Zoznam a opis metód analýzy uvedených v článku 120g prvom pododseku nariadenia Rady (ES) č. 1234/2007 (1)

[uverejnený v súlade s článkom 15 ods. 2 nariadenia Komisie (ES) č. 606/2009 z 10. júla 2009 (2) ]

2010/C 43/01

V nižšie uvedenej tabuľke sa uvádza zoznam metód analýzy, ktoré sa uplatňujú na kontrolu limitov a požiadaviek ustanovených v právnych predpisoch Spoločenstva na výrobu vinárskych výrobkov. V treťom stĺpci sa pri každom príslušnom parametri nachádza odkaz na zodpovedajúcu metódu analýzy opísanú v „Zbierke medzinárodných metód analýzy vín a muštov“ OIV v poslednom vydaní (2009), ktoré je k dispozícii k dátumu tohto uverejnenia. Pri každom parametri sa opisujú len referenčné metódy („Typ I“ alebo „Typ II“ podľa klasifikácie OIV) s výnimkou parametrov, pre ktoré nie sú v súčasnosti schválenými metódami typu I alebo typu II. Opis metód sa nachádza v prílohe k oznámeniu.

Upozornenie:

V Zbierke OIV sa v prílohe A oddiele I ustanovuje vymedzenie rôznych typov metód analýzy, a najmä typu I (Metóda referenčného kritéria), typu II (Referenčná metóda) a typu IV (Dočasná metóda).

Metódy analýzy olova a kadmia sa teraz opisujú v nariadení Komisie (ES) č. 333/2007 z 28. marca 2007 (príloha C-3) (3). Okrem toho, v nariadení (ES) č. 401/2006 z 23. februára 2006 (4) sa v prílohe II.4 ustanovujú všeobecné kritéria metód analýzy ochratoxínu A. Pre túto látku nie je teda potrebné opísať osobitnú metódu pre vinárske výrobky.

ZOZNAM METÓD ANALÝZY

Orgány OIV aktualizujú opis niektorých metód analýz. Tieto opisy sa uverejnia v ďalšom oznámení Komisie hneď po tom, ako OIV uverejní aktualizovaný text vo vydaní Zbierky medzinárodných metód analýzy vín a muštov na rok 2010.

(1) Ú. v. EÚ L 299, 16.11.2007.

(2) Ú. v. EÚ L 193, 24.7.2009, s. 1.

(3) Ú. v. EÚ L 88, 29.3.2007, s. 29.

(4) Ú. v. EÚ L 70, 9.3.2006, s. 12.

PRÍLOHA

OBSAH

1 MERNÁ HMOTNOSŤ PRI 20 °C A RELATÍVNA HUSTOTA PRI 20 °C (OIV - AS2 - 01- MASVOL) – Metóda typu I

2 STANOVENIE OBSAHU CUKRU V MUŠTOCH, ZAHUSTENÝCH MUŠTOCH A REKTIFIKOVANÝCH ZAHUSTENÝCH MUŠTOCH POMOCOU REFRAKTOMETRIE (OIV AS202- SUCREF) – Metóda typu I

3 CELKOVÝ SUCHÝ EXTRAKT (OIV-AS-2-03-EXTSEC) Celková sušina – Metóda Typu I

4 STANOVENIE POMERU IZOTOPOV 18O/16O VODY OBSIAHNUTEJ VO VÍNE (OIV-AS-2-09-MOUO18) – Metóda Typu II

5 FOLINOV-CIOCALTEUOV INDEX (OIV-AS-2-10-INDFOL) – Metóda Typu IV

6 GLUKÓZA A FRUKTÓZA (OIV-AS-311-02-GLUFRU) – Metóda Typu II

7 MERANIE CUKROV METÓDOU HPLC (SACHARÓZA) (OIV-AS-311-03-SUCRES) – Metóda Typu II

8 DETEKCIA OBOHATENIA HROZNOVÝCH MUŠTOV, ZAHUSTENÝCH HROZNOVÝCH MUŠTOV, REKTIFIKOVANÝCH ZAHUSTENÝCH HROZNOVÝCH MUŠTOV A VÍN POMOCOU NUKLEÁRNEJ MAGNETICKEJ REZONANCIE DEUTÉRIA (OIV-AS-311-05-ENRRMN) – Metóda Typu I

9 OBSAH ALKOHOLU V OBJ. % (OIV-AS-312-01-TALVOL) – Metóda Typu I

10 STANOVENIE POMERU IZOTOPOV 13 C/ 12 C VO VÍNNOM ETANOLE ALEBO ETANOLE ZÍSKANOM KVASENÍM MUŠTOV, ZAHUSTENÝCH MUŠTOV ALEBO REKTIFIKOVANÝCH ZAHUSTENÝCH MUŠTOV IZOTOPOVOU HMOTNOSTNOU SPEKTROMETRIOU (OIV-AS-312-06-ETHANO) – Metóda Typu II

11 CELKOVÁ ACIDITA (OIV-AS-313-01-ACITOT) – Metóda Typu I

12 OBSAH PRCHAVÝCH KYSELÍN (OIV-AS-313-02-ACIVOL) – Metóda Typu I

13 KYSELINA CITRÓNOVÁ (OIV -AS-313-09-ACIENZ) – Metóda typu II

14 KYSELINA SORBOVÁ (OIV-AS-313-14-ACISOR) – Metóda Typu IV

15 pH (OIV-AS-313-15-PH) – Metóda Typu I

16 SIMULTÁNNE MERANIE KYSELINY L - ASKORBOVEJ A KYSELINY D-IZOASKORBOVEJ METÓDOU HPLC A UV DETEKCIE (OIV-AS-313-22-ACASCO) – Metóda Typu II

17 OXID UHLIČITÝ (OIV-AS-314-01-DIOCAR) – Metóda Typu II

18 MERANIE OXIDU UHLIČITÉHO VO VÍNE TLAKOMERNOU METÓDOU (OIV-AS314-04-CO2MAN) – Metóda Typu II

19 MERANIE PRETLAKU ŠUMIVÝCH A PERLIVÝCH VÍN (OIV-AS-314-02-SURPRES) – Metóda Typu I

20 Meranie lyzozýmu vo víne pomocou HPLC (OIV-AS-315-14) – Metóda Typu IV

21 SÍRANY (OIV- AS-321-05-SULFAT) – Metóda Typu II

22 ŽELEZO (OIV-AS-322-05-FER) – Metóda Typu IV

23 MEĎ (OIV-AS 322-06) – Metóda Typu IV

24 OXID SIRIČITÝ (OIV-AS-323-04-DIOSU) – Metóda Typu II

1 MERNÁ HMOTNOSŤ PRI 20 °C A RELATÍVNA HUSTOTA PRI 20 °C (OIV - AS2 - 01- MASVOL) – METÓDA TYPU I

1. VYMEDZENIA

Merná hmotnosť je hmotnosť na jednotkový objem vína alebo muštu pri 20 °C. Vyjadruje sa v gramoch na mililiter a jej symbol je ρ20 °C.

Relatívna hustota pri 20 °C alebo hustota 20 °C/20 °C je pomer hmotnosti určitého objemu vína alebo muštu pri 20 °C k hmotnosti toho istého objemu vody pri tej istej teplote, vyjadrený desatinným číslom. Jej symbol je

2. PRINCÍP METÓD

Merná hmotnosť a relatívna hustota pri 20 °C sa stanovujú na pokusnej vzorke:

buď pyknometriou: referenčná metóda,

alebo meraním hustoty pomocou hydrostatických váh alebo elektronickým meraním hustoty.

Poznámka:

V prípade potreby veľmi presného merania sa musí merná hmotnosť opraviť pre pôsobenie oxidu siričitého.

ρ20 °C = ρ′20 °C – 0,0006 × S ρ20 °C = opravená merná hmotnosť ρ′20 °C = konštatovaná merná hmotnosť S = celkové množstvo oxidu siričitého v g/l

3. PREDBEŽNÉ SPRACOVANIE VZORKY

Ak víno alebo mušt obsahujú významnejšie množstvá oxidu uhličitého, väčšina z neho sa odstráni zatrasením 250 ml vína vo fľaštičke o objeme 1 000 ml alebo filtráciou pri zníženom tlaku cez 2 g bavlny umiestnenej v predlžovacej rúrke.

4. REFERENČNÁ METÓDA

4.1. Prístroje

Bežné laboratórne vybavenie, najmä:

4.1.1. Pyknometer (1) z pyrexového skla o objeme približne 100 ml s odstrániteľným teplomerom so zábrusom, kalibrovaným na desatiny stupňa od 10 do 30 °C. Tento teplomer musí byť normalizovaný (obrázok 1).

Pyknometer sa skladá z 25 mm dlhej bočnej rúrky, ktorej vnútorný priemer je maximálne 1 mm, ukončenej zábrusnou kužeľovou časťou. Táto bočná rúrka môže byť uzavretá „zátkou so zásobníkom“ zloženou z kužeľovej zábrusnej rúrky a ukončenej kapilárou. Táto zátka slúži ako expanzná komora.

Oba zábrusy na prístroji musia byť vypracované veľmi dôkladne.

4.1.2. Tarovacia nádobka s tým istým vonkajším objemom (s presnosťou najmenej na 1 ml) ako pyknometer a s hmotnosťou rovnajúcou sa hmotnosti pyknometra naplneného tekutinou s hustotou 1,01 (roztok chloridu sodného 2,0 hmotn. % ).

Tepelne izolujúci obal, ktorý sa presne prispôsobí telu pyknometra.

4.1.3. Váha s dvoma miskami s rozsahom minimálne 300 g, vážiaca s presnosťou na desatinu miligramu

alebo

váha s jednou miskou s rozsahom minimálne 200 g, vážiaca s presnosťou na desatinu miligramu.

4.2. Kalibrovanie pyknometra

Kalibrovanie pyknometra sa skladá z určenia týchto vlastností:

— hmotnosť obalu (tara) prázdneho pyknometra,

— objem pyknometra pri 20 °C,

— hmotnosť pyknometra naplneného vodou pri 20 °C.

4.2.1. Použitie dvojmiskových váh

Umiestnite tarovaciu nádobku na ľavú misku váhy a čistý a suchý pyknometer so „zátkou so zásobníkom“ na pravú misku. Na misku, na ktorej je položený pyknometer, pridávajte označené závažia, až kým nedosiahnete rovnovážny stav: nech je to p gramov.

Starostlivo naplňte pyknometer destilovanou vodou o teplote okolitého prostredia a umiestnite teplomer. Pyknometer starostlivo utrite a umiestnite ho do tepelne izolujúceho obalu. Prevracaním ním traste, až kým sa údaj na teplomere neustáli. Presne zarovnajte hladinu s horným okrajom bočnej rúrky. Utrite túto bočnú rúrku, nasaďte zátku so zásobníkom, starostlivo odčítajte teplotu t °C a eventuálne ju opravte o nepresnosť mierky teplomera. Odvážte pyknometer naplnený vodou, čo bude hmotnosť p′ v gramoch potrebná na dosiahnutie rovnováhy.

Výpočty

Tarovanie prázdneho pyknometra: Hmotnosť obalu (tara) prázdneho pyknometra= p + m m= hmotnosť vzduchu v pyknometri m= 0,0012 (p – p′).

Objem pri 20 °C: V20 °C= (p + m – p′) × Ft Ft= faktor vybratý z tabuľky I pre teplotu t °C V20 °C musí byť známy s presnosťou ± 0, 001 ml

Hmotnosť vody pri 20 °C: M20 °C= V20 °C × 0,998203 0,998203= merná hmotnosť vody pri 20 °C.

4.2.2. Použitie jednomiskových váh

Určite:

— hmotnosť čistého a suchého pyknometra: P

— hmotnosť pyknometra naplneného vodou pri t °C: P1 podľa postupu opísaného v bode 4.2.1

— hmotnosť tarovacej nádobky T0

Výpočty

Tarovanie prázdneho pyknometra:

Hmotnosť obalu (tara) prázdneho pyknometra= P – m m= hmotnosť vzduchu v pyknometri m= 0,0012 (P1 – P)

Objem pri 20 °C: V20 °C= [P1 – (P – m)] × Ft Ft= faktor odčítaný z tabuľky I pre teplotu t °C

Objem pri 20 °C musí byť známy s presnosťou ± 0, 001 ml.

Hmotnosť vody pri 20 °C: M20 °C= V20 °C × 0,998203 0,998203= merná hmotnosť vody pri 20 °C.

4.3. Metóda merania

4.3.1. Použitie dvojmiskových váh

Podľa postupu opísaného v bode 4.2.1 odvážte pyknometer naplnený pripravenou skúšobnou vzorkou (bod 3).

Nech ρ″ je hmotnosť v gramoch potrebná na dosiahnutie rovnováhy pri t °C

Hmotnosť tekutiny obsiahnutej v pyknometri = ρ + m – ρ″.

Zdanlivá merná hmotnosť pri t °C:

ρt °C = (p + m – p″)/V20 °C

Pomocou nižšie uvedených korekčných tabuliek a v závislosti od povahy meranej tekutiny vypočítajte mernú hmotnosť pri 20 °C: suché víno (tabuľka II), prírodný alebo zahustený mušt (tabuľka III), sladké víno (tabuľka IV).

Hustota vína 20 °C/20 °C sa vypočíta vydelením jeho mernej hmotnosti pri 20 °C číslom 0,998203.

4.3.2. Použitie jednomiskových váh

Odvážte tarovaciu nádobku. Nech je jej hmotnosť T1.

Vypočítajte dT = T1 – T0

Hmotnosť prázdneho pyknometra v čase merania = P – m + dT.

V súlade s postupmi opísanými v bode 4.2.1 odvážte pyknometer naplnený pripravenou skúšobnou vzorkou (bod 3). Nech P2 je jeho hmotnosť pri t °C.

Hmotnosť tekutiny obsiahnutej v pyknometri pri t °C = P2 – (P – m + dT)

Zdanlivá merná hmotnosť pri t °C:

ρt °C = (P2 – (P – m + dT))/V20 °C

Vypočítajte mernú hmotnosť meranej tekutiny pri 20 °C: suché víno, prírodný alebo zahustený mušt, sladké víno, ako sa uvádza v bode 4.3.1.

Hustota 20 °C/20 °C sa vypočíta vydelením mernej hmotnosti pri 20 °C číslom 0,998203.

4.3.3. Opakovateľnosť meraní mernej hmotnosti:

pre suché a polosladké vína: r = 0,00010

pre sladké vína: r = 0,00018

4.3.4. Reprodukovateľnosť meraní mernej hmotnosti:

pre suché a polosladké vína: R = 0,00037

pre sladké vína: R = 0,00045

TABUĽKA I

Faktory F,

ktorými je potrebné vynásobiť hmotnosť vody obsiahnutej v pyknometri z pyrexového skla pri t °C na výpočet objemu pyknometra pri 20 °C

[Vychádzať z tabuľky I prílohy II k metóde AS2 - 01 opísanej v Zbierke medzinárodných metód analýzy vín a muštov OIV]

TABUĽKA II

Teplotné korekcie c na mernú hmotnosť suchých vín a odalkoholizovaných suchých vín, nameranú v pyknometri z pyrexového skla pri t °C, tak aby mohla byť upravená na 20 °C

[Vychádzať z tabuľky II prílohy II k metóde AS2 - 01 opísanej v Zbierke medzinárodných metód analýzy vín a muštov OIV]

ρ20 = ρ t ± (c/1 000) – ak t °C je nižšia ako 20 °C + ak t o C je vyššia ako 20 °C

TABUĽKA III

Teplotné korekcie c na mernú hmotnosť prírodných muštov a zahustených muštov, nameranú v pyknometri z pyrexového skla pri t °C, tak aby mohla byť upravená na 20 °C

[Vychádzať z tabuľky III prílohy II k metóde AS2 - 01 opísanej v Zbierke medzinárodných metód analýzy vín a muštov OIV]

ρ20 = ρ t ± (c/1 000) – ak t °C je nižšia ako 20 °C + ak t °C je vyššia ako 20 °C

TABUĽKA IV

Teplotné korekcie c na mernú hustotu vín s obsahom aspoň 13 objemových % alkoholu, obsahujúcich zvyškový cukor, nameranú v pyknometri z pyrexového skla pri t °C, tak aby mohla byť upravená na 20 °C

[Vychádzať z tabuľky IV prílohy II k metóde AS2 - 01 opísanej v Zbierke medzinárodných metód analýzy vín a muštov OIV]

ρ20 = ρ t ± (c/1 000) – ak t °C je nižšia ako 20 °C + ak t °C je vyššia ako 20 °C

2 STANOVENIE OBSAHU CUKRU V MUŠTOCH, ZAHUSTENÝCH MUŠTOCH A REKTIFIKOVANÝCH ZAHUSTENÝCH MUŠTOCH POMOCOU REFRAKTOMETRIE (OIV AS202- SUCREF) – METÓDA TYPU I

1. PRINCÍP METÓDY

Index lomu pri 20 °C vyjadrený ako absolútna hodnota alebo ako hmotnostné percento sacharózy je uvedený v príslušnej tabuľke na získanie obsahu cukru v gramoch na liter a v gramoch na kilogram muštu, zahusteného muštu a rektifikovaného zahusteného muštu.

2. PRÍSTROJE

2.1. Abbeho refraktometer

Použitý refraktometer musí byť vybavený stupnicou označujúcou:

— buď hmotnostné percento sacharózy s presnosťou 0,1 %,

— alebo indexy lomu na štyri desatinné miesta.

Refraktometer musí byť vybavený teplomerom so stupnicou najmenej od + 15 °C do + 25 °C a zariadením na obeh vody umožňujúcim uskutočniť merania pri teplote 20 °C ± 5 °C.

Návod na obsluhu pre tento prístroj sa musí striktne dodržiavať, najmä pokiaľ ide o kalibráciu a svetelný zdroj.

3. PRÍPRAVA VZORKY

3.1 Mušt a zahustený mušt

V prípade potreby prefiltrujte mušt cez suchú gázu zloženú na štyri časti a po odstránení prvých kvapiek z prefiltrovanej tekutiny stanovte výsledok z tohto filtrovaného produktu.

3.2 Rektifikovaný zahustený mušt

V závislosti od stupňa zahustenia použite buď rektifikovaný zahustený mušt alebo roztok získaný zmiešaním presne odvážených 200 g rektifikovaného zahusteného muštu s vodou, pričom výsledná váha musí byť presne 500 g.

4. POSTUP

Zabezpečte, aby bola teplota vzorky približne 20 °C. Položte malú testovaciu vzorku na spodný hranol refraktometra, a keďže sú hranoly umiestnené tesne jeden vedľa druhého, dbajte na to, aby táto testovacia vzorka rovnomerne pokrývala sklenenú plochu. Meranie vykonajte podľa návodu na obsluhu pre používaný prístroj.

Odčítajte hmotnostné percento sacharózy s presnosťou na 0,1 %, alebo zistite index lomu na štyri desatinné miesta.

Pre každú pripravenú vzorku vykonajte najmenej dve stanovenia. Odčítajte teplotu t °C.

5. VÝPOČTY

5.1. Korekcia teploty

5.1.1. Prístroje so stupnicou v hmotnostných % sacharózy: na korekciu teploty použite tabuľku I.

5.1.2. Prístroje so stupnicou v indexe lomu: index nameraný pri t °C zaznamenajte do tabuľky II, aby ste získali (stĺpec 1) hodnotu zodpovedajúcu hodnote hmotnostných percent sacharózy pri t °C. Pomocou tabuľky I sa táto hodnota upraví na teplotu a vyjadrí sa pri 20 °C.

5.2. Obsah cukru v mušte a v zahustenom mušte

V tabuľke II odčítajte hmotnostné percento sacharózy pri 20 °C s cieľom získať obsah cukru v gramoch na liter a v gramoch na kilogram. Obsah cukru je vyjadrený ako invertný cukor s presnosťou na jedno desatinné miesto.

5.3. Obsah cukru v rektifikovanom zahustenom mušte

V tabuľke III odčítajte hmotnostné percento sacharózy pri 20 °C s cieľom získať obsah cukru v gramoch na liter a v gramoch na kilogram. Obsah cukru je vyjadrený ako invertný cukor s presnosťou na jedno desatinné miesto.

Ak bol predmetom merania zriedený rektifikovaný zahustený mušt, vynásobte výsledok faktorom zriedenia.

5.4 Index lomu muštu, zahusteného muštu a rektifikovaného zahusteného muštu

V tabuľke II odčítajte hmotnostné percento sacharózy pri 20 °C s cieľom získať index lomu pri 20 °C. Tento index je vyjadrený s presnosťou na štyri desatinné miesta.

Poznámka: Potenciálny alkoholometrický titer muštu, zahusteného muštu a rektifikovaného zahusteného muštu sa môže určiť pomocou ekvivalenčnej tabuľky uvedenej v prílohe I k nariadeniu Komisie (ES) č. 1623/2000 z 25. júla 2000 (Ú. v. ES L 194, 31.7.2000).

TABUĽKA I

Korekcia, ktorá sa musí urobiť, ak sa hmotnostné percento sacharózy stanovilo pri inej teplote ako 20 °C

[Vychádzať z tabuľky I prílohy k metóde AS2 - 02 opísanej v Zbierke medzinárodných metód analýzy vín a muštov OIV]

TABUĽKA II

Tabuľka udávajúca obsah cukru v mušte a zahustenom mušte v gramoch na liter a v gramoch na kilogram, stanovený pomocou refraktometra so stupnicou buď v hmotnostných percentách sacharózy pri 20 °C alebo ako index lomu pri 20 °C. Udáva sa aj merná hmotnosť pri 20 °C.

[Vychádzať z tabuľky II prílohy k metóde AS2 - 02 opísanej v Zbierke medzinárodných metód analýzy vín a muštov OIV]

TABUĽKA III

Tabuľka udávajúca obsah cukru v zahustenom rektifikovanom mušte v gramoch na liter a v gramoch na kilogram, stanovený pomocou refraktometra so stupnicou buď v hmotnostných percentách sacharózy pri 20 °C alebo ako index lomu pri 20 °C. Udáva sa aj merná hmotnosť pri 20 °C.

[Vychádzať z tabuľky III prílohy k metóde AS2 - 02 opísanej v Zbierke medzinárodných metód analýzy vín a muštov OIV]

3 CELKOVÝ SUCHÝ EXTRAKT (OIV-AS-2-03-EXTSEC) CELKOVÁ SUŠINA – METÓDA TYPU I

1. VYMEDZENIE

Celkový suchý extrakt alebo celková sušina zahŕňa všetky látky, ktoré za stanovených fyzikálnych podmienok nie sú prchavé. Tieto fyzikálne podmienky sa musia stanoviť tak, aby boli látky, z ktorých sa skladá tento extrakt, vystavené čo najmenším možným zmenám.

Bezcukorný extrakt je celkový suchý extrakt znížený o celkový obsah cukrov.

Redukovaný extrakt je celkový suchý extrakt znížený o celkový obsah cukrov presahujúci 1 g/l, o síran draselný presahujúci 1 g/l, o manitol, ak nejaký obsahuje, a o všetky chemické látky, ktoré mohli byť eventuálne pridané do vína.

Zvyškový extrakt je bezcukorný extrakt znížený o stanovený obsah kyselín vyjadrený obsahom kyseliny vínnej.

Extrakt je vyjadrený v gramoch na liter a musí sa stanoviť s presnosťou na 0,5 g.

2. PRINCÍP METÓDY

[Orgány OIV aktualizujú opis tejto metódy analýzy. Tento opis sa uverejní v ďalšom oznámení Komisie hneď po tom, ako OIV uverejní aktualizovaný text vo vydaní Zbierky medzinárodných metód analýzy vín a muštov na rok 2010. Pre informáciu môžete počas obdobia, kým dôjde k jeho uverejneniu, vychádzať z kapitoly 4 prílohy k nariadeniu Komisie (EHS) č. 2676/90.]

4 STANOVENIE POMERU IZOTOPOV 18O/16O VODY OBSIAHNUTEJ VO VÍNE (OIV-AS-2-09-MOUO18) – METÓDA TYPU II

(p.m.)

[Orgány OIV aktualizujú opis tejto metódy analýzy. Tento opis sa uverejní v ďalšom oznámení Komisie hneď po tom, ako OIV uverejní aktualizovaný text vo vydaní Zbierky medzinárodných metód analýzy vín a muštov na rok 2010. Pre informáciu môžete počas obdobia, kým dôjde k jeho uverejneniu, vychádzať z kapitoly 43 prílohy k nariadeniu Komisie (EHS) č. 2676/90.]

5 FOLINOV-CIOCALTEUOV INDEX (OIV-AS-2-10-INDFOL) – METÓDA TYPU IV

1. VYMEDZENIE

Folinov-Ciocalteuov index je výsledok získaný uplatnením nižšie opísanej metódy.

2. PRINCÍP

Všetky fenolové zlúčeniny obsiahnuté vo víne sa oxidujú Folinovým-Ciocalteuovým činidlom. Toto činidlo sa pripraví zo zmesi kyseliny fosforečno-volfrámovej (H3PW12O40) a kyseliny fosforečno-molybdénovej (H3PMo12O40), ktorá sa po oxidácii fenolov zredukuje na zmes modrých oxidov volfrámu (W8O23) a molybdénu (Mo8O23).

Vzniknuté modré sfarbenie má maximálnu absorpciu v oblasti 750 nm a je priamo úmerné celkovému obsahu pôvodne prítomných fenolových zlúčenín.

3. ČINIDLÁ

Tieto činidlá musia mať kvalitu analytických činidiel. Použiť sa musí destilovaná voda alebo voda rovnocennej čistoty.

3.1. Folinovo-Ciocalteuovo činidlo

Toto činidlo je komerčne dostupné vo forme pripravenej na použitie. Môže sa pripraviť takto: 100 g volfrámanu sodného (Na2WO4·2H2O) a 25 g molybdénanu sodného (Na2MoO4·2H2O) sa rozpustí v 700 ml destilovanej vody. Pridá sa 50 ml 85 % kyseliny fosforečnej (ρ20 = 1,71 g/ml) a 100 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej (ρ20 = 1,19 g/ml). Nechá sa zovrieť a zahrieva sa pri použití spätného chladiča 10 hodín. Potom sa pridá 150 g síranu lítneho (Li2SO4·H2O), niekoľko kvapiek brómu a opäť sa nechá zovrieť a zahrieva sa ešte raz 15 minút. Nechá sa ochladiť a doplní sa destilovanou vodou do jedného litra.

3.2. Roztok bezvodného uhličitanu sodného (Na2CO3) - 20 % (m/v).

4. PRÍSTROJE

Bežné laboratórne vybavenie, najmä:

4.1. 100 ml odmerné banky.

4.2. Spektrofotometer umožňujúci meranie pri 750 nm.

5. POSTUP

5.1. Červené víno

Do 100 ml odmernej banky (bod 4.1) vlejte v uvedenom poradí:

1 ml červeného vína, zriedeného v pomere 1:5

50 ml destilovanej vody,

5 ml Folinovho-Ciocalteuovho činidla (3.1)

20 ml roztoku uhličitanu sodného (3.2)

Doplní sa destilovanou vodou do 100 ml.

Zhomogenizujú sa pretrepaním. Počká sa 30 minút, kým sa reakcia stabilizuje. Stanoví sa hodnota absorbancie pri 750 nm cez kyvety s dĺžkou optickej dráhy 1 cm voči referenčnej vzorke pripravenej z destilovanej vody namiesto vína.

Ak absorbancia nie je okolo 0,3, vzorka vína sa primerane zriedi.

5.2. Biele víno

Uskutoční sa rovnaký postup za rovnakých podmienok s 1 ml nezriedeného vína.

5.3. Rektifikované zahustené mušty

5.3.1. Príprava vzorky

Použije sa roztok, ktorého obsah cukru je 25 hmotn. % (25o Brix) a ktorý sa pripraví tak, ako je opísané v kapitole „pH“ v bode 4.1.2.

5.3.2. Meranie

Postupuje sa, ako je opísané v prípade červeného vína (bod 5.1) s použitím 5 ml vzorky pripravenej podľa bodu 5.3.1, a zmeria sa absorbancia voči referenčnej vzorke pripravenej s 5 ml 25 hmotn. % roztoku invertného cukru.

6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

6.1. Spôsob výpočtu

Výsledok sa vyjadrí vo forme indexu získaného vynásobením absorbancie číslom 100 v prípade červeného vína zriedeného v pomere 1:5 (alebo faktorom zodpovedajúcim inému zriedeniu) a číslom 20 v prípade bielych vín. V prípade rektifikovaných zahustených muštov sa absorbancia vynásobí číslom 16.

6.2. Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch stanovení uskutočnených súbežne alebo tesne za sebou tým istým analytikom nesmie byť väčší ako 1.

Dobrá opakovateľnosť výsledkov sa dosiahne použitím starostlivo vyčistených prístrojov (odmerné banky a spektrofotometrické kyvety).

6 GLUKÓZA A FRUKTÓZA (OIV-AS-311-02-GLUFRU) – METÓDA TYPU II

1. VYMEDZENIE

Glukóza a fruktóza sa môžu merať samostatne pomocou enzýmovej metódy, s výhradným cieľom stanoviť pomer glukóza/fruktóza.

2. PRINCÍP

Glukóza a fruktóza sú fosforylované adenozín-trifosfátom (ATP) v enzymatickej reakcii katalyzovanej hexokinázou (HK), pričom vzniká glukóza-6-fosfát (G6P) a fruktóza-6-fosfát (F6P):

glukóza + ATP ←→G6P + ADP

fruktóza + ATP←→F6P + ADP

Glukóza-6-fosfát sa najprv oxiduje nikotínamid-adenín-dinukleotid-fosfátom (NADP) za prítomnosti enzýmu glukóza-6-fosfát-dehydrogenáza (G6PDH) na glukonát-6-fosfát. Množstvo vzniknutého redukovaného nikotínamid-adenín-dinukloeotid-fosfátu (NADPH) zodpovedá množstvu glukóza-6-fosfátu, a teda množstvu glukózy.

G6P + NADP+ Glukonát-6-fosfát + NADPH + H+

Redukovaný nikotínamid-adenín-dinukleotid-fosfát sa stanovuje z jeho absorpcie pri 340 nm.

Pri skončení tejto reakcie sa fruktóza-6-fosfát premení pôsobením fosfoglukóza-izomerázy (PGI) na glukóza-6-fosfát:

F6P G6P

Glukóza-6-fosfát znova reaguje s nikotínamid-adenín-dinukleotid-fosfátom za vzniku glukonát-6-fosfátu a redukovaného nikotínamid-adenín-dinukleotid-fosfátu, ktorý sa stanoví následne.

3. PRÍSTROJE

— Spektrofotometer umožňujúci uskutočniť meranie pri 340 nm, čo je vlnová dĺžka, pri ktorej sa dosahuje maximálna miera absorpcie NADPH. Keďže sa jedná o absolútne stanovenia (t.j. nepoužíva sa kalibračná krivka, ale štandardizácia sa uskutočňuje s využitím extinkčného koeficientu NADPH), je potrebné overiť presnosť vlnových dĺžok a hodnôt absorbancie určených prístrojom. Ak nie je dostupný takýto spektrofotometer, môže sa použiť spektrofotometer s nespojitým spektrom, ktorý umožňuje uskutočniť merania pri 334 nm alebo pri 365 nm.

— Sklené kyvety s dĺžkou optickej dráhy 1 cm alebo jednorazové kyvety.

— Pipety na použitie v enzýmových testoch - 0,02 - 0,05 - 0,1 - 0,2 ml.

4. ČINIDLÁ

4.1. Roztok č. 1: tlmivý roztok (2,2',2''-nitrilotrietanol 0,3 M; pH = 7,6; 4x10–3M v Mg2+): v 150 ml dvakrát destilovanej vody sa rozpustí 11,2 g hydrochloridu 2,2',2''-nitrilotrietanolu (C2H5)3N, HCl) a 0,2 g Mg SO4·7 H2O, pridajú sa približne 4 ml roztoku 5 M hydroxidu sodného (NaOH), aby sa dosiahlo pH rovné 7,6 a objem 200 ml.

Tento tlmivý roztok sa uchováva počas 4 týždňov pri teplote + 4 °C.

4.2. Roztok č. 2: roztok nikotínamid-adenín-dinukleotid-fosfátu (približne 11,5x10–3 M): 50 mg dinátrium-nikotínamid-adenín-dinukleotid-fosfátu sa rozpustí v 5 ml dvakrát destilovanej vody.

Tento roztok sa uchováva štyri týždne pri teplote + 4 °C.

4.3. Roztok č. 3: roztok adenozín-5'-trifosfátu (približne 81x10-3 M): 250 mg dinátrium-adenozín-5'-trifosfátu a 250 mg hydrogenuhličitanu sodného (NaHCO3) sa rozpustí v 5 ml dvakrát destilovanej vody.

Tento roztok sa uchováva štyri týždne pri teplote + 4 °C.

4.4. Roztok č. 4: Hexokináza/glukóza-6-fosfát-dehydrogenáza: zmieša sa 0,5 ml hexokinázy (2 mg proteínu/ml alebo 280 U/ml) a 0,5 ml glukóza-6-fosfát-dehydrogenázy (1 mg proteínu/ml).

Tento roztok sa uchováva rok pri teplote + 4 °C.

4.5. Roztok č. 5: Fosfoglukóza-izomeráza (2 mg proteínu/ml alebo 700 U/ml). Suspenzia sa používa nezriedená.

Tento roztok sa uchováva rok pri teplote + 4 °C.

Poznámka:

Všetky činidlá potrebné na toto meranie sú komerčne dostupné.

5. POSTUP

5.1. Príprava vzorky

V závislosti od odhadnutého množstva glukózy + fruktózy na liter sa vzorka zriedi takto:

Meranie pri 340 a 334 nm Meranie pri 365 nm Zriedenie vodou Zrieďovací faktor F do 0,4 g/l do 0,8 g/l — — do 4,0 g/l do 8,0 g/l 1 + 9 10 do 10,0 g/l do 20,0 g/l 1 + 24 25 do 20,0 g/l do 40,0 g/l 1 + 49 50 do 40,0 g/l do 80,0 g/l 1 + 99 100 nad 40,0 g/l naf 80,0 g/l 1 + 999 1 000

5.2. Meranie

Pri meraní na spektrofotometri nastavenom na vlnovú dĺžku 340 nm sa merania uskutočnia s použitím vzduchu (bez kyvety v optickej dráhe) alebo vody ako referenčného média.

Teplota medzi 20 až 25 °C.

Do dvoch kyviet s dĺžkou optickej dráhy 1 cm sa umiestni:

Referenčná vzorka Kyveta s meranou vzorkou Roztok 1 (4.1) (zohriaty na 20 °C) 2,50 ml 2,50 ml Roztok 2 (4.2) 0,10 ml 0,10 ml Roztok 3 (4.3) 0,10 ml 0,10 ml Meraná vzorka 0,20 ml Dvakrát destilovaná voda 0,20 ml

Obsah kyviet sa premieša a približne po troch minútach sa odčíta absorbancia roztokov (A1). Reakcia sa začne pridaním:

Roztok 4 (4.4) 0,02 ml 0,02 ml

Obsah kyviet sa premieša, nechá sa 15 minút stáť, odčíta sa absorbancia a po ďalších dvoch minútach sa overí zastavenie reakcie (A2).

Ihneď sa pridá:

Roztok 5 (4.5) 0,02 ml 0,02 ml

Obsah kyviet sa premieša, po 10 minútach sa vykoná odčítanie, po ďalších dvoch minútach sa overí zastavenie reakcie (A3).

Vypočítajú sa rozdiely absorbancií:

A2 – A1 zodpovedá glukóze,

A3 – A2 zodpovedá fruktóze,

pre referenčnú kyvetu a kyvetu s meranou vzorkou.

Vypočítajú sa rozdiely absorbancie medzi referenčnou kyvetou (ΔAR) a kyvetou s meranou vzorkou (ΔAS) a stanoví sa:

pre glukózu: ΔAG = ΔAS – ΔAT

pre fruktózu: ΔAF = ΔAS – ΔAT

Poznámka:

Čas potrebný na ukončenie aktivity enzýmu sa môže líšiť medzi jednotlivými dávkami. Vyššie uvedený čas je len na informatívne účely. Odporúča sa stanoviť čas pre každú dávku.

5.3. Vyjadrenie výsledkov

5.3.1. Výpočet

Všeobecný vzorec na výpočet koncentrácie je:

C= ((V x PM)/(ε x d x v x 1 000)) Δ A (g/l)

V= objem testovacieho roztoku (ml)

v= objem vzorky (ml)

PM= molekulová hmotnosť meranej látky

d= dĺžka optickej dráhy kyvety (cm)

ε= absorpčný koeficient NADPH pri 340 nm = 6,3 (mmol -1 × l × cm-1)

V= 2,92 ml pri meraní glukózy

V= 2,94 ml pri meraní fruktózy

v= 0,20 ml

PM= 180

d= 1.

Výsledok:

pre glukózu: C (g/l) = 0,417 × ΔAG

pre fruktózu: C (g/l) = 0,420 × ΔAF

Ak počas prípravy bola vzorka zriedená, výsledok sa vynásobí zrieďovacím faktorom F.

Poznámka:

Ak sa meranie uskutočnilo pri vlnovej dĺžke 334 alebo 365 nm, získajú sa tieto výsledky:

— meranie pri 334 nm: ε = 6,2 (mmole–1 × l × cm–1) pre glukózu: Cg/l = 0,425 × Δ AG pre fruktózu: C (g/l) = 0,428 × ΔAF

— meranie pri 365 nm: ε = 3,4 (mmole–1 × l × cm–1) pre glukózu: C(g/l) = 0,773 × ΔAG pre fruktózu: C (g/l) = 0,778 × ΔAF

5.3.2. Opakovateľnosť (r)

r= 0,056 xi

5.3.3. Reprodukovateľnosť (R)

R= 0,12 + 0,076 xi

xi= obsah glukózy alebo fruktózy v g/l.

7 MERANIE CUKROV METÓDOU HPLC (SACHARÓZA) (OIV-AS-311-03-SUCRES) – METÓDA TYPU II

(p.m.)

[Orgány OIV aktualizujú opis tejto metódy analýzy. Tento opis sa uverejní v ďalšom oznámení Komisie hneď po tom, ako OIV uverejní aktualizovaný text vo vydaní Zbierky medzinárodných metód analýzy vín a muštov na rok 2010. Pre informáciu môžete počas obdobia, kým dôjde k jeho uverejneniu, vychádzať z kapitoly 6 ods. 3 prílohy k nariadeniu Komisie (EHS) č. 2676/90.]

8 DETEKCIA OBOHATENIA HROZNOVÝCH MUŠTOV, ZAHUSTENÝCH HROZNOVÝCH MUŠTOV, REKTIFIKOVANÝCH ZAHUSTENÝCH HROZNOVÝCH MUŠTOV A VÍN POMOCOU NUKLEÁRNEJ MAGNETICKEJ REZONANCIE DEUTÉRIA (OIV-AS-311-05-ENRRMN) – METÓDA TYPU I

(p.m.)

[Vedecké orgány OIV aktualizujú opis tejto metódy analýzy. Tento opis sa uverejní v oznámení Komisie hneď po tom, ako Valné zhromaždenie OIV prijme konečný text. Pre informáciu môžete počas obdobia, kým sa prijme toto rozhodnutie, vychádzať z kapitoly 8 prílohy k nariadeniu Komisie (EHS) č. 2676/90.]

9 OBSAH ALKOHOLU V OBJ. % (OIV-AS-312-01-TALVOL) – METÓDA TYPU I

(p.m.)

[Orgány OIV aktualizujú opis týchto metód analýzy. Tieto metódy sa uverejnia v ďalšom oznámení Komisie hneď po tom, ako OIV uverejní aktualizovaný text vo vydaní Zbierky medzinárodných metód analýzy vín a muštov na rok 2010. Pre informáciu môžete počas obdobia, kým dôjde k jeho uverejneniu, vychádzať z kapitoly 3 prílohy k nariadeniu Komisie (EHS) č. 2676/90.]

10 STANOVENIE POMERU IZOTOPOV 13C/12C VO VÍNNOM ETANOLE ALEBO ETANOLE ZÍSKANOM KVASENÍM MUŠTOV, ZAHUSTENÝCH MUŠTOV ALEBO REKTIFIKOVANÝCH ZAHUSTENÝCH MUŠTOV IZOTOPOVOU HMOTNOSTNOU SPEKTROMETRIOU (OIV-AS-312-06-ETHANO) – METÓDA TYPU II

1. OBLASŤ POUŽITIA

Metóda umožňuje meranie pomeru izotopov 13C/12C vo vínnom etanole a etanole získanom kvasením vinárskych produktov (muštov, zahustených muštov, rektifikovaných zahustených muštov).

2. REFERENČNÉ NORMY

ISO: 5725:1994 „Presnosť (správnosť a zhodnosť) metód a výsledkov merania – Stanovenie opakovateľnosti a reprodukovateľnosti normalizovanej metódy merania pomocou medzilaboratórnych pokusov“ V-PDB : Viedenský belemnit Pee-Dee (RPDB = 0,0112372) Metóda OIV AS-311-O5-ENRRMN „Zisťovanie obohatenia muštov, zahustených muštov, rektifikovaných zahustených muštov a vín meraním nukleárnej magnetickej rezonancie deutéria (SNIF-NMR)“

3. TERMÍNY A VYMEDZENIA

13C/12C : Pomer izotopov uhlíka 13 (13C) k uhlíku 12 (12C) v danej vzorke. δ13C : Obsah uhlíka 13 (13C) vyjadrený v promile (‰). SNIF-NMR : Stanovenie podielov jednotlivého prirodzeného izotopu nukleárnou magnetickou rezonanciou V-PDB : Viedenský belemnit Pee-Dee. PDB, primárny referenčný materiál na meranie prirodzených zmien obsahu izotopu uhlíka 13, bol uhličitan vápenatý pochádzajúci z lomu na kriedový belemnit z útvaru Pee Dee v Južnej Karolíne (USA). Jeho pomer izotopov 13C/12C, čiže RPDB, je RPDB = 0,0112372. Zásoby PDB sú už dávno vyčerpané, ale zostal primárnym referenčným materiálom na vyjadrenie prirodzených zmien obsahu izotopu uhlíka 13, na ktorý sa kalibrujú referenčné materiály dostupné v Medzinárodnej agentúre pre atómovú energiu (IAEA) vo Viedni (Rakúsko). Izotopové údaje pre prirodzene sa vyskytujúci uhlík 13 sa teda dohodou vyjadrujú v pomere k V-PDB. m/z : Pomer hmotnosti k náboju.

4. PRINCÍP

Pri fotosyntéze prebieha asimilácia oxidu uhličitého rastlinami dvomi základnými formami metabolizmu, a to metabolizmom C3 (Calvinovým cyklom) a metabolizmom C4 (podľa Hatcha a Slacka). Tieto dva mechanizmy fotosyntézy prinášajú odlišný typ podielu izotopov. Produkty z rastlín C4, ako sú cukry a alkohol získaný kvasením, majú teda vyšší obsah uhlíka 13 než podobné produkty z rastlín C3. Väčšina rastlín, ako sú vinič a cukrová repa, patria do skupiny C3. Cukrová trstina a kukurica patria do skupiny C4. Meranie obsahu uhlíka 13 teda umožňuje zistiť a vyhodnotiť cukry pochádzajúce z rastlín skupiny C4 (cukrová trstina alebo izoglukóza z kukurice), pridávané do produktov pochádzajúcich z hrozna (hroznový mušt, víno atď.). Informácie o obsahu uhlíka 13 v spojení s informáciami získanými zo SNIF-NMR umožňujú zároveň stanoviť pridané množstvá zmesí cukrov alebo alkoholov z rastlín C3 a C4.

Obsah uhlíka 13 sa stanoví v oxide uhličitom získanom dokonalým spálením vzorky. Zastúpenie základných izotopomerov s molekulovými hmotnosťami 44 (12C16O2), 45 (13C16O2 a 12C17O16O) a 46 (12C16O18O), ktoré vznikajú z rôznych možných kombinácií izotopov 18O, 17O, 16O, 13C a 12C, sa stanoví z iontových prúdov meraných na troch rôznych kolektoroch hmotnostného izotopového spektrometra. Príspevok izotopomerov 13C17O16O a 12C17O2 sa môže vzhľadom na ich veľmi nízke zastúpenie zanedbať. Iontový prúd pre m/z = 45 sa koriguje na príspevok 12C17O16O, ktorý sa vypočíta podľa prúdovej intenzity nameranej pre m/z = 46, pričom sa zohľadní relatívne zastúpenie 18O a 17O (Craigova korekcia). Porovnanie s referenčnou vzorkou kalibrovanou na medzinárodný referenčný materiál V-PDB umožňuje výpočet obsahu uhlíka 13 na relatívnej stupnici δ13C.

5. ČINIDLÁ

Materiály a spotrebný materiál závisia od prístroja (6), ktorý používa laboratórium. Všeobecne používané systémy sa zakladajú na prístroji na elementárnu analýzu. Tento prístroj môže byť vybavený tak, aby umožňoval vnášanie vzoriek v uzavretých kovových kapsulách alebo vstrekovanie kvapalných vzoriek cez septum pomocou injekčnej striekačky.

V závislosti od typu použitého prístroja sa môžu použiť tieto referenčné materiály, činidlá a spotrebný materiál:

— referenčné materiály

— dostupné v IAEA: Názov Materiál δ13C vzhľadom na V-PDB (9) — IAEA-CH-6 sacharóza –10,4 ‰ — IAEA-CH-7 polyetylén –31,8 ‰ — NBS22 olej –29,7 ‰ — USGS24 grafit –16,1 ‰

— dostupné v Ústave pre referenčné materiály a merania (IRMM) v Geele (Belgicko) Názov Materiál δ13C vzhľadom na V-PDB (9) — CRM/BCR 656 vínny alkohol –26,93 ‰ — CRM/BCR 657 glukóza –10,75 ‰ — CRM/BCR 660 vodný roztok alkoholu (12 obj. %) –26,72 ‰

— štandardná pracovná vzorka so známym pomerom 13C/12C kalibrovaná na medzinárodné referenčné materiály,

— nasleduje informatívny zoznam spotrebných materiálov pre systémy s kontinuálnym prietokom: — hélium na analýzu (CAS 07440-59-7), — kyslík na analýzu (CAS 07782-44-7), — oxid uhličitý na analýzu používaný ako sekundárny referenčný plyn pre obsah uhlíka 13 (CAS 00124-38-9), — oxidačné činidlo pre pec spaľovacieho systému, napríklad oxid meďnatý na elementárnu analýzu (CAS 1317-38-0), — sušiaci prostriedok na odstraňovanie vody, ktorá vzniká spaľovaním, napríklad anhydron na elementárnu analýzu (chloristan horečnatý, CAS 10034-81-8). (Nie je nevyhnutný pre prístroje vybavené zariadením na odstraňovanie vody, napríklad vymrazovacími odlučovačmi alebo selektívne priepustnými kapilárami).

6. PRÍSTROJE A ZARIADENIE

6.1. Hmotnostný spektrometer izotopových pomerov (IRMS)

Hmotnostný spektrometer izotopových pomerov (IRMS) umožňujúci stanoviť relatívny obsah 13C v prirodzene sa vyskytujúcom plynnom CO2 s vnútornou presnosťou 0,05 ‰ alebo lepšou, vyjadrený ako pomerná hodnota (bod 9). Vnútorná presnosť je tu definovaná ako rozdiel medzi dvoma meraniami tej istej vzorky CO2. Hmotnostný spektrometer izotopových pomerov je bežne vybavený trojitým kolektorom pre simultánne meranie intenzít pre m/z = 44, 45 a 46. Hmotnostný spektrometer izotopových pomerov musí byť vybavený buď dvojitým vstupom pre striedavé meranie neznámej vzorky a referenčnej vzorky, alebo musí využívať integrovaný systém, ktorý vykonáva kvantitatívne spaľovanie vzoriek a oddeľuje oxid uhličitý od ostatných produktov spaľovania pred meraním na hmotnostnom spektrometri.

6.2. Spaľovací prístroj

Spaľovací prístroj schopný kvantitatívne premeniť etanol na oxid uhličitý a eliminovať všetky ostatné produkty spaľovania vrátane vody bez frakcionácie izotopov. Tento prístroj môže byť buď systém s nepretržitým prietokom začlenený do hmotnostného spektrometra (bod 6.2.1.), alebo samostatný spaľovací systém (bod 6.2.2.). Prístrojom sa musí dať dosiahnuť prinajmenšom taká presnosť, aká sa uvádza v bode 11.

6.2.1. Systémy s nepretržitým prietokom

Takým systémom je buď prístroj na elementárnu analýzu, alebo plynový chromatograf s napojeným spaľovacím systémom.

Pre systémy vybavené na vkladanie vzoriek v kovových kapsulách je potrebné toto laboratórne zariadenie:

— kalibrovaná mikrostriekačka alebo mikropipeta s vhodnými hrotmi (ihlami),

— váhy vážiace s presnosťou na 1 μg alebo vyššou,

— kliešte na vkladanie vzoriek do kapsúl,

— cínové kapsule pre kvapalné vzorky,

— cínové kapsule pre pevné vzorky.

Poznámka:

Na zníženie rizika odparenia etanolových vzoriek sa môže do kapsúl vložiť absorbčný materiál (napríklad Chromosorb W 45-60 mesh). Predtým je ale potrebné overiť meraním bez vzorky, či neobsahuje veľké množstvo uhlíka, ktoré by mohlo ovplyvniť výsledok.

Ak sa používa prístroj na elementárnu analýzu vybavený vstrekovacím zariadením na kvapaliny alebo v prípade prípravného systému pre spaľovaciu chromatografiu, je potrebné toto laboratórne zariadenie:

— injekčná striekačka na kvapaliny,

— banky so vzduchotesným uzáverom a inertnou priehradkou.

Vyššie uvedené laboratórne zariadenie je len príkladom a môže sa nahradiť iným vybavením s rovnocennými úžitkovými vlastnosťami podľa druhu spaľovacieho zariadenia a hmotnostného spektrometra, ktoré laboratórium používa.

6.2.2. Samostatné prípravné systémy

V prípade samostatných prípravných systémov sa vzorky oxidu uhličitého, ktoré vzniknú spálením vzoriek určených na analýzu, a referenčná vzorka zachytia do baniek. Banky sa potom umiestnia do dvojitého vstupného systému spektrometra s cieľom vykonať izotopovú analýzu. Môže sa používať niekoľko spaľovacích prístrojov opísaných v literatúre:

— uzavretý spaľovací systém naplnený cirkulujúcim kyslíkom,

— prístroj na elementárnu analýzu s prúdom hélia a kyslíka,

— zatavená sklenená banka, ktorá obsahuje oxid meďnatý ako oxidačné činidlo.

7. PRÍPRAVA VZORIEK NA TESTOVANIE

Pred stanovením pomeru izotopov sa musí z vína extrahovať etanol. Táto extrakcia sa robí destiláciou vína podľa postupu opísaného v bode 3.1 metódy SNIF-NMR.

V prípade hroznových muštov, zahustených hroznových muštov a rektifikovaných zahustených hroznových muštov musia cukry najprv skvasiť na etanol podľa bodu 3.2 metódy SNIF-NMR (OIV - MA-E-AS311-05-ENRRMN).

8. POSTUP

Všetky prípravné kroky sa musia vykonať bez akejkoľvek významnej straty etanolu odparením, ktorá by mohla spôsobiť zmenu izotopového zloženia vzorky.

Nasledujúci popis sa týka postupov, ktoré sa všeobecne používajú na spaľovanie etanolových vzoriek pomocou komerčných automatických spaľovacích systémov. Na prípravu oxidu uhličitého na izotopovú analýzu sa môže použiť aj akákoľvek iná metóda, ak sa zabezpečí, že sa vzorka etanolu premení kvantitatívne na oxid uhličitý bez strát etanolu odparovaním.

Experimentálny postup založený na použití prístroja na elementárnu analýzu:

a) uloženie vzoriek do kapsúl: — použite čisté kapsule, kliešte a prípravnú misku, — vezmite kliešťami kapsulu vhodnej veľkosti, — mikropipetou vneste do kapsule príslušné množstvo kvapaliny, — Poznámka: Na získanie 2 mg uhlíka je potrebné množstvo 3,84 mg čistého etanolu alebo 4,17 mg destilátu s obsahom alkoholu 92 hmotn. %. Príslušné množstvo destilátu sa musí vypočítať rovnakým spôsobom podľa množstva uhlíka, ktoré je potrebné vzhľadom na citlivosť hmotnostného spektrometra. — kapsulu uzavrite kliešťami, — každá kapsula musí byť dokonale uzavretá. V opačnom prípade sa musí vyradiť a pripraviť nová, — pre každú vzorku sa musia pripraviť dve kapsule, — kapsule umiestnite na príslušné miesto na miske automatického vzorkovacieho zariadenia prístroja na elementárnu analýzu. Každá kapsula musí byť starostlivo označená poradovým číslom, — na začiatok a koniec každej série vzoriek systematicky vkladajte kapsule, ktoré obsahujú pracovné referenčné vzorky, — do série vzoriek pravidelne vkladajte kontrolné vzorky,

b) kontrola a nastavenie prístrojov na elementárnu analýzu a hmotnostnú spektrometriu: — nastavte teplotu pecí prístroja na elementárnu analýzu a prietoky hélia a kyslíka na optimálne spálenie vzorky, — skontrolujte systém elementárnej analýzy a hmotnostnej spektrometrie na netesnosti (napríklad kontrolou iontového prúdu, kde m/z = 28 pre N2), — nastavte hmotnostný spektrometer tak, aby meral intenzitu iontových prúdov, kde m/z = 44, 45 a 46, — pred meraním vzoriek skontrolujte systém pomocou známych kontrolných vzoriek,

c) vykonanie série meraní: Vzorky umiestnené na automatickom vzorkovacom zariadení prístroja na elementárnu analýzu (alebo na chromatografe) sa vkladajú postupne. Oxid uhličitý zo spaľovania každej vzorky sa vymýva do hmotnostného spektrometra, ktorý meria iontové prúdy. Počítač pripojený k zariadeniu zaznamenáva inzenzitu iontových prúdov a vypočítava hodnotu δ pre každú vzorku (bod 9).

9. VÝPOČET

Cieľom tejto metódy je zmerať pomer izotopov 13C/12C etanolu extrahovaného z vína alebo z produktov získaných kvasením hrozna. Pomer izotopov 13C/12C je možné vyjadriť jeho odchýlkou od pracovnej referenčnej vzorky. Potom sa vypočíta izotopická odchýlka uhlíka 13 (δ13C) na stupnici delta v promile (δ/1 000) porovnaním výsledkov meranej vzorky s výsledkami pracovnej referenčnej vzorky, vopred kalibrovanej na základe primárnej medzinárodnej normy (V-PDB). Hodnoty δ13C sa vyjadria v pomere k pracovnej referenčnej vzorke takto:

δ13C vz/ref ‰ = 1 000 × (Rvz – Rref)/Rref

kde Rvz a Rref sú príslušné pomery izotopov 13C/12C vo vzorke a v oxide uhličitom, ktorý sa použil ako referenčný plyn.

Hodnoty δ13C sa teda vo vzťahu k V-PDB vyjadrujú takto:

δ13Cvz/V-PDB ‰ = δ13Cvz/ref + δ13Cref/V-PDB + (δ13Cvz/ref × δ13Cref/V-PDB)/1 000,

kde δ13Cref/V-PDB je vopred stanovená izotopická odchýlka pracovnej referenčnej vzorky od V-PDB.

Pri meraní môžu vzniknúť malé odchýlky spôsobené zmenami podmienok prístrojového vybavenia. V tomto prípade musia byť hodnoty δ13C vzoriek opravené podľa rozdielu medzi hodnotou δ13C nameranou pre referenčnú pracovnú vzorku a jej skutočnou hodnotou, pričom sa táto vzorka vopred kalibrovala na V-PDB porovnaním s jedným z medzinárodných referenčných materiálov. Dá sa predpokladať, že medzi dvoma meraniami referenčnej pracovnej vzorky bude odchýlka, a teda aj oprava, ktorú je potrebné použiť na výsledky získané zo vzoriek, lineárna. Referenčná pracovná vzorka sa musí merať vždy na začiatku a na konci každej série vzoriek. Opravu potom možno vypočítať pre každú vzorku lineárnou interpoláciou.

10. ZABEZPEČOVANIE KVALITY A KONTROLA

Skontrolujte, či sa hodnota 13C pre pracovnú referenčnú vzorku nelíši od prípustnej hodnoty o viac ako 0,5 ‰. V opačnom prípade je potrebné skontrolovať nastavenie spektrometra, prípadne ho opäť nastaviť.

Pre každú vzorku skontrolujte, či je rozdiel výsledkov oboch kapsúl meraných po sebe menší než 0,3 ‰. Konečný výsledok pre určitú vzorku je teda priemerná hodnota z oboch kapsúl. Ak je odchýlka väčšia než 0,3 ‰, musí sa meranie zopakovať.

Kontroly správnosti merania môžu byť založené na intenzite iontového prúdu, kde m/z = 44, ktorý je priamo úmerný množstvu uhlíka vstreknutého do prístroja na elementárnu analýzu. V štandardných podmienkach by mala byť intenzita tohto iontového prúdu pre analyzované vzorky takmer konštantná. Významná odchýlka môže znamenať odparenie etanolu (napríklad v dôsledku nedokonalého utesnenia kapsule) alebo nestabilitu prístroja na elementárnu analýzu či hmotnostného spektrometra.

11. PRACOVNÉ CHARAKTERISTIKY METÓDY (PRESNOSŤ)

Prvá spoločná štúdia (bod 11.1) sa urobila na destilátoch, ktoré obsahovali alkohol vínneho pôvodu a alkohol z cukrovej trstiny a cukrovej repy, ako aj rôzne zmesi alkoholov týchto troch pôvodov. Keďže sa v tejto štúdii nezohľadnil proces destilácie, zobrali sa do úvahy aj ďalšie informácie z iných medzilaboratórnych štúdií vína (bod 11.2), a najmä séria skúšok odbornej úrovne izotopických meraní (bod 11.3). Výsledky ukázali, že rôzne systémy destilácie použité za uspokojivých podmienok a najmä za podmienok uplatniteľných na merania SNIF-NMR nespôsobujú významné odchýlky pri stanovení hodnoty δ13C vo vínnom etanole. Parametre presnosti sledované v prípade vína sú takmer zhodné s parametrami získanými v spoločnej štúdii na destilátoch (bod 11.1).

11.1. Spoločná štúdia na destilátoch

Rok medzilaboratórnych skúšok: 1996 Počet laboratórií: 20 Počet vzoriek: 6 vzoriek v dvakrát slepom porovnaní Predmet rozboru: δ13C etanolu





Kód vzorky Alkohol vínneho pôvodu Alkohol z repy Alkohol z trstiny A & G 80 % 10 % 10 % B & C 90 % 10 % 0 % D & F 0 % 100 % 0 % E & I 90 % 0 % 10 % H & K 100 % 0 % 0 % J & L 0 % 0 % 100 %





Vzorky A/G B/C D/F E/I H/K J/L Počet laboratórií po vylúčení odchylných výsledkov 19 18 17 19 19 19 Počet akceptovaných výsledkov 38 36 34 38 38 38 Stredná hodnota (δ13C) ‰ –25,32 –26,75 –27,79 –25,26 –26,63 –12,54 Sr 2 0,0064 0,0077 0,0031 0,0127 0,0069 0,0041 Štandardná odchýlka za podmienok opakovateľnosti (Sr) ‰ 0,08 0,09 0,06 0,11 0,08 0,06 Medza opakovateľnosti r (2,8 x Sr) ‰ 0,22 0,25 0,16 0,32 0,23 0,18 SR 2 0,0389 0,0309 0,0382 0,0459 0,0316 0,0584 Štandardná odchýlka za podmienok reprodukovateľnosti (SR) ‰ 0,20 0,18 0,20 0,21 0,18 0,24 Medza reprodukovateľnosti R (2,8 x SR) ‰ 0,55 0,49 0,55 0,60 0,50 0,68

11.2. Medzilaboratórna štúdia na dvoch vínach a jednom alkohole

Rok medzilaboratórnych skúšok: 1996 Počet laboratórií 14 na destiláciu vín, z ktorých sedem meralo aj δ13C etanolu vo víne 8 na meranie δ13C vzorky alkoholu Počet vzoriek: 3 (biele víno s obsahom alkoholu 9,3 obj. %, biele víno s obsahom alkoholu 9,6 obj. % a alkohol s alkoholometrickým titrom 93 hmotn. %) Predmet rozboru: δ13C etanolu





Vzorky Červené víno Biele víno Alkohol Počet laboratórií 7 7 8 Počet akceptovaných výsledkov 7 7 8 Stredná hodnota (δ 13C) ‰ –26,20 –26,20 –25,08 Druhá mocnina štandardnej odchýlky za podmienok reprodukovateľnosti SR 2 0,0525 0,0740 0,0962 Štandardná odchýlka za podmienok reprodukovateľnosti (SR) ‰ 0,23 0,27 0,31 Medza reprodukovateľnosti R (2,8 x SR) ‰ 0,64 0,76 0,87

Zúčastnené laboratóriá používali rôzne systémy destilácie. Stanovenia pomeru izotopov δ13C uskutočnené v jedinom laboratóriu na všetkých destilátoch vrátených účastníkmi neukazujú žiadnu abnormálnu hodnotu ani hodnotu, ktorá by sa významne odchyľovala od stredných hodnôt. Odchýlka vo výsledkoch (S2 = 0,0059) je porovnateľná s druhou mocninou štandardnej odchýlky opakovateľnosti Sr 2 zo spoločnej štúdie o destilátoch (bod 11.1).

11.3. Výsledky skúšok na monitorovanie odbornej úrovne výkonu izotopických testov

Od decembra 1994 sa pravidelne usporadúvajú medzinárodné skúšky odbornej úrovne na stanovovanie pomerov izotopov pre vína a alkoholy (destiláty s obsahom alkoholu 96 obj. %). Výsledky umožňujú zúčastneným laboratóriám kontrolovať kvalitu ich analýz. Štatistické výsledky umožňujú posúdiť odchýlky stanovení za podmienok reprodukovateľnosti, a tým aj odhadnúť parametre odchýlky a medzu reprodukovateľnosti. Výsledky získané na stanovenie δ13C etanolu z vína a destilátov sa uvádzajú v tejto tabuľke:

Dátum Vína Destiláty N SR SR 2 R N SR SR 2 R December 1994 6 0,210 0,044 0,59 6 0,151 0,023 0,42 Jún 1995 8 0,133 0,018 0,37 8 0,147 0,021 0,41 December 1995 7 0,075 0,006 0,21 8 0,115 0,013 0,32 Marec 1996 9 0,249 0,062 0,70 11 0,278 0,077 0,78 Jún 1996 8 0,127 0,016 0,36 8 0,189 0,036 0,53 September 1996 10 0,147 0,022 0,41 11 0,224 0,050 0,63 December 1996 10 0,330 0,109 0,92 9 0,057 0,003 0,16 Marec 1997 10 0,069 0,005 0,19 8 0,059 0,003 0,16 Jún 1997 11 0,280 0,079 0,78 11 0,175 0,031 0,49 September 1997 12 0,237 0,056 0,66 11 0,203 0,041 0,57 December 1997 11 0,127 0,016 0,36 12 0,156 0,024 0,44 Marec 1998 12 0,285 0,081 0,80 13 0,245 0,060 0,69 Jún 1998 12 0,182 0,033 0,51 12 0,263 0,069 0,74 September 1998 11 0,264 0,070 0,74 12 0,327 0,107 0,91 Vážený priemer 0,215 0,046 0,60 0,209 0,044 0,59 N : počet zúčastnených laboratórií

11.4. Medze opakovateľnosti a reprodukovateľnosti

Na základe údajov z rôznych medzilaboratórnych skúšok uvedených v tabuľkách vyššie je teda možné stanoviť pre túto metódu (vrátane fázy destilácie) tieto medze opakovateľnosti a reprodukovateľnosti:

Medza opakovateľnosti r: 0,24

Medza reprodukovateľnosti R: 0,6.

11 CELKOVÁ ACIDITA (OIV-AS-313-01-ACITOT) – METÓDA TYPU I

1. VYMEDZENIE

Celková acidita je suma všetkých titrovateľných kyselín pri titrácii do pH 7 pridaním titračného alkalického roztoku.

Oxid uhličitý nie je zahrnutý do celkovej acidity.

2. PRINCÍP METÓDY

Potenciometrická titrácia alebo titrácia na brómtymolovú modrú ako indikátor ukončenia reakcie porovnaním so štandardom zafarbenia.

3. ČINIDLÁ

3.1. Tlmivý roztok s pH 7,0:

dihydrogenfosforečnan draselný KH2PO4: 107,3 g

1 M roztok hydroxidu sodného (NaOH): 500 ml

doplnený vodou do: 1 000 ml.

Môžu sa tiež použiť komerčné referenčné tlmivé roztoky.

3.2. 0,1 M roztok hydroxidu sodného (NaOH)

3.3. Roztok brómtymolovej modrej s koncentráciou 4 g/l

Brómtymolová modrá (C27H28Br2O5S) … 4 g Neutrálny etanol, 96 obj. % … 200 ml Rozpustí sa a pridá sa: Voda zbavená CO2 … 200 ml Hydroxid sodný - roztok 1 M doplnený vodou na vytvorenie modrozeleného sfarbenia (pH 7) … 7,5 ml doplnený vodou do … 1 000 ml

4. PRÍSTROJE

4.1. Vodná výveva

4.2. Vákuová banka, 500 ml

4.3. Potenciometer so stupnicou v hodnotách pH a elektródy. Sklená elektróda sa musí uchovávať v destilovanej vode. Elektróda kombinácie kalomelu s nasýteným roztokom chloridu sodného sa musí uchovávať v nasýtenom roztoku chloridu draselného. Najčastejšie sa používa kombinovaná elektróda: tá sa musí uchovávať v destilovanej vode.

4.4. Odmerné valce s objemom 50 ml (na víno) a 100 ml (na rektifikovaný zahustený mušt)

5. POSTUP

5.1. Príprava vzorky

5.1.1. Vína

Z vína sa odstráni oxid uhličitý. Asi 50 ml vína sa umiestni do vákuovej banky, za neustáleho pretrepávania sa v banke pomocou vodnej vývevy vytvorí vákuum. Pretrepávanie musí trvať 1 až 2 minúty.

5.1.2. Rektifikované zahustené mušty

200 g presne odváženého rektifikovaného zahusteného muštu sa naleje do odmernej banky s objemom 500 ml. Doplní sa vodou po rysku. Zhomogenizuje sa.

5.2. Potenciometrická titrácia

5.2.1. Kalibrácia pH metra

pH-meter sa okalibruje na použitie pri 20 °C podľa pokynov výrobcu pomocou tlmivého roztoku s hodnotou pH 7,00 pri 20 °C.

5.2.2. Metóda merania

Do odmerného valca (bod 4.4) sa naleje určitý objem vzorky pripravenej podľa bodu 5.1, a to 10 ml v prípade vína a 50 ml v prípade rektifikovaného zahusteného muštu. Pridá sa asi 10 ml destilovanej vody a potom sa pridá z byrety 0,1 M roztok hydroxidu sodného (bod 3.2), kým sa nedosiahne pH rovné 7 pri teplote 20 °C. Nech n je objem pridaného 0,1 M roztoku NaOH v ml.

5.3. Titrácia na indikátor (brómtymolovú modrú)

5.3.1. Predbežná skúška: určenie farby v koncovom bode

Do odmerného valca (bod 4.4) sa naleje 25 ml prevarenej destilovanej vody, 1 ml roztoku brómtymolovej modrej (bod 3.3) a určitý objem vzorky pripravenej podľa bodu 5.1, a to 10 ml v prípade vína a 50 ml v prípade rektifikovaného zahusteného muštu. Pridáva sa 0,1 M roztok hydroxidu sodného (bod 3.2), kým sa sfarbenie nezmení na modrozelené. Pridá sa 5 ml tlmivého roztoku s pH 7 (3.1).

5.3.2. Meranie

Do odmerného valca (bod 4.4) sa naleje 30 ml prevarenej destilovanej vody, 1 ml roztoku brómtymolovej modrej (bod 3.3) a určitý objem vzorky pripravenej podľa bodu 5.1, a to 10 ml v prípade vína a 50 ml v prípade rektifikovaného zahusteného muštu. Pridá sa 0,1 M roztok hydroxidu sodného (bod 3.2), kým sa nedosiahne rovnaké sfarbenie ako pri predbežnej skúške (bod 5.3.1). Nech n je objem pridaného 0,1 M roztoku hydroxidu sodného v ml.

6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

6.1. Spôsob výpočtu

6.1.1. Vína

Celková acidita vyjadrená v miliekvivalentoch na liter bude:

A = 10 n

Určí sa na jedno desatinné miesto.

Celková acidita vyjadrená v gramoch kyseliny vínnej na liter bude:

A′ = 0,075 × A

Určí sa na jedno desatinné miesto.

6.1.2. Rektifikované zahustené mušty

— Celková acidita vyjadrená v miliekvivalentoch na kilogram rektifikovaného zahusteného muštu bude: a = 5 × n

— Celková acidita vyjadrená v miliekvivalentoch na kilogram celkového obsahu cukrov: — A = (500 × n)/(P) — P = celkový obsah cukrov v hmotnostných percentách.

Určí sa na jedno desatinné miesto.

6.2. Opakovateľnosť (r) pre titráciu na indikátor (5.3):

r = 0,9 mekv/l r = 0,07 g kyseliny vínnej/l

pre biele, ružové a červené vína.

6.3. Reprodukovateľnosť (R) pre titráciu na indikátor (5.3):

Pre biele a ružové vína: R = 3,6 mekv/l R = 0,3 g kyseliny vínnej/l.

Pre červené vína: R = 5,1 mekv/l R = 0,4 g kyseliny vínnej/l.

12 OBSAH PRCHAVÝCH KYSELÍN (OIV AS-313-02-ACIVOL) – METÓDA TYPU I

1. VYMEDZENIE

Obsah prchavých kyselín tvoria kyseliny patriace do skupiny octových a prítomné vo víne vo voľnej forme alebo ako soli.

2. PRINCÍP METÓDY

Titrácia prchavých kyselín oddelených z vína destiláciou vodnou parou a rektifikácia pár.

Najskôr sa z vína odstráni oxid uhličitý.

Acidita voľného a viazaného oxidu siričitého predestilovaného za týchto podmienok sa musí odčítať z obsahu kyselín v destiláte.

Acidita kyseliny sorbovej, ktorá bola prípadne k vínu pridaná, sa musí tiež odčítať.

Poznámka:

Časť kyseliny salicylovej, ktorá sa v niektorých krajinách používa na stabilizáciu vín pred analýzou, je tiež prítomná v destiláte. Jej obsah musí byť stanovený a odčítaný z obsahu kyselín. Metóda na jej meranie sa uvádza v odseku 7 tejto kapitoly.

3. ČINIDLÁ

3.1. Kryštalická kyselina vínna (C4H6O6)

3.2. 0,1 M roztok hydroxidu sodného (NaOH)

3.3. 1 % roztok fenolftaleínu v 96 % (obj.) neutrálnom alkohole

3.4. Kyselina chlorovodíková (ρ20 = 1,18 až 1,19 g/ml), zriedená 1:4 (obj.)

3.5. 0,005 M roztok jódu (I2)

3.6. Kryštalický jodid draselný (KI)

3.7. Roztok škrobu s koncentráciou 5 g/l

5 g škrobu sa zmieša s približne 500 ml vody. Za stáleho miešania sa privedie do varu a povarí sa 10 minút. Pridá sa 200 g chloridu sodného. Po ochladení sa doplní do jedného litra.

3.8. Nasýtený roztok boritanu sodného (Na2B4O7, 10H2O), t.j. asi 55 g/l pri 20 °C

4. PRÍSTROJE

4.1. Zariadenie na destiláciu vodnou parou pozostávajúce z:

1) generátora vodnej pary - vodná para nesmie obsahovať oxid uhličitý;

2) destilačnej banky;

3) destilačnej kolóny;

4) chladiča.

Toto zariadenie musí prejsť týmito troma skúškami:

a) Do destilačnej banky sa naleje 20 ml prevarenej vody. Zachytí sa 250 ml destilátu a pridá sa 0,1 ml 0,1 M roztoku hydroxidu sodného (bod 3.2) a dve kvapky roztoku fenolftaleínu (bod 3.3). Ružové sfarbenie musí byť stabilné aspoň po dobu 10 sekúnd (t.j. vodná para neobsahuje oxid uhličitý).

b) Do destilačnej banky sa naleje 20 ml 0,1 M roztoku kyseliny octovej. Zachytí sa 250 ml destilátu. Titruje sa 0,1 M roztokom hydroxidu sodného (bod 3.2). Naliaty objem musí byť aspoň 19,9 ml (aspoň 99,5 % kyseliny octovej sa predestilovalo vodnou parou).

c) Do destilačnej banky sa naleje 20 ml 1 M roztoku kyseliny mliečnej. Zachytí sa 250 ml destilátu. Titruje sa 0,1 M roztokom hydroxidu sodného (bod 3.2).

Naliaty objem musí byť aspoň 1,0 ml (nie viac ako 0,5 % kyseliny mliečnej sa predestilovalo vodnou parou).

Akékoľvek zariadenie alebo postup, ktorý úspešne prejde týmito troma skúškami, spĺňa oficiálne medzinárodné požiadavky na zariadenia alebo postupy.

4.2. Vodná výveva

4.3. Vákuová banka

5. POSTUP

5.1. Príprava vzorky: odstránenie oxidu uhličitého

Približne 50 ml vína sa naleje do vákuovej banky. Za neustáleho pretrepávania sa v banke pomocou vodnej vývevy vytvorí vákuum. Pretrepávanie musí trvať 1 až 2 minúty.

5.2. Destilácia vodnou parou

Do destilačnej banky sa naleje 20 ml vína zbaveného oxidu uhličitého podľa bodu 5.1. Pridá sa približne 0,5 g kyseliny vínnej (bod 3.1). Zachytáva sa najmenej 250 ml destilátu.

5.3. Titrácia

Titruje sa 0,1 M roztokom hydroxidu sodného (bod 3.2) s použitím dvoch kvapiek roztoku fenolftaleínu (bod 3.3). Nech n je použitý objem v ml.

Pridajte 4 kvapky kyseliny chlorovodíkovej zriedenej v pomere 1:4 (bod 3.4), 2 ml roztoku škrobu (bod 3.7) a niekoľko kryštálikov jodidu draselného (bod 3.6). Voľný oxid siričitý titrujte 0,005 M roztokom jódu (bod 3.5). Nech n′ je použitý objem v ml.

Pridajte nasýtený roztok boritanu sodného (bod 3.8), až kým sa znovu neobjaví ružové sfarbenie. Viazaný oxid siričitý titrujte 0,005 M roztokom jódu (bod 3.5). Nech n′′ je použitý objem v ml.

6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

6.1. Spôsob výpočtu

Obsah prchavých kyselín, vyjadrený v miliekvivalentoch na liter a zaokrúhlený na jedno desatinné miesto, bude:

A = 5 (n – 0,1 n′ – 0,05 n″)

Obsah prchavých kyselín, vyjadrený v gramoch kyseliny octovej na liter zaokrúhlený na dve desatinné miesta, bude:

0,300 (n – 0,1 n′ – 0,05 n″)

6.2. Opakovateľnosť ( r)

r = 0,7 mekv/l r = 0,04 g kyseliny octovej/l

6.3. Reprodukovateľnosť (R)

R = 1,3 mekv/l R = 0,08 g kyseliny octovej/l

6.4. Víno s pridanou kyselinou sorbovou

Keďže kyselina sorbová sa dá predestilovať vodnou parou na 96 % do destilátu s objemom 250 ml, jej acidita sa musí odčítať z obsahu prchavých kyselín vediac, že 100 mg kyseliny sorbovej zodpovedá acidite 0,89 miliekvivalentov alebo 0,053 g kyseliny octovej a poznajúc obsah kyseliny sorbovej (mg/l) stanovený inými metódami.

7. MERANIE KYSELINY SALICYLOVEJ V DESTILÁTE S OBSAHOM PRCHAVÝCH KYSELÍN

7.1. Zásada

Po zmeraní obsahu prchavých kyselín a korekcii oxidu siričitého sa prítomnosť kyseliny salicylovej indikuje po okyslení objavením fialového sfarbenia po pridaní železitej soli.

Meranie kyseliny salicylovej v destiláte s obsahom prchavých kyselín sa uskutoční z druhého destilátu s rovnakým objemom, ako sa použil na meranie obsahu prchavých kyselín. Obsah kyseliny salicylovej v tomto destiláte sa meria porovnávacou kolorimetrickou metódou. Odčíta sa od acidity destilátu s obsahom prchavých kyselín.

7.2. Činidlá

7.2.1. Kyselina chlorovodíková (HCl) (ρ20 = 1,18 až 1,19 g/ml)

7.2.2. Tiosíran sodný (Na2S2O3, 5H2O), 0,1 M roztok

7.2.3. 10 % (hmot./objem.) roztok síranu železito-amónneho [Fe2(SO4)3 × (NH4)2SO4 ×24H2O]

7.2.4. 0,01 M roztok salicylátu sodného. Roztok obsahujúci 1,60 g/l salicylátu sodného (NaC7H5O3)

7.3. Postup

7.3.1. Identifikácia kyseliny salicylovej v destiláte s obsahom prchavých kyselín

Ihneď po zmeraní obsahu prchavých kyselín a korekcii na voľný a viazaný oxid siričitý sa do kónickej banky pridá 0,5 ml kyseliny chlorovodíkovej (bod 7.2.1), 3 ml 0,1 M roztoku tiosíranu sodného (bod 7.2.2) a 1 ml roztoku síranu železito-amónneho (bod 7.2.3).

Ak je prítomná kyselina salicylová, objaví sa fialové sfarbenie.

7.3.2. Meranie kyseliny salicylovej

Na vyššie uvedenej kónickej banke sa referenčnou značkou označí objem destilátu. Banka sa vyprázdni a opláchne.

Nová skúšobná vzorka 20 ml vína sa podrobí destilácii vodnou parou a destilát sa zachytáva do kónickej banky po referenčnú značku. Pridá sa 0,3 ml čistej kyseliny chlorovodíkovej (bod 7.2.1) a 1 ml roztoku síranu železito-amónneho (bod 7.2.3). Obsah kónickej banky sa sfarbí do fialova.

Do kónickej banky identickej s tou, ktorá má referenčnú značku, sa naleje destilovaná voda do tej istej úrovne, ako bola úroveň destilátu. Pridá sa 0,3 ml čistej kyseliny chlorovodíkovej (bod 7.2.1) a 1 ml roztoku síranu železito-amónneho (bod 7.2.3). Z byrety sa prilieva 0,01 M roztok salicylátu sodného (bod 7.2.4), až kým sa nedosiahne fialové sfarbenie rovnakej intenzity, ako je sfarbenie v kónickej banke obsahujúcej vínny destilát.

Nech n′′′ je použitý objem v ml.

7.4. Korekcia na obsah prchavých kyselín

Od objemu n 0,1 M roztoku hydroxidu sodného (v ml) použitého na titráciu acidity destilátu pri meraní obsahu prchavých kyselín sa odčíta objem 0,1 × n′′′ (v ml).

13 KYSELINA CITRÓNOVÁ (OIV -AS-313-09-ACIENZ) – METÓDA TYPU II

1. PRINCÍP METÓDY

Kyselina citrónová sa premení na oxalacetát a acetát v reakcii katalyzovanej citrát-lyázou (CL):

Citrát oxaloacetát + acetát

Oxalacetát a jeho dekarboxylačný produkt, pyruvát, sa v prítomnosti malát-dehydrogenázy (MDH) a laktát-dehydrogenázy (LDH) redukujú redukovaným nikotínamid-adenín-dinukleotidom (NADH) na L-malát a L-laktát:

Oxalacetát + NADH + H+ L-malát + NAD+

Pyruvát + NADH + H+ L-laktát + NAD+

Množstvo NADH oxidovaného na NAD+ v týchto reakciách je úmerné množstvu prítomného citrátu. Miera oxidácie NADH sa meria poklesom jeho absorbancie pri vlnovej dĺžke 340 nm.

2. ČINIDLÁ

2.1. Tlmivý roztok s pH 7,8

(0,51 M glycylglycín; pH = 7,8; Zn2+: 0,6 × 10- 3M):

7,13 g glycylglycínu sa rozpustí v približne 70 ml dvakrát destilovanej vody.

Pomocou približne 13 ml 5 M roztoku hydroxidu sodného sa upraví pH na 7,8. Pridá sa 10 ml roztoku chloridu zinočnatého ZnCl2 (80 mg v 100 ml H2O) a doplní sa do 100 ml dvakrát destilovanou vodou.

Tento roztok ostane stabilný najmenej štyri týždne pri + 4 °C.

2.2. Roztok redukovaného nikotínamid-adenín-dinukleotidu (NADH) (približne 6.10-3 M): 30 mg NADH a 60 mg NaHCO3 sa rozpustí v 6 ml dvakrát destilovanej vody.

2.3. Roztok malát-dehydrogenázy/laktát-dehydrogenázy (MDH/LDH, 0,5 mg MDH/ml; 2,5 mg LDH/ml):

zmieša sa 0,1 ml MDH (5 mg MDH/ml), 0,4 ml roztoku síranu amónneho (3,2 M) a 0,5 ml LDH (5 mg LDH/ml). Táto suspenzia ostane stabilná najmenej rok pri + 4 °C.

2.4. Citrát-lyáza (CL, 5 mg proteínu/ml): 168 mg lyofilizátu sa rozpustí v 1 ml ľadovej vody. Tento roztok ostáva stabilný najmenej týždeň pri + 4 °C a ak je zmrazený, najmenej štyri týždne.

Odporúča sa, aby sa pred meraním overila enzýmová aktivita.

2.5. Polyvinylpolypyrolidón (PVPP)

Poznámka: Všetky činidlá potrebné na toto meranie sú komerčne dostupné.

3. PRÍSTROJE

3.1. Spektrofotometer, ktorý umožňuje merania pri vlnovej dĺžke 340 nm, keď absorpcia NADH dosahuje maximum.

Ak nie je k dispozícii, môže sa použiť aj spektrofotometer s nespojitým spektrom, ktorý umožňuje merania pri vlnovej dĺžke 334 alebo 365 nm. Keďže ide o absolútne merania absorbancie (nepoužívajú sa kalibračné krivky, ale zohľadňuje sa extinkčný koeficient NADH), je potrebné overiť rozsahy vlnových dĺžok a absorbanciu prístroja.

3.2. Sklené kyvety s dĺžkou optickej dráhy 1 cm alebo jednorazové kyvety.

3.3. Mikropipety na odber objemov v rozsahu od 0,02 do 2 ml.

4. PRÍPRAVA VZORKY

Meranie citrátu sa zvyčajne uskutočňuje priamo vo víne bez prechádzajúceho odfarbenia a zriedenia pod podmienkou, že je obsah kyseliny citrónovej menší ako 400 mg/l. Ak tomu tak nie je, víno sa zriedi tak, aby bola koncentrácia citrátu medzi 20 a 400 mg/l (t.j. medzi 5 a 80 μg citrátu v skúšobnej vzorke).

V prípade červeného vína bohatého na fenolové zlúčeniny sa odporúča najskôr úprava vzorky s PVPP:

Vytvorí sa suspenzia približne 0,2 g PVPP vo vode a nechá sa odstáť 15 minút. Prefiltruje sa cez poskladaný filter.

Do kónickej banky s objemom 50 ml sa naleje 10 ml vína a pridá sa navlhčený PVPP odobratý z filtra pomocou špachtle. Pretrepáva sa dve až tri minúty. Prefiltruje sa.

5. POSTUP

Pri meraní na spektrofotometri nastavenom na vlnovú dĺžku 340 nm sa merania absorbancie uskutočňujú s použitím kyviet s dĺžkou optickej dráhy 1 cm a s použitím vzduchu ako štandardu nulovej absorbancie (bez kyvety v optickej dráhe). Do kyviet s dĺžkou 1 cm sa nalieva toto:

Referenčná vzorka Kyveta so vzorkou Roztok 2.1 1,00 ml 1,00 ml Roztok 2.2 0,10 ml 0,10 ml Vzorka — 0,20 ml Dvakrát destilovaná voda 2,00 ml 1,80 ml Roztok 2.3 0,02 ml 0,02 ml

Obsah kyviet sa premieša a po približne piatich minútach sa odčíta absorbancia v referenčnej kyvete a kyvete so vzorkou (A1).

Pridá sa:

Roztok 2.4 0,02 ml 0,02 ml

Obsah kyviet sa premieša, počká sa na ukončenie reakcie (približne 5 minút) a odčíta sa absorbancia v referenčnej kyvete a kyvete so vzorkou (A2).

Stanovia sa rozdiely absorbancie (A1 – A2) referenčnej kyvety a kyvety so vzorkou.

Vypočíta sa rozdiel týchto dvoch rozdielov:

ΔA = Δ AD – Δ AT

Poznámka: Čas potrebný na ukončenie aktivity enzýmov sa môže medzi jednotlivými dávkami líšiť. Vyššie uvedené údaje sa uvádzajú len pre informáciu. Odporúča sa stanoviť čas pre každú dávku.

6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

Obsah kyseliny citrónovej sa udáva v miligramoch na liter (mg/l) zaokrúhlený na celé čísla.

6.1. Spôsob výpočtu

Všeobecný vzorec na výpočet koncentrácie v mg/l je:

C = ((V × PM)/(ε × d × v)) × ΔA

V = objem testovacieho roztoku v mililitroch (v tomto prípade 3,14 ml) v = objem vzorky v mililitroch (v tomto prípade 0,2 ml) P.M = molekulová hmotnosť meranej látky (v tomto prípade bezvodá kyselina citrónová: M = 192,1) d = optická dráha kyvety v cm (v tomto prípade 1 cm) ε = absorbčný koeficient NADH pri 340 nm ε = 6,3 mmole- 1 × l × cm- 1.

Výsledok:

C = 479 × ΔA

Ak sa vzorka pri príprave zriedila, výsledok sa vynásobí zrieďovacím faktorom.

Poznámka: pri 334 nm: C = 488 Δ A, (ε = 6,2 mmole- 1 × l × cm- 1)

pri 365 nm: C = 887 × Δ A (ε = 3,4 mmole- 1 × l × cm- 1)

6.2. Opakovateľnosť (r)

Pre obsah kyseliny citrónovej menší ako 400 mg/l: r = 14 mg/l

Pre obsah kyseliny citrónovej väčší ako 400 mg/l: r = 28 mg/l

6.3. Reprodukovateľnosť (R)

Pre obsah kyseliny citrónovej menší ako 400 mg/l: R = 39 mg/l

Pre obsah kyseliny citrónovej väčší ako 400 mg/l: R = 65 mg/l

14 KYSELINA SORBOVÁ (OIV AS-313-14-ACISOR) – METÓDA TYPU IV

1. PRINCÍP METÓDY

1.1. Metóda merania absorpčnou spektrofotometriou v ultrafialovej oblasti

Kyselina sorbová (kyselina trans, trans - hexa-2,4-diénová) extrahovaná destiláciou vodnou parou sa vo vínnom destiláte meria absorpčnou spektrofotometriou v ultrafialovej oblasti. Látky, ktoré rušia meranie absorpcie v ultrafialovej oblasti, sa odstránia odparením do sucha skúšobnej vzorky jemne zásaditého destilátu s použitím roztoku hydroxidu vápenatého. Na potvrdenie obsahu pri úrovniach nižších ako 20 mg/l sa musí použiť chromatografia na tenkej vrstve (citlivosť: 1 mg/l).

1.2. Metóda merania plynovou chromatografiou

Kyselina sorbová, extrahovaná v etyléteri, sa meria plynovou chromatografiou s použitím vnútorného štandardu.

1.3. Metóda identifikácie stôp chromatografiou na tenkej vrstve

Kyselina sorbová, extrahovaná v etyléteri, sa oddeľuje chromatografiou na tenkej vrstve a jej koncentrácia sa určuje semikvantitatívne.

2. METÓDA MERANIA ABSORPČNOU SPEKTROFOTOMETRIOU V ULTRAFIALOVEJ OBLASTI

2.1. Činidlá

2.1.1. Kryštalická kyselina vínna (C4H6O6)

2.1.2. Roztok hydroxidu vápenatého, Ca(OH)2, približne 0,02 M

2.1.3. Referenčný roztok kyseliny sorbovej, 20 mg/l

20 mg kyseliny sorbovej, C6H8O2, sa rozpustí v približne 2 ml 0,1 M roztoku hydroxidu sodného. Vleje sa do odmernej banky s objemom 1 000 ml a doplní sa vodou po rysku. Alternatívne je možné rozpustiť 26,8 mg sorbanu draselného, C6H7KO2, vo vode a doplniť vodou do 1 000 ml.

2.2. Prístroje

2.2.1. Zariadenie na destiláciu vodnou parou (pozri kapitolu „Obsah prchavých kyselín“)

2.2.2. Vodný kúpeľ s teplotou 100 °C

2.2.3. Spektrofotometer umožňujúci uskutočnenie meraní pri vlnovej dĺžke 256 nm s kremennou kyvetou s dĺžkou optickej dráhy 1 cm

2.3. Postup

2.3.1. Destilácia

Do destilačnej banky zaradenia na destiláciu vodnou parou sa naleje 10 ml vína a pridá sa 1 až 2 g kyseliny vínnej (2.1.1). Zachytí sa 250 ml destilátu.

2.3.2. Kalibračná krivka

Zriedením referenčného roztoku (bod 2.1.3) vodou sa pripravia štyri referenčné roztoky s koncentráciou 0,5 - 1 - 2,5 a 5 mg kyseliny sorbovej na liter. Na spektrofotometri sa odmerajú ich absorbancie pri vlnovej dĺžke 256 nm v pomere k absorbancii destilovanej vody. Graficky sa znázorní krivka zmien absorbancie v závislosti od koncentrácií roztokov. Závislosť je lineárna.

2.3.3. Meranie

Do kapsule s priemerom 55 mm sa naleje 5 ml destilátu, pridá sa 1 ml roztoku hydroxidu vápenatého (bod 2.1.2). Odparí sa do sucha na vodnom kúpeli.

Zvyšok sa rozpustí v niekoľkých ml destilovanej vody, kvantitatívne sa destiluje v odmernej banke s objemom 20 ml a doplní sa výplachovou vodou po rysku. Absorbancia sa zmeria na spektrofotometri pri 256 nm porovnaním s referenčnou vzorkou, ktorú predstavuje roztok získaný zriedením 1 ml roztoku hydroxidu vápenatého (bod 2.1.2) s vodou na 20 ml.

Hodnota zmeranej absorbancie sa vnesie na kalibračnú krivku a odčíta sa z nej koncentrácia C roztoku kyseliny sorbovej.

Poznámka: V bežnej praxi sa môžu straty spôsobené odparením pri tejto metóde zanedbať a absorbancia sa meria priamo z destilátu zriedeného v pomere 1:4 destilovanou vodou.

2.4. Vyjadrenie výsledkov

2.4.1. Spôsob výpočtu

Koncentrácia kyseliny sorbovej vo víne, vyjadrená v miligramoch na liter, sa rovná:

100 × C

C = koncentrácia kyseliny sorbovej roztoku analyzovaného pomocou spektrofotometra, vyjadrená v miligramoch na liter.

3. METÓDA MERANIA PLYNOVOU CHROMATOGRAFIOU

3.1. Činidlá

3.1.1. Etyléter, (C2H5)2O, destilovaný v okamihu použitia

3.1.2. Roztok vnútorného štandardu: roztok kyseliny undekánovej, C11H22O2, v 95 % (obj. %) etanole s koncentráciou 1 g/l

3.1.3. Vodný roztok kyseliny sírovej, H2SO4 (ρ20 = 1,84 g/ml), zriedený 1:3 (obj. %)

3.2. Prístroje

3.2.1. Plynový chromatograf vybavený plameňovým ionizačným detektorom a kolónou z nerezovej ocele (4 m × 1/8 palca) vopred upravenou dichlórdimetylsilánom a naplnenou stacionárnou fázou pozostávajúcou zo zmesi sukcinátu dietylénglykolu (5 %) a kyseliny fosforečnej (1 %) (DEGS — H3PO4) alebo zo zmesi adipátu dietylénglykolu (7 %) a kyseliny fosforečnej (1 %) (DEGA — H3PO4) viazanej na Gaschrom Q so zrnitosťou 80 — 100.

Úprava kolóny dichlórdimetylsilánom (DMDCS) — cez kolónu sa prepustí roztok obsahujúci 2 až 3 g DMDCS v toluéne. Kolóna sa ihneď premyje metanolom, potom sa cez ňu prepustí prúd dusíka, potom hexánu a znovu prúd dusíka. Takto je pripravená na plnenie.

Pracovné podmienky:

Teplota pece: 175 °C

Teplota vstrekovača a detektora: 230 °C

Nosný plyn: dusík (prietok = 20 ml/min.)

3.2.2. Mikrostriekačka s objemom 10 μl, delená po 0,1 μl

Poznámka: Môžu sa použiť aj iné druhy kolón, ktoré umožňujú dobré oddelenie, najmä kapilárne kolóny (napríklad FFAP).

Nižšie opísaný postup je uvedený ako príklad.

3.3. Postup

3.3.1. Príprava analyzovanej vzorky

Do sklenej skúmavky s objemom približne 40 ml a so zátkou so zábrusom sa naleje 20 ml vína, pridajú sa 2 ml roztoku vnútorného štandardu (bod 3.1.2) a 1 ml zriedeného roztoku kyseliny sírovej (bod 3.1.3).

Po premiešaní roztoku opakovaným prevrátením skúmavky sa k nemu pridá 10 ml etyléteru (bod 3.1.1). Kyselina sorbová sa extrahuje v organickej fáze pretrepávaním skúmavky počas piatich minút. Nechá sa ustáliť.

3.3.2. Príprava referenčného roztoku

Vyberie sa víno, ktorého chromatogram éterového extraktu nevykazuje žiadne maximum na úrovni elúcie kyseliny sorbovej. Do tohto vína sa pridá kyselina sorbová tak, aby jej koncentrácia bola 100 mg na liter. 20 ml takto pripravenej vzorky sa upraví podľa postupu opísaného v bode 3.3.1.

3.3.3. Chromatografia

S použitím mikrostriekačky sa do chromatografu postupne vstreknú najprv 2 μl éterovej fázy získanej podľa postupu uvedeného v bode 3.3.2 a potom 2 μl éterovej fázy získanej podľa postupu uvedeného v bode v 3.3.1.

Zaznamenajú sa zodpovedajúce chromatogramy, overí sa zhoda príslušných retečných časov kyseliny sorbovej a vnútorného štandardu. Odmeria sa výška (plocha) každého zaznamenaného maxima.

3.4. Vyjadrenie výsledkov

3.4.1. Spôsob výpočtu

Koncentrácia kyseliny sorbovej v analyzovanom víne, vyjadrená v miligramoch na liter, sa rovná:

100 × (h/H) × (l/i)

H výška maxima kyseliny sorbovej v referenčnom roztoku

h= výška maxima kyseliny sorbovej v analyzovanej vzorke

I= výška maxima vnútorného štandardu v referenčnom roztoku

i= výška maxima vnútorného štandardu v analyzovanej vzorke

Poznámka: Koncentrácia kyseliny sorbovej sa môže stanoviť rovnakým spôsobom z merania plôch zodpovedajúcich maxím.

15 PH (OIV AS-313-15-PH) – METÓDA TYPU I

1. PRINCÍP

Meria sa rozdiel potenciálu medzi dvoma elektródami ponorenými do skúmanej kvapaliny. Jedna z týchto dvoch elektród má potenciál, ktorý je funkciou pH kvapaliny, zatiaľ čo druhá má stály a známy potenciál a slúži ako referenčná elektróda.

2. PRÍSTROJE

2.1. PH meter so stupnicou delenou v jednotkách pH umožňujúci uskutočňovať merania s presnosťou najmenej ± 0, 05 jednotky pH

2.2. Elektródy:

2.2.1. Sklená elektróda, ktorá sa má uchovávať v destilovanej vode.

2.2.2. Referenčná kalomelová elektróda s nasýteným chloridom draselným, ktorá sa má uchovávať v nasýtenom roztoku chloridu draselného,

2.2.3. alebo kombinovaná elektróda, ktorá sa má uchovávať v destilovanej vode.

3. ČINIDLÁ

3.1. Tlmivé roztoky:

3.1.1. Nasýtený roztok hydrogenvínanu draselného. Roztok obsahujúci minimálne 5,7 g/l hydrogenvínanu draselného (C4H5KO6) pri 20 °C. Tento roztok sa môže za prítomnosti 0,1 g tymolu na 200 ml roztoku uchovávať 2 mesiace.

pH 3,57 pri 20 °C 3,56 pri 25 °C 3,55 pri 30 °C

3.1.2. 0,05 M roztok kálium-hydrogen-ftalátu. Roztok obsahujúci 10,211 g/l kálium-hydrogen-ftalátu (C8H5KO4) pri 20 °C. (Maximálna doba uchovávania: 2 mesiace).

pH 3,999 pri 15 °C 4,003 pri 20 °C 4,008 pri 25 °C 4,015 pri 30 °C

3.1.3. Roztok obsahujúci:

dihydrogenfosforečnan draselný, KH2PO4 … 3,402 g hydrogenfosforečnan didraselný, K2HPO4 … 4,354 g doplnený vodou do… 1 l

(Maximálna doba uchovávania: 2 mesiace)

pH 6,90 pri 15 °C 6,88 pri 20°C 6,86 pri 25 °C 6,85 pri 30 °C

Poznámka: Môžu sa použiť aj komerčné referenčné tlmivé roztoky.

4. POSTUP

4.1. Príprava analyzovanej vzorky

4.1.1. Mušt alebo víno

Mušt alebo víno sa použijú priamo.

4.1.2. Rektifikovaný zahustený mušt

Rektifikovaný zahustený mušt sa zriedi vodou tak, aby sa dosiahol celkový obsah cukrov 25 ± 0, 5 hmotn. % (25o Brix).

Ak P je celkový obsah cukrov v rektifikovanom zahustenom mušte v hmotnostných percentách, odváži sa hmotnosť, ktorá sa rovná 2 500/P

a doplní sa vodou do 100 g. Použitá voda musí mať vodivosť nižšiu ako 2 mikrosiemensy na centimeter.

4.2. Vynulovanie prístroja

Vynulovanie sa vykonáva pred uskutočnením každého merania, a to podľa návodu na použitie daného prístroja.

4.3. Kalibrácia pH metra

pH meter sa kalibruje pri 20 °C podľa návodu pre daný pH meter s použitím tlmivých roztokov s pH 6,88 a 3,57 pri 20 °C.

Tlmivý roztok s pH 4,00 pri 20 °C sa použije na kontrolu kalibrácie stupnice.

4.4. Meranie

Elektróda sa ponorí do analyzovanej vzorky, ktorej teplota musí byť medzi 20 a 25 °C a čo najbližšie k 20 °C. Hodnota pH sa odčíta priamo zo stupnice.

Na tej istej vzorke sa vykonajú aspoň dve stanovenia.

Za konečný výsledok sa považuje aritmetický priemer týchto stanovení.

5. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

pH muštu, vína alebo 25 % (hmotn.) (25° Brix) roztoku rektifikovaného zahusteného muštu sa uvádza na dve desatinné miesta.

16 SIMULTÁNNE MERANIE KYSELINY L - ASKORBOVEJ A KYSELINY D-IZOASKORBOVEJ METÓDOU HPLC A UV DETEKCIE (OIV-AS-313-22-ACASCO) – METÓDA TYPU II

1. ÚVOD

Kyselina askorbová je antioxidant, ktorý sa prirodzene vyskytuje v celej škále potravín. Bežné množstvo kyseliny askorbovej sa v hrozne počas prípravy muštov a v priebehu výroby vína znižuje. V istých hraniciach sa môže pridávať do muštov a vín.

Opísaná metóda sa potvrdila v rámci medzilaboratórnych skúšok pomocou analýz vzoriek vína s pridanými množstvami 30 mg/l až 150 mg/l kyseliny L-askorbovej a 10 mg/l až 100 mg/l kyseliny D-izoaskorbovej.

2. OBLASŤ POUŽITIA

Táto metóda je vhodná na simultánne meranie kyseliny L-askorbovej a kyseliny D-izoaskorbovej (kyselina erytorbová) vo víne pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie a UV detekcie v rozmedzí od 3 do 150 mg/l.

Pre obsah vyšší ako 150 mg/l je potrebné vzorku zriediť.

3. PRINCÍP

Po filtrácii cez membránu sa vzorky vstreknú priamo do systému HPLC. Analyzované zložky sa oddeľujú cez kolónu s reverznou fázou a sú podrobné UV detekcii pri vlnovej dĺžke 266 nm. Určenie množstva kyseliny L-askorbovej a kyseliny D-izoaskorbovej sa vykoná vzhľadom na vonkajší štandard.

Poznámka: Kolóny a podmienky fungovania sa uvádzajú len ako príklad. Dobré oddelenie zložiek môžu zaistiť aj iné typy kolón.

4. ČINIDLÁ A PRODUKTY

4.1 Činidlá

4.1.1 n – oktylamín, čistota ≥ 99,0 %

4.1.2 Octan sodný x 3 H2O, čistota ≥ 99,0 %

4.1.3 Čistá kyselina octová, 100 %

4.1.4 Kyselina fosforečná, približne 25 %

4.1.5 Kyselina šťaveľová, čistota ≥ 99,0 %

4.1.6 Askorbátoxidáza

4.1.7 Kyselina L-askorbová, ultra ≥ 99,5 %

4.1.8 Kyselina D-izoaskorbová, čistota ≥ 99,0 %

4.1.9 Dvakrát destilovaná voda

4.1.10 Metanol, p.A. 99,8 %

4.2 Príprava mobilnej fázy

4.2.1 Roztoky pre mobilnú fázu

Pripravia sa tieto roztoky pre mobilnú fázu:

4.2.1.1 12,93 g n-oktylamínu v 100 ml metanolu

4.2.1.2 68,05 g octanu sodného x 3 H2O v 500 ml dvakrát destilovanej vody

4.2.1.3 12,01 g čistej kyseliny octovej v 200 ml dvakrát destilovanej vody

4.2.1.4 Tlmivý roztok (pH 5,4): 430 ml roztoku octanu sodného (4.2.1.2) a 70 ml roztoku kyseliny octovej (4.2.1.3)

4.2.2 Príprava mobilnej fázy

Do približne 400 ml dvakrát destilovanej vody v kadičke sa pridá 5 ml roztoku n-oktylamínu (4.2.1.1). pH tohto roztoku sa upraví na 5,4 až 5,6 tak, že sa po kvapkách pridáva 25 % kyselina fosforečná (4.1.4). Pridá sa 50 ml tlmivého roztoku (4.2.1.4) a zlúčenina sa prenesie do odmernej banky s objemom 1 000 ml a následne sa doplní dvakrát destilovanou vodou. Pred použitím sa musí mobilná fáza prefiltrovať cez membránu (0,2 μm regenerovaná celulóza) a ak je to možné, zbavená plynu pomocou hélia (počas približne 10 minút) v závislosti od použitého systému HLPC.

4.3. Príprava štandardného roztoku

Poznámka:

Všetky štandardné roztoky (zásobný roztok – bod 4.3.1 a pracovné roztoky – bod 4.3.2) sa musia pripraviť pripravovať každý deň a pred ich vstreknutím by sa mali uskladňovať v chladničke.

4.3.1. Príprava zásobného roztoku (1 mg/ml)

Pripraví sa 2 % vodný roztok kyseliny šťaveľovej a prebublávaním dusíkom sa odstráni rozpustený kyslík.

Odváži sa presne 100 mg kyseliny L – askorbovej a 100 mg kyseliny D – izoaskorbovej do odmernej banky s objemom 100 ml a doplní sa 2 % vodným roztokom kyseliny šťaveľovej.

4.3.2. Príprava pracovných roztokov

V prípade pracovných roztokov sa zásobný roztok (4.3.1) zriedi 2 % roztokom kyseliny šťaveľovej na požadované koncentrácie. Odporúčajú sa koncentrácie od 10 mg/l do 120 mg/l. Napríklad 100 μl, 200 μl, 400 μl, 800 μl 1 200 μl pri 10 ml, čo zodpovedá 10, 20, 40, 80 a 120 mg/l.

5. PRÍSTROJE

Bežné laboratórne pomôcky a zariadenia, najmä:

5.1 Čerpadlo HPLC

5.2 Vstrekovač s 20 μl slučkou

5.3 UV detektor

6. ODBER VZORKY

Pred vstreknutím sa vzorky vína filtrujú cez membránu s priemerom pórov 0,2 μm.

Pre obsah vyšší ako 150 mg/l je potrebné vzorku zriediť.

7. POSTUP

7.1 Podmienky použitia systému HLPC

Do chromatografického prístroja sa vstrekne 20 μl vzorky prefiltrovanej cez membránu.

Predkolóna : napríklad Nucleosil 120 C18 (4 cm × 4 mm × 7 μm) Kolóna : napríklad Nucleosil 120 C18 (25 cm × 4 mm × 7 μm) Vstreknutý objem : 20 μl Mobilná fáza : viď 4.2.2, izokratická Prietok : 1ml/min UV detektor : 266 nm Cyklus preplachovania : minimálne 30 ml dvakrát destilovanej vody, potom 30 ml metanolu a 30 ml acetonitrilu

7.2 Identifikácia/potvrdenie

Maximá sa identifikujú porovnaním retenčných časov štandardných roztokov a vzoriek. S chromatografickým systémom, ktorý sa uvádza len ako príklad, sú retenčné časy 7,7 min. v prípade kyseliny L–askorbovej a 8,3 min. v prípade kyseliny D–izoaskorbovej (viď obrázok 1, chromatogram A).

Na potvrdenie pozitívnych výsledkov sa tieto vzorky musia upraviť špachtľou s askorbátoxidázou a nanovo sa zmerať (viď obrázok 1, chromatogram B).

Vzhľadom na rozklad kyseliny L-askorbovej a kyseliny D–izoaskorbovej vyvolaný askorbátoxidázou by sa v retenčnom čase kyseliny L–askorbovej a kyseliny D–izoaskorbovej nemal zaznamenať žiadny signál. V prípade detekcie vedľajších maxím sa ich plocha musí zohľadniť vo výpočte koncentrácie analyzovaných vzoriek.

Poznámka: Odporúča sa analyzovať vzorky ošetrené askorbátoxidázou na konci sekvencie, po ktorej nasleduje cyklus preplachovania, aby sa odstránili zvyšky askorbátoxidázy z kolóny, inak by zvyšky askorbátoxidázy mohli počas merania pomocou HPLC premeniť kyselinu L–askorbovú a kyselinu D–izoaskorbovú, a tým by sa mohol ovplyvniť výsledok.

8. VÝPOČTY

Na základe pracovných roztokov (4.3.2) sa vytvorí kalibračná krivka. Množstvo kyseliny L–askorbovej a kyseliny D–izoaskorbovej sa stanoví podľa metódy vonkajšieho štandardu pomocou meraní plôch maxím a ich porovnaním s príslušnou koncentráciou na kalibračnej krivke.

Vyjadrenie výsledkov

Výsledky sa vyjadria na jedno desatinné miesto v mg/l kyseliny L–askorbovej a následne kyseliny D–izoaskorobovej (napríklad 51,3 mg/l).

Pre obsah vyšší ako 150 mg/l je potrebné zohľadniť zriedenie.

9. PRESNOSŤ (SPRÁVNOSŤ A ZHODNOSŤ)

Metóda sa otestovala v rámci medzilaboratórnej skúšky, ktorú zorganizoval v roku 1994 bývalý Federálny úrad verejnej hygieny (Bundesgesundheitsamt, Nemecko) a zúčastnilo sa na nej 27 laboratórií. Program medzilaboratórnej skúšky sa riadil § 35 nemeckého zákona o potravinách, ktorý OIV akceptovala až do zavedenia nového protokolu (OENO 6/2000).

Štúdia sa robila na štyroch rôznych vzorkách vína, na dvoch bielych vínach a dvoch červených vínach, s požiadavkou piatich opakovaní pri každej vzorke. Keďže nebolo možné pripraviť vzorky s dostatočnou stabilitou analyzovaných zložiek (rozdielne rýchlosti rozkladu), rozhodlo sa, že sa účastníkom zašlú definované množstvá štandardných čistých látok, ako aj vzorky vína. Laboratóriá dostali príkaz presunúť štandardy kvantitatívne do vzoriek vína a bezodkladne ich analyzovať. Analyzovali sa objemy 30 až 150 mg/l v prípade kyseliny L–askorbovej a 10 až 100 mg/l v prípade kyseliny D–izoaskorbovej. Podrobné výsledky štúdie sa uvádzajú v PRÍLOHE, ktorú uverejnila OIV. Štúdia sa uskutočnila podľa DIN/ISO 5725 (verzia z roku 1988).

Štandardné odchýlky opakovateľnosti (sr) a reprodukovateľnosti (sR) zodpovedali koncentráciám kyseliny L–askorbovej a kyseliny D–izoaskorbovej. Parameter skutočnej presnosti sa môže vypočítať pomocou týchto rovníc:

Kyselina L-askorbová sr = 0,011 x + 0,31 sR = 0,064 x + 1,39 x: koncentrácia kyseliny L-askorbovej (mg/l)

Kyselina D-izoaskorbová sr = 0,014 x + 0,31 sR = 0,079 x + 1,29 x: koncentrácia kyseliny D-izoaskorbovej (mg/l)

Príklad:

50 mg/l kyseliny D-izoaskorbovej sr = 1,0 mg/l

sR = 5,2 mg/l

10. ĎALŠIE CHARAKTERISTIKY ANALÝZY

10.1 Medza detekcie

Medza detekcie tejto metódy sa odhadla na 3 mg/l v prípade kyseliny L-askorbovej a kyseliny D-izoaskorbovej.

10.2 Správnosť

Priemerná výťažnosť vypočítaná na základe medzilaboratórnej skúšky vykonanej na štyroch vzorkách (viď PRÍLOHU uverejnenú v Zbierke OIV) bola:

— 100,6 % v prípade kyseliny L-askorbovej

— 103,3 % v prípade kyseliny D-izoaskorbovej

17 OXID UHLIČITÝ (OIV AS-314-01-DIOCAR) – METÓDA TYPU II

1. PRINCÍP METÓDY

1.1. Nešumivé vína (pretlak CO2 ≤ 0,5 × 105 Pa) (2)

Zo vzorky sa odoberie istý objem vína a ochladený na približne 0 °C sa vleje do množstva titrovaného roztoku hydroxidu sodného postačujúceho na dosiahnutie pH 10 až 11. Titrácia sa uskutoční roztokom kyseliny v prítomnosti karbonát-dehydratázy. Obsah oxidu uhličitého sa odpočíta od použitého objemu potrebného na zmenu pH z 8,6 (hydrogenuhličitanová forma) na 4,0 (kyselina uhličitá). Referenčná titrácia uskutočnená za rovnakých podmienok s vínom, z ktorého sa odstránil oxid uhličitý, umožňuje zohľadniť objem roztoku hydroxidu sodného spotrebovaného kyselinami z vína.

1.2. Perlivé a šumivé vína

Analyzovaná vzorka vína sa ochladí na teplotu blízku teplote, pri ktorej začína víno mrznúť. Po odobratí istého množstva, ktoré sa má po odstránení oxidu uhličitého použiť ako referenčná vzorka, sa zvyšok vína vo fľaši zalkalizuje na viazanie všetkého CO2 vo forme Na2CO3. Titrácia sa uskutoční roztokom kyseliny v prítomnosti karbonát-dehydratázy. Obsah oxidu uhličitého sa odpočíta od objemu roztoku kyseliny použitého na zmenu pH z 8,6 (hydrogenuhličitanová forma) na 4,0 (kyselina uhličitá). Referenčná titrácia uskutočnená za rovnakých podmienok s vínom, z ktorého sa odstránil oxid uhličitý umožňuje zohľadniť objem hydroxidu sodného spotrebovaný kyselinami z vína.

2. OPIS METÓDY

2.1. Nešumivé vína (pretlak CO2 ≤ 0,5 × 105 Pa)

2.1.1. Prístroje

2.1.1.1. Magnetické miešadlo

2.1.1.2. pH meter

2.1.2. Činidlá

2.1.2.1. Roztok hydroxidu sodného (NaOH), 0,1 M

2.1.2.2. Roztok kyseliny sírovej (H2SO4) 0,05 M

2.1.2.3. Roztok karbonát-dehydratázy, 1 g/l

2.1.3. Postup

Vzorka vína sa spolu s 10 ml pipetou, určenou na odber danej vzorky, ochladí na približne 0 °C.

Do 100 ml odmerného valca sa naleje 25 ml roztoku hydroxidu sodného (bod 2.1.2.1), pridajú sa 2 kvapky vodného roztoku karbonát-dehydratázy (bod 2.1.2.3). Pomocou pipety ochladenej na 0 °C sa do valca vnesie 10 ml vína.

Odmerný valec sa umiestni na magnetické miešadlo, nastaví sa elektróda a magnetická tyčinka a nechá sa mierne miešať.

Keď kvapalina opäť dosiahne teplotu okolia, pomaly sa titruje roztokom kyseliny sírovej (bod 2.1.2.2), kým sa nedosiahne pH 8,6.

Pokračuje sa v titrácii kyselinou sírovou (bod 2.1.2.2), kým sa nedosiahne pH 4,0. Nech n je objem v ml použitý na zmenu pH z 8,6 na 4,0.

Zo vzorky približne 50 ml vína sa počas 3 minút pri jej miešaní vo vákuu a pri súčasnom zahrievaní banky vo vodnom kúpeli na teplotu okolo 25 °C odstráni CO2.

Horeuvedený postup sa uskutoční so vzorkou 10 ml vína, z ktorého sa odstránil oxid uhličitý. Nech n′ je použitý objem.

2.1.4. Vyjadrenie výsledkov

1 ml titrovaného 0,05 M roztoku kyseliny sírovej zodpovedá 4,4 mg CO2.

Množstvo CO2 v gramoch na liter vína sa dané vzťahom:

0,44 (n – n′).

Výsledok sa uvedie na dve desatinné miesta.

Poznámka: V prípade vína s nízkym obsahom CO2 (CO2< 1 g/l) nie je potrebné pridať karbonát-dehydratázu na katalýzu hydratácie CO2.

2.2. Perlivé a šumivé vína

2.2.1. Prístroje

2.2.1.1. Magnetické miešadlo

2.2.1.2. pH meter

2.2.2. Činidlá

2.2.2.1. Roztok hydroxidu sodného (NaOH), 50 % (hmotn.)

2.2.2.2. Roztok kyseliny sírovej (H2SO4), 0,05 M

2.2.2.3. Roztok karbonát-dehydratázy, 1 g/l

2.2.3. Postup

Na fľaši sa vyznačí, pokiaľ siaha víno určené na analýzu, a fľaša sa potom ochladí až na teplotu mrazu.

Fľaša sa za pretrepávania nechá mierne ohriať, až kým nezmiznú kryštáliky ľadu.

Rýchlo sa vyberie zátka a do skúmavky sa odoberie 45 až 50 ml vína, ktoré sa použije na referenčné meranie. Presný objem tejto odobratej vzorky v ml sa odčíta na skúmavke po jej opätovnom zohriatí na teplotu okolitého prostredia.

Ihneď po odobratí referenčnej vzorky sa do fľaše s objemom 750 ml pridá 20 ml roztoku hydroxidu sodného (bod 2.2.2.1).

Počká sa, kým sa víno opäť zohreje na teplotu okolitého prostredia.

Do 100 ml odmerného valca sa naleje 30 ml prevarenej destilovanej vody a pridajú sa 2 kvapky roztoku karbonát-dehydratázy (bod 2.2.2.3). Pridá sa 10 ml zalkalizovaného vína.

Valec sa umiestni na magnetické miešadlo, nastaví sa elektróda a magnetická tyčinka a nechá sa mierne miešať.

Pomaly sa titruje roztokom kyseliny sírovej (bod 2.2.2.2), kým sa nedosiahne pH 8,6.

Pokračuje sa v pomalej titrácii kyselinou sírovou (bod 2.2.2.2), kým sa nedosiahne pH 4,0. Nech n je objem v ml použitý na zmenu pH z 8,6 na 4,0.

Z vína s objemom v ml, odloženého bokom na referenčné meranie, sa následne počas 3 minút pri jeho miešaní vo vákuu a pri súčasnom zahrievaní banky vo vodnom kúpeli na teplotu okolo 25 °C odstráni CO2. Do 30 ml prevarenej destilovanej vody sa pridá 10 ml vína, z ktorého sa odstránil oxid uhličitý, pridajú sa 2 až 3 kvapky roztoku hydroxidu sodného (bod 2.2.2.1), aby sa dosiahlo pH 10 až 11. Potom sa postupuje podľa horeuvedeného postupu. Nech n′ je objem v ml pridanej 0,05 M kyseliny sírovej.

2.2.4. Vyjadrenie výsledkov

1 ml 0,05 M roztoku kyseliny sírovej zodpovedá 4,4 mg CO2.

Fľaša, v ktorej bolo zalkalizované víno, sa vyprázdni a s presnosťou na 1 ml sa určí pôvodný objem vína V v ml doplnením vodou po rysku.

Množstvo CO2 v gramoch na liter vína sa rovná:

0,44(n – n′) × ((V – v + 20)/(V – v))

Výsledok sa uvedie na dve desatinné miesta.

2.3. Výpočet teoretického pretlaku

Pretlak pri 20 °C (Paph20) vyjadrený v pascaloch je daný vzorcom:

Paph20 = ((Q)/(1,951 × 10–5(0,86 – 0,01 A)(1 – 0,00144 S))) – Patm

pričom:

Q : obsah CO2 vo víne v g/l A : obsah alkoholu vo víne pri 20 °C S : obsah cukru vo víne v g/l Patm : atmosférický tlak vyjadrený v pascaloch

18 MERANIE OXIDU UHLIČITÉHO VO VÍNE TLAKOMERNOU METÓDOU (OIV AS314-04-CO2MAN) – METÓDA TYPU II

(p.m.)

[Orgány OIV aktualizujú opis tejto metódy analýzy. Tento opis sa uverejní v ďalšom oznámení Komisie hneď po tom, ako OIV uverejní aktualizovaný text vo vydaní Zbierky medzinárodných metód analýzy vín a muštov na rok 2010.]

19 MERANIE PRETLAKU ŠUMIVÝCH A PERLIVÝCH VÍN (OIV AS-314-02-SURPRES) – METÓDA TYPU I

1. PRINCÍP

Po ustálení teploty a po pretrepaní fľaše sa pretlak meria pomocou afrometra (tlakomeru). Pretlak sa vyjadruje sa v pascaloch (Pa) [metóda typu I]. Táto metóda sa môže použiť aj v prípade sýtených šumivých vín a sýtených perlivých vín.

2. PRÍSTROJE

Prístroj, ktorý umožňuje meranie pretlaku vo fľašiach so šumivým a perlivým vínom, sa nazýva afrometer. Existuje v rôznych podobách v závislosti od uzáveru fľaše (kovový uzáver, korunkový uzáver, korková alebo plastová zátka).

2.1. Pokiaľ ide o fľaše s kovovým alebo korunkovým uzáverom,

používa sa afrometer zložený z troch častí (obrázok 1):

— vrchná časť (alebo skrutka s hrotom) sa skladá z tlakomera, krúžku s ručným uťahovaním, skrutky bez konca, ktorá sa posúva v strednej časti, a z hrotu, ktorý prechádza uzáverom fľaše. Hrot je vybavený bočným otvorom, cez ktorý sa zabezpečuje prívod tlaku do tlakomera. Pomocou tesnenia sa zaistí tesné priľnutie prístroja na uzáver fľaše,

— stredná časť (alebo matica) slúži na vycentrovanie vrchnej časti. Naskrutkuje sa do spodnej časti, tak aby celok pevne držal na fľaši,

— spodná časť (alebo svorka) je vybavená výčnelkom, ktorý skĺzne pod obrubu na hrdle fľaše tak, aby sa uchytil prístroj na fľaši. Existujú objímky prispôsobené každému typu fľaše.

2.2. Pokiaľ ide o fľaše so zátkou,

používa sa afrometer zložený z dvoch častí (obrázok 2):

— vrchná časť je rovnaká ako v prípade predchádzajúceho prístroja, hrot je však dlhší a má tvar dlhej dutej rúrky, na konci ktorej je špička, ktorá umožní prienik zátkou. Táto špička je odnímateľná a po preniknutí zátkou spadne do vína,

— spodná časť sa skladá z matice a z podstavca, ktorý sa umiestňuje na zátku. Tento podstavec je vybavený štyrmi uťahovacími skrutkami, ktorými sa prichytí celok na zátku.

Poznámky týkajúce sa tlakomerov, ktorými sú vybavené tieto dva typy prístrojov:

— tlakomery môžu byť mechanické s Bourdonovou rúrkou alebo digitálne s piezoelektrickým snímačom. V prvom prípade musí byť Bourdonová rúrka bezpodmienečne z nerezovej ocele,

— tlakomery majú stupnicu v pascaloch (skratka Pa). V prípade šumivých vín je praktickejšie používať ako jednotky 105 pascalov (105 Pa) alebo kilopascaly (kPa),

— tlakomery sa môžu rozdeliť do rôznych tried. Trieda tlakomera je daná presnosťou odčítania meranej hodnoty vo vzťahu k celkovému rozsahu stupnice, vyjadrenou v percentách (napr.: tlakomer 1 000 kPa triedy 1 znamená, že maximálny odmerateľný tlak je 1 000 kPa s presnosťou odčítania ± 10 kPa). Trieda 1 sa odporúča pri presných meraniach.

3. POSTUP

Meranie sa musí uskutočniť na fľašiach, ktoré majú ustálenú teplotu najmenej po dobu 24 hodín. Po prieniku korunkovým uzáverom, korkovou alebo plastovou zátkou sa fľašou musí silne triasť, až kým sa nedosiahne stály tlak, ktorý možno odčítať.

3.1. Fľaše s kovovým alebo korunkovým uzáverom

Vsuňte výčnelok svorky pod obrubu na hrdle fľaše. Zaťahujte maticu, až kým nebude celok úplne priliehať k fľaši. Potom zaskrutkujte vrchnú časť do matice. S cieľom zabrániť únikom plynu je potrebné uzáver prepichnúť čo najrýchlejšie, aby sa tesnenie dostalo čo najskôr do kontaktu s uzáverom. Fľaša sa následne musí silne pretrepávať, až kým sa nedosiahne stály tlak, ktorý možno odčítať.

3.2. Fľaše so zátkou

Umiestnite špičku na hrot. Zmontovaný prístroj nasaďte na zátku. Zatiahnite štyri skrutky na zátke. Naskrutkujte vrchnú časť (hrot tak prenikne zátkou). Špička musí spadnúť do fľaše, aby sa mohol tlak dostať do tlakomera. Traste fľašou, pokiaľ sa nedosiahne stály tlak, a odčítajte hodnotu tlaku. Po odčítaní špičku vyberte.

4. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

Pretlak pri 20 °C (Paph20) sa vyjadruje v pascaloch (Pa) alebo kilopascaloch (kPa). Musí byť v súlade s presnosťou tlakomera (napríklad: 6,3 × 105 Pa alebo 630 kPa, a nie 6,33 105 Pa alebo 633 kPa v prípade 1 000 kPa tlakomera triedy 1 s celým rozsahom stupnice).

Ak teplota, pri ktorej sa uskutočňuje meranie, nie je 20 °C, mala by sa skorigovať vynásobením nameraného tlaku príslušným koeficientom (pozri tabuľku 1).

Tabuľka 1

Pomer pretlaku Paph20 v perlivom alebo šumivom víne pri 20 °C k pretlaku Papht pri teplote t

°C 0 1,85 1 1,80 2 1,74 3 1,68 4 1,64 5 1,59 6 1,54 7 1,50 8 1,45 9 1,40 10 1,36 11 1,32 12 1,28 13 1,24 14 1,20 15 1,16 16 1,13 17 1,09 18 1,06 19 1,03 20 1,00 21 0,97 22 0,95 23 0,93 24 0,91 25 0,88

5. KONTROLA VÝSLEDKOV

Metóda priameho stanovovania fyzikálnych parametrov (metóda typu I)

Overenie afrometrov

Afrometre musia byť predmetom pravidelného overovania (minimálne jedenkrát do roka).

Overovanie sa vykonáva pomocou kalibračného prístroja. Umožňuje porovnať testovaný tlakomer s referenčným, paralelne zapojeným tlakomerom vyššej triedy, ktorý vyhovuje vnútroštátnym štandardom. Kontrola slúži na porovnanie hodnôt, ktoré oba prístroje ukazujú pri stúpajúcich a následne klesajúcich tlakoch. Ak je medzi nimi rozdiel, potrebné úpravy sa môžu vykonať pomocou regulačnej skrutky.

Všetky autorizované laboratóriá a subjekty sú vybavené takýmito kalibračnými prístrojmi a k dispozícii ich majú aj výrobcovia tlakomerov.

20 MERANIE LYZOZÝMU VO VÍNE POMOCOU HPLC (OIV-AS-315-14) – METÓDA TYPU IV

1. ÚVOD

Pre lyzozým je vhodnejšie použiť analytickú metódu, ktorá nie je založená na aktivite enzýmov.

2. OBLASŤ POUŽITIA

Táto metóda umožňuje určiť množstvo lyzozýmu (mg proteínu/l) prítomného v bielych a červených vínach nezávisle od aktivity enzýmov (ktorá by sa mohla narušiť čiastočnou denaturizáciou alebo prejavmi komplexácie a koprecipitácie) matrice.

3. VYMEDZENIE

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) ponúka analytický prístup založený na interakcii sterického, polárneho alebo adsorpčného typu medzi stacionárnou fázou a analyzovanou látkou, a teda nesúvisiacej so skutočnou aktivitou enzýmov proteínu.

4. PRINCÍP

Analýza sa vykonáva vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) spojením spektrofotometrického detektora so spektrofluorimetrickým detektorom. Neznámy obsah vzorky vína sa vypočíta v závislosti od plochy chromatografického maxima s použitím metodiky vonkajších štandardov.

5. ČINIDLÁ

5.1. Rozpúšťadlá a roztoky

Acetonitril (CH3CN) na analýzu HPLC

Čistá kyselina trifluóroctová (TFA)

Deionizovaná voda na analýzu HPLC

Štandardný roztok: kyselina vínna 1g/l, 10 % (obj.) etylalkohol upravený neutrálnym vínanom draselným na pH 3,2

5.2. Výluhy

A : CH3CN 1 %, TFA 0,2 %, H2O= 98,8 % B : CH3CN 70 %, TFA 0,2 %, H2O= 29,8 %

5.3. Referenčné roztoky

Od 1 do 250 mg/l štandardného lyzozýmu rozpusteného vo vzorovom roztoku neustálym trasením počas minimálne 12 hodín.

6. ZARIADENIA A PRÍSTROJE

6.1. Prístroj na HPLC s prečerpávacím systémom určeným na vykonanie gradientu elúcie.

6.2. Miesto pre termostatickú kolónu (pec)

6.3. Spektrofotometrický detektor spojený so spektrofluorimetrickým detektorom

6.4. Vstrekovacia slučka, 20 μL

6.5. Polymérová kolóna s reverznou fázou s funkčnými fenylovými skupinami (priemer pórov = 1 000 Å, medza vylúčenia = 1 000 000 Da), Tosoh Bioscience TSK-gel Fenyl 5PW RP 7,5 cm × 4,6 mm ID, uvedené ako príklad

6.6. Predkolóna z toho istého materiálu ako kolóna, Tosoh Bioscience TSK-gel Fenyl 5PW RP Guardgel 1,5 cm × 3,2mm ID, uvedené ako príklad

7. PRÍPRAVA VZORKY

Vzorky vína sa okyslia HCl (10 M) zriedeným v pomere 1:10 a 5 minút po jeho pridaní sa prefiltrujú cez polyamidový filter s priemerom pórov 0,22 μm. Chromatografická analýza sa vykoná hneď po filtrácii.

8. PRACOVNÉ PODMIENKY

8.1. Prietok výluhu: 1ml/min

8.2. Teplota kolóny: 30 °C

8.3. Spektrofotometrická detekcia: 280 nm

8.4. Spektrofluorimetrická detekcia: λ ex = 276 nm, λ em = 345 nm, zisk = 10

8.5. Program gradientu elúcie

Čas (min.) Roztok A % Roztok B % Gradient 0 100 0 izokratický 3 100 0 lineárny 10 65 35 izokratický 15 65 35 lineárny 27 40,5 59,5 lineárny 29 0 100 izokratický 34 0 100 lineárny 36 100 0 izokratický 40 100 0

8.6. Priemerný retenčný čas lyzozýmu: 25,50 min.

9. VÝPOČET

Referenčné roztoky obsahujúce nasledujúce koncentrácie lyzozýmu sa analyzujú trikrát: 1; 5; 10; 50; 100; 200; 250 mg/l. Na každom chromatograme sa plochy maxím zodpovedajúce lyzozýmu prenesú do diagramu v závislosti od ich príslušných koncentrácií, aby sa získali priamky lineárnej regresie vyjadrené vzťahom Y = ax+b. Koeficient stanovenia r2 musí byť > 0,999.

10. VLASTNOSTI METÓDY

S cieľom vyhodnotiť spôsobilosť metódy pre stanovený cieľ sa vykonala overovacia štúdia pri zohľadnení lineárnosti, medzí detekcie a kvantifikácie a presnosti metódy. Posledný parameter sa stanovil tým, že sa definovala miera presnosti a exaktnosti metódy.

Rozsah lineárnosti (mg/l) Sklon priamky Koeficient stanovenia (r2) LD (mg/l) LQ (mg/l) Opakovateľnosť (n=5) RSD% Reprodukovateľnosť (n=5) RSD% Std1 V.R.2 V.B.3 Std1 UV 5-250 3,786 0,9993 1,86 6,20 4,67 5,54 0,62 1,93 FLD 1-250 52,037 0,9990 0,18 0,59 2,61 2,37 0,68 2,30

Tabuľka 1: Údaje týkajúce sa vlastností metódy: Std1 štandardný roztok, V.R.2 červené víno, V.B.3 biele víno

10.1. Lineárnosť metódy

Na základe výsledkov získaných vďaka analýze lineárnej regresie sa metóda v rozsahoch uvedených v tabuľke 1 javí ako lineárna.

10.2. Medza detekcie a kvantifikácia

Medza detekcie (LD) a medza kvantifikácie (LQ) sa vypočítali ako signál zodpovedajúci troj- a desaťnásobku chromatografického šumu v pracovných podmienkach na skutočnej matrici (tabuľka 1).

10.3. Presnosť metódy

Parametre, ktoré sa zohľadnili, sú opakovateľnosť a reprodukovateľnosť. V tabuľke 1 sa uvádzajú hodnoty týchto parametrov (vyjadrené ako % štandardnej odchýlky opakovaných meraní s rozdielnymi koncentráciami) zaznamenané pri štandardnom roztoku, bielom víne a červenom víne.

10.4. Exaktnosť metódy

Percento výťažnosti sa vypočítalo pre štandardné roztoky obsahujúce 5 a 50 mg/l lyzozýmu, doplnené daným množstvom lyzozýmu, ako sa uvádza v tejto tabuľke.

[C] východiskový nominálny (mg/l) Doplnenie (mg/l) [C] teoreticky (mg/l) [C] zistený (mg/l) Štandardná odchýlka Výťažnosť % UV 280 nm 50 13,1 63,1 62,3 3,86 99 FD 50 13,1 63,1 64,5 5,36 102 UV 280 nm 5 14,4 19,4 17,9 1,49 92,1 FD 5 14,4 19,4 19,0 1,61 97,7

21 SÍRANY (OIV- AS-321-05-SULFAT) – METÓDA TYPU II

1. PRINCÍP METÓD

1.1. Referenčná metóda

Vyzrážanie síranu bárnatého a jeho odváženie. Fosforečnan bárnatý vyzrážaný za rovnakých podmienok sa odstráni premytím zrazeniny kyselinou chlorovodíkovou.

V prípade muštov alebo vín bohatých na oxid siričitý sa musí uskutočniť najprv odsírenie povarením vo vzduchotesnej nádobe.

1.2. Rýchla skúšobná metóda

Vína sa rozdeľujú do niekoľkých kategórií s použitím takzvanej limitnej metódy založenej na vyzrážaní síranu bárnatého s použitím titrovaného roztoku iónmi bárya.

2. REFERENČNÁ METÓDA

2.1. Činidlá

2.1.1. 2 M roztok kyseliny chlorovodíkovej

2.1.2. Roztok chloridu bárnatého s koncentráciou BaCl2, 2H2O, 200 g/l

2.2. Postup

2.2.1. Všeobecný prípad

40 ml vzorky určenej na analýzu sa naleje do odstredivky s objemom 50 ml. Pridajú sa 2 ml 2 M kyseliny chlorovodíkovej a 2 ml roztoku chloridu bárnatého s koncentráciou 200 g/l. Roztok sa mieša sklenou tyčinkou. Tyčinka sa opláchne malým množstvom destilovanej vody a nechá sa 5 minút odstáť. Roztok sa nechá odstreďovať počas piatich minút, potom sa kvapalina nad zrazeninou opatrne dekantuje.

Zrazenina síranu bárnatého sa potom premyje týmto spôsobom: pridá sa 10 ml 2 M kyseliny chlorovodíkovej, zrazenina sa premieša za vytvorenia suspenzie a počas piatich minút sa odstreďuje. Kvapalina nad zrazeninou sa opatrne dekantuje. Premývanie sa opakuje dvakrát za rovnakých podmienok zakaždým s použitím 15 ml destilovanej vody.

Zrazenina sa kvantitatívne prenesie prepláchnutím destilovanou vodou do tarovanej platinovej kapsule a umiestni sa do vodného kúpeľa s teplotou 100 °C, až kým sa voda úplne neodparí. Vysušená zrazenina sa niekoľkokrát krátko vyžíha v plameni, kým sa nezíska biely zvyšok. Nechá sa vychladnúť v exsikátore a odváži sa.

Nech m je hmotnosť získaného síranu bárnatého v miligramoch.

2.2.2. Zvláštny prípad: sírené mušty a vína so zvýšeným obsahom oxidu siričitého

Najskôr sa odstráni oxid siričitý.

Do 500 ml kónickej banky s dávkovacím lievikom a vypúšťacou rúrkou sa vleje 25 ml vody a 1 ml čistej kyseliny chlorovodíkovej (ρ20 = 1,15 až 1,18 g/ml). Roztok s