PRÍLOHA II

TESTOVACIA SCHÉMA NA DIAGNOSTIKU, URČOVANIE PRÍTOMNOSTI A IDENTIFIKÁCIU RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

ROZSAH TESTOVACEJ SCHÉMY

V tejto schéme sa opisujú rozličné postupy používané pri:

i) diagnostike hnedej hniloby v hľuzách zemiakov a baktériového vädnutia rastlín zemiakov, rajčiakov a niektorých iných hostiteľských rastlín;

ii) určovaní prítomnosti Ralstonia solanacearum vo vzorkách hľúz zemiakov, v hostiteľských rastlinách zemiakov, rajčiakov a iných vo vode a pôde;

iii) identifikácii Ralstonia solanacearum (R. solanacearum).

OBSAH

Strana Základné princípy 40 ODDIEL I: Aplikácia testovacej schémy 40 1. Schéma určovania prítomnosti hnedej hniloby a baktériového vädnutia (R. solanacearum) hľúz zemiakov a rastlín zemiakov, rajčiakov alebo iných hostiteľských rastlín s príznakmi hnedej hniloby alebo baktériového vädnutia 40 2. Schéma určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vzorkách hľúz zemiakov bez príznakov 43 3. Schéma určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vzorkách rastlín zemiakov, rajčiakov alebo iných hostiteľských rastlín bez príznakov 46 ODDIEL II: Podrobné metódy určovania prítomnosti R. solanacearum v hľuzách zemiakov a v rastlinách zemiakov, rajčiakov alebo v iných hostiteľských rastlinách s príznakmi hnedej hniloby alebo baktériového vädnutia 48 1. Príznaky 48 2. Skríningové testy 48 3. Postup izolácie 49 4. Identifikačné testy R. solanacearum 49 ODDIEL III: 1. Podrobné metódy určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vzorkách hľúz zemiakov bez príznakov 49 1.1. Príprava vzoriek 49 1.2. Testovanie 51 2. Podrobné metódy určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vzorkách rastlín zemiakov, rajčiakov alebo iných rastlín bez príznakov 51 2.1. Príprava vzorky 51 2.2. Testovanie 52 ODDIEL IV: 1. Systém určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vode 53 2. Metódy určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vode 55 2.1. Príprava vzorky 55 2.2. Testovanie 55 ODDIEL V: 1. Systém určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum v pôde 56 2. Metódy určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum v pôde 58 2.1. Príprava vzorky 58 2.2. Testovanie 58 ODDIEL VI: Optimalizované protokoly na určovanie prítomnosti a identifikáciu R. solanacearum 58 A. Diagnostické testy a testy na určovanie prítomnosti 58 1. Test vytekania baktériového slizu zo stonky 58 2. Určovanie prítomnosti granúl poly-β-hydroxybutyrátu 58 3. Testy sérologickej aglutinácie 59 4. Selektívna izolácia 60 4.1. Selektívny platňový rozter 60 4.2. Obohacovanie 60 5. Imunofluorescenčný test (IF test) 61 6. Test polymerázovej reťazovej reakcie (test PCR) 64 6.1. Metódy čistenia DNA 65 a) Metóda podľa Pastrika (2000) 65 b) Iné metódy 65 6.2. Test PCR 66 6.3. Analýza produktu PCR 66 7. Test flourescenčnej hybridizácie in situ (test FISH) 67 8. Testy enzýmovej imunoanalýzy (ELISA) 69 a) Nepriamy test ELISA 69 b) Test DASI ELISA (sendvičová metóda enzýmovej imunoanalýzy ELISA) 70 9. Biotest 71 B. Identifikačné testy 72 1. Nutričné a enzymatické identifikačné testy 72 2. Test IF 72 3. Test ELISA 73 4. Test PCR 73 5. Test FISH 73 6. Profilovanie mastných kyselín (FAP) 73 7. Metódy pre charakterizáciu kmeňa 73 7.1. Určenie biovaru 73 7.2. Genómová daktyloskopia 74 7.3. Metódy PCR 74 C. Konfirmačný test 74 Dodatok 1 Laboratóriá zúčastnené na optimalizácii a validácii protokolov 76 Dodatok 2 Médiá na izoláciu a kultiváciu R. solanacearum 77 Dodatok 3 A. Štandardný komerčne dostupný normalizovaný materiál 79 B. Príprava pozitívnych a negatívnych kontrol pre skríningové testy výrezkov PCR/IF a FISH 80 Dodatok 4 Pufre pre testovacie postupy 82 Dodatok 5 Určovanie stupňa kontaminácie pri testoch IF a FISH 85 Dodatok 6 Validované protokoly a reagenty 86 Dodatok 7 Validované reagenty pre test FISH 91 Dodatok 8 Pestovanie rajčiakov a baklažánov 93 Bibliografia 94

ZÁKLADNÉ PRINCÍPY

V dodatkoch sa uvádzajú optimalizované protokoly rôznych metód, validované činidlá a podrobné pokyny na prípravu testovaných a kontrolných materiálov. V dodatku 1 sa nachádza zoznam laboratórií, ktoré sa podieľali na optimalizácii a validácii protokolov.

Keďže v protokoloch ide o zisťovanie karanténnych organizmov a zahŕňajú použitie živých kultúr R. solanacearum ako kontrolných materiálov, postupy bude potrebné uskutočňovať vo vhodných karanténnych podmienkach s primeranými zariadeniami na likvidáciu odpadov a za podmienky príslušného povolenia vydaného príslušnými úradmi pre karanténu rastlín.

Parametre testovania musia zabezpečiť konzistentné a reprodukovateľné odhalenie stupňov výskytu R. solanacearum pri stanovených prahových hodnotách zvolenej metódy.

Presná príprava pozitívnej kontroly je nevyhnutná.

Testovanie podľa požadovaných prahových hodnôt zahŕňa aj správne nastavenie, údržbu a kalibráciu zariadení, opatrnú manipuláciu s činidlami a ich starostlivé uchovávanie a dodržiavanie všetkých opatrení na predchádzanie kontaminácie medzi vzorkami, t. j. oddelenia pozitívnej kontroly od testovaných vzoriek. Musia sa uplatňovať normy na kontrolu kvality, aby nedochádzalo k administratívnym a iným omylom, najmä pokiaľ ide o označovanie a dokumentáciu.

Podozrenie na výskyt, ako sa uvádza v článku 4 ods. 2 smernice 98/57/ES, znamená pozitívny výsledok pri diagnostických alebo skríningových testoch uskutočnených na vzorke, ako sa určuje v nižšie uvedených vývojových diagramoch. Pozitívny prvý skríningový test (IF test, PCR/FISH, selektívna izolácia) sa musí potvrdiť druhým skríningovým testom založeným na inom biologickom princípe.

Ak je prvý skríningový test pozitívny, potom je podozrenie na kontamináciu R. solanacearum a musí sa urobiť druhý skríningový test. Ak je pozitívny druhý skríningový test, potom sa podozrenie potvrdí (podozrenie na výskyt) a testovanie podľa systému musí pokračovať. Ak je druhý skríningový test negatívny, vzorka sa nepovažuje za kontaminovanú R. solanacearum.

Potvrdená prítomnosť, ako sa uvádza v článku 5 ods. 1) smernice 98/57/ES, znamená izoláciu a identifikáciu čistej kultúry R. solanacearum s potvrdenou patogenitou.

ODDIEL I

APLIKÁCIA TESTOVACEJ SCHÉMY

1. Schéma určovania prítomnosti hnedej hniloby a baktériového vädnutia (Ralstonia solanacearum) hľúz zemiakov a rastlín zemiakov, rajčiakov alebo iných hostiteľských rastlín s príznakmi hnedej hniloby alebo baktériového vädnutia

Testovanie je určené pre hľuzy zemiakov a rastliny s typickými príznakmi hnedej hniloby alebo cievneho vädnutia alebo s podozrením na ne. Zahŕňa skríningový test, izoláciu patogénu z infikovaného cievneho pletiva na (selektívnom) médiu a v prípade pozitívneho výsledku identifikáciu kultúry ako Ralstonia solanacearum.

2. Schéma určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vzorkách hľúz zemiakov bez príznakov

Princíp

Testovanie je zamerané na určenie prítomnosti latentných infekcií v hľuzách zemiakov. Pozitívny výsledok najmenej dvoch skríningových testov3, založených na rôznych biologických princípoch, sa musí doplniť izoláciou patogénu; v prípade izolácie typických kolónií nasleduje potvrdenie čistej kultúry ako R. solanacearum. Pozitívny výsledok iba jedného zo skríningových testov vzorky nestačí na potvrdenie podozrenia.

Skríningové testy a izolačné testy musia umožniť diagnostiku resuspendovaného peletu s hustotou 103 až 104 buniek/ml, ktorý je ako pozitívna kontrola súčasťou každej série testov.

3. Schéma určovania prítomnosti a identifikácie Ralstonia solanacearum vo vzorkách rastlín zemiakov, rajčiakov alebo iných hostiteľských rastlín bez príznakov

ODDIEL II

PODROBNÉ METÓDY URČOVANIA PRÍTOMNOSTI RALSTONIA SOLANACEARUM V HĽUZÁCH ZEMIAKOV A V RASTLINÁCH ZEMIAKOV, RAJČIAKOV ALEBO INÝCH HOSTITEĽSKÝCH RASTLINÁCH S PRÍZNAKMI HNEDEJ HNILOBY ALEBO BAKTÉRIOVÉHO VÄDNUTIA

1. Príznaky (pozri internetovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1. Príznaky na zemiakoch

Rastlina zemiaka. V ranom štádiu sa infekcia na poli rozozná podľa uvädnutých listov vo vrchnej časti rastliny pri vysokých teplotách počas dňa, pričom cez noc sa zotavia. V raných štádiách vädnutia listy zostávajú zelené, ale neskôr žltnú a dochádza k hnedému odumieraniu. Vyskytujú sa aj epinastie. Vädnutie jedného výhonku alebo celých rastlín sa rýchlo stane nezvratným a jeho dôsledkom je odumretie rastliny. Cievne zväzky priečne rozrezaných stoniek zvädnutých rastlín sú zvyčajne hnedé a z povrchu rezu sa samovoľne alebo po stlačení vylučuje mliečny baktériový slizovitý exkrét. Ak sa odrezaná stonka umiestni zvislo do vody, z cievnych zväzkov vytekajú vlákna slizu.

Hľuza zemiaka. Hľuzy zemiaka sa musia rozrezať priečne blízko pupkového (stolónového) konca, alebo pozdĺžne cez stolónový koniec. Rané štádium infekcie sa prejavuje sklovito žltým až svetlohnedým sfarbením cievnych zväzkov, z ktorých sa po niekoľkých minútach spontánne vylučuje svetlý smotanový baktériový sliz. Neskôr sa cievne sfarbenie zmení na zreteľnejšie hnedé a odumieranie pletiva sa môže rozšíriť na parenchymatózne pletivo. V pokročilých štádiách infekcia pokračuje smerom od pupkového konca a očiek, z ktorých sa vylučuje baktériový sliz spôsobujúci prilínanie častíc zeminy. Môžu sa objaviť červenkasto hnedé, mierne vtlačené lézie na šupe spôsobené prepadnutím cievnych zväzkov dovnútra. V pokročilých štádiách infekcie sa bežne vyskytuje sekundárna hubová a baktériová mäkká hniloba.

1.2. Príznaky na rajčiaku

Rastlina rajčiaka. Prvým viditeľným príznakom je ochabnutý vzhľad najmladších listov. V podmienkach priaznivých pre patogény (teplota pôdy okolo 25 °C, nasýtená vlhkosť vzduchu) nasleduje do niekoľkých dní epinastia a vädnutie jednej strany rastliny alebo celej rastliny, čo má za následok kolaps celej rastliny. V menej priaznivých podmienkach (teplota pôdy pod 21 °C) je vädnutie menej výrazné, ale na stonke sa môže vyvinúť veľký počet postranných výhonkov. Pozdĺž stonky možno pozorovať slizovitý pás, ktorý svedčí o odumieraní cievneho systému. Pri priečnom reze stonky sfarbené hnedé cievne zväzky vylučujú biely alebo žltkastý baktériový sliz.

1.3. Príznaky na iných hostiteľoch

Rastliny Solanum dulcamara a S. nigrum. V normálnych podmienkach, ak teploty pôdy neprekročia 25 °C alebo ak úroveň inokula nie je extrémne vysoká (napr. pri S. nigrum, ktoré rastie vedľa infikovaných rastlín zemiaka alebo rajčiaka), sa príznaky vädnutia u týchto hostiteľských burín vyskytujú zriedka. Ak sa vädnutie vyskytne, príznaky sú rovnaké, ako sa opisujú u rajčiaka. Nezvädnuté rastliny S. dulcamara rastúce so stonkou a koreňmi vo vode môžu mať na priečnom reze spodnej časti stonky alebo časti, ktorá je pod vodou, mierne svetlohnedé sfarbenie cievnych zväzkov. Ak sa odrezaná stonka umiestni zvisle do vody, aj v prípade absencie príznakov vädnutia sa z povrchu rezu cievnych zväzkov vylučuje baktériový sliz alebo vlákna slizu.

2. Testy vytekania baktériového slizu zo stonky

Testy vytekania baktétiového slizu zo stonky môžu uľahčiť predbežnú diagnostiku, ale nie sú rozhodujúce. Použije sa jeden alebo viacero z týchto validovaných testov:

2.1. Test vytekania baktériového slizu zo stonky

(Pozri oddiel VI.A.1.)

2.2. Určovanie prítomnosti granúl poly-β-hydroxybutyrátu (PHB)

Charakteristické granuly PHB v bunkách R. solanacearum sa zviditeľňujú sfarbením teplom fixovaného rozteru baktériového slizu z infikovaného pletiva na podložnom mikroskopickom sklíčku prostredníctvom nílskej modrej A alebo sudánskej čiernej (pozri oddiel VI.A.2).

2.3. Testy sérologickej aglutinácie

(Pozri oddiel VI.A.3.)

2.4. Iné testy

K ďalším vhodným skríningovým testom patria test IF (pozri oddiel VI.A.5), test FISH (pozri oddiel VI.A.7), testy ELISA (pozri oddiel VI.A.8) a testy PCR (pozri oddiel VI.A.6).

3. Postup izolácie

a) Odstráňte sliz alebo časti odfarbeného pletiva z cievnych zväzkov hľuzy zemiaka alebo z cievnych pletív stonky rastliny zemiaka, rajčiaka alebo inej vädnúcej hostiteľskej rastliny. Urobí sa suspenzia v malom objeme sterilnej destilovanej vody alebo v 50 mM fosfátovom pufri (dodatok 4) a nechá sa 5 až 10 minút stáť.

b) Zo suspenzie sa pripraví viacero desatinných riedení.

c) Objem 50 – 100 µl suspenzie a jednotlivých riedení prenesieme na univerzálnu živnú pôdu (NA, YPGA alebo SPA; pozri dodatok 2) a/alebo na Kelmanovo tetrazóliové médium (dodatok 2) a/alebo a validované selektívne médium (napr. SMSA; pozri dodatok 2). Riedenia rozotrieme vhodnou platňovou metódou. Je vhodné pripraviť si samostatné platne so zriedenou kultúrou bunkovej suspenzie biovaru 2 R. solanacearum ako pozitívnu kontrolu.

d) Platne sa nechajú inkubovať pri 28 °C 2 až 6 dní. — Na univerzálnych živných pôdach virulentné izoláty R. solanacearum vytvárajú perlovo biele, ploché, nepravidelné a fluidné kolónie, často s charakteristickými špirálkami v strede. Nevirulentné formy R. solanacearum vytvárajú malé kruhové, nefluidné, maslovité kolónie, ktoré sú celé smotanovo biele. — Na Kelmanovom tetrazóliovom médiu a SMSA médiu majú špirálky krvavočervenú farbu. Nevirulentné formy Ralstonia solanacearum vytvárajú malé kruhové, nefluidné, maslovité kolónie, ktoré sú celé tmavočervené.

4. Identifikačné testy na R. solanacearum

Testy na potvrdenie identity predpokladaných izolátov R. solanacearum sa uvádzajú v oddiele VI.B.

ODDIEL III

1. Podrobné metódy určovania prítomnosti a identifikácie Ralstonia solanacearum vo vzorkách hľúz zemiakov bez príznakov

1.1. Príprava vzoriek

Poznámka:

— Štandardná veľkosť vzoriek je 200 hľúz na test. Intenzívnejšie odoberanie vzoriek vyžaduje viac testov na vzorkách tejto veľkosti. Väčší počet hľúz zemiakov vo vzorke vedie k inhibícii alebo k zložitej interpretácii výsledkov. Tento test je však vhodný na použitie aj pri vzorkách s menej ako 200 hľuzami, ak je k dispozícii menej hľúz.

— Validácia všetkých nižšie uvedených metód určovania prítomnosti sa zakladá na skúšaní vzoriek z 200.

— Nižšie opísaný extrakt zo zemiaka sa môže použiť aj na určenie prítomnosti baktérie spôsobujúcej krúžkovitosť zemiakov, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Nepovinná predúprava pred prípravou vzorky:

a) Inkubácia vzoriek pri 25 – 30 °C až do 2 týždňov pred testovaním podporí množenie všetkých populácií R. solanacearum.

b) Umytie hľúz. Medzi každou vzorkou použite vhodné dezinfekčné prostriedky (ak sa použije test PCR, zlúčeniny chlóru na odstránenie DNA patogénu) a čistidlá. Hľuzy nechajte na vzduchu vyschnúť. Toto umývanie je užitočné (ale nevyžaduje sa) najmä pri vzorkách, na ktorých sa nachádza príliš veľa zeminy, a ak sa má robiť test PCR alebo priama izolácia.

1.1.1. Čistým, dezinfikovaným skalpelom alebo zeleninovým nožom odstráňte šupku hľuzy na jej pupkovom (stolónovom) konci tak, aby bolo vidieť cievne pletivo. Z cievneho pletiva na pupkovom konci každej hľuzy opatrne vyrežte malý výrezok cievneho pletiva z pupkového konca tak, aby sa vyrezalo čo najmenej necievnych pletív. (Pozri internetovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Poznámka: Vyraďte všetky (hnijúce): ponechajte hľuzy vykazujúce symptómy hnedej hrdze a testujte ich oddelene.

Ak sa pri odstraňovaní pupkového konca zistia vo výrezku príznaky hnedej hniloby, hľuza sa musí vizuálne prehliadnuť a odrezať blízko pupkového konca. Každá rozrezaná hľuza s príznakmi sa uloží aspoň na 2 dni pri izbovej teplote, aby sa umožnila suberizácia (zahojenie reznej rany) a skladuje sa schladená (pri 4 až 10 °C) v primeraných podmienkach karantény. Všetky hľuzy, vrátane hľúz podozrivých na symptómy, sa majú uchovávať podľa prílohy III.

1.1.2. Výrezky z pupkových koncov hľúz zhromaždite v nepoužitých jednorazových nádobách, ktoré sa dajú uzatvoriť a/alebo utesniť (v prípade opakovaného použitia nádoby musia byť dôkladne očistené a dezinfikované zlúčeninami chlóru). Odporúča sa výrezky z pupkových koncov okamžite spracovať. Ak to nie je možné, skladujte ich v nádobe bez pridania pufra schladené najdlhšie 72 hodín alebo pri izbovej teplote najdlhšie 24 hodín.

Výrezky z pupkových koncov hľúz spracujete jedným z týchto postupov:

a) buď pridajte dostatočný objem (asi 40 ml) maceračného pufra (dodatok 4), aby bol výrezok prekrytý, umiestnite do rotačnej trepačky a inkubujte počas 4 hodín (50 až 100 otáčok/min.) pri teplote pod 24 °C alebo počas 16 až 24 hodín schladené. alebo

b) výrezok homogenizujte dostatočným objemom (asi 40 ml) maceračného pufra (dodatok 4) buď v mixéri (napr. Waring alebo Ultra Thurax) alebo rozdrvením v uzatvorenom jednorazovom maceračnom vrecúšku (napr. Stomacher alebo Bioreba strong guage polythene, 150 mm × 250 mm; sterilizovanom ožiarením) gumeným kladivkom alebo iným vhodným nástrojom na drvenie (napr. Homex).

Poznámka: Keď sa vzorky homogenizujú v mixéri, je riziko krížovej kontaminácie vzoriek vysoké. Počas extrakcie treba urobiť opatrenia, aby nedochádzalo k rozprašovaniu ani k rozlievaniu. Pri každej vzorke použite čerstvo sterilizované čepele v mixéri a nádoby. Ak sa použije test PCR, zabráňte prenosu DNA na nádobách alebo na drviacom zariadení. Keď sa použije test PCR, odporúča sa drvenie v jednorazových vrecúškach…

1.1.3. Dekantujte supernatant. Ak je príliš kalný, zjasní sa buď odstredením pri nízkej rýchlosti (pri odstredivej sile nie viac ako 180 g počas 10 minút pri teplote od 4 do 10 °C), alebo vákuovou filtráciou (40 až 100 µm), pričom sa filter premyje ďalším maceračným pufrom (~ 10 ml).

1.1.4. Bakteriálnu frakciu koncentrujte odstredením pri odstredivej sile 7 000 g počas 15 minút (alebo 10 000 g počas 10 minút) pri teplote od 4 do 10 °C a supernatant vylejte tak, aby ste neporušili vzniknutý pelet.

1.1.5. Pelet resuspendujte v 1,5 ml peletového pufra (dodatok 4). Použite 500 µl na test na R. solanacearum, 500 µl pre Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus a 500 µl na referenčné účely. Pridajte 10 – 25 % (v/v) sterilný glycerín do 500 µl referenčného alikvotného podielu a do zostávajúceho testovaného alikvotného podielu, pretrepte a skladujte pri teplote od –16 do –24 °C (niekoľko týždňov) alebo pri teplote od –68 do –86 °C (niekoľko mesiacov). Testované podiely počas testovania uchovávajte pri teplote od 4 do 10 °C.

Opakované zmrazovanie a rozmrazovanie sa neodporúča.

Ak je potrebná doprava extraktu, zabezpečte dodanie v chladiacom boxe do 24 až 48 hodín.

1.1.6. Je nevyhnutné, aby sa so všetkými pozitívnymi kontrolami a vzorkami R. solanacearum manipulovalo oddelene, aby nedošlo ku kontaminácii. Toto platí aj pre podložné sklíčka pri testoch IF a pri všetkých ostatných testoch.

1.2. Testovanie

Vývojové diagramy a popis testov a optimalizovaných protokolov sa nachádzajú v príslušných dodatkoch:

Selektívna izolácia (pozri oddiel VI.A.4)

Test IF (pozri oddiel VI.A.5)

Testy PCR (pozri oddiel VI.A.6)

Test FISH (pozri oddiel VI.A.7)

Testy ELISA (pozri oddiel VI.A.8)

Biotest (pozri oddiel VI.A.9)

2. Podrobné metódy určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vzorkách rastlín zemiakov, rajčiakov alebo iných hostiteľských rastlín bez príznakov

2.1. Príprava vzorky

Poznámka: Pri určovaní prítomnosti latentných populácií R. solanacearum sa odporúča testovať kompozitné vzorky. Postup sa môže vhodným spôsobom uplatniť pri kompozitných vzorkách až z 200 častí stoniek. V prípade prehľadov by sa tieto mali zakladať na štatisticky reprezentatívnej vzorke skúmanej populácie rastlín.

2.1.1. Vložte 1 – 2 cm dlhé segmenty stonky do uzatvorenej sterilnej nádoby podľa týchto postupov odoberania vzoriek:

Semenáče rajčiaka z pestovateľskej škôlky: Čistým dezinfikovaným nožom oddeľte 1 cm dlhú časť z dolnej časti každej stonky tesne nad úrovňou zeminy.

Rastliny rajčiaka pestované na poli alebo v skleníku: Čistým dezinfikovaným nožom oddeľte rezom tesne nad miestom vyrastania z hlavnej stonky najnižší postranný výhonok z každej rastliny. Odstráňte 1 cm dlhú časť z každého postranného výhonku.

Ostatné hostiteľské rastliny: Čistým dezinfikovaným nožom alebo záhradníckymi nožnicami oddeľte 1 cm dlhý úsek z dolnej časti každej stonky tesne nad úrovňou zeminy. V prípade S. dulcamara alebo iných hostiteľských rastlín rastúcich vo vode oddeľte 1 – 2 cm dlhé časti zo stonky rastúcej pod vodou alebo zo stolónov s vodnými koreňmi.

Pri odoberaní vzoriek z osobitných miest sa odporúča testovať štatisticky reprezentatívnu vzorku najmenej 10 rastlín na miesto odberu každého potenciálneho burinného hostiteľa. Určenie prítomnosti patogénu je najspoľahlivejšie neskoro na jar, v lete alebo v jeseni, hoci v prírode sa infekcie na celoročne vo vode rastúcej Solanum dulcamara dajú určiť po celý rok. K známym hostiteľom patria divoko rastúce rastliny zemiaka (náhodne rastúce zemiaky z minulej úrody), Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium a iní členovia čeľade Solanaceae. Ďalšími hostiteľmi sú Pelargonium spp. a Portulaca oleracea. K niektorým druhom európskych burín, ktoré v určitých environmentálnych podmienkach môžu byť útočiskom populácií R. solanacearum biovaru 2, rasy 3 v koreňoch a/alebo rizosfére patria Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra and Urtica dioica.

Poznámka: V tomto štádiu sa môže urobiť vizuálna prehliadka vnútorných príznakov (sfarbenie cievnych zväzkov alebo baktériový sliz). Všetky segmenty stonky s príznakmi oddeľte a testujte ich samostatne (pozri oddiel II).

2.1.2. Segmenty stonky krátko dezinfikujete 70 % etanolom a okamžite osušte jemným pijavým papierom. Potom segmenty stonky spracujte jedným z uvedených postupov:

a) Pridajte dostatočné množstvo (približne 40 ml) maceračného pufra (dodatok 4), aby boli odrezky stonky prekryté, a inkubujte na rotačnej trepačke (50 až 100 ot/min) počas 4 hodín pri teplote nižšej ako 24 °C alebo schladené počas 16 až 24 hodín.

b) Odrezky okamžite rozdrvte gumeným kladivkom alebo iným vhodným nástrojom na drvenie (napr. Homex) v jednorazovom maceračnom vrecúšku (napr. Stomacher alebo Bioreba) s primeraným množstvom maceračného pufra (dodatok 4). Ak to nie je možné, odrezky skladujte v chlade najdlhšie 72 hodín alebo pri izbovej teplote najdlhšie 24 hodín.

2.1.3. Supernatant nechajte asi 15 minút usadiť a potom ho dekantujte.

2.1.4. Ďalšie čistenie extraktu ani koncentrácia baktériovej frakcie sa zvyčajne nevyžadujú, ale môžu sa dosiahnuť filtráciou a/alebo odstredením, ako sa opisuje v oddiele III.1.1.3 až 1.1.5.

2.1.5. Čistú alebo koncentrovanú vzorku rozdeľte na 2 rovnaké diely. Jeden diel uchovávajte počas testovania pri teplote 4 až 10 °C a v prípade, že je potrebné ďalšie testovanie, druhý diel skladujte s 10 až 25 % (objem/objem) sterilným glycerínom pri teplote od –16 °C do –24 °C (niekoľko týždňov) alebo pri teplote od –68 °C do –86 °C (niekoľko mesiacov).

2.2. Testovanie

Vývojové diagramy a popis testov a optimalizovaných protokolov sa nachádzajú v príslušných dodatkoch:

Selektívna izolácia (pozri oddiel VI.A.4)

Test IF (pozri oddiel VI.A.5)

Testy PCR (pozri oddiel VI.A.6)

Test FISH (pozri oddiel VI.A.7)

Testy ELISA (pozri oddiel VI.A.8)

Biotest (pozri oddiel VI.A.9)

ODDIEL IV

1. Systém určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vode

2. Metódy určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vode

Princíp

Validovaný systém určovania prítomnosti popísaný v tomto oddiele je použiteľný aj pri určovaní prítomnosti patogénov vo vzorkách povrchovej vody a môže sa použiť aj pri testovaní vzoriek vody zo spracovania zemiakov alebo odpadovej vody. Je však potrebné poznamenať, že predpokladaná citlivosť určovania prítomnosti sa mení podľa substrátu. Citlivosť izolačného testu ovplyvňujú populácie konkurenčných saprofytických baktérií, ktoré sú zvyčajne oveľa väčšie vo vode zo spracovania zemiakov alebo v odpadovej vode ako v povrchovej vode. Keďže sa očakáva, že nižšie uvedeným systémom sa určí aj také malé množstvo ako 103 buniek na liter povrchovej vody, citlivosť určovania vo vode zo spracovania zemiakov alebo v odpadovej vode je pravdepodobne oveľa nižšia. Z tohto dôvodu sa odporúča testovať odpadovú vodu až po všetkých procesoch úpravy (napr. sedimentácia alebo filtrácia), počas ktorých sa znížia populácie saprofytických baktérií. Obmedzená citlivosť testovacieho systému by sa mala brať do úvahy pri posudzovaní spoľahlivosti dosiahnutých negatívnych výsledkov. Keďže sa tento systém úspešne použil pri výskumných prácach na určenie prítomnosti alebo neprítomnosti patogénov v povrchovej vode, jeho obmedzenia si treba uvedomiť, keď sa použije v podobných výskumných prácach s vodou zo spracovania zemiakov alebo s odpadovou vodou.

2.1. Príprava vzorky

Poznámka:

— Určovanie prítomnosti R. solanacearum v povrchovej vode je najspoľahlivejšie neskoro na jar, v lete a v jeseni, keď sú teploty vody vyššie ako15 °C.

— Opakovaným odoberaním vzoriek v uvedených obdobiach v rôznom čase a na určených miestach sa zvýši spoľahlivosť určenia prítomnosti tým, že sa znížia účinky klimatických zmien…

— Zohľadnením vplyvu silných dažďov a geografie toku vody sa vylúči účinok prílišného zriedenia, ktorý môže stlmiť prítomnosť patogénu.

— Vzorky povrchovej vody odoberajte v blízkosti hostiteľských rastlín, ak sa tam vyskytujú.

2.1.1. Na vybraných miestach odberu vzoriek odoberte vzorky vody do jednorazových skúmaviek alebo fliaš podľa možnosti v hĺbke 30 cm a do 2 metrov od brehu. Vzorky na spracovanie odpadových vôd odoberajte v mieste výtoku odpadu. Odporúčaná veľkosť vzorky je do 500 ml na odberové miesto. Ak sa uprednostnia menšie vzorky, odporúča sa odoberať vzorky na jednom mieste aspoň na trikrát, pričom každá vzorka sa skladá z 2 opakovaných podvzoriek s objemom najmenej 30 ml. Pri intenzívnej výskumnej práci zvoľte aspoň 3 miesta odberu vzoriek na 3 kilometre vodného toku a zabezpečte odber vzoriek aj z prítokov vodného toku.

2.1.2. Vzorky prepravujte v chlade a tme (4 °C až 10 °C) a testujte do 24 hodín.

2.1.3. V prípade potreby sa baktériová frakcia môže koncentrovať niektorou z týchto metód:

a) Odstreďte 30 – 50 ml podvzorky pri 10 000 g počas 10 minút (alebo 7 000 g 15 minút) najlepšie pri teplote 4 °C až 10 °C, vylejte supernatant a resuspendujte pelet v 1 ml peletového pufra (dodatok 4).

b) Prefiltrujte cez membránu (minimálna veľkosť pórov 0,45 µm), opláchnite filter v 5 až 10 ml peletového pufra a oplachový pufor zachyťte. Táto metóda je vhodná pre väčšie množstvá vody obsahujúcej malé množstvo saprofytov.

Pri vzorkách vody zo spracovania zemiakov a odpadovej vody sa koncentrácia zvyčajne neodporúča, pretože zvýšené populácie konkurenčných saprofytických baktérií spomaľujú určovanie prítomnosti Ralstonia solanacearum.

2.2. Testovanie

Pozri vývojový diagram a popis testov v relevantných dodatkoch.

ODDIEL V

1. Systém určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum v pôde

2. Metódy určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum v pôde

Princíp

Validovaný systém určovania prítomnosti, ktorý sa popisuje v tomto oddiele, je použiteľný pri určovaní prítomnosti patogénov vo vzorkách pôdy, ale môže sa použiť aj na testovanie tuhých odpadov zo spracovania zemiakov alebo splaškových kalov. Treba však poznamenať, že tieto metódy nie sú dostatočne citlivé, aby zaručili určenie prítomnosti malých a/alebo nepravidelne roztrúsených populácií Ralstonia solanacearum, ktoré sa môžu vyskytovať v prirodzene zamorených vzorkách týchto substrátov.

Obmedzená citlivosť tohto systému testovania by sa mala brať na zreteľ pri posudzovaní spoľahlivosti všetkých negatívnych výsledkov a aj v prípade, keď sa použije na výskum zameraný na určenie prítomnosti alebo neprítomnosti patogénu v pôdach alebo v kaloch. Najspoľahlivejším testom prítomnosti patogénu v pôde z poľa je zasadiť vnímavého hostiteľa a sledovať, či sa infikuje, ale aj pri tejto metóde môžu nízke úrovne kontaminácie zostať neodhalené.

2.1. Príprava vzorky

2.1.1. Pri odoberaní vzoriek pôdy z poľa by sa mali dodržiavať štandardné postupy odoberania vzoriek háďatok. Na vzorku odoberte 0,5 až 1 kg pôdy zo 60 miest na 0,3 ha z hĺbky 10 až 20 cm (alebo v rastri 7 × 7 meter). Ak je podozrenie na prítomnosť patogénu, zvýšte počet miest odberu na 120 na 0,3 ha. Vzorky pred testovaním skladujte pri teplote 12 až 15 °C. Vzorku odpadov zo spracovania zemiakov a splaškových kalov pripravte zozbieraním celkovo 1 kg materiálu z viacerých miest reprezentujúcich celý objem splaškov, ktoré sa majú testovať. Každú vzorku pred testovaním dôkladne zamiešajte.

2.1.2. Podvzorky z 10 až 25 g pôdy alebo kalu rozptyľujte pomocou rotačnej trepačky (250 ot/min) v 60 až 150 ml maceračného pufra (dodatok 4) počas až 2 hodín. V prípade potreby podporte disperziu pridaním 0,02 % sterilného Tween-20 a 10 až 20 g sterilného štrku.

2.1.3. Počas testovania udržiavajte suspenziu pri teplote 4 °C.

2.2. Testovanie

Pozri vývojový diagram a popis testov v relevantných dodatkoch.

ODDIEL VI

OPTIMALIZOVANÉ PROTOKOLY NA URČOVANIE PRÍTOMNOSTI A IDENTIFIKÁCIU R. SOLANACEARUM

A. DIAGNOSTICKÉ TESTY A TESTY NA URČOVANIE PRÍTOMNOSTI

1. test vytekania baktériového slizu stonky

Prítomnosť R. solanacearum v stonkách vädnúcich rastlín zemiaka, rajčiaka alebo iných hostiteľských rastlín sa môže určiť týmto jednoduchým predbežným testom: Odrežte stonku v úrovni nad zeminou. Umiestnite povrch rezu do skúmavky s čistou vodou. Po niekoľkých minútach začnú z cievnych zväzkov samovoľne vytekať vlákna baktériového slizu.

2. Určovanie prítomnosti granúl poly-β-hydroxybutyrátu

1. Pripravte si na podložné mikroskopické sklíčko rozter z baktériového slizu z infikovaného pletiva alebo zo 48-hodinovej kultúry na médiu YPGA alebo SPA (dodatok 2).

2. Pripravte si pozitívne kontrolné roztery kmeňa biovaru 2 R. solanacearum a v prípade, že to je užitočné, aj negatívny kontrolný rozter známeho druhu, ktorý je PHB negatívny.

3. Nechajte na vzduchu vyschnúť a spodnou stranou sklíčka prejdite niekoľkokrát rýchlo ponad plameň, kým sa rozter nezafixuje.

4. Preparát sfarbite buď nílskou modrou alebo sudánskou čiernou a pozorujte pod mikroskopom podľa tohto popisu:

Test nílskou modrou

a) Každé sklíčko zalejte 1 % vodným roztokom nílskej modrej A a inkubujte 10 minút pri teplote 55 °C.

b) Nechajte odtiecť farbiaci roztok. Krátko opláchnite pod slabo tečúcou vodou. Prebytočnú vodu odsajte jemným pijavým papierom.

c) Zalejte rozter 8 % vodným roztokom kyseliny octovej a inkubujte 1 minútu pri izbovej teplote.

d) Krátko opláchnite pod slabo tečúcou vodou. Prebytočnú vodu odsajte jemným pijavým papierom.

e) Opätovne zvlhčite kvapkou vody a zakryte krycím sklíčkom.

f) Preskúmajte sfarbený rozter epifluorescenčným mikroskopom pri vlnovej dĺžke 450 nm a s olejovou imerziou pri 600- až 1 000-násobnom zväčšení pomocou objektívu s vodnou alebo olejovou imerziou.

g) Všímajte si sýtooranžovú fluorescenciu granúl PHB. Pozorujte aj za prechádzajúceho bežného svetla a uistite sa, či sú granuly vnútrobunkové a či morfológia buniek je typická pre R. solanacearum.

Test sudánskou čiernou

a) Každé sklíčko zalejte 0,3 % roztokom sudánskej čiernej B v 70 % etanole a inkubujte 10 minút pri izbovej teplote.

b) Nechajte odtiecť roztok farbiva, krátko opláchnite v tečúcej vode a prebytočnú vodu odsajte jemným pijavým papierom.

c) Sklíčka ponorte nakrátko do xylolu a osušte jemným pijavým papierom. Upozornenie: Xylol je zdraviu škodlivý, nevyhnutné sú všetky bezpečnostné opatrenia a musí sa pracovať v digestore.

d) Sklíčka sa zalejú 0,5 % (hmotnosť/objem) vodným roztokom safranínu a nechá sa 10 sekúnd stáť pri izbovej teplote. Upozornenie: Safranín je zdraviu škodlivý, nevyhnutné sú všetky bezpečnostné opatrenia a musí sa pracovať v digestore.

e) Sklíčka sa opláchnu v slabo tečúcej vode, osušia sa jemným pijavým papierom a priloží sa krycie sklíčko.

f) Sfarbené roztery sa pozorujú v mikroskope s prechádzajúcim svetlom s olejovou imerziou pri 1 000-násobnom zväčšení pomocou objektívu s olejovou imerziou.

g) Pozorujte modro-čierne sfarbenie granúl PHB v bunkách R. solanacearum s ružovo sfarbenými bunkovými stenami.

3. Testy sérologickej aglutinácie

Aglutinácia buniek R. solanacearum v baktériovom slize alebo v extrakte pletiva s príznakmi sa najlepšie pozoruje pomocou validovaných protilátok (pozri dodatok 3) označených príslušnými farebnými značkami ako sú červené bunky Staphylococcus aureus alebo farebnými latexovými časticami. Ak sa použije komerčne dostupná sada (pozri dodatok 3), dodržiavajte pokyny výrobcu. Inak dodržiavajte tento postup:

a) Zmiešajte kvapky suspenzie označenej protilátky a baktériový sliz (približne 5 µl z každého) v jamkách viacobjektových testovacích sklíčok.

b) Pripravte pozitívne a negatívne kontroly pomocou suspenzií R. solanacearum biovaru 2 a jedného nerovnocenného kmeňa.

c) Po jemnom miešaní počas 15 sekúnd pozorujte aglutináciu v pozitívnych vzorkách.

4. Selektívna izolácia

4.1. Selektívny platňový rozter

Poznámka: Pred prvým použitím tejto metódy urobte predbežné testy na zaistenie opakovateľnosti určenia prítomnosti buniek R. solanacearum tvoriacich kolónie v hodnote 103 až 104 na 1 ml, ktoré sa pridajú do extraktov zo vzoriek, ktoré boli predtým testované s negatívnym výsledkom.

Použite primerane validované selektívne médium ako SMSA (modifikované podľa Elphinstone et al., 1996; pozri dodatok 2).

Je potrebné venovať pozornosť odlíšeniu R. solanacearum od iných baktérií schopných tvoriť v médiu kolónie. Okrem toho, ak sú platňové roztery prerastené alebo ak sú prítomné antagonistické baktérie, kolónie R. solanacearum môžu vykazovať netypickú morfológiu. V prípade podozrenia na konkurenčné alebo antagonistické vplyvy musí sa vzorka pretestovať pomocou iného testu.

Najvyššia citlivosť určenia prítomnosti touto metódou sa dá očakávať, ak sa použijú čerstvo pripravené extrakty vzoriek. Táto metóda je však použiteľná aj pri extraktoch, ktoré boli skladované v glyceríne pri teplote od –68 do –86 °C.

Ako pozitívne kontroly pripravte desatinné riedenia suspenzie s hustotou 106 buniek tvoriacich kolónie na 1 ml virulentného kmeňa R. solanacearum biovaru 2 (napr. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Aby sa vylúčila akákoľvek možnosť kontaminácie, pripravujte pozitívne vzorky úplne oddelene od vzoriek, ktoré sa majú testovať.

Pri každej novopripravenej dávke selektívneho média by sa pred jej použitím pri testovaní bežných vzoriek mala otestovať jej vhodnosť na rast patogénu.

Kontrolný materiál testujte rovnakým spôsobom ako vzorku(-y).

4.1.1. Použite vhodnú zrieďovaciu platňovú techniku rozteru, ktorou sa zabezpečí, aby sa zriedili všetky nežiaduce saprofytické populácie tvoriace kolónie. Rozotrite 50 až 100 µl extraktu vzorky na platňu a na každé riedenie.

4.1.2. Platne nechajte inkubovať pri teplote 28 °C. Po 48 hodinách platne skontrolujte a potom každý deň až do 6 dní. Typické kolónie R. solanacearum na médiu SMSA sú mliečne biele, ploché, nepravidelné a fluidné a po 3 dňoch inkubácie sa v strede vytvorí ružové až krvavočervené sfarbenie s vnútornými prúžkami alebo závitmi (pozri internetovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Poznámka: Na tomto médiu sa niekedy tvoria netypické kolónie R. solanacearum. Môžu byť malé, kruhové, celé červeno sfarbené a nefluidné alebo iba čiastočne fluidné, a preto ťažko rozoznateľné od saprofytických baktérií tvoriacich kolónie.

4.1.3. Predpokladané kolónie R. solanacearum po nanesení v prúžkoch alebo po zriedenom roztere na univerzálnu živnú pôdu očistite, aby ste dostali izolované kolónie (pozri dodatok 2).

4.1.4. Kultúry krátkodobo uchovajte v sterilnej vode (pH 6 – 8, bez chlóru) v tme pri izbovej teplote, alebo dlhodobo vo vhodnom kryogénnom ochrannom prostredí pri teplote od –68 do –86 °C alebo lyofilizované.

4.1.5. Identifikujte predpokladané kultúry (pozri oddiel VI. B) a urobte test patogenity (pozri oddiel VI. C).

Vyhodnotenie výsledkov testu selektívneho platňového rozteru

Test selektívneho platňového rozteru je negatívny, ak sa po šiestich dňoch nedajú spozorovať žiadne kolónie baktérií, alebo ak sa nezistia žiadne predpokladané typické kolónie R. solanacearum za podmienky, že sa nepredpokladá žiadna inhibícia inými konkurenčnými alebo antagonistickými baktériami a že v pozitívnych kontrolách sa nachádzajú typické kolónie R. solanacearum.

Test selektívneho platňového rozteru je pozitívny, ak sa izolujú predpokladané kolónie R. solanacearum.

4.2. Obohacovanie

Použite validované obohacovacie médium ako je modifikovaný živný roztok Wilbrink (pozri dodatok 2).

Tento postup sa môže použiť na selektívne zvýšenie populácií R. solanacearum v extraktoch zo vzoriek a na zvýšenie citlivosti pri určovaní ich prítomnosti. Týmto postupom sa zároveň účinne riedia inhibítory reakcie PCR (1:100). Treba však poznamenať, že obohacovanie R. solanacearum môže byť neúspešné kvôli konkurencii alebo antagonizmu saprofytických organizmov, ktoré sa tiež často súčasne obohatia. Z tohto dôvodu môže byť izolácia R. solanacearum z kultúr obohatených v živných roztokoch ťažká. Okrem toho, keďže sa môžu zvýšiť populácie sérologicky príbuzných saprofytov, ak sa má použiť test ELISA, odporúča sa prednostné použitie osobitných monoklonálnych protilátok pred polyklonálnymi protilátkami.

4.2.1. Pri obohacovaní pre test PCR preneste 100 µl extraktu zo vzorky do 10 ml obohateného živného roztoku (dodatok 2), ktorý ste predtým primerane rozdelili do skúmaviek alebo fliaš bez DNA. Pri obohacovaní pre test ELISA sa môžu použiť vyššie pomery extraktu zo vzorky k živnému roztoku (napr. 100 µl v 1,0 ml obohateného živného roztoku).

4.2.2. Inkubujte 72 hodín a pri teplote 27 až 30 °C v trepačke alebo staticky s uvoľneným uzáverom, aby bol prístup vzduchu.

4.2.3. Pred použitím v testoch ELISA alebo PCR dôkladne premiešajte.

4.2.4. Obohatený živný roztok pripravte rovnakým spôsobom ako vzorku(-y) vo vyššie uvedených testoch.

Poznámka: Ak sa očakáva inhibícia obohacovania R. solanacearum kvôli vysokým populáciám určitých konkurenčných saprofytických baktérií, lepšie výsledky sa dajú dosiahnuť obohatením extraktu vzorky pred akýmkoľvek odstredením alebo inými spôsobmi koncentrácie.

5. Test IF

Princíp

Použitie testu IF ako hlavného skríningového testu sa odporúča, pretože je dokázaná jeho účinnosť pri dosahovaní požadovaných prahových hodnôt.

Keď sa ako hlavný skríningový test použije test IF a vyhodnotenie je pozitívne, musia sa urobiť testy PCR alebo FISH alebo izolačný test ako druhý skríningový test. Keď sa test IF použije ako druhý skríningový test a odčítavanie IF je pozitívne, na úplnú analýzu sa vyžaduje ďalšie testovanie podľa vývojového diagramu.

Poznámka: Používajte validovaný zdroj protilátok R. solanacearum (pozri internetovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Odporúča sa, aby sa pre každú novú dávku protilátok stanovil titer. Titer sa definuje ako najvyššie riedenie, pri ktorom sa pri testovaní suspenzie obsahujúcej 105 to 106 buniek na 1 ml homológneho kmeňa R. solanacearum a s použitím vhodného konjugátu fluorescenčného izotiokyanátu (FITC) podľa pokynov výrobcu, dosahuje optimálna reakcia. Všetky validované polyklonálne antiséra mali titer IF najmenej 1:2 000. Počas testovania by sa mali používať protilátky v pracovnom riedení(-iach) blízkom alebo na úrovni titra.

Test by sa mal urobiť s čerstvo pripravenými extraktmi zo vzoriek. V prípade potreby sa môže úspešne urobiť aj s extraktmi skladovanými pri teplote –68až–86 °C v glyceríne. Glycerín sa môže zo vzorky odstrániť pridaním 1 ml peletového pufra (dodatok 4), opakovaným odstredením počas 15 minút pri odstredivej sile 7 000 g a resuspenzii v rovnakom objeme peletového pufra. Toto však často nie je potrebné, najmä ak sú vzorky fixované na podložné sklíčka flambovaním.

Pripravte samostatné podložné sklíčka s pozitívnou kontrolou z homológneho kmeňa alebo akéhokoľvek iného referenčného kmeňa R. solanacearum, suspendovaného v extrakte zo zemiaka ako je špecifikované v dodatku 3B, a podľa želania v pufri.

Ak je to možné, ako obdobná kontrola by sa na tom istom sklíčku malo použiť prirodzene infikované pletivo (udržiavané lyofilizáciou alebo zmrazením pri teplote –16až–24 °C.

Ako negatívna kontrola sa môžu použiť alikvotné podiely extraktu vzorky, ktorá sa predtým testovala na R. solanacearum s negatívnym výsledkom.

Štandardné pozitívne a negatívne kontrolné materiály, ktoré sú k dispozícii na použitie pri tomto teste, sa uvádzajú v dodatku 3.

Použite viacobjektové podložné sklíčka, najlepšie s 10 jamkami s minimálnym priemerom 6 mm.

Kontrolný materiál testujte rovnakým spôsobom ako vzorku(-y).

5.1. Podložné sklíčka pripravte jedným z nasledujúcich postupov:

i) Pri peletoch s relatívne malým sedimentom škrobu: Pipetou naneste odmeraný štandardný objem (15 µl postačuje pre jamku s priemerom 6 mm – pri väčších jamkách treba použiť primerane väčší objem) riedenia 1/100 resuspendovaného zemiakového peletu do prvej jamky. Potom do zostávajúcich jamiek v rade pipetou naneste rovnaký objem neriedeného peletu (1/1). Ďalší rad sa môže použiť ako duplikát alebo pre druhú vzorku, ako je znázornené na obr. 1.

ii) Pri ostatných peletoch: Pripravte desatinné riedenia (1/10, 1/100) resuspendovaného peletu v peletovom pufri. Pipetou naneste odmeraný štandardný objem (15 µl postačuje pre jamku s priemerom 6 mm – pri väčších jamkách treba použiť primerane väčší objem) resuspendovaného peletu a každého riedenia do radu jamiek. Ďalší rad sa môže použiť ako duplikát alebo pre druhú vzorku, ako je znázornené na obr. 2.

5.2. Kvapky nechajte vyschnúť pri izbovej teplote alebo ohrievaním pri teplote 40 až 45 °C. Baktériové bunky fixujte na podložné sklíčko buď ohrievaním (15 minút pri teplote 60 °C), flambovaním, 95 % etanolom alebo podľa osobitných pokynov od dodávateľa protilátok.

V prípade potreby sa fixované podložné sklíčka pred ďalším testovaním môžu skladovať čo najkratšie (najviac 3 mesiace) zmrazené vo vysušenom boxe.

5.3. Postup pri teste IF

i) Pri príprave podložného sklíčka podľa 5.1.i): Pripravte sadu dvojnásobných riedení. Prvá jamka by mala obsahovať 1/2 titra (T/2), ostatné 1/4 titra (T/4), 1/2 titra (T/2), titer (T) a dvojnásobok titra (2T).

ii) Pri príprave podložného sklíčka podľa 5.1.ii): Pripravte pracovné riedenie (PR) protilátky v pufri IF. Pracovné riedenie ovplyvňuje špecifickosť.

Obrázok 1 Príprava podložného sklíčka postupom podľa 5.1.i) a 5.3.i)

Riedenia resuspendovaného peletu 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Riedenie resuspendovaného peletu (T = titer) T/2 T/4 T/2 T 2T  Dvojnásobné riedenia antisérum/protilátka Vzorka 1 1 2 3 4 5 Duplikát vzorky 1 alebo vzorka 2 6 7 8 9 10





Obrázok 2 Príprava podložného sklíčka postupom podľa 5.1.ii) a 5.3.ii)

Pracovné riedenie antiséra/protilátky 1/1 1/10 1/100 prázdna prázdna  Desatinné riedenie resuspendovaného peletu Vzorka 1 1 2 3 4 5 Duplikát vzorky 1 alebo vzorka 2 6 7 8 9 10

5.3.1. Podložné sklíčka položte na vlhký hodvábny papier. Všetky testovacie jamky úplne pokryte riedeniami antiséra. Objem antiséra naneseného na každú jamku musí minimálne zodpovedať objemu naneseného extraktu.

Nasledujúci postup by sa mal vykonať v prípade, že chýbajú osobitné pokyny výrobcov protilátok:

5.3.2. Podložné sklíčka inkubujte 30 minút zakryté na vlhkom papieri pri izbovej teplote (18 až 25 °C).

5.3.3. Kvapky z každého podložného sklíčka opatrne straste a opláchnite pufrom IF. Preplachujte ponorené 5 minút v roztoku pufra IF-Tween (dodatok 4) a potom v pufri IF. Zabráňte rozprašovaniu alebo kvapkaniu, ktoré by mohli spôsobiť krížovú kontamináciu. Prebytočnú vlhkosť starostlivo odstráňte jemným odsatím pijavým papierom.

5.3.4. Podložné sklíčka položte na vlhký papier. Testovacie jamky pokryte riedením konjugátu FITC použitím na stanovenie titra. Objem konjugátu naneseného na jamky musí presne zodpovedať objemu nanesenej protilátky.

5.3.5. Podložné sklíčka inkubujte zakryté na vlhkom papieri 30 minút pri izbovej teplote (18 až 25 °C).

5.3.6. Kvapky konjugátu opatrne straste z podložného sklíčka. Opláchnite a preplachujte rovnako ako v bode 5.3.3.

Dôkladne odstráňte prebytočnú vlhkosť.

5.3.7. Na každú jamku napipetujte 5 až 10 µl 0,1M glycerínu pufrovaného fosfátom (dodatok 4) alebo inou komerčnou krycou kvapalinou na udržanie signálu a priložte krycie sklíčko.

5.4. Hodnotenie testu IF

5.4.1. Podložné sklíčka prehliadnite pod epifluorescenčným mikroskopom s filtrami vhodnými na excitáciu FITC pod olejovou alebo vodnou imerziou pri zväčšení 500 až 1 000-krát. Každú jamku mikroskopicky prehliadnite vo dvoch navzájom kolmých priemeroch a aj po obvode. Pri vzorkách, v ktorých sa nenachádzajú žiadne bunky alebo len malý počet buniek, pozorujte aspoň 40 mikroskopických políčok.

Najprv skontrolujte podložné sklíčka s pozitívnou kontrolou. Bunky musia pri titrovaní stanovenou protilátkou alebo pracovným riedením jasne fluoreskovať a byť úplne sfarbené. Pri odlišnom sfarbení sa musí test IF (oddiel VI.A.5) zopakovať.

5.4.2. V testovacích jamkách podložných sklíčok pozorujte jasne fluoreskujúce bunky s charakteristickou morfológiou R. solanacearum (pozri internetovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intenzita fluorescencie musí zodpovedať pozitívnemu kontrolnému kmeňu pri rovnakom riedení antiséra. Bunky s neúplným sfarbením alebo so slabou fluorescenciou sa neberú do úvahy.

Ak je akékoľvek podozrenie na kontámináciu, test sa musí zopakovať. Môže to byť v prípade, keď sa na všetkých podložných sklíčkach vo vzorke nájdu pozitívne bunky kvôli kontaminácii pufra, alebo ak sa pozitívne bunky nájdu (mimo jamiek na podložnom sklíčku) na krycom sklíčku.

5.4.3. So špecifickosťou imunofluorescenčného testu sa spája niekoľko problémov. Nežiaduce populácie fluoreskujúcich buniek s netypickou morfológiou a saprofytické baktérie spôsobujúce krížovú reakciu a podobnou veľkosťou a morfológiou ako R. solanacearum sa zvyčajne vyskytujú v peletoch výrezkov z pupkových koncov a segmentov stonky.

5.4.4. Pri titrovaní alebo pracovnom riedení protilátok ako sa uvádza v bode 5.3 berte do úvahy len fluoreskujúce bunky s typickou veľkosťou a morfológiou.

5.4.5. Vyhodnotenie výsledkov testu IF:

i) Ak sa nájdu jasne fluoreskujúce bunky s charakteristickou morfológiou, stanovte priemerný počet typických buniek na mikroskopické políčko a vypočítajte počet typických buniek na 1 ml resuspendovaného peletu (dodatok 5). Výsledok testu IF je pozitívny pri vzorkách s počtom najmenej 5 × 103 typických buniek na 1 ml resuspendovaného peletu. Vzorka sa považuje za potenciálne kontaminovanú a vyžaduje sa ďalšie testovanie.

ii) Výsledok testu IF je negatívny pri vzorkách s menším počtom ako 5 × 103 buniek na 1 ml resuspendovaného peletu a vzorka sa považuje za negatívnu. Ďalšie testovanie sa nevyžaduje.

6. TESTY PCR

Princípy

Keď sa PCR použije ako hlavný skríningový test a je pozitívny, musí sa urobiť izolačný test alebo IF ako druhý povinný skríningový test. Keď sa PCR použije ako druhý skríningový test a je pozitívny, na úplnú diagnostiku sa vyžaduje ďalšie testovanie podľa vývojového diagramu.

Úplné využitie tejto metódy ako hlavného skríningového testu sa odporúča iba v prípade špecializovanej odbornosti.

Poznámka: Predbežné testovanie touto metódou by malo umožniť opakovateľné určenie prítomnosti 103 až 104 buniek R. solanacearum na 1 ml pridaných do extraktov vzoriek, ktoré boli predtým testované s negatívnym výsledkom. Na dosiahnutie maximálnej citlivosti a špecifickosti sa môže vo všetkých laboratóriách vyžadovať optimalizácia experimentov.

Použite validované činidlá a protokoly pre testy PCR (pozri dodatok 6). Prednostne si zvoľte metódu s vnútornou kontrolou.

Prijmite všetky opatrenia na vylúčenie kontaminácie vzorky cieľovou DNA. Test PCR by mali uskutočniť skúsení technici v laboratóriách na molekulárnu biológiu, aby sa na minimum obmedzila možnosť kontaminácie cieľovou DNA.

S negatívnou kontrolou (extrakcie DNA a postupov PCR) by sa malo vždy pracovať ako s poslednou vzorkou celého postupu, aby bolo zrejmé, či sa vyskytol nejaký prenos DNA.

Test PCR by mal zahŕňať túto negatívnu kontrolu:

— extrakt zo vzorky, ktorá bola predtým testovaná na R. solanacearum s negatívnym výsledkom,

— kontrolné pufre použité na extrahovanie baktérie a DNA zo vzorky,

— reakčná zmes pre PCR.

Zahrnutá by mala byť táto pozitívna kontrola:

— alikvotné podiely resuspendovaných peletov, do ktorých sa pridala R. solanacearum (prípravu pozri v dodatku 3 B),

— suspenzia 106 buniek na 1 ml R. solanacearum vo vode z virulentného izolátu (napr. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; pozri dodatok 3 B),

— ak je to možné, použite aj DNA extrahovanú z pozitívnych kontrolných vzoriek pri teste PCR.

Aby sa vylúčila možnosť kontaminácie, pozitívne kontroly pripravujte v prostredí oddelenom od vzoriek, ktoré sa majú testovať.

Extrakty zo vzoriek by mali byť čo najdôkladnejšie zbavené zeminy. Preto ak sa použijú protokoly testu PCR, je v určitých prípadoch vhodné pripravovať extrakty z umytých zemiakov.

Štandardný pozitívny a negatívny kontrolný materiál, ktorý je k dispozícii na použitie pri tomto teste, sa uvádza v dodatku 3.

6.1. Metódy čistenia DNA

Použite vyššie uvedené pozitívne a negatívne kontrolné vzorky (pozri dodatok 3).

Kontrolný materiál testujte rovnakým spôsobom ako vzorku(-y).

K dispozícii je viacero metód čistenia cieľovej DNA zo substrátov komplexných vzoriek, čím sa odstránia inhibítory PCR a iné enzymatické reakcie a skoncentruje sa cieľová DNA v extrakte vzorky. Na použitie pri validovaných metódach PCR, ktoré sú uvedené v dodatku 6, sa optimalizovala nasledujúca metóda.

a) Metóda podľa Pastrika (2000)

1. Pipetou naneste 220 µl lyzovacieho pufra [100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] do Eppendorfovej skúmavky s objemom 1,5 ml.

2. Pridajte 100 µl extraktu vzorky a umiestnite na 10 minút do ohrievacieho bloku alebo do vodného kúpeľa s teplotou 95 °C.

3. Skúmavku premiestnite na 5 minút na ľad.

4. Pridajte 80 µl koncentrovaného roztoku lyzozýmu (50 mg lyzozýmu na 1 ml v 10 mM Tris HCl, pH 8,0) a inkubujte 30 minút pri teplote 37 °C.

5. Pridajte 220 µl roztoku Easy DNA® solution A (Invitrogen), dobre pretrepte a 30 minút inkubujte pri teplote 65 °C.

6. Pridajte 100 µl roztoku Easy DNA® solution B (Invitrogen), dôkladne pretrepte, až kým precipitát voľne nepláva v skúmavke a vzorka nemá jednotnú viskozitu.

7. Pridajte 500 µl chloroformu a pretrepávajte, až kým viskozita klesne a zmes nie je homogénna.

8. Odstreďujte 20 minút pri odstredivej sile 15 000 g pri teplote 4 °C, aby sa oddelili fázy a vytvorilo sa rozhranie.

9. Hornú fázu premiestnite do čistej Eppendorfovej skúmavky.

10. Pridajte 1 ml 100 % etanolu (–20 °C), krátko pretrepte a inkubujte na ľade 10 minút.

11. Odstreďujte 20 minút pri odstredivej rýchlosti 15 000 g pri teplote 4 °C a odstráňte etanol z peletu.

12. Pridajte 500 µl 80 % etanolu (–20 °C) a premiešajte otočením skúmavky hore dnom.

13. Odstreďujte 10 minút pri odstredivej rýchlosti 15 000 g pri teplote 4 °C, zachyťte pelet a odstráňte etanol.

14. Pelet nechajte vyschnúť na vzduchu alebo v DNA Speed Vac.

15. Resuspendujte pelet v 100 µl sterilnej ultračistej vody (UPW) a nechajte stáť pri izbovej teplote najmenej 20 minút.

16. Do použitia na test PCR skladujte pri teplote –20 °C.

17. Odstredením odstráňte všetok biely precipitát a na test PCR použite 5 µl supernatantu obsahujúceho DNA.

b) Iné metódy

Iné metódy extrakcie DNA, napr. súprava Qiagen DNeasy Plant Kit, by sa mohli použiť za podmienky, že sa dokáže, že sú rovnako účinné pri čistení DNA z kontrolných vzoriek obsahujúcich 103 až 104 buniek patogénu na 1 ml.

6.2. Test PCR

6.2.1. Podľa validovaných protokolov pripravte pre test PCR testovacie a kontrolné matrice (oddiel VI.A.6). Pripravte jedno desatinné riedenie extraktu zo vzorky DNA (1:10 v UPW).

6.2.2. Podľa uverejnených protokolov (dodatok 6) pripravte v prostredí, v ktorom nedôjde ku kontaminácii, pre test PCR vhodnú reakčnú zmes. Odporúča sa v prípade, ak to je možné, používať viacnásobný protokol PCR, ktorý obsahuje aj vnútornú kontrolu testu PCR.

6.2.3. Podľa protokolov PCR (pozri dodatok 6) pridajte do sterilných PCR skúmaviek 2 až 5 µl extraktu DNA na 25 µl reakčnej zmesi pre PCR.

6.2.4. Vytvorte negatívnu kontrolnú vzorku obsahujúcu iba reakčnú zmes PCR a namiesto vzorky pridajte ultračistú vodu (UPW) z toho istého zdroja, ktorý ste použili pri zmesi PCR.

6.2.5. Skúmavky umiestnite do toho istého termocykléra, ktorý sa použil pri predbežnom testovaní, a spustite vhodne optimalizovaný program PCR (dodatok 6).

6.3. Analýza produktu PCR

6.3.1. Dekódujte amplikóny PCR agarózovou gélovou elektroforézou. Elektroforézu vykonajte na aspoň 12 µl zosilnenej reakčnej zmesi DNA z každej vzorky zmiešanej s 3 µl nanášacieho pufra (dodatok 6) v 2,0 % (hmotnosť/objem) agarózového gélu v tris-octanovom-EDTA pufri (TAE) (dodatok 6) pri napätí 5 až 8 V/cm. Použite vhodný markér DNA, napr. 100 bp ladder.

6.3.2. Zviditeľnite pásiky DNA sfarbením pomocou etidiumbromidu (0,5 mg/l) počas 30 až 60 minút, pričom pri manipulácii s touto mutagénnou látkou je potrebné použiť ochranné opatrenia.

6.3.3. V sfarbenom géle pozorujte krátkovlnnou ultrafialovou transilumináciou (λ = 302 nm) zosilnené produkty PCR predpokladanej veľkosti (dodatok 6) a zdokumentujte ich.

6.3.4. Pri všetkých nových zisteniach/prípadoch si overte autentickosť amplikónu PCR pomocou analýzy reštrikčných enzýmov na vzorke zvyšnej zosilnenej DNA inkubovaním pri optimálnej teplote a optimálne dlhý čas s vhodným enzýmom a pufrom (pozri dodatok 6). Digerované fragmenty oddeľte agarózovou gélovou elektroforézou ako prv a sledujte charakteristický vzor reštrikčného fragmentu pri ultrafialovej transiluminácii po sfarbení etidium bromidom a porovnajte s digerovanou a nedigerovanou pozitívnou kontrolou.

Vyhodnotenie výsledku testu PCR

Test PCR je negatívny, ak v príslušnej vzorke nebol zistený špecifický amplikón PCR R. solanacearum očakávanej veľkosti, ale zistí sa vo všetkých pozitívnych kontrolných vzorkách (v prípade viacnásobných testov PCR so špecifickými rastlinnými vnútornými kontrolnými primermi: druhý produkt PCR predpokladanej veľkosti sa musí zosilniť príslušnou vzorkou).

Test PCR je pozitívny, ak sa zistí špecifický amplicon PCR R. solanacearum s predpokladanou veľkosťou a reštrikčným vzorom (ak sa vyžaduje), za podmienky, že sa nezosilňuje zo žiadnej negatívnej kontrolnej vzorky. Spoľahlivé potvrdenie pozitívneho výsledku sa dosiahne aj opakovaním testu s druhou sadou primerov PCR (dodatok 6).

Poznámka: Ak sa z pozitívnej kontrolnej vzorky obsahujúcej R. solanacearum vo vode získa predpokladaný amplicon, ale z pozitívnych kontrol s R. solanacearum v extrakte zo zemiaka sa získajú negatívne výsledky, môže byť podozrenie na inhibíciu PCR. Pri viacnásobných protokoloch PCR s vnútornými kontrolami sa inhibícia reakcie indikuje, ak sa nezíska žiadny z týchto dvoch amplikónov.

Podozrenie na kontamináciu môže byť aj vtedy, ak sa predpokladaný amplicon získa z jednej alebo viacerých negatívnych kontrol.

7. Test FISH

Princíp

Keď sa test FISH použije ako prvý skríningový test a zistí sa, že je pozitívny, musí sa ako druhý povinný skríningový test vykonať izolačný test alebo test IF. Keď sa test FISH použije ako druhý skríningový test a zistí sa, že je pozitívny, na stanovenie úplnej diagnózy sa vyžaduje ďalšie testovanie podľa vývojového diagramu.

Poznámka: Použite validované špecifické oligopróby pre R. solanacearum (pozri dodatok 7). Predbežné testovanie touto metódou by malo umožniť opakovateľné určenie prítomnosti najmenej 103 až 104 buniek R. solanacearum na 1 ml pridaných do extraktov vzoriek, ktoré boli predtým testované s negatívnym výsledkom.

Nasledujúce postupy by sa mali prednostne vykonávať na čerstvo pripravených extraktoch zo vzoriek, ale úspešne sa môžu použiť aj pri extrakte zo vzorky, ktorý sa skladoval v glyceríne pri teplote od –16 do –24 °Calebo od –68 do –86 °C.

Ako negatívnu kontrolu použite alikvotný podiel extraktu vzorky, ktorá bola predtým testovaná na R. solanacearum s negatívnym výsledkom.

Ako pozitívne kontroly si pripravte suspenzie obsahujúce na 1 ml 105 až 106 buniek R. solanacearum biovar 2 (napr. kmeň NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, pozri dodatok 3) v 0,01M fosfátového pufra (PB) z 3 až 5-dňovej kultúry. Samostatne pripravte podložné sklíčka s pozitívnou kontrolou z homologického kmeňa alebo akéhokoľvek iného referenčného kmeňa R. solanacearum suspendovanou v extrakte zo zemiaka podľa špecifikácie v dodatku 3B.

Použitie eubaktériovej oligopróby s označením FITC umožňuje kontrolu procesu hybridizácie, pretože sfarbí všetky eubaktérie, ktoré sú prítomné vo vzorke.

Štandardný pozitívny a negatívny kontrolný materiál, ktorý je k dispozícii na použitie pri tomto teste, sa uvádza v dodatku 3 bode A.

Kontrolný materiál testujte presne tým istým spôsobom ako vzorku(-y).

7.1. Fixácia extraktu zo zemiaka

Tento protokol je podľa Wullings et al. (1998):

7.1.1. Pripravte fixačný roztok (pozri dodatok 7).

7.1.2. Pipetou preneste 100 µl každého extraktu zo vzorky do Eppendorfovej skúmavky a 7 minút odstreďujte pri odstredivej sile 7 000 g.

7.1.3. Dekantujte supernatant a rozpustite pelet v 200 µl fixatívu pripraveného < 24 hodín vopred. Pretrepte a 1 hodinu inkubujte v chladničke.

7.1.4. Odstreďujte 7 minút pri odstredivej rýchlosti 7 000 g, dekantujte supernatant a resuspendujte pelet v 75 µl 0,01M PB (pozri dodatok 7).

7.1.5. Naneste 16 µl zafixovanej suspenzie na čisté viacobjektové podložné sklíčko podľa obr. 7.1. Na každé podložné sklíčko naneste 2 rôzne nezriedené vzorky a použite 10 µl na prípravu roztoku 1:100 (v 0,01 M PB). Zvyšná vzorka roztoku (49 µl) sa po pridaní 1 objemovej jednotky 96 % etanolu môže skladovať pri teplote –20 °C. V prípade, že sa skúška FISH musí opakovať, odstráňte etanol odstredením a pridajte rovnaký objem 0,01 PB (zmiešajte pretrepaním).

Obr. 7.1 Schéma podložného sklíčka pri teste FISH

Vzorka 1 Prázdna Prázdna Prázdna Vzorka 2 jamka 1 jamka 2 jamka 3 jamka 4 jamka 5 Vzorka 1 Prázdna Prázdna Prázdna Vzorka 2 jamka 6 jamka 7 jamka 8 jamka 9 jamka 10 Krycie sklíčko 1 Krycie sklíčko 2

7.1.6. Podložné sklíčka osušte na vzduchu (alebo v sušičke pri teplote 37 °C) a zafixujte ich flambovaním.

V tomto štádiu sa proces môže prerušiť a hybridizácia môže pokračovať nasledujúci deň. Podložné sklíčka by sa mali skladovať v bezprašnom prostredí, v suchu a pri izbovej teplote.

7.2. Hybridizácia

7.2.1. Bunky dehydrujte ich postupným ponorením do 50 %, 80 % a 96 % etanolu, do každého na 1 minútu. Podložné sklíčka osušte na vzduchu umiestnené v stojane.

7.2.2. Pripravte vlhkú inkubačnú komoru tak, že dno vzduchotesnej nádoby prikryjete hodvábnym alebo filtrovacím papierom nasiaknutým hybmixom 1x (dodatok 7). Box predinkubujte v hybridizačnej peci pri teplote 45 °C najmenej 10 minút.

7.2.3. Do 8 jamiek každého podložného sklíčka (jamky 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 a 10; pozri obr. 7.1) dajte 10 μl hybridizačného roztoku (dodatok 7) a dve stredné jamky (3 a 8) nechajte prázdne.

7.2.4. Na prvé a posledné 4 jamky priložte krycie sklíčka (24 × 24 mm) tak, aby v nich nezostal vzduch. Podložné sklíčka vložte do predhriatej vlhkej komory a 5 hodín hybridizujte v tme v peci pri teplote 45 °C.

7.2.5. Pripravte 3 kadičky obsahujúce 1 l vody Mili Q (molekulárny gradient), 1 l hybmixu 1x (334 ml 3x hybmixu a 666 ml vody Mili Q) a 1 l hybmixu 1/8x (42 ml 3x hybmixu a 958 ml vody Mili Q). Každú kadičku predinkubujte vo vodnom kúpeli pri teplote 45 °C.

7.2.6. Z podložných sklíčok odložte krycie sklíčka a podložné sklíčka umiestnite do stojana.

7.2.7. Prebytočnú sondu vyplavte inkubovaním 15 minút v kadičke s hybromixom 1x pri teplote 45 °C.

7.2.8. Držiak s podložnými sklíčkami premiestnite do premývacieho roztoku hybmixu 1/8x a inkubujte ďalších 15 minút.

7.2.9. Podložné sklíčka krátko ponorte do vody Mili Q a položte ich na filtrovací papier. Prebytočnú vodu odstráňte jemným priložením filtrovacieho papiera na povrch. Pipetou pridajte do každej jamky 5 až 10 μl roztoku krycej kvapaliny na udržanie signálu (napr. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA alebo rovnocennú) a na celé podložné sklíčko priložte veľké krycie sklíčko (24 × 60 mm).

7.3. Vyhodnotenie výsledkov testu FISH

7.3.1. Podložné sklíčka okamžite prehliadnite pod vhodným epifluorescenčným mikroskopom s olejovou imerziou pri 630- alebo 1 000-násobnom zväčšení. S filtrom, ktorý je vhodný na fluorescenčný izotiokyanát (FITC), sú eubaktériové bunky (vrátane väčšiny gram-negatívnych buniek) vo vzorke sfarbené a fluoreskujú na zeleno. Ak sa použije filter na tetrametylrodamín-5-izotiokyanát, bunky R. solanacearum sfarbené Cy3 fluoreskujú na červeno. Morfológiu buniek porovnajte s morfológiou pozitívnej kontroly. Bunky musia jasno fluoreskovať a byť úplne sfarbené. Ak je sfarbenie odchylné, test FISH (oddiel VI.A.7) sa musí zopakovať. Jamky prehliadnite vo dvoch navzájom kolmých priemeroch a po obvode. Pri vzorkách vykazujúcich malý počet buniek alebo nevykazujúcich žiadne bunky prehliadnite najmenej 40 mikroskopických políčok.

7.3.2. V testovacích jamkách testovacích podložných sklíčok (pozri internetovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main) pozorujte jasne fluoreskujúce bunky s charakteristickou morfológiou R. solanacearum. Intenzita fluorescencie musí byť rovnaká alebo vyššia ako fluorescencia kmeňa pozitívnej kontroly. Bunky s neúplným sfarbením alebo slabou fluorescenciou sa neberú do úvahy.

7.3.3. Ak je akékoľvek podozrenie na kontamináciu, test sa musí zopakovať. Môže to byť v prípade, keď sa na všetkých podložných sklíčkach v dávke nachádzajú pozitívne bunky kvôli kontaminácii pufra, alebo ak sa pozitívne bunky zistia (mimo jamiek) na podložných sklíčkach.

7.3.4. So špecifickosťou testu FISH sa spája niekoľko problémov. Vo výrezkoch z pupkových koncov hľúz a v peletoch zo segmentov stonky sa môžu vyskytnúť nežiadúce populácie fluoreskujúcich buniek s netypickou morfológiou a saprofytické baktérie s krížovou reakciou podobnej veľkosti a morfológie ako R. solanacearum, hoci zriedkavejšie ako pri teste IF.

7.3.5. Do úvahy vezmite len fluoreskujúce bunky s typickou veľkosťou a morfológiou.

7.3.6. Vyhodnotenie výsledkov testu FISH:

i) Platné výsledky testu FISH sa dosiahnu, ak sa s použitím filtra FITC pozorujú jasne zelené fluoreskujúce bunky s veľkosťou a morfológiou typickou pre R. solanacearum a rhodaminového filtra červené fluoreskujúce bunky vo všetkých pozitívnych kontrolách, ale v žiadnej negatívnej kontrole. Ak sa zistia jasné fluoreskujúce bunky s charakteristickou morfológiou, odhadnite priemerný počet typických buniek na mikroskopické políčko a vypočítajte počet typických buniek na 1 ml resuspendovaného peletu (dodatok 4). Vzorky s najmenej 5 × 103 typických buniek na 1 ml resuspendovaného peletu sa považujú za potenciálne kontaminované. Vyžaduje sa ďalšie testovanie. Vzorky s menej ako 5 × 103 typických buniek na 1 ml resuspendovaného peletu sa považujú za negatívne.

ii) Test FISH je negatívny, ak sa pomocou rodamínového filtra nezistia jasnočervené fluoreskujúce bunky s veľkosťou a morfológiou typickou pre R. solanacearum za predpokladu, že v pozitívnych kontrolných preparátoch sa s použitím rodamínového filtra pozorujú typické jasnočervené fluoreskujúce bunky.

8. Testy ELISA

Princíp

Test ELISA sa môže používať len ako nepovinný test popri teste IF, PCR alebo FISH z dôvodu relatívne nízkej citlivosti tohto testu. Pri použití testu DAS ELISA je obohacovanie a použitie monoklónnych protilátok povinné (pozri internetovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Obohacovanie vzoriek pred použitím testu ELISA môže byť užitočné z dôvodu zvýšenia citlivosti testu, ale môže byť neúspešné v dôsledku konkurenčného pôsobenia iných organizmov vo vzorke.

Poznámka: Použite validovaný zdroj protilátok pre R. solanacearum (pozri internetovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Odporúča sa, aby sa pre každú novú dávku protilátok určil titer. Titer sa definuje ako najvyššie riedenie pri ktorom sa optimálne reakcie objavujú, keď sa testuje suspenzia obsahujúca105 až 106 buniek na ml homologického kmeňa R. solanacearum a keď sa použijú primerané sekundárne protilátkové konjugáty podľa odporúčaní výrobcu. Počas testovania by sa protilátky mali použiť v pracovnom riedení podobnom titri alebo v titri komerčnej receptúry.

Na suspenzii s 105 až 106 bunkami na ml homologického kmeňa R. solanacearum určite titer protilátok.

Zahrňte extrakt vzorky, ktorá bola pri predchádzajúcom teste na R. solanacearum negatívna a suspenziu baktérie, pri ktorej nedochádza k vzájomným reakciám vo fosfátovom pufrovanom roztoku (STP), ako negatívne kontroly.

Ako pozitívnu kontrolu použite alikvotný podiel vzorkového extraktu, ktorý bol pri predchádzajúcom teste negatívny, zmiešajte ho s 103 až 104 bunkami na ml biovaru 2 R. solanacearum (napr. kmeň NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, pozri dodatok 2A a B). Na porovnanie výsledkov na každej platni použite štandardnú suspenziu z 105 až 106 buniek na ml vo fosfátovom pufrovanom roztoku (STP) R. solanacearum. Zabezpečte, aby boli pozitívne kontroly dobre oddelené na mikrotitračnej platni od testovanej vzorky (vzoriek).

Normalizované kontrolné materiály pre pozitívne a negatívne kontroly, ktoré sú dostupné pre tento test, sa uvádzajú v dodatku 3 bode A.

Kontrolný materiál otestujte úplne rovnakým spôsobom ako pri vzorke/vzorkách.

Boli validované dva ELISA protokoly.

a) Nepriamy test ELISA (Robinson Smith a kol., 1995)

1. Použite 100 – 200 µl alikvotného podielu vzorkového extraktu. (Zahriatím na 100 °C na 4 minúty vo vodnom kúpeli alebo zahrievacom bloku môžete v niektorých prípadoch znížiť nešpecifické výsledky).

2. Pridajte alikvotný objem dvojnásobne silného krycieho pufra (dodatok 4) a premiešajte.

3. Použite 100 µl alikvotného podielu pre každú z najmenej 2 jamiek mikrotitračnej platne (napr. Nunc-Polysorp alebo ekvivalent) a inkubujte 1 hodinu pri teplote 37 °C alebo cez noc pri teplote 4 °C.

4. Extrakty z jamiek celkom odstráňte. Jamky vymyte trikrát fosfátovým pufrom (PBS) s tvínom (dodatok 4), pričom by posledný premývací roztok mal v jamkách zostať aspoň 5 minút.

5. Pripravte vhodné riedenie protilátok pre R. solanacearum v blokačnom (protilátkovom) pufri (dodatok 4). Pre validované komerčné protilátky použite odporúčané riedenie (obyčajne s dvojnásobne vyššou koncentráciou ako má titer).

6. Pridajte 100 µl do každej jamky a inkubujte 1 hodinu pri teplote 37 °C.

7. Z jamiek celkom odstráňte protilátkový roztok a umyte ich ako pri predchádzajúcom postupe (bod 4).

8. Pripravte vhodné riedenie sekundárneho konjugátu alkalickej fosfatázy v blokačnom pufri. Pridajte 100 µl do každej jamky a inkubujte 1 hodinu pri teplote 37 °C.

9. Z jamiek celkom odstráňte konjugátovú protilátku a umyte ich ako pri predchádzajúcom postupe (bod 4).

10. Do každej jamky pridajte 100 µl substrátového alkalického roztoku fosfatázy (dodatok 4). Inkubujte na tmavom mieste pri priaznivej teplote a absorbanciu odčítajte pri vlnovej dĺžke 405 nm v pravidelných intervaloch v rozsahu 90 min.

b) Test DASI ELISA

1. Pripravte primeraný roztok anti-R. solanacearum polykonálnych immunoglobulínov v krycom pufri pH 9,6 (dodatok 4). Pridajte 200 µl do každej jamky. Inkubujte pri teplote 37 °C počas 4 – 5 hodín alebo pri teplote 4 °C počas 16 hodín.

2. Jamky umyte trikrát s PBS-tvínom (dodatok 4). Pridajte 190 µl vzorkového extraktu do najmenej 2 jamiek. Pridajte tiež pozitívne a negatívne kontroly do dvoch jamiek na každej platni. Inkubujte 16 hodín pri teplote 4 °C.

3. Jamky umyte trikrát s PBS-tvínom (dodatok 4).

4. Pripravte vhodné riedenie R. solanacearum-špecifické monokolónne protilátky v PBS (dodatok 4), ktoré tiež obsahujú 0,5 % albumínu hovädzieho séra (BSA) a pridajte 190 µl do každej jamky. Inkubujte pri teplote 37 °C počas 2 hod.

5. Jamky umyte trikrát s PBS-tvínom (dodatok 4).

6. Pripravte vhodné riedenie protimyších imunoglobulínov konjugovaných s alkalickou fosfatázou v PBS. Pridajte 190 µl do každej jamky. Inkubujte pri teplote 37 °C počas 2 hod.

7. Jamky umyte trikrát s PBS-tvínom (dodatok 4).

8. Pripravte substrátový alkalický roztok fosfatázy obsahujúci 1 mg p-nitrofenylfosfátu na ml substrátového pufra (dodatok 4). Pridajte 200 µl do každej jamky. Inkubujte na tmavom mieste pri priaznivej teplote a absorbanciu odčítajte pri vlnovej dĺžke 405 nm v pravidelných intervaloch v rozsahu 90 min.

Vyhodnotenie výsledkov testu ELISA:

Test ELISA je negatívny, ak hodnota priemernej optickej hustoty (OH) z jamiek s duplikátom vzorky je < 2x OH kontrolnej jamky negatívneho vzorkového extraktu pod podmienkou, že OH pre pozitívne kontroly je vyššia ako 1,0 (po 90 minútach inkubácie so substrátom) a je väčšia ako dvojnásobná OH získaná pre negatívne vzorkové extrakty.

Test ELISA je pozitívny, ak priemerné hodnoty OH z jamiek s duplikátom vzorky sú > 2x OH v jamke s negatívny vzorkovým extraktom pod podmienkou, že OH hodnoty vo všetkých jamkách s negatívnou kontrolou sú < 2x OH hodnoty v jamkách s pozitívnou kontrolou.

Negatívne hodnoty testu ELISA v jamkách pre pozitívnu kontrolu naznačujú, že test nebol urobený správne alebo bol inhibovaný. Pozitívne hodnoty testu ELISA v jamkách pre negatívnu kontrolu naznačujú, že došlo ku vzájomnej kontaminácii alebo k nešpecifickej protilátkovej väzbe.

9. Biotest

Poznámka: Predbežné testovanie s touto metódou by malo umožniť reprodukovateľné zistenie 103 až 104 kolónotvorných jednotiek R. solanacearum na ml pridaných do vzorkových extraktov, ktoré boli v predchádzajúcich testoch negatívne (prípravu pozri v dodatku 3).

Najvyššiu citlivosť zistenia môžete očakávať, keď použijete čerstvo pripravený vzorkový extrakt a podmienky pre optimálny rast. Metóda sa však môže úspešne použiť pri extraktoch, ktoré boli uskladnené pod glycerínom pri teplote –68 to –86 °C.

Nasledujúci protokol vychádza z metódy podľa Jansea (1988):

9.1. Použite 10 testovacích rastlín a citlivý rajčiakový kultivar (napr. Moneymaker alebo kultivar s rovnakou citlivosťou, aká bola určená v testujúcom laboratóriu) v tretej skutočnej rastovej fáza pre každú vzorku. Ohľadom podrobností o kultivácii, pozri dodatok 8. Alternatívne použite baklažány (napr. kultivar Black Beauty alebo kultivary s rovnakou vnímavosťou), použite len rastliny v rastovej fáze 2 – 3 až do úplnej expanzie tretej skutočnej rastovej fázy. Symptómy sa prejavili ako menej vážne a ich vývoj v baklažáne je pomalší. V možných prípadoch sa preto odporúča použiť rajčiakové semenáče.

Medzi testované rastliny rozdelíme 100 µl vzorkového extraktu.

9.2.1. Naočkovanie injekčnou striekačkou

Stopky rastlín naočkujte presne nad klíčnymi listami pomocou injekčnej striekačky vybavenej hypodermickou ihlou (najmenej 23 G). Vzorku rozdeľte medzi testované rastliny.

9.2.2. Naočkovanie pozdĺžneho rezu

Rastlinu uchopte medzi dva prsty a napipetujte kvapku (asi 5 až 10 µl) rozptýleného peletu na stonku medzi klíčne listy a prvý list.

Skalpelom urobte do stonky priečny rez asi 1 cm dlhý, približne do hĺbky 2/3 hrúbky stonky, počnúc pri kvapke rozptýleného peletu.

Rez uzavrite sterilnou vazelínou z injekčnej striekačky.

9.3. Rovnakým postupom naočkujte 5 semenáčov s vodnou suspenziou 105 až 106 buniek na ml pripravenou zo 48 hodinovej kultúry virulentného kmeňa biovaru 2 R. solanacearum ako pozitívnou kontrolou a s pufrom peletu (dodatok 4) ako negatívnou kontrolou. Oddeľte rastliny s pozitívnou a negatívnou kontrolou od ostatných rastlín, aby nedochádzalo ku vzájomnej kontaminácii.

9.4. Testovacie rastliny pestujte v karanténnych zariadeniach najdlhšie 4 týždne pri teplote 25 – 30 °C a vysokej relatívnej vlhkosti s príslušným zalievaním, aby nedochádzalo k podmokaniu alebo vädnutiu v dôsledku nedostatku vody. Aby ste zabránili kontaminácii, inkubujte rastliny s pozitívnou a negatívnou kontrolou na jasne oddelených častiach v skleníku alebo v miestnosti na pestovanie, alebo v prípade obmedzeného priestoru, zabezpečte prísne oddelenie medzi jednotlivými postupmi. Ak musia byť rastliny na rôzne vzorky inkubované v tesnej blízkosti, oddeľte ich vhodnými clonami. Pri oplodňovaní, zalievaní, kontrole a iných manipuláciách musíte dávať veľký pozor, aby nedošlo ku vzájomnej kontaminácii. Je potrebné, aby sa skleníky a miestnosti na pestovanie udržiavali chránené pred pesticídami hmyzu, ktoré môžu preniesť baktériu zo vzorky na vzorku.

Pozorujte symptómy vädnutia, epinastie, chlorózy a/alebo zakrpatenia.

9.5. Izolujte od infikovaných rastlín (kapitola II.3) a určite vyčistené kultúry predpokladaného R. solanacearum (kapitola VI. B).

9.6. Ak po 3 týždňoch nepozorujete žiadne symptómy, uskutočnite IF/PCR/izoláciu na zmiešanej vzorke z centimetrových častí stonky každej testovanej rastliny, ktoré odoberiete nad miestom očkovania. Ak je test pozitívny, vykonajte riedenie na platničke (kapitola 4.1).

9.7. Určite akékoľvek vyčistené kultúry predpokladaného R. solanacearum (kapitola VI. B).

Zhodnotenie výsledkov biotestu

Platné výsledky biotestu získate, keď sa na rastlinách s pozitívnou kontrolou prejavujú typické symptómy, baktéria sa môže opätovne izolovať z týchto rastlín a neprejavujú sa žiadne symptómy pri negatívnych kontrolách.

Biotest je negatívny, ak testované rastliny nie sú infikované R. solanacearum a pod podmienkou, že R. solanacearum sa zistí pri pozitívnych kontrolách.

Biotest je pozitívny, ak sú testované rastliny nainfikované baktériou R. solanacearum.

B. IDENTIFIKAČNÉ TESTY

Pomocou najmenej dvoch z nasledujúcich testov založených na rozličných biologických princípoch identifikujte čisté kultúry izolátov predpokladaného R. solanacearum.

V potrebných prípadoch pre každý uskutočňovaný test zahrňte známe referenčné kmene (pozri dodatok 3).

1. Nutričné a enzymatické identifikačné testy

Určite nasledujúce fenotypické vlastnosti, ktoré sú všeobecne prítomné alebo neprítomné v R. solanacearum na základe metód podľa Lelliotta a Steada (1987), Klement a kol. (1990), Schaad (2001).

Test Očakávaný výsledok Produkcia fluoreskujúceho pigmentu – Prítomnosť poly-β-hydroxybutyratu + Oxidačno-fermentačný test (O/F) O+/F– Katalázová aktivita + Kováčov oxidačný test + Redukcia dusíka + Použitie citrátu + Rast pri 40 °C – Rast v 1 % NaCl + Rast v 2 % NaCl – Arginín dihydrolázová aktivita – Skvapalňovanie želatíny – Hydrolýza škrobu – Hydrolýza eskulínu – Produkcia levanu –

2. Test IF

2.1. Pripravte suspenziu približne z 106 buniek na ml v pufri IF (dodatok 4).

2.2. Pripravte sériu dvojnásobného riedenia príslušného antiséra (pozri internetovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3. Použite postup IF (kapitola VI.A.5).

2.4. Pozitívny test IF dosiahnete, ak je IF titer kultúry ekvivalentný s titrom pozitívnej kontroly.

3. Test ELISA

Poznámka: Ak robíte len 2 identifikačné testy, k tejto metóde nepoužite žiadny dodatočný serologický test.

3.1. Pripravte suspenziu z približne 108 buniek na ml v 1X STP (PBS) (dodatok 4).

3.2. Uskutočnite príslušný postup ELISA so špecifickou monoklonálnou protilátkou pre R. solanacearum.

3.3. Pozitívny test ELISA dosiahnete, ak hodnota testu ELISA získaná z kultúry je aspoň polovičná v porovnaní s hodnotou získanou pri pozitívnej kontrole.

4. Testy PCR

4.1. Pripravte suspenziu približne z 106 buniek na ml v sterilnej vode molekulárneho gradientu.

4.2. Zahrejte 100 µl bunkovej suspenzie v uzavretých skúmavkách 4 minúty v zahrievacom bloku alebo vo vriacom vodnom kúpeli pri teplote 100 °C. Vzorky môžete následne uložiť pri teplote –16 až –24 °C, až kým ich nebudete potrebovať.

4.3. Použite príslušné postupy PCR na zdôraznenie špecifických amplikónov R. solanacearum [napr. Seal a kol. (1993); Pastrik a Maiss (2000); Pastrik a kol. (2002); Boudazin a kol. (1999); Opina a kol. (1997), Weller a kol. (1999)].

4.4. Pozitívnu identifikáciu R. solanacearum dosiahnete, ak majú PCR amplikóny rovnakú veľkosť a vyznačujú sa rovnakým polymorfizmom s obmedzenou dĺžkou fragmentu.

5. Test FISH

5.1. Pripravte suspenziu približne z 106 buniek na ml v UPW.

5.2. Uskutočnite postupy FISH (kapitola VI.A.7) s najmenej dvomi R. solanacearum – špecifickými oligopróbami (dodatok 7).

5.3. Pozitívny test FISH dosiahnete, ak sa rovnaké reakcie dosiahnú pri kultúre aj pri pozitívnej kontrole.

6. Analýza mastných kyselín (FAP)

6.1. Kultúru pestujte na tryptikázovom sójovom agare (Oxoid) 48 hodín pri teplote 28 °C.

6.2. Uskutočnite príslušné postupy FAP (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3. Pozitívny test FAP dosiahnete, ak je profil predpokladanej kultúry totožný s profilom pozitívnej kontroly. Prítomnosť charakteristických mastných kyselín je 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH a 18:1 2OH a absencia 16:0 3OH je významným určovateľom Ralstonia sp.

7. Metódy pre charakterizáciu kmeňa

Charakterizácia kmeňa pomocou jednej z nasledujúcich metód sa odporúča pre každý nový prípad izolácie R. solanacearum.

V potrebných prípadoch zahrňte pre každý uskutočňovaný test známe referenčné kmene (pozri dodatok 3).

7.1. Určenie biovaru

R. solanacearum sa rozdeľuje do biovarov na základe schopnosti použiť a/alebo oxidovať tri disacharidy a tri alkoholy hexózy (Hayward, 1964 a Hayward a kol., 1990). Médiá rastu pre biovarový test sú popísané v dodatku 2. Test sa môže úspešne uskutočniť naočkovaním média vstreknutím čistých kultúr izolátov R. solanacearum a inkubovaním pri teplote 28 °C. Ak sa médiá rozdelia do sterilných platní s bunkovou kultúrou s 96 jamkami (200 µl na jamku), môžete pozorovať zmenu farby z olivovo zelenej na žltú v priebehu 72 hodín, ktorá znamená pozitívny výsledok testu.

Biovar 1 2 3 4 5 Použitie: Maltózy – + + – + Laktózy – + + – + D (+) Cellobiózy – + + – + Manitu – – + + + Sorbitu – – + + – Dulcitu – – + + –

Dodatočné testy diferencujú 2 sub-fenotypy biovaru

Biovar 2A (Celosvetové rozšírenie) Biovar 2A (Zistený v Čile a Kolumbii) Biovar 2T (Zistený v tropických oblastiach) Použitie trehalózy – + + Použitie mezo-inozitolu + – + Použitie ribózy D – – + Pektolytická aktivita (1) nízka nízka vysoká

7.2. Genomic fingerprinting

Molekulárna diferenciácia kmeňov v komplexe R. solanacearum sa môže dosiahnuť pomocou viacerých techník, vrátane:

7.2.1. analýzy polymorfizmu s obmedzenou dĺžkou fragmentov (RFLP) (Cook a kol., 1989);

7.2.2. opakovanej sekvencie PCR pomocou iniciátorov REP, BOX a ERIC (Louws a kol., 1995; Smith a kol., 1995);

7.2.3. analýzy polymorfizmu s obmedzenou dĺžkou fragmentov (AFLP) (Van der Wolf a kol., 1998).

7.3. Metódy PCR

Špecifické iniciátory PCR (Pastrik a kol, 2002; pozri dodatok 6) sa môžu použiť na diferenciáciu kmeňov patriacich do oddielu 1 (biovary 3, 4 a 5) a oddielu 2 (biovary 1, 2A a 2T) R. solanacearum na základe pôvodnej definície podľa analýzy RFLP (Cook a kol., 1989) a 16S rDNA sekvencovania (Taghavi a kol., 1996).

C. KONFIRMAČNÝ TEST

Test patogenity sa musí vykonať ako konečné potvrdenie diagnózy R. solanacearum a na zhodnotenie virulencie kultúr identifikovaných ako R. solanacearum.

1. Pripravte očkovaciu látku z približne 106 buniek na ml z 24 – 28 hodinovej kultúry izolátu určeného na testovanie a príslušný kmeň R. solanacearum s pozitívnou kontrolou (napr. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; pozri dodatok 3).

2. Naočkujte 5 – 10 vnímavých rajčinových alebo baklažánových semenáčov v tretej skutočnej rastovej fáze (pozri kapitolu VI.A.9).

3. Inkubujte najviac 2 týždne pri teplote 25 – 28 °C a vysokej relatívnej vlhkosti s vhodným zalievaním, aby nedochádzalo k podmokaniu alebo stresu zo sucha. Pri čistých kultúrach by sa typické vädnutie malo prejaviť do 14 dní. Ak sa po tomto období neprejavia príznaky tohto ochorenia, kultúra sa nemôže označiť za patogénnu formu R. solanacearum.

4. Pozorujte symptómy vädnutia a/alebo epinastie, chlorózy a zakrpatenia.