Úradný vestník L 143 , 11/06/2003 S. 0035 - 0049



Rozhodnutie Komisie z 26. mája 2003, ktorým sa schvaľuje diagnostická príručka pre africký mor ošípaných (oznámené pod číslom dokumentu C(2003) 1696) (Text s významom pre EHP) (2003/422/ES) KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV, so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spoločenstva, so zreteľom na smernicu Rady 2002/60/ES z 27. júna 2002, ktorou sa ustanovujú osobitné ustanovenia na kontrolu afrického moru ošípaných a mení a dopĺňa smernica 92/119/EHS, pokiaľ ide o nákazlivú obrnu ošípaných a africký mor ošípaných [1], najmä na jej článok 18 ods. 3, keďže: (1) Podľa smernice 2002/60/ES je potrebné, aby sa ustanovili jednotné diagnostické postupy, metódy na odber vzoriek a kritériá na vyhodnocovanie výsledkov laboratórnych testov na potvrdenie afrického moru ošípaných. (2) V súlade s uvedenou smernicou musí Referenčné laboratórium spoločenstva pre africký mor ošípaných po konzultácii s Komisiou koordinovať metódy používané v členských štátoch pri diagnostikovaní choroby, medzi iným vykonávaním pravidelných porovnávacích testov a poskytovaním štandardných činidiel na úrovni spoločenstva. (3) Africký mor ošípaných sa nepovažuje za nebezpečný pre ľudské zdravie. (4) Na rýchle potvrdenie afrického moru ošípaných sa vyvinuli laboratórne testy. (5) Výsledkom skúseností získaných v rámci kontroly afrického moru ošípaných v posledných rokoch je určenie najvhodnejších postupov na odber vzoriek a kritérií na vyhodnocovanie laboratórnych testov na správnu diagnostiku tejto choroby v rôznych situáciách. (6) Preto je vhodné, aby sa schválila príručka ustanovujúca takéto postupy a kritériá. (7) Národné diagnostické laboratóriá by mali byť oprávnené modifikovať schválené laboratórne testy alebo používať odlišné testy za predpokladu, že je možné preukázať rovnakú senzitivitu a špecifickosť. (8) Opatrenia ustanovené v tomto rozhodnutí sú v súlade so stanoviskom Stáleho výboru pre potravinový reťazec a zdravie zvierat, PRIJALA TOTO ROZHODNUTIE: Článok 1 1. Schvaľuje sa diagnostická príručka pre africký mor ošípaných uvedená v prílohe. 2. Členské štáty zabezpečujú, aby sa potvrdzovanie afrického moru ošípaných vykonávalo v súlade s postupmi, metódami na odber vzoriek a kritériami na vyhodnocovanie výsledkov laboratórnych testov, ktoré sú ustanovené v príručke a ktorých základom je: a) zisťovanie klinických príznakov a postmortálnych nálezov choroby; b) zisťovanie vírusu, antigénu alebo genómu vo vzorkách tkaniva, orgánov, krvi alebo výlučkov ošípaných; c) preukazovanie špecifickej reakcie protilátok vo vzorkách krvi. 3. Odlišne od odseku 2 môžu národné diagnostické laboratóriá uvedené v prílohe IV k smernici 2002/60/ES uplatňovať modifikácie laboratórnych testov uvedených v príručke, alebo používať odlišné testy za predpokladu, že je možné preukázať rovnakú citlivosť a špecifickosť. Ak sa použijú pozmenené alebo odlišné testy, musí sa ich citlivosť a špecifickosť vyhodnotiť v rámci pravidelných porovnávacích testov, ktoré vykonáva Referenčné laboratórium spoločenstva pre africký mor ošípaných. Článok 2 Toto rozhodnutie sa bude uplatňovať od 1. júla 2003. Článok 3 Toto rozhodnutie je adresované členským štátom. V Bruseli 26. mája 2003 Za Komisiu David Byrne člen Komisie [1] Ú. v. ES L 192, 20.7.2002, s. 27. -------------------------------------------------- PRÍLOHA DIAGNOSTICKÁ PRÍRUČKA PRE AFRICKÝ MOR OŠÍPANÝCH Kapitola I Úvod, ciele a definície 1. S cieľom zabezpečenia jednotných postupov na diagnostiku afrického moru ošípaných (ďalej len "ASF"), táto príručka: a) ustanovuje usmernenia a minimálne požiadavky na diagnostické postupy, metódy odberu vzoriek a kritériá na vyhodnocovanie výsledkov klinických a postmortálnych vyšetrení a laboratórnych testov s cieľom správnej diagnostiky ASF [1]; b) ustanovuje minimálne požiadavky na biologickú bezpečnosť a štandardy kvality, ktoré musia dodržiavať diagnostické laboratóriá pre ASF a požiadavky na prepravu vzoriek; c) ustanovuje laboratórne testy, ktoré sa musia používať na diagnostiku ASF a laboratórne techniky, ktoré sa musia používať pri genotypizácii izolátov vírusu ASF. 2. Táto príručka je v podstate adresovaná orgánom zodpovedným za kontrolu ASF. Preto sa kladie dôraz na zásady a použitie laboratórnych testov a vyhodnocovanie ich výsledkov a nie na podrobné laboratórne techniky. 3. Na účel tejto príručky sa okrem definícií uvedených v článku 2 smernice 2002/60/ES uplatňujú tieto definície: a) výraz "podozrivý poľnohospodársky podnik" znamená poľnohospodársky podnik s chovom ošípaných, v ktorom je jedna alebo viac ošípaných podozrivých z infekcie vírusom ASF alebo kontaktný poľnohospodársky podnik definovaný v článku 2 písm. k smernice 2002/60/ES; b) výraz "epidemiologická podjednotka" alebo "podjednotka" znamená budovu, miesto alebo okolitú krajinu, kde sa chovajú ošípané v rámci poľnohospodárskeho podniku takým spôsobom, že majú častý priamy alebo nepriamy kontakt medzi sebou, ale zároveň sú držané oddelene od ostatných ošípaných v tom istom poľnohospodárskom podniku; c) výraz "kontaktné ošípané" znamená ošípané, ktoré žijú v poľnohospodárskom podniku v priamom kontakte s jednou alebo viacerými ošípanými, ktoré sú podozrivé, že sa infikovali vírusom ASF za posledných 21 dní. Kapitola II Opis ASF s dôrazom na diferenciálnu diagnostiku A. ÚVOD 1. ASF spôsobuje obalený vírus DNA, ktorý patrí do rodu Asfivirus čelade Asfarviridae. Kmene vírusu ASF sa odlišujú vo virulencii, odlišné sérotypy však nie je možné identifikovať. 2. Vírus ASF je veľmi stabilný vo výlučkoch infikovaných ošípaných, v jatočných telách ošípaných a v čerstvom bravčovom mäse a v niektorých výrobkoch z bravčového mäsa. Na zabezpečenie jeho inaktivácie v prostredí sa musia použiť vhodné dezinfekčné prostriedky. 3. Hlavná prirodzená cesta infekcie ošípaných v Európe je oro-nazálna cesta alebo nepriamy kontakt s infikovanými ošípanými alebo skrmovaním krmiva kontaminovaného vírusom. Avšak v tých oblastiach, kde existujú nosiči [2], dôležitú úlohu pri prežívaní a šírení vírusu zohráva prenos prostredníctvom takýchto nosičov. ASF sa môže šíriť aj prostredníctvom priameho kontaktu s kontaminovanými materiálmi a prostredníctvom bodavého hmyzu, ktorý mechanicky prenáša vírus ASF. Prenos choroby môže nastať aj prostredníctvom spermy infikovaných kancov. 4. Inkubačná doba u jednotlivých zvierat je asi 5 až 15 dní, v terénnych podmienkach sa však klinické symptómy môžu objaviť v poľnohospodárskom podniku niekoľko týždňov po zavlečení alebo aj neskôr, ak sa jedná o slabo virulentné kmene vírusu. 5. Vyskytujú sa akútne, subakútne a chronické formy ASF, pričom sa odlišujú najmä virulenciou vírusu. 6. U ošípaných, ktoré sa po infekcii klinicky zotavia, pretrváva virémia počas 40 až 60 dní a takéto ošípané sa stávajú nosičmi vírusu. Vírus ASF sa z prenášajúcich ošípaných izoloval až do šiesteho mesiaca po infekcii. B. AKÚTNA FORMA 1. Objavenie sa vysokej horúčky (viac ako 40 °C) je prvým klinickým príznakom choroby, ktorá je sprevádzaná depresiou, stratou chuti, rýchlym a ťažkým dýchaním, výtokmi z nosa a očí. Ošípané majú nekoordinované pohyby a tlačia sa dokopy. Prasnice môžu potratiť vo všetkých stupňoch gravidity. U niektorých ošípaných sa vyskytuje zvracanie a zápcha, u iných krvavá hnačka. Najmä na končatinách a ušiach sa objavujú subkutánne prekrvené miesta alebo zrazeniny krvi. Pred uhynutím, ktoré nastane jeden až sedem dní po objavení sa klinických príznakov, môže zviera upadnúť do kómy. Miera chorobnosti a úmrtnosti v rámci poľnohospodárskeho podniku môže dosahovať 100 %. Posmrtné nálezy preukazujú typický syndróm krvácania so všeobecnou kongesciou tela zvieraťa, krvnou tekutinou v hrudi a brušných dutinách, zväčšenú tmavú slezinu, krvavé lymfatické uzliny, petechiálne krvácania v obličkách (kortikálne a medulárne pyramídy a renálny pelvis), v seróze žalúdka, sliznici žalúdka a črevách ako aj v srdci (epikardium a endokardium), hydrotorax a petechiálne krvácanie pohrudnice. 2. Vo všeobecnosti akútna forma klasického moru ošípaných vedie ku klinickému a patologickému obrazu, ktorý je veľmi podobný patologickému obrazu afrického moru ošípaných. Prípadné krvácania na koži a ušiach sa ľahko zistia a vedú k podozreniu z klasického alebo afrického moru ošípaných. Iba niekoľko iných ochorení spôsobuje podobné zmeny. Akútny africký mor ošípaných sa musí brať do úvahy aj v prípadoch podozrenia z červienky, reproduktívneho a respiračného syndrómu ošípaných, otravy kumarínom, purpura hemoragika, multisystemického syndrómu chradnutia, syndrómu dermatitídy a nefropatie ošípaných, infekcií salmonelou alebo pasterelou alebo z akýchkoľvek črevných alebo respiračných syndrómov s horúčkou, ktoré nereagujú na liečbu antibiotikami. C. SUBAKÚTNE FORMY Subakútne formy choroby sú bežnejšie v endemických oblastiach. Pre subakútnu infekciu je charakteristická kolísavá horúčka, depresie a pneumónia. Smrť môže nastať následkom zlyhania srdca. Nálezy pri subakútnych formách sú podobné nálezom v akútnej forme, ale sú miernejšie. Charakteristickými nálezmi sú krvácania v lymfatických uzlinách, obličkách a slezine, kongescie a edémy pľúc a v niektorých prípadoch intersticiálna pneumónia. D. CHRONICKÉ FORMY Chronické formy choroby sú zriedkavé. Pri chronických formách je možné pozorovať sekundárne bakteriálne infekcie. Keďže klinické príznaky pri chronických formách ASF sú dosť nešpecifické, musia sa pri diferenciálnej diagnóze brať do úvahy mnohé iné choroby. Zvýšená horúčka sa nemusí nevyhnutne vyskytovať u všetkých zvierat, ale v infikovaných poľnohospodárskych podnikoch je aspoň u niektorých ošípaných možné zistiť horúčku. Klinické symptómy chronického ASF môžu zahŕňať respiračné problémy, potraty, artritídu, chronické vredy kože alebo nekrózu, ktoré nezodpovedajú typickému klinickému obrazu infekcií vírusom ASF. Nálezy môžu byť minimálne alebo žiadne. Histopatologické nálezy sú charakterizované zväčšenými lymfatickými uzlinami a zväčšenou slezinou, pleuritídou a fibrinóznou perikarditídou a infiltrovanou pneumonitídou. Opísané sú aj fokálna kazeózna nekróza a mineralizácia pľúc. Kapitola III Usmernenia o hlavných kritériách, ktoré sa musia brať do úvahy pri vyhlásení poľnohospodárskeho podniku za podnik podozrivý z ASF 1. Pri rozhodovaní o vyhlásení poľnohospodárskeho podniku za podnik podozrivý z ASF sa berú do úvahy tieto zistenia, kritériá a dôvody: a) klinické a patologické nálezy u ošípaných. Do úvahy sa berú hlavne tieto klinické a patologické nálezy: - horúčka s chorobnosťou a úmrtnosťou u ošípaných všetkých vekových kategórií, - horúčka so syndrómom krvácania, petechiálne a ekchymotické krvácania, predovšetkým v lymfatických uzlinách, obličkách, slezine (ktorá je zväčšená a tmavá, najmä v akútnych formách) a v močovom mechúre a tvorenie vredov v žlčníku; b) epidemiologické nálezy. Hlavné epidemiologické nálezy, ktoré sa musia brať do úvahy, sú: - ak ošípané mali priamy alebo nepriamy kontakt s poľnohospodárskym podnikom s chovom ošípaných, ktorý bol dokázateľne infikovaný vírusom ASF, - ak poľnohospodársky podnik dodával ošípané, o ktorých sa následne preukázalo, že sú infikované vírusom ASF, - ak prasnice boli umelo inseminované spermou pochádzajúcou z podozrivého zdroja, - ak prišlo k priamemu alebo nepriamemu kontaktu s voľne žijúcimi ošípanými v populácii, kde sa vyskytuje ASF, - ak sa ošípané držia vonku v regiónoch, kde sú voľne žijúce ošípané infikované vírusom ASF, - ak sa ošípané kŕmili kuchynskými odpadmi a ak existuje podozrenie, že tento kuchynský odpad sa neošetril takým spôsobom, aby sa inaktivoval vírus ASF, - ak mohlo prísť k vystaveniu sa vplyvu vírusu ASF, napríklad prostredníctvom osôb, ktoré majú prístup do poľnohospodárskeho podniku, prostredníctvom prepravy, atď. prichádzajúcich z poľnohospodárskych podnikov podozrivých z infekcie alebo infikovaných vírusom ASF, - ak sa v oblasti poľnohospodárskeho podniku vyskytujú nosiči vírusu. 2. V každom prípade musí poľnohospodársky podnik byť považovaný za podozrivý podnik, ak v tomto poľnohospodárskom podniku vzniklo podozrenie z klasického moru ošípaných na základe klinických alebo patologických nálezov, ale klinické, epidemiologické a laboratórne vyšetrenia neviedli k potvrdeniu tejto choroby alebo k identifikácii iných zdrojov alebo pôvodcov choroby v príslušnom poľnohospodárskom podniku. Kapitola IV Postupy na kontrolu a odber vzoriek A. USMERNENIA A POSTUPY NA KLINICKÉ VYŠETROVANIE OŠÍPANÝCH A ODBER VZORIEK V PODOZRIVÝCH POĽNOHOSPODÁRSKYCH PODNIKOCH 1. Členské štáty zabezpečujú, aby sa v podozrivých poľnohospodárskych podnikoch vykonávali vhodné klinické vyšetrenia, odbery vzoriek a laboratórne vyšetrenia s cieľom potvrdenia alebo vylúčenia ASF, v súlade s usmerneniami a postupmi ustanovenými v bodoch 2 až 6. Tieto usmernenia a postupy platia nezávisle od toho, či sa v príslušnom poľnohospodárskom podniku prijmú opatrenia uvedené v článku 4 ods. 2 smernice 2002/60/ES, aj v prípadoch choroby, v ktorých sa v rámci diferenciálnej diagnostiky testuje na ASF. Toto zahŕňa situácie, keď klinické príznaky a epidemiologický priebeh choroby, ktoré sa spozorujú u ošípaných, iba s veľmi malou pravdepodobnosťou naznačujú výskyt ASF. Vo všetkých ostatných prípadoch, ak je podozrenie, že jedna alebo viac ošípaných je infikovaných vírusom ASF, prijmú sa v príslušnom podozrivom poľnohospodárskom podniku opatrenia uvedené v článku 4 ods. 2 smernice 2002/60/ES. Aj v prípade podozrenia z ASF u ošípaných v bitúnku alebo v dopravnom prostriedku sa usmernenia a postupy ustanovené v bodoch 2 až 6 uplatňujú mutatis mutandis. 2. Ak úradný veterinárny lekár navštívi podozrivý poľnohospodársky podnik s cieľom potvrdenia alebo vylúčenia ASF: - musí sa vykonať kontrola výrobných a zdravotných záznamov poľnohospodárskeho podniku, ak sú tieto k dispozícii; musí sa vykonať inšpekcia každej podjednotky poľnohospodárskeho podniku, aby sa vytriedili ošípané, ktoré sa musia klinicky vyšetriť. Klinické vyšetrenie musí zahŕňať odmeranie teploty a v prvom rade sa týka týchto ošípaných alebo skupín ošípaných: - chorých alebo ošípaných prejavujúcich nechutenstvo, - ošípaných nedávno presunutých z potvrdených ohnísk alebo z iných podozrivých zdrojov, - ošípaných držaných v podjednotkách, ktoré nedávno navštívili návštevníci, ktorí nedávno mali blízky kontakt s ošípanými podozrivými z ASF alebo s infikovanými ošípanými, alebo pri ktorých boli identifikované iné zvlášť rizikové kontakty s potenciálnymi zdrojmi vírusu ASF, - ošípaných, z ktorých sa už odobrali vzorky, alebo ktoré boli sérologicky testované na ASF v prípade, že tieto testy neumožňujú vylúčenie ASF, ako aj kontaktných ošípaných, - ošípaných, ktoré sa nedávno vyliečili z tejto choroby. Ak sa pri inšpekcii v podozrivom poľnohospodárskom podniku nepreukázala prítomnosť ošípaných alebo skupiny ošípaných uvedených v pododseku vyššie, musí príslušný orgán bez toho, aby boli dotknuté iné opatrenia, ktoré sa môžu uplatniť v príslušných poľnohospodárskych podnikoch v súlade so smernicou 2002/60/ES a pri zohľadnení epidemiologickej situácie: - vykonať ďalšie vyšetrenia v príslušnom poľnohospodárskom podniku v súlade s bodom 3, alebo - zabezpečiť, aby sa od ošípaných v príslušnom poľnohospodárskom podniku odobrali vzorky krvi na laboratórne testy (v takomto prípade sa s cieľom usmernenia použijú postupy na odber vzorky ustanovené v bode 5 ako aj v oddieli F ods. 2), alebo - prijať alebo dodržiavať opatrenia ustanovené v článku 4 ods. 2 smernice 2002/60/ES, až do ďalších vyšetrení v príslušnom poľnohospodárskom podniku, alebo - vylúčiť podozrenie z ASF. 3. Ak sa odkazuje na tento odsek, musí sa vykonať klinické vyšetrenie v príslušnom poľnohospodárskom podniku na náhodne vybratých ošípaných v podjednotkách, u ktorých sa identifikovalo zavlečenie vírusu ASF alebo je podozrenie z neho. Pritom musí minimálny počet ošípaných podrobených vyšetreniu byť taký, aby v týchto podjednotkách umožňoval identifikáciu moru, ak existuje, s prevalenciou 10 % pri dôkaznosti 95 %. 4. Ak sa v podozrivom poľnohospodárskom podniku zistia uhynuté alebo hynúce ošípané, musia sa vykonať postmortálne vyšetrenia, pokiaľ možno minimálne na piatich z takýchto ošípaných, a najmä na ošípaných, ktoré: - pred uhynutím vykazovali veľmi zreteľné príznaky choroby, - majú vysokú horúčku, - uhynuli nedávno. Ak tieto vyšetrenia nepreukázali zmeny naznačujúce ASF, ale z dôvodu epidemiologickej situácie sa považujú za potrebné ďalšie vyšetrenia: - musí sa v podjednotke, kde sa držali uhynuté alebo hynúce ošípané vykonať klinické vyšetrenie ustanovené v bode 3 a odber krvnej vzorky uvedený v bode 5, a - musia sa vykonať postmortálne vyšetrenia na troch až štyroch kontaktných ošípaných, najmä ak tieto ošípané vykazujú klinické príznaky. Bez ohľadu na to, či existujú alebo neexistujú zmeny naznačujúce ASF, musia sa orgány alebo tkanivá z ošípaných, ktoré sa podrobili postmortálnemu vyšetreniu, odobrať na virologické testy v súlade s kapitolou V časť B ods. 1 Takéto vzorky sa musia odobrať najmä z nedávno uhynutých ošípaných. Pri vykonávaní postmortálnych vyšetrení musí príslušný orgán zabezpečiť, aby: - sa prijali potrebné bezpečnostné a hygienické opatrenia na zabránenie akéhokoľvek šírenia choroby, a - v prípade hynúcich ošípaných, sa tieto usmrtili humánnym spôsobom v súlade so smernicou Rady 93/119/EHS z 22. decembra 1993 o ochrane zvierat v čase zabíjania a usmrcovania [3], naposledy zmenenou a doplnenou nariadením (ES) č. 806/2003 [4]. 5. Ak sa v podozrivých poľnohospodárskych podnikoch zistia ďalšie klinické príznaky alebo zmeny, ktoré môžu naznačovať ASF, avšak príslušný orgán je toho názoru, že tieto zistenia sú nedostačujúce na potvrdenie ohniska ASF a že sú preto potrebné ďalšie laboratórne testy, musia sa na laboratórne testy odobrať vzorky krvi od podozrivých ošípaných a od iných ošípaných v každej podjednotke, v ktorej sa podozrivé ošípané držali, v súlade s týmito postupmi: a) na sérologické skúšky sa musí odobrať taký minimálny počet vzoriek, aby v každej dotyčnej podjednotke umožňoval zistenie sérologickej prevalencie 10 % pri dôkaznosti 95 %; b) počet vzoriek, ktoré sa musia odobrať na virologické testy, musí byť v súlade s pokynmi príslušného orgánu, ktorý zoberie do úvahy rozsah testov, ktoré je možné vykonať, senzitivitu použitých laboratórnych testov a epidemiologickú situáciu. 6. Ak sa po vyšetreniach vykonávaných v podozrivom poľnohospodárskom podniku nezistia klinické príznaky alebo zmeny naznačujúce ASF, ale príslušný orgán považuje za potrebné ďalšie laboratórne testy na vylúčenie ASF, tak sa s cieľom usmernenia použijú postupy na odber vzorky ustanovené v bode 5. B. POSTUPY NA ODBER VZORIEK V POĽNOHOSPODÁRSKOM PODNIKU, AK SA OŠÍPANÉ MUSIA USMRTIŤ PO POTVRDENÍ CHOROBY 1. Aby sa dal stanoviť spôsob zavlečenia vírusu ASF do infikovaného poľnohospodárskeho podniku a doba, ktorá uplynula od jeho zavlečenia, musia sa pri usmrcovaní zvierat v poľnohospodárskom podniku po potvrdení ohniska v súlade s článkom 5 ods. 1 písm. a smernice 2002/60/ES náhodne odobrať vzorky krvi na sérologické skúšky z ošípaných pri ich usmrtení. 2. Minimálny počet ošípaných, ktorým sa majú odobrať vzorky, musí byť taký, aby umožňoval zistenie sérologickej prevalencie 10 % pri dôkaznosti 95 % u ošípaných v každej podjednotke poľnohospodárskeho podniku [5]. Vzorky, ktoré sa musia odobrať na virologické testy, musia byť v súlade s pokynmi príslušného orgánu, ktorý zoberie do úvahy rozsah testov, ktoré je možné vykonať, senzitivitu použitých laboratórnych testov a epidemiologickú situáciu. V tých oblastiach, kde sa predtým preukázala prítomnosť nosičov infikovaných vírusom ASF, sa musia urobiť aj príslušné odbery kliešťov na virologické testy v súlade s pokynmi príslušného orgánu a s prílohou III k smernici 2002/60/ES. 3. V prípade sekundárnych ohnísk však príslušný orgán môže rozhodnúť odlišne od bodov 1 a 2 a ustanoviť iné postupy na odber vzoriek, pričom zoberie do úvahy epidemiologické informácie, ktoré sú už dostupné o zdroji a spôsoboch zavlečenia vírusu do poľnohospodárskeho podniku a o prípadnom šírení choroby z poľnohospodárskeho podniku. C. POSTUPY NA ODBER VZORIEK, AK SA OŠÍPANÉ USMRTIA AKO PREVENTÍVNE OPATRENIE V PODOZRIVOM POĽNOHOSPODÁRSKOM PODNIKU 1. S cieľom potvrdenia alebo vylúčenia a získania dodatočných epidemiologických informácií, ak sa ošípané usmrtia ako preventívne opatrenie v podozrivom poľnohospodárskom podniku v súlade s ustanoveniami článku 4 ods. 3 písm. a alebo článku 7 ods. 2 smernice 2002/60/ES, sa vzorky krvi na sérologické testy ako aj vzorky krvi na virologické testy musia odoberať v súlade s postupom ustanoveným v bode 2. 2. Vzorky sa v prvom rade musia odobrať od: - ošípaných, ktoré preukazujú príznaky alebo postmortálne zmeny naznačujúce ASF, a tiež kontaktných ošípaných, - iných ošípaných, ktoré mohli mať rizikové kontakty s infikovanými alebo podozrivými ošípanými, alebo u ktorých je podozrenie z kontaminácie vírusom ASF. Vzorky od takýchto ošípaných sa musia odobrať v súlade s pokynmi príslušného orgánu, ktorý zoberie do úvahy epidemiologickú situáciu. Okrem toho sa náhodne musia odoberať vzorky od ošípaných odchádzajúcich z každej podjednotky poľnohospodárskeho podniku [6]. V tomto prípade sa na sérologické skúšky musí odobrať taký minimálny počet vzoriek, aby v každej dotyčnej podjednotke umožňoval zistenie sérologickej prevalencie 10 % pri dôkaznosti 95 %. Druh vzoriek, ktoré sa musia odobrať na virologické testy a testy, ktoré sa použijú, musia byť v súlade s pokynmi príslušného orgánu, ktorý zoberie do úvahy rozsah testov, ktoré je možné vykonať, senzitivitu použitých laboratórnych testov a epidemiologickú situáciu. D. POSTUPY NA VYKONÁVANIE KONTROLY A NA ODBER VZORIEK PRED UDELENÍM POVOLENIA NA PREMIESTNENIE OŠÍPANÝCH Z POĽNOHOSPODÁRSKYCH PODNIKOV UMIESTNENÝCH V PÁSME OCHRANY ALEBO PÁSME DOHĽADU A V PRÍPADE, ŽE TAKÉTO ZVIERATÁ SA ZABIJÚ ALEBO USMRTIA (ČLÁNKY 10 A 11 SMERNICE 2002/60/ES) 1. Bez toho, aby boli dotknuté ustanovenia v článku 11 ods. 1 písm. f druhý pododsek smernice 2002/60/ES, musí klinické vyšetrenie, ktoré musí vykonať úradný veterinárny lekár, aby sa mohlo udeliť povolenie na premiestnenie ošípaných z poľnohospodárskych podnikov umiestnených v pásme ochrany alebo pásme dohľadu v súlade s článkom 10 ods. 3 uvedenej smernice: - byť vykonané v priebehu 24-hodinovej lehoty pred premiestnením ošípaných, - byť v súlade s ustanoveniami ustanovenými v časti A ods. 2 2. V prípade ošípaných, ktoré sa musia premiestniť do iného poľnohospodárskeho podniku, sa okrem vyšetrení, ktoré sa musia vykonať v súlade s bodom 1, musí v každej podjednotke poľnohospodárskeho podniku, kde sa držia ošípané, ktoré sa majú premiestniť, vykonať klinické vyšetrenie ošípaných, vrátane odmerania teploty u časti ošípaných. Minimálny počet ošípaných podrobených kontrole musí byť taký, aby v týchto podjednotkách umožňoval identifikáciu moru, ak existuje, s prevalenciou 10 % pri dôkaznosti 95 %. 3. V prípade ošípaných, ktoré sa majú premiestniť do bitúnku, do spracovateľského podniku alebo na iné miesta na usmrtenie alebo zabitie, sa okrem vyšetrení, ktoré sa musia vykonať v súlade s bodom 1, musí v každej podjednotke, kde sa držia ošípané, ktoré sa majú premiestniť, vykonať klinické vyšetrenie ošípaných. V prípade ošípaných starších ako tri až štyri mesiace musí toto vyšetrenie zahŕňať meranie teploty u časti ošípaných. Minimálny počet ošípaných podrobených kontrole musí byť taký, aby v príslušných podjednotkách umožňoval identifikáciu moru, ak existuje, s prevalenciou 20 % pri dôkaznosti 95 %. 4. Ak sa ošípané uvedené v bode 3 majú zabiť alebo usmrtiť, musia sa od ošípaných prichádzajúcich z podjednotiek, z ktorých sa premiestnili ošípané, odobrať vzorky krvi na sérologické testy alebo krv alebo vzorky orgánov, ako sú mandle, slezina alebo lymfatické uzliny na virologické testy. Minimálny počet odobratých vzoriek musí byť taký, aby v každej podjednotke umožňoval identifikáciu sérologickej prevalencie alebo prevalencie vírusu 10 % pri dôkaznosti 95 %. Druh vzoriek, ktoré sa musia odobrať a testy, ktoré sa použijú, musia byť v súlade s pokynmi príslušného orgánu, ktorý zoberie do úvahy rozsah testov, ktoré je možné vykonať, senzitivitu použitých laboratórnych testov a epidemiologickú situáciu. 5. Ak sa však pri zabití alebo usmrtení ošípaných zistia klinické príznaky alebo postmortálne zmeny naznačujúce ASF, uplatňujú sa odlišne od bodu 4 ustanovenia pre odber vzoriek ustanovené v časti C. 6. Výnimka ustanovená v článku 10 ods. 5 a v článku 11 ods. 4 smernice 2002/60/ES sa môže udeliť iba vtedy, ak príslušné orgány zabezpečia, aby sa systém intenzívneho odberu vzoriek a testovania uplatnil aj na skupiny ošípaných, ktoré sa musia kontrolovať alebo ktorým sa musia odoberať vzorky, uvedené v bodoch 2, 3 a 4. V rámci tohto systému musí minimálny počet odobratých vzoriek krvi byť taký, aby v skupine dotyčných ošípaných umožňoval identifikáciu sérologickej prevalencie 5 % pri dôkaznosti 95 %. E. POSTUPY NA VYKONÁVANIE KONTROLY A NA ODBER VZORIEK V POĽNOHOSPODÁRSKOM PODNIKU V SÚVISLOSTI S OBNOVOU CHOVU 1. Ak sa v poľnohospodárskom podniku obnovuje chov ošípaných v súlade s článkom 13 ods. 3 smernice 2002/60/ES, musia sa uplatňovať tieto postupy na odber vzoriek: - vzorky krvi sa musia odobrať najskôr 45 dní po obnove chovu ošípaných, - v prípade obnovy chovu sentinelových ošípaných sa vzorky krvi na sérologické testy musia odobrať náhodne z takého počtu ošípaných, aby v každej podjednotke poľnohospodárskeho podniku umožňovali identifikáciu sérologickej prevalencie 10 % pri dôkaznosti 95 %, - v prípade celkovej obnovy chovu sa vzorky krvi na sérologické testy musia odobrať náhodne z takého počtu ošípaných, aby v každej podjednotke poľnohospodárskeho podniku umožňovali identifikáciu sérologickej prevalencie 20 % pri dôkaznosti 95 %. 2. Ak sa v poľnohospodárskom podniku obnovuje chov ošípaných v súlade s článkom 13 ods. 4 smernice 2002/60/ES, musia sa uplatňovať tieto postupy na odber vzoriek: - vzorky krvi sa musia odobrať najskôr 45 dní po obnove chovu ošípaných, - v prípade obnovy chovu sentinelových ošípaných sa vzorky krvi na sérologické testy musia odobrať náhodne z takého počtu ošípaných, aby v každej podjednotke poľnohospodárskeho podniku umožňovali identifikáciu sérologickej prevalencie 5 % pri dôkaznosti 95 %, - v prípade celkovej obnovy chovu sa vzorky krvi na sérologické testy musia odobrať náhodne z takého počtu ošípaných, aby v každej podjednotke poľnohospodárskeho podniku umožňovali identifikáciu sérologickej prevalencie 10 % pri dôkaznosti 95 %. Postup ustanovený vyššie v tretej zarážke sa potom musí opakovať najskôr 60 dní po celkovej obnove chovu. 3. Po akejkoľvek obnove chovu ošípaných príslušný orgán zabezpečuje, aby sa v prípade akejkoľvek choroby alebo uhynutia ošípaných z neznámych dôvodov dotyčné ošípané okamžite vyšetrili na ASF. Tieto ustanovenia platia až do zrušenia obmedzení v dotyčnom poľnohospodárskom podniku na premiestňovanie ošípaných uvedených v článku 13 ods. 3 písm. a a ods. 4 smernice 2002/60/ES. F. POSTUPY NA ODBER VZORIEK V POĽNOHOSPODÁRSKYCH PODNIKOCH V OCHRANNOM PÁSME PRED ZRUŠENÍM OBMEDZENÍ 1. Aby sa mohli zrušiť obmedzenia uvedené v článku 10 smernice 2002/60/ES v ochrannom pásme, vo všetkých poľnohospodárskych podnikoch pásma: - musí sa v súlade s postupmi ustanovenými v časti A ods. 2 a ods. 3 vykonať klinické vyšetrenie, - musia sa odobrať vzorky krvi na sérologické testy ustanovené v bode 2. 2. Minimálny počet vzoriek krvi, ktoré sa majú odobrať, musí byť taký, aby umožňoval zistenie sérologickej prevalencie 10 % pri dôkaznosti 95 % u ošípaných v každej podjednotke poľnohospodárskeho podniku. Výnimka ustanovená v článku 10 ods. 5 a v článku 11 ods. 4 smernice 2002/60/ES sa môže udeliť iba vtedy, ak príslušný orgán zabezpečí, že počet odobratých vzoriek krvi bude taký, aby v každej podjednotke v poľnohospodárskom podniku umožňoval identifikáciu sérologickej prevalencie 5 % pri dôkaznosti 95 %. G. POSTUPY NA ODBER VZORIEK V POĽNOHOSPODÁRSKYCH PODNIKOCH V PÁSME DOHĽADU PRED ZRUŠENÍM OBMEDZENÍ 1. Aby sa mohli zrušiť obmedzenia uvedené v článku 11 smernice 2002/60/ES v pásme dohľadu, musí sa vo všetkých poľnohospodárskych podnikoch pásma vykonať klinické vyšetrenie v súlade s postupmi ustanovenými v časti A ods. 2 Okrem toho sa musia odobrať vzorky krvi na sérologické testy od ošípaných: - v akomkoľvek inom poľnohospodárskom podniku, ak príslušný orgán považuje odber vzoriek za potrebný, - vo všetkých inseminačných staniciach. 2. Ak sa odber vzoriek na sérologické testy vykonáva v poľnohospodárskych podnikoch umiestnených v pásme dohľadu, musí počet vzoriek krvi, ktoré sa musia odobrať, byť v súlade s časťou F ods. 2, prvá veta. Výnimka ustanovená v článku 10 ods. 5 a v článku 11 ods. 4 smernice 2002/60/ES sa môže udeliť iba vtedy, ak príslušný orgán zabezpečí, že vzorky krvi na sérologické testy sa odoberú v každom poľnohospodárskom podniku pásma. Minimálny počet vzoriek krvi, ktoré sa majú odobrať, musí byť taký, aby umožňoval zistenie sérologickej prevalencie 5 % pri dôkaznosti 95 % v každej podjednotke poľnohospodárskeho podniku. H. POSTUPY NA SÉROLOGICKÉ MONITOROVANIE A ODBER VZORIEK V OBLASTIACH, KDE JE PODOZRENIE Z VÝSKYTU ASF ALEBO KDE SA ASF POTVRDILO U VOĽNE ŽIJÚCICH OŠÍPANÝCH 1. V prípade sérologického monitorovania u voľne žijúcich ošípaných v oblastiach, kde sa ASF potvrdilo, alebo kde je podozrenie z jeho výskytu, by sa veľkosť a zemepisná oblasť cieľovej populácie, ktorej sa majú odoberať vzorky, mali vopred definovať, aby sa stanovil počet vzoriek, ktoré sa musia odobrať. Veľkosť vzorky sa musí stanoviť ako funkcia odhadovaného počtu živých zvierat nie ako funkcia zastrelených zvierat. 2. Ak nie sú k dispozícii údaje o populácii a počte, musí sa identifikovať zemepisná oblasť, v rámci ktorej sa odoberú vzorky, pričom sa zoberie do úvahy nepretržitá prítomnosť voľne žijúcich ošípaných a existencia prirodzených a umelých prekážok, ktoré účinne bránia veľkému a neustálemu premiestňovanie zvierat. Ak také okolnosti neexistujú, alebo v prípade veľkých oblastí sa odporúča, aby sa stanovili oblasti na odber vzoriek o veľkosti asi 200 km2, kde zvyčajne môže žiť populácia o veľkosti asi 400 až 1000 voľne žijúcich ošípaných. 3. Bez toho, aby boli dotknuté ustanovenia v článku 15 ods. 2 písm. c smernice 2002/60/ES, musí byť minimálny počet ošípaných, ktorým sa odoberú vzorky v rámci stanovenej oblasti na odber vzorky taký, aby umožňoval zistenie sérologickej prevalencie 5 % pri dôkaznosti 95 %. Za týmto účelom sa musia odobrať vzorky minimálne od 56 zvierat v každej stanovenej oblasti. 4. Odber vzoriek na virologické testy od zastrelených alebo nájdených uhynutých voľne žijúcich ošípaných sa musí vykonať podľa kapitoly V časť B ods. 1 Ak sa považuje za dôležité virologické monitorovanie zastrelených voľne žijúcich ošípaných, musí sa vykonať na zvieratách mladších ako jeden rok. 5. Ku všetkým vzorkám, ktoré sa pošlú do laboratória, sa musí priložiť dotazník uvedený v článku 16 ods. 3 písm. h smernice 2002/60/ES. Kapitola V Všeobecné postupy a kritériá pre odber a prepravu vzoriek A. VŠEOBECNÉ POSTUPY A KRITÉRIÁ 1. Pred odberom vzoriek v podozrivom poľnohospodárskom podniku sa musí vypracovať mapa poľnohospodárskeho podniku a musia sa zaznačiť epidemiologické podjednotky poľnohospodárskeho podniku. 2. Vždy, keď sa predpokladá vykonanie opakovaného odberu vzoriek od ošípaných, musia sa všetky ošípané, ktorým sa odoberajú vzorky, jednotne označiť takým spôsobom, aby sa im znovu mohli odobrať vzorky. 3. Ku všetkým vzorkám sa pri posielaní do laboratória musia priložiť náležité formuláre, a to v súlade s požiadavkami, ktoré ustanoví príslušný orgán. Tieto formuláre musia obsahovať podrobné údaje o histórii ošípaných, ktorým sa odobrali vzorky a o klinických príznakoch alebo pozorovaných postmortálnych zmenách. V prípade ošípaných držaných v poľnohospodárskom podniku sa musia poskytnúť informácie o veku, kategórii a poľnohospodárskom podniku pôvodu ošípaných, ktorým sa odobrali vzorky. Odporúča sa, aby sa zaznamenalo umiestnenie každej ošípanej v poľnohospodárskom podniku, ktorej sa odobrala vzorka, spolu s jednotnou identifikačnou značkou. B. ODBER VZORIEK NA VIROLOGICKÉ TESTY 1. Najvhodnejšími vzorkami na zisťovanie vírusu ASF, antigénu alebo genómu z uhynutých alebo humánne zlikvidovaných ošípaných, sú mandle, lymfatické uzliny (gastrohepatické, renálne, submandibulárne a retrofaryngálne), tkanivá sleziny, obličiek a pľúc [7]. V prípade autolyzovaných tiel zvierat je vhodným vzorkovým materiálom úplná dlhá kosť alebo hrudná kosť. 2. Od ošípaných preukazujúcich príznaky horúčky alebo iné príznaky choroby sa v súlade s pokynmi príslušného orgánu musia odobrať vzorky nezrazenej krvi alebo zrazenej krvi. C. PREPRAVA VZORIEK 1. Odporúča sa, aby sa všetky vzorky: - riadne identifikovali, - prepravovali a skladovali v nádobách utesnených proti vytekaniu, - držali v chlade pri teplote chladničky; ak sa však očakáva, že vzorky sa do laboratória dostanú za viac ako 48 hodín, mali by sa od laboratória získať informácie o najvhodnejších teplotných podmienkach, - dodali do laboratória čo najrýchlejšie, - uchovali v obale obsahujúcom balíky s ľadom alebo suchým ľadom na udržanie chladu, - tkanív alebo orgánov umiestnili do osobitných zapečatených plastových nádob a vhodne sa označili. Potom sa musia umiestniť do väčšej nádoby a obaliť dostatočne absorbujúcim materiálom, aby boli ochránené pred poškodením a mohli absorbovať akýkoľvek vytekajúci obsah, - pokiaľ možno vždy prepravili priamo do laboratória zodpovednou osobou, aby sa zabezpečila rýchla a spoľahlivá preprava. 2. Vonkajšia strana obalu musí byť označená adresou prijímajúceho laboratória a malo by na nej byť viditeľne uvedené toto označenie: "Živočíšny patologický materiál; podliehajúci skaze; krehký; neotvárajte mimo laboratória pre ASF." 3. Zodpovedná osoba v prijímacom laboratóriu sa musí včas informovať o príchode vzoriek. 4. Pri leteckej preprave vzoriek do Referenčného laboratória spoločenstva pre ASF [8] sa obal musí označiť v súlade s predpismi IATA. Kapitola VI Zásady a použitie virologických testov a vyhodnotenie ich výsledkov A. ZISŤOVANIE ANTIGÉNOV VÍRUSU 1. Priamy imunofluorescentný test (DIFT) Základom testu je mikroskopické zisťovanie vírusových antigénov na škvrnitých preparátoch alebo kryosekciách orgánového materiálu z ošípaných, ktoré sú podozrivé z infekcie vírusom ASF. Medzibunkové antigény sa zistia pomocou špecifických protilátok združených s FIT [9]. V cytoplazme infikovaných buniek sa objavia fluorescenčné včlenené granule. Vhodnými orgánmi sú obličky, slezina a rôzne lymfatické uzliny. Pri voľne žijúcich ošípaných sa môže použiť aj výter z buniek kostnej drene, ak ich orgány nie sú dostupné alebo ak sú autolyzované. Test sa môže vykonať v priebehu dvoch hodín. Keďže vzorky orgánov sa môžu získať iba z uhynutých zvierat, je ich použitie na účely preverovania obmedzené. Toto je vysoko senzitívny test pre prípady akútneho ASF. Pri subakútnych alebo chronických formách predstavuje DIFT iba senzitivitu približne 40 %, ktorá je spôsobená pravdepodobne prítomnosťou komplexov antigén-protilátka, ktoré blokujú reakciu s protilátkami združenými s ASF. Dôveryhodnosť výsledkov testu môže byť obmedzená pochybným zafarbením najmä vtedy, ak sa nezískali dostačujúce skúsenosti s vykonávaním testu, alebo ak sú testované orgány autolyzované. 2. ELISA na zisťovanie antigénov Vírusové antigény sa môžu zisťovať aj pomocou technológie ELISA, odporúča sa však iba pre akútne formy choroby, kvôli jej malej citlivosti, ak sú prítomné komplexy antigén-protilátka. Senzitivita testu ELISA – antigén by mala byť tak vysoká, aby sa zabezpečil pozitívny výsledok u zvierat, u ktorých sú príznaky akútnej ASF. V každom prípade sa odporúča použiť tento test iba ako test "stáda" a v spojení v inými virologickými skúškami. B. IZOLÁCIA VÍRUSU A IDENTIFIKÁCIA POMOCOU TESTU HAEMADSORPTION (HAD) 1. Izolácia vírusu sa robí na základe naočkovania vzorkového materiálu do vnímavých primárnych bunečných kultúr pochádzajúcich z ošípaných, do buniek monocytov a makrofágov. Uprednostňovanými vzorkovými materiálmi na izoláciu vírusu ASF sú úplná krv a leukocyty získané z nekoagulovaných krvných vzoriek alebo z orgánov uvedených v časti A ods. 1 Ak sa vo vzorke nachádza vírus ASF, tak sa v bunkách reprodukuje a v infikovaných bunkách vyvoláva charakteristický cytopatický efekt. 2. Technika HAD sa odporúča na identifikáciu vírusu ASF kvôli jej vysokej senzitivite a špecifickosti. Základom HAD je schopnosť reprodukovania sa vírusu ASF v makrofágoch ošípaných a spôsobenia hemadsorpcie v prítomnosti erytrocytov ošípaných. Okolo infikovaných makrofágov sa tvorí charakteristická "rozeta" erytrocytov. Malý počet terénnych kmeňov vírusu ASF nemôže vyvolávať hemadsorpciu, ale spôsobuje cytopatický efekt. Tieto kmene je možné špecificky identifikovať pomocou testu DIF na sedimentoch bunkových kultúr alebo pomocou PCR. 3. Izolácia vírusu sa viac hodí na šetrenie vzoriek z malých skupín zvierat ako na sledovanie veľkých skupín zvierat. Postup na izoláciu vírusu je náročný na prácu a vyžaduje si jeden až tri dni, pokiaľ sa dosiahnú výsledky. Na zistenie malých množstiev vírusu môžu byť potrebné dve ďalšie dávky bunkových kultúr. Na dosiahnutie konečného výsledku môže byť potrebná doba skúmania až 10 dní. Autolyzované vzorky môžu byť cytotoxické voči bunkovej kultúre, a preto môžu mať obmedzené použitie. 4. Izolácia a identifikácia vírusu pomocou HAD sa odporúča ako referenčný test na potvrdenie pozitívnych výsledkov predchádzajúcich testov ELISA, PCR alebo DIFT. Odporúčajú sa aj vtedy, ak sa ASF už potvrdilo pomocou iných metód, najmä v prípade primárneho ohniska alebo prípadu ASF. Vírusy ASF izolované v makrofágoch ošípaných sa môžu použiť na charakterizáciu vírusu a molekulárnu epidemiológiu. 5. Všetky izoláty ASF zo všetkých primárnych ohnísk, primárnych prípadov alebo prípadov v bitúnkoch alebo v dopravných prostriedkoch musí charakterizovať národné referenčné laboratórium v príslušnom členskom štáte, alebo akékoľvek iné laboratórium povolené príslušným členským štátom alebo referenčným laboratóriom spoločenstva v súlade s časťou E. V každom prípade sa takéto izoláty vírusu okamžite musia poslať do referenčného laboratória spoločenstva na odber vírusu. C. ZISTENIE GENÓMU VÍRUSU 1. Reťazová reakcia polymerázy (PCR) sa používa na zistenie vírusového genómu vo vzorkách krvi, séra, tkaniva alebo orgánov. Pritom sa malé fragmenty vírusovej DNA zväčšia pomocou PCR na identifikovateľné množstvá. Použitím primérov z vysoko konzervovaného regiónu genómu je možné identifikovať široký rozsah izolátov patriacich ku všetkým známym genotypom vírusu, vrátane vírusov neabsorbujúcich krv a izolátov so slabou virulenciou. Keďže sa týmto testom dá zistiť iba genómová sekvencia vírusu, môže byť PCR pozitívna aj vtedy, ak sa izoláciou vírusu nezistí žiadny infekčný vírus (napr. v autolyzovanom tkanive alebo vo vzorkách od rekonvalescentných ošípaných alebo od ošípaných, ktoré sa zotavili a sú klinicky normálne). 2. PCR sa dá použiť na obmedzenom počte vzoriek, ktoré sa starostlivo vybrali z podozrivých zvierat. Je to odporúčaná metóda pre vzorky orgánov, ktoré sú cytotoxické, pri ktorých preto nie je možná izolácia vírusu (napríklad vzorky od voľne žijúcich ošípaných). 3. Vhodným vzorkovým materiálom na PCR sú orgány opísané na izoláciu vírusu a séra. Homogenáty kliešťov je tiež možné analyzovať pomocou PCR. 4. PCR je možné vykonať v priebehu jedného pracovného dňa. Vyžaduje to vhodné laboratórne vybavenie, samostatné priestory a skúsených pracovníkov. Výhodou je, že infekčný vírus sa nemusí replikovať v laboratóriu. PCR je vysoko citlivá, ale ľahko môže nastať kontaminácia, čo vedie k nesprávnym pozitívnym výsledkom. Preto sú dôležité prísne postupy na kontrolu kvality. D. ODPORÚČANÉ VIROLOGICKÉ TESTY A VYHODNOTENIE VÝSLEDKOV Na potvrdenie ASF sú dôležité virologické testy. Izolácia vírusu a HAD sa musia považovať za referenčné virologické testy, a ak je to potrebné, musia sa použiť ako potvrdzujúce testy. Ich použite sa odporúča najmä tam, kde pozitívne výsledky nesúvisia so zisťovaním klinických príznakov alebo lézií choroby a v akýchkoľvek iných nepresvedčivých prípadoch. Primárne ohnisko ASF sa však môže potvrdiť, ak sa zistili klinické príznaky alebo zmeny choroby u dotyčných ošípaných a minimálne dva oddelené testy na zistenie antigénu, genómu alebo protilátok ukázali pozitívny výsledok na vzorkách odobratých od tej istej ošípanej. Sekundárne ohnisko ASF sa môže potvrdiť, ak sa okrem epidemiologickej súvislosti s potvrdeným ohniskom alebo prípadom zistili klinické príznaky alebo lézie choroby u dotyčných ošípaných a test na zistenie antigénu, genómu alebo protilátok preukázal pozitívny výsledok. Primárny prípad ASF u voľne žijúcich ošípaných je možné potvrdiť izoláciou vírusu, alebo ak minimálne dva testy na zistenie antigénu, genómu alebo protilátok ukázali pozitívny výsledok. Ďalšie prípady ASF u voľne žijúcich ošípaných, u ktorých sa zistila epidemiologická súvislosť s predtým potvrdenými prípadmi, je možné potvrdiť, ak test na zistenie antigénu, genómu alebo protilátok preukázal pozitívny výsledok. E. GENETICKÁ CHARAKTERIZÁCIA IZOLÁTOV VÍRUSU ASF 1. Genetická charakterizácia izolátov vírusu ASF sa dosiahne určením vzoriek reštriktívneho enzýmu a nukleovej sekvencie častí vírusového genómu. Podobnosť týchto obmedzených vzoriek alebo sekvencií s tými vzorkami, ktoré sa už získali z predošlých izolátov vírusu môže ukázať, či ohniská choroby spôsobili vírusy, ktoré zodpovedajú európskemu alebo africkému molekulárnemu modulu. Genetická charakterizácia izolátov vírusu ASF má podstatný význam na zdokonalenie poznatkov o molekulárnej epidemiológii ASF a genetickej variácii vírusov. Molekulárne údaje umožňujú klasifikáciu nových izolátov a poskytujú informácie o ich prípadnom pôvode. 2. Ak molekulárnu charakterizáciu vírusu nie je v rámci krátkej doby možné vykonať v národnom laboratóriu alebo v ktoromkoľvek inom laboratóriu, ktoré má oprávnenie na určovanie diagnózy ASF, musí sa pôvodná vzorka alebo izolát vírusu čo najskôr poslať do referenčného laboratória spoločenstva na molekulárnu charakterizáciu. Údaje z analýzy reštrikčných enzýmov a sekvencovania izolátov vírusu ASF, ktoré sú k dispozícii pre laboratóriá oprávnené na určovanie diagnózy ASF, sa musia poslať do referenčného laboratória spoločenstva, aby sa tieto informácie mohli vložiť do databázy vedenej týmto laboratóriom. Informácie obsiahnuté v tejto databáze musia byť k dispozícii pre všetky národné referenčné laboratóriá v členských štátoch. S cieľom uverejnenia vo vedeckých časopisoch, ak to vyžaduje príslušné laboratórium, zaručí však referenčné laboratórium spoločenstva uchovanie týchto údajov v dôvernosti až do ich uverejnenia. Kapitola VII Zásady a použitie virologických testov a vyhodnotenie ich výsledkov A. ZÁKLADNÉ ZÁSADY A DIAGNOSTICKÁ HODNOTA 1. Pri neakútnych a chronických formách ako aj na veľkoplošné testovanie a pri programoch na eradikáciu ASF sa používa zisťovanie protilátok špecifických pre ASF, a to z niekoľkých dôvodov: i) u infikovaných ošípaných sa rýchlo tvoria protilátky. U takýchto ošípaných sa protilátky zvyčajne dajú zistiť vo vzorkách séra od sedem do desať dní od infekcie; ii) proti ASF neexistujú očkovacie látky. Toto znamená, že protilátky špecifické pre ASF sa indukujú iba infekciou vírusu ASF; iii) reakcia protilátok dlho zotrvá. U ošípaných, ktoré sa zotavili z choroby je špecifické protilátky možné na najvyššej úrovni zistiť počas mnohých mesiacov alebo dokonca u niektorých z týchto ošípaných počas celého života. Počas prvých týždňov života je u ciciakov možné zistiť protilátky materinského pôvodu špecifické pre ASF. Polčas materinských protilátok u ciciakov je asi tri týždne. Ak sa zistia u odstavčiat starších ako tri mesiace, je pravdepodobné, že protilátky proti ASF sú materinského pôvodu. 2. Zisťovanie protilátok proti vírusu ASF v sére alebo exudátoch plazmy z predložených orgánov slúži ako pomôcka pri určovaní diagnózy ASF v podozrivých poľnohospodárskych podnikoch, pri odhadovaní dátumu zavlečenia infekcie v prípade potvrdeného ohniska a s cieľom monitorovania a dohľadu. Umiestnenie séropozitívnych ošípaných v poľnohospodárskom podniku môže poskytnúť cenné informácie o tom, ako a kde sa vírus ASF dostal do poľnohospodárskeho podniku. Musí sa však vykonať presné vyhodnotenie výsledkov sérologických testov, pričom sa zoberú do úvahy všetky klinické, virologické a epidemiologické nálezy v rámci prieskumu, ktorý sa vykoná v prípade podozrenia alebo potvrdenia ASF v súlade s článkom 8 smernice 2002/60/ES. B. ODPORÚČANÉ SÉROLOGICKÉ TESTY 1. S cieľom sérologického potvrdenia ASF je možné vybrať z testov ELISA, nepriama imunofluorescencia (IIFT) a imunoblotting (IB). Kvalita a efektivita sérologických diagnóz vykonávaných národnými laboratóriami sa musí pravidelne kontrolovať v rámci medzilaboratórneho porovnávacieho testu, ktorý pravidelne organizuje referenčné laboratórium spoločenstva. 2. Test ELISA je najspoľahlivejším a najužitočnejším testom na veľkoplošné sérologické prieskumy. Jeho základom je zisťovanie protilátok proti vírusu ASF viazaných na vírusové proteíny, ktoré sa viažu na pevnú fázu pridávaním proteínu A združeného s enzýmom, ktorý vytvára viditeľnú farebnú reakciu, ak reaguje s vhodným substrátom. 3. Národné laboratóriá musia každú šaržu činidiel ELISA pravidelne podrobovať kontrole kvality týkajúcej sa senzitivity a špecifickosti, pričom využijú zoznam referenčných sér, ktoré poskytne referenčné laboratórium spoločenstva. Zoznam sér zahŕňa: - séra od ošípaných v počiatočnej fáze infekcie vírusom ASF (menej ako 17 dní po infekcii), - séra od rekonvalescentných ošípaných (viac ako 17 dní po infekcii). Metóda ELISA, ktorá sa použije na sérologickú diagnostiku ASF, musí preukázať všetky referenčné séra od rekonvalescentných ošípaných. Všetky výsledky získané s referenčnými sérami musia byť reprodukovateľné. Odporúča sa, aby sa zisťovali všetky pozitívne séra z počiatočnej fázy. Výsledky získané s referenčnými sérami od ošípaných v počiatočnej fáze infekcie ukazujú senzitivitu metódy ELISA. 4. IIFT je rýchly postup s vysokou senzitivitou a špecifickosťou na zisťovanie protilátok proti ASF zo séra alebo z exudátov tkaniva. Základom je zisťovanie protilátok ASF, ktoré sa viažu na jednu vrstvu buniek MS infikovaných adaptovaným vírusom ASF. Reakcia protilátka – antigén sa zistí pomocou proteínu A vyznačujúceho sa fluorescenciou. Pozitívne vzorky vykazujú špecifickú fluoroscenciu blízko jadra infikovaných buniek. Kombinované použitie DIFT a IIFT na testovanie orgánov, krvi a exudátov odobratých zo zvierat, ktoré prejavujú klinické príznaky ASF, môže viesť k rýchlemu a spoľahlivému potvrdeniu choroby. 5. Test IB je vysoko špecifická a senzitívna technika, ktorej základom je použitie nitrocelulózových pásikov obsahujúcich vírusové proteíny ako antigénov. Špecifická reakcia protilátka – antigén sa zistí pridaním konjugátu peroxidázy proteínu A a vhodného substrátu. Je veľmi vhodná na testovanie sér, ktoré sú nepresvedčivé pri teste ELISA. Kapitola VIII Minimálne bezpečnostné opatrenia pre laboratóriá pre ASF 1. Každé laboratórium, kde sa zosilňuje vírus ASF replikáciou bunkových kultúr, musí spĺňať požiadavky ustanovené v tabuľke 1. Postmortálne vyšetrenia, spracovanie tkanív pre DIFT alebo PCR a sérologické vyšetrenia používajúce inaktivované antigény sa však môžu vykonávať na nižšej bezpečnostnej úrovni za predpokladu, že sú splnené minimálne požiadavky v tabuľke 1, uplatňuje sa základná hygiena a vykonáva sa pooperačná dezinfekcia s bezpečným zlikvidovaním tiel zvierat, tkanív a sér. 2. Každé laboratórium, kde sa zvieratá očkujú vírusom ASF, musí spĺňať požiadavky ustanovené v tabuľke 2. 3. Všetky zásoby vírusu ASF sa musia uchovávať v bezpečnom sklade, zmrazené alebo lyofilizované. Všetky jednotlivé ampulky musia byť jasne označené a o zásobách vírusu sa musia viesť podrobné záznamy spolu s údajmi a výsledkami o kontrolách kvality. Záznamy sa musia viesť aj o nových vírusoch dodaných do skladu, s podrobnými údajmi o zdroji, ako aj o vírusoch vydaných do iných laboratórií. 4. Odporúča sa, aby sa útvar biologickej bezpečnosti pre prácu s vírusom ASF doplnil pracovnými priestormi, kde sa nenarába s vírusom ASF. Tieto iné priestory by mali byť k dispozícii na prípravu sklených nádob a médií, údržbu a prípravu neinfikovaných bunečných kultúr, spracovanie sér a sérologické testovanie (iné, ako sú metódy používajúce živý vírus ASF), a na administratívne a kancelárske práce. Tabuľka 1 Zásady biologickej bezpečnosti určené pre diagnostické laboratóriá | Minimálne požiadavky | Dodatočné požiadavky | Celkové prostredie | Normálny atmosferický tlak. Vyhradené miestnosti vymedzené na určené postupy. | Normálny atmosferický tlak. Jedna filtrácia HEPA vyčerpaného vzduchu. Vyhradené miestnosti, používané výlučne na postupy pre klasický mor ošípaných alebo na diagnostické postupy pre ASF. Potenciálne kontaminované výtoky ošetrené tak, aby sa inaktivoval vírus ASF (teplom alebo chemicky). | Laboratórne oblečenie | Vyhradené vonkajšie oblečenie používané iba v jednotkách s vírusom ASF. Jednorázové rukavice na všetky manipulácie s infikovaným materiálom. Vonkajšie oblečenie sterilizované pred odstránením z jednotky, alebo umyté pri vysokej teplote v rámci jednotky. | Úplná výmena šatstva pri vstupe. Laboratórne oblečenie používané iba v jednotkách s vírusom ASF. Jednorázové rukavice na všetky manipulácie s infikovaným materiálom. Oblečenie sterilizované pred odstránením z jednotky, alebo umyté pri vysokej teplote v rámci jednotky. | Kontrola personálu | Vstup do jednotky povolený iba konkrétnym a zaškoleným osobám. Pred odchodom z jednotky sa ruky musia umyť a dezinfikovať. Personál nesmie vstúpiť do priestorov s ošípanými počas 48 hodín po odchode z jednotky. | Vstup do jednotky povolený iba konkrétnym, zaškoleným osobám. Pred odchodom z jednotky sa ruky musia umyť a dezinfikovať. Personál nesmie vstúpiť do priestorov s ošípanými počas 48 hodín po odchode z jednotky. | Vybavenie | Biologicky bezpečný kabinet (I. alebo II. trieda) používaný na všetky manipulácie so živým vírusom. Kabinet musí mať dvojnásobnú filtráciu HEPA vyčerpaného vzduchu. Všetko vybavenie potrebné na laboratórne postupy musí byť k dispozícii v rámci vyhradenej laboratórnej miestnosti. | Tabuľka 2 Požiadavky na biologickú bezpečnosť priestorov na pokusy so zvieratami | Požiadavky | Celkové prostredie | Ventilácia regulovaná negatívnym tlakom. Jedna filtrácia HEPA vyčerpaného vzduchu. Zariadenie na úplnú dekontamináciu alebo fumigáciu na konci pokusu. Všetky pevné a tekuté odpadové výtoky sa ošetria s cieľom inaktivácie vírusu ASF (teplom/spopolnením alebo chemicky). | Laboratórne oblečenie | Úplná výmena šatstva pri vstupe. Oblečenie sterilizované pred odstránením z jednotky, alebo umyté pri vysokej teplote v rámci jednotky. | Kontrola personálu | Vstup do jednotky povolený iba konkrétnym, zaškoleným osobám. Pred sprchovaním nechajte šatstvo v miestnosti. Pri vstupe do jednotky je potrebné sa úplne osprchovať. Personál nesmie vstúpiť do priestorov s ošípanými počas 48 hodín po odchode z jednotky. | Vybavenie | Všetko vybavenie potrebné na postupy so zvieratami musí byť k dispozícii v rámci jednotky. Všetok materiál sa pri odstránení z jednotky musí sterilizovať alebo v prípade vzoriek zo zvierat musí byť dvojmo zabalený v nádobe utesnenej proti vytekaniu, ktorej povrch je dezinfikovaný pri preprave do laboratória pre ASF. | Zvieratá | Všetky zvieratá sa pred odchodom z jednotky musia zabiť, postmortálne vyšetrenia sa vykonajú v rámci biologicky bezpečnej plochy a telá zvierat sa pri ukončení vyšetrenia spopolnia. | [1] Referenčné laboratórium spoločenstva má otvorenú licenciu na prijímanie diagnostických vzoriek a izolátov vírusu ASF z ktoréhokoľvek iného členského štátu. Ak vzorka prichádza z krajiny mimo EÚ, môže sa pred prepravou vyžiadať kópia povolenia na dovoz z takéhoto laboratória a v obálke sa pripevní k vonkajšej strane obalu. [2] Ako je definované v clánku 2 písm. r) smernice 2002/60/ES. [3] Ú. v. ES L 340, 31.12.1993, s. 21. [4] Ú. v. ES L 122, 16.5.2003, s. 1. [5] Ak sa však uplatnila výnimka ustanovená v clánku 6 ods. 1 smernice 2002/60/ES, musí sa odber vzoriek týkat podjednotiek polnohospodárskeho podniku, kde ošípané boli usmrtené, a to bez toho, aby boli dotknuté dalšie vyšetrenia a odbery vzoriek, ktoré sa musia vykonat na ostatných ošípaných v polnohospodárskom podniku v súlade s pokynmi príslušného orgánu. [6] Ak však príslušný orgán obmedzil uplatnenie preventívneho usmrcovania iba na tú cast polnohospodárskeho podniku, kde sa drali ošípané podozrivé z toho, e boli infikované alebo kontaminované vírusom ASF, v súlade s clánkom 4 ods. 3 písm. a) smernice 2002/60/ES, musí sa odber vzoriek týkat podjednotiek polnohospodárskeho podniku, kde sa toto opatrenie uplatnilo, a to bez toho, aby boli dotknuté dalšie vyšetrenia a odbery vzoriek, ktoré sa musia vykonat na ostatných ošípaných v polnohospodárskom podniku, a ktoré sa vykonajú v súlade s pokynmi príslušného orgánu. [7] Odporúca sa aj odber vzoriek ilea, pretoe môu byt uitocné na urcenie diagnózy klasického moru ošípaných. [8] Referenčné laboratórium spoločenstva má otvorenú licenciu na prijímanie diagnostických vzoriek a izolátov vírusu ASF z ktoréhokoľvek iného členského štátu. Ak vzorka prichádza z krajiny mimo EÚ, môže sa pred prepravou vyžiadať kópia povolenia na dovoz z takéhoto laboratória a v obálke sa pripevní k vonkajšej strane obalu. [9] Ako je definované v clánku 2 písm. r) smernice 2002/60/ES. --------------------------------------------------