PRÍLOHA I

Schéma testov, ktoré sa majú vykonávať podľa článkov 3, 4, 5 a 7

1. VŠEOBECNÉ ZÁSADY TÝKAJÚCE SA VÝSKYTU ŠPECIFIKOVANÉHO ŠKODCU

1.1. Podozrenie na výskyt špecifikovaného škodcu existuje vtedy, ak sa v prvom detekčnom teste vykonanom na špecifikovanej rastline alebo na vzorkách vody získa pozitívny výsledok.

1.2. Výskyt špecifikovaného škodcu je potvrdený v týchto prípadoch: a) ak prvým alebo druhým detekčným testom je selektívna izolácia, ktorej výsledkom sú kolónie s typickou morfológiou, a pozitívne výsledky sa získajú v dvoch identifikačných testoch vykonaných na kolóniách; b) ak prvým a druhým testom sú iné testy ako selektívna izolácia a pozitívne výsledky sa získajú v dvoch identifikačných testoch po tom, ako bola vzorka podrobená selektívnej izolácii, ktorej výsledkom sú kolónie s typickou morfológiou. Jedným z týchto dvoch identifikačných testov je test uvedený v bode 2.2 písm. e), f) a g).

2. TESTY

2.1. Detekčné testy

Detekčné testy musia byť také, aby dôsledne detegovali najmenej 104 buniek/ml resuspendovaného peletu získaného z asymptomatických vzoriek.

Druhý detekčný test musí byť založený na odlišných biologických princípoch alebo iných oblastiach nukleotidov ako prvý detekčný test.

Detekčné testy sú tieto:

a) testy fluorescenčnými protilátkami, ako sú opísané v medzinárodných diagnostických normách;

b) izolácia špecifikovaného škodcu na semiselektívnom rastovom médiu mSMSA, ako je opísaná v medzinárodných diagnostických normách;

c) štandardný test PCR s použitím primerov Pastrik et al. (2002) (1), ako je opísaný v medzinárodných diagnostických normách;

d) testy PCR v reálnom čase TaqMan®, pri ktorých sa používajú tieto primery a sondy: i) Weller et al. (2000) (2), ako sú opísané v medzinárodných diagnostických normách; ii) Vreeburg et al. (2016) (3) [s použitím sondy TaqMan® zmenenej z pôvodnej sondy opísanej v publikácii od Wellera et al. (2000)], ako sú opísané v medzinárodných diagnostických normách; iii) Vreeburg et al. (2018) (4) (tzv. test NYtor), ako sú opísané v medzinárodných diagnostických normách; iv) Massart et al. (2014) (5), ako sú opísané v medzinárodných diagnostických normách;

e) test LAMP (cyklická izotermálna amplifikácia) s použitím primerov Lenarčič et al. (2014) (6) (iba pre symptomatický rastlinný materiál), ako sa opisuje v medzinárodných diagnostických normách.

2.2. Identifikačné testy

Identifikačné testy sú tieto:

a) testy fluorescenčnými protilátkami, ako sú opísané v medzinárodných diagnostických normách;

b) štandardné testy PCR s použitím primerov Pastrik et al. (2002), ako sú opísané v medzinárodných diagnostických normách;

c) testy PCR v reálnom čase TaqMan®, pri ktorých sa používajú tieto primery a sondy: i) Weller et al. (2000), ako sú opísané v medzinárodných diagnostických normách; ii) Vreeburg et al. (2016) [s použitím sondy TaqMan® zmenenej z pôvodnej sondy opísanej v publikácii od Wellera et al. (2000)], ako sú podrobne opísané v medzinárodných diagnostických normách; iii) Vreeburg et al. (2018) (tzv. test NYtor), ako sú opísané v medzinárodných diagnostických normách; iv) Massart et al. (2014), ako sú opísané v medzinárodných diagnostických normách;

d) test LAMP (cyklická izotermálna amplifikácia) s použitím primerov Lenarčič et al. (2014), ako sa opisuje v medzinárodných diagnostických normách.

e) štandardný multiplexový test PCR pre konkrétny fylotyp [Opina et al. (1997) (7); Fegan & Prior (2005) (8)], ako je opísaný v medzinárodných diagnostických normách;

f) čiarové kódovanie DNA [Wicker et al. (2007) (9)], ako je opísané v medzinárodných diagnostických normách;

g) hmotnostná spektrometria MALDI-TOF [van de Bilt et al. (2018) (10)], ako je opísaná v medzinárodných diagnostických normách;

3. VÝVOJOVÉ DIAGRAMY POSTUPOV

Vývojový diagram č. 1: Diagnostický postup na zistenie prítomnosti špecifikovaného škodcu vo vzorkách zo špecifikovanej rastliny.

a) Izolácia sa môže použiť ako prvý alebo druhý detekčný test. Ak existuje podozrenie na výskyt špecifikovaného škodcu na rastovom médiu, kolónie sa musia prečistiť, aby sa získali čisté kultúry, na ktorých sa musia vykonať dva identifikačné testy.

b) Jedným z týchto dvoch identifikačných testov je test uvedený v bode 2.2 písm. e), f) a g). Na potvrdenie výskytu škodcu sa vyžadujú pozitívne výsledky v dvoch identifikačných testoch.

c) Tretí detekčný test musí byť založený na odlišných biologických princípoch alebo iných oblastiach nukleotidov.

Vývojový diagram č. 2: Diagnostický postup v prípade špecifikovaného škodcu vo vzorkách vody.

a) Jedným z týchto dvoch identifikačných testov je test uvedený v bode 2.2 písm. e), f) a g). Na potvrdenie výskytu škodcu sa vyžadujú pozitívne výsledky v dvoch identifikačných testoch.

4. PRÍPRAVA VZORKY

4.1. Vzorky z asymptomatických hľúz

Štandardná veľkosť vzoriek má obsahovať 200 hľúz na test. Vhodný laboratórny postup na spracovanie výrezkov pupkových koncov na získanie extraktu na zistenie prítomnosti špecifikovaného škodcu je opísaný v medzinárodných diagnostických normách.

4.2. Vzorky z asymptomatických špecifikovaných rastlín

Zistenie latentných infekcií sa vykonáva na súhrnných vzorkách kmeňových segmentov alebo spodných častí listov. Postup sa môže uplatniť až na 200 častí stoniek alebo 200 spodných častí listov z rôznych rastlín v jednej vzorke. Vhodný laboratórny postup na dezinfekciu a spracovanie stoniek a spodných častí listov na získanie extraktu na zistenie prítomnosti špecifikovaného škodcu je opísaný v medzinárodných diagnostických normách.

4.3. Vzorky zo symptomatického materiálu špecifikovaných rastlín

Rezy tkaniva sa asepticky odstránia z prstenca cievnych zväzkov v hľuze zemiaka alebo z cievnych pletív stonky špecifikovaných rastlín vykazujúcich symptómy vädnutia. Vhodný laboratórny postup na spracovanie týchto tkanív na získanie extraktu na zistenie prítomnosti špecifikovaného škodcu je podrobne opísaný v medzinárodných diagnostických normách.

4.4. Vzorky povrchovej alebo recirkulačnej vody (vrátane spracovania zemiakov alebo splaškovej odpadovej vody)

Hlavným testom na zistenie prítomnosti špecifikovaného škodcu vo vzorkách povrchovej vody, vody z recirkulačných systémov a vo vzorkách odpadovej vody (odvetvie spracovania zemiakov) je selektívna izolácia. Vhodný laboratórny postup na spracovanie vzoriek vody je opísaný v medzinárodných diagnostických normách.

(1) Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G., Pukall, R. (2002) Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831 – 842.

(2) Weller, S.A, Elphinstone, J.G., Smith, N., Boonham, N., Stead, D.E. (2000). Detection of Ralstonia solanacearum strains with a quantitative, multiplex, real-time, fluorogenic PCR (TaqMan) assay. Applied and Environmental Microbiology, 66, 2853–2858. https://journals.asm.org/doi/10.1128/AEM.66.7.2853-2858.2000.

(3) Vreeburg, R.A.M., Bergsma-Vlami, M., Bollema, R.M., de Haan, E.G., Kooman-Gersmann, M., Smits-Mastebroek, L., Tameling, W.I.L., Tjou-Tam-Sin, N.N.A., van de Vossenberg B.T.L.H, Janse, J.D. (2016). Performance of real-time PCR and immunofluorescence for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and Ralstonia solanacearum in potato tubers in routine testing. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 46, 112 – 121.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach. EPPO Bulletin 48, 86 – 96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay. European Journal of Plant Pathology 138, 29 – 37.

(6) Lenarčič, R., Morisset, D., Pirc, M., Llop, P., Ravnikar, M., Dreo, T. (2014). Loop-mediated isothermal amplification of specific endoglucanase gene sequence for detection of the bacterial wilt pathogen Ralstonia solanacearum. PLoS ONE 9(4), e96027. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096027.

(7) Opina, N., Tavner, F., Holloway, G., Wang, J.F., Li, T.H., Maghirang, R., Fegan, M., Hayward, A.C., Viji Krishnapillai, A., Wai-Foong Hong, Holloway, B.W, Timmis, J.N. (1997). A novel method for development of species and strainspecific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 5, 19 – 30.

(8) Fegan, M., Prior, P. (2005). How complex is the „Ralstonia solanacearum species complex“. In Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex (eds Allen C, Hayward AC & Prior P), s. 449 – 461. American Phytopathological Society, St Paul, MN (US).

(9) Wicker, E., Grassart, L., Coranson-Beaudu, R., Mian, D., Guilbaud, C., Fegan, M., Prior, P. (2007). Ralstonia solanacearum strains from Martinique French West Indies) exhibiting a new pathogenic potential. Applied and Environmental Microbiology 73, 6790 – 6801.

(10) van de Bilt, J.L.J., Wolsink, M.H.L., Gorkink-Smits, P.P.M.A., Landman, N.M., Bergsma-Vlami, M. (2018). Application of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry for rapid and accurate identification of Ralstonia solanacearum and Ralstonia pseudosolanacearum. European Journal of Plant Pathology, https://doi.org/10.1007/s10658-018-1517-5.