3.

Vkladá sa táto kapitola VIII: „VIII. CELKOVÝ OBSAH CUKROV 1. Zameranie Na stanovenie celkového obsahu cukrov (vyjadrený ako invertný cukor) v liehovinách, s výnimkou likérov obsahujúcich vajcia a mliečne výrobky, sa používa metóda HPLC-RI. Metóda bola validovaná medzilaboratórnou štúdiou likéru pastis, destilovaného anízu, čerešňového likéru a krémového likéru z (nasleduje názov použitého ovocia alebo použitej suroviny), krémového likéru z čiernych ríbezlí na úrovniach v rozsahu od 10,86 g/l do 509,7 g/l. Lineárnosť odozvy prístroja však bola dokázaná v prípade rozsahu koncentrácie od 2,5 g/l do 20,0 g/l. Táto metóda nie je určená na stanovenie nízkych úrovní obsahu cukrov. 2. Odkazy na normy ISO 3696:1987: Kvalita vody na analytické účely. Špecifikácia a skúšobné metódy. 3. Princíp Vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou sa analyzujú roztoky cukru s cieľom stanoviť koncentrácie glukózy, fruktózy, sacharózy, maltózy a laktózy v nich. Táto metóda využíva alkylamínovú stacionárnu fázu a diferenciálnu refraktometriu a uvádza sa ako príklad. Možné by malo byť aj použitie meniča aniónov ako stacionárnej fázy. 4. Reagenty a materiály 4.1. Glukóza (CAS č. 50-99-7) s čistotou najmenej 99 %. 4.2. Fruktóza (CAS č. 57-48-7) s čistotou najmenej 99 %. 4.3. Sacharóza (CAS č. 57-50-1) s čistotou najmenej 99 %. 4.4. Laktóza (CAS č. 5965-66-2) s čistotou najmenej 99 %. 4.5. Maltóza, monohydrát (CAS č. 6363-53-7) s čistotou najmenej 99 %. 4.6. Čistý acetonitril (CAS 75-05-8) na analýzu HPLC. 4.7. Destilovaná alebo demineralizovaná voda, najlepšie mikrofiltrovaná. 4.8. Rozpúšťadlá (príklad) Elučné rozpúšťadlo je zložené: zo 75 objemových častí acetonitrilu (4.6), z 25 objemových častí acetonitrilu (4.7). Pred odplynením nechajte 5 až 10 minút prúdiť hélium malým prietokom. Ak použitá voda nebola mikrofiltrovaná, rozpúšťadlo by sa malo filtrovať filtrom na organické rozpúšťadlá s veľkosťou pórov ≤ 0,45 μm. 4.9. Absolútny etanol (CAS 64-17-5). 4.10. Roztok etanolu (5 % obj.). 4.11. Príprava zásobného štandardného roztoku (20 g/l) Odvážte 2 g z každého cukru, ktorý sa má analyzovať (4.1. až 4.5.), a preneste ich bez straty do 100 ml odmernej banky. (pozn.: 2,11 g monohydrátu maltózy zodpovedá 2 g maltózy). Doplňte do 100 ml roztokom 5 % obj. etanolu (4.10), pretrepte a skladujte pri teplote okolo + 4 °C. Nový zásobný roztok pripravujte raz týždenne. 4.12. Príprava pracovných štandardných roztokov (2,5, 5,0, 7,5, 10,0 a 20,0 g/l) Zásobný roztok 20g/l (4.11) zrieďte v roztoku 5 % obj. etanolu (4.10), aby ste získali päť pracovných štandardných roztokov 2,5, 5,0, 7,5, 10,0 a 20,0 g/l. Filtrujte filtrom s veľkosťou pórov ≤ 0,45 μm (5.3.). 5. Prístroje a vybavenie 5.1. HPLC systém umožňujúci dosiahnuť úplné rozlíšenie všetkých cukrov. 5.1.1. Vysokoúčinný kvapalinový chromatograf so šesťcestným vstrekovacím ventilom vybavený 10 μl slučkou alebo akýmkoľvek iným zariadením, automatickým či manuálnym, umožňujúci spoľahlivé vstrekovanie mikroobjemov. 5.1.2. Čerpací systém umožňujúci dosiahnuť a udržiavať konštantnú alebo naprogramovanú rýchlosť prietoku s veľkou presnosťou. 5.1.3. Diferenciálny refraktometer. 5.1.4. Počítačový integrátor alebo zapisovač, ktorého výkon je kompatibilný so zvyškom zostavy. 5.1.5. Predkolóna: odporúča sa spojiť analytickú kolónu s vhodnou predkolónou. 5.1.6. Kolóna (príklad): Materiál: nehrdzavejúca oceľ alebo sklo. Vnútorný priemer: 2 až 5 mm. Dĺžka: 100 až 250 mm (v závislosti od veľkosti častíc v balení), napríklad 250 mm v prípade častíc s priemerom 5 μm. Stacionárna fáza: alkylamínové funkčné skupiny viazané na oxid kremičitý s maximálnou veľkosťou častíc 5 μm. 5.1.7. Chromatografické podmienky (príklad). Elučné rozpúšťadlo (4.8.), prietoková rýchlosť: 1 ml/min. Detekcia: diferenciálnym refraktometrom. Aby ste sa uistili, že je detektor dokonale stabilný, mali by ste ho zapnúť niekoľko hodín pred použitím. Referenčná kyveta sa musí naplniť elučným rozpúšťadlom. 5.2. Analytické váhy s presnosťou na 0,1 mg. 5.3. Filtračná zostava pre malé objemy s použitím 0,45 μm mikromembrány. 6. Skladovanie vzoriek Po doručení sa vzorky pred analýzou skladujú pri izbovej teplote. 7. Postup 7.1. ČASŤ A: Príprava vzorky 7.1.1. Vzorku pretrepte. 7.1.2. Vzorku filtrujte filtrom s veľkosťou pórov ≤ 0,45 μm (5.3). 7.2. ČASŤ B: HPLC 7.2.1. Stanovenie Nadávkujte 10 μl štandardných roztokov (4.12.) a vzoriek (7.1.2.). Analyzujte za vhodných chromatografických podmienok, napr. tých, ktoré sú opísané vyššie. 7.2.2. Ak by niektorý z píkov dosiahol väčšiu plochu (alebo výšku) ako zodpovedajúci pík štandardného roztoku s najvyššou koncentráciou, mala by sa vzorka zriediť destilovanou vodou a znovu analyzovať. 8. Výpočet Porovnajte dva chromatogramy – jeden zo štandardného roztoku a jeden z liehoviny. Identifikujte píky podľa ich retenčných časov. Zmerajte ich plochy (alebo výšky) na výpočet koncentrácie metódou externého štandardu. Zohľadnite každé zriedenie vzorky. Konečným výsledkom je suma sacharózy, maltózy, laktózy, glukózy a fruktózy vyjadrená ako invertný cukor v gramoch/L. Invertný cukor sa vypočíta ako suma všetkých prítomných monosacharidov a redukujúcich disacharidov plus stechiometrické množstvo glukózy a fruktózy vypočítané z prítomnej sacharózy. Invertný cukor (g/l) = glukóza (g/l) + fruktóza (g/l) + maltóza (g/l) + laktóza (g/l) + (sacharóza (g/l) × 1,05) 1,05 = (molekulová hmotnosť fruktózy + molekulová hmotnosť glukózy)/molekulová hmotnosť sacharózy 9. Pracovné charakteristiky metódy (presnosť) 9.1. Štatistické výsledky medzilaboratórnej porovnávacej skúšky Ďalej uvedené údaje boli získané z medzinárodnej porovnávacej štúdie metódy, ktorá bola vypracovaná podľa medzinárodne odsúhlasených postupov [1], [2]. Rok vykonania medzilaboratórnej porovnávacej skúšky 2000 Počet laboratórií 24 Počet vzoriek 8 [1] ‚Protocol for the Design, Conduct and Interpretation of Method- Performance Studies‘ Horwitz, W. (1995) Pure and Applied Chemistry 67, 332-343. [2] Horwitz, W. (1982) ‚Analytical Chemistry 54, 67A-76A‘. Tabuľka 1 Fruktóza, glukóza, maltóza Analyt Fruktóza Glukóza Maltóza Vzorky (× 2) Krémový likér z čiernych ríbezlí Štandard (50 g/l) Liehoviny s anízovou príchuťou Krémový likér z čiernych ríbezlí Štandard (50 g/l) Liehoviny s anízovou príchuťou Štandard (10 g/l) Stredná hodnota [v g/l] 92,78 50,61 15,62 93,16 50,06 15,81 9,32 Počet laboratórií bez odľahlých hodnôt 21 22 21 23 19 21 22 Štandardná odchýlka opakovateľnosti sr [v g/l] 2,34 2,12 0,43 3,47 1,01 0,48 0,54 Relatívna štandardná odchýlka opakovateľnosti RSDR [v %] 2,53 4,2 2,76 3,72 2,03 3,02 5,77 Limit opakovateľnosti r [v g/l] (r = 2,8 × sr) 6,56 5,95 1,21 9,71 2,84 1,34 1,51 Štandardná odchýlka reprodukovateľnosti sR [v g/l] 7,72 3,13 0,84 9,99 2,7 0,88 1,4 Relatívna štandardná odchýlka reprodukovateľnosti RSDR [v %] 8,32 6,18 5,37 10,72 5,4 5,54 15,06 Limit reprodukovateľnosti R [v g/l] (R = 2,8 × sR) 21,62 8,76 2,35 27,97 7,57 2,45 3,93

Tabuľka 2 Sacharóza Analyt Sacharóza Vzorky Pastis Ouzo Čerešňový likér Krémový likér z mäty Krémový likér z čiernych ríbezlí Štandard (100 g/l) Stredná hodnota [v g/l] 10,83 29,2 19,7 (*) 103,33 349,96 319,84 99,83 Počet laboratórií bez odľahlých hodnôt 19 19 20 18 18 18 Štandardná odchýlka opakovateľnosti sr [v g/l] 0,09 0,75 2,17 5,99 4,31 1,25 Relatívna štandardná odchýlka opakovateľnosti RSDR [v %] 0,81 3,07 2,1 1,71 1,35 1,25 Limit opakovateľnosti r [v g/l] (r = 2,8 × sr) 0,25 2,1 6,07 16,76 12,06 3,49 Štandardná odchýlka reprodukovateľnosti sR [v g/l] 0,79 0,92 4,18 9,94 16,11 4,63 Relatívna štandardná odchýlka reprodukovateľnosti RSDR [v %] 7,31 3,76 4,05 2,84 5,04 4,64 Limit reprodukovateľnosti R [v g/l] (R = 2,8 × sR) 2,22 2,57 11,7 27,84 45,12 12,97

Tabuľka 3 Celkový obsah cukrov (Poznámka: tieto údaje boli vypočítané pre celkový obsah cukrov, nie pre invertný cukor podľa oddielu 8.)

Vzorky Pastis Ouzo Liehoviny s anízovou príchuťou Čerešňový likér Krémový likér z mäty Krémový likér z čiernych ríbezlí Štandard (220 g/l) Stredná hodnota [v g/l] 10,86 29,2 19,7 (**) 31,59 103,33 349,73 509,69 218,78 Počet laboratórií bez odľahlých hodnôt 20 19 20 20 18 18 19 Štandardná odchýlka opakovateľnosti sr [v g/l] 0,13 0,75 0,77 2,17 5,89 5,59 2,71 Relatívna štandardná odchýlka opakovateľnosti RSDR [v %] 1,16 3,07 2,45 2,1 1,69 1,1 1,24 Limit opakovateľnosti r [v g/l] (r = 2,8 × sr) 0,35 2,1 2,17 6,07 16,5 15,65 7,59 Štandardná odchýlka reprodukovateľnosti sR [v g/l] 0,79 0,92 1,51 4,18 9,98 14,81 8,53 Relatívna štandardná odchýlka reprodukovateľnosti RSDR [v %] 7,25 3,76 4,79 4,04 2,85 2,91 3,9 Limit reprodukovateľnosti R [v g/l] (R = 2,8 × sR) 2,21 2,57 4,24 11,7 27,94 41,48 23,89