8.

V časti B sa dopĺňajú tieto kapitoly: „B.63 SKRÍNINGOVÝ TEST REPRODUKČNEJ/VÝVOJOVEJ TOXICITY ÚVOD 1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 421 (2016). Usmernenia OECD na testovanie chemikálií sa pravidelne revidujú vzhľadom na vedecký pokrok. Pôvodné usmernenie 421 na vykonávanie skríningových testov bolo prijaté v roku 1995 na základe protokolu pre „Predbežný skríningový test reprodukčnej toxicity“, o ktorom sa diskutovalo na dvoch stretnutiach odborníkov, a to v Londýne v roku 1990 (1) a v Tokiu v roku 1992 (2). 2. Táto testovacia metóda bola doplnená o príslušné sledované parametre endokrinných disruptorov, a to v nadväznosti na činnosť s vysokou prioritou, ktorú začala OECD v roku 1998 s cieľom zrevidovať existujúce usmernenia na vykonávanie testov a vypracovať nové usmernenia na vykonávanie testov na skríning a testovanie potenciálnych endokrinných disruptorov (3). Napríklad usmernenie OECD TG 407 (28-dňová štúdia orálnej toxicity po opakovaných dávkach pri hlodavcoch, kapitola B.7 tejto prílohy) bolo v roku 2008 rozšírené o parametre vhodné na zistenie endokrinného pôsobenia testovaných chemikálií. Cieľom aktualizácie TG 421 bolo zahrnúť niektoré príslušné sledované parametre endokrinných disruptorov do TG týkajúcich sa skríningu, kde časy expozície zahŕňajú niektoré z citlivých období počas vývoja (prenatálne alebo skoré postnatálne obdobie). 3. Tieto vybrané dodatočné príslušné sledované parametre endokrinných disruptorov, ktoré sú zároveň súčasťou TG 443 (Rozšírená jednogeneračná štúdia reprodukčnej toxicity, kapitola B.56 tejto prílohy) boli zahrnuté do TG 421 na základe štúdie uskutočniteľnosti, ktorá sa týkala vedeckých a technických otázok súvisiacich s ich zaradením, ako aj možných úprav koncepcie testu potrebných na ich zaradenie (4). 4. Táto testovacia metóda je navrhnutá tak, aby sa v nej generovali obmedzené informácie týkajúce sa účinkov testovanej chemikálie na samčiu a samičiu reprodukčnú schopnosť, ako sú funkcie pohlavných žliaz, rozmnožovacie správanie, počatie, vývoj zárodku a pôrod. Nie je alternatívou k existujúcim testovacím metódam B.31, B.34, B.35 alebo B.56, ani ich nenahrádza. POČIATOČNÉ ÚVAHY 5. Táto skríningová testovacia metóda sa môže použiť na poskytnutie počiatočných informácií o možných účinkoch na reprodukciu a/alebo vývoj v skorom štádiu posudzovania toxikologických vlastností chemikálií, alebo informácií o predmetných chemikáliách. Môže sa použiť aj ako súčasť súboru počiatočných skríningových testov pri existujúcich chemikáliách, o ktorých je k dispozícii len málo toxikologických informácií alebo nie sú k dispozícii žiadne toxikologické informácie, ako štúdia na zistenie rozsahu dávok pri rozsiahlejších štúdiách o reprodukcii/vývoji, alebo ak sa to inak považuje za relevantné. Pri vykonávaní štúdie je potrebné sa riadiť zásadami a hľadiskami uvedenými v usmerňovacom dokumente OECD č. 19 o uznávaní, posudzovaní a používaní klinických príznakov ako sledovaných parametrov u ľudí v prípade pokusných zvierat používaných pri hodnotení bezpečnosti (5). 6. Táto testovacia metóda neposkytuje úplné informácie o všetkých aspektoch reprodukcie a vývoja. Predovšetkým ponúka len obmedzené prostriedky na zistenie postnatálnych prejavov prenatálnej expozície alebo na zistenie účinkov, ktoré môžu byť vyvolané počas postnatálnej expozície. V dôsledku (okrem iných dôvodov) pomerne malého počtu zvierat v dávkových skupinách, selektívnosti sledovaných parametrov a krátkeho trvania štúdie táto metóda neposkytuje dôkazy na podloženie konečných záverov o neexistencii účinkov. Okrem toho, ak neexistujú údaje z iných testov reprodukčnej/vývojovej toxicity, pozitívne výsledky sú užitočné pri počiatočnom posúdení nebezpečnosti a prispievajú k rozhodnutiam, pokiaľ ide o potrebu a načasovanie ďalšieho testovania. 7. Výsledky získané pomocou parametrov súvisiacich s endokrinným systémom by sa mali posudzovať v kontexte „Koncepčného rámca OECD na testovanie a hodnotenie chemikálií poškodzujúcich endokrinný systém“ (6). V tomto koncepčnom rámci je rozšírené usmernenie OECD TG 421 obsiahnuté na úrovni 4 ako skúška in vivo poskytujúca údaje o nežiaducich účinkoch na príslušné sledované parametre endokrinného systému. Signál endokrinného systému sa však sám osebe nemusí považovať za dostatočný dôkaz, že testovaná chemikália je endokrinným disruptorom. 8. Pri tejto testovacej metóde sa testovaná chemikália podáva orálne. Ak sa použijú iné spôsoby expozície, môžu sa vyžadovať úpravy. 9. Pred použitím tejto testovacej metódy na zmesi s cieľom generovať údaje plánované na regulačné účely by sa malo zvážiť, či môže poskytnúť adekvátne výsledky na tento účel, a ak áno, tak prečo. Takéto úvahy nie sú nutné, pokiaľ existuje regulatórna požiadavka na testovanie danej zmesi. 10. Vymedzenie použitých pojmov sa uvádza v dodatku 1. PRINCÍP TESTU 11. Testovaná chemikália sa podáva viacerým skupinám samčích a samičích pokusných zvierat v odstupňovaných dávkach. Samcom by sa mali dávky podávať najmenej štyri týždne a až do dňa pred naplánovaným usmrtením vrátane tohto dňa (to znamená minimálne dva týždne pred párením, počas obdobia párenia a približne dva týždne po párení). Vzhľadom na obmedzené obdobie podávania dávok pred párením pri samcoch nemôže plodnosť predstavovať osobitný citlivý ukazovateľ testikulárnej toxicity. Z toho dôvodu je dôležité podrobné histologické vyšetrenie semenníkov. Na zistenie väčšiny účinkov na samčiu plodnosť a spermatogenézu sa za dostatočnú kombináciu považuje spojenie dvojtýždňového obdobia podávania dávok pred párením a následných pozorovaní párenia/plodnosti s najmenej štvortýždňovým celkovým obdobím podávania dávok, po ktorom nasleduje podrobná histopatológia samčích pohlavných žliaz. 12. Samiciam by sa mali podávať dávky počas celej štúdie. To zahŕňa dva týždne pred párením (s cieľom pokryť aspoň dva úplné estrálne cykly), variabilný čas do počatia, trvanie gravidity a najmenej trinásť dní po pôrode až do dňa pred naplánovaným usmrtením vrátane tohto dňa. 13. Trvanie štúdie – po aklimatizácii a vyhodnotení estrálneho cyklu pred začatím podávania dávok – závisí od stavu samice a má dĺžku približne 63 dní [najmenej 14 dní pred obdobím párenia, (do) 14 dní obdobia párenia, 22 dní gravidity, 13 dní laktácie]. 14. Počas obdobia podávania sa zvieratá dôkladne pozorujú, pričom sa denne kontroluje prítomnosť toxických príznakov. Pitva sa uskutoční na zvieratách uhynutých alebo usmrtených počas obdobia testovania, ako aj po ukončení testu na zvieratách, ktoré test prežijú. OPIS METÓDY Výber druhov zvierat 15. Táto testovacia metóda je určená na použitie s potkanmi. Ak sa parametre uvedené v rámci tejto testovacej metódy skúmajú pri inom druhu hlodavcov, je potrebné uviesť podrobné odôvodnenie. V rámci medzinárodného programu overovania na zistenie endokrinných disruptorov v usmernení OECD TG 407 (ktoré zodpovedá kapitole B.7 tejto prílohy) sa použili iba potkany. Kmene s nízkou plodnosťou alebo kmene, o ktorých je známe, že majú vysoký výskyt vývojových porúch, by sa nemali používať. Mali by byť použité zdravé panenské zvieratá, ktoré dosiaľ neboli predmetom žiadnych testov. Pokusné zvieratá by mali byť charakterizované, pokiaľ ide o druh, kmeň, pohlavie, hmotnosť a vek. Na začiatku štúdie by mala byť hmotnostná variabilita použitých zvierat minimálna a nemala by presiahnuť 20 % strednej hmotnosti každého pohlavia. Ak sa táto štúdia uskutočňuje ako predbežná štúdia k dlhodobej alebo celogeneračnej štúdii, je lepšie v oboch štúdiách použiť zvieratá toho istého druhu a z toho istého zdroja. Umiestnenie a kŕmenie 16. Všetky postupy musia byť v súlade s miestnymi normami starostlivosti o laboratórne zvieratá. Teplota v miestnosti pre pokusné zvieratá by mala byť 22 °C (±3 °). Aj keď relatívna vlhkosť by mala byť aspoň 30 % a pokiaľ možno, okrem obdobia počas čistenia miestnosti, by nemala prevyšovať 70 %, cieľová relatívna vlhkosť by mala byť 50 – 60 %. Osvetlenie by malo byť umelé a malo by sa striedať 12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. Výber krmiva môže byť ovplyvnený potrebou zabezpečiť vhodnú prímes testovanej chemikálie, keď sa podáva týmto spôsobom. 17. Zvieratá by mali byť umiestnené spolu v malých skupinách rovnakého pohlavia. Ak je to vedecky opodstatnené, zvieratá môžu byť umiestnené samostatne. Pokiaľ ide o umiestnenie skupín do klietok, v jednej klietke by nemalo byť viac ako päť zvierat. Párenie sa uskutoční v klietkach, ktoré sú vhodné na tento účel. Gravidné samice by mali byť jednotlivo umiestnené do klietok a mal by sa im poskytnúť materiál na tvorbu hniezda. Samice v laktácii sa jednotlivo umiestnia do klietok so svojím potomstvom. 18. Krmivo treba pravidelne analyzovať, aby sa zistilo, či neobsahuje kontaminanty. Vzorka krmiva by sa mala zachovať až do dokončenia správy. Príprava zvierat 19. Zdravé, mladé, dospelé zvieratá sa náhodne rozdelia do kontrolných a pokusných skupín. Klietky sa usporiadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné vplyvy spôsobené ich umiestnením. Zvieratá sa jednotlivo označia. Zvieratá sa v klietkach aklimatizujú na laboratórne podmienky najmenej päť dní pred začatím štúdie. Príprava dávok 20. Odporúča sa, aby sa testovaná chemikália podávala orálne, pokiaľ sa iná cesta podania nepokladá za vhodnejšiu. Keď sa zvolí orálna cesta, testovaná chemikália sa obvykle podáva sondou. Alternatívne sa však testované chemikálie môžu podávať v krmive alebo pitnej vode. 21. V prípade potreby sa testovaná chemikália rozpustí alebo suspenduje vo vhodnom nosiči. Odporúča sa, aby sa vždy, keď je to možné, najskôr zvážilo použitie vodného roztoku/suspenzie, potom roztoku/emulzie v oleji (napr. v kukuričnom oleji) a nakoniec použitie prípadného roztoku v iných nosičoch. Pre iné nosiče ako voda majú byť známe toxické vlastnosti nosiča. Mala by sa určiť stabilita a homogenita testovanej chemikálie v nosiči. POSTUP Počet zvierat a ich pohlavie 22. Odporúča sa, aby každá skupina začala najmenej s 10 samcami a 12 – 13 samicami. Pri samiciach sa pred expozíciou vyhodnotí estrálny cyklus a zvieratá, ktoré nevykazujú príznačné 4 – 5-dňové cykly, nebudú zaradené do štúdie. Preto sa odporúča viac samíc, aby na skupinu pripadalo 10 samíc. Očakáva sa, s výnimkou prípadov výrazných toxických účinkov, že takto sa dosiahne počet najmenej 8 gravidných samíc na skupinu, čo je obvykle minimálny prijateľný počet gravidných samíc na skupinu. Cieľom je dosiahnuť dostatočný počet gravidných samíc a potomkov, aby sa zabezpečilo zmysluplné hodnotenie potenciálu testovanej chemikálie pôsobiť na plodnosť, graviditu, materské a dojčenské správanie, ako aj na rast a vývoj potomstva generácie F 1 od počatia po 13. deň po pôrode. Dávkovanie 23. Bežne sa používajú tri testované skupiny a jedna kontrolná skupina. Úrovne dávok môžu vychádzať z informácií z testov akútnej toxicity alebo z výsledkov štúdií s opakovanou dávkou. So zvieratami v kontrolnej skupine sa musí zaobchádzať takisto ako so zvieratami v testovaných skupinách, s výnimkou aplikovania testovanej chemikálie. Ak sa pri podávaní testovanej chemikálie používa nosič, kontrolná skupina dostane nosič v najvyššom používanom objeme. 24. Pri výbere úrovní dávok by sa mali brať do úvahy existujúce údaje o toxicite a (toxiko-) kinetike. Okrem toho by sa malo vziať do úvahy, že môžu existovať rozdiely v citlivosti medzi gravidnými a negravidnými samicami. Najvyššia úroveň dávky sa vyberie tak, aby vyvolala toxické účinky, ale nespôsobila uhynutie zvierat ani vážne utrpenie. Potom sa klesajúca postupnosť úrovní dávok zvolí tak, aby sa preukázala každá odozva na dávku a stanovila sa hladina bez pozorovaného nepriaznivého účinku (NOAEL) pri najnižšej úrovni dávky. Pri stanovení klesajúcich úrovní dávok sú často optimálne intervaly predstavujúce dvoj- až štvornásobok, pričom pridanie štvrtej testovanej skupiny je často vhodnejšie než použitie veľmi veľkých intervalov medzi dávkami (napr. viac než 10-násobku). 25. Ak sa pozoruje všeobecná toxicita (napr. zníženie telesnej hmotnosti, účinky na pečeň, srdce, pľúca alebo obličky atď.) alebo iné zmeny, ktoré nemusia byť toxikologickou reakciou (napr. nižší príjem potravy, zväčšenie pečene), pri interpretácii pozorovaných účinkov na endokrinné citlivé sledované parametre je potrebné postupovať obozretne. Limitný test 26. Ak sa v orálnej štúdii s jednou úrovňou dávky dosahujúcou minimálne 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň alebo, v prípade podávania v krmive alebo pitnej vode, pri rovnakom percentuálnom podiele v krmive alebo pitnej vode s použitím postupov opísaných pre túto štúdiu neprejavia žiadne pozorovateľné toxické účinky a ak sa vzhľadom na údaje o štrukturálne príbuzných látkach toxicita neočakáva, potom sa môže upustiť od úplnej štúdie zahŕňajúcej viaceré úrovne dávok. Limitný test sa neuplatňuje vtedy, keď z expozície ľudí vyplýva, že je potrebné použiť vyššiu orálnu dávku. V prípade iných ciest podania, napr. pri inhalácii alebo dermálnej aplikácii, môžu maximálnu dosiahnuteľnú koncentráciu často určovať fyzikálno-chemické vlastnosti testovaných chemikálií. Podávanie dávok 27. Zvieratám sa podáva testovaná chemikália každý deň, 7 dní v týždni. Ak je testovaná chemikália podávaná cez sondu, musí sa to realizovať v jednej dávke pre zviera s použitím žalúdočnej sondy alebo vhodnej intubačnej kanyly. Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže jednorazovo podať, závisí od veľkosti pokusného zvieraťa. Objem nemá byť vyšší ako 1 ml/100 g telesnej hmotnosti, s výnimkou vodných roztokov, pri ktorých sa môže použiť objem 2 ml/100 g telesnej hmotnosti. S výnimkou dráždivých alebo žieravých testovaných chemikálií, ktoré pri vyšších koncentráciách zvyčajne spôsobujú zhoršenie účinkov, by sa variabilita v aplikovanom objeme mala minimalizovať tým, že sa koncentrácie upravia tak, aby sa zabezpečil stály objem pri všetkých úrovniach dávok. 28. V prípade podávania testovanej chemikálie v krmive alebo pitnej vode je dôležité zaistiť, aby množstvo obsiahnutej testovanej chemikálie nenarúšalo normálnu nutričnú alebo vodnú rovnováhu. Keď sa testovaná chemikália podáva v krmive, môže sa použiť buď stála koncentrácia v krmive (ppm), alebo stála úroveň dávky vzhľadom na telesnú hmotnosť zvierat; iné možnosti by sa mali špecifikovať. V prípade podávania testovanej chemikálie pomocou sondy sa má príslušná dávka podávať každý deň približne v rovnakom čase a aspoň raz za týždeň sa upraví, aby sa zachovala stála úroveň dávky vzhľadom na telesnú hmotnosť zvierat. Harmonogram testu 29. Podávanie dávky obom pohlaviam by sa malo začať najmenej 2 týždne pred párením, pričom najskôr sa zvieratá najmenej päť dní aklimatizujú a vykoná sa skríning samíc na účely zistenia normálnych estrálnych cyklov (v 2-týždňovom období pred aplikáciou chemikálie). Štúdia by sa mala naplánovať tak, aby sa hodnotenie estrálneho cyklu začalo tesne po dosiahnutí úplnej pohlavnej zrelosti zvierat. To sa v prípade rôznych kmeňov potkanov v rôznych laboratóriách môže mierne líšiť, napr. pri potkanoch z kmeňa Sprague Dawley je to vo veku 10 týždňov a pri potkanoch z kmeňa Wistar približne vo veku 12 týždňov. Matky s potomstvom by mali byť usmrtené 13. deň po pôrode alebo krátko po tomto dni. Deň narodenia (t. j. deň ukončenia pôrodu) sa označuje ako deň 0 po pôrode. Samice, pri ktorých sa nezaznamená kopulácia, sú usmrtené 24 – 26 dní od posledného dňa obdobia párenia. Podávanie dávky pokračuje pri oboch pohlaviach počas obdobia párenia. Samcom sa dávka ďalej podáva po období párenia aspoň do skončenia minimálneho 28-dňového celkového obdobia podávania dávok. Potom sa usmrtia, prípadne sa uchovajú a naďalej sa im podáva dávka na účely možného druhého párenia, ak sa to považuje za vhodné. 30. Denné podávanie dávok rodičovským samiciam by malo pokračovať v priebehu gravidity a najmenej do 13. dňa (vrátane) po pôrode alebo do dňa pred usmrtením. V prípade štúdií, pri ktorých sa testovaná chemikália podáva inhaláciou alebo transdermálne, by podávanie dávky malo pokračovať najmenej do 19. dňa gravidity (vrátane) a podávanie dávky by sa malo čo najskôr obnoviť – najneskôr na 4. postnatálny deň. 31. Schéma harmonogramu testu je uvedená v dodatku 2. Párenie 32. V tejto štúdii sa bežne používajú pomery párenia 1:1 (jeden samec a jedna samica). Výnimky sa môžu vyskytnúť v prípade príležitostných úmrtí samcov. Samica sa má nachádzať v prítomnosti toho istého samca, kým sa nezaznamená kopulácia alebo kým neuplynú dva týždne. Každé ráno sa samice vyšetria na prítomnosť spermy alebo vaginálnej zátky. Za 0. deň gravidity sa určí deň, keď sa potvrdí dôkaz o párení (zistí sa prítomnosť vaginálnej zátky alebo spermy). V prípade neúspešného párenia sa zváži opätovné párenie samíc so samcami z rovnakej skupiny s preukázanou plodnosťou. Veľkosť vrhu 33. Na 4. deň po narodení možno upraviť veľkosť jednotlivých vrhov odstránením prebytočných mláďat náhodným výberom, aby sa v čo najväčšej miere dosiahli vrhy so štyrmi alebo piatimi mláďatami z každého pohlavia v závislosti od bežnej veľkosti vrhu použitého kmeňa potkanov. Z dvoch prebytočných mláďat sa odoberú vzorky krvi, ktoré sa zlúčia a použijú na určenie hladín hormónu T4 v sére. Nie je vhodné selektívne odstraňovanie mláďat, napríklad na základe telesnej hmotnosti alebo anogenitálnej vzdialenosti (AGD). Ak vzhľadom na počet samčích alebo samičích mláďat nemožno dospieť k tomu, aby každý vrh tvorilo štyri až päť mláďat z každého pohlavia, je prijateľná čiastočná úprava (napríklad šesť samcov a štyri samice). Mláďatá sa neodstraňujú, ak by veľkosť vrhu klesla pod cieľovú hodnotu na utratenie (8 alebo 10 mláďat/vrh). Ak sa cieľová hodnota na utratenie prekročí len o jedno mláďa, odstráni sa len jedno mláďa, ktoré sa použije na odber krvi na prípadné vyšetrenia T4 v sére. 34. Ak sa veľkosť vrhu neupraví, 4. deň po narodení sa usmrtia dve mláďatá v každom vrhu a odoberú sa vzorky krvi na meranie koncentrácií hormónu štítnej žľazy v sére. Ak je to možné, uvedené dve mláďatá v každom vrhu by mali byť samice, aby bolo možné vyhradiť samčie mláďatá na vyhodnotenie vzniku retenčnej mliečnej cysty. Neplatí to však v prípade, keď by po odstránení týchto mláďat neostali žiadne samice na posúdenie po usmrtení. Mláďatá sa neodstraňujú, ak by veľkosť vrhu klesla pod 8 alebo 10 mláďat/vrh (v závislosti od bežnej veľkosti vrhu použitého kmeňa potkanov). Ak sa bežná veľkosť vrhu prekročí len o jedno mláďa, odstráni sa len jedno mláďa, ktoré sa použije na odber krvi na prípadné vyšetrenia T4 v sére. Pozorovania počas života Klinické pozorovania 35. Počas celého testovacieho obdobia sa najmenej raz denne vykonávajú všeobecné klinické pozorovania, pričom v prípade pozorovania toxických príznakov sa vykonávajú častejšie. Vykonávajú sa pokiaľ možno každý deň v rovnakom čase s prihliadnutím na obdobie, keď sa predpokladajú maximálne účinky po podaní dávky. Zaznamenávajú sa príslušné zmeny správania, príznaky ťažkého alebo dlhotrvajúceho pôrodu a všetky toxické príznaky vrátane úmrtnosti. Tieto záznamy by mali zahŕňať čas nástupu, stupeň a trvanie toxických príznakov. Telesná hmotnosť a spotreba potravy/vody 36. Samce a samice sa odvážia v prvý deň podávania dávok, potom najmenej raz týždenne a následne pri usmrtení. Počas gravidity sa samice odvážia na 0., 7., 14. a 20. deň a do 24 hodín po pôrode (0. alebo 1. deň po pôrode) a najmenej na 4. a 13. deň po pôrode. Tieto zistenia sa zaznamenajú jednotlivo pre každé dospelé zviera. 37. Počas obdobia pred párením, obdobia gravidity a laktácie by sa mala aspoň raz za týždeň merať spotreba potravy. Meranie spotreby potravy počas párenia je voliteľné. Počas týchto období sa meria aj spotreba vody, ak sa testovaná chemikália podáva v pitnej vode. Estrálne cykly 38. Estrálne cykly sa monitorujú pred začatím ošetrenia s cieľom vybrať do štúdie samice s pravidelnými cyklami (pozri odsek 22). Od začiatku obdobia ošetrenia až do zaznamenania párenia sa denne monitorujú aj vaginálne stery. Ak existujú obavy z akútnych stresových účinkov, ktoré by mohli zmeniť estrálne cykly po začatí podávania dávok, laboratóriá môžu použiť expozíciu pokusných zvierat počas 2 týždňov, potom denne odoberať vaginálne stery na monitorovanie estrálneho cyklu najmenej dva týždne počas obdobia pred párením a pokračovať s monitorovaním až do obdobia párenia, až kým sa nezaznamená párenie. Pri odbere vaginálnych/cervikálnych buniek je potrebné dbať na to, aby sa neporušila sliznica, čo by mohlo vyvolať pseudograviditu (7) (8). Parametre potomstva 39. Trvanie gravidity sa zaznamená a počíta sa od jej 0. dňa. Každý vrh je potrebné čo najskôr po pôrode vyšetriť a stanoviť počet a pohlavie mláďat, mŕtvonarodených, živonarodených a nevyvinutých jedincov (mláďat, ktoré sú výrazne menšie než príslušné mláďatá z kontrolnej skupiny) a prítomnosť výrazných abnormalít. 40. Živé mláďatá sa spočítajú, určí sa ich pohlavie a do 24 hodín od pôrodu (na 0. alebo 1. deň po pôrode) a následne najmenej na 4. a 13. deň po pôrode sa určí ich telesná hmotnosť. Okrem pozorovaní uvedených v odseku 35 je potrebné zaznamenať akékoľvek abnormálne správanie potomstva. 41. V ten istý deň medzi 0. až 4. postnatálnym dňom sa zmeria anogenitálna vzdialenosť (AGD) každého mláďaťa. V deň merania AGD sa zisťuje aj telesná hmotnosť mláďaťa, pričom sa AGD štandardizuje na mieru veľkosti mláďaťa, najlepšie na tretiu odmocninu telesnej hmotnosti (9). Na 12. alebo 13. postnatálny deň sa určí počet bradaviek/areol pri samčích mláďatách, ako sa odporúča v usmerňovacom dokumente OECD č. 151 (10). Klinická biochémia 42. Vzorky krvi sa odoberajú z určeného miesta na základe tohto harmonogramu: — najmenej dvom mláďatám na vrh na 4. deň po narodení, ak to umožňuje počet mláďat (pozri odseky 33 – 34), — všetkým matkám a najmenej dvom mláďatám na vrh pri usmrtení na 13. deň a — všetkým dospelým samcom pri usmrtení. Všetky vzorky krvi sa uchovávajú za vhodných podmienok. Vzorky krvi mláďat z 13. dňa a dospelých samcov sa posudzujú, pokiaľ ide o hladiny hormónov štítnej žľazy (T4) v sére. Ak je to relevantné, vykoná sa ďalšie posúdenie T4 vo vzorkách krvi matiek a mláďat zo 4. dňa. V relevantných prípadoch možno voliteľne vykonať meranie iných hormónov. Na účely analýzy hormónov štítnej žľazy možno krv mláďat zlúčiť v rámci vrhu. Hormóny štítnej žľazy (T4 a TSH) sa majú podľa možnosti merať ako celková hodnota. 43. Variabilitu a absolútne koncentrácie hormonálnych ukazovateľov môžu ovplyvniť tieto faktory: — čas usmrtenia z dôvodu každodennej zmeny koncentrácií hormónov, — metóda usmrtenia s cieľom zabrániť neprimeranému stresu pre zvieratá, ktorý môže ovplyvniť koncentrácie hormónov, — súpravy na testovanie hormonálnych ukazovateľov, ktoré sa môžu líšiť štandardnými krivkami. 44. Vzorky plazmy osobitne určené na stanovenie hladiny hormónov sa odoberú počas porovnateľných denných časov. Číselné hodnoty získané analýzou koncentrácií hormónov sa v prípade použitia rozličných komerčne dostupných testovacích súprav líšia. Patológia Makroskopická pitva 45. V čase usmrtenia alebo uhynutia počas štúdie sa dospelé zvieratá vyšetria makroskopicky na všetky abnormality alebo patologické zmeny. Osobitná pozornosť sa venuje orgánom reprodukčného systému. Je potrebné zaznamenať počet implantačných miest. Ráno v deň pitvy sa vyšetria vaginálne stery, aby sa určilo štádium estrálneho cyklu a umožnilo sa určenie korelácie s histopatológiou vaječníkov. 46. Semenníky a nadsemenníky, ako aj prostata a semenné mechúriky s koagulačnými žľazami ako celok všetkých dospelých zvierat sa podľa potreby zbavia priľahlých tkanív a čo najskôr po disekcii sa určí ich vlhká hmotnosť, kým orgány nevyschnú. Okrem toho možno voliteľne určiť hmotnosť orgánov, ako je komplex zdvíhača konečníka a bulbokavernóznych svalov, Cowperove žľazy a žaluď pri samcoch a párové vaječníky (vlhká hmotnosť) a maternica (vrátane krčka maternice) pri samiciach. V prípade zahrnutia týchto orgánov je potrebné určiť ich hmotnosť čo najskôr po disekcii. 47. Mŕtve mláďatá a mláďatá usmrtené na 13. deň po narodení alebo krátko po tomto dni je potrebné prinajmenšom dôkladne preskúmať zvonku na účely zistenia výrazných abnormalít. Je potrebné venovať osobitnú pozornosť vonkajším reprodukčným pohlavným orgánom, ktoré by sa mali vyšetriť na príznaky zmien vo vývoji. Na 13. deň sa uchová štítna žľaza z 1 samčieho a 1 samičieho mláďaťa z každého vrhu. 48. Uchovajú sa vaječníky, semenníky, akcesórne pohlavné orgány (maternica a krčok maternice, nadsemenníky, prostata, semenné mechúriky s koagulačnými žľazami), štítna žľaza a všetky orgány, ktoré majú makroskopické lézie, všetkých dospelých zvierat. Na rutinné vyšetrenie semenníkov a nadsemenníkov sa neodporúča fixácia formalínom. Prijateľnou metódou pre tieto tkanivá je použitie Bouinovho fixačného prostriedku alebo modifikovaného Davidsonovho fixačného prostriedku (11). Obal tunica albuginea sa môže opatrne a plytko prepichnúť ihlou na oboch stranách orgánu, aby sa umožnilo rýchle napustenie fixačným prostriedkom. Histopatológia 49. Vykoná sa podrobné histologické vyšetrenie vaječníkov, semenníkov a nadsemenníkov (s osobitným dôrazom na štádiá spermatogenézy a histopatológiu štruktúry intersticiálnych buniek semenníkov) zvierat v skupine s najvyššou dávkou a v kontrolnej skupine. Podľa potreby možno vyšetriť aj ostatné uchované orgány vrátane štítnej žľazy mláďat a dospelých zvierat. Hmotnosť štítnej žľazy sa môže určiť po fixácii. Orezanie je potrebné vykonať veľmi opatrne a až po fixácii, aby sa predišlo poškodeniu tkaniva. Poškodenie tkaniva by mohlo ohroziť histopatologickú analýzu. Ak sa zistia zmeny v skupine s najvyššou dávkou, tieto vyšetrenia sa aplikujú aj pri zvieratách zo skupín s odlišnou úrovňou dávok. V usmernení o histopatológii (11) sa uvádzajú ďalšie podrobnosti o disekcii, fixácii, vykonávaní rezov a histopatológii endokrinných tkanív. ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV Údaje 50. Uvádzajú sa údaje o jednotlivých zvieratách. Okrem toho sa všetky údaje zhrnú v tabuľkovej podobe, kde sa pre každú pokusnú skupinu uvedie počet zvierat na začiatku testu, počet zvierat, ktoré sa našli uhynuté počas testu alebo boli usmrtené z humánnych dôvodov, čas každého úmrtia alebo usmrtenia, počet plodných zvierat, počet gravidných samíc, počet zvierat vykazujúcich toxické príznaky, opis zistených príznakov toxicity vrátane času nástupu, trvania a závažnosti každého toxického účinku, typy histopatologických zmien a všetky relevantné údaje, ktoré sa týkajú vrhu. Formát súhrnnej správy v tabuľkovej podobe, ktorý sa ukázal ako veľmi užitočný na hodnotenie reprodukčného/vývojového účinku, sa uvádza v dodatku 3. 51. Vzhľadom na obmedzené rozmery štúdie majú štatistické analýzy vo forme testov „významnosti“ obmedzenú hodnotu v prípade mnohých sledovaných parametrov, najmä reprodukčných sledovaných parametrov. Ak sa použijú štatistické analýzy, vybraná metóda by mala byť vhodná na distribúciu skúmanej premennej a mala by sa zvoliť pred začiatkom štúdie. Štatistická analýza AGD a retenčnej mliečnej cysty vychádza z údajov o jednotlivých mláďatách, pričom sa zohľadňujú vplyvy spojené s vrhom. Ak je to vhodné, jednotkou analýzy je vrh. Štatistická analýza telesnej hmotnosti mláďaťa vychádza z údajov o jednotlivých mláďatách s prihliadnutím na veľkosť vrhu. Vzhľadom na veľkosť malých skupín môže byť ako pomoc pri výklade štúdie užitočné aj použitie historických údajov z kontrolných skupín (napr. pokiaľ ide o veľkosť vrhu), ak sú k dispozícii. Vyhodnotenie výsledkov 52. Zistenia z tejto štúdie toxicity by sa mali vyhodnotiť na základe zistených účinkov, pitvy a mikroskopických nálezov. Hodnotenie bude zahŕňať vzťah medzi dávkou testovanej chemikálie a prítomnosťou alebo absenciou abnormalít, početnosťou ich výskytu, ako aj ich závažnosťou, a to vrátane makroskopických lézií, identifikovaných cieľových orgánov, neplodnosti, klinických abnormalít, ovplyvnenej reprodukčnej činnosti a schopnosti vrhnúť, zmien telesnej hmotnosti, účinkov na mortalitu a akýchkoľvek iných toxických účinkov. 53. Z dôvodu krátkeho obdobia ošetrovania samca je pri posudzovaní účinkov na reprodukčnú schopnosť samcov potrebné zvážiť histopatológiu semenníkov a nadsemenníkov spolu s údajmi o plodnosti. Ako pomôcka pri interpretácii štúdie môže byť užitočné aj použitie historických údajov o reprodukcii/vývoji z kontrolných skupín (napr. pokiaľ ide o veľkosť vrhu, AGD, retenčnú mliečnu cystu, hladiny T4 v sére), ak sú k dispozícii. 54. Na účely kontroly kvality sa navrhuje, aby sa zozbierali historické údaje z kontrolných skupín a aby sa vypočítali variačné koeficienty pre číselné údaje, najmä pre parametre spojené s detekciou endokrinného disruptora. Tieto údaje sa môžu použiť pre porovnanie, keď sa vyhodnocujú jednotlivé štúdie. Správa o teste 55. Správa o teste obsahuje tieto informácie: Testovaná chemikália: — zdroj, číslo šarže, konečný dátum použitia, ak sú tieto informácie k dispozícii, — stabilita testovanej chemikálie, ak je známa. Jednozložkové látky: — fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode a ďalšie relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti, — identifikácia chemikálie, napríklad názov podľa IUPAC alebo CAS, číslo CAS, kód SMILES alebo InChI, štruktúrny vzorec, čistota, chemická identita nečistôt, ak to je vhodné a prakticky uskutočniteľné, atď. Viaczložkové látky, UVCB a zmesi: — charakterizácia v najväčšej možnej miere na základe chemickej identity (pozri vyššie), kvantitatívneho výskytu a príslušných fyzikálno-chemických vlastností zložiek. Nosič (v prípade potreby): — odôvodnenie výberu nosiča, ak je iný ako voda. Pokusné zvieratá: — použitý druh/kmeň, — počet, vek a pohlavie zvierat, — zdroj, podmienky umiestnenia, potrava atď., — hmotnosť jednotlivých zvierat na začiatku testu, — odôvodnenie výberu druhu, ak je iný ako potkan. Podmienky testovania: — odôvodnenie výberu úrovne dávky, — údaje o príprave testovanej chemikálie/krmiva, dosiahnutých koncentráciách, stabilite a homogenite prípravku, — podrobné údaje o podávaní testovanej chemikálie, — prepočet koncentrácie testovanej chemikálie v krmive/pitnej vode (ppm) na skutočnú dávku (mg/kg telesnej hmotnosti/deň), ak sa uplatňuje, — podrobné informácie o kvalite potravy a vody, — podrobný opis postupu randomizácie na výber mláďat na utratenie, ak boli utratené. Výsledky: — telesná hmotnosť a zmeny telesnej hmotnosti, — spotreba potravy a spotreba vody, ak sú údaje k dispozícii, — údaje o toxickej reakcii pri jednotlivých pohlaviach a dávkach vrátane plodnosti, gravidity a akýchkoľvek iných toxických príznakov, — dĺžka gravidity, — toxické alebo iné účinky na reprodukciu, potomstvo, postnatálny rast atď., — povaha, závažnosť a trvanie klinických pozorovaní (údaje o tom, či sú účinky vratné alebo nevratné), — počet dospelých samíc s normálnym alebo abnormálnym estrálnym cyklom a trvanie cyklu, — počet živonarodených zvierat a straty po implantácii, — údaje o telesnej hmotnosti mláďat, — AGD všetkých mláďat (a telesná hmotnosť v deň merania AGD), — retenčná mliečna cysta pri samčích mláďatách, — hladiny hormónov štítnej žľazy pri mláďatách na 13. deň a dospelých samcoch (a pri matkách a mláďatách na 4. deň, ak sa uskutočnilo meranie), — počet mláďat s makroskopicky viditeľnými abnormalitami, všeobecné hodnotenie vonkajších pohlavných orgánov, počet nevyvinutých jedincov, — čas uhynutia počas štúdie alebo údaj, či zvieratá prežili do usmrtenia, — počet implantátov, veľkosť vrhu a hmotnosť vrhu v čase zaznamenávania, — telesná hmotnosť pri usmrtení a údaje o hmotnosti orgánov rodičov, — pitevné nálezy, — podrobný opis histopatologických pozorovaní, — údaje o absorpcii (ak sú k dispozícii), — štatistické spracovanie výsledkov v prípade potreby. Rozbor výsledkov. Závery. Interpretácia výsledkov 56. Štúdia umožní hodnotenia reprodukčnej/vývojovej toxicity v súvislosti s podávaním opakovaných dávok (pozri odseky 5 a 6). Mohla by poskytnúť údaj o potrebe vykonať ďalšie skúmania a poskytuje usmernenia pri navrhovaní následných štúdií. Pri interpretácii výsledkov skúmania reprodukcie a vývoja by sa malo nahliadnuť do usmerňovacieho dokumentu OECD 43 (12). V usmerňovacom dokumente OECD č. 106 o histopatologickom hodnotení endokrinných a reprodukčných testov pri hlodavcoch (11) sa nachádzajú informácie o príprave a hodnotení (endokrinných) orgánov a vaginálnych sterov, ktoré môžu byť užitočné pre toto usmernenie na vykonávanie testov (TG). LITERATÚRA (1) OECD (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Available upon request at Organisation for Economic and Cooperation and Development, Paris. (2) OECD (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokyo, 27th-29th October, 1992. Available Upon Request at Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (3) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998. Available Upon Request at Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (4) OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (5) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations. Series on Testing and Assessment, (No 19), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (6) OECD (2011). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment(No 150), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (7) Goldman, J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M. and Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research, Part B, 80 (2), 84-97. (8) Sadleir R.M.F.S (1979). Cycles and Seasons, in Auston C.R. and Short R.V. (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York. (9) Gallavan R.H. Jr, Holson J.F., Stump D.G., Knapp J.F. and Reynolds V.L.(1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights, Reproductive Toxicology, 13: 383-390. (10) OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (11) OECD (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No106), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (12) OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 43), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. Dodatok 1 VYMEDZENIE POJMOV [POZRI AJ USMERŇOVACÍ DOKUMENT OECD Č. 150 (6)] Androgénny účinok je schopnosť chemikálie pôsobiť v organizme cicavcov ako prirodzený androgénny hormón (napr. testosterón). Antiandrogénny účinok je schopnosť chemikálie potlačiť v organizme cicavcov pôsobenie prirodzeného androgénneho hormónu (napr. testosterónu). Antiestrogénový účinok je schopnosť chemikálie potlačiť v organizme cicavcov pôsobenie prirodzeného estrogénového hormónu (napr. estradiolu 17ß). Antityreoidné pôsobenie je schopnosť chemikálie potlačiť v organizme cicavcov pôsobenie prirodzeného hormónu štítnej žľazy (napr. T3). Chemikália je látka alebo zmes. Vývojová toxicita je prejav reprodukčnej toxicity predstavujúci prenatálne, perinatálne, postnatálne, štrukturálne alebo funkčné poruchy potomstva. Dávkovanie je všeobecný pojem, ktorý zahŕňa dávku, frekvenciu a trvanie podávania dávok. Dávka je množstvo podanej testovanej chemikálie. Dávka je vyjadrená ako hmotnosť testovanej chemikálie na jednotku telesnej hmotnosti pokusného zvieraťa za deň (napr. mg/kg telesnej hmotnosti/deň) alebo ako konštantná koncentrácia v potrave. Zjavná toxicita je všeobecný termín opisujúci jasné toxické príznaky po podaní testovanej chemikálie. Tieto príznaky by mali postačovať na posúdenie nebezpečnosti a pri zvýšení podanej dávky by podľa nich malo byť možné predpokladať výskyt závažných toxických príznakov a pravdepodobnej mortality. Porucha plodnosti predstavuje poruchy samčích alebo samičích reprodukčných funkcií alebo reprodukčnej schopnosti. Toxicita v prípade matiek znamená nežiaduce účinky na gravidné samice, ktoré sa vyskytujú buď špecificky (priamy účinok), alebo nešpecificky (nepriamy účinok). NOAEL je skratka pre hladinu bez pozorovaného nepriaznivého účinku. Je to najvyššia úroveň dávky, pri ktorej po podaní testovanej chemikálie nie sú pozorované žiadne nepriaznivé nálezy. Estrogénový účinok je schopnosť chemikálie pôsobiť v organizme cicavcov ako prirodzený estrogénový hormón (napr. estradiol 17ß). Reprodukčná toxicita predstavuje škodlivé účinky na potomstvo a/alebo poruchu samčích alebo samičích reprodukčných funkcií alebo reprodukčnej schopnosti. Testovaná chemikália je akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy. Tyreoidné pôsobenie je schopnosť chemikálie pôsobiť v organizme cicavcov ako prirodzený hormón štítnej žľazy (napr. T3). Validácia je vedecký postup určený na charakterizovanie prevádzkových požiadaviek a obmedzení testovacej metódy a na preukázanie jej spoľahlivosti a relevantnosti pre konkrétny účel. Dodatok 2 SCHÉMA HARMONOGRAMU TESTU ZNÁZORŇUJÚCA MAXIMÁLNE TRVANIE ŠTÚDIE NA ZÁKLADE ÚPLNÉHO 14-DŇOVÉHO OBDOBIA PÁRENIA ﻿Dodatok 3 SÚHRNNÁ SPRÁVA V TABUĽKOVEJ PODOBE O ÚČINKOCH NA REPRODUKCIU/VÝVOJ POZOROVANIA HODNOTY Dávkovanie (jednotky) 0 (kontrola) … … … … Počet párov na začiatku (N) Estrálny cyklus (minimálne stredná dĺžka a frekvencia nepravidelných cyklov) Samice vykazujúce známky kopulácie (N) Samice, pri ktorých nastala gravidita (N) Dni počatia 1 – 5 (N) Dni počatia 6 –... (21) (N) Gravidita ≤ 21 dní (N) Gravidita = 22 dní (N) Gravidita ≥ 23 dní (N) Matky so živonarodenými mláďatami (N) Matky so živými mláďatami na 4. deň pp (N) Počet implantátov na matku (stredná hodnota) Počet živých mláďat na matku pri narodení (stredná hodnota) Počet živých mláďat na matku na 4. deň (stredná hodnota) Pomer pohlaví (samec/samica) pri narodení (stredná hodnota) Pomer pohlaví (samec/samica) na 4. deň (stredná hodnota) Hmotnosť vrhu pri narodení (stredná hodnota) Hmotnosť vrhu na 4. deň (stredná hodnota) Hmotnosť mláďat pri narodení (stredná hodnota) Hmotnosť mláďat v čase merania AGD (stredná hodnota pri samcoch, stredná hodnota pri samiciach) AGD mláďat meraná v rovnaký postnatálny deň, medzi 0. až 4. PND (stredná hodnota pri samcoch, stredná hodnota pri samiciach, zaznamenať PND) Hmotnosť mláďat na 4. deň (stredná hodnota) Retenčná mliečna cysta pri samčích mláďatách na 13. deň (stredná hodnota) Hmotnosť mláďat na 13. deň (stredná hodnota) ABNORMÁLNE MLÁĎATÁ Matky s počtom 0 Matky s počtom 1 Matky s počtom ≥ 2 STRATA POTOMSTVA Prenatálna/postimplantačná (počet implantátov mínus živonarodené mláďatá) Samice s počtom 0 Samice s počtom 1 Samice s počtom 2 Samice s počtom ≥ 3 Postnatálna (životnarodené mláďatá mínus živé mláďatá na 13. postnatálny deň) Samice s počtom 0 Samice s počtom 1 Samice s počtom 2 Samice s počtom ≥ 3 B.64 KOMBINOVANÁ ŠTÚDIA TOXICITY PO OPAKOVANÝCH DÁVKACH SO SKRÍNINGOVÝM TESTOM REPRODUKČNEJ/VÝVOJOVEJ TOXICITY ÚVOD 1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 422 (2016). Usmernenia OECD na testovanie chemikálií sa pravidelne revidujú vzhľadom na vedecký pokrok. Pôvodné usmernenie 422 na vykonávanie skríningových testov bolo prijaté v roku 1996 na základe protokolu pre „Kombinovaný skríningový test toxicity po opakovaných dávkach a reprodukčnej/vývojovej toxicity“, o ktorom sa diskutovalo na dvoch stretnutiach odborníkov, a to v Londýne v roku 1990 (1) a v Tokiu v roku 1992 (2). 2. Táto testovacia metóda spája časť skríningu reprodukčnej/vývojovej toxicity, ktorá je založená na skúsenostiach získaných v členských krajinách pri používaní pôvodnej metódy v prípade existujúcich chemikálií s vysokým objemom výroby a v prieskumných testoch s látkami, ktoré slúžia ako pozitívna kontrola (3) (4), a časť zameranú na toxicitu po opakovaných dávkach v súlade s usmernením OECD na vykonávanie testov 407 (28-dňová štúdia orálnej toxicity po opakovaných dávkach pri hlodavcoch; zodpovedá kapitole B.7 tejto prílohy). 3. Táto testovacia metóda bola doplnená o príslušné sledované parametre endokrinných disruptorov, a to v nadväznosti na činnosť s vysokou prioritou, ktorú začala OECD v roku 1998 s cieľom zrevidovať existujúce usmernenia na vykonávanie testov a vypracovať nové usmernenia na vykonávanie testov na skríning a testovanie potenciálnych endokrinných disruptorov (5). V tomto kontexte bolo TG 407 (ktoré zodpovedá kapitole B.7 tejto prílohy) v roku 2008 rozšírené o parametre vhodné na určenie endokrinného pôsobenia testovaných chemikálií. Cieľom aktualizácie TG 422 bolo zahrnúť niektoré príslušné sledované parametre endokrinných disruptorov do TG týkajúcich sa skríningu, kde časy expozície zahŕňajú niektoré z citlivých období počas vývoja (prenatálne alebo skoré postnatálne obdobie). 4. Tieto vybrané dodatočné príslušné sledované parametre endokrinných disruptorov, ktoré sú zároveň súčasťou TG 443 (Rozšírená jednogeneračná štúdia reprodukčnej toxicity; zodpovedá kapitole B.56 tejto prílohy) boli zahrnuté do TG 422 na základe štúdie uskutočniteľnosti, ktorá sa týkala vedeckých a technických otázok súvisiacich s ich zaradením, ako aj možných úprav koncepcie testu potrebných na ich zaradenie (6). 5. Táto testovacia metóda je navrhnutá tak, aby sa v nej generovali obmedzené informácie týkajúce sa účinkov testovanej chemikálie na samčiu a samičiu reprodukčnú schopnosť, ako sú funkcie pohlavných žliaz, rozmnožovacie správanie, počatie, vývoj zárodku a pôrod. Nie je alternatívou k existujúcim testovacím metódam B.31, B.34, B.35 alebo B.56, ani ich nenahrádza. POČIATOČNÉ ÚVAHY 6. Pri posudzovaní a vyhodnocovaní toxických charakteristík testovanej chemikálie možno orálnu toxicitu pomocou opakovaných dávok stanoviť po získaní prvotných informácií o toxicite prostredníctvom testovania akútnej toxicity. Táto štúdia poskytuje informácie o možnej nebezpečnosti pre zdravie, ktorá môže pravdepodobne vyplynúť z opakovanej expozície počas pomerne obmedzeného časového obdobia. Metóda zahŕňa základnú štúdiu toxicity po opakovaných dávkach, ktorú možno použiť v prípade chemikálií, pri ktorých nie je odôvodnené vykonať 90-dňovú štúdiu (napr. keď objem produkcie neprekračuje určité limity), alebo ju možno použiť ako predbežnú štúdiu k dlhodobej štúdii. Pri vykonávaní štúdie je potrebné sa riadiť zásadami a hľadiskami uvedenými v usmerňovacom dokumente OECD č. 19 o uznávaní, posudzovaní a používaní klinických príznakov ako sledovaných parametrov u ľudí v prípade pokusných zvierat používaných na hodnotenie bezpečnosti (7). 7. Ďalej zahŕňa skríningový test reprodukčnej/vývojovej toxicity, a preto sa môže použiť aj na poskytnutie počiatočných informácií o možných účinkoch na samčiu a samičiu reprodukčnú schopnosť, napríklad na funkciu pohlavných žliaz, rozmnožovacie správanie, počatie, vývoj zárodku a pôrod, a to buď v skorom štádiu posudzovania toxikologických vlastností testovaných chemikálií, alebo informácií o predmetných chemikáliách. Táto testovacia metóda neposkytuje úplné informácie o všetkých aspektoch reprodukcie a vývoja. Predovšetkým ponúka len obmedzené prostriedky na zistenie postnatálnych prejavov prenatálnej expozície alebo na zistenie účinkov, ktoré môžu byť vyvolané počas postnatálnej expozície. V dôsledku (okrem iných dôvodov) selektívnosti sledovaných parametrov a krátkeho trvania štúdie táto metóda neposkytne dôkazy na podloženie konečných záverov o neexistencii reprodukčných/vývojových účinkov. Okrem toho, ak neexistujú údaje z iných testov reprodukčnej/vývojovej toxicity, pozitívne výsledky sú užitočné pri počiatočnom posúdení nebezpečnosti a prispievajú k rozhodnutiam, pokiaľ ide o potrebu a načasovanie ďalšieho testovania. 8. Výsledky získané pomocou parametrov súvisiacich s endokrinným systémom by sa mali posudzovať v kontexte „koncepčného rámca OECD na testovanie a hodnotenie chemikálií poškodzujúcich endokrinný systém“ (8). V tomto koncepčnom rámci je rozšírené usmernenie OECD TG 422 obsiahnuté na úrovni 4 ako skúška in vivo poskytujúca údaje o nežiaducich účinkoch na príslušné sledované parametre endokrinného systému. Signál endokrinného systému sa však sám osebe nemusí považovať za dostatočný dôkaz, že testovaná chemikália je endokrinným disruptorom. 9. Pri tejto testovacej metóde sa kladie dôraz aj na neurologické účinky ako na osobitný sledovaný parameter, pričom sa zdôrazňuje potreba venovať pozornosť dôsledným klinickým pozorovaniam zvierat, aby sa získalo čo najviac informácií. Pri tejto metóde by sa mal určiť neurotoxický potenciál chemikálií, na základe ktorého možno následne odôvodniť ďalšie podrobné preskúmanie tohto aspektu. Navyše môže táto metóda poskytnúť základné údaje o imunologických účinkoch. 10. Ak neexistujú údaje z iných štúdií systémovej toxicity, reprodukčnej/vývojovej toxicity, neurotoxicity a/alebo imunotoxicity, pozitívne výsledky sú užitočné pri počiatočnom posúdení nebezpečnosti a prispievajú k rozhodnutiam, pokiaľ ide o potrebu a načasovanie ďalšieho testovania. Test môže byť obzvlášť užitočný ako súčasť súboru dostupných údajov charakterizujúcich danú látku (SIDS) OECD na posúdenie existujúcich chemikálií, o ktorých je k dispozícii len málo toxikologických informácií alebo žiadne toxikologické informácie, a môže slúžiť ako alternatíva k vykonaniu dvoch samostatných testov na toxicitu po opakovaných dávkach (OECD TG 407, zodpovedajúce kapitole B.7 tejto prílohy) a na reprodukčnú/vývojovú toxicitu (OECD TG 421, zodpovedajúce kapitole B.63 tejto prílohy). Môže sa použiť aj ako štúdia na zistenie rozsahu dávok pre rozsiahlejšie štúdie o reprodukčnej/vývojovej toxicite, alebo ak sa to inak považuje za relevantné. 11. Vo všeobecnosti sa predpokladá, že existujú rozdiely v citlivosti medzi gravidnými a negravidnými zvieratami. V dôsledku toho môže byť v tomto kombinovanom teste zložitejšie určiť úrovne dávok, ktoré sú primerané na hodnotenie všeobecnej systémovej toxicity aj špecifickej reprodukčnej/vývojovej toxicity, v porovnaní so situáciou, keď sa jednotlivé testy vykonávajú samostatne. Okrem toho výklad výsledkov testu, pokiaľ ide o všeobecnú systémovú toxicitu, môže byť náročnejší než vtedy, keď sa vykonáva samostatná štúdia toxicity po opakovaných dávkach, najmä keď sa sérové a histopatologické parametre nehodnotia v štúdii súčasne. Vzhľadom na uvedenú technickú zložitosť sú na vykonanie tohto kombinovaného skríningového testu potrebné značné skúsenosti v oblasti testovania toxicity. Na druhej strane môže tento kombinovaný test okrem menšieho počtu použitých zvierat ponúknuť lepšie prostriedky na rozlíšenie priamych účinkov na reprodukciu/vývoj od účinkov, ktoré sú sekundárne k iným (systémovým) účinkom. 12. V tomto teste je obdobie podávania dávok dlhšie než v bežnej 28-dňovej štúdii toxicity po opakovaných dávkach. V porovnaní so situáciou, keď sa popri skríningovom teste reprodukčnej/vývojovej toxicity uskutočňuje bežná 28-dňová štúdia toxicity po opakovaných dávkach, sa však použije menej zvierat z každého pohlavia na skupinu. 13. Pri tejto testovacej metóde sa testovaná chemikália podáva orálne. Ak sa použijú iné spôsoby expozície, môžu sa vyžadovať úpravy. 14. Pred použitím tejto testovacej metódy na zmesi s cieľom generovať údaje plánované na regulačné účely by sa malo zvážiť, či môže poskytnúť adekvátne výsledky na tento účel, a ak áno, tak prečo. Takéto úvahy nie sú nutné, pokiaľ existuje regulatórna požiadavka na testovanie danej zmesi. 15. Vymedzenie použitých pojmov sa uvádza v dodatku 1. PRINCÍP TESTU 16. Testovaná chemikália sa podáva viacerým skupinám samčích a samičích pokusných zvierat v odstupňovaných dávkach. Samcom by sa mali dávky podávať najmenej štyri týždne až do dňa naplánovaného usmrtenia vrátane tohto dňa (to znamená minimálne dva týždne pred párením, počas obdobia párenia a približne dva týždne po párení). Vzhľadom na obmedzené obdobie podávania dávok pred párením pri samcoch nemôže plodnosť predstavovať osobitný citlivý ukazovateľ testikulárnej toxicity. Z toho dôvodu je dôležité podrobné histologické vyšetrenie semenníkov. Na zistenie väčšiny účinkov na samčiu plodnosť a spermatogenézu sa za dostatočnú kombináciu považuje spojenie dvojtýždňového obdobia podávania dávok pred párením a následných pozorovaní párenia/plodnosti s najmenej štvortýždňovým celkovým obdobím podávania dávok, po ktorom nasleduje podrobná histopatológia samčích pohlavných žliaz. 17. Samiciam by sa mali podávať dávky počas celej štúdie. To zahŕňa dva týždne pred párením (s cieľom pokryť aspoň dva úplné estrálne cykly), variabilný čas do počatia, trvanie gravidity a najmenej trinásť dní po pôrode až do dňa pred naplánovaným usmrtením vrátane tohto dňa. 18. Trvanie štúdie – po aklimatizácii a vyhodnotení estrálneho cyklu pred začatím podávania dávok – závisí od stavu samice a má dĺžku približne 63 dní [najmenej 14 dní pred obdobím párenia, (do) 14 dní obdobia párenia, 22 dní gravidity, 13 dní laktácie]. 19. Počas obdobia podávania sa zvieratá dôkladne pozorujú, pričom sa denne kontroluje prítomnosť toxických príznakov. Pitva sa uskutoční na zvieratách uhynutých alebo usmrtených počas testovania, ako aj po ukončení testu na zvieratách, ktoré test prežijú. OPIS METÓDY Výber druhov zvierat 20. Táto testovacia metóda je určená na použitie s potkanmi. Ak sa parametre uvedené v rámci tohto TG 422 skúmajú pri inom druhu hlodavcov, je potrebné uviesť podrobné odôvodnenie. V rámci medzinárodného programu overovania na zistenie endokrinných disruptorov v TG 407 sa použili iba potkany. Kmene s nízkou plodnosťou alebo kmene, o ktorých je známe, že majú vysoký výskyt vývojových porúch, by sa nemali používať. Mali by byť použité zdravé panenské zvieratá, ktoré dosiaľ neboli predmetom žiadnych testov. Pokusné zvieratá by mali byť charakterizované, pokiaľ ide o druh, kmeň, pohlavie, hmotnosť a vek. Na začiatku štúdie by mala byť hmotnostná variabilita použitých zvierat minimálna a nemala by presiahnuť ±20 % strednej hmotnosti každého pohlavia. Ak sa táto štúdia uskutočňuje ako predbežná štúdia k dlhodobej alebo celogeneračnej štúdii, je lepšie v oboch štúdiách použiť zvieratá toho istého druhu a z toho istého zdroja. Umiestnenie a kŕmenie 21. Všetky postupy musia byť v súlade s miestnymi normami starostlivosti o laboratórne zvieratá. Teplota v miestnosti pre pokusné zvieratá má byť 22 °C (± 3 °C). Relatívna vlhkosť by mala dosahovať minimálne 30 % a pokiaľ možno, okrem obdobia počas čistenia miestnosti, by nemala presiahnuť 70 %. Osvetlenie by malo byť umelé a malo by sa striedať 12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. Výber krmiva môže byť ovplyvnený potrebou zabezpečiť vhodnú prímes testovanej chemikálie, keď sa podáva týmto spôsobom. 22. Zvieratá by mali byť umiestnené spolu v malých skupinách rovnakého pohlavia. Ak je to vedecky opodstatnené, zvieratá môžu byť umiestnené samostatne. Pokiaľ ide o umiestnenie skupín do klietok, v jednej klietke by nemalo byť viac ako päť zvierat. Párenie sa uskutoční v klietkach, ktoré sú vhodné na tento účel. Gravidné samice by mali byť jednotlivo umiestnené do klietok a mal by sa im poskytnúť materiál na tvorbu hniezda. Samice v laktácii sa jednotlivo umiestnia do klietok so svojím potomstvom. 23. Krmivo treba pravidelne analyzovať, aby sa zistilo, či neobsahuje kontaminanty. Vzorka krmiva by sa mala zachovať až do dokončenia správy. Príprava zvierat 24. Zdravé, mladé, dospelé zvieratá sa náhodne rozdelia a priradia sa do pokusných skupín a jednotlivých klietok. Klietky sa usporiadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné vplyvy spôsobené ich umiestnením. Zvieratá sa jednotlivo označia. Zvieratá sa v klietkach aklimatizujú na laboratórne podmienky najmenej päť dní pred začatím štúdie. Príprava dávok 25. Odporúča sa, aby sa testovaná chemikália podávala orálne, pokiaľ sa iná cesta podania nepokladá za vhodnejšiu. Keď sa zvolí orálna cesta, testovaná chemikália sa obvykle podáva sondou. Alternatívne sa však testované chemikálie môžu podávať aj v krmive alebo pitnej vode. 26. V prípade potreby sa testovaná chemikália rozpustí alebo suspenduje vo vhodnom nosiči. Odporúča sa, aby sa vždy, keď je to možné, najskôr zvážilo použitie vodného roztoku/suspenzie, potom roztoku/suspenzie v oleji (napr. kukuričnom oleji) a nakoniec použitie prípadného roztoku v iných nosičoch. Pre iné nosiče ako voda majú byť známe toxické vlastnosti nosiča. Mala by sa určiť stabilita a homogenita testovanej chemikálie v nosiči. POSTUP Počet zvierat a ich pohlavie 27. Odporúča sa, aby každá skupina začala najmenej s 10 samcami a 12 – 13 samicami. Pri samiciach sa pred expozíciou vyhodnotí estrálny cyklus a zvieratá, ktoré nevykazujú príznačné 4 – 5-dňové cykly, nebudú zaradené do štúdie. Preto sa odporúča viac samíc, aby na skupinu pripadalo 10 samíc. Očakáva sa, s výnimkou prípadov výrazných toxických účinkov, že takto sa dosiahne počet najmenej 8 gravidných samíc na skupinu, čo je obvykle minimálny prijateľný počet gravidných samíc na skupinu. Cieľom je dosiahnuť dostatočný počet gravidných samíc a potomkov, aby sa zabezpečilo zmysluplné hodnotenie potenciálu testovanej chemikálie pôsobiť na plodnosť, graviditu, materské a dojčenské správanie, ako aj na rast a vývoj potomstva generácie F 1 od počatia do 13. dňa po pôrode. Ak sa plánuje usmrtenie zvierat v priebehu štúdie, ich počet by mal byť zvýšený o plánovaný počet zvierat, ktoré majú byť usmrtené pred kompletizáciou štúdie. Treba zvážiť použitie ďalšej satelitnej skupiny piatich zvierat z každého pohlavia ku kontrolnej skupine a k skupine vystavenej najvyššej dávke na účely pozorovania vratnosti, perzistencie alebo oneskorenia systémových toxických účinkov, a to najmenej počas 14 dní po ošetrení. Zvieratá zo satelitnej skupiny sa nebudú páriť, a teda nebudú použité na posúdenie reprodukčnej/vývojovej toxicity. Dávkovanie 28. Bežne sa používajú tri testované skupiny a jedna kontrolná skupina. Ak nie sú k dispozícii vhodné všeobecné údaje o toxicite, môže sa vykonať štúdia na zistenie rozsahu dávok (zvieratá toho istého kmeňa a z toho istého zdroja), aby sa ľahšie stanovili dávky, ktoré sa použijú. So zvieratami v kontrolnej skupine sa musí zaobchádzať takisto ako so zvieratami v testovaných skupinách, s výnimkou aplikovania testovanej chemikálie. Ak sa pri podávaní testovanej chemikálie používa nosič, kontrolná skupina dostane nosič v najvyššom používanom objeme. 29. Pri výbere úrovní dávok by sa mali brať do úvahy existujúce údaje o toxicite a (toxiko-) kinetike. Okrem toho by sa malo vziať do úvahy, že môžu existovať rozdiely v citlivosti medzi gravidnými a negravidnými samicami. Najvyššia úroveň dávky sa vyberie tak, aby vyvolala toxické účinky, ale nespôsobila uhynutie zvierat ani zjavné utrpenie. Potom sa klesajúca postupnosť úrovní dávok zvolí tak, aby sa preukázala každá odozva na dávku a stanovila sa najnižšia úroveň dávky, pri ktorej nevznikajú žiadne nežiaduce účinky. Často sú na to optimálne intervaly predstavujúce dvoj- až štvornásobok, pričom pridanie štvrtej testovanej skupiny je často vhodnejšie než použitie veľmi veľkých intervalov medzi dávkami (napr. viac než 10-násobku). 30. Ak sa pozoruje všeobecná toxicita (napr. zníženie telesnej hmotnosti, účinky na pečeň, srdce, pľúca alebo obličky atď.) alebo iné zmeny, ktoré nemusia byť toxikologickou reakciou (napr. nižší príjem potravy, zväčšenie pečene), pri interpretácii pozorovaných účinkov na endokrinné citlivé sledované parametre je potrebné postupovať obozretne. Limitný test 31. Ak sa v orálnej štúdii s jednou úrovňou dávky dosahujúcou minimálne 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň alebo, v prípade podávania v krmive, pri rovnakom percentuálnom podiele v krmive alebo pitnej vode (na základe hodnôt podľa telesnej hmotnosti) s použitím postupov opísaných pre túto štúdiu neprejavia žiadne pozorovateľné toxické účinky a ak sa vzhľadom na údaje o štrukturálne príbuzných látkach toxicita neočakáva, potom sa môže upustiť od úplnej štúdie zahŕňajúcej viaceré úrovne dávok. Limitný test sa neuplatňuje vtedy, keď z expozície ľudí vyplýva, že je potrebné použiť vyššiu dávku. V prípade iných ciest podania, napr. pri inhalácii alebo dermálnej aplikácii, môžu maximálnu dosiahnuteľnú expozíciu často určovať fyzikálno-chemické vlastnosti testovaných chemikálií. Podávanie dávok 32. Zvieratám sa podáva testovaná chemikália každý deň, 7 dní v týždni. Ak je testovaná chemikália podávaná cez sondu, musí sa to realizovať v jednej dávke pre zviera s použitím žalúdočnej sondy alebo vhodnej intubačnej kanyly. Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže jednorazovo podať, závisí od veľkosti pokusného zvieraťa. Objem nemá byť vyšší ako 1 ml/100 g telesnej hmotnosti, s výnimkou vodných roztokov, pri ktorých sa môže použiť objem 2 ml/100 g telesnej hmotnosti. S výnimkou dráždivých alebo žieravých testovaných chemikálií, ktoré pri vyšších koncentráciách zvyčajne spôsobujú zhoršenie účinkov, by sa variabilita v aplikovanom objeme mala minimalizovať tým, že sa koncentrácie upravia tak, aby sa zabezpečil stály objem pri všetkých úrovniach dávok. 33. V prípade podávania testovaných chemikálií v krmive alebo pitnej vode je dôležité zaistiť, aby množstvo obsiahnutej testovanej chemikálie nenarúšalo normálnu nutričnú alebo vodnú rovnováhu. Keď sa testovaná chemikália podáva v krmive, môže sa použiť buď stála koncentrácia v krmive (ppm), alebo stála úroveň dávky vzhľadom na telesnú hmotnosť zvierat; iné možnosti by sa mali špecifikovať. V prípade podávania testovanej chemikálie pomocou sondy sa príslušná dávka podáva každý deň približne v rovnakom čase a aspoň raz za týždeň sa upraví, aby sa zachovala stála úroveň dávky vzhľadom na telesnú hmotnosť zvierat. Ak sa kombinovaná štúdia použije ako predbežná štúdia k dlhodobej štúdii alebo úplnej štúdii o reprodukčnej toxicite, v obidvoch štúdiách sa použije rovnaké krmivo. Harmonogram testu 34. Podávanie dávky obom pohlaviam by sa malo začať dva týždne pred párením, pričom najskôr sa zvieratá najmenej päť dní aklimatizujú a vykoná sa skríning samíc na účely zistenia normálnych estrálnych cyklov (v 2-týždňovom období pred aplikáciou chemikálie). Štúdia by sa mala naplánovať tak, aby sa hodnotenie estrálneho cyklu začalo tesne po dosiahnutí úplnej pohlavnej zrelosti zvierat. To sa v prípade rôznych kmeňov potkanov v rôznych laboratóriách môže mierne líšiť, napr. pri potkanoch z kmeňa Sprague Dawley je to vo veku 10 týždňov a pri potkanoch z kmeňa Wistar približne vo veku 12 týždňov. Matky s potomstvom by mali byť usmrtené 13. deň po pôrode alebo krátko po tomto dni. V prípade, že je potrebné, aby sa matkám noc pred odberom krvi nepodávala potrava (ak sa uprednostňuje táto možnosť), nemusia byť matky a ich potomstvo nevyhnutne usmrtené v ten istý deň. Deň narodenia (t. j. deň ukončenia pôrodu) sa označuje ako 0. deň po pôrode. Samice, pri ktorých sa nezaznamená kopulácia, sú usmrtené 24 – 26 dní od posledného dňa obdobia párenia. Podávanie dávky pokračuje pri oboch pohlaviach počas obdobia párenia. Samcom sa dávka ďalej podáva po období párenia aspoň do skončenia minimálneho 28-dňového celkového obdobia podávania dávok. Potom sa usmrtia, prípadne sa uchovajú a naďalej sa im podáva dávka na účely možného druhého párenia, ak sa to považuje za vhodné. 35. Denné podávanie dávok rodičovským samiciam by malo pokračovať v priebehu gravidity a najmenej do 13. dňa (vrátane) po pôrode alebo do dňa pred usmrtením. V prípade štúdií, pri ktorých sa testovaná chemikália podáva inhaláciou alebo transdermálne, by podávanie dávky malo pokračovať najmenej do 19. dňa gravidity (vrátane) a podávanie dávky by sa malo čo najskôr obnoviť – najneskôr na 4. postnatálny deň (PND). 36. Zvieratá satelitnej skupiny, ktoré sú určené na dodatočné pozorovanie, ak sú zahrnuté, sa nepária. Mali by sa uchovať najmenej ďalších 14 dní po prvom naplánovanom usmrtení matiek, bez expozície, aby bolo možné zistiť oneskorený výskyt, pretrvávanie toxických príznakov alebo zotavenie sa z nich. 37. Schéma harmonogramu testu je uvedená v dodatku 2. Estrálne cykly 38. Estrálne cykly sa monitorujú pred začatím ošetrenia s cieľom vybrať do štúdie samice s pravidelnými cyklami (pozri odsek 27). Od začiatku obdobia ošetrenia až do zaznamenania párenia sa denne monitorujú aj vaginálne stery. Ak existujú obavy z akútnych stresových účinkov, ktoré by mohli zmeniť estrálne cykly po začatí podávania dávok, laboratóriá môžu použiť expozíciu pokusných zvierat počas 2 týždňov, potom denne odoberať vaginálne stery na monitorovanie estrálneho cyklu najmenej dva týždne počas obdobia pred párením a pokračovať s monitorovaním až do obdobia párenia, až kým sa nezaznamená párenie. Pri odbere vaginálnych/cervikálnych buniek je potrebné dbať na to, aby sa neporušila sliznica, čo by mohlo vyvolať pseudograviditu (8) (9). Párenie 39. V tejto štúdii sa bežne používajú pomery párenia 1:1 (jeden samec a jedna samica). Výnimky sa môžu vyskytnúť v prípade príležitostných úmrtí samcov. Samica sa má nachádzať v prítomnosti toho istého samca, kým sa nezaznamená kopulácia alebo kým neuplynú dva týždne. Každé ráno sa samice vyšetria na prítomnosť spermy alebo vaginálnej zátky. Za 0. deň gravidity sa určí deň, keď sa potvrdí dôkaz o párení (zistí sa prítomnosť vaginálnej zátky alebo spermy). V prípade neúspešného párenia sa zváži opätovné párenie samíc so samcami z rovnakej skupiny s preukázanou plodnosťou. Veľkosť vrhu 40. Na 4. deň po narodení možno upraviť veľkosť jednotlivých vrhov odstránením prebytočných mláďat náhodným výberom, aby sa v čo najväčšej miere dosiahli vrhy so štyrmi alebo piatimi mláďatami z každého pohlavia v závislosti od bežnej veľkosti vrhu použitého kmeňa potkanov. Z dvoch prebytočných mláďat sa odoberú vzorky krvi, ktoré sa zlúčia a použijú na určenie hladín hormónu T4 v sére. Nie je vhodné selektívne odstraňovanie mláďat, napríklad na základe telesnej hmotnosti alebo anogenitálnej vzdialenosti (AGD). Ak vzhľadom na počet samčích alebo samičích mláďat nemožno dospieť k tomu, aby každý vrh tvorilo štyri až päť mláďat z každého pohlavia, je prijateľná čiastočná úprava (napríklad šesť samcov a štyri samice). Mláďatá sa neodstraňujú, ak by veľkosť vrhu klesla pod cieľovú hodnotu na utratenie (8 alebo 10 mláďat/vrh). Ak sa cieľová hodnota na utratenie prekročí len o jedno mláďa, odstráni sa len jedno mláďa, ktoré sa použije na odber krvi na prípadné vyšetrenia T4 v sére. 41. Ak sa veľkosť vrhu neupraví, 4. deň po narodení sa usmrtia dve mláďatá v každom vrhu a odoberú sa vzorky krvi na meranie koncentrácií hormónu štítnej žľazy v sére. Ak je to možné, uvedené dve mláďatá v každom vrhu by mali byť samice, aby bolo možné vyhradiť samčie mláďatá na vyhodnotenie vzniku retenčnej mliečnej cysty. Neplatí to však v prípade, keď by po odstránení týchto mláďat neostali žiadne samice na posúdenie po usmrtení. Mláďatá sa neodstraňujú, ak by veľkosť vrhu klesla pod 8 alebo 10 mláďat/vrh (v závislosti od bežnej veľkosti vrhu použitého kmeňa potkanov). Ak sa bežná veľkosť vrhu prekročí len o jedno mláďa, odstráni sa len jedno mláďa, ktoré sa použije na odber krvi na prípadné vyšetrenia T4 v sére. Pozorovania 42. Najmenej raz denne by sa mali vykonať všeobecné klinické pozorovania, najlepšie každý deň v rovnakom čase a so zreteľom na časový interval najintenzívnejších predpokladaných účinkov po podaní dávky. Zaznamenáva sa zdravotný stav zvierat. Je potrebné aspoň dvakrát denne sledovať chorobnosť a úmrtnosť zvierat. 43. Raz pred prvou expozíciou (aby bolo možné porovnanie jednotlivých zvierat medzi sebou) a potom najmenej raz týždenne sa uskutočňujú pri všetkých rodičovských zvieratách podrobné klinické pozorovania. Uskutočňujú sa mimo domovských klietok v štandardnom priestore, pokiaľ možno v jednotlivé dni vždy v tom istom čase. Musia byť pozorne zaznamenané, podľa možnosti s použitím hodnotiaceho systému explicitne definovaného testovacím laboratóriom. Je potrebné zaistiť čo najmenšie zmeny podmienok testovania a pozorovania má podľa možnosti viesť pozorovateľ, ktorý nie je oboznámený s postupom testovania. Medzi príznaky, ktoré je potrebné si všímať, patria zmeny na koži, srsti, očiach, slizniciach, výskyt sekrécie, exkrécie a vegetatívnej aktivity (napr. slzenie, piloerekcia, veľkosť zreničiek, nezvyčajné dýchanie), pričom uvedené príznaky nie sú vyčerpávajúce. Zmeny chôdze, držania tela a reakcie na zaobchádzanie, ako aj prítomnosť klonických alebo tonických pohybov, stereotypné správanie (napr. nadmerné čistenie sa, opakované točenie sa), náročný alebo dlhý pôrod alebo zvláštne správanie (napr. samozmrzačovanie, chôdza dozadu) sa takisto musia zaznamenať (10). 44. Jedenkrát počas štúdie sa na piatich samcov a piatich samiciach náhodne vybratých z každej skupiny uskutoční hodnotenie senzorickej reaktivity na rôznorodé podnety (napr. sluchové, vizuálne a proprioceptívne podnety) (8) (9) (11), hodnotenie sily zovretia (12) a hodnotenie motorickej aktivity (13). Ďalšie podrobnosti o postupoch, podľa ktorých možno postupovať, sú uvedené v príslušných odkazoch. Možno však použiť aj iné alternatívne postupy k postupom, ktoré tu boli opísané. Pri samcoch sa tieto funkčné pozorovania majú uskutočniť ku koncu obdobia podávania dávok, krátko pred plánovaným usmrtením, avšak pred odberom vzoriek krvi na účely hematológie alebo klinickej chémie (pozri odseky 53 – 56 vrátane poznámky pod čiarou č. 1). Počas týchto funkčných testov majú byť samice vo fyziologicky podobnom stave a podľa možnosti sa majú testovať raz počas posledného týždňa laktácie (t. j. 6. – 13. deň laktácie), krátko pred plánovaným usmrtením. V čo najväčšej možnej miere je potrebné minimalizovať čas odlúčenia matiek a mláďat. 45. Funkčné pozorovania uskutočňované raz ku koncu štúdie možno vynechať, ak sa štúdia uskutočňuje ako predbežná štúdia k následnej (90-dňovej) štúdii subchronickej toxicity alebo dlhodobej štúdii. V tomto prípade sa funkčné pozorovania uskutočnia v nasledujúcej štúdii. Na druhej strane, dostupnosť údajov o funkčných pozorovaniach z tejto štúdie toxicity po opakovanej dávke môže zvýšiť možnosť výberu úrovní dávok v nasledujúcej štúdii subchronickej toxicity alebo dlhodobej štúdii. 46. Výnimočne sa nemusia uskutočniť funkčné pozorovania ani pri skupinách, v ktorých sa inak preukážu toxické príznaky v takom rozsahu, že by mohli významne interferovať s uskutočnením funkčných testov. 47. Trvanie gravidity sa zaznamená a počíta sa od jej 0. dňa. Každý vrh je potrebné čo najskôr po pôrode vyšetriť a stanoviť počet a pohlavie mláďat, mŕtvonarodených, živonarodených a nevyvinutých jedincov (mláďat, ktoré sú výrazne menšie než príslušné mláďatá z kontrolnej skupiny) a prítomnosť výrazných abnormalít. 48. Živé mláďatá sa spočítajú, určí sa ich pohlavie a do 24 hodín po narodení (0. alebo 1. deň po narodení) a následne najmenej na 4. a 13. deň po narodení sa určí ich telesná hmotnosť. Okrem pozorovaní rodičovských zvierat (pozri odseky 43 a 44) sa zaznamená aj akékoľvek abnormálne správanie potomstva. 49. V ten istý deň medzi 0. až 4. postnatálnym dňom sa zmeria anogenitálna vzdialenosť (AGD) každého mláďaťa. V deň merania AGD sa zisťuje aj telesná hmotnosť mláďaťa, pričom sa AGD štandardizuje na mieru veľkosti mláďaťa, najlepšie na tretiu odmocninu telesnej hmotnosti (14). Na 12. alebo 13. postnatálny deň sa určí počet bradaviek/areol pri samčích mláďatách, ako sa odporúča v usmerňovacom dokumente OECD č. 151 (15). Telesná hmotnosť a spotreba potravy/vody 50. Samce a samice sa odvážia v prvý deň podávania dávok, potom najmenej raz týždenne a následne pri usmrtení. Počas gravidity sa samice odvážia na 0., 7., 14. a 20. deň a do 24 hodín po pôrode (0. alebo 1. deň po pôrode) a najmenej na 4. a 13. deň po pôrode. Tieto zistenia sa zaznamenajú jednotlivo pre každé dospelé zviera. 51. V období pred párením, počas gravidity a laktácie sa spotreba potravy meria najmenej raz za týždeň. Meranie spotreby potravy počas párenia je voliteľné. Počas týchto období sa meria aj spotreba vody, ak sa testovaná chemikália podáva prostredníctvom tohto média. Hematológia 52. Jedenkrát počas štúdie sa pri piatich samcoch a piatich samiciach náhodne vybratých z každej skupiny uskutočňujú tieto hematologické vyšetrenia: hematokrit, koncentrácie hemoglobínu, počet erytrocytov, retikulocyty, celkový a diferenciálny počet leukocytov, počet trombocytov a meranie času/potenciálu zrážanlivosti krvi. Medzi ďalšie stanovenia, ktoré sa uskutočňujú, ak testovaná chemikália alebo jej predpokladané metabolity majú oxidačné vlastnosti alebo ak existuje podozrenie, že majú oxidačné vlastnosti, patrí koncentrácia methemoglobínu a Heinzove telieska. 53. Vzorky krvi sa odoberajú z označeného miesta. Počas odberu vzoriek majú byť samice vo fyziologicky podobnom stave. S cieľom predchádzať praktickým ťažkostiam spojeným s variabilitou začiatku gravidity sa môže odber krvi pri samiciach uskutočniť na konci obdobia pred párením ako alternatíva k odberu vzoriek tesne pred postupom usmrtenia zvierat alebo počas neho. Vzorky krvi samcov sa majú podľa možnosti odoberať tesne pred postupom usmrtenia zvierat alebo počas neho. Odber krvi pri samcoch sa môže prípadne uskutočniť aj na konci obdobia pred párením, ak sa tento čas uprednostnil v prípade samíc. 54. Vzorky krvi je potrebné uchovávať za vhodných podmienok. Klinická biochémia 55. Na vzorkách krvi získaných od vybratých piatich samcov a piatich samíc z každej skupiny sa uskutočnia stanovenia v rámci klinickej biochémie s cieľom skúmať hlavné toxické účinky na tkanivá a osobitne účinky na pečeň a obličky. Odporúča sa, aby sa zvieratám cez noc pred odobratím vzoriek krvi nepodávala potrava ( 22 ) . Vyšetrenie plazmy alebo séra zahŕňa sodík, draslík, glukózu, celkový cholesterol, močovinu, kreatinín, celkový obsah bielkovín a albumínu, najmenej dva enzýmy indikujúce hepatocelulárne účinky (ako alanín-aminotransferáza, aspartát-aminotransferáza a sorbitol-dehydrogenáza) a žlčové kyseliny. Meranie ďalších enzýmov (hepatálneho alebo iného pôvodu) a bilirubínu môže za určitých okolností poskytnúť užitočné informácie. 56. Vzorky krvi sa odoberajú z určeného miesta na základe tohto harmonogramu: — najmenej dvom mláďatám na vrh na 4. deň po narodení, ak to umožňuje počet mláďat (pozri odseky 40 – 41), — všetkým matkám a najmenej dvom mláďatám na vrh pri usmrtení na 13. deň a — všetkým dospelým samcom pri usmrtení. Všetky vzorky krvi sa uchovávajú za vhodných podmienok. Vzorky krvi mláďat z 13. dňa a dospelých samcov sa posudzujú, pokiaľ ide o hladiny hormónov štítnej žľazy (T4) v sére. Ak je to relevantné, vykoná sa ďalšie posúdenie T4 vo vzorkách krvi matiek a mláďat zo 4. dňa. V relevantných prípadoch možno voliteľne vykonať meranie iných hormónov. Na účely analýzy hormónov štítnej žľazy možno krv mláďat zlúčiť v rámci vrhu. Hormóny štítnej žľazy (T4 a TSH) sa majú podľa možnosti merať ako celková hodnota. 57. Voliteľne možno počas posledného týždňa štúdie vykonať rozbor moču piatich náhodne vybratých samcov z každej skupiny, pričom sa použije časový zber objemu moču, na stanovenie týchto parametrov: vzhľad, objem, osmolalita alebo špecifická hmotnosť, pH, bielkoviny, glukóza a krv/krvné bunky. 58. Okrem toho by sa mali brať do úvahy aj štúdie na vyšetrovanie sérových markerov všeobecného poškodenia tkaniva. Medzi ďalšie stanovenia, ktoré sa uskutočňujú, ak známe vlastnosti testovanej chemikálie môžu ovplyvňovať alebo existuje podozrenie, že ovplyvňujú príbuzné metabolické profily, patrí stanovenie vápnika, fosfátu, hladiny triglyceridov nalačno a glykémie nalačno, špecifických hormónov, methemoglobínu a cholínesterázy. Tieto prípady je potrebné identifikovať jednotlivo. 59. Variabilitu a absolútne koncentrácie hormonálnych ukazovateľov môžu ovplyvniť tieto faktory: — čas usmrtenia z dôvodu každodennej zmeny koncentrácií hormónov, — metóda usmrtenia s cieľom zabrániť neprimeranému stresu pre zvieratá, ktorý môže ovplyvniť koncentrácie hormónov, — súpravy na testovanie hormonálnych ukazovateľov, ktoré sa môžu líšiť štandardnými krivkami. 60. Vzorky plazmy osobitne určené na stanovenie hladiny hormónov sa odoberú počas porovnateľných denných časov. Číselné hodnoty získané analýzou koncentrácií hormónov sa v prípade použitia rozličných komerčne dostupných testovacích súprav líšia. 61. Ak sú historické bazálne hodnoty nevhodné, zváži sa stanovenie premenných v oblasti hematológie a klinickej biochémie pred začatím dávkovania alebo podľa možnosti na skupine zvierat, ktoré neboli zaradené do pokusných skupín. V prípade samíc musia údaje pochádzať z dojčiacich zvierat. PATOLÓGIA Makroskopická pitva 62. Všetky dospelé zvieratá v štúdii budú predmetom úplnej detailnej makroskopickej pitvy, ktorá zahŕňa pozorné vyšetrenie vonkajšieho povrchu tela, všetkých telesných otvorov a lebečnej, hrudnej a brušnej dutiny a ich obsahu. Osobitná pozornosť sa venuje orgánom reprodukčného systému. Je potrebné zaznamenať počet implantačných miest. V deň pitvy sa vyšetria vaginálne stery, aby sa určilo štádium estrálneho cyklu a umožnilo určenie korelácie s histopatológiou v reprodukčných orgánoch samíc. 63. Semenníky a nadsemenníky, ako aj prostata a semenné mechúriky s koagulačnými žľazami ako celok všetkých dospelých zvierat sa podľa potreby zbavia priľahlých tkanív a čo najskôr po disekcii sa určí ich vlhká hmotnosť, kým orgány nevyschnú. Okrem toho možno voliteľne určiť hmotnosť orgánov, ako je komplex zdvíhača konečníka a bulbokavernóznych svalov, Cowperove žľazy a žaluď pri samcoch a párové vaječníky (vlhká hmotnosť) a maternica (vrátane krčka maternice) pri samiciach. V prípade zahrnutia týchto orgánov je potrebné určiť ich hmotnosť čo najskôr po disekcii. Zachovať sa majú vaječníky, semenníky, nadsemenníky, akcesórne pohlavné orgány, ako aj všetky orgány vykazujúce makroskopické lézie zo všetkých dospelých zvierat. 64. Zo všetkých dospelých samcov a samíc a z jedného samčieho a jedného samičieho mláďaťa z 13. dňa z každého vrhu sa má zachovať štítna žľaza v čo najvhodnejšom fixačnom médiu na neskoršie zamýšľané histopatologické vyšetrenie. Hmotnosť štítnej žľazy sa môže určiť po fixácii. Orezanie je potrebné vykonať veľmi opatrne a až po fixácii, aby sa predišlo poškodeniu tkaniva. Poškodenie tkaniva by mohlo ohroziť histopatologickú analýzu. Vzorky krvi sa odoberajú zo stanoveného miesta tesne pred postupom usmrtenia zvierat alebo počas tohto postupu a uchovávajú sa za vhodných podmienok (pozri odsek 56). 65. Okrem toho sa najmenej pri piatich dospelých samcoch a samiciach náhodne vybratých z každej skupiny (okrem moribundných a/alebo usmrtených pred ukončením štúdie) z pečene, obličiek, nadobličiek, týmusu, zo sleziny, z mozgu a zo srdca podľa možnosti odstráni všetko priľahlé tkanivo a ich vlhká hmotnosť sa zaznamená čo najskôr po disekcii, kým orgány nevyschnú. Tieto tkanivá sa uchovávajú v čo najvhodnejšom fixačnom médiu vzhľadom na typ tkanív a neskoršie zamýšľané histopatologické vyšetrenie: všetky makroskopické lézie, mozog (reprezentatívne oblasti vrátane veľkého mozgu, mozočka a mosta), miecha, oko, žalúdok, tenké a hrubé črevo (vrátane Peyerových plakov), pečeň, obličky, nadobličky, slezina, srdce, týmus, priedušnica a pľúca (uskladnené nafúknutím s fixačným prostriedkom a potom ponorením), gonády (semenníky a vaječníky), akcesórne pohlavné orgány (maternica a krčok maternice, nadsemenníky, prostata, semenné mechúriky s koagulačnými žľazami), vagína, močový mechúr, lymfatické uzliny [okrem najbližšej odvodňovacej uzliny by sa mala odobrať ešte jedna lymfatická uzlina podľa praxe laboratória (16)], periférny nerv (sedací alebo tibiálny) podľa možnosti čo najbližšie k svalu, kostrový sval a kosť, s kostnou dreňou (prierez alebo čerstvo odobratá vzorka kostnej drene). Odporúča sa fixovať semenníky ponorením do Bouinovho fixačného prostriedku alebo modifikovaného Davidsonovho fixačného prostriedku (16) (17) (18); pre tieto tkanivá sa neodporúča fixácia formalínom. Obal tunica albuginea sa môže opatrne a plytko prepichnúť ihlou na oboch stranách orgánu, aby sa umožnilo rýchle napustenie fixačným prostriedkom. Z klinických a iných nálezov môže vyplynúť potreba vyšetrenia ďalších tkanív. Takisto by sa mali zachovať všetky orgány, ktoré vzhľadom na známe vlastnosti testovanej chemikálie možno považovať za cieľové orgány. 66. Tieto tkanivá môžu poskytnúť cenné údaje o účinkoch na endokrinný systém: gonády (vaječníky a semenníky), akcesórne pohlavné orgány (maternica vrátane krčka maternice, nadsemenníky, semenné mechúriky s koagulačnými žľazami, dorzolaterálna a ventrálna prostata), vagína, hypofýza, samčia prsná žľaza a nadoblička. Zmeny na samčích prsných žľazách nie sú dostatočne zdokumentované, ale tento parameter môže byť veľmi citlivý na látky s estrogénovým pôsobením. Skúmanie orgánov/tkanív, ktoré nie sú uvedené v odseku 65, je voliteľné. 67. Mŕtve mláďatá a mláďatá usmrtené na 13. deň po narodení alebo krátko po tomto dni je potrebné prinajmenšom dôkladne preskúmať zvonku na účely zistenia výrazných abnormalít. Je potrebné venovať osobitnú pozornosť vonkajším reprodukčným pohlavným orgánom, ktoré by sa mali vyšetriť na príznaky zmien vo vývoji. Histopatológia 68. Úplná histopatológia sa uskutoční na uskladnených orgánoch a tkanivách vybratých zvierat v kontrolnej skupine a v skupine s vysokými dávkami (s osobitným dôrazom na štádiá spermatogenézy v samčích gonádach a histopatológiu štruktúry intersticiálnych buniek semenníkov). V prípade potreby sa môže vyšetriť štítna žľaza mláďat a zvyšných dospelých zvierat. Ak sa v skupine s vysokou dávkou zistia zmeny súvisiace s ošetrením, tieto vyšetrenia sa aplikujú aj pri zvieratách zo skupín s odlišnou úrovňou dávok. V usmernení o histopatológii (10) sa uvádzajú ďalšie podrobnosti o disekcii, fixácii, vykonávaní rezov a histopatológii endokrinných tkanív. 69. Všetky závažné lézie je potrebné preskúmať. S cieľom pomôcť pri stanovení úrovní NOAEL je potrebné vyšetriť cieľové orgány v skupinách s odlišnou úrovňou dávok, obzvlášť v skupinách, v ktorých sa uvádza úroveň NOAEL. 70. Ak sa použila satelitná skupina, histopatológia sa vykoná na tkanivách a orgánoch, pri ktorých boli v ošetrených skupinách zistené účinky. ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV Údaje 71. Uvádzajú sa údaje o jednotlivých zvieratách. Okrem toho sa všetky údaje zhrnú v tabuľkovej podobe, kde sa pre každú testovanú skupinu uvedie počet zvierat na začiatku testu, počet zvierat, ktoré sa našli uhynuté počas testu alebo boli usmrtené z humánnych dôvodov, čas každého úmrtia alebo usmrtenia, počet plodných zvierat, počet gravidných samíc, počet zvierat vykazujúcich príznaky toxicity, opis zistených toxických príznakov vrátane času nástupu, trvania a závažnosti každého toxického účinku, typy histopatologických zmien a všetky relevantné údaje, ktoré sa týkajú vrhu. V dodatku 3 sa uvádza formát súhrnnej správy v tabuľkovej podobe, ktorý sa ukázal ako veľmi užitočný na hodnotenie reprodukčných a vývojových účinkov. 72. Ak je to možné, číselné výsledky sa vyhodnotia vhodnou a všeobecne akceptovateľnou štatistickou metódou. Porovnávanie účinkov podľa rozsahu dávok má zamedziť používaniu opakovaných t-testov. Štatistické metódy by sa mali vybrať počas plánovania štúdie. Štatistická analýza AGD a retenčnej mliečnej cysty vychádza z údajov o jednotlivých mláďatách, pričom sa zohľadňujú vplyvy spojené s vrhom. Ak je to vhodné, jednotkou analýzy je vrh. Štatistická analýza telesnej hmotnosti mláďaťa vychádza z údajov o jednotlivých mláďatách s prihliadnutím na veľkosť vrhu. Vzhľadom na obmedzené rozmery štúdie majú štatistické analýzy vo forme testov „významnosti“ obmedzenú hodnotu v prípade mnohých sledovaných parametrov, najmä reprodukčných sledovaných parametrov. Niektoré z najčastejšie používaných metód, obzvlášť parametrické testy na meranie strednej tendencie, nie sú vhodné. Ak sa použijú štatistické analýzy, vybraná metóda by mala byť vhodná na distribúciu skúmanej premennej a mala by sa zvoliť pred začiatkom štúdie. Vyhodnotenie výsledkov 73. Zistenia z tejto štúdie toxicity sa majú vyhodnotiť na základe zistených účinkov, pitvy a mikroskopických nálezov. Hodnotenie bude zahŕňať vzťah medzi dávkou testovanej chemikálie a prítomnosťou alebo absenciou abnormalít, početnosťou ich výskytu, ako aj ich závažnosťou, a to vrátane makroskopických lézií, identifikovaných cieľových orgánov, neplodnosti, klinických abnormalít, ovplyvnenej reprodukčnej činnosti a schopnosti vrhnúť, zmien telesnej hmotnosti, účinkov na mortalitu a akýchkoľvek iných toxických účinkov. 74. Z dôvodu krátkeho obdobia ošetrovania samca je pri posudzovaní účinkov na reprodukčnú schopnosť samcov potrebné zvážiť histopatológiu semenníkov a nadsemenníkov spolu s údajmi o plodnosti. Ako pomôcka pri interpretácii štúdie môže byť užitočné aj použitie historických údajov o reprodukcii/vývoji z kontrolných skupín (napr. pokiaľ ide o veľkosť vrhu, AGD, retenčnú mliečnu cystu, hladiny T4 v sére), ak sú k dispozícii. 75. Na účely kontroly kvality sa navrhuje, aby sa zozbierali historické údaje z kontrolných skupín a aby sa vypočítali variačné koeficienty pre číselné údaje, najmä pre parametre spojené s detekciou endokrinného disruptora. Tieto údaje sa môžu použiť pre porovnanie, keď sa vyhodnocujú jednotlivé štúdie. Správa o teste 76. Správa o teste obsahuje tieto informácie: Testovaná chemikália: — zdroj, číslo šarže, konečný dátum použitia, ak sú tieto informácie k dispozícii, — stabilita testovanej chemikálie, ak je známa. Jednozložkové látky: — fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode a ďalšie relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti, — identifikácia chemikálie, napríklad názov podľa IUPAC alebo CAS, číslo CAS, kód SMILES alebo InChI, štruktúrny vzorec, čistota, chemická identita nečistôt, ak to je vhodné a prakticky uskutočniteľné, atď. Viaczložkové látky, UVCB a zmesi: — charakterizácia v najväčšej možnej miere na základe chemickej identity (pozri vyššie), kvantitatívneho výskytu a príslušných fyzikálno-chemických vlastností zložiek . Nosič (v prípade potreby): — odôvodnenie výberu nosiča, ak je iný ako voda. Pokusné zvieratá: — použitý druh/kmeň, — počet, vek a pohlavie zvierat, — zdroj, podmienky umiestnenia, potrava atď., — hmotnosť jednotlivých zvierat na začiatku testu, — odôvodnenie výberu druhu, ak je iný ako potkan. Podmienky testovania: — odôvodnenie výberu úrovne dávky, — údaje o zložení testovanej chemikálie/krmiva, dosiahnutých koncentráciách, stabilite a homogenite prípravku, — podrobné údaje o podávaní testovanej chemikálie, — prepočet koncentrácie testovanej chemikálie v krmive/pitnej vode (ppm) na skutočnú dávku (mg/kg telesnej hmotnosti/deň), ak sa uplatňuje, — podrobné údaje o kvalite potravy a vody, — podrobný opis postupu randomizácie na výber mláďat na utratenie, ak boli utratené. Výsledky: — telesná hmotnosť a zmeny telesnej hmotnosti, — spotreba potravy a spotreba vody, ak sa uplatňuje, — údaje o toxickej reakcii pri jednotlivých pohlaviach a dávkach vrátane plodnosti, gravidity a akýchkoľvek iných — toxických príznakov — dĺžka gravidity, toxické alebo iné účinky na reprodukciu, potomstvo, postnatálny rast atď., — povaha, závažnosť a trvanie klinických pozorovaní (údaje o tom, či sú účinky vratné alebo nevratné), — hodnotenie senzorickej aktivity, sily zovretia a motorickej aktivity, — hematologické testy s významnými základnými hodnotami, — testy klinickej biochémie s významnými základnými hodnotami, — počet dospelých samíc s normálnym alebo abnormálnym estrálnym cyklom a trvanie cyklu, — počet živonarodených zvierat a straty po implantácii, — počet mláďat s makroskopicky viditeľnými abnormalitami, všeobecné hodnotenie vonkajších pohlavných orgánov, počet nevyvinutých jedincov, — čas uhynutia počas štúdie alebo údaj, či zvieratá prežili do usmrtenia, — počet implantátov, veľkosť vrhu a hmotnosť vrhu v čase zaznamenávania, — údaje o telesnej hmotnosti mláďat, — AGD všetkých mláďat (a telesná hmotnosť v deň merania AGD), — retenčná mliečna cysta pri samčích mláďatách, — hladiny hormónov štítnej žľazy pri mláďatách na 13. deň a dospelých samcoch (a pri matkách a mláďatách na 4. deň, ak sa uskutočnilo meranie), — telesná hmotnosť pri usmrtení a údaje o hmotnosti orgánov rodičov, — pitevné nálezy, — podrobný opis histopatologických pozorovaní, — údaje o absorpcii (ak sú k dispozícii), — štatistické spracovanie výsledkov v prípade potreby. Rozbor výsledkov. Závery. Interpretácia výsledkov 77. Štúdia umožní hodnotenia reprodukčnej/vývojovej toxicity v súvislosti s podávaním opakovaných dávok. Keďže dôraz sa kladie na sledované parametre všeobecnej toxicity, ako aj reprodukčnej/vývojovej toxicity, výsledky štúdie predovšetkým umožnia rozlíšenie medzi účinkami na reprodukciu/vývoj, ktoré sa vyskytnú pri neprítomnosti všeobecnej toxicity, a účinkami, ktoré sa prejavujú iba pri dávkach, ktoré sú toxické aj pre rodičovské zvieratá (pozri odseky 7 – 11). Mohlo by to naznačovať potrebu ďalšieho dokazovania a poskytnúť usmernenie pri návrhu ďalších štúdií. Pri interpretácii výsledkov skúmania reprodukcie a vývoja by sa malo nahliadnuť do usmerňovacieho dokumentu OECD 43 (19). V usmerňovacom dokumente OECD č. 106 o histologickom hodnotení endokrinných a reprodukčných testov pri hlodavcoch (16) sa uvádzajú informácie o príprave a hodnotení (endokrinných) orgánov a vaginálnych sterov, ktoré môžu byť užitočné pre túto testovaciu metódu. LITERATÚRA (1) OECD (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Available upon request at Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris (2) OECD (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods , Tokyo, 27th-29th October, 1992. Available upon request at Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris (3) Mitsumori K., Kodama Y., Uchida O., Takada K., Saito M. Naito K., Tanaka S., Kurokawa Y., Usami, M., Kawashima K., Yasuhara K., Toyoda K., Onodera H., Furukawa F., Takahashi M. and Hayashi Y. (1994). Confirmation Study, Using Nitro-Benzene, of the Combined Repeat Dose and Reproductive/ Developmental Toxicity Test Protocol Proposed by the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) . J. Toxicol, Sci., 19, 141-149. (4) Tanaka S., Kawashima K., Naito K., Usami M., Nakadate M., Imaida K., Takahashi M., Hayashi Y., Kurokawa Y. and Tobe M. (1992). Combined Repeat Dose and Reproductive/Developmental Toxicity Screening Test (OECD): Familiarization Using Cyclophosphamide . Fundam. Appl. Toxicol., 18, 89-95. (5) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force , 10th-11th March 1998, Available upon request at Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris (6) OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints . Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (7) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations , Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 19), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (8) Goldman J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M. and Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies , Birth Defects Research, Part B, 80 (2), 84-97. (9) Sadleir R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, in Auston C.R. and Short R.V. (Eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization , Cambridge, New York. (10) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals . Environmental Health Criteria Document (No 60). (11) Moser V.C., McDaniel K.M. and Phillips P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz . Toxicol. Appl. Pharmacol., 108, 267-283. (12) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C. and Riley M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice . Neurobehav. Toxicol., 1, 233-236. (13) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments . Neurotoxicol. Teratol. 13, 599-609. (14) Gallavan R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. Reynolds. (1999). „Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights“ , Reproductive Toxicology, 13: 383-390. (15) OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study . Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151). Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (16) OECD (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents . Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No. 106) Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (17) Hess RA and Moore BJ. (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis . In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (Eds.). Academic Press: San Diego, CA, s. 52-85. (18) Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM. (2002). Fixation of Testes and Eyes Using a Modified Davidson’s Fluid: Comparison with Bouin’s Fluid and Conventional Davidson’s fluid . Toxicol. Pathol. 30, 524-533. (19) OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 43), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (20) OECD (2011), Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption (No 150), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. Dodatok 1 VYMEDZENIE POJMOV [POZRI AJ USMERŇOVACÍ DOKUMENT OECD Č. 150 (20)] Androgénny účinok je schopnosť chemikálie pôsobiť v organizme cicavcov ako prirodzený androgénny hormón (napr. testosterón). Antiandrogénny účinok je schopnosť chemikálie potlačiť v organizme cicavcov pôsobenie prirodzeného androgénneho hormónu (napr. testosterónu). Antiestrogénový účinok je schopnosť chemikálie potlačiť v organizme cicavcov pôsobenie prirodzeného estrogénového hormónu (napr. estradiolu 17ß). Antityreoidné pôsobenie je schopnosť chemikálie potlačiť v organizme cicavcov pôsobenie prirodzeného hormónu štítnej žľazy (napr. T3). Chemikália je látka alebo zmes. Vývojová toxicita je prejav reprodukčnej toxicity predstavujúci prenatálne, perinatálne, postnatálne, štrukturálne alebo funkčné poruchy potomstva. Dávka je množstvo podanej testovanej chemikálie. Dávka je vyjadrená ako hmotnosť testovanej chemikálie na jednotku telesnej hmotnosti pokusného zvieraťa za deň (napr. mg/kg telesnej hmotnosti/deň) alebo ako konštantná koncentrácia v potrave. Dávkovanie je všeobecný pojem, ktorý zahŕňa dávku, frekvenciu a trvanie podávania dávok. Zjavná toxicita je všeobecný termín opisujúci jasné toxické príznaky po podaní testovanej chemikálie. Tieto príznaky by mali postačovať na posúdenie nebezpečnosti a pri zvýšení podanej dávky by podľa nich malo byť možné predpokladať výskyt závažných toxických príznakov a pravdepodobnej mortality. Porucha plodnosti predstavuje poruchy samčích alebo samičích reprodukčných funkcií alebo reprodukčnej schopnosti. Toxicita v prípade matiek znamená nežiaduce účinky na gravidné samice, ktoré sa vyskytujú buď špecificky (priamy účinok), alebo nešpecificky (nepriamy účinok) a ktoré súvisia so stavom gravidity. NOAEL je skratka pre hladinu bez pozorovaného nepriaznivého účinku. Je to najvyššia úroveň dávky, pri ktorej po podaní testovanej chemikálie nie sú pozorované žiadne nepriaznivé nálezy. Estrogénový účinok je schopnosť chemikálie pôsobiť v organizme cicavcov ako prirodzený estrogénový hormón (napr. estradiol 17ß). Reprodukčná toxicita predstavuje škodlivé účinky na potomstvo a/alebo poruchu samčích alebo samičích reprodukčných funkcií alebo reprodukčnej schopnosti. Testovaná chemikália je akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy. Tyreoidné pôsobenie je schopnosť chemikálie pôsobiť v organizme cicavcov ako prirodzený hormón štítnej žľazy (napr. T3). Validácia je vedecký postup určený na charakterizovanie prevádzkových požiadaviek a obmedzení testovacej metódy a na preukázanie jej spoľahlivosti a relevantnosti pre konkrétny účel. Dodatok 2 SCHÉMA HARMONOGRAMU TESTU ZNÁZORŇUJÚCA MAXIMÁLNE TRVANIE ŠTÚDIE NA ZÁKLADE ÚPLNÉHO 14-DŇOVÉHO OBDOBIA PÁRENIA Dodatok 3 SÚHRNNÁ SPRÁVA V TABUĽKOVEJ PODOBE O ÚČINKOCH NA REPRODUKCIU/VÝVOJ POZOROVANIA HODNOTY Dávkovanie (jednotky)....... 0 (kontrola) … … … … Počet párov na začiatku (N) Estrálny cyklus (minimálne stredná dĺžka a frekvencia nepravidelných cyklov) Samice vykazujúce známky kopulácie (N) Samice, pri ktorých nastala gravidita (N) Dni počatia 1 – 5 (N) Dni počatia 6 –... (23) (N) Gravidita ≤ 21 dní (N) Gravidita = 22 dní (N) Gravidita ≥ 23 dní (N) Matky so živonarodenými mláďatami (N) Matky so živými mláďatami na 4. deň pp (N) Počet implantátov na matku (stredná hodnota) Počet živých mláďat na matku pri narodení (stredná hodnota) Počet živých mláďat na matku na 4. deň (stredná hodnota) Pomer pohlaví (samec/samica) pri narodení (stredná hodnota) Pomer pohlaví (samec/samica) na 4. deň (stredná hodnota) Hmotnosť vrhu pri narodení (stredná hodnota) Hmotnosť vrhu na 4. deň (stredná hodnota) Hmotnosť mláďat pri narodení (stredná hodnota) Hmotnosť mláďat v čase merania AGD (stredná hodnota pri samcoch, stredná hodnota pri samiciach) AGD mláďat meraná v rovnaký postnatálny deň, medzi 0. až 4. PND (stredná hodnota pri samcoch, stredná hodnota pri samiciach, zaznamenať PND) Hmotnosť mláďat na 4. deň (stredná hodnota) Hmotnosť mláďat na 13. deň (stredná hodnota) Retenčná mliečna cysta pri samčích mláďatách na 13. deň (stredná hodnota) ABNORMÁLNE MLÁĎATÁ Matky s počtom 0 Matky s počtom 1 Matky s počtom ≥ 2 STRATA POTOMSTVA Prenatálna (počet implantátov mínus živonarodené mláďatá) Samice s počtom 0 Samice s počtom 1 Samice s počtom 2 Samice s počtom ≥ 3 Postnatálna (životnarodené mláďatá mínus živé mláďatá na 13. postnatálny deň) Samice s počtom 0 Samice s počtom 1 Samice s počtom 2 Samice s počtom ≥ 3 B.65 METÓDA NA TESTOVANIE POLEPTANIA KOŽE S VYUŽITÍM MEMBRÁNOVEJ BARIÉRY IN VITRO ÚVOD 1. in vitro , ktorá slúži na identifikáciu žieravých chemikálií. V rámci tejto testovacej metódy sa používa umelá membrána navrhnutá tak, aby na žieravé chemikálie reagovala podobným spôsobom ako koža zvieraťa in situ . Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 435 (2015). Poleptanie kože predstavuje vznik nevratného poškodenia kože, ktoré sa prejavuje ako viditeľná nekróza cez epidermu až do dermy po aplikácii testovanej chemikálie, ako sa vymedzuje v Globálnom harmonizovanom systéme klasifikácie a označovania chemikálií (GHS) Organizácie Spojených národov (OSN) (1) a nariadení Európskej únie (EÚ) č. 1272/2008 o klasifikácii, označovaní a balení látok a zmesí (nariadenie CLP) ( 24 ) . Táto testovacia metóda, ktorá je rovnocenná s aktualizovaným usmernením OECD na vykonávanie testov 435, predstavuje testovaciu metódu s využitím membránovej bariéry, ktorá slúži na identifikáciu žieravých chemikálií. V rámci tejto testovacej metódy sa používa umelá membrána navrhnutá tak, aby na žieravé chemikálie reagovala podobným spôsobom ako koža zvieraťa 2. Žieravosť pre kožu sa tradične posudzuje nanesením testovanej chemikálie na kožu živých zvierat a posúdením rozsahu poškodenia tkaniva po uplynutí stanoveného času (2). Okrem súčasnej testovacej metódy sa prijalo viacero testovacích metód in vitro , ktoré predstavujú alternatívy (3) (4) k štandardnému postupu in vivo s využitím králičej kože (kapitola B.4 tejto prílohy, ktorá je rovnocenná s usmernením OECD TG 404), ktorý slúži na identifikovanie žieravých chemikálií (2). V stratégii viacúrovňového testovania a hodnotenia podľa GHS OSN pri hodnotení a klasifikácii žieravosti pre kožu a v usmerňovacom dokumente OECD o integrovaných prístupoch k testovaniu a hodnoteniu (IATA) v prípade podráždenia/poleptania kože sa odporúča použitie validovaných a uznaných testovacích metód in vitro v rámci modulov 3 a 4 (1) (5). V rámci prístupu IATA sa opisuje viacero modulov, v ktorých sú zoskupené zdroje informácií a analytické nástroje, a i) poskytuje sa usmernenie o tom, ako integrovať a používať existujúce údaje z testovania, ako aj údaje nepochádzajúce z testovania na posúdenie potenciálu chemikálií na spôsobenie podráždenia a poleptania kože; a ii) navrhuje sa prístup v prípade potreby ďalšieho testovania vrátane prípadov, keď sa zistia negatívne výsledky (5). V rámci tohto modulárneho prístupu možno na základe pozitívnych výsledkov z testovacích metód in vitro označiť chemikáliu za žieravú bez toho, aby bolo potrebné testovanie na zvieratách, čím sa obmedzí a spresní používanie zvierat a predíde sa bolesti a utrpeniu, ku ktorým by mohlo dôjsť, ak by sa na tento účel používali zvieratá. 3. Pre model s využitím membránovej bariéry in vitro , ktorý je komerčne dostupný pod označením Corrositex ® (6) (7) (8), sa uskutočnili validačné štúdie, ktorými sa preukázala celková presnosť pri predikcii žieravosti pre kožu na úrovni 79 % (128/163), citlivosť na úrovni 85 % (76/89) a špecifickosť na úrovni 70 % (52/74), a to na základe databázy 163 látok a zmesí (7). Na základe uznanej validity sa táto validovaná referenčná metóda (VRM) odporúča na použitie v rámci viacúrovňovej testovacej stratégie na posudzovanie potenciálu chemikálií, pokiaľ ide o nebezpečenstvo žieravosti pre kožu (5) (7). Skôr ako sa na účely regulácie môže použiť test poleptania kože s využitím membránovej bariéry in vitro , je potrebné stanoviť jeho spoľahlivosť, relevantnosť (presnosť) a obmedzenia jeho navrhovaného používania, aby sa zabezpečila jeho podobnosť s metódou VRM (9) v súlade s vopred určenými normami výkonnosti (PS) (10). Vzájomné uznávanie údajov podľa dohody OECD bude možné garantovať len po tom, ako bola akákoľvek nová alebo aktualizovaná metóda v súlade s normami výkonnosti preskúmaná a zaradená do rovnocenného usmernenia OECD na vykonávanie testov. V súčasnosti usmernenie OECD na vykonávanie testov 435 zahŕňa len jednu metódu in vitro , a to túto testovaciu metódu, ktorá je komerčne dostupná ako model Corrositex ® . 4. Ostatné metódy na testovanie žieravosti pre kožu sú založené na použití rekonštituovanej ľudskej kože (OECD TG 431) (3) a izolovanej kože potkanov (OECD TG 430) (4). Súčasťou tohto usmernenia na vykonávanie testov je aj zaradenie žieravých chemikálií do troch podkategórií žieravosti podľa GHS OSN a do troch prepravných obalových skupín OSN z hľadiska nebezpečenstva žieravosti. Toto usmernenie na vyk