PRÍLOHA

Príloha k nariadeniu (ES) č. 440/2008 sa mení takto:

Vkladajú sa kapitoly B.53, B.54, B.55, B.56, B.57 a B.58:

„B.53. ŠTÚDIA VÝVOJOVEJ NEUROTOXICITY

ÚVOD

1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmerneniami OECD na vykonávanie testov (TG) 426 (2007). V júni 1995 v Kodani diskutovala pracovná skupina OECD pre reprodukciu a vývojovú toxicitu o potrebe aktualizovať existujúce usmernenia OECD na vykonávanie testov reprodukcie a vývojovej toxicity a o vypracovaní nových usmernení k sledovaným parametrom, ktoré zatiaľ nie sú zahrnuté (1). Pracovná skupina odporučila, aby sa usmernenia na vykonávanie testov vývojovej neurotoxicity vypracovali na základe usmernení US EPA, ktoré boli medzičasom revidované (2). V júni 1996 sa v Kodani uskutočnilo druhé konzultačné stretnutie s cieľom poskytnúť sekretariátu prehľad nových usmernení na vykonávanie testov vývojovej neurotoxicity vrátane hlavných prvkov, napr. podrobností týkajúcich sa výberu druhov zvierat, obdobia dávkovania, obdobia testovania, sledovaných parametrov, ktoré sa majú posudzovať, a kritérií pre hodnotenie výsledkov. Usmernenia USA k posudzovaniu rizika neurotoxicity boli uverejnené v roku 1998 (3). V októbri 2000 sa konalo konzultačné stretnutie odborníkov OECD a v nadväznosti naň seminár Inštitútu ILSI pre vedecké riziká (ILSI Risk Science Institute) a v roku 2005 konzultačné stretnutie odborníkov v Tokiu. Tieto stretnutia sa uskutočnili s cieľom prediskutovať vedecké a technické otázky týkajúce sa súčasných usmernení na vykonávanie testov a odporúčania zo stretnutí (4)(5)(6)(7) sa zohľadnili pri vypracúvaní tejto testovacej metódy. Ďalšie informácie o realizácii, interpretácii a použitej terminológii v súvislosti s touto testovacou metódou sú k dispozícii v usmerňovacom dokumente OECD č. 43 o ‚testovaní a hodnotení reprodukčnej toxicity‘ (8) a v usmerňovacom dokumente č. 20 o ‚testovaní neurotoxicity‘ (9).

ÚVODNÉ ÚVAHY

2. O mnohých chemikáliách je známe, že majú vývojové neurotoxické účinky na ľudí a iné živočíšne druhy (10)(11)(12)(13). Na posúdenie a hodnotenie toxických vlastností chemikálie môže byť potrebné určiť potenciál vývojovej neurotoxicity. Štúdie vývojovej neurotoxicity sú určené na získanie údajov, medzi ktoré patrí aj charakterizácia vzťahu medzi dávkou a reakciou, o potenciálnych funkčných a morfologických účinkoch na vyvíjajúcu sa nervovú sústavu mláďat, ktoré môžu súvisieť s expozíciou v utere a v ranom vývojovom štádiu.

3. Štúdiu vývojovej neurotoxicity možno vykonať ako samostatnú štúdiu, zahrnutú do štúdie reprodukčnej toxicity a/alebo štúdie neurotoxicity u dospelých jedincov (napr. testovacie metódy B.34 (14), B.35 (15), B.43 (16)) alebo ju priložiť k štúdii prenatálnej vývojovej toxicity (napr. testovacia metóda B.31 (17)). Ak je štúdia vývojovej neurotoxicity zahrnutá do inej štúdie, alebo je k nej priložená, je nevyhnutné zachovať integritu oboch typov štúdií. Všetky testy by mali byť v súlade s príslušnými právnymi predpismi alebo vládnymi a inštitucionálnymi usmerneniami pre používanie laboratórnych zvierat vo výskume (napr. 18).

4. Testovacie laboratórium by malo posúdiť všetky dostupné informácie o testovanej chemikálii pred uskutočnením štúdie. Tieto informácie zahŕňajú identitu a štruktúru chemikálie, jej fyzikálno-chemické vlastnosti, výsledky všetkých ostatných in vitro alebo in vivo testov toxicity s chemikáliou, toxikologické údaje o štrukturálne príbuzných chemikáliách a predpokladané použitie(-ia) chemikálie. Tieto informácie sú potrebné, aby sa zainteresované strany presvedčili, že test má význam pre ochranu zdravia ľudí a pomôže pri výbere vhodnej počiatočnej dávky.

PRINCÍP TESTU

5. Testovaná chemikália sa podá zvieratám počas gravidity a laktácie. Účelom testovania matiek je posúdiť účinky u gravidných samíc a samíc v laktácii, pričom tieto testy môžu priniesť aj komparatívne informácie (matky v porovnaní s mláďatami). Mláďatá sa na účely hodnotenia neurotoxicity vyberú z vrhov náhodne. Hodnotenie pozostáva z pozorovaní s cieľom odhaliť makroskopické neurologické abnormality a poruchy správania vrátane posúdenia fyzického vývinu, behaviorálnej ontogenézy, motorickej aktivity, motorických a zmyslových funkcií, učenia a pamäte, ako aj posúdenia hmotnosti mozgu a neuropatológie počas postnatálneho vývinu a dospelosti.

6. Ak sa testovacia metóda vykonáva ako samostatná štúdia, možno ďalšie dostupné zvieratá v každej skupine použiť na špecifické neurobehaviorálne, neuropatologické, neurochemické alebo elektrofyziologické postupy, ktoré môžu doplniť údaje získané z vyšetrení odporúčaných podľa tejto testovacej metódy (16)(19)(20)(21). Dodatočné postupy môžu byť mimoriadne užitočné, keď empirické pozorovania, očakávané účinky alebo mechanizmus/pôsobenie indikujú špecifický typ neurotoxicity. Tieto dodatočné postupy možno použiť v prípade matiek, ako aj mláďat. Okrem toho možno použiť aj postupy ex vivo alebo in vitro, pokiaľ tieto postupy nenarúšajú integritu postupov in vivo.

PRÍPRAVY NA TEST

Výber druhov zvierat

7. Uprednostňovaným druhom zvierat sú potkany, ak je to vhodné, môžu sa použiť aj iné druhy. Majte však na pamäti, že gestačné a postnatálne dni uvedené v tejto testovacej metóde sú špecifické pre bežne používané kmene potkanov a ak sa použije iný druh alebo menej bežný kmeň, mali by sa zvoliť porovnateľné dni. Použitie iného druhu je potrebné odôvodniť na základe toxikologických, farmakokinetických a/alebo iných údajov. V odôvodnení sa uvedie dostupnosť druhovo špecifických postnatálnych neurobehaviorálnych a neuropatologických hodnotení. Ak sa predtým uskutočnil test, ktorý viedol k obavám, mal by sa zvážiť druh/kmeň, ktorý tieto obavy vyvolal. Vzhľadom na rozdielne vlastnosti rôznych kmeňov potkanov by mali byť k dispozícii dôkazy, že vybraný kmeň, ktorý sa použije, má zodpovedajúcu plodnosť a vnímavosť. Na účely zistenia vývojovej neurotoxicity je potrebné zdokumentovať spoľahlivosť a citlivosť ostatných druhov.

Podmienky umiestnenia a kŕmenia

8. Teplota v miestnosti pre pokusné zvieratá by mala byť 22 ± 3 °C. Hoci relatívna vlhkosť by mala byť najmenej 30 % a podľa možnosti by nemala presiahnuť 70 %, okrem času čistenia miestnosti, cieľom by mala byť 50 – 60 % vlhkosť. Osvetlenie by malo byť umelé a malo by sa striedať 12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Takisto možno obrátiť svetelný cyklus pred párením a po celú dobu štúdie s cieľom posúdiť funkčné a behaviorálne sledované parametre počas obdobia tmy (pri červenom svetle), t. j. v čase, keď sú zvieratá zvyčajne aktívne (22). Akékoľvek zmeny cyklu striedania svetla a tmy by mali zahŕňať primeraný čas na aklimatizáciu, aby sa zvieratá mohli prispôsobiť novému cyklu. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. Druh krmiva a vody by sa mal uviesť do správy a krmivo aj voda sa analyzujú s cieľom zistiť, či neobsahujú kontaminanty.

9. Zvieratá môžu byť umiestnené jednotlivo alebo v malých skupinách rovnakého pohlavia v klietkach. Párenie sa uskutoční v klietkach, ktoré sú vhodné na tento účel. Po spárení alebo najneskôr do 15. dňa gravidity sa spárené zvieratá umiestnia do samostatných klietok určených na vrh alebo pre matky. Klietky sa usporiadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné vplyvy vzhľadom na ich umiestnenie. Krátko pred termínom vrhu sa spáreným samiciam poskytne vhodný a vymedzený hniezdiaci materiál. Je všeobecne známe, že nesprávne zaobchádzanie alebo stres počas gravidity môže viesť k nežiaducim následkom, napríklad k prenatálnej strate alebo k zmene fetálneho alebo postnatálneho vývinu. Aby sa zabránilo strate plodu v dôsledku faktorov, ktoré nesúvisia so zaobchádzaním, malo by sa so zvieratami počas gravidity zaobchádzať starostlivo a nemali by sa vystavovať stresu v dôsledku vonkajších faktorov, akým je napr. nadmerný hluk zvonka.

Príprava zvierat

10. Mali by sa použiť zdravé zvieratá, ktoré sa aklimatizovali v laboratórnych podmienkach a neboli predmetom predchádzajúcich experimentálnych postupov, pokiaľ daná štúdia nie je zahrnutá do inej štúdie (pozri odsek 3). Pokusné zvieratá sa charakterizujú na základe druhu, kmeňa, zdroja, pohlavia, hmotnosti a veku. Každému zvieraťu sa pridelí jedinečné identifikačné číslo, ktorým sa zviera označí. Zvieratá vo všetkých pokusných skupinách by podľa možnosti mali mať tú istú hmotnosť a vek a mali by byť v obvyklom rozsahu druhu a kmeňa, ktorý je predmetom štúdie. Na každú veľkosť dávky sa použijú mladé dospelé, panenské samice. Súrodenci by sa nemali páriť a treba dôkladne dbať na to, aby sa zabezpečilo, že sa nespária. Deň gravidity 0 je deň, keď sa pozoruje vaginálna zátka a/alebo spermie. Pri kupovaní zvierat od dodávateľa, ktoré sú podľa časových údajov gravidné, by sa im mala umožniť primeraná doba na aklimatizáciu (napr. 2 – 3 dni). Spárené samice sa náhodne rozdelia do kontrolných a ošetrovaných skupín a podľa možnosti sa do týchto skupín rozdelia rovnomerne (na zabezpečenie rovnomerného rozdelenia medzi všetky skupiny sa odporúča napr. stratifikovaný náhodný postup, ako je rozdelenie na základe na telesnej hmotnosti). Samice oplodnené rovnakým samcom sa rovnomerne rozdelia do skupín.

POSTUP

Počet a pohlavie zvierat

11. Každá pokusná a kontrolná skupina by mala obsahovať dostatočný počet gravidných samíc, ktoré budú vystavené testovanej chemikálii, aby sa zabezpečil dostatočne veľký počet mláďat na účely hodnotenia neurotoxicity. Pre každú úroveň dávky sa odporúča celkom 20 vrhov. Duplicitné dávkovanie a dávkovanie rozložené do skupín je povolené, ak sa dosiahne celkový počet vrhov na skupinu, a v prípade replikátov sa použijú primerané štatistické modely.

12. Na 4. postnatálny deň (4. PND) alebo skôr (deň pôrodu je 0. PND) sa veľkosť každého vrhu upraví tak, že mláďatá navyše sa náhodne odoberú, aby sa zabezpečila jednotná veľkosť vrhu v prípade všetkých vrhov (23). Veľkosť vrhu by nemala prekročiť priemernú veľkosť vrhu kmeňa použitých hlodavcov (8 – 12). Vo vrhu by sa mal podľa možnosti nachádzať rovnaký počet samčích a samičích mláďat. Selektívne odstránenie mláďat, napr. na základe telesnej hmotnosti, nie je vhodné. Po štandardizácii vrhov (utratení) a pred ďalším testovaním funkčných sledovaných parametrov sa jednotlivé mláďatá, ktoré sa majú testovať pred odstavením alebo po odstavení od matky, jednoznačne identifikujú s využitím akejkoľvek vhodnej humánnej metódy na identifikáciu mláďat (napr. 24).

Zaradenie zvierat na funkčné a behaviorálne testy, váženie mozgu a neuropatologické hodnotenia

13. Táto testovacia metóda umožňuje rôzne prístupy, pokiaľ ide o zaradenie zvierat vystavených chemikálii v utere a prostredníctvom laktácie na funkčné a behaviorálne testy, určenie pohlavnej zrelosti, hmotnosti mozgu a neuropatologické hodnotenie (25). Ďalšie testy neurobehaviorálnych funkcií (napr. sociálneho správania), neurochémie alebo neuropatológie možno pridať v závislosti od jednotlivých prípadov, pokiaľ sa tým nenaruší integrita pôvodných požadovaných testov.

14. Z každej dávkovej skupiny sa na 4. postnatálny deň alebo neskôr vyberú mláďatá a priradia sa na účely hodnotení sledovaných parametrov. Mláďatá by sa mali vybrať tak, aby boli v prípade všetkých testov podľa možnosti z každého vrhu v každej dávkovej skupine rovnako zastúpené obe pohlavia. Na účely testovania motorickej aktivity sa testuje rovnaký pár samčích a samičích mláďat všetkých vekových skupín pred odstavením od matky (pozri odsek 35). Pri všetkých ostatných testoch sa rovnaké alebo samostatné páry samcov a samíc môžu priradiť na rôzne behaviorálne testy. Na účely testovania kognitívnych funkcií odstavených mláďat v porovnaní s dospelými jedincami môže byť potrebné priradiť rôzne mláďatá, aby sa predišlo chybnej interpretácii v dôsledku veku zvierat a predchádzajúcich skúseností s týmito meraniami (26)(27). Pri odstavení od matky (21. postnatálny deň) sa mláďatá, ktoré neboli vybrané na testovanie, humánnym spôsobom utratia. Akékoľvek zmeny v zaradení mláďat sa uvedú do správy. Štatistická merná jednotka je vrh (alebo matka), nie mláďa.

15. Existujú rôzne spôsoby, ako priradiť mláďatá na účely vyšetrení pred odstavením a po odstavení od matky, kognitívnych testov, patologických vyšetrení atď. (všeobecná schéma je uvedená na obrázku 1 a príklady priradenia v dodatku 1). Odporúčaný minimálny počet zvierat v každej dávkovej skupine na účely vyšetrení pred odstavením a po odstavení od matky je tento:

Klinické vyšetrenia a telesná hmotnosť Všetky zvieratá Podrobné klinické vyšetrenia 20/pohlavie (1/pohlavie/vrh) Hmotnosť mozgu (po fixácii) 11. – 22. PND 10/pohlavie (1/vrh) Hmotnosť mozgu (bez fixácie) ~ 70. PND 10/pohlavie (1/vrh) Neuropatológia (fixácia ponorením alebo perfúziou) 11 – 22. PND 10/pohlavie (1/vrh) Neuropatológia (fixácia perfúziou) ~ 70. PND 10/pohlavie (1/vrh) Pohlavná zrelosť 20/pohlavie (1/pohlavie/vrh) Iné vývojové medzníky (nepovinné) Všetky zvieratá Behaviorálna ontogenéza 20/pohlavie (1/pohlavie/vrh) Motorická aktivita 20/pohlavie (1/pohlavie/vrh) Motorické a zmyslové funkcie 20/pohlavie (1/pohlavie/vrh) Učenie a pamäť 10/pohlavie (1) (1/vrh)

Dávkovanie

16. Použijú sa aspoň tri veľkosti dávok a uskutoční sa paralelná kontrola. Dávky sa rozložia tak, aby sa toxické účinky zvyšovali. Ak tomu nebráni fyzikálno-chemický charakter alebo biologické vlastnosti chemikálie, zvolí sa najvyššia úroveň dávky s cieľom vyvolať určitú toxicitu u matiek (napr. klinické príznaky, zníženie prírastku telesnej hmotnosti (nie viac ako 10 %) a/alebo známky toxicity limitnej dávky v cieľovom orgáne). Vysoká dávka môže byť až na niektoré výnimky limitovaná na 1 000 mg/kg/deň telesnej hmotnosti. Napríklad očakávaná expozícia ľudí môže indikovať, že je potrebné použiť vyššiu úroveň dávkovania. Prípadne možno vykonať pilotné štúdie alebo prípravné štúdie na zistenie rozsahu najvyššej dávky, ktorá by mala vyvolať minimálnu úroveň toxicity u matiek. Ak štandardná štúdia vývojovej toxicity alebo pilotná štúdia preukáže, že testovaná chemikália spôsobuje vývojovú toxicitu, najvyššia dávka by mala byť maximálna úroveň dávky, ktorá nespôsobí nadmernú toxicitu u mláďat alebo v utere, smrť alebo malformácie plodu v takom rozsahu, ktorý znemožní zmysluplné hodnotenie neurotoxicity. Najnižšia úroveň dávky by mala byť taká, aby nevyvolala žiadne príznaky toxicity u matiek alebo vývojovej toxicity vrátane neurotoxicity. Klesajúca postupnosť dávok sa zvolí tak, aby sa preukázala každá reakcia súvisiaca s dávkou a hladina bez pozorovaného nepriaznivého účinku (NOAEL), alebo sa použijú dávky blízko detekčného limitu, ktorý by umožnil stanoviť referenčnú dávku. Dvojnásobné až štvornásobné intervaly sú často optimálne na stanovenie klesajúceho dávkovania a pridanie štvrtej dávkovej skupiny je často vhodnejšie ako používanie veľmi veľkých intervalov (napr. viac ako faktor 10) medzi dávkami.

17. Pri výbere úrovní dávok sa zohľadnia všetky existujúce údaje o toxicite, ako aj ďalšie informácie o metabolizme a toxikokinetike testovanej chemikálie alebo príbuzných materiálov. Tieto informácie môžu pomôcť aj pri preukazovaní vhodnosti režimu dávkovania. Priame dávkovanie u mláďat by sa malo zvážiť z hľadiska expozície a farmakokinetických informácií (28)(29). Pred vykonaním štúdií s priamym dávkovaním by sa mali dôkladne posúdiť všetky výhody a nevýhody (30).

18. Súbežnou kontrolnou skupinou je zdanlivo ošetrovaná kontrolná skupina alebo kontrolná skupina, ktorej sa podáva nosič, ak sa pri podávaní testovanej chemikálie používa nosič. Všetkým zvieratám sa bežne podá rovnaké množstvo testovanej chemikálie alebo nosiča podľa telesnej hmotnosti. Ak sa použije nosič alebo iné aditívum na uľahčenie dávkovania, je potrebné zvážiť tieto vlastnosti: vplyv na absorpciu, distribúciu, metabolizmus alebo zadržiavanie testovanej chemikálie, účinky na chemické vlastnosti testovanej chemikálie, ktoré môžu zmeniť svoje toxické vlastnosti, vplyv na spotrebu potravy a vody alebo na stav výživy zvierat. Nosič by nemal mať účinky, ktoré by mohli mať vplyv na interpretáciu štúdie, nemal by mať neurobehaviorálne toxické účinky ani účinky na reprodukciu alebo vývoj. U nových nosičov sa okrem kontrolnej skupiny nosiča použije zdanlivo ošetrovaná kontrolná skupina. So zvieratami v kontrolnej(-ých) skupine(-ách) sa zaobchádza rovnakým spôsobom ako so zvieratami v pokusných skupinách.

Podávanie dávok

19. Testovaná chemikália alebo nosič sa podá spôsobom, ktorý je najrelevantnejší pre potenciálnu expozíciu na ľudí, a na základe dostupných informácií o metabolizme a distribúcii u pokusných zvierat. Spôsob podávania bude vo všeobecnosti orálny (napr. sondou, v krmive, v pitnej vode), ale možno použiť aj iné spôsoby (napr. dermálnou aplikáciou, inhaláciou) v závislosti od vlastností a očakávaných alebo známych spôsobov expozície na ľudí (ďalšie usmernenia sú k dispozícii v usmerňovacom dokumente č. 43 (8)). Výber spôsobu podávania je potrebné odôvodniť. Testovaná chemikália sa podáva každý deň približne v rovnakom čase.

20. Dávka podávaná každému zvieraťu sa zvyčajne zakladá na naposledy zistenej telesnej hmotnosti. Osobitnú pozornosť je však potrebné venovať nastavovaniu dávok počas posledného trimestra gravidity. Ak sa zaznamená nadmerná toxicita u ošetrených matiek, tieto zvieratá sa humánnym spôsobom usmrtia.

21. Testovaná chemikália alebo nosič sa podáva minimálne raz denne spáreným samiciam od okamihu implantácie (6. deň gravidity) a počas laktácie (21. postnatálny deň), aby boli mláďatá vystavené testovanej chemikálii počas prenatálneho a postnatálneho neurologického vývoja. Vek, v ktorom sa začínajú podávať dávky, trvanie a frekvencia dávkovania možno upraviť, ak sa preukáže, že takéto pokusné usporiadanie má pre expozíciu na ľudí väčší význam. Trvanie dávkovania sa pre ostatné druhy upraví tak, aby sa zabezpečila expozícia počas počiatočných fáz vývoja mozgu (t. j. fáz zodpovedajúcich prenatálnemu a počiatočnému postnatálnemu vývoju ľudského mozgu). S dávkovaním sa môže začať od začiatku gravidity (0. deň gravidity), hoci je potrebné zvážiť potenciál testovanej chemikálie spôsobiť predimplantačnú stratu. Podávaním od 6. dňa gravidity sa tomuto riziku zabráni, nezohľadnia sa však vývojové štádiá medzi 0. a 6. dňom gravidity. Ak laboratórium nakúpi zvieratá spárené na základe časových údajov, nie je praktické začať s dávkovaním na 0. deň gravidity a je vhodné začať s ním na 6. deň gravidity. Pokusné laboratórium by malo stanoviť režim dávkovania na základe relevantných informácií o účinkoch testovanej chemikálie, predchádzajúcich skúseností a logistických aspektov, ktoré môžu viesť k predĺženiu dávkovania na obdobie, keď sa mláďa odstaví od matky. Dávka by sa v deň pôrodu nemala podať tým zvieratám, ktoré ešte nevrhli všetky svoje mláďatá. Vo všeobecnosti sa predpokladá, že k expozícii mláďat dôjde prostredníctvom materského mlieka, priame dávkovanie u mláďat by sa však malo zvážiť v tých prípadoch, keď nemožno preukázať nepretržitú expozíciu mláďat. Dôkazy o nepretržitej expozícii možno získať napr. z farmakokinetických informácií, na základe toxicity u mláďat alebo zmien biomarkerov (28).

POZOROVANIA

Pozorovania u matiek

22. Všetky matky sa dôkladne pozorujú najmenej raz denne, a to s ohľadom na ich zdravotný stav vrátane chorobnosti a úmrtnosti.

23. Počas ošetrovania a pozorovania by sa mali pravidelne vykonávať podrobnejšie klinické vyšetrenia (najmenej dvakrát počas dávkovania v období gravidity a dvakrát počas dávkovania v období laktácie) najmenej u desiatich matiek pri každej úrovni dávkovania. Zvieratá mimo domácej klietky pozorujú školení technici, ktorí nie sú informovaní, akým spôsobom boli zvieratá ošetrené, a to s využitím štandardizovaných postupov, aby sa minimalizoval stres u zvierat a zaujatosť pozorovateľa a maximalizovala sa spoľahlivosť pozorovateľa. Odporúča sa, aby vyšetrovania v danej štúdii podľa možnosti vykonával ten istý technik.

24. Pozorované príznaky sa zaznamenajú. Vždy, keď je to možné, zaznamená sa aj závažnosť pozorovaných príznakov. Klinicky sa pozorujú okrem iného zmeny na koži, srsti, očiach, slizniciach, výskyt sekrétov a autonómna aktivita (napr. slzenie, zježenie, veľkosť zreničky, nezvyčajný priebeh dýchania a/alebo dýchanie ústami, všetky nezvyčajné príznaky pri močení alebo vyprázdňovaní).

25. Všetky nezvyčajné reakcie, pokiaľ ide o polohu tela, stupeň aktivity (napr. zvýšený alebo znížený záujem o preskúmanie zvyčajného priestoru) a koordinácia pohybu, sa tiež zaznamenajú. Zmeny chôdze (napr. tackavá chôdza, ataxia), poloha (napr. zhrbená) a reaktivita na zaobchádzanie, premiestnenie alebo iné podnety z prostredia, ako aj výskyt klonických alebo tonických pohybov, kŕče, triaška, stereotypy (napr. nadmerná starostlivosť o srsť, nezvyčajné pohyby hlavou, opakovaný beh dokola), zvláštne správanie (napr. hryzenie alebo nadmerné olizovanie, sebamrzačenie, chôdza dozadu, vydávanie zvukov) alebo agresia sa zaznamenajú.

26. Zaznamenajú sa príznaky toxicity vrátane dňa nástupu, dennej doby, stupňa a trvania.

27. Zvieratá sa v období dávkovania v priebehu štúdie vážia najmenej raz týždenne alebo v deň pôrodu či krátko pred ním a na 21. postnatálny deň (odstavenie od matky). V prípade štúdií, v ktorých sa chemikália podáva sondou, sa matky vážia najmenej dvakrát týždenne. Dávky sa pri každom stanovení telesnej hmotnosti podľa potreby upravia. Spotreba potravy sa meria každý týždeň prinajmenšom v období gravidity a laktácie. V prípade expozície prostredníctvom vody sa aspoň raz týždenne meria spotreba vody.

Pozorovania u mláďat

28. Všetky mláďatá sa dôkladne pozorujú najmenej raz denne, a to s ohľadom na známky toxicity, chorobnosť a úmrtnosť.

29. Počas ošetrovania a pozorovania by sa u mláďat mali pravidelne vykonávať podrobnejšie klinické vyšetrenia. Mláďatá (aspoň jedno mláďa z každého pohlavia z každého vrhu) pozorujú školení technici, ktorí nie sú informovaní, akým spôsobom boli zvieratá ošetrené, a to s využitím štandardizovaných postupov, aby sa minimalizovala zaujatosť pozorovateľa a maximalizovala sa jeho spoľahlivosť. Odporúča sa, aby vyšetrovania podľa možnosti vykonával ten istý technik. Podľa potreby sa monitorujú prinajmenšom sledované parametre opísané v odsekoch 24 a 25 s ohľadom na pozorované vývojové štádium.

30. Zaznamenajú sa všetky príznaky toxicity u mláďat vrátane dňa nástupu, dennej doby, stupňa a trvania.

Fyzické a vývojové medzníky

31. Zmeny vývojových medzníkov pred odstavením (napr. odlepovanie ušných boltcov, otváranie očí, prerezávanie hryzákov) majú vysokú koreláciu s telesnou hmotnosťou (30)(31). Telesná hmotnosť môže byť najlepším ukazovateľom telesného vývoja. Meranie vývojových medzníkov sa preto odporúča iba vtedy, ak sa predtým preukázalo, že tieto sledované parametre prinesú ďalšie informácie. Časový harmonogram pre hodnotenie týchto parametrov je uvedený v tabuľke 1. V závislosti od očakávaných účinkov a výsledkov počiatočných meraní môže byť vhodné pridať ďalšie časy alebo vykonať merania v iných vývojových štádiách.

32. Pri posudzovaní telesného vývoja sa namiesto postnatálneho veku odporúča použiť postkoitálny vek (33). Ak sa mláďatá testujú v deň odstavenia od matky, odporúča sa, aby sa toto testovanie vykonalo pred samotným odstavením, aby sa predišlo chybnej interpretácii v dôsledku stresu spojeného s odstavením. Okrem toho dva dni po odstavení by sa mláďatá nemali podrobovať žiadnemu testovaniu.

Tabuľka 1

Časový harmonogram hodnotenia telesných a vývojových medzníkov a funkčné/behaviorálne sledované parametre (2)

Vekové obdobie Sledované parametre Pred odstavením (3) Dospievanie (3) Mladé dospelé jedince (3) Fyzické a vývojové medzníky Telesná hmotnosť a klinické vyšetrenia každý týždeň (4) aspoň každé dva týždne aspoň každé dva týždne Hmotnosť mozgu 22. PND (5) pri ukončení Neuropatológia 22. PND (5) pri ukončení Pohlavná zrelosť — podľa potreby — Iné vývojové medzníky (6) podľa potreby — — Funkčné/behaviorálne sledované parametre Behaviorálna ontogenéza Aspoň dve merania Motorická aktivita (vrátane návykov) 1 -3 razy (7) — raz Motorické a zmyslové funkcie — raz raz Učenie a pamäť — raz raz

33. Určí sa počet a pohlavie živých mláďat, napr. vizuálnou kontrolou alebo zmeraním anogenitálnej vzdialenosti (34)(35), a každé mláďa v rámci vrhu sa jednotlivo odváži pri narodení alebo krátko po ňom, aspoň raz týždenne počas laktácie a potom aspoň raz za dva týždne. Pri hodnotení pohlavnej zrelosti sa určí vek a telesná hmotnosť aspoň jedného samca a jednej samice z každého vrhu v čase, keď sa u nich pozoruje vaginálna priechodnosť (36) alebo oddelenie predkožky (37).

Behaviorálna ontogenéza

34. Ontogenéza vybraného správania sa meria aspoň u jedného mláďaťa z každého pohlavia z každého vrhu v príslušnom vekovom období, pričom na hodnotenie každého správania sa počas všetkých dní testovania použijú tie isté mláďatá. Medzi dňami merania by mali byť počas tohto obdobia rovnomerné odstupy, aby sa určila buď normálna zmena v ontogenéze daného správania, alebo zmena v ontogenéze daného správania súvisiaca s ošetrením (38). Medzi príklady správania, u ktorých možno hodnotiť ich ontogenézu, patrí: reflex rovnováhy, negatívna geotaxia a motorická aktivita (38)(39)(40).

Motorická aktivita

35. Motorická aktivita sa monitoruje (41)(42)(43)(44)(45) v období pred odstavením od matky a počas dospelosti. Informácie o testovaní v čase odstavenia od matky sa uvádzajú v odseku 32. Testy by mali trvať dostatočne dlho, aby sa počas testovania u neošetrených kontrolných skupín prejavili návyky. Na hodnotenie behaviorálnej ontogenézy sa dôrazne odporúča použitie motorickej aktivity. Ak sa motorická aktivita použije ako test behaviorálnej ontogenézy, potom sa v rámci testovania pri všetkých skúškach pred odstavením od matky použijú tie isté zvieratá. Testovania by mali prebiehať dostatočne často, aby bolo možné posúdiť ontogenézu návykov počas testu (44). Na tento účel môže byť potrebných tri alebo viac období pred dňom odstavenia vrátane dňa odstavenia (napr. na 13., 17., 21. postnatálny deň). Tie isté zvieratá alebo zvieratá z toho istého vrhu by sa mali testovať aj v dospelom veku krátko pred ukončením štúdie (napr. na 60. - 70. postnatálny deň). Podľa potreby môžu testovania prebiehať aj počas ďalších dní. Motorická aktivita sa monitoruje automatizovaným prístrojom, ktorý zaznamenáva aktivitu a ktorý by mal byť schopný detekovať zvýšenie, ako aj zníženie aktivity (t. j. základná aktivita podľa merania prístroja by nemala byť taká nízka, aby znemožňovala detekciu zníženej aktivity, ani taká vysoká, aby znemožňovala detekciu zvýšenej aktivity). Každý prístroj by sa mal otestovať štandardnými postupmi, aby sa v maximálnej miere zabezpečila spoľahlivosť fungovania všetkých prístrojov počas všetkých dní. Podľa možnosti sa ošetrené skupiny rovnomerne rozdelia medzi jednotlivé prístroje. Každé zviera sa testuje jednotlivo. Ošetrené skupiny sa rovnomerne rozdelia medzi jednotlivé časy testovania, aby sa predišlo mätúcemu vplyvu denného rytmu aktivity. Je potrebné zaistiť, aby boli zmeny testovacích podmienok čo najmenšie a aby neboli systematicky spojené s ošetrením. Medzi premenné, ktoré môžu ovplyvniť mnoho ukazovateľov správania vrátane motorickej aktivity, patrí hladina hluku, veľkosť a tvar pokusnej klietky, teplota, relatívna vlhkosť, svetelné podmienky, pachy, použitie domácej klietky alebo novej pokusnej klietky a rozptýlenie vplyvom prostredia.

Motorické a zmyslové funkcie

36. Motorické a zmyslové funkcie sa podrobne vyšetria najmenej raz v období dospievania a raz u mladého dospelého jedinca (napr. na 60.- 70. postnatálny deň). Informácie o testovaní v čase odstavenia od matky sa uvádzajú v odseku 32. Testovanie by malo byť dostatočné, aby sa zabezpečilo primerané kvantitatívne vzorkovanie zmyslových modalít (napr. somatické zmyslové, vestibulárne) a motorických funkcií (napr. sila, koordinácia). Medzi príklady testov motorických a zmyslových funkcií patrí reflex skríženej extenzie (46), reflex rovnováhy (47)(48), poplašná reakcia na zvukový podnet (40)(49)(50)(51)(52)(53)(54) a evokovaný potenciál (55).

Testy učenia a pamäte

37. Test asociatívneho učenia a pamäte sa vykoná po odstavení (napr. 25. deň ± 2 dni) a u mladých dospelých jedincov (na 60. postnatálny deň a neskôr). Informácie o testovaní v čase odstavenia od matky sa uvádzajú v odseku 32. V týchto dvoch vývojových štádiách možno použiť rovnaký test alebo samostatné testy. U odstavených a dospelých potkanov je pri výbere testov učenia a pamäte povolená určitá miera flexibility. Testy však musia byť navrhnuté tak, aby spĺňali dve kritériá. Po prvé, učenie sa posudzuje buď ako zmena schopnosti v priebehu viacerých opakovaných skúšok alebo testov, alebo v testoch, ktoré pozostávajú z jednej skúšky, s ohľadom na podmienku, ktorou sa zabezpečí kontrola neasociatívnych účinkov procesu učenia. Po druhé, testy by okrem prvotného učenia (nadobúdania zručností) mali zahŕňať meranie pamäte (krátkodobej alebo dlhodobej); toto meranie pamäte však nemožno uviesť do správy bez merania nadobúdania zručností z toho istého testu. Ak testy učenia a pamäte odhalia účinok testovanej chemikálie, možno zvážiť ďalšie testy, aby sa vylúčili alternatívne interpretácie na základe zmien zmyslových, motivačných a/alebo motorických schopností. Okrem dvoch uvedených kritérií sa odporúča, aby sa test učenia a pamäte vybral na základe jeho preukázanej citlivosti na triedu skúmanej chemikálie, pokiaľ sú takéto informácie k dispozícii v literatúre. Ak takéto informácie nie sú k dispozícii, medzi príklady testov, ktoré možno vykonať na splnenie týchto kritérií, patrí: pasívne vyhýbanie sa (43)(56)(57), oneskorená reakcia na pozíciu u dospelých potkanov (58) a nedospelých potkanov (59), úprava čuchových podmienok (43)(60), Morrisovo vodné bludisko (61)(62)(63), Bielovo bludisko alebo Cincinnati bludisko (64)(65), 8-ramenné radiálne bludisko (66), T-bludisko (43) a nadobúdanie a uchovávanie správania riadeného časovým harmonogramom (26)(67)(68). Ďalšie testy sú opísané v literatúre týkajúcej sa odstavených (26)(27) a dospelých potkanov (19)(20).

Vyšetrenie post mortem

38. Materské zvieratá možno po odstavení mláďat utratiť.

39. Neuropatologické hodnotenie mláďat sa vykoná s využitím tkanív z humánne usmrtených zvierat na 22. postnatálny deň alebo skôr, medzi 11. a 22. postnatálnym dňom, a tiež pri ukončení štúdie. U mláďat usmrtených na 22. postnatálny deň sa posudzuje mozgové tkanivo; u zvierat usmrtených na konci sa posudzujú tkanivá centrálnej nervovej sústavy (CNS), ako aj tkanivá periférnej nervovej sústavy (PNS). Zvieratá usmrtené na 22. postnatálny deň alebo skôr možno fixovať ponorením alebo perfúziou. Zvieratá usmrtené na konci štúdie sa fixujú perfúziou. Všetky aspekty prípravy vzoriek tkanív, od perfúzie zvierat, po pitvu vzoriek tkanív, spracovanie tkanív a farbenie sklíčok by sa mali vykonať podľa vyváženej schémy, aby každá sada obsahovala reprezentatívne vzorky z každej dávkovej skupiny. Ďalšie usmernenia k neuropatológii sa uvádzajú v usmerňovacom dokumente OECD č. 20 (9), pozri aj (103).

Spracovanie vzoriek tkanív

40. Všetky makroskopické abnormality viditeľné v čase autopsie by sa mali zaznamenať. Vzorky odobratých tkanív by mali reprezentovať všetky hlavné oblasti nervovej sústavy. Vzorky tkanív sa uchovávajú vo vhodnom fixačnom prostriedku a spracujú sa v súlade so štandardizovanými uverejnenými histologickými protokolmi (69)(70)(71) (103). Zaliatie do parafínu je v prípade tkanív CNS a PNS povolené, ak sa však požaduje vyšší stupeň rozlíšenia, môže byť vhodné použiť osmium po fixácii spolu so zaliatím do epoxidu (napr. v prípade periférnych nervov pri podozrení na periférnu neuropatiu a/alebo pri morfometrickej analýze periférnych nervov). Mozgové tkanivo odobraté na morfometrickú analýzu sa zaleje do vhodného prostriedku pri všetkých úrovniach dávky súčasne, aby sa predišlo zmenšeniu bunkových štruktúr, ktoré môže súvisieť s predĺženým skladovaním vo fixačnom prostriedku (6).

Neuropatologické vyšetrenie

41. Účelom kvalitatívneho vyšetrenia je:

i) identifikovať oblasti v rámci nervovej sústavy, ktoré vykazujú známky neuropatologických zmien;

ii) identifikovať typy neuropatologických zmien, ktoré sú dôsledkom expozície účinkom testovanej chemikálie; a

iii) stanoviť rozsah závažnosti neuropatologických zmien.

Reprezentatívne histologické rezy zo vzoriek tkaniva pod mikroskopom preskúma na tento účel vyškolený patológ s cieľom zistiť neuropatologické zmeny. Všetkým neuropatologickým zmenám sa priradí subjektívna známka indikujúca závažnosť. Na hodnotenie rezov mozgu zo zvierat humánne usmrtených na 22. postnatálny deň alebo skôr môže postačovať farbenie hematoxylínom a eozínom. Pre rezy tkanív CNS a PNS zo zvierat usmrtených na konci štúdie sa však odporúča farbenie myelínom (napr. luxol fast blue/kresyl violet) a striebrom (napr. Bielschowskeho alebo Bodianova metóda). Na základe odborného posúdenia patológa a druhu pozorovaných zmien možno zvážiť iné farbenie vhodné na identifikáciu a charakterizáciu osobitných typov zmien (napr. gliový fibrilárny acidický proteín (GFAP) alebo lektínovú histochémiu na posúdenie gliových a mikrogliových zmien (72), farbenie farbivom Fluoro-Jade na detekciu nekrózy (73)(74) alebo farbenie striebrom špecifické pre nervovú degeneráciu (75)).

42. Malo by sa vykonať morfometrické (kvantitatívne) hodnotenie, keďže tieto údaje môžu pomôcť pri detekcii účinkov spojených s ošetrením a majú význam pre interpretáciu rozdielov hmotnosti alebo morfológie mozgu súvisiacich s aplikáciou chemikálie (76)(77). Na účely morfometrického hodnotenia sa odoberie a pripraví nervové tkanivo. Súčasťou morfometrických hodnotení môžu byť napr. lineárne alebo plošné merania špecifických oblastí mozgu (78). Na lineárne alebo plošné merania je potrebné použiť homologické rezy, ktoré sa uvážlivo zvolia na základe spoľahlivých mikroskopických medzníkov (6). Na zistenie účinkov v dôsledku ošetrenia v prípade parametrov, ako je objem alebo počet buniek konkrétnych neuroanatomických oblastí (79)(80)(81)(82)(83)(84), možno použiť stereológiu.

43. Mozgy sa vyšetria, aby sa zistilo, či nevykazujú známky neuropatologických zmien súvisiacich s ošetrením, a na zabezpečenie dôkladného vyšetrenia sa vhodné vzorky odoberú zo všetkých hlavných oblastí mozgu (napr. čuchové bulby, mozgová kôra, hipokampus, bazálne gangliá, talamus, hypotalamus, stredný mozog (tectum, tegmentum a mozgové stopky), Varolov most, predĺžená miecha, mozoček). Je dôležité, aby sa rezy u všetkých zvierat odobrali v rovnakej rovine. U dospelých jedincov humánne usmrtených na konci štúdie sa odoberú reprezentatívne vzorky rezov miechy a PNS. Vyšetria sa tieto oblasti: oko s očným nervom a sietnicou, zväčšená miecha na krčných a bedrových častiach, tkanivá chrbtové a dutiny, proximálny sedací nerv, proximálny tibiálny nerv (na kolene) a tibiálne vetvy nervu lýtkového svalu. Rezy tkanív miechy a periférnych nervov budú obsahovať krížové, ako aj priečne a pozdĺžne rezy.

44. Neuropatologické hodnotenie zahŕňa vyšetrenie príznakov vývojového poškodenia nervovej sústavy (6)(85)(86)(87)(88)(89), okrem bunkových zmien (napr. neuronálna vakuolizácia, degenerácia, nekróza) a zmeny tkanív (napr. glióza, leukocytová infiltrácia, tvorba cýst). V tejto súvislosti je dôležité, aby sa účinky v dôsledku ošetrenia odlíšili od bežných vývojových udalostí, o ktorých je známe, že sa vyskytujú vo vývinovom štádiu, ktoré zodpovedá dobe utratenia (90). Príklady významných zmien, ktoré svedčia o narušení vývoja, zahŕňajú nielen:

— zmeny makroskopickej veľkosti alebo tvaru čuchových bulbov, mozgu alebo mozočka,

— zmeny relatívnej veľkosti rôznych oblastí mozgu vrátane zmenšenia alebo zväčšenia oblastí v dôsledku straty alebo pretrvávania bežne prechodných populácií buniek alebo axonálnych projekcií (napr. vonkajšia zárodočná vrstva mozočka, kalózne teleso),

— zmeny proliferácie, migrácie a diferenciácie, ako indikujú oblasti nadmernej apoptózy alebo nekrózy, zhluky alebo rozptýlené populácie ektopických, dezorientovaných alebo poškodených neurónov alebo zmeny relatívnej veľkosti rôznych vrstiev kortikálnych štruktúr,

— zmeny štruktúr myelinizácie vrátane celkového zmenšenia alebo zmeny zafarbenia myelinizovaných štruktúr,

— známky hydrocefalu, najmä zväčšenie dutín, stenóza Sylviovho kanálika a stenčenie mozgových hemisfér.

Analýza vzťahu medzi dávkou a reakciou v prípade neuropatologických zmien

45. Na kvalitatívne a kvantitatívne neuropatologické analýzy sa odporúča tento postup. Najprv sa porovnajú rezy zo skupiny s vysokou dávkou s rezmi z kontrolnej skupiny. Ak zvieratá zo skupiny s vysokou dávkou nejavia známky neuropatologických zmien, ďalšia analýza nie je potrebná. Ak sa v skupine s vysokou dávkou zistia neuropatologické zmeny, potom sa vyšetria zvieratá zo skupiny so stredne veľkou dávkou a s vysokou dávkou. Ak je skupina s vysokou dávkou ukončená v dôsledku smrti alebo inej neobjasnenej toxicity, skupiny s vysokou a stredne veľkou dávkou sa podrobia analýze na neuropatologické zmeny. Ak sa v skupinách s nižšími dávkami prejavia známky neurotoxicity, tieto skupiny sa podrobia neuropatologickej analýze. Ak sa pri kvalitatívnom alebo kvantitatívnom vyšetrení zistia akékoľvek neuropatologické zmeny v dôsledku ošetrenia, určí sa výskyt v závislosti od dávky, frekvencia a stupeň závažnosti poškodení alebo morfometrických zmien, a to na základe hodnotenia všetkých zvierat zo všetkých dávkových skupín. Do tohto hodnotenia sa zahrnú všetky oblasti mozgu, ktoré vykazujú známky neuropatologických zmien. Pri každom type poškodenia sa uvedú charakteristiky používané na vymedzenie jednotlivých stupňov závažnosti a vlastnosti používané na rozlíšenie jednotlivých stupňov. Frekvencia jednotlivých typov poškodení a ich závažnosti sa zaznamená a vykoná sa štatistická analýza, ktorá vyhodnotí povahu vzťahov medzi dávkou a reakciou. Odporúča sa použiť kódované sklíčka (91).

ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV

Údaje

46. Údaje sa do správy uvedú jednotlivo a zhrnú sa v tabuľke, pričom pri každej pokusnej skupine sa uvedú typy zmien a počet matiek, mláďatá podľa pohlavia a vrhy pri jednotlivých typoch zmien. Ak u mláďat došlo k priamej postnatálnej expozícii, do správy sa uvedie spôsob, trvanie a čas expozície.

Hodnotenie a interpretácia výsledkov

47. Štúdia vývojovej neurotoxicity prinesie informácie o účinkoch opakovanej expozície účinkom chemikálie in utero a v počiatočnom postnatálnom vývojovom štádiu. Keďže dôraz sa kladie tak na všeobecnú toxicitu, ako aj vývojovú neurotoxicitu, výsledky štúdie umožnia rozlíšenie medzi účinkami na neurologický vývoj, ktoré sa vyskytnú pri neprítomnosti všeobecnej toxicity u matky, a účinkami, ktoré sa prejavujú iba pri dávkach, ktoré sú toxické aj pre materské zviera. Vzhľadom na zložité vzájomné súvislosti medzi plánom štúdie, štatistickou analýzou a biologickou významnosťou údajov je súčasťou primeranej interpretácie údajov o vývojovej neurotoxicite aj odborný posudok (107)(109). Interpretácia výsledkov testov by mala byť založená na prístupe váhy dôkazov (20)(92)(93)(94). Štruktúra behaviorálnych alebo morfologických nálezov, pokiaľ sú prítomné, ako aj dôkazy o vzťahu medzi dávkou a reakciou sa rozoberú. Údaje zo všetkých štúdií, ktoré majú význam pre hodnotenie vývojovej neurotoxicity, vrátane epidemiologických štúdií u ľudí alebo kazuistík a experimentálnych štúdií na zvieratách (napr. toxikokinetické údaje, informácie o vzťahu medzi štruktúrou a aktivitou, údaje z iných štúdií toxicity) sa zahrnú do tejto charakterizácie. Sem patrí vzťah medzi dávkami testovanej chemikálie a prítomnosťou/neprítomnosťou, výskytom a rozsahom akýchkoľvek neurotoxických účinkov u každého pohlavia (20)(95).

48. Súčasťou hodnotenia údajov by mala byť diskusia o biologickej a štatistickej významnosti. Štatistickú analýzu treba vnímať ako nástroj, ktorý usmerňuje, nie určuje interpretáciu údajov. Chýbajúca štatistická významnosť by nemala byť jediným dôvodom pre vyvodenie záveru o účinku v dôsledku nepodania chemikálie, rovnako ako by štatistická významnosť nemala byť jediným odôvodnením pre vyvodenie záveru o účinku v dôsledku podania chemikálie. S cieľom zabezpečiť sa proti možným falošným negatívnym zisteniam a vnútorným problémom pri ‚dokazovaní negatívneho vzťahu‘ je potrebné prediskutovať dostupné pozitívne a historické kontrolné údaje, najmä ak podanie chemikálie nevyvolá žiadne účinky (102)(106). Pravdepodobnosť falošných pozitívnych výsledkov by sa mala prediskutovať so zreteľom na celkové štatistické hodnotenie údajov (96). Hodnotenie by sa malo týkať aj vzťahu medzi pozorovanými neuropatologickými a behaviorálnymi zmenami, pokiaľ takýto vzťah existuje.

49. Všetky výsledky sa analyzujú s využitím štatistických modelov, ktoré sú primerané experimentálnej schéme (108). Výber parametrickej alebo neparametrickej analýzy je potrebné odôvodniť vzhľadom na faktory, ako je povaha údajov (transformovaných alebo netransformovaných) a ich distribúcia, ako aj relatívna spoľahlivosť zvolenej štatistickej analýzy. Účel a plán štúdie by mali usmerňovať výber štatistických analýz, aby sa minimalizovali chyby typu I (falošné pozitívne) a typu II (falošné negatívne) (96)(97)(104)(105). V prípade vývojových štúdií využívajúcich multiparitné druhy, pri ktorých sa testuje viacero mláďat z jedného vrhu, by sa do štatistického modelu mal zahrnúť vrh, aby sa predišlo zvýšenej chybovosti typu I (98)(99)(100)(101). Štatistickou mernou jednotkou by mal byť vrh, nie mláďa. Pokusy by mali byť navrhnuté tak, aby sa mláďatá z toho istého vrhu nevyšetrovali nezávisle od seba. Každý sledovaný parameter, ktorý sa u toho istého objektu nameria opakovane, sa podrobí analýze s využitím štatistických modelov, ktoré zaručia, že tieto merania nebudú od seba navzájom nezávislé.

Správa o teste

50. Správa o teste obsahuje tieto informácie:

Testovaná chemikália:

— fyzikálny charakter a v prípade potreby fyzikálno-chemické vlastnosti,

— identifikačné údaje vrátane zdroja,

— čistota prípravku a známe a/alebo očakávané nečistoty.

Nosič (v prípade potreby):

— odôvodnenie výberu nosiča, ak je iný ako voda alebo fyziologický roztok.

Pokusné zvieratá:

— použité druhy a kmene a odôvodnenie použitia druhov iných ako potkany,

— dodávateľ pokusných zvierat,

— počet, vek na začiatku testu a pohlavie zvierat,

— zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo, voda atď.,

— hmotnosti jednotlivých zvierat na začiatku testu.

Podmienky testovania:

— odôvodnenie výberu úrovne dávok,

— odôvodnenie spôsobu podávania a časového trvania,

— špecifikácia podávaných dávok, vrátane údajov o nosiči, objeme a fyzikálnej forme podávaného materiálu,

— údaje o príprave testovanej chemikálie/krmiva, dosiahnutých koncentráciách, stabilite a homogenite prípravku,

— metóda použitá na jednoznačnú identifikáciu matiek a mláďat,

— podrobný opis postupu randomizácie použitého na priradenie matiek do ošetrovaných skupín, na výber mláďat na utratenie a na priradenie mláďat do testovaných skupín,

— údaje o podávaní testovanej chemikálie,

— konverzia z koncentrácie testovanej chemikálie v strave/vode (ppm) alebo pri inhalácii na samotnú dávku (mg/kg/telesná hmotnosť/deň), ak je to vhodné,

— podmienky prostredia,

— údaje o kvalite potravy a vody (napr. voda z vodovodu, destilovaná),

— dátum začiatku a konca štúdie.

Pozorovania a postupy testovania:

— podrobný opis postupov použitých na štandardizáciu pozorovaní a postupov, ako aj operačné vymedzenia pre vyhodnocovanie pozorovaní,

— zoznam všetkých použitých postupov testovania a odôvodnenie ich použitia,

— údaje o použitých behaviorálnych/funkčných, patologických, neurochemických alebo elektrofyziologických postupoch vrátane informácií a údajov o automatizovaných prístrojoch,

— postupy kalibrácie a na zabezpečenie rovnocennosti prístrojov a vyváženosti ošetrených skupín v postupoch testovania,

— stručné odôvodnenie všetkých rozhodnutí zahŕňajúcich odborné posúdenie.

Výsledky (individuálne a zhrnuté vrátane strednej hodnoty a rozptylu v prípade potreby):

— počet zvierat na začiatku štúdie a ich počet na konci štúdie,

— počet zvierat a vrhov použitých pri jednotlivých metódach testovania,

— identifikačné číslo každého zvieraťa a vrh, z ktorého pochádza,

— veľkosť vrhu a stredná hmotnosť pri narodení podľa pohlavia,

— údaje o telesnej hmotnosti a o zmene telesnej hmotnosti vrátane konečnej telesnej hmotnosti matiek a mláďat,

— údaje o spotrebe potravy a vody, ak je to vhodné (napr. ak sa testovaná chemikália podáva vo vode),

— údaje o toxikologickej reakcii podľa pohlavia a úrovne dávky vrátane známok toxicity alebo úmrtnosti, času a príčiny smrti, ak je to vhodné,

— charakter, závažnosť, trvanie, deň začiatku, denná doba a následný priebeh podrobných klinických vyšetrení,

— hodnotenie jednotlivých vývojových medzníkov (hmotnosť, pohlavná zrelosť a behaviorálna ontogenéza) v každom období vyšetrenia,

— podrobný opis všetkých behaviorálnych, funkčných, neuropatologických, neurochemických, elektrofyziologických nálezov podľa pohlavia, ako aj zvýšeného alebo zníženého výskytu u kontrolných skupín,

— pitevné nálezy,

— hmotnosť mozgu,

— všetky diagnózy vyvodené na základe neurologických známok a poškodení vrátane ochorení alebo podmienok, ktoré sa vyskytnú prirodzene,

— snímky exemplárnych nálezov,

— snímky vytvorené pri nízkej spotrebe na posúdenie homológie rezov použitých pri morfometrii,

— údaje o absorpcii a metabolizme vrátane doplňujúcich údajov zo samostatnej toxikokinetickej štúdie, ak je k dispozícii,

— štatistické spracovanie výsledkov vrátane štatistických modelov použitých na analýzy údajov a výsledky bez ohľadu na ich významnosť,

— zoznam pracovníkov, ktorí sa zúčastnili štúdie, a odborná príprava.

Rozbor výsledkov:

— údaje o vzťahu medzi dávkou a reakciou podľa pohlavia a skupiny,

— vzťah medzi inými toxickými účinkami pre výsledné posúdenie neurotoxického potenciálu testovanej chemikálie podľa pohlavia a skupiny,

— vplyv akýchkoľvek toxikokinetických informácií na výsledné posúdenie,

— podobnosti účinkov s účinkami akýchkoľvek známych neurotoxických látok,

— údaje, ktoré preukazujú spoľahlivosť a citlivosť testovacej metódy (t. j. pozitívne a historické kontrolné údaje),

— vzťah medzi neuropatologickými a funkčnými účinkami, ak existuje,

— NOAEL alebo referenčná dávka pre matky a mláďatá podľa pohlavia a skupiny.

Závery:

— rozbor celkovej interpretácie údajov na základe výsledkov vrátane výsledného posúdenia, či testovaná chemikália viedla k vývojovej neurotoxicite a NOAEL alebo nie.

LITERATÚRA

1. OECD (1995). Draft Report of the OECD Ad Hoc Working Group on Reproduction and Developmental Toxicity. Kodaň, Dánsko, 13.-14. jún 1995.

2. US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98-239. Dostupné na: [http://www.epa.gov/opptsfrs/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/].

3. US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 630/R-95/001F. Dostupné na: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordisplay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].

4. Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79 - 91.

5. Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101-111.

6. Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Claudio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropathology. Environ. Health Perspect., 109:93 - 100.

7. OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., US, 23. -25. október 2000.

8. OECD (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, OECD, Paríž. Júl 2008 Dostupné na: [http://search.oecd.org/officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage = en].

9. OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OECD, Paríž, September 2003. Dostupné na: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html].

10. Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantitative comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173-292.

11. Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000) Experimental and Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition, ISBN 0195084772, Oxford University Press, New York.

12. Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188 - 197.

13. Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998) Handbook of Developmental Neurotoxicology, 1 st Edition, ISBN 0126488606, Academic Press, New York.

14. Kapitola B.34 tejto prílohy, One-generation reproduction toxicity study.

15. Kapitola B.35 tejto prílohy, Two-generation reproduction toxicity study.

16. Kapitola B.43 tejto prílohy, Neurotoxicity Study in Rodents.

17. Kapitola B.31 tejto prílohy, Prenatal developmental toxicity study.

18. Smernica Európskeho parlamentu a Rady 2010/63/EÚ z 22. septembra 2010 o ochrane zvierat používaných na vedecké účely Ú. v. EÚ L 276, 20.10.2010, s. 33.

19. WHO (1986) Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals, (Environmental Health Criteria 60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, USA. Dostupné na: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060.htm].

20. WHO (2001) Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles and Approaches, (Environmental Health Criteria 223), World Health Organization Publications, Ženeva. Dostupné na: [http://www.intox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].

21. Chang, L.W., Slikker, W. (1995) Neurotoxicology: Approaches and Methods, 1 st Edition, ISBN 012168055X, Academic Press, New York.

22. De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxicol. Teratol., 19:499 - 509.

23. Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2 - 6.

24. Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. Animal Sci., 27:110 -112.

25. Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118 -136.

26. Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979) Ontogeny of Learning and Memory. ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.

27. Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987) Perinatal Development: A Psychobiological Perspective. Academic Press, Orlando.

28. Zoetis, T., Walls, I. (2003) Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research. ILSI Press, Washington, DC.

29. Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87 - 94.

30. Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1-4.

31. ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceuticals for Human Use.

32. Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical considerations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433 - 439.

33. Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449 - 457.

34. Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. (1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383-390.

35. Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350 - 365.

36. Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579 - 586.

37. Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. A Literature Review. Reprod., 17:298 -303.

38. Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489 -95.

39. Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896 - 920.

40. Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. In: Handbook of Behavioral Teratology. Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, New York, s. 67 -100.

41. Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53 - 66.

42. Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measurement of spontaneous motor activity, Handbook of Psychopharmacology, Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, New York, s. 37 - 82.

43. Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neurotoxicity following neonatal exposure to 3,3′-iminodipropionitrile in the rat. Neurotoxicol. Teratol., 15:117 - 129.

44. Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247 - 260.

45. Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599 - 609.

46. Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 19:1997. 405 - 411.

47. Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals.Physiol. Behav., 64:661 - 669.

48. Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol., 40:589 - 591.

49. Davis, M. (1984) The mammalian startle response. In: Neural Mechanisms of Startle Behavior, Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, s. 287-351

50. Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107-128.

51. Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory dysfunction. In Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology, Tilson, H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, s. 181- 211.

52. Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 8:199 -211.

53. Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototoxicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res.,80:25 - 30.

54. Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 6:437 - 445.

55. Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked potentials into neurotoxicity test schemes. In: Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicity, Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New York. s. 125 - 145.

56. Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory deficits in rats following exposure to 3,3′-iminopropionitrile. Toxicol. Appl. Pharmacol., 105:321 - 332.

57. Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247 -296.

58. Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 10:237 - 244.

59. Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98 -105.

60. Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 17:465 - 479.

61. Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47 - 60.

62. Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29 - 69.

63. D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60 - 90.

64. Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235 - 241.

65. Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387 - 399.

66. Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced microcephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327 - 332.

67. Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 71:342 - 352.

68. Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338 –341.

69. Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 28: 122 - 131.

70. Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994) Laboratory Methods in Histotechnology, American Registry of Pathology, Washington, DC, s. 84 - 107.

71. Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002) Theory and Practice of Histological Techniques, 5th edition, Churchill Livingstone, Londýn.

72. Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evaluation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291 - 304.

73. Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123 - 130.

74. Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 53:365 - 372.

75. De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545 - 561.

76. De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Environ. Toxicol. Pharmacol., 19:745 - 755.

77. De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for developmental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417 - 432.

78. Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 1:129 – 135.

79. Howard, C.V., Reed, M.G. (1998) Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy, Springer-Verlag, New York.

80. Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A practical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305 - 310.

81. Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262 - 268.

82. Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in disector stereology. J. Neurocytol., 26:707 - 710.

83. West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22:51 - 61.

84. Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience, 130: 813 – 831.

85. Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of growth deficiency in rats exposed in utero to undernutrition, ethanol, or the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113 - 121.

86. Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 84:294-298.

87. Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental neurotoxicology. In: Handbook of Developmental Neurotoxicology, Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, s. 3 - 41.

88. Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science, 283:70 - 74.

89. Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056 – 1060.

90. Friede, R. L. (1989) Developmental Neuropathology. Second edition. Springer-Verlag, Berlin.

91. House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127 - 133.

92. Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401 405.

93. US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA NCEA-F-0644A.

94. US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, Federal Register 61(212): 56274 - 56322.

95. Danish Environmental Protection Agency (1995) Neurotoxicology. Review of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefoged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.

96. Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxicology, 5:113 - 126.

97. Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 8:21 - 27.

98. Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329 - 335.

99. Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in teratology studies. Teratology, 12:165 - 172.

100. Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 14: 221 - 228.

101. Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. (1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587 - 90.

102. Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. (2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345 - 352.

103. Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an ad hoc working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006) A ‚best practices‘ approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing – for today. Toxicol. Pathol. 34:296 - 313.

104. Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205 - 210.

105. Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295 - 301.

106. Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):266 - 287.

107. Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. (2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):288 - 325.

108. Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):326 - 348.

109. Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints Neurotoxicology and Teratology, 30(4):349 - 381.

Obrázok 1.

Všeobecná schéma testovania pre funkčné/behaviorálne testy, neuropatologické hodnotenie a určenie hmotnosti mozgu. Tento diagram vychádza z opisu v odsekoch 13 - 15 (PND = postnatálny deň). Príklady priradenia sú uvedené v dodatku 1

Dodatok 1 1. Príklady možného priradenia sú opísané a uvedené v tabuľkách nižšie. Tieto príklady sú poskytnuté s cieľom názorne poukázať, že existuje viacero rôznych spôsobov, ako priradiť pokusné zvieratá k rôznym testovacím modelom. Príklad 1 2. Jeden súbor 20 mláďat/pohlavie/dávku (t. j. 1 samec a 1 samica z každého vrhu) sa použije na testovanie behaviorálnej ontogenézy pred odstavením. Z týchto zvierat sa 10 mláďat/pohlavie/dávku (t. j. 1 samec alebo 1 samica z každého vrhu) humánne usmrtí na 22. postnatálny deň. Mozog zvierat sa odoberie, odváži a spracuje pre histopatologické hodnotenie. Okrem toho sa získajú údaje o hmotnosti mozgov podľa mozgov zo zvyšných 10 samcov a 10 samíc pri každej úrovni dávky. 3. Ďalší súbor 20 zvierat/pohlavie/dávku (t. j. 1 samec a 1 samica z každého vrhu) sa použije na funkčné/behaviorálne testy po odstavení (podrobné klinické vyšetrenia, motorická aktivita, testovanie poplašnej reakcie na zvukový podnet a kognitívnych funkcií u dospievajúcich jedincov) a hodnotenie veku pohlavnej zrelosti. Z týchto zvierat sa na konci štúdie (približne na 70. postnatálny deň) podá 10 zvieratám/pohlavie/dávku (t. j. 1 samcovi alebo 1 samici z každého vrhu) anestézia a zafixujú sa použitím perfúzie. Po ďalšom fixovaní in-situ sa mozog odoberie a spracuje pre neuropatologické hodnotenie. 4. Na testovanie kognitívnych funkcií u mladých dospelých jedincov (napríklad na 60. - 70. postnatálny deň) sa použije tretí súbor 20 mláďat/pohlavie/dávku (t. j. 1 samec a 1 samica z každého vrhu). Z týchto zvierat sa na konci štúdie 10 zvierat/pohlavie/dávku (1 samec alebo 1 samica z každého vrhu) usmrtí a mozog sa odoberie a odváži. 5. Zvyšných 20 zvierat/pohlavie/skupinu je vyhradených pre možné ďalšie testy. Tabuľka 1 Mláďa č. (8) Počet mláďat priradených na test Vyšetrenie/test samce samice 1 5 20 samcov + 20 samíc Behaviorálna ontogenéza 10 samcov + 10 samíc Hmotnosť/neuropatológia/morfometria mozgu na 22. PND 10 samcov + 10 samíc Hmotnosť mozgu na 22. PND 2 6 20 samcov + 20 samíc Podrobné klinické vyšetrenia 20 samcov + 20 samíc Motorická aktivita 20 samcov + 20 samíc Pohlavná zrelosť 20 samcov + 20 samíc Motorické a zmyslové funkcie 20 samcov + 20 samíc Učenie a pamäť (25. PND) 10 samcov + 10 samíc Hmotnosť/neuropatológia/morfometria mozgu u mladých dospelých jedincov ~70. PND 3 7 20 samcov + 20 samíc Učenie a pamäť (mladí dospelí jedinci) 10 samcov + 10 samíc Hmotnosť mozgu u mladých dospelých jedincov ~ 70. PND 4 8 — Zvieratá určené ako náhrada alebo na ďalšie testy Príklad 2 6. Jeden súbor 20 mláďat/pohlavie/dávku (t. j. 1 samec a 1 samica z každého vrhu) sa použije na testovanie behaviorálnej ontogenézy pred odstavením. Z týchto zvierat sa 10 mláďat/pohlavie/dávku (1 samec alebo 1 samica z každého vrhu) humánne usmrtí na 11. postnatálny deň. Mozog zvierat sa odoberie, odváži a spracuje pre histopatologické hodnotenie. 7. Ďalší súbor 20 zvierat/pohlavie/dávku (1 samec a 1 samica z každého vrhu) sa použije na vyšetrenie po odstavení (podrobné klinické vyšetrenia, motorická aktivita, hodnotenie veku pohlavnej zrelosti a motorických a zmyslových funkcií). Z týchto zvierat sa na konci štúdie (približne na 70. postnatálny deň) podá 10 zvieratám/pohlavie/dávku (t. j. 1 samcovi alebo 1 samici z každého vrhu) anestézia a zafixujú sa použitím perfúzie. Po ďalšom fixovaní in situ sa mozog odoberie, odváži a spracuje pre neuropatologické hodnotenie. 8. Na testovanie kognitívnych funkcií u dospievajúcich a mladých dospelých jedincov sa použije 10 mláďat/pohlavie/dávku (t. j. 1 samec alebo 1 samica z každého vrhu). Na testovanie kognitívnych funkcií na 23. postnatálny deň a u mladých dospelých jedincov sa použijú rôzne pokusné zvieratá. Na konci sa 10 zvierat/pohlavie/skupinu, ktoré boli testované ako dospelé jedince, usmrtí a ich mozog sa odoberie a odváži. 9. Zvyšných 20 zvierat/pohlavie/skupinu, ktoré neboli vybrané pre testovanie, sa usmrtí a vyradí pri odstavení. Tabuľka 2 Mláďa č. (9) Počet mláďat priradených na test Vyšetrenie/test samce samice 1 5 20 samcov + 20 samíc Behaviorálna ontogenéza 10 samcov + 10 samíc Hmotnosť/neuropatológia/morfometria mozgu na 11. PND 2 6 20 samcov + 20 samíc Podrobné klinické vyšetrenia 20 samcov + 20 samíc Motorická aktivita 20 samcov + 20 samíc Pohlavná zrelosť 20 samcov + 20 samíc Motorické a zmyslové funkcie 10 samcov + 10 samíc Hmotnosť/neuropatológia/morfometria mozgu u mladých dospelých jedincov ~70. PND 3 7 10 samcov + 10 samíc (10) Učenie a pamäť (23. PND) 3 7 10 samcov + 10 samíc (10) Učenie a pamäť (mladí dospelí jedinci) Hmotnosť mozgu u mladých dospelých jedincov 4 8 — Zvieratá usmrtené a vyradené na 21. PND Príklad 3 10. Jeden súbor 20 mláďat/pohlavie/dávku (t. j. 1 samec a 1 samica z každého vrhu) sa použije na hodnotenie hmotnosti a neuropatológie mozgu na 11. postnatálny deň. Z týchto zvierat sa 10 mláďat/pohlavie/dávku (t. j. 1 samec alebo 1 samica z každého vrhu) humánne usmrtí na 11. postnatálny deň a mozog zvierat sa odoberie, odváži a spracuje pre histopatologické hodnotenie. Okrem toho sa získajú údaje o hmotnosti mozgov podľa mozgov zo zvyšných 10 samcov a 10 samíc pri každej úrovni dávky. 11. Ďalší súbor 20 zvierat/pohlavie/dávku (t. j. 1 samec a 1 samica z každého vrhu) sa použije na testovanie behaviorálnej ontogenézy (motorickej aktivity), vyšetrenia po odstavení (motorická aktivita a hodnotenie veku pohlavnej zrelosti) a testovanie kognitívnych funkcií u dospievajúcich jedincov. 12. Ďalší súbor 20 zvierat/pohlavie/dávku (t. j. 1 samec a 1 samica z každého vrhu) sa použije na testovanie motorických a zmyslových funkcií (poplašná rekcia na zvukový podnet) a podrobné klinické vyšetrenia. Z týchto zvierat sa na konci štúdie (približne na 70. postnatálny deň) podá 10 zvieratám/pohlavie/dávku (t. j. 1 samcovi alebo 1 samici z každého vrhu) anestézia a zafixujú sa použitím perfúzie. Po ďalšom fixovaní in situ sa mozog odoberie, odváži a spracuje pre neuropatologické hodnotenie. 13. Ďalší súbor 20 mláďat/pohlavie/dávku sa použije na testovanie kognitívnych funkcií u mladých dospelých jedincov (t. j. 1 samec a 1 samica z každého vrhu). Z týchto zvierat sa na konci štúdie 10 zvierat/pohlavie/dávku (t. j. 1 samec alebo 1 samica z každého vrhu) usmrtí a ich mozog sa odoberie a odváži. Tabuľka 3 Mláďa č. (11) Počet mláďat priradených na test Vyšetrenie/test samce samice 1 5 10 samcov + 10 samíc Hmotnosť/neuropatológia/morfometria mozgu na 11. PND 10 samcov + 10 samíc Hmotnosť mozgu na 11. PND 2 6 20 samcov + 20 samíc Behaviorálna ontogenéza (motorická aktivita) 20 samcov + 20 samíc Motorická aktivita 20 samcov + 20 samíc Pohlavná zrelosť 20 samcov + 20 samíc Učenie a pamäť (27. PND) 3 7 20 samcov + 20 samíc Poplašná reakcia na zvukový podnet (dospievajúce a mladé dospelé jedince) 20 samcov + 20 samíc Podrobné klinické vyšetrenia 10 samcov + 10 samíc Hmotnosť/neuropatológia/morfometria mozgu u mladých dospelých jedincov ~70. PND 4 8 20 samcov + 20 samíc Učenie a pamäť (mladí dospelí jedinci) 10 samcov + 10 samíc Hmotnosť mozgu u mladých dospelých jedincov

Dodatok 2 Vymedzenia pojmov Chemikália: látka alebo zmes Testovaná chemikália: akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy

B.54. UTEROTROFICKÝ BIOLOGICKÝ TEST U HLODAVCOV: KRÁTKODOBÝ SKRÍNINGOVÝ TEST NA ESTROGÉNNE VLASTNOSTI

ÚVOD

1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmerneniami OECD na vykonávanie TG 440 (2007). Organizácia OECD v roku 1998 iniciovala aktivitu s vysokou prioritou s cieľom zrevidovať existujúce usmernenia a vypracovať nové usmernenia na vykonávanie testov potenciálnych endokrinných disruptorov (1). Súčasťou tejto činnosti bolo vypracovať usmernenie na vykonávanie uterotrofického biologického testu u hlodavcov. Uterotrofický biologický test u hlodavcov vtedy prešiel rozsiahlym programom validácie, ktorého súčasťou bolo vypracovanie podrobného podkladového dokumentu (2)(3) a vykonanie rozsiahlych intralaboratórnych a medzilaboratórnych štúdií s cieľom preukázať význam a reprodukovateľnosť biologického testu s použitím silného referenčného estrogénu, slabých agonistov estrogénnych receptorov, silných antagonistov estrogénnych receptorov a negatívnej referenčnej chemikálie (4)(5)(6)(7)(8)(9). Testovacia metóda B.54 je výsledkom skúseností nadobudnutých počas programu validácie testu a výsledkov získaných pomocou tohto testu s estrogénnymi agonistami.

2. Uterotrofický biologický test je krátkodobý skríningový test, ktorý vznikol v 30. rokoch 20. storočia (27)(28), a odborný výbor ho prvýkrát štandardizoval na skríning v roku 1962 (32)(35). Je založený na zvýšení hmotnosti maternice alebo uterotrofickej reakcii (pre posúdenie pozri 29). Hodnotí schopnosť chemikálie vyvolať biologické aktivity zodpovedajúce agonistom alebo antagonistom prirodzených estrogénov (napr. 17β-estradiol), na zistenie antagonistov sa však používa oveľa menej ako na zistenie agonistov. Maternica reaguje na estrogény dvoma spôsobmi. Prvá reakcia je nárast hmotnosti v dôsledku nasiaknutia vody. Po tejto reakcii nasleduje hmotnostný prírastok v dôsledku rastu tkaniva (30). Reakcie maternice u potkanov a myší sú kvalitatívne porovnateľné.

3. Tento biologický test slúži ako skríningový test in vivo a jeho použitie je potrebné posudzovať v kontexte ‚Koncepčného rámca OECD na testovanie a hodnotenie chemikálií ako endokrinných disruptorov‘ (dodatok 2). V tomto koncepčnom rámci je uterotrofický biologický test zahrnutý do úrovne 3 ako test in vivo poskytujúcu údaje o jednom endokrinnom mechanizme, t. j. o estrogénnych účinkoch.

4. Uterotrofický biologický test sa má zahrnúť do skupiny testov in vitro a in vivo, ktorých cieľom je identifikovať chemikálie s potenciálnym pôsobením na endokrinný systém a v konečnom dôsledku posúdiť riziká pre ľudské zdravie alebo životné prostredie. Vo validačnom programe OECD sa použili silní aj slabí estrogénni agonisti s cieľom zhodnotiť účinnosť testu pri identifikácii estrogénnych chemikálií (4)(5)(6)(7)(8). Okrem dobrej intralaboratórnej a medzilaboratórnej reprodukovateľnosti sa tak preukázala aj citlivosť postupu testovania pre estrogénnych agonistov.

5. Pokiaľ ide o negatívne chemikálie, do validačného programu bola zahrnutá iba jedna ‚negatívna‘ referenčná chemikália, ktorej negatívne účinky potvrdil uterotrofický test, ako aj testy viazania receptorov in vitro a testy receptorov, na základe testov, ktoré nesúvisia s validačným programom OECD, však boli vyhodnotené doplňujúce údaje, ktoré tiež potvrdzujú špecifickosť uterotrofického biologického testu pre skríning estrogénnych agonistov (16).

ÚVODNÉ ÚVAHY A OBMEDZENIA

6. Estrogénni agonisti a antagonisti pôsobia ako ligandy pre estrogénne receptory a a b a môžu v uvedenom poradí aktivovať alebo brániť transkripčnému pôsobeniu receptorov. Výsledkom môžu byť nepriaznivé zdravotné riziká vrátane účinkov na rozmnožovanie a vývoj. Existuje preto potreba rýchleho posudzovania a hodnotenia chemikálií ako možných estrogénnych agonistov a antagonistov. Afinita ligandu pre estrogénny receptor alebo transkripčná aktivácia reportérových génov in vitro je iba jedným z viacerých faktorov poukazujúcich na možné riziko, hoci má iba informatívnu hodnotu. Ďalšie faktory môžu zahŕňať metabolickú aktiváciu a deaktiváciu pri vstupe do tela, distribúciu do cieľových tkanív a odstránenie z tela v závislosti – aspoň sčasti – od spôsobu podávania a od testovanej chemikálie. Ak z vlastností chemikálie týkajúcich sa absorpcie – distribúcie – metabolizmu – eliminácie (ADME) nevyplynuli príslušné informácie, vzniká potreba testovať možné účinky chemikálie in vivo za relevantných podmienok. Maternicové tkanivá reagujú na stimuláciu estrogénmi rýchlym a intenzívnym rastom, najmä u laboratórnych hlodavcov, u ktorých estrálny cyklus trvá približne 4 dni. Hlodavce, najmä potkany, sa takisto všeobecne používajú v štúdiách toxicity na charakterizáciu rizika. Preto je maternica hlodavcov vhodný cieľový orgán na testovanie estrogénnych agonistov a antagonistov in vivo.

7. Táto testovacia metóda je založená na protokoloch použitých pri validačnej štúdii OECD, ktoré sa v intralaboratórnych a medzilaboratórnych štúdiách ukázali ako spoľahlivé a opakovateľné (5)(7). V súčasnosti sú k dispozícii dve metódy, t. j. metóda, pri ktorej sa používajú dospelé samice po ovariektómii (metóda dospelých samíc po ovx), a metóda, pri ktorej sa používajú nedospelé samice bez ovariektómie (metóda nedospelých samíc). V programe validácie testov OECD sa ukázalo, že obe metódy majú porovnateľnú citlivosť a reprodukovateľnosť. Metóda nedospelých samíc je však o niečo menej špecifická, keďže má neporušenú os hypotalamus-hypofýza-gonády (HPG), zahŕňa však väčší rozsah vyšetrovania ako metóda dospelých samíc po ovx, pretože môže reagovať na chemikálie, ktoré pôsobia na os HPG a nie len na estrogénny receptor. Os HGP začína u potkana fungovať približne vo veku 15 dní. Predtým nie je možné pubertu urýchliť liečbou, napr. pomocou GnRH. Keď samice začnú pohlavne dospievať, samica má pred otvorením vagíny niekoľko tichých cyklov, ktoré nemajú za následok otvorenie vagíny alebo ovuláciu, ale vyskytujú sa u nej určité hormonálne výkyvy. Ak chemikália priamo alebo nepriamo stimuluje os HPG, výsledkom je predčasná pohlavná zrelosť, skorá ovulácia a urýchlené otvorenie vagíny. Takéto účinky nemajú iba chemikálie, ktoré pôsobia na os HPG, ale aj niektoré krmivá, ktoré majú vyššie hladiny metabolizovateľnej energie ako iné a stimulujú rast a urýchľujú otvorenie vagíny, aj keď nemajú estrogénny charakter. Takéto chemikálie by u dospelých zvierat po ovariektómii nevyvolali uterotrofickú reakciu, pretože ich os HPG nie je funkčná.

8. V záujme dobrých životných podmienok zvierat by sa mala uprednostniť metóda, pri ktorej sa používajú nedospelé potkany, čím sa predíde chirurgickej predpríprave zvierat a tiež možnému nevyužitiu zvierat, ktoré vykazujú akékoľvek znaky začínajúceho estrálneho cyklu (pozri odsek 30).

9. Uterotrofická reakcia nemá výhradne estrogénny pôvod, t. j. reakciu môžu vyvolať aj chemikálie, ktoré nie sú estrogénnymi agonistami alebo antagonistami. Napríklad relatívne vysoké dávky progesterónu, testosterónu alebo rôznych syntetických progestínov môžu viesť k stimulačnej reakcii (30). Každá reakcia sa môže histologicky analyzovať na keratinizáciu a kornifikáciu vagíny (30). Pozitívny výsledok uterotrofického biologického testu by mal bez ohľadu na možný pôvod reakcie zvyčajne viesť k ďalším opatreniam s cieľom lepšie ho objasniť. Ďalší dôkaz o estrogénnych účinkoch by mohol vyplynúť z testov in vitro, napríklad z testu viazania estrogénnych receptorov a testu transkripčnej aktivácie, alebo z iných testov in vivo, napríklad z testu samičieho pohlavného dospievania.

10. Vzhľadom na to, že uterotrofický biologický test slúži ako skríningový test in vivo, zvolený validačný prístup splnil svoj účel z hľadiska ohľadu na životné podmienky zvierat aj z hľadiska stratégie viacúrovňového testovania. Na tento účel sa úsilie zameralo na presnú validáciu reprodukovateľnosti a citlivosti na estrogénne účinky – čo je hlavný problém v prípade mnohých chemikálií – zatiaľ čo na zložku testu týkajúcu sa antiestrogénnych účinkov bolo vynaložené nepatrné úsilie. Vzhľadom na veľmi obmedzený počet chemikálií s jednoznačnými antiestrogénnymi vlastnosťami (ktoré nie sú zakryté estrogénnymi účinkami) sa testoval iba jeden antiestrogén so silným účinkom. Preto sa táto testovacia metóda venuje estrogénnemu protokolu, zatiaľ čo protokol opisujúci režim testu so zameraním sa na antagonistov je súčasťou usmerňovacieho dokumentu (37). Reprodukovateľnosť a citlivosť testu na chemikálie s čisto antiestrogénnym pôsobením bude jasnejšie vymedzená neskôr, keď bude postup testovania nejakú dobu v rutinnej prevádzke a identifikujú sa ďalšie chemikálie s týmto druhom pôsobenia.

11. Je zrejmé, že všetky postupy využívajúce zvieratá musia byť v súlade s miestnymi normami starostlivosti o zvieratá. Opisy starostlivosti a zaobchádzania uvedené ďalej predstavujú minimálne normy pre vykonávanie postupov a v prípade, že miestne predpisy sú prísnejšie, budú mať prednosť miestne predpisy, ako napríklad smernica Európskeho parlamentu a Rady 2010/63/EÚ z 22. septembra 2010 o ochrane zvierat používaných na vedecké účely (38). Ďalšie usmernenia k humánnemu zaobchádzaniu so zvieratami uvádza organizácia OECD (25).

12. Podobne ako pri všetkých testoch využívajúcich živé zvieratá je dôležité pred začiatkom testu zabezpečiť, aby boli údaje naozaj nevyhnutné. Napríklad dve podmienky, pri ktorých môžu byť údaje potrebné, sú:

— potenciál vysokej expozície (úroveň 1 koncepčného rámca, dodatok 2) alebo známky estrogénnych účinkov (úroveň 2) s cieľom skúmať, či takéto účinky môžu nastať in vivo,

— účinky poukazujúce na estrogénne účinky v testoch in vivo na úrovni 4 alebo 5 s cieľom preukázať, že účinky sa týkali estrogénneho mechanizmu, ktorý nie je možné objasniť pomocou testu in vitro.

13. Vymedzenia pojmov použité v tejto testovacej metóde sú uvedené v dodatku 1.

PRINCÍP TESTU

14. Citlivosť uterotrofického biologického testu je založená na systéme testovania na zvieratách, v ktorom os hypotalamus-hypofýza-vaječníky nie je funkčná, čo má za následok nízke hladiny endogénneho estrogénu v obehu. Zabezpečí sa tak nízka východisková hmotnosť maternice a maximálny rozsah reakcie na podávané estrogény. U samíc hlodavcov túto požiadavku spĺňajú dva stavy citlivosti na estrogén:

i) nedospelé samice po odstavení a pred pubertou; a

ii) mladé dospelé samice po ovariektómii po uplynutí dostatočného času na regresiu maternicových tkanív.

15. Testovaná chemikália sa podáva denne orálnou sondou alebo podkožnou injekciou. Postupné dávky testovanej chemikálie sa podávajú minimálne dvom skupinám (usmernenie sa uvádza v odseku 33) pokusných zvierat s použitím jednej úrovne dávky pri každej skupine, pričom chemikália sa podáva po dobu troch po sebe nasledujúcich dní v prípade metódy nedospelých samíc a po dobu najmenej troch po sebe nasledujúcich dní v prípade metódy dospelých samíc po ovariektómii. Zvieratá sa pitvú približne 24 hodín po poslednej dávke. V prípade estrogénnych agonistov sa z hľadiska štatisticky významného zvýšenia posudzuje stredná hmotnosť maternice v skupinách zvierat, ktorým sa podala chemikália, v porovnaní so skupinou, ktorej sa podal nosič. Štatisticky významné zvýšenie strednej hmotnosti maternice v pokusnej skupine v tomto biologickom teste svedčí o pozitívnej reakcii.

OPIS METÓDY

Výber druhov zvierat

16. Môžu sa použiť bežne používané laboratórne kmene hlodavcov. Počas validácie sa ako príklad použili potkany z kmeňa Sprague-Dawley a Wistar. Kmene, o ktorých je známe, že majú menej citlivú maternicu, alebo sa to o nich predpokladá, sa nepoužívajú. Laboratórium musí preukázať citlivosť použitého kmeňa, ako sa uvádza v odsekoch 26 a 27.

17. Potkany a myši sa v uterotrofickom biologickom teste bežne používajú od 30. rokov 20. storočia. Validačné štúdie OECD sa vykonali iba u potkanov vzhľadom na predpoklad, že oba druhy by mali byť rovnocenné, a preto by v záujme šetrenia zdrojov a zvierat mal na celosvetovú validáciu stačiť jeden druh. Potkan je druh, ktorý sa vyberá vo väčšine štúdií reprodukčnej a vývojovej toxicity. Vzhľadom na rozsiahle historické údaje o myšiach a s cieľom rozšíriť rozsah pôsobnosti testovacej metódy uterotrofického biologického testu u hlodavcov o používanie myší ako pokusného druhu sa vykonala menšia doplňujúca validačná štúdia na myšiach (16). V súlade s pôvodným zámerom ušetriť zdroje a zvieratá bol zvolený preklenovací prístup s obmedzeným počtom testovaných chemikálií, zúčastnených laboratórií a bez testovania kódovaných vzoriek. Z preklenovacej validačnej štúdie v prípade uterotrofického biologického testu u mladých dospelých myší po ovariektómii vyplýva, že údaje získané u potkanov a myší navzájom kvalitatívne a kvantitatívne súhlasia. Ak uterotrofický biologický test prinesie výsledok, ktorý môže viesť k dlhodobej štúdii, v oboch štúdiách sa môžu použiť zvieratá z rovnakého kmeňa a zdroja. Preklenovací prístup bol obmedzený na myši po ovariektómii a správa neposkytuje podrobné údaje pre validáciu modelu nedospelých samíc, preto sa model nedospelých samíc v rámci rozsahu pôsobnosti súčasnej testovacej metódy neberie do úvahy.

18. V niektorých prípadoch sa preto môžu namiesto potkanov použiť myši. Výber tohto druhu je potrebné odôvodniť na základe toxikologických, farmakokinetických a/alebo iných kritérií. V prípade myší môžu byť potrebné zmeny v protokole. U myší je napríklad spotreba potravy v pomere k telesnej hmotnosti vyššia ako u potkanov, preto by mal byť obsah fytoestrogénu v potrave u myší nižší ako u potkanov (9)(20)(22).

Podmienky umiestnenia a kŕmenia

19. Všetky postupy musia byť v súlade s miestnymi normami starostlivosti o pokusné zvieratá. Tieto opisy starostlivosti a zaobchádzania predstavujú minimálne normy a v prípade, že miestne predpisy sú prísnejšie, budú mať prednosť miestne predpisy, ako napríklad smernica Európskeho parlamentu a Rady 2010/63/EÚ z 22. septembra 2010 o ochrane zvierat používaných na vedecké účely (38). Teplota v miestnosti pre pokusné zvieratá by mala byť 22 °C (v rozsahu približne ± 3 °C). Relatívna vlhkosť by mala byť minimálne 30 % a podľa možnosti by nemala presiahnuť maximálnu úroveň 70 % okrem obdobia počas čistenia miestnosti. Cieľom by mala byť relatívna vlhkosť vzduchu 50 - 60 %. Osvetlenie by malo byť umelé. Pokiaľ ide o denný svetelný rytmus, malo by sa striedať 12 hodín svetla a 12 hodín tmy.

20. Laboratórne krmivo a pitná voda by mali byť k dispozícii neobmedzene. Mladé dospelé zvieratá môžu byť umiestnené jednotlivo alebo v klietkach po skupinách do troch zvierat. Vzhľadom na nízky vek nedospelých zvierat sa odporúča umiestnenie v sociálnych skupinách.

21. Je známe, že laboratórne krmivá s vysokou hladinou fytoestrogénov zvyšujú u hlodavcov hmotnosť maternice dostatočne na to, aby mali vplyv na uterotrofický biologický test (13)(14)(15). V prípade použitia nedospelých zvierat môžu vysoké hladiny fytoestrogénov a metabolizovateľnej energie v laboratórnych krmivách tiež viesť k predčasnej puberte. Prítomnosť fytoestrogénov predovšetkým súvisí s obsahom produktov zo sóje a lucerny v laboratórnych krmivách a preukázalo sa, že koncentrácie fytoestrogénov sa v rôznych šaržiach štandardného laboratórneho krmiva líšia (23). Telesná hmotnosť je dôležitou premennou, pretože množstvo skonzumovanej potravy súvisí s telesnou hmotnosťou. Preto sa skutočná dávka fytoestrogénu skonzumovaného z rovnakého krmiva môže v závislosti od druhu zvierat a veku líšiť (9). U nedospelých samíc potkanov môže byť spotreba potravy v pomere k telesnej hmotnosti približne dvakrát vyššia ako u mladých dospelých samíc po ovariektómii. U mladých dospelých myší môže byť spotreba potravy v pomere k telesnej hmotnosti približne štvornásobne vyššia ako u mladých dospelých samíc potkanov po ovariektómii.

22. Výsledky uterotrofického biologického testu (9)(17)(18)(19) však ukazujú, že obmedzené množstvá fytoestrogénov v krmive sú prijateľné a neznižujú citlivosť biologického testu. Ako usmernenie slúži informácia, že hladiny fytoestrogénov v krmive by u nedospelých samíc potkanov z kmeňa Sprague Dawley a Wistar nemali prekročiť 350 μg ekvivalentov genisteínu/gram laboratórneho krmiva (6)(9). Podobné krmivá by mali byť vhodné aj pri testovaní na mladých dospelých potkanoch po ovariektómii, pretože spotreba potravy v pomere k telesnej hmotnosti je u mladých dospelých jedincov v porovnaní s nedospelými zvieratami nižšia. Ak sa použijú dospelé myši po ovariektómii alebo potkany citlivejšie na fytoestrogény, je potrebné zvážiť proporcionálne zníženie hladiny fytoestrogénu v krmive (20). Okrem toho môžu rozdiely v dostupnej metabolickej energii z rôznych krmív viesť k časovým posunom začiatku puberty (21)(22).

23. Pred začiatkom štúdie je potrebné starostlivo vybrať krmivo bez zvýšenej hladiny fytoestrogénov (pre usmernenie pozri (6)(9)) alebo metabolizovateľnej energie, ktorá môže znehodnotiť výsledky (15)(17)(19)(22)(36). Zabezpečenie primeraného fungovania testovacieho systému použitého v laboratóriu podľa odsekov 26 a 27 predstavuje dôležitú kontrolu obidvoch faktorov. V súlade s dobrou laboratórnou praxou (DLP) by sa mala pre istotu odobrať reprezentatívna vzorka z každej šarže krmiva podávaného počas štúdie na účely prípadnej analýzy obsahu fytoestrogénu (napr. v prípade vysokej hmotnosti kontrolnej maternice v porovnaní s historickými kontrolami alebo v prípade neprimeranej reakcie na referenčný estrogén 17alfa-etinylestradiol). Alikvotné časti by sa mali analyzovať v rámci štúdie alebo zmrazené pri teplote –20 °C alebo takým spôsobom, aby sa zabránilo rozkladu vzorky pred analýzou.

24. Niektoré podstielkové materiály môžu obsahovať prirodzene sa vyskytujúce estrogénne alebo antiestrogénne chemikálie (napríklad je známe, že kukuričný klas ovplyvňuje cyklus u potkanov a podľa všetkého má antiestrogénne účinky). Hladina fytoestrogénov vo vybranej podstielke by mala byť minimálna.

Príprava zvierat

25. Pokusné zvieratá bez známok akejkoľvek choroby alebo fyzických abnormalít sa náhodne rozdelia do kontrolných a pokusných skupín. Klietky sa usporiadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné vplyvy vzhľadom na ich umiestnenie. Zvieratá sa jednotlivo označia. Nedospelé zvieratá by mali byť počas aklimatizácie umiestnené v klietke so svojimi matkami alebo náhradnými matkami až do odstavenia. Obdobie aklimatizácie pred začatím štúdie by malo u mladých dospelých zvierat a u nedospelých zvierat umiestnených spolu s matkami alebo náhradnými matkami trvať asi 5 dní. Ak sa nedospelé zvieratá získajú ako odstavené mláďatá bez matiek, môže postačovať na aklimatizáciu kratšie obdobie, pretože dávkovanie by sa malo začať okamžite po odstavení (pozri odsek 29).

POSTUP

Overovanie odbornosti laboratória

26. Na overenie odbornosti laboratória sa môžu použiť dve rôzne metódy:

— pravidelné overovanie vychádzajúce z počiatočnej východiskovej pozitívnej kontrolnej štúdie (pozri odsek 27). Aspoň raz za 6 mesiacov a vždy, keď dôjde k zmene, ktorá môže ovplyvniť účinnosť analýzy (napr. nové zloženie krmiva, zmena pracovníkov vykonávajúcich pitvy, zmena kmeňa zvierat alebo zmena dodávateľa atď.), je potrebné overiť citlivosť testovacieho systému (zvierací model) pomocou primeranej dávky (na základe základnej pozitívnej kontrolnej štúdie opísanej v odseku 27) referenčného estrogénu: 17a- etinylestradiol (CAS č. 57-63-6) (EE),

— použitie súbežných kontrol, pričom súčasťou každého testu bude skupina, ktorej sa bude podávať primeraná dávka referenčného estrogénu.

Ak systém nereaguje podľa očakávania, je potrebné preskúmať a podľa potreby upraviť podmienky testovania. Odporúčaná dávka referenčného estrogénu, ktorá sa má použiť pri obidvoch prístupoch, je približne ED70 až 80.

27. Východisková pozitívna kontrolná štúdia – Pred prvým vykonaním štúdie podľa tejto testovacej metódy je potrebné preukázať odbornosť laboratória otestovaním citlivosti zvieracieho modelu, a to stanovením reakcie na dávku referenčného estrogénu 17a- etinylestradiol (CAS č. 57-63-6) (EE) minimálne v štyroch dávkach. Reakcia na hmotnosť maternice sa porovná s príslušnými historickými údajmi (pozri odkaz (5)). Ak táto východisková pozitívna kontrolná štúdia neprinesie očakávané výsledky, je potrebné preskúmať a upraviť podmienky testovania.

Počet a stav zvierat

28. Každá pokusná a kontrolná skupina by mala zahŕňať aspoň 6 zvierat (na účely protokolov metódy nedospelých samíc, ako aj metódy dospelých samíc po ovx).

Vek nedospelých zvierat

29. V uterotrofickom biologickom teste s nedospelými zvieratami sa musí presne určiť deň narodenia. Dávkovanie by sa malo začať dostatočne včas s cieľom zabezpečiť, aby na konci podávania testovanej chemikálie nedochádzalo k fyziologickému nárastu endogénnych estrogénov spojenému s pohlavným dospievaním. Na druhej strane však existujú dôkazy, že veľmi mladé zvieratá môžu byť menej citlivé. Pri určovaní optimálneho veku musí každé laboratórium vziať do úvahy svoje vlastné podkladové údaje o dospievaní.

Ako všeobecné usmernenie slúži informácia, že dávkovanie u potkanov sa môže začať ihneď po predčasnom odstavení na 18. postnatálny deň (dátum narodenia je postnatálny deň 0). Dávkovanie by sa u potkanov malo podľa možnosti skončiť na 21. postnatálny deň, v každom prípade však pred 25. postnatálnym dňom, pretože v tomto veku začína byť funkčná os hypotalamus-hypofýza-vaječníky a endogénne hladiny estrogénu môžu začať stúpať spolu s nárastom stredných hodnôt východiskovej hmotnosti maternice a zvýšením počtu štandardných odchýlok v skupine (2)(3)(10)(11)(12).

Postup pri ovariektómii

30. V prípade samíc potkanov a myší po ovariektómii (v pokusných a kontrolných skupinách) by sa ovariektómia mala vykonať vo veku 6 až 8 týždňov. U potkanov by medzi ovariektómiou a prvým dňom podávania malo uplynúť minimálne 14 dní, aby sa umožnila regresia maternice na minimálnu stabilnú východiskovú úroveň. U myší by medzi ovariektómiou a prvým dňom podávania malo uplynúť aspoň 7 dní. Keďže na produkciu významných hladín estrogénov v obehu stačí malé množstvo ovariálneho tkaniva (3), zvieratá by sa mali pred použitím testovať aspoň päť po sebe nasledujúcich dní (napr. medzi 10. - 14. dňom po ovariektómii u potkanov) pozorovaním epitelových buniek získaných výterom z vagíny. Ak zvieratá vykazujú známky začínajúceho estrálneho cyklu, nemali by sa použiť. Neskôr je potrebné pri pitve preskúmať zvyšky po vaječníkoch, aby sa odhalili známky prítomnosti ovariálneho tkaniva. Ak sa preukáže jeho prítomnosť, zviera sa nezaradí do výpočtov (3).

31. Postup ovariektómie sa začína po dôkladnej anestézii zvieraťa, keď zviera leží na bruchu. Rez otvárajúci dorzolaterálnu brušnú stenu by mal byť približne 1 cm dlhý a mal by sa začínať v strede medzi spodnou hranicou rebier a lopatou bedrovej kosti, niekoľko milimetrov bočne od laterálneho okraja bedrového svalu. Vaječníky sa odoberú z brušnej dutiny na sterilný podklad. Vaječník sa odpojí v mieste, kde sa vajcovod pripája k telu maternice. Po uistení, že nedochádza k silnému krvácaniu, sa brušná stena zašije a koža uzavrie pomocou šicích svoriek alebo vhodnou sutúrou. Miesta podviazania sú schematicky znázornené na obrázku 1. Použije sa vhodná pooperačná analgézia podľa odporúčania veterinárneho lekára so skúsenosťami so starostlivosťou o hlodavce.

Telesná hmotnosť

32. Pri metóde dospelých samíc po ovariektómii nie je medzi telesnou hmotnosťou a hmotnosťou maternice korelácia, pretože na hmotnosť maternice majú vplyv hormóny ako estrogény, nie však rastové faktory, ktoré regulujú veľkosť tela. Pri metóde nedospelých samíc telesná hmotnosť naopak súvisí s hmotnosťou maternice počas dospievania (34). Pri metóde nedospelých samíc by preto váhové odchýlky u zvierat mali byť minimálne a nemali by presahovať ± 20 % strednej hmotnosti. To znamená, že chovateľ by mal štandardizovať veľkosť vrhu s cieľom zabezpečiť, aby boli mláďatá rôznych matiek kŕmené približne rovnako. Zvieratá sa rozdelia do skupín (kontrolných a pokusných) na základe náhodného rozloženia hmotnosti tak, že stredná telesná hmotnosť každej skupiny sa od akejkoľvek inej skupiny štatisticky nebude odlišovať. Je potrebné dbať na to, aby do tej istej pokusnej skupiny neboli priradené zvieratá z rovnakého vrhu, podľa možnosti bez navýšenia počtu vrhov potrebných na testovanie.

Dávkovanie

33. Na určenie možného estrogénneho pôsobenia in vivo testovanej chemikálie zvyčajne postačujú dve dávkové skupiny a jedna kontrolná, preto sa tento model uprednostňuje v záujme dobrých životných podmienok zvierat. Ak je cieľom odvodiť krivku závislosti reakcie od dávky alebo extrapolovať nižšie dávky, sú potrebné aspoň 3 dávkové skupiny. Ak sa vyžadujú informácie nad rámec určenia estrogénneho pôsobenia (napríklad odhad účinnosti), je potrebné zvážiť iný dávkový režim. So zvieratami v kontrolnej skupine sa musí zaobchádzať takisto ako so zvieratami v testovaných skupinách, s výnimkou aplikovania testovanej chemikálie. Ak sa pri podávaní testovanej chemikálie používa nosič, kontrolná skupina dostane rovnaké množstvo nosiča, aké sa použilo v pokusných skupinách (alebo najvyššie množstvo použité v pokusných skupinách, ak sa v jednotlivých skupinách líši).

34. V prípade uterotrofického biologického testu je cieľom vybrať dávky, ktoré zabezpečia prežitie zvierat a ktoré nespôsobujú výraznú toxicitu alebo utrpenie zvierat po troch po sebe nasledujúcich dňoch podávania chemikálie na úrovni maximálne 1 000 mg/kg/deň. Pri navrhovaní a výbere úrovní dávok sa berú do úvahy existujúce údaje o toxicite a (toxiko-) kinetike testovanej chemiká