Štvrtá Smernica Komisie z 5. decembra 1972, ktorou sa ustanovujú analytické metódy spoločenstva na úradnú kontrolu krmív



Úradný vestník L 083 , 30/03/1973 S. 0021 - 0034

Fínske špeciálne vydanie: Kapitola 3 Zväzok 5 S. 0115

Grécke špeciálne vydanie: Kapitola 03 Zväzok 9 S. 0114

Švédske špeciálne vydanie: Kapitola 3 Zväzok 5 S. 0115

Španielske špeciálne vydanie: Kapitola 03 Zväzok 6 S. 0230

Portugalské špeciálne vydanie Kapitola 03 Zväzok 6 S. 0230

CS.ES Kapitola 03 Zväzok 02 S. 12 - 25

ET.ES Kapitola 03 Zväzok 02 S. 12 - 25

HU.ES Kapitola 03 Zväzok 02 S. 12 - 25

LT.ES Kapitola 03 Zväzok 02 S. 12 - 25

LV.ES Kapitola 03 Zväzok 02 S. 12 - 25

MT.ES Kapitola 03 Zväzok 02 S. 12 - 25

PL.ES Kapitola 03 Zväzok 02 S. 12 - 25

SK.ES Kapitola 03 Zväzok 02 S. 12 - 25

SL.ES Kapitola 03 Zväzok 02 S. 12 - 25



Štvrtá Smernica Komisie z 5. decembra 1972, ktorou sa ustanovujú analytické metódy spoločenstva na úradnú kontrolu krmív (73/46/EHS) KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV, so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho hospodárskeho spoločenstva, so zreteľom na smernicu Rady z 20. júla 1970 [1] o zavedení metód vzorkovania a analýz spoločenstva na úradnú kontrolu krmív, zmenenú a doplnenú smernicou č. 72/275/EHS z 20. júla 1972 [2], a najmä na jej článok 2; keďže predmetná smernica vyžaduje, aby sa úradné kontroly krmív vykonávali metódami vzorkovania a analytickými metódami spoločenstva na účely kontroly dodržiavania požiadaviek vyplývajúcich zo zákonov, iných právnych predpisov a administratívnych postupov týkajúcich sa kvality a zloženia krmív; keďže smernice č. 71/250/EHS z 15. júna 1971 [3], č. 71/393/EHS z 18. novembra 1971 [4] a č. 72/199/EHS z 27. apríla 1972 [5] už ustanovili určitý počet analytických metód spoločenstva; keďže vzhľadom na pokrok dosiahnutý odvtedy v oblasti tejto činnosti je rozumné prijať štvrtý súbor metód; keďže opatrenia uvedené v tejto smernici sú v súlade so stanoviskom Riadiaceho výboru pre krmivá, PRIJALA TÚTO SMERNICU: Článok 1 Členské štáty budú vyžadovať, aby sa analýzy na úradnú kontrolu krmív pokiaľ ide o obsah vlhkosti v živočíšnych a rastlinných tukoch a olejoch a obsah horčíka a vlákniny v krmivách vykonávali v súlade s metódami opísanými v prílohe I k tejto smernici. Všeobecné ustanovenia uvedené v časti 1 (Úvod) prílohy k Prvej smernici Komisie č. 71/250/EHS z 15. júna 1971 sa budú aplikovať aj na metódy opísané v prílohe I k tejto smernici. Článok 2 Členské štáty budú vyžadovať, aby sa analýzy na úradnú kontrolu krmív, pokiaľ ide o obsah retinolu (vitamín A), tiamínu (aneurín, vitamín B1), kyseliny askorbovej a dehydroaskorbovej (vitamín C) v nich, vykonávali v súlade s metódami opísanými v prílohe II k tejto smernici. Všeobecné ustanovenia uvedené v časti 1 (Úvod) prílohy k Prvej smernici Komisie 71/250/EHS z 15. júna 1971, okrem časti zaoberajúcej sa prípravou vzorky na analýzu, sa budú aplikovať aj na metódy opísané v prílohe II k tejto smernici. Článok 3 Členské štáty uvedú do účinnosti najneskôr do 1. januára 1974 zákony, iné právne predpisy a administratívne opatrenia nevyhnutné na dosiahnutie súladu s touto smernicou. Bezodkladne o tom budú informovať Komisiu. Článok 4 Táto smernica je adresovaná členským štátom. V Bruseli 5. decembra 1972 Za Komisiu S. L. Mansholt predseda [1] Ú. v. ES L 170, 3.8.1970, s. 2. [2] Ú. v. ES L 171, 29.7.1972. s. 39. [3] Ú. v. ES L 155, 12.7.1971, s. 13. [4] Ú. v. ES L 279, 20.12.1971, s. 7. [5] Ú. v. ES L 123, 29.5.1972, s. 6. -------------------------------------------------- PRÍLOHA I 1. STANOVENIE VLHKOSTI V IVOČÍŠNYCH A RASTLINNÝCH TUKOCH A OLEJOCH 1. Účel a oblasť Táto metóda umožňuje stanoviť obsah vody a prchavých látok v živočíšnych a rastlinných tukoch a olejoch. 2. Podstata metódy Vzorka sa vysuší na konštantnú hmotnosť pri teplote 103 °C. Úbytok hmotnosti sa stanoví vážením. 3. Prístroje 3.1. Miska s plochým dnom, z nehrdzavejúceho materiálu, o priemere 8 až 9 cm a výške približne 3 cm. 3.2. Ortuťový teplomer so spevnenou guľôčkou a s vyrovnávacou rúrkou na hornom konci, s delenou stupnicou od približne 80 °C najmenej do 110 °C a o dĺžke približne 10 cm. 3.3. Pieskový kúpeľ alebo elektrická vyhrievacia platňa. 3.4. Exsikátor, obsahujúci účinné vysušovadlo. 3.5. Analytické váhy. 4. Postup Navážte s presnosťou na 1 mg približne 20 g zhomogenizovanej vzorky do suchej, odváženej misky (3.1.), v ktorej sa nachádza teplomer (3.2.). Zohrievajte na pieskovom kúpeli alebo elektrickej vyhrievacej platni (3.3.), za trvalého miešania teplomerom tak, aby teplota dosiahla hodnotu 90 °C za približne 7 minút. Znížte intenzitu ohrevu, pozorujúc frekvenciu s akou stúpajú bubliny z dna misky. Teplota nesmie presiahnuť hodnotu 105 °C. Pokračujte v miešaní, stierajúc dno misky, kým sa neprestanú tvoriť bubliny. S cieľom zabezpečiť úplné odstránenie vlhkosti, niekoľkokrát znovu zohrejte na teplotu 103 °C ± 2 °C, pričom medzi jednotlivými zohriatiami ochlaďte na 93 °C. Potom nechajte vychladnúť na laboratórnu teplotu v exsikátore (3.4.) a odvážte. Túto operáciu opakujte dovtedy, kým úbytok hmotnosti medzi dvomi následnými váženiami nebude menší ako 2 mg. Poznámka: Nárast hmotnosti vzorky po opakovanom zohriatí znamená oxidáciu tuku, v takomto prípade vypočítajte výsledok z váženia vykonaného bezprostredne predtým, ako začala hmotnosť stúpať. 5. Výpočet výsledkov Obsah vlhkosti, ako percento vzorky, je daný nasledovným vzorcom: · 100M0 v ktorom: MO = hmotnosť skúšobnej vzorky v gramoch; M1 = hmotnosť misky v gramoch s obsahom pred zohrievaním; M2 = hmotnosť misky v gramoch s obsahom po zohriatí. Výsledky menšie ako 0,05 % sa musia vyjadriť ako "menej ako 0,05 %". Opakovateľnosť Rozdiel vo vlhkosti medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť 0,05 % absolútnych. 2. STANOVENIE HORČÍKA — atómovou absorpčnou spektrofotometriou – 1. Účel a oblasť Táto metóda umožňuje stanoviť množstvo horčíka v krmivách. Je obzvlášť vhodná na stanovovanie obsahu horčíka menšieho ako 5 %. 2. Podstata metódy Vzorka sa spopolní a rozpustí v zriedenej kyseline chlorovodíkovej. Ak neobsahuje žiadne organické látky, priamo sa rozpustí v zriedenej kyseline chlorovodíkovej. Roztok sa zriedi a obsah horčíka sa stanoví atómovou absorpčnou spektrofotometriou pri 285,2 nm, porovnaním so štandardnými roztokmi. 3. Chemikálie 3.1. Kyselina chlorovodíková, p. a. d: 1,16. 3.2. Koncentrovaná kyselina chlorovodíková, p. a. d: 1,19. 3.3. Horčíkový pás alebo drôt, alebo heptahydrát síranu horečnatého, vysušený pri laboratórnej teplote. 3.4. Roztok soli stroncia (chlorid alebo dusičnan) s obsahom stroncia 2,5 % (w/v) (= 76,08 g SrCl2. 6H2O p. a. alebo 60,38 g Sr (NO3)2 p. a.). 3.5. Štandardný roztok horčíka: navážte s presnosťou na 1 mg 1 g horčíka (3.3.), z ktorého bola vopred opatrne odstránená vrstva oxidu, alebo zodpovedajúce množstvo (10,143 g) heptahydrátu síranu horečnatého (3.3.). Vložte do 1000 ml odmernej banky, pridajte 80 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.1.), nechajte rozpustiť a doplňte na 1000 ml vodou. 1 ml tohto roztoku obsahuje 1,000 mg horčíka. 4. Prístroje 4.1. Platinové, kremičitanové alebo porcelánové spaľovacie misky. 4.2. Termostatom regulovaná elektrická muflová pec. 4.3. Atómový absorpčný spektrofotometer. 5. Postup 5.1. Príprava roztoku vzorky 5.1.1. Krmivá minerálneho pôvodu Navážte s presnosťou na 1 mg 5 g vzorky do 500 ml odmernej banky obsahujúcej 250 až 300 ml vody. Pridajte 40 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.1.), priveďte do varu a nechajte kvapalinu mierne vrieť 30 minút. Nechajte vychladnúť, doplňte na požadovaný objem vodou, premiešajte a prefiltrujte do suchej kadičky cez suchý skladaný filter. Prvých 30 ml filtrátu odstráňte. Ak je vo vzorke oxid kremičitý, do 5 g vzorky pridajte dostatočné množstvo (15-30 ml) kyseliny chlorovodíkovej (3.2.), odparte do sucha vo vodnom kúpeli a preneste na jednu hodinu do sušiarne nastavenej na teplotu 105 °C. Ďalej pokračujte od tretej vety bodu 5.1.2. 5.1.2. Krmivá zložené prevažne z minerálnych látok Navážte s presnosťou na 1 mg 5 g vzorky do misky a spopolňujte pri teplote 550 °C v muflovej peci kým nezískate popol bez uhlíkatých častíc a nechajte vychladnúť. Aby sa odstránil oxid kremičitý, pridajte do popola dostatočné množstvo (15-30 ml) kyseliny chlorovodíkovej (3.2.), odparte do sucha vo vodnom kúpeli a preneste na jednu hodinu do sušiarne nastavenej na teplotu 105 °C. Do zvyšku pridajte 10 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.1.) a pomocou teplej vody preneste do 500 ml odmernej banky. Nechajte vychladnúť a na požadovaný objem doplňte vodou. Premiešajte a prefiltrujte do suchej kadičky cez suchý skladaný filter. Prvých 30 ml filtrátu odstráňte. 5.1.3. Krmivá zložené prevažne z organických látok Navážte s presnosťou na 1 mg 5 g vzorky do misky a spopolňujte pri teplote 550 °C v muflovej peci, kým nezískate popol bez uhlíkatých častíc. Do popola pridajte 5 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.2.), odparte do sucha vo vodnom kúpeli a potom sušte jednu hodinu v sušiarni pri teplote 105 °C, čím sa oxid kremičitý stane nerozpustným. Do popola pridajte 5 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.1.), pomocou teplej vody preneste do 250 ml odmernej banky, priveďte do varu, nechajte vychladnúť a na požadovaný objem doplňte vodou. Premiešajte a prefiltrujte do suchej kadičky cez suchý skladaný filter. Prvých 30 ml filtrátu odstráňte. 5.2. Meranie atómovou absorpciou Zriedením štandardného roztoku (3.5.) vodou, pripravte najmenej 5 porovnávacích roztokov o stúpajúcich koncentráciách, zodpovedajúcich optimálnemu rozsahu merania spektrofotometra. Do každého roztoku pridajte 10 ml roztoku soli stroncia (3.4.) a doplňte na požadovaný objem 100 ml vodou. Zrieďte vodou alikvotnú časť filtrátu získaného podľa bodu 5.1.1., 5.1.2. alebo 5.1.3. tak, aby ste dosiahli koncentráciu horčíka v rozmedzí koncentrácií porovnávacích roztokov. Koncentrácia kyseliny chlorovodíkovej v tomto roztoku nesmie presiahnuť hodnotu 0,4 N. Pridajte 10 ml roztoku soli stroncia (3.4.) a na objem 100 ml doplňte vodou. Zmerajte absorpciu roztoku vzorky a absorpciu porovnávacích roztokov pri 285,2 nm. 6. Výpočet výsledkov Vypočítajte množstvo horčíka vo vzorke porovnaním s porovnávacími roztokmi. Výsledok vyjadrite ako percento vzorky. Opakovateľnosť Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť 5 % relatívnych. 3. STANOVENIE VLÁKNINY 1. Účel a oblasť Táto metóda umožňuje stanoviť v krmivách množstvo organických látok neobsahujúcich tuky, ktoré sú nerozpustné v kyseline a v alkalických roztokoch a ktoré sa obvykle označujú ako vláknina. 2. Podstata metódy Vzorka podľa potreby odtučnená sa postupne vystaví účinku vriacich roztokov kyseliny sírovej a hydroxidu draselného o presne určených koncentráciách. Zvyšok sa oddelí filtráciou v prítomnosti azbestu, premyje, vysuší, odváži a spopolní pri teplote 900 °C. Úbytok hmotnosti vyplývajúci zo spopolnenia zodpovedá vláknine prítomnej v skúšobnej vzorke. 3. Chemikálie 3.1. 0,26 N kyselina sírová. 3.2. Upravený azbest: pridajte k azbestu podľa používaného typu Goochovho téglika približne 5-násobné množstvo zriedenej kyseliny chlorovodíkovej vzhľadom na hmotnosť azbestu (1 objem kyseliny chlorovodíkovej, d: 1,19 + 3 objemy vody). Zmes nechajte variť približne 45 minút, nechajte ju vychladnúť a prefiltrujte cez Buchnerov lievik. Najprv premývajte zvyšok vodou do úplného vymytia kyseliny chlorovodíkovej, a následne acetónom (3.6.). Azbest vysušte v sušiarni, a potom spopolňujte 2 hodiny pri teplote 900 °C. Nechajte vychladnúť a uchovávajte v uzatvorenej fľaši. Takto upravený azbest sa môže použiť niekoľkokrát. Podmienky týkajúce sa slepého pokusu sú uvedené v bode 5. 3.3. Protipeniaca emulzia (napr. silikónový olej). 3.4. 0,23 N roztok hydroxidu draselného. 3.5. 0,5 N kyselina chlorovodíková. 3.6. Acetón. 3.7. Dietyléter. 4. Prístroje 4.1. Kadičky o objeme najmenej 600 ml, s ryskami pri objeme 200 ml. 4.2. Porcelánové kruhové platne o priemere približne 80 mm a hrúbke približne 4 mm, s 32 otvormi, o priemere približne 4 mm. 4.3. Vákuové banky s gumovou zátkou o objeme približne 2 litre, s ryskami pri objeme 800 ml, so sklenými lievikmi o priemere 120 mm. 4.4. Filtračné platne o priemere približne 40 mm a hrúbke približne 4 mm so skosenými hranami tak, aby zapadali do kužeľa lievika (4.3.), približne so 16 otvormi o priemere približne 4 mm, a zakryté drôtenou sieťkou s veľkosťou otvorov asi 1 mm. Platničky a drôtená sieťka musia byť odolné voči kyseline a alkáliám. 4.5. Platinové alebo kremenné misky na spopolňovanie. 4.6. Termostatom regulovaná elektrická muflová pec. 4.7. Exsikátor 4.8. Azbestový filter: 2,0 g azbestu (3.2.) vložte do 100 ml vody. Prefiltrujte pod vákuom cez filtračnú platňu zakrytú drôtenou sieťkou (4.4.) a umiestnenú v lieviku vákuovej fľaše (4.3.) Filtrát zachyťte a prefiltrujte ešte raz cez ten istý filter. Filter odstráňte. 5. Postup Navážte, s presnosťou na 1 mg, 3 g vzorky a 2 g upraveného azbestu (3.2.) do kadičky (4.1.), pridajte 200 ml kyseliny sírovej (3.1.) a niekoľko kvapiek protipeniacej emulzie (3.3). Uveďte rýchlo do varu a nechajte vrieť presne 30 minút. Na zachovanie konštantného objemu prikryte kadičku chladiacim zariadením, napr. 500 ml bankou s guľatým dnom, v ktorej cirkuluje studená voda. Ukončite var pridaním približne 50 ml studenej vody a ihneď prefiltrujte pod vákuom cez azbestový filter vopred upravený spôsobom uvedeným v bode 4.8. Zvyšok premyte 5 dávkami približne 100 ml veľmi horúcej vody tak, aby ste získali konečný objem filtrátu 800 ml. Zvyšok preneste kvantitatívne do kadičky (4.1.), s porcelánovou platňou (4.2.) kvôli regulácii varu. Pridajte 200 ml roztoku hydroxidu draselného (3.4.). Uveďte rýchlo do varu a nechajte vrieť presne 30 minút. Pridajte približne 50 ml studenej vody a ihneď prefiltrujte pod vákuom cez nový azbestový filter vopred upravený spôsobom uvedeným v bode 4.8. Zvyšok premývajte veľmi horúcou vodou až kým premývacia voda nebude neutrálna (skúška na lakmusový papierik), potom 3-krát acetónom (3.6.) (približne 100 ml acetónu celkove). Zvyšok preneste kvantitatívne do spaľovacej misky (4.5.), v prípade potreby rozdrvte a vysušte na konštantnú hmotnosť v sušiarni pri teplote 130 °C. Nechajte vychladnúť v exsikátore (4.7.) a rýchlo odvážte. Misku vložte do muflovej pece (4.6.) a nechajte spopolňovať 30 minút pri teplote 900 °C. Nechajte vychladnúť v exsikátore (4.7.) a rýchlo odvážte. Vykonajte slepý pokus rovnakým postupom s upraveným azbestom (3.2.), ale bez vzorky. Úbytok na hmotnosti vyplývajúci zo spopolňovania 6 g azbestu nesmie presiahnuť 10 mg. 6. Výpočet výsledkov Obsah vlákniny, ako percento vzorky, je daný vzorcom: M . 100 3 v ktorom: a = úbytok hmotnosti po spopolnení počas stanovenia; b = úbytok hmotnosti po spopolnení počas slepého pokusu. Opakovateľnosť Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť: 0,3, v absolútnej hodnote, pre obsahy vlákniny menšie ako 10 %; 3 % relatívnych pre obsahy vlákniny rovné alebo väčšie ako 10 %. 7. Poznámky 7.1. Krmivá obsahujúce viac ako 10 % olejov a tukov sa musia pred analýzou odtučniť dietyléterom (3.7.). Skúšobnú vzorku (3 g navážené s presnosťou na 1 mg) vložte na azbestový filter (4.8.). Prelejte 3-krát približne 50 ml dietyléteru (3.7.) a zakaždým opatrne prefiltrujte pod vákuom. Odtučnenú skúšobnú vzorku a azbest preneste kvantitatívne do kadičky (4.1.) a pokračujte v analýze spôsobom uvedeným v bode 5. 7.2. Krmivá obsahujúce oleje a tuky, ktoré sa nedajú vyextrahovať priamo, sa musia odtučniť tak, ako je uvedené v bode 7.1. a odtučniť znova po vymytí kyseliny zo zvyšku. Kyselinu vymyte zo zvyšku 3-krát acetónom (3.6.) (celkove 100 ml) a potom 3-krát 50 ml dietyléteru (3.7.). Potom preneste zvyšok kvantitatívne do kadičky (4.1.) a pokračujte v analýze spôsobom uvedeným v druhom odseku bodu 5 (var s roztokom hydroxidu draselného). 7.3. Ak sú krmivá bohaté na vápnik (viac ako 2 % vápnika), skúšobnú vzorku (3 g navážené s presnosťou na 1 mg) vložte do kadičky (4.1.) so 100 ml 0,5 N kyseliny chlorovodíkovej (3.5.) a nechajte stáť pri nízkej teplote po dobu 5 minút. Ihneď prefiltrujte a premyte studenou vodou. Ako filtračnú pomôcku použite 2,0 g azbestu určeného na varenie v kyseline sírovej. Ak je filtrácia obtiažna, zrieďte suspenziu acetónom (3.6.). Ďalej postupujte spôsobom uvedeným v bode 5. -------------------------------------------------- PRÍLOHA II 1. STANOVENIE RETINOLU (VITAMÍN A) 1. Účel a oblasť Táto metóda umožňuje stanoviť množstvo retinolu (vitamín A) v krmivách, koncentrátoch a v premixoch. Dolná medza stanoviteľnosti je 10000 m. j./kg vo vysokopigmentovaných krmivách a 4000 m. j./kg v ostatných [1]. Produkty sú rozdelené do dvoch skupín, podľa predpokladaného obsahu retinolu v nich: Skupina A: obsahy menšie ako 200000 m. j./kg; Skupina B: obsahy rovné alebo väčšie ako 200000 m. j./kg. 2. Podstata metódy Vzorka sa zhydrolyzuje za horúca roztokom hydroxidu draselného v etanole v prítomnosti antioxidantu alebo v atmosfére dusíka. Zmes sa vyextrahuje 1,2-dichlóretánom. Extrakt sa odparí dosucha a rozpustí v petroléteri. Roztok sa podrobí chromatografii na kolóne s oxidom hlinitým (v produktoch skupiny Bsachromatografia vyžaduje iba v určitých prípadoch). V produktoch skupiny A sa retinol stanoví spektrofotometricky pri 610 nm po vytvorení farebného komplexu podľa Carr Pricovej reakcie; v produktoch skupiny B spektrofotometricky v ultrafialovom svetle pri 325 nm. 3. Chemikálie a) používané na analyzovanie produktov skupiny A a B 3.1. 96 % (v/v) etanol, 3.2. 10 % (w/v) roztok askorbátu sodného, p. a., alebo 3.3. Prečistený dusík. 3.4. 50 % (w/v) roztok hydroxidu draselného p. a. 3.5. 1 N roztok hydroxidu draselného p. a. 3.6. 0,5 N roztok hydroxidu draselného p. a. 3.7. 1,2-dichlóretán p. a. 3.8. Petroléter, bod varu: 30-50 °C. V prípade potreby vyčistite nasledovne: zmiešajte s 1000 ml petroléteru s toľkými 20 ml dávkami koncentrovanej kyseliny sírovej, kým kyselina nezostane bezfarebná. Kyselinu odstráňte a petroléter premyte 500 ml vody, dvakrát 250 ml 10 % (w/v) roztoku hydroxidu sodného a trikrát 500 ml vody. Vodnú vrstvu odstráňte, petroléter vysušte 1 hodinu nad aktívnym uhlím a bezvodým síranom sodným, prefiltrujte a predestilujte. 3.9. Oxid hlinitý, štandardizovaný podľa Brockmana: spopolňujte 8 hodín pri teplote 750 °C, ochlaďte v exsikátore a uchovávajte v fľaši z hnedého skla so zábrusovou zátkou. Pred použitím na chromatografiu navlhčite nasledovným spôsobom: vložte do fľaše z hnedého skla 10 g oxidu hlinitého a 0,7 ml vody; uzatvorte zátkou a za stáleho trepania znovu zahrievajte vo vriacom vodnom kúpeli 5 minút. Nechajte vychladnúť. Overte aktivitu takto pripraveného hliníka tak, že podrobíte známe množstvo retinolu (3.17.) (približne 500 m. j.) postupu opísanému v bodoch 5.3. a 5.4. a skontrolujte návratnosť. 3.10. Zásaditý oxid hlinitý, stupeň aktivity 1 (Woelm; Merck alebo ekvivalentný). 3.11. Čistý dietyléter. Peroxidy a zvyšok vody odstráňte chromatograficky na kolóne so zásaditým oxidom hlinitým (3.10.). (25 g oxidu hlinitého na 250 ml dietyléteru.) 3.12. Roztoky petroléteru (3.8.) v 4, 8, 12, 16 a 20 % dietyléteru (3.11.) (v/v). 3.13. 0,5 molárny roztok sulfidu sodného v 70 % (v/v) glyceríne pripravený zo sulfidu sodného p. a. b) používané výlučne na analyzovanie produktov skupiny A 3.14. Kryštalizovateľný benzén o p. a. 3.16. Chloroform p. a. Odstráňte etanol, fosgén a zvyšky vody chromatograficky na kolóne so zásaditým oxidom hlinitým (3.10.) (50 g oxidu hlinitého na 200 ml chloroformu; doporučuje sa prvých 50 ml eluátu podrobiť chromatografii ešte raz). Carr-Priceovo činidlo: miešajte približne 25 g chloridu antimonitého p. a. (uchovávaného v exsikátore) so 100 ml chloroformu (3.15.), až do nasýtenia roztoku. Mierny nadbytok chloridu antimonitého nespôsobuje žiadne problémy. Pridajte 2 ml o anhydridu kyseliny octovej p. a. Uchovávajte v chladničke vo fľaši z hnedého skla so zábrusovou zátkou. Roztok vydrží niekoľko týždňov. 3.17. Retinol — štandardizovaný spektrofotometricky. c) používané výlučne na analyzovanie produktov skupiny B 3.18. Izopropanol pre chromatografiu. 4. Aparatúra 4.1. Vodný kúpeľ. 4.2. Vákuová odparka s bankami s guľatým dnom o rôznych objemoch. 4.3. Sklené chromatografické kolóny (dĺžka: 300 mm, vnútorný priemer: približne 13 mm). 4.4. Spektrofotometer s 10 mm článkami. Merania v UV svetle si vyžadujú články z oxidu kremičitého. 4.5. UV žiarivky vhodné pre 365 nm. 5. Postup Dôležité upozornenie: Všetky operácie sa musia vykonávať mimo dosahu priameho svetla, v prípade potreby v zariadení z hnedého skla. 5.1. Skúšobná vzorka Z jemne delenej vzorky odoberte skúšobnú vzorku proporcionálne k predpokladanému obsahu retinolu nasledovným spôsobom: 0,1 — 1,0 g v prípade koncentrátov (obsah vyšší ako 20000 IU/g). 3,0- 5,0 g v prípade predzmesí (obsah medzi 400 a 20000 IU/g). 10-20 g pre v prípade anorganických zmesí; 30 g v prípade produktov skupiny A. Skúšobnú vzorku ihneď vložte do 500 ml banky so zábrusovým uzáverom. 5.2. Hydrolýza a extrakcia [2] Pridávajte postupne do skúšobnej vzorky 40 ml etanolu (3.1.), 2 ml roztoku askorbanu sodného (3.2.) [3], 10 ml roztoku hydroxidu draselného (3.4.) a 2 ml roztoku sulfidu sodného (3.13.). Zahrievajte 30 minút pri teplote 70-80oC s použitím spätného chladiča, a potom nechajte vychladnúť pod prúdom vody. Pridajte 50 ml etanolu (3.1.) a 100 ml 1,2-dichlóretánu (3.7.) (odoberte pipetou). Intenzívne trepte, a potom dekantujte kalovú kvapalinu do dekantačnej nádoby. Pridajte do nádoby 150 ml roztoku hydroxidu draselného (3.5.), trepte po dobu 30 sekúnd a nechajte stáť až do oddelenia vrstiev. Vrstvu dichlóretánu (spodná vrstva) zachyťte do usadzovacej nádoby, pridajte 40 ml roztoku hydroxidu draselného (3.6.), trepte 10 sekúnd a nechajte stáť, až kým sa vrstvy neoddelia. Dichlóretánovú vrstvu zachyťte do usadzovacej nádoby a premývajte 6–8-krát 40 ml dávkami vody až kým nebude bez obsahu alkálií (skúška na fenolftaleín). Zachyťte dichlóretánovú vrstvu a odstráňte posledné stopy vody pomocou pásikov filtračného papiera.. Alikvotnú časť roztoku odparte dosucha vo vákuu a vo vodnom kúpeli pri teplote 40o C. Zvyšok rýchlo upravte 5 ml ľahkého benzínu (3.8.). V prípade produktov skupiny A, chromatografujte tak, ako je uvedené v bode 5.3.1. V prípade produktov skupiny B, preneste roztok do 50 ml odmernej banky, doplňte na požadovaný objem ľahkým benzínom (3.8.) premiešajte a zmerajte optickú hustotu spôsobom uvedeným bode 5.4.2.). 5.3. Chromatografia 5.3.1. Produkty skupiny A Naplňte chromatografickú kolónu (4.3.) do výšky 200 mm 10 g oxidu hlinitého (3.9.) predtým suspendovaného v ľahkom benzíne (3.8.). Roztok získaný podľa bodu 5.2. vložte do kolóny a ihneď pridajte 20 ml ľahkého benzínu (3.8.). Eluujte následne 10 ml dávkami roztokov ľahkého benzínu s koncentráciou dietyléteru (3.12.) 4, 8, 12, 16 a 20 % pod tlakom alebo parciálnym vákuom, pričom prietok bude činiť 2 až 3 kvapky za sekundu. Ako prvý sa eluuje karotén [4] Retinol sa spravidla eluuje roztokom ľahkého benzínu s koncentráciou dietyléteru 20 % (3.12.). Eluovanie sa sleduje pod UV svetlom (krátkodobé ožiarenie kolóny ortuťovou výbojkou). Fluoreskujúca zóna retinolu je jasne oddelená od žltých zón xantofylu, ktoré nasledujú za ňou. Frakciu eluátu obsahujúcu retinol zachyťte do Erlenmeyerovej banky. 5.3.2. Produkty skupiny B Chromatografia sa musí vykonať iba vtedy, keď výsledky merania optickej hustoty získané podľa bodu 5.4.2. nebudú v súlade s požiadavkami uvedenými v bode 5.4.2. Ak sa chromatografia ukáže byť nevyhnutnou, tak vložte do chromatografickej kolóny alikvotnú časť roztoku v ľahkom benzéne získanú podľa bodu 5.2., obsahujúcu približne 500 IU retinolu a chromatografujte spôsobom uvedeným v bode 5.3.1. 5.4. Meranie optickej hustoty 5.4.1. Produkty skupiny A Odparte do sucha pod vákuom eluát obsahujúci retinol, získaný podľa bodu 5.3.1. Do zvyšku pridajte 2 ml benzénu. (3.14.) Odoberte 0,3 tohto roztoku, pridajte 3 ml Carr-Priceovho činidla (3.13.). Vznikne modré sfarbenie. Zmerajte absorbanciu spektrofotometrom pri 610 nm presne 30 sekúnd po začiatku reakcie. Stanovte obsah retinolu porovnaním s kalibračnou krivkou získanou z benzénových roztokov so stúpajúcimi koncentráciami štandardu retinolu, pripravených s Carr-Priceovým činidlom (2 až 16 m. j. štandardu retinolu (3.17.) na 0,3 ml benzénu (3.14.) + 3 ml Carr-Priceovho činidla (3.16.)). Kalibračná krivka sa musí pravidelne a často kontrolovať pomocou štandardu a čerstvo pripraveného roztoku Carr- Priceovho činidla. 5.4.2 Produkty skupiny B Odoberte alikvotnú časť petroléterového roztoku získaného podľa bodu 5.2., obsahujúcu približne 200 m. j. retinolu. Odparte do sucha pod vákuom a zvyšok rozpustite v 25 ml izopropanolu (3.18.). Zmerajte absorbanciu v spektrofotometri pri 325, 310 a 334 nm. Absorpčné maximum sa nachádza pri 325 nm. Obsah retinolu v roztoku sa vypočíta nasledovným spôsobom: E 325. 18,30 = m. j. retinolu/ml. Avšak pomer absorbancií E310: E325a E334: E325 musí byť 6:7 = 0,857. Pokiaľ sa jeden z týchto pomerov bude značne líšiť od hodnoty (< 0,830 alebo >0,880), meraniu absorbancií hustôt musí prechádzať chromatografia v súlade s metódou uvedenou v 5.3.2. Ak meranie absorbancií vykonané po chromatografii ukáže, že vyššie uvedené pomery sa ešte stále značne líšia od hodnoty 0,857 (< 0,830 alebo > 0,880), stanovenie sa musí vykonať v súlade s metódou uvedenou pre produkty skupiny A. 6. Výpočet výsledkov Vypočítajte obsah retinolu vo vzorke berúc do úvahy hmotnosť skúšobnej vzorky a zriedenia vykonané počas analýzy. Výsledky vyjadrite v m. j. retinolu na kg krmiva alebo na kg koncentrátu alebo premixu. Opakovateľnosť Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť: - 20 % relatívnych pre obsahy retinolu menšie ako 75000 m. j./kg; - 15000 m. j. pre obsahy medzi 75000 a 150000 m. j./kg; - 10 % relatívnych pre obsahy medzi 150000 m. j./kg; a 250000 m. j./kg; - 25000 m. j. pre obsahy medzi 250000 a 500000 m. j./kg; - 5 % relatívnych pre obsahy viac ako 500000 m. j./kg. 2. STANOVENIE TIAMÍNU (VITAMÍN B1, ANEURÍN) 1. Účel a oblasť Táto metóda umožňuje stanoviť množstvo tiamínu (aneurín, vitamín B1) v krmivách, koncentrátoch a v premixoch. Dolná medza stanoviteľnosti je 5 ppm. 2. Podstata metódy Roztok sa vystaví za horúca účinku zriedenej kyseliny sírovej a následne sa enzymaticky zhydrolyzuje. Získaný roztok sa podrobí alkalickej oxidácii. Vzniknutý tiochróm sa vyextrahuje izobutanolom a stanoví sa fluorimetricky. 3. Chemikálie 3.1. Štandardný roztok tiamínu 100 μg/ml: rozpustite 112,3 mg tiamínhydrochloridu, vopred vysušeného pod vákuom na konštantnú hmotnosť, v 1000 ml 0,2 N kyseliny sírovej (3.2.). Pri skladovaní na chladnom a tmavom mieste tento roztok vydrží jeden mesiac. 3.2. 0,2 N kyselina sírová. 3.3. Čistý hydrogénsiričitan sodný. 3.4. 20 % (w/v) roztok ferikyanidu draselného p. a. 3.5. 25 % (w/v) roztok hydroxidu draselného p. a. 3.6. Oxidačná zmes: zmiešajte 2 ml roztoku ferikyanidu draselného (3.4.) so 48 ml roztoku hydroxidu draselného (3.5.). Táto zmes nevydrží dlhšie ako 4 hodiny. 3.7. Izobután p. a. 3.8. 2,5 1 N roztok octanu sodného. 3.9. Multienzymatický prípravok obsahujúci proteázu, fosfatázu a amylázu (napr. Clarase). 3.10. 96 % (v/v) etanol. 4. Prístroje 4.1. Vodný kúpeľ. 4.2. Odstredivka (3500 ot/min.) s 30 — 50 ml kyvetami so zábrusovými zátkami. 4.3. Fluorimeter. 5. Postup 5.1. Enzymatická hydrolýza Vložte do dvoch 250 ml odmerných baniek, A a B rovnaké množstvá jemne pomletej vzorky obsahujúce približne 100 μg tiamínu a 125 ml kyseliny sírovej (3.2.). Do banky A pridajte 1,0 ml roztoku štandardu (3.1.) (vnútorný štandard). Bankami intenzívne pretrepte, vložte do vriaceho vodného kúpeľa a za občasného pretrepávania ich tam nechajte 15 minút. Nechajte vychladnúť na teplotu približne 45oC. Do každej banky pridajte 20 ml roztoku octanu sodného (3.8.) a 0,5 g multienzymatického prípravku (3.9.), potom nechajte stáť 20 minút pri laboratórnej teplote. Pridajte 20 ml roztoku octanu sodného (3.8.), doplňte na požadovaný objem vodou, premiešajte a prefiltrujte. Prvých 15 ml odstráňte a zachyťte filtráty A a B. Pripravte nasledovné roztoky: 5.1.1. Porovnávací roztok T Vložte do kyvety odstredivky (4.2.) 5 ml filtrátu A a približne 10 mg hydrogénsiričitanu sodného (3.3.). Kyvetu ponorte na 15 minút do vriaceho vodného kúpeľa, a potom ju nechajte vychladnúť na laboratórnu teplotu. 5.1.2. Roztoky A (vnútorný štandard) a B (vzorka) Do kyvety odstredivky (4.2.) vložte 5 ml filtrátu A a do ďalšej kyvety (4.2.) 5 ml filtrátu B. 5.2. Oxidácia Pridajte do roztokov T, A a B 5 ml oxidačnej zmesi (3.6.) a o minútu neskôr 10 ml izobutanolu (3.7.). Kyvety zazátkujte a intenzívne pretrepávajte päť sekúnd. Nechajte stáť jednu minútu a odstreďte tak, aby sa vrstvy oddelili. Z každej kyvety preneste 5 ml supernatantu z izobutanolovej vrstvy do každej 25 ml odmernej banky, doplňte na požadovaný objem etanolom (3.10.) a premiešajte (= extrakty T, A a B). 5.3. Meranie fluorescencie Merania vykonajte pri vlnovej dĺžke pri ktorej fluorimeter dáva optimálnu odozvu na fluorescenciu tiochrómu. Ožiarte pri vlnovej dĺžke približne 365 nm. Prístroj nastavte na nulu extraktom T. Zmerajte intenzitu fluorescencie extraktov A a B. 6. Výpočet výsledkov Obsah tiamínu v mg/kg vo vzorke je daný vzorcom: c v ktorom: a = intenzita fluorescencie extraktu A (vnútorný štandard); b = intenzita fluorescencie extraktu B (vzorka); c = hmotnosť skúšobnej vzorky v g; d = množstvo tiamínu v μg, pridaného do skúšobnej vzorky (vnútorný štandard). Opakovateľnosť Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť: 10 % relatívnych pre obsahy menšie ako 500 mg/kg, a 5 % relatívnych pre obsahy rovné alebo väčšie ako 500 mg/kg. 3. STANOVENIE KYSELINY ASKORBOVEJ A KYSELINY DEHYDROASKORBOVEJ (VITAMÍN C) 1. Účel a oblasť Táto metóda umožňuje stanoviť celkové množstvo kyseliny askorbovej a kyseliny dehydroaskorbovej (vitamín C) v krmivách, koncentrátoch a v premixoch. Dolná medza stanoviteľnosti je 5 ppm. Produkty sú rozdelené do dvoch skupín podľa predpokladaného obsahu vitamínu C v nich: Skupina A: obsahy menšie ako 10 g/kg; Skupina B: obsahy rovné alebo väčšie ako 10 g/kg. 2. Podstata metódy Vzorka sa vystaví účinku roztoku zriedenej kyseliny metafosforečnej a vyextrahuje sa chloroformom. Vodná fáza sa vystaví účinku roztoku 2,6-dichlórfenol-indofenolu, čím sa kyselina askorbová prevedie na kyselinu dehydroaskorbovú a potom roztoku 2,4-dinitrofenylhydrazínu. Vzniknutý hydrazón sa vyextrahuje zmesou etylacetátu, ľadovej kyseliny octovej a acetónu. Roztok sa podrobí chromotografii na kolóne so silikagélom, eluát sa odparí do sucha a zvyšok sa rozpustí v zriedenej kyseline sírovej. Absorbancia roztoku sa zmeria spektrofotometrom pri 509 nm. V prípade produktov skupiny A sa eluát získaný chromatografiou na kolóne ďalej podrobí chromatografii na tenkej vrstve s cieľom izolovať hydrazón. 3. Chemikálie 3.1. štandardný roztok 0,05 % kyseliny L-askorbovej: rozpustite 50 mg kyseliny L-askorbovej p. a. v približne 20 ml roztoku kyseliny metafosforečnej (3.2.) a doplňte na 100 ml vodou. Pripravujte tesne pred použitím. 3.2. 10 % roztok (w/v) kyseliny metafosforečnej: po jej rozotretí v trecej miske rozpustite vo vode 200 g kyseliny metafosforečnej p.a. a doplňte na 2000 ml vodou. Uchovávajte pri teplote 4 °C. Roztok je stály jeden týždeň. 3.3. Chloroform p. a. 3.4. Roztok 0,5 % (w/v) 2,6-dichlórofenol-indofenol p. a. Pripravte bezprostredne pred použitím. 3.5. Filtračná pomôcka (S. a S. č. 121 alebo ekvivalentná). 3.6. Kyslý roztok (w/v) 2,4-dinitrofenylhydrazínu 2 %: rozpustite 2 g 2,4-dinitrofenylhydrazínu v 100 ml zriedenej kyseliny sírovej (25 ml kyseliny sírovej p. a., d: 1,84, zriedenej doplnením na 100 ml vodou). Skladovaný pri nízkej teplote vydrží tento roztok jeden týždeň. 3.7. Dusík alebo 3.8. Oxid uhličitý. 3.9. Zmes etylacetátu p. a./ľadovej kyseliny octovej/acetónu p. a.: 96/2/2 v objemových dieloch. 3.10. Zmes dichlórmetánu p. a./ľadovej kyseliny octovej: 97/3 v objemových dieloch. 3.11. Silikagél, veľkosť častíc: 0,05 až 0,2 mm. 3.12. Silikagél H podľa Stahla, na chromatografiu na tenkej vrstve. 3.13. Zrieďte kyselinu sírovú: vložte 105 ml vody do 200 ml odmernej banky, doplňte na požadovaný objem kyselinou sírovou p. a., d:1,84. 3.14. Elučné činidlo na chromatografiu na tenkej vrstve: zmiešajte 75 ml dietyléteru p. a., 25 ml etylacetátu p. a. a 4,0 ml 96 % (w/v) kyseliny octovej p. a. Činidlo vymeňte po 2 až 3 chromatografiách. 4. Prístroje 4.1. Vodný kúpeľ s termostatom nastaveným na 20 °C. 4.2. Odstredivka (3500 ot/min.) so 40 — 50 ml kyvetami so zábrusovými zátkami. 4.3. Rotačná vákuová odparka s 250 ml bankami. 4.4. Sklené chromatografické kolóny (dĺžka: 100 mm, vnútorný priemer: 20 mm), s fritou (napr. Allihnove trubice). 4.5. Spektrometer alebo kolorimeter s filtrami, s 10 mm kyvetami. 4.6. Zariadenie na chromatografiu na tenkej vrstve so silikagélovými platňami (3.12.) s vrstvou 0,5 až 0,6 mm. (Vhodné sú hotové platne). Platne sušte 2,5 až 3 hodiny v sušiarni pri teplote 120 až 130 °C. Nechajte vychladnúť, a potom uchovávajte najmenej 24 hodín pred použitím v exsikátore. 4.7. Sušiareň nastavená na 120 až 130 °C. 5. Postup 5.1. Extrakcia Vložte do dvoch 250 ml odmerných baniek (so zábrusovými zátkami), A a B rovnaké množstvá jemne pomletej vzorky obsahujúce približne 200 μg vitamínu C. Do banky A pridajte 0,4 ml štandardného roztoku (3.1.) a jemne premiešajte (vnútorný štandard). Pridajte do každej banky 30 ml chloroformu (3.3.) a 25 ml roztoku kyseliny metafosforečnej (3.2.) pri teplote 4 °C. Krátko pretrepte a potom nechajte stáť 10 až 15 minút. Pridajte 25 ml vody, banky zazátkujte, intenzívne pretrepávajte 10 sekúnd a nechajte stáť 10 až 15 minút vo vodnom kúpeli (4.1.). Odstredením oddeľte vodnú vrstvu od chloroformovej vrstvy. Súčasne vykonajte postup opísaný nižšie vo vodných extraktoch (A) (vnútorný štandard) a B. 5.2. Oxidácia ml supernatantu vodného roztoku (mierne zakaleného) získaného v bode 5.1. napipetujte do reakčnej skúmavky so zábrusovou zátkou, pridajte 0,5 až 1 ml roztoku 2,6-dichlófenol-indofenolu (3.4.) a premiešajte. Vznikne červené sfarbenie, ktoré musí pretrvať aspoň 15 minút. Potom pridajte približne 300 mg filtračnej pomôcky (3.5.), pretrepte a prefiltrujte cez suchý skladaný filter. Filtrát nemusí byť nevyhnutne číry. 5.3. Reakcia s 2,4-dinitrofenylhydrazínom a extrakcia hydrazónu. 10 ml filtrátu získaného postupom uvedeným v bode 5.2. napipetujte do centrifugačnej kyvety (4.2.) pridajte 2 ml roztoku 2,4-dinitrofenylhydrazínu (3.6.) a premiešajte. Do kyvety rýchlo priveďte prúd dusíka (3.7.) alebo oxidu uhličitého (3.8.), kyvetu zazátkujte a ponorte ju na približne 15 hodín (cez noc) do vodného kúpeľa (4.1.). Potom pridajte 3 ml vody, 20 ml zmesi etylacetátu/ľadovej kyseliny octovej/acetónu (3.9.) a približne 800 mg filtračnej pomôcky (3.5.). Kyvetu zazátkujte, intenzívne pretrepávajte 30 sekúnd a odstreďte. Vložte 15 ml supernatantu do odparovacej banky a odparujte pri zníženom tlaku v rotačnej odparke (4.3.) až do získania olejovitého zvyšku. Zvyšok rozpustite v 2 ml zmesi etylacetátu/ľadovej kyseliny octovej/acetónu (3.9.) opätovným zahriatím na 50 °C, nechajte vychladnúť a pridajte 10 ml zmesi dichlórmetán/ľadová kyselina octová (3.10.) a premiešajte. 5.4. Chromatografia na kolóne Chromatografickú kolónu (4.4.) naplňte po úroveň 30 mm zmesou dichlórmetán/ľadová kyselina octová (3.10.). Pridajte (za intenzívneho trepania) 5 g silikagélu (3.11.) do 30 ml zmesi dichlórmetán/ľadová kyselina octová (3.10); suspenziu nalejte do kolóny. Nechajte stáť a potom stlačte dusíkom (3.7.) pri nízkom tlaku. Prelejte do kolóny roztok získaný v bode 5.3., banku vypláchnite malým množstvom zmesi dichlórmetán/ľadová kyselina octová (3.10.) a prelejte do kolóny, kolónu potom naplňte zmesou (3.10.) a začnite kolónu premývať tou istou zmesou (3 až 4 dávky po približne 5 ml) až do vzniku bezfarebného eluátu. Dožlta sfarbenú časť eluátu odstráňte. Červenkastú zónu v hornej časti kolóny eluujte zmesou etylacetát/ľadová kyselina octová/acetón (3.9.), eluát zachyťte a odparte do sucha. 5.4.1. Ak ide o produkty skupiny A (obsahy vitamínu C menšie ako 10g/kg) rozpustite zvyšok v 2 ml zmesi etylacetát/ľadová kyselina octová/acetón (3.9.) a okamžite vykonajte chromatografiu na tenkej vrstve postupom uvedeným v bode 5.5. 5.4.2. Ak ide o produkty skupiny B (obsahy vitamínu C rovné alebo väčšie ako 10g/kg) rozpustite olejovitý zvyšok v 4,0 ml zriedenej kyseliny sírovej (3.13.), intenzívne pretrepte, aby sa zvyšok úplne rozpustil a zmerajte absorbanciu postupom uvedeným v bode 5.6. 5.5. Chromatografia na tenkej vrstve Opísaný pracovný postup vykonajte dvojmo nasledovným spôsobom. Na tenkú čiaru na platni (4.6.) naneste 0,5 ml roztoku získaného podľa bodu 4.1. Elučným činidlom (3.14.) vyvíjajte najmenej 20 minút v kyvete n nasýtenej parami rozpúšťadla, až kým doružova sfarbená hydrazónová zóna nebude jednoznačne oddelená. Nechajte vyschnúť na vzduchu. Vyznačte okraje ružovej zóny, zónu zoškrabte špachtľou a prášok preneste kvantitatívne do chromatografickej kolóny (4.4.). Postupne eluujte jedenkrát 2 ml a dvakrát 1,5 ml zmesi etylacetát/ľadová kyselina octová/acetón (3.9.). Eluát zachyťte do malej banky (posledná časť musí byť bezfarebná). Odparte do sucha, olejovitý zvyšok rozpustite v 4,0 ml zriedenej kyseliny sírovej (3.13), intenzívne pretrepte, aby sa zvyšok úplne rozpustil a zmerajte absorbanciu. 5.6. Meranie absorbancie Absorbanciu zmerajte spektrofotometrom pri 509 nm 20 až 30 minút po rozpustení zvyšku v kyseline sírovej. Merania vykonajte porovnaním so zriedenou kyselinou sírovou (3.13). 5.7. Slepý pokus Vykonajte slepý pokus tým istým postupom, ale bez vzorky. 6. Výpočet výsledkov Obsah vitamínu C vo vzorke je daný vzorcom: · 2 · 10d v ktorom: a = absorbancia slepého pokusu; b = absorbancia roztoku vnútorného štandardu; c = absorbancia roztoku vzorky; d = hmotnosť skúšobnej vzorky gramoch; Opakovateľnosť Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť: 10 % relatívnych pre obsahy vitamínu C menšie ako 10 g/kg a 5 % relatívnych pre obsahy rovné alebo väčšie ako 10 g/kg. [1] 1 m. j. = 0,3 μg retinolu. [2] V prípade mliečnych krmív a produktov s tendenciou aglomerovať alebo napučiavať zdvojnásobte množstvo reagentov, uvedené v prvom a druhom odseku bodu 5.2. [3] Ak hydrolýza prebieha v atmosfére dusíka, tak potom netreba pridávať askorban sodný. [4] Obsah karoténu sa dá merať stanovením optickej hustoty pri 450 nm;E1 %1 cm = 2 600. --------------------------------------------------