Rozhodnutie Komisie zo 14. apríla 1993 ustanovujúce metódy zisťovania rezíduí látok s hormonálnym účinkom a látok s tyreostatickým účinkom



Úradný vestník L 118 , 14/05/1993 S. 0064 - 0074

Fínske špeciálne vydanie: Kapitola 3 Zväzok 49 S. 0190

Švédske špeciálne vydanie: Kapitola 3 Zväzok 49 S. 0190

CS.ES Kapitola 3 Zväzok 14 S. 198 - 208

ET.ES Kapitola 3 Zväzok 14 S. 198 - 208

HU.ES Kapitola 3 Zväzok 14 S. 198 - 208

LT.ES Kapitola 3 Zväzok 14 S. 198 - 208

LV.ES Kapitola 3 Zväzok 14 S. 198 - 208

MT.ES Kapitola 3 Zväzok 14 S. 198 - 208

PL.ES Kapitola 3 Zväzok 14 S. 198 - 208

SK.ES Kapitola 3 Zväzok 14 S. 198 - 208

SL.ES Kapitola 3 Zväzok 14 S. 198 - 208



Rozhodnutie Komisie zo 14. apríla 1993 ustanovujúce metódy zisťovania rezíduí látok s hormonálnym účinkom a látok s tyreostatickým účinkom (93/256/EHS) KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV, so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho hospodárskeho spoločenstva, so zreteľom na smernicu Rady 85/358/EHS zo 16. júla 1985, ktorou sa dopĺňa smernica 81/602/EHS o zákaze niektorých látok s hormonálnym účinkom a látok s tyreostatickým účinkom [1], naposledy zmenená a doplnená smernicou 88/146/EHS [2], najmä na jej článok 5 ods. 2, keďže vyšetrenia na rezíduá musia byť podľa článku 8 ods. 1 smernice Rady 64/433/EHS z 26. júna 1964 o hygienických otázkach obchodu s čerstvým mäsom v rámci spoločenstva [3], naposledy zmenenou a doplnenou smernicou 92/5/EHS [4], podľa druhého pododseku článku 11 ods. 4 smernice Rady 85/397/EHS z 5. augusta 1985 o hygienických a veterinárnych otázkach obchodu s tepelne ošetreným mliekom v rámci spoločenstva [5], naposledy zmenenej a doplnenej smernicou 89/662/EHS [6], uskutočnená podľa schválených a vedecky uznaných metód, najmä podľa metód, ktoré sú uvedené v smerniciach spoločenstva alebo v iných medzinárodných normách; keďže stanovenie metód analýzy vzoriek zahŕňa definovanie analytických postupov, ktoré sa majú používať, pravidiel, ktoré sa majú dodržiavať pri odbere vzoriek, a kritérií, ktoré sa uplatňujú pri vykonávaní analýz; keďže prijaté analytické postupy musia byť dostatočne citlivé na zaistenie prítomnosti rezíduí látok, ktoré majú hormonálny alebo tareostatický účinok; keďže odber vzoriek predstavuje podstatnú súčasť analytickej metódy; keďže je vhodné ustanoviť pravidlá týkajúce sa odberu vzoriek; keďže vzhľadom na účely tohto rozhodnutia je potrebné vziať do úvahy kritériá uvedené v bode 1 prílohy smernice Rady 85/591/EHS z 20. decembra 1985 o zavedení metód spoločenstva pre odber vzoriek a analýzu pre sledovanie potravín určených na ľudskú spotrebu [7]; keďže z dôvodu väčšej prehľadnosti a zohľadnenia vývoje vedeckých a technických poznatkov je potrebné zrušiť rozhodnutie Komisie 87/410/EHS [8]; keďže opatrenia stanovené v tomto rozhodnutí sú v súlade so stanoviskom Stáleho veterinárneho výboru, PRIJALA TOTO ROZHODNUTIE: Článok 1 Postupy rutinnej analýzy vzoriek schválenej na zisťovanie rezíduí látok s hormonálnym účinkom a látok s tyreostatickým účinkom sú tieto: - imunologická analýza, - tenkovrstevná chromatografia, - kvapalinová chromatografia, - plynová chromatografia, - hmotnostná spektrometria, - spektrometria alebo ostatné metódy, ktoré vyhovujú kritériám porovnateľným s kritériami ustanovenými v prílohe pre predmetné. Článok 2 Odber vzoriek sa musí vykonávať podľa týchto pravidiel: 1. vzorka musí byť reprezentatívna a dostatočne veľká pre príslušnú analýzu a možné opakovanie tejto analýzy aj pri uskutočnení všetkých overovacích analýz; 2. vzorky musia byť označené takým spôsobom, aby bola kedykoľvek možná ich identifikácia; 3. metódy odberu, balenie, konzervovanie, preprava a skladovanie vzoriek musia zabezpečovať ich neporušiteľnosť a nesmú nepriaznivo ovplyvňovať výsledky vyšetrovania. Musí sa zabrániť neoprávnenému prístupu k vzorkám. Článok 3 Kritéria, ktoré sa vzťahujú na metódy rutinných vyšetrení na rezíduá látok s hormonálnym účinkom a látok s tyreostatickým účinkom, sú uvedené v prílohe. Článok 4 Toto rozhodnutie sa preskúma do 1. januára 1996 zo zreteľom na vývoj vedeckých a technických poznatkov. Článok 5 Týmto sa rozhodnutie 87/410/EHS zrušuje. Článok 6 Toto rozhodnutie je určené členským štátom. V Bruseli 14. apríla 1993 Za Komisiu René Steichen člen Komisie [1] Ú. v. ES L 191, 23.7.1985, s. 46. [2] Ú. v. ES L 70, 16.3.1988, s. 16. [3] Ú. v. ES L 121, 29.7.1964, s. 2012/64. [4] Ú. v. ES L 57, 2.3.1992, s. 1. [5] Ú. v. ES L 226, 24.8.1985, s. 13. [6] Ú. v. ES L 359, 30.12.1989, s. 13. [7] Ú. v. ES L 372, 31.12.1985, s. 50. [8] Ú. v. ES L 223, 11.8.1987, s. 18. -------------------------------------------------- PRÍLOHA 1. DEFINÍCIE A VŠEOBECNÉ POŽIADAVKY 1.1. Definície 1.1.1. Rutinné analytické metódy Rutinné analytické metódy sú analytické metódy používané členskými štátmi s cieľom zavedenia národných plánov kontroly rezíduí u jatočných zvierat a v produktoch získaných z týchto zvierat, v súlade s ustanoveniami smernice Rady 86/469/EHS [1]. Rutinné analytické metódy musia byť schválené referenčnými laboratóriami a musia zodpovedať kritériám ustanoveným v tejto prílohe. Môžu sa používať na účely vyhľadávania a/alebo zhody: - metódy používané na vyhľadávanie (screeningové metódy) sú metódy zamerané na zisťovanie prítomnosti analytov alebo triedy analytov v predpokladanej koncentrácii. Predstavujú veľkú kapacitu vyšetrení vzoriek a používajú sa priamo pri triedení veľkého počtu vzoriek potenciálne pozitívnych. Sú zamerané na vylúčenie falošných negatívnych výsledkov, - metódy používané na účely zhody (overovacie metódy) sú metódy, ktoré musia umožniť jednoznačnú identifikáciu analytu v predpokladanej koncentrácii. Tieto metódy sú zamerané na vylúčenie falošných pozitívnych výsledkov a majú iba nízku tolerovateľnú pravdepodobnosť falošne negatívnych výsledkov. 1.1.2. Analyt Analyt je zložkou analyzovanej vzorky, ktorá má byť zistená, identifikovaná a/alebo má byť stanovené jej množstvo. Výraz "analyt" zahrnuje i prípadné rozkladné produkty, ktoré vznikajú z analytu počas analýzy. Množstvo analytu môže byť vyjadrené ako: - množstvo vyjadrené hmotnostným množstvom (napríklad μg, ng) alebo - obsah vyjadrený ako hmotnostný zlomok (napríklad μg kg-1, ng kg-1), hmotnostná koncentrácia (napríklad μg l-1) alebo koncentrácia (napríklad mol l-1). 1.1.3. Vzorky 1.1.3.1. Laboratórna vzorka Vzorka pripravená k odoslaniu do laboratória a určená na skúšku alebo analýzu. 1.1.3.2. Testovacia vzorka Vzorka pripravená z laboratórnej vzorky, z ktorej má byť odobratá časť na analýzu. 1.1.3.3. Časť vzorky určená na analýzu Množstvo materiálu odobratého z testovacej vzorky (alebo z laboratórnej vzorky, ak je zároveň testovacou vzorkou), ktorá je vlastným predmetom analýzy alebo skúšky. 1.1.4. Analytický štandard Je presne stanovená látka so známym obsahom analytu, najväčšieho možného stupňa čistoty, ktorá je určená na použitie pri analýze ako referenční látka. 1.1.5. Referenčný materiál Materiál, ktorého jedna alebo viacej charakteristických vlastností boli stanovené schválenou metódou a ktorý sa môže používať na kalibráciu prístroja alebo na overenie metódy merania. 1.1.6. Slepý pokus 1.1.6.1. Analýza slepej vzorky Ide o úplný analytický postup aplikovaný na analýzu časti vzorky, ktorá neobsahuje analyt. 1.1.6.2. Slepá skúška reagencie Ide o úplný analytický postup aplikovaný bez vzorky určenej na analýzu alebo pri použití rovnakého množstva vhodného rozpúšťadla namiesto vzorky určenej na analýzu. 1.1.7. Špecifickosť Špecifickosť je schopnosť metódy odlíšiť analyt od iných látok. Táto charakteristika je v podstate zásadnou charakteristikou použitej skúšky, ale môže kolísať podľa druhu zlúčeniny alebo matrice. Informácie týkajúce sa špecifickosti musia prinajmenej vziať do úvahy všetky látky (napr. zhodné látky, obdobné látky, produkty metabolizmu príslušného rezídua), ktoré môžu stimulovať pozitívny výsledok, ak sa použije popísaný spôsob skúšania. Z informácií týkajúcich sa špecifickosti musí byť možné odvodiť kvantitatívne do akej miery metóda umožňuje v pokusných podmienkach rozlíšenie analytu od ostatných látok. 1.1.8. Správnosť V tomto rozhodnutí sa správnosťou rozumie správnosť priemeru. Definícia, ktorá sa tu použila, je ucedená v norme ISO 3534-1977 v bode 2.83 (správnosť priemeru: stupeň zhody medzi skutočnou hodnotou a priemerom získaným mnohonásobným opakovaním experimentálneho postupu). Hlavné príčiny obmedzenej správnosti sú: a) náhodné chyby; b) systémové chyby. Pri veľkom počte pokusov sa správnosť približuje systémovej chybe. Pre dokumentáciu vyhodnotenia nejakej metódy sa musí uviesť počet pokusov. Miera správnosti je rozdiel medzi priemernou hodnotou zistenou analýzou referenčného materiálu a jej skutočnou hodnotou a je vyjadrená v percentách skutočnej hodnoty. Pri absencii referenčného materiálu môžu byť zodpovedajúce parametre získané analýzou fortifikovanej vzorky. Pri absencii presne definovanej metódy a aj overeného referenčného materiálu môže byť obsah analytu definovaný pomocou výsledkov získaných použitím metódy vykazujúcej vysoký stupeň špecifickosti, správnosti a presnosti pre analyt. 1.1.9. Presnosť Vysoký stupeň zhody medzi výsledkami získanými opakovaným uskutočnením experimentálneho pokusu v predpísaných podmienkach (norma ISO 3534-1977 [2], 2.84), zahŕňajúca opakovateľnosť a reprodukovateľnosť. Opakovateľnosť: Stupeň zhody medzi výsledkami nezávislých analýz, získanými za reprodukovateľných podmienok zhody, t. j. rovnakou metódou, s rovnakým testovacím materiálom, v rovnakom laboratóriu, rovnakým analytikom, s rovnakým prístrojovým vybavením a v krátkych časových intervaloch. Reprodukovatelnosť: Stupeň zhody medzi výsledkami vyšetrení získaných za reprodukovateľných podmienok, t. j. rovnakou metódou, s rovnakým testovacím materiálom, v rôznych laboratóriách, rôznymi analytikmi s rôznym prístrojovým vybavení. V súlade s prílohou smernice Rady 85/591/EHS [3] hodnoty presnosti analytických metód – o ktorých prijatí sa uvažuje v súlade s ustanoveniami uvedenej smernice, majú vychádzať z kolaboratívnych pokusov uskutočňovaných prednostne podľa normy ISO 5725-1986 [4]. Na tento účel sú názvy "opakovateľnosť" a "reprodukovateľnosť" definované normou ISO 5725-1986. Na realizáciu týchto pokusov je vhodné používať materiál zo vzoriek, ktorých známy obsah analytu je blízky maximálnemu limitu príslušného rezídua. Kým sa laboratórnym pokusom nestanoví reprodukovateľnosť metódy, stačí, s cieľom predbežného výberu metód dokumentárnou analýzou, mať k dispozícii údaje o opakovateľnosti. Ukazovateľom používaným na posudzovanie opakovateľnosti a reprodukovateľnosti je variačný koeficient definovaný v norme ISO 3534-1977, 2.35 (variační koeficient: pomer medzi odchýlkou a absolútnou hodnotou aritmetického priemeru). 1.1.10. Detekčný limit Najmenší merateľný obsah, z ktorého je možné odvodiť prítomnosť analytu zo štatistickou významnosťou (najmenej 95 % pre nepovolené látky – pozri 1.2.6.1.). Detekčný limit sa môže vypočítať rôznymi spôsobmi: a) je možné zmerať obsah analytu najmenej 20 slepých reprezentatívnych vzorkách, detekční limit má hodnotu vychádzajúcu z priemeru merania povýšeného trikrát o smerodatnú odchýlku slepých pokusov. Poznámka 1: Je treba špecifikovať množstvo testovacieho materiálu používaného pri analýze. Poznámka 2: V prípade, ak je možné predpokladať, že na výsledky metódy môžu mať vplyv faktory ako je druh, pohlavie, vek, kŕmenie alebo iné faktory vychádzajúce zo životného prostredia, je potrebné vykonať najmenej 20 slepých pokusov pri testovaní každej homogénnej populácie, pre ktorú sa má metóda použiť; b) v prípade spektrometrických ustanovení, pri ktorých reprezentatívne slepé ustanovenia dávajú iba šum v pozadí, detekční limit sa vypočíta ako množstvo zodpovedajúce trojnásobku výšky šumu medzi vrcholmi. 1.1.11. Limit stanovenia Je to najmenšia koncentrácia analytu, pre ktorú bola metóda potvrdená špecifickou správnosťou a presnosťou. 1.1.12. Citlivosť Je miera schopnosti metódy rozlíšiť rozdiely v koncentráciách analytu. V tomto rozhodnutí je citlivosť definovaná ako strmosť kalibračnej krivky v uvažovanom rozsahu. 1.1.13. Praktickosť Je charakteristika analytické metódy, ktorá je závislá na zameraní metódy a ktorá je definovaná ukazovateľmi, ako je prácnosť a náklady. 1.1.14. Použiteľnosť Predstavuje výpočet typov vzoriek a/alebo analytov, na ktoré možno metódu použiť tak, ako je predložená, alebo s menšími modifikáciami. 1.1.15. Hodnotenie výsledkov 1.1.15.1. Pozitívny výsledok Prítomnosť analytu vo vzorke je dokázaná v súlade s analytickým postupom, ak sú splnené všeobecné kritériá a kritériá špecifikované pre jednotlivú detekčnú metódu. a) U látok s nulovou toleranciou je výsledok pozitívny, ak je analyt obsiahnutý vo vzorke identifikovaný bez akejkoľvek pochybnosti. b) U látok so stanoveným maximálnym limitom je výsledok analýzy pozitívny, ak je množstvo analytu obsiahnutého vo vzorke, zistené experimentálne (na uplatnenie korekcie na výťažnosť), vyššie ako stanovený maximálny reziduálny limit, zohľadňujúc prijateľnú pravdepodobnosť výskytu falošných pozitívnych alebo negatívnych výsledkov. 1.1.15.2. Negatívny výsledok Výsledok vyšetrení sa považuje za negatívny v súlade s analytickým postupom, ak sú splnené všeobecné a špecifické kritériá ustanovené pre použitú detekčnú metódu v prípade vhodných referenčných materiálov a slepých ustanovení a: a) v prípade látok s nulovou toleranciou, ak identita analytu nebola preukázaná bez akýchkoľvek pochybností, alebo b) v prípade látok so stanoveným maximálnym limitom, ak množstvo analytu obsiahnutého vo vzorke je nižšie ako hladina špecifikovaná v uvedenom bode 1.1.15.1 b). Poznámka: V prípade a) negatívny výsledok nepotvrdzuje, že vzorka neobsahuje analyt, a v prípade b) negatívny výsledok nepotvrdzuje, že reálny obsah analytu je nižší ako stanovený maximálny reziduálny limit. 1.1.16. Ko-chromatografia Pri tejto metóde sa purifikovaný testovací roztok pred chromatografiou rozdelí na dve frakcie: a) jedna frakcia je predmetom chromatografického vyšetrenia v pôvodnom stave; b) do druhej frakcie sa pridá štandardný analyt a táto zmes štandardného analytu a testovacieho roztoku sa chromatografuje. Množstvo pridaného štandardného analytu musí podobné odhadovanému množstvu analytu obsiahnutému v testovacom roztoku. 1.1.17. Imunogram V tomto rozhodnutí sa pod pojmem "imunogram" rozumie grafické vyjadrenie imunochemickej odozvy, vzhľadom na retenčný čas alebo objemu eluátu, získaného pri chromatografickomj oddeľovaní s imunochemickou detekciou zložiek extraktu zo vzorku. 1.2. Všeobecné požiadavky 1.2.1. Kritériá V súlade s prílohou smernice 85/591/EHS sa uvedené kritériá vzťahujú na vykonávanie analytických metód. 1.2.2. Screeningové metódy Pre screeningové metódy nemožno stanoviť pevné požiadavky. Najdôležitejším hľadiskom pri ich vykonávaní je čo najnižší výskyt falošných negatívnych výsledkov. 1.2.2.1. Musia sa stanoviť špecifikácie. 1.2.2.2. Správnosť a presnosť: Kvantifikácie nie je nevyhnutná. Podľa toho, či je použitie látky zakázané alebo povolené, môže byť screeningová metóda kvalitatívna alebo kvantitatívna. Falošné pozitívne výsledky sú akceptovateľné, ale falošné negatívne výsledky musia byť v sledovanej hladine obmedzené na minimum. 1.2.2.3. Detekčný limit: Detekčný limit musí byť primeraný účelu, ktorému má slúžiť. U látok zo stanoveným maximálnym reziduálnym limitom musí byť dostatočne nízky, aby rezíduum mohlo byť na danej hladine zistené. Pre látky, ktorých použitie je u jatočných zvierat zakázané, musí byť detekční limit čo najnižší. 1.2.2.4. Praktickosť: Je žiaduce, aby metóda umožňovala analýzu veľkého množstva vzoriek a aby náklady boli nízke. 1.2.3. Overovacie metódy 1.2.3.1. Špecifickosť: Overovacie metódy musia poskytovať, čo najviac jednoznačných informácií o chemickej štruktúre analytu. Ak viac zložiek dáva rovnakú odpoveď, potom metóda neumožňuje stanovenie rozdielov medzi týmito zložkami. Metódy založené iba na chromatografickej analýze bez použitia molekulárnej spektrometrickej detekcie nie sú vhodné ako overovacie metódy. Ak jednotlivé technika nemá dostatočnú špecifickosť, požadovaná špecifickosť sa môže dosiahnuť pomocou analytického postupu pozostávajúceho z vhodných kombinácií purifikácie, chromatografickej(-ých) separácie(-í) a spektrometrickej detekcii alebo imunochemickej detekcii; napríklad: GC-MS, LC-MS, IAC/GC-MS, GC-IR,LC-IR, LC/IMG. 1.2.3.2. Správnosť: V prípade opakovania analýz referenčného materiálu odchýlka medzi experimentálne stanoveným priemerom a skutočnou hodnotou (pri eventuálnej aplikácii opráv vyžadovaných pre výťažnosť) musí vychádzať z týchto hodnôt: Skutočná hodnota | Rozmedzie | ≤ 1 μg kg-1 | –50 % až +20 % | > 1 μg kg-1 až 10 μg kg-1 | –30 % až +10 % | > 10 μg kg-1 | –20 % až +10 % | 1.2.3.3. Presnosť: V prípade opakovania analýz referenčného materiálu za podmienok reprodukovateľnosti sú charakteristické hodnoty medzilaboratórneho variačného koeficientu (CV) – vypočítané v súlade s rovnicou podľa Horowitze [(CV( %) = 2(1-0,5 log C), kde C je obsah vyjadrený v mocninách 10] – takto: Obsah | CV | 1 μg kg-1 | 45 % | 10 μg kg-1 | 32 % | 100 μg kg-1 | 23 % | 1 μg kg-1 | 16 % | Pre analýzy vykonávané za reprodukovateľných podmienok sa medzilaboratórne CV musí celkovo nachádzať medzi polovicou a dvoma tretinami uvedených hodnôt. 1.2.3.4. Detekčný limit: Zodpovedajúci účelu, ktorému má slúžiť (pozri 1.2.6.1.). 1.2.3.5. Limit rozlíšenia: Zodpovedajúci účelu, ktorému má slúžiť (pozri 1.2.6.2.). 1.2.3.6. Citlivosť: Zodpovedajúca účelu, ktorému má slúžiť. 1.2.3.7. Praktickosť: Rýchlosť a náklady sú menej dôležité ako u screeningových metód. Pre overovacie metódy je väčšina aspektov praktickosti menej dôležitá v porovnaní s inými kritériami definovanými v tomto rozhodnutí. Všeobecne postačuje, aby požadované reagencie a vybavení boli k dispozícii. 1.2.4. Kalibrační krivky Ak závisí použitá metóda na kalibračnej krivke, je treba uviesť tieto informácie: - matematický vzorec, ktorý popisuje kalibrační krivku, - prípustné rozmedzie, v ktorom môžu parametre kalibračnej krivky od dňa ku dnu kolísať, - pracovnú zónu kalibračnej krivky. Kedykoľvek je to možné, majú byť na kontrolu kvality kalibračných kriviek overovacích metód používané vhodné vnútorné normy a referenčné materiály a majú byť uvedené detaily o odchýlkach premenných veličín aspoň pre pracovnú oblasť kalibračnej krivky. 1.2.5. Citlivosť na interferenciu 1.2.5.1. Pre všetky experimentálne podmienky, ktoré sa v praxi môžu meniť (napr. stabilita reagencií, zloženie vzoriek, pH, teplota), je potrebné uvádzať všetky zmeny, ktoré môžu ovplyvniť výsledky analýzy. Popis metódy musí obsahovať spôsoby na prekonanie predpokladaných interferencií. Ak je to potrebné, uvedú sa alternatívne detekčné princípy, vhodné na overovanie. 1.2.5.2. Pri kochromatografii sa musí získať iba jeden stupeň, výška (nebo plocha) stupňa zodpovedá množstvu pridaného analytu. V prípade GC nebo LC šírka stupňa v polovici maximálnej výšky musí byť v rozsahu medzi 90 % a 110 % pôvodnej šírky a retenčné časy musia byť rovnaké s toleranciou 5 %. Pre metódy TLC musí byť predpokladaná škvrna analytu iba zosilnená; nesmie sa objaviť nová škvrna a jej vzhľad sa nesmie meniť. 1.2.5.3. Je dôležité, aby sa sledovali všetky interferencie, ktoré môžu byť vyvolané zložkami matrice. 1.2.6. Vzťah medzi povolenými hladinami rezíduí a analytickými limitmi 1.2.6.1. Pre látky, ktorých podávanie je u jatočných zvierat zakázané, musí byť detekčný limit analytickej metódy dostatočne nízky, aby hladiny rezíduí, ktoré sa môžu vyskytnúť po používaní zakázaných látok, boli zistené s pravdepodobnosťou najmenej 95 %. 1.2.6.2. Pre látky s určeným maximálnym limitom rezídua nesmie limit stanovenej metódy, zvýšený trikrát o štandardnú odchýlku, ktorú metóda vykazuje pre zodpovedajúcu vzorku s maximálnym reziduálnym limitom, presahovať tento stanovený maximálny limit rezídua. 1.2.6.3. Pre látky zo stanoveným maximálnym limitom rezídua musí byť metóda potvrdená pre výšku limitu, pre polovicu a pre dvojnásobok výške tohto limitu. 2. KRITÉRIÁ PRE IDENTIFIKÁCIU A KVANTIFIKÁCIU REZÍDUA 2.1. Všeobecné požiadavky Laboratórne vykonávané analýzy s cieľom konečného potvrdenia prítomnosti rezíduí organických látok s nízkymi molekulárnymi hmotnosťami musia zabezpečiť, aby kritériá pre hodnotenie výsledkov boli dodržané v súlade s požiadavkami uvedenými v tomto oddiele. Kritériá sú určené k identifikácii analytu a zabráneniu vzniku falošných pozitívnych výsledkov. K získaniu presvedčivých záverov je nevyhnutné, aby analytické výsledky spĺňali kritériá formulované pre príslušný analytický postup. 2.2. Všeobecné poznámky k analytickej metóde 2.2.1. Príprava vzorky Vzorka musí byť získaná, ošetrovaná a spracovaná takým spôsobom, aby možnosti zistenia analytu, ak je prítomný, boli čo najväčšie. 2.2.2. Citlivosť na interferenciu Musí byť k dispozícii informácie uvedenej v bode 1.2.5 (Citlivosť na interferenciu) 2.2.3. Všeobecné kritériá týkajúce sa postupu 2.2.3.1. Musia byť známe informácie o špecifickosti (1.1.7), detekčnom limite (1.1.10) a limite ustanovení (1.1.11) metódy použiteľné pre analyt obsiahnutý vo vyšetrovanej vzorke. Poznámka: Tieto informácie sa môžu získať z experimentálnych údajov a/alebo z teoretických úvah. 2.2.3.2. Aby sa mohol získať pozitívny výsledok, nesmú sa fyzikálne a chemické vlastnosti analytov líšiť v priebehu analýzy od zodpovedajúceho štandardného analytu pridaného do danej vzorky. 2.2.3.3. Pozitívny alebo negatívny výsledok analýzy je platný iba v rozsahu špecifickosti, detekčného limitu a limitu nastanoviteľnosti metódy pre analyt a analyzovanú vzorku. 2.2.3.4. Referenčný alebo fortifikovaný materiál, obsahujúci známe množstvo analytu, sa musí analyzovať rovnakou metódou a súčasne s každou skupinou analyzovaných vzoriek. Alternatívne sa môže pridať do analyzovaných vzoriek vnútorný štandard. 2.2.4. Kritériá pre fyzikálne a/alebo chemické zvýšenie koncentrácie, purifikácie, extrakcie a separácie. 2.2.4.1. Analyt musí byť vo frakcii zodpovedajúcej štandardnému analytu v zodpovedajúcej vzorke, a to za rovnakých experimentálnych podmienok. 2.2.4.2. Hodnoty retenčného času noriem, kontrolných vzoriek a testovaných vzoriek sa musia uviesť súčasne s konečným výsledkom, pozitívnym alebo negatívnym. 2.2.5. Kritériá pre stanovenie množstva 2.2.5.1. Výťažnosť musí byť stanovená a špecifikovaná pre všetky kvantitatívne merania. 2.2.5.2. Vnútrolaboratórna variabilita vyťaženosti musí byť čo najmenšia. 2.2.5.3. Musí byť jasne uvedené, či konečné výsledky boli alebo neboli upravené vo vzťahu k výťažnosti. Ak boli upravené, musí sa uviesť použitá korekčná metóda. 2.3. Kritériá pre analytické metódy, ktoré sa môžu použiť na overovacie účely iba v kombinácii s inými metódami. 2.3.1. Požiadavky na stanovenie analytu metódou IA 2.3.1.1. Je potrebné špecifikovať pracovnú zónu kalibračnej krivky, ktorá musí vo všeobecnosti pokrývať interval najmenej jednej dekády. 2.3.1.2. Požaduje sa, aby bolo k dispozícii najmenej šesť kalibračných bodov, rozmiestnených primerane po celej dĺžke kalibračnej krivky. 2.3.1.3. Primerané kvalitatívne kontrolné parametre musia byť v súlade s uvedenými parametrami, napr.: NSB a parametre kalibračnej krivky. 2.3.1.4. Kontrolné vzorky musia byť zaradené do každého pokusu. Hladiny koncentrácií: nulová a nižšia, stredné a vyššie časti pracovného rozsahu. Výsledky týchto pokusov sa musia zhodovať s výsledkami predchádzajúcich pokusov. Všetky približné hodnoty týkajúce sa kontrolných a testovacích vzoriek musia byť uvedené súčasne s konečným výsledkom, pozitívnym alebo negatívnym. 2.3.2. Kritériá pre stanovení analytu metódou GC alebo LC s nešpecifickou detekciou 2.3.2.1. Analyt musí byť vylúhovaný v retenčnom čase, ktorý je charakteristický pre zodpovedajúcu analytickú normu, za rovnakých podmienok. 2.3.2.2. Maximum najbližšieho stupňa na chromatografe musí byť oddelené od stupňa analytu vzdialenosťou najmenej rovnej celkovej šírke v 10 % v maximálnej výške. 2.3.2.3. K získaniu ďalších informácií možno využiť kochromatografiu a chromatografiu za použitia najmenej dvoch stĺpcov s rozdielnou polaritou. 2.3.3. Kritéria pre stanovení analytu metódou TLC 2.3.3.1. Hodnota (alebo hodnoty) Rf analytu musí zodpovedať charakteristickej hodnote (alebo charakteristickým hodnotám) Rf analytickej normy. Táto požiadavka je splnená, ak sa hodnota (alebo hodnoty) Rf analytu nachádzajú v rozmedzí ± 3 % hodnoty (alebo hodnôt) Rf analytickej normy za rovnakých experimentálnych podmienok. 2.3.3.2. Analyt sa nesmie vzhľadom odlišovať od analytickej normy. 2.3.3.3. Stred škvrny, ktorá je najbližšie k škvrne prislúchajúcej analytu, musí byť od tejto škvrny oddelený na vzdialenosť zodpovedajúcu najmenej polovici súčtu priemeru škvŕn. 2.3.3.4. Kochromatografie a/alebo dvojrozmerná TLC sa môže používať na získanie doplnkových informácií. 2.4. Kritériá pre analytické metódy, ktoré sa môžu použiť na overovacie účely 2.4.1. Kritériá pre stanovenie analytu metódou LC/IA nebo LC/IMG 2.4.1.1. Pre metódu LC/IMG má byť stupeň analytu v IMG zložený najmenej z piatich frakcií pre metódu LC. 2.4.1.2. Kritéria uvedené v bode 2.2.4.1 a 2.2.4.2 musí byť dodržané. 2.4.1.3. Reagencie Pôvod a vlastnosti protilátok a ostatných reagencií musí byť špecifikovaný. 2.4.1.4. Kalibrační krivka Ak je metóda závislá na kalibračnej krivke, musia sa stanoviť údaje uvedené v bode 1.2.4 (kalibrační krivka). Požiadavky na akosť pre metódu IA (2.3.1.1 až 2.3.1.4) musia byť splnené. 2.4.1.5. Ak metóda vykonávaná s cieľom overenia nie je používaná v kombinácii s inými metódami, musia sa uskutočniť dve rôzne oddelenia LC alebo dve imunogramy s použitím protilátok, ktoré majú rozdielnu špecifickosť. 2.4.2. Kritéria pre stanovenie analytu metódou LC-SP 2.4.2.1. Kritéria uvedená v 2.3.2.1 a 2.3.2.2 musia byť splnené. 2.4.2.2. Vlnová dĺžka maximálnej absorpcie vo spektre musí byť identická s vlnovou dĺžkou pre analytickú normu, so šírkou pásma zistenou detekčným systémom. Na detekciu metódou diódového poľa je táto hodnota typicky v rozpätí ± 2 nm. 2.4.2.3. Spektrum analytu nad 220 nm nesmie byť viditeľné rozdielne od spektra analytickej normy v týchto častiach obidvoch spektier s relatívnou absorbciou rovnajúcou sa 10 % alebo vyššou. Toto kritérium je splnené, ak sú prítomné rovnaké maximá a ak pri rozdiele sa nezistil žiadny bod v rozpätí vyššom ako 10 % absorpcie analytickej normy. 2.4.2.4. Ak metóda uskutočňovaná s cieľom overenia nie je používaná v kombinácii s inými metódami, musí sa povinne vykonať kochromatografia vo fáze LC. Pozri 1.2.5.2, kde sú uvedené požiadavky, ktoré sa musia splniť pri kochromatografii. 2.4.3. Kritériá pre stanovenie analytu metódou TLC-SP 2.4.3.1. Metóda musí spĺňať kritériá stanovené pre TLC (2.3.3.1 až 2.3.3.3). 2.4.3.2. Absorpčné maximum spektra analytu musí mať rovnakú vlnovú dĺžku ako analytická norma v rozpätí stanoveným daným detekčným systémom. 2.4.3.3. Spektrum analytu nesmie byť viditeľne rozlíšené od spektra analytickej normy. 2.4.3.4. Ak metóda uskutočňovaná s cieľom overenia nie je používaná v kombinácii s inými metódami, musí sa povinne vykonať kochromatografia vo fáze TLC. Pozri 1.2.5.2, kde sú uvedené požiadavky, ktoré musia byť dodržané pri kochromatografii. 2.4.4. Kritéria pre stanovenie analytu metódou GC-MS 2.4.4.1. Kritéria, ktoré sa vzťahujú na metódu GC 2.4.4.1.1. Musia byť splnené kritériá uvedené v 2.3.2.1 a 2.3.2.2. 2.4.4.1.2. Ak je k dispozícii vhodný materiál, musí sa použiť ako vnútorná norma. Prednostne to má byť analyt označený stabilným izotopom alebo, ak to nie je možné, podobná norma, ktorá má retenčný čas analytu. 2.4.4.1.3. Pomer medzi retenčným časom analytu u metódy GC a retenčným časom vnútornej normy, t. j. relatívny retenčný čas analytu, musí byť rovnaký ako u analytickej normy vo vhodnej matrici, v rozpätí ± 0,5 %. 2.4.4.1.4. Ak je metóda uskutočňovaná s cieľom overenia a ak sa nepoužíva žiadny vnútorná norma, musí byť identifikácia analytu potvrdená kochromatografiou. 2.4.4.2. Kritéria, ktoré sa vzťahujú na metódu LRMS 2.4.4.2.1. Na účely screeningu je potrebné merať prinajmenšom intenzitu diagnostického iónu, ktorého je najviac. 2.4.4.2.2. Na overovacie účely je nevyhnutné, aby sa merala intenzita najmenej štyroch diagnostických iónov. Ak pri používanej metóde analyt neposkytne 4 diagnostické ióny, vykoná sa identifikácia na základe výsledkov najmenej dvoch nezávislých metód GC-LRMS, založených na rôznych derivatizáciách alebo technikách ionizácie, každá z nich poskytne dva alebo tri diagnostické ióny. Molekulárnym iónom musí byť prednostne niektorý z vybraných diagnostických iónov. 2.4.4.2.3. Relatívne prebytky všetkých diagnostických iónov pochádzajúcich z analytu musia byť rovnocenné týmto iónom z analytickej normy v rozpätí ± 10 % (mód IE) alebo v rozpätí ± 20 % (mód IC). 2.4.5. Kritériá pre identifikáciu analytu metódou IR 2.4.5.1. Definícia adekvátnych stupňov Adekvátne stupne sú absorpčné maximá v infračervenom spektre štandardného analytu, ktorý spĺňa tieto podmienky. 2.4.5.1.1. Maximum absorpcie je v rozpätí vlnových dĺžok od 1800 do 500 cm-1. 2.4.5.1.2. Intenzita absorpcie nie je menšia ako: a) špecifická molárna absorbcia 40 vzhľadom k nulovej absorpcii a špecifická molárna absorpcia 20 vzhľadom k základnej línii stupňa, alebo b) relatívna absorpcia 12,5 % absorpcia najintenzívnejšieho stupňa v oblasti 1800 – 500 cm-1, keď sú obidva merané vo vzťahu k nulovej absorpcii, 5 % absorpcie najintenzívnejšieho stupňa v oblasti 1800 – 500 cm-1, keď sú obidva merané vzhľadom na základnú líniu ich stupňov. Poznámka: Aj keď primerané stupne podľa písm. a) sú uprednostňované z teoretického hľadiska, stupne podľa písm. b) je možné ľahšie stanoviť v praxi. 2.4.5.2. Stanoví sa počet stupňov v infračervenom spektre analytu, ktorých frekvencie zodpovedajú primeranému stupňu v spektre analytickej normy, v rozpätí približne ± 1 cm-1. 2.4.5.3. Kritéria, ktoré sa vzťahujú na metódu IR 2.4.5.3.1. Absorpcia musí byť zrejmá vo všetkých oblastiach spektra analytu, ktoré zodpovedá primeranému stupňu v referenčnom spektre štandardného analytu. 2.4.5.3.2. Požaduje sa najmenej šesť primeraných stupňov v infračervenom spektre štandardného analytu. Ak je menej ako šesť primeraných stupňov, potom príslušné infračervené spektrum nesmie byť použité ako referenčné spektrum. 2.4.5.3.3. "Výsledok", t. j. počet percent zodpovedajúcich stupňom nájdených v infračervenom spektre analytu, musí byť najmenej 50 %. 2.4.5.3.4. Ak nie je presná zhoda pre primeraný stupeň, musí byť vhodná oblasť spektra analytu zhodná so stupňom rovnakej úrovne. 2.4.5.3.5. Postup je použiteľný iba pre absorpčné stupne v spektre vzoriek, ktoré majú intenzitu najmenej trikrát vyššiu ako šum v pozadí. 2.5. Iné analytické metódy Iné analytické metódy alebo kombinácia analytických metód iných ako tých, ktoré sú uvedené v oddiele 2.3 a 2.4 (napr.: LC-MS, MS-MS, GC-IR), sa môžu používať na screeningové alebo overovacie účely, pokiaľ zodpovedajú porovnateľným kritériám umožňujúcim jednoznačnú identifikáciu analytu v zisťovanej oblasti koncentrácie. [1] Ú. v. ES L 275, 26.9.1986, s. 36. [2] Medzinárodná organizácia pre štandardizáciu: Štatistika – názvoslovie a symboly. [3] Ú. v. ES L 372, 31.12.1985, s. 50. [4] Medzinárodná organizácia pre štandardizáciu: presnosť metód pokusiv – Stanovenie opakovateľnosti a reprodukovateľnosti pre štandardnú metódu pokusov medzilaboratórnych testov. --------------------------------------------------