SK Úradný vestník Európskej únie L 220/1

NARIADENIE KOMISIE (ES) č. 761/2009

z 23. júla 2009,

ktorým sa na účely prispôsobenia technickému pokroku mení a dopĺňa nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 440/2008, ktorým sa ustanovujú testovacie metódy podľa nariadenia Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemických látok (REACH)

(Text s významom pre EHP)

KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV,

so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spoločenstva,

so zreteľom na nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 z 18. decembra 2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemických látok (REACH) a o zriadení Európskej chemickej agentúry, o zmene a doplnení smernice 1999/45/ES a o zrušení nariadenia Rady (EHS) č. 793/93 a nariadenia Komisie (ES) č. 1488/94, smernice Rady 76/769/EHS a smerníc Komisie 91/155/EHS, 93/67/EHS, 93/105/ES a 2000/21/ES (1), a najmä na jeho článok 13 ods. 3,

keďže:

(1) Nariadenie Komisie (ES) č. 440/2008 (2) obsahuje testovacie metódy na určovanie fyzikálno-chemických vlastností, toxicity a ekotoxicity látok, ktoré sa majú používať na účely nariadenia (ES) č. 1907/2006.

(2) Je potrebné aktualizovať nariadenie (ES) č. 440/2008 s cieľom zmeniť niektoré testovacie metódy a pridať niekoľko nových testovacích metód, ktoré prijala OECD. Tento návrh bol prekonzultovaný so zainteresovanými stranami. Predmetné zmeny a doplnenia majú za cieľ prispôsobiť metódy vedeckému a technickému pokroku.

(3) Mali by sa zrevidovať ustanovenia týkajúce sa tlaku pár s cieľom pridať novú metódu efúzie.

(4) Je potrebné pridať novú metódu merania dĺžky váženého geometrického stredného priemeru vláken.

(5) Je vhodné aktualizovať nariadenie (ES) č. 440/2008 s cieľom prioritne pridať novú in vitro testovaciu metódu podráždenia kože s cieľom dosiahnuť zníženie počtu zvierat používaných na pokusné účely v súlade so smernicou Rady 86/609/EHS z 24. novembra 1986 o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení členských štátov týkajúcich sa ochrany zvierat používaných na pokusné a iné vedecké účely (3). Hoci o návrhu in vitro testovacej metódy podráždenia kože sa v rámci OECD ešte stále diskutuje, je v tomto výnimočnom prípade vhodné začleniť metódu B 46 do tohto nariadenia. Metóda B 46 by sa mala aktualizovať čo najskôr po dosiahnutí dohody v rámci OECD alebo po sprístupnení informácií odôvodňujúcich takúto revíziu.

(6) Je potrebné zrevidovať ustanovenia týkajúce sa inhibičného testu rias s cieľom pridať ďalšie druhy a splniť požiadavky týkajúce sa hodnotenia nebezpečnosti a klasifikácie chemických látok.

(7) Je potrebné pridať test simulovanej biodegradácie ako novú metódu merania aeróbnej mineralizácie povrchových vôd, ako aj test inhibície rastu ako novú metódu hodnotenia toxicity pre rod Lemna.

(8) Nariadenie (ES) č. 440/2008 by sa preto malo zodpovedajúcim spôsobom zmeniť a doplniť.

(9) Opatrenia stanovené v tomto nariadení sú v súlade so stanoviskom výboru zriadeného podľa článku 133 nariadenia (ES) č. 1907/2006,

PRIJALA TOTO NARIADENIE:

Článok 1

Príloha k nariadeniu (ES) č. 440/2008 sa mení a dopĺňa takto:

1. Časť A sa mení a dopĺňa takto: a) kapitola A.4 sa nahrádza kapitolou A.4 uvedenou v prílohe I k tomuto nariadeniu; b) dopĺňa sa kapitola A.22 uvedená v prílohe II k tomuto nariadeniu.

2. Časť B sa mení a dopĺňa takto: Dopĺňa sa kapitola B.46 uvedená v prílohe III k tomuto nariadeniu.

3. Časť C sa mení a dopĺňa takto: a) kapitola C.3 sa nahrádza kapitolou C.3 uvedenou v prílohe IV k tomuto nariadeniu; b) dopĺňajú sa kapitoly C.25 a C.26 uvedené v prílohách V a VI k tomuto nariadeniu.

Článok 2

Toto nariadenie nadobúda účinnosť tretím dňom po jeho uverejnení v Úradnom vestníku Európskej únie.

Toto nariadenie je záväzné v celom rozsahu a priamo uplatniteľné vo všetkých členských štátoch V Bruseli 23. júla 2009 Za Komisiu Stavros DIMAS člen Komisie

(1) Ú. v. EÚ L 396, 30.12.2006, s. 1.

(2) Ú. v. EÚ L 142, 31.5.2008, s. 1.

(3) Ú. v. ES L 358, 18.12.1986, s. 1.

PRÍLOHA I A.4. Tlak pary 1. METÓDA Táto metóda je rovnocenná s OECD TG 104 (2004). 1.1. ÚVOD Táto revidovaná verzia metódy A.4(1) obsahuje dodatočnú metódu, výtokovú metódu: izotermálnu termogravimetriu určenú pre látky s veľmi nízkym tlakom (až do 10–10 Pa). Vzhľadom na potreby postupov, najmä pokiaľ ide o získanie tlaku pary v prípade látok s nízkym tlakom pary, sa prehodnotili iné postupy tejto metódy pri zohľadnení rozmedzí použiteľnosti. Pri termodynamickej rovnováhe je tlak pary čistej látky výlučne funkciou teploty. Základné princípy sú uvedené v odkazoch (2) (3). Neexistuje jediný postup merania, ktorý by sa dal aplikovať na celé rozmedzie tlakov pary od menej ako 10–10 Pa do 105 Pa. V tejto metóde sa uvádza osem metód na meranie tlaku pary, ktoré sa môžu použiť v rôznych rozmedziach tlakov pary. Porovnávajú sa rôzne metódy, pokiaľ ide o uplatnenie a rozsah merania v tabuľke 1. Metódy sa môžu použiť výlučne na zlúčeniny, ktoré sa v podmienkach testu nerozkladajú. V prípadoch, keď sa z technických dôvodov nemôžu uplatniť experimentálne metódy, možno tiež tlak pary odhadnúť a odporúčaná metóda odhadu je uvedená v dodatku. 1.2. POJMY A JEDNOTKY Tlak pary látky je definovaný ako tlak nasýtenej pary nad tuhou alebo kvapalnou látkou. Pre tlak sa používa jednotka SI pascal (Pa). Ďalej sa uvádzajú iné jednotky, ktoré sa používali v minulosti, spolu s ich prepočítavacími koeficientmi: 1 Torr = 1 mm Hg = 1,333 × 102 Pa 1 atmosféra = 1,013 × 105 Pa 1 bar = 105 Pa Jednotkou teploty v rámci sústavy SI je kelvin (K). Stupne Celzia sa prepočítavajú na kelviny podľa vzorca: T = t + 273,15 kde T je kelvin alebo termodynamická teplota a t je teplota v stupňoch Celzia. Tabuľka 1 Metóda merania Látky Odhadovaná opakovateľnosť Odhadovaná reprodukovateľnosť Odporúčaný rozsah Tuhá Kvapalná Dynamická metóda s nízkou teplotou tavenia áno do 25 % 1 až 5 % do 25 % 1 až 5 % 103 Pa až 2 × 103 Pa 2 × 103 Pa až 105 Pa Statická metóda áno áno 5 až 10 % 5 až 10 % 10 Pa až 105 Pa 10–2 Pa až 105 Pa (1) Metóda s s použitím izoteniskopu áno áno 5 až 10 % 5 až 10 % 102 Pa až 105 Pa Výtoková metóda: váhy na meranie tlaku pary áno áno 5 až 20 % do 50 % 10–3 až 1 Pa Výtoková metóda: Knudsenova komôrka áno áno 10 až 30 % — 10–10 až 1 Pa Výtoková metóda: izotermálna termogravimetria áno áno 5 až 30 % do 50 % 10–10 až 1 Pa Metóda plynovej saturácie áno áno 10 až 30 % do 50 % 10–10 až 103 Pa Metóda rotujúcej guľôčky áno áno 10 až 20 % — 10–4 až 0,5 Pa 1.3. PRINCÍP TESTU Vo všeobecnosti sa tlak pary stanovuje pri rozličných teplotách. V limitovanom teplotnom rozmedzí je logaritmus tlaku pary čistej látky lineárnou funkciou inverzie termodynamickej teploty podľa zjednodušenej Clapeyronovej-Clausiusovej rovnice: kde: p = tlak pary látky vyjadrený v pascaloch ΔHv = teplota vyparovania v J mol–1 R = všeobecná plynová konštanta, 8,314 J mol–1 K–1 T = teplota v K (v kelvinoch). 1.4. REFERENČNÉ LÁTKY Referenčné látky sa nemusia použiť. V prvom rade slúžia na občasnú kontrolu účinnosti metódy a na umožnenie porovnania výsledkov dosiahnutých pri použití rozličných metód. 1.5. OPIS METÓDY 1.5.1. Dynamická metóda (Cottrellova metóda) 1.5.1.1. Princíp Tlak pary sa meria stanovením teploty varu látky pri rôznych špecifikovaných tlakoch v rozmedzí približne 103 a 105 Pa. Táto metóda sa odporúča aj na stanovenie teploty varu. Na tento účel sa dá použiť až do teploty 600 K. Teploty varu kvapalných látok sú približne o 0,1 °C vyššie v hĺbke 3 až 4 cm ako na povrchu kvôli hydrostatickému tlaku stĺpca kvapaliny. V Cottrellovej metóde (4) sa teplomer umiestni do pary nad povrch kvapaliny a vriaca kvapalina sa kontinuálne vyzdvihne nad guľôčku teplomeru. Tenká vrstva kvapaliny, ktorá je v rovnováhe s parou pri atmosférickom tlaku, pokryje guľôčku. Teplomer takto odmeria skutočný bod varu bez chýb kvôli prehriatiu alebo hydrostatickému tlaku. Pumpa, ktorú skonštruoval Cottrell, je znázornená na obrázku 1. Trubica A obsahuje vriacu kvapalinu. Platinový drôt B zatavený do dna umožňuje rovnomerný var. Bočná trubica C vedie k chladiču a plášť D zabraňuje, aby sa studený kondenzát dostal k teplomeru E. Keď kvapalina v A vrie, bubliny a kvapalina zachytená v lieviku sa vlejú cez dve ramená pumpy F nad guľôčku teplomeru. Obrázok 1 Obrázok 2 Cottrellova pumpa (4) A: Termočlánok B: Objem na vyrovnávanie vákua C: Manometer D: Vákuum E: Miesto merania F: Ohrievací článok približne 150 W 1.5.1.2. Prístroje Veľmi presný prístroj využívajúci Cottrellovu metódu je znázornený na obrázku 2. Pozostáva z trubice s varnou časťou v spodnej časti, chladiča v strednej časti a výstupom a prírubou v hornej časti. Cottrellova pumpa je umiestnená vo varnej časti, ktorú zohrieva elektrický patrónový ohrievač. Teplota sa meria pomocou plášťového termočlánku alebo odporového teplomera zasunutím cez prírubu na vrchu. Výstup je pripojený k zariadeniu na reguláciu tlaku. Zariadenie na reguláciu tlaku pozostáva z vákuovej pumpy, objemu na vyrovnávanie, manostatu na dávkovanie dusíka na reguláciu tlaku a manometra. 1.5.1.3. Postup Látka sa umiestni do varnej časti. S problémami sa možno stretnúť v prípade tuhých látok, ktoré nie sú vo forme prášku, ale tieto problémy sa môžu v niektorých prípadoch vyriešiť zahriatím chladiaceho plášťa. Po naplnení nádoby sa prístroj tesne uzavrie v prírube a testovaná látka sa odplyní. Použitie tejto metódy nie je vhodné pre peniace látky. Ďalej sa nastaví najnižší požadovaný tlak a zapne sa ohrievanie. Zároveň sa snímač teploty pripojí na registračný prístroj. Rovnováha sa dosiahne vtedy, keď sa zaregistruje konštantná teplota varu pri konštantnom tlaku. Treba dávať pozor najmä na to, aby sa zabránilo prudkému varu. Okrem toho sa musí v chladiči dosiahnuť úplná kondenzácia. Keď sa stanovuje tlak pary tuhých látok s nízkou teplotou topenia, je potrebné dbať na to, aby sa zabránilo zablokovaniu chladiča. Po zaregistrovaní tohto rovnovážneho bodu sa nastaví vyšší tlak. Postup pokračuje rovnakým spôsobom až po dosiahnutie tlaku 105 Pa (spolu je to približne 5 až 10 meraní). V rámci kontroly sa musia rovnovážne body opakovať a merať pri klesajúcich tlakoch. 1.5.2. Statická metóda 1.5.2.1. Princíp V statickej metóde (5) sa pri termodynamickej rovnováhe stanovuje tlak pary pri špecifikovanej teplote. Táto metóda je vhodná pre látky a viaczložkové kvapaliny a tuhé látky v rozmedzí od 10–1 do 105 Pa a za predpokladu, že sa bude postupovať opatrne, aj v rozmedzí 1 až 10 Pa. 1.5.2.2. Prístroje Prístroj pozostáva z kúpeľa s konštantnou teplotou (presnosť ±0,2 K), nádoby na testovanú vzorku pripojenej k podtlakovej rúrke, manometra a systému na reguláciu tlaku. Komora na vzorky (obrázok 3a) je pripojená k podtlakovej rúrke cez ventil a diferenciálny manometer (trubica v tvare U obsahuje vhodnú manometrovú kvapalinu), ktorá slúži ako nulový indikátor. Pre diferenčný manometer možno použiť ortuť, silikóny a ftaláty v závislosti od tlakového rozmedzia a chemických vlastností testovanej látky. Pokiaľ možno, malo by sa z ekologických dôvodov vyhnúť používaniu ortuti. Testovaná látka sa nesmie vo výraznejšej miere rozpúšťať v kvapaline nachádzajúcej sa v trubici v tvare U alebo s ňou reagovať. Namiesto trubice v tvare U možno použiť manometer (obrázok 3b). Pre manometer možno v rozsahu normálneho atmosférického tlaku do 102 Pa použiť ortuť, zatiaľ čo silikóny a ftaláty sú vhodné na použitie pri tlakoch nižších ako 102 Pa až po 10 Pa. Existujú aj iné manometre, ktoré možno použiť pri tlakoch nižších ako 102 Pa a pri tlakoch nižších ako 10–1 Pa sa môžu dokonca použiť kapacitné manometre so zahrievateľnou membránou. Teplota sa meria na vonkajšej stene nádoby obsahujúcej vzorku alebo v samotnej nádobe. 1.5.2.3. Postup Ak sa použije prístroj opísaný na obrázku 3a, naplňte trubicu v tvare U zvolenou kvapalinou, ktorá musí byť pred odčítaním nameraných hodnôt odplynená pri zvýšenej teplote. Testovaná látka sa umiestni do prístroja a odplyní pri zníženej teplote. V prípade viaczložkovej vzorky by mala byť teplota dostatočne nízka, aby sa zabezpečilo, že sa nezmení zloženie materiálu. Rovnováhu možno rýchlejšie dosiahnuť miešaním. Vzorka sa môže chladiť kvapalným dusíkom alebo suchým ľadom, pričom treba dbať na to, aby sa zabránilo kondenzácii vzduchu alebo nasatiu kvapaliny. Pri otvorenej polohe ventilu nad nádobou sa po niekoľkých minútach odsávaním odstráni vzduch. Ak je to potrebné, musí sa postup odplynenia opakovať niekoľkokrát. Obrázok 3a Obrázok 3b Keď sa vzorka pri uzatvorenom ventile zahreje, tlak pary narastá. Toto zmení rovnováhu kvapaliny v trubici v tvare U. Na kompenzovanie tohto javu sa do prístroja cez ventil vpúšťa dusík alebo vzduch dovtedy, kým sa diferenciálny indikátor tlaku opäť neustáli na nulovej hodnote. Tlak, ktorý je na to potrebný, sa môže odčítať z manometra alebo z presného prístroja. Tento tlak zodpovedá tlaku pary testovanej látky pri teplote merania. Ak sa použije prístroj opísaný na obrázku 3b, tlak pary sa odčítava priamo. Teplotná závislosť tlaku pary sa stanovuje v primerane krátkych intervaloch (spolu približne 5 až 10 meracích bodov) až po požadované maximum teploty. Odčítania nízkych teplôt sa musia opakovať ako kontrola. Ak sa hodnoty získané z opakovaných odčítaní nezhodujú s krivkou získanou pre stúpajúcu teplotu, môže to byť následkom jednej z uvedených skutočností: i) testovaná vzorka ešte obsahuje vzduch (napríklad materiály s vysokou viskozitou) alebo nízkovriace látky, ktorý sa uvoľňuje alebo ktoré sa uvoľňujú počas zahrievania; ii) testovaná látka podlieha chemickej reakcii v skúmanom teplotnom rozmedzí (napr. rozklad alebo polymerizácia). 1.5.3. Metóda s s použitím izoteniskopu 1.5.3.1. Princíp Izoteniskop (6) je založený na princípe statickej metódy. Pri tejto metóde sa vzorka umiestni do banky, ktorá sa udržiava pri konštantnom tlaku a je pripojená k manometru a vákuovej pumpe. Nečistoty prchavejšie ako testovaná látka sa odstránia odplynením pri zníženom tlaku. Tlak pary vzorky pri zvolených teplotách sa vyrovnáva známym tlakom inertného plynu. Izoteniskop bol vyvinutý na meranie tlaku pary určitých kvapalných uhľovodíkov, ale je vhodný aj na skúmanie tuhých látok. Metóda obvykle nie je vhodná pre viaczložkové systémy. Výsledky sú ovplyvnené len malými chybami v prípade vzoriek, ktoré obsahujú neprchavé nečistoty. Odporúčané rozmedzie je 102 až 105 Pa. 1.5.3.2. Prístroje Príklad meracieho prístroja je znázornený na obrázku 4. Úplný opis možno nájsť v ASTM D 2879 – 86 (6). 1.5.3.3. Postup V prípade kvapalín samotná testovaná látka slúži ako kvapalina v diferenciálnom manometri. Množstvo kvapaliny, ktoré je dostatočné na zaplnenie banky a krátkeho ramena manometra, sa umiestni do izoteniskopu. Izoteniskop sa napojí na vákuový systém a vákuuje, potom sa naplní dusíkom. Vákuovanie a prečistenie systému sa opakuje dvakrát, aby sa odstránil reziduálny kyslík. Naplnený izoteniskop sa umiestni v horizontálnej polohe tak, aby sa testovaná vzorka rozšírila v tenkej vrstve vo vzorkovej banke a manometri. Tlak systému sa redukuje na 133 Pa a vzorka sa mierne zahrieva, až kým nezačne vrieť (odstránenie rozpustených plynov). Izoteniskop sa potom umiestni tak, aby sa vzorka opäť vrátila do banky a naplnila krátke rameno manometra. Tlak sa udržiava na 133 Pa. Vytiahnutý hrot banky so vzorkou sa zohrieva malým plameňom dovtedy, kým sa uvoľnená para zo vzorky nerozšíri v dostatočnej miere na to, aby vytlačila časť vzorky z hornej časti banky a ramena manometra do manometra, vytvoriac tak plynom naplnený priestor bez prítomnosti dusíka. Izoteniskop sa potom umiestni do kúpeľa s konštantnou teplotou a tlak dusíka sa nastaví tak, aby sa rovnal tlaku vzorky. V rovnovážnom stave sa tlak dusíka rovná tlaku pary testovanej látky. Obrázok 4 V prípade tuhých látok a v závislosti od tlakového a teplotného rozmedzia sa použijú manometrové kvapaliny, napr. silikónové kvapaliny alebo ftaláty. Odplynená manometrová kvapalina sa naleje do vydutiny na dlhom ramene izoteniskopu. Potom sa tuhá látka určená na skúmanie umiestni do banky a odplyní sa pri zvýšenej teplote. Po tomto úkone sa izoteniskop nakloní tak, aby tlakomerová kvapalina mohla natiecť do trubice v tvare U. 1.5.4. Výtoková metóda: váhy na meranie tlaku pary (7) 1.5.4.1. Princíp Vzorka testovanej látky sa zahrieva v malej piecke a umiestni do vákuového zvonu. Piecka je prikrytá vekom s malými otvormi známych priemerov. Para testovanej látky, ktorá uniká z jedného z otvorov, sa nasmeruje na misku citlivých váh, ktoré sa tiež nachádzajú vo vákuovom zvone. V niektorých modeloch môže byť miska váh obklopená chladiacou nádobou zabezpečujúcou odvádzanie tepla smerom von prenosom tepla a chladená sálaním tak, aby sa unikajúca para na nej kondenzovala. Impulz prúdu pary pôsobí na váhy ako sila. Tlak pary možno odvodiť dvomi spôsobmi: priamo zo sily pôsobiacej na misku váh a tiež z rýchlosti odparovania s použitím Hertzovej-Knudsenovej rovnice (2): kde: G = rýchlosť odparovania (kg s–1 m–2) M = mólová hmotnosť (g mol–1) T = teplota (K) R = všeobecná plynová konštanta (J mol–1 K–1) P = tlak pary (Pa) Odporúčané rozmedzie je 10–3 až 1 Pa. 1.5.4.2. Prístroje Všeobecný princíp prístroja je znázornený na obrázku 5. Obrázok 5 A: Podložka F: Chladiaci box a chladiaca tyč B: Pohyblivá cievka G: Odparovacia piecka C: Vákuový zvon H: Dewarova nádoba s tekutým dusíkom D: Váhy s miskou I: Meranie teploty vzorky E: Vákuový merací prístroj J: Testovaná látka 1.5.5. Výtoková metóda: Knudsenova komôrka 1.5.5.1. Princíp Táto metóda je založená na odhade hmotnosti testovanej látky, ktorá za jednotku času unikla z Knudsenovej komôrky (8) vo forme pary cez mikrootvor v ultravákuových podmienkach. Hmotnosť výtokovej uniknutej pary sa dá zistiť buď stanovením úbytku hmotnosti komôrky, alebo kondenzáciou pary pri nízkej teplote a stanovením množstva vyprchanej látky využitím chromatografie. Tlak pary sa vypočíta s použitím Hertzovej-Knudsenovej rovnice (pozri oddiel 1.5.4.1) s korekčnými koeficientmi, ktoré závisia od parametrov prístroja (9). Odporúčané rozmedzie je 10–10 až 1 Pa (10) (11) (12) (13) (14). 1.5.5.2. Prístroje Všeobecný princíp prístroja je znázornený na obrázku 6. Obrázok 6 1: Pripojenie na vákuum 7: Veko so závitom 2: Dutina na zasunutie platinového odporového teplomera alebo na meranie a reguláciu teploty 8: Krídlové matice 3: Veko vákuovej nádoby 9: Svorníky 4: Tesniaci O-krúžok 10: Efúzne komôrky z nehrdzavejúcej ocele 5: Hliníková vákuová nádoba 11: Ohrievacie teleso 6: Zariadenie na inštalovanie a vyberanie efúznych komôr 1.5.6. Výtoková metóda: izotermálna termogravimetria 1.5.6.1. Princíp Metóda je založená na stanovení zvýšených rýchlostí odparovania v prípade testovanej látky pri zvýšených teplotách a tlaku okolitého prostredia s použitím termogravimetrie (10) (15) (16) (17) (18) (19) (20). Rýchlosti odparovania vT vznikajú na základe vystavenia zvolenej zlúčeniny pomalému prúdu inertného plynu a sledovania úbytku hmotnosti pri určených izotermických teplotách T v kelvinoch počas príslušných časových období. Tlaky pary pT sa vypočítajú z hodnôt vT s použitím lineárneho vzťahu medzi logaritmom tlaku pary a logaritmom rýchlosti odparovania. V prípade potreby sa môže urobiť extrapolácia na teploty 20 °C a 25 °C regresnou analýzou log pT proti 1/T. Táto metóda je vhodná pre látky, ktoré majú tlak pár rovnako nízky ako 10–10 Pa (10–12 mbar) a stupeň čistoty čo možno najbližšie k 100 %, aby sa zabránilo chybnej interpretácii nameraných úbytkov hmotnosti. 1.5.6.2. Prístroje Všeobecný princíp experimentálnej zostavy je znázornený na obrázku 7. Obrázok 7 Nosná doštička so vzorkou, ktorá visí na mikrováhach v komore s regulovanou teplotou, sa umiestni do prúdu suchého dusíka, ktorý unáša odparené molekuly testovanej látky. Po opustení komory sa prúd plynu prečistí na sorpčnej jednotke. 1.5.6.3. Postup Testovaná látka sa aplikuje na povrch zdrsnenej sklenej doštičky v homogénnej vrstve. V prípade tuhých látok sa doštička rovnomerne navlhčí roztokom testovanej látky vo vhodnom rozpúšťadle a vysuší v inertnej atmosfére. Na meranie sa pokrytá doštička umiestni do termogravimetrického analyzátora a následne sa kontinuálne meria úbytok hmotnosti ako funkcia času. Rýchlosť odparovania vT sa pri stanovenej teplote vypočíta z úbytku hmotnosti Δm doštičky so vzorkou na základe kde F je povrchová plocha nanesených testovaných látok, obvykle povrchová plocha doštičky so vzorkou, a t je čas úbytku hmotnosti Δm. Tlak pary pT sa vypočíta na základe toho, že je funkciou rýchlosti odparovania vT: Log pT = C + D log vT kde C a D sú konštanty špecifické pre používané experimentálne usporiadanie závislé od priemeru komory, kde sa uskutočňuje meranie, a od prietokovej rýchlosti plynu. Tieto konštanty sa musia stanoviť vopred tak, že sa odmeria súbor zlúčenín so známym tlakom pary a regresiou log pT proti log vT (11) (21) (22). Vzťah medzi tlakom pary pT a teplotou T v kelvinoch je daný vzorcom Log pT = A + B 1/T kde A a B sú konštanty získané regresiou log pT proti 1/T. Na základe tejto rovnice sa extrapoláciou môže tlak pary vypočítať pre akúkoľvek inú teplotu. 1.5.7. Metóda plynovej saturácie (23) 1.5.7.1. Princíp Prúd inertného nosného plynu sa prepúšťa cez vzorku testovanej látky alebo nad ňou dostatočne pomaly, aby sa plyn nasýtil parou testovanej látky. Dosiahnutie nasýtenia v plynnej fáze je mimoriadne dôležité. Transportovaná látka sa zachytí obvykle s použitím sorbentu a zmeria sa jej množstvo. Ako alternatíva k zachyteniu pary a následnej analýze sa môžu použiť analytické techniky typu „in-train“ ako plynová chromatografia na stanovenie množstva transportovanej látky. Tlak pary sa vypočíta na základe predpokladu, že je dodržaný zákon ideálneho plynu a že celkový tlak zmesi plynov sa rovná sume tlakov plynov tvoriacich zmes. Parciálny tlak testovanej látky, t. j. tlak pary, sa vypočíta na základe známeho objemu celkového plynu a hmotnosti transportovaného materiálu. Postup plynovej saturácie možno použiť na tuhé alebo kvapalné látky. Môže sa použiť pre tlaky pár až do 10–10 Pa (10) (11) (12) (13) (14). Metóda je najspoľahlivejšia pre tlaky pár nižšie ako 103 Pa. Pre vyššie tlaky pár ako 103 Pa sú obvykle nadhodnotené pravdepodobne kvôli vytváraniu aerosólu. Keďže merania tlaku pary sa uskutočňujú pri teplote miestnosti, nie je potrebná extrapolácia údajov z vysokých teplôt a vyhne sa tak extrapolácii vysokej teploty, ktorá môže často spôsobovať vážne chyby. 1.5.7.2. Prístroje Postup vyžaduje, aby sa použila nádoba s konštantnou teplotou. Na obrázku 8 je znázornená nádoba, v ktorej sa nachádzajú držiaky na tri tuhé a tri kvapalné vzorky, ktoré umožňujú trojnásobnú analýzu buď tuhej, alebo kvapalnej vzorky. Teplota je regulovaná v rozmedzí ±0,5 °C alebo viac. Obrázok 8 Vo všeobecnosti sa ako inertný nosný plyn používa dusík, ale príležitostne sa môže vyžadovať aj použitie iného plynu (24). Nosný plyn musí byť suchý. Prúd plynu sa rozdelí do 6 prúdov regulovaných ihlovými ventilmi (otvor približne 0,79 mm) a prúdi do nádoby cez medenú trubicu s vnútorným priemerom 3,8 mm. Po vyrovnaní teploty plyn prúdi cez vzorku a zachytávač so sorbentom a opúšťa nádobu. Tuhé vzorky sa vložia do sklenej rúrky s vnútorným priemerom 5 mm medzi zátky zo sklenej vaty (pozri obrázok 9). Na obrázku 10 je znázornený držiak kvapalnej vzorky a sorpčný systém. Najlepšie reprodukovateľnou metódou na meranie tlaku pary kvapalín je naniesť kvapalinu na sklené guľôčky alebo na inertný sorbent, ako napr. kremeň, a naplniť držiak týmito guľôčkami. Alternatívne sa môže prúdenie nosného plynu nastaviť tak, aby prechádzal cez hrubú fritu a prebublal cez kolónu testovanej kvapalnej látky. Obrázok 9 Obrázok 10 Sorpčný systém sa skladá z vrchnej a spodnej sorpčnej časti. Pri veľmi nízkych tlakoch pary sa na sorbente zachytia len veľmi malé množstvá a adsorpcia na sklenej vate a sklenej trubici medzi vzorkou a sorbentom môže spôsobiť vážny problém. Ďalším účinným spôsobom na získanie odpareného materiálu sú zachytávače chladené tuhým CO2. Nespôsobujú žiadny protitlak na saturátorovú kolónu a zachytený materiál sa tiež veľmi jednoducho kvantitatívne uvoľňuje. 1.5.7.3. Postup Prietoková rýchlosť unikajúceho nosného plynu sa meria pri izbovej teplote. Prietoková rýchlosť sa počas experimentu často kontroluje, aby sa zabezpečila správna hodnota pre celkový objem nosného plynu. Uprednostňuje sa priebežné sledovanie hmotnostným prietokomerom. Nasýtenie plynnej fázy môže vyžadovať značný čas kontaktu, a preto aj pomerne nízke prietokové rýchlosti plynu (25). Na konci experimentu sa obidve časti sorbentu, vrchná a spodná, analyzujú samostatne. Zlúčenina v každej časti sa pridaním rozpúšťadla desorbuje. Výsledné roztoky sa kvantitatívne analyzujú na stanovenie hmotnosti desorbovanej z každej časti. Výber analytickej metódy (aj výber sorbentu a rozpúšťadla na desorpciu) je určený vlastnosťami testovaného materiálu. Účinnosť desorpcie sa stanoví vstreknutím známeho množstva vzorky na sorbent, jej desorpciou a analýzou získaného množstva. Je dôležité skontrolovať účinnosť desorpcie a koncentráciu, ktorá je rovnaká alebo približná ako koncentrácia vzorky, pri podmienkach testu. Na zabezpečenie toho, aby sa nosný plyn nasýtil testovanou látkou, sa používajú tri rozdielne prietokové rýchlosti. Ak vypočítaný tlak pary nevykazuje žiadnu závislosť od prietokovej rýchlosti, predpokladá sa, že plyn je nasýtený. Tlak pary sa vypočíta na základe rovnice: kde: p = tlak pary (Pa) W = hmotnosť odparenej testovanej látky (g) V = objem nasýteného plynu (m3) R = všeobecná plynová konštanta 8,314 (J mol–1 K–1) T = teplota (K) M = mólová hmotnosť testovanej látky (g mol–1). Namerané objemy musia byť opravené z hľadiska tlakových a teplotných rozdielov medzi prietokomerom a saturátorom. 1.5.8. Rotujúca guľôčka 1.5.8.1. Princíp Táto metóda využíva meradlo viskozity rotujúceho rotora, v ktorom je meracím prvkom malá oceľová guľôčka, ktorá je zavesená do magnetického poľa, v ktorom rotuje (26) (27) (28). Snímacie cievky umožňujú meranie jej rýchlosti otáčania. Ak guľôčka dosiahla danú rotačnú rýchlosť, približne 400 otáčok za sekundu, ďalšie budenie sa zastaví a následkom trenia plynu dochádza k spomaľovaniu. Pokles rýchlosti otáčania sa meria ako funkcia času. Tlak pary sa odvodí zo spomalenia oceľovej guľôčky, ktoré je závislé od tlaku. Odporúčané rozmedzie je 10–4 až 0,5 Pa. 1.5.8.2. Prístroje Schematický nákres pokusného systému je zobrazený na obrázku 11. Meracia hlava je umiestnená v termostaticky upravovanom uzavretom priestore s presnosťou regulácie na 0,1 °C. Nádoba so vzorkou je umiestnená v termostaticky upravovanom uzavretom priestore tiež s presnosťou regulácie na 0,1 °C. Všetky ostatné časti zostavy sa udržiavajú pri vyššej teplote, aby sa zabránilo kondenzácii. Celý prístroj je napojený na vysokovákuový systém. Obrázok 11 2. Údaje a správy 2.1. ÚDAJE Tlak pary zo všetkých predchádzajúcich metód sa musí stanoviť aspoň pre dve teploty. V rozmedzí od 0 °C do 50 °C sa odporúčajú tri alebo viacej teplôt, aby sa dala skontrolovať lineárnosť krivky tlaku plynu. V prípade výtokovej metódy (Knudsenova komôrka a izotermická termogravimetria) a metód plynovej saturácie sa pre stanovenie teplotného rozmedzia odporúča 120 °C až 150 °C namiesto 0 °C až 50 °C. 2.2. SPRÁVA O TESTE Správa o teste musí obsahovať tieto informácie: — použitú metódu, — presnú špecifikáciu látky (identitu a prímesi) a opatrenia v rámci predbežnej purifikácie testovanej látky, ak sa uskutočnili, — minimálne dve tlakové a teplotné hodnoty a prednostne tri alebo viac sa vyžadujú v rozmedzí od 0 °C do 50 °C (alebo 120 °C až 150 °C), — aspoň jedna teplota musí byť pod 25 °C, ak je to technicky možné na základe zvolenej metódy, — všetky pôvodné údaje, — log p verzus 1/T krivka, — odhad tlaku pary pri 20 °C alebo 25 °C. Ak sa pozoruje premena (zmena skupenstva, rozklad), treba uviesť nasledujúce informácie: — charakter zmeny, — teplotu, pri ktorej sa zmena prejavuje pri atmosférickom tlaku, — tlak pary pri 10 °C a 20 °C pod teplotou premeny a 10 °C a 20 °C nad touto teplotou (s výnimkou premeny z tuhej látky na plyn). V správe z testu musia byť uvedené všetky informácie a poznámky, ktoré sú dôležité pre interpretáciu výsledkov testu, najmä týkajúce sa nečistôt a fyzikálneho stavu (skupenstva) testovanej látky. 3. POUŽITÁ LITERATÚRA 1. Úradný vestník Európskych spoločenstiev L 383A, s. 26 – 47 (1992). 2. Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, Le Neindre, B., and Vodar, B., Eds., Butterworths, London. 3. Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. Chapter IX, Interscience Publ., New York. 4. Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., Van Nostrand Company, New York. 5. NF T 20 – 048 AFNOR (September 1985). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within a range from 10–1 to 105 Pa – Static method. 6. ASTM D 2879 – 86, Standard test method for vapour pressure – temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. 7. NF T 20 – 047 AFNOR (September 1985). Chemical products for industrial use –Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–3 to 1 Pa – Vapour pressure balance method. 8. Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 593. 9. Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. Thermodynamics 7, 1173. 10. Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest Management Science 56, 521 – 532. 11. Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition (2000). 12. Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determination of small vapour pressures determination of the vapour pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 22 – 28. 13. Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 269 – 278. 14. Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p-dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), 117 – 122. 15. Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science 4 (1973), 137 – 147. 16. Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide Science 5 (1974), 393 – 400. 17. Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relationship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesticide Science 13 (1982), 161 – 168. 18. Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 45 (1995), 27 – 31. 19. Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermogravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction (SPME); Pesticide Science, 53 (1998), 300 – 310. 20. Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low-Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87(12) (1998), 1512 – 20. 21. Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range –25 °C to 150 °C. 22. Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 (2002). 23. 40 CFR, 796 (1993), pp 148 – 153, Office of the Federal Register, Washington DC. 24. Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435. 25. Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375. 26. Messer G., Röhl, P., Grosse G., and Jitschin W. (1987). J. Vac. Sci. Technol. (A), 5(4), 2440. 27. Comsa G., Fremerey J.K., and Lindenau, B. (1980). J. Vac. Sci. Technol. 17(2), 642. 28. Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715. (1) Pri použití kapacitného manometra. Dodatok Metóda odhadu ÚVOD Predbežne vypočítané hodnoty tlaku pary sa môžu použiť na: — rozhodnutie, ktorá z existujúcich pokusných metód je najvhodnejšia, — poskytnutie odhadu alebo medznej hodnoty v prípadoch, keď sa pokusná metóda z technických príčin nemôže uplatniť. METÓDA ODHADU Tlak pary kvapalín a tuhých látok sa môže odhadnúť s s použitím modifikovanej Watsonovej korelácie (a). Jediným potrebným pokusným údajom je normálna teplota varu. Táto metóda sa dá použiť v celom rozmedzí tlaku od 105 Pa do 10–5 Pa. Podrobné informácie o tejto metóde sú uvedené v príručke Handbook of Chemical Property Estimation Methods (Príručka metód na odhadovanie vlastností) (b). Pozri aj OECD Environmental Monograph (Monografia OECD o životnom prostredí), č. 67 písm. c). POSTUP VÝPOČTU Tlak pary sa vypočíta takto: kde: T = daná teplota Tb = normálny bod varu PVP = tlak pary pri teplote T ΔHVb = výparné teplo ΔZb = koeficient stlačiteľnosti (odhadovaný pri 0,97) m = empirický koeficient závislý od fyzikálneho skupenstva pri danej teplote T. Ďalej kde KF je empirický koeficient zohľadňujúci polaritu testovanej látky. Pre viaceré typy zlúčenín sú koeficienty KF uvedené v odkazoch pod písmenom b). Často sú k dispozícii údaje, ktoré uvádzajú teplotu varu pri zníženom tlaku. V takom prípade sa tlak pary vypočíta takto: kde T1 je bod varu pri zníženom tlaku P1. SPRÁVA Ak sa použije metóda odhadu, správa o teste musí obsahovať úplnú dokumentáciu výpočtov. POUŽITÁ LITERATÚRA (a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398. (b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill. (c) OECD Environmental Monograph No.67. Application of Structure-Activity Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Assessment (1993).

PRÍLOHA II A.22. DĹŽKOVÁ HODNOTA GEOMETRICKÉHO VYJADRENIA PRIEMERU VLÁKEN 1. METÓDA 1.1. ÚVOD Táto metóda opisuje postup merania dĺžkovej hodnoty geometrického vyjadrenia priemeru (Length Weighted Geometric Mean Diameter – LWGMD) objemu umelých minerálnych vláken (Man Made Mineral Fibres – MMMF). Keďže hodnota LWGMD štatistického súboru sa bude s 95 % pravdepodobnosťou nachádzať medzi 95 % hladinami spoľahlivosti vzorky (t. j. LWGMD ±2 štandardné chyby), vykazovaná hodnota (testovacia hodnota) bude na nižšej úrovni 95 % hladiny spoľahlivosti (napríklad LWGMD – dve štandardné chyby). Metóda je založená na aktualizácii (jún 1994) návrhu postupu HSE (Health and Safty Executive – Výkonný výbor pre zdravie a bezpečnosť), ktorý bol prijatý 26. septembra 1993 na stretnutí medzi ECFIA (European Ceramic Fibres Industry Association – Európska asociácia odvetví priemyselných vláken) a HSE v Chesteri a bol vyvinutý pri druhej medzilaboratórnej skúške (1,2). Táto metóda merania sa môže používať na určenie priemeru vlákna látok výrobkov obsahujúcich MMMF vrátane ohňovzdorných keramických vláken (RCF), umelých sklovitých vláken (MMVF), kryštalických a polykryštalických vláken. Dĺžková hmotnosť vyjadruje nahradenie vplyvu rozloženia na priemer v dôsledku porušenia dlhých vláken počas odoberania, prípadne narábania s materiálom. Geometrická štatistika (geometrická hodnota) sa používa na meranie miery rozloženia MMMF priemerov, pretože tieto priemery mávajú zvyčajne veľkosť rozloženia, ktorá sa približuje k normálnej polohe. Meranie dĺžky, ako aj priemeru je zdĺhavé a zároveň časovo náročné, ale ak sa merajú len tie vlákna, ktoré sa plynulo dotýkajú tenkou čiarou poľa SEM pohľadu, potom je pravdepodobnosť výberu daného vlákna pomerná k jeho dĺžke. Takto sa určí dĺžka pri výpočtoch dĺžkových hodnôt, pričom jedinou požadovanou hodnotou je veľkosť priemeru, a LWGMD-2SE sa môže vypočítať, ako bolo uvedené. 1.2. POJMY Zrno: predmet s pomerom dĺžky k šírke menej ako 3:1. Vlákno: Predmet s pomerom dĺžky k šírke (pomer strán) menej ako 3:1. 1.3. ROZSAH A OBMEDZENIA Metóda sa zameriava na zobrazenie rozloženia priemeru, ktorý má strednú hodnotu od 0,5 μm do 6 μm. Väčšie priemery sa môžu zmerať s použitím menšieho zvýšenia SEM, ale táto metóda bude značne obmedzená pri jemnejšom rozložení vlákna a meranie pomocou TEM (mikroskop prenosu elektrónov) sa odporúča v prípade, ak je stredná hodnota priemeru nižšia ako 0,5 μm. 1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY Určité množstvo reprezentatívnej vzorky sa odoberie z vlákninovej zóny alebo voľne uloženého vlákna. Voľné vlákna sa skrátia s použitím postupu drvenia a reprezentatívna časť vzorky sa rozptýli vo vode. Hmota sa potom oddelí a prefiltruje polykarbonátovým filtrom cez sito s okami veľkosti 0,2 μm a pripraví na skúšku s použitím techniky skenovacieho elektrónového mikroskopu (SEM). Priemer vláken sa odmeria na 10 000-násobne zväčšenej obrazovke, prípadne väčšom zväčšení (1) s použitím metódy priesečníka, ktorá poskytne nestranný odhad strednej hodnoty priemeru. Vypočíta sa spodná hodnota 95 % intervalu spoľahlivosti (na základe jednostranného testu) a stanoví sa odhad najnižšej hodnoty geometrického vyjadrenia priemeru vláken materiálu. 1.5. OPIS TESTOVACEJ METÓDY 1.5.1. Bezpečnostné opatrenia Priamy kontakt s jemnými vláknami sa musí obmedziť na minimum a pri narábaní so suchými vláknami je nutné používať digestor alebo odkladaciu skrinku. Pravidelné monitorovanie kontaktu s látkami sa vykonáva na účel stanovenia efektívnosti kontrolných metód. Pri narábaní s MMMF je nevyhnutné používať rukavice na jednorazové použitie, aby sa predišlo podráždeniu pokožky a zabránilo krížovej kontaminácii (nakazeniu). 1.5.2. Prístroje/zariadenia — lis a farbivo (schopný vyprodukovať tlak 10 Mpa), — polykarbonátové kapilárne pórovité filtre s veľkosťou pórov 0,2 μm (priemer 25 mm), — membránový celulózový filter s veľkosťou pórov 5 μm, určený ako pomocný filter, — sklený filtračný prístroj (alebo jednorazové filtračné systémy) umožňujúce požitie filtrov s priemerom 25 mm (napríklad milipórová sklená mikroanalýzová sada, typ č. XX10 025 00), — čistá destilovaná voda získaná prefiltrovaním cez filter s veľkosťou pórov 0,2 μm na účely odstránenia mikroorganizmov, — katódový rozprašovač s anódou zo zlata, prípadne zo zlata či paládia, — skenovací (rastrovací) elektrónový mikroskop s rozlišovacou schopnosťou do 10 nm a pracujúci s 10 000-násobným zväčšením, — rôzne: stierky, skalpel s čepeľou typu 24, klieštičky, SEM tubusy, karbónové lepidlo alebo karbónová lepiaca páska, strieborný skalpel, — ultrazvuková sonda alebo ultrazvuková vanička na doske laboratórneho stola, — odoberač vzorky sedimentov alebo korkovrt na odoberanie vzoriek z pokrývky MMMF. 1.5.3. Postup pri teste 1.5.3.1. Odber vzoriek Pri vrchných vrstvách sa na odoberanie vzoriek profilu použije 25 mm odoberač vzorky sedimentov alebo korkovrt. Mali by byť rovnomerne rozmiestnené po šírke z kratšej strany vrstvy alebo v prípade, že sú k dispozícii dlhé dĺžky vrstiev, sa odoberú z náhodných častí. Rovnaké zariadenie možno použiť na náhodné odoberanie vzoriek z uvoľnených vláken. Malo by sa odobrať šesť vzoriek, aby sa zohľadnili priestorové odchýlky objemu materiálu. Šesť vzoriek jadra sa pod tlakom 10 Mpa rozdrví v lisovadle s priemerom 50 mm. Materiál sa rozmieša pomocou stierky a znovu sa lisuje pod tlakom 10 Mpa. Potom sa materiál odoberie z lisovadla a uskladní v hermeticky uzatvorenej sklenej fľaši. 1.5.3.2. Príprava vzorky V nutnom prípade sa organický tmel odstráni umiestnením vlákna dovnútra pece pri teplote 450 °C počas približne jednej hodiny. Vytvarujte vzorku do kužeľa a rozštvrťte ju (vykonáva sa vnútri prachovej skrinky). S použitím stierky pridajte malé množstvo (< 0,5 g) vzorky do 100 ml čerstvo destilovanej vody, ktorá bola prefiltrovaná pomocou membránového filtra veľkosti 0,2 µm (ak sa použitie ukáže opodstatnené, možno použiť náhradný zdroj ultračistej vody). Dôkladne rozmiešajte s použitím ultrazvukovej sondy poháňanej 100 W zdrojom a nastavenej tak, aby sa vytvorila kavitácia. (V prípade, že sonda nie je k dispozícii, použite nasledujúcu metódu: 30 sekúnd ju treba opakovane triasť a obracať; nechať 5 minút pôsobiť pod ultrazvukom umiestnením v stolnej ultrazvukovej vaničke; potom opakovane triasť a obracať počas ďalších 30 sekúnd.) Okamžite po rozptýlení vlákna je potrebné odobrať niekoľko častíc (napríklad tri pomerné časti 3,6 a 10 ml) pomocou širokootvorovej pipety (s objemom 2 – 5 ml). Prefiltrujte každú časť cez polykarbonátový filter veľkosti otvorov 0,2 μm s pomocou MEC filtru veľkosti pórov 5 µm s použitím 25 ml skleného filtrovacieho lievika s valcovitým zásobníkom. Približne 5 ml prefiltrovanej destilovanej vody by sa malo umiestniť do lievika a častica sa pomaly prekvapkáva do vody, držiac konček pipety pod ohybom. Pipeta a zásobník sa po prekvapkávaní musia riadne prepláchnuť z toho dôvodu, že vlákna sa zvyčajne nachádzajú viac na povrchu. Opatrne odoberte filter a pred umiestnením do sušiacej nádoby ho oddeľte od podporného filtra. Kmitavým pohybom narežte štvrtinu alebo polovicu z prefiltrovanej hmoty s použitím skalpovacej čepele typu 24. Opatrne pripevnite oddelenú časť k bloku SEM s s použitím lepiaceho uhlíkového štítka alebo uhlíkového lepidla. Použite strieborný skalpel najmenej v troch polohách tak, aby sa zlepšil elektrický kontakt okrajov filtra a ústrižku. Keď lepidlo/strieborný skalpel oschne, obaľte katódu vrstvou 50 nm zlata, prípadne zmesou zlata/paládia na povrchu usadeniny. 1.5.3.3. SEM kalibrácia a postup 1.5.3.3.1. Kalibrácia SEM kalibráciu je potrebné skontrolovať najmenej raz do týždňa (najlepšie každodenne) s použitím certifikovanej kalibračnej mriežky. Kalibráciu je nutné porovnať s certifikovanou normou a v prípade, ak meraná hodnota (SEM) nie je v rozpätí ±2 % certifikovanej hodnoty, musí sa kalibrácia SEM upraviť a znovu skontrolovať. SEM by malo byť schopné rozpustiť prinajmenšom viditeľný priemer 0,2 µm s použitím absolútnej vzorkovej matrice pri 2 000-násobnom zväčšení. 1.5.3.3.2. Pracovný postup Proces SEM sa vykonáva pri 10 000-násobnom zväčšení (2) za podmienok, ktoré umožňujú dobrú rozlíšiteľnosť prostredníctvom obrazu pri nízkych hodnotách skenovania, napríklad 5 sekúnd na snímku. Napriek tomu, že pracovné podmienky pri rôznych SEM sa môžu odlišovať, všeobecne platí, že na získanie najlepšej viditeľnosti a rozlíšenia je pri použití relatívne malého objemu hmoty atómov potrebné použiť zvyšujúce sa napätie od 5 – 10 keV pomocou malého bodového nastavenia a krátkej prevádzkovej vzdialenosti. Pri realizácii lineárneho priečneho pohybu sa musí použiť 0o sklon na účely minimalizovania opätovného zaostrenia alebo ak sa SEM nachádza v eucentrickej polohe, použije sa eucentrická prevádzková vzdialenosť. Menšie zväčšenie možno použiť v prípade, ak materiál neobsahuje vlákna s malým priemerom, a pre vlákna s väčším priemerom (> 5 µm). 1.5.3.4. Meranie veľkosti 1.5.3.4.1. Zhodnotenie vzorky preskúšaním pri malom zväčšení Najskôr sa vzorka preskúša pri malom zväčšení, aby sa zistil zhluk väčších vláken a ich hustota. V prípade nadmerného zhlukovania vláken sa odporúča pripraviť novú vzorku. Štatistická presnosť si vyžaduje meranie minimálneho počtu vláken, pričom vysoká hustota vláken je výhodnejšia, pretože preskúšavanie prázdnych polí je časovo náročné a nepredstavuje prínos k celkovej analýze. Ak je filter preplnený, meranie všetkých merateľných vláken sa stáva náročným a malé vlákna môžu byť vynechané, lebo sú prekryté väčšími. Ku skresleniu výsledkov nadhodnotením LWGMD môže dôjsť, ak je hustota vláken väčšia ako 150 vláken na milimeter lineárneho priečneho posunu. Na druhej strane nízka koncentrácia vláken zvyšuje čas analýzy a často je efektívnejšie pripraviť vzorku s hustotou vláken bližšou optimálnej hodnote, ako sa spoliehať na vlákna s nízkou koncentráciou. Optimálna hustota vláken sa určuje na základe priemeru jedného alebo dvoch počítateľných vláken na polia zo záberu pri 5 000-násobnom zväčšení. Napriek tomu optimálna hustota závisí od veľkosti (priemeru) vláken, takže laborant pri rozhodovaní, či hustota vlákna je blízko k optimálnej hodnote, alebo nie, musí použiť vlastný odborný úsudok. 1.5.3.4.2. Meranie dĺžky priemeru vláken Počítajú sa iba tie vlákna, ktoré sa dotýkajú (alebo prečnievajú) tenkej (plynulej) čiary naznačenej na obrazovke SEM. Na tento účel sa nakreslí horizontálna (alebo vertikálna) čiara idúca stredom obrazovky. Alternatívou sa ukazuje byť možnosť umiestnenia jednotlivého bodu do stredu obrazovky s plynulým skenovaním jedným smerom krížom cez celý filter. Každé vlákno s koeficientom s priemerom 3:1, ktoré sa dotýka tohto bodu alebo ho presahuje, sa potom zmeria a zaznamená. 1.5.3.4.3. Triedenie vláken Odporúča sa odmerať minimálne 300 vláken. Každé vlákno sa odmeria iba raz v priesečníku s čiarou alebo bodom nakresleným na obraze (alebo blízko k priesečníku, ak sú okraje vlákna prekryté). Ak sa objavia vlákna, ktoré majú nerovnomerné priečne rezy, je potrebné použiť rozmer reprezentujúci priemernú hodnotu priemeru vlákna. Opatrne treba určiť presný okraj a odmerať najkratšiu vzdialenosť medzi okrajmi vlákna. Triedenie možno realizovať online alebo offline s použitím uložených obrázkov alebo fotografií. Vzhľadom na úsporu času a zamedzenie chýb pri prepise, ako aj kvôli zautomatizovaniu samotného výpočtu sa odporúča použiť poloautomatizovaný snímkovací systém merania, ktorý je schopný stiahnuť údaje priamo do tabuľkovej formy. Konce dlhých vláken je potrebné preveriť pri nízkej hodnote zväčšenia, aby sa zamedzilo ich opätovnému zvlneniu do zorného poľa merania a zabezpečilo, že sa odmerajú iba raz. 2. ÚDAJE 2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV Priemery vláken zvyčajne nemajú normálne rozloženie. Napriek tomu možno získať pri logaritmickej transformácii rozloženie, ktoré sa približuje k normálnemu stavu. Výpočet aritmetickej hodnoty (stredná hodnota lnD) a štandardnej odchýlky (SDlnD) od prenosu základne hodnôt e (lnD) z priemerov vláken (D). (1) (2) Štandardná odchýlka sa vydelí druhou odmocninou počtu meraní (n), čím vyrátame štandardnú chybu (SElnD). (3) Odpočítajte dvakrát štandardnú chybu od hodnoty a vypočítajte exponenciál tejto hodnoty (stredná hodnota mínus dve štandardné chyby) a dostanete strednú geometrickú hodnotu mínus dve štandardné chyby. (4) 3. NAHLASOVANIE SPRÁV PROTOKOL O TESTE Protokol o teste musí obsahovať aspoň nasledujúcu informáciu: — hodnotu LWGMD-2SE, — všetky odchýlky a zvlášť tie, ktoré môžu mať vplyv na presnosť a správnosť výsledkov s patričným zdôvodnením. 4. LITERATÚRA 1. B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. February 1999. 2. G. Burdett and G. Revell. Development of a standard method to measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research and Laboratory Services Division, 1994. (1) Táto hodnota zväčšenia sa uvádza pre vlákna s priemerom 3 μm, pre vlákna s priemerom 6 μm je vhodnejšie 5 000-násobné zväčšenie. (2) Pri vláknach 3 μm pozri predchádzajúcu poznámku.

PRÍLOHA III B.46. PODRÁŽDENIE KOŽE IN VITRO: TEST NA MODELI REKONŠTRUOVANEJ ĽUDSKEJ POKOŽKY 1. METÓDA 1.1. ÚVOD Podráždením kože sa rozumie reverzibilné poškodenie kože po aplikácii testovacej látky maximálne na štyri hodiny [v znení definície podľa globálneho harmonizovaného systému klasifikácie a označovania chemických látok a zmesí (GHS) Organizácie Spojených národov (OSN)] (1). Touto testovacou metódou sa zabezpečuje postup in vitro, ktorý v závislosti od požiadaviek na informácie umožňuje určiť podráždenie pokožky látkami ako nezávislý náhradný test v rámci testovacej stratégie, ktorá vychádza z posúdenia závažnosti dôkazov (weight of evidence) (2). Posudzovanie podráždenia kože sa zvyčajne vykonávalo na laboratórnych zvieratách (pozri metódu B.4) (3). Pokiaľ ide o obavy o životné podmienky zvierat, metóda B.4 umožňuje určiť poleptanie/podráždenie kože pomocou stratégie sekvenčného testovania, s použitím overených metód in vitro a ex vivo, vďaka čomu sa vylúči bolesť a utrpenie zvierat. Tri overené testovacie metódy in vitro alebo usmernenia k testovaniu, B.40, B.40a a TG 435 (4, 5, 6), sú užitočné pri tej časti stratégie sekvenčného testovania B.4, ktorá sa týka poleptania. Táto testovacia metóda je založená na modeloch rekonštruovanej ľudskej pokožky, ktoré svojím celkovým usporiadaním (použitie keratinocytov získaných z ľudskej pokožky ako zdroja buniek, reprezentatívneho tkaniva a cytoarchitektúry) presne napodobňujú biochemické a fyziologické vlastnosti vrchnej časti ľudskej kože, t. j. epidermy. Postup opísaný v tejto testovacej metóde umožňuje určenie nebezpečenstva dráždivých látok v súlade s kategóriou 2 GHS OSN. Táto testovacia metóda takisto zahŕňa súbor noriem výkonnosti na posudzovanie podobných a upravených testovacích metód založených na rekonštruovanej ľudskej pokožke (7). Prevalidačné, optimalizačné a validačné štúdie sa ukončili pre dve testovacie metódy in vitro (8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17) a sú komerčne dostupné ako EpiSkin™ a EpiDerm™, pričom používajú modely rekonštruovanej ľudskej pokožky. Tieto referencie vychádzali z R 38. Niektoré aspekty prepočítania na účely GHS sa uvádzajú v referencii 25. Metódy, ktoré vykazujú výkonnosť ekvivalentnú EpiSkin™ (overená referenčná metóda 1), sa odporúčajú ako nezávislá testovacia metóda, ktorá slúži ako náhrada za testy králikov in vivo na klasifikáciu dráždivých látok kategórie 2 GHS. Metódy, ktoré vykazujú výkonnosť ekvivalentnú EpiDerm™ (overená referenčná metóda 2), sa odporúčajú len ako skríningová testovacia metóda alebo ako časť stratégie sekvenčného testovania v závislosti od posúdenia závažnosti dôkazov na klasifikáciu dráždivých látok kategórie 2 GHS. Skôr ako sa na účely regulácie môže použiť navrhovaný test na modeli rekonštruovanej ľudskej pokožky in vitro, mala by sa stanoviť jeho spoľahlivosť, relevantnosť (presnosť) a obmedzenia jeho navrhovaného používania, aby sa zabezpečila jeho porovnateľnosť s overenou referenčnou metódou 1 v súlade s normami výkonnosti stanovenými v tejto testovacej metóde (doplnok). V súlade s požiadavkami tejto testovacej metódy boli overené ďalšie dve testovacie metódy na modeli rekonštruovanej ľudskej pokožky in vitro, ktoré vykazujú podobné výsledky ako overená referenčná metóda 1 (18). Ide o upravenú testovaciu metódu EpiDerm™ (metóda „me-too“ 1) a testovaciu metódu SkinEthic RHE™ (upravená referenčná metóda 1). 1.2. VYMEDZENIE POJMOV V rámci tejto testovacej metódy sa vymedzujú tieto pojmy: Presnosť: Miera zhody výsledkov testovacej metódy s prijatými referenčnými hodnotami. Ide o opatrenie výkonnosti testovacej metódy a jeden z aspektov relevantnosti. Tento pojem sa často používa zameniteľne s pojmom „zhoda“ a označuje podiel správnych výsledkov testovacej metódy. Dávkovaná kontrolná látka: Referenčná látka, ktorá v tkanivách vyvoláva odozvu bunkovej životaschopnosti stredného rozsahu. Životaschopnosť buniek: Parameter na meranie celkovej aktivity bunkovej populácie, ako napríklad schopnosť bunkových mitochondriálnych dehydrogenáz redukovať vitálne farbivo MTT [3 – (4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazólium bromid, tiazolylová modrá)], ktorý v závislosti od posledného meraného cieľového bodu a od použitej koncepcie testu zodpovedá celkovému počtu a/alebo vitalite živých buniek. ET50 : Expozičný čas potrebný na zníženie životaschopnosti buniek o 50 % pri použití markerovej látky v špecifikovanej pevnej koncentrácii, pozri takisto IC50. Miera nesprávnej negativity: Podiel všetkých pozitívnych látok, ktoré sú testovacou metódou nesprávne identifikované ako negatívne. Je to jeden z ukazovateľov výkonnosti testovacej metódy. Miera nesprávnej pozitivity: Podiel všetkých negatívnych (neaktívnych) látok, ktoré sú nesprávne identifikované ako pozitívne. Je to jeden z ukazovateľov výkonnosti testovacej metódy. Nekonečná dávka: Množstvo testovanej látky aplikovanej na kožu, ktoré prekračuje množstvo potrebné na úplné a rovnomerné pokrytie povrchu kože. GHS (globálny harmonizovaný systém klasifikácie a označovania chemických látok): Systém navrhovania klasifikácie látok a zmesí podľa štandardizovaných typov a stupňov fyzických, zdravotných a environmentálnych rizík a označovania pomocou príslušných komunikačných prvkov, ako sú piktogramy, signalizačné slová, upozornenia na nebezpečnosť, bezpečnostné upozornenia a karty bezpečnostných údajov, ktoré obsahujú informácie o ich nežiaducich účinkoch z hľadiska ochrany ľudí (vrátane zamestnancov, pracujúcich, prepravcov, spotrebiteľov a osoby zodpovedné za riešenie havárií) a životného prostredia (1); v rámci EÚ bol implementovaný nariadením (ES) č. 1272/2008. IC50 : Koncentrácia, pri ktorej markerová látka znižuje životaschopnosť tkanív o 50 % (IC50) po stanovenom expozičnom čase, pozri takisto ET50. Normy výkonnosti: Normy založené na overenej referenčnej metóde, ktoré slúžia ako základňa na hodnotenie porovnateľnosti navrhovanej testovacej metódy, ktorá je mechanicky a funkčne podobná. Patria sem: I. nevyhnutné zložky testovacej metódy; II. minimálny zoznam referenčných látok vybraných spomedzi látok používaných na preukázanie prijateľnej výkonnosti overenej referenčnej metódy a III. porovnateľné úrovne presnosti a spoľahlivosti založené na tom, čo sa získalo pre overenú referenčnú metódu, ktorú by navrhovaná testovacia metóda mala preukázať pri hodnotení pomocou minimálneho zoznamu referenčných látok. Spoľahlivosť: Meria rozsah, v rámci ktorého sa môže testovacia metóda počas istého časového obdobia opakovane vykonávať v rámci laboratórií a medzi nimi navzájom, pričom sa používa ten istý protokol. Posudzuje sa vypočítaním vnútrolaboratórnej a medzilaboratórnej reprodukovateľnosti. Citlivosť: Podiel všetkých pozitívnych/aktívnych látok, ktoré sa testom správne klasifikovali. Je to miera presnosti testovacej metódy, ktorá poskytuje kategorizačné výsledky, a ide o dôležité hľadisko pri hodnotení relevantnosti testovacej metódy. Špecifickosť: Podiel všetkých negatívnych/neaktívnych látok, ktoré sa testom správne klasifikovali. Je to miera presnosti testovacej metódy, ktorá poskytuje kategorizačné výsledky, a ide o dôležité hľadisko pri hodnotení relevantnosti testovacej metódy. Podráždenie kože: Vytvorenie reverzibilného poškodenia kože po aplikácii testovanej látky v trvaní do štyroch hodín. Podráždenie kože je lokálne vzniknutá, neimunogenetická reakcia, ktorá sa objaví krátko po stimulácii (24). Jeho charakteristickou vlastnosťou je reverzibilný proces, ku ktorému patria zápalové reakcie a väčšina klinických prejavov podráždenia charakteristických pre zápalový proces (erytém, edém, svrbenie a bolesť). 1.3. ROZSAH A OBMEDZENIA Obmedzením testov rekonštruovanej ľudskej pokožky, ktoré patria do tejto testovacej metódy, je to, že klasifikujú len látky dráždivé pre kožu podľa kategórie 2 GHS OSN. Keďže neumožňujú klasifikáciu látok do nepovinnej kategórie 3 v zmysle GHS OSN, všetky zostávajúce látky nebudú klasifikované (žiadna kategória). V závislosti od regulačných potrieb a možného budúceho začlenenia nových koncových bodov, zlepšení alebo rozvoja nových testov „me-too“ bude možno nutné túto testovaciu metódu revidovať. Táto testovacia metóda umožňuje určenie nebezpečenstva dráždivých jednozložkových látok (19), ale neposkytuje adekvátne informácie o poleptaní kože. Plyny a aerosóly nemožno testovať, kým nedošlo k hodnoteniu zmesí vo validačnej štúdii. 1.4. PRINCÍP TESTU Testovacia látka sa lokálne aplikuje na trojrozmerný model rekonštruovanej ľudskej pokožky pozostávajúci z normálnych keratinocytov získaných z ľudskej pokožky, ktoré sa vykultivovali, aby vytvorili viacvrstvový, vysoko diferencovaný model ľudskej pokožky. Pozostáva z organizovanej bazálnej vrstvy, vrstvy ostnitých buniek a vrstvy zrnitých buniek a viacvrstvovej rohovitej vrstvy (stratum corneum) obsahujúcej medzibunkové lipidové lamelové vrstvy usporiadané vo vzoroch, ktoré sú analogické vrstvám nachádzajúcim sa in vivo. Princíp testu na modeli rekonštruovanej ľudskej pokožky je založený na predpoklade, že dráždivé látky dokážu prejsť cez rohovitú vrstvu pokožky vďaka difúzii, pričom sú cytotoxické pre hlbšie ležiace vrstvy buniek. Životaschopnosť buniek sa meria premenou dehydrogenázy vitálneho farbiva MTT [3 – (4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazólium-bromid, tiazolylová modrá; EINECS číslo 206 – 069 – 5, CAS číslo 298 – 93 – 1)] na modrú formazánovú soľ, ktorá sa kvantitatívne meria po extrakcii z tkanív (20). Dráždivé látky sa identifikujú na základe ich schopnosti spôsobiť pokles životaschopnosti buniek pod vymedzenú prahovú úroveň (t. j. ≤ 50 % pre dráždivé látky kategórie 2 GHS OSN). Látky, ktoré spôsobujú pokles životaschopnosti buniek nad vymedzenú prahovú úroveň, sa neklasifikujú (t. j. > 50 %, žiadna kategória). Systémy modelu rekonštruovanej ľudskej pokožky sa môžu použiť na testovanie pevných látok, kvapalín, polotuhých látok a voskov. Kvapaliny môžu byť vodné alebo nevodné, pevné látky môžu byť rozpustné alebo nerozpustné vo vode. Ak je to možné, pevné látky by sa mali vždy testovať vo forme jemného prášku. Keďže do overovania systémov testu na modeli rekonštruovanej ľudskej pokožky sa zaradilo 58 starostlivo vybratých látok zastupujúcich široké spektrum chemických tried, očakáva sa, že tieto metódy budú všeobecne platné pre všetky chemické triedy (16). Validácia zahŕňa 13 dráždivých látok kategórie 2 GHS. Je potrebné upozorniť na to, že nežieravé kyseliny, zásady, soli a iné anorganické dráždivé látky neboli zahrnuté do validácie a niektoré známe triedy organických dráždivých látok, ako napríklad hydroperoxidy, fenoly a surfaktanty, neboli zahrnuté alebo boli zahrnuté len v obmedzenej miere. 1.5. PREUKÁZANIE SPÔSOBILOSTI Predtým ako sa začne bežne používať overená metóda, ktorá vyhovuje požiadavkám tejto testovacej metódy, laboratóriá môžu prejaviť želanie preukázať technickú spôsobilosť pomocou desiatich látok odporúčaných v tabuľke 1. V rámci tejto testovacej metódy sa nepovinná kategória 3 GHS OSN nepovažuje za žiadnu kategóriu. Pri nových podobných testovacích metódach („me-too“) vyvinutých v rámci tejto testovacej metódy, ktoré sú štrukturálne a funkčne podobné overeným referenčným metódam alebo pri úprave overených metód, by sa mali použiť normy výkonnosti opísané v dodatku k tejto testovacej metóde na preukázanie porovnateľnej spoľahlivosti a presnosti novej testovacej metódy predtým, ako sa začne používať na regulačné testovanie. Tabuľka 1 Látky na preukázanie spôsobilosti, ktoré patria do podskupiny referenčných látok uvedených v dodatku Látka CAS číslo Hodnota in vivo Fyzikálny stav Kategória GHS kyselina 1-naftyloctová 86 – 87 – 3 0 pevná látka žiadna kat. propán-2-ol 67 – 63 – 0 0,3 kvapalina žiadna kat. metyl-stearát 112 – 61 – 8 1 pevná látka žiadna kat. heptyl-butyrát 5870 – 93 – 9 1,7 kvapalina nepovinná kat. 3 hexyl-2-hydroxybenzoát 6259 – 76 – 3 2 kvapalina nepovinná kat. 3 3-p-kumenyl-2-metylpropanál 103 – 95 – 7 2,3 kvapalina kat. 2 1-brómhexán 111 – 25 – 1 2,7 kvapalina kat. 2 butyl-metakrylát 97 – 88 – 1 3 kvapalina kat. 2 1-metyl-3-fenyl-1-piperazín 5271 – 27 – 2 3,3 pevná látka kat. 2 heptanál 111 – 71 – 7 4 kvapalina kat. 2 1.6. OPIS METÓDY Nasleduje opis zložiek a postupov testu na modeli rekonštruovanej ľudskej pokožky na posúdenie podráždenia kože. Model rekonštruovanej ľudskej pokožky sa môže vytvoriť, pripraviť alebo získať komerčne (napr. EpiSkin™, EpiDerm™ a SkinEthic RHE™). Štandardné protokoly testovacej metódy pre EpiSkin™, EpiDerm™ a SkinEthic RHE™ možno nájsť na [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] (21, 22, 23). Testovanie by sa malo vykonať takto: 1.6.1. Zložky modelu rekonštruovanej ľudskej pokožky 1.6.1.1. Všeobecné podmienky modelu Na zostavenie epitelu by sa mali použiť normálne ľudské keratinocyty. Pod funkčnou rohovitou vrstvou sa musí nachádzať viac vrstiev životaschopných epitelových buniek (bazálna vrstva, vrstva ostnitých buniek, vrstva zrnitých buniek). Rohovitá vrstva by mala byť viacvrstvová a obsahovať potrebný profil lipidov, aby sa vytvorila silná funkčná bariéra, ktorá odolá rýchlemu prenikaniu cytotoxických markerových látok, ku ktorým patrí napr. dodecylsulfát sodný (SDS) alebo Triton X-100. Bariérová funkcia sa môže posudzovať buď určením koncentrácie, pri ktorej markerová látka znižuje životaschopnosť tkanív o 50 % (IC50) po stanovenom expozičnom čase, alebo určením expozičného času, ktorý je potrebný na zníženie životaschopnosti buniek o 50 % (ET50) pri používaní markerovej látky v určitej pevne stanovenej koncentrácii. Izolačné vlastnosti modelu by mali zabrániť prieniku materiálu okolo rohovitej vrstvy do životaschopného tkaniva, čo by viedlo k chybnému modelovaniu vystavenia kože. Model kože by nemal byť kontaminovaný baktériami, vírusmi, mykoplazmami ani hubami. 1.6.1.2. Podmienky funkčného modelu 1.6.1.2.1. Životaschopnosť Uprednostňovanou analýzou na určenie stupňa životaschopnosti je MTT (20). Optická hustota (optical density – OD) farbiva extrahovaného (rozpusteného) z tkaniva získaného z negatívnej kontroly (negative control – NC) by mala byť aspoň 20-násobne vyššia ako OD samotného extrakčného rozpúšťadla. Malo by sa zdokumentovať, že tkanivo získané z negatívnej kontroly je stabilné v kultúre (zabezpečuje podobné výsledky merania životaschopnosti) počas expozičného času testu. 1.6.1.2.2. Bariérová funkcia Rohovitá vrstva a zloženie jej lipidov musia byť schopné zabrániť rýchlemu prieniku cytotoxických markerových látok, ku ktorým patrí napr. SDS alebo Triton X-100, podľa odhadu pomocou IC50 alebo ET50. 1.6.1.2.3. Morfológia Rekonštruovanú kožu/pokožku by mal histologicky preskúmať riadne kvalifikovaný personál, ktorý musí preukázať, že model rekonštruovanej kože/pokožky má štruktúru podobnú ľudskej koži/pokožke (vrátane viacvrstvovej rohovitej vrstvy). 1.6.1.2.4. Reprodukovateľnosť Výsledky metódy používajúcej špecifický model by mali preukázať reprodukovateľnosť v čase, najlepšie prostredníctvom príslušnej dávkovanej kontrolnej látky (referenčnej hodnoty) (pozri dodatok). 1.6.1.2.5. Kontroly kvality modelu (QC) Každá dávka epidermálneho modelu by mala spĺňať stanovené kritériá na uvoľnenie do obehu, v rámci ktorých sú najvýznamnejšie kritériá životaschopnosti (bod 1.6.1.2.1) a bariérovej funkcie (bod 1.6.1.2.2). Rozsah prijateľnosti (horná a dolná hranica) pre IC50 alebo ET50 by mal stanoviť poskytovateľ modelu kože (alebo overovateľ v prípade použitia interného modelu). Bariérové vlastnosti tkanív by sa mali overiť v laboratóriu po prijatí tkanív. Na spoľahlivú prognózu účinkov podráždenia sú prijateľné len výsledky získané pomocou kvalifikovaných tkanív. Ako príklad sa nižšie uvádzajú rozpätia prijateľnosti pre overené referenčné metódy. Tabuľka 2 Príklady kritérií kontroly kvality na uvoľnenie dávok do obehu Dolná hranica prijateľnosti Stredná hodnota rozpätia prijateľnosti Horná hranica prijateľnosti Overená referenčná metóda 1 (18-hodinové ošetrenie SDS) IC50 = 1,0 mg/ml IC50 = 2,32 mg/ml IC50 = 3,0 mg/ml Overená referenčná hodnota 2 (1 % Triton X100) ET50 = 4,8 hod. ET50 = 6,7 hod. ET50 = 8,7 hod. 1.6.1.3. Aplikácia testovacích a kontrolných látok Pri každom ošetrení a kontrole by sa mal použiť dostatočný počet replík tkaniva (minimálne tri repliky na jeden pokus). V prípade kvapalných a pevných látok je potrebné na celý povrch kože rovnomerne naniesť dostatočné množstvo testovacej látky, pričom je nutné sa vyhýbať nekonečnej dávke (pozri 1.2. Vymedzenie pojmov), t. j. malo by sa použiť minimálne 25 μL/cm2 alebo 25 mg/cm2. V prípade pevných látok by sa mal pred aplikáciou povrch pokožky zvlhčiť deionizovanou alebo destilovanou vodou, aby sa tak zabezpečil dobrý kontakt s kožou. Ak je to možné, pevné látky by sa mali vždy testovať vo forme jemného prášku. Na konci expozičného času sa testovacia látka musí dôkladne zmyť z povrchu kože vodným pufrom alebo 0,9 % roztokom NaCl. V závislosti od použitého modelu rekonštruovanej ľudskej pokožky sa expozičný čas môže pohybovať v rozmedzí od 15 do 60 minút a inkubačná teplota v rozmedzí 20 °C a 37 °C. Ďalšie informácie sa nachádzajú v štandardných pracovných postupoch pre dané tri metódy (21, 22, 23). Pre každú štúdiu by sa mali súbežne vykonať negatívne a pozitívne kontroly, aby sa preukázalo, že životaschopnosť (NC), bariérová funkcia a výsledná tkanivová citlivosť tkanív (PC) sú v rámci stanoveného historického rozpätia prijateľnosti. Navrhovaná látka na pozitívnu kontrolu je 5 % vodný SDS. Navrhované látky na negatívnu kontrolu sú voda alebo fosfátom pufrovaný fyziologický roztok (PBS). 1.6.1.4. Merania bunkovej životaschopnosti Najdôležitejším prvkom testovacieho postupu je to, že merania životaschopnosti sa nevykonávajú hneď po expozícii testovacím látkam, ale až po dostatočne dlhom inkubačnom čase po ošetrení opláchnutých tkanív v čerstvom médiu. Tento čas umožňuje regeneráciu po slabo dráždivých účinkoch, ako aj výskyt jasných cytotoxických účinkov. Počas fázy optimalizácie testu (9, 10, 11, 12, 13) sa ako optimálny ukázal byť 42-hodinový inkubačný čas po ošetrení, a preto sa používal pri overovaní referenčných testovacích metód. Analýza premeny MTT je overená kvantitatívna metóda, ktorá by sa mala používať na meranie životaschopnosti buniek. Je vhodná na použitie v trojrozmernom modeli tkaniva. Vzorka kože sa na 3 hodiny vloží do roztoku MTT s vhodnou koncentráciou (napr. 0,3 – 1 mg/mL). Pomocou rozpúšťadla (napr. izopropanol, kyslý izopropanol) sa potom z tkaniva extrahuje vyzrážaný modrý formazánový produkt, pričom koncentrácia formazánu sa odmeria stanovením OD pri 570 nm pomocou priepustného pásma maximálne ±30 nm. Optické vlastnosti testovacej látky alebo jej chemický účinok na MTT môžu interferovať s analýzou, čo vedie k nesprávnemu odhadu životaschopnosti (keďže testovacia látka môže zabraňovať procesu tvorby farby alebo ho zvrátiť, ale rovnako ho môže aj spôsobovať). K tomu môže dôjsť, keď sa špecifická testovacia látka úplne neodstráni z kože pri oplachovaní alebo keď prenikne cez pokožku. Ak testovacia látka pôsobí priamo na MTT, je prirodzene zafarbená alebo sa zafarbí pri ošetrovaní tkaniva, musia sa použiť ďalšie kontroly, aby sa zistilo, či nedochádza k interferencii testovacej látky s technikou merania životaschopnosti, a aby sa táto prípadná interferencia skorigovala. Podrobný opis testovania priamej redukcie MTT sa nachádza v protokole testovacej metódy pre overené referenčné metódy (21, 22, 23). Nešpecifická farba (NSC) spôsobená týmito zásahmi by nemala presahovať 30 % negatívnej kontroly (pre korekcie). Ak NSC > 30 %, testovacia látka sa považuje za nezlučiteľnú s testom. 1.6.1.5. Kritériá prijateľnosti analýzy Pri každej analýze používajúcej platné dávkovanie (pozri odsek 1.6.1.2.5) by tkanivá spracované negatívnou kontrolou mali vykázať OD, čím by sa prejavila kvalita tkanív po všetkých krokoch zaslania a prijatia a celom procese protokolu podráždenia. Hodnoty OD z kontrol by nemali byť nižšie ako historicky stanovené dolné hranice. Podobne by tkanivá ošetrené pozitívnou kontrolou, t. j. 5 % vodným SDS, mali reflektovať citlivosť, ktorú si tkanivá uchovali, a ich schopnosť reagovať na dráždivú látku v podmienkach každej jednotlivej analýzy (napr. životaschopnosť 40 % pre overenú referenčnú metódu 1 a 20 % pre overenú referenčnú metódu 2). Mali by sa stanoviť súvisiace a vhodné merania variability medzi replikami tkaniva (napr. ak sa použije štandardná odchýlka, mali by byť < 18 %). 2. ÚDAJE 2.1. ÚDAJE Pre každé ošetrenie je potrebné do tabuľky zaznamenať údaje z jednotlivých testovacích vzoriek replikátu (napr. hodnoty OD a vypočítaný percentuálny podiel životaschopnosti buniek pre každú testovaciu látku vrátane klasifikácie) vrátane údajov o duplicitných alebo opakovaných experimentoch. Okrem toho by sa mali pre každý pokus uvádzať aj stredné hodnoty ± štandardnej odchýlky. Pozorované interakcie s reagentom MTT a zafarbenými testovacími látkami by sa mali oznamovať pre každú testovaciu látku. 2.2. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV Hodnoty OD namerané pre každú testovaciu vzorku sa môžu použiť na výpočet percenta životaschopnosti v porovnaní s negatívnou kontrolou, ktorá je stanovená na 100 %. Je potrebné jasne definovať, dokumentovať a v prípade potreby preukázať hraničnú percentuálnu hodnotu životaschopnosti buniek odlišujúcu od seba dráždivé látky a nezatriedené testovacie látky a štatistické postupy použité pri hodnotení výsledkov a identifikácii dráždivých látok. Hraničné hodnoty prognózy podráždenia v rámci overených referenčných metód sa uvádzajú nižšie: Testovacia látka sa pokladá za dráždivú pre kožu v súlade s kategóriou 2 GHS OSN: i) ak životaschopnosť tkaniva po expozičnom a pozorovacom inkubačnom čase je menšia alebo sa rovná (≤) 50 %. Testovacia látka nepatrí do žiadnej kategórie: ii) ak životaschopnosť tkaniva po expozičnom a pozorovacom inkubačnom čase je väčšia (>) ako 50 %. 3. PODÁVANIE SPRÁV 3.1. SPRÁVA O TESTE Správa o teste by mala obsahovať tieto informácie: Testovacie a kontrolné látky: — chemický názov (chemické názvy), ako napríklad názov podľa IUPAC alebo CAS a číslo CAS, ak je známe, — čistota a zloženie látky (v hmotnostných percentách), — fyzikálno-chemické vlastnosti relevantné na vykonanie štúdie (napr. fyzikálny stav, stabilita a nestabilita, pH, rozpustnosť vo vode, ak je známa), — prípadná úprava testovacích/kontrolných látok pred testovaním (napr. zahriatie, rozomletie), — podmienky skladovania. Zdôvodnenie modelu kože a použitého protokolu. Podmienky testovania: — použitý bunkový systém, — údaje o kalibrácii zariadenia a priepustnom pásme použitom na meranie životaschopnosti buniek (napr. spektrofotometer), — úplné podkladové údaje o použitom osobitnom modeli kože vrátane jeho výkonnosti. K nim by mala patriť predovšetkým: i) životaschopnosť; ii) bariérová funkcia; iii) morfológia; iv) reprodukovateľnosť a predvídateľnosť; v) kontroly kvality modelu (QC), — podrobné informácie o použitom postupe testovania, — testovacie dávky, trvanie expozície a pozorovacieho inkubačného času, — opis všetkých modifikácií testovacieho postupu, — odkaz na historické údaje o modeli. K nim by mali patriť predovšetkým: i) prijateľnosť údajov o kontrole kvality s odkazom na historické údaje o dávkach; ii) prijateľnosť hodnôt pozitívnych a negatívnych kontrol s odkazom na prostriedky a miery pozitívnych a negatívnych kontrol, — opis použitých hodnotiacich kritérií vrátane zdôvodnenia výberu hraničných bodov pre model prognózy. Výsledky: — údaje z individuálnych testovacích vzoriek spracované v podobe tabuľky, — opis ďalších pozorovaných účinkov. Rozbor výsledkov. Závery. 4. ODKAZY 1. United Nations (UN) (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), druhé prepracované vydanie, UN New York a Ženeva 2007. Dostupné na internete: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html. 2. REACH: Guidance on Information Requirements and Chemical Safety Assessment. Dostupné na internete: http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/information_requirements_en.htm?time=1232447649. 3. Testovacia metóda B.4. ACUTE TOXICITY; AKÚTNE PODRÁŽDENIE/POLEPTANIE KOŽE. 4. Testovacia metóda B.40. POLEPTANIE KOŽE IN VITRO: TEST TRANSKUTÁNNEHO ELEKTRICKÉHO ODPORU TER. 5. Testovacia metóda B.40A. POLEPTANIE KOŽE IN VITRO: TEST NA MODELI ĽUDSKEJ KOŽE. 6. OECD (2006). Testovacie usmernenie 435. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. In Vitro Membrane Barrier Test Method. Prijaté 19. júla 2006. Dostupné na internete: http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html. 7. ECVAM (2009) Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Dostupné na internete pod Download Study Documents: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 8. Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J.M. & Botham, P. (2001). A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in vitro 15, 57 – 93. 9. Portes, P., Grandidier, M.H., Cohen, C. & Roguet, R. (2002). Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study. Toxicology in vitro 16, 765 – 770. 10. Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. & Spielmann, H. (2004). Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests. ALTEX 21, 107 – 114. 11. Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. & Spielmann H. (2005) The EpiDerm Test Protocol fort the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests – An Assessment of the Performance of the Optimised Test. ATLA 33, 351 – 367. 12. Cotovio, J., Grandidier, M. – H., Portes, P., Roguet, R. & G. Rubinsteen. (2005). The In Vitro Acute Skin Irritation of Chemicals: Optimisation of the EPISKIN Prediction Model within the Framework of the ECVAM Validation Process. ATLA 33, 329 – 349. 13. Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. & Worth, A. (2002). Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. ECVAM Skin Irritation Task Force Report 2. ATLA 30,109 – 129. 14. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, 559 – 601. 15. Hoffmann, S. (2006). ECVAM Skin Irritation Validation Study Phase II: Analysis of the Primary Endpoint MTT and the Secondary Endpoint IL1-α. 135 pp. + annexes. Dostupné na internete pod Download Study Documents: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 16. Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. & Zuang. V (2007) ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals. ATLA 35, 603 – 619. 17. J. Cotovio, M. – H. Grandidier, D. Lelièvre, R. Roguet, E. Tinois-Tessonneaud, J. Leclaire (2007). In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy – Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, Special Issue-proceedings from WC6. Vol.14, 351 – 358. 18. Vyhlásenie ESAC o aktualizovanej analýze EpiDerm a podobných analýzach SkinEthic. 5. november 2008. 19. ES (2006). Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 z 18. decembra 2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemických látok (REACH) a o zriadení Európskej chemickej agentúry, o zmene a doplnení smernice 1999/45/ES a o zrušení nariadenia Rady (EHS) č. 793/93 a nariadenia Komisie (ES) č. 1488/94, smernice Rady 76/769/EHS a smerníc Komisie 91/155/EHS, 93/67/EHS, 93/105/ES a 2000/21/ES. Úradný vestník Európskej únie L 396/1, 30.12.2006. OPOCE, Luxemburg. 20. Mosman, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, 55 – 63. 21. EpiSkin™ SOP, Version 1.6 (január 2005). Validation of the EpiSkin Skin Irritation Test – 42 Hours Assay For The Prediction of Acute Skin Irritation of Chemicals. Dostupné na internete pod Download Study Documents: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 22. EpiDerm™ SOP, Version 5.0 (október 2004). Draft Standard Operating Procedure. In Vitro Skin Irritation Test: Human Skin Model. Model: EpiDerm™- 200. Dostupné na internete pod Download Study Documents: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 23. SkinEthic RHE™ SOP. Bude dostupné na internete pod Download Study Documents: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 24. Harvell, J.D., Lammintausta, K., Maibach H.I. (1995) Irritant contact dermatitis IN: Guin J.D. Practical Contact Dermatitis Mc Graw-Hill New York, s. 7 – 18. 25. Griesinger C, Barroso J & Zuang V: ECVAM background document on the recent adaptations of the ECVAM performance standards for in vitro skin irritation testing in the context of the drafting process of an EU test method and an OECD draft test guideline. Ispra 13. november 2008. Dodatok Hodnotenie výkonnostných charakteristík navrhovaných modelov rekonštruovanej ľudskej pokožky in vitro pri podráždení pokožky ÚVOD Postupy navrhované v rámci tejto testovacej metódy by sa mali hodnotiť, aby sa určila ich spoľahlivosť a presnosť pomocou látok, ktoré zastupujú celý rozsah výsledkov dráždivosti Draizovho testu. Pri hodnotení a použití 20 odporúčaných referenčných látok (tabuľka 1) by navrhované postupy mali mať hodnoty spoľahlivosti a presnosti, ktoré sú porovnateľné s hodnotami overených referenčných metód 1 (tabuľka 3) (1). Normy pre presnosť a spoľahlivosť, ktoré by sa mali dosiahnuť, sa uvádzajú v bode II a III. Zaraďujú sa sem neklasifikované aj klasifikované látky (kategória 2 GHS OSN), ktoré predstavujú relevantné chemické triedy, aby sa spoľahlivosť a výkonnosť (citlivosť, špecifickosť, miera nesprávneho negatívu a miera nesprávneho pozitívu a presnosť) navrhovanej testovacej metódy mohli porovnať s hodnotami overenej referenčnej metódy 1. Spoľahlivosť testovacej metódy, ako aj jej schopnosť správne identifikovať dráždivé látky kategórie 2 GHS OSN by sa mali stanoviť pred jej s použitím pri testovaní nových látok. NORMY VÝKONNOSTI Normy výkonnosti zahŕňajú tieto tri zložky: I. nevyhnutné zložky testovacej metódy; II. referenčné látky a III. vymedzené hodnoty spoľahlivosti a presnosti (2). Tieto normy výkonnosti sú založené na normách výkonnosti po dokončení validačnej štúdie ECVAM o podráždení kože (3). I. Nevyhnutné zložky testovacej metódy Všeobecné podmienky modelu Na zostavenie epitelu by sa mali použiť normálne ľudské keratinocyty. Pod funkčnou rohovitou vrstvou sa musí nachádzať viac vrstiev životaschopných epitelových buniek (bazálna vrstva, vrstva ostnitých buniek, vrstva zrnitých buniek). Rohovitá vrstva by mala byť viacvrstvová a obsahovať potrebný profil lipidov, aby sa vytvorila silná funkčná bariéra, ktorá odolá rýchlemu prenikaniu cytotoxických markerových látok, ku ktorým patrí napr. dodecylsulfát sodný (SDS) alebo Triton X-100. Bariérová funkcia sa môže posudzovať buď určením koncentrácie, pri ktorej markerová látka znižuje životaschopnosť tkanív o 50 % (IC50) po stanovenom expozičnom čase, alebo určením expozičného času, ktorý je potrebný na zníženie životaschopnosti buniek o 50 % (ET50) pri používaní markerovej látky v určitej pevne stanovenej koncentrácii. Izolačné vlastnosti modelu by mali zabrániť prieniku materiálu okolo rohovitej vrstvy do životaschopného tkaniva, čo by viedlo k chybnému modelovaniu vystavenia kože. Model kože by nemal byť kontaminovaný baktériami, vírusmi, mykoplazmami ani hubami. Podmienky funkčného modelu Životaschopnosť Uprednostňovanou analýzou na určenie stupňa životaschopnosti je MTT (4). Optická hustota (OD) farbiva extrahovaného (rozpusteného) z tkaniva získaného z negatívnej kontroly (NC) by mala byť aspoň 20-násobne vyššia ako OD samotného extrakčného rozpúšťadla. Malo by sa zdokumentovať, že tkanivo získané z negatívnej kontroly je stabilné v kultúre (zabezpečuje podobné výsledky merania životaschopnosti) počas expozičného času testu. Bariérová funkcia Rohovitá vrstva a zloženie jej lipidov musia byť schopné zabrániť rýchlemu prieniku cytotoxických markerových látok, ku ktorým patrí napr. SDS alebo Triton X-100, podľa odhadu pomocou IC50 alebo ET50. Morfológia Rekonštruovanú kožu/pokožku by mal histologicky preskúmať riadne kvalifikovaný personál, ktorý musí preukázať, že model rekonštruovanej kože/pokožky má štruktúru podobnú ľudskej koži/pokožke (vrátane viacvrstvovej rohovitej vrstvy). Reprodukovateľnosť Výsledky metódy používajúcej špecifický model by mali preukázať reprodukovateľnosť v čase, najlepšie prostredníctvom príslušnej dávkovanej kontrolnej látky (referenčnej hodnoty) (pozri vymedzenie pojmov v bode 1.2). Kontroly kvality modelu (QC) Každá dávka epidermálneho modelu by mala spĺňať stanovené kritériá na uvoľnenie do obehu, v rámci ktorých sú najvýznamnejšie kritériá životaschopnosti a bariérovej funkcie. Rozsah prijateľnosti (horná a dolná hranica) pre IC50 alebo ET50 by mal stanoviť poskytovateľ modelu kože (alebo overovateľ v prípade použitia interného modelu). Bariérové vlastnosti tkanív by sa mali overiť v laboratóriu po prijatí tkanív. Na spoľahlivú prognózu účinkov podráždenia sú prijateľné len výsledky získané pomocou kvalifikovaných tkanív. Ako príklad sa nižšie uvádzajú rozpätia prijateľnosti pre overené referenčné metódy. Tabuľka 1 Príklady kritérií kontroly kvality na uvoľnenie dávok do obehu Dolná hranica prijateľnosti Stredná hodnota rozpätia prijateľnosti Horná hranica prijateľnosti Overená referenčná metóda 1 (18-hodinové ošetrenie SDS) IC50 = 1,0 mg/ml IC50 = 2,32 mg/ml IC50 = 3,0 mg/ml Overená referenčná hodnota 2 (1 % Triton X100) ET50 = 4,8 hod. ET50 = 6,7 hod. ET50 = 8,7 hod. II. Referenčné látky Referenčné látky sa používajú na určenie toho, či spoľahlivosť a presnosť navrhovanej novej testovacej metódy rekonštruovanej ľudskej pokožky in vitro, ktorá sa ukázala byť štrukturálne a funkčne dostatočne podobná overeným referenčným metódam alebo predstavuje menšiu úpravu overenej referenčnej metódy, je z hľadiska výkonnosti porovnateľná s overenou referenčnou metódou 1 (1). K 20 referenčným látkam uvedeným v tabuľke 2 patria látky predstavujúce rozličné dôležité chemické triedy, ako aj látky kategórie 2 GHS OSN. K látkam uvedeným v tomto zozname patrí 10 látok kategórie 2 GHS OSN, 3 látky nepovinnej kategórie 3 GHS OSN a 7 nezatriedených látok. V rámci tejto testovacej metódy sa nepovinná kategória 3 nepovažuje za žiadnu kategóriu. Tieto referenčné látky predstavujú minimálny počet látok, ktoré by sa mali použiť na hodnotenie presnosti a spoľahlivosti navrhovanej testovacej metódy rekonštruovanej ľudskej pokožky pri podráždení kože. V situácii, keď nie je uvedená látka k dispozícii, môžu sa použiť iné látky, pre ktoré sú dostupné adekvátne referenčné údaje in vivo. Ak je to žiaduce, môžu sa do minimálneho zoznamu referenčných látok pridať ďalšie látky, ktoré predstavujú ostatné chemické triedy a pre ktoré sú dostupné referenčné údaje, aby sa tak mohla ohodnotiť presnosť navrhovanej testovacej metódy. Tabuľka 2 Referenčné látky na určenie hodnôt presnosti a spoľahlivosti modelov rekonštruovanej ľudskej pokožky pri podráždení kože Látka (1) CAS číslo EINECS číslo Fyzikálny stav Hodnota in vivo GHS kat. in vitro GHS kat. in vivo 1-bróm-4-chlórbután 6940-78-9 230-089-3 kvapalina 0 kat. 2 žiadna kat. dietylftalát 84-66-2 201-550-6 kvapalina 0 žiadna kat. žiadna kat. kyselina 1-naftyloctová 86-87-3 201-705-8 pevná látka 0 žiadna kat. žiadna kat. alyl-fenoxyacetát 7493-74-5 231-335-2 kvapalina 0,3 žiadna kat. žiadna kat. propán-2-ol 67-63-0 200-661-7 kvapalina 0,3 žiadna kat. žiadna kat. 4-(metylsulfanyl)benzaldehyd 3446-89-7 222-365-7 kvapalina 1 kat. 2 žiadna kat. metyl-stearát 112-61-8 203-990-4 pevná látka 1 žiadna kat. žiadna kat. heptyl-butyrát 5870-93-9 227-526-5 kvapalina 1,7 žiadna kat. nepovinná kateg. kat. 3 hexyl-2-hydroxybenzoát 6259-76-3 228-408-6 kvapalina 2 žiadna kat. nepovinná kat. 3 triizobutyl-fosfát 126-71-6 204-798-3 kvapalina 2 kat. 2 nepovinná kat. 3 dekán-1-ol 112-30-1 203-956-9 kvapalina 2,3 kat. 2 kat. 2 3-p-kumenyl-2-metylpropanál 103-95-7 203-161-7 kvapalina 2,3 kat. 2 kat. 2 1-brómhexán 111-25-1 203-850-2 kvapalina 2,7 kat. 2 kat. 2 2-chlór metyl-3,5-dimetyl-4-metoxypyridín hydrochlorid 86604-75-3 434-680-9 pevná látka 2,7 kat. 2 kat. 2 2-(4-metylcyklohex-3-enyl)propán-2-ol 98-55-5 202-680-6 kvapalina 2,7 kat. 2 kat. 2 dipropyldisulfán 629-19-6 211-079-8 kvapalina 3 žiadna kat. kat. 2 butyl-metakrylát 97-88-1 202-615-1 kvapalina 3 kat. 2 kat. 2 benzénetiol, 5-(1,1 dimetyletyl)-2-metyl 7340-90-1 438-520-9 kvapalina 3,3 kat. 2 kat. 2 1-metyl-3-fenyl-1-piperazín 5271-27-2 431-180-2 pevná látka 3,3 kat. 2 kat. 2 heptanál 111-71-7 203-898-4 kvapalina 4 kat. 2 kat. 2 Látky uvedené v tabuľke 2 poskytujú reprezentatívne rozdelenie 58 látok, ktoré sa použili pri medzinárodnej validačnej štúdii ECVAM o podráždení kože (1). Ich výber sa zakladá na týchto kritériách: — látky sú komerčne dostupné, — reprezentujú celý rad výsledkov dráždivosti Draizovho testu (od nedráždiacich až po silne dráždiace), — majú dobre definovanú chemickú štruktúru, — reprezentujú reprodukovateľnosť a schopnosť prognózy overenej metódy, ako je stanovené vo validačnej štúdii ECVAM, — reprezentujú chemickú funkčnosť použitú pri validačnom procese, — nesúvisia s extrémne toxickým profilom (napr. karcinogénnym alebo toxickým pre reprodukčný systém) a nesúvisia s obmedzujúcimi nákladmi na odstránenie. III. Vymedzené hodnoty presnosti a spoľahlivosti Výkonnosť (citlivosť, špecifickosť, miera nesprávneho negatívu a miera nesprávneho pozitívu a presnosť) navrhovanej testovacej metódy by mala byť porovnateľná s hodnotami overenej referenčnej metódy 1 (tabuľka 3), t. j. citlivosť by mala byť vyššia alebo sa rovnať (≥) 80 %, špecifickosť by mala byť vyššia alebo sa rovnať (≥) 70 % a presnosť by mala byť vyššia alebo sa rovnať (≥) 75 %. Vypočítanie výkonnosti by sa malo vykonať pomocou všetkých klasifikácií získaných pre 20 látok v rozličných zúčastnených laboratóriách. Klasifikácia pre každú látku v každom laboratóriu by sa mala získať s použitím strednej hodnoty životaschopnosti za rozličné vykonané pokusy (minimálne tri platné pokusy). Tabuľka 3 Výkonnosť overenej referenčnej metódy 1 (2) Testovacia metóda Počet látok Citlivosť Špecifickosť Miera nesprávneho negatívu Miera nesprávneho pozitívu Presnosť Overená referenčná metóda 1 (3) 58 87,2 % (4) 71,1 % (5) 12,8 % 29,9 % 74,7 % Overená referenčná metóda 1 (3) 20 90 % 73,3 % 10 % 26,7 % 81,7 % Spoľahlivosť navrhovanej testovacej metódy by mala byť porovnateľná so spoľahlivosťou overených referenčných metód. Vnútrolaboratórna reprodukovateľnosť Hodnotenie vnútrolaboratórnej variability by malo dokázať súlad s klasifikáciami (kategória 2/žiadna kategória) získanými pri iných, nezávislých pokusoch 20 referenčných látok v rámci jedného laboratória, ktorý je vyšší ako alebo sa rovná (≥) 90 %. Medzilaboratórna reprodukovateľnosť Hodnotenie medzilaboratórnej reprodukovateľnosti nie je nevyhnutné, ak sa navrhovaná testovacia metóda používa len v jednom laboratóriu. Pre metódy, ktoré by sa mali prenášať medzi laboratóriami, by mal byť súlad s klasifikáciami (kategória 2/žiadna kategória) získanými pri iných, nezávislých pokusoch 20 referenčných látok najlepšie medzi minimálne tromi laboratóriami vyšší ako alebo sa rovnať (≥) 80 %. ODKAZY 1. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, 559- 601. 2. OECD (2005) Guidance Document No. 34 on the validation and international acceptance of new or updated test methods for hazard assessment. OECD, Paris. 3. ECVAM (2007) Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Dostupné na internete pod Download Study Documents: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu (cit. 27. októbra 2008). 4. Mosman, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, 55- 63. 5. Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. & Zuang. V (2007) ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals. ATLA 35, 603- 619. (1) 20 referenčných látok predstavuje reprezentatívny výber z 58 látok, ktoré sa pôvodne používali na overenie referenčnej metódy 1 (EpiSkin™). Kompletný zoznam testovacích látok a kritériá ich výberu sú k dispozícii (5). (2) Tabuľka 3 poskytuje výkonnosť overenej referenčnej metódy 1 s ohľadom na jej schopnosť správne identifikovať dráždivé látky (kategória 2 GHS OSN) a neklasifikované látky (žiadna kategória vrátane nepovinnej kategórie 3) pre 58 a 20 referenčných látok (tabuľka 2). (3) EpiSkin™. (4) Na základe 13 dráždivých látok kategórie 2 GHS. (5) Na základe 45 dráždivých látok kategórie 3 GHS alebo chemických látok, ktoré podľa GHS nepatria do žiadnej kategórie.

PRÍLOHA IV C.3. SLADKOVODNÉ RIASY A SINICE, TEST INHIBÍCIE RASTU 1. METÓDA Táto metóda je rovnocenná s OECD TG 201 (2006) (1). 1.1. ÚVOD Testovacie metódy sa pravidelne revidujú a aktualizujú vzhľadom na vedecký pokrok. Bolo potrebné revidovať testovaciu metódu C.3 tak, aby zahŕňala ďalšie druhy a spĺňala požiadavky posudzovania rizika a aby bola uvedená klasifikácia chemických látok. Revízia sa uskutočnila na základe rozsiahlych praktických skúseností, vedeckého pokroku v oblasti štúdií toxicity rias a rozsiahleho regulačného využitia, ktoré od pôvodného prijatia metódy nastali. 1.2. VYMEDZENIE POJMOV Na účely tejto testovacej metódy sa používajú tieto pojmy a skratky: Biomasa: je suchá hmotnosť živej hmoty nachádzajúcej sa v populácii, vyjadrená ako daný objem, napr. mg rias/liter testovaného roztoku. „Biomasa“ je obvykle definovaná ako hmotnosť, ale v tomto teste sa toto slovo používa na vyjadrenie hmotnosti na objem. V tomto teste biomasu vyjadruje napr. aj počet buniek, fluorescencia atď., ktoré sa bežne merajú, a teda používanie pojmu „biomasa“ sa vzťahuje aj na tieto náhradné kritériá. Koeficient odchýlky: je bezrozmerná hodnota premenlivosti parametra definovaná ako pomer štandardnej odchýlky k strednej hodnote. Môže sa vyjadriť aj ako percentuálna hodnota. Stredný koeficient odchýlky priemernej špecifickej rýchlosti rastu sa v paralelných kontrolných kultúrach vypočíta takto: 1. Vypočítajte % KO priemerného špecifického rastu na základe každodenných rýchlostí rastu/rýchlostí rastu po častiach pre príslušné paralelky. 2. Vypočítajte strednú hodnotu zo všetkých hodnôt vypočítaných v bode 1 na získanie stredného koeficientu zmeny špecifickej dennej rýchlosti rastu/špecifickej rýchlosti rastu po častiach v paralelných kontrolných kultúrach. ECx : je koncentrácia testovanej látky rozpustená v testovacom médiu, ktorej následkom je x % (napr. 50 %) zníženie rastu testovaného organizmu v rámci stanoveného času expozície (je potrebné výslovne uviesť, ak sa odchyľuje od celkovej alebo obvyklej dĺžky testu). Na jednoznačné zaznamenanie hodnoty EC odvodenej od rýchlosti rastu sa používa symbol „ErC“ alebo symbol „EyC“ na zaznamenanie hodnoty z výťažku. Rastové médium: je kompletné syntetické kultivačné médium, v ktorom testovaná riasa rastie v prítomnosti testovanej látky (expozícii, ktorej je vystavená). Testovaná látka sa za normálnych podmienok rozpustí v testovanom médiu. Rýchlosť rastu (priemerná špecifická rýchlosť rastu): je logaritmickým nárastom biomasy počas času expozície testovanou látkou. Najnižšia koncentrácia s pozorovateľnými účinkami (LOEC): je najnižšia testovaná koncentrácia, pri ktorej sa pozoruje, že látka má štatisticky významný účinok na zníženie rastu (pri p < 0,05) v porovnaní s kontrolou v rámci daného času expozície. Škodlivý účinok všetkých testovaných koncentrácií nad LOEC sa však vždy rovná alebo je väčší ako účinky pozorované pri LOEC. Ak nie sú splnené tieto dve podmienky, je potrebné poskytnúť úplné vysvetlenie, akým spôsobom sa zvolila LOEC (a teda aj NOEC). Koncentrácia bez pozorovaného účinku (NOEC): je testovaná koncentrácia bezprostredne pod LOEC. Hodnota reakcie: je premenná hodnota na odhad toxicity odvodená z akýchkoľvek stanovených parametrov opisujúcich biomasu rôznymi metódami výpočtu. V prípade tejto metódy sú rýchlosti rastu a výťažok hodnotami reakcie odvodenými priamo z merania biomasy alebo uvedených náhradných parametrov. Špecifická rýchlosť rastu: je hodnota premennej reakcie definovaná ako kvocient rozdielu prirodzených logaritmov parametra pozorovania (v tejto testovacej metóde biomasy) a príslušného časového intervalu. Výťažok: je hodnota meranej premennej na konci času expozície mínus hodnota meranej premennej na začiatku času expozície na vyjadrenie nárastu biomasy počas testu. 1.3. POUŽITEĽNOSŤ TESTU Táto testovacia metóda sa dá najľahšie použiť pre látky rozpustné vo vode, pri ktorých sa predpokladá, že za podmienok testu zostávajú vo vode. V prípade testovania látok, ktoré sú prchavé, silne sa adsorbujú, sú sfarbené, s nízkou rozpustnosťou vo vode, alebo látky, ktoré môžu ovplyvniť dostupnosť živín alebo minerálnych látok v testovacom médiu, môžu byť potrebné určité modifikácie uvedeného postupu (napr. uzatvorený systém, úprava testovacích nádob). Usmernenia k niektorým vhodným úpravám sú uvedené v (2) (3) a (4). 1.4. PRINCÍP TESTU Cieľom tohto testu je stanoviť účinky látky na rast sladkovodných mikrorias a/alebo siníc. Exponenciálne rastúce testované organizmy sú vystavené testovanej látke v jednorazových kultúrach obvykle počas 72 hodín. Napriek pomerne krátkej dĺžke testu sa môžu hodnotiť účinky na niekoľkých generáciách. Reakciou systému je zníženie rastu v sérii kultúr rias (testované jednotky) vystavených rôznym koncentráciám testovanej látky. Reakcia sa hodnotila ako funkcia expozičnej koncentrácie v porovnaní s priemerným rastom paralelných, nevystavených kontrolných kultúr. Na preukázanie úplnej reakcie systému na toxické účinky (optimálna citlivosť) sa kultúram umožní neobmedzený exponenciálny rast v podmienkach s vhodnými živinami a nepretržité svetlo počas času postačujúceho na meranie zníženia špecifickej rýchlosti rastu. Rast a inhibícia rastu sa kvantifikujú stanovením biomasy rias ako funkcie času. Biomasa rias je definovaná ako suchá hmotnosť na objem, napr. mg rias/liter testovaného roztoku. Suchá hmotnosť sa však zložito stanovuje, a preto sa používajú náhradné parametre. Z týchto náhradných parametrov sa najčastejšie používa počet buniek. Iné náhradné parametre zahŕňajú objem buniek, fluorescenciu, optickú hustotu atď. Je potrebné poznať prepočítavací koeficient medzi meraným náhradným parametrom a biomasou. Konečným bodom testu je inhibícia rastu vyjadrená ako logaritmický nárast biomasy (priemerná špecifická rýchlosť rastu) počas času expozície. Z priemerných špecifických rýchlostí rastu zaznamenaných v sérii testovaných roztokov sa stanoví koncentrácia, ktorá spôsobuje špecifickú x % inhibíciu rýchlosti rastu (napr. 50 %), a vyjadrí sa ako ErCx (napr. ErC50). Na uplatnenie tejto metódy v regulačnom rámci EÚ by sa mal výpočet výsledkov opierať o priemernú špecifickú rýchlosť rastu z dôvodov uvedených v odseku 2.2. Ďalšou hodnotou reakcie použitou v tejto testovacej metóde je výťažok, ktorý sa v niektorých krajinách vyžaduje na splnenie špecifických regulačných požiadaviek. Definovaný je ako biomasa na konci času expozície mínus biomasa na začiatku času expozície. Z výťažkov zaznamenaných v sérii testovaných roztokov sa stanoví koncentrácia, ktorá spôsobuje špecifickú x % inhibíciu výťažku (napr. 50 %), a vypočíta sa a vyjadrí ako EyCx (napr. EyC50). Okrem toho možno štatisticky stanoviť najnižšiu koncentráciu s pozorovateľnými účinkami (LOEC) a koncentráciu bez pozorovaného účinku (NOEC). 1.5. INFORMÁCIE O TESTOVANEJ LÁTKE Informácie o testovanej látke, ktoré môžu byť užitočné pri stanovovaní testovacích podmienok, zahŕňajú štrukturálny vzorec, čistotu, svetelnú stálosť, stabilitu pri skúšobných podmienkach, vlastnosti týkajúce sa absorpcie svetla, pKa a výsledky štúdií transformácie vrátane biologickej odbúrateľnosti vo vode. Rozpustnosť vo vode, rozdeľovací koeficient oktanol-voda (Pow) a tlak pary testovanej látky musia byť známe a musí byť k dispozícii validovaná metóda na kvantifikáciu látky v testovaných roztokoch so zaznamenanou výťažnosťou a detekčný limit. 1.6. REFERENČNÁ LÁTKA Referenčná(-é) látka(-y), ako napr. 3,5-dichlórfenol, používané v medzinárodnej kruhovej skúške (4) sa môže(-u) testovať ako prostriedok kontroly postupu testu. Pre zelené riasy sa môže použiť ako referenčná látka aj dvojchroman draselný. Referenčnú látku je potrebné testovať aspoň dvakrát do roka. 1.7. PLATNOSŤ TESTU Test je platný, ak sú splnené tieto kritériá: — Biomasa v kontrolných kultúrach sa musí exponenciálne zvýšiť aspoň o faktor 16 počas 72-hodinového času testu. To je v súlade so špecifickou rýchlosťou rastu 0,92 deň–1. Rýchlosť rastu je obvykle podstatne vyššia pre najčastejšie používané druhy (pozri dodatok 1). Toto kritérium sa nemusí splniť, ak sa používajú druhy, ktoré rastú pomalšie ako druhy, ktoré sú uvedené v dodatku 1. V tomto prípade sa čas testu predĺži, aby sa dosiahol aspoň 16-násobný rast v kontrolných kultúrach, pričom počas trvania testu musí byť rast exponenciálny. Trvanie testu sa môže skrátiť najmenej na 48 hod., aby sa zachoval neobmedzený exponenciálny rast počas testu, pokiaľ sa dosiahol minimálny multiplikačný faktor 16. — Priemerný koeficient odchýlky pre špecifické rýchlosti rastu po častiach (dni 0 – 1, 1 – 2 a 2 – 3 pre 72-hodinové testy) v kontrolných kultúrach (pozri oddiel 1.2 pod nápisom „koeficient odchýlky“) nesmie byť väčší ako 35 %. Pozri druhý odsek v oddiele 2.2.1 na výpočet špecifických rýchlostí rastu po častiach. Toto kritérium platí na strednú hodnotu koeficientov odchýlky vypočítanú pre paralelné kontrolné kultúry. — Koeficient odchýlky priemerných špecifických rýchlostí rastu počas celého času testu v paralelných kontrolných kultúrach nesmie byť väčší ako 7 % v testoch s Pseudokirchneriella subcapitata a Desmodesmus subspicatus. Pre iné, menej často testované druhy nesmie hodnota presiahnuť 10 %. 1.8. OPIS METÓDY 1.8.1. Prístroje Testovacie nádoby a iné prístroje, ktoré prichádzajú do styku s testovanými roztokmi, musia byť celé zo skla alebo iného chemicky inertného materiálu. Predmety sa musia dôkladne umyť, aby sa zabezpečilo, že žiadne organické ani anorganické kontaminanty neovplyvnia rast rias ani zloženie testovaných roztokov. Testovacími nádobami sú zvyčajne sklené banky s rozmermi, ktoré umožnia dostačujúci objem kultúry pre merania počas testu a prenos dostatočného množstva CO2 z atmosféry (pozri druhý odsek v oddiele 1.8.9). Pamätajte, že objem kvapaliny musí byť postačujúci pre analytické stanovenia (pozri piaty odsek v oddiele 1.8.11). Okrem toho budú potrebné niektoré z týchto zariadení: — prístroj na kultiváciu: miestnosť alebo priestor, v ktorom sa môže udržiavať inkubačná teplota v rozmedzí ±2 °C; — prístroje na meranie svetla: je dôležité pripomenúť, že metóda merania intenzity svetla, a najmä typ receptora (kolektora) ovplyvní hodnotu merania. Merania by sa mali prednostne uskutočniť s použitím guľových (4 π) receptorov (ktoré reagujú na priame a odrazené svetlo zo všetkých uhlov nad a pod rovinou merania) alebo 2 π receptora (ktorý reaguje na svetlo zo všetkých uhlov nad rovinou merania); — prístroj na stanovenie biomasy rias. Počet buniek, ktorý je najčastejšie používaným náhradným parametrom za biomasu rias, sa môže vypočítať s použitím elektronického počítadla častíc, mikroskopu s počítacou komôrkou alebo prietokovým cytometrom. Iné náhradné parametre za biomasu možno zmerať s použitím prietokového cytometra, fluorimetra, spektrofotometra alebo kolorimetra. Na výpočet je potrebný prepočítavací faktor vzťahujúci sa na počet buniek na suchú hmotnosť. Na zabezpečenie potrebných meraní pri nízkych koncentráciách biomasy s použitím spektrofotom