Smernica Komisie z 18. novembra 1987, ktorou sa prispôsobuje technickému pokroku po deviatykrát smernica Rady 67/548/EHS o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení týkajúcich sa klasifikácie, balenia a označovania nebezpečných látok



Úradný vestník L 133 , 30/05/1988 S. 0001 - 0127

Fínske špeciálne vydanie: Kapitola 15 Zväzok 14 S. 0003

Švédske špeciálne vydanie: Kapitola 15 Zväzok 14 S. 0003

CS.ES Kapitola 13 Zväzok 009 S. 90 - 216

ET.ES Kapitola 13 Zväzok 009 S. 90 - 216

HU.ES Kapitola 13 Zväzok 009 S. 90 - 216

LT.ES Kapitola 13 Zväzok 009 S. 90 - 216

LV.ES Kapitola 13 Zväzok 009 S. 90 - 216

MT.ES Kapitola 13 Zväzok 009 S. 90 - 216

PL.ES Kapitola 13 Zväzok 009 S. 90 - 216

SK.ES Kapitola 13 Zväzok 009 S. 90 - 216

SL.ES Kapitola 13 Zväzok 009 S. 90 - 216



Smernica Komisie z 18. novembra 1987, ktorou sa prispôsobuje technickému pokroku po deviatykrát smernica Rady 67/548/EHS o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení týkajúcich sa klasifikácie, balenia a označovania nebezpečných látok (88/302/EHS) KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV, so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho hospodárskeho spoločenstva, so zreteľom na smernicu Rady 67/548/EHS z 27. júna 1967 o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení týkajúcich sa klasifikácie, balenia a označovania nebezpečných látok [1], v znení smernice 79/831/EHS [2] po šiestej zmene, a najmä na jej článok 19, keďže článok 3 ods. 1 smernice 67/548/EHS ustanovuje, že fyzikálno-chemické vlastnosti, toxicita a ekotoxicita látok a prípravkov sa ustanoví podľa metód špecifikovaných v prílohe V; keďže článok 3 ods. 2 smernice 67/548/EHS ustanovuje, že skutočné alebo potenciálne nebezpečenstvo pre životné prostredie sa hodnotí podľa vlastností stanovených v prílohách VII a VIII; keďže príloha V tak, ako bola zavedená smernicou 84/449/EHS [3], obsahuje v súčasnej dobe iba skúšobné metódy pre vlastnosti uvedené v prílohe VII a je teda nevyhnutné opísať skúšobné metódy pre vlastnosti uvedené v prílohe VIII; keďže opatrenia tejto smernice sú v súlade so stanoviskom Výboru na prispôsobovanie sa smerníc technickému pokroku pri odstraňovaní technických prekážok obchodu s nebezpečnými látkami a prípravkami, PRIJALA TÚTO SMERNICU: Článok 1 Text prílohy tejto smernice sa dopĺňa do prílohy V smernice 67/548/EHS. Článok 2 Členské štáty prijmú a uverejnia opatrenia nevyhnutné na dosiahnutie súladu s touto smernicou najneskôr do 31. decembra 1988. Bezodkladne o tom informujú Komisiu. Tieto predpisy uplatnia najneskôr od 30. júna 1989. Článok 3 Táto smernica je určená členským štátom. V Bruseli 18. novembra 1987 Za Komisiu STANLEY clinton davis člen Komisie [1] Ú. v. ES 196, 16.8.1967, s. 1/67. [2] Ú. v. ES L 259, 15.10.1979, s. 10. [3] Ú. v. ES L 251, 19.9.1984, s. 1. -------------------------------------------------- PRÍLOHA Nižšie opísané testovacie metódy slúžia na stanovenie niektorých toxických a ekotoxických účinkov uvedených v prílohe VIII smernice Rady 79/831/EHS. Sú tu opísané testovacie metódy vhodné pre stupeň 1 a stupeň 2 podľa prílohy VIII, nie sú však rozlíšené na jednotlivé stupne. OBSAH | Strana | ČASŤ B: Metódy stanovenia toxicity … | 4 | Všeobecný úvod: Časť B … | 4 | Test subchronickej orálnej toxicity (po 90 - dňovom opakovanom orálnom vystavení u hlodavcov) … | 8 | Test subchronickej orálnej toxicity (po 90 - dňovom opakovanom orálnom vystavení u nehlodavcov) … | 12 | Štúdia subchronickej dermálnej toxicity (po 90 - dňovej opakovanej kožnej aplikácii u hlodavcov) … | 16 | Test toxicity subchronickej inhalácie (90 - dňový test opakovaného inhalačného vystavenia na hlodavcoch) … | 20 | Test teratogenity – hlodavce a nehlodavce … | 24 | Test chronickej toxicity … | 27 | Test karcinogenity … | 32 | Kombinovaný test chronickej toxicity/karcinogenity … | 37 | Jednogeneračný reprodukčný test toxicity … | 43 | Dvojgeneračný reprodukčný test toxicity … | 47 | Toxikokinetika … | 51 | Testovanie mutagenity a karcinogenity … | 55 | —Génová mutácia – Saccharomyces cerevisiae… | 55 | —Mitotická rekombinácia – Saccharomycesc cerevisiae… | 58 | —Test génových mutácií buniek cicavcov In vitro… | 61 | —Poškodenie a oprava DNA – neprogramovaná syntéza DNA – bunky cicavcov in vitro… | 64 | —Test výmeny sesterských chromatíd in vitro… | 68 | —Test na zachytenie recesívnych letálnych mutácií viazaných na pohlavie pri Drosophila melanogaster… | 71 | —Testy bunkovej transformácie cicavčích buniek in vitro… | 73 | —Dominantný letálny test u hlodavcov … | 76 | —Cytogenetika cicavčích zárodočných buniek in vivo… | 79 | —Spot test u myší … | 82 | —Dedičná translokácia u myší … | 85 | ČASŤ C: Metódy na určovanie ekotoxicity … | 88 | Všeobecný úvod: Časť C … | 88 | Test inhibície na riasach … | 89 | Toxicita na dážďovkách: Umelopôdny test … | 95 | Biodegradácia: Zahn-Wellensov test … | 99 | Biodegradácia: Simulačné testy na aktivovanom kale … | 106 | Biodegradácia: Test respiračnej inhibície aktivovaného kalu … | 118 | Biodegradácia: Modifikovaný SCAS – test … | 123 | ČASŤ B: METÓDY STANOVENIA TOXICITY VŠEOBECNÝ ÚVOD: ČASŤ B DLHODOBÉ ŠTÚDIE Štúdie subchronickej a chronickej toxicity a štúdie karcinogenity Charakterizácia testovanej látky a testovacej zmesi Zloženie testovanej látky, včítane hlavných prísad, a jej príslušné fyzikálno-chemické vlastnosti, včítane stability, by mali byť známe pred začatím akejkoľvek štúdie toxicity. Fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej látky ponúkajú dôležité informácie pre výber spôsobu podávania, pre návrh každej jednotlivej štúdie a pre manipuláciu s testovanou látkou a jej uchovávanie. Údaje o chemickej štruktúre a fyzikálno-chemických vlastnostiach môžu tiež ponúknuť informáciu o absorpčných charakteristikách u plánovaného spôsobu dávkovania a o možnostiach metabolického spracovania a distribúcie látky v tkanivách. Môžu tiež existovať údaje o toxiko-kinetických parametroch z predchádzajúcich štúdií toxicity a z toxiko-kinetických štúdií. Začiatku štúdie by mal predchádzať vývoj analytickej metódy pre kvalitatívne a kvantitatívne stanovenie testovanej látky (pokiaľ možno včítane hlavných prísad) v dávkovacom médiu a v biologickom materiále. Pokusné zvieratá: výber druhu a kmeňa S ohľadom na to, že je nevyhnutné zvieratá vystaviť počas doby predstavujúcej väčšinovú časť dĺžky ich života, existuje tendencia obmedziť štúdie na relatívne krátko žijúce testovacie druhy nevyžadujúce zložitú opateru. Je vysoko žiaduce, aby bol známy spontánny výskyt ochorení a nádorov u kmeňov použitých zvierat, ak sa chovajú v porovnateľných podmienkach. Kmene by mali byť dobre ocharakterizované a nesmú sa u nich vyskytovať nepriaznivé vrodené vady. V tomto ohľade má určitú výhodu použitie potomkov príbuzenského kríženia (inbredné kmene) alebo hybridov F1-generácie; ak sú však k dispozícii dostatočné údaje o pozadí outbredných kmeňov (nepríbuzenské kríženie), môžu byť použité tiež na zvieratách z definovaného zásobného chovu. Opatera zvierat, podávanie výživy a vody Testy a štúdie na zvieratách musia byť uskutočnené v súlade s vnútroštátnymi predpismi a musia byť pri nich zohľadnené humánne princípy a medzinárodný vývoj v oblasti ochrany zvierat. Ak majú byť získané zmysluplné výsledky, je nevyhnutná prísna kontrola podmienok prostredia a adekvátna opatera zvierat. Faktory ako chovateľské podmienky, chronická choroba, medikamentózna liečba, prísady vo výžive, vzduchu, vode a stelivu a všeobecné podmienky chovu, môžu významne ovplyvniť výsledky štúdií pri opakovanej dávke. Všeobecne by mal byť známy účinok chemických sterilizačných prostriedkov na štúdiu. Krmivo musí spĺňať všetky požiadavky na výživu testovaného druhu a nesmie obsahovať prísady, ktoré by mohli mať vplyv na výsledky testov. Hlodavce musia byť zásobované potravou a vodou ad libitum, pričom im musí byť potrava vymieňaná najmenej raz do týždňa. V súčasnosti sa používajú tri typy krmív: bežné krmivo, syntetické krmivo a rôzne druhy špeciálne zloženého krmiva. Bez ohľadu na zvolený typ krmiva musia dodávatelia periodickým sledovaním zaručiť nutričnú hodnotu a obsah kontaminujúcich látok v základnej strave a musia tieto informácie ponúknuť laboratóriu pri každej šarži potravy. Je vysoko žiaduce, aby boli známe účinky potravného režimu na metabolizmus a vznik nádorov a dĺžku života. Okrem toho môže skúšobné laboratórium uskutočňovať kontrolné analýzy výživy na zložky krmiva i nežiaduce prímesi, včítane karcinogénov. Ak sa také analýzy uskutočňujú, ich výsledky sa archivujú a uvedú sa v záverečnej správe o každej testovanej látke. Bežné zložky výživy, o ktorých je známe, že vplývajú na karcinogenézu (napr. antioxidačné látky, nenasýtené mastné kyseliny, selén), nesmú byť prítomné v nepriaznivých koncentráciách. Možný vplyv radu známych kontaminujúcich látok obsiahnutých vo výžive na posúdenie karcinogenity vyžaduje, aby bola u krmiva venovaná zvláštna pozornosť prítomnosti zvyškov pesticídov, organochlórových zlúčenín, polycyklických aromatických uhľovodíkov, estrogénov, ťažkých kovov, nitrózoamínov a mykotoxínov. Ak sa testovaná látka aplikuje vo vode alebo v potrave, je nevyhnutné uskutočniť skúšky stability. Na základe skúšok stability a homogenity adekvátne uskutočnených pred štúdiami, pri opakovanej dávke je možné stanoviť, ako často má byť strava pripravovaná a monitorovaná. Počas sterilizácie krmiva musia byť známe účinky takého pôsobenia na testovanú látku a zložky stravy. V prípade zistenia účinkov musí byť uskutočnená vhodná úprava. Pri testoch karcinogenity si musia byť experimentátori vedomí možnej prítomnosti kontaminujúcich látok v použitej vode. V zásade vyhovuje pitná voda, pričom by malo byť známe jej zloženie. Koncentrácia testovanej látky vo výžive sa upravuje podľa rastu zvierat, aby sa udržiaval približne konštantný príjem testovanej látky na jednotku telesnej hmotnosti. Kontrolná a testovaná strava by mali mať, pokiaľ možno, podobnú nutričnú hodnotu. Je teda potrebné brať do úvahy nutričnú hodnotu testovanej látky zamiešanej do krmiva. Podľa skúseností by menej ako 5 % testovanej látky, ktorá nemá výživové vlastnosti, nemalo mať významnejší vplyv na nutričnú hodnotu výživy. 1. Inhalačné štúdie Nie je stanovený limitný test, nakoľko nebolo možné definovať jedinú limitnú hodnotu inhalačnej expozície. 2. Štúdie teratogenity Testovacie metódy sú primárne zamerané na orálne podávanie. V závislosti od fyzikálnych vlastností testovanej látky alebo od pravdepodobného spôsobu vystavenia človeka je možné použiť iné spôsoby podávania. V takýchto prípadoch sa skúšobný postup zodpovedajúcim spôsobom upraví, pričom sa zohľadnia príslušné kritériá 28 - dňových testov. 3. Toxiko-kinetika Toxiko-kinetické štúdie napomáhajú pri interpretácii a vyhodnotení údajov o toxicite. Tieto štúdie sú určené k objasneniu určitých aspektov toxicity testovanej chemickej látky a výsledky môžu pomôcť pri plánovaní ďalších štúdií toxicity. Nepredpokladá sa, že by bolo vo všetkých prípadoch nevyhnutné stanoviť všetky parametre. Iba v zriedkavých prípadoch bude nevyhnutné uskutočniť kompletnú sadu toxikokinetických štúdií (štúdií absorpcie, vylučovania, distribúcie a metabolizmu). Pre určité zlúčeniny môžu byť vhodné zmeny v tejto sade alebo môže stačiť štúdia s jedinou dávkou. Definícia Toxikokinetika: | štúdie absorpcie, distribúcie, metabolizmu a vylučovania testovaných látok; | Absorpcia: | proces, ktorým podaná látka vstupuje do tela; | Vylučovanie: | proces, ktorým sú podaná látka a/alebo jej metabolity vylúčené z tela; | Distribúcia: | proces, ktorým je absorbovaná látka a/alebo jej metabolity rozdelené v tele; | Metabolizmus: | proces, ktorým je podaná látka v tele štruktúrne menená enzymatickými alebo neenzymatickými reakciami. | 4. Akútne a subakútne štúdie na inom zvieracom druhu Účelom štúdie na inom zvieracom druhu je doplniť závery vyplývajúce z prvého testu. V prípade štúdie na inom zvieracom druhu môžu byť použité už opísané metódy alebo môžu byť upravené pre menší počet zvierat. 5. Štúdie plodnosti Ak je nevyhnutný trojgeneračný test reprodukcie (plodnosti), môže byť už opísaná metóda dvojgeneračného testu reprodukcie rozšírená tak, aby pokrývala tretiu generáciu. 6. Štúdie mutagenity Doplňujúce testy mutagenity, včítane skríningových skúšok karcinogenity V prílohe VIII smernice sa uvádzajú doplňujúce testy na vyšetrenie mutagenity alebo na skríning karcinogenity. Štúdie uvedené v tejto sekcii môžu byť v zásade použité na obidva účely. Úvod Prvé posúdenie mutagénnej aktivity látky zahŕňa test na génové (bodové) mutácie u baktérií a testy na cytogenetické poškodenie cicavčích buniek (v podmienkach in vitro alebo in vivo); vhodné metódy pre túto základnú sadu boli opísané skôr. Táto sekcia sa zaoberá doplňujúcimi testami, ktoré sú vhodné na overenie a/alebo rozšírenie výsledkov základnej sady a slúžia na ďalšie účely: 1. na potvrdenie výsledkov získaných v základnej sade štúdií; 2. na vyšetrenie ukazovateľov, ktoré neboli zahrnuté do základnej sady; 3. na začiatok alebo prehĺbenie štúdií v podmienkach in vivo; Na tieto účely zahŕňajú opísané testy eukaryotické systémy v podmienkach in vivo a in vitro a rozšírený rad biologických ukazovateľov. Testy poskytujú informácie o bodových mutáciách u organizmov, ktoré sú zložitejšie ako baktérie použité v základnej sade a rozširujú informácie o schopnosti látky indukovať chromozómové aberácie. Rovnako sú opísané testy iných ukazovateľov, ako sú bodové mutácie a chromozómové aberácie. Poskytujú doplňujúce informácie a môžu byť podľa potreby začlenené do testovacích schém. Všeobecne platí, že ak sa zvažuje program ďalších štúdií mutagenity, mal by byť navrhnutý takým spôsobom, aby poskytol príslušné doplňujúce informácie o mutagénnom a/alebo karcinogénnom potenciáli látky. Výber štúdií, ktoré môžu byť vhodné pre daný prípad, závisí od mnohých faktorov, včítane chemických a fyzikálnych vlastností látky, výsledkov základných bakteriálnych a cytogenetických testov, metabolického profilu látky, výsledkov ďalších štúdií toxicity a známych spôsobov použití látky. Pevná schéma výberu testov teda nie je vhodná, s ohľadom na veľký počet faktorov vyžadujúcich zváženie. Určité všeobecné zásady však môžu slúžiť ako návod. Ak by test v základnej sade bol pozitívny, mal by byť medzi doplnkové štúdie zahrnutý aspoň jeden test umožňujúci hodnotiť ten istý genetický ukazovateľ. Pokiaľ boli obidva testy v základne sade negatívne, mali by byť ako doplnkové testy zvyčajne uskutočnené testy génových mutácií a chromozómových aberácií. Rovnako môže byť vhodné získať doplňujúce údaje z indikátorových testov (ako je uvedené nižšie). Metódy pre tieto vyšetrenia sú nižšie zoskupené na základe ich hlavného (analyzovaného) genetického ukazovateľa. Štúdie sledujúce génové (bodové) mutácie Na ďalšie vyšetrenie schopnosti látky vyvolávať génové (bodové) mutácie je možné použiť jeden z nasledovných testov: a) štúdie priamej alebo spätnej mutácie u eukaryotických mikroorganizmov (Saccharomyces cerevisiae); b) štúdie priamych mutácií v cicavčích bunkách v podmienkach in vitro; c) test recesívnej letálnej mutácie viazanej na pohlavie u Drosophila melanogaster; d) test somatických mutácií buniek v podmienkach in vivo: spot test na myšiach. Štúdie sledujúce chromozómové aberácie Na ďalšie vyšetrenie schopnosti látky vyvolávať chromozómové aberácie je možné použiť jeden z nasledovných testov: a) cytogenetické štúdie cicavcov v podmienkach in vivo; Do úvahy by mala byť braná analýza metafázy buniek kostnej drene, pokiaľ nebola zaradená do základného vyšetrenia (štúdie základnej sady). Okrem toho môže byť tiež uskutočnená cytogenetická analýza zárodočných buniek v podmienkach in vivo; b) cytogenetická štúdia cicavčích buniek v podmienkach in vitro, pokiaľ nebola zaradená do základného vyšetrenia; c) test dominantnej letality na hlodavcoch; d) test dedičnej translokácie u myší. Indikátorové testy účinkov na DNA Používajú sa, ak sú k dispozícii metódy, ktoré poskytujú dôkaz niektorých účinkov na DNA, no ich analyzovaným ukazovateľom nie sú ukazovatele mutagénnych účinkov. Tieto štúdie môžu podať doplňujúce informácie k výsledkom štúdií mutagenity a môžu byť užitočné pri interpretácii takýchto štúdií. V prípade potreby môžu byť pre pozorovanie týchto javov vhodné nasledovné metódy využívajúce eukaryotické mikroorganizmy alebo bunky cicavcov: a) mitotická rekombinácia u Saccharomyces cerevisiae; b) poškodenie a reparácie DNA – neplánovaná syntéza DNA v cicavčích bunkách v podmienkach in vitro; c) výmena sesterských chromatíd v cicavčích bunkách v podmienkach in vitro. Iné indikátorové metódy vyšetrovania karcinogénneho potenciálu Testy transformácie cicavčích buniek umožňujú merať schopnosť látky vyvolať zmeny morfológie a správania v bunkových kultúrach, u ktorých sa predpokladá, že majú súvis s malígnou transformáciou v podmienkach in vivo. Použité môžu byť rôzne typy buniek a rôzne kritériá transformácie. Posúdenie rizika dedičných účinkov u cicavcov Existuje niekoľko metód merania dedičných účinkov vyvolaných genetickými (bodovými) mutáciami u cicavcov (napr. test na špecifické umiestnenie génov v chromozóme u myší [1]) alebo chromozómových aberácií (napr. test na prenosné translokácie u myší). Tieto metódy je možné použiť na odhad možného genetického rizika, ktoré látka predstavuje pre človeka. Vzhľadom k zložitosti týchto testov a k vysokému nevyhnutnému počtu zvierat, najmä pre test špecifického umiestnenia génov v chromozóme, je však nutné presvedčivé zdôvodnenie pred samotným prevedením týchto štúdií. TEST SUBCHRONICKEJ ORÁLNEJ TOXICITY (PO 90 - DŇOVOM OPAKOVANOM ORÁLNOM VYSTAVENÍ U HLODAVCOV) 1. METÓDA 1.1. Úvod Pozri všeobecný úvod časť B. 1.2. Definícia Pozri všeobecný úvod časť B. 1.3. Referenčné látky Žiadne. 1.4. Podstata skúšobnej metódy Testovaná látka sa podáva denne, orálne, v odstupňovaných dávkach niekoľkým skupinám pokusných zvierat, každej skupine jedna úroveň dávky 90 dní. V priebehu obdobia podávania sa zvieratá každý deň pozorujú, aby sa zistili príznaky toxicity. Zvieratá, ktoré počas skúšky uhynuli a i zvieratá, ktoré do konca skúšky prežili, sa pitvú. 1.5. Kritériá kvality Neustanovené. 1.6. Opis testovacej metódy Príprava Najmenej päť dní pred testom si zvieratá zvykajú na chovateľské a vyživovacie podmienky, v ktorých budú počas experimentu. Pred testom sa zdravé mladé zvieratá randomizujú a priradia sa k pokusným a kontrolným skupinám. Testovanú látku je možné dávkovať v potrave ako sondu, v kapsliach alebo v pitnej vode. Môžu sa použiť aj iné prostriedky dávkovania. Všetkým zvieratám sa testovaná látka dávkuje počas celého obdobia testu rovnakou metódou. Ak sa na uľahčenie dávkovania použije pomocná látka alebo iná prísada, musí byť zabezpečený jej účinok, ktorý nie je toxický. Na to sa podľa možností môžu použiť údaje z predchádzajúcich testov. Podmienky testovania Pokusné zvieratá Ak neexistujú mimoriadne dôvody, uprednostňuje sa potkan. Používajú sa mladé zdravé zvieratá známych pokusných kmeňov, v ideálnom prípade by na počiatku dávkovania látky mali byť potkany mladšie ako 6 týždňov, v žiadnom prípade by nemali byť staršie ako 8 týždňov. Na začiatku testu by nemali odchýlky hmotnosti použitých zvierat byť viac ako ± 20 % od prispôsobenej strednej priemernej hodnoty. Ak sa uprednostňuje subchronická orálna štúdia ako predbežná štúdia pred dlhodobou štúdiou, mal by byť v oboch štúdiách použitý rovnaký druh zvierat a rovnaký kmeň. Počet a pohlavie Pre každú pokusnú skupinu by sa malo použiť minimálne 20 zvierat (10 samičiek a 10 samčekov). Samičky nesmú byť ani po vrhu a ani nesmú byť gravidné. Ak majú byť počas testu usmrtené zvieratá, zvýši sa celkový počet zvierat o počet zvierat, ktoré majú byť usmrtené ešte pred koncom testu. Okrem toho sa môže vystaviť aj dodatočná skupina (satelitná skupina) s 20 zvieratami (10 samičiek a 10 samčekov) počas 90 dní s najvyššou dávkou, aby sa počas 28 dní po vystavení mohla sledovať reverzibilita, pretrvávanie alebo oneskorený prejav toxických účinkov. Expozičné koncentrácie Potrebné sú minimálne tri koncentrácie a jedna kontrolná skupina. Odhliadnuc od aplikácie testovanej látky musia sa zvieratá v kontrolnej skupine vystaviť rovnako ako pokusné zvieratá. Ak sa pre uľahčenie dávkovania používa pomocná látka, podáva sa kontrolnej skupine rovnakým spôsobom ako pokusným zvieratám, a to v rovnakom množstve, aké prijme skupina, ktorej sa aplikuje najvyššia dávka. Najvyššia koncentrácia sa volí tak, aby v každom prípade došlo k toxickému účinku, ale aby zvieratá nehynuli alebo iba v malom množstve. Najnižšia koncentrácia nesmie spôsobovať žiadne príznaky toxicity. Ak existujú použiteľné odhady o výške vystavenia u človeka, najnižšia dávka musí túto hodnotu prekročiť. V ideálnom prípade by mala stredná dávka spôsobiť len nízke toxické účinky. Ak sa podávajú viaceré medzikoncentrácie, tak sa musia voliť tak, aby došlo k postupnej klasifikácii toxických účinkov. V skupinách s nízkou a strednou koncentráciou, ako aj v kontrolných skupinách, by mal byť počet úmrtí nízky, aby sa umožnilo výrazne vyhodnotenie výsledkov. Ak sa testovaná látka aplikuje v potrave, môže sa použiť buď konštantná koncentrácia v potrave (v jednotkách ppm alebo mg/kg potravy), alebo konštantné dávkovanie aproximované na telesnú hmotnosť zvieraťa; použitá alternatívna možnosť musí byť špecifikovaná. Ak sa testovaná látka podáva sondou, malo by sa tak robiť každý deň približne v rovnaký čas. Dávkovanie by sa malo podľa potreby v pravidelných intervaloch (týždenných alebo dvojtýždenných) prispôsobovať tak, aby bolo konštantné vzhľadom na telesnú hmotnosť zvieraťa. Limitný test Pokiaľ 90 - dňová skúška uskutočnená nižšie opísanou metódou nevyvolá žiadne toxické účinky pri koncentrácii 1000 mg/kg telesnej hmotnosti za deň alebo pri vyššej koncentrácii zodpovedajúcej prispôsobenému vystaveniu u človeka, ak je táto známa, nie je ďalšie testovanie nutné. Ak sa podáva látka o nízkej toxicite v potrave, je nutné zaistiť, aby ani aplikované množstvo, ani ďalšie vlastnosti testovanej látky neboli prekážkou normálnej výživy zvierat. Doba pozorovania Všetky zvieratá sa pozorujú denne a zaznamenávajú sa prejavy toxicity, včítane času nástupu, závažnosti a trvania. Zaznamenajú sa: doba úmrtia a čas, v ktorom sa objavili a znova odzneli toxické účinky. Postup Testovaná látka sa v ideálnom prípade zvieratám podáva sedem dní v týždni po dobu 90 dní. Zvieratá satelitnej skupiny, ktoré sú určené na dodatočné pozorovanie, by mali byť ďalších 28 dní bez vystavenia, aby sa dala zistiť reverzibilita toxických účinkov alebo ich pretrvávanie. Pozorovanie v klietke zahŕňa zmeny kože, srsti, očí, slizníc, dýchacieho systému a krvného obehu, zmeny funkcie autonómnej a centrálnej nervovej sústavy, somatomotoriky a správania. Meranie spotreby potravy (a spotreby vody pri aplikácii testovanej látky v pitnej vode) a hmotnosti zvierat sa uskutočňujú týždenne. Je nutné zaistiť pravidelnú kontrolu zvierat, aby pokiaľ možno počas testu nedochádzalo k stratám zvierat, napr. v dôsledku kanibalizmu, autolýzy tkanív alebo chybou pri premiestňovaní zvierat. Po ukončení fázy vystavenia sa všetky zvieratá, ktoré prežili, s výnimkou zvierat satelitnej skupiny, pitvú. Zvieratá, ktoré sú pred smrťou, by sa mali vytriediť, humánne usmrtiť a pitvať. U všetkých zvierat, včítane kontrolných, sa zvyčajne vykonávajú nasledovné vyšetrenia: a) Oftalmologické vyšetrenie pomocou oftalmoskopu alebo rovnakého vhodného prístroja by sa malo vykonať pred expozíciou voči testovanej látke a na konci štúdie, najlepšie u všetkých zvierat, aspoň však v skupine s najvyššou dávkou a v kontrolnej skupine. Ak sa na konci testu zistia zmeny na očiach, vyšetria sa všetky zvieratá. b) Na konci testu by sa malo vykonať hematologické vyšetrenie, ktoré má zahŕňať hodnotu hematokrytu, koncentráciu hemoglobínu, počet erytrocytov, leukocytov, diferenciálny obraz, hemokoagulačné parametre ako testy zrážania krvi, zmeria sa napríklad čas zrážania, protrombínový čas, tromboplastínový čas alebo počet trombocytov. c) Na konci testu by sa mali vykonať biochemické analýzy krvi. Pre tieto štúdie je vhodné analyzovať koncentráciu elektrolytov, metabolizmus glycidov, funkciu pečene a ľadvín. Výber špecifických skúšok bude odvodený z pozorovania spôsobu účinku látky. Navrhované vyšetrenia zahŕňajú stanovenie vápniku, fosforu, chloridov, sodíku, draslíku, glukózy na lačno (s pôstnou periodou určenou pre druh zvietraťa), hladiny sérovej glutamátpyruvát transaminázy [2], glutamátoxalacetát transaminázy [3], ornitindekarboxylázy, gamaglutamyltranspeptidázy, dusíku močoviny, albumínu, kreatinínu, celkového bilirubínu a celkových sérových bielkovín. Medzi ďalšie stanovenia, ktoré môžu byť nevyhnutné pre správne toxikologické hodnotenie, patrí stanovenie lipidov, hormónov, rovnováhy kyselín a zásad, methemoglobínu a aktivity cholinesterázy. Dodatočné biochemické analýzy môžu byť použité, ak je nevyhnutné prehĺbenie vyšetrenia pozorovaných toxických účinkov. d) Analýza moču nie je spravidla potrebná, potrebná je vtedy, ak sa pozoruje alebo očakáva toxický účinok. Ak údaje z predošlých testov neboli preukázané, mal by sa brať ohľad na hematologické a biochemické parametre pred začiatkom testu. Autopsia U všetkých zvierat zúčastňujúcich sa na teste sa musí vykonať kompletná autopsia skladajúca sa z vonkajšej prehliadky povrchu tela, všetkých telesných otvorov, lebečnej, hrudnej a brušnej dutiny, včítane ich obsahu. Pečeň, obličky, nadobličky a semenníky sa musia čo najskôr po sekcii odvážiť vlhké, aby sa predišlo vysušeniu. Nasledovné orgány a tkanivá je nutné uchovať vo vhodnom médiu pre prípadné neskoršie histopatologické vyšetrenia: všetky orgány s makroskopickými zmenami, mozog – vrátane medulla/pons, kôry malého a veľkého mozgu, hypofýza, štítna žľaza/prištítna žľaza, všetky týmusové tkanivá, priedušnice a pľúca, srdce, aorta, (slinné žľazy), pečeň, slezina, obličky, nadobličky, pankreas, gonády, maternica (akcesórne pohlavné orgány), (kôža), ezofagus, žalúdok, dvanástnik, jejunum, ileum, caecum, kolon, rektum, močový mechúr, reprezentatívne lymfatické uzliny, (samičie prsné žľazy), (svalstvo stehna), nervy periférneho systému, hrudná kosť s kostnou dreňou, (oči), (femur, včítane povrchu kĺbu), (miecha v troch úrovniach – oblasť krku, toraxu a bedier) a (extraorbitálna slzná žľaza). Tkanivá uvedené v zátvorkách sa vyšetrujú iba v prípade, ak je možné na ich postihnutie usudzovať na základe príznakov toxicity alebo pokiaľ súvisia s cieľovým orgánom. Histopatologické vyšetrenie a) Kompletné histopatologické vyšetrenie orgánov a tkanív sa uskutoční u všetkých zvierat skupiny, ktorým bola aplikovaná najvyššia dávka a u zvierat kontrolnej skupiny. b) Vyšetria sa všetky orgány s makroskopickými zmenami. c) Vyšetria sa cieľové orgány zvierat ostatných dávkových skupín. d) Pľúca zvierat v skupinách s nízkou a strednou koncentráciou sa histopatologicky vyšetria k zisteniu príznakov infekcie, aby to umožnilo vhodné posúdenie zdravotného stavu zvierat. Uváži sa vhodnosť histopatologického vyšetrenia pečene a obličiek u týchto skupín. Ďalšie histopatologické vyšetrenie sa u zvierat týchto skupín nemusí uskutočňovať rutinne, musí sa však uskutočniť vždy na orgánoch, na ktorých boli zistené zmeny v skupine s najvyššou koncentráciou. e) U zvierat satelitnej skupiny sa musia histopatologicky vyšetriť tie tkanivá a orgány, ktoré v exponovaných skupinách reagujú na testovanú látku. 2. ÚDAJE Údaje sa zhrnú do tabuľky, pričom sa uvedie u každej pokusnej skupiny počet zvierat na začiatku testu, počet zvierat so zmenami, druh zmien ako aj percento zvierat pre každý druh zmeny. Výsledky sa vyhodnotia vhodným štatistickým postupom. Môže byť použitá akákoľvek uznávaná štatistická metóda. 3. SPRÁVA 3.1. Správa z testu Správa z testu musí, pokiaľ možno, obsahovať tieto informácie: - živočíšny druh, kmeň, pôvod, chovateľské podmienky, krmivo, - podmienky testu, - koncentrácie vystavenia (včítane pomocnej látky, ak je použitá), - údaje o toxických reakciách podľa pohlavia a dávky, - koncentrácie bez účinku, pokiaľ ich možno stanoviť, - čas úmrtia počas experimentu, prípadne údaj o prežití zvierat do konca testu, - opis toxických alebo iných účinkov, - čas, keď boli pozorované jednotlivé abnormálne príznaky a ich ďalší vývoj, - údaje o spotrebe potravy a o telesnej hmotnosti, - oftalmologické nálezy, - uskutočnené hematologické vyšetrenia a ich výsledky, - uskutočnené biochemické vyšetrenia a ich výsledky (včítane výsledkov prípadných analýz moču), - sekčné nálezy, - podrobný opis všetkých histopatologických nálezov, - štatistické vyhodnotenie výsledkov, kde je to možné, - diskusia k výsledkom, - vyhodnotenie výsledkov. 3.2. Vyhodnotenie a interpretácia Pozri všeobecný úvod časť B. 4. LITERATÚRA Pozri všeobecný úvod časť B. TEST SUBCHRONICKEJ ORÁLNEJ TOXICITY PO 90 - DŇOVOM OPAKOVANOM ORÁLNOM VYSTAVENÍ U NEHLODAVCOV 1. METÓDA 1.1. Úvod Pozri všeobecný úvod časť B. 1.2. Definícia Pozri všeobecný úvod časť B. 1.3. Referenčné látky Žiadne. 1.4. Podstata skúšobnej metódy Testovaná látka sa podáva denne, orálne, v odstupňovaných dávkach niekoľkým skupinám pokusných zvierat, každej skupine jedna úroveň dávky 90 dní. V priebehu období podávania sa zvieratá každý deň pozorujú, aby sa zistili príznaky toxicity. Zvieratá, ktoré počas skúšky uhynuli a i zvieratá, ktoré do konca skúšky prežili, sa pitvú. 1.5. Kritériá kvality Neustanovené. 1.6. Opis testovacej metódy Príprava Najmenej päť dní pred testom si zvieratá zvykajú na chovateľské a vyživovacie podmienky, v ktorých budú počas experimentu. Pred testom sa zdravé mladé zvieratá randomizujú a priradia sa k pokusným a kontrolným skupinám. Testovanú látku je možné dávkovať v potrave alebo v kapsliach, ak sa to javí byť vhodnejšie. Môžu sa použiť aj iné prostriedky dávkovania. Všetkým zvieratám sa testovaná látka dávkuje počas celého obdobia testu rovnakou metódou. Ak sa na uľahčenie dávkovania použije pomocná látka alebo iná prísada, musí byť zabezpečený jej účinok, ktorý nie je toxický. Na to sa podľa možností môžu použiť údaje z predchádzajúcich testov. Podmienky testovania Pokusné zvieratá Ak neexistujú kontraindikácie, uprednostňuje sa ako druh – nehlodavec - pes, pričom sa dáva prednosť definovanému plemenu. Môžu sa použiť aj iné druhy nehlodavcov. Používajú sa mladé zdravé zvieratá; v prípade psov sa s dávkovaním začína vo veku od štyroch do šiestich mesiacov a v žiadnom prípade by nemali byť psi starší ako deväť mesiacov. Ak sa uprednostňuje subchronická orálna štúdia ako predbežná štúdia pred dlhodobou štúdiou, mal by byť v oboch štúdiách použitý rovnaký druh zvierat a rovnaké plemeno. Počet a pohlavie Pre každú koncentráciu sa použije najmenej osem zvierat (štyri samičky a štyria samčekovia). Počet zvierat na konci pokusu musí byť taký, aby umožnil vyhodnotenie toxických účinkov. Expozičné koncentrácie Potrebné sú minimálne tri koncentrácie a jedna kontrolná skupina. Odhliadnuc od aplikácie testovanej látky musia sa zvieratá v kontrolnej skupine vystaviť rovnako ako pokusné zvieratá. Najvyššia koncentrácia sa volí tak, aby v každom prípade došlo k toxickému účinku, ale aby zvieratá nehynuli alebo iba v malom množstve. Najnižšia koncentrácia nesmie spôsobovať žiadne príznaky toxicity. Ak existujú použiteľné odhady o výške expozície u človeka, najnižšia dávka musí túto hodnotu prekročiť. V ideálnom prípade by mala stredná dávka spôsobiť len nízke toxické účinky. Ak sa podávajú viaceré medzikoncentrácie, musia sa voliť tak, aby došlo k postupnej klasifikácii toxických účinkov. V skupinách s nízkou a strednou koncentráciou ako aj v kontrolných skupinách by sa tiež nemali vyskytovať úmrtia. V skupinách s nízkou toxicitou je dôležité sa uistiť, že ak sa testovaná látka aplikuje v potrave, množstvo testovanej látky nesmie interferovať s bežnými vyživovateľskými podmienkami. Ak sa testovaná látka aplikuje v potrave, môže sa použiť buď konštantná koncentrácia v potrave (v jednotkách ppm alebo mg/kg potravy), alebo konštantné dávkovanie aproximované na telesnú hmotnosť zvieraťa; použitá alternatívna možnosť musí byť špecifikovaná. Ak sa testovaná látka podáva priamo, napr. v kapsliach, malo by sa tak robiť každý deň približne v rovnaký čas. Dávkovanie by sa malo podľa potreby v pravidelných týždenných intervaloch prispôsobovať tak, aby bolo konštantné vzhľadom na telesnú hmotnosť zvieraťa. Ak sa vykoná subchronický test ako predbežná štúdia pred dlhodobým testom, použijú sa rovnaké vyživovacie podmienky v oboch testoch. Limitný test Pokiaľ 90 - dňová skúška uskutočnená opísanou metódou nevyvolá žiadne toxické účinky pri koncentrácii 1000 mg/kg telesnej hmotnosti za deň alebo pri vyššej koncentrácii zodpovedajúcej prispôsobenému vystaveniu u človeka, ak je táto známa, nie je ďalšie testovanie nutné. Ak sa podáva látka o nízkej toxicite v potrave, je nutné zaistiť, aby ani aplikované množstvo, ani ďalšie vlastnosti testovanej látky neboli prekážkou normálnej výživy zvierat. Doba pozorovania Všetky zvieratá sa pozorujú denne a zaznamenávajú sa prejavy toxicity, včítane času nástupu, závažnosti a trvania. Zaznamenajú sa: doba úmrtia a čas, v ktorom sa objavili a znova odzneli toxické účinky. Postup Testovaná látka sa v ideálnom prípade zvieratám podáva sedem dní v týždni počas 90 dní. Ak sa však testovaná látka aplikuje iným spôsobom ako v potrave, považuje sa z praktických dôvodov za prijateľné podávať látku 5 dní v týždni. Pozorovanie zahŕňa zmeny kože, srsti, očí, slizníc, dýchacieho systému a krvného obehu, zmeny funkcie autonómnej a centrálnej nervovej sústavy, somatomotoriky a správania. Meranie spotreby potravy (a spotreby vody pri aplikácii testovanej látky v pitnej vode) a hmotnosti zvierat sa uskutočňujú týždenne. Denne sa vykonávajú opatrné klinické vyšetrenia zvierat tak, aby prijaté vhodné opatrenia minimalizovali straty zvierat zahrnutých v teste. Po ukončení fázy vystavenia sa všetky zvieratá, ktoré prežili, s výnimkou zvierat satelitnej skupiny, pitvú. Zvieratá, ktoré sú pred smrťou, by sa mali vytriediť, humánne usmrtiť a pitvať. U všetkých zvierat, včítane kontrolných, sa zvyčajne vykonávajú nasledujúce vyšetrenia: a) Oftalmologické vyšetrenie pomocou oftalmoskopu alebo rovnakého vhodného prístroja by sa malo vykonať pred expozíciou voči testovanej látke a na konci štúdie, najlepšie u všetkých zvierat, aspoň však v skupine s najvyššou dávkou a v kontrolnej skupine. Ak sa na konci testu zistia zmeny na očiach, vyšetria sa všetky zvieratá. b) Na konci testu by sa malo vykonať vykonať hematologické vyšetrenie, ktoré má zahŕňať hodnotu hematokrytu, koncentráciu hemoglobínu, počet erytrocytov, leukocytov, diferenciálny obraz, hemokoagulačné parametre ako testy zrážania krvi, zmeria sa napríklad čas zrážania, protrombínový čas, tromboplastínový čas alebo počet trombocytov. c) Na konci testu by sa mali vykonať biochemické analýzy krvi. Pre tieto štúdie je vhodné analyzovať koncentráciu elektrolytov, metabolizmus glycidov, funkciu pečene a ľadvín. Výber špecifických skúšok bude odvodený z pozorovania spôsobu účinku látky. Navrhované vyšetrenia zahŕňajú stanovenie vápniku, fosforu, chloridov, sodíku, draslíku, glukózy na lačno (s pôstnou periodou určenou pre druh zvietraťa), hladiny sérovej glutamátpyruvát transaminázy [4], glutamátoxalacetát transaminázy [5], ornitindekarboxylázy, gamaglutamyltranspeptidázy, dusíku močoviny, albumínu, kreatinínu, celkového bilirubínu a celkových sérových bielkovín. Medzi ďalšie stanovenia, ktoré môžu byť nevyhnutné pre správne toxikologické hodnotenie, patrí stanovenie lipidov, hormónov, rovnováhy kyselín a zásad, methemoglobínu a aktivity cholinesterázy. Dodatočné biochemické analýzy môžu byť použité, ak je nevyhnutné prehĺbenie vyšetrenia pozorovaných toxických účinkov. d) Analýza moču nie je spravidla potrebná, potrebná je vtedy, ak sa pozoruje alebo očakáva toxický účinok. Autopsia U všetkých zvierat zúčastňujúcich sa na teste sa musí vykonať kompletná autopsia skladajúca sa z vonkajšej prehliadky povrchu tela, všetkých telesných otvorov, lebečnej, hrudnej a brušnej dutiny, včítane ich obsahu. Pečeň, obličky, nadobličky, tyroid (ako aj paratyroid) a semenníky sa musia čo najskôr po sekcii odvážiť vlhké, aby sa predišlo vysušeniu. Nasledovné orgány a tkanivá je nutné uchovať vo vhodnom médiu pre prípadné neskoršie histopatologické vyšetrenia: všetky orgány s makroskopickými zmenami, mozog – vrátane medulla/pons, kôry malého a veľkého mozgu, hypofýza, štítna žľaza/príštitna žľaza, všetky týmusové tkanivá, priedušnice a pľúca, srdce, aorta, (slinné žľazy), pečeň, slezina, obličky, nadobličky, pankreas, gonády, maternica (akcesórne pohlavné orgány), (kôža), ezofagus, žalúdok, dvanástnik, jejunum, ileum, coecum, kolon, rektum, močový mechúr, reprezentatívne lymfatické uzliny, (samičie prsné žľazy), (svalstvo stehna), nervy periférneho systému, hrudná kosť s kostnou dreňou, (oči), (femur, včítane povrchu kĺbu), (miecha v troch úrovniach – oblasť krku, toraxu a bedier) a (extraorbitálna slzná žľaza). Tkanivá uvedené v zátvorkách sa vyšetrujú iba v prípade, že je možné ich postihnutie usudzovať na základe príznakov toxicity alebo pokiaľ súvisia s cieľovým orgánom. Histopatologické vyšetrenie Kompletné histopatologické vyšetrenie orgánov a tkanív by sa malo uskutočniť u všetkých zvierat skupiny, ktorým bola aplikovaná najvyššia dávka a u zvierat kontrolnej skupiny. Doplňujúce histopatologické vyšetrenia v skupinách s inými koncentráciami by sa malo vyšetriť v prípade orgánov, ktoré vykazujú zmeny v skupine s najvyššou koncentráciou alebo ak si to vyžadujú indikácie z klinických štúdií. 2. ÚDAJE Údaje by sa mali zhrnúť do tabuľky, pričom sa uvedie u každej pokusnej skupiny počet zvierat na začiatku testu, počet zvierat so zmenami, druh zmien ako aj percento zvierat pre každý druh zmeny. Výsledky sa vyhodnotia vhodným štatistickým postupom. Môže byť použitá akákoľvek uznávaná štatistická metóda. 3. SPRÁVA 3.1. Správa z testu Správa z testu obsahuje, pokiaľ možno, tieto informácie: - živočíšny druh, kmeň, pôvod, chovateľské podmienky, krmivo, - podmienky testu, - expozičné koncentrácie (včítane pomocnej látky, ak je použitá), - údaje o toxických reakciách podľa pohlavia a dávky, - koncentrácie bez účinku, pokiaľ ju možno stanoviť, - čas úmrtia počas experimentu, prípadne údaj o prežití zvierat do konca testu, - opis toxických alebo iných účinkov, - čas, keď boli pozorované jednotlivé abnormálne príznaky a ich ďalší vývoj, - údaje o spotrebe potravy a o telesnej hmotnosti, - oftalmologické nálezy, - uskutočnené hematologické vyšetrenia a ich výsledky, - uskutočnené biochemické vyšetrenia a ich výsledky (včítane výsledkov prípadných analýz moču), - sekčné nálezy, - podrobný opis všetkých histopatologických nálezov, - štatistické vyhodnotenie výsledkov, kde je to možné, - diskusia k výsledkom, - vyhodnotenie výsledkov. 3.2. Vyhodnotenie a interpretácia Pozri všeobecný úvod časť B. 4. LITERATÚRA Pozri všeobecný úvod časť B. ŠTÚDIA SUBCHRONICKEJ DERMÁLNEJ TOXICITY PO 90 - DŇOVEJ OPAKOVANEJ KOŽNEJ APLIKÁCII U HLODAVCOV 1. METÓDA 1.1. Úvod Pozri všeobecný úvod časť B. 1.2. Definícia Pozri všobecný úvod časť B. 1.3. Referenčné látky Žiadne. 1.4. Podstata skúšobnej metódy Testovaná látka sa denne nanáša na kožu, v odstupňovaných dávkach niekoľkým skupinám pokusných zvierat, každej skupine jedna úroveň dávky 90 dní. V priebehu obdobia podávania sa zvieratá každý deň pozorujú, aby sa zistili príznaky toxicity. Zvieratá, ktoré počas skúšky uhynuli a i zvieratá, ktoré do konca skúšky prežili, sa pitvú. 1.5. Kritériá kvality Neustanovené. 1.6. Opis testovacej metódy Príprava Najmenej päť dní pred testom si zvieratá zvykajú na chovateľské a vyživovacie podmienky, v ktorých budú počas experimentu. Pred testom sa zdravé mladé zvieratá randomizujú a priradia sa k pokusným a kontrolným skupinám. Krátko pred začatím testu sa zvieratám ostrihá srsť na chrbte. Vyholenie srsti je tiež prípustné, malo by sa však uskutočniť asi 24 hodín pred testom. Ostrihanie alebo oholenie je zvyčajne potrebné opakovať približne v týždenných intervaloch. Pri strihaní alebo holení srsti je potrebné dať pozor na to, aby sa neporanila koža. Pre aplikáciu testovanej látky sa pripraví najmenej 10 % povrchu tela. Pri rozhodovaní o veľkosti pripravovanej plochy kože, ktorá má byť zbavená srsti a o veľkosti krycieho obväzu je treba vziať do úvahy hmotnosť zvierat. Pri testoch pevných látok, ktoré môžu byť v prípade potreby rozdrvené na prach, sa testovaná látka dostatočne navlhčí vodou, poprípade vhodnou pomocnou látkou, aby bol zaistený dostatočný styk s kožou. Kvapalné testované látky sa spravidla aplikujú neriedené. Aplikácia sa uskutočňuje päť až sedem dní v týždni. Podmienky testovania Pokusné zvieratá Je možné použiť potkana, králika alebo morča. Je možné použiť aj iné živočíšne druhy, ale ich použitie musí byť zdôvodnené. Na začiatku testu by nemali byť odchýlky hmotnosti použitých zvierat viac ako ± 20 % od prispôsobenej strednej priemernej hodnoty. Ak sa uprednostňuje subchronická dermálna štúdia ako predbežná štúdia pred dlhodobou štúdiou, mal by byť v oboch štúdiách použitý rovnaký druh zvierat a rovnaký kmeň. Počet a pohlavie Pre každú pokusnú skupinu by sa malo použiť minimálne 20 zvierat (10 samičiek a 10 samčekov) so zdravou kožou. Samičky nesmú byť ani po vrhu a ani nesmú byť gravidné. Ak majú byť počas testu usmrtené zvieratá, zvýši sa celkový počet zvierat o počet zvierat, ktoré majú byť usmrtené ešte pred koncom testu. Okrem toho sa môže vystaviť aj dodatočná skupina (satelitná skupina) s 20 zvieratami (10 samičiek a 10 samčekov) počas 90 dní najvyššej dávke, aby sa počas 28 dní po vystavení mohla sledovať reverzibilita, pretrvávanie alebo oneskorený prejav toxických účinkov. Expozičné koncentrácie Potrebné sú minimálne tri koncentrácie a jedna kontrolná skupina. Odhliadnuc od aplikácie testovanej látky sa zvieratá v kontrolnej skupine musia vystaviť rovnako ako pokusné zvieratá. Ak sa pre uľahčenie dávkovania používa pomocná látka, podáva sa kontrolnej skupine rovnakým spôsobom ako pokusným zvieratám, a to v rovnakom množstve, aké prijme skupina, ktorej sa aplikuje najvyššia dávka. Doba vystavenia by mala byť najmenej šesť hodín denne. Testovaná látka by sa mala aplikovať každý deň približne v rovnakom čase a dávkovanie by malo byť pravidelne (týždenne alebo každých štrnásť dní) prispôsobené, aby bolo konštantné vzhľadom na telesnú hmotnosť zvieraťa. Najvyššia koncentrácia sa volí tak, aby v každom prípade došlo k toxickému účinku, ale aby zvieratá nehynuli alebo iba v malom množstve. Najnižšia koncentrácia by nemala spôsobovať žiadne príznaky toxicity. Ak existujú použiteľné odhady o úrovni vystavenia u človeka, najnižšia dávka by mala túto hodnotu prekročiť. V ideálnom prípade by mala stredná dávka spôsobiť len nízke toxické účinky. Ak sa podávajú viaceré medzikoncentrácie, musia sa voliť tak, aby došlo k postupnej klasifikácii toxických účinkov. V skupinách s nízkou a strednou koncentráciou, ako aj v kontrolných skupinách, by mal byť počet úmrtí nízky, aby sa umožnilo výrazne vyhodnotenie výsledkov. Ak aplikácia testovanej látky smeruje k závažnému podráždeniu kože, je potrebné znížiť dávku, čo u vysokej koncentrácie môže viesť k obmedzeniu alebo eliminácii iných toxických účinkov. Ak už došlo k závažnému poškodeniu kože, je potrebné test ukončiť a uskutočniť ho znova s nižšími koncentráciami. Limitný test Ak predbežná štúdia pri koncentrácii 1000 mg/kg telesnej hmotnosti za deň alebo pri vyššej koncentrácii zodpovedajúcej prispôsobenej vystaveniu u človeka, ak je táto známa, nevyvolá žiadne toxické účinky, nie je ďalšie testovanie nutné. Doba pozorovania Zvieratá sa pozorujú denne a zaznamenávajú sa prejavy toxicity, včítane času úmrtia a času, v ktorom sa objavili a znova odzneli toxické účinky. Postup Zvieratá sa chovajú jednotlivo v klietkach. Testovaná látka sa v ideálnom prípade zvieratám podáva sedem dní v týždni po dobu 90 dní. Zvieratá satelitnej skupiny, ktoré sú určené na dodatočné pozorovanie, by nemali byť ďalších 28 dní vystavené, aby sa dala zistiť reverzibilita toxických účinkov alebo pretrvávanie toxických účinkov. Doba vystavenia by mala byť najmenej šesť hodín denne. Testovaná látka sa nanesie rovnomerne na plochu, ktorá sa rovná asi 10 % celkového povrchu tela. V prípade vysokotoxických látok môže byť táto plocha menšia, no mala by sa však pokryť čo najväčší časť tejto plochy čo najslabšou a najrovnomernejšou vrstvou. Počas vystavenia sa testovaná látka udržuje v styku s kožou pomocou porézneho mulového obväzu a nedráždivej náplasti. Testovaná plocha sa ďalej vhodným spôsobom prekryje, aby sa mulový obväz a testovaná látka fixovali a aby zvieratá testovanú látku nepožili. K zamedzeniu požitia látky je možné použiť aj prostriedky pre obmedzenie voľnosti pohybu, celkové znehybnenie sa však neodporúča. Po uplynutí doby vystavenia sa odstránia zvyšky testovanej látky, pokiaľ možno vodou alebo iným vhodným spôsobom očistenia kože. Všetky zvieratá sa pozorujú denne a zaznamenávajú sa prejavy toxicity, včítane času nástupu, závažnosti a trvania. Pozorovanie v klietke zahŕňa zmeny kože, srsti, očí, slizníc, dýchacieho systému a krvného obehu, zmeny funkcie autonómnej a centrálnej nervovej sústavy, somatomotoriky a správania. Meranie spotreby potravy a hmotnosti zvierat sa uskutočňuje týždenne. Je nutné zaistiť pravidelnú kontrolu zvierat, aby pokiaľ možno počas testu nedochádzalo k stratám zvierat, napr. v dôsledku kanibalizmu, autolýzy tkanív alebo chybou pri premiestňovaní zvierat. Po ukončení fázy vystavenia sa všetky zvieratá, ktoré prežili, s výnimkou zvierat satelitnej skupiny, pitvú. Zvieratá, ktoré sú pred smrťou, by sa mali vytriediť, humánne usmrtiť a pitvať. U všetkých zvierat, včítane kontrolných, sa zvyčajne uskutočňujú nasledujúce vyšetrenia: a) Oftalmologické vyšetrenie pomocou oftalmoskopom alebo rovnakého vhodného prístroja by sa malo vykonať pred vystavením testovanej látke a na konci štúdie, najlepšie u všetkých zvierat, aspoň však v skupine s najvyššou dávkou a v kontrolnej skupine. Ak sa na konci testu zistia zmeny na očiach, vyšetria sa všetky zvieratá. b) Na konci testu sa musia vykonať hematologické vyšetrenia, ktoré majú zahŕňať hodnotu hematokrytu, koncentráciu hemoglobínu, počet erytrocytov, leukocytov, diferenciálny obraz, hemokoagulačné parametre ako testy zrážania krvi, zmeria sa napríklad čas zrážania, protrombínový čas, tromboplastínový čas alebo počet trombocytov. c) Na konci testu by sa mali vykonať biochemické analýzy krvi. Pre tieto štúdie je vhodné analyzovať koncentráciu elektrolytov, metabolizmus glycidov, funkciu pečene a ľadvín. Výber špecifických testov bude odvodený z pozorovania spôsobu účinku látky. Navrhované vyšetrenia zahŕňajú stanovenie vápniku, fosforu, chloridov, sodíku, draslíku, glukózy na lačno (s pôstnou periodou určenou pre druh zvieraťa), hladiny sérovej glutamát-pyruvát transaminázy [6], glutamátoxalacetáttransaminázy [7], ornitíndekarboxylázy, gamaglutamyltranspeptidázy, dusíku močoviny, albumínu, kreatinínu, celkového bilirubínu a celkových sérových bielkovín. Medzi ďalšie stanovenia, ktoré môžu byť nevyhnutné pre správne toxikologické hodnotenie, patrí stanovenie lipidov, hormónov, rovnováhy kyselín a zásad, methemoglobínu a aktivity cholinesterázy. Dodatočné biochemické analýzy môžu byť použité, ak je nevyhnutné prehĺbenie vyšetrenia pozorovaných toxických účinkov. d) Analýza moču nie je spravidla potrebná, potrebná je vtedy, ak sa očakáva alebo pozoruje toxický účinok. Ak údaje z predošlých testov boli nepreukázané, mal by sa brať ohľad na hematologické a biochemické parametre ešte pred začiatkom testu. Autopsia U všetkých zvierat zúčastňujúcich sa na teste sa musí vykonať kompletná autopsia skladajúca sa z vonkajšej prehliadky povrchu tela, všetkých telesných otvorov, lebečnej, hrudnej a brušnej dutiny, včítane ich obsahu. Pečeň, obličky, nadobličky a semenníky sa musia čo najskôr po sekcii odvážiť vlhké, aby sa predišlo vysušeniu. Nasledovné orgány a tkanivá je nutné uchovať vo vhodnom médiu pre prípadné neskoršie histopatologické vyšetrenia: všetky orgány s makroskopickými zmenami, mozog – vrátane medula/pons, kôry malého a veľkého mozgu, hypofýza, štítna žľaza/príštitna žľaza, všetky týmusové tkanivá, (priedušnice), pľúca, srdce, aorta, slinné žľazy, pečeň, slezina, obličky, nadobličky, pankreas, gonády, maternica, akcesórne pohlavné orgány, žlčník (ak je prítomný), ezofagus, žalúdok, dvanástnik, jejunum, ileum, caecum, kolon, rektum, močový mechúr, reprezentatívne lymfatické uzliny, (samičie prsné žľazy), (svalstvo stehna), nervy periférneho systému, (oči), (hrudná kosť s kostnou dreňou), (femur včítane povrchu kĺbu), (miecha v troch úrovniach – oblasť krku, toraxu a bedier) a (extraorbitálna slzná žľaza). Tkanivá uvedené v zátvorkách sa vyšetrujú iba v prípade, ak je možné na ich postihnutie usudzovať na základe príznakov toxicity alebo pokiaľ súvisia s cieľovým orgánom. Histopatologické vyšetrenie a) Kompletné histopatologické vyšetrenie normálnej a exponovanej kože, orgánov a tkanív sa uskutoční u všetkých zvierat kontrolnej skupiny a u zvierat skupiny, ktorým bola aplikovaná najvyššia dávka. b) Vyšetria sa všetky orgány s makroskopickými zmenami. c) Vyšetria sa cieľové orgány zvierat ostatných dávkových skupín. d) Ak sa použijú potkany, pľúca zvierat v skupinách s nízkou a strednou koncentráciou sa histopatologicky vyšetria k zisteniu príznakov infekcie, aby to umožnilo vhodné posúdenie zdravotného stavu zvierat. Uváži sa vhodnosť histopatologického vyšetrenia pečene a obličiek u zvierat týchto skupín. Ďalšie histopatologické vyšetrenie sa u zvierat týchto skupín nesmie uskutočňovať rutinne, musí sa však uskutočniť vždy na orgánoch, na ktorých boli zistené zmeny v skupine s najvyššou koncentráciou. e) U zvierat satelitnej skupiny sa musia histopatologicky vyšetriť tie tkanivá a orgány, ktoré vo vystavených skupinách reagujú na testovanú látku. 2. ÚDAJE Údaje by sa mali zhrnúť do tabuľky, pričom sa uvedie u každej pokusnej skupiny počet zvierat na začiatku testu, počet zvierat so zmenami, druh zmien ako aj percento zvierat pre každý druh zmeny. Výsledky sa vyhodnotia vhodným štatistickým postupom. Môže byť použitá akákoľvek uznávaná štatistická metóda. 3. SPRÁVA 3.1. Správa z testu Správa z testu obsahuje, pokiaľ možno, tieto informácie: - živočíšny druh, kmeň, pôvod, chovateľské podmienky, krmivo, - podmienky testu, - expozičné koncentrácie (včítane pomocnej látky, ak je použitá) a koncentrácie, - údaje o toxických reakciách podľa pohlavia a dávky, - koncentrácie bez účinku, pokiaľ je možné ju stanoviť, - čas úmrtia počas experimentu, prípadne údaj o prežití zvierat do konca testu, - opis toxických alebo iných účinkov, - čas, keď boli pozorované jednotlivé abnormálne príznaky a ich ďalší vývoj, - údaje o spotrebe potravy a o telesnej hmotnosti, - oftalmologické nálezy, - uskutočnené hematologické vyšetrenia a ich výsledky, - uskutočnené biochemické vyšetrenia a ich výsledky (včítane výsledkov prípadných analýz moču), - sekčné nálezy, - podrobný opis všetkých histopatologických nálezov, - štatistické vyhodnotenie výsledkov tam, kde je to možné, - diskusia k výsledkom, - vyhodnotenie výsledkov. 3.2. Vyhodnotenie a interpretácia Pozri všeobecný úvod časť B. 4. LITERATÚRA Pozri všeobecný úvod časť B. TEST TOXICITY SUBCHRONICKEJ INHALÁCIE 90 - DŇOVÝ TEST OPAKOVANÉHO INHALAČNÉHO VYSTAVENIA NA HLODAVCOCH 1. Metóda 1.1. Úvod Pozri všeobecný úvod časť B. 1.2. Definície Pozri všeobecný úvod časť B. 1.3. Referenčné látky Žiadne. 1.4. Princíp testovacej metódy Niekoľko skupín experimentálnych zvierat sa ovplyvňuje denne počas určeného časového intervalu odstupňovanými koncentráciami testovanej látky, jedna koncentrácia je použitá pre jednu skupinu počas obdobia 90 dní. Ak je pri vytvorení príslušnej koncentrácie testovanej látky v prostredí použitý nosič, mala by byť použitá kontrola s nosičom. Počas obdobia podávania danej látky sa zvieratá denne sledujú kvôli detekcii príznakov toxicity. Zvieratá, ktoré uhynú, sa pitvú počas testovania a na záver testovania sa pitvú zvieratá, ktoré prežili. 1.5. Kritériá kvality Žiadne. 1.6. Opis testovacej metódy Príprava Zvieratá by mali byť prispôsobované v laboratórnych podmienkach aspoň 5 dní pred začatím experimentu. Pred testovaním sa náhodne rozdelia mladé zdravé zvieratá do kontrolných a ovplyvňovaných skupín a označia. Ak je to nevyhnutné, do testovanej látky môže byť pridaný vhodný nosič pre vytvorenie príslušnej koncentrácie látky v prostredí. Ak sú použité pri dávkovaní nosiče alebo ďalšie pomocné látky, nemali by mať toxický účinok. Môžu sa použiť údaje z literárnych zdrojov. Podmienky testovania Pokusné zvieratá Pokiaľ nie sú známe vedľajšie účinky, odporúča sa druh potkan. Mali by sa používať mladé zdravé zvieratá bežne používaných laboratórnych kmeňov. Na začiatku testu by variabilita hmotnosti zvierat nemala presahovať ± 20 % primeranej priemernej hodnoty. Ak je testovanie subchronickej inhalácie určené ako predbežné pre dlhodobé testovanie, mali by sa použiť v oboch testoch rovnaké druhy aj kmene. Počet a pohlavie Pre každú koncentráciu by malo byť použitých aspoň 20 zvierat (10 samíc a 10 samcov). Samice by mali byť virgínne, negravidné. Ak sa plánuje utratiť zvieratá aj počas testu, počet zvierat by mal byť zvýšený o množstvo zvierat, ktoré sú plánované na utratenie pred ukončením testu. Navyše u doplňujúcej skupiny 20 zvierat (10 z každého pohlavia), ktorá môže byť ovplyvňovaná vysokou koncentráciou látky 90 dní, sa môže sledovať reverzibilita (návrat stavu), pretrvávanie, alebo oddialený prejav toxického účinku 28 dní po skončení expozície. Koncentrácie vystavenia Potrebné sú aspoň 3 koncentrácie a kontrola alebo kontrola s nosičom (zodpovedajúca najvyššej použitej koncentrácii nosiča), ak je použitý. Okrem použitia testovanej látky, so zvieratami v kontrolnej skupine by malo byť zaobchádzané identicky ako s testovanými subjektami. Najvyššia koncentrácia by mala mať toxický účinok, ale nie smrteľný. Ak je odhadnutá koncentrácia pre vystavenie ľudí, najnižšia použitá koncentrácia by mala byť vyššia. Za ideálnych podmienok by po ovplyvnení strednou koncentráciou malo byť pozorované minimálne množstvo toxických príznakov. Ak je použitých viac stredných koncentrácií, mali by byť tak odstupňované, aby postupne zvyšovali množstvo toxických príznakov. V skupinách s najnižšou, strednou koncentráciou a aj v kontrole by mal byť výskyt úmrtí nízky, aby bolo možné zmysluplné vyhodnotenie výsledkov. Expozičná doba Dĺžka denného vystavenia by mala byť 6 hodín po vyrovnaní koncentrácie v testovacej komore. Iné časové intervaly môžu byť použité podľa špecifických požiadaviek. Vybavenie Zvieratá by mali byť testované v inhalačnom zariadení vytvorenom pre udržanie aktívneho prúdu vzduchu s výmenou 12 - krát za hodinu, aby bol zaistený adekvátny obsah kyslíka a rovnomerne rozdelená ovplyvňovacia atmosféra. Ak je použitá testovacia komora, jej tvar by mal minimalizovať tiesnenie sa testovaných zvierat a umožniť maximálne ovplyvnenie inhaláciou testovanej látky. Základné pravidlo pre zaistenie stability atmosféry v testovacej komore je, že celkový objem testovaných zvierat by nemal presiahnuť 5 % objemu testovacej komory. Môžu sa použiť aj individuálne komory pre ústa a nos, len pre hlavu alebo pre celé telo, prvé dve minimalizujú prijatie látky iným spôsobom. Doba0 pozorovania U experimentálnych zvierat by mali byť denne sledované toxické príznaky počas celého ovplyvnenia aj počas zotavovacieho obdobia. Mal by byť zaznamenaný čas smrti a čas, keď sa objavia aj zmiznú toxické príznaky. Postup Zvieratá sú vystavené testovanej látke denne, 5 - 7 dní v týždni počas 90 dní. Zvieratá v každej doplňujúcej skupine, určené pre ďalšie pozorovanie, by mali byť sledované ďalších 28 dní bez ovplyvnenia kvôli detekcii zotavovacieho obdobia alebo pretrvávania toxického účinku. Teplota pri testovaní by mala byť udržiavaná okolo 22 ± 3 °C. Za ideálnych podmienok by mala byť udržiavaná relatívna vlhkosť medzi 30 až 70 %, ale v určitých prípadoch (napríklad testovanie aerosólov) to nemusí byť použiteľné. Voda a potrava by sa nemali podávať počas vystavenia. Mal by sa použiť dynamický inhalačný systém s kontrolou koncentrácie. Pre stanovenie vhodných koncentrácií pre ovplyvnenie je odporúčaný skúšobný test. Prietok vzduchu by mal byť nastavený tak, aby boli zaistené homogénne podmienky v testovacej komore počas celého vystavenia. Systém by mal zaisťovať, aby stabilné podmienky ovplyvnenia boli dosiahnuté čo najrýchlejšie. Merané alebo monitorované by mali byť: a) miera prietoku vzduchu (nepretržite); b) aktuálna koncentrácia testovanej látky meraná v dýchacej zóne. Počas každodenného času vystavenia by koncentrácia sa nemala meniť viac ako ± 15 % od priemernej hodnoty. V prípade prachu a aerosólov nie je táto úroveň kontroly dosiahnuteľná a môže byť akceptovaný aj širší rozsah. Počas trvania celého experimentu by rozdiel v koncentrácii medzi jednotlivými dňami mal byť čo najmenší, ako je možné prakticky dosiahnuť. Počas zostavovania systému by mala byť prevedená analýza veľkosti častíc potrebná na stanovenie stability aerosólovej koncentrácie. Počas vystavenia by sa mali analýzy vykonávať tak často, ako je potrebné na určenie hustoty distribúcie častíc; c) teplota a vlhkosť; d) počas expozície a po nej sa systematicky zaznamenávajú pozorovania; mali by byť zachované individuálne údaje o každom zvierati. Všetky zvieratá by mali byť sledované denne a mali by byť zaznamenávané príznaky toxicity, vrátane času objavenia, stupňa príznakov a trvania. Pozorovania v klietkach by mali zahŕňať; zmeny na koži a srsti, očiach, slizniciach, dýchací, obehový, autonómny a centrálny nervový systém, somatomotorickú aktivitu a model správania. Merania spotreby potravy a hmotnosti zvierat by mali byť vykonané každý týždeň. Pravidelné sledovanie zvierat je nevyhnutné pre istotu, že zvieratá v teste nestratíme kvôli prípadom, ako je kanibalizmus, autolýza tkanív alebo nesprávne premiestňovanie zvierat. Na konci expozičného obdobia sa všetky zvieratá, ktoré prežili, vypitvajú. Ak sa objavia umierajúce zvieratá, mali by byť utratené a vypitvané. Na všetkých zvieratách, vrátane kontroly, sú obvykle robené nasledujúce vyšetrenia: a) oftalmologické vyšetrenie použitím oftalmoskopu alebo podobného vhodného zariadenia by malo byť urobené pred vystavením testovanej látke a po skončení testu najlepšie u všetkých zvierat, ale aspoň pri najvyššej koncentrácii a v kontrolnej skupine. Ak sa zistia zmeny na očiach, mali by byť vyšetrené všetky zvieratá; b) hematológia zahŕňajúca hematokrit, koncentráciu hemoglobínu, počet erytrocytov, celkový počet leukocytov a počet diferencovaných leukocytov (leukogram), meranie potenciálu zrážanlivosti, ako je čas zrážania, protrombínový čas, tromboplastínový čas, počet trombocytov, by mala byť vyšetrená na konci testovacieho obdobia; c) klinická biochemická skúška krvi by sa mala vykonať na konci testovacieho obdobia. Rozsah vyšetrení, ktoré sa považujú za vhodné pre všetky testy, zahŕňa elektrolytickú rovnováhu, metabolizmus uhľovodíkov, funkcie pečene a obličiek. Výber špecifických vyšetrení je ovplyvnený sledovaním spôsobu účinku látky. Predpokladané sú stanovenia vápnika, fosforu, chloridov, sodíka, draslíka, glukóza na lačno (s časom hladovania primeraným druhu), sérovej glutamát-piruvát transaminázy [8], sérovej glutamát-oxalacetát transaminázy [9], ornitín dekarboxylázy, gama glutamyl transpeptidázy, močoviny, albumínu, krvného kreatinínu, celkového bilirubínu a celkového množstva proteínov v sére. Iné stanovenia, ktoré by mohli byť potrebné pre adekvátne toxikologické vyhodnotenie, zahrňujú analýzy lipidov, hormónov, pH rovnováhy, methemoglobínu a cholín esterázovej aktivity. Ak je potrebné rozšíriť vyšetrenia zistených príznakov, môžu sa pridať ďalšie klinické biochemické stanovenia; d) analýza moču nie je bežne potrebná, len ak na ňu existujú dôvody na základe očakávanej alebo zistenej toxicity. Ak neexistujú adekvátne staršie literárne údaje, mali by byť tieto okolnosti brané do úvahy pri stanovení parametrov hematológie a klinickej biochémie pred začatím dávkovania. Celková pitva Všetky zvieratá by mali byť podrobené celkovej pitve, ktorá zahŕňa vyšetrenie vonkajšieho povrchu tela, všetkých otvorov, lebečných, hrudných a brušných dutín a ich obsahu. Pečeň, obličky, nadobličky a semenníky by sa mali odvážiť čo najskôr po rozrezaní, aby sa predišlo vysychaniu. Nasledujúce orgány a tkanivá by sa mali uchovať vo vhodnom médiu pre možné budúce histopatologické vyšetrenia: všetky veľké poškodenia (lézie), pľúca – by mali byť odstránené v nepoškodenom stave, odvážené a uchované vo vhodnom fixačnom prostriedku kvôli zachovaniu štruktúry (perfúzia s fixačným prostriedkom je považovaná za účinnú metódu), nosohltanové tkanivá, mozog – vrátane predĺženej miechy/varolov most, mozočkovú a mozgovú kôru, hypofýzu, štítnu žľazu a prištítne telieska, každé tkanivo týmusu, priedušnicu, pľúca, srdce, aortu, slinné žľazy, pečeň, slezinu obličky, nadobličky, pankreas, gonády, maternicu (príslušné pohlavné orgány), (kožu), žlčník (ak je prítomný), pažerák, žalúdok, dvanástorník (duodenum), bedrovník (jejunum), lačník (ileum), slepé črevo, hrubé črevo, konečník, močový mechúr, reprezentatívnu lymfatickú uzlinu, (samičie mliečne žľazy), (stehenné svalstvo), periférne nervy, (oči), hrudnú kosť aj s kostnou dreňou, stehnovú kosť aj s povrchom kĺbu, miechu z troch častí – krčnej, strednohrudníkovej a bedrovej. Tkanivá v zátvorkách je potrebné vyšetriť, iba ak vykazujú známky toxicity alebo sú v zasiahnutom orgáne. Histopatologické vyšetrenie a) Kompletné histopatologické vyšetrenie by malo byť vykonané na dýchacom trakte a ostatných orgánoch a tkanivách všetkých zvierat v kontrolnej skupine a skupine ovplyvnenej najvyššou koncentráciou látky. b) Všetky veľké poškodenia (lézie) by mali byť vyšetrené. c) Cieľové orgány by mali byť vyšetrené aj v ostatných skupinách. d) Pľúca zvierat zo skupín s nízkou a strednou koncentráciou by mali byť tiež podrobené histopatologickému vyšetreniu, pretože môže poskytnúť základné vyhodnotenie zdravotného stavu zvierat. Ďalšie histopatologické vyšetrenia nie sú bežne potrebné na zvieratách v týchto skupinách, ale musia byť vždy prevedené na orgánoch, ktoré vykazujú príznaky poškodenia v skupine ovplyvnenej najvyššou koncentráciou. e) Ak je použitá aj doplňujúca (satelitná) skupina, histopatológia by mala byť urobená na tkanivách a orgánoch, ktoré vykazovali príznaky v ostatných ovplyvnených skupinách. 2. ÚDAJE Údaje by mali byť zhrnuté do tabuľky a udávať pre každú testovaciu skupinu počet zvierat na začiatku testu, počet zvierat vykazujúcich poškodenia (lézie), typy poškodení a percento zvierat so všetkými typmi poškodení. Výsledky by mali byť vyhodnotené vhodnou štatistickou metódou. Môže byť použitá hociktorá uznaná štatistická metóda. 3. SPRÁVA 3.1. Správa z testu Správa z testu má podľa možnosti obsahovať nasledujúce informácie: - druh, kmeň, pôvod, podmienky prostredia, výživu, - podmienky pri teste: Opis zariadenia na ovplyvňovanie: vrátane tvaru, typu, rozmerov, zdroja vzduchu, systému pre vytváranie častíc a aerosólov, klimatizačného systému, odpadového vzduchu a metódy chovu zvierat v testovacích komorách, ak boli použité. Malo by byť opísané zriadenie na meranie teploty, vlhkosti a, kde je potrebné, aj stability koncentrácie aerosólov alebo veľkosti častíc. Údaje o vystavení: mali by byť v tabuľkách, prezentované priemernou hodnotou a mierou variability (napr. smerodajná odchýlka) a mali by obsahovať: a) pomer prietoku vzduchu cez inhalačné zariadenie; b) teplotu a vlhkosť vzduchu; c) relatívnu koncentráciu (celkové množstvo testovanej látky naplnenej do inhalačného zariadenia delené objemom vzduchu); d) povahu nosiča, ak je použitý; e) skutočnú koncentráciu v testovanej dýchacej zóne; f) priemernú veľkosť častíc (kde je to vhodné), - údaje o toxickej reakcii pre každé pohlavie a koncentráciu, - koncentrácie bez vyvolania príznakov, ak je to možné, - časy úmrtí počas testu alebo údaje, či zvieratá prežili po ukončení testu, - opis toxických alebo iných príznakov, - čas objavenia každého nenormálneho príznaku a jeho ďalší vývoj, - údaje o výžive a hmotnosti, - oftalmologické nálezy, - použité hematologické testy a ich výsledky, - použité klinické biochemické testy a ich výsledky (vrátane výsledkov každej analýzy moču), - nálezy pitvy, - detailný opis všetkých histopatologických nálezov, - štatistické spracovanie výsledkov, ak je potrebné, - diskusia o výsledkoch, - interpretácia výsledkov. 3.2. Vyhodnotenie a interpretácia Pozri všeobecný úvod časť B. 4. LITERATÚRA Pozri všeobecný úvod časť B. TEST TERATOGENITY – HLODAVCE A NEHLODAVCE 1. METÓDA 1.1. Úvod Pozri všeobecný úvod časť B. 1.2. Definície Pozri všeobecný úvod časť B. 1.3. Referenčné látky Žiadne. 1.4. Princíp testovacej metódy Testovaná látka je podávaná v odstupňovaných dávkach alebo koncentráciách minimálne v tej časti gravidity, ktorá zahŕňa organogenézu v niekoľkých skupinách gravidných experimentálnych zvierat, jedna dávka v každej skupine. Krátko pred očakávaným termínom pôrodu sa samice utratia, odstráni sa maternica a vyšetrí sa jej obsah. Táto testovacia metóda stanoví toxicitu pre embryo a plod. 1.5. Kritériá kvality Žiadne. 1.6. Opis testovacej metódy Príprava Zdravé mladé dospelé virgínne samičky v podobnom veku a veľkosti sú aklimatizované na laboratórne podmienky aspoň 5 dní pred testom, a potom sú spárené so samcami s už dokázanou plodnosťou (fertilitou). Oplodnené samičky sú náhodne rozdelené do skupín a označené. Párenie môže prebehnúť prirodzene alebo umelou insemináciou. Testovaná látka je podávaná samiciam denne so začiatkom hneď po implantácii a v priebehu celej organogenézy. Deň pred termínom je plod vybratý hysterektómiou a vyšetrený na abnormality kostry a vnútorností, vrátane spomalenia rastu, oneskorenie osifikácie a črevné hemoragie. Podmienky testovania Pokusné zvieratá Bežne používané druhy sú potkan, myš, škrečok a králik. Preferované druhy sú potkan a králik. Používajú sa bežné laboratórne kmene. Kmene by nemali mať nízku plodnosť a mala by byť u nich známa reakcia na teratogén. Zvieratá by mali byť v klietkach samostatne. Počet a pohlavie Pre každú dávku je potrebných aspoň 20 gravidných potkanov, myší alebo škrečkov alebo 12 gravidných králikov. Pre objektívne vyhodnotenie teratogénneho potenciálu látky je potrebné zaistiť dostatočný počet vrhov a mláďat. Testované dávky Mali by byť použité aspoň 3 testované dávky a kontrola. Ak je testovaná látka podávaná s nosičom, mala by byť použitá kontrolná skupina s nosičom. Ak je použitý nosič, mali by byť známe jeho vlastnosti; nemal by mať teratogénny účinok alebo vplyv na reprodukciu. Okrem použitia testovanej látky, so zvieratami v kontrolnej skupine by sa malo zaobchádzať identicky ako s testovanými subjektami. Ak neexistuje nejaké obmedzenie kvôli fyzikálnej/chemickej povahe alebo biologickým vlastnostiam testovanej látky, najvyššia dávka by v ideálnom prípade mala indukovať niektoré viditeľné príznaky toxicity u matky, ako je slabý úbytok hmotnosti, ale nie viac ako 10 % úmrtnosť matiek. Najnižšia dávka by nemala indukovať pozorovateľné príznaky spôsobené testovanou látkou. Stredná dávka by mala tvoriť geometrický stred medzi najvyššou a najnižšou dávkou. Limitný test V prípade látky s nízkou toxicitou, ak dávka aspoň 1000 mg/kg neindukuje teratogenitu alebo žiadne toxické príznaky na embryo, sledovanie ďalších dávok nie je nevyhnutné. Doba vystavenia Deň 0 je deň, keď je pozorovaná vaginálna zátka a/alebo spermie (ak je to možné). Doba dávkovania by mala pokrývať obdobie hlavnej organogenézy. Môže to byť od 6. dňa do 15. u potkana a myši, od 6. do 14. dňa u škrečka alebo od 6. do 18. dňa u králika. Ak deň 0 je založený na sledovaní párenia alebo na umelej inseminácii, stanovený čas by mal byť upravený pridaním jedného dňa. Alternatívne, doba podávania by mala byť predĺžená o približne jeden deň pred očakávaným termínom vrhu. Doba pozorovania Podrobné klinické vyšetrenia by mali byť robené každý deň aspoň raz. Ďalšie pozorovania by mali byť robené denne vhodnými spôsobmi, aby boli minimalizované straty zvierat počas testovania. Postup Testovaná látka je denne podávaná orálne, žalúdkovou sondou. Testovaná látka by mala byť podávaná denne približne v tom istom čase. Testované samičky sú ovplyvňované testovanou látkou denne počas primeranej expozičnej doby. Veľkosť dávky môže závisieť od hmotnosti samičiek na začiatku podávania látky alebo alternatívne s ohľadom na rapídne priberanie počas gravidity by zvieratá mali byť opakovane vážené a dávka by mala byť závislá od momentálnej hmotnosti. Príznaky toxicity by sa mali zaznamenávať hneď po objavení, vrátane času objavenia, stupňa a dĺžky trvania. Samice prejavujúce príznaky potratu alebo predčasného vrhu by mali byť utratené a podrobené detailnému makroskopickému vyšetreniu. Obdobie pozorovania po vystavení by malo pokračovať približne do jedného dňa do termínu vrhu; objektívne je pokryť väčšinu obdobia gravidity, ale vyhnúť sa komplikovanej interpretácii výsledkov, ktoré by mohli vzniknúť nasledovným prirodzeným pôrodom. Pozorovania v klietkach by mali zahŕňať zmeny na koži a srsti, očiach, slizniciach ako aj dýchací, obehový, autonómny a centrálny nervový systém, somatomotorickú aktivitu a model správania. Spotreba potravy a hmotnosť zvierat by mala byť meraná každý týždeň. Pitva Po smrti, počas alebo na konci testovania by mali byť samice makroskopicky vyšetrené na všetky štruktúrne abnormality alebo patologické zmeny, ktoré môžu mať vplyv na graviditu. Okamžite po smrti by sa mala odobrať maternica a vyšetriť mŕtve embryá a plody a určiť počet živých plodov. Zvyčajne je možné určiť čas intrauterínnej smrti plodu. V potkanoch a králikoch sa môže zisťovať množstvo žltých teliesok (corpora lutea). Malo by byť určené pohlavie plodov, plody by mali byť individuálne odvážené, hmotnosti zaznamenané a vypočítaná priemerná hmotnosť plodu. Po odobratí by sa mal každý plod vyšetriť zvonka. Pri potkanoch, myšiach a škrečkoch by mala byť vypreparovaná jedna tretina až jedna polovica každého vrhu a vyšetrená na anomálie kostry a zvyšná časť každého vrhu by mala byť vhodnými metódami vyšetrená na anomálie v mäkkých tkanivách. Pri králikoch by mal byť každý plod vyšetrený opatrnou disekciou na abnormality vnútorností, a potom vyšetrený na anomálie kostry. 2. ÚDAJE Údaje by sa mali zhrnutúť do tabuľky a udávať pre každú testovaciu skupinu počet zvierat na začiatku testu, počet zvierat, ktoré dosiahli graviditu, počet a percento živých plodov a plodov s anomáliami mäkkých tkanív alebo abnormalitami kostry vzhľadom ku konkrétnym vrhom. Výsledky by mali byť vyhodnotené vhodnou štatistickou metódou. Môže sa použiť hociktorá uznaná štatistická metóda. 3. SPRÁVA 3.1. Správa z testu Správa z testu má podľa možnosti obsahovať nasledujúce informácie: - druh, kmeň, pôvod, podmienky prostredia, výživa, - podmienky pri teste, - veľkosť dávky (vrátane nosiča, ak bol použitý) a koncentrácie, - údaje o toxickej reakcii pri jednotlivých dávkach, - dávku bez toxickej reakcie (ak je to reálne), - časy úmrtí počas testu alebo údaje či zvieratá prežili po ukončení testu, - opis toxických alebo iných príznakov, - čas objavenia každého abnormálneho príznaku a jeho ďalší vývoj, - údaje o výžive a hmotnosti, - trvanie gravidity a údaje o vrhoch (vrátane historických údajov), - údaje o plodoch (živé/mŕtve, pohlavie, defekty mäkkých tkanív a kostry), - údaje o vrhoch (živé/mŕtve, pohlavie, defekty mäkkých tkanív a kostry v každom vrhu), - štatistické spracovanie výsledkov, - diskusia o výsledkoch, - interpretácia výsledkov. 3.2. Vyhodnotenie a interpretácia Pozri všeobecný úvod časť B. 4. LITERATÚRA Pozri všeobecný úvod časť B. TEST CHRONICKEJ TOXICITY 1. METÓDA 1.1. Úvod Pozri všeobecný úvod časť B. 1.2. Definície Pozri všeobecný úvod časť B. 1.3. Referenčné látky Žiadne. 1.4. Princíp testovacej metódy Testovaná látka je podávaná vhodným spôsobom v niekoľkých skupinách pokusných zvierat počas väčšej dĺžky ich života, a to sedem dní v týždni, jedna dávka na jednu skupinu. Počas a po ovplyvnení testovanou látkou sú u experimentálnych zvierat denne sledované toxické príznaky. 1.5. Kritériá kvality Žiadne. 1.6. Opis testovacej metódy Príprava Zvieratá sú udržiavané v laboratórnych podmienkach aspoň 5 dní pred začatím experimentu. Pred testovaním sa náhodne rozdelia mladé zdravé zvieratá do kontrolných a exponovaných skupín a označia. Podmienky testovania Pokusné zvieratá Preferovaným druhom je potkan. Na základe výsledkov predchádzajúcich testovaní iných zvierat (hlodavcov alebo nehlodavcov) môžu byť použité aj iné druhy. Mali by sa použiť bežné laboratórne kmene mladých zdravých zvierat a podávanie testovanej látky by sa malo začať čo najskôr po odstavení od matky. Na začiatku testu by variabilita hmotnosti zvierat nemala presahovať ± 20 % vhodnej priemernej hodnoty. Ak sa robí sub-chronický orálny test ako predbežný k dlhodobému testu, mali by byť použité v oboch testoch rovnaké druhy alebo línie. Počet a pohlavie Pri hlodavcoch by malo byť použitých aspoň 40 zvierat (20 samíc a 20 samcov) pre každú dávku aj súbežnú kontrolu. Samice by mali byť virgínne, negravidné. Ak sa plánujú počas testu utratenia zvierat, počet zvierat by mal byť zvýšený o plánovaný počet zvierat, ktoré majú byť utratené pred ukončením testu. Pre nehlodavce je akceptovateľné menšie množstvo zvierat, ale aspoň štyri z jedného pohlavia pre každú skupinu. Dávkovanie a frekvencia vystavení Okrem súbežnej kontrolnej skupiny by mali byť použité aspoň tri rôzne dávky. Najvyššia dávka by mala vyvolať jednoznačné toxické príznaky, ale nespôsobiť príliš vysokú úmrtnosť. Najnižšia dávka by nemala vyvolať viditeľné toxické príznaky. Stredná dávka alebo dávky by mali byť stanovené v strede intervalu medzi najvyššou a najnižšou dávkou. Výber dávok môže byť odhadnutý z údajov z predchádzajúcich sledovaní a testov toxicity. Bežné je denné vystavenie. Ak je chemikália podávaná v pitnej vode alebo primiešaná do potravy, voda a potrava mali by byť k dispozícii nepretržite. Kontroly Mali by byť použité súbežné kontrolné skupiny, ktoré sú identické v každom ohľade s vytavenými skupinami, okrem podávanej testovanej látky. Za špeciálnych okolností ako je použitie aerosólov v inhalačných testoch alebo použitie emulgátorov s neurčenou biologickou aktivitou v orálnych testoch by sa mala použiť súbežná negatívna kontrolná skupina. Negatívna kontrolná skupina je vystavená rovnakým spôsobom ako testované skupiny, okrem testovanej látky a nosiča (ak je použitý). Spôsob podávania Dva základné spôsoby podávania sú orálne a inhalácia. Výber spôsobu podávania závisí na fyzikálnych a chemických vlastnostiach testovanej látky a je závislý na pravdepodobnom vystavení ľudí. Použitie kožnej (dermálnej) aplikácie spôsobuje značné praktické problémy. Systematická chronická toxicita, ktorá je výsledkom kožnej absorbcie, môže byť bežne odvodená z výsledkov orálnych testov a poznatkov o rozsahu kožnej absorbcie, odvodených z predchádzajúcich testov toxicity. Orálne testy Ak je testovaná látka absorbovaná z gastrointestinálneho traktu a ak je prehltnutie jeden zo spôsobov, ako môže byť ovplyvnený človek, pokiaľ nie sú vedľajšie účinky, je odporúčaný orálny spôsob podávania. Zvieratá môžu prijímať testovanú látku v potrave, rozpustenú v pitnej vode, alebo podávanú v kapsuliach. Ideálne by malo byť použité denné dávkovanie počas siedmych dní v týždni, pretože dávkovanie počas piatich dní v týždni by mohlo spôsobiť zotavenie alebo ústup toxických príznakov v čase nedávkovania, a to ovplyvní výsledok a ďalšie hodnotenie. Z praktického hľadiska je však prípustné aj dávkovanie päť dní v týždni. Inhalačné testy Pretože inhalačné testy predstavujú technický problém pre ich väčšiu komplikovanosť v porovnaní s inými spôsobmi podávania, je namieste detailnejší návod pre tento spôsob podávania testovanej látky. Je nutné poznamenať, že vnútropriedušnicová injekcia (infúzia) môže byť za špecifickej situácie opodstatnenou alternatívou. Vzorom pre dlhodobé testy sú obyčajne predpokladané vystavenia ľudí, čo znamená denné vystavenie zvierat šesť hodín po vyrovnaní koncentrácie v inhalačnej komore, päť dní v týždni (prerušované vystavenie) alebo pri pravdepodobnom vystavení z prostredia 22 až 24 hodinové vystavenie sedem dní v týždni (nepretržité vystavenie), pričom je plánovaná jedna hodina na kŕmenie a údržbu komory v rovnakom čase. V oboch prípadoch sú zvieratá obyčajne vystavené stálou koncentráciou testovanej látky. Podstatný rozdiel medzi prerušovaným a nepretržitým vystavením je, že pri prvom spôsobe je 17 až 18 - hodinový interval, v ktorom sa môžu zvieratá zotaviť z príznakov denného vystavenia dokonca s ešte dlhším intervalom na zotavenie cez víkendy. Výber prerušovaného alebo nepretržitého vystavenia závisí od cieľov testu a ľudského vystavenia, ktoré je simulované v testoch. Musia sa brať do úvahy aj určité technické problémy. Napríklad výhody nepretržitého vystavenia pri simulácii podmienok prostredia sa negujú nevyhnutnosťou kŕmenia a napájania počas vystavenia a potrebou zložitejších (spoľahlivých) aerosólov, vytvárania pary a tiež technikou monitorovania. Komory pre vystavenie Zvieratá by mali byť testované v inhalačných komorách, ktoré umožňujú aktívny prúd vzduchu s výmenou 12 - krát za hodinu, aby bol zaistený adekvátny obsah kyslíka a rovnomerne rozdelená ovplyvňovacia atmosféra. Kontrolné komory a komory pre vystavenie by mali mať rovnakú konštrukciu a tvar kvôli zaisteniu porovnateľných podmienok pre ovplyvnenie vo všetkých ohľadoch, okrem testovanej látky. Jemný podtlak vo vnútri komory je bežne udržiavaný pre zabránenie rozptylu testovanej látky do okolitého prostredia. Komory by mali minimalizovať tiesnenie testovaných zvierat. Základné pravidlo pre zaistenie stability atmosféry v testovacej komore je, že celkový objem testovaných zvierat by nemal presiahnuť 5 % objemu testovacej komory. Merané a monitorované by mali byť: i) Prúd vzduchu: miera prietoku vzduchu cez komoru by mala byť, pokiaľ je možné, meraná nepretržite; ii) Koncentrácia: počas každodenného času vystavenia by sa koncentrácia testovanej látky nemala odchyľovať viac ako ± 15 % od priemernej hodnoty; iii) Teplota a vlhkosť: pre hlodavce by mala byť udržiavaná teplota 22 ± 2°C a vlhkosť v komore 30 až 70 % okrem prípadu, keď je použitá voda na rozptýlenie testovanej látky v atmosfére testovacej komory. Pokiaľ je možné, obe veličiny by mali byť monitorované nepretržite; iv) Meranie veľkosti častíc: mala by byť určená veľkosť rozptýlených častíc v atmosfére komory, vrátene kvapalných alebo pevných aerosólov. Aerosólové častice by mali mať dýchateľnú veľkosť pre použité testované zvieratá. Vzorky atmosféry v testovacej komore by mali byť otestované v dýchacej zóne zvierat. Vzorka vzduchu by mala reprezentovať distribúciu častíc, ktorou sú zvieratá ovplyvňované a mala by byť gravimetricky stanovená pre všetky suspendované aerosóly, aj keď mnoho aerosólov nie je dýchateľných. Analýza veľkosti častíc by mala byť stanovovaná často počas zostavovania testovacieho systému kvôli zaisteniu stability aerosólov a potom tak často, ako je nevyhnutné počas ovplyvnenia stanoviť zhodnosť distribúcie častíc, ktorými sú ovplyvňované zvieratá. Trvanie testu Testovaná látka by sa mala podávať aspoň 12 mesiacov. Postup Pozorovania Podrobné klinické vyšetrenia by mali byť robené aspoň raz denne. Ďalšie pozorovania by mali byť denne robené vhodnými spôsobmi, aby bolo minimum strát zvierat počas testu, napríklad pitva alebo uchovanie v chlade nájdených mŕtvych zvierat a izolácia alebo utratenie slabých alebo chradnúcich zvierat. Podrobné pozorovania by mali robiť na odhalenie nástupu a priebehu všetkých toxických príznakov, ako aj minimalizovanie straty v dôsledku chorôb, autolýzy alebo kanibalizmu. Klinické príznaky, vrátane neurologických a očných zmien, rovnako ako aj mortalita, by mali byť zaznamenané pre všetky zvieratá. Mal by byť zaznamenaný čas nástupu a priebeh toxických príznakov, vrátane podozrivých tumorov. Hmotnosť zvierat by sa mala zaznamenávať individuálne pre všetky zvieratá raz za týždeň prvých 13 týždňov testovania a potom najmenej raz za štyri týždne. Príjem potravy by mal byť stanovovaný raz za týždeň počas prvých 13 týždňov testovania a potom približne v trojmesačných intervaloch, pokiaľ to nie je nutné zmeniť kvôli zdravotnému stavu alebo zmene hmotnosti. Hematologické vyšetrenie Hematologické vyšetrenie (napr. obsah hemoglobínu, hematokrit, množstvo červených krviniek, množstvo bielych krviniek, krvných doštičiek a ďalšie merania zrážanlivosti) by sa mali robiť po treťom, po šiestom mesiaci a potom približne v šesťmesačných intervaloch a na konci na krvných vzorkách zozbieraných zo všetkých nehlodavcov a z 10 potkanov z každého pohlavia zo všetkých skupín. Mali by byť, ak je to možné, z tých istých potkanov v každom intervale. Navyše z nehlodavcov by mali byť vzorky zozbierané aj pred testom. Ak z klinických vyšetrení vyplýva zhoršenie zdravotného stavu zvierat počas testu, mal by sa urobiť krvný obraz u postihnutých zvierat. Krvný obraz sa robí na vzorkách zvierat v skupine s najvyššou dávkou a v kontrole. Pre skupiny s nižšou dávkou sa robí iba, ak je veľký rozdiel medzi skupinou s najvyššou dávkou a kontrolou, alebo ak sú zistené patologické nálezy. Analýza moču Zo všetkých nehlodavcov a z 10 potkanov z každého pohlavia zo všetkých skupín by mali by byť zozbierané vzorky moču na analýzu, ak je to možné, v každom odbere z tých istých potkanov podobne ako pri hematologickom vyšetrení. Nasledujúce údaje by mali byť pri hlodavcoch robené individuálne pre každé zviera alebo na spojenej vzorke pre každé pohlavie a skupinu: - vonkajšie hodnotenie: objem a hustota pre každé zviera, - proteíny, glukóza, ketóny, krv alebo krvné farbivo (semikvantitatívne), - mikroskopické vyšetrenie sedimentu (semikvantitatívne). Biochemické vyšetrenia Približne v šesťmesačných intervaloch a na konci testu sa odoberú vzorky krvi zo všetkých nehlodavcov a z 10 potkanov z každého pohlavia zo všetkých skupín na biochemické vyšetrenie, ak je to možné, v každom odbere z tých istých potkanov. Navyše z nehlodavcov by mali vzorky zozbierané aj pred testom. Zo vzoriek sa pripraví plazma a stanovia sa nasledujúce hodnoty: - koncentrácia celkových proteínov, - koncentrácia albumínu, - pečeňové testy (ako aktivita alkalickej fosfatázy, glutamát-piruvát transaminázy [10], sérovej glutamát-oxalacetát transaminázy [11]), gama glutamyl transpeptidázy, ornitín dekarboxylázy, - metabolizmus uhľovodíkov ako glukóza na lačno, - testy funkcie obličiek ako močovina v krvi. Celková pitva Všetky zvieratá by mali byť podrobené celkovej pitve, vrátane tých, ktoré uhynuli počas experimentu alebo boli utratené, lebo chradli. Pred utratením by sa mali odobrať vzorky krvi zo všetkých zvierat pre stanovenie krvného obrazu. Všetky výrazne viditeľné poškodenia (lézie), tumory alebo poškodenia (lézie) podozrivé na tumor by mali byť zafixované. Sledovanie nálezov pitvy by malo korelovať s mikroskopickými nálezmi. Všetky orgány a tkanivá by sa mali zafixovať pre histopatologické vyšetrenie. Týka sa to zvyčajne nasledujúcich orgánov a tkanív: mozog [12] (predĺžená miecha/varolov most, mozočková a mozgová kôra), hypofýza, štítna žľaza (vrátane prištítnych teliesok), týmus, pľúca (vrátane priedušnice), srdce, aorta, slinné žľazy, pečeň [13], slezina, obličky [14], nadobličky [15], pažerák, žalúdok, dvanástorník (duodenum), bedrovník (jejunum), lačník (ileum), slepé črevo, hrubé črevo, konečník, maternica, močový mechúr, lymfatické uzliny, pankreas, gonády [16], (prídavné pohlavné orgány), samičie mliečne žľazy, kožu, svalstvo, periférne nervy, miecha (krčná, hrudná, bedrová), hrudná kosť aj s kostnou dreňou, stehnová kosť (vrátane kĺbu) a oči. Naplnenie pľúc a močového mechúra fixačným činidlom je optimálny spôsob zachovania týchto tkanív, naplnenie pľúc pri inhalačných testoch je nevyhnutné pre primerané histopatologické vyšetrenia. Pri špeciálnych testoch ako sú inhalačné testy, by mal byť preskúmaný dýchací trakt, vrátane nosa, hltana a hrtana. Ak sa vykonávajú aj iné klinické vyšetrenia, mali by byť výsledky z nich dostupné pred mikroskopickým vyšetrením, pretože môžu poskytnúť dôležité informácie pre patológa. Histopatológia Všetky viditeľné zmeny, obzvlášť tumory a ostatné poškodenia (lézie), ktoré nastali v hociktorom orgáne, by mali byť mikroskopicky vyšetrené. Odporúčaný je nasledujúci postup: a) Mikroskopické vyšetrenie všetkých zafixovaných orgánov a tkanív s kompletným opisom všetkých poškodení nájdených: 1. vo všetkých zvieratách, ktoré zahynuli alebo boli utratené počas testu; 2. vo všetkých zvieratách v skupine s najvyššou dávkou a v kontrole; b) Orgány a tkanivá vykazujúce abnormality spôsobené alebo pravdepodobne spôsobené testovanou látkou sa tiež vyšetrujú v skupinách s nižšími dávkami; c) Ak výsledky testu dokazujú značné zníženie dĺžky života zvierat alebo indukciu príznakov, ktoré môžu ovplyvniť toxickú odpoveď, mala by sa vyšetriť aj skupina s druhou najnižšou dávkou podľa predchádzajúceho opisu; d) Informácie o výskyte poškodení (lézií), bežne sa vyskytujúcich u použitých laboratórnych kmeňov zvierat v rovnakých laboratórnych podmienkach, t. j. kontrolné dáta z predchádzajúcich testov sú nevyhnutné pre správne posúdenie významnosti zmien sledovaných u testovaných zvierat. 2. ÚDAJE Údaje by mali byť zhrnuté v tabuľke a udávať pre každú testovaciu skupinu počet zvierat na začiatku testu, počet zvierat vykazujúcich poškodenia (lézie) a percento zvierat so všetkými typmi poškodení. Výsledky by mali byť vyhodnotené vhodnou štatistickou metódou. Môže byť použitá hociktorá uznaná štatistická metóda. 3. SPRÁVA 3.1. Správa z testu Správa z testu podľa možnosti obsahuje nasledujúce informácie: - druh, kmeň, pôvod, podmienky prostredia, výživu, - podmienky pri teste: Opis expozičného zariadenia: vrátane tvaru, typu, rozmerov, zdroja vzduchu, systému pre vytváranie častíc a aerosólov, klimatizačného systému, spracovania odpadového vzduchu a metódy chovu zvierat v testovacích komorách, ak boli použité. Malo by byť opísané zriadenie na meranie teploty, vlhkosti a kde je potrebné, aj stability koncentrácie aerosólov alebo veľkosti častíc. Údaje vystavenia: mali by byť v tabuľkách, s uvedením priemernej hodnoty a miery variability (napr. smerodajnej odchýlky) a mali by obsahovať: a) pomer prietoku vzduchu cez inhalačné zariadenie; b) teplotu a vlhkosť vzduchu; c) relatívnu koncentráciu (celkové množstvo testovanej látky naplnenej do inhalačného zariadenia delené objemom vzduchu); d) povahu nosiča, ak je použitý; e) aktuálnu koncentráciu v testovanej dýchacej zóne; f) strednú veľkosť častíc (kde je to vhodné), - veľkosti dávok (vrátane nosiča, ak bol použitý) a koncentrácie, - údaje o toxickej reakcii pre každé pohlavie a dávku, - dávku bez toxickej reakcie, ak je to reálne, - časy úmrtí počas pozorovania alebo údaje, či zvieratá prežili po ukončení testu, - opis toxických alebo iných príznakov, - čas objavenia každého nenormálneho príznaku a jeho ďalší vývoj, - údaje o výžive a hmotnosti, - oftalmologické nálezy, - použité hematologické testy a všetky ich výsledky, - použité klinické biochemické testy a všetky ich výsledky (vrátane výsledkov každej analýzy moču), - nálezy pitvy, - detailný opis všetkých histopatologických nálezov, - štatistické spracovanie výsledkov, ak je potrebné, - diskusiu o výsledkoch, - interpretáciu výsledkov. 3.2. Vyhodnotenie a interpretácia Pozri všeobecný úvod časť B. 4. LITERATÚRA Pozri všeobecný úvod časť B. TEST KARCINOGENITY 1. METÓDA 1.1. Úvod Pozri všeobecný úvod časť B. 1.2. Definície Pozri všeobecný úvod časť B. 1.3. Referenčné látky Žiadne. 1.4. Princíp testovacej metódy Testovaná látka je podávaná obyčajne sedem dní v týždni vhodným spôsobom v niekoľkých skupinách pokusných zvierat, jedna dávka na jednu skupinu počas väčšej dĺžky ich života. Počas a po ovplyvnení testovanou látkou sú u experimentálnych zvierat denne sledované príznaky toxicity, obzvlášť vznik tumorov. 1.5. Kritériá kvality Žiadne. 1.6. Opis testovacej metódy Zvieratá sú udržiavané v laboratórnych podmienkach aspoň 5 dní pred začatím experimentu. Pred testovaním sa náhodne rozdelia mladé zdravé zvieratá do kontrolných a exponovaných skupín a označia. Pokusné zvieratá Na základe predchádzajúcich výsledkov môžu byť použité aj iné druhy (hlodavce aj nehlodavce). Mali by sa používať mladé zdravé zvieratá bežne používaných laboratórnych kmeňov a dávkovanie by sa malo začať čo najskôr po odstavení od matky. Na začiatku testu by odchýlka hmotnosti zvierat nemala presahovať ± 20 % priemernej hodnoty. Ak sa robí sub-chronický orálny test ako predbežný pre dlhodobý test, mali by sa použiť v oboch testoch rovnaké druhy/línie a kmene. Počet a pohlavie Pri hlodavcoch by sa malo použiť aspoň 100 zvierat (50 samíc a 50 samcov) pre každú dávku aj súbežnú kontrolu. Samice by mali byť virgínne, negravidné. Ak je v pláne utratiť nejaké zvieratá aj počas testu, počet by mal byť zvýšený o plánovaný počet zvierat, ktoré majú byť utratené pred ukončením testu. Dávkovanie a frekvencia expozície Okrem súbežnej kontrolnej skupiny by mali byť použité aspoň tri rôzne dávky. Najvyššia dávka by mala vyvolať minimálne príznaky toxicity ako slabé zníženie hmotnosti (menej ako ± 10 %). Zmeny v dĺžke života by nemali byť spôsobené inými vplyvmi, ako sú tumory. Najnižšia dávka by nemala mať vplyv na normálny rast, vývin a dlhovekosť zvierat ani vyvolávať žiadne toxické príznaky. Všeobecne by nemala byť nižšia ako 10 % najvyššej dávky. Stredná dávka alebo dávky by mali byť stanovené v strede intervalu medzi najvyššou a najnižšou dávkou. Výber dávok môže byť odhadnutý z údajov z predchádzajúcich sledovaní a testov toxicity. Bežná frekvencia ovplyvňovania je denná. Ak je chemikália podávaná v pitnej vode alebo primiešaná do potravy, voda a potrava by mali byť k dispozícii nepretržite. Kontroly Mali by byť použité súbežné kontrolné skupiny, ktoré sú identické v každom ohľade s ovplyvňovanými skupinami, okrem podávanej testovanej látky. Za špeciálnych okolností ako sú inhalačné testy aerosólov alebo použitie emulgátorov s neurčenou biologickou aktivitou v orálnych testoch, by mala byť použitá ďalšia kontrolná skupina, ktorá nie je vystavená ani použitým nosičom. Spôsob podávania Tri základné spôsoby podávania sú orálne, kožné (dermálne) a inhalácia. Výber spôsobu podávania závisí na fyzikálnych a chemických vlastnostiach testovanej látky a je pravdepodobný pre vystavenie človeka. Orálne testy Ak je testovaná látka absorbovaná z gastro-intestinálneho traktu a ak je prehltnutie jeden zo spôsobov, ako môže byť vystavený človek, pokiaľ nie sú vedľajšie účinky, je odporúčaný orálny spôsob podávania. Zvieratá môžu prijímať testovanú látku v potrave, rozpustenú v pitnej vode, alebo podávanú v kapsuliach. V ideálnom prípade by sa malo použiť denné dávkovanie počas sedem dní v týždni, pretože dávkovanie počas päť dní v týždni by mohlo spôsobiť zotavenie alebo ústup toxicity v čase nedávkovania a to ovplyvní výsledok a ďalšie hodnotenie. Z praktického hľadiska je však prijateľné aj dávkovanie päť dní v týždni. Kožné (dermálne) testy Vystavenie kože jej natieraním môže byť vybraté kvôli simulácii hlavného spôsobu vystavenia človeka a tiež ako modelový systém pre indukciu kožných poškodení (lézií). Inhalačné testy Pretože inhalačné testy predstavujú technický problém pre ich väčšiu komplikovanosť v porovnaní s inými spôsobmi podávania, je namieste detailnejší návod pre tento spôsob podávania testovanej látky. Je nutné poznamenať, že vnútropriedušnicová injekcia (infúzia) môže byť opodstatnenou alternatívou za špecifickej situácie. Vzorom pre dlhodobé testy sú obyčajne predpokladané vystavenia ľudí, čo znamená denné vystavenie zvierat šesť hodín po vyrovnaní koncentrácie v inhalačnej komore, päť dní v týždni (prerušované vystavenia), alebo pri pravdepodobnom vystavení z prostredia 22 až 24 - hodinové vystavenie denne sedem dní v týždni (nepretržité vystavenie), každý deň je v ten istý čas vyhradená jedna hodina na kŕmenie a údržbu testovacej komory. V oboch prípadoch sú zvieratá obyčajne ovplyvňované stálou koncentráciou testovanej látky. Podstatný rozdiel medzi prerušovaným a nepretržitým vystavením je, že v prvom je 17 až 18 - hodinový interval, v ktorom sa môžu zvieratá zotaviť z príznakov denného vystavenia dokonca s ešte dlhším intervalom na zotavenie cez víkendy. Výber prerušovaného alebo nepretržitého vystavenia závisí od cieľov testu a ľudského vystavenia, ktoré je simulované v testoch. Musia sa brať do úvahy aj určité technické problémy. Napríklad výhody nepretržitého vystavenia pri simulácii podmienok prostredia sa negujú nevyhnutnosťou kŕmenia a napájania počas vystavenia a potrebou zložitejších (spoľahlivých) aerosólov, vytvárania pary a tiež technikou monitorovania. Komory pre vystavenie Zvieratá by mali byť testované v inhalačných komorách vytvorených pre udržanie aktívneho prúdu vzduchu s výmenou 12 - krát za hodinu, aby bol zaistený adekvátny obsah kyslíka a rovnomerne rozdelená ovplyvňovacia atmosféra. Kontrolné komory a komory na vystavenie by mali mať rovnakú konštrukciu a tvar kvôli zaisteniu porovnateľných podmienok pre vystavenie vo všetkých ohľadoch, okrem testovanej látky. Jemný podtlak vo vnútri komory je bežne udržiavaný pre zabránenie rozptylu testovanej látky do okolitého prostredia. Komory by mali minimalizovať tiesnenie testovaných zvierat. Základné pravidlo pre zaistenie stability atmosféry v testovacej komore je, že celkový objem testovaných zvierat by nemal presiahnuť 5 % objemu testovacej komory. Merať a monitorovať by sa mali: i) Prúd vzduchu: pomer prietoku vzduchu cez komoru by mal byť, pokiaľ je možné, meraný nepretržite; ii) Koncentrácia: počas každodenného času vystavenia by sa koncentrácia testovanej látky nemala odchyľovať viac ako ± 15 % od priemernej hodnoty. Počas celkového trvania testu by sa mala koncentrácia zo dňa na deň udržiavať konštantne, ako to je len možné; iii) Teplota a vlhkosť: pre hlodavce by mala byť udržiavaná teplota 22 ± 2°C a vlhkosť v komore 30 až 70 %, okrem prípadu, keď je použitá voda na rozptýlenie testovanej látky v atmosfére testovacej komory. Pokiaľ je možné, obe veličiny by mali byť monitorované nepretržite; iv) Meranie veľkosti častíc: mala by byť určená veľkosť rozptýlených častíc v atmosfére komory, vrátene kvapalných alebo pevných aerosólov. Aerosólové častice by mali mať dýchateľnú veľkosť pre použité testované zvieratá. Vzorky atmosféry v testovacej komore by mali byť otestované v dýchacej zóne zvierat. Vzorka vzduchu by mala reprezentovať distribúciu častíc, ktorou sú zvieratá ovplyvňované a mala by byť určená gravimetrickým stanovením pre všetky suspendované aerosóly, aj keď mnoho aerosólov nie je dýchateľných. Analýza veľkosti častíc by mala byť prevádzaná často počas zostavovania testovacieho systému kvôli zaisteniu stability aerosólov, a potom tak často, ako je nevyhnutné, počas ovplyvnenia stanoviť zhodnosť distribúcie častíc, ktorými sú ovplyvňované zvieratá. Trvanie testu Trvanie testu karcinogenity zahŕňa väčšiu časť normálnej dĺžky života testovaných zvierat. Ukončenie testu by malo byť po 18 mesiacoch u myši a škrečka a po 24 mesiacoch u potkana; pri určitých kmeňoch zvierat s väčšou dĺžkou života a/alebo s nízkym spontánnym výskytom tumorov by sa mal test ukončiť po 24 mesiacoch u myši a škrečka a po 30 mesiacoch u potkana. Alternatívne, takéto predĺžené sledovanie je prijateľné, ak počet prežívajúcich zvierat v skupine s najnižšou dávkou alebo kontrole dosahuje 25 %. Pri ukončení testu, kde je výrazný rozdiel v odpovedi rôznych pohlaví, by sa malo hodnotiť každé pohlavie oddelene. Ak len skupina s najväčšou dávkou hynie predčasne na jasné následky toxicity, nie je dôvod na ukončenie testu za predpokladu, že prejav toxicity nie je problémom v ostatných skupinách. Pri negatívnych výsledkoch testu nie je prijateľná väčšia strata ako 10 % v každej skupine z dôvodu autolýzy, kanibalizmu alebo technických problémov a prežívanie všetkých skupín nie je nižšie ako 50 % počas 18 mesiacov u myši a škrečka a 24 mesiacov u potkana. Postup Pozorovania Denné pozorovania v klietkach by mali zahŕňať; zmeny na koži a srsti, očiach, slizniciach ako aj dýchacieho, obehového, autonómneho a centrálneho nervového systému, somatomotorickú aktivitu a model správania. Pravidelné pozorovania sú nevyhnutné pre zabezpečenie, že počet zvierat nebude klesať počas testu z dôvodov kanibalizmu, autolýzy tkanív a nesprávneho premiestňovania. Chradnúce zvieratá by mali byť utratené a vypitvané. Klinické príznaky a mortalita by mala byť zaznamenávaná pri všetkých zvieratách. Špeciálna pozornosť sa musí venovať vzniku tumorov: mal by byť zaznamenaný čas vzniku, lokalizácia, rozmery, výzor a rast výrazne viditeľných alebo hmatateľných tumorov. Počas prvých 13 týždňov pozorovania by mala byť meraná spotreba potravy (a vody ak je testovaná látka podávaná v pitnej vode) týždenne, a potom približne v trojmesačných intervaloch, pokiaľ to nie je potrebné zmeniť kvôli zdravotnému stavu alebo zmene hmotnosti. Hmotnosť zvierat by mala byť zaznamenávaná individuálne pre všetky zvieratá raz za týždeň prvých 13 týždňov testovania a potom najmenej raz za štyri týždne. Klinické vyšetrenia Hematológia Ak testovanie v klietkach predpokladá zhoršenie zdravia zvierat počas testu, mal by sa robiť krvný obraz postihnutých zvierat. Po 12 a 18 mesiacoch a pred utratením je potrebné urobiť krvné stery zvierat. Krvný obraz sa urobí na vzorkách zo zvierat v skupine s najvyššou dávkou a v kontrole. Ak údaje, zvlášť tie získané pred utratením alebo údaje z patologických skúšok, naznačujú nevyhnutnosť, mal by sa urobiť krvný obraz aj pre skupinu (-y) s nižšou dávkou. Celková pitva Všetky zvieratá by mali byť podrobené celkovej pitve, vrátane tých, ktoré zahynuli počas experimentu alebo boli utratené, lebo chradli. Všetky výrazne viditeľné tumory a poškodenia (lézie) alebo poškodenia (lézie) podozrivé na tumor by mali byť zafixované. Všetky orgány a tkanivá by sa mali fixovať vo vhodných médiách pre možné budúce histopatologické vyšetrenia: mozog (vrátane časti predĺženej miechy/varolov most, mozočková a mozgová kôra), hypofýza, štítna žľaza (vrátane prištítnych teliesok), každé tkanivo týmusu, priedušnica a pľúca, srdce, aorta, slinné žľazy, pečeň, slezina, obličky, nadobličky, pankreas, gonády, maternica, prídavné pohlavné orgány, kožu, pažerák, žalúdok, dvanástorník (duodenum), bedrovník (jejunum), lačník (ileum), slepé črevo, hrubé črevo, konečník, močový mechúr, zástupcu lymfatických uzlín, samičie mliečne žľazy, stehenné svalstvo, periférne nervy, hrudná kosť aj s kostnou dreňou, stehnová kosť (vrátane kĺbu), miecha z troch častí (krčná, stredno-hrudníková, bedrová) a oči. Naplnenie pľúc a močového mechúra fixačným činidlom je optimálny spôsob zachovania týchto tkanív: naplnenie pľúc pri inhalačných testoch je nevyhnutné pre primerané histopatologické vyšetrenia. Pri inhalačných testoch mal by byť uchovaný celý dýchací trakt, vrátane nosných dutín, hltana a hrtana. Histopatológia a) Kompletné histopatologické vyšetrenie by malo byť urobené na orgánoch a tkanivách všetkých zvierat, ktoré zahynuli alebo boli utratené počas testu a všetkých zvierat v kontrolnej skupine a v skupine s najvyššou dávkou. b) Všetky viditeľné tumory a poškodenia (lézie) alebo poškodenia (lézie) podozrivé na tumor by mali byť vyšetrené mikroskopicky vo všetkých skupinách. c) Ak je významný rozdiel vo výskyte neoplastických (rakovinových) poškodení (lézií) v skupine s najvyššou dávkou v porovnaní s kontrolou, malo by byť urobené histopatologické vyšetrenie obzvlášť na postihnutých orgánoch alebo tkanivách aj v ostatných skupinách. d) Ak je prežívanie v skupine s najvyššou dávkou podstatne nižšie ako v kontrole, mala by byť kompletne vyšetrená aj skupina s druhou na