PRÍLOHA I

Metódy testovania na detekciu a identifikáciu špecifikovaného škodcu uvedené v článku 3 ods. 2

1. Testovanie pomocou spór

Na detekciu a identifikáciu sa používajú letné spórangiá a zimné spóry, ktoré sa získavajú z pôdy po preosievaní alebo priamo z rastlinného materiálu.

2. Metódy na detekciu škodcu

Na extrakciu spór špecifikovaného škodcu z pôdy sa používa jedna z týchto metód:

a) metóda preosievania pôdy, ako ju opisuje Pratt (1976) (1);

b) metóda preosievania pôdy, ako ju opisuje van Leeuwen et al. (2005) (2);

c) technika zónovej odstredivky na spracovanie vzoriek s vysokou priepustnosťou, ako je opisuje Wander et al. (2007) (3).

3. Metódy identifikácie

Po extrakcii sa spóry špecifikovaného škodcu identifikujú jednou z týchto metód:

a) morfologická identifikácia pod svetelným mikroskopom pri zväčšení 100 – 400 x;

b) konvenčný test PCR s použitím primerov na základe Lévesque et al. (2001) (4) a van den Boogert et al. (2005) (5);

c) test PCR v reálnom čase, pri ktorom sa používajú primery a sondy podľa van Gent-Pelzer et al. (2010) (6);

d) test PCR v reálnom čase, pri ktorom sa používajú primery a sondy podľa Smith et al. (2014) (7).

4. Životaschopnosť zimných spór

Stanovenie životaschopnosti zimných spór možno dosiahnuť mikroskopickým vyšetrením alebo biologickou analýzou. Životaschopnosť spórangií sa môže stanoviť mikroskopickým vyšetrením spórangií naložených v laktofenole alebo vo vode (Przetakiewicz 2015) (8). Spórangiá s granulovým obsahom alebo s mierne zaoblenou protoplazmou sa môžu považovať za životaschopné. Trvale plazmolizované alebo bez viditeľného obsahu sa považujú za mŕtve.

Ako alternatíva alebo v prípade pochybností sa môže vykonať biologická analýza opísaná v bode 3 prílohy IV.

5. Určenie patotypov

Na určenie patotypov sú potrebné čerstvé nádory.

Inokulum určené na test sa vytvorí jednou z týchto metód:

a) metóda SASA (Science and Advice for Scottish Agriculture), pozostávajúca z týchto dvoch krokov: i) produkcia inokula; Staré (hnedé) tkanivo nádora sa rozdrví na menšie kusy a pri izbovej teplote sa suší na vzduchu, až kým nestvrdne. Tvrdé tkanivo sa rozomelie buď ručne, alebo mechanicky. Mletý materiál sa na sucho preosieva, pričom sa zachytáva frakcia od 25 do 75 μm a následne sa extrahuje chloroformovou metódou Pratt (1976)1; ii) produkcia čerstvých nádorov Približne 10 mg extrahovaných zimných spór sa roztrúsi na povrch 10 ml sterilnej destilovanej vody v malej plastovej Petriho miske a inkubuje sa v tme pri teplote 20 °C až do vyklíčenia. Hľuzy zemiakov s malými klíčkami s dĺžkou približne 1 až 2 mm sa umiestnia do priehľadných plastových nádob potiahnutých vlhkým vláknitým papierom s označenými klíčkami smerujúcimi nahor. Klíčky sa pomocou striekačky obkrúžia roztavenou vazelínou. Kruh musí byť neprerušený a dostatočne vysoký, aby udržal spórovú suspenziu a nedochádzalo k jej úniku. 10 ml spór klíčiacich zimných spór sa ďalej zriedi sterilnou vodou na 20 ml a pomocou pipety alebo stlačenej fľaše sa umiestni do vnútra kruhov, až kým sa klíček úplne neponorí do spórovej suspenzie. Plastové nádoby sa uzavrú viečkami a inkubujú sa 4 dni pri teplote 10 °C, potom sa nádoby otvoria, inokulum a vazelínové kruhy sa odstránia a nádoby sa premiestnia do zahmleného skleníka s teplotou 15 až 18 °C (16 hodín svetla);

b) metóda Spiekermann & Kothoff (1924) (9);

c) metóda Potoček et al. (1991) (10);

d) metóda Glynne-Lemmerzahl (Glynne 1925 (11); Lemmerzahl 1930 (12); Noble and Glynne 1970 (13)).

Na určenie všetkých patotypov, o ktorých je známe, že sú pre Úniu relevantné [1(D1), 2(G1), 6(O1), 18(T1) a 38(Nevşehir)], sa použije diferenciálny test na stanovenie infekcie s rôznymi odrodami špecifikovanej rastliny, ako sa uvádza v tabuľke. Test sa vykoná podľa protokolu uvedeného v písmene d) (metóda Glynne-Lemmerzahl).

Selektívna citlivosť kultivarov zemiakov na určenie patotypov huby S. endobioticum

Kultivar Patotypy huby S. endobioticum 1(D1) 2(G1) 6(O1) 18(T1) 38(Nevşehir) Tomensa/Evora/Deodara S S S S S Irga/Producent R S S S S Talent R R* R* S S Saphir R S R R S Ikar/Gawin/Karolin/Belita R R R R R „S“: náchylný „R“: odolný *: poukazuje na slabú náchylnosť odrody na hubu S. endobioticum („výskyt sorusových polí bez nekrózy a vytvárania nádorov“).

(1) Pratt MA. 1976. A wet-sieving and flotation technique for the detection of resting sporangia of Synchytrium endobioticum in soil. Annals of Applied Biology 82: 21 – 29.

(2) van Leeuwen GCM, Wander JGN, Lamers J, Meffert JP, van den Boogert PHJF, Baayen RP. 2005. Direct examination of soil for sporangia of Synchytrium endobioticum using chloroform, calcium chloride and zinc sulphate as extraction reagents. EPPO Bulletin 35: 25 – 31.

(3) Wander JGN, van den Berg W, van den Boogert PHJF, Lamers JG, van Leeuwen GCM, Hendrickx G, Bonants P. 2007. A novel technique using the Hendrickx centrifuge for extracting winter sporangia of Synchytrium endobioticum from soil. European Journal of Plant Pathology 119: 165 – 174.

(4) Lévesque CA, de Jong SN, Ward LJ & de Boer SH (2001) Molecular phylogeny and detection of Synchytrium endobioticum, the causal agent of potato wart. Canadian Journal of Plant Pathology 23: 200 – 201.

(5) van den Boogert PHJF, van Gent-Pelzer MPE, Bonants PJM, de Boer SH, Wander JGN, Lévesque CA, van Leeuwen GCM, Baayen RP. 2005. Development of PCR-based detection methods for the quarantine phytopathogen Synchytrium endobioticum, causal agent of potato wart disease. European Journal of Plant Pathology 113: 47 – 57.

(6) van Gent-Pelzer MPE, Krijger M, Bonants PJM. 2010. Improved real-time PCR assay for the detection of the quarantine potato pathogen, Synchytrium endobioticum, in zonal centrifuge extracts from soil and in plants. European Journal of Plant Pathology 126: 129 – 133.

(7) Smith DS, Rocheleau H, Chapados JT, Abbott C, Ribero S, Redhead SA, Lévesque CA, De Boer SH. 2014. Phylogeny of the genus Synchytrium and the development of TaqMan PCR assay for sensitive detection of Synchytrium endobioticum in soil. Phytopathology 104: 422 – 432.

(8) Przetakiewicz, J. 2015. The Viability of Winter Sporangia of Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. From Poland. American Journal of Potato Research 92:704-708.

(9) Spieckermann A, Kothoff P. 1924. Testing potatoes for wart resistance. Deutsche Landwirtschaftliche Presse 51: 114 – 115.

(10) Potoček J, Krajíčková K, Klabzubová S, Krejcar Z, Hnízdil M, Novák F, Perlová V. 1991. Identification of new Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. pathotypes in Czech Republic. Ochrana Rostlin 27: 191 – 205.

(11) Glynne MD. 1925. Infection experiments with wart disease of potatoes. Synchytrium endobioticum. Annals of Applied Biology 12: 34 – 60.

(12) Lemmerzahl J. 1930. A new simplified method for inoculation of potato cultivars to test for wart resistance. Züchter 2: 288 – 297.

(13) Noble M, Glynne MD. 1970. Wart disease of potatoes. FAO Plant Protection Bulletin 18: 125 – 135.