PRÍLOHA I

Schéma testov, ktoré sa majú vykonávať podľa článkov 3, 4, 5, 7 a 8

1. VŠEOBECNÉ ZÁSADY TÝKAJÚCE SA VÝSKYTU ŠPECIFIKOVANÉHO ŠKODCU

1.1. Podozrenie na výskyt špecifikovaného škodcu existuje vtedy, ak sa v prvom detekčnom teste vykonanom na špecifikovanej rastline získa pozitívny výsledok. V prípade symptomatického rastlinného materiálu môže byť prvým detekčným testom selektívna izolácia.

1.2. Výskyt špecifikovaného škodcu je potvrdený na symptomatických vzorkách zo špecifikovaných rastlín v týchto prípadoch: a) ak je prvý detekčný test selektívna izolácia, ktorej výsledkom sú kolónie s typickou morfológiou: pozitívne výsledky sa získajú v dvoch identifikačných testoch; b) ak je prvý detekčný test iný ako selektívna izolácia: i) pozitívne výsledky sa získajú v dvoch identifikačných testoch po tom, ako bola vzorka podrobená selektívnej izolácii; ii) pozitívne výsledky sa získajú v druhom detekčnom teste inom ako selektívna izolácia.

1.3. Výskyt špecifikovaného škodcu je potvrdený na asymptomatických vzorkách zo špecifikovaných rastlín v týchto prípadoch: a) ak sa v druhom detekčnom teste získa pozitívny výsledok, a za predpokladu, že prvý alebo druhý detekčný test je molekulárny test (na základe DNA) (TaqMan® PCR v reálnom čase alebo konvenčný test PCR); b) v prípade vzoriek odobratých v členskom štáte alebo v oblasti členského štátu, kde nie je známy výskyt špecifikovaného škodcu, a v prípade vzoriek, ktoré pochádzajú z iného členského štátu: ak sa v druhom detekčnom teste získa pozitívny výsledok v súlade s písmenom a) a pozitívne výsledky sa získajú v dvoch identifikačných testoch vykonaných po tom, ako bola vzorka podrobená selektívnej izolácii.

2. TESTY

2.1. Detekčné testy

Detekčné testy musia byť také, aby dôsledne detegovali najmenej 104 buniek/ml resuspendovaného peletu.

Druhý detekčný test musí byť založený na odlišných biologických princípoch alebo iných oblastiach nukleotidov ako prvý detekčný test.

Detekčné testy sú tieto:

a) testy fluorescenčnými protilátkami, ako sú opísané v medzinárodných diagnostických normách;

b) test FISH (van Beuningen et al. [(1995) (1)], ako je opísaný v medzinárodných diagnostických normách;

c) izolácia, ako je opísaná v medzinárodných diagnostických normách. Vykonáva sa jedna z týchto dvoch možností: i) priama izolácia na semiselektívnych (alebo neselektívnych) médiách, ako je opísaná v medzinárodných diagnostických normách; ii) izolácia po obohatení o biologickú analýzu, ako je opísaná v medzinárodných diagnostických normách;

d) štandardný test PCR s použitím primerov Pastrik (2000) (2), ako je opísaný v medzinárodných diagnostických normách;

e) testy PCR v reálnom čase TaqMan®, pri ktorých sa používajú tieto primery a sondy: i) Schaad et al. (1999) (3), ako sú opísané v medzinárodných diagnostických normách; ii) Vreeburg et al. (2018) (4) (tzv. test NYtor), ako sú opísané v medzinárodných diagnostických normách; iii) Gudmestad et al. (2009) podľa úpravy Vreeburg et al. (2018)4, ako sú opísané v medzinárodných diagnostických normách; iv) Massart et al. (2014) (5), ako sú opísané v medzinárodných diagnostických normách.

2.2. Identifikačné testy

Identifikačné testy sú tieto:

a) test fluorescenčnými protilátkami, ako je opísaný v medzinárodných diagnostických normách;

b) štandardný test PCR s použitím primerov Pastrik (2000), ako je opísaný v medzinárodných diagnostických normách;

c) testy PCR v reálnom čase TaqMan®, pri ktorých sa používajú tieto primery a sondy: i) Schaad et al. (1999), ako sú opísané v medzinárodných diagnostických normách; ii) Vreeburg et al. (2018) (tzv. test NYtor), ako sú opísané v medzinárodných diagnostických normách; iii) Gudmestad et al. (2009) podľa úpravy Vreeburg et al. (2018)4, ako sú opísané v medzinárodných diagnostických normách; iv) Massart et al. (2014), ako sú opísané v medzinárodných diagnostických normách.

d) čiarové kódovanie DNA, ako je opísané v medzinárodných diagnostických normách;

e) hmotnostná spektrometria MALDI-TOF [Zaluga et al. (2011)] (6), ako je opísaná v medzinárodných diagnostických normách.

3. VÝVOJOVÉ DIAGRAMY POSTUPOV

Vývojový diagram č. 1: Diagnostický postup na zistenie výskytu špecifikovaného škodcu v symptomatických vzorkách zo špecifikovanej rastliny.

a) Izolácia sa môže použiť ako prvý alebo druhý detekčný test. Ak existuje podozrenie na výskyt špecifikovaného škodcu na rastovom médiu, kolónie sa musia prečistiť, aby sa získali čisté kultúry, na ktorých sa musia vykonať dva identifikačné testy. Na potvrdenie výskytu škodcu sa vyžadujú pozitívne výsledky v dvoch identifikačných testoch.

b) Tretí detekčný test musí byť založený na odlišných biologických princípoch alebo iných oblastiach nukleotidov.

Vývojový diagram č. 2: Diagnostický postup na zistenie prítomnosti špecifikovaného škodcu v asymptomatických vzorkách zo špecifikovanej rastliny.

a) Izolácia sa nepoužíva.

b) Tretí detekčný test musí byť založený na odlišných biologických princípoch alebo iných oblastiach nukleotidov. Izolácia sa nepoužíva.

c) V prípade vzoriek uvedených v bode 1.3 písm. b) sa po potvrdení výskytu špecifikovaného škodcu po druhom pozitívnom detekčnom teste vyžaduje izolácia špecifikovaného škodcu zo vzorky, po ktorej nasledujú dva pozitívne identifikačné testy.

4. PRÍPRAVA VZORKY

4.1. Vzorky z asymptomatických hľúz

Štandardná veľkosť vzoriek má obsahovať 200 hľúz na test. Vhodný laboratórny postup na spracovanie výrezkov pupkových koncov na získanie extraktu na zistenie prítomnosti špecifikovaného škodcu je opísaný v medzinárodných diagnostických normách.

4.2. Vzorky z asymptomatického rastlinného materiálu iného ako hľuzy

Detekcia latentných infekcií sa vykonáva na súhrnných vzorkách kmeňových segmentov. Postup sa môže uplatniť až na 200 častiach stoniek z rôznych rastlín v jednej vzorke. Vhodný laboratórny postup na dezinfekciu a spracovanie stoniek na získanie extraktu na zistenie prítomnosti špecifikovaného škodcu je opísaný v medzinárodných diagnostických normách.

4.3. Vzorky zo symptomatických špecifikovaných rastlín

Rezy tkaniva sa asepticky odstránia z cievneho prstenca v hľuze alebo z cievnych zväzkov v stonke špecifikovaných rastlín vykazujúcich symptómy vädnutia. Vhodný laboratórny postup na spracovanie týchto tkanív na získanie extraktu na zistenie prítomnosti špecifikovaného škodcu je podrobne opísaný v medzinárodných diagnostických normách.

(1) van Beuningen, A.R., Derks, H., Janse, J.D. (1995). Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in situ hybridization (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Züchtungs Forschung 1, 266 – 269.

(2) Pastrik, K.H. (2000). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA. European Journal of Plant Pathology, 106, 155 – 165.

(3) Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A., Knorr, D (1999). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIOPCR and an automated real-time fluorescence detection system. Plant Disease 83, 1095 – 1100.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach. EPPO Bulletin 48, 86 – 96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay. European Journal of Plant Pathology 138, 29 – 37.

(6) Zaluga, J., Heylen, K., Van Hoorde, K., Hoste, B., Vaerenbergh, J., Maes, M., De Vos, P. (2011). GyrB sequence analysis and MALDI-TOF MS as identification tools for plant pathogenic Clavibacter. Systematic and applied microbiology 34, 400 – 7. 10.1016/j.syapm.2011.05.001.