Smernica Komisie 2004/73/ES

z 29. apríla 2004,

ktorou sa po dvadsiaty deviatykrát technickému pokroku prispôsobuje smernica Rady 67/548/EHS o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení týkajúcich sa klasifikácie, balenia a označovania nebezpečných látok

(Text s významom pre EHP)

KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV,

so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spoločenstva,

so zreteľom na smernicu Rady 67/548/EHS z 27. júna 1967 o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení týkajúcich sa klasifikácie, balenia a označovania nebezpečných látok [1], a najmä na jej článok 28,

keďže:

(1) Príloha I k smernici 67/548/EHS obsahuje zoznam nebezpečných látok spolu s podrobnými údajmi o klasifikácii a označovaní každej látky. Tento zoznam je potrebné aktualizovať s cieľom zahrnúť ďalšie notifikované nové látky a ďalšie existujúce látky, ako aj prispôsobiť existujúce zápisy technickému pokroku, ako je stanovenie limitných hodnôt pre koncentrácie v životnom prostredí pre určité látky. V súlade s tým je tiež potrebné zápisy určitých látok vypustiť a niektoré zápisy rozdeliť, pretože v týchto zápisoch sa klasifikácia na všetky látky už neuplatňuje. Označenie látok, ktoré obsahujú 1,3-butadién, by sa malo zmeniť s cieľom vyjadriť, že táto smernica bude túto látku klasifikovať ako mutagén.

(2) Príloha V k smernici 67/548/EHS ustanovuje metódy na stanovenie fyzikálno-chemických vlastností, toxicity a ekotoxicity látok a prípravkov. Uvedenú prílohu je potrebné zmeniť a doplniť, aby sa počet zvierat, používaných na experimentálne účely, znížil na minimum, v súlade so smernicou Rady 86/609/EHS z 24. novembra 1986 o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení členských štátov týkajúcich sa ochrany zvierat používaných na experimentálne a iné vedecké účely [2]. Na základe toho by sa mali revidovať metódy pre subchronickú orálnu toxicitu v kapitolách B.1, B.4, B.5, B.31 a B.35. Okrem toho kapitola B.42 by sa mala pridať k prílohe V, aby sa sprístupnila vylepšená metóda na subchronickú orálnu toxicitu. Nakoniec, mali by sa pridať kapitola A.21 o fyzikálno-chemických vlastnostiach, kapitola B.43 o subchronickej orálnej toxicite a kapitoly C.21 až C.24 o environmentálnej toxicite, aby sa umožnilo stanovenie vlastností, ktoré zatiaľ nie sú dostatočné pokryté metódami v prílohe V.

(3) Opatrenia ustanovené v tejto smernici sú v súlade so stanoviskom Výboru na prispôsobenie technickému pokroku smerníc na odstránenie technických prekážok obchodu s nebezpečnými látkami a prípravkami,

PRIJALA TÚTO SMERNICU:

Článok 1

Smernica 67/548/EHS sa mení a dopĺňa takto:

1. Príloha I sa mení a dopĺňa takto:

a) poznámka K v predslove sa nahrádza znením uvedeným v prílohe 1A;

b) zápisy zodpovedajúce zápisom uvedeným v prílohe 1B k tejto smernici sa nahrádzajú znením, ktoré je uvedené v uvedenej prílohe;

c) zápisy uvedené v prílohe 1C k tejto smernici sa vkladajú v súlade s poradím zápisov uvedeným v prílohe I k smernici 67/548/EHS;

d) zápisy s indexovými číslami 604-050-00-X, 607-050-00-8, 607-171-00-6 a 613-130-00-3 sa vypúšťajú;

e) zápis s indexovým číslom 048-002-00-0 sa nahrádza zápismi s indexovými číslami 048-002-00-0 a 048-011-00-X, ktoré sú uvedené v prílohe 1D k tejto smernici;

f) zápis s indexovým číslom 609-006-00-3 sa nahrádza zápismi s indexovými číslami 609-006-00-3 a 609-065-00-5, ktoré sú uvedené v prílohe 1D k tejto smernici;

g) zápis s indexovým číslom 612-039-00-6 sa nahrádza zápismi s indexovými číslami 612-039-00-6 a 612-207-00-9, ktoré sú uvedené v prílohe 1D.

2. Príloha V sa mení a dopĺňa takto:

a) znenie uvedene v prílohe 2A k tejto smernici sa pridáva ako kapitola A.21;

c) kapitola B.1 bis sa nahrádza znením uvedeným v prílohe 2B k tejto smernici;

c) kapitola B.1 tris sa nahrádza znením uvedeným v prílohe 2C k tejto smernici;

d) kapitola B.4 sa nahrádza znením uvedeným v prílohe 2D k tejto smernici;

e) kapitola B.5 sa nahrádza znením uvedeným v prílohe 2E k tejto smernici;

f) kapitola B.31 sa nahrádza znením uvedeným v prílohe 2F k tejto smernici;

g) kapitola B.35 sa nahrádza znením uvedeným v prílohe 2G k tejto smernici;

h) text uvedený v prílohe 2H k tejto smernici sa pridáva ako kapitola A.42 a B.43;

i) text uvedený v prílohe 2I k tejto smernici sa pridáva ako kapitola C.21 a C.24.

Článok 2

1. Členské štáty prijmú zákony, iné právne predpisy a správne opatrenia potrebné na dosiahnutie súladu s touto smernicou najneskôr do 31. októbra 2005. Bezodkladne informujú Komisiu o znení týchto ustanovení a o korelačnej tabuľke medzi týmito ustanoveniami a touto smernicou. Členské štáty uvedú priamo v prijatých opatreniach alebo pri ich úradnom uverejnení odkaz na túto smernicu. Podrobnosti o odkaze upravia členské štáty.

2. Členské štáty oznámia Komisii znenie základných ustanovení vnútroštátnych právnych predpisov, ktoré prijmú v oblasti pôsobnosti tejto smernice.

Článok 3

Táto smernica nadobúda účinnosť dvadsiatym dňom po jej zverejnení v Úradnom vestníku Európskej únie.

Článok 4

Táto smernica je určená členským štátom.

V Bruseli 29. apríla 2004

Za Komisiu

Margot Wallström

členka Komisie

[1] Ú. v. ES L 196, 16.8.1967, s. 1. Smernica naposledy zmenená a doplnená nariadením (ES) č. 807/2003 (Ú. v. EÚ L 122, 16.5.2003, s. 36).

[2] Ú. v. ES L 358, 18.12.1986, s. 1. Smernica naposledy zmenená a doplnená smernicou 2003/65/ES Európskeho parlamentu a Rady (Ú. v. EÚ L 230, 16.9.2003, s. 32).

--------------------------------------------------

PRÍLOHA 1A

"Poznámka K:

Klasifikácia ako karcinogén alebo mutagén sa nemusí uplatňovať, ak je možné preukázať, že látka obsahuje menej ako 0,1 % hmotnostných buta-1,3-diénu (číslo EINECS 203-450-8). Ak látka nie je klasifikovaná ako karcinogén alebo mutagén, potom je potrebné uviesť aspoň S-vety: (2-)9-16. Táto poznámka platí pre určité komplexné ropné deriváty, ktoré sú uvedené v prílohe I."

--------------------------------------------------

PRÍLOHA 2A

A.21. OXIDAČNÉ VLASTNOSTI (KVAPALINY)

1. METÓDA

1.1 ÚVOD

Táto metóda je určená na meranie potenciálu kvapalnej látky zvýšiť rýchlosť alebo intenzitu horenia horľavej látky alebo tvoriť s horľavou látkou zmes, ktorá sa samovoľne vznieti, keď sa obe látky dôkladne zmiešajú. Zakladá sa na teste OSN pre oxidujúce kvapaliny (1) a je s ním rovnocenná. Metóda A.21 je však určená predovšetkým na splnenie požiadaviek smernice 67/548, vyžaduje sa však porovnanie iba s jednou referenčnou látkou. Ak sa očakáva, že výsledky testu sa použijú na iné účely, môže byť potrebné testovanie a porovnanie s ďalšími referenčnými látkami [1].

Tento test nie je potrebné vykonať, ak sa na základe posúdenia štruktúrneho vzorca nepochybne potvrdí, že látka nie je schopná s horľavým materiálom exotermicky reagovať.

Pred uskutočnením testu je užitočné mať predbežné informácie o akýchkoľvek potenciálnych výbušných vlastnostiach látky.

Tento test nie je vhodný pre tuhé látky, plyny, výbušné alebo veľmi horľavé látky, alebo organické peroxidy.

Ak sú pre testovanú látku už dostupné výsledky testu OSN pre oxidujúce kvapaliny, tento test sa nemusí vykonať (1).

1.2 DEFINÍCIE A JEDNOTKY

Priemerný čas zvýšenia tlaku je priemerná hodnota nameraných časov, počas ktorých testovaná zmes spôsobí zvýšenie tlaku od 690 kPa do 2070 kPa nad atmosférický tlak.

1.3 REFERENČNÁ LÁTKA

Ako referenčná látka sa používa vodný roztok kyseliny dusičnej (65 hmotn. %, čistota p.a. - analyticky čistý) [2].

Nepovinne, ak experimentátor predpokladá, že výsledky tejto skúšky sa môžu prípadne použiť na iné účely [3], môže sa tiež vykonať skúška ďalších referenčných látok [4].

1.4 PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY

Kvapalina, ktorá sa má testovať, sa zmieša s vláknitou celulózou v hmotnostnom pomere 1:1 a zmes sa nadávkuje do tlakovej nádoby. Ak počas zmiešavania alebo dávkovania nastane samovoľné vznietenie, ďalšie testovanie nie je potrebné.

Ak samovznietenie nenastane, vykoná sa celý test. Zmes sa v tlakovej nádobe zahrieva a stanoví sa priemerný čas zvýšenia tlaku od 690 kPa do 2070 kPa nad atmosférický tlak. Tento čas sa porovná s priemerným časom zvýšenia tlaku pre zmes referenčnej látky (referenčných látok) a celulózy (1:1).

1.5 KRITÉRIÁ KVALITY

V sérii piatich pokusov na jedenej látke by sa ani jeden výsledok nemal odlišovať od aritmetického priemeru o viac ako 30 %. Výsledky, ktoré sa odlišujú od priemeru o viac ako 30 %, sa vylúčia, zdokonalí sa postup zmiešavania a dávkovania a testovanie sa zopakuje.

1.6 OPIS METÓDY

1.6.1 Príprava

1.6.1.1 Horľavá látka

Ako horľavý materiál sa používa vysušená, vláknitá celulóza s dĺžkou vlákien medzi 50 a 250 μm a priemernou hodnotou priemeru 25 μm [5]. Celulóza sa suší pri 105 °C počas 4 hodín do konštantnej hmotnosti vo vrstve s hrúbkou najviac 25 mm a počas chladnutia a pred použitím sa uchováva v exsikátore so sušidlom. Obsah vody vo vysušenej celulóze by mal byť nižší ako 0,5 % suchej hmotnosti [6]. Na to, aby sa dosiahla takáto hodnota, sa v prípade potreby čas sušenia predĺži [7] Počas skúsšky je potrebné používať rovnakú šaržu celulózy.

1.6.1.2 Aparatúra

1.6.1.2.1 Tlaková nádoba

Používa sa tlaková nádoba. Nádoba pozostáva z oceľovej tlakovej nádoby valcovitého tvaru s dĺžkou 89 mm a vonkajším priemerom 60 mm (pozri obrázok 1). Dve plochy na protiľahlých stranách sú opracované (zmenšujúc prierez nádoby na 50 mm), aby bolo možné namontovanie zážihového a odvzdušňovacieho nástavca. Nádoba má vnútorný priemer 20 mm a na oboch koncoch je zoslabená do hĺbky 19 mm a opatrená závitom 1 "(1 palec) podľa BSP (British Standard Pipe) alebo jeho metrickým ekvivalentom. Snímač tlaku v tvare bočného ramena je priskrutkovaný k zaoblenému povrchu tlakovej nádoby vo vzdialenosti 35 mm od jedného konca a v 90o uhle k opracovaným stranám. Príslušný otvor je vyvŕtaný do hĺbky 12 mm a na konci bočného ramena opatrený závitom na 1/2" podľa BSP (alebo jeho metrickým ekvivalentom). V prípade potreby sa na zabezpečenie plynotesného utesnenia upevní inertné tesnenie. Bočné rameno vyčnieva 55 mm z tlakovej nádoby a má 6 mm vývrt. Koniec bočného ramena je zoslabený a opatrený závitom na pripojenie membránového snímača tlaku. Môže sa použiť akékoľvek zariadenie na meranie tlaku, ktoré je odolné voči pôsobeniu horúcich plynov alebo produktov rozkladu a na rýchlosť zvýšenia tlaku v rozsahu 690 - 2070 kPa dokáže reagovať za najviac 5 ms.

Koniec tlakovej nádoby, ktorý je ďalej od bočného ramena, je uzatvorený zážihovým nástavcom, ktorý je vybavený dvomi elektródami, jednou izolovanou od telesa nástavca a druhou uzemnenou k nástavcu. Druhý koniec tlakovej nádoby je uzatvorený poistným diskom (kritický tlak približne 2200 kPa), upevneným v uzatváracom nástavci s 20 mm vývrtom. V prípade potreby sa na zabezpečenie plynotesného utesnenia zážihového nástavca použije inertné tesnenie. Počas používania je zariadenie udržiavané v správnej polohe stojanom (obrázok 2). Zvyčajne sa skladá z podložky z mäkkej ocele s rozmermi 235 mm x 184 mm x 6 mm a zo 185 mm dlhého štvorcového dutého profilu (Š.D.P.) s rozmermi 70 mm x 70 mm x 4 mm.

Profil je na protiľahlých stranách jedného konca Š.D.P. zrezaný tak, že vznikne konštrukcia s dvomi plochými ramenami, ktoré prečnievajú o 86 mm nad celým rámom profilu. Konce plochých ramien sú zrezané pod uhlom 60o k horizontálnej rovine a privarené k podložke. Na jednej strane vrchného konca základne profilu je vyrezaný 22 mm široký a 46 mm hlboký otvor tak, aby sa pri vložení tlakovej nádoby do rámu profilu stojana dostal prvý zážihový nástavec a aby bočné rameno zapadlo do otvoru. Kus ocele, široký 30 mm a hrubý 6 mm, ktorý má funkciu rozpery, je privarený k dolnej časti vnútornej plochy rámu profilu. Na upevnenie tlakovej nádoby slúžia dve 7 mm prítlačné skrutky, ktoré sú priskrutkované do protiľahlej strany. Zospodu podopierajú tlakovú nádobu dva 12 mm široké pásy 6 mm hrubej ocele, privarené k bočným stranám dosadajúcim na rám profilu.

1.6.1.2.2 Systém zážihu

Systém zážihu pozostáva z 25 cm dlhého Ni/Cr drôtu, ktorý má priemer 0,6 mm a odpor 3,85 ohm/m. Drôt má špirálovitý tvar s vnútorným priemerom 5 mm a je pripojený k elektródam zážihového nástavca. Špirála musí byť usporiadaná jedným zo spôsobov zobrazených na obrázku 3. Vzdialenosť medzi dnom nádoby a spodnou časťou zážihovej špirály je 20 mm. Ak nie sú elektródy nastaviteľné, konce zážihového drôtu medzi špirálou a dnom nádoby musia byť izolované keramickým obalom. Drôt sa rozžeravuje konštantným prúdom najmenej 10 A.

1.6.2 Vykonanie testu [8]

Kompletne zmontovaná aparatúra so snímačom tlaku a zážihovým systémom, ale bez vloženého poistného disku, sa pripevní na stojan tak, že zážihový nástavec bude v dolnej časti. V sklenenej kadičke sa sklenenou tyčinkou premieša 2,5 g testovanej kvapaliny s 2,5 g sušenej celulózy [9]. Z bezpečnostných dôvodov sa miešanie vykonáva s ochranným štítom, ktorý je medzi experimentátorom a zmesou. Ak sa počas miešania alebo plnenia zmes vznieti, ďalšie testovanie nie je potrebné. Zmes sa pridáva do tlakovej nádoby v malých dávkach poklepávaním do tlakovej nádoby, pričom sa musí dávať pozor na to, aby zmes dostatočne pokryla zážihovú špirálu a bola s ňou v dobrom kontakte. Je dôležité, aby sa špirála počas dávkovania nezdeformovala, pretože by to mohlo viesť k chybným výsledkom [10]. Do uzatváracieho nástavca sa vloží poistný disk a nástavec sa pevne zaskrutkuje. Naplnená nádoba sa presunie do stojanu tak, aby bol poistný disk v hornej polohe, umiestni sa vo vhodnom vystuženom digestore alebo v spaľovacej komore. Do zážihového nástavca sa pripojením na externú zásuvku pustí prúd 10 A. Čas medzi začiatkom miešania a zapnutím prúdu by nemal presiahnuť 10 minút.

Signál z tlakového snímača sa zaznamenáva na vhodný systém, ktorý umožňuje meranie a vytváranie permanentného záznamu získaného časového profilu zmeny tlaku (napr. záznamník spojený so zapisovačom). Zmes sa zahrieva dovtedy, kým nepraskne poistný disk, alebo neuplynie aspoň 60 s. Ak poistný disk nepraskne, zmes sa pred opatrným rozobratím aparatúry nechá vychladnúť, pričom je potrebné dodržiavať bezpečnostné opatrenia pre prípad možného výskytu zvýšeného tlaku. Vykonáva sa päť pokusov s testovanou látkou a referenčnou látkou (referenčnými látkami). Zaznamenáva sa čas potrebný na zvýšenie tlaku zo 690 kPa na 2070 kPa nad atmosférický tlak. Vypočíta sa priemerný čas zvýšenia tlaku.

V niektorých prípadoch môžu chemické reakcie látok, ktoré nesúvisia s ich oxidačnými vlastnosťami, spôsobiť (príliš vysoké alebo príliš nízke) zvýšenie tlaku. V takýchto prípadoch môže byť potrebné kvôli objasneniu povahy reakcie zopakovať test s inertnou látkou namiesto celulózy, napr. diatomit (kremelina).

2. ÚDAJE

Čas zvýšenia tlaku pre testovanú látku a referenčnú látku (referenčné látky).

Čas zvýšenia tlaku pri testoch s inertnou látkou, ak sa realizovali.

2.1 SPRACOVANIE VÝSLEDKOV

Vypočíta sa priemerný čas zvýšenia tlaku pre testovanú látku a referenčnú látku (referenčné látky).

Vypočíta sa priemerný čas zvýšenia tlaku pri testoch s inertnou látkou, ak sa realizovali.

Niektoré príklady výsledkov sú uvedené v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Príklady výsledkov [14]

Látka [13] | Priemerný čas zvýšenia tlaku pre zmes s celulózou v pomere 1:1 (ms) |

Dichróman amónny, nasýtený vodný roztok | 20800 |

Dusičnan vápenatý, nasýtený vodný roztok | 6700 |

Dusičnan železitý, nasýtený vodný roztok | 4133 |

Chloristan lítny, nasýtený vodný roztok | 1686 |

Chloristan horečnatý, nasýtený vodný roztok | 777 |

Dusičnan nikelnatý, nasýtený vodný roztok | 6250 |

Kyselina dusičná, 65 % | 4,767 [11] |

Kyselina chloristá, 50 % | 121 [11] |

Kyselina chloristá, 55 % | 59 |

Dusičnan draselný, 30 % vodný roztok | 26690 |

Dusičnan strieborný, nasýtený vodný roztok | — [12] |

Chlorečnan sodný, 40 % vodný roztok | 2555 [11] |

Dusičnan sodný, 45 % vodný roztok | 4133 |

Inertná látka | |

Voda:celulóza | — [12] |

3. SPRÁVA

3.1 SPRÁVA O TESTE

Správa o teste obsahuje tieto informácie:

- identifikáciu, zloženie, čistotu atď. testovanej látky;

- koncentráciu testovanej látky;

- postup sušenia použitej celulózy;

- obsah vody v použitej celulóze;

- výsledky meraní;

- výsledky testov s inertnou látkou, ak existujú;

- vypočítané priemerné časy zvýšenia tlaku;

- všetky odchýlky od tejto metódy a ich dôvody;

- všetky doplňujúce poznámky a poznámky dôležité pre interpretáciu výsledkov;

3.2 INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV [15]

Výsledky testov sa vyhodnotia na základe:

a) toho, či sa zmes testovanej látky a celulózy samovoľne vznieti; a

b) porovnania priemerného času potrebného na zvýšenie tlaku od 690 kPa do 2070 kPa s časom potrebným na zvýšenie tlaku u referenčnej látky (referenčných látok).

Kvapalná látka sa pokladá za oxidačné činidlo, keď:

a) zmes látky a celulózy v hmotnostnom pomere 1:1 sa samovoľne vznieti; alebo

b) zmes látky a celulózy v hmotnostnom pomere 1:1 má priemerný čas zvýšenia tlaku menší alebo rovnaký ako priemerný čas zvýšenia tlaku zmesi vodného roztoku kyseliny dusičnej a celulózy (65 hmotn. %).

Na to, aby bol vylúčený falošný pozitívny výsledok sa v prípade potreby pri interpretácii výsledkov zoberú do úvahy aj výsledky získané pri testovaní látky s inertným materiálom.

4. ODKAZY

(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids.

+++++ TIFF +++++

Tlaková nádoba

(A) Telo tlakovej nádoby

(B) Uzatvárací nástavec s poistným diskom

(C) Zážihový nástavec

(D) Podložka z mäkkého olova

(E) Poistný disk

(F) Bočné rameno

(G) Hlava snímača tlaku

(H) Tesnenie

(J) Izolovaná elektróda

(K) Uzemňovacia elektróda

(L) Izolácia

(M) Oceľový kónus

(N) Deformačná drážka tesnenia

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

(A) Zážihová špirála

(B) Izolácia

(C) Elektródy

(D) Zážihový nástavec

Poznámka:

môže sa použiť ktorákoľvek z týchto zostáv.

[1] Napríklad v rámci transportných predpisov OSN.

[2] Kyselina sa musí titrovať pred testovaním, aby sa potvrdila jej koncentrácia.

[3] Napríklad v rámci transportných predpisov OSN.

[4] Napr.: 50 hmotn. % (w/w) perchlórovej kyseliny a 40 hmotn. % chlorečnanu sodného sa používa v odkaze 1.

[5] t. j. celulózový prášok z Whatman stĺpcovej chromatografie CF 11, katalógové č. 4021 050.

[6] Potvrdené (napr.) Karl-Fisherovou titráciou.

[7] Alternatívne sa môže tento obsah vody tiež dosiahnuť (napr.) zahriatím na 105 °C vo vákuu na 24 h.

[8] So zmesami oxidačných činidiel s celulózou sa musí zaobchádzať ako s potenciálne explozívnymi a manipulovať s nimi s náležitou pozornosťou.

[9] V praxi sa to dá dosiahnuť prípravou zmesi testovanej kvapaliny s celulózou v pomere 1:1 vo väčšom množstve, ako je potrebné pre test, a do tlakovej nádoby sa nadávkuje 5 ± 0,1 g. Pre každý test osobitne sa pripraví čerstvá zmes.

[10] Je potrebné zabrániť najmä kontaktu medzi susednými závitmi špirály.

[11] Priemerná hodnota z medzilaboratórnych porovnávacích skúšok

[12] Maximálny tlak 2070

[13] Nasýtené roztoky sa pripravujú pri teplote 20 °C

[14] Klasifikáciu podľa transportného systému OSN pozri v odkaze (1)

[15] Pozri odkaz 1 na interpretáciu výsledkov podľa transportných predpisov OSN pri použití rôznych referenčných látok.

--------------------------------------------------

PRÍLOHA 2B

B.1 bis. AKÚTNA ORÁLNA TOXICITA – METÓDA STABILNEJ DÁVKY

1. METÓDA

Táto testovacia metóda je rovnocenná s OECD TG 420 (2001)

1.1 ÚVOD

Tradičné metódy na hodnotenie akútnej toxicity využívajú smrť zvierat ako konečný bod. V roku 1984 Britská toxikologická spoločnosť navrhla novú koncepciu testovania akútnej toxicity založenú na podávaní série stabilných dávok (1). Koncepcia nevyužíva smrť zvierat ako konečný bod a vychádza namiesto toho z pozorovaní jasných príznakov toxicity pri jednej zo série stabilných dávok. Po validačných štúdiách in vivo v Spojenom kráľovstve (2) a aj v medzinárodných štúdiách in vivo sa tento postup prijal ako testovacia metóda v roku 1992. Následne sa štatistické vlastnosti metódy stabilnej dávky hodnotili s použitím matematických modelov v rade štúdií (4) (5) (6). Štúdie in vivo a modelové štúdie spolu názorne ukázali, že metóda je reprodukovateľná, používa sa pri nej menej zvierat a spôsobuje menej utrpenia ako tradičné metódy a umožňuje zatriediť látky podobne ako iné testovacie metódy akútnej toxicity.

Usmernenie pre výber najvhodnejšej testovacej metódy na daný účel je možné nájsť v Usmerňujúcom dokumente o testovaní akútnej orálnej toxicity (Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing) (7). Tento usmerňujúci dokument obsahuje aj doplňujúce informácie o vykonávaní a interpretácii testovacej metódy B.1 bis.

Princípom tejto metódy je, že sa v základnej štúdii používajú iba mierne toxické dávky a že je potrebné vyhýbať sa podávaniu dávok, pri ktorých sa očakáva, že sú smrteľné. Nie je tiež potrebné podávať dávky, o ktorých je známe, že spôsobujú silnú bolesť a utrpenie následkom leptavých alebo silne dráždivých účinkov. Moribundné zvieratá alebo zvieratá so zrejmými bolesťami alebo vykazujúcimi známky silného a pretrvávajúceho utrpenia sa humánnym spôsobom usmrtia a pri interpretácii výsledkov testu sa vyhodnotia ako zvieratá, ktoré uhynuli pri teste. Kritériá pre rozhodnutie usmrtiť moribundné alebo silne trpiace zvieratá a usmernenie o uznaní predvídateľnej alebo nastávajúcej smrti je predmetom samostatného usmerňovacieho dokumentu (8).

Metóda poskytuje informácie o nebezpečných vlastnostiach a umožňuje, aby sa látka mohla zatriediť a klasifikovať podľa Globálne harmonizovaného systému (GHS) pre klasifikáciu chemikálií, ktoré spôsobujú akútnu toxicitu (9).

Testovacie laboratórium posúdi všetky dostupné informácie o testovanej látke pred uskutočnením štúdie. Takéto informácie budú obsahovať identitu a chemickú štruktúru látky; jej fyzikálno-chemické vlastnosti; výsledky všetkých ostatných in vitro alebo in vivo testov toxicity s látkou; toxikologické údaje o štrukturálne príbuzných látkach; a predpokladané použitie(-ia) látky. Tieto informácie sú potrebné na ubezpečenie všetkých zainteresovaných, že test je relevantný pre ochranu zdravia ľudí a pomôže pri výbere vhodnej počiatočnej dávky.

1.2 DEFINÍCIE

Akútna orálna toxicita: sa vzťahuje na tie nepriaznivé účinky, ktoré sa vyskytnú po orálnom podaní jednorazovej dávky látky alebo viacnásobných dávok podávaných v priebehu 24 hodín.

Oneskorená smrť: znamená, že zviera neuhynie, ani sa nejaví, že je moribundné v priebehu 48 hodín, ale uhynie neskôr v priebehu 14-dennej doby pozorovania.

Dávka: je množstvo podanej testovanej látky. Dávka je vyjadrená ako hmotnosť testovanej látky na jednotku hmotnosti pokusného zvieraťa (napr. mg/kg).

Zrejmá toxicita: všeobecný termín popisujúci jasné príznaky toxicity po podaní testovanej látky (príklady pozri v (3)), ktoré sú také, že pri podaní najbližšej najvyššej stabilnej dávky sa dá očakávať buď silná bolesť a pretrvávajúce príznaky silného utrpenia, moribundný stav (kritériá sú uvedené v Humane Endpoints Guidance Document (8)) alebo pravdepodobná mortalita u väčšiny zvierat.

GHS: Globálne harmonizovaný klasifikačný systém pre chemické látky a zmesi. Spoločný projekt OECD (zdravie ľudí a životné prostredie ), Výboru expertov OSN pre prepravu nebezpečného tovaru (fyzikálno-chemické vlastnosti) a ILO (oznamovanie nebezpečenstva) a koordinovaný v rámci Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC).

Blížiaca sa smrť: keď sa očakáva moribundný stav pred ďalšou plánovanou dobou pozorovania. Príznaky, ktoré sú príznačné pre tento stav u hlodavcov by mohli zahrnovať kŕče, polohu na boku, polohu v ľahu a triašku. (Ďalšie informácie pozri v Humane Endpoint Guidance Document (8)).

LD50 (stredná smrteľná dávka): je štatistický odvodená jednorazová dávka látky, pri ktorej sa dá očakávať, že spôsobí úhyn 50 % zvierat po orálnom podaní. Hodnota LD50 je vyjadrená ako hmotnosť testovanej látky na jednotku hmotnosti pokusného zvieraťa (mg/kg).

Limitná dávka: sa vzťahuje na dávku nad hornou hranicou testovania (2000 alebo 5000 mg/kg).

Moribundný stav: stav umierania alebo neschopnosti prežiť, dokonca aj pri liečbe. (Ďalšie informácie pozri v Humane Endpoint Guidance Document (8)).

Predvídateľná smrť: prítomnosť klinických príznakov charakteristických pre smrť v známom čase v budúcnosti pred plánovaným ukončením experimentu, napríklad: neschopnosť prijímať vodu alebo jedlo. (Ďalšie informácie pozri v Humane Endpoint Guidance Document (8)).

1.3 PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY

Skupine zvierat rovnakého pohlavia sa postupne podávajú stabilné dávky 5, 50, 300 a 2000 mg/kg (výnimočne sa môže uvažovať o podaní ďalšej stabilnej dávky 5000 mg/kg, pozri oddiel 1.6.2). Na základe predbežnej štúdie sa zvolí počiatočná dávka, pri ktorej sa očakáva, že spôsobí určité príznaky toxicity bez toho, aby spôsobila vážne toxické účinky alebo mortalitu. Klinické príznaky a podmienky, ktoré sa spájajú s bolesťou, utrpením a blížiacou sa smrťou, sú podrobne uvedené v samostatnom usmerňovacom dokumente OECD (8). Ďalším skupinám zvierat sa môžu podávať vyššie alebo nižšie stabilné dávky v závislosti od prítomnosti alebo neprítomnosti príznakov toxicity alebo mortality. Tento postup pokračuje po dávku spôsobujúcu zrejmú toxicitu alebo po zistenie najviac jedného uhynutia, alebo keď nie sú viditeľné žiadne účinky pri najvyššej dávke, alebo keď sa vyskytnú uhynutia pri najnižšej dávke.

1.4 OPIS TESTOVACEJ METÓDY

1.4.1 Výber druhu zvierat

Spomedzi živočíchov z druhu hlodavcov sa pokiaľ možno používa potkan, aj keď sa môže použiť aj iný druh hlodavca. Zvyčajne sa používajú samice (7). Je to preto, že prehľady bežných LD50 testov, uverejnené v odbornej literatúre, uvádzajú, že zvyčajne je malý rozdiel v citlivosti medzi pohlaviami, ale v tých prípadoch, keď sa pozorujú rozdiely, sú samice zvyčajne mierne citlivejšie (10). Ak však z poznatkov o toxikologických alebo toxikokinetických vlastnostiach štrukturálne príbuzných chemikálií vyplýva, že samce môžu byť citlivejšie, potom sa použije toto pohlavie. Ak sa test uskutočňuje na samcoch, je potrebné uviesť primerané zdôvodnenie.

Používajú sa zdravé mladé dospelé zvieratá bežne používaných laboratórnych kmeňov. Samice majú byť panenské a negravidné. Každé zviera má byť na začiatku dávkovania vo veku medzi 8 a 12 týždňami a jeho hmotnosť má byť v intervale ± 20 % priemernej hmotnosti všetkých zvierat, ktorým sa predtým podala dávka.

1.4.2 Podmienky pre umiestnenie a kŕmenie

Teplota miestnosti pre pokusné zvieratá má byť 22 °C (± 3 °C). Aj keď relatívna vlhkosť má byť aspoň 30 %, a nemala by prevyšovať 70 %, okrem doby počas čistenia miestnosti má dosahovať 50-60 %. Osvetlenie má byť umelé, v rytme 12 hodín svetlo, 12 hodín tma. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. Zvieratá môžu byť v klietkach po skupinách podľa dávok, ale počet zvierat na klietku musí umožniť zreteľné pozorovanie každého zvieraťa.

1.4.3 Príprava zvierat

Zvieratá sú náhodne vybraté, označené tak, aby sa umožnila jednotlivá identifikácia a držia sa v klietkach aspoň 5 dní pred začiatkom podávania látky, aby sa im umožnila aklimatizácia na laboratórne podmienky.

1.4.4 Príprava dávok

Testované látky sa zvyčajne podávajú v stálom objeme počas celého rozsahu dávok, ktoré sa majú testovať zmenou koncentrácie dávkovaného prípravku. Ak sa však má testovať kvapalný konečný produkt alebo zmes, použitie neriedenej testovanej látky, t. j. pri konštantnej koncentrácii, môže byť vhodnejšie pre následné stanovenie rizika tejto látky a požadujú ho niektoré regulačné orgány. V každom prípade nesmie byť prevýšený maximálny objem podávanej dávky. Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže jednorázovo podať, závisí od veľkosti pokusného zvieraťa. U hlodavcov by objem zvyčajne nemal presiahnuť 1ml/100g telesnej hmotnosti: v prípade vodných roztokov sa však môže uvažovať o 2 ml/100g telesnej hmotnosti. Pokiaľ ide o zloženie dávkovaného prípravku, odporúča sa, pokiaľ je to možné, použitie vodného roztoku/suspenzie/emulzie, za ktorým v poradí nasleduje roztok/suspenzia/emulzia v oleji (napr. kukuričný olej) a potom prípadne roztok v iných nosičoch. Pre nosiče, ktoré sú iné ako voda, by mali byť známe toxikologické charakteristiky. Dávky musia byť pripravené tesne pred podávaním, pokiaľ nie je známa a prijateľná stabilita prípravku počas jeho používania.

1.5 POSTUP

1.5.1 Podávanie dávok

Testovaná látka sa podáva ako jednorazová dávka cez sondu s použitím žalúdočnej sondy alebo vhodnej intubačnej kanyly. Za nezvyčajných okolností, keď nie je možná jednorazová dávka, sa dávka môže podávať v menších množstvách v priebehu maximálne 24 hodín.

Zvieratá sa pred podaním dávky vyhladujú (napr. potkanom sa cez noc zadrží potrava, ale nie voda; myšiam sa na 3-4 hodiny zadrží potrava, ale nie voda). Po období hladovania sa zvieratá odvážia a podá sa im testovaná látka. Po podaní látky sa potrava môže zadržať na ďalšie 3-4 hodiny potkanom, alebo myšiam na 1-2 hodiny. Ak sa dávka podáva po častiach počas určitého obdobia, môže byť potrebné poskytnúť zvieratám potravu a vodu v závislosti od dĺžky obdobia.

1.5.2 Predbežná štúdia

Účelom predbežnej štúdie je umožniť výber vhodnej počiatočnej dávky pre základnú štúdiu. Testovaná látka sa podáva jednotlivým zvieratám postupne podľa postupového diagramu v prílohe 1. Predbežná štúdia je hotová, keď je možné vykonať rozhodnutie o počiatočnej dávke pre základnú štúdiu (alebo ak sa vyskytne uhynutie pri najnižšej stabilnej dávke).

Počiatočná dávka sa v prípade predbežnej štúdie vyberie zo stabilných dávok 5, 50, 300 a 2000 mg/kg ako dávka, pri ktorej sa očakáva, že spôsobí zrejmú toxicitu, ktorá je založená pokiaľ možno na dôkaze z in vivo a in vitro údajov pre tú istú chemikáliu a pre štrukturálne príbuzné chemikálie. Ak takéto informácie chýbajú, bude počiatočná dávka 300 mg/kg.

Medzi podaním jednotlivých dávok každému zvieraťu je časový interval aspoň 24 hodín. Všetky zvieratá sa pozorujú aspoň 14 dní.

Výnimočne, a iba v odôvodnených prípadoch na základe osobitných regulačných potrieb, sa môže zohľadniť použitie ďalšej vyššej stabilnej dávky 5000 mg/kg (pozri prílohu 3). Z dôvodu starostlivosti o zvieratá sa pokusy na zvieratách v rozsahoch GHS kategórie 5 (2000-5000 mg/kg) neodporúčajú a uvážia sa iba v prípade veľkej pravdepodobnosti, že výsledky takéhoto testu sú bezprostredne dôležité pre ochranu zdravia ľudí a zvierat alebo ochranu životného prostredia.

V prípadoch, keď zviera, testované pri najnižšej stabilnej dávke (5mg/kg) v predbežnej štúdii, uhynie, zvyčajným postupom je, že štúdia sa ukončí a látka sa zaradí do GHS kategórie 1 (ako je uvedené v prílohe 1). Ak sa však vyžaduje ďalšie potvrdenie klasifikácie, môže sa vykonať tento voliteľný doplnkový postup. Druhému zvieraťu sa podá dávka 5mg/kg. Ak toto druhé zviera uhynie, potom sa potvrdí GHS kategória 1 a štúdia sa ihneď ukončí. Ak druhé zviera prežije, potom sa maximálne trom ďalším zvieratám podá dávka 5 mg/kg. Pre výskyt veľkého rizika mortality sa týmto zvieratám z dôvodu starostlivosti o zvieratá podá dávka postupne. Časový interval medzi podaním dávky každému zvieraťu má byť dostatočný na to, aby sa stanovila pravdepodobnosť prežitia predchádzajúceho zvieraťa. Ak sa vyskytne druhé uhynutie, postupnosť podávania dávok sa ihneď ukončí a žiadnym ďalším zvieratám sa nepodajú dávky. Keďže výskyt druhého uhynutia (bez ohľadu na počet pokusných zvierat v čase ukončenia) patrí do výsledku A (2 alebo viac uhynutí), postupuje sa podľa klasifikačného pravidla prílohy 2 pri stabilnej dávke 5mg/kg (kategória 1, ak sa vyskytne 2 alebo viac uhynutí alebo kategória 2, ak sa nevyskytne viac ako 1 uhynutie). Okrem toho príloha 4 poskytuje usmernenie pre klasifikáciu v systéme EÚ až kým sa nezavedie nový GHS.

1.5.3 Základná štúdia

1.5.3.1 Počet zvierat a dávky

Opatrenia, ktoré sa majú prijať po testovaní s počiatočnou dávkou, sa uvádzajú v postupových diagramoch v prílohe 2. Vyžaduje sa jedno z troch opatrení; buď sa testovanie ukončí a priradí príslušná trieda klasifikácie nebezpečenstva, testuje sa pri vyššej stabilnej dávke, alebo sa testuje pri nižšej stabilnej dávke. Na ochranu zvierat sa však v základnej štúdii nezopakuje dávka, ktorá spôsobila uhynutie v predbežnej štúdii (pozri prílohu 2). Zo skúseností vyplýva, že najpravdepodobnejším výsledkom pri počiatočnej dávke bude to, že látku je možné klasifikovať a nie je potrebné ďalšie testovanie.

Zvyčajne sa používa celkove päť zvierat rovnakého pohlavia pre každú skúmanú dávku. K týmto piatim zvieratám patrí jedno zviera z predbežnej štúdie, ktorému sa podala zvolená dávka, a ďalšie štyri zvieratá (okrem výnimočného prípadu, keď sa dávka, použitá v základnej štúdii, nezahrnula do predbežnej štúdie).

Časový interval medzi dávkovaním s každou veľkosťou dávky je určený nástupom, trvaním a závažnosťou príznakov toxicity. Ďalšia dávka sa podá zvieratám až po ubezpečení, že zvieratá, ktorým sa predtým podala dávka, prežili. Podľa potreby sa odporúča interval 3 alebo 4 dni medzi jednotlivými dávkami, aby sa umožnilo pozorovanie oneskorenej toxicity. Časový interval sa môže nastaviť podľa potreby, napr. v prípade nepresvedčivej reakcie.

Ak sa uvažuje o použití vyššej stabilnej dávky 5000 mg/kg, postupuje sa podľa postupu uvedeného v prílohe 3 (pozri tiež oddiel 1.6.2).

1.5.3.2 Limitný test

Limitný test sa pokiaľ možno používa v situáciách, keď experimentátor má informácie, z ktorých vyplýva, že testovaný materiál je pravdepodobne netoxický, t. j. že je toxický iba v prípade, keď prevyšuje predpismi stanovené limitné dávky. Informácie o toxicite testovaného materiálu je možné získať z poznatkov o podobných testovaných látkach alebo podobných testovaných zmesiach alebo produktoch pri zohľadnení identity a percenta zložiek, o ktorých je známe, že sú toxikologicky významné. V tých situáciách, keď je málo informácií alebo nie sú informácie o jeho toxicite, alebo v ktorých sa očakáva, že testovaný materiál bude toxický, je potrebné vykonať základný test.

Pri zvyčajnom postupe sa počiatočná dávka predbežnej štúdie 2000 mg/kg (alebo výnimočne 5000 mg/kg) následne podá ďalším štyrom zvieratám, čo slúži ako limitný test v prípade tohto usmernenia.

1.6 POZOROVANIA

Zvieratá sa vyšetrujú individuálne po podaní dávky aspoň raz počas prvých 30 minút, pravidelne počas prvých 24 hodín, osobitne pozorne počas prvých 4 hodín, a potom každý deň počas celkove 14 dní, okrem prípadu, keď je potrebné zvieratá vylúčiť zo štúdie a z dôvodu starostlivosti o zvieratá humánnym spôsobom usmrtiť, alebo keď sa zistí, že uhynuli. Dĺžka pozorovania by sa však nemala pevne určiť. Určí na základe toxických reakcií, času nástupu a dĺžky času zotavenia a malo by sa teda umožniť jej predĺženie, ak sa to pokladá za potrebné. Časy, kedy sa objavia a zmiznú príznaky toxicity sú dôležité, predovšetkým v prípade tendencie oneskorenia toxických príznakov (11). Všetky pozorovania sa systematicky zaznamenajú, pričom každé zviera má individuálny záznam.

Ďalšie vyšetrenia budú potrebné, ak zvieratá naďalej vykazujú príznaky toxicity. Pri vyšetreniach sa venuje pozornosť zmenám na pokožke a srsti, očiach a slizniciach a tiež respiračnému, obehovému, autonómnemu a centrálnemu nervovému systému a somatomotorickej aktivite a spôsobu správania. Pozornosť sa zameriava na pozorovanie triašky, kŕčov, slinenia, hnačky, letargie, spánku a kómy. Zohľadnia sa zásady a kritériá zosumarizované v Humane Endpoints Guidance Document (8). Zvieratá nachádzajúce sa v moribundnom stave, alebo ktoré vykazujú silné bolesti alebo pretrvávajúce príznaky veľkého utrpenia, sa humánnym spôsobom usmrtia. Keď sa zvieratá usmrtia z humánnych dôvodov, alebo sa nájdu uhynuté, je potrebné čo možno najpresnejšie zaznamenať čas uhynutia.

1.6.1 Telesná hmotnosť

Hmotnosť jednotlivých zvierat sa stanoví krátko pred podaním testovanej látky a potom aspoň každý týždeň. Zmeny hmotnosti sa vypočítajú a zaznamenajú. Na konci testu sa zvieratá, ktoré prežili, odvážia a potom humánnym spôsobom usmrtia.

1.6.2 Patológia

Všetky testované zvieratá (vrátane tých, ktoré uhynú počas testu, alebo sú vylúčené zo štúdie z dôvodu starostlivosti o zvieratá), sa podrobia autopsii. Všetky makroskopické patologické zmeny u každého zvieraťa sa zaznamenajú. Môže sa uvažovať aj o mikroskopickom vyšetrení orgánov dokazujúcom makroskopické patologické nálezy u zvierat, ktoré prežili 24 alebo viac hodín po podaní počiatočnej dávky, ktoré môže poskytnúť užitočné informácie.

2. ÚDAJE

O jednotlivých zvieratách sa poskytujú informácie. Okrem toho sa všetky údaje zosumarizujú vo forme tabuliek, kde sa uvedie pre každú pokusnú skupinu počet použitých zvierat, počet zvierat vykazujúcich príznaky toxicity, počet zvierat, ktoré sa našli uhynuté počas testu, alebo boli usmrtené z humánnych dôvodov, čas uhynutia jednotlivých zvierat, popis časového priebehu toxických účinkov a reverzibility a pitevné nálezy.

3. PODÁVANIE SPRÁV

3.1 SPRÁVA O TESTE

Správa o teste musí podľa potreby obsahovať tieto informácie:

Testovaná látka:

- fyzikálny charakter, čistota a v prípade potreby fyzikálno-chemické vlastnosti (vrátane izomerizácie);

- identifikačné údaje vrátane čísla CAS,

Nosič (v prípade potreby):

- zdôvodnenie výberu nosiča, ak je iný ako voda.

Pokusné zvieratá:

- použitý druh/kmeň;

- mikrobiologický stav zvierat, ak je známy;

- počet, vek a pohlavie zvierat (v prípade potreby vrátane zdôvodnenia, prečo sa použili samce namiesto samíc);

- zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo atď.;

Testovacie podmienky:

- údaje o zložení testovanej látky, vrátane údajov o fyzikálnej forme podávaného materiálu;

- údaje o podávaní testovanej látky, vrátane objemov dávok a čase podávania;

- údaje o kvalite krmiva a vody (vrátane druhu krmiva/zdroja, zdroja vody);

- zdôvodnenie výberu počiatočnej dávky.

Výsledky:

- tabuľkové spracovanie údajov o reakcii a veľkosti dávky pre každé zviera (t. j. zvieratá vykazujúce príznaky toxicity vrátane mortality, povahy, závažnosti a trvania účinkov);

- tabuľkové spracovanie telesnej hmotnosti a zmien telesnej hmotnosti;

- hmotnosti jednotlivých zvierat v deň podania dávky, potom v týždenných intervaloch a v čase uhynutia alebo usmrtenia;

- dátum a čas uhynutia v prípade vopred naplánovaného usmrtenia;

- časový priebeh nástupu príznakov toxicity a či tieto príznaky boli reverzibilné pre každé zviera;

- pitevné nálezy a histopatologické nálezy pre každé zviera, ak sú k dispozícii.

Diskusia a interpretácia výsledkov.

Závery.

4. ODKAZY

(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85-92.

(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279-291.

(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482.

(4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324.

(5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol.

(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183-196.

(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.

(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19.

(9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, s.11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].

(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231.

(11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3 rd Edition. A.W. Hayes , Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.

--------------------------------------------------

PRÍLOHA 2C

"B.1tris. AKÚTNA ORÁLNA TOXICITA – METÓDA TRIEDY AKÚTNEJ TOXICITY

1. METÓDA

Táto testovacia metóda je rovnocenná s OECD TG 423 (2001).

1.1 ÚVOD

Metóda triedy akútnej toxicity (1), uvedená v tomto teste, je postupnou metódou, pri ktorej sa na každý krok použijú 3 zvieratá rovnakého pohlavia. V závislosti od mortality a/alebo ich moribundného stavu môžu byť potrebné priemerne 2 až 4 kroky na posúdenie akútnej toxicity testovanej látky. Táto metóda je reprodukovateľná, používa sa pri nej veľmi málo zvierat a umožňuje zatriediť látky podobne ako iné testovacie metódy akútnej toxicity. Metóda triedy akútnej toxicity je založená na biometrických hodnoteniach (2) (3) (4) (5) so stabilnými dávkami dostatočne odlíšenými, aby umožnili zatriedenie látky na klasifikačné účely a posúdenie nebezpečenstva. Metóda, ktorá bola prijatá v roku 1996, bola rozsiahlo validovaná pokusmi in vivo v porovnaní s údajmi LD50 získanými z literatúry, ako na národnej (6), tak aj na medzinárodnej úrovni (7).

Usmernenie pre výber najvhodnejšej testovacej metódy na daný účel je možné nájsť v Usmerňujúcom dokumente o testovaní akútnej orálnej toxicity (Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (8)). Tento usmerňujúci dokument obsahuje aj doplňujúce informácie o vykonávaní a interpretácii testovacej metódy B.1 tris.

Nie je potrebné podávať testované látky pri dávkach, o ktorých je známe, že spôsobujú silnú bolesť a utrpenie následkom leptavých alebo silne dráždivých účinkov. Moribundné zvieratá alebo zvieratá s bolesťami alebo zviaratá, ktoré vykazujú príznaky silného a trvalého utrpenia, sa humánnym spôsobom usmrcujú a pri interpretácii výsledkov testu sa vyhodnocujú rovnako ako zvieratá, ktoré uhynuli pri teste. Kritériá pre rozhodnutie usmrtiť moribundné alebo silne trpiace zvieratá a usmernenie o uznaní predvídateľnej alebo nastávajúcej smrti sú predmetom samostatného usmerňovacieho dokumentu (9).

Metóda využíva vopred stanovené dávky a výsledky umožňujú, aby sa látka mohla zatriediť a klasifikovať podľa Globálne harmonizovaného systému pre klasifikáciu chemikálií, ktoré spôsobujú akútnu toxicitu (10).

V zásade metóda nie je určená na umožnenie výpočtu presnej hodnoty LD50, ale umožňuje stanovenie definovaných rozsahov expozície, kde sa očakáva letalita, keďže uhynutie časti zvierat je stále najdôležitejším konečným bodom tohto testu. Metóda umožňuje stanovenie hodnoty LD50 iba v prípade, keď v dôsledku podania aspoň dvoch dávok je mortalita vyššia ako 0 % a nižšia ako 100 %. Výber vopred stanovených dávok bez ohľadu na testovanú látku s klasifikáciou výlučne viazanou na počet zvierat vyšetrovaných v rôznych stavoch zlepšuje možnosti konzistencie podávania správ a reprodukovateľnosti medzi laboratóriami.

Testovacie laboratórium posúdi všetky dostupné informácie o testovanej látke pred uskutočnením štúdie. Takéto informácie budú zahrnovať identitu a chemickú štruktúru látky; jej fyzikálno-chemické vlastnosti; výsledok všetkých ostatných in vivo alebo in vitro testov toxicity s látkou; toxikologické údaje o štrukturálne príbuzných látkach; a predpokladané použitie(-ia) látky. Tieto informácie sú potrebné na ubezpečenie všetkých zainteresovaných, že test je dôležitý na ochranu zdravia ľudí a pomôže pri výbere najvhodnejšej počiatočnej dávky.

1.2 DEFINÍCIE

Akútna orálna toxicita: sa vzťahuje na tie nepriaznivé účinky, ktoré sa vyskytnú po orálnom podaní jednorazovej dávky látky alebo viacnásobných dávok podávaných v priebehu 24 hodín.

Oneskorená smrť: znamená, že zviera neuhynie, ani sa nejaví ako moribundné v priebehu 48 hodín, ale uhynie neskôr v priebehu vymedzeného 14-denného času pozorovania.

Dávka: je množstvo podanej testovanej látky. Dávka je vyjadrená ako hmotnosť testovanej látky na jednotku hmotnosti pokusného zvieraťa (napr. mg/kg).

GHS: Globálne harmonizovaný klasifikačný systém pre chemické látky a zmesi. Spoločný projekt OECD (zdravie ľudí a životné prostredie), Výboru expertov OSN pre prepravu nebezpečného tovaru (fyzikálno-chemické vlastnosti) a ILO (oznamovanie nebezpečenstva) a koordinovaný v rámci Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC).

Blížiaca sa smrť: keď sa očakáva moribundný stav pred ďalšou plánovanou dobou pozorovania. Príznaky, ktoré sú príznačné pre tento stav u hlodavcov by mohli zahrnovať kŕče, polohu na boku, polohu v ľahu a triašku. (Ďalšie informácie sa nachádzajú v Humane Endpoint Guidance Document (9)).

LD50 (stredná smrteľná orálna dávka): je štatistický odvodená jednorazová dávka látky, pri ktorej sa dá očakávať, že spôsobí úhyn 50 % zvierat pri orálnom podaní. Hodnota LD50 je vyjadrená ako hmotnosť testovanej látky na jednotku hmotnosti pokusného zvieraťa (mg/kg).

Limitná dávka: sa vzťahuje na dávku nad hornou hranicou testovania (2000 alebo 5000 mg/kg).

Moribundný stav: stav umierania alebo neschopnosti prežiť, dokonca aj pri liečbe. (Ďalšie informácie sa nachádzajú v Humane Endpoint Guidance Document (9)).

Predvídateľná smrť: prítomnosť klinických príznakov charakteristických pre smrť v známom čase v budúcnosti pred plánovaným ukončením experimentu; napríklad: neschopnosť prijímať vodu alebo jedlo. (Ďalšie informácie sa nachádzajú v Humane Endpoint Guidance Document (9)).

1.3 PRINCÍP TESTU

Princíp testu spočíva v tom, že na základe metódy postupných krokov s použitím minimálneho počtu zvierat na krok sa získajú dostatočné informácie o akútnej toxicite testovanej látky, ktoré umožnia jej klasifikáciu. Látka sa podáva orálne skupine pokusných zvierat v jednej zo stanovených dávok. Látka sa testuje s použitím metódy postupných krokov, v každom kroku sa použijú tri zvieratá rovnakého pohlavia (zvyčajne samice). Absencia alebo výskyt mortality súvisiacej s látkou u zvierat, ktorým sa podala dávka v jednom kroku určí ďalší krok, t. j.:

- nie je potrebné ďalšie testovanie,

- podanie rovnakej dávky trom ďalším zvieratám,

- podanie najbližšej vyššej alebo najbližšej nižšej dávky trom ďalším zvieratám.

Informácie o postupe testu sú uvedené v prílohe 1. Metóda umožní posúdenie vzhľadom na klasifikáciu testovanej látky do jednej z viacerých tried toxicity definovaných pevnými hraničnými hodnotami LD50.

1.4 OPIS METÓDY

1.4.1 Výber druhu zvierat

Spomedzi druhov hlodavcov sa prednostne používa potkan, hoci sa môže použiť aj iný druh hlodavca. Zvyčajne sa používajú samice (9). Je to preto, že prehľady konvenčných LD50 testov, uverejnené v odbornej literatúre, uvádzajú, že hoci je malý rozdiel v citlivosti medzi pohlaviami, v tých prípadoch, keď sa pozorovali rozdiely, sú samice zvyčajne mierne citlivejšie (11). Ak však z poznatkov o toxikologických alebo toxikokinetických vlastnostiach štrukturálne príbuzných chemikálií vyplýva, že samce môžu byť citlivejšie, potom sa použije toto pohlavie. Ak sa test uskutočňuje na samcoch, je potrebné uviesť primerané zdôvodnenie.

Používajú sa zdravé mladé dospelé zvieratá bežne používaných laboratórnych kmeňov. Samice majú byť panenské a negravidné. Každé zviera na začiatku dávkovania má byť vo veku medzi 8 a 12 týždňami a jeho hmotnosť má byť v rozpätí ± 20 % priemernej hmotnosti všetkých zvierat, ktorým sa predtým podala dávka.

1.4.2 Podmienky pre umiestnenie a kŕmenie

Teplota v miestnosti pre pokusné zvieratá by mala byť 22 °C (± 3 °C). Aj keď relatívna vlhkosť by mala byť aspoň 30 % a nemala by prevyšovať 70 %, okrem obdobia počas čistenia miestnosti by mala dosahovať 50-60 %. Osvetlenie by malo byť umelé, v rytme 12 hodín svetlo, 12 hodín tma. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. Zvieratá môžu byť v klietkach po skupinách podľa dávok, ale počet zvierat na klietku musí umožniť zreteľné pozorovanie každého zvieraťa.

1.4.3 Príprava zvierat

Zvieratá sú náhodne vybraté, označené tak, aby sa umožnila jednotlivá identifikácia a držia sa v klietkach aspoň 5 dní pred začiatkom podávania dávok, aby sa aklimatizovali na laboratórne podmienky.

1.4.4 Príprava dávok

Testované látky sa zvyčajne podávajú v stálom objeme počas celého intervalu dávkovania, ktoré sa má testovať na základe zmeny koncentrácie dávkovaného prípravku. Ak sa však má testovať kvapalný konečný produkt alebo zmes, použitie neriedenej testovanej látky, t. j. s konštantnou koncentráciou, môže byť pre následné stanovenie rizika tejto látky vhodnejšie a požadujú ho niektoré regulačné orgány. V každom prípade sa nesmie prekročiť maximálny objem podávanej dávky. Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže jednorázovo podať, závisí od veľkosti pokusného zvieraťa. U hlodavcov by objem zvyčajne nemal presiahnuť 1ml/100g telesnej hmotnosti: v prípade vodných roztokov sa však môže uvažovať o 2 ml/100g telesnej hmotnosti. Pokiaľ ide o zloženie dávkovaného prípravku, odporúča sa vždy, keď je to možné, použitie vodného roztoku/suspenzie/emulzie, za ktorým v poradí nasleduje roztok/suspenzia/emulzia v oleji (napr. kukuričný olej) a potom prípadne roztok v iných nosičoch. Pre nosiče, ktoré sú iné ako voda, by mali byť známe toxikologické charakteristiky. Dávky musia byť pripravené tesne pred podávaním, pokiaľ nie je známa a prijateľná stabilita prípravku počas obdobia, kedy sa bude používať.

1.5 POSTUP

1.5.1 Podávanie dávok

Testovaná látka sa podáva ako jednorazová dávka cez sondu s použitím žalúdočnej sondy alebo vhodnej intubačnej kanyly. Za nezvyčajných okolností, keď nie je možná jednorazová dávka, sa môže dávka podávať v menších množstvách v priebehu maximálne 24 hodín.

Zvieratá sa pred podávaním dávok vyhladujú (napr. potkanom sa cez noc zadrží potrava, ale nie voda; myšiam sa na 3-4 hodiny zadrží potrava, ale nie voda). Po období hladovania sa zvieratá odvážia a podá sa im testovaná látka. Po podaní látky sa zadrží potrava na ďalšie 3-4 hodiny potkanom, alebo myšiam na 1-2 hodiny. Ak sa dávka podáva po častiach počas určitého obdobia, môže byť potrebné poskytnúť zvieratám potravu a vodu v závislosti od dĺžky obdobia.

1.5.2 Počet zvierat a veľkosť dávok

Na každý krok sa použijú tri zvieratá. Veľkosť dávky, ktorá sa použije ako počiatočná dávka, sa vyberie z jednej zo štyroch stabilných hodnôt 5, 50, 300 a 2000 mg/kg telesnej hmotnosti. Počiatočná dávka má byť taká, pri ktorej s najväčšou pravdepodobnosťou nastane smrť u niektorých zvierat, ktorým sa podala dávka. Postupové diagramy v prílohe 1 popisujú postup, ktorý je potrebné dodržiavať pre každú z počiatočných dávok. Popritom príloha 4 poskytuje usmernenie ku klasifikácii v schéme EÚ až kým sa nezavedie nový GHS.

Keď z dostupných informácií vyplýva, že úmrtie je nepravdepodobné pri najvyššej počiatočnej dávke (2000 mg/kg telesnej hmotnosti), potom je potrebné vykonať limitný test. Ak nie sú žiadne informácie o látke, ktorá sa má testovať, z dôvodu starostlivosti o zvieratá sa odporúča použiť počiatočnú dávku 300 mg/kg telesnej hmotnosti.

Časový interval medzi skupinami dávok je určený nástupom, trvaním a závažnosťou príznakov toxicity. Zvieratám sa podá ďalšia dávka až po ubezpečení, že zvieratá, ktorým sa predtým podala dávka, prežili.

Výnimočne, a iba v odôvodnených prípadoch na základe osobitných regulačných potrieb, sa môže uvažovať o použití ďalšej vyššej stabilnej dávky 5000 mg/kg telesnej hmotnosti (pozri prílohu 2). Z dôvodu starostlivosti o zvieratá sa testy na zvieratách v rozsahu GHS kategórie 5 (2000-5000 mg/kg) neodporúčajú a uvažuje sa o nich iba v prípade veľkej pravdepodobnosti, že výsledky takéhoto testu by mohli byť bezprostredne dôležité pre ochranu zdravia ľudí a zvierat alebo ochranu životného prostredia.

1.5.3 Limitný test

Limitný test sa používa predovšetkým v situáciách, keď experimentátor má informácie, z ktorých vyplýva, že testovaný materiál je pravdepodobne netoxický, t. j. že je toxický iba v prípade, keď prevyšuje predpismi stanovené limitné dávky. Informácie o toxicite testovaného materiálu je možné získať z poznatkov o podobných testovaných látkach alebo podobne testovaných zmesiach alebo produktoch pri zohľadnení identity a percenta zložiek, o ktorých je známe, že sú toxikologicky významné. V týchto situáciách, keď existuje málo informácií, alebo neexistujú žiadne informácie, o jeho toxicite, alebo v ktorých sa očakáva, že testovaný materiál bude toxický, je potrebné vykonať základný test.

Limitný test s jednou dávkou 2000 mg/kg telesnej hmotnosti sa môže vykonať so šiestimi zvieratami (tri zvieratá na každý krok). Výnimočne sa môže vykonať limitný test s jednou dávkou 5000 mg/kg s tromi zvieratami (pozri prílohu 2). Ak sa vyskytne uhynutie súvisiace s testovanou látkou, môže byť potrebné vykonať ďalšie testovanie s najbližšou nižšou dávkou.

1.6 POZOROVANIA

Zvieratá sa pozorujú individuálne po podaní dávky aspoň raz počas prvých 30 minút, pravidelne počas prvých 24 hodín, osobitne pozorne počas prvých 4 hodín a potom každý deň počas celkove 14 dní, okrem prípadu, keď je potrebné zvieratá vylúčiť zo štúdie a z dôvodu starostlivosti o zvieratá humánnym spôsobom usmrtiť, alebo keď sa zistí, že uhynuli. Dĺžka pozorovania by sa však nemala pevne stanoviť. Stanoví na základe toxických reakcií, času nástupu a dĺžky času zotavenia a teda sa môže predĺžiť, ak sa to pokladá za potrebné. Časy, kedy sa objavia a zmiznú príznaky toxicity, sú dôležité, predovšetkým v prípade tendencie oneskorenia toxických príznakov (12). Všetky pozorovania sa systematicky zaznamenávajú, pričom každé zviera má individuálny záznam.

Ďalšie pozorovania budú potrebné, ak zvieratá naďalej vykazujú príznaky toxicity. Pri vyšetreniach sa venuje pozornosť zmenám na pokožke a srsti, očiach a slizniciach a tiež respiračnému, obehovému, autonómnemu a centrálnemu nervovému systému a somatomotorickej aktivite a spôsobu správania. Pozornosť sa zameriava na pozorovanie triašky, kŕčov, slinenia, hnačky, letargie, spánku a kómy. Zohľadňujú sa aj zásady a kritériá zosumarizované v Humane Endpoints Guidance Document (9). Zvieratá, ktoré sú moribundom stave, alebo vykazujú silné bolesti alebo pretrvávajúce príznaky silného utrpenia, sa humánnym spôsobom usmrtia. Keď sa zvieratá usmrtia z humánnych dôvodov, alebo sa nájdu uhynuté, je potrebné čo možno najpresnejšie zaznamenať čas uhynutia.

1.6.1 Telesná hmotnosť

Hmotnosť jednotlivých zvierat sa stanovuje krátko pred podaním testovanej látky a potom aspoň každý týždeň. Zmeny hmotnosti sa vypočítajú a zaznamenajú. Na konci testu sa zvieratá, ktoré prežili, odvážia a humánnym spôsobom usmrtia.

1.6.2 Patológia

Všetky testované zvieratá (vrátane tých, ktoré uhynú počas testu, alebo sú vylúčené zo štúdie z dôvodu starostlivosti o zvieratá), sa podrobujú autopsii. Všetky makroskopické patologické zmeny u každého zvieraťa sa zaznamenávajú. Môže sa tiež uvažovať o vykonaní mikroskopického vyšetrenia orgánov, dokazujúceho makropatologické nálezy vo zvieratách, ktoré prežili 24 alebo viac hodín, ktoré môže poskytnúť užitočné informácie.

2. ÚDAJE

O jednotlivých zvieratách sa uvádzajú informácie. Okrem toho sa všetky údaje zhrnú v podobe tabuliek, kde sa uvedie pre každú pokusnú skupinu počet použitých zvierat, počet zvierat vykazujúcich príznaky toxicity, počet zvierat, ktoré sa našli uhynuté počas testu, alebo sa usmrtili z humánnych dôvodov, čas uhynutia jednotlivých zvierat, popis a časový priebeh toxických účinkov a reverzibility a pitevné nálezy.

3. PODÁVANIE SPRÁV

3.1 Správa o teste

Správa o teste musí podľa potreby obsahovať tieto informácie:

Testovaná látka:

- fyzikálny charakter, čistota a v prípade potreby fyzikálno-chemické vlastnosti (vrátane izomerizácie);

- identifikačné údaje vrátane čísla CAS,

Nosič (v prípade potreby)

- zdôvodnenie výberu nosiča, ak je iný ako voda.

Pokusné zvieratá:

- použitý druh/kmeň;

- mikrobiologický stav zvierat, ak je známy;

- počet, vek a pohlavie zvierat (vrátane, ak je potrebné, zdôvodnenia na použitie samcov namiesto samíc);

- zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo atď.;

Testovacie podmienky:

- údaje o zložení testovanej látky vrátane údajov o fyzikálnej forme podávaného materiálu;

- údaje o podávaní testovanej látky vrátane objemov dávok a čase podávania;

- údaje o kvalite krmiva a vody (vrátane druhu krmiva/zdroja, zdroja vody);

- zdôvodnenie výberu počiatočnej dávky.

Výsledky:

- tabuľkové spracovanie získaných údajov o reakcii a veľkosti dávky pre každé zviera (t. j. zvieratá vykazujúce príznaky toxicity vrátane mortality, charakteru, závažnosti a trvania účinkov);

- tabuľkové spracovanie telesnej hmotnosti a zmien telesnej hmotnosti;

- hmotnosti jednotlivých zvierat v deň podávania dávok, potom v týždňových intervaloch a v čase uhynutia alebo usmrtenia;

- dátum a čas uhynutia v prípade vopred naplánovaného usmrtenia;

- časový priebeh nástupu príznakov toxicity a či tieto príznaky boli reverzibilné pre každé zviera;

- pitevné nálezy a histopatologické nálezy pre každé zviera, ak sú k dispozícii.

Diskusia a interpretácia výsledkov.

Závery.

4. ODKAZY

(1) Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86.

(2) Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341.

(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610.

(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734.

(5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129-134.

(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470.

(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670.

(8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.

(9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.

(10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]

(11) Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223-231.

(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994 ). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA."

--------------------------------------------------

PRÍLOHA 2D

B. 4. AKÚTNA TOXICITA: PODRÁŽDENIE/POLEPTANIE KOŽE

1. METÓDA

Táto metóda je rovnocenná s OECD TG 404 (2002).

1.1 ÚVOD

Pri príprave tejto aktualizovanej metódy sa osobitná pozornosť venovala možným zlepšeniam v súvislosti so starostlivosťou o zvieratá a posúdeniu všetkých existujúcich informácií o testovanej látke, aby sa zabránilo zbytočnému testovaniu na laboratórnych zvieratách. Táto metóda zahrnuje odporúčanie, aby sa pred uskutočnením opísaného in vivo testu na poleptanie/podráždenie látkou urobila kritická analýza existujúcich príslušných údajov. Ak dostačujúce údaje nie sú dostupné, môžu sa získať na základe postupného testovania (1). Stratégia testovania zahrnuje vykonanie validovaných a uznaných in vitro testov a je uvedená ako príloha k tejto metóde. Okrem toho sa v prípade potreby odporúča v počiatočnom in vivo teste použiť postupne, a nie súčasne, tri testovacie náplasti na zviera.

V záujme vedeckej spoľahlivosti, a aj starostlivosti o zvieratá, sa in vivo testovanie nevykonáva, pokiaľ neboli všetky dostupné údaje, súvisiace s potenciálnym poleptaním/podráždením kože látkou, vyhodnotené v kritickej analýze. Takéto údaje zahrnujú dôkaz z existujúcich štúdií na ľuďoch a/alebo laboratórnych zvieratách, dôkaz o poleptaní/podráždení jednou alebo viacerými štrukturálne príbuznými látkami alebo zmesami takýchto látok, údaje dokazujúce silnú aciditu alebo alkalitu látky (2) (3) a výsledky z validovaných a uznaných in vitro alebo ex vivo testov (4) (5) (5a). Táto analýza zníži potrebu in vivo testovania na poleptanie/podráždenie kože látkami, pre ktoré už existujú dostatočné dôkazy z iných štúdií k uvedeným dvom konečným bodom.

Uprednostňovaná stratégia postupného testovania, ktorá zahrnuje vykonanie validovaných a uznaných in vitro alebo ex vivo testov na poleptanie/podráždenie, je do tejto metódy zahrnutá ako príloha. Stratégia bola vypracovaná a jednomyseľne odporučená účastníkmi OECD workshopu (6) a bola prijatá ako odporúčaná stratégia testovania v Globálne harmonizovanom systéme pre klasifikáciu chemických látok (GHS) (7). Odporúča sa, aby sa táto stratégia testovania dodržiavala pred uskutočnením in vivo testovania. V prípade nových látok sa na získanie vedecky spoľahlivých údajov o poleptaní/podráždení látkou odporúča koncepcia postupného testovania. V prípade existujúcich látok s nedostačujúcimi údajmi o poleptaní/podráždení kože sa vedená stratégia použije na získanie chýbajúcich údajov. Použitie odlišnej stratégie testovania alebo testovacej metódy alebo rozhodnutie nepoužiť koncepciu postupného testovania, je potrebné zdôvodniť.

Ak sa poleptanie alebo podráždenie nemôže stanoviť s použitím kritickej analýzy, ktorá je konzistentná so stratégiou postupného testovania, je potrebné uvažovať o použití in vivo testu (pozri prílohu).

1.2 DEFINÍCIE

Podráždenie kože: je vznik reverzibilného poškodenia kože po aplikácii testovanej látky v trvaní do 4 hodín.

Poleptanie kože: je vznik ireverzibilného poškodenia kože; konkrétne ide o viditeľné nekrózy cez epidermu až do dermy po aplikácii testovanej látky v trvaní do štyroch hodín. Pre reakcie na poleptanie sú typické vredy, krvácanie, krvavé chrasty a, na konci pozorovania po 14 dňoch, strata farby následkom vyblednutia kože, kompletné partie bez srsti a jazvy. Na vyhodnotenie nejasných poškodení je potrebné uvažovať o vykonaní histopatologického vyšetrenia.

1.3 PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY

Látka, ktorá sa má testovať, sa aplikuje v jednorazovej dávke na kožu pokusného zvieraťa; neošetrené časti kože testovaného zvieraťa slúžia ako kontrola. V stanovených intervaloch zistí a vyhodnotí stupeň podráždenia/poleptania a následne sa popíše, aby sa zabezpečilo kompletné posúdenie účinkov. Trvanie štúdie má byť dostatočné na posúdenie reverzibility alebo ireverzibility pozorovaných účinkov.

Zvieratá, ktoré vykazujú pretrvávajúce príznaky silného utrpenia a/alebo bolesti v ktoromkoľvek štádiu testu, sa humánnym spôsobom usmrtia a daná látka sa na základe toho posúdi. Kritéria pre rozhodnutie o humánnom spôsobe usmrtenia moribundných a silne trpiacich zvierat je možné nájsť v odkaze (8).

1.4 OPIS TESTOVACEJ METÓDY

1.4.1 Príprava na in vivo test

1.4.1.1 Výber druhu zvierat

Ako laboratórne zviera sa prednostne používa králik - albín a použijú sa zdravé mladé dospelé králiky. Použitie iných druhov je potrebné zdôvodniť.

1.4.1.2 Príprava zvierat

Približne 24 hodín pred testom sa dôkladným ostrihaním na chrbtovej časti trupu týchto zvierat odstráni srsť. Je potrebné venovať pozornosť tomu, aby sa koža neodrala a použijú sa iba zvieratá so zdravou, neporušenou kožou.

Niektoré druhy králikov majú miesta s hustou srsťou, ktoré sa objavujú v určitých obdobiach roka. Takéto miesta, zarastené hustou srsťou, by sa nemali používať ako miesta na testovanie.

1.4.1.3 Podmienky pre umiestnenie a kŕmenie

Zvieratá sa umiestnia jednotlivo. Teplota miestnosti pre králiky ako pokusné zvieratá má byť 22 °C (± 3 °C). Aj keď relatívna vlhkosť má byť aspoň 30 % a nemala by prevyšovať 70 %, okrem obdobia počas čistenia miestnosti má dosahovať 50-60 %. Osvetlenie má byť umelé, v rytme 12 hodín svetlo, 12 hodín tma. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody.

1.4.2 Postup testu

1.4.2.1 Aplikácia testovanej látky

Testovaná látka sa aplikuje na malé plochy (približne 6 cm2) kože a zakryje náplasťou z gázy, ktorá sa prichytí leukoplastom, ktorý nespôsobuje podráždenie. V prípadoch, keď nie je možná priama aplikácia (napr. kvapaliny alebo niektoré pasty), sa testovaná látka nanesie najskôr na náplasť z gázy, ktorá sa potom aplikuje na kožu. Náplasť sa voľne prichytí, aby mala kontakt s kožou pomocou vhodného semiokluzívneho obväzu počas trvania expozície. Ak sa testovaná látka aplikuje na náplasť, pripevní sa tak, aby mala dobrý kontakt s kožou a aby látka bola na koži rovnomerne rozložená. Je potrebné zabrániť tomu, aby zviera dosiahlo na náplasť a aby požilo alebo vdýchlo testovanú látku.

Kvapalné testované látky sa zvyčajne používajú neriedené. Pri testovaní tuhých látok (ktoré sa môžu v prípade potreby rozotrieť na prach) sa testovaná látka navlhčí malým množstvom vody (alebo v prípade potreby iným vhodným nosičom), ktoré bude dostatočné na to, aby zabezpečilo dobrý kontakt s kožou. Ak sa použijú iné nosiče ako voda, prípadný vplyv nosiča na podráždenie kože má byť minimálny.

Po skončení expozície, ktorá trvá zvyčajne 4 hodiny, sa zvyšná testovaná látka odstráni podľa potreby s použitím vody alebo vhodného roztoku bez toho, aby sa pozmenila existujúca reakcia alebo integrita epidermy.

1.4.2.2 Veľkosť dávky

Na testované miesto sa aplikuje dávka o veľkosti 0,5 ml kvapaliny alebo 0,5 g tuhej látky alebo pasty.

1.4.2.3 Počiatočný test (In vivo test podráždenia/poleptania kože na jednom zvierati)

Dôrazne sa odporúča, aby sa v in vivo počiatočnom teste použilo jedno zviera, najmä keď sa predpokladá, že látka môže byť žieravá. Je to v súlade so stratégiou postupného testovania (pozri prílohu 1).

Keď sa na základe kritickej analýzy usúdi, že látka je žieravá, ďalšie testovanie na zvieratách nie je potrebné. Pre väčšinu látok, o ktorých sa predpokladá, že sú žieravé, ďalšie in vivo testovanie zvyčajne nie je potrebné. V tých prípadoch, kde však následkom nedostatočných dôkazov chýbajú ďalšie potvrdzujúce údaje, sa môže vykonať testovanie na zvieratách v obmedzenom rozsahu na základe tohto prístupu: Postupne sa aplikujú na zviera tri testovacie náplasti. Prvá náplasť sa odstráni po troch minútach. Ak sa nezistí závažná reakcia kože, aplikuje sa druhá náplasť a odstráni sa po jednej hodine. Ak zo zistení v tomto štádiu vyplýva, že je humánne, aby sa expozícia mohla predĺžiť na štyri hodiny, aplikuje sa tretia náplasť a odstráni sa po štyroch hodinách a reakcia sa vyhodnotí.

Ak sa zistí žieravý účinok po ktorejkoľvek z troch postupných expozícií, test sa ihneď ukončí. Ak sa po odstránení poslednej náplasti nezistí žieravý účinok, zviera sa pozoruje 14 dní, pokiaľ sa poleptanie neprejaví skôr.

V tých prípadoch, keď sa neočakáva, že testovaná látka spôsobí poleptanie, ale môže byť dráždivá, aplikuje sa jediná náplasť jednému zvieraťu na štyri hodiny.

1.4.2.4 Potvrdzujúci test (In vivo test podráždenia kože na ďalších zvieratách)

Ak sa nezistí žieravý účinok v počiatočnom teste, dráždivá alebo negatívna reakcia sa potvrdí na maximálne dvoch ďalších zvieratách, každé s jednou náplasťou s časom expozície štyri hodiny. Ak sa v počiatočnom teste zistí dráždivý účinok, môže sa vykonať potvrdzujúci test postupným spôsobom alebo expozíciou dvoch ďalších zvierat súčasne. Vo výnimočnom prípade, keď sa neuskutoční počiatočný test, dvom alebo trom zvieratám sa môže aplikovať jediná náplasť, ktorá sa odstráni po štyroch hodinách. V prípade, keď sa použijú dve zvieratá, ak obidve vykazujú rovnakú reakciu, nie je potrebné ďalšie testovanie. V opačnom prípade sa testuje aj tretie zviera. Môže byť potrebné, aby sa nejednoznačné reakcie vyhodnotili na ďalších zvieratách.

1.4.2.5 Doba pozorovania

Dĺžka času pozorovania má byť dostatočná na celkové posúdenie reverzibility zistených účinkov. Pokus je však potrebné ukončiť vždy, keď zviera vykazuje pretrvávajúce príznaky silnej bolesti alebo utrpenia. Na určenie reverzibilných účinkov sa zvieratá pozorujú do 14 dní po odstránení náplastí. Ak sa pozoruje reverzibilita pred uplynutím 14 dní, pokus je potrebné v tomto čase ukončiť.

1.4.2.6 Klinické pozorovania a vyhodnotenie kožných reakcií

Všetky zvieratá sa vyšetria, či nemajú príznaky erytému (sčervenania kože) a edému (opuchu) a reakcie po 60 minútach sa vyhodnotia a potom po 24, 48 a 72 hodinách po odstránení náplasti. V prípade počiatočného testu na jednom zvierati sa testované miesto tiež vyšetrí bezprostredne po odstránení náplasti. Kožné reakcie sa vyhodnotia a zaznamenajú podľa stupňov v nižšie uvedenej tabuľke. Ak sa vyskytne poškodenie kože, ktoré nie je možné označiť ako podráždenie alebo poleptanie po 72 hodinách, budú potrebné pozorovania až do 14. dňa, aby sa určila reverzibilita účinkov. Okrem toho na pozorovanie podráždenia, všetky lokálne toxické účinky, ako je odmastenie pokožky a všetky systémové nepriaznivé účinky (napr. účinky na klinické príznaky toxicity a telesnú hmotnosť), sa celkove popíšu a zaznamenajú. Na objasnenie nejednoznačných reakcií je potrebné uvažovať o vykonaní histopatologického vyšetrenia.

Vyhodnotenie kožných reakcií je nevyhnutne subjektívne. Na podporu zosúladenia pri vyhodnocovaní kožnej reakcie a na pomoc testovacím laboratóriám a tým, ktorí sú zainteresovaní na uskutočňovaní a interpretovaní výsledkov, zamestnanci uskutočňujúci vyšetrenia musia byť primerane vyškolení na používanie systému hodnotenia. Užitočnou by mohla byť ilustrovaná príručka na vyhodnotenie podráždenia kože a iných poškodení (9).

2. ÚDAJE

2.1 PREDKLADANIE VÝSLEDKOV

Výsledky štúdie sa zhrnú v podobe tabuliek v záverečnej správe z testu a vzťahujú sa na všetky body uvedené v oddiele 3.1.

2.2 VYHODNOTENIE VÝSLEDKOV

Stupne podráždenia kože sa posudzujú v súvislosti s charakterom a závažnosťou poškodení a ich reverzibilitou alebo ireverzibilitou. Jednotlivé stupne nepredstavujú pre dráždivé vlastnosti materiálu absolútnu normu, keďže sa hodnotia aj iné účinky testovaného materiálu. Skôr je potrebné na jednotlivé stupne nazerať ako na referenčné hodnoty, ktoré sa majú posudzovať v súvislosti s inými pozorovaniami zo štúdie.

Pri hodnotení dráždivých reakcií je potrebné posúdiť reverzibilitu poškodení kože. Keď reakcie ako alopécia (obmedzená), hyperkeratóza, hyperplázia a šupinatosť pretrvávajú do konca 14-denného obdobia pozorovania, testovaná látka sa pokladá za dráždivú.

3. PODÁVANIE SPRÁV

2.1 SPRÁVA O TESTE

Správa z testu musí obsahovať tieto informácie:

Zdôvodnenie in vivo testovania: kritická analýza údajov z predchádzajúcich testov, vrátane výsledkov zo stratégie postupného testovania:

- popis dôležitých údajov dostupných z predchádzajúceho testovania;

- údaje získané v každom štádiu stratégie testovania;

- popis vykonaných in vitro testov, vrátane údajov o postupoch, získaných výsledkov s testovanými/referenčnými látkami;

- kritická analýza pre uskutočnenie in vivo štúdie

Testovaná látka:

- identifikačné údaje (napr. číslo CAS; zdroj; čistota; známe nečistoty; číslo šarže);

- fyzikálny charakter a fyzikálno-chemické vlastnosti (napr. pH, prchavosť, rozpustnosť, stabilita);

- v prípade zmesi, zloženie a vzájomný percentuálny podiel zložiek.

Nosič:

- identifikácia, koncentrácia (v prípade potreby), použitý objem;

- zdôvodnenie výberu nosiča.

Pokusné zvieratá:

- použitý druh/kmeň, zdôvodnenie pre použitie iných zvierat ako králik - albín;

- počet zvierat každého pohlavia;

- hmotnosti jednotlivých zvierat na začiatku a konci testu;

- vek na začiatku štúdie;

- zdroj zvierat, podmienky umiestnenia, krmivo atď.;

Testovacie podmienky:

- technika prípravy miesta pre náplasť;

- údaje o použitých materiáloch na náplasť a metóda pokrytia náplasťou;

- údaje o príprave testovanej látky, aplikácii a odstránení.

Výsledky:

- tabuľkové spracovanie stupňov reakcie podráždenia/poleptania pre každé zviera vo všetkých meraných časoch;

- popisy všetkých pozorovaných poškodení;

- podrobný popis charakteru a stupňa zisteného podráždenia alebo poleptania a všetky histopatologické nálezy;

- popis iných nepriaznivých lokálnych (napr. odmastenie kože) a systémových účinkov okrem podráždenia kože alebo poleptania.

Diskusia k výsledkom

4. ODKAZY

(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429.

(2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26.

(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709-720.

(4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, "Skin Irritation", European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels.

(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524.

(5a) Testovacia metóda B.40 Leptanie kože.

(6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. V Solne, Švédsko, 22. – 24. januára 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(7) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, potvrdený 28. spoločným zasadaním Výboru pre chemikálie a Pracovnej skupiny pre chemikálie, november 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www1.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

(9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. [Na požiadanie k dispozícii na sekretariáte OECD].

TABUĽKA I: STUPNE REAKCIÍ KOŽE

Vytvorenie erytému alebo chrasty

Žiadny erytém … | 0 |

Veľmi slabý erytém (sotva pozorovateľný) … | 1 |

Jasne ohraničený erytém … | 2 |

Mierny až silný erytém … | 3 |

Výrazný erytém (tmavočervený) až vytvorenie chrasty zabraňujúcej posúdenie erytému … | 4 |

Maximálne možný: 4 |

Vytvorenie edému

Žiadny edém … | 0 |

Veľmi slabý edém (sotva pozorovateľný) … | 1 |

Slabý edém (okraje oblasti jasne ohraničené zreteľným opuchom) … | 2 |

Mierny edém (opuch približne 1 mm) … | 3 |

Výrazný edém (opuch viac ako 1 mm a presahujúci za oblasť expozície) … | 4 |

Maximálne možný: 4 |

Na objasnenie nejednoznačných reakcií sa môže vykonať histopatologické vyšetrenie.

--------------------------------------------------

PRÍLOHA 2E

B. 5. AKÚTNA TOXICITA: PODRÁŽDENIE/POLEPTANIE OKA

1. METÓDA

Táto metóda je rovnocenná s OECD TG 405 (2002).

1.1 ÚVOD

Pri príprave tejto aktualizovanej metódy sa osobitná pozornosť venovala možným zlepšeniam na základe vyhodnotenia všetkých existujúcich informácií o testovanej látke, aby sa zabránilo zbytočnému testovaniu na pokusných zvieratách, a tým zohľadnila ochrana zvierat. Táto metóda zahrnuje odporúčanie, aby sa pred uskutočnením opísaného in vivo testu poleptania/podráždenia oka látkou uskutočnila kritická analýza existujúcich príslušných údajov. Ak nie sú k dispozícii dostačujúce údaje, odporúča sa, aby sa získali na základe postupného testovania (2) (3). Stratégia testovania zahrnuje vykonanie validovaných a uznaných in vitro testov a je uvedená ako príloha k testovacej metóde. Okrem toho sa odporúča použiť in vivo test podráždenia/poleptania kože na predpovedanie poleptania oka pred uvážením in vivo očného testu.

V záujme vedeckej spoľahlivosti a aj starostlivosti o zvieratá, nie je potrebné uvažovať o in vivo testovaní, pokiaľ neboli všetky dostupné údaje súvisiace s potenciálnym poleptaním/podráždením oka látkou vyhodnotené v kritickej analýze. Takéto údaje zahrnujú dôkaz z existujúcich štúdií na ľuďoch a/alebo laboratórnych zvieratách, dôkaz o poleptaní/podráždení jednou alebo viacerými štrukturálne príbuznými látkami alebo zmesami takýchto látok, údaje dokazujúce silnú aciditu alebo alkalitu látky (4) (5) a výsledky z validovaných a uznaných in vitro alebo ex vivo testov na poleptanie a podráždenie kože (6) (6a). Štúdie je možné vykonať pred kritickou analýzou alebo ako jej výsledok.

V prípade určitých látok takáto analýza môže poukázať na potrebu in vivo štúdií potenciálu látky spôsobiť poleptanie/podráždenie oka. Vo všetkých takýchto prípadoch sa pred uvažovaním o použití in vivo očného testu pokiaľ možno uskutoční najskôr štúdia in vivo účinkov látky na kožu a vyhodnotí sa v súlade s testovacou metódou B.4 (7). Použitie kritickej analýzy a stratégie postupného testovania má znížiť potrebu in vivo testovania poleptania/podráždenia oka látkami, pre ktoré už existuje dostatok dôkazov z iných štúdií. Ak sa stanovenie poleptania alebo podráždenia oka nedá vykonať s použitím stratégie postupného testovania, ani po uskutočnení in vivo štúdie poleptania a podráždenia kože, môže sa vykonať in vivo test poleptania/podráždenia oka.

Uprednostňovaná stratégia postupného testovania, ktorá zahrnuje vykonanie validovaných a uznaných in vitro alebo ex vivo testov poleptania/podráždenia, je zahrnutá v prílohe k tejto testovacej metóde. Stratégia bola vypracovaná a jednomyseľne odporučená účastníkmi OECD workshopu (8) a bola prijatá ako odporúčaná stratégia testovania v Globálne harmonizovanom systéme pre klasifikáciu chemických látok (GHS) (9). Odporúča sa, aby sa táto stratégia testovania dodržiavala pred uskutočnením in vivo testovania. V prípade nových látok sa na získanie vedecky spoľahlivých údajov o poleptaní/podráždení látkou odporúča koncepcia postupného testovania. V prípade existujúcich látok s nedostačujúcimi údajmi o poleptaní/podráždení kože a oka sa uvedená stratégia použije na získanie chýbajúcich údajov. Použitie odlišných stratégií testovania alebo testovacieho postupu alebo rozhodnutie nepoužiť koncepciu postupného testovania je potrebné zdôvodniť.

1.2 DEFINÍCIE

Podráždenie oka: je vytvorenie zmien na oku po aplikácii testovanej látky na vonkajší povrch oka, ktoré sú úplne reverzibilné do 21 dní po aplikácii.

Poleptanie oka: je vytvorenie poškodenia tkaniva oka alebo závažné fyzické oslabenie zraku po aplikácii testovanej látky na vonkajší povrch oka, ktoré nie sú úplne reverzibilné do 21 dní po aplikácii.

1.3 PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY

Testovaná látka sa aplikuje v jednorazovej dávke do jedného oka pokusného zvieraťa; neošetrené oko slúži ako kontrola. Stupeň podráždenia/poleptania oka sa vyhodnotí na základe hodnotenia poškodenia spojoviek, rohovky a dúhovky v špecifických intervaloch. Iné účinky na oku a nepriaznivé systémové účinky sa tiež popíšu, aby sa uviedlo úplné vyhodnotenie účinkov. Trvanie štúdie má byť dostatočné na posúdenie reverzibility alebo ireverzibility účinkov.

Zvieratá vykazujúce pretrvávajúce príznaky silného utrpenia a/alebo bolesti v ktoromkoľvek štádiu testu sa humánnym spôsobom usmrtia a daná látka sa na základe toho zatriedi. Kritéria pre rozhodnutie humánnym spôsobom usmrtiť moribundné a silne trpiace zvieratá je možné nájsť v odkaze (10).

1.4 OPIS TESTOVACEJ METÓDY

1.4.1 Príprava na in vivo test

1.4.1.1 Výber druhov

Ako laboratórne zviera sa pokiaľ možno použije králik – albín a použijú sa zdravé mladé dospelé zvieratá. Je potrebné uviesť zdôvodnenie, ak sa použijú iné kmene alebo druhy.

1.4.1.2 Príprava zvierat

Obe oči každého pokusného zvieraťa, predbežne vybratého na testovanie, sa 24 hodín pred začatím testovania vyšetria. Nepoužijú sa zvieratá vykazujúce podráždenie očí, očné poruchy alebo predchádzajúce zranenie rohovky.

1.4.1.3 Podmienky pre umiestnenie a kŕmenie

Zvieratá majú byť umiestnené jednotlivo. Teplota miestnosti na pokusy s králikmi má byť 22 °C (± 3 °C). Aj keď relatívna vlhkosť má byť aspoň 30 % a pokiaľ možno, nemala by prevyšovať 70 %, okrem obdobia počas čistenia miestnosti má dosahovať 50-60 %. Osvetlenie má byť umelé, v rytme 12 hodín svetlo, 12 hodín tma. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody.

1.4.2 Postup testu

1.4.2.1 Aplikácia testovanej látky

Testovaná látka sa umiestni do spojovkového vaku jedného oka každého zvieraťa po jemnom odtiahnutí spodného viečka od očnej gule. Viečka sa jemne podržia pri sebe asi jednu sekundu, aby sa zabránilo stratám materiálu. Druhé oko, ktoré nebolo ošetrené, slúži ako kontrola.

1.4.2.2 Vymývanie

Oči testovaných zvierat sa nevymývajú aspoň 24 hodín po nakvapkaní testovanej látky, okrem tuhých látok (pozri oddiel 1.4.2.3.2), a v prípade okamžitých leptavých alebo dráždivých účinkov. Po 24 hodinách sa môžu vymyť, ak sa usúdi, že je to potrebné.

Použitie vedľajšej skupiny zvierat na vyšetrenie vplyvu vymytia sa neodporúča, pokiaľ to nie je vedecky odôvodnené. Ak je potrebná súbežná skupina, použijú sa dva králiky. Podmienky vymytia sa starostlivo zdokumentujú, napr. čas vymytia; zloženie a teplota vymývacieho roztoku, trvanie, objem a rýchlosť aplikácie.

1.4.2.3 Veľkosť dávky

1.4.2.3.1 Testovanie kvapalín

Pre testovanie kvapalín sa používa dávka 0,1 ml. Na nakvapkanie látky priamo do oka sa nepoužijú pumpičkové spreje. Tekutina zo spreja sa vystrieka a zozbiera v nádobke predtým, ako sa vkvapne do oka 0,1 ml.

1.4.2.3.2 Testovanie tuhých látok

Pri testovaní tuhých látok, pást a látok, ktoré sú tvorené z častíc, použité množstvo má mať objem 0,1 ml alebo hmotnosť maximálne 100 mg. Testovaný materiál sa pomelie na jemný prášok. Objem tuhého materiálu sa zmeria po jemnom zhutnení, napr. poklepaním nádobky na meranie. Ak testovaná tuhá látka nebola fyziologicky odstránená z oka pokusného zvieraťa pri prvom zisťovaní v časovom bode 1 hodina po ošetrení, oko sa môže vymyť fyziologickým roztokom alebo destilovanou vodou.

1.4.2.3.3 Testovanie aerosólov

Odporúča sa, aby sa všetky látky v pumpičkových sprejoch a aerosóloch vystriekali a zozbierali pred nakvapkaním do oka. Jedinou výnimkou sú látky v tlakových aerosólových nádobách, ktoré sa nedajú vystriekať a zozbierať kvôli vyparovaniu. V takýchto prípadoch sa oko ponechá otvorené a testovaná látka sa aplikuje do oka ako jednorazové vstrieknutie približne jednu sekundu zo vzdialenosti 10 cm priamo na prednú časť oka. Táto vzdialenosť sa môže meniť v závislosti od tlaku spreja a jeho obsahu. Pozornosť je potrebné venovať tomu, aby sa tlakom zo spreja nepoškodilo oko. V určitých prípadoch môže byť potrebné posúdiť možnosť "mechanického" poškodenia oka tlakom kvapaliny zo spreja.

Odhad dávky z aerosólu sa môže urobiť simulovaním testu takto: látka sa nasprejuje na navažovací papier cez otvor o veľkosti oka králika, ktoré je umiestnené tesne pred papierom. Na základe zvýšenia hmotnosti papiera sa odhadne množstvo nasprejované do oka. V prípade prchavých látok sa môže dávka odhadnúť tak, že sa nádobka s materiálom odváži pred odstránením testovaného materiálu a po ňom.

1.4.2.4 Počiatočný test (In vivo test podráždenia/poleptania oka na jednom zvierati)

Ako sa zdôrazňuje v stratégii postupného testovania (pozri prílohu 1), dôrazne sa odporúča, aby sa v in vivo test uskutočnil najskôr na jednom zvierati.

Ak z výsledkov tohto testu vyplynie, že látka je žieravá alebo silne dráždivá pre oko s použitím uvedeného postupu, ďalšie testovanie na očnú dráždivosť nie je potrebné vykonať.

1.4.2.5 Lokálne anestetiká

Lokálne anestetiká sa môžu použiť v jednotlivých prípadoch. Ak z kritickej analýzy vyplýva, že látka môže spôsobiť bolesť, alebo počiatočné testovanie ukáže, že sa vyskytne bolestivá reakcia, môže sa pred nakvapkaním testovanej látky použiť lokálne anestetikum. Je potrebné starostlivo zvoliť typ, koncentráciu a dávku lokálneho anestetika, aby sa zabezpečilo, že rozdiely v reakcii na testovanú látku nevzniknú na základe toho, že sa použilo. Kontrolné oko sa rovnako ošetrí anestetikom.

1.4.2.6 Potvrdzujúci test (In vivo test podráždenia oka na ďalších zvieratách)

Ak sa v počiatočnom teste nezistí žieravý účinok, dráždivá alebo negatívna reakcia by sa mal potvrdiť na maximálne dvoch ďalších zvieratách. Ak sa zistí silný dráždivý účinok v počiatočnom teste, z ktorého vyplýva silný (ireverzibilný) účinok v potvrdzujúcom testovaní, odporúča sa, aby sa potvrdzujúci test uskutočnil postupným spôsobom v danom čase na jednom zvierati a nie súčasnou expozíciou dvoch ďalších zvierat. Ak sa na druhom zvierati prejavia žieravé alebo silne dráždivé účinky, test sa preruší. Ďalšie zvieratá môže byť potrebné použiť na potvrdenie slabých alebo miernych dráždivých reakcií.

1.4.2.7 Doba pozorovania

Dĺžka času pozorovania má byť dostatočná na celkové posúdenie miery a reverzibility zistených účinkov. Pokus je však potrebné ukončiť vždy, keď zviera vykazuje pretrvávajúce príznaky silnej bolesti alebo utrpenia (9). Na stanovenie reverzibility účinkov sa zvieratá zvyčajne pozorujú spravidla 21 dní po podaní testovanej látky. Ak sa zistí reverzibilita pred uplynutím 21 dní, pokus sa v tomto čase ukončí.

1.4.2.7.1 Klinické pozorovania a vyhodnotenie reakcií oka

Oči sa vyšetria po 1, 24, 48 a 72 hodinách po aplikácii testovanej látky. Hneď ako sa získa konečná informácia, zvieratá už nie potrebné ďalej testovať. Zvieratá vykazujúce pretrvávajúce príznaky silného utrpenia alebo bolesti sa ihneď humánnym spôsobom usmrtia a daná látka sa na základe toho posúdi. Zvieratá, ktoré po nakvapkaní majú tieto poškodenia oka, sa humánnym spôsobom usmrtia: perforácia rohovky alebo závažná ulcerácia rohovky vrátane stafylomu; krvácanie prednej komory oka; nepriehľadnosť rohovky 4. stupňa, ktoré pretrváva 48 hodín; chýbajúca reakcia zreničiek na svetlo (reakcia dúhovky stupeň 2), ktorá pretrváva 72 hodín; ulcerácia spojovkovej membrány (conjuctivea); nekróza spojoviek alebo tretieho viečka; alebo odlupovanie. Je to kvôli tomu, že takéto poškodenia zvyčajne nie sú reverzibilné.

Zvieratá, u ktorých sa nevyskytlo žiadne poškodenie oka, môžu byť usmrtené najskôr 3 dni po nakvapkaní látky.

Zvieratá so slabými až miernymi poškodeniami sa pozorujú, pokiaľ poškodenia nezmiznú alebo 21 dní, keď je štúdia ukončená. Pozorovania sa uskutočnia na 7., 14. a 24. deň na stanovenie stavu poškodení a ich reverzibility alebo ireverzibility.

Stupne reakcií oka (spojovky, rohovky a dúhovky) sa pri každom vyšetrení zaznamenajú (Tabuľka I). Každé ďalšie poškodenia oka (napr. panus, sfarbenie) alebo systémové nepriaznivé účinky sa tiež zaznamenajú.

Na vyšetrenie reakcií sa môže použiť binokulárna lupa, ručná štrbinová lampa, alebo biomikroskop alebo iný vhodný prístroj. Po tom, ako sa zaznamenajú zistenia po 24 hodinách, sa ďalej môžu oči vyšetriť fluoresceínom.

Vyhodnotenie reakcií oka je nevyhnutne subjektívne. Na podporu harmonizácie pri vyhodnotení reakcie oka a na pomoc testovacím laboratóriám a tým, ktorí sú zainteresovaní na uskutočňovaní a interpretovaní výsledkov, musia byť zamestnanci, ktorí uskutočňujú pozorovania, primerane vyškolení na používanie systému hodnotenia.

2. ÚDAJE

2.2 VYHODNOTENIE VÝSLEDKOV

Vyhodnotenie podráždenia oka sa posúdi v súvislosti s charakterom a závažnosťou poškodení a ich reverzibilitou alebo ireverzibilitou. Jednotlivé stupne nepredstavujú absolútne kritérium pre dráždivé vlastnosti materiálu, keďže sa hodnotia aj iné účinky testovaného materiálu. Skôr je potrebné na jednotlivé stupne nazerať ako na referenčné hodnoty, ktoré majú zmysel iba vtedy, keď sú doložené celkovým popisom a posúdením všetkých vyšetrení.

3. PODÁVANIE SPRÁV

3.1 SPRÁVA O TESTE

Správa o teste musí obsahovať tieto informácie:

Zdôvodnenie pre in vivo testovanie: kritická analýza údajov z predchádzajúcich testov, vrátane výsledkov zo stratégie postupného testovania:

- popis dôležitých údajov dostupných z predchádzajúceho testovania;

- údaje získané v každom štádiu stratégie testovania;

- popis uskutočnených in vitro testov, vrátane údajov o postupoch, získaných výsledkov s testovanými/referenčnými látkami;

- popis in vivo uskutočnenej štúdie podráždenia/poleptania kože, vrátane získaných výsledkov;

- kritická analýza pre uskutočnenie in vivo štúdie

Testovaná látka:

- identifikačné údaje (napr. číslo CAS; zdroj, čistota, známe nečistoty, číslo šarže);

- fyzikálny charakter a fyzikálno-chemické vlastnosti (napr. pH, prchavosť, rozpustnosť, stabilita, reaktivita s vodou);

- v prípade zmesi, zloženie a vzájomný percentuálny podiel zložiek;

- ak sa použije lokálne anestetikum, identifikácia, čistota, typ, dávka a prípadná interakcia s testovanou látkou.

Nosič:

- identifikácia, koncentrácia (v prípade potreby), použitý objem;

- zdôvodnenie výberu nosiča.

Pokusné zvieratá:

- použitý druh/kmeň, zdôvodnenie pre použitie iných zvierat ako králik – albín;

- vek každého zvieraťa na začiatku štúdie;

- počet zvierat každého pohlavia v testovaných a kontrolných skupinách (v prípade potreby);

- hmotnosti jednotlivých zvierat na začiatku a konci testu;

- zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo atď.

Výsledky:

- opis použitej metódy na hodnotenie podráždenia v každom čase vyšetrenia (napr. ručná štrbinová lampa, biomikroskop, fluoresceín);

- tabuľkové spracovanie údajov o dráždivých/žieravých účinkoch pre každé zviera v každom čase vyšetrenia až do vylúčenia každého zvieraťa z testu;

- podrobný opis stupňa zisteného podráždenia alebo poleptania;

- opis všetkých pozorovaných poškodení oka (napr. vaskularizácia, vytvorenie panusu, sfarbenie);

- popis iných lokálnych a systémových nepriaznivých účinkov, ktoré sa nevyskytujú na oku, a prípadné histopatologické zistenia.

Diskusia k výsledkom.

3.2 INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV

Extrapolácia výsledkov štúdií podráždenia oka u laboratórnych zvierat na ľudí je možná len v obmedzenej miere. V mnohých prípadoch je králik – albín citlivejší na látky, ktoré spôsobujú podráždenie alebo poleptanie oka, ako ľudia.

Pozornosť je potrebné venovať interpretácii údajov na vylúčenie podráždenia vyplývajúceho zo sekundárnej infekcie.

4. ODKAZY

(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410- 429.

(2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159-164.

(3) Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177.

(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19 - 26.

(5) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 - 231.

(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524.

(6a) Testovacia metóda B.40 Leptanie kože.

(7) Testovacia metóda B.4. Akútna toxicita: podráždenie/poleptanie kože.

(8) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. V Solne, Švédsko, 22.–24. januára 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(9) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, potvrdený 28. spoločným zasadaním Výboru pre chemikálie a Pracovnej skupiny pre chemikálie, november 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(10) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

TABUĽKA I: STUPNE POŠKODENIA OKA

Rohovka

Nepriehľadnosť (opacita): stupeň zákalu (odčítava sa od najhustejšej oblasti) [1] |

Žiadna ulcerácia alebo nepriehľadnosť (opacita) … | 0 |

Roztrúsené alebo difúzne oblasti nepriehľadnosti (opacity) (iné ako ľahký zákal normálneho lesku); zreteľne viditeľné detaily dúhovky … | 1 |

Ľahko rozoznateľná priehľadná oblasť; detaily dúhovky mierne zakalené … | 2 |

Perleťová oblasť; neviditeľné detaily dúhovky, veľkosť zreničky ťažko rozoznateľná … | 3 |

Nepriehľadná rohovka; dúhovka nezistiteľná cez zákal … | 4 |

Maximálne možný: 4 |

Dúhovka

Normálna … | 0 |

Nápadne privreté riasy, prekrvenie, opuch, mierne prekrvenie okolo rohovky; alebo injektácia, dúhovka reaguje na svetlo (pomalá reakcia sa pokladá za pozitívnu) … | 1 |

Krvácanie, hrubé poškodenie, bez reakcie na svetlo … | 2 |

Maximálne možný: 2 |

Spojovky

Sčervenanie (týka sa palpebrálnych a bulbárnych spojoviek, bez rohovky a dúhovky) |

Normálne … | 0 |

Niektoré cievy prekrvené (injektované) … | 1 |

Difúzne karmínové zafarbenie, jednotlivé cievy ťažko rozoznateľné … | 2 |

Difúzna tmavá červeň … | 3 |

Maximálne možný: 3 |

Chemóza

Opuch (týka sa viečok a/alebo tretieho viečka) |

Normálne … | 0 |

Trocha opuchnuté nad normálom … | 1 |

Zreteľný opuch s čiastočným vyvrátením viečok … | 2 |

Opuch s polovičným uzavretím viečok … | 3 |

Opuch s väčším ako polovičným uzavretím viečok … | 4 |

Maximálne možný: 4 |

[1] Veľkosť nepriehľadnej oblasti rohovky sa zaznamená

--------------------------------------------------

PRÍLOHA 2F

B.31. ŠTÚDIA PRENATÁLNEJ VÝVOJOVEJ TOXICITY

1. METÓDA

Táto metóda zodpovedá OECD TG 414 (2001).

1.1. ÚVOD

Táto metóda na testovanie vývojovej toxicity je určená na poskytnutie všeobecnej informácie týkajúcej sa účinkov prenatálnej expozície na gravidné pokusné zviera a na vývoj organizmu v utere; sem môže patriť hodnotenie účinkov na matku, ako aj uhynutie, štrukturálne abnormality alebo poruchy rastu plodu. Funkčné poruchy, aj keď sú dôležitou časťou vývoja, nie sú integrálnou časťou tejto testovacej metódy. Môžu byť testované na tieto účinky v oddelenej štúdii, alebo ako doplnok k tejto štúdii, s použitím testovacej metódy pre vývojovú neurotoxicitu. Informácie o testovaní funkčných porúch a iných postnatálnych účinkov sa dajú v prípade potreby získať z testovacej metódy pre dvojgeneračnú štúdiu reprodukčnej toxicity a štúdiu vývojovej neurotoxicity.

Táto testovacia metóda môže vyžadovať, aby sa jednotlivé testy osobitne upravili na základe konkrétnych poznatkov napr. o fyzikálno-chemických alebo toxikologických vlastnostiach testovanej látky. Takáto úprava je prípustná, ak na základe presvedčivého vedeckého dôkazu vyplýva, že úprava vedie k spoľahlivejšiemu testu. V takomto prípade sa tento vedecký dôkaz starostlivo zdokumentuje v správe zo štúdie.

1.2 DEFINÍCIE

Vývojová toxikológia: štúdia nepriaznivých účinkov na vyvíjajúci sa organizmus, ktoré môže zapríčiniť expozícia pred počatím, počas prenatálneho vývoja alebo postnatálne do obdobia sexuálnej zrelosti. K hlavným prejavom vývojovej toxicity patrí 1. smrť organizmu, 2. štrukturálna abnormalita, 3. poruchy rastu a 4. funkčné poruchy. Vývojová toxikológia sa predtým označovala ako teratológia.

Nepriaznivý účinok: každá zmena voči normálnemu stavu v súvislosti s ošetrením, ktorá znižuje schopnosť organizmu prežiť, reprodukovať sa alebo prispôsobovať sa prostrediu. V širšom zmysle vývojová toxikológia zahrnuje každý účinok, ktorý vplýva na normálny vývoj zárodku ako pred narodením, tak aj a po narodení.

Porucha rastu: zmena hmotnosti alebo veľkosti orgánov alebo tela potomstva.

Zmeny (anomálie): štrukturálne zmeny vo vývoji, ktoré zahrnujú malformácie a aj odchýlky (28).

Malformácia/veľká abnormalita: Štrukturálna zmena, ktorá sa pokladá za škodlivú pre zviera (môže byť tiež smrteľná) a je zvyčajne zriedkavá.

Odchýlka/malá abnormalita: štrukturálna zmena, o ktorej sa usudzuje, že má malý alebo žiadny škodlivý účinok na zviera; môže byť prechodná a môže sa vyskytovať pomerne často v kontrolnej populácii.

Zárodok: suma derivátov oplodneného vajíčka v každom štádiu vývoja od oplodnenia do narodenia vrátane extraembryonálnych membrán, ako aj embrya alebo plodu.

Implantácia (nidácia): uchytenie blastocysty v epitelovej výstelke uteru, vrátane jej penetrácie cez epitel utera a jej zahniezdenie do endometria.

Embryo: skoré štádium alebo vývojové štádium každého organizmu, najmä vyvíjajúceho sa produktu oplodnenia vajíčka po vzniku pozdĺžnej osi a pokiaľ nie sú prítomné všetky hlavné štruktúry.

Embryotoxicita: škodlivé pre normálnu štruktúru, vývoj, rast a/alebo životaschopnosť embrya.

Plod: nenarodené potomstvo v postembryonálnom období.

Fetotoxicita: škodlivé pre normálnu štruktúru, vývoj, rast a/alebo životaschopnosť plodu.

Potrat: predčasné vypudenie produktov oplodnenia z uteru: embrya alebo neživotaschopného plodu.

Resorpcia: zárodok, ktorý po implantovaní do uteru, uhynul a sa vstrebáva, alebo sa vstrebal.

Skorá resorpcia: dôkaz implantácie bez toho, aby sa dalo embryo/plod rozoznať

Neskorá resorpcia: mŕtve embryo alebo plod s vonkajšími degeneratívnymi zmenami

NOAEL: skratka pre hladinu bez pozorovaného nepriaznivého účinku a je to najvyššia dávka alebo úroveň expozície, pri ktorej sa nepozorujú žiadne nepriaznivé zistenia v súvislosti s ošetrením.

1.3 REFERENČNÁ LÁTKA

Žiadna.

1.4 PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY

Testovaná látka sa zvyčajne podáva gravidným zvieratám v dobe aspoň od implantácie do jedného dňa pred napl