Nariadenie Komisie (ES) č. 2091/2002 z 26. novembra 2002, ktorým sa mení a dopĺňa nariadenie (ES) č. 2870/2000, ktoré stanovuje referenčné metódy spoločenstva pre analýzu liehovín



Úradný vestník L 322 , 27/11/2002 S. 0011 - 0027

CS.ES Kapitola 3 Zväzok 37 S. 395 - 411

ET.ES Kapitola 3 Zväzok 37 S. 395 - 411

HU.ES Kapitola 3 Zväzok 37 S. 395 - 411

LT.ES Kapitola 3 Zväzok 37 S. 395 - 411

LV.ES Kapitola 3 Zväzok 37 S. 395 - 411

MT.ES Kapitola 3 Zväzok 37 S. 395 - 411

PL.ES Kapitola 3 Zväzok 37 S. 395 - 411

SK.ES Kapitola 3 Zväzok 37 S. 395 - 411

SL.ES Kapitola 3 Zväzok 37 S. 395 - 411



Nariadenie Komisie (ES) č. 2091/2002 z 26. novembra 2002, ktorým sa mení a dopĺňa nariadenie (ES) č. 2870/2000, ktoré stanovuje referenčné metódy spoločenstva pre analýzu liehovín KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV, so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spoločenstva, so zreteľom na nariadenie Rady (EHS) č. 1576/89 z 29. mája 1989, ktoré stanovuje všeobecné pravidlá na definíciu, opis a propagáciu liehovín [1], zmenené a doplnené Aktom o pristúpení Rakúska, Fínska a Švédska, a najmä na jeho článok 4 ods. 8, keďže: (1) Nariadenie Komisie (ES) č. 2870/2000 z 19. decembra 2000, ktoré stanovuje referenčné metódy Komisie pre analýzu liehovín [2], opisuje tieto metódy v prílohe. (2) Štyri metódy analýzy pre stanovenie trans-anetolu v liehovinách s anízovou príchuťou, glycyrizínovej kyseliny a chalkónov v pastise a vaječného žĺtku vo vaječnom likéri a v likéri s vajíčkom, ktoré boli validované podľa medzinárodne uznávaných postupov ako súčasť výskumného projektu podporeného Komisiou. (3) Tieto štyri metódy môžu byť uznávané ako referenčné metódy spoločenstva a musia byť doplnené do prílohy k nariadeniu (ES) č. 2870/2000. (4) Opatrenia stanovené v tomto nariadení sú v súlade so stanoviskom Výboru pre uplatňovanie ustanovení o liehovinách, PRIJALA TOTO NARIADENIE: Článok 1 Príloha k nariadeniu (ES) č. 2870/2000 sa týmto mení a dopĺňa takto: 1. V súhrne prílohy sa v bodoch V, VI, VII a IX vypúšťa výraz "(p.m.)". 2. Kapitoly V, VI, VII a IX v prílohe k tomuto nariadeniu sa pridávajú po kapitole III. Článok 2 Toto nariadenie nadobúda účinnosť siedmy deň po zverejnení v Úradnom vestníku Európskych spoločenstiev. Toto nariadenie je záväzné vo svojej celistvosti a je priamo uplatniteľné vo všetkých členských štátoch. V Bruseli 26. novembra 2002 Za Komisiu Franz Fischler člen Komisie [1] Ú. v. ES L 160, 12.6.1989, s. 1. [2] Ú. v. ES L 333, 29.12.2000, s. 20. -------------------------------------------------- PRÍLOHA V. ANETOL. STANOVENIE TRANS-ANETOLU V LIEHOVINÁCH PLYNOVOU CHROMATOGRAFIOU 1. Pôsobnosť Táto metóda je vhodná pre stanovenie trans-anetolu v liehovinách s príchuťou anízu s použitím kapilárnej plynovej chromatografie. 2. Odkazy na normy ISO 3696: 1987 Voda pre použitie v analytickom laboratóriu – Špecifikácie a skúšobné metódy. 3. Princíp Koncentrácia trans-anetolu v liehu sa určuje plynovou chromatografiou (PC). Do skúšobnej vzorky a do referenčného roztoku trans-anetolu známej koncentrácie sa pridá rovnaké množstvo vnútorného štandardu, t. j. 4-alylanizolu (estragolu), ak nie je prirodzene prítomný vo vzorke, ktoré sa potom zriedia so 45 % roztokom etanolu a vstrekujú priamo do systému PC. Pre likéry, ktoré obsahujú veľké množstvo cukru, je pred prípravou vzorky a analýzou potrebná extrakcia. 4. Činidlá a materiály Počas analýzy používame len činidlá s čistotou minimálne 98 %. Mala by sa použiť voda s minimálnou triedou 3, tak ako ju definuje ISO 3696. Referenčné chemikálie by sa mali skladovať v chlade (pri 4 °C), chrániť pred svetlom, v hliníkových zásobníkoch alebo vo farebných (tmavých) sklených reagenčných fľašiach. Zátky by mali byť vybavené tesnením, najvýhodnejšie hliníkovým. Pred použitím bude treba previesť trans-anetol z jeho kryštalického stavu do stavu "kvapalného", v takom prípade teplota nesmie nikdy prekročiť 35 °C. 4.1. 96 % obj. etanol (CAS 64-17-5) 4.2. 1-metoxy-4-(1-propenyl) benzén, (trans-anetol) (CAS 4180-23-8) 4.3. 4-alylanizol, (estragol) (CAS 140-67-0), navrhovaný vnútorný štandard (IS) 4.4. Etanol 45 % obj. Pridajte 560 g destilovanej vody do 378 g etanolu 96 % obj. 4.5. Príprava roztokov štandardu Všetky roztoky štandardu treba skladovať pri teplote miestnosti (15 až 35 °C) chránené pred svetlom, v hliníkových zásobníkoch alebo vo farebných (tmavých) sklených reagenčných fľašiach. Zátky by mali byť vybavené prednostne hliníkovým tesnením. Trans-anetol a 4-alylanizol sú prakticky nerozpustné vo vode a preto ich treba pred pridaním 45 % etanolu (4.1.) rozpustiť v troške 96 % etanolu (4.4.). Zásobné roztoky sa musia čerstvo pripraviť každý týždeň. 4.5.1. Roztok štandardu A Roztok štandardu trans-anetolu (koncentrácia: 2 g/l) Odvážte 40 mg trans-anetolu (4.2.) v 20 ml odmernej banke (alebo 400 mg v 200 ml atď.). Pridajte trošku 96 % obj. etanolu (4.1.) a doplňte po značku 45 % obj. etanolom (4.4.), dôkladne zamiešajte. 4.5.2. Roztok vnútorného štandardu B Zásobný roztok vnútorného štandardu, t. j. estragolu (koncentrácia: 2 g/l) Odvážte 40 mg estragolu (4.3.) v 20 ml odmernej banke (alebo 400 mg v 200 ml atď.). Pridajte trošku 96 % obj. etanolu (4.1.) a doplňte po značku 45 % obj. etanolom (4.4.), dôkladne zamiešajte. 4.5.3. Roztoky, ktoré sa používajú na kontrolu linearity odozvy plamenného ionizačného detektoru (PID) Linearita odozvy PID pre analýzu sa musí skontrolovať berúc do úvahy rozsah koncentrácií trans-anetolu v liehovinách od 0 g/l až do 2,5 g/l. V procese analýzy neznáme vzorky liehovín, ktoré sa majú analyzovať, sa zrieďujú 10 násobne (8.3.). Pre podmienky analýzy opísanej v tejto metóde sa pripravia zásobné roztoky zodpovedajúce koncentráciám 0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2 a 0,25 g/l trans-anetolu vo vzorke, ktorá sa má analyzovať, takto: vezmite 0,5, 1,5, 2 a 2,5 ml zásobného roztoku A (4.5.1) a pipetujte do oddelených 20 ml odmerných baniek; pipetujte do každej banky 2 ml roztoku vnútorného štandardu B (4.5.2.) a doplňte po značku 45 % obj. etanolom (4.4.), dôkladne zamiešajte. Ako slepé vzorky (8.4) sa použijú roztoky s 0 g/l. 4.5.4. Roztok štandardu C Vezmite 2 ml roztoku štandardu A (4.5.1.) a pipetujte do 20 ml odmernej banky, potom pridajte 2 ml roztoku vnútorného štandardu B (4.5.2.) a doplňte po značku 45 % obj. etanolom (4.4.), dôkladne zamiešajte. 5. Prístroj a zariadenie 5.1. Kapilárny plynový chromatograf vybavený plamenným ionizačným detektorom (PID) a integrátorom alebo iným zariadením na spracovanie údajov pre meranie výšky píku alebo plochy a s automatickým alebo manuálnym dávkovačom. 5.2. Injektor split/splitless 5.3. Kapilárna kolóna, napríklad: Dĺžka: 50 m Vnútorný priemer: 0,32 mm Hrúbka filmu: 0,2 μm Stacionárna fáza: FFAP – modifikovaný TPA polyetylénglykol sieťový, porézny polymér. 5.4. Bežné laboratórne zariadenie: A stupeň kvality odmerných sklených nádob, analytické váhy (presnosť ± 0,1 mg). 6. Chromatografické podmienky Typ kolóny a rozmery a podmienky chromatografie by mali byť také, aby anetol a vnútorný štandard boli oddelené jeden od druhého a bez akýchkoľvek rušiacich látok. Typické podmienky pre kolónu sú uvedené ako príklad v 5.3.: 6.1. Nosný plyn: analytické hélium 6.2. Prietok: 2 ml/min 6.3. Teplota injektora: 250 °C 6.4. Teplota detektora: 250 °C 6.5. Teplotné podmienky pece: izotermický režim, 180 °C, čas chodu 10 minút 6.6. Vstrekovaný objem: 1 μl, split 1:40 7. Vzorky Vzorky by sa mali skladovať pri teplote miestnosti, chránené pred svetlom a chladom. 8. Postup 8.1. Kontrola vzorky na estragol Aby sme zabezpečili, že vo vzorke nie je prítomný žiadny estragol, musí sa vykonať analýza slepej vzorky bez pridania vnútorného štandardu. Ak je estragol prirodzene prítomný, potom sa musí vybrať iný vnútorný štandard (napríklad mentol). Pipetujte 2 ml vzorky do 20 ml odmernej banky a doplňte po značku 45 % obj. etanolom (4.4.), dôkladne zamiešajte. 8.2. Príprava neznámych vzoriek Pipetujte 2 ml vzorky do 20 ml odmernej banky, potom pridajte 2 ml roztoku vnútorného štandardu B (4.5.2.) a doplňte po značku 45 % obj. etanolom (4.4.), dôkladne zamiešajte. 8.3. Slepý pokus Pipetujte 2 ml roztoku vnútorného štandardu B (4.5.2.) do 20 ml odmernej banky a doplňte po značku 45 % obj. etanolom (4.4.), dôkladne zamiešajte. 8.4. Skúška linearity Pred začatím analýzy by sa mala skontrolovať linearita odozvy PID postupne analýzou v trikrát opakovaných nástrekoch každého z roztokov štandardu linearity (4.5.3.). Z plôch píkov alebo z výšok píkov integrátora pre každý nástrek zostrojte graf koncentrácii ich materských roztokov (g/l) voči pomeru R. R = výška píku alebo plocha trans-anetolu delená výškou píku alebo plochou estragolu. Graf by mal byť lineárny. 8.5. Stanovenie Vstreknite roztok slepej vzorky (8.3.), po ktorom nasleduje roztok štandardu C (4.5.4.), po ktorom nasleduje jeden z roztokov štandardu pre určenie linearity (4.5.3.), ktorý sa použije ako kontrolná vzorka kvality (táto sa môže vybrať ako referenčná k predpokladanej koncentrácii trans-anetolu v neznámej vzorke), po ktorej nasleduje päť neznámych vzoriek (8.2.); nastreknite štandard pre kontrolu linearity (kontrola kvality) po každých piatich neznámych vzorkách, aby ste zabezpečili analytickú stabilitu. 9. Výpočet faktoru odozvy Zmerajte buď plochy píkov (použitím integrátora alebo inej data stanice) alebo výšky píkov (ručná integrácia) pre píky trans-anetolu a vnútorného štandardu. 9.1. Výpočet faktoru odozvy (RFi) Faktor odozvy sa vypočíta takto: RFi = (Ci/plocha alebo výškai)·(plocha alebo výškais/Cis) kde: Ci koncentrácia trans-anetolu v roztoku štandardu A (4.5.1), Cis koncentrácia vnútorného štandardu v roztoku štandardu B (4.5.2), plochai je plocha píku (alebo výška píku) trans-anetolu, plochais je plocha píku (alebo výška píku) vnútorného štandardu, RFi sa vypočíta z piatich vzoriek roztoku C (4.5.4.) 9.2. Analýza linearity odozvy analyzovaných roztokov Vstreknite roztoky (4.5.3.) pre skúšku linearity odozvy. 9.3. Analýza vzorky Vstreknite neznámy roztok vzorky (8.2.). 10. Výpočet výsledkov Vzorec pre výpočet koncentrácie trans-anetolu je nasledujúci: ci = Cis ·(plocha alebo výškai/plocha alebo výškais)· RFi kde: ci je neznáma koncentrácia trans-anetolu, Cis je koncentrácia vnútorného štandardu v neznámej vzorke (4.5.2) plocha alebo výškai je plocha píku alebo výška píku trans-anetolu, plocha alebo výškais je plocha píku alebo výška píku vnútorného štandaru RFi je koeficient odozvy (vypočítaný ako 9.1.). Koncentrácia trans-anetolu je vyjadrená v g/l na jedno desatinné miesto. 11. Zabezpečovanie a kontrola kvality Chromatogramy musia byť také, aby anetol a vnútorný štandard boli oddelené jeden od druhého a od akýchkoľvek rušiacich látok. Hodnota RFi sa vypočíta z výsledkov pre päť nástrekov roztoku C (4.5.4.). Ak koeficient variácie (CV % = (štandardná odchýlka/stredná) * 100)) je v rozsahu plus alebo mínus 1 %, priemerná hodnota RFi je prijateľná. Uvedený výpočet treba použiť na výpočet koncentrácie trans-anetolu vo vzorke vybratej pre kontrolu kvality z roztokov na kontrolu linearity (4.5.3.). Ak stredné vypočítané výsledky z analýzy roztoku linearity vybratého pre vzorku vnútornej kontroly kvality (IQC) sú v rozsahu plus alebo mínus 2,5 % ich teoretickej hodnoty, potom výsledky pre neznáme vzorky môžu byť prijateľné. 12. Úprava vzorky liehoviny, ktorá obsahuje veľké množstvo cukru a so vzorkou likéru pred analýzou PC Extrakcia alkoholu z liehového nápoja obsahujúceho veľké množstvo cukru tak, aby bol vhodný na stanovenie koncentrácie trans-anetolu použitím kapilárnej plynovej chromatografie. 12.1 Princíp Odoberie sa podiel vzorky likéru a pridá sa k nej vnútorný štandard, v koncentrácii podobnej stanovovanej zložke (trans-anetol) v likéri. K tomuto sa pridá dodekahydrát hydrogenfosforečnanu disodného a bezvodý síran amónny. Výsledná zmes sa dobre zamieša a schladí, vytvoria sa dve vrstvy a horná alkoholická vrstva sa odstráni. Odoberie sa podiel tejto alkoholickej vrstvy a zriedi 45 % roztokom etanolu (4.4.) (Poznámka: v tomto stupni sa žiadny vnútorný štandard nepridáva, pretože už bol pridaný). Výsledný roztok sa analyzuje plynovou chromatografiou. 12.2. Činidlá a materiály Počas extrakcie používajte len činidlá s čistotou viac než 99 %. 12.2.1. Síran amónny, bezvodý (CAS 7783-20-2) 12.2.2. Dodekahydrát hydrogenfosforečnanu disodného (CAS 10039-32-4). 12.3. Prístroj a zariadenia Kužeľové banky, deliace banky, chladnička. 12.4. Postup 12.4.1. Kontrola vzorky na estragol Na zabezpečenie, aby vo vzorke nebol prirodzene prítomný žiadny estragol, bolo by potrebné vykonať extrakciu slepej vzorky (12.6.2.) a analýzu urobiť bez pridania vnútorného štandardu. Ak je estragol prirodzene prítomný, potom sa musí vybrať iný vnútorný štandard. 12.4.2. Extrakcia Pipetujte 5 ml 96 % etanolu (4.1.) do kužeľovej banky, navážte do tejto banky 50 mg vnútorného štandardu (4.3.) a pridajte 50 ml vzorky. Pridajte 12 g síranu amónneho, bezvodého (12.2.1.) a 8,6 g dodekahydrátu hydrogenfosforečnanu disodného (12.2.2). Zazátkujte kužeľovú banku. Traste bankou aspoň 30 minút. Môžete použiť aj mechanickú trepačku, ale nie magnetickú miešaciu tyčinku pokrytú teflónom, pretože teflón by mohol absorbovať časť stanovovanej zložky. Sledujte, až kým sa pridané soli úplne nerozpustia. Umiestnite zazátkovanú banku do chladničky (T < 5°C) na minimálne dve hodiny. Po tomto čase by sa mali vytvoriť dve rozdielne kvapalné vrstvy a pevný zvyšok. Alkoholová vrstva by mala byť číra; ak nie je, dajte banku znovu do chladničky, až kým sa nedosiahne číre oddelenie. Keď je alkoholová vrstva číra, opatrne odoberte podiel (napr. 10 ml) bez porušenia vodnej vrstvy, dajte do vialky z tmavého skla a bezpečne uzatvorte. 12.4.3. Príprava extrahovanej vzorky, ktorá sa má analyzovať Nechajte extrakt (12.4.2.) tak, aby dosiahol teplotu miestnosti. Vezmite 2 ml alkoholovej vrstvy temperovanej vzorky a pipetujte do 20 ml odmernej banky, doplňte po značku 45 % etanolom (4.4.), dôkladne zamiešajte. 12.5. Stanovenie Dodržujte postup opísaný v 8.5. 12.6. Výpočet výsledkov Použite nasledujúci vzorec na výpočet výsledkov: Ci = (mis/V)* (plochai/plochais)* RFi kde: mi je hmotnosť (v mg) odobratého (12.4.2.) vnútorného štandardu (4.3), V je objem neznámej vozrky (50 ml), RFi je faktor odozvy (9.1) plochai je plocha píku trans-anetolu, plochais je plocha píku vnútorného štandardu. Výsledky sú vyjadrené v g/l na jedno desatinné miesto. 12.7. Zabezpečovanie a kontrola kvality Dodržujte postup opísaný v 11. 13. Charakteristika vybraných metrologických parametrov metódy (presnosť) Štatistické výsledky medzilaboratórnej skúšky: nasledujúce tabuľky uvádzajú hodnoty pre anetol. Tieto údaje boli získané z medzinárodnej štúdie vybraných metrologických parametrov metódy vykonanej medzinárodne dohodnutým postupom. Rok medzilaboratórnej skúšky | 1998 | Počet laboratórií | 16 | Počet vzoriek | 10 | Skúmaná látka | anetol | Pastis: Vzorky | A | B | C | D | E | F | Počet laboratórií, ktoré boli ponechané po odstránení odchýlených výsledkov | 15 | 15 | 15 | 13 | 16 | 16 | Počet odchýlených výsledkov (laboratóriá) | 1 | 1 | 1 | 3 | – | – | Počet prijatelných výsledkov | 30 | 30 | 30 | 26 | 16 | 16 | Stredná hodnota g/l | 1,477 | 1,955 | 1,940 | 1,833 | 1,741 | 1,754 | Štandardná odchýlka opakovateľnosti (Sr) g/l | 0,022 | 0,033 | 0,034 | 0,017 | – | – | Relatívna štandardná odchýlka opakovateľnosti (RSDr) (%) | 1,5 | 1,7 | 1,8 | 0,9 | – | – | Limit opakovateľnosti (r) g/l | 0,062 | 0,093 | 0,096 | 0,047 | – | – | Štandardná odchýlka reprodukovateľnosti (SR) g/l | 0,034 | 0,045 | 0,063 | 0,037 | 0,058 | 0,042 | Relatívna štandardná odchýlka reprodukovateľnosti (RSDR) (%) | 2,3 | 2,3 | 3,2 | 2,0 | 3,3 | 2,4 | Limit reprodukovateľnosti (R) g/l | 0,094 | 0,125 | 0,176 | 0,103 | 0,163 | 0,119 | Typy vzoriek: A pastis, slepé duplikáty B pastis, slepé duplikáty C pastis, slepé duplikáty D pastis, slepé duplikáty E pastis, jednotlivé duplikáty F pastis, jednotlivé duplikáty Ostatné liehové nápoje s príchuťou anízu: Vzorky | G | H | I | J | Počet laboratórií, ktoré boli ponechané po odstránení odchýlených výsledkov | 16 | 14 | 14 | 14 | Počet odchýlených výsledkov (laboratóriá) | – | 2 | 1 | 1 | Počet prijateľných výsledkov | 32 | 28 | 28 | 28 | Stredná hodnota g/l | 0,7780,530* | 1,742 | 0,351 | 0,599 | Štandardná odchýlka opakovateľnosti (Sr) g/l | 0,020 | 0,012 | 0,013 | 0,014 | Relatívna štandardná odchýlka opakovateľnosti (RSDr) (%) | 3,1 | 0,7 | 3,8 | 2,3 | Limit opakovateľnosti (r) g/l | 0,056 | 0,033 | 0,038 | 0,038 | Štandardná odchýlka reprodukovateľnosti (SR) g/l | 0,031 | 0,029 | 0,021 | 0,030 | Relatívna štandardná odchýlka reprodukovateľnosti (RSDR) (%) | 4,8 | 1,6 | 5,9 | 5,0 | Limit reprodukovateľnosti (R) g/l | 0,088 | 0,080 | 0,058 | 0,084 | Typy vzoriek: G ouzo, delené hladiny* H aníz slepé duplikáty I likér s príchoťou anízu, duplikáty J likér s príchoťou anízu, duplikáty VI. GLYCYRIZÍNOVÁ KYSELINA. STANOVENIE GLYCYRIZÍNOVEJ KYSELINY POUŽITÍM VYSOKOÚČINNEJ KVAPALINOVEJ CHROMATOGRAFIE 1. Rozsah Táto metóda je vhodná na stanovenie glycyrizínovej kyseliny v liehových nápojoch s príchuťou anízu použitím vysoko účinnej kvapalinovej chromatografie (VUKC). Nariadenie (EHS) č. 1576/89 určuje, aby akákoľvek liehovina s príchuťou anízu, ktorá sa volá "pastis", obsahovala glycyrizínovú kyselinu v rozmedzí 0,05 až 0,5 g/l. 2. Odkazy na normy ISO 3696: 1987 Voda pre použitie v analytickom laboratóriu – Špecifikácie a skúšobné metódy. 3. Princíp Koncentrácia glycyrizínovej kyseliny sa určuje použitím vysoko účinnej kvapalinovej chromatografie (VUKC) s UV detekciou. Roztok štandardu a skúšobná vzorka sa prefiltrujú a oddelene vstrekujú do systému VUKC. 4. Činidlá a materiály Počas analýzy používajte len činidlá s triedou čistoty pre VUKC, absolútny etanol a vodu v triede 3, ako ju definuje ISO 3696. 4.1. Etanol 96 % obj. (CAS 64-17-5) 4.2. Glycyrizinát amónny, C42 H62 O16.NH3 (amónna soľ kyseliny glycyrizínovej) (pomerná molekulová hmotnosť 839,98) (CAS 53956-04-0), čistota minimálne 90 % kyselina glycyrizínová (pomerná molekulová hmotnosť 822,94) 4.3. Ľadová kyselina octová, CH3COOH, (CAS 64-19-7) 4.4. Metanol, CH3OH (CAS 67-56-1). 4.5. Etanol 50 % obj. Na 1000 ml pri 20°C je potrebné: - 96 % obj. etanol (4.1.): 521 ml - voda (2.0.): 511 ml. 4.6. Príprava elučných roztokov pre VUKC 4.6.1. Elučné rozpúšťadlo A (príklad) 80 častí (objemových) vody (2.0.) 20 častí (objemových) kyseliny octovej (4.3.). Elučné rozpúšťadlo odplyňujte päť minút. Poznámka: Ak použitá voda nebola mikrofiltrovaná, odporúča sa filtrovať pripravené elučné rozpúšťadlo na filtri pre organické rozpúšťadlá s veľkosťou pórov menších alebo rovných 0,45 μm. 4.6.2. Elučné rozpúšťadlo B Metanol (4.4.). 4.7. Príprava roztokov štandardu Všetky roztoky štandardu musia byť po dvoch mesiacoch čerstvo pripravené. 4.7.1. Referenčný roztok C Navážte do odmernej banky s presnosťou na 0,1 mg, 25 mg glycyrizinátu amónneho (4.2.) v 100 ml odmernej banke. Pridajte trochu 50 % obj. etanolu (4.5.) a rozpustite glycyrizinát amónny. Keď je rozpustený, doplňte po značku s 50 % obj. etanolom (4.5.). Prefiltrujte cez filter pre organické rozpúšťadlá. 4.7.2. Roztoky štandardu používané na kontrolu linearity odozvy prístrojového vybavenia. 1,0 g/l zásobného roztoku sa pripraví navážením 100 mg glycyrizinátu amónneho s presnosťou na 0,1 mg do 100 ml odmernej banky. Pridajte trochu 50 % obj. etanolu (4.5.) a nechajte rozpustiť glycyrizinát amónny. Keď je rozpustený, doplňte po značku s 50 % obj. etanolom (4.5.). Pripravia sa minimálne štyri ďalšie roztoky zodpovedajúce 0,05, 0,1, 0,25 a 0,5 g/l glycyrizinátu amónneho pipetovaním príslušných 5 ml, 10 ml, 25 ml a 50 ml 1,0 g/l zásobného roztoku do jednotlivých 100 ml odmerných baniek. Potom doplňte po značku s 50 % obj. etanolom (4.5.), dôkladne zamiešajte. Prefiltrujte všetky roztoky cez filter pre organické rozpúšťadlá. 5. Prístroje a zariadenie 5.1. Deliaci systém 5.1.1. Vysoko účinný kvapalinový chromatograf. 5.1.2. Čerpací systém umožňujúci dosiahnuť a udržiavať konštantnú alebo naprogramovanú rýchlosť prietoku s veľkou presnosťou. 5.1.3. UV spektrofotometrický detekčný systém: treba nastaviť na 254 nm. 5.1.4. Zariadenie na odplynenie eluenta. 5.2. Integrátor alebo zapisovač, ktoré sú kompatibilné so zvyškom systému. 5.3. Kolóna (príklad): Materiál: nehrdzavejúca oceľ alebo sklo Vnútorný priemer: 4 až 5 mm Dĺžka: 100 až 250 mm Stacionárna fáza: sieťový oxid kremičitý s (výhodnejší je sférický) oktadecyl funkčnou skupinou (C18), maximálna veľkosť častíc: 5 μm. 5.4. Laboratórne zariadenie 5.4.1. Analytické váhy s presnosťou 0,1 mg 5.4.2. Analytické odmerné nádoby triedy presnosti A 5.4.3. Mikromembránová filtračná zostava pre malé objemy 6. Chromatografické podmienky 6.1. Elučné charakteristiky: (príklad) - prietoková rýchlosť: 1 ml/min, - rozpúšťadlo A = 30 %, - rozpúšťadlo B = 70 %. 6.2. Detekcia: - UV = 254 nm 7. Postup 7.1. Príprava liehovej vzorky Prefiltrujte, ak treba, cez filter na organické rozpúšťadlá (priemer pórov: 0,45 μm). 7.2. Stanovenie Len čo sú chromatografické podmienky stabilizované: - vstreknite 20 μl referenčného roztoku C (4.7.1.), - vstreknite 20 μl roztoku vzorky, - porovnajte tieto dva chromatogramy. Určite píky glycyrizínovej kyseliny z ich retenčných časov. Zmerajte ich plochy (alebo výšky) a vypočítajte koncentráciu v g/l na dve desatinné čísla s použitím nasledujúcej rovnice: c = c x ×h × P × 823H × 100 × 840 kde: c je koncentrácia v g/l glycyrizínovej kyseliny v liehu, ktorý bol analyzovaný, C je koncentrįcia v g/l glycyrizinįtu amónneho v referenčnom roztoku, H je plocha (alebo výška) píku glycyrizínovej kyseliny liehu, ktorý analyzujeme, H je plocha (alebo vżka) pķku glycyrizķnovej kyseliny referenčného roztoku, P je čistota referenčného glycyrizinátu amónneho (v %), 823 je hmota jedného mólu glycyrizínovej kyseliny, 840 je hmota jedného mólu glycyrizinátu amónneho. 8. Charakteristika vybraných metrologických parametrov metódy (presnosť) Štatistické výsledky medzilaboratórnej skúšky: nasledujúca tabuľka uvádza hodnoty pre glycyrizínovú kyselinu. Nasledujúce údaje boli získané z medzinárodnej štúdie metrologických parametrov metódy medzinárodne dohodnutým postupom. Rok medzilaboratórnej skúšky | 1998 | Počet laboratórií | 16 | Počet vzoriek | 5 | Skúmaná látka | glycyrizínová kyselina | Vzorky | A | B | C | D | E | Počet laboratórií, ktoré boli ponechané po odstránení odchýlených výsledkov | 13 | 14 | 15 | 16 | 16 | Počet odchýlených výsledkov (laboratóriá) | 3 | 2 | 1 | – | – | Počet prijatých výsledkov | 26 | 28 | 30 | 32 | 32 | Stredná hodnota g/l | 0,046 | 0,092*0,099 | 0,089 | 0,249 | 0,493 | Štandardná odchýlka opakovateľnosti (Sr) g/l | 0,001 | 0,001 | 0,001 | 0,002 | 0,003 | Relatívna štandardná odchýlka opakovateľnosti (RSDr) (%) | 1,5 | 1,3 | 0,7 | 1,0 | 0,6 | Limit opakovateľnosti (r) g/l | 0,002 | 0,004 | 0,002 | 0,007 | 0,009 | Štandardná odchýlka reprodukovateľnosti (SR) g/l | 0,004 | 0,007 | 0,004 | 0,006 | 0,013 | Relatívna štandardná odchýlka reprodukovateľnosti (RSDR) (%) | 8,6 | 7,2 | 4,0 | 2,5 | 2,7 | Limit reprodukovateľnosti (R) g/l | 0,011 | 0,019 | 0,010 | 0,018 | 0,037 | Typy vzoriek: A pastis, slepé duplikáty B pastis, delené hladiny* C pastis, slepé duplikáty D pastis, slepé duplikáty E pastis, jednotlivé duplikáty VII. CHALKÓNY. VYSOKOÚČINNÁ KVAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIA. METÓDA NA OVERENIE PRÍTOMNOSTI CHALKÓNOV V PASTISE 1. Rozsah Táto metóda je vhodná na zistenie, či sú chalkóny prítomné v nápojoch s príchuťou anízu, alebo nie. Chalkóny sú prírodné farbivá zo skupiny flavonoidov, ktoré sú prítomné v koreni sladovky hladkoplodej (Glycyrrhiza glabra). Liehovina s príchuťou anízu, ktorá sa volá "pastis", musí obsahovať chalkóny (nariadenie (EHS) č. 1576/89). 2. Odkazy na normy ISO 3696: 1987, Voda pre použitie v analytickom laboratóriu – Špecifikácie a skúšobné metódy. 3. Princíp Pripraví sa referenčný roztok extraktu zo sladovky hladkoplodej. Prítomnosť alebo neprítomnosť chalkónov sa určí pomocou vysoko účinnej kvapalinovej chromatografie (VUKC) s UV detekciou. 4. Činidlá a materiály Počas analýzy používajte len činidlá s čistotou triedy pre VUKC. Etanol 96 % obj. Vodu treba použiť len triedy čistoty 3, ako ju definuje ISO 3696. 4.1. Etanol 96 % obj. (CAS 64-17-5) 4.2. Acetonitril,CH3CN (CAS 75-05-8) 4.3. Referenčná látka: sladovka hladkoplodá (Glycyrrhiza glabra), "sladké drievko". Hrubo zomleté korene sladovky hladkoplodej (Glycyrrhiza glabra). Priemerné rozmery tyčinkovitých častí: dĺžka: 10 až 15 mm, hrúbka 1 až 3 mm. 4.4. Octan sodný, CH3COONa, (CAS 127-09-3) 4.5. Ľadová kyselina octová, CH3COOH, (CAS 64-19-7) 4.6. Príprava roztokov 4.6.1. Etanol 50 % obj. Na 1000 ml pri 20 °C treba: - Etanol 96 % obj. (4.1.): 521 ml, - voda (2.0.): 511 ml. 4.6.2. Rozpúšťadlo A: acetonitril Acetonitril (4.2.) s analytickou čistotou pre VUKC. Odplyňte. 4.6.3. Rozpúšťadlo B: 0,1 M octan sodný, tlmivý roztok, pH 4,66. Odvážte 8,203 g octanu sodného (4.4.), pridajte 6,005 g ľadovej kyseliny octovej (4.5.) a doplňte vodou (2) odmernú banku na 1000 ml. 5. Príprava referenčného extraktu z (Glycyrrhiza glabra (4.3) 5.1. Odvážte 10 g zomletého koreňa sladovky hladkoplodej (Glycyrrhiza glabra) (4.3.) a vložte do destilačnej banky s guľatým dnom: - pridajte 100 ml 50 % obj. etanolu (4.6.1.), - varte refluxom jednu hodinu, - prefiltrujte, - odložte filtrát bokom na neskoršie použitie. 5.2. Získanie extraktu sladovky z filtra: - vložte ho do banky s guľatým dnom, - pridajte 100 ml 50 % obj. etanolu (4.6.1.), - varte refluxom jednu hodinu, - prefiltrujte. Odložte filtrát bokom na neskoršie použitie. 5.3. Extrakcia koreňa sladovky sa musí vykonať trikrát po sebe. 5.4. Spojte tieto tri filtráty. 5.5. Odparte rozpúšťadlo (z 5.4.) na rotačnom odparovacom zariadení. 5.6. Rozpustite zvyšok (z 5.5.) so 100 ml 50 % obj. etanolu (4.6.1.). 6. Prístroje a zariadenie 6.1. Deliaci systém. 6.1.1. Vysoko účinná kvapalinová chromatografia. 6.1.2. Čerpací systém umožňujúci dosiahnuť a udržiavať konštantnú alebo naprogramovanú rýchlosť prietoku s veľkou presnosťou. 6.1.3. UV/VIS spektrofotometrický detekčný systém, ktorý môže byť nastavený na 254 a 375 nm. 6.1.4. Zariadenie na odplyňovanie rozpúšťadla: 6.1.5. Kolónový termostat, ktorý sa dá nastaviť na teplotu 40 ± 0,1°C. 6.2. Integrátor alebo zapisovač, ktoré sú kompatibilné so zvyškom deliaceho systému. 6.3. Kolóna Materiál: nehrdzavejúca oceľ alebo sklo Vnútorný priemer: 4 až 5 mm Stacionárna fáza: sieťový oxid kremičitý s oktadecyl funkčnou skupinou (C18), veľkosť častíc: maximálne 5 μm (sieťová fáza). 6.4. Bežné laboratórne zariadenie zahŕňa: 6.4.1. analytické váhy s presnosťou ± 0,1 mg; 6.4.2 destilačný prístroj s refluxným kondenzátorom skladajúci sa napr. z: - 250 ml banky s guľatým dnom so štandardizovaným spojom so zábrusom, - 30 cm dlhého refluxného kondenzátora a - tepelného zdroja (treba sa vyhnúť akejkoľvek pyrogénnej reakcii v súvislosti s extrakčnou hmotou použitím príslušnej zostavy). 6.4.3. Zariadenie na rotačné odparovanie. 6.4.4. Filtračná zostava (t. j. Buchnerov lievik). 6.5. Chromatografické podmienky (príklad). 6.5.1. Elučné charakteristiky rozpúšťadiel A (4.6.2.) a B (4.6.3.): - posun z 20/80 (v/v) na 50/50 (v/v) gradient počas 15 minút, - posun z 50/50 (v/v) na 75/25 (v/v) gradient počas 5 minút, - rovnaká elučná mohutnosť pri 75/25 (v/v) počas 5 minút, - stabilizácia kolóny medzi nástrekmi, - rovnaká elučná mohutnosť pri 20/80 (v/v) počas 5 minút. 6.5.2. Rýchlosť prietoku: 1 ml/min. 6.5.3. Nastavenia UV detektora: tento detektor musí byť nastavený na 370 nm, aby detekoval prítomnosť chalkónov a potom na 254 nm, aby detekoval kyselinu glycyrizínovú. Poznámka: zmena vlnovej dĺžky (z 370 nm na 254 nm) sa musí vykonať 30 sekúnd pred začiatkom elúcie píku kyseliny glycyrizínovej. 7. Postup 7.1. Príprava vzorky liehu Prefiltrujte cez filter pre organické rozpúšťadlá (priemer póru: 0,45 μm). 7.2. Príprava zvyškového extraktu sladovky (5.6.) Zrieďte pred analýzou v pomere 1:10 s 50 % obj. etanolom (4.6.1.). 7.3. Stanovenie 7.3.1. Nastreknite 20 μl pripraveného extraktu sladovky (7.2.). Vykonajte analýzu za použitia chromatografických podmienok uvedených hore (6.5.). 7.3.2. Nastreknite 20 μl vzorky (7.1.) (anizovou príchuťou fortifikovanú vzorku liehu).Vykonajte unalýzu za použitia chromatografických podmienok opísaných vyššie (6.5.). 7.3.3. Porovnajte tieto dva chromatogramy. Musí byť veľká podobnosť medzi nimi vo výstupnej zóne chalkónu (počas detekcie pri 370 nm pri analytických podmienkach uvedených hore) (pozri obrázok 1). 8. Charakteristický chromatogram pre pastis +++++ TIFF +++++ 9. Charakteristika vybraných metrologických parametrov metódy(presnosť) Výsledky medzilaboratórnej skúšky: nasledujúca tabuľka uvádza schopnosť metódy pre uznanie prítomnosti alebo neprítomnosti chalkónov v pastise a liehovinách s príchuťou anízu. Nasledujúce údaje boli získané z medzinárodnej štúdie parametrov metódy vykonanej medzinárodne dohodnutým postupom. Rok medzilaboratórnej skúšky | 1998 | Počet laboratórií | 14 | Počet vzoriek | 11 | Skúmaná látka | chalkóny | Vzorky | A | B | C | D | E | F | Počet laboratórií, ktoré boli ponechané po odstránení odchýlených výsledkov | 14 | 14 | 14 | 14 | 14 | 13 | Počet odchýlených výsledkov (laboratóriá) | – | – | – | – | – | 1 [1] | Počet prijatých výsledkov | 28 | 1 | 14 | 28 | 28 | 26 | Počet výsledkov na prítomnosť chalkónov | 28 | 14 | 14 | 0 | 28 | 0 | Počet výsledkov na neprítomnosť chalkónov | 0 | 0 | 0 | 28 | 0 | 26 | Percento správnych výsledkov (%) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | Vzorky | G | H | I | J | K | Počet laboratórií, ktoré boli ponechané po odstránení odchýlených výsledkov | 14 | 14 | 14 | 14 | 14 | Počet odchýlených výsledkov (laboratóriá) | – | – | – | – | – | Počet prijatých výsledkov | 28 | 14 | 14 | 28 | 28 | Počet výsledkov na prítomnosť chalkónov | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | Počet výsledkov na neprítomnosť chalkónov | 28 | 14 | 14 | 28 | 28 | Percento správnych výsledkov (%) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | Typy vzoriek: A pastis, slepé duplikáty, B pastis, jediná vzorka, C pastis, jediná vzorka, D "pastis" (neobsahujúci chalkóny), slepé duplikáty, E "pastis" (neobsahujúci chalkóny), slepé duplikáty, F likér s prķchuou anķzu (neobsahujści chalkóny), slepé duplikáty, G likér s príchuťou anžzu (neobsahujúci chalkóny), slepé duplikįty, H ouzo (neobsahujúce chalkóny), jediná vzorka, I ouzo (neobsahujúce chalkóny), jediná vzorka, J aníz (neobsahujúci chalkóny), slepé duplikáty, K "pastis" (neobsahujúci chalkóny), slepé duplikáty. IX. VAJEČNÝ ŽĹTOK. STANOVENIE VAJEČNÉHO ŽĹTKU V LIEHOVÝCH NÁPOJOCH – FOTOMETRICKÁ METÓDA 1. Rozsah Táto metóda je vhodná na stanovenie vaječného žĺtka v rozmedzí 40 až 250 g/l vo vaječnom likéri alebo likéri s vajíčkom. 2. Odkazy na normy ISO 3696: 1987 Voda pre použitie v analytickom laboratóriu – Špecifikácie a skúšobné metódy. 3. Princíp V etanole rozpustné zlúčeniny obsahujúce fosfor, ktoré sa nachádzajú vo vaječnom žĺtku, sa extrahujú a skúšajú fotometricky ako komplex molybdenanu fosforečného. 4. Činidlá a materiály 4.1. Redestilovaná voda 4.2. Infuzóriová hlinka 4.3. Etanol 96 % obj. (CAS 64-17-5) 4.4. Roztok 15 % octanu horečnatého (CAS 16674-78-5) 4.5. 10 % kyselina sírová (CAS 7664-93-9) 4.6. 1 N kyselina sírová 4.7. Roztok 0,16 g/l dihydrogenfosforečnanu draselného (CAS 778-77-0), KH2PO4 4.8. Činidlo pre stanovenie forforečnanu: rozpustite 20 g molybdenanu amónneho (CAS 12054-85-2), (NH4Mo7O24.4H20 v 400 ml vody pri 50 °C; v ďalšej nádobe rozpustite 1 g vanadičnanu amónneho (CAS 7803-55-6), NH4VO3 v 300 ml horúcej vody, nechajte ochladiť, potom pridajte 140 ml koncentrovanej kyseliny dusičnej (CAS 7697-37-2). Spojte ochladené roztoky do 1000 ml odmernej banky a doplňte po značku na 1000 ml. 5. Prístroje a zariadenie 5.1. 100 ml kužeľová banka 5.2. Ultrazvukový kúpeľ (alebo magnetické miešadlo) 5.3. 100 ml odmerná banka 5.4. Kúpeľ s 20 °C vodou 5.5. Filter (Whatman č. 4 alebo rovnocenný) 5.6. Porcelánový (alebo platinový) téglik 5.7. Vodný kúpeľ 5.8. Horúca platňa 5.9. Muflová pec 5.10. 50 ml odmerná banka 5.11. 20 ml odmerná banka 5.12. Spektrofotometer nastavený na 420 nm 5.13. 1 cm kyveta 6. Vzorky Pred analýzou sa vzorky skladujú pri izbovej teplote. 7. Postup 7.1. Príprava vzorky 7.1.1. Navážte 10 g vzorky do 100 ml kužeľovej banky (5.1.). 7.1.2. Pridávajte postupne 70 ml etanolu (4.3.) po malých častiach s krúžením pri každom pridaní a vložte do ultrazvukového kúpeľa (5.2.) na 15 minút (alebo miešajte zmes magnetickým miešadlom (5.2.) 10 minút pri izbovej teplote). 7.1.3. Preneste obsah banky do 100 ml odmernej banky (5.3.) s premytím etanolom (4.3.). Upravte po kalibračnú značku etanolom (4.3.) a položte banku do 20 °C vodného kúpeľa (5.4.). Upravte po kalibračnú značku pri 20 °C. 7.1.4. Pridajte malé množstvo infuzóriovej hlinky (4.2.) a prefiltrujte (5.5.), odstráňte prvých 20 ml. 7.1.5. Preneste 25 ml filtrátu do porcelánového/platinového téglika (5.6.). Filtrát sa musí potom zahustiť jemným odparovaním na vodnom kúpeli s vriacou vodou (5.7.) pridaním 5 ml 15 % roztoku octanu horečnatého (4.4.). 7.1.6. Položte tégliky na horúci platňu (5.8) a zohrievajte kým nie sú suché. 7.1.7. Spopolnite zvyšok ohrievaním do bieleho žiaru pri 600 °C v muflovej peci (5.9.), pokiaľ nie je popol biely, minimálne jeden a pol hodiny, môže tam byť ale aj cez noc. 7.1.8. Pridajte do popola 10 ml 10 % kyseliny sírovej (4.5.) a preneste zmes prepláchnutím destilovanou vodou (4.1.) do 50 ml odmernej banky (5.10.) a pri izbovej teplote doplňte po značku destilovanou vodou (4.1.). 5 ml podiel tohto roztoku popola sa má použiť na prípravu roztoku vzorky na fotometrické stanovenie. 7.2. Fotometrické stanovenie fosforečnanu 7.2.1. Porovnávací roztok 7.2.1.1. Dajte 10 ml 10 % kyseliny sírovej (4.5.) do 50 ml odmernej banky a doplňte po značku destilovanou vodou (4.1.). 7.2.1.2. Pridajte do 5 ml podielu tohto roztoku (7.2.1.1.) v 20 ml odmernej banke (5.11.), 1 ml 1 N kyseliny sírovej (4.6.) a 2 ml fosforečného činidla (4.8.) a doplňte po značku destilovanou vodou (4.1.). 7.2.1.3. Zazátkujte s voľne vloženou zátkou, potraste a zohrievajte na vodnom kúpeli s vriacou vodou (5.7.) 10 minút, potom nechajte chladiť vo vodnom kúpeli s 20 °C vodou (5.4.) 20 minút. 7.2.1.4. Naplňte 1 cm kyvetu (5.13.) týmto porovnávacím roztokom. 7.2.2. Roztok vzorky 7.2.2.1. Pridajte do 5 ml podielu roztoku popola (7.1.8.) v 20 ml odmernej banke (5.11.) 1 ml 1 N kyseliny sírovej (4.6.) a 2 ml fosforečného činidla (4.8.) a doplňte po značku destilovanou vodou (4.1.). 7.2.2.2. Zazátkujte s voľne vloženou zátkou, potraste a zohrievajte na vodnom kúpeli s vriacou vodou (5.7.) 10 minút, potom nechajte chladiť na vodnom kúpeli 20 °C vodou (5.4.) 20 minút. 7.2.2.3. Žltý roztok, ktorý sa vytvoril, sa ihneď analyzuje spektrofotometricky (5.12.) v 1 cm kyvete (5.13.) pri 420 nm voči porovnávaciemu roztoku (7.2.1.4.). 7.2.3. Kalibračná krivka 7.2.3.1. S cieľom skonštruovania kalibračnej krivky dajte 2 ml podiely fosforečného činidla (4.8.) do 20 ml odmerných baniek (5.11.), každá z nich obsahuje 1 ml 1 N kyseliny sírovej (4.6.) a 0, 2, 4, 6, 8 a 10 ml roztoku dihydrogenfosforečnanu draselného (4.7.) a doplňte po značku destilovanou vodou (4.1.). 7.2.3.2. Zazátkujte voľne vloženou zátkou, potraste a zohrievajte na vodnom kúpeli s vriacou vodou (5.7.) 10 minút, potom nechajte chladiť na vodnom kúpeli 20 °C vodou (5.4.) 20 minút a analyzuje spektrofotometricky (5.12.) v 1 cm kyvete (5.13.) pri 420 nm voči porovnávaciemu roztoku (7.2.1.4.). 7.2.3.3. Zostrojenie kalibračnej krivky: roztok dihydrogenfosforečnanu (ml) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | P2O5 (mg) | 0 | 0,167 | 0,334 | 0,501 | 0,668 | 0,835 | 8. Vyjadrenie výsledkov Obsah vaječného žĺtka v g/l sa vypočíta z tejto rovnice: g/l vaječného žĺtka = mg P2O5 × 110 × hustotaE/40 kde: 110 je prepočítavací faktor na celkový P2O5 v g v 100 g vaječného ĺtka, mg P2O5 je hodnota stanovená z kalibračnej krivky, hustota je hmotnosť na jednotku objemu (g/ml) likéru na báze vajíčka pri 20 °C, E váha likéru na báze vajíčka v g, 40 faktor zriedenia pre 5 ml podiel roztoku popola. 9. Charakteristika vybraných metrologických parametrov metódy (presnosť) Štatistické výsledky medzilaboratórnej skúšky: nasledujúca tabuľka uvádza hodnoty pre vaječný žĺtok. Nasledujúce údaje boli získané z medzinárodnej štúdie určenia vybraných parametrov metódy získané medzinárodne dohodnutým postupom. Rok medzilaboratórnej skúšky: | 1998 | Počet laboratórií: | 24 | Počet vzoriek: | 5 | Skúmaná látka: | vaječný žĺtok | Vzorky | A | B | C | D | E | Počet laboratórií, ktoré boli ponechané po odstránení odchýlených výsledkov | 19 | 20 | 22 | 20 | 22 | Počet odchýlených výsledkov (laboratóriá) | 3 | 4 | 2 | 4 | 2 | Počet prijatých výsledkov | 38 | 40 | 44 | 40 | 4 | Stredná hodnota | 147,3 | 241,1 | 227,4 | 51,9*)72,8*) | 191,1 | Štandardná odchýlka opakovateľnosti (Sr) g/l | 2,44 | 4,24 | 3,93 | 1,83 | 3,25 | Relatívna štandardná odchýlka opakovateľnosti (RSDr) (%) | 1,7 | 1,8 | 1,8 | 2,9 | 1,7 | Limit opakovateľnosti (r) g/l | 6,8 | 11,9 | 11,0 | 5,1 | 9,1 | Štandardná odchýlka reprodukovateľnosti (SR) g/l | 5,01 | 6,06 | 6,66 | 3,42 | 6,87 | Relatívna štandardná odchýlka reprodukovateľnosti (RSDR) (%) | 3,4 | 2,5 | 2,9 | 5,5 | 3,6 | Limit reprodukovateľnosti (R) g/l | 14,0 | 17,0 | 18,7 | 9,6 | 19,2 | Typy vzoriek: A Advocaat, slepé duplikáty, B pastis, jediná vzorka, C Advocaat, jediná vzorka, D Advocaat (zriedený), delené hladiny* E Advocaat, slepé duplikáty, [1] rozporné výsledky medzi dvoma duplikátmi, poukazujúce na chybu vzorkovania --------------------------------------------------