19.

V časti C sa dopĺňajú tieto kapitoly: „C.47 Test toxicity v ranom štádiu vývoja rýb ÚVOD 1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 210 (2013). Účelom testov v ranom štádiu vývoja rýb je určiť letálne a subletálne účinky chemikálií na testované štádiá a druhy. Poskytujú hodnotné informácie pre odhad chronických letálnych a subletálnych účinkov chemikálie na ďalšie druhy rýb. 2. Usmernenie na vykonávanie testov 210 vychádza z návrhu Spojeného kráľovstva, o ktorom sa rokovalo na stretnutí expertov OECD, ktoré sa konalo v Medmenhame (Spojené kráľovstvo) v novembri 1988, a ktorý bol ďalej aktualizovaný v roku 2013, aby sa v ňom zohľadnili skúsenosti z používania testu a odporúčania z pracovného seminára OECD o testovaní toxicity na rybách, ktorý sa konal v septembri 2010 (1). PRINCÍP TESTU 3. Rané štádiá vývoja rýb sú vystavené sérii koncentrácií testovanej chemikálie rozpustenej vo vode. Uprednostňujú sa prietokové podmienky, ak to však nie je možné, sú prijateľné aj semistatické podmienky. Pokiaľ ide o podrobnosti, treba sa riadiť pokynmi OECD o testovaní toxicity zložitých látok a zmesí vo vodnom prostredí (2). Test sa začne umiestnením oplodnených vajíčok do testovacích komôr a pokračuje sa v ňom počas časového úseku špecifického pre jednotlivé druhy, ktorý je potrebný na to, aby kontrolné ryby dosiahli vývojové štádium mlade. Posúdením letálnych a subletálnych účinkov a ich porovnaním s kontrolnými hodnotami sa určí najnižšia koncentrácia s pozorovaným účinkom (LOEC) s cieľom určiť i) koncentráciu bez pozorovaného účinku (NOEC) a/alebo ii) hodnotu ECx (napr. EC10, EC20), a to použitím regresného modelu na odhadnutie koncentrácie, ktorá by spôsobila x % zmenu v meranom účinku. Uvedenie príslušných účinných koncentrácií a parametrov môže závisieť od regulačného rámca. Testovacie koncentrácie by mali zahŕňať hodnotu ECx, aby hodnota ECx vychádzala z interpolácie, a nie z extrapolácie (definície nájdete v dodatku 1). INFORMÁCIE O TESTOVANEJ CHEMIKÁLII 4. Testovaná chemikália je to, čo sa testuje. Jej rozpustnosť vo vode (pozri kapitolu A.6 tejto prílohy) a tlak pár (pozri kapitolu A.4 tejto prílohy) by mali byť známe a mala by byť dostupná spoľahlivá analytická metóda na stanovenie množstva chemikálie v testovacom roztoku so známou a udanou presnosťou a kvantifikačným limitom. Výsledky testu akútnej toxicity (pozri kapitolu C.1 alebo C.49 tejto prílohy), pokiaľ možno vykonaného s druhom vybraným pre tento test, môžu poskytnúť užitočné informácie, hoci jeho vykonanie sa nepožaduje. 5. Ak sa daná testovacia metóda použije na testovanie zmesi, jej zloženie by malo byť čo najviac charakterizované, napr. chemickou identitou jej zložiek, ich kvantitatívnym výskytom a vlastnosťami jednotlivých látok (ako sú vlastnosti uvedené vyššie). Pred použitím testovacej metódy na regulačné testovanie zmesi by sa malo posúdiť, či poskytne prijateľné výsledky z hľadiska zamýšľaného regulačného účelu. 6. Užitočné informácie zahŕňajú štruktúrny vzorec, čistotu látky, rozpustnosť vo vode, stabilitu vo vode a na svetle, pKa, Pow a výsledky testu na ľahkú biologickú odbúrateľnosť (napr. kapitoly C.4 alebo C.29 tejto prílohy). PLATNOSŤ TESTU 7. Ak má byť test platný, musia byť splnené tieto podmienky: — koncentrácia rozpusteného kyslíka by mala počas testu dosahovať > 60 % hodnoty saturácie vzduchom, — teplota vody by sa medzi testovacími komorami alebo medzi za sebou nasledujúcimi dňami v žiadnom okamihu počas testu nemala líšiť o viac ako ± 1,5 °C a mala by byť v rozsahu teplôt určených pre testované druhy (dodatok 2), — analytické meranie testovacích koncentrácií je povinné, — počet všetkých oplodnených vajíčok, ktoré prežili, a počet vyliahnutých lariev, ktoré prežili, v kontrolných skupinách, prípadne v kontrolných skupinách s rozpúšťadlom, by mal byť väčší alebo rovnaký ako limity stanovené v dodatku 2. 8. Ak sa zistí mierna odchýlka od kritérií platnosti, dôsledky by sa mali posudzovať s ohľadom na spoľahlivosť testovacích údajov a tieto úvahy by mali byť zahrnuté do správy. Mali by sa oznamovať účinky na prežitie, liahnutie alebo rast, ku ktorým dochádza v kontrolnej skupine s rozpúšťadlom, v porovnaní s negatívnou kontrolnou skupinou, a malo by sa o nich diskutovať v súvislosti so spoľahlivosťou testovacích údajov. OPIS METÓDY Testovacie komory 9. Možno použiť akékoľvek nádoby zo skla, nehrdzavejúcej ocele alebo iné chemicky inertné nádoby. Keďže je známe, že silikón má silnú schopnosť absorbovať lipofilné látky, používanie silikónových rúrok v prietokových štúdiách a používanie silikónových tesnení v kontakte s vodou by sa malo minimalizovať používaním napr. monoblokových sklenených akvárií. Rozmery nádob by mali byť dostatočne veľké na to, aby umožňovali náležitý rast v kontrolnej skupine, udržiavanie koncentrácie rozpusteného kyslíka (napr. pri malých druhoch rýb sa to dosiahne nádržou s objemom 7 l) a dodržanie kritéria veľkosti násady uvádzaného v bode 19. Žiaduce je, aby bolo umiestnenie skúšobných komôr na testovacej ploche náhodné. Náhodný blokový návrh, v ktorom sa v každom bloku nachádza každá skupina s aplikovanou chemikáliou, sa uprednostňuje pred úplne náhodným dizajnom. Testovacie komory by sa mali chrániť pred nežiaducim rušením. Testovací systém by mal byť kondiciovaný koncentráciami testovanej chemikálie dostatočne dlho, aby sa prejavili stabilné expozičné koncentrácie ešte pred vložením testovaných organizmov. Výber druhov 10. Odporúčané druhy rýb sú uvedené v tabuľke 1. Týmto sa nevylučuje použite iných druhov, postup testovania však môže byť potrebné upraviť tak, aby sa dosiahli vhodné testovacie podmienky. V tom prípade treba uviesť dôvody, ktoré viedli k výberu iných druhov, a experimentálnu metódu. Chov generačných rýb 11. Podrobnosti o chove generačných rýb za uspokojivých podmienok možno nájsť v dodatku 3 a citovaných odkazoch (3)(4)(5). Manipulácia s oplodnenými vajíčkami, embryami a larvami 12. Na začiatku možno oplodnené vajíčka, embryá a larvy vystaviť chemikálii v rámci hlavnej nádoby, a to v menších sklenených nádobách alebo nádobách z nehrdzavejúcej ocele vybavených sieťovinovými stenami alebo koncami, aby sa umožnilo pretekanie testovacieho roztoku cez nádobu. Neturbulentný tok cez tieto malé nádoby možno zabezpečiť ich zavesením na rameno upravené na pohybovanie nádobami nahor a nadol tak, aby organizmy zostali vždy ponorené. Oplodnené vajíčka lososovitých rýb možno umiestniť na inkubačných podložkách alebo sieťkach s dostatočne veľkými okami, aby mohli cez ne larvy po vyliahnutí prepadnúť. 13. Ak boli na držanie vajíčok v hlavnej testovacej nádobe použité inkubačné vložky na vajíčka, mriežky alebo sieťky, tieto držiaky by sa mali po vyliahnutí lariev odstrániť podľa návodu v dodatku 3 okrem prípadov, keď treba sieťky ponechať na zabránenie úniku lariev. Ak treba larvy preniesť, nemali by sa vystaviť vzduchu a nemali by sa používať sieťky na ich vylovenie z inkubačných vložiek. Načasovanie tohto prenosu sa líši v závislosti od druhu a malo by sa zdokumentovať v správe. Prenos však nemusí byť vždy nevyhnutný. Voda 14. Každú vodu, v ktorej testovaný druh vykazuje vyhovujúco dlhotrvajúce prežívanie a rast, možno použiť na testovanie (pozri dodatok 4). Mala by mať konštantnú kvalitu počas celého trvania testu. S cieľom zaistiť, že voda na riedenie neovplyvní výsledky testu neprimeraným spôsobom (napríklad tvorbou komplexov testovanej chemikálie) alebo že nebude mať nepriaznivý vplyv na reprodukčnú úžitkovosť generačných rýb, mali by sa z nej v pravidelných intervaloch odoberať vzorky na analýzu. Ak je známe, že voda na riedenie má relatívne stálu kvalitu, mal by sa v nej napríklad dvakrát ročne merať obsah ťažkých kovov (napr. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), hlavných aniónov a katiónov (napr. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl-, SO4 2-), amoniaku, celkového zvyškového chlóru, pesticídov, celkový obsah organického uhlíka a obsah suspendovaných tuhých látok. Ak je známe, že voda má premenlivú kvalitu, merania sa musia vykonávať častejšie, pričom frekvencia závisí od miery premenlivosti kvality. Niektoré chemické vlastnosti pre prijateľnú vodu na riedenie sú uvedené v dodatku 4. Testovacie roztoky 15. Pri prietokových testoch sa vyžaduje systém, ktorý kontinuálne privádza a riedi zásobný roztok testovanej chemikálie (napr. dávkovacie čerpadlo, proporcionálny zrieďovač, saturačný systém) na prísun série koncentrácií do testovacích komôr. Prietoky zásobných roztokov a vody na riedenie by sa mali kontrolovať v určitých intervaloch počas testu, pričom by sa v priebehu testu nemali meniť o viac ako 10 %. Za vhodný sa považuje prietok zodpovedajúci aspoň piatim objemom testovacej komory za 24 hodín (3). Ak sa však dodrží veľkosť násady stanovená v bode 19, je možný aj nižší prietok napr. 2 – 3 objemy testovacej komory, aby sa zabránilo rýchlemu vymývaniu potravy. 16. Testovacie roztoky vybraných koncentrácií sa pripravujú riedením zásobného roztoku. Zásobný roztok by sa mal podľa možností pripraviť jednoduchým miešaním alebo trepaním testovanej chemikálie vo vode na riedenie mechanickým prostriedkom (napr. miešadlom a/alebo ultrazvukom). Na dosiahnutie vhodne koncentrovaného zásobného roztoku možno použiť saturačné kolóny (rozpúšťacie kolóny) alebo pasívne dávkovacie metódy (6). Použitie rozpúšťadla ako nosiča sa neodporúča. Ak je však rozpúšťadlo potrebné, mala by sa súbežne testovať kontrolná skupina s rozpúšťadlom, a to s rovnakou koncentráciou rozpúšťadla, aká je v skupinách s aplikovanou chemikáliou. t. j. úroveň rozpúšťadla by mala byť podľa možnosti rovnaká pri všetkých koncentráciách, ako aj v kontrolnej skupine s rozpúšťadlom. Pri niektorých riediacich systémoch to môže byť technicky náročné, pričom v takom prípade by mala byť koncentrácia rozpúšťadla v kontrolnej skupine s rozpúšťadlom totožná s najvyššou koncentráciou rozpúšťadla v skupine s aplikovanou chemikáliou. Pri ťažko testovateľných látkach by sa mal konzultovať usmerňovací dokument OECD č. 23 o testovaní toxicity ťažko testovateľných látok a zmesí vo vodnom prostredí (2). Ak sa používa rozpúšťadlo, výber rozpúšťadla bude daný chemickými vlastnosťami látky. V pokynoch OECD č. 23 sa odporúča maximálna koncentrácia 100 μl/l. Aby sa predišlo možnému účinku rozpúšťadla na ukazovatele (7), odporúča sa udržovať čo najnižšiu koncentráciu rozpúšťadla. 17. V prípade semistatického testu možno použiť dva rôzne postupy obnovy. Buď sa nové testovacie roztoky pripravia v čistých nádobách a živé vajíčka a larvy sa opatrne prenesú do nových nádob alebo sa testovacie organizmy nechajú v testovacích nádobách a časť (aspoň dve tretiny) objemu testovacieho roztoku/kontrolného roztoku sa vymení. POSTUP Podmienky expozície Trvanie 18. Test by sa mal začať čo najskôr po oplodnení vajíčok a vajíčka by sa podľa možnosti mali ponoriť do testovacích roztokov pred začatím ryhovania blastodisku, alebo čo najskôr po tomto štádiu. Dĺžka testu bude závisieť od použitých druhov. Niektoré odporúčané dĺžky testu sú uvedené v dodatku 2. Nasádzanie 19. Počet oplodnených vajíčok na začiatku testu by mal byť dostatočný na to, aby sa splnili štatistické požiadavky. Mali by byť náhodne rozdelené do skupín s aplikovanou chemikáliou a malo by sa použiť najmenej 80 vajíčok rozdelených v rovnakom množstve najmenej do štyroch paralelných testovacích komôr (replikátov) na každú koncentráciu. Veľkosť násady (množstvo biomasy na objem testovacieho roztoku) by mala byť dosť nízka na to, aby sa počas štádia vajíčka a larválneho štádia mohla koncentrácia rozpusteného kyslíka udržiavať na hodnote najmenej 60 % hodnoty saturácie vzduchom bez prevzdušňovania. Pri prietokových testoch sa neodporúča, aby veľkosť násady v ktoromkoľvek okamihu prekročila 0,5 g/l mokrej hmotnosti počas 24 hodín a prekročila 5 g/l roztoku (3). Svetlo a teplota 20. Fotoperióda a teplota vody by mali byť vhodné pre dané testované druhy (pozri dodatok 2). Kŕmenie 21. Potrava a kŕmenie zohrávajú rozhodujúcu úlohu a je nevyhnutné, aby sa v každom vývojovom štádiu poskytovala správna potrava od vhodného okamihu a v dostatočnom množstve na podporu normálneho rastu. Kŕmenie by malo byť približne rovnaké vo všetkých replikátoch, pokiaľ ho netreba upraviť z dôvodu úmrtnosti. Nadbytočná potrava a výkaly by sa mali podľa potreby odstrániť, aby sa nehromadil odpad. Podrobné kŕmne režimy sú uvedené v dodatku 3, ale s nadobúdaním skúseností sa potrava a kŕmne režimy priebežne vylepšujú s cieľom zvýšiť prežitie a optimalizovať rast. Živá potrava je zdrojom obohatenia prostredia, a preto by sa mala používať namiesto sušenej alebo mrazenej potravy alebo ako jej doplnok, pokiaľ je to vhodné z hľadiska daného druhu a vývojového štádia. Testovacie koncentrácie 22. Spravidla sa vyžaduje päť koncentrácií testovanej chemikálie, minimálne so štyrmi opakovaniami (replikátmi) na koncentráciu, s odstupom daným konštantným faktorom nepresahujúcim hodnotu 3,2. Pokiaľ sú dostupné informácie o testovaní akútnej toxicity, podľa možnosti na tom istom druhu, mali by sa zohľadniť pri výbere rozsahu testovacích koncentrácií a/alebo by sa malo zvážiť vykonanie testu na vyhľadávanie rozsahu (1). Pri výbere rozsahu testovacích koncentrácií by sa však mali zohľadniť všetky zdroje informácií vrátane zdrojov, ako je krížové porovnávanie údajov z testovania akútnej toxicity rybích embryí. Tam, kde sa majú stanoviť len empirické NOEC, môže byť ako konečný test prijateľný limitný test alebo rozšírený limitný test s menej ako piatimi koncentráciami. Použije menej ako piatich koncentrácií by sa malo odôvodniť. Koncentrácia testovanej chemikálie vyššia ako 96 hodín LC50 alebo 10 mg/l a tá, ktorá z nich je nižšia, nemusí byť testovaná. Kontroly 23. Jedna kontrolná skupina s vodou na riedenie a podľa potreby jedna kontrolná skupina s rozpúšťadlom obsahujúca len samotné rozpúšťadlo ako nosič by sa mali testovať ako doplnok k sériám koncentrácií testovanej chemikálie (pozri bod 16). Frekvencia analytických stanovení a meraní 24. Pred spustením expozície by sa bolo treba uistiť, že systém prísunu chemikálie riadne funguje vo všetkých replikátoch (napr. meraním testovacích koncentrácií). Mali by sa určiť požadované analytické metódy vrátane vhodného kvantifikačného limitu (LOQ) a dostatočných znalostí o stabilite látky v testovacom systéme. Počas testu sa koncentrácie testovanej chemikálie stanovujú v pravidelných časových intervaloch s cieľom charakterizovať expozíciu. Potrebných je minimálne päť stanovení. V prietokových systémoch by sa mali aspoň raz za týždeň vykonávať analytické merania testovanej chemikálie v jednom replikáte na koncentráciu so systematickým striedaním replikátov. Ďalšími analytickými stanoveniami sa často zlepší kvalita výsledku testu. Vzorky možno treba filtrovať, aby sa odstránili akékoľvek tuhé častice (napr. použitím filtra s veľkosťou pórov 0,45 μm), alebo odstreďovať, aby sa zaistilo, že sa stanovenia vykonávajú s chemikáliou v skutočnom roztoku. Aby sa znížila adsorpcia testovanej chemikálie, filtre by mali byť pred použitím nasýtené. Keď merané koncentrácie nezostanú na 80 – 120 % nominálnej koncentrácie, účinné koncentrácie by sa mali stanoviť a vyjadriť vo vzťahu k aritmeticky priemernej koncentrácii pre prietokové testy [pozri dodatok 6 testovacej metódy C.20 pre výpočet aritmetického priemeru (8)] a vo vzťahu ku geometrickému priemeru meraných koncentrácií pre semistatické testy [pozri kapitolu 5 v pokynoch OECD o testovaní toxicity zložitých látok a zmesí vo vodnom prostredí (2)]. 25. Počas testu by sa mal vo všetkých testovacích nádobách aspoň raz týždenne merať rozpustený kyslík, pH a teplota a na začiatku a konci testu by sa mala odmerať salinita a tvrdosť, ak je to opodstatnené. Teplota by sa mala podľa možnosti monitorovať kontinuálne aspoň v jednej testovacej nádobe. Pozorovania 26. Štádium embryonálneho vývoja : na začiatku vystavenia testovanej chemikálii by sa embryonálne štádium malo čo najpresnejšie overiť. Toto overenie možno vykonať na reprezentatívnej vzorke vajíčok vhodne uchovaných a vyčistených. 27. Liahnutie a prežitie : pozorovania liahnutia a prežívania by sa mali vykonávať najmenej raz za deň a údaje by sa mali zaznamenať. Ak sa na vajíčkach v rannom štádiu embryonálneho vývoja spozoruje pleseň (napr. v prvý alebo druhý deň testu), takéto vajíčka by sa mali spočítať a odstrániť. Mŕtve embryá, larvy a mlaď by sa mali odstrániť hneď, ako sa spozorujú, lebo sa môžu rýchlo rozkladať a môže ich narušiť činnosť ostatných rýb. Pri odstraňovaní mŕtvych jedincov treba postupovať mimoriadne opatrne, aby nedošlo k fyzickému poškodeniu susedných vajíčok/lariev. Prejavy úhynu sa líšia podľa druhu a vývojového štádia. Napríklad: — u oplodnených vajíčok: predovšetkým v ranných štádiách, výrazná strata priehľadnosti a zmena v zafarbení spôsobené koaguláciou a/alebo zrážaním proteínov, čo vedie k bielemu nepriehľadnému vzhľadu, — u embryí, lariev a mladi: nepohyblivosť a/alebo neprítomnosť respiračných pohybov a/alebo neprítomnosť tlkotu srdca a/alebo strata reakcií na mechanické stimuly. 28. Abnormálny vzhľad : počet lariev alebo mlade prejavujúcich abnormality v tvare tela by sa mal zaznamenávať v primeraných časových intervaloch v závislosti od dĺžky trvania testu a charakteru opísaných abnormalít. Treba poznamenať, že abnormálne larvy a mlaď sa vyskytujú prirodzene a v kontrolných skupinách sa pri niektorých druhoch môžu vyskytnúť v počte rádovo niekoľko percent. Ak sa deformácie a súvisiace abnormálne správanie považujú za tak vážne, že organizmus značne trpí a dosiahol bod, z ktorého sa už nezotaví, možno ho odstrániť z testu. Takéto zvieratá by sa mali usmrtiť a v rámci následnej analýzy údajov by sa mali považovať za uhynuté jedince. Pri väčšine druhov odporúčaných v tejto testovacej metóde bol zaznamenaný normálny embryonálny vývoj (9) (10) (11) (12). 29. Abnormálne správanie : abnormality ako hyperventilácia, nekoordinované plávanie, netypická nehybnosť a netypické správanie pri kŕmení by sa mali zaznamenávať v primeraných časových intervaloch v závislosti od dĺžky trvania testu (napr. raz denne pri teplovodných druhoch). Tieto účinky, hoci ich je ťažké kvantifikovať, môžu (ak sú spozorované) pomôcť pri interpretácii údajov o mortalite. 30. Hmotnosť : na konci testu sa všetky živé ryby odvážia aspoň podľa replikátov (s udaním počtu zvierat v replikáte a priemernej hmotnosti na zviera): uprednostňuje sa mokrá hmotnosť (vytreté do sucha), uvádzať však možno aj údaje o suchej hmotnosti (13). 31. Dĺžka : na konci testu sa zmeria dĺžka jednotlivých jedincov. Odporúča sa celková dĺžka, ak sa však vyskytne hnitie chvostovej plutvy alebo erózia plutvy, možno použiť štandardnú dĺžku. Na všetky ryby v rámci daného testu by sa mala použiť rovnaká metóda. Dĺžku jednotlivých jedincov možno merať buď napr. posuvným meradlom, digitálnym fotoaparátom, alebo kalibrovaným okulárovým mikrometrom. Typické minimálne dĺžky sú uvedené v dodatku 2. ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV Spracovanie výsledkov 32. Odporúča sa, aby návrh experimentu a výber štatistického testu poskytovali dostatočnú silu (80 % alebo viac) na detekciu zmien biologického významu v ukazovateľoch, pri ktorých má byť určený NOEC. Uvedenie príslušných účinných koncentrácií a parametrov môže závisieť od regulačného rámca. Ak sa má zaznamenať hodnota ECx, návrh experimentu a výber regresného modelu by mali umožňovať odhad hodnoty ECx, aby i) 95 % interval spoľahlivosti uvádzaný pre hodnotu ECx neobsahoval nulu a nebol príliš široký; ii) 95 % interval spoľahlivosti pre predpokladanú strednú hodnotu pri ECx neobsahoval strednú hodnotu kontrolnej skupiny; iii) medzi regresným modelom a údajmi nebol významný nesúlad. Pri obidvoch prístupoch sa vyžaduje identifikácia percentuálnej zmeny v každom sledovanom ukazovateli, ktorého zistenie alebo odhad sú dôležité. Návrh experimentu by sa mal prispôsobiť tak, aby to bolo možné. Pokiaľ nie sú uvedené podmienky na stanovenie hodnoty ECx splnené, mal by sa uplatniť prístup založený na NOEC. Nie je pravdepodobné, že rovnaká percentuálna zmena bude platiť pre všetky ukazovatele, a nie je pravdepodobné ani to, že sa podarí navrhnúť uskutočniteľný experiment, ktorý bude spĺňať tieto kritériá pre všetky ukazovatele, preto je v záujme správneho naplánovania experimentu dôležité zamerať sa na ukazovatele, ktoré sú dôležité pre daný experiment. Štatistické vývojové diagramy a návod ku každému prístupu sú k dispozícii v dodatkoch 5 a 6 na poskytnutie usmernenia pri spracovaní údajov a pri výbere najvhodnejšieho štatistického testu alebo modelu. Možno použiť aj iné štatistické prístupy za predpokladu, že sú vedecky podložené. 33. V každom súbore replikátov bude treba analyzovať variabilitu použitím analýzy rozptylu alebo kontingenčnej tabuľky a na základe tejto analýzy použiť vhodné metódy štatistickej analýzy. Aby bolo možné urobiť viacnásobné porovnanie výsledkov pre jednotlivé koncentrácie a kontroly, odporúča sa step-down Jonckheereho-Terpstrov alebo Williamsov test pre spojité hodnoty a step-down Cochranov-Armitageov test pre diskrétne hodnoty, ktoré zodpovedajú monotónnej koncentračnej závislosti bez extra-binomického rozptylu (14). Ak existuje dôkaz o extrabinomickom rozptyle, odporúča sa Raova-Scottova úprava Cochranovho-Armitageovho testu (15) (16) alebo použitie Wiliamsovho alebo Dunnettovho (po transformácii arkussínusovej odmocniny) alebo Jonckheereho-Terpstrovho testu na jednotlivé replikáty. Ak údaje nezodpovedajú monotónnej koncentračnej závislosti, pre spojité hodnoty môže byť užitočná Dunnettova, Dunnova alebo Mannova-Whitneyho metóda a pre diskrétne hodnoty Fisherov exaktný test (14) (17) (18). Pri použití akejkoľvek štatistickej metódy alebo modelu treba postupovať opatrne, aby sa zaistilo splnenie požiadaviek metódy alebo modelu (napr. odhadne sa variabilita medzi komorami a zohľadní sa pri navrhovaní experimentu a použitom teste alebo modeli). Treba zhodnotiť normalitu údajov, pričom v dodatku 5 sa uvádza, čo by sa malo vykonať s rezíduami z ANOVA. V dodatku 6 sa hovorí o ďalších aspektoch regresného prístupu. Mali by sa zvážiť transformácie na splnenie požiadaviek štatistického testu. Pri transformáciách s cieľom umožniť zavedenie regresného modelu však treba postupovať mimoriadne opatrne, keďže, napríklad, 25 % zmena v netransformovanej reakcii nezodpovedá 25 % zmene v transformovanej reakcii. Vo všetkých analýzach je jednotkou analýzy a experimentálnou jednotkou testovacia komora, nie jednotlivé ryby, čo by sa malo zohľadniť pri testoch hypotéz aj pri regresii (3) (14) (19) (20). Skúšobný protokol 34. Skúšobný protokol by mal zahŕňať tieto informácie: Testovaná chemikália: Jednozložková látka — fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode a ďalšie relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti; — chemická identifikácia ako názov IUPAC alebo názov CAS, CAS číslo, kód SMILES alebo InChI, štruktúrny vzorec, čistota, chemická identita nečistôt podľa vhodnosti a praktickej realizovateľnosti atď. (prípadne vrátane obsahu organického uhlíka). Viaczložková látka, UVCB a zmesi: — čo najviac charakterizované, napr. chemickou identitou (pozri vyššie), kvantitatívnym výskytom a príslušnými fyzikálno-chemickými vlastnosťami zložiek. Testovaný druh: — vedecký názov, kmeň, zdroj a spôsob zberu oplodnených vajíčok a následná manipulácia. Podmienky testovania: — použitý postup testovania (napr. semistatický alebo prietokový, nasádzanie), — fotoperióda(-y), — návrh štúdie (napr. počet testovacích komôr a replikátov, počet vajíčok na replikát, materiál a veľkosť testovacej komory (výška, šírka, objem), objem vody na testovaciu komoru), — metóda prípravy zásobných roztokov a frekvencia obnovy (ak bol použitý solubilizačný prostriedok, mal by sa uviesť spolu s jeho koncentráciou), — metóda dávkovania testovanej chemikálie (napr. čerpadlá, riediace systémy), — miera výťažnosti metódy a nominálne testovacie koncentrácie, kvantifikačný limit, stredné hodnoty meraných hodnôt a ich štandardné odchýlky v testovacích nádobách a metóda, ktorou boli dosiahnuté, a dôkaz, že sa namerané hodnoty týkajú koncentrácií testovanej chemikálie v pravom roztoku, — vlastnosti vody na riedenie: pH, tvrdosť vody, teplota, koncentrácia rozpusteného kyslíka, úroveň zvyškového chlóru (ak bola meraná), celkový obsah organického uhlíka (ak bol meraný), suspendované tuhé látky (ak boli merané), salinita v testovacom prostredí (ak bola meraná) a akékoľvek iné vykonané merania, — kvalita vody v testovacích nádobách: pH, tvrdosť, teplota a koncentrácia rozpustného kyslíka, — podrobné informácie o kŕmení (napr. druh potravy, zdroj, dávkované množstvo a frekvencia). Výsledky uvádzané jednotlivo (alebo podľa replikátov) a ako priemer a variačný koeficient, podľa potreby, pre tieto ukazovatele: — dôkaz, že v kontrolných skupinách bola splnená norma celkovej prípustnosti prežitia testovaných druhov (dodatok 2), — údaje o úmrtnosti v každom štádiu (embryo, larva a mlaď) a o kumulovanej úmrtnosti, — dni potrebné na vyliahnutie, počty lariev vyliahnutých každý deň a koniec liahnutia, — počet zdravých rýb na konci testu, — údaje o dĺžke (uviesť buď štandardnú alebo celkovú) a hmotnosti zvierat, ktoré prežili, — incidencia, opis a počet morfologických abnormalít, ak sa nejaké vyskytli, — incidencia, opis a počet účinkov na správanie, ak sa nejaké vyskytli, — prístup uplatnený pri štatistickej analýze (regresná analýza alebo analýza rozptylu) a spracovaní údajov (použitý štatistický test alebo model), — koncentráciu bez pozorovaného účinku pre každú posudzovanú reakciu (NOEC), — najnižšia koncentrácia s pozorovaným účinkom (pri p = 0,05) pre každú posudzovanú reakciu (LOEC); — hodnota ECx pre každú posudzovanú reakciu, v prípade potreby, a intervaly spoľahlivosti (napr. 90 % alebo 95 %) a graf zavedeného modelu použitého na jej výpočet, sklon krivky koncentračnej závislosti, vzorec regresného modelu, odhadované parametre modelu a ich štandardné chyby. Akákoľvek odchýlka od testovacej metódy. Diskusia o výsledkoch vrátane akéhokoľvek vplyvu odchýlok od testovacej metódy na výsledok testu. Tabuľka 1 Druhy rýb odporučené na testovanie SLADKOVODNÉ RYBY RYBY Z ÚSTÍ a MORSKÉ RYBY Oncorhynchus mykiss pstruh dúhový Cyprinodon variegatus kaprozúbka diamantová Pimephales promelas čerebľa potočná Menidia sp. menídia pobrežná Danio rerio danio pruhované Oryzias latipes ryžovníčka japonská LITERATÚRA 1. OECD (2012), Fish Toxicity Testing Framework, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.171, OECD, Paris. 2. OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment. No. 23, OECD Paris. 3. ASTM (1988), Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials, E 1241-88. 26 pp. 4. Brauhn, J.L. a R.A. Schoettger (1975), Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel catfish and Bluegills, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota. 5. Brungs, W.A. a B.R. Jones (1977), Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota. 6. Adolfsson-Erici, et al. (2012), A flow-through passive dosing system for continuously supplying aqueous solutions of hydrophobic chemicals to bioconcentration and aquatic toxicity tests, Chemosphere 86, 593-599. 7. Hutchinson, T.H. et al. (2006), Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review, Aquatic Toxicology, 76, 69-92. 8. Chapter C.20 of this Annex, Daphnia magna Reproduction Test. 9. Hansen, D.J. a P.R. Parrish (1977), Suitability of sheepshead minnows (Cyprindon variegatus) for life-cycle toxicity tests, In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.L. Mayer a J.L. Hamelink), ASTM STP 634. 10. Kimmel, H. B.et al. (1995), Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics, 203:253–310. 11. Gonzalez-Doncel, M. et al. (2005), A quick reference guide to the normal development of Oryzias latipes (Teleostei, Adrinichthydae) Journal of Applied Ichthyology, 20:1–14. 12. Devlin, E.W. et al. (1996), Prehatching Development of the Fathead Minnow, Pimephales promelas Rafinesque. EPA/600/R-96/079. USEPA, Office of Research and Development, Washington, D.C.. 13. Oris, J.T., S.C. Belanger, a A.J. Bailer, (2012), Baseline characteristics and statistical implications for the OECD 210 Fish Early Life Stage Chronic Toxicity Test, Environmental Toxicology and Chemistry 31; 2, 370 – 376. 14. OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.54, OECD, Paris. 15. Rao, J.N.K. a A.J. Scott (1992), A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585. 16. Rao, J.N.K. a A.J. Scott (1999), A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385. 17. Dunnett C.W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of Ameican Statistical Association, 50, 1096-1121. 18. Dunnett C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491. 19. Rand, G.M. a S.R. Petrocelli (1985), Fundamentals of Aquatic Toxicology. Hemisphere Publication Corporation, New York. 20. McClave, J.T., J.H. Sullivan a J.G. Pearson (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data, Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia. Dodatok 1 DEFINÍCIE Vidlicová dĺžka (FL): označuje dĺžku od špičky rypáka po koniec stredných lúčov chvostových plutiev a používa sa pri rybách, pri ktorých je ťažké rozoznať, kde končí chrbtica (www.fishbase.org). Štandardná dĺžka (SL): označuje dĺžku ryby meranú od špičky rypáka po zadný koniec posledného stavca alebo po zadný koniec stredu bočnej časti hypurálnej kosti. Jednoducho povedané, v tomto rozmere nie je zahrnutá dĺžka chvostovej plutvy (www.fishbase.org). Celková dĺžka (TL): označuje dĺžku od špičky rypáka po koniec dlhšieho laloka chvostovej plutvy, spravidla meranú s lalokmi stlačenými pozdĺž stredovej čiary. Je to priamočiary rozmer, nemeraný cez zakrivenie tela (www.fishbase.org). Obrázok 1 Opis rôznych používaných dĺžok Chemikália: látka alebo zmes ECx: (Účinná koncentrácia pre x % účinok) je koncentrácia, ktorá počas daného trvania expozície vyvolá x % účinok na testované organizmy v porovnaní s kontrolnou skupinou. Napríklad EC50 je koncentrácia, pri ktorej sa odhaduje, že počas vymedzenej doby expozície vyvolá účinok na sledovaný ukazovateľ testu v 50 % exponovanej populácie. Najnižšia koncentrácia s pozorovaným účinkom (LOEC) je najnižšia testovaná koncentrácia testovanej chemikálie, pri ktorej je účinok chemikálie štatisticky významný (pri p < 0,05) v porovnaní s kontrolnou chemikáliou. Škodlivý účinok všetkých testovaných koncentrácií nad LOEC by však mal byť rovnaký alebo väčší ako účinok pozorovaný pri LOEC. Ak nie sú splnené tieto dve podmienky, treba poskytnúť úplné vysvetlenie spôsobu, akým sa zvolila LOEC (a teda aj NOEC). V dodatkoch 5 a 6 sa uvádza návod. Koncentrácia bez pozorovaného účinku (NOEC) je testovaná koncentrácia chemikálie ihneď pod LOEC, ktorá pri porovnaní s kontrolnou chemikáliou nemá štatisticky významný účinok (p < 0,05) počas daného trvania expozície. Testovaná chemikália: Každá látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy. UVCB: látky neznámeho alebo variabilného zloženia, produkty komplexných reakcií alebo biologické materiály. IUPAC: Medzinárodná únia pre čistú a aplikovanú chémiu. SMILES: zjednodušený systém zadávania molekulárnych štruktúr. Dodatok 2 PODMIENKY A TRVANIE TESTU A KRITÉRIÁ PREŽITIA U ODPORUČENÝCH DRUHOV RÝB DRUH PODMIENKY TESTU ODPORÚČANÉ TRVANIE TESTU Typická minimálna priemerná celková dĺžka kontrolných rýb na konci štúdie (mm) (98) PREŽITIE KONTROLNÝCH SKUPÍN (minimum) Teplota (°C) Salinita (0/00) Fotoperióda (hod.) Úspešné vyliahnutie Počet vyliahnutých lariev, ktoré prežili Sladkovodné: Oncorhynchus mykiss pstruh dúhový 10 ± 1,5 (99) 12 – 16 (100) 2 týždne po tom, ako kontrolné skupiny začnú prijímať potravu (alebo 60 dní po vyliahnutí) 40 75 % 75 % Pimephales promelas čerebľa potočná 25 ± 1,5 16 32 dní od začiatku testu (alebo 28 dní po vyliahnutí) 18 70 % 75 % Danio rerio danio pruhované 26 ± 1,5 12 – 16 (101) 30 dní po vyliahnutí 11 70 % 75 % Oryzias latipes ryžovníčka japonská 25 ± 2 12 – 16 (101) 30 dní po vyliahnutí 17 80 % 80 % Ryby z ústí a morské ryby: Cyprinodon variegatus kaprozúbka diamantová 25 ± 1,5 15 – 35 (102) 12 – 16 (101) 32 dní od začiatku testu (alebo 28 dní po vyliahnutí) 17 75 % 80 % Menidia sp. menídia pobrežná 22 – 25 15 – 35 (102) 13 28 dní 20 80 % 60 % Dodatok 3 NÁVOD NA KŔMENIE GENERAČNÝCH A TESTOVANÝCH ZVIERAT ODPORÚČANÝCH DRUHOV A NA MANIPULÁCIU S NIMI DRUH POTRAVA (*9) ČAS PRENOSU PO VYLIAHNUTÍ ČAS DO PRVÉHO KŔMENIA Generačné ryby Novo vyliahnuté larvy Mlaď Typ Frekvencia Sladkovodné: Oncorhynchus mykiss pstruh dúhový potrava pre pstruhy žiadna (1) štartovacia potrava pre pstruhy, BSN 2 – 4 kŕmenia denne 14 – 16 dní po vyliahnutí alebo pri vyplávaní (nie rozhodujúce) 19 dní po vyliahnutí alebo pri vyplávaní Pimephales promelas čerebľa potočná BSN, vločkové krmivo, FBS BSN BSN48, vločkové krmivo 2 – 3-krát denne po vyliahnutí 90 % vajíčok 2 dni po vyliahnutí Danio rerio danio pruhované BSN, vločkové krmivo Komerčné krmivo pre larvy, prvoky (2), bielkoviny (3) BSN48, vločkové krmivo, BSN raz denne; vločkové krmivo dvakrát denne po vyliahnutí 90 % vajíčok 2 dni po vyliahnutí Oryzias latipes ryžovníčka japonská vločkové krmivo BSN, vločkové krmivo (alebo prvoky alebo vírniky) BSN48, vločkové krmivo (alebo vírniky) BSN raz denne; vločkové krmivo dvakrát denne alebo vločkové krmivo a vírniky raz denne neuplatňuje sa 6 – 7 dní po vytretí Ryby z ústí a morské ryby: Cyprinodon variegatus kaprozúbka diamantová BSN, vločkové krmivo, FBS BSN BSN48 2 – 3 kŕmenia denne neuplatňuje sa 1 deň po vyliahnutí/pri vyplávaní Menidia sp. menídia pobrežná BSN48, vločkové krmivo BSN BSN48 2 – 3 kŕmenia denne neuplatňuje sa 1 deň po vyliahnutí/pri vyplávaní Dodatok 4 NIEKTORÉ CHEMICKÉ VLASTNOSTI VODY VHODNEJ NA RIEDENIE Zložka Hraničná koncentrácia Tuhé častice 5 mg/l Celkový obsah organického uhlíka 2 mg/l Neionizovaný amoniak 1 μg/l Zvyškový chlór 10 μg/l Celkový obsah organofosfátových pesticídov 50 ng/l Celkový obsah organochlórových pesticídov a polychlórovaných bifenylov 50 ng/l Celkový obsah organického chlóru 25 ng/l Hliník 1 μg/l Arzén 1 μg/l Chróm 1 μg/l Kobalt 1 μg/l Meď 1 μg/l Železo 1 μg/l Olovo 1 μg/l Nikel 1 μg/l Zinok 1 μg/l Kadmium 100 ng/l Ortuť 100 ng/l Striebro 100 ng/l Dodatok 5 ŠTATITICKÉ USMERNENIE NA STANOVENIE NOEC Všeobecné informácie Jednotkou analýzy je nádrž s replikátom. To znamená, že pre kontinuálne merania, ako je veľkosť, by sa mala vypočítať priemerná alebo mediánová hodnota replikátu a tieto hodnoty replikátu sa stanú údajmi pre analýzu. Mala by sa preukázať sila vykonávaných testov, najlepšie na základe príslušnej historickej databázy pre každé laboratórium. Pre každý ukazovateľ by sa mal poskytnúť účinok na veľkosť, ktorý možno zistiť so 75 – 80 % silou, a to spolu so štatistickým testom, ktorý sa má použiť. Podľa databáz dostupných v čase vypracúvania tejto testovacej metódy sa určí sila, ktorá je možná na základe odporúčaných štatistických postupov. Jednotlivé laboratóriá by mali preukázať svoju schopnosť splniť túto požiadavku na silu buď vykonaním svojej vlastnej analýzy sily alebo preukázaním toho, že variačný koeficient (CV) pre žiadnu reakciu neprekračuje 90. percentil CV použitých pri vypracúvaní usmernení na vykonávanie testov. V tabuľke 1 sú uvedené tieto CV. Ak sú k dispozícii len priemerné alebo mediánové hodnoty replikátu, CV v rámci replikátu možno ignorovať. Tabuľka 1 90. percentil CV pre zvolené sladkovodné druhy Druh Reakcia CV_medzi replikátmi CV_v rámci replikátov Pstruh dúhový dĺžka 17,4 9,8 hmotnosť 10,1 28 Čerebľa potočná dĺžka 16,9 13,5 hmotnosť 11,7 38,7 Danio pruhované dĺžka 43,7 11,7 hmotnosť 11,9 32,8 Takmer pri všetkých štatistických testoch používaných na vyhodnocovanie laboratórnych toxikologických štúdií majú dôležitosť porovnania skupín s aplikovanou chemikáliou s kontrolnými skupinami. Preto nie je vhodné pred použitím Dunnettovho alebo Williamsovho testu požadovať významný ANOVA F-test alebo pred použitím Jonckheereho-Terpstrovho, Mannovho-Whitneyho alebo Dunnovho testu požadovať významný Kruskalov-Wallisov test (Hochberg a Tamhane 1987, Hsu 1996, Dunnett 1955, 1964, Williams 1971, 1972, 1975, 1977, Robertson et al. 1988, Jonckheere 1954, Dunn 1964). Dunnettov test má v sebe zabudovanú úpravu mnohopočetnosti a na jeho mieru falošných pozitívnych a falošných negatívnych nálezov má nepriaznivý vplyv použitie F-testu ako kontrolného testu. Podobne sa step-down Williamsovým a Jonckheereho-Terpstrovým testom trendu používajúcimi v každom kroku úroveň významnosti 0,05 zachováva celková 5 % miera falošných pozitívnych nálezov a túto mieru a silu testov nepriaznivo ovplyvňuje používanie F-testu alebo Kruskalovho-Wallisovho testu ako kontrolného testu. Mannov-Whitneyho a Dunnov test sa musí upraviť na mnohopočetnosť, pričom sa odporúča Bonferroniho-Holmova úprava. Dôkladná diskusia o väčšine odporúčaní k testovaniu hypotéz a overovaniu predpokladov, z ktorých tieto testy vychádzajú, je uvedená v dokumente OECD z roku 2006, kde sa takisto uvádza rozsiahla bibliografia. Spracovanie kontrolných skupín pri použití rozpúšťadla Kontrolná skupina s vodou na riedenie aj kontrolná skupina s rozpúšťadlom by sa mali zahrnúť, ak sa používa rozpúšťadlo. V týchto dvoch kontrolných skupinách sa porovná každá reakcia a, ak sa medzi nimi nezistí žiadny významný rozdiel, skombinujú sa na účely štatistickej analýzy. Inak by sa na stanovenie NOEC alebo odhad ECx mala použiť kontrolná skupina s rozpúšťadlom a kontrolná skupina s vodou sa nepoužije. Pozri obmedzenia v kritériách platnosti (bod 7). Pokiaľ ide o dĺžku, hmotnosť, pomer vyliahnutia vajíčok, úmrtnosti lariev alebo abnormálnych lariev a prvý alebo posledný deň liahnutia alebo vyplávanie, na porovnanie kontrolnej skupiny s vodou na riedenie a kontrolnej skupiny s rozpúšťadlom pri 0,05 hladine významnosti by sa mal použiť T-test alebo Mannov-Whitneyho test, pričom by sa mali ignorovať všetky skupiny s aplikovanou chemikáliou. Výsledky týchto testov by sa mali uviesť. Merania veľkosti (dĺžka a hmotnosť) Hodnoty dĺžky a hmotnosti jednotlivých rýb môžu byť rozložené normálne alebo logaritmicko-normálne. V obidvoch prípadoch majú stredné hodnoty replikátov tendenciu byť rozložené normálne v zmysle centrálnej limitnej vety a potvrdené z údajov z vyše 100 štúdií ELS troch sladkovodných druhov. Alternatívne tam, kde z údajov alebo historických databáz vyplýva logaritmicko-normálne rozdelenie hodnôt veľkostí jednotlivých rýb, možno vypočítať logaritmus priemernej veľkosti jednotlivých rýb replikátov a ako údaje pre analýzu možno potom použiť antilogaritmy týchto logaritmov priemernej hodnoty replikátov. Údaje by sa mali vyhodnotiť z hľadiska konzistencie s normálnym rozložením a homogenitou rozptylu. Na tento účel by sa mali použiť reziduá z modelu ANOVA s koncentráciou ako jedinou vysvetľujúcou triednou premennou. Možno použiť vizuálne stanovenie z korelačných (bodových) grafov a histogramov alebo stonkových a listových (tzv. stem-and-leaf) grafov. Alternatívne možno použiť neformálny test, ako je Shapirov-Wilkov test alebo Andersonov-Darlingov test. Konzistentnosť s homogenitou rozptylu možno posúdiť na základe vizuálneho preskúmania toho korelačného (bodového) grafu alebo formálne z Levenovho testu. Len parametrické testy (napr. Williamsov, Dunnettov) treba vyhodnotiť z hľadiska normality alebo homogenity rozptylu. Mala by sa venovať pozornosť možným extrémnym hodnotám (outlier) a ich účinku na analýzu. Možno použiť Tukeyho test extrémnych hodnôt a vizuálnu kontrolu tých istých už opísaných diagramov reziduí. Treba pripomenúť, že pozorovaniami sú celé replikáty, takže k vypusteniu extrémnej hodnoty z analýzy by sa malo pristúpiť len po dôkladnom zvážení. Štatistické testy, pri ktorých sa používajú charakteristiky návrhu experimentu a biologické očakávania, sú step-down testmi trendu, ako sú Williamsov a Jonckheereho-Terpstrov test. Tieto testy predpokladajú monotónnu koncentračnú závislosť a malo by sa posúdiť, či sú údaje v súlade s týmto predpokladom. To možno vykonať vizuálne z korelačného (bodového) grafu vzťahu medzi priemernými hodnotami replikátov a koncentráciami. Tento korelačný (bodový) graf by bolo vhodné prekryť úsekovým lineárnym grafom spájajúcim priemerné koncentrácie vážené veľkosťou vzorky replikátu. Veľká odchýlka tohto úsekového lineárneho diagramu od monotónnosti by naznačovala možnú potrebu použitia netrendových testov. Alternatívne možno použiť formálne testy. Jednoduchým formálnym testom je vypočítanie lineárnych a kvadratických kontrastov priemerných koncentrácií. Ak je kvadratický kontrast významný a lineárny kontrast nie je významný, naznačuje to možný problém s monotónnosťou, ktorej ďalšie hodnotenie by sa malo uskutočniť na základe diagramov. Ak môžu normalita alebo homogenita rozptylu predstavovať problém, možno tieto kontrasty zostaviť z údajov transformovaných podľa poradia. Možno použiť alternatívne postupy, ako je Bartholomewov test monotónnosti, pridávajú však na zložitosti. Obrázok 2 Vývojový diagram NOEC s meraniami veľkosti (dĺžka a hmotnosť) Pokiaľ nie sú údaje v súlade s požiadavkami týchto testov, NOEC sa stanoví uplatnením step-down Williamsovho alebo Jonckheereho-Terpstrovho testu trendu. V dokumente OECD z roku 2006 sa uvádzajú podrobnosti k tomuto postupu. Pre údaje, ktoré nie sú v súlade s požiadavkami na step-down test trendu, možno použiť Dunnettov test alebo Tamhaneho-Dunnettov (T3) test, z ktorých obidva majú zabudované úpravy pre mnohopočetnosť. Tieto testy predpokladajú normalitu a, v prípade Dunnettovho testu, homogenitu rozptylu. Ak nie sú tieto podmienky splnené, možno použiť Dunnov neparametrický test. V dokumente OECD z roku 2006 sa uvádzajú podrobnosti ku všetkým týmto testom. Na obrázku 2 je uvedený prehľad o tom, ako vybrať test. Vyliahnutie vajíčok a prežitie lariev Údaje predstavujú pomery vajíčok, z ktorých sa vyliahnu larvy, alebo lariev, ktoré prežijú v jednotlivých replikátoch. Pri týchto pomeroch by sa mal posúdiť extrabinomický rozptyl, ktorý je pri takýchto nameraných hodnotách bežný, ale nie univerzálny. Vývojový diagram na obrázku 3 poskytuje usmernenie k voľbe testu; podrobné opisy nájdete v texte. Bežne sa používajú dva testy. Sú to Taroneho test C(α) (Tarone, 1979) a chí-kvadrát testy, každý použitý osobitne na každú testovaciu koncentráciu. Ak sa extrabinomický rozptyl zistí čo i len pri jednej testovacej koncentrácii, mali by sa použiť metódy, ktoré ho berú do úvahy. Vzorec 1 Taroneho test C(α) (Tarone, 1979) kde ̂ je priemerný pomer pre danú koncentráciu, m je počet nádrží s replikátom, nj je počet subjektov v replikáte j a xj je počet reagujúcich subjektov v danom replikáte, teda nie vyliahnutých alebo mŕtvych. Tento test sa použije na každú koncentráciu osobitne. Tento test možno považovať za upravený chí-kvadrát test, ale obmedzené simulácie sily, ktoré vykonal Tarone, ukázali, že má väčšiu silu ako chí-kvadrát test. Obrázok 3 Vývojový diagram NOEC pre vyliahnutie a úmrtnosť lariev Tam, kde neexistuje žiadny významný dôkaz extrabinomického rozptylu, možno použiť step-down Cochranov-Armitageov test. Pri tomto teste sa ignorujú replikáty, takže tam, kde existuje dôkaz o takomto rozptyle, sa odporúča Raova-Scottova úprava Cochranovho-Armitageovho testu, ktorá zohľadňuje replikáty, veľkosti replikátov a extrabinomický rozptyl. Alternatívne testy zahŕňajú step-down Williamsov test, Jonckheereho-Terpstrov test a Dunnettov test, ako sa uvádza pri meraniach veľkosti. Tieto testy sa používajú bez ohľadu na existenciu extrabinomického rozptylu, ale majú o niečo menšiu silu (Agresti 2002, Morgan 1992, Rao and Scott 1992, 1999, Fung et al. 1994, 1996). Prvý alebo posledný deň liahnutia alebo vyplávanie Reakcia je celé číslo udávajúce, ktorý deň došlo k pozorovaniu uvedeného javu v danej nádrži s replikátom. Rozsah hodnôt je všeobecne veľmi obmedzený a často je vysoký pomer viazaných hodnôt, napr. vo všetkých kontrolných replikátoch je pozorovaný ten istý prvý deň liahnutia a možno aj v jednej alebo dvoch nízkych testovacích koncentráciách. Parametrické testy ako Williamsov a Dunnettov nie sú na takéto údaje vhodné. Pokiaľ neexistuje dôkaz o vážnej nemonotónnosti, je na zistenie účinkov testovanej chemikálie veľmi vhodný step-down Jonckheereho-Terpstrov test trendu. Inak možno použiť Dunnov test. Abnormality lariev Reakciou je počet lariev, u ktorých sa zistí nejaká forma abnormality. Táto reakcia má často malý výskyt a spája sa s rovnakými problémami ako prvý deň liahnutia, a takisto niekedy vykazuje nepravidelnosť v koncentračnej závislosti. Ak údaje aspoň zhruba sledujú monotónny tvar koncentrácie, je na zistenie účinkov vhodný step-down Jonckheereho-Terpstrov test trendu. Inak možno použiť Dunnov test. ODKAZY Agresti, A. (2002); Categorical Data Analysis, second edition, Wiley, Hoboken. Dunnett C. W. (1955); A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control, J. American Statistical Association 50, 1096-1121. Dunn O. J. (1964 ); Multiple Comparisons Using Rank Sums, Technometrics 6, 241-252. Dunnett C. W. (1964); New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics 20, 482-491. Fung, K.Y., D. Krewski, J.N.K. Rao, A.J. Scott (1994); Tests for Trend in Developmental Toxicity Experiments with Correlated Binary Data, Risk Analysis 14, 639-648. Fung, K.Y, D. Krewski, R.T. Smythe (1996); A comparison of tests for trend with historical controls in carcinogen bioassay, Canadian Journal of Statistics 24, 431-454. Hochberg, Y. and A. C. Tamhane (1987); Multiple Comparison Procedures, Wiley, New York. Hsu, J.C. (1996); Multiple Comparisons: Theory and Methods; Chapman and Hall/CRC Press, Boca Raton. Jonckheere A. R. (1954); A distribution-free k-sample test against ordered alternatives, Biometrika 41, 133. Morgan, B.J.T. (1992). Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London. OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series on Testing and Assessment, No. 54. Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris. Rao J.N.K. and Scott A.J. (1992) – A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585. Rao J.N.K. and Scott A.J. (1999) – A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385. Robertson, T., Wright F.T. and Dykstra R.L. (1988). Order restricted statistical inference, Wiley. Tarone, R.E. (1979). Testing the goodness of fit of the Binomial distribution, Biometrika 66, 585-590. Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics 27, 103-117. Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics 28, 519-531. Williams D. A. (1975). The Analysis of Binary Responses from Toxicological Experiments Involving Reproduction and Teratology, Biometrics 31, 949-952. Williams D.A. (1977). Some inference procedures for monotonically ordered normal means, Biometrika 64, 9-14. Dodatok 6 ŠTATISTICKÉ USMERNENIE NA STANOVENIE REGRESNÝCH ODHADOV Všeobecné informácie Pozorovania použité na zavedenie modelu sú stredné hodnoty replikátov (dĺžka a hmotnosť) alebo pomery replikátov (počet vyliahnutých vajíčok a úmrtnosť lariev) (OECD, 2006). Všeobecne sa odporúča vážená regresia s použitím veľkosti vzorky replikátu ako váhy. Možno použiť ďalšie systémy váženia, napríklad váženie predpokladanou priemernou reakciou alebo kombináciou tohto systému a veľkosti vzorky replikátu. Váženie recipročnou hodnotou rozptylu vzorky v rámci koncentrácie sa neodporúča (Bunke et al. 1999, Seber a Wild, 2003, Motulsky and Christopoulos 2004, Huet et al. 2003). Pri akejkoľvek transformácii reakcií pred analýzou by sa mala zachovať nezávislosť pozorovaní a hodnoty ECx a jej hranice spoľahlivosti by sa mali vyjadriť v pôvodných meracích jednotkách, nie v transformovaných jednotkách. Napríklad 20 % zmena v logaritme dĺžky nie je ekvivalentná 20 % zmene dĺžky (Lyles et.al 2008, Draper a Smith 1999). Vývojový diagram na obrázku 4 poskytuje prehľad odhadov ECx. Podrobnosti sú opísané v ďalšom texte. Obrázok 4 Vývojový diagram odhadov ECx priemernej dĺžky, hmotnosti alebo pomeru vyliahnutých lariev alebo úmrtnosti lariev replikátu, ďalšie podrobnosti nájdete v texte Úvahy v súvislosti s liahnutím vajíčok a úmrtnosťou lariev Pokiaľ ide o liahnutie vajíčok a úmrtnosť lariev, vo všeobecnosti je najlepšie zaviesť klesajúci model, pokiaľ sa nezavádza probitový model podľa ďalej uvedeného opisu. To znamená, že by sa mal vytvoriť model pomeru vajíčok, z ktorých sa nevyliahnu larvy, alebo lariev, ktoré uhynú. Dôvodom je to, že hodnota ECx sa vzťahuje na koncentráciu, pri ktorej dochádza k zmene rovnajúcej sa x % priemernej reakcie kontrolnej skupiny. Ak je v kontrolnej skupine 5 % vajíčok, z ktorých sa nevyliahnu larvy, a ak sa na základe toho vytvorí model nevyliahnutia, potom sa EC20 vzťahuje na koncentráciu, pri ktorej je šanca rovnajúca sa 20 % z 5 % nevyliahnutí lariev v kontrolnej skupine, čo predstavuje zmenu 0,2 * 0,05 = 0,01 alebo 1 percentuálneho bodu do 6 % nevyliahnutia lariev. Takúto malú zmenu nemožno odhadnúť žiadnym zmysluplným spôsobom z dostupných údajov a nie je biologicky významná. Ak sa však vytvára model pomeru vajec, z ktorých sa vyliahnu larvy, pomer kontrolnej skupiny by bol v tomto príklade 95 % a 20 % pokles z priemernej hodnoty kontrolnej skupiny by predstavoval zmenu 0,95 * 0,2 = 0,18, takže z 95 % úspešného vyliahnutia na 77 % (= 95 – 18) úspešné vyliahnutie, pričom túto účinnú koncentráciu možno odhadnúť a má pravdepodobne väčší význam. Nejde o problém s nameranými hodnotami veľkosti, hoci nepriaznivé účinky na veľkosť spravidla znamenajú zníženie veľkosti. Modely pre veľkosť (dĺžku alebo hmotnosť) a úspešné vyliahnutie vajíčok alebo prežitie lariev. Okrem Brainovho-Cousensovho hormetického modelu sa všetky tieto modely opisujú a odporúčajú v dokumente OECD z roku 2006. V súvislosti s modelmi nazývanými OECD 2-5 sa Slobova práca z roku 2002 takisto zaoberá experimentmi na ekotoxicitu. Existuje, samozrejme, mnoho iných modelov, ktoré môžu byť užitočné. Bunke, et al. (1999) uvádzajú početný zoznam modelov, ktoré tu nie sú zahrnuté, a existuje mnoho odkazov na ďalšie modely. Modely uvedené ďalej sa odporúčajú ako zvlášť vhodné v experimentoch na ekotoxicitu a často sa používajú. S 5 testovacími koncentráciami plus kontrolou — Bruceov-Versteegov model, — jednoduchý exponenciálny model (OECD 2), — exponenciálny model s parametrom tvaru (OECD 3), — jednoduchý exponenciálny model s dolnou hranicou (OECD 4). So 6 testovacími koncentráciami plus kontrolou — exponenciálny model s parametrom tvaru a dolnou hranicou (OECD 5), — Michaelisov-Mentenovej model, — Hillov model. Ak existuje vizuálny dôkaz hormézy (nepravdepodobné pri úspešnom vyliahnutí alebo prežití lariev, ale občas ju možno zaznamenať pri pozorovaní veľkosti) — Brainov-Cousensov hormetický model; Brain a Cousens (1989). Alternatívne modely pre nevyliahnutie vajíčok a úmrtnosť lariev — Na stúpajúce modely pre tieto reakcie možno použiť probitové (alebo logistické) modely, ak neexistuje žiadny dôkaz extrabinomického rozptylu a odhad výskytu v kontrole je súčasťou zavedeného modelu. Toto nie je uprednostňovaná metóda, pretože za jednotku analýzy považuje jedinca, nie replikát (Morgan 1992, O'Hara Hines a Lawless 1993, Collett 2002, 2003). Vhodnosť zavedenia jedného modelu — Vizuálne porovnajte pozorovaný a predpokladaný percentuálny pokles pri každej testovacej koncentrácii (Motulsky a Christopoulos 2004, Draper a Smith 1999). — Porovnajte strednú kvadratickú chybu regresie s čistou strednou kvadratickou chybou pomocou F-testu (Draper a Smith 1999). — Skontrolujte, či sa každý člen v modeli významne líši od nuly (t. j. určte, či sú všetky členy modelu dôležité), (Motulsky a Christopoulos 2004). — Diagramy reziduí z regresie oproti testovacej koncentrácii, pokiaľ možno na logaritmickej stupnici (koncentrácia). Tento diagram by nemal mať žiadny vzor, body by mali byť náhodne rozptýlené okolo horizontálnej línie v nulovej výške. — Údaje by sa mali vyhodnotiť z hľadiska normality a homogenity rozptylu rovnako, ako sa uvádza v dodatku 5. — Okrem toho by sa mala posúdiť normalita reziduí v rámci regresného modelu tými istými metódami, ktoré sú uvedené v dodatku 5 pre reziduá z ANOVA. Porovnajte modely — Použite Akaikeho AICc kritériá. Menšie hodnoty AICc označujú lepšie zavedené modely a, ak AICc(B) – AICc(A) ≥ 10, model A je takmer určite lepší ako model B (Motulsky a Christopoulos 2004). — Porovnajte tieto dva modely vizuálne na základe toho, ako dobre spĺňajú uvedené kritériá jedného modelu. — Odporúča sa princíp úspornosti, na základe ktorého sa použije najjednoduchší model, ktorý primerane dobre zodpovedá údajom (Ratkowsky 1993, Lyles et.al 2008). Kvalita odhadu hodnoty ECx Interval spoľahlivosti (CI) pre hodnotu ECx by nemal byť príliš široký. Na rozhodnutie o tom, aký široký môže byť interval spoľahlivosti, aby bola hodnota ECx stále užitočná, je potrebný štatistický úsudok. Simulácie pre regresné modely prispôsobené údajom o liahnutí a veľkosti ukazujú, že okolo 75 % intervalov spoľahlivosti pre ECx (x=10, 20 alebo 30) zahŕňa nie viac ako dve testovacie koncentrácie. To poskytuje všeobecný návod na to, čo je prijateľné, a praktický návod na to, čo možno dosiahnuť. Mnohí autori tvrdia, že treba uvádzať intervaly spoľahlivosti pre všetky parametre modelu a že široké intervaly spoľahlivosti pre parametre modelov poukazujú na neprijateľné modely (Ott a Longnecker 2008, Alvord a Rossio 1993, Motulsky a Christopoulos 2004, Lyles et al. 2008, Seber a Wild 2003, Bunke et al. 1999, Environment Canada 2005). CI pre ECx (alebo akýkoľvek iný parameter modelu) by nemal obsahovať nulu (Motulsky a Christopoulos 2004). Toto je v regresnom modeli ekvivalent minimálneho významného rozdielu, ktorý sa často cituje v prístupoch k testovaniu hypotéz (napr. Wang et al 2000). Takisto zodpovedá intervalu spoľahlivosti pre stredné reakcie pri LOEC neobsahujúcej priemernú hodnotu kontroly. Treba sa zamyslieť nad tým, či sú odhady parametrov vedecky možné. Napr. ako interval spoľahlivosti pre y0 je ±20 %, žiadny odhad EC10 nie je hodnoverný. Ak model predpokladá 20 % účinok pri koncentrácii C a maximálny pozorovaný účinok pri C a nižších koncentráciách je 10 %, potom hodnota EC20 nie je hodnoverná (Motulsky and Christopoulos 2004, Wang et al. 2000, Environment Canada 2005). Hodnota ECx by si nemala vyžadovať extrapoláciu mimo rozsahu pozitívnych koncentrácií (Draper a Smith 1999, OECD 2006). Napríklad všeobecným návodom by mohlo byť, že hodnota ECx by nemala byť viac než okolo 25 % pod najnižšou testovanou koncentráciou alebo nad najvyššou testovanou koncentráciou. ODKAZY Alvord, W.G., Rossio, J.L. (1993). Determining confidence limits for drug potency in immunoassay, Journal of Immunological Methods 157, 155-163. Brain P. a Cousens R. (1989). An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed res. 29: 93 – 96. Bunke, O., Droge, B. a Polzehl, J. (1999). Model selection, transformations and variance estimation in nonlinear regression. Statistics 33, 197-240. Collett, D. (2002). Modelling Binary Data, second edition, Chapman and Hall, London. Collett, D. (2003). Modelling Survival Data in Medical Research, second edition, Chapman and Hall, London. Draper, N.R. a Smith, H. (1999). Applied Regression Analysis, third edition. New York: John Wiley & Sons. Environment Canada (2005). Guidance Document on Statistical Methods for Environmental Toxicity Tests, Report EPS 1/RM/46 Huet, S., A. Bouvier, M.-A. Poursat, E. Jolivet (2003). Statistical Tools for Nonlinear Regression: A Practical Guide with S-PLUS and R Examples, Springer Series in Statistics, New York. Lyles, R. H., C. Poindexter, A. Evans, M. Brown, a C.R. Cooper (2008). Nonlinear Model-Based Estimates of IC50 for Studies Involving Continuous Therapeutic Dose-Response Data, Contemp Clin Trials. 2008 November; 29(6): 878 – 886. Morgan, B.J.T. (1992). Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London. Motulsky, H., A. Christopoulos (2004). Fitting Models to Biological Data Using Linear and Nonlinear Regression: A Practical Guide to Curve Fitting, Oxford University Press, USA. O'Hara Hines, R. J. a J. F. Lawless (1993). Modelling Overdispersion in Toxicological Mortality Data Grouped over Time, Biometrics Vol. 49, pp. 107-121 OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series Testing and Assessment, No. 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris. Ott, R.L., M.T. Longnecker, An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, sixth edition, 2008, Brooks-Cole, Belmont, CA Ratkowsky, D.A. (1993). Principles of nonlinear regression, Journal of Industrial Microbiology 12, 195-199. Seber, G.A.F., C.J. Wild, Nonlinear Regression, Wiley, 2003 Slob W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci., 66, 298-312 Wang, Q., D.L. Denton, a R. Shukla (2000). Applications and Statistical Properties Of Minimum Significant Difference-Based Criterion Testing In a Toxicity Testing Program, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 19, pp. 113–117, 2000. C.48 Krátkodobý reprodukčný test na rybách ÚVOD 1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 229 (2012). Potreba vypracovať a validovať test na rybách schopný odhaliť chemikálie s účinkom na endokrinný systém vychádza z obavy, že úroveň týchto chemikálií v životnom prostredí môže mať škodlivé účinky na ľudí aj na voľne žijúce živočíchy v dôsledku pôsobenia týchto chemikálií na endokrinný systém. Organizácia OECD v roku 1998 iniciovala aktivitu s vysokou prioritou s cieľom zrevidovať existujúce usmernenia a vypracovať nové usmernenia na vykonávanie skríningu a testov potenciálnych endokrinných disruptorov. Jednou zložkou tejto aktivity bolo vypracovanie usmernenia na vykonávanie testov pre skríning chemikálií s účinkom na endokrinný systém určitých druhov rýb. Krátkodobý reprodukčný test na rybách podstúpil rozsiahly program validácie pozostávajúci z medzilaboratórnych štúdií s vybranými chemikáliami na preukázanie relevantnosti a spoľahlivosti testu na odhalenie chemikálií, ktoré rôznymi mechanizmami vplývajú na reprodukciu rýb vrátane zmien endokrinného systému (1, 2, 3, 4, 5). Všetky ukazovatele usmernenia OECD na vykonávanie testov boli validované na čerebli potočnej a podmnožina ukazovateľov bola validovaná na ryžovníčke japonskej (medaka) (t. j. vitelogenín a sekundárne pohlavné znaky) a na daniu pruhovanom (t. j. vitelogenín). Validácia bola čiastočne partnersky preskúmaná panelom odborníkov menovaných národnými koordinátormi programu OECD pre usmernenia na vykonávanie testov (6) a nezávislým panelom odborníkov, ktorých si objednala Agentúra Spojených štátov na ochranu životného prostredia (29). Tento test nie je určený na identifikáciu špecifických mechanizmov hormonálneho narušenia, lebo testované zvieratá majú intaktnú os hypotalamus – hypofýza – gonády (HHG), ktorá môže reagovať na ovplyvňujúce chemikálie na rôznych úrovniach. 2. Táto testovacia metóda opisuje skríningový test in vivo, v rámci ktorého sa pohlavne dospelí samci a neresiace sa samice rýb držia spolu a vystavia sa pôsobeniu chemikálie počas obmedzenej etapy ich životného cyklu (21 dní). Po skončení 21-dňovej expozície sa u samcov a samíc odmerajú dva biomarkerové ukazovatele ako indikátory endokrinnej aktivity testovanej chemikálie; týmito ukazovateľmi sú vitelogenín a sekundárne pohlavné znaky. Vitelogenín sa meria pri čerebli potočnej, ryžovníčke japonskej a daniu pruhovanom, zatiaľ čo sekundárne pohlavné znaky iba pri čerebli potočnej a ryžovníčke japonskej. Okrem toho sa počas testu denne monitoruje kvantitatívna plodivosť. Gonády sú takisto zachované a na posúdenie reprodukčného zdravia testovaných zvierat a zvýšenie váhy dôkazov iných ukazovateľov možno vyhodnotiť histopatológiu. 3. Tento biologický test slúži ako skríningový test in vivo a jeho použitie by sa malo posudzovať v kontexte „Koncepčného rámca OECD na testovanie a hodnotenie chemikálií ako endokrinných disruptorov“ (30). V tomto koncepčnom rámci sa krátkodobý reprodukčný test na rybách navrhuje na úrovni 3 ako test in vivo poskytujúci údaje o vybranom endokrinnom mechanizme(-och)/endokrinnej ceste(-ách). POČIATOČNÉ ÚVAHY A OBMEDZENIA 4. Vitelogenín (VTG) sa spravidla vytvára v pečeni samíc vajcorodých stavovcov ako reakcia na cirkulujúci endogénny estrogén. Je to prekurzor proteínov vaječného žĺtka a po vzniku v pečeni sa krvným obehom dostáva k vaječníkom, ktoré ho prijmú a modifikujú v procese tvorby vajíčok. Vitelogenín je takmer nezistiteľný v plazme nedospelých samíc a samcov rýb, pretože nemajú dostatok cirkulujúceho estrogénu; ich pečeň je však schopná syntetizovať a vylučovať vitelogenín v prípade stimulácie exogénnym estrogénom. 5. Meranie vitelogenínu slúži na zisťovanie chemikálií s rôznymi estrogénnymi mechanizmami pôsobenia. Estrogénne chemikálie možno zisťovať meraním indukcie vitelogenínu v telách samcov rýb, čo bolo veľakrát zdokumentované v partnersky preskúmanej vedeckej literatúre [napr. (7)]. Indukcia vitelogenínu sa preukázala aj po vystavení pôsobeniu aromatizovateľných androgénov (8, 9). Zníženie úrovne cirkulácie estrogénu v telách samíc, napríklad v dôsledku inhibície aromatázy konverziou endogénneho androgénu na prírodný estrogén 17β-estradiol, spôsobuje pokles úrovne VTG, čo sa používa na zisťovanie chemikálií s vlastnosťami inhibície aromatázy (10, 11). Biologický význam reakcie vitelogenínu na estrogénne pôsobenie alebo inhibíciu aromatázy je preukázaný a vo veľkej miere zdokumentovaný. Je však možné, že tvorbu VTG v telách samíc môže ovplyvňovať aj všeobecná toxicita a iné ako endokrinné toxické mechanizmy pôsobenia, napríklad hepatotoxicita. 6. Viaceré metódy merania boli úspešne vyvinuté a štandardizované na bežné použitie. Je tak aj v prípade druhovo špecifických metód enzýmového imunosorbentového stanovenia (ELISA) využívajúcich imunochémiu na kvantifikáciu VTG produkovaného v malých vzorkách krvi alebo pečene odobratých z jednotlivých rýb (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18). Na meranie VTG sa odoberajú vzorky krvi čereble potočnej, krvi alebo homogenátu hlavy/chvosta dania pruhovaného a pečene ryžovníčky japonskej. V prípade ryžovníčky japonskej existuje dobrá korelácia medzi VTG meraným z krvi a z pečene (19). Dodatok 6 obsahuje odporúčané postupy odberu vzoriek na analýzu VTG. Súpravy na meranie VTG sú bežne dostupné, pričom by tieto súpravy mali byť založené na validovanej druhovo špecifickej metóde ELISA. 7. Sekundárne pohlavné znaky samcov určitých druhov rýb sú zvonku viditeľné, kvantifikovateľné a citlivé na cirkulujúce úrovne endogénnych androgénov. Týka sa to čereble potočnej a ryžovníčky japonskej, ale nie dania pruhovaného, ktoré nemá kvantifikovateľné sekundárne pohlavné znaky. Samice si udržiavajú schopnosť vývoja samčích sekundárnych pohlavných znakov, ak sú vystavené pôsobeniu androgénnym chemikáliám vo vode. Vo vedeckej literatúre sú k dispozícii viaceré štúdie dokumentujúce tento typ reakcie pri jedincoch druhu čereble potočnej (20) a ryžovníčky japonskej (21). Interpretácia úbytku sekundárnych pohlavných znakov pri samcoch by mala byť opatrná vzhľadom na nízku štatistickú silu a mala by byť založená na odbornom posudku a závažnosti dôkazov. Použitie dania pruhovaného v rámci tohto testu je obmedzené, keďže nemá kvantifikovateľné sekundárne pohlavné znaky citlivé na androgénne účinky chemikálií. 8. V prípade čereble potočnej je hlavným indikátorom pôsobenia exogénneho estrogénu počet tuberkulov nachádzajúcich sa na rypáku samíc rýb. V prípade ryžovníčky japonskej predstavuje hlavný marker exogénneho pôsobenia androgénnych chemikálií na samice rýb počet papilárnych výbežkov. V dodatkoch 5A a 5B sú uvedené odporúčané postupy, ktoré treba dodržiavať pri hodnotení vývoja pohlavných znakov čereble potočnej, a ryžovníčky japonskej, v uvedenom poradí. 9. 21-dňový test na rybách zahŕňa vyhodnotenie kvantitatívnej produkcie vajíčok a zachovanie gonád na voliteľné histopatologické vyšetrenie. Niektoré regulačné orgány môžu vyžadovať tento dodatočný ukazovateľ na kompletnejšie vyhodnotenie reprodukčného zdravia testovaných zvierat alebo v prípadoch, keď vitelogenín a sekundárne pohlavné znaky nereagovali na vystavenie chemikálii. Hoci niektoré ukazovatele môžu mať vysokú diagnostickú hodnotu (napr. indukcia VTG u samcov a tvorba tuberkulov u samíc), nie všetky ukazovatele (napr. plodivosť a histopatológia gonád) v teste majú jednoznačne identifikovať špecifické bunkové mechanizmy pôsobenia. Súbor ukazovateľov skôr kolektívne umožňuje vyvodzovanie záverov v súvislosti s možnými narušeniami endokrinného systému, a teda poskytujú usmernenie na ďalšie testovanie. Hoci plodivosť nie je endokrinologicky špecifická, v dôsledku jej preukázanej citlivosti na mnohé známe chemikálie s účinkom na endokrinný systém (5) ju treba zahrnúť ako dôležitý ukazovateľ, pretože keď zostane spoločne s inými ukazovateľmi neovplyvnená, je väčšia istota, že zlúčenina pravdepodobne nemá účinok na endokrinný systém. Keď je však plodivosť ovplyvnená, významne prispeje pri vyvodzovaní záverov o váhe dôkazov. Návod na interpretáciu údajov a na uznanie výsledkov testu je uvedený ďalej v rámci tejto testovacej metódy. 10. Definície použité v tejto testovacej metóde sú uvedené v dodatku 1. PRINCÍP TESTU 11. V rámci skúšky sa samci a samice rýb v reprodukčnom stave spoločne vystavia pôsobeniu chemikálie v testovacích nádobách. Ich stav dospelosti a reprodukčný stav umožňuje jasné rozlíšenie obidvoch pohlaví, a teda analýzu každého sledovaného ukazovateľa s ohľadom na pohlavie, a zabezpečuje ich citlivosť na exogénne chemikálie. Po ukončení testu sa pohlavie potvrdí makroskopickým skúmaním gonád po ventrálnom otvorení brušnej dutiny nožnicami. Prehľad príslušných podmienok biologickej analýzy je uvedený v dodatku 2. Skúška sa spravidla začína výberom vzorky rýb z populácie, ktorá je v stave neresenia, pričom by sa nemali používať starnúce živočíchy. Usmernenie týkajúce sa veku rýb a ich reprodukčného stavu sa uvádza v časti o výbere rýb. Test sa vykonáva s použitím troch expozičných koncentrácií chemikálie, ako aj s kontrolnou skupinou s vodou a, ak je to potrebné, s kontrolnou skupinou s rozpúšťadlom. Pri daniu pruhovanom sa používajú dve nádoby alebo replikáty na jednu úroveň aplikácie chemikálie (každá nádoba obsahuje 5 samcov a 5 samíc). Pri čerebli potočnej sa používajú štyri nádoby alebo replikáty na jednu úroveň aplikácie chemikálie (každá nádoba obsahuje 2 samcov a 4 samice). Ide o zohľadnenie teritoriálneho správania samcov čereble potočnej pri súčasnom zachovaní dostatočnej sily testu. Pri ryžovníčke japonskej sa používajú štyri nádoby alebo replikáty na jednu úroveň aplikácie chemikálie (každá nádoba obsahuje 3 samcov a 3 samice). Expozícia trvá 21 dní a odber vzoriek rýb sa vykoná v 21. deň expozície. Kvantitatívna plodivosť sa monitoruje denne. 12. Pre odber vzoriek v 21. deň sa všetky živočíchy humánne usmrtia. Sekundárne pohlavné znaky sa zisťujú pri čerebli potočnej a ryžovníčke japonskej (pozri dodatok 5A a dodatok 5B); na stanovenie VTG v tele dania pruhovaného a čereble potočnej sa odoberú vzorky krvi, pričom alternatívne možno na stanovenie VTG v tele dania pruhovaného odobrať hlavy/chvosty (dodatok 6); na analýzu VTG v tele ryžovníčky japonskej sa odoberie pečeň (dodatok 6); gonády sa fixujú buď v celku alebo rozrezané na možné histopatologické vyhodnotenie (22). AKCEPTAČNÉ KRITÉRIÁ TESTU 13. Na to, aby boli výsledky testu prijateľné, musia byť splnené tieto podmienky: — úmrtnosť v kontrolných skupinách s vodou (alebo s rozpúšťadlom) na konci trvania expozície by nemala prekročiť hodnotu 10 %, — koncentrácia rozpusteného kyslíka by mala byť počas trvania expozície aspoň 60 % hodnoty saturácie vzduchom (ASV), — teplota vody by sa v žiadnom okamihu počas expozície nemala líšiť o viac ako ± 1,5 °C medzi testovacími nádobami a mala by sa udržiavať v rozsahu 2 °C v rámci teplotných rozsahov špecifikovaných pre daný testovaný druh (dodatok 2), — malo by byť preukázateľné, že koncentrácia testovanej chemikálie v roztoku bola uspokojivo udržiavaná v rozsahu ± 20 % stredných nameraných hodnôt, — malo by byť preukázané, že ryby sa aktívne neresia vo všetkých replikátoch pred začatím chemickej expozície a v kontrolných replikátoch počas testu. OPIS METÓDY Prístrojové vybavenie 14. Bežné laboratórne vybavenie, a najmä tieto zariadenia: a) zariadenie na meranie kyslíka a pH meter; b) zariadenie na stanovenie tvrdosti a alkality vody; c) vhodné zariadenie na reguláciu teploty a podľa možnosti na kontinuálne monitorovanie; d) nádrže z chemicky inertného materiálu a vhodného objemu vo vzťahu k odporúčanej veľkosti násady a chovnej hustote (pozri dodatok 2); e) substrát na neresenie pre čerebľu potočnú a danio pruhované (potrebné údaje sú uvedené v dodatku 4); f) dostatočne presné váhy (t. j. s presnosťou na ±0,5 mg). Voda 15. Každú vodu, v ktorej testovaný druh vykazuje vyhovujúco dlhotrvajúce prežívanie a rast, možno použiť na testovanie, Mala by mať konštantnú kvalitu počas celého trvania testu. pH vody by mal byť v rozsahu od 6,5 do 8,5, ale počas daného testu by mal byť v rozsahu ± 0,5 jednotky pH. S cieľom zabezpečiť, aby voda na riedenie nemala prílišný vplyv na výsledok testu (napr. tvorbou komplexu testovanej chemikálie), v určitých intervaloch by sa z nej mali odoberať vzorky. Ak je známe, že voda na riedenie má relatívne stálu kvalitu, zisťovanie ťažkých kovov (napr. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd a Ni), hlavných aniónov a katiónov (napr. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl-a SO4 2-), pesticídov (napr. celkového obsahu organofosfátových a organochlórových pesticídov), celkového obsahu organického uhlíka a suspendovaných tuhých látok by sa malo vykonávať napríklad každé tri mesiace. Ak sa preukázalo, že kvalita vody je stabilná najmenej počas jedného roka, merania možno vykonávať menej často a časové intervaly medzi nimi možno predĺžiť (napr. na každých šesť mesiacov). Niektoré chemické vlastnosti vody vhodnej na riedenie sú uvedené v dodatku 3. Testovacie roztoky 16. Testovacie roztoky vybraných koncentrácií sa pripravujú riedením zásobného roztoku. Zásobný roztok by sa mal podľa možností pripraviť jednoduchým miešaním alebo trepaním testovanej chemikálie vo vode na riedenie mechanickým prostriedkom (napr. miešadlom alebo ultrazvukom). Na dosiahnutie zásobného roztoku vhodnej koncentrácie možno použiť saturačné kolóny (rozpúšťacie kolóny). Použitie rozpúšťadla ako nosiča sa neodporúča. Ak je však rozpúšťadlo potrebné, mala by sa súbežne pripraviť kontrolná skupina s rozpúšťadlom s rovnakou koncentráciou rozpúšťadla, aká je v skupinách s aplikovanou chemikáliou. Pri ťažko testovateľných chemikáliách by mohlo byť rozpúšťadlo technicky najlepším riešením, mal by sa však konzultovať usmerňovací dokument OECD o testovaní toxicity zložitých látok a zmesí vo vodnom prostredí (23). Výber rozpúšťadla bude daný chemickými vlastnosťami látky alebo zmesi. V usmerňovacom dokumente OECD sa odporúča maximálna hodnota 100 μl/l, ktorá by sa mala dodržiavať. Nedávny prieskum (24) však poukázal na ďalšie problémy pri používaní rozpúšťadiel v rámci testovania endokrinného pôsobenia. Preto sa v prípadoch, keď je použitie rozpúšťadla potrebné, odporúča minimalizovať jeho koncentráciu všade tam, kde je to technicky možné (v závislosti od fyzikálno-chemických vlastností testovanej chemikálie). 17. Používať sa bude prietokový testovací systém. Takýmto systémom sa kontinuálne rozdeľuje a riedi zásobný roztok testovanej chemikálie (napr. dávkovacím čerpadlom, proporcionálnym zrieďovačom, saturačným systémom) s cieľom dodať sériu koncentrácií do testovacích komôr. Prietoky zásobných roztokov a vody na riedenie by sa mali počas testu kontrolovať v určitých intervaloch, najlepšie denne, a ich hodnoty by sa nemali v priebehu celého testu meniť viac ako o 10 %. Pozornosť by sa mala venovať tomu, aby sa nepoužívali potrubia z plastov s nízkym stupňom kvality alebo z iných materiálov, ktoré môžu obsahovať biologicky aktívne chemikálie. Pri výbere materiálu pre prietokový systém by sa mala zvážiť možná adsorpcia testovanej chemikálie na tento materiál. Chov rýb 18. Testované ryby by sa mali vyberať z laboratórnej populácie, podľa možnosti z jednej zásoby, ktorá sa aklimatizovala najmenej dva týždne pred testom v podobných podmienkach, pokiaľ ide o kvalitu vody a osvetlenie, aké sa použijú v rámci testu. Je dôležité, aby veľkosť násady a chovná hustota (definície sú uvedené v dodatku 1) boli vhodné pre použitý testovaný druh (pozri dodatok 2). 19. Po 48-hodinovej privykacej (adaptačnej) fáze sa zaznamená úmrtnosť a uplatnia sa tieto kritériá: — úmrtnosť počas siedmich dní prevyšuje 10 % populácie: celá násada sa vyradí, — úmrtnosť 5 % až 10 % populácie: aklimatizovať ďalších sedem dní; ak je úmrtnosť počas uvedených ďalších siedmich dní vyššia ako 5 %, celá násada sa vyradí, — úmrtnosť je počas siedmich dní nižšia ako 5 % populácie: násada sa akceptuje. 20. Ryby by nemali byť podrobené liečeniu chorôb počas aklimatizácie, v období pred expozíciou, ani počas expozície. Obdobie pred expozíciou a výber rýb 21. Odporúča sa, aby sa zvieratá umiestnili do nádob podobných tým, ktoré sa použijú v rámci skutočného testu, na obdobie jedného až dvoch týždňov pred expozíciou. Ryby by sa mali kŕmiť ad libitum počas celého obdobia chovu a počas fázy expozície. Fáza expozície sa začína s pohlavne dimorfnými dospelými rybami z laboratórnej zásoby reprodukčne zrelých zvierat (napr. s jasne viditeľnými sekundárnymi pohlavnými znakmi v prípade čereble potočnej a ryžovníčky japonskej) vo fáze aktívneho neresenia. Tieto údaje slúžia iba ako všeobecné usmernenie (a nemali by sa brať do úvahy izolovane od pozorovania skutočného reprodukčného stavu danej dávky rýb). Čereble potočné by mali byť približne v 20. (± 2) týždni života za predpokladu, že počas celého života boli chované pri teplote 25 ± 2 °C. Ryžovníčky japonské by mali byť približne v 16. (± 2) týždni života za predpokladu, že počas celého života boli chované pri teplote 25 ± 2 °C. Dania pruhované by mali byť približne v 16. (± 2) týždni života za predpokladu, že počas celého života boli chované pri teplote 26 ± 2 °C. Produkcia vajíčok by sa mala v období pred expozíciou posudzovať denne. Pred zahrnutím nádrží s replikátmi do expozičnej fázy testu sa odporúča pozorovať neresenie vo všetkých vo všetkých z nich. Pokiaľ ide o dennú produkciu vajíčok, v tomto štádiu nie je možné poskytnúť kvantitatívne usmernenie, je však pomerne bežné pri každom druhu pozorovať priemerné neresenie > 10 vajíčok/samica/deň. S cieľom zaistiť vyvážené rozloženie replikátov by sa podľa objemu produkcie vajíčok mal použiť náhodný blokový návrh, v rámci ktorého by sa replikáty pridelili na rôzne experimentálne úrovne. PLÁN ŠTÚDIE 22. Používajú sa tri koncentrácie testovanej chemikálie, jedna kontrolná skupina (s vodou), a ak je to potrebné, jedna kontrolná skupina s rozpúšťadlom. Údaje možno analyzovať s cieľom určiť štatisticky významné rozdiely medzi reakciami v skupinách s aplikovanou chemikáliou a v kontrolných skupinách. Tieto analýzy skôr poskytnú informáciu o tom, či je potrebné ďalšie dlhodobé testovanie nepriaznivých účinkov chemikálie (a to na prežitie, rozvoj, rast a reprodukciu), než o ich použiteľnosti na účely hodnotenia rizika (25). 23. V prípade dania pruhovaného sa 21. deň testu u samcov a samíc na každej úrovni aplikácie chemikálie (5 samcov a 5 samíc v každom z dvoch replikátov) a v kontrolných skupinách odoberú vzorky na meranie vitelogenínu. V prípade ryžovníčky japonskej sa 21. deň testu u samcov a samíc na každej úrovni aplikácie chemikálie (3 samcov a 3 samíc v každom zo štyroch replikátov) a v kontrolných skupinách odoberú vzorky na meranie vitelogenínu a na preskúmanie sekundárnych pohlavných znakov. V prípade čereble potočnej sa 21. deň expozície u samcov a samíc (2 samcov a 4 samíc v každom zo štyroch replikátov) a v kontrolných skupinách odoberú vzorky na meranie vitelogenínu a na preskúmanie sekundárnych pohlavných znakov. Vyžaduje sa kvantitatívne hodnotenie plodivosti a gonádne tkanivá by sa mali fixovať v celku alebo rozrezané na možné histopatologické vyhodnotenie, v prípade potreby. Výber testovacích koncentrácií 24. Na účely tohto testu by sa najvyššia testovacia koncentrácia mala stanoviť vo výške maximálnej tolerovanej koncentrácie (MTC), ktorá sa určí testom na zistenie rozsahu alebo z iných údajov o toxicite, alebo vo výške 10 mg/l, alebo na základe maximálnej rozpustnosti vo vode podľa toho, ktorá hodnota je najnižšia. MTC je definovaná ako najvyššia testovacia koncentrácia chemikálie, ktorá spôsobuje úmrtnosť nižšiu ako 10 %. Pri tomto prístupe sa predpokladá, že existujú empirické údaje o akútnej toxicite alebo iné údaje o toxicite, na základe ktorých je možné odhadnúť hodnotu MTC. Odhad hodnoty MTC môže byť nepresný a spravidla sa vyžaduje určitý odborný posudok. 25. Potrebné sú tri testovacie koncentrácie s konštantným faktorom rozstupu nepresahujúcim hodnotu 10 a kontrolná skupina s vodou na riedenie (v prípade potreby aj kontrolná skupina s rozpúšťadlom). Odporúčaná hodnota faktoru rozstupu by mala byť v rozsahu od 3,2 do 10. POSTUP Výber a váženie testovaných rýb 26. Je dôležité hneď na začiatku testu minimalizovať variabilitu hmotnosti rýb. Vhodný rozsah veľkostí pre jednotlivé druhy rýb odporučený na tento test je uvedený v dodatku 2. Pre celý súbor rýb použitých v rámci testu platí, že rozsah individuálnych hmotností samcov a samíc na začiatku testu by sa mal držať podľa možnosti v rozsahu ± 20 % aritmetického priemeru hmotnosti jedincov rovnakého pohlavia. Odporúča sa odvážiť aj čiastkovú vzorku zásoby rýb pred testom, aby bolo možné odhadnúť priemernú hmotnosť. Podmienky expozície Trvanie 27. Test trvá 21 dní nasledujúcich po období pred expozíciou. Odporúčané obdobie pred expozíciou je jeden až dva týždne. Kŕmenie 28. Ryby by sa mali kŕmiť ad libitum vhodnou potravou (dodatok 2) dostatočne často, aby sa udržiaval ich telesný stav. Treba dbať na to, aby sa predišlo rastu mikroorganizmov a zakaleniu vody. Ako všeobecné usmernenie platí, že dennú dávku možno rozdeliť do dvoch alebo troch rovnakých porcií podávaných vo viacerých kŕmeniach za deň, pričom jednotlivé kŕmenia majú byť oddelené najmenej trojhodinovými prestávkami. Jedna väčšia porcia je prijateľná najmä počas víkendov. Ryby by sa nemali kŕmiť počas 12 hodín pred odberom vzoriek/pitvou. 29. Potrava pre ryby by sa mala vyhodnotiť z hľadiska prítomnosti kontaminantov, ako sú organochlórové pesticídy, polycyklické aromatické uhľovodíky (PAU), polychlórované bifenyly. Vylúčiť by sa mala potrava so zvýšenou úrovňou fytoestrogénov, ktorá by ovplyvnila reakciu pri teste v dôsledku známych agonistov estrogénu (napr. 17β- estradiol). 30. Nezožraná potrava a fekálny materiál by sa mali odstraňovať z testovacích nádob najmenej dvakrát týždenne, napríklad dôkladným vyčistením dna každej nádrže odsávaním. Svetlo a teplota 31. Fotoperióda a teplota vody by mali byť vhodné pre dané testované druhy (pozri dodatok 2). Frekvencia analytických stanovení a meraní 32. Pred spustením expozície treba zabezpečiť riadne fungovanie systému prísunu chemikálie. Pripraviť by sa mali všetky potrebné analytické metódy vrátane dostatočných vedomostí o chemickej stabilite v testovacom systéme. Počas testu sa koncentrácie testovanej chemikálie určujú v pravidelných intervaloch takto: prietoky riedidla a zásobného roztoku toxickej látky by sa mali kontrolovať podľa možnosti denne, ale minimálne dvakrát za týždeň, a nemali by sa počas celého testu meniť viac ako o 10 %. Odporúča sa merať skutočné koncentrácie testovanej chemikálie vo všetkých nádobách na začiatku testu a potom v týždenných intervaloch. 33. Odporúča sa, aby výsledky vychádzali z nameraných koncentrácií. Ak bola koncentrácia testovanej chemikálie v roztoku uspokojivo udržiavaná v rozsahu ± 20 % nominálnej koncentrácie počas celého testu, výsledky môžu vychádzať buď z nominálnych, alebo z nameraných hodnôt. 34. Vzorky je možno potrebné filtrovať (napr. cez filter s veľkosťou pórov 0,45 μm) alebo odstreďovať. V prípade potreby je odstreďovanie odporúčaným postupom. Ak sa však testovaný materiál neadsorbuje na filtri, aj filtrácia je prijateľná. 35. Počas testu by sa najmenej raz za týždeň mala merať koncentrácia rozpusteného kyslíka, teplota a hodnota pH vo všetkých testovacích nádobách. Najmenej raz za týždeň by sa mala merať celková tvrdosť vody a alkalita v kontrolných nádobách a v jednej nádobe s najvyššou koncentráciou. Teplota by sa mala podľa možnosti monitorovať kontinuálne aspoň v jednej testovacej nádobe. Pozorovania 36. V priebehu alebo na konci testu sa posudzujú viaceré všeobecné (napr. prežitie) a biologické reakcie (napr. úroveň VTG). Vyžaduje sa denné kvantitatívne monitorovanie plodivosti. Meranie a hodnotenie týchto ukazovateľov a ich využitie sú opísané v ďalších bodoch. Prežitie 37. Ryby by sa mali počas testovacieho obdobia denne prehliadnuť, každý úhyn by sa mal zaznamenať a uhynutá ryba čo najskôr odstrániť. Mŕtve ryby by sa nemali nahrádzať ani v kontrolných nádobách, ani v nádobách s aplikovanou chemikáliou. Pohlavie rýb, ktoré uhynuli počas testu, by sa malo určiť makroskopickým hodnotením gonád. Správanie a vzhľad 38. Akékoľvek abnormálne správanie (v porovnaní s kontrolnými skupinami) by sa malo zaznamenať; môže ísť o príznaky všeobecnej toxicity vrátane hyperventilácie, nekoordinovaného plávania, straty rovnováhy a atypickej nehybnosti alebo atypického kŕmenia. Okrem toho by sa mali zaznamenať aj vonkajšie abnormality (ako napríklad krvácanie, strata farby). Takéto príznaky toxicity by sa mali starostlivo zvážiť pri interpretácii údajov, lebo môžu naznačovať existenciu koncentrácií, pri ktorých biomarkery endokrinného pôsobenia nie sú spoľahlivé. Takéto pozorovania správania môžu poskytovať aj užitočné kvalitatívne informácie na vypracovanie potenciálnych budúcich požiadaviek na vykonávanie testov s rybami. Napríklad, v prípade normálnych samcov a maskulinizovaných samíc čereble potočnej vystavených androgénnemu pôsobeniu bola pozorovaná teritoriálna agresivita; v prípade dania pruhovaného sa po vystavení estrogénnemu alebo antiandrogénnemu pôsobeniu znižuje alebo brzdí charakteristická aktivita pri párení a neresení po navodení svetelných podmienok svitania. 39. Keďže niektoré aspekty vzhľadu (predovšetkým farba) sa môžu rýchlo zmeniť pri manipulácii, je dôležité, aby sa kvalitatívne pozorovania vykonávali pred vybratím živočíchov z testovacieho systému. Doterajšie skúsenosti s druhom čereble potočnej naznačujú, že niektoré chemikálie s účinkom na endokrinný systém môžu najskôr vyvolať zmeny týchto vonkajších znakov: farba tela (svetlá alebo tmavá), vzorované sfarbenie (prítomnosť zvislých pruhov) a tvar tela (hlavová a prsná oblasť). Pozorovania fyzického vzhľadu rýb by sa preto mali vykonávať v priebehu celého testu a na záver štúdie. Plodivosť 40. Denné kvantitatívne pozorovania neresenia by sa mali zaznamenávať podľa replikátov. Produkcia vajíčok by sa mala zaznamenávať ako počet vajíčok/samicu, ktorá prežila/deň podľa replikátov. Vajíčka sa budú z testovacích komôr odstraňovať denne. V prípade čereble potočnej a dania pruhovaného by sa mali substráty na neresenie umiestniť do testovacej komory, aby sa rybám umožnilo neresiť sa v normálnych podmienkach. V dodatku 4 sa uvádzajú ďalšie podrobnosti o odporúčaných substrátoch na neresenie pre danio pruhované (dodatok 4A) a čerebľu potočnú (dodatok 4B). Poskytnutie substrátu na neresenie pre ryžovníčku japonskú sa nepovažuje za nevyhnutné. Humánne usmrcovanie rýb 41. V 21. deň, t. j. po ukončení expozície, by sa ryby mali usmrtiť primeraným množstvom trikaínu [trikaín metán sulfonát, Metacain, MS-222 (CAS 886-86-2)], 100 – 500 mg/l, tlmeného pridaním 300 mg/l NaHCO3 (hydrogenuhličitan sodný, CAS 144-55-8) na zníženie podráždenia slizníc; potom sa odoberú vzorky krvi alebo tkaniva na stanovenie VTG, ako je vysvetlené v časti o vitelogeníne. Pozorovanie sekundárnych pohlavných znakov 42. Niektoré chemikálie s účinkom na endokrinný systém môžu vyvolávať zmeny špecializovaných sekundárnych pohlavných znakov (počet tuberkulov u samcov čereble potočnej, papilárnych výbežkov u samcov ryžovníčky japonskej). Najmä chemikálie s určitými mechanizmami pôsobenia môžu vyvolávať abnormálny výskyt sekundárnych pohlavných znakov u zvierat opačného pohlavia; napríklad agonisty androgénových receptorov, ako sú trenbolón, metyltestosterón a dihydrotestosterón, môžu spôsobovať vyvinutie výrazných tuberkulov u samíc čereble potočnej alebo papilárnych výbežkov u samíc ryžovníčky japonskej (11, 20, 21). Uvádza sa takisto, že agonisty estrogénových receptorov môžu znížiť počet tuberkulov a veľkosť záhlavnej časti chrbta u dospelých samcov čereble potočnej (26, 27). Takéto celkové morfologické pozorovania môžu poskytovať užitočné kvalitatívne a kvantitatívne informácie na vypracovanie potenciálnych budúcich požiadaviek na vykonávanie testov s rybami. Počet a veľkosť tuberkulov u čereble potočnej a papilárnych výbežkov u ryžovníčky japonskej možno kvantifikovať priamo alebo praktickejšie na konzervovaných exemplároch. V dodatkoch 5A a 5B sú uvedené odporúčané postupy hodnotenie sekundárnych pohlavných znakov čereble potočnej a ryžovníčky japonskej v uvedenom poradí. Vitelogenín (VTG) 43. Krv sa odoberá z chvostovej tepny/žily heparinizovanou mikrohematokritovou kapilárou alebo alternatívne srdcovou punkciou pomocou striekačky. V závislosti od veľkosti rýb sa objem krvi, ktorú je možné odobrať, vo všeobecnosti pohybuje v rozsahu – 60 μl na jedinca čereble potočnej a 5 – 15 μl na jedinca dania pruhovaného. Plazma sa oddelí od krvi odstredením a uchová sa s inhibítorom proteázy pri teplote – 80 °C, pokým nebude analyzovaná na prítomnosť VTG. Alternatívne sa ako zdroj tkaniva na stanovenie VTG použije pečeň v prípade ryžovníčky japonskej a homogenát hlavy/chvosta v prípade dania pruhovaného (dodatok 6). Meranie VTG by malo byť založené na validovanej homologickej metóde ELISA s použitím homologického štandardu VTG a homologických protilátok. Odporúča sa použiť metódu, ktorou možno zistiť množstvo VTG na úrovni niekoľkých ng/ml plazmy (alebo ng/mg tkaniva), čo je úroveň pozadia v tele samcov rýb, ktoré neboli vystavené chemikálii. 44. Kontrola kvality analýzy VTG sa vykoná s použitím štandardov, slepých vzoriek a aspoň duplicitnej analýzy. Pre každú metódu ELISA by sa mal na určenie minimálneho faktora riedenia vzorky vykonať test na matricový efekt (efekt zriedenia vzorky). Každá platnička ELISA používaná v rámci testov na zistenie VTG by mala obsahovať tieto vzorky na kontrolu kvality: najmenej 6 kalibračných štandardov zahŕňajúcich rozsah očakávaných koncentrácií VTG a najmenej jednu nešpecifickú viazanú testovaciu slepú vzorku (analyzuje sa duplicitne). Absorbancia týchto slepých vzoriek by mala byť nižšia ako 5 % maximálnej absorbancie kalibračného štandardu. Analyzovať sa budú najmenej dve alikvotné časti (paralelné) každého zriedenia vzorky. Paralelné vzorky, ktoré sa líšia o viac ako 20 %, by sa mali opätovne analyzovať. 45. Korelačný koeficient (R2) pre kalibračné krivky by mal byť väčší ako 0,99. Vysoká korelácia však nie je dostatočná na to, aby sa zaručilo primerané predvídanie koncentrácie vo všetkých rozsahoch. Okrem dostatočne vysokej korelácie pre kalibračnú krivku by koncentrácia každého štandardu, ktorá sa vypočíta z kalibračnej krivky, mala ležať v rozsahu 70 – 120 % nominálnej koncentrácie. Ak sa nominálne koncentrácie odkláňajú od kalibračnej regresnej priamky (napr. pri nižších koncentráciách), môže byť nevyhnutné rozdeliť kalibračnú krivku na nízky a vysoký rozsah, alebo použiť nelineárny model, ktorý primerane zodpovedá údajom o absorbancii. Ak sa krivka rozdelí, obidve jej časti by mali mať R2 > 0,99. 46. Detekčný limit (LOD) je definovaný ako koncentrácia najnižšieho analytického štandardu a kvantifikačný limit (LOQ) je definovaný ako súčin koncentrácie najnižšieho analytického štandardu a najnižšieho faktora riedenia. 47. Každý deň, keď sa vykonávajú testy na zistenie VTG, sa bude analyzovať obohatená vzorka s použitím „inter-assay“ referenčného štandardu (dodatok 7). Spolu s výsledkami z každého súboru testov vykonaných v tento deň sa uvádza pomer očakávanej koncentrácie a nameranej koncentrácie. Vyhodnotenie histopatológie gonád 48. Vykonanie histopatológie gonád môžu vyžadovať regulačné orgány na preštudovanie cieľového orgánu na osi HHG po vystavení chemikálii. V tomto zmysle sa gonády fixujú buď v celku alebo rozrezané. Keď sa vyžaduje histopatológia, budú sa pri posudzovaní endokrinného pôsobenia testovanej chemikálie hľadať špecifické reakcie na gonádach súvisiace s endokrinným systémom. Tieto diagnostické reakcie v zásade zahŕňajú prítomnosť testikulárnych oocytov, Leydigovej bunkovej hyperplázie, zníženú tvorbu žĺtka, zvýšené množstvo spermatogónií a perifolikulárnu hyperpláziu. Ďalšie lézie gonád, ako je atrézia oocytov, degenerácia semenníkov a zmeny v štádiách, môžu mať rôzne príčiny. V pokynoch k histopatológii rybích gonád sa stanovujú postupy, ktoré sa budú používať pri rozrezaní, fixovaní, narezaní tenkých vrstiev a histopatologickom vyhodnotení gonád (22). ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV Vyhodnocovanie reakcií biomarkerov analýzou rozptylu (ANOVA) 49. Na zistenie potenciálneho pôsobenia chemikálie sa porovnávajú reakcie v skupinách s aplikovanou chemikáliou a reakcie v kontrolných skupinách pomocou analýzy rozptylu (ANOVA). Ak sa použije kontrolná skupina s rozpúšťadlom, mali by sa pre každý sledovaný ukazovateľ vykonať vhodné štatistické testy na porovnanie kontrolných skupín s vodou na riedenie a kontrolných skupín s rozpúšťadlom. Usmernenia k spôsobu spracovania údajov z kontrolných skupín s vodou na riedenie a kontrolných skupín s rozpúšťadlom v následnej štatistickej analýze možno nájsť v dokumente OECD 2006c (28). Všetky údaje o biologických reakciách by sa mali analyzovať a uvádzať osobitne podľa pohlavia. Ak sa nesplnia požadované predpoklady parametrických metód – iné ako normálne rozdelenie (napr. Shapirov-Wilkov test) alebo heterogénny rozptyl (Barlettov alebo Levenov test), malo by sa zvážiť transformovanie údajov pred vykonaním analýzy ANOVA tak, aby sa dosiahli homogénne rozptyly, alebo vykonanie váženej ANOVA. V prípade nemonotónnej závislosti reakcie od dávky možno použiť Dunnettov test (parametrický) na viacnásobné párové porovnávanie alebo Mannov-Whitneyho test s Bonferroniho úpravou (neparametrický). Ak je závislosť reakcie od dávky približne monotónna, možno použiť iné štatistické testy (napr. Jonckheereho-Terpstrov test trendu alebo Williamsov test). V dodatku 8 je uvedený štatistický vývojový diagram, ktorý má pomôcť pri rozhodovaní o najvhodnejšom štatistickom teste, ktorý sa má použiť. Doplnkové informácie možno získať aj z dokumentu OECD o súčasných prístupoch v štatistickej analýze údajov o ekotoxicite (28). Popis výsledkov testu 50. Údaje zo štúdie by mali zahŕňať: Testovacie zariadenie: — zodpovední pracovníci a ich úlohy v rámci štúdie, — každé laboratórium by malo preukázať odbornosť v používaní škály reprezentatívnych chemikálií. Testovaná chemikália: — charakteristika testovanej chemikálie, — fyzikálny charakter a dôležité fyzikálno-chemické vlastnosti, — metóda a frekvencia prípravy testovacích koncentrácií, — informácie o stabilite a biodegradovateľnosti. Rozpúšťadlo: — charakteristika rozpúšťadla (povaha, použitá koncentrácia), — odôvodnenie výberu rozpúšťadla (ak je iné ako voda). Testované zvieratá: — druh a kmeň, — dodávateľ a konkrétne zariadenie dodávateľa, — vek rýb na začiatku testu a stav reprodukcie/neresenia, — údaje o postupe aklimatizácie zvierat, — telesná hmotnosť rýb na začiatku expozície (z podvzorky populácie rýb). Podmienky testovania: — použitý postup testovania (druh testu, veľkosť násady, chovná hustota atď.), — metóda prípravy zásobných roztokov a prietok, — nominálne testovacie koncentrácie, týždenne merané koncentrácie testovacích roztokov a použitá analytická metóda, stredné namerané hodnoty a štandardné odchýlky v testovacích nádobách a dôkaz o tom, že merania zodpovedajú koncentráciám testovanej chemikálie v skutočnom roztoku, — vlastnosti vody na riedenie (vrátane pH, tvrdosti, alkality, teploty, koncentrácie rozpusteného kyslíka, úrovne zvyškového chlóru, celkového obsahu organického uhlíka, suspendovaných tuhých látok a výsledkov akýchkoľvek iných vykonaných meraní), — kvalita vody v testovacích nádržiach: pH, tvrdosť, teplota a koncentrácia rozpustného kyslíka, — podrobné informácie o kŕmení [napr. druh potravy, zdroj, dávkované množstvo a frekvencia a analýza príslušných kontaminantov (napr. polychlórované bifenyly, polycyklické aromatické uhľovodíky a organochlórové pesticídy), ak je k dispozícii]. Výsledky — dôkaz, že kontrolné skupiny splnili akceptačné kritériá testu, — údaje o úmrtnosti vyskytujúcej sa pri každej z testovacích koncentrácií a v kontrolnej skupine, — používané štatistické analytické techniky, spracovanie údajov a odôvodnenie použitia daných techník, — údaje o biologických pozorovaniach celkovej morfológie vrátane sekundárnych pohlavných znakov, tvorbe vajíčok a VTG, — výsledky analýz údajov, najlepšie v tabuľkovej a grafickej forme, — výskyt akýchkoľvek neobvyklých reakcií rýb a akýchkoľvek viditeľných účinkov vyvolaných testovanou chemikáliou. USMERNENIE KINTERPRETÁCII A AKCEPTÁCII VÝSLEDKOV TESTU 51. Táto časť obsahuje niekoľko aspektov, ktoré treba brať do úvahy pri interpretácii výsledkov testu pre jednotlivé merané ukazovatele. Výsledky by sa mali interpretovať opatrne, ak sa zdá, že testovaná chemikália má zjavné toxické účinky alebo ovplyvňuje celkový stav testovaného zvieraťa. 52. S cieľom umožniť zmysluplnú interpretáciu údajov by sa pri stanovení rozsahu testovacích koncentrácií malo dbať na to, aby sa neprekročila maximálna tolerovaná koncentrácia. Je dôležité mať najmenej jednu skupinu s aplikovanou chemikáliou, v ktorej nie sú žiadne príznaky toxických účinkov. Príznaky choroby a príznaky toxických účinkov by sa mali dôkladne vyhodnotiť a zaznamenať. Je napríklad možné, že produkciu VTG v telách samíc môže ovplyvňovať aj všeobecná toxicita a neendokrinné toxické mechanizmy pôsobenia, napríklad hepatotoxicita. Interpretáciu účinkov však možno podporiť inými množstvami aplikovanej chemikálie, ktoré si nemožno pomýliť so systémovou toxicitou. 53. Existuje niekoľko aspektov, ktoré treba brať do úvahy pri akceptácii výsledkov testu. Ako usmernenie platí, že úrovne VTG v kontrolných skupinách samcov a samíc by sa mali odlišovať a mali by ich oddeľovať približne tri rádové hodnoty v prípade čereble potočnej a dania pruhovaného a približne jedna rádová hodnota v prípade ryžovníčky japonskej. Príklady rozsahu hodnôt, ktoré sa vyskytli v kontrolných skupinách a v skupinách s aplikovanou chemikáliou, sú k dispozícii vo validačných správach (1, 2, 3, 4). Vysoké hodnoty VTG kontrolných samcov by mohli ohroziť citlivosť testu a jeho schopnosť odhaliť slabé agonisty estrogénu. Nízke hodnoty VTG samíc v kontrolných skupinách by mohli ohroziť citlivosť testu a jeho schopnosť odhaliť inhibítory aromatázy a antagonisty estrogénu. Na vypracovanie tohto usmernenia sa použili validačné štúdie. 54. Kvantifikácia tvorby vajíčok podlieha značnej variabilite [variačný koeficient (CV) sa môže pohybovať od 20 do 60 %], ktorá ovplyvňuje schopnosť testu odhaliť významný pokles produkcie vajíčok menší ako 70 % v prípade, že sa CV blíži k 50 % alebo je vyšší. Keď je CV obmedzený na nižšie hodnoty (okolo 20 – 30 %), potom bude mať test prijateľnú silu (80 %) na odhalenie 40 – 50 % poklesu tvorby vajíčok. Plán štúdie použitý pre čerebľu potočnú, zahŕňajúci štyri replikáty na úroveň aplikácie chemikálie, by mal umožniť väčšiu silu vo vzťahu k ukazovateľu plodivosti v porovnaní s plánom testu len s 2 replikátmi. 55. Ak laboratórium predtým nevykonávalo tento test alebo nastali podstatné zmeny (napr. zmena kmeňa rýb alebo dodávateľa), je vhodné realizovať štúdiu technickej spôsobilosti. Odporúča sa použitie chemikálií, ktoré zahŕňajú rôzne mechanizmy pôsobenia alebo vplyvu na viaceré ukazovatele testu. V praxi sa každému laboratóriu odporúča, aby si budovalo svoju vlastnú historickú databázu kontrolných údajov pre samcov a samice a aby používalo chemikáliu na pozitívnu kontrolu na estrogénne pôsobenie (napr. 17β-estradiol, 100 ng/l, alebo známe slabé agonisty), ktoré vedie k zvýšeniu množstva VTG u samcov rýb, chemikáliu na pozitívnu kontrolu na inhibíciu aromatázy (napr. fadrozol alebo prochloraz, 300 μg/l), ktorá vedie k zníženiu množstva VTG u samíc rýb, a chemikáliu na pozitívnu kontrolu na androgénne pôsobenie (napr. 17β-trenbolón, 5 μg/l), ktoré vedie k vzniku sekundárnych pohlavných znakov u samíc čereble potočnej a ryžovníčky japonskej. Všetky tieto údaje možno porovnať s dostupnými údajmi z validačných štúdií (1, 2, 3), aby sa zabezpečila spôsobilosť laboratória. 56. Vo všeobecnosti by sa meranie VTG malo považovať za pozitívne, ak v porovnaní s kontrolnou skupinou existuje štatisticky významné zvýšenie množstva VTG u samcov (p < 0,05) alebo štatisticky významný pokles u samíc (p < 0,05) aspoň pri najvyššej testovanej dávke a ak sa nevyskytnú príznaky všeobecnej toxicity. Pozitívny výsledok ďalej podporí preukázanie biologicky hodnoverného vzťahu medzi dávkou a reakčnou krivkou. Ako už bolo uvedené, pokles VTG nemusí mať výlučne endokrinný pôvod; pozitívny výsledok by sa však mal vo všeobecnosti interpretovať ako dôkaz endokrinného pôsobenia in vivo a mal by spravidla viesť k opatreniam na ďalšie objasnenie. 57. Regulačné orgány môžu vyžadovať vyhodnotenie histopatológie gonád s cieľom stanoviť reprodukčné zdravie testovaných zvierat a umožniť posúdenie váhy dôkazov vyplývajúcich z výsledkov testu. Výsledky histopatológie gonád nemusia byť nevyhnutné v prípadoch, keď buď VTG alebo sekundárne pohlavné znaky sú pozitívne (t. j. zvýšenie alebo pokles VTG alebo vznik sekundárnych pohlavných znakov). LITERATÚRA 1. OECD (2006a). Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine active Substances (Phase 1A). OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.60, Paris. 2. OECD (2006b). Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine active Substances (Phase 1B). OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.61, Paris. 3. OECD (2007). Final report of the Validation of the 21-day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine Active Substances. Phase 2: Testing Negative Substances. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.78, Paris. 4. Owens JW (2007). Phase 3 report of the validation of the OECD Fish Screening Assay. CEFIC LRI Project, Endocrine. http://www.cefic-lri.org/index.php?page=projects (accessed 18/09/08). 5. US EPA (2007). Validation of the Fish Short-Term Reproduction Assay: Integrated Summary Report. 15 December 2007. US Environmental Protection A