VYKONÁVACIE ROZHODNUTIE KOMISIE (EÚ) 2015/1554

z 11. septembra 2015,

ktorým sa stanovujú pravidlá na uplatňovanie smernice 2006/88/ES, pokiaľ ide o požiadavky týkajúce sa metód dohľadu a diagnostických metód

[oznámené pod číslom C(2015) 6188]

(Text s významom pre EHP)

EURÓPSKA KOMISIA,

so zreteľom na Zmluvu o fungovaní Európskej únie,

so zreteľom na smernicu Rady 2006/88/ES z 24. októbra 2006 o zdravotných požiadavkách na živočíchy a produkty akvakultúry a o prevencii a kontrole niektorých chorôb vodných živočíchov (1), a najmä na jej články 49 ods. 3, 50 ods. 4, 57 písm. b) a 61 ods. 3,

keďže:

Eradikácia chorôb uvedených v zozname a dosiahnutie štatútu oblasti bez výskytu chorôb v členskom štáte, zóne alebo priestore by mali byť v celej Únii založené na rovnakých zásadách a riadiť sa rovnakým vedeckým prístupom. Z toho dôvodu je potrebné stanoviť na úrovni Únie osobitné požiadavky týkajúce sa systémov eradikácie a dohľadu a metód odberu vzoriek a diagnostických metód, ktoré členské štáty použijú na získanie štatútu oblasti bez výskytu chorôb pre celé územie členského štátu alebo jeho zónu alebo priestor.

Laboratórne vyšetrenia, ktoré sa majú vykonať v prípade podozrenia na prítomnosť chorôb uvedených v zozname alebo v prípade ich potvrdenia, by mali byť na úrovni Únie rovnaké a mali by vychádzať z rovnakých vedeckých noriem a protokolov. V súlade so smernicou 2006/88/ES je potrebné stanoviť osobitné diagnostické metódy a postupy na použitie v laboratóriách, ktoré na daný účel určí príslušný orgán členských štátov.

V Kódexe zdravia vodných živočíchov Svetovej organizácie pre zdravie zvierat (OIE) (ďalej len „kódex zdravia vodných živočíchov“) sa stanovujú normy na zlepšenie zdravia vodných živočíchov a dobrých životných podmienok rýb z farmového chovu na celom svete vrátane noriem pre bezpečný medzinárodný obchod s chovnými vodnými živočíchmi a výrobkami z nich. V niekoľkých kapitolách v kódexe zdravia vodných živočíchov sú uvedené odporúčania týkajúce sa používania určitých diagnostických testov. Takéto testy, stanovené OIE, sú uvedené v príručke OIE o diagnostických testoch pre vodné živočíchy (ďalej len „príručka testov pre vodné živočíchy“). S cieľom zabezpečiť, aby požiadavky Únie v súvislosti s diagnostikou chorôb vodných živočíchov boli v súlade s medzinárodnými normami, by mali pravidlá stanovené v tomto rozhodnutí zohľadňovať normy a odporúčania kódexu zdravia vodných živočíchov.

V tejto súvislosti, v prípade mnohých chorôb uvedených v zozname, príručka testov pre vodné živočíchy uvádza niekoľko testov a postupov, ktoré sa majú použiť na účely laboratórnych vyšetrení. Na zjednotenie jednotného vedeckého základu diagnostickej práce v súvislosti s chorobami uvedenými v zozname na úrovni Únie je potrebné uskutočniť výber spomedzi diagnostických testov a postupov odporúčaných výborom OIE a špecifikovať, ktoré testy by mali byť povinné na účely laboratórneho vyšetrenia pri vykonávaní programov dohľadu a na vylúčenie podozrenia na výskyt chorôb uvedených v zozname alebo na potvrdenie ich prítomnosti. Zatiaľ čo v určitých prípadoch bude potrebné, aby boli dostupné aj alternatívne metódy a postupy, mali by sa poskytnúť opisy a niektoré vedecké vysvetlenia toho, kedy a ako by sa mohli uplatňovať alternatívne metódy. To je predovšetkým potrebné v prípade podrobných diagnostických postupov.

S cieľom získať presné a reprodukovateľné diagnostické výsledky je dôležité, aby podrobné postupy a protokoly, ktoré sa majú používať, boli validované v súlade s príslušnými normami kvality uvedenými v časti I prílohy VI k smernici 2006/88/ES. Pri mnohých diagnostických metódach stanovených v tomto rozhodnutí je používanie komerčných testovacích súprav nevyhnutnou súčasťou diagnostických protokolov a uvedené testovacie súpravy boli validované v akreditovaných testoch európskymi referenčnými laboratóriami (EURL), pokiaľ ide o príslušné choroby. V záujme právnej istoty by sa obchodné názvy uvedených validovaných komerčných testovacích súprav mali uviesť v tomto rozhodnutí.

Pre niektoré členské štáty môže byť ťažké dosiahnuť štatút oblasti bez výskytu chorôb pre celé územie členského štátu alebo pre jeho zónu alebo priestor, pokiaľ ide o jednu alebo viaceré z chorôb uvedených v zozname. V takýchto situáciách si členský štát nemusí želať, aby získal alebo opätovne získal štatút oblasti bez výskytu daných chorôb uvedených v zozname. Minimálne kontrolné opatrenia, ktoré sa majú uplatňovať v prípadoch, keď si dotknutý členský štát neželá získať alebo opätovne získať štatút oblasti bez výskytu chorôb, by mali byť na úrovni Únie rovnaké a mali by vychádzať z rovnakých kritérií. Preto je nevyhnutné v súlade so smernicou 2006/88/ES stanoviť podrobné pravidlá na zabránenie šíreniu daných chorôb uvedených v zozname a minimálne požiadavky na zrušenie uvedených opatrení na zabránenie šíreniu daných chorôb.

V rozhodnutí Komisie 2001/183/ES (2) sa stanovujú požiadavky týkajúce sa plánov odberu vzoriek a diagnostických metód na zisťovanie a potvrdzovanie infekčnej hematopoietickej nekrózy a vírusovej hemoragickej septikémie, chorôb uvedených v zozname. Rozhodnutím Komisie 2003/466/ES (3) sa stanovujú požiadavky týkajúce sa plánov odberu vzoriek a diagnostických metód na zisťovanie nákazlivej chudokrvnosti lososov, ako aj kritériá na vymedzenie pásiem a úradný dozor pri podozrení na výskyt uvedenej choroby alebo pri jej potvrdení. Rozhodnutím Komisie 2002/878/ES (4) sa stanovujú požiadavky týkajúce sa plánov na zber vzoriek a diagnostických metód na zistenie a potvrdenie prítomnosti chorôb mušlí bonamióza a marteilióza. S cieľom aktualizovať požiadavky by sa uvedené tri rozhodnutia mali nahradiť týmto rozhodnutím. Rozhodnutie 2001/183/ES, rozhodnutie 2002/878/ES a rozhodnutie 2003/466/ES by sa preto mali zrušiť.

Keďže niektoré členské štáty požadujú čas na aktualizáciu svojich národných referenčných laboratórií na dosiahnutie súladu s požiadavkami stanovenými v tomto rozhodnutí, toto rozhodnutie by sa malo uplatňovať od 1. apríla 2016.

Opatrenia stanovené v tomto rozhodnutí sú v súlade so stanoviskom Stáleho výboru pre rastliny, zvieratá, potraviny a krmivá,

PRIJALA TOTO ROZHODNUTIE:

Článok 1

Predmet úpravy

Týmto rozhodnutím sa stanovujú pravidlá, pokiaľ ide o:

dohľad, nárazníkové zóny, odber vzoriek a diagnostické metódy, ktoré členské štáty majú používať v súvislosti so štatútom chorôb členských štátov alebo zón alebo priestorov v prípade neexotických chorôb vodných živočíchov uvedených v časti II prílohy IV k smernici 2006/88/ES („choroby uvedené v zozname“);

c)

Článok 2

Vymedzenie pojmov

Na účely tohto rozhodnutia sa uplatňuje toto vymedzenie pojmov:

„vírusová hemoragická septikémia“ („VHS“) je nákaza spôsobená vírusom vírusovej hemoragickej septikémie (VHSV), známym aj ako Egtved vírus, ktorý patrí do rodu Novirhabdovirus v čeľadi Rhabdoviridae;

„infekčná hematopoetická nekróza“ („IHN“) je nákaza spôsobená vírusom infekčnej hematopoetickej nekrózy, ktorý patrí do rodu Novirhabdovirus v čeľadi Rhabdoviridae;

„herpesviróza kaprov koi“ („KHVD“) je nákaza spôsobená koi herpesvírusom (KHV), ktorý patrí do čeľade Alloherpesviridae. Vedecký názov je herpesvírus kaprovitých rýb 3 (CyHV-3);

c)

„infekčná anémia lososov“ („ISA“) je nákaza spôsobená infekciou vírusom infekčnej anémie lososov (ISAV) s deléciou vo vysoko polymorfnej oblasti, ktorý patrí do rodu Isavirus v čeľadi Orthomyxoviridae;

„marteilióza (Marteilia refringens)“ je nákaza spôsobená infekciou prvokom Marteilia refringens patriacim do radu Paramyxida;

„bonamióza (Bonamia ostreae)“ je nákaza spôsobená infekciou prvokom Bonamia ostreae patriacim do skupiny Haplosporidia;

„choroba bielych škvŕn“ („WSD“) je nákaza spôsobená vírusom choroby bielych škvŕn, ktorý je dvojvláknovým DNA vírusom patriacim do rodu Whispovirus a čeľade Nimaviridae.

Článok 3

Minimálne požiadavky, pokiaľ ide o programy eradikácie a dohľadu

Členské štáty zabezpečia, aby boli splnené pravidlá týkajúce sa programov dohľadu a eradikačných programov, nárazníkových zón, odberu vzoriek a diagnostických metód stanovených v prílohe I a špecifických metód a podrobných postupov stanovených v prílohe II, ak sa má v prípade členského štátu, jeho zóny alebo priestoru udeliť, odobrať alebo obnoviť štatút oblasti bez výskytu chorôb, pokiaľ ide o jednu alebo viaceré z chorôb uvedených v zozname.

Článok 4

Minimálne požiadavky, pokiaľ ide o diagnostické metódy a špecifické postupy

Členské štáty zabezpečia, aby boli splnené kontrolné metódy stanovené v prílohe I, ako aj špecifické diagnostické metódy a podrobné postupy stanovené v prílohe II, ak sa laboratórne vyšetrenia vykonávajú s cieľom potvrdiť alebo vylúčiť prítomnosť choroby uvedenej v zozname.

Článok 5

Minimálne kontrolné opatrenia na zabránenie šíreniu chorôb uvedených v zozname a minimálne požiadavky na zrušenie opatrení na zabránenie šíreniu chorôb v členských štátoch, zónach alebo priestoroch, ktoré nie sú vyhlásené za oblasti bez výskytu chorôb uvedených v zozname

Členské štáty zabezpečia, aby pri vykonávaní kontrolných opatrení a pri rušení opatrení na zabránenie šíreniu chorôb v prípade jednej alebo viacerých chorôb uvedených v zozname v členskom štáte alebo jeho zóne alebo priestore, ktoré nie sú vyhlásené za oblasti bez výskytu daných chorôb uvedených v zozname, boli splnené minimálne kontrolné opatrenia a minimálne požiadavky na zrušenie opatrení na zabránenie šíreniu chorôb stanovené v prílohe I.

Článok 6

Zrušenia

Rozhodnutia 2001/183/ES, 2002/878/ES a 2003/466/ES sa zrušujú.

Článok 7

Dátum uplatňovania

Toto rozhodnutie sa uplatňuje od 1. apríla 2016.

Článok 8

Adresáti

Toto rozhodnutie je adresované členským štátom.

(1) Ú. v. EÚ L 328, 24.11.2006, s. 14.

(2) Rozhodnutie Komisie 2001/183/ES z 22. februára 2001, ktoré ustanovuje plány odberu vzoriek a diagnostické metódy na zisťovanie a potvrdzovanie určitých nákaz rýb a ktorým sa ruší rozhodnutie 92/532/EHS (Ú. v. ES L 67, 9.3.2001, s. 65).

(3) Rozhodnutie Komisie 2003/466/ES z 13. júna 2003, ktorým sa stanovujú kritériá na vymedzenie pásiem a úradný dozor pri podozrení na výskyt nákazlivej chudokrvnosti lososov (ISA) alebo pri jeho potvrdení (Ú. v. EÚ L 156, 25.6.2003, s. 61).

(4) Rozhodnutie Komisie 2002/878/ES zo 6. novembra 2002, ktorým sa ustanovujú plány na zber vzoriek a diagnostické metódy na zistenie a potvrdenie prítomnosti chorôb mušlí bonamióza (Bonamia ostreae) a marteilióza (Marteilia refringens) (Ú. v. ES L 305, 7.11.2002, s. 57).

(14) Vzorky sa musia každoročne odoberať a vyšetrovať počas dvoch jednomesačných skúšobných období (konkrétne jar a jeseň) alebo vtedy, keď je to vhodné z praktických dôvodov.

(12) Vzorky sa musia každoročne odoberať, uchovávať a vyšetrovať počas dvoch jednomesačných skúšobných období (konkrétne jar a jeseň) alebo alebo vtedy, keď je to vhodné z praktických dôvodov.

(7) Vzorky sa nesmú odoberať skôr ako tri týždne po presune rýb zo sladkej vody do morskej.

(4) Vzorky sa nesmú odoberať skôr ako tri týždne po presune rýb zo sladkej vody do morskej.

(1) Vzorky sa nesmú odoberať skôr ako tri týždne po presune rýb zo sladkej vody do slanej.

V prípade pozitívneho výsledku dvojkrokovej PCR musí byť pred tým, ako sa uplatnia počiatočné kontrolné opatrenia stanovené v článku 28 smernice 2006/88/ES, výsledok potvrdený sekvenovaním amplikónu, a ak je to v rámci praktických podmienok možné, preukázaním patognomonických príznakov WSD pri uvedených vybraných vnímavých hostiteľoch, prostredníctvom histológie a transmisnej elektrónovej mikroskopie.

Pred prípravou vzoriek na dvojkrokovú PCR sa odoberú vzorky integumentu, buď samostatné alebo ako súčasť kráčavých končatín, plávacích končatín, ústneho ústrojenstva alebo žiabier vyšetrovaného živočícha, ktoré by mali byť fixované v 95 % etanole.

c)

všetky farmy úradne vyhlásené za infikované WSD a všetky ostatné farmy, ktoré boli úhorované alebo podliehali alternatívnym opatreniam v súlade s písm. a) v rámci zriadených ochranných zón a zón pozorovania, boli opätovne nasádzané kôrovcami pochádzajúcimi z členských štátov, zón alebo priestorov so zdravotným štatútom kategórie I, II alebo III, pokiaľ ide o WSD;

sú splnené požiadavky stanovené v bode I.2.2.1 písm. a), b) a c). V prípade, že úhorovanie nie je technicky možné, dané farmy podliehajú alternatívnemu opatreniu, na základe ktorého sa poskytuje takmer rovnaká záruka, pokiaľ ide o vyhubenie WSSV v prostredí farmy;

Ak sa na udržanie zdravotného štatútu kategórie I vyžaduje cielený dohľad podľa článku 52 smernice 2006/88/ES, všetky farmy držiace vnímavé druhy uvedené v časti II prílohy IV k uvedenej smernici v rámci príslušného členského štátu, zóny alebo priestoru sa podrobia veterinárnej kontrole a odberu vzoriek v súlade s tabuľkou 6 B stanovenou v oddiele II, so zohľadnením úrovne rizika farmy v súvislosti s nákazou WSD.

farma s WSD bola opätovne nasádzaná kôrovcami pochádzajúcimi z členských štátov, zón alebo priestorov so zdravotným štatútom kategórie I v súvislosti s WSD.

Suchozemský priestor zahŕňajúci jednu jedinú farmu so zdravotným štatútom kategórie I v súvislosti s WSD, ktorej zdravotný štatút v súvislosti s danou chorobou uvedenou v zozname je nezávislý od okolitých prírodných vôd v súlade s bodom 3 časti II prílohy V k smernici 2006/88/ES a ktorej zdravotný štatút kategórie I bol zrušený v súlade s článkom 53 ods. 3 uvedenej smernice, môže opätovne získať zdravotný štatút kategórie I okamžite potom, ako príslušný orgán potvrdil, že boli splnené tieto podmienky:

Opätovné nasádzanie sa uskutoční len vtedy, keď všetky farmy úradne vyhlásené za infikované WSD boli vyprázdnené, vyčistené, vydezinfikované a úhorované v súlade s bodom I.2.2.1 písm. c);

počas prechodného obdobia do 31. decembra 2020, kôrovcami z členských štátov, zón alebo priestorov so schváleným programom dohľadu v súvislosti s WSD.

kôrovcami pochádzajúcimi z členských štátov, zón alebo priestorov so zdravotným štatútom kategórie I v súvislosti s WSD; alebo

c)

jednu veterinárnu kontrolu; v tých farmách, kde testy uvedené v podbode i) priniesli negatívne výsledky, veterinárne kontroly pokračujú raz mesačne počas obdobia, keď je pravdepodobné, že teplota vody dosiahne svoje najvyššie ročné hodnoty až do zrušenia ochrannej zóny v súlade s bodom I.2.2.1 písm. c);

v morských oblastiach: oblasti, ktorá okolo ochrannej zóny presahuje pásma posunu prílivu; alebo oblasti okolo ochrannej zóny, ktorá patrí do okruhu s priemerom 10 km od stredu ochrannej zóny; alebo rovnocennej oblasti určenej na základe príslušných hydrodynamických alebo epidemiologických údajov; alebo

Uzavretá oblasť sa musela vymedziť na základe jednotlivých prípadov, so zohľadnením faktorov, ktoré majú vplyv na riziká rozširovania WSD na chované i voľne žijúce kôrovce, ako sú: počet, miera a rozdelenie úhynu kôrovcov na farme infikovanej WSD; vzdialenosť k susedným farmám a hustota susedných fariem; farmy, ktoré sú v styku; druhy prítomné na farmách; chovné postupy použité na postihnutých farmách a na susedných farmách; zistené hydrodynamické podmienky a ostatné faktory epidemiologického významu.

bola opätovne nasádzaná kôrovcami pochádzajúcimi z členských štátov, zón alebo priestorov so zdravotným štatútom kategórie I v súvislosti s WSD.

ak sa počas realizácie programu dohľadu uvedeného v písm. a) na farme zaradenej do uvedeného programu dohľadu potvrdí infekcia WSSV, a na základe toho sa zruší jej zdravotný štatút kategórie II, uvedená farma môže okamžite znovu získať zdravotný štatút kategórie II a pokračovať v realizácii programu dohľadu s cieľom dosiahnuť štatút oblasti bez výskytu chorôb bez toho, aby uplatňovala eradikačný program, ako sa uvádza v bode I.2.2, za predpokladu, že:

Farmy alebo miesta odberu vzoriek boli podrobené veterinárnym kontrolám a odberu vzoriek minimálne počas dvoch po sebe nasledujúcich rokov, ako je to stanovené v tabuľke 6.A v oddiele II.

členský štát, zóna alebo priestor, ktoré majú zdravotný štatút kategórie III v súvislosti s WSD v súlade s časťou B prílohy III k smernici 2006/88/ES, môžu dosiahnuť zdravotný štatút kategórie I v súvislosti s danou chorobou uvedenou v zozname, ak všetky farmy držiace vnímavé druhy uvedené v časti II prílohy IV k uvedenej smernici v rámci členského štátu, zóny alebo priestoru spĺňajú príslušné požiadavky stanovené v prílohe V k uvedenej smernici a všetky uvedené farmy, a ak sa to vyžaduje v druhom odseku bodu 2 časti I prílohy V k smernici 2006/88/ES, aj miesta odberu vzoriek v prípade voľne žijúcich populácií vybraných v súlade s uvedeným bodom, boli predmetom tohto dvojročného programu dohľadu, ktorý zahŕňa veterinárne kontroly a odber vzoriek na testovanie.

ak sa na chov kôrovcov využíva viac ako jeden vodný zdroj, do odberu vzoriek musia byť zahrnuté vnímavé kôrovce reprezentujúce všetky vodné zdroje.

prítomnosť Bonamia ostreae sa považuje za potvrdenú, ak je pozitívny výsledok prostredníctvom histopatológie, odtlačkov tkaniva alebo hybridizácie pre dôkaz in situ kombinovaný s pozitívnym výsledkom PCR doplnenej sekvenovaním v súlade so schválenými metódami a postumi uvedenými v časti 5 prílohy II;

Na vykonávanie diagnostických testov uvedených v bodoch II.2 a II.3 sa do laboratória musí dodať celý živočích.

počas obdobia dvoch rokov, ktoré nasleduje po ukončení opatrení uvedených v písm. a), b) a c) nedošlo k potvrdeniu bonamiózy (Bonamia ostreae) a podozrenia počas tohto obdobia boli vylúčené podľa postupov stanovených v bode II. 3.

c)

všetky farmy alebo chovné oblasti pre mäkkýše úradne vyhlásené za infikované a všetky ostatné farmy alebo chovné oblasti pre mäkkýše úhorované alebo podrobené alternatívnym opatreniam v súlade s písm. a) v rámci zriadených ochranných zón a zón pozorovania boli opätovne nasádzané mäkkýšmi pochádzajúcimi z členských štátov, zón alebo priestorov so zdravotným štatútom kategórie I, II alebo III, pokiaľ ide o bonamiózu (Bonamia ostreae).

sú splnené požiadavky stanovené v bode I.2.2 písm. a), b) a c). V prípade, že úhorovanie nie je technicky možné, dané farmy podliehajú alternatívnemu opatreniu, na základe ktorého sa poskytuje takmer podobná záruka, pokiaľ ide o vyhubenie Bonamia ostreae v prostredí farmy;

Ak sa na udržanie zdravotného štatútu kategórie I vyžaduje cielený dohľad podľa článku 52 smernice 2006/88/ES, všetky farmy alebo chovné oblasti pre mäkkýše držiace vnímavé druhy uvedené v časti II prílohy IV k uvedenej smernici v rámci príslušného členského štátu, zóny alebo priestoru podliehajú veterinárnym kontrolám a odberu vzoriek v súlade s tabuľkou 5.B stanovenou v oddiele II tejto časti, so zohľadnením úrovne rizika farmy alebo chovnej oblasti pre mäkkýše v súvislosti s nakazením bonamiózou (Bonamia ostreae).

všetky farmy alebo chovné oblasti pre mäkkýše úradne vyhlásené za infikované a všetky ostatné farmy alebo chovné oblasti pre mäkkýše úhorované v rámci zriadených ochranných zón a zón pozorovania musia byť opätovne nasádzané mäkkýšmi pochádzajúcimi z členských štátov, zón alebo priestorov so zdravotným štatútom kategórie I, pokiaľ ide o bonamiózu (Bonamia ostreae). Opätovné nasádzanie sa uskutoční len vtedy, ak všetky farmy úradne vyhlásené za infikované boli vyprázdnené, vyčistené, vydezinfikované a úhorované v súlade s bodom I.2.2 písm. c);

c)

Uzavretá oblasť sa vymedzí na základe jednotlivých prípadov, so zohľadnením faktorov, ktoré majú vplyv na riziká rozširovania danej choroby uvedenej v zozname, ako sú: počet, miera, vek a rozdelenie úhynov mäkkýšov na farme alebo v chovnej oblasti pre mäkkýše, ktoré sú infikované Bonamia ostreae, vrátane voľne žijúcich mäkkýšov; vzdialenosť a hustota susediacich fariem alebo chovných oblastí pre mäkkýše vrátane voľne žijúcich mäkkýšov; blízkosť k spracovateľským prevádzkárňam, k farmám, ktoré sú v styku, alebo k chovným oblastiam pre mäkkýše; druhy prítomné na farmách alebo v chovných oblastiach pre mäkkýše, najmä vnímavé druhy a prenášače; chovné postupy uplatňované v postihnutých a susediacich farmách alebo chovných oblastiach pre mäkkýše; zistené hydrodynamické podmienky a ostatné faktory epidemiologického významu.

ak vo vzorke majú byť zahrnuté Ostrea edulis pochádzajúce z členského štátu, zóny alebo priestoru so zdravotným štatútom kategórie I, museli byť umiestnené vo farme alebo v chovnej oblasti pre mäkkýše prinajmenšom na jeseň, ktorá predchádza obdobiu, keď sa vykonáva program dohľadu.

c)

farmy a chovné oblasti pre mäkkýše držiace vnímavé druhy uvedené v časti II prílohy IV k smernici 2006/88/ES boli podrobené veterinárnym kontrolám a odberu vzoriek minimálne počas dvoch po sebe nasledujúcich rokov, ako je to stanovené v tabuľke 5.A uvedenej v tejto časti;

pri odbere vzoriek v chovných oblastiach pre mäkkýše sa do vzorky musia zahrnúť mäkkýše z dostatočného počtu miest odberu vzoriek. Hlavnými faktormi, ktoré je potrebné zvážiť pri výbere týchto miest odberu vzoriek, sú predchádzajúce miesta, kde sa zistil výskyt Bonamia ostreae, hustota chovu, vodné toky, prítomnosť vnímavých druhov, prítomnosť prenášačov, batymetria a postupy riadenia. Do odberu vzoriek sa zahrnú prírodné dná v rámci chovných oblastí alebo oblastí, ktoré s nimi susedia.

pri odbere vzoriek vo farmách, v ktorých sa na produkciu mäkkýšov využíva viac ako jeden vodný zdroj, musia byť do odberu vzoriek zahrnuté mäkkýše reprezentujúce všetky vodné zdroje tak, aby boli vo vzorke pomerne zastúpené všetky časti farmy;

c)

Veterinárne kontroly, a ak je to vhodné, odber vzoriek v prípade výrobných jednotiek, sa vykonáva v období roka, keď je známe, že prevalencia Bonamia ostreae v členskom štáte, zóne alebo priestore je najvyššia. Ak takéto údaje nie sú k dispozícii, odber vzoriek sa vykonáva v zime alebo na začiatku jari.

prítomnosť Marteilia refringens sa považuje za potvrdenú, ak je pozitívny výsledok prostredníctvom histopatológie, odtlačkov tkaniva alebo hybridizácie pre dôkaz in situ kombinovaný s pozitívnym výsledkom PCR doplnenej sekvenovaním;

Na vykonávanie diagnostických testov uvedených v bodoch II.2 a II.3 sa do laboratória musí dodať celý živočích.

počas obdobia dvoch rokov, ktoré nasleduje po ukončení opatrení uvedených v písm. a), b) a c), nedošlo k potvrdeniu marteiliózy (Marteilia refringens) a podozrenia počas tohto obdobia boli vylúčené podľa postupov stanovených v bode II.3.

c)

všetky farmy alebo chovné oblasti pre mäkkýše úradne vyhlásené za infikované a všetky ostatné farmy alebo chovné oblasti pre mäkkýše úhorované alebo podrobené alternatívnym opatreniam v súlade s písm. a) v rámci zriadených ochranných zón a zón pozorovania boli opätovne nasádzané mäkkýšmi pochádzajúcimi z členských štátov, zón alebo priestorov so zdravotným štatútom kategórie I, II alebo III, pokiaľ ide o marteiliózu (Marteilia refringens);

sú splnené požiadavky stanovené v bode I.2.2 písm. a), b) a c). V prípade, že úhorovanie nie je technicky možné, dané farmy podliehajú alternatívnemu opatreniu, na základe ktorého sa poskytuje takmer podobná záruka, pokiaľ ide o vyhubenie Marteilia refringens v prostredí farmy;

Ak sa na udržanie zdravotného štatútu kategórie I vyžaduje cielený dohľad podľa článku 52 smernice 2006/88/ES, všetky farmy alebo chovné oblasti pre mäkkýše držiace vnímavé druhy uvedené v časti II prílohy IV k smernici 2006/88/ES v rámci príslušného členského štátu, zóny alebo priestoru podliehajú veterinárnym kontrolám a odberu vzoriek v súlade s tabuľkou 4.B stanovenou v oddiele II tejto časti, so zohľadnením úrovne rizika farmy alebo chovnej oblasti pre mäkkýše v súvislosti s nakazením Marteilia refringens.

Opätovné nasádzanie sa uskutoční len vtedy, keď všetky farmy úradne vyhlásené za infikované boli vyprázdnené, vyčistené, vydezinfikované a úhorované v súlade s bodom I.2.2 písm. c);

všetky farmy alebo chovné oblasti pre mäkkýše úradne vyhlásené za infikované a všetky ostatné farmy alebo chovné oblasti pre mäkkýše úhorované v rámci zriadených ochranných zón a zón pozorovania musia sú opätovne nasádzané mäkkýšmi pochádzajúcimi z členských štátov, zón alebo priestorov so zdravotným štatútom kategórie I, pokiaľ ide o marteiliózu (Marteilia refringens).

c)

Uzavretá oblasť sa vymedzí na základe jednotlivých prípadov, so zohľadnením faktorov, ktoré majú vplyv na riziká rozširovania Marteilia refringens, ako sú: počet, vek, miera a rozdelenie úhynov mäkkýšov na farme alebo v chovnej oblasti pre mäkkýše, ktoré sú infikované Marteilia refringens, vrátane voľne žijúcich mäkkýšov; vzdialenosť a hustota susediacich fariem alebo chovných oblastí pre mäkkýše vrátane voľne žijúcich mäkkýšov; blízkosť k spracovateľským prevádzkárňam, k farmám, ktoré sú v styku, alebo k chovným oblastiam pre mäkkýše; druhy, najmä vnímavé druhy, a prenášače prítomné na farmách alebo v chovných oblastiach pre mäkkýše; chovné postupy uplatňované v postihnutých a susediacich farmách a chovných oblastiach pre mäkkýše; zistené hydrodynamické podmienky a ostatné faktory epidemiologického významu.

ak vo vzorke majú byť zahrnuté Ostrea edulis, Mytilus edulis alebo Mytilus galloprovincialis pochádzajúce z členského štátu, zóny alebo priestoru so zdravotným štatútom kategórie I, museli byť umiestnené vo farme alebo v chovnej oblasti pre mäkkýše prinajmenšom na jar, ktorá bezprostredne predchádza obdobiu, keď sa vykonáva program dohľadu.

c)

farmy alebo chovné oblasti pre mäkkýše museli byť podrobené veterinárnym kontrolám a odberu vzoriek minimálne počas obdobia dvoch po sebe nasledujúcich rokov, ako je to stanovené v tabuľke 4.A v oddiele II;

pri odbere vzoriek v chovných oblastiach pre mäkkýše sa do odberu vzoriek zahrnú mäkkýše z dostatočného počtu miest odberu vzoriek tak, aby boli vo vzorke pomerne zastúpené všetky časti chovnej oblasti pre mäkkýše. Hlavnými faktormi, ktoré je potrebné zvážiť pri výbere týchto miest odberu vzoriek, sú predchádzajúce miesta odberu vzoriek, kde sa zistil výskyt Marteilia refringens, hustota chovu, vodné toky, prítomnosť vnímavých druhov, prítomnosť prenášačov, batymetria a postupy riadenia. Do odberu vzoriek sú zahrnuté prírodné dná.

pri odbere vzoriek vo farmách s chovom mäkkýšov, v ktorých sa na produkciu mäkkýšov využíva viac ako jeden vodný zdroj, sa do odberu vzoriek zahrnú mäkkýše reprezentujúce všetky vodné zdroje tak, aby boli vo vzorke pomerne zastúpené všetky časti farmy;

c)

Veterinárne kontroly, a ak je to vhodné, odber vzoriek na laboratórne vyšetrenie, sa vykonáva v tom období roka, keď je známe, že prevalencia parazitu v členskom štáte, zóne alebo priestore je najvyššia. Ak takéto údaje nie sú k dispozícii, odber vzoriek sa vykonáva bezprostredne po tom, ako teplota vody presiahne 17 °C.

v prípade pozorovania prítomnosti klinických zmien, vážnych patologických zmien alebo histopatologických nálezov zlučiteľných s ISA sa dané zistenia musia potvrdiť detekciou vírusu prostredníctvom dvoch diagnostických metód vychádzajúcich z nezávislých princípov detekcie, ako je RT-qPCR a IHC, a to v súlade s časťou 3 prílohy II.

c)

detekcia ISAV prostredníctvom RT-qPCR vrátane sekvenovania HE génu na účely overenia delécie v HPR a

detekcia ISAV prostredníctvom RT-qPCR vrátane sekvenovania HE génu na overenie delécie v HPR a detekcia ISAV v tkanivových preparátoch prostredníctvom špecifických protilátok proti ISAV (konkrétne IHC na fixovaných rezoch alebo IFAT na odtlačkoch tkaniva);

c)

skríning vzoriek prostredníctvom RT-qPCR vrátane sekvenovania HE génu na účely overenia delécie v HPR;

c)

počas obdobia dvoch rokov, ktoré nasleduje po ukončení opatrení uvedených v písm. a), b) a c) nedošlo k potvrdeniu ISAV s deléciou v HPR a podozrenia počas tohto obdobia boli vylúčené v súlade s postupmi stanovenými v bode II.3.

c)

všetky farmy úradne vyhlásené za infikované a všetky ostatné farmy, ktoré boli úhorované alebo podliehali alternatívnym opatreniam v súlade s písm. a) v rámci zriadených ochranných zón a zón pozorovania, boli opätovne zarybnené rybami pochádzajúcimi z členských štátov, zón alebo priestorov so zdravotným štatútom kategórie I, II alebo III, pokiaľ ide o ISA;

sú splnené požiadavky stanovené v bode I.2.2.1 písm. a), b) a c). V prípade, ak úhorovanie nie je technicky možné, dané farmy podliehajú alternatívnemu opatreniu, na základe ktorého sa poskytuje takmer rovnaká záruka, pokiaľ ide o vyhubenie ISAV v prostredí farmy;

Pri určovaní frekvencie veterinárnych kontrol v prípade priestorov so zdravotným štatútom kategórie I, pokiaľ ide o ISA, ktoré sú umiestnené v suchozemských oblastiach a ktorých zdravotný štatút, pokiaľ ide o ISA, je závislý od zdravotného štatútu okolitých prírodných vôd, v ktorých sa nachádza losos atlantický (Salmo salar), sa riziko nakazenia ISA považuje za vysoké.

Ak sa na udržanie zdravotného štatútu kategórie I vyžaduje cielený dohľad podľa článku 52 smernice 2006/88/ES, všetky farmy držiace vnímavé druhy uvedené v časti II prílohy IV k uvedenej smernici v rámci príslušného členského štátu, zóny alebo priestoru podliehajú veterinárnym kontrolám a odberu vzoriek v súlade s tabuľkou 3.B (11) stanovenou v oddiele II tejto časti, so zohľadnením úrovne rizika farmy v súvislosti s nakazením ISA.

bola opätovne zarybnená rybami pochádzajúcimi z členských štátov, zón alebo priestorov so zdravotným štatútom kategórie I v súvislosti s ISA.

Suchozemský priestor zahŕňajúci jednu jedinú farmu so zdravotným štatútom kategórie I v súvislosti s ISA, ktorej zdravotný štatút je nezávislý od okolitých prírodných vôd v súlade s bodom 3 časti II prílohy V k smernici 2006/88/ES a ktorej zdravotný štatút kategórie I sa zrušil v súlade s článkom 53 ods. 3 uvedenej smernice, ho môže opätovne získať okamžite potom, ako príslušný orgán potvrdil, že spĺňa tieto podmienky:

I.2.2.2. Požiadavky týkajúce sa opätovného získania štatútu oblasti bez výskytu chorôb v prípade suchozemských priestorov zahŕňajúcich jednu jedinú farmu, ktorá bola predtým vyhlásená za oblasť so zdravotným štatútom kategórie I

Opätovné zarybňovanie sa uskutoční len vtedy, keď všetky farmy úradne vyhlásené za infikované boli vyprázdnené, vyčistené, vydezinfikované a úhorované v súlade s bodom I.2.2.1 písm. c);

c)

jedna veterinárna kontrola; v tých farmách, kde testy uvedené v podbode i) priniesli negatívne výsledky, veterinárne kontroly pokračujú raz mesačne až do zrušenia ochrannej zóny v súlade s bodom I.2.2.1 písm. c);

v pobrežných oblastiach: oblasti, ktorá okolo ochrannej zóny presahuje pásma posunu prílivu; alebo oblasti okolo ochrannej zóny, ktorá patrí do okruhu s priemerom 10 km od stredu ochrannej zóny; alebo rovnocennej oblasti určenej na základe príslušných hydrodynamických alebo epidemiologických údajov; alebo

Uzavretá oblasť sa musela vymedziť na základe jednotlivých prípadov, so zohľadnením faktorov, ktoré majú vplyv na riziká rozširovania ISA na chované alebo voľne žijúce ryby, ako sú: počet, miera a rozloženie úhynu rýb na farme infikovanej ISAV s deléciou v HPR alebo potvrdenou ISA; vzdialenosť k susedným farmám a hustota susedných fariem; blízkosť bitúnkov; farmy, ktoré sú v styku; druhy prítomné na farmách; chovné postupy uplatňované na postihnutých farmách a na susedných farmách; zistené hydrodynamické podmienky a ostatné faktory epidemiologického významu.

ak sa počas realizácie programu dohľadu na farme zahrnutej do uvedeného programu dohľadu potvrdila ISA, a na základe toho sa zrušil jej zdravotný štatút kategórie II, musel sa realizovať eradikačný program v súlade s bodom I.2.2.

c)

farmy alebo miesta odberu vzoriek boli podrobené veterinárnym kontrolám a odberu vzoriek minimálne počas dvoch po sebe nasledujúcich rokov, ako je to stanovené v tabuľke 3.A v oddiele II;

Členský štát, zóna alebo priestor, ktoré majú zdravotný štatút kategórie III v súlade s časťou B prílohy III k smernici 2006/88/ES v súvislosti s ISA, môžu dosiahnuť zdravotný štatút kategórie I v súvislosti s danou chorobou uvedenou v zozname, ak všetky farmy držiace vnímavé druhy uvedené v časti II prílohy IV k smernici 2006/88/ES v rámci uvedeného členského štátu, zóny alebo priestoru spĺňajú príslušné požiadavky stanovené v prílohe V k uvedenej smernici a všetky uvedené farmy, a ak sa to vyžaduje v druhom odseku bodu 2 časti I prílohy V k uvedenej smernici, aj miesta odberu vzoriek v prípade voľne žijúcich populácií vybraných v súlade s uvedeným bodom, boli podrobené tomuto programu dohľadu:

ak sa na produkciu rýb využíva viac ako jeden vodný zdroj, do vzorky sa musia zahrnúť ryby reprezentujúce všetky vodné zdroje;

c)

c)

všetky farmy úradne vyhlásené za infikované a všetky ostatné farmy, ktoré boli úhorované alebo podrobené alternatívnym opatreniam v súlade s písm. a) v rámci zriadenej ochrannej zóny a zóny pozorovania boli opätovne zarybnené rybami pochádzajúcimi z členských štátov, zón alebo priestorov so zdravotným štatútom kategórie I, II alebo III, pokiaľ ide o KHVD;

sú splnené požiadavky stanovené v bode I.2.2.1 písm. a), b) a c). V prípade, ak úhorovanie nie je technicky možné, dotknuté farmy podliehajú alternatívnemu opatreniu, na základe ktorého sa poskytuje takmer rovnaká záruka, pokiaľ ide o vyhubenie KHV v prostredí farmy;

I.4. Osobitné požiadavky na zrušenie opatrení na zabránenie šíreniu podľa článku 39 smernice 2006/88/ES s cieľom získať zdravotný štatút kategórie III v súvislosti s KHVD v členských štátoch, priestoroch alebo zónach so zdravotným štatútom kategórie V

Ak sa na udržanie zdravotného štatútu kategórie I vyžaduje cielený dohľad podľa článku 52 smernice 2006/88/ES, všetky farmy držiace vnímavé druhy uvedené v časti II prílohy IV k uvedenej smernici v rámci príslušného členského štátu, zóny alebo priestoru podliehajú veterinárnej kontrole a odberu vzoriek v súlade s tabuľkou 2.B stanovenou v oddiele III tejto časti, so zohľadnením úrovne rizika farmy v súvislosti s nakazením KHV.

bola opätovne zarybnená rybami pochádzajúcimi z členských štátov, zón alebo priestorov so zdravotným štatútom kategórie I alebo priestorov so schváleným programom dohľadu, pokiaľ ide o KHVD (zdravotný štatút kategórie II).

Suchozemský priestor zahŕňajúci jednu jedinú farmu so zdravotným štatútom kategórie I v súvislosti s KHVD, ktorej zdravotný štatút v súvislosti s KHVD je nezávislý od okolitých prírodných vôd v súlade s bodom 3 časti II prílohy V k smernici 2006/88/ES a ktorej štatút kategórie I bol zrušený v súlade s článkom 53 ods. 3 uvedenej smernice, môže opätovne získať zdravotný štatút kategórie I v súvislosti s KHVD okamžite potom, ako príslušný orgán potvrdil, že boli splnené tieto podmienky:

Opätovné zarybňovanie sa uskutoční len vtedy, keď všetky farmy úradne vyhlásené za infikované boli vyprázdnené, vyčistené, vydezinfikované a úhorované v súlade s bodom I.2.2.1 písm. c);

počas prechodného obdobia do 31. decembra 2020, rybami z členských štátov, zón alebo priestorov so schváleným programom dohľadu v súvislosti s KHVD.

rybami pochádzajúcimi z členských štátov, zón alebo priestorov so zdravotným štatútom kategórie I v súvislosti s KHVD; alebo

c)

jedna veterinárna kontrola; v tých farmách, kde testy uvedené v bode III.2 priniesli negatívne výsledky; veterinárne kontroly pokračujú raz mesačne počas obdobia, keď je pravdepodobné, že teplota vody dosiahne > 15 °C, až kým sa ochranná zóna nezruší v súlade s bodom I.2.2.1 písm. c);

Uzavretá oblasť sa musela vymedziť na základe jednotlivých prípadov, so zohľadnením faktorov, ktoré majú vplyv na riziká rozširovania KHVD na chované a voľne žijúce ryby, ako sú: počet, miera a rozloženie úhynov rýb na farme infikovanej KHV; vzdialenosť k susedným farmám a hustota susedných fariem; blízkosť bitúnkov; farmy, ktoré sú v styku; druhy prítomné na farmách; chovné postupy uplatňované na postihnutých farmách a na susedných farmách; zistené hydrodynamické podmienky a ostatné faktory epidemiologického významu.

bola opätovne zarybnená rybami pochádzajúcimi z členských štátov, zón alebo priestorov so zdravotným štatútom kategórie I v súvislosti s KHVD.

ak sa počas realizácie štvorročného programu dohľadu uvedeného v písm. a) na farme zaradenej do uvedeného programu dohľadu potvrdí infekcia KHV, a na základe toho sa jej zrušil zdravotný štatút kategórie II, uvedená farma môže okamžite znovu získať zdravotný štatút kategórie II a pokračovať v realizácii programu dohľadu s cieľom dosiahnuť štatút oblasti bez výskytu chorôb bez toho, aby uplatňovala eradikačný program, ako sa opisuje v bode I.2.2, za predpokladu, že daná farma spĺňa tieto podmienky:

Farmy alebo miesta odberu vzoriek museli byť podrobené veterinárnym kontrolám a odberu vzoriek minimálne počas obdobia štyroch po sebe nasledujúcich rokov, ako je to stanovené v tabuľke 2.B v oddiele III.

model B – štvorročný program dohľadu so zníženým množstvom vzoriek

Farmy alebo miesta odberu vzoriek museli byť podrobené veterinárnym kontrolám a odberu vzoriek minimálne počas obdobia dvoch po sebe nasledujúcich rokov, ako je to stanovené v tabuľke 2.A v oddiele III.

členský štát, zóna alebo priestor, ktoré majú zdravotný štatút kategórie III v súvislosti s KHVD, môžu dosiahnuť zdravotný štatút kategórie I, ak sú všetky farmy držiace vnímavé druhy uvedené v časti II prílohy IV k smernici 2006/88/ES v rámci uvedeného členského štátu, zóny alebo priestoru v súlade s požiadavkami týkajúcimi sa štatútu oblasti bez výskytu chorôb, ktoré sú stanovené v prílohe V k uvedenej smernici, a všetky uvedené farmy, a ak sa to vyžaduje v druhom odseku bodu 2 časti I uvedenej prílohy, aj miesta odberu vzoriek v prípade voľne žijúcich populácií vybraných v súlade s uvedenou časťou, boli podrobené jednému z týchto programov dohľadu:

ak sa na chov rýb využíva viac ako jeden vodný zdroj, do odberu vzoriek musia byť zahrnuté ryby zo všetkých vodných zdrojov;

odobrať vzorky pri výlove alebo počas inej manipulácie s rybami ako súčasť bežných postupov riadenia. Ak je to možné, vzorky sa odoberajú 24 až 72 hodín po takýchto postupoch riadenia na zvýšenie pravdepodobnosti detekcie KHV.

odobrať subpopuláciu pri prenose zo zimných do letných rybníkov a držať ryby v rovnakej vode ako v letnom rybníku dovtedy, kým sa nedosiahnu minimálne požiadavky týkajúce sa teploty, alebo

Vždy, keď je to možné, sa odoberú vzorky z rýb, ktoré boli dlhší čas držané v teplotnom rozsahu priaznivom pre vírus, konkrétne dva až tri týždne pri teplote 15 °C až 26 °C. Za prijateľný sa však môže považovať aj tento prístup:

Cielený dohľad sa musí zakladať na pravidelnom monitorovaní lokalít držiacich vnímavé druhy. Lokality sa monitorujú, keď teploty vody dosiahnu úrovne, ktoré umožňujú rozvoj choroby (> 15 °C), a to nie skôr ako dva týždne od dátumu, keď sa tieto teploty dosiahli. Odoberú a otestujú sa vzorky zo všetkých chorých rýb alebo rýb vykazujúcich neobvyklé správanie, ktoré sa v lokalite nájdu.

c)

c)

Systém dohľadu so zníženou veľkosťou vzorky na štvorročné kontrolné obdobie uvedené v bode I.2.1. písm. a) podbode ii), ktoré predchádza dosiahnutiu štatútu oblasti bez výskytu VHS alebo IHN

c)

c)

Diagnostickou metódou v súlade so schválenými diagnostickými metódami a postupmi stanovenými v bode I. časti 1 prílohy II na dosiahnutie alebo na udržanie štatútu oblasti bez výskytu chorôb v súvislosti buď s VHS alebo IHN alebo obomi chorobami je buď:

c)

všetky farmy úradne vyhlásené za infikované a všetky ostatné farmy, ktoré boli úhorované alebo podliehali alternatívnym opatreniam v súlade s písm. a) v rámci zriadených ochranných zón a zón pozorovania boli opätovne zarybnené rybami pochádzajúcimi z členských štátov, zón alebo priestorov so zdravotným štatútom kategórie I, II alebo III, pokiaľ ide buď o VHS alebo IHN alebo obe choroby;

sú splnené požiadavky stanovené v bode I.2.2.1 písm. a), b) a c). V prípade, ak úhorovanie nie je technicky možné, dotknuté farmy podliehajú alternatívnemu opatreniu, na základe ktorého sa poskytuje takmer podobná záruka, pokiaľ ide o vyhubenie buď IHNV alebo VHSV alebo oboch chorôb v prostredí farmy;

Pri určovaní frekvencie veterinárnych kontrol v prípade priestorov so zdravotným štatútom kategórie I, pokiaľ ide buď o VHS alebo IHN alebo obe choroby, ktoré sú umiestnené v suchozemských oblastiach a ktorých zdravotný štatút, pokiaľ ide o VHS alebo IHN, závisí od zdravotného štatútu populácií vodných živočíchov v okolitých prírodných vodách v súlade s bodom 2 časti II prílohy V k smernici 2006/88/ES, sa riziko nakazenia buď VHS alebo IHN alebo obomi chorobami považuje za vysoké.

Ak sa na udržanie zdravotného štatútu kategórie I vyžaduje cielený dohľad podľa článku 52 smernice 2006/88/ES, všetky farmy držiace vnímavé druhy uvedené v časti II prílohy IV k uvedenej smernici v rámci príslušného členského štátu, zóny alebo priestoru podliehajú veterinárnej kontrole a vzorky rýb sa odoberajú v súlade s tabuľkou 1.C stanovenou v oddiele II tejto časti, so zohľadnením úrovne rizika farmy v súvislosti s nakazením buď VHS alebo IHN alebo obomi danými chorobami uvedenými v zozname.

farma úradne vyhlásená za infikovanú buď VHS alebo IHN alebo obomi chorobami bola opätovne zarybnená rybami pochádzajúcimi z členských štátov, zón alebo priestorov so zdravotným štatútom kategórie I buď v súvislosti VHS alebo IHN alebo obomi chorobami.

Opätovné zarybňovanie sa uskutoční len vtedy, keď všetky farmy úradne vyhlásené za infikované boli vyprázdnené, vyčistené, vydezinfikované a úhorované v súlade s bodom I.2.2.1 písm. c);

všetky farmy úradne vyhlásené za infikované buď VHS alebo IHN alebo obomi danými chorobami uvedenými v zozname a všetky ostatné farmy úhorované v rámci zriadených ochranných zón a zón pozorovania podľa písm. c) musia byť opätovne zarybnené rybami pochádzajúcimi z členských štátov, zón alebo priestorov so zdravotným štatútom oblasti bez výskytu chorôb (kategória I), pokiaľ ide buď o VHS alebo IHN alebo obe choroby.

c)

veterinárna kontrola: v tých farmách, kde testy uvedené v podbode i) priniesli negatívne výsledky; veterinárne kontroly pokračujú raz mesačne počas obdobia, keď je teplota vody nižšia ako 14 °C, okrem prípadov, keď sú rybníky alebo sieťové klietky pokryté ľadom, až kým sa ochranná zóna nezruší v súlade s bodom I.2.2.1. písm. c);

v pobrežných oblastiach: oblasti, ktorá okolo ochrannej zóny presahuje pásma posunu prílivu; alebo oblasti okolo ochrannej zóny, ktorá patrí do okruhu s priemerom 10 km od stredu ochrannej zóny; alebo rovnocennej oblasti určenej na základe príslušných hydrodynamických alebo epidemiologických údajov;

Uzavretá oblasť sa musela vymedziť na základe jednotlivých prípadov, so zohľadnením faktorov, ktoré majú vplyv na riziká rozširovania daných chorôb uvedených v zozname na chované a voľne žijúce ryby, ako sú: počet, miera a rozdelenie úhynu rýb na farme infikovanej buď VHS alebo IHN alebo obomi chorobami; vzdialenosť k susedným farmám a hustota týchto susedných fariem; blízkosť bitúnkov; farmy, ktoré sú v styku; druhy prítomné na farmách; chovné postupy uplatňované na postihnutých farmách a na farmách susediacich s postihnutými farmami; zistené hydrodynamické podmienky a ostatné faktory epidemiologického významu.

Členský štát, zóna alebo priestor so zdravotným štatútom kategórie V, pokiaľ ide buď o VHS alebo IHN alebo obe choroby, môžu dosiahnuť zdravotný štatút kategórie I v súvislosti s danými chorobami uvedenými v zozname, pod podmienkou, že všetky farmy držiace vnímavé druhy uvedené v časti II prílohy IV k smernici 2006/88/ES v rámci daného členského štátu, zóny alebo priestoru boli predmetom eradikačného programu, ktorý je v súlade s písm. a) až e):

bola opätovne zarybnená rybami pochádzajúcimi z členských štátov, zón alebo priestorov so zdravotným štatútom kategórie I buď v súvislosti s VHS alebo IHN alebo obomi chorobami.

ak sa počas realizácie programu dohľadu uvedeného v písm. a) na farme zaradenej do uvedeného programu dohľadu potvrdila infekcia VHS alebo IHN alebo obomi chorobami, a na základe toho sa danej farme zrušil zdravotný štatút kategórie II, uvedená farma môže okamžite znovu získať svoj zdravotný štatút kategórie II a pokračovať v realizácii programu dohľadu s cieľom získať štatút oblasti bez výskytu chorôb bez toho, aby uplatňovala eradikačný program, ako sa uvádza v bode I.2.2, za predpokladu, že daná farma spĺňa tieto podmienky:

Farmy alebo miesta odberu vzoriek museli byť podrobené veterinárnym kontrolám a odberu vzoriek minimálne počas štyroch po sebe nasledujúcich rokov, ako je to stanovené v tabuľke 1.B uvedenej v oddiele II.

model B – štvorročný program dohľadu so zníženou veľkosťou vzorky:

Farmy alebo miesta odberu vzoriek museli byť podrobené veterinárnym kontrolám a odberu vzoriek minimálne počas dvoch po sebe nasledujúcich rokov, ako je to stanovené v tabuľke 1.A v oddiele II.

členský štát, zóna alebo priestor, ktoré majú zdravotný štatút kategórie III podľa časti B prílohy III k smernici 2006/88/ES v súvislosti s VHS alebo IHN alebo obomi chorobami, môžu dosiahnuť zdravotný štatút kategórie I v súvislosti s danými chorobami uvedenými v zozname, pod podmienkou, že všetky farmy držiace vnímavé druhy uvedené v časti II prílohy IV k uvedenej smernici v rámci uvedeného členského štátu, zóny alebo priestoru sú v súlade s požiadavkami stanovenými v prílohe V k uvedenej smernici a všetky uvedené farmy, a ak sa to vyžaduje v druhom odseku bodu 2 časti I prílohy V k uvedenej smernici, aj miesta odberu vzoriek v prípade voľne žijúcich populácií vybraných v súlade s uvedenou časťou, boli podrobené jednému z týchto programov dohľadu:

ak sú prítomné slabé, abnormálne sa správajúce alebo čerstvo uhynuté, ale nerozložené ryby, takéto ryby sa vyberú; ak sa na produkciu rýb využíva viac ako jeden vodný zdroj, do vzorky sa zahrnú ryby reprezentujúce všetky vodné zdroje;

c)

veterinárne kontroly, a ak je to vhodné, odber vzoriek, sa vykonávajú v období roka, keď je teplota vody nižšia ako 14 °C, alebo vtedy, keď je pravdepodobné, že teplota vody dosiahne svoje najnižšie ročné hodnoty;

c)

„suchozemský priestor“ je jedna farma alebo viacero fariem nachádzajúcich sa v suchozemskej časti jedného alebo viacerých členských štátov v rámci spoločného systému biologickej bezpečnosti, ktorá obsahuje populáciu vodných živočíchov s jasne odlíšeným zdravotným štatútom v súvislosti so špecifickou chorobou;

opatrenia na zabránenie šíreniu chorôb, ktoré sa majú prijať v prípade potvrdenia výskytu choroby uvedenej v zozname, uvedené v článku 39 smernice 2006/88/ES, a opatrenia, ktoré sa majú prijať s cieľom získať zdravotný štatút kategórie III pre členský štát, zónu alebo priestor so zdravotným štatútom kategórie V.

c)

PRÍLOHA II

PODROBNÉ DIAGNOSTICKÉ METÓDY A POSTUPY

I. Úvod

V tejto prílohe sa stanovujú podrobné postupy týkajúce sa diagnostických metód, ktoré sa majú použiť na laboratórne vyšetrenie v eradikačných programoch a programoch dohľadu uvedených v prílohe I k tomuto rozhodnutiu, a s cieľom potvrdiť alebo vylúčiť podozrenie na výskyt týchto neexotických chorôb uvedených v časti II prílohy IV k smernici 2006/88/ES (ďalej len „choroby uvedené v zozname“) v súlade s článkom 57 písm. b) uvedenej smernice:

1. Vírusová hemoragická septikémia (VHS) Časť 1 2. Infekčná hematopoetická nekróza (IHN) Časť 1 3. Herpesviróza kaprov koi (KHV) Časť 2 4. Infekčná anémia lososov (ISA) Časť 3 5. Marteilióza (Marteilia refringens) Časť 4 6. Bonamióza (Bonamia ostreae) Časť 5 7. Choroba bielych škvŕn (WSD) Časť 6

II. Vymedzenie pojmov

Na účely tejto prílohy je „transportné médium“ médium na kultiváciu buniek s 10 % teľacím sérom a s 200 iu penicilínu, 200 μg streptomycínu a 200 μg kanamycínu na mililiter alebo s inými antibiotikami s preukázanou účinnosťou.

ČASŤ 1

PODROBNÉ DIAGNOSTICKÉ METÓDY A POSTUPY NA DOHĽAD NAD IHN A VHS A POTVRDENIE IHN A VHS

I. Diagnostické metódy a postupy na dohľad nad VHS a IHN

Pri výkone odberu vzoriek a laboratórneho vyšetrenia na účely získania alebo udržania zdravotného štatútu oblasti bez výskytu chorôb, pokiaľ ide o IHN alebo VHS, ako sa stanovuje v oddiele I časti 1 prílohy I, s použitím diagnostických metód stanovených v bodoch II.1 a II.2 časti 1 uvedenej prílohy, sa uplatňujú podrobné diagnostické metódy a postupy stanovené v bodoch I.1 až I. 6.

I.1. Príprava a zasielanie vzoriek rýb

I.1.1. Tkanivá na virologické vyšetrenie na bunkovej kultúre

Pred zasielaním alebo prepravou do laboratória sa z rýb sterilnými pitevnými nástrojmi vyberú časti orgánov, ktoré majú byť vyšetrené, vložia sa do sterilných plastových skúmaviek, ktoré obsahujú transportné médium.

Množstvo materiálu z rýb, ktoré je vhodné na virologické vyšetrenie na bunkovej kultúre a prostredníctvom RT-qPCR, závisí od veľkosti rýb. Preto sú vzorkovanými tkanivami celý vreckový plôdik (dĺžka tela < 4 cm), vnútornosti vrátane obličiek (4 cm < dĺžka tela < 6 cm), alebo, v prípade rýb väčšej veľkosti, sú to obličky, slezina, srdce a/alebo mozog a vaječníková tekutina z chovu generačných rýb v čase neresenia.

Vaječníková tekutina alebo semenná tekutina alebo časti orgánov najviac z 10 rýb môžu byť vložené do jednej sterilnej skúmavky, ktorá obsahuje aspoň 4 ml transportného média a predstavuje jednu zmesnú vzorku. Tkanivo v každej vzorke musí vážiť aspoň 0,5 gramu g).

Virologické vyšetrenie na bunkovej kultúre sa začne čo najskôr, a najneskôr do 48 hodín po odobratí vzoriek. Vo výnimočných prípadoch môže virologické vyšetrenie začať najneskôr do 72 hodín po odobratí materiálu, a to za predpokladu, že materiál, ktorý má byť vyšetrovaný, je chránený transportným médiom, a že je počas prepravy možné dodržať požiadavky na teplotu.

I.1.2. Vzorky na analýzu pomocou polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou (RT-PCR alebo RT-qPCR)

Vzorky sa odoberú z rýb v súlade s postupom opísaným v bode I.1.1 s použitím sterilného nástroja a vložia sa do sterilnej plastovej skúmavky, ktorá obsahuje transportné médium. Tkanivo z 10 rýb sa môže odobrať do jednej skúmavky, pričom predstavuje jednu zmesnú vzorku. Ak je však množstvo inokula malé, môže sa použiť tkanivo maximálne z piatich rýb. Alternatívnym spôsobom môže byť odobratie zmesnej vzorky do činidla na stabilizáciu RNA, napríklad 0,2 g tkaniva/ml činidla podľa odporúčania výrobcov, hoci každá ryba sa spracúva jednotlivo a nesmie sa vo vzorkách spojiť vzhľadom na malé množstvo materiálu, ktoré sa má použiť na extrakciu.

Do laboratória sa môžu odoslať aj celé ryby.

I.2. Zasielanie vzoriek v prípade rýb

Skúmavky, ktoré obsahujú tkanivá rýb v transportnom médiu na kultiváciu buniek alebo analýzu RT-PCR/RT-qPCR sa umiestnia do izolovaných nádob, ako sú polystyrénové krabice s hrubými stenami, spolu s dostatočným množstvom ľadu alebo alternatívnym chladiacim médiom s podobným chladiacim účinkom na zabezpečenie chladenia vzoriek počas prepravy do laboratória. Je potrebné vyvarovať sa zmrazenia vzoriek. Teplota vzorky počas prepravy nesmie nikdy prekročiť 10 °C, pričom v transportnej prepravke musí byť aj pri prevzatí ešte stále prítomný ľad alebo jeden alebo viaceré chladiace vložky musia byť stále čiastočne alebo úplne zamrznuté.

Do laboratória môžu byť odoslané celé ryby, ak je počas prepravy možné splniť požiadavky na teplotu uvedené v prvom odseku. Celé ryby sa zabalia do papiera s absorpčnými vlastnosťami a nakoniec sú zasielané v plastovom vrecku. Môžu sa zasielať aj živé ryby.

I.3. Odber doplnkového diagnostického materiálu

V prípade schválenia diagnostickým laboratóriom môžu byť na doplňujúce vyšetrenia odobraté a pripravené aj iné tkanivá rýb.

I.4. Príprava vzoriek na vyšetrenie na bunkovej kultúre a RT-qPCR

I.4.1. Zmrazovanie vo výnimočných prípadoch

Ak vzniknú praktické problémy, ktoré znemožňujú spracovanie vzoriek do 48 hodín od odberu tkaniva rýb, môže byť prípustné zmraziť vzorky tkanív v transportnom médiu pri teplote – 20 °C alebo nižšej a vykonať virologické vyšetrenie do 14 dní. Tkanivá rýb sa však pred vyšetrením zmrazia a rozmrazia iba raz. Musia byť vedené záznamy s informáciami o dôvode každého zmrazenia vzoriek tkaniva rýb.

I.4.2. Homogenizácia orgánov

Rybie tkanivo, ktoré je v skúmavkách, sa v laboratóriu úplne homogenizuje (homogenizátorom stomacher, mixérom alebo trecou miskou a roztieradlom so sterilným pieskom) a následne suspenduje v pôvodnom transportnom médiu.

Ak vzorka pozostáva z celých rýb kratších ako 4 cm, na drobné kúsky sa nastrihá sterilnými nožnicami alebo poseká skalpelom po odstránení tela za črevným otvorom. Ak vzorka pozostáva z celých rýb s dĺžkou tela 4 až 6 cm, uskutoční sa odber vnútorností vrátane obličiek. Ak vzorka pozostáva z celých rýb dlhších ako 6 cm, vzorky tkaniva sa odoberajú tak, ako je to opísané v bode I.1. Vzorky tkaniva sa na drobné kúsky nastrihajú sterilnými nožnicami alebo skalpelom, homogenizujú sa podľa opisu v prvom odseku tohto bodu a suspendujú v transportnom médiu.

Konečný pomer medzi tkanivovým materiálom a transportným médiom je v laboratóriu upravený na 1:10.

I.4.3. Centrifugácia homogenátu

Homogenát sa centrifuguje v odstredivke chladenej na teplotu 2 °C až 5 °C a pri 2 000 až 4 000 × g počas 15 minút a supernatant sa odoberá a môže sa ošetriť antibiotikami buď počas štyroch hodín pri teplote 15 °C, alebo cez noc pri teplote 4 °C až 8 °C. Ak bola vzorka zaslaná v transportnom médiu, ošetrenie supernatantu antibiotikami možno vynechať.

Ak vzniknú praktické problémy, ako je porucha inkubátora alebo problémy s bunkovými kultúrami, ktoré znemožňujú naočkovanie buniek do 48 hodín od odberu vzoriek tkaniva rýb, supernatant sa môže zmraziť pri teplote – 80 °C a virologické vyšetrenie sa môže vykonať do 14 dní.

Ak je odobratý supernatant skladovaný pri teplote – 80 °C počas 48 hodín po odbere vzorky, na virologické vyšetrenie môže byť znovu použitý len raz.

Pred naočkovaním buniek sa supernatant zmieša s rovnakým množstvom vhodne zriedeného antiséra proti indigénnemu sérotypu vírusu infekčnej pankreatickej nekrózy (IPN) a inkubuje sa s ním aspoň jednu hodinu pri teplote 15 °C alebo maximálne 18 hodín pri teplote 4 °C. Titer antiséra je aspoň 1:2 000 v 50 % plakovom neutralizačnom teste.

Cieľom ošetrenia všetkých inokul antisérom proti vírusu IPN je zabránenie vzniku cytopatického efektu (CPE) v dôsledku vírusu IPN v naočkovaných bunkových kultúrach. Tým sa skráti trvanie virologických vyšetrení, ako aj počet prípadov, pri ktorých by výskyt CPE musel byť považovaný za možný indikátor VHSV alebo IHNV.

Ak vzorky pochádzajú z výrobných jednotiek, ktoré sú považované za oblasti bez výskytu vírusu IPN, ošetrenie inokulom s antisérom proti vírusu IPN sa smie vynechať.

I.4.4. Príprava vzoriek na programy dohľadu založené na RT-PCR a RT-qPCR

Ak boli vzorky odobrané do transportného média, vykoná sa postup uvedený v bodoch I.4.2 a I.4.3. Po centrifugácii sa odoberie supernatant a extrahuje RNA. Ak sa po centrifugácii nemá hneď vykonať ďalšie vyšetrenie, vzorky sa okamžite zmrazia pri teplote – 20 °C alebo nižšej.

Na analýzu tkanív rýb konzervovaných v činidle na stabilizáciu RNA sa vykoná ďalšia práca v týchto časových rámcoch v prípade vzoriek skladovaných pri rôznych teplotách:

vzorky skladované pri 37 °C: jeden deň;

vzorky skladované pri 25 °C: jeden týždeň;

vzorky skladované pri 4 °C: jeden mesiac;

vzorky skladované pri – 20 °C: na neurčito.

Zmesné vzorky v činidle na stabilizáciu RNA sa spracúvajú ako samostatné vzorky v činidle na stabilizáciu RNA. V prípade zmesných vzoriek v činidle na stabilizáciu RNA množstvo vzorky nesmie prekročiť hodnotu odporúčanú výrobcom na extrakciu so súpravami RNA, ako sú RNeasy Mini kits (Qiagen) alebo podobné súpravy. Ak sa spájajú väčšie vzorky, je potrebné to zohľadniť a použiť vhodné extrakčné súpravy alebo metódy.

Vzorky odobraté do činidiel na stabilizáciu RNA sa nepoužívajú na kultiváciu buniek.

I.4.5. Spájanie vzoriek na RT-qPCR

Keďže dané protokoly RT-qPCR majú podobnú alebo vyššiu citlivosť ako metódy kultivácie buniek, za prijateľné riešenie sa môže považovať, ak sa na PCR použije supernatant z homogenizovaného materiálu tkanív zmesných vzoriek orgánov najviac 10 rýb v médiu na kultiváciu buniek. Vzhľadom na to, že inokulum použité na PCR je v porovnaní s kultiváciou buniek oveľa menšie, sa však všetky tkanivá rýb pred spojením materiálu na extrakciu dôkladne homogenizujú.

Rovnaká zásada sa uplatňuje aj vtedy, ak sa vzorky odoberajú v činidlách na stabilizáciu RNA. V takom prípade je však často obtiažne vykonať odber reprezentatívneho materiálu až 10 rýb do jednej skúmavky, a preto sa počet rýb v zmesnej vzorke musí znížiť na 2 až 5.

I.5. Virologické vyšetrenie na bunkovej kultúre

I.5.1. Bunkové kultúry a médiá

Bunkové línie BF-2 poteru zo slnečnice modrožiabrovej (Bluegill fry) alebo RTG-2 gonád pstruha dúhového (Rainbow trout gonad) a buď bunky EPC (Epithelioma papulosum cyprini) alebo FHM (čerebľa potočná, Fathead minnow) sa kultivujú pri teplote 20 až 30 °C vo vhodnom médiu, konkrétne v minimálnom základnom médiu podľa Eagla (MEM) alebo v jeho modifikáciách, s prídavkom 10 % séra získaného z plodov hovädzieho dobytka a antibiotík v štandardných koncentráciách.

Ak sú bunky kultivované v uzatvorených nádobách, médium sa pufruje hydrogénuhličitanom. Médium použité na kultiváciu buniek v otvorených jednotkách sa môže tlmiť pomocou tris(hydroxymetyl)aminometánu-HCl (Tris-HCl) (23 mM) a hydrogénuhličitanu sodného (6 mM). pH musí byť 7,6 ± 0,2.

Bunkové kultúry, ktoré sa majú použiť na naočkovanie tkanivového materiálu rýb, musia byť mladé, zvyčajne sa pokiaľ možno použijú jeden deň staré jednovrstvové bunkové kultúry; prijateľné však môžu byť aj bunkové kultúry staré od 4 do 48 hodín. Bunky musia pri naočkovaní aktívne rásť.

I.5.2. Naočkovanie bunkových kultúr

Suspenzia orgánov spracovaná pomocou antibiotík sa naočkuje do bunkových kultúr v dvoch riedeniach, konkrétne primárny roztok a okrem toho jeho riedenie v pomere 1:10, výsledkom čoho sú konečné riedenia tkanivového materiálu v médiu na kultiváciu bufniek v pomere 1:100 a 1:1 000 (v danom poradí), s cieľom zabrániť homologickej interferencii. Naočkujú sa aspoň dve bunkové línie, ako sa uvádza v bode I.5.1. Pomer medzi veľkosťou inokula a objemom média na kultiváciu buniek je približne 1:10.

Pri každom roztoku a každej bunkovej línii sa použije bunková plocha s veľkosťou približne aspoň 2 cm2, čo zodpovedá jednej jamke v 24-jamkovej platničke pre bunkové kultúry. Podľa možnosti sa používajú platničky pre bunkové kultúry.

I.5.3. Inkubácia bunkových kultúr

Inkubácia naočkovaných bunkových kultúr sa uskutočňuje pri teplote 15 °C počas siedmich až desiatich dní. Ak sa farba média na kultiváciu buniek mení z červenej na žltú, čo naznačuje okysľovanie média, musí sa vykonať úprava pH sterilným roztokom hydrogénuhličitanu alebo ekvivalentnými látkami na zabezpečenie bunkovej vnímavosti na vírusovú infekciu.

Aspoň každých šesť mesiacov alebo pri podozrení na zníženú vnímavosť buniek sa vykoná titrácia zmrazených zásob VHSV a IHNV na overenie vnímavosti bunkových kultúr na infekciu. Podľa možnosti sa použije postup uvedený v oddiele III.

I.5.4. Mikroskopia

Naočkované bunkové kultúry sa pravidelne kontrolujú, a to aspoň trikrát týždenne, v súvislosti s výskytom CPE pri 40 až 150-násobnom zväčšení. V prípade, ak je pozorovaný CPE, je potrebné okamžite začať postupy na identifikáciu vírusu v súlade s bodom I.6.

I.5.5. Subkultivácia

Ak sa po primárnej inkubácii 7 až 10 dní nevyvinul CPE, na čerstvých bunkových kultúrach sa vykonáva subkultivácia, pričom veľkosť bunkovej plochy je podobná ploche použitej pri primárnej kultúre.

Pomerné časti média (supernatantu) zo všetkých kultúr alebo jamiek, ktoré predstavujú primárnu kultúru, sa spoja podľa bunkovej línie 7 až 10 dní po naočkovaní. Zmesné vzorky sa potom naočkujú do homologických bunkových kultúr v nezriedenom a zriedenom stave, a to 1:10 [čím sa dosiahnu konečné zriedenia supernatantu 1:10 a 1:100 (v danom poradí)], podľa opisu v bode I.5.2. Alternatívnym spôsobom je, že sa pomerné časti 10 % média, ktoré predstavujú primárnu kultúru, naočkujú priamo do jamky s čerstvou bunkovou kultúrou (konkrétne subkultivácia z jamky do jamky). Naočkovaniu môže predchádzať inkubácia príslušných riedení s antisérom proti vírusu IPN podľa opisu v bode I.4.3.

Potom sa vykoná inkubácia naočkovaných kultúr počas 7 až 10 dní pri teplote 15 °C a kontrola v súlade s bodom I.5.4.

Ak sa toxický CPE vyskytne počas prvých troch dní inkubácie, v tejto fáze sa vykoná subkultivácia, ale bunky sa potom inkubujú sedem dní a opäť subkultivujú a inkubujú ďalších sedem dní. Ak sa toxický CPE vyvinie po troch dňoch, bunky sa prenášajú len jeden raz a inkubujú tak, aby bolo dosiahnutých celkovo 14 dní od primárneho naočkovania. Počas posledných siedmich dní inkubácie nesmie byť zistený žiadny dôkaz toxicity.

Ak napriek ošetreniu antibiotikami dôjde k bakteriálnej kontaminácii, subkultivácii predchádza centrifugácia pri 2 000 to 4 000 × g počas 15 až 30 minút pri teplote 2 až 5 °C alebo filtrácia supernatantu cez 0,45 μm filter (membrána s nízkou väzbou bielkovín) alebo oba tieto kroky. Okrem toho subkultivácia uplatňuje rovnaké postupy ako postupy opísané pri toxickom CPE vo štvrtom odseku tohto bodu.

Ak sa nevyskytne CPE, test sa môže vyhlásiť za negatívny.

I.6. Identifikácia vírusu

Ak bol zistený dôkaz prítomnosti CPE v bunkovej kultúre, médium (supernatant) sa odoberie a vyšetrí jednou alebo viacerými z týchto techník: imunoenzymatická reakcia (ELISA), imunofluorescencia (IF), neutralizácia, RT-PCR alebo RT-qPCR. Ak tieto testy neumožnia definitívnu identifikáciu vírusu do jedného týždňa, supernatant sa odošle do národného referenčného laboratória alebo referenčného laboratória EÚ pre choroby rýb uvedeného v prílohe VI k smernici 2006/88/ES na okamžitú identifikáciu.

I.6.1. ELISA

Sendvičová ELISA s dvojitou protilátkou sa vykoná s cieľom identifikovať izolát vírusu. Mikrotitračné platničky sú potiahnuté 50 μl/jamku (0,9 pg) imunoglobulínmi (Ig) prečistenými vysokokvalitným proteínom A z králičieho antiséra proti IHNV alebo VSHV, ktoré sú rozpustené v uhličitanovom tlmivom roztoku (pH 9,6) s obsahom 15 mM azidu sodného, a inkubujú sa od 18 hodín do 2 týždňov pri teplote 4 °C.

Na riediacej platničke sa každá vzorka s obsahom 1 % Triton X-100 a pozitívne kontrolné vzorky zriedia tlmivým roztokom (konkrétne fosfátovým tlmivým fyziologickým roztokom (PBS)-T-BSA, 1 % BSA) v týchto štyroch pomeroch riedenia: neriedený, 1:4, 1:16, 1:64. Platničky ELISA sa premyjú PBS s obsahom 0,05 % Tween-20 (PBS-T) a z riediacej platničky sa na premytú a potiahnutú platničku ELISA prenesie 50 μl každého riedenia.

Platničky ELISA sa potom inkubujú počas 30 minút pri teplote 37 °C. Platničky sa následne premyjú a inkubujú počas 30 minút pri teplote 37 °C so špecifickými monoklonálnymi protilátkami (na identifikáciu VHSV sa použije MAb IP5B11 a na identifikáciu IHNV sa použije Hyb 136-3, v danom poradí). Na platničku ELISA sa prenesie 50μl králičích protimyšacích protilátok konjugovaných s chrenovou peroxidázou, zriedených v pomere 1:1 000 v PBS-T-BSA.

Nakoniec, po opätovnom premytí, sa vyvolajú reakcie pridaním ortofenyléndiamínu (OPD) v množstve 50 μl/jamku. Platničky ELISA sa inkubujú počas 20 minút pri izbovej teplote v tme a reakcia sa zastaví pridaním 100 μl 0,5 M H2SO4/jamku.

Absorbancia sa monitoruje pri vlnovej dĺžke 492 a 620 nm v zariadení na čítanie platničiek ELISA. Vzorky sa označia ako pozitívne alebo negatívne porovnaním hodnôt testovaných vzoriek s hodnotami absorbancie pozitívnach a negatívnych kontrol. Vo všeobecnosti sa vzorky s kombinovanou absorbanciou (A) < 0,5 pri nezriedenom materiáli považujú za negatívne, vzorky s hodnotami A medzi 0,5 a 1,0 sa považujú za podozrivé a vzorky s hodnotami A > 1,0 sa považujú za pozitívne.

Namiesto verzií ELISA, ktoré sú uvedené v tomto bode, sa môžu použiť iné verzie ELISA s preukázanou podobnou účinnosťou.

I.6.2. Imunofluorescencia – IF

Identifikácia patogénov VHSV a IHNV uvedených v zozname sa vykoná infikovaním buniek v čiernych „Black“ 96-jamkových platničkách, bežných 24-jamkových platničkách alebo na krycích sklíčkach do 24-jamkových platničiek. Ak sa VHSV alebo IHNV alebo oba zistia infikovaním buniek na krycích sklíčkach, uplatňuje sa tento protokol:

a) krycie sklíčka sa vysejú bunkami s hustotou, ktorá povedenie k zhlukovaniu medzi 60 % a 90 % po 24 hodinách od kultivácie. Na tento účel sa podľa možnosti použijú bunky EPC z dôvodu ich silnej priľnavosti k skleným povrchom, pričom však môžu byť použité aj iné bunkové línie, ako je BF-2, RTG-2 alebo FHM. 150 μl supernatantu bunkovej kultúry v dvoch rozdielnych riedeniach (1:10 and 1:1 000) sa naočkuje duplicitne na jednodňové jednovrstvové bunkové kultúry a inkubuje pri teplote 15 °C počas 24 hodín;

b) médium na kultiváciu buniek sa následne odstráni a infikované jednovrstvové bunkové kultúry sa fixujú 0,5 ml ľadového vodného acetónového roztoku (80 % vol:vol). Fixácia sa uskutoční v digestóriu počas 15 minút pri izbovej teplote, potom sa acetónový roztok odstráni a krycie sklíčka sa aspoň 30 minút sušia na vzduchu. V tejto fáze sa platničky buď ihneď spracujú alebo skladujú pri teplote – 20 °C na ďalšie použitie;

c) špecifické monoklonálne protilátky (na identifikáciu VHSV sa použije monoklonálna protilátka MAb IP5B11 a na identifikáciu IHNV sa použije Hyb 136-3, v danom poradí) sa zriedia v 0,01 M PBST, pH 7,2, v pomere odporučenom dodávateľom týchto monoklonálnych protilátok; 50 až 100 μl/jamku sa pridá k fixovanej jednovrstve a platničky sa inkubujú počas jednej hodiny pri teplote 37 °C vo vlhkej komore;

d) krycie sklíčka sa trikrát jemne premyjú PBS s obsahom 0,05 % Tween-20 (PBS-T) a tlmivý roztok sa po poslednom premytí úplne odstráni. Bunky sa potom inkubujú počas jednej hodiny pri teplote 37 °C s protilátkami proti myšiemu imunoglobulínu konjugovanými s fluorescenčným izotiokyanátom (FITC) alebo tetrametylrodamín-5-(and-6-) izotiokyanátom (TRITC), použitých ako primárna protilátka, zriedených podľa pokynov dodávateľa, potom sa opäť premyjú PBS-T a sušia. Farbené kultúry sa montujú na podložných sklíčkach s použitím roztoku glycerínu a vyšetrujú pod dopadajúcim ultrafialovým (UV) svetlom. Používajú sa okuláre 10 × alebo 12 × a šošovky objektívu × 25 alebo × 40 s numerickou apertúrou > 0,7 a > 1,3 (v danom poradí).

Pokiaľ ide o bunkové kultúry, fixáciu a protilátky referenčnej kvality, môžu byť alternatívne použité iné metódy IF s podobnou preukázanou účinnosťou.

I.6.3. Neutralizácia

Bunky sa z odobratého supernatantu odstránia centrifugáciou (2 000 až 4 000 × g) alebo membránovou filtráciou (0,45 μm) s membránou s nízkou väzbou bielkovín a supernatant sa zriedi v pomere 1:100 and 1:10 000 v médiu na kultiváciu buniek.

Pomerné časti minimálne dvoch riedení supernatantu sa zmiešajú a inkubujú počas 60 minút pri teplote 15 °C s rovnakými časťami nasledovných činidiel osobitne:

a) sérum obsahujúce skupinovo špecifickú protilátku proti VHSV pri riedení 1:50 (obj:obj);

b) sérum obsahujúce skupinovo špecifickú protilátku proti IHNV pri riedení 1:50 (obj:obj);

c) zmesné antiséra proti indigénnym sérotypom IPNV pri zriedení 1:50 (obj:obj);

d) samotné médium (pozitívna kontrola).

Z každej zmesi vírusového supernatantu a séra sa naočkujú aspoň dve bunkové kultúry (každá 50 μl) a potom sa inkubujú pri teplote 15 °C. Vývoj CPE sa kontroluje podľa opisu v bode I.5.4.

Kmene a izoláty VHSV, ktoré pri neutralizačných testoch nereagujú, sa identifikujú prostredníctvom IF alebo ELISA.

Alternatívne môžu byť použité iné neutralizačné testy s podobnou preukázanou účinnosťou.

I.6.4. RT-PCR/RT-qPCR

I.6.4.1. Príprava vírusovej RNA

Celá práca s RNA sa vykonáva na ľade a s použitím rukavíc.

RNA sa extrahuje fenol-chloroformovou metódou alebo pomocou centrifugačných kolón s afinitou k RNA, podľa pokynov výrobcu. Môžu sa použiť komerčne dostupné súpravy na extrakciu RNA, ktorými sa získa kvalitná RNA vhodná na použitie s protokolmi RT-PCR, ktoré sú podrobne opísané v nasledujúcich bodoch.

RNA sa resuspenduje v destilovanej vode bez RNázy (konkrétne vode ošetrenej 0,1 % dietyl pyrokarbonátom), alebo vo vhodnom elučnom tlmivom roztoku.

I.6.4.2. RT-PCR

Na zistenie IHNV sa použijú tieto primery:

priamy primer 5′-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3′;

reverzný primer 5′-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3′.

Použijú sa tieto cykly (jednokroková RT-PCR): 1 cyklus: 50 °C počas 30 minút; 1 cyklus: 95 °C počas 2 minút; 30 cyklov: 95 °C počas 30 sekúnd, 50 °C počas 30 sekúnd, 72 °C počas 60 sekúnd; 1 cyklus: 72 °C počas 7 minút s namočením pri 4 °C.

Na zistenie VHSV sa použijú tieto primery:

VN priamy 5′-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3′;

VN reverzný 5′-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3′.

Použijú sa tieto cykly (jednokroková RT-PCR): 50 °C počas 30 minút, 95 °C počas 15 minút, 35 cyklov pri 94 °C počas 30 sekúnd, 55 °C počas 30 sekúnd a 68 °C počas 60 sekúnd. Následne prebieha reakcia pri teplote 68 °C počas 7 minút.

Množstvo a špecificita RT-PCR reakcií sa hodnotí pomocou gélovej elektroforézy v 1,5 % agarózovom géli s etídium-bromidom a s pozorovaním pomocou UV transiluminácie. Pri IHNV možno pozorovať PCR amplikón s veľkosťou 693 bp. V prípade VHSV ide o veľkosť 505 bp.

Výsledky PCR sa môžu líšiť v závislosti od podmienok, v ktorých sa vykonáva, konkrétne môže byť v závislosti od používaného termocykléra potrebné optimalizovať termálne protokoly. Okrem toho môže dôjsť k falošne pozitívnym výsledkom z dôvodu nesprávnej anelácie primeru alebo kontaminácie laboratória. S cieľom vyhnúť sa akejkoľvek pochybnosti sa preto použijú adekvátne pozitívne a negatívne kontrolné vzorky a sekvenované amplikóny. V prípade primerov VHSV treba venovať osobitnú pozornosť používaniu buniek BF-2, keďže primery môžu reagovať s DNA/RNA tejto bunkovej línie a spôsobiť falošne pozitívne výsledky podobnej veľkosti. Pri testovaní supernatantu z buniek BF-2 sa sekvenujú všetky fragmenty amplifikované pomocou PCR.

I.6.4.3. RT-qPCR v prípade VHSV

V prípade VHSV sa amplifikácia vykonáva s použitím týchto primerov a tejto sondy:

Priamy primer: 5′-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3′;

Reverzný primer: 5′-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3′;

a sonda: 5′-FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTG-ATC-TTC-TG-BHQ1.

Jednokroková RT-qPCR:

Každý beh musí obsahovať negatívne vzorové kontrolné vzorky a pozitívne kontrolné vzorky. Podmienky cyklovania: 50 °C počas 30 minút, 95 °C počas 15 minút, 40 cyklov pri 94 °C počas 15 sekúnd, 60 °C počas 40 sekúnd a 72 °C počas 20 sekúnd; v prípade potreby sa tieto podmienky upravia. Alternatívne môžu byť použité iné verzie RT-PCR alebo RT-qPCR s podobnou preukázanou účinnosťou.

I.6.4.4. RT-qPCR v prípade IHNV

V prípade IHNV sa amplifikácia vykonáva s použitím týchto primerov a sondy:

Priamy primer: 5′- AGA-GCC-AAG-GCA-CTG-TGC-G-3′;

Reverzný primer: 5′- TTCTTTGCGGCTTGGTTGA – 3′;

a sonda: 5′ 6FAM-TGAGACTGAGCGGGACA-NFQ/MGB.

Dvojkroková RT-qPCR:

Keďže táto skúška závisí od dvojkrokovej amplifikácie, je potrebné venovať osobitnú pozornosť zaobchádzaniu so skúmavkami medzi jednotlivými reakciami, aby sa predišlo kontaminácii.

Podmienky cyklovania (po kroku RT): 50 °C počas 2 minút, 95 °C počas 10 minút, potom nasleduje 40 cyklov pri 95 °C počas 15 sekúnd a 60 °C počas 1 minúty; v prípade potreby sa tieto podmienky upravia.

Alternatívne môžu byť použité iné verzie RT-PCR alebo RT-qPCR s podobnou preukázanou účinnosťou.

II. Podrobné diagnostické metódy a postupy na potvrdenie alebo vylúčenie podozrenia na VHS alebo IHN alebo oboch chorôb pri podozrení na ohniská

Ak sa na potvrdenie alebo vylúčenie prítomnosti IHN alebo VHS alebo oboch chorôb vyžaduje laboratórne vyšetrenie v súlade s článkom 57 písm. b) smernice 2006/88/ES s použitím diagnostických metód uvedených v bode II.3 časti 1 prílohy I, uplatňujú sa tieto podrobné diagnostické metódy a postupy:

a) konvenčná izolácia vírusu s následnou sérumneutralizačnou, imunochemickou alebo molekulárnou identifikáciou vírusu;

b) detekcia vírusu prostredníctvom RT-PCR alebo RT-qPCR;

c) iné diagnostické techniky, ako sú IFAT, ELISA, RT-PCR, IHC.

II.1. Konvenčná izolácia vírusu s následnou identifikáciou vírusu

II.1.1. Výber vzoriek

Na vyšetrenie sa vyberie aspoň 10 rýb, ktoré majú typické príznaky IHN alebo VHS.

II.1.2. Príprava a zasielanie vzoriek rýb

Pri príprave a zasielaní na účely konvenčnej izolácie vírusu sa dodržiavajú metódy a postupy uvedené v bode I.2.

II.1.3. Odber doplnkového diagnostického materiálu

Pri odbere doplnkového materiálu na účely konvenčnej izolácie vírusu sa dodržiavajú metódy a postupy uvedené v bode I.3.

II.1.4. Príprava vzoriek na vyšetrenie bunkovej kultúry

Pri príprave vzoriek na vyšetrenie bunkovej kultúry na účely konvenčnej izolácie vírusu sa dodržiavajú metódy a postupy uvedené v bode I.4.

II.1.5. Virologické vyšetrenie na bunkovej kultúre

Pri virologickom vyšetrení na účely konvenčnej izolácie vírusu sa dodržiavajú metódy a postupy uvedené v bode I.5.

II.1.6. Identifikácia vírusu

Pri identifikácii vírusu na účely konvenčnej izolácie vírusu sa dodržiavajú metódy a postupy uvedené v bode I.6.

II.2. Detekcia vírusu prostredníctvom RT-qPCR

II.2.1. Výber vzoriek

Pri výbere vzoriek na účely detekcie vírusu prostredníctvom RT-qPCR sa dodržiavajú metódy a postupy uvedené v bode I.1.2.

II.2.2. Príprava a zasielanie vzoriek rýb

Pri príprave a zasielaní na účely detekcie vírusu prostredníctvom RT-qPCR sa dodržiavajú metódy a postupy uvedené v bode I.2.

II.2.3. Odber doplnkového diagnostického materiálu

Pri odbere doplnkového diagnostického materiálu na účely detekcie vírusu prostredníctvom RT-qPCR sa dodržiavajú metódy a postupy uvedené v bode I.3.

II.2.4. Príprava vzoriek na RT-qPCR

Pri príprave vzoriek na účely detekcie vírusu prostredníctvom RT-qPCR sa dodržiavajú metódy a postupy uvedené v bode I.6.4.1.

II.2.5. RT-qPCR

Pri detekcii vírusu prostredníctvom RT-qPCR sa dodržiavajú metódy a postupy uvedené v bodoch I.6.4.1, I.6.4.3 a I.6.4.4.

II.3. Iné diagnostické techniky

Supernatant pripravený podľa opisu v bode I.4.3. sa môže predložiť na test ELISA, nepriamy imunofluorescenčný test (IFAT) alebo na RT-PCR v súlade s bodom I.6.1, bodom I.6.2 alebo bodom I.6.4 (v uvedenom poradí). Tkanivový materiál môže byť podrobený iným diagnostickým technikám, ako je IFAT na rezoch zmrazeného materiálu, imunohistochémia tkaninového materiálu fixovaného formalínom. Uvedené rýchle techniky sa doplnia virologickým vyšetrením v súlade buď s bodom II písm. a), alebo bodom II písm. b), do 48 hodín po odbere vzoriek, ak:

a) je zistený negatívny výsledok; alebo

b) je zistený pozitívny výsledok pri materiáli, ktorý predstavuje prvý prípad IHN alebo VHS.

III. Postup titrácie na overenie vnímavosti bunkových kultúr na infekciu

Ak sa vykoná titrácia na overenie vnímavosti bunkových kultúr na infekciu, ako je uvedené v bode I.5.3, dodržiavajú sa postupy uvedené v nasledujúcich odsekoch tohto bodu.

Použijú sa aspoň dva izoláty VHSV a jeden izolát IHNV. V izolátoch musí byť zastúpená hlavná skupina vírusov v Európskej únii, konkrétne v prípade VHSV jeden patogénny izolát pstruha dúhového v sladkej vode a jeden patogénny izolát kambaly veľkej v slanej vode a v prípade IHNV jeden patogénny kmeň pstruha dúhového z Európskej únie. Použijú sa dobre definované izoláty z členských štátov. Dávky vírusov s nízkymi číslami pasáže sa množia v bankách s bunkovými kultúrami na bunkách BF-2 alebo RTG-2 v prípade VHSV a na bunkách EPC alebo FHM v prípade IHNV. Použije sa médium na kultiváciu buniek s aspoň 10 % sérom. Na naočkovanie sa použije nízke MOI (< 1).

V prípade celkového CPE sa vírus získava l5-minútovou centrifugáciou supernatantu bunkovej kultúry pri 2 000 × g počas 15 minút, podrobí sa sterilizačnej filtrácii pomocou membránového filtra (0,45 μm) a distribuuje v označených kryoskúmavkách. Vírus sa uchováva pri teplote – 80 °C.

Týždeň po zmrazení sa tri vialky s každým vírusom nechajú rozmraziť v studenej vode a titrujú sa na svojich príslušných bunkových líniách. Aspoň každých šesť mesiacov alebo ak existuje podozrenie na zníženie vnímavosti bunkovej línie, sa každý izolát vírusu rozmrazí a titruje.

Postupy titrácie musia byť podrobne opísané a vždy musí byť použitý rovnaký postup.

Titrácia s riedením až do konečného bodu zahŕňa najmenej šesť opakovaní každého kroku riedenia. Titre sa porovnajú s predtým získanými titrami. Ak sa titer ktoréhokoľvek z troch izolátov vírusu zníži o 2 logs alebo viac v porovnaní so začiatočným titrom, bunková línia sa ďalej nepoužíva na účely dohľadu.

Ak sa v laboratóriu nachádzajú rôzne bunkové línie, každá línia sa skúma osobitne.

Záznamy sa uchovávajú aspoň počas obdobia 10 rokov.

ČASŤ 2

PODROBNÉ DIAGNOSTICKÉ METÓDY A POSTUPY V PRÍPADE DOHĽADU NAD HERPESVIRÓZOU KAPROV KOI (KHVD) A V PRÍPADE JEJ POTVRDENIA

I. Podrobné diagnostické metódy a postupy na potvrdenie prítomnosti KHVD alebo na vylúčenie podozrenia na KHVD

Ak sa na na potvrdenie prítomnosti KHVD alebo na vylúčenie podozrenia na KHVD vyžaduje laboratórne vyšetrenie v súlade s článkom 57 písm. b) smernice 2006/88/ES s použitím diagnostických metód uvedených v oddiele III časti 2 prílohy I, uplatňujú sa tieto podrobné diagnostické metódy a postupy uvedené v bodoch I.1 – I.2 tejto časti:

I.1. Príprava vzoriek rýb

Na diagnostické účely sa na testovanie štandardnými metódami založenými na PCR alebo qPCR môžu používať ryby (zasielané živé alebo zabité a balené oddelene v zapečatených aseptických nádobách) alebo mrazené orgány alebo časti orgánov konzervované v 80 % až absolútnom etanole alebo vo vírusovom transportnom médiu (je potrebné ich spracovať do 48 hodín po odbere).

Na detekciu KHV sa odoberú žiabre a obličky; okrem toho sa do dodatočnej oddelenej vzorky môže zahrnúť slezina, mozog a črevo. V naliehavých prípadoch sa môže spojiť tkanivový materiál až piatich rýb.

Okrem toho sa v určitých prípadoch môžu použiť neletálne vzorky, ako je krv, výtery zo žiaber, biopsia zo žiaber či ster hlienu (konkrétne v prípade podozrenia na výskyt KHV sa môžu použiť veľmi cenné ryby).

I.1.1. Extrakcia DNA

DNA sa extrahuje v súlade so štandardnými postupmi.

Môžu sa použiť komerčne dostupné súpravy na extrakciu DNA, ktorými sa získava kvalitná DNA vhodná na použitie s protokolmi PCR uvedenými v bode I.2.

I.2. Detekcia pôvodcu a identifikácia prostredníctvom metód založených na polymerázovej reťazovej reakcii (PCR)

I.2.1. qPCR na detekciu KHV

Na detekciu KHV prostredníctvom qPCR sa použije táto skúška qPCR:

Priamy primer (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;

Reverzný primer (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;

a sonda (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.

Podmienky cyklovania: jeden cyklus pri 95 °C počas 15 minút, po ktorom nasleduje 40 cyklov pri 94 °C počas 15 sekúnd a 60 °C počas 60 sekúnd. Každý beh musí obsahovať negatívne vzorové kontrolné vzorky a pozitívne kontrolné vzorky. Alternatívne však môžu byť použité iné verzie qPCR s podobnou preukázanou účinnosťou.

I.2.2. Konvenčné PCR na detekciu KHV

Použije sa skúška opísaná v tomto bode zameraná na gén pre tymidínkinázu (TK) KHV. Namiesto nej sa môžu použiť iné skúšky PCR s preukázanou podobnou citlivosťou a osobitosťami, aké má opísaná skúška.

Priamy primer (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTAC GAG-3′;

Reverzný primer (KHV-TKr): 5′-CACCCAGTAGATTA TGC-3′.

Podmienky cyklovania: jeden cyklus pri 95 °C počas 5 minút, po ktorom nasleduje 35 cyklov pri 95 °C počas 30 sekúnd, 52 °C počas 30 sekúnd, 72 °C počas jednej minúty a jeden cyklus pri 72 °C počas 10 minút. Veľkosť produktu by mala byť 409 bp.

Výsledky PCR sa môžu líšiť v závislosti od podmienok, v ktorých sa vykonáva, konkrétne môže byť v závislosti od používaného termocykléra potrebné optimalizovať termálne protokoly. Okrem toho môžu nastať falošne pozitívne výsledky z dôvodu nesprávnej teplotnej hybridizácie primeru alebo kontaminácie. Každý beh musí obsahovať negatívne vzorové kontrolné vzorky a pozitívne kontrolné vzorky. Namiesto nej však môžu byť použité iné verzie PCR s preukázanou podobnou účinnosťou.

Prvé zistenie v oblasti sa potvrdí sekvenovaním alebo sa pošle na okamžitú identifikáciu do národného referenčného laboratória alebo referenčného laboratória EÚ pre choroby rýb uvedeného v prílohe VI k smernici 2006/88/ES.

II. Podrobné diagnostické metódy a postupy dohľadu v prípade KHVD

Pri výkone odberu vzoriek a laboratórneho vyšetrenia na účely získania alebo udržania určitých zdravotných štatútov v súvislosti s KHVD podľa oddielu I časti 2 prílohy I s použitím diagnostických metód stanovených v oddieloch II alebo III časti 2 uvedenej prílohy sa uplatňujú podrobné diagnostické metódy a postupy uvedené v nasledujúcich bodoch II.1 a II.2 tejto časti.

II.1. Príprava vzoriek rýb

Ak je to možné, odoberú sa vzorky rýb, ktoré boli dlhší čas držané v teplotnom rozsahu priaznivom pre vírus (konkrétne dva až tri týždne pri teplote 15 °C až 26 °C). Ak je to možné, vzorky sa odoberú 24 hodín, ale nie neskôr ako 72 hodín, po postupoch riadenia, ktoré môžu vírus reaktivovať pri rybách so štatútom prenášača, ako je odchyt rýb do sietí alebo doprava, s cieľom zvýšiť šancu detekcie KHV.

Na účely dohľadu nad KHVD sa môžu na testovanie metódami založenými na PCR zasielať ryby živé alebo zabité a balené oddelene v zapečatených aseptických nádobách alebo mrazené orgány, alebo časti orgánov konzervované v 80 % až 100 % alkohole alebo vo vírusovom transportnom médiu (je potrebné ich spracovať do 48 hodín po odbere). Pri dohľade nad KHVD sa odoberú žiabre a obličky.

Na účely dohľadu nad KHVD je podľa možností potrebné čo najviac sa vyhýbať spájaniu vzoriek. Ak je spájanie nevyhnutné, môže sa spojiť tkanivový materiál najviac z dvoch rýb. Väčšie vzorky sa homogenizujú v trecej miske a roztieradle alebo v homogenizátori stomacher a čiastkové vzorky sa získajú na extrakciu DNA pred objasnením. Alternatívnym spôsobom môže byť odobranie čiastkových vzoriek z každého tkaniva zaradeného do vzorky a ich umiestnenie v skúmavkach na lýzu.

II.1.1. Extrakcia DNA

DNA sa extrahuje v súlade so štandardnými postupmi. Môžu sa použiť komerčne dostupné súpravy na extrakciu DNA, ktorými sa získava kvalitná DNA vhodná na použitie s protokolmi PCR, ktoré sú uvedené v bode II.2.

Prijateľný pomer medzi tkanivom a médiom je 1:9 w/v. Do testov sa zahrnie 20 až 25 mg tkanivového materiálu.

II.2. Dohľad nad KHVD prostredníctvom metód založených na PCR

Na účely dohľadu nad KHV sa použije qPCR. Ak sa v oblasti, ktorá predtým nebola potvrdená ako pozitívna, objavia pozitívne vzorky, výsledky testu sa potvrdia buď:

a) sekvenovaním produktu PCR alebo vnorenej PCR zo vzoriek. Získaná čistá konsenzus sekvencia zodpovedá (najmenej 98 %) týmto referenčným sekvenciám;

b) alebo alternatívne sa vzorky môžu poslať do národného referenčného laboratória na potvrdenie.

II.2.1. qPCR na detekciu KHV

Použije sa qPCR zodpovedajúca tomuto opisu:

Priamy primer (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;

Reverzný primer (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;

a sonda (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.

Podmienky cyklovania: jeden cyklus pri 95 °C počas 15 minút, po ktorom nasleduje 50 cyklov pri 94 °C počas 15 sekúnd a 60 °C počas 60 sekúnd.

Výsledky qPCR sa môžu líšiť v závislosti od podmienok, v ktorých sa vykonáva, konkrétne môže byť v závislosti od používaného termocykléra potrebné optimalizovať termálne protokoly. Okrem toho môže dôjsť k falošne pozitívnym výsledkom z dôvodu nesprávnej anelácie primeru alebo kontaminácie laboratória. Každý beh musí obsahovať negatívne vzorové kontrolné vzorky a pozitívne kontrolné vzorky.. Namiesto tohto postupu však môžu byť použité iné verzie qPCR s preukázanou podobnou účinnosťou.

II.2.2. Štandardná PCR na potvrdenie detekcie KHV

Na potvrdenie prítomnosti infekcie KHV sa použije štandardná vnorená PCR opísaná v nasledujúcej tabuľke 2.1, po ktorej nasleduje sekvenovanie amplifikovaného produktu.

Tabuľka 2.1

Primery a podmienky na vnorenú PCR zameranú na všetky koi herpesvírusy (CyHV-1, CyHV-2 a CyHV-3)

Názov primeru Sekvencia Podmienky cyklovania Veľkosť produktu CyHVpol-priamy 5′-CCAGCAACATGTGCGACGG-3′ Prvé kolo PCR 1 cyklus: 95 °C počas 2 minút 40 cyklov: 95 °C počas 30 sekúnd 55 °C počas 30 sekúnd 72 °C počas 45 sekúnd 1 cyklus: 72 °C počas 10 minút 362 bp CyHVpol-reverzný 5′-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3′ CyHVpol-vnútorný priamy 5′-CGACGGVGGYATCAGCCC-3′ Druhé kolo PCR 1 cyklus: 95 °C počas 2 minút, 40 cyklov: 95 °C počas 30 sekúnd 55 °C počas 30 sekúnd 72 °C počas 45 sekúnd 1 cyklus: 72 °C počas 10 minút 339 bp CyHVpol-vnútorný reverzný 5′-GAGTTGGCGCAYACYTTCATC-3′

Výsledky PCR sa môžu líšiť v závislosti od podmienok, v ktorých sa vykonáva, konkrétne môže byť v závislosti od používaného termocykléra potrebné optimalizovať termálne protokoly. Okrem toho môže dôjsť k falošne pozitívnym výsledkom z dôvodu nesprávnej anelácie primeru alebo kontaminácie laboratória. Každý beh musí obsahovať negatívne vzorové kontrolné vzorky a pozitívne kontrolné vzorky. Namiesto nej môžu byť použité verzie PCR s preukázanou podobnou účinnosťou.

Sekvenovanie môže vykonávať laboratórium alebo sa môže vykonávať v externých spoločnostiach špecializovaných na sekvenovanie. Výsledky sekvenovania sa analyzujú zosúladením sekvencií na známe referenčné sekvencie KHV (prístupové čísla v Gen Bank sú AP008984, DQ657948 a DQ177346). Získaná čistá konsenzus sekvencia musí zodpovedať uvedeným referenčným sekvenciám aspoň na 98 %.

ČASŤ 3

PODROBNÉ DIAGNOSTICKÉ METÓDY A POSTUPY NA DOHĽAD NAD INFEKČNOU ANÉMIOU LOSOSOV (ISA) A NA POTVRDENIE INFEKČNEJ ANÉMIE LOSOSOV (ISA)

I. Postupy odberu vzoriek na účely dohľadu nad ISA a jej kontroly

Pri vykonávaní odberu vzoriek a laboratórneho vyšetrenia na účely programov dohľadu alebo eradikačných programov podľa časti 3 prílohy I alebo na potvrdenie alebo vylúčenie prítomnosti ISA v súlade s článkom 57 písm. b) smernice 2006/88/ES sa uplatňujú podrobné metódy a postupy uvedené v bodoch I.1, I.2 a I.3 tejto časti.

I.1. Príprava vzoriek rýb

Na účely laboratórneho vyšetrenia na zistenie prítomnosti ISA sa vzorky rýb podľa možnosti nespájajú. Na účely dohľadu nad ISA je však prijateľné spájanie vzoriek 2 až 5 rýb.

Vzorky na analýzu polymerázovou reťazovou reakciou spojenou s reverznou transkripciou (RT-PCR) sa odoberajú zo všetkých rýb, ktoré sú predmetom odberu vzoriek. Časť zadnej obličky sa z ryby odstráni použitím sterilného nástroja a prenesie sa do mikroskúmavky, ktorá obsahuje 1 ml roztoku konzervujúceho RNA preukázanej účinnosti. Tkanivá maximálne z piatich rýb sa môžu odobrať do jednej skúmavky, ktorá obsahuje prepravný roztok, a predstavujú jednu zmesnú vzorku. Hmotnosť tkaniva v jednej vzorke je 0,5 g. Ak sú ryby príliš malé na to, aby sa získala vzorka požadovanej hmotnosti, môžu byť odobraté časti obličky, srdca, sleziny, pečene alebo pylorického slepého čreva v tomto poradí tak, aby ich hmotnosť bola 0,5 g.

Tkanivo na histologické vyšetrenie sa odoberá iba z čerstvo zabitých rýb s normálnou konštitúciou, ktoré vykazujú klinické príznaky alebo nálezy post-mortem svedčiace o prítomnosti ISA. Vzorky sa odoberú z akýchkoľvek vonkajších alebo vnútorných lézií, v každom prípade sa však z jednotlivých rýb odoberú vzorky zo zadnej obličky, srdca, pečene, pankreasu, čreva, žiaber a sleziny s použitím skalpela a prenesú sa do slaného tlmiaceho roztoku 8 až 10 % (vol:vol) formalínu. Pomer medzi fixatívom a tkanivom je aspoň 20:1, aby sa zabezpečila spoľahlivá konzervácia tkanív. Na imunohistochémiu (IHC) sa odoberú vzorky zo zadnej obličky a srdca.

Tkanivá na virologické vyšetrenie na bunkovej kultúre sa odoberajú zo všetkých rýb, ktoré sú predmetom odberu vzoriek. Časti pečene, prednej alebo zadnej obličky, srdca a sleziny sa z rýb odoberajú pomocou sterilného nástroja a prenesú sa do plastových skúmaviek obsahujúcich 9 ml transportného média. Tkanivá maximálne z piatich rýb sa môžu zbierať do jednej skúmavky, ktorá obsahuje prepravný roztok, a to predstavuje jednu zmesnú vzorku. Hmotnosť tkaniva v jednej vzorke je 1,0 ± 0,5 g.

I.2. Odosielanie vzoriek rýb

Do laboratória sa môžu prepravovať tiež celé ryby, ak môžu byť počas dopravy splnené teplotné požiadavky, ako je opísané v ods. 3 Celá ryba sa zabalí do sacieho papiera a odošle sa v plastovom vreci, chladená, ako je opísané v uvedenom odseku.

Takisto sa môžu odosielať aj živé ryby, ale iba pod dohľadom národného referenčného laboratória pre choroby rýb a so zohľadnením dodatočných aspektov dezinfekcie a biologickej bezpečnosti pri preprave živých rýb.

Vzorky krvi a skúmavky, ktoré obsahujú tkanivá rýb určené na virologické vyšetrenie alebo analýzu RT-PCR sa umiestnia do izolovaných nádob, ako sú polystyrénové krabice s hrubými stenami, spolu s dostatočným množstvom ľadu alebo mraziacimi blokmi na účely zaistenia chladenia vzoriek počas prepravy do laboratória. Nesmie dôjsť k zmrazeniu a v prepravnej nádobe musí byť v čase prijatia stále ľad alebo musí byť čiastočne alebo úplne zmrazený jeden alebo viaceré z mraziacich blokov. Za mimoriadnych okolností môžu byť vzorky RT-PCR a vzorky na virologické vyšetrenie rýchlo zmrazené a prepravované do laboratória pri teplote – 20 °C alebo nižšej.

Na analýzu RT-PCR tkanív konzervovaných v roztoku Ribonucleic acid (RNA) later sa extrakcia RNA vykonáva v rámci týchto časových rámcov v závislosti od teploty, pri ktorej sa vzorky skladujú:

vzorky skladované pri 37 °C: jeden deň;

vzorky skladované pri 25 °C: jeden týždeň;

vzorky skladované pri 4 °C: jeden mesiac;

vzorky skladované pri – 20 °C: na neurčito.

Ak sú tkanivá rýb prepravované vo fixatíve na histologické vyšetrenie, odosielajú sa v utesnených skúmavkách umiestnených do nádob odolných voči nárazom. Je potrebné vyvarovať sa zmrazeniu vzoriek.

Virologické vyšetrenie na bunkovej kultúre sa začne čo najskôr, a najneskôr do 48 hodín po odobratí vzoriek. Vo výnimočných prípadoch môže virologické vyšetrenie začať najneskôr do 72 hodín po odobratí materiálu, a to za predpokladu, že materiál, ktorý má byť vyšetrovaný, je chránený transportným médiom a počas prepravy je možné dodržať požiadavky na teplotu.

I.3. Odber doplnkového diagnostického materiálu

Na základe schválenia diagnostického laboratória sa môžu odoberať a na doplnkové vyšetrenie pripravovať tkanivá rýb iné ako tie, ktoré sú uvedené v bode I.1.

II. Podrobné diagnostické metódy a postupy na účely dohľadu nad ISA a na potvrdenie prítomnosti ISA alebo na vylúčenie podozrenia na ISA

Ak sa vykonávajú laboratórne vyšetrenia na účely získania alebo udržania určitého zdravotného štatútu, pokiaľ ide o ISA, ako sa uvádza v oddiele I časti 3 prílohy I, alebo na účely potvrdenia prítomnosti ISA alebo vylúčenia podozrenia na ISA v súlade s článkom 57 písm. b) smernice 2006/88/ES s použitím diagnostických metód uvedených v oddiele II časti 3 prílohy I, uplatňujú sa podrobné metódy a postupy stanovené v týchto bodoch II.1 až II.5.

II.1. Vyšetrenie vzoriek pomocou RT-PCR

Diagnostickou metódou, ktorá sa má používať na skríning ISAV, je RT-qPCR. Keďže výsledky RT-qPCR sa môžu líšiť v závislosti od podmienok, za ktorých sa vykonáva, zahrnú sa adekvátne pozitívne a negatívne kontrolné vzorky a amplikóny s cieľom predísť akýmkoľvek pochybnostiam.

II.1.1. Extrakcia celej RNA

Celá práca s RNA sa vykonáva na ľade a s použitím rukavíc.

Celá RNA sa extrahuje použitím fenol-chloroformovej metódy alebo centrifugačných kolón s afinitou k RNA, podľa pokynov výrobcu.

Purifikovaná RNA sa resuspenduje v destilovanej vode bez RNázy (konkrétne vode ošetrenej 0,1 % dietyl pyrokarbonátom).

Koncentrácia a čistota extrahovanej RNA sa odhaduje meraním optickej hustoty pri 260 nm a pri 280 nm. Alternatívnym spôsobom môže byť zahrnúť vnútorné kontroly zamerané proti genómu vírusu podľa bodu II.1.3.

II.1.2. RT-PCR na detekciu ISAV

Na amplifikáciu genómu ISAV možno použiť niekoľko metód RT-PCR. Dvojkroková RT-PCR, pričom kroky reakcií RT a PCR prebiehajú v dvoch oddelených skúmavkách. Môže sa však takisto vykonať jednokroková reakcia, kde dané dve reakcie prebiehajú v jednej skúmavke. Vždy, keď je to možné, sa použije jednokroková metóda, keďže pri skúške s jednou skúmavkou sa minimalizuje riziko krížovej kontaminácie, keďže sa nemusí uskutočniť prenos obsahu, a táto metóda sa považuje za rovnako citlivú ako dvojkroková metóda.

Použijú sa primery a skúška, ktoré sú opísané v tomto bode, konkrétne pár primerov ILA1 alebo ILA2, ktoré sú zamerané na segment 8 a ktoré sa považujú za vhodné na detekciu ohnísk ISAV a pri rybách, ktoré sú prenášačmi. Reverzný primer ILA2 nezodpovedá izolátom zo Severnej Ameriky a v uvedených prípadoch sa použije alternatívny súbor primerov.

Priamy primer (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′;

Reverzný primer (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.

Podmienky cyklovania: jeden cyklus pri 50 °C počas 30 minút, 1 cyklus pri 94 °C počas 15 minút, 40 cyklov pri 94 °C počas 30 sekúnd, 55 °C počas 30 sekúnd a 72 °C počas 60 sekúnd; jeden cyklus pri 72 °C počas 5 min. Veľkosť produktu 155 bp.

Výsledky PCR sa môžu líšiť v závislosti od podmienok, v ktorých sa vykonáva, konkrétne môže byť v závislosti od používaného termocykléra potrebné optimalizovať termálne protokoly. Okrem toho môže dôjsť k falošne pozitívnym výsledkom z dôvodu nesprávnej anelácie primeru alebo kontaminácie laboratória. Každý beh musí obsahovať negatívne vzorové kontrolné vzorky a pozitívne kontrolné vzorky. Namiesto nej však môžu byť použité iné verzie RT-PCR s preukázanou podobnou účinnosťou.

II.1.3. RT-qPCR na detekciu ISAV

Používanie RT-qPCR môže zvýšiť špecificitu a pravdepodobne aj citlivosť. Metódu možno vykonať rýchlejšie, keďže sa nevyžaduje gélová elektroforéza, a znižuje sa ňou riziko krížovej kontaminácie, keďže je možné odhadnúť množstvo vírusovej genómovej RNA v skúmavke so vzorkou. Nevýhodou skúšky RT-qPCR je, že často nie je možné sekvenovanie amplifikovaných produktov. Ak však existujú pochybnosti o špecifickosti amplifikovaného produktu, musí sa vykonať ďalšia ISAV-špecifická skúška na overenie výsledku.

Použije sa skúška opísaná v tomto bode, ktorá je skúškou zameranou na segment 8. Táto skúška zahŕňa izoláty z Európskej únie, Európskeho združenia voľného obchodu a Severnej Ameriky. Jednokroková metóda sa použije vždy, keď je to možné, pretože pri skúške s jednou skúmavkou sa minimalizuje riziko krížovej kontaminácie.

Priamy primer: 5′- CTACACAGCAGGATGCAGATGT -3′;

Reverzný primer: 5′- CAGGATGCCGGAAGTCGAT -3′;

a sonda: 5′-FAM- CATCGTCGCTGCAGTTC – MGBNFQ-3′.

Každý beh musí obsahovať negatívne vzorové kontrolné vzorky a pozitívne kontrolné vzorky. Podmienky cyklovania: jeden cyklus pri 50 °C počas 30 minút, jeden cyklus pri 95 °C počas 15 minút, 40 cyklov pri 94 °C počas 15 sekúnd, 60 °C počas 60 sekúnd; v prípade potreby sa tieto podmienky upravia. Alternatívne môžu byť použité iné verzie RT-PCR alebo RT-qPCR s podobnou preukázanou účinnosťou.

II.1.4. Sekvenovanie amplifikovaných produktov PCR

Priamy primer (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA -3′;

Reverzný primer (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA -3′.

Každý beh musí obsahovať negatívne vzorové kontrolné vzorky a pozitívne kontrolné vzorky. Podmienky cyklovania (jednokroková RT-PCR): jeden cyklus pri 50 °C počas 30 minút, jeden cyklus pri 94 °C počas 15 minút, 40 cyklov pri 94 °C počas 30 sekúnd, 55 °C počas 30 sekúnd, 72 °C počas 60 sekúnd a jeden cyklus pri 72 °C počas 5 minút; v prípade potreby sa tieto podmienky upravia. Namiesto toho môžu byť použité iné verzie RT-PCR alebo RT-qPCR s podobnou preukázanou účinnosťou.

Alternatívne sa môže použiť táto metóda na sekvenovanie HPR v segmente 6:

Priamy primer: 5′-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′;

Reverzný primer: 5′-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3′;.

Veľkosť produktu: 304 nt v prípade HPR0.

Môžu sa použiť aj skúšky RT-PCR s podobnou citlivosťou a osobitosťami, ako má skúška opísaná v tomto bode.

Pred sekvenovaním sa skontroluje čistota amplifikovaného produktu RT-PCR pomocou gélovej elektroforézy. Ak sa objaví len jeden čistý fragment, purifikuje sa priamo z reakcie PCR. Ak je prítomných viacero amplifikovaných fragmentov, fragment, ktorý je predmetom záujmu, sa purifikuje gélovou elektroforézou. Purifikácia fragmentov PCR od roztokov alebo agarózových gélov sa uskutoční s použitím centrifugačných kolón s afinitou k PCR fragmentu, podľa pokynov výrobcu.

Sekvenovanie sa vykonáva použitím amplifikovaných primerov v externých spoločnostiach špecializovaných na sekvenovanie. Výsledky sekvenovania sa analyzujú nástrojom vyhľadávania BLAST a sekvencie sa porovnávajú s ostatnými známymi sekvenciami v databáze nukleotidov národného centra USA pre biotechnologické informácie (US National Centre for Biotechnical Information – NCBI).

Sekvenovaním sa musí odstrániť akákoľvek pochybnosť o špecifickosti amplifikovaného produktu RT-PCR.

II.2. Izolácia ISAV na bunkových kultúrach

II.2.1. Príprava vzoriek

Tkanivo sa môže uchovávať pri teplote – 80 °C. Tkanivo sa pred vyšetrením zmrazí a rozmrazí iba raz. Na účely dohľadu a kontroly sa vyšetrenie uskutoční čo najskôr.

Každá vzorka (zmes tkaniva v prepravnom roztoku) sa úplne homogenizuje použitím validovaného homogenizátora, centrifuguje sa pri 2 000 až 4 000 × g počas 15 minút pri teplote 0 až 6 °C a supernatant sa filtruje (0,45 μm) a inkubuje rovnakým objemom zmesi vhodne zriedeného antiséra proti indigénnym sérotypom IPNV. Titer antiséra musí byť aspoň 1:2 000 v 50 % plakovom neutralizačnom teste. Zmes sa inkubuje počas jednej hodiny pri teplote 15 °C. To prestavuje inokulum.

Cieľom spracovania všetkých inokul s antisérom proti vírusu infekčnej pankreatickej nekrózy (vírus, ktorý sa v niektorých častiach Európy vyskytuje pri 50 % vzoriek rýb) je zabrániť výskytu cytopatického efektu CPE v naočkovaných bunkových kultúrach v dôsledku vírusu IPN. Takéto ošetrenie sa môže vykonať, aby sa skrátilo trvanie virologických vyšetrení, ako aj počet prípadov, pri ktorých by výskyt CPE musel byť považovaný za potenciálny indikátor ISAV. Ak vzorky pochádzajú z výrobných jednotiek, ktoré sú považované za jednotky bez výskytu vírusu IPN, ošetrenie inokulom s antisérom proti vírusu IPN sa smie vynechať.

II.2.2. Naočkovanie na bunkových kultúrach

Na primárnu izoláciu ISAV sa použijú bunky z obličky lososa atlantického (ASK). Môžu byť použité aj iné bunkové línie s preukázanou účinnosťou a citlivosťou na izolovanie vírusu ISA, pričom sa zohľadňuje variabilita kmeňa a schopnosť rôznych kmeňov rozmnožovať sa v rôznych bunkových líniách. Zdá sa, že bunky ASK podporujú izoláciu a rast doteraz známych izolátov vírusu, pokiaľ sa používa úroveň s nízkou pasážou. V bunkách ASK sa môže objaviť výraznejší cytopatický efekt (CPE) ako v iných vnímavých bunkových líniách ako SHK-1 (Salmon head kidney-1).

Bunky ASK (pasáž 65 alebo nižšia) sa kultivujú v prostredí L-15 obsahujúcom 10 % fetálne bovinné sérum, 2 % (vol:vol) 200 mM L-glutamín a 0,08 % (vol:vol) 50 mM 2-merkaptoetanol na viacjamkových platničkách. Suspenzia orgánov ošetrená antisérom sa naočkuje do mladých aktívne rastúcich bunkových kultúr, aby sa dosiahlo konečné riedenie tkanivového materiálu v kultivačnom médiu v pomere 1:1 000. V prípade každého orgánu sa pridá suspenzia 40 μl inokula do jednej jamky obsahujúcej 2 ml kultivačného média. Na účely minimalizácie rizika krížovej kontaminácie sa použijú samostatné platničky s 12 alebo 24 jamkami v prípade vzoriek pochádzajúcich z rôznych fariem s chovom rýb.

Jedna platnička zostane nenaočkovaná, aby slúžila ako negatívna kontrolná vzorka. Osobitná platnička sa naočkuje referenčným izolátom ISAV ako pozitívna kontrola podľa nasledujúceho postupu. 100 μl zásobného roztoku ISAV (minimálny titer 107 infekčnej dávky pre tkanivovú kultúru v 50 % koncovom bode (TCID50 ml– 1)) sa naočkuje do prvej jamky a premieša. Objem tohto materiálu sa prenesie z prvej jamky do druhej, aby sa získalo riedenie v pomere 1:10 a premieša sa. Tento postup sa opakuje v celej platničke, aby sa získalo šesť riedení v pomere 1:10. Zásobný roztok ISAV sa môže uchovávať pri teplote – 80 °C počas obdobia minimálne dvoch rokov, ale ak sa raz rozmrazí musí sa použiť do troch dní. Pozornosť sa venuje tomu, aby sa zabránilo krížovej kontaminácii testovacích platničiek s pozitívnym kontr