2.

Dopĺňa sa táto časť D: „D. Metóda magnetického miešania pri trávení súhrnných vzoriek/technika ‚izolácia na filtri‘ a detekcia lariev latexovým aglutinačným testom Táto metóda sa považuje za rovnocennú len pri testovaní mäsa domácich ošípaných. 1. Prístroje a činidlá a) nôž alebo nožnice a pinzety na rezanie vzoriek; b) podnosy s vyznačenými 50 štvorcami, kde každý štvorec môže obsiahnuť približne 2 g vzorky mäsa, alebo iné pomôcky poskytujúce rovnocenné záruky, pokiaľ ide o vysledovateľnosť vzoriek; c) homogenizátor s ostrou čepeľou na rezanie. Ak sú vzorky väčšie ako 3 g, musí sa použiť mlynček na mäso s otvormi 2 až 4 mm alebo nožnice. V prípade mrazeného mäsa alebo jazyka (po odstránení povrchovej vrstvy, ktorá sa nedá stráviť) je potrebný mlynček na mäso a veľkosť vzorky sa musí výrazne zväčšiť; d) magnetické miešačky s termostaticky regulovanou vyhrievacou platňou a miešacími tyčinkami potiahnutými teflónom s dĺžkou približne 5 cm; e) sklené kadičky s objemom 3 litre; f) sitá s veľkosťou ôk 180 mikrónov s vonkajším priemerom 11 cm, so sieťou z nehrdzavejúcej ocele; g) oceľový filtračný prístroj na filtre s veľkosťou ôk 20 μm s oceľovým lievikom; h) vákuová pumpa; i) kovové alebo umelé nádoby s objemom 10 až 15 litrov na zber tráviacej šťavy; j) otáčavá trepačka 3D; k) hliníková fólia; l) 25 % kyselina chlorovodíková; m) pepsín, koncentrácia: 1: 10 000 NF (US National Formulary - Národný liekopis USA), ktorá zodpovedá 1: 12 500 BP (British Pharmacopoeia – Britský liekopis) a 2 000 FIP (International Pharmaceutical Federation – Medzinárodná farmaceutická federácia), alebo stabilizovaný kvapalný pepsín obsahujúci minimálne 660 jednotiek European Pharmacopoeia (Európskeho liekopisu)/ml; n) voda z vodovodu zohriata na 46 až 48 °C; o) váhy s presnosťou na 0,1 g; p) pipety s rôznym objemom (1, 10 a 25 ml), mikropipety v súlade s pokynmi výrobcu latexovej aglutinácie a držiaky na pipety; q) nylónové filtre s veľkosťou ôk 20 mikrónov s priemerom, ktorý zodpovedá filtračnému systému; r) plastové alebo oceľové kliešte s veľkosťou 10 – 15 cm; s) kužeľové fľaštičky s objemom 15 ml; t) pistil s teflónovým alebo oceľovým kužeľovým špicom, ktorý pasuje do kužeľových fľaštičiek; u) teplomer s presnosťou 0,5 °C s rozsahom 1 až 100 °C; v) karty latexového aglutinačného testu z testovacej súpravy na detekciu Trichin-L antigen validovanej podľa kódu č. EURLP_D_001/2011; w) tlmivý roztok s konzervačným prostriedkom (roztok na riedenie vzoriek) z testovacej súpravy na detekciu Trichin-L antigen validovanej podľa kódu č. EURLP_D_001/2011; x) tlmivý roztok s pridaným konzervačným prostriedkom (negatívna kontrola) z testovacej súpravy na detekciu Trichin-L antigen validovanej podľa kódu č. EURLP_D_001/2011; y) tlmivý roztok s pridanými antigénmi Trichinella spiralis a konzervačným prostriedkom (pozitívna kontrola) z testovacej súpravy na detekciu Trichin-L antigen validovanej podľa kódu č. EURLP_D_001/2011; z) tlmivý roztok s polystyrenovými časticami potiahnutými protilátkami s pridaným konzervačným prostriedkom (latexové guľôčky) z testovacej súpravy na detekciu Trichin-L antigen validovanej podľa kódu č. EURLP_D_001/2011; aa) tyčinky na jedno použitie. 2. Odber vzoriek Ako sa uvádza v kapitole I bode 2. 3. Postup I. V prípade úplných súhrnných vzoriek (100 g vzoriek súčasne) sa musí postupovať tak, ako je stanovené v písm. a) až i) časti I bodu 3 kapitoly I. Okrem toho sa musí použiť aj tento postup: a) Nylónový filter s veľkosťou ôk 20 mikrónov sa umiestni na filtračný podstavec. Kužeľový filtračný oceľový lievik sa pripevní k podstavcu pomocou držadla a oceľové sitko s veľkosťou ôk 180 mikrónov sa umiestni na lievik. Vákuová pumpa sa pripojí k filtračnému podstavcu a ku kovovej alebo pastovej nádobe na zber tráviacej tekutiny. b) Tráviaca tekutina sa prestane miešať a preleje sa do filtračného lievika cez sitko. Kadička sa prepláchne 250 ml teplej vody. Preplachovacia tekutina sa musí naliať do filtračnej rampy potom, ako sa tráviaca tekutina úspešne prefiltruje. c) Kliešťami sa uchopí filtračná membrána, pričom sa drží za okraj. Filtračná membrána sa preloží najmenej na štyrikrát a vloží do kužeľovej skúmavky s objemom 15 ml. d) Filtračná membrána sa zatlačí na dno kužeľovej skúmavky s objemom 15 ml pomocou pistilu a silno sa pritlačí, pričom sa pistilom, ktorý by mal byť podľa pokynov výrobcu umiestnený na vnútornej strane ohybu filtračnej membrány, nepretržite pohybuje tam a nazad. e) Roztok na riedenie vzoriek sa pipetou pridá do kužeľovej skúmavky s objemom 15 ml a filtračná membrána sa homogenizuje pomocou krátkych opakovaných pohybov pistilu dopredu a dozadu, pričom je podľa pokynov výrobcu potrebné sa vyhnúť prudkým pohybom, aby sa obmedzilo špliechanie. f) Každá vzorka, negatívna kontrola a pozitívna kontrola, sa podľa pokynov výrobcu pipetami nadávkuje do rôznych polí karty aglutinačného testu. g) Pomocou pipety sa podľa pokynov výrobcu latexové guľôčky pridajú do každého poľa karty aglutinačného testu bez toho, aby sa dostali do kontaktu so vzorkou(-ami) a kontrolami. V každom poli sa potom guľôčky jemne miešajú pomocou jednorazovej tyčinky dovtedy, kým celé pole nepokrýva homogénna kvapalina. h) Karta aglutinačného testu sa položí na trepačku 3D a podľa pokynov výrobcu sa pretrepáva. i) Po čase, ktorý je stanovený výrobcom v pokynoch, sa pretrepávanie zastaví a karta aglutinačného testu sa položí na rovný povrch, kde sa odpočítajú výsledky reakcie. V prípade pozitívnej vzorky sa musia objaviť zhluky guľôčok. V prípade negatívnej vzorky zostáva suspenzia homogénna bez zhlukov guľôčok. j) Celé vybavenie v kontakte s mäsom sa musí medzi jednotlivými úkonmi dôkladne dekontaminovať tak, že sa na niekoľko sekúnd ponorí do teplej vody (60 až 90 °C). Povrchy, na ktorých mohli zostať mäsové zvyšky alebo inaktivovaná(-é) larva(-y), sa môžu vyčistiť čistou špongiou a vodou z vodovodu. Po dokončení postupu sa môže pridať niekoľko kvapiek čistiaceho prostriedku na odmastenie zariadenia. Každá časť sa musí niekoľkokrát dôkladne opláchnuť, aby sa odstránili všetky stopy čistiaceho prostriedku. k) Pistil sa musí medzi jednotlivými úkonmi dôkladne dekontaminovať tak, že sa na niekoľko sekúnd ponorí do minimálne 250 ml teplej vody (60 až 90 °C). Zvyšky mäsa alebo inaktivovanej larvy, ktoré mohli zostať na jeho povrchu, sa musia odstrániť čistou špongiou a vodou z vodovodu. Po dokončení postupu sa môže pridať niekoľko kvapiek čistiaceho prostriedku na odmastenie pistilu. Pistil sa musí následne niekoľkokrát dôkladne opláchnuť, aby sa odstránili všetky stopy čistiaceho prostriedku. II. Súhrnná vzorka s objemom menším ako 100 g, ako sa uvádza v kapitole I bode 3 časti II V prípade súhrnných vzoriek s objemom menším ako 100 g sa musí dodržať postup stanovený v kapitole I bode 3 časti II. III. Pozitívne alebo dubiózne výsledky Ak má vyšetrenie kolektívnej vzorky pozitívny alebo neistý výsledok latexového aglutinačného testu, odoberie sa z každej ošípanej v súlade s kapitolou I bodom 2 písm. a) ďalšia vzorka s hmotnosťou 20 g. Dvadsaťgramové vzorky z piatich ošípaných sa spoja a vyšetria pomocou metódy opísanej v bode I. Takto sa musia vyšetriť vzorky z 20 skupín piatich ošípaných. Ak sa dosiahne pozitívny výsledok latexového aglutinačného testu v skupine piatich ošípaných, odoberú sa ďalšie vzorky s hmotnosťou 20 g jednotlivcom v skupine a každá vzorka sa vyšetruje osobitne pomocou jednej z metód opísaných v kapitole I. Na účely konzervácie a identifikácie na úrovni druhov v referenčnom laboratóriu EÚ alebo v národnom referenčnom laboratóriu sa vzorky parazitov musia uchovávať v 90 % etylalkohole. Po odbere parazitov sa musia pozitívne tekutiny dekontaminovať zahriatím na minimálne 60 °C.“