1972L0199 — SL — 27.08.1999 — 005.001

Ta dokument je mišljen zgolj kot dokumentacijsko orodje in institucije za njegovo vsebino ne prevzemajo nobene odgovornosti

►B TRETJA DIREKTIVA KOMISIJE z dne 27. aprila 1972 o določitvi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme (72/199/EGS) (UL L 123, 29.5.1972, p.6)

spremenjena z:









▼B

TRETJA DIREKTIVA KOMISIJE

z dne 27. aprila 1972

o določitvi analitskih metod Skupnosti za uradni nadzor krme

(72/199/EGS)







KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske gospodarske skupnosti, ob upoštevanju Direktive Sveta z dne 20. julija 1970 ( 1 ) o uvedbi metod vzorčenja in analiz Skupnosti za uradni nadzor krme in zlasti člena 2 Direktive, ker navedena direktiva zahteva, da se uradni nadzor krme izvaja na podlagi metod vzorčenja in analiz Skupnosti za preverjanje skladnosti z zahtevami, določenimi z zakoni in drugimi predpisi v zvezi s kakovostjo in sestavo krme; ker direktivi Komisije št. 71/250/EGS ( 2 ) z dne 15. junija 1971 in št. 71/393/EGS ( 3 ) z dne 18. novembra 1971 že določata številne metode analiz Skupnosti; ker je treba glede na napredek, ki je bil dosežen v nadaljnjem delu, sprejeti tretji sklop metod; ker so ukrepi, predvideni s to direktivo, v skladu z mnenjem Stalnega odbora za krmo, SPREJELA NASLEDNJO DIREKTIVO:







Člen 1

Države članice zahtevajo, da se uradni nadzor krme glede vsebnosti škroba, surovih beljakovin, surovih beljakovin, topnih v pepsinu in klorovodikovi kislini, prostega in celotnega gosipola in aktivnosti pepsina izvajajo z metodami, opisanimi v Prilogi I k tej direktivi.

▼M1 —————

▼B

Člen 2

Države članice zahtevajo, da se analize za uradni nadzor krme, katerih namen je ►M4 ————— ◄ določiti vsebnost ►M4 ————— ◄ tilozina in virginiamicina v krmi, izvajajo z metodami, ki so opisane v Prilogi II k tej direktivi.

▼M1 —————

▼B

Člen 3

Države članice sprejmejo zakone in druge predpise, potrebne za uskladitev s to direktivo, najpozneje do 1. julija 1973. O tem takoj obvestijo Komisijo.

Člen 4

Ta direktiva je naslovljena na države članice.









PRILOGA I

▼M5

1. DOLOČANJE ŠKROBA

POLARIMETRIČNA METODA

1. Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določitev vsebnosti škroba in visokomolekularnih produktov degradacije škroba v krmi za preverjanje skladnosti z Direktivo Komisije 86/174/EGS in Direktivo Sveta 96/25/ES.

2. Princip

Metoda vključuje dve določitvi. Pri prvi se vroč vzorec obdela z razredčeno klorovodikovo kislino. Po zbistritvi in filtriranju se izmeri optična rotacija raztopine s polarimetrijo.

Pri drugi se vzorec ekstrahira s 40 % etanolom. Po nakisanju filtrata s klorovodikovo kislino, se po zbistritvi in filtriranju izmeri optična rotacija tako kot pri prvem določanju.

Razlika med dvema meritvama, pomnožena z znanim faktorjem, poda vsebnost škroba v vzorcu.

3. Reagenti

3.1 25 % (m/m) klorovodikova kislina, d: 1,126 g/ml.

3.2 1,128 % (m/v) klorovodikova kislina Koncentracijo moramo preveriti s titracijo, z uporabo 0,1 mol/liter raztopine natrijevega hidroksida, v prisotnosti 0,1 % (m/v) metil rdečega v 94 % (v/v) etanolu. 10ml = 30.94ml NaOH 0.1 mol/liter.

3.3 Carrez I raztopina: raztopimo 21,9 g cinkovega acetata Zn(CH3COO)2. H 2O in 3g led-ocetne kisline v vodi. Dopolnimo do 100 ml z vodo.

3.4 Carrez II raztopina: raztopimo 10,6 g kalijevega ferocianida [K4(Fe(CN)6].3 H2O v vodi. Dopolnimo do 100 ml z vodo.

3.5 40 % (v/v) etanola, d: 0,948 g/ml pri 20°C.

4. Oprema

4.1 4.1 250 ml erlenmajerica s standardnim brušenim vratom in povratnim hladilnikom

4.2 Polarimeter ali saharometer.

5. Postopek

5.1 Priprava vzorca

Vzorec drobimo, do velikosti delcev, ki popolnoma preidejo skozi 0,5 mm sito z okroglimi odprtinami.

5.2 Določanje celotne optične rotacije (P ali S) (glej pripombo 7.1)

Natehtamo 2,5 g zdrobljenega vzorca s točnostjo do mg in ga prenesemo v 100 ml merilno bučko. Dodamo 25ml klorovodikove kisline (3.2), pretresemo, da dobimo enakomerno porazdelitev preskusnega vzorca in dodamo nadaljnjih 25ml klorovodikove kisline (3.2). Bučko potopimo v vrelo vodno kopel in prve tri minute močno in enakomerno stresamo, da preprečimo nastanek aglomeratov. Količina vode v vodni kopeli mora biti tolikšna, da kopel ostane na točki vrelišča, ko vanjo potopimo bučko. Bučke med stresanjem ne smemo vzeti iz kopeli. Po točno 15 minutah jo odstranimo iz kopeli, dodamo 30 ml hladne vode in jo takoj ohladimo na 20°C.

Dodamo 5 ml Carrez I (3.3) raztopine in stresamo eno minuto. Nato dodamo 5 ml raztopine Carrez II (3.4) in ponovno stresamo eno minuto. Dopolnimo z vodo do oznake, premešamo in filtriramo. Če filtrat ni popolnoma bister (kar je redko), ponovimo določanje z uporabo večje količine Carrez raztopin I in II, na primer 10 ml.

Optično rotacijo raztopine izmerimo s polarimetrom ali saharometrom v 200 mm epruveti.

5.3 Določanje optične rotacije (P′ ali S′) snovi, ki so topne v 40 % etanolu.

Natehtamo 5g vzorca s točnostjo do mg, prenesemo v 100 ml merilno bučko in dodamo približno 80 ml etanola (3.5) (glej opombo 7.2). Bučko pustimo stati 1 uro na sobni temperaturi; v tem času šestkrat močno pretresemo, da se preskusni vzorec temeljito premeša z etanolom. Dopolnimo do oznake z etanolom (3.5), premešamo in filtriramo. Odpipetiramo 50 ml filtrata (= 2,5 g vzorca) v 250 ml erlenmajerico, dodamo 2,1 ml klorovodikove kisline (3.1) in močno pretresemo. Erlenmajerico spojimo s povratnim hladilnikom in jo potopimo v vrelo vodno kopel. Po točno 15 minutah odstranimo erlenmajerico iz kopeli, prenesemo vsebino v 100 ml merilno bučko, speremo z malo hladne vode in ohladimo na 20 °C. Zbistrimo z uporabo Carrez raztopin I (3.3.) in II (3.4), dopolnimo do oznake z vodo, premešamo, filtriramo in izmerimo optično rotacijo, kot je navedeno v drugem in tretjem odstavku 5.2.

6. Izračun rezultatov

Vsebnost škroba ( %) izračunamo na naslednji način:

6.1 Meritve s polarimetrom

P = celotna optična rotacija, v kotnih stopinjah

P′ = optična rotacija, v kotnih stopinjah, snovi, ki so topne v 40 % (V/V) etanolu

= specifična optična rotacija čistega škroba. Dogovorno sprejete numerične vrednosti za faktor so naslednje + 185.9° : rižev škrob + 185.4° : krompirjev škrob + 184.6° : koruzni škrob + 182.7° : pšenični škrob + 181.5° : ječmenov škrob + 181.3° : ovseni škrob + 184.0° : druge vrste škroba in škrobnih mešanic v krmnih mešanicah

6.2 Meritve s saharometrom

S = celotna optična rotacija, v saharometrskih stopinjah

S′ = optična rotacija v saharometrskih stopinjah snovi, ki so topne v 40 % (V/V) etanolu

N = masa (g) saharoze v 100 ml vode, ki daje optično rotacijo 100 saharometrskih stopinj, kadar se meri z uporabo 200 mm epruvete 16,29 g za francoske saharometre 26,00 g za nemške saharometre 20,00 g za mešane saharometre.

= specifična optična rotacija čistega škroba (6.1)

6.3 Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati 0,4 absolutne vrednosti za vsebnost škroba, ki je nižja od 40 % in 1,1 % relativne vrednosti, za vsebnost škroba, ki je enaka ali višja od 40 %.

7. Pripombe

7.1 Če vzorec vsebuje več kot 6 % karbonatov, izračunanih v obliki kalcijevega karbonata, jih moramo pred določitvijo celotne optične rotacije razkrojiti z obdelavo s primerno točno količino razredčene žveplove (VI) kisline.

7.2 V primeru proizvodov, ki imajo visoko vsebnost laktoze, kot je serum mleka v prahu ali posneto mleko v prahu, po dodatku 80 ml etanola (3.5) izvajamo naslednje. Na bučko namestimo povratni hladilnik in jo za 30 minut potopimo v vodno kopel pri 50°C. Nato pustimo, da se ohladi in nadaljujemo z analizo, kot je navedeno v 5.3.

7.3 Za naslednja posamična krmila, v primeru, če so prisotne v znatni količini v krmi, je poznano, da povzročijo motnje pri določanju vsebnosti škroba s pomočjo polarimetrične metode, zaradi česar se lahko pojavijo nepravilni rezultati: — proizvodi iz (sladkorne) pese, kot je pulpa, melasirana pulpa, usedlina pri destilaciji, pesni sladkor, — pulpa citrusov, — laneno seme; laneno seme z nižjo vrednostjo maščobe; ekstrahirano laneno seme, — seme oljne repice; oljna repica z nižjo vrednostjo maščobe, ekstrakt oljne repice; luske oljne repice, — sončnično seme; ekstrahirano sončnično seme, sončnično seme, delno olupljeno, ekstrahirano, — kopra, z nižjo vrednostjo maščobe; ekstrakt kopre, — krompirjeva pulpa, — dehidrirani kvas, — proizvodi, bogati z inulinom (npr. čips in zdrob topinamburja), — ocvirki.

▼M3

2. DOLOČANJE VSEBNOSTI SUROVIH BELJAKOVIN

1. Namen in področje uporabe

S to metodo je mogoče določiti vsebnost beljakovin v krmi na podlagi vsebnosti dušika, določenega po Kjeldahlovi metodi.

2. Princip

Vzorec razkrojimo z žveplovo kislino v prisotnosti katalizatorja. Kislo raztopino naalkalimo z raztopino natrijevega hidroksida. Amoniak destiliramo in ga lovimo v odmerjeno količino žveplove kisline, katere presežek titriramo s standardno raztopino natrijevega hidroksida.

3. Reagenti

3.1. Kalijev sulfat.

3.2. Katalizator: Bakrov (II) oksid CuO ali bakrov (II) sulfat pentahidrat, CuSO4 · 5H2O

3.3. Cink v zrncih.

3.4. Žveplova (VI) kislina, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5. Žveplova (VI) kislina c(½H2SO4) = 0,5 mol/l.

3.6. Žveplova (VI) kislina c(½H2SO4) = 0,1 mol/l.

3.7. Indikator metil rdeče; 300 mg metil rdečega raztopimo v 100 ml etanola, σ = 95-96 % (v/v).

3.8. Raztopina natrijevega hidroksida (lahko tehnični) v = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.9. Raztopina natrijevega hidroksida c = 0,25 mol/l.

3.10. Raztopina natrijevega hidroksida c = 0,1 mol/l.

3.11 Zdrobljen plovec, opran v klorovodikovi kislini in prežaren.

3.12. Acetanilid (tališče = 114 °C, N = 10,36 %)

3.13. Saharoza (brez dušika).

4. Oprema

Aparatura, primerna na izvajanje razklopa, destilacijo in titracijo po Kjeldahlovi metodi.

5. Postopek

5.1. Razklop

Natehtamo 1 g vzorca s točnostjo 0,001 g in ga prenesemo v bučko aparature za razklop. Dodamo 15 g kalijevega sulfata (3.1), ustrezno količino katalizatorja (3.2) (od 0,3 do 0,4 g bakrovega (II) oksida ali od 0,9 do 1,2 g bakrovega (II) sulfata pentahidrata), 25 ml žveplove (VI) kisline (3.4) in nekaj zrnc plovca (3.11) ter vse skupaj premešamo. Bučko najprej zmerno segrevamo in jo od časa do časa obrnemo, dokler masa ne zogleni in pena ne izgine; nato jo močneje segrevamo do enakomernega vrenja tekočine. Segrevanje je ustrezno, če se kislina, ki vre, kondenzira na stenah bučke. Pazimo, da se stene bučke ne pregrejejo in da se organski delci ne sprimejo nanje. Ko se raztopina zbistri in obarva rahlo zeleno, pustimo, da vre še dve uri, nato pa pustimo, da se ohladi.

5.2. Destilacija

Previdno dodamo toliko vode, da se sulfati povsem raztopijo. Pustimo, da se ohladi, in nato dodamo nekaj zrnc cinka (3.3).

V zbirno bučko naprave za destilacijo odmerimo točno 25 ml žveplove (VI) kisline (3.5) ali (3.6), odvisno od pričakovane vsebnosti dušika. Nato dodamo nekaj kapljic indikatorja metil rdečega (3.7).

Bučko za razklop povežemo s kondenzatorjem aparature za destilacijo in potopimo konec kondenzatorja v tekočino v zbirni bučki vsaj do globine 1 cm (glej opombo 8.3). V bučko za razklop počasi vlijemo 100 ml raztopine natrijevega hidroksida (3.8) tako, da ne pride do izgube amonija (glej opombo 8.1).

Bučko segrevamo do popolne destilacije amonija.

5.3. Titracija

Presežek žveplove kisline v zbirni bučki titriramo do ekvivalentne točke z raztopino natrijevega hidroksida (3.9) ali (3.10), odvisno od koncentracije uporabljene žveplove (VI) kisline.

5.4. Slepi preskus

Da reagenti ne vsebujejo dušika, se prepričamo s slepim preskusom (razklop, destilacija in titracija), v katerem namesto vzorca uporabimo 1 g saharoze (3.13).

6. Izračun rezultatov

Pri čemer je

text

Vo = volumen (ml) NaOH (3.9 ali 3.10), uporabljen pri slepem preskusu.

V1 = volumen (ml) NaOH (3.9 ali 3.10), uporabljen pri titraciji vzorca.

c = koncentracija (mol/l) natrijevega hidroksida (3.9 ali 3.10).

m = masa (g)vzorca.

7. Preverjanje metode

7.1. Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določitev, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati:

0,2 % absolutne vrednosti za vsebnosti surovih beljakovin pod 20 %;

1,0 % relativno glede na višjo vrednost za vsebnosti surovih beljakovin od 20 % do 40 %;

0,4 % absolutne vrednosti za vsebnosti surovih beljakovin nad 40 %.

7.2. Točnost

Analizo (razklop, destilacija, titracija) izvedemo z 1,5 do 2,0 g acetanilida (3.12) ob navzočnosti 1 g saharoze (3.13); 1 g acetanilida porabi 14,80 ml žveplove kisline (3.5). Izkoristek mora biti najmanj 99 %.

8. Opombe

8.1. Aparatura je lahko ročna, polavtomatska ali avtomatska. Če je pri aparaturi med razklopom in destilacijo potreben prenos, ga moramo izvesti brez kakršne koli izgube. Če bučka aparature za destilacijo ni opremljena s kapalnim lijakom, dodamo natrijev hidroksid tik pred povezavo bučke s kondenzatorjem, pri čemer tekočino vlivamo počasi ob steni bučke.

8.2. Če se vsebina v bučki strjuje, začnemo znova, vendar uporabimo večjo količino žveplove kisline (3.4), kakor je navedeno zgoraj.

8.3. Pri proizvodih z nizko vsebnostjo dušika lahko volumen žveplove kisline (3.6), ki jo moramo dodati v zbirno bučko, po potrebi zmanjšamo na 10 ali 15 ml in dopolnimo bučko do 25 ml z vodo.

▼B

3. DOLOČANJE VSEBNOSTI SUROVIH BELJAKOVIN, TOPNIH V PEPSINU IN KLOROVODIKOVI KISLINI

1. Namen in področje uporabe

S to metodo je mogoče določiti frakcijo surovih beljakovin, ki so pod opredeljenimi pogoji topne v pepsinu in klorovodikovi kislini. Uporabna je za vso krmo.

2. Princip

Vzorec segrevamo 48 ur pri 40°C v raztopini pepsinhidroklorida. Suspenzijo filtriramo in določimo vsebnost dušika v filtratu, v skladu z metodo za določanje surovih beljakovin.

3. Reagenti

3.1 Klorovodikova kislina, d: 1,125.

3.2 Klorovodikova kislina 0,075 N.

3.3 Pepsin 2,0 U/mg; aktivnost pepsina je opredeljena v metodi, opisani v delu 4 te priloge, in jo moramo ugotoviti v skladu s to metodo.

3.4 Približno 0,2 % (m/v) sveže pripravljene raztopine pepsina v klorovodikovi kislini (3.2); aktivnost: 400 U/l.

3.5 Emulzija proti penjenju (npr. silikon).

3.6 Vsi reagenti, našteti pod 3, metode za določanje surovih beljakovin.

4. Oprema

4.1 Vodna kopel ali inkubator, nastavljen na 40 °C ± 1 °C.

4.2 Aparatura za razklop in destilacijo po Kjeldahlovi metodi.

5. Postopek

5.1 Priprava raztopine (glej opombo 7.2)

Natehtamo 2 g vzorca na mg natančno in ga prenesemo v 500-mililitrsko merilno bučko. Dodamo 450 ml raztopine pepsinhidroklorida (3.4), ki smo ga predtem segreli na 40 °C, in stresamo, da preprečimo sprijemanje. Preverimo pH vrednost suspenzije, ki mora biti nižja od 1,7. Bučko postavimo za 48 ur na vodno kopel ali v inkubator (4.1). Po 8, 24 in 32 urah jo pretresemo. Po 48 urah dodamo 15 ml klorovodikove kisline (3.1), ohladimo na 20 °C, dopolnimo z vodo do oznake in filtriramo.

5.2 Razklop

250 ml filtrata prenesemo v bučko aparature za destilacijo (4.2). Dodamo reagente, potrebne za razklop, kakor je opisano v drugem stavku 5.1 metode za določanje vsebnosti surovih beljakovin. Premešamo in segrejemo do vrenja. Če nastane pena, dodamo nekaj kapljic emulzije proti penjenju (3.5). Tekočino pustimo močno vreti, dokler ne izpari skoraj vsa voda. Znižamo temperaturo in previdno odstranimo še zadnje sledove vode.

Ko se raztopina zbistri in postane brezbarvna (ali svetlo zelena, če smo uporabili katalizator, ki vsebuje baker), pustimo, da vre še eno uro. Ohladimo.

5.3 Destilacija in titracija

Nadaljujemo, kakor je določeno v 5.2 in 5.3 metode za določanje surovih beljakovin.

5.4 Slepi preskus

Z enakim postopkom izvedemo slepi preskus, brez vzorca, ki ga analiziramo.

6. Izračun rezultatov

Odštejemo volumen žveplove kisline, porabljene pri slepem preskusu, od volumna, ki ga je porabil vzorec. 1 ml žveplove kisline 0,1 N ustreza 1,4 mg dušika.

Količino dušika pomnožimo s faktorjem 6,25. Rezultat izrazimo v odstotnem masnem deležu glede na vzorec.

Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določitev, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati:

— 0,4, v absolutni vrednosti, za vsebnosti pod 20 %,

— 2,0 %, v relativni vrednosti, za vsebnosti med 20 % in 40 %,

— 0,8, v absolutni vrednosti, za vsebnosti nad 40 %.

7. Opombe

7.1 Vrednosti, dobljene po tej metodi, niso neposredno povezane z in vivo prebavljivostjo.

7.2 Proizvode, katerih vsebnost olj in maščob presega 10 %, moramo najprej razmastiti, in to z ekstrakcijo s petroletrom (vrelišče od 40 do 60 °C).

4. DOLOČANJE AKTIVNOSTI PEPSINA

1. Namen in področje uporabe

S to metodo je mogoče ugotoviti aktivnost pepsina, ki se uporablja za določanje surovih beljakovin, topnih v pepsinu in klorovodikovi kislini.

2. Princip

Pod opredeljenimi pogoji obdelamo hemoglobin s pepsinom in razredčeno klorovodikovo kislino. Nehidrolizirano frakcijo beljakovine oborimo s triklorocetno kislino. Filtratu dodamo natrijev hidroksid in reagent po Folin-Ciocalteuju. Pri 750 nm izmerimo optično gostoto raztopine in z umeritvene krivulje odčitamo ustrezno količino tirozina.

Opredelitev: Enota pepsina (E) je opredeljena kot količina encima, ki v pogojih metode na minuto sprosti toliko hidroksiarilnih skupin, da ima njihovo obarvanje z reagentom po Folin-Ciocalteuju za posledico optično gostoto, ki ustreza optični gostoti enega μ-mola tirozina pod enakimi pogoji.

3. Reagenti

3.1 Klorovodikova kislina 0,2 N.

3.2 Klorovodikova kislina 0,06 N.

3.3 Klorovodikova kislina 0,025 N.

3.4 5-odstotna (m/v) raztopina triklorocetne kisline.

3.5 Raztopina natrijevega hidroksida 0,5 N.

3.6 Reagent po Folin-Ciocalteuju. V 2-litrsko bučko z okroglim dnom in s standardnim brusom prenesemo 100 g natrijevega volframata (Na2WO4 × 2H2O), 25 g natrijevega molibdata (Na2MoO4 × 2H2O) in 700 ml vode. Dodamo 50 ml fosforjeve kisline (d: 1,71) in 100 ml koncentrirane klorovodikove kisline (d: 1.19), bučko povežemo s povratnim hladilnikom, segrejemo do vrenja in pustimo, da raztopina 10 ur rahlo vre. Ohladimo, odstranimo povratni hladilnik, dodamo 175 g litijevega sulfata (Li2SO4 × 2H2O), 50 ml vode in 1 ml broma. Pustimo vreti 15 minut, da odstranimo presežek broma. Ohladimo, raztopino prelijemo v litrsko merilno bučko, dopolnimo z vodo do oznake, premešamo in filtriramo. Raztopina ne sme biti niti malo zelenkasto obarvana. Pred uporabo razredčimo en volumen reagenta z dvema volumnoma vode.

3.7 Raztopina hemoglobina: Natehtamo količino hemoglobina (približno 2 g beljakovinskega substrata, določenega po Ansonu), ki ustreza 354 mg dušika ( 4 ), in ga prenesemo v 200-mililitrsko bučko s standardnim brusom. Dodamo nekoliko mililitrov klorovodikove kisline (3.2), bučko spojimo z vakuumsko črpalko in stresamo, dokler se hemoglobin popolnoma ne raztopi. Vakuum odstranimo in med stresanjem dodajamo klorovodikovo kislino (3.2) do 100 ml. Pripravimo tik pred uporabo.

3.8 Standardna raztopina tirozina: Raztopimo 181,2 mg tirozina v klorovodikovi kislini (3.1) in z isto kislino dopolnimo do enega litra (osnovna raztopina). 20,0 ml razredčimo do 100 ml s klorovodikovo kislino (3.1). 1 ml te raztopine vsebuje 0,2 μ-molov tirozina.

4. Oprema

4.1 Vodna kopel, naravnana z ultratermostatom na 25 °C ± 0,1 °C.

4.2 Spektrofotometer.

4.3 Kronometer, točnost: 1 sekunda.

4.4 pH-meter.

5. Postopek

5.1 Priprava raztopine (glej opombo 7.1)

Raztopimo 150 mg pepsina v 100 ml klorovodikove kisline (3.2). Odpipetiramo 2 ml raztopine v 50-mililitrsko merilno bučko in dopolnimo s klorovodikovo kislino (3.3) do oznake. Vrednost pH, ki jo izmerimo s pH-metrom, mora biti 1,6 ± 0,1. Bučko potopimo v vodno kopel (4.1).

5.2 Hidroliza

V epruveto odpipetiramo 5,0 ml raztopine hemoglobina (3.7), na vodni kopeli (4.1) jo segrejemo na 25 °C, dodamo 1,0 ml raztopine pepsina, dobljene po navodilih iz 5.1, in s stekleno paličico, odebeljeno na enem koncu, mešamo tekočino tako, da desetkrat potegnemo skoznjo naprej in nazaj. Epruveto pustimo na vodni kopeli pri 25 °C točno 10 minut po tem, ko smo dodali raztopino pepsina (trajanje in temperaturo moramo strogo spremljati). Nato dodamo 10,0 ml raztopine triklorocetne kisline (3.4), ki smo jo poprej segreli na 25 °C, premešamo in filtriramo skozi suh filter.

5.3 Razvijanje barve in merjenje optične gostote

5,0 ml filtrata odpipetiramo v 50-mililitrsko erlenmajerico, dodamo 10,0 ml raztopine natrijevega hidroksida (3.5) in ob nenehnem stresanju še 3,0 ml razredčenega reagenta po Folin-Ciocalteuju (3.6). Po 5 do 10 minutah določimo optično gostoto raztopine s spektrofotometrom pri 750 nm v 1 cm kiveti, proti vodi.

5.4 Slepi preskus

Za vsako določitev izvedemo slepi preskus:

V epruveto odpipetiramo 5,0 ml raztopine hemoglobina (3.7), na vodni kopeli (4.1) jo segrejemo na 25 °C, dodamo 10,0 ml raztopine triklorocetne kisline (3.4), ki smo jo poprej segreli na 25 °C, premešamo in nato dodamo 1,0 ml raztopine pepsina, dobljene po navodilih iz 5.1. Premešamo s stekleno paličico in pustimo epruveto na vodni kopeli (4.1) pri 25°C točno 10 minut. Premešamo in filtriramo skozi suh filter. Nadaljujemo po postopku, opisanem v 5.3.

5.5 Umeritvena krivulja

V 50-mililitrske erlenmajerice odmerimo 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 in 5,0 ml standardne raztopine tirozina (3.8), kar ustreza 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 in 1,0 μ-molom tirozina. Serijo dopolnimo s primerjalno raztopino, ki ne vsebuje tirozina. Volumne dopolnimo do 5,0 ml s klorovodikovo kislino (3.1). Dodamo 10,0 ml raztopine natrijevega hidroksida (3.5) in ob nenehnem stresanju še 3,0 ml razredčenega reagenta po Folin-Ciocalteuju (3.6). Nato izmerimo optično gostoto, kakor je opisano v zadnjem stavku 5.3. V umeritveno krivuljo vnesemo optične gostote v odvisnosti od količin tirozina.

6. Izračun rezultatov

Z umeritvene krivulje odčitamo količino tirozina (v μ-molih), ki ustreza optični gostoti obarvane raztopine, korigirane glede na slepo vrednost.

Aktivnost pepsina, v μ-molih, tirozina pri 25 °C, na mg in na minuto, izračunamo z naslednjo enačbo:

pri čemer je:

a = količina torozina (v μ-molih), odčitana s krivulje;

p = masa, v mg, količine pepsina, dodanega v 5.2.

7. Opombe

7.1 Pepsina moramo raztopiti toliko, da dobimo pri končnih fotometričnih meritvah optično gostoto 0,35 ± 0,035.

7.2 Dve enoti na mg, dobljeni s to metodo, ustrezata: 3,64 Anson milienot/mg (μ-molov tirozina/mg minuto pri 35,5 °C) ali 36 400 komercialnih enot/g (μ-molov tirozina/g v 10 minutah pri 35,5 °C).

5. DOLOČANJE VSEBNOSTI PROSTEGA IN CELOTNEGA GOSIPOLA

1. Namen in področje uporabe

S to metodo je v krmnih mešanicah mogoče določiti vsebnost prostega in celotnega gosipola ter kemijsko sorodnih snovi v semenu, moki in tropinah bombaževca, kjer je njihova vsebnost nad 20 ppm.

2. Princip

Gosipol ekstrahiramo v navzočnosti 3-aminopropan-1-ola z mešanico izopropanola in heksana pri določanju prostega gosipola ali z dimetilformamidom pri določanju celotnega gosipola. Z anilinom gosipol pretvorimo v gosipol-dianilin, katerega optično gostoto izmerimo pri 440 nm.

3. Reagenti

3.1 Mešanica izopropanola in heksana: Zmešamo 60 volumskih delov izopropanola p.a. s 40 volumskimi deli n-heksana.

3.2 Topilo A: V litrsko merilno bučko vlijemo približno 500 ml mešanice izopropanola in heksana (3.1), 2 ml 3-amino-1-propanola, 8 ml ledoceta in 50 ml vode. Z mešanico izopropanola in heksana (3.1) dopolnimo do oznake. Reagent je obstojen en teden.

3.3 Topilo B: V 100-mililitrsko merilno bučko odpipetiramo 2 ml 3-amino-1-propanola in 10 ml ledoceta. Ohladimo na sobno temperaturo in dopolnimo z N,N-dimetilformamidom do oznake. Reagent je obstojen en teden.

3.4 Anilin p.a.: Če optična gostota v slepem preskusu presega 0,022, destiliramo anilin prek cinka v prahu, pri čemer zavržemo prvih in zadnjih 10 % destilata. Če reagent hranimo v rjavi, zaprti stekleni posodi v hladilniku, je obstojen več mesecev.

3.5 Standardna raztopina gosipola A: V 250-mililitrski merilni bučki raztopimo 27,9 mg gosipolacetata s topilom A (3.2) in z njim dopolnimo bučko do oznake. V 250-mililitrsko merilno bučko odpipetiramo 50 ml te raztopine in s topilom A dopolnimo bučko do oznake. Koncentracija gosipola v tej raztopini je 0,02 mg na ml. Pred uporabo pustimo raztopino eno uro na sobni temperaturi.

3.6 Standardna raztopina gosipola B: V 50-mililitrski merilni bučki raztopimo 27,9 mg gosipolacetata s topilom B (3.3) in z njim dopolnimo bučko do oznake. Koncentracija gosipola v tej raztopini je 0,5 mg na ml.

Če standardni raztopini gosipola A in B hranimo zaščiteni pred svetlobo, sta obstojni 24 ur.

4. Oprema

4.1 Mešalec: približno 35 obr./min.

4.2 Spektrofotometer.

5. Postopek

5.1 Preskusni vzorec

Količina uporabljenega preskusnega vzorca je odvisna od pričakovane vsebnosti gosipola v vzorcu. Primerneje je uporabiti majhen preskusni vzorec in relativno velik alikvot filtrata, da dobimo dovolj gosipola, s katerim omogočimo natančne fotometrične meritve. Za določanje prostega gosipola v semenu, moki in tropinah bombaževca preskusni vzorec ne sme presegati 1 g, pri krmnih mešanicah pa ga je lahko tudi 5 g. V večini primerov je najbolj primeren 10-mililitrski alikvot filtrata; vsebuje naj od 50 do 100 μg gosipola. Za določanje celotnega gosipola naj bi imeli od 0,5 do 5 g preskusnega vzorca, da bo 2-mililitrski alikvot filtrata vseboval od 40 do 200 μg gosipola.

Analizo je treba izvajati pri sobni temperaturi okrog 20 °C.

5.2 Določanje prostega gosipola

Preskusni vzorec prenesemo v 250-mililitrsko bučko z brusom, katere dno je prekrito z drobci stekla. S pipeto dodamo 50 ml topila A (3.2), bučko zamašimo in z mešalnikom mešamo eno uro. Filtriramo skozi suhi filter v majhno bučko z brusom. Med filtriranjem prekrijemo lijak z urnim steklom. V dve 25-mililitrski merilni bučki (A in B) odpipetiramo enaka alikvota filtrata, ki vsebujeta od 50 do 100 μg gosipola. Po potrebi dopolnimo do 10 ml s topilom A (3.2). Bučko (A) dopolnimo z mešanice izopropanola in heksana (3.1) do oznake. To raztopino bomo uporabili kot primerjalno raztopino, proti kateri bomo merili raztopino vzorca.

V dve drugi 25-mililitrski merilni bučki (C in D) odpipetiramo 10 ml topila A (3.2). Bučko (C) dopolnimo z mešanico izopropanola in heksana (3.1) do oznake. To raztopino bomo uporabili kot primerjalno raztopino, proti kateri bomo merili raztopino iz slepega preskusa.

V vsako od bučk (D) in (B) dodamo po 2 ml anilina (3.4). Nato ju 30 minut segrevamo na vreli vodni kopeli, da se razvije barva. Ohladimo ju na sobno temperaturo, dopolnimo z mešanico izopropanola in heksana (3.1) do oznake, premešamo in pustimo stati eno uro.

V spektrofotometru pri 440 nm in 1 cm kiveti določimo optično gostoto raztopine iz slepega preskusa (D) tako, da jo primerjamo s primerjalno raztopino (C), optično gostoto raztopine vzorca (B) pa primerjamo s primerjalno raztopino (A).

Optično gostoto raztopine iz slepega preskusa odštejemo od optične gostote raztopine vzorca (= korigirana optična gostota). S to vrednostjo izračunamo vsebnost prostega gosipola, kakor je navedeno v 6.

5.3 Določanje celotnega gosipola

V 50-mililitrsko merilno bučko prenesemo preskusni vzorec, ki vsebuje od 1 do 5 mg gosipola, in dodamo 10 ml topila B (3.3). Hkrati pripravimo slepi preskus, in to tako, da v drugo 50-mililitrsko merilno bučko vlijemo 10 ml topila B (3.3). Obe bučki segrevamo 30 minut na vreli vodni kopeli. Nato ju ohladimo na sobno temperaturo in dopolnimo z mešanico izopropanola in heksana (3.1) do oznake. Premešamo in pustimo od 10 do 15 minut, da se usede, nato filtriramo v bučko z brusom.

V dve 25-mililitrski merilni bučki odpipetiramo po 2 ml filtrata vzorca, v dve drugi 25-mililitrski bučki pa po 2 ml filtrata iz slepega preskusa. Po eno od bučk iz vsake serije dopolnimo z mešanico izopropanola in heksana (3.1) do oznake. Te raztopine bomo uporabili kot primerjalne raztopine.

V vsako od drugih dveh bučk dodamo po 2 ml anilina (3.4). Nato ju 30 minut segrevamo na vreli vodni kopeli, da se razvije barva. Ohladimo ju na sobno temperaturo, dopolnimo z mešanico izopropanola in heksana (3.1) do oznake, premešamo in pustimo stati eno uro.

Določimo optično gostoto, kakor je opisano v 5.2 za prosti gosipol. S to vrednostjo izračunamo vsebnost celotnega gosipola, kakor je navedeno v 6.

6. Izračun rezultatov

Rezultate lahko izračunamo iz specifične optične gostote (6.1) ali iz umeritvene krivulje (6.2).

6.1 Iz specifične optične gostote

Pod opisanimi pogoji bodo imele specifične optične gostote naslednje vrednosti:







Prosti gosipol: Celotni gosipol:

Vsebnost prostega ali celotnega gosipola v vzorcu izračunamo z naslednjo enačbo:

pri čemer je:

E = korigirana optična gostota, določena, kakor je opisano v 5.2;

p = preskusni vzorec, v gramih;

a = alikvot filtrata, v ml.

6.2 Z umeritvene krivulje

6.2.1 Prosti gosipol

Pripravimo dve seriji po pet 25-mililitrskih merilnih bučk. V vsako serijo odmerimo po 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 in 10,0 ml standardne raztopine gosipola A (3.5). Volumne dopolnimo do 10 ml s topilom A (3.2). Vsaki seriji dodamo 25-mililitrsko merilno bučko, ki vsebuje samo 10 ml topila A (3.2) (slepi preskus).

Bučke iz prve serije (vključno z bučko za slepi preskus) dopolnimo do 25 ml z mešanico izopropanola in heksana (3.1) (primerjalna serija).

V vsako bučko iz druge serije (vključno z bučko za slepi preskus) dodamo 2 ml anilina (3.4). Nato jih 30 minut segrevamo na vreli vodni kopeli, da se razvije barva. Ohladimo jih na sobno temperaturo, jih do oznake dopolnimo z mešanico izopropanola in heksana (3.1), premešamo in pustimo eno uro mirovati (standardna serija).

Kakor je navedeno v 5.2, določimo optično gostoto raztopin v standardni seriji v primerjavi z ustreznimi raztopinami v primerjalni seriji. Na umeritveno krivuljo nanašamo optične gostote v odvisnosti od količin gosipola (v μg).

6.2.2 Celotni gosipol

Pripravimo pet 50-mililitrskih merilnih bučk. V prvo bučko vlijemo 10 ml topila B (3.3), v druge pa po 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 in 10,0 ml standardne raztopine gosipola B (3.6). Volumne dopolnimo do 10 ml s topilom B (3.3). Nato jih 30 minut segrevamo na vreli vodni kopeli, zatem pa ohladimo na sobno temperaturo in dopolnimo bučke z mešanico izopropanola in heksana (3.1) ter premešamo.

V vsako 25-mililitrsko merilno bučko iz obeh serij odpipetiramo po 2,0 ml teh raztopin. Bučke dopolnimo do 25 ml z mešanico izopropanola in heksana (3.1) (primerjalni preskus).

Dodamo 2 ml anilina (3.4). Nato jih 30 minut segrevamo na vreli vodni kopeli, zatem pa jih ohladimo na sobno temperaturo, jih do oznake dopolnimo z mešanico izopropanola in heksana (3.1), premešamo in pustimo eno uro mirovati (standardna serija).

Kakor je navedeno v 5.2, določimo optično gostoto raztopin v standardni seriji v primerjavi z ustreznimi raztopinami v primerjalni seriji. Na umeritveno krivuljo nanašamo optične gostote v odvisnosti od količine gosipola (v μg).

6.3 Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati:

— 15 %, v relativni vrednosti, za vsebnost gosipola pod 500 ppm,

— 75 ppm, v absolutni vrednosti, za vsebnost gosipola od 500 ppm do 750 ppm,

— 10 %, v relativni vrednosti, za vsebnost gosipola nad 750 ppm.









PRILOGA II

▼M4 —————

▼B

4. DOLOČANJE VSEBNOSTI TILOZINA

– Z difuzijo na agarju –

1. Namen in področje uporabe

S to metodo je mogoče določiti vsebnost tilozina v krmi, koncentratih in premiksih pri vsebnostih nad 2 ppm.

2. Princip

Vzorec obdelamo z raztopino fosfatnega puferja (pH 8), ki smo ga poprej segreli na 80 °C, in ga nato ekstrahiramo z metanolom. Po centrifugiranju ekstrakt razredčimo in določimo njegovo antibiotično aktivnost tako, da izmerimo difuzijo tilozina na agarskem gojišču, ki je nacepljeno s Sarcina lutea. Difuzija je potrjena, ko se ob navzočnosti mikroorganizma oblikujejo inhibicijske cone. Premer teh con je neposredno sorazmeren z logaritmom koncentracije antibiotika.

3. Mikroorganizem: Sarcina lutea ATCC št. 9341

3.1 Vzdrževanje osnovnega seva

V epruveti s poševnim nanosom agarja nacepimo s Sarcina lutea gojišče (4.1)in vrednost pH naravnamo na 7,0. Inkubiramo prek noči pri približno 35°C. Kulturo hranimo v hladilniku, poševni nanos agarja pa ponovno nacepimo vsak mesec.

3.2 Priprava suspenzije bakterij

Z 2 do 3 ml fiziološke raztopine (4.4) speremo bakterije iz pravkar pripravljene epruvete s poševnim nanosom agarja (3.1). S to suspenzijo zasejemo v Rouxovi steklenici 250 ml gojišča (4.1), katerega vrednost pH je bila naravnana na 7,0. Po inkubaciji, ki traja 24 ur pri 35 °C, bakterije zberemo v 25 ml fiziološke raztopine (4.4). Premešamo in suspenzijo razredčimo, da dobimo pri 650 nm približno 75 % prepustnost svetlobe.

Suspenzija je, če jo hranimo v hladilniku, obstojna en teden.

S poprejšnjimi preskusi na ploščah z gojiščem (4.1) ugotovimo količino cepiva, ki bo pri različnih koncentracijah uporabljenega tilozina dala največje možne in še vedno povsem jasne inhibicijske cone. Gojišče nacepimo pri temperaturi od 48 do 50 °C.

4. Gojišča in reagenti

4.1 Osnovno gojišče za določanje ( 5 )







Glukoza 1 g Triptikpepton 10 g Mesni ekstrakt 1,5 g Kvasni ekstrakt 3 g Agar, odvisno od kakovosti od 10 do 20 g Destilirana voda do 1 000 ml

Za vzdrževanje osnovnega seva in pripravo suspenzije bakterij tik pred uporabo naravnamo pH na 7,0, za določanje pa pH na 8,0.

4.2 Raztopina fosfatnega puferja, pH 8







Kalijev dihidrogenfosfat KH2PO4 p.a. 0,523 g Dikalijev hidrogenfostfat K2HPO4 p.a. 16,730 g Destilirana voda do 1 000 ml

4.3 Raztopina fosfatnega puferja, pH 7







Kalijev dihidrogenfosfat KH2PO4 p.a. 5,5 g Dikalijev hidrogenfostfat K2HPO4 p.a. 13,6 g Destilirana voda do 1 000 ml

4.4 Sterilna fiziološka raztopina.

4.5 Čisti metanol.

4.6 40 % (v/v) metanol.

4.7 Mešanica (volumska) raztopine fosfatnega puferja (4.2)/čistega metanola: 60/40 po prostornini.

4.8 Standardna snov: tilozin z znano aktivnostjo.

5. Standardne raztopine

Standardno snov (4.8) sušimo 3 ure pri 60 °C v vakuumskem sušilniku (5 mm živega srebra). Natehtamo od 10 do 50 mg v merilno bučko, raztopimo v 5 ml metanola (4.5) in to raztopino razredčimo z raztopino fosfatnega puferja, pH 7 (4.3), da dobimo koncentracijo tilozina 1000 μg na ml.

Osnovno raztopino razredčimo z mešanico (4.7), da dobimo standardno delovno raztopino S8, ki vsebuje 2 μg na ml tilozina.

Nato z dodatnim razredčevanjem (1 + 1) z raztopino (4.7) pripravimo naslednje koncentracije:







S4 1 µg/ml S2 0,5 µg/ml S1 0,25 µg/ml

6. Ekstrakcija

Za koncentrate vzamemo 10 g preskusnega vzorca, za premikse in krmo pa 20 gramov. Dodamo 60 ml raztopine fosfatnega puferja, pH 8 (4.2), ki smo ga poprej segreli na 80 °C, in 2 minuti mešamo (gospodinjski mešalnik, Ultra-turrax itn.).

Pustimo mirovati 10 minut, dodamo 40 ml metanola (4.5) in mešamo še 5 minut. Ekstrakt centrifugiramo in alikvot razredčimo z mešanico (4.7), da dobimo pričakovano vsebnost tilozina 2 μg na ml (= U8). Nato z zaporednim razredčevanjem (1 + 1) z mešanico (4.7) pripravimo koncentracije U4, U2 in U1.

Pri vsebnostih pod 10 ppm uparimo ekstrakt v rotacijskem uparjalniku pri 35 °C do suhega, ostanek pa raztopimo v 40-odstotnem metanolu (4.6).

7. Metoda določanja

7.1 Nacepljenje gojišča

Osnovno gojišče za določanje (4.1) nacepimo pri 48 do 50 °C s suspenzijo bakterij (3.2) in naravnamo pH na 8,0.

7.2 Priprava plošč

Difuzijo na agarju izvajamo na ploščah s štirimi koncentracijami standardne raztopine (S8, S4, S2, S1) in s štirimi koncentracijami ekstrakta (U8, U4, U2, U1). Na vsako ploščo moramo nanesti štiri koncentracije standardne raztopine in ekstrakta.

Zato izberemo plošče, ki so dovolj velike, da v agarsko gojišče lahko vdolbemo vsaj 8 vdolbin premera od 10 do 13 mm. Izračunamo količino nacepljenega gojišča (7.1), ki je potrebna, da dobimo enakomerno plast debeline približno 2 mm. Najbolje, da preskus izvajamo na ravnih ploščah s stekleno površino, ki so opremljene z aluminijevimi ali plastičnimi obroči, premera 200 mm in višine 20 mm.

V vdolbine odpipetiramo točno odmerjene količine raztopine antibiotika, od 0,10 do 0,15 ml, odvisno od premera vdolbin.

Za vsak vzorec ponovimo difuzijo najmanj štirikrat z vsako koncentracijo, tako da pri vsakem določanju ovrednotimo 32 inhibicijskih con.

7.3 Inkubacija

Inkubacija plošč poteka čez noč pri 35 do 37 °C.

8. Vrednotenje

Izmerimo premer inhibicijskih con, po možnosti s projekcijo. Meritve vnesemo v semilogaritemski diagram, ki prikazuje logaritem koncentracij v odvisnosti od premera inhibicijskih con. Narišemo premici standardne raztopine in ekstrakta. Če ni interference, bosta premici vzporedni.

Logaritem relativne aktivnosti izračunamo z naslednjo enačbo:

Dejanska aktivnost = pričakovana aktivnost × relativna aktivnost.

9. Ponovljivost

Relativna vrednost razlike med rezultati dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati 10 %.

▼M2

5. DOLOČANJE VSEBNOSTI VIRGINIAMICINA

– z difuzijo na agarskem gojišču –

1. Namen in področje uporabe

S to metodo se določa vsebnost virginiamicina v krmi in premiksih. Spodnja meja določanja je 2 mg/kg (2 ppm) ( 6 ).

2. Princip

Vzorec se ekstrahira z metanolno raztopino Tween 80. Ekstrakt se oddekantira ali centrifugira in razredči. Njegova antibiotična aktivnost se določi tako, da se izmeri difuzija virginiamicina na agarskem gojišču, ki je nacepljen z Micrococcus luteus. Znak difuzije je oblikovanje inhibicijskih con mikroorganizma. Za premer teh con velja, da je premosorazmeren logaritmu koncentracije antibiotika v območju uporabljenih koncentracij antibiotika.

3. Mikroorganizem: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553)

3.1 Vzdrževanje osnovne kulture

Epruvete s poševnimi nanosi gojišča (4.1) se nacepijo z Micrococcus luteus in inkubirajo 24 ur pri 30 °C. Kultura se hrani v hladilniku pri 4 °C. Vsakih štirinajst dni se precepi.

3.2 Priprava suspenzije bakterij ( 7 )

Z 2 do 3 ml raztopine natrijevega klorida (4.3) se posname prirastek z agarskega gojišča (3.1). S to suspenzijo se nacepi 250 ml gojišča (4.1), ki se nahaja v Rouxovi steklenici, in se inkubira od 18 do 20 ur pri 30 °C. Kultura se posname v 25 ml natrijevega klorida (4.3) in premeša. Suspenzija se z raztopino natrijevega klorida (4.3) razredči na 1/10. Prepustnost svetlobe suspenzije mora biti okrog 75 %, izmerjena pri 650 nm v 1-centimetrski kiveti, proti raztopini natrijevega klorida (4.3). Suspenzija je obstojna en teden pri približno 4 °C.

4. Gojišča in reagenti

4.1 Gojišča kulture in preskusna gojišča ( 8 )







Mesni pepton 6,0 g Tripton 4,0 g Kvasni ekstrakt 3,0 g Mesni ekstrakt 1,5 g Glukoza 1,0 g Agar od 10,0 do 20,0 g Voda 1 000 ml pH 6,5 (po sterilizaciji).

4.2 Fosfatni pufer, pH 6







Kalijev hidrogenfosfat, K2HPO4 2,0 g Kalijev dihidrogenfosfat, KH2PO4 8,0 g Voda do 1 000 ml

4.3 Raztopina natrijevega klorida 0,8 % (m/v): v vodi se raztopi 8 g natrijevega klorida in razredči na 1 000 ml; nato se sterilizira.

4.4 Metanol.

4.5 Mešanica fosfatnega pufra (4.2)/metanola (4.4): 80/20 (v/v).

4.6 Metanolna raztopina Tween 80 0,5 % (m/v): 5 g Tween 80 se raztopi v metanolu (4.4) in razredči z metanolom do 1 000 ml.

4.7 Standardna substanca: virginiamicin z znano aktivnostjo.

5. Standardne raztopine

Točno natehtana količina standardne substance (4.7) se raztopi v metanolu (4.4) in razredči z metanolom (4.4), da se dobi osnovna raztopina, ki vsebuje 1 000 μg virginiamicina na ml.

Raztopina je stabilna do pet dni, če se hrani v zaprti posodi pri 4 °C.

Z zaporednim razredčevanjem z mešanico (4.5) se iz te osnovne raztopine pripravijo naslednje raztopine:







s8 1 μg/ml s4 0,5 μg/ml s2 0,25 μg/ml s1 0,125 μg/ml

6. Priprava ekstrakta in preskusnih raztopin

6.1 Ekstrakcija

6.1.1 Proizvodi z vsebnostjo virginiamicina do 100 mg/kg

Natehta se 50 g vzorca, doda 200 ml raztopine (4.6) in stresa 30 minut. Pusti se, da se mešanica usede, ali centrifugira, nato se odpipetira 20 ml bistre raztopine nad usedlino in pusti, da izpari do približno 5 ml v rotacijskem uparjalniku pri temperaturi, ki ne presega 40 °C. Ostanek se razredči z mešanico (4.5), da se dobi pričakovana vsebnost virginiamicina 1 μg/ml (= u8).

6.1.2 Proizvodi z vsebnostjo virginiamicina, ki presega 100 mg/kg

Natehta se količina vzorca, ki ne presega 10,0 g in vsebuje od 1 do 50 mg virginiamicina, doda se 100 ml raztopine (4.6) in stresa 30 minut. Pusti se, da se mešanica usede, ali se centrifugira, nato se bistra raztopina nad usedlino razredči z mešanico (4.5), da se dobi pričakovana vsebnost virginiamicina 1 μg/ml (= u1).

6.2 Preskusne raztopine

Z zaporednim razredčevanjem (1 + 1) z mešanico (4.5) se iz raztopine u8 pripravijo raztopine u4 (pričakovana vsebnost: 0,5 μg/ml), u2 (pričakovana vsebnost: 0,25 μg/ml), u2 (pričakovana vsebnost: 0,125 μg/ml).

7. Postopek preskusa

7.1. Nacepljenje preskusnega gojišča

Preskusno gojišče (4.1) se nacepi s suspenzijo bakterij (3.2) pri približno 50 °C. S predhodnimi preskusi na ploščah z gojiščem (4.1) se določi količina suspenzije bakterij, ki je potrebna za nastanek največjih in najbistrejših inhibicijskih con z različnimi koncentracijami virginiamicina.

7.2 Priprava plošč

Difuzija skozi agar se izvaja na ploščah s štirimi koncentracijami standardne raztopine (s8, s4, s2 in s1) in s štirimi koncentracijami preskusne raztopine (u8, u4, u2 in u1). Na vsako ploščo je treba nujno nanesti vse štiri koncentracije ekstrakta in standardne raztopine. V ta namen se izberejo plošče, ki so dovolj velike za najmanj osem vdolbin s premerom od 10 do 13 mm z razdaljo najmanj 30 mm med središči, ki jih je treba vdolbsti v agarsko gojišče. Preskus se lahko izvaja na steklenih ploščah, na katerih je obroč iz obdelanega aluminija ali plastike s premerom 200 mm in višino 20 mm.

Na plošče se nanese določena količina gojišča (4.1), ki je nacepljeno skladno s točko 7.1, da se dobi približno 2 mm debela plast (60 ml za ploščo s premerom 200 mm). Počaka se, da se površina utrdi. Nato se izdolbejo vdolbine in vanje se nanesejo natanko odmerjeni volumni preskusnih in standardnih raztopin (med 0,10 in 0,15 ml na vdolbino, odvisno od premera). Vsaka koncentracija se uporabi najmanj štirikrat, tako da se pri vsakem preskusu ovrednoti 32 inhibicijskih con.

7.3 Inkubacija

Plošče se inkubirajo od 16 do 18 ur pri 30 ± 2 °C.

8. Vrednotenje

Premer inhibicijskih con se izmeri s točnostjo 0,1 mm. Srednje vrednosti za vsako koncentracijo se vnesejo v semilogaritemski diagram, ki prikazuje logaritem koncentracij v odvisnosti od premerov inhibicijskih con. Na diagramu se izrišeta premici z najboljšim potekom, tako za standardno raztopino kot tudi za ekstrakt, kakor je navedeno na primeru spodaj:

„Najboljša“ točka za najmanjšo vrednost standarda (SL) se določi po enačbi:

(a)

„Najboljša“ točka za največjo vrednost standarda (SH) se določi po enačbi:

(b)

Na podoben način se izračunata „najboljši“ točki za najmanjšo (UL) in največjo (UH) vrednost ekstrakta, in sicer tako, da se u1, u2, u4 in u8 v zgornjih enačbah zamenjajo s s1, s2, s4 in s8.

Izračunani vrednosti SL in SH se vneseta na isti diagram in povežeta, da se dobi premica z „najboljšim“ potekom za standardno raztopino. Na podoben način se vneseta vrednosti UL in UH ter povežeta, da se dobi premica z „najboljšim“ potekom za ekstrakt.

Če ni interferenc, morata biti premici vzporedni. Iz praktičnih razlogov se premici lahko štejeta za vzporedni, če se vrednosti (SH-SL) ter (UH-UL) ne razlikujejo za več kot 10 % od njihove srednje vrednosti.

Če premici nista vzporedni, se lahko izločita bodisi u1 in s1 ali u8 in s8, in se vrednosti SL, SH, UL in UH izračunajo z alternativnima enačbama, s katerima se dobita alternativni premici z „najboljšim“ potekom:







(a′) SL = ali (b′) SH = ali

in podobno velja tudi za UL in UH. Tudi v tem primeru veljajo ista merila za vzporednost. Če je bil rezultat izračunan s tremi vrednostmi, je treba to navesti v končnem poročilu.

Kadar se šteje, da sta premici vzporedni, se izračuna logaritem relativne aktivnosti (log A), in sicer z eno od naslednjih enačb, odvisno od tega, ali so bile za oceno vzporednosti uporabljene tri ali štiri vrednosti.

Za štiri vrednosti

(c)

Za tri vrednosti

(d)

ali

(d′)

Aktivnost ekstrakta vzorca = aktivnost ustreznega standarda × A

(u8 = s8 × A)

Če relativna aktivnost presega območje od 0,5 do 2,0, se preskus ponovi tako, da se ustrezno prilagodijo koncentracije ekstrakta, ali če to ni mogoče, prilagodijo standardne raztopine. Kadar relativne aktivnosti ni mogoče privesti do zahtevanega območja, je treba vsak dobljeni rezultat obravnavati kot približek in to tudi navesti v končnem poročilu.

Kadar se šteje, da premici nista vzporedni, se določanje ponovi. Če vzporednost še vedno ni dosežena, se določanje šteje za nezadovoljivo.

Rezultat se izrazi v milligramih virginiamicina na kilogram krme.

9. Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, ki jih na istem vzorcu izvaja isti analitik, ne sme presegati:

— 2 mg/kg, v absolutni vrednosti, za vsebnosti virginiamicina do 10 mg/kg,

— 20 % glede na največjo vrednost za vsebnosti od 10 do 25 mg/kg,

— 5 mg/kg, v absolutni vrednosti, za vsebnosti od 25 do 50 mg/kg,

— 10 % glede na največjo vrednost za vsebnosti nad 50 mg/kg.