Smernica Komisie 98/73/ES z 18. septembra 1998, ktorou sa dvadsiatyštvrtýkrát prispôsobuje technickému pokroku smernica Rady 67/548/EHS o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení týkajúcich sa klasifikácie, balenia a označovania nebezpečných látokText s významom pre EHP.



Úradný vestník L 305 , 16/11/1998 S. 0001 - 0181

CS.ES Kapitola 13 Zväzok 21 S. 139 - 316

ET.ES Kapitola 13 Zväzok 21 S. 139 - 316

HU.ES Kapitola 13 Zväzok 21 S. 139 - 316

LT.ES Kapitola 13 Zväzok 21 S. 139 - 316

LV.ES Kapitola 13 Zväzok 21 S. 139 - 316

MT.ES Kapitola 13 Zväzok 21 S. 139 - 316

PL.ES Kapitola 13 Zväzok 21 S. 139 - 316

SK.ES Kapitola 13 Zväzok 21 S. 139 - 316

SL.ES Kapitola 13 Zväzok 21 S. 139 - 316



Smernica Komisie 98/73/ES z 18. septembra 1998, ktorou sa dvadsiatyštvrtýkrát prispôsobuje technickému pokroku smernica Rady 67/548/EHS o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení týkajúcich sa klasifikácie, balenia a označovania nebezpečných látok (Text s významom pre EHP) KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV, so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spoločenstva, so zreteľom na smernicu Rady 67/548/EHS z 27. júna 1967 o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení týkajúcich sa klasifikácie, balenia a označovania nebezpečných látok [1], naposledy zmenenú a doplnenú smernicou Komisie 97/69/ES [2], a najmä na jej článok 28, keďže príloha I k smernici 67/548/EHS obsahuje zoznam nebezpečných látok a podrobnosti týkajúce sa klasifikácie, balenia a postupov pri označovaní každej z nich; keďže súčasný vedecký a technický pokrok preukázal, že zoznam nebezpečných látok v tejto prílohe treba zmeniť a doplniť; keďže príloha V k smernici 67/548/EHS ustanovuje metódy na stanovovanie fyzikálnochemických vlastností, toxicity a ekotoxicity látok a prípravkov; keďže prílohu V treba prispôsobiť technickému pokroku; keďže opatrenia ustanovené v tejto smernici sú v súlade so stanoviskom Výboru pre prispôsobovanie smerníc technickému pokroku pri odstraňovaní technických prekážok obchodu s nebezpečnými látkami a prípravkami, PRIJALA TÚTO SMERNICU: Článok 1 Smernica 67/548/EHS sa týmto mení a dopĺňa takto: 1. Príloha I sa mení a dopĺňa takto: a) položky v prílohe I k tejto smernici nahrádzajú zodpovedajúce položky v prílohe I k smernici 67/548/EHS; b) položky v prílohe II k tejto smernici sa vkladajú do prílohy I k smernici 67/548/EHS. 2. Príloha V sa mení a dopĺňa takto: a) znenie prílohy III A, III B a III C k tejto smernici sa pridáva k časti A prílohy V k smernici 67/548/EHS; b) znenie prílohy III D tejto smernice sa pridáva k časti C prílohy V k smernici 67/548/EHS. Článok 2 Členské štáty prijmú zákony, iné právne predpisy a správne opatrenia potrebné na dosiahnutie súladu s touto smernicou najneskôr do 31. októbra 1999. Ihneď o tom budú informovať Komisiu. Keď členské štáty prijmú tieto opatrenia, tieto budú obsahovať odkaz na túto smernicu alebo ich bude sprevádzať takýto odkazpri príležitosti ich úradného uverejnenia. Metodiku týchto odkazov ustanovia členské štáty. Článok 3 Táto smernica nadobúda účinnosť dvadsiaty deň po jej uverejnení v Úradnom vestníku Európskych spoločenstiev. Článok 4 Táto smernica je adresovaná členským štátom. V Bruseli 18. septembra 1998 Za Komisiu Ritt Bjerregaard člen Komisie [1] Ú. v. ES 196, 16.8.1967, s. 1. [2] Ú. v. ES L 343, 13.12.1997, s. 19. -------------------------------------------------- ANEXO IBILAG IANHANG IΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IANNEX IANNEXE IALLEGATO IBIJLAGE IANEXO ILIITE IBILAGA I +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ -------------------------------------------------- ANEXO IIBILAG IIANHANG IIΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IIANNEX IIANNEXE IIALLEGATO IIBIJLAGE IIANEXO IILIITE IIBILAGA II +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ -------------------------------------------------- PRÍLOHA III A A.18. ČÍSELNÁ PRIEMERNÁ MOLEKULOVÁ HMOTNOSŤ A DISTRIBÚCIA MOLEKULOVÝCH HMOTNOSTÍ POLYMÉROV 1. METÓDA Táto metóda, založená na gélovej permeačnej chromatografii, je prevzatá z OECD TG 118 (1996). Základné princípy a ďalšie technické informácie sú uvedené v literárnom odkaze 1. 1.1. Úvod Vlastnosti polymérov sú veľmi rôznorodé a nie je preto možné opísať jedinú metódu, ktorá by presne vymedzovala podmienky ich vzájomného oddeľovania a vyhodnocovania a ktorá by brala do úvahy všetky možnosti a špecifické situácie vyskytujúce sa pri separácii polymérov. Predovšetkým nie vždy sa dá pri komplexných polymérových systémoch použiť gélová permeačná chromatografia (GPC). Tam, kde nie je použitie GPC z praktického hľadiska možné, dajú sa molekulové hmotnosti stanoviť inými spôsobmi (pozri prílohu). V takýchto prípadoch je potrebné uviesť všetky podrobnosti a použitie konkrétnej metódy sa musí odôvodniť. Opisovaná metóda je založená na norme DIN 55672 (1). Podrobné informácie o vykonaní pokusu a spôsobe vyhodnotenia údajov možno nájsť v uvedenej norme. Všetky zmeny, ktoré sú potrebné v metóde urobiť, musia byť odôvodnené. Možno použiť aj iné normy, no treba pri tom uviesť plný odkaz. Pri opisovanej metóde sa na kalibráciu používajú vzorky polystyrénu so známou polydosperzitou a možno ju modifikovať tak, aby bola vhodná pre určité polyméry, napríklad pre polyméry rozpustné vo vode a pre vetvené polyméry s dlhými reťazcami. 1.2. Definície a jednotky Číselná priemerná molekulová hmotnosť Mn a hmotnostná priemerná molekulová hmotnosť Mw sa stanovili pomocou týchto rovníc: +++++ TIFF +++++ kde: Hi je hladina signálu detektora od základnej čiary pre retenčný objem Vi Mi je molekulová hmotnosť polymérovej frakcie pri retenčnom objeme Vi a n je počet dátových bodov. Šírka distribúcie molekulových hmotností, ktorá je mierou disperzity systému, je daná pomerom Mw/Mn. 1.3. Referenčné látky GPC je relatívna metóda, a preto je pri nej potrebné uskutočniť kalibráciu. Bežne sa na tento účel používajú lineárne skonštruované polystyrénové štandardy so známymi molekulovými hmotnosťami Mn a Mw a s úzkou oblasťou distribúcie molekulových hmotností. Kalibračnú krivku možno použiť na stanovenie molekulovej hmotnosti neznámej vzorky iba vtedy, ak sa pri separácii štandardov aj neznámej vzorky použijú úplne rovnaké podmienky. Vzťahy stanovené medzi molekulovou hmotnosťou a elučným objemom sú platné iba pri špecifických podmienkach daného pokusu. Medzi tieto podmienky patria predovšetkým teplota, typ rozpúšťadla (alebo zmesi rozpúšťadiel), chromatografické podmienky a rozdeľovacia kolóna alebo systém kolón. Takto stanovené molekulové hmotnosti vzoriek predstavujú pomerné hodnoty a označujú sa ako "molekulové hmotnosti polystyrénového ekvivalentu". Znamená to, že v závislosti od štrukturálnych a chemických rozdielov medzi vzorkou a štandardmi sa môžu molekulové hmotnosti do väčšej alebo menšej miery od svojich absolútnych hodnôt odlišovať. Prípadné použitie iných štandardov, napríklad polyetylénglykolu, polyetylénoxidu, polymetylmetakrylátu alebo kyseliny polyakrylovej, je potrebné odôvodniť. 1.4. Princíp testovacej metódy Distribúciu molekulových hmotností vzorky aj priemerné molekulové hmotnosti (Mn, Mw) možno stanoviť pomocou metódy GPC. Metóda GPC predstavuje osobitný typ kvapalinovej chromatografie, pri ktorej dochádza k rozdeleniu vzorky na základe hydrodynamických objemov jej jednotlivých zložiek (2). K oddeľovaniu dochádza pri prechode vzorky cez kolónu, ktorá je naplnená poréznym materiálom, ktorým je zvyčajne organický gél. Malé molekuly cez póry prechádzajú, zatiaľ čo veľké molekuly sa z objemu gélu vylučujú. Dráha, ktorú prekonajú veľké molekuly, je preto kratšia a vylučujú sa ako prvé. Molekuly strednej veľkosti do niektorých pórov vnikajú a vylučujú sa z kolóny neskôr. Najmenšie molekuly s hydrodynamickým priemerom menším, ako je veľkosť pórov gélu, môžu vnikať do všetkých z nich a vylučujú sa ako posledné. V ideálnych podmienkach závisí oddeľovanie výlučne od veľkosti jednotlivých molekúl, hoci v praxi je ťažké vyhnúť sa aspoň určitému stupňu interferencie absorpčných vplyvov. Situácia sa môže zhoršiť aj v dôsledku nerovnomerného naliatia kolóny a mŕtvych objemov (2). Detekciu možno uskutočňovať napríklad pomocou merania indexu lomu alebo UV-absorpcie eluátov. Na základe takýchto údajov je možné zostrojiť jednoduchú distribučnú krivku. Aby bolo možné prisúdiť bodom na distribučnej krivke molekulové hmotnosti, je však potrebné kolónu najprv okalibrovať. Robí sa to tak, že na kolónu sa nanesú polyméry so známou molekulovou hmotnosťou, v ideálnom prípade aj s približne podobnou štruktúrou, napríklad rozličné polystyrénové štandardy. Zvyčajne sa získava gaussovská krivka, ktorá býva niekedy na strane nízkych molekulových hmotností mierne pretiahnutá. Zvislá os udáva hmotnostné množstvo jednotlivých typov molekúl vyplavených z kolóny, vodorovná os je vyjadrená ako dekadický logaritmus molekulovej hmotnosti. 1.5. Kritériá kvality Reprodukovateľnosť (relatívna štandardná odchýlka, RSD) elučného objemu by mala byť lepšia ako 0,3 %. Ak sa chromatogram vyhodnocuje nezávisle od času a ak nespĺňa horeuvedené kritérium, potom je potrebné zabezpečiť reprodukovateľnosť analýzy pomocou vnútorného štandardu (1). Polydisperzita závisí od molekulových hmotností štandardov. V prípade polystyrénových štandardov sú typické hodnoty takéto: Mp < 2000 | Mw/Mn < 1,20 | 2000 ≤ Mp ≤ 106 | Mw/Mn < 1,05 | Mp > 106 | Mw/Mn < 1,20 | (Mp je molekulová hmotnosť štandardu v maxime píku) 1.6. Opis testovacej metódy 1.6.1. Príprava štandardných roztokov polystyrénu Polystyrénové štandardy sa opatrným miešaním rozpustia vo zvolenom elučnom činidle. Pri príprave roztokov sa treba riadiť odporúčaniami výrobcov. Voľba koncentrácií štandardov závisí od rozličných faktorov, napríklad od nanášacieho objemu, viskozity roztoku a citlivosti analytického detektora. Maximálny nanášací objem musí byť prispôsobený dĺžke kolóny, aby nedochádzalo k jej preťaženiu. Zvyčajné nanášacie objemy pri analytických separáciách pomocou GPC sa pri kolóne s rozmerom 30 cm x 7,8 mm pohybujú v rozmedzí 40 až 100 μl. Je možné použiť aj vyššie objemy, nemali by však presiahnuť 250 μl. Pred samotnou kalibráciou kolóny je potrebné určiť optimálny pomer medzi nanášacím objemom a koncentráciou nanášanej vzorky. 1.6.2. Príprava roztoku vzorky V zásade rovnaké požiadavky sa vzťahujú aj na prípravu roztokov vzoriek. Vzorka sa opatrným potriasaním rozpustí vo vhodnom rozpúšťadle, napríklad v tetrahydrofuráne (THF). V žiadnom prípade ju nemožno rozpúšťať v ultrazvukovom kúpeli. V prípade potreby sa vzorka prečistí filtráciou cez membránový filter s veľkosťou pórov medzi 0,2 a 2 μm. V záverečnej správe sa treba zmieniť o prítomnosti nerozpustených tuhých častíc, ktoré môžu byť dôsledkom prítomnosti vysokých molekulových hmotností. Percentuálne zastúpenie hmotnosti rozpustených čiastočiek je potrebné určiť pomocou primeranej metódy. Roztoky sa musia použiť do 24 hodín. 1.6.3. Prístrojové vybavenie - nádrž na rozpúšťadlo, - zariadenie na odplynenie kvapalín (ak je potrebné), - čerpadlo, - tlmič pulzov kvapaliny (ak je potrebný), - nanášací systém, - chromatografické kolóny, - detektor, - prietokomer (ak je potrebný), - zariadenie na zaznamenávanie a spracúvanie údajov, - nádoba na odpad. Treba zabezpečiť inertnosť systému GPC voči používaným rozpúšťadlám (napríklad použitím oceľových kapilár, ak je rozpúšťadlo THF). 1.6.4. Nanášací systém a systém na privádzanie rozpúšťadla Buď pomocou automatického nanášacieho zariadenia, alebo ručne sa na kolónu nanesie v ostro vymedzenej zóne presne definované množstvo roztoku vzorky. Príliš rýchle vytiahnutie striekačky alebo stlačenie jej piestu pri ručnom nanášaní vzorky môže spôsobiť zmeny v pozorovanej distribúcii molekulových hmotností. Systém na privádzanie rozpúšťadla by nemal spôsobovať pulzové vlny, čo možno v ideálnom prípad zabezpečiť zaradením tlmiča pulzov. Prietok sa pohybuje okolo hodnoty 1 ml/min. 1.6.5. Kolóna V závislosti od vzorky možno polymér charakterizovať buď pomocou jedinej kolóny, alebo pomocou viacerých za sebou spojených kolón. Ako náplň kolóny je komerčne dostupných viacero poréznych materiálov s definovanými vlastnosťami (napríklad veľkosť pórov, limit vylučovania). Voľba separačného gélu a dĺžky kolóny závisí od vlastností vzorky (hydrodynamické objemy, distribúcia molekulových hmotností) aj od špecifických podmienok pri separácii, napríklad od typu rozpúšťadla, teploty a rýchlosti prietoku (1) (2) (3). 1.6.6. Teoretické poschodia kolóny Kolóna alebo kombinácia viacerých kolón používaných pri separácii musí byť charakterizovaná počtom teoretických poschodí. V prípade THF ako rozpúšťadla sa to robí tak, že na kolónu so známou dĺžkou sa nanesie roztok etylbenzénu alebo iného vhodného nepolárneho rozpúšťadla. Počet teoretických poschodí udáva táto rovnica: N = 5,54 alebo N = 16 kde: N je počet teoretických poschod Ve je elučný objem v maxime píku W je šírka píku pri základnej čiare W1/2 je šírka píku v polovici jeho výšky. 1.6.7. Účinnosť separácie Okrem počtu teoretických poschodí, ktorý určuje šírku pásu, hrá pri separácii úlohu aj jej účinnosť, ktorá sa určuje na základe strmosti kalibračnej krivky. Účinnosť separácie kolóny možno získať z tohto vzťahu: e,M e, ≥ 6,0 cm3cm2 kde: Ve, Mx je elučný objem polystyrénu s molekulovou hmotnosťou Mx Ve (10Mx) je elučný objem polystyrénu s desaťnásobne väčšou molekulovou hmotnosťou. Rozlíšiteľnosť systému sa zvyčajne definuje takto: R = 2 × × M /M 1 kde: Ve1, Ve2 sú elučné objemy dvoch polystyrénových štandardov v maxime píku W1, W2 sú šírky píkov pri základnej čiare M1, M2 sú molekulové hmotnosti v maxime píku (mali by sa líšiť o faktor 10). R-hodnota kolóny musí byť vyššia ako 1,7 (4). 1.6.8. Rozpúšťadlá Všetky rozpúšťadlá musia mať vysoký stupeň čistoty (pri THF je stupeň čistoty 99,5 %). Zásobník na rozpúšťadlo (v prípade potreby s atmosférou inertného plynu) musí byť dostatočne veľký, aby umožnil kalibráciu kolóny a analýzu niekoľkých vzoriek. Pred vháňaním do kolóny pomocou čerpadla treba rozpúšťadlo zbaviť plynov. 1.6.9. Kontrola teploty Teplota kritických vnútorných zložiek systému (nanášacia slučka, detektor a hadičky) musí byť stála a musí zodpovedať zvolenému rozpúšťadlu. 1.6.10. Detektor Účelom detektora je kvantitatívne zaznamenávanie koncentrácie vzorky, ktorá sa eluuje z kolóny. V záujme eliminácie zbytočného rozširovania píku by mala mať kyveta meracej komôrky detektora čo možno najmenší objem. S výnimkou detektorov založených na rozptyle svetla a viskozitných detektorov by nemal tento objem presahovať 10 μl. Ako detekčná metóda sa zvyčajne používa diferenciálna refraktometria. V závislosti od osobitných požiadaviek vzorky alebo elučného činidla však možno použiť aj iné typy detektorov, napríklad UV/VIS, IR, viskozitný detektor atď. 2. ÚDAJE A PRÍPRAVA TESTOVACEJ SPRÁVY 2.1. Údaje Podrobné vyhodnocovacie kritériá a požiadavky vzťahujúce sa na zber a spracúvanie údajov sú uvedené v norme DIN (1). Pri každej vzorke je potrebné uskutočniť dva nezávislé pokusy. Každý z nich treba analyzovať osobitne. Pri každom meraní treba udať Mn, Mw, Mw/Mn a Mp. Treba výslovne uviesť, že namerané hodnoty sú pomerné hodnoty ekvivalentné použitým štandardom. Po stanovení retenčných objemov alebo retenčných časov (podľa možnosti korigovaných použitím vnútorného štandardu) sa voči jednej z týchto hodnôt nanášajú do grafu hodnoty log Mp (Mp je maximum píku kalibračného štandardu). Na každú dekádu molekulových hmotností treba použiť aspoň dva kalibračné body, na zostrojenie celej kalibračnej krivky, ktorá by mala pokrývať odhadnutú molekulovú hmotnosť vzorky, je potrebných aspoň päť bodov. Koncový bod kalibračnej krivky v oblasti nízkych molekulových hmotností sa definuje pomocou n-hexylbenzénu alebo iného vhodného nepolárneho rozpúšťadla. Číselné priemerné a hmotnostné priemerné molekulové hmotnosti sa vo všeobecnosti stanovujú pomocou elektronického spracúvania údajov, založeného na vzorcoch uvedených v časti 1.2. V prípade manuálnej digitalizácie sa možno riadiť dokumentom ASTM D 3536-91 (3). V prípade zadržania každého nerozpustného polyméru v kolóne je vysoko pravdepodobné, že jeho molekulová hmotnosť je vyššia ako molekulová hmotnosť rozpustnej frakcie. Výsledkom nevzatia tejto skutočnosti do úvahy môže byť nadhodnotenie zastúpenia zložiek s nízkou molekulovou hmotnosťou. Návod na uskutočnenie korekcie obsahu zložiek s nízkou molekulovou hmotnosťou na nerozpustný polymér je uvedený v prílohe. 2.2. Správa z testu Správa z testu musí obsahovať tieto informácie: 2.2.1. Testovaná látka - dostupné informácie o testovanej látke (totožnosť, prísady, nečistoty/prímesi), - postup spracovania vzorky, zistené skutočnosti, problémy. 2.2.2. Prístroje a zariadenia - zásobník na elučné činidlo, inertný plyn, zariadenie na odplynenie elučného činidla, zloženie elučného činidla, nečistoty/prímesi, - čerpadlo, tlmič pulzov kvapaliny, nanášací systém, - rozdeľovacie kolóny (výrobca, všetky informácie o charakteristikách kolón, ako sú veľkosť pórov, druh separačného materiálu atď., počet, dĺžka a usporiadanie použitých kolón), - počet teoretických poschodí kolóny (alebo kombinácie kolón), účinnosť rozdeľovania (rozlišovacia schopnosť systému), - informácie o symetrii píkov, - teploty kolóny, spôsob kontroly teploty, - detektor (princíp merania, typ, objem meracej kyvety), - prietokomer, ak sa používa (výrobca, princíp merania), - systém na zaznamenávanie a spracúvanie údajov (hardvér a softvér). 2.2.3. Kalibrácia systému - podrobné opísanie metódy použitej na zostrojenie kalibračnej krivky, - informácie o kritériách kvality tejto metódy (napríklad korelačný koeficient, odchýlka súčtu štvorcov atď.), - informácie o všetkých extrapoláciách, predpokladoch a aproximáciách, ktoré sa uskutočnili počas priebehu pokusu, a o vyhodnocovaní a spracúvaní údajov, - všetky merania, ktoré boli použité na zostrojenie kalibračnej krivky musia byť zdokumentované v tabuľke, ktorá obsahuje pre každý bod merania tieto informácie: - názov vzorky, - výrobcu vzorky, - charakteristické hodnoty štandardov, t. j. Mp, Mn, Mw a Mw/Mn, tak ako ich uvádza výrobca alebo ako boli odvodené z následných meraní, a tiež podrobnosti o metóde stanovenia, - nanášací objem a koncentráciu nanesenej vzorky, - hodnotu Mp, ktorá bola použitá na kalibráciu, - elučný objem alebo opravený retenčný čas, nameraný pri maxime píku, - Mp vypočítaná v maxime píku, - percentuálna odchýlka vypočítanej hodnoty Mp od kalibračnej krivky. 2.2.4. Vyhodnotenie - vyhodnotenie na základe času: metódy použité na zabezpečenie požadovanej reprodukovateľnosti (korekčná metóda, vnútorné štandardy atď.), - informácia o tom, či bolo vyhodnotenie vykonané na základe elučného objemu, alebo retenčného času, - informácie o limitoch vyhodnocovania, ak nebola vykonaná úplná analýza píku, - opísanie vyrovnávacej/prekladacej metódy, ak sa pri grafickom vyhodnocovaní použila, - príprava a predbežné spracovanie vzorky, - prítomnosť nerozpustených čiastočiek, ak boli pozorované, - objem (μl) a koncentrácia (mg/ml) nanesenej vzorky, - opísanie vplyvov, ktoré mohli spôsobiť odchýlku od ideálneho GPC profilu, - podrobné opísanie modifikácií uskutočnených v testovacej metóde, - podrobnosti o rozsahu chýb merania, - všetky iné informácie a pozorované skutočnosti, ktoré by mohli byť významné z hľadiska interpretácie výsledkov. 3. ODKAZY 1. DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil I. 2. Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds. (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography; J. Wiley and Sons. 3. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 4. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High-Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. -------------------------------------------------- PRÍLOHA III B A.19 OBSAH ZLOŽIEK S NÍZKOU MOLEKULOVOU HMOTNOSŤOU V POLYMÉROCH 1. METÓDA Táto metóda, založená na gélovej permeačnej chromatografii, je prevzatá z OECD TG 119 (1996). Základné princípy a ďalšie technické informácie sú uvedené v literárnych odkazoch. 1.1. Úvod Vlastnosti polymérov sú veľmi rôznorodé a nie je preto možné opísať jedinú metódu, ktorá by presne vymedzovala podmienky ich separácie a vyhodnocovania a ktorá by brala do úvahy všetky možnosti a špecifické situácie vyskytujúce sa pri separácii polymérov. Predovšetkým nie vždy možno pri komplexných polymérových systémoch použiť gélovú permeačnú chromatografiu (GPC). Tam, kde nie je použitie GPC z praktického hľadiska možné, dajú sa molekulové hmotnosti stanoviť inými spôsobmi (pozri prílohu). V takýchto prípadoch je potrebné uviesť všetky podrobnosti a použitie konkrétnej metódy treba odôvodniť. Opisovaná metóda je založená na norme DIN 55672 (1). Podrobné informácie o vykonaní pokusu a spôsobe vyhodnotenia údajov možno nájsť v uvedenej norme. Všetky zmeny, ktoré sú potrebné v metóde urobiť, musia byť odôvodnené. Možno použiť aj iné normy, no treba pri tom uviesť plný literárny odkaz. Pri opisovanej metóde sa na kalibráciu používajú vzorky polystyrénu so známou polydisperzitou a možno ju modifikovať tak, aby bola vhodná pre určité polyméry, napríklad pre polyméry rozpustné vo vode a vetvené polyméry s dlhými reťazcami. 1.2. Definície a jednotky Nízka molekulová hmotnosť je arbitrárne definovaná ako molekulová hmotnosť nižšia ako 1000 daltonov. Číselná priemerná molekulová hmotnosť Mn a hmotnostná priemerná molekulová hmotnosť Mw sa stanovili pomocou týchto rovníc: +++++ TIFF +++++ kde: Hi je hladina signálu detektora od základnej čiary retenčného objemu Vi Mi je molekulová hmotnosť polymérovej frakcie pri retenčnom objeme Vi a n je počet dátových bodov. Šírka distribúcie molekulových hmotností, ktorá predstavuje mieru disperzity systému, je daná pomerom Mw/Mn. 1.3. Referenčné látky GPC je relatívna metóda, a preto je potrebné uskutočniť kalibráciu. Bežne sa na tento účel používajú lineárne konštruované polystyrénové štandardy so známymi molekulovými hmotnosťami Mn a Mw a s úzkou oblasťou distribúcie. Kalibračnú krivku možno použiť na stanovenie molekulovej hmotnosti neznámej vzorky iba vtedy, ak sa pri separácii štandardov aj neznámej vzorky použijú úplne rovnaké podmienky. Vzťahy stanovené medzi molekulovou hmotnosťou a elučným objemom sú platné iba pri špecifických podmienkach daného pokusu. Medzi tieto podmienky patrí predovšetkým teplota, typ rozpúšťadla (alebo zmesi rozpúšťadiel), chromatografické podmienky a rozdeľovacia kolóna alebo systém kolón. Takto stanovené molekulové hmotnosti vzoriek predstavujú pomerné hodnoty a označujú sa ako "molekulové hmotnosti polystyrénového ekvivalentu". Znamená to, že v závislosti od štrukturálnych a chemických rozdielov medzi vzorkou a štandardmi sa môžu molekulové hmotnosti do väčšej alebo menšej miery od svojich absolútnych hodnôt odlišovať. Prípadné použitie iných štandardov, napríklad polyetylénglykolu, polyetylénoxidu, polymetylmetakrylátu alebo kyseliny polyakrylovej, je potrebné odôvodniť. 1.4. Princíp testovacej metódy Distribúciu molekulových hmotností vzorky aj priemerné molekulové hmotnosti (Mn, Mw) možno stanoviť pomocou metódy GPC. Metóda GPC predstavuje osobitný typ kvapalinovej chromatografie, pri ktorej dochádza k rozdeleniu vzorky na základe hydrodynamických objemov jej jednotlivých zložiek (2). K oddeľovaniu dochádza pri prechode vzorky cez kolónu, ktorá je naplnená poréznym materiálom, ktorým je zvyčajne organický gél. Malé molekuly cez póry prechádzajú, zatiaľ čo veľké molekuly sa z objemu gélu vylučujú. Dráha, ktorú prekonajú veľké molekuly, je preto kratšia a tieto sa vylučujú ako prvé. Molekuly strednej veľkosti do niektorých pórov vnikajú a vylučujú sa z kolóny neskôr. Najmenšie molekuly s hydrodynamickým priemerom menším, ako je veľkosť pórov gélu, môžu vnikať do všetkých z nich a vylučujú sa ako posledné. V ideálnych podmienkach závisí oddeľovanie výlučne od veľkosti jednotlivých molekúl, no v praxi býva ťažké vyhnúť sa aspoň určitej interferencii absorpčných vplyvov. Situácia sa môže zhoršiť aj v dôsledku nerovnomerného naliatia kolóny a mŕtvych objemov (2). Detekciu je možné uskutočňovať napríklad pomocou merania indexu lomu alebo UV-absorpcie eluátov. Na základe takýchto údajov je možné zostrojiť jednoduchú distribučnú krivku. Molekulové hmotnosti možno bodom na distribučnej krivke prisúdiť iba po predchádzajúcom okalibrovaní kolóny. Robí sa to tak, že na kolónu sa nanesú polyméry so známou molekulovou hmotnosťou, v ideálnom prípade aj s približne podobnou štruktúrou, napríklad rozličné polystyrénové štandardy. Zvyčajne sa získava gaussovská krivka, ktorá býva niekedy na strane nízkych molekulových hmotností mierne pretiahnutá. Zvislá os udáva hmotnostné množstvo jednotlivých typov molekúl vyplavených z kolóny, vodorovná os je vyjadrená ako dekadický logaritmus molekulovej hmotnosti. Obsah zložiek s nízkou molekulovou hmotnosťou sa odvádza z tejto krivky. Výpočet môže byť presný iba vtedy, ak zložky s nízkou molekulovou hmotnosťou ekvivalentne na hmotnostnom základe zodpovedajú polyméru ako celku. 1.5. Kritériá kvality Reprodukovateľnosť (relatívna štandardná odchýlka, RSD) elučného objemu by mala byť lepšia ako 0,3 %. Ak sa chromatogram vyhodnocuje nezávisle od času a ak nespĺňa horeuvedené kritérium, potom je potrebné zabezpečiť reprodukovateľnosť analýzy pomocou vnútorného štandardu (1). Polydisperzita závisí od molekulových hmotností štandardov. V prípade polystyrénových štandardov sú typické tieto hodnoty: Mp < 2000 | Mw/Mn < 1,20 | 2000 ≤ Mp ≤ 106 | Mw/Mn < 1,05 | Mp > 106 | Mw/Mn < 1,20 | (Mp je molekulová hmotnosť štandardu v maxime píku) 1.6. Opis testovacej metódy 1.6.1. Príprava štandardných roztokov polystyrénu Polystyrénové štandardy sa rozpustia opatrným miešaním vo zvolenom elučnom činidle. Pri príprave roztokov sa treba riadiť odporúčaniami výrobcov. Voľba koncentrácií štandardov závisí od rozličných faktorov, napríklad od nanášacieho objemu, viskozity roztoku a citlivosti analytického detektora. Maximálny nanášací objem musí byť prispôsobený dĺžke kolóny, aby nedochádzalo k jej preťaženiu. Zvyčajné nanášacie objemy pri analytických separáciách pomocou GPC sa pri kolóne s rozmerom 30 cm x 7,8 mm pohybujú v rozmedzí 40 až 100 μl. Je možné použiť aj vyššie objemy, nemali by však presiahnuť 250 μl. Pred samotnou kalibráciou kolóny je potrebné určiť optimálny pomer medzi nanášacím objemom a koncentráciou nanášanej vzorky. 1.6.2. Príprava roztoku vzorky V zásade rovnaké požiadavky sa vzťahujú aj na prípravu roztokov vzoriek. Vzorka sa opatrným potriasaním rozpustí vo vhodnom rozpúšťadle, napríklad v tetrahydrofuráne (THF). V žiadnom prípade ju nemožno rozpúšťať v ultrazvukovom kúpeli. V prípade potreby sa vzorka prečistí filtráciou cez membránový filter s veľkosťou pórov medzi 0,2 a 2 μm. V záverečnej správe je potrebné zmieniť sa o prítomnosti nerozpustených tuhých častíc, ktoré môžu byť dôsledkom prítomnosti vysokých molekulových hmotností. Percentuálne zastúpenie hmotnosti rozpustených čiastočiek je potrebné určiť pomocou primeranej metódy. Roztoky sa musia použiť do 24 hodín. 1.6.3. Korekcia na obsah nečistôt a prímesí Zvyčajne je potrebné vykonať korekciu na obsah molekúl s molekulovou hmotnosťou M < 1000, ktorými prispievajú zložky nepolymérovej povahy (napríklad nečistoty, resp. prímesi). Korekciu netreba vykonať v prípade, ak je ich nameraný obsah nižší ako 1 %. Na tento účel možno analyzovať priamo roztok polyméru alebo GPC eluát. V prípadoch, v ktorých je eluát po prechode cez kolónu na vykonanie ďalšej analýzy príliš zriedený, treba ho koncentrovať. Môže byť potrebné eluát odpariť dosucha a opätovne rozpustiť. Koncentrovanie eluátu treba vykonať za takých podmienok, ktoré zaručia, že v ňom neprebehnú žiadne zmeny. Spracovanie eluátu po GPC závisí od analytickej metódy, ktorá sa použije na kvantitatívne stanovenie. 1.6.4. Prístrojové vybavenie Prístrojové vybavenie GPC zahŕňa tieto zložky: - nádrž na rozpúšťadlo, - zariadenie na odplyňovanie kvapalín (ak je potrebné), - čerpadlo, - tlmič pulzov kvapaliny (ak je potrebný), - nanášací systém, - chromatografické kolóny, - detektor, - prietokomer (ak je potrebný), - zariadenie na zaznamenávanie a spracúvanie údajov, - nádoba na odpad. Treba zabezpečiť inertnosť systému GPC voči používaným rozpúšťadlám (napríklad použitím oceľových kapilár, ak je rozpúšťadlo THF). 1.6.5. Nanášací systém a systém na privádzanie rozpúšťadla Buď pomocou automatického nanášacieho zariadenia, alebo ručne sa na kolónu nanesie v ostro vymedzenej zóne definované množstvo roztoku vzorky. Príliš rýchle vytiahnutie striekačky alebo stlačenie jej piestu pri ručnom nanášaní vzorky môže spôsobiť zmeny v pozorovanej distribúcii molekulových hmotností. Systém na privádzanie rozpúšťadla by nemal spôsobovať pulzové vlny, čo možno v ideálnom prípade zabezpečiť zaradením tlmiča pulzov. Rýchlosť prietoku sa pohybuje okolo hodnoty 1 ml/min. 1.6.6. Kolóna V závislosti od vzorky možno polymér charakterizovať buď pomocou jedinej kolóny, alebo pomocou viacerých za sebou spojených kolón. Ako náplň kolóny je komerčne dostupných viacero poréznych materiálov s definovanými vlastnosťami (napríklad veľkosť pórov, limit vylučovania). Voľba separačného gélu a dĺžky kolóny závisí od vlastností vzorky (hydrodynamické objemy, distribúcia molekulových hmotností) aj od špecifických podmienok pri separácii, napríklad od typu rozpúšťadla, teploty a rýchlosti prietoku (1) (2) (3). 1.6.7. Teoretické poschodia kolóny Kolóna alebo kombinácia viacerých kolón používaných pri separácii musí byť charakterizovaná počtom teoretických poschodí. V prípade THF ako rozpúšťadla sa to robí tak, že na kolónu so známou dĺžkou sa nanesie roztok etylbenzénu alebo iného vhodného nepolárneho rozpúšťadla. Počet teoretických poschodí udáva táto rovnica: N = 5,54 alebo N = 16 kde: N je počet teoretických poschodí Ve je elučný objem v maxime píku W je šírka píku pri základnej čiare W1/2 je šírka píku v polovici jeho výšky. 1.6.8. Účinnosť separácie Okrem počtu teoretických poschodí, ktorý určuje šírku pásu, hrá pri separácii úlohu aj jej účinnosť, ktorá sa určuje na základe strmosti kalibračnej krivky. Účinnosť separácie kolóny možno získať z tohto vzťahu: V – V 10M ≥ 6,0 cm3cm2 kde: VeMx je elučný objem polystyrénu s molekulovou hmotnosťou Mx Ve(10Mx) je elučný objem polystyrénu s desaťnásobne väčšou molekulovou hmotnosťou. Rozlíšiteľnosť systému sa zvyčajne definuje takto: R = 2 × × M /M 1 kde: Ve1, Ve2 sú elučné objemy dvoch polystyrénových štandardov v maxime píku W1, W2 sú šírky píkov pri základnej čiare M1, M2 sú molekulové hmotnosti v maxime píku (mali by sa líšiť o faktor 10). R-hodnota kolóny musí byť vyššia ako 1,7 (4). 1.6.9. Rozpúšťadlá Všetky rozpúšťadlá musia mať vysoký stupeň čistoty (pri THF je stupeň čistoty 99,5 %). Zásobník na rozpúšťadlo (v prípade potreby s atmosférou inertného plynu) musí byť dostatočne veľký na to, aby umožnil kalibráciu kolóny a analýzu niekoľkých vzoriek. Pred vháňaním do kolóny pomocou čerpadla treba elučné činidlo zbaviť plynov. 1.6.10. Kontrola teploty Teplota kritických vnútorných zložiek systému (nanášacia slučka, detektor a hadičky) musí byť stála a musí zodpovedať zvolenému rozpúšťadlu. 1.6.11. Detektor Účelom detektora je kvantitatívne zaznamenávanie koncentrácie vzorky eluovanej z kolóny. V záujme eliminácie zbytočného rozširovania píku by mala mať kyveta meracej komôrky detektora čo možno najmenší objem. S výnimkou detektorov založených na rozptyle svetla a viskozitných detektorov by nemal presahovať 10 μl. Ako detekčná metóda sa zvyčajne používa diferenciálna refraktometria. Možno použiť aj iné typy detektorov (napríklad UV/VIS, IR, viskozitný detektor atď.), ak si to vyžaduje osobitný charakter vzorky alebo elučného činidla. 2. ÚDAJE A PRÍPRAVA TESTOVACEJ SPRÁVY 2.1. Údaje Podrobné vyhodnocovacie kritériá a požiadavky vzťahujúce sa na zber a spracúvanie údajov sú uvedené v norme DIN (1). Pri každej vzorke je potrebné uskutočniť dva nezávislé pokusy. Každý z nich treba analyzovať osobitne. Pri každom meraní treba udat' Mn, Mw, Mw/Mn a Mp. Treba výslovne uviesť, že namerané hodnoty sú pomerné hodnoty, ekvivalentné použitým štandardom. Po stanovení retenčných objemov alebo retenčných časov (podľa možnosti korigovaných použitím vnútorného štandardu) sa voči jednej z týchto hodnôt nanášajú do grafu hodnoty log Mp (Mp je maximum píku kalibračného štandardu). Na každú dekádu molekulových hmotností treba použiť aspoň dva kalibračné body, na zostrojenie celej kalibračnej krivky, ktorá by mala pokrývať odhadnutú molekulovú hmotnosť vzorky, je potrebných aspoň päť bodov. Koncový bod kalibračnej krivky v oblasti nízkych molekulových hmotností sa definuje pomocou n-hexylbenzénu alebo iného vhodného nepolárneho rozpúšťadla. Pri stanoveni sa časť krivky zodpovedajúcej molekulovým hmotnostiam nižším ako 1000 podľa potreby koriguje na nečistoty a prísady. Nanášacie krivky sa zvyčajne hodnotia pomocou elektronického spracovania údajov. V prípade manuálnej digitalizácie sa možno riadiť dokumentom ASTM D 3536-91 (3). V prípade zadržania každého nerozpustného polyméru v kolóne je vysoko pravdepodobné, že jeho molekulová hmotnosť je vyššia ako molekulová hmotnosť rozpustnej frakcie. Výsledkom nevzatia tejto skutočnosti do úvahy môže byť nadhodnotenie zastúpenia zložiek s nízkou molekulovou hmotnosťou. Návod na uskutočnenie korekcie obsahu zložiek s nízkou molekulovou hmotnosťou na nerozpustný polymér je uvedený v prílohe. Distribučná krivka sa musi znázorniť vo forme tabuľky alebo graficky (diferenciálna frekvencia alebo kumulatívna frekvencia v percentách proti log M). V grafickom znázorneni by mal mať jeden poriadok molekulovej hmotnosti dľžku 4 cm a výška maxima piku by mala byť asi 8 cm. Pri integrálnych distribučných krivkách by mala byť vzdialenosť medzi 0 a 100 % na osi y približne 10 cm. 2.2. Správa z testu Správa z testu musí obsahovať tieto informácie: 2.2.1. Testovaná látka - dostupné informácie o testovanej látke (totožnosť, prísady, nečistoty/prímesi), - opis spracovania vzorky, zistené skutočnosti, problémy. 2.2.2. Prístroje a zariadenia - zásobník na elučné činidlo, inertný plyn, odplynenie elučného činidla, zloženie elučného činidla, nečistoty/prímesi, - čerpadlo, tlmič pulzov kvapaliny, nanášací systém, - rozdeľovacie kolóny (výrobca, všetky informácie o charakteristikách kolón, ako napríklad veľkosť pórov, druh separačného materiálu atď., počet, dĺžka a usporiadanie použitých kolón), - počet teoretických poschodí kolóny (alebo kombinácie kolón), účinnosť rozdeľovania (rozlišovacia schopnosť systému), - informácie o symetrii píkov, - teploty kolóny, spôsob kontroly teploty, - detektor (princíp merania, typ, objem kyvety), - prietokomer, ak sa používa (výrobca, princíp merania), - systém na zaznamenávanie a spracúvanie údajov (hardvér a softvér). 2.2.3. Kalibrácia systému - podrobné opísanie metódy použitej na zostrojenie kalibračnej krivky, - informácie o kritériách kvality tejto metódy (napríklad korelačný koeficient, odchýlka súčtu štvorcov atď.), - informácie o všetkých extrapoláciách, predpokladoch a aproximáciách, ktoré sa uskutočnili počas priebehu pokusu a o vyhodnocovaní a spracúvaní údajov, - všetky merania, ktoré boli použité na zostrojenie kalibračnej krivky, musia byť zdokumentované v tabuľke, ktorá obsahuje tieto informácie pre každý bod merania: - názov vzorky, - výrobcu vzorky, - charakteristické hodnoty štandardov, t. j. Mp, Mn, Mw a Mw/Mn, tak ako ich uvádza výrobca alebo ako boli odvodené z následných meraní, ako aj podrobnosti o metóde stanovenia, - nanášací objem a koncentráciu nanesenej vzorky, - hodnotua Mp, ktorá bola použitá na kalibráciu, - elučný objem alebo opravený retenčný čas nameraný pri maxime píku, - Mp vypočítanú v maxime píku, - percentuálnu odchýlku vypočítanej hodnoty Mp od kalibračnej krivky. 2.2.4. Informácie o obsahu polyméru s nízkou molekulovou hmotnosťou - opísanie metódy, ktorá sa použila na vykonanie analýzy a spôsobu vykonania pokusu, - informácie o percentuálnom obsahu molekúl s nízkou molekulovou hmotnosťou (w/w) vzhľadom na celkové množstvo vzorky, - informácie o percentuálnom obsahu (w/w) nečistôt, prísad a iných molekúl nepolymérovej povahy vzhľadom na celkové množstvo vzorky. 2.2.5. Vyhodnotenie - vyhodnotenie na základe času: metódy použité na zabezpečenie požadovanej reprodukovateľnosti (korekčná metóda, vnútorné štandardy atď.), - informácia o tom, či bolo vyhodnotenie vykonané na základe elučného objemu, alebo retenčného času, - informácie o limitoch vyhodnocovania, ak nebola vykonaná úplná analýza píku, - opísanie vyrovnávacej/prekladacej metódy, ak sa použila, - príprava a predbežné spracovanie vzorky, - prítomnosť nerozpustených čiastočiek, ak boli pozorované, - objem (μl) a koncentrácia (mg/ml) nanesenej vzorky, - opísanie vplyvov, ktoré mohli spôsobiť odchýlku od ideálneho GPC profilu, - podrobné opísanie modifikácií uskutočnených v testovacej metóde, - podrobnosti o rozsahu chýb merania, - všetky iné informácie a pozorované skutočnosti, ktoré by mohli byť významné z hľadiska interpretácie výsledkov. 3. ODKAZY 1. DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil I. 2. Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds. (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. 3. ASTM D 3536-91 (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography - GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 4. ASTM D 5296-92 (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High-Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. -------------------------------------------------- PRÍLOHA III C A.20 ROZPÚŠŤACIE/EXTRAKTÍVNE VLASTNOSTI POLYMÉROV VO VODE 1. METÓDA Metóda je prevzatá z revidovanej verzie OECD TG 120 (1997). Ďalšie technické informácie sa nachádzajú v odkaze (1). 1.1. Úvod Skôr ako sa pri určitých polyméroch, napríklad emulzných, bude dať použiť metóda, ktorá je opísaná v ďalšom texte, môže byť potrebné vykonať prípravné postupy. Metódu nemožno použiť pri kvapalných polyméroch a pri polyméroch, ktoré pri pokusných podmienkach reagujú s vodou. V prípadoch, v ktorých nie je metóda praktická alebo uskutočniteľná, možno extrakčné vlastnosti polymérov stanovovať inými metódami, ktoré je potrebné podrobne opísať a ich použitie odôvodniť. 1.2. Referenčné látky Žiadne. 1.3. Princíp testovacej metódy Extraktívne vlastnosti polymérov vo vodnom prostredí sa stanovujú pomocou bankovej metódy (pozri A.6 rozpustnosť vo vode, banková metóda) s modifikáciami, ktoré sú opísané v ďalšom texte. 1.4. Kvalitatívne kritériá Žiadne. 1.5. Opis testovacej metódy 1.5.1. Vybavenie Pre metódu je potrebné toto vybavenie: - drviace zariadenie, napríklad drvič, na získanie čiastočiek so známou veľkosťou, - trepacie zariadenie s možnosťou kontrolovania teploty, - systém membránových filtrov, - primerané analytické zariadenie, - štandardizované sitá. 1.5.2. Príprava vzorky Reprezentatívna vzorka sa najprv rozdrví a pomocou primeraných sít upraví tak, aby sa získali čiastočky s veľkosťou medzi 0,125 a 0,25 mm. Počas drvenia môže byť v záujme zachovania stability vzorky potrebné zabezpečiť chladenie. Materiály gumovitej konzistencie možno drviť pri teplote kvapalného dusíka (1). Ak dosiahnutie uvedeného rozmeru čiastočiek nie je možné, potom je potrebné pokúsiť sa o dosiahnutie ich najmenšieho možného rozmeru a výsledok treba zaznamenať. V testovacom protokole je potrebné uviesť spôsob uskladnenia vzorky pred vykonaním testu. 1.5.3. Postup Do každej z troch nádob so sklenou zátkou sa naváži 10 g testovanej látky a pridá sa k nim 1000 ml vody. Ak spracúvanie 10 g testovanej látky nie je z praktického hľadiska možné, potom treba použiť jej najvyššie možné množstvo blízke tejto hodnote a objem vody mu treba príslušným spôsobom prispôsobiť. Potom sa nádoby tesne uzavrú a nechajú sa premiešavať pri teplote 20 °C. Treba pri tom použiť trepacie alebo miešacie zariadenie pracujúce pri stálej teplote. Po 24 hodinách sa obsah každej nádoby scentrifuguje alebo prefiltruje a pomocou vhodnej analytickej metódy sa v čírej vodnej fáze stanoví koncentrácia polyméru. Ak pre vodnú fázu neexistujú vhodné analytické metódy, potom možno celkovú rozpustnosť/extraktivitu stanoviť na základe suchej hmotnosti zvyšku na filtri alebo suchej hmotnosti scentrifugovanej usadeniny. Zvyčajne býva potrebné uskutočniť kvantitatívne rozlíšenie medzi nečistotami a prímesami na jednej strane a medzi polymérnymi zložkami s nízkou molekulovou hmotnosťou na druhej strane. V prípade gravimetrických stanovení je tiež dôležité vykonať slepé meranie bez testovacej látky, aby sa vzali do úvahy prímesi/nečistoty, ktoré sú do pokusu zanášané počas jeho postupu. Rozpúšťacie/extraktívne správanie polymérov vo vode pri 37 °C pH 2 a pH 9 možno stanoviť rovnakým spôsobom ako pri vykonávaní pokusu pri 20 °C. Požadované hodnoty pH možno dosiahnuť pridaním buď vhodných tlmivých roztokov, alebo vhodných kyselín, alebo zásad, ako sú kyselina chlorovodíková, kyselina octová, hydroxid sodný alebo draselný analytickej čistoty, alebo NH3. V závislosti od použitej analytickej metódy treba uskutočniť jeden alebo dva testy. Ak sú na priame analyzovanie obsahu polymérovej zložky vodnej fázy k dispozícii dostatočne špecifické metódy, potom by mal postačovať jediný z horeuvedených testov. Ak však takéto metódy k dispozícii nie sú a stanovenie rozpúšťacích/extraktívnych vlastností polyméru je obmedzené na nepriamu analýzu pomocou stanovenia iba celkového množstva organicky viazaného uhlíka (TOC) vo vodnom extrakte, potom je potrebné uskutočniť prídavný test. Takýto prídavný test je potrebné vykonať v triplikátoch s použitím desaťnásobne menšieho množstva polyméru a rovnakého množstva vody ako pri prvom teste. 1.5.4. Analýza 1.5.4.1. Testy vykonávané s jedným množstvom vzorky Môžu existovať metódy na priamu analýzu polymerických zložiek vodnej fázy. Možno uvažovať taktiež o nepriamej analýze rozpustených/extrahovaných zložiek, pri ktorej sa stanovuje celkové množstvo rozpustných čiastočiek, ktoré sa upravuje na obsah zložiek nepolymérovej povahy. Analýzu celkového obsahu polymérových látok vo vodne fáze možno uskutočniť: buď pomocou dostatočne citlivej metódy, napríklad: - pomocou stanovenia TOC, pri ktorom sa vzorka najprv rozloží kyselinou persírovou alebo kyselinou dvojchrómovu za vzniku CO2, po čom nasleduje stanovenie pomocou IR alebo chemickej analýzy, - pomocou atómovej absorpčnej spektrometrie (AAS) alebo na ekvivalentnej metóde založenej na emisii induktívne naviazanej plazmy (Inductively Coupled Plasma, ICP) pri polyméroch s obsahom kremíka alebo kovov, - pomocou UV absorpcie alebo spektrofluorometrie pri arylových polyméroch, - LC-MS pri nízkomolekulárnych vzorkách, alebo pomocou vákuového odparenia vodného extraktu dosucha a následnou spektroskopickou (IR, UV atď.), alebo AAS/ICP analýzou zvyšku. Ak analýza vodnej fázy ako takej nie je z praktického hľadiska uskutočniteľná, potom je potrebné podrobiť vodný extrakt extrakcii organickým rozpúšťadlom nemiešateľným s vodou, čo môže byť napríklad chlórovaný uhľovodík. Rozpúšťadlo sa potom nechá odpariť a zvyšok sa analyzuje na obsah daného polyméru horeuvedeným spôsobom. Všetky zložky takéhoto zvyšku, ktoré sa vyhodnotia ako nečistoty alebo prímesi, je potrebné od výsledku odrátať, aby sme stanovili stupeň rozpustnosti/extrakcie iba samotného polyméru. Ak je množstvo takýchto materiálov vo vzorke relatívne veľké, potom môže byť potrebné podrobiť zvyšok napríklad analýze pomocou HPLC alebo GC. Umožní to odlíšiť nečistoty od prítomných monomérov alebo ich derivátov, čím sa umožní stanovenie ich skutočného obsahu. V niektorých prípadoch môže postačovať jednoduché odparenie organického rozpúšťadla dosucha a odváženie zvyšku. 1.5.4.2. Testy vykonávané s dvoma množstvami vzorky Všetky vodné extrakty sa analyzujú na prítomnosť TOC. Nerozpustená/neextrahovaná časť vzorky sa podrobí gravimetrickému stanoveniu. Ak zostanú po centrifugácii alebo filtrácii obsahu každej banky prichytené na stenách nádoby zvyšky polyméru, potom treba nádobu oplachovať filtrátom dovtedy, kým sa nebude na jej stenách nachádzať žiaden viditeľný zvyšok. Filtrát sa potom podrobí opätovnej centrifugácii alebo filtrácii. Zvyšky, ktoré zostanú na filtri alebo v centrifugačnej kyvete, sa nechajú vysušiť pri 40 °C a odvážia sa. V sušení sa pokračuje až po dosiahnutie konštantnej hmotnosti. 2. ÚDAJE 2.1. Testy vykonávané s jedným množstvom vzorky Je potrebné uviesť jednotlivé výsledky získané pri každej z troch baniek a priemerné hodnoty vyjadrené v jednotkách hmotnosti na objem roztoku (zvyčajne mg/l) alebo v jednotkách hmotnosti na hmotnosť vzorky polyméru (zvyčajne mg/g). Treba uviesť i straty hmotnosti vzorky (vypočítané ako hmotnosť rozpustenej látky vydelená hmotnosťou pôvodnej vzorky). Treba vypočítať relatívne štandardné odchýlky (RSD). Údaje pre celkové množstvo látky (polymér + hlavné prímesi atď.) a iba pre samotný polymér (t. j. po odčítaní príspevku horeuvedených prímesí) treba uviesť osobitne. 2.2. Testy vykonávané s dvoma množstvami vzorky Treba uviesť jednotlivé hodnoty TOC vodných extraktov oboch pokusov vykonaných v triplikátoch, vyjadrené v jednotkách hmotnosti na objem rozpúšťadla (zvyčajne mgC/l), ako aj v jednotkách hmotnosti na hmotnosť pôvodnej vzorky (zvyčajne mgC/g). Z neexistencie rozdielu medzi výsledkami získanými pri vysokom a nízkom pomere vzorka/voda môže vyplývať, že všetky extrahovateľné látky boli skutočne aj extrahované. V takomto prípade nebude priama analýzy zvyčajne potrebná. Treba uviesť jednotlivé hmotnosti zvyškov vyjadrené ako percentuálny podiel z pôvodnej hmotnosti vzorky. Pri každom z pokusov treba vypočítať priemerné hodnoty. Rozdiely medzi hodnotou 100 a zisteným percentuálnym zastúpením predstavujú percentuálne zastúpenie rozpustenej a extrahovateľnej hmoty v pôvodnej vzorke. 3. PRÍPRAVA TESTOVACEJ SPRÁVY 3.1. Správa z testu Správa z testu musí obsahovať tieto informácie: 3.1.1. Testovaná látka - dostupné informácie o testovanej látke (totožnosť, prísady, obsah nízkomolekulárnych zložiek). 3.1.2. Pokusné podmienky - opísanie použitých postupov a pokusných podmienok, - opísanie analytických a detekčných metód. 3.1.3. Výsledky - výsledky týkajúce sa rozpustnosti/extrahovateľnosti v mg/l; jednotlivé a priemerné hodnoty extrakčných testov pri jednotlivých roztokoch, rozdelené podľa obsahu polyméru a nečistôt, prímesí atď., - výsledky týkajúce sa rozpustnosti/extrahovateľnosti v mg/g polyméru, - TOC hodnoty vodných extraktov, hmotnosť rozpusteného podielu a vypočítané percento, ak bolo stanovené, - pH každej vzorky, - informácie o hodnotách získaných pri slepých vzorkách, - ak je potrebné, aj informácie o chemickej nestálosti testovanej látky počas samotného testovania aj analytických postupov, - všetky informácie, ktoré môžu mať význam pre interpretovanie výsledkov. 4. ODKAZY 1. DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke. -------------------------------------------------- PRÍLOHA III D C.13 BIOKONCENTRÁCIA: PRIETOKOVÝ RYBÍ TEST 1. METÓDA Táto metóda je prevzatá z OECD TG 305 (1996). 1.1. Úvod Táto metóda opisuje postup, ktorý sa používa na charakterizáciu potenciálu látok na biokoncentrovanie v rybách pri prietočných podmienkach. Prednosť sa dáva prietočným testovacím režimom, no pod podmienkou spĺňania kritérií platnosti možno použiť aj poloprietočné režimy. Metóda poskytuje dostatok podrobností na uskutočnenie testu a súčasne poskytuje primeranú voľnosť na prispôsobenie pokusného usporiadania podmienkam jednotlivých laboratórií a rozličným charakteristikám testovaných látok. Najplatnejším spôsobom ju možno použiť pri stálych organických chemických zlúčeninách s hodnotami log Pow medzi 1,5 a 6,0 (1), no dá sa ešte použiť aj pre superlipofilné látky (s hodnotou Pow > 6,0). Predbežne odhadnutá hodnota biokoncentračného faktora (BCF), ktorý sa niekedy označuje ako KB, týchto superlipofilných látok bude pravdepodobne vyššia ako hodnota rovnovážneho biokoncentračného faktora (BCFss), ktorú možno dosiahnuť v laboratórnych pokusoch. Predbežné odhady biokoncentračného faktora organických látok s hodnotami log Pow do 9,0 možno získať pomocou rovnice Bintena a spol. (2). Medzi parametre, ktoré charakterizujú biokoncentračný potenciál, patria vychytávacia konštanta/konštanta rýchlosti vychytávania (k1), konštanta rýchlosti depurácie/vylučovania (k2) a BCFss. Analyzovanie vzoriek vody i rýb uľahčuje použitie rádioaktívne označených látok, na základe ktorých sa dá overiť, či treba uskutočniť identifikáciu a kvantifikáciu degradačných produktov. Pri meraní celkových rádioaktívnych zvyškov (napríklad spaľovaním alebo solubilizáciou tkanív) je BCF založené na materskej látke, všetkých jej metabolitoch zadržaných v organizme a tiež na asimilovanom uhlíku. Hodnoty BCF, ktoré sú založené na celkovom množstve rádioaktívnych zvyškov, preto nemožno priamo porovnávať s hodnotami BCF získanými pomocou špecifickej chemickej analýzy iba materskej látky. Na stanovenie BCF založeného iba na materskej látke možno v štúdiách s rádioaktívne označenými látkami použiť čistiace postupy a v prípade potreby možno stanovovať najvýznamnejšie metabolity. Je tiež možná kombinácia rybej metabolickej štúdie a biokoncentračnej štúdie, pri ktorej sa analyzujú a identifikujú metabolity v tkanivách. 1.2. Definície a jednotky Biokoncentrácia/bioakumulácia je zvyšovanie koncentrácie testovanej látky v alebo na organizme (jeho určenom tkanive) vzhľadom na jej koncentráciu v okolitom prostredí. Biokoncentračný faktor (BCF alebo KB) v ktoromkoľvek čase počas vychytávacej fázy tohto akumulačného testu predstavuje koncentráciu testovanej látky v/na rybe alebo jej určenom tkanive [Cf ako μg/g (ppm)], vydelenú koncentráciou tejto látky v okolitom prostredí [Cw ako μl/ml (ppm)]. Rovnovážny biokoncentračný faktor (BCFss alebo KB) sa počas dlhého časového obdobia významne nemení, koncentrácia testovanej látky v okolitom prostredí je počas tohto obdobia stála. Plató alebo rovnovážny stav nastáva pri grafickom znázornení závislosti obsahu testovanej látky v rybe (Cf) od času vtedy, keď sa priebeh krivky stáva paralelný s časovou osou a tri po sebe idúce analýzy Cf, uskutočnené na vzorkách odobratých minimálne v dvojdňových intervaloch, sa od seba neodlišujú o viac ako ± 20 % a ak počas týchto troch odberov vzoriek nedochádza k žiadnym významným zmenám. Pri analyzovaní spájaných vzoriek je potrebné vykonať najmenej štyri bezprostredne za sebou idúce analýzy. Pri pomaly sa vychytávajúcich látkach je primeranejší interval sedem dní. Biokoncentračné faktory vypočítané priamo z kinetických konštánt (k1/k2) sa nazývajú kinetický koncentračný faktor (BCFk). Rozdeľovací koeficient oktanol-voda (Pow) je pomer rozpustnosti chemickej zlúčeniny v n-oktanole a vo vode pri rovnovážnych podmienkach (metóda A.8), tiež označovaný ako Kow. Dekadický logaritmus veličiny Pow sa používa na vyjadrenie potenciálu chemickej látky na biokoncentráciu vo vodných živočíchoch. Expozičná alebo vychytávaciafáza je čas, počas ktorého sú ryby vystavené testovanej chemickej látke. Rýchlostná konštanta vychytávania (k1) je číselná hodnota, ktorá definuje rýchlosť zvyšovania koncentrácie testovanej látky v/na testovaných rybách (alebo ich určenom tkanive), keď sú ryby vystavené jej prítomnosti (k1 sa vyjadruje ako deň–1). Poexpozičná alebo depuračná (vylučovacia) fáza je čas, ktorý nasleduje po premiestnení testovaných rýb z prostredia obsahujúceho testovanú látku do média, v ktorom táto látka nie je prítomná a počas ktorého sa skúma depurácia (alebo čisté vylučovanie) látky z testovacích rýb (alebo z ich určených tkanív). Rýchlostná konštanta depurácie (vylučovania) (k2) je číselná hodnota definujúca rýchlosť znižovania koncentrácie testovanej látky v testovacích rybách (alebo ich určených tkanivách) po premiestnení testovacích rýb z média obsahujúceho testovanú látku do média, ktoré túto látku neobsahuje (k2 sa vyjadruje ako deň–1). 1.3. Princíp testovacej metódy Test pozostáva z dvoch fáz, t. j. z expozičnej (vychytávacej) a poexpozičnej (depuračnej) fázy. Počas vychytávacej fázy sa dve oddelené skupiny jedného druhu rýb vystavujú najmenej dvom koncentráciám testovanej látky. Potom sa premiestnia do prostredia, ktoré testovanú látku neobsahuje, a začne prebiehať depuračná fáza. Okrem prípadov, v ktorých dochádza počas vychytávacej fázy iba k nevýznamnému vychytávaniu testovanej látky (t. j. hodnota BCF je nižšia ako 10), je depuračná fáza vždy potrebná. Počas oboch fáz testu sa sleduje koncentrácia testovanej látky v/na rybách (alebo ich určených tkanivách). Okrem dvoch testovaných koncentrácií sa kontrolná skupina rýb vystavuje prostrediu s úplne identickými podmienkami, ktoré však neobsahuje testovanú látku. Účelom tejto skupiny je vztiahnutie možných nepriaznivých účinkov pozorovaných počas biokoncentračného testu na príslušné kontroly a získanie koncentrácie testovanej látky v pozadí. S výnimkou prípadov, v ktorých sa preukáže dosiahnutie rovnovážneho stavu skôr, trvá vychytávacia fáza 28 dní. Predpovedanie dĺžky vychytávacej fázy potrebnej na dosiahnutie rovnovážneho stavu možno uskutočniť na základe rovnice, ktorá je uvedená v prílohe 3. Depuračná fáza sa začne premiestnením rýb do čistej nádrže s úplne rovnakým prostredím, ktoré však neobsahuje testovanú látku. Vždy keď je to možné, sa biokoncentračný faktor prednostne vypočíta ako pomer (BCFss) koncentrácie testovanej látky v rybách (Cf) a vo vode (Cw) pri zjavnom rovnovážnom stave a tiež ako kinetický biokoncentračný faktor (BCFk), ako pomer rýchlostných konštánt vychytávania (k1) a depurácie (k2) za predpokladu, že proces sa riadi kinetikou prvého poriadku. V prípadoch, v ktorých sa proces zjavne neriadi kinetikou prvého poriadku, treba použiť komplexnejšie modely (príloha 5). Ak sa rovnovážny stav nedosiahne do 28 dní, potom je potrebné pokračovať vo vychytávacej fáze až do jeho dosiahnutia alebo počas 60 dní podľa toho, čo nastane prv. Potom sa začína depuračná fáza. Na základe modelu, ktorý najlepšie opisuje namerané koncentrácie testovanej látky v rybách a vo vode, sa vypočíta rýchlostná konštanta vychytávania, rýchlostná koncentrácia depurácie (vylučovania) (alebo rýchlostné konštanty v prípade komplexnejších modelov), biokoncentračný faktor a tam, kde je to možné, aj intervaly spoľahlivosti každého z týchto parametrov. BCF sa vyjadruje ako funkcia celkovej vlhkej hmotnosti rýb. Z osobitných dôvodov sa však môžu v prípadoch dostatočnej veľkosti rýb niekedy použiť určené tkanivá alebo orgány (napríklad sval, pečeň), alebo sa môžu ryby rozdeliť na jedlé (rezy/filety) alebo nejedlé časti (vnútornosti). Pretože pri mnohých organických látkach sa pozoruje jasná súvislosť medzi ich biokoncentračným potenciálom a lipofilitou, existuje tiež príslušná súvislosť medzi obsahom tuku v testovaných rybách a pozorovanou biokoncentráciou týchto látok. V záujme znižovania takéhoto zdroja variability výsledkov testovania by sa pri veľmi lipofilných látkach (t. j. ak je ich log Pow > 3) mala biokoncentrácia vyjadrovať okrem celkovej telesnej hmotnosti rýb aj na obsah tuku. Ak je to možné, obsah tuku by sa mal stanovovať v rovnakom biologickom materiáli, ktorý sa použil na stanovenie koncentrácie testovanej látky. 1.4. Informácie o testovanej látke Pred uskutočnením testu na zisťovanie biokoncentrácie treba mať k dispozícii tieto informácie o testovanej látke: a) rozpustnosť vo vode; b) rozdeľovací koeficient oktanol-voda Pow (označovaný aj ako Kow, stanovený pomocou metódy HPLC uvedenej v A.8); c) hydrolýzu; d) fototransformáciu vo vode, stanovenú pri slnečnom alebo simulovanom slnečnom svetle a pri takých svetelných podmienkach, pri akých sa bude uskutočňovať test na stanovenie biokoncentrácie (3); e) povrchové napätie (t. j. pri látkach, pri ktorých nemožno stanoviť log Pow); f) tlak nasýtených pár; g) okamžitú biodegradáciu (ak je to potrebné). Medzi ďalšie požadované informácie patrí toxicita pre druh rýb použitý v teste, podľa možnosti vyjadrená ako asymptotická LC50 (t. j. nezávislá od času). Na kvantifikáciu testovanej látky v testovaných roztokoch a v biologickom materiáli musí byť k dispozícii primeraná analytická metóda so známou presnosťou a spoľahlivosťou. Musia byť známe aj údaje o príprave a skladovaní vzorky. Treba tiež poznať analytický prah detekcie testovanej látky vo vode a v rybích tkanivách. Pri používaní testovaných látok označených uhlíkom 14C treba poznať aj percentuálne zastúpenie rádioaktivity spojenej s nečistotami/prímesami. 1.5. Platnosť testu Aby bol test platný, musia byť dodržané tieto podmienky: - výkyvy teploty menšie ako ± 2 °C, - koncentrácia rozpusteného kyslíka nesmie klesnúť pod 60 % saturácie, - koncentrácia testovanej látky v komorách sa musí udržiavať v rozmedzí ± 20 % priemeru hodnôt nameraných počas vychytávacej fázy, - úhyn alebo iné nepriaznivé vplyvy/choroby sú na konci testu u testovaných aj kontrolných rýb nižšie ako 10 %; pri trvaní testu počas niekoľkých týždňov alebo mesiacov musí byť úhyn alebo iné nepriaznivé javy nižší ako 5 % za týždeň a celkovo nesmie presiahnuť 30 %. 1.6. Referenčné zlúčeniny V prípade potreby možno experimentálne postupy overiť pomocou referenčných zlúčenín so známym biokoncentračným potenciálom. Nemožno však zatiaľ odporúčať žiadne konkrétne látky. 1.7. Opis testovacej metódy 1.7.1. Prístrojové vybavenie Pri všetkých súčastiach zariadení sa treba vyhýbať používaniu materiálov, ktoré sa môžu rozpúšťať, absorbovať a vylúhovávať a ktoré môžu mať na ryby nepriaznivé účinky. Možno používať bežné nádrže pravouhlého alebo valcovitého tvaru z vhodného materiálu a takej veľkosti, ktorá zodpovedá veľkosti násady rýb. Pokiaľ možno, treba sa vyhýbať používaniu hadičiek a rúrok z mäkkých plastických látok. Prednostne treba používať hadičky, rúrky vyrobené z teflónu (R), nehrdzavejúcej ocele alebo skla. Zo skúseností vyplýva, že pri látkach s vysokým absorpčným koeficientom (napríklad pri syntetických pyretroidoch) môže byť potrebné používať posilanizované sklo. V takýchto prípadoch je potrebné zariadenia po skončení pokusu zlikvidovať. 1.7.2. Voda Pri testoch sa vo všeobecnosti používa prírodná voda, ktorá musí byť získavaná z nekontaminovaných zdrojov s jednotnou kvalitou. Riediaca voda musí mať takú kvalitu, aby umožnila prežívanie zvoleného druhu rýb počas celého obdobia aklimatizácie a testovania bez toho, aby sa pri nich prejavil nezvyčajný vzhľad alebo správanie. V ideálnom prípade treba preukázať, že testovaný druh dokáže vo vode používanej na riedenie prežívať, rásť a rozmnožovať sa (napríklad pomocou testu v laboratórnej kultúre alebo testu toxicity pre životný cyklus). Vodu treba charakterizovať najmenej z hľadiska pH, tvrdosti, celkového obsahu tuhých látok a organicky viazaného uhlíka a pokiaľ možno tiež obsahu amoniaku, dusitanov a alkalitov a pri morských druhoch aj z hľadiska slanosti. Hoci sú parametre, ktoré sú potrebné na zaručenie optimálneho blahobytu rýb, dobre známe, v prílohe 1 sú uvedené odporúčané maximálne koncentrácie celého radu parametrov charakterizujúcich sladkú aj morskú vodu. Voda musí mať počas celého trvania testu stálu kvalitu. Hodnota pH by sa mala pohybovať v rozmedzí 6,0 až 8,5, no počas daného testu by nemala kolísať o viac ako ± 0, 5 jednotiek pH. Aby voda neovplyvňovala neprimeraným spôsobom výsledky testovania (napríklad vznikaním komplexov testovanej látky) alebo aby nemal nepriaznivý vplyv na násadu testovacích rýb, je potrebné zabezpečiť v pravidelných intervaloch odber vzoriek na analýzu. Ak je známe, že voda má relatívne stálu kvalitu, stačí, ak sa v nej bude napríklad raz za každé tri mesiace stanovovať obsah ťažkých kovov (napríklad Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), hlavných aniónov a katiónov (napríklad Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), pesticídov (napríklad celkové organofosforečné a organochloridové pesticídy), celkového organicky viazaného uhlíka a rozsuspendovaných tuhých častíc. Ak si voda preukázateľne zachováva stálu kvalitu počas najmenej jedného roka, potom možno vykonávať tieto stanovenia menej často (napríklad každých šesť mesiacov). Obsah prirodzených tuhých častíc aj celkového organicky viazaného uhlíka by mal byť v riediacej vode čo možno najnižší, aby sa zabránilo absorpcii testovanej látky na organickú hmotu, v dôsledku čoho by sa mohla znížiť jej biologická dostupnosť (4). Maximálny prípustný obsah tuhých častíc je 5 mg/l (suchá hmotnosť, neprechádzajúca cez 0,45 μm filter) a celkového organicky viazaného uhlíka 2 mg/l (pozri prílohu 1). V prípade potreby treba vodu pred použitím filtrovať. Príspevok testovacích rýb (exkrementy) a zvyškov krmiva k obsahu organicky viazaného uhlíka vo vode by mal byť čo možno najnižší. Koncentrácia organicky viazaného uhlíka v testovacej nádrži by nemala počas celého trvania testu prekročiť koncentráciu organicky viazaného uhlíka, pochádzajúcu z testovanej látky, prípadne použitého solubilizačného činidla, o viac ako 10 mg/l (± 20 %). 1.7.3 Testovacie roztoky Pripraví sa zásobný roztok testovanej látky s vhodnou koncentráciou. Zásobný roztok treba podľa možnosti pripraviť jednoduchým zmiešaním alebo trepaním testovanej látky v rozpúšťacej vode. Použitie rozpúšťadiel alebo disperzných činidiel (rozpúšťajúcich činidiel) sa neodporúča, hoci v niektorých prípadoch to môže byť v záujme prípravy zásobného roztoku s vhodnou koncentráciou potrebné. Medzi rozpúšťadlá, ktoré možno použiť, patrí etanol, metanol, etylénglykol, momometyléter, etylénglykoldimetyléter, dimetylformamid a trietylénglykol. Ako disperzné činidlá možno použiť Cremophor RH 40, Tween 80, 0,01 % metylcelulózu a HCO-40. Činidlá, ktoré ľahko podliehajú biodegradácii, treba používaťs opatrnosťou, pretože môžu v prietokových testoch spôsobovať problémy s rastom baktérií. Testovanú látku možno označiť rádioaktívnym izotopom a musí mať najvyššiu možnú čistotu (napríklad podľa možnosti > 98 %). Pri prietočných testoch je potrebný systém pre nepretržitý prívod a zrieďovanie zásobného roztoku testovanej látky (napríklad dávkovacie čerpadlo, úmerný dávkovač, saturátorový systém), ktorým sa zabezpečuje jej prívod do testovacích komôr. Objem každej testovacej komory by sa mal denne vymeniť aspoň päťkrát. Treba uprednostniť prietočný systém, hoci tam, kde to nie je možné (malo by to napríklad nepriaznivý vplyv na testovací organizmus) sa môžu pod podmienkou splnenia kritérií validity použiť aj poloprietočné usporiadania. Prietokovú rýchlosť zásobného roztoku aj zrieďovacej vody je potrebné skontrolovať 48 hodín pred začatím pokusu a potom najmenej raz denne počas celého jeho trvania. Treba pri tom kontrolovať aj rýchlosť prietoku cez každú testovaciu komoru a zabezpečiť, aby výkyvy prietoku v rámci komôr i medzi nimi nepresahovali 20 %. 1.7.4. Voľba biologických druhov Pri voľbe biologických druhov sa treba riadiť týmito kritériami: musia byť ľahko dostupné, možno ich získať vo výhodnej veľkosti a možno ich uspokojivo udržiavať v laboratóriu. Ako ďalšie kritériá pri voľbe vhodných druhov rýb treba brať do úvahy ich rekreačný, komerčný a ekologický význam, ako aj ich pomernú citlivosť, úspešnosť použitia v minulosti a podobne. Odporúčané testovacie druhy sú uvedené v prílohe 2. Možno použiť aj iné druhy, postup testovania však treba upraviť tak, aby sa dosiahli vhodné testovacie podmienky. Použitie daného druhu a pokusnej metódy treba v takomto prípade odôvodniť. 1.7.5. Uchovávanie rýb Aklimatizujte zásobnú populáciu rýb najmenej dva týždne vo vode a pri testovacej teplote. Počas celej aklimatizácie ich kŕmte dostatočným množstvom stravy, ktorá sa bude používať aj počas pokusu. Po 48-hodinovej privykacej-adaptačnej fáze sa zaznamená úhyn a uplatnia sa tieto selekčné kritériá: - úhyn za sedem dní prevyšuje 10 % celej populácie: celá násada sa vyradí, - úhyn za sedem dní je medzi 5 a 10 % populácie: aklimatizovať ďalších sedem dní, - úhyn za sedem dní je nižší ako 5 % populácie: násadu možno použiť; ak je úhyn počas ďalších siedmich dní vyšší ako 5 %, celá násada sa vyradí. Treba zabezpečiť, aby boli použité testovacie ryby bez zjavných chorôb a abnormalít. Všetky choré ryby treba z pokusu vyradiť. Dva týždne pred testom ani počas jeho trvania nesmú byť ryby ošetrované proti ochoreniam. 1.8. Priebeh testu 1.8.1. Predbežná skúška V záujme optimalizácie podmienok hlavného testovania môže byť užitočné vykonať predbežný pokus zameraný napríklad na voľbu koncentrácie/koncentrácií testovanej látky a trvanie vychytávacej a depuračnej fázy. 1.8.2. Podmienky vystavenia testovanej látke 1.8.2.1. Trvanie vychytávacej fázy Trvanie vychytávacej fázy možno predpovedať na základe praktických skúseností (napríklad na základe predchádzajúcej štúdie alebo znalosti o akumulácii príbuznej látky) alebo na základe istých empirických vzťahov vychádzajúcich buď z rozpustnosti danej látky vo vode, alebo z jej rozdeľovacieho koeficientu v systéme oktanol/voda (pozri prílohu 3). Okrem prípadov, v ktorých nastane rovnovážny stav preukázateľne skôr, by mala vychytávacia fáza trvať 28 dní. Ak sa rovnovážny stav do 28 dní nedosiahne, potom treba vychytávaciu fázu a analyzovanie vzoriek predĺžiť buď do jeho dosiahnutia, alebo na 60 dní, podľa toho, čo nastane skôr. 1.8.2.2. Trvanie depuračnej fázy Na dosiahnutie dostatočného odstránenia (napríklad 95 %) testovanej látky z tela zvyčajne stačí polovičný čas trvania vychytávacej fázy (tento odhad je vysvetlený v prílohe 3). Ak je čas potrebný na 95 % odstránenie testovanej látky z praktického hľadiska pridlhý a je napríklad dva razy dlhší ako trvanie vychytávacej fázy (t. j. viac ako 56 dní), potom možno použiť kratšie obdobie (napríklad kým koncentrácia testovanej látky nebude nižšia ako 10 % rovnovážnej koncentrácie). V prípade látok, ktorých vychytávanie a depurácia sa riadia zložitejším priebehom ako pri jednokomorovom rybom modeli s kinetikou prvého poriadku, treba použiť na stanovenie rýchlostnej konštanty depurácie dlhšie obdobie. Podmienkou však je, aby bola koncentrácia testovanej látky počas takéhoto predĺženého obdobia vždy vyššia, ako je prah analytickej detekcie. 1.8.2.3. Počty testovacích rýb Počet testovacích rýb na testovanú koncentráciu voľte tak, aby boli pri každom odbere vzoriek k dispozícii najmenej štyri kusy na jedno meranie. V prípade potreby vyššej štatistickej sily treba na jednu vzorku viac rýb. V prípade použitia dospelých rýb zaznamenajte, či sa pokus vykonáva na samčekoch, alebo samičkách, alebo na oboch pohlaviach. Pri používaní oboch pohlaví treba ešte pred začatím testovania zdokumentovať, že rozdiel v obsahu tuku medzi nimi nie je významný. Môže byť potrebné spájanie všetkých samčekov i samičiek. Pri každom odbere vzoriek treba vyberať ryby podobnej veľkosti, tak aby najmenšie z nich neboli menšie ako dve tretiny hmotnosti najväčších. Všetky musia byť z rovnakého roka a musia pochádzať z toho istého zdroja. Vek a hmotnosť majú podľa všetkého niekedy na hodnoty BCF významný vplyv (1), a preto je potrebné tieto údaje presne zaznamenávať. Odporúča sa, aby sa priemerná hmotnosť rýb zistila pomocou odváženia subpopulácie rýb ešte pred uskutočnením testovania. 1.8.2.4. Veľkosť násady Používa sa vysoký pomer vody k rybám, aby sa minimalizovalo znižovanie Cw spôsobené pridaním rýb na začiatku pokusu a aby sa zabránilo znižovaniu koncentrácie rozpusteného kyslíka. Je dôležité, aby veľkosť násady zodpovedala použitému druhu rýb. V každom prípade sa však odporúča zvyčajná veľkosť násady v rozmedzí 0,1 do 1,0 g rýb (vlhká hmotnosť) na liter vody a deň. Možno použiť aj vyššie násady, treba však zabezpečiť udržiavanie požadovanej koncentrácie testovanej látky v rozmedzí povolených výkyvov ± 20 % a koncentrácia rozpusteného kyslíka nesmie klesnúť pod 60 % saturácie. Pri voľbe primeraných režimov nasadzovania treba brať do úvahy bežné prirodzené prostredie daného druhu. Napríklad ryby žijúce pri dne si môžu vyžadovať väčšiu plochu dna nádrže pri rovnakom objeme vody ako druhy žijúce pri hladine. 1.8.2.5. Kŕmenie Počas aklimatizačnej aj testovacej fázy sa ryby kŕmia primeranou stravou so známym obsahom tukov a celkových bielkovín v množstve dostatočnom na udržiavanie rýb v dobrom zdravotnom stave a na priberanie telesnej hmotnosti. Počas aklimatizačnej aj testovacej fázy sa ryby kŕmia denne množstvom, ktoré zodpovedá približne 1 až 2 % telesnej hmotnosti. Takýto režim kŕmenia zabezpečí počas celého testu relatívne stálu koncentráciu lipidov. Množstvo krmiva treba pravidelne prepočítavať, napríklad raz týždenne, aby sa zabezpečila jednotná telesná hmotnosť aj obsah tukov. Na účely takéhoto výpočtu možno hmotnosť rýb nachádzajúcich sa v testovacej komore odhadnúť na základe hmotnosti rýb odobratých z danej komory pri poslednom odbere vzoriek. Ryby, ktoré zostávajú v pokusnej komore, sa nesmú vážiť. Neskonzumované krmivo aj výkaly sa z testovacej komory denne odsávajú, a to krátko po skončení kŕmenia (do pol až jednej hodiny). Testovacie komory treba počas celého testovacieho obdobia udržiavať v čo možno najčistejšom stave, aby sa na čo možno najnižšiu úroveň znižovala aj koncentrácia organickej hmoty. Prítomnosť organicky viazaného uhlíka totiž môže obmedzovať biologickú dostupnosť testovanej látky (1). Mnohé krmivá obsahujú rybaciu múčku, krmivo je preto potrebné analyzovať na prítomnosť testovanej látky. Je žiaduce, aby sa v krmive stanovoval aj obsah pesticídov a ťažkých kovov. 1.8.2.6. Svetlo a teplota Dĺžka fotoperiódy je zvyčajne 12 až 16 hodín a teplota (± 2 °C) by mala byť primeraná druhu testovacích rýb (príloha 2). Musí byť známy typ osvetlenia a jeho charakteristiky. Treba zachovávať opatrnosť z hľadiska možnosti fototransformácie testovanej látky pod vplyvom svetelných podmienok štúdie. Treba udržiavať primerané osvetlenie, aby sa ryby nevystavovali účinkom neprirodzených fotoproduktov. V niektorých prípadoch môže byť potrebné používať filtre na elimináciu ultrafialového žiarenia s vlnovou dĺžkou nižšou ako 290 nm. 1.8.2.7. Testované koncentrácie Ryby sa v prietočných podmienkach vystavujú najmenej dvom koncentráciám testovanej látky vo vode. Vyššia (alebo najvyššia) koncentrácia testovanej látky sa zvyčajne volí tak, aby predstavovala približne 1 % jej akútnej asymptotickej LC50 a aby bola najmenej desať ráz vyššia ako jej prah detegovateľnosti pomocou používanej analytickej metódy. Najvyššiu testovanú koncentráciu tiež možno stanoviť vydelením hodnoty akútnej 96-hodinovej LC50 príslušným pomerom akútnej/chronickej koncentrácie (príslušné pomery sa môžu pri niektorých chemikáliách pohybovať od 3 to 100). Ak je to možné, druhú (prípadne ďalšie) z testovaných koncentrácií treba voliť tak, aby sa od prvej odlišovala/odlišovali o faktor 10. Ak to z dôvodu kritéria 1 % hodnoty LC50 alebo analytického prahu nie je možné, potom možno použiť faktor nižší ako 10 alebo treba uvažovať o označení testovanej látky izotopom 14C. Nesmú sa používať koncentrácie, ktoré sú vyššie ako rozpustnosť testovanej látky. V prípade použitia solubilizačného činidla nesmie byť jeho koncentrácia vyššia ako 0,1 ml/l a malo by byť rovnaké pre všetky pokusné nádrže. Musí byť známe, akým spôsobom prispievajú spoločne s testovanou látkou k celkovému obsahu organicky viazaného uhlíka v testovanej vode. V každom prípade treba urobiť všetko pre to, aby sa tieto látky nemuseli vôbec používať. 1.8.2.8. Kontroly Okrem pokusných skupín je potrebné mať aj kontrolnú skupinu udržiavanú iba v riediacej vode a v príslušných prípadoch aj kontrolnú skupinu udržiavanú v riediacej vode s prídavkom iba solubilizačného činidla. Podmienkou je, aby solubilizačné činidlo nemalo na ryby žiadny účinok. Ak takýto účinok má, potom je potrebné zaradiť do pokusu obidve kontrolné skupiny. 1.8.3. Frekvencia merania kvality vody Počas testu treba vo všetkých nádržiach sledovať obsah rozpusteného kyslíka, TOC, pH a teplotu. Pri kontrolnej skupine a v jednej nádrži s vyššou (najvyššou) koncentráciou treba merať celkovú tvrdosť, a ak to prichádza do úvahy, aj slanosť vody. Množstvo rozpusteného kyslíka, a ak to prichádza do úvahy, aj slanosť je počas vychytávacej fázy potrebné merať minimálne tri razy, t. j. na jej začiatku, približne v strede a na konci. Počas depuračnej fázy treba tieto hodnoty merať raz týždenne. TOC sa musí merať na začiatku testu (24 a 48 hodín pred začatím vychytávacej fázy) pred pridaním rýb a potom najmenej raz týždenne počas vychytávacej aj depuračnej fázy. Teplotu treba merať denne, pH na začiatku a konci každého obdobia a tvrdosť raz počas každého testu. Aspoň v jednej nádrži by sa malo zabezpečiť kontinuálne meranie teploty. 1.8.4. Odber a analyzovanie vzoriek rýb a vody 1.8.4.1. Harmonogram odoberania vzoriek rýb a vody Voda na stanovenie koncentrácie testovanej látky sa z testovacích nádrží odoberá pred pridaním rýb a počas vychytávacej i depuračnej fázy. Vzorky vody sa ako minimum odoberajú v rovnakom čase ako ryby a tiež pred kŕmením. Počas vychytávacej fázy sa merajú koncentrácie testovanej látky, aby sa overovalo spĺňanie kritéria platnosti. Vzorky rýb sa odoberajú najmenej päť ráz počas vychytávacej a najmenej štyri razy počas depuračnej fázy. Dostatočne presné hodnoty BCF sa niekedy pri takomto počte vzoriek vypočítavajú veľmi ťažko, najmä ak sa depurácia zjavne riadi inou ako jednoduchou kinetikou prvého poriadku. V takýchto prípadoch je žiaduce robiť odber počas oboch fáz častejšie (pozri prílohu 4). Navyše odobraté vzorky sa uskladňujú a analyzujú iba vtedy, ak sa výsledky prvého kola analýz ukážu byť pre výpočet BCF s požadovanou presnosťou nedostatočné. Príklad prijateľného harmonogramu odberu vzoriek je uvedený v prílohe 4. Jednoducho možno vypočítať aj iné harmonogramy, použijúc pri tom iné predpokladané hodnoty Pow potrebné na výpočet dĺžky vystavenia, ktorá je potrebná na dosiahnutie 95 % vychytávania. Počas vychytávacej fázy pokračujú odbery až po dosiahnutie rovnovážneho stavu alebo počas 28 dní, podľa toho, čo nastane skôr. Ak sa rovnovážny stav do 28 dní nedosiahne, odbery pokračujú až do jeho dosiahnutia alebo počas 60 dní, podľa toho, čo nastane skôr. Pred začatím depuračnej fázy sa ryby premiestnia do čistej nádrže. 1.8.4.2. Odber a príprava vzoriek Vzorky vody sa na analyzovanie odoberajú napríklad odsávaním pomocou inertnej hadičky zo stredu testovacej nádrže. Oddelenie frakcií testovanej látky dostupných pre biodegradáciu od frakcií pre biodegradáciu nedostupných často nemožno uskutočniť ani filtráciou, ani centrifugáciou (najmä v prípade superlipofilných chemikálií s hodnotou log Pow > 5 (1) (5), takže podrobovať vzorky týmto postupom nemusí byť potrebné. Namiesto toho treba vykonávať také opatrenia, ktoré zabezpečia čo možno najlepšiu čistotu nádrží, a počas vychytávacej aj depuračnej fázy treba sledovať obsah celkového organicky viazaného uhlíka. Pri každom odbere vzoriek sa z testovacích nádrží odoberie primeraný počet rýb (zvyčajne minimálne štyri). Odobraté ryby sa rýchle opláchnu, osušia pomocou absorpčného materiálu a pomocou najprimeranejšej a najhumánnejšej metódy ihneď usmrtia a odvážia. Voda aj ryby by sa mali analyzovať podľa možnosti ihneď po odbere, čím sa predíde degradácii alebo iným stratám. Priebežne počas vykonávania testu treba vypočítavať približné rýchlosti vychytávania a depurácie. Okamžitým vykonávaním analýz predídeme aj oddialeniu identifikácie dosiahnutia rovnovážneho stavu. Pri oddialení analýz treba vzorky primeraným spôsobom uskladniť. Pred začatím štúdie sa treba oboznámiť so správnym spôsobom skladovania danej testovanej látky — napríklad zamrazením, skladovaním pri 4 °C, extrahovaním atď. 1.8.4.3. Kvalita analytických metód Celý postup v zásade závisí od presnosti a citlivosti analytických metód používaných pri testovanej látke. Treba preto experimentálne overiť, či sú presnosť a reprodukovateľnosť chemických analýz, ako aj úroveň opätovného získania testovanej látky z vody aj z rýb pre danú metódu uspokojivé. Treba tiež overiť, či nie je testovaná látka v detegovateľných množstvách prítomná v riediacej vode. V prípade potreby sa hodnoty Cw a Cf získané z testu upravia podľa úrovne opätovného získania testovanej látky a hodnôt pozadia zistených pri kontrolách. So vzorkami rýb aj vody je potrebné počas celého testovania zaobchádzať tak, aby sa minimalizovala koncentrácia a straty (vznikajúce napríklad v dôsledku absorpcie na odoberacie zariadenie). 1.8.4.4. Analyzovanie rybích vzoriek V prípade použitia rádioaktívne označeného materiálu možno stanovovať celé množstvo označenej látky (t. j. materskú zlúčeninu aj jej metabolity) alebo možno vzorky prečistiť a stanovovať materskú látku osobitne. V rovnovážnom stave alebo na konci vychytávacej fázy, podľa toho, čo nastane skôr, možno charakterizovať aj hlavné metabolity. V prípadoch, v ktorých je hodnota BCF vyjadreného celkovým množstvom rádioaktívnych zvyškov ≥ 1000 %, môže byť žiaduce a pre niektoré kategórie chemických látok, ako sú pesticídy, sa to dôrazne odporúča, aby sa identifikovali a kvantifikovali tie degradačné produkty testovanej látky, ktoré v rybích tkanivách predstavujú v rovnovážnom stave ≥ 10 % celkového množstva zvyškov. Po identifikácii a kvantifikácii degradačných produktov, ktoré predstavujú v rybích tkanivách ≥ 10 % celkového množstva rádioaktívnych zvyškov, sa tiež odporúča identifikácia a kvantifikácia takýchto degradačných produktov aj v testovanej vode. Koncentráciu testovanej látky je zvyčajne potrebné stanoviť v každej jednej odváženej rybe. Ak to nie je možné, potom možno vzorky odobraté pri rovnakom odbere spájať, hoci spájaním sa obmedzujú štatistické metódy, ktoré možno použiť pri spracúvaní výsledkov. Ak má niektorá štatistická metóda a stupeň štatistickej významnosti osobitnú dôležitosť, potom je potrebné použiť v teste taký počet rýb, ktorý umožní uskutočniť požadovaný spôsob spájania vzoriek (6) (7). BCF je potrebné vyjadriť ako funkciu celkovej vlhkej hmotnosti a v prípade vysoko lipofilných látok aj ako funkciu obsahu tuku. Ak je to možné, obsah tuku treba stanoviť pri každom odbere vzoriek. Obsah tuku treba stanoviť pomocou vhodnej metódy (literárne odkazy 8 a 2 v prílohe 3). Ako štandardnú metódu možno odporúčať extrakciu zmesou chloroformu a metanolu (9). Jednotlivé metódy neposkytujú rovnaké výsledky (10), pri každej z nich je preto dôležité uviesť podrobné údaje. Ak je to možné, obsah tuku treba stanovovať v rovnakom extrakte, ktorý sa pripravil na analyzovanie testovanej látky, pretože tuky býva často potrebné pred chromatografickým krokom zo vzorky odstrániť. Obsah tukov v rybách (ako mg/kg vlhkej hmotnosti) na konci pokusu by sa nemal líšiť od obsahu tukov na jeho začiatku o viac ako ± 25 %. Treba zaznamenať aj percentuálny obsah sušiny v tkanivách, aby bolo možné vyjadriť obsah tuku aj na suchú hmotnosť. 2. ÚDAJE 2.1. Spracovanie výsledkov Vychytávacia krivka testovanej látky sa získa grafickým vynášaním koncentrácie v/na rybách (alebo určenom tkanive) počas vychytávacej fázy proti času na aritmetických osiach. Ak krivka dosiahne plató, t. j. ak sa stane približne asymptotická k časovej osi, potom možno rovnovážnu hodnotu BCFss vypočítať zo vzťahu: C rovnovážne C rovnovážne priemer Ak sa rovnovážny stav nedosiahne, potom sa môže dať BCFss vypočítať s presnosťou dostatočnou na vyhodnotenie rizika na základe "rovnovážneho stavu" pri 80 % (1,6/k2) alebo 95 % (3,0/k2) rovnováhe. Stanovuje sa aj koncentračný faktor (BCFk), ktorý je vyjadrený ako pomer dvoch kinetických konštánt prvého poriadku, t. j. k1/k2. Rýchlostná konštanta depurácie (k2) sa zvyčajne stanovuje z depuračnej krivky (t. j. z grafického znázornenia znižovania koncentrácie testovanej látky v rybách v závislosti od času). Z hodnoty k2 a na základe Cf, ktorá je odvodená z vychytávacej krivky, sa potom vypočíta rýchlostná konštanta vychytávania (k1). Prednostným spôsobom stanovovania BCFk a oboch rýchlostných konštánt k1 a k2 sú nelineárne metódy odhadovania parametrov pomocou počítača (11). Na výpočet k1 a k2 možno okrem toho použiť grafické metódy. V prípade zjavnej nelineárnosti depuračnej krivky (t. j. ak sa depurácia neriadi kinetikou prvého poriadku) treba použiť komplexnejšie modely (pozri literárne odkazy v prílohe 3) a poradiť sa s bioštatistikom. 2.2. Interpretácia výsledkov V prípadoch, v ktorých sa koncentrácie testovaných roztokov pohybujú na úrovni blízkej prahu detegovateľnosti analytickej metódy, treba interpretovať výsledky s veľkou opatrnosťou. Jasne vymedzené krivky vychytávania a odbúravania sú príznakom dobrej kvality údajov o biokoncentrácii. Rozdiely vychytávacích/depuračných konštánt medzi dvoma testovanými koncentráciami musia byť menšie ako 20 %. Významné rozdiely v rýchlosti vychytávania a depurácie medzi dvoma testovacími koncentráciami treba zaznamenať a treba sa pokúsiť sa o ich možné vysvetlenie. Medza spoľahlivosti hodnôt BCF sa pri dobre zostavených štúdiách zvyčajne približuje k hodnote ± 20 %. 3. PRÍPRAVA TESTOVACEJ SPRÁVY Správa z testu musí obsahovať tieto informácie: 3.1. Testovaná látka - fyzikálna povaha a v primeraných prípadoch fyzikálno-chemické vlastnosti, - identifikačné chemické údaje (vrátane obsahu organicky viazaného uhlíka, ak to prichádza do úvahy) - v prípade rádioaktívneho označenia presná poloha označeného atómu/označených atómov a percento rádioaktivity viazanej na nečistoty/prímesi. 3.2. Testovací biologický druh - vedecký názov, kmeň, pôvod, všetky zásahy uskutočnené pred pokusom, aklimatizácia, vek, rozsah hmotností atď. 3.3. Testovacie podmienky - typ pokusu (napríklad prietočný alebo poloprietočný systém), - typ a charakteristiky osvetlenia a dĺžka svetlej fázy/svetlých fáz, - zostava pokusu (napríklad počet a veľkosť testovacích komôr, rýchlosť výmeny celého objemu vody, počet replikátov, počet rýb v replikáte, počet testovaných koncentrácií, dĺžka vychytávacej a depuračnej fázy, frekvencia odoberania vzoriek rýb a vody), - metóda prípravy zásobného roztoku a frekvencia jeho obnovovania (solubilizačné činidlo, v prípade použitia musí byť uvedená jeho koncentrácia a príspevok k obsahu organicky viazaného uhlíka), - nominálne testované koncentrácie, priemery hodnôt nameraných v testovacích nádržiach a ich štandardné odchýlky a spôsob, akým sa vypočítali, - zdroj zrieďovacej vody, opis jej každého ošetrenia pred pokusom, výsledky každého preukazovania, že ryby sú schopné v pokusnej vode žiť, charakteristiky vody: pH, tvrdosť, teplota, koncentrácia rozpusteného kyslíka, zvyškové hladiny chlóru (ak boli merané), celkový organicky viazaný uhlík, rozsuspendované tuhé častice, slanosť testovacieho média (ak prichádza do úvahy) a všetky ďalšie merania, - kvalita vody v testovacej nádrži, pH, tvrdosť, TOC, teplota a koncentrácia rozpusteného kyslíka, - podrobné informácie o režime kŕmenia (napríklad typ krmiva, zdroj, zloženie –– prinajmenšom obsah tukov a bielkovín, a ak to je možné, aj dávané množstvo a frekvencia kŕmenia), - informácie o spracúvaní vzoriek rýb a vody vrátane údajov o ich príprave, skladovaní, extrakcii a analytických metódach použitých pri stanovovaní testovanej látky a obsahu tukov (ak sa meral). 3.4. Výsledky - výsledky všetkých predbežných štúdií, - úhyn rýb v kontrolnej skupine a v skupine nachádzajúcej sa v expozičnej komore a všetky pozorované abnormality v správaní, - obsah tukov v rybách (ak sa pri testovaní stanovoval), - krivky (vrátane všetkých nameraných údajov) opisujúce vychytávanie a depuráciu testovanej látky v rybách, čas potrebný na dosiahnutie rovnovážneho stavu, - Cf a Cw (spolu so štandardnou odchýlkou a rozsahom, ak je to potrebné) v každom čase odberu vzoriek [Cf je vyjadrené v μg/g vlhkej hmotnosti (ppm) celého tela alebo jeho určeného tkaniva, napríklad tuku, a Cw vyjadrené v μg/ml (ppm)]. Hodnoty Cw pre kontrolné skupiny (treba uviesť aj hodnoty pozadia), - rovnovážny biokoncentračný faktor (BCFss), resp. kinetický biokoncentračný faktor (BCFk), a ak to prichádza do úvahy, tak aj 95 % medzu spoľahlivosti pre konštanty vychytávania a depurácie (všetky vyjadrené vzhľadom na celé telo zvieraťa alebo jeho určené tkanivo a celkový obsah tukov, ak bol meraný), medzu spoľahlivosti a štandardné odchýlky (ak sú k dispozícii) a metódy výpočtu pre každú použitú koncentráciu testovanej látky, - v prípade použitia rádioaktívne označených látok, a ak sa to vyžaduje, možno uviesť aj hromadenie všetkých zachytených metabolitov, - čokoľvek nezvyčajné, čo sa počas testu pozorovalo, všetky odchýlky od týchto postupov a všetky iné významné informácie. Počas predbežných pokusov a pri vypracúvaní experimentálnej zostavy minimalizujte výskyt výsledkov typu "nezachytené pri danom prahu detegovateľnosti", pretože takéto výsledky sa nedajú použiť na výpočet konštánt. 4. ODKAZY 1. Connell D. W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, pp. 117-156. 2. Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29-390. 3. OECD, Paris (1996). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3. 4. Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark. 5. US EPA 822-94-002 (1994). Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994. 6. US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide Analytical Manual, 1, 5600 Fisher‘s Lane, Rockville, MD 20852, July 1975. 7. US EPA (1974). Section 5, A(1). Analysis of Human or Animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson J. F. (ed.) Research Triangle Park, N. C. 27711. 8. Compaan H. (1980) in "The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation", Ch. 2.3. Part II. Government Publishing Office, the Hague, Netherlands. 9. Gardner et al. (1995). Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099-1105. 10. Randall R. C., Lee H., Ozretich R. J., Lake J. L. and Pruell R. J. (1991). Evaluation of selected methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp, 1431-1436. 11. CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method- Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholm. 12. ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for Conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs. --------------------------------------------------