10.

Dopĺňajú sa kapitoly C.27, C.28, C.29 a C.30: „C.27 TEST TOXICITY CHIRONOMIDAE V SYSTÉME SEDIMENT – VODA ZA POUŽITIA OBOHATENÉHO SEDIMENTU ÚVOD 1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykonávanie testov (TG) 218 (2004). Táto testovacia metóda bola vypracovaná s cieľom hodnotiť účinky predĺženého pôsobenia chemikálií na vodné larvy dvojkrídlovcov rodu Chironomus žijúce v sedimente. Vychádza z existujúcich protokolov o testoch toxicity pri druhoch Chironomus riparius a Chironomus tentans, ktoré boli vypracované v Európe (1) (2) (3) a Severnej Amerike (4) (5) (6) (7) (8) a boli podrobené kruhovým testom (1) (6) (9). Môžu sa použiť aj iné dobre zdokumentované druhy pakomárov, napr. Chironomus yoshimatsui (10) (11). 2. Expozičný scenár použitý v tejto testovacej metóde je obohacovanie sedimentu testovanou látkou. Výber vhodného expozičného scenára závisí od plánovaného použitia testu. Scenár obohacovania sedimentu je určený na simuláciu akumulovaných úrovní chemikálií pretrvávajúcich v sedimente. Tento expozičný systém zahŕňa obohacovanie sedimentu v testovacom systéme sediment – voda. 3. Látky, ktoré je potrebné testovať na organizmoch žijúcich v sedimente, zvyčajne pretrvajú v tomto kompartmente dlhý čas. Organizmy žijúce v sedimente môžu byť exponované viacerými spôsobmi. Relatívny význam každého spôsobu expozície a časové obdobie, v ktorom sa každý z nich podieľa na celkových toxických účinkoch, závisí od fyzikálno-chemických vlastností danej chemikálie. V prípade silno adsorbujúcich látok (napr. s log Kow > 5) alebo látok, ktoré sa kovalentne viažu na sediment, môže byť významným spôsobom expozície prijímanie kontaminovanej potravy. S cieľom zabrániť podhodnoteniu toxicity vysokolipofilných látok možno zvážiť použitie potravy pridanej do sedimentu pred aplikáciou testovanej látky. S cieľom zohľadniť všetky potenciálne spôsoby expozície sa táto testovacia metóda zameriava na dlhodobú expozíciu. Trvanie testu je v rozsahu 20 – 28 dní v prípade druhov C. riparius a C. yoshimatsui a 28 – 65 dní pri C. tentans. Ak sú na špecifické účely potrebné krátkodobé údaje, napríklad s cieľom skúmať účinky nestabilnej chemikálie, môžu sa po desiatich dňoch odstrániť ďalšie replikáty. 4. Meranými parametrami sú celkový počet vykuklených dospelých jedincov a čas do vykuklenia. Ak sú potrebné ďalšie krátkodobé údaje, odporúča sa vykonať merania prežitia a rastu lariev až po desiatich dňoch s použitím ďalších replikátov podľa potreby. 5. Odporúča sa použiť umelo pripravený sediment. Umelo pripravený sediment má oproti prírodným sedimentom niekoľko výhod: — zníži sa variabilita testu, lebo umelo pripravený sediment vytvára reprodukovateľnú ‚štandardizovanú matricu‘, a odstráni sa potreba nájsť nekontaminované a čisté zdroje sedimentu, — testy je možné začať kedykoľvek bez problému sezónnej variability v testovanom sedimente a nie je potrebné sediment predpripraviť, aby sa odstránila pôvodná fauna. Použitie umelo pripraveného sedimentu takisto znižuje náklady spojené s odberom dostatočných množstiev sedimentu v teréne na rutinné testovanie, — použitie umelo pripraveného sedimentu umožňuje porovnanie toxicity a následné zatriedenie látok. 6. Vymedzenie pojmov je uvedené v dodatku 1. PRINCÍP TESTU 7. Larvy pakomárov v prvom instare sú exponované rozsahu koncentrácií testovanej chemikálie v systémoch sediment – voda. Sediment sa obohatí testovanou látkou a následne sa larvy prvého instaru zavedú do testovacích kadičiek, v ktorých sa stabilizovali koncentrácie sedimentu a vody. Na konci testu sa meria vykuklenie pakomárov a vývojový pomer. Podľa potreby sa môže po desiatich dňoch merať aj prežitie a hmotnosť lariev (pomocou ďalších replikátov podľa potreby). Tieto údaje sa analyzujú buď prostredníctvom regresného modelu na odhadnutie koncentrácie, ktorá by spôsobila × % pokles vo vykuklení, prežívaní lariev alebo raste (napr. EC15, EC50 atď.), alebo prostredníctvom testovania štatistickej hypotézy na stanovenie koncentrácie NOEC/LOEC. Pri druhom spôsobe je potrebné pomocou štatistických testov porovnať hodnoty účinkov s kontrolnými hodnotami. INFORMÁCIE O TESTOVANEJ LÁTKE 8. Je potrebné poznať rozpustnosť testovanej látky vo vode, jej tlak pary, namerané alebo vypočítané delenie na sediment a stabilitu vo vode a v sedimente. Mala by byť k dispozícii spoľahlivá analytická metóda so známou a zdokumentovanou presnosťou a detekčným limitom na kvantifikáciu testovanej látky v nadložnej vode, pórovej vode a sedimente. Medzi užitočné informácie patrí štrukturálny vzorec a čistota testovanej látky. Užitočnou informáciou je aj chemický osud testovanej chemikálie (napr. rozptýlenie, abiotická a biotická degradácia atď.). Ďalšie informácie pre testované látky s fyzikálno-chemickými vlastnosťami, ktoré sťažujú ich testovanie, sú uvedené v odkaze (12). REFERENČNÉ CHEMIKÁLIE 9. Referenčné chemikálie sa môžu testovať pravidelne ako prostriedok na zabezpečenie spoľahlivosti testovacieho protokolu a testovacích podmienok. Príkladmi referenčných toxických látok, ktoré sa úspešne používajú v kruhových testoch a overovacích štúdiách, sú: lindán, trifluralín, pentachlórfenol, chlorid kademnatý a chlorid draselný (1) (2) (5) (6) (13). PLATNOSŤ TESTU 10. Pre platnosť testu je potrebné uplatňovať tieto podmienky: — vykuklenie v kontrolných skupinách musí byť na konci testu na úrovni minimálne 70 % (1) (6), — vykuklenie druhov C. riparius a C. yoshimatsui na dospelé jedince z kontrolných nádob by malo nastať 12 – 23 dní po ich vložení do nádob. V prípade druhu C. tentans je potrebné obdobie 20 – 65 dní, — na konci testu je potrebné zmerať v každej nádobe pH a koncentráciu rozpusteného kyslíka. Koncentrácia kyslíka by pri použitej teplote mala predstavovať najmenej 60 % saturačnej hodnoty vzduchom (ASV) a hodnota pH nadložnej vody by vo všetkých testovacích nádobách mala byť v rozmedzí 6 – 9, — teplota vody by sa nemala líšiť o viac ako ± 1,0 °C. Teplotu vody je možné kontrolovať pomocou izotermickej komory a v tom prípade je potrebné v primeranom časovom intervale potvrdiť teplotu v komore. OPIS METÓDY Testovacie nádoby 11. Štúdia sa vykonáva v sklenených kadičkách s objemom 600 ml a s priemerom 8 cm. Sú vhodné aj iné nádoby, ale musia zaručiť vhodnú hĺbku nadložnej vody a sedimentu. Povrch sedimentu by mal byť dostatočne veľký, aby poskytoval 2 – 3 cm2 priestoru na larvu. Pomer hĺbky vrstvy sedimentu k hĺbke nadložnej vody by mal byť 1: 4. Testovacie nádoby a iné prístroje, ktoré prichádzajú do styku s testovacím systémom, by mali byť vyrobené výlučne zo skla alebo iného chemicky inertného materiálu (napr. teflónu). Výber druhov 12. Uprednostňovaným druhom na použitie v teste je Chironomus riparius. Chironomus tentans je takisto vhodný, ale je náročnejší na starostlivosť a vyžaduje si dlhšie trvanie testu. Možno použiť aj Chironomus yoshimatsui. Podrobné informácie o kultivačných metódach v prípade druhu Chironomus riparius sú uvedené v dodatku 2. Informácie o kultivačných podmienkach sú k dispozícii aj pre iné druhy, t. j. Chironomus tentans (4) a Chironomus yoshimatsui (11). Identifikácia druhov musí byť pred testovaním potvrdená, ale nevyžaduje sa pred každým testom, ak organizmy pochádzajú z internej kultúry. Sediment 13. Uprednostňuje sa použitie umelo pripraveného sedimentu (známeho aj pod názvom rekonštituovaný, umelý alebo syntetický sediment). Ak sa však použije prírodný sediment, je potrebné ho charakterizovať (aspoň pH, obsah organického uhlíka, odporúča sa takisto stanovenie ostatných parametrov ako pomer C/N a granulometria) a nemal by obsahovať žiadne kontaminanty ani iné organizmy, ktoré by mohli s pakomármi súperiť alebo ich požierať. Takisto sa odporúča, aby bol prírodný sediment pred použitím v teste toxicity pri pakomároch na sedem dní uvedený do podmienok, ktoré budú prevládať v nasledujúcom teste. V tomto teste (1) (15) (16) sa odporúča použiť nasledujúci umelo pripravený sediment založený na umelej pôde použitej v testovacej metóde C.8 (14): a) 4 – 5 % (suchá hmotnosť) rašeliny: čo najbližšie k pH 5,5 – 6,0. Je dôležité použiť rašelinu v práškovej forme, jemne rozomletú (veľkosť častíc ≤ 1 mm) a sušenú iba vzduchom; b) 20 % (suchá hmotnosť) kaolínu (obsah kaolinitu podľa možnosti nad 30 %); c) 75 – 76 % (suchá hmotnosť) kremenného piesku (mal by prevládať jemný piesok s viac ako 50 % častíc s veľkosťou od 50 do 200 μm); d) deionizovaná voda sa pridá, aby sa dosiahla vlhkosť konečnej zmesi v rozsahu 30 - 50 %; e) uhličitan vápenatý chemicky čistej kvality (CaCO3) sa pridá, aby sa pH konečnej zmesi sedimentu upravila na 7,0 ± 0,5; obsah organického uhlíka v konečnej zmesi by mal byť 2 % (± 0,5 %) a je potrebné ho upraviť pomocou primeraného množstva rašeliny a piesku podľa písmen a) a c). 14. Zdroj rašeliny, kaolínu a piesku by mal byť známy. Je potrebné skontrolovať, či zložky sedimentu neobsahujú chemické kontaminanty (napr. ťažké kovy, organochlórové zlúčeniny, organofosforové zlúčeniny atď.). Príklad prípravy umelo pripraveného sedimentu je uvedený v dodatku 3. Miešanie suchých zložiek je takisto prípustné, ak sa preukáže, že po pridaní nadložnej vody nedochádza k separácii zložiek sedimentu (napr. k vyplaveniu častíc rašeliny) a že rašelina alebo sediment sú v dostatočnej miere uvedené do podmienok. Voda 15. Každá voda, ktorá vyhovuje chemickým charakteristikám prijateľnej riediacej vody podľa zoznamu uvedeného v dodatkoch 2 a 4, je vhodná ako testovacia voda. Každá vhodná voda, prírodná voda (povrchová alebo podzemná voda), rekonštituovaná voda (pozri dodatok 2) alebo odchlórovaná voda z vodovodu sú prijateľné ako voda na kultiváciu a testovacia voda, ak v nej pakomáre prežijú počas celej kultivácie a testovania bez príznakov stresu. Na začiatku testu by pH testovacej vody mala mať hodnotu medzi 6 a 9 a celková tvrdosť by nemala byť vyššia ako 400 mg/l pre CaCO3. Ak však existuje podozrenie na interakciu medzi iónmi tvrdosti a testovanou látkou, mala by sa použiť voda s nižšou tvrdosťou (a v takom prípade sa teda nesmie použiť Elendtovo médium M4). Počas celej štúdie by sa mal používať rovnaký druh vody. Charakteristiky kvality vody uvedené v dodatku 4 by sa mali merať najmenej dvakrát za rok alebo ak existuje podozrenie, že sa tieto charakteristiky mohli významne zmeniť. Zásobné roztoky – obohatené sedimenty 16. Obohatené sedimenty vybratej koncentrácie sa zvyčajne pripravujú pridaním roztoku testovanej látky priamo do sedimentu. Zásobný roztok testovanej látky rozpustenej v deionizovanej vode sa zmieša s umelo pripraveným sedimentom pomocou valcovne, stroja na miešanie krmív alebo ručným miešaním. Ak je testovaná látka slabo rozpustná vo vode, možno ju rozpustiť v čo najmenšom objeme vhodného organického rozpúšťadla (napr. hexán, acetón alebo chloroform). Tento roztok sa následne zmieša s 10 g jemného kremenného piesku na jednu testovaciu nádobu. Počká sa, kým sa rozpúšťadlo odparí, pričom sa musí z piesku celkom odstrániť. Piesok sa potom zmieša s vhodným množstvom sedimentu na testovaciu kadičku. Na zvýšenie rozpustnosti, na disperziu alebo na emulziu testovanej látky možno použiť iba látky, ktoré sú ľahko prchavé. Treba mať na pamäti, že pri príprave sedimentu je nutné zohľadniť piesok, ktorý pochádza z testovanej látky a pieskovej zmesi (t. j. sediment by sa teda mal pripraviť s menším množstvom piesku). Je nutné zabezpečiť, aby sa testovaná látka pridávaná do sedimentu v sedimente dôkladne a rovnomerne distribuovala. V prípade potreby možno na účely stanovenia stupňa homogenity analyzovať podvzorky. KONCEPCIA TESTU 17. Koncepcia testu sa vzťahuje na výber počtu a odstup testovaných koncentrácií, počet nádob pri každej koncentrácii a počet lariev v každej nádobe. Sú tu opísané koncepcie na odhadnutie bodu EC, na odhadnutie koncentrácie NOEC a na vykonanie limitného testu. Koncepcia regresnej analýzy 18. Účinná koncentrácia (napr. EC15, EC50) a koncentračný rozsah, v ktorom sa skúmajú účinky testovanej látky, sa merajú koncentráciami zahrnutými do testu. Vo všeobecnosti sú presnosť a najmä platnosť, s ktorou možno odhadovať účinné koncentrácie (ECx), lepšie, ak je účinná koncentrácia v rozsahu testovaných koncentrácií. Je potrebné vyhýbať sa extrapolácii hlboko pod najnižšou pozitívnou koncentráciou alebo nad najvyššou koncentráciou. Pri výbere rozsahu koncentrácií, ktoré sa použijú, je užitočný predbežný test na zistenie rozsahu (pozri odsek 27). 19. Ak je potrebné odhadnúť ECx, malo by sa testovať najmenej päť koncentrácií a tri replikáty pre každú koncentráciu. V každom prípade sa odporúča použiť dostatočné testovacie koncentrácie, ktoré umožnia dobrý modelový odhad. Faktor medzi koncentráciami by nemal byť väčší ako dva (v prípadoch, keď má krivka závislosti reakcie od dávky plytký sklon, možno urobiť výnimku). Počet replikátov pri každej aplikácii sa môže znížiť, ak sa zvýši počet testovacích koncentrácií s rozdielnymi reakciami. Zvýšenie počtu replikátov alebo skrátenie dĺžky intervalov testovacích koncentrácií zvyčajne vedie k nižším intervalom spoľahlivosti testu. Ak sa odhaduje desaťdňové prežívanie a rast lariev, sú potrebné ďalšie replikáty. Koncepcia odhadu NOEC/LOEC 20. Ak sa odhadujú koncentrácie LOEC alebo NOEC, použije sa päť testovacích koncentrácií s najmenej štyrmi replikátmi a faktor medzi koncentráciami by nemal byť vyšší ako 2. Počet replikátov by mal byť dostatočný, aby sa zabezpečila primeraná štatistická výpovedná hodnota na zistenie rozdielu 20 % pri kontrole pri úrovni významnosti 5 % (p = 0,05). V prípade vývojového pomeru je zvyčajne vhodná analýza rozptylu (ANOVA), ako napríklad Dunnettov test a Williamsov test (17) (18) (19) (20). Pri pomere vykuklenia možno použiť Cochranov-Armitageho test, Fisherov exaktný test (s Bonferroniho korekciou) alebo Mantelov-Haenszelov test. Limitný test 21. Môže sa vykonať limitný test (jedna testovaná koncentrácia a kontrola), ak v predbežnom teste na zistenie rozsahu neboli pozorované žiadne účinky. Účelom limitného testu je vykonať test pri dostatočne vysokej koncentrácii, ktorá umožní subjektom zodpovedným za rozhodovanie vylúčiť možné toxické účinky testovanej látky a stanoviť limit pri koncentrácii, ktorá sa neočakáva v žiadnej situácii. Odporúča sa úroveň 1 000 mg/kg (suchá hmotnosť). Zvyčajne je na aplikáciu aj kontrolu potrebných najmenej šesť replikátov. Je nutné preukázať primeranú štatistickú výpovednú hodnotu na zistenie rozdielu 20 % pri kontrole pri úrovni významnosti 5 % (p = 0,05). V prípade metrickej reakcie (vývojový pomer a hmotnosť) je vhodnou štatistickou metódou t-test, pokiaľ údaje spĺňajú požiadavky tohto testu (normalita, homogénne rozptyly). Ak tieto požiadavky nie sú splnené, môže sa použiť t-test nerovnomerných rozptylov alebo neparametrický test ako napríklad Wilcoxonov-Mannov-Whitheyho test. Pri pomere vykuklenia je vhodný Fisherov exaktný test. POSTUP Podmienky expozície Príprava systému obohatený sediment – voda 22. Postup obohacovania opísaný v testovacej metóde C.8: Toxicita pre dážďovky je odporúčaným postupom na aplikáciu testovanej látky (14). Obohatené sedimenty sa umiestnia do nádob, do ktorých sa pridá nadložná voda, aby sa vytvoril objemový pomer sediment – voda 1: 4 (pozri odseky 11 a 15). Výška vrstvy sedimentu by mala byť v rozsahu 1,5 - 3 cm. S cieľom zabrániť separácii zložiek sedimentu a resuspendovaniu jemného materiálu počas pridávania testovacej vody do vodného stĺpca môže byť sediment v čase, keď sa naň nalieva voda, prikrytý umelohmotným kotúčom, ktorý sa hneď potom odstráni. Môže byť vhodné aj použitie iných prístrojov. 23. Testovacie nádoby sa zakryjú (napr. sklenenými platňami). V prípade potreby sa počas štúdie dopĺňajú hladiny vody na pôvodný objem s cieľom kompenzovať vyparovanie vody. Na tento účel sa použije destilovaná alebo deionizovaná voda, aby sa predišlo hromadeniu solí. Stabilizácia 24. Keď je obohatený sediment s nadložnou vodou pripravený, je vhodné umožniť delenie testovanej látky z vodnej fázy do sedimentu (3) (4) (6) (13). To by sa podľa možnosti malo vykonať za rovnakých teplotných a prevzdušňovacích podmienok, aké sa použijú v teste. Primeraný čas vyvažovania závisí od konkrétneho sedimentu a chemikálie a môže trvať niekoľko hodín až dní a v zriedkavých prípadoch až niekoľko týždňov (štyri až päť týždňov). Keďže tým by sa poskytol čas na degradáciu mnohých chemikálií, na rovnovážny stav sa nečaká, ale odporúča sa vyvažovacie obdobie v trvaní 48 hodín. Na konci tohto ďalšieho vyvažovacieho obdobia sa odmeria koncentrácia testovanej látky v nadložnej vode, pórovej vode a sedimente aspoň pri najvyššej koncentrácii a pri jednej nižšej koncentrácii (pozri odsek 38). Tieto analytické skúmania testovanej látky umožňujú výpočet hmotnostnej bilancie a vyjadrenie výsledkov na základe meraných koncentrácií. Pridanie testovacích organizmov 25. Štyri až päť dní pred pridaním testovacích organizmov do testovacích nádob sa z kultúr odoberú vajíčkové masy a umiestnia sa do malých nádob s kultivačných médiom. Môže sa použiť staršie médium zo zásobnej kultúry alebo čerstvo pripravené médium. Ak sa použije čerstvo pripravené kultivačné médium, je potrebné doň pridať malé množstvo potravy, napr. zelené riasy a/alebo niekoľko kvapiek filtrátu z jemne rozomletej suspenzie vločkového krmiva pre ryby (pozri dodatok 2). Použijú sa iba čerstvo nakladené vajíčkové masy. Larvy sa zvyčajne začnú liahnuť niekoľko dní po nakladení vajíčok (dva až tri dni v prípade druhu Chironomus riparius pri teplote 20 °C a jeden až štyri dni v prípade Chironomus tentans pri teplote 23 °C a Chironomus yoshimatsui pri teplote 25 °C) a rast lariev prebieha v štyroch instaroch, z ktorých každý trvá štyri až osem dní. V teste sa použijú larvy prvého instaru (dva až tri alebo jeden až štyri dni po vyliahnutí). Instar pakomárov je možné skontrolovať podľa šírky hlavového segmentu (6). 26. Larvy 21. instaru sa pomocou tupej pipety náhodne rozdelia do jednotlivých testovacích nádob obsahujúcich obohatený sediment a vodu. Prevzdušňovanie vody je nutné počas pridávania lariev do testovacích nádob prerušiť a musí byť pozastavené počas ďalších 24 hodín po pridaní lariev (pozri odseky 25 a 32). Podľa použitej koncepcie testu (pozri odseky 19 a 20) je počet lariev použitých pri každej koncentrácii najmenej 60 na odhad bodu EC a 80 na stanovenie koncentrácie NOEC. Testovacie koncentrácie 27. Pri určovaní rozsahu koncentrácií pre konečný test môže byť užitočný test na zistenie rozsahu. Na tento účel sa použije súbor koncentrácií testovanej látky s veľkými odstupmi. S cieľom zabezpečiť rovnakú hustotu povrchu na pakomára, ktorá sa použije pri konečnom teste, sú pakomáre vystavené každej koncentrácii testovanej látky na obdobie, ktoré umožňuje odhad vhodných testovacích koncentrácií, pričom nie sú potrebné žiadne replikáty. 28. Testovacie koncentrácie pre konečný test sa vyberú na základe výsledkov testu na zistenie rozsahu. Je potrebné použiť a vybrať najmenej päť koncentrácií, ako sa uvádza v odsekoch 18 – 20. Kontroly 29. Súčasťou testu sú kontrolné nádoby bez prítomnosti testovanej látky, ktoré však obsahujú sediment, a primeraný počet replikátov (pozri odseky 19 – 20). Ak sa pri aplikácii testovanej látky použije rozpúšťadlo (pozri odsek 16), je potrebné pridať kontrolu rozpúšťadla v sedimente. Testovací systém 30. Použijú sa statické systémy. Vo výnimočných prípadoch sa môžu použiť semistatické alebo prietokové systémy s prerušovaným alebo nepretržitým obmieňaním nadložnej vody, napríklad ak sú špecifikácie kvality vody nevhodné pre testovacie organizmy alebo ak ovplyvňujú chemickú rovnováhu (napr. úrovne rozpusteného kyslíka príliš klesnú, koncentrácia vylučovaných produktov príliš stúpne alebo sa zo sedimentu lúhujú minerály, čo má vplyv na pH a/alebo tvrdosť vody). Zvyčajne však postačujú a uprednostňujú sa iné metódy zlepšenia kvality nadložnej vody, ako napríklad prevzdušňovanie. Potrava 31. Je nevyhnutné larvy kŕmiť podľa možnosti každý deň alebo najmenej trikrát do týždňa. V prvých desiatich dňoch je pre mladé larvy podľa všetkého vhodné krmivo pre ryby (suspenzia vo vode alebo jemne rozomletá potrava, napr. Tetra-Min alebo Tetra-Phyll, bližšie informácie pozri v dodatku 2) v dennom množstve 0,25 – 0,5 mg (0,35 – 0,5 mg pre druh C. yoshimatsui) na jednu larvu. Pre staršie larvy môže byť potrebné o niečo väčšie množstvo potravy: denné množstvo 0,5 – 1 mg na jednu larvu by malo po zvyšok testu postačovať. Ak sa pozoruje rast hubovitých organizmov alebo ak sa v kontrolných nádobách pozoruje mortalita, prídel potravy by sa mal vo všetkých testovacích nádobách znížiť a mal by sa kontrolovať. Ak nie je možné vznik hubovitých organizmov zastaviť, test je nutné opakovať. Pri testovaní silno adsorbujúcich látok (napr. s log Kow > 5) alebo látok, ktoré sa kovalentne viažu na sediment, sa môže do umelo pripraveného sedimentu pred stabilizačným obdobím pridať množstvo potravy potrebné na zabezpečenie prežitia a prirodzeného rastu organizmov. Na tento účel sa namiesto krmiva pre ryby musí použiť rastlinný materiál, napr. sa môže pridať 0,5 % (suchá hmotnosť) jemne rozomletých listov napr. pŕhľavy dvojdomej (Urtica dioica), moruše (Morus alba), ďateliny plazivej (Trifolium repens), špenátu (Spinacia oleracea) alebo iného rastlinného materiálu (Cerophyl alebo alfa celulóza). Podmienky inkubácie 32. Najlepšie po 24 hodinách od pridania lariev sa zabezpečí jemné prevzdušňovanie nadložnej vody v testovacích nádobách a pokračuje v ňom počas celého testu (treba dbať na to, aby koncentrácia rozpusteného kyslíka neklesla pod 60 % ASV). Prevzdušňovanie sa zabezpečí pomocou sklenenej Pasteurovej pipety upevnenej 2 – 3 cm nad vrstvou sedimentu (t. j. jedna alebo niekoľko bublín za sekundu). Ak sa testujú prchavé chemikálie, možno zvážiť, že systém sediment – voda sa nebude prevzdušňovať. 33. Test sa vykonáva pri konštantnej teplote 20 °C (± 2 °C). V prípade druhu C. tentans sa odporúča teplota 23 °C a v prípade C. yoshimatsui 25 °C (± 2 °C). Použije sa 16-hodinová svetlá fáza, pričom intenzita svetla by mala byť 500 – 1 000 luxov. Trvanie expozície 34. Expozícia sa začne pridaním lariev do obohatených a kontrolných nádob. Maximálna dĺžka expozície je 28 dní v prípade druhov C. riparius a C. yoshimatsui a 65 dní v prípade C. tentans. Ak sa pakomáre vykuklia skôr, test sa môže ukončiť najskôr po piatich dňoch po vykuklení posledného dospelého jedinca v kontrolnej skupine. Pozorovania Vykuklenie 35. Určí sa čas vývoja a celkový počet úplne vykuklených samčích a samičích pakomárov. Samčeky sa ľahko identifikujú podľa obrvených tykadiel. 36. Testovacie nádoby je potrebné pozorovať najmenej trikrát do týždňa s cieľom vizuálne zhodnotiť každé abnormálne správanie (napr. opúšťanie sedimentu, nezvyčajné plávanie) v porovnaní s kontrolnou skupinou. Počas obdobia očakávaného vykuklenia je nevyhnutné každý deň spočítať vykuklené pakomáre. Pohlavie a počet úplne vykuklených pakomárov sa zaznamenáva denne. Po identifikácii sa pakomáre vyberú z nádob. Všetky vajíčkové masy nakladené pred ukončením testu sa zaznamenajú a následne odstránia, aby sa predišlo opätovnému zavedeniu lariev do sedimentu. Takisto sa zaznamená počet viditeľných kukiel, ktoré sa nevykuklili. Usmernenie k meraniu vykuklenia je uvedené v dodatku 5. Rast a prežívanie 37. Ak je potrebné získať údaje o desaťdňovom prežívaní a raste lariev, na začiatku sa pripravia ďalšie testovacie nádoby tak, aby sa mohli následne použiť. Sediment z týchto ďalších nádob sa precedí pomocou cedidla s hrúbkou 250 μm, aby sa zachytili larvy. Kritérium na stanovenie smrti je nehybnosť alebo absencia reakcie na mechanický podnet. Stratené larvy sa takisto počítajú medzi mŕtve (larvy, ktoré uhynuli na začiatku testu, sa mohli rozložiť pôsobením mikróbov). Určí sa suchá hmotnosť (bez popola) lariev, ktoré prežili v každej testovacej nádobe, a vypočíta sa stredná suchá hmotnosť jedincov na jednu nádobu. Je užitočné určiť, do ktorého instaru patria larvy, ktoré prežili. Na toto meranie sa môže použiť šírka hlavového segmentu každého jedinca. Analytické merania Koncentrácia testovanej látky 38. Pred začiatkom testu (t. j. pred pridaním lariev) sa pri každom ošetrení z najmenej jednej nádoby odstránia súhrnné vzorky sedimentu na účely analytického stanovenia koncentrácie testovanej látky v sedimente. Odporúča sa, aby sa vzorky nadložnej vody, pórovej vody a sedimentu analyzovali minimálne na začiatku (pozri odsek 24) a na konci testu pri najvyššej koncentrácii a pri jednej nižšej koncentrácii. Tieto skúmania testovanej látky poskytujú informácie o správaní/delení testovanej látky v systéme voda – sediment. 39. Ak sa vykonajú prostredné merania (napr. v deň 7) a ak sú na analýzu potrebné veľké vzorky, ktoré nemožno odobrať z testovacích nádob bez ovplyvnenia testovacieho systému, analytické vyšetrenia je potrebné vykonať na vzorkách z ďalších testovacích nádob, s ktorými sa zaobchádzalo rovnakým spôsobom (vrátane prítomnosti testovacích organizmov), ale ktoré sa nepoužijú na biologické pozorovania. 40. Na izolovanie intersticiálnej vody je odporúčaným postupom odstredenie napr. pri 10 000 g a 4 °C počas 30 minút. Ak sa však preukáže, že testovaná látka sa na filtroch neadsorbuje, môže byť prijateľná aj filtrácia. V niektorých prípadoch nemusí byť možné analyzovať koncentrácie v pórovej vode, lebo vzorka je príliš malá. Fyzikálno-chemické parametre 41. Je potrebné vhodným spôsobom odmerať pH a teplotu v testovacích nádobách (pozri odsek 10). Tvrdosť a amoniak sa merajú v kontrolných nádobách a v jednej testovacej nádobe pri najvyššej koncentrácii na začiatku a na konci testu. ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV Spracovanie výsledkov 42. Účelom tohto testu je určiť vplyv testovanej látky na vývojový pomer a celkový počet úplne vykuklených samčích a samičích pakomárov, alebo v prípade desaťdňového testu účinky na prežívanie a hmotnosť lariev. Ak nič nepoukazuje na štatisticky rozdielnu vnímavosť medzi pohlaviami, výsledky pre samčeky a samičky možno na účely štatistických analýz zhrnúť spoločne. Rozdiely vnímavosti medzi pohlaviami sa môžu štatisticky posúdiť napr. tabuľkovým testom χ2 – r × 2. Prežívanie lariev a stredná suchá hmotnosť jedincov na jednu nádobu sa podľa potreby musí určiť po desiatich dňoch. 43. Účinné koncentrácie vyjadrené a vychádzajúce zo suchej hmotnosti sa podľa možnosti vypočítajú na základe koncentrácií nameraných v sedimente na začiatku testu (pozri odsek 38). 44. Na vyčíslenie odhadu bodu EC50 alebo akejkoľvek inej hodnoty ECx sa ako pravé replikáty môže použiť štatistika na jednu nádobu. Pri výpočte intervalu spoľahlivosti pre každú hodnotu ECx je potrebné zohľadniť variabilitu medzi nádobami alebo je nutné preukázať, že táto variabilita je taká malá, že je možné ju ignorovať. Ak sa model upraví metódou najmenších štvorcov, v štatistike na jednu nádobu je potrebné aplikovať transformáciu, aby sa zlepšila homogénnosť rozptylu. Hodnoty ECx by sa však mali vypočítať po tom, ako sa reakcia transformuje naspäť na pôvodnú hodnotu. 45. Ak je cieľom štatistickej analýzy určenie koncentrácie NOEC/LOEC prostredníctvom testovania hypotézy, je potrebné zohľadniť variabilitu medzi nádobami, napr. pomocou hierarchickej analýzy ANOVA. Alternatívne môžu byť vhodné podrobnejšie testy (21) v prípadoch, keď dochádza k nedodržaniu zvyčajných predpokladov analýzy ANOVA. Pomer vykuklenia 46. Pomery vykuklenia sú kvantové údaje a môžu sa analyzovať pomocou Cochranovho-Armitageho testu aplikovaného zostupne v prípadoch, keď sa očakáva monotónna reakcia na dávku a tieto údaje zodpovedajú tomuto očakávaniu. Ak to tak nie je, možno použiť Fisherov exaktný test alebo Mantzelov-Haentzalov test s Bonferroniho-Holmovou úpravou hodnôt p. Ak sa medzi replikátmi pri rovnakej koncentrácii preukáže väčšia variabilita, než akú by indikovala binomická distribúcia (často sa uvádza ako ‚extra-binomická‘ variácia), potom by sa mal použiť podrobný Cochranov-Armitageho test alebo Fisherov exaktný test, ako sa navrhuje v bode (21). Určí sa súčet pakomárov vykuklených na jednu nádobu, ne, a vydelí sa počtom zavedených lariev, na: kde: ER = pomer vykuklenia, ne = počet pakomárov vykuklených na nádobu, na = počet zavedených lariev na nádobu. 47. Najvhodnejšou alternatívou pri veľkých vzorkách v prípadoch extra binomickej variácie je brať pomer vykuklenia (ER) ako nepretržitú reakciu a použiť postupy, ako je napríklad Williamsov test, ak sa očakáva monotónna reakcia na dávku, ktorá je konzistentná s týmito údajmi o ER. Ak reakcia nie je monotónna, je vhodný Dunnettov test. Za veľkú vzorku sa pokladá vzorka, v ktorej je počet vykuklených aj počet nevykuklených jedincov v každom replikáte (nádobe) vyšší ako päť. 48. Pri aplikovaní metód ANOVA je potrebné najskôr transformovať hodnoty ER pomocou arkussínusovej transformácie druhej odmocniny alebo Freemanovej-Tukeyho transformácie s cieľom získať približnú normálnu distribúciu a vyrovnať rozptyly. Cochranov-Armitageho test, Fisherov exaktný (Bonferroniho) test alebo Mantelov-Haenszelov test možno aplikovať, ak sa použijú absolútne frekvencie. Arkussínusová transformácia druhej odmocniny sa aplikuje pomocou prevrátenej hodnoty sínusu (sin–1) druhej odmocniny ER. 49. Pri pomeroch vykuklenia sa hodnoty ECx vypočítajú pomocou regresnej analýzy (alebo napr. pomocou modelov probit (22), logit, Weibull, vhodného komerčného softvéru atď.). Ak je regresná analýza neúspešná (napr. ak sú k dispozícii menej ako dve čiastkové reakcie), použijú sa iné neparametrické metódy, ako je metóda pohyblivého priemeru alebo jednoduchá interpolácia. Vývojový pomer 50. Stredný vývojový čas predstavuje stredné časové rozpätie medzi zavedením lariev (deň 0 testu) a vykuklením pokusnej kohorty pakomárov. (Pri výpočte reálneho vývojového času sa zohľadní vek lariev v čase zavedenia). Vývojový pomer je prevrátená hodnota vývojového času (jednotka: 1/deň) a predstavuje časť vývinu lariev, ktorá prebieha za deň. Pri hodnotení týchto štúdií toxicity v sedimente sa uprednostňuje vývojový pomer, lebo jeho rozptyl je nižší a v porovnaní s vývojovým časom je homogénnejší a bližší normálnej distribúcii. Výkonné parametrické testovacie postupy teda možno lepšie použiť s vývojovým pomerom ako s vývojovým časom. Pre vývojový pomer ako nepretržitú reakciu možno hodnoty ECx odhadnúť pomocou regresnej analýzy [napr. (23), (24)]. 51. Pri nasledujúcich štatistických testoch sa predpokladá, že počet pakomárov pozorovaných v kontrolnom dni × sa vykuklil v strednom časovom intervale medzi dňom × a dňom x - l (l = dĺžka kontrolného intervalu, zvyčajne jeden deň). Stredný vývojový pomer na nádobu sa vypočíta podľa tejto rovnice: kde: : stredný vývojový pomer na nádobu, i : index kontrolného intervalu, m : maximálny počet kontrolných intervalov, : počet pakomárov vykuklených v kontrolnom intervale i, ne : celkový počet pakomárov vykuklených na konci pokusu, (= ), xi : vývojový pomer pakomárov vykuklených v intervale i; kde: deňi : kontrolný deň (dni od aplikácie), li : dĺžka kontrolného intervalu i (dni, zvyčajne jeden deň). Správa o teste 52. Správa o teste musí obsahovať aspoň tieto informácie: Testovaná látka: — fyzikálny charakter a významné fyzikálno-chemické vlastnosti (rozpustnosť vo vode, tlak pary, rozdeľovací koeficient v pôde (alebo v sedimente, ak je k dispozícii), stabilita vo vode atď.), — chemické identifikačné údaje (bežný názov, chemický názov, štrukturálny vzorec, číslo CAS atď.) vrátane čistoty a analytickej metódy kvantifikácie testovanej látky. Testovacie druhy: — použité testovacie zvieratá: druh, vedecký názov, zdroj organizmov a podmienky chovu, — informácie o manipulácii s vajíčkovými masami a larvami, — vek testovacích zvierat pri umiestnení do testovacích nádob. Podmienky testovania: — použitý sediment, t. j. prírodný alebo umelo pripravený sediment, — v prípade prírodného sedimentu poloha a opis miesta odobratia vzoriek vrátane histórie kontaminácie, ak je to možné, charakteristiky: pH, obsah organického uhlíka, pomer C/N a granulometria (podľa potreby), — príprava umelo pripraveného sedimentu: zložky a charakteristiky (obsah organického uhlíka, pH, vlhkosť atď. na začiatku testu), — príprava testovacej vody (ak sa použije rekonštituovaná voda) a charakteristiky (koncentrácia kyslíka, pH, vodivosť, tvrdosť atď. na začiatku testu), — výška sedimentu a nadložnej vody, — objem nadložnej a pórovej vody, hmotnosť mokrého sedimentu s pórovou vodou a bez nej, — testovacie nádoby (materiál a veľkosť), — metóda obohatenia sedimentu: použité testovacie koncentrácie, počet replikátov a prípadné použitie rozpúšťadiel, — rovnovážna fáza stabilizácie systému obohatený sediment – voda: trvanie a podmienky, — inkubačné podmienky: teplota, svetelný cyklus a intenzita, prevdzušňovanie (frekvencia a intenzita), — podrobné informácie o kŕmení vrátane druhu potravy, prípravy, množstva a kŕmneho režimu. Výsledky: — nominálne testovacie koncentrácie, namerané testovacie koncentrácie a výsledky všetkých analýz na stanovenie koncentrácie testovanej látky v testovacej nádobe, — kvalita vody v testovacích nádobách, t. j. pH, teplota, rozpustený kyslík, tvrdosť a amoniak, — kompenzácia prípadnej vyparenej testovacej vody, — počet vykuklených samčích a samičích pakomárov na nádobu na deň, — počet lariev na nádobu, ktoré sa nevykuklili, — stredná suchá hmotnosť jednotlivých lariev na nádobu a na instar podľa potreby, — percentuálne vykuklenie na replikát a testovaciu koncentráciu (samčie a samičie pakomáre spolu), — stredný vývojový pomer úplne vykuklených pakomárov na replikát a miera ošetrenia (samčie a samičie pakomáre spolu), — odhady toxických parametrov, napr. ECx (a súvisiace intervaly spoľahlivosti), NOEC a/alebo LOEC a štatistické metódy použité na ich stanovenie, — rozbor výsledkov vrátane každého vplyvu na výsledok testu vyplývajúceho z odchýlok od tejto testovacej metódy. LITERATÚRA 1. BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Upravili M. Streloke a H.Köpp. Berlín 1995. 2. Fleming, R. a kol. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Záverečná správa pre Európsku komisiu. Správa č.: EK, 3738. August 1994. WRc, UK. 3. SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. Zo seminára WOSTA, ktorý sa uskutočnil v Holandsku. 4. ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. s. 1125 – 1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA. 5. Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. 6. US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Druhé vydanie. EPA 600/R-99/064. Marec 2000. Revízia prvého vydania z júna 1994. 7. US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. 8. US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. 9. Milani, D., Day, K. E., McLeay, D. J., a Kirby, R. S. (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Kanada. 10. Sugaya, Y. (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345 – 350. 11. Kawai, K. (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47 – 57. 12. OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. 13. Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. 14. Testovacia metóda C.8 tejto prílohy, Toxicita pre dážďovky. 15. Suedel, B. C., a Rodgers, J. H. (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163 – 1175. 16. Naylor, C., a Rodrigues, C. (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291 – 3303. 17. Dunnett, C. W. (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096 – 1121. 18. Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482 – 491. 19. Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103 – 117. 20. Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510 – 531. 21. Rao, J. N. K., a Scott, A. J. (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577 – 585. 22. Christensen, E. R. (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213 – 221. 23. Bruce a Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485 – 1494. 24. Slob, W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312. Dodatok 1 VYMEDZENIE POJMOV Na účely tejto testovacej metódy sa používajú tieto vymedzenia pojmov: Umelo pripravený sediment alebo rekonštituovaný, umelý alebo syntetický sediment, je zmes materiálov použitých na napodobnenie fyzických zložiek prírodného sedimentu. Nadložná voda je voda umiestnená v testovacej nádobe nad sedimentom. Intersticiálna voda alebo pórová voda je voda nachádzajúca sa v priestore medzi časticami sedimentu a pôdy. Obohatený sediment je sediment, do ktorého bola pridaná testovaná látka. Testovaná chemikália: akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy. Dodatok 2 Odporúčania ku kultúre Chironomus riparius 1. Larvy rodu Chironomus sa môžu chovať v kryštalizačných miskách alebo vo väčších nádobách. Na dno nádoby sa nanesie tenká vrstva jemného kremenného piesku vo výške 5 – 10 mm. Je preukázané, že vhodným substrátom je aj diatomit (napr. Merck, článok 8117) (postačuje tenšia vrstva do výšky len niekoľkých milimetrov). Potom sa pridá vhodná voda do výšky niekoľkých centimetrov. Hladiny vody by sa mali podľa potreby dopĺňať, aby sa kompenzovala strata vyparením a aby sa predišlo vysychaniu. Vodu je možné v prípade potreby vymeniť. Je potrebné zabezpečiť jemné prevzdušňovanie. Misky na chov lariev by mali byť umiestnené vo vhodnej klietke, ktorá zabráni úniku vykuklených dospelých jedincov. Klietka by mala byť dostatočne veľká, aby umožňovala rojenie vykuklených dospelých jedincov, v opačnom prípade by nemuselo dôjsť ku kopulácii (minimálna veľkosť je asi 30 × 30 × 30 cm). 2. Klietky je potrebné udržiavať pri izbovej teplote alebo v miestnosti so stálym prostredím pri teplote 20 ± 2 °C so svetlou fázou v trvaní 16 hodín (intenzita asi 1 000 luxov) a fázou tmy v trvaní 8 hodín. Je preukázané, že vlhkosť vzduchu nižšia ako 60 % RH môže brániť reprodukcii. Riediaca voda 3. Možno použiť akúkoľvek vhodnú prírodnú alebo syntetickú vodu. Bežne sa používa studňová voda, odchlórovaná voda z vodovodu a umelé médiá (napr. Elendtovo médium ‚M4‘ alebo ‚M7‘, pozri ďalej). Pred použitím je potrebné vodu prevzdušniť. V prípade potreby možno kultivačnú vodu obnoviť opatrným odliatím alebo odčerpaním použitej vody z kultivačných nádob bez toho, aby sa poškodili trubice lariev. Kŕmenie lariev 4. Larvy rodu Chironomus sa kŕmia vločkovým krmivom pre ryby [Tetra Min®, Tetra Phyll® alebo iná podobná značka patentovaného krmiva pre ryby] približným množstvom 250 mg na nádobu na deň. Krmivo sa môže podávať ako suchý rozomletý prášok alebo ako suspenzia vo vode: 1,0 g vločkového krmiva sa pridá do 20 ml riediacej vody a premieša sa, aby sa získala homogénna zmes. Tento prípravok sa môže podávať v množstve približne 5 ml na nádobu na deň (pred použitím pretrepať). Staršie larvy môžu dostávať viac. 5. Kŕmenie sa upraví podľa kvality vody. Ak sa kultivačné médium zakalí, kŕmenie je potrebné obmedziť. Prídavky do krmiva sa musia starostlivo monitorovať. Nedostatok potravy spôsobí, že larvy sa budú presúvať k vodnému stĺpcu, a prebytok potravy spôsobí zvýšenie činnosti mikróbov a zníženie koncentrácií kyslíka. V obidvoch prípadoch môže dôjsť k zníženiu rastových pomerov. 6. Pri založení nových kultivačných nádob sa môžu pridať aj bunky niektorých zelených rias (napr. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris). Kŕmenie vykuklených dospelých jedincov 7. Z niektorých pokusov vyplýva, že ako potrava pre vykuklené dospelé jedince môže slúžiť vatový tampón napustený nasýteným sacharózovým roztokom. Vykuklenie 8. Pri teplote 20 ± 2 °C sa dospelé jedince začnú kukliť z nádoby na chov lariev po približne 13 – 15 dňoch. Samčeky sa ľahko rozlíšia podľa obrvených tykadiel. Vajíčkové masy 9. Keď sú v chovnej klietke prítomné dospelé jedince, vo všetkých nádobách na chov lariev je potrebné trikrát do týždňa kontrolovať kladenie želatínových vajíčkových más. Ak sú vajíčkové masy prítomné, opatrne sa odoberú. Mali by sa preniesť na malú misku so vzorkou kultivačnej vody. Vajíčkové masy sa použijú na založenie nových kultivačných nádob (napr. dve až štyri vajíčkové masy na nádobu) alebo sa použijú v testoch toxicity. 10. Larvy prvého instaru by sa mali vyliahnuť po dvoch až troch dňoch. Založenie nových kultivačných nádob 11. Po vytvorení kultúr by malo byť možné založiť novú nádobu na kultiváciu lariev každý týždeň alebo menej často v závislosti od testovacích požiadaviek, pričom staršie nádoby sa po vykuklení dospelých pakomárov odstránia. Týmto spôsobom sa pri minimálnom riadení zabezpečí pravidelné dopĺňanie dospelých jedincov. Príprava testovacích roztokov ‚M4‘ a ‚M7‘ 12. Elendt (1990) opísal médium ‚M4‘. Médium ‚M7‘ sa pripravuje ako médium ‚M4‘ s výnimkou látok označených v tabuľke 1, pre ktoré sú koncentrácie v médiu ‚M7‘ štyrikrát nižšie ako v médiu ‚M4‘. Publikácia o médiu ‚M7‘ je v štádiu prípravy (Elendt, osobná komunikácia). Testovací roztok by sa nemal pripraviť podľa Elendta a Biasa (1990), lebo koncentrácie NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 a K2HPO4 uvedené pre prípravu zásobných roztokov nie sú vhodné. Príprava média ‚M7‘ 13. Každý zásobný roztok (I) sa pripraví jednotlivo a kombinovaný zásobný roztok (II) sa pripraví z týchto zásobných roztokov (I) (pozri tabuľku 1). Na prípravu média ‚M7‘ sa 50 ml z kombinovaného zásobného roztoku (II) a množstvá každého makronutričného zásobného roztoku uvedené v tabuľke 2 doplnia do jedného litra deionizovanej vody. Vitamínový zásobný roztok sa pripraví pridaním troch vitamínov do deionizovanej vody, ako je uvedené v tabuľke 3, a krátko pred použitím sa do konečného média ‚M7‘ pridá 0,1 ml kombinovaného vitamínového zásobného roztoku. (Vitamínový zásobný roztok sa skladuje zmrazený v malých alikvotných častiach.) Médium sa prevzdušňuje a stabilizuje. LITERATÚRA BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Upravili M. Streloke a H.Köpp. Berlín 1995. Tabuľka 1 Zásobné roztoky stopových prvkov pre médiá M4 a M7 Zásobné roztoky (I) Množstvo (mg) doplnené do jedného litra deionizovanej vody Na prípravu kombinovaného zásobného roztoku (II) sa zmiešajú tieto množstvá (ml) zásobných roztokov (I) a doplnia sa do jedného litra deionizovanej vody Konečné koncentrácie v testovacích roztokoch (mg/l) M4 M7 M4 M7 H3BO3 (15) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 MnCl2 · 4 H2O (15) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 LiCl (15) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 RbCl (15) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 SrCl2 · 6 H2O (15) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 NaBr (15) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 Na2MoO4 · 2 H2O (15) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 CuCl2 · 2 H2O (15) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 ZnCl2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 CaCl2 · 6 H2O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na2SeO3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 NH4VO3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 Na2EDTA · 2 H2O (15) (16) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 FeSO4 · 7 H2O (15) (16) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249

Tabuľka 2 Makronutričné zásobné roztoky pre médiá M4 a M7 Množstvo doplnené do jedného litra deionizovanej vody (mg) Množstvo pridaných makronutričných zásobných roztokov pri príprave médií M4 a M7 (ml/l) Konečné koncentrácie v testovacích roztokoch M4 a M7 (mg/l) CaCl2 · 2 H2O 293 800 1,0 293,8 MgSO4 · 7 H2O 246 600 0,5 123,3 KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO3 64 800 1,0 64,8 NaSiO3 · 9 H2O 50 000 0,2 10,0 NaNO3 2 740 0,1 0,274 KH2PO4 1 430 0,1 0,143 K2HPO4 1 840 0,1 0,184

Tabuľka 3 Vitamínový zásobný roztok pre médiá M4 a M7. Všetky tri vitamínové roztoky sa skombinujú, aby sa vytvoril jeden vitamínový zásobný roztok. Množstvo doplnené do jedného litra deionizovanej vody (mg) Množstvo pridaného vitamínového zásobného roztoku pri príprave médií M4 a M7 (ml/l) Konečné koncentrácie v testovacích roztokoch M4 a M7 (mg/l) Tiamín hydrochlorid 750 0,1 0,075 Kyanokobalamín (B12) 10 0,1 0,0010 Biotín 7,5 0,1 0,00075 LITERATÚRA Elendt, B. P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25 – 33. Elendt, B. P., a Bias, W.-R. (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157 – 1167. Dodatok 3 PRÍPRAVA UMELO PRIPRAVENÉHO SEDIMENTU Zloženie sedimentu Zloženie umelo pripraveného sedimentu by malo byť takéto: Zložka Charakteristika % suchej hmotnosti sedimentu Rašelina Rašelinníková rašelina, pH čo najbližšie k 5,5 – 6,0, bez viditeľných zvyškov rastlín, jemne rozomletá (veľkosť častíc ≤ 1 mm) a usušená vzduchom 4 – 5 Kremenný piesok Veľkosť zrniek: > 50 % častíc by malo mať veľkosť v rozsahu 50 – 200 μm 75 – 76 Kaolín Obsah kaolinitu ≥ 30 % 20 Organický uhlík Upravený pridaním rašeliny a piesku 2 (± 0,5) Uhličitan vápenatý CaCO3, rozomletý na prach, chemicky čistý 0,05 - 0,1 Voda Vodivosť ≤ 10 μS/cm 30 - 50 Príprava Rašelina sa usuší vzduchom a rozomelie na jemný prášok. V deionizovanej vode sa pomocou vysokovýkonného homogenizačného prístroja pripraví suspenzia požadovaného množstva rašelinového prášku. Hodnota pH tejto suspenzie sa upraví na 5,5 ± 0,5 pomocou CaCO3. Suspenzia sa aspoň na dva dni uvedie do podmienok jemným premiešavaním pri teplote 20 ± 2 °C, aby sa stabilizovala hodnota pH a vytvorila stabilná mikrobiálna zložka. Opäť sa zmeria pH, ktoré by malo byť na úrovni 6,0 ± 0,5. Rašelinová suspenzia sa následne zmieša s ostatnými zložkami (piesok a kaolín) a s deionizovanou vodou, aby sa získal homogénny sediment s obsahom vody v rozsahu 30 - 50 percent suchej hmotnosti sedimentu. Znova sa zmeria hodnota pH konečnej zmesi a podľa potreby sa pomocou CaCO3 upraví na 6,5 – 7,5. Odoberú sa vzorky sedimentu, aby sa určila suchá hmotnosť a obsah organického uhlíka. Následne sa odporúča, aby sa pred použitím v teste toxicity pri pakomároch umelo pripravený sediment uviedol na sedem dní do rovnakých podmienok, aké budú prevládať v nasledujúcom teste. Skladovanie Suché zložky na prípravu umelého sedimentu sa môžu skladovať na suchom a chladnom mieste pri izbovej teplote. Umelo pripravený (mokrý) sediment by sa pred použitím v teste nemal skladovať. Mal by sa použiť hneď po sedemdňovom období uvádzania do podmienok, ktorým sa končí jeho príprava. LITERATÚRA Kapitola C.8 tejto prílohy. Toxicita pre dážďovky. Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10 – 20. Dodatok 4 Chemické charakteristiky prijateľnej riediacej vody Látka Koncentrácie Pevné častice < 20 mg/l Celkový organický uhlík < 2 mg/l Neionizovaný amoniak < 1 μg/l Tvrdosť ako CaCO3 < 400 mg/l (17) Zostatkový chlór < 10 μg/l Celkové organofosfátové pesticídy < 50 ng/l Celkové organochlórované pesticídy plus polychlórované bifenyly < 50 ng/l Celkový organický chlór < 25 ng/l Dodatok 5 Usmernenie k monitorovaniu vykuklenia lariev pakomárov Na testovacie kadičky sa umiestnia pasce na vykuklené jedince. Tieto pasce sú potrebné odo dňa 20 do skončenia testu. Ďalej je znázornený príklad použitej pasce. A: nylonová sieťka B: prevrátené umelohmotné misky C: expozičná kadička bez okraja D: sieťované otvory na výmenu vody E: voda F: sediment C. 28. TEST TOXICITY CHIRONOMIDAE V SYSTÉME SEDIMENT – VODA ZA POUŽITIA OBOHATENEJ VODY ÚVOD 1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s OECD TG 219 (2004). Táto testovacia metóda bola vypracovaná s cieľom hodnotiť účinky predĺženého pôsobenia chemikálií na vodné larvy dvojkrídlovcov rodu Chironomus žijúce v sedimente. Vychádza najmä z usmernenia BBA, ktoré používa testovací systém sediment – voda s umelou pôdou a expozičným scenárom vo vodnom stĺpci (1). Zohľadňuje aj existujúce protokoly o testoch toxicity na Chironomus riparius a Chironomus tentans, ktoré boli vypracované v Európe a Severnej Amerike (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) a boli podrobené kruhovým testom (1) (6) (9). Môžu sa použiť aj iné dobre zdokumentované druhy pakomárov, napr. Chironomus yoshimatsui (10) (11). 2. Expozičný scenár použitý v tejto testovacej metóde je obohacovanie vody. Výber vhodného expozičného scenára závisí od plánovaného použitia testu. Vodný expozičný scenár zahŕňajúci obohatenie vodného stĺpca je určený na simuláciu prípadu pesticídneho postreku a zahŕňa počiatočné maximálne koncentrácie v pórovej vode. Je užitočný aj pri iných druhoch expozície (vrátane chemických únikov) s výnimkou akumulačných procesov, ktoré trvajú dlhšie ako testovacie obdobie. 3. Látky, ktoré je potrebné testovať na organizmoch žijúcich v sedimente, zvyčajne pretrvajú v tomto kompartmente dlhý čas. Organizmy žijúce v sedimente môžu byť exponované viacerými spôsobmi. Relatívny význam každého spôsobu expozície a časové obdobie, v ktorom sa každý z nich podieľa na celkových toxických účinkoch, závisí od fyzikálno-chemických vlastností danej chemikálie. V prípade silno adsorbujúcich látok (napr. s log Kow > 5) alebo látok, ktoré sa kovalentne viažu na sediment, môže byť významným spôsobom expozície prijímanie kontaminovanej potravy. S cieľom vyhnúť sa podhodnoteniu toxicity vysokolipofilných látok možno zvážiť použitie potravy pridanej do sedimentu pred aplikáciou testovanej látky. S cieľom zohľadniť všetky potenciálne spôsoby expozície sa táto testovacia metóda zameriava na dlhodobú expozíciu. Trvanie testu je v rozsahu 20 – 28 dní v prípade druhov C. riparius a C. yoshimatsui a 28 – 65 dní pri C. tentans. Ak sú na špecifické účely potrebné krátkodobé údaje, napríklad s cieľom skúmať účinky nestabilných chemikálií, môžu sa po desiatich dňoch odstrániť ďalšie replikáty. 4. Meranými parametrami sú celkový počet vykuklených dospelých jedincov a čas do vykuklenia. Ak sú potrebné ďalšie krátkodobé údaje, odporúča sa vykonať merania prežitia a rastu lariev až po desiatich dňoch s použitím ďalších replikátov podľa potreby. 5. Odporúča sa použiť umelo pripravený sediment. Umelo pripravený sediment má oproti prírodným sedimentom niekoľko výhod: — zníži sa variabilita testu, lebo umelo pripravený sediment vytvára reprodukovateľnú ‚štandardizovanú matricu‘, a odstráni sa potreba nájsť nekontaminované a čisté zdroje sedimentu, — testy je možné začať kedykoľvek bez problému sezónnej variability v testovanom sedimente a nie je potrebné sediment predpripraviť, aby sa odstránila pôvodná fauna. Použitie umelo pripraveného sedimentu takisto znižuje náklady spojené s odberom dostatočných množstiev sedimentu v teréne na rutinné testovanie, — použitie umelo pripraveného sedimentu umožňuje porovnanie toxicity a následné zatriedenie látok: údaje o toxicite z testov s prírodnými a umelými sedimentmi boli v prípade viacerých chemikálií porovnateľné (2). 6. Vymedzenie pojmov je uvedené v dodatku 1. PRINCÍP TESTU 7. Larvy pakomárov v prvom instare sú exponované rozsahu koncentrácií testovanej látky v systémoch sediment – voda. Test sa začne umiestnením lariev v prvom instare do testovacích kadičiek obsahujúcich systém sediment – voda a následne obohatením vody testovanou látkou. Na konci testu sa meria vykuklenie pakomárov a vývojový pomer. Podľa potreby sa môže po desiatich dňoch merať aj prežitie a hmotnosť lariev (pomocou ďalších replikátov podľa potreby). Tieto údaje sa analyzujú buď prostredníctvom regresného modelu na odhadnutie koncentrácie, ktorá by spôsobila x % pokles vo vykuklení, prežívaní lariev alebo raste (napr. EC15, EC50 atď.), alebo prostredníctvom testovania štatistickej hypotézy na stanovenie koncentrácie NOEC/LOEC. Pri druhom spôsobe je potrebné pomocou štatistických testov porovnať hodnoty účinkov s kontrolnými hodnotami. INFORMÁCIE O TESTOVANEJ LÁTKE 8. Je potrebné poznať rozpustnosť testovanej látky vo vode, jej tlak pary, namerané alebo vypočítané delenie na sediment a stabilitu vo vode a v sedimente. Mala by byť k dispozícii spoľahlivá analytická metóda so známou a zdokumentovanou presnosťou a detekčným limitom na kvantifikáciu testovanej látky v nadložnej vode, pórovej vode a sedimente. Medzi užitočné informácie patrí štrukturálny vzorec a čistota testovanej látky. Užitočnou informáciou je aj chemický osud testovanej chemikálie (napr. rozptýlenie, abiotická a biotická degradácia atď.). Ďalšie informácie pre testované látky s fyzikálno-chemickými vlastnosťami, ktoré sťažujú ich testovanie, sú uvedené v odkaze (12). REFERENČNÉ CHEMIKÁLIE 9. Referenčné chemikálie sa môžu testovať pravidelne ako prostriedok na zabezpečenie spoľahlivosti testovacieho protokolu a testovacích podmienok. Príkladmi referenčných toxických látok, ktoré sa úspešne používajú v kruhových testoch a overovacích štúdiách, sú: lindán, trifluralín, pentachlórfenol, chlorid kademnatý a chlorid draselný (1) (2) (5) (6) (13). PLATNOSŤ TESTU 10. Aby bol test platný, musí spĺňať tieto podmienky: — vykuklenie v kontrolných skupinách musí byť na konci testu na úrovni minimálne 70 % (1) (6), — vykuklenie druhov C. riparius a C. yoshimatsui na dospelé jedince z kontrolných nádob by malo nastať 12 – 23 dní po ich vložení do nádob. V prípade druhu C. tentans je potrebné obdobie 20 – 65 dní, — na konci testu je potrebné zmerať v každej nádobe pH a koncentráciu rozpusteného kyslíka. Koncentrácia kyslíka by pri použitej teplote mala predstavovať najmenej 60 % saturačnej hodnoty vzduchom (ASV) a hodnota pH nadložnej vody by vo všetkých testovacích nádobách mala byť v rozmedzí 6 – 9, — teplota vody by sa nemala líšiť o viac ako ± 1,0 °C. Teplotu vody je možné kontrolovať pomocou izotermickej komory a v tom prípade je potrebné v primeraných časových intervaloch potvrdiť teplotu v komore. OPIS METÓDY Testovacie nádoby 11. Štúdia sa vykonáva v sklenených kadičkách s objemom 600 ml a s priemerom 8 cm. Sú vhodné aj iné nádoby, ale musia zaručiť vhodnú hĺbku nadložnej vody a sedimentu. Povrch sedimentu by mal byť dostatočne veľký, aby poskytoval 2 – 3 cm2 priestoru na larvu. Pomer hĺbky vrstvy sedimentu k hĺbke nadložnej vody by mal byť 1: 4. Testovacie nádoby a iné prístroje, ktoré prichádzajú do styku s testovacím systémom, by mali byť vyrobené výlučne zo skla alebo iného chemicky inertného materiálu (napr. teflónu). Výber druhov 12. Uprednostňovaným druhom na použitie v teste je Chironomus riparius. Chironomus tentans je takisto vhodný, ale je náročnejší na starostlivosť a vyžaduje si dlhšie trvanie testu. Možno použiť aj Chironomus yoshimatsui. Podrobné informácie o kultivačných metódach v prípade druhu Chironomus riparius sú uvedené v dodatku 2. Informácie o kultivačných podmienkach sú k dispozícii aj pre iné druhy, t. j. Chironomus tentans (4) a Chironomus yoshimatsui (11). Identifikácia druhov musí byť pred testovaním potvrdená, ale nevyžaduje sa pred každým testom, ak organizmy pochádzajú z internej kultúry. Sediment 13. Uprednostňuje sa použitie umelo pripraveného sedimentu (známeho aj pod názvom rekonštituovaný, umelý alebo syntetický sediment). Ak sa však použije prírodný sediment, je potrebné ho charakterizovať (aspoň pH, obsah organického uhlíka, odporúča sa aj stanovenie ostatných parametrov ako pomer C/N a granulometria) a nemal by obsahovať žiadne kontaminanty ani iné organizmy, ktoré by mohli s pakomármi súperiť alebo ich požierať. Takisto sa odporúča, aby bol prírodný sediment pred použitím v teste toxicity pri pakomároch na sedem dní uvedený do podmienok, ktoré budú prevládať v nasledujúcom teste. V tomto teste (1) (15) (16) sa odporúča použiť nasledujúci umelo pripravený sediment založený na umelej pôde použitej v testovacej metóde C.8 (14): a) 4 – 5 % (suchá hmotnosť) rašeliny: čo najbližšie k pH 5,5 – 6,0. Je dôležité použiť rašelinu v práškovej forme, jemne rozomletú (veľkosť častíc ≤ 1 mm) a sušenú iba vzduchom; b) 20 % (suchá hmotnosť) kaolínu (obsah kaolinitu podľa možnosti nad 30 %); c) 75 – 76 % (suchá hmotnosť) kremenného piesku (mal by prevládať jemný piesok s viac ako 50 % častíc s veľkosťou od 50 do 200 μm); d) deionizovaná voda sa pridá, aby sa dosiahla vlhkosť konečnej zmesi v rozsahu 30 – 50 %; e) uhličitan vápenatý chemicky čistej kvality (CaCO3) sa pridá, aby sa pH konečnej zmesi sedimentu upravila na 7,0 ± 0,5; f) obsah organického uhlíka v konečnej zmesi by mal byť 2 % (± 0,5 %) a je potrebné ho upraviť pomocou primeraného množstva rašeliny a piesku podľa písmen a) a c). 14. Zdroj rašeliny, kaolínu a piesku by mal byť známy. Je potrebné skontrolovať, či zložky sedimentu neobsahujú chemické kontaminanty (napr. ťažké kovy, organochlórové zlúčeniny, organofosforové zlúčeniny atď.). Príklad prípravy umelo pripraveného sedimentu je uvedený v dodatku 3. Miešanie suchých zložiek je takisto prípustné, ak sa preukáže, že po pridaní nadložnej vody nedochádza k separácii zložiek sedimentu (napr. k vyplaveniu častíc rašeliny) a že rašelina alebo sediment sú v dostatočnej miere uvedené do podmienok. Voda 15. Každá voda, ktorá vyhovuje chemickým charakteristikám prijateľnej riediacej vody podľa zoznamu uvedeného v dodatkoch 2 a 4, je vhodná ako testovacia voda. Každá vhodná voda, prírodná voda (povrchová alebo podzemná voda), rekonštituovaná voda (pozri dodatok 2) alebo odchlórovaná voda z vodovodu sú prijateľné ako voda na kultiváciu a testovacia voda, ak v nej pakomáre prežijú počas celej kultivácie a testovania bez príznakov stresu. Na začiatku testu by pH testovacej vody mala mať hodnotu medzi 6 a 9 a celková tvrdosť by nemala byť vyššia ako 400 mg/l pre CaCO3. Ak však existuje podozrenie na interakciu medzi iónmi tvrdosti a testovanou látkou, mala by sa použiť voda s nižšou tvrdosťou (a v takom prípade sa teda nesmie použiť Elendtovo médium M4). Počas celej štúdie by sa mal používať rovnaký druh vody. Charakteristiky kvality vody uvedené v dodatku 4 by sa mali merať najmenej dvakrát za rok, alebo ak existuje podozrenie, že sa tieto charakteristiky mohli významne zmeniť. Zásobné roztoky – obohatená voda 16. Testovacie koncentrácie sa vypočítajú na základe koncentrácií vo vodnom stĺpci, t. j. vody nad sedimentom. Testovacie roztoky vybratých koncentrácií sa zvyčajne pripravujú zriedením zásobného roztoku. Zásobné roztoky sa podľa možnosti pripravujú rozpustením testovanej látky v testovacom médiu. V niektorých prípadoch môže byť na vytvorenie vhodne koncentrovaného zásobného roztoku potrebné použiť rozpúšťadlá alebo disperzné činidlá. Príkladmi vhodných rozpúšťadiel sú acetón, etanol, metanol, etylénglykolmonoetyléter, etylénglykoldimetyléter, dimetylformamid a trietylénglykol. Ako disperzné činidlá možno použiť Cremophor RH40, Tween 80, 0,01 % metylcelulózu a HCO-40. Koncentrácia látky zvyšujúcej rozpustnosť v konečnom testovacom médiu by mala byť minimálna (t. j. ≤ 0,1 ml/l) a mala by byť vo všetkých pokusoch rovnaká. Ak sa použije látka zvyšujúca rozpustnosť, nesmie mať žiadne signifikantné účinky na prežívanie ani žiaden viditeľný škodlivý účinok na larvy pakomárov, aké sa preukázali pri kontrole s rozpúšťadlom. Je však potrebné vynaložiť maximálne úsilie, aby sa predišlo použitiu týchto materiálov. KONCEPCIA TESTU 17. Koncepcia testu sa vzťahuje na výber počtu a odstup testovaných koncentrácií, počet nádob pri každej koncentrácii a počet lariev v každej nádobe. Sú tu opísané koncepcie na odhadnutie bodu EC, na odhadnutie koncentrácie NOEC a na vykonanie limitného testu. Uprednostňuje sa regresná analýza pred testovaním hypotéz. Koncepcia regresnej analýzy 18. Účinná koncentrácia (napr. EC15, EC50) a koncentračný rozsah, v ktorom sa skúmajú účinky testovanej látky, sa merajú koncentráciami zahrnutými do testu. Vo všeobecnosti sú presnosť a najmä platnosť, s ktorou možno odhadovať účinné koncentrácie (ECx), lepšie, ak je účinná koncentrácia v rozsahu testovaných koncentrácií. Je potrebné vyhýbať sa extrapolácii hlboko pod najnižšou pozitívnou koncentráciou alebo nad najvyššou koncentráciou. Pri výbere rozsahu koncentrácií, ktoré sa použijú, je užitočný predbežný test na zistenie rozsahu (pozri odsek 27). 19. Ak je potrebné odhadnúť ECx, malo by sa testovať najmenej päť koncentrácií a tri replikáty pre každú koncentráciu. V každom prípade je vhodné použiť dostatočné testovacie koncentrácie, ktoré umožnia dobrý modelový odhad. Faktor medzi koncentráciami by nemal byť väčší ako 2 (v prípadoch, keď má krivka závislosti reakcie od dávky plytký sklon, možno urobiť výnimku). Počet replikátov pri každej aplikácii sa môže znížiť, ak sa zvýši počet testovacích koncentrácií s rozdielnymi reakciami. Zvýšenie počtu replikátov alebo skrátenie dĺžky intervalov testovacích koncentrácií zvyčajne vedie k nižším intervalom spoľahlivosti testu. Ak sa odhaduje desaťdňové prežívanie a rast lariev, sú potrebné ďalšie replikáty. Koncepcia odhadu NOEC/LOEC 20. Ak sa odhadujú koncentrácie NOEC/LOEC, použije sa päť testovacích koncentrácií s najmenej štyrmi replikátmi a faktor medzi koncentráciami by nemal byť vyšší ako dva. Počet replikátov by mal byť dostatočný, aby sa zabezpečila primeraná štatistická výpovedná hodnota na zistenie rozdielu 20 % pri kontrole pri úrovni významnosti 5 % (p = 0,05). V prípade vývojového pomeru je zvyčajne vhodná analýza rozptylu (ANOVA), ako napríklad Dunnettov test a Williamsov test (17) (18) (19) (20). Pri pomere vykuklenia možno použiť Cochranov-Armitageho, Fisherov exaktný (s Bonferroniho korekciou) alebo Mantelov-Haenszelov test. Limitný test 21. Môže sa vykonať limitný test (jedna testovaná koncentrácia a kontrola), ak v predbežnom teste na zistenie rozsahu neboli pozorované žiadne účinky. Účelom limitného testu je ukázať, že toxická hodnota testovanej látky je väčšia ako testovaná limitná koncentrácia. V tejto testovacej metóde nemožno navrhnúť odporúčanú koncentráciu. Toto rozhodnutie je na posúdení regulačného orgánu. Zvyčajne je na aplikáciu aj kontrolu potrebných najmenej šesť replikátov. Je nutné preukázať primeranú štatistickú výpovednú hodnotu na zistenie rozdielu 20 % pri kontrole pri úrovni významnosti 5 % (p = 0,05). V prípade metrickej reakcie (vývojový pomer a hmotnosť) je vhodnou štatistickou metódou t-test, pokiaľ údaje spĺňajú požiadavky tohto testu (normalita, homogénne rozptyly). Ak tieto požiadavky nie sú splnené, môže sa použiť t-test nerovnomerných rozptylov alebo neparametrický test, ako napríklad Wilcoxonov-Mannov-Whitheyho test. Pri pomere vykuklenia je vhodný Fisherov exaktný test. POSTUP Podmienky expozície Príprava systému obohatená voda – sediment 22. Do testovacích nádob sa pridajú primerané množstvá umelo pripraveného sedimentu (pozri odseky 13 – 14 a dodatok 3), aby sa vytvorila vrstva hrubá najmenej 1,5 cm. Voda sa pridá do výšky 6 cm (pozri odsek 15). Pomer výšky vrstvy sedimentu a výšky vody by nemal presiahnuť 1: 4, pričom vrstva sedimentu by nemala byť hrubšia ako 3 cm. Systém sediment – voda by sa mal pred pridaním testovacích organizmov nechať jemne prevzdušňovať počas siedmich dní (pozri odsek 14 a dodatok 3). S cieľom zabrániť separácii zložiek sedimentu a resuspendovaniu jemného materiálu počas pridávania testovacej vody do vodného stĺpca môže byť sediment v čase, keď sa naň nalieva voda, prikrytý umelohmotným kotúčom, ktorý sa hneď potom odstráni. Môže byť vhodné aj použitie iných prístrojov. 23. Testovacie nádoby sa zakryjú (napr. sklenenými platňami). V prípade potreby sa počas štúdie dopĺňajú hladiny vody na pôvodný objem s cieľom kompenzovať vyparovanie vody. Na tento účel sa použije destilovaná alebo deionizovaná voda, aby sa predišlo hromadeniu solí. Pridanie testovacích organizmov 24. Štyri až päť dní pred pridaním testovacích organizmov do testovacích nádob sa z kultúr odoberú vajíčkové masy a umiestnia sa do malých nádob s kultivačných médiom. Môže sa použiť staršie médium zo zásobnej kultúry alebo čerstvo pripravené médium. Ak sa použije čerstvo pripravené kultivačné médium, je potrebné doň pridať malé množstvo potravy, napr. zelené riasy a/alebo pár kvapiek filtrátu z jemne rozomletej suspenzie vločkového krmiva pre ryby (pozri dodatok 2). Použijú sa iba čerstvo nakladené vajíčkové masy. Larvy sa zvyčajne začnú liahnuť niekoľko dní po nakladení vajíčok (dva až tri dni v prípade druhu Chironomus riparius pri teplote 20 °C a jeden až štyri dni v prípade Chironomus tentans pri teplote 23 °C a Chironomus yoshimatsui pri teplote 25 °C) a rast lariev prebieha v štyroch instaroch, z ktorých každý trvá štyri až osem dní. V teste sa použijú larvy prvého instaru (dva až tri alebo jeden až štyri dni po vyliahnutí). Instar pakomárov je možné skontrolovať podľa šírky hlavového segmentu (6). 25. Larvy 21. instaru sa pomocou tupej pipety náhodne rozdelia do jednotlivých testovacích nádob obsahujúcich obohatený sediment a vodu. Prevzdušňovanie vody je nutné počas pridávania lariev do testovacích nádob prerušiť a musí byť pozastavené počas ďalších 24 hodín po pridaní lariev (pozri odseky 24 a 32). Podľa použitej koncepcie testu (pozri odseky 19 a 20) je počet lariev použitých pri každej koncentrácii najmenej 60 na odhad bodu EC a 80 na stanovenie koncentrácie NOEC. 26. Dvadsaťštyri hodín po pridaní lariev sa do nadložného vodného stĺpca pridá testovaná látka a opäť sa začne s jemným prevzdušňovaním. Pod povrch vody sa pomocou pipety aplikujú malé množstvá roztokov testovanej látky. Nadložná voda sa potom opatrne premieša, aby sa nenarušil sediment. Testovacie koncentrácie 27. Pri určovaní rozsahu koncentrácií pre konečný test môže byť užitočný test na zistenie rozsahu. Na tento účel sa použije súbor koncentrácií testovanej látky s veľkými odstupmi. S cieľom zabezpečiť rovnakú hustotu povrchu na pakomára, ktorá sa použije pri konečnom teste, sú pakomáre vystavené každej koncentrácii testovanej látky na obdobie, ktoré umožňuje odhad vhodných testovacích koncentrácií, pričom nie sú potrebné žiadne replikáty. 28. Testovacie koncentrácie pre konečný test sa vyberú na základe výsledkov testu na zistenie rozsahu. Je potrebné použiť a vybrať najmenej päť koncentrácií, ako sa uvádza v odsekoch 18 – 20. Kontroly 29. Súčasťou testu sú kontrolné nádoby bez prítomnosti testovanej látky, ktoré však obsahujú sediment, a primeraný počet replikátov (pozri odseky 19 – 20). Ak sa pri aplikácii testovanej látky použije rozpúšťadlo (pozri odsek 16), je potrebné pridať kontrolu rozpúšťadla v sedimente. Testovací systém 30. Použijú sa statické systémy. Vo výnimočných prípadoch sa môžu použiť semistatické alebo prietokové systémy s prerušovaným alebo nepretržitým obmieňaním nadložnej vody, napríklad ak sú špecifikácie kvality vody nevhodné pre testovacie organizmy alebo ak ovplyvňujú chemickú rovnováhu (napr. úrovne rozpusteného kyslíka príliš klesnú, koncentrácia vylučovaných produktov príliš stúpne alebo sa zo sedimentu lúhujú minerály, čo má vplyv na pH a/alebo tvrdosť vody). Zvyčajne však postačujú a uprednostňujú sa iné metódy zlepšenia kvality nadložnej vody, ako napríklad prevzdušňovanie. Potrava 31. Je nevyhnutné larvy kŕmiť podľa možnosti každý deň alebo najmenej trikrát do týždňa. V prvých desiatich dňoch je pre mladé larvy podľa všetkého vhodné krmivo pre ryby (suspenzia vo vode alebo jemne rozomletá potrava, napr. Tetra-Min alebo Tetra-Phyll, bližšie informácie pozri v dodatku 2) v dennom množstve 0,25 – 0,5 mg (0,35 – 0,5 mg pre druh C. yoshimatsui) na jednu larvu. Pre staršie larvy môže byť potrebné o niečo väčšie množstvo potravy: denné množstvo 0,5 – 1 mg na jednu larvu by malo po zvyšok testu postačovať. Ak sa pozoruje rast hubovitých organizmov alebo ak sa v kontrolných nádobách pozoruje mortalita, prídel potravy by sa mal vo všetkých testovacích a kontrolných nádobách znížiť. Ak nie je možné vznik hubovitých organizmov zastaviť, test je nutné opakovať. Pri testovaní silno adsorbujúcich látok (napr. s log Kow > 5) alebo látok, ktoré sa kovalentne viažu na sediment, sa môže do umelo pripraveného sedimentu pred stabilizačným obdobím pridať množstvo potravy potrebné na zabezpečenie prežitia a prirodzeného rastu organizmov. Na tento účel sa namiesto krmiva pre ryby musí použiť rastlinný materiál, napr. sa môže pridať 0,5 % (suchá hmotnosť) jemne rozomletých listov napr. pŕhľavy dvojdomej (Urtica dioica), moruše (Morus alba), ďateliny plazivej (Trifolium repens), špenátu (Spinacia oleracea) alebo iného rastlinného materiálu (Cerophyl alebo alfa celulóza). Podmienky inkubácie 32. Najlepšie po 24 hodinách od pridania lariev sa zabezpečí jemné prevzdušňovanie nadložnej vody v testovacích nádobách a pokračuje v ňom počas celého testu (treba dbať na to, aby koncentrácia rozpusteného kyslíka neklesla pod 60 % ASV). Prevzdušňovanie sa zabezpečí pomocou sklenenej Pasteurovej pipety upevnenej 2 – 3 cm nad vrstvou sedimentu (t. j. jedna alebo niekoľko bublín za sekundu). Ak sa testujú prchavé chemikálie, možno zvážiť, že systém sediment – voda sa nebude prevzdušňovať. 33. Test sa vykonáva pri konštantnej teplote 20 °C (± 2 °C). V prípade druhu C. tentans sa odporúča teplota 23 °C a v prípade C. yoshimatsui 25 °C (± 2 °C). Použije sa 16-hodinová svetlá fáza, pričom intenzita svetla by mala byť 500 – 1 000 luxov. Trvanie expozície 34. Expozícia sa začne pridaním lariev do obohatených a kontrolných nádob. Maximálna dĺžka expozície je 28 dní v prípade druhov C. riparius a C. yoshimatsui a 65 dní v prípade C. tentans. Ak sa pakomáre vykuklia skôr, test sa môže ukončiť najskôr päť dní po vykuklení posledného dospelého jedinca v kontrolnej skupine. POZOROVANIA Vykuklenie 35. Určí sa čas vývoja a celkový počet úplne vykuklených samčích a samičích pakomárov. Samčeky sa ľahko identifikujú podľa obrvených tykadiel. 36. Testovacie nádoby je potrebné pozorovať najmenej trikrát do týždňa s cieľom vizuálne zhodnotiť každé abnormálne správanie (napr. opúšťanie sedimentu, nezvyčajné plávanie) v porovnaní s kontrolnou skupinou. Počas obdobia očakávaného vykuklenia je nevyhnutné každý deň spočítať vykuklené pakomáre. Pohlavie a počet úplne vykuklených pakomárov sa zaznamenáva denne. Po identifikácii sa pakomáre vyberú z nádob. Všetky vajíčkové masy nakladené pred ukončením testu sa zaznamenajú a následne odstránia, aby sa predišlo opätovnému zavedeniu lariev do sedimentu. Takisto sa zaznamená počet viditeľných kukiel, ktoré sa nevykuklili. Usmernenie k meraniu vykuklenia je uvedené v dodatku 5. Rast a prežívanie 37. Ak je potrebné získať údaje o desaťdňovom prežívaní a raste lariev, na začiatku sa pripravia ďalšie testovacie nádoby tak, aby sa mohli následne použiť. Sediment z týchto ďalších nádob sa precedí pomocou cedidla s hrúbkou 250 μm, aby sa zachytili larvy. Kritériami na stanovenie smrti sú nehybnosť alebo chýbajúca reakcia na mechanický podnet. Stratené larvy sa takisto počítajú medzi mŕtve (larvy, ktoré uhynuli na začiatku testu, sa mohli rozložiť pôsobením mikróbov). Určí sa suchá hmotnosť (bez popola) lariev, ktoré prežili v každej testovacej nádobe, a vypočíta sa stredná suchá hmotnosť jedincov na jednu nádobu. Je užitočné určiť, do ktorého instaru patria larvy, ktoré prežili. Na toto meranie sa môže použiť šírka hlavového segmentu každého jedinca. Analytické merania Koncentrácia testovanej látky 38. Vzorky nadložnej vody, pórovej vody a sedimentu sa musia analyzovať minimálne na začiatku (najlepšie jednu hodinu po aplikácii testovanej látky) a na konci testu pri najvyššej koncentrácii a pri jednej nižšej koncentrácii. Tieto skúmania koncentrácie testovanej látky poskytujú informácie o správaní/delení testovanej látky v systéme voda – sediment. Odoberanie vzoriek na začiatku testu môže ovplyvniť testovací systém (napr. odstránenie testovaných lariev), preto je potrebné použiť ďalšie testovacie nádoby, aby bolo podľa potreby možné vykonať analytické vyšetrenia na začiatku a počas testu (pozri odsek 39). Merania v sedimente nemusia byť potrebné, ak sa delenie testovanej látky medzi vodu a sediment jednoznačne určilo v štúdii voda/sediment pri porovnateľných podmienkach (napr. pomer sedimentu k vode, druh aplikácie, obsah organického uhlíka v sedimente). 39. Ak sa vykonajú prostredné merania (napr. v deň 7) a ak sú na analýzu potrebné veľké vzorky, ktoré nemožno odobrať z testovacích nádob bez ovplyvnenia testovacieho systému, analytické vyšetrenia je potrebné vykonať na vzorkách z ďalších testovacích nádob, s ktorými sa zaobchádzalo rovnakým spôsobom (vrátane prítomnosti testovacích organizmov), ale ktoré sa nepoužijú na biologické pozorovania. 40. Na izolovanie intersticiálnej vody je odporúčaným postupom odstredenie napr. pri 10 000 g a 4 °C počas 30 minút. Ak sa však preukáže, že testovaná látka sa na filtroch neadsorbuje, môže byť prijateľná aj filtrácia. V niektorých prípadoch nemusí byť možné analyzovať koncentrácie v pórovej vode, lebo vzorka je príliš malá. Fyzikálno-chemické parametre 41. Je potrebné vhodným spôsobom odmerať pH, rozpustený kyslík v testovacej vode a teplotu v testovacích nádobách (pozri odsek 10). Tvrdosť a amoniak sa merajú v kontrolných nádobách a v jednej testovacej nádobe pri najvyššej koncentrácii na začiatku a na konci testu. ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV Spracovanie výsledkov 42. Účelom tohto testu je určiť účinok testovanej látky na vývojový pomer a celkový počet úplne vykuklených samčích a samičích pakomárov, alebo v prípade desaťdňového testu účinky na prežívanie a hmotnosť lariev. Ak nič nepoukazuje na štatisticky rozdielnu vnímavosť medzi pohlaviami, výsledky pre samčeky a samičky možno na účely štatistických analýz zhrnúť spoločne. Rozdiely vnímavosti medzi pohlaviami sa môžu štatisticky posúdiť, napr. tabuľkovým testom χ2 – r × 2. Prežívanie lariev a stredná suchá hmotnosť jedincov na jednu nádobu sa podľa potreby musí určiť po desiatich dňoch. 43. Účinné koncentrácie vyjadrené ako koncentrácie v nadložnej vode sa podľa možnosti vypočítajú na základe nameraných koncentrácií na začiatku testu (pozri odsek 38). 44. Na vyčíslenie odhadu bodu EC50 alebo akejkoľvek inej hodnoty ECx sa ako pravé replikáty môže použiť štatistika na jednu nádobu. Pri výpočte intervalu spoľahlivosti pre každú hodnotu ECx je potrebné zohľadniť variabilitu medzi nádobami alebo je nutné preukázať, že táto variabilita je taká malá, že je možné ju ignorovať. Ak sa model upraví metódou najmenších štvorcov, v štatistike na jednu nádobu je potrebné aplikovať transformáciu, aby sa zlepšila homogénnosť rozptylu. Hodnoty ECx by sa však mali vypočítať po tom, ako sa reakcia transformuje naspäť na pôvodnú hodnotu. 45. Ak je cieľom štatistickej analýzy určenie koncentrácie NOEC/LOEC prostredníctvom testovania hypotézy, je potrebné zohľadniť variabilitu medzi nádobami, napr. pomocou hierarchickej analýzy ANOVA. Alternatívne môžu byť vhodné podrobnejšie testy (21) v prípadoch, keď dochádza k nedodržaniu zvyčajných predpokladov analýzy ANOVA. Pomer vykuklenia 46. Pomery vykuklenia sú kvantové údaje a môžu sa analyzovať pomocou Cochranovho-Armitageho testu aplikovaného zostupne v prípadoch, keď sa očakáva monotónna reakcia na dávku a tieto údaje zodpovedajú tomuto očakávaniu. Ak tomu tak nie je, možno použiť Fisherov exaktný test alebo Mantzelov-Haentzalov test s Bonferroniho-Holmovou úpravou hodnôt p. Ak sa medzi replikátmi pri rovnakej koncentrácii preukáže väčšia variabilita, než akú by indikovala binomická distribúcia (často sa uvádza ako ‚extra-binomická‘ variácia), potom by sa mal použiť podrobný Cochranov-Armitageho test alebo Fisherov exaktný test, ako sa navrhuje v bode (21). 47. Určí sa súčet pakomárov vykuklených na jednu nádobu, ne, a vydelí sa počtom zavedených lariev, na: kde: ER = pomer vykuklenia, ne = počet pakomárov vykuklených na nádobu, na = počet zavedených lariev na nádobu. 48. Najvhodnejšou alternatívou pri veľkých vzorkách v prípadoch extra binomickej variácie je brať pomer vykuklenia (ER) ako nepretržitú reakciu a použiť postupy, ako je napríklad Williamsov test, ak sa očakáva monotónna reakcia na dávku, ktorá je konzistentná s týmito údajmi o ER. Ak reakcia nie je monotónna, je vhodný Dunnettov test. Za veľkú vzorku sa pokladá vzorka, v ktorej je počet vykuklených aj počet nevykuklených jedincov v každom replikáte (nádobe) vyšší ako päť. 49. Pri aplikovaní metód ANOVA je potrebné najskôr transformovať hodnoty ER pomocou arkussínusovej transformácie druhej odmocniny alebo Freemanovej-Tukeyho transformácie s cieľom získať približnú normálnu distribúciu a vyrovnať rozptyly. Cochranov-Armitageho test, Fisherov exaktný (Bonferroniho) test alebo Mantelov-Haenszelov test možno aplikovať, ak sa použijú absolútne frekvencie. Arkussínusová transformácia druhej odmocniny sa aplikuje pomocou prevrátenej hodnoty sínusu (sin–1) druhej odmocniny ER. 50. Pri pomeroch vykuklenia sa hodnoty ECx vypočítajú pomocou regresnej analýzy (alebo napr. pomocou modelov probit (22), logit, Weibull, vhodného komerčného softvéru atď.). Ak je regresná analýza neúspešná (napr. ak sú k dispozícii menej ako dve čiastkové reakcie), použijú sa iné neparametrické metódy, ako je metóda pohyblivého priemeru alebo jednoduchá interpolácia. Vývojový pomer 51. Stredný vývojový čas predstavuje stredné časové rozpätie medzi zavedením lariev (deň 0 testu) a vykuklením pokusnej kohorty pakomárov. (Pri výpočte reálneho vývojového času sa zohľadní vek lariev v čase zavedenia). Vývojový pomer je prevrátená hodnota vývojového času (jednotka: 1/deň) a predstavuje časť vývinu lariev, ktorá prebieha za deň. Pri hodnotení týchto štúdií toxicity v sedimente sa uprednostňuje vývojový pomer, lebo jeho rozptyl je nižší a v porovnaní s vývojovým časom je homogénnejší a bližší normálnej distribúcii. Výkonné parametrické testovacie postupy teda možno lepšie použiť s vývojovým pomerom ako s vývojovým časom. Pre vývojový pomer ako nepretržitú reakciu možno hodnoty ECx odhadnúť pomocou regresnej analýzy [napr. (23) (24)]. 52. Pri nasledujúcich štatistických testoch sa predpokladá, že počet pakomárov pozorovaných v kontrolnom dni × sa vykuklil v strednom časovom intervale medzi dňom × a dňom x - l (l = dĺžka kontrolného intervalu, zvyčajne jeden deň). Stredný vývojový pomer na nádobu x) sa vypočíta podľa tejto rovnice: kde: : stredný vývojový pomer na nádobu, i : index kontrolného intervalu, m : maximálny počet kontrolných intervalov, : počet pakomárov vykuklených v kontrolnom intervale i, ne : celkový počet pakomárov vykuklených na konci pokusu (= ), xi : vývojový pomer pakomárov vykuklených v intervale i; kde: deňi : kontrolný deň (dni od aplikácie), li : dĺžka kontrolného intervalu i (dni, zvyčajne jeden deň). Správa o teste 53. Správa o teste musí obsahovať aspoň tieto informácie: Testovaná látka: — fyzikálny charakter a, ak je to relevantné, fyzikálno-chemické vlastnosti (rozpustnosť vo vode, tlak pary, rozdeľovací koeficient v pôde (alebo v sedimente, ak je k dispozícii), stabilita vo vode atď.), — chemické identifikačné údaje (bežný názov, chemický názov, štrukturálny vzorec, číslo CAS atď.) vrátane čistoty a analytickej metódy kvantifikácie testovanej látky. Testovacie druhy: — použité testovacie zvieratá: druh, vedecký názov, zdroj organizmov a podmienky chovu, — informácie o manipulácii s vajíčkovými masami a larvami, — vek testovacích zvierat pri umiestnení do testovacích nádob. Podmienky testovania: — použitý sediment, t. j. prírodný alebo umelo pripravený sediment, — v prípade prírodného sedimentu poloha a opis miesta odobratia vzoriek sedimentu vrátane histórie kontaminácie, ak je to možné, charakteristiky: pH, obsah organického uhlíka, pomer C/N a granulometria (podľa potreby), — príprava umelo pripraveného sedimentu: zložky a charakteristiky (obsah organického uhlíka, pH, vlhkosť atď. na začiatku testu), — príprava testovacej vody (ak sa použije rekonštituovaná voda) a charakteristiky (koncentrácia kyslíka, pH, vodivosť, tvrdosť atď. na začiatku testu), — výška sedimentu a nadložnej vody, — objem nadložnej a pórovej vody, hmotnosť mokrého sedimentu s pórovou vodou a bez nej, — testovacie nádoby (materiál a veľkosť), — metóda prípravy zásobných roztokov a testovacích koncentrácií, — aplikácia testovanej látky: použité testovacie koncentrácie, počet replikátov a prípadné použitie rozpúšťadiel, — inkubačné podmienky: teplota, svetelný cyklus a intenzita, prevdzušňovanie (frekvencia a intenzita), — podrobné informácie o kŕmení vrátane druhu potravy, prípravy, množstva a kŕmneho režimu. Výsledky: — nominálne testovacie koncentrácie, namerané testovacie koncentrácie a výsledky všetkých analýz na stanovenie koncentrácie testovanej látky v testovacej nádobe, — kvalita vody v testovacích nádobách, t. j. pH, teplota, rozpustený kyslík, tvrdosť a amoniak, — kompenzácia prípadnej vyparenej testovacej vody, — počet vykuklených samčích a samičích pakomárov na nádobu na deň, — počet lariev na nádobu, ktoré sa nevykuklili, — stredná suchá hmotnosť jednotlivých lariev na nádobu a na instar podľa potreby, — percentuálne vykuklenie na replikát a testovaciu koncentráciu (samčie a samičie pakomáre spolu), — stredný vývojový pomer úplne vykuklených pakomárov na replikát a miera ošetrenia (samčie a samičie pakomáre spolu), — odhady toxických parametrov, napr. ECx (a súvisiace intervaly spoľahlivosti), NOEC a/alebo LOEC a štatistické metódy použité na ich stanovenie, — rozbor výsledkov vrátane každého vplyvu na výsledok testu vyplývajúceho z odchýlok od tejto testovacej metódy. LITERATÚRA 1. BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Upravili M. Streloke a H. Köpp. Berlín 1995. 2. Fleming, R. a kol. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Záverečná správa pre Európsku komisiu. Správa č.: EK, 3738. August 1994. WRc, UK. 3. SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. Zo seminára WOSTA, ktorý sa uskutočnil v Holandsku. 4. ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates, s. 1125 – 1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. 5. Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. 6. US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Druhé vydanie. EPA 600/R-99/064. Marec 2000. Revízia prvého vydania z júna 1994. 7. US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. 8. US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. 9. Milani, D., Day, K. E., McLeay, D. J., Kirby, R. S. (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Kanada. 10. Sugaya, Y. (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345 – 350. 11. Kawai, K. (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47 – 57. 12. OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. 13. Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. 14. Kapitola C.8 tejto prílohy, Toxicita pre dážďovky. 15. Suedel, B. C., a Rodgers, J. H. (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163 – 1175. 16. Naylor, C., a Rodrigues, C. (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291 – 3303. 17. Dunnett, C. W. (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096 – 1121. 18. Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482 – 491. 19. Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103 – 117. 20. Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510 – 531. 21. Rao, J. N. K., a Scott, A. J. (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577 – 585. 22. Christensen, E. R. (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213 – 221. 23. Bruce a Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485 – 1494. 24. Slob, W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298 – 312. Dodatok 1 VYMEDZENIE POJMOV Na účely tejto metódy sa používajú tieto vymedzenia pojmov: Umelo pripravený sediment alebo rekonštituovaný, umelý alebo syntetický sediment je zmes materiálov použitých na napodobnenie fyzických zložiek prírodného sedimentu. Nadložná voda je voda umiestnená v testovacej nádobe nad sedimentom. Intersticiálna voda alebo pórová voda je voda nachádzajúca sa v priestore medzi časticami sedimentu a pôdy. Obohatená voda je voda, do ktorej bola pridaná testovaná látka. Testovaná chemikália: akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy. Dodatok 2 Odporúčania ku kultúre Chironomus riparius 1. Larvy rodu Chironomus sa môžu chovať v kryštalizačných miskách alebo vo väčších nádobách. Na dno nádoby sa nanesie tenká vrstva jemného kremenného piesku vo výške 5 – 10 mm. Je preukázané, že vhodným substrátom je aj diatomit (napr. Merck, článok 8117) (postačuje tenšia vrstva do výšky len niekoľkých milimetrov). Potom sa pridá vhodná voda do výšky niekoľkých centimetrov. Hladiny vody by sa mali podľa potreby dopĺňať, aby sa kompenzovala strata vyparením a aby sa predišlo vysychaniu. Vodu je možné v prípade potreby vymeniť. Je potrebné zabezpečiť jemné prevzdušňovanie. Misky na chov lariev by mali byť umiestnené vo vhodnej klietke, ktorá zabráni úniku vykuklených dospelých jedincov. Klietka by mala byť dostatočne veľká, aby umožňovala rojenie vykuklených dospelých jedincov, v opačnom prípade by nemuselo dôjsť ku kopulácii (minimálna veľkosť je asi 30 × 30 × 30 cm). 2. Klietky je potrebné udržiavať pri izbovej teplote alebo v miestnosti so stálym prostredím pri teplote 20 ± 2 °C so svetlou fázou v trvaní 16 hodín (intenzita asi 1 000 luxov) a fázou tmy v trvaní osem hodín. Je preukázané, že vlhkosť vzduchu nižšia ako 60 % RH môže brániť reprodukcii. Riediaca voda 3. Možno použiť akúkoľvek vhodnú prírodnú alebo syntetickú vodu. Bežne sa používa studňová voda, odchlórovaná voda z vodovodu a umelé médiá (napr. Elendtovo médium ‚M4‘ alebo ‚M7‘, pozri ďalej). Pred použitím je potrebné vodu prevzdušniť. V prípade potreby možno kultivačnú vodu obnoviť opatrným odliatím alebo odčerpaním použitej vody z kultivačných nádob bez toho, aby sa poškodili trubice lariev. Kŕmenie lariev 4. Larvy rodu Chironomus sa kŕmia vločkovým krmivom pre ryby [Tetra Min®, Tetra Phyll® alebo inou podobnou značkou patentovaného krmiva pre ryby] približným množstvom 250 mg na nádobu na deň. Krmivo sa môže podávať ako suchý rozomletý prášok alebo ako suspenzia vo vode: 1,0 g vločkového krmiva sa pridá do 20 ml riediacej vody a premieša sa, aby sa získala homogénna zmes. Tento prípravok sa môže podávať v množstve približne 5ml na nádobu na deň (pred použitím pretrepať). Staršie larvy môžu dostávať viac. 5. Kŕmenie sa upraví podľa kvality vody. Ak sa kultivačné médium zakalí, kŕmenie je potrebné obmedziť. Prídavky do krmiva sa musia starostlivo monitorovať. Nedostatok potravy spôsobí, že larvy sa budú presúvať k vodnému stĺpcu, a prebytok potravy spôsobí zvýšenie činnosti mikróbov a zníženie koncentrácií kyslíka. V obidvoch prípadoch môže dôjsť k zníženiu rastových pomerov. 6. Pri založení nových kultivačných nádob sa môžu pridať aj bunky niektorých zelených rias (napr. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris). Kŕmenie vykuklených dospelých jedincov 7. Z niektorých pokusov vyplýva, že ako potrava pre vykuklené dospelé jedince môže slúžiť vatový tampón napustený nasýteným sacharózovým roztokom. Vykuklenie 8. Pri teplote 20 ± 2 °C sa dospelé jedince začnú kukliť z nádoby na chov lariev po približne 13 – 15 dňoch. Samčeky sa ľahko rozlíšia podľa obrvených tykadiel. Vajíčkové masy 9. Keď sú v chovnej klietke prítomné dospelé jedince, vo všetkých nádobách na chov lariev je potrebné trikrát do týždňa kontrolovať kladenie želatínových vajíčkových más. Ak sú vajíčkové masy prítomné, opatrne sa odoberú. Mali by sa preniesť na malú misku so vzorkou kultivačnej vody. Vajíčkové masy sa použijú na založenie nových kultivačných nádob (napr. dve až štyri vajíčkové masy na nádobu) alebo sa použijú v testoch toxicity. 10. Larvy prvého instaru by sa mali vyliahnuť po dvoch až troch dňoch. Založenie nových kultivačných nádob 11. Po vytvorení kultúr by malo byť možné založiť novú nádobu na kultiváciu lariev každý týždeň alebo menej často v závislosti od testovacích požiadaviek, pričom staršie nádoby sa po vykuklení dospelých pakomárov odstránia. Týmto spôsobom sa pri minimálnom riadení zabezpečí pravidelné dopĺňanie dospelých jedincov. Príprava testovacích roztokov ‚M4‘ a ‚M7‘ 12. Elendt (1990) opísal médium ‚M4‘. Médium ‚M7‘ sa pripravuje ako médium ‚M4‘ s výnimkou látok označených v tabuľke 1, pre ktoré sú koncentrácie v médiu ‚M7‘ štyrikrát nižšie ako v médiu ‚M4‘. Publikácia o médiu ‚M7‘ je v štádiu prípravy (Elendt, osobná komunikácia). Testovací roztok by sa nemal pripraviť podľa Elendta a Biasa (1990), lebo koncentrácie NaSiO3.5H2O, NaNO3, KH2PO4 a K2HPO4 uvedené pre prípravu zásobných roztokov nie sú vhodné. Príprava média ‚M7‘ 13. Každý zásobný roztok (I) sa pripraví jednotlivo a kombinovaný zásobný roztok (II) sa pripraví z týchto zásobných roztokov (I) (pozri tabuľku 1). Na prípravu média ‚M7‘ sa 50 ml z kombinovaného zásobného roztoku (II) a množstvá každého makronutričného zásobného roztoku uvedené v tabuľke 2 doplnia do 1 l deionizovanej vody. Vitamínový zásobný roztok sa pripraví pridaním troch vitamínov do deionizovanej vody, ako je uvedené v tabuľke 3, a krátko pred použitím sa do konečného média ‚M7‘ pridá 0,1 ml kombinovaného vitamínového zásobného roztoku. (Vitamínový zásobný roztok sa skladuje zmrazený v malých alikvotných častiach). Médium sa prevzdušňuje a stabilizuje. Tabuľka 1 Zásobné roztoky stopových prvkov pre médiá M4 a M7 Zásobné roztoky (I) Množstvo (mg) doplnené do jedného litra deionizovanej vody Na prípravu kombinovaného zásobného roztoku (II) sa zmiešajú tieto množstvá (ml) zásobných roztokov (I) a doplnia sa do jedného litra deionizovanej vody Konečné koncentrácie v testovacích roztokoch (mg/l) M4 M7 M4 M7 H3BO3 (18) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 MnCl2 • 4 H2O (18) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 LiCl (18) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 RbCl (18) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 SrCl2 • 6 H2O (18) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 NaBr (18) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 Na2MoO4 • 2 H2O (18) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 CuCl2 • 2 H2O (18) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 ZnCl2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 CaCl2 • 6 H2O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na2SeO3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 NH4VO3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 Na2EDTA • 2 H2O (18) (19) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 FeSO4 • 7 H2O (18) (19) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249 Tabuľka 2 Makronutričné zásobné roztoky pre médiá M4 a M7 Množstvo doplnené do jedného litra deionizovanej vody (mg) Množstvo pridaných makronutričných zásobných roztokov pri príprave médií M4 a M7 (ml/l) Konečné koncentrácie v testovacích roztokoch M4 a M7 (mg/l) CaCl2 • 2 H2O 293 800 1,0 293,8 MgSO4 • 7 H2O 246 600 0,5 123,3 KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO3 64 800 1,0 64,8 NaSiO3 • 9 H2O 50 000 0,2 10,0 NaNO3 2 740 0,1 0,274 KH2PO4 1 430 0,1 0,143 K2HPO4 1 840 0,1 0,184 Tabuľka 3 Vitamínový zásobný roztok pre médiá M4 a M7 Všetky tri vitamínové roztoky sa skombinujú, aby sa vytvoril jeden vitamínový zásobný roztok.

Množstvo doplnené do jedného litra deionizovanej vody (mg) Množstvo pridaného vitamínového zásobného roztoku pri príprave médií M4 a M7 (ml/l) Konečné koncentrácie v testovacích roztokoch M4 a M7 (mg/l) Tiamín hydrochlorid 750 0,1 0,075 Kyanokobalamín (B12) 10 0,1 0,0010 Biotín 7,5 0,1 0,00075 LITERATÚRA BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Upravili M. Streloke a H.Köpp. Berlín 1995. Elendt, B. P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25 – 33. Elendt, B. P., a Bias, W.-R. (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157 – 1167. Dodatok 3 PRÍPRAVA UMELO PRIPRAVENÉHO SEDIMENTU Zloženie sedimentu Zloženie umelo pripraveného sedimentu by malo byť takéto: Zložka Charakteristika % suchej hmotnosti sedimentu Rašelina Rašelinníková rašelina, pH čo najbližšie k 5,5 – 6,0, bez viditeľných zvyškov rastlín, jemne rozomletá (veľkosť častíc ≤ 1 mm) a usušená vzduchom 4 – 5 Kremenný piesok Veľkosť zrniek: > 50 % častíc by malo mať veľkosť v rozsahu 50 – 200 μm 75 – 76 Kaolín Obsah kaolinitu ≥ 30 % 20 Organický uhlík Upravený pridaním rašeliny a piesku 2 (± 0,5) Uhličitan vápenatý CaCO3, rozomletý na prach, chemicky čistý 0,05 – 0,1 Voda Vodivosť ≤ 10 μS/cm 30 – 50 Príprava Rašelina sa usuší vzduchom a rozomelie na jemný prášok. V deionizovanej vode sa pomocou vysokovýkonného homogenizačného prístroja pripraví suspenzia požadovaného množstva rašelinového prášku. Hodnota pH tejto suspenzie sa upraví na 5,5 ± 0,5 pomocou CaCO3. Suspenzia sa aspoň na dva dni uvedie do podmienok jemným premiešavaním pri teplote 20 ± 2 °C, aby sa stabilizovala hodnota pH a vytvorila stabilná mikrobiálna zložka. Opäť sa zmeria pH, ktoré by malo byť na úrovni 6,0 ± 0,5. Rašelinová suspenzia sa následne zmieša s ostatnými zložkami (piesok a kaolín) a s deionizovanou vodou, aby sa získal homogénny sediment s obsahom vody v rozsahu 30 – 50 percent suchej hmotnosti sedimentu. Znova sa zmeria hodnota pH konečnej zmesi a podľa potreby sa pomocou CaCO3 upraví na 6,5 – 7,5. Odoberú sa vzorky sedimentu, aby sa určila suchá hmotnosť a obsah organického uhlíka. Následne sa odporúča, aby sa pred použitím v teste toxicity pri pakomároch umelo pripravený sediment uviedol na sedem dní do rovnakých podmienok, aké budú prevládať v nasledujúcom teste. Skladovanie Suché zložky na prípravu umelého sedimentu sa môžu skladovať na suchom a chladnom mieste pri izbovej teplote. Umelo pripravený (mokrý) sediment by sa pred použitím v teste nemal skladovať. Mal by sa použiť hneď po sedemdňovom období uvádzania do podmienok, ktorým sa končí jeho príprava. LITERATÚRA: Kapitola C.8 tejto prílohy. Toxicita pre dážďovky. Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10 – 20. Dodatok 4 Chemické charakteristiky prijateľnej riediacej vody Látka Koncentrácie Pevné častice < 20 mg/l Celkový organický uhlík < 2 mg/l Neionizovaný amoniak < 1 μg/l Tvrdosť ako CaCO3 < 400 mg/l (20) Zostatkový chlór < 10 μg/l Celkové organofosfátové pesticídy < 50 ng/l Celkové organochlórované pesticídy plus polychlórované bifenyly < 50 ng/l Celkový organický chlór < 25 ng/l Dodatok 5 Usmernenie k monitorovaniu vykuklenia lariev pakomárov Na testovacie kadičky sa umiestnia pasce na vykuklené jedince. Tieto pasce sú potrebné odo dňa 20 do skončenia testu. Ďalej je znázornený príklad použitej pasce. A : nylonová sieťka B : prevrátené umelohmotné misky C : expozičná kadička bez okraja D : sieťované otvory na výmenu vody E : voda F : sediment C.29. ĽAHKÁ BIODEGRADOVATEĽNOSŤ – CO2 V HERMETICKY UZAVRETÝCH NÁDOBÁCH (TEST V UZAVRETOM PRIESTORE NAD KVAPALINOU) ÚVOD 1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykonávanie testov (TG) 310 (2003). Táto testovacia metóda je skríningovou metódou na hodnotenie ľahkej biodegradovateľnosti chemikálií a poskytuje podobné informácie ako šesť testovacích metód opísaných v kapitole C.4 tejto prílohy A až F. Chemikáliu, pri ktorej sa v tejto testovacej metóde preukážu pozitívne výsledky, možno preto považovať za ľahko biodegradovateľnú, a teda za rýchlo degradovateľnú v životnom prostredí. 2. Zvyčajne bola prvou voľbou na testovanie slabo rozpustných chemikálií a chemikálií, ktoré silne adsorbujú, osvedčená metóda (1) oxidu uhličitého (CO2) založená na Sturmovom pôvodnom teste (2) na hodnotenie biodegradovateľnosti organických chemikálií meraním oxidu uhličitého vytváraného mikrobiálnym pôsobením. Vyberá sa aj v prípade rozpustných (ale nie prchavých) chemikálií, lebo uvoľňovanie oxidu uhličitého mnohí považujú za jediný jednoznačný dôkaz mikrobiálnej činnosti. Rozpustený organický uhlík možno odstrániť fyzikálno-chemickými procesmi (adsorpciou, vyparením, zrážaním, hydrolýzou), ako aj mikrobiálnym pôsobením, pričom mnohé nebiologické reakcie spotrebúvajú kyslík. V zriedkavých prípadoch sa CO2 z organických chemikálií tvorí abioticky. V pôvodnom a modifikovanom Sturmovom teste (1) (2) sa CO2 odstráni z tekutej fázy do absorbujúcich nádob čerením (t. j. bublajúcim vzduchom aplikovaným s cieľom odstrániť CO2 cez tekuté médium), zatiaľ čo v Larsonovej verzii (3) (4) sa CO2 prevedie z reakčnej nádoby do absorbérov púšťaním vzduchu bez obsahu CO2 cez uzavretý priestor nad kvapalinou a ďalej nepretržitým pretrepávaním testovacej nádoby. Reakčná nádoba sa pretrepáva iba v Larsonovej modifikácii. Premiešavanie je v ISO 9439 (5) a v pôvodnej americkej verzii (6) špecifikované iba pre nerozpustné látky, pričom obe normy špecifikujú skôr čerenie namiesto výmeny uzavretého priestoru nad kvapalinou. V ďalšej oficiálnej metóde USA EPA (7) založenej na Gledhillovej metóde (8) sa pretrepávaná reakčná nádoba uzavrie pred ovzduším a vyprodukované CO2 sa hromadí vo vnútornom alkalickom zachytávači priamo z ply