Smernica Komisie 92/95/EHS z 9. novembra 1992, ktorou sa mení a dopĺňa príloha k siedmej smernici 76/372/EHS, ktorou sa ustanovujú analytické metódy Spoločenstva na úradnú kontrolu krmív



Úradný vestník L 327 , 13/11/1992 S. 0054 - 0062

Fínske špeciálne vydanie: Kapitola 3 Zväzok 45 S. 0182

Švédske špeciálne vydanie: Kapitola 3 Zväzok 45 S. 0182

CS.ES Kapitola 3 Zväzok 46 S. 3 - 11

ET.ES Kapitola 3 Zväzok 46 S. 3 - 11

HU.ES Kapitola 3 Zväzok 46 S. 3 - 11

LT.ES Kapitola 3 Zväzok 46 S. 3 - 11

LV.ES Kapitola 3 Zväzok 46 S. 3 - 11

MT.ES Kapitola 3 Zväzok 46 S. 3 - 11

PL.ES Kapitola 3 Zväzok 46 S. 3 - 11

SK.ES Kapitola 3 Zväzok 46 S. 3 - 11

SL.ES Kapitola 3 Zväzok 46 S. 3 - 11



Smernica Komisie 92/95/EHS z 9. novembra 1992, ktorou sa mení a dopĺňa príloha k siedmej smernici 76/372/EHS, ktorou sa ustanovujú analytické metódy Spoločenstva na úradnú kontrolu krmív KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV, so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho hospodárskeho spoločenstva, so zreteľom na smernicu Rady 70/373/EHS z 20. júla 1970, ktorou sa zavádzajú metódy odberu vzoriek a analytické metódy Spoločenstva na úradnú kontrolu krmív [1], v znení Aktu o pristúpení Španielska a Portugalska, a najmä na jej článok 2, keďže siedma smernica Komisie 76/372/EHS z 1. marca 1976, ktorou sa ustanovujú komunitárne analytické metódy na úradnú kontrolu krmív [2], v znení smernice 81/680/EHS [3], predpisuje metódy, ktoré sa musia používať na stanovenie aflatoxínu B1, keďže sú dôvody na prispôsobenie týchto metód s prihliadnutím na pokroky vo vedeckých a technických poznatkoch; keďže sa konkrétne odporúča mať k dispozícii metódu na kontrolu veľmi nízkych obsahov aflatoxínu ustanovených smernicou Rady 74/63/EHS zo 17. decembra 1973 o stanovení maximálnych povolených hladín pre nežiaduce látky a produkty vo výžive zvierat [4], v znení smernice 91/132/EHS [5]; keďže sa taktiež odporúča mať k dispozícii metódu na určenie aflatoxínu B1 v prítomnosti interferujúcich látok, ako je napríklad citrusová dužina; keďže opatrenia uvedené v tejto smernici sú v súlade so stanoviskom Stáleho výboru pre krmivá, PRIJALA TOTO ROZHODNUTIE: Článok 1 Príloha k smernici 76/372/EHS sa mení a dopĺňa v súlade s prílohou k tejto smernici. Článok 2 Členské štáty uvedú do účinnosti zákony, iné právne predpisy a správne opatrenia potrebné na dosiahnutie súladu s touto smernicou najneskôr do 1. októbra 1993. Bezodkladne o tom informujú Komisiu. Členské štáty uvedú priamo v prijatých opatreniach alebo pri ich úradnom uverejnení odkaz na túto smernicu. Podrobnosti o odkaze upravia členské štáty. Článok 3 Táto smernica je určená členským štátom. V Bruseli 9. novembra 1992 Za Komisiu Ray Mac Sharry člen Komisie [1] Ú. v. ES L 170, 3.8.1970, s. 2. [2] Ú. v. ES L 102, 15.4.1976, s. 8. [3] Ú. v. ES L 246, 29.8.1981, s. 32. [4] Ú. v. ES L 38, 11.2.1974, s. 31. [5] Ú. v. ES L 66, 13.3.1991, s. 16. -------------------------------------------------- PRÍLOHA I. V časti A "Metóda jednorozmernej tenkovrstvovej chromatografie" sa text v bode 1 "Účel a rozsah" nahrádza týmto textom: "1. Účel a rozsah Táto metóda umožňuje stanoviť obsah aflatoxínu B1 v surovinách a jednozložkových krmivách: Táto metóda s nemôže použiť pri výskyte citrusovej dužiny. Spodná hranica pre stanovenie je 0,01 mg/kg (10 ppb). Pri výskyte interferujúcich látok sa musí analýza opakovať, pričom sa použije metóda B (vysokoúčinná kvapalinová chromatografia)." II. V časti B "Metóda dvojrozmernej tenkovrstvovej chromatografie" sa daný text nahrádza týmto znením: "B. STANOVENIE AFLATOXÍNU B1. METÓDA VYSOKOÚČINNEJ KVAPALINOVEJ CHROMATOGRAFIE 1. Účel a rozsah Táto metóda je na stanovenie aflatoxínu B1 v krmivách pre zvieratá, vrátane krmív obsahujúcich citrusovú dužinu. Spodná hranica pre stanovenie je 0,001 mg/kg (1 ppb). 2. Podstata metódy Vzorka sa extrahuje chloroformom. Extrakt sa filtruje a pomerná časť sa prečistí na florisilovej patróne a potom na patróne C18. Konečná separácia a stanovenie sa dosiahne vysokoúčinnou kvapalnou chromatografiou (HPLC) s použitím reverznej fázy kolóny C18, po ktorej nasleduje pokolónová derivatizácia jódom vo vode, a fluoroscentnej detekcie. Poznámka: mykotoxíny sú veľmi toxické látky. Odporúča sa narábať s nimi v určenom digestore. Osobitné bezpečnostné opatrenia by sa mali prijať pre prípady, keď toxíny sú v suchom stave, pretože majú elektrostatickú povahu a následkom toho majú tendenciu rozptýliť sa po pracovisku. 3. Činidlá 3.1. Chloroform, stabilizovaný 0,5 až 1,0 hmotnostným percentom etanolu. Pozri poznámku 10.2. 3.2. Metanol, čistoty HPLC pre preatáciu 3.6. 3.3. Acetón. 3.4. Acetonitril, čistoty HPLC. 3.5. Premývacie rozpúšťadlá: Pripraví sa jeden deň pred použitím, alebo ultrazvukom sa v rozpúšťadle odstráni vzduch. 3.5.1. Zmes acetónu (3.3) a vody, 98 + 2 (v + v). 3.5.2. Zmes vody a metanolu (3.2) a vody, 80 + 20 (v + v). 3.5.3. Zmes vody a acetónu (3.3), 85 + 15 (v + v). 3.6. Mobilná fáza pre HPLC Zmes vody, metanolu (3.2) a acetonitrilu (3.4), 130 + 70 + 40 (v + v + v). Poznámka: V závislosti na vlastnostiach použitej HPLC kolóny môže vzniknúť potreba upraviť zloženie rozpúšťadla v mobilnej fáze. 3.7. Nasýtený jódový roztok: Do 400 ml vody dajte 2 g jódu. Zmiešavajte najmenej 90 minút a prefiltrujte cez membránový filter. (4.15). Nasýtený roztok chráňte pred svetlom, aby sa zabránilo fotodegradácii. 3.8. Kyselinou premytý celit 545, alebo jeho ekvivalent. 3.9. Florisilová patróna (Waters SEP-PAK), alebo podobné. 3.10. Patróna C18 (Waters SEP-PAK), alebo podobné. 3.11. Inertný plyn, napr. dusík. 3.12. Štandardný roztok aflatoxínu B1 v chloroforme, koncentrácia 10 μg/ml. Prekontrolujte koncentráciu roztoku týmto spôsobom: pomocou spektrofotometra (4.23) stanovte absorpčné spektrum roztoku medzi 330 a 370 nm. Odmerajte absorbanciu (A) pri maximálnej hodnote 363 nm. Vypočítajte koncentráciu aflatoxínu B1 v mikrogramoch na mililiter roztoku pomocou tohto vzorca: Koncentrácia (μg/ml) = = 13,991 × A 3.12.1. Zásobný štandardný roztok aflatoxínu B1 v chloroforme. Kvantitatívne preneste 2,5 ml štandardného roztoku aflatoxínu B1 (3.12) do odmernej banky s obsahom 50 ml a upravte po značku s chloroformom (3.1). Tento roztok skladujte na chladnom tmavom mieste (pri teplote 4 °C), dôkladne utesnený a zabalený v hliníkovej fólii. 3.13. HPLC kalibračných roztokov aflatoxínu B1. Poznámka: Na prípravu týchto roztokov použite laboratórne sklo umyté kyselinou (pozri bod 4 – Aparatúra). 3.13.1. Kalibračný roztok 4ng/ml. V hliníkovej fólii zohrievajte odmernú banku so zásobným štandardným roztokom (3.12.1) až na izbovú teplotu (niekoľko hodín). Preneste 400 ml zásobného štandardného roztoku (200 ng aflatoxínu B1) do odmernej banky s obsahom 50 ml, a roztok odparujte dosucha v prúde inertného plynu (3.11). Rozpusťte získané rezíduum v približne 20 ml zmesi vody a acetónu (3.5.3), doplňte po značku zmesou vody a acetónu a dobre zamiešajte. 3.13.2. Kalibračný roztok 3 ng/ml. Kvantitatívne preneste 7,5 ml kalibračného roztoku (3.13.1) do odmernej banky s obsahom 10 ml, doplňte po značku zmesou vody a acetónu (3.5.3) a dobre premiešajte. 3.13.3. Kalibračný roztok 2 ng/ml. Kvantitatívne preneste 25 ml kalibračného roztoku (3.13.1) do odmernej banky s obsahom 50 ml, doplňte po značku zmesou vody a acetónu (3.5.3) a dobre premiešajte. Tento roztok sa taktiež uvádza ako referenčný etalón, ktorý sa má používať pri opakovanom vstreknutí počas HPLC (5.5). 3.13.4. Kalibračný roztok 1 ng/ml. Kvantitatívne preneste 2,5 ml kalibračného roztoku (3.13.1) do odmernej banky s obsahom 10 ml, doplňte po značku zmesou vody a acetónu (3.5.3) a dobre premiešajte. 3.14. Ampula obsahujúca zmes aflatoxínov B1, B2, G1 a G2 koncentrácie približne 1, 0,5, 1 a prípadne 0,5 mg/ml v 1 ml chloroformu. 3.14.1. Chromatografický skúšobný roztok. Preneste obsah ampuly (3.14) do skúmavky uzavretej sklenou zátkou alebo do liekovky uzavretej šrubovacím vrchnákom. Preneste 40 ml tohto roztoku do skúmavky uzavretej sklenou zátkou (vypláchnutej kyselinou) (4.22). Odparujte chloroform prúdom inertného plynu (3.11) a znova rozpusťte v 10 ml zmesi vody a acetónu (3.5.3). 3.15. Činidlá pre potvrdzujúcu skúšku (6). 3.15.1. Roztok chloridu sodného. 3.15.2. Síran sodný, bezvodý, granulovaný. 4. Aparatúra Upozornenie: Použtie laboratórneho skla neumytého kyselinou pre vodné roztoky aflatoxínov môže spôsobiť straty. Pozornosť je potrebné venovať najmä novému laboratórnemu sklu, ako sú napríklad liekovky na automatický odber vzoriek a Pasteurove pipety. Laboratórne sklo, ktoré prichádza do styku a vodnými roztokmi aflatoxínov, by sa preto malo na niekoľko hodín ponoriť do zriedenej kyseliny (napr. kyseliny sírovej = 2 mol/l) a potom dôkladne vypláchnuť destilovanou vodou, aby sa odstránili všetky stopy kyseliny (napr. trikrát, a skontrolujte to pH-papierom). V praxi je tento postup potrebný pre banky s guľatým dnom (4.4), odmerné banky, odmerné valce, liekovky alebo skúmavky používané pre kalibračné roztoky a konečné extrakty (konkrétne liekovky pre autosamplery), a Pasteurove pipety, ak sa používajú na prenos kalibračných roztokov alebo extraktov. 4.1. Mlynček – mixér. 4.2. Sito s otvormi, ktoré majú veľkosť 1,0 mm, (ISO R 565). 4.3. Mechanická trepačka. 4.4. Rotačná vákuová odparka, so 150 ml až 250 ml bankou s guľatým dnom. 4.5. Vysokovýkonný kvapalný chromatograf, striekačka s dávkovačom určeným na vstrekovanie 250 ml. Pozri návody výrobcov pre čiastočné alebo úplné náplne dávkovača. 4.6. Analytická kolóna pre HPLC: balenie 3 μm alebo 5 μm C18. 4.7. Neimpulzové čerpadlo na podávanie jódového pokolónového činidla. 4.8. Fiting Valco s nulovým vlastným objemom, nehrdzavejúca oceľ (1/16” × 0,75 mm). 4.9. Špirálová reakčná cievka; teflón alebo nehrdzavejúca oceľ. Zistilo sa, že vhodné sú rozmery 3000 × 0,5 mm až 5000 × 0,5 mm v kombinácii s 5 μm alebo 3 μm HPLC kolónami. 4.10. Termostaticky riadený vodný kúpeľ prispôsobený na 60 °C, s možnosťou regulácie teploty na viac ako 0,1 °C. 4.11. Fluorescenčný detektor s excitačnou vlnovou dĺžkou 365 nm a emisnou vlnovou dĺžkou 435 nm. (Pre filtrovacie zariadenie: emisná vlnová dĺžka > 400 nm). Musí umožniť zistiť aspoň 0,05 ng aflatoxínu B1. Odporúča sa trocha spätného tlaku (napr. škrtiaci ventil, teflónová cievka alebo cievka z nehrdzavejúcej ocele pripojená na výpust detektora), na potlačenie vzduchových bublín v prietokovej komore. 4.12. Záznamník s registračným pásikom. 4.13. Elektronický integrátor (dobrovoľne). 4.14. Priemer skladaného filtračného papiera: 24 cm, Macherey-Nagel 617 1/4 alebo ekvivalent. 4.15. Membránový filter s veľkosťou pórov 0,45 μm, Millipore HAWP 04700 alebo ekvivalent. 4.16. Kónická banka s obsahom 500 ml, uzavretá sklenou zátkou. 4.17. Sklená kolóna (vnútorný priemer približne 1 cm, dĺžka približne 30 cm) s Luerovým hrotom. 4.18. Luerov uzatvárací kohútik odolný proti chloroformu (napr. Bio-rad 7328017, Analytichem A1 6078, J. T. Baker 4514 alebo ekvivalentný). 4.19. Chemicky odolná injekčná striekačka, 10 ml Luerov konektor. 4.20. Injekčná striekačka vhodná na HPLC vstrieknutie 250 μl (pozri 4.5). 4.21. 100 ml injekčná mikrostriekačka na prípravu kalibračných roztokov (skontrolujte, či presnosť je v rámci 2 % hmotnosti). 4.22. 10 ml kalibrované rúrky uzavreté sklenou zátkou. 4.23. Spektrofotometer, určený na vykonávanie meraní v UV oblasti spektra. 4.24. Vybavenie pre potvrdzujúcu skúšku (6). 4.24.1. 100 ml separačný lievik s teflónovým kohútikom a prepláchnutý kyselinou. 4.24.2. Ohrievací blok, 40 až 50 °C. 5. Postup 5.1. Príprava vzorky. Vzorku zomeľte tak, aby prešla cez sito (4.2) 5.2. Skúšobná časť vzorky. Odvážte 50 g pripravenej skúšobnej vzorky do kónickej banky (4.16). 5.3. Extrakcia Do skúšobnej časti vzorky pridajte 25 g celitu (3.8), 250 ml chloroformu (3.1) a 25 ml vody (5.2). Banku zazátkujte a pretrepávajte 30 minút ma mechanickej trepačke (4.3). Prefiltrujte cez skladaný filtračný papier (4.14). Zachyťte 50 ml filtrátu. V prípade potreby vezmite pomernú časť filtrátu a rozpusťte na 50 ml chloroformom tak, aby koncentrácia aflatoxínu B1 nebola vyššia ako 4 ng/ml. 5.4. Prečistenie (postup by sa mal vykonať bez podstatného prerušenia). Upozornenie: - pri vykonávaní analýzy primerane chráňte laboratórium pred denným svetlom. Účinne sa to dá urobiť tak, že použijete: i) Fólia absorbujúca UV svetlo na oknách v kombinácii s tlmeným svetlom (bez priameho slnečného svetla); ii) záclony alebo rolety v kombinácii s umelým svetlom (prijateľné sú žiarivky). - Aflatoxín s obsahom roztokov sa musí čo možno najviac chrániť pred svetlom (uchovávajte v tme, použite hliníkovú fóliu). 5.4.1. Čistenie florisilom SEP-PAK 5.4.1.1. Príprava zostavy kolóna-patróna Pripojte uzatvárací kohútik (4.18) ku kratšiemu násadcu florisilovej patróny (3.9) [pozri obrázok 1]. Patrónu umyte a odstráňte pomôcku, tak, že vezmete 10 ml chloroformu (3.1) a rýchlo preženiete 8 ml kohútikovým uzáverom cez patrónu s použitím injekčnej striekačky (4.19). Pripojte dlhšiu časť násadca patróny na sklenú kolónu (4.17) a prežeňte zostávajúce 2 ml chloroformu cez patrónu do kolóny. Uzavrite kohútik. Odstráňte injekčnú striekačku. 5.4.1.2. Čistenie Do zbernej kolóny-patróny pridajte filtrát uvedený v 5.3 a nechajte samovoľne odtiecť. Vypláchnite pomocou 5 ml chloroformu (3.1) a potom 20 ml metanolu (3.2). Eluáty vylejte. Počas týchto operácií zabezpečte, aby kolóna-patróna nevyschla. Eluujte aflatoxín B1 pomocou 40 ml zmesi acetónu a vody (3.5.1) a zachyťte celý eluát v banke s guľatým dnom rotačnej odparky (4.4). Eluát zahusťujte na rotačnej odparke pri 40 °C až 50 °C až dovtedy, kým sa nevydestiluje všetok acetón. (Poznámka: tu zostane v banke približne 0,5 ml kvapaliny. Z pokusov vyplynulo, že ďalšie odparovanie nie je škodlivé a že ak zostane 0,5 ml kvapaliny, nenachádza sa tu významné množstvo acetónu. Rezíduá acetónu by mohli viesť k stratám aflatoxínu B1 na patróne C18). Pridajte 1 ml metanolu (3.2), rýchlym krúživým pohybom banky obsah premiešavajte, aby sa aflatoxín B1 rozpustil na stenách banky, pridajte 4 ml vody, a premiešajte. Odpojte a vyprázdnite patrónu. Sklenú kolónu vypláchnite vodou a ponechajte ju na purifikačný krok C18. 5.4.2. Čistenie pomocou C18 SEP-PAK 5.4.2.1. Príprava zostavy kolóna-patróna Pripojte uzatvárací kohútik (4.18) ku kratšiemu násadcu patróny C18 (3.10) [pozri obrázok 1]. Naplňte patrónu a pomocou striekačky odstráňte všetok vzduch tak, že preženiete 10 ml metanolu (3.2) kohútikovým uzáverom cez patrónu (4.19) (Vzduchové bubliny v patróne sú viditeľné ako svetlé škvrny na pozadí, ktoré má inokedy sivastú farbu). Vezmite 10 ml vody a cez patrónu prežeňte 8 ml (pri vystriedaní metanolu vodou zabráňte vniknutiu vzduchu do patróny). Pripojte dlhšiu časť násadca patróny na sklenú kolónu (4.17) a prežeňte zostávajúce 2 ml vody cez patrónu do kolóny. Uzavrite kohútik. odstráňte injekčnú striekačku. 5.4.2.2. Čistenie Do sklenej kolóny (4.17) kvantitatívne preneste extrakt zachytený v 5.4.1.2, prepláchnite banku dvakrát 5 ml zmesi vody a metanolu (3.5.2) a nechajte samovoľne odtiecť. Počas týchto operácií zabezpečte, aby kolóna-patróna nevyschla. (Ak sa v priehradke v blízkosti patróny vytvárajú vzduchové bubliny, zastavte prietok a otvorte ventil na vrchu sklenej kolóny, aby sa odstránili vzduchové bubliny. Potom pokračujte). Eluujte pomocou 25 ml zmesi vody a metanolu. Vypusťte eluát. Eluujte aflatoxín B1 pomocou 50 ml zmesi vody a acetónu (3.5.3) a zachyťte všetok eluát v 50 ml odmernej banke. Doplňte po značku vodou a premiešajte. Výsledný skúšobný roztok sa použije na chromatografiu (5.5). Upozornenie: Konečný extrakt sa pred HPLC zvyčajne nemusí filtrovať. Ak je to nevyhnutné, nepoužívajú sa celulózové filtre, pretože by to mohlo viesť k stratám aflatoxínu B1. Prijateľné sú teflónové filtre. 5.5. Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (Montáž zariadenia pozri na obrázku 2). Na aklimatizáciu a stabilizáciu nástrojov poskytnite dostatok času. Poznámka 1: Prietoky dané pre mobilnú fázu a pokolónové činidlo sú iba orientačné. Možno ich bude potrebné upraviť v závislosti na vlastnostiach HPLC kolóny. Poznámka 2: Reakcia detektora na aflatoxín B1 závisí od teploty, a preto by sa drift mal kompenzovať (pozri obrázok 3). Vstreknutím pevne stanoveného množstva referenčného etalónu aflatoxínu B1 (3.13.3) v pravidelných intervaloch (t. j. každé tretie vstreknutie), maximálne hodnoty aflatoxínu B1 medzi týmito referenčnými etalónmi sa môžu opraviť použitím strednej hodnoty odozvy, za predpokladu, že rozdiel medzi reakciami po sebe nasledujúcich referenčných úrovní je veľmi malý (< 10 %). Vstreknutia sa preto musia vykonať bez prerušenia. Ak je prerušenie nevyhnutné, referenčným etalónom musí byť posledné vstreknutie pred prerušením a prvé vstreknutie po prerušení (3.13.3). Pretože kalibračná krivka je lineárna a prechádza cez východiskový bod, množstvá aflatoxínu B1 v extrakte vzorky sa určia priamo odkazom na susedné úrovne. 5.5.1. Nastavenie čerpadla HPLC Nastavte čerpadlo HPLC (4.5), aby sa dosiahol prietok 0,5 alebo 0,3 ml/min pre 5 mm alebo 3 mm kolónu HPLC (4.6) s použitím mobilnej fázy (3.6). 5.5.2. Nastavenie pokolónového čerpadla Nastavte čerpadlo (4.7) tak, aby prietok vodného roztoku nasýteného jódom bol 0,2 až 0,4 ml/min (3.7). Pre približnú orientáciu: Odporúča sa prietok približne 0,4 alebo 0,2 ml/min v kombinácii s prietokom 0,5 a prípadne 0,3 ml/min mobilnej fázy (3.6). 5.5.3. Fluorescenčný detektor Nastavte fluorescenčný detektor (4,11) na excitačnú vlnovú dĺžku = 365 nm a em = 435 nm (filtračný nástroj; > 400 nm). Nastavte detektorový tlmič tak, aby ste získali približne 80 % z vychýlenia plného rozsahu zapisovača pre 1 ng aflatoxínu B1. 5.5.4. Injektor Platí pre všetky roztoky – vstrekujte 250 μl množstvá podľa návodu výrobcu injektora. 5.5.5. Kontrola chromatografickej separácie Vstreknite chromatografický skúšobný roztok (3.14.1). Hodnoty sediel by mali byť nižšie ako 5 % súčtu maximálnych hodnôt susedných vrcholov. 5.5.6. Kontrola stability systému Pred každým súborom analýz vstrekujte referenčný etalón (3.13.3), až kým sa nedosiahnu stabilné plochy pod zónou (Poznámka: Špičkové odozvy pre aflatoxín B1 medzi vstreknutiami po sebe nasledujúcimi by sa nemali odlišovať o viac ako 6 %). Vzápätí ihneď pokračujte kontrolou linearity (5.5.7). 5.5.7. Kontrola linearity Vstrekujte kalibračné roztoky aflatoxínu B1 (3.13.1 až 3.13.4). Na opravu driftu v odozve sa pri každom treťom vstreknutí použije referenčný etalón (3.13.3) (Poznámka: Špičková odozva pre tento referenčný etalón sa nesmie za 90 minút odlišovať o viac ako o 10 %). Opravte drift podľa vzorca v bode 7. Kalibračný graf by mal byť lineárny a mal by prechádzať východiskovým bodom, v rámci štandardnej odchýlky odhadu Y. Zistené hodnoty sa od nominálnych hodnôt nesmú odlišovať o viac ako o 3 %. Ak sú splnené tieto podmienky, ihneď pokračujte ďalej. Ak nie sú splnené, zistite a opravte zdroj problému skôr ako budete pokračovať. 5.5.8. Vstrekovanie vzoriek extraktov Vstrekujte vyčistené extrakty vzoriek (5.4.2.2). Vždy po dvoch vzorkách extraktov opakujte vstrekovanie referenčného etalónu (3.13.3) v tomto poradí: referenčný etalón, extrakt, extrakt, referenčný etalón, extrakt, extrakt, referenčný etalón atď. 6. Overovacia skúška 6.1. Ďalšie ošetrenie extraktu (5.4.2.2) Do konečného extraktu, získaného pri 5.4.2.2., pridajte 5 ml roztoku chloridu sodného (3.15.1). Každý extrahujte v separačnom lieviku trikrát pomocou 2 ml chloroformu (3.1) počas jednej minúty (4.21.1). Do skúmavky s obsahom 10 ml nalejte kombinované extrakty chloroformu na približne 1 g síranu sodného (3.15.2). Malý lievik (priemer: 4 cm) môže sa použiť s kúskom bavlny v priehradke, pokrytom približne 1 g síranu sodného. Premyte vrstvu síranu sodného niekoľkými mililitrami chloroformu a zachyťte povlak do tej istej skúmavky. V tej istej skúmavke odparte extrakt chloroformu dosucha s použitím ohrievacieho bloku (4.24.2) a znova rozpusťte v 1 ml chloroformu. 6.2. Príprava derivácie a tenkovrstvovej chromatografie: Pozri prílohu k smernici Rady 76/372/EHS metóda A bod 5.6.2. 7. Výpočet výsledkov Obsah aflatoxínu B1 (mm/kg) prítomného vo vzorke sa vypočíta pomocou tohto vzorca: obsah aflatoxínu B1 v μg/kg = m × V V × M × VfVc pričom: m m = P + P × 2 r st P (vzorka) = plocha pod zónou aflatoxínu B1 pre vzorku P (st1) = plocha pod zónou aflatoxínu B1 vyplývajúca z predchádzajúceho vstreknutia referenčného etalónu (3.13.3) P (st2) = plocha pod zónou aflatoxínu B1 vyplývajúca z nasledujúceho vstreknutia referenčného etalónu (3.13.3) r(st) = vstreknuté množstvo aflatoxínu B1 v referenčnom etalóne (3.13.3) v ng Vm = objem vstreknutého extraktu vzorky v ml Ve x t = konečný objem extraktu vzorky v ml s prihliadnutím na všetky vykonané riedenia (5.3) M = hmotnosť vzorky v g Vf = objem filtrátu prenesený na florisilovú patrónu (5.4.1.2) v ml Vc = objem chloroformu použitý na extrakciu vzorky v ml Ak postup prebieha tak, ako v tomto protokole, vzorec sa redukuje na: obsah aflatoxínu B1 v mg/kg = 20 × m. 7.1. Výsledky sa môžu vypočítať aj pomocou merania výšky píku. 8. Opakovateľnosť: pozri v bode 10.1.9. 9. Reprodukovateľnosť: pozri v bode 10.1. 10. Pozorovania 10.1. Presnosť Z porovnávacej štúdie [1], vykonanej na medzinárodnej úrovni na zmiešaných krmivách, vyplynuli výsledky pre opakovateľnosť a reprodukovateľnosť uvedené v tabuľke 1. Termín opakovateľnosť r), ktorý je tu použitý, je vymedzený ako najväčší pomer, ktorý nie je významný pri 95 % úrovni pravdepodobnosti pre porovnávanie dvoch odčítaní údajov tej istej vzorky v tom istom laboratóriu za podobných podmienok. Termín reprodukovateľnosť (R) je podobne vymedzený pre porovnávanie dvoch odlišných laboratórií. V zhode s ISO 3534 – 1977, 2.35 [2] a rozhodnutím Komisie 89/610/EHS [3] r a R sú tiež uvedené v tabuľke 1 vo význame variačných koeficientov. Tabuľka 1 Opakovateľnosť r) a reprodukovateľnosť (R) vyjadrené ako pomery a zodpovedajúce variačné koeficienty (15 laboratórií) Úroveň | r | R | CVr [4] | CVR | (μg/kg) | | | (%) | (%) | 8 & 14 | 1,4 | 1,7 | 11 | 18 | "CV 10.2. Stabilizácia chloroformu (3.1) Adsorpčné vlastnosti florisilovej patróny sa môžu zmeniť, ak sa použijú iné stabilizátory ako etanol. Malo by sa to overiť v súlade s bodom 10.3, keď nie je k dispozícii opísaný chloroform. 10.3. Presnosť Správnosť použitie metódy sa musí overiť opakovanými meraniami na certifikovaných referenčných materiáloch. Ak nie sú k dispozícii, vykonanie danej metódy by sa malo overiť regeneračnými pokusmi na obohatených slepých vzorkách. Odchýlka od priemeru skutočnej hodnoty, vyjadrená v percentách skutočnej hodnoty, sa nesmie nachádzať mimo hraníc od mínus 20 % do plus 10 %. +++++ TIFF +++++ Obrázok 1: Zostava kolóna-patróna +++++ TIFF +++++ Obrázok 2: Prietokový diagram LC systému s jódovou pokolónovou derivatizáciou +++++ TIFF +++++ Obrázok 3: Vyrovnávanie driftu v odozve aflatoxínu B1 vstreknutím referenčného etalónu (3.13.3) v pravidelných intervaloch" [1] Egmond, H.P van, Heisterkamp, S.H. and Paulsch, W.E (1991). Food nad Contaminants 8, 17-29. [2] ISO 3534-1977. [3] Ú. v. ES L 351, 2.12.1989, s. 39. [4] "variačný koeficient --------------------------------------------------