SMERNICA KOMISIE 2006/56/ES

z 12. júna 2006,

ktorou sa menia a dopĺňajú prílohy k smernici Rady 93/85/EHS o boji proti baktériovej krúžkovitosti zemiaka

KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV,

so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spoločenstva,

so zreteľom na smernicu Rady 93/85/EHS zo 4. októbra 1993 (1) o boji proti baktériovej krúžkovitosti zemiaka, a najmä na jej článok 12,

keďže:

Jedným z významných škodlivých organizmov zemiakov je Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., ktorý spôsobuje baktériovú krúžkovitosť zemiakov (ďalej len ako „organizmus“).

PRIJALA TÚTO SMERNICU:

Článok 1

Prílohy k smernici 93/85/EHS sa týmto nahrádzajú zodpovedajúcimi zneniami v prílohe k tejto smernici.

Článok 2

1. Členské štáty prijmú a uverejnia najneskôr do 31. marca 2007 zákony, iné právne predpisy a správne ustanovenia potrebné na dosiahnutie súladu s touto smernicou. Bezodkladne predložia Komisii text týchto ustanovení a korelačnú tabuľku uvádzajúcu tieto ustanovenia a smernicu.

Uplatňujú tieto opatrenia od 1. apríla 2007.

Členské štáty uvedú priamo v prijatých ustanoveniach alebo pri ich úradnom uverejnení odkaz na túto smernicu. Spôsob a formu tohto odkazu upravia členské štáty.

2. Členské štáty okamžite odošlú Komisii znenie hlavných ustanovení vnútroštátneho zákona, ktorý prijmú v oblasti pôsobnosti tejto smernice.

Článok 3

Táto smernica nadobúda účinnosť tretím dňom po jej uverejnení v Úradnom vestníku Európskej únie.

Článok 4

Táto smernica je určená členským štátom.

(1) Ú. v. ES L 259, 18.10.1993, s. 2.

PRÍLOHA I

TESTOVACIA SCHÉMA NA DIAGNOSTIKU, URČOVANIE PRÍTOMNOSTI A IDENTIFIKÁCIU BAKTÉRIE, KTORÁ SPÔSOBUJE KRÚŽKOVITOSŤ ZEMIAKA, CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (Smith) Davis et al. ssp. SEPEDONICUS (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al.

ROZSAH TESTOVACEJ SCHÉMY

Predložená schéma opisuje rozličné postupy používané pri:

i) diagnóze baktériovej krúžkovitosti zemiaka v zemiakových hľuzách a rastlinách zemiaka;

ii) určovaní prítomnosti Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus vo vzorkách zemiakových hľúz a rastlín zemiaka;

iii) identifikácii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (C. m. subsp. sepedonicus).

VŠEOBECNÉ ZÁSADY

Optimalizované protokoly pre rôzne metódy, validované činidlá a podrobnosti o príprave materiálu potrebného na testy sa stanovujú v dodatkoch. Zoznam laboratórií, ktoré boli zaradené do optimalizácie a validovania protokolov, sa stanovuje v dodatku 1.

Keďže súčasťou protokolov je určovanie prítomnosti karanténneho organizmu a budú obsahovať aj využitie životaschopných kultúr C. m. subsp. sepedonicus ako kontrolného materiálu, bude nevyhnutné vykonať postupy na základe náležitých karanténnych podmienok s adekvátnymi zariadeniami na likvidáciu odpadu a na základe podmienok náležitých licencií, ktoré vydali príslušné úrady pre karanténu rastlín.

Parametre testovania musia zaručiť pevné a opakovateľné zistenie prítomnosti úrovní C. m. subsp. sepedonicus na prahoch stanovených pre vybrané metódy.

Presná príprava pozitívnych kontrol je nevyhnutná.

Testovanie v súlade s požadovanými prahmi zahŕňa aj správne nastavenia, údržbu a kalibráciu zariadenia, starostlivé zaobchádzanie s činidlami a ich uchovávanie, ako aj všetky opatrenia na zabránenie kontaminácii medzi vzorkami, napr. oddelenie pozitívnych kontrol od testovaných vzoriek. Musia sa uplatňovať normy na kontrolu kvality, aby nedošlo k administratívnym či iným omylom, najmä pokiaľ ide o označovanie a dokumentáciu.

Pozitívny výskyt, ako sa uvádza v článku 4 ods. 2 smernice 93/85/EHS, znamená pozitívny výsledok v diagnostických alebo skríningových testoch, ktoré sa vykonali na vzorke, ako sa uvádza v diagramoch.

Ak je prvý skríningový test (IF alebo PCR/FISH) pozitívny, existuje podozrenie kontaminácie Cms a musí sa vykonať druhý skríningový test. Ak je druhý skríningový test pozitívny, podozrenie je potvrdené (podozrivý výskyt) a testovanie podľa schémy musí pokračovať. Ak je druhý skríningový test negatívny, považuje sa vzorka za nekontaminovanú Cms.

Pozitívna reakcia na IF test, ako sa uvádza v článku 4 ods. 2, sa teda definuje ako pozitívna reakcia na IF test, ktorá sa potvrdila v druhom skríningovom teste (PCR/FISH).

Potvrdená prítomnosť, ako sa uvádza v článku 5 ods. 1 smernice 93/85/EHS, znamená izolovanie a identifikáciu čistej kultúry C. m. subsp. sepedonicus s potvrdením patogenity.

1. ZNÁZORNENIE VÝVOJOVÝM DIAGRAMOM

1.1. Schéma určovania prítomnosti na diagnostikovanie baktériovej krúžkovitosti zemiaka v zemiakových hľzách a v rastlinách zemiaka s príznakmi baktériovej krúžkovitosti zemiaka

Postup testovania sa týka zemiakových hľúz a rastlín s typickými alebo podozrivými príznakmi baktériovej krúžkovitosti zemiaka. Patrí sem rýchly skríningový test, izolácia patogénu z infikovaného cievneho pletiva na diagnostických médiách a v prípade pozitívneho výsledku identifikácia kultúry ako C. m. subsp. sepedonicus.

1.2. Schéma na určenie prítomnosti a identifikáciu Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus vo vzorkách bezpríznakových zemiakových hľúz

Princíp

Cieľom testovacieho postupu je zistiť prítomnosť skrytých infekcií v zemiakových hľuzách. Pozitívny výsledok najmenej dvoch skríningových testov založených na rôznych biologických princípoch musí dopĺňať izolácia patogénu a následne v prípade izolácie typických kolónií potvrdenie čistej kultúry ako C. m. subsp. sepedonicus. Pozitívny výsledok iba jedného zo skríningových testov nie je dostatočný na to, aby sa vzorka považovala za podozrivú.

Skríningové testy a izolačné testy musia umožniť prah zistenia prítomnosti 103 až 104 buniek/ml resuspendovaného peletu a zahrnujú sa ako pozitívne kontroly v každej sérii testov.

1.3. Schéma na určovanie prítomnosti a identifikáciu Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus vo vzorkách bezpríznakových rastlín zemiaka

2. VIZUÁLNE HODNOTENIE PRÍZNAKOV BAKTÉRIOVEJ KRÚŽKOVITOSTI ZEMIAKA

2.1. Rastliny zemiaka

V európskych klimatických podmienkach sa príznaky nájdu v teréne len zriedka a často len na konci sezóny. Príznaky sa navyše často ukrývajú za príznaky iných chorôb, starnutie alebo mechanické poškodenie, alebo sa s nimi zamieňajú. Môže sa preto ľahko stať, že pri inšpekciách v teréne zostanú príznaky bez povšimnutia. Príznaky starnutia sa veľmi odlišujú od príznakov baktériovej hnedej hniloby; vädnutie je spravidla pomalé a spočiatku sa obmedzuje na okraje listov. Mladé infikované listy sa často naďalej vyvíjajú, ale na infikovaných miestach menej výrazne. Listy tak nadobúdajú nepravidelný tvar. Listy postihnuté blokovaním cievnych zväzkov stonky, nachádzajúce sa nižšie na stonke, často rozvíjajú chlorotické, žlté až oranžové interkostálne oblasti. Infikované lístočky, listy a dokonca stonky môžu prípadne odumrieť. Listy a hľuzy často len zmenšia svoju veľkosť. Príležitostne sa vývin rastlín zastaví. Farebné obrázky celého radu príznakov sa nachádzajú na webovej stránke http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

2.2. Zemiakové hľuzy

Prvými príznakmi sú jemná sklovitosť alebo priesvitnosť pletiva bez zmäknutého okolia cievneho systému, predovšetkým blízko pupkového konca. Sfarbenie prstenca cievnych zväzkov na pupkovom konci môže byť oproti normálnemu stavu mierne tmavšie. Prvými ľahko identifikovateľnými príznakmi sú žltkasté sfarbenie prstenca cievnych zväzkov a vytekanie stĺpčekov látky syrovitej konzistencie z ciev pri jemnom stlačení hľuzy. Tento výlučok obsahuje milióny baktérií. Môže sa objaviť hnednutie cievneho pletiva a príznaky na hľuze sa v tomto štádiu podobajú na príznaky hnedej hniloby, ktorú spôsobuje Ralstonia solanacearum. Tieto príznaky sa najprv môžu obmedzovať na jednu časť prstenca, nemusí to však byť nevyhnutne pri pupkovom konci, a postupne sa môžu rozširovať na celý prstenec. S postupujúcou infekciou dochádza k rozkladu cievnych pletív; vonkajšia vrstva zásobného pletiva sa môže oddeľovať od vnútornej. V pokročilých štádiách infekcie sa na povrchu hľúz objavujú priehlbiny, ktoré majú často červeno-hnedé sfarbenie okrajov. V Európe sa nedávno vyskytlo niekoľko prípadov hniloby strednej vrstvy zásobného pletiva a zároveň aj prstenca cievnych zväzkov, v dôsledku čoho dochádza k druhotnej invázii prostredníctvom vnútorného vpadnutia a nekrózy. Druhotné napadnutie hubami alebo baktériami môže tieto príznaky prekryť a rozlíšenie pokročilejších štádií tohto ochorenia od ostatných hnilobných ochorení sa môže sťažiť, ba až znemožniť. Možné sú aj netypické príznaky. Farebné obrázky celého radu príznakov sa nachádzajú na webovej stránke Komisie http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

3. PRÍPRAVA VZORIEK

3.1. Zemiakové hľuzy

Poznámka:

— Štandardná veľkosť vzorky je 200 hľúz na každý test. Intenzívnejší odber vzoriek znamená viac testov na vzorkách tejto veľkosti. Väčšie počty hľúz vo vzorke povedú k inhibícii alebo zložitej interpretácii výsledkov. Postup sa však môže bez ťažkostí uplatniť aj na vzorky s menej ako 200 hľuzami, keď je k dispozícii menej hľúz.

— Overenie všetkých metód na určovanie prítomnosti opísaných nižšie sa zakladá na testovaní vzoriek 200 hľúz.

— Extrakt zemiaka, ktorý sa opisuje nižšie, sa môže použiť aj na určovanie prítomnosti baktériovej hnedej hniloby zemiaka, Ralstonia solanacearum.

Nepovinné predbežné spracovanie, ktoré predchádza príprave vzorky:

Hľuzy očistite. Použite vhodný dezinfekčný prostriedok (zlúčeniny chlóru, ak sa má použiť test PCR s cieľom odstrániť prípadný patogén DNA) a čistiaci prostriedok medzi každou vzorkou. Hľuzy nechajte na vzduchu vyschnúť. Tento čistiaci postup je užitočný (nie je však povinný) predovšetkým pre vzorky s nadbytočným obsahom pôdy a tiež keď sa má vykonať test PCR alebo priama izolácia.

3.1.1. Čistým a dezinfikovaným skalpelom alebo nožom na zeleninu odstráňte šupku hľuzy na jej pupkovom konci, aby bolo vidieť cievne pletivo. Z cievneho pletiva na pupkovom konci každej hľuzy opatrne vyrežte malý kúsok, dbajte pritom na to, aby sa vyrezalo čo najmenej necievneho pletiva (pozri webovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Poznámka:

Akékoľvek hľuzy s podozrivými príznakmi baktériovej krúžkovistosti odložte nabok a testuje oddelene.

Ak sa počas odoberania na pupkovom konci hľuzy objavia podozrivé príznaky baktériovej krúžkovitosti, mala by sa vykonať vizuálna prehliadka tejto hľuzy po narezaní pri pupkovitom konci. Všetky odrezané hľuzy s podozrivými príznakmi by sa mali suberizovať (zahojenie reznej rany) najmenej dva dni pri izbovej teplote, a potom uskladniť v chlade v karanténnych podmienkach (pri teplote 4 – 10 °C), pokiaľ sa neskončia všetky testy. Všetky hľuzy vo vzorke (vrátane hľúz s podozrivými príznakmi) by sa mali uchovávať v súlade s prílohou II.

3.1.2. Výrezky pupkových koncov hľúz umiestnite do nepoužitých jednorazových nádob, ktoré sa dajú uzatvoriť a/alebo utesniť (v prípade opätovného použitia sa nádoby musia dôkladne vyčistiť a dezinfikovať pomocou chlórových zlúčenín). Výrezky pupkových koncov hľúz by sa mali spracovať pokiaľ možno čo najskôr. Ak to nie je možné, skladujte ich v nádobe bez pridania pufra, ochladené nie dlhšie ako 72 hodín, alebo pri izbovej teplote nie dlhšie ako 24 hodín. Sušenie a suberizácia (zahojenie reznej rany) výrezkov, ako aj rast saprofytov počas skladovania môžu byť prekážkou pri určovaní prítomnosti baktérie, ktorá spôsobuje krúžkovitosť zemiaka.

3.1.3. Výrezky pupkových koncov hľúz spracujte jedným z nasledujúcich postupov, a to buď:

a) pokryte výrezky dostatočným množstvom (približne 40 ml) extrakčného pufra (dodatok 3) a vložte do rotačnej trepačky (50 – 100 otáčok za minútu) na 4 hodiny pri teplote nižšej ako 24 °C, alebo ochladené na 16–24 hodín, alebo

b) výrezky zhomogenizujte s dosatočným množstvom (približne 40 ml) extračného pufra (dodatok 3) buď v mixéri (napr. Waring alebo Ultra Thurax), alebo drvením v utesnenom jednorazovom maceračnom vrecúšku (napr. Stomacher alebo Bioreba strong guage polythene, 150 mm × 250 mm; sterilizované ožiarením) s použitím gumeného kladivka alebo vhodného drviaceho zariadenia (napr. Homex).

Poznámka:

Riziko krížovej kontaminácie vzoriek je vysoké, keď sa vzorky homogenizujú pomocou mixéra. Prijmite opatrenia, aby sa predišlo vytváraniu aerosolu alebo preliatiu počas extrakčného procesu. Zabezpečte, aby sa pre každú vzorku použili čerstvo sterilizované čepele mixéra a nádoby. Ak sa má použiť test PCR, zabráňte akémukoľvek prenosu DNA na nádobách alebo drviacom zariadení. Ak sa má použiť PCR, odporúča sa drvenie v jednorazových vrecúškach a použitie jednorazových skúmaviek.

3.1.4. Dekantujte supernatant. Ak je nadmerne kalný, prečistite ho buď nízkou rýchlosťou odstreďovania (pri odstredivej sile nie väčšej ako 180 g počas 10 minút pri teplote medzi 4–10 °C), alebo vákuovou filtráciou (40–100 µm), filter premyte dodatočným (10 ml) extrakčným pufrom (dodatok 3).

3.1.5. Skoncentrujte bakteriálnu frakciu odstreďovaním pri odstredivej sile 7 000 g počas 15 minút (alebo 10 000 g počas 10 minút) pri teplote medzi 4–10 °C a supernatant vylejte tak, aby ste neporušili vzniknutý pelet.

3.1.6. Pelet resuspendujte v 1,5 ml peletového pufru (dodatok 3). Použite 500 µl a test pre C. m. subsp. sepedonicus, 500 µl pre Ralstonia solanacearum a 500 µl na referenčné účely. Pridajte sterilný glycerín do konečnej koncentrácie 10–25 % (objem/objem) k 500 µl referenčného alikvotného podielu a k zostávajúcemu testovanej alikvotnému podielu, pretrepte a skladujte pri teplote –16 až –24 °C (niekoľko týždňov), alebo pri teplote –68 až –86 °C (niekoľko mesiacov). Počas testovania uchovávajte testované alikvotné podiely pri teplote 4–10 °C.

Opakované zmrazovanie a rozmrazovanie sa neodporúča.

Ak sa požaduje preprava extraktu, zabezpečte dodanie v chladiacom boxe v časovom rozpätí 24 až 48 hodín.

3.1.7. Je nevyhnutné, aby sa so všetkými pozitívnymi kontrolami a vzorkami C. m. subsp. sepedonicus zaobchádzalo oddelene, aby nedošlo ku kontaminácii. Platí to pre podložné sklíčka pre IF test a pre všetky testy.

3.2. Rastliny zemiaka

Poznámka:

Na určenie prítomnosti skrytých populácií C. m. subsp. sepedonicus sa odporúča testovať kompozitné vzorky. Postup sa môže bez ťažkostí uplatniť na kompozitné vzorky až do množstva 200 častí stonky. (Keď sa uskutočňujú prieskumy, mali by sa zakladať na štatisticky reprezentatívnej vzorke skúmanej rastlinnej populácie.)

3.2.1. Čistým dezinfikovaným nožom alebo záhradníckymi nožnicami odoberte 1–2 cm segment zo spodnej časti každej stonky, tesne nad úrovňou pôdy.

Segmenty stonky krátko dezinfikujte 70 % etanolom a okamžite ich usušte na hodvábnom papieri.

Segmenty stonky vložte do uzatvorenej sterilnej nádoby v súlade s nasledujúcimi postupmi odoberania vzoriek:

3.2.2. Segmenty stonky spracujte podľa jedného z nasledujúcich postupov, a to buď:

a) segmenty pokryte dostatočným množstvom (približne 40 ml) extrakčného pufra (dodatok 3) a vložte do rotačnej trepačky (50 – 100 otáčok za minútu) na 4 hodiny pri teplote nižšej ako 24 °C, alebo ochladené na 16 – 24 hodín, alebo

b) segmenty okamžite spracujte drvením v pevnom maceračnom vrecúšku (napr. Stomacher alebo Bioreba) s náležitým množstvom extrakčného pufra (dodatok 3) s použitím gumeného kladivka alebo vhodného drviaceho zariadenia (napr. Homex). Ak to nie je možné, uchovajte segmenty stoniek ochladené nie dlhšie ako 72 hodín alebo pri izbovej teplote nie dlhšie ako 24 hodín.

3.2.3. Dekantujte supernatant po usadzovaní počas 15 minút.

3.2.4. Ďalšie čistenie extraktu alebo koncentrácie bakteriálnej frakcie sa spravidla nevyžaduje, no dá sa dosiahnuť filtráciou a/alebo odstreďovaním, ako sa opisuje v oddiele 3.1.4 – 3.1.6.

3.2.5. Rozdeľte neriedený alebo koncentrovaný extrakt zo vzorky na dve rovnaké časti. Jednu časť uchovajte počas testovania pri teplote 4 – 10 °C a druhú časť uskladnite pomocou 10 – 25 % (objem/objem) sterilného glycerínu pri teplote –16 až –24 °C (niekoľko týždňov) alebo pri teplote –68 až –86 °C (niekoľko mesiacov) v prípade, že sa vyžaduje ďalšie testovanie.

4. IF TEST

Princíp

Použitie IF testu ako základného skríningového testu sa odporúča kvôli jeho preukázanej schopnosti dosiahnuť požadované prahy.

Keď sa IF test používa ako hlavný skríningový test a jeho výsledok je pozitívny, test PCR alebo test FISH sa musí vykonať ako doplnkový skríningový test. Keď sa IF test používa ako doplnkový skríningový test a jeho výsledok je pozitívny, vyžadujú sa ďalšie testy na doplnenie analýzy v súlade s vývojovým diagramom.

Poznámka:

Keď sa používa IF test ako hlavný skríningový test, vždy používajte polyklonálnu protilátku. V prípade pozitívneho výsledku IF testu s polyklonálnou protilátkou môžu ďalšie skríningy vzorky s monoklonálnou protilátkou poskytnúť viac špecifickosti, no môžu byť tiež menej citlivé.

Použite protilátky k referenčnému kmeňu C. m. subsp. sepedonicus. Odporúča sa, aby sa titer určil pre každú novú dávku protilátok. Titer sa definuje ako najvyšší roztok, pri ktorom nastane optimálna reakcia pri testovaní suspenzie obsahujúcej 105 až 106 buniek na ml homologického kmeňa C. m. subsp. sepedonicus a s použitím vhodného konjugátu fluorescenčného izotiokyanátu (FITC) podľa odporúčania výrobcu. Surové polyklonálne alebo monoklonálne protilátky by mali mať titer IF najmenej 1:2000. Počas testovania by sa protilátky mali používať v pracovnom riedení (riedeniach) blízkom alebo na úrovni titra. Používajte overené protilátky (pozri webovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Test by sa mal vykonať na čerstvo pripravených extraktoch vzoriek. V prípade potreby sa môže úspešne vykonať na extraktoch uskladnených v glyceríne pri teplote –68 až –86 °C. Glycerín sa dá zo vzorky odstrániť pridaním 1 ml peletového pufra (dodatok 4), opätovným odstreďovaním počas 15 minút pri odstredivej sile 7 000 g a resuspenzii v rovnakom objeme peletového pufra. Často to nie je nevyhnutné, najmä ak sa vzorky upevnia na podložných sklíčkach flambovaním (pozri 2.2).

Pripravte osobitné kontrolné pozitívne podložné sklíčka homologického kmeňa alebo akéhokoľvek iného referenčného kmeňa C. m. subsp. sepedonicus, v suspenzii zemiakového extraktu, ako sa uvádza v dodatku 2, a prípadne v pufri.

Prirodzene infikované pletivo (udržiavané v lyofilizovanej forme alebo zmrazené pri teplote –16 až –24 °C) by sa malo použiť, keď je to možné, ako podobná kontrola na rovnakom podložnom sklíčku.

Pokiaľ ide o negatívne kontroly, použite alikvotné podiely extraktu vzorky, ktoré mali pri predchádzajúcom testovaní negatívny výsledok.

Použite viacobjektové podložné sklíčka, podľa možnosti s desiatimi jamkami s minimálnym priemerom 6 mm.

Testujte kontrolný materiál rovnakým spôsobom ako vzorky.

4.1. Podložné sklíčka pripravte jedným z nasledujúcich postupov:

i) Pri peletoch s relatívne malým škrobovým sedimentom: Odmeraný štandardný objem (15 µl je postačujúci pre jamku s priemerom 6 mm – pri väčších jamkách je potrebné použiť zodpovedajúci väčší objem) 1/100 roztoku resuspendovaného zemiakového peletu do prvej jamky. Následne naneste pipetou podobný objem nezriedeného peletu (1/1) do zostávajúcich jamiek v rade. Ďalší rad sa môže použiť ako duplikát alebo pre druhú vzorku, ako je znázornené na obrázku 1.

ii) Pre iné pelety: Pripravte decimálne riedenia (1/10 a 1/100) resuspendovaného peletu v peletovom pufri. Odmeraný štandardný objem (15 µl je postačujúci pre jamku s priemerom 6 mm – pri väčších jamkách je potrebné použiť zodpovedajúci väčší objem) resuspendovaného peletu a z každého riedenia naneste pipetou na rad jamiek. Ďalší rad sa môže použiť ako duplikát alebo pre druhú vzorku, ako je znázornené na obrázku 2.

4.2. Kvapky nechajte vyschnúť pri teplote okolitého prostredia alebo zohriatím na teplotu 40 až 45 °C. Baktériové bunky fixujte na podložnom sklíčku buď zahriatím (15 minút pri 60 °C), flambovaním, 95 % etanolom alebo podľa špecifických pokynov od dodávateľov protilátok.

V prípade potreby sa môžu fixované sklíčka potom uskladniť zmrazené vo vysušenej schránke pokiaľ možno čo najkratší čas (maximálne tri mesiace) pred ďalším testovaním.

Postup pri IF

i) Pri príprave podložného sklíčka podľa 4.1 i): Pripravte sadu dvojnásobných riedení protilátky v pufri IF. V prvej jamke by mala byť 1/2 titra (T/2), v ostatných 1/4 titra (T/4), 1/2 titra (T/2), titer (T) a dvojnásobok titra (2T).

ii) Pri príprave podložného sklíčka podľa 4.1 ii): Pripravte pracovné riedenie protilátky v pufri IF. Pracovné riedenie ovplyvní špecifickosť.

Obrázok 1 Príprava podložného sklíčka postupom podľa 4.1 i) a 4.3 i)

Riedenia resuspendovaného peletu 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Riedenie resuspendovaného peletu (T = titer) T/2 T/4 T/2 T 2T  Dvojnásobné riedenia antiséra/protilátky Vzorka 1 1 2 3 4 5 Duplikát vzorky 1 alebo vzorka 2 6 7 8 9 10





Obrázok 2 Príprava podložného sklíčka podľa 4.1 ii) a 4.3 ii)

Pracovné riedenie antiséra/protilátky 1/1 1/10 1/100 prázdne prázdne  Decimálne riedenie resuspendovaného peletu Vzorka 1 1 2 3 4 5 Duplikát vzorky 1 alebo vzorka 2 6 7 8 9 10

4.3.1. Podložné sklíčka uložte na vlhký papier. Všetky testovacie jamky úplne pokryte riedeniami protilátky. Objem protilátky nanášaný na každú jamku musí prinajmenšom zodpovedať objemu naneseného extraktu.

Nasledujúci postup by sa mal vykonať v prípade, že dodávatelia protilátok neposkytli špecifické pokyny:

4.3.2. Podložné sklíčka na vlhkom papieri nechajte zakryté počas 30 minút pri teplote okolitého prostredia (18 – 25 °C).

4.3.3. Z každého podložného sklíčka opatrne straste kvapky a podložné sklíčka opatrne opláchnite pufrom IF. Preplachujte 5 minút v roztoku IF-pufer-Tween (dodatok 3) a potom 5 minút v pufri IF. Zabráňte vytváraniu aerosolu alebo prenosu kvapôčok, ktoré by mohli spôsobiť krížovú kontamináciu. Prebytočnú vlhkosť starostlivo odstráňte pijavým papierom.

4.3.4. Podložné sklíčka položte na vlhký papier. Testovacie jamky pokryte riedením konjugátu FITC použitým na stanovenie titra. Objem konjugátu nanášaný na jamky musí zodpovedať objemu aplikovanej protilátky.

4.3.5. Podložné sklíčka na vlhkom papieri nechajte zakryté počas 30 minút pri teplote okolitého prostredia (18 – 25 °C).

4.3.6. Kvapky konjugátu opatrne straste z podložného sklíčka. Opláchnite a prepláchnite rovnako ako v bode 4.3.3.

Prebytočnú vlhkosť starostlivo odstráňte.

4.3.7. Na každú jamku napipetujte 5 – 10 µl 0,1 M glycerínu pufrovaného fosfátom (dodatok 3) alebo komerčnú kryciu kvapalinu na udržanie signálu a priložte krycie sklíčko.

Hodnotenie testu IF:

4.4.1. Podložné sklíčka prezrite pod epifluorescenčným mikroskopom s filtrami vhodnými pre excitáciu FITC, pod olejovou alebo vodnou imerziou pri zväčšení 500 – 1 000. Každé políčko mikroskopicky prezrite v dvoch navzájom kolmých priemeroch a tiež po obvode. Pri vzorkách, v ktorých sa nenachádzajú žiadne bunky alebo len malý počet buniek, preskúmajte najmenej 40 mikroskopických polí.

Najprv prezrite podložné sklíčka s pozitívnou kontrolou. Bunky musia jasne fluoreskovať a byť úplne sfarbené pri určenom titri protilátky alebo pracovnom riedení. Test IF (oddiel 4) sa pri odlišnom sfarbení musí zopakovať.

4.4.2. V testovacích jamkách podložných sklíčok pozorujte jasne fosforeskujúce bunky s charakteristickou morfológiou C. m. subsp. sepedonicus (pozri webovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intenzita fluorescencie musí byť rovnaká alebo lepšia ako pozitívny kontrolný kmeň pri rovnakom riedení protilátky. Bunky s neúplným sfarbením alebo so slabou fluorescenciou neberte na zreteľ.

Ak existuje akékoľvek podozrenie z kontaminácie, test sa musí zopakovať. Tento prípad môže nastať, ak všetky podložné sklíčka v šarži vykazujú pozitívne bunky v dôsledku kontaminácie pufra, alebo ak sa pozitívne bunky nachádzajú (mimo jamiek podložných sklíčok) na krycej vrstve podložného sklíčka.

4.4.3. Existuje viacero problémov súvisiacich so špecifickosťou imunofluorescenčného testu. Nežiaduce populácie fluoreskujúcich buniek s atypickou morfológiou a saprofytických baktérií spôsobujúcich krížové reakcie s veľkosťou a morfológiou podobnou C. m. sepedonicus sa pravdepodobne vyskytnú v peletoch výrezkov pupkovitých koncov hľúz a segmentov stoniek.

4.4.4. Do úvahy zoberte iba fluoreskujúce bunky s typickou veľkosťou a morfológiou pri titri alebo pracovnom riedení protilátok, ako sa uvádza v bode 4.3.

4.4.5. Vyhodnotenie výsledkov testu IF:

i) Ak sa nájdu jasne fluoreskujúce bunky s charakteristickou morfológiou, odhadnite priemerný počet typických buniek na mikroskopické pole a vypočítajte počet typických buniek na ml resuspendovaného peletu (dodatok 4). Výsledok testu IF sa hodnotí ako pozitívny pri vzorkách s najmenej 5 × 103 typických buniek na ml resuspendovaného peletu. Vzorka sa považuje za potenciálne kontaminovanú a vyžaduje sa ďalšie testovanie.

ii) Výsledok testu IF sa hodnotí ako negatívny pri vzorkách s menej ako 5 × 103 buniek na ml resuspendovaného peletu a vzorka sa považuje za negatívnu. Ďalšie testovanie sa nevyžaduje.

5. TEST FISH

Princíp

Keď sa test FISH používa ako prvý skríningový test a má pozitívny výsledok, musí sa vykonať test IF ako druhý povinný skríningový test. Keď sa test FISH používa ako druhý skríningový test a má pozitívny výsledok, vyžaduje sa ďalšie testovanie podľa vývojového diagramu na dokončenie diagnostiky.

Poznámka:

Použite overené špecifické oligopróby C. m. subsp. sepedonicus (dodatok 7). Predbežné testovanie touto metódou by malo umožniť opakovateľné určenie prítomnosti najmenej 103–104 buniek C. m. subsp. sepedonicus na ml pridaných do extraktov vzoriek, ktoré boli predtým testované s negatívnym výsledkom.

Nasledujúci postup by sa mal podľa možnosti vykonať na čerstvo pripravenom extrakte vzorky, no dá sa úspešne vykonať na extrakte vzorky, ktorý bol uchovaný v glyceríne pri teplote –16 až –24 °C alebo –68 až –86 °C.

Pokiaľ ide o negatívne kontroly, použite alikvotné podiely extraktu vzorky, ktoré boli predtým testované s negatívnym výsledkom pre C. m. subsp. sepedonicus.

Pokiaľ ide o pozitívne kontroly, pripravte suspenzie s obsahom 105 až 106 buniek na ml C. m. subsp. sepedonicus (napr. kmeň NCPPB 4053 alebo PD 406) v 0,01 M fosfátového pufra (PB) z 3 – 5-dňovej kultúry (príprava: pozri dodatok 2). Osobitne pripravte kontrolné pozitívne podložné sklíčka homologického kmeňa alebo akéhokoľvek iného referenčného kmeňa C. m. subsp. sepedonicus v suspenzii zemiakového extraktu, ako sa uvádza v dodatku 2.

Použitie eubakteriálnej oligopróby s označením FITC umožňuje kontrolovať proces hybridizácie, pretože sfarbí všetky eubaktérie prítomné vo vzorke.

Testujte kontrolný materiál rovnakým spôsobom ako vzorku (vzorky).

5.1. Fixovanie zemiakového extraktu

Nasledujúci protokol sa zakladá na Wullings et al. (1998):

5.1.1. Pripravte fixačný roztok (pozri dodatok 7).

5.1.2. Pipetou naneste 100 µl z každého extraktu vzorky do Eppendorfovej skúmavky a odstreďujte pri odstredivej sile 7 000 g počas 8 minút.

5.1.3. Odoberte supernatant a rozpustite pelet v 500 µl fixatívu pripraveného < 24 hodín vopred. Pretrepte a inkubujte cez noc pri teplote 4 °C.

Je možné použiť ako fixatív aj 96 % etanol. V taktomto prípade rozpustite pelet opísaný v bode 5.1.2 v zmesi pozostávajúcej z 50 µl 0,01 M PB a 50 µl 96 % etanolu. Zmiešajte pretrepaním a inkubujte pri teplote 4 °C počas 30 až 60 minút.

5.1.4. Odstreďujte počas 8 minút pri odstredivej sile 7 000 g, odoberte supernatant a resuspendujte pelet v 75 µl 0,01M PB (pozri dodatok 3).

5.1.5. Naneste 16 µl fixačných suspenzií na čisté multitestové podložné sklíčko, ako znázorňuje obr. 3. Aplikujte 2 rôzne neriedené vzorky na každé sklíčko a použite 10 µl na vytvorenie riedenia 1:100 (v 0,01 M PB). Zvyšný roztok vzorky (49 µl) sa môže uskladniť pri teplote –20 °C po pridaní 1 objemovej jednotky 96 % etanolu. V prípade, že si skúška FISH vyžaduje opakovanie, odstráňte etanol odstredením a pridajte rovnaké množstvo 0,01 M PB (zmiešajte pretrepaním).

Obrázok 3 Usporiadanie podložného sklíčka pre test FISH

Vzorka 1 Prázdna Prázdna Prázdna Vzorka 2 jamka 1 jamka 2 jamka 3 jamka 4 jamka 5 Vzorka 1 Prázdna Prázdna Prázdna Vzorka 2 jamka 6 jamka 7 jamka 8 jamka 9 jamka 10 Krycie sklíčko 1 Krycie sklíčko 2

5.1.6. Nechajte podložné sklíčka usušiť na vzduchu (alebo v sušičke pri teplote 37 °C) a zafixujte ich flambovaním.

V tomto štádiu je možné postup prerušiť a s hybridizáciou pokračovať nasledujúci deň. Podložné skíčka by sa mali uložiť na suchom mieste, chránené pred prachom, pri izbovej teplote.

5.2. Predhybridizácia a hybridizácia

5.2.1. Pripravte lyzozýmový roztok s obsahom 10 mg lyzozýmu (Sigma L-6876) v 10 ml pufri (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0). Tento roztok je možné uskladniť, no smie sa zmraziť a rozmraziť len raz. Každú vzorku pokryte približne 50 µl lyzozýmového roztoku a inkubujte počas 10 minút pri izbovej teplote. Potom namočte podložné sklíčka jeden raz do demineralizovanej vody a vysušte pomocou filtračného papiera.

Iná možnosť: v každej jamke pridajte namiesto lyzozýmu do pufra 50 µl proteinázy K 40 – 400µg ml–1 (20 mM Tris-HCl, 2mM CaCl2, pH 7,4) a inkubujte pri teplote 37 °C počas 30 minút.

5.2.2. Dehydratujte bunky postupným ponáraním do etanolu 50 %, 80 % a 96 %, do každého na 1 minútu. Podložné sklíčka usušte na vzduchu v stojane.

5.2.3. Pripravte vlhkú inkubačnú komoru tak, že vysteliete dno hermetickej škatule absorpčným papierom alebo filtračným papierom nasiaknutým hybmixom 1x (dodatok 7). Predinkubujte škatuľu v hybridizačnej peci pri teplote 55 °C počas najmenej 10 minút.

5.2.4. Pripravte hybridizačný roztok (dodatok 7) v množstve 45 µl na každé podložné sklíčko a predinkubujte počas 5 minút pri teplote 55 °C.

5.2.5. Podložné sklíčka umiestnite na platňu zohriatu na teplotu 45 °C a naneste 10 µl hybridizačného roztoku na každú zo 4 jamiek na podložnom sklíčku (sklíčkach).

5.2.6. Každé podložné sklíčko zakryte 2 krycími sklíčkami (24 × 24 mm) tak, aby v nich nezostal vzduch. Tieto podložné sklíčka umiestnite do predhriatej vlhkej komory a hybridizujte cez noc v peci pri teplote 55 °C v tme.

5.2.7. Pripravte 3 kadičky s obsahom 1 l ultra čistej vody (UPW), 1 l 1x hybmixu (334 ml 3x hybmixu a 666 ml UPW) a 1 l 1/2x hybmixu (167 ml 3x hybmixu a 833 ml UPW). Predinkubujte každú z nich vo vodnom kúpeli pri teplote 55 °C.

5.2.8. Odstráňte krycie sklíčka z podložných sklíčok a podložné sklíčka uložte na stojan.

5.2.9. Odstráňte zvyšok sondy inkubovaním počas 15 minút v kadičke s 1x hybmix pri teplote 55 °C.

5.2.10. Presuňte držiak podložného sklíčka do umývacieho roztoku 1/2 hybmix a inkubujte počas ďalších 15 minút.

5.2.11. Podložné sklíčka krátko ponorte do UPW a položte ich na filtračný papier. Odstráňte prebytočnú vlhkosť tak, že povrch opatrne pokryjete filtračným papierom. Napipetujte 5 – 10 μl roztoku krycej kvapaliny na udržanie signálu (napr. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA alebo jej ekvivalent) na každú jamku a položte veľké krycie sklíčko (24 × 60 mm) cez celé podložné sklíčko.

5.3. Hodnotenie testu FISH

5.3.1. Podložné sklíčka okamžite preskúmajte mikroskopom prispôsobeným na epifluorescenčnú mikroskopiu pri zväčšení 630 alebo 1 000x pod olejovou imerziou. S filtrom vhodným na fluorescenčný izotiokyanát (FITC) sa eubakteriálne bunky (vrátane väčšiny gram negatívnych buniek) vo vzorke sa sfarbia na fluorescenčnú zelenú. S použitím filtra pre tetrametylrodamín-5-izotiokyanát, Cy3-sfarbené bunky C. m. subsp. sepedonicus sa ukážu ako fluorescenčné červené. Porovnajte morfológiu buniek s morfológiou pozitívnych kontrol. Bunky musia byť jasne fluoreskujúce a úplne sfarbené. Test FISH (oddiel 9.4) sa musí zopakovať, ak je sfarbenie odlišné. Každé pole mikroskopicky prehliadnite vo dvoch navzájom kolmých priemeroch a taktiež po obvode. V prípade vzoriek, ktoré neukazujú žiadny alebo ukazujú len malý počet buniek, preskúmajte najmenej 40 mikroskopických polí.

5.3.2. V testovacích jamkách podložných sklíčok pozorujte jasne fluoreskujúce bunky s charakteristickou morfológiou C. m. subsp. sepedonicus (pozri webovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intenzita fluorescencie musí byť rovnaká alebo lepšia ako intenzita fluorescencie pozitívneho kontrolného kmeňa. Bunky s neúplným sfarbením alebo so slabou fluorescenciou neberte na zreteľ.

5.3.3. Ak existuje podozrenie na akúkoľvek kontamináciu, test sa musí zopakovať. Tento prípad môže nastať, keď všetky podložné sklíčka v dávke ukazujú pozitívne bunky kvôli kontaminácii pufra alebo keď sa zistia pozitívne bunky (mimo jamiek podložných sklíčok) na krycej vrstve podložného sklíčka.

5.3.4. Existuje viacero problémov súvisiacich so špecifickosťou testu FISH. Môžu sa objaviť nežiaduce populácie fluoreskujúcich buniek s atypickou morfológiou a saprofytické baktérie spôsobujúce krížové reakcie s veľkosťou a morfológiou podobnou C. m. subsp. sepedonicus, je to však menej časté ako v IF teste, v peletoch pupkovitých koncov hľúz a segmentov stoniek.

5.3.5. Do úvahy sa berú len fluoreskujúce bunky s typickou veľkosťou a morfológiou, pozri 5.3.2.

5.3.6. Vyhodnotenie výsledkov testu FISH:

i) Platné výsledky testu FISH sa dosiahnu, ak sa nájdu jasnozeleno fluoreskujúce bunky s veľkosťou a morfológiou typickou pre C. m. subsp. sepedonicus s použitím filtra FITC a jasnočerveno fluoreskujúce bunky s použitím rodaminového filtra vo všetkých pozitívnych kontrolách, avšak v žiadnej negatívnej kontrole. Ak sa zistia jasno fluoreskujúce bunky s charakteristickou morfológiou, odhadnite priemerný počet typických buniek na každé mikroskopické pole a vypočítajte počet typických buniek na ml resuspendovaného peletu (dodatok 4). Vzorky s najmenej 5 × 103 typických buniek na ml resuspendovaného peletu sa považujú za potenciálne kontaminované. Vyžaduje sa ďalšie testovanie. Vzorky s menej ako 5 × 103 typických buniek na ml resuspendovaného peletu sa považujú za negatívne.

ii) Test FISH je negatívny, ak sa jasnočerveno fluoreskujúce bunky s veľkosťou a morfológiou typickou pre C. m. subsp. sepedonicus nenájdu s použitím rodaminového filtra za predpokladu, že typické jasnočerveno fluoreskujúce bunky sa nájdu v preparátoch pozitívnych kontrol s použitím rodaminového filtra.

6. TEST PCR

Princípy

Keď sa test PCR používa ako základný skríningový test a má pozitívny výsledok, test IF sa musí vykonať ako druhý povinný skríningový test. Keď sa test PCR používa ako druhý skríningový test a má pozitívny výsledok, vyžaduje sa ďalšie testovanie podľa vývojového diagramu na dokončenie diagnostiky.

Plné využitie tejto metódy ako základného skríningového testu sa odporúča len vtedy, ak sa získala špecializovaná expertíza.

Poznámka:

Predbežné testovanie touto metódou by malo umožniť opakovateľné určenie prítomnosti 103 až 104 buniek C. m. subsp. sepedonicus na ml pridaných do extraktov vzoriek, ktoré sa predtým testovali s negatívnym výsledkom. Optimalizačné experimenty sa môžu vyžadovať na dosiahnutie maximálnych úrovní citlivosti a špecifickosti vo všetkých laboratóriách.

Používajte validované činidlá a protokoly PCR. Podľa možnosti vyberte metódu s internou kontrolou.

Prijmite potrebné opatrenia s cieľom zabrániť kontaminácii vzorky cieľovou DNA. Test PCR by mali vykonať skúsení odborníci v špecializovaných laboratóriách molekulárnej biológie s cieľom minimalizovať možnosť kontaminácie cieľovou DNA.

S negatívnymi kontrolami (na extrakciu DNA a procedúry PCR) by sa vždy malo zaobchádzať ako s konečnými vzorkami v procedúre, aby bolo zrejmé, či došlo k nejakému prenosu DNA.

Do testu PCR by sa mali zaradiť tieto negatívne kontroly:

— extrakt vzorky, ktorý sa predtým testoval s negatívnym výsledkom pre C. m. subsp. sepedonicus,

— kontroly pufra používané na extrakciu baktérie a DNA zo vzorky,

— reakčná zmes určená na PCR.

Mali by sa zaradiť aj tieto pozitívne kontroly:

— alikvotné podiely resuspendovaných peletov, ku ktorým sa pridal C. m. subsp. sepedonicus (pre prípravu pozri dodatok 2),

— suspenzia 106 buniek na ml C. m. subsp. sepedonicus vo vode z virulentného izolátu (napr. NCPPB 2140 alebo NCPPB 4053),

— ak je to možné, použite aj DNA získanej zo vzoriek pozitívnych kontrol pri vykonávaní testu PCR.

S cieľom predísť potenciálnej kontaminácii pripravte pozitívne kontroly v prostredí oddelenom od prostredia, v ktorom sú vzorky na testovanie.

Extrakty vzoriek by mali byť čo možno najviac zbavené pôdy. V niektorých prípadoch by sa mohlo odporúčať pripraviť extrakcie z umytých zemiakov, ak sa majú použiť protokoly PCR.

6.1. Metódy čistenia DNA

Použite vzorky pozitívnych a negatívnych kontrol podľa opisu v predchádzajúcom texte.

Pripravte kontrolný materiál rovnakým spôsobom ako vzorky.

Na čistenie cieľovej DNA je k dispozícii celá škála metód v prípade komplexných substrátov vzoriek s cieľom odstrániť inhibítory PCR a ďalšie enzymatické reakcie a koncentrovať cieľovú DNA v extrakte vzorky.

Nasledujúca metóda sa optimalizovala na použitie s validovanou metódou PCR, ktorá sa opisuje v dodatku 6.

6.1.a) Metóda podľa Pastrika (2000)

1. Napipetujte 220 µl lyzovacieho pufra (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) do 1,5 ml Eppendorfovej skúmavky.

2. Pridajte 100 µl extraktu vzorky a vložte do ohrievacieho bloku alebo vodného kúpeľa s teplotou 95 °C na 10 minút.

3. Skúmavku položte na ľad na 5 minút.

4. Pridajte 80 µl koncentrovaného roztoku lyzozýmu (50 mg lyzozýmu na ml v 10 mM Tris HCl, pH 8,0) a inkubujte pri teplote 37 °C počas 30 minút.

5. Pridajte 220 µl Easy DNA® roztoku A (Invitrogen), dobre premiešajte pretrepaním a inkubujte pri teplote 65 °C počas 30 minút.

6. Pridajte 100 µl Easy DNA® roztoku B (Invitrogen), riadne pretrepte tak, aby zrazenina v skúmavke voľne obiehala a vzorka bola rovnomerne viskózna.

7. Pridajte 500 µl chloroformu a pretrepte tak, aby sa viskozita znížila a zmes bola homogénna.

8. Odstreďujte s odstredivou silou 15 000 g počas 20 minút pri teplote 4 °C, aby sa oddelili fázy a vytvorilo sa rozhranie.

9. Premiestnite hornú fázu do novej Eppendorfovej skúmavky.

10. Pridajte 1 ml 100 % etanolu (–20 °C), krátko pretrepte a inkubujte na ľade počas 10 minút.

11. Odstreďujte s odstredivou silou 15 000 g počas 20 minút pri teplote 4 °C a odstráňte etanol z peletu.

12. Pridajte 500 µl 80 % etanolu (–20 °C) a premiešajte obrátením skúmavky.

13. Odstreďujte s odstredivou silou 15 000 g počas 10 minút pri teplote 4 °C, uchovajte pelet a odstráňte etanol.

14. Nechajte pelet usušiť na vzduchu alebo v DNA speed vac.

15. Resuspendujte pelet v 100 µl sterilnej UPW a nechajte pri izbovej teplote počas najmenej 20 minút.

16. Uchovajte pri teplote –20 °C, až kým sa nebude požadovať pre PCR.

17. Odstreďte ku dnu akúkoľvek bielu zrazeninu a použite 5 µl supernatantu obsahujúceho DNA pre PCR.

6.1.b) Iné metódy

Uplatniť sa môžu aj iné metódy extrakcie DNA (napr. Qiagen DNeasy Plant Kit) pod podmienkou, že sa preukázala ich rovnaká účinnosť v čistení DNA od kontrolných vzoriek obsahujúcich 103 až 104 patogénnych buniek na ml.

6.2. PCR

6.2.1. Pripravte testové a kontrolné matrice pre PCR v súlade s validovaným protokolom (dodatok 6). Pripravte jedno decimálne riedenie z extraktu vzorky DNA (1:10 v UPW).

6.2.2. Pripravte vhodnú reakčnú zmes PCR v prostredí zbavenom akejkoľvek kontaminácie v súlade s uverejneným protokolom (dodatok 6). Validovaný protokol PCR je viacnásobnou reakciou a patrí tam aj interná PCR kontrola.

6.2.3. Pridajte 5 µl extraktu DNA na 25 µl PCR reakcie v sterilných PCR skúmavkách.

6.2.4. Vytvorte vzorku negatívnej kontroly, ktorá obsahuje iba reakčnú zmes PCR, a pridajte namiesto vzorky ultračistú vodu UPW z rovnakého zdroja, ako sa použil v zmesi PCR.

6.2.5. Skúmavky vložte do toho istého termocykléra, ktorý sa použil v predbežnom testovaní, a spustite náležitý optimalizovaný program PCR (dodatok 6).

6.3. Analýza produktu PCR

6.3.1. Dekódujte amplikóny PCR agarózovou gélovou elektroforézou. Uveďte pod napätie s hodnotou 5 až 8 V/cm najmenej 12 µl amplifikovanej DNA reakčnej zmesi z každej vzorky zmiešanej s 3 µl nanášacieho pufra (dodatok 6) na 2,0 % (hmotnosť/objem) agarózových géloch v tris-octanovom-EDTA (TAE) pufri (dodatok 6). Použite príslušný markér DNA, napr. 100 bp ladder.

6.3.2. Na odhalenie pásikov DNA použite sfarbenie etidiumbromidom (0,5 mg/l) počas 30 – 45 minút, pričom dodržiavajte náležité opatrenia na zaobchádzanie s týmto mutagénom.

6.3.3. Pozorujte sfarbený gél pod transilumináciou krátkymi ultrafialovými vlnami (napr. λ = 302 nm) v prípade amplifikovaných produktov PCR s očakávanou veľkosťou (dodatok 6) a zaznamenajte výsledky.

6.3.4. Vo všetkých nových nálezoch/prípadoch overte autentickosť amplikónu PCR vykonaním analýzou enzymatickej reštrikcie na zvyšnej vzorke amplifikovanej DNA inkubovaním pri optimálnej teplote a počas optimálnej doby s použitím vhodného enzýmu a pufra (pozri dodatok 6). Digerované fragmenty dekódujte agarózovou gélovou elektroforézou podľa postupu opísaného vyššie a pozorujte charakteristické usporiadanie fragmentov po enzymatickej reštrikcii pod ultrafialovou transilumináciou po sfarbení etidiumbromidom a porovnajte s nedigerovanou a digerovanou pozitívnou kontrolou

Vyhodnotenie výsledkov testu PCR:

Test PCR je negatívny, ak sa nezistí prítomnosť špecifického amplikónu PCR C. m. subsp. sepedonicus s očakávanou veľkosťou v danej vzorke, no zistí sa vo všetkých vzorkách pozitívnych kontrol (v prípade viacnásobného PCR so špecifickými primermi vnútornej kontroly pre rastlinu: druhý produkt PCR s očakávanou veľkosťou sa musí amplifikovať s danou vzorkou).

Test PCR je pozitívny, ak sa zistí prítomnosť špecifického amplikónu PCR C. m. subsp. sepedonicus s očakávanou veľkosťou a v prípade potreby s očakávaným usporiadaním po reštrikcii, pod podmienkou, že sa neamplifikuje zo žiadnej zo vzoriek negatívnych kontrol. Spoľahlivé potvrdenie pozitívneho výsledku je možné získať aj zopakovaním testu s druhým súborom primerov PCR (oddiel 9.3).

Poznámka:

Je možné mať podozrenie na inhibíciu PCR, ak sa očakávaný amplikón získa zo vzorky pozitívnej kontroly s obsahom C. m. subsp. sepedonicus vo vode, no negatívne výsledky sa získajú z pozitívnych kontrol s C. m. subsp. sepedonicus v zemiakovom extrakte. Vo viacnásobných protokoloch PCR s internými kontrolami PCR sa inhibícia reakcie ukazuje, keď sa nedosiahne žiadny z dvoch amplikónov.

Je možné mať podozrenie na kontamináciu, ak sa očakávaný amplikón získa z jednej alebo viac negatívnych kontrol.

7. BIOTEST

Poznámka:

Predbežné testovanie s touto metódou by malo umožniť reprodukovateľné zistenie 103 až 104 kolónotvorných jednotiek C. m. subsp. sepedonicus na ml pridaných do vzorkových extraktov, ktoré boli v predchádzajúcich testoch negatívne (prípravu pozri v dodatku 2).

Najvyššiu citlivosť zistenia môžete očakávať, keď použijete čerstvo pripravený vzorkový extrakt a podmienky pre optimálny rast. Metóda sa však môže úspešne použiť pri extraktoch, ktoré boli uskladnené pod glycerínom pri teplote od –68 do –86 °C.

Niektoré odrody baklažánu predstavujú výborné selektívne obohacovacie médium pre rast C. m. subsp. sepedonicus, dokonca aj pri neprítomnosti symptómov, a tiež umožňujú výborný potvrdzovací test.

Podmienky rastu by mali byť optimálne, aby sa znížilo riziko chybných negatívnych výsledkov testu.

Ohľadom podrobností o pestovaní rastlín na test pozri dodatok 8.

7.1. Rozdeľte celý zostávajúci testový alikvotný podiel resuspendovaného peletu z kapitoly 3.1.6 alebo 3.2.5 medzi rastliny baklažánu pomocou jednej z nižšie uvedených metód (7.3 alebo 7.4). Použite len rastliny v rastovej fáze 2 – 3 až do úplnej expanzie tretej skutočnej rastovej fázy. Aby sa zabezpečilo úplné využitie resuspendovaného peletu, ako aj účinné naočkovanie, postupy uvedené nižšie si budú vyžadovať 15 – 25 rastlín baklažánov na každú vzorku.

7.2. Rastliny baklažánu 1 až 2 dni pred očkovaním nepolievajte, aby ste znížili ich vnútorné napätie.

Naočkovanie pozdĺžneho rezu

7.3.1. Rastlinu baklažánu uchopte medzi dva prsty a napipetujte kvapku (asi 5 až 10 µl) rozptýleného peletu na stonku medzi klíčne listy a prvý list.

7.3.2. Skalpelom urobte do stonky priečny rez asi 1 cm dlhý, približne do hĺbky 2/3 hrúbky stonky, počnúc pri kvapke očkovacej látky.

7.3.3. Rez uzavrite sterilnou vazelínou z injekčnej striekačky.

7.4. Naočkovanie injekčnou striekačkou

Stopky rastlín baklažánu naočkujte presne nad klíčnymi listami pomocou injekčnej striekačky vybavenej hypodermickou ihlou (najmenej 23 G). Vzorku rozdeľte medzi rastliny baklažánu.

7.5. Ako pozitívne kontroly naočkujte 5 rastlín s alikvotným podielom 105 to 106 buniek na ml známej kultúry C. m. subsp. sepedonicus a v možnom prípade prirodzene infikovaným hľuzovým vláknom (pozri kapitolu 4) pomocou tej istej očkovacej metódy (7.3 alebo 7.4).

7.6. Ako negatívny kontrolu naočkujte 5 rastlín sterilným peletovým pufrom pomocou tej istej očkovacej metódy (7.3 alebo 7.4).

7.7. Rastliny inkubujte v karanténnych zariadeniach počas 4 týždňov pri teplote 18 – 24 °C. Rastliny inkubujte pri dostatočnom svetle a vysokej vlhkosti (70 – 80 %) a zalievajte ich tak, aby nedochádzlo k podmokaniu alebo vädnutiu v dôsledku nedostatku vody. Bunky C. m. sepedonicus odumierajú pri teplotách nad 30 °C a optimálna teplota predstavuje 21 °C. Aby ste sa vyhli kontaminácii, inkubujte rastliny s pozitívnou a negatívnou kontrolou na jasne oddelených častiach v skleníku alebo v miestnosti na pestovanie, alebo v prípade obmedzeného priestoru zabezpečte prísne oddelenie medzi jednotlivými postupmi. Ak musia byť rastliny na rôzne vzorky inkubované v tesnej blízkosti, oddeľte ich vhodnými clonami. Pri oplodňovaní, zalievaní, kontrole a iných manipuláciách musíte dávať veľký pozor, aby nedošlo ku vzájomnej kontaminácii. Je potrebné, aby sa skleníky a miestnosti na pestovanie udržiavali chránené pred škodiacim hmyzom, ktorý môže preniesť baktériu zo vzorky na vzorku.

7.8. Po týždni začnite pravidelne sledovať symptómy. Vypočítajte počet rastlín, na ktorých s prejavujú symptóny C. m. subsp. sepedonicus, ktoré spôsobujú vädnutie listov na rastlinách baklažánu, ktoré sa môže začať buď okrajovým, alebo medzižilovým ochabnutím. Zvädnuté pletivá sa najprv sfarbujú do tmavozelena alebo sa na nich vytvárajú škvrny, pred odumieraním často blednú. Medzižilové vädnutie má mazľavý vodou nasiaknutý vzhľad. Odumierajúce tkanivo má často svetložlté okraje. Rastliny nemusia byť nutne mŕtva; čím dlhšie je obdobie, keď sa začínajú objavovať symptómy, tým vyššia je možnosť prežitia. Rastliny môžu infekciu prekonať. Mladšie rastliny baklažánu sú aj voči menším populáciám C. m. subsp. sepedonicus oveľa citlivejšie ako staršie rastliny, preto treba použiť rastliny pred dosiahnutím rastovej fázy 3.

Vädnutie môže byť taktiež vyvolané aj populáciami iných baktérií či húb, ktoré sú v pletivách hľúz zemiaka prítomné. Patrí medzi ne Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora supsp. carotovora a Erwinia carotovora subsp. atroseptica, Phoma exigua var. foveata, ako aj populáciami saprofytických baktérií. Predovšetkým Erwinia chrysanthemi môže spôsobiť symptómy na listoch a vädnutie, ktoré je veľmi podobné symptómom Clavibacter michiganensis sepedonicus. Jediný rozdiel spočíva v sčernetí stopiek v prípade infekcií Erwinia chrysanthemi. Ďalšie vädnutie sa od vädnutia spôsobeného Clavibacter michiganensisssp subsp. sepedonicus dá odlíšiť, pretože dochádza k rýchlemu vädnutiu celých listov alebo celých rastlín. Rovnako sa môže pripraviť farbenie podľa Grama: týmto testom sa odlíši C. m., subsp. sepedonicus od Erwinia spp.

7.9. Hneď ako sa začnú prejavovať symptómy na rastlinách baklažánu, mala by sa zabezpečiť opätovná izolácia pomocou častí zvädnutého listového tkaniva alebo tkaniva stopky z rastlín (pozri 3.1.3 v súvislosti s maceráciou). Povrch listov a stopiek baklažánu dezinfikujte potretím 70 %-ným etanolom. Uskutočnite test IF alebo test PCR na miazge rastliny baklažánu a izolujte do vhodného (selektívneho) média (pozri oddiel 8). Rovnako sa môže pripraviť farbenie podľa Grama (dodatok 9). Identifikujte čisté kultúry predpokladaného C. m. subsp. sepedonicus a potvrďte patogenecitu (pozri oddiel 9 a 10).

7.10. Za určitých podmienok, najmä keď rastové podmienky nie sú optimálne, môže Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus v rastlinách baklažánu prežívať v podobe latentnej infekcie až 4 týždne po naočkovaní. Ak po 4 týždňoch nepozorujete žiadne symptómy, uskutočnite IF/PCR testy na zmiešanej vzorke z centimetrových častí stonky každej testovanej rastliny, ktoré odoberiete nad miestom očkovania. Ak je test pozitívny, mala by sa zabezpečiť opätovná izolácia na vhodnom (selektívnom) médiu podľa postupu v oddiele 8. Identifikujte čisté kultúry predpokladaného Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus a potvrďte patogenitu (pozri oddiel 9 a 10).

Vyhodnotenie výsledkov biotestu:

Platné výsledky biotestu získate, keď sa na rastlinách s pozitívnou kontrolou prejavujú typické symptómy, baktéria sa môže opätovne izolovať z týchto rastlín a neprejavujú sa žiadne symptómy pri negatívnych kontrolách.

Biotest je negatívny, ak testované rastliny nie sú infikované Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus a pod podmienkou, že Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus sa zistí pri pozitívnych kontrolách.

Biotest je pozitívny, ak sú testované rastliny nainfikované baktériou Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

8. IZOLÁCIA C. M. SUBSP. SEPEDONICUS

Poznámka:

Diagnóza je kompletná len vtedy, ak je Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus izolované, následne identifikované (pozri oddiel 9) a potvrdené testom patogenity (oddiel 10). Hoci je C. m. subsp. sepedonicus organizmom citlivým, možno ho izolovať z pletív vykazujúcich príznaky ochorenia.

Môžu ho však prerásť rýchlorastúce saprofytické baktérie, a preto sú priame izolácie z peletu pochádzajúceho z hľúz zemiaka alebo stopkového tkaniva (oddiel 3.1.6 alebo 3.2.5) zložité. Priama izolácia Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus sa môže uskutočniť pomocou selektívneho média a primeraného riedenia resuspendovaného peletu z výrezkov pupkových koncov alebo stopiek zemiakov.

Uskutočnia sa izolácie zo všetkých symptomatických zemiakových hľúz alebo častí stopiek a z rastlín baklažánu, pri ktorých sa neprejavili žiadne symptómy, ale test IF/PCR zo zmiešanej vzorky bol pozitívny (pozri oddiel 7.10). V prípade potreby možno maceráciu stoniek rastlín baklažánu vykonať podľa postupov uvedených v oddiele 3.1.3.

Ako pozitívne kontroly pripravte decimálne riedenia zo suspenzie s 106 cfu na ml Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (napr. NCPPB 4053 alebo PD 406). Aby sa vylúčila akákoľvek možnosť kontaminácie, pozitívne kontroly pripravte úplne oddelene od vzoriek určených na testovanie.

Pre každú novopripravenú dávku selektívneho média by sa mala jej vhodnosť na rast patogénu otestovať predtým, ako sa použije na testovanie bežných vzoriek.

Kontrolný materiál otestujeme úplne rovnakým spôsobom ako pri vzorke/vzorkách.

8.1. Selektívny platňový rozter

8.1.1. Zo 100 µl alikvotného podielu vzorky resuspendovaného rajčiakového peletu alebo miazgy baklažánu pripravte 10-násobné riedena v peletovom pufri (dodatok 3).

8.1.2. Izolácia z neriedeného peletu obyčajne nie je úspešná z dôvodu prieberčivých rastových zvyklostí Cms a konkurenčného pôsobenia saprofytov. Keďže baktéria je obyčajne prítomná v rozsiahlych populáciách v infikovaných tkanivách, saprofyty sa obyčajne môžu riedením odstrániť, zatiaľ čo patogén zostáva. Preto sa odporúča rozdeliť 100 µl z každej zo vzoriek, 1/100 až 1/10 000 riedení na médium MTNA alebo médium NCP-88 (dodatok 5) (pri použití Petriho misiek s priemerom 90 mm, pre misky s alternatívnou veľkosťou upravte množstvo), pomocou nanášačiek (hokejkového tvaru) a techniky platňového nanášania.

Poznámka:

Alternatívna stratégia spočíva v nanesení počiatočného alikvotného podielu 100 µl rajčiakového peletu na prvú platničku s agarom pomocou nanášačky a potom presunúť nanášačku do druhej platničky s agarom, vystriekať akýkoľvek zvyšok z nanášačky; nakoniec zopakovať tento postup pri tretej platničke, a tak zabezpečiť efekt riedenia na platničke pomocou nanášačky.

8.1.3. Platničky inkubujte na tmavom mieste pri teplote 21 – 23 °C.

8.1.4. Počiatočné preskúmanie platničiek vrátane s odkazom na kontrolné platničky a počítanie pravdepodobne tvoriacich sa kolónií Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus začnite po 3 dňoch a následne spočítajte pravdepodobne tvoriace sa kolónie po 5, 7, príp. 10 dňoch.

8.2. Čistenie podozrivých kolónií

Poznámka:

Preočkovávanie pravdepodobne tvoriacich sa kolónií C. m. subsp. sepedonicus by malo prebiehať na médiách YGM pri naočkovaní rastlín baklažánu a/alebo následnej identifikácii; malo by sa tak urobiť predtým, ako sa začne na platničkách prejavovať intenzívny rast, t. j. najlepšie po 3 – 5 dňoch.

8.2.1. Kolónie s pravdepodobným C. m. subsp. sepedonicus vstreknite na jedno z nasledujúcich médií (vzorce sú uvedené v dodatku 5):

živný dextrózový agar (len pre subkultúry),

kvasnicovo-glukózový peptónový agar,

kvasnicový agar s výluhom minerálnych solí.

Inkubujte počas až 10 dní pri teplote 21 – 24 °C.

Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus rastie pomaly, zvyčajne v priebehu 10 dní vytvára bodové, smotanovo sfarbené a kupolovité kolónie. Fotografie typických kolónií Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (pozri webovú stránku: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

8.2.2. Kultúru opätovným rozterom prečistíme.

Subkultúrou možno rýchlosť rastu zlepšiť. Typické kolónie sú smotanovo až slonovinovobiele sfarbené, výnimočne žlté, okrúhle, na povrchu hladké, kupolovito vyhnuté, majú hubovo-roztekavú konzistenciu s uceleným okrajom a zvyčajne majú priemer od 1 do 3 mm.

Jednoduché farbenie podľa Grama (dodatok 9) môže pomôcť pri výbere kolóní na ďalšie testovanie.

8.2.3 Určite predpokladané kultúry (pozri oddiel 9) a urobte test patogenity (pozri oddiel 10).

9. IDENTIFIKÁCIA

Pomocou najmenej dvoch z nasledujúcich testov založených na rozličných biologických princípoch identifikujte čisté kultúry izolátov predpokladaného Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

V potrebných prípadoch zahrňte pre každý uskutočňovaný test známe referenčné kmene.

9.1. Nutričné a enzymatické identifikačné testy

Určite nasledujúce fenotypické vlastnosti, ktoré sú všeobecne prítomné alebo neprítomné v Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, na základe metód podľa Lelliotta a Steada (1987), Klementa a kol. (1990), bez uvedenia autora (1987).

Všetky médiá by sa mali inkubovať pri 21 °C a po šiestich dňoch by sa mali preskúšať. Ak nebudú rásť, inkubujeme ďalších 20 dní.

Všetky testy musia obsahovať známe kontroly s C. m. subsp. sepedonicus. V nutričných a fyziologických testoch by sa mali použiť očkovacie látky zo subkultúr vypestovaných na živných agaroch. Morfologické porovnávanie sa musí vykonávať s kultúrami vypestovanými na živných dextrózových agaroch.

Testy Očakávaný výsledok oxidačno-fermentačný test (O/F) Inertný alebo slabo oxidatívny aktivita oxidázy – rast pri 37 °C – aktivita ureázy – hydrolýza eskulínu + hydrolýza škrobu – alebo slabá tolerancia 7 % NaCl – tvorba indolu – katalázová aktivita + tvorba H2S – využitie citranov – skvapalňovanie želatíny – kyselina glycerolová – kyselina z laktózy – alebo slabá kyselina z ramnózy – kyselina z glycerínu – farbenie podľa Grama (dodatok 9) +

9.2. Imunofluorescenčný test (IF test)

a) Pripravte suspenziu približne z 106 buniek na ml v pufri IF(dodatok 3).

b) Pripravte sériu dvojnásobného riedenia príslušného antiséra.

c) Použite metódu IF (oddiel 4).

d) Pozitívny test IF dosiahnete, ak je IF titer kultúry ekvivalentný s titrom pozitívnej kontroly.

9.3. Polymerázová reťazová reakcia (test PCR)

a) Pripravte suspenziu približne 106 buniek na ml v pufri.

b) Zahrejte 100 µl bunkovej suspenzie v uzavretých skúmavkách v zahrievacom bloku alebo vo vriacom vodnom kúpeli pri teplote 100 °C na 4 minúty. Ak je to potrebné, pomôcť môže pridanie čerstvo pripraveného NaOH s konečnou koncentráciou 0,05 M na získanie bunkového lysátu. Vzorky môžete následne uložiť pri teplote –16 až –24 °C, až kým ich nebudete potrebovať.

c) Aplikujte vhodné postupy PCR na amplifikáciu C. m. subsp. sepedonicus specific amplicons (e. g. Pastrik, 2000; see Appendix 4; Li and de Boer, 1995; Mills et al., 1997; Pastrik and Rainey, 1999; Schaad et al., 1999).

d) Pozitívnu identifikáciu C. m. subsp. sepedonicus dosiahnete, ak majú PCR amplikóny rovnakú veľkosť a to isté skrátenie dĺžky polymorfného fragmentu ako pri pozitívnej kontrole kmeňa.

9.4. Fluorescenčná hybridizácia in situ (test FISH)

a) Pripravte suspenziu približne 106 buniek na ml v UPW.

b) Použite metódu FISH (oddiel 5).

c) Pozitívny test FISH dosiahnete, ak sa rovnaké reakcie dosiahnú pri kultúre aj pri pozitívnej kontrole.

9.5. Profilovanie mastných kyselín (FAP)

a) Kultúru pestujte na tryptikázovom sójovom agare (Oxoid) 72 hodín pri teplote 21 °C.

b) Uskutočnite príslušné postupy FAP (Janse, 1991; Stead, 1992).

c) Pozitívny test FAP dosiahnete, ak je profil predpokladanej kultúry totožný s profilom pozitívnej kontroly. Prítomnosť charakteristických mastných kyselín je 15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 a 17:0 Anteiso je vysoko indikačná pre C. m. sepedonicus. Ostatné rody ako Curtobacterium, Arthrobacter a Micrococcus tiež obsahujú niektoré z týchto kyselín, ale 15:1 Anteiso A je vzácna v týchto baktériách, ale vyskytuje sa vo všetkých Clavibacter spp. na úrovni medzi 1 – 5 %. V C. m. sepedonicus je hodnota obyčajne okolo 5 %.

9.6. BOX-PCR

a) Pripravte suspenziu približne 106 buniek na ml v UPW.

b) Aplikujte tento test podľa daného postupu (Smith et al., 2001)

10. POTVRDZOVACÍ TEST

Test patogenity sa musí vykonať ako konečné potvrdenie diagnózy C. m. subsp. sepedonicus a pre zhodnotenie virulencie kultúr identifikovaných ako C. m. subsp. sepedonicus.

10.1. Pripravte očkovaciu látku približne z 106 buniek na ml z 3-dňových kultúr z izolátu, ktorý sa má testovať, ako aj vhodnú pozitívnu kontrolu kmeňa C. m. subsp. sepedonicus.

10.2. Naočkujte 5 – 10 stoniek baklážanu mladých semenáčov na úrovni listov (oddiel 7.3 alebo 7.4).

10.3. Inkubujte pri teplote 18 – 24 °C pri dostatočnom svelte a relatívne vysokej vlhkosti s dostatočným zavlažovaním, aby sa predišlo strestu z podmokania alebo sucha (oddiel 7.7) U čistých kultúr by sa typické vädnutie malo získať do 2 týždňov, ale rastliny, ktoré nebudú po tomto období preukazovať symptómy (pozri 7.8), by sa mali inkubovať až do 3 týždňov pri teplotách prospievajúcich rastu baklažánov, ale nepresahujúcich teplotu 25 °C (dodatok 8). Ak sa po 3 dňoch príznaky tohto ochorenia neprejavia, kultúra sa nemôže potvrdiť za patogénnu formu C. m. subsp. sepedonicus.

10.4. Odstránením izolujte zo symptomických rastlín česť stopky asi 2 cm nad bodom očkovania. Pokračujte a rozptýľte v malom množstve sterilnej destilovanej vody alebo 50 mM fosfátového pufra (dodatok 3). Izolujte od suspenzie nanášaním alebo nanášaním v pruhoch riedenia na MTNA a YPGA (dodatok 5), inkubujte po dobu 3 – 5 dní pri teplote 21 – 23 °C a pozorujte tvorbu kolóníí typických pre C. m. subsp. sepedonicus.

Dodatok 1 Laboratóriá zapojené do optimalizácie a validácie protokolov Laboratórium (1) Miesto Krajina Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Viedeň a Linz Rakúsko Departement Gewasbescherming Merelbeke Belgicko Plantedirektoratet Lyngby Dánsko Central Science Laboratory York Anglicko Scottish Agricultural Science Agency Edinburgh Škótsko Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité de Bactériologie Angers Francúzsko Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre Le Rheu Francúzsko Biologische Bundesanstalt Kleinmachnow Nemecko Pflanzenschutzamt Hannover Hannover Nemecko State Laboratory Dublin Írsko Plantenziektenkundige Dienst Wageningen Holandsko Norwegian Crop Research Institute, Plant Protection Centre Aas Nórsko Direcção-Geral de Protecção das Culturas Lisabon Portugalsko Nacionalni institut za biologijo Ľubľana Slovinsko Centro de Diagnostico de Aldearrubia Salamanca Španielsko (1) Kontaktní vedeckí odborníci: pozri webovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

Dodatok 2 Príprava pozitívnych a negatívnych kontrol pre skríningové testy výrezkov v PCR/IF a FISH Vyrobte 72 hodinovú kultúru virulentného kmeňa C. m. subsp. sepedonicus (NCPPB 4053 alebo PD 406) na základnom médiu SMSA a suspendujte v 10 mM fosforečnanového pufra, aby ste dosiahli bunkovú hustotu približne 2 × 108 cfu na ml. Toto sa obyčajne dosiahne pomocou slabo zakalenej suspenzie, ktorá je ekvivalentná s optickou hustotou 0,20 pri 600 nm. Odstráňte kužeľovité výrezky pupkových koncov z 200 hľúz pochádzajúcich z produkcie odrody s bielou šupkou, o ktorej vieme, že neobsahuje C. m. subsp. sepedonicus. Pupkové konce upravte ako obyčajne a pelet resuspendujeme v 10 ml. Pripravte 10 sterilných 1,5 ml mikroskúmaviek s 900 µl resuspendovaného peletu. Umiestnite 100 µl suspenzie C. m. subsp. sepedonicus do prvej mikroskúmavky. Pretrepte. Stanovte desiatkové úrovne kontaminácie pomocou ďalšieho riedenia v ďalších piatich mikroskúmavkách. Šesť kontaminových mikroskúmaviek použite ako pozitívne kontroly. Štyry nekontaminové mikroskúmavky použite ako negatívne kontroly. Mikroskúmavky príslušne označte. Pripravte alikvotný podiel 100 µl v sterilných mikroskúmavkách s objemom 1,5 ml a získate tak 9 replík každej kontrolnej vzorky. Uskladnite pri teplote –16 až –24 °C až do použitia. Prítomnosť a kvantifikácia C. m. subsp. sepedonicus v kontrolných vzorkách by sa mala najskôr potvrdiť pomocou testu IF. Pre test PCR uskutočnite extrakciu DNA zo vzoriek pozitívnej a negatívnej kontroly pre každú sériu testovaných vzoriek. Pre testy IF a FISH uskutočnite skúšky na vzorkách pozitívnej a negatívnej kontroly pre každú sériu testovaných vzoriek. Pre skúšky IF, FISH a PCR sa C. m. subsp. sepedonicus musí identifikovať v najmenej 106 a 104 buniek/ml pozitívnych kontrol a nesmie byť v žiadnej negatívnej kontrole.

Dodatok 3 Pufre pre testovacie postupy VŠEOBECNÉ PRAVIDLO: Neotvorené sterilizované pufre sa môžu skladovať až jeden rok. 1. Pufre pre extrakčný postup 1.1. Extrakčný pufer (50 mM fosfátový pufer, pH 7,0) Tento pufer sa používa na extrakciu baktérie z rastlinného tkaniva pomocou homogenizácie alebo pretrepaním. Na2HPO4 (bezvodný) 4,26 g KH2PO4 2,72 g Destilovaná voda 1,00 L Rozpustite prísady, skontrolujte pH a sterilizujte v autokláve pri 121 °C počas 15 min. Dodatočné zložky môžu byť užitočné nasledujúcim spôsobom: Účel Množstvo (na L) vločky Lubrol antivločkovací prípravok (1) 0,5 g DC silicone antifoam (protipenový prípravok) protipenové činidlo (1) 1,0 ml tetrasodium pyrofosfát antioxidant 1,0 g polyvinylpyrrolidon-40 000 (PVP-40) viazanie inhibítorov PCR 50 g 1.2. Peletový pufer (10 mM fosfátový pufer, pH 7,2) Tento pufer sa používa pri resuspenzácii a riedení extraktov výrezkov pupkových koncov zemiakových hľúz podľa koncentrácie do peletu pomocou odstreďovania. Na2HPO4.12H2O 2,7 g NaH2PO4.2H2O 0,4 g destilovaná voda 1,00 L Rozpustite prísady, skontrolujte pH a sterilizujte v autokláve pri 121 °C počas 15 min. 2. Pufre pre test IF 2.1. Pufer IF [10 mM fosfátový pufer NaCl (PBS), pH 7,2] Tento pufer sa používa na riedenie protilátok. Na2HPO4.12H2O 2,7 g NaH2PO4.2H2O 0,4 g NaCl 8,0 g destilovaná voda 1,0 L Rozpustite prísady, skontrolujte pH a sterilizujte v autokláve pri 121 °C počas 15 min. 2.2. IF-pufer-tween Tento pufer sa používa na umývanie podložných sklíčok. Pridáme 0,1 % tween 20 do pufra IF. 2.3. Glycerín pufrovaný fosfátom, pH 7,6 Tento pufer sa používa ako krycia kvapalina v jamkách podložných sklíčok IF na podporu fluorescencie. Na2HPO4.12H2O 3,2 g NaH2PO4.2H2O 0,15 g glycerín 50 ml destilovaná voda 100 ml Roztoky krycej kvapaliny sú komerčne dostupné napr. vo Vectashield® (Vector Laboratories) alebo Citifluor® (Leica). (1) Na použitie pri homogenizačnej extrakčnej metóde.

Dodatok 4 Určovanie stupňa kontaminácie pri testoch IF a FISH 1. Vypočítajte priemerný počet typických fluoreskujúcich buniek na zorné pole (c) 2. Vypočítajte počet typických fluoreskujúcich buniek v jamke mikroskopického sklíčka (C) C = c × S/s kde S = povrchová plocha poľa viacjamkového podložného sklíčka s = povrchová plocha poľa objektívu:

s = πi2/4G2K2 kde I = koeficient poľa (v rozsahu 8 – 24 v závislosti od optického typu) K = tubusový koeficient (1 alebo 1,25) G = zväčšenie objektívu (100x, 40x atď.) 3. Vypočítajte počet typických fluoreskujúcich buniek na jeden ml resuspendovaného peletu (N). N = C × 1 000/y × F kde y = množstvo resuspendovaného peletu na každom poli a F = dilučný faktor resuspendovaného peletu.

Dodatok 5 Médiá na izoláciu a kultiváciu Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus a) Všeobecné médiá rastu živný agar (NA) živný agar (Difco) 23,0 g destilovaná voda 1,0 L Rozpustite prísady a sterilizujte v autokláve pri 121 °C počas 15 min. Živný dextrózový agar (NDA) Živný agar Difco bacto s obsahom 1 % monohydrátu D(+) glukózy. Sterilizujeme ho v autokláve pri 115 °C počas 20 minút. Kvasnicovo-peptónovo-glukózový agar (YPGA) kvasnicový extract (Difco) 5,0 g Peptón bacto (Difco) 5,0 g monohydrát D(+) glukózy 10,0 g Bacto-agar (Difco) 15,0 g destilovaná voda 1,0 L Rozpustite prísady a sterilizujte v autokláve pri 121 °C počas 15 min. Kvasnicový výluh s obsahom minerálnych solí (YGM) kvasnicový extract (Difco) 2,0 g monohydrát D(+) glukózy 2,5 g K2HPO4 0,25 g KH2PO4 0,25 g MgSO4.7H2O 0,1 g MnSO4.H2O 0,015 g NaCl 0,05 g FeSO4.7H2O 0,005 g Bacto-agar (Difco) 18 g Destilovaná voda 1,0 L V autokláve 20 minút sterilizujeme 0,5 l celkového objemu média pri 115 °C. b) Validované selektívne médiá rastu Médium MTNA Ak sa neuvádza inak, všetky zložky média pochádzajú z BDH kvasnicový extract (Difco) 2,0 g manitol 2,5 g K2HPO4 0,25 g KH2PO4 0,25 g NaCl 0,05 g MgSO4.7H2O 0,1 g MnSO4.H2O 0,015 g FeSO4.7H2O 0,005 g agar (oxoid č. 1) 16,0 g destilovaná voda 1,0 L Rozpustite prísady, ustáľte hodnotu pH na 7,2. Po sterilizovaní v autokláve (pri teplote 121 °C počas 15 minút) a ochlaďte na 50 °C, pridajte antibiotiká: trimetoprim 0,06 g, kyselinu nalidixínovú 0,002 g, amfotericín B 0,01 g. Zásobné antibiotické roztoky: trimetoprim (Sigma) a kyselina nalidixínová (Sigma) (obidva po 5 mg/ml), v 96 % metanole, amfotericín B (Sigma) (1 mg/ml) v dimethyl sulfoxide. Zásobné roztoky sa sterilizujú cez filter. Poznámka: Doba použiteľnosti základného média je 3 mesiace. Po pridaní antibiotík je doba trvania použiteľnosti 1 mesiac pri skladovaní v chlade. Médium NCP-88 živný agar (Difco) 23 g kvasnicový extract (Difco) 2 g D-manitol 5 g K2HPO4 2 g KH2PO4 0,5 g MgSO4.7H2O 0,25 g destilovaná voda 1,0 L Rozpustite prísady, ustáľte hodnotu pH na 7,2. Po sterilizovaní v autokláve a ochladení na 50 °C pridajte tieto antibiotiká: polymyxín B sulfát (Sigma) 0,003 g, kyselina nalidixínová (Sigma) 0,008 g, Cycloheximid (Sigma) 0,2 g. Antibiotiká rozpustite v zásobných roztokoch takto: kyselina nalidixínová v 0,01 M NaOH, cykloheximid v 50 % etanolu, polymyxín B sulfát v destilovanej vode. Zásobné roztoky sa sterilizujú cez filter. Poznámka: Doba použiteľnosti základného média je 3 mesiace. Po pridaní antibiotík je doba trvania použiteľnosti 1 mesiac pri skladovaní v chlade.

Dodatok 6 Validované PCR protokoly a činidlá Poznámka: Predbežné testovanie s touto metódou by malo umožniť reprodukovateľné zistenie minimálne 103 až 104 buniek Clavibacter michiganensis sepedonicus na ml vzorkového extraktu. Predbežné testovanie by rovnako nemalo ukázať žiadne nesprávne pozitívne výsledky pre panel vybraných bakteriálnych kmeňov. 1. Viacnásobný protokol PCR s internou kontrolou PCR (Pastrik a kol., 2000) 1.1. Oligonukleotídne primery progresívny primer PSA-1 5’- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3’ reverzný primer PSA-R 5’- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3’ progresívny primer NS-7-F 5’- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3’ reverzný primer NS-8-R 5’- tcc gca ggt tca cct acg ga -3’ Predpokladaná veľkosť amplikónu z matrice DNA Clavibacter michiganensis, subsp. sepedonicus = 502 bp (PSA-primer). Predpokladaná veľkosť amplikónu z 18S rRNA internej kontroly PCR = 377 bp (NS-primer). 1.2. Reakčná zmes PCR Činidlo Množstvo na reakciu Konečná koncentrácia sterilné UPW 15,725 µl 10x PCR pufer (1) (15 mM MgCl2) 2,5 µl 1x (1,5 mM MgCl2) BSA (frakcia V) (10 %) 0,25 µl 0,1 % d-nTP zmes (20 mM) 0,125 µl 0,1 mM Primer PSA-1 (10 µM) 0,5 µl 0,2 µM Primer PSA-R (10 µM) 0,5 µl 0,2 µM Primer NS-7-F (10 µM) (2) 0,1 µl 0,04 µM Primer NS-8-R (10 µM) (2) 0,1 µl 0,04 µM Taq polymeráza (5 U/µl) (1) 0,2 µl 1,0 U Objem vzorky 5,0 µl Celkový objem: 25,0 µl 1.3. Reakčné podmienky PCR Spustite nasledujúci program: 1 cyklus: i) 3 minúty pri teplote 95 °C (denaturácia matrice DNA) 10 cyklov: ii) 1 minúta pri teplote 95 °C (denaturácia matrice DNA) iii) 1 minúta pri teplote 64 °C (pripájanie primerov) iv) 1 minúta pri teplote 72 °C (predlžovanie kópie) 25 cyklov: v) 30 sekúnd pri teplote 95 °C (denaturácia matrice DNA) vi) 30 sekúnd pri teplote 62 °C (pripájanie primerov) vii) 1 minúta pri teplote 72 °C (predlžovanie kópie) 1 cyklus: viii) 5 minút pri teplote 72 °C (konečné predĺženie) ix) držte pri teplote 4 °C Poznámka: Tento program je optimalizovaný na použitie s teplotným cyklérom MJ Research PTC 200. Zmena v trvaní krokov cyklov ii), iii), iv), v), vi) a vii) sa môže vyžadovať pri použití iných modelov. 1.4. Analýza enzýmovej reštrikcie amplikónu. Produkty PCR amplifikované z DNA C.m. subsp. sepedonicus tvoria skrátenie dlĺžky polymorfného fragmentu s enzýmom Bgl II po inkubácii pri teplote 37 °C počas 30 minút. Obmedzené fragmenty získané z C.m. subsp. sepedonicus -špecifického fragmentu majú veľkosť 282 bp ad 220 bp. 2. Príprava nanášacieho pufra 2.1. Bromfenolová modrá (10 %-zásobný roztok) bromfenolová modrá 5 g destilovaná voda (bidest) 50 ml 2.2. Nanášací pufer glycerín (86 %) 3,5 ml bromfenolová modrá (5,1) 300 µl destilovaná voda (bidest) 6,2 ml 3. 10x Tris acetát EDTA (TAE) pufer, pH 8,0 Tris pufer 48,4 g Glaciálna kyselina octová 11,42 ml EDTA (disodná soľ) 3,72 g Destilovaná voda 1,00 L Zriedime na 1x pred použitím. Tiež komerčne dostupný (napr. invitrogén alebo ekvivalent). (1) Metódy boli validované pomocou Taq polymerázy od Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL. (2) Koncentrácie primerov NS-7-F a NS-8-R boli optimalizované pre extrakciu výrezkov pupkových koncov zemiakových hľúz pomocou metódy homogenizácie a čistenia DNA podľa Pastrika (2000) (pozri oddiel 6.1.a.). Reoptimalizácia koncentrácií činidiel sa bude vyžadovať, ak sa použije extrakcia potrepaním alebo iné metódy izolácie DNA.

Dodatok 7 Validované reagenty pre FISH test 1. Oligopróby Cms-špecifická próba CMS-CY3-01: 5’- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3’ Nešpecifická eubakteriálna próba EUB-338-FITC: 5’- gct gcc tcc cgt agg agt -3’ 2. Fixatívny roztok [UPOZORNENIE! FIXATÍVUM OBSAHUJE PARAFORMALDEHYD, KTORÝ MÁ TOXICKÉ ÚČINKY. NASAĎTE SI RUKAVICE A NEVDYCHUJTE. ODPORÚČAME PRACOVAŤ V DIGESTORE.] i) Zahrejte 9 ml vody molekulárneho gradienta (napr. ultra čistá voda (UČW) na teplotu asi 60 °C a pridáme 0,4 g paraformaldehydu. Paraformaldehyd sa rozpúšťa po pridaní 5 kvapiek 1N NaOH a miešaním s magnetickým miešadlom. ii) Upravte pH na 7,0 pridaním 1 ml 0,1,1M fosfátového puferu (PB; pH 7,0) a 5 kvapiek 1N HCl. Skontrolujte pH pomocou indikačných pásikov a podľa potreby upravte pomocou HCl alebo NaOH. [UPOZORNENIE! NEPOUŽÍVAJTE PH METER V ROZTOKOCH S PARAFORMALDEHYDOM.] iii) Roztok prefiltrujte cez 0,22 µm membránový filter, zamedzte prístupu prachu a uložte pri teplote 4 °C na ďalšie použitie. iv) Poznámka: Alternatívny fixačný roztok: 96 % etanol. 3. 3x Hybmix NaCl 2,7 M Tris-HCl 60 mM (pH 7,4) EDTA (sterilizované cez filter a v autokláve) 15 mM Zrieďte na 1x, ako sa vyžaduje. 4. Hybridizačný roztok 1x Hybmix Sódium dodecyl sulfát (SDS) 0,01 % probe EUB 338 5 ng/μl próba CMSCY301 5 ng/μl Pripravte množstvá hybridizačného roztoku na základe výpočtov v tabuľke 1. Pre každé podložné sklíčko (obsahujúce 2 rôzne vzorky dvojmo) treba 90 μl hybridizačného roztoku. Tabuľka: Navrhované množstvá na prípravu hybridizačnej zmesi. 2 podložné sklíčka 8 podložných sklíčok sterilná UPW 50,1 200,4 3x hybmix 30,0 120,0 1 % SDS 0,9 3,6 próba EUB 338 (100 ng/μl) 4,5 18,0 próba CMSCY301 (100 ng/μl) 4,5 18,0 Celkový objem (μl) 90,0 360,0 Pozn.: Všetky roztoky, ktoré obsahujú oligopróby citlivé na svetlo, skladujte na tmavom mieste pri teplote –20 °C. Počas používania ich chráňte pred priamym slnečným svetlom a elektrickým svetlom. 5. 0,1M fosforečnanový pufer, pH 7,0 Na2HPO4 8,52 g KH2PO4 5,44 g destilovaná voda 1,00 L Rozpustite prísady, skontrolujte pH a sterilizujte v autokláve pri 121 °C počas 15 min.

Dodatok 8 Kultivácia rastlín baklažánu Osivo baklažánu (Solanum melongena) vysejeme do pasterizovaného kompostu. Semenáče s plne vyvinutými klíčnymi listami (10 až 14 dní staré) presaďte do kvetináčov s pasterizovaným kompostom. Baklažány by sa mali pestovať v skleníkoch pri zachovaní nasledujúcich klimatických podmienok: Dĺžka dňa: 14 hodín alebo prirodzená dĺžka dňa, ak je väčšia; Teplota: deň: 21 až 24 °C noc: 15 °C

Vnímavé odrody baklažánu: „Black Beauty“ „Long Tom“ „Rima“ „Balsas“ Dodávateľ: pozri webovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main