Dopĺňajú sa tieto prílohy:

„

Dodatok

METÓDA ZISŤOVANIA PRÍTOMNOSTI KRAVSKÉHO MLIEKA A KAZEINÁTU V SYROCH VYROBENÝCH Z OVČIEHO MLIEKA, KOZIEHO MLIEKA ALEBO BYVOLIEHO MLIEKA, ALEBO ZO ZMESÍ KOZIEHO, OVČIEHO A BYVOLIEHO MLIEKA

1. ROZSAH

Zisťovanie prítomnosti kravského mlieka a kazeinátu v syroch vyrobených z ovčieho mlieka, kozieho mlieka alebo byvolieho mlieka, alebo zo zmesí kozieho, ovčieho a byvolieho mlieka izoelektrickou fokusáciou γ-kazeínov po plazminolýze.

2. OBLASŤ POUŽITIA

Metóda je vhodná na citlivé a špecifické zisťovanie prírodného a tepelne upraveného mlieka a kazeinátu v čerstvých a zrejúcich syroch vyrobených z ovčieho mlieka, kozieho mlieka alebo byvolieho mlieka, alebo zo zmesí kozieho, ovčieho a byvolieho mlieka. Nie je vhodná na zisťovanie falšovania mlieka a syra tepelne upravenými bielkovinovými koncentrátmi z kravskej srvátky.

3. PRINCÍP METÓDY

3.1. Izolácia kazeínov zo syra a referenčných štandardov

3.2. Rozpustenie izolovaných kazeínov a prevedenie plazmínového (EC.3.4.21.7) štiepenia

3.3. Izoelektrická fokusácia plazmínovaných kazeínov za prítomnosti močoviny a farbenie bielkovín

3.4. Hodnotenie zafarbených γ3 a γ2-kazeínových záznamov (dôkaz prítomnosti kravského mlieka) porovnaním záznamu získaného zo vzorky so záznamami získanými z rovnakého gélu z referenčných štandardných roztokov obsahujúcich 0 % a 1 % kravského mlieka.

4. REAGENTY

Ak nie je uvedené inak, použijú sa chemikálie analytickej kvality. Použije sa dvojnásobne destilovaná voda alebo voda ekvivalentnej čistoty.

Poznámka: Nasledujúci podrobný popis použite na laboratórne pripravené polyakrylamidové gély obsahujúce močovinu s rozmermi 265 × 125 × 0,25 mm. Ak sa použije iná veľkosť a typ gélu, môže byť potrebná úprava podmienok separácie.

Izoelektrická fokusácia

4.1. Reagenty pre výrobu polyakrylamidových gélov obsahujúcich močovinu

4.1.1. Zásobný gélový roztok

Vo vode rozpusťte:

4,85 g akrylamidu

0,15 g N, N′-metyléndiakrylamidu (BIS)

48,05 g močoviny

15,00 g glycerolu (87 % hm.)

doplňte vodou do 100 ml a uskladnite vo fľaši z hnedého skla v chladničke.

Poznámka: Namiesto uvedených pevne stanovených hmotností neurotoxických akrylamidov možno použiť komerčne dostupný namiešaný roztok akrylamidu a BIS. Ak takýto roztok obsahuje 30 % hm./obj. akrylamidu a 0,8 % hm./obj. BIS, namiesto uvedených presne stanovených hmotností sa na zmiešanie roztoku použije objem 16,2 ml komerčného roztoku. Trvanlivosť zásobného roztoku je maximálne 10 dní; ak je jeho vodivosť väčšia ako 5 μS, deionizujte ho miešaním s 2 g amberlitu MB-3 počas 30 minút a potom ho prefiltrujte cez membránový filter s veľkosťou pórov 0,45 μm.

4.1.2. Gélový roztok

Gélový roztok pripravte zmiešaním aditív a amfolytov (*) so zásobným gélovým roztokom (pozri 4.1.1).

9,0 ml zásobného roztoku

24 mg β-alanínu

500 μl amfolytu pH 3,5 – 9,5

250 μl amfolytu pH 5 – 7

250 μl amfolytu pH 6 – 8

Gélový roztok zmiešajte a odplyňte počas dvoch až troch minút v ultrazvukovom kúpeli alebo vo vákuu.

Poznámka: Gélový roztok pripravte tesne pred jeho použitím (pozri 6.2).

4.1.3. Katalytické roztoky

4.1.3.1. N, N, N′, N′-tetrametyletyléndiamín (Temed)

4.1.3.2. 40 % hm./obj. peroxodisíran diamónny (PER):

Rozpusťte 800 mg PER vo vode a doplňte vodu do 2 ml.

Poznámka: Vždy používajte čerstvo pripravený roztok PER.

4.2. Kontaktná kvapalina

Kerozín alebo kvapalný parafín

4.3. Anódový roztok

Vo vode rozpusťte 5,77 g kyseliny fosforečnej (85 % hm.) a doplňte na 100 ml.

4.4. Katódový roztok

Vo vode rozpusťte 2 g hydroxidu sodného a doplňte vodou na 100 ml.

Príprava vzorky

4.5. Reagenty na izoláciu bielkovín

4.5.1. Zrieďte kyselinu octovú (25 ml ľadovej kyseliny octovej doplňte vodou do 100 ml.)

4.5.2. Dichlórmetán

4.5.3. Acetón

4.6. Tlmivý roztok rozpúšťajúci bielkoviny

Vo vode rozpusťte

5,75 g glycerolu (87 % hm.)

24,03 g močoviny

250 mg (+-)-(R*,R*)-1,4-disulfanylbután-2,3-diolu (dithiothreitolu)

doplňte vodou do 50 ml.

Poznámka: Skladujte v chladničke; maximálna trvanlivosť je jeden týždeň.

4.7. Reagenty pre plazmínové štiepenie kazeínov

4.7.1. Tlmivý roztok uhličitanu amónneho

Titrujte roztok 0,2 mol/l hydrogénuhličitanu amónneho (1,58 g/100 ml vody) obsahujúci 0,05 mol/l kyseliny etyléndiamíntetraoctovej (EDTA, 1,46 g/100 ml) s 0,2 mol/l roztokom uhličitanu amónneho (1,92 g/100 ml vody) obsahujúcim 0,05 mol/l EDTA na pH 8.

4.7.2. Plazmín z kravského mlieka (EC. 3.4.21.7), s aktivitou najmenej 5 U/ml

4.7.3. Roztok kyseliny ε-aminohexánovej na inhibíciu enzýmov

Rozpusťte 2,624 g kyseliny ε-aminohexánovej (kyselina 6-amino-n-hexánová) v 100 ml 40 % (obj.) etanolu.

4.8. Referenčné štandardy

4.8.1. Certifikované referenčné štandardy zmesi odstredeného ovčieho a kozieho mlieka upraveného syridlom s obsahom 0 % a 1 % kravského mlieka sú dostupné v Inštitúte Komisie pre referenčné materiály a merania (Commission's Institute for Reference Materials and Measurements), B-2440 Geel, Belgicko.

4.8.2. Príprava dočasných laboratórnych štandardných roztokov pre byvolie mlieko upravené syridlom s obsahom 0 % a 1 % kravského mlieka.

Odstredené mlieko sa pripraví odstredením buď byvolieho, alebo kravského surového mlieka pri podmienkach 37 °C, 2 500 g, 20 minút. Po rýchlom ochladení skúmavky a jej obsahu na 6 až 8 °C sa úplne odstráni horná vrstva tuku. Na prípravu 1 % štandardu pridajte do 495 ml byvolieho odstredeného mlieka 5 ml kravského odstredeného mlieka v kadičke s objemom 1 liter a pridaním zriedenej kyseliny mliečnej (10 % hm./obj.) upravte pH na 6,4. Teplotu nastavte na 35 °C a pridajte 100 μl teľacieho syridla (aktivita syridla 1: 10 000, c. 3 000 U/ml), miešajte 1 minútu a potom kadičku prikryte hliníkovou fóliou a nechajte jednu hodinu odstáť pri teplote 35 °C, aby sa vytvoril tvaroh. Po vytvorení tvarohu celé mlieko upravené syridlom vysušte mrazom bez predošlej homogenizácie alebo zliatia srvátky. Po vysušení mrazom je roztok vhodný na vytvorenie homogénneho prášku. Na prípravu 0 % štandardného roztoku uskutočnite rovnaký postup s použitím pravého byvolieho odstredeného mlieka. Štandardy sa musia skladovať pri teplote – 20 °C.

Poznámka: Pred prípravou štandardného roztoku sa odporúča skontrolovať čistotu byvolieho mlieka izoelektrickou fokusáciou plazmínovaných kazeínov.

Reagenty na farbenie bielkovín

4.9. Ustaľovač

Vo vode rozpusťte 150 g kyseliny trichlóroctovej a doplňte na 1 000 ml.

4.10. Roztok na odfarbovanie

Rozrieďte 500 ml metanolu a 200 ml ľadovej kyseliny octovej s destilovanou vodou na 2 000 ml.

Poznámka: Roztok na odfarbovanie pripravte každý deň čerstvý; môže sa pripraviť zmiešaním rovnakých objemov zásobných roztokov 50 % (obj.) metanolu a 20 % (obj.) ľadovej kyseliny octovej.

4.11. Roztoky na farbenie

4.11.1. Roztok na farbenie (zásobný roztok 1)

Rozpusťte 3,0 g Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) v 1 000 ml 90 % (obj.) metanolu magnetickým miešadlom (miešajte asi 45 minút), prefiltrujte cez dva stredne rýchle skladané filtre.

4.11.2. Roztok na farbenie (zásobný roztok 2)

V 1 000 ml 20 % (obj.) kyseliny octovej rozpusťte 5,0 g pentahydrátu síranu meďnatého.

4.11.3. Roztok na farbenie (pracovný roztok)

Bezprostredne pred farbením zmiešajte 125 ml oboch zásobných roztokov (4.11.1, 4.11.2).

Poznámka: Roztok na farbenie by sa mal pripraviť v deň použitia.

5. VYBAVENIE

5.1. Sklenené platničky (265 × 125 × 4 mm); gumený valček (šírka 15 cm); vyrovnávacia tabuľka.

5.2. Fólia na gél (265 × 125 mm)

5.3. Krycia fólia (280 × 125 mm). Na oba dlhé konce upevnite pás lepiacej pásky (280 × 6 × 0,25 mm) (pozri obrázok 1).

5.4. Elektrofokusačná komora s chladiacou doskou (napr. 265 × 125 mm) a vhodným zdrojom energie (≥ 2,5 kV) alebo automatické elektroforézne zariadenie

5.5. Cirkulačný kryostat s termostatickou kontrolou na 12 ± 0,5 °C

5.6. Odstredivka nastaviteľná na 3 000 g

5.7. Elektródy (≥ 265 mm dlhé)

5.8. Plastové fľaše s kvapkadlom na anódový a katódový roztok

5.9. Aplikátory vzoriek (10 × 5 mm, viskózový papier alebo papier s nízkou absorpciou bielkovín)

5.10. Nerezové alebo sklené misky na farbenie a odfarbovanie (napr. podnosy na nástroje s rozmermi 280 × 150 mm)

5.12. Nastaviteľný tyčový homogenizátor (priemer hriadeľa 10 mm), 8 000 až 20 000 ot/min

5.13. Magnetické miešadlo

5.14. Ultrazvukový kúpeľ

5.15. Zváračka fólií

5.16. Mikropipety na 25 μl

5.17. Vákuový koncentrátor alebo lyofilizátor

5.18. Termostaticky kontrolovaný vodný kúpeľ nastaviteľný na 35 a 40 ± 1 °C, s možnosťou pretrepania

5.19. Denzitometer umožňujúci meranie pri vlnovej dĺžke λ = 634 nm

6. POSTUP

6.1. Príprava vzorky

6.1.1. Izolácia kazeínov

Do odstreďovacej skúmavky s objemom 100 ml odvážte množstvo syra alebo referenčných štandardov zodpovedajúce 5 g sušiny, pridajte 60 ml destilovanej vody a homogenizujte tyčovým homogenizátorom (8 000 až 10 000 ot/min). Hodnotu pH upravte na 4,6 zriedenou kyselinou octovou (4.5.1) a odstreďte (5 minút, 3 000 g). Zlejte tuk a srvátku, rezíduum homogenizujte pri 20 000 ot/min v 40 ml destilovanej vody s pH upraveným na 4,5 zriedenou kyselinou octovou (4.5.1), pridajte 20 ml dichlórmetánu (4.5.2), opäť homogenizujte a odstreďte (5 minút, 3 000 g). Špachtličkou odstráňte vrstvu kazeínu, ktorá sa nachádza medzi vodnou a organickou vrstvou (pozri obrázok 2) a zlejte obe vrstvy. Kazeín znova homogenizujte v 40 ml destilovanej vody (pozri vyššie) a 20 ml dichlórometánu (4.5.2.) a odstreďte. Tento postup opakujte, pokým nebudú obe extrakčné vrstvy bezfarebné (dva až trikrát). Bielkovinové rezíduum homogenizujte s 50 ml acetónu (4.5.3) a prefiltrujte cez stredne rýchly skladaný filtračný papier. Rezíduum z filtra zakaždým zmyte dvoma osobitnými 25 ml dávkami acetónu a nechajte vyschnúť na vzduchu alebo pod prúdom dusíka a potom ho rozdrvte na jemný prášok v mažiari.

Poznámka: Suché izoláty kazeínu by sa mali skladovať pri – 20 °C.

6.1.2. Plazmínové štiepenie β-kazeínov na intenzifikáciu γ-kazeínov

V 0,5 ml tlmivého roztoku uhličitanu amónneho (4.7.1.) rozpusťte 25 mg izolovaných kazeínov (6.1.1.) a 20 minút ich homogenizujte napr. použitím ultrazvuku. Zohrejte ich na 40 °C a pridajte 10 μl plazmínu (4.7.2), premiešajte a inkubujte 1 hodinu pri teplote 40 °C za stáleho pretrepávania. Na inhibovanie enzýmu pridajte 20 μl roztoku kyseliny ε-aminohexánovej (4.7.3) a následne pridajte 200 mg pevnej močoviny a 2 mg (2R,3S)-1,4-disulfanylbután-2,3-diolu (dithiothreitolu).

Poznámka: Na dosiahnutie väčšej symetrie vo fokusovaných kazeínových pásoch je vhodné roztok po pridaní kyseliny ε-aminohexánovej mrazom vysušiť a rezíduá potom rozpustiť v 0,5 ml tlmivého roztoku rozpúšťajúceho bielkoviny (4.6.)

6.2. Príprava polyakrylamidových gélov s obsahom močoviny

Pomocou niekoľkých kvapiek vody rozbaľte fóliu na gél (5.2) na sklenenú platničku (5.1) a prebytočnú vodu odstráňte papierovým obrúskom. Na ďalšiu platničku rozložte rovnakým spôsobom kryciu fóliu (5.3) s rozpernými vložkami (0,25 mm). Platničku horizontálne položte na vyrovnávaciu tabuľku.

Do pripraveného a odvzdušneného gélového roztoku (4.1.2) pridajte 10 μl Temedu (4.1.3.1), premiešajte a pridajte 10 μl roztoku PER (4.1.3.2), dôkladne premiešajte a ihneď rovnomerne nalejte na stred krycej fólie. Jeden okraj platničky s gélom (s fóliou otočenou smerom dole) položte na platničku s krycou fóliou a pomaly ju pritlačte tak, aby sa medzi platničkami vytvorila rovnomerne rozotretá gélová vrstva bez bubliniek (obrázok 3). Pomocou tenkej špachtle opatrne pritlačte doštičku s gélom po celom povrchu a na vrch umiestnite ďalšie tri sklenené doštičky ako závažie. Po ukončení polymerizácie (približne 60 minút) odstráňte gél polymerizovaný na fólii na gél spolu s krycou fóliou tak, že sklenené doštičky nakloníte. Opačnú stranu fólie na gél pozorne očistite, aby ste odstránili zvyšky gélu a močovinu. Gélový ‚sendvič‘ zvarte do fólie a uskladnite stočený do rúrky v chladničke (maximálne šesť týždňov).

Poznámka: Kryciu fóliu s rozpernými vložkami možno znovu použiť. Polyakrylamidový gél možno rozrezať na menšie kúsky, čo sa odporúča vtedy, ak je málo vzoriek, alebo ak sa používa automatické elektroforézne zariadenie (dva gély s rozmermi 4,5 × 5 cm).

6.3. Izoelektrická fokusácia

Chladiaci termostat nastavte na 12 °C. Opačnú stranu fólie na gél očistite kerozínom, potom kvapnite niekoľko kvapiek kerozínu (4.2) do stredu chladiaceho bloku. Potom naň položte gélový sendvič, s fóliou otočenou smerom nadol, a vyhnite sa pritom vzniku bubliniek. Prebytočný kerozín zotrite a odstráňte kryciu fóliu. Elektródové pásy ponorte do elektródových roztokov (4.3, 4.4), odrežte na dĺžku gélu a umiestnite na dané miesta (vzdialenosť elektród 9,5 cm).

Podmienky izoelektrickej fokusácie:

6.3.1. Rozmer gélu 265 × 125 × 0,25 mm

Krok Čas (min.) Napätie (V) Prúd (mA) Výkon (W) Volthodiny (Vh) 1. Predbežná fokusácia 30 maximálne 2 500 maximálne 15 konštantný 4 c. 300 2. Fokusácia vzorky (7) 60 maximálne 2 500 maximálne 15 konštantný 4 c. 1 000 3. Záverečná fokusácia 60 maximálne 2 500 maximálne 5 maximálne 20 c. 3 000 40 maximálne 2 500 maximálne 6 maximálne 20 c. 3 000 30 maximálne 2 500 maximálne 7 maximálne 25 c. 3 000

Poznámka: Ak sa zmení hrúbka alebo šírka gélov, hodnoty prúdu a výkonu sa musia vhodne upraviť (napr. dvojnásobok hodnoty pre elektrický prúd a výkon, ak sa používa gél s rozmermi 265 × 125 × 0,5 mm).

6.3.2. Príklad programu napätia pre automatické elektroforézne zariadenie (2 gély s rozmermi 5 × 4,5 cm), elektródy bez pásov sa prikladajú priamo na gél.

Krok Napätie Prúd Výkon Teplota Volthodiny 1. Predbežná fokusácia 1 000 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 85 Vh 2. Fokusácia vzorky 250 V 5,0 mA 2,5 W 8 °C 30 Vh 3. Fokusácia 1 200 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 80 Vh 4. Fokusácia 1 500 V 5,0 mA 7,0 W 8 °C 570 Vh

Aplikátor vzorky vložte v kroku 2 pri 0 Vh.

Aplikátor vzorky odstráňte v kroku 2 pri 30 Vh.

6.4. Farbenie bielkovín

6.4.1. Ustálenie bielkovín

Ihneď po vypnutí zariadenia odstráňte elektródové pásy a gél ihneď vložte do misky na farbenie/odfarbovanie naplnenej ustaľovačom (4.9.) v objeme 200 ml; za stáleho pretrepávania nechajte pôsobiť 15 min.

6.4.2. Umývanie a farbenie gélovej platničky

Dôkladne odstráňte ustaľovač a gélovú platničku premyte dvakrát počas 30 sekúnd 100 ml roztokom na odfarbovanie (4.10). roztok na odfarbovanie vylejte a misku naplňte 250 ml roztokom na farbenie (4.11.3.); nechajte ho pôsobiť za jemného pretrepávania počas 45 minút.

6.4.3. Odfarbenie gélovej platničky

Roztok na farbenie vylejte, gélovú platničku zakaždým dvakrát premyte pomocou 100 ml roztoku na odfarbovanie (4.10.), následne pretrepte s 200 ml roztoku na odfarbovanie počas 15 minút a postup odfarbenia opakujte najmenej dva alebo trikrát, pokým nie je pozadie čisté a bezfarebné. Potom gélovú platničku opláchnite destilovanou vodou (2 × 2 minúty) a nechajte vysušiť na vzduchu (2 až 3 hodiny) alebo sušičom na vlasy (10 až 15 minút).

Poznámka 1: Ustálenie, umývanie, farbenie a odfarbovanie vykonávajte pri teplote 20 °C. Nepoužívajte vyššie teploty.

Poznámka 2: Ak sa uprednostní citlivejšie strieborné farbivo (napr. Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, Code No. 17-1150-01), musia byť kazeínové vzorky ošetrené plazmínom zriedené na 5 mg/ml.

7. HODNOTENIE

Hodnotenie sa vykonáva porovnaním záznamov bielkovín neznámej vzorky s referenčnými štandardmi na tom istom géle. Obsah kravského mlieka v syroch z ovčieho mlieka, kozieho mlieka a byvolieho mlieka a zo zmesí ovčieho, kozieho a byvolieho mlieka sa detekuje prostredníctvom γ3- a γ2-kazeínov, ktorých izoelektrické body sú v rozmedzí pH 6,5 a pH 7,5 (obrázky 4a, 4b a 5). Detekčný limit je nižší ako 0,5 %.

7.1. Vizuálny odhad

Pri vizuálnom hodnotení množstva kravského mlieka sa odporúča upraviť koncentrácie vzoriek a štandardných roztokov s cieľom dosiahnuť rovnakú úroveň intenzity v prípade ovčích, kozích a/alebo byvolích γ2- a γ3-kazeínov (pozri hodnoty „γ2 E,G,B“ a „γ3 E,G,B“ v obrázkoch 4a, 4b a 5) Následne možno posúdiť množstvo kravského mlieka (menej ako 1 %, 1 % alebo viac ako 1 %) v neznámej vzorke, a to priamo porovnaním intenzity hovädzích γ3- a γ2-kazeínov (pozri „γ3 C“ a „γ2 C“ na obrázkoch 4a, b a na obrázku 5) s intenzitou kazeínov v 0 % a 1 % referenčných štandardoch (ovčie, kozie) alebo v dočasných laboratórnych štandardoch (byvolie).

7.2. Denzitometrický odhad

Ak je to možné, na stanovenie pomeru plochy píku kravských k ovčím, kozím a/alebo byvolím γ2- a γ3-kazeínom použite denzitometriu (5.19.) (pozri obrázok 5). Túto hodnotu porovnajte s pomerom plochy píku γ2- a γ3-kazeínov 1 % referenčného štandardného roztoku (ovčie, kozie) alebo dočasného laboratórneho štandardu (byvolie) analyzovanými na tom istom géle.

Poznámka: Metóda funguje uspokojivo, ak je jasný pozitívny signál v prípade oboch hovädzích γ2- a γ3-kazeínov v 1 % referenčnom štandarde, ale nie v 0 % referenčnom štandarde. V opačnom prípade postup optimalizujte presným dodržaním pokynov stanovených v danej metóde.

Vzorka sa hodnotí ako pozitívna, ak sa oba kravské γ2- a γ3-kazeíny alebo zodpovedajúce pomery plochy píku rovnajú alebo sú väčšie ako úroveň 1 % referenčného štandardu.

8. ODKAZY

Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).

Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).

Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte — and carrier ampholyte/immobilized pH gradient — isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier. in: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.) pp 389-393, Bode-Verlag, München (1989).

Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).

Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

Obrázok 1

Schematický nákres krycej fólie

Obrázok 2

Kazeínová vrstva plávajúca medzi vodnou a organickou fázou po odstredení

Obrázok 3

Klapková technika liatia ultratenkých polyakrylamidových gélov

a = oddeľovacia páska (0,25 mm); b = krycia fólia (5.3.); c, e = sklenené platničky (5.1.); d = gélový roztok (4.1.2.); f = fólia na gél (5.2.)

Obrázok 4a

Izoelektrická fokusácia kazeínov ošetrených plazmínom z ovčieho a kozieho syra s obsahom rôznych množstiev kravského mlieka

% CM = percentuálny podiel kravského mlieka, C = krava, E = ovca, G = koza

Znázornená je horná polovica izoelektricky fokusovaného gélu.

Obrázok 4b

Izoelektrická fokusácia kazeínov ošetrených plazmínom zo syra vyrobeného zo zmesí ovčieho, kozieho a byvolieho mlieka s obsahom rôznych množstiev kravského mlieka

% CM = percentuálny podiel kravského mlieka; 1+ = vzorka obsahujúca 1 % kravského mlieka s pridaním čistého kravského kazeínu v strede stopy. C = krava, E = ovca, G = koza, B = byvol.

Znázornená je celková separačná vzdialenosť izoelektricky fokusovaného gélu.

Obrázok 5

Superpozícia denzitogramov štandardných roztokov (STD) a vzoriek syra vyrobeného zo zmesi ovčieho a kozieho mlieka po izoelektrickej fokusácii

a, b = štandardné vzorky s obsahom 0 a 1 % kravského mlieka; c – g = vzorky kozích syrov s obsahom 0, 1, 2, 3 a 7 % kravského mlieka. C = krava, E = ovca, G = koza.

Horná polovica IEF gélu bola skenovaná pri λ = 634 nm.