.1 Priprava

4.1.1 Krma, razen tiste iz točk 4.1.2 in 4.1.3

Vzame se najmanj 50 g vzorca. Po potrebi se zdrobi ali razdeli tako, da se prepreči sprememba vsebnosti vlage (glej točko 6).

4.1.2 Žita in drobljenci

Vzame se najmanj 50 g vzorca. Zdrobi se tako, da najmanj 50 % delcev preide skozi sito z odprtinami velikosti 0,5 mm in jih na situ z okroglimi odprtinami velikosti 1 mm ostane največ 10 %.

4.1.3 Tekoča ali kašasta krma in krma, sestavljena predvsem iz olj in maščob

Približno 25 g vzorca se natehta na 10 mg natančno, doda se primerna količina brezvodnega peska, stehtanega na 10 mg natančno, in se meša do nastanka homogene mase.

4.2 Sušenje

4.2.1 Krma, razen tiste iz točk 4.2.2 in 4.2.3

Posoda (3.3) s pokrovom se stehta na 1 mg natančno. V stehtano posodo se natehta 5 g vzorca na 1 mg natančno, ki se enakomerno porazdeli. Posoda brez pokrova se postavi v sušilnik, segret na 103 oC. Posoda se postavi v sušilnik v najkrajšem možnem času, da se prepreči prevelik padec temperature. Sušenje traja štiri ure od trenutka, ko je temperatura v sušilniku ponovno 103 oC. Posoda se pokrije s pokrovom, vzame iz sušilnika, pusti v eksikatorju (3.6) 30 do 45 minut, da se ohladi, in stehta na 1 mg natančno.

Krma, sestavljena zlasti iz olj in maščob, se suši v sušilniku nadaljnjih 30 minut pri 130 oC. Razlika med obema tehtanjema ne sme presegati 0,1 % vlage.

4.2.2 Žita, moka, drobljenci in zdrob

Posoda (3.3) s pokrovom se stehta na 0,5 mg natančno. V stehtano posodo se natehta približno 5 g zdrobljenega vzorca na 1 mg natančno, ki se enakomerno porazdeli. Posoda brez pokrova se postavi v sušilnik, segret na 130 oC. Posoda se postavi v sušilnik v najkrajšem možnem času, da se prepreči prevelik padec temperature. Sušenje traja 2 uri od trenutka, ko je temperatura v sušilniku ponovno 130 oC. Posoda se pokrije s pokrovom, vzame iz sušilnika, pusti v eksikatorju (3.6) 30 do 45 minut, da se ohladi, in stehta na 1 mg natančno.

4.2.3 Krmne mešanice, ki vsebujejo več kot 4 % saharoze ali laktoze: posamična krmila, kot so rožiči, hidrolizirani žitni proizvodi, fermentirana semena, posušena mleta pesa, ribe in raztopine sladkorja; krmne mešanice, ki vsebujejo več kot 25 % mineralnih soli, vključno s kristalno vodo. Posoda (3.3) s pokrovom se stehta na 0,5 mg natančno. V stehtano posodo se natehta približno 5 g vzorca na 1 mg natančno, ki se enakomerno porazdeli. Posoda brez pokrova se postavi v vakuumski sušilnik (3.5), segret na 80–85 oC. Posoda se postavi v sušilnik v najkrajšem možnem času, da se prepreči prevelik padec temperature. Počaka se, da tlak naraste do 100 torov in pri tem tlaku sušenje traja štiri ure na vročem suhem zraku ali s sušilnim sredstvom (približno 300 g za 20 vzorcev). V zadnjem primeru se vakuumska črpalka izklopi, ko je želeni tlak dosežen. Čas sušenja se računa od trenutka, ko je temperatura v sušilniku ponovno 80–85 oC. Tlak v sušilniku se previdno izenači z atmosferskim. Sušilnik se odpre, posoda se takoj pokrije s pokrovom in vzame iz peči, pusti se 30 do 45 minut v eksikatorju (3.6), da se ohladi, in stehta na 1 mg natančno. Suši se nadaljnjih 30 minut v vakuumskem sušilniku pri 80–85 oC in ponovno stehta. Razlika med obema tehtanjema ne sme presegati 0,1 % vlage.

4.3 Predhodno sušenje

4.3.1 Krma, razen tiste iz točke 4.3.2

Trdna krma z visoko vsebnostjo vlage, ki jo je težko drobiti, mora biti predhodno sušena na naslednji način:

v primerno posodo (npr. aluminijast krožnik velikosti 20 × 12 cm in z robom 0,5 cm) se natehta 50 g nezdrobljenega vzorca na 10 mg natančno (stisnjeno ali zgoščeno krmo se lahko po potrebi na grobo razdeli). V sušilniku se suši pri 60–70 oC, dokler se vsebnost vlage ne zniža na 8–12 %. Posoda se vzame iz sušilnika in eno uro ohlaja v laboratoriju brez pokrova, nato pa stehta na 10 mg natančno. Krma se takoj zdrobi, kakor je navedeno v točki 4.1.1, in osuši, kakor je navedeno v točki 4.2.1 ali 4.2.3 glede na vrsto krme.

4.3.2 Žita

Zrna z vsebnostjo vlage nad 17 % morajo biti predhodno sušena na naslednji način:

v primerno posodo (npr. aluminijast krožnik velikosti 20 × 12 cm in z robom 0,5 cm) se natehta 50 g nezdrobljenega zrna na 10 mg natančno. Suši se 5 do 7 minut v sušilniku pri 130 oC. Posoda se vzame iz sušilnika in 2 uri ohlaja v laboratoriju brez pokrova ter nato stehta na 10 mg natančno. Krma se takoj zmelje, kakor je navedeno v točki 4.1.2, in osuši, kakor je navedeno v točki 4.2.2.

5. Izračun rezultatov

Vsebnost vlage (X), izražena kot masni delež vzorca, se izračuna po naslednji formuli:

5.1 Sušenje brez predhodnega sušenja

pri čemer je:

m = začetna masa vzorčenega deleža v gramih;

m0 = masa suhega vzorčenega deleža v gramih.

5.2 Sušenje s predhodnim sušenjem

pri čemer je:

m = začetna masa vzorčenega deleža v gramih;

m1 = masa vzorčenega deleža po predhodnem sušenju v gramih;

m2 = masa vzorčenega deleža po drobljenju ali mletju v gramih;

m0 = masa suhega vzorčenega deleža v gramih.

5.3 Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne presega 0,2 % absolutne vrednosti vlage.

6. Opomba

Če se izkaže, da je potrebno drobljenje, in če se izkaže, da se pri tem spremeni vsebnost vlage v proizvodu, se morajo rezultati analize sestavin krme popraviti glede na vsebnost vlage v vzorcu v prvotnem stanju.

B. DOLOČANJE VLAGE V MAŠČOBAH IN OLJIH ŽIVALSKEGA IN RASTLINSKEGA IZVORA

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda se uporablja za določanje vsebnosti vode in hlapnih snovi v maščobah in oljih živalskega in rastlinskega izvora.

2. Načelo

Vzorec se posuši do konstantne mase (izguba mase med dvema zaporednima tehtanjema ne sme presegati 1 mg) pri 103 oC. Izguba mase se določi s tehtanjem.

3. Oprema

3.1 Posoda z ravnim dnom iz nerjavečega materiala s premerom 8 do 9 cm in višino približno 3 cm

3.2 Termometer z utrjeno bučko in podaljškom na zgornjem delu, s skalo od približno 80 oC do vsaj 110 oC in dolžino približno 10 cm

3.3 Peščena kopel ali električna plošča

3.4 Eksikator, ki vključuje učinkovito sušilo

3.5 Analitska tehtnica

4. Postopek

Približno 20 g homogeniziranega vzorca se natehta na 1 mg natančno in prenese v suho, stehtano posodo (3.1), v kateri je termometer (3.2). Ob nenehnem mešanju s termometrom se segreva na peščeni kopeli ali vroči plošči (3.3) tako, da temperatura doseže 90 oC v približno 7 minutah.

Temperatura se zniža, pri čemer se opazuje pogostost dviganja mehurčkov z dna posode. Temperatura ne sme preseči 105 oC. Nadaljuje se z mešanjem in pri tem se drgne dno posode, dokler mehurčki ne prenehajo izhajati.

Da se zagotovi popolna odstranitev vlage, se večkrat segreje na 103 ± 2 oC ob ohlajevanju na 93 oC med zaporednimi segrevanji. Nato se pusti, da se vzorec v eksikatorju (3.4) ohladi na sobno temperaturo, in se stehta. Postopek se ponavlja, dokler izguba mase med dvema zaporednima tehtanjema ni manjša od 2 mg.

Opomba : Povečanje mase vzorca po ponovljenem segrevanju kaže na oksidacijo maščobe, v tem primeru je treba upoštevati rezultat tehtanja, izvedenega neposredno pred začetkom povečevanja mase.

5. Izračun rezultatov

Masni delež vlage (X) v vzorcu se izračuna po naslednji formuli:

pri čemer je:

m = masa vzorčenega deleža v gramih;

m1 = masa posode z vsebino pred segrevanjem v gramih;

m2 = masa posode z vsebino po segrevanju v gramih.

Rezultati, nižji od 0,05 %, se navedejo kot „manj kot 0,05 %“.

Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati 0,05 % absolutne vrednosti.

C. DOLOČANJE VSEBNOSTI SUROVIH BELJAKOVIN

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda se uporablja za določanje vsebnosti surovih beljakovin v krmi na podlagi vsebnosti dušika, določenega po Kjeldahlovi metodi.

2. Načelo

Vzorec se razkroji z žveplovo kislino v prisotnosti katalizatorja. Raztopina natrijevega hidroksida se doda kisli raztopini, da postane bazična. Amonijak se destilira in zbere v odmerjeno količino žveplove kisline, katere presežek se titrira s standardno raztopino natrijevega hidroksida.

Sproščeni amonijak se lahko destilira v presežek raztopine borove kisline ter nato titrira z raztopino klorovodikove ali žveplove kisline.

3. Reagenti

3.1 Kalijev sulfat

3.2 Katalizator: bakrov (II) oksid CuO ali bakrov (II) sulfat pentahidrat, CuSO4 5H2O

3.3 Cink v zrncih

3.4 Žveplova kislina, ρ20 = 1,84 g/ml

3.5 Žveplova kislina, standardna volumetrična raztopina, c(H2SO4) = 0,25 mol/l

3.6 Žveplova kislina, standardna volumetrična raztopina, c(H2SO4) = 0,10 mol/l

3.7 Žveplova kislina, standardna volumetrična raztopina, c(H2SO4) = 0,05 mol/l

3.8 Indikator metil rdeče; 300 mg metil rdečega se raztopi v 100 ml etanola, σ = 95–96 % (v/v)

3.9 Raztopina natrijevega hidroksida (lahko tehnična) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %)

3.10 Žveplova kislina, standardna volumetrična raztopina, c(NaOH) = 0,25 mol/l

3.11 Žveplova kislina, standardna volumetrična raztopina, c(NaOH) = 0,10 mol/l

3.12 Zdrobljen plovec, opran v klorovodikovi kislini in prežaren

3.13 Acetanilid (tališče = 114 oC, N-vsebnost = 10,36 %)

3.14 Saharoza (brez dušika)

3.15 Borova kislina (H3BO3)

3.16 Raztopina indikatorja metil rdeče: 100 mg metil rdečega se raztopi v 100 ml etanola ali metanola.

3.17 Raztopina bromokrezol zelenega: 100 mg bromokrezol zelenega se raztopi v 100 ml etanola ali metanola.

3.18 Raztopina borove kisline (10–40 g/l glede na uporabljeno opremo) Pri določanju s kolorimetrično ekvivalentno točko se morata raztopinam borove kisline dodati indikatorja metil rdeče in bromokrezol. Pri pripravi 1 litra raztopine borove kisline se pred uravnavanjem volumna doda 7 ml raztopine indikatorja metil rdeče (3.16) in 10 ml raztopine bromokrezol zelenega (3.17). Glede na uporabljeno vodo se lahko pH raztopine borove kisline med serijami razlikuje. Pogosto je za doseganje pozitivnega slepega vzorca treba dodati majhen volumen baze. Opomba : 3 do 4 ml NaOH (3.11) v 1 liter 10 g/l borove kisline ponavadi zadošča. Raztopina se shrani pri sobni temperaturi ter zaščiti pred svetlobo in viri amonijevih hlapov.

3.19 Klorovodikova kislina, standardna volumetrična raztopina, c(HCl) = 0,10 mol/l Opomba : Druge koncentracije volumetričnih raztopin (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 in 3.19) se lahko uporabljajo, če se upoštevajo v izračunih. Koncentracije se vedno izrazijo na štiri decimalke natančno.

4. Oprema

Naprava, primerna za izvajanje razklopa, destilacije in titracije po Kjeldahlovi metodi.

5. Postopek

5.1 Razklop

1 g vzorca se natehta na 0,001 g natančno in se prenese v bučko naprave za razklop. Doda se 15 g kalijevega sulfata (3.1), ustrezna količina katalizatorja (3.2) (0,3–0,4 g bakrovega (II) oksida ali 0,9–1,2 g bakrovega (II) sulfat pentahidrata), 25 ml žveplove (VI) kisline (3.4) in po potrebi nekaj zrnc plovca (3.12) ter vse skupaj premeša.

Bučka se najprej zmerno segreva in po potrebi občasno obrne, dokler masa ne zogleni in pena ne izgine; nato se močneje segreva do enakomernega vretja tekočine. Segrevanje je ustrezno, če se vrela kislina kondenzira na stenah bučke. Paziti je treba, da se stene bučke ne pregrejejo in da se organski delci ne sprimejo nanje.

Ko se raztopina zbistri in obarva rahlo zeleno, se pusti vreti še 2 uri, nato pa pusti, da se ohladi.

5.2 Destilacija

Previdno se doda toliko vode, da se sulfati povsem raztopijo. Pusti se, da se ohladi, nato pa se po potrebi doda nekaj zrnc cinka (3.3). Nadaljuje se v skladu s točko 5.2.1 ali 5.2.2.

5.2.1 Destilacija v žveplovo kislino

V zbirno bučko naprave za destilacijo se doda natančno 25 ml žveplove kisline (3.5) ali (3.7) glede na pričakovano vsebnost dušika. Doda se nekaj kapljic indikatorja metil rdeče (3.8).

Bučka za razklop se poveže s kondenzatorjem naprave za destilacijo in konica kondenzatorja se potopi v tekočino v zbirni bučki vsaj do globine 1 cm (glej opombo 8.3). V bučko za razklop se počasi vlije 100 ml raztopine natrijevega hidroksida (3.9) tako, da ne pride do izgube amonijaka (glej opombo 8.1). Bučka se segreva do popolne destilacije amonijaka.

5.2.2. Destilacija v borovo kislino

Pri ročni titraciji amonijaka iz destilata se uporablja spodaj navedeni postopek. Kadar je destilacijska enota v celoti avtomatizirana in vključuje titracijo amonijaka iz destilata, se upoštevajo navodila proizvajalca za upravljanje z destilacijsko enoto.

Zbirna bučka s 25–30 ml raztopine borove kisline (3.18) se postavi pod izhodno odprtino kondenzatorja tako, da je dovodna cev pod površino presežka raztopine borove kisline. Destilacijska enota se nastavi tako, da se dovaja 50 ml raztopine natrijevega hidroksida (3.9). Destilacijska enota se upravlja v skladu z navodili proizvajalca, sproščeni amonijak pa se destilira z raztopino natrijevega hidroksida. Destilat se zbere v raztopino borove kisline. Na količino destilata (čas parne destilacije) vpliva količina dušika v vzorcu. Upoštevati je treba navodila proizvajalca.

Opomba : V polavtomatski destilacijski enoti sta dodajanje presežka natrijevega hidroksida in parna destilacija avtomatizirana postopka.

5.3 Titracija

Nadaljuje se v skladu s točko 5.3.1 ali 5.3.2.

5.3.1 Žveplova kislina

Presežek žveplove kisline v zbirni bučki se titrira do ekvivalentne točke z raztopino natrijevega hidroksida (3.10 ali 3.11) glede na koncentracijo uporabljene žveplove kisline.

5.3.2 Borova kislina

Vsebina zbirne bučke se titrira s standardno volumetrično raztopino klorovodikove kisline (3.19) ali standardno volumetrično raztopino žveplove kisline (3.6), pri čemer se uporabi bireta in odčita količina uporabljene titracijske snovi.

Pri določanju s kolorimetrično ekvivalentno točko je ekvivalentna točka dosežena pri prvem znaku rožnatega obarvanja vsebine. Volumen birete se odčita na 0,05 ml natančno. Magnetna mešalna plošča z osvetlitvijo ali fotometrični detektor lahko pripomoreta k določanju ekvivalentne točke.

Parni destilator z avtomatično titracijo lahko to opravi avtomatično.

Upoštevati je treba navodila proizvajalca za upravljanje specifičnega destilatorja ali destilatorja/titratorja.

Opomba : Pri avtomatičnem sistemu titriranja se titracija začne takoj po začetku destilacije, uporabi pa se 1-odstotna raztopina borove kisline (3.18). Pri popolnoma avtomatizirani destilacijski enoti se lahko izvaja avtomatična titracija amonijaka, ekvivalentna točka pa se lahko določa s potenciometričnim pH sistemom. V tem primeru se uporablja avtomatični titrator s pH metrom. Ta pH meter se ustrezno umeri med pH 4 in pH 7 z običajnimi laboratorijskimi postopki za umerjanje pH. Ekvivalentna točka pH pri titraciji je dosežena pri pH 4,6, ko je naklon titracijske krivulje največji (točka pregiba).

5.4 Slepi preskus

Slepi preskus (razklop, destilacija in titracija), v katerem se namesto vzorca uporabi 1 g saharoze (3.14), se izvede za potrditev, da reagenti ne vsebujejo dušika.

6. Izračun rezultatov

Izračuni se izvedejo v skladu s točko 6.1 ali 6.2.

6.1 Izračun za titracijo v skladu s točko 5.3.1

Vsebnost surovih beljakovin, izražena kot masni delež, se izračuna po naslednji formuli:

pri čemer je:

Vo = volumen (ml) NaOH (3.10 ali 3.11), uporabljen pri slepem preskusu;

V1 = volumen (ml) NaOH (3.10 ali 3.11), uporabljen pri titraciji vzorca;

c = koncentracija (mol/l) natrijevega hidroksida (3.10 ali 3.11);

m = masa (g) vzorca.

6.2 Izračun za titracijo v skladu s točko 5.3.2

6.2.1 Titracija s klorovodikovo kislino

Vsebnost surovih beljakovin, izražena kot masni delež, se izračuna po naslednji formuli:

pri čemer je:

m = masa (g) vzorčenega deleža;

c = koncentracija (mol/l) standardne volumetrične raztopine klorovodikove kisline (3.19);

V0 = volumen (ml) klorovodikove kisline, uporabljen pri slepem preskusu;

V1 = volumen (ml) klorovodikove kisline, uporabljen v vzorčenem deležu.

6.2.2 Titracija s žveplovo kislino

Vsebnost surovih beljakovin, izražena kot masni delež, se izračuna po naslednji formuli:

pri čemer je:

m = masa (g) vzorčenega deleža;

c = koncentracija (mol/l) standardne volumetrične raztopine žveplove kisline (3.6);

V0 = volumen (ml) žveplove kisline (3.6), uporabljen v slepem preskusu;

V1 = volumen (ml) žveplove kisline (3.6), uporabljen v vzorčenem deležu.

7. Preverjanje metode

7.1 Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati:

— 0,2 % absolutne vrednosti za vsebnosti surovih beljakovin pod 20 %,

— 1,0 % višje vrednosti za vsebnosti surovih beljakovin 20–40 %,

— 0,4 % absolutne vrednosti za vsebnosti surovih beljakovin nad 40 %.

7.2 Točnost

Za analizo (razklop, destilacija, titracija) se uporabi 1,5 do 2,0 g acetanilida (3.13) ob navzočnosti 1 g saharoze (3.14); za 1 g acetanilida se porabi 14,80 ml žveplove kisline (3.5). Izkoristek mora biti najmanj 99-odstoten.

8. Opombe

8.1 Naprava je lahko ročna, polavtomatska ali avtomatska. Če je pri napravi med razklopom in destilacijo potreben prenos, se ta prenos mora izvesti brez kakršne koli izgube. Če bučka naprave za destilacijo ni opremljena s kapalnim lijakom, se natrijev hidroksid doda tik pred povezavo bučke s kondenzatorjem, pri čemer se tekočina vliva počasi ob steni bučke.

8.2 Če se vsebina bučke strjuje, se določanje začne znova, vendar z večjo količino žveplove kisline (3.4), kakor je navedeno zgoraj.

8.3 Pri proizvodih z nizko vsebnostjo dušika se lahko volumen žveplove kisline (3.7), ki se doda v zbirno bučko, po potrebi zmanjša na 10 ali 15 ml, bučka pa se dopolni do 25 ml z vodo.

8.4 Pri redni analizi se lahko za določanje surovih beljakovin uporabi nadomestna analitska metoda, vendar je Kjeldahlova metoda, opisana v tem delu C, referenčna metoda. Za vsako matrico posebej je treba dokazati, da so rezultati, pridobljeni z nadomestno metodo (npr. DUMAS), enakovredni rezultatom, pridobljenim z referenčno metodo. V poročilu o analizi je treba navesti analitsko metodo, uporabljeno za določanje surovih beljakovin, saj lahko rezultati, pridobljeni z nadomestno metodo, kljub potrditvi enakovrednosti, odstopajo od rezultatov, pridobljenih z referenčno metodo.

D. DOLOČANJE SEČNINE

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje ravni sečnine v krmi.

2. Načelo

Vzorec se suspendira v vodi s snovjo za zbistritev. Suspenzija se filtrira. Doda se 4-dimetilaminobenzaldehid (4-DMAB), nato pa se določi vsebnost sečnine v filtratu z merjenjem optične gostote pri valovni dolžini 420 nm.

3. Reagenti

3.1 Raztopina 4-dimetilaminobenzaldehida: 1,6 g 4-DMAB se raztopi v 100 ml 96-odstotnega etanola in doda 10 ml klorovodikove kisline (ρ201,19 g/ml). Reagent se lahko hrani največ dva tedna.

3.2 Raztopina Carrez I: 21,9 g cinkovega acetata Zn(CH3COO)2 2H2O in 3 g ledoceta se raztopi v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.3 Raztopina Carrez II: 10,6 g kalijevega ferocianida K4 Fe (CN)6 3H2O se raztopi v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.4 Aktivno oglje, ki ne absorbira sečnine (treba je preveriti).

3.5 Sečnina, 0,1-odstotna raztopina (m/v)

4. Oprema

4.1 Mešalnik: približno 35 do 40 obr./min.

4.2 Epruvete: 160 × 16 mm z brušenimi zamaški

4.3 Spektrofotometer

5. Postopek

5.1 Analiza vzorca

2 g vzorca se natehta na 1 mg natančno in skupaj z 1 g aktivnega oglja (3.4) prenese v 500-mililitrsko merilno bučko. Doda se 400 ml vode in 5 ml raztopine Carrez I (3.2), meša se približno 30 sekund in doda 5 ml raztopine Carrez II (3.3). Meša se 30 minut v mešalniku. Dopolni se z vodo do oznake, pretrese in filtrira.

5 ml prozornega brezbarvnega filtrata se odstrani in prenese v epruvete z brušenimi zamaški, doda se 5 ml raztopine 4-DMAB (3.1) ter premeša. Epruvete se postavijo v kopel z vodo pri 20 oC (+/- 4 oC). Po 15 minutah se izmeri optična gostota raztopine vzorca s spektrofotometrom pri 420 nm. Rezultat se primerja z raztopino reagentov iz slepega preskusa.

5.2 Umeritvena krivulja

V 100-mililitrske merilne bučke se prenese 1, 2, 4, 5 in 10 ml raztopine sečnine (3.5), ki se dopolnijo z vodo do oznake. Od vsake raztopine se odpipetira 5 ml, vsaki se doda 5 ml raztopine 4-DMAB (3.1), homogenizira se in izmeri optična gostota, kakor je opisano zgoraj s primerjavo s kontrolno raztopino, ki vsebuje 5 ml 4-DMAB in 5 ml vode brez sečnine. Pripravi se umeritvena krivulja.

6. Izračun rezultatov

Količina sečnine v vzorcu se določi iz umeritvene krivulje.

Rezultat se izrazi kot masni delež vzorca.

7. Opombe

7.1 Če vsebnost sečnine presega 3 %, se vzorec zmanjša na 1 g ali se prvotna raztopina razredči, tako da v 500 ml ni več kot 50 mg sečnine.

7.2 Če je vsebnost sečnine nizka, se vzorec poveča, dokler je filtrat še prozoren in brezbarven.

7.3 Če vzorec vsebuje preproste dušikove spojine, kot so aminokisline, se optična gostota meri pri 435 nm.

E. DOLOČANJE HLAPNIH DUŠIKOVIH BAZ

I. Z MIKRODIFUZIJO

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda se uporablja za določanje vsebnosti hlapnih dušikovih baz v krmi, izraženih kot amonijak.

2. Načelo

Vzorec se ekstrahira z vodo, raztopina pa zbistri in filtrira. Hlapne dušikove baze se ločijo z mikrodifuzijo z uporabo raztopine kalijevega karbonata, zberejo v raztopino borove kisline in titrirajo z žveplovo kislino.

3. Reagenti

3.1 Trikloroocetna kislina, 20-odstotna raztopina (m/v)

3.2 Indikator: 33 mg bromokrezol zelenega in 65 mg metil rdečega se raztopi v 100 ml 95–96-odstotnega (v/v) etanola.

3.3 Raztopina borove kisline: v litrski merilni bučki se v 200 ml 95–96-odstotnega (v/v) etanola in 700 ml vode raztopi 10 g borove kisline. Doda se 10 ml indikatorja (3.2). Premeša se, po potrebi pa se barva raztopine spremeni v svetlo rdečo z dodajanjem raztopine natrijevega hidroksida. 1 ml te raztopine ustreza največ 300 μg NH3.

3.4 Nasičena raztopina kalijevega karbonata: v 100 ml vrele vode se raztopi 100 g kalijevega karbonata. Pusti se, da se ohladi, ter nato filtrira.

3.5 Žveplova kislina, 0,01 mol/l

4. Oprema

4.1 Mešalec: približno 35 do 40 obr./min.

4.2 Steklene ali plastične Conwayeve celice (glej diagram)

4.3 Mikrobirete z označenim merilom 1/100 ml

5. Postopek

10 g vzorca se natehta na 1 mg natančno in se s 100 ml vode prenese v 200-mililitrsko merilno bučko. V mešalcu se meša ali stresa 30 minut. Doda se 50 ml raztopine trikloroocetne kisline (3.1), dopolni z vodo do oznake, močno pretrese in filtrira skozi nagubani filter.

S pipeto se doda 1 ml raztopine borove kisline (3.3) v srednji del Conwayeve celice in 1 ml filtrata vzorca v zgornji del celice. Delno se pokrije z namaščenim pokrovom. V zgornji del celice se hitro nakapa 1 ml nasičene raztopine kalijevega karbonata (3.4), nato se neprepustno zapre. Celica se pazljivo obrača v vodoravni ravnini, da se reagenta premešata. Pusti se najmanj štiri ure pri sobni temperaturi ali eno uro pri temperaturi 40 oC.

Z mikrobireto (4.3) se hlapne baze v raztopini borove kisline titrirajo z žveplovo kislino (3.5).

Slepi preskus se izvede po istem postopku, vendar brez vzorca, ki se analizira.

6. Izračun rezultatov

1 ml H2SO40,01 mol/l ustreza 0,34 mg amonijaka.

Rezultat se izrazi kot masni delež vzorca.

Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne presega:

— 10 % relativne vrednosti, če je vsebnost amonijaka nižja od 1,0 %,

— 0,1 % absolutne vrednosti, če je vsebnost amonijaka 1,0 % ali več.

7. Opomba

Če vsebnost amonijaka v vzorcu presega 0,6 %, se začetni filtrat razredči.

II. Z DESTILACIJO

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda se uporablja za določanje vsebnosti hlapnih dušikovih baz, izraženih kot amonijak, v ribji moki, ki praktično ne vsebuje sečnine. Uporablja se le za vsebnost amonijaka, ki je nižja od 0,25 %.

2. Načelo

Vzorec se ekstrahira z vodo, raztopina pa zbistri in filtrira. Hlapne dušikove baze se izločijo pri temperaturi vrelišča z dodatkom magnezijevega oksida in zberejo v določeno količino žveplove kisline, katere presežek se titrira z raztopino natrijevega hidroksida.

3. Reagenti

3.1 Trikloroocetna kislina, 20-odstotna raztopina (m/v)

3.2 Magnezijev oksid

3.3 Emulzija proti penjenju (npr. silikon)

3.4 Žveplova kislina, 0,05 mol/l

3.5 Raztopina natrijevega hidroksida, 0,1 mol/l

3.6 0,3-odstotna raztopina metil rdečega v 95–96-odstotnem (v/v) etanola

4. Oprema

4.1 Mešalec: približno 35 do 40 obr./min.

4.2 Naprava za destilacijo po Kjeldahlu

5. Postopek

10 g vzorca se natehta na 1 mg natančno in s 100 ml vode prenese v 200-mililitrsko merilno bučko. V mešalcu se meša ali stresa 30 minut. Doda se 50 ml raztopine trikloroocetne kisline (3.1), dopolni z vodo do oznake, močno pretrese in filtrira skozi nagubani filter.

Odpipetira se volumen bistrega filtrata, ki ustreza pričakovani vsebnosti hlapnih dušikovih baz (ponavadi zadošča 100 ml). Razredči se na 200 ml, doda se 2 g magnezijevega oksida (3.2) in nekaj kapljic emulzije proti penjenju (3.3). Raztopina mora biti alkalna pri preskusu z lakmusovim papirjem, če ni, se doda magnezijev oksid (3.2). Nadaljevati je treba v skladu s točkama 5.2 in 5.3 dela C te priloge, tj. Analitske metode za določanje vsebnosti surovih beljakovin.

Slepi preskus se izvede po istem postopku, vendar brez vzorca, ki se analizira.

6. Izračun rezultatov

1 ml H2SO40,05 mol/l ustreza 1,7 mg amonijaka.

Rezultat se izrazi kot masni delež vzorca.

Ponovljivost

Relativna razlika med rezultatoma dveh vzporednih določitev, izvedenih na istem vzorcu, ne presega 10 % amonijaka.

F. DOLOČANJE AMINOKISLIN (RAZEN TRIPTOFANA)

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda se uporablja za določanje prostih (sintetičnih in naravnih) in celotnih (vezanih s peptidi in prostih) aminokislin v krmi z uporabo analizatorja aminokislin. Uporablja se za naslednje aminokisline: cist(e)in, metionin, lizin, treonin, alanin, arginin, aspartat, glutaminsko kislino, glicin, histidin, izolevcin, levcin, fenilalanin, prolin, serin, tirozin in valin.

S metodo ni možno ločiti soli aminokislin ter D in L oblik aminokislin. Ne uporablja se za določanje triptofana ali hidroksi-analogov aminokislin.

2. Načelo

2.1 Proste aminokisline

Proste aminokisline se ekstrahirajo z razredčeno klorovodikovo kislino. Soekstrahirane dušikove makromolekule se oborijo s sulfosalicilno kislino in odstranijo s filtriranjem. pH filtrirane raztopine se uravna na 2,20. Aminokisline se ločijo z ionsko izmenjevalno kromatografijo in določijo z reakcijo z ninhidrinom s fotometrično detekcijo pri 570 nm.

2.2 Celotne aminokisline

Postopek se izbere glede na preiskovane aminokisline. Cist(e)in in metionin se morata pred hidrolizo oksidirati v cisteinsko kislino in metionin-sulfon. Tirozin se mora določiti v hidrolizatih neoksidiranih vzorcev. Vse druge aminokisline, navedene v točki 1, se lahko določajo v oksidiranem ali neoksidiranem vzorcu.

Oksidacija se izvede pri 0 oC z mešanico peroksimravljične kisline in fenola. Presežek oksidacijskega reagenta se razgradi z natrijevim disulfitom. Oksidiran ali neoksidiran vzorec se 23 ur hidrolizira s klorovodikovo kislino (3.20). pH hidrolizata se uravna na 2,20. Aminokisline se ločijo z ionsko izmenjevalno kromatografijo in določijo z reakcijo z ninhidrinom s fotometrično detekcijo pri 570 nm (440 nm za prolin).

3. Reagenti

Uporabiti je treba dvojno destilirano vodo ali vodo enakovredne kakovosti (prevodnost < 10 μS)

3.1 Vodikov peroksid, m (m/m) = 30 %

3.2 Mravljična kislina, m (m/m) = 98–100 %

3.3 Fenol

3.4 Natrijev disulfit

3.5 Natrijev hidroksid

3.6 5-sulfosalicilat dihidrat

3.7 Klorovodikova kislina, približno 1,18 g/ml

3.8 Tri-natrijev citrat dihidrat

3.9 2,2'-tiodietanol (tiodiglikol)

3.10 Natrijev klorid

3.11 Ninhidrin

3.12 Petroleter, vrelišče 40–60 oC

3.13 Norlevcin ali druga spojina, primerna za uporabo kot notranji standard

3.14 Plinasti dušik (< 10 ppm kisika)

3.15 1-oktanol

3.16 Aminokisline

3.16.1 Standardne snovi iz točke 1. Čiste spojine, ki ne vsebujejo kristalne vode. Pred uporabo se suši 1 teden pod vakuumom s P2O5 ali H2SO4.

3.16.2 Cisteinska kislina

3.16.3 Metionin-sulfon

3.17 Raztopina natrijevega hidroksida, c = 7,5 mol/l: 300 g NaOH (3.5) se raztopi v vodi in dopolni z vodo do 1 litra.

3.18 Raztopina natrijevega hidroksida, c = 1 mol/l: 40 g NaOH (3.5) se raztopi v vodi in dopolni z vodo do 1 litra.

3.19 Mravljična kislina – raztopina fenola: 889 g mravljične kisline (3.2) se zmeša s 111 g vode ter se doda 4,73 g fenola (3.3).

3.20 Hidrolizna mešanica, c = 6 mol HCl/l, ki vsebuje 1 g fenola/l: 1 g fenola (3.3) se doda k 492 ml HCl (3.7) in dopolni z vodo do 1 litra.

3.21 Mešanica ekstrakcije, c = 0,1 mol HCl/l, ki vsebuje 2 % tiodiglikola: 8,2 ml HCl (3.7) se razredči s približno 900 ml vode, doda se 20 ml tiodiglikola (3.9) in dopolni z vodo do 1 litra (3.7 in 3.9 se ne smeta zmešati neposredno).

3.22 5-sulfosalicilna kislina, ß = 6 %: 60 g 5-sulfosalicilne kisline (3.6) se raztopi v vodi in dopolni z vodo do 1 litra.

3.23 Oksidacijska mešanica (peroksimravljična kislina – fenol): 0,5 ml vodikovega peroksida (3.1) se zmeša s 4,5 ml raztopine mravljične kisline in fenola (3.19) v majhni čaši. Inkubira se 1 uro pri 20–30 oC, da nastane peroksimravljična kislina, nato se ohladi v ledeni kopeli (15 min), preden se doda vzorcu. Opozorilo: Izogibati se je treba stiku s kožo in nositi je treba zaščitna oblačila.

3.24 Citratni pufer, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: v približno 800 ml vode se raztopi 19,61 g natrijevega citrata (3.8), 5 ml tiodiglikola (3.9), 1 g fenola (3.3) in 16,50 ml HCl (3.7). pH se uravna na 2,20. Dopolni se z vodo do 1 litra.

3.25 Pufri za eluiranje, pripravljeni v skladu z navodili za uporabljeni analizator (4.9)

3.26 Reagent ninhidrin, pripravljen v skladu z navodili za uporabljeni analizator (4.9)

3.27 Standardne raztopine aminokislin. Te raztopine se hranijo pri temperaturi do 5 oC.

3.27.1 Osnovna standardna raztopina aminokislin (3.16.1). c = 2,5 μmol/ml za vsako v klorovodikovi kislini. Lahko se priskrbi iz proste prodaje.

3.27.2 Osnovna standardna raztopina cisteinske kisline in metionin-sulfona, c = 1,25 μmol/ml. V litrski merilni bučki se raztopi 0,2115 g cisteinske kisline (3.16.2) in 0,2265 g metionin-sulfona (3.16.3) v citratnem pufru (3.24) ter dopolni s citratnim pufrom do oznake. Hrani se največ 12 mesecev pri temperaturi do 5 oC. Ta raztopina se ne uporablja, če osnovna standardna raztopina (3.27.1) vsebuje cisteinsko kislino in metionin-sulfon.

3.27.3 Osnovna standardna raztopina notranjega standarda, npr. norlevcina, c = 20 μmol/ml. V merilni bučki se raztopi 0,6560 g norlevcina (3.13) v citratnem pufru (3.24) in dopolni s citratnim pufrom do 250 ml. Hrani se največ 6 mesecev pri temperaturi do 5 oC.

3.27.4 Raztopina za umerjanje standardnih aminokislin, ki se uporablja s hidrolizati, c = 5 nmol/50 μl za cisteinsko kislino in metionin-sulfon ter c = 10 nmol/50 μl za druge aminokisline. V 100-mililitrski čaši se raztopi 2,2 g natrijevega klorida (3.10) s 30 ml citratnega pufra (3.24). Dodajo se 4,00 ml osnovne standardne raztopine aminokisline (3.27.1), 4,00 ml osnovne standardne raztopine cisteinske kisline in metionin-sulfona (3.27.2) ter 0,50 ml osnovne standardne raztopine notranjega standarda (3.27.3), če se uporablja. pH se uravna na 2,20 z natrijevim hidroksidom (3.18). Vsebina se prenese v 50-mililitrsko merilno bučko, dopolni se s citratnim pufrom (3.24) do oznake in premeša. Hrani se največ 3 mesece pri temperaturi do 5 oC. Glej tudi opombo 9.1.

3.27.5 Raztopina za umerjanje standardnih aminokislin, ki se uporablja s hidrolizati, se pripravi v skladu s točko 5.3.3.1, za ekstrakte pa v skladu s točko 5.2. Raztopina za umerjanje se pripravi v skladu s točko 3.27.4, vendar brez natrijevega klorida. Hrani se največ 3 mesece pri temperaturi do 5 oC.

4. Oprema

4.1 100- ali 250-mililitrska bučka z okroglim dnom in kondenzatorjem povratnega toka

4.2 100-mililitrska borosilikatna steklena posoda z zamaškom z navojem in ovita v gumo/teflon (npr. Duran, Schott) za uporabo v sušilniku

4.3 Sušilnik s prezračevanjem z umetnim dotokom zraka in regulatorjem temperature z natančnostjo, boljšo od ± 2 oC

4.4 pH meter (na tri decimalke)

4.5 Membranski filter (0,22 μm)

4.6 Centrifuga

4.7 Rotacijski vakuumski uparjalnik

4.8 Mehanski stresalnik ali magnetno mešalo

4.9 Aminokislinski analizator ali oprema za HPLC s kolono z ionskim izmenjevalcem, pripravo za ninhidrin, derivatizacijo po koloni in fotometričnim detektorjem Kolona se napolni s smolo sulfoniranega polistirena, ki lahko loči aminokisline med seboj in od drugih materialov, ki vsebujejo ninhidrin. Črpalki s stabilnim tokom ±0,5 % zagotavljata tok v pufrski in ninhidrinski črti pri standardnem umerjanju in analizi vzorca. Za nekatere aminokisline se lahko uporabi hidroliza v analizatorju, pri čemer je koncentracija natrija v hidrolizatu c = 0,8 mol/l in v hidrolizatu je vsa mravljična kislina, ki nastane pri oksidaciji. Druge metode ne zagotavljajo zadovoljive ločitve nekaterih aminokislin, če je v hidrolizatu preveč mravljične kisline in/ali visoka koncentracija natrijevih ionov. V tem primeru se volumen kisline po hidrolizi in pred uravnavanjem pH zmanjša z uparevanjem na približno 5 ml. Uparevanje se izvede pod vakuumom pri največ 40 oC.

5. Postopek

5.1 Priprava vzorca

Vzorec se zdrobi, tako da preide skozi 0,5 mm sito. Vzorci z visoko vlago se morajo pred drobljenjem osušiti na zraku pri temperaturi, ki ne presega 50 oC, ali osušiti z zmrzovanjem. Vzorci z visoko vsebnostjo maščobe se pred drobljenjem ekstrahirajo s petroletrom (3.12).

5.2 Določanje prostih aminokislin v krmi in premiksih

Primerna količina (1–5 g) pripravljenega vzorca (5.1) se natehta na 0,2 mg natančno in prenese v erlenmajerico, temu pa se doda 100,0 ml mešanice ekstrakcije (3.21). Z mehanskim stresalnikom ali magnetnim mešalom (4.8) se mešanica stresa 60 minut. Pusti se, da se usedlina usede na dno, in odpipetira 10,0 ml supernatanta v 100-mililitrsko čašo.

Med mešanjem se doda 5,0 ml raztopine sulfosalicilne kisline (3.22) in 5 minut nadaljuje z mešanjem s pomočjo magnetnega mešala. Supernatant se filtrira ali centrifugira, da se odstrani ves precipitat. 10,0 ml te raztopine se prenese v 100-mililitrsko čašo in pH uravnava na 2,20 z raztopino natrijevega hidroksida (3.18), s citratnim pufrom (3.24) se prenese v merilno bučko ustreznega volumna in dopolni z raztopino pufra (3.24) do oznake.

Če se uporablja notranji standard, se za vsakih 100 ml končne raztopine doda 1,00 ml notranjega standarda (3.27.3) ter dopolni z raztopino pufra (3.24) do oznake.

Nadaljuje se s kromatografijo v skladu s točko 5.4.

Če se ekstrakti ne pregledajo isti dan, se morajo hraniti pri temperaturi do 5 oC.

5.3 Določanje celotnih aminokislin

5.3.1 Oksidacija

0,1–1 g pripravljenega vzorca (5.1) se natehta na 0,2 mg natančno in prenese v:

— 100-mililitrsko bučko z okroglim dnom (4.1) (za odprto hidrolizo 5.3.2.3) ali

— 250-mililitrsko bučko z okroglim dnom (4.1), če je zahtevana nizka koncentracija natrija (5.3.3.1), ali

— 100-mililitrsko steklenico z zamaškom z navojem (4.2) (za zaprto hidrolizo 5.3.2.4).

V natehtanem vzorčenem deležu mora biti vsebnost dušika približno 10 mg, vsebnost vlage pa ne sme preseči 100 mg.

Bučka/steklenica se postavi v ledeno kopel in ohladi na 0 oC, doda se 5 ml oksidacijske mešanice (3.23) in meša s stekleno lopatico z ukrivljeno konico. Bučka/steklenica z lopatico se nepredušno zapre s filmom, ledena kopel, ki vsebuje nepredušno zaprto posodo, pa se postavi v hladilnik s temperaturo 0 oC in pusti 16 ur. Po 16 urah se posoda vzame iz hladilnika, presežni oksidacijski reagent pa se razgradi z dodatkom 0,84 g natrijevega disulfita (3.4).

Nadaljuje se s točko 5.3.2.1.

5.3.2 Hidroliza

5.3.2.1 Hidroliza oksidiranih vzorcev

Oksidiranemu vzorcu, pripravljenemu v skladu s točko 5.3.1, se doda 25 ml hidrolizne mešanice (3.20), pri čemer je treba pazljivo sprati kakršne koli ostanke vzorca s stene posode in lopatice.

Nadaljuje se v skladu s točko 5.3.2.3 ali 5.3.2.4 odvisno od uporabljenega postopka hidrolize.

5.3.2.2 Hidroliza neoksidiranih vzorcev

V 100- ali 250-mililitrsko bučko z okroglim dnom (4.1) ali 100-mililitrsko steklenico z zamaškom z navojem (4.2) se natehta 0,1–1 g pripravljenega vzorca (5.1) na 0,2 mg natančno. V natehtanem vzorčenem deležu mora biti vsebnost dušika približno 10 mg. Pazljivo se doda 25 ml hidrolizne mešanice (3.20) in zmeša z vzorcem. Nadaljuje se v skladu s točko 5.3.2.3 ali 5.3.2.4.

5.3.2.3 Odprta hidroliza

Mešanici v bučki (pripravljeni v skladu s točko 5.3.2.1 ali 5.3.2.2) se dodajo 3 steklene kroglice, nato se pusti vreti z neprestanim mehurčenjem pri povratnem toku 23 ur. Po zaključku hidrolize se kondenzator spere s 5 ml citratnega pufra (3.24). Bučka se odstrani in ohladi v ledeni kopeli.

Nadaljuje se v skladu s točko 5.3.3.

5.3.2.4 Zaprta hidroliza

Steklenica, ki vsebuje mešanico, pripravljeno v skladu s točko 5.3.2.1 ali 5.3.2.2, se postavi v sušilnik (4.3) pri 110 oC. V prvi uri se za preprečitev povečanja tlaka (zaradi nastanka plinastih snovi) in eksplozije zamašek z navojem postavi čez vrh steklenice. Steklenica se ne sme zapreti z zamaškom. Po eni uri se steklenica zapre z zamaškom in pusti v sušilniku (4.3) 23 ur. Po zaključku hidrolize se steklenica odstrani iz sušilnika, zamašek steklenice se pazljivo odpre, steklenica pa položi v ledeno kopel. Pusti se, da se ohladi.

Odvisno od postopka za uravnavanje pH (5.3.3) se vsebina steklenice z uporabo citratnega pufra (3.24) prenese v 250-mililitrsko čašo ali 250-mililitrsko bučko z okroglim dnom.

Nadaljuje se v skladu s točko 5.3.3.

5.3.3 Uravnavanje pH

Glede na odstopanje analizatorja aminokislin (4.9) za natrij se za uravnavanje pH nadaljuje v skladu točko 5.3.3.1 ali 5.3.3.2.

5.3.3.1 Kromatografski sistemi (4.9), pri katerih je zahtevana nizka koncentracija natrija

Ko se uporabljajo analizatorji aminokislin, pri katerih je zahtevana nizka koncentracija natrija (ko je treba zmanjšati volumen kisline), je priporočljivo uporabiti raztopino notranjega osnovnega standarda (3.27.3).

V tem primeru se hidrolizatu pred uparevanjem dodata 2,00 ml raztopine notranjega osnovnega standarda (3.27.3).

Hidrolizatu, pridobljenemu v skladu s točko 5.3.2.3 ali 5.3.2.4, se dodata 2 kaplji 1-oktanola (3.15).

Z rotacijskim uparilnikom (4.7) se pod vakuumom pri 40 oC volumen zmanjša na 5–10 ml. Če se volumen nenamerno zmanjša na manj kot 5 ml, se mora hidrolizat izločiti in analiza začeti znova.

pH se uravna na 2,20 z raztopino natrijevega hidroksida (3.18), nato pa se nadaljuje v skladu s točko 5.3.4.

5.3.3.2 Za vse druge analizatorje aminokislin (4.9)

Hidrolizati, pridobljeni v skladu s točko 5.3.2.3 ali 5.3.2.4, se delno nevtralizirajo, tako da se med mešanjem pazljivo doda 17 ml raztopine natrijevega hidroksida (3.17), pri čemer se mora ohranjati temperatura pod 40 oC.

Pri sobni temperaturi se pH uravna na 2,20 z raztopino natrijevega hidroksida (3.17) in nato raztopino natrijevega hidroksida (3.18). Nadaljuje se v skladu s točko 5.3.4.

5.3.4 Raztopina vzorca za kromatografijo

Hidrolizat (5.3.3.1 ali 5.3.3.2), uravnan na pH, se s citratnim pufrom (3.24) prenese v 200-mililitrsko merilno bučko in dopolni s pufrom (3.24) do oznake.

Če notranji standard še ni bil uporabljen, se dodata 2,00 ml notranjega standarda (3.27.3), nato pa se dopolni s citratnim pufrom (3.24) do oznake. Temeljito se premeša.

Nadaljuje se s kromatografijo (5.4).

Če se raztopine vzorca ne pregledajo še isti dan, se morajo shraniti pri temperaturi pod 5 oC.

5.4 Kromatografija

Pred kromatografijo mora biti temperatura ekstrakta (5.2) ali hidrolizata (5.3.4) enaka sobni temperaturi. Mešanica se stresa, primerna količina pa se filtrira skozi membranski filter 0,22 μm (4.5). S to bistro raztopino se opravi ionska izmenjevalna kromatografija z analizatorjem aminokislin (4.9).

Vbrizgavanje je lahko ročno ali avtomatično. Pomembno je, da se ista količina raztopine (± 0,5 %) doda koloni za analizo standardov in vzorcev, razen ko se uporablja notranji standard, ter da je razmerje med natrijem in aminokislino v raztopinah standarda in vzorca takšno, kot se uporablja ponavadi.

Na splošno je pogostost umerjanja odvisna od stabilnosti reagenta ninhidrina in analitskega sistema. Standard ali vzorec se razredči s citratnim pufrom (3.24), da se doseže površina vrha standarda, ki je 30–200 % površine vrha aminokislin v vzorcu.

Kromatografija aminokislin se nekoliko razlikuje glede na vrsto uporabljenega analizatorja in smole. Izbrani sistem mora imeti možnost ločitve aminokisline med seboj in od materialov, ki vsebujejo ninhidrin. V delovnem območju se mora kromatografski sistem odzivati linearno na spremembe količin aminokislin, dodanih koloni.

Pri kromatografiji se uporabljajo spodaj navedena razmerja med najnižjimi in najvišjimi vrednostmi, ko se analizira istomolarna raztopina (aminokislin, ki se določajo). Istomolarna raztopina mora vsebovati vsaj 30 % največje vsebnosti vsake aminokisline, ki se lahko natančno izmeri s sistemom za analizo aminokislin (4.9).

Za ločevanje treonina od serina razmerje med najnižjo in najvišjo vrednostjo za aminokislino z nižjo vrednostjo izmed dveh prekrivajočih se aminokislin ne sme presegati 2:10. (Če se določajo le cistein, metionin, treonin in lizin, bo neustrezna ločitev od sosednjih vrhov negativno vplivala na določanje.) Za vse druge aminokisline mora biti ločevanje boljše od 1:10.

Sistem mora zagotavljati, da se lizin loči od „lizinskih artefaktov“ in ornitina.

6. Izračun rezultatov

Za vsako posamezno aminokislino se izračuna površina vzorca in najvišje vrednosti standarda ter količina (X), izražena v g aminokislin na kg vzorca.

Če se uporablja notranji standard, se pomnoži z:

A = površina vrha hidrolizata ali ekstrakta;

B = površina vrha standardne raztopine za umerjanje;

C = površina vrha hidrolizata ali ekstrakta kot notranjega standarda;

D = površina vrha standardne raztopine za umerjanje kot notranjega standarda;

M = molska masa aminokisline, ki se določa;

c = koncentracija standarda v μmol/ml;

m = masa vzorca v gramih (popravljena na prvotno maso, če je vzorec posušen ali razmaščen);

V = ml celotnega hidrolizata (5.3.4) ali izračunani celotni volumen razredčitve ekstrakta (6.1) v ml.

Cistin in cistein se določata kot cisteinska kislina v hidrolizatih oksidiranega vzorca, vendar se izračunata kot cistin (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) z uporabo molske mase 120,15 g/mol (= 0,5 x 240,30 g/mol).

Metionin se določa kot metionin-sulfon v hidrolizatih oksidiranega vzorca, vendar se izračuna kot metionin, pri čemer se uporabi molska masa metionina: 149,21 g/mol.

Dodani prosti metionin se določa po ekstrakciji kot metionin, za izračun pa se uporabi ista molska masa.

6.1 Celotni volumen razredčitve ekstraktov (F) za določanje prostih aminokislin (5.2) se izračuna po naslednji formuli: V = volumen končnega ekstrakta.

7. Ocena metode

Metoda je bila preskušena v mednarodni medlaboratorijski primerjavi, ki je bila izvedena leta 1990 s štirimi različnimi vrstami krme (mešana prašičja krma, mešanica za pitovne piščance, beljakovinski koncentrat, premiks). Rezultati, brez izjem, s srednjimi vrednostmi in standardnimi odmiki so prikazani v preglednici v tej točki:







Srednje vrednosti v g/kg Referenčni material Aminokislina Treonin Cist(e)in Metionin Lizin Mešana prašičja krma 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Mešanica za pitovne piščance 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Beljakovinski koncentrat 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Premiks 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = število sodelujočih laboratorijev.

7.1 Ponovljivost

Ponovljivost zgoraj navedene primerjave, izražena kot „standardni odmik v laboratoriju“, je prikazana v spodnji preglednici:







Standardni odmik (Sr) v laboratoriju, izražen v g/kg Referenčni material Aminokislina Treonin Cist(e)in Metionin Lizin Mešana prašičja krma 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Mešanica za pitovne piščance 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Beljakovinski koncentrat 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Premiks 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = število sodelujočih laboratorijev.







Koeficient variacije (%) standardnega odmika (Sr) v laboratoriju Referenčni material Aminokislina Treonin Cist(e)in Metionin Lizin Mešana prašičja krma 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Mešanica za pitovne piščance 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Beljakovinski koncentrat 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Premiks 2,2 n= 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = število sodelujočih laboratorijev.

7.2 Obnovljivost

Rezultati zgoraj navedene primerjave, izraženi kot standardni odmik med laboratoriji, so prikazani v spodnji preglednici:







Standardni odmik (SR) med laboratoriji, izražen v g/kg Referenčni material Aminokislina Treonin Cist(e)in Metionin Lizin Mešana prašičja krma 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Mešanica za pitovne piščance 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Beljakovinski koncentrat 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Premiks 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = število sodelujočih laboratorijev.







Koeficient variacije (%) standardnega odmika (SR) med laboratoriji Referečni material Amino Acid Treonin Cist(e)in Metionin Lizin Mešana prašičja krma 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Mešanica za pitovne piščance 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Beljakovinski koncentrat 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Premiks 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = število sodelujočih laboratorijev.

8. Uporaba referenčnih materialov

Pravilna uporaba metode se preveri s ponovljenimi merjenji na potrjenih referenčnih materialih, kadar so na voljo. Priporočeno je umerjanje s potrjeno raztopino za umerjanje aminokislin.

9. Opombe

9.1 Zaradi razlik med analizatorji aminokislin se kot smernica obravnavajo končne koncentracije raztopin standardnih aminokislin za umerjanje (glej 3.27.4 in 3.27.5) in hidrolizata (glej 5.3.4). Za vse aminokisline je treba preveriti območje naprave, v katerem je odziv linearen. Standardna raztopina se razredči s citratnim pufrom, da je površina vrha na sredini tega območja.

9.2 Kadar se za analizo hidrolizatov uporablja oprema za tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti, se morajo eksperimentalni pogoji optimizirati v skladu s priporočili proizvajalca.

9.3 Pri uporabi metode za krmo, ki vsebuje več kot 1 % klorida (koncentrat, mineralna krma, nadomestna krma), se lahko pojavi prenizka vrednost vsebnosti metionina in je zato potrebna posebna obdelava.

G. DOLOČANJE TRIPTOFANA

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje celotnega in prostega triptofana v krmi. Ne omogoča pa ločevanja med oblikama D in L.

2. Načelo

Za določanje celotnega triptofana se vzorec hidrolizira pri bazičnih pogojih z nasičeno raztopino barijevega hidroksida in 20 ur segreva do 110 oC. Po hidrolizi se doda notranji standard.

Za določanje prostega triptofana se vzorec ekstrahira pri rahlo kislih pogojih v prisotnosti notranjega standarda.

Triptofan in notranji standard v hidrolizatu ali ekstraktu se določata s HPLC s fluorescenčno detekcijo.

3. Reagenti

3.1 Uporabljati je treba dvakrat destilirano vodo ali vodo enake kakovosti (prevodnost < 10 μS/cm).

3.2 Standardna snov: triptofan (čistoča/vsebnost ≥ 99 %), osušen pod vakuumom nad fosforjevim pentoksidom

3.3 Snov, ki je notranji standard: α-metil-triptofan (čistoča/vsebnost ≥ 99 %), osušen pod vakuumom nad fosforjevim pentoksidom.

3.4 Barijev hidroksid oktahidrat (paziti je treba, da Ba(OH)2 .8 H2O ni pretirano izpostavljen zraku, da se ne bi tvoril BaCO3, ki lahko moti določanje) (glej opombo 9.3).

3.5 Natrijev hidroksid

3.6 Ortofosforna kislina, m (m/m) = 85 %

3.7 Klorovodikova kislina, ρ201,19 g/ml

3.8 Metanol, za HPLC

3.9 Petroleter, vrelišče 40–60 oC

3.10 Raztopina natrijevega hidroksida, c = 1 mol/l: 40,0 g NaOH (3.5) se raztopi v vodi in dopolni z vodo do 1 litra (3.1).

3.11 Klorovodikova kislina, c = 6 mol/l: 492 ml HCl (3.7) se dopolni z vodo do 1 litra.

3.12 Klorovodikova kislina, c = 1 mol/l: 82 ml HCl (3.7) se dopolni z vodo do 1 litra.

3.13 Klorovodikova kislina, c = 0,1 mol/l: 8,2 ml HCl (3.7) se dopolni z vodo do 1 litra.

3.14 Ortofosforna kislina, c = 0,5 mol/l: 34 ml ortofosforne kisline (3.6) se dopolni z vodo (3.1) do 1 litra.

3.15 Koncentrirana raztopina triptofana (3.2), c = 2,50 μmol/ml: v 500-mililitrski merilni bučki se raztopi 0,2553 g triptofana (3.2) v klorovodikovi kislini (3.13) in dopolni s klorovodikovo kislino (3.13) do oznake. Hrani se največ 4 tedne pri –18 oC.

3.16 Koncentrirana raztopina notranjega standarda, c = 2,50 μmol/ml: v 500-mililitrski merilni bučki se raztopi 0,2728 g α-metil-triptofana (3.3) v klorovodikovi kislini (3.13) in dopolni se s klorovodikovo kislino (3.13) do oznake. Pri –18 oC se shrani največ 4 tedne.

3.17 Standardna raztopina triptofana in notranjega standarda za umerjanje: pripravi se 2,00 ml koncentrirane raztopine triptofana (3.15) in 2,00 ml koncentrirane raztopine notranjega standarda (α-metil-triptofan) (3.16). Razredči se z vodo (3.1) in metanolom (3.8) na približno enak volumen in približno enako koncentracijo metanola (10–30 %) kot pri končnem hidrolizatu. Ta raztopina se mora pripraviti sveža pred uporabo. Med pripravo jo je treba zaščititi pred neposredno sončno svetlobo.

3.18 Ocetna kislina

3.19 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanol

3.20 Etanolamin, m (m/m) > 98 %

3.21 1 g 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanola (3.19) se raztopi v 100 ml metanola (3.8).

3.22 Mobilna faza za HPLC: 3,00 g ocetne kisline (3.18) + 900 ml vode (3.1) +50,0 ml raztopine (3.21) 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanola (3.19) v metanolu (3.8) (1 g/100 ml). pH se uravna na 5,00 z etanolaminom (3.20). Dopolni se z vodo do 1 000 ml (3.1).

4. Oprema

4.1 Oprema HPLC s spektrofluorometričnim detektorjem

4.2 Kolona za tekočinsko kromatografijo, 125 mm x 4 mm C18, polnitev 3 μm ali enakovredna

4.3 pH meter

4.4 Bučka iz polipropilena, volumna 125 ml, s širokim vratom in zamaškom z navojem

4.5 Membranski filter, 0,45 μm

4.6 Avtoklav, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1) bar

4.7 Mehanski stresalnik ali magnetno mešalo

4.8 Vorteks mešalnik

5. Postopek

5.1 Priprava vzorcev

Vzorec se zdrobi, tako da preide skozi 0,5 mm sito. Vzorce z visoko vsebnostjo vlage je treba pred drobljenjem osušiti na zraku pri temperaturi do 50 oC ali pa osušiti z zmrzovanjem. Vzorci z visoko vsebnostjo maščobe se pred drobljenjem ekstrahirajo s petroletrom (3.9).

5.2 Določanje prostega triptofana (ekstrakt)

Primerna količina (1–5 g) pripravljenega vzorca (5.1) se natehta na 1 mg natančno in prenese v erlenmajerico. Doda se 100,0 ml klorovodikove kisline (3.13) in 5,00 ml koncentrirane raztopine notranjega standarda (3.16). Z mehanskim stresalnikom ali magnetnim mešalom (4.7) se stresa ali meša 60 minut. Pusti se, da se usedlina usede na dno, nato pa se odpipetira 10,0 ml supernatanta v čašo. Doda se 5 ml ortofosforne kisline (3.14). pH raztopine se z natrijevim hidroksidom (3.10) uravna na 3. Doda se dovolj metanola (3.8), da je v končnem volumnu koncentracija metanola 10–30 %. Prenese se v merilno bučko primernega volumna in razredči z vodo na volumen, potreben za kromatografijo (približno enak volumen kot pri standardni raztopini za umerjanje (3.17)).

Pred vbrizganjem na HPLC kolono se nekaj ml raztopine prefiltrira skozi 0,45 μm membranski filter (4.5). Nadaljuje se s kromatografijo v skladu s točko 5.4.

Standardna raztopina in ekstrakti se zaščitijo pred neposredno sončno svetlobo. Če ni možno analizirati ekstraktov istega dne, se lahko hranijo največ 3 dni pri 5 oC.

5.3 Določanje celotnega triptofana (hidrolizat)

0,1–1 g pripravljenega vzorca (5.1) se natehta na 0,2 mg natančno in prenese v bučko iz polipropilena (4.4). Vsebnost dušika v natehtanem delu vzorca je približno 10 mg. Doda se 8,4 mg barijevega hidroksid oktahidrata (3.4) in 10 ml vode. Meša se na vorteks mešalniku (4.8) ali z magnetnim mešalom (4.7). S teflonom prevlečeni magnet se pusti v mešanici. Stene posode se sperejo s 4 ml vode. Zapre se z zamaškom z navojem, bučka pa se rahlo zapre. Prenese se v avtoklav (4.6), kjer je vrela voda, in pusti v pari 30–60 minut. Zapre se avtoklav in 20 ur avtoklavira pri 110 (± 2) oC.

Preden se avtoklav odpre, se temperatura zmanjša nekoliko pod 100 oC. Da se prepreči kristalizacija Ba(OH)2 ×8 H2O, se topli mešanici doda 30 ml vode sobne temperature. Rahlo se pretresa ali meša. Doda se 2,00 ml koncentrirane raztopine notranjega standarda (α-metil-triptofana) (3.16). Posode se 15 minut hladijo na vodni/ledeni kopeli.

Nato se doda 5 ml ortofosforne kisline (3.14). Posoda se zadrži v hladilni kopeli, med mešanjem nevtralizira s HCl (3.11), pH pa se s HCl (3.12) uravna na 3,0. Doda se dovolj metanola, da je koncentracija metanola v končnem volumnu 10–30 %. Prenese se v merilno bučko primernega volumna in razredči z vodo do volumna, potrebnega za kromatografijo (na primer 100 ml). Dodatek metanola ne povzroči obarjanja.

Pred vbrizganjem na HPLC kolono se nekaj ml raztopine prefiltrira skozi 0,45 μm membranski filter (4.5). Nadaljuje se s kromatografijo v skladu s točko 5.4.

Standardna raztopina in hidrolizati se zaščitijo pred neposredno sončno svetlobo. Če ni možno analizirati ekstraktov istega dne, se lahko hranijo največ 3 dni pri 5 oC.

5.4 Določanje s HPLC

Za izokratsko eluiranje se lahko kot smernica uporabljajo naslednji pogoji; lahko se uporabljajo tudi drugi pogoji, če zagotavljajo enakovredne rezultate (glej tudi opombi 9.1 in 9.2).







Kolona za tekočinsko kromatografijo (4.2): 125 mm × 4 mm, C18, polnitev 3 μm ali enakovredna Temperatura kolone: sobna temperatura Mobilna faza (3.22): 3,00 g ocetne kisline (3.18) + 900 ml vode (3.1) +50,0 ml raztopine (3.21) 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanola (3.19) v metanolu (3.8) (1 g/100 ml). pH raztopine se z etanolaminom (3.20) uravna na 5,00. Dopolni se z vodo (3.1) do 1 000 ml. Hitrost pretoka: 1 ml/min Skupni čas izvedbe: približno 34 min Detekcijska valovna dolžina: ekscitacija: 280 nm, emisija: 356 nm. Volumen, ki se vbrizga: 20 μl

6. Izračun rezultatov

Količina triptofana (X), izražena v g na 100 g vzorca, se izračuna po naslednji formuli:

A = površina vrha notranjega standarda, standardne raztopina za umerjanje (3.17);

B = površina vrha triptofana, ekstrakta (5.2) ali hidrolizata (5.3);

V1 = volumen, v ml (2 ml), koncentrirane raztopine triptofana (3.15), dodane raztopini za umerjanje (3.17);

c = koncentracija, v μmol/ml (= 2,50), koncentrirane raztopine triptofana (3.15), dodane raztopini za umerjanje (3.17);

V2 = volumen, v ml, koncentrirane raztopine notranjega standarda (3.16), dodane pri ekstrakciji (5.2) (= 5,00 ml) ali hidrolizatu (5.3) (= 2,00 ml);

C = površina vrha notranjega standarda, ekstrakta (5.2) ali hidrolizata (5.3);

D = površina vrha triptofana, standardne raztopine za umerjanje (3.17);

V3 = volumen, v ml (= 2,00 ml), koncentrirane raztopine notranjega standarda (3.16), dodane standardni raztopini za umerjanje (3.17);

m = masa vzorca v g (popravljena na prvotno maso, če je vzorec posušen in/ali razmaščen);

M = molska masa triptofana (= 204,23 g/mol).

7. Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati 10 % najvišjega rezultata.

8. Rezultati medlaboratorijske študije

Organizirana je bila medlaboratorijska študija ES (četrta medlaboratorijska primerjava), pri kateri je 12 laboratorijev analiziralo 3 vzorce, da se potrdi metoda za hidrolizo. Vsak vzorec je bil analiziran petkrat. Rezultati so prikazani v spodnji preglednici:







Vzorec 1 Prašičja krma Vzorec 2 Prašičja krma z dodanim L-triptofanom Vzorec 3 Koncentrat prašičje krme L 12 12 12 n 50 55 50 Srednja vrednost [g/kg] 2,42 3,40 4,22 Sr [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CVr [ %] 1,9 1,6 1,9 SR [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 CVR [ %] 6,3 6,0 2,2

L = število laboratorijev, ki so predložili rezultate;

n = število uporabljenih posameznih rezultatov, razen izjem (identificiranih s testom za izjeme po Cochranu in Dixonu);

Sr = standardni odmik ponovljivosti;

SR = standardni odmik obnovljivosti;

r = ponovljivost;

R = obnovljivost;

CVr = koeficient variacije ponovljivosti v %;

CVR = koeficient variacije obnovljivosti v %.

Organizirana je bila še ena medlaboratorijska študija ES (tretja medlaboratorijska primerjava), v kateri je 13 laboratorijev analiziralo 2 vzorca, da se potrdi metoda za ekstrakcijo prostega triptofana. Vsak vzorec je bil analiziran petkrat. Rezultati so prikazani v spodnji preglednici:







Vzorec 4 Mešanica pšenice in soje Vzorec 5 Mešanica pšenice in soje (= vzorec 4) z dodanim triptofanom (0,457 g/kg1) L 12 12 n 55 60 Srednja vrednost [g/kg] 0,391 0,931 Sr [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 CVr [ %] 1,34 1,34 SR [g/kg] 0,018 0,048 R [g/kg] 0,050 0,134 CVR [ %] 4,71 5,11

L = število laboratorijev, ki so predložili rezultate;

n = število uporabljenih posameznih rezultatov, razen izjem (identificiranih s testom za izjeme po Cochranu in Dixonu);

Sr = standardni odmik ponovljivosti;

SR = standardni odmik obnovljivosti;

r = ponovljivost;

R = obnovljivost;

CVr = koeficient variacije ponovljivosti v %;

CVR = koeficient variacije obnovljivosti v %.

Organizirana je bila še ena medlaboratorijska študija ES, v kateri je do 7 laboratorijev analiziralo 4 vzorce, da se potrdi metoda za hidrolizo triptofana. Rezultati so prikazani spodaj. Vsak vzorec je bil analiziran petkrat.







Vzorec 1 Mešana prašičja krma (CRM 117) Vzorec 2 Ribja moka z nizko vsebnostjo maščob (CRM 118) Vzorec 3 Sojina moka (CRM 119) Vzorec 4 Posneto mleko v prahu (CRM 120) L 7 7 7 7 n 25 30 30 30 Srednja vrednost [g/kg] 2,064 8,801 6,882 5,236 Sr [g/kg] 0,021 0,101 0,089 0,040 r [g/kg] 0,059 0,283 0,249 0,112 CVr [ %] 1,04 1,15 1,30 0,76 SR [g/kg] 0,031 0,413 0,283 0,221 R [g/kg] 0,087 1,156 0,792 0,619 CVR [ %] 1,48 4,69 4,11 4,22

L = število laboratorijev, ki so predložili rezultate;

n = število uporabljenih posameznih rezultatov, po izločitvi izjem (identificiranih s testom za izjeme po Cochranu in Dixonu);

Sr = standardni odmik ponovljivosti;

SR = standardni odmik obnovljivosti;

r = ponovljivost;

R = obnovljivost;

CVr = koeficient variacije ponovljivosti v %;

CVR = koeficient variacije obnovljivosti v %.

9. Opombe

9.1 Ločevanje triptofana in α-metil-triptofana lahko izboljšajo naslednji posebni kromatografski pogoji. Izokratsko eluiranje, ki mu sledi gradientno čiščenje kolone:



Kolona za tekočinsko kromatografijo: 125 mm x 4 mm, C18, polnitev 5 μm ali enakovredna Temperatura kolone: 32 oC Mobilna faza: A. 0,01 mol/l KH2PO4/Metanol, 95+5 (V+V). B: Metanol Gradientni program: 0 min 100 % A 0 % B 15 min 100 % A 0 % B 17 min 60 % A 40 % B 19 min 60 % A 40 % B 21 min 100 % A 0 % B 33 min 100 % A 0 % B Hitrost pretoka: 1,2 ml/min Skupni čas izvedbe: približno 33 min

9.2 Kromatografija se spreminja glede na vrsto HPLC in uporabljeni material za polnitev kolone. Izbrani sistem mora zagotavljati ločevanje bazne linije triptofana