PRÍLOHA III

Príprava vzoriek a požiadavky na metódy analýzy, ktoré sa využívajú pri úradnej kontrole hladín dioxínov (PCDD/PCDF) a dioxínom podobných PCB v určitých potravinách

1. OBLASŤ POUŽITIA

Požiadavky, ktoré sú stanovené v tejto prílohe, sa uplatňujú v prípadoch, keď sa vykonáva analýza potravín na úradnú kontrolu hladín 2,3,7,8-substituovaných polychlórovaných dibenzo-p-dioxínov a polychlórovaných dibenzofuránov (PCDD/F) a dioxínom podobných polychlórovaných bifenylov (dioxínom podobných PCB) a na iné regulačné účely.

Monitorovanie na prítomnosť PCDD/F a dioxínom podobných PCB sa môže vykonávať s dvoma rozličnými cieľmi:

2. KLASIFIKÁCIA ANALYTICKÝCH METÓD PODĽA CIEĽA ANALÝZY (1)

„Kvalitatívnymi metódami“ sa zistí prítomnosť/neprítomnosť skúmaných analytov, pričom ale neposkytujú číselnú indikáciu koncentrácie uvažovaného analytu. Tieto metódy môžu byť schopné poskytnúť čiastočné číselné (semikvantitatívne) výsledky, ale používajú sa jedine na zistenie prítomnosti/neprítomnosti látky, ako indikátory hladín nad určitým rozpätím alebo pod ním, napr. nad alebo pod medzou detekcie, medzou stanoviteľnosti alebo medznými hodnotami.

Na kontrolu maximálnych a akčných hladín PCDD/F a dioxínom podobných zlúčenín v potravinách sa môžu používať skríningové metódy, ktoré sú založené na porovnávaní analytického výsledku s medznou hodnotou a poskytujú indikáciu možného prekročenia skúmanej hladiny. Na tento účel boli zavedené bioanalytické metódy. Vo všeobecnosti by sa mohli vyvinúť aj fyzikálno–chemické metódy, avšak pokiaľ ide o maximálne a akčné hladiny založené na TEQ a komplexnú analýzu s požadovaným stanovením relevantných individuálnych kongenérov, neexistujú praktické príklady.

„Semikvantitatívne metódy“ poskytujú približnú indikáciu koncentrácie, ktorá môže byť užitočná ako informácia o oblasti koncentrácie analytu a nápomocná pre analytika pri výbere kalibračného rozpätia pre prípadný následný konfirmačný test, ako aj na účely kontroly kvality. Ako príklad možno uviesť:

„Kvantitatívne metódy“ spĺňajú tie isté požiadavky na správnosť, dynamický rozsah a presnosť ako konfirmačné testy. V prípade požadovaného stanovenia sa tieto metódy validujú ako konfirmačné metódy, ako je opísané v tomto dokumente, pokiaľ ide o PCDD/F a PCB podobné dioxínom.

3. SÚVISLOSTI

Pri vypočítavaní koncentrácií toxických ekvivalentov (TEQ) sa násobia koncentrácie jednotlivých látok v predmetnej vzorke im prislúchajúcim faktorom toxickej ekvivalencie (TEF) stanoveným Svetovou zdravotníckou organizáciou a nachádzajúcim sa na zozname v dodatku k tejto prílohe, a následne sa spočítavajú, aby spolu vyjadrili celkovú koncentráciu zlúčenín podobných dioxínom, vyjadrenú v toxických ekvivalentoch (TEQ).

Skríningové a konfirmačné metódy sa môžu použiť iba na kontrolu určitej matrice, ak príslušné metódy nie sú dostatočne citlivé na to, aby bola detekcia skúmaných hladín spoľahlivá (akčná alebo maximálna hladina).

4. POŽIADAVKY ZABEZPEČENIA KVALITY

5. POŽIADAVKY NA LABORATÓRIÁ

6. ZÁKLADNÉ POŽIADAVKY, KTORÉ MÁ SPĹŇAŤ ANALYTICKÝ POSTUP PRE DIOXÍNY (PCDD/F) A DIOXÍNOM PODOBNÉ PCB

6.1. Nízke pracovná rozpätie a medze stanoviteľnosti

6.2. Vysoká selektívnosť (špecifickosť)

6.3. Vysoká miera správnosti (pravdivosť výsledku merania a presnosť, biotestová zdanlivá výťažnosť)

6.4. Validácia v oblasti skúmanej hladiny a všeobecné opatrenia kontroly kvality

6.5. Medza stanoviteľnosti

6.6. Analytické kritériá

6.7. Špecifické požiadavky na skríningové metódy

7. ŠPECIFICKÉ POŽIADAVKY NA METÓDY GC/HRMS, KTORÉ JE POTREBNÉ SPLNIŤ NA ÚČELY SKRÍNINGU A KONFIRMÁCIE

7.1. Všeobecné požiadavky

7.2. Kontrola výťažností

7.3. Odstránenie interferujúcich látok

7.4. Kalibrácia na základe štandardnej krivky

8. OSOBITNÉ POŽIADAVKY NA BIOANALYTICKÉ METÓDY

Bioanalytické metódy sú metódy na báze použitia biologických princípov, ako sú bunkové testy, receptorové testy alebo imunologické testy. V tomto bode 8 sú stanovené požiadavky na bioanalytické metódy ako také.

Skríningová metóda klasifikuje v princípe vzorku ako vzorku, v prípade ktorej sú stanovené hladiny dodržané, alebo ako vzorku, v prípade ktorej existuje podozrenie na nedodržanie stanovených hladín. Na tieto účely sa vypočítaná hladina BEQ porovná s medznou hodnotou (pozri bod 8.3). Vzorky pod medznou hodnotou sa vyhlásia za vzorky, v prípade ktorých je dodržaná stanovená hladina, vzorky rovnajúce sa medznej hodnote alebo nad medznou hodnotou za vzorky, v prípade ktorých existuje podozrenie na prekročenie stanovených hladín a vyžadujúce si analýzu pomocou konfirmačnej metódy. Hladina BEQ zodpovedajúca 2/3 maximálnej hladiny môže prakticky poslúžiť ako najvhodnejšia medzná hodnota, a tak sa zabezpečí výskyt chybných meraní vykazujúcich dodržanie stanovených hladín pod úrovňou 5 % a prijateľnú mieru výskytu chybných výsledkov poukazujúcich na nedodržanie stanovených hladín. Pri použití samostatných maximálnych hladín pre PCDD/F a pre sumu PCDD/F a PCB podobné dioxínom si overenie dodržania stanovených hladín u vzoriek bez frakcionácie vyžaduje vhodné medzné hodnoty pre biologické testy na PCDD/F. Na kontrolu vzoriek prekračujúcich akčné hladiny by ako medznú hodnotu bolo vhodné použiť primeraný percentuálny podiel z príslušnej skúmanej hladiny.

Ďalej, v prípade určitých bioanalytických metód sa môže pre vzorky v pracovnej oblasti a prekračujúce medzu oznamovania (pozri body 8.1.1 a 8.1.6) použiť indikatívna hladina vyjadrená v BEQ.

8.1. Hodnotenie reakcie na test

8.1.1. Všeobecné požiadavky

8.1.2. Kalibrácia

8.1.2.1. Kalibrácia na základe štandardnej krivky

8.1.2.2. Kalibrácia pomocou referenčných vzoriek

Alternatívne sa môže použiť kalibračná krivka zostrojená z aspoň 4 referenčných vzoriek (pozri bod 8.2: jedna slepá matrica plus tri referenčné vzorky s 0,5-, 1,0- a 2,0-násobkom skúmanej hladiny) v oblasti skúmanej hladiny, pričom nie je potrebné vykonať korekciu na slepú vzorku a výťažnosť. V tomto prípade môže byť reakcia na test zodpovedajúca 2/3 maximálnej hladiny (pozri bod 8.3) vypočítaná priamo z týchto vzoriek a použitá ako medzná hodnota. Na kontrolu vzoriek prekračujúcich akčné hladiny by ako medznú hodnotu bolo vhodné použiť primeraný percentuálny podiel z týchto akčných hladín.

8.1.3. Oddelené stanovovanie PCDD/F a PCB podobných dioxínom

Extrakty sa môžu rozdeliť do frakcií obsahujúcich PCDD/F a PCB podobné dioxínom, čím sa umožní samostatné stanovenie hladín TEQ (v BEQ) pre PCDD/F a PCB podobné dioxínom. Štandardná kalibračná krivka PCB 126 sa preferenčne používa na hodnotenie výsledkov pre frakciu obsahujúcu PCB podobné dioxínom.

8.1.4. Biotestové zdanlivé výťažnosti

„Biotestová zdanlivá výťažnosť“ sa vypočítava z vhodných referenčných vzoriek s reprezentatívnym kongenérovým profilom v oblasti sledovaných hladín a vyjadruje sa ako percentuálny podiel hladiny BEQ v porovnaní s hladinou TEQ. V závislosti od použitého typu testu a TEF (3) môžu rozdiely medzi faktormi TEF a REP pre PCB podobné dioxínom spôsobovať nízke zdanlivé výťažnosti pre PCB podobné dioxínom v porovnaní s PCDD/F. Preto v prípade oddeleného stanovovania PCDD/F a PCB podobných dioxínom sú biotestové zdanlivé výťažnosti: pre PCB podobné dioxínom na úrovni 25 až 60 %, pre PCDD/F 50 až 130 % (pri použití kalibračnej krivky TCDD). Keďže príspevok PCB podobných dioxínom k sume PCDD/F a PCB podobných dioxínom môže byť rôzny u rozličných matríc a vzoriek, biotestové zdanlivé výťažnosti pre súhrnný parameter odzrkadľujú tieto rozpätia a nachádzajú sa medzi 30 až 130 %.

8.1.5. Kontrola výťažností čistenia

8.1.6. Medza oznamovania

8.2. Používanie referenčných vzoriek

8.3. Stanovenie medzných hodnôt

Stanovuje sa pomer medzi bioanalytickými výsledkami v BEQ a výsledkami GC/HRMS v TEQ [napr. pomocou kalibračných experimentov prispôsobených na príslušnú matricu, pri použití referenčných vzoriek umelo nakontaminovaných 0-, 0,5-, 1,00- a 2,00- násobkom maximálnej hladiny (ML), so 6 opakovaniami pri každej hladine (n = 24)]. Korekčné faktory (slepý pokus a výťažnosť) sa môžu určiť z tohto vzťahu, ale overujú sa v každej testovacej sérii zahrnutím slepých vzoriek postupu/matrice a vzoriek na stanovenie výťažnosti (bod 8.2).

Medzné hodnoty sa stanovujú na účely rozhodovania o tom, či sú vzorky v súlade s maximálnymi hladinami, resp. na účely kontroly akčných hladín, ak sú sledované, a to s príslušnými skúmanými hladinami stanovenými buď zvlášť pre PCDD/F a pre PCB podobné dioxínom, alebo pre sumu PCDD/F a PCB podobných dioxínom. Predstavuje dolnú hranicu distribúcie bioanalytických výsledkov (korigovaných na slepý pokus a výťažnosť) zodpovedajúcich rozhodovaciemu limitu GC/HRMS na základe 95 % úrovne spoľahlivosti, čiže pri nižšej ako 5 % úrovni výskytu merania nesprávne indikujúceho súlad (falošné negatívne merania), a pri RSDR < 25 %. Rozhodovací limit GC/HRMS je maximálnou hladinou zohľadňujúcou nepresnosť merania.

V praxi je možné medznú hodnotu (v BEQ) vypočítať na základe týchto postupov (pozri obrázok 1):

8.3.1. Použitie dolného pásma 95 % predikčného intervalu pre rozhodovací limit GC/HRMS

pričom:

parameter súčtu štvorcov, i = index pre kalibračný bod i

8.3.2. Výpočet súvisiaci s celým radom analýz vzoriek (n ≥ 6) z bioanalytických výsledkov (korigovaných na slepý pokus a výťažnosť), kontaminovaných na úrovni rozhodovacieho limitu GC/HRMS predstavujúceho dolnú hranicu dátovej distribúcie pri zodpovedajúcej priemernej hodnote BEQ:

Medzná hodnota = BEQDL – 1,64 × SDR

pričom

8.3.3. Výpočet ako priemerná hodnota bioanalytických výsledkov (v BEQ, korigovaných na slepý pokus a výťažnosť) z radu analýz vzoriek (n ≥ 6) kontaminovaných na úrovni 2/3 skúmanej hladiny. Vychádza sa z pozorovania, že táto hladina bude okolo medze stanovenej v bodoch 8.3.1 alebo 8.3.2.

Obrázok 1

Výpočet medzných hodnôt na základe 95 % úrovne spoľahlivosti, čiže pri 5 % pravdepodobnosti výskytu merania nesprávne indikujúceho dodržanie hladín, a pri RSDR < 25 %: 1. z dolného pásma 95 % predikčného intervalu pre rozhodovací limit HRGC/HRMS; 2. z celého radu analýz vzoriek (n ≥ 6) kontaminovaných na úrovni rozhodovacieho limitu HRGC/HRMS predstavujúceho dolnú hranicu distribúcie dát (zobrazený na obrázku krivkou zvonovitého tvaru) pri zodpovedajúcej priemernej hodnote BEQ.

8.3.4. Obmedzenia týkajúce sa medzných hodnôt:

medzné hodnoty založené na BEQ a vypočítané z RSDR získanej pri procese validácie použitím obmedzeného počtu vzoriek s rozličnými matricami/kongenérovými profilmi môžu byť vyššie ako skúmané hladiny založené na TEQ z dôvodu vyššej presnosti, než akú možno bežne docieliť v prípade, že sa musí kontrolovať neznáme spektrum možných kongenérových profilov. V takýchto prípadoch sa medzné hodnoty vypočítavajú z RSDR = 25 %, alebo sa zvolí výpočet odvodený z dvoch tretín skúmanej hladiny.

8.4. Charakteristiky výkonnosti

9. OZNAMOVANIE VÝSLEDKU

Konfirmačné metódy

Bioanalytické skríningové metódy

(1) Prispôsobené na PCDD/F a zlúčeniny podobné dioxínom na základe Usmernení pre validáciu metód skríningu rezíduí veterinárnych liekov, Referenčné laboratóriá EÚ (EURL) pre rezíduá veterinárnych liekov a kontaminantov v potravinách živočíšneho pôvodu vo Fougeres, v Berlíne a Bilthovene, 20.1.2010, http://ec.europa.eu/food/food/chemicalsafety/residues/lab_analysis_en.htm.

(2) s maximálnymi hladinami.

(3) Súčasné požiadavky sú založené na TEF uverejnenom v publikácii: M. Van den Berg et al, Toxicol Sci 93 (2), 223 – 241 (2006).

Dodatok k PRÍLOHE III

Tabuľka WHO TEF na posudzovanie rizika pre ľudí na základe záverov kongresu Svetovej zdravotníckej organizácie v Ženeve v júni 2005 [Martin van den Berg et al., The 2005 World Health Organization Re-evaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin-like Compounds – Martin van den Berg a kol, Prehodnotenie faktorov toxickej ekvivalencie pre dioxíny a zlúčeniny podobné dioxínom vo vzťahu k človeku a cicavcom vypracované Svetovou zdravotníckou organizáciou v roku 2005. Toxicological Sciences 93(2), 223–241 (2006)].