SK Úradný vestník Európskej únie L 88/1

NARIADENIE KOMISIE (ES) č. 273/2008

z 5. marca 2008,

ktorým sa ustanovujú podrobné pravidlá uplatňovania nariadenia Rady (ES) č. 1255/1999 týkajúce sa metód analýzy a hodnotenia kvality mlieka a mliečnych výrobkov

KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV,

so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spoločenstva,

so zreteľom na nariadenie Rady (ES) č. 1255/1999 zo 17. mája 1999 o spoločnej organizácii trhu s mliekom a mliečnymi výrobkami (1), a najmä na jeho články 10 a 15 a článok 26 ods. 3, článok 29 ods. 1 a článok 31 ods. 4,

keďže:

(1) Nariadením Komisie (ES) č. 213/2001 (2) sa ustanovujú podrobné pravidlá uplatňovania nariadenia Rady (ES) č. 1255/1999 týkajúce sa metód analýzy a hodnotenia kvality mlieka a mliečnych výrobkov. Z hľadiska technického rozvoja v oblasti analytickej metodiky treba vykonať ďalšie podstatné zmeny. V záujme jasnosti a efektívnosti a z dôvodu počtu a technického charakteru zmien a doplnení by sa malo nariadenie (ES) č. 213/2001 zrušiť a nahradiť novým nariadením.

(2) Požiadavky na zloženie a kvalitu mlieka a mliečnych výrobkov ustanovené podľa nariadenia (ES) č. 1255/1999 musia byť overené, aby sa zabezpečilo ich dôsledné dodržiavanie.

(3) Referenčné metódy takýchto overovaní sú často metódy, ktoré uverejňujú a pravidelne aktualizujú medzinárodné organizácie, ako sú Európsky výbor pre normalizáciu (CEN), Medzinárodná mliekarenská federácia (IDF), Medzinárodná organizácia pre normalizáciu (ISO) a Medzinárodné vedecké združenie pre dokonalosť analýz (AOAC International), a pravidelne aktualizujú. V niektorých prípadoch sa ustanovuje referenčná metóda Spoločenstva, zatiaľ čo v iných prípadoch pravidlá Spoločenstva referenčnú metódu nešpecifikujú. V snahe zabezpečiť jednotné uplatňovanie referenčných metód treba vypracovať zoznam referenčných metód a ustanoviť povinnosť, že Komisia tento zoznam podľa potreby aktualizuje.

(4) Používanie rutinných metód sa nevylučuje. Preto je potrebné špecifikovať minimálne podmienky ich použitia.

(5) Treba ustanoviť aj bežné metódy na zabezpečenie jednotného postupu hodnotenia výsledkov analýz, senzorického hodnotenia daných výrobkov a prehodnocovania sporných výsledkov.

(6) Pre niektoré analýzy v súčasnosti neexistujú medzinárodne akceptované referenčné metódy, a preto nie sú dostupné žiadne informácie o rozdieloch medzi výsledkami analýz dosiahnutými v rôznych laboratóriách. Preto je potrebné ustanoviť metódy Spoločenstva, ktoré boli overené podľa medzinárodných pravidiel a ktoré by sa mali používať ako referenčné metódy.

(7) Nariadením Komisie (ES) č. 1898/2005 (3) sa ustanovujú podrobné pravidlá vykonávania nariadenia Rady (ES) č. 1255/1999, pokiaľ ide o opatrenia na predaj smotany, masla a koncentrovaného masla na trhu Spoločenstva, a ustanovuje sa za určitých okolností používanie značkovacích látok pri smotane, masle a koncentrovanom masle na zabezpečenie správneho konečného použitia týchto výrobkov. Sledovanie je dôležité na správne fungovanie systému. Na zabezpečenie rovnakého zaobchádzania s hospodárskymi subjetkmi treba ustanoviť spoločné metódy na určovanie niektorých z týchto značkovacích látok.

(8) Podľa článku 9 nariadenia (ES) č. 1255/1999 je možné poskytovať pomoc pre súkromné skladovanie syrov vyrobených z ovčieho mlieka. Podľa článku 31 uvedeného nariadenia je možné poskytnúť na tieto výrobky osobitnú vývoznú náhradu. Syry vyrobené z ovčieho mlieka, kozieho mlieka a byvolieho mlieka a zo zmesí ovčieho, kozieho a byvolieho mlieka je možné dovážať do Spoločenstva z niektorých tretích krajín podľa preferenčných dohôd. Vzhľadom na uvedené ustanovenia sú potrebné vhodné kontroly, ktorými sa zaručí, že dané výrobky neobsahujú kravské mlieko. Je preto potrebné ustanoviť referenčnú metódu Spoločenstva na zisťovanie kravského mlieka bez toho, aby bolo dotknuté používanie rutinných metód, ak tieto spĺňajú určité kritériá.

(9) Podľa nariadenia Komisie (EHS) č. 2921/90 z 10. októbra 1990 o pomoci pre výrobu kazeínu a kazeinátov z odstredeného mlieka (4) treba zisťovať neprítomnosť koliforiem. Medzinárodne uznávanou referenčnou metódou na zisťovanie koliforiem v mlieku a mliečnych výrobkoch je ISO 4831. Na základe uvedenej normy sa ustanovila referenčná metóda Spoločenstva na zisťovanie koliforiem.

(10) Nariadením Rady (EHS) č. 2658/87 z 23. júla 1987 o colnej a štatistickej nomenklatúre a o Spoločnom colnom sadzobníku (5) sa stanovujú rôzne výšky cla pre kŕmne zmesi patriace do položky colného sadzobníka č. 2309 v závislosti od ich obsahu mlieka. Na zabezpečenie jednotného uplatňovania uvedených pravidiel je potrebné ustanoviť všeobecne uznávanú metódu analýzy obsahu laktózy určenú na povinné používanie vo všetkých členských štátoch.

(11) Podľa nariadenia (ES) č. 1255/1999 maslo a sušené odstredené mlieko určené na intervenciu alebo v prípade sušeného odstredeného mlieka určené na použitie ako krmivo pre zvieratá musí spĺňať určité požiadavky kvality. Je potrebné ustanoviť referenčné metódy na overenie plnenia týchto požiadaviek.

(12) Niektoré metódy sú v tomto nariadení uvedené po prvýkrát. Na správne zavedenie a používanie týchto metód treba poskytnúť laboratóriám dostatočne dlhý čas od nadobudnutia platnosti tohto nariadenia pred ich povinným používaním. Kedykoľvek normalizačná organizácia zreviduje a zverejní referenčnú metódu uvedenú v prílohe I, laboratóriá majú na aktualizáciu svojich analytických postupov podľa novej normy šesť mesiacov.

(13) Opatrenia uvedené v tomto nariadení sú v súlade so stanoviskom Riadiaceho výboru pre mlieko a mliečnej výrobky,

PRIJALA TOTO NARIADENIE:

KAPITOLA 1

VŠEOBECNÉ USTANOVENIA

Článok 1

Predmet a rozsah pôsobnosti

1. Týmto nariadením sa ustanovujú určité referenčné metódy chemickej, fyzikálnej a mikrobiologickej analýzy a senzorického hodnotenia mlieka a mliečnych výrobkov, ktoré sa budú používať podľa úprav ustanovených v rámci spoločnej organizácii trhu s mliekom a mliečnymi výrobkami zavedenej nariadením (ES) č. 1255/1999 a pravidiel uplatňovania týchto metód.

2. Zoznam referenčných metód uplatniteľných na analýzy uvedené v odseku 1 sa uvádza v prílohe I k tomuto nariadeniu.

3. Komisia aktualizuje zoznam v súlade s postupom uvedeným v článku 42 nariadenia (ES) č. 1255/1999.

Článok 2

Rutinné metódy

Rutinné metódy je možné používať na analýzy požadované pravidlami Spoločenstva za predpokladu, že musia spĺňať rovnaké kritériá ako referenčná metóda a že sa pravidelne kontrolujú porovnávaním s referenčnou metódou. Výsledky sa porovnávajú so zreteľom na opakujúcu sa chybu, opakovateľnosť a reprodukovateľnosť.

V sporných prípadoch sú rozhodujúce výsledky získané referenčnou metódou.

Členské štáty informujú Komisiu o používaní rutinných metód analýzy uvedených v článku 1.

KAPITOLA II

METÓDY ANALÝZY

Článok 3

Hodnotenie súladu zásielky so zákonným limitom

Príloha II k tomuto nariadeniu sa používa na účely zistenia súladu so zákonnými požiadavkami na zloženie s výnimkou analýzy značkovacích látok.

Článok 4

Senzorické hodnotenie

1. Pre mlieko a mliečne výrobky s výnimkou masla určeného na verejné skladovanie je referenčnou metódou, ktorú majú členské štáty používať na senzorické hodnotenie, buď norma IDF 99C:1997, alebo iné porovnateľné metódy, ktoré členské štáty oznámia Komisii.

Postupy opísané v prílohe III sa používajú na kontrolu výkonu hodnotiteľov a spoľahlivosť výsledkov senzorických analýz.

2. V prípade masla určeného na verejné skladovanie sa uplatňujú postupy kontroly výkonu hodnotiteľov a spoľahlivosti výsledkov opísané v prílohe III.

Postup ustanovený v prílohe IV sa uplatňuje ako referenčná metóda pre senzorické hodnotenie.

Článok 5

Značkovacie látky

1. Metóda analýzy ustanovená v prílohe V sa používa ako referenčná metóda na určovanie obsahu triglyceridov kyseliny heptánovej v masle, maslovom oleji a smotane.

2. Ako referenčná metóda na určovanie obsahu vanilínu v koncentrovanom masle, masle a smotane sa používa metóda analýzy ustanovená v prílohe VI.

3. Ako referenčná metóda na určovanie obsahu etyl-esteru kyseliny beta-apo-8' karoténovej v koncentrovanom masle a masle sa používa metóda analýzy ustanovená v prílohe VII.

4. Ako referenčná metóda na určovanie obsahu β-sitosterolu alebo stigmasterolu v masle a koncentrovanom masle sa používa metóda analýzy ustanovená v prílohe VIII.

5. Koncentrované maslo, maslo a smotana sa považujú za značkované podľa príslušných pravidiel Spoločenstva, ak sú získané výsledky v súlade so špecifikáciami bodov 10 a 11 prílohy V a bodu 8 príloh VI, VII a VIII.

Článok 6

Zisťovanie kazeínu z kravského mlieka

1. Na overenie toho, že syr, ktorý musí byť vyrobený výlučne z ovčieho mlieka, kozieho mlieka alebo byvolieho mlieka, alebo zo zmesi ovčieho, kozieho a byvolieho mlieka, neobsahuje kazeín z kravského mlieka, sa používa referenčná metóda analýzy ustanovená v prílohe IX.

Prítomnosť kazeínu z kravského mlieka sa potvrdí, ak je obsah kazeínu z kravského mlieka v analyzovanej vzorke rovnaký alebo vyšší ako obsah v referenčnej vzorke obsahujúcej 1 % kravského mlieka, ako sa ustanovuje v prílohe IX.

2. Na zisťovanie kazeínu z kravského mlieka v syroch uvedených odseku 1 je možné použiť rutinné metódy, ak:

a) je detekčný limit max. 0,5 % a

b) neexistujú žiadne nesprávne pozitívne výsledky;

c) kazeín z kravského mlieka je zistiteľný s požadovanou citlivosťou aj po dlhých dobách zrenia, ku ktorým môže dôjsť v bežných obchodných podmienkach.

Ak nie je splnená niektorá z uvedených požiadaviek, použijú sa referenčné metódy ustanovené v prílohe IX.

Článok 7

Zisťovanie koliforiem

Koliformy v masle, sušenom odstredenom mlieku, kazeíne a kazeinátoch sa zisťujú v súlade s referenčnou metódou ustanovenou v prílohe X.

Článok 8

Stanovenie obsahu laktózy

Obsah laktózy vo výrobkoch patriacich pod číselný znak KN 2309 sa určuje v súlade s referenčnou metódou ustanovenou v prílohe XI.

Článok 9

Zisťovanie syridlovej srvátky

1. Syridlová srvátka v sušenom odstredenom mlieku určenom na verejné skladovanie sa zisťuje v súlade s referenčnou metódou ustanovenou v prílohe XII.

2. Syridlová srvátka v sušenom odstredenom mlieku a v zmesiach určených na použitie ako krmivo pre zvieratá sa zisťuje v súlade s metódou ustanovenou v prílohe XII. V prípade zisťovania syridlovej srvátky by sa mali uplatniť ustanovenia v prílohe XIII.

Článok 10

Zisťovanie cmaru

Cmar v sušenom odstredenom mlieku sa zisťuje v súlade s referenčnou metódou ustanovenou v prílohe XIV.

Článok 11

Zisťovanie antimikrobiotických rezíduí

Antimikrobiotické rezíduá v sušenom odstredenom mlieku sa zisťujú v súlade s referenčnou metódou ustanovenou v prílohe XV.

Článok 12

Zisťovanie obsahu sušeného odstredeného mlieka

Obsah sušeného odstredeného mlieka v kŕmnych zmesiach sa zisťuje v súlade s referenčnou metódou ustanovenou v prílohe XVI.

Článok 13

Zisťovanie škrobu

Škrob v sušenom odstredenom mlieku, denaturovanom mliečnom prášku a kŕmnych zmesiach sa zisťuje v súlade s referenčnou metódou ustanovenou v prílohe XVII.

Článok 14

Určovanie obsahu vlhkosti v sušenej smotane

Obsah vlhkosti v sušenej smotane sa zisťuje v súlade s referenčnou metódou ustanovenou v prílohe XVIII.

Článok 15

Určovanie obsahu vlhkosti kyslého sušeného cmaru

Obsah vlhkosti kyslého cmaru v prášku určeného na použitie v kŕmnych zmesiach sa určuje v súlade s referenčnou metódou ustanovenou v prílohe XIX.

Článok 16

Určovanie čistoty mliečneho tuku

Čistota mliečneho tuku sa určuje v súlade s referenčnou metódou ustanovenou v prílohe XX.

KAPITOLA III

VŠEOBECNÉ A ZÁVEREČNÉ USTANOVENIA

Článok 17

Zabezpečenie kvality

Analýzy sa vykonávajú v laboratóriách, ktoré majú analytický systém zaistenia kvality vrátane interných postupov kontroly kvality. Neakreditované laboratóriá sa zúčastňujú systémov preskúšania odbornosti aspoň raz do roka a ich výsledky sa nesmú odchyľovať o viac ako 2σ R (štandardná odchýlka reprodukovateľnosti referenčnej metódy) od konvenčnej hodnoty. Podrobný opis používaných systémov je k dispozícii k nahliadnutiu v laboratóriu.

Laboratóriá, ktoré sú akreditované v súlade s normami uvedenými v článku 12 nariadenia Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 882/2004 z 29. apríla 2004 o úradných kontrolách uskutočňovaných s cieľom zabezpečiť overenie dodržiavania potravinového a krmivového práva a predpisov o zdraví zvierat a starostlivosti o zvieratá (6), sú vyňaté z povinnosti zúčastňovať sa preskúšania odbornosti.

Článok 18

Odber vzoriek a spory o výsledkoch analýz

1. Vzorky sa odoberajú v súlade s príslušným nariadením vzťahujúcim sa na posudzovaný výrobok. Ak nie sú uvedené ustanovenia o odbere vzoriek, používajú sa ustanovenia uvedené v ISO 707 | IDF 50, Mlieko a mliečne výrobky – návod na odber vzoriek.

2. Laboratórne správy o výsledkoch analýz musia obsahovať dostatočné informácie na vyhodnotenie výsledkov, ktoré sa vykoná v súlade s prílohami II a XXI.

3. Na analýzy požadované podľa pravidiel Spoločenstva sa odoberajú dvojité vzorky.

4. Postup opísaný v prílohe XXI sa použije v prípadoch, keď hospodársky subjekt neakceptuje výsledky analýzy.

5. Ak môže hospodársky subjekt do piatich pracovných dní od odberu vzorky dokázať, že postup odberu vzorky sa neuskutočnil správne, odber vzorky treba podľa možnosti zopakovať. Ak sa odber vzorky nemôže zopakovať, zásielka sa musí akceptovať.

Článok 19

Prechodné obdobie

Hodnotenie súladu podľa prílohy II k tomuto nariadeniu sa vykoná do 12 mesiacov po tom, ako nariadenie nadobudne účinnosť. Členské štáty v prípade potreby bezodkladne informujú Komisiu, ak sa počas tohto obdobia vyskytne podstatnejší problém s postupom štatistickej kontroly.

Článok 20

Zrušenia

Nariadenie (ES) č. 213/2001 sa zrušuje.

Odkazy na zrušené nariadenia sa vykladajú ako odkazy na toto nariadenie a čítajú sa v súlade s tabuľkou zhody v prílohe XXII.

Článok 21

Nadobudnutie účinnosti

Toto nariadenie nadobúda účinnosť tretím dňom po jeho uverejnení v Úradnom vestníku Európskej únie.

Uplatňuje sa od 31. marca 2008.

Toto nariadenie je záväzné v celom rozsahu a priamo uplatniteľné vo všetkých členských štátoch. V Bruseli 5. marca 2008 Za Komisiu Mariann FISCHER BOEL členka Komisie

(1) Ú. v. ES L 160, 26.6.1999, s. 48. Nariadenie naposledy zmenené a doplnené nariadením (ES) č. 1152/2007 (Ú. v. EÚ L 258, 4.10.2007, s. 3). Nariadenie (ES) č. 1255/1999 sa nahrádza nariadením (ES) č. 1234/2007 (Ú. v. EÚ L 299, 16.11.2007, s. 1) s účinnosťou od 1. júla 2008.

(2) Ú. v. ES L 37, 7.2.2001, s. 1.

(3) Ú. v. EÚ L 308, 25.11.2005, s. 1. Nariadenie naposledy zmenené a doplnené nariadením (ES) č. 1546/2007 (Ú. v. EÚ L 337, 21.12.2007, s. 68).

(4) Ú. v. ES L 279, 11.10.1990, s. 22. Nariadenie naposledy zmenené a doplnené nariadením (ES) č. 1487/2006 (Ú. v. EÚ L 278, 10.10.2006, s. 8).

(5) Ú. v. ES L 256, 7.9.1987, s. 1. Nariadenie naposledy zmenené a doplnené nariadením Komisie (ES) č. 1352/2007 (Ú. v. EÚ L 303, 21.11. 2007, s. 3).

(6) Ú. v. EÚ L 165, 30.4.2004, s. 1.

PRÍLOHA I (Článok 1) ZOZNAM REFERENČNÝCH METÓD Index min. = minimum, max. = maximum, príloha = príloha k citovanému nariadeniu, NS = netučná sušina, HP = hodnota peroxidu, V = vzhľad, Ch = chuť, K = konzistencia, CPB = celkový počet baktérií, Term = termofilický počet baktérií, ČŠ = členský štát, IDF = Medzinárodná federácia pre mliečne výrobky, ISO = Medzinárodná normalizačná organizácia, IUPAC = Medzinárodná únia čistej a aplikovanej chémie, ADPI = Americký inštitút pre mliečne výrobky, SKM = sladené kondenzované mlieko, VMS = vyparené mlieko alebo smotana ČASŤ A Nariadenie Komisie Výrobok Parameter Limit (1) Referenčná metóda Poznámka nariadenie (ES) č. 2771/1999 – verejné skladovanie nesolené maslo tuk min. 82 % m/m ISO 17189:2003|IDF 194:2003 voda až do 16 % m/m ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001 NS až do 2 % m/m ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001 kyslosť tuku 1,2 mmol/100 g tuku ISO 1740:2004|IDF 6:2004 HP (max.) 0,3 meq. kyslíka/1 000 g tuku ISO 3976:2006|IDF 74:2006 poznámka 1 koliformy nezistiteľné v 1 g príloha X poznámka 3 nemliečny tuk nezistiteľné analýzou triglyceridov príloha XX sterolové značkovacie látky nezistiteľné, β-sitosterol ≤ 40 mg/kg príloha VIII Ostatné značkovacie látky — vanilín nezistiteľné príloha VI — etyl-ester kyseliny karoténovej ≤ 6 mg/kg príloha VII — triglyceridy kyseliny heptánovej nezistiteľné príloha V senzorické vlastnosti najmenej 4 z 5 bodov pre V, Ch a K príloha IV disperzia vody najmenej 4 body ISO 7586:1985-IDF 112A:1989 nariadenie (ES) č. 2771/1999 – súkromné skladovanie nesolené maslo tuk min. 82 % m/m ISO 17189:2003|IDF 194:2003 voda až do 16 % m/m ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001 NS až do 2 % m/m ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001 nariadenie (ES) č. 2771/1999 – súkromné skladovanie solené maslo tuk min. 80 % m/m ISO 17189:2003|IDF 194:2003 voda až do 16 % m/m ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001 NS (okrem soli) až do 2 % m/m ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001 soľ až do 2 % m/m ISO 15648:2004|IDF 179:2004 nariadenie (ES) č. 1898/2005 kapitola II nesolené maslo tuk min. 82 % m/m ISO 17189:2003|IDF 194:2003 nemliečny tuk Príloha XX voda až do 16 % m/m ISO 3727-1 2001|IDF 80-1:2001 NS až do 2 % m/m ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001 Značkovacie látky: — steroly pozri prílohu VIII príloha VIII — vanilín pozri prílohu VI príloha VI — etyl-ester kyseliny karoténovej pozri prílohu VII príloha VII — triglyceridy kyseliny heptánovej pozri prílohu V príloha V nariadenie (ES) č. 1898/2005 kapitola II solené maslo tuk min. 80 % m/m ISO 17189:2003|IDF 194:2003 nemliečny tuk Príloha XX voda až do 16 % m/m ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001 NS (okrem soli) až do 2 % m/m ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001 soľ až do 2 % m/m ISO 15648:2004|IDF 179:2004 Značkovacie látky: — steroly pozri prílohu VIII príloha VIII — vanillín pozri prílohu VI príloha VI — etyl-ester kyseliny karoténovej pozri prílohu VII príloha VII — triglyceridy kyseliny heptánovej pozri prílohu V príloha V nariadenie (ES) č. 1898/2005 kapitola II koncentrované maslo tuk min. 99,8 % m/m IDF 24:1964 voda a ns až do 0,2 % m/m ISO 5536:2002|IDF 23:2002 (vlhkosť) IDF 24:1964 (NS) kyslosť tuku 1,2 mmol/100 g tuku ISO 1740:2004|IDF 6:2004 HP (max.) 0,5 meq. kyslíka/1 000 g tuku ISO 3976:2006|IDF 74:2006 Poznámka 1 nemliečny tuk neprítomný príloha XX chuť čistá zápach bez cudzieho zápachu iné bez neutralizačných činidiel, antioxidantov a konzervačných látok Značkovacie látky — steroly pozri prílohu VIII príloha VIII — vanillín pozri prílohu VI príloha VI — etyl-ester kyseliny karoténovej pozri prílohu VII príloha VII — triglyceridy kyseliny heptánovej pozri prílohu V príloha V nariadenie (ES) č. 1898/2005 kapitola II smotana tuk minimum 35 % m/m ISO 2450:1999 – IDF 16 C:1987 nemliečny tuk príloha XX Značkovacie látky: — steroly pozri prílohu VIII poznámka 2 — vanilín pozri prílohu VI príloha VI — etyl-ester kyseliny karoténovej pozri prílohu VII poznámka 2 — triglyceridy kyseliny heptánovej pozri prílohu V príloha V nariadenie (ES) č. 1898/2005 kapitola III koncentrované maslo tuk min. 96 % m/m poznámka 2 nemliečny tuk príloha XX NS až do 2 % m/m poznámka 2 Značkovacie látky: — stigmasterol (95 % m/m) 15 g/100 kg koncentrovaného masla príloha VIII — stigmasterol (85 % m/m) 17 g/100 kg koncentrovaného masla príloha VIII — triglyceridy kyseliny heptánovej 10,34 kg/t koncentrovaného masla príloha V — etyl-ester kyseliny maslovej a stigmasterol — etyl-ester kyseliny maslovej — stigmasterol: príloha VIII poznámka 2 — etyl-ester kyseliny maslovej a triglyceridy kyseliny heptánovej — etyl-ester kyseliny maslovej — triglyceridy kyseliny heptánovej: príloha V poznámka 2 lecitín (E 322) až do 0,5 % m/m poznámka 2 NaC1 až do 0,75 % m/m ISO 15648:2004|IDF 179:2004 kyslosť tuku 1,2 mmol/100 g tuku ISO 1740:2004|IDF 6:2004 HP (max.) až do 0,5 meq. kyslíka/1 000 g tuku ISO 3976:2006|IDF 74:2006 poznámka 1 chuť čistá pach bez cudzieho zápachu iné neprítomnosť neutralizačných činidiel, antioxidantov a konzervačných látok Nariadenie (ES) č. 1898/2005 kapitola IV nesolené maslo tuk min. 82 % m/m ISO 17189:2003|IDF 194:2003 voda až do 16 % m/m ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001 NS až do 2 % m/m ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001 nariadenie (ES) č. 1898/2005 kapitola IV solené maslo tuk min. 80 % m/m ISO 17189:2003|IDF 194:2003 voda až do 16 % m/m ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001 NS (okrem soli) až do 2 % m/m ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001 soľ až do 2 % m/m ISO 15648:2004|IDF 179:2004 článok 9 a hlava II nariadenia (ES) č. 1255/1999 syr vyrábaný z ovčieho a/alebo kozieho mlieka kravské mlieko < 1 % m/m príloha IX Nariadenie (EHS) č. 2921/90 príloha I – Kyslý kazeín voda až do 12,00 % m/m ISO 5550:2006|IDF 78:2006 tuk až do 1,75 % m/m ISO 5543:2004|IDF127:2004 voľné kyseliny až do 0,30 ml roztoku 0,1 N NaOH/g ISO 5547:1978 – IDF 91:1979 nariadenie (EHS) č. 2921/90 príloha I – Syridlový kazeín voda až do 12,00 % m/m ISO 5550:2006|IDF 78:2006 tuk až do 1,00 % m/m ISO 5543:2004|IDF 127:2004 popol min. 7,50 % m/m ISO 5545:1978 – IDF 90:1979 nariadenie (EHS) č. 2921/90 príloha I – Kazeináty voda až do 6,00 % m/m ISO 5550:2006|IDF 78:2006 mliečny proteín min. 88,00 % m/m ISO 5549:1978 – IDF 92:1979 tuk a popol až do 6,00 % m/m ISO 5543:2004|IDF 127:2004 viazaný popol ISO 5544:1978 – IDF 89:1979 popol ISO 5545:1978 – IDF 90:1979 nariadenie (EHS) č. 2921/90 príloha II – Kyslý kazeín voda až do 10,00 % m/m ISO 5550:2006|IDF 78:2006 tuk až do 1,50 % m/m ISO 5543:2004|IDF 127:2004 voľné kyseliny až do 0,20 ml roztoku 0,1 N NaOH /g ISO 5547:1978 – IDF 91:1979 CPB (max.) 30 000/ g ISO 4833:2003 poznámka 3 koliformy neprítomné v 0,1 g príloha X poznámka 3 term. (max.) 5 000/ g ISO 4833:2003 poznámky 3 a 4 nariadenie (EHS) č. 2921/90 príloha II – Syridlový kazeín voda až do 8,00 % m/m ISO 5550:2006|IDF 78:2006 tuk až do 1,00 % m/m ISO 5543:2004|IDF 127:2004 popol min. 7,50 % m/m ISO 5545:1978 – IDF 90:1979 CPB (max.) 30 000/ g ISO 4833:2003 poznámka 3 koliformy neprítomné v 0,1 g príloha X poznámka 3 term. (max.) 5 000/ g ISO 4833:2003 poznámky 3 a 4 nariadenie (EHS) č. 2921/90 príloha II – Kazeináty voda až do 6,00 % m/m ISO 5550:2006|IDF 78:2006 mliečny proteín min. 88,00 % m/m ISO 5549:1978 – IDF 92:1979 tuk a popol až do 6,00 % m/m ISO 5543:2004|IDF 127:2004 ISO 5544:1978 – IDF 89:1979 or ISO 5545:1978 – IDF 90:1979 CPB (max.) 30 000/ g ISO 4833:2003 poznámka 3 koliformy neprítomné v 0,1 g príloha X poznámka 3 term. (max.) 5 000/g ISO 4833:2003 poznámky 3 a 4 nariadenie (EHS) č. 2921/90 príloha III – Kazeináty voda až do 6,00 % m/m ISO 5550:2006|IDF 78:2006 mliečne proteíny min. 85,00 % m/m ISO 5549:1978 – IDF 92:1979 tuk až do 1,50 % m/m ISO 5543:2004|IDF 127:2004 laktóza až do 1,00 % m/m ISO 5548:2004|IDF 106:2004 popol až do 6,50 % m/m ISO 5544:1978 – IDF 89:1979 alebo ISO 5545:1978 – IDF 90:1979 CPB (max.) 30 000/ g ISO 4833:2003 poznámka 3 koliformy neprítomné v 0,1 g príloha X poznámka 3 term. (max.) 5 000/ g ISO 4833:2003 poznámky 3 a 4 nariadenie (ES) č. 2799/1999 kŕmne zmesi a odstredené sušené mlieko (OSM) (na použitie v krmivách) voda (kyslý sušený cmar) až do 5 % m/m príloha XIX proteín 31,4 % m/m (min.) netučnej sušiny ISO 8968-1|2|3:2001|IDF 20-1|2|3:2001 voda (OSM) až do 5 % m/m ISO 5537:2004|IDF 26:2004 tuky (OSM) až do 11 % m/m ISO 1736:2000 – IDF 9C:1987 syridlová srvátka (OSM) neprítomná príloha XIII poznámka 6 škrob (OSM) neprítomná príloha XVII voda (zmesi) až do 5 % m/m netučnej látky ISO 5537:2004|IDF 26:2004 tuk (zmesi) smernica Komisie 84/4/EHS (Ú. v. ES L 15, 18.1.1984, s. 29) syridlová srvátka (zmesi) neprítomná príloha XIII obsah OSM (v konečnom výrobku) min. 50 % m/m príloha XVI tuk (v konečnom výrobku) min. 2,5 % m/m alebo 5 % m/m smernica Komisie 84/4/EHS (Ú. v. ES L 15, 18.1.1984, s. 29) poznámka 7 škrob (v konečnom výrobku) min. 2 % m/m príloha XVII poznámka 8 meď (v konečnom výrobku) 25 ppm smernica Komisie 78/633/EHS (Ú. v. ES L 206, 26.7.1987, s. 43) nariadenie (ES) č. 214/2001 OSM (sprej) tuk až do 1,0 % m/m ISO 1736:2000 – IDF 9C:1987 proteín 31,4 % (2)m/m (min.) netučnej sušiny ISO 8968-1/2:2001|IDF 20-1/2:2001 voda až do 3,5 % m/m ISO 5537:2004|IDF 26:2004 kyslosť až do 19,5 ml, 0,1N NaOH, 10 g netučnej sušiny ISO 6091:1980 – IDF 86:1981 laktáty až do 150 mg/100 g netučnej sušiny ISO 8069:2005|IDF 69:2005 fosfatáza negatívna ISO 11816-1:2006|IDF 155-1:2006 index nerozpustnosti až do 0,5 ml pri 24 °C ISO 8156:2005|IDF 129:2005 pripálené častice disk A alebo B (15,0 mg) ADPI (1990) CPB 40 000/ g ISO 4833:2003 poznámka 3 koliformy negatívne/0,1 g príloha X poznámka 3 cmar negatívne príloha XIV syridlová srvátka negatívne príloha XII kyslá srvátka negatívne poznámka 2 antimikrobiálne činitele príloha XV

ČASŤ B Referenčné metódy uvedené v časti B sa môžu uplatniť na analýzu výrobkov, ktorých sa týkajú nariadenia uvedené v stĺpci 1. Nariadenie Komisie Výrobok Číselný znak KN Parameter Limit Referenčná metóda Poznámka nariadenie (EHS) č. 2658/87 nariadenie (ES) č. 2535/2001 nariadenie (ES) č. 1282/2006 mlieko a smotana, nekoncentrované bez obsahu pridaného cukru alebo iného sladidla 0401 tuk (≤ 6 % m/m) limity sú uvedené v opise kódu KN pre konkrétny výrobok, v príslušných prípadoch ďalej definované v nariadení Komisie (EHS) č. 3846/87 (Ú. v. ES L 366, 24.12.1987, s. 1), časť 9 exportnej nomenklatúry, alebo v nariadení (ES) č. 2535/2001 (Ú. v. ES L 341, 22.12.2001, s. 29) ISO 1211:2001 – IDF 1D:1996 tuk (> 6 % m/m) ISO 2450:1999 – IDF 16C:1987 mlieko a smotana, koncentrované alebo obsahujúce pridaný cukor alebo sladidlo 0402 tuk (v tekutej forme) ISO 1737:1999 – IDF 13C:1987 tuk (v tuhej forme) ISO 1736:2000 – IDF 9C:1987 proteín ISO 8968-1|2|3:2001|IDF 20-1|2|3:2001 sacharóza (normálny obsah) ISO 2911:2004| IDF 35:2004 sacharóza (nízky obsah) poznámka 2 sušina (SKM) ISO 6734:1989 – IDF 15B:1991 sušina (VMS) ISO 6731:1989 – IDF 21B:1987 voda (sušené mlieko) ISO 5537:2004/IDF 26:2004 voda (sušená smotana) príloha XVIII cmar, fermentované alebo acidofilné mlieko a smotana, koncentrované alebo nekoncentrované, obsahujúce pridaný cukor alebo iné sladidlo 0403 tuk ISO 1211:2001 – IDF 1D:1996 ISO 1736:2000 – IDF 9C:1987 ISO 2450:1999 – IDF 16 C:1987 ISO 7208:1999 – IDF 22B:1987 ISO 8262 – 3:2005 – IDF 124 – 3:2005 proteín ISO 8968-1|2|3:2001|IDF 20-1|2|3:2001 sacharóza (normálny obsah) ISO 2911:2004|IDF 35:2004 sacharóza (nízky obsah) poznámka 2 voda (kyslý sušený cmar) príloha XIX voda (sladký sušený cmar) ISO 5537:2004|IDF 26:2004 sušina (iné výrobky) metódy schválené príslušným orgánom srvátka, koncentrovaná alebo nekoncentrovaná, alebo obsahujúca či neobsahujúca pridaný cukor alebo iné sladidlo; výrobky z prírodných mliečnych zložiek 0404 tuk ISO 1736:2000 – IDF 9C:1987 ISO 2450:1999 – IDF 16C:1987 ISO 7208:1999 – IDF 22B:1987 proteín ISO 8968-1|2|3:2001|IDF 20-1|2|3:2001 sacharóza (normálny obsah) ISO 2911:2004|IDF 35:2004 sacharóza (nízky obsah) poznámka 2 0404 90 proteín ISO 8968 1/2 2001|IDF 20-1/2:2001 voda IDF 21B:1987 sušina ISO 6734:1989 – IDF 15B:1991 (koncentrované výrobky) ISO 6731:1989 – IDF 21B:1987 maslo a iné mliečne tuky; nátierky z mliečnych výrobkov 0405 tuk (ak ≤ 85 % m/m) ISO 17189:2003|IDF 194:2003 maslo voda ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001 NS ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001 NaCl ISO 15648:2004|IDF 179:2004 tuk (ak > 99 % m/m) IDF 24:1964 maslový olej voda (ak je tuk < 99 % m/m) ISO 5536:2002|IDF 23:2002 syr a tvaroh 0406 tuk ISO 1735:2004|IDF 5:2004 sušina ISO 5534:2004|IDF 4:2004 sušina (Ricotta) ISO 2920:2004|IDF 58:2004 NaCl ISO 5943:2006|IDF 88:2006 laktóza ISO 5765-1/2:2002|IDF 79-1/2:2002 nariadenie (EHS) č. 2658/87 kŕmne zmesi 2309 laktóza príloha XI Poznámky k zoznamu referenčných metód Európskej únie Poznámka 1: Izolovanie mliečneho tuku podľa opisu v ISO 1740:1991 (chrániť pred svetlom). Poznámka 2: Nebola ustanovená žiadna referenčná metóda. Metódy schválil príslušný orgán. Poznámka 3: Vzorky treba pripraviť podľa ISO 8261:2001|IDF 122:2001. Poznámka 4: Inkubačná doba je 48 hodín pri teplote 55 °C, pozor, aby kultúra nevyschla. Poznámka 5: % m/m NS = % m/m sušiny – % m/m tuku. Poznámka 6: Smernica Komisie 84/4/EHS. Poznámka 7: Nariadenie Komisie (ES) č. 2799/1999 (Ú. v. ES L 340, 31.12.1999, s. 3 – 27). Poznámka 8: Smernica Komisie 78/633/EHS. (1) Bez toho, aby boli dotknuté požiadavky v osobitnom nariadení. (2) Minimálny obsah proteínov od 1. septembra 2009 bude 34 %.

PRÍLOHA II (Článok 3) HODNOTENIE SÚLADU ZÁSIELKY SO ZÁKONNÝM LIMITOM 1. PRINCÍP V prípadoch, kde sú podrobné postupy odberu vzoriek ustanovené v príslušných právnych predpisoch, sa tieto postupy dodržiavajú. Vo všetkých ostatných prípadoch sa zo zásielky predloženej na kontrolu použije vzorka najmenej troch náhodne odobraných častí vzorky. Možno pripraviť vzorku pozostávajúcu z viacerých jednotlivých častí. Získaný výsledok sa porovnáva so zákonnými limitnými hodnotami výpočtom 95 % intervalu spoľahlivosti ako 2 x štandardná odchýlka, pričom príslušná štandardná odchýlka závisí od toho, či 1. je metóda overená v medzinárodnej spolupráci s hodnotami pre σr a σR, alebo 2. je vypočítaná interná reprodukovateľnosť v prípade interného overovania. Tento interval spoľahlivosti sa potom rovná výsledku neistoty merania. 2. METÓDA JE OVERENÁ PROSTREDNÍCTVOM MEDZINÁRODNEJ SPOLUPRÁCE V tomto prípade sa stanovila štandardná odchýlka opakovateľnosti σr a štandardná odchýlka reprodukovateľnosti σR a laboratórium môže preukázať zhodu s výkonnostnými charakteristikami overenej metódy. Vypočítajte aritmetický priemer opakovaných meraní n. Vypočítajte rozšírenú neistotu (k = 2) ako Ak sa konečný výsledok x merania vypočíta podľa vzorca v tvare x = y 1 + y 2, x = y 1 – y 2, x = y 1 · y 2 alebo x = y 1 / y 2, treba dodržiavať zvyčajné postupy kombinovania štandardných odchýlok v takýchto prípadoch. Zásielka nie je v súlade s horným zákonným limitom UL, ak , inak sa posudzuje ako v súlade s UL. Zásielka nie je v súlade so spodným zákonným limitom LL, ak , inak sa posudzuje ako v súlade s LL. 3. INTERNÉ OVEROVANIE S VÝPOČTOM ŠTANDARDNEJ ODCHÝLKY INTERNEJ REPRODUKOVATEĽNOSTI V prípadoch, v ktorých sa používajú metódy, ktoré nie sú tomto nariadení vymedzené, a neustanovili sa presné kritériá, treba vykonať internú validáciu. Vo vzorci na výpočet rozšírenej neistoty U treba namiesto σr a σ R použiť štandardnú odchýlku internej opakovateľnosti sir a štandardnú odchýlku internej reprodukovateľnosti siR . Rozhodujúce pravidlá sú uvedené v bode 1. Ak však zásielka nie je v súlade so zákonným limitom, meranie treba zopakovať metódou uvedenou v tomto nariadení a dospieť k rozhodnutiu podľa bodu 1.

PRÍLOHA III (Článok 4) HODNOTENIE HODNOTITEĽOV A SPOĽAHLIVOSŤ VÝSLEDKOV V SENZORICKÝCH ANALÝZACH Pri použití bodovacích metód (norma IDF 99C:1997) sa uplatňujú tieto postupy. A. STANOVENIE „INDEXU OPAKOVATEĽNOSTI“ Hodnotiteľ v období 12 mesiacov vykoná na desiatich dvojitých vzorkách slepé skúšky. Tieto analýzy sa zvyčajne uskutočňujú v rozličných časoch. Výsledky pre jednotlivé vlastnosti výrobku sa hodnotia použitím nasledujucého vzorca: pričom wI : index opakovateľnosti xi1 : body za prvé hodnotenie vzorky xi xi2 : body za druhé hodnotenie vzorky xi n : počet vzoriek Vzorky, ktoré sa hodnotia, by mali zahŕňať širokú škálu kvality. 1 by nemalo prekročiť hodnotu 1,5 (5-bodovej stupnice). B. URČOVANIE „INDEXU ODCHÝLKY“ Tento index sa používa na kontrolu, či hodnotiteľ používa rovnakú stupnicu na hodnotenie kvality ako skúsená skupina expertov. Body získané hodnotiteľom sa porovnajú s priemerom bodov získaných skupinou expertov. Na hodnotenie výsledkov sa používa tento vzorec: pričom xi1; xi2 : pozri oddiel (A) ; : priemerný počet bodov skupiny expertov za prvé a druhé hodnotenie vzorky xi n : počet vzoriek (najmenej desať za 12 mesiacov) Vzorky, ktoré sa hodnotia, by mali zahŕňať širokú škálu kvality. D1 by nemalo prekročiť hodnotu 1,5 (5 bodové stupnice). Členské štáty musia oznámiť akékoľvek ťažkosti spojené s uplatňovaním tohto postupu. Ak sa zistí, že jednotliví hodnotitelia prekročili 1,5-bodový limit pre indexy odchýlky alebo opakovateľnosti, expert/experti úradného orgánu musia v niekoľkých nasledujúcich týždňoch vykonať jednu alebo viacero náhodných „opakovane vykonaných“ kontrol vzoriek alebo vykonať jednu kontrolu alebo viac „sprievodných“ kontrol s týmito hodnotiteľmi. Prísne monitorovanie je nevyhnutné na rozhodnutie, či využívať ich služby aj naďalej. Nálezy by sa mali zdokumentovať a zachovať ako dôkaz následne podniknutých krokov. C. POROVNANIE VÝSLEDKOV ZÍSKANÝCH V RÔZNYCH REGIÓNOCH ČLENSKÉHO ŠTÁTU A V RÔZNYCH ČLENSKÝCH ŠTÁTOCH Ak je to vhodné, najmenej jedenkrát za rok je potrebné uskutočniť test na porovnanie výsledkov, ktoré získali experti z rôznych regiónov. Ak sa spozorujú významné odchýlky, treba vykonať potrebné kroky na identifikovanie dôvodov a dosiahnuť porovnateľné výsledky. Členské štáty môžu uskutočniť testy na porovnanie výsledkov, ktoré získali ich vlastní hodnotitelia, s výsledkami hodnotiteľov zo susedných členských štátov. Významné odchýlky by mali viesť k podrobnému prešetreniu s cieľom dosiahnuť porovnateľné výsledky. Členské štáty informujú Komisiu o výsledkoch týchto porovnaní.

PRÍLOHA IV (Článok 4) SENZORICKÉ HODNOTENIE MASLA 1. ROZSAH PÔSOBNOSTI Účelom tohto postupu senzorického hodnotenia masla je ustanovenie jednotnej metódy uplatniteľnej vo všetkých členských štátoch. Ďalšie podrobnosti o senzorickom hodnotení pozri v súčasnej medzinárodnej norme IDF pre mlieko a mliečne výrobky, IDF 99 – časti 1, 2, 3. 2. VYMEDZENIE POJMOV Senzorické hodnotenie (posúdenie) znamená preskúmanie atribútov výrobku zmyslovými orgánmi. Panel znamená skupinu vybraných hodnotiteľov pracujúcich počas hodnotenia bez vzájomnej komunikácie a bez vzájomného ovplyvňovania. Hodnotiteľ je definovaný ako osoba vybraná pre svoju schopnosť vykonať senzorický test. Tento druh hodnotiteľa môže mať obmedzené skúsenosti. Odborný hodnotiteľ je definovaný ako osoba s vysokým stupňom senzorickej citlivosti a skúsenosti so senzorickou metodikou, ktorá je schopná robiť dôsledné a spoľahlivé senzorické hodnotenia rôznych výrobkov. Tento druh hodnotiteľa má dobrú dlhodobú senzorickú pamäť. Bodovanie znamená, že panel maslo senzoricky hodnotí prostredníctvom bodovej stupnice. Musí sa použiť nomenklatúra kazov. Známkovanie znamená klasifikáciu kvality, ktorá sa vykonáva na základe bodovania. Kontrolné dokumenty: dokumenty používané na zaznamenanie jednotlivých počtov bodov pre každý atribút a konečnú známku výrobku. (Tento dokument sa môže použiť aj na zaznamenanie chemického zloženia.) 3. TESTOVACIA MIESTNOSŤ Bližšie pozri v ISO 8589 a ISO/DIS 22935-2 | IDF 99-2 ods. 7. Je potrebné prijať bezpečnostné opatrenia, aby hodnotitelia neboli v testovacej miestnosti ovplyvňovaní vonkajšími faktormi. Testovacia miestnosť nesmie obsahovať žiadne cudzie pachy a musí sa dať ľahko čistiť. Steny musia mať svetlú farbu a nesmú odrážať svetlo. Testovacia miestnosť a jej osvetlenie musia byť také, aby neovplyvňovali vlastnosti výrobkov, ktoré sa bodujú. Miestnosť musí byť vybavená vhodným termostatickým ovládačom, ktorý umožňuje udržiavať stálu teplotu masla. V čase posudzovania by malo mať maslo teplotu 12 °C (±2 °C). 4. VÝBER HODNOTITEĽOV Hodnotiteľ musí poznať maslové výrobky a musí byť kompetentný na vykonanie senzorického známkovania. Jeho kompetentnosť pravidelne (najmenej jedenkrát za rok) hodnotí príslušný orgán. 4.1. Podrobné údaje o všeobecných požiadavkách a skríningových testoch, ktoré možno použiť pred oficiálnym využitím nového hodnotiteľa, treba overiť v ISO/DIS 22935-1 | IDF 99-1 ods. 4 (nábor) a ods. 5.1. Zásadne dôležité je priebežná odborná príprava a pravidelné všeobecné kurzy. Informácie o odbornej príprave panelu pozri v ISO 8586-1. 4.2. Počiatočné školenie by sa malo obsahovať: — všeobecnú teóriu a praktický význam senzorického hodnotenia, — metódy, stupnice a opis senzorických dojmov, — zisťovanie a uznávanie senzorických atribútov a osobitných senzorických termínov, — základnú odbornú prípravu o výrobe masla, — potvrdené referenčné hodnoty a vzorky, ktoré majú hodnotiteľovi pomôcť identifikovať osobitné príchute a intenzitu chuti výrobku. 5. POŽIADAVKY NA PANEL Počet hodnotiteľov v paneli by mal byť nepárny, najmenej traja. Väčšina z nich musí byť zamestnancami príslušného orgánu alebo oprávnenými osobami, ktoré nie sú zamestnané v mliekarenskom priemysle. Za celý postup zodpovedá vedúci panelu, ktorý sa na činnosti panelu môže zúčastňovať. Pred hodnotením je potrebné zohľadniť na dosiahnutie optimálnych výkonov subjektov tieto faktory: — hodnotitelia nesmú trpieť chorobou, ktorá by mohla ovplyvniť ich výkon. V takom prípade sa daný hodnotiteľ v paneli nahradí iným, — hodnotitelia sa musia dostaviť načas, aby sa zúčastnili hodnotenia, a vyhradiť si dostatok času na vykonanie hodnotenia, — hodnotitelia nesmú používať látky so silnou vôňou ako parfum, vodu po holení, dezodorant atď. a mali by sa vyhýbať jedlám so silnou chuťou (napr. veľmi koreneným jedlám) atď., — hodnotitelia nesmú počas pol hodiny pred hodnotením fajčiť, jesť alebo piť niečo iné než vodu. 6. VÝKON Všetci hodnotitelia by sa mali zúčastňovať na pravidelných paneloch senzorického hodnotenia, aby si zachovali svoju kompetentnosť. Frekvencia závisí od objemu a množstva masla, a ak je to možné, mesačne by sa malo konať aspoň jedno zasadanie. Aj skúsení hodnotitelia by sa mali každoročne zúčastňovať na viacerých paneloch, ak je to možné, najmenej raz za štvrťrok. 7. VÝBER A PRÍPRAVA VZORKY Zásadne dôležité je, aby bola počas hodnotenia identita vzoriek utajená, aby sa tým predišlo možnej predpojatosti. Vzorky by mali byť kódované. Toto treba zorganizovať pred hodnotením. Požadovaná teplota masla počas prevozu do testovacej miestnosti by mala byť nastavená (6 °C ± 2 °C). Ak sa senzorické hodnotenie vykonáva v studenom sklade, vzorka sa odoberie vzorkovacou sondou. Ak sa senzorické hodnotenie vykonáva na inom mieste ako v studenom sklade, odoberie sa najmenej 500 gramová vzorka. Počas hodnotenia by malo mať maslo teplotu 12 °C (±2 °C) (pozri: v ISO/DIS 22935-2 | IDF 99-2 teplota masla pri hodnotení je 14 °C ± 2 °C). V každom prípade je potrebné vyhnúť sa veľkým odchýlkam. 8. URČOVANIE HODNOTY KAŽDÉHO ATRIBÚTU 8.1. Senzorické hodnotenie treba vykonávať vo vzťahu k týmto trom atribútom: vzhľad, konzistencia a chuť. Vzhľad zahŕňa tieto vlastnosti: farba, viditeľná čistota, neprítomnosť fyzickej kontaminácie, neprítomnosť rastu plesne a jednotnosť disperzie vody. Disperzia vody sa testuje podľa normy IDF 112A/1989. Konzistencia zahŕňa tieto vlastnosti: masa, textúra a pevnosť. Roztierateľnosť možno sledovať fyzickými prostriedkami, ak si to jednotlivý členský štát želá na uspokojenie požiadaviek zákazníkov. Komisia sa môže v budúcnosti rozhodnúť zharmonizovať metodiku. Masa je pojem, ktorý sa vzťahuje na súdržnosť výrobku pri konzumácii. Bežne súvisí s pevnosťou a roztierateľnosťou a mala by byť v celom výrobku jednotná. Úzko súvisí s textúrou a je to schopnosť výrobku odolávať vlastnej hmotnosti. Naznačuje ju odolnosť pri krájaní a možno ju merať mechanicky a pocitom v ústach a prstoch. Chuť je vlastnosť pociťovaná v ústach predovšetkým chuťovými pohárikmi jazyka. Aróma je vlastnosť pociťovaná nosom a čuchovým zmyslom. Významná odchýlka od odporučenej teploty znemožňuje spoľahlivé hodnotenie konzistencie a chuti. Teplota má mimoriadne veľký význam. Známkovanie masla treba odložiť, ak je teplota mimo odporúčaného rozsahu. 8.2. Každá charakteristika sa musí senzoricky hodnotiť osobitne. Bodovanie treba robiť podľa tabuľky 1. 8.3. Môže byť žiaduce, aby hodnotitelia na dosiahnutie jednotnosti pred začatím hodnotenia spoločne obodovali vzhľad, konzistenciu a chuť jednej alebo viacerých referenčných vzoriek. 8.4. Bodovanie na prijateľnosť je: Pozri časť 7 – Nomenklatúra a opis kritérií uplatniteľných na body pri bodovaní. Maximum Požadované Vzhľad 5 4 Konzistencia 5 4 Chuť/aróma 5 4 — Ak sa nedosiahnu požadované body, je nutné poskytnúť opis kazu. — Body poskytnuté každým hodnotiteľom pre každú charakteristiku musia byť zaznamenané v kontrolnom dokumente. — Výrobok sa akceptuje alebo odmietne na základe väčšinového rozhodnutia. — Prípady, keď rozdiely medzi jednotlivými bodovaniami každého atribútu sú väčšie ako susedné body, by sa nemali vyskytovať často (nie viackrát ako jedenkrát na 20 vzoriek). V opačnom prípade vedúci panelu preverí kompetentnosť panelu. 9. DOZOR Za celý proces je zodpovedný vedúci panelu, ktorý musí byť oficiálnym zamestnancom príslušného orgánu a môže byť členom panelu. Do kontrolného dokumentu musí zaznamenať jednotlivé počty bodov pre každú charakteristiku a potvrdiť, či sa výrobok akceptuje, alebo zamieta. 10. NOMENKLATÚRA Pozri priloženú tabuľku 2. 11. ZDROJ FIL-IDF 99C:1997 Sensory evaluation of dairy products by scoring – Reference method (Senzorické hodnotenie mliekarenských výrobkov bodovaním – referenčná metóda) ISO/DIS 22935 | IDF 99 International Standard for Milk and Milk Products – Sensory analysis – Parts 1 – 3 (Medzinárodná norma pre mlieko a mliečne výrobky – Senzorická analýza – časti 1 – 3) ISO 8586-1 General guidance for selection, training and monitoring of assessors- Part 1 (Senzorická analýza – Všeobecná smernica na výber, školenie a monitorovanie hodnotiteľov – časť 1) ISO 8589 Senzorická analýza – Všeobecná smernica na usporiadanie senzorického pracoviska FIL-IDF 112A:1989 Butter- Determination of water dispersion value (Maslo – určovanie hodnoty disperzie vody) Tabuľka 1 Bodovanie masla Vzhľad Konzistencia Chuť a aróma Body Číslo (1) Poznámky Body (trieda kvality) Číslo (1) Poznámky Body (trieda kvality) Číslo (1) Poznámky 5 Veľmi dobrý ideálny typ najvyššej kvality (rovnomerne suchý) 5 Veľmi dobrá ideálny typ najvyššej kvality (dobre roztierateľná) 5 Veľmi dobrá ideálny typ najvyššej kvality (úplne čistá najjemnejšia aróma) 4 Dobrý (2) bez viditeľných kazov 4 17 18 Dobrá (2) tvrdá mäkká 4 Dobrá (2) bez viditeľných kazov 3 1 2 3 4 5 6 7 8 Dostatočný (drobné kazy) voľná vlhkosť nejednotný dvojfarebný prúžkovaný škvrnitý, mramorový fľakatý separácia oleja príliš farebné slabý, otvorená textúra 3 14 15 16 17 18 Dostatočná (drobné kazy) krátke, krehké, drobivé pastovité, cestovité, mastné lepkavé tvrdé mäkké 3 21 22 25 27 33 34 35 Dostatočná (drobné kazy) nečisté cudzia príchuť kyslé varivá príchuť, pripálená chuť chuť po krmive surové, horké presolené 2 1 3 4 5 6 10 11 12 Zlý (viditeľné kazy) voľná vlhkosť prúžkovaný škvrnitý, mramorový fľakatý separácia oleja cudzie látky plesnivý nerozpustená soľ 2 14 15 16 17 18 Zlá (viditeľné kazy) krátke, krehké, drobivé pastovité, cestovité, mastné lepkavé tvrdé mäkké 2 21 22 23 25 32 33 34 35 36 38 Zlá (viditeľné kazy) nečisté cudzia príchuť zatuchnuté kyslé okysličená príchuť, kovová príchuť chuť po krmive surové, horké presolené plesnivé, hnilé chemická príchuť 1 1 3 4 5 6 7 9 10 11 12 Veľmi zlý (silné kazy) voľná vlhkosť prúžkovaný škvrnitý, mramorový fľakatý separácia oleja príliš farebný granulovitý cudzie látky plesnivý nerozpustená soľ 1 14 15 16 17 18 Veľmi zlá (silné kazy) krátke, krehké, drobivé pastovité, cestovité, mastné lepkavé tvrdé mäkké 1 22 24 25 26 28 29 30 31 32 34 35 36 37 38 Veľmi zlá (silné kazy) cudzia príchuť syrová, mliečna príchuť kyslé drožďovité plesnivá príchuť zhnité olejnaté, rybnaté lojovité okysličená príchuť, kovová príchuť surové, horké presolené plesnivé, hnilé sladovité chemická príchuť

Tabuľka 2 Tabuľka kazov masla I. Vzhľad 1. voľná vlhkosť 2. nejednotné, dvojfarebné 3. prúžkované 4. škvrnité, mramorované 5. fľakaté 6. separácia oleja 7. príliš farebné 8. slabý, (otvorená textúra) 9. granulovité 10. cudzie látky 11. plesnivé 12. nerozpustená soľ II. Konzistencia 14. krátke, krehké, drobivé 15. pastovité, cestovité, mastné 16. lepkavé 17. tvrdé 18. mäkké III. Chuť a aróma 20. bez chuti 21. nečisté (3) 22. cudzia príchuť 23. zatuchnuté 24. syrová, mliečna príchuť 25. kyslé 26. drožďovité 27. a) varivá príchuť b) pripálená príchuť 28. plesnivá chuť 29. zhnité 30. olejnaté, rybnaté 31. lojovité 32. a) okysličená príchuť b) kovová príchuť 33. chuť po krmive 34. surové, horké 35. presolené 36. plesnivé, zhnité 37. sladovité 38. chemická príchuť (1) Tabuľka 2. (2) Kazy uvedené pod „dobrý“ sú len veľmi malé odchýlky od ideálneho typu. (3) Toto označenie by sa malo používať čo najmenej a len ak sa nedá kaz opísať presnejšie.

PRÍLOHA V (Článok 5) STANOVENIE OBSAHU TRIGLYCERIDOV KYSELINY HEPTÁNOVEJ V MASLE, MASLOVOM OLEJI A SMOTANE PLYNOVOU CHROMATOGRAFICKOU ANALÝZOU TRIGLYCERIDOV 1. ROZSAH Týmto sa ustanovuje metóda určovania obsahu triglyceridov kyseliny heptánovej v maslovom oleji, masle a smotane. 2. POJMY A ICH VYMEDZENIA Obsah kyseliny heptánovej: obsah triglyceridov kyseliny heptánovej určený postupom ustanoveným v tejto metóde. Poznámka: Obsah kyseliny heptánovej je vyjadrený v kg/t výrobku u maslového oleja a masla a v kg/t mliečneho tuku u smotany. 3. PRINCÍP Mliečny tuk sa extrahuje z rôznych výrobkov podľa ISO 14156 | IDF 172:2001. Kvantitatívne určovanie obsahu triglyceridov kyseliny heptánovej v extrahovanom tuku sa vykonáva kapilárnou plynovou chromatografiou. Výsledok získaný u vzorky sa hodnotí vo vzťahu k triglyceridom kyseliny hexánovej ako k medzinárodnému štandardu. Poznámka: Zistilo sa, že uspokojivým interný štandardom je aj tributyrín. 4. REAGENTY Používajte len reagenty uznaného analytického stupňa. 4.1. n-hexán 4.2. štandardný triglycerid kyseliny hexánovej s čistotou najmenej 99 % 4.3. štandardný triglycerid kyseliny heptánovej s čistotou najmenej 99 % 4.4. bezvodný síran sodný (Na2SO4) 5. PRÍSTROJE Zvyčajné laboratórne vybavenie, konkrétne: 5.1. Analytické váhy s presnosťou na 1 mg 5.2. 10 ml a 20 ml odmerky 5.3. 30 ml odstreďovacie skúmavky 5.4. Rotačný vyparovač 5.5. Pec schopná udržiavať teplotu 50 °C ± 5 °C 5.6. Filtračný papier, stredne porézny, s priemerom okolo 15 cm Zariadenie na plynovú chromatografiu 5.7.1. Plynový chromatograf vybavený injektorom „split“ aj „splitless“ alebo injektorom s nástrekom do kolóny („on column“) a plameňovým ionizačným detektorom (FID) Kolóna na plynovú chromatografiu so stacionárnou fázou, ktorá sa úspešne využíva na separáciu triglyceridov [100 % dimetylpolysiloxán alebo 5 % fenylmetylpolysiloxán (95 % metyl)]. Stacionárnu fázu, dĺžku kolóny (od 4 m do 15 m), vnútorný priemer (od 0,22 mm do 0,50 mm) a hrúbku filmu (0,12 μm alebo viac) zvoľte so zreteľom na laboratórne skúsenosti a použitý systém injektáže. V každom prípade musí pri vybranej kolóne byť pík rozpúšťadla vyznačený oddelene od píku triglyceridu kyseliny hexánovej a rozlíšenie základnej čiary medzi píkmi triglyceridov kyseliny hexánovej a heptánovej. Príklady zostáv sa uvádzajú ďalej. 5.7.2.1. Príklady zostavy s použitím injektoru „split“: — nosný plyn: hélium, — hydrostatický tlak kolóny: 100 KPa, — kolóna: 12 m dlhý kolóna z taveného kremeňa s vnútorným priemerom 0,5 mm a hrúbkou filmu 0,1 μm, — stacionárna fáza: 100 % dimetylpolysiloxán alebo 5 % fenyldimetylpolysiloxán (95 %) (napr. HT5), — teplota kolóny: počiatočná teplota 130 °C udržiavaná 1 min. sa zvyšuje rýchlosťou 20 °C/min na 260 °C a potom rýchlosťou 30 °C/min na 360 °C; teplota 360 °C sa udržiava 10 min., — teplota detektora: 370 °C, — teplota injektora: 350 °C, — pomer rozdelenia: 1:30, — množstvo injektovanej vzorky: 1 μl. 5.7.2.2. Príklad zostavy s použitím injektora s nástrekom do kolóny — nosný plyn: vodík (systém konštantného prietoku), — tlak na hlave kolóny: 89 kPa, — kolóna: 4 m dlhá kolóna z taveného kremeňa s vnútorným priemerom 0,32 mm a hrúbkou filmu 0,25 μm, — stacionárna fáza, 5 % fenyl- 95 % dimetylpolysiloxán, — teplota kolóny: počiatočná teplota 60 °C udržiavaná 2 minúty sa zvyšuje rýchlosťou 35 °C/min na 340 °C a na tejto teplote sa udržiava 5 minút, — teplota detektora: 350 °C, — množstvo injektovanej vzorky: 1 μl. 5.8. Injekčná striekačka s objemom 5 μl 6. ODBER VZORIEK Dôležité je, aby laboratórium získalo vzorku, ktorá je skutočne reprezentatívna a nebola poškodená počas prepravy alebo skladovania. Odber vzoriek nie je súčasťou metódy uvedenej v tejto medzinárodnej norme. Odporúčaná metóda odberu vzoriek je uvedená v IDF: norma 50C:1995 alebo ISO 707 – 1997 – Mlieko a mliečne výrobky – návod na odber vzoriek. 7. POSTUP 7.1. Príprava skúšobnej vzorky a skúšobnej dávky Postupujte podľa ISO 14156 | IDF 172:2001 7.1.1. Maslový olej, maslo 7.1.1.1. Roztopte 50 g až 100 g skúšobnej vzorky v peci (5.5). 7.1.1.2. Do preloženého filtračného papiera vložte 0,5 g až 1,0 g bezvodného síranu sodného (5.4). 7.1.1.3. Tuk prefiltrujte cez filtračný papier s bezvodným síranom sodným a filtrát zachytávajte do banky, ktorú držíte v peci (5.5). Pri dekantácii roztopeného masla na filtračný papier dávajte pozor, aby sa neprenieslo sérum. 7.1.2. Smotana 7.1.2.1. Skúšobnú vzorku zahrejte na teplotu 20 °C ± 2 °C. 7.1.2.2. Vzorku dôkladne premiešajte. 7.1.2.3. Zrieďte primerané množstvo skúšobnej vzorky na 100 ml skúšobnej dávky s približne 4-percentným podielom tuku. 7.1.2.4. Pri extrakcii tuku zo smotany postupujte ako u surového mlieka a homogenizovaného mlieka (pozri ISO 14156 | IDF 172:2001, § 8.3). 7.1.2.5. V 10 ml odmerke (5.2) odmerajte 1 g extrahovaného tuku na najbližší 1 mg. Pridajte 1 ml roztoku 7.2.2. Doplňte do 10 ml n-hexánom (5.1) a zhomogenizujte. 7.1.2.6. Do 10 ml odmerky (5.2) nalejte 1 ml roztoku 7.1.1.2 a n-hexánom zrieďte na 10 ml (4.1). 7.2. Príprava kalibračných noriem 7.2.1. Rozpustite 100 mg triglyceridu kyseliny heptánovej (4.3) v 10 ml n-hexánu (4.1). 7.2.2. Rozpustite 100 mg triglyceridu kyseliny hexánovej (4.2) v 10 ml n-hexánu (4.1). 7.2.3. Do 10 ml odmerky (5.2) nalejte 1 ml roztoku 7.2.2. Doplňte hexánom na 10 ml (4.1). 7.2.4. Do 10 ml odmerky (5.2) nalejte 1 ml roztoku 7.2.1 a 1 ml roztoku 7.2.2. Doplňte n-hexánom na 10 ml (4.1). 7.2.5. Do 10 ml odmerky (5.2) nalejte 1 ml roztoku 7.2.4 a doplňte n-hexánom na 10 ml (4.1). 7.3. Chromatografické určenie 7.3.1. Dvakrát injektujte 1 μl štandardného roztoku 7.2.5. 7.3.2. Injektujte 1 μl roztoku každej vzorky. Poznámka: Ak používate systém nástreku do kolóny, štandardný roztok aj roztok vzorky musia byť viac zriedené. 7.3.3. Operáciu 7.3.1 opakujte u každej tretej vzorky, aby ste vzorky oddelili opakovanými injekciami štandardného roztoku. Výsledky vychádzajú zo stredného priemeru reakčných faktorov štandardných chromatogramov. 8. VÝPOČET VÝSLEDKOV Pre každý chromatogram integrujte plochu píkov triglyceridov kyseliny heptánovej a kyseliny hexánovej. Tieto pokyny dodržiavajte pre každú oddelenú sekvenciu, t. j. pri súbore oddelených vzoriek je štandardná vzorka dvakrát injektovaná bezprostredne pred nimi STD1 a štandardná vzorka dvakrát injektovaná bezprostredne po nich je STD2. 8.1. Kalibrácia 8.1.1. Vypočítajte reakčný faktor pre každý duplikát STD1 Rf1(a) a Rf1(b): Rf1 (a) alebo (b) = (plocha píkov triglyceridov kyseliny hexánovej/plocha píkov triglyceridov kyseliny heptánovej) × 100 Vypočítajte stredný priemer reakčného faktora Rf1 Rf1 = (Rf1(a) + Rf1(b)) / 2 8.1.2. Podobne vypočítajte stredný priemer reakčného faktora STD2 Rf2. 8.1.3. Vypočítajte stredný priemer reakčného faktora Rf: Rf = (Rf1 + Rf2) /2 8.2. Skúšobné vzorky Pre každý chromatogram vzorky medzi STD1 a STD2 vypočítajte obsah kyseliny heptánovej C (kg/t): C = (plocha píkov triglyceridov kyseliny heptánovej × Rf × 100)/(plocha píkov triglyceridov kyseliny hexánovej × Wt × 1 000) pričom — Wt = hmotnosť odobraného tuku(g), — 100 = zriedený objem vzorky, — 1 000 = faktor konverzie (z μg/g na kg/t) U vzoriek masla zohľadnite obsah tuku v masle a vypočítajte správnu hodnotu koncentrácie, Cmasla (kg/t masla) Cmasla = Ctuku × F pričom F je obsah tuku v masle. 9. PRESNOSŤ Podrobnosti medzilaboratórneho testu masla v súlade s ISO 5725 – 1 a ISO 5725 – 2 o metóde presnosti sú uvedené v bode 12. Hodnoty limitu opakovateľnosti a reprodukovateľnosti sú vyjadrené pre 95 percentnú úroveň pravdepodobnosti a nemožno ich aplikovať na iné než dané rozsahy a matrice koncentrácie. 9.1. Opakovateľnosť Absolútne rozdiely medzi výsledkami dvoch individuálnych testov získané rovnakou metódou na rovnakom skúšobnom materiáli v rovnakom laboratóriu rovnakého analytika s použitím rovnakého zariadenia v rámci krátkeho časového intervalu sú väčšie než 0,35 kg/t najviac v 5 % prípadov. 9.2. Reprodukovateľnosť Absolútne rozdiely medzi výsledkami dvoch individuálnych testov získané rovnakou metódou na rovnakom skúšobnom materiáli v rôznych laboratóriách rôznych analytikov s použitím rôzneho zariadenia sú väčšie než 0,66 kg/t najviac v 5 % prípadov. 10. TOLERANČNÉ LIMITY: SPODNÉ LIMITY (PRÍPAD NEDOSTATOČNÝCH MNOŽSTIEV) 10.1. Na kontrolu správneho obsahu značkovacej látky sa z výrobku obsahujúceho značkovaciu látku odoberú tri vzorky. 10.2. Maslo a koncentrované maslo 10.2.1. Miera vstrebávania je 11 kg triglyceridu kyseliny heptánovej s čistotou najmenej 95 % na tonu masla, t. j. 10,45 kg/t. 10.2.2. Na kontrolu miery a homogenity vstrebávania značkovacej látky sa použijú výsledky z troch vzoriek získané z analýzy výrobku a najnižší z týchto výsledkov sa porovná s týmito limitmi: — 9,51 kg/t (95 % minimálnej miery vstrebávania triglyceridu kyseliny heptánovej s čistotou najmenej 95 %, jedno určenie), — 6,89 kg/t (70 % minimálnej miery vstrebávania triglyceridu kyseliny heptánovej s čistotou najmenej 95 %, jedno určenie). — Koncentrácia značkovacej látky vo vzorke s najnižším výsledkom sa používa v spojení s interpoláciou od 9,51 kg do 6,89 kg. 10.3. Smotana 10.3.1. Miera vstrebávania je 10 kg triglyceridu kyseliny heptánovej s čistotou najmenej 95 % na tonu mliečneho tuku, t. j. 9,50 kg/t značkovacej látky mliečneho tuku. 10.3.2. Na kontrolu miery a homogenity vstrebávania značkovacej látky sa použijú výsledky z troch vzoriek získané z analýzy výrobku a najnižší z týchto výsledkov sa porovná s týmito limitmi: — 8,60 kg/t (95 % minimálnej miery vstrebávania triglyceridu kyseliny heptánovej s čistotou najmenej 95 %, jedno určenie), — 6,23 kg/t (70 % minimálnej miery vstrebávania triglyceridu kyseliny heptánovej s čistotou najmenej 95 %, jedno určenie). — Koncentrácia značkovacej látky vo vzorke s najnižším výsledkom sa používa v spojení s interpoláciou medzi 8,60 kg a 6,23 kg. 11. TOLERANČNÉ LIMITY: HORNÉ LIMITY (PRÍPAD PREKROČENIA MNOŽSTVA O VIAC AKO 20 %) 11.1. Na kontrolu správneho obsahu značkovacej látky sa z výrobku obsahujúceho značkovacej látku odoberú tri vzorky. 11.2. Maslo a koncentrované maslo 11.2.1. Na kontrolu miery a homogenity vstrebávania značkovacej látky sa použijú výsledky z troch vzoriek získané z analýzy výrobku a najnižší z týchto výsledkov sa porovná s týmito limitmi: — horný limit je 12,96 kg/t. 11.3. Smotana 11.3.1. Na kontrolu miery a homogenity vstrebávania značkovacej látky sa použijú výsledky z troch vzoriek získané z analýzy výrobku a najnižší z týchto výsledkov sa porovná s týmito limitmi: — horný limit je 11,82 kg/t. 12. DODATOČNÉ INFORMÁCIE: ŠTATISTICKÁ ANALÝZA VÝSLEDKOV NA STANOVENIE TRIENANTOÁTU V MASLOVOM TUKU ANALÝZOU TRIGLYCERIDOV Na stanovenie obsahu trienantoátu v masle s obsahom značkovacích látok boli vykonané štyri kolaboratívne pokusy. Prvého kola testov sa zúčastnilo deväť laboratórií, ktoré nedostali žiadne špecifikácie analytických metód, ktoré by mali použiť. Druhého kola testov sa zúčastnilo desať laboratórií, ktoré použili 4 rôzne metódy: — stanovenie metylheptanoátu pomocou n-nonánu alebo metylnonanoátu ako medzinárodného štandardu, — stanovenie trienantoátu pomocou trikaproátu ako interného štandardu, — stanovenie metylheptanoátu pomocou kalibračnej vzorky/zmesi, — stanovenie metylheptanoátu pomocou kalibračnej zmesi. Okrem toho sa na analýzu FAME použili dva rôzne postupy metylácie (podľa De Francesca a Christophersona & Glassa). Na základe získaných výsledkov sa na tretie kolo testov vybrali dve metódy: — stanovenie metylheptanoátu pomocou n-nonánu alebo metylnonanoátu ako interného štandardu, — stanovenie trienantoátu pomocou trikaproátu ako interného štandardu. Z výsledkov 7 laboratórií vyplynulo, že metóda FAME produkuje vysokú variabilitu, a následne sa rozhodlo, že sa bude používať len na stanovenie trienantoátu ako triglyceridu na základe postupu stanovenia trienantoátu pomocou trikaproátu ako interného štandardu. Navyše treba vykonať analýzu triglyceridov kapilárnou kolónou. Vo štvrtom kole testov sa rozdelili štyri vzorky (A, B, C, D) a výsledky poskytlo deväť laboratórií (tabuľky 1 a 2). Dve laboratóriá (DE a UE) analyzovali vzorky metódou FAME. V dôsledku nižšieho počtu laboratórií sa štatistický výpočet vykonal na úplnom súbore údajov (obrázky 1 a 2) vrátane výsledkov FAME, ako aj na údajoch získaných analýzou triglyceridov. Testy na výrazne odlišné výsledky: — vzorka A: Dixonov, Cochranov a Grubbsov test na úrovni 1 a 5 % vykázal jeden výrazne odlišný výsledok, — vzorka B: Grubbsov test na úrovni 5 % vykázal jeden výrazne odlišný výsledok, — vzorka C: Dixonov a Grubbsov test na úrovni 1 a 5 % ukázal jeden odlišný výsledok, — vzorka D: Dixonov a Grubbsov test na úrovni 1 a 5 % vykázal jeden výrazne odlišný výsledok. Výrazne odlišné výsledky sa z výpočtu vylúčili. Treba poznamenať, že výsledky získané metódou FAME sa v aplikovaných testoch nikdy nepokladali za výrazne odlišné výsledky. Parametre presnosti V tabuľkách 1 a 2 sa uvádzajú výsledky všetkých laboratórií a parametre presnosti vypočítané na prijateľný počet (8) laboratórií, ktoré ale nanešťastie nie sú odvodené od rovnakej analytickej metódy. V tabuľkách 3 a 4 sa uvádzajú výsledky len metódy TG a príslušné parametre presnosti. Prijateľnosť týchto parametrov podlieha akceptácii nízkeho počtu laboratórií (6). Na obrázkoch 3 a 4 je zachytený trend Sr a SR vypočítaný na 4 vzorky dvoch opísaných súborov údajov. V tabuľke 5 sa uvádzajú hodnoty Sr a SR spolu s príslušnými spoločnými hodnotami a celkové parametre r a R. Nakoniec bol vypočítaný kritický rozdiel na 95 percentnej úrovni pravdepodobnosti. Tabuľka 1 Štatistické výsledky metód TG + FAME* Vzorka A R1 R2 Stred Počet laboratórií zachovaný po vynechaní výrazne odlišných výsledkov 8 RENNES FR1 11,0 11,1 11,1 Počet výrazne odlišných výsledkov 1 RIKILT NL 11,2 11,2 11,2 Výrazne odlišné výsledky DК ZPLA DE* 11,6 11,8 11,7 Stredná hodnota 11,3 ADAS GB 11,4 11,2 11,3 Skutočná hodnota 11,0 CNEVA FR2 11,4 11,4 11,4 Štandardná odchýlka opakovateľnosti (Sr) 0,09 LODI IT 11,1 11,3 11,2 Relatívna opakovateľnosť sd (RSDr%) 0,80 EELA FI 11,3 11,2 11,3 Opakovateľnosť r (95 %) 0,26 ISPRA UE* 11,0 11,0 11,0 Relatívna opakovateľnosť r % 2,24 D.V.F.A. DK 13,3 11,8 12,6 Štandardná odchýlka reprodukovateľnosti (SR) 0,23 Relatívna reprodukovateľnosť sd (RSDR%) 2,04 Reprodukovateľnosť R (95 %) 0,84 Relatívna reprodukovateľnosť R % 5,71 Vzorka B R1 R2 Stred Počet laboratórií zachovaný po vynechaní výrazne odlišných výsledkov 8 RENNES FR1 12,7 12,8 12,8 Počet výrazneodlišných výsledkov 1 RIKILT NL 13,5 13,3 13,4 Výrazne odlišné výsledky DK ZPLA DE* 14,0 13,8 13,9 Stredná hodnota 13,4 ADAS GB 13,4 13,5 13,5 Skutočná hodnota 13,5 CNEVA FR2 13,3 13,4 13,4 Štandardná odchýlka opakovateľnosti (Sr) 0,14 LODI IT 13,9 13,5 13,7 Relatívna opakovateľnosť sd (RSDr%) 1,04 EELA FI 13,4 13,2 13,3 Opakovateľnosť r (95 %) 0,40 ISPRA UE* 13,2 13,3 13,3 Relatívna opakovateľnosť r % 2,91 D.V.F.A. DK 14,1 14,8 14,5 Štandardná odchýlka reprodukovateľnosti (SR) 0,35 Relatívna reprodukovateľnosť sd (RSDR%) 2,61 Reprodukovateľnosť R (95 %) 0,99 Relatívna reprodukovateľnosť R % 7,31

Tabuľka 2 Štatistické výsledky metód TG + FAME* Vozrka C R1 R2 Stred Počet laboratórií zachovaný po vynechaní výrazne odlišných výsledkov 8 RENNES FR1 8,9 9,2 9,1 Počet výrazne odlišných výsledkov 1 RIKILT NL 9,2 9,3 9,3 Výrazne odlišné výsledky DK ZPLA DE* 9,2 9,4 9,3 Stredná hodnota 9,3 ADAS GB 9,5 9,3 9,4 Skutočná hodnota 9,3 CNEVA FR2 9,4 9,4 9,4 Štandardná odchýlka opakovateľnosti (Sr) 0,14 LODI IT 9,2 9,5 9,4 Relatívna opakovateľnosť sd (RSDr%) 1,50 EELA FI 9,4 9,6 9,5 Opakovateľnosť r (95 %) 0,40 ISPRA UE* 9,4 9,3 9,4 Relatívna opakovateľnosť r % 4,20 D.V.F.A. DK 10,7 10,9 10,8 Štandardná odchýlka reprodukovateľnosti (SR) 0,17 Relatívna reprodukovateľnosť sd (RSDR%) 1,82 Reprodukovateľnosť R (95 %) 0,47 Relatívna reprodukovateľnosť R % 5,10 Vzorka D R1 R2 Stred Počet laboratórií zachovaný po vynechaní výrazne odlišných výsledkov 8 RENNES R1 1,6 1,6 1,6 Počet výrazne odlišných výsledkov 1 RIKILT NL 2,1 2,1 2,1 Výrazne odlišné výsledky DK ZPLA DE* 2,3 2,3 2,3 Stredná hodnota 2,1 ADAS GB 2,1 2,2 2,2 Skutočná hodnota 2,1 CNEVA FR2 2,1 2,1 2,1 Štandardná odchýlka opakovateľnosti (Sr) 0,08 LODI IT 2,2 1,9 2,1 Relatívna opakovateľnosť sd (RSDr%) 3,81 EELA FI 2,3 2,3 2,3 Opakovateľnosť r (95 %) 0,22 ISPRA UE* 2,3 2,3 2,3 Relatívna opakovateľnosť r % 10,67 D.V.F.A. DK 3,4 2,9 3,2 Štandardná odchýlka reprodukovateľnosti (SR) 0,24 Relatívna reprodukovateľnosť sd (RSDR%) 11,43 Reprodukovateľnosť R (95 %) 0,67 Relatívna reprodukovateľnosť R % 32,00

Tabuľka 3 Štatistické výsledky metód TG + FAME* Vzorka A R1 R2 Stred Počet laboratórií zachovaný po vynechaní výrazne odlišných výsledkov 6 RENNES FR1 11,0 11,1 11,1 Počet výrazne odlišných výsledkov 1 RIKILT NL 11,2 11,2 11,2 Výrazne odlišné výsledky DК ADAS GB 11,4 11,2 11,3 Stredná hodnota 11,2 CNEVA FR2 11,4 11,4 11,4 Skutočná hodnota 11,0 LODI IT 11,1 11,3 11,2 Štandardná odchýlka opakovateľnosti (Sr) 0,09 EELA FI 11,3 11,2 11,3 Relatívna opakovateľnosť sd (RSDr%) 0,80 D.V.F.A. DK 13,3 11,8 12,6 Opakovateľnosť r (95 %) 0,25 Relatívna opakovateľnosť r % 2,24 Štandardná odchýlka reprodukovateľnosti (SR) 0,13 Relatívna reprodukovateľnosť sd (RSDR%) 1,16 Reprodukovateľnosť R (95 %) 0,36 Relatívna reprodukovateľnosť R % 3,25 Vzorka B R1 R2 Stred Počet laboratórií zachovaný po vynechaní výrazne odlišných výsledkov 6 RENNES FR1 12,7 12,8 12,8 Počet výrazne odlišných výsledkov 1 RIKILT NL 13,5 13,3 13,4 Výrazne odlišné výsledky DК ADAS GB 13,4 13,5 13,5 Stredná hodnota 13,3 CNEVA FR2 13,3 13,4 13,4 Skutočná hodnota 13,5 LODI IT 13,9 13,5 13,7 Štandardná odchýlka opakovateľnosti (Sr) 0,15 EELA FI 13,4 13,2 13,3 Relatívna opakovateľnosť sd (RSDr%) 1,13 D.V.F.A. DK 14,1 14,8 14,5 Opakovateľnosť r (95 %) 0,42 Relatívna opakovateľnosť r % 3,16 Štandardná odchýlka reprodukovateľnosti (SR) 0,33 Relatívna reprodukovateľnosť sd (RSDR%) 2,48 Reprodukovateľnosť R (95 %) 0,93 Relatívna reprodukovateľnosť R % 6,94

Tabuľka 4 Štatistické výsledky metódy TG Vzorka C R1 R2 Stred Počet laboratórií zachovaný po vynechaní výrazne odlišných výsledkov 6 RENNES FR1 8,9 9,2 9,1 Počet výrazne odlišných výsledkov 1 RIKILT NL 9,2 9,3 9,3 Výrazne odlišné výsledky DК ADAS GB 9,5 9,3 9,4 Stredná hodnota 9,3 CNEVA FR2 9,4 9,4 9,4 Skutočná hodnota 9,3 LODI IT 9,2 9,5 9,4 Štandardná odchýlka opakovateľnosti (Sr) 0,15 EELA FI 9,4 9,6 9,5 Relatívna opakovateľnosť sd (RSDr%) 1,61 D.V.F.A. DK 10,7 10,9 10,8 Opakovateľnosť r (95 %) 0,42 Relatívna opakovateľnosť r % 4,51 Štandardná odchýlka reprodukovateľnosti (SR) 0,19 Relatívna reprodukovateľnosť sd (RSDR%) 2,04 Reprodukovateľnosť R (95 %) 0,53 Relatívna reprodukovateľnosť R % 5,71 Vzorka D R1 R2 Stred Počet laboratórií zachovaný po vynechaní výrazne odlišných výsledkov 6 RENNES FR1 1,6 1,6 1,6 Počet výrazne odlišných výsledkov 1 RIKILT NL 2,1 2,1 2,1 Výrazne dlišné výsledky DK Stredná hodnota 2,1 ADAS GB 2,1 2,2 2,2 Skutočná hodnota 2,1 CNEVA FR2 2,1 2,1 2,1 Štandardná odchýlka opakovateľnosti (Sr) 0,09 LODI IT 2,2 1,9 2,1 Relatívna opakovateľnosť sd (RSDr%) 4,29 EELA FI 2,3 2,3 2,3 Opakovateľnosť r (95 %) 0,26 D.V.F.A. DK 3,4 2,9 3,2 Relatívna opakovateľnosť r % 12,01 Štandardná odchýlka reprodukovateľnosti (SR) 0,25 Relatívna reprodukovateľnosť sd (RSDR%) 11,90 Reprodukovateľnosť R (95 %) 0,69 Relatívna reprodukovateľnosť R % 33,32

Tabuľka 5 Opakovateľnosť a reprodukovateľnosť (s FAME) Počet laboratórií Výrazne odlišný výsledok Opakovateľnosť Sr (95 %) Reprodukovateľnosť SR (95 %) Vzorka A 8 1 0,09 0,23 Vzorka Β 8 1 0,14 0,35 Vzorka C 8 1 0,14 0,17 Vzorka D 8 1 0,08 0,24 Spoločná hodnota 0,116 0,256 R R Spoločná hodnota* 2.8 0,324 0,716 CrD95 = 0,40 Minimálna čistota stanovená pre trienantoát = 95 % Minimálny limit stanovený pre trienantoát v maslovom tuku = 11 kg/t Vzhľadom na kritický rozdiel 95 % úrovne pravdepodobnosti nemôže byť priemer dvoch výsledkov menší než: 10,05 kg/t v prípade primiešania 95 % trienantoátu.

Opakovateľnosť a reprodukovateľnosť (bez FAME) Počet laboratórií Výrazne odlišný výsledok Opakovateľnosť Sr (95 %) Reprodukovateľnosť SR (95 %) Vzorka A 6 1 0,09 0,13 Vzorka B 6 1 0,15 0,33 Vzorka C 6 1 0,15 0,19 Vzorka D 6 1 0,09 0,25 Spoločná hodnota 0,124 0,237 r R Spoločná hodnota * 2.8 0,347 0,663 CrD95 = 0,36 Minimálna čistota stanovená pre trienantoát = 95 % Minimálny limit stanovený pre trienantoát v maslovom tuku = 11 kg/t Vzhľadom na kritický rozdiel 95 % úrovne pravdepodobnosti nemôže byť priemer dvoch výsledkov menší než: 10,09 kg/t v prípade primiešania 95 % trienantoátu. Obrázok 1 (1) Experimentálne výsledky: Vzorka A Experimentálne výsledky: Vzorka B Experimentálne výsledky: Vzorka C Experimentálne výsledky: Vzorka D Obrázok 2 Štandardná odchýlka opakovateľnosti a reprodukovateľnosti na rozličných úrovniach (TG + FAME) Obrázok 3 Štandardná odchýlka opakovateľnosti a reprodukovateľnosti na rozličných úrovniach (TG) Obrázok 4 Príklad s použitím injektora s nástrekom priamo do kolóny (1) = metóda FAME

PRÍLOHA VI (Článok 5) STANOVENIE OBSAHU VANILÍNU V KONCENTROVANOM MASLE, MASLE ALEBO SMOTANE VYSOKOVÝKONNOU KVAPALINOVOU CHROMATOGRAFIOU 1. ROZSAH A OBLASŤ APLIKÁCIE V tejto časti sa opisuje postup kvantitatívneho stanovenia obsahu vanilínu v koncentrovanom masle, masle alebo smotane. 2. PRINCÍP Extrakcia známeho množstva vzorky zmesou propán-2-olu/etanolu/acetonitrilu (1:1:2). Zrazenie väčšiny tuku schladením pri teplotách v rozmedzí –15 °C až –20 °C s následným odstredením. Po zriedení vodou stanovenie obsahu vanilínu vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC). 3. PRÍSTROJE Bežné laboratórne prístroje, konkrétne: 3.1. mraznička fungujúca v teplotnom rozsahu –15 °C až –20 °C; 3.2. striekačky s obsahom 2 ml; 3.3. membránové mikrofiltre s veľkosťou pórov 0,45 μm, odolné voči roztoku obsahujúcemu 5 % extrakčného roztoku (4.4); 3.4. systém kvapalinovej chromatografie pozostávajúci z čerpadla (tok 1,0 ml/min.), injektora (20 μl injekcia, automatická alebo manuálna), UV detektora (fungujúceho pri 306 nm, 0,01 AU celá stupnica), zapisovača alebo integrátora a stĺpikového termostatu fungujúceho pri teplote 25 °C; 3.5. analytická kolóna (250 mm × 4,6 mm ID) naplnená LIChrospherom RP 18 (Merck, 5 μm) alebo ekvivalentom; 3.6. ochranná predkolóna (približne 20 mm × 3 mm ID), naplnená zasucha LIChrospherom RP 18 (5 až 10 μm) alebo ekvivalentom; 3.7. odstredivka s výkonom 2 000 ot/min. 4. REAGENTY Všetky reagenty musia mať schválenú analytickú kvalitu. 4.1. Propán-2-ol 4.2. Etanol 96 % (v/v) 4.3. Acetonitril 4.4. Extrakčný roztok Zmiešajte propán-2-ol(4.1), etanol (4.2) a acetonitril (4.3) v pomere 1:1:2 (v/v). Vanilín (4-hydroxy-3metoxybenzaldehyd) ≥ 98 % 4.5.1. Vanilínový zásobný roztok (= 500 μg/ml) S presnosťou na 0,1 mg odvážte približne 50 mg (CM mg) vanilínu (4.5) do 100 ml odmernej banky, pridajte 25 ml extrakčného roztoku (4.4) a doplňte vodou. 4.5.2. Vanilínový štandardný roztok (= 10 μg/ml) Pipetujte 5 ml vanilínového zásobného roztoku (4.5.1) do 250 ml odmernej banky a doplňte vodou. 4.5.3. Metanol, v HPLC kvalite 4.5.4. Kyselina octová, ľadová 4.5.5. Voda, v HPLC kvalite 4.5.6. HPLC mobilná fáza Zmiešajte 300 ml metanolu (4.5.3) s približne 500 ml vody (4.5.5) a 20 ml kyseliny octovej (4.5.4) v 1 000 ml odmernej banke a doplňte vodou (4.5.5). Prefiltrujte cez 0,45 μm filter (3.3). 5. POSTUP 5.1. Príprava vzorky 5.1.1. Maslo Nahrievajte vzorku, pokým sa nezačne topiť. Teplota nahrievania nesmie presiahnuť 30 °C. Maslo sa v žiadnom prípade nesmie rozložiť na dve fázy. Ak vzorka dostatočne spružnie, pretrepaním ju zhomogenizujte. Pred odberom vzorky maslo miešajte 15 sekúnd. Odvážte najbližší 1 mg približne 5 g (SM g) masla do 100 ml odmernej banky. 5.1.2. Koncentrované maslo Bezprostredne pred odberom vzorky vložte nádobu s koncentrovaným maslom do pece pri teplote 40 až 50 °C, kým sa úplne neroztopí. Vzorku premiešajte vírením alebo miešaním, uistite sa, že nevznikajú vzduchové bublina v dôsledku príliš silného miešania. Odvážte na najbližší 1 mg približne 4 g (SM g) koncentrovaného masla do 100 ml odmernej banky. 5.1.3. Smotana Vzorku zohrejte vo vodnom kúpeli alebo inkubátore pri teplote 35 až 40 °C. Tuk rovnomerne rozmiešajte vírením a v prípade potreby miešaním. Vzorku rýchlo ochlaďte na 20 ± 2 °C. Vzorka by mala vyzerať homogénne, inak treba postup zopakovať. Odvážte na najbližší 1 mg približne 10 g (SM g) smotany do 100 ml odmernej banky. 5.2. Príprava testovacieho roztoku Do dávky testovacej vzorky (5.1.1, 5.1.2 alebo 5.1.3) pridajte približne 75 ml extrakčného roztoku (4.4), miešajte alebo silno pretrepávajte asi 15 minút a doplňte extrakčným roztokom (4.4). Približne 10 ml tohto extraktu preneste do testovacej skúmavky s ventilom. Skúmavku vložte do mrazničky (3.1) a nechajte ju tam približne 30 minút. Studený extrakt odstreďujte 5 minút pri približne 2 000 ot/min a ihneď zlejte. Zliaty roztok ochlaďte na izbovú teplotu. 5 ml zliateho roztoku pipetujte do 100 ml odmernej banky a doplňte vodou. Vzorku prefiltrujte cez membránový mikrofilter (3.3) pomocou striekačky (3.2). Filtrát je pripravený na stanovenie obsahu pomocou HPLC. 5.3. Kalibrácia Do 100 ml odmernej banky pipetujte 5 ml vanilínového štandardného roztoku (4.5.2). Pridajte 5 ml extrakčného roztoku (4.4) a doplňte vodu po značku. Tento roztok obsahuje 0,5 μg/ml vanilínu. 5.4. Analýza HPLC Chromatografický systém nechajte stabilizovať asi 30 minút. Injektujte štandardný roztok (5.3). Toto opakujte, pokým rozdiel v ploche píku alebo výške píku medzi dvomi následnými injekciami nedosiahne menej ako 2 %. V uvedených podmienkach je retenčný čas vanilínu približne 9 minút. Štandardný roztok (5.3) analyzujte duplicitne injektovaním 20 μl. Injektujte 20 μl testovacích roztokov (5.2). Stanovte plochu alebo výšku získaného vanilínového píku. Duplicitnú injektáž štandardného roztoku (5.3) opakujte po 10 injekciách testovacích vzoriek (5.2). 6. VÝPOČET VÝSLEDKOV Vypočítajte priemernú plochu píku (alebo výšku) (AC) píkov vanilínu spojených s duplicitnými injekciami pre každú dávku testovacích roztokov (spolu štyri plochy alebo výšky). Vypočítajte reakčný faktor (R): pričom CM je hmotnosť vanilínu v mg (4.5.1). Obsah (mg/kg) vanilínu (C) v testovacej vzorke je daný: pričom AS = plocha alebo výška píku vanilínu testovacej vzorky SM = hmotnosť testovacej vzorky v g (5.1.1., 5.1.2. alebo 5.1.3). Poznámka: Ak sa na vanilín analyzuje smotana, koncentrácia značkovacej látky sa vyjadruje ako mg značkovacej látky/kg mliečneho tuku. Tú dosiahnete vynásobením C faktorom 100/f. f je obsah tuku v smotane v percentách (m/m). 20 = faktor, v ktorom sú zohľadnené roztoky štandardnej a testovacej vzorky 0,96 = korekčný faktor pre obsah tuku v prvom roztoku testovacej vzorky Poznámka: Namiesto plochy píku sa môžu použiť výšky píku (pozri 8.3). 7. PRESNOSŤ METÓDY 7.1. Opakovateľnosť (r) Rozdiel medzi výsledkami dvoch analýz uskutočnených v rámci najkratšieho možného časového intervalu jedným analytikom s použitím rovnakých prístrojov na rovnakom testovacom materiáli nesmie presiahnuť 16 mg/kg. 7.2. Reprodukovateľnosť Rozdiel medzi výsledkami dvoch analýz uskutočnených analytikmi v rôznych laboratóriách s použitím rôznych prístrojov na rovnakom testovacom materiáli nesmie presiahnuť 27 mg/kg. 8. TOLERANČNÉ LIMITY 8.1. Na kontrolu homogénnosti sa odoberú tri vzorky z kontrolovaného výrobku. Značkovacia látka získaná buď z vanilky, alebo zo syntetického vanilínu 8.2.1. Miera vstrebávania 4-hydroxy-3-metoxybenzaldehydu je 250 g na tonu koncentrovaného masla alebo masla. Ak sa kontroluje smotana, miera vstrebávania je 250 g na tonu mliečneho tuku. 8.2.2. Na kontrolu miery a homogenity vstrebávania značkovacej látky sa použijú výsledky z troch vzoriek získané z analýzy výrobku a najnižší z týchto výsledkov sa porovná s týmito limitmi: — 220,8 mg/kg (95 % minimálnej miery vstrebávania), — 158,3 mg/kg (70 % minimálnej miery vstrebávania). Koncentrácia značkovacej látky vo vzorke s najnižším výsledkom sa používa v spojení s interpoláciou medzi 220,8 mg/kg a 158,3 mg/kg. Značkovacia látka získaná výlučne z vanilkových bôbov alebo ich integrálnych extraktov: 8.3.1. Miera vstrebávania pre 4-hydroxy-3-metoxybenzaldehyd je 100 g na tonu koncentrovaného masla alebo masla. Ak sa kontroluje smotana, miera vstrebávania je 100 g na tonu mliečneho tuku. 8.3.2. Na kontrolu miery a homogenity vstrebávania značkovacej látky sa použijú výsledky z troch vzoriek získané z analýzy výrobku a najnižší z týchto výsledkov sa porovná s týmito limitmi: — 78,3 mg/kg (95 % minimálnej miery vstrebávania), — 53,3 mg/kg (70 % minimálnej miery vstrebávania). Koncentrácia značkovacej látky vo vzorke s najnižším výsledkom sa používa v spojení s interpoláciou medzi 78,3 mg/kg a 53,3 mg/kg. 9. POZNÁMKY 9.1. Získanie pridaného vanilínu s hodnotou 250 mg/kg maslového oleja sa pohybuje medzi 97,0 a 103,8. Priemerný zistený obsah bol 99,9 % so štandardnou odchýlkou 2,7 %. 9.2. Štandardný roztok obsahuje 5 % extrakčného roztoku na kompenzáciu rozšírenia píku zapríčineného prítomnosťou 5 % extrakčného roztoku testovacích vzoriek. Toto umožňuje kvantifikáciu výškou píku. 9.3. Analýza je založená na lineárnej kalibračnej línii s nulovým prienikom. 9.4. Prostredníctvom vhodných roztokov štandardného roztoku (4.5.2) by sa linearita mala kontrolovať pri prvom vykonaní analýzy a potom v pravidelných intervaloch a po zmenách zariadenia HPLC alebo jeho oprave. Pôsobením vlastných enzýmov v nepasterizovanej smotane alebo vo výrobkoch z nej sa môže vanilín rozštiepiť na kyselinu vanilínovú, divanilín a ďalšie zložky.

PRÍLOHA VII (Článok 5) SPEKTROMETRICKÉ STANOVENIE ETYL-ESTERU KYSELINY BETA-APO-8'-KAROTÉNOVEJ V KONCENTROVANOM MASLE A MASLE 1. ROZSAH A OBLASŤ POUŽITIA V tejto časti sa opisuje postup na kvantitatívne určovanie obsahu etyl-esteru kyseliny beta-apo-8'-karoténovej (apokaroténový ester) v koncentrovanom masle a masle. Apokaroténový ester je súčtom všetkých látok prítomných v extrakte vzoriek získaných v podmienkach opísaných v metóde, ktoré absorbujú svetlo pri 440 nm. 2. PRINCÍP Maslový tuk sa rozpúšťa v ľahkej rope a absorpčná schopnosť sa meria pri 440 nm. Obsah apokaroténového esteru sa určuje podľa externého štandardu. 3. PRÍSTROJE 3.1. Pipety – so stupnicou, s objemom 0,25, 0,50, 0,75 a 1,0 ml 3.2. Spektrofotometer – vhodný na použitie pri 440 nm (a 447 – 449 nm) a vybavený kyvetami s dĺžkou optickej dráhy 1 cm 3.3. Odmerné banky, 20 ml a 100 ml 3.4. Analytické váhy s citlivosťou 0,1 mg, schopné vážiť na najbližší 1 mg, s odčítateľnosťou po 0,1 mg 3.5. Pec, 45 °C ± 1 °C 3.6. Rýchle filtre bez obsahu popola 4. REAGENTY Všetky reagenty musia mať schválenú analytickú kvalitu. Suspenzia apokaroténového esteru (približne 20 %) 4.1.1. Obsah suspenzie stanovte takto: Suspenziu zahrejte na 45 °C až 50 °C a homogenizujte v neotvorenej pôvodnej nádobe. Do odmernej banky (100 ml) odvážte približne 400 mg, rozpusťte v 20 ml chloroformu (4.4) a doplňte objem cyklohexánom (4.5). Rozrieďte 5 ml tohto roztoku cyklohexánom na 100 ml (roztok A). Rozrieďte 5 ml roztoku A cyklohexánom na 100 ml. Zmerajte absorpciu pri 447 – 449 nm (merajte maximum oproti cyklohexánu ako nulovej hodnote pomocou kyviet s dĺžkou optickej dráhy 1 cm). Obsah apokaroténového esteru P (%) = (Absmax × 40 000) / (Msusp × 2 550) alebo vývoj: (Absmax / 2 550) × (100/5) × (100/5) × (100/Msusp) Absmax = absorpcia meraného roztoku na maxime Msusp = hmotnosť suspenzie (g) 2 550 = referenčná hodnota Abs (1 %, 1 cm) P = čistota (obsahu) suspenzie (%) Poznámka: Suspenzia apokaroténového esteru je citlivá na vzduch, teplo a svetlo. V uzavretej pôvodnej nádobe (zapečatenej pod dusíkom) sa môže na chladnom mieste skladovať približne 12 mesiacov. Po otvorení treba obsah čo najrýchlejšie spotrebovať. 4.1.2. Štandardný roztok apokaroténového esteru, približne 0,2 mg/ml Odvážte na najbližší 1 mg približne 0,100 g suspenzie apokaroténového esteru (4.1.1) (W), rozpusťte ju v ropnom liehu (4.2), preložte do banky s objemom 100 ml a doplňte po značku ropným liehom. Tento roztok obsahuje (W × P)/10mg/ml apokaroténového esteru. Poznámka: Roztok sa musí skladovať na tmavom a chladnom mieste. Nepoužitý roztok po jednom mesiaci vyhoďte. 4.2. Ropný lieh (40 – 60 °C) 4.3. Síran sodný, bezvodný, granulárny, predtým sušený 2 hodiny pri teplote 102 °C 4.4. Chloroform 4.5. Cyklohexán 5. POSTUP 5.1. Príprava vzorky 5.1.1. Koncentrované maslo Roztopte vzorku v peci pri teplote približne 45 °C. 5.1.2. Maslo Vzorku roztopte v peci pri teplote približne 45 °C a reprezentatívne množstvo prefiltrujte cez filter obsahujúci približne 10 g bezvodného síranu sodného (4.3) v prostredí chránenom pred silným prirodzeným a umelým svetlom a so stálou teplotou 45 °C. Zozbierajte primerané množstvo maslového tuku. 5.2. Stanovenie obsahu Odvážte na najbližší 1 mg približne 1 g koncentrovaného masla [alebo extrahovaného maslového tuku (5.1.2)] (M). Preneste ho do 20 ml (V) odmernej banky pomocou ropného liehu, doplňte po značku a dôkladne premiešajte. Preneste primerané množstvo do 1 cm kyvety a zmerajte absorpciu pri 440 nm oproti nulovej hodnote ropného liehu. Koncentráciu apokaroténového esteru v roztoku získate z kalibračnej krivky (C μ/ml). 5.3. Kalibrácia Pipetujte 0, 0,25, 0,5, 0,75 a 1,0 ml štandardného roztoku apokaroténového esteru (4.1.2) do piatich 100 ml baniek. Roztok rozrieďte ropným liehom (4.2) a premiešajte. Približné koncentrácie roztoku siahajú od 0 do 2 μg/ml a vypočítavajú sa presne podľa koncentrácie štandardného roztoku (4.1.2) (W. × P) / 10 mg/ml. Absorpciu zmerajte pri 440 nm oproti nulovej hodnote ropného liehu (4.2). Hodnoty absorpcie preneste na os y oproti koncentráciám apokaroténového esteru na osi x. Vypočítajte rovnicu štandardnej krivky. 6. VÝPOČET VÝSLEDKOV 6.1. Obsah apokaroténového esteru vyjadrený v mg/kg výrobku sa vypočíta takto: Koncentrované maslo (C × V)/M Maslo 0,82 (C × V)M pričom C = obsah apokaroténového esteru v μg/ml, odvodený z kalibračného grafu (5.3) V = objem (ml) testovacieho roztoku (5.2) M = hmotnosť (g) dávky testovacej vzorky (5.2) 0,82 = korekčný faktor pre obsah maslového tuku v masle 7. PRESNOSŤ METÓDY 7.1. Opakovateľnosť 7.1.1. Analýza masla Rozdiel medzi výsledkami dvoch analýz uskutočnených v rámci najkratšieho možného časového intervalu jedným analytikom s použitím rovnakých prístrojov na rovnakom testovacom materiáli nesmie presiahnuť 1,4 mg/kg. 7.1.2. Analýzaq koncentrovaného masla Rozdiel medzi výsledkami dvoch analýz uskutočnených v rámci najkratšieho možného časového intervalu jedným analytikom s použitím rovnakých prístrojov na rovnakom testovacom materiáli nesmie presiahnuť 1,6 mg/kg. 7.2. Reprodukovateľnosť 7.2.1. Analýza masla Rozdiel medzi výsledkami dvoch analýz uskutočnených analytikmi v rôznych laboratóriách s použitím rôznych prístrojov na rovnakom testovacom materiáli nesmie presiahnuť 4,7 mg/kg. 7.3. Analýza koncentrovaného masla Rozdiel medzi výsledkami dvoch analýz uskutočnených analytikmi v rôznych laboratóriách s použitím rôznych prístrojov na rovnakom testovacom materiáli nesmie presiahnuť 5,3 mg/kg. 7.4. Zdroj údajov o presnosti Údaje o presnosti boli stanovené pokusom uskutočneným v roku 1995, na ktorom sa podieľalo 11 laboratórií a pri ktorom sa použilo 12 vzoriek (šesť slepých duplikátov) pre maslo a 12 vzoriek (šesť slepých duplikátov) pre koncentrované maslo. 8. TOLERANČNÉ LIMITY 8.1. Na kontrolu správneho obsahu značkovacej látky sa z výrobku obsahujúceho značkovaciu látku odoberú tri vzorky. 8.2. Maslo 8.2.1. Miera vstrebávania pri masle pri zohľadnení absorbancie pozadia je 22 mg/kg. 8.2.2. Na kontrolu miery a homogenity obsahu značkovacej látky sa použijú výsledky z troch vzoriek získané z analýzy výrobku a najnižší z týchto výsledkov sa porovná s týmito limitmi: — 17,7 mg/kg (95 % minimálnej miery vstrebávania), — 12,2 mg/kg (70 % minimálnej miery vstrebávania). Koncentrácia značkovacej látky vo vzorke s najnižším výsledkom sa používa v spojení s interpoláciou medzi 17,7 mg/kg a 12,2 mg/kg. 8.3. Koncentrované maslo 8.3.1. Miera vstrebávania koncentrovaného masla pri zohľadnení absorbancie pozadia je 24 mg/kg. Na kontrolu miery a homogenity obsahu značkovacej látky sa použijú výsledky z troch vzoriek získané z analýzy výrobku a najnižší z týchto výsledkov sa porovná s týmito limitmi: — 19,2 mg/kg (95 % minimálnej miery vstrebávania), — 13,2 mg/kg (70 % minimálnej miery vstrebávania). Koncentrácia značkovacej látky vo vzorke s najnižším výsledkom sa používa v spojení s interpoláciou medzi 19,2 mg/kg a 13,2 mg/kg.

PRÍLOHA VIII (Článok 5) STANOVENIE SITOSTEROLU ALEBO STIGMASTEROLU V MASLE ALEBO V KONCENTROVANOM MASLE KAPILÁRNOU PLYNOVOU CHROMATOGRAFIOU 1. ROZSAH A OBLASŤ POUŽITIA V tejto časti sa opisuje postup kvantitatívneho stanovenia obsahu sitosterolu alebo stigmasterolu v masle a koncentrovanom masle. Sitosterol predstavuje súčet beta-sitosterolu a 22 dihydro-beta-sitosterolu, ostatné sitosteroly sa považujú za nepodstatné. 2. PRINCÍP Maslo alebo koncentrované maslo sa zmydelnia hydroxidom draselným v etanolovom roztoku a nezmydeliteľná časť sa vyextrahuje dietyléterom. Steroly sa transformujú na trimetylsilyl-étery a analyzujú sa kapilárnou plynovou chromatografiou na základe internej normy/betulín. 3. PRÍSTROJE 3.1. 150 ml banka na zmydelňovanie vybavená kondenzátorom so spätným tokom so sklenenými spojmi 3.2. 500 ml separačné lieviky 3.3. 250 ml banky 3.4. Lieviky na vyrovnávanie tlaku s objemom 250 ml alebo podobné, na prebytočný dietyléter 3.5. Sklenený valec 350 mm × 20 mm, vybavený zátkou zo spečeného skla 3.6. Vodný kúpeľ alebo izoobal 3.7. Reakčné fioly 2 ml Plynový chromatograf vhodný na použitie s kapilárnou kolónou, vybavený rozdeľovacím systémom pozostávajúcim z: 3.8.1. termostatickej komory pre odmerné valce, ktorá je schopná udržiavať požadovanú teplotu s presnosťou na 1 °C; 3.8.2. vyparovacej jednotky s nastaviteľnou teplotou; 3.8.3. plameňového ionizačného detektora a konvertora – zosilňovača; 3.8.4. integrátora – zapisovača vhodného na použitie s konvertorom – zosilňovačom (3.8.3). 3.9. Kapilárna kolóna z taveného kremeňa celá pokrytá BP1 alebo ekvivalentom (alebo akákoľvek iná kolóna s minimálne rovnocenným rozlíšením) jednotnej hrúbky 0,25 μm; kolónou sa musia dať riediť trimetylsilyl-deriváty lanosterolu a sitosterolu. Vhodná je kolóna s dĺžkou 12 m a vnútorným priemerom 0,2 mm. 3.10. Mikrostriekačka na plynovú chromatografiu s tvrdenou ihlou a objemom 1 μl 4. REAGENTY Všetky reagenty musia mať schválenú analytickú kvalitu. Použitá voda musí byť destilovaná alebo mať aspoň ekvivalentnú čistotu. 4.1. Etanol, minimálne 95 % čistoty 4.2. Rozpusťte 600 g hydroxidu draselného (minimálne 85 %) vo vode a doplňte vodou do jedného litra na 60 % roztok hydroxidu draselného. Betulín, minimálne 99 % čistoty Roztoky betulínu v dietyléteri (4.4) 4.3.1.1. Koncentrácie betulínového roztoku používané na stanovenie obsahu sitosterolu by mali byť 1,0 mg/ml. 4.3.1.2. Koncentrácie betulínového roztoku používané na stanovenie obsahu stigmasterolu by mali byť 0,4 mg/ml. 4.4. Dietyléter analytickej čistoty (bez peroxidov alebo rezíduí) 4.5. Síran sodný, bezvodný, granulárny, predtým sušený dve hodiny pri teplote 102 °C 4.6. Silanizačný reagent, napríklad TRI-SIL (k dispozícii u Pierce Chemical Co, katalógové číslo 49001) alebo ekvivalent (dôležité: TRI-SIL je nehorľavý, toxický, korozívny a potenciálne karcinogénny. Laboratórni pracovníci musia byť oboznámení s bezpečnostnými údajmi TRI-SIL-u a musia prijať príslušné preventívne opatrenia.) 4.7. Lanosterol Sitosterol známej čistoty, nie menej ako 90 % (P) Poznámka 1: Čistota štandardných materiálov používaných na kalibráciu sa stanovuje metódou normalizácie. Predpokladom je, že všetky steroly prítomné vo vzorke sú prítomné na chromatograme, celková plocha vrcholov píkov predstavuje 100 % sterolových zložiek a reakcie detektora sú rovnaké na všetky steroly. Linearita systému sa musí overovať na základe daných rozpätí koncentrácií. 4.8.1. Sitosterolový štandardný roztok – pripravte roztok obsahujúci približne 0,5 mg/ml (W1) sitosterolu (4.8) odvážený na najbližší 0,001 mg/ml v dietyléteri (4.4). Stigmasterol známej čistoty, nie menej ako 90 % (P) 4.9.1. Stigmasterolový štandardný roztok – pripravte roztok obsahujúci približne 0,2 mg/ml (W1) stigmasterolu (4.9) (odvážený na najbližší 0,001 mg/ml) v dietyléteri (4.4). 4.10. Zmes na test rozlíšenia. Pripravte roztok obsahujúci 0,05 mg/ml lanosterolu (4.7) a 0,5 mg/ml sitosterolu (4.8) v dietyléteri (4.4). 5. METÓDA 5.1. Príprava štandardných roztokov na chromatografiu. Interný štandardný roztok (4.3.1) sa musí pridať do príslušného sterolového štandardného roztoku v rovnakom čase ako do zmydlenej vzorky (pozri 5.2.2). 5.1.1. Sitosterolový štandardný chromatographický roztok: do dvoch reakčných fiol (3.7) prelejte 1 ml sitosterolového štandardného roztoku (4.8.1) a dietyléter odstráňte prúdom dusíka. Pridajte 1 ml interného roztoku (4.3.1.1) a dietyléter odstráňte prúdom dusíka. 5.1.2. Stigmasterolový štandardný chromatographický roztok: do dvoch reakčných fiol (3.7) prelejte 1 ml stigmasterolového štandardného roztoku (4.9.1) a dietyléter odstráňte prúdom dusíka. Pridajte 1 ml interného štandardného roztoku (4.3.1.2) a dietyléter odstráňte prúdom dusíka. 5.2. Príprava nezmydliteľných častí 5.2.1. Roztopte vzorku masla pri teplote nepresahujúcej 35 °C, vzorku dôkladne premiešajte. Odvážte na najbližší 1 mg približne 1 g masla (W2) alebo koncentrovaného masla (W2) do 150 ml banky (3.1). Pridajte 50 ml etanolu (4.1) a 10 ml roztoku hydroxidu draselného (4.2). Pripevnite kondenzátor so spätným tokom a 30 minút zohrievajte na teplote približne 75 °C. Kondenzátor odpojte a banku ochlaďte približne na izbovú teplotu. 5.2.2. Ak sa stanovuje obsah sitosterolu, do banky pridajte 1,0 ml interného štandardného roztoku (4.3.1.1) alebo (4.3.1.2), ak sa stanovuje obsah stigmasterolu. Dôkladne premiešajte. Obsah banky prelejte do 500 ml separačného lievika (3.2), banku umyte v 50 ml vody a 250 ml dietyléteru (4.4). Separačný lievik dôkladne pretrepávajte dve minúty, aby sa vrstvy oddelili. Spodnú vodnatú vrstvu zlejte a éterovú vrstvu zmyte pretrepaním so štyrmi po sebe nasledujúcimi 100 ml dávkami vody. Poznámka 2: Na to, aby sa nevytvorila emulzia je dôležité, aby sa prvé dve dávky vody aplikovali jemne (10 okruhov). Tretia dávka sa môže dôkladne pretrepávať 30 sekúnd. Ak sa vytvorí emulzia, možno ju zničiť pridaním 5 – 10 ml etanolu. Ak sa pridáva etanol, treba vzorku dvakrát dôkladne pretrepať s vodou. 5.2.3. Čistú éterovú vrstvu bez mydla prelejte cez sklenený valec (3.5) obsahujúci 30 g bezvodného síranu sodného (4.5). Éter zberajte do 250 ml banky (3.3). Pridajte jednu protinárazovú granulu a nechajte vypariť takmer do sucha vo vodnom kúpeli alebo izoobale, pričom dbajte na to, aby ste zachytili odpadové rozpúšťadlá. Poznámka 3: Ak sa extrakty vzoriek vysušia úplne pri príliš vysokej teplote, môže dôjsť k stratám sterolu. 5.3. Príprava trimetylsilyl-éterov 5.3.1. Zvyšný éterový roztok prelejte z banky do 2 ml reakčnej fioly (3.7) s 2 ml dietyléteru a éter odstráňte použitím prúdu dusíka. Banku umyte dvomi ďalšími 2 ml dávkami dietyléteru, prelejte ho do fioly a éter zakaždým odstráňte dusíkom. 5.3.2. Vzorku silanizujte pridaním 1 ml TRI-SIL-u (4.6). Fiolu uzavrite a silne pretrepte, až sa obsah rozpustí. Ak sa nerozpustí úplne, ohrejte ho na 65 – 70 °C. Pred injektovaním do plynového chromatografu ho nechajte postáť aspoň päť minút. Štandardné roztoky silanizujte rovnako ako vzorky. Zmes na test rozlíšenia (4.10) silanizujte rovnakým spôsobom ako vzorky. Poznámka 4: Silanizácia sa musí uskutočniť v prostredí bez prítomnosti vody. Neúplná silanizácia betulínu sa prejaví ako druhý pík blízky píku betulínu. Silanizácii prekáža prítomnosť etanolu. K tomu môže dôjsť nedostatočným odstránením v extrakčnej fáze. Ak tento problém pretrváva, je v extrakčnej fáze potrebné vykonať piate premytie dôkladným pretrepaním počas 30 sekúnd. 5.4. Analýza plynovou chromatografiou 5.4.1. Vytvorenie pracovných podmienok Plynový chromatograf nastavte v súlade s pokynmi výrobcu. Orientačné prevádzkové podmienky sú takéto: — teplota kolóny: 265 °C — teplota injektora: 265 °C — teplota detektora: 300 °C — prietok nosného plynu: 0,6 ml/min. — tlak vodíka: 84 kPa — tlak vzduchu: 155 kPa — delenie vzorky: 10:1 až 50:1; pomer delenia musí byť optimalizovaný v súlade s pokynmi výrobcu a linearitou reakcie detektora a potom overený na základe daného rozpätia koncentrácií Poznámka 5: Osobitne dôležité je pravidelné čistenie lineru (vložky do injektora). — množstvo nastrekovanej substancie: 1 μl roztoku TMSE Pred začatím analýzy nechajte systém vyvážiť, aby ste dosiahli stabilnú reakciu. Tieto podmienky treba meniť podľa vlastností kolóny a plynového chromatografu na získanie chromatogramov, ktoré spĺňajú tieto kritériá: — Pík sitosterolu sa primerane odvodí z lanosterolu. Na obrázku 1 je znázornený typický chromatogram, ktorý sa získava zo silizovanej zmesi na test rozlíšenia (4.10). — Relatívne časy väzby týchto sterolov by mali byť približne: — cholesterol: 1,0 — stigmasterol: 1,3 — sitosterol: 1,5 — betulín: 2,5 — Čas väzby pre betulín by mal byť približne 24 minút. 5.4.2. Analytický postup Injektujte 1 μl silanizovaného štandardného roztoku (stigmasterolu alebo sitosterolu) a nastavte kalibračné parametre integrátora. Injektujte ďalší 1 μl silanizovaného štandardného roztoku na určenie reakčných faktorov vo vzťahu k betulínu. Injektujte 1 μl silanizovaného roztoku vzorky a odmerajte plochy píkov. Na začiatku a konci každej novej chromatografickej analýzy sa musí nastreknúť štandardný roztok. Dobrým usmernením je nastreknúť štandardný roztok po každých šiestich pokusných vzorkách. Poznámka 6: Integrácia píku stigmasterolu by mala zahŕňať všetky „chvosty píku“ (tailing) znázornené v bodoch 1, 2 a 3 na obrázku 2b. Pri posudzovaní celkového zastúpeného sitosterolu by integrácia píku sitosterolu mala zahŕňať plochu píku 22 dihydro-beta-sitosterolu (stigmastanol), ktorý sa eluuje ihneď po sitosterole (pozri obrázok 3b). 6. VÝPOČET VÝSLEDKOV 6.1. Určte plochu píkov sterolov a betulínu v obidvoch štandardných roztokoch na začiatku a konci každého kola a vypočítajte R1: R1 = (priemerná plocha píkov sterolu v štandardnom roztoku)/(priemerná plocha píkov betulínu v štandardnom roztoku) Určte plochu píku sterolu (stigmasterol alebo sitosterol) a píku betulínu vo vzorke a vypočítajte R2: R2 = (plocha píkov sterolu vo vzorke)/(plocha píkov betulínu vo vzorke) W1 = obsah sterolu v štandardnom roztoku (mg) obsiahnutého v 1 ml štandardného roztoku (4.8.1 alebo 4.9.1) W2 = hmotnosť vzorky (g) (5.2.1) P = čistota štandardného sterolu (4.8 alebo 4.9) Obsah sterolu vo vzorke (mg/kg) = ((R 2)/(R 1)) × ((W 1)/(W 2)) × P × 10 7. PRESNOSŤ METÓDY 7.1. Maslo 7.1.1. Opakovateľnosť 7.1.1.1. Stigmasterol Rozdiel medzi výsledkami dvoch analýz uskutočnených v rámci najkratšieho možného časového intervalu jedným analytikom s použitím rovnakých prístrojov na rovnakom testovacom materiáli nesmie presiahnuť 19,3 mg/kg. 7.1.1.2. Sitosterol Rozdiel medzi výsledkami dvoch analýz uskutočnených v rámci najkratšieho možného časového intervalu jedným analytikom s použitím rovnakých prístrojov na rovnakom testovacom materiáli nesmie presiahnuť 23,0 mg/kg. 7.1.2. Reprodukovateľnosť 7.1.2.1. Stigmasterol Rozdiel medzi výsledkami dvoch analýz uskutočnených analytikmi v rôznych laboratóriách s použitím rôznych prístrojov na rovnakom testovacom materiáli nesmie presiahnuť 31,9 mg/kg. 7.1.2.2. Sitosterol Rozdiel medzi výsledkami dvoch analýz uskutočnených analytikmi v rôznych laboratóriách s použitím rôznych prístrojov na rovnakom testovacom materiáli nesmie presiahnuť 8,7 % v pomere k strednej hodnote analýzy. 7.1.3. Zdroj údajov o presnosti Údaje o presnosti boli stanovené pokusom uskutočneným v roku 1992, na ktorom sa podieľalo osem laboratórií a použilo šesť vzoriek (tri slepé duplikáty) pre stigmasterol a šesť vzoriek (tri slepé duplikáty) pre sitosterol. 7.2. Koncentrované maslo 7.2.1. Opakovateľnosť 7.2.1.1. Stigmasterol Rozdiel medzi výsledkami dvoch analýz uskutočnených v rámci najkratšieho možného časového intervalu jedným analytikom s použitím rovnakých prístrojov na rovnakom testovacom materiáli nesmie presiahnuť 10,2 mg/kg. 7.2.1.2. Sitosterol Rozdiel medzi výsledkami dvoch analýz uskutočnených v rámci najkratšieho možného časového intervalu jedným analytikom s použitím rovnakých prístrojov na rovnakom testovacom materiáli nesmie presiahnuť 3,6 % v pomere k strednej hodnote analýzy. 7.2.2. Reprodukovateľnosť 7.2.2.1. Stigmasterol Rozdiel medzi výsledkami dvoch analýz uskutočnených analytikmi v rôznych laboratóriách s použitím rôznych prístrojov na rovnakom testovacom materiáli nesmie presiahnuť 25,3 mg/kg. 7.2.2.2. Sitosterol Rozdiel medzi výsledkami dvoch analýz uskutočnených analytikmi v rôznych laboratóriách s použitím rôznych prístrojov na rovnakom testovacom materiáli nesmie presiahnuť 8,9 % v pomere k strednej hodnote analýzy. 7.2.3. Zdroj údajov o presnosti Údaje o presnosti boli stanovené pokusom uskutočneným v roku 1991, na ktorom sa podieľalo deväť laboratórií a použilo šesť vzoriek (tri slepé duplikáty) pre stigmasterol a šesť vzoriek (tri slepé duplikáty) pre sitosterol. 8. TOLERANČNÉ LIMITY 8.1. Na kontrolu správneho obsahu značkovacej látky sa z výrobku obsahujúceho značkovaciu látku odoberú tri vzorky obsahujúce značkovaciu látku. 8.2. Maslo 8.2.1. Stigmasterol 8.2.1.1. Miera vstrebávania pre stigmasterol je 150 g najmenej 95 % čistého stigmasterolu na tonu masla, t. j. 142,5 mg/kg, alebo 170 g najmenej 85 % čistého stigmasterolu na tonu masla, t. j. 144,5 mg/kg. 8.2.1.2. Na kontrolu miery a homogenity obsahu značkovacej látky sa použijú výsledky z troch vzoriek získané z analýzy výrobku a najnižší z týchto výsledkov sa porovná s týmito limitmi: — 115,8 mg/kg (95 % minimálnej miery vstrebávania pre 95 % čistý stigmasterol), — 117,7 mg/kg (95 % minimálnej miery vstrebávania pre 85 % čistý stigmasterol), — 80,1 mg/kg (70 % minimálnej miery vstrebávania pre 95 % čistý stigmasterol), — 81,5 mg/kg (70 % minimálnej miery vstrebávania pre 85 % čistý stigmasterol). Koncentrácia značkovacej látky vo vzorke s najnižším výsledkom sa používa v spojení s interpoláciou medzi 115,8 mg/kg a 80,1 mg/kg alebo 117,7 mg/kg a 81,5 mg/kg. 8.2.2. Sitosterol 8.2.2.1. Miera vstrebávania pre sitosterol je 600 g najmenej 90 % čistého sitosterolu na tonu masla, t. j. 540 mg/kg. 8.2.2.2. Na kontrolu miery a homogenity obsahu značkovacej látky sa použijú výsledky z troch vzoriek získané z analýzy výrobku a najnižší z týchto výsledkov sa porovná s týmito limitmi: — 482,6 mg/kg (95 % minimálnej miery vstrebávania pre 90 % čistý sitosterol), — 347,6 mg/kg (70 % minimálnej miery vstrebávania pre 90 % čistý sitosterol). Koncentrácia značkovacej látky vo vzorke s najnižším výsledkom sa používa v spojení s interpoláciou medzi 482,6 mg/kg a 347,6 mg/kg. 8.3. Koncentrované maslo 8.3.1. Stigmasterol 8.3.1.1. Miera vstrebávania pre stigmasterol je 150 g najmenej 95 % čistého stigmasterolu na tonu koncentrovaného masla, t. j. 142,5 mg/kg, alebo 170 g najmenej 85 % čistého stigmasterolu na tonu koncentrovaného masla, t. j. 144,5 mg/kg 8.3.1.2. Na kontrolu miery a homogenity obsahu značkovacej látky sa použijú výsledky z troch vzoriek získané z analýzy výrobku a najnižší z týchto výsledkov sa porovná s týmito limitmi: — 118,5 mg/kg (95 % minimálnej miery vstrebávania pre 95 % čistý stigmasterol), — 120,4 mg/kg (95 % minimálnej miery vstrebávania pre 85 % čistý stigmasterol), — 82,9 mg/kg (70 % minimálnej miery vstrebávania pre 95 % čistý stigmasterol), — 84,3 mg/kg (70 % minimálnej miery vstrebávania pre 85 % čistý stigmasterol). Koncentrácia značkovacej látky vo vzorke s najnižším výsledkom sa používa v spojení s interpoláciou medzi 118,5 mg/kg a 82,9 mg/kg alebo 120,4 mg/kg a 84,3 mg/kg. 8.3.2. Sitosterol 8.3.2.1. Miera vstrebávania pre sitosterol je 600 g najmenej 90 % čistého sitosterolu na tonu masla, t. j. 540 mg/kg. 8.3.2.2. Na kontrolu miery a homogenity obsahu značkovacej látky sa použijú výsledky z troch vzoriek získané z analýzy výrobku a najnižší z týchto výsledkov sa porovná s týmito limitmi: — 480,9 mg/kg (95 % minimálnej miery vstrebávania pre 90 % čistý sitosterol), — 345,9 mg/kg (70 % minimálnej miery vstrebávania pre 90 % čistý sitosterol). Koncentrácia značkovacej látky vo vzorke s najnižším výsledkom sa používa v spojení s interpoláciou medzi 480,9 mg/kg a 345,9 mg/kg. Obrázok 1 Chromatogram rozlíšenia testovacej zmesi Uprednostňuje sa úplné rozlíšenie, t. j. pík lanosterolu sa musí vrátiť k základnej línii predtým, ako sa vyznačí pík sitosterolu, neúplné rozlíšenie je však prijateľné tiež. Obrázok 2a Obrázok 2b Štandardný roztok stigmasterolu Vzorka masla denaturovaná stigmasterolom Poznámka: Integrácia píkov stigmasterolu by mala obsahovať všetky prípadné „chvosty píku“ (tailings) znázornené v bodoch 1, 2 a 3. Obrázok 3a Obrázok 3b Štandardný roztok sitosterolu Vzorka masla denaturovaná β-sitosterolom Poznámka: β-sitosterol často obsahuje nečistotu (určuje sa ako stigmastanol), ktorá sa eluuje bezprostredne po β-sitosterole. Plochy týchto dvoch píkov by sa pri posúdení zastúpeného β-sitosterolu mali spočítať.

PRÍLOHA IX (Článok 6) REFERENČNÁ METÓDA ZISŤOVANIA KRAVSKÉHO MLIEKA A KAZEINÁTU V SYROCH VYROBENÝCH Z OVČIEHO MLIEKA, KOZIEHO MLIEKA ALEBO BYVOLIEHO MLIEKA, ALEBO ZO ZMESÍ KOZIEHO, OVČIEHO A BYVOLIEHO MLIEKA 1. ROZSAH Zisťovanie kravského mlieka a kazeinátu v syroch vyrobených z ovčieho mlieka, kozieho mlieka alebo byvolieho mlieka, alebo zo zmesí kozieho, ovčieho a byvolieho mlieka izoelektrickým zaostrovaním γ-kazeínov po plazminolýze. 2. OBLASŤ POUŽITIA Metóda je vhodná na citlivé a špecifické zisťovanie prírodného a tepelne upraveného mlieka a kazeinátu v čerstvých a zrejúcich syroch vyrobených z ovčieho mlieka, kozieho mlieka alebo byvolieho mlieka a zo zmesí kozieho, ovčieho a byvolieho mlieka. Nie je vhodná na zisťovanie falšovania mlieka a syra koncentrátmi tepelne upravených srvátkových proteínov z kravského mlieka. 3. PRINCÍP METÓDY 3.1. Izolácia kazeínov zo syra a referenčných štandardných vzoriek 3.2. Rozpustenie izolovaných kazeínov a vystavenie plazmínovému (EC.3.4.21.7) oddeľovaniu 3.3. Izoelektrické zaostrovanie plazmínovaných kazeínov za prítomnosti močoviny a farbenie proteínov 3.4. Hodnotenie zafarbených γ3 a γ2-kazeínových vzorov (dôkaz prítomnosti kravského mlieka) porovnaním vzoru získaného zo vzorky s vzormi získanými z rovnakého gélu z referenčných štandardných roztokov obsahujúcich 0 % a 1 % kravského mlieka 4. REAGENTY Ak nie je uvedené inak, musia sa použiť chemikálie analytickej kvality. Voda musí byť dvojnásobne destilovaná alebo ekvivalentnej čistoty. Poznámka: Tieto údaje sa vzťahujú na laboratórne vyrobené polyakrylamidové gély obsahujúce močovinu z rozmermi 265 × 125 × 0,25 mm. Ak sa použije iná veľkosť a typ gélov, môže byť potrebná úprava podmienok separácie. Izoelektrické zaostrovanie 4.1. Reagenty pre výrobu polyakrylamidových gélov obsahujúcich močovinu 4.1.1. Zásobný gélový roztok Rozpusťte: 4,85 g akrylamidu 0,15 g N, N'-metyléndiakrylamidu 48,05 g močoviny 15 g glycerolu (87 % w/w) vo vode, doplňte vodou do 100 ml a uskladnite vo fľaši z hnedého skla v chladničke. Poznámka: Namiesto uvedených pevne stanovených hmotností neurotoxických akrylamidov možno použiť predmiešaný roztok akrylamidu/BIS dostupný v predaji. Ak takýto roztok obsahuje 30 % w/v akrylamidu a 0,8 % w/v BIS, namiesto uvedených presne stanovených hmotností sa na vytvorenie roztoku musí použiť 16,2 ml. Trvanlivosť zásobného roztoku je maximálne 10 dní; ak je jeho vodivosť väčšia ako 5 μS, deionizujte ho miešaním s 2 g amberlitu MB-3 počas 30 minút, a potom ho prefiltrujte cez membránu s hrúbkou 0,45 μm. 4.1.2. Gélový roztok G