Úradný vestník L 248 , 30/09/1996 S. 0001 - 0230



Smernica Komisie 96/54/ES z 30. júla 1996, ktorou sa po dvadsiatydruhýkrát prispôsobuje technickému pokroku, smernica Rady 67/548/EHS o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení týkajúcich sa klasifikácie, balenia a označovania nebezpečných látok (Text s významom pre EHP) KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV, so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spoločenstva, so zreteľom na smernicu Rady 67/548/EHS z 27. júna 1967 o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení týkajúcich sa klasifikácie, balenia a označovania nebezpečných látok [1], naposledy zmenenú a doplnenú smernicou Komisie 94/69/ES [2], najmä na jej článok 28, keďže príloha I smernice 67/548/EHS obsahuje zoznam nebezpečných látok, ich klasifikácie, označovania a, ak je to vhodné, ich charakterizácie koncentračnými limitmi a inými parametrami umožňujúcimi odhad rizika pre zdravie ľudí a životné prostredie; keďže sa zoznam nebezpečných látok v prílohe I musí prispôsobiť súčasným vedeckým a technickým poznatkom; keďže v dôsledku nevyhnutnosti doplnenia predhovoru k prílohe I tak, aby zahrňovala poznámky týkajúce sa označovania prípravkov a nových skupín organických látok v tabuľke B; keďže zoznam nebezpečných látok v prílohe I obsahuje látky, pre ktoré bola v Rakúsku a Švédsku aktom o pristúpení Rakúska, Fínska a Švédska priznaná dočasná osobitná výnimka z klasifikácie a označovania; keďže akt o pristúpení poskytuje prehľad klasifikácie a požiadavky označovania týchto látok; keďže klasifikácie niektorých týchto látok boli uvedené podľa toho prehľadu; keďže príloha III smernice 67/548/EHS obsahuje zoznam výrazov vyjadrujúcich charakter osobitného rizika spojeného s nebezpečnými látkami a prípravkami; keďže je nevyhnutné uviesť výrazy vyjadrujúce zdravotné ohrozenie určitými látkami a prípravkami; keďže v prílohe V smernice 67/548/EHS sú stanovené metódy určovania fyzikálno-chemických vlastností, toxicity a ekotoxicity látok a prípravkov; keďže je nevyhnutné prispôsobiť prílohu technickému pokroku; keďže príloha VI smernice 67/548/EHS obsahuje všeobecné kritériá klasifikácie a označovania nebezpečných látok a prípravkov; keďže je potrebné, uviesť kritériá pre zdravotne nebezpečné látky a prípravky; keďže je potrebné zmeniť a doplniť kritériá pre senzibilizujúce látky a prípravky; keďže je potrebné uviesť kritériá pre označovanie plynových zásobníkov určených pre propán, bután alebo skvapalnený ropný plyn (LPG); keďže ustanovenia tejto smernice sú v súlade so stanoviskom Výboru na prispôsobenie smerníc odstráneniu technických prekážok v obchode s nebezpečnými látkami a prípravkami, technickému pokroku; PRIJALA TÚTO SMERNICU: Článok 1 Smernica 67/548/EHS sa mení a dopĺňa takto: 1. Príloha I sa mení a dopĺňa nasledovne: a) poznámka 4 v predslove sa nahrádza týmto textom: "Poznámka 4 Prípravky obsahujúce tieto látky musia byť klasifikované ako škodlivé s R65, ak boli uvedené v kritériách v časti 3.2.3 prílohy VI."; b) pridáva sa poznámka 5: "Poznámka 5 Koncentračné limity plynných prípravkov sú vyjadrené ako objemové percentá." c) Do tabuľky B v predslove prílohy I smernice 67/548/EHS sa pridáva osobitná klasifikácia organických látok: +++++ TIFF +++++ d) položky v prílohe I podľa tejto smernice sa nahrádzajú zodpovedajúcimi položkami; e) po prvýkrát sa pridávajú položky v prílohe II podľa tejto smernice; f) Položky s nasledujúcimi číslami sa vypúšťajú: 008-002-00-3 612-045-00-9 648-011-00-5 648-025-00-1 648-157-00-X 648-158-00-5 648-159-00-0 649-192-00-3 g) položky uvedené v prílohe III podľa tejto smernice sa menia a dopĺňajú nahradením všetkých odkazov "R 22" za "R 65". 2. Do prílohy III sa pridáva nasledujúci pokyn: +++++ TIFF +++++ 3. Časť B prílohy V sa mení a dopĺňa takto: a) text prílohy IV.A tejto smernice nahrádza nadpis a všeobecný úvod k časti B: Metódy stanovenia toxicity; b) text prílohy IV.B tejto smernice sa vkladá po kapitole B.1 bis; c) text prílohy IV.C tejto smernice nahrádza kapitolu B.6; d) text prílohy IV.D tejto smernice nahrádza kapitolu B.7; e) text prílohy IV.E tejto smernice sa pridáva na koniec. 4. Príloha VI sa mení a dopĺňa textami stanovenými v prílohe V tejto smernice, ak je to v nej uvedené. Článok 2 1. Bez toho, aby sa to dotklo odseku 2, najneskôr však do 31. mája 1998, členské štáty uvedú do účinnosti zákony, iné právne predpisy a správne opatrenia potrebné na dosiahnutie súladu s touto smernicou. Členské štáty o tom bezodkladne informujú Komisiu. 2. Najneskôr do 31. októbra 1997 členské štáty uvedú do účinnosti zákony, iné právne predpisy a správne opatrenia potrebné na dosiahnutie súladu s prílohou V, bodmi F, I a J tejto smernice. Členské štáty o tom bezodkladne informujú Komisiu. 3. Členské štáty uvedú ustanovenia vzťahujúce sa na odsek 1 a 2, alebo pri ich úradnom uverejnení odkaz na túto smernicu. Podrobnosti o odkaze upravia členské štáty. Článok 3 Táto smernica nadobúda účinnosť 20. deň po jej uverejnení v Úradnom vestníku Európskych spoločenstiev. Článok 4 Táto smernica je adresovaná členským štátom. V Bruseli 30. júla 1996 Za Komisiu Ritt Bjerregaard člen Komisie [1] Ú. v. ES L 196, 16.8.1967, s. 1. [2] Ú. v. ES L 381, 31.12.1994, s. 1. -------------------------------------------------- ANEXO I — BILAG I — ANHANG I — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I — ANNEX I — ANNEXE I — ALLEGATO I — BIJLAGE I — ANEXO I — LIITE I — BILAGA I +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ -------------------------------------------------- ANEXO II — BILAG II — ANHANG II — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II — ANNEX II — ANNEXE II — ALLEGATO II — BIJLAGE II — ANEXO II — LIITE II — BILAGA II +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ -------------------------------------------------- ANEXO III — BILAG III — ANHANGIII — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ III — ANNEX III — ANNEXE III — ALLEGATO III — BIJLAGE III — ANEXO III — LIITE III — BILAGA III Indexové číslo +++++ TIFF +++++ -------------------------------------------------- PRÍLOHA IV A " ČASŤ B: METÓDY STANOVENIA TOXICITY A INÉHO ÚČINKU NA ZDRAVIE VŠEOBECNÝ ÚVOD: ČASŤ B A. VYSVETĽUJÚCA POZNÁMKA Na účely všeobecného úvodu sa používa nasledujúce číslovanie: B.15. Génová mutácia - Saccharomyces cerevisiae B.16. Mitotická rekombinácia - Saccharomyces cerevisiae B.17. Test génovej mutácie buniek cicavcov in vitro B.18. Poškodenie a náprava DNA – neplánovaná syntéza DNA pri bunkách cicavcov in vitro B.19. Test výmeny sesterských chromatidov in vitro B.20. Test na zachytenie recesívnych letálnych mutácii na pohlavie na Drosophila melanogaster B.21. Test bunkovej transformácie in vitro u cicavcov B.22. Dominantný letálny test u hlodavcov B.23. Cytogenetika zárodočných buniek cicavcov in vivo B.24. Test škvrnitosti na koži myší – in vivo B.25. Dedičná translokácia u myší – in vivo B.26. Test subchronickej orálnej toxicity: opakovaná orálna dávka podávaná po dobu 90 dní s použitím hlodavca B.27. Test subchronickej orálnej toxicity: opakovaná orálna dávka podávaná po dobu 90 dní s použitím iného druhu ako hlodavca B.28. Test subchronickej dermálnej toxicity: opakovaná dermálna dávka podávaná po dobu 90 dní s použitím rôznych druhov hlodavcov B.29. Test toxicity po 90 dňovej subchronickej inhalačnej expozície u hlodavcov B.30. Test chronickej toxicity B.31. Test teratogenity – u hlodavcov a iných druhov B.32. Test karcinogenity B.33. Test kombinovanej chronickej toxicity - karcinogenity B.34. Jednogeneračný test reprodukčnej toxicity B.35. Dvojgeneračný test reprodukčnej toxicity B.36. Toxikokinetika B. VŠEOBECNÉ DEFINÍCIE VÝRAZOV POUŽÍVANÝCH V TESTOVACÍCH METÓDACH V TEJTO PRÍLOHE i) Akútna toxicita zahŕňa nepriaznivé účinky, ktoré sa prejavia v priebehu určeného času (zvyčajne 14 dní) po podaní jednorázovej dávky látky. ii) Evidentná toxicita je všeobecný pojem opisujúci jasné znaky toxicity po podaní testovanej látky. Tieto by mali byť dostatočné pre hodnotenie nebezpečenstva a mali by byť také, že po zvýšení podanej dávky sa môžu očakávať intenzívne prejavy toxicity a pravdepodobné úmrtie. iii) Dávka je množstvo podanej testovanej látky. Dávka sa vyjadruje ako hmotnosť (gramy alebo miligramy) alebo ako hmotnosť testovanej látky na jednotku hmotnosti pokusného zvieraťa (t. j. miligramy na kilogram telesnej hmotnosti), alebo ako konštantná koncentrácie vo výžive (ppm alebo miligramy na kilogram potravy). iv) Odstupňovanádávka je najvyššia zo štyroch stabilných dávok, ktoré môžu byť podané bez toho, aby v súvislosti s podanou látkou spôsobili úmrtie (vrátane ľudských úmrtí). v) Dávkovanie je všeobecný pojem zahŕňajúci dávku, frekvenciu a dobu jej podávania. vi) LD50 (stredná letálna dávka) je štatisticky odvodená dávka látky, pri ktorej sa môže očakávať úmrtie 50 % testovaných zvierat. Hodnota LD50 sa vyjadruje ako hmotnosť testovanej látky na jednotku hmotnosti pokusného zvieraťa (miligramy na kilogram). vii) LC50 (stredná letálna koncentrácia) je štatisticky odvodená koncentrácia látky, pri ktorej sa môže očakávať úmrtie počas expozície alebo do určitého času po expozícii u 50 % testovaných zvierat za predpísanú dobu. Hodnota LC50 sa vyjadruje ako hmotnosť testovanej látky na štandardný objem vzduchu (miligramy na liter). viii) NOAEL je skratka pre hladinu, pri ktorej nebol pozorovaný nepriaznivý účinok a je to najvyššia dávka alebo expozícia, pri ktorej nebol po podaní látky pozorovaný nepriaznivý nález. ix) Opakovaná dávka/Subchronická toxicita zahŕňa nepriaznivé účinky vyskytujúce sa u pokusných zvierat ako výsledok opakovanej denne podávanej dávky látky, alebo expozície ňou počas krátkeho úseku očakávanej dĺžky života pokusných zvierat. x) Maximálna tolerovateľná dávka (MTD) je najvyššia zistená dávka so známkami toxicity u zvierat bez závažnejšieho vplyvu na ich prežitie vo vzťahu k testu, na ktorý bola použitá. xi) Podráždenie kože je tvorba zápalových zmien na koži následkom použitia testovanej látky. xii) Podráždenie oka je tvorba zmien v oku následkom použitia testovanej látky na predný povrch oka. xiii) Kožná senzibilizácia (alergická kontaktná dermatitída) je imunologicky sprostredkovaná kožná reakcia na látku. xiv) Dermálna žieravosť je tvorba ireverzibilného poškodenia tkaniva kože následkom použitia testovanej látky počas doby od 3 minút do 4 hodín. xv) Toxikokinetika je skúmanie absorpcie, distribúcie, metabolizmu a exkrécie testovanej látky. xvi) Absorpcia je proces, ktorým podaná látka vstupuje do tela. xvii) Exkrécia je proces, ktorým je podaná látka a/alebo sú jej metabolity odstránené z tela. xviii) Distribúcia je proces, ktorým absorbovaná látka a/alebo jej metabolity sú rozdelené v tele. xix) Metabolizmus je proces(y), ktorým(i) sa zmenia v tele štruktúry distribuovaných látok buď enzymatickými alebo neenzymatickými reakciami. B.I Akútna – opakovaná dávka/subchronická a chronická toxicita Akútne toxické účinky a orgánová alebo systémová toxicita látky môže byť hodnotená použitím rôznych toxikologických testov (metódy B.1-B.5), z ktorých sa po podaní jednej dávky získajú predbežné indikácie o toxicite. Konečným krokom testu by malo byť v závislosti od toxicity látky určenie hodnoty LD50, hoci u inhalačných štúdií nie je konečný krok určený, pretože po jednotlivej inhalačnej expozícii nie je možné určiť konečnú hodnotu. S ohľadom na minimalizáciu utrpenia zvierat sa môžu používať také metódy, ktoré používajú iba nevyhnutné množstvo zvierat, napr. metóda stabilnej dávky (metóda B.1 bis) a trieda akútnej toxicity (metóda B.1 tris). Na testovacej úrovni 1 môže byť doplnkom záverov z prvej štúdie testovanie na inom druhu zvierat. V tomto prípade sa používa štandardná metóda testovania alebo metóda môže byť prispôsobená pre menšie množstvo zvierat. Toxikologický test opakovanej dávky (metóda B.7, B.8 a B.9) zahŕňa odhad toxických účinkov vzniknutých po opakovanej expozícii. Z dôvodu získania čo najväčšieho množstva informácií sú potrebné starostlivé klinické pozorovania stresovaných zvierat. Tieto testy môžu pomôcť identifikovať toxicitu pre cieľové orgány a identifikovať toxické a netoxické dávky. V dlhodobých štúdiách sa môže vyžadovať hlbšie skúmanie týchto aspektov (metóda B.26 – B.30 a B.33). B.II Mutagenita – genotoxicita Mutagenita sa týka indukcie prenosných trvalých zmien v množstve alebo štruktúre genetického materiálu buniek alebo organizmov. Tieto zmeny, tzv. "mutácie", sa týkajú jedného génu alebo segmentov génov, blokády génov, alebo celých chromozómov. Účinky na celé chromozómy sú štrukturálne a/alebo číselné. Mutagénna aktivita látky sa stanovuje v testoch in vitro bodovými mutáciami génov pri baktériách (metóda B.13 a B.14) a/alebo anomálie štruktúry chromozómov buniek cicavcov (metóda B.10). Akceptujú sa tiež postupy in vivo, napr. mikronukleový test (metóda B.12) alebo analýza metafázy buniek kostnej drene (metóda B.11). Pri nedostatku kontraindikácií sú, pravdaže, výrazne uprednostňované metódy in vitro. Pre zvýšenie objemu a/alebo riadenia alebo ďalšieho skúmania odhadu rizika sa vyžadujú ďalšie doplnkové štúdie preskúmania mutagenity alebo predbežné vyšetrenie na karcinogenitu, čo môže byť použité na rôzne účely: overenie výsledkov získaných v základnej sade; preskúmanie ukazovateľov, ktoré neboli skúmané v základnej sade; inicializovanie alebo rozšírenie štúdii in vivo. Z týchto dôvodov zahŕňajú metódy B.15 až B.25 aj in vivo aj in vitro eukaryotické systémy a rozširujú hranice biologických ukazovateľov. Testy poskytujú informácie o bodových mutáciách a iných ukazovateľoch v zložitejších organizmoch ako sú baktérie, používané v základnom súbore. Vo všeobecnosti, ak sa vyžaduje program ďalších štúdií mutagenity, mal by byť naplánovaný tak, aby poskytol podstatné doplňujúce informácie o mutagénnom a/alebo karcinogénnom potenciáli látky. Súčasné štúdie, ktoré sú v osobitných prípadoch vhodné, budú závisieť od množstva faktorov, medzi ktoré patria chemické a fyzikálne vlastnosti látky, výsledky počiatočných bakteriálnych a cytogenetických pokusov, metabolický profil látky, výsledky iných toxikologických štúdií, a znalosť použitia látky. Z pohľadu rozmanitosti faktorov, ktoré môžu vyžadovať okolnosti, je z tohto dôvodu pevná schéma výberu testov nevhodná. Niektoré všeobecné princípy stratégie testovania sú načrtnuté v smernici 93/67/EHS, ale jasné stratégie testovania sú uvedené v dokumente technických zásad pre odhad rizika, ktorý je napriek tomu flexibilný a za určitých okolností sa prispôsobuje okolnostiam. Na základe všeobecných genetických ukazovateľov sú metódy pre ďalšie skúmanie predsa len nižšie roztriedené: Štúdie skúmajúce (bodové) genetické mutácie a) priame alebo reverzné štúdie mutácie pri použití eukaryotických mikroorganizmov (Saccharomyces cerevisiae) (metóda B.15) b) štúdie in vitro na skúmanie priamych mutácií v bunkách cicavcov (metóda B.17) c) test pohlavne viazanej recesívnej letality Drosophila melanogaster (metóda B.20) d) test mutácie somatických buniek in vivo, spot test myší (metóda B.24) Štúdie skúmajúce anomálie chromozómov a) cytogenetické štúdie in vivo u cicavcov; do úvahy sa berú analýzy metafázy buniek kostnej drene in vivo, ak neboli zahrnuté v počiatočnom hodnotení (metóda B.11). Naviac sa skúma aj cytogenéza zárodočných buniek in vivo (metóda B.23) b) štúdie cytogenézy buniek cicavcov in vitro, ak neboli zahrnuté v počiatočnom hodnotení (metóda B.10) c) štúdie dominantnej letality hlodavcov (metóda B.22) d) test dedičnej translokácie myší (metóda B.25) Genotoxické účinky – účinky na DNA Genotoxicita, stotožňovaná s potenciálne škodlivým účinkom na genetický materiál, nie je nevyhnutne spojená s mutagenitou, jej príznakom je indukované poškodenie DNA bez priamej prítomnosti mutácie. Na skúmanie genotoxicity sú uvedené metódy, pri ktorých sa používajú eukaryotické mikroorganizmy alebo bunky cicavcov, vhodné: a) mitotická rekombinácia Saccharomyces cerevisiae (metóda B.16) b) poškodenie a náprava DNA – neplánované syntézy DNA – cicavčie bunky– in vitro (metóda B.18) c) výmena sesterských chromatidov v bunkách cicavcov – in vitro (metóda B.19) Alternatívne metódy skúmania karcinogénneho potenciálu Používajú sa pokusy transformácie buniek cicavcov, pri ktorých sa skúma schopnosť látky indukovať morfologické zmeny bunkových kultúr a zmeny ich správania, pričom sa predpokladá, že sú spojené so zhubnou transformáciou (metóda B.21). Používa sa množstvo odlišných typov buniek a kritérií pre transformáciu. Odhad rizika vplyvu na dedičnosť cicavcov Používajú sa metódy merania vplyvu na dedičnosť cicavcov, ktoré spôsobujú bodové génové mutácie, napr. osobitný miestny test myší, pri ktorom sa merajú mutácie zárodočných buniek v prvej generácii (v tejto prílohe nie sú zahrnuté) alebo anomálie chromozómov, napr. test dedičnej translokácie u myší (metóda B.25). Tieto metódy sa používajú, ak pomôžu pri odhade možného genetického rizika látky pre človeka. Z pohľadu obtiažnosti týchto testov a nevyhnutnosti použitia veľkého množstva zvierat, najmä v osobitnom miestnom teste, je, pochopiteľne, pred vykonaním štúdii nutné ich dôrazné zdôvodnenie. B.III Karcinogenita Chemikália je v závislosti od odhadovaného mechanizmu účinku opísaná ako genotoxická alebo negenotoxická. Predbežné informácie o genotoxickom karcinogénnom potenciále látky sa získavajú zo štúdií mutagenity/genotoxicity. Prídavné informácie sa získavajú zo štúdií opakovanej dávky, testov subchronickej alebo chronickej toxicity. Toxikologický test opakovanej dávky, metóda B.7 a dlhšie štúdie opakovanej dávky zahŕňajú stanovenie histopatologických zmien, ktoré sú pozorované v toxikologických testoch opakovanej dávky, napr. hyperplazia určitých tkanív. Tieto štúdie a toxikokinetické informácie pomáhajú identifikovať chemikálie s karcinogénnym potenciálom, ktoré vyžadujú podrobné skúmanie týchto aspektov v teste karcinogenity (metóda B.32) alebo často v kombinácii s chronickou toxicitou/štúdiom karcinogenity (metóda B.33). B.IV Reprodukčná toxicita Reprodukčná toxicita môže byť zisťovaná rôznymi spôsobmi, napr. funkcie alebo kapacita párenia samcov a samíc označovaná ako "vplyv na plodnosť", alebo indukcia nededičného škodlivého vplyvu na progény, označovaná ako "vývojová toxicita", do ktorej sa zahŕňa aj teratogenita a účinky počas laktácie. U teratogénnych štúdií ako súčasti testovania vývojovej toxicity je testovacia metóda (metóda B.31) riadená najmä spôsobom orálneho použitia. Prípadne sa v závislosti od fyzikálnych vlastností testovanej látky používajú iné spôsoby podania látky alebo spôsoby pravdepodobné pri expozícii človeka. V takýchto prípadoch je vhodné metódu upraviť tak, že sa zoberú do úvahy vhodné prvky 28-dňovej metódy testovania. Ak sa vyžaduje trojgeneračný reprodukčný test plodnosti, popísaný dvojgeneračný reprodukčný test (metóda B.35) sa rozšíri o tretiu generáciu. B.V Neurotoxicita Neurotoxicita môže byť zisťovaná rôznymi spôsobmi, napr. funkčné a/alebo štruktúrne a biochemické zmeny centrálneho alebo periférneho nervového systému. Predbežné indikácie neurotoxicity sa získavajú pri testoch akútnej toxicity. Toxikologický test opakovanej dávky, metóda B.7, zahŕňa odhad neurotoxických účinkov, a nevyhnutnosť starostlivého klinického pozorovania stresovaných zvierat tak, aby sa získalo toľko informácií, koľko je len možné. Táto metóda pomáha pri identifikácii látok s neurotoxickým potenciálom, ktoré vyžadujú podrobné skúmanie týchto aspektov. Okrem toho je potrebné vziať do úvahy potenciál látok s osobitnými neurotoxickými účinkami, ktoré neboli zistené v iných toxikologických štúdiách. Napr. pri niektorých organofosforových zlúčeninách bol pozorovaný v metódach B.37 a B.38 oneskorený neurotoxický účinok po expozícii jednou alebo opakovanými dávkami. B.VI Imunotoxicita Imunotoxicita môže byť zisťovaná rôznymi spôsobmi, napr. imunosupresia a/alebo zvýšenie odozvy imunitného systému s vplyvom na precitlivenosť alebo na indukovanú autoimunitu. Odhad imunotoxických účinkov je zahrnutý v toxikologickom teste opakovanej dávky, metóda B.7. Táto metóda pomáha pri identifikácii látok s imunotoxickým potenciálom, ktoré vyžadujú podrobné skúmanie týchto aspektov. B.VII Toxikokinetika Toxikokinetické štúdie pomáhajú pri interpretácii a vyhodnotení toxikologických údajov. Tieto štúdie objasňujú detailné aspekty toxicity testovaných chemikálií a pomáhajú pri navrhovaní ďalších toxikologických štúdií. Neuvažuje sa o tom, že by bolo potrebné vo všetkých prípadoch stanovovať všetky parametre. Iba vo výnimočných prípadoch je nevyhnutná celá séria toxikokinetických štúdií (absorpcia, exkrécia, distribúcia a metabolizmus). Pri niektorých zlúčeninách sa doporučujú zmeny poradia v sérii alebo sa za postačujúcu považuje štúdia jednej dávky (metóda B.36). Indikácie o absorpčných vlastnostiach pomocou plánovaného spôsobu použitia a možností metabolizmu a distribúcie v tkanivách poskytujú aj informácie o chemickej štruktúre (SAR) a fyzikálno-chemických vlastnostiach. Informácie o toxikokinetických parametroch pochádzajú aj z predchádzajúcej toxicity a toxikokinetických štúdií. C. KLASIFIKÁCIA TESTOVANEJ LÁTKY Pred začatím toxikologickej štúdie musí byť známe zloženie testovanej látky, hlavné nečistoty, a podstatné fyzikálno-chemické vlastnosti vrátane jej stability. Fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej látky poskytujú dôležité informácie pri výbere spôsobu použitia, plánovaní každého detailu štúdie a pri manipulácii s testovanou látkou a pri jej skladovaní. Začatiu štúdie musí predchádzať vývoj analytickej metódy pre kvalitatívne a kvantitatívne stanovenie testovanej látky (vrátane hlavných nečistôt, ak je možné) v testovanom a biologickom materiále. V správe z testu musia byť uvedené všetky informácie týkajúce sa identifikácie, fyzikálno-chemických vlastností, čistoty a chovania sa testovanej látky. D. STAROSTLIVOSŤ O ZVIERATÁ Pri toxikologickom testovaní je dôležitá prísna kontrola životných podmienok a vhodnej starostlivosti o zvieratá. i) Podmienky bývania Životné podmienky v experimentálnych zverincoch alebo ohradách musia byť vhodné pre testovaný druh. Pre potkany, myši a morčatá je vhodná teplota miestnosti 22°C ± 3°C s relatívnou vlhkosťou od 30 % do 70 %. Pre králiky je to teplota 20oC ± 3°C s relatívnou vlhkosťou od 30 % do 70 %. Niektoré experimentálne postupy sú najmä citlivé na teplotu a v týchto prípadoch bývajú podrobnosti uvedené v opise metódy testovania. Pri všetkých sledovaniach toxických účinkov sa sleduje tiež teplota a vlhkosť, zaznamenáva sa a uvádza sa v záverečnej správe štúdie. Osvetlenie má byť umelé v intervaloch 12 hodín svetlo, 12 hodín tma. Detaily o vlastnostiach osvetlenia sa zaznamenávajú a uvádzajú v záverečnej správe štúdie. Zvieratá sú držané jednotlivo alebo sú umiestnené do klietok v malých skupinách toho istého pohlavia, iba ak je to v metóde uvedené; v jednej klietke nesmie byť umiestnených viac ako päť zvierat. V správe k pokusom so zvieratami sa uvádza spôsob ich umiestnenia v klietkach, počet zvierat v každej klietke aj počas expozície chemikáliou aj počas nasledujúcej doby pozorovania. ii) Podmienky kŕmenia Strava musí vyhovovať výživovým požiadavkám testovaného druhu. Ak sú testované látky podávané zvieratám v strave, môžu byť nutričné hodnoty znížené interakciou medzi látkou a zložkami potravy. Pri interpretácii výsledkov testu sa musí vziať do úvahy možnosť takýchto reakcií. Bežná laboratórna strava sa podáva s neobmedzeným prídelom pitnej vody. Výber potravy môže byť ovplyvnený potrebou zaistenia vhodného prídavku testovanej látky pri použití danej metódy. Kontaminanty potravy, o ktorých je známe, že vplývajú na toxicitu, nesmú byť prítomné v koncentráciách, ktoré by rušili testovanie. E. POHODLIE ZVIERAT Pohodliu zvierat sa musí pri vypracovávaní metódy testovania venovať primeraná pozornosť. Nižšie sú stručne uvedené niektoré príklady, ale tento prehľad nie je vyčerpávajúci. Presné znenie a/alebo podmienky sú uvedené v textovej časti metód: - pri stanovení akútnej orálnej toxicity je potrebné uvažovať o dvoch alternatívnych metódach, "metóde stabilnej dávky" a "metóde zaradenia akútnej toxicity". "Metóda stabilnej dávky" nevyužíva úmrtnosť ako typický ukazovateľ a používa sa pri nej málo zvierat. "Metóda zaradenia akútnej toxicity" používa priemerne o 70 % menej zvierat ako metóda B.1 pre akútnu orálnu toxicitu. Obidve tieto alternatívne metódy sú menej bolestivé a spôsobujú menej utrpenia než klasické metodiky, - počet používaných zvierat sa redukuje na vedecky akceptovateľné minimum: pri metóde B.1 a B.3 sa testujú na jednej hladine dávky iba 5 zvierat toho istého pohlavia; test maximalizácie stanovenia precitlivenosti pokožky u morčiat používa iba 10 zvierat (a iba 5 v negatívnej kontrolnej skupine) (metóda B.6); počet zvierat potrebných na pozitívnu kontrolu pri testovaní mutagenity in vivo sa tiež znižuje (metóda B.11 a B.12), - bolesť a utrpenie zvierat počas testov sa minimalizuje; zvieratá vykazujúce vážne a trvanlivé príznaky utrpenia a bolesti je nutné humánne usmrtiť; dávky testovaných látok, o ktorých je známe, že zapríčiňujú zjavnú bolesť a utrpenie spôsobené leptavými a dráždivými vlastnosťami látky, sa nesmú používať (metóda B.1, B.2 a B.3). - testovaniu s neodôvodnene vysokými dávkami je nutné sa vyhnúť zavedením obmedzených testov, a to nielen pri testoch akútnej toxicity (metóda B.1, B.2 a B.3), ale aj pri testoch mutagenity in vivo (metóda B.11 a B.12). - stratégia testovania na dráždivosť v súčasnosti dovoľuje, ak už existuje vedecky postačujúci dôkaz, nevykonať test alebo ho redukovať na štúdiu na jednom zvierati. Takýto vedecký dôkaz je založený na fyzikálno-chemických vlastnostiach látky, na výsledkoch iných už uskutočnených testov alebo na výsledkoch dostatočne potvrdených testov in vitro. Napríklad, ak bola štúdia akútnej toxicity po kožnej aplikácii riadená testom limitnej dávky zlúčeniny (metóda B.3) a nebolo pozorované žiadne podráždenie pokožky, ďalšie testovanie na podráždenie pokožky (metóda B.4) nie je nevyhnutné; látky, u ktorých bolo dokázané jednoznačné rozožieranie alebo silné dráždenie pokožky v štúdii dermálnej dráždivosti (metóda B.4) sa ďalej netestujú na očnú dráždivosť (metóda B.5). F. ALTERNATÍVNE TESTOVANIE Vedeckým zámerom v Európskej únii je vývoj a hodnotenie alternatívnych postupov, ktoré poskytnú takú istú úroveň informácií ako súčasné štúdie na zvieratách, ale ktoré používajú menej zvierat, spôsobujú menej utrpenia alebo sa vyhýbajú ich použitiu úplne. Tieto metódy, tak ako sa zavádzajú, treba brať do úvahy všade tam, kde je možné uskutočniť charakterizáciu rizika a následnú klasifikáciu a opísanie vlastného rizika. G. VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA Po vyhodnotení a interpretovaní testov sa berú do úvahy obmedzenia v rozsahu, v ktorom boli výsledky štúdií na zvieratách a štúdií in vitro extrapolované priamo na človeka a z toho dôvodu sa dôkaz nepriaznivého účinku na človeka, pokiaľ je prístupný, používa na potvrdenie výsledkov testovania. Na základe skutočných vlastností, ktoré boli zistené a kvantifikované týmito metódami sa používajú výsledky na klasifikáciu a označenie nových a existujúcich chemikálií vzhľadom na ich účinky na ľudské zdravie. Výsledky sa používajú tiež na štúdie odhadu rizika nových a existujúcich chemikálií a z tohto dôvodu sa v príslušných dokumentoch zásad uvádzajú vhodné stratégie testovania. H. ODPORÚČANÁ LITERATÚRA Väčšina uvedených metód sa vyvíja v rámci programu OECD pre zásady testovania a uskutočňuje sa v zhode so zásadami správnej laboratórnej praxe s cieľom zaistenia "vzájomnej akceptácie údajov" v takom rozsahu, ako je len možné. Ďalšie informácie sa dajú získať v odkazoch uvedených v zásadách OECD a v príslušnej inde uvedenej literatúre. " -------------------------------------------------- PRÍLOHA IV B " B.1 tris AKÚTNA (ORÁLNA) TOXICITA – METÓDA TRIEDY AKÚTNEJ TOXICITY 1. METÓDA 1.1. Úvod Metóda triedy akútnej toxicity poskytuje informácie pre odhad aj pre klasifikáciu rizika. Pri metóde sa používajú tri stabilné dávky, ktoré sa vyberajú tak, aby na základe výsledkov štúdie umožnili klasifikáciu zlúčeniny. Okrem toho postup opísaný v tejto testovacej metóde umožňuje výber troch doplnkových stabilných dávok, ktoré sa môžu použiť buď ako alternatívna možnosť pri danom rozhodovaní, alebo ako možnosť pre ďalšie testovanie. Použitie (niektorej) doplnkovej dávky prichádza do úvahy v prípade vhodnosti alebo nutnosti ďalšej prepracovanosti metódy. Pri metóde sa používajú určené počiatočné dávky, pričom sa neuvažuje o tom, že by sa získala presná hodnota LD50, ale očakáva sa stanovenie rozsahu letálnej expozície, aj keď usmrtenie časti zvierat je ešte stále hlavným ukazovateľom testu. Výsledky testu umožňujú klasifikáciu podľa kritérií prílohy VI. Určitou nevýhodou výsledného charakteru metódy je jej dĺžka, ktorá je vyššia ako pri postupe uvedenom v B.1. Hlavnou výhodou je zníženie počtu zvierat oproti metóde akútnej (orálnej) toxicity (B.1), ako aj oproti metóde stabilnej dávky (B.1 bis). Pozri aj všeobecný úvod časť B. 1.2 Definície Pozri Všeobecný úvod Časť B. 1.3 Princíp testovacej metódy Skupine experimentálnych zvierat sa orálne podáva jedna z určených dávok. Látka sa testuje postupne, pričom pri každom kroku sa používajú tri zvieratá jedného pohlavia. Nie je nevyhnutné uskutočniť predbežnú štúdiu. Neprítomnosť alebo prítomnosť mortality zvierat v súvislosti s podanou dávkou v jednom kroku určuje nasledujúci krok, napríklad: - ďalšie testovanie nie je potrebné - nasledujúci krok sa uskutoční s tou istou dávkou, ale so zvieratami odlišného pohlavia - nasledujúci krok sa uskutoční s vyššou alebo nižšou dávkou. 1.4 Popis testovacej metódy 1.4.1 Príprava Náhodne sa vyberú mladé zdravé dospelé zvieratá označené povolením zvláštnej registrácie a najmenej 5 dní pred začiatkom testovania sú držané v klietkach, aby sa aklimatizovali na laboratórne podmienky. Môžu byť umiestnené v klietkach po skupinách podľa pohlavia a dávky, ale ich počet v klietke nesmie prekážať možnosti pozorovania každého jedinca. Testovaná látka sa podáva v jednej dávke žalúdočnou sondou alebo vhodnou intubačnou kanylou. Ak je to potrebné, testovaná látka sa rozpustí alebo je suspendovaná vo vhodnom nosiči. Najprv sa, pokiaľ je to možné, odporúča použitie vodných roztokov alebo suspenzií, ako druhé použitie (kukuričných) olejových roztokov alebo suspenzií a potom iných roztokov v iných nosičoch. Toxické vlastnosti nevodných nosičov by mali byť známe a ak nie sú, musia byť pred testovaním stanovené. Zvieratá nesmú byť pred fortifikáciou kŕmené (napríklad u potkanov noc pred tým a u myší 3-4 hodiny pred tým); voda im nesmie byť odoprená. 1.4.2 Podmienky testovania 1.4.2.1. Testované zvieratá Ak neexistujú žiadne kontraindikácie, uprednostňujú sa hlodavce. Musia sa vybrať samičky, ktoré zatiaľ nerodili a nie sú tehotné. Na začiatku štúdie musia byť rozdiely hmotností zvierat minimálne a nesmú presahovať 20 % priemernej hmotnosti u každého pohlavia. 1.4.2.2. Počet a pohlavie V každom kroku sa použijú tri zvieratá jedného pohlavia. V počiatočnom kroku sa použijú obidve pohlavia. 1.4.2.3. Hladiny dávok Dávka, s ktorou sa začína, je vybraná z troch stabilných dávok, t. j. 25, 200 a 2000 mg/kg telesnej hmotnosti. Táto dávka musí s veľkou pravdepodobnosťou spôsobovať mortalitu prinajmenšom u niektorých zvierat. V závislosti na počiatočnej dávke sa použije jedna z blokových schém postupov opísaných v prílohe 1. Pri výbere pohlavia a počiatočnej dávky sa využijú všetky prístupné informácie vrátane informácií o vzťahu medzi štruktúrou a aktivitou. Ak informácie naznačujú, že pri najvyššej dávke je mortalita nepravdepodobná (2000 mg/kg telesnej hmotnosti), uskutoční sa limitný test. Pokiaľ nie sú žiadne informácie o testovanej látke, z humánnych dôvodov sa odporúča použiť počiatočnú dávku 200 mg/kg telesnej hmotnosti. Príležitostne je žiaduce jemné rozlíšenie dávkovania, pri ktorom nestačí použitie troch stabilných dávok 25, 200 a 2000 mg/kg telesnej hmotnosti. V týchto prípadoch sa použije aj testovanie s doplnkovými stabilnými dávkami 5, 50 alebo 500 mg/kg telesnej hmotnosti. Dávky, o ktorých je známe, že spôsobujú zjavnú bolesť a utrpenie vplyvom leptavých alebo prudko dráždivých vlastností, sa nesmú používať. Časový interval medzi testovanými skupinami sa určuje nábehom, trvaním a bolestivosťou toxických príznakov. Testovanie zvierat iného pohlavia alebo testovanie s nasledujúcou dávkou sa musí odložiť do doby, kým nie je presvedčivo dokázané prežitie zvierat testovaných s predchádzajúcou dávkou. 1.4.2.4. Limitný test Limitný test na jednej úrovni dávky 2000 mg/kg telesnej hmotnosti sa uskutočňuje s tromi zvieratami každého pohlavia. Ak táto dávka spôsobuje mortalitu, uskutočňuje sa ďalšie testovanie na úrovniach 200 mg/kg (alebo 500 mg/kg) telesnej hmotnosti. 1.4.2.5. Doba pozorovania Bežne sa zvieratá pozorujú 14 dní s výnimkou prípadov, pri ktorých musia byť zvieratá vyňaté zo štúdie a humánne usmrtené z humánnych dôvodov, alebo ak uhynú. Doba pozorovania nie je, pochopiteľne, prísne nemenná. Môže byť určená toxickými reakciami, časom nábehu a dĺžkou doby zotavenia, a ak je to nutné, predlžuje sa. Čas, keď sa toxické príznaky objavia a keď zmiznú, je dôležitý, a to najmä vtedy, ak toxické príznaky majú tendenciu oneskorovať sa. Všetky pozorovania sa systematicky priebežne zaznamenávajú pre každé zviera osobitne. 1.4.3. Postup Pred podaním dávky sa musí zvážiť doba, počas ktorej sa zvieratá nebudú kŕmiť. Po použití dávky sa potrava zvieratám nepodáva počas ďalších 3-4 hodín. Pokiaľ sa dávka podáva po častiach presahujúcich uvedený čas, v závislosti od dĺžky použitia sa zvieratám poskytuje strava aj voda. Maximálny objem naraz podanej kvapaliny závisí od veľkosti testovaných zvierat. U hlodavcov nesmie bežne tento objem presahovať 1 ml/100g telesnej hmotnosti; pri dávkovaní vodných roztokov je to objem 2 ml/100 mg telesnej hmotnosti. Premenlivosť dávkovaných objemov sa minimalizuje nastavením koncentrácie, čím sa zaistí konštantný objem na všetkých úrovniach dávok. Ak nie je možné podať dávku naraz, dávka sa podáva v malých podieloch počas doby, ktorá neprevyšuje 24 hodín. Podrobnosti o postupe testovania sú opísané v prílohe 1. 1.4.3.1. Všeobecné pozorovania Počas testovania sa uskutočňujú starostlivé klinické pozorovania najmenej dvakrát denne alebo ešte častejšie počas indikácie odozvy zvierat na testovanie a najmenej raz denne po nej. Pri zistení stavu umierania zvierat a zvierat vykazujúcich vážne bolesti a trvalé znaky vážneho utrpenia musia byť tieto humánne usmrtené. Zvieratá usmrtené z humánnych dôvodov sa považujú za zvieratá uhynuté pri testovaní. Čas usmrtenia zvierat z humánnych dôvodov alebo čas ich uhynutia pri testovaní sa musí zaznamenať tak presne, ako je len možné. Ďalšie pozorovania sú nevyhnutné, ak zvieratá ďalej vykazujú známky toxicity. V týchto pozorovaniach musia byť zahrnuté zmeny na pokožke a kožušine, očiach a sliznici, a tiež zmeny dýchacieho, obehového, vegetatívneho a centrálneho nervového systému, zmeny pohybovej aktivity a správania. Pozornosť sa zameriava na pozorovanie chvenia, záchvatov, kŕčov, slinenie, hnačku, letargiu, spánku a bezvedomia. Všetky pozorovania sa systematicky zaznamenávajú pre každé zviera osobitne. 1.4.3.2. Telesná hmotnosť Všetky zvieratá sa vážia krátko pred podaním testovanej látky a najmenej každý týždeň potom. Zmeny v hmotnostiach sa prepočítavajú a zaznamenávajú. Po skončení testu sa prežité zvieratá vážia pred tým, ako sú humánne usmrtené. 1.4.3.3 Autopsia Všetky testované zvieratá vrátane tých, ktoré uhynuli počas testovania, alebo boli z testu vyňaté, sa podrobujú autopsii. U každého zvieraťa sa zaznamenávajú všetky makroskopické patologické zmeny. U zvierat, ktoré prežívajú 24 alebo viac hodín, sa vykonávajú mikroskopické vyšetrenia orgánov vykazujúcich makroskopický patologický dôkaz, pretože môžu poskytnúť užitočné informácie. 2. ÚDAJE Pre každé zviera sa musia zabezpečiť osobitné údaje. Naviac musia byť všetky údaje zhrnuté v tabuľkovej forme pre každú testovanú skupinu s počtom použitých zvierat, počtom zvierat, u ktorých sa prejavili známky toxicity, počtom zvierat uhynutých počas testu alebo usmrtených z humánnych dôvodov, časom uhynutia jednotlivých zvierat, opisom a časovým priebehom toxických účinkov a ich reverzibility, a pitevné nálezy. Všeobecné zásady interpretácie výsledkov pri klasifikácii sú v prílohe 2. 3. SPRÁVA Správa z testu Správa z testu má obsahovať, pokiaľ je to možné, nasledujúce informácie: Testované zvieratá: - druh/kmeň - mikrobiálny stav, pokiaľ je známy - počet, vek a pohlavie zvierat - zdroj, spôsob chovu, strava, atď.; - individuálne hmotnosti zvierat na začiatku testu, v týždenných intervaloch po začiatku a na konci testu. Podmienky testovania: - zdôvodnenie iného výberu nosiča ako voda - podrobnosti o podávaní testovanej látky vrátane dávkovaného objemu a času dávkovania - podrobnosti o strave a kvalite vody (vrátane typu/zdroja, zdroja vody) - zdôvodnenie výberu počiatočnej dávky. Výsledky: - zostavenie tabuliek údajov o odozve podľa pohlavia a dávky pre každé zviera (t. j. zvierat vykazujúcich známky toxicity vrátane úmrtnosti, povahy, sily a trvania účinkov); - časový priebeh nábehu toxických príznakov a či boli reverzibilné u každého zvieraťa; - pitevné a ak sú prístupné aj histopatologické nálezy u každého zvieraťa. Diskusia Záver 4. ODKAZY Táto metóda je obdobná OECD TG 423. PRÍLOHA 1 POSTUP TESTOVANIA 1. Ako je uvedené v bode 1.4.2.3, počiatočná dávka musí s veľkou pravdepodobnosťou spôsobovať mortalitu prinajmenšom u niektorých testovaných zvierat. Informácie, ktoré sa používajú pri výbere počiatočnej dávky zahŕňajú: - údaje o fyzikálno-chemických vlastnostiach, - závislosť štruktúra - aktivita, - všetky údaje z iných toxikologických testov a - predpokladané použitie testovanej látky. 2. Pre každú počiatočnú dávku poskytujú príslušné testovacie schémy zahrnuté do tejto prílohy návod na postup, ktorým sa treba riadiť. Postup testovania sa riadi v závislosti od počtu humánne usmrtených alebo uhynutých zvierat vyznačených šípkami. 3. Keď pri počiatočnej dávke 25 alebo 200 mg/kg telesnej hmotnosti uhynie iba jedno zviera z druhého pohlavia, bežne sa v testovaní nepokračuje. Ak však u ďalších piatich zvierat neboli pozorované žiadne toxické príznaky, počas pitvy je nutné vylúčiť možnosť súvislosti úmrtia s testovanou látkou. V takýchto prípadoch je nutné, aby test pokračoval s nasledujúcou vyššou dávkou. 4. Ak pri dávke 2000 mg/kg telesnej hmotnosti zahynie jedno zviera z každého pohlavia, predpokladá sa, že hodnota LD50 prevyšuje túto dávku. Keďže toto je hraničný výsledok, reakciu zvyšných dvoch zvierat z každého pohlavia je potrebné starostlivo zvážiť a jav potvrdiť. Zjavné toxické príznaky u týchto zvierat môžu oprávnene viesť ku klasifikácii príslušnej hodnoty LD50 na 2000 mg/kg telesnej hmotnosti alebo menej, alebo je to nutné potvrdiť ďalším testovaním na tej istej hladine. 5. Postup dovoľuje testovanie pri troch doplnkových stabilných dávkach (možnosť 2). Táto možnosť sa môže použiť buď pri výbere ďalšej dávky v danom bode rozhodovania, alebo na ďalšie testovanie po ukončení súčasného testu (možnosť 1). Pri možnosti 1 je postup testovania vyznačený hrubými šípkami a pri možnosti 2 tenkými. a) Postup testovania s počiatočnou dávkou 25 mg/kg telesnej hmotnosti +++++ TIFF +++++ b) Postup testovania s počiatočnou dávkou 200 mg/kg telesnej hmotnosti +++++ TIFF +++++ c) Postup testovania s počiatočnou dávkou 2000 mg/kg telesnej hmotnosti +++++ TIFF +++++ PRÍLOHA 2 INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV TESTOVANIA NA ZÁKLADE MOŽNOSTI 1 Sivé políčka znázornené nižšie a políčko "žiadne ďalšie testovanie" v schémach tejto prílohy zobrazujú uzavretie klasifikácie hodnôt. Ďalší postup testovania je načrtnutý v možnosti 1, príslušný ukazovateľ je nutné sledovať smerom dolu pokiaľ nedosiahne dotyčný sivé políčko. a) Interpretácia výsledkov testovania na základe možnosti 1 Počiatočná dávka: 25 mg/kg telesnej hmotnosti +++++ TIFF +++++ b) Interpretácia výsledkov testovania na základe možnosti 1 Počiatočná dávka: 200 mg/kg telesnej hmotnosti +++++ TIFF +++++ c) Interpretácia výsledkov testovania na základe možnosti 1 Počiatočná dávka: 2000 mg/kg telesnej hmotnosti +++++ TIFF +++++ " -------------------------------------------------- PRÍLOHA IV C " B.6 PODRÁŽDENIE POKOŽKY 1. METÓDA 1.1. Úvod Poznámky: Citlivosť a schopnosť testov zistiť potenciál senzibilizátorov ľudskej pokožky je považovaný v systéme klasifikácie toxicity dôležitej pre ľudské zdravie za dôležitý. Neexistuje jednoduchá metóda testovania, ktorá by postačujúco rozpoznala všetky látky s potenciálom dráždenia ľudskej pokožky a ktorá by bola vhodná pre všetky látky. Pri výbere testu sa berú do úvahy také faktory, ako sú fyzikálne vlastnosti látky, vrátane jej schopnosti prenikať do pokožky. Skúšky s adjuvansom sú pravdepodobne presnejšie v predpovedi pravdepodobného senzibilizačného účinku na ľudskú pokožku ako metódy bez použitia Freundsovho kompletného adjuvansu, a preto sa im dáva prednosť. Vyvinuli sa dva typy testov, pri ktorých sa používajú morčatá: testy s pomocnou látkou, v ktorých je alergický stav zosilňovaný rozpustením alebo suspendovaním látky v kompletnom Freundsovom adjuvanse (FCA), a testy bez pomocnej látky. Často používaným typom adjuvansového testu je maximalizovaný test morčiat (GPMT). Hoci sa na zistenie potenciálu látky spôsobujúcej precitlivelosť pokožky používajú aj iné metódy, GPMT sa medzi adjuvansovými metódami uprednostňuje. U väčšiny skupín chemikálií sa neadjuvansové metódy (uprednostňuje sa Buehlerov test) považujú za menej citlivé. V určitých prípadoch môžu existovať príčiny pre výber Buehlerovho testu, v ktorom sa využíva miestne použitie namiesto intradermálneho vstrekovania využívaného maximalizovaným testom morčiat (GPMT). Pri použití Buehlerovho testu je nevyhnutné vedecké zdôvodnenie jeho použitia. V tejto metóde je popísaný maximalizovaný test morčiat (GPMT) aj Buehlerov test. Iné metódy sa môžu použiť za predpokladu, že sú dostatočne overené a vedecky zdôvodnené. Ak sa v screeningovom teste zistia pozitívne výsledky, látka sa navrhne ako potenciálny senzibilizátor a nie je potrebné uskutočniť ďalšie testovanie s morčatami. Ak sa v takomto teste zistia negatívne výsledky, je nutné uskutočniť test s morčatami použitím postupu opísaného v tejto testovacej metóde. Pozri aj všeobecný úvod časť B. 1.2 Definície Precitlivenosť pokožky: (alergická kontaktná dermatitída) je imunologicky sprostredkovaná kožná reakcia na látku. U človeka sú reakcie charakterizované svrbením, sčervenaním pokožky, edémami, bradavicami, vezikulami, bulami alebo ich kombináciou. U iných druhov môžu byť reakcie odlišné a môže sa spozorovať iba sčervenanie kože a edémy. Indukcia expozície: experimentálna expozícia jedinca testovanou látkou s cieľom vyvolania precitlivelého stavu. Doba indukcie: doba najmenej jeden týždeň nasledujúca po indukcii expozície, počas ktorej sa vyvinul precitlivelý stav. Opakované vyvolanie reakcie expozíciou: experimentálna expozícia jedinca testovanou látkou nasledujúca po dobe indukcie. Zisťuje sa ňou, či jedinec reaguje hypersenzitívne. 1.3 Doporučené látky Citlivosť a spoľahlivosť použitej experimentálnej metódy sa stanovuje každých šesť mesiacov použitím látok, u ktorých sú známe mierne účinky na precitlivenosť pokožky. V správne riadených testoch sa očakáva u látok s miernymi účinkami na precitlivenosť pokožky prinajmenšom 30 % odozva v adjuvansovom teste a 15 % v neadjuvansovom teste. Uprednostňujú sa nasledujúce látky: CAS číslo | EINECS číslo | Názov EINECS | Bežný názov | 101-86-0 | 202-983-3 | aldehyd kys. α-hexyl škoricovej | aldehyd kys. α-hexyl škoricovej | 149-30-4 | 205-736-8 | benzotiazol-2-tiol (merkaptobenzotiazol) | kaptax | 94-07-7 | 202-303-5 | benzokaín | nordkaín | Pri splnení horeuvedených kritérií sa za určitých okolností môžu použiť s primeraným zdôvodnením aj iné kontrolné látky. 1.4 Princíp testovacej metódy Na začiatku sú testované zvieratá vystavené účinku testovanej látky intradermálnym vstrekovaním a/alebo epidermálnou aplikáciou (indukcia expozície). Nasleduje vyčkávacie obdobie perióda 10 až 14 dní (indukcia expozície), počas ktorej sa vyvíja imunitná odozva, a potom sa zvieratá vystavia účinku opakovanej dávky. U testovaných zvierat sa rozsah a stupeň reakcie pokožky pri opakovanej expozícii porovná s kontrolnými zvieratami, ktoré boli podrobené simulovanej aplikácii počas indukcie a bola na nich použitá opakovaná expozícia. 1.5 Popis testovacích metód Ak sa považuje za nevyhnutné odstrániť testovanú látku, uskutočňuje sa to vodou alebo vhodným rozpúšťadlom bez toho, aby sa tým zmenila už existujúca odozva, alebo aby bola porušená celistvosť pokožky. 1.5.1 Maximalizovaný test morčiat (GPMT) 1.5.1.1. Príprava Mladé zdravé dospelé morčatá (albíni) sa aklimatizujú na laboratórne podmienky prinajmenšom počas 5-tich dní pred testom. Pred testom sú zvieratá náhodne pridelené do testovaných skupín. Srsť sa im v závislosti od použitej metódy ostrihá, oholí alebo chemicky depiluje. Je nutné chrániť pokožku pred obrúsením. Pred začatím testu a pri jeho ukončení sa zvieratá zvážia. 1.5.1.2. Podmienky testovania 1.5.1.2.1. Testované zvieratá Bežne sa používajú laboratórne kmene albínov morčiat. 1.5.1.2.2. Počet a pohlavie Používajú sa samce a/alebo samice. Ak sa používajú samice musia to byť jedinci, ktoré zatiaľ nerodili, a nie sú tehotné. V testovanej skupine sa používa minimálne 10 zvierat a v kontrolnej skupine 5 zvierat. Ak sa použije menej ako 20 testovaných a 10 kontrolných morčiat a nie je možné dôjsť k záveru, že testovaná látka je senzibilizátor, testuje sa s dodatočnými zvieratami, pričom sa výrazne doporučuje pracovať s minimálne 20 zvieratami v testovanej skupine a 10 zvieratami v kontrolnej skupine. 1.5.1.2.3. Hladiny dávok Koncentrácia testovanej látky pri každej indukcii expozície musí byť systematicky tolerovaná a musí byť použitá najvyššia z dávok spôsobujúcich mierne podráždenie pokožky. Pri opakovanej expozícii sa používa najvyššia dávka nespôsobujúca podráždenie. Ak je to nevyhnutné, vhodné koncentrácie sa určia pri pilotnej štúdii používajúcej dve alebo tri zvieratá. Pri aplikácii sa používa kompletný Freundsov Adjuvans (FCA). 1.5.1.3. Postup 1.5.1.3.1. Indukcia Deň 0 – testovaná skupina Na oblasť pleca zbaveného srsti sa použijú tri páry intradermálneho vstreknutia objemu 0,1 ml. Vstrekovanie 1: zmes 1:1 (v/v) FCA/voda alebo fyziologický roztok Vstrekovanie 2: vybraná koncentrácia testovanej látky vo vhodnom nosiči Vstrekovanie 3: vybraná koncentrácia testovanej látky zmiešaná so zmesou 1:1 (v/v) FCA/voda alebo fyziologický roztok. Pri 3. vstrekovaní sú rozpustné látky rozpustené vo vodnej fáze ešte pred zmiešaním s FCA. Lipofilné alebo nerozpustné látky sa suspendujú v FCA ešte pred spojením s vodnou fázou. Výsledná koncentrácia musí byť totožná s koncentráciou použitou pri 2. vstrekovaní. Vstrekovania 1 a 2 sú prevedené blízko seba a to čo najbližšie k hlave, zatiaľ čo vstrekovanie 3 sa prevedie kaudálnym smerom na testovanom povrchu. Deň 0 – kontrolná skupina Na to isté miesto ako u testovanej skupiny sa použijú tri páry intradermálneho vstreknutia objemu 0,1 ml. Vstrekovanie 1: zmes 1:1 (v/v) FCA/voda alebo fyziologický roztok Vstrekovanie 2: neriedený nosič Vstrekovanie 3: zmes 50 % v/v nosiča v zmesi 1:1 (v/v) FCA/voda alebo fyziologický roztok. Deň 5-7 – testovaná a kontrolná skupina. V prípade látky, ktorá nedráždi pokožku, sa približne dvadsať štyri hodín pred uskutočnením indukcie pri lokálnom nanášaní testovaný povrch po ostrihaní a/alebo oholení ošetrí 0,5 ml 10 % sodnej soli sulfátu kyseliny laurovej vo vazelíne, čím sa lokálne podráždenie vyvolá. Deň 6-8 – testovaná skupina Na testovanej ploche sa opäť odstráni srsť. Filtračný papier (2 x 4 cm) zmáčaný testovanou látkou vo vhodnom nosiči sa priloží na testovaný povrch a počas 48 hodín sa udržuje s ním v kontakte pomocou nepriepustného obväzu alebo nepriepustného obalu. Deň 6-8 – kontrolná skupina Na testovanej ploche sa opäť odstráni srsť. Podobným spôsobom sa vhodný nosič priloží na testovaný povrch a počas 48 hodín sa udržuje v kontakte s ním pomocou nepriepustného obväzu alebo nepriepustného obalu. 1.5.1.3.2. Opakovaná aplikácia Deň 20-22 – testovaná a kontrolná skupina Z bokov testovaných a kontrolných zvierat sa odstráni srsť. Náplasť zmáčaná testovanou látkou sa použije na jeden bok zvierat a ak je to potrebné, na druhý bok sa použije náplasť zmáčaná samotným nosičom. Náplasti sa počas 48 hodín udržujú v kontakte s testovaným povrchom pomocou nepriepustného obväzu alebo obalu. 1.5.1.3.3. Pozorovania a odstupňovanie odozvy: testovaná a kontrolná skupina - približne 21 hodín po odstránení náplasti je testovaný povrch vyčistený, ostrihaný a/alebo vyholený a depilovaný, ak je to nevyhnutné; - približne o 3 hodiny neskôr (približne 48 hodín po začatí opakovanej aplikácie) sa sleduje kožná reakcia a pozorovanie sa zaznamená podľa stupňov uvedených v dodatku; - približne 24 hodín po tomto a druhom (72 hodín) pozorovaní sa pozorovanie uskutoční opäť a zaznamená sa; Doporučuje sa uskutočnenie slepého pokusu testovaných aj kontrolných zvierat. Ak je potrebné potvrdiť výsledky získané opakovanou aplikáciou, uskutoční sa opätovná opakovaná aplikácia s použitím novej kontrolnej skupiny. Táto aplikácia sa prevádza približne jeden týždeň po prvej. Opätovná opakovaná aplikácia sa tiež prevádza s pôvodnou kontrolnou skupinou. Všetky kožné reakcie a nezvyčajné nálezy, vrátane systémových reakcií, zistené pri metóde indukčnej aj opakovanej aplikácie je nutné zaznamenať podľa klasifikačnej škály Magnusson/Kligman (pozri dodatok). Pri objasňovaní nejednoznačných reakcií sa uskutočňujú ďalšie postupy, napríklad histopatologické vyšetrenie alebo meranie hrúbky zriasenia pokožky. 1.5.2. Buehlerov test 1.5.2.1. Príprava Mladé zdravé dospelé morčatá (albíni) sa aklimatizujú na laboratórne podmienky prinajmenšom počas 5-tich dní pred testom. Pred testom sú zvieratá náhodne pridelené do testovaných skupín. Srsť sa im v závislosti od použitej metódy ostrihá, oholí alebo chemicky depiluje. Je nutné chrániť pokožku pred obrúsením. Pred začatím testu a pri jeho ukončení sa zvieratá zvážia. 1.5.2.2. Podmienky testovania 1.5.2.2.1. Testované zvieratá Bežne sa používajú laboratórne kmene albínov morčiat. 1.5.2.2.2. Počet a pohlavie Používajú sa samce a/alebo samice. Ak sa používajú samice musia to byť jedinci, ktoré zatiaľ nerodili, a nie sú tehotné. V testovanej skupine sa používa minimálne 20 zvierat a v kontrolnej skupine 10 zvierat. 1.5.2.2.3. Hladiny dávok Pri každej indukcii expozície sa používa koncentrácia testovanej látky zodpovedajúca najvyššej dávke spôsobujúcej mierne, ale nie nadmerné podráždenie pokožky. Pri opakovanej expozícii sa používa najvyššia dávka nespôsobujúca podráždenie. Ak je to nevyhnutné, vhodné koncentrácie sa určia pri pilotnej štúdii, ktorá používa dve alebo tri zvieratá. Pre testované látky rozpustné vo vode je vhodné použiť vodu alebo zriedený roztok zmáčadla ako nosiča. U iných testovaných materiálov sa uprednostňuje pri indukčnej aplikácii 80 % etanol/voda a pri opakovanej aplikácii acetón. 1.5.2.3. Postup 1.5.2.3.1. Indukcia Deň 0 – testovaná skupina Jeden bok je vyčistený od srsti (krátkym ostrihaním). Náplasti musia byť zmáčané testovanou látkou vo vhodnom nosiči (výber nosiča musí byť oprávnený; ak je to výhodné, môžu byť kvapalné testované látky použité neriedené). Náplasť sa použije na testovaný povrch a počas 6 hodín sa udržuje s ním v kontakte pomocou vhodného obväzu alebo obalu. Náplasti musia byť nepriepustné. Vhodné sú bavlnené vankúšiky buď kruhového alebo štvorcového tvaru veľkosti približne 4-6 cm2. Uprednostňuje sa zabezpečenie pohltenia použitím vhodných ochranných materiálov. Pri použití obväzovania je možné, že sa bude musieť použiť doplňujúca expozícia. Deň 0 – kontrolná skupina Jeden bok je vyčistený od srsti (krátkym ostrihaním). Použije sa iba nosič, a to obdobne ako pri kontrolnej skupine. Náplasť sa počas 6 hodín udržuje v kontakte s pokožkou pomocou nepriepustného obväzu alebo obalu. Ak je dokázané, že nie je nevyhnutné použiť simulovanú kontrolnú skupinu, používa sa obyčajná kontrolná skupina. Deň 6-8 a 13-15 – testovaná a kontrolná skupina Na tej istej testovanej ploche (ak je to potrebné, vyčistenej) toho istého boku sa používa tá istá aplikácia ako v 0. dni aj v 6.-8. dni a aj v 13.-15. dni. 1.5.2.3.2. Opakovaná aplikácia Deň 27-29 – testovaná a kontrolná skupina Netestovaný bok testovaných a kontrolných zvierat sa vyčistí od srsti (krátkym ostrihaním). Vhodné množstvo testovanej látky na nepriepustnom obväze alebo v obale sa použije na zadnú časť netestovaného boku testovaných a kontrolných zvierat. Používa sa maximálna koncentrácia, pri ktorej nedochádza k podráždeniu. Ak je to vhodné, na predtým netestovanú časť boku testovaných aj kontrolných zvierat sa použije nepriepustná náplasť alebo obal s nosičom. Nepriepustná náplasť alebo obal prichytený vhodným obväzom sa udržuje v kontakte s pokožkou počas 6 hodín. 1.5.2.3.3. Pozorovania a odstupňovanie odozvy: testovaná a kontrolná skupina - približne 21 hodín po odstránení náplasti je testovaný povrch opäť vyčistený od srsti, - približne o 3 hodiny neskôr (asi 30 hodín po začatí opakovanej aplikácie) sa sleduje kožná reakcia a pozorovanie sa zaznamená podľa stupňov uvedených v dodatku, - približne 24 hodín po predchádzajúcom pozorovaní (asi 54 hodín po opakovanej aplikácii) sa uskutoční ďalšie pozorovanie a opäť sa zaznamená. Doporučuje sa uskutočnenie slepého pokusu testovaných aj kontrolných zvierat. Ak je potrebné potvrdiť výsledky získané prvou opakovanou aplikáciou, uskutoční sa druhá opakovaná aplikácia s použitím novej kontrolnej skupiny. Táto aplikácia sa prevádza približne jeden týždeň po prvej. Opätovná opakovaná aplikácia sa uskutočňuje tiež s pôvodnou kontrolnou skupinou. Všetky kožné reakcie a nezvyčajné nálezy, vrátane systémových reakcií, zistené pri metóde indukčnej aj opakovanej aplikácii je nutné sledovať a zaznamenať podľa klasifikačnej škály Magnusson/Kligman (pozri prílohu). Pri objasňovaní nejednoznačných reakcií sa uskutočňujú ďalšie postupy, napríklad histopatologické vyšetrenie alebo meranie hrúbky zriasenia pokožky. 2. ÚDAJE Všetky údaje musia byť zhrnuté v tabuľkovej forme s každou pozorovanou reakciou podráždenia pokožky zvieraťa. 3. SPRÁVA (GPMT A BUEHLER) Ak sa pred testom morčiat uskutoční screeningová skúška, je potrebné uviesť spolu s výsledkami uskutočneného testu a doporučenými testovacími látkami aj popis alebo odkaz na screeningovú skúšku (napríklad skúška lokálnych lymfatických uzlín (LLNA), test opuchnutia ucha u myší (MEST)), vrátane podrobností o postupoch. Správa o teste (GPMT a Buehler) Správa o teste má obsahovať, pokiaľ je to možné, nasledujúce informácie: Testované zvieratá: - kmeň použitých morčiat, - počet, vek a pohlavie zvierat, - zdroj, podmienky bývania, strava, atď., - individuálne hmotnosti zvierat na začiatku testu. Podmienky testovania: - metódu prípravy náplastí, - podrobnosti o materiále náplastí a technike ich použitia pri testovaní, - výsledky pilotnej štúdie s vyhodnotením koncentrácií použitých pri indukčnej a opakovanej aplikácii, - podrobnosti o príprave použitej látky, o jej aplikácii a odstránení, - zdôvodnenie výberu nosiča, - koncentrácie nosiča a testovanej látky použité pri indukčnej a opakovanej expozícii a celkové množstvo aplikovanej látky použitej pri indukcii aj opakovanej expozícii. Výsledky: - zostavenie tabuliek posledných výsledkov precitlivenosti a kontrole spoľahlivosti (pozri 1.3) vrátane informácií o testovanej látke, jej koncentrácii a nosiči, - o každom zvierati vrátane systému stupňovania dávok, - podrobný popis povahy a stupňa pozorovaných účinkov, - histopatologické nálezy. Diskusia. Záver. 4. ODKAZY Táto metóda je obdobná OECD TG 406. Dodatok TABUĽKA Klasifikačná škála pre vyhodnotenie škodlivých účinkov vyvolaných škvŕn podľa Magnusson/Kligmana 0 = | žiadne viditeľné zmeny | 1 = | nespojitý alebo škvrnitý erytém (sčervenanie kože) | 2 = | stredne silný a zlievajúci sa erytém | 3 = | intenzívny erytém a edém | " -------------------------------------------------- PPRÍLOHA IV D " B.7 TOXICITA PO 28 DŇOVEJ OPAKOVANEJ DÁVKE PO ORÁLNEJ APLIKÁCII 1. METÓDA 1.1. Úvod Pozri všeobecný úvod časť B. 1.2 Definície Pozri všeobecný úvod časť B. 1.3 Princíp testovacej metódy Niekoľkým skupinám experimentálnych zvierat sa denne orálne podáva testovaná látka v odstupňovaných dávkach spôsobom, pri ktorom sa každej skupine podáva jedna dávka počas 28-dňovej periódy. Počas periódy podávania sa zvieratá často pozorujú, pričom sa denne kontroluje prítomnosť znakov toxického účinku. Pitva sa uskutoční aj na zvieratách uhynutých alebo usmrtených počas testovania, tak aj po ukončení testu na zvieratách, ktoré test prežijú. Pri tejto metóde sa kladie väčší dôraz na neurologické účinky ako osobitný parameter a zvláštnu pozornosť je potrebné venovať klinickým pozorovaniam zvierat tak, aby sa získalo čo najviac informácií. Pri tejto metóde je potrebné určiť neurotoxický potenciál látok a získať tak oprávnenie pre podrobné preskúmanie tohto aspektu. Naviac môže táto metóda poskytnúť indikácie o imunologických účinkoch a o toxicite na reprodukčné orgány. 1.4 Popis testovacej metódy 1.4.1 Príprava Náhodne sa do kontrolných a testovaných skupín vyberú mladé zdravé dospelé zvieratá. Klietky sa musia umiestniť tak, že bude minimalizovaný vplyv umiestnenia na účinky. Zvieratá musia byť jednoznačne rozpoznateľné a najmenej 5 dní pred začiatkom testovania sú držané v klietkach, aby sa aklimatizovali na laboratórne podmienky. Testovaná látka sa podáva žalúdočnou sondou alebo prostredníctvom stravy alebo pitnej vody. Metóda orálnej aplikácie závisí od účelov testovania a od fyzikálno-chemických vlastností látok. Ak je potrebné, testovaná látka sa rozpustí alebo je suspendovaná vo vhodnom nosiči. Ako prvé sa, pokiaľ je to možné, odporúča použitie vodných roztokov alebo suspenzií, ako druhé použitie (kukuričných) olejových roztokov alebo suspenzií a potom iných roztokov v iných nosičoch. Toxické vlastnosti nevodných nosičov by mali byť známe. Stabilita testovanej látky v nosiči sa musí stanoviť. 1.4.2. Podmienky testovania 1.4.2.1. Testované zvieratá Uprednostňovaným druhom zvierat sú potkany, aj keď sa môžu použiť aj iné hlodavce. Používajú sa bežné laboratórne kmene mladých zdravých a dospelých jedincov. Musia sa vybrať samice, ktoré zatiaľ nerodili, a nie sú tehotné. Testovanie je nutné začať čo najskôr po odstavení dojčiat a v niektorých prípadoch pred dosiahnutím veku deväť týždňov. Na začiatku štúdie musia byť rozdiely hmotností zvierat minimálne a nesmú presahovať 20 % priemernej hmotnosti u každého pohlavia. Ak je štúdia opakovanej orálnej dávky predbežnou štúdiou dlhodobej štúdie, pokiaľ je to možné, používajú sa v oboch štúdiách zvieratá toho istého kmeňa a z toho istého zdroja. 1.4.2.2. Počet a pohlavie Na každej hladine dávkovania sa použije prinajmenšom 10 zvierat (päť samíc a päť samcov). Ak sa medzitým plánuje usmrcovanie zvierat, ich množstvo sa zvyšuje o plánovaný počet zvierat, ktoré sa usmrtia pred ukončením štúdie. Môže sa naviac použiť sprievodná skupina 10 zvierat (5 z každého pohlavia), ktorej sa podáva vyššia dávka počas 28 dní a sleduje sa reverzibilita, perzistencia, alebo oneskorovanie toxických účinkov počas 14 dní po ukončení aplikácie. Tak isto sa používa sprievodná skupina 10 kontrolných zvierat (5 z každého pohlavia). 1.4.2.3. Hladiny dávok Bežne sa používajú tri testované a jedna kontrolná skupina. So zvieratami v kontrolnej skupine sa musí zaobchádzať tak isto ako so zvieratami v testovaných skupinách s výnimkou podania testovanej látky. Ak sa pri podávaní testovanej látky používa nosič, kontrolná skupina ho musí dostať v najvyššom objeme, v akom je použitý v testovaných skupinách. Ak sa zo zhodnotenia iných údajov neočakávajú žiadne účinky pri dávke 1000 mg/kg telesnej hmotnosti za deň, uskutočňuje sa limitný test. Ak nie sú k dispozícii žiadne vhodné údaje, uskutočňuje sa vyhľadávací test s cieľom stanoviť dávky, ktoré sa použijú. Pri výbere hladín dávok sa berú do úvahy existujúce údaje o toxicite a (toxiko-) kinetike testovanej látky a príbuzných látok. Najvyššia dávka sa vyberá tak, aby indukovala toxické účinky, ale nespôsobovala uhynutie zvierat alebo vážne utrpenie. Podľa toho sa vyberá aj znižujúca sa postupnosť hladín dávok s cieľom určenia závislosti odozvy od dávky a stanovenia hodnoty NOAEL pri najnižšej hladine. Pri nastavovaní klesania úrovní sú často najvhodnejšie dvoj- až štvorúrovňové intervaly a pridanie štvrtej testovacej skupiny sa považuje za výhodnejšie z dôvodu zvýšenia veľkosti intervalov (napríklad viac ako o faktor 10) medzi hladinami dávok. Pri látkach podávaných prostredníctvom stravy alebo pitnej vody je dôležité sa uistiť, že používané množstvá testovanej látky neinterferujú s obvyklou výživovou hodnotou stravy alebo s vodnou rovnováhou. Testovaná látka sa v strave podáva buď pri konštantnej koncentrácii v strave (ppm) alebo pri konštantnej hladine vzhľadom na telesnú hmotnosť zvierat; použitá alternatíva musí byť určená. Pri podávaní žalúdočnou sondou sa dávka používa v rovnakom čase každý deň a prispôsobuje sa telesnej hmotnosti zvierat, čím sa zachová konštantnosť dávky. Ak je štúdia opakovanej orálnej dávky predbežnou štúdiou dlhodobej štúdie, v obidvoch štúdiách sa používa rovnaká strava. 1.4.2.4. Limitný test Ak sa zistí, že test pri jednej hladine najmenej 1000 mg/kg telesnej hmotnosti za deň, alebo rovnocenné množstvo v percentách v strave alebo v pitnej vode (založené na určení telesnej hmotnosti) nespôsobil u testovaných zvierat žiadne toxické príznaky, a ak sa toxické účinky neočakávajú ani na základe údajov štruktúrne príbuzných zlúčenín, potom sa nepovažuje za nevyhnutné uskutočniť celú štúdiu s použitím troch hladín. Výnimkou je prípad, keď expozícia človeka indikuje potrebnosť skúmania na vyššej hladine, a vtedy sa používa limitný test. 1.4.2.5. Doba pozorovania Doba pozorovania trvá 28 dní. Zvieratá v sprievodnej skupine, ktoré sa plánujú použiť pri ďalšom sledovaní, sa držia najmenej ďalších 14 dní bez akéhokoľvek podávania, aby bolo možné zistiť oneskorené účinky, alebo ich perzistenciu, alebo zotavenie sa po nich. 1.4.3. Postup Dávky sú zvieratám podávané denne sedem dní v týždni počas obdobia 28 dní, použitie 5-dňového režimu dávkovania je nutné zdôvodniť. Ak sa testovaná látka podáva žalúdočnou sondou, uskutočňuje sa to v jednej dávke a to buď žalúdočnou sondou alebo vhodnou intubačnou kanylou. Maximálny objem kvapaliny, ktorý môže byť použitý naraz závisí od veľkosti testovaných zvierat. Objem nesmie presiahnuť 1 ml/100 g telesnej hmotnosti s výnimkou vodných roztokov, pri ktorých sa používa objem 2 ml/100 g telesnej hmotnosti. Kolísanie objemu sa minimalizuje nastavením koncentrácie, aby sa zabezpečil konštantný objem pri všetkých dávkovaných úrovniach, s výnimkou dráždiacich alebo žieravých látok, ktoré bežne so zvyšujúcou sa koncentráciou zhoršujú účinky. 1.4.3.1. Všeobecné pozorovania Najmenej raz denne je nutné uskutočniť všeobecné klinické pozorovania, najlepšie vždy v tom istom čase s ohľadom na časový vrchol očakávaných účinkov po podaní. Zaznamenáva sa zdravotný stav zvierat. Najmenej dvakrát denne si treba všímať chorobnosť a úmrtnosť zvierat. Pri zaznamenaní umierajúcich zvierat a zvierat viditeľne trpiacich alebo viditeľne pociťujúcich bolesť sa tieto odstránia, humánne usmrtia a prevedie sa ich pitva. Raz pred prvou aplikáciou (je dovolené porovnanie jednotlivých zvierat medzi sebou) a potom najmenej raz týždenne sa uskutočňujú u všetkých zvierat podrobné klinické skúmania. Uskutočňujú sa mimo domovských klietok, pokiaľ možno, vždy v tom istom čase. Pozorovania sa starostlivo zaznamenávajú najlepšie systémom čiarok v políčkach podrobne formulovanými testujúcim laboratóriom. Je potrebné zaistiť čo najmenšie zmeny testovacích podmienok a výhodné je, ak pozorovania vedie pozorovateľ nepoznajúci postup testovania. Medzi príznaky, ktoré je potrebné si všímať, patria zmeny na koži, kožušine, očiach, sliznici, výskyt sekrécie, exkrécie a vegetatívnej aktivity (slzenie, piloerekcia, veľkosť zreničiek, nezvyčajné dýchanie), ale uvedené príznaky nie sú vyčerpávajúce. Zmeny chôdze, postoj a reakcia na manipuláciu, ako aj prítomnosť šklbavých pohybov alebo svalové napätie, stereotypné (napríklad nadmerné očisťovanie tela, opakované krúženie) alebo výstredné správanie (napríklad samozmrzačovanie, cúvanie) je nutné tiež zaznamenať. Vo štvrtom týždni expozície sa uskutočňuje určenie zmyslovej reaktivity podnecovanej odlišnými spôsobmi (napríklad zvukovými, zrakovými a proprioceptívnymi podnetmi), určenie sily zovretia a určenie motorickej aktivity. Ďalšie podrobnosti o postupoch, ktoré sa majú uskutočniť, sú uvedené v literatúre (pozri všeobecný úvod časť B). Funkčné pozorovania vo štvrtom týždni expozície sa nemusia uskutočniť, ak je štúdia uskutočňovaná ako predbežná štúdia subchronickej štúdie (90 dní).V tomto prípade sa funkčné pozorovania uskutočnia v nasledujúcej štúdii. Na druhej strane, dostupnosť údajov o funkčných pozorovaniach zo štúdie opakovanej dávky zvyšujú možnosť výberu úrovní dávkovaných v nasledujúcej subchronickej štúdii. Výnimočne sa nemusia uskutočniť funkčné pozorovania u skupiny, v ktorej sa inak preukážu toxické príznaky v takom rozsahu, že by mohli významne interferovať s uskutočnením funkčných testov. 1.4.3.2. Telesná hmotnosť a spotreba potravy/vody Všetky zvieratá sa vážia najmenej raz za týždeň. Meranie spotreby potravy a vody sa uskutočňuje najmenej raz za týždeň. Pokiaľ je testovaná látka podávaná v pitnej vode, meria sa aj spotreba vody najmenej raz za týždeň. 1.4.3.3. Hematológia Na konci testovacieho obdobia sa uskutočňujú nasledujúce hematologické testy: hematokrit, koncentrácia hemoglobínu, počet erytrocytov, celkový a diferenčný počet leukocytov, počet krvných doštičiek a meranie času/potenciálu zrážanlivosti krvi. Vzorky krvi sa odoberajú zo stanoveného miesta tesne pred alebo počas postupu usmrtenia zvierat a uchovávajú sa za vhodných podmienok. 1.4.3.4. Klinická biochémia Klinická biochémia skúma hlavné toxické účinky v tkanivách a najmä účinky na obličky a pečeň. Vyšetrenie sa uskutočňuje zo vzoriek krvi, ktoré sa odoberajú všetkým zvieratám tesne pred alebo počas postupu usmrtenia zvierat a uchovávajú sa za vhodných podmienok (okrem uhynutých a/alebo práve usmrtených zvierat). Noc pred odberom vzoriek krvi sa odporúča zvieratám potravu nepodávať [1]. Vyšetrenie plazmy alebo séra zahŕňa sodík, draslík, glukózu, celkový cholesterol, močovinu, kreatinín, celkové proteíny a albumín, najmenej dva enzýmy indukujúce hepatocelulárne účinky (ako alanín-aminotransferáza, aspartát-aminotransferáza, alkalická fosfatáza, gama-glutamyl transpeptidáza, a sorbitol-dehydrogenáza). Meranie ďalších enzýmov (hepatálneho alebo iného pôvodu) a žlčových kyselín môže za určitých okolností poskytnúť užitočné informácie. Nepovinne sa uskutočňujú počas posledného týždňa štúdie nasledujúce analýzy moču, ktorý sa zhromažďuje v závislosti od času: vzhľad, objem, osmolalita alebo určitá hmotnosť, pH, proteíny, glukóza a krv/krvinky. Naviac sa berú do úvahy aj štúdie na vyšetrenie sérových markerov poškodenia hlavných tkanív. Ďalšie stanovenia sa uskutočňujú, ak známe vlastnosti testovanej látky sú alebo sú podozrievané z toho, že ovplyvňujú príbuzné metabolické profily vrátane vápnika, fosfátov, stálych triglyceridov, určitých hormónov, methemoglobínu a cholínesterázy. Tieto parametre je potrebné určiť u látok určitých tried alebo prípad od prípadu. Celkovo je potrebný pružný prístup, ktorý závisí od druhu zvierat a od pozorovaných a/alebo očakávaných účinkov s danou látkou. Ak je historická databáza údajov nedostatočná, musí sa pred začatím podávania odôvodniť uskutočnenie stanovenia hematologických a klinicko-biochemických premenných. 1.4.3.5. Makroskopická pitva Všetky zvieratá v štúdii sa podrobujú kompletnej podrobnej makroskopickej pitve, ktorá zahŕňa starostlivé skúmanie vonkajšieho povrchu tela, všetky otvory, a lebečnú, hrudnú a brušnú dutinu a ich obsah. Pečeň, obličky, nadobličky, semenníky, nadsemenníky, týmus, slezina, mozog a srdce všetkých zvierat sa v prípade potreby orežú od prirastených tkanív a odvážia sa za mokra čo najskôr po pitve, aby sa zabránilo ich vysušeniu. V čo najvhodnejších stabilizačných médiách sa uchovávajú obidva druhy tkanív a kvôli budúcemu histopatologickému skúmaniu sa uchovávajú nasledujúce tkanivá: všetky makroskopické poškodenia tkaniva, mozog (reprezentatívne časti vrátane mozgu, mozočku a mostu), miecha, žalúdok, tenké a hrubé črevo (vrátane Peyerových škvŕn), pečeň, obličky, nadoblička, slezina, srdce, týmus, štítna žľaza, priedušnica a pľúca (konzervované nafúknutím fixačným prostriedkom a potom ponorením doň), pohlavné žľazy, vedľajšie pohlavné orgány (napríklad maternica, prostata), močový mechúr, lymfatické uzliny (pokiaľ možno jednu lymfatickú uzlinu na skúmanie trasy podávanej látky a jednu vzdialenejšiu od miesta podania na skúmanie systémových účinkov), periférne nervy (ischiatické alebo holenné) prednostne blízko proximálneho svalu, a časť kostnej drene (alebo ako náhrada mikroskopicky odsatá čerstvá kostná dreň). Klinické a ďalšie nálezy naznačujú potrebu skúmania ďalších tkanív. Podobne sa uchovávajú aj orgány považované za cieľové orgány na základe známych vlastností testovanej látky. 1.4.3.6. Histopatologické vyšetrenie Úplná histopatológia sa uskutočňuje na uchovaných orgánoch a tkanivách všetkých zvierat v kontrolnej skupine aj v skupinách testovaných vysokými dávkami. Histopatologické vyšetrenie sa môže rozšíriť aj na zvieratá v skupinách s iným dávkovaním, ak sa pozorovali od dávky závislé zmeny v skupine s vysokou dávkou. Skúmajú sa všetky makroskopické poškodenia. Pri použití sprievodnej skupiny zvierat sa histopatológia uskutoční na tkanivách a orgánoch, u ktorých v testovaných skupinách boli zistené nejaké účinky. 2. ÚDAJE Pre každé zviera sa musia zabezpečiť osobitné údaje. Naviac musia byť všetky údaje zhrnuté v tabuľkovej forme pre každú testovanú skupinu na začiatku testu, počet zvierat uhynutých počas testu alebo usmrtených z humánnych dôvodov, čas uhynutia alebo humánneho usmrtenia jednotlivých zvierat, počet zvierat, u ktorých sa prejavili známky toxicity, popis pozorovaných známok toxicity vrátane nábehu, doby a prudkosti toxických účinkov, počet zvierat vykazujúcich poškodenie, typy poškodení a percentuálne množstvo zvierat, u ktorých sa prejavil daný typ poškodenia. Ak je to možné, numerické výsledky sa vyhodnotia vhodnou a všeobecne prijateľnou štatistickou metódou. Štatistická metóda sa vyberá počas plánovania štúdie. 3. SPRÁVA Správa z testu Správa z testu má obsahovať, pokiaľ je to možné, nasledujúce informácie: Testované zvieratá: - druh/použitý kmeň, - počet, vek a pohlavie zvierat, - zdroj, podmienky bývania, strava, atď., - individuálne hmotnosti zvierat na začiatku testu, v týždenných intervaloch po začiatku a na konci testu. Podmienky testovania: - zdôvodnenie iného výberu nosiča ako voda, - logické zdôvodnenie o výbere dávky, - podrobnosti o príprave testovanej látky/príprave potrave (krmive), dosiahnutých koncentráciách, stabilite a homogenity prípravku, - podrobnosti o podávaní testovanej látky, - prepočet z koncentrácie testovanej látky v potrave (krmive)/vode (ppm) na skutočnú dávku (mg/kg telesnej hmotnosti/deň), ak bolo použité, - podrobnosti o kvalite potravy (krmiva) a vody. Výsledky: - telesná hmotnosť/zmeny telesnej hmotnosti, - spotreba potravy, a spotreba pitnej vody, ak bola použitá, - údaje o toxickej odozve podľa pohlavia a dávky, vrátane príznakov toxicity, - povaha, intenzita a trvanie klinických pozorovaní (či boli reverzibilné alebo nie), - senzorická aktivita, sila zovretia, a určenie motorickej aktivity, - hematologické testy s príslušnou základňou hodnôt, - klinicko-biochemické testy s príslušnou základňou hodnôt, - telesná hmotnosť pri usmrtení a údaje o hmotnosti orgánov, - pitevné nálezy, - podrobný opis všetkých histopatologických nálezov, - údaje o absorpcii, ak sú prístupné, - štatistické spracovanie výsledkov, ak je vhodné. Diskusia. Záver. 4. ODKAZY Táto metóda je obdobná OECD TG 407. " [1] Pri mnohých meraniach v sére a plazme, najmä glukózy, sa uprednostňuje nepodávanie potravy cez noc pred odberom. Hlavným dôvodom je zvýšenie pravdepodobnosti kolísania hodnôt ako nevyhnutný dôsledok prijímania potravy. Môže to viesť k zakrytiu jemnejších účinkov a sťaží to interpretáciu. Na druhej strane môže nočné postenie rušivo vplývať s celkovým metabolizmom zvierat a čiastočne aj so štúdiami výživy, a môže to rušiť aj dennú expozíciu testovanou látkou. Ak sa použije nočné postenie, klinicko-biochemické vyšetrenie sa uskutočňuje po funkčných pozorovaniach vo štvrtom týždni štúdie. -------------------------------------------------- PRÍLOHA IV E " B.37 ONESKORENÁ NEUROTOXICITA ORGANOFOSFOROVÝCH LÁTOK PO AKÚTNEJ EXPOZÍCII ICH ÚČINKOM 1. METÓDA 1.1. Úvod Pri stanovení a vyhodnotení toxických účinkov látok je dôležité zvážiť potenciál určitých skupín látok spôsobujúcich špecifické druhy neurotoxicity, ktoré nemusia byť zistené (objavené) v iných štúdiách toxicity. U určitých organofosforových zlúčenín sa zistilo, že spôsobujú oneskorenú neurotoxicitu a je nutné ich z tohto hľadiska hodnotiť. Látky, ktoré môžu spôsobovať oneskorenú polyneuropatiu sa identifikujú pri použití screeningových testov in vitro; pravdaže, negatívne výsledky z in vitro štúdií neposkytujú dôkaz, že testovaná látka nie je neurotoxická. Pozri aj všeobecný úvod časť B. 1.2. Definície Organofosforové zlúčeniny zahŕňajú nenabité organofosforové estery, tioestery alebo anhydridy organofosforečných, organofosfónových alebo organofosforamidových kyselín, alebo príbuzných tiolfosforových, tiónfosforových, tiolfosfónových, tiónfosfónových alebo fosforotioamínových kyselín, alebo iné látky spôsobujúce oneskorenú neurotoxicitu občas pozorovanú v tejto kategórie látok. Oneskorená neurotoxicita je syndróm spájaný s predĺženým oneskorením nábehu ataxie, distálnej axonopatie v mieche a periférnom nervstve, a inhibíciou a starnutím neuropatiou postihnutej esterázy (NTE) v nervových tkanivách. 1.3. Referenčné látky Referenčná látka sa môže testovať s pozitívnou kontrolnou skupinou ako prostriedok dôkazu, že za daných laboratórnych testovacích podmienok sa odozva testovaných druhov zvierat významne nemení. Ako príklad široko používaného neurotoxikantu slúži tri-o-tolylfosfát (CAS 78-30-8, EINECS 201-103-5, CAS názov: fosforečná kyselina, tris(2-metylfenyl)ester, známy tiež ako tris-o-krezylfosfát. 1.4. Princíp testovacej metódy Skupine sliepok domácich, ktoré sú (ak je to vhodné) chránené od akútneho cholinergného účinku, sa orálne podáva jedna dávka testovanej látky. Zvieratá sa pozorujú 21 dní, pričom sa sledujú abnormality v správaní, ataxia, a paralýza. Biochemické merania a najmä inhibícia neuropatiou postihnutej esterázy (NTE) sa vykonávajú na náhodne vybraných sliepkach každej skupiny, bežne 24 a 48 hodín po podaní látky. 21 dní po expozícii sa zvyšok sliepok usmrtí a uskutoční sa histopatologické vyšetrenie vybraných nervových tkanív. 1.5. Popis testovacej metódy 1.5.1. Príprava Náhodne sa vyberú mladé zdravé dospelé sliepky, ktoré netrpia vírovou chorobou a nie sú podrobené lekárskej terapii, ktoré by rušili pozorovania, a zaradia sa do testovanej a kontrolnej skupiny. Najmenej 5 dní pred začiatkom testovania sa aklimatizujú na laboratórne podmienky. Použijú sa dostatočne veľké klietky alebo ohrady, aby umožňovali voľný pohyb sliepok a jednoduché pozorovanie chôdze. Orálne dávkovanie testovanej látky sa bežne uskutočňuje pomocou žalúdočnej sondy, želatínových kapsúl alebo porovnateľným spôsobom. Kvapaliny sa dávkujú neriedené alebo rozpustené vo vhodnom nosiči (napríklad kukuričný olej); Pevné látky sa rozpustia, ak je to možné vzhľadom na veľkosť dávky, v želatínových kapsulách, čím nemusí byť zabezpečená účinná absorpcia. Toxické vlastnosti nevodných nosičov by mali byť známe a ak nie sú, musia byť pred testovaním stanovené. 1.5.2. Podmienky testovania 1.5.2.1. Testované zvieratá Doporučujú sa mladé dospelé domáce sliepky (Gallus gallus domesticus) vo veku 8 až 12 mesiacov. Používa sa štandardná veľkosť chovov a pokolení a sliepky musia byť chované za podmienok umožňujúcich im voľný pohyb. 1.5.2.2. Počet a pohlavie Okrem testovanej skupiny sa používa aj kontrolná skupina s nosičom aj pozitívna kontrolná skupina. Kontrolná skupina s nosičom je testovaná rovnako ako testovaná skupina s tým rozdielom, že sa im nepodáva testovaná látka. Vhodný počet vtákov v každej skupine sa určí tak, že najmenej šesť jedincov môže byť usmrtených na biochemické stanovenia (tri v obidvoch časových bodoch) a šesť musí prežiť 21 dní pozorovacieho obdobia na patologické vyšetrenie. Pozitívna kontrolná skupina sa sleduje súčasne alebo v nedávnej minulosti. Má obsahovať minimálne šesť sliepok, ktoré sú testované známym oneskorovacím neurotoxikantom. Tri sliepky sa použijú na biochemické stanovenia a tri na patologické vyšetrenie. Doporučuje sa periodické obnovovanie údajov z minulosti. Nové pozitívne kontrolné údaje sa získavajú vtedy, ak sa v testovacom laboratóriu zmení niektorá podstatná riadiaca zložka testu (pokolenie, potrava, podmienky ubytovania). 1.5.2.3. Úrovne dávok Stanovenie úrovne dávky neskôr použitej v hlavnej štúdii sa uskutočňuje v predbežnej štúdii, pri ktorej sa používa vhodný počet sliepok a hladín. Väčšinou je v predbežnej štúdii nevyhnutné úmrtie, aby sa zistila postačujúca dávka pre hlavnú štúdiu. Zabrániť úmrtiu spôsobenému akútnym cholinergickým účinkom sa môže využitím atropínu alebo iných ochranných činidiel, o ktorých je známe, že rušivo nevplývajú na oneskorené neurotoxické reakcie. Na odhad maximálnej neletálnej dávky testovanej látky je k dispozícii množstvo testovacích metód (pozri metódu B.1 bis). Pri výbere dávky pomáhajú tiež údaje získané testovaním sliepok z minulosti a iné toxikologické informácie. Dávka testovanej látky v hlavnej štúdii má byť tak vysoká ako je len možné, s ohľadom na výsledky výberu dávky predbežnej štúdie a najvyššiu limitnú dávku 2000 mg/kg telesnej hmotnosti. Možné úmrtie by nemalo rušivo vplývať s postačujúcim počtom prežitých zvierat na biochemické vyšetrenie (šesť) a histológiu (šesť) po 21 dňoch. Atropín alebo iné ochranné činidlá, o ktorých je známe, že rušivo nevplývajú na oneskorené neurotoxické reakcie, by mal byť použitý, aby sa predišlo úmrtiu testovaných zvierat v dôsledku akútneho cholinergického účinku. 1.5.2.4. Limitný test Ak sa test na úrovni dávky 2000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň uskutočňuje použitím postupov popísaných v tejto štúdii a neboli pozorované žiadne toxické účinky, a ak sa neočakáva toxicita ani na základe údajov štruktúrne príbuzných zlúčenín, potom štúdia pri vyššej hladine nie je nevyhnutná. Výnimkou je prípad, keď expozícia človeka indikuje potrebnosť skúmania na vyššej hladine, a vtedy sa používa limitný test. 1.5.2.5. Doba pozorovania Doba pozorovania je 21 dní. 1.5.3. Postup Po použití ochranného činidla na zabránenie úmrtia v dôsledku akútneho cholinergického účinku sa podáva testovaná látka v jednej dávke. 1.5.3.1. Celkové pozorovania Pozorovania začínajú ihneď po expozícii. Všetky sliepky sa starostlivo pozorujú niekoľkokrát počas prvých dvoch dní a potom najmenej raz denne počas 21 dní alebo do plánovaného usmrtenia. Všetky toxické príznaky sa zaznamenávajú, vrátane času nábehu, druhu, prudkosti a dĺžky trvania abnormalít správania. Ataxia sa meria v rádovej odstupňovanej mierke na najmenej štyroch úrovniach a sleduje sa paralýza. Najmenej dvakrát za týždeň sú sliepky určené na patologické vyšetrenie vybrané z klietok a podrobené cyklu vynútenej motorickej aktivity, ako je vyliezanie po rebríku, s cieľom umožniť pozorovanie minimálnych toxických účinkov. Umierajúce zvieratá a zvieratá viditeľne trpiace alebo viditeľne pociťujúce bolesť sa odstránia, humánne usmrtia a prevedie sa ich pitva. 1.5.3.2. Telesná hmotnosť Všetky sliepky sa vážia krátko pred podaním testovanej látky a najmenej každý týždeň potom. 1.5.3.3. Biochémia Šesť sliepok náhodne vybraných z každej testovanej a kontrolnej skupiny s nosičom, a tri sliepky z pozitívnej kontrolnej skupiny (ak je táto skupina testovaná súčasne) sa usmrtí do niekoľkých dní po expozícii. Mozog a miecha sa pripravia a analyzujú na neuropatiu inhibície aktivity cieľovej esterázy. Naviac môžu byť použité na prípravu a analýzu neuropatie inhibície aktivity cieľovej esterázy sedacieho ischiatického nervového tkaniva. Normálne sa po 24 hodinách usmrtia tri sliepky kontrolnej a každej testovanej skupiny a tri po 48 hodinách, zatiaľ čo po 24 hodinách sa usmrtia tri sliepky pozitívnej kontrolnej skupiny. Ak pozorovania klinických príznakov intoxikácie (tie bývajú často zistené pozorovaním času nábehu cholinergických príznakov) naznačujú, že zvieratá sa toxického činidla zbavujú veľmi pomaly, potom sa uprednostňuje odoberanie vzoriek tkanív z troch vtákov po 24 a až 72 hodinách po podaní. Pokiaľ sa usúdi, že to je potrebné, tieto vzorky sa používajú aj na analýzu acetylcholínesterázy (AchE). Spontánna reaktivácia AchE však môže nastať aj in vivo, čo vedie k podhodnoteniu potenciálu látky ako inhibítora AchE. 1.5.3.4. Makroskopická pitva Pitva všetkých zvierat (plánovane usmrtených aj usmrtených z dôvodu umierania) zahŕňa pozorovanie vzhľadu mozgu a miechy. 1.5.3.5. Histopatologické vyšetrenie Nervové tkanivo zo zvierat, ktoré prežili pozorovaciu periódu a neboli použité na biochemické štúdie, sa podrobí mikroskopickému vyšetreniu. Tkanivá musia byť fixované použitím premývacích metód in situ. Časti zahŕňajú mozoček (stredne pozdĺžna úroveň), predĺženú miechu, miechu, a periférne nervy. Časti miechy sa zoberú z horného krčného úseku, strednej hrudníkovej a bedrovokrížovej oblasti. Berú sa aj časti distálnej oblasti holenných nervov a ich vetvy vedúcich k dvojhlavému lýtkovému svalu a sedacie nervy. Sekcie sa zafarbia vhodným myelínom a axonovo určitými farbivami. 2. ÚDAJE Negatívne výsledky vybraných parametrov tejto metódy (biochémia, histopatológia a pozorovanie správania) normálne nevyžadujú ďalšie testovanie na oneskorenú neurotoxicitu. Nejednoznačné alebo nepresvedčivé výsledky týchto parametrov si môžu vyžadovať ďalšie vyhodnotenie. Musia sa zabezpečiť individuálne údaje. Naviac musia byť všetky údaje zhrnuté v tabuľkovej forme pre každú testovanú skupinu s počtom použitých zvierat na začiatku testu, počtom zvierat, u ktorých sa prejavili známky poškodenia, účinkov na správanie alebo biochemických účinkov, typy a prudkosť týchto poškodení alebo účinkov, percentuálne množstvo zvierat prejavujúcich jednotlivý typ a prudkosť poškodenia alebo účinku. Nálezy pochádzajúce z tejto štúdie sa vyhodnotia z hľadiska rozsahu, intenzity a korelácie so správaním, biochemických a histopatologických účinkov, a ďalších pozorovaných účinkov u testovanej a kontrolnej skupiny. Ak je to možné, numerické výsledky sa vyhodnotia vhodnou a všeobecne prijateľnou štatistickou metódou. Štatistická metóda sa vyberá počas plánovania štúdie. 3. SPRÁVA Správa z testu Správa z testu má obsahovať, pokiaľ je to možné, nasledujúce informácie: Testované zvieratá: - použitý kmeň, - počet a vek zvierat, - zdroj, podmienky bývania, atď., - individuálne hmotnosti zvierat na začiatku testu. Testovacie podmienky: - podrobnosti o príprave testovanej látky, jej stabilite a homogenite, pokiaľ je to možné, - zdôvodnenie výberu nosiča, - podrobnosti o podávaní testovanej látky, - podrobnosti o kvalite krmiva a pitnej vody, - zdôvodnenie voľby výberu dávky, - upresnenie podávaných dávok, vrátane podrobností o nosiči, objeme a fyzikálnej forme podávanej látky, - totožnosť a podrobnosti o podávanom ochrannom činidle. Výsledky: - údaje o telesných hmotnostiach, - toxické reakcie podľa úrovne dávky, vrátane úmrtnosti, - povaha, intenzita a dĺžka trvania klinických pozorovaní (či boli reverzibilné alebo nie), - podrobný opis biochemických metód a zistení, - pitevné nálezy, - podrobný popis všetkých histopatologických nálezov, - štatistické spracovanie výsledkov, ak je vhodné. Diskusia. Záver. 4. ODKAZY Táto metóda je obdobná OECD TG 418. B.38 ONESKORENÁ NEUROTOXICITA ORGANOFOSFOROVÝCH LÁTOK PRI 28-DŇOVEJ ŠTÚDII OPAKOVANEJ DÁVKY 1. METÓDA 1.1. Úvod Pri stanovení a vyhodnotení toxických účinkov látok je dôležité zvážiť potenciál určitých kategórií látok spôsobujúcich určité druhy neurotoxicity, ktoré nemusia byť zistené v iných štúdiách toxicity. U určitých organofosforových látok sa zistilo, že spôsobujú oneskorenú neurotoxicitu a je nutné ich z tohto hľadiska hodnotiť. Látky, ktoré môžu spôsobovať oneskorenú polyneuropatiu sa identifikujú pri použití screeningových testov in vitro; pravdaže, negatívne výsledky z in vitro štúdií neposkytujú dôkaz, že testovaná látka nie je neurotoxická. 28-dňový test oneskorenej neurotoxicity poskytuje informácie o možných zdravotných rizikách, pravdepodobne sa zvyšujúcich po opakovanej expozícii cez obmedzené časové obdobie. Test poskytuje informácie o odozve na dávku a môže tiež umožňovať odhad hodnoty nepozorovaných žiadnych nepriaznivých účinkov, na základe ktorej je možné stanoviť kritérium bezpečnosti expozície. Pozri aj všeobecný úvod časť B. 1.2. Definície Organofosforové látky zahŕňajú nenabité organofosforové estery, tioestery alebo anhydridy organofosforečných, organofosfónových alebo organofosforamidových kyselín, alebo príbuzných tiolfosforových, tiónfosforových, tiolfosfónových, tiónfosfónových alebo fosforotioamidových kyselín, alebo iné látky spôsobujúce oneskorenú neurotoxicitu občas pozorovanú v tejto kategórie látok. Oneskorená neurotoxicita je syndróm spájaný s predĺženým oneskorením nábehu ataxie, distálnej axonopatie v mieche a periférnom nervstve, a inhibíciou a starnutím neuropatiou postihnutej esterázy (NTE) v nervových tkanivách. 1.3. Princíp testovacej metódy Denné dávky testovanej látky sa orálne podávajú sliepkam domácim počas 28 dní. Zvieratá sa pozorujú prinajmenšom denne a sledujú sa abnormality správania, ataxia a paralýza až do 14 dní po poslednej dávke: Biochemické merania a najmä inhibícia neuropatiou postihnutej esterázy (NTE) sa vykonávajú na náhodne vybraných sliepkach každej skupiny, bežne 24 a 48 hodín po podaní látky. Dva týždne po poslednej dávke sa zvyšok sliepok usmrtí a uskutoční sa histopatologické vyšetrenie vybraných nervových tkanív. 1.4. Popis testovacej metódy 1.4.1. Príprava Náhodne sa vyberú mladé zdravé dospelé sliepky, ktoré netrpia vírovou chorobou a nie sú podrobené lekárskej terapii, a bez abnormalít chôdze, čo by rušilo pozorovania, a zaradia sa do testovanej a kontrolnej skupiny. Najmenej 5 dní pred začiatkom testovania sa aklimatizujú na laboratórne podmienky. Použijú sa dostatočne veľké klietky alebo výbehy, aby umožňovali voľný pohyb sliepok a jednoduché pozorovanie chôdze. Orálne sa dávkuje každý deň, 7 dní do týždňa a uprednostňuje sa podávanie pomocou žalúdočnej sondy alebo želatínových kapsúl. Tekutiny sa dávkujú neriedené alebo rozpustené vo vhodnom nosiči (napríklad kukuričný olej); Pevné látky sa rozpustia, ak je to možné vzhľadom na veľkosť dávky, v želatínových tobolkách, čím nemusí byť zabezpečená účinná absorpcia. Toxické vlastnosti nevodných nosičov by mali byť známe a ak nie sú, musia byť pred testovaním stanovené. 1.4.2. Podmienky testovania 1.4.2.1. Testované zvieratá Doporučujú sa mladé dospelé domáce sliepky (Gallus gallus domesticus) vo veku 8 až 12 mesiacov. Používa sa štandardná veľkosť chovov a pokolení a sliepky musia byť chované za podmienok umožňujúcich im voľný pohyb. 1.4.2.2. Počet a pohlavie Všeobecne sa používajú najmenej tri testované skupiny a kontrolná skupina s nosičom. Kontrolná skupina s nosičom je testovaná rovnako ako testovaná skupina s tým rozdielom, že sa im nepodáva testovaná látka. Vhodný počet sliepok v každej skupine sa určí tak, že najmenej šesť jedincov môže byť usmrtených na biochemické stanovenia (tri v obidvoch časových bodoch) a šesť musí prežiť 14 dní pozorovacieho obdobia na patologické vyšetrenie. 1.4.2.3. Hladiny dávok Dávky sa vyberajú so zreteľom na tri výsledky získané pri akútnom teste oneskorenej neurotoxicity a ďalších prístupných údajov o toxicite alebo kinetike testovanej látky. Najvyššia dávka sa vyberá s cieľom indukovania toxických účinkov, pričom sa uprednostňuje oneskorená neurotoxicita, ale bez toho, aby spôsobovala uhynutie alebo očividné trápenie zvierat. Podľa toho sa vyberá zostupujúca postupnosť dávok so zámerom dokázať závislosť odozvy od dávky a pri najnižšej dávke dokázať aj hladinu, pri ktorej nebol pozorovaný žiadny nepriaznivý účinok. 1.4.2.4. Limitný test Ak sa test na úrovni dávky 1000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň uskutočňuje použitím postupov popísaných v tejto štúdii a neboli pozorované žiadne toxické účinky, a ak sa neočakáva toxicita ani na základe údajov štruktúrne príbuzných zlúčenín, potom štúdia pri vyššej hladine nie je nevyhnutná. Výnimkou je prípad, ak expozícia človeka indikuje potrebnosť skúmania na vyššej hladine, a vtedy sa používa limitný test. 1.4.2.5. Doba pozorovania Všetky zvieratá sa pozorujú prinajmenšom denne počas expozičného obdobia a 14 dní potom, s výnimkou plánovanej pitvy. 1.4.3. Postup Zvieratám sa podáva testovaná látka sedem dní v týždni počas obdobia 28 dní. 1.4.3.1. Celkové pozorovania Pozorovania začínajú ihneď po začatí expozície. Všetky sliepky sa starostlivo pozorujú prinajmenšom raz denne počas 28 dní a potom 14 dní alebo až do plánovaného usmrtenia. Všetky toxické príznaky sa zaznamenávajú, vrátane času nábehu, druhu, intenzity a dĺžky trvania príznakov. Do pozorovaní sa zahŕňa sledovanie abnormalít správania, ale aj ďalšie príznaky. Ataxia sa meria v rádovej odstupňovanej mierke na najmenej štyroch úrovniach a sleduje sa paralýza. Najmenej dvakrát za týždeň sú sliepky, určené na patologické vyšetrenie, vybrané z klietok a podrobené cyklu vynútenej motorickej aktivity, ako je vyliezanie po rebríku, s cieľom umožniť pozorovanie minimálnych toxických účinkov. Umierajúce zvieratá a zvieratá viditeľne trpiace alebo viditeľne pociťujúce bolesť sa odstránia, humánne usmrtia a prevedie sa ich pitva. 1.4.3.2. Telesná hmotnosť Všetky sliepky sa zvážia krátko pred prvým podaním testovanej látky a najmenej každý týždeň potom. 1.4.3.3. Biochémia Šesť sliepok náhodne vybraných z každej testovanej a kontrolnej skupiny s nosičom sa usmrtí do niekoľkých dní po poslednej dávke. Mozog a bedrová miecha sa pripravia a analyzujú na neuropatiu inhibície aktivity cieľovej esterázy (NTE). Naviac môžu byť použité na prípravu a analýzu neuropatie inhibície aktivity cieľovej esterázy sedacieho ischiatického nervového tkaniva na neuropatiu inhibície aktivity cieľovej esterázy (NTE). Normálne sa po 24 hodinách usmrtia tri sliepky kontrolnej a každej testovanej skupiny a tri po 48 hodinách po poslednej dávke. Ak údaje získané pri akútnej štúdii alebo pri iných štúdiach (napríklad toxikokinetiky) naznačujú, že je výhodnejší iný čas usmrtenia zvierat po podaní poslednej dávky, potom sa použije tento čas a zdôvodní sa. Pokiaľ sa usúdi, že to je potrebné, tieto vzorky sa používajú aj na analýzu acetylcholínesterázy (AchE). Spontánna reaktivácia AchE však môže nastať aj in vivo, čo vedie k podhodnoteniu potenciálu látky ako inhibítora AchE. 1.5.3.4. Makroskopická pitva Pitva všetkých zvierat (plánovane usmrtených aj usmrtených z dôvodu umierania) zahŕňa pozorovanie vzhľadu mozgu a miechy. 1.5.3.5. Histopatologické vyšetrenie Nervové tkanivo zo zvierat, ktoré prežili pozorovaciu periódu a neboli použité na biochemické štúdie, sa podrobí mikroskopickému vyšetreniu. Tkanivá musia byť fixované použitím premývacích metód in situ. Časti zahŕňajú mozoček (stredne pozdĺžna úroveň), predĺženú miechu, miechu, a periférne nervy. Časti miechy sa odoberú z horného krčného úseku, strednej hrudníkovej a bedrovokrížovej oblasti. Odoberú sa aj časti distálnej oblasti holenných nervov a ich vetvy do dvojhlavých lýtkových svalov a sedacie ischiatické nervy. Sekcie sa zafarbia vhodným myelínom a axónovo určitými farbivami. Zo začiatku sa mikroskopické vyšetrenie uskutočňuje s konzervovanými tkanivami všetkých zvierat kontrolnej skupiny a skupiny testovanej pri vysokej dávke. Ak je mikroskopické vyšetrenie na prítomnosť účinkov pozitívne, uskutoční sa aj u sliepok zo skupín testovaných so strednou a nízkou dávkou. 2. ÚDAJE Negatívne výsledky vybraných parametrov tejto metódy (biochémia, histopatológia a pozorovanie správania) normálne nevyžadujú ďalšie testovanie na oneskorenú neurotoxicitu. Nejednoznačné alebo nepresvedčivé výsledky týchto parametrov si môžu vyžadovať ďalšie vyhodnotenie. Musia sa zabezpečiť individuálne údaje. Naviac musia byť všetky údaje zhrnuté v tabuľkovej forme pre každú testovanú skupinu s počtom použitých zvierat na začiatku testu, počtom zvierat, u ktorých sa prejavili známky poškodenia, účinkov na správanie alebo biochemických účinkov, typy a intenzitu týchto poškodení, alebo účinkov, a percentuálne množstvo zvierat vykazujúce jednotlivý typ a prudkosť poškodenia alebo účinku. Nálezy pochádzajúce z tejto štúdie sa vyhodnotia z hľadiska rozsahu, intenzity a korelácie so správaním, biochemických a histopatologických účinkov, a ďalších pozorovaných účinkov u každej testovanej a kontrolnej skupiny. Ak je to možné, číselné výsledky sa vyhodnotia vhodnou a všeobecne prijateľnou štatistickou metódou. Štatistická metóda sa vyberá počas plánovania štúdie. 3. SPRÁVA Správa z testu Správa z testu má obsahovať, pokiaľ je to možné, nasledujúce informácie: Testované zvieratá: - použitý kmeň, - počet a vek zvierat, - zdroj, podmienky bývania, atď., - individuálne hmotnosti zvierat na začiatku testu. Testovacie podmienky: - podrobnosti o príprave testovanej látky, jej stabilite a homogenite, pokiaľ je to možné, - zdôvodnenie výberu nosiča, - podrobnosti o podávaní testovanej látky, - podrobnosti o kvalite krmiva a pitnej vody, - zdôvodnenie voľby výberu dávky, - upresnenie podávaných dávok, vrátane podrobností o nosiči, objeme a fyzikálnej forme podávanej látky, - zdôvodnenie voľby pre výber iných časov biochemického stanovenia ako je 24 a 48 hodín. Výsledky: - údaje o telesných hmotnostiach, - toxické reakcie podľa úrovne dávky, vrátane úmrtnosti, - hodnota nepozorovaných žiadnych nepriaznivých účinkov, - povaha, intenzita a dĺžka trvania klinických pozorovaní (či boli reverzibilné alebo nie), - podrobný opis biochemických metód a zistení, - pitevné nálezy, - podrobný opis všetkých histopatologických nálezov, - štatistické spracovanie výsledkov, ak je vhodné. Diskusia. Záver. 4. ODKAZY Táto metóda je obdobná OECD TG 419. " -------------------------------------------------- PRÍLOHA V Všeobecné požiadavky na klasifikáciu a označovanie nebezpečných látok a prípravkov Pozri smernicu Komisie 2001/59/ES, Ú. v. L 332, 28.12.2000, s. 81. --------------------------------------------------