6.

Dopĺňajú sa kapitoly C.31 až C.46: „ C.31. TEST SUCHOZEMSKÝCH RASTLÍN: TEST VZCHÁDZANIA SEMIEN A RASTU SADENÍC ÚVOD 1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 208 (2006). Testovacie metódy sa pravidelne revidujú vzhľadom na vedecký pokrok a použiteľnosť na regulačné účely. Táto aktualizovaná testovacia metóda je určená na hodnotenie možných účinkov chemikálií na vzchádzanie semien a rast sadeníc. Nevzťahuje sa na chronické účinky alebo účinky na reprodukciu (t. j. prípravu osiva, tvorbu kvetov, dozrievanie plodov). Posúdiť sa musia podmienky expozície a vlastnosti chemikálie, ktorá sa má testovať, aby sa zabezpečilo použitie vhodných testovacích metód (napr. pri testovaní kovov/kovových zlúčenín by sa mali posúdiť účinky pH a súvisiacich iónov s opačnými nábojmi) (1). Táto testovacia metóda sa nevzťahuje na rastliny vystavené pôsobeniu pár chemikálií. Použiteľná je na testovanie všeobecných chemikálií, biocídov a výrobkov na ochranu plodín (známych aj ako prípravky na ochranu rastlín alebo pesticídy). Metóda bola vyvinutá na základe existujúcich metód uvedených v literatúre pod číslami (2) (3) (4) (5) (6) (7). Uvádzajú sa aj ďalšie odkazy týkajúce sa testovania rastlín pod číslami (8) (9) (10). Vymedzenie použitých pojmov je uvedené v dodatku 1. PRINCÍP TESTU 2. Týmto testom sa hodnotia účinky na rast sadeníc a skorý rast vyšších rastlín po expozícii testovanej chemikálii v pôde (alebo inej vhodnej pôdnej matrici). Semená sa vystavia styku s pôdou s aplikovanou testovanou chemikáliou a hodnotia sa účinky po uplynutí zvyčajne 14 – 21 dní po vzídení sadenice v kontrolnej skupine o 50 %. Meranými konečnými parametrami sú vizuálne posúdenie vzchádzania sadeníc, suchá hmotnosť výhonkov (prípadne čerstvá hmotnosť výhonkov) a v niektorých prípadoch výška výhonku, ako aj posúdenie viditeľných škodlivých účinkov na rôzne časti rastliny. Tieto merania a pozorovania sa porovnávajú s meraniami a pozorovaniami kontrolných rastlín bez aplikovanej chemikálie. 3. V závislosti od očakávaného spôsobu expozície sa testovaná chemikália pridá do pôdy (prípadne do matrice s umelo pripravenou pôdou) alebo sa aplikuje na povrch pôdy, čo primerane reprezentuje potenciálny spôsob expozície chemikálie. Pri pridávaní do pôdy sa chemikália aplikuje do určitého objemu voľnej pôdy. Po aplikácii sa pôda prenesie do nádob a následne sa semená daného rastlinného druhu vysadia do pôdy. Povrchové aplikácie sa robia na pôdu v nádobách, do ktorej boli semená už vysadené. Testovacie jednotky (kontrolné vzorky, vzorky pôdy s aplikovanou chemikáliou a semená) sa následne umiestnia do vhodných podmienok na podporu klíčenia/rastu rastlín. 4. Podľa zámeru štúdie sa test môže vykonať s cieľom zostrojiť krivku závislosti odozvy od dávky, alebo ako limitný test jednej koncentrácie/dávky. Ak výsledky testu jednej koncentrácie/dávky prekročia určitú úroveň toxicity (napr. ak boli zaznamenané väčšie účinky než x %), vykoná sa test na vyhľadávanie rozsahu, ktorým sa stanoví horné a dolné hranice toxicity, a následne sa vykoná viacnásobný test koncentrácie/dávky na vytvorenie krivky závislosti odozvy od dávky. Na získanie hodnôt účinnej koncentrácie ECx alebo účinnej aplikačnej dávky ERx (napr. EC25, ER25, EC50, ER50) pre najcitlivejšie sledovaný parameter, resp. parametre sa používa vhodná štatistická analýza. V rámci tohto testu sa môžu vypočítať aj hodnoty koncentrácie bez pozorovaného účinku (NOEC) a najnižšej koncentrácie s pozorovaným účinkom (LOEC). INFORMÁCIE O TESTOVANEJ CHEMIKÁLII 5. Pri identifikácii očakávaného spôsobu expozície chemikálie a pri navrhovaní testu sú užitočné tieto informácie: štrukturálny vzorec, čistota, rozpustnosť vo vode, rozpustnosť v organických rozpúšťadlách, rozdeľovacia konštanta 1-oktanol/voda, sorpčné vlastnosti pôdy, tlak pary, chemická stabilita vo vode a na svetle a biodegradovateľnosť. PLATNOSŤ TESTU 6. Na to, aby bol test platný, je potrebné v kontrolných vzorkách splniť tieto kritériá: — vzchádzanie semien (sadeníc) dosahuje najmenej 70 %, — sadenice nevykazujú viditeľné fytotoxické účinky (napr. chlorózu, nekrózu, vädnutie, deformácie listov a stoniek) a rastliny vykazujú len rozdiely v raste a morfológii bežné pre daný druh, — stredná miera prežitia vzídených kontrolných sadeníc počas celej štúdie je najmenej 90 %, — environmentálne podmienky pre jednotlivé druhy sú rovnaké a rastové médiá obsahujú rovnaké množstvo pôdnej matrice, podporných médií alebo substrátu z rovnakého zdroja. REFERENČNÁ CHEMIKÁLIA 7. Referenčná chemikália sa môže testovať v pravidelných intervaloch s cieľom overiť, či sa vykonanie testu, reakcia príslušných testovacích rastlín a podmienky testu postupom času výrazne nezmenili. Alternatívne by sa staršie merania množstva biomasy alebo rastu kontrolných vzoriek mohli použiť na hodnotenie výkonnosti testovacieho systému v konkrétnych laboratóriách a môžu slúžiť ako prostriedok kontroly kvality v rámci jednotlivých laboratórií. OPIS METÓDY Prirodzená pôda – umelý substrát 8. Rastliny sa môžu pestovať v nádobách v pieskovohlinitej pôde, hlinitopieskovej pôde alebo pieskovoílovitej hline, ktorá obsahuje až 1,5 % organického uhlíka (približne 3 % organickej hmoty). Použiť sa môže aj komerčná záhradkárska zemina alebo syntetická pôdna zmes s obsahom do 1,5 % organického uhlíka. Ílovité pôdy by sa nemali používať, ak je testovaná chemikália známa vysokou afinitou k ílom. Pôda z poľa by sa mala preosiať na veľkosť častíc 2 mm s cieľom zhomogenizovať ju a odstrániť z nej veľké častice. Zaznamenať by sa mal typ a štruktúra konečnej pripravenej pôdy, jej percentuálny obsah organického uhlíka, pH a obsah soli ako parameter elektrónovej vodivosti. Pôda by sa mala klasifikovať podľa štandardnej klasifikačnej schémy (11). Pôda by sa mohla pasterizovať alebo tepelne ošetriť s cieľom znížiť vplyv pôdnych patogénov. 9. Prírodná pôda môže skomplikovať interpretáciu výsledkov a zvýšiť ich premenlivosť v dôsledku premenlivých fyzikálnych/chemických vlastností a mikrobiálnych populácií. Tieto premenné následne menia schopnosť zadržiavania vlhkosti, schopnosť vytvárania chemických väzieb, prevdzušňovanie a obsah živín a stopových prvkov. Okrem premenlivosti týchto fyzikálnych faktorov sa vyskytnú aj zmeny v chemických vlastnostiach, ako je napríklad pH a oxidačno-redukčný potenciál, ktoré môžu ovplyvniť biodostupnosť testovanej chemikálie (12) (13) (14). 10. Umelé substráty sa spravidla nepoužívajú na testovanie výrobkov na ochranu plodín, ale môžu sa použiť na testovanie všeobecných chemikálií, alebo ak je žiaduce, aby sa minimalizovala premenlivosť prírodnej pôdy a zvýšila porovnateľnosť výsledkov testu. Použité substráty by mali byť zložené z inertných materiálov, ktoré minimalizujú interakciu s testovanou chemikáliou, nosným rozpúšťadlom alebo obidvoma. Kyselinou premytý kremenný piesok, minerálna vlna a sklené guľôčky (s priemerom napríklad 0,35 – 0,85 mm) sú vhodné inertné materiály, ktoré minimálne absorbujú testovanú chemikáliu (15), aby sa zabezpečilo, že chemikália bude maximálne dostupná sadenici prostredníctvom koreňa. Medzi nevhodné substráty patria vermikulit, perlit alebo iné vysokoabsorpčné materiály. Na to, aby rastliny netrpeli nedostatkom výživy, mali by sa im dodávať živiny potrebné na ich rast. Ak je to možné, potreba živín by sa mala posúdiť prostredníctvom chemickej analýzy alebo vizuálnym hodnotením kontrolných rastlín. Kritériá pre výber testovaných druhov 11. Výber druhov by mal byť dostatočne široký, napríklad vzhľadom na ich taxonomickú diverzitu v rastlinnej ríši, ich rozdelenie, hojnosť, osobitné charakteristiky životného cyklu druhov a región prirodzeného výskytu, aby vznikol dostatočne široký rozsah reakcií (8) (10) (16) (17) (18) (19) (20). Pri výbere by sa mali zohľadniť tieto charakteristiky možných testovacích druhov: — použité druhy majú jednotné semená, ktoré sú ľahko dostupné zo spoľahlivých štandardných zdrojov osiva, ich klíčenie je konzistentné, spoľahlivé a rovnomerné a rast sadeníc je tiež rovnomerný, — rastlinu je možné testovať v laboratóriu a môže poskytnúť spoľahlivé a reprodukovateľné výsledky v rámci rôznych testovacích zariadení, — citlivosť testovacích druhov by mala byť v súlade s reakciami rastlín vystavených účinkom chemikálie v prírodnom prostredí, — do určitej miery sa využívali v predchádzajúcich testoch toxicity a ich použitie, napríklad v rámci biologických testov herbicídov, skríningových testov ťažkých kovov, stresových testov slanosti alebo minerálov alebo štúdií alelopatie, ukazuje citlivosť na širokú škálu stresových faktorov, — sú zlučiteľné s rastovými podmienkami testovacej metódy, — spĺňajú kritériá platnosti testu. Niektoré v minulosti použité testovacie druhy sú uvedené v dodatku 2 a potenciálne druhy iné ako plodiny v dodatku 3. 12. Počet druhov, ktoré sa majú testovať, závisí od príslušných regulačných požiadaviek, preto nie je uvedený v tejto testovacej metóde. Aplikácia testovanej chemikálie 13. Chemikália by sa mala aplikovať vo vhodnom nosiči (napr. voda, acetón, etanol, polyetylénglykol, arabská guma, piesok). Testovať sa môžu aj zmesi (pripravené výrobky alebo prípravky), ktoré obsahujú účinné zložky a rozličné pomocné látky. Pridávanie do pôdy/do umelého substrátu 14. Chemikálie, ktoré sú rozpustné vo vode alebo suspendované vo vode, sa môžu pridať do vody a potom sa roztok zmieša s pôdou pomocou vhodného miešacieho zariadenia. Tento typ testu môže byť vhodný, ak k expozícii chemikálie dochádza cez pôdu alebo cez vodu, ktorá sa nachádza v pôdnych póroch, pričom existujú obavy o prenos koreňmi. Pridaním testovanej chemikálie by sa nemala prekročiť pôdna kapacita retencie vody. Objem pridanej vody by mal byť rovnaký pre každú testovanú koncentráciu, ale mal by byť obmedzený tak, aby nedochádzalo k vytváraniu zhlukov v pôde. 15. Chemikálie s nízkou rozpustnosťou vo vode by sa mali rozpustiť vo vhodnom prchavom rozpúšťadle (napr. acetón, etanol) a zmiešať s pieskom. Rozpúšťadlo sa potom môže z piesku odstrániť pomocou prúdu vzduchu za nepretržitého premiešavania piesku. Piesok s aplikovanou chemikáliou sa zmieša s experimentálnou pôdou. Vytvorí sa druhá kontrolná vzorka, do ktorej sa pridá iba piesok a rozpúšťadlo. Do vzoriek s aplikovanou chemikáliou všetkých koncentrácií a do druhej kontrolnej vzorky sa pridá rovnaké množstvo piesku so zamiešaným a následne odstráneným rozpúšťadlom. V prípade tuhých, nerozpustných testovaných chemikálií sa vo vhodnom miešacom zariadení zmieša suchá pôda s chemikáliou. Pôda sa potom pridá do nádob a okamžite sa zasadia semená. 16. Ak sa namiesto pôdy používa umelý substrát, chemikálie, ktoré sú rozpustné vo vode, sa môžu rozpustiť v živnom roztoku tesne pred začiatkom testu. Chemikálie, ktoré nie sú rozpustné vo vode, ale je možné ich suspendovať vo vode pomocou nosiča, ktorým je rozpúšťadlo, by sa mali pridať do živného roztoku s nosičom. Chemikálie, ktoré nie sú rozpustné vo vode a pre ktoré nie je k dispozícii netoxický nosič rozpustný vo vode, by sa mali rozpustiť vo vhodnom prchavom rozpúšťadle. Roztok sa zmieša s pieskom alebo sklenými guľôčkami, vloží do rotačného vákuového zariadenia a odparí, pričom vznikne rovnomerný nános chemikálie na piesku alebo guľôčkach. Pred naplnením nádob by sa mala odvážená časť guľôčok extrahovať rovnakým organickým rozpúšťadlom a testovanou chemikáliou. Povrchová aplikácia 17. V prípade výrobkov na ochranu plodín sa pri aplikácii testovanej chemikálie často používa striekanie testovacieho roztoku na povrch pôdy. Všetko vybavenie, ktoré sa používa na vykonávanie testov, vrátane zariadenia používaného na prípravu a podávanie testovanej chemikálie, by malo mať takú konštrukciu a kapacitu, aby bolo možné testy s týmto vybavením vykonať presne a s reprodukovateľným pokrytím. Pokrytie by malo byť jednotné na celej ploche pôdy. Je potrebné dbať na to, aby sa zabránilo možnosti adsorbovania chemikálií alebo ich reagovania v styku so zariadením (napr. plastovými rúrkami a lipofilnými chemikáliami alebo oceľovými časťami a prvkami). Testovaná chemikália sa rozstrieka na povrch pôdy tak, aby sa simulovala typická aplikácia postrekom z cisterny. Vo všeobecnosti by sa mal objem rozstriekanej chemikálie pohybovať v rozsahu normálnej poľnohospodárskej praxe a používaných objemov (množstvo vody atď. by sa malo zaznamenať). Typ dýzy by sa mal zvoliť tak, aby sa zabezpečilo rovnomerné pokrytie povrchu pôdy. Ak sa používajú rozpúšťadlá a nosiče, mala by sa vytvoriť druhá skupina kontrolných rastlín, pri ktorých by sa použilo iba rozpúšťadlo/nosič. To nie je potrebné v prípade výrobkov na ochranu plodín, ktoré sa testujú ako prípravky. Overovanie koncentrácie/dávky testovanej chemikálie 18. Hodnoty koncentrácií/dávok aplikácie sa musia potvrdiť príslušným analytickým overovaním. V prípade rozpustných chemikálií sa všetky testovacie koncentrácie/dávky môžu potvrdiť analýzou najvyššej koncentrácie testovacieho roztoku použitého na test, s dokumentáciou o následnom riedení a o používaní kalibrovaného aplikačného zariadenia (napr. kalibrovaného analytického skla, kalibrovaného postrekovacieho aplikačného zariadenia). V prípade nerozpustných chemikálií sa na overovanie materiálu zlúčeniny musia použiť hmotnosti testovanej chemikálie pridané do pôdy. Ak sa vyžaduje preukázanie homogénnosti, môže byť potrebná analýza pôdy. POSTUP Koncepcia testu 19. Semená toho istého druhu sa pestujú v príslušných nádobách. Počet semien zasadených do každej nádoby bude závisieť od druhu rastliny, veľkosti nádoby a trvania testu. Počet rastlín v nádobe by mal zabezpečiť vhodné podmienky na rast a zabrániť preplneniu nádoby v priebehu testu. Maximálna hustota výsadby je približne 3 až 10 semien na 100 cm2 v závislosti od veľkosti semien. Napríklad do nádoby s priemerom 15 cm sa odporúča zasadiť jednu až dve rastliny kukurice, sóje, rajčiaku, uhorky alebo cukrovej repy, tri rastliny repky alebo hrachu a 5 až 10 semien cibule, pšenice alebo iných malých semien. Počet semien a paralelných nádob (replikát sa vymedzuje ako paralelná nádoba, takže rastliny v rámci tej istej nádoby netvoria replikát) by mal byť primeraný pre optimálnu štatistickú analýzu (21). Je potrebné si uvedomiť, že variabilita bude vyššia v prípade testovaných druhov, v prípade ktorých sa v každej nádobe (replikáte) použije menší počet veľkých semien v porovnaní s testovacím druhom, pri ktorom sa v každej nádobe môže použiť väčší počet malých semien. Zasadením rovnakého počtu semien do každej nádoby sa táto variabilita môže minimalizovať. 20. Kontrolné skupiny sa používajú s cieľom zabezpečiť, aby pozorované účinky boli spájané len s expozíciou testovanej chemikálie alebo sa expozícii testovanej chemikálie pripisovali. Vhodná kontrolná skupina by mala byť v každom ohľade identická s testovacou skupinou, okrem expozície účinkom testovanej chemikálie. V rámci daného testu by všetky testovacie rastliny vrátane kontrolných mali pochádzať z toho istého zdroja. S cieľom predísť ovplyvňovaniu je potrebné náhodné zaraďovanie testovacích a kontrolných nádob. 21. Používať by sa nemali semená obaľované insekticídom alebo herbicídom (t. j. upravené semená). Použitie určitých nesystémových kontaktných fungicídov (napr. kaptánu, tirámu) však niektoré regulačné orgány povoľujú (22). Ak existuje možnosť výskytu patogénov prenášaných semenami, semená sa môžu nakrátko namočiť do slabého, 5 % roztoku chlórnanu, potom sa dôkladne opláchnu v tečúcej vode a vysušia. Žiadne ošetrenie iným výrobkom na ochranu plodín nie je povolené. Podmienky testu 22. Podmienky testu by sa mali približovať podmienkam potrebným na normálny rast testovacích druhov a odrôd (príklady podmienok testu sú uvedené v dodatku 4). Klíčiace rastliny by sa mali udržiavať správnymi záhradníckymi postupmi v kontrolovanom prostredí komôr, fytotrónov alebo skleníkov. Pri použití rastových zariadení tieto postupy zvyčajne zahŕňajú kontrolu a primerane časté (napr. denné) zaznamenávanie teploty, vlhkosti, koncentrácie oxidu uhličitého, svetla (intenzity, vlnovej dĺžky, fotosynteticky aktívneho žiarenia) a času osvetlenia, spôsobu zavlažovania atď., s cieľom zabezpečiť správny rast rastlín v porovnaní s kontrolnými rastlinami vybratých druhov. Teplota v skleníku by sa mala regulovať prostredníctvom systémov vetrania, vykurovania a/alebo chladenia. Na testovanie v skleníkoch sa vo všeobecnosti odporúčajú tieto podmienky: — teplota: 22 °C ± 10 °C, — vlhkosť: 70 % ± 25 %, — fotoperióda: minimálne 16 hodín svetla, — svietivosť: 350 ± 50 μE/m2/s. Môže byť potrebné doplnkové osvetlenie, ak intenzita klesne pod hodnotu 200 μE/m2/s pri vlnových dĺžkach 400 – 700 nm, s výnimkou určitých druhov, ktorých požiadavky na svetlo sú nižšie. Podmienky prostredia by sa mali v priebehu štúdie monitorovať a zaznamenávať. Rastliny by sa mali pestovať v nepórovitých plastových alebo glazovaných nádobách s podložkou alebo miskou pod nádobou. Nádoby sa môžu pravidelne premiestňovať s cieľom minimalizovať variabilitu v raste rastlín (vzhľadom na rozdiely v podmienkach testu v rámci rastových zariadení). Nádoby musia byť dostatočne veľké, aby umožnili normálny rast. 23. Pôdne živiny sa môžu podľa potreby dopĺňať, aby sa zachovala vysoká životaschopnosť rastlín. Potreba a časovanie ďalších živín je možné posúdiť pozorovaním kontrolných rastlín. Odporúča sa spodné dopĺňanie vody do testovacích nádob (napr. pomocou knôtov zo sklenených vlákien). Počiatočné vrchné zavlažovanie sa však môže využiť na stimuláciu klíčenia semena a v prípade aplikácie na povrchu pôdy uľahčuje pohyb chemikálie do pôdy. 24. Osobitné podmienky rastu by mali byť vhodné pre skúmaný testovací druh a testovanú chemikáliu. Kontrolné rastliny a rastliny s aplikovanou chemikáliou sa musia uchovávať v rovnakých podmienkach prostredia, mali by sa však prijať primerané opatrenia, aby sa zabránilo krížovej expozícii (napr. prchavých chemikálií) medzi jednotlivými rastlinami s aplikovanou chemikáliou a kontrolných rastlín testovacím chemikáliám. Testovanie s jednou koncentráciou/dávkou 25. Pri určovaní vhodnej koncentrácie/dávky chemikálie na vykonanie testu s jednou koncentráciou alebo dávkou (kontrolný/limitný test) je potrebné zvážiť viaceré faktory. V prípade všeobecných chemikálií to zahŕňa fyzikálne/chemické vlastnosti danej chemikálie. V prípade výrobkov na ochranu plodín je potrebné zvážiť fyzikálne/chemické vlastnosti a spôsob použitia testovanej chemikálie, jej maximálnu koncentráciu alebo aplikačnú dávku, počet aplikácií za sezónu a/alebo perzistenciu testovanej chemikálie. Na zistenie, či všeobecná chemikália má fytotoxické vlastnosti, môže byť vhodné vykonať test pri maximálnej hladine 1 000 mg/kg suchej pôdy. Test na vyhľadávanie rozsahu 26. V prípade potreby sa môže vykonať test na vyhľadávanie rozsahu, poskytujúci usmernenie týkajúce sa koncentrácií/dávok, ktoré sa majú testovať v rámci konečnej štúdie odozvy na dávku. Pri teste na vyhľadávanie rozsahu by hodnoty testovacích koncentrácií/dávok mali mať veľké rozstupy (napr. 0,1, 1, 10, 100 a 1 000 mg/kg suchej pôdy). V prípade výrobkov na ochranu plodín by sa hodnoty koncentrácií/dávok mohli zakladať na odporúčaných alebo maximálnych hodnotách koncentrácie alebo aplikačnej dávky, napríklad 1/100, 1/10, 1/1 odporúčanej/maximálnej koncentrácie alebo aplikačnej dávky. Testovanie s viacerými koncentráciami/dávkami 27. Účelom testu s viacerými koncentráciami/dávkami je určiť vzťah dávky a účinku a stanoviť hodnotu ECx alebo ERx pre vzchádzanie, biomasu a/alebo vizuálne účinky v porovnaní s kontrolnými rastlinami bez expozície tak, ako to vyžadujú regulačné orgány. 28. Počet a rozstup hodnôt koncentrácie alebo dávky by mal byť dostatočný na vytvorenie spoľahlivého vzťahu dávky a účinku a príslušnej regresnej rovnice, ako aj na stanovenie odhadu hodnoty ECx alebo ERx. Zvolené koncentrácie/dávky by mali zahŕňať hodnoty ECx alebo ERx, ktoré treba určiť. Napríklad, ak sa požaduje hodnota koncentrácie EC50, bolo by žiaduce vykonať test s dávkami, ktoré vytvárajú účinok 20 – 80 %. Na dosiahnutie tohto cieľa sa odporúča použiť najmenej päť testovacích koncentrácií/dávok v geometrickom rade, spolu s kontrolnými vzorkami bez aplikovanej chemikálie, pričom faktor rozstupu medzi hodnotami by nemal presahovať tri. Počet replikátov pre každú skupinu s aplikovanou chemikáliou a kontrolnú skupinu by mal byť najmenej štyri a celkový počet semien by mal byť najmenej 20. V prípade väčšieho počtu replikátov určitých rastlín s nízkou rýchlosťou klíčenia alebo variabilnými spôsobmi rastu môže byť potrebné zvýšiť štatistickú významnosť testu. Ak sa použije väčší počet testovacích koncentrácií/dávok, počet replikátov sa môže znížiť. Ak sa má odhadnúť hodnota koncentrácie NOEC, na dosiahnutie želanej štatistickej významnosti môže byť potrebných viac replikátov (23). Pozorovania 29. Počas sledovaného obdobia, t. j. 14 až 21 dní od vyklíčenia 50 % kontrolných rastlín (prípadne aj kontrol s aplikáciou rozpúšťadla), sa rastliny často pozorujú (najmenej raz týždenne, a ak je to možné, denne), pričom sa sleduje klíčenie a vizuálna fytotoxicita a mortalita. Na konci testu by sa mali zaznamenať výsledky merania percentuálnych hodnôt vzchádzania a množstva biomasy rastlín, ktoré prežili, ako aj viditeľné škodlivé účinky na rôzne časti rastliny. Medzi viditeľné škodlivé účinky patria abnormality vo vzhľade vzídených sadeníc, zastavený rast, chloróza, úbytok farby, mortalita a účinky na vývoj rastliny. Konečné množstvo biomasy je možné merať pomocou konečnej priemernej sušiny vo výhonkoch rastlín, ktoré prežili. Výhonky na povrchu pôdy na zozbierajú a vysušia na konštantnú hmotnosť pri teplote 60 °C. Alternatívne sa konečné množstvo biomasy môže merať pomocou hmotnosti výhonkov v čerstvom stave. Ďalším konečným parametrom môže byť výška výhonku, ak to vyžadujú regulačné orgány. Na hodnotenie pozorovateľných toxických reakcií by sa mal použiť jednotný systém hodnotenia viditeľného poškodenia. Príklady kvalitatívneho a kvantitatívneho vizuálneho hodnotenia sú uvedené v literatúre pod číslami (23) (24). ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV Štatistická analýza Test s jednou koncentráciou/dávkou 30. Údaje pre každý rastlinný druh by sa mali analyzovať s použitím vhodnej štatistickej metódy (21). V správe by sa mala uviesť úroveň účinku pri testovanej koncentrácii/dávke alebo skutočnosť, že sa pri testovanej koncentrácii/dávke daný účinok nedosiahol (napr. účinok < x % pozorovaný pri koncentrácii alebo dávke y). Test s viacerými koncentráciami/dávkami 31. Vzťah medzi dávkou a reakciou sa stanoví regresným výpočtom. Použiť sa môžu rôzne modely: napríklad na odhad hodnôt ECx alebo ERx (napr. EC25, ER25, EC50, ER50) a ich hraníc spoľahlivosti pre vzchádzanie ako kvantálny údaj by mohli byť vhodné metódy ako probitová, logitová, Weibullova, Spearman-Karberova, upravená Spearman-Karberova atď. Pre priebežné parametre rastu sadeníc (hmotnosť a výšku) sa hodnoty ECx alebo ERx a ich hranice spoľahlivosti môžu odhadnúť pomocou vhodnej regresnej analýzy [napríklad Bruceova-Versteegova nelineárna regresná analýza (25)]. Vždy, keď je to možné, hodnota R2 pre najcitlivejšie druhy by mala byť 0,7 alebo vyššia a účinky použitých testovacích koncentrácií/dávok by mali byť v rozsahu 20 až 80 %. Ak sa má odhadnúť hodnota koncentrácie NOEC, uprednostniť by sa malo použitie výkonných štatistických testov a tie by sa mali vyberať na základe rozdelenia údajov (21) (26). Protokol o skúške 32. V protokole o skúške by sa mali predložiť výsledky štúdie, ako aj podrobný opis podmienok testu, dôkladný rozbor výsledkov, analýza údajov a závery vyplývajúce z analýzy. Poskytnúť by sa malo zhrnutie vo forme tabuliek a prehľad výsledkov. Protokol musí obsahovať tieto informácie: Testovaná chemikália: — identifikačné údaje chemikálie, dôležité vlastnosti testovanej chemikálie (napr. hodnota log Pow, rozpustnosť vo vode, tlak pary a informácie o osude a správaní látky v životnom prostredí, ak sú k dispozícii), — podrobné údaje o testovacom roztoku a overovaní testovaných koncentrácií tak, ako sa uvádza v bode 18. Testované druhy: — podrobné údaje o testovacom organizme: druh/odroda, čeľaď rastliny, vedecké a bežné názvy, čo najpodrobnejšie informácie o zdroji a histórii osiva (t. j. názov dodávateľa, percentuálna klíčivosť, trieda veľkosti semena, číslo dávky alebo šarže, rok vysemenenia alebo sezóna rastu, dátum hodnotenia klíčivosti), životaschopnosť atď., — počet jedno- a dvojklíčnolistových testovacích druhov, — odôvodnenie výberu druhov, — opis skladovania, ošetrovania a udržiavania osiva. Podmienky testu: — testovacie zariadenie (napr. rastová komora, fytotrón a skleník), — opis testovacieho systému (napr. rozmery nádob, materiál nádob a množstvá pôdy), — vlastnosti pôdy (textúra alebo typ pôdy: rozdelenie a klasifikácia častíc pôdy, fyzikálne a a chemické vlastnosti vrátane percentuálneho podielu organickej hmoty, percentuálneho podielu organického uhlíka a pH), — príprava pôdy/substrátu (napr. pôdy, umelo pripravenej pôdy, piesku a pod.) pred testom, — opis média obsahujúceho živiny, ak sa použilo, — aplikácia testovanej chemikálie: opis metódy aplikácie, opis vybavenia, miera a objem expozície vrátane verifikácie chemikálie, opisu kalibračnej metódy a opisu podmienok prostredia počas aplikácie, — podmienky rastu: svietivosť (napr. fotosynteticky aktívneho žiarenia), fotoperióda, maximálne a minimálne teploty, rozpis a metóda zavlažovania, hnojenie, — počet semien v každej nádobe, počet rastlín na dávku, počet replikátov (paralelných nádob) na mieru expozície, — typ a počet kontrolných vzoriek (negatívne a/alebo pozitívne kontrolné vzorky, kontrolné vzorky s rozpúšťadlom, ak sa použili), — trvanie testu. Výsledky: — tabuľka všetkých parametrov pre každý replikát, testovaná koncentrácia/dávka a druh rastliny, — počet a percento vyklíčených sadeníc a vzchádzania v porovnaní s kontrolnými vzorkami, — meranie množstva biomasy rastlín (suchej hmotnosti výhonkov alebo hmotnosti výhonkov v čerstvom stave) ako percentuálneho podielu kontrolných rastlín, — výška výhonkov rastlín ako percentuálny podiel kontrolných rastlín, ak sa meria, — percentuálna miera viditeľného poškodenia a kvalitatívny a kvantitatívny opis viditeľného poškodenia (chloróza, nekróza, vädnutie, deformácia listov a stonky, ako aj neprítomnosť účinkov) spôsobeného testovanou chemikáliou v porovnaní s kontrolnými rastlinami, — opis hodnotiacej škály používanej na posúdenie viditeľného poškodenia, ak sa vizuálne hodnotenie vykonáva, — v prípade štúdií s jednou dávkou aj percentuálna miera poškodenia, — hodnoty ECx alebo ERx (napr. EC50, ER50, EC25, ER25) a súvisiace hranice spoľahlivosti; ak sa vykonáva regresná analýza, uvedie sa štandardná chyba pre regresný výpočet a štandardná chyba pre odhad jednotlivých parametrov (napr. sklon, úsek), — hodnota koncentrácie NOEC (a LOEC), ak sa vypočítava, — opis použitých štatistických postupov a predpokladov, — grafické zobrazenie týchto údajov a vzťahu dávky a účinku testovacích druhov. Uvedú sa odchýlky od postupov opísaných v tejto testovacej metóde a všetky nezvyčajné udalosti počas testu. LITERATÚRA 1. Schrader G., Metge K., and Bahadir M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189-193. 2. International Organisation of Standards. (1993). ISO 11269-1. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 1: Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth. 3. International Organisation of Standards. (1995). ISO 11269-2. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 2: Effects of Chemicals on the Emergence and Growth of Higher Plants. 4. American Standard for Testing Material (ASTM). (2002). E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests. 5. U.S. EPA. (1982). FIFRA, 40CFR, Part 158.540. Subdivision J, Parts 122-1 and 123-1. 6. US EPA. (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines: — 850.4000: Background – Non-target Plant Testing; — 850.4025: Target Area Phytotoxicity; — 850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence); — 850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test; — 850.4225: Seedling Emergence, Tier II; — 850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test. 7. AFNOR, X31-201. (1982). Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1. (1993) Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines. 8. Boutin, C., Freemark, K.E. and Keddy, C.J. (1993). Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Non-target plant testing and evaluation. Technical Report Series No.145. Canadian Wildlife Service (Headquarters), Environment Canada, Hull, Québec, Canada. 9. Forster, R., Heimbach, U., Kula, C., and Zwerger, P. (1997). Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms – A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. No 48. 10. Hale, B., Hall, J.C., Solomon, K., and Stephenson, G. (1994). A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario Canada. 11. Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sc. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962). 12. Audus, L.J. (1964). Herbicide behaviour in the soil. In: Audus, L.J. ed. The Physiology and biochemistry of Herbicides, London, New York, Academic Press, NY, Chapter 5, pp. 163-206. 13. Beall, M.L., Jr. and Nash, R.G. (1969). Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil, J. Agro. 61:571-575. 14. Beetsman, G.D., Kenney, D.R. and Chesters, G. (1969). Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties, J. Agro. 61:247-250. 15. U.S. Food and Drug Administration (FDA). (1987). Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, 14 pp., FDA, Washington, DC. 16. McKelvey, R.A., Wright, J.P., Honegger, J.L. and Warren, L.W. (2002). A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Management Science vol. 58:1161-1174 17. Boutin, C.; Elmegaard, N. and Kjær, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology vol. 13(4): 349-369. 18. Boutin, C., and Rogers, C.A. (2000). Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides – An analysis with two databases. Ecotoxicology vol.9(4):255-271. 19. Boutin, C. and Harper, J.L. (1991). A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9:155-271. 20. Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T.E., Batchelor, S.P. and Maguire, R.J.. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Envir. Toxicol. Chem. 19 (10): 2532-2541. 21. OECD (2006). Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris. 22. Hatzios, K.K. and Penner, D. (1985). Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1:1-63. 23. Hamill, P.B., Marriage, P.B. and G. Friesen. (1977). A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Science 25:386-389. 24. Frans, R.E. and Talbert, R.E. (1992). Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. In: B. Truelove (Ed.) Research Methods in Weed Science, 2nd ed. Southern weed Science Society, Auburn, 15-23. 25. Bruce, R.D. and Versteeg, D. J.(1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. Environmental Toxicology and Chemistry 11, 1485-1492. 26. Chapter C.33 of this Annex: Earthworm Reproduction Test (Eisenia fetida/Eisenia andrei). Dodatok 1 Vymedzenie pojmov Účinná zložka (alebo účinná látka) je materiál určený na vyvolanie osobitného biologického účinku (napr. na reguláciu hmyzu, reguláciu chorôb rastlín, reguláciu buriny v oblasti, kde sa aplikuje testovaná chemikália), známy aj ako technická účinná zložka, účinná látka. Chemikália je látka alebo zmes. Výrobky na ochranu plodín alebo prípravky na ochranu rastlín alebo pesticídy sú materiály so špecifickou biologickou aktivitou, ktoré sa úmyselne používajú na ochranu plodín pred škodcami (napr. plesňovými ochoreniami, hmyzom a konkurenčnými rastlinami). Účinná koncentrácia x % (ECx) alebo účinná dávka x % (ERx) je koncentrácia alebo dávka, ktorá má za následok nežiaducu zmenu alebo modifikáciu konečného parametra testu o x % pri meraní vo vzťahu ku kontrolnej vzorke (napr. redukciu vzchádzania semien, hmotnosti výhonkov, konečného počtu prítomných rastlín alebo nárast viditeľného poškodenia o 25 % alebo 50 % by predstavovalo hodnoty EC25/ER25 alebo EC50/ER50). Vzchádzanie je objavenie sa časti klíčka (koleoptily alebo kotyledónu) nad povrchom pôdy. Prípravok je komerčne pripravený výrobok s obsahom účinnej látky (účinnej zložky), známy aj ako konečný prípravok (8) alebo typický výrobok na konečné použitie. LOEC (najnižšia koncentrácia s pozorovaným účinkom) je najnižšia koncentrácia testovanej chemikálie, pri ktorej bol pozorovaný daný účinok. Pokiaľ ide o tento test, koncentrácia zodpovedajúca hodnote LOEC má štatisticky významný účinok (p < 0,05) v rámci daného expozičného času v porovnaní s kontrolnou vzorkou, a je vyššia ako hodnota NOEC. Necieľové rastliny: ide o rastliny, ktoré sa nachádzajú mimo cieľovej oblasti. V prípade výrobkov na ochranu plodín sa to zvyčajne týka rastlín mimo oblasti s aplikovanou chemikáliou. NOEC (koncentrácia bez pozorovaného účinku) je najvyššia koncentrácia testovanej chemikálie, pri ktorej nebol pozorovaný žiadny účinok. V tomto teste koncentrácia zodpovedajúca hodnote NOEC nemá žiadny štatisticky významný účinok (p < 0,05) v rámci daného expozičného času v porovnaní s kontrolnou vzorkou. Fytotoxicita je súbor negatívnych odchýlok (na základe merania a vizuálneho hodnotenia) od obvyklého vzhľadu a rastu rastlín v reakcii na danú chemikáliu. Replikát je experimentálna jednotka, ktorá predstavuje kontrolnú skupinu a/alebo skupinu s aplikovanou chemikáliou. V rámci týchto štúdií sa za replikát považuje paralelná nádoba. Vizuálne hodnotenie je hodnotenie viditeľného poškodenia na základe pozorovaní rastlinného porastu, vitality, malformácie, chlorózy, nekrózy a celkového vzhľadu v porovnaní s kontrolnou vzorkou. Testovaná chemikália je akákoľvek látka alebo zmes, ktorá sa testuje pomocou tejto testovacej metódy. Dodatok 2 Zoznam druhov v minulosti používaných na testovanie rastlín Čeľaď Druh Slovenský názov DICOTYLEDONAE Apiaceae (Umbelliferae) Daucus carota mrkva obyčajná Asteraceae (Compositae) Helianthus annuus slnečnica ročná Asteraceae (Compositae) Lactuca sativa šalát siaty Brassicaceae (Cruciferae) Sinapis alba horčica biela Brassicaceae (Cruciferae) Brassica campestris var. chinensis kapusta poľná čínska Brassicaceae (Cruciferae) Brassica napus kapusta repková Brassicaceae (Cruciferae) Brassica oleracea var. capitata kapusta obyčajná hlávková Brassicaceae (Cruciferae) Brassica rapa kapusta poľná Brassicaceae (Cruciferae) Lepidium sativum žerucha siata Brassicaceae (Cruciferae) Raphanus sativus reďkev siata Chenopodiaceae Beta vulgaris repa obyčajná Cucurbitaceae Cucumis sativus uhorka siata Fabaceae (Leguminosae) Glycine max (G. soja) sója fazuľová Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus aureus fazuľa zlatá (mungo) Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus vulgaris fazuľa obyčajná fazuľa záhradná Fabaceae (Leguminosae) Pisum sativum hrach siaty Fabaceae (Leguminosae) Trigonella foenum-graecum senovka grécka Fabaceae (Leguminosae) Lotus corniculatus ľadenec rožkatý Fabaceae (Leguminosae) Trifolium pratense ďatelina lúčna Fabaceae (Leguminosae) Vicia sativa vika siata Linaceae Linum usitatissimum ľan siaty Polygonaceae Fagopyrum esculentum pohánka jedlá Solanaceae Solanum lycopersicon rajčiak jedlý MONOCOTYLEDONAE Liliaceae (Amarylladaceae) Allium cepa cesnak cibuľový Poaceae (Gramineae) Avena sativa ovos siaty Poaceae (Gramineae) Hordeum vulgare jačmeň siaty Poaceae (Gramineae) Lolium perenne mätonoh trváci Poaceae (Gramineae) Oryza sativa ryža siata Poaceae (Gramineae) Secale cereale raž siata Poaceae (Gramineae) Sorghum bicolor cirok dvojfarebný Poaceae (Gramineae) Triticum aestivum pšenica letná Poaceae (Gramineae) Zea mays kukurica siata Dodatok 3 Zoznam potenciálnych nepoľnohospodárskych druhov Potenciálne druhy na testovanie toxicity rastlín podľa OECD Poznámka: Táto tabuľka poskytuje informácie o 52 nepoľnohospodárskych druhoch (odkazy na literatúru sú uvedené v zátvorkách pri každom zápise). Údaje o klíčivosti sú prevzaté z publikovanej literatúry a slúžia len na všeobecné usmernenie. Individuálne skúsenosti sa môžu líšiť v závislosti od zdroja osiva a iných faktorov. ČEĽAĎ Botanický názov druhu (slovenský názov) Životnosť (9) a biotop Hmotnosť osiva (mg) Fotoperióda na klíčenie alebo rast (10) Hĺbka sadenia (mm) (11) Čas na klíčenie (počet dní) (12) Osobitné postupy (13) Test toxicity (14) Dodávatelia osív (15) Ďalšie odkazy (16) APIACEAE Torilis japónica (torica japonská) А, В narušené oblasti, živé ploty, pastviny (16, 19) 1,7 – 1,9 (14, 19) L = D (14) 0 (1, 19) 5 (50 %) (19) studená stratifikácia (7, 14, 18, 19) môže byť potrebné dozrievanie (19) klíčenie brzdí tma (1, 19) žiadne osobitné postupy (5) PO (5) ASTERACEAE Bellis perennis (sedmokráska obyčajná) Ρ lúky, orná pôda, rašeliny (16, 19) 0,09 – 0,17 (4, 19) L = D (14) 0 (4) 3 (50 %) (19) 11 (100 %) (18) klíčenie neovplyvňuje intenzita ožiarenia (18, 19) žiadne osobitné postupy (4, 14) PO (4) A, D, F 7 Centaurea cyanus (nevädza poľná) A polia, blízkosť ciest, otvorené biotopy (16) 4,1 – 4,9 (4, 14) L = D (14) 0-3 (2, 4, 14) 14 – 21 (100 %) (14) žiadne osobitné postupy (2, 4) PO (2,4) A, D, E, F 7 Centaurea nigra (nevädzovec frygický pravý) Ρ polia, blízkosť ciest, otvorené biotopy (16, 19) 2,4 – 4,9 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3 (50 %) (19) 4 (97 %) (18) môže byť potrebné dozrievanie (18, 19) klíčenie brzdí tma (19) žiadne osobitné postupy (5, 14, 26) PO (5, 22, 26) A Inula helenium (oman pravý) Ρ vlhké, narušené oblasti (16) 1 – 1,3 (4, 14, 29) 0 (4, 29) žiadne osobitné postupy (4) PO (4) A, F Leontodon hispidus (púpavec srstnatý) Ρ polia, blízkosť ciest, narušené oblasti (16, 19) 0,85 – 1,2 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 4 (50 %) (19) 7 (80 %) (18) klíčenie brzdí tma (17, 18, 19) žiadne osobitné postupy (5, 23) PO (5, 22, 23) Rudbeckia hirta (rudbekia srstnatá) Β, Ρ narušené oblasti (16) 0,3 (4, 14) L = D (14) 0 (4, 33) < 10 (100 %) (33) žiadne osobitné postupy (4, 14, 33) PO (4, 33) C, D, E, F Solidago canadensis (zlatobyľ kanadská) Ρ pasienky, otvorené priestranstvá (16) 0,06 – 0,08 (4, 14) L = D (11) 0 (4) 14 – 21 (11) zmiešať s rovnakým dielom piesku a namočiť do 500 ppm GA na 24 hodín (11) žiadne osobitné postupy (4) PO (4) E, F Xanthium pensylvanicum (voškovník) A polia, otvorené biotopy (16) 25 – 61 (14, 29) 0(1) 5(29) klíčenie môže brzdiť tma (1) namočiť do teplej vody na 12 hodín (29) PRED a PO (31) A Xanthium spinosum (voškovník tŕnitý) A otvorené biotopy (16) 200 (14) L = D (14) L > D (6) 10 (6) skarifikácia (14) žiadne osobitné postupy (6) PRED a PO (6) A Xanthium strumarium (voškovník obyčajný) A polia, otvorené biotopy (16) 67,4 (14) L = D (14) 10 – 20 (6, 21) žiadne osobitné postupy (6, 14, 21) PRED a PO (6, 21, 28, 31) A BRASSICACEAE Cardamine pratensis (žerušnica lúčna) Ρ polia, blízkosť ciest, rašeliny (16, 19) 0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 15 (98 %) (18) klíčenie brzdí tma (18, 19) žiadne osobitné postupy (5, 14, 22) PO (5, 22) F CARYOPHYLLACEAE Lychnis flos-cuculi (kukučka lúčna) Ρ (16) 0,21 (14) L = D (14) < 14 (100 %) (14, 25) môže byť potrebné dozrievanie (18) žiadne osobitné postupy (5, 14, 15, 22 – 26) PO (5, 15, 22-26) F CHENOPODIACEAE Chenopodium album (mrlík biely) A medze, narušené oblasti (16, 19) 0,7 – 1,5 (14, 19, 34) L = D (14) 0 (1, 19) 2 (50 %) (19) postup sa odlišuje v závislosti od farby osiva (19) dormancia skladovaním v suchu (19) klíčenie brzdí tma (1, 18, 19) studená stratifikácia (18) žiadne osobitné postupy (14, 34) PRED a PO (28, 31, 34) A 32 CLUSIACEAE Hypericum perforatum (ľubovník bodkovaný) Ρ polia, orná pôda, otvorené biotopy (16, 19) 0,1 – 0,23 (14, 19) L = D (14) 0 (1, 19) 3 (19) 11 (90 %) (18) klíčenie brzdí tma (1, 18, 19) žiadne osobitné postupy (5, 14, 15, 25, 27) PO (5, 15, 25, 27) A, E, F CONVOLVULACEAE Ipomoea hederacea (povojník) A blízkosť ciest, otvorené biotopy, obilné polia (16) 28,2 (14) L > D (6, 10) 10-20 (6, 10, 21) 4 (100 %) (10) klíčenie neovplyvňuje intenzita ožiarenia (1) žiadne osobitné postupy (6, 21) PRED a PO (6, 12, 21, 28) A CYPERACEAE Cyperus rotundus (šachor) Ρ orná pôda, pasienky, blízkosť ciest (16, 30) 0,2 (14) L = D (14) 0 (1) 10 – 20 (6, 10) 12 (91 %) (10) klíčenie brzdí tma (1) žiadne osobitné postupy (6, 10, 14) PRED a PO (6, 28, 31) B 7 FABACEAE Lotus corniculatus ľadenec rožkatý Ρ trávnaté plochy, blízkosť ciest, otvorené biotopy (16, 19) 1 – 1,67 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) skarifikácia (14, 19) klíčenie neovplyvňuje intenzita ožiarenia (18, 19) žiadne osobitné postupy (23, 25) PO (5, 23, 25) A, D, E, F Senna obtusifolia (kasia sennová) A vlhké lesy (16) 23-28 (9) L = D (14) L > D (9) 10 – 20 (6,9) namočiť semená do vody na 24 hodín (9) skarifikácia (14) životaschopnosť osiva sa odlišuje v závislosti od farby (1) žiadne osobitné postupy (6) PO (6,9) A Sesbania exaltata (konope) A aluviálne pôdy (16) 11 – 13 (9, 14) L > D (9) 10 – 20 (9, 21) namočiť semená do vody na 24 hodín (9) klíčenie neovplyvňuje intenzita ožiarenia (1) žiadne osobitné postupy (21, 14) PRED a PO (9, 21, 28, 31) A Trifolium pratense ďatelina lúčna Ρ polia, blízkosť ciest, orná pôda (16, 19) 1,4 – 1,7 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) skarifikácia (14, 18) môže byť potrebné dozrievanie (19) klíčenie neovplyvňuje intenzita ožiarenia (1, 19) žiadne osobitné postupy (5) PO (5) A, E, F LAMIACEAE Leonurus cardiaca (srdcovník obyčajný) Ρ otvorené priestranstvá (16) 0,75 – 1,0 (4, 14) L = D (14) 0 (4) žiadne osobitné postupy (4, 14) PO (4) F Mentha spicata (mäta klasnatá) Ρ vlhké oblasti (16) 2,21 (4) 0 (4) žiadne osobitné postupy (4) PO (4) F Nepeta cataria (kocúrnik obyčajný) Ρ narušené oblasti (16) 0,54 (4, 14) L = D (14) 0 (4) žiadne osobitné postupy (2, 4, 14) PO (2,4) F Prunella vulgaris (čiernohlávok obyčajný) Ρ orná pôda, trávnaté plochy, narušené oblasti (16, 19) 0,58 – 1,2 (4, 14, 19) L = D (14) 0 (4, 19) 5 (50 %) (19) 7 (91 %) (18) klíčenie brzdí tma (18, 19) väčšie klíčenie pri väčších semenách (1 ) žiadne osobitné postupy (4, 14, 22) PO (4, 22) A, F Stachys officinalis (betonika lekárska) Ρ lúky, medze (19) 14 – 18 (14, 19) L = D (14) 7 (50 %) (19) žiadne osobitné postupy (5, 14, 22) PO (5, 22) F MALVACEAE Abutilón theophrasti (abutilon) A polia, otvorené biotopy (16) 8,8 (14) L = D (14) 10 – 20 (6, 10, 21) 4 (84 %) (10) skarifikácia (14) žiadne osobitné postupy (5, 10, 21) PRED a PO (6, 22, 28, 31) A, F Sida spinosa (podlsnečník) A polia, blízkosť ciest (16) 3,8 (14) L = D (14) 10 – 20 (6, 21) skarifikácia (14) klíčenie neovplyvňuje intenzita ožiarenia (1) žiadne osobitné postupy (6, 21) PRED a PO (6, 21, 28, 31) A, F PAPAVERACEAE Papaver rhoeas (mak vlčí) A polia, orná pôda, narušené oblasti (16, 19) 0,1 – 0,3 (4, 14, 19, 29) L = D (14) 0 (4, 29) 4 (50 %) (19) studená stratifikácia a skarifikácia (1, 19, 32) žiadne osobitné postupy (4, 14, 29) PO (4) A, D, E, F, G POACEAE Agrostis tenuis (psinček tenký) trávniky, pasienky (16) 0,07 (14) L > D (Ю) 20 (10) 10 (62 %) (10) klíčenie brzdí tma (1, 17 – 19) žiadne osobitné postupy (10) PO (10) A, E Alopecurus myosuroides (psiarka roľná) A polia, otvorené biotopy (16) 0,9 – 1,6 (29, 34) L = D (14) 2 (29) < 24 (30 %) (34) skarifikácia (14) ošetriť 101 mg/l KNO3 (14) teplá stratifikácia (1) klíčenie brzdí tma (1) žiadne osobitné postupy (34) PRED a PO (28, 34) A 32 Avena fatua (ovos hluchý) A obrábané plochy, otvorené biotopy (16) 7 – 7,5 (14, 30) L = D (14) L > D (6) 10 – 20 (6, 10) 3 (70 %) (18) skarifikácia (7, 32) klíčenie brzdí tma (1) studená stratifikácia (1, 18) žiadne osobitné postupy (6, 10, 14) PRED a PO (6, 10, 28, 31) A Bromus tectorum (stoklas strechový) A polia, blízkosť ciest, orná pôda (16) 0,45 – 2,28 (14, 29) L = D (14) 3 (29) obdobie dozrievania (1, 7, 32) klíčenie brzdí svetlo (1) žiadne osobitné postupy (14) PRED a PO (28, 31) A Cynosurus cristatus (hrebienka obyčajná) P polia, blízkosť ciest, otvorené biotopy (16, 19) 0,5 – 0,7 (14, 19, 29) L = D (14) 0 (29) 3 (50 %) (19) klíčenie neovplyvňuje intenzita ožiarenia (19) žiadne osobitné postupy (14, 29) PO (5) A Digitaria sanguinalis (rosička krvavá) A polia, rašeliny, otvorené biotopy (16) 0,52 – 0,6 (14, 30) L = D (14) 10 – 20 (21) 7 (75 %) 14 (94 %) (7) skarifikácia, studená stratifikácia a dozrievanie (1, 7, 14, 32) ošetriť 101 mg/l KNO3 (14) klíčenie brzdí tma (1) žiadne osobitné postupy (21) PRED a PO (18, 25, 31) A Echinochloa crusgalli (ježatka kuria) A (16) 1,5 (14) L = D (14) L > D (3) 10 – 20 (7, 21) skarifikácia (7, 32) klíčenie neovplyvňuje intenzita ožiarenia (1) žiadne osobitné postupy (3, 14, 21) PRED a PO (3, 21, 28, 31) A Elymus canadensis (pýrovník kanadský) P pobrežné územia, narušené oblasti (16) 4 – 5 (14, 30) L = D (11) 1 (11) 14 – 28 (11) žiadne osobitné postupy (2, 11) PO (2) C, D, E Festuca pratensis (kostrava lúčna) P polia, vlhké oblasti (16, 19) 1,53 – 2,2 (16, 19) L = D (14) L > D (10) 20 (10) 9 (74 %) (10) 2 (50 %) (19) žiadne osobitné postupy (10, 19) PO (10) A 7 Hordeum pusillum (jačmeň) A pasienky, blízkosť ciest, otvorené biotopy (16) 3,28 (14) teplá stratifikácia (1) klíčenie neovplyvňuje intenzita ožiarenia (1) PRED (31) 7 Phieum pratense (timotejka lúčna) P pasienky, orná pôda, narušené oblasti (16, 19) 0,45 (14, 19) L > D (10, 14) 0 – 10 (10, 19) 2 (74 %) (10) 8 (50 %) (19) klíčenie brzdí tma (19) klíčenie neovplyvňuje intenzita ožiarenia (17) žiadne osobitné postupy (10, 14, 17, 19) PO (10) A, E POLYGONACEAE Polygonum convolvulus (pohánkovec ovíjavý) A otvorené biotopy, blízkosť ciest (16) 5 – 8 (4, 14, 29) L = D (20) 0 – 2 (4, 29) studená stratifikácia 4 – 8 týždňov (1, 2, 4, 20, 29) klíčenie neovplyvňuje intenzita ožiarenia (1) PRED a PO 1, 2, 20, 28, 31 A 32 Polygonum lapathifolium (horčiak štiavolistý) A vlhká pôda (16) 1,8 – 2,5 (14) L > D (6) 5 (94 %) (18) klíčenie neovplyvňuje intenzita ožiarenia (1) klíčenie brzdí tma (18) studená stratifikácia (1) žiadne osobitné postupy (5) PRED a PO (6) A, E Polygonum pennsylvanicum (horčiak) A polia, otvorené biotopy (16) 3,6 – 7 (14, 29) 2 (29) studená stratifikácia 4 týždne pri teplote 0 – 5 °C (1, 29) klíčenie brzdí tma (1) PRED (31) A, E Polygonum periscaria (horčiak broskyňolistý) A narušené oblasti, orná pôda (16, 19) 2,1 – 2,3 (14, 19) L > D (13) 0 (19) < 14 (13) 2 (50 %) (19) skarifikácia, studená stratifikácia, ošetrenie GA (14) studená stratifikácia, dozrievanie (17 – 19) klíčenie brzdí tma (19) žiadne osobitné postupy (13) PO (13) A 32 Rumex crispus (štiavec kučeravý) P orná pôda, blízkosť ciest, otvorené priestranstvá (16, 19) 1,3 – 1,5 (4, 14, 19) L = D (14, 33) 0 (4, 19, 33) 3 (50 %) (19) 6 (100 %) (33) klíčenie brzdí tma (18, 19) môže byť potrebné dozrievanie (18) žiadne osobitné postupy (4, 14, 33) PO (4, 33) A, E 32 PRIMULACEAE Anagallis arvensis (drchnička roľná) A orná pôda, otvorené priestranstvá, narušené oblasti (16, 19) 0,4 – 0,5 (4, 14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) studená stratifikácia, ošetrenie GA (1,14, 18, 19, 32) na klíčenie je potrebné svetlo (1) žiadne osobitné postupy (2, 4) PO (2,4) A, F RANUNCULACEAE Ranunculus acris (iskerník prudký) Ρ orná pôda, blízkosť ciest, otvorené priestranstvá (16, 19) 1,5 – 2 (14, 19, 29) L = D (14) 1 (29) 41 – 56 (19, 29) žiadne osobitné postupy (5, 14, 22, 24 – 26) PO (5, 22, 24 – 26) 32 ROSACEAE Geum urbanum (kuklík mestský) Ρ živé ploty, vlhké oblasti (16, 19) 0,8 – 1,5 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 16 (79 %) (18) klíčenie brzdí tma (18, 19) teplá stratifikácia (1) žiadne osobitné postupy (5, 14, 22, 25, 26) PO (5, 22, 25, 26) A RUBIACEAE Galium aparine (lipkavec obyčajný) A orná pôda, vlhké oblasti, narušené oblasti (16, 19) 7 – 9 (14, 19) L = D (14) 5 (50 %) (19) 6 (100 %) (18) studená stratifikácia (1, 18, 19) klíčenie neovplyvňuje intenzita ožiarenia (18, 19) klíčenie brzdí svetlo (1) žiadne osobitné postupy (6, 14) PRED a PO (6, 28) A 32 Galium mollugo (lipkavec mäkký) Ρ okraje živých plotov, otvorené priestranstvá (8) 7 (29) L = D (14) 2 (29) žiadne osobitné postupy (5, 14, 22, 24, 26, 29) PO (5, 22, 24, 26) A SCROPHULARIACEAE Digitalis purpurea (náprstník červený) B, P živé ploty, otvorené priestranstvá (16, 19) 0,1 – 0,6 (4, 14, 19) L = D (14) 0 (4, 19) 6 (50 %) (19) 8 (99 %) (18) klíčenie brzdí tma (1, 17 – 19) žiadne osobitné postupy (4, 22 – 26) PO (4, 22 – 26) D, G, F Veronica persica (veronika perzská) A orná pôda, otvorené priestranstvá, narušené oblasti (16, 19) 0,5 – 0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3 (19) 5 (96 %) (18) klíčenie brzdí tma (18, 19) studená stratifikácia (18) žiadne osobitné postupy (14) PRED a PO (28) A 32 Uvádzaní dodávatelia semien Označenie dodávateľa Informácie o dodávateľovi A Herbiseed New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ ENGLAND +44 (0) 1189 349 464 www.herbiseed.com B Tropilab Inc. 8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771-3948 USA (727) 344 – 4050 www.tropilab.com C Pterophylla – Native Plants & Seeds #316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0 CANADA (519) 586 – 3985 D Applewood Seed Co. 5380 Vivian St., Arvada, CO 80002 USA (303) 431 – 7333 www.applewoodseed.com E Ernst Conservation Seeds 9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335 USA (800) 873 – 3321 www.ernstseed.com F Chiltern Seeds Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB ENGLAND +44 1229 581137 www.chiltemseeds.co.uk G Thompson & Morgan P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7 CANADA (800) 274 – 7333 www.thompson-morgan.com UVÁDZANÁ LITERATÚRA 1. Baskin, C.C. & Baskin, J.M. 1998. Seeds. Academic Press, Toronto 2. Blackburn, L.G. & Boutin, C. 2003. Subtle effects of herbicide use in the context of genetically modified crops: a case study with glyphosate (Round-Up®). Ecotoxicology, 12:271-285. 3. Boutin, C., Lee, H-B., Peart, T., Batchelor, P.S., & Maguire, R.J. 2000. Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Environmental Toxicology & Chemistry, 19(10):2532-2541. 4. Boutin, C., Elmegaard, N., & Kjaer, C. 2004. Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: implications for risk assessment. Ecotoxicology, 13:349-369. 5. Breeze, V., Thomas, G., & Butler, R. 1992. Use of a model and toxicity data to predict the risks to some wild plant species from drift of four herbicides. Annals of Applied Biology, 121:669-677. 6. Brown, R.A., & Farmer, D. 1991. Track-sprayer and glasshouse techniques for terrestrial plant bioassays with pesticides. In: Plants for toxicity assessment: 2nd volume. ASTM STP 1115, J.W. Gorsuch, W.R. Lower, W.Wang, & M.A. Lewis, eds. American Society for Testing & Materials, Philadelphia. pp 197 – 208. 7. Buhler, D.D. & Hoffman, M.L. 1999. Anderson's guide to practical methods of propagating weeds and other plants. Weed Science Society of America, Lawrence, K. 8. Clapham, A.R., Tutin, T.G., & Warburg, E.F. 1981. Excursion flora of the British Isles, 3rd ed. Cambridge University Press, Cambridge 9. Clay, P.A. & Griffin, J.L. 2000. Weed seed production and seedling emergence response to late-season glyphosate applications. Weed Science, 48:481-486. 10. Cole, J.F.H. & Canning, L. 1993. Rationale for the choice of species in the regulatory testing of the effects of pesticides on terrestrial non-target plants. BCPC – Weeds. pp. 151 – 156. 11. Fiely, M. (Ernst Conservation Seeds). 2004. Personal communication. (www.ernstseed.com) 12. Fletcher, J.S., Johnson, F.L., & McFarlane, J.C. 1990. Influence of greenhouse versus field testing and taxonomic differences on plant sensitivity to chemical treatment. Environmental Toxicology & Chemistry, 9:769-776. 13. Fletcher, J.S., Pfleeger, T.G., Ratsch, H.C., & Hayes, R. 1996. Potential impact of low levels of chlorsulfuron and other herbicides on growth and yield of nontarget plants. Environmental Toxicology & Chemistry, 15(7):1189-1196. 14. Flynn, S., Turner, R.M., and Dickie, J.B. 2004. Seed Information Database (release 6.0, Oct 2004) Royal Botanic Gardens, Kew (www.rbgkew.org.uk/data/sid) 15. Franzaring, J., Kempenaar, C., & van der Eerden, L.J.M. 2001. Effects of vapours of chlorpropham and ethofumesate on wild plant species. Environmental Pollution, 114:21-28. 16. Gleason, H.A. & Cronquist, A. 1991. Manual of vascular plants of northeastern United States and adjacent Canada, 2nd ed. New York Botanical Garden, Bronx, NY 17. Grime, J.P. 1981. The role of seed dormancy in vegetation dynamics. Annals of Applied Biology, 98:555-558. 18. Grime, J.P., Mason, G., Curtis, A.V., Rodman, J., Band, S.R., Mowforth, M.A.G., Neal, A.M., & Shaw, S. 1981. A comparative study of germination characteristics in a local flora. Journal of Ecology, 69:1017-1059. 19. Grime, J.P., Hodgson, J.G., & Hunt, R. 1988. Comparative plant ecology: a functional approach to common British species. Unwin Hyman Ltd., London 20. Kjaer, C. 1994. Sublethal effects of chlorsulfuron on black bindweed (Polygonum convolvulus L.). Weed Research, 34:453-459. 21. Klingaman, T.E., King, C.A., & Oliver, L.R. 1992. Effect of application rate, weed species, and weed stage of growth on imazethapyr activity. Weed Science, 40:227-232. 22. Marrs, R.H., Williams, C.T., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1989. Assessment of the effects of herbicide spray drift on a range of plant species of conservation interest. Environmental Pollution, 59:71-86. 23. Marrs, R.H., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1991. Effects of herbicide spray drift on selected species of nature conservation interest: the effects of plant age and surrounding vegetation structure. Environmental Pollution, 69:223-235. 24. Marrs, R.H., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1991. Effects of mecoprop drift on some plant species of conservation interest when grown in standardized mixtures in microcosms. Environmental Pollution, 73:25-42. 25. Marrs, R.H., Frost, A.J., Plant, R.A., & Lunnis, P. 1993. Determination of buffer zones to protect seedlings of non-target plants from the effects of glyphosate spray drift. Agriculture, Ecosystems, & Environment, 45:283-293. 26. Marrs, R.H. & Frost, A.J. 1997. A microcosm approach to detection of the effects of herbicide spray drift in plant communities. Journal of Environmental Management, 50:369-388. 27. Marshall, E.J.P. & Bernie, J.E. 1985. Herbicide effects on field margin flora. BCPC – Weeds. pp. 1021-1028. 28. McKelvey, R.A., Wright, J.P., & Honegger, J.L. 2002. A comparison of crop and non-crop plants as sensitive species for regulatory testing. Pest Management Science, 58:1161-1174. 29. Morton, S. (Herbiseed). 2004. Personal communication. (http://www.herbiseed.com) 30. USDA, NRCS. 2004. The Plants Database, version 3.5. (http://plants.usda.gov). National Plant Data Centre, Baton Rouge, LA 70874-4490 USA 31. USEPA. 1999. One-Liner Database. [U.S. E.P.A./Office of Pesticide Programs/Environmental Fate and Effects Division/Environmental Epidemiology Branch]. 32. Webster, R.H. 1979. Technical Report No. 56: Growing weeds from seeds and other propagules for experimental purposes. Agricultural Research Council Weed Research Organization, Oxford. 33. White, A. L. & Boutin, C. (National Wildlife Research Centre, Environment Canada). 2004. Personal communication. 34. Zwerger, P. & Pestemer, W. 2000. Testing the phytotoxic effects of herbicides on higher terrestrial non-target plants using a plant life-cycle test. Z. PflKrankh. PflSchutz, Sonderh., 17:711-718. Dodatok 4 Príklady vhodných rastových podmienok pre určité druhy plodín Tieto podmienky sa považujú za vhodné pre desať druhov plodín a môžu sa použiť aj ako usmernenie pre testy v rastových komorách s určitými inými druhmi plodín: koncentrácia oxidu uhličitého: 350 ppm ± 50 ppm, relatívna vlhkosť: 70 % ± 5 % počas obdobia svetla a 90 % ± 5 % počas obdobia tmy, teplota: 25 ± 3 °C počas dňa, 20 ± 3 °C počas noci, fotoperióda: 16 hodín svetla/8 hodín tmy, za predpokladu priemernej vlnovej dĺžky v rozsahu 400 – 700 nm, svetlo: svietivosť 350 ± 50 μE/m2/s, meraná vo vrchnej časti veka. Druhy plodín: — rajčiak jedlý (Solanum lycopersicon), — uhorka siata (Cucumis sativus), — šalát hlávkový (Lactuca sativa), — sója fazuľová (Glycine max), — kapusta obyčajná hlávková (Brassica oleracea var. capitata), — mrkva obyčajná (Daucus carota), — ovos siaty (Avena sativa), — mätonoh trváci (Lolium perenne), — kukurica siata (Zea mays), — cesnak cibuľový (Allium cepa). C.32. REPRODUKČNÝ TEST S ČERVAMI ČEĽADE ENCHYTRAEIDAE ÚVOD 1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 220 (2004). Je určená na posúdenie účinkov chemikálií na reprodukčný výstup červov čeľade Enchytraeidae (Enchytraeus albidus Henle 1873) v pôde. Založená je predovšetkým na metóde, ktorú vyvinula Spolková agentúra pre životné prostredie (Umweltbundesamt) v Nemecku (1) a ktorá bola podrobená kruhovým testom (2). Do úvahy sa brali aj iné metódy testovania toxicity chemikálií pre červy čeľade Enchytraeidae a pre dážďovky (3) (4) (5) (6) (7) (8). ÚVODNÉ ÚVAHY 2. Pôdne červy rodu Enchytraeus sú ekologicky vhodné druhy na ekotoxikologické testovanie. Aj keď červy čeľade Enchytraeidae sa často nachádzajú v pôdach obsahujúcich dážďovky, je tiež pravda, že často sú na ne bohaté aj mnohé pôdy, v ktorých sa dážďovky nevyskytujú. Červy čeľade Enchytraeidae je možné použiť pri laboratórnych testoch, ako aj v rámci polopoľných a poľných štúdií. Z praktického hľadiska sú mnohé druhy rodu Enchytraeus vhodné vzhľadom na jednoduchú manipuláciu a rozmnožovanie a na generačný čas, ktorý je omnoho kratší ako v prípade dážďoviek. Reprodukčný test s červami Enchytraeidae preto trvá iba štyri až šesť týždňov, zatiaľ čo s dážďovkami (Eisenia fetida) je to osem týždňov. 3. Základné informácie o ekológii a ekotoxikológii čeľade Enchytraeidae v suchozemskom životnom prostredí je možné nájsť v literatúre pod číslami (9), (10), (11), (12). PRINCÍP TESTU 4. Dospelé červy Enchytraeidae sa vystavia účinkom rôznych koncentrácií testovanej chemikálie zamiešanej do umelo pripravenej pôdy. Test je možné rozdeliť na dve fázy: a) test na vyhľadávanie rozsahu v prípade, ak nie sú k dispozícii dostatočné informácie, v rámci ktorého je hlavným parametrom mortalita hodnotená po dvoch týždňoch expozície a b) konečný reprodukčný test, v rámci ktorého sa hodnotí celkový počet juvenilných jedincov vyprodukovaných rodičovským živočíchom a prežitie rodičovských živočíchov. Konečný test trvá šesť týždňov. Po prvých troch týždňoch sa dospelé červy odoberú a zaznamenajú sa morfologické zmeny. Po ďalších troch týždňoch sa spočíta potomstvo vyliahnuté z kokónov, ktoré vyprodukovali dospelé červy. Výstup reprodukcie živočíchov exponovaných testovanej chemikálii sa porovnáva s reprodukčným výstupom kontrolných vzoriek s cieľom stanoviť hodnoty i) koncentrácie bez pozorovaného účinku (NOEC) a/alebo ii) koncentrácie ECx (napr. EC10, EC50) pomocou regresného modelu na odhad koncentrácie, ktorá by spôsobila zníženie reprodukčného výstupu o x %. Koncentrácia ECx (napr. EC10, EC50) by mala byť v rozsahu testovacích koncentrácií, aby sa potom hodnota ECx určila interpoláciou namiesto extrapolácie. INFORMÁCIE O TESTOVANEJ CHEMIKÁLII 5. Predovšetkým by mala byť známa rozpustnosť vo vode, hodnota log Kow, rozdeľovacia konštanta pôdnej vody (napr. kapitola C.18 alebo C.19 tejto prílohy) a tlak pary testovanej chemikálie. Žiaduce sú aj doplnkové informácie o osude testovanej chemikálie v pôde, napríklad rýchlosť fotolýzy a hydrolýzy. 6. Táto testovacia metóda sa môže použiť na chemikálie rozpustné alebo nerozpustné vo vode. Spôsob aplikácie testovanej chemikálie sa však bude zodpovedajúcim spôsobom líšiť. Testovacia metóda nie je použiteľná v prípade prchavých chemikálií, t. j. chemikálií, pre ktoré je hodnota Henryho konštanty alebo rozdeľovacej konštanty vzduch/voda vyššia ako jeden, alebo chemikálií, pre ktoré tlak pár pri teplote 25 °C presahuje hodnotu 0,0133 Pa. PLATNOSŤ TESTU 7. Na to, aby bol test platný, by kontrolné vzorky mali spĺňať tieto kritériá: — mortalita dospelých jedincov by nemala presahovať hodnotu 20 % na konci testu na vyhľadávanie rozsahu a po prvých troch týždňoch reprodukčného testu, — za predpokladu, že na začiatku testu bolo použitých 10 dospelých jedincov na nádobu, na konci testu by malo byť vyprodukovaných v priemere najmenej 25 juvenilných jedincov na nádobu, — variačný koeficient okolo stredného počtu juvenilných jedincov na konci reprodukčného testu by nemal byť vyšší ako 50 %. Ak test nespĺňa uvedené kritériá platnosti, jeho vykonávanie by sa malo ukončiť, pokiaľ nie je možné predložiť odôvodnenie pokračovania testu. Toto odôvodnenie by malo byť zahrnuté do správy o teste. REFERENČNÁ CHEMIKÁLIA 8. Referenčná chemikália by sa mala testovať v pravidelných intervaloch alebo prípadne zahrnúť do každého testu s cieľom overiť, že reakcia testovaných organizmov sa postupom času výrazne nezmenila. Vhodnou referenčnou chemikáliou je karbendazim, pri ktorom sa preukázalo, že ovplyvňuje prežívanie a reprodukciu červov čeľade Enchytraeidae (13) (14), alebo by sa mohli používať aj iné chemikálie, ktorých údaje o toxicite sú dobre známe. V kruhovom teste (2) sa použil karbendazim vo forme prípravku známeho pod obchodným názvom Derosal™, ktorý dodáva spoločnosť AgrEvo (Frankfurt, Nemecko) a ktorý obsahuje 360 g/l (32,18 %) účinnej zložky. Koncentrácia EC50 pre reprodukciu stanovená v rámci kruhového testu dosahovala hodnoty v rozsahu 1,2 mg ± 0,8 mg účinnej zložky/kg suchej hmotnosti (2). Ak sa do série testov zahrnie pozitívny štandard toxicity, použije sa jedna koncentrácia a počet replikátov by mal byť rovnaký ako pri kontrolných vzorkách. V prípade karbendazimu sa na testovanie odporúča 1,2 mg účinnej zložky/kg suchej hmotnosti (testuje sa ako kvapalný prípravok). OPIS TESTU Zariadenia 9. Testovacie nádoby by mali byť vyrobené zo skla alebo iného chemicky inertného materiálu. Vhodné sú sklené poháre (napr. s objemom 0,2 – 0,25 litra a priemerom ≈ 6 cm). Nádoby by mali mať priesvitné veká (napr. zo skla alebo polyetylénu) navrhnuté tak, aby znížili vyparovanie vody, ale zároveň umožnili výmenu plynov medzi pôdou a atmosférou. Veká by mala byť priesvitné, aby umožňovali prechod svetla. 10. Potrebné je bežné laboratórne vybavenie, konkrétne toto: — skrinka na sušenie, — stereomikroskop, — pH-meter a fotometer, — vhodné presné váhy, — primerané zariadenie na regulovanie teploty, — primerané zariadenie na regulovanie vlhkosti (nie je to nevyhnutné, ak nádoby s exponovanými vzorkami majú veká), — inkubátor alebo malá miestnosť s klimatizačným zariadením, — pinzety, háčiky alebo slučky, — fotografická miska. Príprava umelej pôdy 11. V tomto teste sa používa umelo prirpavená pôda (5) (7) s týmto zložením (na základe sušiny vysušenej na konštantnú hmotnosť pri teplote 105 °C): — 10 % rašeliny, vysušenej vzduchom a jemne drvenej (prijateľné sú častice veľkosti 2 mm ± 1 mm); odporúča sa pred použitím na test skontrolovať, či je pôda pripravená s čerstvou dávkou rašeliny vhodná na kultiváciu červov, — 20 % kaolínovej hliny (obsah kaolinitu podľa možnosti nad 30 %), — približne 0,3 – 1 % uhličitanu vápenatého (CaCO3, práškový, analytickej čistoty) na dosiahnutie hodnoty pH 6,0 ± 0,5; pridávané množstvo uhličitanu vápenatého môže do značnej miery závisieť od kvality/vlastností rašeliny, — približne 70 % vzduchom vysušeného kremenného piesku (v závislosti od potrebného množstva CaCO3), prevažne jemný piesok s viac ako 50 % častíc s veľkosťou od 50 do 200 mikrónov. Odporúča sa pred použitím na konečný test preukázať vhodnosť umelej pôdy na kultiváciu červov a na splnenie kritérií platnosti testu. Osobitne sa odporúča, aby sa takouto kontrolou zabezpečilo, že priebeh testu nebude ohrozený, ak obsah organického uhlíka v umelej pôde klesne, napríklad znížením obsahu rašeliny na 4 – 5 % a zodpovedajúcim zvýšením obsahu piesku. V dôsledku takéhoto poklesu obsahu organického uhlíka sa môžu znížiť možnosti adsorpcie testovanej chemikálie na pôdu (organický uhlík) a dostupnosť testovanej chemikálie pre červy sa môže zvýšiť. Preukázalo sa, že červy druhu Enchytraeus albidus môžu splniť kritériá platnosti, pokiaľ ide o reprodukciu, keď sa testy vykonávajú v poľných pôdach s nižším obsahom organického uhlíka, než bolo uvedené (napr. 2,7 %) (15), a existujú skúsenosti, hoci obmedzené, že toto je možné dosiahnuť aj v umelo pripravenej pôde s 5 % rašeliny. Poznámka: Vhodnosť pôdy a splnenie kritérií platnosti testu by sa mali preukázať aj v prípade použitia prírodnej pôdy v ďalšom testovaní (napr. vyššieho stupňa). 12. Suché zložky pôdy sa dôkladne zmiešajú (napr. vo veľkokapacitnom laboratórnom miešači). Malo by sa tak urobiť prinajmenšom týždeň pred začiatkom testu. Zmiešaná pôda by sa mala skladovať dva dni, aby sa vyvážila/stabilizovala jej kyslosť. Na stanovenie pH sa používa zmes pôdy a roztoku 1 M chloridu draselného (KCl) alebo 0,01 M chloridu vápenatého (CaCl2) v pomere 1: 5 (pozri literatúru (16) a dodatok 3). Ak je pôda kyslejšia než požadovaný rozsah (pozri bod 11), môže sa upraviť pridaním príslušného množstva CaCO3. Ak je pôda príliš alkalická, môže sa upraviť pridaním väčšieho množstva zmesi, uvedenej v bode 11, ale s vylúčením CaCO3. 13. Maximálna kapacita zadržiavania vody umelej pôdy sa stanoví v súlade s postupmi opísanými v dodatku 2. Jeden alebo dva dni pred začiatkom testu sa suchá umelá pôda predvlhčí pridaním dostatočného množstva deionizovanej vody, aby sa dosiahla približne polovica konečného obsahu vody, čo je 40 – 60 % maximálnej kapacity zadržiavania vody. Na začiatku testu sa predvlhčená pôda rozdelí na časti zodpovedajúce počtu testovacích koncentrácií (a v prípade potreby počtu vzoriek referenčnej chemikálie) a kontrolných vzoriek používaných na test. Obsah vlhkosti sa upraví na 40 – 60 % maximálnej kapacity zadržiavania vody pridaním roztoku testovanej chemikálie a/alebo pridaním destilovanej alebo deionizovanej vody (pozri body 19 – 21). Obsah vlhkosti sa stanoví na začiatku a na konci testu (vysušením na konštantnú hmotnosť pri teplote 105 °C) a jeho hodnota by mala byť v optimálnom rozsahu pre prežitie červov. Hrubú kontrolu obsahu vlhkosti v pôde je možné vykonať jemným stláčaním pôdy v ruke. Ak je obsah vlhkosti správny, medzi prstami by sa mali objaviť malé kvapky vody. Výber a príprava testovacích živočíchov 14. Odporúčaný testovací druh je Enchytraeus albidus Henle 1837 (mrlica biela), patriaci do čeľade Enchytraeidae (trieda Oligochaeta, kmeň Annelida). E. albidus je jeden z najväčších druhov čeľade Enchytraeidae, so zaznamenanými exemplármi dĺžky až 35 mm (17) (18). E. albidus sa vyskytuje na celom svete v morských, sladkovodných a suchozemských biotopoch, najmä v rozkladajúcej sa organickej hmote (morské riasy, kompost) a iba zriedka na lúkach (9). Jeho široká ekologická tolerancia a niektoré morfologické odchýlky by mohli poukazovať na existenciu viacerých línií. 15. E. albidus je komerčne dostupný ako krmivo pre ryby. Je potrebné skontrolovať, či kultúra nie je kontaminovaná inými, zvyčajne menšími druhmi (1) (19). Ak sa zistí kontaminácia, všetky červy by sa mali premyť vodou v Petriho miske. Potom by sa mali vybrať (pomocou stereomikroskopu) veľké dospelé exempláre E. albidus s cieľom začať novú kultúru, pričom všetky ostatné červy sa odstránia. E. albidus je možné jednoducho pestovať v širokej škále organických materiálov (pozri dodatok 4). Životný cyklus E. albidus je krátky, keďže dospievanie červa trvá od 33 dní (pri teplote 18 °C) do 74 dní (pri teplote 12 °C) (1). Na test sa použijú iba kultúry, ktoré sa bez problémov udržiavali v laboratóriu najmenej päť týždňov (jedna generácia). 16. Iné druhy rodu Enchytraeus sú tiež vhodné, napríklad E. buchholzi Vejdovsky 1879 alebo E. crypticus Westheide a Graefe 1992 (pozri dodatok 5). Ak sa použijú iné druhy rodu Enchytraeus, musia byť jednoznačne identifikované a do správy by sa malo uviesť odôvodnenie výberu daného druhu. 17. Živočíchy použité na testy sú dospelé červy. Mali by mať vajíčka (biele škvrny) v oblasti klitella a mali by byť približne rovnakej veľkosti (asi 1 cm dlhé). Synchronizácia chovu kultúry nie je potrebná. 18. Ak sa červy nechovajú v tom istom druhu pôdy a za podmienok (vrátane kŕmenia) používaných pre záverečný test, musia sa aklimatizovať najmenej 24 hodín, prípadne až tri dni. Spočiatku by sa mal aklimatizovať väčší počet dospelých jedincov, než je potrebný na vykonanie testu, aby bol priestor na zamietnutie poškodených alebo inak nevhodných exemplárov. Na konci obdobia aklimatizácie sa na testy vyberú len červy, ktoré obsahujú vajíčka a nevykazujú žiadne poruchy správania (napr. pokusy uniknúť z pôdy). Červy sa opatrne vyberú pomocou klenotníckych pinziet, háčikov alebo slučiek a umiestnia sa do Petriho misky obsahujúcej malé množstvo sladkej vody. Na tento účel sa uprednostňuje rekonštituovaná sladká voda, ako sa navrhuje v kapitole C.20 tejto prílohy (reprodukčný test na Daphnia magna), keďže deionizovaná voda, demineralizovaná voda alebo voda z vodovodu by mohla byť pre červov škodlivá. Červy sa kontrolujú pod stereomikroskopom a každý, ktorý neobsahuje vajíčka, sa vyradí. Dbá sa na vybratie a odstránenie všetkých roztočov alebo chvostoskokov, ktoré môžu infikovať kultúry. Zdravé červy, ktoré sa nepoužijú na test, sa vrátia do zásobnej kultúry. Príprava testovacích koncentrácií Testovaná chemikália rozpustná vo vode 19. Roztok testovanej chemikálie sa pripravuje s deionizovanou vodou v množstve dostatočnom pre všetky replikáty jednej testovacej koncentrácie. Odporúča sa použitie primeraného množstva vody, aby sa dosiahol požadovaný obsah vlhkosti, t. j. 40 – 60 % maximálnej kapacity zadržiavania vody (pozri bod 13). Každý roztok testovanej chemikálie sa pred vložením do testovacej nádoby dôkladne premieša s jednou šaržou predvlhčenej pôdy. Testovaná chemikália nerozpustná vo vode 20. V prípade chemikálií nerozpustných vo vode, ale rozpustných v organických rozpúšťadlách, sa testovaná chemikália môže rozpustiť v čo najmenšom objeme vhodného nosiča (napr. acetónu). Používať by sa mali iba prchavé rozpúšťadlá. Nosič sa nastrieka na malé množstvo, napríklad 2,5 g, jemného kremenného piesku, alebo sa s ním zmieša. Nosič sa odstráni najmenej hodinovým odparovaním pod digestorom. Táto zmes kremenného piesku a testovanej chemikálie sa pridá do predvlhčenej pôdy a po pridaní primeraného množstva deionizovanej vody, aby sa dosiahol požadovaný obsah vlhkosti, sa dôkladne premieša. Konečná zmes sa vloží do testovacích nádob. 21. V prípade chemikálií, ktoré sú slabo rozpustné vo vode a v organických rozpúšťadlách, sa ekvivalent 2,5 g jemne drveného kremenného piesku na testovaciu nádobu zmieša s príslušným množstvom testovanej chemikálie na dosiahnutie požadovanej testovacej koncentrácie. Táto zmes kremenného piesku a testovanej chemikálie sa pridá do predvlhčenej pôdy a dôkladne zmieša s primeraným množstvom deionizovanej vody, aby sa dosiahol požadovaný obsah vlhkosti. Konečná zmes sa rozdelí medzi testovacie nádoby. Tento postup sa opakuje pre každú testovaciu koncentráciu a pripravia sa aj primerané kontrolné vzorky. 22. Chemikálie by sa spravidla nemali testovať pri koncentráciách vyšších ako 1 000 mg/kg suchej hmotnosti pôdy. Testovanie pri vyšších koncentráciách sa však môže vyžadovať v súlade s cieľmi osobitného testu. VYKONANIE TESTOV Testovacie skupiny a kontrolné vzorky 23. Pre každú testovaciu koncentráciu sa množstvo testovacej pôdy zodpovedajúce 20 g sušiny umiestni do testovacej nádoby (pozri body 19 – 21). Pripravia sa tiež kontrolné vzorky bez testovanej chemikálie. Do každej nádoby sa pridá potrava v súlade s postupmi opísanými v bode 29. Do každej testovacej nádoby sa náhodným výberom umiestni desať červov. Červy sa opatrne prenesú do každej testovacej nádoby a umiestnia na povrch pôdy, napríklad pomocou klenotníckych pinziet, háčikov alebo slučiek. Počet replikátov pre testovacie koncentrácie a kontrolné vzorky závisí od použitej koncepcie testu (pozri bod 34). Testovacie nádoby sa náhodne umiestnia v testovacom inkubátore a tieto pozície sa raz týždenne náhodne zmenia. 24. Ak sa na aplikáciu testovanej chemikálie použije nosič, mala by sa okrem testovacej série pripraviť jedna kontrolná séria obsahujúca kremenný piesok s nastriekaným alebo zamiešaným rozpúšťadlom. Koncentrácia rozpúšťadla alebo dispergantu by mala byť rovnaká, aká sa používa v testovacích nádobách obsahujúcich testovanú chemikáliu. V prípade chemikálií, ktoré si vyžadujú aplikáciu v súlade s postupmi uvedenými v bode 21, by sa mala pripraviť kontrolná séria obsahujúca doplnkový kremenný piesok (2,5 g na nádobu). Podmienky testu 25. Testovacia teplota je 20 °C ± 2 °C. S cieľom zabrániť úniku červov z pôdy sa test vykonáva v kontrolovaných cykloch svetla a tmy (podľa možnosti 16 hodín svetla a 8 hodín tmy) s intenzitou osvetlenia 400 až 800 luxov v okolí testovacích nádob. 26. S cieľom kontrolovať vlhkosť pôdy sa nádoby odvážia na začiatku testu a potom raz týždenne. Úbytok hmotnosti sa dopĺňa pridaním primeraného množstva deionizovanej vody. Je potrebné si uvedomiť, že strata vody sa môže znížiť udržiavaním vysokej vlhkosti vzduchu (> 80 %) v testovacom inkubátore. 27. Obsah vlhkosti a hodnota pH by sa mali merať na začiatku a na konci testu na vyhľadávanie rozsahu aj konečného testu. Merania by sa mali robiť v kontrolných vzorkách pôdy, ako aj vo vzorkách s aplikovanou chemikáliou (všetky koncentrácie), ktoré boli pripravené a udržiavané rovnakým spôsobom ako testovacie kultúry, ale bez červov. Potrava by sa mala pridávať do vzoriek pôdy len na začiatku testu na uľahčenie mikrobiálnej aktivity. Množstvo pridanej potravy by malo byť rovnaké, aké sa pridáva do testovaných kultúr. Počas testu nie je potrebné pridávať do týchto nádob ďalšiu potravu. Kŕmenie 28. Používať sa môže potrava, ktorá je schopná udržiavať populáciu červov čeľade Enchytraeidae. Zistilo sa, že vhodným kŕmnym materiálom sú ovsené otruby, ktoré sa podľa možnosti pred použitím autoklávujú, aby sa predišlo mikrobiálnej kontaminácii (vhodné je aj zohrievanie). 29. Potrava sa najskôr pripraví zmiešaním 50 mg mletých ovsených otrúb s pôdou v každej nádobe pred vložením červov. Potom sa potrava dodáva týždenne, až do 21. dňa. Kŕmenie sa nevykoná v 28. deň, keďže dospelé jedince boli v tejto fáze premiestnené a mladé červy odvtedy potrebujú pomerne málo doplnkovej potravy. Kŕmenie počas testu pozostáva z 25 mg mletých ovsených otrúb na nádobu, ktoré sa opatrne uložia na povrch pôdy tak, aby sa predišlo poraneniu červov. V záujme obmedzenia tvorby plesní by sa uložené ovsené vločky mali prekryť malým množstvom pôdy. Ak potrava zostáva neskonzumovaná, dávka by sa mala znížiť. Koncepcia testu na vyhľadávanie rozsahu 30. V prípade potreby sa vykoná test na vyhľadávanie rozsahu, napríklad s piatimi koncentráciami testovanej chemikálie: 0,1, 1,0, 10, 100 a 1 000 mg/kg (suchej hmotnosti pôdy). Postačuje jeden replikát pre každú vzorku s aplikovanou chemikáliou a kontrolnú vzorku. 31. Test na vyhľadávanie rozsahu trvá dva týždne. Na konci testu sa posudzuje mortalita červov. Červ sa považuje za mŕtveho, keď nereaguje na mechanický podnet v prednej časti tela. Doplnkové informácie o mortalite môžu byť užitočné aj pri rozhodovaní o rozsahu koncentrácií, ktoré sa použijú v konečnom teste. Preto by sa mali zaznamenať aj zmeny v správaní (napr. neschopnosť zavŕtať sa do pôdy, ležanie bez pohybu pri sklenej stene testovacej nádoby) a morfológii (napr. prítomnosť otvorených rán) dospelých jedincov, ako aj existencia každého juvenilného jedinca. Prírastok juvenilných jedincov je možné určovať pomocou metódy farebného označovania opísanej v dodatku 6. 32. Hodnotu koncentrácie LC50 je možné približne určiť výpočtom geometrickej strednej hodnoty údajov o mortalite. Pri stanovení koncentračného rozsahu pre konečný test sa predpokladá, že účinky na reprodukciu sú nižšie ako hodnota LC50, s faktorom až do 10. To je však empirický vzťah a v každom konkrétnom prípade môže byť iný. Ďalšie pozorovania v rámci testu na vyhľadávanie rozsahu, ako je výskyt juvenilných jedincov, môžu pomôcť spresniť rozsah koncentrácie testovanej chemikálie, ktorý sa použije pri konečnom teste. 33. Na presné stanovenie hodnoty LC50 sa odporúča vykonanie testu s použitím najmenej štyroch replikátov každej koncentrácie testovanej chemikálie a primeraným počtom koncentrácií, ktoré vyvolajú aspoň štyri odlišné štatisticky významné stredné reakcie na tieto koncentrácie. V prípade potreby sa používa podobný počet koncentrácií a replikátov pre kontrolné vzorky. Koncepcia konečného reprodukčného testu 34. Na základe odporúčaní vyplývajúcich z kruhového testu sa navrhujú tri koncepcie (2): — Na stanovenie hodnoty NOEC by sa malo testovať aspoň päť koncentrácií v geometrickej sérii. Odporúčajú sa štyri replikáty pre každú testovaciu koncentráciu a osem kontrolných vzoriek. Faktor rozstupu medzi hodnotami koncentrácie by nemal presahovať 1,8. — Na stanovenie hodnoty ECx (napr. EC10, EC50) by sa malo testovať aspoň päť koncentrácií, pričom hodnota ECx by mala byť v rozsahu týchto koncentrácií, aby sa mohla určiť interpoláciou namiesto extrapolácie. Odporúčajú sa najmenej štyri replikáty pre každú testovaciu koncentráciu a štyri kontrolné replikáty. Faktor rozstupu sa môže meniť, t. j. môže mať hodnotu najviac 1,8 v očakávanom rozsahu účinkov a viac ako 1,8 pri vyšších a nižších koncentráciách. — Kombinovaný prístup umožňuje určenie obidvoch koncentrácií, NOEC aj ECx. Použiť by sa malo osem koncentrácií aplikovanej chemikálie v geometrickom rade. Odporúčajú sa štyri replikáty pre každú aplikáciu chemikálie a osem kontrolných vzoriek. Faktor rozstupu medzi hodnotami koncentrácie by nemal presahovať 1,8. 35. Použiť by sa malo desať dospelých červov na testovaciu nádobu (pozri bod 23). Potrava sa pridáva do testovacích nádob na začiatku testu a potom raz týždenne (pozri bod 29), až do 21. dňa vrátane. V 21. deň sa vzorky pôdy pozorne ručne prehľadajú, nájdu a spočítajú sa žijúce dospelé červy a zaznamenajú sa zmeny v ich správaní (napr. neschopnosť zavŕtať sa do pôdy, ležanie bez pohybu pri sklenej stene testovacej nádoby) a morfológii (napr. otvorené rany). Všetky dospelé červy sa potom vyberú z testovacích nádob a testovacej pôdy. Testovacia pôda, ktorá obsahuje akékoľvek vzniknuté kokóny, sa inkubuje ďalšie tri týždne za tých istých podmienok testu, s výnimkou toho, že kŕmenie sa vykonáva len v 35. deň (25 mg mletých ovsených vločiek na nádobu). 36. Po šiestich týždňoch sa počítajú čerstvo vyliahnuté červy. Odporúča sa metóda založená na farebnom označovaní bengálskym červeným farbivom (pozri dodatok 6), hoci aj iné mokré (ale nie tepelné) techniky extrakcie a vyplavovania (pozri dodatok 6) sa ukázali ako vhodné (4) (10) (11) (20). Farebné označovanie bengálskou červeňou sa odporúča, lebo mokrej extrakcii z pôdneho substrátu môže brániť turbidite spôsobenej suspendovanými časticami ílu. Limitný test 37. Ak sa v rámci testu na vyhľadávanie rozsahu nepozorujú žiadne účinky ani pri najvyššej koncentrácii (t. j. 1 000 mg/kg), reprodukčný test sa môže vykonať ako limitný test s použitím koncentrácie 1 000 mg/kg s cieľom dokázať, že hodnota NOEC z hľadiska reprodukcie je vyššia ako uvedená hodnota. Zhrnutie a harmonogram testu 38. Jednotlivé kroky testu je možné zhrnúť takto: Čas Test na vyhľadávanie rozsahu Konečný test –7. deň alebo skôr — príprava umelej pôdy (miešanie suchých zložiek) — príprava umelej pôdy (miešanie suchých zložiek) –5. deň — kontrola pH umelej pôdy — meranie maximálnej kapacity zadržiavania vody v pôde — kontrola pH umelej pôdy — meranie maximálnej kapacity zadržiavania vody v pôde –5. deň až –3. deň — roztriedenie červov na aklimatizáciu — roztriedenie červov na aklimatizáciu – 3. až 0. deň — aklimatizácia červov najmenej 24 hodín — aklimatizácia červov najmenej 24 hodín –1. deň — predvlhčenie umelo pripravenej pôdy a rozdelenie do dávok — predvlhčenie umelo pripravenej pôdy a rozdelenie do dávok 0. deň — príprava zásobných roztokov — aplikácia testovanej chemikálie — váženie testovacieho substrátu do testovacích nádob — zamiešanie potravy — vloženie červov — meranie pH pôdy a obsahu vlhkosti v pôde — príprava zásobných roztokov — aplikácia testovanej chemikálie — váženie testovacieho substrátu do testovacích nádob — zamiešanie potravy — vloženie červov — meranie pH pôdy a obsahu vlhkosti v pôde 7. deň — kontrola vlhkosti pôdy — kontrola vlhkosti pôdy — kŕmenie 14. deň — stanovenie mortality dospelých jedincov — odhad počtu juvenilných jedincov — meranie pH pôdy a obsahu vlhkosti v pôde — kontrola vlhkosti pôdy — kŕmenie 21. deň — pozorovanie správania dospelých jedincov — premiestnenie dospelých jedincov — stanovenie mortality dospelých jedincov — kontrola vlhkosti pôdy — kŕmenie 28. deň — kontrola vlhkosti pôdy — bez kŕmenia 35. deň — kontrola vlhkosti pôdy — kŕmenie 42. deň — počítanie juvenilných červov — meranie pH pôdy a obsahu vlhkosti v pôde ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV Spracovanie výsledkov 39. Hoci v dodatku 7 je uvedený prehľad, žiadne definitívne štatistické usmernenia na analýzu výsledkov testu táto testovacia metóda neposkytuje. 40. V rámci testu na vyhľadávanie rozsahu je hlavným parametrom mortalita. Preto by sa mali zaznamenať aj zmeny v správaní (napr. neschopnosť zavŕtať sa do pôdy, ležanie bez pohybu pri sklenej stene testovacej nádoby) a morfológii (napr. prítomnosť otvorených rán) dospelých jedincov, ako aj existencia každého juvenilného jedinca. Na stanovenie koncentrácie LC50 by sa mala spravidla používať probitová analýza (21) alebo logaritmická regresia. Napriek tomu v prípadoch, keď je táto metóda analýzy nevhodná (napr. ak sú k dispozícii menej ako tri koncentrácie čiastočne spôsobujúce usmrtenie), je možné použiť alternatívne metódy. Tieto metódy môžu zahŕňať pohyblivé priemery (22), upravenú Spearman-Karberovu metódu (23) alebo jednoduchú interpoláciu (napr. geometrickú strednú hodnotu LC0 a LC100, vypočítanú ako súčin druhej odmocniny LC0 a hodnoty LC100). 41. V rámci konečného testu je hlavným parametrom plodnosť (t. j. počet narodených juvenilných jedincov). Pokiaľ však ide o test na vyhľadávanie rozsahu, všetky ostatné škodlivé príznaky by sa mali uviesť v záverečnej správe. Štatistická analýza si vyžaduje výpočet aritmetickej strednej hodnoty a štandardnej odchýlky vo vzťahu k reprodukcii pre vzorky s aplikovanou chemikáliou a kontrolné vzorky. 42. Ak sa vykonáva analýza variancie, štandardnú odchýlku (s) a stupne voľnosti (df) môže nahradiť odhad výberovej variancie, získaný postupom ANOVA, a jej stupne voľnosti, za predpokladu, že variancia nezávisí od koncentrácie. V tomto prípade sa použije jedna hodnota variancií pre kontrolné vzorky a pre vzorky s aplikovanou chemikáliou. Tieto hodnoty sa zvyčajne vypočítajú pomocou komerčného štatistického softvéru s využitím výsledkov pre jednotlivé nádoby ako replikátov. Ak sa spájanie údajov pre negatívne kontrolné vzorky a kontrolné vzorky s rozpúšťadlom zdá byť primeranejšie než porovnávanie s jednou z týchto skupín v rámci testu, malo by sa testovaním zistiť, či nie sú výrazne odlišné (vhodné testy sú uvedené v bode 45 a dodatku 7). 43. Ďalšie štatistické testovanie a odvodzovanie závisí od toho, či majú hodnoty pre replikáty normálne rozdelenie a sú homogénne, pokiaľ ide o ich varianciu. Odhad koncentrácie NOEC 44. Uprednostniť by sa malo použitie výkonných testov. Mali by sa využívať informácie napríklad z predchádzajúcich skúseností s kruhovým testovaním alebo iné historické údaje o tom, či sú údaje približne normálne rozdelené. Homogénnosť variancie (homoskedasticita) je kritickejšia. Zo skúseností vyplýva, že variancia sa často zvyšuje s rastúcou strednou hodnotou. V týchto prípadoch by transformácia údajov mohla viesť k homoskedasticite. Taká transformácia by však mala byť založená na skúsenostiach s historickými údajmi, a nie na údajoch, ktoré sú predmetom prešetrovania. S homogénnymi údajmi by sa mali vykonať viaceré t-testy, ako napríklad Williamsov test (α = 0,05, jednostranný) (24) (25), alebo v určitých prípadoch Dunnettov test (26) (27). Je potrebné si uvedomiť, že v prípade nerovnakej replikácie sa tabuľkové t-hodnoty musia upraviť, ako navrhujú Dunnett a Williams. Niekedy sa reakcie nezvyšujú/neznižujú pravidelne v dôsledku veľkých odchýlok. V prípade výraznej odchýlky od monotónnosti je Dunnettov test vhodnejší. Ak sa vyskytujú odchýlky od homoskedasticity, môže byť vhodné podrobnejšie preskúmať možné účinky na variancie s cieľom rozhodnúť, či sa t-testy môžu použiť bez výraznejšej straty výkonnosti (28). Alternatívne sa môžu použiť viacnásobné U-testy, napríklad Bonferroniho U-test podľa Holma (29), alebo v prípade, keď tieto údaje vykazujú heteroscedasticitu, ale inak sú v súlade so základným monotónnym priebehom krivky závislosti dávka-odpoveď, môže sa použiť iný neparametrický test [napr. Jonckheereho-Terpstrov (30) (31) alebo Shirleyho (32) (33)], pričom vo všeobecnosti sú tieto testy uprednostňované pred t-testami s nerovnakou varianciou (pozri tiež náčrt v dodatku 7). 45. Ak sa vykonáva limitný test a sú splnené podmienky postupov parametrického testu (normalita, homogenita), môže sa použiť Studentov párový t-test, alebo inak Mannov-Whitneyho postup U-testu (29). Odhad koncentrácie ECx 46. Pri výpočte ktorejkoľvek hodnoty ECx sa na regresnú analýzu (lineárnu alebo nelineárnu) používajú stredné hodnoty pre jednotlivé vzorky s aplikovanou chemikáliou, a to po získaní vhodnej funkcie závislosti dávky a reakcie. Pre rast červov ako nepretržitú reakciu sa hodnoty ECx môžu odhadnúť použitím vhodnej regresnej analýzy (35). Medzi vhodné funkcie pre kvantálne údaje (mortalita/prežitie a počet vyprodukovaných potomkov) patria bežný sigmoid, logistická alebo Weibullova funkcia s dvomi až štyrmi parametrami, pričom niektoré z týchto funkcií môžu modelovať aj hormetické reakcie. Ak sa lineárnou regresnou analýzou určila funkcia závislosti dávky a reakcie, mal by sa pred odhadom hodnoty ECx nájsť regresnou analýzou významný koeficient determinácie (r2) a/alebo sklon zadaním hodnoty zodpovedajúcej x % strednej hodnoty pre kontrolnú vzorku do rovnice získanej regresnou analýzou. Hranice spoľahlivosti 95 % sa vypočítajú podľa Fiellera [citovaný v práci Finneyho (21)] alebo inými modernými vhodnými metódami. 47. Alternatívne sa reakcia modeluje ako percentuálna časť alebo podiel modelového parametra, ktorý sa interpretuje ako stredná hodnota reakcie kontrolnej vzorky. V týchto prípadoch sa výsledky často môžu ľahko znázorniť normálnou (logistickou, Weibullovou) sigmoidnou krivkou s použitím postupu probitovej regresie (21). V týchto prípadoch sa váhová funkcia musí upraviť na metrické reakcie, ako uvádza Christensen (36). Ak sa však pozoruje horméza, probitovú analýzu by mala nahradiť logistická alebo Weibullova funkcia so štyrmi parametrami, určená postupom nelineárnej regresie (36). Ak z údajov nie je možné určiť vhodnú funkciu závislosti dávky a reakcie, môžu sa na odhad hodnoty ECx a jej hraníc spoľahlivosti použiť alternatívne metódy, ako sú pohyblivé priemery podľa Thompsona (22) a upravený Spearman-Karberov postup (23). PROTOKOL O SKÚŠKE 48. Protokol o skúške musí obsahovať tieto informácie: Testovaná chemikália: — fyzikálny charakter, a ak je to relevantné, fyzikálno-chemické vlastnosti (napr. rozpustnosť vo vode, tlak pary), — chemická identifikácia testovanej chemikálie podľa názvoslovia IUPAC, číslo CAS, číslo šarže, dávky, štrukturálny vzorec a čistota, — dátum expirácie vzorky. Testované druhy: — použité testované živočíchy: druh, vedecký názov, zdroj organizmov a podmienky chovu, Podmienky testu: — zložky a príprava umelej pôdy, — metóda aplikácie testovanej chemikálie, — opis testovacích podmienok vrátane teploty, obsahu vlhkosti, pH atď., — úplný opis koncepcie experimentu a postupov. Výsledky testu: — mortalita dospelých červov po dvoch týždňoch a počet juvenilných jedincov na konci testu na vyhľadávanie rozsahu, — mortalita dospelých červov po troch týždňoch expozície a celý záznam o juvenilných jedincoch na konci konečného testu, — akékoľvek pozorované fyzikálne alebo patologické príznaky a zmeny v správaní testovaných organizmov, — hodnoty LC50, NOEC a/alebo ECx (napr. EC50, EC10) pre reprodukciu, ak sú niektoré z nich použiteľné, spolu s intervalmi spoľahlivosti a grafom, ktorý znázorňuje model ich výpočtu, ako aj všetky informácie a pozorovania, ktoré môžu byť nápomocné pri interpretácii výsledkov, Uvedú sa odchýlky od postupov opísaných v tejto testovacej metóde a všetky nezvyčajné udalosti počas testu. LITERATÚRA 1. Römbke, J. (1989). Entwicklung eines Reproduktionstests an Bodenorganismen – Enchytraeen. Abschlußbericht des Battelle-Instituts e.V. Frankfurt für das Umweltbundesamt (Berlin), FE-Vorhaben 106 03 051/01. 2. Römbke, J. and Moser, T. (1999). Organisation and Performance of an International Ringtest for the Validation of the Enchytraeid Reproduction Test. UBA-Texte 4/99, 150 + 223 pp. 3. Westheide, W. and Bethge-Beilfuss, D. (1991). The sublethal enchytraeid test system: guidelines and some results, In: Modern Ecology: Basic and Applied Aspects. Ed. by Esser, G. and Overdieck, D. pp 497-508. Elsevier, Amsterdam, 4. Dirven-Van Breemen, E., Baerselmann, R. and Notenboom, J. (1994). Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Annelida) in Bodemecotoxicologisch Onderzoek. RIVM Rapport Nr. 719102025. 46 pp. 5. Chapter C.8 of this Annex, Toxicity for Earthworms. 6. ISO (International Organization for Standardization) (1993). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 1: Determination of acute toxicity using Artificial Soil substrate, No. 11268-1. ISO, Geneve. 7. ISO (International Organization for Standardization) (1996). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2. ISO, Geneve. 8. Rundgren, S. and A.K. Augustsson (1998). Test on the enchytraeid Cognettia sphagnetorum (Vejdovsky 1877). In: Løkke, H. and C.A.M. Van Gestel, Handbook of soil invertebrate toxicity tests. John Wiley and Sons, Chichester, 73-94. 9. Kasprzak, K. (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23, 217-232. 10. Römbke, J. (1995). Enchytraeen (Oligochaeta) als Bioindikator, UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 7, 246-249. 11. Dunger, W. and Fiedler, H.J. (1997). Methoden der Bodenbiologie. G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York. 12. Didden, W.A.M. (1993). Ecology of terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37, 2-29. 13. Becker, H. (1991). Bodenorganismen – Prüfungskategorien der Forschung. UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 3, 19-24. 14. Römbke, J. and Federschmidt, A. (1995). Effects of the fungicide Carbendazim on Enchytraeidae in laboratory and field tests, Newsletter on Enchytraeidae 4, 79-96. 15. Römbke, J., Riepert, F. & Achazi R. (2000): Enchytraeen als Testorganismen. In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 59-81. 16. ISO (International Organization for Standardization) (1994). Soil Quality – Determination of pH, No. 10390. ISO, Geneve. 17. Bell, A.W. (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902, 1-13. 18. Nielsen, C.O. and Christensen, B. (1959). The Enchytraeidae, critical revision and taxonomy of European species. Natura Jutlandica 8-9, 1-160. 19. Bouguenec, V. and Giani, N. (1987). Deux nouvelles especes d'Enchytraeus (Oligochaeta, Enchytraeidae) et rediscription d'E. bigeminus. Remarques sur le genre Enchytraeus. Ann. Limnol. 23, 9-22. 20. Korinkova, J. and Sigmund, J. (1968). The colouring of bottom-fauna samples before sorting, Vestnik Ceskoslovensko Spolecnosti Zoologicke 32, 300-305. 21. Finney, D.J. (1971). Probit Analysis (3rd ed.), pp. 19-76. Cambridge Univ. Press. 22. Finney, D.J. (1978). Statistical Method in Biological Assay. – Charles Griffin & Company Ltd, London. 23. Hamilton, M.A., R.C. Russo and R.V. Thurston. (1977). Trimmed Spearman-Karber Method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environ. Sci. Technol. 11(7), 714-719; Correction Environ. Sci. Technol. 12(1998), 417. 24. Williams, D.A., (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103-117. 25. Williams, D.A., (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, 519-531. 26. Dunnett, C.W., (1955). A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control. Amer. Statist. Ass. J. 50, 1096-1121. 27. Dunnett, C.W., (1964) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20, 482-491. 28. Hoeven, N. van der, (1998). Power analysis for the NOEC: What is the probability of detecting small toxic effects on three different species using the appropriate standardized test protocols? Ecotoxicology 7: 355-361 29. Holm, S., (1979): A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand. J. Statist. 6, 65-70. 30. Jonckheere, A. R. (1954); A Distribution-free k-Sample Test Against Ordered Alternatives, Biometrika 41, 133-145. 31. Terpstra, T. J. (1952); The Asymptotic Normality and Consistency of Kendall's Test Against Trend, When Ties are Present in One Ranking, Indagationes Math. 14, 327-333. 32. Shirley, E. A. (1979); The comparison of treatment to control group means in toxicology studies, Applied Statistics 28, 144-151. 33. Williams, D.A. (1986); A Note on Shirley's Nonparametric Test for Comparing Several Dose Levels with a Zero-Dose Control, Biometrics 42, 183-186. 34. Sokal, R.R. and F.J. Rohlf. (1981). Biometry. The Principle and practice of statistics in biological research. 2nd edition. W.H. Freeman and Company. New York. 35. Christensen, E.R., (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18, 213-221. 36. Van Ewijk, P.H. and J.A. Hoekstra. (1993). Calculation of the EC50 and its confidence interval when sub-toxic stimulus is present. Ecotox, Environ. Safety. 25, 25-32. Dodatok 1 Vymedzenie pojmov Na účely tejto testovacej metódy sa používajú tieto vymedzenia pojmov: Chemikália je látka alebo zmes. ECx (účinná koncentrácia x %) je koncentrácia, ktorá v rámci stanoveného času expozície vyvolá účinok x % na testované organizmy v porovnaní s kontrolnou vzorkou. V rámci tohto testu sa účinné koncentrácie vyjadrujú ako hmotnosť testovanej chemikálie na suchú hmotnosť testovacej pôdy. LC0 (nulová letálna koncentrácia) je koncentrácia testovanej chemikálie, ktorá v danom časovom úseku nespôsobí usmrtenie testovaných organizmov vystavených jej pôsobeniu. V rámci tohto testu sa LC0 vyjadruje ako hmotnosť testovanej chemikálie na suchú hmotnosť testovanej pôdy. LC50 (stredná letálna koncentrácia) je koncentrácia testovanej chemikálie, ktorá v danom časovom úseku spôsobí usmrtenie 50 % testovaných organizmov vystavených jej pôsobeniu. V rámci tohto testu sa LC50 vyjadruje ako hmotnosť testovanej chemikálie na suchú hmotnosť testovanej pôdy. LC100 (absolútna letálna koncentrácia) je koncentrácia testovanej chemikálie, ktorá v danom časovom úseku spôsobí usmrtenie 100 % testovaných organizmov vystavených jej pôsobeniu. V rámci tohto testu sa LC100 vyjadruje ako hmotnosť testovanej chemikálie na suchú hmotnosť testovanej pôdy. LOEC (najnižšia koncentrácia s pozorovaným účinkom) je najnižšia koncentrácia testovanej chemikálie, ktorá má štatisticky významný účinok (p < 0,05). V rámci tohto testu sa LOEC vyjadruje ako hmotnosť testovanej chemikálie na suchú hmotnosť testovacej pôdy. Všetky testovacie koncentrácie vyššie ako LOEC by za normálnych okolností mali vyvolať účinok, ktorý je štatisticky odlišný od kontrolných vzoriek. Akékoľvek odchýlky od uvedeného pri určovaní LOEC musia byť odôvodnené v správe o teste. NOEC (koncentrácia bez pozorovaného účinku) je najvyššia koncentrácia testovanej chemikálie, bezprostredne pod koncentráciou LOEC, pri ktorej sa nepozoruje žiadny účinok. V tomto teste koncentrácia zodpovedajúca hodnote NOEC nemá žiadny štatisticky významný účinok (p < 0,05) v rámci daného expozičného času v porovnaní s kontrolnou vzorkou. Miera reprodukcie je stredná hodnota počtu narodených juvenilných červov na počet dospelých červov počas testu. Testovaná chemikália je akákoľvek látka alebo zmes, ktorá sa testuje pomocou tejto testovacej metódy. Dodatok 2 Stanovenie maximálnej kapacity zadržiavania vody Stanovenie kapacity zadržiavania vody umelej pôdy Táto metóda sa považuje za vhodnú. Opísaná je v prílohe C normy ISO DIS 11268-2. Pomocou vhodného zariadenia (špirálová trubica atď.) sa odoberie určené množstvo (napr. 5 g) testovacieho pôdneho substrátu. Spodná časť trubice sa zakryje kúskom filtračného papiera a po naplnení vodou sa umiestni na stojan vo vodnom kúpeli. Trubica by sa mala postupne ponárať do vody, až kým vodná hladina nestúpne nad vrchnú vrstvu pôdy. Potom by sa mala nechať vo vode približne tri hodiny. Keďže nie všetka voda, ktorú absorbujú kapiláry pôdy, sa môže zachovať, vzorke pôdy by sa malo umožniť odvodnenie počas dvoch hodín tak, že sa trubica uloží na vrstvu veľmi mokrého jemne drveného kremenného piesku v uzavretej nádobe (aby sa zabránilo vysúšaniu). Vzorka by sa potom mala odvážiť a vysušiť na konštantnú hmotnosť pri teplote 105 °C. Kapacitu zadržiavania vody (WHC) je možné vypočítať takto: kde: S = vodou saturovaný substrát + hmotnosť trubice + hmotnosť filtračného papiera, T = hmotnosť obalu (hmotnosť trubice + hmotnosť filtračného papiera), D = suchá hmotnosť substrátu. LITERATÚRA: ISO (International Organization for Standardization) (1996). Soil Quality -Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2. ISO, Geneve. Dodatok 3 Stanovenie ph pôdy Táto metóda stanovenia pH vzorky pôdy je založená na opise uvedenom v norme ISO 10390 (Kvalita pôdy – stanovenie pH). Určené množstvo pôdy sa suší pri teplote miestnosti najmenej 12 hodín. Potom sa vytvorí suspenzia pôdy (obsahujúca najmenej 5 g pôdy) s päťnásobným objemom 1 M chloridu draselného (KCl) analytickej čistoty alebo 0,01 M roztoku chloridu vápenatého (CaCl2) analytickej čistoty. Suspenzia sa potom päť minút dôkladne pretrepáva. Po pretrepaní sa suspenzia nechá stáť najmenej 2 hodiny, ale nie dlhšie ako 24 hodín. Hodnota pH kvapalnej fázy sa potom meria pH-metrom, ktorý sa pred každým meraním kalibruje pomocou vhodnej série tlmivých roztokov (napr. s pH 4,0 a 7,0). LITERATÚRA: ISO (International Organization for Standardization) (1994). Soil Quality – Determination of pH, No. 10390. ISO, Geneve. Dodatok 4 Kultivačné podmienky rodu Enchytraeus Červy druhu Enchytraeus albidus (ako aj iné druhy rodu Enchytraeus) z čeľade Enchytraeidae je možné kultivovať vo veľkých plastových boxoch (napr. s rozmermi 30 × 60 × 10 cm) naplnených zmesou 1:1 umelo pripravenej pôdy a prírodnej nekontaminovanej záhradnej pôdy. Kompostový materiál sa nesmie používať, lebo by mohol obsahovať toxické chemikálie,