SK Úradný vestník Európskej únie L 54/1

NARIADENIE KOMISIE (ES) č. 152/2009

z 27. januára 2009,

ktorým sa stanovujú metódy odberu vzoriek a analýzy na účely úradných kontrol krmív

(Text s významom pre EHP)

KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV,

so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spoločenstva,

so zreteľom na nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 882/2004 z 29. apríla 2004 o úradných kontrolách uskutočňovaných s cieľom zabezpečiť overenie dodržiavania potravinového a krmivového práva a predpisov o zdraví zvierat a o starostlivosti o zvieratá (1), a najmä na jeho článok 11 ods. 4 písm. a), b) a c),

keďže:

(1) Na implementáciu smernice 70/373/EHS boli prijaté tieto akty, ktoré zostávajú v platnosti v súlade s článkom 61 ods. 2 nariadenia (ES) č. 882/2004: — prvá smernica Komisie 71/250/EHS z 15. júna 1971, ktorou sa stanovujú analytické metódy Spoločenstva na úradnú kontrolu krmív (2), — druhá smernica Komisie 71/393/EHS z 18. novembra 1971, ustanovujúca metódy analýzy na úradnú kontrolu krmív v Spoločenstve (3), — tretia smernica Komisie 72/199/EHS z 27. apríla 1972 stanovujúca analytické metódy Spoločenstva na úradnú kontrolu krmív (4), — štvrtá smernica Komisie 73/46/EHS z 5. decembra 1972, ktorou sa ustanovujú analytické metódy Spoločenstva na úradnú kontrolu krmív (5), — prvá smernica Komisie 76/371/EHS z 1. marca 1976, ktorou sa určujú metódy Spoločenstva pre odber vzoriek na úradnú kontrolu krmív (6), — siedma smernica Komisie 76/372/EHS z 1. marca 1976, ktorá ustanovuje analytické metódy Spoločenstva na úradnú kontrolu krmív (7), — ôsma smernica Komisie 78/633/EHS z 15. júna 1978, ktorou sa stanovujú analytické metódy Spoločenstva pre potreby úradnej kontroly krmív (8), — deviata smernica Komisie 81/715/EHS z 31. júla 1981, ktorá ustanovuje metódy analýzy na úradnú kontrolu krmív v Spoločenstve (9), — desiata smernica Komisie 84/425/EHS z 25. júla 1984, ktorá stanovuje metódy analýzy pri úradnej kontrole krmív v Spoločenstve (10), — smernica Komisie 86/174/EHS z 9. apríla 1986, ktorá stanovuje metódu výpočtu energetickej hodnoty kŕmnej zmesi pre hydinu (11), — jedenásta Smernica Komisie 93/70/EHS z 28. júla 1993, ktorou sa určujú metódy analýzy Spoločenstva na úradnú kontrolu krmív (12), — dvanásta smernica Komisie 93/117/ES zo 17. decembra 1993, ktorou sa stanovujú analytické metódy Spoločenstva na úradnú kontrolu krmív (13), — smernica Komisie 98/64/ES z 3. septembra 1998, ktorou sa ustanovujú analytické metódy Spoločenstva na stanovenie aminokyselín, olejov a tukov a olaquindoxu v krmivách a ktorou sa mení a dopĺňa smernica 71/393/EHS (14), — smernica Komisie č. 1999/27/ES z 20. apríla 1999, ktorou sa zavádzajú analytické metódy Spoločenstva na stanovenie amprólia, diklazurilu a karbadoxu v krmivách a ktorá mení a dopĺňa smernice 71/250/EHS, 73/46/EHS a zrušuje smernica 74/203/EHS (15), — smernica Komisie 1999/76/ES z 23. júla 1999 stanovujúca analytickú metódu Spoločenstva pre stanovenie lasalocidu sodného v krmivách (16), — smernica Komisie 2000/45/ES zo 6. júla 2000, ktorou sa ustanovujú analytické metódy Spoločenstva na stanovenie vitamínu A, vitamínu E a tryptofánu v krmivách (17), — smernica Komisie 2002/70/ES z 26. júla 2002, ktorou sa zavádzajú požiadavky na určovanie koncentrácie dioxínov a PCB podobných dioxínom v krmivách (18), — smernica Komisie 2003/126/ES z 23. decembra 2003 o analytickej metóde na stanovenie zložiek živočíšneho pôvodu na úradnú kontrolu krmiva (19).

(2) Keďže smernica 70/373/EHS bola nahradená nariadením (ES) č. 882/2004, je vhodné nahradiť vykonávacie predpisy k tejto smernici jediným nariadením. Zároveň by sa metódy mali prispôsobiť vývoju vedeckých a technický poznatkov. Metódy, ktoré už nie sú platné pre svoj plánovaný účel, by sa mali vypustiť. Očakáva sa aktualizácia ustanovení o odbere vzoriek v plánovanom čase, pri ktorej sa zohľadní súčasný vývoj v spôsobe výroby, skladovania, prepravy a uvádzania krmiva na trh, napriek tomu je však vhodné dovtedy zachovať súčasné predpisy týkajúce sa odberu vzoriek.

(3) Smernice 71/250/EHS, 71/393/EHS, 72/199/EHS, 73/46/EHS, 76/371/EHS, 76/372/EHS, 78/633/EHS, 81/715/EHS, 84/425/EHS, 86/174/EHS, 93/70/EHS, 93/117/ES, 98/64/ES, 1999/27/ES, 1999/76/ES, 2000/45/ES, 2002/70/ES a 2003/126/ES by sa preto mali zrušiť.

(4) Opatrenia ustanovené v tomto nariadení sú v súlade so stanoviskom Stáleho výboru pre potravinový reťazec a zdravie zvierat,

PRIJALA TOTO NARIADENIE:

Článok 1

Odber vzoriek na účely úradných kontrol krmív, pokiaľ ide o stanovenie zložiek, doplnkových látok a nežiaducich látok s výnimkou rezíduí pesticídov a mikroorganizmov, sa vykonáva v súlade s metódami stanovenými v prílohe I.

Článok 2

Vzorky na analýzu sa pripravujú a výsledky sa vyjadrujú v súlade s metódami stanovenými v prílohe II.

Článok 3

Analýza na účely úradnej kontroly krmív sa vykonáva použitím metód stanovených v prílohe III (metódy analýzy na kontrolu zloženia kŕmnych surovín a kŕmnych zmesí), prílohe IV (metódy analýzy na účely kontroly obsahu povolených doplnkových látok), prílohe V (metódy analýzy na kontrolu nežiaducich látok v krmivách) a prílohe VI (metódy analýzy na určenie zložiek živočíšneho pôvodu na účely úradnej kontroly krmív).

Článok 4

Energetická hodnota kŕmnej zmesi pre hydinu sa vypočíta podľa prílohy VII.

Článok 5

Metódy analýzy na účely kontroly nelegálnej prítomnosti doplnkových látok, ktoré už nie sú povolené, stanovené v prílohe VIII, sa používajú na účely potvrdenia.

Článok 6

Smernice 71/250/EHS, 71/393/EHS, 72/199/EHS, 73/46/EHS, 76/371/EHS, 76/372/EHS, 78/633/EHS, 81/715/EHS, 84/425/EHS, 86/174/EHS, 93/70/EHS, 93/117/ES, 98/64/ES, 1999/27/ES, 1999/76/ES, 2000/45/ES, 2002/70/ES a 2003/126/ES sa zrušujú.

Odkazy na tieto zrušené smernice sa považujú za odkazy na toto nariadenie a vykladajú sa v súlade s tabuľkami zhody v prílohe IX.

Článok 7

Toto nariadenie nadobúda účinnosť dvadsiatym dňom po jeho uverejnení v Úradnom vestníku Európskej únie.

Uplatňuje sa od 26. augusta 2009.

Toto nariadenie je záväzné v celom rozsahu a priamo uplatniteľné vo všetkých členských štátoch. V Bruseli 27. januára 2009 Za Komisiu Androulla VASSILIOU členka Komisie

(1) Ú. v. EÚ L 165, 30.4.2004, s. 1.

(2) Ú. v. ES L 155, 12.7.1971, s. 13.

(3) Ú. v. ES L 279, 20.12.1971, s. 7.

(4) Ú. v. ES L 123, 29.5.1972, s. 6.

(5) Ú. v. ES L 83, 30.3.1973, s. 21.

(6) Ú. v. ES L 102, 15.4.1976, s. 1.

(7) Ú. v. ES L 102, 15.4.1976, s. 8.

(8) Ú. v. ES L 206, 29.7.1978, s. 43.

(9) Ú. v. ES L 257, 10.9.1981, s. 38.

(10) Ú. v. ES L 238, 6.9.1984, s. 34.

(11) Ú. v. ES L 130, 16.5.1986, s. 53.

(12) Ú. v. ES L 234, 17.9.1993, s. 17.

(13) Ú. v. ES L 329, 30.12.1993, s. 54.

(14) Ú. v. ES L 257, 19.9.1998, s. 14.

(15) Ú. v. ES L 118, 6.5.1999, s. 36.

(16) Ú. v. ES L 207, 6.8.1999, s. 13.

(17) Ú. v. ES L 174, 13.7.2000, s. 32.

(18) Ú. v. ES L 209, 6.8.2002, s. 15.

(19) Ú. v. EÚ L 339, 24.12.2003, s. 78.

PRÍLOHA I METÓDY ODBERU VZORIEK 1. ÚČEL A ROZSAH Vzorky určené na úradnú kontrolu krmív sa odoberajú v súlade s metódami opísanými nižšie. Takto získané vzorky sa považujú za reprezentatívne pre vzorkované partie. 2. PRACOVNÍCI ODOBERAJÚCI VZORKY Vzorky odoberajú pracovníci poverení členskými štátmi na tento účel. 3. VYMEDZENIE POJMOV Vzorkovaná partia: množstvo výrobku tvoriace celok a majúce charakteristické znaky, na základe ktorých sa predpokladá, že má homogénne zloženie. Čiastková vzorka: množstvo odobraté z jedného miesta vzorkovanej partie. Súhrnná vzorka: súhrn všetkých čiastkových vzoriek odobratých z tej istej vzorkovanej partie. Zredukovaná vzorka: reprezentatívna časť súhrnnej vzorky získaná jej delením. Konečná vzorka: časť zredukovanej vzorky alebo zhomogenizovanej súhrnnej vzorky. 4. VZORKOVACIE POMÔCKY 4.1. Pomôcky na odber vzoriek musia byť vyrobené z materiálov, ktoré nemôžu kontaminovať výrobky určené na odber vzoriek. Toto vybavenie môže byť úradne schválené členskými štátmi. 4.2. Odporúčané vybavenie na odber vzoriek zo suchých krmív 4.2.1. Ručný odber vzoriek 4.2.1.1. Lopatka s plochým dnom a vertikálnymi stranami. 4.2.1.2. Vzorkovacia tyč s dlhou dutinou alebo priehradkami. Rozmery vzorkovacej tyče musia byť primerané vlastnostiam vzorkovanej partie (hĺbka nádoby, rozmery vreca atď.) a veľkosti častíc krmív. 4.2.2. Mechanický odber vzoriek Schválené mechanické vybavenie sa môže používať na odber vzoriek z pohybujúceho sa krmiva. 4.2.3. Delič vzorky Vybavenie určené na rozdelenie vzorky na približne rovnaké časti sa môže použiť pri odbere čiastkových vzoriek a na prípravu zredukovanej a konečnej vzorky. 5. KVANTITATÍVNE POŽIADAVKY 5.A. V súvislosti s kontrolou látok alebo produktov rovnomerne rozložených v krmive 5.A.1. Vzorkovaná partia Veľkosť vzorkovanej partie musí byť taká, aby v odobratej vzorke bola prítomná každá zložka krmiva. 5.A.2. Čiastkové vzorky 5.A.2.1. Voľne ložené krmivá: Minimálny počet čiastkových vzoriek: 5.A.2.1.1. Vzorkované partie, ktorých hmotnosť nepresahuje 2,5 metrických ton Sedem 5.A.2.1.2. Vzorkované partie, ktorých hmotnosť presahuje 2,5 metrických ton √ 20 násobok počtu metrických ton, ktoré predstavujú vzorkovanú partiu (1), pričom najvyšší počet čiastkových vzoriek je 40 5.A.2.2. Balené krmivá: Minimálny počet balení, z ktorých sa má odobrať vzorka (2): 5.A.2.2.1. Balenia s hmotnosťou viac ako jeden kilogram: 5.A.2.2.1.1. Vzorkované partie s počtom jedno až štyri balenia Všetky balenia 5.A.2.2.1.2. Vzorkované partie s počtom päť až 16 balení Štyri 5.A.2.2.1.3. Vzorkované partie s počtom viac ako 16 balení √ počet balení, ktoré predstavujú vzorkovanú partiu (1), pričom najvyšší počet balení je 20 5.A.2.2.2. Balenia s hmotnosťou do 1 kg Štyri 5.A.2.3. Tekuté alebo polotekuté krmivá: Minimálny počet nádob, z ktorých sa má odobrať vzorka (2): 5.A.2.3.1. Nádoby s objemom viac ako jeden liter: 5.A.2.3.1.1. Vzorkované partie s počtom jedna až štyri nádoby Všetky nádoby 5.A.2.3.1.2. Vzorkované partie s počtom päť až 16 nádob Štyri 5.A.2.3.1.3. Vzorkované partie s počtom viac ako 16 nádob √ počet nádob, ktoré predstavujú vzorkovanú partiu (1), pričom najvyšší počet nádob je 20 5.A.2.3.2. Nádoby s objemom nepresahujúcim jeden liter Štyri 5.A.2.4. Bloky krmiva a minerálne lizy Minimálny počet blokov alebo lizov, z ktorých sa má odobrať vzorka (2): Jeden blok alebo jeden liz na vzorkovanú partiu s počtom 25 jednotiek, najviac však štyri bloky alebo štyri lizy 5.A.3. Súhrnná vzorka Vyžaduje sa jedna súhrnná vzorka na vzorkovanú partiu. Celkové množstvo čiastkových vzoriek, ktoré tvorí súhrnnú vzorku, predstavuje najmenej: 5.A.3.1. Voľne ložené krmivá 4 kg 5.A.3.2. Balené krmivá: 5.A.3.2.1. Balenia s hmotnosťou viac ako 1 kg 4 kg 5.A.3.2.2. Balenia, ktorých hmotnosť nepresahuje 1 kg Hmotnosť obsahu štyroch pôvodných balení 5.A.3.3. Tekuté alebo polotekuté krmivá: 5.A.3.3.1. Nádoby s objemom viac ako jeden liter Štyri litre 5.A.3.3.2. Nádoby, ktorých objem nepresahuje jeden liter Objem obsahu štyroch pôvodných nádob 5.A.3.4. Bloky krmiva a minerálne lizy: 5.A.3.4.1. Každý s hmotnosťou viac ako 1 kg 4 kg 5.A.3.4.2. Každý s hmotnosťou do 1 kg Hmotnosť štyroch pôvodných blokov alebo lizov 5.A.4. Konečné vzorky V prípade potreby sa konečné vzorky získajú redukciou súhrnnej vzorky. Vyžaduje sa analýza aspoň jednej konečnej vzorky. Množstvo konečnej vzorky na analýzu nie je menšie ako: Suché krmivá 500 g Tekuté alebo polotekuté krmivá 500 ml 5.B. V súvislosti s kontrolou nežiaducich látok alebo produktov, ktoré by mohli byť nerovnomerne rozložené v krmive, napr. aflatoxínov, ražného námelu, ricínu a krotónu v kŕmnej surovine (3) 5.B.1. Vzorkovaná partia: pozri 5.A.1. 5.B.2. Čiastkové vzorky 5.B.2.1. Voľne krmivá: pozri 5.A.2.1. 5.B.2.2. Balené krmivá: Minimálny počet balení, z ktorých sa majú odobrať vzorky: 5.B.2.2.1. Vzorkované partie pozostávajúce z jedného až štyroch balení Všetky balenia 5.B.2.2.2. Vzorkované partie pozostávajúce z piatich až 16 balení Štyri 5.B.2.2.3. Vzorkované partie pozostávajúce z viac ako 16 balení √ počet balení, ktoré predstavujú vzorkovanú partiu (1), pričom najvyšší počet balení je 40 5.B.3. Súhrnné vzorky Počet súhrnných vzoriek závisí od veľkosti vzorkovanej partie. Minimálny počet súhrnných vzoriek na vzorkovanú partiu je uvedený nižšie. Celková hmotnosť čiastkových vzoriek, ktoré tvoria súhrnnú vzorku, predstavuje najmenej 4 kg na každú súhrnnú vzorku. 5.B.3.1. Voľne ložené krmivá Hmotnosť vzorkovanej partie v metrických tonách: Minimálny počet súhrnných vzoriek na vzorkovanú partiu: najviac 1 1 viac ako 1 až do 10 2 viac ako 10 až do 40 3 nad 40 4 5.B.3.2. Veľkosť vzorkovanej partie baleného krmiva vyjadrená počtom balení: Minimálny počet súhrnných vzoriek na vzorkovanú partiu: 1 až 16 1 17 až 200 2 201 až 800 3 viac ako 800 4 5.B.4. Konečné vzorky Z každej súhrnnej vzorky sa redukciou získavajú konečné vzorky. Vyžaduje sa analýza aspoň jednej konečnej vzorky na jednu súhrnnú vzorku. Hmotnosť konečnej vzorky na analýzu nesmie byť nižšia ako 500 g. 6. POKYNY PRE ODBER, PRÍPRAVU A BALENIE VZORIEK 6.1. Všeobecné pokyny Vzorky sa musia odobrať a pripraviť čo najrýchlejšie s ohľadom na preventívne opatrenia, ktoré sú potrebné na zabezpečenie toho, aby nedošlo k zámene alebo ku kontaminácii produktu. Nástroje, ako aj plochy a nádoby určené na príjem vzoriek musia byť čisté a suché. 6.2. Čiastkové vzorky 6.2.A. V súvislosti s kontrolou látok alebo produktov rovnomerne rozložených v krmive Čiastkové vzorky sa musia odobrať náhodne z celej vzorkovanej partie a musia mať približne rovnakú veľkosť. 6.2.A.1. Voľne ložené krmivá Vzorkovaná partia sa imaginárne rozdelí na určitý počet približne rovnakých častí. Počet častí zodpovedajúci počtu čiastkových vzoriek požadovanému v súlade s bodom 5.A.2 sa vyberá náhodne a z každej z týchto častí sa odoberá aspoň jedna vzorka. V prípade potreby odber vzorky môže byť vykonaný počas pohybu vzorkovanej partie (nakladanie alebo vykladanie). 6.2.A.2. Balené krmivo Po výbere požadovaného množstva balení na odber vzoriek podľa bodu 5.A.2 sa časť obsahu každého balenia odoberá pomocou tyče alebo lopaty. V prípade potreby sa vzorky odoberú jednotlivo po vyprázdnení balení. Hrudky sa v každej súhrnnej vzorke rozbijú; v prípade potreby sa hrudky rozbijú oddelene a potom sa vrátia do vzorky. 6.2.A.3. Homogénne alebo homogenizovateľné tekuté alebo polotekuté krmivá Po výbere požadovaného počtu nádob na odber vzoriek podľa bodu 5.A.2 sa obsah v prípade potreby homogenizuje a z každej nádoby sa odoberie určité množstvo. Čiastkové vzorky môžu byť odobraté počas vyprázdňovania obsahu nádoby. 6.2.A.4. Nehomogenizovateľné, tekuté alebo polotekuté krmivá Po výbere požadovaného počtu nádob na odber vzoriek podľa bodu 5.A.2 sa odoberú vzorky z rôznych vrstiev. Vzorky môžu byť odobraté aj počas vyprázdňovania obsahu, ale prvé frakcie treba odstrániť. V každom prípade celkový odobratý objem nesmie byť menší ako 10 litrov. 6.2.A.5. Bloky krmiva a minerálne lizy Po výbere požadovaného počtu blokov alebo lizov na odber vzoriek podľa bodu 5.A.2 sa odoberie časť z každého bloku alebo lizu. 6.2.B. V súvislosti s kontrolou nežiaducich látok alebo produktov, ktoré by mohli byť nerovnomerne rozložené v krmive, napr. aflatoxínov, ražného námelu, ricínu a krotónu v kŕmnych surovinách. Vzorkovaná partia sa imaginárne rozdelí na určitý počet približne rovnakých častí zodpovedajúci počtu súhrnných vzoriek uvedenému v bode 5.B.3. Ak tento počet je väčší než 1, celkový počet čiastkových vzoriek uvedený v bode 5.B.2 sa rozloží približne rovnako v jednotlivých častiach. Potom sa odoberú približne rovnako veľké vzorky (4) tak, aby celkové množstvo vo vzorkách z každej časti malo hmotnosť aspoň 4 kg požadovanú pre každú súhrnnú vzorku. Čiastkové vzorky odobraté z rozdielnych častí sa nespájajú. 6.3. Príprava súhrnných vzoriek 6.3.A. V súvislosti s kontrolou látok alebo produktov rovnomerne rozložených v krmive Čiastkové vzorky sa zmiešajú tak, aby vytvorili jednu súhrnnú vzorku. 6.3.B. V súvislosti s kontrolou nežiaducich látok alebo produktov, ktoré by mohli byť nerovnomerne rozložené v krmive, napr. aflatoxínov, ražného námelu, ricínu a krotónu v kŕmnych surovinách Čiastkové vzorky z každej časti vzorkovanej partie sa zmiešajú a vytvoria sa súhrnné vzorky v počte podľa bodu 5.B.3, pričom sa starostlivo zaznamená pôvod každej súhrnnej vzorky. 6.4. Príprava konečných vzoriek Materiál v každej súhrnnej vzorke sa starostlivo premieša, čím sa získa homogenizovaná vzorka (5). V prípade potreby sa súhrnná vzorka vopred zredukuje na vzorku s hmotnosťou najmenej 2 kg alebo objemom najmenej 2 l pomocou mechanického alebo automatického deliča alebo metódou štvrtenia. Takto sa pripravia aspoň tri konečné vzorky v približne rovnakom množstve, ktoré budú spĺňať kvantitatívne požiadavky bodu 5.A.4 alebo 5.B.4. Každá vzorka sa vloží do vhodnej nádoby. Urobia sa všetky potrebné opatrenia, aby sa zabránilo zmene zloženia vzorky, jej kontaminácii alebo znehodnoteniu, ktoré by mohlo vzniknúť počas prepravy alebo skladovania. 6.5. Balenie konečných vzoriek Nádoby alebo obaly sa pečatia a označujú (celé označenie musí byť neoddeliteľnou súčasťou pečatenia) tak, aby sa nedali otvoriť bez porušenia pečate. 7. ZÁZNAM O ODBERE VZORKY O každom odbere vzorky je potrebné viesť záznam, ktorý umožní jednoznačne rozoznať každú vzorkovanú partiu. 8. MIESTO URČENIA VZORIEK Za každú súhrnnú vzorku sa v najrýchlejšom možnom čase zašle oprávnenému laboratóriu na analýzu aspoň jedna konečná vzorka spolu s informáciami potrebnými pre analytika. (1) Ak je počet vyjadrený zlomkom, zaokrúhli sa na najbližšie vyššie celé číslo. (2) V prípade balení alebo nádob, ktorých obsah každého(-ej) nepresahuje 1 kilogram alebo 1 liter a v prípade blokov alebo lizov, z ktorých každý neváži viac ako 1 kg, čiastkovú vzorku tvorí obsah jedného pôvodného balenia alebo nádoby, jeden blok alebo jeden liz. (3) Metódy stanovené v bode 5.A sa uplatňujú na kontrolu aflatoxínov, ražného námelu, ricínu a krotónu v kompletnom alebo doplnkovom krmive. (4) Pri balených krmivách sa odstráni časť obsahu balení, z ktorých sa majú odobrať vzorky použitím tyče alebo lopaty po tom, ako sa v prípade potreby balenia jednotlivo vyprázdnia. (5) Hrudky sa pri každej súhrnnej vzorke rozbijú (v prípade potreby sa najskôr oddelia a neskôr vrátia k vzorke).

PRÍLOHA II VŠEOBECNÉ USTANOVENIA TÝKAJÚCE SA ANALYTICKÝCH METÓD PRE KRMIVÁ A. PRÍPRAVA VZORIEK NA ANALÝZU 1. Účel Postupy opísané nižšie sa týkajú prípravy na analýzu konečných vzoriek zasielaných kontrolným laboratóriám po odobratí vzoriek v súlade s ustanoveniami stanovenými v prílohe I. Tieto vzorky musia byť pripravené tak, aby navážené množstvá, ktoré sú uvedené v analytických metódach, boli homogénne a reprezentatívne konečné vzorky. 2. Predbežné opatrenia Postup prípravy vzorky, ktorý je potrebné dodržať, závisí od použitých analytických metód. Preto je mimoriadne dôležité zabezpečiť, aby bol tento postup prípravy vzorky primeraný použitej analytickej metóde. Všetky potrebné kroky pracovného postupu sa musia vykonať takým spôsobom, aby sa v čo najvyššej možnej miere zamedzilo kontaminácii vzorky a zmenám jej zloženia. Mletie, premiešanie a preosievanie by sa mali vykonať čo možno najrýchlejšie s minimálnym vystavením vzorky účinkom vzduchu a svetla. Nemali by sa používať mlynčeky a drviče, ktoré by mohli vzorky značne zahrievať. Ručné mletie sa odporúča v prípade krmív obzvlášť citlivých na zohriatie. Malo by sa dbať aj na to, aby samotné prístrojové vybavenie nebolo zdrojom kontaminácie mikroprvkami. Ak prípravu nemožno vykonať bez výrazných zmien v obsahu vlhkosti vzorky, je potrebné obsah vlhkosti určiť pred prípravou a po nej podľa metódy stanovenej v časti A prílohy III. 3. Postup Rozdeľte vzorku na niekoľko čiastkových vzoriek vhodných na analýzu a referenčné účely použitím vhodných techník delenia ako napr. striedavý odber lopatkou, stacionárne alebo krúživé deliace zariadenie. Delenia metódou kužeľov a štvrtenia sa neodporúčajú, keďže v ich dôsledku môžu vzniknúť dielčie vzorky s vysokou pravdepodobnosťou chyby z delenia. Vzorka sa uchová na referenčné účely vo vhodnej čistej a suchej nádobe so vzduchotesným uzáverom a pripravia sa z nej dielčie vzorky na analýzu s hmotnosťou najmenej 100 g spôsobom uvedeným nižšie. 3.1. Krmivá, ktoré sa môžu priamo drviť Pokiaľ nie je v analytických metódach ustanovené inak, po pomletí sa celá vzorka podľa potreby preoseje cez sito so štvorcovými okami so stranami 1 mm (v súlade s odporúčaním ISO R565). Vyhnite sa nadmerne jemnému pomletiu. Preosiata vzorka sa premieša a vloží do vhodnej čistej, suchej nádoby so vzduchotesným uzáverom. Bezprostredne pred navažovaním množstva určeného na analýzu sa znovu premieša. 3.2. Krmivá, ktoré sa môžu drviť po vysušení Pokiaľ nie je v analytických metódach ustanovené inak, vzorka sa vysuší tak, aby sa jej vlhkosť znížila na 8 až 12 %, v súlade s postupom na predsušenie opísaným v bode 4.3 metódy na stanovenie vlhkosti uvedenej v časti A prílohy III. Ďalej sa postupuje podľa oddielu 3.1. 3.3. Tekuté alebo polotekuté krmivá Vzorka sa vloží do vhodnej čistej, suchej nádoby so vzduchotesným uzáverom. Bezprostredne pred navažovaním množstva určeného na analýzu sa dôkladne premieša. 3.4. Iné krmivá Vzorky, ktoré sa nedajú pripraviť v súlade s jedným z vyššie uvedených postupov, by sa mali upraviť akýmkoľvek iným postupom, ktorým sa zabezpečí, že množstvá navážené na analýzu budú homogénne a reprezentatívne konečné vzorky. 4. Uskladnenie vzoriek Vzorky sa musia skladovať pri teplote, ktorá nespôsobí zmeny v ich zložení. Vzorky určené na analýzu vitamínov alebo látok obzvlášť citlivých na svetlo by sa mali skladovať v nádobách z hnedého skla. B. USTANOVENIA TÝKAJÚCE SA CHEMIKÁLIÍ A PRÍSTROJOVÉHO VYBAVENIA POUŽÍVANÝCH PRI ANALYTICKÝCH METÓDACH 1. Pokiaľ nie je v analytických metódach ustanovené inak, tak všetky chemikálie musia byť analyticky čisté (a.p.). Pri analýze mikroprvkov sa čistota chemikálií musí kontrolovať slepým pokusom. Na základe dosiahnutých výsledkov sa môže vyžadovať ďalšie prečistenie chemikálií. 2. Akýkoľvek krok pracovného postupu zahŕňajúci prípravu roztokov, riedenie, preplachovanie alebo premývanie, uvedený v analytických metódach bez uvedenia použitého rozpúšťadla alebo riediacej kvapaliny znamená, že sa musí použiť voda. Všeobecne platí, že voda musí byť demineralizovaná alebo destilovaná. V konkrétnych prípadoch, ktoré sú uvedené v analytických metódach, sa musí osobitne prečistiť. 3. Vzhľadom na zariadenie bežných kontrolných laboratórií sa pri analytických metódach uvádzajú len špeciálne nástroje a prístrojové vybavenie alebo také, ktoré vyžadujú osobitné používanie. Musia byť čisté, najmä vtedy, keď ide o stanovenie veľmi malých množstiev látok. C. POUŽITIE ANALYTICKÝCH METÓD A VYJADRENIE VÝSLEDKOV 1. Postup pri extrakcii Niektoré metódy si vyžadujú špecifické extrakčné postupy. Vo všeobecnosti platí, že iné postupy pri extrakcii ako ten, ktorý je uvedený v metóde, sa môžu uplatňovať len pod podmienkou, že sa dokáže, že tento použitý extrakčný postup má rovnakú extrakčnú účinnosť na analyzovanú matricu ako postup uvedený v metóde. 2. Postup pri čistení Niektoré metódy si vyžadujú špecifické postupy čistenia. Vo všeobecnosti platí, že iné postupy pri čistení ako ten, ktorý je uvedený v metóde, sa môžu uplatňovať len pod podmienkou, že sa dokáže, že tento použitý postup pri čistení má rovnaké analytické výsledky pre analyzovanú matricu ako postup uvedený v metóde. 3. Správa o použitej metóde analýzy Vo všeobecnosti je ustanovená jedna analytická metóda na stanovenie každej látky v krmive. Pokiaľ sa uvádza niekoľko metód, v správe o analýze musí byť uvedená metóda použitá v kontrolnom laboratóriu. 4. Počet stanovení Výsledky uvádzané v správe o analýze predstavujú priemernú hodnotu získanú najmenej z dvoch paralelných stanovení vykonaných z dvoch samostatných navážiek vzorky a musia sa vyznačovať uspokojivou opakovateľnosťou. Avšak v prípade analýzy nežiaducich látok, ak je výsledok prvého stanovenia výrazne (> 50 %) nižší ako špecifikácia, ktorá sa má skontrolovať, nie sú potrebné žiadne ďalšie stanovenia, ak sa použijú vhodné postupy na určenie kvality. V prípade kontroly deklarovaného obsahu látky alebo zložky, ak výsledok prvého stanovenia potvrdí deklarovaný obsah, t. j. ak analytický výsledok spadá do rozsahu prijateľnej odchýlky od deklarovaného obsahu, nie sú potrebné žiadne ďalšie stanovenia za podmienky, že sa použijú vhodné postupy na určenie kvality. V niektorých prípadoch sa tento prijateľný rozsah odchýlky definuje v právnych predpisoch, ako napr. v smernici Rady 79/373/EHS (1). 5. Správa o analytickom výsledku Analytický výsledok sa vyjadruje spôsobom uvedeným v analytickej metóde na vhodný počet platných číslic a podľa potreby sa koriguje na obsah vlhkosti v konečnej vzorke pred prípravou. 6. Neistota merania a miera návratnosti v prípade analýzy nežiaducich látok Čo sa týka nežiaducich látok v zmysle smernice 2002/32/ES vrátane dioxínov a dioxínom podobných PCB, produkt určený ako krmivo pre zvieratá sa považuje za nevyhovujúci z hľadiska najvyššieho prípustného obsahu, ak sa na základe analytického výsledku najvyšší prípustný obsah pokladá za prekročený, pričom sa zohľadňuje rozšírená neistota merania a korekcia vzhľadom na návratnosť. Na posúdenie zhody sa používa analyzovaná koncentrácia upravená vzhľadom na návratnosť a po odpočítaní rozšírenej neistoty merania. Tento postup sa používa len v prípadoch, keď analytická metóda umožňuje odhad neistoty merania a korekcie vzhľadom na návratnosť (nie je možné ho použiť napr. v prípade mikroskopickej analýzy). Správa o analytickom výsledku sa podáva takto (pokiaľ používaná analytická metóda umožňuje odhadnúť neistotu merania a mieru návratnosti): a) upravený vzhľadom na návratnosť s uvedením miery návratnosti. Úprava vzhľadom na návratnosť nie je potrebná v prípade, že miera návratnosti je v rozmedzí 90 – 110 %. b) ako „x +/– U“, kde x je analytický výsledok a U je rozšírená neistota merania, pomocou koeficientu pokrytia v hodnote 2, ktorý zabezpečuje približne 95-percentnú úroveň spoľahlivosti. Ak je však výsledok analýzy výrazne nižší (> 50 %) ako špecifikácia, ktorá sa má skontrolovať, a za podmienky, že sa uplatňujú vhodné postupy na určenie kvality, a ak analýzy slúžia len na účely kontroly dodržania právnych ustanovení, môže sa podať správa o analytickom výsledku bez úpravy vzhľadom na návratnosť, a miera návratnosti, ako aj neistota merania sa v týchto prípadoch môžu zo správy vynechať. (1) Ú. v. ES L 86, 6.4.1979, s. 30.

PRÍLOHA III ANALYTICKÉ METÓDY NA KONTROLU ZLOŽENIA KŔMNYCH SUROVÍN A KŔMNYCH ZMESÍ A. STANOVENIE VLHKOSTI 1. Účel a oblasť Táto metóda umožňuje stanovenie vlhkosti v krmivách. V prípade, že krmivo obsahuje prchavé látky, ako napr. organické kyseliny, treba si uvedomiť, že spolu s vlhkosťou sa stanoví aj značné množstvo prchavých látok. Táto metóda sa nevzťahuje na analýzu mliečnych výrobkov ako kŕmnych surovín, analýzu minerálnych látok a zmesí zložených predovšetkým z minerálnych látok, analýzu živočíšnych a rastlinných tukov a olejov, ani na analýzu olejnatých semien a olejnatých plodov. 2. Podstata metódy Vzorka sa vysuší za špecifikovaných podmienok, ktoré sa líšia podľa druhu krmiva. Úbytok hmotnosti sa stanoví vážením. V prípade krmív tuhého skupenstva, ktoré majú vysoký obsah vlhkosti, je potrebné ich predsušenie. 3. Prístrojové vybavenie 3.1. Mlynček z materiálu, ktorý neabsorbuje vlhkosť, ľahko sa čistí, umožňuje rýchle mletie bez vytvárania znateľného tepla, v najvyššej možnej miere zamedzuje kontaktu s okolitým vzduchom a spĺňa požiadavky uvedené nižšie v bodoch 4.1.1 a 4.1.2 (napr. kladivkové alebo vodou chladené mikromlynčeky, rozoberateľné kužeľové mlynčeky, nízkootáčkové mlynčeky alebo mlynčeky s ozubenými kolesami). 3.2. Analytické váhy s presnosťou na 1 mg. 3.3. Suché vysúšačky z nehrdzavejúceho kovu alebo skla s vrchnákmi zaručujúcimi vzduchotesné uzatvorenie; s pracovným povrchom, na ktorom je možné rozprestrieť skúšobnú vzorku vo vrstve približne 0,3 g/m2. 3.4. Elektricky vyhrievaná izotermická sušiareň (± 2 oC), primerane vetraná, s možnosťou rýchlej regulácie teploty (1). 3.5. Nastaviteľná elektricky vyhrievaná vákuová sušiareň vybavená olejovým čerpadlom a buď mechanizmom na vpúšťanie horúceho suchého vzduchu, alebo sušiacou látkou (napr. oxid vápenatý). 3.6. Exsikátor s hrubou perforovanou kovovou alebo porcelánovou platňou obsahujúci účinnú sušiacu látku. 4. Postup Poznámka: Postupy opísané v tomto oddiele sa musia vykonať ihneď po otvorení balení so vzorkami. Analýza sa musí vykonať aspoň dvakrát. 4.1. Príprava 4.1.1. Krmivá iné ako krmivá patriace pod body 4.1.2 a 4.1.3 Odoberte aspoň 50 g vzorky. Ak je potrebné, rozmeľte alebo rozdeľte ju takým spôsobom, aby sa zamedzilo akejkoľvek odchýlke v obsahu vlhkosti (pozri bod 6). 4.1.2. Obilniny a obilné krúpy Odoberte aspoň 50 g vzorky. Pomeľte na častice, z ktorých najmenej 50 % prejde sitom s veľkosťou ôk 0,5 mm, a zvyšok, ktorý zostane na site s okrúhlymi okami s veľkosťou 1 mm, bude najviac 10 %. 4.1.3. Krmivá v tekutej alebo pastovitej forme, krmivá prevažne zložené z olejov a tukov Odoberte približne 25 g vzorky, odvážte s presnosťou na 10 mg, pridajte primerané množstvo bezvodého piesku odváženého s presnosťou na 10 mg a miešajte, až kým sa nezíska homogénny produkt. 4.2. Sušenie 4.2.1. Krmivá iné ako krmivá patriace pod body 4.2.2 a 4.2.3 Odvážte vysúšačku (3.3) s vrchnákom s presnosťou na 1 mg. Do odváženej vysúšačky navážte približne 5 g vzorky s presnosťou na 1 mg a rovnomerne rozložte. Vložte vysúšačku bez vrchnáka do sušiarne predhriatej na teplotu 103 oC. Aby ste sa vyhli neželanému poklesu teploty sušiarne, vysúšačku do nej vložte čo najrýchlejšie. Vzorka sa suší štyri hodiny, ktoré sa počítajú od času, keď sa teplota v sušiarni vráti na 103 oC. Na vysúšačku položte vrchnák, vyberte ju z pece, nechajte ju v exsikátore (3.6) počas 30 až 45 minút vychladnúť a odvážte s presnosťou na 1 mg. Krmivá zložené prevažne z olejov a tukov sušte v sušiarni ešte ďalších 30 minút pri teplote 130 oC. Rozdiel medzi dvomi váženiami nesmie presiahnuť 0,1 % vlhkosti. 4.2.2. Obilniny, múka, krúpy a šrot Odvážte vysúšačku (3.3) s vrchnákom s presnosťou na 0,5 mg. Do odváženej vysúšačky navážte približne 5 g rozdrvenej vzorky s presnosťou na 1 mg a rovnomerne rozložte. Vložte vysúšačku bez vrchnáka do sušiarne predhriatej na teplotu 130 oC. Aby ste sa vyhli neželanému poklesu teploty sušiarne, vysúšačku do nej vložte čo najrýchlejšie. Vzorku nechajte sušiť dve hodiny, ktoré sa počítajú od času, keď sa teplota v sušiarni vráti na 130 oC. Na vysúšačku položte vrchnák, vyberte ju z pece, nechajte ju v exsikátore (3.6) za 30 až 45 minút vychladnúť a odvážte s presnosťou na 1 mg. 4.2.3. Kŕmna zmes obsahujúca viac ako 4 % sacharózy alebo laktózy: kŕmne suroviny ako napr. svätojánsky chlieb, hydrolyzované obilninové produkty, slad, sušené repné rezky, šťavy z rýb a cukru; kŕmne zmesi obsahujúce viac ako 25 % minerálnych solí vrátane vody z kryštalizácie. Odvážte vysúšačku (3.3) s vrchnákom s presnosťou na 0,5 mg. Do odváženej vysúšačky navážte približne 5 g vzorky s presnosťou na 1 mg a rovnomerne rozložte. Vysúšačku bez vrchnáka vložte do vákuovej sušiarne (3.5) predhriatej na teplotu medzi 80 oC a 85 oC. Aby ste sa vyhli neželanému poklesu teploty sušiarne, nádobu do nej vložte čo najrýchlejšie. Nastavte tlak na 100 torrov a nechajte pri tomto tlaku sušiť štyri hodiny, buď pod prúdom horúceho suchého vzduchu alebo použite sušiaci prostriedok (približne 300 g na 20 vzoriek). V prípade použitia sušiacej látky odpojte vákuové čerpadlo po dosiahnutí predpísaného tlaku. Čas sušenia počítajte od momentu, keď sa teplota v sušiarni vráti na hodnotu od 80 oC do 85 oC. Opatrne upravte atmosférický tlak v sušiarni na pôvodnú hodnotu. Potom ju otvorte, ihneď na vysúšačku položte vrchnák, vyberte ju zo sušiarne, nechajte v exsikátore (3.6) za 30 až 45 minút vychladnúť a odvážte s presnosťou na 1 mg. Sušte ďalších 30 minút vo vákuovej sušiarni pri teplote od 80 oC to 85 oC a opäť odvážte. Rozdiel medzi dvomi váženiami nesmie presiahnuť 0,1 % vlhkosti. 4.3. Predsušenie 4.3.1. Krmivá iné ako krmivá patriace pod bod 4.3.2 Krmivá tuhého skupenstva s vysokým obsahom vlhkosti, ktoré spôsobujú problémy pri mletí, sa musia predsušiť podľa nasledujúceho postupu: Navážte 50 g nerozdrvenej vzorky s presnosťou na 10 mg (lisované alebo zhrudkované krmivá sa môžu v prípade potreby rozdrviť nahrubo) vo vhodnej vysúšačke (napr. hliníková platňa s veľkosťou 20 × 12 cm s 0,5 cm rámom). Nechajte sušiť v sušiarni pri teplote od 60 oC to 70 oC, až kým sa vlhkosť nezníži na 8 % až 12 %. Vytiahnite zo sušiarne, nechajte v laboratóriu nezakrytú po dobu 1 hodiny vychladnúť a odvážte s presnosťou na 10 mg. Vzorku ihneď rozdrvte podľa bodu 4.1.1 a vysušte podľa bodu 4.2.1 alebo 4.2.3 podľa druhu krmiva. 4.3.2. Obilniny Obilné zrná s obsahom vlhkosti vyšším ako 17 % sa musia predsušiť, a to nasledujúcim postupom: Navážte 50 g nerozdrvených zŕn s presnosťou na 10 mg vo vhodnej vysúšačke (napr. hliníková platňa s veľkosťou 20 × 12 cm s 0,5 cm rámom). Nechajte v sušiarni 5 až 7 minút sušiť pri teplote 130 oC. Vytiahnite zo sušiarne, nechajte v laboratóriu nezakrytú po dobu 2 hodín vychladnúť a odvážte s presnosťou na 10 mg. Vzorku ihneď rozdrvte podľa bodu 4.1.2 a vysušte podľa bodu 4.2.2. 5. Výpočet výsledkov Obsah vlhkosti (X), ako percento zo vzorky sa vypočíta podľa tejto rovnice: 5.1. Sušenie bez predsušenia kde: m = počiatočná hmotnosť skúšobnej vzorky v gramoch, m0 = hmotnosť vysušenej skúšobnej vzorky v gramoch. 5.2. Sušenie s predsušením kde: m = počiatočná hmotnosť skúšobnej vzorky v gramoch, m1 = hmotnosť skúšobnej vzorky v gramoch po predsušení, m2 = hmotnosť skúšobnej vzorky po rozdrvení alebo pomletí v gramoch, m0 = hmotnosť vysušenej skúšobnej vzorky v gramoch. 5.3. Opakovateľnosť Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke nesmie presiahnuť 0,2 % absolútnej hodnoty vlhkosti. 6. Poznámky Ak vzorku treba upraviť drvením a ak sa zdá, že táto úprava zmení obsah vlhkosti produktu, výsledky analýzy zložiek krmív sa musia upraviť na základe obsahu vlhkosti vzorky v jej pôvodnom stave. B. STANOVENIE VLHKOSTI V ŽIVOČÍŠNYCH A RASTLINNÝCH TUKOCH A OLEJOCH 1. Účel a oblasť Táto metóda umožňuje stanoviť obsah vody a prchavých látok v živočíšnych a rastlinných tukoch a olejoch. 2. Podstata metódy Vzorka je vysušená na konštantnú hmotnosť (úbytok hmotnosti medzi dvoma za sebou nasledujúcimi váženiami musí byť ≤ 1 mg) pri teplote 103 oC. Úbytok hmotnosti sa stanoví vážením. 3. Prístrojové vybavenie 3.1. Miska s plochým dnom z nehrdzavejúceho materiálu s priemerom 8 až 9 cm a výškou približne 3 cm. 3.2. Teplomer so spevnenou guľôčkou a s vyrovnávacou rúrkou na hornom konci, s delenou stupnicou od približne 80 oC do najmenej 110 oC a s dĺžkou približne 10 cm. 3.3. Pieskový kúpeľ alebo elektrická vyhrievacia platňa. 3.4. Exsikátor obsahujúci účinnú sušiacu látku. 3.5. Analytické váhy. 4. Postup Navážte s presnosťou na 1 mg približne 20 g zhomogenizovanej vzorky do suchej odváženej misky (3.1), v ktorej sa nachádza teplomer (3.2). Zohrejte na pieskovom kúpeli alebo vyhrievacej platni (3.3), za trvalého miešania teplomerom tak, aby teplota dosiahla hodnotu 90 oC za približne 7 minút. Znížte intenzitu ohrevu pozorujúc frekvenciu akou stúpajú bubliny z dna misky. Teplota nesmie presiahnuť hodnotu 105 oC. Pokračujte v miešaní, stierajúc dno misky, kým sa neprestanú tvoriť bubliny. S cieľom zabezpečiť úplné odstránenie vlhkosti niekoľkokrát znovu zohrejte na teplotu 103 oC ± 2 oC, pričom medzi jednotlivými zohriatiami ochlaďte na 93 oC. Potom nechajte vychladnúť na laboratórnu teplotu v exsikátore (3.4) a odvážte. Túto operáciu opakujte dovtedy, kým úbytok hmotnosti medzi dvomi za sebou nasledujúcimi váženiami nebude menší ako 2 mg. Poznámka: Nárast hmotnosti vzorky po opakovanom zohriatí znamená oxidáciu tuku, v takomto prípade vypočítajte výsledok z váženia vykonaného bezprostredne pred tým, ako začala hmotnosť stúpať. 5. Výpočet výsledkov Obsah vlhkosti (X), ako percento vzorky, je daný nasledujúcim vzorcom: kde: m = počiatočná hmotnosť skúšobnej vzorky v gramoch, m1 = hmotnosť misky v gramoch s obsahom pred zohrievaním, m2 = hmotnosť misky v gramoch s obsahom po zohriatí. Výsledky menšie ako 0,05 % sa musia vyjadriť ako „menej ako 0,05 %“. Opakovateľnosť Rozdiel vo vlhkosti medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť 0,05 % v absolútnej hodnote. C. STANOVENIE OBSAHU DUSÍKATÝCH LÁTOK 1. Účel a oblasť Táto metóda umožňuje stanoviť obsah dusíkatých látok na základe obsahu dusíka stanoveného podľa Kjeldahlovej metódy. 2. Podstata metódy Vzorka sa mineralizuje kyselinou sírovou v prítomnosti katalyzátora. Kyslý roztok sa zalkalizuje roztokom hydroxidu sodného. Amoniak sa oddestiluje a zachytí v odmeranom množstve kyseliny sírovej, ktorej prebytok sa titruje štandardným roztokom hydroxidu sodného. Uvoľnený amoniak sa eventuálne oddestiluje do prebytku roztoku kyseliny boritej, po čom nasleduje titrácia roztokom kyseliny chlorovodíkovej alebo kyseliny sírovej. 3. Chemikálie 3.1. Síran draselný. 3.2. Katalyzátor: oxid meďnatý (II) CuO alebo pentahydrát síranu meďnatého (II), CuSO4 5H2 O. 3.3. Granulovaný zinok. 3.4. Kyselina sírová, ρ20 = 1,84 g/ml. 3.5. Kyselina sírová, štandardný odmerný roztok, c(H2SO4) = 0,25 mol/l. 3.6. Kyselina sírová, štandardný odmerný roztok, c(H2SO4) = 0,10 mol/l. 3.7. Kyselina sírová, štandardný odmerný roztok, c(H2SO4) = 0,05 mol/l. 3.8. Indikátor metylčerveň; rozpustite 300 mg metylčervene v 100 ml etanolu, σ = 95 – 96 % (v/v). 3.9. Roztok hydroxidu sodného (môže sa použiť technicky čistý) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %). 3.10. Hydroxid sodný, štandardný odmerný roztok, c (NaOH) = 0,25 mol/l. 3.11. Hydroxid sodný, štandardný odmerný roztok, c (NaOH) = 0,10 mol/l. 3.12. Granulovaná pemza premytá kyselinou chlorovodíkovou a vyžíhaná. 3.13. Acetanilid (b.t. = 114 oC, N-obsah = 10,36 %). 3.14. Sacharóza (bez dusíka). 3.15. Kyselina boritá (H3BO3). 3.16. Indikátorový roztok metylčervene: rozpustite 100 mg metylčervene v 100 ml etanolu alebo metanolu. 3.17. Roztok bromkrezolovej zelene: rozpustite 100 mg bromkrezolovej zelene v 100 ml etanolu alebo metanolu. 3.18. Roztok kyseliny boritej (10 g/l až 40 g/l v závislosti od použitého prístrojového vybavenia) Ak sa použije kolorimetrická detekcia bodu ekvivalencie, do roztokov kyseliny boritej sa musia pridať indikátory metylčerveň a bromkrezol. Ak sa pripravuje 1 liter kyseliny boritej, pred úpravou objemu sa pridá 7 ml indikátorového roztoku metylčervene (3.16) a 10 ml roztoku bromkrezolovej zelene (3.17). V závislosti od použitej vody sa môže pH jednotlivých roztokov kyseliny boritej líšiť. Často je potrebná úprava pomocou malého objemu zásaditej látky tak, aby sme získali vhodné pH. Poznámka: Pridanie cca 3 až 4 ml NaOH (3.11) do 1 litra 10 g/l kyseliny boritej je zvyčajne dobrou metódou úpravy. Roztok skladujte pri izbovej teplote a počas skladovania ho chráňte pred svetlom a zdrojom amoniakových výparov. 3.19 Štandardný odmerný roztok kyseliny chlorovodíkovej c(HCL) = 0,10 mol/l. Poznámka: Možno použiť aj iné koncentrácie odmerných roztokov (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 a 3.19), ak sa to zohľadní pri výpočtoch. Koncentrácie by sa vždy mali vyjadriť s presnosťou na štyri desatinné miesta. 4. Prístrojové vybavenie Prístrojové vybavenie je vhodné na vykonanie mineralizácie, destilácie a titrácie podľa Kjeldahlovej metódy. 5. Postup 5.1. Mineralizácia Navážte 1 g vzorky s presnosťou na 0,001 g a vzorku preneste do mineralizačnej banky. Pridajte 15 g síranu draselného (3.1), vhodné množstvo katalyzátora (3.2) [0,3 až 0,4 g oxidu meďnatého (II) alebo 0,9 až 1,2 g pentahydrátu síranu meďnatého (II)], 25 ml kyseliny sírovej (3.4) a v prípade potreby niekoľko granúl pemzy (3.12) a premiešajte. Banku najskôr mierne zahrievajte, ak je potrebné, obsah občas premiešajte, až kým hmota zuhoľnatie a kým sa prestane tvoriť pena; potom zahrievajte intenzívnejšie, až kým kvapalina nedosiahne trvalý var. Zahrievanie je primerané vtedy, keď vriaca kyselina kondenzuje na stenách banky. Zabráňte prehriatiu stien banky a zachytávaniu organických častíc na nich. Keď sa roztok vyčíri a získa svetlozelenú farbu, pokračujte vo vare ešte ďalšie dve hodiny, potom nechajte vychladnúť. 5.2. Destilácia Opatrne pridajte dostatočné množstvo vody, aby sa sírany úplne rozpustili. Nechajte vychladnúť a potom v prípade potreby pridajte niekoľko granúl zinku (3.3). Postupujte podľa bodov 5.2.1 alebo 5.2.2. 5.2.1. Destilácia do kyseliny sírovej Do zachytávacej banky destilačného prístroja dajte presne odmerané množstvo 25 ml kyseliny sírovej (3.5) alebo (3.7) v závislosti od predpokladaného obsahu dusíka. Pridajte niekoľko kvapiek indikátora metylčervene (3.8). Pripojte mineralizačnú banku na chladič destilačného prístroja a ponorte koniec chladiča do kvapaliny nachádzajúcej sa v zachytávacej banke do hĺbky najmenej 1 cm (pozri poznámku 8.3). Pomaly nalejte 100 ml roztoku hydroxidu sodného (3.9) do mineralizačnej banky bez straty amoniaku (pozri poznámku 8.1). Banku zahrievajte až do úplného predestilovania amoniaku. 5.2.2. Destilácia do kyseliny boritej V prípade manuálnej titrácie amoniakového obsahu destilátu sa uplatňuje nižšie opísaný postup. V prípade, že destilačná jednotka je plne automatizovaná a zahŕňa titráciu amoniakového obsahu destilátu, dodržiavajte pokyny pre prevádzku destilačnej jednotky. Umiestnite zachytávaciu banku s obsahom 25 až 30 ml roztoku kyseliny boritej (3.18) pod otvor chladiča tak, že vývod chladiča je ponorená pod hladinu roztoku kyseliny boritej, ktorá je v prebytku. Prispôsobte destilačnú jednotku na dávkovanie 50 ml roztoku hydroxidu sodného (3.9). S destilačnou jednotkou pracujte podľa pokynov výrobcu a destilujte amoniak uvoľnený pridaním roztoku hydroxidu sodného. Zachytávajte destilát do zachytávacieho roztoku kyseliny boritej. Množstvo destilátu (doba parnej destilácie) závisí od množstva dusíka vo vzorke. Dodržujte pokyny výrobcu. Poznámka: V poloautomatickej destilačnej jednotke sa dopĺňanie zvyšného hydroxidu sodného a parná destilácia vykonávajú automaticky. 5.3. Titrácia Postupujte podľa bodu 5.3.1 alebo 5.3.2. 5.3.1. Kyselina sírová Titrujte prebytočnú kyselinu sírovú v zachytávacej banke s roztokom hydroxidu sodného (3.10 alebo 3.11) v závislosti od koncentrácie použitej kyseliny sírovej až do dosiahnutia bodu ekvivalencie. 5.3.2. Kyselina boritá Titrujte obsah zachytávacej banky so štandardným odmerným roztokom kyseliny chlorovodíkovej (3.19) alebo štandardným odmerným roztokom kyseliny sírovej (3.6) použitím byrety a prečítajte množstvo použitého titračného roztoku. Ak sa použije kolorimetrická detekcia bodu ekvivalencie, bod ekvivalencie sa dosiahne pri prvom sfarbení obsahu na ružovo. Odčítajte objem byrety s presnosťou na 0,05 ml. Bod ekvivalencie možno lepšie vidieť, ak sa použije osvietená magnetická platňa na miešanie alebo fotometrický detektor. Tento postup možno vykonať automaticky použitím parného destilátora s automatickou titráciou. Pri prevádzke špecifického destilátora alebo destilátora/titrátora dodržiavajte pokyny výrobcu. Poznámka: Pri použití automatického titračného systému sa titrácia začína hneď po začatí destilácie a použije sa 1 % roztok kyseliny boritej (3.18). Pri použití plne automatickej destilačnej jednotky sa automatická titrácia amoniaku môže vykonať aj pomocou detekcie bodu ekvivalencie použitím potenciometrického pH systému. V tomto prípade sa použije automatický titrátor s pH-metrom. Tento pH-meter má byť správne nakalibrovaný v rozsahu pH od 4 do 7 podľa bežných laboratórnych postupov týkajúcich sa kalibrácie pH. Bod ekvivalencie titrácie pH sa dosiahne pri hodnote pH 4,6, pričom ide o bod obratu na titračnej krivke (inflexný bod). 5.4. Slepý pokus Vykonajte slepý pokus, ktorým sa potvrdí, že chemikálie neobsahujú dusík (mineralizáciou, destiláciou a titráciou), s použitím 1 g sacharózy (3.14) namiesto vzorky. 6. Výpočet výsledkov Výpočty sa robia podľa bodu 6.1 alebo 6.2. 6.1. Výpočet pri titrácii podľa bodu 5.3.1 Obsah dusíkatých látok vyjadrený ako percentuálny podiel hmotnosti sa vypočíta podľa tohto vzorca: kde: V0 = objem (ml) NaOH (3.10 alebo 3.11) použitého pri slepom pokuse, V1 = objem (ml) NaOH (3.10 alebo 3.11) použitého pri titrácii vzorky, c = koncentrácia (mol/l) hydroxidu sodného (3.10 alebo 3.11), m = hmotnosť (g) vzorky. 6.2. Výpočet pri titrácii podľa bodu 5.3.2 6.2.1. Titrácia s kyselinou chlorovodíkovou Obsah dusíkatých látok vyjadrený ako percentuálny podiel hmotnosti sa vypočíta podľa tohto vzorca: kde: m = hmotnosť (g) skúšobnej vzorky, c = koncentrácia (mol/l) štandardného odmerného roztoku kyseliny chlorovodíkovej (3.19), V0 = objem (ml) kyseliny chlorovodíkovej použitej pri slepom pokuse, V1 = objem (ml) kyseliny chlorovodíkovej použitej na skúšobnú vzorku. 6.2.2. Titrácia s kyselinou sírovou Obsah dusíkatých látok vyjadrený ako percentuálny podiel hmotnosti sa vypočíta podľa tohto vzorca: kde: m = hmotnosť (g) skúšobnej vzorky, c = koncentrácia (mol/l) štandardného odmerného roztoku kyseliny sírovej (3.6), V0 = objem (ml) kyseliny sírovej (3.6) použitej pri slepom pokuse, V1 = objem (ml) kyseliny sírovej (3.6) použitej na skúšobnú vzorku. 7. Overenie metódy 7.1. Opakovateľnosť Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť: — 0,2 % v absolútnej hodnote pre obsah dusíkatých látok nižší ako 20 %, — 1,0 % relatívnych z vyššej hodnoty pre obsah dusíkatých látok od 20 % do 40 %, — 0,4 % v absolútnej hodnote pre obsah dusíkatých látok vyšší ako 40 %. 7.2. Správnosť Vykonajte analýzu (mineralizáciu, destiláciu a titráciu) na 1,5 až 2,0 g acetanilidu (3.13) v prítomnosti 1 g sacharózy (3.14); na 1 g acetanilidu sa spotrebuje 14,80 ml kyseliny sírovej (3.5). Návratnosť musí byť aspoň 99 %. 8. Poznámky 8.1. Prístrojové vybavenie môže byť manuálne, poloautomatické a automatické. Ak si vybavenie vyžaduje prenos medzi krokom mineralizácie a destilácie, musí sa vykonať bez toho, aby došlo k stratám. Ak zachytávacia banka destilačného prístroja nie je vybavená prikvapkávacím lievikom, pridajte bezprostredne pred jej pripojením na chladič hydroxid sodný pomalým prilievaním kvapaliny po stene banky. 8.2. Ak zmineralizovaná látka stuhne, zopakujte stanovenie s použitím väčšieho množstva kyseliny sírovej (3.4) ako je množstvo uvedené vyššie. 8.3. Pri produktoch s nižším obsahom dusíka možno v prípade potreby objem kyseliny sírovej (3.7) pridávanej do zachytávacej banky znížiť na 10 alebo 15 ml a doplniť vodou na 25 ml. 8.4. Pri rutinnej analýze sa na stanovenie dusíkatých látok môžu použiť alternatívne metódy, no referenčnou metódou je Kjeldahlova metóda opísaná v časti C. Ekvivalencia výsledkov získaných alternatívnou metódou (napr. DUMAS) v porovnaní s referenčnou metódou sa musí dokázať samostatne pri každej matrici. Keďže výsledky získané alternatívnou metódou sa môžu aj v prípade overenia ekvivalencie nepatrne odchyľovať od výsledkov získaných referenčnou metódou, je potrebné v správe o analýze uviesť metódu analýzy použitú pri stanovení dusíkatých látok. D. STANOVENIE MOČOVINY 1. Účel a oblasť Táto metóda umožňuje stanovenie obsahu močoviny v krmivách. 2. Podstata metódy Vzorka sa rozmieša vo vode s číriacim činidlom. Suspenzia sa prefiltruje. Obsah močoviny vo filtráte sa stanovuje po pridaní 4-dimetylaminobenzaldehydu (4-DMAB) zmeraním absorbancie pri vlnovej dĺžke 420 nm. 3. Chemikálie 3.1. Roztok 4-dimetylaminobenzaldehydu: rozpustite 1,6 g 4-DMAB v 100 ml 96 % etanolu a pridajte 10 ml kyseliny chlorovodíkovej (ρ201,19 g/ml). Túto chemikáliu možno uchovávať maximálne dva týždne. 3.2. Carrezovo činidlo I: Rozpustite vo vode 21,9 g dihydrátu octanu zinočnatého, Zn(CH3COO)2 2H2O a 3 g ľadovej kyseliny octovej. Doplňte vodou na objem 100 ml. 3.3. Carrezovo činidlo II: Rozpustite vo vode 10,6 g trihydrátu ferokyanidu draselného, K4 Fe (CN)6 3H2O. Doplňte vodou na objem 100 ml. 3.4. Aktívne uhlie, ktoré neabsorbuje močovinu (je potrebné skontrolovať). 3.5. Močovina, 0,1 % roztok (w/v). 4. Prístrojové vybavenie 4.1. Mixér (trepačka): Približne 35 až 40 ot/min. 4.2. Skúmavky: 160 × 16 mm so zábrusovými zátkami. 4.3. Spektrofotometer. 5. Postup 5.1. Analýza vzorky Navážte 2 g vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte spolu s 1 g aktívneho uhlia (3.4) do 500 ml odmernej banky. Pridajte 400 ml vody a 5 ml Carrezovho činidla I (3.2), miešajte približne 30 sekúnd a pridajte 5 ml Carrezovho činidla II (3.3). Miešajte 30 minút v trepačke. Doplňte objem vodou, potrepte a prefiltrujte. Odoberte 5 ml z číreho bezfarebného filtrátu do skúmaviek so zábrusovými zátkami, pridajte 5 ml roztoku 4-DMAB (3.1) a premiešajte. Skúmavky umiestnite do vodného kúpeľa s teplotou 20 oC (+/– 4 oC). Po pätnástich minútach zmerajte absorbanciu roztoku vzorky pomocou spektrofotometra pri 420 nm. Porovnajte so slepým pokusom z použitých chemikálií. 5.2. Kalibračná krivka Odoberte objemy 1, 2, 4, 5 a 10 ml z roztoku močoviny (3.5), vložte každý do jednej 100 ml odmernej banky a doplňte objem vodou. Odoberte z každého roztoku 5 ml, pridajte do každého 5 ml roztoku 4-DMAB (3.1), zhomogenizujte a zmerajte absorbanciu podľa vyššie uvedeného postupu porovnaním s kontrolným roztokom obsahujúcim 5 ml 4-DMAB a 5 ml vody bez močoviny. Zakreslite kalibračnú krivku. 6. Výpočet výsledkov Množstvo močoviny vo vzorke sa stanoví pomocou kalibračnej krivky. Výsledok sa vyjadrí ako percento zo vzorky. 7. Poznámky 7.1. V prípade, že obsah močoviny presahuje 3 %, zredukujte vzorku na 1 g alebo rozrieďte pôvodný roztok tak, aby v 500 ml nebolo viac ako 50 mg močoviny. 7.2. V prípade nízkeho obsahu močoviny vzorku zväčšite až dovtedy, kým filtrát zostane číry a bezfarebný. 7.3. Ak vzorka obsahuje dusíkaté zlúčeniny, ako sú aminokyseliny, absorbanciu treba merať pri 435 nm. E. STANOVENIE PRCHAVÝCH DUSÍKATÝCH LÁTOK I. MIKRODIFÚZIOU 1. Účel a oblasť Táto metóda umožňuje stanoviť obsah prchavých dusíkatých látok v krmivách vyjadrených ako amoniak. 2. Podstata metódy Vzorka sa extrahuje s vodou a roztok sa vyčíri a prefiltruje. Prchavé dusíkaté látky sú vytesnené mikrodifúziou s použitím roztoku uhličitanu draselného, zachytené v roztoku kyseliny boritej a titrované kyselinou sírovou. 3. Chemikálie 3.1. Kyselina trichlóroctová, roztok 20 % (w/v). 3.2. Indikátor: Rozpustite 33 mg bromkrezolovej zelene a 65 mg metylčervene v 100 ml 95 % – 96 % (v/v) etanolu. 3.3. Roztok kyseliny boritej: v odmernej banke s objemom 1 liter rozpustite 10 g kyseliny boritej v 200 ml 95 % – 96 % (v/v) etanolu a 700 ml vody. Pridajte 10 ml indikátora (3.2). Premiešajte a v prípade potreby upravte farbu roztoku na bledočervenú pridaním roztoku hydroxidu sodného. V 1 ml tohto roztoku sa zachytí najviac 300 μg NH3. 3.4. Nasýtený roztok uhličitanu draselného: Rozpustite 100 g uhličitanu draselného v 100 ml vriacej vody. Nechajte vychladnúť a prefiltrujte. 3.5. Kyselina sírová, 0,01 mol/liter. 4. Prístrojové vybavenie 4.1. Mixér (trepačka): približne 35 až 40 ot/min. 4.2. Sklenené alebo plastové Conwayove misky (pozri diagram). 4.3. Mikrobyrety delené na 1/100 ml. 5. Postup Navážte 10 g vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte ju so 100 ml vody do odmernej banky s objemom 200 ml. Mixujte alebo miešajte 30 minút v trepačke. Pridajte 50 ml roztoku kyseliny trichlóroctovej (3.1), doplňte vodou na celkový objem, rázne potrepte a prefiltrujte cez skladaný filter. Použitím pipety dajte 1 ml roztoku kyseliny boritej (3.3) do stredu Conwayovej misky a 1 ml filtrátu vzorky do medzikružia misky. Čiastočne prikryte vazelínou natretým vrchnákom. Rýchlo prikvapnite 1 ml nasýteného roztoku uhličitanu draselného (3.4) do medzikružia misky a vzduchotesne uzatvorte vrchnákom. Opatrne otáčajte misku v horizontálnej polohe tak, aby sa zmiešali obe chemikálie. Nechajte inkubovať aspoň štyri hodiny pri laboratórnej teplote alebo hodinu pri teplote 40 oC. Použitím mikrobyrety (4.3) titrujte prchavé látky v roztoku kyseliny boritej s kyselinou sírovou (3.5). Urobte slepý pokus podľa toho istého postupu, no bez vzorky, ktorá sa má analyzovať. 6. Výpočet výsledkov 1 ml H2SO40,01 mol/liter zodpovedá 0,34 mg amoniaku. Vyjadrite výsledok ako percento zo vzorky. Opakovateľnosť Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť: — 10 % v relatívnej hodnote pre obsah amoniaku nižší ako 1,0 %, — 0,1 % v absolútnej hodnote pre obsah amoniaku 1,0 % alebo viac. 7. Poznámky Ak obsah amoniaku vo vzorke presiahne 0,6 %, pôvodný filtrát rozrieďte. CONWAYOVE MISKY Mierka 1/1 II. DESTILÁCIOU 1. Účel a oblasť Táto metóda umožňuje stanoviť obsah prchavých dusíkatých látok, vyjadrených ako amoniak, v rybej múčke, ktorá prakticky neobsahuje močovinu. Používa sa len pri obsahu amoniaku nižšom ako 0,25 %. 2. Podstata metódy Vzorka sa extrahuje s vodou a roztok sa vyčíri a prefiltruje. Prchavé dusíkaté látky sa vytesnia pri bode varu pridaním oxidu horečnatého a zachytia v špecifikovanom množstve kyseliny sírovej, ktorej prebytok sa spätne titruje s roztokom hydroxidu sodného. 3. Chemikálie 3.1. Kyselina trichlóroctová, roztok 20 % (w/v). 3.2. Oxid horečnatý. 3.3. Emulzia proti peneniu (napr. silikón). 3.4. Kyselina sírová, 0,05 mol/liter. 3.5. Roztok hydroxidu sodného 0,1 mol/liter. 3.6. Roztok metylčervene 0,3 % v 95 % – 96 % (v/v) etanole. 4. Prístrojové vybavenie 4.1. Mixér (trepačka): približne 35 až 40 ot/min. 4.2. Kjeldahlov destilačný prístroj. 5. Postup Navážte 10 g vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte ju spolu so 100 ml vody do odmernej banky s objemom 200 ml. Mixujte alebo miešajte v trepačke 30 minút. Pridajte 50 ml roztoku kyseliny trichlóroctovej (3.1), doplňte objem vodou, rázne potrepte a prefiltrujte cez skladaný filter. Odoberte čistý filtrát v množstve primeranom predpokladanému obsahu prchavých dusíkatých látok (100 ml je zvyčajne vhodné množstvo). Rozrieďte na 200 ml a pridajte 2 g oxidu horečnatého (3.2) a niekoľko kvapiek emulzie proti peneniu (3.3). Roztok musí reagovať na lakmusový papier zásadito; v opačnom prípade pridajte trochu oxidu horečnatého (3.2). Postupujte podľa bodov 5.2 a 5.3 analytickej metódy na stanovenie obsahu dusíkatých látok (časť C tejto prílohy). Urobte slepý pokus podľa toho istého postupu, no bez vzorky, ktorá sa má analyzovať. 6. Výpočet výsledkov 1 ml H2SO40,05 mol/liter zodpovedá 1,7 mg amoniaku. Výsledok sa vyjadrí ako percento zo vzorky. Opakovateľnosť Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke nesmie presiahnuť 10 % amoniaku v relatívnej hodnote. F. STANOVENIE AMINOKYSELÍN (OKREM TRYPTOFÁNU) 1. Účel a oblasť Táto metóda umožňuje stanovenie voľných (syntetických a prírodných) a celkových (viazaných peptidickou väzbou a voľných) aminokyselín v krmivách s použitím analyzátora aminokyselín. Je použiteľná pre tieto aminokyseliny: cysteín (cystín), metionín, lyzín, treonín, alanín, arginín, kyselinu asparágovú, kyselinu glutámovú, glycín, histidín, izoleucín, leucín, fenylalanín, prolín, serín, tyrozín a valín. Táto metóda nedokáže rozlíšiť soli aminokyselín a nedokáže diferencovať medzi D a L formami aminokyselín. Neplatí pre stanovenie tryptofánu alebo hydroxyanalógov aminokyselín. 2. Podstata metódy 2.1. Voľné aminokyseliny Voľné aminokyseliny sa extrahujú zriedenou kyselinou chlorovodíkovou. Spolu vyextrahované dusíkové makromolekuly sa vyzrážajú kyselinou sulfosalicylovou a odstránia sa filtráciou. Hodnota pH prefiltrovaného roztoku sa upraví na 2,20. Aminokyseliny sa oddelia pomocou iónovo-výmennej chromatografie a stanovia sa reakciou s ninhydrínom pomocou fotometrickej detekcie pri 570 nm. 2.2. Celkové aminokyseliny Zvolený postup závisí od aminokyselín, ktoré sa majú skúmať. Cysteín (cystín) a metionín sa musia pred hydrolýzou zoxidovať na kyselinu cysteovú a metionín sulfón. Tyrozín sa musí stanoviť v hydrolyzátoch neoxidovaných vzoriek. Všetky ostatné aminokyseliny uvedené v bode 1 sa dajú stanoviť v oxidovanej alebo neoxidovanej vzorke. Oxidácia sa vykoná pri 0 oC zmesou kyseliny permravčej a fenolu. Prebytočné oxidačné činidlo sa rozloží pomocou disiričitanu disodného. Oxidovaná alebo neoxidovaná vzorka sa hydrolizuje 23 hodín kyselinou chlorovodíkovou (3.20). Hodnota pH hydrolyzátu sa upraví na 2,20. Aminokyseliny sa oddelia pomocou iónovo-výmennej chromatografie a stanovia sa reakciou s ninhydrínom pomocou fotometrickej detekcie pri 570 nm (v prípade prolínu pri 440 nm). 3. Chemikálie Musí sa použiť dvakrát destilovaná voda alebo voda rovnakej kvality (vodivosť < 10μS). 3.1. Peroxid vodíka, w (w/w) = 30 %. 3.2. Kyselina mravčia, w (w/w) = 98 – 100 %. 3.3. Fenol. 3.4. Disiričitan sodný 3.5. Hydroxid sodný 3.6. Dihydrát kyseliny 5-sulfosalicylovej 3.7. Kyselina chlorovodíková, hustota približne 1,18 g/ml. 3.8. Dihydrát citranu trojsodného. 3.9. 2,2'-tiodietanol (tiodiglykol). 3.10. Chlorid sodný. 3.11. Ninhydrín. 3.12. Petroléter, rozpätie bodu varu 40 – 60 oC. 3.13. Norleucín alebo iná zlúčenina vhodná na použitie ako vnútorný štandard. 3.14. Plynný dusík (< 10 ppm kyslíka). 3.15. 1-oktanol. 3.16. Aminokyseliny. 3.16.1. Štandardné látky uvedené v odseku 1. Čisté zlúčeniny bez obsahu vody z kryštalizácie. Pred použitím ich sušte vo vákuu jeden týždeň nad P2O5 alebo H2SO4. 3.16.2. Kyselina cysteová 3.16.3. Metionín sulfón. 3.17. Roztok hydroxidu sodného c = 7,5 mol/l: Rozpustite 300 g NaOH (3.5) vo vode a objem doplňte na 1 liter. 3.18. Roztok hydroxidu sodného c = 1 mol/l: Rozpustite 40 g NaOH (3.5) vo vode a objem doplňte na 1 liter. 3.19. Roztok kyseliny mravčej a fenolu: Zmiešajte 889 g kyseliny mravčej (3.2) so 111 g vody a pridajte 4,73 g fenolu (3.3). 3.20. Hydrolyzačná zmes, c = 6 mol HCl/l s obsahom 1 g fenolu/l: Pridajte 1 g fenolu (3.3) k 492 ml HCl (3.7) a objem doplňte vodou na 1 liter. 3.21. Extrakčná zmes, c = 0,1 mol HCl/l s obsahom 2 % tiodiglykolu: Vezmite 8,2 ml HCl (3.7), rozrieďte s približne 900 ml vody, pridajte 20 ml tiodiglykolu (3.9) a objem doplňte vodou na 1 liter (nezmiešajte 3.7 a 3.9 priamo). 3.22. Kyselina 5-sulfosalicylova, ß = 6 %: Rozpustite 60 g kyseliny 5-sulfosalicylovej (3.6) vo vode a objem doplňte vodou na 1 liter. 3.23. Oxidačná zmes (kyselina permravčia – fenol): Zmiešajte 0,5 ml peroxidu vodíka (3.1) so 4,5 ml roztoku kyseliny mravčej s fenolom (3.19) v malej kadičke. Inkubujte pri teplote 20 – 30 oC 1 hodinu, aby sa vytvorila kyselina permravčia, potom nechajte vychladnúť v ľadovom kúpeli (15 minút) pred pridaním k vzorke. Upozornenie: Vyhnite sa kontaktu s kožou a použite ochranný odev. 3.24. Citranový tlmivý roztok, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: Rozpustite 19,61 g citranu sodného (3.8), 5 ml tioglykolu (3.9), 1 g fenolu (3.3) a 16,50 ml HCl (3.7) v približne 800 ml vody. Upravte pH na 2,20. Doplňte objem vodou na 1 liter. 3.25. Elučné tlmivé roztoky pripravené podľa podmienok pre použitý analyzátor (4.9). 3.26. Nihydrinové činidlo pripravené podľa podmienok pre použitý analyzátor (4.9). 3.27. Štandardné roztoky aminokyselín. Tieto roztoky treba skladovať pri teplote pod 5 oC. 3.27.1. Zásobný štandardný roztok aminokyselín (3.16.1). c = 2,5 μmol/ml každá v kyseline chlorovodíkovej. Možno ich získať aj komerčne. 3.27.2. Zásobný štandardný roztok kyseliny cysteovej a metionín sulfónu, c = 1,25 μmol/ml. Rozpustite 0,2115 g kyseliny cysteovej (3.16.2) a 0,2265 g metionín sulfónu (3.16.3) v citranovom tlmivom roztoku (3.24) v 1 l odmernej banke a doplňte po značku citranovým tlmivým roztokom. Skladujte pri teplote pod 5 oC najviac podobu 12 mesiacov. Tento roztok sa nepoužíva, ak zásobný štandardný roztok (3.27.1) obsahuje kyselinu cysteovú a metionín sulfón. 3.27.3. Zásobný štandardný roztok vnútorného štandardu napr. norleucín, c = 20 μmol/ml. Rozpustite 0,6560 g norleucínu (3.13) v citranovom tlmivom roztoku (3.24) v odmernej banke a doplňte objem citranovým tlmivým roztokom na 250 ml. Skladujte pri teplote pod 5 oC najviac po dobu 6 mesiacov. 3.27.4. Kalibračný roztok štandardných aminokyselín na použitie s hydrolyzátmi, c = 5 nmol/50 μl kyseliny cysteovej a metionín sulfónu a c = 10 nmol/50 μl ostatných aminokyselín. Rozpustite 2,2 g chloridu sodného (3.10) v 100 ml kadičke s 30 ml citranového tlmivého roztoku (3.24). Pridajte 4,00 ml zásobného štandardného roztoku aminokyselín (3.27.1), 4,00 ml zásobného štandardného roztoku kyseliny cysteovej a metionín sulfónu (3.27.2) a 0,50 ml zásobného štandardného roztoku vnútorného štandardu (3.27.3), ak sa používa. Hydroxidom sodným (3.18) upravte pH na 2,20. Preneste kvantitatívne do 50 ml odmernej banky a doplňte po značku citranovým tlmivým roztokom (3.24) a premiešajte. Skladujte pri teplote pod 5 oC najviac po dobu 3 mesiacov. Pozri poznámku 9.1. 3.27.5. Kalibračný roztok štandardných aminokyselín na použitie s hydrolyzátmi pripravenými podľa odseku 5.3.3.1 a na použitie s extraktmi (5.2). Kalibračný roztok sa pripravuje podľa 3.27.4, no bez použitia chloridu sodného. Skladujte pri teplote pod 5 oC po dobu najviac 3 mesiace. 4. Prístrojové vybavenie 4.1. Banka s guľatým dnom s objemom 100 alebo 250 ml vybavená spätným chladičom. 4.2. Fľaša z borokremičitého skla s objemom 100 ml so skrutkovým uzáverom s gumovou/teflonovou podložkou (napr. Duran, Schott) na použitie v sušiarni. 4.3. Sušiareň s nútenou ventiláciou a regulátorom teploty s presnosťou vyššou ako ± 2 oC. 4.4. pH meter (s presnosťou na tri desatinné miesta). 4.5. Membránový filter (0,22 μm). 4.6. Odstredivka. 4.7. Rotačná vákuová odparka. 4.8. Mechanická trepačka alebo magnetické miešadlo. 4.9. Analyzátor aminokyselín alebo zariadenie HPLC s iónovo-výmennou kolónou, zariadenie pre ninhydrín, postkolónová derivatizačná jednotka a fotometrický detektor. Kolóna je naplnená sulfónovanými polystyrénovými živicami, ktoré sú schopné oddeliť aminokyseliny navzájom, ako aj od iných ninhydrín-pozitívnych materiálov. Prietok pre tlmivý roztok a ninhydrín zabezpečujú pumpy, ktoré majú stabilitu prietoku ±0,5 % v dobe, počas ktorej sa vykoná aj kalibrácia pomocou štandardu aj analyzovanie vzorky. U niektorých analyzátorov aminokyselín sa môžu použiť také postupy hydrolýzy, v ktorých hydrolyzát má koncentráciu sodíka c = 0,8 mol/l a obsahuje všetku zvyškovú kyselinu mravčiu z oxidácie. Iné analyzátory nedokážu uspokojivo oddeliť aminokyseliny, ak hydrolyzát obsahuje prebytok kyseliny mravčej a/alebo vysoké koncentrácie sodíkového iónu. V tomto prípade sa objem kyseliny zredukuje odparením na približne 5 ml po hydrolýze a pred úpravou pH. Odparenie musí prebehnúť vo vákuu pri teplote najviac 40 oC. 5. Postup 5.1. Príprava vzorky Vzorka sa pomelie tak, aby prepadla sitom s veľkosťou ôk 0,5 mm. Vzorky s vysokým obsahom vlhkosti sa pred mletím musia vysušiť buď vzduchom pri teplote do 50 oC, alebo lyofilizáciou. Vzorky s vysokým obsahom tuku treba pred mletím extrahovať s petroléterom (3.12). 5.2. Stanovenie voľných aminokyselín v krmivách a v premixoch Navážte s presnosťou na 0,2 mg primerané množstvo (1 – 5 g) pripravenej vzorky (5.1) do Erlenmeyerovej banky a pridajte 100,0 ml extrakčnej zmesi (3.21). Zmes trepte 60 min. použitím mechanickej trepačky alebo magnetického miešadla (4.8). Nechajte sediment usadiť a pipetou odoberte 10,0 ml z roztoku nad sedimentom do kadičky s objemom 100 ml. Primiešajte 5,0 ml roztoku kyseliny 5-sulfosalicylovej (3.22) a pokračujte v miešaní pomocou magnetického miešadla po dobu 5 minút. Roztok nad sedimentom odstreďte alebo prefiltrujte, aby sa odstránili všetky zrazeniny. Preneste 10,0 ml výsledného roztoku do 100 ml kadičky a upravte pH na 2,20 použitím roztoku hydroxidu sodného (3.18), preneste do odmernej banky primeraného objemu s použitím citranového tlmivého roztoku (3.24) a doplňte týmto roztokom (3.24) po značku. Ak sa používa vnútorný štandard, pridajte 1,00 ml vnútorného štandardu (3.27.3) na každých 100 ml konečného roztoku a doplňte citranovým tlmivým roztokom (3.24) po značku. Pristúpte k ďalšiemu kroku, ktorým je chromatografia, podľa odseku 5.4. Ak sa extrakty neanalyzujú v ten istý deň, musia sa uskladniť pri teplote pod 5 oC. 5.3. Stanovenie celkových aminokyselín 5.3.1. Oxidácia Navážte s presnosťou na 0,2 mg 0,1 – 1 g pripravenej vzorky (5.1) do: — 100 ml banky s guľatým dnom (4.1) na otvorenú hydrolýzu (5.3.2.3) alebo — 250 banky s guľatým dnom (4.1), ak sa vyžaduje nízka koncentrácia sodíka (5.3.3.1), alebo — 100 ml fľaše so skrutkovým uzáverom (4.2) (na uzavretú hydrolýzu 5.3.2.4). Navážené množstvo vzorky musí mať obsah dusíka približne 10 mg a obsah vlhkosti nesmie presahovať 100 mg. Vložte banku/fľašu do ľadového vodného kúpeľa a ochlaďte na 0 oC, pridajte 5 ml oxidačnej zmesi (3.23) a premiešajte sklenenou špachtľou s ohnutým hrotom. Utesnite banku/fľašu, v ktorej je špachtľa, vzduchotesnou fóliou, vložte ľadový vodný kúpeľ s utesnenou nádobou do chladničky pri teplote 0 oC a nechajte pôsobiť 16 hodín. Po 16 hodinách vyberte z chladničky a rozložte prebytok oxidačného činidla pridaním 0,84 g disiričitanu sodného (3.4). Prejdite k bodu 5.3.2.1. 5.3.2. Hydrolýza 5.3.2.1. Hydrolýza oxidovaných vzoriek K oxidovanej vzorke pripravenej podľa 5.3.1 pridajte 25 ml hydrolyzačnej zmesi (3.20), pričom pozorne zmyte všetky zvyšky vzorky, ktoré sa držia na stranách nádoby a špachtle. V závislosti od použitého postupu hydrolýzy postupujte podľa 5.3.2.3 alebo 5.3.2.4. 5.3.2.2. Hydrolýza neoxidovaných vzoriek Navážte do 100 ml alebo 250 ml banky s guľatým dnom (4.1) alebo do 100 ml fľaše so skrutkovým uzáverom (4.2) 0,1 až 1 g pripravenej vzorky (5.1) s presnosťou na 0,2 mg. Navážené množstvo vzorky musí mať obsah dusíka približne 10 mg. Opatrne pridajte 25 ml hydrolyzačnej zmesi (3.20) a zmiešajte so vzorkou. Postupujte podľa bodu 5.3.2.3 alebo 5.3.2.4. 5.3.2.3. Otvorená hydrolýza Pridajte 3 sklenené guľôčky k zmesi v banke (pripravenej v súlade s bodom 5.3.2.1 alebo 5.3.2.2) a varte pri stálom prebublávaní s refluxom 23 hodín. Po dokončení hydrolýzy chladič umyte 5 ml v citranového tlmivého roztoku (3.24). Odpojte banku a ochlaďte v ľadovom kúpeli. Postupujte podľa bodu 5.3.3. 5.3.2.4. Uzavretá hydrolýza Vložte fľašu s obsahom zmesi pripravenej v súlade s bodom 5.3.2.1 alebo 5.3.2.2 do sušiarne (4.3) pri teplote 110 oC. Počas prvej hodiny len položte na vrch nádoby skrutkový uzáver, aby ste predišli vytvoreniu tlaku (v dôsledku vytvárania plynných látok) a zabránili výbuchu. Nezatvárajte nádobu uzáverom. Po hodine uzatvorte nádobu uzáverom a nechajte na 23 hodín v sušiarni (4.3). Po ukončení hydrolýzy vyberte fľašu zo sušiarne, opatrne otvorte uzáver fľaše a vložte ju do ľadového vodného kúpeľa. Nechajte vychladnúť. V závislosti od postupu na úpravu pH (5.3.3) preneste kvantitatívne obsah fľaše do 250 ml kadičky alebo 250 ml alebo 250 ml banky s guľatým dnom s použitím citranového tlmivého roztoku (3.24). Postupujte podľa bodu 5.3.3. 5.3.3. Úprava pH V závislosti od tolerancie analyzátora aminokyselín (4.9) voči sodíku postupujte pri úprave pH podľa bodov 5.3.3.1 alebo 5.3.3.2. 5.3.3.1. Chromatografické systémy (4.9) vyžadujúce nízku koncentráciu sodíka. Pri použití analyzátora, ktorý vyžaduje nízku koncentráciu sodíka (keď sa musí znížiť objem kyseliny), sa odporúča použiť zásobný roztok vnútorného štandardu (3.27.3). V takomto prípade pridajte k hydrolyzátu pred odparovaním 2,00 ml zásobného roztoku vnútorného štandardu (3.27.3). Pridajte 2 kvapky 1-oktanolu (3.15) k hydrolyzátu získanému podľa ods. 5.3.2.3 alebo 5.3.2.4. Použitím rotačnej odparky (4.7) znížte objem na 5 – 10 ml vo vákuu pri teplote 40 oC. Ak sa objem náhodou zníži na menej ako 5 ml, hydrolyzát sa musí znehodnotiť a analýza opakovať. Upravte pH na 2,20 s roztokom hydroxidu sodného (3.18) a postupujte ďalej podľa odseku 5.3.4. 5.3.3.2. Pre všetky ostatné analyzátory aminokyselín (4.9) Vezmite hydrolyzáty získané podľa bodov 5.3.2.3 alebo 5.3.2.4 a čiastočne ich zneutralizujte opatrným pridávaním za miešania 17 ml roztoku hydroxidu sodného (3.17), pričom je potrebné zabezpečiť, aby sa teplota udržala pod 40 oC. Upravte pH na 2,20 pri izbovej teplote použitím roztoku hydroxidu sodného (3.17) a nakoniec roztoku hydroxidu sodného (3.18). Postupujte ďalej podľa bodu 5.3.4. 5.3.4. Roztok vzorky na chromatografiu Kvantitatívne preneste hydrolyzát s upraveným pH (5.3.3.1 alebo 5.3.3.2) s citranovým tlmivým roztokom (3.24) do 200 ml odmernej banky a doplňte po značku tlmivým roztokom (3.24). Ak ešte nebol použitý vnútorný štandard, pridajte 2,00 ml vnútorného štandardu (3.27.3) a doplňte po značku citranovým tlmivým roztokom (3.24). Dôkladne premiešajte. Pristúpte ďalej ku chromatografii (5.4). Ak sa roztoky vzorky neanalyzujú v ten istý deň, musia sa uskladniť pri teplote pod 5 oC. 5.4. Chromatografia Pred chromatografiou upravte teplotu extraktu (5.2) alebo hydrolyzátu (5.3.4) na laboratórnu teplotu. Zmes potrepte a prefiltrujte vhodné množstvo cez 0,22 μm membránový filter (4.5). Výsledný číry roztok sa podrobí iónovo-výmennej chromatografii s použitím analyzátora aminokyselín (4.9). Nastreknutie sa môže vykonať manuálne alebo automaticky. Dôležité je, aby sa na kolónu nadávkovalo rovnaké analyzované množstvo roztoku štandardov a vzoriek s odchýlkou ±0,5 % s výnimkou prípadov používania vnútorného štandardu a aby boli pomery sodíka a aminokyselín v roztokoch štandardu a vzorky v najvyššej možnej miere podobné. Vo všeobecnosti závisí frekvencia kalibrácií od stability ninhydrínového činidla a analytického systému. Štandard alebo vzorka sa rozriedi s citranovým tlmivým roztokom (3.24) tak, aby plocha píku štandardu predstavovala 30 – 200 % plochy píku aminokyseliny vzorky. Chromatografia aminokyselín sa mierne odlišuje podľa typu použitého analyzátora a použitej živice. Zvolený systém musí byť schopný oddeliť aminokyseliny navzájom, ako aj od iných ninhydrín-pozitívnych materiálov. V pracovnom rozsahu musí chromatografický systém poskytnúť lineárnu odozvu na zmeny v množstvách aminokyselín pridaných do kolóny. Počas chromatografie, keď sa analyzuje ekvimolárny roztok (aminokyselín, ktoré sa stanovujú), sa uplatňujú pomery výšky údolia k výške píku, ako sa uvádza nižšie. Tento ekvimolárny roztok musí obsahovať najmenej 30 % maximálneho množstva každej aminokyseliny, ktorá sa dá presne odmerať pomocou systému analyzátora aminokyselín (4.9). Pri oddeľovaní treonínu od serínu výška údolia k výške píku u nižšej z dvoch prekrývajúcich sa aminokyselín na chromatograme nesmie prekročiť pomer 2 : 10 (ak sa stanovuje len cystín, cysteín, metionín, treonin a lysín, nedostatočné oddelenie od susedných píkov nepriaznivo ovplyvní proces stanovenia). Pri všetkých ostatných aminokyselinách musí byť oddelenie v pomere lepšom ako 1 : 10. Systém musí zabezpečiť, aby sa lyzín oddelil od „lyzínových artefaktov“ a od ornitínu. 6. Výpočet výsledkov Plochy píkov vzorky a štandardu sa merajú pre každú jednotlivú aminokyselinu a vypočíta sa množstvo (X) v g aminokyselín na kg vzorky. Ak sa použije vnútorný štandard, vynásobte: A = plocha píku, hydrolyzátu alebo extraktu, B = plocha píku, kalibračný štandardný roztok, C = plocha píku, vnútorny štandard v hydrolyzáte alebo extrakte, D = plocha píku, vnútorny štandard, kalibračný štandardný roztok, M = molekulová hmotnosť aminokyseliny, ktorá sa stanovuje, c = koncentrácia štandardu v μmol/ml, m = hmotnosť vzorky (g) (upravená na pôvodnú hmotnosť ak je sušená alebo odtučnená), V = celkový hydrolyzát v ml (5.3.4) alebo vypočítaný objem celkového zriedenia extraktu (6.1). Cystín a cysteín sa obidva stanovujú ako kyselina cysteová v hydrolyzátoch oxidovanej vzorky, no vypočítajú sa ako cystín (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) pomocou M 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol). Metionín sa stanovuje ako metionín sulfón v hydrolyzátoch oxidovanej vzorky, no vypočíta sa ako metionín pomocou M metionínu: 149,21 g/mol. Pridaný voľný metionín sa stanovuje po extrakcii ako metionín a výpočet sa vykoná pomocou toho istého MW. 6.1. Celkový objem zriedených extraktov (F) na stanovenie voľných aminokyselín (5.2) sa vypočíta takto: V = objem konečného extraktu 7. Hodnotenie metódy Metóda bola testovaná v rámci vzájomného porovnávania na medzinárodnej úrovni v roku 1990 pomocou štyroch rôznych krmív (kŕmna zmes pre ošípané, kŕmna zmes pre brojlery, bielkovinový koncentrát, premix). Výsledky priemeru a smerodajnej odchýlky po eliminácii odľahlých hodnôt sú uvedené v atbuľkách v tomto bode: Priemery v g/kg Referenčný materiál Aminokyselina Treonín Cyst(e)ín Metionín Lysín Kŕmna zmes pre ošípané 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Kŕmna zmes pre brojlery 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Bielkovinový koncentrát 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Premix 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = počet zúčastnených laboratórií 7.1. Opakovateľnosť Opakovateľnosť vyjadrená ako „vnútrolaboratórna smerodajná odchýlka“ uvedeného vzájomného porovnávania je uvedená v nasledujúcich tabuľkách: Vnútrolaboratórna smerodajná odchýlka (Sr) v g/kg Referenčný materiál Aminokyselina Treonín Cyst(e)ín Metionín Lysín Kŕmna zmes pre ošípané 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Kŕmna zmes pre brojlery 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Bielkovinový koncentrát 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Premix 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = počet zúčastnených laboratórií

Variačný koeficient (%) vnútrolaboratórnej smerodajnej odchýlky (Sr) Referenčný materiál Aminokyselina Treonín Cyst(e)ín Metionín Lysín Kŕmna zmes pre ošípané 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Kŕmna zmes pre brojlery 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Bielkovinový koncentrát 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Premix 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = počet zúčastnených laboratórií 7.2. Reprodukovateľnosť Výsledky medzilaboratórnej smerodajnej odchýlky na základe uvedeného vzájomného porovnávania sú uvedené v nasledujúcich tabuľkách: Medzilaboratórna smerodajná odchýlka (SR) v g/kg Referenčný materiál Aminokyselina Treonín Cyst(e)ín Metionín Lysín Kŕmna zmes pre ošípané 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Kŕmna zmes pre brojlery 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Bielkovinový koncentrát 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Premix 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = počet zúčastnených laboratórií

Variačný koeficient (%) medzilaboratórnej smerodajnej odchýlky (SR) Referenčný materiál Aminokyselina Treonín Cyst(e)ín Metionín Lysín Kŕmna zmes pre ošípané 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Kŕmna zmes pre brojlery 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Bielkovinový koncentrát 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Premix 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = počet zúčastnených laboratórií 8. Využitie referenčných materiálov Správne uplatňovanie tejto metódy sa overí vykonaním opakovaných meraní certifikovaných referenčných materiálov, ak sú takéto materiály k dispozícii. Odporúča sa kalibrácia certifikovaným kalibračným roztokom aminokyselín. 9. Poznámky 9.1. V dôsledku rozdielov medzi analyzátormi aminokyselín sa berú za základ konečné koncentrácie kalibračných roztokov štandardných aminokyselín (pozri body 3.27.4 a 3.27.5) a hydrolyzátu (pozri 5.3.4). Rozsah lineárnej odozvy prístroja sa musí preveriť pre všetky aminokyseliny. Štandardný roztok sa zriedi s citranovým tlmivým roztokom tak, aby plochy píkov boli v strede rozsahu. 9.2. V prípade použitia zariadenia na vysoko účinnú kvapalinovú chromatografiu na analýzu hydrolyzátov sa musia optimalizovať experimentálne podmienky v súlade s odporúčaniami výrobcu. 9.3. Uplatňovaním tejto metódy na krmivá s obsahom viac ako 1 % chloridu (koncentrát, minerálne krmivá, doplnkové krmivá) môže dôjsť k podhodnoteniu metionínu a musí sa vykonať osobitná úprava. G. STANOVENIE TRYPTOFÁNU 1. Účel a oblasť Metóda umožňuje stanovenie celkového a voľného tryptofánu v krmivách. Nerozlišuje medzi D a L formami. 2. Podstata metódy Na stanovenie celkového tryptofánu sa vzorka hydrolyzuje v alkalickom prostredí s nasýteným roztokom hydroxidu bárnatého a zahreje sa na 110 oC na 20 hodín. Po hydrolýze sa pridá vnútorný štandard. Na stanovenie voľného tryptofánu sa vzorka extrahuje v mierne kyslom prostredí v prítomnosti vnútorného štandardu. Tryptofán a vnútorný štandard v hydrolyzáte alebo v extrakte sa stanovujú pomocou HPLC s fluorescenčnou detekciou. 3. Chemikálie 3.1. Musí sa použiť dvakrát destilovaná voda alebo voda rovnakej kvality (vodivosť < 10 μS/cm). 3.2. Štandardná látka: tryptofán (čistota/obsah ≥ 99 %) vysušený vo vákuu nad oxidom fosforečným. 3.3. Vnútorný štandard: α-metyl-tryptofán (čistota/obsah ≥ 99 %) vysušený vo vákuu nad oxidom fosforečným. 3.4. Oktahydrát hydroxidu bárnatého Ba(OH)2 8H2O (ktorý sa nesmie nechať dlho na vzduchu, aby sa nevytváral BaCO3, ktorý môže narušiť proces stanovenia) (pozri poznámku 9.3). 3.5. Hydroxid sodný. 3.6. Kyselina orto-fosforečná, w (w/w) = 85 %. 3.7. Kyselina chlorovodíková, ρ201,19 g/ml. 3.8. Metanol, čistoty HPLC. 3.9. Petroléter, rozpätie bodu varu 40 – 60 oC. 3.10. Roztok hydroxidu sodného c = 1 mol/l: Rozpustite 40,0 g NaOH (3.5) vo vode a objem doplňte vodou na 1 liter (3.1). 3.11. Kyselina chlorovodíková, c = 6 mol/l: Vezmite 492 ml HCl (3.7) a objem doplňte vodou na 1 liter. 3.12. Kyselina chlorovodíková, c = 1 mol/l: Vezmite 82 ml HCl (3.7) a objem doplňte vodou na 1 liter. 3.13. Kyselina chlorovodíková, c = 0,1 mol/l: Vezmite 8,2 ml HCl (3.7) a objem doplňte vodou na 1 liter. 3.14. Kyselina orto-fosforečná, c = 0,5 mol/l. Vezmite 34 ml kyseliny orto-fosforečnej (3.6) a objem doplňte vodou na 1 liter (3.1). 3.15. Koncentrovaný roztok tryptofánu (3.2), c = 2,50 μmol/ml: V 500 ml odmernej banke rozpustite 0,2553 g tryptofánu (3.2) v kyseline chlorovodíkovej (3.13) a doplňte kyselinou chlorovodíkovou (3.13) po značku. Skladujte pri teplote –18 oC po dobu maximálne 4 týždne. 3.16. Koncentrovaný roztok vnútorného štandardu, c = 2,50 μmol/ml: V 500 ml odmernej banke rozpustite 0,2728 g α-metyl-tryptofánu (3.3) v kyseline chlorovodíkovej (3.13) a doplňte kyselinou chlorovodíkovou (3.13) po značku. Skladujte pri teplote –18 oC po dobu maximálne 4 týždne. 3.17. Kalibračný štandardný roztok tryptofánu a vnútorného štandardu: Vezmite 2,00 ml koncentrovaného roztoku tryptofánu (3.15) a 2,00 ml koncentrovaného roztoku vnútorného štandardu (α-metyl-tryptofán) (3.16). Rozrieďte s vodou (3.1) a metanolom (3.8) na približne rovnaký objem a na približne rovnakú koncentráciu metanolu (10 – 30 %) ako hotový hydrolyzát. Tento roztok sa musí pripraviť tesne pred použitím. Počas prípravy chráňte ho pred priamym slnečným svetlom. 3.18. Kyselina octová 3.19. 1,1,1-trichloro-2-metyl-2-propanol 3.20. Etanolamín w (w/w) > 98 %. 3.21. Roztok 1 g 1,1,1-trichloro-2-metyl-2-propanolu (3.19) v 100 ml metanolu (3.8). 3.22. Mobilná fáza pre HPLC: 3,00 g kyseliny octovej (3.18) + 900 ml vody (3.1) +50,0 ml roztoku (3.21) 1,1,1-trichloro-2-metyl-2-propanolu (3.19) v metanole (3.8) (1g/100ml). Upravte pH na 5,00 pomocou etanolamínu (3.20). Objem doplňte vodou (3.1) na 1 000 ml. 4. Prístrojové vybavenie 4.1. Zariadenie HPLC s fluorescenčným detektorom. 4.2. Kolóna na kvapalinovú chromatografiu, 125 mm × 4 mm, s náplňou C18, 3 μm alebo ekvivalentná 4.3. pH meter. 4.4. Polypropylénová banka, objem 125 ml so širokým hrdlom a závitovým uzáverom. 4.5. Membránový filter, 0,45 μm. 4.6. Autokláv, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1) bar. 4.7. Mechanická trepačka alebo magnetická miešačka. 4.8. Vírivý mixér. 5. Postup 5.1. Príprava vzoriek Vzorka sa pomelie tak, aby prepadla cez sito o veľkosti ôk 0,5 mm. Vzorky s vysokým obsahom vlhkosti sa pred mletím musia vysušiť buď vzduchom pri teplote do 50 oC, alebo lyofilizáciou. Vzorky s vysokým obsahom tuku sa pred mletím extrahujú petroléterom (3.9). 5.2. Stanovenie voľného tryptofánu (extrakt) Navážte s presnosťou na 1 mg primerané množstvo (1 – 5 g) pripravenej vzorky (5.1) do Erlenmayerovej banky. Pridajte 100,0 ml kyseliny chlorovodíkovej, (3.13) a 5,00 ml koncentrovaného roztoku vnútorného štandardu (3.16). Zmes trepte alebo miešajte 60 min. na mechanickej trepačke alebo na magnetickej miešačke (4.7). Nechajte sediment usadiť a napipetujte 10,0 ml z roztoku nad sedimentom do kadičky. Pridajte 5 ml kyseliny orto-fosforečnej (3.14). Upravte pH na 3 pomocou hydroxidu sodného (3.10). Pridajte dostatočné množstvo metanolu (3.8) na dosiahnutie koncentrácie medzi 10 a 30 % metanolu v konečnom objeme. Preneste do odmernej banky primeraného objemu a rozrieďte s vodou na objem potrebný na chromatografiu [približne rovnaký objem ako je objem kalibračného štandardného roztoku (3.17)]. Prefiltrujte niekoľko ml roztoku cez 0,45 μm membránový filter (4.5) pred nástrekom na HPLC kolónu. Pokračujte ďalším krokom chromatografie podľa odseku 5.4. Roztok štandardu a extrakty chráňte pred priamym slnečným svetlom. Ak nie je možné analyzovať extrakty v ten istý deň, môžu sa uskladniť pri teplote 5 oC maximálne počas 3 dní. 5.3. Stanovenie celkového tryptofánu (hydrolyzát). Navážte s presnosťou na 0,2 mg od 0,1 do 1 g pripravenej vzorky (5.1) do polypropylénovej banky (4.4). Navážka vzorky má obsahovať približne 10 mg dusíka. Pridajte 8,4 g oktahydrátu hydroxidu bárnatého (3.4) a 10 ml vody. Premiešajte vo vírivom mixéri (4.8) alebo na magnetickej miešačke (4.7). Magnet potiahnutý teflónom ponechajte v zmesi. Steny nádoby opláchnite 4 ml vody. Položte na ňu skrutkový uzáver a voľne banku uzatvorte. Preneste do autoklávu (4.6) s vriacou vodou a nechajte v pare 30 – 60 minút. Uzatvorte autokláv a autoklávujte 20 hodín pri 110 (± 2) oC. Pred otvorením autoklávu znížte teplotu na hodnotu tesne pod 100 oC. K teplej zmesi pridajte 30 ml vody laboratórnej teploty, aby ste sa vyhli kryštalizácii Ba(OH)2.8 H2O. Jemne potrepte alebo premiešajte. Pridajte 2,00 ml koncentrovaného roztoku vnútorného štandardu (α-metyl-tryptofán) (3.16). Nechajte nádobu 15 minút ochladzovať vo vodnom/ľadovom kúpeli. Potom pridajte 5 ml kyseliny orto-fosforečnej (3.14). Nádobu nechajte v chladiacom kúpeli a neutralizujte pomocou HCl (3.11) za stáleho miešania a upravte pH na 3,0 pomocou HCl (3.12). Pridajte dostatočné množstvo metanolu na dosiahnutie koncentrácie medzi 10 a 30 % metanolu v konečnom objeme. Preneste do odmernej banky primeraného objemu a zrieďte s vodou, aby sa dosiahol stanovený objem potrebný na chromatografiu (napr. 100 ml). Pridanie metanolu nesmie spôsobiť vyzrážanie. Prefiltrujte niekoľko ml roztoku cez 0,45 μm membránový filter (4.5) pred nástrekom na HPLC kolónu. Ďalším krokom je chromatografia podľa odseku 5.4. Roztok štandardu a hydrolyzáty chráňte pred priamym slnečným svetlom. Ak nie je možné analyzovať hydrolyzáty v ten istý deň, môžu sa uskladniť pri teplote 5 oC maximálne počas 3 dní. 5.4. Stanovenie HPLC Na usmernenie sú k dispozícii tieto podmienky pre izokratické eluovanie; môžu sa uplatniť iné podmienky, ak poskytujú rovnaké výsledky (pozri poznámky 9.1 a 9.2): Kolóna na kvapalinovú chromatografiu kolóna (4.2): 125 mm × 4 mm, s náplňou C18, 3 μm alebo ekvivalentná Teplota kolóny: laboratórna teplota Mobilná fáza (3.22): 3,00 g kyseliny octovej (3.18) + 900 ml vody (3.1) +50,0 ml roztoku (3.21) 1,1-trichloro-2-metyl-2-propanolu (3.19) v metanole (3.8) (1 g/100 ml). Upravte pH na 5,00 pomocou tanolamínu (3.20). Doplňte objem vodou (3.1) na 1 000 ml Prietoková rýchlosť: 1 ml/min. Celkový čas analýzy: približne 34 min. Detekčná vlnová dĺžka: excitácia: 280 nm, emisia: 356 nm Vstrekový objem 20 μl 6. Výpočet výsledkov Množstvo tryptofánu (X) v g na 100 vzorky sa vypočíta podľa vzorca: A = plocha píku vnútorného štandardu, kalibračného štandardného roztoku (3.17), B = plocha píku extraktu tryptofánu (5.2) alebo hydrolyzátu (5.3), V1 = objem v ml (2 ml) koncentrovaného roztoku tryptofánu (3.15) pridaného do kalibračného roztoku (3.17), c = koncentrácia v μmol/ml (= 2,50) koncentrovaného roztoku tryptofánu (3.15) pridaného do kalibračného roztoku (3.17), V2 = objem v ml koncentrovaného roztoku vnútorného štandardu (3.16) pridaného pri extrakcii (5.2) (= 5,00 ml) alebo k hydrolyzátu (5.3) (= 2,00 ml), C = plocha píku vnútorného štandardu, extraktu (5.2) alebo hydrolyzátu (5.3), D = plocha píku tryptofánu, kalibračného štandardného roztoku (3.17), V3 = objem v ml (= 2,00 ml) koncentrovaného roztoku vnútorného štandardu (3.16) pridaného do kalibračného štandardného roztoku (3.17), m = hmotnosť vzorky v g (upravená na pôvodnú hmotnosť, ak je sušená a/alebo odtučnená), M = molekulová hmotnosť tryptofánu (= 204,23 g/mol). 7. Opakovateľnosť Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke nesmie presiahnuť 10 % relatívnych z vyššej hodnoty. 8. Výsledky medzilaboratórnej štúdie Zorganizovala sa medzilaboratórna štúdia ES (4. vzájomné porovnávanie), v ktorej sa analyzovali tri vzorky až v 12 laboratóriách na overenie metódy pre hydrolýzu. Každá vzorka sa analyzovala 5 krát. Výsledky sú uvedené v tejto tabuľke: Vzorka 1 Krmivo pre ošípané Vzorka 2 Krmivo pre ošípané doplnené L-tryptofánom Vzorka 3 Koncentrát krmiva pre ošípané L 12 12 12 n 50 55 50 Priemery [g/kg] 2,42 3,40 4,22 sr [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CVr [ %] 1,9 1,6 1,9 SR [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 CVR [ %] 6,3 6,0 2,2 L = počet laboratórií, ktoré poskytli výsledky, n = počet jednotlivých výsledkov, ktoré zostali po eliminácii odľahlých hodnôt (určené Cochranovým, Dixonovým testom na odľahlé hodnoty), sr = smerodajná odchýlka opakovateľnosti, SR = smerodajná odchýlka reprodukovateľnosti, r = opakovateľnosť, R = reprodukovateľnosť, CVr = variačný koeficient opakovateľnosti, %, CVR = variačný koeficient reprodukovateľnosti, %. Zorganizovala sa ďalšia medzilaboratórna štúdia ES (3. vzájomné porovnávanie), v ktorej sa analyzovali dve vzorky až v 13 laboratóriách na overenie metódy pre extrakciu voľného tryptofánu. Každá vzorka sa analyzovala 5 krát. Výsledky sú uvedené v tejto tabuľke: Vzorka 4 Zmesi pšenice a sóje Vzorka 5 Zmes pšenice a sóje (= vzorka 4) s pridaným tryptofánom (0,457g/kg) L 12 12 n 55 60 Priemer [g/kg] 0,391 0,931 sr [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 CVr [ %] 1,34 1,34 SR [g/kg] 0,018 0,048 R [g/kg] 0,050 0,134 CVR [ %] 4,71 5,11 L = počet laboratórií, ktoré poskytli výsledky, n = počet jednotlivých výsledkov, ktoré zostali po eliminácii odľahlých hodnôt (určené Cochranovým, Dixonovým testom na odľahlé hodnoty), sr = smerodajná odchýlka opakovateľnosti, SR = smerodajná odchýlka reprodukovateľnosti, r = opakovateľnosť, R = reprodukovateľnosť, CVr = variačný koeficient opakovateľnosti, %, CVR = variačný koeficient reprodukovateľnosti, %. Zorganizovala sa ďalšia štúdia ES vzájomného porovnania, v ktorej sa analyzovali štyri vzorky až v 7 laboratóriách s cieľom osvedčiť tryptofán pre hydrolýzu. Výsledky sú uvedené nižšie. Každá vzorka sa analyzovala 5 krát. Vzorka 1 Kŕmna zmes pre ošípané (CRM 117) Vzorka 2 Rybia múčka s nízkym obsahom tuku (CRM 118) Vzorka 3 Sójová múčka (CRM 119) Vzorka 4 Sušené odstredené mlieko (CRM 120) L 7 7 7 7 n 25 30 30 30 Priemer [g/kg] 2,064 8,801 6,882 5,236 sr [g/kg] 0,021 0,101 0,089 0,040 r [g/kg] 0,059 0,283 0,249 0,112 CVr [ %] 1,04 1,15 1,30 0,76 SR [g/kg] 0,031 0,413 0,283 0,221 R [g/kg] 0,087 1,156 0,792 0,619 CVR [ %] 1,48 4,69 4,11 4,22 L = počet laboratórií, ktoré poskytli výsledky, n = počet jednotlivých výsledkov, ktoré zostali po eliminácii odľahlých hodnôt (určené Cochranovým, Dixonovým testom na odľahlé hodnoty), sr = smerodajná odchýlka opakovateľnosti, SR = smerodajná odchýlka reprodukovateľnosti, r = opakovateľnosť, R = reprodukovateľnosť, CVr = variačný koeficient opakovateľnosti, %, CVR = variačný koeficient reprodukovateľnosti, %. 9. Poznámky 9.1. Dodržanie špeciálnych chromatografických podmienok môže viesť k lepšiemu oddeleniu tryptofánu od α-metyl-tryptofánu. Izokratické eluovanie, po ktorom nasleduje gradientové čistenie kolóny: Kolóna na kvapalinovú hromatografiu: 125 mm × 4 mm, s náplňou C18, 5 μm alebo ekvivalentná Teplota kolóny: 32 oC Mobilná fáza: A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanol, 95+5 (V+V). B: metanol Gradientový program: 0 min 100 % A 0 % B 15 min 100 % A 0 % B 17 min 60 % A 40 % B 19 min 60 % A 40 % B 21 min 100 % A 0 % B 33 min 100 % A 0 % B Prietoková rýchlosť: 1,2 ml/min. Celkový čas analýzy: približne 33 min. 9.2. Chromatografia sa mení v závislosti od typu HPLC a od použitej náplne kolóny. Zvolený systém musí umožňovať rozlíšenie na základnú čiaru medzi tryptofánom a vnútorným štandardom. Okrem toho je dôležité, aby sa produkty degradácie dobre oddelili od tryptofánu a vnútorného štandardu. Hydrolyzáty bez vnútorného štandardu sa musia analyzovať na kontrolu základnej čiary pod vnútorným štandardom na prítomnosť nečistôt. Je dôležité, aby bol čas analýzy dostatočne dlhý na elúciu všetkých produktov degradácie, inak môžu oneskorene eluujúce píky interferovať s nasledujúcim chromatografickým dejom. V pracovnom rozsahu chromatografický systém má dávať lineárnu odozvu. Lineárna odozva sa meria konštantnou (bežnou) koncentráciou vnútorného štandardu a meniacimi sa koncentráciami tryptofánu. Je dôležité, aby rozmery oboch píkov tryptofánu aj vnútorného štandardu spadali do lineárneho rozsahu HPLC/fluorescenčného systému. Ak je jeden z píkov – tryptofánu a/alebo vnútorného štandardu – príliš malý alebo príliš veľký, analýzu treba zopakovať s inou navážkou vzorky a/alebo so zmeneným konečným objemom. 9.3. Hydroxidy bárnatý Čím je hydroxid bárnatý starší, tým sa ťažšie rozpúšťa. Výsledkom je nečíry roztok na stanovenie HPLC, ktorý môže viesť k nízkym výsledným hodnotám tryptofánu. H. STANOVENIE OLEJOV A TUKOV 1. Účel a oblasť Táto metóda je určená na stanovenie olejov a tukov v krmivách. Nevzťahuje sa na analýzu olejnatých semien a olejnatých plodov. Použitie týchto dvoch nižšie uvedených postupov závisí od charakteru a zloženia krmív a dôvodu, prečo sa analýza vykonáva. 1.1. Postup A – priamo extrahovateľné oleje a tuky Táto metóda sa uplatňuje na kŕmne suroviny rastlinného pôvodu okrem tých, na ktoré sa vzťahuje postup B. 1.2. Postup B – celkové oleje a tuky Táto metóda sa uplatňuje na kŕmne suroviny živočíšneho pôvodu a na všetky kŕmne zmesi. Používa sa aj pri všetkých materiáloch, z ktorých sa oleje a tuky nedajú úplne vyextrahovať bez predchádzajúcej hydrolýzy (napr. glutény, kvasnice, zemiakové bielkoviny a produkty, ktoré boli spracované postupom ako extrúzia, vločkovanie a zahrievanie). 1.3. Interpretácia výsledkov Vo všetkých prípadoch, keď sa postupom B dosiahne vyšší výsledok ako postupom A, sa za správnu hodnotu považuje výsledok získaný postupom B. 2. Podstata metódy 2.1. Postup A Vzorka sa extrahuje petroléterom. Rozpúšťadlo sa oddestiluje a zvyšok sa vysuší a odváži. 2.2. Postup B Vzorka sa upravuje kyselinou chlorovodíkovou za varu. Zmes sa ochladí a prefiltruje. Zvyšok sa premýva a vysuší a postúpi na stanovenie podľa postupu A. 3. Chemikálie 3.1. Petroléter, rozpätie bodu varu: 40 až 60 oC. Hodnota brómového čísla musí byť nižšia ako 1 a zvyšok po odparení menej ako 2 mg/100 ml. 3.2. Síran sodný, bezvodý. 3.3. Kyselina chlorovodíková, c = 3 mol/l 3.4. Filtračná pomôcka, napr. Kieselguhr, Hyflo-supercel. 4. Prístrojové vybavenie 4.1. Prístroj na extrakciu. Ak je vybavený sifónom (Soxhletov prístroj), prietoková rýchlosť musí byť taká, aby vykazovala 10 cyklov za hodinu; ak ide o zariadenie bez sifónu, prietoková rýchlosť musí byť 10 ml za minútu. 4.2. Extrakčné patróny, ktoré neobsahujú látky rozpustné v petroléteri a ktoré majú priepustnosť v súlade s požiadavkami bodu 4.1. 4.3. Sušiareň, buď vákuová nastavená na 75 ± 3 oC, alebo vzduchová nastavená na 100 ± 3 oC. 5. Postup 5.1. Postup A (pozri bod 8.1) Navážte 5 g vzorky s presnosťou na 1 mg, preneste ju do extrakčnej patróny (4.2) a prikryte kúskom beztukovej vaty. Vložte patrónu do extraktora (4.1) a extrahujte šesť hodín petroléterom (3.1). Zachyťte extrakt petroléteru v suchej odváženej banke s obsahom zrniečok pemzy (2). Oddestilujte rozpúšťadlo. Sušte zvyšok, ktorý zostal v banke, jeden a pol hodiny v sušiarni (4.3). Nechajte vychladnúť v exsikátore a odvážte. Opäť sušte 30 minút, čím sa zabezpečí, že hmotnosť olejov a tukov zostane konštantná (strata hmotnosti medzi dvomi po sebe nasledujúcimi váženiami musí byť menšia alebo rovná 1 mg). 5.2. Postup B Navážte 2,5 g vzorky s presnosťou na 1 mg (pozri bod 8.2), vložte do 400 ml kadičky alebo do 300 ml Erlenmayerovej banky a pridajte 100 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.3) a zrniečka pemzy. Kadičku prikryte hodinovým sklíčkom alebo na Erlenmayerovu banku nasaďte spätný chladič. Uveďte zmes do mierneho varu na slabom ohni alebo vyhrievacej platni a varte jednu hodinu. Zabráňte prilepeniu vzorky na steny nádobky. Ochlaďte a pridajte také množstvo filtračnej pomôcky (3.4), ktoré bude dostatočné na zabránenie akýmkoľvek stratám oleja a tuku počas filtrácie. Prefiltrujte cez navlhčený, beztukový, dvojitý filtračný papier. Zvyšok premývajte studenou vodou, kým nezískate neutrálny filtrát. Skontrolujte, či filtrát neobsahuje oleje a tuky. Ich prítomnosť znamená, že sa vzorka pred hydrolýzou musí extrahovať petroléterom podľa postupu A. Položte dvojitý filtračný papier obsahujúci zvyšok na hodinové sklíčko a sušte jeden a pol hodiny vo vzduchovej sušiarni (4.3) pri teplote 100 oC ± 3 oC. Vložte dvojitý filtračný papier obsahujúci suché zvyšky do extrakčnej patróny (4.2) a prikryte kúskom beztukovej vaty. Patrónu vložte do extraktora (4.1) a postupujte tak, ako je uvedené v druhom a treťom odseku bodu 5.1. 6. Vyjadrenie výsledkov Vyjadrite hmotnosť zvyšku ako percento zo vzorky. 7. Opakovateľnosť Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení uskutočnených z tej istej vzorky tým istým analytikom nesmie presiahnuť: — 0,2 % v absolútnej hodnote pre obsahy olejov a tukov pod 5 %, — 4,0 % relatívnych z hodnoty vyššieho výsledku pri obsahoch od 5 do 10 %, — 0,4 % v absolútnej hodnote pre obsahy nad 10 %. 8. Poznámky 8.1. Pri produktoch s vysokým obsahom olejov a tukov, ktoré sa obtiažne drvia alebo sú nevhodné na získanie homogénnej redukovanej skúšobnej vzorky, postupujte podľa tohto postupu: Navážte 20 g vzorky s presnosťou na 1 mg a zmiešajte s 10 alebo viac gramami bezvodého síranu sodného (3.2). Extrahujte petroléterom (3.1) podľa bodu 5.1. Získaný extrakt doplňte na 500 ml petroléterom (3.1) a premiešajte. Odoberte 50 ml roztoku a vložte do malej, suchej, odváženej banky obsahujúcej zrniečka pemzy. Rozpúšťadlo oddestilujte, vysušte a postupujte spôsobom uvedeným v poslednom odseku bodu 5.1. Odstráňte rozpúšťadlo z extrakčného zvyšku, ktorý zostal v patróne, zvyšok rozdrvte na jemnosť 1 mm, vráťte do extrakčnej patróny (nepridávajte síran sodný) a postupujte spôsobom uvedeným v druhom a treťom odseku bodu 5.1. Vypočítajte obsah olejov a tukov ako percento vzorky s pomocou tohto vzorca: (10 m1 + m2) × 5 kde: m1 = hmotnosť zvyšku v gramoch po prvej extrakcii (alikvotná časť extraktu), m2 = hmotnosť zvyšku v gramoch po druhej extrakcii. 8.2. V prípade produktov s nízkym obsahom olejov a tukov sa môže množstvo skúšobnej vzorky zvýšiť na 5 g. 8.3. V prípade krmív pre spoločenské zvieratá s vysokým obsahom vody sa môže stať, že ich bude treba zmiešať s bezvodým síranom sodným ešte pred hydrolýzou a extrakciou podľa postupu B. 8.4. V odseku 5.2 môže byť na premytie zvyšku po filtrácii efektívnejšie použiť horúcu vodu namiesto studenej. 8.5. V prípade niektorých krmív môže byť potrebné 1,5 hodinovú dobu sušenia predĺžiť. Vyhnite sa nadmernému sušeniu, keďže to môže viesť k nízkym výsledným hodnotám. Je možné použiť aj mikrovlnnú rúru. 8.6. Ak je obsah oleja/tuku vyšší ako 15 %, tak sa odporúča predbežná extrakcia podľa postupu A pred hydrolýzou a reextrakcia podľa postupu B. Závisí to do určitej miery od charakteru krmiva a od charakteru oleja/tuku v krmive. I. STANOVENIE VLÁKNINY 1. Účel a oblasť Táto metóda umožňuje stanoviť beztukové organické látky v krmivách, ktoré sú nerozpustné v kyslom a zásaditom prostredí a bežne sa označujú ako vláknina. 2. Podstata metódy Vzorka, v prípade potreby odtučnená, sa postupne rozkladá vriacimi roztokmi kyseliny sírovej a hydroxidu draselného v predpísaných koncentráciách. Zvyšok sa oddelí filtráciou na sklenenej frite, premyje, vysuší, odváži a spopolní pri teplote 475 až 500 oC. Úbytok hmotnosti v dôsledku spopolnenia zodpovedá vláknine prítomnej v skúšobnej vzorke. 3. Chemikálie 3.1. Kyselina sírová, c = 0,13 mol/l 3.2. Protipeniace činidlo (napr. n-oktanol) 3.3. Filtračná pomôcka (Celit 545 alebo ekvivalentná) žíhaná 4 hodiny pri teplote 500 oC (8.6) 3.4. Acetón 3.5. Petroléter s rozpätím bodu varu od 40 do 60 oC 3.6. Kyselina chlorovodíková, c = 0,5 mol/l 3.7. Roztok hydroxidu draselného c = 0,23 mol/l 4. Prístrojové vybavenie 4.1. Vyhrievacia jednotka určená na rozklad kyselinou sírovou a roztokom hydroxidu draselného vybavená držiakom na filtračný téglik (4.2) a výstupnou rúrkou s kohútom na vypustenie kvapaliny a vákua, podľa možnosti so stlačeným vzduchom. Pred použitím jednotku každý deň predhrievajte vriacou vodou počas piatich minút. 4.2. Sklenený filtračný téglik so sklenenou filtračnou fritou s veľkosťou pórov 40 – 90 μm. Pred prvým použitím žíhajte niekoľko minút pri teplote 500 oC a nechajte vychladnúť (8.6). 4.3. Valec s objemom najmenej 270 ml so spätným chladičom, vhodný na varenie. 4.4. Sušiareň s termostatom. 4.5. Muflová pec s termostatom. 4.6. Extrakčná jednotka s podpornou platňou na filtračný téglik (4.2) a vypúšťacím potrubím s kohútom na uvoľňovanie vákua a vypúšťanie kvapaliny. 4.7. Spojovacie krúžky na spájanie vyhrievacej jednotky (4.1), téglika (4.2) a valca (4.3) a na pripojenie jednotky na extrakciu za studena (4.6) a téglika. 5. Postup Navážte 1 g pripravenej vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte do téglika (4.2) (pozri poznámky 8.1, 8.2 a 8.3) a pridajte 1 g filtrovacej pomôcky (3.3). Spojte vyhrievaciu jednotku (4.1) a filtračný téglik (4.2), potom pripojte k tégliku valec (4.3). Nalejte 150 ml vriacej kyseliny sírovej (3.1) do valca spojeného s téglikom a v prípade potreby pridajte niekoľko kvapiek protipeniaceho činidla (3.2). Uveďte tekutinu do varu v priebehu 5 ± 2 minút a prudko varte po dobu presne 30 minút. Otvorte kohút na vypúšťacom potrubí (4.1) a vo vákuu filtrujte kyselinu sírovú cez filtračný téglik a zvyšok premyte tromi po sebe nasledujúcimi 30 ml dávkami vriacej vody. Presvedčte sa, že zvyšok je prefiltrovaný po každom premytí dosucha. Zatvorte výpustný kohút a nalejte 150 ml vriaceho roztoku hydroxidu draselného (3.7) do valca spojeného s téglikom a pridajte niekoľko kvapiek protipeniaceho činidla (3.2). Uveďte tekutinu do varu v priebehu 5 ± 2 minút a prudko varte po dobu presne 30 minút. Prefiltrujte a zopakujte postup premývania použitý pri kroku s kyselinou sírovou. Po poslednom premytí a vysušení odpojte téglik a jeho obsah a znovu pripojte k jednotke na extrakciu za studena (4.6). Vytvorte vákuum a premyte zvyšok v tégliku tromi po sebe nasledujúcimi 25 ml dávkami acetónu (3.4) a presvedčte sa, či bol zvyšok po každom premytí prefiltrovaný dosucha. Vysušte téglik na konštantnú hmotnosť v sušiarni pri teplote 130 oC. Po každom vysušení nechajte vychladnúť v exsikátore a rýchlo odvážte. Umiestnite téglik do muflovej pece a spopolňujte na konštantnú hmotnosť (strata hmotnosti medzi dvoma po sebe nasledujúcimi váženiami musí byť nižšia alebo rovná 2 mg) pri teplote 475 oC až 500 oC po dobu najmenej 30 minút. Po každom zahriatí najskôr nechajte vychladnúť v peci a potom v exsikátore pred vážením. Vykonajte slepý pokus bez vzorky. Strata hmotnosti v dôsledku spopolňovania nesmie presiahnuť 4 mg. 6. Výpočet výsledkov Obsah vlákniny ako percento vzorky je daný týmto vzorcom: kde: m = hmotnosť vzorky v g, m0 = strata hmotnosti po spopolnení počas stanovenia, v g, m1 = strata hmotnosti po spopolnení počas slepého pokusu, v g. 7. Opakovateľnosť Rozdiel medzi dvoma paralelnými stanoveniami vykonanými v tej istej vzorke nesmie presiahnuť: — 0,6 % v absolútnej hodnote pr