PRÍLOHA III

PRÍPRAVA VZORIEK A POŽIADAVKY NA METÓDY ANALÝZY, KTORÉ SA VYUŽÍVAJÚ NA KONTROLU hodnôt DIOXÍNOV (PCDD/F) A DIOXÍNOM PODOBNÝCH PCB V URČITÝCH POTRAVINÁCH

1. OBLASŤ POUŽITIA

Požiadavky, ktoré sú stanovené v tejto prílohe, sa uplatňujú v prípadoch, keď sa vykonáva analýza potravín na úradnú kontrolu hodnôt 2,3,7,8-substituovaných polychlórovaných dibenzo-p-dioxínov a polychlórovaných dibenzofuránov (PCDD/F) a dioxínom podobných polychlórovaných bifenylov (dioxínom podobných PCB), a pokiaľ ide o prípravu vzoriek a analytické požiadavky na iné regulačné účely vrátane kontrol vykonávaných prevádzkovateľom potravinárskeho podniku na zabezpečenie súladu s ustanoveniami článku 4 nariadenia (ES) č. 852/2004.

Monitorovanie prítomnosti PCDD/F a dioxínom podobných PCB sa môže vykonávať pomocou dvoch rozličných druhov analytických metód:

a) Skríningové metódy

Cieľom skríningových metód je výber vzoriek s hodnotami PCDD/F a dioxínom podobných PCB, ktoré prekračujú maximálne hodnoty alebo akčné hodnoty. Skríningové metódy umožňujú analýzu vysokého počtu vzoriek pri priaznivom pomere efektivity a nákladov, čím sa zvyšuje pravdepodobnosť zistenia nových prípadov, v ktorých môže vysoká úroveň expozície viesť k zdravotným rizikám pre spotrebiteľov. Ich použitie má za cieľ predchádzať výsledkom chybne vykazujúcim súlad. Môžu zahŕňať bioanalytické metódy a metódy GC/MS.

Skríningovými metódami sa porovnáva analytický výsledok s medznou hodnotou, na základe čoho sa určuje možné prekročenie/neprekročenie maximálnej alebo akčnej hodnoty. Koncentrácia PCDD/F a suma PCDD/F a dioxínom podobných PCB vo vzorkách, pri ktorých existuje podozrenie, že nie sú v súlade s maximálnou hodnotou, sa musí stanoviť alebo potvrdiť potvrdzujúcou metódou.

Skríningové metódy môžu navyše poskytnúť informáciu o hodnotách PCDD/F a dioxínom podobných PCB prítomných vo vzorke. V prípade uplatňovania bioanalytických skríningových metód sa výsledok vyjadruje v bioanalytických ekvivalentoch (BEQ), zatiaľ čo v prípade uplatňovania fyzikálno-chemických metód GC-MS sa vyjadruje v toxických ekvivalentoch (TEQ). Číselné výsledky skríningových metód sú vhodné na preukázanie súladu, podozrenia na nesúlad alebo prekročenia akčných hodnôt a poskytujú informáciu o rozsahu hodnôt v prípade nasledovného použitia potvrdzujúcich metód. Nie sú vhodné na hodnotenie pozaďových hodnôt, odhad príjmu, sledovanie dlhodobého vývoja hodnôt, ani na prehodnotenie akčných a maximálnych hodnôt.

b) Potvrdzujúce metódy

Potvrdzujúce metódy umožňujú jednoznačnú identifikáciu a kvantifikáciu PCDD/F a dioxínom podobných PCB prítomných vo vzorke a poskytujú úplné informácie o jednotlivých kongenéroch. Preto tieto metódy umožňujú kontrolu maximálnych a akčných hodnôt vrátane potvrdenia výsledkov získaných skríningovými metódami. Okrem toho sa výsledky môžu použiť na iné účely, ako napríklad na stanovenie nízkych pozaďových hodnôt pri monitorovaní potravín, sledovanie dlhodobého vývoja hodnôt, posúdenie vystavenia obyvateľstva a vytváranie databázy na účely možného prehodnotenia akčných a maximálnych hodnôt. Takisto sú dôležité z dôvodu stanovenia kongenérových profilov na účely identifikácie zdroja možnej kontaminácie. Pri týchto metódach sa používa GC-HRMS. Na potvrdenie súladu alebo nesúladu s maximálnymi hodnotami sa môže použiť aj metóda GC-MS/MS.

2. SÚVISLOSTI

Pri výpočte koncentrácií TEQ sa násobia koncentrácie jednotlivých látok v predmetnej vzorke príslušným faktorom TEF stanoveným Svetovou zdravotníckou organizáciou, ktorý sa uvádza v dodatku k tejto prílohe, a následne sa spočítavajú, aby sa dospelo k celkovej koncentrácii dioxínom podobných zlúčenín, vyjadrenej v TEQ.

Skríningové a potvrdzujúce metódy sa môžu použiť na kontrolu určitej matrice iba za predpokladu, že príslušné metódy sú dostatočne citlivé na to, aby sa nimi dala spoľahlivo zistiť maximálna alebo akčná hodnota.

3. POŽIADAVKY NA ZABEZPEČENIE KVALITY

V prípade potreby sa každá laboratórna vzorka jemne rozmelie a dôkladne premieša, a to postupom, ktorý preukázateľne zabezpečí dokonalú homogenizáciu (napr. rozomieľanie do stupňa prechodu 1 mm sitom); ak je obsah vlhkosti vo vzorkách príliš vysoký, pred rozomletím sa musia vzorky vysušiť.

4. POŽIADAVKY NA LABORATÓRIÁ

5. ZÁKLADNÉ POŽIADAVKY, KTORÉ MÁ SPĹŇAŤ ANALYTICKÝ POSTUP PRE DIOXÍNY (PCDD/F) A DIOXÍNOM PODOBNÉ PCB

5.1. Nízky pracovný rozsah a kvantifikačné limity

5.2. Vysoká selektívnosť (špecifickosť)

5.3. Vysoká miera správnosti (pravdivosť a presnosť, zdanlivá výťažnosť biotestu)

5.4. Validácia v rozsahu maximálnej hodnoty a všeobecné opatrenia na kontrolu kvality

5.5. Kvantifikačný limit

Pri bioanalytickej skríningovej metóde nie je stanovenie kvantifikačného limitu (LOQ – limit of quantification) nevyhnutnou požiadavkou, ale pomocou tejto metódy musí byť možné rozlišovať medzi slepou a medznou hodnotou. Pri stanovovaní hodnoty BEQ sa stanovuje referenčná hodnota pre zaobchádzanie so vzorkami vykazujúcimi odozvu pod touto hodnotou. Preukáže sa, že príslušná referenčná hodnota sa aspoň trojnásobne odlišuje od slepých vzoriek použitých pri postupe, ktoré vykazujú odozvu pod pracovným rozsahom. Vypočítava sa preto zo vzoriek obsahujúcich cieľové zlúčeniny v koncentrácii približujúcej sa požadovanej minimálnej hodnote, a nie na základe pomeru signál-šum (S/N) alebo slepého pokusu.

5.6. Analytické kritériá

5.7. Špecifické požiadavky na skríningové metódy

6. ŠPECIFICKÉ POŽIADAVKY NA METÓDY GC/MS, KTORÉ JE POTREBNÉ SPLNIŤ NA ÚČELY SKRÍNINGU A POTVRDZOVANIA

6.1. Prijateľné rozdiely medzi hornou a dolnou medzou hodnôt WHO-TEQ.

6.2. Kontrola výťažností

6.3. Odstránenie interferujúcich látok

6.4. Kalibrácia na základe štandardnej krivky

6.5. Špecifické kritériá pre potvrdzujúce metódy

7. ŠPECIFICKÉ POŽIADAVKY NA BIOANALYTICKÉ METÓDY

Bioanalytické metódy sú metódy založené na využívaní biologických princípov, ako sú bunkové testy, receptorové testy alebo imunologické testy. V tomto bode sú stanovené požiadavky na bioanalytické metódy ako také.

Skríningová metóda v zásade klasifikuje vzorku ako vzorku, v ktorej sú stanovené hodnoty dodržané, alebo ako vzorku, pri ktorej existuje podozrenie na nedodržanie stanovených hodnôt. Na tieto účely sa vypočítaná hodnota BEQ porovná s medznou hodnotou (pozri bod 7.3). Vzorky pod medznou hodnotou sa vyhlásia za vzorky, v prípade ktorých je dodržaná stanovená hodnota, vzorky rovnajúce sa medznej hodnote alebo nad medznou hodnotou za vzorky, v prípade ktorých existuje podozrenie na prekročenie stanovených hodnôt a vyžadujúce si analýzu pomocou konfirmačnej metódy. Hodnota BEQ zodpovedajúca dvom tretinám maximálnej hodnoty môže v praxi poslúžiť ako medzná hodnota, pokiaľ je zabezpečené, že podiel meraní chybne vykazujúcich súlad je nižší ako 5 % a podiel výsledkov chybne vykazujúcich nesúlad je prijateľný. Pri použití samostatných maximálnych hodnôt pre PCDD/F a pre sumu PCDD/F a dioxínom podobných PCB si overenie dodržania stanovených hodín v prípade vzoriek bez frakcionácie vyžaduje vhodné medzné hodnoty pre biologické testy na PCDD/F. Na kontrolu vzoriek prekračujúcich akčné hodnoty by bolo vhodné použiť ako medznú hodnotu primerané percento príslušnej akčnej hodnoty.

Ak je indikatívna hodnota vyjadrená v BEQ, výsledky zo vzorky sa musia vyjadriť v pracovnom rozsahu a musia prekračovať medzu oznamovania (pozri body 7.1.1 a 7.1.6).

7.1. Hodnotenie reakcie na test

7.1.1. Všeobecné požiadavky

7.1.2. Kalibrácia

7.1.2.1. Kalibrácia na základe štandardnej krivky

7.1.2.2. Kalibrácia pomocou referenčných vzoriek

Alternatívne sa môže použiť kalibračná krivka vyhotovená z aspoň 4 referenčných vzoriek (pozri bod 7.2): jedna slepá matrica plus tri referenčné vzorky s 0,5, 1,0 a 2,0-násobkom maximálnej alebo akčnej hodnoty, pričom nie je potrebné vykonať korekciu na slepú vzorku a výťažnosť, ak vlastnosti matrice referenčných vzorcov zodpovedajú neznámym vzorkám. V tomto prípade môže byť odozva testu zodpovedajúca dvom tretinám maximálnej hodnoty (pozri bod 7.3) vypočítaná priamo z týchto vzoriek a použitá ako medzná hodnota. Na kontrolu vzoriek prekračujúcich akčné hodnoty by ako medznú hodnotu bolo vhodné použiť primeraný percentuálny podiel z týchto akčných hodnôt.

7.1.3. Oddelené stanovenie PCDD/F a dioxínom podobných PCB

Extrakty sa môžu rozdeliť do frakcií obsahujúcich PCDD/F a dioxínom podobné PCB, čím sa umožní samostatné stanovenie hodnôt TEQ (v BEQ) pre PCDD/F a dioxínom podobné PCB. Na hodnotenie výsledkov pre frakciu obsahujúcu dioxínom podobné PCB sa prednostne používa štandardná kalibračná krivka PCB 126.

7.1.4. Zdanlivé výťažnosti biotestu

„Zdanlivá výťažnosť biotestu“ sa vypočítava z vhodných referenčných vzoriek s reprezentatívnymi kongenérovými profilmi v oblasti maximálnej a akčnej hodnoty a vyjadruje sa ako percentuálny podiel hodnoty BEQ v porovnaní s hodnotou TEQ. V závislosti od použitého typu testu a TEF (2) môžu rozdiely medzi faktormi TEF a REP pre dioxínom podobné PCB spôsobovať nízke zdanlivé výťažnosti pre dioxínom podobné PCB v porovnaní s PCDD/F. Preto v prípade samostatného stanovovania PCDD/F a dioxínom podobných PCB sú biotestové zdanlivé výťažnosti: pre dioxínom podobné PCB na úrovni 20 % až 60 %, pre PCDD/F 50 % až 130 % (pri použití kalibračnej krivky TCDD). Keďže príspevok dioxínom podobných PCB k sume PCDD/F a dioxínom podobných PCB môže byť rôzny v prípade rozličných matríc a vzoriek, zdanlivé výťažnosti biotestu pre súhrnný parameter odzrkadľujú tieto rozsahy a musia sa nachádzať v rozpätí od 30 % do 130 %.

7.1.5. Kontrola výťažností čistenia

Pri validácii sa kontroluje strata zlúčenín, ku ktorej došlo pri čistení. Slepá vzorka s prídavkom zmesi rozličných kongenérov sa podrobuje čisteniu (aspoň n = 3) a pomocou potvrdzujúcej metódy sa overuje výťažnosť a variabilita. Výťažnosť sa nachádza v rozpätí 60 % až 120 % predovšetkým v prípade kongenérov prispievajúcich viac než 10 % k hodnote TEQ v rozličných zmesiach.

7.1.6. Medza oznamovania

Pri oznamovaní hodnôt BEQ sa medza oznamovania stanovuje z príslušných vzoriek matríc vykazujúcich typické kongenérové profily, nie však z kalibračnej krivky štandardov vzhľadom na malú presnosť v nižšej oblasti krivky. Musia sa zohľadniť účinky extrakcie a čistenia. Medza oznamovania musí byť stanovená významne (aspoň trojnásobne) nad slepými vzorkami.

7.2. Používanie referenčných vzoriek

7.3. Stanovenie medzných hodnôt

Stanovuje sa pomer medzi bioanalytickými výsledkami v BEQ a výsledkami potvrdzujúcich metód v TEQ (napr. pomocou kalibračných experimentov zohľadňujúc príslušnú matricu, pri použití referenčných vzoriek s prídavkom analytov 0-, 0,5-, 1,00- a 2,00-násobkom maximálnej hodnoty (ML), so 6 opakovaniami pri každej hodnote (n = 24)). Korekčné faktory (slepý pokus a výťažnosť) sa môžu určiť z tohto vzťahu, ale overujú sa v každej testovacej sérii zahrnutím slepých vzoriek postupu/matrice a vzoriek na stanovenie výťažnosti (pozri bod 7.2).

Medzné hodnoty sa stanovujú na účely rozhodovania o tom, či sú vzorky v súlade s maximálnymi hodnotami, resp. na účely kontroly akčných hodnôt, ak sú sledované, a to s príslušnými maximálnymi alebo akčnými hodnotami stanovenými buď zvlášť pre PCDD/F a pre dioxínom podobné PCB, alebo pre sumu PCDD/F a dioxínom podobných PCB. Predstavujú dolnú hranicu distribúcie bioanalytických výsledkov (korigovaných na slepý pokus a výťažnosť) zodpovedajúcich rozhodovaciemu limitu potvrdzujúcej metódy pri 95 % úrovni spoľahlivosti, čiže pri nižšej ako 5 % úrovni výskytu miery meraní chybne vykazujúcich súlad (falošné negatívne merania), a pri RSDR < 25 %. Rozhodovací limit potvrdzujúcej metódy je maximálna hodnota berúc do úvahy rozšírenú neistotu merania.

V praxi je možné medznú hodnotu (v BEQ) vypočítať na základe týchto postupov (pozri obrázok 1):

7.3.1. Použitie dolného pásma 95 % predikčného intervalu rozhodovacieho limitu potvrdzujúcej metódy

pričom:

parameter súčtu štvorcov

7.3.2. Výpočet z bioanalytických výsledkov (korigovaných na slepý pokus a výťažnosť) viacnásobne opakovaných analýz vzoriek (n≥ 6) kontaminovaných na úrovni rozhodovacieho limitu potvrdzujúcej metódy predstavujúceho dolnú hranicu distribúcie dát pri zodpovedajúcej priemernej hodnote BEQ:

Medzná hodnota = BEQDL – 1,64 × SDR

pričom

7.3.3. Výpočet ako priemerná hodnota bioanalytických výsledkov (v BEQ, korigovaných na slepý pokus a výťažnosť) viacnásobne opakovaných analýz vzoriek (n≥ 6) kontaminovaných na úrovni dvoch tretín maximálnej alebo akčnej hodnoty. Vychádza sa z pozorovania, že táto hodnota bude okolo medze stanovenej v bode 7.3.1 alebo 7.3.2.

Výpočet medzných hodnôt pri 95 % úrovni spoľahlivosti, čiže pri nižšej ako 5 % miere výskytu meraní chybne vykazujúcich súlad, a pri RSDR < 25 %:

Obrázok 1

7.3.4. Obmedzenia týkajúce sa medzných hodnôt

medzné hodnoty vychádzajúce z BEQ a vypočítané z RSDR získanej pri validácii použitím obmedzeného počtu vzoriek s rozličnými matricami/kongenérovými profilmi môžu byť vyššie ako maximálne alebo akčné hodnoty vyjadrené v TEQ z dôvodu vyššej presnosti, než akú možno bežne docieliť v prípade, že sa analyzuje neznáme spektrum možných kongenérových profilov. V takýchto prípadoch sa medzné hodnoty vypočítavajú z RSDR = 25 %, alebo sa zvolí výpočet odvodený z dvoch tretín maximálnej alebo akčnej hodnoty.

7.4. Charakteristiky účinnosti

Úspešnosť metódy sa môže preukázať takisto účasťou na kruhových testoch. Výsledky zo vzoriek analyzovaných v rámci kruhových testov nachádzajúce sa v koncentračnom rozpätí až do napr. 2x ML (dvojnásobok maximálnej hodnoty) môžu byť takisto zahrnuté do vyhodnocovania podielu meraní chybne vykazujúcich súlad, ak je laboratórium schopné preukázať úspešnú účinnosť metódy. Vzorky musia pokryť najčastejšie kongenérové profily a reprezentovať rozličné zdroje.

8. OZNAMOVANIE VÝSLEDKU

Potvrdzujúce metódy

Bioanalytické skríningové metódy

Fyzikálno-chemické skríningové metódy

(1) Usmerňovací dokument o neistote merania pre laboratóriá vykonávajúce analýzu PCDD/F a PCB pomocou izotopickej zrieďovacej hmotnostnej spektrometrie [odkaz na webové sídlo], Metodika odhadu limitu detekcie (LOD) a kvantifikačného limitu (LOQ) pri meraní kontaminantov v krmivách a potravinách [odkaz na webové sídlo].

(*1) Pokiaľ ide o maximálne hodnoty.

(2) Súčasné požiadavky sú založené na TEF uverejnených v publikácii: M. Van den Berg et al, Toxicol Sci 93 (2), 223–241 (2006).

Dodatok

WHO TEF na posudzovanie rizika pre ľudí na základe záverov stretnutia odborníkov Svetovej zdravotníckej organizácie (WHO) v rámci Medzinárodného programu chemickej bezpečnosti (IPCS), ktoré sa konalo v Ženeve v júni 2005 (1)

Kongenér Hodnota TEF Kongenér Hodnota TEF dibenzo-p-dioxíny (PCDD) dioxínom podobné PCB neorto PCB + mono-orto PCB 2,3,7,8-TCDD 1 1,2,3,7,8 – PeCDD 1 Non-orto PCB 1,2,3,4,7,8-HxCDD 0,1 PCB 77 0,0001 1,2,3,6,7,8-HxCDD 0,1 PCB 81 0,0003 1,2,3,7,8,9-HxCDD 0,1 PCB 126 0,1 1,2,3,4,6,7,8 – HpCDD 0,01 PCB 169 0,03 OCDD 0,0003 Dibenzofurány (PCDF) Mono-orto PCB 2,3,7,8-TCDF 0,1 PCB 105 0,00003 1,2,3,7,8-PeCDF 0,03 PCB 114 0,00003 2,3,4,7,8-PeCDF 0,3 PCB 118 0,00003 1,2,3,4,7,8-HxCDF 0,1 PCB 123 0,00003 1,2,3,6,7,8-HxCDF 0,1 PCB 156 0,00003 1,2,3,7,8,9-HxCDF 0,1 PCB 157 0,00003 2,3,4,6,7,8-HxCDF 0,1 PCB 167 0,00003 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 0,01 PCB 189 0,00003 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 0,01 OCDF 0,0003 Použité skratky: T = tetra; Pe = penta; Hx = hexa; Hp = hepta; O = okta; CDD = chlórodibenzodioxín; CDF = chlorodibenzofurán; CB = chlórobifenyl.

(1) Martin van den Berg a kol., The 2005 World Health Organization Re-evaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin-like Compounds. Toxicological Sciences 93(2), 223–241 (2006).