Smernica Rady 98/57/ES z 20. júla 1998 o potláčaní choroby Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.



Úradný vestník L 235 , 21/08/1998 S. 0001 - 0039

CS.ES Kapitola 3 Zväzok 23 S. 375 - 413

ET.ES Kapitola 3 Zväzok 23 S. 375 - 413

HU.ES Kapitola 3 Zväzok 23 S. 375 - 413

LT.ES Kapitola 3 Zväzok 23 S. 375 - 413

LV.ES Kapitola 3 Zväzok 23 S. 375 - 413

MT.ES Kapitola 3 Zväzok 23 S. 375 - 413

PL.ES Kapitola 3 Zväzok 23 S. 375 - 413

SK.ES Kapitola 3 Zväzok 23 S. 375 - 413

SL.ES Kapitola 3 Zväzok 23 S. 375 - 413



Smernica Rady 98/57/ES z 20. júla 1998 o potláčaní choroby Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. RADA EURÓPSKEJ ÚNIE, so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spoločenstva, najmä na jej článok 43, so zreteľom na návrh Komisie [1], so zreteľom na stanovisko Európskeho parlamentu [2], so zreteľom na stanovisko Hospodárskeho a sociálneho výboru [3], keďže škodlivý organizmus Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. bol v minulosti známy pod názvom Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith keďže Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. sa pravdepodobne stane všeobecne uznávaným názvom tohto organizmu keďže táto smernica by mala zobrať na vedomie tento vedecký pokrok keďže výroba zemiakov a rajčiakov zaujíma v poľnohospodárstve spoločenstva významné postavenie keďže úrody zemiakov a rajčiakov neustále ohrozujú škodlivé organizmy keďže prostredníctvom ochrany pestovania zemiakov a rajčiakov pred takýmito škodlivými organizmami by sa mala nielen udržiavať výrobná kapacita, ale aj zvyšovať poľnohospodárska produktivita keďže ochranné opatrenia zabraňujúce zaneseniu škodlivých organizmov na územie členských štátov by mali iba obmedzený účinok, ak by sa tieto organizmy v celom spoločenstve súčasne a metodicky nepotláčali a nezabraňovalo sa ich šíreniu keďže jedným zo škodlivých organizmov v zemiakoch a rajčiakoch je Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., patogén hnedej hniloby zemiakov a baktériového vädnutia zemiakov a rajčiakov keďže v niektorých častiach spoločenstva vypukli choroby spôsobované týmto patogénom a ešte stále existujú niektoré obmedzené zdroje nákazy keďže, ak sa neprijmú účinné opatrenia týkajúce sa zemiakov a rajčiakov, zamerané na zisťovanie prítomnosti tohto organizmu a jeho rozšírenie, na zamedzovanie jeho výskytu a šírenia a, v prípade jeho zistenia, na zamedzenie jeho šírenia a jeho potlačenie s cieľom jeho vyhubenia, bude pestovanie zemiakov a rajčiakov v celom spoločenstve vystavené značnému riziku keďže s cieľom zabezpečenia uvedeného musia byť v spoločenstve prijaté niektoré opatrenia keďže členské štáty musia mať navyše v prípade potreby možnosť prijať ďalšie alebo prísnejšie opatrenia za predpokladu, že tým nevznikne prekážka voľnému pohybu zemiakov a rajčiakov v spoločenstve, s výnimkou prípadov stanovených v smernici Rady 779/93/EHS z 21. decembra 1976 o ochranných opatreniach zabraňujúcich zaneseniu organizmov škodiacich rastlinám a rastlinným výrobkom do spoločenstva a ich šíreniu v spoločenstve [4] keďže opatrenia musia brať zreteľ na skutočnosť, že na zisťovanie prítomnosti patogéna sú potrebné systematické úradné prieskumy keďže takéto prieskumy by mali pozostávať z kontrolných postupov a, kde je to vhodné, aj postupov týkajúcich sa odberu vzoriek a testov týchto vzoriek, nakoľko za istých okolností daných prostredím môže choroba zostávať latentnou a nespozorovanou v rastúcich porastoch zemiakov, ako aj v skladovaných hľuzách zemiakov keďže šírenie patogéna v rámci rastúcich plodín nie je najdôležitejším faktorom, ale keďže patogén sa môže šíriť prostredníctvom povrchovej vody a niektorých pridružených divokorastúcich ľuľkovitých rastlín, a preto sa zdá, že zavlažovanie plodín zemiakov a rajčiakov znečistenou vodou predstavuje riziko nákazy týchto plodín keďže patogén môže prežívať zimu v divokorastúcich (samovysiatych) rastlinách zemiakov a rajčiakov a tieto môžu byť zdrojom nákazy prenesenej z jednej sezóny do nasledujúcej keďže patogén sa taktiež šíri kontamináciou zemiakov stykom s nakazenými zemiakmi a stykom so zariadeniami používanými na sadenie, zber a spracovanie alebo prepravnými a skladovacími kontajnermi, ktoré boli kontaminované daným organizmom stykom s nakazenými zemiakmi v minulosti keďže šírenie patogéna možno zoslabiť alebo mu predchádzať dezinfekciou týchto predmetov keďže akákoľvek takáto kontaminácia sadivových zemiakov predstavuje závažné riziko rozšírenia patogéna podobné závažné riziko šírenia patogéna predstavuje aj latentná nákaza sadivových zemiakov, ktorej možno predchádzať používaním sadivových zemiakov vyrobených v rámci úradne schváleného programu, v rámci ktorého boli na sadivových zemiakoch vykonané testy, ktoré preukázali, že nie sú nakazené keďže súčasné vedomosti týkajúce sa biológie a epidemiológie choroby Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. sú v európskych podmienkach neúplné a očakáva sa, že v priebehu niekoľkých sezón bude nutné preskúmanie navrhovaných opatrení vzhľadom na ďalší vývoj sa podobne očakávajú vylepšenia testovacieho postupu, najmä v oblastiach citlivosti a špecifickosti testovacích metód, aby sa zvolili a znormalizovali optimálne dostupné testovacie metódy keďže s cieľom určiť podrobností takýchto všeobecných opatrení, ako aj prísnejších a ďalších opatrení vykonávaných členskými štátmi s cieľom zabrániť zavlečeniu patogéna na ich územie je žiadúce, aby členské štáty úzko spolupracovali s Komisiou v rámci Stáleho výboru pre zdravie rastlín (ďalej iba "výbor"), PRIJALA TÚTO SMERNICU: Článok 1 Táto smernica sa týka opatrení, ktoré sa majú v členských štátoch vykonať proti chorobe Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., v minulosti známej ako Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, (ďalej iba "škodlivý organizmus") vo vzťahu k hostiteľským rastlinám tohto organizmu uvedeným v oddiele 1 prílohy I (ďalej iba "uvedený rastlinný materiál"), s cieľom: a) zistiť jeho prítomnosť a rozšírenie b) zamedziť jeho výskytu a šíreniu a c) v prípade jeho zistenia, zamedziť jeho šíreniu a potlačiť ho s cieľom jeho vyhubenia. Článok 2 1. Členské štáty vykonávajú každoročné systematické úradné prieskumy prítomnosti škodlivého organizmu v uvedenom rastlinnom materiáli pochádzajúcom z ich územia. Členské štáty s cieľom identifikácie ostatných možných zdrojov kontaminácie ohrozujúcich výrobu uvedeného rastlinného materiálu vykonajú analýzu rizík a, pokiaľ počas tejto analýzy identifikujú riziko rozšírenia škodlivého organizmu, vykonajú v oblastiach produkcie uvedeného rastlinného materiálu cielené úradné prieskumy prítomnosti škodlivého organizmu v rastlinách iných, ako je uvedený rastlinný materiál, vrátane burinného spoločenstva patriaceho do čeľade ľuľkovitých rastlín, ako aj v povrchovej vode používanej na zavlažovanie alebo postrekovanie uvedeného rastlinného materiálu a v tekutých odpadoch vypúšťaných z prevádzkových priestorov priemyselného spracovania alebo balenia, v ktorých sa uvedený rastlinný materiál spracúva, používaných na zavlažovanie alebo postrekovanie uvedeného rastlinného materiálu. Rozsah týchto cielených prieskumov sa stanoví v súlade so zistenou mierou rizika. Členské štáty môžu taktiež vykonávať prieskumy výskytu škodlivého organizmu v materiáli, ako je napríklad záhradnícky substrát, zemina a tuhý odpad z prevádzkových priestorov priemyselného spracovania alebo balenia. 2. Úradné prieskumy uvedené v odseku 1 sa vykonávajú: a) v prípade uvedeného rastlinného materiálu v súlade s podrobnosťami stanovenými v bode I oddielu II prílohy I a b) v prípade hostiteľských rastlín iných ako uvedený rastlinný materiál a vody vrátane tekutých odpadov, v súlade s vhodnými metódami pričom, kde je to vhodné, sa odoberajú vzorky, ktoré sa podrobujú úradným laboratórnym testom alebo laboratórnym testom pod úradným dohľadom c) v prípade iného materiálu v súlade s súlade s vhodnými metódami. Vo vzťahu k týmto prieskumom rozhodnú o ďalších podrobnostiach týkajúcich sa kontrolných postupov a počtu, pôvodu, priestorového rozloženia a načasovania odberu vzoriek zodpovedné úradné orgány v zmysle smernice 77/93/EHS na základe vhodných vedeckých a štatistických princípov a biológie organizmu, prihliadajúc na konkrétne systémy produkcie uvedeného rastlinného materiálu a, podľa vhodnosti, ostatných hostiteľských rastlín škodlivého organizmu v príslušnom členskom štáte. 3. Podrobnosti týkajúce sa úradných prieskumov a ich výsledky sa v súlade s ustanoveniami bodu 2 oddielu II prílohy I každoročne oznamujú ostatným členským štátom a Komisii. Tieto oznámenia sa odovzdávajú do 1. júna, s výnimkou oznámení týkajúcich sa zemiakov používaných ako pestovateľom ponechané sadivové zemiaky, pre ktoré sa oznámenia odovzdávajú do 1. septembra. Podrobnosti a výsledky pre plodiny sa týkajú produkcie z predchádzajúceho roka. Podrobnosti o týchto oznámeniach možno odovzdať výboru. 4. V súlade s postupom stanoveným v článku 16a smernice 77/93/EHS sa príjmu nasledovné ustanovenia: - vhodné metódy pre prieskumy a laboratórne testy stanovené v bode b) prvého pododseku odseku 2. 5. V súlade s postupom stanoveným v článku 16a smernice 77/93/EHS sa môžu prijať nasledovné ustanovenia: - vhodné metódy pre prieskumy a stanovené v bode c) prvého pododseku odseku 2 - s cieľom zabezpečiť porovnateľné úrovne dôvery medzi členskými štátmi, ďalšie podrobnosti testov stanovených v druhom pododseku odseku 2. Článok 3 Členské štáty zabezpečia, aby sa podozrenie na výskyt alebo potvrdená prítomnosť škodlivého organizmu na ich území ohlásila ich príslušným zodpovedným úradným orgánom. Článok 4 1. Zodpovedné úradné orgány príslušného členského štátu(ov) zabezpečia, aby sa v každom z prípadov podozrenia na výskyt škodlivého organizmu vykonali úradné laboratórne testy alebo laboratórne testy pod úradným dohľadom, v prípade uvedeného rastlinného materiálu za použitia relevantnej metódy stanovenej v prílohe II, v súlade s podmienkami stanovenými v bode 1 prílohy III, alebo vo všetkých ostatných prípadoch, akejkoľvek inej úradne schválenej metódy, s cieľom potvrdiť alebo vyvrátiť podozrenia na výskyt škodlivého organizmu. V prípade potvrdenia podozrenia sa uplatňujú požiadavky stanovené v bode 2 prílohy III. 2. Do rozhodnutia o potvrdení alebo vyvrátení podozrenia na výskyt škodlivého organizmu podľa odseku 1, v každom prípade podozrenia na výskyt škodlivého organizmu, kedy, buď: i) boli pozorované diagnostické príznaky choroby spôsobovanej škodlivým organizmom a boli získané pozitívne výsledky skríningových testov tak, ako sú uvedené v bode 1 oddielu I a oddiele II prílohy II alebo, ii) boli získané pozitívne výsledky skríningových testov tak, ako sú uvedené v bode 2 oddielu I a oddiele III prílohy II, sú zodpovedné štátne orgány členských štátov vo vzťahu k ich vlastnej produkcii povinné: a) zakázať pohyb rastlín a hľúz zo všetkých plodín, partií alebo zásielok, z ktorých boli odobraté vzorky, s výnimkou kedy sa tak deje pod ich dohľadom a za predpokladu, že bolo stanovené, že neexistuje identifikovateľné riziko šírenia škodlivého organizmu b) vykonať kroky potrebné na vystopovanie pôvodu možného výskytu škodlivého organizmu c) zaviesť na základe odhadovanej úrovne rizika ďalšie primerané predbežné opatrenia, najmä vo vzťahu k produkcii uvedeného rastlinného materiálu a pohybu partií sadivových zemiakov iných ako tých uvedených v bode a), vyrobených na mieste, z ktorého boli odobraté vzorky uvedené v bode a), s cieľom zabrániť akémukoľvek šíreniu škodlivého organizmu. 3. V tých prípadoch podozrenia na výskyt škodlivého organizmu, kedy hrozí kontaminácia uvedeného rastlinného materiálu alebo povrchovej vody z iného členského štátu(och) alebo v inom členskom štáte(och), oznámi bezodkladne členský štát, v ktorom sa podozrenie na výskyt škodlivého organizmu vyskytlo, v závislosti od identifikovaného rizika, podrobnosti o danom podozrení na výskyt príslušnému členskému štátu(om) a tieto členské štáty potom primerane spolupracujú. Členský štát(y), ktorý dostane takéto oznámenie(ia), zavedie v súlade s odsekom 2c) preventívne opatrenia a podľa vhodnosti vykoná v súlade s odsekmi 1 a 2 akékoľvek ďalšie kroky. 4. V súlade s postupom stanoveným v článku 16a smernice 77/93/EHS sa môže prijať takéto ustanovenie: - opatrenia uvedené v odseku 2c). Článok 5 1. Ak úradné laboratórne testy alebo laboratórne testy pod úradným dohľadom za použitia relevantnej metódy stanovenej v prílohe II v prípade uvedeného rastlinného materiálu, alebo vo všetkých ostatných prípadoch akejkoľvek inej úradne schválenej metódy potvrdia prítomnosť škodlivého organizmu vo vzorke odobratej v súlade s touto smernicou, sú zodpovedné štátne orgány príslušného členského štátu, prihliadajúc na vhodné vedecké princípy, biológiu organizmu a konkrétne produkčné, distribučné a spracovateľské systémy používané v príslušnom členskom štáte pre hostiteľské rastliny škodlivého organizmu, povinné: a) v prípade uvedeného rastlinného materiálu: i) začať vyšetrovanie s cieľom zistiť rozsah a prvotný zdroje) kontaminácie v súlade s ustanoveniami prílohy IV, súčasne s ďalšími testami v súlade s článkom 4 (1) aspoň pri všetkých porastoch klonovo príbuzných sadivových zemiakov a ii) označiť za kontaminovaný uvedený rastlinný materiál, partiu alebo zásielku, z ktorej bola vzorka odobratá, ako aj strojové zariadenie, vozidlo, plavidlo, sklad či jeho časť, ktoré boli v styku s uvedeným infikovaným rastlinným materiálom; za kontaminované treba taktiež podľa vhodnosti označiť polia, chránené jednotky rastlinnej výroby a miesta produkcie rastlinného materiálu, z ktorého bol uvedený rastlinný materiál zozberaný a z ktorého bola odobratá vzorka; v prípade vzoriek odobratých počas vegetačného obdobia sa za kontaminované musia označiť polia, miesta produkcie a jednotky chránenej rastlinnej výroby, z ktorých bola vzorka odobratá a iii) určiť v súlade s ustanoveniami bodu 1 prílohy V rozsah pravdepodobnej kontaminácie v dôsledku styku s uvedeným rastlinným materiálom v priebehu zberovej či pozberovej manipulácie, v dôsledku spoločného pestovania, zavlažovania alebo postrekovania alebo v dôsledku klonovej spojitosti s označenou kontamináciou a iv) vyznačiť v súlade s ustanoveniami bodu 2 i) prílohy V a na základe označenia kontaminácie podľa bodu ii), určenia rozsahu pravdepodobnej kontaminácie podľa bodu iii) a možného rozšírenia škodlivého organizmu bezpečnostné pásmo b) v prípade plodín alebo hostiteľských rastlín, iných ako tie, ktoré sú uvedené v bode a), ak je produkcia uvedeného rastlinného materiálu identifikovaná ako riziková; i) začať vyšetrovanie v súlade s bodom a) i) a ii) označiť ako kontaminované tie hostiteľské rastliny škodlivého organizmu, z ktorých bola vzorka odobratá a iii) určiť v súlade s bodom a) iii) a iv) pravdepodobnú kontamináciu a vyznačiť bezpečnostné pásmo vzťahujúce sa na produkciu uvedeného rastlinného materiálu c) pre povrchovú vodu (vrátane tekutých odpadov vypúšťaných z prevádzkových priestorov priemyselného spracovania alebo balenia, v ktorých sa uvedený rastlinný materiál spracúva) a burinné spoločenstvo hostiteľských rastlín, ktoré patrí do čeľade ľuľkovitých, kde sa produkcia uvedeného rastlinného materiálu identifikuje ako riziková v dôsledku zavlažovania, postrekov alebo zaplavením povrchovou vodou, i) začať vyšetrovanie vrátane vhodne načasovaného úradného prieskumu vzoriek povrchovej vody a, v prípade jeho prítomnosti, burinného spoločenstva hostiteľských rastlín patriacich do čeľade ľuľkovitých, s cieľom stanoviť rozsah kontaminácie a ii) označiť v primeranom rozsahu a na základe výsledkov vyšetrovania podľa bodu i) povrchovú vodu, z ktorej boli odobraté vzorky ako kontaminované a iii) určiť pravdepodobný rozsah kontaminácie a na základe označenia kontaminácie podľa bodu ii) a možného šírenia škodlivého organizmu vyznačiť bezpečnostné pásmo, prihliadajúc na ustanovenia bodov 1 a 2 ii) prílohy V. 2. Členské štáty v súlade s ustanoveniami bodu 3 prílohy V bezodkladne oznámia ostatným členským štátom a Komisii akúkoľvek kontamináciu označenú podľa odsekov 1a) ii) a 1c) ii), ako aj podrobnosti o vyznačení bezpečnostného pásma podľa odseku 1a) iv) a, podľa vhodnosti, 1c) iii). Údaje nachádzajúce sa v oznámení podľa tohto odseku možno odovzdať výboru. Členské štáty súčasne odovzdajú Komisii dodatočné oznámenie stanovené v bode 4 prílohy V. Údaje nachádzajúce sa v oznámení podľa tohto pododseku sa bezodkladne odovzdajú členom výboru. 3. Na základe oznámenia podľa odseku 2 a informácií v ňom uvedených začnú ostatné členské štáty uvedené v oznámení vyšetrovanie v súlade s odsekom 1 a) i) a, podľa vhodnosti, 1 c) i) a podľa vhodnosti vykonajú ďalšie opatrenia v súlade s odsekmi 1 a 2. Článok 6 1. Členské štáty nariadia zákaz pestovania uvedeného rastlinného materiálu, ktorý bol podľa článku 5 (1) a) ii) označený za kontaminovaný a stanovia, že tento materiál pod dohľadom a so súhlasom príslušných štátnych orgánov podlieha jednému z ustanovení bodu 1 prílohy VI, aby bolo možné preukázať, že viac neexistuje identifikovateľné riziko ďalšieho šírenia škodlivého organizmu. 2. Členské štáty nariadia zákaz pestovania uvedeného rastlinného materiálu, ktorý bol podľa článku 5 (1) a) iii) a c) iii) označený za pravdepodobne kontaminovaný, vrátane uvedeného rastlinného materiálu, pre ktorý bolo identifikované riziko a ktorý bol vyprodukovaný na miestach produkcie označených za pravdepodobne kontaminované podľa článku 5 (1) a) iii) a stanovia, že tento materiál, pod dohľadom príslušných štátnych orgánov sa tak, ako je to uvedené v bode 2 prílohy VI, využije alebo zneškodní tak, aby bolo možné preukázať, že viac neexistuje identifikovateľné riziko ďalšieho šírenia škodlivého organizmu. 3. Členské štáty nariadia zničenie alebo dezinfekciu metódami uvedenými v bode 3 prílohy VI akéhokoľvek strojového zariadenia, vozidiel, plavidiel, skladov či ich častí a akýchkoľvek ostatných predmetov vrátane obalového materiálu, ktoré boli podľa článku 5 (1) a) ii) označené za kontaminované, alebo ktoré boli podľa článku 5 (1) a) iii) a c) iii) označené za pravdepodobne kontaminované. Po dezinfekcii sa tieto predmety viac nepovažujú za kontaminované. 4. Bez toho, aby boli dotknuté opatrenia vykonávané podľa odsekov 1, 2 a 3, nariadia členské štáty v bezpečnostnom pásme vymedzenom podľa článku 5 (1) a) iv) a c) iii) vykonanie skupiny opatrení špecifikovaných v bodoch 4.1 a 4.2 prílohy VI. Podrobnosti o týchto opatreniach sa každoročne oznámia ostatným členským štátom a Komisii. Údaje nachádzajúce sa v oznámení podľa tohto odseku možno odovzdať výboru. Článok 7 1. Členské štáty nariadia, že sadivové zemiaky musia spĺňať požiadavky smernice 77/93/EHS a musia pochádzať z priamej línie materiálu zemiakov získaného v rámci úradne schváleného množiteľského programu, označeného na základe úradných testov alebo testov pod úradným dohľadom vykonaných za použitia relevantných metód stanovených v prílohe II za nenapadnutý škodlivým organizmom. Vyššie uvedené testy členský štát vykoná: a) v prípadoch, kedy bol potvrdený výskyt(y) prítomnosti škodlivého organizmu v jeho produkcii sadivových zemiakov; i) vykonaním testov vyšších množiteľských stupňov vrátane klonového východiskového materiálu a systematickými testami klonov základného sadivového materiálu, alebo ii) v prípadoch, v ktorých preukázateľne neexistuje žiadna klonová spojitosť, vykonaním testov všetkých klonov základného sadivového materiálu alebo vyšších množiteľských stupňov vrátane klonového východiskového materiálu a b) v ostatných prípadoch, buď na každej rastline klonového východiskového materiálu, alebo na reprezentatívnych vzorkách základného sadivového materiálu, alebo vyšších množiteľských stupňov. 2. V súlade s postupom stanoveným v článku 16a smernice 77/93/EHS možno prijať tieto ustanovenia: - podrobné pravidlá uplatňovania bodu a) druhého pododseku odseku 1, - pravidlá týkajúce sa reprezentatívnych vzoriek uvedených v bodu b) druhého pododseku odseku 1. Článok 8 Členské štáty zakážu držbu a manipuláciu so škodlivým organizmom. Článok 9 Bez toho, aby boli dotknuté ustanovenia smernice 77/93/EHS, môžu členské štáty pre testovacie potreby, potreby vedeckého výskumu a šľachtiteľské potreby v súlade s ustanoveniami stanovenými v smernici 95/44/EHS [5] povoliť výnimky z opatrení uvedených v článkoch 6 a 8. Článok 10 Členské štáty môžu v prípade potreby prijať vo vzťahu k vlastnej produkcii ďalšie a prísnejšie opatrenia na potlačenie škodlivého organizmu alebo na zabránenie jeho rozširovaniu, pokiaľ sú tieto opatrenia v súlade so smernicou 77/93/EHS. Podrobnosti o týchto opatreniach sa oznámia ostatným členským štátom a Komisii. Údaje nachádzajúce sa v tomto oznámení sa môžu odovzdať výboru. Článok 11 Zmeny a doplnenia príloh k tejto smernici, ktoré bude nutné vykonať v dôsledku vývoja vedeckých alebo technických vedomostí, sa musia prijať v súlade s postupom stanoveným v článku 16a smernice 77/93/EHS. V prípade metód stanovených v prílohe II a opatrení v odsekoch 4.1 a 4.2 prílohy VI k tejto smernici je Komisia povinná vypracovať správu o preskúmaní týchto metód a opatrení na základe získaných skúseností, pričom správu je povinná predložiť výboru do 1. januára 2002. Článok 12 1. Členské štáty uvedú do učinnosti zákony, iné právne predpisy a správne opatrenia potrebné na dosiahnutie súladu s touto smernicou s účinnosťou od 21. augusta 1999. Bezodkladne o tom informujú Komisiu. Pri prijímaní týchto opatrení v nich členské štáty uvedú odkaz na túto smernicu alebo spoja takýto odkaz s ich úradným uverejnením. Metódy tvorby takýchto odkazov ustanovia členské štáty. 2. Členské štáty bezodkladne oznámia Komisii základné ustanovenia vnútroštátneho práva, ktoré prijmú v oblasti upravenej touto smernicou. Komisia o tom bude informovať ostatné členské štáty. Článok 13 Táto smernica nadobúda účinnosť dňom jej uverejnenia v Úradnom vestníku Európskych spoločenstiev. Článok 14 Táto smernica je adresovaná členským štátom. V Bruseli 20. júla 1998 Za Radu predseda W. Molterer [1] Ú. v. ES C 124, 21.4.1997, s. 12 a Ú. v. ES C 108, 7.4.1998, s. 85. [2] Ú. v. ES C 14, 19.1.1998, s. 34. [3] Ú. v. ES C 206, 7.7.1997, s. 57. [4] Ú. v. ES L 26, 31.1.1977, s. 20. Smernica naposledy zmenená a doplnené smernicou Komisie 98/2/ES (Ú. v. ES L 15, 21.1.1998, s. 34). [5] Ú. v. ES L 184, 3.8.1995, s. 34. Smernica naposledy zmenená alebo doplnená smernicou Komisie 97/46/ES (Ú. v. ES L 204, 31.7.1997, s. 43). -------------------------------------------------- PRÍLOHA I ODDIEL I Zoznam hostiteľských rastlín Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. uvedený v článku 1 Rastliny druhu Sonanum tuberosum L. (vrátane hľúz), okrem semien | zemiak | Rastliny druhu Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex Farw., okrem plodov a semien | rajčiak | ODDIEL II Prieskumy 1. Úradné prieskumy uvedené v článku 2 (2) a) sa zakladajú na biológii príslušného organizmu a konkrétnych produkčných systémoch členských štátov a pozostávajú z: i) v prípade zemiakov, - vizuálnych kontrol porastov počas vhodných období a/alebo odoberania vzoriek sadivových, ako aj ostatných druhov zemiakov počas vegetačného obdobia alebo zo skladov. Na týchto vzorkách sa potom rezom hľúz vykonajú úradné vizuálne kontroly alebo vizuálne kontroly pod úradným dohľadom - v prípade sadivových zemiakov a, kde je to vhodné, ostatných druhov zemiakov, úradných laboratórnych testov alebo laboratórnych testov pod úradným dohľadom, prostredníctvom metódy stanovenej v prílohe II, ii) v prípade rajčiakov, - vizuálnych kontrol, počas vhodných období, aspoň tých porastov, ktoré sú určené na ďalšiu výsadbu s cieľom profesionálneho použitia. 2. Oznámenia o úradných prieskumoch uvedené v článku 2 (3) obsahujú: i) v prípade prieskumov zemiakov: - odhad celkovej vysadenej plochy pre sadivové a ostatné zemiaky v hektároch, - rozvrstvenie podľa kategórií sadivových zemiakov a konzumných zemiakov a, kde je to vhodné, podľa regiónov, - počet vzoriek odobratých na testovanie a termín ich odobratia - počet vizuálnych kontrol v teréne, - počet vizuálnych kontrol hľúz (a veľkosť odobratých vzoriek) ii) v prípade prieskumov aspoň tých porastov rajčiakov, ktoré sú určené na ďalšiu výsadbu s cieľom profesionálneho použitia: - odhad celkového počtu rastlín, - počet vizuálnych kontrol iii) v prípade prieskumov hostiteľských rastlín iných ako zemiaky a rajčiaky vrátane burinného spoločenstva patriaceho do čeľade ľuľkovitých: - druhy, - počet odobratých vzoriek a termín ich odobratia, - oblasť alebo, podľa vhodnosti, rieka pôvodu vzoriek, - metóda rozboru iv) v prípade prieskumov vody a tekutých odpadov vypúšťaných z prevádzkových priestorov priemyselného spracovania alebo balenia: - počet odobratých vzoriek a termín ich odobratia, - oblasť, rieka, alebo, podľa vhodnosti, miesto prevádzkových priestorov pôvodu vzoriek, - metóda rozboru. -------------------------------------------------- PRÍLOHA II TESTOVACIA SCHÉMA PRE DIAGNOSTIKU, URČOVANIE PRÍTOMNOSTI A IDENTIFIKÁCIU RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. ROZSAH TESTOVACEJ SCHÉMY Predložená schéma popisuje rozličné postupy používané pri: i) diagnostike baktériovej hnedej hniloby v hľuzách zemiakov a baktériového vädnutia v rastlinách zemiakov a rajčiakov ii) určovaní prítomnosti Ralstonia solanacearum vo vzorkách hľúz zemiakov iii) identifikácii Ralstonia solanacearum. V dodatkoch sú uvedené podrobnosti týkajúce sa prípravy testovacích materiálov, t. j. živných pôd, pufrov a iných roztokov, činidiel. OBSAH: ODDIEL I: | Aplikácia testovacej schémy | 9 | 1.Diagnostika hnedej hniloby v hľuzách zemiakov a baktériového vädnutia v rastlinách zemiakov a rajčiakov | 9 | 2.Určovanie prítomnosti a identifikácia Ralstonia solanacearum vo vzorkách hľúz zemiakov | 11 | ODDIEL II: | Diagnostika hnedej hniloby v hľuzách zemiakov a baktériového vädnutia v rastlinách zemiakov a rajčiakov | 13 | 1.Príznaky | 13 | 2.Skríningové testy | 13 | 3.Izolácia baktérií | 14 | 4.Potvrdzovacie testy | 14 | ODDIEL III: | Určovanie prítomnosti a identifikáciaRalstonia solanacearumvo vzorkách hľúz zemiakov | 17 | 1.Príprava vzorky na test | 17 | 2.Imunofluorescenčný (IF) test | 18 | 3.Test ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) | 20 | 4.Polymerázová reťazová reakcia (test PCR™) | 20 | 5.Selektívny platňový rozter | 22 | 6.Biotest | 23 | 7.Obohacovacie testy | 23 | 8.Test patogenity | 23 | Dodatok 1 | Živné pôdy pre izoláciu a kultiváciu Ralstonia solanacearum | 24 | Dodatok 2 | Materiály pre prípravu vzoriek | 25 | Dodatok 3 | Materiály pre test IF | 26 | Dodatok 4 | Určenie stupňa kontaminácie pri teste IF | 27 | Dodatok 5 | Materiály pre test ELISA | 28 | Dodatok 6 | Materiály pre test PCR | 29 | Dodatok 7 | Materiály pre selektívny platňový rozter a obohacovacie testy | 29 | Bibliografia | 30 | ODDIEL I APLIKÁCIA TESTOVACEJ SCHÉMY 1. Diagnostika hnedej hniloby v hľuzách zemiakov a baktériového vädnutia v rastlinách zemiakov a rajčiakov Tento testovací postup je určený pre hľuzy zemiakov s príznakmi typickými pre hnedú hnilobu alebo vzbudzujúcimi podozrenie na hnedú hnilobu a pre rastliny zemiakov a rajčiakov s príznakmi typickými pre baktériové vädnutie alebo vzbudzujúcimi podozrenie na baktériové vädnutie. Skladá sa zo skríningového testu, izolácie patogéna z nakazeného cievneho pletiva na diagnostickom médiu a, v prípade pozitívneho výsledku, identifikácie kultúry ako Ralstonia solanacearum. +++++ TIFF +++++ Odkazy z vývojového diagramu vyššie: () Popis príznakov sa nachádza v oddiele II.1. () Skríningové testy uľahčujú predbežnú diagnostiku. Vhodné sú tieto testy: - Skríningový test výtoku slizu z cievnych zväzkov stonky (oddiel II.2), - Test prítomnosti granúl poly-ß-hydroxybutyrátu (oddiel II.2) - Test IF (oddiel III.2) - Test ELISA (oddiel III.3) - Test PCR (oddiel III.4) () Hoci je izolácia patogéna z rastlinného materiálu s typickými príznakmi prostredníctvom zrieďovacích rozterov priama, zakladanie kultúr môže v pokročilých štádiách nákazy zlyhať. Saprofytické baktérie, ktoré rastú v odumretom pletive, môžu v izolačnom médiu patogén prerásť alebo inhibovať. Ak je test izoláciou negatívny, ale príznaky choroby sú typické, je nutné izoláciu opakovať, najlepšie testom selektívnym platňovým rozterom. () Spoľahlivá identifikácia Ralstonia solanacearum sa dosiahne minimálne jedným testom uvedeným v oddiele II.4.1 v kombinácii s testom patogenity (oddiel II.4.3). Charakterizácia kmeňa je nepovinná, ale odporúča sa pre každý nový prípad. 2. Určovanie prítomnosti a identifikácia Ralstonia solanacearum vo vzorkách hľúz zemiakov Tento testovací postup je určený pre určovanie prítomnosti latentných infekcií hľúz zemiakov prostredníctvom jedného alebo viacerých (preferovaná možnosť) skríningových testov, ktoré sa, v prípade ich pozitívneho výsledku, dopĺňajú o izoláciu patogéna v prípade izolácie typických kolónií nasleduje identifikácie kultúry ako Ralstonia solanacearum. +++++ TIFF +++++ Odkazy z vývojového diagramu vyššie: () Veľkosť vzorky Štandardná veľkosť vzorky je 200 hľúz. Postupy však možno bez problémov aplikovať na vzorkách menších ako 200 hľúz. () Skríningové testy Jediný test nemusí byť dostatočne citlivý alebo spoľahlivý na to, aby sa ňou dala vo vzorke zistiť Ralstonia solanacearum. Preto sa odporúča viac testov, pričom tieto testy by sa mali podľa možností zakladať na rozdielnych biologických princípoch. () Imunofluorescenčný (IF) test Test IF je osvedčený skríningový test. Je preto výhodný v porovnaní s ostatnými testami, ktoré ešte nie sú plne vyvinuté alebo uznané za osvedčené. Používa sa pre mnohé iné karanténne baktérie, napr. Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Pri použití parametrov odčítavania hodnôt špecifikovaných v rámci tejto metódy ide o citlivý test (prah citlivosti 103-104 buniek na ml peletu zemiakového extraktu). Kritickým faktorom podmieňujúcim spoľahlivosť výsledku testu je kvalita antiséra. Prípustné je výhradne antisérum s vysokým titrom (najmenej 2000 pre surové antisérum) a všetky testy musia byť vykonané na úrovni titra antiséra alebo zriedenia pod úroveň titra. Uprednostňuje sa nepriama metóda. Priamu metódu možno použiť, ak úroveň citlivosti a špecifickosť testu zodpovedá nepriamej metóde. Test IF má výhodu subjektívneho výkladu morfológie sfarbenia buniek a intenzity fluorescencie, ktorý poskytuje informácie o špecifickosti reakcie. Krížové reakcie vyvolané sérologicky príbuznými baktériami s morfológiou buniek Ralstonia solanacearum z pôdy alebo pletív zemiakov sú bežné. Test IF možno použiť ako jediný skríningový test, v prípadoch keď existuje podozrenie na krížové reakcie, by sa mal vykonať ďalší skríningový test, založený na rozdielnom biologickom princípe. V takýchto prípadoch je najvhodnejším testom selektívny platňový rozter. () Selektívny platňový rozter Pri použití modifikovanej živnej pôdy SMSA a metodológie testu uvedenej v rámci tejto metódy ide o citlivý a selektívny test prítomnosti Ralstonia solanacearum. Výsledok je k dispozícii 3 až 6 dní po príprave vzorky. Patogén sa získa priamo z kultúry a možno ho ihneď identifikovať. Využitie plného potenciálu testu si vyžaduje obozretnú prípravu pupkových koncov hľúz tak, aby sa zamedzila prítomnosť druhotných baktérií nachádzajúcich sa v hľuzách zemiakov, ktoré v živnej pôde konkurujú Ralstonia solanacearum a môžu ovplyvniť vývoj patogéna. Niektoré kmene môžu rásť nedokonalo, nakoľko zložky živnej pôdy môžu ovplyvniť cieľový organizmus. Taktiež je potrebná opatrnosť pri odlišovaní Ralstonia solanacearum od ostatných baktérií, ktoré môžu narásť v živnej pôde. Selektívny platňový rozter možno použiť ako jediný test za predpokladu, že v prípadoch, kedy existuje podozrenie na inhibíciu Ralstonia solanacearum inými baktériami na platniach a výsledok testu je negatívny, vzorka sa preskúša iným testom, ktorá potvrdí alebo vyvráti pôvodnú diagnózu. V takýchto prípadoch je najvhodnejším testom test IF. () Test ELISA Test ELISA je vo všeobecnosti menej citlivý ako test IF (prah citlivosti 104-105 buniek na ml peletu zemiakového extraktu). Test nie je nákladný a je rýchly, je ale vo všeobecnosti náchylnejší na falošné pozitívne (krížové reakcie) a negatívne (inhibícia fenolovými molekulami v zemiakovom extrakte) výsledky. Požiadavky na špecifičnosť antiséra sú mimoriadne vysoké. Test ELISA nemožno používať ako jediný skríningový test. () Test PCR Test PCR potenciálne umožňuje veľmi citlivú detekciu, hoci býva ľahko inhibovaná zložkami extraktov z rastlín alebo hľúz, dôsledkom čoho sú falošné negatívne výsledky. Niektoré odrody zemiakov obsahujú viacero inhibítorov ako iné. Je teda potrebné tieto inhibítory odstrániť. Inhibíciu možno zredukovať zriedením, tým sa však zriedia aj populácie Ralstonia solanacearum. Počas všetkých krokov prípravy vzorky a testu sa musí venovať veľká pozornosť tomu, aby sa zabránilo kontaminácii, nakoľko jej dôsledkom sú falošné pozitívne výsledky. Falošné pozitívne výsledky môžu nastať aj v dôsledku homológnych sekvencií iných organizmov. Z týchto dôvodov nemožno priamy test PCR používať ako jediný skríningový test. () Obohacovací test Inkubovaním vzoriek peletov zo zemiakového extraktu v poloselektívnej živnej pôde, ako je napríklad modifikovaný živný roztok SMSA, sa umožňuje množenie Ralstonia solanacearum. Čo je však možno ešte dôležitejšie, takouto inkubáciou sa riedia potenciálne inhibítory testov ELISA alebo PCR. Ralstonia solanacearum v obohatenom živnom roztoku tak možno zistiť testami IF, ELISA a PCR. Tvorbu priameho rozteru z obohatených živných roztokov neodporúčame. Tieto obohacovacie metódy zatiaľ neboli dostatočne odskúšané a otestované. Sú na tomto mieste začlenené, pretože majú kvalitný potenciál. Vzhľadom na relatívne malé skúsenosti ich však nemožno používať ako jediné metódy určovania prítomnosti. () Biotest Biotest sa používa na izoláciu Ralstonia solanacearum z peletov zemiakového extraktu prostredníctvom selektívneho obohatenia v hostiteľskej rastline a možno ju aplikovať na rastliny rajčiaku a baklažánu. Test si vyžaduje optimálne inkubačné podmienky tak, ako sú uvedené v rámci tejto metódy. Baktérie inhibujúce Ralstonia solanacearum v živnej pôde SMSA do tohto testu najpravdepodobnejšie zasahovať nebudú. () Potvrdzovací test(y) Spoľahlivá identifikácia čistej kultúry Ralstonia solanacearum sa dosiahne aspoň jedným z testov uvedených v oddiele II.4.1 v kombinácii s testom patogenity (oddiel II.4.3). Charakterizácia kmeňa je nepovinná, ale odporúča sa pre každý nový prípad. ODDIEL II Diagnostika hnedej hniloby v hľuzách zemiakov a baktériového vädnutia v rastlinách zemiakov a rajčiakov 1. Príznaky 1.1. Príznaky na zemiakoch Rastlina zemiaka. V rannom štádiu nákazy listy vädnú vo vrchnej časti rastliny pri vysokých teplotách počas dňa, pričom cez noc sa zotavia. Vädnutie sa rýchlo stane nezvratným a jeho dôsledkom je odumretie rastliny. Cievne zväzky priečne rozrezaných stoniek zvädnutých rastlín môžu zhnednúť a z povrchu rezu sa vylučuje mliečny slizovitý exkrét – buď samovoľne, alebo ho možno stlačením ľahko vytlačiť. Ak sa odrezaná stonka umiestni zvislo do vody, z cievnych zväzkov vytekajú vlákna slizu. Hľuza zemiaka. Hľuzy zemiaka sa musia rozrezať priečne, blízko pupkového (stolónového) konca. Ranné štádium nákazy sa prejavuje sklovito žltým až svetlo hnedým sfarbením cievnych zväzkov, z ktorých sa začne vylučovať svetlosmotanový slizovitý exkrét – buď spontánne po niekoľkých minútach, alebo vyvinutím jemného tlaku palcami na šupu blízko povrchu rezu. Neskôr sa cievne sfarbenie zmení na zreteľnejšie hnedé a odumieranie pletiva sa môže rozšíriť na parenchymatózne pletivo. V pokročilých štádiách nákaza postupuje smerom od pupkového konca a očiek, výsledkom čoho môžu byť červenkasto hnedé, mierne vtlačené lézie na šupe, z ktorých sa môže vylučovať baktériový sliz, ktorý spôsobuje prilínanie častíc zeminy. 1.2. Príznaky na rajčiaku Rastlina rajčiaka. Prvým viditeľným príznakom je ochabnutý vzhľad najmladších listov. Za podmienok priaznivých pre patogény (teplota pôdy 25 °C, nasýtená vlhkosť vzduchu), nasleduje do niekoľkých dní epinastia a vädnutie jednej strany rastliny alebo celej rastliny, čo má za následok jej celkový kolaps. Za menej priaznivých podmienok (teplota pôdy pod 21 °C) sa na stonke môže vyvinúť veľký počet postranných výhonkov. Pozdĺž stonky možno pozorovať slizovitý pás, ktorý svedčí o odumieraní cievneho systému. Pri priečnom reze stonky sfarbené hnedé cievne zväzky vylučujú kvapky hustého bieleho alebo žltkastého baktériového slizu. 2. Skríningové testy Skríningové testy uľahčujú predbežnú diagnostiku. Použite jeden alebo viacero z týchto testov: Skríningový test stonky Prítomnosť Ralstonia solanacearum vo vädnúcich stonkách zemiaka alebo rajčiaku možno stanoviť nasledujúcimi jednoduchým predbežným testom: Odrežte stonku v úrovni nad zeminou. Umiestnite povrch rezu do kade s vodou. O malú chvíľu začnú z cievnych zväzkov samovoľne vytekať vlákna baktériového slizu. Žiadne iné baktérie spôsobujúce nákazu cievnych zväzkov v rastlinách zemiaka alebo rajčiaka nespôsobujú takýto fenomén. Určovanie prítomnosti granúl poly-ß-hydroxybutyrátu Granule PHB v bunkách Ralstonia solanacearum sa zviditeľňujú sfarbením prostredníctvom nílskej modrej A alebo sudánskej čiernej B. Pripravte si buď rozter slizovitého exkrétu, alebo suspendovaného pletiva na podložné mikroskopické sklíčko, alebo pripravte 48 hodinovú kultúru na živných pôdach YPGA, alebo SPA (dodatok 1). Pripravte si pozitívny kontrolný rozter kmeňa biovaru-2/rasy-3 a, ak to považujete za užitočné, negatívny kontrolný rozter heterologného kmeňa. Nechajte vyschnúť. Prejdite spodnou stranou sklíčka niekoľkokrát rýchlo ponad plameň, pokiaľ sa rozter nezafixuje. Test nílskou modrou 1. Zalejte zafixovaný rozter 1 % vodným roztokom nílskej modrej. Inkubujte 10 minút pri teplote 55 °C. 2. Nechajte odtiecť farbiaci roztok. Krátko opláchnite pod jemne tečúcou vodou. Odstráňte nadbytočnú vodu pijavým papierom. 3. Zalejte rozter 8 % vodným roztokom kyseliny octovej. Inkubujte 1 minútu pri laboratórnej teplote. 4. Umyte pod jemne tečúcou vodou. Odsajte vodu jemným pijavým papierom. 5. Opätovne zvlhčite kvapkou vody. Zakryte krycím sklíčkom. 6. Preskúmajte sfarbený rozter epifluorescenčným mikroskopom pri vlnovej dĺžke 450 nm a olejovej imerzii pri zväčšení 1:1000. Všímajte si sýtooranžovú fluorescenciu granúl PHB. Pozorujte taktiež za bežného svetla a uistite sa, či sú granule vnútrobunkové a či morfológia buniek zodpovedá Ralstonia solanacearum. Test sudánskou čiernou 1. Fixovaný rozter sa zaleje 0,3 % roztokom sudánskej čiernej B v 70 % etanole. Inkubuje sa pri laboratórnej teplote počas 10 minút. 2. Roztok farbiva sa nechá odtiecť. Rozter sa potom krátko oplachuje pod tečúcou vodou. Prebytočná voda sa odsaje pijavým papierom. 3. Rozter sa nakrátko ponorí do xylolu. Po vytiahnutí sa opäť osuší pijavým papierom. Pozor! Xylol je zdraviu škodlivá látka! Nevyhnutne sa musí pracovať v digestore! 4. Rozter sa zaleje 0,5 % (hmotnosť/objem) vodným roztokom safranínu a nechá sa počas 10 sekúnd stáť pri laboratórnej teplote. Pozor! Safranín je zdraviu škodlivá látka! Nevyhnutne sa musí pracovať v digestore! 5. Rozter sa opláchne pod slabo tečúcou vodou. Osuší sa pijavým papierom. Priloží sa krycie sklíčko. 6. Sfarbený rozter sa pozoruje ako preparát v mikroskope s prechádzajúcim svetlom, s olejovou imerziou pri zväčšení 1:1000. Granule PHB v bunkách Ralstonia solanacearum sú modro-čierno sfarbené. Bunkové steny majú farbu ružovo červenú. Iné testy Z iných testov sú vhodnými Test IF (oddiel III.2), test ELISA (oddiel III.3) a test PCR (oddiel III.4). 3. Postup pri izolácii 3.1 Odoberie sa slizovitý exkrét alebo časť diskolorovaného pletiva z cievnych zväzkov zemiakovej hľuzy alebo z cievnych pletív stonky rastliny zemiaka alebo rajčiaka. Urobí sa suspenzia v malom objeme sterilnej destilovanej vody alebo v 50 mM fosfátovom pufri, ktorý sa nechá 5 až 10 minút stáť. 3.2 Zo suspenzie sa pripravia minimálne dve desatinné riedenia (1/10 a 1/100), v prípade potreby aj viacero. 3.3 Štandardizovaný objem suspenzie a jednotlivých riedení prenesieme na univerzálnu živnú pôdu (NA, YPGA a SPA, dodatok 1) a/alebo na Kelmanovo tetrazóliové médium (dodatok 1) a/alebo na selektívnu živnú pôdu SMSA (dodatok 7). Riedenia rozotrieme na platne s použitím primeranej metódy. Vhodné je pripraviť si samostatné platne z každej použitej živnej pôdy so zriedenou kultúrou bunkovej suspenzie biovaru-2/rasy-3 kmeňa Ralstonia solanacearum ako pozitívnu kontrolu. 3.4 Platne sa nechajú inkubovať pri teplote 28 °C počas 3 dní. Pri pomalom raste je možné dobu inkubácie predĺžiť na 6 dní, pričom sa však kolónie baktérií v živnej pôde SMSA často stávajú atypickými a odumierajú. Na univerzálnych živných substrátoch virulentné izoláty Ralstonia solanacearum vytvárajú perlovobiele, ploché, nepravidelné a fluidné kolónie, často s charakteristickými špirálkami. Na Kelmanovom tetrazóliovom médiu vytvárajú virulentné izoláty Ralstonia solanacearum typické krémovo sfarbené, ploché, nepravidelné fluidné kolónie s krvavo červeno zafarbeným stredom. Nevirulentné formy Ralstonia solanacearum naproti tomu vytvárajú maslovité, tmavočervené kolónie. V živnej pôde SMSA vytvárajú virulentné izoláty Ralstonia solanacearum mliečnobiele, ploché, nepravidelné a fluidné kolónie s krvavo červeno zafarbeným stredom. Nevirulentné formy Ralstonia solanacearum vytvárajú v živnej pôde SMSA kolónie menej fluidné, ktoré sú úplne ružové až červené. 3.5 Kolónie s charakteristickou morfológiou sa subkultivujú až do čistej kultúry na niektorej univerzálnej živnej pôde. Je potrebné vyhnúť sa pravidelnému preočkovávaniu, ktoré by mohlo viesť až k strate virulencie. 4. Potvrdzovacie testy 4.1. Identifikácia Ralstonia solanacearum Čisté kultúry Ralstonia solanacearum sa identifikujú minimálne jedným z nasledujúcich postupov: Vyživovacie a enzymatické testy Upozornenie: Do každého použitého testu je nutné zahrnúť vhodné kontrolné kmene. Vždy sú buď prítomné, alebo chýbajú nasledujúce univerzálne fenotypové vlastnosti Ralstonia solanacearum: fluorescenčné pigmenty | – | inklúzie PHB | + | oxidačno-fermentačný (O/F) test | O+/F– | kataláza | + | oxidáza podľa Kovácsa | + | redukcia dusičnanov | + | využitie citránov | + | rast pri 40 °C | – | rast v 1 % roztoku NaCl | + | rast v 2 % roztoku NaCl | – | arginin-dihydroláza | – | skvapalnenie želatíny | – | hydrolýza škrobu | – | hydrolýza aezulínu | – | produkcia levánu | – | Živné pôdy a metódy podľa Lelliott & Stead (1987) Test IF Pripraví sa suspenzia s hustotou 106 buniek na 1 ml z testovanej kultúry a kontrolného kmeňa (kontrolných kmeňov). Pripraví sa rad dvojnásobných riedení antiséra. Použije sa IF metódu (oddiel III.2). IF titer kultúry musí zodpovedať IF titru pozitívnej kontroly. ELISA test Pripraví sa suspenzia s hustotou >106 buniek na 1 ml z testovanej kultúry a kontrolného kmeňa (kontrolných kmeňov). Použije sa metóda ELISA (oddiel III.3). Extinkčná hodnota kultúry musí zodpovedať extinkčnej hodnote pozitívnej kontroly. PCR test Pripraví sa suspenzia s hustotou 106 na 1 ml z testovanej kultúry a kontrolného kmeňa (kontrolných kmeňov). Použije sa metóda PCR (oddiel III.4). PCR produkt kultúry musí mať rovnakú veľkosť a rovnaký vzor reštrikčnej analýzy enzýmov (REA), ako má produkt pozitívnej kontroly. Fluorescenčná hybridizácia in-situ (FISH) Pripraví sa suspenzia s hustotou 106 na 1 ml z testovanej kultúry a kontrolného kmeňa (kontrolných kmeňov). Použije sa metóda FISH (van Beuningen et al., 1995) s PCR primerom OLI-1 (Seal et al. 1993). Kultúra musí vykazovať rovnakú reakciu ako pozitívna kontrola. Profilácia bielkovín Denaturované bielkoviny celých buniek sú rozdelené polyakrylamidovou gélovou elektroforézou (PAGE) (Stead, 1992a). Profilácia mastných kyselín (FAP) Kultúra a pozitívna kontrola sa nechajú rásť 48 hodín pri teplote 28 °C na tryptikázovej sójovej živnej pôde s použitím metódy FAP (Fatty acid profilling) (Jasen 1991; Stead 1992a, Stead 1992b). Profil kultúry sa musí zhodovať s profilom pozitívnej kontroly. Charakteristickými mastnými kyselinami za daných podmienok sú: 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH a 18:1 2OH. 4.2. Charakteristika kmeňa Charakterizácia kmeňa nie je povinná, doporučuje sa ale uskutočniť ju pre každý nový prípad s použitím aspoň jedného z nasledujúcich testov: — Určenie biovaru Ralstonia solanacearum sa člení na biovary, a to podľa schopnosti vytvárať z troch hexózových alkoholov a troch cukrov kyseliny (Hayward, 1964 & 1994): | Biovar | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | Využitie: | | | | | | — maltózy | – | + | + | – | + | — laktózy | – | + | + | – | + | — celobiózy | – | + | + | – | + | — manitolu | – | – | + | + | + | — sorbitolu | – | – | + | + | – | — dulcitolu | – | – | + | + | – | Ďalšími testami sa dá biovar 2 rozčleniť na subfenotypy (Hayward, 1994): | biovar 2 | biovar 2-A | biovar 2-T | použitie trehalózy | – | + | + | použitie inozitolu | + | – | + | použitie D-ribózy | – | – | + | pektolytická aktivita | nízka | nízka | vysoká | Určenie rás Určenie rasy (Buddenhagen et al., 1962) sa vykoná na základe testov patogenity na rastlinách rajčiaka alebo baklažánu, na rastlinách tabaku a taktiež hypersenzitívnou reakciou (HR) na listoch tabaku (Lozano & Sequiera, 1970): | [1]rasa | 1 | 2 | 3 | Reakcia na: | | | | rastlinách rajčiakov/baklažánu | vädnutie | žiadna reakcia | vädnutie | rastlinách tabaku | vädnutie | žiadna reakcia | žiadna reakcia | listoch tabaku | nekróza (48 hodín) a vädnutie (7-8 dní) | HR (12-24 hodín) | chloróza (za 2-8 dní) | Určenie rasy testom patogenity alebo testom hypersenzitívnej reakcie tabaku nemusí byť príliš spoľahlivé a miesto toho sa dá na príslušnosť k rase usudzovať podľa biovaru a pôvodného hostiteľa. Kultúru možno ďalej charakterizovať týmito znakmi: Genómová peptidová mapa Molekulárne odlíšenie kmeňov v rámci komplexu Ralstonia solanacearum sa dá vykonať analýzou RFLP (Cook et al., 1989). Repetitívnou sekvenciou PCR (REP-, ERIC- & BOX-PCR (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995). 4.3. Test patogenity Tento test je zameraný na potvrdenie správnosti určenia Ralstonia solanacearum a na vyhodnotenie virulencie kultúr, identifikovaných ako Ralstonia solanacearum. Z kultúry a pozitívneho kontrolného kmeňa sa pripraví inokulum s hustotou 106 buniek na 1 ml. Potom sa naočkuje 5 – 10 rastlín rajčiaka alebo baklažánu, a to najlepšie v štádiu tretieho pravého listu alebo v neskoršom štádiu (oddiel III.6). Dĺžka kultivácie je dva týždne pri teplotách 22 °C až 28 °C a vysokej relatívnej vzdušnej vlhkosti. Denne zavlažujte. Pozor treba dávať na výskyt vädnutia a/alebo epinastií, chloróz a zakrpatievania rastlín. Z rastlín, ktoré vykazujú charakteristické príznaky sa pripravia nasledujúcim postupom izoláty: - zo stonky sa vo výške asi 2 cm nad miestom očkovania odoberie pletivo. - odobraté pletivo sa rozotrie a suspenduje v sterilnej destilovanej vode alebo v 50 mM fosfátovom pufri, potom sa suspenzia rozotrie na platne, inkubuje a potom sa vyhodnotí výskyt typických kolónií Ralstonia solanacearum. ODDIEL III URČOVANIE PRÍTOMNOSTI A IDENTIFIKÁCIA RALSTONIA SOLANACEARUM VO VZORKÁCH HĽÚZ ZEMIAKOV Upozornenie: Štandardná veľkosť vzorky je 200 hľúz. Postup je však vhodný i pre vzorky s menej ako 200 hľuzami. 1. Príprava vzorky pre test Upozornenie: Pelet zemiakového extraktu, získaný týmto postupom sa dá použiť i pre detekciu baktérie Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Možnosti úpravy pred testom, pokiaľ je to vhodné: i) Vzorku nechajte inkubovať 2 týždne pri teplote 25 – 30 °C, aby sa podporilo pomnoženie malých populácií Ralstonia solanacearum; ii) Hľuzy očistite pod tečúcou vodou vhodným dezinfekčným a čistiacim prostriedkom a nechajte ich na vzduchu vyschnúť. 1.1 Čistým, dezinfikovaným skalpelom alebo zeleninovým nožom odstráňte šupku hľuzy na jej pupkovom konci tak, aby bolo vidieť cievne pletivo. Z cievneho pletiva na pupkovom konci každej hľuzy opatrne vyrežte na jej pupkovom konci malý kužeľovitý kúsok (3-5 mm v priemere). Pritom je potrebné dbať súčasne o to, aby sa vyrezalo čo najmenej necievnych pletív. Vykonajte na každej hľuze vo vzorke. Upozornenie: V tejto fáze môžete hľuzy dôkladne vizuálne prehliadnuť (oddiel II.1). Hľuzy vykazujúce symptómy alebo silnú hnilobu je potrebné vyradiť a skúmať oddelene (oddiel II). 1.2 Pupkové konce hľuzy umiestnite do uzatvorenej nádoby. Vzorka by mala byť urýchlene spracovaná. Pokiaľ to nie je možné, nemala by byť skladovaná dlhšie ako 24 hodín alebo pri teplote 4 °C dlhšie ako 72 hodín. 1.3 Pupkové konce hľúz spracujete jedným z nasledujúcich postupov: i) Pupkové konce hľúz vložte do vhodnej nádoby. Pridajte dostatočný objem maceračného pufru (dodatok 2), aby boli pupkové konce hľúz prikryté. Kúsky hľúz v mixéri Waring Blender alebo Ultra Turrax homogenizujeme. Je však potrebné zabrániť príliš silnej homogenizácii. Macerát nechajte 15 – 30 minút lúhovať. ii) Pupkové konce hľúz vložte do vhodnej nádoby. Pridajte dostatočný objem maceračného pufru, aby boli pupkové konce hľúz prekryté. Nádobu umiestnite do rotačnej trepačky. Inkubujte pri 50 – 100 otáčkach za minútu počas 4 hodín pri teplote 20 °C/22 °C alebo počas 16 – 24 hodín pri teplote 4 °C. iii) Pupkové konce hľúz vložte do pevného jednorazového maceračného vrecúška (napr. Stomacher s rozmermi 105x150 mm a sterilizovaného ožiarením). Pupkové konce hľúz rozmeľnite vhodným nástrojom, napr. kladivom, až do ich úplnej homogenizácie. Pridajte dostatočné množstvo maceračného pufru, aby boli pupkové konce hľúz prekryté. Macerát nechajte 15 – 30 minút odstáť. 1.4 Z takto pripravených pupkových koncov hľúz sa baktérie extrahujú niektorým z nasledujúcich postupov: i) Macerát opatrne nalejte do centrifugačnej skúmavky, tuhý zvyšok pritom ponechajte v nádobe alebo vrecúšku. Ak je zliaty macerát kalný, potom odstreďujte pri teplote pod 10 °C počas 10 minút pri odstredivej sile nie väčšej ako 180 g. Zliaty macerát alebo supernatant z prvého odstreďovania odstreďte počas 15 minút pri 7000 g alebo 10 minút pri 10000 g pri teplote pod 10 °C. Supernatant vylejte tak, aby sme neporušili vzniknutý pelet. ii) Macerát prefiltrujte cez filtračný systém so šírkou pórov 40 – 100 μm. Filtráciu je pritom nutné posilniť vákuovým čerpadlom. Filtrát zhromaždite v centrifugačnej skúmavke. Filtrát premyte maceračným pufrom. Filtrát odstreďte počas 15 minút pri 7000 g alebo 10 minút pri 10000 g pri teplote pod 10 °C. Supernatant vylejte tak, aby sme neporušili vzniknutý pelet. 1.5 Pelet resuspendujte v 1 ml peletového pufru (dodatok 2). Rozdeľte na dva rovnaké diely a každý z nich nalejte do jednej mikroskúmavky. Pre test používajte len jednu mikroskúmavku. Zvyšok tohoto extraktu skladujte počas testovania pri teplote 4 °C. Do druhej mikroskúmavky prilejte 10-25 % sterilný glycerín. Pretrepte. Skladujte pri teplote –18 °C (niekoľko týždňov) alebo pri teplote – 70 °C (niekoľko mesiacov). 2. Test IF Použite antisérum Ralstonia solanacearum, najlepšie rasa3/biovar 2. Určite titer u suspenzie s hustotou 106 buniek na ml homologického kmeňa Ralstonia solanacearum s vhodným zriedením konjugátu fluorescenčného isothiokyanátu (FITC) podľa doporučenia výrobcu. Surové sérum by malo mať titer IF minimálne 1: 2000. Použite viacobjektové podložné sklíčko najlepšie s 10 jamkami s minimálnym priemerom 6 mm. Na každé podložné sklíčko naneste kontrolu konjugátu FITC. Ak pracujete s veľkým množstvom podložných sklíčok, môžete vynechať kontrolu s fosfátovým pufrom (PBS). Test by však mal byť opakovaný s kontrolou PBS, ak v kontrole FITC nenájdete žiadnu pozitívnu bunku. Osobitne pripravte kontrolné pozitívne podložné sklíčko so suspenziou s hustotou 106 buniek na mililiter niektorého kmeňa Ralstonia solanacearum príslušnej rasy a biovaru. V každej sérii testovaní musí byť použité jedno podložné sklíčko. 2.1 Podložné sklíčka pripravte jedným z nasledujúcich postupov: i) Pri pelete s relatívne malým obsahom škrobu: Odmeraný štandardný objem (15 μl je postačujúci pre jamku s priemerom 6 mm – pri väčších jamkách je potrebné použiť zodpovedajúci väčší objem resuspendovaného peletu) naneste pipetou na rad jamiek. Ďalší rad môže byť použitý ako duplikát alebo pre druhú vzorku, ako je znázornené na obr. 1. ii) Pri iných peletoch: Pripravte desatinné riedenia, to značí 1/10, 1/100 a 1/1000 resuspendovaného peletu v peletovom pufri. Odmeraný štandardný objem (15 μl je postačujúci pre jamku s priemerom 6 mm – pri väčších jamkách je potrebné použiť zodpovedajúci väčší objem) resuspendovaného peletu a z každého zriedenia naneste pipetou na rad jamiek. Ďalší rad môže byť použitý ako duplikát alebo pre druhú vzorku, ako je znázornené na obr. 2. 2.2 Kvapky nechajte vyschnúť. Baktériové bunky fixujte na podložnom sklíčku buď zahriatím, flambovaním, alebo 95 % etanolom. 2.3 Postup pri IF i) Pri príprave podložného sklíčka podľa 2.1 i): Pripravte sadu dvojnásobných zriedení antiséra v pufri IF (dodatok 3): 1/4 titra (T/4), 1/2 titra (T/2)l, titer T a dvojnásobok titra (2T). ii) Pri príprave podložného sklíčka podľa 2.1 ii): Pripravte pracovné riedenia antiséra v pufri IF. Pracovné riedenie je riedenie antiséra s optimálnou špecifickosťou a normálne má polovicu hodnoty titra. +++++ TIFF +++++ Obrázok 1Príprava podložného sklíčka postupom podľa 2.1 i) a 2.3 i) +++++ TIFF +++++ Obrázok 2Príprava podložného sklíčka postupom podľa 2.1 ii) a 2.3 ii) 2.3.1 Všetky podložné sklíčka vyložte na vlhké hodvábne papiere. Všetky testovacie jamky pokryte riedeniami antiséra. Na pole FITC naneste fosfátový pufor PBS. Objem antiséra nanášaný na políčka musí zodpovedať objemu naneseného extraktu. 2.3.2 Nechajte zakryté počas 30 minút pri laboratórnej teplote. 2.3.3 Kvapky antiséra opatrne straste z podložného sklíčka a podložné sklíčka opatrne opláchnite pufrom IF. Preplachujte 5 minút v roztoku IF-pufri-Tween a potom 5 minút v pufri IF (dodatok 3). Prebytočnú vlhkosť starostlivo odstráňte. 2.3.4 Podložné sklíčka položte na vlhké hodvábne papiere. Testovacie jamky a jamku s FITC pokryte riedením konjugátu FITC použitým pre stanovenie titra. Objem konjugátu, nanášaný na jamky musí zodpovedať objemu aplikovaného antiséra. 2.3.5 Nechajte zakryté počas 30 minút pri laboratórnej teplote. 2.3.6 Kvapky konjugátu opatrne sklepte z podložného sklíčka. Opláchnite a prepláchnite rovnako ako v bode 2.3.3. Prebytočnú vlhkosť starostlivo odstráňte. 2.3.7 Na každú jamku napipetujte 5 až 10 μm 0,1 M glycerolu pufrovaného fosfátom (dodatok 3) alebo inú podobnú kryciu kvapalinu a priložte krycie sklíčko. 2.4 Hodnotenie testu IF Podložné sklíčka prehliadnite pod epifluorescenčným mikroskopom s filtrami vhodnými pre excitáciu FITC, pod olejovou imerziou pri zväčšení 500 – 1000 x. Každé políčko mikroskopicky prehliadnite vo dvoch navzájom kolmých priemeroch a taktiež po obvode. Najprv prehliadnite podložné sklíčka s pozitívnou kontrolou. Bunky musia jasne fluoreskovať a byť plne sfarbené. Upozornenie: Pri odlišnom sfarbení je potrebné test opakovať. Vyhodnotenie podložných sklíčok s testovanými vzorkami. Najprv preskúmajte preparáty z hľadiska absencie fluoreskujúcich buniek v jamkách s kontrolou FITC. Fluoreskujúce bunky v kontrolnej jamke FITC ukazujú na nešpecifickú väzbu konjugátu, na autofluorescenciu alebo na kontamináciu. Upozornenie: Ak dôjdete k tomuto záveru, je potrebné test opakovať. V testovacích jamkách pozorujte silne fluoreskujúce bunky s charakteristickou morfológiou Ralstonia solanacearum. Intenzita fluorescencie musí zodpovedať pozitívnemu kontrolnému kmeňu pri rovnakom riedení antiséra. Na bunky s neúplným zafarbením alebo so slabou fluorescenciou neberte ohľad, iba ak by bolo takýchto buniek prítomných veľmi mnoho (pozri vyhodnotenie výsledkov testov IF). Vyhodnotenie výsledkov testu IF i) Ak nie sa nájdu silne fluoreskujúce bunky s charakteristickou morfológiou, test IF je negatívny. ii) Ak sa nájdu jasne fluoreskujúce bunky s charakteristickou morfológiou, je potrebné určiť priemerný počet buniek na mikroskopickom poli a ten prepočítať na jeden mililiter (hodnota N) resuspendovaného peletu (dodatok 4). Hustotu baktérií v hodnote asi 103 buniek na jeden mililiter resuspendovaného peletu možno považovať za hranicu detekcie testu IF: - pri vzorkách s N > 103 buniek na 1 ml resuspendovaného peletu sa výsledok testu IF hodnotí ako pozitívny; - pri vzorkách s N > 103 buniek na 1 ml resuspendovaného peletu sa výsledok testu IF môže hodnotiť ako pozitívny. iii) Ak je zistený vysoký počet (>105 buniek na 1 mililiter) s neúplne alebo slabo fluoreskujúcimi bunkami pri titre antiséra, treba uskutočniť druhý test: - buď test na základe niektorého iného biologického princípu, alebo - opakovaný test IF, buď s druhým antisérom, alebo s desaťnásobným zriedením peletu. 3. Test ELISA Podľa Robinsona-Smitha et al., 1995 Použite antisérum pre Ralstonia solanacearum, najlepšie k rase 3 biovaru 2. Titer stanovte v suspenzii s hustotou 106 na 1 ml buniek homologického kmeňa Ralstonia solanacearum. Doporučuje sa používať mikrotitračné doštičky NUNC-Polysorb. Test by mal zahŕňať negatívnu kontrolu zemiakového extraktu a kontrolu fosfátového pufru (PBS). Ako pozitívnu kontrolu použite suspenziu s hustotou > 106 buniek na 1 ml z kmeňa vhodnej rasy/biovaru Ralstonia solanacearum. Test uskutočnite rovnako ako pri vzorke/vzorkách, ale oddelene od vzoriek na mikrotitračnej doštičke. 3.1 Do mikroskúmavky odpipetujte 100 – 200 μl resuspendovaného peletu. Obsah mikroskúmavky zahrievajte pri teplote 100 °C štyri minúty. Potom mikroskúmavku položte na ľad. 3.2 Pridajte alikvótny objem dvojnásobne silného uhličitanového krycieho pufru (dodatok 5) a premiešame. 3.3 Do najmenej dvoch jamiek mikrotitračnej doštičky umiestnite vždy po 100 μl zmesi. Inkubujte jednu hodinu pri teplote 37 °C alebo cez noc pri teplote 4 °C. 3.4 Extrakty z jamiek celkom odstráňte. Jamky vymyte trikrát fosfátovým pufrom (PBS) s Tweenom (dodatok 5), pričom by posledný premývací roztok mal v jamkách zostať aspoň 5 minút. 3.5 Pripravte vhodné riedenie antiséra Ralstonia solanacearum v blokačnom (protilátkovom) pufri (dodatok 5). Do jamiek umiestnite po 100 μl riedeného antiséra. Inkubujte pri teplote 37 °C jednu hodinu. 3.6 Antisérum z jamiek celkom odstráňte. Jamky vymyte rovnakým spôsobom, ako je opísané vyššie (3.4). 3.7 Pripravte vhodné riedenie konjugátu alkalickej fosfatázy v blokačnom pufri. Do jamiek umiestnite po 100 μl riedeného konjugátu. Inkubujte pri teplote 37 °C jednu hodinu. 3.8 Konjugát z jamiek celkom odstráňte. Jamky vymyte rovnakým, vyššie opísaným spôsobom (3.4, 3.6). 3.9 Pripravte substrátový alkalický roztok fosfatázy (dodatok 5). Pipetujte po 100 μl do jamiek. Uchovajte v tme pri laboratórnej teplote 30 až 60 minút. 3.10 Absorbanciu odčítajte pri vlnovej dĺžke 409 nm. Vyhodnotenie výsledkov testu ELISA: Výsledok testu ELISA je negatívny vtedy, ak je optická hustota (OD) vzorky < 2 x OD negatívnej kontroly. Výsledok testu ELISA je pozitívny vtedy, ak je optická hustota (OD) vzorky > 2 x OD negatívnej kontroly. 4. Test PCR Podľa Seal et al., 1993. Upozornenie: Pri všetkých krokoch prípravy vzorky aj všetkých ostatných činnostiach pri PCR sa musia používať špičky pipiet s filtrom. Ako pozitívnu kontrolu pripravte suspenziu kmeňa Ralstonia solanacearum rasy-3/biovaru-2 s hustotou 106 buniek na 1 ml. Test pri tejto kontrole uskutočnite úplne rovnakým postupom ako pri vzorke/vzorkách. 4.1 Odpipetujte 100 μl resuspendovaného peletu do mikroskúmavky. Alternatívne možno pipetovať 90 μl resuspendovaného peletu do mikroskúmavky, ktorá obsahuje 10 μl 0,5 M NaOH. Miešame opakovaným prevracaním mikroskúmavky. 4.2 Zahrievajte 4 minúty pri teplote 100 °C. Mikroskúmavku potom ihneď premiestnite na ľad. 4.3 Pripravte minimálne dve decimálne riedenia, napr. 1/10 a 1/100 alebo v prípade potreby viacnásobné v sterilizovanej, destilovanej vode alebo ultračistej vode (UPW). 4.4 V sterilnej skúmavke pripravte reakčnú zmes pre PCR (dodatok 6) pridaním nasledujúcich zložiek v tomto poradí: Pre reakčný objem 50 μl: Zložka | Množstvo | Konečná koncentrácia | Sterilná voda, destilovaná voda alebo ultračistá voda | 30,8 až 33,8 μl | | 10 x PCR pufor | 5,0 μl | 1 x | d-ATP | 1,0 μl | 0,2 mM | d-CTP | 1,0 μl | 0,2 mM | d-GTP | 1,0 μl | 0,2 mM | d-TTP | 1,0 μl | 0,2 mM | Primer OLI-l (20 μM) | 2,5 μl | 1 μM | Primer Y-2 (20 μM) | 2,5 μl | 1 μM | Taq-polymeráza (5 U/μl) | 0,2 μl | 1,0 U | Celkový objem | 45 až 48 μl | | Pre viac reakcií: Je treba vypočítať množstvo každej zložky pre požadovaný počet reakcií. Zložky zmiešajte a 45 až 48 μl zmesi umiestnite do sterilných skúmaviek na PCR. Skúmavky s reakčnou zmesou PCR položte na ľad. Pre reakčný objem 25 μl: Množstvo zložiek zodpovedajúcim spôsobom zmenšite. 4.5 Amplifikácia PCR 4.5.1 Nepovinne: Skúmavky s povarenou vzorkou a pozitívnou kontrolou odstreďte na pulznej centrifúge. Do skúmaviek s reakčnou zmesou PCR pridajte v uvedenom poradí 2 – 5 μl vzorky/vzoriek, vodnú kontrolu a pozitívnu kontrolu. Skúmavky postavte do ohrievacieho bloku termocykléru DNA. 4.5.2 Spustite nasledujúci program: 1 cyklus: 2 minúty pri teplote 96 °C : (denaturácia matrice); 50 cyklov: 20 sekúnd pri teplote 94 °C : (denaturácia), 20 sekúnd pri teplote 68 °C : (pripájanie primerov), 30 sekúnd pri teplote 72 °C : (predlžovanie kópie); 1 cyklus: 10 minút pri teplote 72 °C : (ďalšie predlžovanie kópie); 1 cyklus: vi) uchovávať pri teplote 4 °C. Upozornenie: Tieto parametre sa vzťahujú na teplotný cyklér Perkin Elmer 9600. Pri iných termocykléroch je prípadne nutná vrstva minerálneho oleja v reakčnej skúmavke PCR a/alebo zmena trvania kroku ii), iii) a iv) v amplifikačnom profile. 4.5.3 Skúmavky vyberte z termocykléru. Analyzujeme produkt PCR. Pokiaľ sa to nedá uskutočniť hneď, uložte skúmavky pre použitie v tom istom dni pri teplote 4 °C a pre použitie o dlhší čas ich skladujte pri teplote –18 °C. 4.6 Analýza produktu PCR Fragmenty PCR sa detekujú agarózovou gélovou elektroforézou a sfarbením ethidiumbromidom. 4.6.1 Pripravte vhodný agarózový gél tak, že agarózu opatrne povarte v elektroforetickom tris-octanovom pufre (TAE). 4.6.2 Rozvarenú agarózu ochlaďte na teplotu asi 50-60 °C, naplňte ňou gélovú nalievaciu komoru elektroforetickej aparatúry a nasaďte hrebeň. Roztok nechajte stuhnúť. 4.6.3 Hrebeň vyberte. Gél ponoríme do pufru TAE tak, aby bol pokrytý vrstvou pufru silnou asi 2-3 mm. 4.6.4 Na parafilm naneste kvapku nanášacieho pufru s objemom 3 μl. Pridajte 12 μl produktu PCR zo vzoriek, z pozitívnej kontroly alebo vodnej kontroly a pred naplnením zamiešame jemným odsatím do špičky pipety. Uvedené objemy sa môžu v závislosti na kapacite jamiek v agarózovom géle upraviť. 4.6.5 Jamky v géle opatrne naplňte. Do najmenej jednej jamky umiestnite pre porovnanie príslušný markér DNA. 4.6.6 Elektroforetickú aparatúru pripojte k napájaciemu zdroju. Elektroforézu vykonajte pri hodnotách 5 až 8 V.cm-1, pokiaľ sa čelo značeného indikátoru nebude nachádzať vo vzdialenosti do 1 cm od konca gélu. 4.6.7 Vypnite prívod prúdu do elektroforetickej aparatúry. Gél opatrne vyberte a nechajte ho 30 – 45 minút presycovať roztokom ethidiumbromidu. Upozornenie: Pri manipulácii s ethidiumbromidom, ktorý je silno mutagénnou látkou, používajte vždy jednorazové rukavice! 4.6.8 Farbivo z gélu vymyte v destilovanej vode 10 až 15 minút. 4.6.9 Zosilnený(é) fragmenty DNA zviditeľnite ultrafialovou transilumináciou. Produkt PCR Ralstonia solanacearum s primermi OLI-1 a Y-2 má dĺžku 288 párov báz. Porovnajte s markérom DNA a s pozitívnou kontrolou. Upozornenie: Vodná (= negatívna) kontrola musí byť v každom prípade negatívna. Ak by vychádzala ako pozitívna, musí sa test opakovať. 4.6.10 Gél možno z dokumentačných dôvodov vyfotografovať. 4.6.11 Pravosť zosileného fragmentu potvrdíme analýzou reštrikčných fragmentov (REA). 4.7 Analýza reštrikčným enzýmom (REA) 4.7.1 8,5 μl PCR produktu (4.5.3) umiestnite do novej mikroskúmavky. Pridajte 1 μl 10x enzýmového pufru a 0,5 μl reštrikčného enzýmu Avall. 4.7.2 Miešajte jemným fúkaním do špičky pipety. Ak na stenách mikroskúmavky zostávajú kvapôčky, vzorku pulzným spôsobom odstreďte v mikroodstredivke. Inkubujte asi hodinu pri teplote 37 °C. 4.7.3 Digerovaný fragment PCR analyzujte ako predtým (4.6) agarózovou gélovou elektroforézou. Vyhodnotenie výsledkov testu PCR: Test PCR je negatívny, ak nebol dokázaný charakteristický fragment 288 bp fragment a tento fragment bol pritom detekovaný u pozitívneho kontrolného kmeňa Ralstonia solanacearum. Test PCR je pozitívny, ak bol dokázaný 288 bp fragment a analýza REA ukazuje, že amplifikovaný fragment je identický s pozitívnym kontrolným kmeňom Ralstonia solanacearum. 5. Selektívny platňový test Podľa Elphinstona et al., 1996 5.1 Test sa vykoná vhodnou zrieďovacou platňovou technikou rozterov, napríklad: i) Pripravte minimálne dve desatinné riedenia, t. j. 1/10 a 1/100 alebo viac riedení resuspendovaného peletu v peletovom pufri. Odmeraný štandardný objem (50 až 100 μl) resuspendovaného peletu a každého riedenia napipetujte na modifikovanú selektívnu živnú pôdu SMSA (dodatok 7) a sklenou tyčinkou rozprestrite po celej ploche živnej pôdy. Ak sa to ukáže ako účelné, je treba 10 μl očkom vykonať zrieďovací rozter resuspendovaného peletu. Medzi roztermi sterilizovať očko plameňom. ii) Odmeraný štandardný objem (50 až 100 μl) resuspendovaného peletu naneste na modifikovanú selektívnu živnú pôdu SMSA a sklenou tyčinkou rozotrite na najmenej dve ďalšie platne s modifikovaným substrátom SMSA. 5.2 Rovnakou zrieďovacou platňovou technikou rozteru naneste suspenziu virulentného kmeňa Ralstonia solanacearum rasa 3/biovar 2 s hustotou 106 buniek v 1 ml ako pozitívnu kontrolu na sadu samostatných platní s modifikovanou živnou pôdou SMSA. 5.3 Platne nechajte inkubovať pri teplote 28 °C. Po 3 dňoch vykonajte prvú kontrolu platní. Pri negatívnom náleze nechajte inkubovať ďalej, až do 6 dní. Virulentné izoláty Ralstonia solanacearum vytvárajú mliečno biele, ploché, nepravidelné a fluidné kolónie, ktorých stred je červeno až purpurovo sfarbený s prúžkami alebo špirálkami. 5.4 Kolónie s charakteristickou morfológiou preveďte preočkovaním do čistej kultúry v univerzálnej živnej pôde (dodatok 1). 5.5 Čisté kultúry identifikujeme (oddiel II, 4.1) a kultúry Ralstonia solanacearum potvrďte testom patogenity (oddiel II, 4.3.). Vyhodnotenie výsledkov testu selektívneho platňového rozteru: Test selektívneho platňového rozteru je negatívny, ak sa po šiestich dňoch nedajú izolovať žiadne kolónie baktérií, alebo ak nie sú izolované žiadne charakteristické kolónie Ralstonia solanacearum, za predpokladu, že sa nepredpokladá inhibícia kolóniami iných baktérií a že v pozitívnych kontrolách neboli nájdené charakteristické kolónie Ralstonia solanacearum. Test selektívneho platňového rozteru je pozitívny, ak boli izolované charakteristické kolónie Ralstonia solanacearum. 6. Biotest Podľa Janseho 1988, 6.1 Pre každú vzorku je potrebné použiť 10 testovacích rastlín náchylných semenáčikov rajčiaka (odr. Money Maker) alebo baklažánu (odr. Black Beauty) v štádiu tretieho listu. Testované rastliny pred očkovaním 24 hodín nepolievať. 6.2 100 μl resuspendovaného peletu rozdeľte na testované rastliny. Inokulujte stopku medzi pošvami na jednom alebo viacerých ďalších miestach. 6.3 Rovnakou technikou naočkujte 10 semenáčov suspenziou virulentného kmeňa Ralstoniasolanacearum rasa 3/biovar 2 s hustotou 106 buniek v 1 ml ako pozitívnu kontrolu a peletovým pufrom ako negatívnu kontrolu. Aby sa predišlo krížovej kontaminácii, oddeľte pozitívne kontrolné rastliny od ostatných. 6.4 Testované rastliny nechajte ďalej rásť pri teplotách 22 až 28 °C a pri vysokej relatívnej vzdušnej vlhkosti až do 4 týždňov. Denne rastliny polievame. Sledujte prítomnosť príznakov vädnutia, epinastie, chlorózy a/alebo zakrpatenia. 6.5 Z infikovaných rastlín urobte izoláciu (oddiel II). Identifikujte čisté kultúry s charakteristickou morfológiou (oddiel II, 4.1) a kultúry Ralstonia solanacearum potvrdíme testom patogenity (oddiel II, 4.3). 6.6 V prípade potreby preskúmajte, či tie testované rastliny, ktoré nevykazujú žiadne príznaky infekcie, neboli infikované. Z každej testovanej rastliny odoberte 2 cm nad miestom naočkovania 1 cm dlhý úsek stonky. Odobraté časti pletív homogenizujeme v maceračnom pufri. Vykonajte test zrieďovacou platňovou technikou (oddiel III, 5.1). V prípade pozitívneho nálezu identifikujte čisté kultúry s charakteristickou morfológiou (oddiel II, 4.1) a pozitívne kultúry potvrďte vykonaním testu patogenity (oddiel II, 4.3). Vyhodnotenie výsledkov biotestu: Výsledok biotestu je negatívny, ak rastliny nie sú infikované Ralstonia solanacearum, za predpokladu, že prítomnosť baktérií Ralstonia solanacearum bola zistená v pozitívnych kontrolách. Výsledok biotestu je pozitívny, ak sú infikované testované rastliny baktériami Ralstonia solanacearum. 7. Obohacovací test Podľa J.G. Elphinstona et al., 1996 7.1 100 μl resuspendovaného peletu preneste do 3 ml modifikovanej živnej pôdy SMSA (dodatok 7). 7.2 Nechajte inkubovať 48 hodín, v žiadnom prípade však nie dlhšie ako 72 hodín, pri teplote 28 °C, a to pri odkrytom uzávere skúmavky, aby sa zabezpečilo vetranie. 7.3 Skúmavku uzavrite viečkom a pretrepete. Rozdeliť množstvo pre test IF (tento oddiel, bod 2), pre test ELISA (tento oddiel, bod 3) a/alebo test PCR (tento oddiel, bod 4). 8. Test patogenity Pozri oddiel II, 4.3. [1] Rasa 4 (patogénna na zázvorovníku a niektorých ďalších hostiteľoch) a rasa 5 (patogénna iba na moruši) nie sú v tejto tabuľke zahrnuté. -------------------------------------------------- PRÍLOHA III 1. Ak existuje podozrenie na výskyt, pri ktorom skríningové testy vykonané pre uvedený rastlinný materiál podľa postupov prílohy II a pre všetky ostatné prípady podľa akejkoľvek inej úradne schválenej metódy priniesli pozitívne výsledky, počas čakania na dokončenie uvedenej metódy a na potvrdenie alebo vyvrátenie výskytu sa do dokončenia tejto metódy zadrží a zachová: - podľa možnosti, partia (z ktorej bola odobratá vzorka) alebo jej časť, v pôvodnom balení s etiketou, - podľa možnosti, zvyšná časť vzoriek, - zvyšné extrakty a ďalší materiál upravený na vykonanie skríningových testov, napr. podložné sklíčka pre imunofluorescenčný test a - všetky príslušné doklady. 2. V prípade potvrdenia výskytu škodlivého organizmu by sa počas najmenej jedného mesiaca po skončení oznamovacieho konania podľa článku 5 (2) mal zadržať a zachovať: - materiál uvedený v odseku 1 tejto prílohy, - vzorka infikovaného materiálu z rajčiaka alebo baklažánu naočkovaná, podľa vhodnosti, extraktom z hľuzy alebo rastlín a - izolovaná kultúra patogéna. -------------------------------------------------- PRÍLOHA IV Vyšetrovanie uvedené v článku 5(1)a)i) sa v jednotlivých prípadoch týka: i) miest produkcie: - kde sa pestujú alebo sa pestovali zemiaky, ktoré sú klonovo príbuzné so zemiakmi, pri ktorých sa dokázalo napadnutie škodlivým organizmom, - kde sa pestujú alebo sa pestovali rajčiaky pochádzajúce z rovnakého zdroja ako rajčiaky, pri ktorých bolo dokázané napadnutie škodlivým organizmom, - kde sa pestujú alebo sa pestovali rajčiaky alebo zemiaky, ktoré boli z dôvodu podozrenia na výskyt škodlivého organizmu podrobené úradnému dohľadu, - kde sa pestujú alebo sa pestovali zemiaky, ktoré sú klonovo príbuzné so zemiakmi, ktoré boli pestované na miestach produkcie, pri ktorých bolo dokázané napadnutie škodlivým organizmom, - kde sa pestujú alebo sa pestovali rajčiaky alebo zemiaky a ktoré ležia v susedstve napadnutých produkčných miest vrátane tých, kde boli priamo alebo prostredníctvom spoločného zmluvného partnera zdieľané poľnohospodárske stroje, alebo zariadenia, - na ktorých bola na zavlažovanie alebo postrekovanie používaná povrchová voda zo zdrojov, pri ktorých bola dokázaná kontaminácia škodlivým organizmom alebo pri ktorých existuje podozrenie na kontamináciu škodlivým organizmom, - na ktorých bola na zavlažovanie alebo postrekovanie používaná povrchová voda zo zdrojov používaných aj miestami produkcie, pri ktorých bola dokázaná kontaminácia škodlivým organizmom alebo pri ktorých existuje podozrenie na kontamináciu škodlivým organizmom, - ktoré sú zaplavené alebo boli zaplavené povrchovými vodami, pri ktorých sa ukázalo, že sú kontaminované škodlivým organizmom, alebo pri ktorých existuje podozrenie na kontamináciu škodlivým organizmom a ii) povrchovej vody používanej na zavlažovanie alebo postrek poľa/polí a miesta/miest produkcie, pri ktorých bola dokázaná kontaminácia škodlivým organizmom alebo ktorá tieto polia a miesta produkcie zaplavila. -------------------------------------------------- PRÍLOHA V 1. Pri stanovovaní rozsahu pravdepodobnej kontaminácie podľa článku 5 (1) a) iii) a 5 (1) c) iii) sa podľa relevantnosti prihliada na: - uvedený rastlinný materiál pestovaný na mieste produkcie, ktoré bolo podľa článku 5 (1) a) ii) označené za kontaminované, - miestoa) produkcie s produkčným prepojením na uvedený rastlinný materiál označený podľa článku 5 (1) a) ii) za kontaminovaný vrátane miest, ktoré priamo alebo prostredníctvom spoločného zmluvného partnera zdieľali výrobné vybavenie alebo zariadenia, - uvedený rastlinný materiál, ktorý bol pestovaný na mieste(ach) produkcie uvedenom v predchádzajúcej zarážke, alebo bol prítomný na takomto mieste(ach) produkcie v čase, kedy na tomto mieste produkcie bol prítomný uvedený rastlinný materiál, ktorý bol podľa článku 5 (1)a)ii) označený za kontaminovaný, - sklady, v ktorých sa manipulovalo s uvedeným rastlinným materiálom z vyššie uvedených miest produkcie, - všetky strojové zariadenia, vozidlá, lode, skladovacie priestory alebo ich časti a akékoľvek iné predmety vrátane obalového materiálu, ktoré mohli prísť do styku s uvedeným rastlinným materiálom, ktorý bol podľa článku 5 (1) a) ii) označený za kontaminovaný, - akýkoľvek rastlinný materiál, ktorý bol v styku so zariadeniami alebo objektmi uvedenými v predchádzajúcej zarážke alebo v nich bol uskladnený pred ich dezinfekciou alebo vyčistením, - v dôsledku vyšetrovania a testov podľa článku 5 (1) a) i), v prípade zemiakov, tie hľuzy alebo rastliny, ktoré majú súrodenecký alebo rodičovský klonový pomer k uvedenému rastlinnému materiálu, ktorý bol podľa článku 5 (1) a) ii) označený za kontaminovaný a v prípade rajčiakov tie rastliny, ktoré pochádzajú z rovnakého osiva ako daný uvedený rastlinný materiál a pri ktorých sa i v prípade negatívneho výsledku skúmania prítomnosti patogéna na základe klonovej príbuznosti kontaminácia zdá byť pravdepodobnou; - miesto(a) produkcie uvedeného rastlinného materiálu spomínaného v predchádzajúcej zarážke, - miesto(a) produkcie uvedeného rastlinného materiálu, na ktorom sa na zavlažovanie alebo postrek používala voda, ktorá bola podľa článku 5 (1) c) ii) označená za kontaminovanú, - uvedený rastlinný materiál vyprodukovaný na poliach, ktoré boli zaplavené povrchovou vodou, v ktorej bolo dokázané zamorenie škodlivým organizmom. 2. Pri stanovovaní možného šírenia škodlivého organizmu podľa článku 5 (1) a) iv) a 5 (1) c) iii) sa prihliada na: i) v prípadoch podľa článku 5 (1) a) iv): - blízkosť k iným miestam produkcie, na ktorých sa uvedený rastlinný materiál pestuje, - bežnú produkciu a použitie porastov sadivových zemiakov, - miesta produkcie, na ktorých sa uvedený rastlinný materiál zavlažuje alebo postrekuje povrchovou vodou v prípadoch, keď existuje alebo existovalo nebezpečenstvo odplavenia povrchovej vody alebo zaplavenia povrchovou vodou z miest produkcie, ktoré boli podľa článku 5 (1) a) ii) označené za kontaminované; ii) v prípadoch, kedy bola povrchová voda označená za kontaminovanú podľa článku 5 (1) c) ii): - miesto(a) produkcie, kde sa uvedený rastlinný materiál pestuje bezprostredne vedľa povrchovej vody označenej ako kontaminovanú alebo ktoré môže byť touto povrchovou vodou zaplavené, - každú samostatnú zavlažovaciu nádrž, ktorá je spojená s povrchovou vodou označenou za kontaminovanú. 3. Medzi podrobnosti oznámenia uvedeného v prvom pododseku článku 5 (2) patrí: - dátum oznámenia podozrenia na výskyt podľa článku 4 a dátumy odberu vzoriek a, podľa vhodnosti, potvrdenia prítomnosti škodlivého organizmu podľa článku 5, - opis označenej kontaminácie a vymedzenia bezpečnostného pásma. 4. Medzi podrobnosti dodatočného oznámenia uvedeného v druhom pododseku článku 5 (2) patrí: - pre každú zásielku alebo partiu zemiakov označenú za kontaminovanú, osvedčenia podľa článkov 7 a 8 smernice 77/93/EHS, číslo pasu rastlinného materiálu alebo, podľa vhodnosti, registračné číslo producenta zemiakov, zberného skladu a zasielateľského centra, - pre každú zásielku alebo partiu rajčiakov označenú za kontaminovanú, osvedčenia podľa článkov 7 a 8 smernice 77/93/EHS a číslo pasu rastlinného materiálu v súlade so zoznamom uvedeným v oddiele 1.2.2 časti A prílohy V k smernici 77/93/EHS, - názov odrody a kategórie sadív v prípade porastov sadivových zemiakov a podľa možnosti i v ostatných prípadoch, - iné údaje týkajúce sa potvrdeného výskytu škodlivého organizmu, ktoré môže požadovať Komisia. -------------------------------------------------- PRÍLOHA VI 1. Ustanovenia, na ktoré sa odvoláva článok 6 (1) sú: - spálenie, alebo - použitie ako krmivo pre zvieratá po tepelnom spracovaní, ktoré vylučuje nebezpečenstvo prežitia škodlivého organizmu, alebo - hlboké zahrabanie materiálu do skládok, pri ktorých neexistuje žiadne riziko priesaku na poľnohospodársky využívané plochy alebo do povrchovej vody, ktoré sa využívajú na zavlažovanie poľnohospodárskej pôdy, alebo - priemyselné spracovanie priamym a okamžitým dodaním do spracovateľského závodu vybaveného úradne schválenými zariadeniami na zneškodňovanie odpadov, ktoré spĺňajú ustanovenia stanovené v prílohe VII k tejto smernici, alebo - iné opatrenia, ak preukázateľne neexistuje žiadne riziko šírenia škodlivého organizmu takéto opatrenia sa bezodkladne oznámia Komisii a ostatným členským štátom. 2. Za vhodné využitie alebo zneškodnenie uvedeného rastlinného materiálu podľa článku 6 (2) pod dohľadom zodpovedných orgánov príslušných členských štátov pri vzájomnom informovaní zodpovedných orgánov s cieľom zabezpečenia takéhoto dohľadu v ktoromkoľvek okamihu a so súhlasom zodpovedného orgánu členského štátu, v ktorom sa zemiaky majú baliť alebo spracovávať v zariadeniach na zneškodňovanie odpadu uvedených v prvej a druhej zarážke, sa považuje: i) v prípade zemiakových hľúz: - využitie ako trhové konzumné zemiaky balené na miestach vybavených vhodnými zariadeniami na zneškodňovanie odpadu, pripravené na okamžitú expedíciu a použitie bez potreby ďalšieho prebaľovania a určené na takúto priamu expedíciu a použitie, alebo - využitie ako trhové zemiaky pre priemyselné spracovanie, určené na priamu a okamžitú dodávku do spracovateľského zariadenia vybaveného vhodným zariadením na zneškodňovanie odpadu, alebo - iné využitie alebo zneškodnenie, ak preukázateľne neexistuje žiadne rozpoznateľné riziko šírenia škodlivého organizmu a po schválení uvedenými zodpovednými orgánmi. Takéto opatrenia sa bezodkladne ohlasujú Komisii a ostatným členským štátom. ii) v prípade iných častí rastlín vrátane stoniek a listového odpadu: - zničenie, alebo - iné využitie alebo zneškodnenie, ak preukázateľne neexistuje žiadne rozpoznateľné nebezpečenstvo šírenia škodlivého organizmu. Takéto opatrenia sa bezodkladne ohlasujú Komisii a ostatným členským štátom. 3. Vhodné metódy dezinfekcie predmetov uvedených v článku 6 (3), s ktorými prišiel nakazený materiál do styku, zahŕňajú vyčistenie a podľa vhodnosti dezinfekciu tak, aby bolo zabezpečené, že neexistuje žiadne rozpoznateľné riziko šírenia škodlivého organizmu, pričom toto opatrenie musí byť vykonané pod dohľadom zodpovedných orgánov členských štátov. 4. Do skupiny opatrení, ktoré musia členské štáty vykonať v bezpečnostnom pásme vymedzenom podľa článku 5 (1) a) iv) a c) iii) patria: 4.1. V prípadoch, v ktorých boli miesta produkcie vyhlásené za kontaminované podľa článku 5 (1) a) ii): a) na poli alebo v jednotke chránenej rastlinnej produkcie, ktorá bola podľa článku 5(1) a) ii) označená za kontaminovanú, buď i) minimálne počas štyroch rokov nasledujúcich po roku označenia kontaminácie: - opatrenia na potláčanie samovýsadby/samovýsevu rastlín zemiakov a rajčiakov, ako aj iných hostiteľských rastlín škodlivého organizmu vrátane burinného spoločenstva patriaceho do čeľade ľuľkovitých; a - vynechanie výsadby/výsevu: - hľúz zemiakov alebo rastlín zemiakov, - rastlín rajčiakov alebo osiva rajčiaka, - prihliadajúc na biológiu škodlivého organizmu, - iných hostiteľských rastlín škodlivého organizmu, - rastlinných druhov z rodu Brassica, pri ktorých preukázateľne existuje riziko prežívania škodlivého organizmu, - plodín, pri ktorých preukázateľne existuje riziko šírenia škodlivého organizmu; - v prvom vegetačnom období zemiakov a rajčiakov nasledujúcom po období uvedenom v predchádzajúcej zarážke a za podmienky, že pole bolo minimálne počas dvoch pestovateľských rokoch pred rokom vysadenia bez rastlín zemiakov alebo rajčiakov vyrastených zo samovýsadby/samovýsevu, ako i bez iných hostiteľských rastlín vrátane burinného spoločenstva patriaceho do čeľade ľuľkovitých, - v prípade zemiakov, pestovanie iba z úradne certifikovaného sadiva zemiakov určeného výlučne pre produkciu konzumných zemiakov a - vykonanie úradného prieskumu vrátane testov podľa článku 2 (1), - vo vegetačnom období zemiakov a rajčiakov nasledujúcom po vegetačnom období uvedenom v predchádzajúcej zarážke pri dodržaní vhodného osevného postupu, v prípade zemiakov, pestovanie iba z úradne certifikovaného sadiva zemiakov buď s cieľom produkcie sadivových zemiakov, alebo produkcie konzumných zemiakov a v prípade zemiakov a rajčiakov vykonanie úradného prieskumu podľa článku 2 (1) alebo ii) počas piatich pestovateľských rokov nasledujúcich po roku označenia pozemkov za kontaminované: - opatrenia na odstránenie samovýsadby/samovýsevu rastlín zemiakov a rajčiakov, ako i iných hostiteľských rastlín škodlivého organizmu vrátane burinného spoločenstva patriaceho do čeľade ľuľkovitých a - počas prvých troch rokov tohto obdobia buď čierny úhor, alebo pestovanie obilnín podľa zisteného rizika alebo trvalá pastvina s častým kosením alebo intenzívnym spásaním alebo pestovanie tráv s cieľom získania semennej produkcie, po ktorých nasledujú dva roky pestovania nehostiteľských rastlín, ktoré preukázateľne nepredstavujú žiadne riziko prežitia alebo šírenia škodlivého organizmu, - v prvom vegetačnom období zemiakov a rajčiakov nasledujúcom po období uvedenom v predchádzajúcej zarážke, - v prípade zemiakov pestovanie iba z úradne certifikovaného sadiva zemiakov, a to buď s cieľom produkcie sadivových zemiakov, alebo konzumných zemiakov, a vykonanie úradného prieskumu vrátane testov podľa článku 2 (1); b) na iných poliach: - v pestovateľskom roku nasledujúcom po roku vyhlásenia pozemkov za - kontaminované: buď vynechanie výsadby zemiakových hľúz, alebo rastlín, alebo iných hostiteľských rastlín škodlivého organizmu, ako i opatrenia na odstránenie samovýsadby/samovýsevu rastlín zemiakov a rajčiakov, ako i iných hostiteľských rastlín škodlivého organizmu vrátane burinného spoločenstva patriaceho do čeľade ľuľkovitých; - v prípade zemiakových hľúz vysádzať iba z úradne certifikovaného sadiva zemiakov výlučne s cieľom produkcie konzumných zemiakov za predpokladu, že zodpovedné orgány súhlasia s tým, že boli eliminované riziká predstavované rastlinami zemiakov a rajčiakov zo samovýsadby/samovýsevu ako i inými hostiteľskými rastlinami škodlivého organizmu vrátane burinného spoločenstva patriaceho do čeľade ľuľkovitých. Porast sa vo vhodných termínoch kontroluje a v prípade rastlín zemiakov zo samovýsadby sa vykonávajú testy na prípadnú prítomnosť škodlivého organizmu; v prípade zemiakov sa navyše kontrolujú i zozbierané hľuzy; - počas prvého pestovateľského roku nasledujúceho po pestovateľskom roku uvedenom v predchádzajúcej zarážke, - v prípade zemiakov vysádzať výlučne úradne certifikované sadivo zemiakov s cieľom produkcie sadivových zemiakov alebo konzumných zemiakov, - minimálne počas druhého pestovateľského roka nasledujúceho po pestovateľskom roku, uvedenom v predchádzajúcej zarážke, - v prípade zemiakov, vysádzať výlučne úradne certifikované sadivo zemiakov alebo sadivo, ktoré bolo vypestovaná pod úradným dohľadom z úradne certifikovaného sadiva zemiakov, a to s cieľom produkcie sadivových zemiakov alebo konzumných zemiakov, - v každom z pestovateľských rokov uvedených v predchádzajúcej zarážke, opatrenia na odstránenie rastlín zo samovýsadby/samovýsevu rajčiakov a zemiakov, ako i ďalších hostiteľských rastlín škodlivého organizmu vrátane burinného spoločenstva patriaceho do čeľade ľuľkovitých a vykonanie úradného prieskumu vrátane testov podľa článku 2 (1) a v prípade, že sa vysádzajú hľuzy zemiakov pre produkciu sadiva, vykonanie testov hľúz; c) ihneď po vyhlásení pozemkov za kontaminované podľa článku 5 1) a) ii) a v každom nasledujúcom pestovateľskom roku až do prvého prípustného pestovania zemiakov alebo rajčiakov na poli označenom za kontaminované podľa odseku a): - riadne vyčistenie a, podľa vhodnosti, dezinfekcia všetkých strojov a skladovacích zariadení nachádzajúcich na mieste produkcie, ktoré sa používajú pri produkcii zemiakov alebo rajčiakov podľa bodu 3, - úradné kontroly zavlažovacích a postrekových programov, vrátane, podľa potreby, vyhlásenia zákazu zavlažovania a postrekov, s cieľom zabrániť šíreniu škodlivého organizmu; d) v jednotke chránenej produkcie rastlín, ktorá bola podľa článku 5 1) a) ii) označená za kontaminovanú a pri ktorej je možná úplná výmena pestovateľského substrátu, - vynechanie výsadby zemiakových hľúz alebo rastlín zemiakov alebo iných hostiteľských rastlín škodlivého organizmu vrátane rastlín rajčiakov, a výsevu semien rajčiakov dovtedy, pokiaľ sa príslušná prevádzková jednotka pod úradným dozorom nepodrobí opatreniam na zničenie škodlivého organizmu a na odstránenie všetkého materiálu hostiteľských rastlín vrátane minimálne jednej úplnej výmeny pestovateľského substrátu, vyčistenia a, podľa potreby, dezinfekcie uvedenej jednotky a všetkých zariadení a pokiaľ nebude potom zodpovednými orgánmi udelený súhlas na pestovanie rajčiakov a zemiakov a - v prípade produkcie zemiakov, použitie úradne certifikovaného sadiva zemiakov, minihľúz alebo meristémových kultúr, ktoré pochádzajú z testovaných zdrojov a - úradné kontroly zavlažovacích a postrekových programov vrátane, podľa potreby, vyhlásenia zákazu zavlažovania a postrekov, s cieľom zabrániť šíreniu škodlivého organizmu. 4.2 Bez toho, aby boli dotknuté opatrenia uvedené v bode 4.1, sú členské štáty vo vymedzenej bezpečnostnej zóne povinné: a) ihneď a minimálne počas troch pestovateľských rokov nasledujúcich po roku vyhlásenia príslušných pozemkov za kontaminované: (aa) v prípadoch, kedy bola bezpečnostná zóna vymedzená podľa článku 5 1) a) iv): - vyžadovať, aby zodpovedné orgány vykonávali dozor nad prevádzkami, ktoré pestujú, skladujú alebo manipulujú so zemiakmi alebo rajčiakmi, ako aj nad prevádzkami, ktoré na zmluvnom základe obsluhujú strojové zariadenia používané pri produkcii zemiakov a rajčiakov, - vyžadovať čistenie a podľa vhodnosti, dezinfekciu strojových zariadení a skladov týchto podnikov vhodným spôsobom stanoveným v bode 3, - vyžadovať, aby v takejto bezpečnostnej zóne boli všetky porasty zemiakov vysádzané výlučne z úradne certifikovaného sadiva alebo aby bolo používané sadivo vypestované pod úradným dozorom a aby sadivové zemiaky, ktoré boli pestované na miestach produkcie, ktoré boli podľa článku 5 1) a) iii) označené ako pravdepodobne napadnuté, boli po zbere testované, - vyžadovať, aby sa vo všetkých podnikoch nachádzajúcich sa v bezpečnostnej zóne oddelene manipulovalo so zozbieranými sadivovými zemiakmi a so zemiakmi určenými na konzumáciu; - vykonať úradný prieskum podľa článku 2 (1), (ab) v prípadoch, kedy bola povrchová voda označená za kontaminovanú pod článku 5 1) c) ii), alebo kedy sa na povrchovú vodu prihliada pri stanovovaní možného šírenia škodlivého organizmu podľa bodu 2 prílohy V, - vykonanie každoročného prieskumu vo vhodnom čase vrátane odberu vzoriek povrchovej vody a vhodných hostiteľských rastlín z čeľade ľuľkovitých v dotyčných zdrojoch vody a testov v súlade s: - pre uvedený rastlinný materiál, relevantnou metódou stanovenou v prílohe II, alebo - v ostatných prípadoch, akoukoľvek inou úradne schválenou metódou, - zaviesť úradné kontroly programov zavlažovania a postrekovania vrátane vyhlásenia zákazu zavlažovania a postrekovania uvedeného rastlinného materiálu a, podľa vhodnosti, iných hostiteľských rastlín vodou označenou za kontaminovanú s cieľom zabrániť šíreniu škodlivého organizmu. Takýto zákaz možno potom zvážiť na základe výsledkov uvedeného každoročného prieskumu, - zaviesť v prípade kontaminácie odpadových vôd úradné kontroly zneškodňovania odpadových vôd z prevádzkových priestorov podnikov priemyselného spracovania a balenia, ktoré manipulujú s uvedeným rastlinným materiálom; b) zriadiť podľa potreby program obnovy všetkých sadivových zemiakov počas primeraného časového obdobie. -------------------------------------------------- PRÍLOHA VII Úradne povolené zariadenia na zneškodňovanie odpadov podľa štvrtej zarážky odseku 1 prílohy VI musia dodržiavať nasledujúce ustanovenia, aby sa vylúčilo riziko šírenia škodlivého organizmu: i) odpady zo spracovania zemiakov a rajčiakov (vrátane vyhodených zemiakov, zemiakových šupiek a rajčiakov) ako i iné tuhé odpady spojené s rajčiakmi a zemiakmi musia byť zneškodňované nasledujúcim spôsobom: - hlbokým zahrabaním materiálu do skládok, pri ktorých neexistuje žiadne nebezpečenstvo priesaku na poľnohospodársky využívané plochy alebo do zdrojov vôd, ktoré by mohli byť využívané na zavlažovanie poľnohospodárskej pôdy. Odpad sa musí byť privezť priamo na skládku a byť izolovaný tak, aby sa vylúčilo nebezpečenstvo straty odpadu cestou, alebo - spálením ii) tekutý spracovateľský odpad: pred zneškodnením treba tekutý odpad, ktorý obsahujú nerozpustené látky, prefiltrovať alebo zaviesť do usadzovacej nádrže, aby sa odpad zbavil nerozpustených látok. Tuhé látky, ktoré z tohto procesu vzídu sa musia zneškodniť postupom uvedeným v pododseku (i). Tekutý odpad sa potom buď: - pred vypustením zahreje počas minimálne 30 minút na teplotu minimálne 70 °C, alebo - v súlade s úradným povolením a pod úradným dohľadom inak zneškodní tak, aby sa vylúčilo riziko, že odpad príde do styku s poľnohospodárskou pôdou alebo vodnými zdrojmi, ktoré by sa mohli používať na zavlažovanie poľnohospodárskej pôdy. Podrobnosti o zneškodnení sa oznámia ostatným členským štátom a komisii. --------------------------------------------------