PRÍLOHA III

PRÍPRAVA VZORIEK A POŽIADAVKY NA METÓDY ANALÝZY, KTORÉ SA VYUŽÍVAJÚ NA KONTROLU HLADÍN DIOXÍNOV (PCDD/PCDF) A DIOXÍNOM PODOBNÝCH PCB V URČITÝCH POTRAVINÁCH

1. OBLASŤ POUŽITIA

Požiadavky, ktoré sú stanovené v tejto prílohe, sa uplatňujú v prípadoch, keď sa vykonáva analýza potravín na úradnú kontrolu hladín 2,3,7,8-substituovaných polychlórovaných dibenzo-p-dioxínov a polychlórovaných dibenzofuránov (PCDD/F) a dioxínom podobných polychlórovaných bifenylov (dioxínom podobných PCB) a na iné regulačné účely.

Monitorovanie prítomnosti PCDD/F a dioxínom podobných PCB sa môže vykonávať pomocou dvoch rozličných druhov analytických metód:

2. SÚVISLOSTI

Pri výpočte koncentrácií toxických ekvivalentov (TEQ) sa násobia koncentrácie jednotlivých látok v predmetnej vzorke príslušným faktorom toxickej ekvivalencie (TEF) stanoveným Svetovou zdravotníckou organizáciou, ktorý sa uvádza v dodatku k tejto prílohe, a následne sa spočítavajú, aby sa dospelo k celkovej koncentrácii dioxínom podobných zlúčenín, vyjadrenej v toxických ekvivalentoch (TEQ).

Skríningové a potvrdzujúce metódy sa môžu použiť na kontrolu určitej matrice iba za predpokladu, že príslušné metódy sú dostatočne citlivé na to, aby sa nimi dala spoľahlivo zistiť maximálna alebo akčná hladina.

3. POŽIADAVKY NA ZABEZPEČENIE KVALITY

4. POŽIADAVKY NA LABORATÓRIÁ

5. ZÁKLADNÉ POŽIADAVKY, KTORÉ MÁ SPĹŇAŤ ANALYTICKÝ POSTUP PRE DIOXÍNY (PCDD/F) A DIOXÍNOM PODOBNÉ PCB

5.1. Nízky pracovný rozsah a limity kvantifikácie

5.2. Vysoká selektívnosť (špecifickosť)

5.3. Vysoká miera správnosti (pravdivosť a presnosť, zdanlivá výťažnosť biotestu)

5.4. Validácia v rozsahu maximálnej hladiny a všeobecné opatrenia na kontrolu kvality

5.5. Kvantifikačný limit

5.6. Analytické kritériá

5.7. Špecifické požiadavky na skríningové metódy

6. ŠPECIFICKÉ POŽIADAVKY NA METÓDY GC-MS, KTORÉ JE POTREBNÉ SPLNIŤ NA ÚČELY SKRÍNINGU ALEBO POTVRDZOVANIA

6.1. Prijateľné rozdiely medzi hornou a dolnou medzou hladín WHO-TEQ

6.2. Kontrola výťažností

6.3. Odstránenie interferujúcich látok

6.4. Kalibrácia na základe štandardnej krivky

6.5. Špecifické kritériá pre potvrdzujúce metódy

7. ŠPECIFICKÉ POŽIADAVKY NA BIOANALYTICKÉ METÓDY

Bioanalytické metódy sú metódy založené na využívaní biologických princípov, ako sú bunkové testy, receptorové testy alebo imunologické testy. V tomto bode 7 sú stanovené požiadavky na bioanalytické metódy ako také.

Skríningová metóda v zásade klasifikuje vzorku ako vzorku, v ktorej sú stanovené hladiny dodržané, alebo ako vzorku, u ktorej existuje podozrenie na nedodržanie stanovených hladín. Na tieto účely sa vypočítaná hladina BEQ porovná s medznou hodnotou (pozri bod 7.3). Vzorky pod medznou hodnotou sa vyhlásia za vzorky, u ktorých je dodržaná stanovená hladina, vzorky s medznou hodnotou alebo nad medznou hodnotou za vzorky, u ktorých existuje podozrenie na prekročenie stanovených hladín a ktoré si vyžadujú analýzu prostredníctvom potvrdzujúcej metódy. Hladina BEQ zodpovedajúca 2/3 maximálnej hladiny môže v praxi poslúžiť ako medzná hodnota, pokiaľ je zabezpečené, že podiel meraní chybne vykazujúcich súlad je nižší ako 5 % a podiel výsledkov chybne vykazujúcich nesúlad je prijateľný. Pri použití samostatných maximálnych hladín pre PCDD/F a pre sumu PCDD/F a dioxínom podobných PCB si overenie dodržania stanovených hladín u vzoriek bez frakcionácie vyžaduje vhodné medzné hodnoty pre biologické testy na PCDD/F. Na kontrolu vzoriek prekračujúcich akčné hladiny by bolo vhodné použiť ako medznú hodnotu primerané percento príslušnej akčnej hladiny.

Okrem toho sa v prípade určitých bioanalytických metód môže pri vzorkách v pracovnom rozsahu, ktoré prekračujú medzu oznamovania (pozri 7.1.1 a 7.1.6), použiť indikatívna hladina vyjadrená v BEQ.

7.1. Hodnotenie reakcie na test

7.1.1. Všeobecné požiadavky

7.1.2. Kalibrácia

7.1.2.1. Kalibrácia na základe štandardnej krivky

7.1.2.2. Kalibrácia pomocou referenčných vzoriek

Alternatívne sa môže použiť kalibračná krivka vyhotovená z aspoň 4 referenčných vzoriek (pozri bod 7.2): jedna slepá matrica plus tri referenčné vzorky s 0,5–, 1,0– a 2,0– násobkom maximálnej alebo akčnej hladiny, pričom nie je potrebné vykonať korekciu na slepú vzorku a výťažnosť. V tomto prípade môže byť odozva testu zodpovedajúca 2/3 maximálnej hladiny (pozri bod 7.3) vypočítaná priamo z týchto vzoriek a použitá ako medzná hodnota. Na kontrolu vzoriek prekračujúcich akčné hladiny by ako medznú hodnotu bolo vhodné použiť primeraný percentuálny podiel z týchto akčných hladín.

7.1.3. Oddelené stanovenie PCDD/F a dioxínom podobných PCB

Extrakty sa môžu rozdeliť do frakcií obsahujúcich PCDD/F a dioxínom podobné PCB, čím sa umožní samostatné stanovenie hladín TEQ (v BEQ) pre PCDD/F a dioxínom podobné PCB. Na hodnotenie výsledkov pre frakciu obsahujúcu dioxínom podobné PCB sa prednostne používa štandardná kalibračná krivka PCB 126.

7.1.4. Zdanlivé výťažnosti biotestu

Zdanlivá výťažnosť biotestu sa vypočítava z vhodných referenčných vzoriek s reprezentatívnymi kongenérovými profilmi v oblasti maximálnej a akčnej hladiny a vyjadruje sa ako percentuálny podiel hladiny BEQ v porovnaní s hladinou TEQ. V závislosti od použitého typu testu a TEF (3) môžu rozdiely medzi faktormi TEF a REP pre dioxínom podobné PCB spôsobovať nízke zdanlivé výťažnosti pre dioxínom podobné PCB v porovnaní s PCDD/F. Preto v prípade samostatného stanovovania PCDD/F a dioxínom podobných PCB sú biotestové zdanlivé výťažnosti: pre dioxínom podobné PCB na úrovni 20 až 60 %, pre PCDD/F 50 až 130 % (pri použití kalibračnej krivky TCDD). Keďže príspevok dioxínom podobných PCB k sume PCDD/F a dioxínom podobných PCB môže byť rôzny u rozličných matríc a vzoriek, zdanlivé výťažnosti biotestu pre súhrnný parameter odzrkadľujú tieto rozsahy a musia sa nachádzať sa medzi 30 až 130 %.

7.1.5. Kontrola výťažností čistenia

Pri validácii sa kontroluje strata zlúčenín, ku ktorej došlo pri čistení. Slepá vzorka s prídavkom zmesi rozličných kongenérov sa podrobuje čisteniu (aspoň n=3) a pomocou potvrdzujúcej metódy sa overuje výťažnosť a variabilita. Výťažnosť sa nachádza v rozpätí 60 až 120 % predovšetkým v prípade kongenérov prispievajúcich viac než 10 % k hladine TEQ v rozličných zmesiach.

7.1.6. Medza oznamovania

Pri uvádzaní hladín BEQ sa medza oznamovania stanovuje z príslušných vzoriek matríc vykazujúcich typické kongenérové profily, nie však z kalibračnej krivky štandardov vzhľadom na malú presnosť v nižšej oblasti krivky. Musia sa zohľadniť účinky extrakcie a čistenia. Medza oznamovania musí byť stanovená významne (aspoň trojnásobne) nad slepými vzorkami.

7.2. Používanie referenčných vzoriek

7.3. Stanovenie medzných hodnôt

Stanovuje sa pomer medzi bioanalytickými výsledkami v BEQ a výsledkami potvrdzujúcich metód v TEQ (napr. pomocou kalibračných experimentov zohľadňujúc príslušnú matricu, pri použití referenčných vzoriek s prídavkom analytov 0–, 0,5–, 1,00– a 2,00– násobkom maximálnej hladiny (ML), so 6 opakovaniami pri každej hladine (n=24)). Korekčné faktory (slepý pokus a výťažnosť) sa môžu určiť z tohto vzťahu, ale overujú sa v každej testovacej sérii zahrnutím slepých vzoriek postupu/matrice a vzoriek na stanovenie výťažnosti (bod 7.2).

Medzné hodnoty sa stanovujú na účely rozhodovania o tom, či sú vzorky v súlade s maximálnymi hladinami, resp. na účely kontroly akčných hladín, ak sú sledované, a to s príslušnými maximálnymi alebo akčnými hladinami stanovenými buď zvlášť pre PCDD/F a pre dioxínom podobné PCB, alebo pre sumu PCDD/F a dioxínom podobných PCB. Predstavujú dolnú hranicu distribúcie bioanalytických výsledkov (korigovaných na slepý pokus a výťažnosť) zodpovedajúcich rozhodovaciemu limitu potvrdzujúcej metódy pri 95 % hladine spoľahlivosti, čiže pri nižšej ako 5 % úrovni výskytu miery meraní chybne vykazujúcich súlad (falošné negatívne merania), a pri RSDR< 25 %. Rozhodovací limit potvrdzujúcej metódy je maximálnou hladinou, s ohľadom na neistotu merania.

V praxi je možné medznú hodnotu (v BEQ) vypočítať na základe týchto postupov (pozri obrázok 1):

7.3.1. Použitie dolného pásma 95 % predikčného intervalu rozhodovacieho limitu potvrdzujúcej metódy

pričom:

7.3.2. Výpočet z bioanalytických výsledkov (korigovaných na slepý pokus a výťažnosť) viacnásobne opakovaných analýz vzoriek (n≥6) kontaminovaných na úrovni rozhodovacieho limitu potvrdzujúcej metódy predstavujúceho dolnú hranicu distribúcie dát pri zodpovedajúcej priemernej hodnote BEQ:

pre

7.3.3. Výpočet ako priemerná hodnota bioanalytických výsledkov (v BEQ, korigovaných na slepý pokus a výťažnosť) viacnásobne opakovaných analýz vzoriek (n≥6) kontaminovaných na úrovni 2/3 maximálnej alebo akčnej hladiny. Vychádza sa z pozorovania, že táto hladina bude okolo medze stanovenej v bodoch 7.3.1 alebo 7.3.2.

Obrázok 1

Výpočet medzných hodnôt pri 95 %-nej hladine spoľahlivosti, čiže pri 5 %-nej miere výskytu meraní chybne vykazujúcich súlad, a pri RSDR < 25 %:

7.3.4. Obmedzenia týkajúce sa medzných hodnôt:

medzné hodnoty vychádzajúce z BEQ a vypočítané z RSDR získanej pri validácii použitím obmedzeného počtu vzoriek s rozličnými matricami/kongenérovými profilmi môžu byť vyššie ako maximálne alebo akčné hladiny vyjadrené v TEQ z dôvodu vyššej presnosti, než akú možno bežne docieliť v prípade, že sa analyzuje neznáme spektrum možných kongenérových profilov. V takýchto prípadoch sa medzné hodnoty vypočítavajú z RSDR = 25 %, alebo sa zvolí výpočet odvodený z dvoch tretín maximálnej alebo akčnej hladiny.

7.4. Charakteristiky účinnosti

8. OZNAMOVANIE VÝSLEDKU

Potvrdzujúce metódy

Bioanalytické skríningové metódy

(1) Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 882/2004 z 29. apríla 2004 o úradných kontrolách uskutočňovaných s cieľom zabezpečiť overenie dodržiavania potravinového a krmivového práva a predpisov o zdraví zvierat a o starostlivosti o zvieratá(Ú. v. EÚ L 165, 30.4.2004, s. 1).

(2) pokiaľ ide o maximálne hladiny

(3) Súčasné požiadavky sú založené na TEF uverejnených v publikácii: M. Van den Berg et al, Toxicol Sci 93 (2), 223–241 (2006).

Dodatok k PRÍLOHE III

WHO TEF na posudzovanie rizika pre ľudí na základe záverov stretnutia odborníkov Svetovej zdravotníckej organizácie (WHO), Medzinárodného programu chemickej bezpečnosti (IPCS) v Ženeve v júni 2005 [Martin van den Berg a kol., The 2005 World Health Organization Re-evaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin-like Compounds – Toxicological Sciences 93(2), 223-241 (2006)]