6.

Príloha VII sa nahrádza týmto textom: „PRÍLOHA VII STANOVENIE PERCENTUÁLNEHO OBSAHU 2-GLYCERIL MONOPALMITÁTU 1. ÚČEL A OBLASŤ POUŽITIA Touto metódou sa popisuje analytický postup na stanovenie percentuálneho obsahu kyseliny palmitovej v pozícii 2 triglyceridov prostredníctvom hodnotenia 2-glyceril monopalmitátu. Táto metóda je použiteľná na tekuté rastlinné oleje pri temperovanej okolitej teplote (20 °C). 2. PRINCÍP Po príprave sa vzorka oleja podrobí procesu pankreatickej lipázy: čiastočná a špecifická hydrolýza v pozíciách 1 a 3 molekuly triglyceridu vyvolá objavenie sa monoglyceridov v pozícii 2. Percentuálny obsah 2-glyceril monopalmitátu v monoglyceridovej frakcii sa stanovuje po silanizácii kapilárnou plynovou chromatografiou. 3. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE A BEŽNÝ LABORATÓRNY MATERIÁL 3.1. 25 ml Erlenmeyerova banka 3.2. 100, 250 a 300 ml kadičky 3.3. Sklená kolóna na chromatografiu, s vnútorným priemerom 21 – 23 mm, dĺžkou 400 mm, vybavená fritovým kotúčom a kohútikom 3.4. Odmerné valce s objemom 10, 50, 100 a 200 ml 3.5. 100 a 250 ml banky 3.6. Rotačná odparka 3.7. 10 ml centrifugačná skúmavka s kónickým dnom so zábrusovou zátkou 3.8. Odstredivka pre 10 a 100 ml skúmavky 3.9. Termostat s možnosťou udržiavania teploty na 40 °C ± 0,5 °C 3.10. Odmerné pipety s objemom 1 a 2 ml 3.11. 1 ml podkožná striekačka 3.12. 100 μl mikrostriekačka 3.13. 1 000 ml lievik 3.14. Plynový chromatograf pre kapilárne kolóny, vybavený injekčným systémom ‚on column’ za studena na priame zavedenie vzorky do kolóny a pecou umožňujúcou udržiavať nastavenú teplotu s presnosťou na 1 °C 3.15. Studený injektor ‚on column’ na priame zavedenie vzorky do kolóny 3.16. Plameňovoionizačný detektor a elektrometer 3.17. Zapisovač-integrátor prispôsobený elektrometru s rýchlosťou odozvy najviac 1 sekundu a s meniteľnou rýchlosťou posunu papiera 3.18. Kapilárna kolóna sklená alebo silikagélová, s dĺžkou 8 až 12 metrov, vnútorným priemerom 0,25 až 0,32 mm, pokrytá metylpolysiloxánom alebo 5 % fenyl metylpolysiloxánom, s hrúbkou 0,10 – 0,30 μm, použiteľná pri teplote 370 °C 3.19. 10 μl mikrostriekačka vybavená cementovou ihlou dlhou aspoň 7,5 cm na priame vstreknutie na kolónu. 4. ČINIDLÁ 4.1. Silikagél s granulometriou medzi 0,063 a 0,200 mm (70/280 mesh) pripravený takto: Silikagél vložte do porcelánovej kapsule, sušte aspoň štyri hodiny v peci pri teplote 160 °C. Nechajte vychladnúť v exsikátore pri temperovanej teplote. Pridajte objem vody, ktorý zodpovedá 5 % hmotnosti silikagélu, takto: odvážte 152 g silikagélu do Erlenmeyerovej banky, pridajte 8 g destilovanej vody, zazátkujte a jemne pretrepte, aby sa voda rovnomerne rozdelila. Pred použitím nechajte aspoň 12 hodín stáť. 4.2. n-hexán (na chromatografiu) 4.3. Izopropanol 4.4. Izopropanol, vodný roztok v objemovom pomere 1/1 4.5. Pankreatická lipáza. Použitá lipáza má mať aktivitu medzi 2,0 a 10 jednotkami lipázy na mg (V obchodnej sieti dostať pankreatické lipázy s aktivitou medzi 2 a 10 jednotkami na mg enzýmu.) 4.6. Tlmiaci roztok tri-hydroxy-metylaminometánu: vodný roztok 1 M upravený až na pH = 8 (kontrolované potenciometrom) pridaním koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej (v objemovom pomere 1/1) 4.7. Cholát sodný enzymatickej kvality, 0,1 % vodný roztok (tento roztok sa musí použiť do 15 dní od jeho prípravy) 4.8. Chlorid vápenatý, 22 % vodný roztok 4.9. Dietyléter na chromatografiu 4.10. Vyvíjacie rozpúšťadlo: zmes n-hexánu/dietyléteru (v objemovom pomere 87/13) 4.11. 12 % hmotnostných roztoku hydroxidu sodného 4.12. Fenolftaleín, 1 % roztok v etanole 4.13. Nosný plyn: vodík alebo hélium na plynovú chromatografiu 4.14. Pomocné plyny: vodík, minimálne 99 %, zbavený vlhkosti a organických látok – a vzduch rovnakej čistoty na plynovú chromatografiu 4.15. Činidlá na silanizáciu: zmes pyridínu/hexametyldisilazánu, trimetylchlórsilánu v objemovom pomere 9/3/1 (Hotové roztoky dostať v obchodnej sieti. Na silanizáciu sa môžu použiť aj ďalšie činidlá, konkrétne bis-trimetylsilyl trifluóracetamid + 1 % trimetylchlorosilán, zriedené rovnakým objemom bezvodého pyridínu.) 4.16. Referenčné vzorky: čisté monoglyceridy alebo zmesi monoglyceridov so známym percentuálnym zložením podobným vzorke. 5. POSTUP 5.1. Príprava vzorky 5.1.1. Oleje s obsahom voľných kyselín menej ako 3 % sa nemusia pred chromatografiou na silikagélovej kolóne neutralizovať. Oleje s obsahom voľných kyselín viac ako 3 % sa musia neutralizovať v súlade s bodom 5.1.1.1. 5.1.1.1. Do 1 000 ml lievika (3.13) dajte 50 g oleja a 200 ml n-hexánu. Pridajte 100 ml izopropanolu a taký objem roztoku 12 % hydroxidu sodného (4.11), aký zodpovedá obsahu voľných kyselín v oleji s 5 % navýšením. Dôkladne pretrepávajte počas 1 minúty. Pridajte 100 ml destilovanej vody, znova pretrepte a nechajte stáť. Po dekantácii eliminujte spodnú vrstvu obsahujúcu mydlá. Eliminujte prípadné stredné vrstvy (sliz a nerozpustné látky). Premyte hexánový roztok neutralizovaného oleja postupnými dávkami 50 – 60 ml roztoku izopropanolu/vody v objemovom pomere 1/1 (4.4) až do vymiznutia ružového sfarbenia fenolftaleínu. Eliminujte najväčšiu časť hexánu vákuovou destiláciou (napríklad s použitím rotačnej odparky) a preneste olej do 100 ml banky (3.5). Vysúšajte olej vo vákuu až do úplnej eliminácie rozpúšťadla. Po skončení tejto procedúry má byť acidita oleja nižšia ako 0,5 %. 5.1.2. Vložte 1,0 g oleja pripraveného podľa vyššie uvedených indikácií do 25 ml (3.1) Erlenmeyerovej banky a rozpustite v 10 ml vyvíjacej zmesi (4.10). Nechajte roztok postáť aspoň 15 minút pred chromatografiou na silikagélovej kolóne. Ak je roztok zakalený, odstreďte ho, aby boli zabezpečené optimálne podmienky na chromatografiu. (Môžu sa použiť aj už hotové 500 g silikagélové patróny SPE – na extrakciu na tuhých fázach). 5.1.3. Príprava chromatografickej kolóny Nalejte do kolóny (3.3) približne 30 ml vyvíjacieho rozpúšťadla (4.10), pomocou sklenenej tyčinky vložte do spodnej časti kolóny kúsok bavlny; stlačte, aby sa odstránil vzduch. V kadičke pripravte suspenziu z 25 g silikagélu (4.1) v približne 80 ml vyvíjacieho rozpúšťadla a pomocou lievika ju vlejte do kolóny. Skontrolujte, či bol do kolóny zavedený všetok silikagél; premyte vyvíjacím rozpúšťadlom (4.10), otvorte kohútik a nechajte, aby hladina tekutiny dosiahla približne 2 mm nad vrchnou úrovňou silikagélu. 5.1.4. Chromatografia na kolóne Do 25 ml Erlenmeyerovej banky (3.1) odvážte presne 1,0 g vzorky pripravenej podľa bodu 5.1. Rozpustite vzorku v 10 ml vyvíjacieho roztoku (4.10). Nalejte roztok do chromatografickej kolóny pripravenej podľa bodu 5.1.3. Nepohnite povrchom kolóny. Otvorte kohútik a nechajte roztok vzorky tiecť, až kým nedosiahne úroveň silikagélu. Vyvíjajte so 150 ml vyvíjacieho rozpúšťadla. Upravte prietok na 2 ml/min (tak, aby 150 ml pretieklo do kolóny približne za 60 – 70 minút). Odoberte eluát do 250 ml banky, ktorú ste predtým odvážili. Odparte rozpúšťadlo vo vákuu a odstráňte jeho posledné stopy pod prúdom dusíka. Odvážte banku a vypočítajte množstvo získaného extrátu. [V prípade použitia už hotových silikagélových patrónov SPE postupujte takto: zaveďte 1 ml roztoku (5.1.2) do vopred pripravených patrónov s 3 ml n-hexánu.] Po perkolovaní roztoku vyvíjajte so 4 ml n-hexánu/dietyléteru v objemovom pomere 9/1. Odoberte eluát do 10 ml skúmavky a odparujte pod prúdom dusíka až do vysušenia. Suché rezíduum podrobte pankreatickej lipáze (5.2). Základom je overiť zloženie mastných kyselín pred a po prechode patrónom SPE. 5.2. Hydrolýza pankreatickou lipázou 5.2.1. Do centrifugačnej skúmavky odvážte 0,1 g oleja pripraveného podľa bodu 5.1. Pridajte 2 ml tlmiaceho roztoku (4.6), 0,5 ml roztoku cholátu sodného (4.7) a 0,2 ml roztoku chloridu vápenatého, pričom po každom pridaní riadne pretrepte. Uzatvorte skúmavku zábrusovou zátkou a umiestnite ju do termostatu pri teplote 40 ± 0,5 °C. 5.2.2. Pridajte 20 mg lipázy, opatrne pretrepte (tak, aby ste nezmáčali zátku) a dajte skúmavku do termostatu presne na 2 minúty, potom ju vyberte, počas 1 minúty dôkladne pretrepávajte a nechajte vychladnúť. 5.2.3. Pridajte 1 ml dietyléteru, zazátkujte a dôkladne pretrepte, potom odstreďte a pomocou mikrostriekačky preneste éterový roztok do čistej a suchej skúmavky. 5.3. Príprava silanizovaných derivátov a plynová chromatografia 5.3.1. Pomocou mikrostriekačky zaveďte 100 μl roztoku (5.2.3) do 10 ml skúmavky s kónickým dnom. 5.3.2. Eliminujte rozpúšťadlo pod miernym prúdom dusíka, pridajte 200 μl činidla na silanizáciu (4.15), uzavrite skúmavku a nechajte 20 minút odstáť. 5.3.3. Po 20 minútach pridajte 1 až 5 ml n-hexánu (v závislosti od chromatografických podmienok): výsledný roztok je pripravený na plynovú chromatografiu. 5.4. Plynová chromatografia Hlavné operačné podmienky sú tieto: — teplota injektora (injektor ‚on column’) nižšia ako teplota varu rozpúšťadla (68 °C), — teplota detektora: 350 °C, — teplota kolóny: nastavenie teploty pece: 60 °C počas 1 minúty, každú minútu zvýšte o 15 °C až do dosiahnutia 180 °C, potom o 5 °C za minútu až do 340 °C, ďalej udržiavajte 340 °C počas 13 minút, — nosný plyn: vodík alebo hélium nastavené na lineárnu rýchlosť adekvátnu na dosiahnutie rozlíšenia znázorneného na obrázku 1. Retenčný čas triglyceridu C54 má byť 40 ± 5 minút (pozri obrázok 2). (Vyššie uvedené podmienky postupu sa uvádzajú len orientačne. Každý subjekt ich musí optimalizovať s cieľom dosiahnuť požadované rozlíšenie. Výška píku zodpovedajúca 2-glyceril monopalmitátu musí dosiahnuť aspoň 10 % rozsahu stupnice zapisovača.), — Množstvo vstreknutej látky: 0,5 – 1 μl roztoku (5 ml) n-hexánu (5.3.3). 5.4.1. Identifikácia píkov Jednotlivé monoglyceridy sa identifikujú v závislosti od získaných retenčných časov a vzhľadom na tie, ktoré boli získané so štandardami zmesí monoglyceridov analyzovaných pri rovnakých podmienkach. 5.4.2. Kvantitatívne hodnotenie Plocha každého píku sa vypočíta pomocou elektronického integrátora. 6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV Percentuálny obsah glyceryl monopalmitátu sa vypočíta na základe vzťahu medzi plochou zodpovedajúceho píku a súčtom plôch píkov všetkých monoglyceridov (pozri obrázok 2) podľa vzorca: glycéryl monopalmitate (%): kde: Ax = plocha píku, ktorý zodpovedá glyceril monopalmitátu, ΣA = súčet plôch všetkých píkov, ktoré zodpovedajú monoglyceridom. Výsledok sa uvádza s presnosťou na jedno desatinné miesto. 7. SPRÁVA O ANALÝZE V správe z analýzy sa má konkrétne uviesť: — odkaz na túto metódu, — všetky údaje potrebné na úplnú identifikáciu vzorky, — výsledok analýzy, — každé odklonenie sa od tejto metódy, či už vplyvom rozhodnutia dotknutých strán alebo z iného dôvodu, — podrobné identifikačné údaje o laboratóriu, dátum uskutočnenia analýzy a podpis zodpovedných za analýzu. Obrázok 1 Chromatogram výsledných produktov reakcie silanizácie, ktoré sa získali lipázou na rafinovanom olivovom oleji s pridaním 20 % esterifikovaného oleja (100 %) Obrázok 2 Chromatogram: A) neesterifikovaného olivového oleja, po lipáze; po silanizácii; za týchto podmienok (kapilárna kolóna 8 – 12 m) je vosková frakcia eluovaná v rovnakom čase ako frakcia diglyceridu alebo krátko potom. Po lipáze by obsah triglyceridov nemal prekročiť 15 %. Chromatogram: B) esterifikovaného oleja po lipáze; po silanizácii; za týchto podmienok (kapilárna kolóna 8 – 12 m) je vosková frakcia eluovaná v rovnakom čase ako frakcia diglyceridu alebo krátko potom. Po lipáze by obsah triglyceridov nemal prekročiť 15 %. 8. POZNÁMKY Poznámka 1 PRÍPRAVA LIPÁZY V obchodnej sieti sú k dispozícii lipázy s dostatočnou aktivitou. V laboratóriu sa tiež dajú pripraviť takto: 5 kg čerstvých pankreasov z ošípaných ochlaďte na 0 °C. Odstráňte tuhý okolitý tuk a spojivové tkanivo a rozomeľte v mlynčeku s lamelami tak, aby ste získali tekutú hmotu. Pretrepávajte túto hmotu 4 až 6 hodín spolu s 2,5 litra bezvodého acetónu a potom odstreďte. Ešte trikrát extrahujte zvyšok s rovnakým objemom bezvodého acetónu, potom ďalších dvakrát so zmesou acetónu/dietyléteru v objemovom pomere (1/1) a dvakrát s dietyléterom. Sušte zvyšok 48 hodín vo vákuu, aby ste získali stabilný prášok, ktorý bude dlhodobo uskladniteľný v chladničke chránený pred vlhkosťou. Poznámka 2 KONTROLA AKTIVITY LIPÁZY Pripravte emulziu olivového oleja takto: Počas 10 minút pretrepávajte v miešači zmes zloženú zo 165 ml roztoku arabskej gumy s koncentráciou 100g/l, 15 g roztlčeného ľadu a 20 ml vopred zneutralizovaného oleja. Postupne zaveďte do 50 ml banky 10 ml tejto emulzie, ďalej 0,3 ml roztoku cholátu sodného s koncentráciou 0,2 g/ml a 20 ml destilovanej vody. Umiestnite banku do termostatu nastaveného na 37 °C; zaveďte elektródy pH-metra a špirálové miešadlo. Pomocou byrety pridávajte po kvapkách roztok hydroxidu sodného 0,1 N, až kým nedosiahnete pH 8,3. Pridajte objem suspenzie prášku lipázy vo vode (0,1 g/ml lipázy). Keď pH-meter ukáže pH 8,3, uveďte chronometer do činnosti a pridávajte po kvapkách roztok hydroxidu sodného takým tempom, aby sa hodnota pH udržiavala na 8,3. Zaznamenajte každú minútu objem spotrebovaného roztoku. Preneste údaje do grafového systému súradníc tak, že os nezávisle premenných (x-ová os) ponesie časové údaje a na osi závisle premenných (y-ová os) uvediete počet mililitrov alkalického roztoku 0,1 N spotrebovaného na udržanie konštantného pH. Mali by ste získať lineárny graf. Aktivita lipázy meraná v jednotkách lipázy na mg sa vypočíta na základe vzorca: kde: A je aktivita vyjadrená v jednotkách lipázy/mg V je počet mililitrov roztoku hydroxidu sodného 0,1 N za minútu (vypočítané na základe grafu) N je molarita roztoku hydroxidu sodného m je množstvo testovacej lipázy v mg. Jednotka lipázy je definovaná ako množstvo enzýmu, ktoré uvoľní 10 mikro-ekvivalentov kyseliny za minútu.“