PRÍLOHA I

KAPITOLA 1

PRACOVNÉ KRITÉRIÁ A INÉ POŽIADAVKY NA ANALYTICKÉ METÓDY

1.1. Požiadavky na skríningové metódy

1.1.1. Kategórie vhodných skríningových metód

Ako vhodné skríningové metódy sa použijú kvalitatívne, semikvantitatívne alebo kvantitatívne metódy.

1.1.2. Požiadavky na biologické, biochemické alebo fyzikálno-chemické skríningové metódy

V prípade zakázaných alebo nepovolených látok musí byť CCβ na čo najnižšej rozumne dosiahnuteľnej úrovni a v každom prípade musí byť nižšia ako referenčná hodnota na prijatie opatrení (RPA) pre látky, pre ktoré sú RPA stanovené podľa nariadenia (EÚ) 2019/1871.

V prípade povolených farmakologicky účinných látok musí byť CCβ nižšia ako hodnota MRL alebo ML.

Na účely skríningu sa smú použiť len tie analytické metódy, pri ktorých možno dokumentovaným vysledovateľným spôsobom preukázať, že sú validované a majú podiel falošne negatívnych výsledkov nižší alebo rovný 5 % (β chyba). Pri podozrení na pozitívny výsledok sa musí tento výsledok potvrdiť konfirmačnou metódou.

Kvantitatívne skríningové metódy používané na skríning aj konfirmáciu musia spĺňať rovnaké požiadavky na správnosť, rozsah a presnosť, ako sú požiadavky opísané v bodoch 1.2.2.1 a 1.2.2.2.

1.2. Požiadavky na konfirmačné metódy

1.2.1. Všeobecné požiadavky na konfirmačné metódy

V prípade zakázaných alebo nepovolených látok musí byť hodnota CCα na čo najnižšej rozumne dosiahnuteľnej úrovni. V prípade zakázaných alebo nepovolených látok, pre ktoré je stanovená RPA podľa nariadenia (EÚ) 2019/1871, musí byť CCα rovný referenčnej hodnote na prijatie opatrení alebo nižší.

V prípade povolených látok musí byť hodnota CCα vyššia ako MRL alebo ML, ale musí byť čo najbližšie k hladine MRL alebo ML.

Na účely konfirmácie sa používajú len analytické metódy, pri ktorých možno dokumentovaným vysledovateľným spôsobom preukázať, že sú validované a majú podiel falošne pozitívnych výsledkov (chyba α) nižší alebo rovný 1 % v prípade zakázaných alebo nepovolených látok, alebo nižší alebo rovný 5 % v prípade povolených látok.

Konfirmačné metódy poskytujú informácie o štrukturálnom chemickom zložení analytu. Z toho vyplýva, že konfirmačné metódy založené len na chromatografickej analýze bez použitia hmotnostnej spektrometrickej detekcie nie sú vhodné na používanie ako konfirmačné metódy pre zakázané alebo nepovolené farmakologicky účinné látky. V prípade, že hmotnostná spektrometria nie je v prípade povolených látok vhodná, môžu sa použiť iné metódy, ako sú napr. HPLC-DAD (HPLC s detektorom s diódovým poľom) a HPLC-FLD (HPLC s fluorescenčným detektorom), alebo ich kombinácia.

Ak si to konfirmačná metóda vyžaduje, pridá sa na začiatku extrakčného postupu do skúšobnej dávky vhodný vnútorný štandard. V závislosti od dostupnosti sa použijú buď stabilné, izotopom značené formy analytu, ktoré sú vhodné najmä na hmotnostnú spekrometrickú detekciu, alebo analogické zlúčeniny, ktoré sú štruktúrou veľmi podobné tomuto analytu. Ak nie je možné použiť žiadny vhodný vnútorný štandard, identifikácia analytu sa potvrdí prednostne kochromatografiou (1). V tomto prípade sa získa len jeden pík, pričom zväčšenie výšky (alebo plochy) píku zodpovedá množstvu pridaného analytu. Ak toto nie je možné urobiť, použijú sa štandardy s odpovedajúcou matricou alebo štandardy s fortifikovanou matricou.

1.2.2. Všeobecné pracovné kritériá pre konfirmačné metódy

1.2.2.1. Pravdivosť prostredníctvom výťažnosti

Pri opakovaných analýzach certifikovaného referenčného materiálu musí odchýlka experimentálne stanovenej strednej hodnoty hmotnostného podielu, korigovaného na výťažnosť od certifikovanej hodnoty, spĺňať rozsahy minimálnej pravdivosti uvedené v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Minimálna pravdivosť kvantitatívnych metód

Hmotnostný podiel (koncentrácia) Rozsah ≤ 1 μg/kg -50 % až +20 % > 1 μg/kg až 10 μg/kg -30 % až +20 % ≥ 10 μg/kg -20 % až +20 %

Ak nie sú k dispozícii žiadne certifikované referenčné materiály, je prijateľné, aby sa pravdivosť meraní stanovila inými spôsobmi, napríklad použitím materiálov s určenými hodnotami z medzilaboratórnych štúdií alebo pridaním známych množstiev analytu(-ov) do slepej matrice.

1.2.2.2. Presnosť

Variačný koeficient (CV) pre opakovanú analýzu referenčného alebo fortifikovaného materiálu v podmienkach vnútrolaboratórnej reprodukovateľnosti nesmie prekročiť hodnotu vypočítanú z Horwitzovej rovnice. Rovnica je:

CV = 2(1 – 0,5 log C)

kde C je hmotnostný podiel vyjadrený vo forme mocniny (exponentu) 10 (napr. 1 mg/g = 10-3). Pri hmotnostných podieloch nižších než 120 μg/kg vedie použitie Horwitzovej rovnice k neprijateľne vysokým hodnotám. Povolený maximálny variačný koeficient preto nesmie presiahnuť hodnoty uvedené v tabuľke 2.

Tabuľka 2

Prijateľný variačný koeficient

Hmotnostný podiel (koncentrácia) CV reprodukovateľnosti (%) > 1 000 μg/kg 16 (odvodené z Horwitzovej rovnice) > 120 μg/kg – 1 000 μg/kg 22 (odvodené z Horwitzovej rovnice) 10 – 120 μg/kg 25 (*) < 10 μg/kg 30 (*)

V prípade analýz vykonaných v podmienkach opakovateľnosti musí byť variačný koeficient v podmienkach opakovateľnosti rovný alebo nižší ako dve tretiny hodnôt uvedených v tabuľke 2.

1.2.3. Požiadavky na chromatografickú separáciu

V prípade kvapalinovej chromatografie (LC) alebo plynovej chromatografie (GC) je minimálny prijateľný retenčný čas pre skúšaný(-é) analyt(-y) dvojnásobkom retenčného času zodpovedajúceho mŕtvemu objemu kolóny. Retenčný čas analytu v extrakte musí zodpovedať retenčnému času kalibračného štandardu, štandardu s odpovedajúcou matricou alebo s fortifikovanou matricou s toleranciou ± 0,1 minúty. V prípade rýchlej chromatografie, pri ktorej je retenčný čas kratší ako 2 minúty, je prípustná odchýlka menej ako 5 % retenčného času. V prípade použitia vnútorného štandardu musí pomer chromatografického retenčného času analytu a vnútorného štandardu, t. j. relatívny retenčný čas analytu, zodpovedať retenčnému času kalibračného štandardu, štandardu s odpovedajúcou matricou alebo štandardu s fortifikovanou matricou s maximálnou odchýlkou 0,5 % pri plynovej chromatografii a 1 % pri kvapalinovej chromatografii pre metódy validované od dátumu nadobudnutia účinnosti tohto nariadenia.

1.2.4. Špecifické pracovné kritériá pre hmotnostnú spektrometriu

1.2.4.1. Hmotnostná spektrometrická detekcia

Hmotnostná spektrometrická detekcia sa vykonáva použitím niektorej z týchto možností:

1. zaznamenávaním celých hmotnostných spektier (full scan, FS);

2. zaznamenávaním vybraných iónov (selected ion monitoring, SIM);

3. techník sekvenčnej hmotnostnej spektrometrie (MSn), ako je napríklad monitorovanie vybranej reakcie (selected reaction monitoring, SRM);

4. kombináciou techník hmotnostnej spektrometrie (MS) alebo sekvenčnej hmotnostnej spektrometrie (MSn) s vhodnými ionizačnými režimami.

Vhodná je hmotnostná spektrometria s nízkym rozlíšením (LRMS, pri rozlíšení na hmotnostnú jednotku), ako aj hmotnostná spektrometria s vysokým rozlíšením (HRMS), vrátane napr. prístrojov typu „double focusing sectors“, „Time of Flight (TOF)“ a „Orbitrap“.

Na potvrdenie identity analytu v hmotnostnej spektrometrii s vysokým rozlíšením (HRMS) musí byť hmotnostná odchýlka všetkých diagnostických iónov nižšia ako 5 ppm (alebo v prípade m/z < 200 nižšia ako 1 mDA). Na základe toho by sa malo vybrať účinné rozlíšenie vhodné na daný účel, ktoré bude zvyčajne väčšie ako 10 000 pre celý hmotnostný rozsah pri 10 % údolí alebo 20 000 pri plnej šírke v polovici výšky (FWHM).

Ak sa hmotnostné spektrometrické stanovenie vykonáva snímaním celého spektra (LRMS aj HRMS), vhodné sú len diagnostické ióny s relatívnou intenzitou vyššou ako 10 % v referenčnom spektre kalibračného štandardu, štandardu s odpovedajúcou matricou alebo štandardu s fortifikovanou matricou. Diagnostické ióny musia zahŕňať molekulový ión (ak je prítomný pri ≥ 10 % intenzite základného píku) a charakteristické fragmentové alebo produktové ióny.

Výber prekurzorových iónov: Ak sa hmotnostné spektrometrické stanovenie vykonáva fragmentáciou po výbere prekurzorového iónu, výber prekurzorového iónu sa vykonáva pri rozlíšení na hmotnostnú jednotku alebo lepšom. Vybraný prekurzorový ión je molekulový ión, charakteristické adukty molekulového iónu, charakteristické produktové ióny alebo jeden z jeho izotopových iónov. V prípade, že výber prekurzorov má vybraný rozsah hmotností väčší než jeden dalton (napr. v prípade nezávislého zberu údajov), táto technika sa považuje za konfirmačnú analýzu celého spektra (full-scan).

Fragmentové a produktové ióny: vybrané fragmentové alebo produktové ióny musia byť diagnostickým fragmentom pre meraný analyt/produkt. Neselektívne prechody (napr. tropyliový katión alebo strata vody) sa vynechajú vždy, keď je to možné. Výdatnosť (intenzita) diagnostických iónov sa určuje z plochy píku alebo jeho výšky z integrovaných extrahovaných iónových chromatogramov. Tento postup možno použiť aj vtedy, keď sa na identifikáciu používajú merania celého spektra. Pomer signál/šum (S/N) musí byť pre všetky diagnostické ióny väčší alebo rovný tri ku jednej (3:1).

Relatívne intenzity: relatívne intenzity diagnostických iónov (iónový pomer) sú vyjadrené ako percento intenzity najvýdatnejšieho iónu alebo prechodu. Iónový pomer sa musí stanoviť porovnaním spektier alebo integráciou signálov hmotnostných stôp extrahovaných iónov. Iónový pomer analytu, ktorý sa má potvrdiť, musí zodpovedať pomeru v štandardoch s odpovedajúcou matricou alebo v štandardoch s fortifikovanou matricou alebo v štandardných roztokoch pri porovnateľných koncentráciách nameraných za rovnakých podmienok v rámci ± 40 % relatívnej odchýlky.

Pre všetky hmotnostné spektrometrické analýzy sa musí stanoviť najmenej jeden iónový pomer. Ide prednostne o ióny získané v rámci skenovania vybraných iónov, ale ióny môžu pochádzať aj z rôznych skenov v tom istom nástreku (t. j. sken celého spektra a fragmentačný sken).

1.2.4.2. Identifikácia

Na výber vhodných meracích režimov a hodnotiacich kritérií sa použije systém identifikačných bodov. Na potvrdenie identity látok v matrici, pre ktoré je stanovená MRL (povolené použitie), sa vyžadujú minimálne 4 identifikačné body. V prípade nepovolených alebo zakázaných látok sa vyžaduje 5 identifikačných bodov. Jeden bod môže pochádzať z chromatografickej separácie. V tabuľke 3 je uvedený počet identifikačných bodov, ktoré každá z techník poskytuje. Na dosiahnutie požadovaných identifikačných bodov pre konfirmáciu možno pridať identifikačné body získané inými technikami.

1. Všetky hmotnostné spektrometrické analýzy sa musia kombinovať so separačnou technikou, ktorá vykazuje dostatočnú separačnú silu a selektivitu pre konkrétne použitie. Vhodnými separačnými technikami sú okrem iného kvapalinová a plynová chromatografia, kapilárna elektroforéza (CE) a superkritická fluidná chromatografia (SFC). V prípade analytu, ktorý predstavuje akúkoľvek izobarickú alebo izomérnu zlúčeninu musí byť na potvrdenie jej identity povinné akceptovanie retenčného času (t. j. ± 0,5 % v GC a ± 1 % v LC a SFC).

2. Na dosiahnutie minimálneho počtu identifikačných bodov sa môžu skombinovať maximálne tri separačné techniky.

3. Rôzne spôsoby ionizácie (napr. elektrónová ionizácia a chemická ionizácia) sa považujú za rôzne techniky. Tabuľka 3 Identifikačné body pre každú techniku Technika Identifikačné body Separácia (GC, LC, SFC, CE) 1 Ión LR-MS 1 Výber prekurzorového iónu pri hmotnostnom rozsahu < ± 0,5 Da 1 (nepriamy) Produktový ión LR-MSn 1,5 Ión HR-MS 1,5 Produktový ión HR-MSn 2.5 Tabuľka 4 Príklady počtu identifikačných bodov pri konkrétnych technikách a kombináciách techník (n = celé číslo) Technika(-y) Separácia Počet iónov Identifikačné body GC-MS (EI alebo CI) GC n 1 + n GC-MS (EI a CI) GC 2 (EI) + 2 (CI) 1 + 4 = 5 GC-MS (EI alebo CI) 2 deriváty GC 2 (derivát A) + 2 (derivát B) 1 + 4 = 5 LC-MS LC n (MS) 1 + n GC- alebo LC-MS/MS GC alebo LC 1 prekurzorový + 2 produktové 1 + 1 + 2 × 1,5 = 5 GC- alebo LC-MS/MS GC alebo LC 2 prekurzorové + 2 produktové 1 + 2 + 2 × 1,5 = 6 GC- alebo LC-MS3 GC alebo LC 1 prekurzorový + 1 MS2 produktový + 1 MS3 produktový 1 + 1 + 1,5 + 1,5 = 5 GC- alebo LC-HRMS GC alebo LC n 1 + n × 1,5 GC- alebo LC-HRMS/MS GC alebo LC 1 prekurzorový (hmotnostný rozsah <± 0,5 Da) + 1 produktový 1 + 1 + 2,5 = 4,5 GC- alebo LC-HRMS a HRMS/MS GC alebo LC 1 ión z celého spektra + 1 HRMS produktový ión (a) 1 + 1,5 + 2,5 = 5 GC- a LC-MS GC a LC 2 ióny (GCMS) + 1 ión (LCMS) 1 + 1 + 2 + 1 + 1 = 6

1.2.5. Špecifické pracovné kritériá na stanovenie analytu pomocou kvapalinovej chromatografie s inými detekčnými technikami než hmotnostná spektrometria

Iba v prípade povolených látok sa ako alternatíva pre metódy založené na hmotnostnej spektrometrii môžu použiť tieto techniky za predpokladu, že sú splnené príslušné kritériá pre tieto techniky:

1. full-scan spektrofotometria s detekciou pomocou diódového poľa (DAD) v prípade použitia s HPLC;

2. spektrofotometria s fluorescenčnou detekciou v prípade použitia s HPLC.

Kvapalinová chromatografia s detekciou v ultrafialovom svetle/vo viditeľnom svetle (jedna vlnová dĺžka) ako taká nie je vhodná na používanie ako konfirmačná metóda.

1.2.5.1. Pracovné kritériá pre full-scan spektrofotometriu s detekciou pomocou diódového poľa

Musia sa splniť pracovné kritériá pre chromatografickú separáciu uvedené v kapitole 1.2.3.

Absorbčné maximá v UV spektre analytu musia byť na rovnakých vlnových dĺžkach ako tie v kalibračnom štandarde v matrici, v rámci maximálneho rozpätia, ktoré je dané rozlišovacou schopnosťou detekčného systému. V prípade detekcie pomocou diódového poľa je toto maximálne rozpätie obvykle ± 2 nm. Spektrum analytu v oblasti nad 220 nm sa nesmie v tých oblastiach oboch spektier, ktoré majú relatívnu absorbanciu rovnú 10 % alebo väčšiu, viditeľne líšiť od spektra kalibračného štandardu. Toto kritérium je splnené, ak, po prvé, existujú tie isté maximá a po druhé, ak rozdiel medzi týmito dvomi spektrami nie je v žiadnom bode väčší než 10 % absorbancie kalibračného štandardu. V prípade, že sa na vyhľadávanie a zisťovanie zhody používa počítačová knižnica, musí byť pri porovnaní údajov zo spektier úradných vzoriek s údajmi zo spektier kalibračného roztoku prekročený kritický faktor zhody. Hodnota tohto faktora sa stanoví v priebehu validačného procesu pre každý analyt na základe spektier, pre ktoré sú splnené vyššie opísané kritériá. Musí sa kontrolovať variabilita spektier, spôsobená matricou vzorky a činnosťou detektora.

1.2.5.2. Pracovné kritériá pre spektrofotometriu s fluorescenčnou detekciou

Musia sa splniť pracovné kritériá pre chromatografickú separáciu uvedené v kapitole 1.2.3.

Výber excitačných a emisných vlnových dĺžok v kombinácii s chromatografickými podmienkami sa musí urobiť takým spôsobom, aby sa minimalizoval účinok interferujúcich zložiek v extraktoch slepej vzorky. Medzi excitačnou a emisnou vlnovou dĺžkou musí byť minimálne 50 nanometrov.

Najbližšie maximum píku v chromatograme musí byť od stanovovaného píku analytu vzdialené najmenej o jednu plnú šírku píku analytu v 10 % maximálnej výšky píku analytu.

Používa sa pre molekuly, ktoré vykazujú prirodzenú fluorescenciu a molekuly, ktoré vykazujú fluorescenciu po transformácii alebo derivatizácii.

KAPITOLA 2

VALIDÁCIA

2.1. Pracovné charakteristiky, ktoré je potrebné stanoviť pre analytické metódy

Validáciou metódy sa musí preukázať, že daná analytická metóda spĺňa kritériá na príslušné pracovné charakteristiky. Rôzne účely kontroly si vyžadujú rôzne kategórie metód. V tabuľke 5 sa určuje, ktoré pracovné charakteristiky sa musia overiť, pre ktorý typ metódy; bližšie vysvetlenie každého parametra je dané v tejto kapitole.

Tabuľka 5

Klasifikácia analytických metód podľa pracovných charakteristík, ktoré musia byť stanovené

Metóda Konfirmačná Skríningová Kvalitatívna Kvantitatívna Kvalitatívna Semi-kvantitatívna Kvantitatívna Látky A A, B A, B A, B A, B Identifikácia v súlade s bodom 1.2 x x CCα x x CCβ - x x x Pravdivosť x x Presnosť x x) x Relatívny matricový efekt/absolútna výťažnosť (*) x x Selektivita/špecifickosť x x x x Stabilita (#) x x x x Robustnosť x x x x x: Prostredníctvom validácie je potrebné preukázať, že sú splnené požiadavky na pracovné charakteristiky. x) Požiadavky na presnosť uvedené v kapitole 1.2.2.2 nemusia byť splnené v prípade semikvantitatívnych skríningových metód. Presnosť by sa však mala stanoviť, aby sa preukázala vhodnosť metódy pre zabránenie výskytu falošne negatívnych analytických výsledkov. A: zakázané alebo nepovolené látky B: povolené látky

2.2. Pravdivosť, opakovateľnosť a vnútrolaboratórna reprodukovateľnosť

V tejto kapitole sú uvedené príklady a odkazy na validačné postupy Môžu sa použiť aj iné prístupy, ktorými sa preukáže, že metóda je v súlade s pracovnými kritériami, za predpokladu, že dosiahnu rovnakú úroveň a kvalitu informácií.

2.2.1. Konvenčná validácia

Výpočet parametrov v súlade s konvenčnými metódami si vyžaduje vykonať niekoľko jednotlivých experimentov. Pre každú veľkú zmenu sa musí stanoviť každá pracovná charakteristika (pozri oddiel 2.4). V prípade viacanalytových metód je možné analyzovať súčasne viac analytov, pokiaľ sa predtým vylúčili možné rušivé vplyvy. Podobným spôsobom sa môže stanoviť niekoľko pracovných charakteristík. Preto sa v záujme minimalizácie pracovného zaťaženia odporúča v čo najväčšej miere kombinovať experimenty (napr. opakovateľnosť a vnútrolaboratórnu reprodukovateľnosť so špecifickosťou, analýzy slepých vzoriek na stanovenie rozhodovacieho limitu pre konfirmáciu a testovanie špecifickosti).

2.2.1.1. Pravdivosť na základe certifikovaného referenčného materiálu

Uprednostňuje sa stanovenie pravdivosti analytickej metódy pomocou certifikovaného referenčného materiálu (CRM). Postup je opísaný v norme ISO 5725-4:1994 (2)

Príklad:

1. Analyzuje sa šesť replikátov CRM v súlade so skúšobným postupom danej metódy.

2. Stanoví sa koncentrácia analytu prítomného v každej vzorke z replikátov.

3. Pre týchto šesť replikátov sa vypočíta priemer, smerodajná odchýlka a variačný koeficient (%).

4. Pravdivosť sa vypočíta ako pomer zistenej priemernej hodnoty koncentrácie a certifikovanej hodnoty (nameranej ako koncentrácia), vynásobený číslom 100, aby sa výsledok vyjadril v percentách.

Pravdivosť (%) = zistená priemerná hodnota koncentrácie korigovaná na výťažnosť x 100/certifikovaná hodnota.

2.2.1.2. Pravdivosť na základe fortifikovaných vzoriek

Ak nie je k dispozícii žiadny certifikovaný referenčný materiál, pravdivosť metódy sa stanoví experimentálne s použitím fortifikovanej slepej matrice minimálne v súlade s touto schémou:

1. V prípade metód validovaných od dátumu nadobudnutia účinnosti tohto nariadenia sa vyberie slepý materiál a fortifikuje sa pri koncentrácii: a) 0,5 (3), 1,0 a 1,5-násobku RPA, alebo b) 0,1 (4), 1,0 a 1,5-násobku MRL alebo ML v prípade povolených látok, alebo c) 1,0, 2,0 a 3,0-násobku LCL v prípade nepovolených látok (pre ktoré nebola stanovená žiadna hodnota RPA).

2. Na každej úrovni sa vykoná analýza so šiestimi replikátmi.

3. Vzorky sa analyzujú.

4. Vypočíta sa zistená koncentrácia v každej vzorke.

5. Vypočíta sa pravdivosť pre každú vzorku podľa nižšie uvedenej rovnice a následne sa vypočíta priemerná pravdivosť a variačný koeficient zo šiestich výsledkov na každej koncentračnej hladine.

Pravdivosť (%) = (zistená priemerná hodnota koncentrácie korigovaná na výťažnosť) x 100/hladina fortifikácie.

V prípade metód pre povolené látky, ktoré boli validované pred dátumom začiatku uplatňovania tohto nariadenia, postačuje stanovenie pravdivosti metódy použitím šiestich fortifikovaných častí na hladine 0,5, 1,0 a 1,5-násobku MRL alebo ML.

2.2.1.3. Opakovateľnosť

1. V prípade metód, ktoré boli validované od dátumu nadobudnutia účinnosti tohto nariadenia, sa pripraví súbor vzoriek identických slepých matríc rovnakého druhu zvieraťa. Tie sa fortifikujú analytom tak, aby sa dosiahli koncentrácie zodpovedajúce: a) 0,5 (5), 1,0 a 1,5-násobku RPA, alebo b) 0,1 (6), 1,0 a 1,5-násobku MRL alebo ML v prípade povolených látok, alebo c) 1,0; 2,0 a 3,0-násobku LCL v prípade nepovolených alebo zakázaných látok, ak nemožno použiť žiadnu RPA.

2. Na každej hladine sa vykoná analýza s najmenej šiestimi replikátmi.

3. Vzorky sa analyzujú.

4. Vypočíta sa zistená koncentrácia v každej vzorke.

5. Vypočíta sa priemerná koncentrácia, smerodajná odchýlka a variačný koeficient (%) fortifikovaných vzoriek.

6. Tieto kroky sa zopakujú najmenej pri dvoch ďalších príležitostiach.

7. Vypočítajú sa celkové priemerné koncentrácie, smerodajné odchýlky (vypočítaním priemeru z druhých mocnín jednotlivých smerodajných odchýlok a jeho odmocnením) a variačné koeficienty pre fortifikované vzorky. V prípade metód pre povolené látky validovaných pred dátumom nadobudnutia účinnosti tohto nariadenia postačuje stanovenie opakovateľnosti s fortifikovanými matricami pri koncentráciách 0,5; 1,0 a 1,5-násobku MRL alebo ML. Prípadne sa výpočet opakovateľnosti môže vykonať podľa normy ISO 5725-2:2019 (7).

2.2.1.4. Vnútrolaboratórna reprodukovateľnosť

1. Na validácie vykonané po dátume nadobudnutia účinnosti tohto nariadenia sa pripraví súbor vzoriek špecifikovaného skúšobného materiálu (identických alebo odlišných matríc) fortifikovaných analytom(-mi) tak, aby sa dosiahli koncentrácie zodpovedajúce: a) 0,5(5), 1,0 a 1,5-násobku RPA, alebo b) 0,1(6), 1,0 a 1,5-násobku MRL alebo ML v prípade povolených látok, alebo c) 1,0; 2,0 a 3,0-násobku LCL v prípade nepovolených alebo zakázaných látok, ak nemožno použiť žiadnu hodnotu RPA.

2. Na každej koncentračnej hladine sa vykoná analýza s minimálne šiestimi replikátmi slepého materiálu.

3. Analyzujú sa fortifikované vzorky.

4. Vypočíta sa zistená koncentrácia v každej vzorke.

5. Tieto kroky sa zopakujú najmenej pri dvoch ďalších príležitostiach s rôznymi šaržami slepého materiálu, rôznymi pracovníkmi a s čo najväčším počtom rôznych podmienok prostredia, napr. s rôznymi šaržami reakčných činidiel, rozpúšťadiel, pri rôznych laboratórnych teplotách, s použitím rôznych prístrojov alebo variácií iných parametrov.

6. Stanoví sa priemerná koncentrácia, smerodajná odchýlka a variačný koeficient (%) fortifikovaných vzoriek. V prípade metód pre povolené látky validovaných pred dátumom nadobudnutia účinnosti tohto nariadenia postačuje stanovenie vnútrolaboratórnej reprodukovateľnosti s fortifikovanými matricami na koncentrácie 0,5; 1,0 a 1,5-násobku MRL alebo ML. Prípadne sa výpočet vnútrolaboratórnej reprodukovateľnosti/medziľahlej presnosti môže vykonať aj podľa noriem ISO 5725-2:2019, ISO 11843-1:1997 (8), Codex CAC/GL 59-2006 (9).

2.2.2. Validácia podľa alternatívnych modelov

Výpočet parametrov v súlade s alternatívnymi modelmi si vyžaduje vypracovanie experimentálneho plánu. Experimentálny plán musí byť navrhnutý v závislosti od počtu rôznych druhov zvierat a rôznych faktorov, ktoré sú predmetom vyšetrovania. Prvým krokom celého validačného postupu je preto zvážiť početnosť a typ vzoriek, ktoré sa budú v budúcnosti analyzovať v laboratóriu, s cieľom určiť najdôležitejšie druhy zvierat a faktory, ktoré môžu ovplyvniť výsledky merania. Prístup zohľadňujúci rôzne faktory umožňuje posúdiť neistotu merania výsledkov skúšok, získaných za rozmanitých skúšobných podmienok v danom laboratóriu, ako napr. rôzni analytici, rôzne prístroje, rôzne šarže reagentov, rôzne matrice, rôzne časy skúšok a rozdielne teploty pri skúškach. Následne sa musí rozsah koncentrácie zvoliť spôsobom prispôsobeným účelu podľa MRL alebo ML v prípade povolených látok alebo podľa RPA alebo LCL v prípade zakázaných alebo nepovolených látok.

Prístup zohľadňujúci rôzne faktory je zameraný na získanie spoľahlivých údajov o presnosti a údajov merania simultánnou kontrolovanou variáciou vybraných faktorov. Umožňuje hodnotenie kombinovaného účinku faktorových a náhodných vplyvov. Navrhovanie experimentov umožňuje aj skúmanie robustnosti (10) analytickej metódy a stanovenie smerodajnej odchýlky vnútrolaboratórnej reprodukovateľnosti u všetkých matríc.

Ďalej sa uvádza príklad alternatívneho prístupu s použitím ortogonálneho experimentálneho plánu.

Môže sa preskúmať až sedem faktorov (faktory šumu). Štúdia je navrhnutá tak, aby sa presnosť, pravdivosť (na základe fortifikovaných vzoriek), citlivosť, neistota merania a kritické koncentrácie mohli určiť súbežne vďaka zavedeniu experimentálneho plánu.

Tabuľka 6

Príklad ortogonálneho experimentálneho plánu so siedmimi faktormi (I – VII), ktoré sa menili na dvoch hladinách (A/B) vo validačnej štúdii s ôsmimi experimentmi (kombinácia faktor – hladina)

Faktor I II III IV V VI VII Meranie 01 A A A A A A A Meranie 02 A A B A B B B Meranie 03 A B A B A B B Meranie 04 A B B B B A A Meranie 05 B A A B B A B Meranie 06 B A B B A B A Meranie 07 B B A A B B A Meranie 08 B B B A A A B

Výpočet charakteristík metódy sa vykoná podľa postupu, ktorý navrhol Jülicher a kol. (11).

2.2.3. Ďalšie validačné prístupy

Na preukázanie toho, že metóda spĺňa pracovné kritériá pre pracovné charakteristiky, sa môžu použiť iné prístupy, za predpokladu, že dosiahnu rovnakú úroveň a kvalitu informácií. Validáciu možno urobiť aj vykonaním medzilaboratórnej štúdie podľa kódexu Codex Alimentarius, ISO alebo IUPAC (12), alebo alternatívnymi metódami, ako sú vnútrolaboratórne štúdie alebo vnútrolaboratórna validácia (13). Ak sa uplatňujú alternatívne validačné postupy, vo validačnom protokole sa uvedie základný model a stratégia s príslušnými nevyhnutnými podmienkami, predpokladmi a vzorcami, alebo sa aspoň uvedú odkazy na ich dostupnosť.

2.3. Selektivita/špecifickosť

Treba zabezpečiť čo najväčšie rozlíšenie medzi analytom a jeho blízko príbuznými látkami. Stanoví sa interferencia homológov, izomérov, produktov rozkladu, endogénnych látok, analógov, metabolických produktov príslušného rezídua, zlúčenín matrice alebo akejkoľvek inej potenciálne interferujúcej látky a v prípade potreby sa táto metóda upraví tak, aby sa zabránilo zisteným interferenciám. Na určenie špecifickosti metódy sa použije tento prístup:

1. Vyberie sa škála chemicky príbuzných zlúčenín alebo iných látok, ktoré sa môžu pravdepodobne vyskytovať spolu so sledovanou zlúčeninou a ktoré môžu byť prítomné vo vzorke, a overí sa, či by mohli narušovať analýzu cieľového(-ých) analytu(-ov).

2. Analyzuje sa vhodný počet reprezentatívnych slepých vzoriek, napr. rôzne šarže alebo šarže pochádzajúce z rôznych druhov zvierat (n ≥ 20), a skontrolujú sa akékoľvek interferencie signálov, píkov alebo stôp iónov v príslušnej oblasti, v ktorej sa očakáva eluovanie cieľového analytu.

3. Fortifikujú sa reprezentatívne slepé vzorky v príslušnej koncentrácii látkami, ktoré by mohli narúšať identifikáciu a/alebo kvantifikáciu analytu, a preskúma sa, či pridaná látka: a) môže viesť k falošnej identifikácii; b) bráni identifikácii cieľového analytu; c) viditeľne ovplyvňuje kvantifikáciu.

2.4. Robustnosť

Testuje sa pretrvávajúca funkčnosť analytickej metódy, a to za rôznych experimentálnych podmienok, ktoré zahŕňajú napríklad rôzne podmienky odberu vzoriek a menšie zmeny, ktoré sa môžu vyskytnúť pri rutinnom testovaní. Pri testovaní robustnosti metódy by zmeny vykonané v experimentálnych podmienkach mali byť menšie. Význam týchto zmien sa vyhodnotí. Pre všetky malé zmeny, u ktorých sa ukázalo, že majú dôležitý vplyv na vykonanie skúšky, sa určí každá pracovná charakteristika.

2.5. Stabilita

Určí sa stabilita kalibračného štandardu, štandardu s odpovedajúcou matricou a/alebo štandardov s fortifikovanou matricou a analytu alebo zložiek matrice vo vzorke počas uchovávania alebo analýzy, keďže nestabilita môže ovplyvniť výsledky skúšky.

Stabilita analytu za rôznych podmienok uchovávania je zvyčajne dobre opísaná. Požadované informácie možno získať z experimentov vykonávaných na monitorovanie podmienok uchovávania štandardov a vzoriek, ktoré sa vykonávajú ako súčasť bežného postupu akreditácie laboratória a systému kontroly kvality. Ak sú k dispozícii údaje o stabilite analytov v matrici (napr. na základe informácií z referenčných laboratórií EÚ, publikovaných údajov atď.), nemusí ich určovať každé laboratórium. Odkaz na dostupné údaje o stabilite analytov v roztoku a matrici je však prijateľný len vtedy, ak sa použijú rovnaké podmienky.

V prípade, že požadované údaje o stabilite nie sú k dispozícii, mali by sa použiť uvedené prístupy.

2.5.1. Určenie stability analytu v roztoku

1. Pripravia sa čerstvé zásobné roztoky analytu(-ov) a zriedia tak, ako sa uvádza v pokynoch na skúšku, aby sa získali dostatočné alikvotné časti (napr. 40) každej vybranej koncentrácie. Pripravia sa vzorky: a) roztokov analytu, ktoré sa používajú na fortifikáciu; b) roztokov analytov, ktoré sa používajú na konečnú analýzu; c) akéhokoľvek iného roztoku, ktorý je vhodný (napr. derivatizované štandardy).

2. Podľa pokynov na skúšku sa zmeria obsah analytu v čerstvo pripravenom roztoku.

3. Príslušné objemy sa rozdelia do vhodných nádob, označia sa a uchovávajú sa vo svetelných a teplotných podmienkach uvedených v tabuľke 7. Čas uchovávania sa zvolí s prihliadnutím na aplikovanú analytickú prax, v ideálnom prípade až dovtedy, kým počas identifikácie a/alebo kvantifikácie nie je pozorovateľný prvý prejav degradácie. Ak sa počas štúdie stability nepozoruje žiadna degradácia, trvanie uchovávania v rámci štúdie stability sa rovná trvaniu maximálneho času uchovávania roztoku.

4. Vypočíta sa koncentrácia analytu(-ov) v každej alikvotnej časti v porovnaní s koncentráciou analytu v čerstvo pripravenom roztoku podľa tohto vzorca: zostatkový analyt (%) = Ci × 100/Cčerstvý Ci = koncentrácia v časovom bode i Cčerstvý = koncentrácia čerstvo pripraveného roztoku Priemerná hodnota piatich replikátov roztoku, ktoré boli uchovávané, sa nesmie líšiť o viac ako 15 % od priemernej hodnoty piatich čerstvo pripravených replikátov roztoku. Ako základ na výpočet percentuálneho rozdielu sa použije priemerná hodnota piatich čerstvo pripravených roztokov. Tabuľka 7 Schéma určenia stability analytu v roztoku -20 °C + 4 °C + 20 °C Tma 10 alikvotných častí 10 alikvotných častí 10 alikvotných častí Svetlo 10 alikvotných častí

2.5.2. Určenie stability analytu(-ov) v matrici

1. Pokiaľ je to možné, použijú sa prirodzene kontaminované vzorky. Ak nie je prirodzene kontaminovaná matrica k dispozícii, použije sa slepá matrica fortifikovaná analytom.

2. Ak je prirodzene kontaminovaná matrica k dispozícii, stanoví sa koncentrácia v čerstvo získanej matrici. Ďalšie alikvotné časti homogenizovanej prirodzene kontaminovanej matrice sa uchovávajú pri teplote mínus 20 °C alebo nižšej, ak je to potrebné, a pokým sa vzorka uchováva v laboratóriu, stanovujú sa koncentrácie analytu.

3. Ak prirodzene kontaminovaná matrica nie je k dispozícii, odoberie sa slepá matrica a homogenizuje sa. Táto matrica sa rozdelí na päť alikvotných častí. Každá alikvotná časť sa fortifikuje analytom, ktorý by mal byť pripravený pokiaľ možno v malom množstve vodného roztoku. Jedna alikvotná časť sa analyzuje hneď. Zostávajúce alikvoty sa uchovávajú pri teplote najmenej mínus 20 °C alebo nižšej, ak je to potrebné, a analyzujú sa po krátkodobom, strednodobom a dlhodobom uchovávaní s ohľadom na použité analytické metódy.

4. Zaznamená sa maximálny prijateľný čas uchovávania a optimálne podmienky uchovávania. Priemerná hodnota uchovávaných piatich replikátov roztoku sa nesmie líšiť od priemernej hodnoty piatich čerstvo pripravených replikátov o viac ako hodnotu vnútrolaboratórnej reprodukovateľnosti metódy. Ako základ na výpočet percentuálneho rozdielu sa použije priemerná hodnota piatich čerstvo pripravených roztokov.

2.6. Rozhodovací limit pre konfirmáciu (CCα)

Pre konfirmačné metódy sa stanoví CCα. CCα sa stanovuje za podmienok, ktoré sú v súlade s požiadavkami na identifikáciu alebo identifikáciu a kvantifikáciu, ako sa vymedzuje v oddiele „Pracovné kritériá a iné požiadavky na analytické metódy“ v kapitole 1.

Na kontrolu vyhovujúcich/nevyhovujúcich vzoriek je v hodnote CCα (rozhodovací limit pre konfirmáciu) už zohľadnená kombinovaná štandardná neistota merania.

1. V prípade nepovolených alebo zakázaných farmakologicky účinných látok sa CCα vypočíta takto: a) Metóda 1: postupom kalibračnej krivky podľa normy ISO 11843-1:1997 (14) (tu sa označuje ako minimálna detegovateľná hodnota čistej stavovej premennej). V tomto prípade sa použije slepý materiál, ktorý sa fortifikuje na hodnotu RPA alebo LCL a vyššie v ekvidištančných krokoch. Vzorky sa analyzujú. Po identifikácii sa do grafu podľa možnosti vynesie signál alebo prepočítaná koncentrácia oproti pridanej koncentrácii. Rozhodovacím limitom je koncentrácia, ktorá zodpovedá signálu rovnajúcemu sa hodnote priesečníka krivky s osou y zvýšenej o 2,33-násobok smerodajnej odchýlky vnútrolaboratórnej reprodukovateľnosti. Táto metóda je použiteľná len na kvantitatívne skúšky. Rozhodovacie limity získané týmto prístupom sa overia analýzou slepej matrice fortifikovanej na koncentráciu zodpovedajúcu vypočítanému rozhodovaciemu limitu. b) Metóda 2: analýzou najmenej 20 reprezentatívnych slepých vzoriek materiálu na každú matricu, aby bolo možné vypočítať pomer signál/šum v časovom intervale, v ktorom sa očakáva analyt. Ako rozhodovací limit je možné použiť trojnásobok pomeru signál/šum. Platí to pre kvantitatívne a kvalitatívne skúšky. Rozhodovacie limity získané týmto prístupom sa overia analýzou slepej matrice fortifikovanej na koncentráciu zodpovedajúcu vypočítanému rozhodovaciemu limitu. c) Metóda 3: CCα = LCL + k(jednostranný interval spoľahlivosti, 99 %) × (kombinovaná) štandardná neistota merania pri LCL V prípade nepovolených alebo zakázaných farmakologicky účinných látok sa v závislosti od validačného experimentu (a jeho príslušných stupňov voľnosti) môže rozumne použiť t-rozdelenie, alebo ak sa vychádza z Gaussovho rozdelenia (jednostranný interval spoľahlivosti, n = ∞), použije sa k-faktor rovný hodnote 2,33. Vnútrolaboratórna reprodukovateľnosť a pravdivosť sú vhodné na určenie (kombinovanej) štandardnej neistoty merania, ak je stanovená s prihliadnutím na všetky relevantné ovplyvňujúce faktory. Metóda 2 na výpočet CCα sa môže používať len do 1. januára 2026 v prípade metód validovaných pred dátumom nadobudnutia účinnosti tohto nariadenia. V prípade metód validovaných po nadobudnutí účinnosti tohto nariadenia sa použijú iba metódy 1 alebo 3.

2. V prípade povolených látok sa CCα vypočíta takto: a) V prípade povolených látok v kombináciách matrica/druh zvieraťa, pre ktoré bola stanovená MRL alebo ML: i) Metóda 1: postupom kalibračnej krivky podľa normy ISO 11843-1:1997 (tu sa označuje ako minimálna detegovateľná hodnota čistej stavovej premennej). V tomto prípade sa použije slepý materiál, ktorý sa fortifikuje na hodnotu MRL alebo ML a vyššie v ekvidištančných krokoch. Vzorky sa analyzujú. Po identifikácii sa do grafu podľa možnosti vynesie signál alebo prepočítaná koncentrácia oproti pridanej koncentrácii. Rozhodovacím limitom je koncentrácia, ktorá zodpovedá MRL alebo ML plus 1,64-násobok smerodajnej odchýlky vnútrolaboratórnej reprodukovateľnosti pri najvyššej prípustnej hodnote (α = 5 %). ii) Metóda 2: CCα = MRL (alebo ML) + k(jednostranný interval spoľahlivosti, 95 %) × (kombinovaná) štandardná neistota merania pri MRL alebo ML. V prípade povolených látok sa v závislosti od validačného experimentu (a jeho príslušných stupňov voľnosti) môže rozumne použiť t-rozdelenie, alebo ak sa vychádza z Gaussovho rozdelenia (jednostranný interval spoľahlivosti, n = ∞), použije sa k-faktor rovný hodnote 1,64. Vnútrolaboratórna reprodukovateľnosť a pravdivosť sú vhodné na určenie (kombinovanej) štandardnej neistoty merania, ak je stanovená s prihliadnutím na všetky relevantné ovplyvňujúce faktory. V prípade farmakologicky účinných látok, pre ktoré je stanovená MRL pre sumu rôznych látok, sa ako CCα na posúdenie sumy látok v meranej vzorke použije CCα látky s najvyššou koncentráciou vo vzorke. b) V prípade povolených látok pre kombinácie matrica/druh zvieraťa, pre ktoré nebola stanovená MRL, nesmú byť prítomné žiadne rezíduá, pokiaľ sa nevykonalo povolené liečenie v súlade s článkom 11 smernice 2001/82/ES. V prípade povolených látok, pre ktoré neboli stanovené MRL, sa na výpočet CCα použije kaskádová MRL stanovená podľa vykonávacieho nariadenia Komisie (EÚ) 2018/470 (15). Použije sa metóda 1 alebo 2 podľa vyššie uvedeného odseku, avšak „MRL“ označuje „0,5-násobok kaskádovej MRL, s cieľom dosiahnuť 0,1-násobok kaskádovej MRL, pokiaľ sa to dá rozumne dosiahnuť“.

2.7. Detekčná schopnosť pre skríning (CCβ)

Pre skríningové metódy sa stanoví CCβ. CCβ sa stanoví tak, ako je vymedzené v kapitole 1 „Pracovné kritériá a iné požiadavky na analytické metódy“ tejto prílohy a v súlade s požiadavkami stanovenými v tabuľke 5. V prípade skríningových metód sa však nemusia uplatňovať všetky požiadavky na identifikáciu (pozri 1.2.3, 1.2.4, 1.2.5).

1. V prípade nepovolených alebo zakázaných farmakologicky účinných látok sa musí zabezpečiť maximálna chyba β 5 %. CCβ sa vypočíta takto: a) Metóda 1: Postupom kalibračnej krivky podľa normy ISO 11843-1:1997 (tu sa uvádza ako minimálna detegovateľná hodnota čistej stavovej premennej). V tomto prípade sa použije reprezentatívna slepá vzorka materiálu, ktorá sa fortifikuje v ekvidištančných krokoch, začínajúc pod hodnotou alebo na hodnote RPA alebo ak nebola stanovená RPA, na hodnoty okolo STC (screening target concentration – cieľová koncentrácia skríningu). Vzorky sa analyzujú. Zostaví sa graf závislosti signálu od pridanej koncentrácie. Detekčnou schopnosťou je koncentrácia, ktorá zodpovedá STC plus 1,64-násobok smerodajnej odchýlky vnútrolaboratórnej reprodukovateľnosti priemerného nameraného obsahu na úrovni STC. Extrapolácia siahajúca hlboko pod najnižšiu fortifikovanú hladinu (< 50 % najnižšej fortifikovanej hladiny) sa potvrdí experimentálnymi údajmi vo validačnom kroku. b) Metóda 2: Analyzovaním fortifikovaného slepého materiálu pri koncentráciách na úrovni STC a vyššej. Pre každú úroveň koncentrácie sa analyzuje 20 fortifikovaných slepých vzoriek, aby sa zabezpečil spoľahlivý základ pre toto stanovenie. Detekčná schopnosť metódy sa rovná koncentrácii pri ktorej zostáva len ≤ 5 % falošne negatívnych výsledkov. c) Metóda 3: CCβ = STC + k(jednostranný interval spoľahlivosti, 95 %) × (kombinovaná) štandardná neistota merania na úrovni STC alebo na vyššej úrovni. V prípade nepovolených alebo zakázaných farmakologicky účinných látok sa v závislosti od validačného experimentu (a jeho príslušných stupňov voľnosti) môže primerane použiť t-distribúcia, alebo ak sa vychádza z Gaussovho rozdelenia (jednostranný interval spoľahlivosti, n=∞), použije sa k-faktor 1,64. Vnútrolaboratórna reprodukovateľnosť a pravdivosť sú vhodné na určenie (kombinovanej) štandardnej neistoty merania, ak je určená s prihliadnutím na všetky relevantné ovplyvňujúce faktory.

2. V prípade povolených látok sa musí zabezpečiť maximálna chyba β 5 %. CCβ sa vypočíta takto: a) Metóda 1: postupom kalibračnej krivky podľa normy ISO 11843-1:1997 (tu sa uvádza ako minimálna detegovateľná hodnota redukovanej koncentrácie). V tomto prípade sa použije slepý materiál, ktorý sa fortifikuje na hodnotu povoleného limitu a pod túto hodnotu, pričom sa začína od STC v ekvidištančných krokoch. Vzorky sa analyzujú a identifikuje sa analyt(-y). Vypočíta sa smerodajná odchýlka priemerného nameraného obsahu na úrovni STC. Detekčnou schopnosťou je koncentrácia, ktorá zodpovedá STC plus 1,64-násobok smerodajnej odchýlky vnútrolaboratórnej reprodukovateľnosti priemerného nameraného obsahu na úrovni STC; b) Metóda 2: analyzovaním fortifikovaného slepého materiálu pri koncentráciách na úrovni pod povoleným limitom. Pre každú úroveň koncentrácie sa analyzuje 20 fortifikovaných slepých vzoriek, aby sa zabezpečil spoľahlivý základ pre toto stanovenie. Detekčná schopnosť metódy sa rovná koncentrácii pri ktorej zostáva len ≤ 5 % falošne negatívnych výsledkov. c) Metóda 3: CCβ = STC + k(jednostranný interval spoľahlivosti, 95 %) × (kombinovaná) štandardná neistota merania na úrovni STC alebo na vyššej úrovni. V prípade povolených látok sa v závislosti od validačného experimentu (a jeho príslušných stupňov voľnosti) môže rozumne použiť t-rozdelenie, alebo ak sa vychádza z Gaussovho rozdelenia (jednostranný interval spoľahlivosti, n = ∞), použije sa k-faktor 1,64 (čokoľvek v rámci použitia kaskády alebo použitia platnej MLR). Vnútrolaboratórna reprodukovateľnosť a pravdivosť sú vhodné na určenie (kombinovanej) štandardnej neistoty merania, ak je stanovená s prihliadnutím na všetky relevantné ovplyvňujúce faktory. V prípade farmakologicky účinných látok, pre ktoré je stanovená MRL pre sumu rôznych látok, sa ako CCβ na posúdenie sumy látok v meranej vzorke použije CCβ látky s najvyššou koncentráciou vo vzorke.

2.8. Kalibračné krivky

Ak sa na kvantifikáciu používajú kalibračné krivky:

1. na zostrojenie krivky by sa prednostne malo použiť najmenej päť ekvidištančných hladín (koncentrácií) (vrátane nulovej hodnoty),

2. opíše sa pracovný rozsah krivky,

3. uvedie sa matematický vzorec krivky a vhodnosť údajov (korelačný koeficient R2) pre opísanú krivkou,

4. opíšu sa prípustné rozsahy parametrov krivky.

V prípade kalibračných kriviek založených na štandardnom roztoku, štandardoch s odpovedajúcou matricou alebo štandardoch s fortifikovanou matricou sa uvedú prípustné rozsahy pre parametre kalibračnej krivky, ktoré sa môžu u jednotlivých sérií meraní líšiť.

2.9. Absolútna výťažnosť

Absolútna výťažnosť metódy sa stanoví vtedy, keď sa nepoužije žiadny vnútorný štandard alebo kalibrácia s použitím fortifikovanej matrice.

Ak sú splnené požiadavky na pravdivosť stanovené v tabuľke 1, môže sa použiť fixný korekčný faktor. V opačnom prípade sa používa korekčný faktor pre výťažnosť, zistený pre konkrétnu sériu merania. Prípadne sa namiesto korekčného faktora pre výťažnosť použije postup štandardného prídavku (16) alebo vnútorný štandard.

Absolútna výťažnosť sa vypočíta pre najmenej šesť reprezentatívnych dávok matrice.

Jedna alikvotná časť slepej matrice sa pred extrakciou fortifikuje analytom a druhá alikvotná časť slepej matrice sa po príprave vzorky fortifikuje na príslušnú úroveň koncentrácie a stanoví sa koncentrácia analytu.

Výťažnosť sa vypočíta takto:

Výťažnosť (analyt) = (štandard s fortifikovanou matricou)/(štandard s odpovedajúcou matricou) × 100

2.10. Relatívne matricové efekty

Relatívny matricový efekt sa určí vo všetkých prípadoch. Môže sa to vykonať buď ako súčasť validácie, alebo v rámci samostatných experimentov. Výpočet relatívneho matricového efektu sa vykoná pre najmenej 20 rôznych slepých dávok (matrica/druh) podľa rozsahu metódy, napr. pre rôzne druhy zvierat, ktoré majú byť zahrnuté.

Slepá matrica sa po extrakcii fortifikuje analytom v koncentrácii zodpovedajúcej RPA, MRL alebo ML a mala by sa analyzovať spolu s čistým roztokom analytu v koncentrácii zodpovedajúcej RPA, MRL alebo ML.

Relatívny matricový efekt alebo matricový faktor (MF) sa vypočíta takto:

IS: vnútorný štandard

MMS: štandard s odpovedajúcou matricou

Variačný koeficient pre MF (štandard vztiahnutý na IS) nesmie byť vyšší ako 20 %.

KAPITOLA 3

KONTROLA KVALITY POČAS RUTINNEJ ANALÝZY – PRIEBEŽNÉ OVEROVANIE FUNKČNEJ SPÔSOBILOSTI METÓDY

Musia byť splnené požiadavky na zabezpečenie kvality analytických výsledkov podľa kapitoly 7.7 normy ISO/IEC 17025:2017 (17).

Uprednostňovanou možnosťou na poskytnutie dôkazov o funkčnej spôsobilosti metódy počas rutinnej analýzy je analýza certifikovaných referenčných materiálov (CRM). Keďže CRM, ktoré obsahujú príslušné analyty na požadovaných úrovniach koncentrácie, sú zriedka dostupné, ako alternatíva sa môžu použiť aj referenčné materiály poskytnuté a charakterizované referenčnými laboratóriami EÚ alebo laboratóriami, ktoré sú držiteľmi akreditácie ISO/IEC 17043:2010 (18). Ako ďalšia alternatíva sa môžu použiť vnútrolaboratórne referenčné materiály, ktoré sa pravidelne kontrolujú.

Priebežné overovanie funkčnej spôsobilosti metódy počas rutinnej analýzy sa musí vykonávať v rámci skríningového aj konfirmačného kroku.

1. Pre skríningový krok: S každou sériou (šaržou) vykonaných analýz sa súčasne analyzuje súbor týchto vzoriek na kontrolu kvality: a) kontrolná vzorka pre vhodnosť systému daného prístroja, ideálne špecifická pre danú metódu; b) vzorky na kontrolu kvality, ktoré sú fortifikované na koncentráciu blížiacu sa STC a v ideálnom prípade na koncentráciu zodpovedajúcu CCβ skríningu (v prípade povolených farmakologicky účinných látok, ako aj zakázaných alebo nepovolených látok); c) negatívna kontrolná vzorka (blank vzorka) a ak je to potrebné slepá vzorka reakčných činidiel.

2. Pre konfirmačný krok: S každou sériou (šaržou) vykonaných analýz sa súčasne analyzuje súbor týchto vzoriek na kontrolu kvality: a) kontrolná vzorka pre vhodnosť systému daného prístroja, ideálne špecifická pre danú metódu; b) vzorky na kontrolu kvality, ktoré sú fortifikované na koncentráciu blížiacu MRL alebo ML v prípade povolených farmakologicky účinných látok alebo blížiacu sa RPA alebo LCL v prípade zakázaných alebo nepovolených látok (nevyhovujúce kontrolné vzorky); c) negatívna kontrolná vzorka (blank vzorka) a ak je to potrebné slepá vzorka reakčných činidiel.

Pre vzorky na kontrolu kvality sa odporúča toto poradie: kontrolná vzorka pre vhodnosť systému prístroja, negatívna kontrolná vzorka (blank vzorka), vzorka(-y), ktorá(-é) sa má (majú) konfirmovať, opätovne negatívna kontrolná vzorka a fortifikovaná vzorka pre kontrolu kvality (pozitívna resp. nevyhovujúca kontrolná vzorka).

V prípade kvantitatívnych metód sa musí pre každú sériu (sekvenciu) úradných vzoriek analyzovať a merať kalibračná krivka pred uvedenými vzorkami alebo po nich.

Ak je to možné, pravdivosť (na základe fortifikovaných vzoriek) všetkých cieľových analytov v nevyhovujúcich kontrolných vzorkách sa vyhodnotí prostredníctvom regulačných diagramov v súlade s kapitolou 7.7 normy ISO/IEC 17025:2017. Ak si to vyžaduje neprimerane vysoký počet stanovení pravdivosti, počet analytov sa môže znížiť na niekoľko reprezentatívnych analytov.

KAPITOLA 4

ROZŠÍRENIE ROZSAHU VALIDÁCIE METÓDY, KTORÁ UŽ BOLA VALIDOVANÁ

Niekedy treba rozšíriť rozsah validácie metódy, ktorá už bola kompletne validovaná. V týchto prípadoch by sa rozšírenie rozsahu validácie malo uskutočniť účinným a analyticky spoľahlivým spôsobom. Možno to dosiahnuť vykonaním validácie na menšom počte vzoriek (napr. na polovičnom počte vzoriek) v porovnaní s úplnou validáciou.

Typ a počet modifikácií, ktoré sa majú validovať v rámci jedného redukovaného validačného plánu, sa však vždy zakladá na odborných znalostiach a predchádzajúcich skúsenostiach, napr. zmena techniky detekcie by si v každom prípade vyžadovala úplnú validáciu.

Vo všeobecnosti platí, že na zabezpečenie pretrvávajúcej validity metódy treba neustále sledovať jej funkčnú spôsobilosť a porovnávať ju s validačnými parametrami získanými na začiatku. V ideálnom prípade je táto priebežná kontrola funkčnej spôsobilosti metódy navrhnutá tak, aby bolo možné v priebehu času zozbierať chýbajúce údaje na úplnú validáciu (napr. pomocou niekoľkých dátových bodov zo vzoriek na kontrolu kvality v každej analytickej sérii).

4.1. Rozšírenie metód, pokiaľ ide o rozsah koncentrácií

V dôsledku zmien MRL, ML a RPA môže byť potrebné upraviť rozsah koncentrácie, pre ktorý je metóda validovaná. V takom prípade je prijateľné použiť redukovaný validačný plán.

Musia sa pripraviť kalibračné krivky pre modifikovaný rozsah podľa validovaného postupu. Musia sa analyzovať rôzne dávky fortifikované na rôzne koncentračné hladiny (porovnaj 2.2.1, 2.2.2). Pravdivosť, opakovateľnosť a vnútrolaboratórna reprodukovateľnosť/medziľahlá presnosť musia byť v prijateľnom rozsahu v porovnaní s hodnotami pôvodne validovanej metódy. V prípade potreby by sa mal vykonať nový výpočet CCβ (skríningové metódy) a CCα (konfirmačné metódy).

4.2. Rozšírenie metód, pokiaľ ide o ďalšie látky

Rozšírenie metódy na ďalšie zlúčeniny je vo všeobecnosti možné len v prípade analytov, ktoré majú podobnú štruktúru a charakteristické vlastnosti ako tie, ktoré sú už zahrnuté v analytickej metóde. V takom prípade je prijateľné použiť redukovaný validačný plán. Podobne nie je dovolené žiadne odchýlenie sa od popisu metódy.

Musia sa pripraviť kalibračné krivky pre pridané látky podľa validovaného postupu. Musia sa analyzovať rôzne šarže matricových materiálov fortifikovaných na rôzne koncentračné hladiny (porovnaj 2.2.1, 2.2.2). Pravdivosť, opakovateľnosť a vnútrolaboratórna reprodukovateľnosť/medziľahlá presnosť musia byť v rozsahu porovnateľnom s hodnotami ďalších analytov pôvodne validovanej metódy a musia byť v súlade s požiadavkami uvedenými v bode 1.2.2. V prípade nových analytov sa musí vykonať výpočet CCβ (skríningové metódy) a CCα (konfirmačné metódy).

4.3. Rozšírenie metód, pokiaľ ide o matrice/druhy zvierat

O zahrnutí nových matríc alebo druhov zvierat do už validovanej analytickej metódy sa vždy rozhoduje v závislosti od konkrétneho prípadu na základe doterajších poznatkov a skúseností s danou metódou a na základe predbežných experimentov odhadujúcich potenciálne matricové efekty a interferencie. Vo všeobecnosti to bude možné len pre matrice, ktoré vykazujú podobné vlastnosti, a pre nekritické analyty (z hľadiska stability a detegovateľnosti).

Musia sa pripraviť kalibračné krivky podľa validovaného postupu (zo štandardných roztokov alebo s fortifikovanou matricou). Musia sa analyzovať rôzne šarže matricového materiálu fortifikovaného na rôzne koncentračné hladiny (porovnaj 2.2.1, 2.2.2). Pravdivosť, opakovateľnosť a vnútrolaboratórna reprodukovateľnosť/medziľahlá presnosť by mali byť v prijateľnom rozsahu v porovnaní s hodnotami pôvodne validovanej metódy a v súlade s požiadavkami uvedenými v bode 1.2.2. V závislosti od validačného prístupu môže byť nevyhnutný nový výpočet CCβ (skríningové metódy) alebo CCα (konfirmačné metódy).

Ak výsledky nie sú v prijateľnom rozsahu v porovnaní s hodnotami pôvodnej matrice, bude nevyhnutná dodatočná úplná validácia, aby sa určili pracovné parametre špecifické pre matricu/druh zvieraťa.

V prípadoch, keď sa MRL pre konkrétnu látku u určitých matríc líšia, bude pravdepodobne ťažké prispôsobiť rozsah metódy dodatočnej matrici/druhu zvieraťa a koncentrácii, keďže v tomto prípade sa musia brať do úvahy dve modifikácie. V takýchto prípadoch sa odporúča úplná validácia.

(1) Kochromatografia je postup, v priebehu ktorého sa extrakt vzorky pred chromatografickým krokom (krokmi) rozdelí na dve časti. Prvá časť je chromatografovaná ako taká. Druhá časť je zmiešaná s analytickým štandardom, ktorý sa má merať. Potom je táto zmes tiež chromatografovaná. Množstvo pridaného analytického štandardu musí byť rovnaké ako odhadované množstvo analytu v extrakte. Kochromatografia sa používa na zlepšenie identifikácie analytu pri používaní chromatografických metód, hlavne ak nemôže byť použitý vhodný vnútorný štandard.

(*) * Uvedený CV (%) predstavuje usmerňujúcu hodnotu a mal by byť čo najnižší.

(a) aAk je tento prekurzorový ión rovnaký ión (alebo adukt alebo izotop) ako ión HRMS sledovaný v skene celého spektra, pre výber prekurzorového iónu sa nezískava žiadny ďalší identifikačný bod.

(#) Ak sú údaje o stabilite analytov v matrici dostupné z vedeckej literatúry alebo z iného laboratória, dotknuté laboratórium nemusí tieto údaje znova stanovovať. Odkaz na dostupné údaje o stabilite analytov v roztoku je však prijateľný len vtedy, ak sa použijú rovnaké podmienky.

(*) Pre MS metódy je dôležité preukázať prostredníctvom validácie, že sú splnené požiadavky na pracovné charakteristiky. Musí sa stanoviť relatívny matricový efekt metódy, pokiaľ nebol určený v priebehu validačného procesu. Absolútna výťažnosť metódy sa musí stanoviť vtedy, keď sa nepoužije žiadny vnútorný štandard, ani kalibrácia s fortifikovanou matricou.

(2) ISO 5725-4:2020 Presnosť (správnosť a zhodnosť) metód a výsledkov merania – Časť 4: Základné metódy stanovenia správnosti normalizovanej metódy merania (Clause 3 – Ustanovenie 3).

(3) Ak v prípade nepovolenej farmakologicky účinnej látky validácia koncentrácie 0,5-násobku RPA nie je rozumne dosiahnuteľná, môže sa koncentrácia 0,5-násobku RPA nahradiť najnižšou koncentráciou medzi 0,5-násobkom a 1,0-násobkom RPA, ktorá je rozumne dosiahnuteľná.

(4) Ak v prípade špecifickej farmakologicky účinnej látky validácia koncentrácie 0,1-násobku MRL nie je rozumne dosiahnuteľná, môže sa koncentrácia 0,1-násobku MRL nahradiť najnižšou koncentráciou medzi 0,1-násobkom a 0,5-násobkom MRL, ktorá je rozumne dosiahnuteľná.

(5) Ak v prípade nepovolenej farmakologicky účinnej látky validácia koncentrácie 0,5-násobku RPA nie je rozumne dosiahnuteľná, môže sa koncentrácia 0,5-násobku RPA nahradiť najnižšou koncentráciou medzi 0,5-násobkom a 1,0-násobkom RPA, ktorá je rozumne dosiahnuteľná.

(6) Ak v prípade špecifickej farmakologicky účinnej látky validácia koncentrácie 0,1-násobku MRL nie je rozumne dosiahnuteľná, môže sa koncentrácia 0,1-násobku MRL nahradiť najnižšou koncentráciou medzi 0,1-násobkom a 0,5-násobkom MRL, ktorá je rozumne dosiahnuteľná.

(7) ISO 5725-2:2019 Presnosť (správnosť a zhodnosť) metód a výsledkov merania – Časť 2: Základná metóda stanovenia opakovateľnosti a reprodukovateľnosti normalizovanej metódy merania (Clause 3 – Ustanovenie 3).

(8) ISO 11843-1:1997 Detekčná schopnosť– Časť 1: Termíny a definície.

(9) Codex Alimentarius, Organizácia OSN pre výživu a poľnohospodárstvo, Svetová zdravotnícka organizácia, Guidelines on estimation of uncertainty of results (Usmernenia k odhadu neistoty výsledkov) (CAC/GL 59 – 2006).

(10) Zmeny experimentálnych podmienok, ktoré sa tu uvádzajú, môžu zahŕňať materiály vzoriek, analyty, podmienky uchovávania, podmienky prostredia a/alebo podmienky prípravy vzoriek. Pri všetkých experimentálnych podmienkach, u ktorých by mohlo v praxi dochádzať ku kolísaniu (napr. stabilita reagentov, zloženie vzorky, hodnota pH, teplota), sa uvádzajú všetky zmeny, ktoré by mohli ovplyvniť analytický výsledok.

(11) Jülicher, B., Gowik, P. and Uhlig, S. (1998) Assessment of detection methods in trace analysis by means of a statistically based in-house validation concept (Posúdenie detekčných metód v stopovej analýze prostredníctvom štatisticky založenej koncepcie vnútrolaboratórnej validácie). Analyst, 120, 173.

(12) IUPAC (1995), Protocol for the design, conduct and interpretation of method-performance studies, Pure & Applied Chem, 67, 331.

(13) Gowik, P., Jülicher, B. and Uhlig, S. (1998) Multi-residue method for non-steroidal anti-inflammatory drugs in plasma using high performance liquid chromatography-photodiode-array detection. Method description and comprehensive in-house validation. J. Chromatogr., 716, 221.

(14) ISO 11843-1:1997 Detekčná schopnosť– Časť 1: Termíny a definície.

(15) Vykonávacie nariadenie Komisie (EÚ) 2018/470 z 21. marca 2018 o podrobných pravidlách týkajúcich sa maximálneho limitu rezíduí, ktoré sa berú do úvahy na kontrolné účely pre potraviny vyrobené zo zvierat, ktoré boli liečené v EÚ podľa článku 11 smernice 2001/82/ES (Ú. v. EÚ L 79, 22.3.2018, s. 16).

(16) Množstvo pridaného analytického štandardu môže byť napríklad dvojnásobkom až päťnásobkom odhadovaného množstva analytu vo vzorke. Tento postup je určený na stanovenie obsahu analytu vo vzorke, pričom sa zohľadňuje výťažnosť tohto analytického postupu.

(17) ISO/IEC 17025: 2017 Všeobecné požiadavky na kompetentnosť testovacích a kalibračných laboratórií (kapitola 7.7).

(18) ISO/IEC17043:2010 Posudzovanie zhody – Všeobecné požiadavky na medzilaboratórne skúšky.