PRÍLOHA X

STANOVOVANIE METYLESTEROV MASTNÝCH KYSELÍN PLYNOVOU CHROMATOGRAFIOU

1. OBLASŤ

Táto príloha poskytuje usmernenia týkajúce sa chromatografického stanovenia voľných a viazaných mastných kyselín v rastlinných tukoch a olejoch po ich konverzii na metylestery mastných kyselín (fatty acid methyl esters, FAME).

Viazané mastné kyseliny triglyceridov (TAG) a v závislosti od metódy esterifikácie voľné mastné kyseliny (free fatty acids, FFA) sa konvertujú na metylestery mastných kyselín, ktoré sa stanovujú kapilárnou plynovou chromatografiou.

Metóda opísaná v tejto prílohe umožňuje stanovenie FAME z C12 až C24 vrátane metylesterov nasýtených, cis- a trans-mononenasýtených a cis- a trans-polynenasýtených mastných kyselín.

2. PRINCÍP

Plynová chromatografia (gas chromatography, GC) sa používa na kvantitatívnu analýzu FAME. FAME sa pripravujú podľa časti A. Potom sa vstreknú do injektora a odparia sa v ňom. Oddelenie FAME sa vykonáva na analytických kolónach so špecifickou polaritou a dĺžkou. Na stanovenie FAME sa používa plameňovoionizačný detektor (Flame Ionisation Detector, FID). Podmienky analýzy sú uvedené v časti B.

V rámci plynovej chromatografie FAME s FID sa ako nosný plyn môžu použiť vodík alebo hélium (mobilná fáza). Vodík zrýchľuje oddeľovanie a zabezpečuje ostrejšie píky. Stacionárna fáza je mikroskopická vrstva tenkého tekutého povlaku na inertnom pevnom povrchu z kremenného skla.

Analyzované odparené zlúčeniny reagujú pri prechode kapilárnou kolónou so stacionárnou fázou, ktorá sa nachádza na vnútornom povrchu kolóny. V dôsledku tohto rozdielneho vzájomného pôsobenia rôznych zlúčenín sa eluujú v rozličnom čase, ktorý sa nazýva retenčný čas zlúčeniny pre daný súbor parametrov analýzy. Porovnanie retenčných časov sa používa na určenie jednotlivých zlúčenín.

ČASŤ A

PRÍPRAVA METYLESTEROV MASTNÝCH KYSELÍN Z OLIVOVÉHO OLEJA A OLEJA Z OLIVOVÝCH VÝLISKOV

1. OBLASŤ

V tejto časti je uvedená príprava metylesterov mastných kyselín. Zahŕňa metódy prípravy metylesterov mastných kyselín z olivového oleja a oleja z olivových výliskov.

2. PÔSOBNOSŤ

Príprava metylesterov mastných kyselín z olivového oleja a oleja z olivových výliskov sa vykonáva transesterifikáciou s metanolovým roztokom hydroxidu draselného pri izbovej teplote. Nevyhnutnosť purifikácie vzorky pred transesterifikáciou závisí od obsahu voľných mastných kyselín vo vzorke a od parametra, ktorý sa má určiť v rámci analýzy, rozhodnúť sa dá podľa tejto tabuľky:

Kategória oleja Metóda Panenský olivový olej s kyslosťou ≤ 2,0 % 1. Mastné kyseliny 2. trans-mastné kyseliny 3. ΔECN42 (po purifikácii so silika gelom SPE) Rafinovaný olivový olej Olivový olej zložený z rafinovaných a panenských olivových olejov Rafinovaný olej z olivových výliskov Olej z olivových výliskov Panenský olivový olej s kyslosťou > 2,0 % Surový olej z olivových výliskov 1. Mastné kyseliny (po purifikácii so silika gelom SPE) 2. trans-mastné kyseliny (po purifikácii so silika gelom SPE) 3. ΔECN42 (po purifikácii so silika gelom SPE)

3. METODIKA

3.1. Transesterifikácia s metanolovým roztokom hydroxidu draselného pri izbovej teplote.

3.1.1. Princíp

Metylestery sa vytvárajú transesterifikáciou s metanolovým hydroxidom draselným ako medzistupeň pred zmydelnením.

3.1.2. Činidlá

3.1.2.1. Metanol obsahujúci maximálne 0,5 % (m/m) vody.

3.1.2.2. Hexán, chromatografickej kvality.

3.1.2.3. Heptán, chromatografickej kvality.

3.1.2.4. Dietyléter, stabilizovaný na analýzu.

3.1.2.5. Acetón, chromatografickej kvality.

3.1.2.6. Elučné rozpúšťadlo na purifikáciu oleja prostredníctvom chromatografie s použitím kolóny/SPE, zmes hexán/dietyléter 87/13 (v/v).

3.1.2.7. Hydroxid draselný, približne 2M metanolový roztok: rozpustite 11,2 g hydroxidu draselného v 100 ml metanolu.

3.1.2.8. Silikagélové patróny, 1 g (6 ml), na extrakciu tuhou fázou.

3.1.3. Prístrojové vybavenie

3.1.3.1. Skúmavky so závitovým uzáverom (objem 5 ml) s PTFE spojom.

3.1.3.2. Odmerné alebo automatické pipety, 2 ml a 0,2 ml.

3.1.4. Purifikácia vzoriek olejov

V prípade potreby sa vzorky vyčistia prechodom oleja cez silikagelové patróny na extrakciu tuhou fázou. Silikagelová patróna (3.1.2.8) sa vloží do vákuového elučného zariadenia a premyje sa 6 ml hexánu (3.1.2.2); premytie sa vykonáva bez vákua. Roztok oleja (približne 0,12 g) v 0,5 ml hexánu (3.1.2.2) sa zavedie do kolóny. Po prechode cez kolónu sa následne nechá eluovať pomocou 10 ml zmesi hexán/dietyléter (87:13 v/v) (3.1.2.6). Kombinované eluáty sa homogenizujú a rozdelia na dva podobné objemy. Alikvotná časť sa odparí dosucha v rotačnej odparke pod nižším tlakom pri izbovej teplote. Zvyšok sa rozpustí v 1 ml heptánu a roztok je pripravený na analýzu mastných kyselín prostredníctvom GC. Prípadne sa odparí druhá alikvotná časť a zvyšok sa rozpustí v 1 ml acetónu na analýzu triglyceridov prostredníctvom HPLC.

3.1.5. Postup

V 5 ml skúmavke so závitovým uzáverom (3.1.3.1) odvážte približne 0,1 g vzorky oleja. Pridajte 2 ml heptánu (3.1.2.2) a pretrepávajte. Pridajte 0,2 ml metanolového roztoku hydroxidu draselného (3.1.2.7), nasaďte uzáver s PTFE spojom, uzáver zatiahnite a 30 sekúnd dôkladne pretrepávajte. Nechajte odstáť, kým sa vrchná vrstva nevyčíri. Zlejte vrchnú vrstvu obsahujúcu metylestery. Heptánový roztok je pripravený na vstreknutie do plynového chromatografu. Roztok by sa mal do analýzy plynovou chromatografiou uchovávať v chladničke. Skladovanie roztoku viac než 12 hodín sa neodporúča.

ČASŤ B

ANALÝZA METYLESTEROV MASTNÝCH KYSELÍN PLYNOVOU CHROMATOGRAFIOU

1. OBLASŤ

Táto časť poskytuje všeobecné usmernenia týkajúce sa používania kapilárnej plynovej chromatografie na určenie kvalitatívneho a kvantitatívneho zloženia zmesi metylesterov mastných kyselín získaných v súlade s metódou uvedenou v časti A.

Táto časť sa na nevzťahuje na polymerizované mastné kyseliny.

2. ČINIDLÁ

2.1. Nosný plyn

Inertný plyn (hélium alebo vodík), dokonale vysušený a s obsahom kyslíka menším ako 10 mg/kg.

Poznámka 1: Vodík môže dvojnásobne urýchliť analýzu, ale je nebezpečný. Sú k dispozícii bezpečnostné zariadenia.

2.2. Pomocné plyny

2.2.1. Vodík (čistota ≥ 99,9 %), bez organických nečistôt.

2.2.2. Vzduch alebo kyslík, bez organických nečistôt.

2.2.3. Dusík (čistota > 99 %).

2.3. Referenčný štandard

Zmes metylesterov čistých mastných kyselín alebo metylesterov tuku známeho zloženia, najlepšie podobného zloženia ako tuková látka na analýzu. Na určenie trans-izomérov nenasýtených kyselín sú užitočné cis- a trans-izoméry metylesterov kyseliny oktadecénovej, oktadekadiénovej a oktadekatriénovej.

Je potrebné dbať na to, aby sa zabránilo oxidácii polynenasýtených mastných kyselín.

3. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE

Uvedené pokyny sa týkajú bežného vybavenia používaného v plynovej chromatografii, využívajúceho kapilárne kolóny a plameňovoionizačný detektor.

3.1. Plynový chromatograf

Plynový chromatograf sa skladá z týchto prvkov:

3.1.1. Injekčný systém

Použite niektorý z injekčných systémov s kapilárnymi kolónami, v tomto prípade by mal byť injekčný systém určený iba na použitie s takýmito kolónami. Môže to byť split (s delením) typ alebo splitless (bez odfuku) on-column injektor.

3.1.2. Pec

Pec musí byť schopná vyhrievať kapilárnu kolónu na teplotu aspoň 260 °C a udržiavať požadovanú teplotu v rozmedzí 0,1 °C. Táto druhá požiadavka je obzvlášť dôležitá pri trubiciach z kremenného skla.

Vo všetkých prípadoch sa odporúča teplotne programovateľné vyhrievanie a to najmä pre mastné kyseliny s menej ako 16 uhlíkovými atómami.

3.1.3. Kapilárna kolóna

3.1.3.1. Trubica vyrobená z materiálu nereagujúceho s látkami, ktoré sa majú analyzovať (obvykle zo skla alebo z kremenného skla). S vnútorným priemerom 0,2 až 0,32 mm. Vnútorný povrch musí pred nanesením stacionárnej fázy prejsť náležitou úpravou (napr. preparáciou povrchu, deaktiváciou). Pre mastné kyseliny a cis- a trans-izoméry mastných kyselín je dostatočná dĺžka 60 m.

3.1.3.2. Stacionárna fáza, vhodné sú kolóny z polárneho polysiloxánu (kyanopropylsilikónu) s krížom viazanými väzbami.

Poznámka 2: Existuje riziko, že polárne polysiloxány môžu spôsobiť ťažkosti pri určovaní a oddeľovaní kyseliny linolénovej a C20 kyselín.

Nanesené vrstvy musia byť tenké, t. j. 0,1 až 0,2 μm.

3.1.3.3. Montáž a kondiciovanie kolóny

Pri montáži kapilárnych kolón dodržte obvyklé opatrenia, t. j. umiestnenie kolóny v peci (držiak), výber a montáž spojov (tesnosť), umiestnenie koncov kolóny v injektore a detektore (redukcia mŕtvych objemov). Uložte kolónu pod prietok nosného plynu [napr. 0,3 bar (30 kPa), v prípade kolóny dĺžky 25 mm a s vnútorným priemerom 0,3 mm].

Kondiciujte kolónu v peci s teplotou nastavovanou na 3 °C/min od teploty prostredia až na teplotu 10 °C pod limitom dekompozície stacionárnej fázy. Udržujte pec na tejto teplote jednu hodinu až do stabilizácie základu. Vráťte teplotu na 180 °C, aby ste pracovali v izotermálnych podmienkach.

Poznámka 3: Vhodné pre-kondiciované kolóny sú dostupné v obchodnej sieti.

3.1.4. Plameňovoionizačný detektor a prevodník-zosilňovač

3.2. Striekačka

Striekačka má maximálnu kapacitu 10 μl, delenú po 0,1 μl.

3.3. Systém získavania údajov

Systém získavania údajov spojený online s detektormi a používaný so softvérovým programom vhodným na integráciu a normalizáciu píkov.

4. POSTUP

Operácie opísané v bodoch 4.1 až 4.3 sa vzťahujú na používanie plameňovoionizačného detektora.

4.1. Podmienky testovania

4.1.1. Výber optimálnych prevádzkových podmienok pre kapilárne kolóny

Vzhľadom na účinnosť a priepustnosť kapilárnych kolón závisí oddeľovanie zložiek a trvanie analýzy vo veľkej miere od prietoku nosného plynu cez kolónu. Preto bude potrebné optimalizovať prevádzkové podmienky úpravou tohto parametra (alebo straty na vstupe kolóny) v závislosti od toho, či je cieľom zlepšenie oddeľovania alebo zrýchlenie analýzy.

Tieto podmienky sa ukázali byť vhodné pre oddelenie FAME (C4 až C26). Príklady chromatogramov sú uvedené v dodatku B:

Teplota injektora: 250 °C Teplota detektora: 250 °C Teplota pece: 165 °C (8 min) až 210 °C pri 2 °C/min Nosný plyn – vodík: tlak na vstupe kolóny 179 kPa Celkový prietok: 154,0 ml/min; Deliaci pomer: 1:100 Objem nástreku: 1 μl

4.1.2. Stanovenie rozlíšenia (pozri dodatok A)

Vypočítajte rozlíšenie, R, dvoch susediacich píkov I a II s použitím vzorca:

R = 2 × ((dr ( II ) – d r(I))/(ω(I) + ω(II))) alebo R = 2 × ((tr ( II ) – t r(I))/(ω(I) + ω(II))) (USP) (liekopis USA)

alebo

R = 1,18 × ((tr ( II ) – tr(I))/( ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB) JP (japonský liekopis), EP (európsky liekopis), BP (liekopis UK)

kde:

d r(I) je retenčná vzdialenosť píku I;

d r(II) je retenčná vzdialenosť píku II;

t r(I) je retenčný čas píku I;

t r(II) je retenčný čas píku II;

ω(I) je šírka základu píku I;

ω(II) je šírka základu píku II;

ω0,5 je šírka píku špecifikovanej zlúčeniny, pri strednej výške píku;

Ak ω(I) ≈ ω(II), vypočítajte R s použitím týchto vzorcov:

R = (dr ( II ) – d r(I))/ω = (dr ( II ) – d r(I))/4σ

kde:

σ je štandardná odchýlka (pozri dodatok A, obrázok 1).

Ak sa vzdialenosť dr medzi dvoma píkmi d r(II) – d r(I) rovná 4σ, faktor rozlíšenia R = 1.

Ak sa dva píky úplne neoddelia, tangenty inflexných bodov dvoch píkov sa pretínajú v bode C. Aby sa oba píky úplne oddelili, vzdialenosť medzi nimi musí byť:

d r(II) – d r(I) = 6 σ odkiaľ R = 1,5 (pozri dodatok A, obrázok 3).

5. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

5.1. Kvalitatívna analýza

Určite píky metylesterov vzorky z chromatogramu v dodatku B (obrázok 1), podľa potreby interpoláciou alebo porovnaním s píkmi referenčných zmesí metylesterov (ako je opísané v bode 2.3).

5.2. Kvantitatívna analýza

5.2.1. Stanovenie zloženia

Vypočítajte hmotnostný zlomok w i jednotlivých metylesterov mastných kyselín, vyjadrený ako percento hmotnosti metylesterov, takto:

5.2.2. Metóda výpočtu

5.2.2.1. Všeobecný prípad

Vypočítajte obsah danej zložky i, vyjadrený ako percento hmotnosti metylesterov, stanovením percenta predstavujúceho plochu príslušného píku vzťahujúceho sa k sume plôch všetkých píkov, pomocou nasledujúceho vzorca:

wi = (Ai/ΣA) × 100

kde:

Ai je plocha pod píkom individuálneho metylesteru mastnej kyseliny i;

ΣA je suma plôch pod všetkými píkmi všetkých individuálnych metylesterov mastných kyselín.

Výsledky sú vyjadrené na dve desatinné miesta.

Poznámka 4: Pokiaľ ide o tuky a oleje, hmotnostný zlomok metylesterov mastných kyselín sa rovná hmotnostnému zlomku triglyceridov v gramoch na 100 g. V prípade, keď tento predpoklad nie je povolený, pozri bod 5.2.2.2.

5.2.2.2. Použitie korekčných faktorov

V niektorých prípadoch, napríklad za prítomnosti mastných kyselín s menej ako 8 atómami uhlíka alebo kyselín so sekundárnou skupinou plochy, by sa plochy mali upraviť špecifickými korekčnými faktormi (Fci). Tieto faktory sa určia pre každý jeden prístroj. Na tento účel sa použijú vhodné referenčné materiály s certifikovaným zložením mastných kyselín v zodpovedajúcom rozsahu.

Poznámka 5: Tieto korekčné faktory nie sú identické s teoretickými korekčnými faktormi FID, ktoré sú uvedené v dodatku A, keďže zahŕňajú aj výkonnosť injekčného systému atď. V prípade väčších rozdielov by sa však mala kontrolovať výkonnosť celého systému.

Pri tejto porovnávacej zmesi je hmotnostné percento FAME i vyjadrené vzorcom:

wi = (mi /Σm) × 100

kde

m i je hmotnosť FAME i v porovnávacej zmesi;

Σm je súčet hmotností rôznych zložiek ako FAME v porovnávacej zmesi.

Z chromatogramu porovnávacej zmesi vypočítajte percento plochy pre FAME i takto:

wi = (Ai/ΣA) × 100

kde:

Ai je plocha FAME i v porovnávacej zmesi;

ΣA je súčet všetkých plôch všetkých FAME porovnávacej zmesi.

Korekčný faktor Fc je potom

Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm)

Pokiaľ ide o vzorku, hmotnostné percento každého FAME i je:

wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai)

Výsledky sú vyjadrené na dve desatinné miesta.

Poznámka 6: Vypočítaná hodnota zodpovedá hmotnostnému percentu jednotlivých mastných kyselín vypočítanému ako triglyceridy na 100 g tuku.

5.2.2.3. Použitie vnútorného štandardu

Pri niektorých analýzach (napr. ak nie sú kvantifikované všetky mastné kyseliny, keď sú napríklad spolu s kyselinami so 16 alebo 18 uhlíkmi prítomné kyseliny so štyrmi alebo šiestimi uhlíkmi alebo keď je potrebné vo vzorke určiť absolútne množstvo mastnej kyseliny) je potrebné použiť vnútorný štandard. Často sa používajú mastné kyseliny s 5, 15 alebo so 17 uhlíkmi. Mal by sa určiť korekčný faktor (podľa potreby) pre vnútorný štandard.

Hmotnostné percento zložky i, vyjadrené ako metylester, je potom dané vzorcom:

wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS)

kde:

A i je plocha FAME i;

A IS je plocha vnútorného štandardu;

F i je korekčný faktor i mastnej kyseliny, vyjadrený ako FAME;

F IS je korekčný faktor vnútorného štandardu;

m je hmotnosť testovanej vzorky, v miligramoch;

m IS je hmotnosť vnútorného štandardu, v miligramoch.

Výsledky sú vyjadrené na dve desatinné miesta.

6. SPRÁVA O VÝSLEDKU TESTU

V správe o výsledku testu sa uvádzajú metódy použité na prípravu metylesterov a na plynovú chromatografickú analýzu. Uvádzajú sa v nej aj všetky podrobnosti o pracovnom postupe, ktoré neboli uvedené v tejto štandardnej metóde alebo sa považovali za nepovinné, spolu s podrobnosťami o akomkoľvek sprievodnom jave, ktorý mohol ovplyvniť výsledky.

Správa o výsledku testu zahŕňa všetky informácie potrebné na úplnú identifikáciu vzorky.

7. PRESNOSŤ

7.1. Výsledky medzilaboratórnej skúšky

Podrobnosti medzilaboratórnej skúšky týkajúce sa presnosti metódy sú uvedené v prílohe C k norme IOC/T.20/Doc. No 33. Hodnoty odvodené z tejto medzilaboratórnej skúšky sa nesmú vzťahovať na iné rozsahy a matrice koncentrácie než tie, ktoré sú dané.

7.2. Opakovateľnosť

Absolútny rozdiel medzi dvoma nezávislými výsledkami jednotlivých testov získanými s použitím rovnakej metódy na rovnakom skúšobnom materiáli v rovnakom laboratóriu rovnakým analytikom s použitím rovnakého vybavenia v rámci krátkeho časového intervalu nie je vo viac ako 5 % prípadov väčší ako r uvedené v tabuľkách 1 až 14 v prílohe C k norme IOC/T.20/Doc. No 33.

7.3. Reprodukovateľnosť

Absolútny rozdiel medzi dvoma nezávislými výsledkami jednotlivých testov získanými s použitím rovnakej metódy na rovnakom skúšobnom materiáli v inom laboratóriu iným analytikom s použitím iného vybavenia nie je vo viac ako 5 % prípadov väčší ako R uvedené v tabuľkách 1 až 14 v prílohe C k norme IOC/T.20/Doc. No 33.

Dodatok A Obrázok 1 So šírkou ω0,5 v polovičnej výške trojuholníka (ABC) a šírkou b v polovičnej výške trojuholníka (NPM). Obrázok 2 Obrázok 3